JP5975983B2 - 固形腫瘍を処置するための方法 - Google Patents

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Description

関連特許出願
２０１１年２月１４日に出願し、「固形腫瘍を処置するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）」との表題の米国仮特許出願第６１／４４２，５８２号に対する優先権；２０１０年６月４日に出願し、「固形腫瘍を処置するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）」との表題の米国仮特許出願第６１／３５１，７６０号に対する優先権；および２０１０年４月１６日に出願し、「固形腫瘍を処置するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）」との表題の米国仮特許出願第６１／３２５，１２７号に対する優先権が主張される。これらの出願は全て言及され、その全体が本明細書中に参考として援用される。
分野
本技術は一般に、免疫学の分野に関し、部分的には、それを必要とする被験体における固形腫瘍を、免疫応答を誘導することにより処置する方法に関する。本技術は、部分的に、固形腫瘍に対する最適化された治療的処置にさらに関する。
背景
抗原提示細胞は、外来の抗原を、ナイーブＴ細胞に提示して、細胞傷害性Ｔリンパ球反応を誘導する。樹状細胞は、有効な抗原提示細胞であり、樹状細胞の活性化は、共刺激分子およびサイトカイン分子の高レベルの発現を結果としてもたらすことが多い。腫瘍細胞など、癌細胞に対して有効な免疫療法を施すためには、腫瘍細胞に対する任意の免疫応答が、持続的にＴ細胞を活性化しうる程度に十分に長い寿命を有する必要がある。癌細胞に対するワクチンとして用いられる場合、抗原提示細胞は、十分に活性化され、リンパ節まで十分に遊走し、リンパ節においてＴ細胞を活性化するのに十分な程度に長い寿命を有する必要がある。
例えば、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−ＴおよびＰｒｏｓｔａｖａｃを含め、前立腺癌に対するワクチンとしての使用について、樹状細胞および抗原提示細胞を介して作用する他のワクチンが被験下にあるが、いずれの薬剤を評価する無作為化臨床試験でも、処置を受ける被験体の疾患進行までの期間において、統計学的に有意な利益が見出されることはなかった（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
Ｄｒｕｇｓ Ｒ ＆ Ｄ （２００６） ７：１９７−２０１ Ｋａｎｔｏｆｆ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．，（２０１０） Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６３：４１１−４２２ Ｋａｎｔｏｆｆ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃ． ２８：１０９９−１１０５
誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）系が、ヒト樹状細胞に適用されており、癌患者における腫瘍サイズを縮小させるのに用いられている。これらの特徴は、例えば、進行したホルモン不応性前立腺癌などの癌を処置または予防するための癌免疫療法の基盤をなしている。したがって、抗原提示細胞においてＣＤ４０を誘導し、前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する抗原反応を活性化すれば、前立腺癌関連腫瘍に対するだけでなく、他の固形腫瘍に対しても、直接的な効果および腫瘍血管新生を標的とすることの両方を介して抗腫瘍効果がもたらされる。前立腺特異的タンパク質抗原、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドに対する免疫応答を誘導することにより、固形腫瘍サイズを縮小させることもでき、固形腫瘍成長を低減することもできる。治療的処置の経過は、各種の画像化モダリティー（例えば、ＣＴ、骨走査、ＭＲＩ、ＰＥＴ走査、Ｔｒｏｆｅｘ走査）を介して、各種の標準的な血液バイオマーカー（例えば、ＰＳＡ、循環腫瘍細胞）を介して、または処置を受ける患者における各種の炎症性因子、低酸素性サイトカイン、もしくは他の因子の血清レベルを介して腫瘍サイズおよび血管新生性を決定することによりモニタリングすることができる。
したがって、一部の実施形態では、被験体における前立腺癌を処置または予防する方法であって、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原などの前立腺癌抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原提示細胞およびリガンドが、被験体における前立腺癌を処置または予防するのに有効な量で投与される方法が特徴とされる。
したがってまた、一部の実施形態では、被験体における、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６類似体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原提示細胞およびリガンドが、被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。一部の実施形態では、免疫応答が、細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫応答である。
また、一部の実施形態では、被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、または腫瘍成長を阻害する方法であって、被験体における腫瘍抗原、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原に対する免疫応答を誘導するステップを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、免疫応答が、細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫応答である。一部の実施形態では、方法が、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原提示細胞およびリガンドが、被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、または腫瘍成長を阻害するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌を有する。一部の実施形態では、腫瘍が、前立腺にある。一部の実施形態では、腫瘍が、肺、骨、肝臓、前立腺、脳、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、リンパ系にあるか、または軟組織肉腫、神経膠芽腫、もしくは悪性骨髄腫である。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原を接触させることにより、抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が負荷される。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この抗原提示細胞を、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードする核酸で形質導入またはトランスフェクトすることにより、抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が負荷される。一部の実施形態では、腫瘍が、前立腺にある。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌を有する。一部の実施形態では、腫瘍が、肺にある。一部の実施形態では、被験体が、肺癌を有する。一部の実施形態では、腫瘍が、肺、リンパ節、骨、または肝臓にある。
また、一部の実施形態では、被験体において、腫瘍血管新生を縮小させるか、または腫瘍血管新生を阻害する方法であって、被験体における腫瘍抗原、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などに対する免疫応答を誘導するステップを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、免疫応答が、細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫応答である。一部の実施形態では、方法が、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原提示細胞およびリガンドが、被験体において、腫瘍血管新生を縮小させるか、または腫瘍血管新生を阻害するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌を有する。一部の実施形態では、腫瘍が、前立腺にある。一部の実施形態では、腫瘍が、肺、骨、肝臓、前立腺、脳、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、リンパ系にあるか、または軟組織肉腫、神経膠芽腫、もしくは悪性骨髄腫である。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この細胞に、例えば、前立腺特異的膜抗原などの抗原を接触させることにより、抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が負荷される。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この抗原提示細胞を、例えば、前立腺特異的膜抗原などの抗原をコードする核酸で形質導入またはトランスフェクトすることにより、抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が負荷される。一部の実施形態では、血管新生のレベルを、分子イメージングにより決定する。一部の実施形態では、分子イメージングが、ヨウ素１２３で標識したＰＳＡ阻害剤、例えば、ＰＳＭＡ阻害剤の投与を含む。一部の実施形態では、阻害剤が、ＴＲＯＦＥＸ（商標）／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である。
また、一部の実施形態では、被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、腫瘍抗原、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原提示細胞およびリガンドが、被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。
一部の実施形態では、腫瘍血管新生を、前立腺において軽減する。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌を有する。一部の実施形態では、腫瘍が、肺、肝臓、リンパ節、または骨にある。
一部の実施形態では、膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、および受容体の膜貫通配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域である。一部の実施形態では、多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性のリンカードメインにより隔てられた重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む単鎖抗体、ならびにこれらが変異した配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である。一部の実施形態では、多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６類似体リガンドである。一部の実施形態では、リガンドが、ＡＰ１９０３である。一部の実施形態では、抗原提示細胞を、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、腫瘍内投与、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）投与、または腹腔内投与を介して、被験体に投与する。一部の実施形態では、前立腺癌が、転移性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢感受性前立腺癌、局所進行前立腺癌、および限局性前立腺癌からなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも２用量の抗原提示細胞およびリガンドを、被験体に投与する。一部の実施形態では、抗原提示細胞が、樹状細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、前立腺特異的膜抗原が、配列番号４のアミノ酸配列もしくはその断片を含むか、または配列番号３のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる。一部の実施形態では、抗原提示細胞を、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターでトランスフェクトする。一部の実施形態では、抗原提示細胞を、Ａｄ５ｆ３５ベクターでトランスフェクトする。一部の実施形態では、ＦＫＢ１２領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である。
一部の実施形態では、方法が、抗原提示細胞およびリガンドを投与した後の被験体におけるＩＬ−６レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、抗原提示細胞およびリガンドを、被験体に、さらに１またはさらに複数の用量を投与するかどうかを決定するステップをさらに含み、この決定が、少なくとも１用量を投与した後の被験体におけるＩＬ−６レベルに基づく。一部の実施形態では、ＩＬ−６レベルが正常レベルを超える場合に、さらなる用量を投与する。一部の実施形態では、ＩＬ−６が、血清に由来する。
一部の実施形態では、方法が、抗原提示細胞およびリガンドを投与した後の被験体におけるＶＣＡＭ−１レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、抗原提示細胞およびリガンドを、被験体に、さらに１またはさらに複数の用量を投与するかどうかを決定するステップをさらに含み、この決定が、少なくとも１用量投与した後の被験体におけるＶＣＡＭ−１レベルに基づく。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ−１レベルが正常レベルを超える場合に、さらなる用量の投与を行う。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ−１が、血清に由来する。
一部の実施形態では、被験体において、前立腺癌の進行を防止するか、または前立腺癌の進行を遅延させる。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この細胞に前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原を接触させることにより、前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原または前立腺特異的膜抗原が負荷される。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この抗原提示細胞を、前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードする核酸で形質導入またはトランスフェクトすることにより、前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が負荷される。一部の実施形態では、前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードする核酸が、ＤＮＡである。一部の実施形態では、前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードする核酸が、ＲＮＡである。一部の実施形態では、抗原提示細胞が、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、キメラタンパク質が、ＭｙＤ８８ポリペプチド、またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号６のペプチド配列もしくはその断片を有するか、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる。一部の実施形態では、前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原が、前立腺特異的膜抗原ポリペプチドである。
また、一部の実施形態では、被験体における前立腺癌を処置または予防する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原または前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、組成物およびリガンドが、被験体における前立腺癌を処置または予防するのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。また、一部の実施形態では、被験体における前立腺癌を処置または予防する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列が、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを用いて送達されるステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、組成物およびリガンドが、被験体における前立腺癌を処置または予防するのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。
一部の実施形態では、前立腺癌の進行を少なくとも６カ月間防止するかまたは遅延させる。一部の実施形態では、前立腺癌の進行を少なくとも１２カ月間防止するかまたは遅延させる。一部の実施形態では、前立腺癌のグリーソンスコアが７、８、９、１０以上である。一部の実施形態では、被験体が、多量体リガンドを投与した３カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す。一部の実施形態では、被験体が、多量体リガンドを投与した６カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す。一部の実施形態では、被験体が、多量体リガンドを投与した９カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す。一部の実施形態では、被験体における血清ＰＳＡレベルを、多量体リガンドを投与した６週間後までに２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。一部の実施形態では、被験体における血清ＰＳＡレベルを、多量体リガンドを投与した３カ月後までに２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。一部の実施形態では、被験体における血清ＰＳＡレベルを、多量体リガンドを投与した６カ月後までに２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。一部の実施形態では、被験体における血清ＰＳＡレベルを、多量体リガンドを投与した９カ月後までに２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。一部の実施形態では、前立腺癌の腫瘍サイズを、多量体リガンドを投与した３カ月後までに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％縮小させる。一部の実施形態では、前立腺癌の腫瘍サイズを、多量体リガンドを投与した６カ月後までに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％縮小させる。一部の実施形態では、前立腺癌の腫瘍サイズを、多量体リガンドを投与した９カ月後までに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％縮小させる。一部の実施形態では、前立腺癌の腫瘍血管新生を、多量体リガンドを投与した３カ月後までに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％軽減する。一部の実施形態では、前立腺癌の腫瘍血管新生を、多量体リガンドを投与した６カ月後までに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％軽減する。一部の実施形態では、前立腺癌の腫瘍血管新生を、多量体リガンドを投与した９カ月後までに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％軽減する。一部の実施形態では、抗原特異的なＴＨ１反応またはＴＨ２免疫応答が、多量体リガンドを投与した後に、被験体において検出される。
また、一部の実施形態では、被験体における腫瘍抗原、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、組成物およびリガンドが、被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与される。また、一部の実施形態では、被験体における腫瘍抗原、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列が、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを用いて送達されるステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列およびリガンドが、被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、免疫応答が、細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫応答である。
また、一部の実施形態では、被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、または腫瘍成長を阻害する方法であって、被験体における、腫瘍抗原、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原に対する免疫応答を誘導するステップを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、方法が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む。一部の実施形態では、方法が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列が、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを用いて送達されるステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む。一部の実施形態では、組成物またはヌクレオチド配列およびリガンドが、被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、または腫瘍成長を阻害するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌を有する。一部の実施形態では、腫瘍が、前立腺にある。一部の実施形態では、腫瘍が、肺、骨、肝臓、前立腺、脳、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、リンパ系にあるか、または軟組織肉腫、神経膠芽腫、もしくは悪性骨髄腫である。一部の実施形態では、腫瘍が、肺、肝臓、リンパ節、または骨にある。
また、一部の実施形態では、被験体において、腫瘍血管新生を軽減するか、または腫瘍血管新生を阻害する方法であって、被験体における、腫瘍抗原、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原に対する免疫応答を誘導するステップを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、方法が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む。一部の実施形態では、方法が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列が、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを用いて送達されるステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む。一部の実施形態では、組成物またはヌクレオチド配列およびリガンドが、被験体において、腫瘍血管新生を軽減するか、または腫瘍血管新生を阻害するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌を有する。一部の実施形態では、腫瘍が、前立腺にある。一部の実施形態では、腫瘍が、肺、骨、肝臓、前立腺、脳、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、リンパ系にあるか、または軟組織肉腫、神経膠芽腫、もしくは悪性骨髄腫である。一部の実施形態では、腫瘍が、骨、肺、肝臓、またはリンパ節にある。一部の実施形態では、血管新生のレベルを、分子イメージングにより決定する。一部の実施形態では、分子イメージングが、ヨウ素１２３で標識したＰＳＡ阻害剤、例えば、ＰＳＭＡ阻害剤の投与を含む。一部の実施形態では、阻害剤が、ＴＲＯＦＥＸ（商標）／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である。
したがって、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原の腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６、もしくはＶＣＡＭ−１、または前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法が特徴とされる。
また、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原の腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６もしくはＶＣＡＭ−１、または前出の一部であるステップと、その後被験体に投与される細胞またはリガンドの用量が、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法も特徴とされる。
したがって、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ、または前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法が特徴とされる。
また、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ、または前出の一部であるステップと、その後被験体に投与される細胞またはリガンドの用量が、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法も特徴とされる。
一部の実施形態では、少なくとも２用量の抗原提示細胞およびリガンドの投与を、各用量の間に１０〜１８日間を置いて、被験体に行う。一部の実施形態では、６用量の抗原提示細胞およびリガンドを、各用量の間に１０〜１８日間を置いて、被験体に投与する。一部の実施形態では、３用量の抗原提示細胞およびリガンドを、各用量の間に２４〜３２日間を置いて被験体に投与する。一部の実施形態では、６用量の抗原提示細胞およびリガンドを、各用量の間に２週間を置いて被験体に投与する。一部の実施形態では、３用量の抗原提示細胞およびリガンドを、各用量の間に４週間を置いて被験体に投与する。一部の実施形態では、抗原提示細胞の各用量が、約４×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、抗原提示細胞の各用量が、約１２．５×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、抗原提示細胞の各用量が、約２５×１０６個の細胞を含む。
一部の実施形態では、方法が、化学療法剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、組成物、リガンド、および化学療法剤が、被験体における前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、組成物またはヌクレオチド配列、リガンド、および化学療法剤が、被験体における前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、化学療法剤を、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）、およびサリドマイドからなる群から選択する。一部の実施形態では、化学療法剤が、タキサンである。タキサンは、例えば、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、パクリタキセル、およびカバジタキセルからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、タキサンが、ドセタキセルである。
一部の実施形態では、化学療法剤を、抗原提示細胞もしくはリガンドの投与と同時であるか、または抗原提示細胞もしくはリガンドの投与後１週間以内に投与する。他の実施形態では、化学療法剤を、リガンドを投与した後に投与する。他の実施形態では、化学療法剤を、リガンドを投与した１〜４週間後、または１週間〜１カ月後、または１週間〜２カ月後、または１週間〜３カ月後に投与する。他の実施形態では、方法が、化学療法剤を、抗原提示細胞を投与する１〜４週間前、または１週間〜１カ月間前、または１週間〜２カ月間前、または１週間〜３カ月間前に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、化学療法剤を、抗原提示細胞を投与する少なくとも２週間前に投与する。一部の実施形態では、化学療法剤を、抗原提示細胞を投与する少なくとも１カ月間前に投与する。一部の実施形態では、化学療法剤を、多量体リガンドを投与した後に投与する。一部の実施形態では、化学療法剤を、多量体リガンドを投与した少なくとも２週間後に投与する。一部の実施形態では、化学療法剤を、多量体リガンドを投与した少なくとも１カ月後に投与する。
一部の実施形態では、方法が、２つ以上の化学療法剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、化学療法剤を、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、およびサリドマイドからなる群から選択する。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学療法剤が、タキサンである。タキサンは、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、およびカバジタキセルからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、タキサンが、ドセタキセルである。一部の実施形態では、化学療法剤を、抗原提示細胞もしくはリガンドの投与と同時であるか、または抗原提示細胞もしくはリガンドの投与後１週間以内に投与する。他の実施形態では、化学療法剤を、リガンドを投与した後に投与する。他の実施形態では、化学療法剤を、リガンドを投与した１〜４週間後、または１週間〜１カ月後、または１週間〜２カ月後、または１週間〜３カ月後に投与する。他の実施形態では、方法が、化学療法剤を、抗原提示細胞を投与する１〜４週間前、または１週間〜１カ月間前、または１週間〜２カ月間前、または１週間〜３カ月間前に投与するステップをさらに含む。
また、一部の実施形態では、腫瘍の化学療法感受性を増大させる方法であって、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、前立腺特異的膜抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原提示細胞およびリガンドが、被験体における腫瘍の化学療法感受性を増大させるのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。腫瘍は、例えば、ドセタキセルまたはカバジタキセルなどの、例えば、タキサンなど、任意の化学療法剤に対して、化学療法感受性を増大させうる。
腫瘍の化学療法感受性を増大させることとは、例えば、腫瘍のサイズ、成長速度、外見、または血管新生性など、任意の方法により測定される、例えば、任意の化学療法剤に対する腫瘍の感受性を増大させることを意味する。腫瘍の化学療法感受性を増大させることとは、腫瘍が、ワクチン療法以前より、例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％化学療法剤に対して感受性を増大させることを意味する。
また、一部の実施形態では、前立腺膜タンパク質抗原が負荷された抗原提示細胞および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、前立腺膜タンパク質抗原が負荷された抗原提示細胞および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、その後被験体に投与される細胞またはリガンドの用量が、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、前立腺膜タンパク質抗原が負荷された抗原提示細胞および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を含む情報を受け取るステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、前立腺膜タンパク質抗原ペプチドが負荷された抗原提示細胞および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整する意思決定者に、このバイオマーカーの存在、非存在、または量を伝達するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、前立腺膜タンパク質抗原ペプチドが負荷された抗原提示細胞および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づきこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するための指標を伝達するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、治療有効性を最適化する方法であって、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６またはＶＣＡＭ−１であるか、あるいはこのバイオマーカーが、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ、または前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、処置の毒性を軽減する方法であって、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６またはＶＣＡＭ−１であるか、あるいはこのバイオマーカーが、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ、または前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与する方法であって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部の量を同定するステップと、この被験体において同定されたＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部の量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、被験体のＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部のレベルが、細胞を投与する前の健常な被験体と比べて上昇する。
また、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与する方法であって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の量を同定するステップと、この被験体において同定されたＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態、方法の実施形態Ｉ１１では、被験体のＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部のレベルが、細胞を投与する前の健常な被験体と比べて上昇する。
また、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与する方法であって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部の量を同定するステップと、この被験体において同定されたＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の量に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態、方法の実施形態Ｉ１１では、被験体のｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部のレベルが、細胞を投与する前の健常な被験体と比べて上昇する。
また、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与する方法であって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体における個別の分泌因子または分泌因子のパネルの量を同定するステップであって、これらの分泌因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、およびＨＧＦからなる群から選択されるステップと、この被験体において同定された個別の血清因子または血清因子のパネルの量または量の変化に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む方法も特徴とされる。また、一部の実施形態では、被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列が、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを用いて送達されるステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含む方法も特徴とされる。
一部の実施形態では、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列、およびキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、異なる核酸または同じ核酸に存在する。一部の実施形態では、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列、およびキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、異なるアデノウイルスベクターまたは同じアデノウイルスベクターに存在する。一部の実施形態では、膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、および受容体の膜貫通配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域である。一部の実施形態では、多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性のリンカードメインにより隔てられた重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む単鎖抗体、ならびにこれらが変異した配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である。一部の実施形態では、多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６類似体リガンドである。一部の実施形態では、前立腺腫瘍抗原が、例えば、前立腺特異的膜抗原ポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物が、粒子をさらに含み、この組成物が、推進力により投与される。一部の実施形態では、粒子が、金粒子またはナノ粒子である。一部の実施形態では、リガンドが、ＡＰ１９０３である。一部の実施形態では、前立腺癌が、転移性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢感受性前立腺癌、局所進行前立腺癌、および限局性前立腺癌からなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも２用量の組成物およびリガンドを、被験体に投与する。一部の実施形態では、少なくとも２用量の、１以上のアデノウイルスベクターおよびリガンドを、被験体に投与する。一部の実施形態では、ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、前立腺特異的膜抗原が、配列番号４のアミノ酸配列もしくはその断片を含むか、または配列番号３のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる。一部の実施形態では、ＦＫＢ１２領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である。
一部の実施形態では、方法が、組成物またはアデノウイルスベクターおよびリガンドを投与した後の被験体におけるＩＬ−６レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、被験体に、さらに１またはさらに複数の用量を投与するかどうかを決定するステップをさらに含み、この決定が、少なくとも１用量投与した後の被験体におけるＩＬ−６レベルに基づく。一部の実施形態では、ＩＬ−６レベルが正常レベルを超える場合に、さらなる用量の投与を行う。一部の実施形態では、ＩＬ−６が、血清に由来する。
一部の実施形態では、方法が、組成物またはアデノウイルスベクターおよびリガンドを投与した後の被験体におけるＶＣＡＭ−１レベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、被験体に、さらに１またはさらに複数の用量を投与するかどうかを決定するステップをさらに含み、この決定が、少なくとも１用量投与した後の被験体におけるＶＣＡＭ−１レベルに基づく。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ−１レベルが正常レベルを超える場合に、さらなる用量の投与を行う。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ−１が、血清に由来する。
一部の実施形態では、方法が、組成物またはアデノウイルスベクターおよびリガンドを投与した後の被験体におけるｕＰＡＲレベル、ＨＧＦレベル、ＥＧＦレベル、またはＶＥＧＦレベルを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、被験体に、さらに１またはさらに複数用量を投与するかどうかを決定するステップをさらに含み、この決定が、少なくとも１用量投与した後の被験体におけるｕＰＡＲレベル、ＨＧＦレベル、ＥＧＦレベル、またはＶＥＧＦレベルに基づく。一部の実施形態では、方法が、ＶＣＡＭ−１レベルが正常レベルを超える場合に、さらなる用量を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、またはＶＥＧＦが、血清に由来する。
一部の実施形態では、被験体において、前立腺癌の進行を防止するか、または前立腺癌の進行を遅延させる。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原を接触させることにより、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷される。一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、この抗原提示細胞を、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードする核酸で形質導入またはトランスフェクトすることにより、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷される。一部の実施形態では、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードする核酸が、ＤＮＡである。一部の実施形態では、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードする核酸が、ＲＮＡである。一部の実施形態では、抗原提示細胞が、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、キメラタンパク質が、ＭｙＤ８８ポリペプチド、またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号６のペプチド配列もしくはその断片を有するか、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる。一部の実施形態では、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原ポリペプチドである。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６もしくはＶＣＡＭ−１、または前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６もしくはＶＣＡＭ−１、または前出の一部であるステップと、その後被験体に投与される組成物またはリガンドの用量が、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ、または前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ、または前出の一部であるステップと、その後被験体に投与される組成物またはリガンドの用量が、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、組成物および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、この組成物が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含み、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合し、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、その後被験体に投与される組成物またはリガンドの用量が、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、組成物および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を含む情報を受け取るステップであって、この組成物が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含み、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合し、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物の用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物の用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、組成物および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、この組成物が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含み、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合し、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整する意思決定者に、このバイオマーカーの存在、非存在、または量を伝達するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、組成物および多量体リガンドを投与された被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、この組成物が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含み、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合し、多量体リガンドが、多量体リガンド結合領域に結合するステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するための指標を伝達するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、治療有効性を最適化する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、
多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６もしくはＶＣＡＭ−１、または前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、治療の毒性を軽減する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定するステップであって、このバイオマーカーが、ＩＬ−６もしくはＶＣＡＭ−１、またはｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、もしくはＶＥＧＦ、あるいは前出の一部であるステップと、この被験体において同定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部の量を同定するステップと、この被験体において同定されたＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部の量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、被験体のＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部のレベルが、組成物を投与する前の健常な被験体と比べて上昇する。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の量を同定するステップと、この被験体において同定されたＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、被験体のＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部のレベルが、組成物を投与する前の健常な被験体と比べて上昇する。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体におけるｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部の量を同定するステップと、この被験体において同定されたｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部の量に基づき、この被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の組成物もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、被験体のｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部のレベルが、組成物を投与する前の健常な被験体と比べて上昇する。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体における個別の分泌因子または分泌因子のパネルの量を同定するステップであって、これらの分泌因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、およびＨＧＦからなる群から選択されるステップと、この被験体において同定された個別の血清因子または血清因子のパネルの量または量の変化に基づき、この被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を維持するか、またはこの被験体に投与される後続の細胞もしくはリガンドの用量を調整するステップとを含む方法も特徴とされる。
一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌を有する。一部の実施形態では、被験体が、固形腫瘍を有する。一部の実施形態では、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原に対する免疫応答を、細胞または組成物およびリガンドを投与することにより誘導する。一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞反応を誘導する。一部の実施形態では、細胞または組成物およびリガンドを投与することにより、腫瘍血管新生を軽減または阻害する。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌の予防を必要とする。一部の実施形態では、キメラタンパク質が、ＭｙＤ８８ポリペプチド、またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをさらに含む。
一部の実施形態では、バイオマーカーの存在、非存在、または量を、被験体に由来する生物学的試料から決定する。一部の実施形態では、試料が、血液または血液画分を含有する。
一部の実施形態では、バイオマーカーが、ＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部である。一部の実施形態では、ＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、ＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部をＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部に特異的に結合する抗体を接触させるステップを含む方法により決定する。一部の実施形態では、ＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、高速液体クロマトグラフィーを介してＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部を解析するステップを含む方法により決定する。一部の実施形態では、ＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、質量分析を介してＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部を解析するステップを含む方法により決定する。
一部の実施形態では、バイオマーカーが、ＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部である。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、ＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部をＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部に特異的に結合する抗体を接触させるステップを含む方法により決定する。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、高速液体クロマトグラフィーを介してＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部を解析するステップを含む方法により決定する。一部の実施形態では、ＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、質量分析を介してＶＣＡＭ−１ポリペプチドまたはその一部を解析するステップを含む方法により決定する。
また、一部の実施形態では、被験体における固形腫瘍を処置する方法であって、被験体におけるＩＬ−６の量もしくはＶＣＡＭ−１の量、またはこれらの両方を低減するのに有効な量で医薬組成物を投与するステップを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、方法が、抗体を被験体に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、ステロイド剤を被験体に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、化学療法剤を被験体に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物が、核酸組成物を含む。一部の実施形態では、固形腫瘍が、前立腺癌腫瘍として分類される。
一部の実施形態では、バイオマーカーが、ｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部である。一部の実施形態では、ｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、ｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部をｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部に特異的に結合する抗体を接触させるステップを含む方法により決定する。一部の実施形態では、ｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、高速液体クロマトグラフィーを介してｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部を解析するステップを含む方法により決定する。一部の実施形態では、ｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部の存在、非存在、または量を、質量分析を介してｕＰＡＲポリペプチド、ＨＧＦポリペプチド、ＥＧＦポリペプチド、もしくはＶＥＧＦポリペプチドまたはその一部を解析するステップを含む方法により決定する。
また、一部の実施形態では、被験体における生活の質を改善する方法であって、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原提示細胞およびリガンドが、被験体における生活の質を改善するのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。
一部の実施形態では、被験体が、癌、例えば、末期癌を有する。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌、例えば、末期前立腺癌を有する。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの１以上の症状が緩和される。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの２つ以上の症状が緩和される。
また、一部の実施形態では、被験体における生活の質を改善する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、抗原化合物およびリガンドが、被験体における生活の質を改善するのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。また、一部の実施形態では、被験体における生活の質を改善する方法であって、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列が、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを用いて送達されるステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップとを含み、これにより、ヌクレオチド配列およびリガンドが、被験体における生活の質を改善するのに有効な量で投与される方法も特徴とされる。一部の実施形態では、被験体が、癌、例えば、末期癌を有する。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌、例えば、末期前立腺癌を有する。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの１以上の症状が緩和される。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの２つ以上の症状が緩和される。
また、一部の実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、この抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原が負荷されているステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体における１以上の生活の質の指標を測定するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、被験体が、癌、例えば、末期癌を有する。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌、例えば、末期前立腺癌を有する。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの１以上の症状が測定される。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの２つ以上の症状が測定される。
また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体における１以上の生活の質の指標を測定するステップとを含む方法も特徴とされる。また、一部の実施形態では、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列が、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを用いて送達されるステップと、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、被験体における１以上の生活の質の指標を測定するステップとを含む方法も特徴とされる。一部の実施形態では、被験体が、癌、例えば、末期癌を有する。一部の実施形態では、被験体が、前立腺癌、例えば、末期前立腺癌を有する。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの１以上の症状が測定される。一部の実施形態では、悪液質、疲労、または貧血のうちの２つ以上の症状が測定される。
また、一部の実施形態では、本明細書における実施形態の方法であって、キメラタンパク質、および、例えば、前立腺癌抗原、前立腺特異的タンパク質抗原、または前立腺特異的膜抗原などの腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を被験体に送達し、このキメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する方法も特徴とされる。したがって、キメラタンパク質および腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を方法において用いる、本明細書における実施形態では、前立腺特異的膜抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではなく、前立腺特異的膜抗原ポリペプチドを被験体に投与する。
一部の実施形態では、被験体が、哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体が、ヒトである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
被験体における前立腺癌を処置する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、前立腺癌抗原が負荷されているステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、方法。
（項目２）
被験体における前立腺癌を処置する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、方法。
（項目３）
被験体における前立腺癌を処置する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与され、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、方法。
（項目４）
被験体における前立腺癌を処置する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、前立腺特異的膜抗原が負荷されているステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、方法。
（項目５）
被験体における前立腺癌を処置する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、方法。
（項目６）
被験体における前立腺癌を処置する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与され、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、方法。
（項目７）
前記前立腺癌抗原が、前立腺特異的タンパク質抗原である、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記前立腺癌抗原が、前立腺特異的膜抗原である、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目９）
被験体における腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に腫瘍抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６類似体リガンドを投与するステップとを含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与される、方法。
（項目１０）
被験体における腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与される、方法。
（項目１１）
被験体における腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該腫瘍抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与される、方法。
（項目１２）
被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、腫瘍成長を阻害するか、腫瘍血管新生を軽減するか、または腫瘍血管新生を阻害する方法であって、該被験体における腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するステップを含む方法。
（項目１３）
前記免疫応答が、細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫応答である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記腫瘍抗原が、前立腺癌抗原である、項目９から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原である、項目９から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に腫瘍抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、または腫瘍成長を阻害するのに有効な量で投与される、項目１２から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、または腫瘍成長を阻害するのに有効な量で投与される、項目１２から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該腫瘍抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体において、腫瘍サイズを縮小させるか、または腫瘍成長を阻害するのに有効な量で投与される、項目１２から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記腫瘍が、前立腺にある、項目１２から１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記腫瘍が、肝臓、骨、リンパ節、または肺にある、項目１２から１８のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記腫瘍血管新生が、前立腺において軽減される、項目１２から１８のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記腫瘍血管新生が、肝臓、骨、リンパ節、または肺において軽減される、項目１２から１８のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
被験体における前立腺癌を予防する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺癌抗原が負荷されているステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含む、方法。
（項目２４）
被験体における前立腺癌を予防する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含む、方法。
（項目２５）
被験体における前立腺癌を予防する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該前立腺癌抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含む、方法。
（項目２６）
被験体における前立腺癌を予防する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺特異的膜抗原が負荷されているステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含む、方法。
（項目２７）
被験体における前立腺癌を予防する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含む、方法。
（項目２８）
被験体における前立腺癌を予防する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該前立腺特異的膜抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含む、方法。
（項目２９）
被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺癌抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与される、方法。
（項目３０）
被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与される、方法。
（項目３１）
被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与される、方法。
（項目３２）
被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺特異的膜抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与される、方法。
（項目３３）
被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与される、方法。
（項目３４）
被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与される、方法。
（項目３５）
前記前立腺癌抗原が、前立腺特異的タンパク質抗原である、項目２３から２５、または１２３から１２５のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記前立腺癌抗原が、前立腺特異的膜抗原である、項目２３から２５、または１２３から１２５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記腫瘍血管新生が、前立腺において軽減される、項目２９から３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記腫瘍が、肝臓、リンパ節、骨、または肺において縮小される、項目２９から３６のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
被験体における生活の質を改善する方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺特異的膜抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における生活の質を改善するのに有効な量で投与される、方法。
（項目４０）
被験体における生活の質を改善する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原化合物および該リガンドが、該被験体における生活の質を改善するのに有効な量で投与される、方法。
（項目４１）
被験体における生活の質を改善する方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における生活の質を改善するのに有効な量で投与される、方法。
（項目４２）
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺癌抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、
（ｃ）該被験体における１以上の生活の質の指標を測定するステップと
を含む方法。
（項目４３）
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、
（ｃ）該被験体における１以上の生活の質の指標を測定するステップと
を含む方法。
（項目４４）
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および前立腺癌抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと、
（ｃ）該被験体における１以上の生活の質の指標を測定するステップと
を含む方法。
（項目４５）
前記前立腺癌抗原が、前立腺特異的タンパク質抗原である、項目４２から４４のいずれかに記載の方法。
（項目４６）
前記前立腺癌抗原が、前立腺特異的膜抗原である、項目４２から４４のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
前記膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、および受容体の膜貫通配列からなる群から選択される、項目１から１１、１３から４５、または４６のいずれかに記載の方法。
（項目４８）
前記膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域である、項目１から１１、１３から４５、または４６のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性のリンカードメインにより隔てられた重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む単鎖抗体、ならびにこれらが変異した配列からなる群から選択される、項目１から１１、１３から４５、または４６のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、項目１から１１、１３から４８、または４９のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６類似体リガンドである、項目１から１１、１３から４９、または５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目１から１１、１３から５０、または５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされる、項目１から１１、１３から５１、または５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記ＦＫＢ１２領域が、ＦＫＢ１２ｖ ３６ 領域である、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
前記キメラタンパク質が、ＭｙＤ８８ポリペプチド、またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをさらに含む、項目１から１１、１３から５３、または５４のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号６のペプチド配列もしくはその断片を有するか、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記抗原提示細胞を、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、腫瘍内投与、前立腺内投与、または腹腔内投与を介して、前記被験体に投与する、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から５５、または５６のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
少なくとも２用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドを、前記被験体に投与する、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から５６、または５７のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
少なくとも１用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドを、前記被験体に投与する、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から５７、または５８のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
前記少なくとも２用量を、各用量の間に１０〜１８日間を置いて、前記被験体に投与する、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
６用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドを、前記被験体に、各用量の間に１０〜１８日間を置いて投与する、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から５６、または５７のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
３用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドを、前記被験体に、各用量の間に２４〜３２日間を置いて投与する、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から５６、または５７のいずれかに記載の方法。
（項目６３）
６用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドを、前記被験体に、各用量の間に２週間を置いて投与する、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
３用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドを、前記被験体に、各用量の間に４週間を置いて投与する、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
抗原提示細胞の各用量が、約４×１０ ６ 個の細胞を含む、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から６３、または６４のいずれかに記載の方法。
（項目６６）
抗原提示細胞の各用量が、約１２．５×１０ ６ 個の細胞を含む、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から６３、または６４のいずれかに記載の方法。
（項目６７）
抗原提示細胞の各用量が、約２５×１０ ６ 個の細胞を含む、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から６３、または６４のいずれかに記載の方法。
（項目６８）
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から６６、または６７のいずれかに記載の方法。
（項目６９）
前記抗原提示細胞が、Ｂ細胞である、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から６６、または６７のいずれかに記載の方法。
（項目７０）
前記抗原提示細胞を、アデノウイルスベクターでトランスフェクトする、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から６８、または６９のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
前記抗原提示細胞を、Ａｄ５ｆ３５ベクターでトランスフェクトする、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から６９、または７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、該細胞に抗原を接触させることにより、該抗原が負荷される、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から７０、または７１のいずれかに記載の方法。
（項目７３）
前記形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、該抗原提示細胞を、抗原をコードする核酸で形質導入またはトランスフェクトすることにより、該抗原が負荷される、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から７０、または７１のいずれかに記載の方法。
（項目７４）
前記抗原をコードする前記核酸が、ＤＮＡである、項目２、３、４から８、１０、１１、１４、１５、１７から２２、２４、２５、２７、２８、３０から３８、４０、４１、４３から７２、または７３のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
前記抗原をコードする前記核酸が、ＲＮＡである、項目２、３、４から８、１０、１１、１４、１５、１７から２２、２４、２５、２７、２８、３０から３８、４０、４１、４３から７２、または７３のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
前記前立腺特異的膜抗原が、配列番号４のアミノ酸配列もしくはその断片を含むか、または配列番号３のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる、項目１、４、９、１６、１９から２２、３２、３５から３９、４２、４５から７１、または７２のいずれかに記載の方法。
（項目７７）
前記抗原をコードする前記ヌクレオチド配列、および前記キメラタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、異なる核酸または同じ核酸に存在する、項目７４または７５に記載の方法。
（項目７８）
前記抗原をコードする前記ヌクレオチド配列、および前記キメラタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、異なるアデノウイルスベクターまたは同じアデノウイルスベクターに存在する、項目７４に記載の方法。
（項目７９）
前記組成物が、粒子をさらに含み、前記組成物が、推進力により投与される、項目２、５、１７、１９から２２、２４、３０、４０、４３、４７から５６、７６から７７、または７８のいずれかに記載の方法。
（項目８０）
前記粒子が、金粒子またはナノ粒子である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
少なくとも２用量の前記組成物および前記リガンドを、前記被験体に投与する、項目２、５、１７、１９から２２、２４、３０、４０、４３、４７から５６、７６から７７、または７８のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
少なくとも２用量の１以上の前記アデノウイルスベクターおよび前記リガンドを、前記被験体に投与する、項目３、１１、１８、２５、３１、４１、または４４のいずれかに記載の方法。
（項目８３）
化学療法剤を投与するステップをさらに含み、これにより、前記抗原提示細胞、リガンド、および前記化学療法剤が、前記被験体における前記前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、項目１、４、９から２２、２３、２６、２９、３７から３９、４２、４７から５７、６３から７５、または７６のいずれかに記載の方法。
（項目８４）
前記化学療法剤を、前記抗原提示細胞を投与する前に投与する、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記化学療法剤を、前記抗原提示細胞を投与する少なくとも２週間前に投与する、項目８３に記載の方法。
（項目８６）
前記化学療法剤を、前記抗原提示細胞を投与する少なくとも１カ月間前に投与する、項目８３に記載の方法。
（項目８７）
前記化学療法剤を、前記多量体リガンドを投与した後に投与する、項目８３に記載の方法。
（項目８８）
前記化学療法剤を、前記多量体リガンドを投与した少なくとも２週間後に投与する、項目８３に記載の方法。
（項目８９）
前記化学療法剤を、前記多量体リガンドを投与した少なくとも１カ月後に投与する、項目８３に記載の方法。
（項目９０）
前記化学療法剤が、タキサンである、項目８３から８９のいずれかに記載の方法。
（項目９１）
前記化学療法剤が、ドセタキセルまたはカバジタキセルである、項目８３から８９のいずれかに記載の方法。
（項目９２）
化学療法剤を投与するステップをさらに含み、これにより、前記組成物、リガンド、および前記化学療法剤が、前記被験体における前記前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、項目２、５、１７、１９から２２、２４、３０、４０、４３、４７から５６、７６から８１、または８２のいずれかに記載の方法。
（項目９３）
化学療法剤を投与するステップをさらに含み、これにより、前記ヌクレオチド配列、リガンド、および前記化学療法剤が、前記被験体における前記前立腺癌を処置するのに有効な量で投与される、項目３、１１、１８、２５、３１、４１、または４４のいずれかに記載の方法。
（項目９４）
前記化学療法剤を、前記組成物または前記ヌクレオチド配列を投与する前に投与する、項目９２または９３に記載の方法。
（項目９５）
前記化学療法剤を、前記組成物または前記ヌクレオチド配列を投与する少なくとも２週間前に投与する、項目９２または９３に記載の方法。
（項目９６）
前記化学療法剤を、前記組成物または前記ヌクレオチド配列を投与する少なくとも１カ月間前に投与する、項目９２または９３に記載の方法。
（項目９７）
前記化学療法剤を、前記多量体リガンドを投与した後に投与する、項目９２または９３に記載の方法。
（項目９８）
前記化学療法剤を、前記多量体リガンドを投与した少なくとも２週間後に投与する、項目９２または９３に記載の方法。
（項目９９）
前記化学療法剤を、前記多量体リガンドを投与した少なくとも１カ月後に投与する、項目９２または９３に記載の方法。
（項目１００）
前記化学療法剤が、ドセタキセルである、項目９２から９９のいずれかに記載の方法。
（項目１０１）
前記前立腺癌が、転移性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢感受性前立腺癌、局所進行前立腺癌、および限局性前立腺癌からなる群から選択される、項目１から８、２３から２８、９３から９９、または１００のいずれかに記載の方法。
（項目１０２）
前記被験体において、前立腺癌の進行を防止するか、または前立腺癌の進行を遅延させる、項目１から８、２３から２８、８３から１００、または１０１のいずれかに記載の方法。
（項目１０３）
前立腺癌の進行を少なくとも６カ月間防止するかまたは遅延させる、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前立腺癌の進行を少なくとも１２カ月間防止するかまたは遅延させる、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
前記前立腺癌のグリーソンスコアが７以上である、項目１から８、２３から２８、８３から１０３、または１０４のいずれかに記載の方法。
（項目１０６）
前記前立腺癌のグリーソンスコアが８以上である、項目１から８、２３から２８、８３から１０３、または１０４のいずれかに記載の方法。
（項目１０７）
前記前立腺癌のグリーソンスコアが９以上である、項目１から８、２３から２８、８３から１０３、または１０４のいずれかに記載の方法。
（項目１０８）
前記前立腺癌のグリーソンスコアが１０以上である、項目１から８、２３から２８、８３から１０３、または１０４のいずれかに記載の方法。
（項目１０９）
前記被験体が、前記多量体リガンドを投与した３カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す、項目１から８、２３から２８、８３から１０７、または１０８のいずれかに記載の方法。
（項目１１０）
前記被験体が、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す、項目１から８、２３から２８、８３から１０７、または１０８のいずれかに記載の方法。
（項目１１１）
前記被験体が、前記多量体リガンドを投与した９カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す、項目１から８、２３から２８、８３から１０７、または１０８のいずれかに記載の方法。
（項目１１２）
前記被験体における血清ＰＳＡレベルが、前記多量体リガンドを投与した３カ月後までに２０％低下される、項目１から３、２３から２８、８３から１１０、または１１１のいずれかに記載の方法。
（項目１１３）
前記被験体における血清ＰＳＡレベルが、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに２０％低下される、項目１から３、２３から２８、８３から１１０、または１１１のいずれかに記載の方法。
（項目１１４）
前記前立腺癌の腫瘍サイズが、前記多量体リガンドを投与した３カ月後までに２０％縮小される、項目１から３、２３から２８、８３から１１２、または１１３のいずれかに記載の方法。
（項目１１５）
前記前立腺癌の腫瘍サイズが、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに２０％縮小される、項目１から３、２３から２８、８３から１１２、または１１３のいずれかに記載の方法。
（項目１１６）
前記前立腺癌の腫瘍血管新生が、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに２０％軽減される、項目１から３、２３から２８、８３から１１２、または１１３のいずれかに記載の方法。
（項目１１７）
前記前立腺癌の腫瘍血管新生が、前記多量体リガンドを投与した９カ月後までに２０％軽減される、項目１から３、２３から２８、８３から１１２、または１１３のいずれかに記載の方法。
（項目１１８）
抗原特異的なＴ Ｈ １免疫応答またはＴ Ｈ ２免疫応答が、前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体において検出される、項目１から３、２３から２８、８３から１１２、または１１３のいずれかに記載の方法。
（項目１１９）
前記被験体がヒトである、項目１から１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記抗原が、前立腺特異的膜抗原である、項目１から１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記抗原をコードするヌクレオチド配列を前記被験体に投与しないことを除き、抗原ポリペプチドを投与するステップをさらに含む、項目２、３、１０、１１、１７、１８、２４、２５、３０、３１、４０、４１、４３、４４、７４、７５、７７から９３、または１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記抗原が、前立腺特異的膜抗原である、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
腫瘍のを増大させる方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に腫瘍抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における該腫瘍の化学療法感受性を増大させるのに有効な量で投与される、方法。
（項目１２４）
腫瘍の化学療法感受性を増大させる方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体における該腫瘍の化学療法感受性を増大させるのに有効な量で投与される、方法。
（項目１２５）
腫瘍の化学療法感受性を増大させる方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該腫瘍抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与され、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該腫瘍のそれを増大させるのに有効な量で投与される、方法。
（項目１２６）
腫瘍の化学療法感受性を増大させる方法であって、
（ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、
該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺特異的膜抗原が負荷されている、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における該腫瘍の化学療法感受性を増大させるのに有効な量で投与される、方法。
（項目１２７）
腫瘍の化学療法感受性を増大させる方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該組成物およびリガンドが、該被験体における該腫瘍の化学療法感受性を増大させるのに有効な量で投与される、方法。
（項目１２８）
腫瘍のを増大させる方法であって、
（ａ）キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および前立腺特異的膜抗原をコードするヌクレオチド配列を、それを必要とする被験体に投与するステップであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列、および該前立腺特異的膜抗原をコードする該ヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ステップと、
（ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するステップと
を含み、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与され、
これにより、該ヌクレオチド配列およびリガンドが、該被験体における該腫瘍の化学療法感受性を増大させるのに有効な量で投与される、方法。
以下の説明、例、特許請求の範囲、および図面では、特定の実施形態がさらに説明される。
図は、当該技術の実施形態を例示し、限定するものではない。例示を明白かつ容易にするために、図は一定の縮尺で作成されておらず、ある場合には、種々の態様は、特定の実施形態の理解を容易にするために誇張または拡大して示されていることがある。
図１は、ｉＣＤ４０の概略図およびヒトＤＣの発現を示す図である。Ａ．ヒトＣＤ４０細胞質ドメインは、ミリストイル化ターゲティングドメイン（Ｍ）および２つのタンデムなドメイン（Ｆｖ）の下流にサブクローニングすることができる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ， Ｙａｎｇ Ｗ， Ｒｏｚａｍｕｓ ＬＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８；９５：１０４３７−１０４４２）。本明細書では誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）と称されるＭ−Ｆｖ−Ｆｖ−ＣＤ４０キメラタンパク質の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に置くことができる。Ｂ．ウエスタンブロットによって評価された、ＣＤ４０の内在性の形態（ｅＣＤ４０）および組換えの誘導性の形態（ｉＣＤ４０）の発現である。レーン１、野生型ＤＣ（内在性のＣＤ４０対照）；レーン２、１マイクログラム／ｍｌのＬＰＳで刺激したＤＣ；レーン３および４、それぞれ、ＡＰ２０１８７二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ ｄｒｕｇ）を用いて、または用いずに、１０，０００ＶＰ／細胞（ＭＯＩ約１６０）のＡｄ５／ｆ３５−ｉＣＤ４０（ｉＣＤ４０−ＤＣ）で形質導入したＤＣ；レーン５、ＬＰＳおよびＡＰ２０１８７で刺激したｉＣＤ４０−ＤＣ；レーン６、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦファミリーのメンバーのタンパク質）およびＬＰＳで刺激したＤＣ；レーン７、Ａｄ５／ｆ３５−ＧＦＰ（ＧＦＰ−ＤＣ）をＭＯＩ１６０で用いて形質導入し、ＡＰ２０１８７およびＬＰＳで刺激したＤＣ；レーン８、ＡＰ２０１８７で刺激したＧＦＰ−ＤＣ；レーン９、Ａｄ５／ｆ３５−ｉＣＤ４０で形質導入した２９３Ｔ細胞（ＣＤ４０の誘導性の形態についての陽性対照）。アルファ−チューブリンの発現レベルが内部標準としての機能を果たした。 図２は、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＲＩＧ−１およびｉＭｙＤ８８を示すグラフである。ＲＡＷ２６４．７細胞を、ｉＲＩＧ−１についての発現プラスミド３マイクログラムおよびＩＦＮガンマ依存性ＳＥＡＰレポータープラスミド１マイクログラムで；およびＮＦ−カッパＢ依存性ＳＥＡＰレポータープラスミド１マイクログラムと一緒にｉＭｙＤ８８ ３マイクログラムで一過性に同時トランスフェクトした。 図３は、誘導性のＣＤ４０受容体およびＭｙＤ８８受容体ならびにＮＦ−カッパＢ活性の誘導の概略図である。 図４は、誘導性キメラＣＤ４０／ＭｙＤ８８受容体およびＮＦ−カッパＢ活性の誘導の概略図である。 図５は、２９３細胞における、誘導性ＭｙＤ８８受容体およびキメラＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体によるＮＦ−カッパＢ活性化に関するグラフである。ＣＤ４０Ｔは、「ｔｕｒｂｏ」ＣＤ４０を示し、受容体は、３コピーのＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン（Ｆｖ’）を含む。 図６は、基質と一緒に３時間インキュベートした後の、誘導性切断型ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８Ｌ）およびキメラ誘導性切断型ＭｙＤ８８／ＣＤ４０によるＮＦ−カッパＢ活性に関するグラフである。 図７は、基質と一緒に２２時間インキュベートした後の、誘導性切断型ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８Ｌ）およびキメラ誘導性の切断型ＭｙＤ８８／ＣＤ４０によるＮＦ−カッパＢ活性に関するグラフである。このアッセイには一部のアッセイ飽和が存在する。 図８は、２９３Ｔ細胞をアデノウイルス−ＭｙＤ８８Ｌで形質導入した後のＨＡタンパク質のウエスタンブロットを示す図である。 図９は、２９３Ｔ細胞をアデノウイルス−ＭｙＤ８８Ｌ−ＣＤ４０で形質導入した後のＨＡタンパク質のウエスタンブロットを示す図である。 図１０は、示されている誘導性のＣＤ４０構築物およびＭｙＤ８８構築物を用いて骨髄由来ＤＣにアデノウイルスを感染させた後のＥＬＩＳＡアッセイに関するグラフである。 図１１は、図１０と同様のＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフである。 図１２は、より高量のアデノウイルスを感染させた後の、図１０および図１１と同様のＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフである。 図１３は、ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ｉＭｙＤ８８の構築物マップである。 図１４は、ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＣＤ４−ＴＬＲ４Ｌ３−Ｅの構築物マップである。 図１５は、ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ｉＭｙＤ８８Ｅ−ＣＤ４０の構築物マップである。 図１６は、誘導性のＭｙＤ８８．ＣＤ４０複合構築物を発現しているアデノウイルスを異なる感染多重度で用いて形質導入したヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）におけるＩＬ−１２ｐ７０の発現の用量依存的な誘導の結果を示す棒グラフである。 図１７は、異なる誘導性構築物を発現しているアデノウイルスで形質導入したヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）におけるＩＬ−１２ｐ７０の発現の薬物依存性の誘導の結果を示す棒グラフである。 図１８は、形質導入された樹状細胞における、ワクチンを接種する前のＩＬ−１２ｐ７０のレベルを示す棒グラフである。 図１９（ａ）は、形質導入された樹状細胞を用いてワクチン接種したマウスにおけるＥＧ．７−ＯＶＡ腫瘍の成長阻害に関するグラフである；図１９（ｂ）は、代表的なワクチン接種したマウスの写真を示す；図１９（ｃ）は、エラーバーを含めた１９（ａ）に関するグラフである。 図１９（ａ）は、形質導入された樹状細胞を用いてワクチン接種したマウスにおけるＥＧ．７−ＯＶＡ腫瘍の成長阻害に関するグラフである；図１９（ｂ）は、代表的なワクチン接種したマウスの写真を示す；図１９（ｃ）は、エラーバーを含めた１９（ａ）に関するグラフである。 図１９（ａ）は、形質導入された樹状細胞を用いてワクチン接種したマウスにおけるＥＧ．７−ＯＶＡ腫瘍の成長阻害に関するグラフである；図１９（ｂ）は、代表的なワクチン接種したマウスの写真を示す；図１９（ｃ）は、エラーバーを含めた１９（ａ）に関するグラフである。 図２０（ａ）は形質導入された樹状細胞によって誘導されるＡｇ特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度の増大を示す散布図であり、２０（ｂ）は形質導入された樹状細胞によって誘導されるＡｇ特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度の増大を示す棒グラフである。 図２１は、形質導入された樹状細胞によって誘導されるＡｇ特異的なＩＦＮガンマ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ ＴＨ１細胞の頻度の増大を示す棒グラフである。 図２２は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性リンパ球アッセイの概略図および結果を示す図である。 図２３は、樹状細胞によって誘導されるｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ活性の増強からのデータを要約している棒グラフである。 図２４は、マウスにおける、形質導入された樹状細胞によって誘導されるＣＴＬアッセイの代表的な結果を示すグラフである。 図２４は、マウスにおける、形質導入された樹状細胞によって誘導されるＣＴＬアッセイの代表的な結果を示すグラフである。 図２４は、マウスにおける、形質導入された樹状細胞によって誘導されるＣＴＬアッセイの代表的な結果を示すグラフである。 図２５は、形質導入された樹状細胞を接種したマウスにおけるＩＬ−４産生ＴＨ２細胞についての細胞内染色の結果を示すグラフである。 図２５は、形質導入された樹状細胞を接種したマウスにおけるＩＬ−４産生ＴＨ２細胞についての細胞内染色の結果を示すグラフである。 図２６は、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８で形質導入された細胞で処置したマウスにおける腫瘍の成長阻害アッセイの結果を示すグラフである。 図２６は、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８で形質導入された細胞で処置したマウスにおける腫瘍の成長阻害アッセイの結果を示すグラフである。 図２６は、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８で形質導入された細胞で処置したマウスにおける腫瘍の成長阻害アッセイの結果を示すグラフである。 図２７は、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８で形質導入された細胞で処置したマウスにおける腫瘍特異的Ｔ細胞アッセイを示すグラフである。 図２７は、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８で形質導入された細胞で処置したマウスにおける腫瘍特異的Ｔ細胞アッセイを示すグラフである。 図２７は、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８で形質導入された細胞で処置したマウスにおける腫瘍特異的Ｔ細胞アッセイを示すグラフである。 図２７は、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８で形質導入された細胞で処置したマウスにおける腫瘍特異的Ｔ細胞アッセイを示すグラフである。 図２８は、処置したマウス由来の脾細胞をエフェクターとして使用した天然キラー細胞アッセイの結果を示すグラフである。 図２９は、処置したマウス由来の脾細胞をエフェクターとして使用した細胞傷害性リンパ球アッセイの結果を示すグラフである。 図３０は、示されているベクターで形質導入した樹状細胞と共培養したＴ細胞を使用したＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰｏｔアッセイの結果を示すグラフである。 図３１は、示されているベクターで形質転換した樹状細胞を使用した、アジュバントとしてＬＰＳを伴う、または伴わないＣＣＲ７上方制御アッセイの結果を示すグラフである。 図３１は、示されているベクターで形質転換した樹状細胞を使用した、アジュバントとしてＬＰＳを伴う、または伴わないＣＣＲ７上方制御アッセイの結果を示すグラフである。 図３２は、多数の動物からのデータを用いたＣＣＲ７上方制御アッセイの結果を１つのグラフに含めて示すグラフである。 図３３は、Ａｄ５ｆ３５ｉｈＣＤ４０のプラスミドマップである。 図３４は、探索的効力評価を示すチャートである。 図３５は、被験体１００１〜１００６についての第１２週の免疫学的反応および臨床反応の概要のチャートである。 図３６は、測定可能な転移性疾患、血管分布、およびＰＳＡレベルについての、ベースラインから１２週間の変化の分析を示すウォーターフォールプロットを示す。 図３７は、処置後の被験体１００８におけるサイトカインレベルに関するグラフである。 図３８は、ＶＣＡＭ−１血清分析の結果のグラフである。 図３９は、１２週の時点のＰＳＡレベルのウォーターフォールプロットである。 図４０は、７週、１２週、および５２週の時点の患者１００３のＣＴスキャンの結果を示す図である。 図４１は、被験体１００３の軟組織の部分奏効に関するグラフである。 図４２は、潜在的な抗血管系効果を示す種々の血清マーカーに関するグラフを示す。 図４３は、被験体１００３において測定されたＰＳＡレベルを示すグラフである。 図４４は、誘導性ＣＤ４０導入遺伝子のマップを示す。 図４５は、患者１００１の血清マーカー分析に関するグラフである。 図４６は、患者１００２の血清マーカー分析に関するグラフである。 図４７は、患者１００３の血清マーカー分析に関するグラフである。 図４８は、患者１００４の血清マーカー分析に関するグラフである。 図４９は、患者１００５の血清マーカー分析に関するグラフである。 図５０は、患者１００６の血清マーカー分析に関するグラフである。 図５１は、患者１００６におけるＰＳＭＡ特異的注射部位免疫応答に関する棒グラフである。 図５２は、ＫＰＳおよびＣＴＣの評価に関するグラフを示す。 図５３は、被験体１００６における、処置期間にわたるＰＳＡレベル血清濃度に関するグラフを示す。 図５４は、被験体１００３についての、処置期間にわたるｕＰＡＲ濃度、ＨＧＦ濃度、ＥＧＦ濃度、およびＶＥＧＦ濃度に関するグラフを示す。 図５５は、被験体１００１〜１００６についての安全性および反応の要約表である。 図５６は、被験体１００７〜１０１２についての安全性および反応の要約表である。 図５７は、被験体１００１〜１０１２についての患者の人口統計表である。 図５８は、被験体１００１〜１０１２についての臨床試験の状況を示す時系列である。 図５９は、被験体１００８の処置後の肺腫瘍の縮小を示す写真を示す。 図６０は、被験体１０１１についてのＰＳＡレベルに関するグラフである。 図６１は、被験体１０１０についてのＰＳＡレベルに関するグラフである。 図６２は、被験体１０１０の骨スキャンの写真を示す。 図６３は、タキサンベースの化学療法とワクチン療法を用いた併用治療に対する被験体の反応のチャートである。 図６４は、被験体１００６における腫瘍の縮小を示す写真を示す。
本明細書で、特許請求の範囲および／または明細書における「〜を含む」という用語と共に用いられる「ａ（ある）」または「ａｎ（ある）」という語の使用は、「１つの」を意味しうるが、また、「１以上の」、「少なくとも１つの」、および「１または１を超える」の意味とも符合する。さらにまた、「〜を有する」、「〜を包含する」、「〜を含有する」、および「〜を含む」という用語は、互換的であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドの用語であることを認識している。
本明細書で用いられる「同種異系」という用語は、抗原的に異なるＨＬＡまたはＭＨＣの遺伝子座を指す。
したがって、同じ種から導入された細胞または組織も、抗原的には異なりうる。同系のマウスも、１以上の遺伝子座においては異なる（類遺伝子性である）可能性があり、同種異系マウスも、バックグラウンドは同じでありうる。
本明細書で用いられる「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体の生成を伴う場合もあり、特定の免疫コンピテント細胞の活性化を伴う場合もあり、これらの両方の場合もある。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、死滅させるかまたは不活化した全細胞または溶解産物に由来しうる。例示的な生物には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ属種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、麻疹ウイルス、ロタウイルス、赤痢菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａが含まれるがこれらに限定されない。したがって、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含めた任意の高分子を、抗原として用いることができる。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導することもできる。病原性のゲノムもしくは遺伝子、または免疫応答を誘発するタンパク質の遺伝子断片のヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含有する任意のＤＮＡは、抗原の合成を結果としてもたらす。さらに、本方法は、遺伝子またはゲノムの全核酸配列の使用に限定されない。本発明には、複数の遺伝子またはゲノムの部分的な核酸配列の使用が含まれるがこれに限定されず、これらの核酸配列が、所望の免疫応答を誘発するように多様な組合せで配列されることは、容易に明らかである。
「抗原提示細胞」という用語は、その細胞表面上において（またはその細胞表面において）、少なくとも１つの抗原または抗原断片を、表示、獲得、または提示することが可能な多様な細胞のうちのいずれかである。一般に、「抗原提示細胞」という用語は、抗原または抗原性組成物に対する免疫応答（すなわち、免疫系のＴ細胞アームまたはＢ細胞アームに由来する免疫応答）の増強を補助する目標を達成する任意の細胞でありうる。例えば、Ｋｕｂｙ， ２０００， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ（参照により本明細書に組み込まれる）において論じられ、本明細書の特定の実施形態で用いられる通り、抗原を、通常は、クラスＩＩ主要組織適合性分子もしくはクラスＩＩ主要組織適合性複合体と共に、免疫細胞に表示または提示する細胞を、「抗原提示細胞」とする。特定の態様では、細胞（例えば、ＡＰＣ細胞）を、所望の抗原を発現する組換え細胞または腫瘍細胞など、別の細胞と融合させることができる。２つ以上の細胞の融合体を調製する方法は、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ．Ｗ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ． ６５−６６， ７１−７４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １３， Ｂｕｒｄｅｎ ＆ Ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｅｌｓｅｖｉｅｗ， ｐｐ． ７５−８３， １９８４； Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７， １９７５； Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：５１１−５１９， １９７６， Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．， ３：２３１−２３６， １９７７において論じられている。場合によっては、抗原提示細胞が、抗原を表示または提示する免疫細胞が、ＣＤ４＋ＴＨ細胞である。ＡＰＣまたは他の免疫細胞上で発現するさらなる分子も、免疫応答の増強を補助または改善しうる。例えば、サイトカインおよびアジュバントなど、分泌分子または可溶性分子もまた、抗原に対する免疫応答を補助または増強しうる。本明細書では、多様な例について論じる。
本明細書で用いられる「癌」という用語は、それらの固有の形質（正常な制御の喪失）の結果として、増殖の非制御、分化の欠如、局所的な組織浸潤、および転移をもたらす細胞の過剰増殖性として定義される。例には、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝臓癌腫（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉癌、舌癌、神経芽細胞腫、頭部癌、頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳腫瘍、結腸癌、肉腫、または膀胱癌が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で用いられる「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という用語は、互換的に用いることができる。これらの用語のすべてはまた、任意およびすべての後代細胞である、それらの子孫細胞も包含する。意図的な突然変異または偶発的な突然変異のために、すべての子孫細胞が同一であるわけではないことが理解される。
本明細書で用いられる「ｉＣＤ４０分子」という用語は、誘導性ＣＤ４０として定義される。このｉＣＤ４０は、内因性のＣＤ４０によるシグナル伝達を消失させる機構をバイパスしうる。「ｉＣＤ４０」という用語は、「ｉＣＤ４０核酸」、「ｉＣＤ４０ポリペプチド」、および／またはｉＣＤ４０発現ベクターを包含する。
本明細書で用いられる「ｃＤＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を鋳型として用いて調製されるＤＮＡを指すことを意図する。ゲノムＤＮＡ、またはプロセシングされていないかもしくはプロセシングが部分的なゲノムＲＮＡ鋳型から重合化されたＤＮＡに対して、ｃＤＮＡを用いることの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含有するということである。最適な発現に非コード領域が必要とされる場合、またはアンチセンス戦略において、イントロンなどの非コード領域が標的とされる場合など、全ゲノム配列または部分的なゲノム配列を用いる場合もある。
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、または宿主もしくは被験体において存在する抗原提示細胞、あるいは造血幹細胞または単球から誘導しうる抗原提示細胞である。樹状細胞およびそれらの前駆細胞は、多様なリンパ器官、例えば、脾臓、リンパ節、ならびに骨髄および末梢血から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞体から複数の方向へと延びる薄いシート（葉状仮足）を伴う、特徴的な形態を有する。樹状細胞は、高レベルのＭＨＣ分子および共刺激分子（例えば、Ｂ７−１分子およびＢ７−２分子）を発現することが典型的である。樹状細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｔ細胞の抗原特異的分化を誘導することが可能であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞の一次反応を誘発することが可能である。
本明細書で用いられる「発現構築物」または「導入遺伝子」という用語は、核酸コード配列のうちの一部または全部を転写することが可能であり、これをベクター内に挿入することが可能な、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物として定義される。転写物は、タンパク質へと翻訳されるが、タンパク質へと翻訳されなくともよい。特定の実施形態では、発現が、遺伝子の転写、およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を包含する。他の実施形態では、発現が、被験体の遺伝子をコードする核酸の転写だけを包含する。「治療用構築物」という用語はまた、発現構築物または導入遺伝子を指すのにも用いることができる。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、癌などの過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害を処置するための療法として用いることができ、したがって、発現構築物または導入遺伝子は、治療用構築物または予防用構築物である。
本明細書で用いられる「発現ベクター」という用語は、転写が可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。ある場合には、次いで、ＲＮＡ分子が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドへと翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムが生成される場合には、これらの配列が翻訳されない。発現ベクターは、各種の制御配列を含有することが可能であり、これらの制御配列とは、特定の宿主生物において、作動的に連結されたコード配列の転写およびおそらくは翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を統御する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列も含有する場合があり、これらについては以下で論じる。
本明細書で用いられる「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、体「外」を指す。本明細書では、「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語と、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語とを互換的に用いる場合がある。
ＣＤ４０に関して本明細書で用いられる「機能的に同等な」という用語は、例えば、ＣＤ４０核酸断片、ＣＤ４０変異体、またはＣＤ４０類似体を指し、腫瘍または過剰増殖性疾患を破壊する免疫応答を刺激する、ＣＤ４０ポリペプチドをコードする核酸、またはＣＤ４０ポリペプチドを指す。「機能的に同等な」とは、例えば、細胞外ドメインを欠いているが、Ｔ細胞を介する腫瘍殺滅反応を増幅することが、樹状細胞による抗原提示分子の発現を上方制御することを介して可能なＣＤ４０ポリペプチドを指す。「機能的に同等な」という用語を、例えば、ＰＳＡペプチド、ＰＳＭＡペプチド、ＭｙＤ８８、または切断型ＭｙＤ８８など、他の核酸またはポリペプチドに適用する場合、この用語は、本明細書における方法による基準のポリペプチドと同じであるかまたは同等の活性を示す断片、変異体などを指す。
「過剰増殖性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖性から結果として生じる疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患には、癌または自己免疫疾患が含まれるがこれらに限定されない。他の過剰増殖性疾患には、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化、または炎症性腸疾患が含まれうる。
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、機能的なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドコード単位として定義される。理解される通り、この機能的な用語には、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および突然変異体を発現するか、またはこれらを発現するように適合させたゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、および操作された低分子遺伝子セグメントが含まれる。
「免疫原性組成物」または「免疫原」という用語は、免疫応答を引き起こすことが可能な物質を指す。免疫原の例には、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、および癌細胞上で発現する腫瘍関連抗原が含まれる。
本明細書で用いられる「免疫障害性の」という用語は、免疫系が低下または脆弱化している被験体として定義される。免疫障害性状態は、免疫系の欠損または機能不全に起因する場合もあり、感染および／または疾患に対する感受性を高める他の因子に起因する場合もある。このような類型化は、評価の概念的基盤を与えるが、免疫障害性の個体は、１つの群または他の群に完全に適合するわけではないことが多い。損なわれる可能性がある体内の防御機構の欠損は、複数でありうる。例えば、ＨＩＶにより特異的なＴリンパ球の欠損が引き起こされる個体はまた、抗ウイルス療法に用いられる薬物により引き起こされる好中球減少症を有する場合もあり、皮膚および粘膜の完全性が損なわれるために免疫障害性となる場合もある。免疫障害性状態は、静脈内における薬物乱用に起因する中心留置ラインまたは他の種類の損傷から結果として生じる場合もあり、続発性の悪性腫瘍、栄養不良、または結核、もしくは性感染症、例えば、梅毒、もしくは肝炎など、他の感染性物質に感染していることにより引き起こされる場合もある。
本明細書で用いられる「薬学的または薬理学的に許容される」という用語は、動物またはヒトに投与されるとき、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」には、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。当技術分野では、薬学的有効成分のためのこのような媒体および薬剤の使用が周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、本明細書で提示されるベクターまたは細胞に適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が意図される。組成物にはまた、補充の有効成分も組み込むことができる。
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で用いられる核酸とポリヌクレオチドとは、互換的である。核酸とは、単量体の「ヌクレオチド」へと加水分解されうるポリヌクレオチドである。単量体のヌクレオチドは、ヌクレオシドへと加水分解されうる。本明細書で用いられるポリヌクレオチドには、限定なしに述べると、組換え手段、すなわち、通常のクローニング法およびＰＣＲ（商標）などを用いる、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、および合成手段を含めた、当技術分野で利用可能な任意の手段により得られるすべての核酸配列が含まれるがこれらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの突然変異も包含し、これらには、当技術分野で周知の方法を介するヌクレオチドまたはヌクレオシドの突然変異が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、通常は配列が規定されたアミノ酸残基鎖として定義される。本明細書で用いられるポリペプチドという用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と互換的である。
本明細書で用いられる「プロモーター」という用語は、遺伝子の特異的な転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列として定義される。
本明細書で用いられる「免疫応答を制御する」または「免疫応答を調節する」という用語は、免疫応答を修飾する能力を指す。例えば、組成物は、免疫応答を増強および／または活性化することが可能である。さらになお、組成物はまた、免疫応答を抑制することも可能である。制御の形態は、組成物と共に用いられるリガンドにより決定される。例えば、化学物質の二量体類似体は、共刺激ポリペプチドの二量体化を結果としてもたらし、これにより、ＤＣが活性化されるが、化学物質の単量体の類似体は、共刺激ポリペプチドの二量体化を結果としてもたらさず、これによりＤＣが活性化されることはない。
「トランスフェクション」および「形質導入」という用語は互換的であり、外因性のＤＮＡ配列を真核宿主細胞へと導入する過程を指す。トランスフェクション（または形質導入）は、電気穿孔、マイクロインジェクション、遺伝子銃による送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクションなどを含めた多くの手段のうちのいずれか１つにより達成することができる。
本明細書で用いられる「同系の」という用語は、同一であるか、もしくは組織移植を可能とする程度に十分に近縁であるか、または免疫学的に適合性である遺伝子型を有する細胞、組織、または動物を指す。例えば、一卵性双生児または同じ近交系の動物を指す。同系と同種同系とは互換的に用いられる。
本明細書で用いられる「被験体」という用語には、生物または動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、または他の非ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類などの哺乳動物以外の脊椎動物、および哺乳動物以外の非脊椎動物を含めた非哺乳動物が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で用いられる「転写制御下にある」または「作動的に連結された」という用語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる開始および遺伝子の発現を制御するのに、核酸との関係で適正な位置および方向にあることとして定義される。
本明細書で用いられる「処置」、「処置する」、「処置された」、または「処置すること」という用語は、予防および／または治療を指す。例えば、癌性の固形腫瘍など、固形腫瘍に関して用いられる場合、この用語は、固形腫瘍または癌に対する被験体の抵抗性を増大させる予防的処置を介する予防を指す。一部の例では、癌が家族性であるか、または遺伝子的に関連している場合に、被験体を処置して、癌を予防することができる。例えば、感染性疾患に関して用いられる場合、この用語は、病原体による感染に対する被験体の抵抗性を増大させるか、または、言い換えれば、被験体が病原体に感染するか、もしくは感染に帰せられる疾病の徴候を示す可能性を減少させる予防的処置のほか、被験体が感染した後に、感染と戦う、例えば、感染を軽減もしくは除去するか、または感染が悪化することを防止するための処置も指す。
本明細書で用いられる「ワクチン」という用語は、動物に投与することが可能な形態にある、本明細書で提示される組成物を含有する製剤を指す。ワクチンは、組成物を懸濁または溶解させる、従来の生理食塩液または緩衝水溶液媒体を含むことが典型的である。この形態にある組成物は、状態を防止、改善、または他の形で処置するのに用いることができて簡便である。被験体に導入されると、ワクチンは、抗体、サイトカインの生成、および／または他の細胞反応が含まれるがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことが可能である。
一部の実施形態では、核酸が、ウイルスベクター内に含有されている。特定の実施形態では、ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞にウイルスベクターを接触させ、一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞にウイルスベクターを接触させることが理解される。
一部の実施形態では、抗原提示細胞が、樹状細胞、例えば、哺乳動物の樹状細胞である。抗原提示細胞は、ヒト樹状細胞であることが多い。
特定の実施形態ではまた、抗原提示細胞に抗原も接触させる。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞に抗原を接触させることが多い。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞に抗原を接触させることもある。一部の実施形態では、抗原提示細胞が、被験体内にあり、抗原に対して免疫応答を発生させる。免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による免疫応答であることもある。腫瘍抗原に対して免疫応答を発生させることもある。特定の実施形態では、抗原提示細胞を、アジュバントを添加せずに活性化させる。
一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入し、皮内投与を介して被験体に投与する。一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入し、皮下投与を介して被験体に投与する。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入することもある。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入することもある。
ＭｙＤ８８とは、例えば、ｎｃｂｉ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４６１５として言及されるそのヒト変化形であるがこれに限定されない、骨髄分化初期応答遺伝子８８を意味する。「切断型」とは、タンパク質が全長ではなく、例えば、ドメインを欠いている可能性を意味する。例えば、切断型ＭｙＤ８８は、全長ではなく、例えば、ＴＩＲドメインを欠いている場合がある。本明細書では、切断型ＭｙＤ８８の一例を、ＭｙＤ８８Ｌと示し、また、配列番号５（核酸配列）および配列番号６（ペプチド配列）としても提示する。配列番号５は、サブクローニング時に付加されたリンカーを包含する。「切断型ＭｙＤ８８」をコードする核酸配列とは、切断型ＭｙＤ８８ペプチドをコードする核酸配列を意味し、この用語はまた、リンカーによってコードされる任意のアミノ酸を含め、クローニングのアーチファクトとして付加される任意のアミノ酸をコードする部分を含めた核酸配列も指す場合がある。
本明細書の方法では、ペプチドの誘導性ＣＤ４０部分を、誘導性ＭｙＤ８８部分または切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド部分の上流に配置することもでき、下流に配置することもできる。また、誘導性ＣＤ４０部分および誘導性ＭｙＤ８８部分または切断型ＭｙＤ８８アダプタータンパク質部分は、同じベクターにより、シスで細胞にトランスフェクトまたは形質導入することもでき、個別のベクターにより、トランスで細胞にトランスフェクトまたは形質導入することもできる。
一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞に抗原を接触させることもある。特定の実施形態では、抗原提示細胞が、被験体内にあり、抗原に対して、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による免疫応答などの免疫応答を発生させる。特定の実施形態では、腫瘍抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に対して免疫応答を発生させる。一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて核酸を調製し、例えば、皮内投与または皮下投与を介して被験体に投与する。ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原提示細胞を核酸で形質導入またはトランスフェクトすることもある。一部の実施形態では、核酸が、ポリヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーター配列を含む。代替的に、核酸は、キメラタンパク質のタンパク質コード領域を含有する、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて転写されたＲＮＡも含む。
固形腫瘍の「腫瘍サイズを縮小させること」または「腫瘍成長を阻害すること」とは、例えば、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）基準などの標準的なガイドラインに従う、処置に対する反応（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または疾患の安定化を意味する。例えば、これは、固形腫瘍の直径を、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％縮小させることを包含する場合もあり、腫瘍の数、循環腫瘍細胞、または腫瘍マーカーを、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減することを包含する場合もある。腫瘍サイズは、例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、胸部Ｘ線撮影（肺の腫瘍について）、または分子イメージング、例えば、阻害剤をＴＲＯＦＥＸ（商標）／ＭＩＰ−１０７２／１０９５とする場合などの、ヨウ素１２３で標識したＰＳＡリガンド、例えば、ＰＳＭＡリガンドを投与した後における、例えば、ＰＥＴ走査などの、例えば、ＰＥＴ走査、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴ、またはＰＳＡ抗体、例えば、イリジウム１１１で標識したＰＳＭＡ抗体である、カプロマブペンデチド（ｃａｐｒｏｍａｄ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）などのＰＳＭＡ抗体を用いるＰＥＴ走査を含めた任意の方法により解析することができる。
「腫瘍血管新生を軽減、緩徐化、または阻害すること」とは、処置前における腫瘍血管新生の量と比較した場合に、腫瘍血管新生を、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％軽減すること、または新たな血管系の出現を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％軽減することを意味する。軽減は、１つの腫瘍を指す場合もあり、複数の腫瘍における血管新生の合計または平均の場合もある。腫瘍血管新生を測定する方法には、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、または分子イメージング、例えば、阻害剤をＴＲＯＦＥＸ（商標）／ＭＩＰ−１０７２／１０９５とする場合などの、ヨウ素１２３で標識したＰＳＡリガンド、例えば、ＰＳＭＡリガンドを投与した後における、例えば、ＰＥＴ走査などの、例えば、ＰＥＴ走査、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴ、またはＰＳＡ抗体、例えば、１１１−イリジウムで標識したＰＳＭＡ抗体である、カプロマブペンデチド（ｃａｐｒｏｍａｄ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）などのＰＳＭＡ抗体を用いるＰＥＴ走査が含まれる。
例えば、腫瘍が、前立腺内に存在するか、または前立腺内の腫瘍に由来したかもしくは前立腺内の腫瘍から転移したか、またはＰＳＡをもたらす場合は、腫瘍を前立腺癌腫瘍と分類する。腫瘍が、例えば、前立腺内の腫瘍から転移した場合、その腫瘍は、被験体の前立腺内の腫瘍と同じであるかまたは類似する、染色体上の切断点を有すると決定される。
前立腺癌
米国では、前立腺癌が、男性において最も一般的な固形悪性腫瘍である。２００８年には、前立腺癌の推定新規症例１８６，３２０例、および２８，６６０例の死亡例を、男性症例が占めると見込まれた（Ｊｅｍａｌ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２００８． ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ． ５８： ７１−９６， ２００８）。一次療法の後でＰＳＡの進行を経過した患者のうちの約７０％は、その前立腺癌経過中のある時点で転移を示す（Ｇｉｔｔｅｓ ＲＦ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３２４： ２３６−４５， １９９１）。アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）が、転移性前立腺癌の標準的療法であり、患者のうちの８０〜８５％において、一時的な腫瘍のコントロールまたは退縮を達成している（Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＥＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３２１： ４１９−２４， １９８９； Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ ＰＦ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｕｒｏｌ． １５７： １７３１−５， １９９７； Ｓｃｈｅｒ ＨＩ ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ ＷＫ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １１： １５６６−７２， １９９３； Ｓｍａｌｌ ＥＪ ａｎｄ Ｓｒｉｎｉｖａｓ Ｓ， Ｃａｎｃｅｒ． ７６： １４２８−３４， １９９５）。ホルモン療法の奏効の持続、ならびにホルモン療法開始後における生存の持続は、元の腫瘍についてのグリーソンスコアの合計、ＡＤＴ開始後において検出不能な最悪のＰＳＡを達成する可能性、およびＡＤＴ開始前においてＰＳＡが倍増するのに要する期間を含め、多くの因子に依存することが示されている。ホルモン療法にもかかわらず、転移性前立腺癌を伴う患者の実質的にすべてが、最終的には進行性前立腺癌を発症する（Ｋｅｌｌｙ ＷＫ ａｎｄ Ｓｌｏｖｉｎ ＳＦ， Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ． ２： ３９４−４０１， ２０００； Ｓｃｈｅｒ ＨＩ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８８： １６２３−３４， １９９６； Ｓｍａｌｌ ＥＪ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ ＮＪ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １５： ３８２−８， １９９７）。元の腫瘍についてのグリーソンスコアの合計、またはグリーソンスコアは、腫瘍の顕微鏡法による評価に基づき、男性における前立腺癌レベルを評価する。グリーソンスコアが高いと、癌はより侵襲性となり、拡大する可能性が高くなるので、その癌の予後は悪くなる。評価システムの例は、Ｇｌｅａｓｏｎ ＤＦ．， Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒａｎ’ｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ： ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｉｎ Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ Ｍ （ｅｄ．） Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ． Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９７７； １７１−１９８において論じられている。
ＡＤＴを開始した、前立腺癌を伴う大半の患者は、一次療法（例えば、根治的前立腺切除術、小線源療法、対外放射線照射療法、低温焼灼など）が失敗した後でＰＳＡが上昇するために処置を受ける。臨床的転移が見られないこれらの患者は、７〜１１年間の範囲にある、比較的に長期にわたる無病期間を経過するが、これらの患者の大部分は、血清テストステロンは去勢レベルにありながら、上昇するＰＳＡレベルの再帰により証拠立てられる通り、最終的には、ホルモン抵抗性前立腺癌を発症する。これらの患者もまた、予後が悪く、大部分は、９カ月間以内に臨床的転移を発症し、生存中央値は２４カ月間である（Ｂｉａｎｃｏ ＦＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ： Ａｂｓｔｒａｃｔ ２７８， ２００５）。「前立腺癌」という用語は、例えば、転移性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢感受性前立腺癌、局所進行前立腺癌、および限局性前立腺癌を含め、異なる形態または病期を包含する。
抗原提示細胞
抗原提示細胞（ＡＰＣ）とは、Ｔ細胞を外来抗原に対して、この外来抗原を主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と共にそれらの表面上に提示することによりプライミングすることが可能な細胞である。ＡＰＣには、プロフェッショナルＡＰＣおよびノンプロフェッショナルＡＰＣの２種類のＡＰＣが存在する。プロフェッショナルＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方を発現し、ノンプロフェッショナルＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩ分子を、構成的に発現するわけではない。特定の実施形態では、本明細書の方法において、プロフェッショナルＡＰＣを用いる。プロフェッショナルＡＰＣには、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。
活性化した抗原提示細胞と関連する１以上の活性を観察および／または測定しうる場合は、抗原提示細胞が「活性化」している。例えば、本明細書で提示される発現ベクターを接触させた後では、抗原提示細胞が活性化し、この発現ベクターを接触させていないか、または陰性対照ベクターを接触させた抗原提示細胞と比較して、発現ベクターを接触させた細胞における活性化と関連する活性を測定することができる。一例では、活性の増大が、接触させていない細胞の活性、または陰性対照を接触させた細胞の活性の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍以上のレベルでありうる。例えば、発現ベクターを接触させた抗原提示細胞では、以下の活性：抗原提示細胞における共刺激分子の発現、抗原提示細胞におけるＮＦ−カッパＢの核転座、例えば、ｔｏｌｌ様受容体の発現またはＣＣＲ７の発現など、ＤＣ成熟マーカーの発現、例えば、腫瘍細胞を指向する比溶解活性など、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球反応、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の発現もしくはケモカインの発現のうちの１つが増強されうる。
抗原提示細胞を活性化するか、または免疫応答を「増強する」組成物の量は、この組成物を添加したときに観察される免疫応答が、この組成物を添加せずに測定した同じ免疫応答と比較した場合に、増大するか、もしくは強化されるか、または何らかの形で偏差する量を指す。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性は、例えば、組成物を伴う場合、および組成物を伴わない場合の５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定することができる。ＣＴＬ溶解活性が、組成物を伴わない場合のＣＴＬ溶解活性と比較して増強される場合の物質量を、この抗原に対する動物の免疫応答を増強するのに十分な量という。例えば、免疫応答を、少なくとも約２倍、または、例えば、約３倍以上増強することができる。分泌されるサイトカインの量もまた、変化させることができる。
増強される免疫応答は、能動的免疫応答の場合もあり、受動的免疫応答の場合もある。代替的に、免疫応答は、抗原提示細胞を被験体（例えば、患者）から得、次いで、これらを、本明細書で提示される発現ベクターまたは構築物を含む組成物で形質導入またはトランスフェクトする、獲得免疫療法の一部でありうる。抗原提示細胞は、例えば、被験体の血液から得ることもでき、被験体の骨髄から得ることもできる。次いで、抗原提示細胞を、同じ動物に投与することもでき、異なる動物に投与することもでき、同じ被験体に投与することもでき、異なる被験体に投与することもできる（例えば、同じドナーに投与することもでき、異なるドナーに投与することもできる）。特定の実施形態では、被験体（例えば、患者）が、例えば、前立腺癌などの癌を有するか、もしくはこれを有することが疑われるか、または感染性疾患を有するか、もしくはこれを有することが疑われる。他の実施形態では、免疫応答を増強する方法を、公知の癌療法、または感染性疾患を処置するための任意の公知の療法と共に実施する。
樹状細胞
自然免疫系は、微生物中に存在する保存的分子パターンを認識するのに、生殖細胞系列によりコードされる受容体のセットを用いる。これらの分子パターンは、リポ多糖、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、ホスファチジルコリン、リポタンパク質を含めた細菌特異的タンパク質、細菌ＤＮＡ、ウイルス一本鎖ＲＮＡおよびウイルス二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧ−ＤＮＡ、マンナン、ならびに他の細菌および真菌の多様な細胞壁構成要素を含めた、微生物の特定の構成要素において生じる。このような分子パターンはまた、植物アルカロイドなど、他の分子においても生じうる。これらの自然免疫認識の標的は、微生物によりもたらされ、感染宿主生物によってはもたらされないので、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， ５４： １−１３； Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３８８：３９４−３９７， １９９７）。
ＰＡＭＰを認識する自然免疫系の受容体は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）と呼ばれる（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。これらの受容体は、構造が異なり、複数の異なるタンパク質ファミリーに属する。これらの受容体のうちの一部（例えば、ＣＤ１４、ＤＥＣ２０５、コレクチン）が、ＰＡＭＰを直接的に認識するのに対し、他の受容体（例えば、補体受容体）は、ＰＡＭＰ認識により発生する生成物を認識する。これらの受容体ファミリーのメンバーは一般に、３つの種類：１）血漿中を循環する体液性受容体、２）免疫細胞の表面上で発現するエンドサイトーシス性受容体、および３）細胞表面上または細胞内で発現しうるシグナル伝達受容体に分けることができる（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｆｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： ５０−３）。
細胞性ＰＲＲは、獲得免疫においてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する細胞を含めた、自然免疫系のエフェクター細胞上で発現する。このようなエフェクター細胞には、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球、および表面上皮細胞が含まれるがこれらに限定されない。この発現プロファイルにより、ＰＲＲが、自然免疫のエフェクター機構を直接的に誘導することが可能となり、また、以下で論じられる炎症性サイトカインおよびケモカインなど、一連の内因性シグナルの発現を誘導することにより、感染性作用物質の存在に対して、宿主生物を警戒させることも可能となる。この後者の機能は、侵入者と戦うためのエフェクター戦力の効果的な移動を可能とする。
樹状細胞（ＤＣ）の主要な機能は、末梢組織において抗原を取り込み、二次的なリンパ組織へと遊走し、抗原を、免疫系のエフェクターＴ細胞へと提示することである（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０００，． １８： ｐ． ７６７−８１１； Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ， Ｊ．， ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｒ． Ｍ．， Ｎａｔｕｒｅ ３９２， ２４５−２５２ （１９９８））。ＤＣは、免疫応答において、重要な役割を果たし、成熟への変化を受け、これにより、それぞれの環境に適切な機能を果たす（Ｔｅｒｍｅｅｒ， Ｃ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０００， Ａｕｇ． １５． １６５： ｐ． １８６３−７０）。ＤＣが成熟する間、抗原の取込み能は失われ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の表面密度は、１０〜１００倍増大し、共刺激分子および接着分子であるＣＤ４０の発現もまた大幅に増大する（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， Ａ． ａｎｄ Ｆ． Ｓａｌｌｕｓｔｏ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０００． ２９０： ｐ． ９２−９６）。加えて、他の遺伝子変化により、ＤＣが、Ｔ細胞に富む排出リンパ節の傍皮質へと帰巣し、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を誘引するＴ細胞ケモカインを発現し、抗原特異的なナイーブＴＨ０細胞をプライミングすることも可能となる（Ａｄｅｍａ， Ｇ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９７， Ｊｕｎ． １２． ３８７： ｐ． ７１３−７）。この段階において、成熟ＤＣは、それらのＭＨＣ ＩＩ分子を介して、抗原を、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞へと提示し、Ｔ細胞のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の上方制御を誘導し、これが、ＤＣのＣＤ４０受容体に結合する。このＤＣ：Ｔ細胞間相互作用により、ＭＨＣ Ｉ分子およびＭＨＣ ＩＩ分子、接着分子、共刺激分子（例えば、Ｂ７．１分子、Ｂ７．２分子）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）、および抗アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質）のさらなる上方制御を含め、強力なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応の開始に重要な、さらなるＤＣ分子の迅速な発現が誘導される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９７， Ｎｏｖ． １３． ３９０： ｐ． １７５−９； Ｏｈｓｈｉｍａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９７， Ｏｃｔ． １５． １５９： ｐ． ３８３８−４８； Ｓａｌｌｕｓｔｏ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９８， Ｓｅｐ． ２８： ｐ． ２７６０−９； Ｃａｕｘ， Ｃ． Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． １９９７， ４１７：２１−５；）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、リンパ節を離れ、再度循環に入り、元の炎症部位に帰巣し、病原体または悪性細胞を破壊する。
ＤＣの機能に影響を与える１つの重要なパラメータが、ＤＣの「オンスイッチ」として用いられるＣＤ４０受容体である（Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｓ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， Ｊｕｎ． ４． ３９３： ｐ． ４７８−８０； Ｃｌａｒｋｅ， Ｓ． Ｒ．， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ， ２０００， Ｍａｙ． ６７： ｐ． ６０７−１４； Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｎ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．，． Ｎａｔ Ｍｅｄ， １９９９， Ａｐｒ． ５： ｐ． ４０５−１１； Ｒｉｄｇｅ， Ｊ． Ｐ．， Ｄ． Ｒ． Ｆ， ａｎｄ Ｐ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， Ｊｕｎ． ４． ３９３： ｐ． ４７４−８； Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， Ｊｕｎ． ４． ３９３： ｐ． ４８０−３）。ＣＤ４０とは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのうちの、４８ｋＤａの膜貫通受容体メンバーである（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ， Ｓ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９９， Ｊｕｌ． ２０． ９６： ｐ． ８４０８−１３）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ間相互作用は、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）を伴うシグナル伝達カスケードを開始させるのに必要な、ＣＤ４０の三量体化を誘導する（Ｎｉ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ２０００， ９７（１９）： １０３９５−１０３９９； Ｐｕｌｌｅｎ， Ｓ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９９， Ｍａｙ １４．２７４： ｐ． １４２４６−５４）。ＣＤ４０は、これらのシグナル伝達分子を用いて、ＮＦ−カッパＢ、ＡＰ−１、ＳＴＡＴ３、およびｐ３８ＭＡＰＫを含め、ＤＣにおける複数の転写因子を活性化する（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ， Ｓ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
抗原をプロセシングおよび提示するそれらの固有の方法、ならびに共刺激分子およびサイトカイン分子を高レベルで発現する可能性のために、樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＴ細胞をプライミングおよび活性化するのに有効な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ２００３； ９８７：１８０−１８７）。この特性のために、ＤＣは、多くの臨床試験において、ワクチン接種のための細胞プラットフォームとして広く用いられ、有望な結果をもたらしている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＤＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００４；１０４：２２３５−２２４６； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． １９９９；１０：２８１−２８７）。しかし、癌患者におけるＤＣワクチンの臨床的有効性は、おそらく、活性化が最適レベル未満であること、排出リンパ節への遊走が限定的であること、および寿命の長さがリンパ節環境における最適なＴ細胞の活性化には不十分であることを含めた、いくつかの重要な欠損のために、満足できないものである。
ＤＣベースの癌ワクチンを最適化するときのパラメータは、ＤＣの、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）などの免疫エフェクター細胞との相互作用である。これらの相互作用では、ＤＣの成熟状態が、結果としてもたらされるエフェクター機能を決定するときの重要な因子となる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＲＭ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３；２１：６８５−７１１）。Ｔｒｅｇの発現を最小化しながら、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞のプライミングを最大化するために、ＤＣは、完全に成熟しており、高レベルの共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６などの）、ならびにＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインを発現する必要がある。同様に重要なことは、ＤＣが、ワクチン接種部位から排出リンパ節へと効果的に遊走して、Ｔ細胞相互作用を開始させることが可能でなければならないことである（Ｖｉｅｗｅｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ２００５；２６：３２９−３４１）。
単球由来の未成熟ＤＣをｅｘ ｖｉｖｏにおいて成熟させるために、ＤＣベースのトライアルの大半は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２を含む標準的な成熟サイトカインカクテル（ＭＣ）を用いてきた。標準的な成熟カクテルにおけるプロスタグラジンＥ２（ＰＧＥ２）の主要な機能は、ＣＣケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）をそのリガンドであるＣＣケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）およびＣＣＬ２１へと感作し、これにより、ＤＣが排出リンパ節へと遊走する能力を増強することである（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ Ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００２；１００：１３５４−１３６１； Ｌｕｆｔ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００２；１００：１３６２−１３７２）。しかし、ＰＧＥ２はまた、Ｔ細胞増殖の抑制（Ｇｏｏｄｗｉｎ ＪＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９７７；１４６：１７１９−１７３４； Ｇｏｏｄｗｉｎ ＪＳ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８９；２：２６４−２６８）、炎症促進性サイトカイン生成の阻害（例えば、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−アルファ（Ｋａｌｉｎｓｋｉ Ｐ， Ｂｌｏｏｄ． ２００１；９７：３４６６−３４６９； ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｕｗ Ｋｒａａｎ ＴＣ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９９５；１８１：７７５−７７９））、および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ＩＩ表面発現の下方制御（Ｓｎｙｄｅｒ ＤＳ， Ｎａｔｕｒｅ． １９８２；２９９：１６３−１６５）を含めた、免疫応答の刺激に潜在的に有害である多くの特性を示すことも報告されている。したがって、遊走を促進しながらＰＧＥ２を回避しうる成熟プロトコールが、ＤＣベースのワクチンの治療的有効性を改善する可能性が高い。
リンパ組織内のＤＣの刺激促進状態を拡張するために、ＣＤ４０シグナル伝達経路を標的とする一時的な制御に基づくＤＣの活性化系が開発されている。ＤＣの機能性は、ＣＤ４０によるシグナル伝達の振幅および持続の両方を増大させることにより改善された（Ｈａｎｋｓ ＢＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００５；１１：１３０−１３７）。これを達成するため、ＣＤ４０の細胞質ドメインを、膜ターゲティング配列と共に、合成のリガンド結合ドメインに融合させるように、ＣＤ４０受容体を再操作した。化学二量体化誘導剤（ＣＩＤ）と称する、脂質透過性の二量体化薬である、ＡＰ２０１８７（ＡＰ）（Ｓｐｅｎｃｅｒ ＤＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９３；２６２：１０１９−１０２４）を投与したところ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、マウスＤＣのＣＤ４０依存性シグナル伝達カスケードが誘導された。この誘導戦略は、他の活性化モダリティーにより達成された免疫原性を超えて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて明確な抗原および腫瘍の両方に対する免疫原性を著明に増強した（Ｈａｎｋｓ ＢＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００５；１１：１３０−１３７）。
その例がＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によるシグナル伝達である、パターン認識受容体（ＰＲＲ）によるシグナル伝達もまた、ＤＣの成熟および活性化の誘導において重要な役割を果たす（ヒトＤＣは、複数の異なるＴＬＲを発現する）（Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２００１；１９４：８６３−８６９）。１１の哺乳動物ＴＬＲが、多様な病原体に由来する高分子に応答し、獲得免疫の開始と共に、自然免疫応答の活性化に寄与している。リポ多糖（ＬＰＳ）、および臨床的に重要な誘導体であるモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）は、細胞表面ＴＬＲ−４複合体に結合し（Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２００１；１９４：８６３−８６９）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）であるｐ３８キナーゼおよびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）と共に、ＮＦ−カッパＢおよびＩＲＦ３などの転写因子を最終的に誘導する、多様なシグナル伝達経路をもたらす（Ａｒｄｅｓｈｎａ ＫＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２０００；９６：１０３９−１０４６； Ｉｓｍａｉｌｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；１６８：９２６−９３２）。この過程において、ＤＣは成熟し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＩ型インターフェロンなど、炎症促進性サイトカインを部分的に情報制御する（Ｒｅｓｃｉｇｎｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９９８；１８８：２１７５−２１８０）。ＬＰＳにより誘導される成熟は、ＤＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける抗原特異的Ｔ細胞反応を刺激する能力を増強することが示されている（Ｌａｐｏｉｎｔｅ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００；３０：３２９１−３２９８）。米国特許第７，４０４，９５０号では、抗原提示細胞を活性化する方法であって、この細胞を、ＣＤ４０ペプチドをコードする核酸で形質導入するステップを含む方法が論じられており、本明細書における参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０４９１１３として公開された、２００７年１０月１９日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８１９６３号では、抗原提示細胞を活性化する方法であって、この細胞を、誘導性ＣＤ４０ペプチド、およびパターン認識受容体、またはこの経路における他の下流のタンパク質を含有するキメラタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトするステップを含む方法が論じられている。
誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）系は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）に適用されており、ｉＣＤ４０シグナル伝達を、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アダプターのリガンド結合と組み合わせると、ヒトＤＣの持続的で頑健な活性化がもたらされることが示されている（本明細書における参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月２１日に出願され、関連の国際出願が、ＷＯ２０１０／０３３９４９として２０１０年３月２５日に公開されている、Ｓｐｅｎｃｅｒら、ＵＳＳＮ１２／５６３，９９１）。
発現構築物の操作
発現構築物は、全てが作動的に連結された、共刺激ポリペプチドおよびリガンド結合ドメインをコードする。一般に、「作動的に連結された」という用語は、プロモーター配列が、第２の配列に機能的に連結され、この場合、このプロモーター配列が、第２の配列に対応するＤＮＡの転写を開始させ、媒介する。より具体的に述べると、発現構築物では、複数のリガンド結合ドメインを用いる。さらにまた、発現構築物は、膜ターゲティング配列も含有する。適切な発現構築物は、上記のＦＫＢＰリガンド結合エレメントのいずれかの側に、共刺激ポリペプチドエレメントを包含しうる。発現構築物は、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドに挿入することができる。提供される方法のステップは、任意の適切な方法を用いて実施することができ、これらの方法には、核酸を、本明細書に提示される抗原提示細胞に形質導入するか、核酸で、本明細書に提示される抗原提示細胞を形質転換するか、または核酸を、本明細書に提示される抗原提示細胞に他の形で備える方法が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、切断型ＭｙＤ８８ペプチドが、配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる（ＤＮＡリンカーを伴うかもしくは伴わない、または配列番号６のアミノ酸配列を有する）。一部の実施形態では、ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号１におけるポリヌクレオチド配列によりコードされる。
共刺激ポリペプチド
共刺激ポリペプチド分子は、Ｔ細胞介在性反応を、樹状細胞による抗原提示分子の発現を上方制御することにより増幅することが可能である。意図される共刺激タンパク質には、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバー（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１Ｂ）、Ｔｏｌｌ様受容体、Ｃ反応性タンパク質受容体、パターン認識受容体、およびＨＳＰ受容体が含まれるがこれらに限定されない。
共刺激ポリペプチドには、ＮＦ−カッパＢ経路、Ａｋｔ経路、および／またはｐ３８経路を活性化する任意の分子またはポリペプチドが含まれる。ＤＣ活性化系は、共刺激ポリペプチドが、オリゴマー化を結果としてもたらすリガンド（すなわち、脂質透過性の有機二量体化薬）により活性化および／または制御される、リガンド結合ドメイン（すなわち、低分子結合ドメイン）に融合させた、組換えシグナル伝達分子を用いることに基づく。共刺激ポリペプチドを架橋するか、またはオリゴマー化するのに用いられうる他の系には、抗体、天然リガンド、および／または人工の交差反応性リガンドもしくは合成リガンドが含まれる。さらにまた、意図される他の二量体化系には、クーママイシン／ＤＮＡギラーゼＢ系が含まれる。
用いうる共刺激ポリペプチドには、ＮＦ−カッパＢ経路、ならびに他の多様なシグナル伝達カスケード、例えば、ｐ３８経路および／またはＡｋｔ経路を活性化するポリペプチドが含まれる。このような共刺激ポリペプチドには、パターン認識受容体、Ｃ反応性タンパク質受容体（すなわち、Ｎｏｄ１、Ｎｏｄ２、ＰｔＸ３−Ｒ）、ＴＮＦ受容体（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）、およびＨＳＰ受容体（Ｌｏｘ−１およびＣＤ−９１）が含まれるがこれらに限定されない。パターン認識受容体には、エンドサイトーシスパターン認識受容体（すなわち、マンノース受容体、スカベンジャー受容体（すなわち、Ｍａｃ−１、ＬＲＰ、ペプチドグリカン、テイコ酸（ｔｅｃｈｏｉｃ ａｃｉｄｓ）、毒素、ＣＤ１１ｃ／ＣＲ４））、外部シグナルパターン認識受容体（Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０）、ペプチドグリカン認識タンパク質（ＰＧＲＰは、細菌性ペプチドグリカンおよびＣＤ１４に結合する））、内部シグナルパターン認識受容体（すなわち、ＮＯＤ受容体１および２）、ＲＩＧ１、および図２に示されるＰＲＲが含まれるがこれらに限定されない。本方法および組成物に適するパターン認識受容体にはまた、例えば、Ｗｅｒｔｓ Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ （２００６） １３：７９８−８１５； Ｍｅｙｌａｎ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２００６） ４４２：３９−４４； ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ （２００６） ６：９−２０において論じられている、例えば、パターン認識受容体も含まれる。
特定の実施形態では、共刺激ポリペプチド分子が、ＣＤ４０である。ＣＤ４０分子は、（１）ストリンジェントな条件下において、公知のＣＤ４０遺伝子の配列を有する核酸にハイブリダイズし、（２）ＣＤ４０ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。特定の例では、ＣＤ４０ポリペプチドが、細胞外ドメインを欠く場合がある。ＣＤ４０ポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列には、配列番号１、および他の分子種に由来するＣＤ４０アイソフォームが含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法および組成物では、ＣＤ４０の他の通常の変異体または突然変異体を用いうることが意図される。したがって、ＣＤ４０領域は、天然配列と、１以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、および／またはアミノ酸挿入だけ異なるアミノ酸配列を有しうる。例えば、１以上のＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）結合領域を、除去するか、または有効に除去することができる（例えば、ＴＲＡＦタンパク質が、それに結合しないか、またはそれに結合するときのアフィニティーが天然のＣＤ４０配列に結合するときより低下するように、ＣＤ４０のアミノ酸配列を欠失または変化させる）。具体的な実施形態では、ＴＲＡＦ ３結合領域を、除去するか、または有効に除去するように、ＴＲＡＦ ３結合領域を欠失または変化させる（例えば、アミノ酸２５０〜２５４を変化または欠失させる。Ｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０２（８）： ２８７４−２８７９ （２００５））。
特定の実施形態では、本方法が、ＣＤ４０の誘導性形態（ｉＣＤ４０）をコードする発現構築物をもたらすように、遺伝子物質の操作を伴う。このような方法は、例えば、ＣＤ４０の細胞質ドメインをコードする異種核酸配列およびそれを発現させるための手段を含有する発現構築物の生成を伴う。適切なヘルパー細胞内でベクターを複製することができ、これによりウイルス粒子を生成させることができ、細胞に組換えウイルス粒子を感染させることができる。
したがって、本明細書で提示されるＣＤ４０分子は、細胞外ドメインを欠く場合がある。特定の実施形態では、細胞外ドメインが切断または除去される。また、標準的な突然変異誘発、挿入、欠失、または置換を用いて、細胞外ドメインを突然変異させ、機能的な細胞外ドメインを有さないＣＤ４０分子を生成させることができることが意図される。ＣＤ４０の核酸は、配列番号１の核酸配列を有しうる。ＣＤ４０の核酸はまた、配列番号１の配列を有する核酸の相同体および対立遺伝子、ならびに前出の核酸の機能的に同等な断片、変異体、および類似体も包含する。誘導性ＣＤ４０のベクターを構築する方法は、例えば、２００８年７月２９日に交付された、米国特許第７，４０４，９５０号において論じられている。
遺伝子治療の文脈では、遺伝子が、ベクターの骨格をもたらすウイルスゲノム以外の供給源に由来する、異種ポリヌクレオチド配列である。遺伝子は、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫、植物、なおまたは動物など、原核生物供給源または真核生物供給源に由来する。異種ＤＮＡはまた、複数の供給源、すなわち、多重遺伝子構築物または融合タンパク質にも由来する。異種ＤＮＡはまた、１つの供給源に由来する制御配列と、異なる供給源に由来する遺伝子とを包含する場合もある。
リガンド結合領域
発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインは、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを用いる誘導を可能とする、任意の簡便なドメインでありうる。リガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内部の場合もあり、外部の場合もある。上記で示した細胞質領域と関連するリガンド結合タンパク質を含め、受容体を含めた多種多様なリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書で用いられる「リガンド結合ドメイン」という用語は、「受容体」という用語と互換的でありうる。そのリガンド（例えば、有機低分子リガンド）が公知であるか、またはこれを容易に生成させうるリガンド結合タンパク質が、特に被験体となる。これらのリガンド結合ドメインまたは受容体には、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、上記で示された他の受容体などのほか、抗体、特に、重鎖サブユニットまたは軽鎖サブユニット、これらが変異した配列、確率的手順により得られる無作為的なアミノ酸配列、組換え合成などから得られうる、「非天然」受容体が含まれる。特定の実施形態では、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群から選択される。リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列を含むことが多い。Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含むこともある。例には、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ， Ｓ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３１３−３２１ （２０００） ａｎｄ ｉｎ Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ． ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １０：６６７−６７５ （２００７）； Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ （２００６） Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ６７：４４０−２； Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ． ， ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ （Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｗｉｌｅｙ， ２００７）において論じられている配列が含まれる。
大半の場合、リガンド結合ドメインまたは受容体ドメインは、天然ドメインまたはその切断型活性部分として、少なくとも約５０アミノ酸であり、約３５０アミノ酸より少なく、通常は２００アミノ酸より少ない。結合ドメインは、二量体化のために構成しうる、例えば、低分子（＜２５ｋＤａであり、ウイルスベクターにおける効率的なトランスフェクションを可能とする）リガンドの場合もあり、単量体リガンドの場合もあり、非免疫原性リガンドの場合もあり、合成により結合可能なリガンドを有する場合もあり、細胞透過性リガンドを有する場合もあり、非毒性リガンドを有する場合もある。
受容体ドメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの結合可能性に応じて、細胞内の場合もあり、細胞外の場合もある。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側の場合もあるが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを、それが結合可能な形態で内部化するための輸送系が存在しない限り、結合ドメインが、通常は細胞膜の外部にある。細胞内受容体の場合、構築物は、シグナルペプチド、および受容体ドメイン配列の５’側または３’側の膜貫通ドメインをコードする場合もあり、受容体ドメイン配列の５’側に脂質結合シグナル配列を有する場合もある。受容体ドメインが、シグナルペプチドと、膜貫通ドメインとの間にある場合、受容体ドメインは、細胞外ドメインである。
受容体をコードする発現構築物部分は、各種の理由により、突然変異誘発を受ける可能性がある。突然変異誘発されたタンパク質は、高度な結合アフィニティーをもたらす場合もあり、天然受容体および突然変異誘発された受容体のリガンドによる識別を可能とする場合もあり、受容体−リガンド対をデザインするための機会をもたらす場合などもある。受容体における変化は、結合部位にあることが公知であるアミノ酸の変化、コンビナトリアル法を用いる無作為突然変異誘発を伴う場合があり、この場合、結合部位と関連するアミノ酸のコドン、または立体構成的変化と関連する他のアミノ酸のコドンを、特定のアミノ酸のコドン（複数可）を公知の変化を伴ってまたは無作為的に変化させ、結果として得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現させ、次いで、結果として得られるタンパク質を結合についてスクリーニングすることにより、突然変異誘発にかけることができる。
抗体および抗体のサブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特に、断片、より具体的には、可変領域の全部もしくは一部、または高アフィニティー結合を創出するための重鎖と軽鎖との融合体を、結合ドメインとして用いることができる。意図される抗体には、免疫応答を誘発せず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域外）では発現しない細胞外ドメインなど、異所性発現させたヒト生成物である抗体が含まれる。このような例には、低アフィニティーの神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、および胎児性表面タンパク質（すなわち、癌胎児性抗原）が含まれるがこれらに限定されない。さらにまた、生理学的に許容されるハプテン分子に対する抗体を調製することができ、個々の抗体のサブユニットを、結合アフィニティーについてスクリーニングすることができる。これらのサブユニットをコードするｃＤＮＡを単離し、定常領域、可変領域の一部を欠失させること、可変領域を突然変異誘発することなどにより改変し、リガンドに適切なアフィニティーを有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このようにして、生理学的に許容されるほとんど任意のハプテン化合物をリガンドとして用いて、このリガンドに対するエピトープをもたらすことができる。結合ドメインが公知であり、結合に有用なリガンドが存在する場合は、抗体ユニットではなく、天然の受容体を用いることができる。
オリゴマー化
伝達されるシグナルは通常、リガンドを介するキメラタンパク質分子のオリゴマー化の結果として生じる、すなわち、リガンド結合後におけるオリゴマー化の結果として生じるが、他の結合イベント、例えば、アロステリック活性化を用いて、シグナルを誘発することもできる。キメラタンパク質の構築物は、多様なドメインの順序、および個別のドメインの反復配列の数に応じて変化する。
受容体を多量化するには、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合ドメイン／受容体ドメインのリガンドを、通常、結合部位の各々がリガンド受容体ドメインに結合することが可能である、少なくとも２つの結合部位をそれが有するという意味で、多量体とする。対象のリガンドは、有機合成低分子の二量体であるか、またはより高次のオリゴマーであるが、通常はおおよそ四量体以下であることが望ましく、個別の分子は、少なくとも約１５０Ｄａ〜約５ｋＤａ未満であることが典型的であり、通常は約３ｋＤａ未満である。合成リガンドおよび受容体の多様な対を用いることができる。例えば、天然の受容体を伴う実施形態では、二量体ＦＫ５０６をＦＫＢＰ１２受容体と共に用いることができ、二量体化したシクロスポリンＡを、シクロフィリン受容体と共に用いることができ、二量体化したエストロゲンを、エストロゲン受容体と共に用いることができ、二量体化したグルココルチコイドを、グルココルチコイド受容体と共に用いることができ、二量体化したテトラサイクリンを、テトラサイクリン受容体と共に用いることができ、二量体化したビタミンＤを、ビタミンＤ受容体と共に用いることなどが可能である。代替的に、より高次のリガンド、例えば、三量体のリガンドも用いることができる。非天然の受容体を伴う実施形態では、例えば、抗体のサブユニット、修飾抗体のサブユニット、可撓性のリンカードメインにより隔てられた、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む単鎖抗体、または修飾受容体、およびこれらが変異した配列など、多種多様な化合物のうちのいずれかを用いることができる。これらのリガンドユニットの著明な特徴は、各結合部位が、高アフィニティーで受容体に結合することが可能であり、これらを化学的に二量体化しうることである。また、リガンドを、血清中に機能的レベルで溶解させるが、大半の適用について、細胞膜を超えて拡散することが可能であるように、リガンドの疎水性／親水性のバランスをとる方法が利用可能である。
特定の実施形態では、本方法が、化学誘導二量体化（ＣＩＤ）法を用いて、条件制御した形で、タンパク質またはポリペプチドを生成させる。この技法は、誘導性であることに加えて、また、不安定性の二量体化剤を分解させるか、または単量体の競合的阻害剤を投与することに起因して、可逆性でもありうる。
ＣＩＤ系は、合成の二価リガンドを用いて、リガンド結合ドメインに融合したシグナル伝達分子を迅速に架橋する。この系は、細胞表面タンパク質のオリゴマー化および活性化（Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３． ２６２： ｐ． １０１９−１０２４； Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６， ６：８３９−８４７； Ｂｌａｕ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９７， ９４：３０７６−３０８１）、もしくは細胞質ゾルタンパク質のオリゴマー化および活性化（Ｌｕｏ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８３：１８１−１８５； ＭａｃＣｏｒｋｌｅ， Ｒ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８， ９５：３６５５−３６６０）、転写因子をＤＮＡエレメントへと動員することによる転写の調節（Ｈｏ， Ｓ． Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９６， ３８２：８２２−８２６； Ｒｉｖｅｒａ， Ｖ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｄ． １９９６， ２：１０２８−１０３２）、またはシグナル伝達分子を細胞膜へと動員することによるシグナル伝達の刺激（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９５， ９２：９８０５−９８０９； Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ， Ｌ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９５， ９５：９８１０−９８１４）を誘発するのに用いられている。
ＣＩＤ系は、表面受容体の凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効果的に活性化するという概念に基づいている。最も単純な実施形態では、ＣＩＤ系が、脂質透過性免疫抑制薬であるＦＫ５０６の二量体類似体を用いるが、このＦＫ５０６は、その通常の生体活性を失う一方で、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝子的に融合させた分子を架橋する能力を得る。１以上のＦＫＢＰおよびミリストイル化配列を、標的受容体の細胞質シグナル伝達ドメインへと融合させることにより、二量体化薬依存的ではあるが、リガンドおよび細胞外ドメインには依存しない形で、シグナル伝達を刺激することができる。これにより、ＣＩＤ系には、一時的な制御、単量体の薬物類似体を用いる可逆性、および特異性の増強がもたらされる。それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対して高アフィニティーである第３世代のＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３ ＣＩＤは、内因性ＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導することなく、ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え受容体の特異的な活性化を可能とする。ＦＫＢＰ１２Ｖ３６など、アミノ酸置換およびアミノ酸欠失を有するＦＫＢＰ１２の変異体であって、二量体化薬に結合する変異体もまた、用いることができる。加えて、合成リガンドは、プロテアーゼによる分解に対して耐性であり、このために、合成リガンドは、送達される大半のタンパク質剤より、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて受容体を活性化させるのに効果的となっている。
用いられるリガンドは、リガンド結合ドメインのうちの２つ以上に結合することが可能である。キメラタンパク質は、複数のリガンド結合ドメインを含有する場合、複数のリガンドに結合することが可能である。リガンドは、非タンパク質または化学物質であることが典型的である。例示的なリガンドには、二量体ＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２）が含まれるがこれに限定されない。
一部の実施形態では、リガンドが、低分子である。選択されるリガンド結合領域に適切なリガンドを選択することができる。リガンドは、二量体であることが多く、リガンドは、二量体ＦＫ５０６または二量体ＦＫ５０６の類似体であることがある。特定の実施形態では、リガンドが、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸，１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−１，２−エタンジルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル，［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９ＣＩ）、ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７、分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０、分子量：１４１１．６５）である。特定の実施形態では、リガンドが、ＡＰ２０１８７である。
このような方法では、多量体分子が、ＣＤ４０の細胞外ドメインのエピトープに結合する抗体（例えば、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４， ２８４６−２８５２ （２００４））の場合もあり、ＣＤ４０リガンド（例えば、米国特許第６，４９７，８７６号（Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら））の場合もあり、別の共刺激分子（例えば、Ｂ７／ＣＤ２８分子）の場合もある。本発明でアッセイされる機能に影響しない、配列内の保存的変化は、本特許請求の範囲内にあることが理解される。
ＣＤ４０活性化の機構は、根本的に三量体化に基づくので、この受容体は、ＣＩＤ系に特に適する。ＣＩＤを制御することにより、ＣＩＤ系には、１）一時的な制御、２）自己免疫反応の徴候が見られるときの、非活性単量体の付加による可逆性、および３）非特異的な副作用の可能性の制限がもたらされる。加えて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて誘導によりＤＣのＣＤ４０を活性化すれば、ＣＤ４０によるシグナル伝達の完全な誘導に通常必要とされる、第２の「危険」シグナルの必要が回避され、ｉｎ ｓｉｔｕにおけるＤＣの存続が潜在的に促進され、Ｔ細胞プライミングの増強が可能となる。したがって、ｉＣＤ４０を発現するＤＣワクチンを操作すると、Ｔ細胞介在性殺滅反応が、ＤＣによる抗原提示分子、接着分子、ＴＨ１促進サイトカイン、および存続促進因子の発現を上方制御することを介して増幅される。
意図される他の二量体化系には、クーママイシン／ＤＮＡギラーゼＢ系が含まれる。クーママイシン誘導性二量体化は、修飾Ｒａｆタンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６を参照されたい。
膜ターゲティング
膜ターゲティング配列は、キメラタンパク質の細胞表面膜への輸送をもたらし、ここで、同じ配列または他の配列が、キメラタンパク質の細胞表面膜への結合をコードしうる。細胞膜と会合する分子は、膜会合を促進する特定の領域を含有し、このような領域は、キメラタンパク質分子内に組み込まれて、膜ターゲティング処理された分子を生成させうる。例えば、一部のタンパク質は、アシル化されたＮ末端またはＣ末端の配列を含有し、これらのアシル部分により、膜への会合が促進される。このような配列は、アシルトランスフェラーゼにより認識され、特定の配列モチーフに適合することが多い。あるアシル化モチーフは、単一のアシル部分により修飾されることが可能であり（アニオン性の脂質ヘッド基との会合を改善するため、複数の正に帯電した残基を後続させることが多い（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ））、他のアシル化モチーフは、複数のアシル部分により修飾されることが可能である。例えば、タンパク質チロシンキナーゼであるＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含みうる。Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）、およびＧタンパク質のアルファサブユニットなど、特定のタンパク質キナーゼのＮ末端領域内には、二重のアシル化領域が位置している。このような二重のアシル化領域は、このようなタンパク質の最初の１８アミノ酸内に位置することが多く、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓに適合する［配列中、Ｍｅｔは切断され、ＧｌｙはＮアシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つはＳアシル化されている］。Ｇｌｙは、ミリストイル化されていることが多く、Ｃｙｓはパルミトイル化されうる。Ｇタンパク質のガンマサブユニットおよび他のタンパク質（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ａｄｄｒｅｓｓ ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）のＣ末端に由来するＣ１５またはＣ１０のイソプレニル部分により修飾されうる、配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる、「ＣＡＡＸボックス」）に適合するアシル化領域もまた、用いることができる。これらのアシル化モチーフおよび他のアシル化モチーフには、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １５： ２２０５−２２１７ （２００４）； Ｇｌａｂａｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０３： ６９７−７００ （１９９４） ａｎｄ Ｚｌａｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０： ６７３−６７９ （１９９７）において論じられているアシル化モチーフが含まれ、これらをキメラ分子に組み込んで、膜への局在化を誘導することができる。特定の実施形態では、アシル化モチーフを含有するタンパク質に由来する天然配列を、キメラタンパク質に組み込む。例えば、一部の実施形態では、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、もしくはＹｅｓ、またはＧタンパク質のアルファサブユニットに由来する最初の２５以下のＮ末端アミノ酸（例えば、任意選択の突然変異を伴う天然配列のうちの約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１９アミノ酸、または約１５〜約１９アミノ酸）など、このようなタンパク質のＮ末端部分を、キメラタンパク質のＮ末端内に組み込むことができる。特定の実施形態では、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含有するＧタンパク質のガンマサブユニットに由来する約２５アミノ酸以下（例えば、任意選択の突然変異を伴う天然配列のうちの約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１８アミノ酸、または約１５〜約１８アミノ酸）のＣ末端配列を、キメラタンパク質のＣ末端に連結することができる。一部の実施形態では、アシル部分のｌｏｇ ｐ値が＋１〜＋６であり、アシル部分のｌｏｇ ｐ値が＋３〜＋４．５のこともある。ｌｏｇ ｐ値は、疎水性の尺度であり、疎水性の高い分子がより高い頻度でオクタノールへと分配され、ｌｏｇ ｐ値が高値であると特徴づけられる、オクタノール／水分配研究から導出されることが多い。多くの親油性分子についてはｌｏｇ ｐ値が公表されており、公知の分配過程を用いてｌｏｇ ｐ値を計算することができる（例えば、登録番号４４９３の分子が、ｌｏｇ ｐ値を４．２とするラウリン酸を示す、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌ． ７１， Ｉｓｓｕｅ ６， ｐａｇｅ ５９９）。任意のアシル部分を、上記で論じたペプチド組成物に連結し、公知の方法および本明細書の後出で論じる方法を用いて抗微生物活性について調べることができる。アシル部分は、例えば、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキル、Ｃ２〜Ｃ２０のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０のアルキニル、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４のハロアルキル、Ｃ４〜Ｃ１２のシクロアルキルアルキル（ｃｙｃｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリール、またはアリール（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルのこともある。任意のアシル含有部分は、脂肪酸のこともあり、脂肪酸部分の例は、プロピル（Ｃ３）部分、ブチル（Ｃ４）部分、ペンチル（Ｃ５）部分、ヘキシル（Ｃ６）部分、ヘプチル（Ｃ７）部分、オクチル（Ｃ８）部分、ノニル（Ｃ９）部分、デシル（Ｃ１０）部分、ウンデシル（Ｃ１１）部分、ラウリル（Ｃ１２）部分、ミリスチル（Ｃ１４）部分、パルミチル（Ｃ１６）部分、ステアリル（Ｃ１８）部分、アラキジル（Ｃ２０）部分、ベヘニル（Ｃ２２）部分、およびリグノセリル（Ｃ２４）部分であり、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７、または８箇所の不飽和（すなわち、二重結合）を含有しうる。任意のアシル部分は、ホスファチジル脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド）、またはこれらの修飾形のこともある。特定の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のアシル部分を、膜会合領域に連結する。本明細書におけるキメラタンパク質はまた、単回膜貫通配列を含有する場合もあり、複数回膜貫通配列を含有する場合もある（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端において）。単回膜貫通領域は、特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼ受容体、セリン／トレオニンキナーゼ受容体、ＴＧＦベータ、ＢＭＰ、アクチビン、およびホスファターゼにおいて見出される。単回膜貫通領域は、シグナルペプチド領域と、約２０〜約２５アミノ酸の膜貫通領域とを包含することが多く、これらのアミノ酸の多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファ螺旋を形成しうる。正に帯電したアミノ酸の短い配列が膜貫通部分に後続して、このタンパク質を膜内に固定することが多い。複数回貫通タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネル、および輸送体が含まれ、膜を複数回にわたり貫通する２つ以上の螺旋を包含する。複数回貫通タンパク質の全てまたは実質的に全てが、キメラタンパク質に組み込まれることもある。単回膜貫通領域および複数回膜貫通領域の配列は公知であり、キメラタンパク質分子への組込みについてこれらを選択することができる。
宿主において機能性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合する場合もあり、会合しない場合もある、任意の膜ターゲティング配列を用いることができる。一部の実施形態では、このような配列に、ミリストイル化ターゲティング配列、パルミトイル化ターゲティング配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化配列、ゲラニル−ゲラニル化配列、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、または受容体に由来する膜貫通配列（シグナルペプチドを用いる）が含まれるがこれらに限定されない。例には、例えば、ｔｅｎ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ＪＰ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ （２００７） ９９， １−１２， Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：９３６−４０， １０９８ （２００３）において論じられている配列が含まれる。
多様な膜におけるタンパク質の貯留を増大させうる、さらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインは、細胞内シグナル伝達に関与することが典型的な２００を超えるヒトタンパク質において見出される。ＰＨドメインは、膜内の多様なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合することが可能であり、これにより、タンパク質を、異なる膜または細胞内区画に動員するのに重要な役割を果たす。ＰＩ脂質のリン酸化状態は、ＰＩ−３キナーゼまたはＰＴＥＮなどにより制御されることが多く、したがって、膜のＰＨドメインとの相互作用は、アシル脂質ほど安定的ではない。
選択マーカー
特定の実施形態では、発現構築物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるその発現がマーカーを発現構築物に組み入れることを介して同定される核酸構築物を含有する。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与することから、発現構築物を含有する細胞の容易な同定が可能となる。通常、薬物選択マーカーを組み入れると、形質転換細胞のクローニングおよび選択の一助となる。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。代替的には、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素も用いられる。細胞外の非シグナル伝達ドメイン、または多様なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）を含有する免疫学的表面マーカーもまた用いることができ、磁性抗体を介する分取、または蛍光抗体を介する分取のための簡潔な方法が可能となる。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することが可能である限りにおいて、用いられる選択マーカーが重要であるとは考えられない。選択マーカーのさらなる例には、例えば、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターが含まれる。
制御領域
１．プロモーター
標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現を方向付けることが可能である限りにおいて、対象のポリヌクレオチド配列の発現を制御するのに用いられる具体的なプロモーターが重要であるとは考えられない。したがって、ヒト細胞を標的とする場合、ポリヌクレオチド配列のコード領域を、例えば、ヒト細胞における発現が可能なプロモーターに隣接して配置し、このプロモーターの制御下に置くことができる。一般的に述べると、このようなプロモーターには、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターが含まれうるであろう。
多様な実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて、対象のコード配列の高レベルの発現を得ることができる。発現レベルが所与の目的に十分である限りにおいて、対象のコード配列の発現を達成するための、当技術分野において周知の他のウイルスプロモーター、または哺乳動物細胞プロモーター、または細菌ファージプロモーターの使用も同様に意図される。周知の特性を伴うプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換の後における、対象のタンパク質の発現レベルおよび発現パターンを最適化することができる。
特定の生理シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターを選択することにより、遺伝子産物の誘導性発現が可能となりうる。例えば、導入遺伝子、またはマルチシストロニックのベクターを用いる場合は複数の導入遺伝子の発現が、その中でベクターを生成させる細胞に対して毒性である場合は、これらの導入遺伝子のうちの１以上の発現を阻害または低減することが望ましい。生成細胞系に対して毒性である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進性遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。導入遺伝子産物が毒性である場合は、ウイルスベクターを生成させるのに、複数の誘導性プロモーター系が利用可能である（より多くの誘導性プロモーターを付加されたい）。
エクジソン系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、このような系の１つである。この系は、哺乳動物細胞における対象の遺伝子の制御発現を可能とするようにデザインされている。エクジソン系は、導入遺伝子の基礎レベルの発現は事実上まったく許容しないが、２００倍を超える誘導性を可能とする、厳密に制御された発現機構からなる。エクジソン系は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属のヘテロ二量体のエクジソン受容体に基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどの類似体がこの受容体に結合すると、この受容体により、下流の導入遺伝子の発現スイッチをオンにするプロモーターが活性化され、高レベルのｍＲＮＡ転写が達せられる。この系では、ヘテロ二量体受容体の両方の単量体がベクターから構成的に発現するが、対象の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミドに存在する。したがって、この種の系を、対象の遺伝子導入ベクターへと遺伝子操作により導入すれば、有用であろう。次いで、対象の遺伝子を含有するプラスミドと、生成細胞系内の受容体単量体とを含有するプラスミドを共トランスフェクトすれば、潜在的に毒性である導入遺伝子を発現させずに、遺伝子導入ベクターを生成させることが可能となるであろう。適切な時点でならば、導入遺伝子の発現を、エクジソンまたはムリステロンＡにより活性化することも可能であろう。
有用でありうる別の誘導系は、元はＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：５５４７−５５５１， １９９２； Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６８：１７６６−１７６９， １９９５）により開発されたＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）系またはＴｅｔ−Ｏｎ（商標）系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）である。この系によってもまた、テトラサイクリン、またはドキシサイクリンなど、テトラサイクリン誘導体に応答して、高レベルの遺伝子発現を制御することが可能となる。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）系では、ドキシサイクリンの存在下で遺伝子発現がスイッチオンとなるのに対し、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）系では、ドキシサイクリンの非存在下で遺伝子発現がスイッチオンとなる。これらの系は、Ｅ．ｃｏｌｉのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの制御性エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質という２つの制御性エレメントである。その中にテトラサイクリン応答性エレメントを存在させるプロモーターの下流に、対象の遺伝子をクローニングする。第２のプラスミドは、テトラサイクリン制御性トランスアクチベーターと称する制御性エレメントを含有し、このエレメントは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）系の場合、単純ヘルペスウイルスに由来するＶＰ１６ドメインと、野生型のテトラサイクリンリプレッサーとからなる。したがって、ドキシサイクリンの非存在下では、転写が構成的にオンとなる。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）系では、テトラサイクリンリプレッサーが野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下において、転写を活性化する。遺伝子治療用にベクターを生成させる場合は、生成細胞を、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で増殖させ、潜在的に毒性である導入遺伝子の発現は防止しうるが、ベクターが患者に導入されると、遺伝子発現が構成的にオンとなるように、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）系を用いることができる。
状況によっては、遺伝子治療用ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、所望の発現レベルに応じて、活性強度の異なるウイルスプロモーターを用いる。哺乳動物細胞では、強力な転写活性化をもたらすのに、ＣＭＶ即初期プロモーターを用いることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， Ｊ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．． １５：６１７−４８において総説されている。導入遺伝子の発現レベルの低減が望ましい場合にはまた、それほど強力でない、ＣＭＶプロモーターの修飾形も用いられている。造血細胞における導入遺伝子の発現が所望される場合は、ＭＬＶまたはＭＭＴＶに由来するＬＴＲなど、レトロウイルスプロモーターを用いることが多い。所望の効果に応じて用いられる他のウイルスプロモーターには、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターおよびＨＩＶ−２ ＬＴＲプロモーター、Ｅ１Ａ領域、Ｅ２Ａ領域、またはＭＬＰ領域に由来するプロモーターなど、アデノウイルスプロモーター、ＡＡＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、およびニワトリ肉腫ウイルスプロモーターが含まれる。
同様に、標的とされない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない影響を軽減するように、組織特異的なプロモーターを用いて、特異的な組織または細胞において転写を実施する。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなど、より強力なプロモーターと比較して、発現の低下を結果としてもたらしうるが、また、発現および免疫原性の制限を結果として増強することも可能である（Ｂｏｊａｋ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．，２００２． Ｖａｃｃｉｎｅ． ２０：１９７５−７９； Ｃａｚｅａｕｘ．， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３２２−３１）。例えば、適切な場合は、ＰＳＡ関連プロモーターもしくは前立腺特異的腺カリクライン、または筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子など、組織特異的なプロモーターを用いることができる。
特定の適応症では、遺伝子治療用ベクターを投与した後の特定の時点において、転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモン制御性またはサイトカイン制御性であるプロモーターなどのプロモーターによりなされる。用いうるサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターには、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２，２３４５−２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ−反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅ， ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６（８）， ３１９５−３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ．， ６， １９０５−１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓｅ， （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６，８２０２−８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ６１８１−６１９１）、ＩＬ−８、アルファ−１酸糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎｎ， （１９８８） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ８，４２−５１）、アルファ−１抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３９４−２４０１， １９８８）、アンギオテンシノーゲン（Ｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２８８７−２８９５）、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（フォルボールエステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸、および過酸化水素により誘導可能）、コラゲナーゼ（フォルボールエステルおよびレチノイン酸により誘導される）、メタロチオネイン（重金属およびグルココルチコイドにより誘導可能）、ストロメリシン（フォルボールエステル、インターロイキン−１、およびＥＧＦにより誘導可能）、アルファ−２マクログロビン、およびアルファ−１抗−キモトリプシンが含まれる。他のプロモーターには、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス、モロニーウイルス（ＭＶ）、ＡＬＶ、エプスタインバーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、およびヒトクレアチンが含まれる。
単独の、または別のプロモーターと組み合わせた、上記のプロモーターのうちのいずれかが、所望の作用に応じて有用となりうることが想定される。プロモーターおよび他の制御性エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能性となるように選択する。加えて、プロモーターのリストは、網羅的または限定的であるとみなされるべきではなく、他のプロモーターも、本明細書で開示されるプロモーターおよび方法と共に用いられる。
２．エンハンサー
エンハンサーとは、同じＤＮＡ分子の遠隔の位置に配置されるプロモーターにより転写を増大させる遺伝子エレメントである。最初の例には、免疫グロブリンと関連するエンハンサーおよびＴ細胞受容体と関連するエンハンサーであって、いずれもがコード配列に隣接し、複数のイントロン内に存在するエンハンサーが含まれる。ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびレトロウイルスＬＴＲプロモーターなど、多くのウイルスプロモーターが、エンハンサー活性と緊密に関連しており、単一のエレメントのように扱われることが多い。エンハンサーも、プロモーターと全く同様に構成されている。すなわち、エンハンサーは、それらの各々が、１以上の転写タンパク質に結合する、多くの個別のエレメントからなる。エンハンサーとプロモーターとの基本的な差違は、作動的なものである。エンハンサー領域は、全体として、遠隔の転写を刺激し、方向に依存しないことが多いが、これは、プロモーター領域またはその構成要素には当てはまらなくともよい。他方、プロモーターが、ＲＮＡ合成の開始を特定の部位において方向付ける１以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠いている。プロモーターとエンハンサーとは、重複および隣接することが多く、極めて類似のモジュール構成を有することが多いと考えられている。エンハンサーのサブセットは、転写活性を増大させうるだけでなく、ゲノム内に組み込まれると、（インシュレーターエレメントと共に）隣接する配列から転写エレメントを絶縁する一助ともなりうる遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）である。任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＥＰＤＢ）による）を用いて、遺伝子の発現を駆動しうるが、多くは、発現を、特定の組織型または組織のサブセットに制限する（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｂ．， ２００８． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７７６−８８において総説されている）。例には、ヒトアクチン配列、ヒトミオシン配列、ヒトヘモグロビン配列、ヒト筋肉クレアチンキナーゼ配列、ならびにＣＭＶウイルス、ＲＳＶウイルス、およびＥＢＶウイルスに由来するエンハンサーが含まれるがこれらに限定されない。具体的な適用に適切なエンハンサーを選択することができる。送達複合体の一部として、またはさらなる遺伝子発現構築物として、適切な細菌ポリメラーゼを備える場合は、真核細胞が、特定の細菌プロモーターからの細胞質における転写を支援しうる。
３．ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡの挿入配列を用いる場合は、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を実施するように、ポリアデニル化シグナルを組み入れようと所望することが典型的である。ポリアデニル化シグナルの性質が本方法を成功裏に実施するのに重要であるとは考えられず、ヒト成長ホルモンのポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、ならびにＬＴＲのポリアデニル化シグナルなど、任意のこのような配列が用いられる。非限定的な一例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０のポリアデニル化シグナルである。また、発現カセットのエレメントとしては、ターミネーターも意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、発現カセットから他の配列への読み抜けを最小化するのに用いられうる。終結シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’端における保存的配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置する場合がある（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ， Ｄ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３． ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：７７７−８３； Ｋｕｔｚｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｂ．， ２００８． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎ． ９：７７６−８８）。
４．開始シグナルおよび配列内リボソーム結合部位
コード配列を効率的に翻訳するにはまた、特異的な開始シグナルも必要とされうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルを備えることが必要でありうる。開始コドンを、所望のコード配列のリーディングフレームと共にインフレームで配置し、挿入配列全体の翻訳を確保する。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然の場合もあり、合成の場合もある。適切な翻訳エンハンサーエレメントを組み入れることにより、発現の効率を増強することができる。
特定の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを用いて、マルチ遺伝子メッセージまたはポリシストロニックメッセージを創出する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソーム走査モデルを回避し、配列内部位において翻訳を開始することが可能である（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４：３２０−３２５， １９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）に由来するＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ， １９８８）のほか、哺乳動物メッセージ配列に由来するＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５３：９０−９４， １９９１）も論じられている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。各々をＩＲＥＳにより隔てた複数のオープンリーディングフレームを、併せて転写し、ポリシストロニックメッセージを創出することができる。ＩＲＥＳエレメントにより、各オープンリーディングフレームがリボソームに結合可能となり、効率的な翻訳がもたらされる。単一のメッセージを転写する単一のプロモーター／エンハンサーを用いて、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる（各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号を参照されたい）。
配列の最適化
タンパク質の生成はまた、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増大させることができる。種特異的なコドンの変化を用いて、タンパク質の生成を増大させることができる。また、コドンを最適化して、ＲＮＡを最適化することもでき、この結果として、より効率的な翻訳をもたらすこともできる。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することにより、不安定性を引き起こす二次構造、例えば、リボソームの結合を阻害しうるｍＲＮＡの二次構造、またはｍＲＮＡの核外移出を阻害しうる潜在配列（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）などのエレメントを除去することができる（Ｋｕｔｚｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｂ．， ２００８． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎ． ９：７７６−８８； Ｙａｎ．， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ２００７． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １５：４１１−２１； Ｃｈｅｕｎｇ， Ｙ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：６２９−３８； Ｎａｒｕｍ．， Ｄ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， ２００１． ６９：７２５０−５５； Ｙａｄａｖａ， Ａ．， ａｎｄ Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ， Ｃ．Ｆ．， ２００３． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ７１：４９６２−６９； Ｓｍｉｔｈ．， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， ２００４． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２０：１３３５−４７； Ｚｈｏｕ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８８：１２７−５１； Ｗｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３１３：８９−９６； Ｚｈａｎｇ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３４９：６９−７８； Ｄｅｍｌ， Ｌ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ２００１． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１０９９−１１００１； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｒ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４８９２−４９０３； Ｗａｎｇ， Ｓ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０； ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， ２０００． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：２６２８−２６３５）。
リーダー配列
リーダー配列を付加して、ｍＲＮＡの安定性を増強し、より効率的な翻訳を結果としてもたらすことができる。リーダー配列は通常、小胞体へのｍＲＮＡのターゲッティングに関与する。例には、その固有の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）のシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子のリーダー配列が含まれる（Ｋｕｔｚｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｂ．， ２００８． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎ． ９：７７６−８８； Ｌｉ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， ２０００． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：４１７−２８； Ｘｕ， Ｚ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． ２００１． Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−５６； Ｍａｌｉｎ， Ａ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ２０００． Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ． ２：１６７７−８５； Ｋｕｔｚｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ２００５． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７５：１１２−１２５； Ｙａｎｇ．， Ｊ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｅｍｅｒｇ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ８：１３７９−８４； Ｋｕｍａｒ．， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ２００６． ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２５：３８３−９２； Ｗａｎｇ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥリーダー配列を用いて、小胞体への挿入を増強することができる（Ｔｅｐｌｅｒ， Ｉ， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５９１２）。
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するのに適切な方法を選択することにより最適化および／または制御することができる。これらの方法には、例えば、プロモーターの最適化、送達法、および遺伝子配列が含まれる（例えば、Ｌａｄｄｙ， Ｄ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， ２００８． ＰＬｏＳ．ＯＮＥ ３ ｅ２５１７； Ｋｕｔｚｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｂ．， ２００８． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎ． ９：７７６−８８において提示されている）。
核酸
本明細書で用いられる「核酸」とは一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸塩基を含むこれらの誘導体もしくは類似体の分子（一本鎖、二本鎖、またはこれを超える鎖）を指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡにおいて見出される天然のプリン塩基もしくはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」、またはシトシン「Ｃ」）、またはＲＮＡにおいて見出される天然のプリン塩基もしくはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」、またはＣ）が含まれる。「核酸」という用語は、各々が「核酸」という用語の亜属としての、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含する。核酸は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００ヌクレオチド、またはこの中で導出可能な任意の範囲の長さであることも可能であり、少なくともこれらの長さであることも可能であり、多くともこれらの長さであることも可能であり、おおよそこれらの長さであることも可能である。
本明細書で提示される核酸は、別の核酸と同一な領域を有する場合もあり、別の核酸と相補的な領域を有する場合もある。相補的な領域または同一な領域は、少なくとも５つの連続残基でありうることが意図されるが、この領域は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００の連続ヌクレオチドであるか、少なくともこれらの連続ヌクレオチドであるか、多くともこれらの連続ヌクレオチドであるか、またはおおよそこれらの連続ヌクレオチドであることがとりわけ意図される。
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることが可能である」とは、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的に二本鎖もしくは三本鎖の性質を伴う分子を形成することを意味するものと理解される。本明細書で用いられる「アニールする」という用語は、「ハイブリダイズする」と同義である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることが可能である」という用語は、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」という用語、および「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件（複数可）」という用語を包含する。
本明細書で用いられる「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」とは、相補的な配列（複数可）を含有する、１以上の核酸鎖間または核酸鎖内でハイブリダイゼーションを可能とするが、無作為的配列のハイブリダイゼーションは除外する条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間にミスマッチがあったとしてもわずかなミスマッチしか許容しない。このような条件は公知であり、高度な選択性を必要とする適用に用いられることが多い。非限定的な適用には、遺伝子もしくはその核酸セグメントなどの核酸の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写物もしくはその核酸セグメントなどの検出が含まれる。
ストリンジェントな条件は、摂氏約４２度〜摂氏約７０度の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．５ＭのＮａＣｌによりもたらされる条件など、低塩分および／または高温の条件を含みうる。所望のストリンジェンシーを有する温度およびイオン強度は、部分的に、特定の核酸（複数可）の長さ、標的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含量、核酸（複数可）の電荷組成、およびハイブリダイゼーション混合物におけるホルムアミド、テトラメチルアンモニウムクロリド、または他の溶媒（複数可）の存在または濃度により決定されることが理解される。
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成、および条件は、非限定的な例だけを目的として言及するものであり、特定のハイブリダイゼーション反応に所望のストリンジェンシーは、１以上の陽性対照または陰性対照と比較することにより経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される適用に応じて、ハイブリダイゼーション条件の変化を用いて、標的配列に対する核酸の選択度の変化を達成することができる。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下では核酸にハイブリダイズしない類縁の標的核酸の同定および単離を、低温および／または高イオン強度においてハイブリダイズさせることにより達成することができる。このような条件を、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシーの条件」と称し、低ストリンジェンシーの非限定的な例には、約０．１５Ｍ〜約０．９ＭのＮａＣｌ、摂氏約２０度〜摂氏約５０度の温度範囲で実施されるハイブリダイゼーションが含まれる。低ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件をさらに修飾して、特定の適用に適合させることができる。
核酸の修飾
以下で論じられる修飾のうちのいずれも、核酸に適用することができる。修飾の例には、ＲＮＡまたはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびこれらの多様な組合せに対する変化が含まれる。核酸における任意の適切な数の骨格連結、糖、および／または塩基を修飾することができる（例えば、個別に約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。非修飾ヌクレオシドとは、ベータ−Ｄ−リボフラノースの１’炭素に接合された、アデニン塩基、シトシン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、またはウラシル塩基のうちのいずれか１つである。
修飾塩基とは、１’位における、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例には、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル（ｐＳＥＱｄｏｕｒａｃｉｌ）、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが含まれる。修飾塩基の他の非限定的な例には、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−，５−，６−ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナプタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが含まれる。
一部の実施形態では、例えば、核酸が、リン酸骨格が修飾された修飾核酸分子を含みうる。骨格修飾の非限定的な例には、ホスホロチオエート修飾、ホスホロジチオエート修飾、メチルホスホネート修飾、ホスホトリエステル修飾、モルホリノ修飾、アミデート修飾、カルバメート修飾、カルボキシメチル修飾、アセトアミデート修飾、ポリアミド修飾、スルホネート修飾、スルホンアミド修飾、スルファメート修飾、ホルムアセタール修飾、チオホルムアセタール修飾、および／またはアルキルシリル修飾が含まれる。特定の場合には、ヌクレオシドにおいて天然であるリボースの糖部分が、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環、またはシクロヘキセニル基で置換されている。特定の場合には、ヘキソース糖が、アロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、またはこれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコース、またはマンノースでありうる。特定の場合には、多環式ヘテロアルキル基が、環中に１つの酸素原子を含有する二環式環でありうる。特定の場合には、多環式ヘテロアルキル基が、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタン、またはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドイル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物クラスのメンバーである。ユニバーサル塩基とは、融解挙動またはオリゴヌクレオチド二重鎖の活性に実質的に影響を与えることなく、４つの天然塩基のうちのいずれかを置換しうる化合物である。天然の核酸塩基と関連する、安定的な水素結合による相互作用とは異なり、３−ニトロピロリル核酸塩基を含有するオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用だけを介して安定化させることができる。ニトロピロリル核酸塩基には、著明な水素結合による相互作用が見られないので、特異的な相補性塩基に対する特異性が除去される。加えて、４−ニトロインドイル、５−ニトロインドイル、および６−ニトロインドイルも、４つの天然塩基に対して極めて小さな特異性しか示さない。Ｇａｕｂｅｒｔ， Ｇ．； Ｗｅｎｇｅｌ， Ｊ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４， ４５， ５６２９では、１−（２’−Ｏ−メチル−ベータ−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドールを調製するための手順が論じられている。他のユニバーサル塩基には、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドイル、ピロロピリミジニル、およびこれらの構造的誘導体が含まれる。
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する、非天然核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基であるチミンの等量式である。しかし、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても感知できるほどの選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾールおよび４−メチルベンズイミダゾールである。加えて、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、および３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルも、天然塩基だけを含有するオリゴヌクレオチド配列と比較して、オリゴヌクレオチド二重鎖によるわずかな不安定化を引き起こすに過ぎない、ユニバーサル塩基である。
他の非天然核酸塩基には、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、およびこれらの構造的誘導体が含まれる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、および上述の他の非天然塩基の合成手順を含めたより詳細な議論については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ５９：７２３８−７２４２ （１９９４）を参照されたい。
加えて、化学的置換基、例えば、架橋形成剤を用いて、反応にさらなる安定性または不可逆性を付加することもできる。架橋形成剤の非限定的な例には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸を伴うエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤が含まれる。
ヌクレオチド類似体にはまた、「ロックト」核酸も含まれうる。特定の組成物を用いて、内因性核酸を、特定の構造内に、本質的に「固定」または「ロック」することができる。配列の固定は、核酸複合体の解離を防止するのに用いられ、このため、内因性配列のコピーを防止しうるだけでなく、その標識化、修飾、および／またはクローニングも可能としうる。ロックト構造は、遺伝子の発現を制御する（すなわち、転写または複製を阻害または増強する）ことも可能であり、内因性の核酸配列を標識化するかまたは他の形で修飾するのに用いうる安定的な構造として用いることもでき、内因性配列を単離する、すなわち、クローニングするのに用いることもできる。
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含有する分子に限定されなくともよく、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドもさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの百分率は、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％でありうる）。
核酸の調製
一部の実施形態では、例えば、核酸を、アッセイにおける対照もしくは基準物質、または治療剤として使用するために提供する。核酸は、例えば、化学合成、酵素的生成、または生物学的生成など、当技術分野で公知の任意の技法により作製することができる。核酸は、生物学的試料から回収または単離することができる。核酸は、組換えの場合もあり、細胞に対して天然または内因性の場合（細胞のゲノムから生成させる場合）もある。核酸低分子の回収を増強するような形で、生物学的試料を処理しうることが意図される。一般的には、方法が、細胞を、グアニジニウムおよび洗浄剤を有する溶液で細胞を溶解させるステップを包含しうる。
核酸の合成はまた、標準的な方法に従い実施することもできる。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてホスホロトリエステル化学反応、亜リン酸化学反応、またはホスホルアミダイト化学反応、および固相法を用いる化学合成により作製される核酸、またはデオキシヌクレオシドＨ−ホスフェート中間体を介して作製される核酸が含まれる。オリゴヌクレオチド合成の異なる多様な機構については、他所で開示されている。
核酸は、公知の技法を用いて単離することができる。特定の実施形態では、核酸低分子を単離する方法、および／またはＲＮＡ分子を単離する方法を用いることができる。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離または単離するのに用いられる工程である。このような方法は、ゲルマトリックス、フィルターカラム、アルコール沈殿を伴う電気泳動、および／または他のクロマトグラフィーを伴いうる。細胞に由来する核酸を使用または評価する場合、方法は一般に、細胞を、カオトロピック（例えば、イソチオシアン酸グアニジニウム）および／または洗浄剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン）で溶解させてから、特定のＲＮＡ集団を単離する実装工程を伴う。
方法は、核酸を単離するための、有機溶媒および／またはアルコールの使用を伴いうる。一部の実施形態では、細胞溶解産物に添加されるアルコールの量により、約５５％〜６０％のアルコール濃度が達成される。異なるアルコールを用いうるが、エタノールが良好に作用する。固相は、任意の構造が可能であり、これには、ビーズ、フィルター、およびカラムが含まれ、これは、電気陰性基を伴う鉱物またはポリマーの支持体を包含しうる。このような単離手順には、ガラスファイバーのフィルターまたはカラムが有効である。
核酸単離工程は、ａ）グアニジニウムを含む溶解溶液により試料中の細胞を溶解させる工程であって、グアニジニウム濃度を少なくとも約１Ｍとする溶解産物がもたらされる工程、ｂ）フェノールを含む抽出溶液により、溶解産物から核酸分子を抽出する工程、ｃ）溶解産物にアルコール溶液を添加して溶解産物／アルコール混合物を形成する工程であって、混合物におけるアルコール濃度が約３５％〜約７０％である工程、ｄ）溶解産物／アルコール混合物を固体の支持体に適用する工程、ｅ）イオン性溶液により、固体の支持体から核酸分子を溶出させる工程、およびｆ）核酸分子を捕捉する工程を包含しうることがある。試料は乾燥させ、後続の操作に適切な液体および容量中に再懸濁させることができる。
遺伝子導入法
細胞における導入遺伝子の発現効果を媒介するため、発現構築物を細胞に導入することが必要となる。このような導入は、ウイルス的遺伝子導入法を用いる場合もあり、非ウイルス的遺伝子導入法を用いる場合もある。本節は、遺伝子導入のための方法および組成物についての議論を提示する。発現ベクターを含む形質転換細胞は、細胞内に発現ベクターを導入することにより生成させる。本方法と共に用いられる細胞小器官、細胞、組織、または生物を形質転換するのに適するポリヌクレオチド送達法には、細胞小器官、細胞、組織、または生物にポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を導入しうる、事実上任意の方法が含まれる。
宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして用いることができ、そのように用いられてきた。所望の結果が、ベクターの複製であるのか、またはベクターによりコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるのかに応じて、宿主細胞は、原核生物に由来する場合もあり、真核生物に由来する場合もある。多くの細胞系および細胞培養物が、宿主細胞としての使用に利用可能であり、生物の培養物および遺伝子物質のアーカイブとして利用されている機構である、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を介してこれらを得ることができる。特定の実施形態では、宿主細胞が、抗原提示細胞である樹状細胞である。
適切な宿主を決定することができる。一般的に述べると、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドを、原核生物の宿主細胞へと導入して、多くのベクターを複製することができる。ベクターを複製および／または発現させるための宿主細胞として用いられる細菌細胞には、ＤＨ５アルファ細胞、ＪＭ１０９細胞、およびＫＣ８細胞のほか、ＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞およびＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）など、市販される多くの細菌宿主が含まれる。代替的には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２細胞などの細菌細胞も、ファージウイルスのための宿主細胞として用いうるであろう。宿主細胞として用いうる真核細胞には、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。ベクターを複製および／または発現させるための、哺乳動物の真核宿主細胞の例には、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓａｏｓ細胞、およびＰＣ１２細胞が含まれるがこれらに限定されない。酵母細胞株の例には、ＹＰＨ４９９株、ＹＰＨ５００株、およびＹＰＨ５０１株が含まれるがこれらに限定されない。
核酸ワクチンには、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「ネイキッド」ＤＮＡおよび「ネイキッド」ＲＮＡ、ならびにウイルスベクターが含まれうる。細胞をこれらのワクチンで形質転換し、これらのワクチンに包含される遺伝子の発現を最適化する方法は公知であり、本明細書でも論じられる。
核酸またはウイルスベクターを導入する方法の例
任意の適切な方法を用いて、抗原提示細胞をトランスフェクトまたは形質転換することもでき、本方法のヌクレオチド配列または組成物を投与することもできる。本明細書では、特定の例が提示され、カチオン性ポリマー、脂質様分子、および、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ ＰＥＩなど、特定の市販品を用いる送達などの方法がさらに含まれる。
１．ｅｘ ｖｉｖｏにおける形質転換
ｅｘ ｖｉｖｏ状況において生物から取り出した血管細胞および血管組織をトランスフェクトするには、多様な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるレトロウイルスによる遺伝子導入を介して遺伝子改変し、イヌへと移植した（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１３４４−１３４６， １９８９）。別の例では、ユカタンミニピッグの内皮細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるレトロウイルスによりトランスフェクトし、動脈内に、ダブルバルーンカテーテルを用いて移植した（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４（４９１０）：１３４２−１３４４， １９８９）。したがって、細胞または組織を取り出し、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、本明細書で提示されるポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトしうることが意図される。特定の態様では、移植された細胞または組織を、生物内に導入することができる。例えば、動物に由来する樹状細胞を、発現ベクターでトランスフェクトし、次いで、トランスフェクトまたは形質転換された細胞を投与して、動物に戻す。
２．注射
特定の実施形態では、抗原提示細胞または核酸もしくはウイルスベクターを、細胞小器官、細胞、組織、または生物に、例えば、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）注射、腫瘍内注射、腹腔内注射など、１以上の注射（すなわち、注射針による注射）を介して送達することができる。注射法には、例えば、生理食塩液を含む組成物の注射が含まれる。さらなる実施形態は、直接的なマイクロインジェクションを介するポリヌクレオチドの導入を包含する。用いられる発現ベクターの量は、用いられる抗原、ならびに細胞小器官、細胞、組織、または生物の性質に応じて変化しうる。
皮内注射、リンパ節内注射、またはリンパ内注射が、ＤＣ投与でより一般的に用いられる方法の一部である。皮内注射は、血流内への吸収は低速であるが、リンパ系への取込みは急速であることを特徴とする。真皮において極めて多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、完全抗原ならびにプロセシングされた抗原が、排出リンパ節へと輸送される。これを正確に実施するには、適正な部位の準備が必要である（すなわち、適正な注射針の設置を観察するために、剃毛する）。リンパ節内注射は、抗原の送達を、リンパ組織へと方向付けることを可能とする。リンパ内注射は、ＤＣの直接的な投与を可能とする。
３．電気穿孔
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを、細胞小器官、細胞、組織、または生物へと、電気穿孔を介して導入する。電気穿孔は、細胞およびＤＮＡの懸濁液を、高電圧放電へと曝露することを伴う。この方法の一部の変化形では、ペクチン分解酵素など、特定の細胞壁分解酵素を用いて、標的レシピエント細胞を、電気穿孔による形質転換に対して、非処理細胞より感受性とする（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３）。
電気穿孔を用いる真核細胞のトランスフェクションは、大きな成功を収めている。この方法で、マウスプレＢリンパ球が、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされており（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされている（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６，７１６−７１８）。
４．リン酸カルシウム
他の実施形態では、ポリヌクレオチドを細胞に、リン酸カルシウム沈殿を用いて導入する。ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ ＤＮＡで、この技法を用いてトランスフェクトされている（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２，４５６−４６７）。この方法ではまた、マウスＬ（Ａ９）細胞、マウスＣ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＨｅＬａ細胞も、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７（８）：２７４５−２７５２， １９８７）、ラット肝細胞も、各種のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０：６８９−６９５， １９９０）。
５．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ポリヌクレオチドを細胞に、ＤＥＡＥ−デキストランの後でポリエチレングリコールを用いて送達する。この方法で、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫およびマウス赤白血病細胞へと導入された（Ｇｏｐａｌ， Ｔ．Ｖ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９８５ Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。
６．超音波処理によるローディング
さらなる実施形態は、直接的な超音波ローディングを介するポリヌクレオチドの導入を包含する。ＬＴＫ線維芽細胞が、チミジンキナーゼ遺伝子で、超音波処理によるローディングを介してトランスフェクトされている（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４，８４６３−８４６７）。
７．リポソームを介するトランスフェクション
さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドを、例えば、リポソームなどの脂質複合体へと封入することができる。リポソームとは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重層リポソームは、水性媒体により隔てられた複数の脂質層を有する。リポソームは、リン脂質を過剰な水溶液中に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分が自己再配置を受けた後に、閉構造が形成され、脂質二重層間に水および溶解した溶質が封入される（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ， （１９９１） Ｉｎ： Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ． ｐｐ． ８７−１０４）。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により複合体化させたポリヌクレオチドも意図される。
８．受容体を介するトランスフェクション
さらにまた、ポリヌクレオチドを、標的細胞に、受容体を介する送達媒体によっても送達することができる。これらは、標的細胞内で生じる、受容体を介するエンドサイトーシスによる高分子の選択的な取込みを利用する。多様な受容体が細胞型特異的に分布することを考慮すると、この送達法は、さらなる特異性を付加する。
ある受容体を介する遺伝子ターゲティング媒体は、細胞受容体特異的リガンドと、ポリヌクレオチド結合剤とを含む。他の受容体を介する遺伝子ターゲティング媒体は、送達されるポリヌクレオチドが作動的に連結されている、細胞受容体特異的リガンドを含む。受容体を介する遺伝子導入には、複数のリガンドが用いられており（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， （１９８７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２，４４２９−４４３２； Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７（９）：３４１０−３４１４， １９９０； Ｐｅｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：４０８６−４０９０， １９９４； Ｍｙｅｒｓ， ＥＰＯ ０２７３０８５）、これにより、この技法の作動性が確立されている。別の哺乳動物細胞型の文脈における特異的な送達も論じられている（参照により本明細書に組み込まれるＷｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．， １２：１５９−１６７， １９９３）。特定の態様では、リガンドを、標的細胞集団において特異的に発現する受容体に対応するように選択する。他の実施形態では、細胞特異的ポリヌクレオチドターゲティング媒体のポリヌクレオチド送達媒体成分が、リポソームと組み合わせた特異的結合リガンドを含みうる。送達されるポリヌクレオチド（複数可）を、リポソーム内に格納し、特異的結合リガンドを、リポソーム膜へと機能的に組み込む。このため、リポソームは、標的細胞の受容体（複数可）に特異的に結合し、その内容物を細胞に送達する。このような系は、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）を、ポリヌクレオチドをＥＧＦ受容体の上方制御を示す細胞へと受容体を介して送達するのに用いる場合に機能性であることが示されている。
なおさらなる実施形態では、ターゲティング処理された送達媒体のポリヌクレオチド送達媒体成分が、例えば、細胞特異的な結合を方向付ける、１以上の脂質または糖タンパク質を含みうる、リポソーム自体でありうる。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシルセラミドが、リポソーム内に組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みの増大が観察されている（Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １４９，１５７−１７６）。同様の方法で、組織特異的な形質転換構築物を、標的細胞内に特異的に送達しうることが意図される。
９．マイクロプロジェクタイルボンバードメント
マイクロプロジェクタイルボンバードメント法は、ポリヌクレオチドを、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織、または生物へと導入するのに用いることができる（それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５５０，３１８；米国特許第５，５３８，８８０；米国特許第５，６１０，０４２；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９）。この方法は、ＤＮＡでコーティングされたマイクロプロジェクタイルを、それらが細胞膜を穿通し、細胞を死滅させることなしに細胞に進入することを可能とする高速まで加速化する能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ， ３２７，７０−７３）。当技術分野では、多種多様なマイクロプロジェクタイルボンバードメント法が公知であり、それらの多くが、本方法に適用可能である。このマイクロプロジェクタイルボンバードメントでは、１以上の粒子を、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングし、推進力により細胞内へと送達することができる。小型の粒子を加速化するための複数のデバイスが、開発されている。このようなデバイスの１つは、電流を発生させる高電圧放電に依存し、これが、起動力をもたらす（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７，９５６８−９５７２）。用いられるマイクロプロジェクタイルは、タングステン粒子もしくはタングステンビーズ、または金粒子もしくは金ビーズなど、生物学的に不活性な物質からなっている。例示的な粒子には、例えば、ナノ粒子を含めた、タングステン、白金、および、特定の例では、金が含まれる。場合によっては、マイクロプロジェクタイルボンバードメントを用いてＤＮＡをレシピエント細胞へと送達するのに、ＤＮＡを金属粒子へと沈殿させる必要はないことが意図される。しかしながら、粒子をＤＮＡでコーティングしうるのではなく、粒子がＤＮＡを含有しうることが意図される。ＤＮＡでコーティングした粒子は、粒子ボンバードメントを介するＤＮＡ送達のレベルを増大させうるが、それ自体において、およびそれ自体が必要なわけではない。
ウイルスベクターを介する導入法の例
本方法では、被験体における１以上の細胞が、ヌクレオチド配列によりコードされる遺伝子を発現しうるように、ヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列を含む組成物を細胞または被験体へと投与するのに適する、任意のウイルスベクターを用いることができる。特定の実施形態では、導入遺伝子をウイルス粒子内に組み込み、細胞への遺伝子導入を媒介する。ウイルスを、生理学的条件下で適切な宿主細胞へと曝露するだけで、ウイルスの取込みが可能となることが典型的である。以下で論じる通り、各種のウイルスベクターを用いて本方法を用いることが有利である。
１．アデノウイルス
アデノウイルスは、そのＤＮＡゲノムサイズが中程度であること、操作が容易であること、高力価であること、標的細胞の範囲が広いこと、および感染性が高いことのために、遺伝子導入ベクターとして用いるのに特に適する。おおよそ３６ｋｂのウイルスゲノムに、１００〜２００塩基対（ｂｐ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ；ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）が結合しており、ここに、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントが含有されている。ウイルスＤＮＡ複製の開始により、異なる転写単位を含有するゲノムの初期（Ｅ）領域と、後期（Ｌ）領域とが分割される。
Ｅ１領域（Ｅ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域）は、ウイルスゲノムおよび数個の細胞遺伝子の転写制御の一因となるタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ領域およびＥ２Ｂ領域）の発現は、ウイルスＤＮＡを複製するためのタンパク質の合成を結果としてもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現、および宿主細胞のシャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ， Ｍ． Ｊ． （１９９０） Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．， １９， １９７−２１８）。ウイルスカプシドタンパク質の大半を含め、後期遺伝子（Ｌ１遺伝子、Ｌ２遺伝子、Ｌ３遺伝子、Ｌ４遺伝子、およびＬ５遺伝子）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から発生する単一の一次転写物が著明にプロセシングされた後に限り発現する。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染後期において特に効果的であり、このプロモーターから発生する全てのｍＲＮＡは、５’トリパータイルリーダー（ＴＬ；ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）配列を保有し、これにより、これらのｍＲＮＡが翻訳に有用となる。
アデノウイルスを遺伝子治療に最適化するには、大型のＤＮＡセグメントを組み入れうるように、移送能を最大化することが必要である。また、特定のアデノウイルス生成物と関連する毒性および免疫応答を軽減することも極めて望ましい。アデノウイルス遺伝子の除去はいずれの目標にも資するので、２つの目標は、ある程度、共通の目標である。本方法を実施することにより、治療用構築物を比較的容易に操作する能力を保持しながら、これらの両方の目標を達成することが可能である。
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントは全て、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの端部のＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化しているので、ＤＮＡの大規模な置換が可能である。ＩＴＲを含有するプラスミドは、非欠損型アデノウイルスの存在下で複製されうる（Ｈａｙ， Ｒ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９８４ Ｊｕｎ ５；１７５（４）：４９３−５１０）。したがって、これらのエレメントをアデノウイルスベクターへと組み入れることにより、複製が可能となる。
加えて、ウイルスを封入するためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在化している（Ｈｅａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． （１９８７） Ｖｉｒｏｌ．， ６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣し、ここで、左端には近接するが、付着端配列からは外部にある特異的配列が、このＤＮＡを、ヘッド構造へと挿入するのに必要とされるタンパク質への結合を媒介する。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）の断片であれば、２９３細胞におけるパッケージングを方向付けうることを裏付けている（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １０１：１９５−２０２， １９９１）。
既に、アデノウイルスゲノムの特定の領域を、哺乳動物細胞のゲノム内に組み込むことができ、これによりコードされる遺伝子を発現させうることが示されている。これらの細胞系は、これらによりコードされる、アデノウイルス機能を欠損させたアデノウイルスベクターの複製を支援することが可能である。また、「支援」ベクター、例えば、野生型のウイルスまたは条件欠損型の突然変異体を介する、複製欠損型アデノウイルスベクターの補完についても、報告がなされている。
複製欠損型アデノウイルスベクターは、トランスにおけるヘルパーウイルスにより補完することができる。しかし、複製機能をもたらすのに必要とされるヘルパーウイルスが存在すれば、いかなる調製物も汚染されるので、この観察だけで、複製欠損ベクターの単離が可能となるわけではない。したがって、複製欠損ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加する、さらなるエレメントが必要とされた。このエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスのパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓ ｅｔ． ａｌ． （１９７７） Ｃｅｌｌ， １２，２４３−２４９）。その後の研究は、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域において欠失を伴う突然変異体の増殖が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞系においてもなお低度であることを示した（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ， （１９８３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６７，８０９−８２２）。補償的アデノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）を、この突然変異体の右端へと組換えにより導入したところ、このウイルスは、正常にパッケージングされた。突然変異についてのさらなる解析により、Ａｄ５ゲノムの左端において、位置依存性の短い反復エレメントが同定された。ゲノムのいずれかの端部に存在する場合は、この反復配列の１つのコピーが、効率的なパッケージングに十分であるが、Ａｄ５ ＤＮＡ分子の内部へと移動させると、効率的なパッケージングには十分でないことが判明した（Ｈｅａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． （１９８７） Ｖｉｒｏｌ．， ６７，２５５５−２５５８）。
パッケージングシグナルの突然変異形を用いることにより、効率を変化させながらパッケージングされるヘルパーウイルスを創出することが可能である。突然変異は、点突然変異または点欠失であることが典型的である。パッケージング効率の低いヘルパーウイルスを、ヘルパー細胞内で増殖させる場合、野生型ウイルスと比較して低速度ではあるが、これらのウイルスはパッケージングされ、これにより、ヘルパーウイルスの増殖が可能となる。しかし、これらのヘルパーウイルスを、野生型のパッケージングシグナルを含有するウイルスと共に細胞内で増殖させる場合は、これらの野生型のパッケージングシグナルが、突然変異形より優先的に認識される。パッケージング因子の量が限定的であることを踏まえると、野生型シグナルを含有するウイルスは、ヘルパーウイルスと比較して選択的にパッケージングされる。優先性が十分に大きい場合は、ウイルス株を均質に近づけることができる。
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の指向性を改善するには、アデノウイルス単離物間で、受容体結合線維配列を置換しうることが多い。例えば、アデノウイルス５において見出されるコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）リガンドを、アデノウイルス３５に由来するＣＤ４６結合線維配列の代わりに用いて、ヒト造血細胞に対する結合アフィニティーを大幅に改善することができる。結果として得られる「ｐＳＥＱｄｏｔｙｐｅｄ」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、臨床開発された複数のウイルス単離物のベースとなっている。さらに、樹状細胞などの標的細胞を再度ウイルスの標的とすることを可能とするように線維を修飾する、多様な生化学的方法も存在する。方法には、二官能性抗体（一方の端部が、ＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の端部が、標的配列に結合する）、およびカスタマイズしたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能とする、線維の代謝的ビオチニル化が含まれる。代替的に、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５抗体）を、ヘテロ二官能性のリンカー（例えば、ＰＥＧを含有するリンカー）を介してアデノウイルス粒子に結合させることもできるであろう。
２．レトロウイルス
レトロウイルスとは、それらのＲＮＡを、感染細胞において、逆転写過程により、二本鎖ＤＮＡへと転換する能力を特徴とする、一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ， （１９９０） Ｉｎ： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １４３７−１５００）。次いで、結果として生じるＤＮＡが、プロウイルスとして、細胞内の染色体へと安定的に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を方向付ける。この組込みの結果、レシピエント細胞およびその後代細胞にウイルスの遺伝子配列が貯留される。レトロウイルスのゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分のそれぞれをコードする３つの遺伝子（ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子）を含有する。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される、ｐｓｉと称する配列が、ゲノムをビリオンへとパッケージングするためのシグナルとして機能する。ウイルスゲノムの５’端および３’端には、２つの長末端反復配列（ＬＴＲ）が存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、また、宿主細胞ゲノムへの組込みにも必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ， １９９０）。
レトロウイルスベクターを構築するには、プロモーターをコードする核酸を、複製欠損型であるウイルスを生成させる特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム内に挿入する。ビリオンを生成させるには、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲ成分およびｐｓｉ成分は伴わないパッケージング用細胞系を構築する（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｃｅｌｌ， ３３，１５３−１５９）。ヒトｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを、レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓｉ配列と共にこの細胞系に導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿を介して）、ｐｓｉ配列により、この組換えプラスミドのＲＮＡ転写物を、ウイルス粒子内にパッケージングし、次いで、これを培養培地中に分泌させることが可能となる（Ｎｉｃｏｌａｓ， Ｊ．Ｆ．， ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ｌ．Ｒ．， （１９８８） Ｉｎ： Ｖｅｃｔｏｒｓ： ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ， Ｅｄｓ．）． Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ； Ｔｅｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｉｎ： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ （ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １４９−１８８； Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。組換えレトロウイルスを含有する培地を回収し、場合によって濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染することが可能である。しかし、多くの種類のレトロウイルスの組込みおよび安定的な発現には、宿主細胞の分裂が必要とされる（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６７，２４２−２４８）。
ガラクトース残基をウイルスエンベロープに化学的に付加することを介するレトロウイルスの化学修飾に基づき、レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングを可能とするようにデザインされた手法が、近年開発された。この修飾によれば、アシアロ糖タンパク質を介する、肝細胞などの細胞に対する特異的な感染が可能となるであろうし、これは所望されうる。
レトロウイルスのエンベロープタンパク質および特異的な細胞受容体に対するビオチニル化抗体を用いて、組換えレトロウイルスをターゲティングする異なる手法もデザインされた。ストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン成分を介して、抗体を連結した（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６，９０７９−９０８３）。主要組織適合性複合体クラスＩ抗原および主要組織適合性複合体クラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、これらの表面抗原を保有する多様なヒト細胞に、同種指向性ウイルスが感染することが裏付けられた（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。
３．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対である、直鎖状の一本鎖ＤＮＡを用いる。ゲノムは、逆方向末端反復により挟み込まれている。ゲノム内には、多数の異なる遺伝子産物をもたらす２つの遺伝子が存在する。第１のｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２、およびＶＰ−３と称する、異なる３つのビリオンタンパク質（ＶＰ）をもたらす。第２のｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造性タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物のうちの１または複数が、ＡＡＶ転写をトランス活性化する一因となる。ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内におけるマップ単位のそれらの位置により名指される。これらを、左から右へ、ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０とする。転写により、３つのプロモーターの各々で２つずつの転写が開始され、各対のうちの一方がスプライシングされる、６つの転写物がもたらされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転写物について同じである。４つの非構造性タンパク質は、明らかに転写物のうちの長い方に由来し、３つのビリオンタンパク質は全て、小さい方の転写物から生じる。
ＡＡＶは、ヒトにおける病態とは関連しない。効率的に複製するには、ＡＡＶが、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、ｐＳＥＱｄｏｒａｂｉｅｓウイルス、ならびに、当然ながら、アデノウイルスなどのウイルスに由来する「支援」機能を必要とすることは興味深い。ヘルパーウイルスのうちで最もよく特徴づけられているのが、アデノウイルスであり、このウイルスの多くの「初期」機能が、ＡＡＶの複製を支援することが示されている。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の発現が低レベルであると、ＡＡＶの構造的発現が中止されると考えられており、ヘルパーウイルスの感染は、このブロックを除去すると考えられている。
ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶ、または修飾ＡＡＶゲノムを含有する、ｐ２０１などのプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ消化することにより（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６１：３０９６−３１０１ （１９８７））、または公表されているＡＡＶの配列に基づき、この末端反復配列を化学的または酵素的に合成することが含まれるがこれに限定されない他の方法により得ることができる。例えば、欠失解析により、機能、すなわち、安定的で部位特異的な組込みを可能とするのに必要とされるＡＡＶ ＩＴＲの最小限の配列または一部を決定することができる。また、この末端反復配列が安定的で部位特異的な組込みを方向付ける能力を維持しながらこの配列に対して許容しうるわずかな修飾がどのようなものであるかも決定することができる。
ＡＡＶベースのベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子送達に安全かつ有効な媒体であることがわかっており、これらのベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の潜在的な遺伝子治療における広範な適用のために、前臨床段階および臨床段階で開発および試験がなされている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ， （１９９５） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７７０； ７９−９０； Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅ， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７７０，７９−９０； Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０，３２２７−３２３４； Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０，５２０−５３２； Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０，１０６１３−１０６１７， （１９９３）； Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｂｌｏｏｄ， ８４，１４９２−１５００； Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｎａｔ’ｌ Ｇｅｎｅｔ．， ８，１４８−１５３； Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ． １９９６ Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９−７６； Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３，１４０８２−１４０８７； Ｋｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４，１４２６−１４３１； Ｍｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２１７，１２４−１３０）。
肺におけるＡＡＶを介する効率的な遺伝子の導入および発現は、嚢胞性線維症の処置についての臨床試験につながっている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ， １９９５； Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０，１０６１３−１０６１７， （１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への因子ＩＸ遺伝子送達によるＢ型血友病の処置、および心臓への血管内皮増殖因子遺伝子送達による心筋梗塞の潜在的な処置の見通しも、これらの器官におけるＡＡＶを介する導入遺伝子の発現は、極めて効率的であることが近年示されているので、有望であると考えられる（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０，５２０−５３２； Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４； １９９６； Ｋｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７； ＭｃＣｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．， ７１３，９９−１０７； Ｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ３，２２５−２２８； Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０，８０９８−８１０８）。
４．他のウイルスベクター
本方法および本組成物における発現構築物としては、他のウイルスベクターも用いられる。牛痘ウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ， （１９８８） Ｉｎ： Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ， ｐｐ． ４６７−４９２； Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ， （１９８６） Ｉｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， ｐｐ． １１７−１４８； Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ６８：１−１０， １９８８）、カナリア痘ウイルス、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターも用いられている。これらのウイルスは、多様な哺乳動物細胞への遺伝子導入に用いるための複数の特徴をもたらす。
構築物を細胞内に送達すると、導入遺伝子をコードする核酸は、異なる部位に配置され、発現する。特定の実施形態では、導入遺伝子をコードする核酸を、細胞のゲノム内に安定的に組み込む。この組込みは、相同組換えを介する同種の位置および方向である（遺伝子置換）か、または無作為的で非特異的な位置でなされる（遺伝子増強）。またさらなる実施形態では、核酸を、細胞内で、ＤＮＡの個別でエピソーム性のセグメントとして安定的に維持する。このような核酸のセグメントまたは「エピソーム」は、宿主の細胞周期には依存しない維持および複製、または宿主の細胞周期と同期する維持および複製を可能とするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのようにして細胞に送達され、細胞のどこに核酸が保持されるかは、用いられる発現構築物の種類に依存する。
免疫応答の増強
特定の実施形態では、生物学的経路、例えば、ＮＦ−カッパＢ経路、Ａｋｔ経路、および／またはｐ３８経路など、例えば、免疫学的経路を活性化する、シグナル伝達共刺激ポリペプチドの操作を組み込むＤＣ活性化戦略が意図される。このＤＣ活性化系は、ＡＰＣ活性化時におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞による支援の要件を代替するので、免疫応答を増強する標準的なワクチンと共に用いることもでき、これらの標準的なワクチンを伴わずに用いることもできる（Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｓ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， Ｊｕｎ． ４． ３９３： ｐ． ４７８−８０； Ｒｉｄｇｅ， Ｊ． Ｐ．， Ｄ． Ｒ． Ｆ， ａｎｄ Ｐ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， Ｊｕｎ． ４． ３９３： ｐ． ４７４−８； Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， Ｊｕｎ． ４． ３９３： ｐ． ４８０−３）。したがって、本明細書で提示されるＤＣ活性化系は、免疫応答を、ＭＨＣクラスＩＩ特異的ペプチドの生成に対する必要を回避することにより増強する。
特定の実施形態では、ＤＣの活性化が、ＣＤ４０の活性化を介する。したがって、内因性のＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を介するＤＣの活性化は、迅速に「ＩＬ−１２バーンアウト効果」をもたらす負のフィードバックに起因する下方制御を受ける可能性がある。ＣＤ４０活性化の７〜１０時間以内に、ＣＤ４０の代替的なスプライシングアイソフォーム（ＩＩ型）が、分泌因子として生成する（Ｔｏｎｅ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ２００１． ９８（４）： ｐ． １７５１−１７５６）。ＩＩ型ＣＤ４０は、主要な負の受容体として作用し、ＣＤ４０Ｌを介するシグナル伝達を下方制御し、発生した免疫応答の抗力を潜在的に制限する可能性がある。したがって、本方法は、天然のＣＤ４０制御を、細胞外ドメインを欠き、代わりに、化学誘導二量体化（ＣＩＤ）と称される技術を介した合成の二量体化リガンドによって活性化する、ＣＤ４０の誘導性形態（ｉＣＤ４０）を創出することにより取り込む（Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３． ２６２： ｐ． １０１９−１０２４）。
被験体における免疫応答を増強する方法であって、発現ベクター、発現構築物、または形質導入された抗原提示細胞をこの被験体に投与するステップを含む方法も包含される。発現ベクターは、ｉＣＤ４０などの共刺激ポリペプチドをコードする。
特定の実施形態では、抗原提示細胞が、ヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯動物などの動物に存在する。被験体は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯動物などの動物でありうる。被験体は、例えば、ヒト、例えば、感染性疾患に関する患者の場合もあり、かつ／または免疫障害である被験体の場合もあり、過剰増殖性疾患に罹患する被験体の場合もある。
さらなる実施形態では、発現構築物および／または発現ベクターを、抗原提示細胞を活性化する組成物または物質として用いることができる。「抗原提示細胞を活性化する」か、または「抗原提示細胞の活性を増強する」組成物とは、抗原提示細胞と関連する１以上の活性を刺激する能力を指す。例えば、本方法の発現構築物または発現ベクターなどの組成物は、共刺激分子による抗原提示細胞に対する上方制御を刺激することも可能であり、抗原提示細胞におけるＮＦ−カッパＢの核転座を誘導することも可能であり、抗原提示細胞におけるｔｏｌｌ様受容体を活性化することも可能であり、サイトカインまたはケモカインを伴う他の活性を活性化することも可能である。
発現構築物、発現ベクター、および／または形質導入された抗原提示細胞は、ワクチンの有効性を、例えば、高度な精製抗原または組換え抗原など、脆弱な抗原の免疫原性を増強し、免疫応答に必要とされる抗原の量を低減し、防御的免疫をもたらすのに必要とされる免疫化の頻度を低減し、新生児個体、老齢個体、および免疫障害個体など、免疫応答が低下または脆弱化している被験体におけるワクチンの有効性を改善し、粘膜における免疫など、標的組織における免疫を増強することにより増強することも可能であり、これらによりワクチンの有効性に寄与することも可能であり、細胞介在性免疫または体液性免疫を、特定のサイトカインプロファイルを誘発することにより促進することも可能である。
特定の実施形態ではまた、抗原提示細胞に、抗原も接触させる。抗原提示細胞に抗原を接触させるのは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてであることが多い。抗原提示細胞に抗原を接触させるのは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてのこともある。一部の実施形態では、抗原提示細胞が被験体に存在し、抗原に対して免疫応答を発生させる。免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による免疫応答のこともある。免疫応答を、腫瘍抗原に対して発生させることもある。特定の実施形態では、抗原提示細胞を、アジュバントを添加せずに活性化する。
一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入し、皮内投与を介して被験体に投与する。一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入し、皮下投与を介して被験体に投与する。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入することもある。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入することもある。
特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、抗原提示細胞を、キメラタンパク質をコードする核酸で形質導入する場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原提示細胞を、キメラタンパク質をコードする核酸で形質導入する場合もある。抗原提示細胞に多量体リガンドを接触させるのと同時に、抗原提示細胞を抗原に対して感作する場合もあり、抗原提示細胞に多量体リガンドを接触させる前に、抗原提示細胞を抗原に対して前感作する場合もある。一部の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞に抗原を接触させる。特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入し、皮内投与を介して被験体に投与するが、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を核酸で形質導入し、皮下投与を介して被験体に投与することもある。抗原は、腫瘍抗原であることが可能であり、ＣＴＬによる免疫応答を、抗原提示細胞を排出リンパ節へと遊走させることにより誘導することができる。腫瘍抗原とは、例えば、宿主における免疫応答を誘発するペプチドまたはポリペプチドなど、任意の抗原である。腫瘍抗原は、新生物性腫瘍細胞と関連する、腫瘍関連抗原でありうる。
一部の実施形態では、免疫障害個体または免疫障害被験体の免疫応答が低下または脆弱化している。このような個体にはまた、化学療法または免疫系を結果として脆弱化させる他の療法を受けた被験体、移植のレシピエント、免疫抑制剤を現在施されている被験体、老齢の個体、またはＣＤ４ヘルパーＴ細胞が減少および／または損なわれている任意の個体も含まれうる。本方法は、免疫障害被験体におけるＣＤ４ヘルパーＴ細胞の量および／または活性を増強するのに用いうることが意図される。
標的抗原による感作
特定の実施形態では、形質導入された抗原提示細胞を投与する前に、これらの細胞を、抗原（本明細書ではまた、「標的抗原」とも称する）で感作する。感作した後で、形質導入されて負荷された抗原提示細胞を、被験体に、非経口投与、皮内投与、リンパ節内投与、またはリンパ内投与する。さらなる非経口経路には、皮下法、筋肉内法、腹腔内法、静脈内法、動脈内法、心筋内法、経心内膜法、経心外膜法、髄腔内法、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）法、腫瘍内法、および注入法が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で用いられる標的抗原とは、抗原またはこの抗原における免疫学的エピトープであり、これは、哺乳動物における疾患原因作用物質または疾患状に対する免疫認識および最終的な除去または制御において重要である。免疫認識は、細胞性の場合もあり、かつ／または体液性の場合もある。細胞内病原体および癌の場合、免疫認識は、例えば、Ｔリンパ球反応でありうる。
標的抗原は、例えば、ＨＩＶウイルス（Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， Ｎ． Ｍｅｘ． １９７７）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス（米国特許第５，７１９，０５４号）、Ｂ型肝炎ウイルス（米国特許第５，７８０，０３６号）、Ｃ型肝炎ウイルス（米国特許第５，７０９，９９５号）、ＥＢＶウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などを含めたウイルスなどの病原性微生物に由来する場合もあり、これらから単離される場合もある。標的抗原は、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属種（米国特許第５，８６９，６０８号）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属種、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属種、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（米国特許第５，９５５，５９６号）など、病原性細菌に由来する場合もあり、これらから単離される場合もある。
標的抗原は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種、侵襲性Ｃａｎｄｉｄａ属種（米国特許第５，６４５，９９２号）、Ｎｏｃａｒｄｉａ属種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ属種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ属種などを含めた、病原性酵母に由来する場合もあり、これらから単離される場合もある。
標的抗原は、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属種（米国特許第５，９６５，２４２号）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種（米国特許第５，５８９，３４３号）、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉが含まれるがこれらに限定されない、病原性原虫および病原性寄生虫に由来する場合もあり、これらから単離される場合もある。
標的抗原には、前新生物状態または過形成状態と関連する抗原が含まれる。標的抗原はまた、癌と関連する場合もあり、癌の原因となる場合もある。このような標的抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、または組織特異的抗原、これらのエピトープ、およびこれらのエピトープアゴニストでありうる。このような標的抗原には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、およびＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄなど、これらのエピトープ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｍ２９５４０号）、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８０：３４７−３５２， １９９４）、ＭＡＧＥ−１（米国特許第５，７５０，３９５号）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（米国特許第５，６４８，２２６号）、ＧＰ−１００（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：６４５８−６４６２，１９９２）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点突然変異させたｒａｓ癌遺伝子、正常のｐ５３癌遺伝子および点突然変異させたｐ５３癌遺伝子（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：３５５１−３５５５， １９９４）、ＰＳＭＡ（Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２２７−２３０，１９９３）、チロシナーゼ（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ８４：７４７３−７４７７，１９８７）、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８：２８０７−２８０８， １９９０；米国特許第５，８４０，８３９号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ９４： １９１４−１９１８， １９９７）、ＴＲＰ−２（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯＪ， １１：５２７−５３５， １９９２）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（米国特許第５，５５０，２１４号）、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＴＡＡおよび組織特異的抗原の修飾体、ＴＡＡのスプライス変異体、エピトープアゴニストなどが含まれるがこれらに限定されない。他のＴＡＡは、米国特許第４，５１４，５０６号において開示されている方法など、当技術分野において公知の方法により、同定、単離、およびクローニングすることができる。標的抗原にはまた、１以上の増殖因子、およびこれら各々のスプライス変異体も含まれうる。抗原は、非癌細胞におけるより、癌細胞において発現されることが高頻度である。抗原は、修飾樹状細胞に、前立腺特異的膜抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）またはその断片を接触させる結果として生じうる。
前立腺抗原（ＰＡ００１）とは、ＰＳＭＡ抗原の細胞外部分からなる組換えタンパク質である。ＰＳＭＡは、約１００ｋＤａ（グリコシル化の前には８４ｋＤａであり、二量体としては約１８０ｋＤａである）のＩＩ型膜タンパク質で、ニューロペプチダーゼ活性および葉酸ヒドロラーゼ活性を伴うが、現在のところ、ＰＳＭＡの真の機能は不明である（Ｃａｒｔｅｒ ＲＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９３： ７４９−５３， １９９６； Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ２２７−３０， １９９３； Ｐｉｎｔｏ ＪＴ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２： １４４５−５１， １９９６）。
発現は、大部分前立腺特異的であるが、もっぱら前立腺特異的であるというわけではなく、進行しておりかつホルモン不応性の疾患では維持される（Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４： １８０７−１１， １９９４）。前立腺以外の正常組織中における微量の検出はまた、唾液腺、脳、小腸、十二指腸粘膜、近位尿細管、および結腸陰窩の神経内分泌細胞においても見られる（Ｓｉｌｖｅｒ ＤＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３： ８１−５， １９９７； Ｔｒｏｙｅｒ ＪＫ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ６２： ５５２−８， １９９５）。さらに、ＰＳＭＡは、アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）の後で上方制御される（Ｗｒｉｇｈｔ ＧＬ， Ｊｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｙ． ４８： ３２６−３４， １９９６）。大半のＰＳＭＡが、細胞質内タンパク質として発現するのに対し、新生物性前立腺細胞の先端面では、代替的な形でスプライシングされた膜貫通形態が主要な形態である（Ｓｕ ＳＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： １４４１−３， １９９５； Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４： ６３０６−１０， １９９４）。
さらに、ＰＳＭＡは、架橋形成後に内部化され、結合した抗体、または放射性核種もしくはウイルスおよび他の複合体高分子と複合体化させたリガンドを内部化させるのに用いられている（Ｌｉｕ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８： ４０５５−６０， １９９８； Ｆｒｅｅｍａｎ ＬＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ４６： １３１−７， ２００２； Ｋｒａａｉｊ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ． ６２： ２５３−９， ２００５）。Ｂａｎｄｅｒらは、腫瘍を微小管阻害剤で前処理すると、異常な基底膜表面のターゲティングおよび抗体を介するＰＳＭＡの内部化が増大することを示した（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ＪＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ４： ７０４−１４， ２００５）。腫瘍のターゲティングは、前立腺腫瘍だけでなく、腎臓腫瘍および他の腫瘍の腫瘍血管内皮細胞におけるＰＳＭＡの異所性発現を観察することにより容易とすることができる（Ｌｉｕ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７： ３６２９−３４， １９９７； Ｃｈａｎｇ ＳＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｙ． ５７： ８０１−５， ２００１； Ｃｈａｎｇ ＳＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５： ２６７４−８１， １９９９）。
ＰＳＭＡは、対応する良性組織の血管内皮細胞では見出されない（ｄｅ ｌａ Ｔａｉｌｌｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ． ２４： ５７９−８８， ２０００）。転移性前立腺疾患について初期になされた１つの組織学的研究は、骨転移のうちでＰＳＭＡを発現したのは約５０％（１８例中の８例）に過ぎない（８例のうちの７例がリンパ節転移を有する）ことを示唆したが、ＰＳＭＡの細胞外ドメインを標的とする、より感受性の高い試薬である、１７７Ｌｕで放射性標識したＭｏＡｂのＪ５９１は、患者３０例中の３０例において、骨転移および軟組織転移について公知である全部位を標的とすることが可能であり、進行した前立腺疾患ではほぼ遍在的な発現が示唆された（Ｂａｎｄｅｒ ＮＨ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２３： ４５９１−６０１， ２００５）。
前立腺特異的抗原またはＰＳＡとは、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡに対する、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球反応などの免疫応答を誘導することが可能であり、任意の抗ＰＳＡ抗体により特異的に認識されうる任意の抗原を包含することを意味する。従来の方法を用いてアッセイされる通り、本方法において用いられるＰＳＡは、抗原提示細胞に負荷するのに用いることが可能である。したがって、「前立腺特異的抗原」または「ＰＳＡ」とは、例えば、ＰＳＡの野生型のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す場合もあり、ＰＳＡタンパク質の一部を包含するポリペプチドを指す場合もある。
前立腺特異的膜抗原またはＰＳＭＡとは、ＰＳＭＡに対して、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球反応などの免疫応答を誘導することが可能であり、抗ＰＳＭＡ抗体により特異的に認識されうる任意の抗原を包含することを意味する。従来の方法を用いてアッセイされる通り、本方法において用いられるＰＳＭＡは、抗原提示細胞に負荷するのに用いることが可能である。したがって、「前立腺特異的膜抗原」または「ＰＳＭＡ」とは、例えば、ＰＳＭＡの野生型のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す場合もあり、配列番号３もしくは配列番号３のヌクレオチド配列の一部によりコードされるＰＳＭＡタンパク質の一部、または配列番号４もしくはその一部のポリペプチドを有する、ＰＳＭＡタンパク質の一部など、ＰＳＭＡタンパク質の一部を包含するポリペプチドを指す場合もある。ＰＳＭＡという用語はまた、例えば、配列番号４の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを指す場合もあり、ＰＳＭＡに対して免疫応答を誘導しうる任意のペプチドも指す場合もある。また、例えば、置換および欠失を有する変異体を含め、前出のうちのいずれかの変異体も包含される。グリコシル化が野生型のＰＳＭＡとは異なるなど、翻訳後プロセシングが野生型のＰＳＭＡとは示差的なタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドもまた、本方法において用いることができる。さらにまた、ＰＳＭＡに対して免疫応答を誘導することが可能である多様な糖分子も意図される。
ＰＳＡポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドは、修飾抗原提示細胞に負荷するのに用いることができる。特定の実施形態では、修飾抗原提示細胞に、配列番号４のアミノ酸配列（例えば、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列）またはその断片を有するＰＳＭＡポリペプチド断片を接触させる。一部の実施形態では、ＰＳＡポリペプチド断片、例えば、ＰＳＭＡポリペプチド断片が、シグナルペプチド配列を包含しない。他の実施形態では、修飾抗原提示細胞に、ポリペプチド中にアミノ酸の置換または欠失を含むＰＳＡポリペプチド断片、例えば、ＰＳＭＡポリペプチド断片を接触させ、この断片が、抗原提示細胞に負荷するのに十分である。
本明細書ではまた、前立腺特異的抗原またはＰＳＡとも称する、前立腺特異的タンパク質抗原またはＰＳＰＡとは、前立腺特異的タンパク質抗原に対して、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球反応などの免疫応答を誘導することが可能な任意の抗原を包含することを意味する。ＰＳＰＡは、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原または前立腺特異的抗原を包含する。従来の方法を用いてアッセイされる通り、本方法において用いられるＰＳＰＡは、抗原提示細胞に負荷するのに用いることが可能である。前立腺特異的抗原またはＰＳＡとは、例えば、ＰＳＡの野生型のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す場合もあり、ＰＳＡタンパク質の一部を包含するポリペプチドを指す場合もある。
前立腺特異的膜抗原またはＰＳＭＡとは、ＰＳＭＡに対して、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球反応などの免疫応答を誘導することが可能であり、抗ＰＳＭＡ抗体により特異的に認識されうる任意の抗原を包含することを意味する。従来の方法を用いてアッセイされる通り、本方法において用いられるＰＳＭＡは、抗原提示細胞に負荷するのに用いることが可能である。したがって、「前立腺特異的膜抗原」または「ＰＳＭＡ」とは、例えば、ＰＳＭＡの野生型のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す場合もあり、配列番号３もしくは配列番号３のヌクレオチド配列の一部によりコードされるＰＳＭＡタンパク質の一部、または配列番号４もしくはその一部のポリペプチドを有する、ＰＳＭＡタンパク質の一部など、ＰＳＭＡタンパク質の一部を包含するポリペプチドを指す場合もある。ＰＳＭＡという用語はまた、例えば、配列番号４の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを指す場合もあり、ＰＳＭＡに対して免疫応答を誘導しうる任意のペプチドも指す場合もある。また、例えば、置換および欠失を有する変異体を含め、前出のうちのいずれかの変異体も包含される。グリコシル化が野生型のＰＳＭＡとは異なるなど、翻訳後プロセシングが野生型のＰＳＭＡとは示差的なタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドもまた、本方法において用いることができる。さらにまた、ＰＳＭＡに対して免疫応答を誘導することが可能である多様な糖分子も意図される。
ＰＳＰＡポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドは、修飾抗原提示細胞に負荷するのに用いることができる。特定の実施形態では、修飾抗原提示細胞に、配列番号４のアミノ酸配列（例えば、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列）またはその断片を有するＰＳＭＡポリペプチド断片を接触させる。一部の実施形態では、ＰＳＡポリペプチド断片、例えば、ＰＳＭＡポリペプチド断片が、シグナルペプチド配列を包含しない。他の実施形態では、修飾抗原提示細胞に、ポリペプチド中にアミノ酸の置換または欠失を含むＰＳＰＡポリペプチド断片、例えば、ＰＳＭＡポリペプチド断片を接触させ、この断片が、抗原提示細胞に負荷するのに十分である。
腫瘍抗原とは、例えば、宿主において、腫瘍に対する免疫応答を誘発するペプチドまたはポリペプチドなど、任意の抗原である。腫瘍抗原は、新生物性腫瘍細胞と関連する、腫瘍関連抗原でありうる。
前立腺癌抗原またはＰＣＡとは、例えば、宿主において、前立腺癌腫瘍に対する免疫応答を誘発するペプチドまたはポリペプチドなど、任意の抗原である。前立腺癌抗原は、前立腺癌腫瘍に特異的な場合もあり、前立腺癌腫瘍に特異的でない場合もある。前立腺癌抗原はまた、他の種類の腫瘍または新生物性細胞に対する免疫応答も誘発しうる。前立腺癌抗原には、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原、前立腺特異的抗原、および前立腺特異的膜抗原が含まれる。
抗原提示細胞に、ＰＳＡポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドなどの腫瘍抗原を、例えば、未成熟ＤＣを、未画分化腫瘍溶解産物、ＭＨＣ溶出ペプチド、腫瘍由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ（ペプチドまたはタンパク質））でパルスするか、またはＤＣを、バルクの腫瘍ｍＲＮＡ、もしくはＴＡＡをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトすることを含めた各種の方法により接触させることができる（Ｇｉｌｂｏａ， Ｅ． ＆ Ｖｉｅｗｅｇ， Ｊ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９， ２５１−６３ （２００４）； Ｇｉｌｂｏａ， Ｅ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４， ４０１−１１ （２００４）において総説されている）。
ＤＮＡゲノムを含有する生物の場合は、標的抗原またはその対象の免疫学的エピトープをコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡから単離する。ＲＮＡゲノムを伴う生物の場合は、所望の遺伝子を、ゲノムのｃＤＮＡコピーから単離することができる。ゲノムの制限マップが利用可能な場合は、対象の遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、日常的な方法による制限エンドヌクレアーゼ消化を介して切断する。所望の遺伝子を既にクローニングしている場合には、遺伝子を、利用可能なクローンから容易に得ることができる。代替的に、遺伝子のＤＮＡ配列が公知である場合は、遺伝子を、デオキシリボ核酸を合成するための従来の技法のうちのいずれかにより合成することができる。
例えば、対象の抗原をコードする遺伝子は、この遺伝子を細菌宿主へとクローニングすることにより増幅することができる。この目的には、各種の原核細胞クローニングベクターを用いることができる。例は、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、およびｐＥＭＢＬである。
少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする遺伝子を調製して、標準的な技法を介する、ウイルスによる組換えのためにデザインされたプラスミドベクターへと挿入することができる。一般に、クローニングされた遺伝子は、原核細胞クローニングベクターから、制限酵素消化により切り出すことができる。大半の場合、切り出された断片は、遺伝子の全コード領域を含有する。クローニングされた遺伝子を保有するＤＮＡ断片は、必要に応じて修飾し、例えば、その末端を、ウイルスによる組換えに用いられるＤＮＡベクターの挿入部位と適合性にし、次いで、これらを精製してから、制限エンドヌクレアーゼによる切断部位（クローニング部位）においてベクターに挿入することができる。
例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞に対する抗原のローディングは、例えば、樹状細胞または前駆細胞などの抗原提示細胞に、例えば、抗原を接触させることにより、例えば、これらの細胞を抗原と共にインキュベートすることにより達成することができる。ローディングはまた、例えば、抗原をコードするＤＮＡ（ネイキッドＤＮＡまたはプラスミドベクター内のＤＮＡ）もしくはＲＮＡをインキュベートすることにより、または抗原を発現する組換え細菌もしくはウイルス（例えば、牛痘ウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）と共にインキュベートすることによっても達成することができる。ローディングの前に、抗原を、Ｔ細胞による支援をもたらす免疫パートナー（例えば、坦体分子）に共有結合的にコンジュゲートすることができる。代替的に、樹状細胞を、非コンジュゲート免疫パートナーで、個別に、またはポリペプチドの存在下においてパルスすることもできる。細胞またはＭＨＣ分子に由来する抗原は、酸溶出法または他の方法により得ることができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６． １８３：８７−９７を参照されたい）。抗原提示細胞は、本方法によるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、これらの細胞に抗原を負荷する前に形質導入またはトランスフェクトすることもでき、抗原を負荷した後に形質導入またはトランスフェクトすることもでき、抗原を負荷するのと同時に形質導入またはトランスフェクトすることもできる。特定の実施形態では、抗原のローディングが、形質導入またはトランスフェクションに後続する。
さらなる実施形態では、形質導入された抗原提示細胞を、腫瘍細胞のｍＲＮＡでトランスフェクトする。形質導入およびトランスフェクトされた抗原提示細胞を、動物に投与し、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞による抗腫瘍抗原免疫応答を生じさせ、二量体ＦＫ５０６および二量体ＦＫ５０６類似体を用いてこれらを制御する。腫瘍細胞のｍＲＮＡは、例えば、前立腺腫瘍細胞に由来するｍＲＮＡでありうる。
一部の実施形態では、形質導入された抗原提示細胞に、腫瘍細胞溶解産物でパルスすることにより負荷することができる。パルスされた形質導入抗原提示細胞を、動物に投与し、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞による抗腫瘍抗原免疫応答を生じさせ、二量体ＦＫ５０６および二量体ＦＫ５０６類似体を用いてこれらを制御する。腫瘍細胞の溶解産物は、例えば、前立腺腫瘍細胞の溶解産物でありうる。
免疫細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球による反応
Ｔリンパ球を、これらに本明細書で論じた発現ベクターを含む抗原提示細胞であって、抗原で感作されるか、トランスフェクトされるか、パルスされるか、または抗原を電気細胞融合させた抗原提示細胞を接触させることにより活性化させることができる。
Ｔ細胞は、それらの膜において、固有の抗原結合受容体（Ｔ細胞受容体）を発現するが、この受容体が認識できるのは、他の細胞の表面において主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と会合した抗原だけである。ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞など、いくつかのＴ細胞集団が存在する。ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は、それぞれ、それらが提示する膜結合糖タンパク質であるＣＤ４およびＣＤ８により主に識別される。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫系の他の細胞を活性化するのに重要である多様なリンホカインを分泌する。これに対し、抗原−ＭＨＣ複合体を認識するナイーブＣＤ８ Ｔ細胞は、増殖し、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と称するエフェクター細胞へと分化する。ＣＴＬは、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞など、抗原を提示する体内の細胞を、細胞の溶解を結果としてもたらす物質を生成させることにより消失させる。
ＣＴＬ活性は、例えば、本明細書で論じられる方法により評価することができる。例えば、ＣＴＬは、単離されたばかりの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において評価することもでき、ＰＢＭＣから確立されたフィトヘマグルチニン刺激ＩＬ−２増殖細胞系（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ， １２（１６）：２１２５−２１３９， １９９８）において評価することもでき、以前免疫化された被験体から単離されたＴ細胞であって、４時間にわたる標準的な５１Ｃｒ放出によるマイクロ毒性アッセイを用いて、抗原を含有するアデノウイルスベクターを感染させたＤＣにより６日間にわたり再刺激されたＴ細胞により評価することもできる。アッセイの１つの種類は、クローニングされたＴ細胞を用いる。クローニングされたＴ細胞が、ペルフォリン依存性殺滅およびＦａｓリガンド依存性殺滅の両方を媒介するそれらの能力について、再指向化細胞傷害性アッセイにおいて調べられている（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １１５（４）：８４９−８５５， １９９８）。クローニングされた細胞傷害性Ｔリンパ球は、Ｆａｓ依存性殺滅およびペルフォリン依存性殺滅の両方を示した。近年になって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるデヒドロゲナーゼ放出アッセイであって、新規の蛍光増幅系を利用するアッセイが開発された（Ｐａｇｅ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９８ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１８（４Ａ）：２３１３−６）。この手法は、高感度、迅速、および再現可能であり、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に用いると有利でありうる。この手法を、細胞膜の完全性を用いる大規模な細胞傷害性試験のためにさらに自動化することは容易に可能であり、したがって、これが考慮される。細胞介在性細胞傷害作用を検出するのに開発された別の蛍光測定アッセイでは、用いられるフルオロフォアが、非毒性分子のＡｌａｍａｒＢｌｕｅである（Ｎｏｃｉａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２１３（２）： １５７−１６７， １９９８）。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅは、ミトコンドリアにおいて還元が生じるまでは蛍光が消光されている（すなわち、量子収量が低い）が、次いで、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光強度は劇的に上昇する（すなわち、量子収量が増大する）。このアッセイは、極めて高感度で、特異的であり、必要とするエフェクター細胞の数が標準的な５１Ｃｒ放出アッセイより著明に少ないことが報告されている。
本方法により誘導されうる他の免疫細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。ＮＫは、抗原特異的受容体を欠くリンパ球であり、自然免疫系の一部である。感染細胞は通常、細胞表面のＭＨＣに結合した外来粒子により警告されたＴ細胞により破壊される。しかし、ウイルスに感染した細胞は、感染シグナルを、抗体により認識されるウイルスタンパク質を発現することにより発する。これらの細胞は、ＮＫにより殺滅されうる。腫瘍細胞では、腫瘍細胞がＭＨＣ Ｉ分子を発現しなくなると、ＮＫに対して感受性となる可能性がある。
製剤および患者への投与経路
臨床適用を意図する場合は、医薬組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入細胞、活性化ＤＣ、形質導入および負荷されたＤＣ）を、意図される適用に適切な形態で調製することが必要となる。一般に、これは、ヒトまたは動物に有害となりうる発熱物質ならびに他の不純物を本質的に含まない組成物を調製するステップを伴う。
一般に、送達ベクターを安定的とし、標的細胞による取込みを可能とするのに適切な塩および緩衝液を用いることが所望される。組換え細胞を患者に導入する場合はまた、緩衝液も用いることができる。水性組成物は、細胞に対して有効量のベクターであって、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散させたベクターを含む。このような組成物はまた、接種物とも称される。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与する場合、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体には、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質に応じたこのような媒体および薬剤の使用は公知である。任意の従来の媒体または薬剤がベクターまたは細胞と不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が意図される。組成物にはまた、補充有効成分も組み込むことができる。
活性組成物は、古典的な医薬調製物を包含しうる。これらの組成物の投与は、標的組織がこの経路を介して利用可能である限りにおいて、任意の一般的な経路を介する。これには、例えば、経口経路、鼻腔内経路、口腔内経路、直腸内経路、膣内経路、または局所経路が含まれる。代替的に、投与は、正所注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介することも可能である。このような組成物は通常、本明細書で論じられる、薬学的に許容される組成物として投与される。
注射用に適する医薬形態には、滅菌水溶液または滅菌分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、医薬形態は滅菌形態であり、容易なシリンジ注入が可能である程度に流体形態である。医薬形態は、製造条件下および保存条件下において安定であり、細菌および真菌など、微生物の汚染作用に対して保護されている。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要とされる粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を用いることにより維持することができる。微生物作用の防止は、各種の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを組み入れることができる。注射用組成物の遅延吸収は、組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用いることによりもたらすことができる。
経口投与の場合、組成物には、賦形剤を組み込むことができ、内服用ではない口腔洗浄剤および歯磨剤の形態で用いることができる。口腔洗浄剤は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒中に必要量で有効成分を組み込んで調製することができる。代替的に、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含有する消毒洗浄剤中に有効成分を組み込むこともできる。有効成分はまた、例えば、ゲル、ペースト、粉末、およびスラリーを含めた歯磨剤中に分散させることもできる。有効成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、芳香剤、発泡剤、および保湿剤を含みうるペースト状の歯磨剤に、治療有効量で添加することができる。
組成物は、中性形態で調合することもでき、塩形態で調合することもできる。薬学的に許容される塩には、例えば、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）が含まれ、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機塩、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機塩により形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基にも由来しうる。
調合されると、溶液は、投与処方と適合的な形および治療的有効量で投与される。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなど、多様な剤形で容易に投与される。例えば、水溶液により非経口投与する場合、溶液は、必要に応じて適切な形で緩衝処理することができ、液体の希釈剤は、まず、十分な生理食塩液またはグルコースで等張とする。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与にとりわけ適する。この関連で、滅菌水性媒体を用いることができる。例えば、１回分の用量であれば、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解させることができ、１０００ｍｌの皮下注入液に添加することもでき、提起される注入部位に注射することもできるであろう（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８ ａｎｄ １５７０−１５８０を参照されたい）。処置される被験体の状態に応じて、ある程度の用量の変化が必然的に生じることになる。投与の責任者は、いずれにせよ、個別の被験体に適切な用量を決定することになる。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準により要求される無菌性基準、発熱物質性基準、および一般的な安全性基準および純度基準を満たしうる。
投与スケジュールは、患者に応じて決定することができ、例えば、細胞を０週間目に投与した後、化学二量体化誘導剤の投与を介する誘導に続き、その後、さらなる細胞および誘導剤を、２週間間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０週間にわたり投与する投与スケジュールを含む。
他の投与スケジュールには、例えば、１用量の細胞を投与し、１用量の誘導剤を投与するスケジュールが含まれる。別の例では、投与スケジュールが、細胞および誘導剤を０週間目に投与した後、さらなる細胞および誘導剤を、４週間間隔で、例えば、合計４、８、１２、１６、２０、２４、２８、または３２週間にわたり投与することを含みうる。
１用量の細胞の投与は、１回のセッションで行う場合もあり、複数回のセッションで行う場合もあるが、用量という用語は、リガンドを投与する前に投与される細胞の総量を指す場合がある。
必要な場合、方法は、処置で用いられるより多くの細胞を得るためのさらなる白血球除去療法をさらに包含しうる。
疾患を処置する方法
本方法はまた、病原性微生物により引き起こされる疾患および／または過剰増殖性疾患を処置または予防する方法も包含する。
処置または予防されうる疾患には、ウイルス、細菌、酵母、寄生虫、原虫、癌細胞などにより引き起こされる疾患が含まれる。医薬組成物（形質導入されたＤＣ、発現ベクター、発現構築物など）を、一般的な免疫増強剤（ＤＣ活性化組成物またはＤＣ活性化系）として用いることができ、これ自体、疾患の処置において有用である。処置および／または予防されうる例示的な疾患には、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタインバーウイルス性疾患、ポリオウイルス性疾患、ウイルス性脳炎、風疹、鶏痘、パピローマウイルス性疾患など、ウイルス性病因による感染症、肺炎、結核、梅毒など、細菌性病因による感染症、またはマラリア、トリパノゾーマ病、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症など、寄生虫性病因による感染症が含まれるがこれらに限定されない。
医薬組成物（形質導入されたＤＣ、発現ベクター、発現構築物など）を用いて処置または予防されうる前新生物性状態または過形成状態には、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などの前新生物性状態または過形成状態が含まれるがこれらに限定されない。
医薬組成物を用いて処置されうる、固形腫瘍を含めた癌には、原発性または転移性の黒色腫、腺癌種、扁平上皮細胞癌腫、腺扁平上皮細胞癌腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽腫、ＮＰＣ、膀胱癌、子宮頸癌などが含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で提示されるＤＣ活性化系を用いて処置されうる、固形腫瘍を含めた他の過剰増殖性疾患には、関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨関節炎、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化、前新生物性病変（腺腫性過形成および前立腺上皮内新生物など）、ｉｎ ｓｉｔｕにおける癌腫、口腔内毛様白斑症、または乾癬が含まれるがこれらに限定されない。処置方法では、医薬組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入細胞、活性化ＤＣ、形質導入および負荷したＤＣ）の投与が、「予防」を目的とする場合もあり、「治療」を目的とする場合もある。予防的に施される場合、医薬組成物は、任意の症状に先立って施される。医薬組成物の予防的投与は、その後における任意の感染症または疾患を予防または改善するのに用いられる。治療的に施される場合、医薬組成物は、感染症または疾患の症状の開始時または開始後において施される。したがって、本明細書で提示される組成物は、予期される疾患原因作用物質または疾患状態への曝露の前に施すこともでき、感染症または疾患の発症後に施すこともできる。
本方法を用いて、任意の組織または器官に由来する固形腫瘍であって、例えば、血管系においてＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡを発現する任意の腫瘍、例えば、固形腫瘍であり、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺、または脳に存在し、ならびにまた、例えば、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟部組織、骨状塊（ｂｏｎｅｙ ｍａｓｓ）、およびリンパ系にも存在する固形腫瘍を含めた固形腫瘍を処置することができる。処置されうる他の固形腫瘍には、例えば、神経膠芽腫および悪性骨髄腫が含まれる。
接種物に関する場合の「単位用量」という用語は、単位用量として哺乳動物に適する物理的な個別単位であって、各単位が、必要とされる希釈剤との関連で所望の免疫効果をもたらすように計算された所定量の医薬組成物を含有する単位を指す。接種物の単位用量についての規格は、医薬組成物の固有の特徴、および達成される特定の免疫効果により決定され、これに依存する。
医薬組成物の有効量は、免疫応答を増強するという選択された結果を達成する量であり、このような量を決定することができるであろう。例えば、免疫系の欠損を処置するのに有効な量は、免疫系を活性化させ、その結果、抗原に曝露されたときに抗原特異的な免疫応答を発生させるのに必要な量でありうるであろう。この用語はまた、「十分量」とも同義である。
任意の特定の適用に有効な量は、処置される疾患もしくは状態、投与される具体的な組成物、被験体の体格、および／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に依存して変化しうる。本明細書で提示される特定の組成物の有効量は、不要な実験を必要とすることなく、経験的に決定することができる。
Ａ．遺伝子ベースの療法
特定の実施形態では、細胞に、抗原提示細胞などの細胞にＣＤ４０などの共刺激ポリペプチドを供給し、ＣＤ４０を活性化させることが可能な発現構築物を施す。発現ベクターおよびそこで用いられる遺伝子エレメントについての詳細な議論が、参照により本節に組み込まれる。特定の例では、発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、牛痘ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターでありうる。別の例では、ベクターが、リソソームに封入された発現ベクターでありうる。遺伝子送達は、ｉｎ ｖｉｖｏ状況およびｅｘ ｖｉｖｏ状況のいずれにおいても実施することができる。ウイルスベクターの場合は一般に、ウイルスベクター株を調製することができる。本出願では、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける、ウイルスベクターを介する遺伝子送達の例が提示される。ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達の場合は、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０４個、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０５個、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０６個、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０７個、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０８個、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０９個、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０１０個、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０１１個、または１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９×１０１２個の感染性粒子を患者に送達する。同様の数値を、リポソーム製剤または他の非ウイルス製剤についても、相対的な取込み効率を比較することにより外挿することができる。以下では、薬学的に許容される組成物としての製剤について論じる。例えば、ＡＰ１９０３などの多量体リガンドは、例えば、被験体の体重１ｋｇ当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、または１０ｍｇの用量で送達することができる。
Ｂ．細胞ベースの療法
意図される別の療法は、形質導入された抗原提示細胞の投与である。抗原提示細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形質導入することができる。本明細書では、薬学的に許容される組成物としての製剤について論じる。
細胞ベースの療法では、形質導入された抗原提示細胞を、例えば、ｍＲＮＡもしくはＤＮＡなどの標的抗原核酸、またはタンパク質でトランスフェクトすることもでき、細胞溶解産物、タンパク質、または核酸でパルスすることもでき、細胞を電気細胞融合させることもできる。細胞、タンパク質、細胞溶解産物、または核酸は、腫瘍細胞などの細胞に由来する場合もあり、例えば、ウイルス、細菌、原虫など、他の病原性微生物に由来する場合もある。
Ｃ．組合せ療法
本明細書で提示される発現ベクターの有効性を増大させるには、これらの組成物および方法を、疾患の処置において有効な薬剤と組み合わせることが所望でありうる。
特定の実施形態では、抗癌剤を、本方法と組み合わせて用いることができる。「抗癌」剤は、例えば、１以上の癌細胞を死滅させることにより、１以上の癌細胞においてアポトーシスを誘導することにより、１以上の癌細胞の増殖速度を低減することにより、転移の発生または数を低減することにより、腫瘍サイズを縮小させることにより、腫瘍成長を阻害することにより、腫瘍または１もしくは複数の癌細胞への血液供給を低減することにより、１もしくは複数の癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進することにより、癌の進行を防止するか、または癌の進行を阻害することにより、あるいは癌を伴う被験体の生存期間を延長することにより、被験体における癌に負の影響を及ぼすことが可能である。抗癌剤には、例えば、化学療法剤（化学療法）、放射線療法剤（放射線療法）、手術手順（手術）、免疫療法剤（免疫療法）、遺伝子治療剤（遺伝子治療）、ホルモン療法、他の生物学的薬剤（生物療法）、および／または代替的な療法が含まれる。
さらなる実施形態では、抗生剤を、医薬組成物と組み合わせて用いて、感染性疾患を処置および／または予防することもできる。このような抗生剤には、アミカシン、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン）、アモキシシリン、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、アンチモン剤、アトバクオン、スチボグルコン酸ナトリウム、アジトロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリトロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、シクロセリン、ダプソン、ドキシシクリン、エタンブトール、エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン、パラアミノサリチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、デフィンシン、プロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン（例えば、シプロフロキサシン）、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、チアセタゾン、トリメタプリム−スルファメトキサゾール、バイオマイシン、またはこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。より一般的には、このような薬剤を、癌細胞および／または微生物の増殖を死滅させるかまたは阻害するのに有効な発現ベクターとの組合せ量で施す。この過程は、細胞（複数可）に、薬剤（複数可）および医薬組成物を、同時に接触させるステップを伴う場合もあり、細胞（複数可）に、薬剤（複数可）および医薬組成物を、ある期間内に接触させるステップであって、医薬組成物および薬剤を細胞、組織、または生物に個別に投与することにより、所望の治療的利益がもたらされるステップを伴う場合もある。これは、細胞、組織、または生物に、単一の組成物、または医薬組成物および１もしくは複数の薬剤の両方を包含する医薬製剤を接触させることにより達成することもでき、細胞に、２つ以上の異なる組成物または製剤であって、一方の組成物が医薬組成物を包含し、他方の組成物が１以上の薬剤を包含する組成物または製剤を接触させることにより達成することもできる。
本明細書では、細胞、組織、または生物に対して適用される場合の「接触」および「曝露」という用語を、医薬組成物および／または、例えば、化学療法剤もしくは放射線療法剤など、別の薬剤を、標的細胞、標的組織、または標的生物に送達するか、あるいは標的細胞、標的組織、または標的生物と直接的に並置する過程を説明するのに用いる。細胞の殺滅または静穏化を達成するには、医薬組成物および／またはさらなる薬剤（複数可）を、細胞（複数可）を死滅させるか、または細胞（複数可）が分裂することを防止するのに有効な組合せ量で、１以上の細胞に送達する。医薬組成物の投与は、数分間〜数週間の範囲の間隔で、他の薬剤（複数可）に先立って行われる場合もあり、他の薬剤（複数可）と共時的に行われる場合もあり、かつ／または他の薬剤（複数可）の後で行われる場合もある。医薬組成物および他の薬剤（複数可）を、細胞、組織、または生物に個別に適用する実施形態では一般に、医薬組成物および薬剤（複数可）が、細胞、組織、または生物に対して有利な組合せ効果を及ぼすことがなお可能であるように、各送達時点の間にそれほどの時間が費やされないことを確保することになろう。例えば、このような場合には、細胞、組織、または生物に、２つ、３つ、４つ以上のモダリティーを、医薬組成物と実質的に同時に（すなわち、約１分間以内に）接触させることができることが意図される。他の態様では、１以上の薬剤を、発現ベクターを投与するのと実質的に同時に、発現ベクターを投与する前の約１分間〜約２４時間、約７日間、約１〜約８週間以上、およびこの範囲内で導出しうる任意の範囲以内に、ならびに／または発現ベクターを投与した後の約１分間〜約２４時間、約７日間、約１〜約８週間以上、およびこの範囲内で導出しうる任意の範囲以内に投与することができる。さらにまた、本明細書で提示される医薬組成物、および１以上の薬剤による、各種の組合せレジメンも用いることができる。
一部の実施形態では、化学療法剤が、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル）の場合もあり、例えば、カバジタキセルなど、別のタキサンの場合もある。化学療法剤は、活性化樹状細胞および誘導剤による処置の前に投与することもでき、活性化樹状細胞および誘導剤による処置時において投与することもでき、活性化樹状細胞および誘導剤による処置の後に投与することもできる。例えば、化学療法剤は、初回用量の活性化樹状細胞を投与する約１年間、１１、１０、９、８、７、６、５、もしくは４カ月間前、または１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２週間、もしくは１週間前に投与することができる。あるいは、例えば、化学療法剤は、初回用量の活性化樹状細胞を投与した約１週間または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８週間後、または４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１カ月後、または１年間後に投与することもできる。
化学療法剤の投与は、複数の化学療法剤の投与を含みうる。例えば、Ｔａｘｏｔｅｒｅ、または、例えば、カバジタキセルなど、他のタキサンに加えて、シスプラチンも投与することができる。
治療的処置の最適化およびカスタマイズ
例えば、前立腺癌を含めた固形腫瘍の処置は、処置期間中のＩＬ−６濃度、ＩＬ６−ｓＲ濃度、またはＶＣＡＭ−１濃度を決定することにより最適化することができる。ＩＬ−６とは、インターロイキン６を指す。ＩＬ−６ｓＲとは、ＩＬ−６の可溶性受容体を指し、そのレベルは、ＩＬ−６レベルと緊密に相関することが多い。ＶＣＡＭ−１とは、血管細胞接着分子を指す。癌の病期または種類を異にする異なる患者は、各種の療法に対する反応も異なりうる。処置に対する反応は、各種の体液または組織におけるＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲ、またはＶＣＡＭ−１の濃度またはレベルを追跡することによりモニタリングすることができる。ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲ、またはＶＣＡＭ−１などのポリペプチドの濃度、レベル、または量の決定は、全長ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の検出を包含しうる。断片または変異体は、例えば、免疫学的方法、質量分析、核酸ハイブリダイゼーションなどを介する検出に十分でありうる。個別の患者に応じて処置を最適化することにより、過剰投与の結果としての副作用を回避する一助とすることもでき、処置が効果的でない場合を決定し、処置のコースを変化させる一助とすることもでき、用量を増大させうる場合を決定する一助とすることもできる。本明細書で論じられる技法は、臨床医が、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲ、またはＶＣＡＭ−１などのバイオマーカーを追跡し、被験体に投与される薬物またはワクチンの後続用量を維持しうるか、低減しうるか、または増大させうるかどうかを決定し、後続用量のタイミングを決定することを可能とすることにより、固形腫瘍癌を治療するための療法を最適化する。
例えば、前立腺癌を含めた固形腫瘍癌の処置はまた、処置期間におけるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の濃度を決定することによっても最適化することができる。癌の病期または種類を異にする異なる患者は、各種の療法に対する反応も異なりうる。図５４は、被験者１００３の処置期間にわたる、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、およびＶＥＧＦのレベルを示す。被験者１００３は、全身の血清において低酸素因子の摂動を示すが、これは、処置に対する陽性の反応を示すものでありうる。この観察の解釈を限定することなく述べると、これは、処置に反応した腫瘍による低酸素因子の分泌を示しうる。したがって、処置に対する反応は、例えば、各種の体液または組織におけるｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、またはＶＥＧＦの濃度またはレベルを追跡することによりモニタリングすることができる。ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、またはＶＥＧＦなどのポリペプチドの濃度、レベル、または量の決定は、全長ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の検出を包含しうる。断片または変異体は、例えば、免疫学的方法、質量分析、核酸ハイブリダイゼーションなどを介する検出に十分でありうる。個別の患者に応じて処置を最適化することにより、過剰投与の結果としての副作用を回避する一助とすることもでき、処置が効果的でない場合を決定し、処置のコースを変化させる一助とすることもでき、用量を増大させうる場合を決定する一助とすることもできる。本明細書で論じられる技法は、臨床医が、例えば、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、またはＶＥＧＦなどのバイオマーカーを追跡し、被験体に投与される薬物またはワクチンの後続用量を維持しうるか、低減しうるか、または増大させうるかどうかを決定し、後続用量のタイミングを決定することを可能とすることにより、固形腫瘍癌を処置するための治療法を最適化する。
例えば、特定のバイオマーカーの量または濃度は、固形腫瘍の処置期間において変化することが決定されている。このようなバイオマーカーの所定の標的レベル、またはバイオマーカーの閾値を、正常の被験体において同定することができ、これらが提示されれば、臨床医が、例えば、前立腺腫瘍などの固形腫瘍を伴う被験体など、それを必要とする被験体に投与される薬物の後続用量を、増大させうるか、低減しうるか、または維持しうるかどうかを決定することが可能となる。特定の実施形態では、臨床医が、このような決定を、バイオマーカーの存在、非存在、または量が、それぞれ、バイオマーカーの閾値未満であるか、閾値を超えるか、または閾値とほぼ同じであるかどうかに基づき行うことができる。
例えば、薬物処置またはワクチン接種の後に、過剰表出されたバイオマーカーレベルが著明に低下し、かつ／または過小表出されたバイオマーカーレベルが著明に上昇することを決定することにより、臨床医に、投与された薬物が治療効果を及ぼしつつあることが示される。「レベル」とは、体液もしくは組織におけるバイオマーカーの濃度、または組織における絶対量を意味する。このようなバイオマーカーの決定に基づけば、臨床医は、投与のタイミングを変更することを含め、後続の薬物用量を維持するか、または後続の用量を増大させるかもしくは低減する決定をなしうるであろう。「薬物」という用語は、低分子など、従来の医薬のほか、核酸、抗体、タンパク質、ポリペプチド、改変細胞などの生物学的薬剤も包含する。別の例では、過剰表出されたバイオマーカーレベルがそれほど低下せず、かつ／または過小表出されたバイオマーカーレベルがそれほど上昇しないことを決定することにより、臨床医に、投与された薬物が治療効果をそれほどは及ぼしつつあるわけではないことが示される。このようなバイオマーカーの決定に基づけば、臨床医は、薬物の後続用量を増大させる決定をなしうるであろう。薬物が被験体に毒性であり、副作用を及ぼす可能性があることを踏まえると、本明細書で提供される方法は、臨床医に、薬物の効果的な用量を「ダイアルイン」し、副作用を最小化する能力を与えるので、処置方法を最適化する。特定の例では、本明細書で提供される方法が、臨床医に、薬物用量を治療的に効果的なレベルまで「ダイアルアップ」することを可能とするが、この場合、このダイアルアップされた用量は、毒性閾値レベル未満である。したがって、本明細書で論じられる処置方法は、有効性を増強し、毒性副作用の可能性を低下させる。
サイトカインとは、多様な起源の細胞により全身で広く生成する多様なポリペプチド制御因子の一大ファミリーである。サイトカインとは、免疫、炎症、および造血作用を媒介および制御する、ペプチドおよび糖タンパク質を含めた、低分子の分泌タンパク質である。サイトカインは、免疫刺激に応答して、新たに生成する。サイトカインは一般に（いつもとは限らないが）、短い距離および短い時間間隔にわたり、低濃度で作用する。サイトカインは一般に、特異的な膜受容体に結合し、次いで、これらが、チロシンキナーゼであることが多い第２のメッセンジャーを介して細胞にシグナル伝達して、細胞の挙動（例えば、遺伝子の発現）を変化させることにより作用する。サイトカインに対する応答には、例えば、膜タンパク質（サイトカイン受容体を含めた）の発現を増大または減少させること、エフェクター分子の増殖および分泌が含まれる。
「サイトカイン」という用語は、タンパク質および糖タンパク質の一大ファミリーについての一般的な説明である。他の名称には、リンホカイン（リンパ球により作製されるサイトカイン）、モノカイン（単球により作製されるサイトカイン）、ケモカイン（走化活性を伴うサイトカイン）、およびインターロイキン（１つの白血球により作製され、他の白血球に作用するサイトカイン）が含まれる。サイトカインは、それらを分泌する細胞に作用する場合（自己分泌作用）もあり、近接する細胞に作用する場合（傍分泌作用）もあり、場合によっては、遠隔の細胞に作用する場合（内分泌作用）もある。
サイトカインの例には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマなど）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータなど）、リンホカイン、モノカイン、およびケモカイン、増殖因子（例えば、形質転換増殖因子（例えば、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータなど））、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）など）などが含まれるがこれらに限定されない。
サイトカインは、細胞表面受容体の対応物を介して作用することが多い。次いで、後続の細胞内シグナル伝達カスケードにより、細胞機能が変化する。このシグナル伝達には、他のサイトカインの生成、他の分子の表面受容体の数の増大、またはフィードバック阻害によるそれら自身の作用の抑制を結果としてもたらす、複数の遺伝子およびそれらの転写因子の上方制御および／または下方制御が含まれうる。
ＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子１であり、また、ＣＤ１０６とも称する）は、６つまたは７つの免疫グロブリンドメインを含有し、内皮細胞がサイトカインにより刺激された後に限り、大血管および小血管の両方において発現する。したがって、ＶＣＡＭ−１の発現は、サイトカイン発現のマーカーである。
サイトカインは、全長（例えば、全）タンパク質、全長（例えば、全）ポリペプチド、全長（例えば、全）代謝物、全長（例えば、全）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、全長（例えば、全）相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに前出の多様な中間体生成物および断片（例えば、切断生成物（例えば、ペプチド、ｍＲＮＡ断片））として検出することができる。例えば、ＩＬ−６タンパク質は、完全な全長分子として検出することもでき、多様なレベルの陽性の同定をもたらすのに十分な大きさの任意の断片として検出することもできる。このような断片は、１０未満、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００およびこれを超える数のアミノ酸を含みうる。同様に、ＶＣＡＭ−１タンパク質は、完全な全長アミノ酸分子として検出することもでき、多様なレベルの陽性の同定をもたらすのに十分な大きさの任意の断片として検出することもできる。このような断片は、１０未満、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０およびこれを超える数のアミノ酸を含みうる。
特定の実施形態では、サイトカインのｍＲＮＡは、完全配列または特異的な検出に十分な任意の断片を標的とすることにより検出することができる。ｍＲＮＡ断片は、１０未満のヌクレオチドを包含する場合もあり、任意のより多くの数のヌクレオチドを包含する場合もある。断片は、ｍＲＮＡ鎖の任意の部分を伴うｍＲＮＡ鎖の３’端、ｍＲＮＡ鎖の任意の部分を伴うｍＲＮＡ鎖の５’端、およびｍＲＮＡ鎖の任意の中央部分を含みうる。
ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲ、およびＶＣＡＭ−１のアミノ酸配列および核酸配列を、配列番号１１〜１６として示す。
検出は、限定なしに述べると、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱着イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ））、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核酸アフィニティー（例えば、ハイブリダイゼーション）、核酸増幅、および核酸検出（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））、ならびに抗体アッセイ（例えば、抗体アレイ、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ））が含まれる、任意の適切な方法を用いて実施することができる。ＩＬ−６アッセイおよび他のサイトカインアッセイの例には、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．により提供されるアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ）が含まれる。ＩＬ６−ｓＲアッセイの例には、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．により提供されるアッセイ（Ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−６Ｒ：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）Ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ））が含まれる。ＶＣＡＭ−１アッセイの例には、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓにより提供されるアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製の（ＣＤ１０６）ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＫｉｔであるＤｕｏＳｅｔ（型番：ＤＹ８０９））が含まれる。
バイオマーカーの供給源
バイオマーカーの存在、非存在、または量は、被験体の内部で（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて）決定することもでき、被験体の外部で（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて）決定することもできる。一部の実施形態では、バイオマーカーの存在、非存在、または量を、細胞（例えば、分化細胞、幹細胞）において決定することもでき、特定の実施形態では、バイオマーカーの存在、非存在、または量を、実質的に細胞を含まない培地（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において決定することもできる。本明細書で用いられる、「被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在、または量を同定すること」という用語は、バイオマーカーを評価し、被験体における（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕ法、ｅｘ ｖｉｖｏ法、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法における）存在、非存在、または量を推定するのに当技術分野において公知である任意の方法を指す。
ｅｘ ｖｉｖｏにおいてバイオマーカーの存在、非存在、または量を決定するために、体液試料または組織試料を被験体から得ることが多い。一部の実施形態では、組織試料を得ることが可能な身体の非限定的な部分に、脚、腕、腹、上背、下背、胸、手、指、手指爪、足、足指、足指爪、首、直腸、鼻腔、咽頭、口腔、頭皮、顔、脊椎、咽頭、心臓、肺、乳房、腎臓、肝臓、腸、結腸、膵臓、膀胱、子宮頸部、精巣、筋肉、皮膚、毛髪、腫瘍または腫瘍を取り巻く領域などが含まれる。特定の実施形態では、組織試料を、限定なしに述べると、生検（例えば、剃毛生検、パンチ生検、切開生検、切除生検、掻爬生検、微細注射針による吸引生検、スクープ生検、スカロップ生検、コア注射針生検、真空支援生検、手術による開口生検）などが含まれる、当技術分野において公知である任意の適切な方法により得ることができる。一部の実施形態では、被験体から得ることのできる体液の例には、限定なしに述べると、血液、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、腹腔洗浄液、胆管洗浄液、耳腔洗浄液、関節鏡検査洗浄液）、尿、腸液、糞便、痰、唾液、鼻腔内粘液、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、乳腺液、炎症領域に由来する体液、筋肉疲労領域に由来する体液などが含まれる。
被験体に由来する試料は、バイオマーカーの存在、非存在、または量を決定する前に処理することができる。例えば、被験体に由来する血液試料を処理して、限定なしに述べると、血漿、血清、軟膜、赤血球層などが含まれる特定の画分をもたらすことができ、この画分においてバイオマーカーの存在、非存在、または量を決定することができる。特定の実施形態では、組織試料（例えば、生検試料）を、この組織試料をスライスし、スライスした試料にバイオマーカーを可視化する薬剤（例えば、抗体）を接触させる前／接触させた後においてこの試料を顕微鏡下で観察することにより処理することができる。一部の実施形態では、組織試料を、以下の非限定的な条件：洗浄、塩濃度の高い溶液または塩濃度の低い溶液（例えば、高張液、低張液、等張液）への曝露、せん断条件（例えば、超音波処理、プレス処理（例えば、フレンチプレス））への曝露、ミンチ処理、遠心分離、細胞の分離、組織の分離などのうちの１または複数に曝露することができる。特定の実施形態では、バイオマーカーを組織から分離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける存在、不在、または量を決定することができる。試料はまた、バイオマーカーの存在、非存在、または量を決定する前に、ある期間にわたり保存することもできる（例えば、試料を、凍結させることもでき、極低温保存することもでき、防腐媒体（例えば、ホルムアルデヒド）中で維持することもできる）。
被験体に薬物を送達した後の任意の適切な回収時点において、試料を被験体から得ることができる。例えば、試料は、被験体に薬物を送達した約１時間後以内（例えば、薬物送達の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、または６０分間以内）に回収することもでき、被験体に薬物を送達した約１日間後以内（例えば、薬物送達の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間以内）に回収することもでき、被験体に薬物を送達した約２週間後以内（例えば、薬物送達の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間以内）に回収することもできる。回収は、例えば、１時間ごと、毎日、毎週２回、毎週、隔週、毎月、隔月、毎年４回、および毎年などを含めた特定のスケジュールで行うことができる。ある時間にわたり薬物を持続投与（例えば、注入）する場合は、被験体に薬物を導入する最初の時点からの経過時間、薬物投与を中止した時点または中間の時点（例えば、投与時間枠の中間点または他の時点）からの経過時間を決定する。
バイオマーカーの検出
当技術分野において公知である任意の適切な方法により、１以上のバイオマーカーの存在、非存在、または量を決定することができ、本明細書でも、非限定的な決定法について論じる。バイオマーカーの存在、非存在、または量の決定は、生物学的アッセイの使用を含むこともある。生物学的アッセイでは、アッセイで検出される１以上のシグナルを、バイオマーカーの存在、非存在、または量へと変換することができる。アッセイで検出されるシグナルの変換は、例えば、検量線、１以上の基準物質（例えば、内部基準物質、外部基準物質）、チャート、シグナルをバイオマーカーの存在、非存在、または量へと変換するコンピュータプログラムなど、および前出の組合せの使用を含みうる。
アッセイで検出されるバイオマーカーは、例えば、全長バイオマーカー、バイオマーカー断片、改変バイオマーカーもしくは修飾バイオマーカー（例えば、バイオマーカーの誘導体、バイオマーカーの代謝物）、または前出のうちの２つ以上の和でありうる。修飾バイオマーカーは、本明細書で論じられるバイオマーカーとの実質的な配列同一性を有することが多い。例えば、修飾バイオマーカーと、本明細書で論じられるバイオマーカーとの同一性百分率は、１５〜２０％、２０〜３０％、３１〜４０％、４１〜５０％、５１〜６０％、６１〜７０％、７１〜８０％、８１〜９０％、および９１〜１００％、（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００の同一性百分率）の範囲内にあることが可能である。修飾バイオマーカーは、本明細書で論じられるバイオマーカーの配列と９０％以上同一の配列（例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）を有することが多い。配列同一性の百分率は、当技術分野において公知であるアライメント法を用いて決定することができる。
バイオマーカーの検出は、限定なしに述べると、質量分析、抗体アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、核酸アフィニティー、マイクロアレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、逆転写ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲが含まれる、当技術分野において公知である任意の適切な方法を用いて実施することができる。例えば、ＲＮＡの純度および濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００において、分光光度法により決定することができる（２６０／２８０＞１．９）。ＲＮＡの品質は、当技術分野において公知の方法（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）など）を用いて評価することができる。
後続の薬物用量を調整または維持するための指標
後続の薬物用量を調整または維持するための指標は、バイオマーカーの存在または非存在に基づきうる。例えば、（ｉ）利用できるバイオマーカーレベルの決定が低感度であり、（ｉｉ）薬物に反応したバイオマーカーレベルのシフトが急激であり、（ｉｉｉ）存在するバイオマーカーのレベルが低レベルもしくは高レベルであり、かつ／または（ｉｖ）投与レベルなら薬物が感知できる程度には毒性でない場合は、後続の薬物用量を調整または維持するための指標を発生させるのに、バイオマーカーの存在または非存在が十分でありうる。
後続の薬物用量を調整または維持するための指標は、バイオマーカーの量またはレベルに基づくことが多い。一部の実施形態では、バイオマーカーの量が、平均量、中央値量、名目量、範囲量、区間量、最大量、最小量、または相対量でありうる。特定の実施形態では、バイオマーカーの量が、測定誤差域を伴って表される場合もあり、測定誤差域を伴わずに表される場合もある。一部の実施形態では、バイオマーカーの量を、バイオマーカー濃度、単位重量当たりのバイオマーカー重量、単位容量当たりのバイオマーカー重量、バイオマーカーモル数、単位容量当たりのバイオマーカーモル数、単位重量当たりのバイオマーカーモル数、単位細胞個数当たりのバイオマーカー重量、単位細胞個数当たりのバイオマーカー容量、単位細胞個数当たりのバイオマーカーモル数などとして表すことができる。重量は、例えば、フェムトグラム、ピコグラム、ナノグラム、マイクログラム、ミリグラム、およびグラムとして表すことができる。容量は、例えば、フェムトリットル、ピコリットル、ナノリットル、マイクロリットル、ミリリットル、およびリットルとして表すことができる。モル数は、例えば、ピコモル、ナノモル、マイクロモル、ミリモル、およびモルとして表すことができる。一部の実施形態では、単位重量が、被験体の体重の場合もあり、被験体に由来する試料の重量の場合もあり、単位容量が、被験体に由来する試料の容量（例えば、血液試料の容量）であることが可能であり、単位細胞個数が、細胞１個当たりの場合もあり、特定の細胞個数当たりの場合（例えば、細胞１０００個当たりのバイオマーカーマイクログラム）もある。当技術分野において公知の通り、一部の実施形態では、１つの組織または体液から決定されるバイオマーカーの量を、別の体液または組織におけるバイオマーカーの量と相関させることができる。
後続の薬物用量を調整または維持するための指標は、被験体において決定されたバイオマーカーレベルを、所定のバイオマーカーレベルと比較することにより作成することが多い。特定の実施形態では、所定のバイオマーカーレベルが、被験体における薬物の治療量または有効量と連関することもあり、薬物の毒性レベルと連関することもあり、状態の存在と連関することもあり、処置の中間評価項目と連関することもあり、処置の評価項目と連関することもある。所定のバイオマーカーレベルは、時間を要素として包含することもあり、一部の実施形態では、閾値が時間依存的な特徴である。例えば、ＩＬ−６レベルまたはＩＬ６−ｓＲレベルが正常レベルの約８倍以上（例えば、正常レベルの約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５倍）であることは、後続の投与において、薬物の用量または投与頻度を増大させうることを示しうる。
「用量」という用語は、用量の量、および、例えば、次回の用量のタイミングなどの投与頻度の両方を包含することを意味する。ＩＬ−６レベルまたはＩＬ６−ｓＲレベルが正常レベルの約８倍未満（例えば、正常レベルの約７、６、５、４、３、２、もしくは１倍、または正常レベル以下）であることは、後続の投与において、用量を維持または低減しうることを示しうる。ＶＣＡＭ−１レベルが正常レベルの約８倍以上（例えば、正常レベルの約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５倍）であることは、後続の投与において、薬物の用量を増大させうることを示しうる。ＶＣＡＭ−１レベルが正常レベルの約８倍未満（例えば、正常レベルの約７、６、５、４、３、２、もしくは１倍、または正常レベル以下）であることは、後続の投与において、用量を維持または低減しうることを示しうる。正常レベルのＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲ、またはＶＣＡＭ−１は、患者における固形腫瘍または患者において処置下にある種類の固形腫瘍を伴わないと診断されている被験体において評価することができる。
薬物用量を調整または維持するための他の指標には、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、またはＨＧＦなど、個別の分泌因子の濃度における摂動、または、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦ、およびＨＧＦからなる群から選択されるマーカーのうちの２つ以上など、分泌因子のパネルの平均濃度における摂動が含まれる。この摂動は、例えば、個別の分布因子の濃度における、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の上昇または低下からなる場合もあり、分泌因子のパネルの血清濃度の平均相対変化における、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の上昇または低下からなる場合もある。この上昇の後、次回の投与前にベースラインの血清濃度への復帰が生じる場合もあり、生じない場合もある。血清濃度の平均相対変化における上昇または低下は、例えば、パネル内の因子の各々の相対値に重みづけすることを伴いうる。また、上昇または低下は、例えば、収集されたデータの時点の各々の相対値に重みづけすることを伴いうる。各時点の重みづけされた値、または各因子の重みづけされた値は、癌、転移、または腫瘍負荷の状態または程度に応じて変化しうる。薬物用量を調整または維持するための指標には、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回以上の投与後における、個別の分泌因子の濃度、または分泌因子のパネルの平均濃度における摂動が含まれうる。例えば、処置期間にわたり、例えば、薬物または本明細書で論じられたワクチンもしくは組成物の６回の投与にわたり、少なくとも１回の投与後において個別の分泌因子の濃度または分泌因子のパネルの平均濃度が摂動することが観察される場合は、これが、投与頻度または後続の用量を維持するか、低減するか、または増大させるための指標となる場合もあり、例えば、さらなる薬物、アデノウイルスワクチン、またはアデノウイルスをトランスフェクトもしくは形質導入した細胞を調製することにより処置を継続するための指標となる場合もある。
一部の処置方法は、（ｉ）被験体に、１回または複数回の投与（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の用量）により薬物を投与するステップと、（ｉｉ）（ｉ）の後で、被験体におけるバイオマーカーまたは被験体に由来するバイオマーカーの存在、非存在、または量を決定するステップと、（ｉｉｉ）被験体に行われる後続の薬物用量を増大させるか、低減するか、または維持するための指標を提示するステップと、（ｉｖ）場合によって、被験体に後続用量を投与するステップであって、後続用量が、（ｉ）における先行用量（複数可）と比べて、増大しているか、低減されているか、または維持されているステップとを含む。一部の実施形態では、バイオマーカーの存在、非存在、または量を、薬物の各用量を被験体に投与した後で決定するが、バイオマーカーの存在、非存在、または量を、薬物の各用量を投与した後で決定しないこともある（例えば、バイオマーカーを、１回目、２回目、３回目、４回目、５回目、６回目、７回目、８回目、９回目、または１０回目の用量のうちの１回または複数回の後で評価するが、必ずしも、各用量を投与した後で毎回評価するわけではない）。
後続の薬物用量を調整するための指標は、後続の薬物用量を増大させる必要、または後続の薬物用量を低減する必要として考慮することができる。後続の薬物用量を調整または維持するための指標を考慮しうるのは臨床医であるが、特定の実施形態では、臨床医が、この指標について決定を下しうる。一部の実施形態では、臨床医が、指標について決定を下さない選択をする場合もある。したがって、臨床医は、提示される指標に基づき、後続の薬物用量を調整するかまたは調整しないかを選択することができる。
後続の薬物用量、および／または後続の薬物用量の調整または維持の指標は、任意の簡便な方法で提供することができる。一部の実施形態では、指標を、表形態（例えば、物理的媒体または電子的媒体による）で提示することができる。例えば、バイオマーカーの閾値を表により提示することができ、臨床医は、被験体について決定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量を、この閾値と比較することができる。次いで、臨床医は、後続の薬物用量についての指標を、この表から同定することができる。特定の実施形態では、指標は、バイオマーカーの存在、非存在、または量がコンピュータに供給された後で（例えば、コンピュータのメモリーに入力された後で）、コンピュータにより提示しうる（例えば、表示される）。例えば、被験体について決定されたバイオマーカーの存在、非存在、または量を、コンピュータに供給する（例えば、使用者がコンピュータメモリーに入力するか、またはコンピュータネットワークにおける遠隔デバイスを介してコンピュータへと送信する）ことができ、コンピュータ内のソフトウェアにより、後続の薬物用量を調整もしくは維持するための指標を作成し、かつ／または後続の薬物用量の量を提示することができる。後続の用量は、例えば、被験体の体重、被験体の１以上の代謝レベル（例えば、肝機能に関する代謝レベル）など、バイオマーカーの存在、非存在、または量以外の特定の因子に基づいて決定することもできる。
指標に基づいて後続の用量を決定したら、臨床医は、後続用量を投与することもでき、用量を調整する指示を別の従事者または実体に与えることもできる。本明細書で用いられる「臨床医」という用語は、意思決定者を指すが、特定の実施形態では、臨床医が、医療の専門家である。一部の実施形態では、意思決定者が、コンピュータまたはコンピュータプログラムの出力表示の可能性があり、医療サービス提供者が、コンピュータにより表示された指示または後続の薬物用量について決定を下す可能性がある。意思決定者は、後続用量を直接的に行う（例えば、注入により後続用量を被験体に行う）場合もあり、遠隔的に行う場合もある（例えば、意思決定者がポンプのパラメータを変更する場合もある）。
特定のバイオマーカーの存在、非存在、または量を決定しうるかどうかを判定するために、被験体をプレスクリーニングすることができる。プレスクリーンの非限定的な例には、遺伝子マーカー（例えば、多型、特定のヌクレオチド配列）の存在または非存在を同定するステップ、特定の代謝物の存在、非存在、または量を同定するステップが含まれる。臨床医は、プレスクリーンの結果を、バイオマーカーの存在、非存在、または量と組み合わせて用いて、後続の薬物用量を調整または維持しうるかどうかを決定することができる。
抗体および低分子
一部の実施形態では、抗体または低分子を、例えば、アッセイにおける対照もしくは基準物質、または治療剤として用いるのに供給することができる。一部の実施形態では、限定せずに述べると、抗体または他の低分子を、ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲが含まれるサイトカインまたはサイトカイン受容体に結合し、このサイトカインの作用を変化させるように構成することもでき、ＶＣＡＭ−１に結合するように構成することもできる。特定の実施形態では、抗体または他の低分子が、サイトカインまたは受容体をコードするｍＲＮＡ構造に結合しうる。
本明細書で用いられる低分子という用語は、約８００ドルトン以下の有機分子を意味する。特定の実施形態では、低分子が、細胞膜を介して拡散し、細胞内の作用部位に到達する。一部の実施形態では、低分子が、タンパク質、核酸、または多糖などの生体ポリマーに高アフィニティーで結合し、この生体ポリマーの活性または機能を変化させることもありうる。多様な実施形態では、低分子が、天然（二次的代謝物など）の場合もあり、人工（抗ウイルス薬など）の場合もあり、疾患に対して有益な効果を及ぼす場合（薬物など）もあり、有害な場合（催奇性物質、発癌物質など）もある。非限定的な例を目的として述べると、低分子には、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、アミノ酸、単糖、ならびに、ジヌクレオチドなど、小型のオリゴマー、抗酸化剤であるグルタチオンなどのペプチド、および、スクロースなどの二糖が含まれうる。
本明細書で用いられる抗体という用語は、脊椎動物の血液中または他の体液中で見出されるガンマグロブリンタンパク質を意味するものとして理解することができ、免疫系が細菌およびウイルスなどの外来対象を同定および中和するのに用いられる。抗体は、２本の大型の重鎖および２本の小型の軽鎖による基本的な構造単位を包含することが典型的である。
抗体に特異的な結合には、特定のタンパク質に対するそのアフィニティーについて選択される抗体が必要とされる。例えば、特定のタンパク質、多型変異体、対立遺伝子、オーソログ、および保存的修飾変異体、もしくはスプライス変異体、またはこれらの一部を、ＧＭ−ＣＳＦ調節タンパク質、ＴＮＦ−アルファ調節タンパク質、もしくはＮＦ−カッパ−Ｂ調節タンパク質と特異的に免疫応答性であるが、他のタンパク質と特異的に免疫応答性であるわけではないポリクローナル抗体だけを得るのに選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り去ることにより達成することができる。
本明細書で提示される方法には、限定なしに述べると、有効量の活性化細胞、核酸、またはこれをコードする発現構築物の送達が含まれる。「有効量」の医薬組成物とは、一般に、言及された所望の結果、例えば、疾患またはその症状の程度を緩和、軽減、最小化、または制限する結果を、検出可能かつ反復された形で達成するのに十分な量として定義される。疾患の消失、根絶、または治癒を含め、より厳密な他の定義も適用することができる。一部の実施形態では、バイオマーカーをモニタリングして、処置の有効性を評価し、毒性を制御するステップが存在しうる。
下記の実施例は、ある特定の実施形態を例示し、当該技術を限定しない。
（実施例１）
材料および方法
後の実施例において考察されている試験において利用する材料および方法について下で考察する。
腫瘍細胞株およびペプチド
ＮＡ−６−Ｍｅｌ細胞株、Ｔ２細胞株、ＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞株およびＬＮＣａＰ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＨＬＡ−Ａ２−制限ペプチドＭＡＧＥ−３ ｐ２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）、インフルエンザマトリックス（ＩＭ）ｐ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）、およびＨＩＶ−１ ｇａｇ ｐ７７−８５（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）を使用して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞反応を解析した。Ｔヘルパー細胞偏極実験では、破傷風トキソイドペプチドＴＴｐ３０ ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥを使用した。ペプチドは全て、Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）により合成され、ＨＰＬＣによって決定された純度は＞９５％であった。
ヒト誘導性ＣＤ４０をコードする組換えアデノウイルス
ヒトＣＤ４０細胞質ドメインは、ヒト単球由来ＤＣ ｃＤＮＡから、Ｘｈｏ Ｉ隣接５’プライマー（５ｈＣＤ４０Ｘ）、５’−ａｔａｔａｃｔｃｇａｇａａａａａｇｇｔｇｇｃｃａａｇａａｇｃｃａａｃｃ−３’、およびＳａｌ Ｉ隣接３’プライマー（３ｈＣＤ４０Ｓ）、５’−ａｔａｔａｇｔｃｇａｃｔｃａｃｔｇｔｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｃｔｇａｇａｔｇ−３’を使用して増幅されたＰｆｕ Ｉポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）であった。ＰＣＲ断片を、Ｓａｌ Ｉで消化したｐＳＨ１／Ｍ−ＦｖＦｖｌｓ−Ｅ１５にサブクローニングし、配列決定して、ｐＳＨ１／Ｍ−ＦｖＦｖｌｓ−ＣＤ４０−Ｅを創出した。その後、誘導性ＣＤ４０を、サイトメガロウイルス初期／即時プロモーターの下で導入遺伝子を発現している非複製的なＥ１、Ｅ３を欠失したＡｄ５／ｆ３５ベースのベクターにサブクローニングした。ｉＣＤ４０をコードする配列を、制限消化および配列決定によって確認した。全てのアデノウイルスの増幅、精製および滴定を、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのウイルスベクターコア施設において行った。
ウエスタンブロット
総細胞抽出物を、プロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製し、界面活性剤適合性タンパク質濃度アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて定量化した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで総タンパク質の１０〜１５マイクログラムを常套的に分離し、タンパク質をニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。ブロットを、ヤギ抗ＣＤ４０（Ｔ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）およびマウス抗アルファチューブリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ａｂ、次いで、それぞれロバ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰおよびヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とハイブリダイズさせた。ブロットを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｓｔａｂｌｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて展開した。
ヒトＤＣの生成および刺激
健康なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン添加血液をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）で密度遠心分離することによって単離した。ＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２で２時間にわたり培養プレートに接着させた。接着しなかった細胞を大規模な洗浄により除去し、接着した単球を、５００Ｕ／ｍｌのｈＩＬ−４および８００Ｕ／ｍｌのｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の存在下で５日間培養した。形態およびＦＡＣＳ解析によって評価された通り、生じた未成熟のＤＣ（ｉｍＤＣ）は、ＭＨＣ−クラスＩ、ＩＩｈｉであり、ＣＤ４０ｌｏ、ＣＤ８０ｌｏ、ＣＤ８３ｌｏ、ＣＤ８６ｌｏを発現した。ｉｍＤＣはＣＤ１４ｎｅｇであり、＜３％の混入ＣＤ３＋ Ｔ、ＣＤ１９＋ Ｂ、およびＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を含有した。
２４ウェルディッシュで、１ｍｌ当たり細胞およそ２×１０６個を培養し、３７℃および５％ＣＯ２で９０分間、アデノウイルスを細胞当たりウイルス粒子（ｖｐ）１０，０００個（約１６０ＭＯＩ）で用いて形質導入した。形質導入したすぐ後に、ＤＣを、ＭＰＬ、ＦＳＬ−１、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＡＰ２０１８７（ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡからの好意の寄贈品）、または、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、１５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および１マイクログラム／ｍｌのＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を含有する成熟化反応混液（ＭＣ）で刺激した。Ｔ細胞アッセイでは、アデノウイルスによる形質導入の２４時間前、または２４時間後に、ＤＣを５０マイクログラム／ｍｌのＰＳＭＡポリペプチドまたはＭＡＧＥ３ペプチドでパルスした。
表面マーカーおよびサイトカインの産生
蛍光色素とコンジュゲートしたモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて細胞表面染色を行った。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で解析した。培養物の上清において、ヒトＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ７０に対する酵素結合免疫吸着検定法キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してサイトカインを測定した。
ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＨＬＡ−Ａ２陽性の健康なボランティアからのＤＣを、培養の４日目にＭＡＧＥ−３ Ａ２．１ペプチド（残基２７１〜２７９；ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）でパルスし、次いで、Ａｄ−ｉＣＤ４０で形質導入し、５日目に種々の刺激で刺激した。自己Ｔ細胞を、負の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によってＰＢＭＣから精製し、ＤＣと、ＤＣ：Ｔ細胞比１：３で混合した。細胞を、２０Ｕ／ｍｌのｈＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２５マイクログラム／ｍｌのＭＡＧＥ３ Ａ２．１ペプチドを伴う完全なＲＰＭＩ中でインキュベートした。培養７日目にＴ細胞を再刺激し、１４日目にアッセイした。
ＥＬＩＳＰＯＴ定量化
平底の９６ウェルニトロセルロースプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、ＩＦＮ−ガンマｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ、１−Ｄ１Ｋ；Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、プレートを完全なＲＰＭＩを用いて、３７℃で２時間ブロッキングした。合計１×１０５個の予備感作した（ｐｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）ＣＤ８＋ Ｔエフェクター細胞を各ウェルに加え、２５マイクログラム／ｍｌのペプチドと一緒に２０時間インキュベートした。次いで、プレートを、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで徹底的に洗浄し、抗ＩＦＮ−ｍＡｂ（０．２マイクログラム／ｍｌ、７−Ｂ６−１−ビオチン；Ｍａｂｔｅｃｈ）を各ウェルに加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１マイクログラム／ｍｌ；Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いて室温で１時間展開した。洗浄した後、基質（３−アミノ−９−エチル−カルバゾール；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、５分間インキュベートした。プレートメンブレンは濃い淡紅色のスポットを示し、それをＺｅｌｌＮｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｆｏｒｔ Ｌｅｅ、ＮＪ）でスキャンし、解析した。
クロム放出アッセイ
抗原認識を、クロム−５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて３７℃で１時間標識し、３回洗浄した標的細胞を使用して評価した。次いで、標識した標的細胞（５０マイクロリットル中、細胞５０００個）を、示されている濃度で、Ｖ底のマイクロウェルプレート中、エフェクター細胞（１００マイクロリットル）に、示されているエフェクター：標的細胞比で加えた。３７℃で６時間インキュベートした後、上清を回収し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ ＣＡ）を使用してクロムの放出を測定した。ＬＮＣａＰ細胞を伴うアッセイを、１８時間実行した。特異的な溶解の百分率を、１００＊［（実験的な放出−自然発生的な放出）／（最大の放出−自然発生的な放出）］として算出した。
四量体染色
ＭＡＧＥ−３．Ａ２ペプチド（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）で組み立てられたＨＬＡ−Ａ２四量体を、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｅｔｒａｍｅｒコア施設（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から得た。０．５％のＦＣＳを含有するＰＢＳ５０μｌ中の予備感作したＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＰＥ標識した四量体を用いて、氷上で１５分間染色した後、ＦＩＴＣ−ＣＤ８ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えた。洗浄した後、結果をフローサイトメトリーによって解析した。
ナイーブＴヘルパー細胞の偏光
ＨＬＡ−ＤＲ１１．５陽性ドナーからのナイーブＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞（ＦＡＳＴＹＰＥ ＨＬＡ−ＤＮＡ ＳＳＰ タイピングキット；ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸを使用して遺伝子型決定した）を、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して負の選択によって単離した。Ｔ細胞を、破傷風トキソイド（５ＦＵ／ｍｌ）でパルスした自己ＤＣで刺激し、種々の刺激を刺激器対応答者比１：１０で用いて刺激した。７日後に、Ｔ細胞をＨＬＡ−ＤＲ１１．５制限ヘルパーペプチドＴＴｐ３０でパルスした自己ＤＣで再刺激し、アデノベクターＡｄ−ｉＣＤ４０で形質導入した。細胞を、ＰＥ−抗ＣＤ４Ａｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して透過処理し、次いで、ｈＩＦＮ−ガンマｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。上清を、ヒトＴＨ１／ＴＨ２ ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ｏｎ ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。
ＰＳＭＡタンパク質の精製
ＰＳＭＡの細胞外部分（残基４４〜７５０）のｃＤＮＡを含有するバキュロウイルス移入ベクター、ｐＡｃＧＰ６７Ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、Ｄｒ Ｐａｍｅｌａ Ｊ．Ｂｊｏｒｋｍａｎ（Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）から好意で提供された。ＰＳＭＡを、疎水性分泌シグナル、第Ｘａ因子切断型部位、およびＮ末端６ｘ−Ｈｉｓアフィニティータグと融合した。Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのバキュロウイルス／モノクローナル抗体コア施設により力価の高いバキュロウイルスが作製された。ＰＳＭＡタンパク質を、組換えウイルスを感染させたＨｉｇｈ５細胞に産生させ、タンパク質を細胞の上清から、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を以前考察されている通り（Ｃｉｓｃｏ ＲＭ， Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ Ｚ， Ｄａｎｎｕｌｌ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４；１７２：７１６２−７１６８）使用して精製した。ＰＳＭＡポリペプチドの約１００ｋＤａの孤立したバンドを精製した後、アクリルアミドゲルの銀染色によってタンパク質を検出した。
分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ
ヒトジャーカット−ＴＡｇ（Ｔ細胞）または２９３（胎児腎臓上皮）細胞またはマウスＲＡＷ２６４．７（マクロファージ）細胞においてレポーターアッセイを行った。対数期の成長中のジャーカット−ＴＡｇ細胞（１０７）に、発現プラスミド２ｍｇおよびレポータープラスミドであるＮＦ−κＢ−ＳＥＡＰまたはＩＦＮｂ−ＴＡ−ＳＥＡＰ（上記を参照されたい）２ｍｇを電気穿孔（９５０ｍＦ、２５０Ｖ）した。対数期の２９３細胞またはＲＡＷ２６４．７細胞（３５ｍｍのディッシュ当たり細胞約２×１０５個）に、増殖培地中６ｍｌのＦｕＧＥＮＥ−６をトランスフェクトした。２４時間後に、形質転換された細胞をＣＩＤで刺激した。さらに２０時間後、上清を、ＳＥＡＰ活性について以前考察されている通り（Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２， １０１９−１０２４ （１９９３））アッセイした。
組織培養
ジャーカット−ＴＡｇ細胞およびＲＡＷ２６４．７細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１４）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）中で成長させた。２９３細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地、１０％のＦＢＳおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ中で成長させた。
データ解析
結果は、平均±標準誤差として表されている。試料サイズを、０．０５の片側アルファ−レベルを用いて０．８の検定力で決定した。実験群間の差異をスチューデントｔ検定によって決定した。
構築物
化学誘導二量体化（ＣＩＤ）に基づき、内在性のＣＤ４０の活性化後にパターン化された誘導性ＣＤ４０受容体を、ＤＣを特異的に標的にするように作製した（図１Ａ）。ｉＣＤ４０と称される組換えＣＤ４０受容体を、精製されたマウス骨髄由来ＤＣ（９５％超のＣＤ１１ｃ＋）由来の２２８ｂｐのＣＤ４０細胞質内シグナル伝達ドメインをｒｔ−ＰＣＲ増幅し、生じたＤＮＡ断片を、二量体化薬結合ドメイン、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）のタンデムなコピーの下流（すなわち、Ｍ−ＦｖＦｖｌｓＣＤ４０−Ｅ）または上流（Ｍ−ＣＤ４０−ＦｖＦｖｌｓ−Ｅ）のいずれかにサブクローニングすることによって構築した（図１Ｂ）。ミリストイル化ターゲティングドメイン（Ｍ）を用いて膜局在化を実現し、同定を容易にするためにＨＡエピトープ（Ｅ）タグを存在させた。転写物が、ＮＦカッパＢを活性化することができるかどうかを決定するために、構築物を、ジャーカットＴ細胞に一過性にトランスフェクトし、用量設定した二量体化薬、ＡＰ２０１８７の存在下でＮＦカッパＢレポーターアッセイを実施した（図１Ｃ）。図１Ｃにより、ＡＰ２０１８７のレベルが増加することにより、ＮＦ Ｂ転写活性が、ＣＤ４０配列を欠く対照ベクター、Ｍ−ＦｖＦｖｌｓ−Ｅと比較して有意に上方制御されることが示された。ｉＣＤ４０の膜近位型であるＭ−ＣＤ４０−ＦｖＦｖｌｓ−Ｅは、このアッセイ系ではＡＰ２０１８７に対する反応性が低かったので、さらなる試験では、Ｍ−ＦｖＦｖｌｓＣＤ４０−Ｅ構築物を使用し、これまで「ｉＣＤ４０」と称されていた。この決定は、異種タンパク質をそのカルボキシル末端に融合することによって有害に変化し得るヘアピンコンフォメーションを示す（Ｎｉ２０００）ＣＤ４０細胞質尾部の結晶学的構造によって補強された。このデータにより、薬物結合ドメインの飽和に起因すると思われる、１００ｎＭを超える高薬物用量抑制も示された。これと同じ現象が、限られたレベルのｉＣＤ４０受容体を発現している他の細胞型において観察された。これらの結果により、ｉＣＤ４０がＮＦ Ｂ転写因子のＣＩＤ依存性の核移行を誘導することができることが示唆された。
誘導性のｉＭｙＤ８８：ヒトＴＩＲを含有する誘導性のＰＲＲアダプターＭｙＤ８８（約９００ｂｐ）を、２９３のｃＤＮＡから、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩをリンカーとしたプライマー５ＭｙＤ８８Ｓ（５’−ａｃａｔｃａａｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇｔｃｃｃｇｇ−３’）および３ＭｙＤ８８Ｓ（５’−ａｃｔｃａｔａｇｔｃｇａｃｃａｇｇｇａｃａａｇｇｃｃｔｔｇｇｃａａｇ−３’）を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＳＨ１／Ｍ−Ｆｖ’−Ｆｖｌｓ−ＥのＸｈｏＩ部位およびＳａｌＩ部位にサブクローニングして（Ｘｉｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１， ６７９５−８０４． （２００１）； Ｆａｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２７３−２２８５ （１９９９））、それぞれｐＳＨ１／Ｍ−ＭｙＤ８８−Ｆｖ’−Ｆｖｌｓ−ＥおよびｐＳＨ１／Ｍ−Ｆｖ’−Ｆｖｌｓ−ＭｙＤ８８−Ｅを得た。全ての挿入断片を配列決定によって確認し、適切なサイズについて、３’血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）エピトープ（Ｅ）に対するウエスタンブロットによって確認した。
（実施例２）
ｉＣＤ４０の発現およびＤＣ成熟化の誘導
ヒトＣＤ４０細胞質内シグナル伝達ドメインを、ミリストイル化ターゲティングドメインおよび二量体化薬ＡＰ２０１８７に結合する２つのタンデムなドメイン（ヒトＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）由来、「Ｆｖ’」と称される）の下流にクローニングした（Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８；９５：１０４３７−１０４４２）。未成熟のＤＣは内在性のＣＤ４０を発現し、これは、ＬＰＳおよびＣＤ４０Ｌによって誘導した。Ａｄ−ｉＣＤ４０の形質導入により、内在性のＣＤ４０発現に干渉しない別個のサイズのｉＣＤ４０の発現が導かれた。興味深いことに、ｉＣＤ４０の発現も、ＬＰＳ刺激によって有意に増強され、これは、遍在する、「構成的な」ＣＭＶプロモーターに結合する転写因子の誘導能に起因すると思われる。
成熟化の状況は、免疫寛容誘発性の状態から活性化した免疫原性の状態への移行に関連づけられるので、完全に成熟し、活性化されたＤＣを得ることが、ＤＣベースのワクチンの設計に関する問題の１つである（Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＲＭ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３；２１：６８５−７１１； Ｈａｎｋｓ ＢＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００５；１１：１３０−１３７； Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． １９９８；３９２：２４５−２５２）。マウス変異体Ａｄ−ｉＣＤ４０を発現させることにより、マウス骨髄由来ＤＣの成熟化を誘導することができることが示されている（Ｈａｎｋｓ ＢＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００５；１１：１３０−１３７）。ヒト化ｉＣＤ４０が、ＤＣにおける成熟化マーカーの発現に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＤＣをＡｄ−ｉＣＤ４０で形質導入し、成熟化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６の発現を評価した。ＬＰＳまたはその誘導体によって媒介されるＴＬＲ−４シグナル伝達ＭＰＬは、ＤＣ成熟化の強力な誘導因子である（Ｉｓｍａｉｌｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；１６８：９２６−９３２； Ｃｉｓｃｏ ＲＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４；１７２：７１６２−７１６８； Ｄｅ Ｂｅｃｋｅｒ Ｇ， Ｍｏｕｌｉｎ Ｖ， Ｐａｊａｋ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００；１２：８０７−８１５； Ｇｒａｎｕｃｃｉ Ｆ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ． １９９９；１：１０７９−１０８４）。内在性のＣＤ４０シグナル伝達により、ヒトＤＣにおけるＣＤ８３の発現が特異的に上方制御されることも以前報告された（Ｍｅｇｉｏｖａｎｎｉ ＡＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ． ２００４；１５：１２６−１３４）。以前の報告と一致して、Ａｄ−ｉＣＤ４０が形質導入されるとＣＤ８３の発現レベルが上方制御され、ＬＰＳまたはＭＰＬを加えた後にＣＤ８３の発現がさらに上方制御された。
（実施例３）
誘導性ＣＤ４０およびＭｙＤ８８および複合性ＭｙＤ８８−ＣＤ４０は２９３細胞においてＮＦ−カッパＢを活性化する
ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の切断型を含めた誘導性の受容体を発現させるために構築物のセットを設計した。２９３細胞に、ＮＦ−カッパＢレポーターを同時トランスフェクトし、ＳＥＡＰレポーターアッセイを基本的にＳｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２， １０１９−１０２４ （１９９３）において考察されている通りに実施した。最初に設計したベクターは、ｐＢＪ５−Ｍ−ＭｙＤ８８Ｌ−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅであった。ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−Ｍ−ＭｙＤ８８Ｌ−Ｆｖ’Ｆｖｌｓを使用して、アデノウイルスを作出した。これらのベクターの両方を、ＳＥＡＰアッセイにおいて試験した。２４時間後に、ＡＰ２０１８７を加え、さらに２０時間後に、細胞の上清を、ＳＥＡＰ活性について試験した。これらのキメラ構築物および活性化に関する図表が図３および図４に提供されている。図５に結果が示されている。
構築物：
対照：ＮＦ−カッパＢレポーターのみでトランスフェクトする。
ＴＬＲ４ｏｎ：ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＣＤ４／ＴＬＲ４−Ｌ３−Ｅ：ＣＤ４／ＴＬＲ４Ｌ３−Ｅは、マウスＣＤ４の細胞外ドメインを、ヒトＴＬＲ４の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとタンデムに含有し（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ． １９９７ Ｊｕｌ ２４；３８８（６６４０）：３９４−７において考察されている）、その次に３つの６アミノ酸のリンカーおよびＨＡエピトープが続く、ＴＬＲ４の構成的な型である。
ｉＭｙＤ８８： Ｍ−ＭｙＤ８８Ｌ−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅを含有する
ｉＣＤ４０： Ｍ−Ｆｖ’−Ｆｖｌｓ−ＣＤ４０−Ｅを含有する
ｉＣＤ４０Ｔ： Ｍ−Ｆｖ’−Ｆｖ’−Ｆｖｌｓ−ＣＤ４０−Ｅを含有する− ｉＣＤ４０Ｔは、追加のＦｖ’（バリンにおけるゆらぎを伴うＦＫＢＰ）を含有する
ｉＭｙＤ８８：ＣＤ４０：Ｍ−ＭｙＤ８８Ｌ−ＣＤ４０−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅを含有する
ｉＭｙＤ８８：ＣＤ４０Ｔ：Ｍ−ＭｙＤ８８ＬＣＤ４０−Ｆｖ’Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅを含有する− ｉＭｙＤ８８：ＣＤ４０と比較して追加のＦｖ’を含有する。
（実施例４）
誘導性ＣＤ４０、ＣＤ４０−ＭｙＤ８８、ＣＤ４０−ＲＩＧ−１、およびＣＤ４０：ＮＯＤ２
以下の構築物を設計し、ＮＦ−カッパＢレポーター系においてアッセイした。２９３細胞に、ＮＦカッパＢレポーターおよび構築物のうちの１つを同時トランスフェクトした。２４時間後に、ＡＰ２０１８７を加え、さらに３時間後（図６）または２２時間後（図７）に、細胞の上清を、ＳＥＡＰ活性について試験した。トランスフェクションから約２０〜２４時間後、細胞を、二量体化薬ＡＰ２０１８７で処理した。二量体化薬で処理した約２０〜２４時間後、細胞を、ＳＥＡＰの基質である４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）で処理した。一晩（１６時間から２２時間までのいずれかの時間）インキュベートした後、ＦＬＵＯＳｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマシンでＳＥＡＰ 計数を記録した。
ＭｙＤ８８ＬＦｖ’ＦｖｌｓＣＤ４０：はＭｙＤ８８Ｌから上流にミリストイル化配列を有するｐＢＪ５骨格で構成された。
Ｆｖ’ＦｖｌｓＣＤ４０ＭｙＤ８８Ｌ：はＦｖ’から上流にミリストイル化配列を有するｐＢＪ５骨格で構成された。
ＭｙＤ８８ＬＣＤ４０Ｆｖ’Ｆｖｌｓ：はＭｙＤ８８Ｌから上流にミリストイル化配列を有する２つのベクターの骨格（ｐＢＪ５）で構成された。
ＣＤ４０Ｆｖ’ＦｖｌｓＭｙＤ８８Ｌ：はＣＤ４０から上流にミリストイル化配列を有するｐＢＪ５骨格で構成された。
Ｆｖ’２ＦｖｌｓＣＤ４０ｓｔＭｙＤ８８Ｌ：はＣＤ４０の後ろの終止配列により、ＭｙＤ８８Ｌの翻訳が妨げられる構築物である。ｉＣＤ４０Ｔ’とも称される。
Ｆｖ’２Ｆｖｌｓは、ｇｔｃｇａｇ配列によって分離された２コピーのＦｖ’を含む。
ＭｙＤ８８ＬＦｖ’Ｆｖｌｓ
Ｆｖ’ＦｖｌｓＭｙＤ８８Ｌ：はＦｖ’から上流にミリストイル化配列を有するｐＢＪ５骨格で構成された。
Ｆｖ’ＦｖｌｓＣＤ４０：はｐＢＪ５およびｐＳｈｕｔｔｌｅＸにおいて利用可能である。
ＣＤ４０Ｆｖ’Ｆｖｌｓ：はＣＤ４０から上流にミリストイル化配列を有するｐＢＪ５骨格において利用可能である。
ＭＦｖ’Ｆｖｌｓ：：はＭによって示されるミリストイル化配列を有するｐＢＪ５骨格において利用可能である。
Ｆｖ’’ＦｖｌｓＮＯＤ２：２つのＦＫＢＰ、その後ろにＮＯＤ２の２つのＣＡＲＤドメインおよびＨＡエピトープを含有する、ミリストイル化配列を有さないｐＢＪ５骨格内のｐＢＪ５−Ｓｎ−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−ＮＯＤ２−Ｅ。
Ｆｖ’ＦｖｌｓＲＩＧ−１：２つのＦＫＢＰ、その後ろにＲＩＧ−Ｉの２つのＣＡＲＤドメインおよびＨＡエピトープを含有する、ミリストイル化配列を有さないｐＢＪ５骨格内のｐＢＪ５−Ｓｎ−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−ＲＩＧ−Ｉ−Ｅ。
アデノウイルスを作製するために使用するｐＳｈｕｔｔｌｅＸ型の構築物マップの例が図１３、図１４、および図１５に示されている。
（実施例５）
２９３Ｔ細胞のＭｙＤ８８Ｌアデノウイルスによるトランスフェクションによりタンパク質の発現がもたらされる
アデノウイルス作製のために以下のｐＳｈｕｔｔｌｅＸ構築物を構築した：
ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＭｙＤ８８Ｌ−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅ
ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＭｙＤ８８ＬＣＤ４０−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅ
ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＣＤ４／ＴＬＲ４−Ｌ３−Ｅ
Ｌ３は、ＤＮＡ配列：ＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴ
タンパク質配列：ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ
を有する３つの６アミノ酸のリンカーを示し、
ＥはＨＡエピトープである。
基本的にＨｅ， Ｔ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５（５）：２５０９−１４において考察されている通りの方法を用いて組換えアデノウイルスを得た。
アデノウイルスアッセイのそれぞれについて、いくつかのウイルスプラークからの粗溶解産物を、タンパク質の発現についてウエスタンブロット法によってアッセイした。Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（世界的なウェブアドレスｈｔｔｐ：／／ｖｅｃｔｏｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／）におけるベクターコアから供給される細胞ペレットから、ペレットを３回凍結融解することによってウイルス粒子を放出させた。２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートにウェル当たり細胞１×１０６個で播いた。２４時間培養した後、細胞を、抗生物質を伴う無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、次に、無血清培地５００マイクロリットル中の細胞単層にウイルス溶解産物２５マイクロリットルまたは１００マイクロリットルを加えた。２時間後、血清を補充したＤＭＥＭ２．５ｍｌを６ウェルプレートの各ウェルに加えた。
２４〜４８時間後、細胞を回収し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１００マイクロモルのＰＭＳＦを含有する）（例えば、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能である）に再懸濁させた。細胞を、１０分ごとに混合しながら氷上で３０分間インキュベートし、次に、４℃、１０，０００ｇで１５分間急速回転させた。上清を、ベータ−メルカプトエタノールを加えたＳＤＳ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と１：２の比率で混合し、１００℃で１０分間インキュベートし、ＳＤＳゲルにローディングし、ニトロセルロースメンブレン上で、ＨＡエピトープに対する抗体を使用してプローブした。図８および図９に結果が示されている。残りの細胞溶解産物は後で使用するために−８０℃で貯蔵した。細胞に、ウイルスであるｖｉｚ．、Ａｄ５−ｉＭｙＤ８８およびＡｄ５−ＴＬＲｏｎのそれぞれを別々に用いて別々に形質導入した。
（実施例６）
ＣＤ４０およびＭｙＤ８８Ｌ−アデノウイルスによって形質導入された細胞におけるＩＬ−１２ｐ７０の発現
骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、抗生物質を伴う無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後に、４８ウェルプレートにウェル当たり細胞０．２５×１０６個で播いた。細胞を、無血清培地１２５マイクロリットル中、６マイクロリットルの粗ウイルス溶解産物で形質導入した。２時間後、血清を補充したＲＰＭＩ３７５マイクロリットルを４８ウェルプレートの各ウェルに加えた。４８時間後、上清を回収し、マウスＩＬ−１２ｐ７０ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して解析した。各試料について、１００ｎＭのＡＰ２１０８７を加えて、または加えずに２連のアッセイを行った。ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０受容体に結合する、ＴＮＦファミリーのメンバーのＣＤ４０リガンドである。ＬＰＳはリポ多糖である。図１０に結果が示されている。粗アデノウイルス溶解産物を細胞２５万個当たり６．２マイクロリットル加えたアッセイの反復の結果が図１１に示されている。図１２は、より多くのウイルス溶解産物、細胞２５万個当たり１２．５マイクロリットルを使用してＢＭＤＣを感染させた追加的なアッセイ結果を示す。
（実施例７）
ＭｙＤ８８Ｌ−アデノウイルスにより形質導入したヒト単球由来樹状細胞におけるＩＬ−１２ｐ７０の発現
未成熟のヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を、抗生物質を伴う無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後に、４８ウェルプレートにウェル当たり細胞０．２５×１０６個で播いた。細胞を、アデノウイルスＡＤ５−ｉＭｙＤ８８．ＣＤ４０を異なる感染多重度（ＭＯＩ）で用いて形質導入し、１００ｎＭの二量体化薬ＡＰ２０１８７で刺激した。使用したウイルスは、以前の実施例において使用したウイルス溶解産物の最適化された型であった。４８時間後、上清を回収し、ＩＬ１２ｐ７０ＥＬＩＳＡアッセイにおいてアッセイした。図１６は、この滴定の結果を示す。
未成熟のヒトｍｏＤＣを、抗生物質を伴う無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、４８ウェルプレートにウェル当たり細胞０．２５×１０６個で播いた。次いで、細胞を、Ａｄ５ｆ３５−ｉＣＤ４０（１０，０００ＶＰ／細胞）；Ａｄ５−ｉＭｙＤ８８．ＣＤ４０（１００ＭＯＩ）；Ａｄ５．ｉＭｙＤ８８（１００ＭＯＩ）またはＡｄ５−ＴＬＲ４ｏｎ（１００ＭＯＩ）のいずれかで形質導入し、記載がある場合は１マイクログラム／ミリリットルのＬＰＳおよび図１７に記載がある場合１００ｎＭの二量体化薬ＡＰ２０１８７で刺激した。４８時間後、上清を回収し、ＩＬ１２ｐ７０ＥＬＩＳＡアッセイにおいてアッセイした。
ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ｉｈＣＤ４０（Ｍ−Ｆｖ’−Ｆｖｌｓ−ｈＣＤ４０；ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−Ｍ−Ｆｖ’−Ｆｖｌｓ−ｈＣＤ４０としても公知である）を使用してＡｄ５ｆ３５−ｉＣＤ４０を作製した。図１６および図１７に示されているＭｙＤ８８は、本明細書においてＭｙＤ８８Ｌとして示されている型と同じＭｙＤ８８の切断型である。Ａｄ５．ｉＭｙＤ８８で示されるアデノウイルスを、ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＭｙＤ８８Ｌ−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅを使用して作製した。Ａｄ５−ｉＭｙＤ８８．Ｃｄ４０で示されるアデノウイルスを、ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＭｙＤ８８ＬＣＤ４０−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅを使用して作製した。Ａｄ５−ＴＬＲ４Ｏｎで示されるアデノウイルスを、ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＣＤ４／ＴＬＲ４−Ｌ３−Ｅを使用して作製した。
（実施例８）
樹状細胞のウイルスによらない形質転換
Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列に作動可能に連結したｉＭｙＤ８８−ＣＤ４０配列を含むプラスミドベクター、例えば、ｐＳｈｕｔｔｌｅＸ−ＭｙＤ８８ＬＣＤ４０−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅ挿入断片などを構築する。プラスミド構築物は、ＭｙＤ８８ｌＣＤ４０−Ｆｖ’Ｆｖｌｓ−Ｅ配列に作動可能に連結した以下の調節エレメントも包含する：プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル。ベクターは、エンハンサー配列も含んでよい。ＭｙＤ８８Ｌ、ＣＤ４０、およびＦｖＦｖｌｓ配列も、当技術分野で公知の合成法を用いて、最適化されたコドンを含むように修飾することができる。
未成熟のヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を、抗生物質を伴う無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、４８ウェルプレートにウェル当たり細胞０．２５×１０６個で播く。細胞に、任意の適切な方法、例えば、ＡＭＡＸＡキットを使用したヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、超音波ローディング（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｌｏａｄｉｎｇ）、リポソーム媒介トランスフェクション、受容体媒介トランスフェクション、または微粒子銃などを用いてプラスミドベクターで形質導入する。
ＤＮＡワクチンは、例えば、２００８年１１月６日に公開された米国特許公報第２００８０２７４１４０号において考察されている。Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列に作動可能に連結したｉＭｙＤ８８−ＣＤ４０配列を、例えば、宿主組織においてｉＭｙＤ８８−Ｃｄ４０ Ｆｖ’Ｆｖｌｓキメラタンパク質を発現させるために必要な調節エレメントも含むＤＮＡワクチンベクターに挿入する。これらの調節エレメントとしては、これらに限定されないが、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーが挙げられ、キメラタンパク質をコードするコドンを最適化することができる。
（実施例９）
ＣＤ４０およびＭｙＤ８８ＣＤ４０で形質転換された樹状細胞の、マウス腫瘍モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの評価
骨髄樹状細胞に、本明細書の実施例に示されている通りアデノウイルスベクターを使用して形質導入した。これらの形質導入されたＢＭＤＣを、ＥＧ．７−ＯＶＡモデルにおいて腫瘍の成長を阻害するそれらの能力について試験した。ＥＧ．７−ＯＶＡ細胞（１００ｍｌ当たり細胞５×１０５個）を雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に接種した。全群のＢＭＤＣを、５０マイクログラム／ｍｌのオボアルブミンタンパク質でパルスし、上記の通り活性化した。腫瘍細胞を接種したおよそ７日後に、ＢＭＤＣを解凍し、マウスの後足蹠に皮下注射した。
全群のマウスにおいて腫瘍の成長を週２回モニターした。全群の無作為のマウスからの末梢血を、四量体染色によって、およびｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイによって解析した。表１は、形質導入されていない樹状細胞（群１および群２）、対照アデノウイルスベクターで形質導入された樹状細胞（群３）、ＣＤ４０細胞質内領域をコードするベクターで形質導入された樹状細胞（群４）、切断型ＭｙＤ８８ベクターで形質導入された樹状細胞（群５および群６）、およびキメラＣＤ４０−切断型ＭｙＤ８８ベクターで形質導入された樹状細胞（群７および群８）を含む実験計画を示している。細胞を、ＡＰ−１９０３、ＬＰＳ、またはＣＤ４０リガンドを用いて、示されている通り刺激した。
腫瘍を接種したマウスにワクチン接種する前に、形質導入された樹状細胞のＩＬ−１２ｐ７０のレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。図１８にＩＬ−１２ｐ７０のレベルが示されている。図１９は、形質導入されたマウスにおいて観察された腫瘍の成長阻害のチャートを示す。ＭｙＤ８８で形質導入され、ＡＰ１９０３で処理された樹状細胞を接種することにより、治癒速度が１／６になり、一方、ＭｙＤ８８−ＣＤ４０で形質導入され、ＡＰ１９０３なしの樹状細胞を接種することにより、治癒速度が４／６になり、これは、二量体化剤に依存しない効果の潜在性を示している。アスタリスクは、Ｌｕｃ＋ＬＰＳ＋ＡＰとｉＣＤ４０ＭｙＤ８８＋ＬＰＳ＋／−ＡＰ１９０３の比較を示す。図１９は、代表的なワクチン接種したマウス写真も提供する。
図２０は、ｉＭｙＤ８８−ＣＤ４０で形質導入された樹状細胞で処置したマウスにおけるＡｇ特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の誘導の頻度の増大の解析を示す。処置したマウスからの末梢骨髄細胞を、７日目にワクチン接種した１０日後に回収した。ＰＢＭＣを抗ｍＣＤ８−ＦＩＴＣおよびＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−四量体−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
図２１は、ｉＭｙＤ８８−ＣＤ４０で形質導入された樹状細胞で処置した後にマウスにおいて誘導されたＡｇ特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ ＴＨ１細胞の頻度の増大を示す。全ての実験群の３匹のマウスを、ワクチン接種の１８日後に屠殺した。群当たり３匹のマウスの脾細胞を一緒に「プール」し、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって解析した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡプレートを、１０マイクログラム／ｍｌの抗マウスＩＦＮ−ガンマＡＮ１８抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ，Ｉｎｃ．、Ｎａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でコーティングした。脾細胞を加え、完全ＥＬＩＳＰｏｔ培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン）中、５％ＣＯ２下、３７℃で２０時間培養した。脾細胞を、２マイクログラム／ｍｌのＯＴ−１（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、ＯＴ−２（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ）またはＴＲＰ−２ペプチド（対照の標識していないペプチド）と一緒にインキュベートした。洗浄した後、マウスＩＦＮ−ガンマに対する第２のビオチン化モノクローナル抗体（Ｒ４−６Ａ２、Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）を１マイクログラム／ｍｌの濃度でウェルに適用し、その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と一緒にインキュベートした。次いで、プレートを、アルカリホスファターゼの基質である３−アミノ−９エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて展開した。ウェル中のスポットの数は、ＺｅｌｌＮｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．で自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダーシステム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ ＮＹ）を用いてスコア化した。
図２２は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性リンパ球アッセイの概略図および結果を示す。ＤＣワクチン接種の１８日後にｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイを実施した。同系のナイーブな脾細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏ標的細胞として使用した。それらを、６マイクロモルのＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｈｉ細胞）または０．６マイクロモルのＣＦＳＥのいずれかと一緒にＣＴＬ培地（ＣＦＳＥｌｏ細胞）中、３７℃で１０分間インキュベートすることによって標識した。ＣＦＳＥｈｉ細胞を、ＯＴ−１ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでパルスし、ＣＦＳＥｌｏ細胞を対照ＴＲＰ２ペプチドと一緒にインキュベートした。ＣＦＳＥｈｉ細胞４×１０６個とＣＦＳＥｌｏ細胞４×１０６個の混合物を、尾静脈から静脈内注射した。ｉｎ ｖｉｖｏで１６時間インキュベートした後に、脾細胞を採取し、ＣＦＳＥ標識された細胞を検出し定量化するために、単一の細胞懸濁液を解析する。図２３は、接種されたマウスにおいて、ｉＭｙＤ８８−ＣＤ４０で形質導入された樹状細胞によって誘導されるＣＴＬ活性の増強を示すチャートである。図２４は、ｉＭｙＤ８８−ＣＤ４０で形質導入された樹状細胞によって誘導されるｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ活性の増強を示す試料を選択するための未加工のＣＴＬヒストグラムを示す。
図２５は、形質導入された細胞を用いてワクチン接種したマウスにおけるＩＬ−４産生ＴＨ２細胞についての細胞内染色の結果を示す。マウスの脾細胞（３匹のマウス由来のプールされた細胞）を、２マイクログラム／ｍｌのＯＴ−２ペプチドを用いて再構成した。細胞を、分泌を抑制するために１０マイクログラム／ｍｌのブレフェルジンＡと一緒に６時間インキュベートした。次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗ｍＩＬ−４−ＡＰＣおよび抗ｍＣＤ４−ＦＩＴＣを用いて細胞内染色することによって解析した。
ｉＣＤ４０−ＭｙＤ８８配列を含むアデノウイルスベクターを、マウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害するその能力について再度評価した。第１の実験では、誘導性ＣＤ４０−切断型ＭｙＤ８８ベクター（Ａｄ−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８）で改変された樹状細胞を接種した後の薬物依存性の腫瘍の成長阻害を測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの骨髄由来の樹状細胞を、１０マイクログラム／ｍｌのオボアルブミンでパルスし、細胞当たりウイルス粒子（ＶＰ／ｃ）２０，０００個の、アデノウイルス構築物Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８、Ａｄ５−ｉＭｙＤ８８またはＡｄ５−Ｌｕｃ（対照）で形質導入した。細胞を、２マイクログラム／ｍｌのＣＤ４０Ｌ、２００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、または５０ｎＭのＡＰ１９０３二量体化薬のいずれかを用いて活性化した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ胸腺腫細胞５×１０５個を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝６／群）の背中に接種した。腫瘍が直径約５ｍｍに達したときに（接種の８日後）、マウスに、ＢＭＤＣ２×１０６個を皮下注射処置した。次の日に、細胞性のワクチン接種をした後、マウスに、５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を腹腔内注射処置した。腫瘍の成長を週２回モニターした。図２６Ａに結果が示されている。実験の別のセットでは、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍を上記の通り確立した。マウス（Ｎ＝６／群）を、ＢＭＤＣ２×１０６個で処置し（オボアルブミンでパルスした）、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８を２０，０００ＶＰ／ｃまたは１，２５０ＶＰ／ｃのいずれかで用いて形質導入した。ＡＰ１９０３群のＢＭＤＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで５０ｎＭのＡＰ１９０３を用いて処置した。次の日に、細胞性のワクチン接種をした後、ＡＰ１９０３群のマウスに、５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を腹腔内注射処置した。図２６Ｂに結果が示されている。図２６Ｃは、種々のワクチン細胞を凍結保存する前に一晩培養した後に産生された相対的なＩＬ−１２ｐ７０のレベルを示す。ＩＬ−１２ｐ７０をＥＬＩＳＡアッセイによってアッセイした。
改変された骨髄樹状細胞を用いて免疫化したマウスからの血液を、腫瘍特異的Ｔ細胞の頻度および機能について四量体染色を用いて解析した。図２７Ａは、マウス（Ｎ＝３〜５）を、オボアルブミンをパルスしたＢＭＤＣを用いて皮下免疫化し、図２６に記載の通り活性化した実験の結果を示す。ワクチン接種した１週間後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗ｍＣＤ８−ＦＩＴＣおよびＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｈ２−Ｋｂ−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。図２７Ｂは、上記の通りＢＭＤＣを用いてワクチン接種したマウスにおいて実施したｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイの結果を示す。ＢＭＤＣによる免疫化の２週間後に、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞を、ＴＲＰ−２対照ペプチドであるＳＶＹＤＦＦＶＷＬ、または標的ペプチドであるＳＩＮＦＥＫＬ標的のいずれかでパルスし、ｉｎ ｖｉｖｏ標的として使用した。脾細胞の半分を、６マイクロモルのＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｈｉ細胞）または０．６マイクロモルのＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｌｏ細胞）で標識した。ＣＦＳＥｈｉ細胞を、ＯＴ−１（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチドでパルスし、ＣＦＳＥｌｏ細胞を、対照ＴＲＰ−２（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）ペプチドと一緒にインキュベートした。ＣＦＳＥｈｉ細胞４×１０６個とＣＦＳＥｌｏ細胞４×１０６個の混合物を、尾静脈から静脈内注射した。次の日に、脾細胞を採取し、単一の細胞懸濁液を、ＣＦＳＥ標識された細胞を検出し定量化するために解析した。図２７Ｃおよび図２７Ｄは、ＩＦＮ−ガンマアッセイの結果を示す。図２６に記載の通り処置したＥ．Ｇ７−ＯＶＡ担持マウスからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１マイクログラム／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＯＴ−１）、ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（ＯＴ−２）およびＴＲＰ−２（無関連Ｈ２−Ｋｂ−制限）ペプチドを用いてＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて解析した。ＩＦＮ−ガンマ産生リンパ球の数を３連のウェルで評価した。群当たり３匹のマウスからの細胞をプールし、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳｐｏｔによって３連のウェルで分析した。アッセイを２回実施した。
図２８は、本実施例に示されている通り処置したマウスからの脾細胞を使用して実施した天然キラー細胞アッセイの結果を示す。マウス（群当たり３匹）から得た脾細胞をエフェクター（Ｅ）として使用した。Ｙａｃ−１細胞を５１Ｃｒで標識し、標的（Ｔ）として使用した。ＥＬ−４細胞株を無関連の対照として使用した。
図２９は、抗原特異的な細胞傷害性リンパ球を検出するためのアッセイの結果を示す。マウス（群当たり３匹）から得た脾細胞をエフェクターとして使用した。ＥＧ．７−Ｏｖａ細胞を５１Ｃｒで標識し、標的（Ｔ）として使用した。ＥＬ−４細胞株を無関連の対照として使用した。
図３０は、誘導性ＣＤ４０−切断型ＭｙＤ８８（ｉＣＤ４０．ＭｙＤＤ）アデノウイルスベクターで形質導入したヒト細胞の活性化の結果を示す。３つの異なるＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからの樹状細胞（培養５日目）をプラスチック−接着法によって精製し、１０，０００ＶＰ／細胞の、Ａｄ５−ｉＣＤ４０．ＭｙＤ８８、Ａｄ５−ｉＭｙＤ８８またはＡｄ５−Ｌｕｃで形質導入した。細胞を、１００ｎＭのＡＰ１９０３または０．５マイクログラム／ｍｌのＣＤ４０Ｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含有する標準の成熟化反応混液（ＭＣ）を用いて活性化した。自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ミクロビーズを使用して負の選択によって精製し、１０マイクログラム／ｍｌのＨＬＡ−Ａ２−制限ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ ＭＡＧＥ−３ペプチドでパルスしたＤＣと、１：５（ＤＣ：Ｔ）の比率で７日間共培養した。ＤＣ（７日目）を用いた第２ラウンドの刺激の５日後に、Ｔ細胞を標準のＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰｏｔアッセイにおいてアッセイした。細胞を、１マイクログラム／ｍｌのＭＡＧＥ−３または無関連のＨＬＡ−Ａ２−制限ＰＳＭＡポリペプチド（ＰＳＭＡ−Ｐ２）でパルスした。実験を３連で実施した。
図３１および図３２は、細胞遊走アッセイの結果を示す。ｍＢＭＤＣを、Ｇｅｎｅ Ｊａｍｍｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の存在下で、１０，０００ＶＰ／細胞のＡｄ５．ルシフェラーゼまたはＡｄ５．ｉＭｙＤ８８．ＣＤ４０で形質導入し、１００ｎＭのＡＰ１９０３（ＡＰ）またはＬＰＳ（１マイクログラム／ｍｌ）を用いて４８時間刺激した。ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の表面におけるＣＣＲ７の発現を、ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗体を用いた細胞内染色によって解析した。図３１は、この実験の結果を示し、各アッセイが別々に示されている；図３２は、結果を同じグラフに提供している。
（実施例１０）
特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例
（実施例１１）
ｉＣＤ４０をトランスフェクトされた樹状細胞を用いた患者の臨床処置
方法の要約
進行性転移性去勢抵抗性前立腺癌の男性を、ＢＰＸ−１０１を評価する３＋３用量漸増第Ｉ／ＩＩａ相試験に登録した。ＢＰＸ−１０１は、単一の白血球除去生成物から、水簸、単球のＤＣへの分化、Ａｄ５ｆ３５誘導性ヒト（ｉｈ）−ＣＤ４０を用いた形質導入、リポ多糖を用いた簡単な処理、および抗原をＰＳＭＡポリペプチド（前立腺特異的膜抗原）の形態で負荷することによって作製する。ＢＰＸ−１０１を、２週間ごとに６用量皮内投与した。各用量の２４時間後に、活性化剤であるＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を１用量注入した。急性期の間に探索的臨床評価および免疫学的評価を実施し、これは、４週間ごとの血清ＰＳＡ、１２週間ごとのＣＴ／ＭＲＩおよび放射性核種骨スキャン、第５週における注射部位のＤＴＨ皮膚生検および抗原特異的な免疫応答についてのアッセイ、ならびに週に１回の、全身免疫応答に関する血清サイトカインおよびＩＬ−６の測定を含んだ。試験に登録された被験体１２人に関して、平均のハラビィの予測生存（Ｈａｌａｂｉ−ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ）は１３．８カ月であった。
ワクチン
Ａｄ５ｆ３５−ｉｈＣＤ４０
誘導性のヒトＣＤ４０受容体を、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）に由来する複製欠損性Ａｄ５ベースのベクターにクローニングした。Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスは、多用途のＡｄＥａｓｙシステム（Ｇｉｔｔｅｓ， Ｒ．Ｆ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３２４， ２３６−４５ （１９９１））にクローニングされており、Ａｄ５線維尾部ドメインおよびＡｄ３５線維シャフトドメインおよびノブドメイン（ｓｈａｆｔ ａｎｄ ｋｎｏｂ ｄｏｍａｉｎｓ）からなる遺伝子操作された遺伝子を含有する。Ａｄ５ｆ３５ウイルスは、宿主細胞に侵入するための受容体として、遍在的に発現されるＣＤ４６を利用するので、造血性起源の細胞に対する効率的な向性を有する（Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｅ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．，［ｅｒｒａｔｕｍ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８９ Ｎｏｖ １６；３２１（２０）：１４２０］． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３２１， ４１９−２４ （１９８９））。
Ａｄ５ｆ３５−ｉｈＣＤ４０は、多数の成分：
・ヒトｃ−Ｓｒｃ由来のミリストイル化ターゲティングドメインの１つのコピー（Ｍｙｒ）
・「ゆらいだ」コドンを含有するヒトＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）の１つのコピー（Ｆｖ’）
・ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）の１つのコピー（Ｆｖ）
・短いＧ−Ｓ リンカー（ｌｓ）
・ヒトＣＤ４０の細胞質ドメイン（ＣＤ４０ｃ）
を含む単一の導入遺伝子をコードする。
導入遺伝子の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターによって制御される。
ｃ−Ｓｒｃ（１４アミノ酸）のＮ末端がミリストイル化された膜局在化ドメインを使用して、ｉＣＤ４０受容体を細胞内の膜に局在化させる。ｃ−Ｓｒｃ由来のミリストイル化ターゲティング配列を、最初に、サブクローニングし、ＦＫＢＰドメインにつなぐために都合のよい制限部位を含有するＰＣＲオリゴヌクレオチドとして設計した。
ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）：Ｆ３６がＶに置換された、ヒトの１２ｋＤａのＦＫ５０６結合性タンパク質は、完全な成熟コード配列（アミノ酸１〜１０７）であり、合成の二量体化薬であるＡＰ１９０３の結合部位をもたらす（Ｊｅｍａｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃ． ５８， ７１−９６ （２００８）； Ｓｃｈｅｒ， Ｈ．Ｉ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ， Ｗ．Ｋ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１， １５６６−７２ （１９９３））。このタンパク質の２つのタンデムなコピーを構築物に含めて、ＡＰ１９０３によって架橋すると高次のオリゴマーが誘導されるようにする； ＣＤ４０の活性化は、通常、受容体三量体の形成を必要とする。
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンがゆらいだ型である。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは、わずかに６２％の相同性のみを有する。レトロウイルスベクターにおける組換えを低下させるためにＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを設計した（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ， Ｐ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５７， １７３１−５ （１９９７））。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを、ＰＣＲ組み立て手順によって構築した。導入遺伝子は、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰの１つのコピーに直接連結したＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰの１つのコピーを含有する。
ＣＤ４０：ＣＤ４０受容体のｃＤＮＡ配列は、ヒトＣＤ４０遺伝子（１８８アミノ酸）の６２アミノ酸細胞質ドメイン全体をコードする。この領域は、ＴＮＦファミリーの受容体を下流のシグナル伝達分子、例えば、ＮＦ−κＢなどと架橋するアダプタータンパク質であるＴＮＦ受容体関連因子２、３および６（ＴＲＡＦ２、３および６）のための多数の結合部位を含む（Ｓｍａｌｌ， Ｅ．Ｊ． ＆ Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ， Ｎ．Ｊ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５， ３８２−８ （１９９７）； Ｓｃｈｅｒ， Ｈ．Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８８， １６２３−３４ （１９９６））。
その後、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙのベクターコア施設において誘導性ＣＤ４０を非複製的なＥ１、Ｅ３−欠失Ａｄ５ｆ３５ベースのベクターにサブクローニングし、その後、関連するＧＭＰベクター作製施設において再プラーク精製し、増幅した。図４４は、ＣＤ４０発現ベクターのマップを示し、図３３は、プラスミドＡｄ５ｆ３５ｉｈＣＤ４０のマップを示す。
ＰＳＭＡ
ＰＳＭＡタンパク質の細胞外ドメインを使用してＭｏＤＣをパルスする。最初に、ＰＳＭＡの細胞外部分の大部分を、ＰＳＭＡクローンＩＤ５２０７１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲ増幅して、２１００ｂｐを得た。この断片を、バキュロウイルス由来のプロモーターおよび豊富な外被表面糖タンパク質であるｇｐ６７由来のアミノ末端の疎水性分泌シグナルペプチドを含有する移入ベクターにサブクローニングした。潜在的な追加的な免疫原性エピトープを含有するＰＳＭＡの前立腺形態に見出されるエクソン１８を付加するために、ヒトＬＮＣａＰ細胞由来のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、ＰＳＭＡの３’末端（約残基６２０〜７５０）を含有する４０８ｂｐの断片を得た。この断片をサブクローニングして、全長のｐＡｃＧＰ６７．ＸＰＳＭＡｘ１８を得、それを、オープンリーディングフレーム全体を通して配列決定した。組換えファージを作出するために、プラスミドｐＡｃＧＰ６７．ＸＰＳＭＡｘ１８を、Ｓｆ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１４９６〜０１５）にＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）ＤＮＡ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と同時トランスフェクトした。ウイルスストックを回収し、２ラウンドのプラーク精製に供した。１つのプラークを選択し、Ｐ１ウイルスストックのレンダリングを拡大し、それを増幅して、力価の高いストックを生成するために使用するＰ２ウイルスストックを生成した。細胞を、常時無血清の昆虫培地（Ｓｆ９００ ＩＩＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。ＰＳＭＡを発現しているバキュロウイルスストックを使用して、Ｗａｖｅバイオリアクター内のｅｘｐｒｅｓｓＳｆ＋（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）細胞の無血清培養物に感染させた。一度発現し、翻訳後修飾を受けたら、アミノ酸配列は、もはやシグナルペプチド配列を含まない。上清を回収し、清澄化し、次いで、接線限外濾過（ＵＦ）によって濃縮し、後のステップにおいて使用するカラム用のローディング緩衝液中にダイアフィルトレーションし、０．２μｍの膜を通して濾過し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。溶出したＰＳＭＡを採取し、緩衝液をＰＢＳと交換した。この材料をナノ濾過し、滅菌濾過し、およそ０．４ｍｇ／ｍＬの濃度でバイアルに分注し、−８０℃で貯蔵した。
ＬＰＳ
ＬＰＳは、ＴＬＲ−４リガンドであり、ＢＰＧＭＡＸ−ＣＤ１を完全に機能的活性化するための重大な成分である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｏｓａ由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し、γ照射し、細胞培養試験する。単一のロットを使用してＢＰＸ−１０１のＭｏＤＣを同時活性化する。
自己細胞プロセシング
ドナー単核細胞を、アフェレーシスによって得、樹状細胞前駆体を水簸によって選択する。培養物中の前駆細胞を８００Ｕ／ｍＬのヒトＧＭ−ＣＳＦを用いて、および無血清のＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＤＣ培地については５００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−４で刺激することによってＭｏＤＣを生成する。未成熟のＤＣを回収し、ＰＳＭＡタンパク質（約１０μｇ／ｍＬ）でパルスし、次いで、Ａｄ５ｆ３５−ｉｈＣＤ４０で形質導入し、ＬＰＳおよびＡＰ１９０３二量体化薬で活性化する。その後、成熟ＭｏＤＣを広範囲にわたって洗浄し、回収し、最終生成物ＢＰＸ−１０１として凍結保存する。
完全なＢＰＸ−１０１活性化の後（ＬＰＳを加えた２４時間後）、内部移行しなかったＬＰＳを大規模な洗浄によって除去する。ＢＰＸ−１０１原薬の各バッチの放出検査は、純度の評価として内毒素の定量化を含んだ。
安定性および貯蔵
製剤ワクチンであるＢＰＸ−１０１は、原薬細胞懸濁液を、臨床で使用するまで凍結し細胞の完全性を維持しやすい処方に調整することによって直接、即座に調製する。これは、適量の保存料（ＨＳＡ）、Ｃｒｙｏｓｅｒｖｅ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＰｌａｓｍａＬｙｔｅを慎重に加え、最終的な細胞懸濁液を制御された凍結手順に供することによって実現される。完全に活性化された細胞調製物（原薬）の処方の第１のステップは、３％のＨＳＡを含有するＰｌａｓｍａＬｙｔｅ−Ａを加えることによって濃度を調整して、総細胞計数および生存能力データ（原薬放出試験）に基づく標的用量（１ｍＬ当たり生存細胞４×１０６個、１２．５×１０６個または４０×１０６個）を実現することである。次いで、細胞調製物を、モニターされている冷蔵庫中で少なくとも１５分間にわたって１〜６℃に冷却する。冷却した凍結保護物質溶液（ＤＭＳＯ／２５％のＨＳＡ／ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ−Ａ、１５：３５：５０ｖ／ｖ／ｖ）を細胞生成物に、制御された速度、１：１の体積比（最終的に体積で７．５％のＤＭＳＯ）で加える。冷却した細胞調製物を、前標識したｃｒｙｏｂａｇｓ（Ｃｒｙｏｃｙｔｅ（商標）、Ｂａｘｔｅｒ、現在はＦｅｎｗａｌｌ Ｂｌｏｏｄ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＶｕｅＬｉｆｅ（商標）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中の個々の用量に適切に分注する。この最終生成物を、標準の速度制御凍結プロセスを用いて凍結保存し、次いで、使用するために診療所に送るまで、蒸気相で貯蔵するために連続的にモニターされる液体窒素貯蔵チャンバーに移す。
ＢＰＸ−１０１の調製および投与
白血球除去およびＡＰＣ前駆体の採取：最初の６回のワクチン接種の４週間前に、患者に対して、標準の、最大１２Ｌ（約１．５〜２．５×血液体積）の白血球除去手順をおよそ４時間にわたって行い、末梢血単核細胞（リンパ球および単球）を回収し、１〜３０×１０９個の範囲の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る。
白血球除去手順に先立って、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を樹立するために使用するために血液約５ｍＬを抜き取った。
患者には、白血球除去の予約日の朝にはカルシウムが豊富な食物を食べるように指示することができる。白血球除去した後、生成物を細胞プロセシングセンターに輸送する。白血球除去生成物からＢＰＸ−１０１を調製し、その後、白血球除去手順のおよそ４週間後に、投与するために放出する。
採取したすぐ後に、白血球除去生成物を、ＢＰＸ−１０１にプロセシングするために細胞プロセシングセンターに輸送する。ＢＰＸ−１０１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）で構成され、Ａｄ５ｆ３５−ｉｈＣＤ４０で形質導入され、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインを含有するＰＡ００１（ＰＳＭＡ）１０マイクログラム／ｍｌで抗原を負荷され、次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３二量体化薬および２５０ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて活性化される。ワクチン調製後、ＰＡ００１が負荷された遺伝子改変された単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ、ＢＰＸ−１０１の生物活性のある成分）を、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ−Ａ／ＨＳＡ／ＤＭＳＯで希釈して、生存可能なＭｏＤＣ４×１０６個、１２．５×１０６個または４０×１０６個の個々の標的用量を実現し、これを、それぞれ２００μＬの一定分量（それぞれ、２００μＬの一定分量当たり細胞０．８×１０６個、２．５×１０６個および３．１×１０６個の濃度）５つまたは８つに分ける。
その後、白血球除去手順のおよそ４週間後に、投与するためにＢＰＸ−１０１を放出する。細胞生成物を放出する前に、その品質管理検査を実施する（すなわち、生存能力、滅菌、内毒素、汚染物質）。
ＢＰＸ−１０１は、外来患者の白血球除去手順の間に採取された単球由来の成熟した、抗原を発現しているＤＣで構成される。中心的なＧＭＰプロセシング施設において行われる６日間のプロセスの終わりに、これらの細胞を、ｉＣＤ４０をコードするアデノベクターで形質導入し、組換えＰＳＭＡと一緒にインキュベートし、ＡＰ１９０３およびＬＰＳを用いて予備活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅ）した。生じたワクチン細胞を洗浄し、個々の用量（約１年の処置のために十分な用量）で凍結保存する。各投薬事象は、多数回の皮内注射によるＢＰＸ−１０１ワクチン投与、次いでその２４時間後の静脈内注入によるＡＰ１９０３の投与からなる。
貯蔵および生成物の安定性：投与する前に、ＢＰ−ＧＭＸ−ＣＤ１ワクチンを−７０℃で凍結して貯蔵する。
ＢＰＸ−１０１の投与
患者に、ワクチン投与する３０分前に、アセトアミノフェン（１，０００ｍｇ）を経口で、およびジフェンヒドラミン（ベナドリルまたはジェネリック、２５〜５０ｍｇ、経口）を前投薬する、または施設の標準に従う。ＢＰＸ−１０１を使用する直前に３５〜３９℃のウォーターバス中で解凍し、次いで、２〜８℃で貯蔵し、解凍した後できるだけ早く投与する。
処置は細胞４×１０６個（コホート１）で開始し、隔週で、次に細胞１２．５×１０６個（コホート２）で開始し、次に細胞２５×１０６個（コホート３）で開始した。ＢＰＸ−１０１をコホート１および２については総用量１ｍＬを投与し、コホート３については総用量１．６ｍＬを投与し、２００μＬの増加量で、コホート１および２については、背側の前腕、上腕および太ももに、上腕と背側の前腕に交互に、および両側間に交互に各ワクチンの追加免疫を伴い；コホート３については、背側の前腕、上腕および太ももに、両側に交互に各ワクチンの追加免疫を伴う。各注射は少なくとも２ｃｍ離して投与する。各位置に少なくとも２回注射する；すなわち、１つの位置に４回注射し、別の位置に１回注射することは許容されない。ワクチンは、各注射部位において３つの角度から投与して、最大の体積の受容を確実にする。
各注射部位を丸で囲み、消えないマーカーで番号を付すことができる。最低でも２ｃｍ離して注射する。１回の来診時に同じ位置に注射し、次の来診時には別の位置に交代する。
患者を、注射した後３０分間、不都合な有害作用について観察する。
注射用ＡＰ１９０３
ＡＰ１９０３ ＡＰＩはＡｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．により製造され、注射用のＡＰ１９０３製剤はＦｏｒｍａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．により作出された。注射用のＡＰ１９０３製剤は、非イオン性の可溶化剤であるＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ、ＢＡＳＦ）の２５％溶液中５ｍｇ／ｍＬのＡＰ１９０３溶液として処方する。この処方は、室温で透明でわずかに黄色の溶液である。冷蔵に際して、この処方は可逆的な相転移を受け、乳状の溶液になる。この相転移は、室温に再加温すると逆転する。一杯の量は、３ｍＬのガラスバイアル中２．３３ｍＬである（バイアル当たりの注射の総計に対するＡＰ１９０３は約１０ｍｇである）。
ＡＰ１９０３を、患者に投薬する前夜に冷蔵庫から取り出し、およそ２１℃の温度で一晩貯蔵し、溶液が希釈前に清澄化されるようにする。ガラスまたはポリエチレンのビンまたは非ＤＥＨＰバッグへの注入を開始した３０分以内に溶液を調製し、投薬する前におよそ２１℃で貯蔵する。
全ての試験薬物を２℃から８℃の間の温度で維持し、過剰な光および熱から保護し、立ち入りが制限された鍵のかかった区域において貯蔵する。
投与
各ワクチン接種サイクルの２４時間（±４時間）後に、患者に、単一の固定用量の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシドの滅菌注入セットを使用して２時間にわたってＩＶ注入によって投与する。ＡＰ１９０３の用量は患者全てについて個別に算出し、体重が１０％以上上下する場合を除き、再算出しない。注入する前に、算出された用量を０．９％の通常の生理食塩水１００ｍＬ中に希釈する。
患者を、注入が終わった後、不都合な有害作用について１５分間観察する。
試験における全患者は、第１３週までに、またはその後に進行を示されなければ、合計１１回のワクチン接種を受ける。患者は、第５１週の時点でその患者の最後の用量を受ける。第１週は、ＢＰＸ−１０１を用いた１回目のワクチン接種をした週と定義される。
ＢＰＸ−１０１は、細胞４×１０６個または１２．５×１０６個の総ワクチン接種用量レベルに対して合計５×２００μＬのＩＤ注射で投与する、または細胞２５×１０６個の最大総ワクチン接種用量レベルに対して合計８×２００μＬのＩＤ注射で投与する。最大の用量を、アフェレーシス生成物の水簸およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４に媒介される単球前駆体の分化の後に最大５．４×１０８個のＤＣを生成することができる、標準約１２Ｌの白血球除去から得ることができるＤＣの最高レベルとして選択した。試験のために選択される最大用量（１ｋｇ当たり細胞約０．５３×１０６個）は、マウス薬理学モデルにおいて使用される改変されたＤＣの最高用量（１ｋｇ当たり細胞８０×１０６個）のおよそ２４０分の１である。
以前のＡＰ１９０３の第Ｉ相試験において、健康なボランティア２４人を、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルの注射用ＡＰ１９０３を２時間にわたってＩＶ注入する単回用量で処置した。ＡＰ１９０３の血漿レベルは、用量に正比例し、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたり、平均Ｃｍａｘ値はおよそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲であった。最初の注入期間の後、血中濃度は急速な分布相を実証し、投与後０．５時間、２時間および１０時間において、血漿レベルがそれぞれ最大濃度のおよそ１８％、７％、および１％に低下した。注射用ＡＰ１９０３は、全用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好都合な薬物動態プロファイルが実証された。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４１： ８７０−９， ２００１。
この試験において使用する注射用ＡＰ１９０３の固定用量は、２時間にわたって０．４ｍｇ／ｋｇの静脈内注入である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の有効なシグナル伝達のために必要なＡＰ１９０３の量は１０〜１００ｎＭ（ＭＷ１６００Ｄａ）である。これは、１６〜１６０μｇ／Ｌまたは約０．０１６〜１．６ｍｇ／ｋｇ（１．６〜１６０μｇ／ｋｇ）と等しい。上記のＡＰ１９０３の第Ｉ相試験では１ｍｇ／ｋｇに至るまでの用量が、耐容性がよかった。したがって、０．４ｍｇ／ｋｇは、この第Ｉ相試験に関して、ＢＰＸ−１０１と組み合わせて安全かつ有効なＡＰ１９０３の用量でありうる。
臨床的な研究デザイン
臨床試験には３つのコホートが含まれる。
用量レベル：
コホート１：ＢＰＸ−１０１、１．０ｍＬ中細胞４×１０６個
コホート２：ＢＰＸ−１０１、１．０ｍＬ中細胞１２．５×１０６個
コホート３：ＢＰＸ−１０１、１．６ｍＬ中細胞２５×１０６個
ＢＰＸ−１０１治療的ワクチンを、ＩＤ注射５回で細胞４×１０６個もしくは１２．５×１０６個、またはＩＤ注射８回で細胞２５×１０６個の用量で投与する。
（実施例１２）
臨床的な評価
アッセイ
方法：各ワクチン接種の直前および１週間後に血液を採取した。遠心分離した（１５００ｇ）血清試料を分注し、後のバッチ検査のために液体窒素中に貯蔵した。希釈していない試料を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦ−αについての分析物を含むＭｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ）を２連で解析した。データを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して解析した。少なくとも部分的に標準範囲（３．２〜１０，０００ｐｇ／ｍＬ）の内側に入った全てのマーカーを各チャートに含めた。
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）
ＩＦＮ−ガンマ産生Ｔ細胞の段階的なレベルを、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定する。記述的な分析（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ＩＦＮ−ガンマ産生Ｔ細胞データを要約する。これらの分析は、以下の測定に基づく：各評価時間におけるベースラインからの変化、各評価時間における、ベースラインを引いた平均の曲線下面積（ＡＡＵＣＭＢ）、最初の６回のワクチン接種についてのＡＡＵＣＭＢ、全ての評価についてのＡＡＵＣＭＢ、最初の６回のワクチン接種後および全ての評価の中の最大値、ならびに最大値までの時間。
統計学的モデリングを実施して、ＩＦＮ−ガンマ産生Ｔ細胞と客観的奏効率の依存関係を評価する。コックス比例ハザード回帰モデルを使用して、この依存関係を評価する。「事象」は、ＣＲまたはＰＲの確認の最初の実現であり、この事象までの時間は、試験薬物の初回投与から測定する。この解析において使用されるＩＦＮ−ガンマ産生細胞のデータは、試験処置を開始した後、客観的奏効率を最後に有効評価するまでに収集された値に限られる；奏効の事象では、事象日までおよび事象日の細胞のデータのみを使用する。モデルは、用量、ベースラインのＩＦＮ−ガンマ細胞レベル、およびＩＦＮ−ガンマ産生細胞のレベルの時間依存性の共変量についての項目を含むようにパラメータ化する。
さらに興味深いのは、それにより奏効が予測される、単一のＩＦＮ−ガンマ産生細胞の値を同定することである。ログランク統計値に基づくカットポイント解析を適用して、全患者の中からこの単一の値を選択することに役立てる（Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３５１： ７８１−９１， ２００４．）。最良の客観的反応が結果変数であり、最良の反応日までおよび最良の反応日の細胞計数のベースラインからの最大の変化が、対象とする「危険」因子である。試料サイズが小さいので、カットポイントの選択においてｐ値０．１０を使用する。
ＣＴＬ反応
ＣＴＬ反応は、従来の方法によって決定することができる。本実施例では、ＰＳＭＡポリペプチドでパルスした自己ＬＣＬを、細胞傷害性アッセイにおいて、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を再刺激することを必要とするアッセイにおいて、ＡＰＣとして使用する。各患者に対して、Ｂ９５−８細胞株によって産生されるＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス含有上清を使用することにより、末梢性のＢ細胞を外因性ウイルスで形質転換することによってＬＣＬを樹立する。ＬＣＬをＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＢＳ中で維持する。ＬＣＬの生成には、臨床試験への登録時に得た血液５ｍｌが必要である。
特異的な溶解の百分率によって算出されるＣＴＬ反応を、各試験時点において決定し、ベースラインレベルと比較する。これらのデータの解析は、記述統計値に基づき、各評価時間において要約されている。非欠損の程度に応じて、客観的奏効率のＣＴＬ反応に対する依存性を評価するための探索的解析を、ＩＦＮ−ガンマ産生細胞のデータに対して提唱されたものと同様に行う。
任意選択のアッセイ：ＨＬＡ−Ａ２＋患者のみがこの任意選択のアッセイに含まれる。ＬＮＣａＰ細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＰＳＭＡ＋）を標的細胞として使用し、ＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞（Ａ２＋／ＰＳＭＡ−）が陰性対照としての機能を果たす。ＰＳＭＡ抗原認識を、５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて３７℃で１時間標識し、３回洗浄した標的細胞を使用して評価する。標識した標的細胞（５０μＬ中細胞５０００個）をエフェクターＣＤ８＋細胞（１００μＬ）に、エフェクター：標的細胞比５：１、１０：１、２５：１、および５０：１で加える。３７℃で４時間インキュベートした後に回収した上清においてクロムの放出を測定する。特異的な溶解の百分率を：１００×［（実験的な放出−自然発生的な放出）／（最大の放出−自然発生的な放出）］として算出する。
ＢＰＸ−１０１＋ＡＰ１９０３を投与した後、コホート１の患者６人中６人が、１つまたは複数のワクチン接種部位において遅延型の過敏症（ＤＴＨ）反応を示す紅斑症および硬結を発症した。３回目のワクチン接種の１週間後に採取した単一の注射部位の生検（６ｍｍ）からＴ細胞を増大させた。ＩＬ−２を含有する培地中で４週間培養した後、フローサイトメトリーにより、約３０〜６０％のＣＤ４＋ Ｔ細胞および２〜１０％のＣＤ８＋ Ｔ細胞が明らかになった。抗原特異的な反応を、（ａ）ＰＳＭＡまたは（ｂ）オボアルブミン（対照）タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）または（ｃ）Ａｄ５ｆ３５−空のアデノウイルス（ウイルス粒子（ＶＰ）５００個／ＬＣＬ）の存在下で、Ｔ細胞と、抗原提示細胞としてのＥＢＶで形質転換された自己リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を種々の比率にして解析した。上清を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦ−αについての解析物を含むＭｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ）を使用して２連で解析した。チャートは、Ｔ細胞、ＬＣＬおよび抗原を含有する群におけるサイトカインのレベルが、抗原を伴わないＴ細胞およびＬＣＬと比較して倍に増加したことを示す。各抗原について、一元配置ＡＮＯＶＡによって、Ｔ＋ＬＣＬ＋抗原とＴ＋ＬＣＬの間のボンフェローニの多重比較事後検定を用いてＰ値を算出する。
サイトカイン
各ドナーからのＢＰＸ−１０１を、自己Ｔ細胞と７日間共培養し（ＤＣ：Ｔ細胞比１：１０）、（８日目にＢＰＸ−１０１で再刺激する）。上清を回収し、Ｔｈ１（ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ）およびＴｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０）サイトカインを発現させるためのＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔによって解析する。
異なる時点で採取した患者からの血清を、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ）を使用して解析して、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン、例えば、（ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）などのレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００ ＩＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で決定する。被験体６人中４人からの生検材料が抗原特異性について評価可能であり、全てが陽性であった。被験体＃１００４（上記）および＃１００１では、ＴＨ１反応を示唆するサイトカインの増加が引き出され、一方、被験体１００５および１００６では、ＴＨ２反応が示唆された。しかし、このデータは、全被験体においてＴＨ１反応を引き出すには不十分でありうる３回の用量の後に生成された。
活性化マーカー
末梢血白血球をＢＰＸ−１０１と一緒に２４時間インキュベートし、Ｔ細胞の種類（ＣＤ４［ヘルパー］またはＣＤ８［細胞傷害性］）および活性化の状態（ＣＤ２５［初期の活性化およびＴＲＥＧサブセット］、ＣＤ４５Ｒ０［活性化および記憶サブセット］、およびＣＤ６９［初期の活性化］）に特異的な抗体のパネルを用いて染色した後、フローサイトメトリー解析する。
これらのデータの解析は、記述統計値に基づき、各評価時間において要約する。グラフィカルな方法を使用して、変化をある期間にわたってさらに探究する。評価される測定値は、以下のＴ細胞の種類のベースラインからの実際の変化を含む：ＣＤ４（ヘルパー）、ＣＤ８（細胞傷害性）および活性化の状態（ＣＤ２５［初期の活性化およびＴＲＥＧサブセット］、ＣＤ４５Ｒ０［活性化および記憶サブセット］、およびＣＤ６９［初期の活性化］）。
他の免疫学的マーカー
患者の末梢血中の天然キラー（ＮＫ）細胞の活性を、単純なＮＫ細胞アッセイによって決定する。患者の白血球を、異なる希釈度で、普遍的なＮＫ標的であるＫ５６２細胞と一緒に２〜４時間培養する。次いで、Ｋ５６２の死滅の程度を、フローサイトメーターを使用してヨウ化プロピジウム排除の損失によって決定する。
注射部位の紅斑症（もしあれば）の程度も、炎症組織の直径の直接的な測定値として決定する。４回目のワクチン接種の２〜３日後に、大部分の炎症を示す部位のいずれかから取得するパンチ生検を行うことを予定する。炎症が観察されない、または確認される炎症がわずかである（＜１ｃｍ）場合、生検材料は、注射部位のうちの任意の１つから取得する。リンパ球の浸潤を組織学的検査および免疫組織学的検査によって決定する。得られた生検材料を２つのおよそ均等な切片に分割する。１つの部分は、抗ＣＤ８、抗グランザイムＢ、および他の可能性のあるマーカーを使用する免疫組織学的検査のために凍結保存する。第２の部分は、小さな小片に切り、ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＢＳと一緒に培養する。これらの組織小片から遊出した白血球をＩＬ−２と一緒に培養する。２週間培養した後、Ｔ細胞を、自己ＡＰＣで刺激した際のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの産生について試験する。
各患者からの週に１回の定期的な採血を、血清サイトカイン／ケモカインの広範なパネルにおいて評価した。被験体６人中４人（＃１００３（パネルＡ）、＃１００４（パネルＣ）、＃１００５および＃１００６を含む）において、各ワクチン接種の１週間後にＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１の全身的な上方制御が実証された。ＴＮＦ−αおよびＩＰ−１０は、全被験体において検出可能であったが、いずれの被験体においても、最小の、用量に関連する変化が示される。
被験体６人中２人（＃１００１（パネルＢ）および＃１００２）において、検出可能な血清サイトカインの変化の一貫したパターンは実証されなかった、しかし、これらの被験体は、最低の全体的な腫瘍負荷量を有し、少なくとも１人（＃１００１）では抗原特異的な反応が実証された（＃１００２は、評価不可能であった）。これは、低体積疾患の患者における腫瘍特異的な反応が血清サイトカインレベルに影響を及ぼさない可能性があることを示唆している可能性がある。
用量に関連するサイトカインの変化を、全サイトカインおよび６用量全てについて、各用量の投与後のサイトカインのレベルの、重みをかけられていない平均的変化を算出することによって数量化した。この解析により、平均の投与後の変化がそれぞれ−２％および−６％であるが、＃１００１においても＃１００２においても、一貫した血清の変化のパターンが示されなかったことが確認される。また、中間用量コホートの被験体３人中３人が、各用量の投与の１週間後に血清サイトカインの有意な増加を示した（平均的変化の範囲＋４２％〜＋７２％）。さらに、被験体１００３は、劇的な血清サイトカインの攪乱（平均的変化＋２８３％）を示した。ＭＣＰ−１のレベルは、ワクチン接種＃１、２、３、および５の１週間後に、ベースラインレベルに対してそれぞれ１７．５倍、１７．２倍、４．２倍および６．８倍に急上昇し、それぞれの場合において、翌週にベースラインレベルの８〜３０％に戻った。ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦのレベルは同様のパターンに従った；ＧＭ−ＣＳＦは、ワクチン接種＃１、２、３、および５の１週間後に、検出不可能なベースラインレベルから、それぞれ２２．０ｐｇ／ｍｌ、１６．２ｐｇ／ｍｌ、９．９ｐｇ／ｍｌ、および１１．７ｐｇ／ｍｌに急上昇し、翌週に検出不可能なレベルに戻った。パネルにおける分泌された因子の用量に関連する変化は図４５〜５０に示されている。このパネルは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦおよびＨＧＦを含む。
薬物動態のエンドポイント
ＡＰ１９０３の平均血漿濃度を各時点で決定する。ＡＰ１９０３の血漿濃度は試験期間中の限られた数の時点で決定するので、薬物動態パラメータの決定はできない。
バイオマーカーのエンドポイント
ＰＳＡベースの転帰
ＰＳＡ反応（３０％以上の低下を実現する患者および５０％以上の低下を実現する患者の割合）を、３カ月の時点で、各患者のベースラインからの最大の変化を用いて要約する。ウォーターフォールプロットを使用してＰＳＡの変化を示すことができる。ＰＳＡの動態（速度の変化および倍加時間）を、記述統計値を用いて要約する。さらに、処置後のＰＳＡの倍加時間を、処置前のＰＳＡの倍加時間と比較する；ＰＳＡの倍加時間（ＰＳＡ勾配／ＰＳＡ速度の変化）において２５％以上の増加を示す患者の割合を表にする。測定された場合、ＰＳＡの他の形態も要約する。
ＰＳＡ疾患進行
療法後にＰＳＡの減退を経験した患者について、最下点の値からのＰＳＡレベルの２５％以上の上昇および２ｎｇ／ｍＬ以上の絶対的増加である最初のＰＳＡ増加を、少なくとも３週間離して少なくとも１つの追加的な決定に際して文書に記録する。一度確認されたら、最初にＰＳＡがこの進行の判定基準に適合した日が、ＰＳＡが進行した日になる。
ベースラインからの減退がない場合、処置前の値からのＰＳＡレベルの２５％以上の上昇および２ｎｇ／ｍＬ以上の絶対的増加を、療法の開始から少なくとも１２週間目に文書に記録する。
ＰＳＡ倍加時間：ＰＳＡ倍加時間は以下の方程式を使用して算出する：ＰＳＡ倍加時間＝［ｌｏｇ（２）ｘ ｔ］÷［ｌｏｇ（最終的なＰＳＡ）−ｌｏｇ（最初のＰＳＡ）］、「ｌｏｇ」は自然対数関数であり、「ｔ」は最初のＰＳＡレベルから最終的なＰＳＡレベルまでの時間である。試験処置を開始する前に測定された最後のＰＳＡレベルが、最初のＰＳＡと定義される。最終的なＰＳＡ値は、試験処置を開始した後、被験体の時点の前に測定された最後のレベルである。ＰＳＡ倍加時間は、療法の前、ならびに療法を開始した後の全ての時点で評価する。患者が、ＰＳＡ進行を有するとみなされた時間を用いて追加的な解析を実施する。
ＰＳＡの速度および勾配：処置前の年間のＰＳＡ速度（１年当たりのＰＳＡの変化の速度）および勾配を、試験中の療法の前の３つ以上のＰＳＡ測定値から、単純な線形回帰によって算出する。完全な日付を伴うＰＳＡ測定値を生じさせて処置前のＰＳＡ速度および勾配を決定する。試験の最初の３カ月の間の処置後のＰＳＡ速度は、線形回帰を使用して（ベースラインの測定値に加えて、２つ以上のＰＳＡ測定値を有する患者）、およびＰＳＡの対数の比率の変化によって（ベースラインの測定値に加えて、ただ１つのＰＳＡ値を有する患者）コンピュータで計算する。生じた適合が最良である株の勾配を使用して、ＰＳＡ速度を決定し、ＰＳＡ速度を評価し、勾配を、療法の前、ならびに療法を開始した３カ月後に評価する。
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）
インタクトな（かつアポトーシス性の）ＣＴＣを、ＰＣａ患者の新鮮な末梢血から濃縮し、上皮細胞の存在について、ＥｐＣＡＭ＋細胞を免疫磁気捕捉するためのＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ技法、次に有核のＣＤ４５陰性およびサイトケラチン（８、１８、１９）陽性細胞について免疫染色を用いて解析する（Ｓｈａｆｆｅｒ ＤＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３： ２０２３−９， ２００７）。一般には、健康なボランティアにおいては５ＣＴＣ／１０ｍＬ未満の血液試料が見出され、ＰＣａ患者においては５超が見出される。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法は、乳癌の出現および進行の診断において首尾よく用いられている（Ｓｃｈｅｒ ＨＩ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００８ Ｍａｒ １； ２６（７）：１１４８−５９）。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法は、乳癌に関して、およびつい最近前立腺癌に関してＦＤＡに承認されており、Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されている。どちらもＥｐＣａｍ＋細胞であるので、ＰＣａについてのアッセイは乳癌と基本的に同一である。
ＣＴＣの、ベースラインからの実際の変化および平均の変化を、各評価時点で決定し、説明的に要約する。さらに、データにより可能な場合、５０％以上の低下を有する患者および９０％以上の低下を有する患者の割合を決定する。患者を、ベースラインを確立するために処置前、４回目のワクチンの前、最初の６回のワクチンの後、４〜６カ月（すなわち１〜２回の追加免疫）後、および１０カ月後に試験する。
有効性の解析
主要有効性解析を、ＦＡＳを使用して実施する；ＰＰＳを使用して実施した解析は、いずれも捕捉的なものとみなされる。
最大尤法を使用して、処置効果の点推定および区間推定を算出する。ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従って、処置を開始する前４週間以内にベースライン評価を実施するべきである；しかし、この第Ｉ相試験の効力のエンドポイントは単に探索的なものである。したがって、スクリーニングスキャンの結果をベースラインとして使用する。最良の客観的奏効率および第１３週の奏効率を、ＣＲまたはＰＲが確認された患者の総数をＦＡＳ（または捕捉的な解析としてＰＰＳ）で割ったものとして算出する。ＣＲが確認された被験体については個別解析も行う。処置を開始した後に評価できない患者は、ＦＡＳデータセットにおいて処置不成功に分類する。
ＣＲまたはＰＲを有する患者についてのみ、ＴＴＲおよび奏効期間を算出する。ＴＴＲは、試験薬物を投与した最初の日と客観的奏効判定基準に適合した最初の日の間の差異（日数単位）を反映する。奏効期間は、どちらの事象が早くても、奏効判定基準に適合した最初の日と疾患進行または死亡についての客観的判定基準に適合した最初の日の間の差異（日数単位）を反映する。進行判定基準に適合しない患者は、有効な評価によって疾患進行がないことが確認された最終日にその患者の事象時間を打ち切る（ｃｅｎｓｏｒ）ことができる。
処置後の腫瘍の評価を欠く患者は、試験薬物を投与した最初の日にその患者のＰＦＳ時間を打ち切ることができる。感受性解析を行って、失敗したまたは予定から外れた評価と比較した、推定値の頑強性を評価する。ＦＡＳ患者集団とＰＰＳ患者集団の両方についてＰＦＳを推定する。
ＯＳを、試験薬物を受けた最初の日と死亡日の間の差異として算出する。最後の経過観察時に死亡していない患者については、最後の公知の接触日にその患者の時間を打ち切ることができる。ＯＳは、ＦＡＳ集団について要約する；処置の開始以降の生存データを欠く患者は、１日目にその患者の観察を打ち切る。ＣｈｏｉのＧＩＳＴ基準（付録Ｄ）を、奏効についての第２の判定基準として使用する。客観的奏効（ＣＲまたはＰＲ）を示す患者の割合を要約する。
奏効期間、無進行生存、および全生存を算出するために、各算出に１日を加える。カプラン・マイヤー統計値を使用してこれらのデータを解析し、事象プロセスの成熟化に応じて、平均事象率の点推定および中央値の９５％信頼区間がもたらされる。
略語の一覧
本明細書または図において以下の略語が用いられ得る：
略語 定義
ＡＡＵＣＭＢ ベースラインを引いた曲線下面積
ＡＤＴ アンドロゲン遮断療法
ＡＥ 有害事象
ＡＬＴ アラニントランスアミナーゼ
ＡＮＣ 絶対好中球数
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＡＳＴ アスパラギン酸トランスアミナーゼ
ＢＰ 結合性タンパク質
ＢＰＩ 簡易疼痛調査票
ＢＵＮ 血中尿素窒素
ＣＡＧＴ 細胞および遺伝子療法の中央
ＣＤ 表面抗原分類
ＣＦＲ 連邦規則集
ＣＩ 信頼区間
ＣＲ 完全奏効
ＣＲＦ 症例報告書
ＣＲＰＣ 去勢抵抗性前立腺癌
ＣＴ コンピュータ断層撮影法
ＣＴＣ 循環性腫瘍細胞
ＣＴＣＡＥ 有害事象共通用語基準
ＣＴＬ 細胞傷害性Ｔリンパ球
ＤＣ 樹状細胞
ＤＬＴ 用量制限毒性
ＤＳＭＢ データ安全性監視委員会
ＥＯＷ 隔週
ＦＡＳ 最大の解析対象集団
ＦＤＡ 食品医薬品局
ＧＣＰ 医薬品の臨床試験の実施の基準
ＧＭ−ＣＳＦ 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＨＢｓＡｇ Ｂ型肝炎表面抗原
ＨＣＶ Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス
ＨＴＬＶ ヒトＴリンパ球向性ウイルス
ＩＤ 皮内
ＩＥＣ 独立倫理委員会
ＩＬ インターロイキン
ＩＮＤ 治験薬
ＩＲＢ 治験審査委員会
ＩＶ 静脈内
ＫＰＳ カルノフスキーのパフォーマンスステータス
ＬＤＨ 乳酸デヒドロゲナーゼ
ＬＮ リンパ節
ＬＰＳ リポ多糖
ＭｅｄＤＲＡ 医薬品規制用語集
ＭＲＩ 磁気共鳴画像法
ｍＲＮＡ メッセンジャーリボ核酸
ＭＴＤ 最大耐用量
ＮＫ 天然キラー
ＮＯＥＬ 最大無作用量
ＯＳ 全生存
ＰＡ００１ 前立腺抗原
ＰＡＰ 前立腺酸性ホスファターゼ（Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞
ＰＤ 進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＰＦＳ 無進行生存
ＰＯ 経口
ＰＳＭＡ 前立腺特異的膜抗原
ＰＰＳ 治験実施計画書に適合した対象集団
ＰＲ 部分奏効
ＰＳＡ 前立腺特異的抗原
ＲＢＣ 赤血球
ＲＥＣＩＳＴ 固形腫瘍の治療効果判定基準
ＳＡＥ 重篤な有害事象
ＳＡＳ 統計解析システム
ＳＤ 安定（ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）／標準偏差
ＳＯＣ 器官別大分類
ＴＥＡＥ 治療下で発現した有害事象
ＴＴＲ 効果発現までの期間
ＵＬＮ 基準値上限
ＷＢＣ 白血球
（実施例１３）
暫定的な臨床的データの概要
結果の要約
結果：結果：現在まで登録された被験体６人のうち、低用量コホートの３人中３人および中間用量コホートの３人中２人は、少なくとも１２週間の療法を完了し（中央値２６、範囲１２〜３６）、また、４人は用量制限毒性が観察されない安定であり、試験に残った。中間用量コホートの１人の患者は、疾患進行により切迫脊髄圧迫を発症し、４用量を投与した後、第７週で試験から外れ、第２の患者は処置の急性期の最後に疾患進行を有すると思われ、試験から外れた。図３４に要約されている通り、患者を、臨床プロトコールの方法に従って、放射線学的変化、生化学的変化、免疫学的変化、および症状の変化について評価した。
低用量コホートおよび中間用量コホートの両方において臨床的なバイオマーカー反応が明らかであった。８週間で約５０％の血清ＰＳＡ減退が実現された１人の被験体（＃１００３）を含め、被験体６人中４人において１０％以上の最大血清ＰＳＡ減退が実現された。また、患者６人中５人で、ＰＳＡＤＴが有意に延長された。ベースラインにおいて測定可能な転移性疾患を有する被験体３人中２人においてＲＥＣＩＳＴ１．１に従った臨床反応が観察され、１人の被験体（＃１００３）は３カ月の時点で測定可能な疾患に２０％の減退を示し、６カ月の時点で２５％の減退にさらに改善され、部分奏効に向かっている。図４１は、被験体１００３における軟組織における部分奏効に関するグラフを示す。被験体１００３は、ベースラインにおいて測定可能なリンパ節の病変を８つ有し、８つのリンパ節全てにおいて、１年超にわたって定常の減少が実証された。１年の時点でＲＥＣＩＳＴ判定基準に従った部分奏効（ＰＲ）が見出された。減少の最大速度は誘導処置期の間に見られた。被験体はベースラインと初回用量（７週間）の間に腫瘍の成長を有した可能性がある。第３の被験体は測定可能な進行を有するが、その患者のＰＳＡは用量＃５の後に安定化した。
疾患が進行している患者を含めた、測定可能な転移性疾患を有する被験体３人中３人において腫瘍血管系の縮小が観察された。図４２は、抗血管系効果を実証している種々の血清マーカーに関するグラフを示す。ＣＴコントラスト増強により、ＭＭＤの全被験体において血管分布の減少が示された。これらの被験体における血清解析により、低酸素の因子の用量に関連する上方制御が明らかになった。ＰＳＭＡは、固形腫瘍の血管系において発現され、抗血管系の標的として提唱されている。リンパ節反応の例が図４０に示されており、サイズおよび血管分布が縮小した２つの節を含み、それはベースラインにおいて３６×２９ｍｍ（ＲＥＣＩＳＴ１．１による、異常な１５ｍｍ超の短い軸）および１２２ハウンスフィールド単位（ＨＵ）ならびに第２６週において２９×２４ｍｍおよび４０ＨＵが測定され（実施例１）、ベースラインにおいて２５×２３ｍｍおよび１２０ＨＵならびに第２６週において１７×１４ｍｍおよび４１ＨＵが測定され（実施例２）；１つの節は完全奏効を示し、ベースラインにおいて２４×１７ｍｍおよび第２６週において１２×６ｍｍ（ＲＥＣＩＳＴ１．１による、正常な１０ｍｍ未満の短い軸）が測定された（実施例３）。
被験体６人中４人において、各ワクチン接種の１週間後に、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１の全身的な上方制御が実証された。ＴＮＦ−αおよびＩＰ−１０は全被験体において検出可能であったが、いずれの被験体においても、最小の、用量に関連する変化が示された。被験体６人中２人において、検出可能な血清サイトカインの変化の一貫したパターンは実証されなかったが、これらの被験体の全体的な腫瘍負荷量は最低であった。評価可能な被験体６人中４人は、３回の投与後に抗原特異的な免疫応答を示し、２人ではＴＨ１反応が示唆され、２人ではＴＨ２反応が示唆された。
結論：ＢＰＸ−１０１およびＡＰ１９０３を用いた処置により、臨床的な全身免疫応答および抗原特異的な全身免疫応答の両方が引き出される。臨床反応は、血清サイトカインにおける用量に関連する有意な攪乱、およびＰＳＡの減退と相関すると思われる。最低用量での１２週間の療法を完了した被験体３人中２人において、血清中の炎症性サイトカインレベルの劇的な急上昇は、両方の患者におけるＰＳＡの減退および１人における測定可能な疾患の減退と相関した。測定可能な転移性疾患を有する患者３人中３人において腫瘍血管新生も減少した。
解析
患者６人を、臨床プロトコールの方法に従って処置を受けた後の進行について評価した。患者を、図３４に要約されている通り、臨床プロトコールの方法に従って、放射線学的変化、生化学的変化、免疫学的変化、および症状の変化について評価した。
図３４は、探索的効力評価を示すチャートである。図３６は、測定可能な転移性疾患、血管分布、およびＰＳＡの１２週間の変化の解析の要約を示す。
放射線学的解析
図４０は、患者１００３のＣＴスキャンの結果を示す（スキャン例１）。
ベースラインにおいて測定可能な転移性疾患を有する被験体３人中２人において、客観的な臨床反応（軟組織、ＲＥＣＩＳＴ１．１に従って）が観察された：
・１人の被験体は、６カ月超安定のままである。
・第２の被験体（＃１００３）は、３カ月の時点で測定可能な疾患が２０％減退し、６カ月の時点で２５％の減退にさらに改善され、部分奏効に向かっている。
被験体１００３は、第０週においてワクチン接種の急性期を開始する７週間前にベースラインスキャンを受けた。第１２週、療法を開始した１９週間後において得られた処置の急性期の最後の繰り返しスキャンにより、測定可能な標的疾患（２つのリンパ節）および非標的疾患（５つのリンパ節）の２０％の減少が示された。第２６週のスキャン、ベースラインスキャンの８カ月後までに、７つの測定可能な病変全てが、サイズのさらなる縮小を示し、全体的な測定可能な疾患の縮小が２５％に達した。リンパ節反応の３つの例が上記されており、それには、ベースラインにおいて２４×１７ｍｍ（ＲＥＣＩＳＴ１．１による、異常な１５ｍｍ超の短い軸）および第２６週において１２×６ｍｍ（ＲＥＣＩＳＴ１．１による、正常な１０ｍｍ未満の短い軸）が測定された、完全奏効を示した１つの節（実施例３）が含まれる。
生化学的解析
図３８は、ＶＣＡＭ−１血清解析の結果を示す。処置後にＶＣＡＭ−１濃度の低下が観察された。
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の存在も評価した。図３９は、１２週間の時点におけるＰＳＡレベルのウォーターフォールプロットを示す。
免疫学的解析
患者を、種々の免疫学的マーカーについて評価した。各マーカーについて有意性および所望の転帰が下に要約されている。
ＧＭ−ＣＳＦ；幹細胞の、マクロファージおよびＤＣにさらに分化することができる顆粒球および単球への分化を刺激する。所望の転帰：増加。
ＩＦＮ−ガンマ：主に活性化ＮＫ、ＮＫＴ、Ｔヘルパー１およびＣＴＬによって産生される。免疫賦活性、抗ウイルス性、および抗腫瘍性である。所望の転帰：増加。
ＭＣＰ−１：単球、記憶Ｔ細胞およびＤＣの、傷害部位または炎症部位への動員を助ける。所望の転帰：増加
ＭＩＰ−１α、β：活性化マクロファージによって産生されて、顆粒球および他の白血球における走化性を活性化し、また他の炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）を誘導する。所望の転帰：増加
図３５は、１２週間の免疫学的反応および臨床反応の概要を示す。
図４５〜５０は、それぞれ患者１００１〜１００６における血清マーカー解析に関するグラフである。
臨床的バイオマーカー
低用量コホートと中間用量コホートの両方において臨床的バイオマーカーの反応が明らかであった。被験体６人中４人において、８週間で約５０％の血清ＰＳＡ減退が実現された１人の被験体（＃１００３）を含め、最大血清ＰＳＡの１０％以上の減退が実現された。
低用量コホートの被験体３人中３人においてＰＳＡの減退が観察され、その全員が、ベースラインにおいて比較的長いＰＳＡ倍加時間（４．９〜７．３カ月）を有し、対照的に、中間の用量の被験体は、その全員が２カ月未満（１．４〜１．７カ月）ベースラインＰＳＡＤＴを有した。
症状
図５２は、ＫＰＳおよびＣＴＣの評価に関するグラフを示す。
ＢＰＸ−１０１およびＡＰ１９０３を用いた処置により、以下の免疫学的反応および臨床反応が引き出される：
・患者４人中４人のＤＴＨ生検において観察された抗原（ＰＳＭＡ）特異的Ｔ細胞反応。生成されるサイトカインは、３用量後のＴＨ１への偏りまたはＴＨ２への偏りを反映する。
・ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１の変化を含めた患者６人中４人におけるいくつかの可溶性の因子の定期的な、周期的な上方制御
客観的な臨床反応は、血清サイトカインにおける用量に関連する有意な攪乱およびＰＳＡの減退と相関すると思われる。
暫定的結論
高ＰＳＡ（３００超）、グリーソンスコア９、１３．３ｐｇ／ｍＬ超の血清ＩＬ−６レベル、および先のドセタキセルによる化学療法の失敗を含めた、危険性の高い進行性のｍＣＲＰＣの特徴を有する低用量コホートに登録された被験体＃１００３は、ちょうど２回ワクチン接種した後に始まったＰＳＡの約５０％の降下、ならびに測定可能な疾患の、１２週間の療法の最後の２０％の減退および６カ月の時点における２５％の減退を含めた、急速な臨床反応を示し、部分奏効に向かっている（ＲＥＣＩＳＴ１．１）。この反応は、血清サイトカインの急増と相関し、各ワクチン接種サイクルによって生じる全身免疫応答と一致した。この被験体において抗原特異性は決定されなかった。
中間用量コホートに登録された、大規模な骨転移、グリーソンスコア８、および急速に上昇しているＰＳＡ（ＰＳＡＤＴが１．４カ月）を有する被験体＃１００５は、最初の２回の用量だけでサイトカインの攪乱を示し、ＴＨ２に偏った。この被験体のＰＳＡ軌道に変化はなかった。この患者は、７週間後によくなった。
この患者および他の患者のデータは、本方法により、短期間の疾患反応が誘導され、処置に関連する毒性を伴わずにより有意な生存利益が導かれ得ることを示唆している。
（実施例１４）
併用療法
転移性去勢抵抗性前立腺癌の患者は、化学療法薬の組み合わせを用いて処置されている。ドセタキセルおよびエストラムスチンホスフェート、それに加えて他の薬剤の組み合わせを用いて処置すると、処置された転移性去勢抵抗性前立腺癌の患者の２９％が、９０％超のＰＳＡの降下を有した。Ｎａｋａｇａｍｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ． ， Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ， ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｕｒｏｌｏｇｙ （ｅａｒｌｙ ｖｉｅｗ， Ａｐｒｉｌ ２６， ２０１０， ｄｉｇｉｔａｌ ｏｂｊｅｃｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ １０．１１１１／ｊ．１４４２−２０４２．２０１０．０２５４４．ｘ）。ドセタキセルと、ドセタキセルおよびそれに加えてエストラムスチンとを比較する無作為化試験において、４１％で４ｎｇ／ｍＬ未満のＰＳＡが実現されたが、ドセタキセル単独に対して生存は改善されなかった。Ｍａｃｈｉｅｌｓ， Ｊ．−Ｐ． ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３２： ５２６１−６８。化学療法薬、例えばタキサンなど、および非ステロイド性ホルモン剤は、ワクチン療法と組み合わせて、ワクチン療法の前、またはその後に使用することができる。
被験体＃１００６に、この実施例において考察されている化学療法薬とワクチン療法の組み合わせを投与した。被験体＃１００６は、疾患進行の症状を示した後にワクチン療法を中断した。次いで、患者を、ドセタキセル、ならびにカルボプラチン、エストラムスチンホスフェート、サリドマイド、デカドロン、プロスカー、アボダートおよびロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）を含めた化学療法剤で処置した。療法後に、ＰＳＡの濃度は、０．２ｎｇ／ｍｌ未満に有意に降下し、９９％を超える血清のレベルの降下であった。図５３に処置期間にわたる血清ＰＳＡの濃度が示されている。
被験体１００３は、図４３に示されている通り、タキソテール、その次にワクチン療法で処置した。ＫＰＳ９０を有するこの被験体は、ワクチン療法の２１カ月後生存していた。
被験体１００７は、ワクチン療法の前に非ステロイド性ホルモン剤であるアビラテロン（Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）で処置し、ワクチン処置後に化学療法に反応した。
グリーソン９のｍＣＲＰＣの病歴を有し、広範にわたる骨転移およびＬＮ転移を有し、先のドセタキセルによる化学療法に失敗した後であり、１０００ｎｇ／ｍｌ超の急速に上昇しているＰＳＡ（ＰＳＡＤＴ１．８カ月）を有し、ＣＴＣ４９であり、ＫＰＳ８０である被験体１０１０（図６１および図６２）を登録した。この患者は、１用量の後に、ＫＰＳが６０に急速に減退したので中止し、ＬＨＲＨアゴニスト以外のさらなる活性な療法を伴わずに在宅ホスピスケアを受けた。この患者は、１カ月以上生存しないと予測された。しかし、４カ月後に、患者の状況は改善し、自己歩行が増し、食欲、体重増加が伴い、およびＫＰＳが８０〜９０に戻り、この患者のＰＳＡは１６９ｎｇ／ｍＬに降下した（８４％の減退）。この患者の状態は、継続して改善され、３カ月後に、この患者のＰＳＡはさらに１０４．３ｎｇ／ｍＬに落ちた（９０％の減退）。３２週間の時点における骨スキャンにより、肋骨、左肩甲骨および左上腕骨におけるびまん性転移の有意な改善が示され、いかなる新しい病変も伴わなかった。その後すぐに、この患者は突然の発熱を発症し、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄのこの患者の家族のＰＣＰにより、尿路性敗血症と診断された。この患者を、経口的な抗生物質で処置したが、急速に悪化し、３３週間の時点で、自宅で亡くなった。
図６３は、タキサンによる化学療法とワクチン療法を含む併用療法の解析について示している。投与量および療法の順序付けのいくつかの例を用いて２つの療法の間の相乗作用が示されている。
これは、潜在的な単一またはそれ以上の限定された投薬活性、およびドセタキセルとの相乗作用を実証している。
被験体１０１１に、この実施例において考察されている化学療法薬とワクチン療法の組み合わせを行った。図６０に示されている通り、被験体１０１１をタキソテールおよびケトコナゾールで処置した後にワクチン療法を行い、ワクチン療法の後にカバジタキセルで処置した。
（実施例１５）
第２の暫定的な臨床的データの概要
高用量コホート（被験体１００７〜１０１２）（１．６ｍＬ中細胞２５×１０６個）を含むさらなる臨床試験を実施した。低用量コホート（被験体１００１〜１００３）（１．０ｍＬ中細胞４×１０６個）および中間用量コホート（被験体１００４〜１００６）（１．０ｍＬ中細胞１２．５×１０６個）からも追加的な試験を得た。図５５は、低用量コホートおよび中間用量コホートからの安全性および反応の要約を示し、図５６は、高用量コホートからの安全性および反応の要約を示す。図５７には全被験体についての患者の人口統計が示されている。図５８には２０１０年１２月現在の患者の臨床試験の状況が示されている。
結果の要約
結果：結果：低用量コホートに登録された被験体３人全員は、試験開始後１２カ月の時点で安定または部分奏効のいずれかを有した。３人全員について、進行が１２カ月遅延した。中間用量コホートの被験体１００６は、臨床試験、その後に化学療法に参加した後、完全奏効を有した。被験体１００６は、ドセタキセルで処置されており、これは、併用療法からの相乗的な反応の可能性を示している。高用量コホートの被験体１００８は、肺腫瘍に対して完全奏効を有し、１２週間の時点で測定したところ安定を維持した（図５９）。被験体１００８における処置後のサイトカインの急上昇のパターンが図３７に示されている。高用量コホートの被験体１００７および１００９も、１２週間の時点で測定したところ安定を有した。
グリーソンスコア：現在までに試験に登録された被験体１２人のうち、１０人が７を超えるグリーソンスコアを有した。グリーソンスコアが９である被験体１００３では、ＢＰＸ−１０１で処置した後に部分奏効が得られた。図４０は、被験体１００３について示されている、処置の腫瘍縮小効果を示す写真を示す。処置の２６週間後に、拡大した大動脈前リンパ節のベースラインにおけるスキャン（３３週間前）と比較して、節のサイズが縮小し、固体の増強性塊から非増強性嚢胞性病変への変化があり、増強性腫瘍組織の縁は、腫瘍の壊死と一致した。グリーソンスコアが８の被験体１００６では、ＢＰＸ−１０１、その後のドセタキセル（ｄｏｃｔａｘｅｌ）ベースの併用化学療法レジメンを用いた併用療法の後に完全奏効が得られた。被験体１００６は、ベースラインにおいて、大規模な生検により診断された前立腺癌の肝臓への転移を示した。被験体の肝機能は、ワクチン療法の１５週間後までに正常に戻った。３４週間の時点で、ベースラインにおける肺病変、ＬＮ病変および骨病変を含め、検出可能な生存可能な腫瘍はなかった（図６４）。図５３は、被験体１００６における処置期間にわたる血清ＰＳＡのレベルを示す。グリーソンスコアが１０の被験体１００８では、６つの別々の肺転移のほぼ排除を伴う肺における完全奏効、および安定な前立腺疾患が得られた。登録時に前立腺癌は肺、リンパ節および骨に広がっていた。被験体１００８は、ベースラインスキャンの６週間後に開始した６用量のＢＰＸ−１０１で処置した（化学療法なし）。肺における腫瘍は１２週間の処置期間の終わりに排除され、他の部位における転移は安定なままであった。患者は、２０週間の時点で臨床的に安定であり、体重がいくらか減少し、疼痛はなく、腎機能の安定により両側性の尿管ステントを除去した。
併用療法
被験体１００３、１００４、１００８、１０１０、１０１１、および１０１２は、タキソテールで処置された後に、臨床試験に参加した。この群のうち、被験体１００３では試験終了時に部分奏効が得られ、被験体１００８では肺における完全奏効および安定な前立腺疾患が得られた。被験体１０１１および１０１２は、１２週の時点で安定を有した。
臨床的バイオマーカーの反応
３つのコホート全てにおいて、臨床的バイオマーカーの反応が明らかであった。被験体１０１０では、１用量後に、血清ＰＳＡレベルの８５％の降下が実現された。この患者は、臨床試験の前にタキソテールで処置されていた。この患者は、臨床的進行があり、動作の状況が急速に劣化しているので、処置を終結する前に単回用量のＢＰＸ−１０１を受けた。試験の原理研究者は、この患者の平均余命は約１カ月であると推定した。しかし、他の処置はせず単回用量のＢＰＸ−１０１の後、患者は改善し、現在は６カ月経って安定な経過で、ＰＳＡが８５％降下した。患者の希望により、スキャンまたは他の腫瘍評価は実施しなかった。
測定可能な軟組織疾患を有する大部分の被験体において腫瘍血管系の縮小が観察され、被験体１００３では有意な腫瘍の縮小および抗血管系効果が得られた。
大部分の評価可能な患者において、抗原特異的な免疫応答が見出された。
結論：
ＰＳＭＡを標的とする新規の、薬物によって活性化される自己ＤＣワクチンであるＢＰＸ−１０１の第Ｉ相／ＩＩ相臨床試験に従った臨床的な観察の要約。１つの先立つ化学療法レジメンに対して経過観察中の進行性ｍＣＲＰＣの男性を、ＢＰＸ−１０１およびＣＤ４０活性化剤であるＡＰ１９０３を評価する３＋３用量漸増試験に登録した。６回用量のＢＰＸ−１０１を、誘導期の間に２週間ごとに皮内投与し、非進行患者については、維持期の間８週間ごとに最大５回用量であった。各ＢＰＸ−１０１用量の２４時間後にＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を注入した。放射線学的な評価を１２週間ごとに実施した。１用量当たり細胞４×１０６個および細胞１２．５×１０６個についてそれぞれ３人、および１用量当たり細胞２５×１０６個の６人を含めた、被験体１２人の計画登録が完了した。ワクチン製品は全て放出可能であった。ハラビィの予測生存（Ｈａｌａｂｉ−ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ）の中央値は１３．８カ月であった。２人の被験体は、進行したために誘導の終わりの前にプロトコールをやめ、８人は誘導の終わりに到達し、２人は誘導の達成に近づいた。毒性（例えば、注射部位反応）は概して穏やかであった。高用量被験体の１人において、２回目のワクチン接種の際にＡＰ１９０３を注入している間に単一の急性サイトカイン反応があったが、さらなる薬物に関連する有害事象を伴わずに誘導が継続された。特に、１人の低用量コホートのドセタキセル後の被験体では、ＲＥＣＩＳＴ ＰＲが実現され、大規模な内臓転移、結節転移および骨転移がある１人の中間用量コホートの化学療法ナイーブな被験体では、ドセタキセルベースの化学療法を伴い、誘導後にＲＥＣＩＳＴ ＣＲが得られ、検出不可能な超高感度のＰＳＡ（０．００９ｎｇ／ｍＬ）が登録後１０カ月維持された。高用量のコホートの第３の被験体では、誘導の終わりに多数の肺転移がほぼ完全に排除され、その他については安定が得られた。３人全てにおいて頑強な免疫応答が見られた。ＢＰＸ−１０１は、確実に製造し、続いて少なくとも細胞２５×１０６個の用量でＡＰ１９０３で安全に投与することができる。癌ワクチン療法により、短期間の反応を伴わずに生存が改善されるという知見に反して、ＢＰＸ−１０１で処置された患者では、危険性の低い内臓疾患のほぼ排除を含めた、測定可能な疾患反応があった。
キメラタンパク質（ＢＰＸ−１０１）を発現している改変抗原提示細胞を用いてワクチン接種した後の抗原特異的な免疫および腫瘍炎症の観察の要約：ｍＣＲＰＣに対する、薬物により活性化されるＤＣワクチンであるＢＰＸ−１０１の第Ｉ相〜ＩＩａ相臨床試験に登録された患者において、ワクチン接種後に抗原特異的な免疫および重篤な前立腺癌の炎症および壊死が観察された。進行性ｍＣＲＰＣの男性１２人を、ＢＰＸ−１０１および活性化剤であるＡＰ１９０３を評価する３＋３用量漸増試験に登録した。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする６用量のＢＰＸ−１０１を、２週間ごとに皮内投与し、その後、各用量の２４時間後にＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を注入した。４回目のワクチン接種の後に注射部位の皮膚生検材料を実施した。皮膚生検材料からｅｘ ｖｉｖｏで培養したＴ細胞をＰＳＭＡタンパク質または対照抗原で刺激し、Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアを使用して炎症性のサイトカイン／ケモカイン３０種について解析した。インタクトな前立腺を有する１人の患者（＃１００７）では、５回目のワクチン接種後に下部尿路の出血が発生し、出血した前立腺癌組織の経尿道的切除術を行った。パラフィン包埋ブロックをヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ３４についての免疫組織化学的染色も実施した。評価可能な注射部位の生検結果を有する被験体５人のうち、全員がＰＳＭＡ特異的な免疫を示した（３人はＴＨ１に偏り、および２人はＴＨ２に偏った）。被験体１００７の注射部位の生検により、ＰＳＭＡによる刺激後に、オボアルブミンによる刺激と比較してＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−２において１０倍を超える有意な増加が実証され、これは強力なＰＳＭＡ特異的ＣＴＬまたはＴＨ１に偏った免疫応答の誘導と一致した。Ｈ＆Ｅ染色された切除前立腺組織により、グリーソン８（４＋４）前立腺腺癌が、浸潤性の形質細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞からなる重篤な炎症反応を示すことが実証された。炎症前立腺癌組織に近接して広い領域の壊死が見られた。ＢＰＸ−１０１、次いでＡＰ１９０３を用いたワクチン接種により、強力な、ＰＳＭＡ特異的免疫応答を誘導することができる。さらに、複数用量のＢＰＸ−１０１の後に、強力なＰＳＭＡ特異的免疫応答に関連づけられる重篤な前立腺癌特異的な炎症および壊死の証拠が観察された。
ＢＰＸ−１０１で処置された患者における血清サイトカインと臨床反応の相関の観察の要約。進行性ｍＣＲＰＣの男性を、ＢＰＸ−１０１および活性化剤であるＡＰ１９０３を評価する３＋３用量漸増試験に登録した。６用量のＢＰＸ−１０１を、誘導期の間に２週間ごとに皮内投与し、非進行性患者については、維持期の間に８週間ごとに最大５用量であった。各ＢＰＸ−１０１用量の２４時間後にＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を注入した。免疫をモニターするための血液試料を、誘導期の間に週に１回、ならびに各維持用量の前およびその１週間後に採取した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳのレベルをＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアによって測定し、ＩＬ−６のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。１回の用量当たり細胞４×１０６個および１２．５×１０６個をそれぞれ３人、および細胞２５×１０６個の６人を含めた被験体１２人の計画登録を完了する。疾患負荷量が大きい被験体において、翌週にベースラインに戻る、各用量の１週間後の血清サイトカインの急上昇のレベルのパターンが観察された。試験に入った１年後にＰＲを得た１人の低用量の被験体では、パネルサイトカインは誘導期の各用量の用量後に平均で４倍に急上昇し、最初に２回の追加免疫後には２倍未満に急上昇し、最終的な３回の追加免疫の後には６倍から５６倍の間に急上昇した。多数の肺転移のほぼＣＲ、その他については安定を得た第２の高用量の被験体（＃１００８）では、パネルサイトカインは誘導期に平均で１５０倍に急上昇した。どちらの場合でも、被験体１００８についてのＴＮＦ−αの１，０００倍を超える平均急上昇を含めて、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βが最も急上昇した。サイトカインの急上昇は、ＡＥを伴わなかった。結論：ＢＰＸ−１０１は、各用量後のサイトカイン上昇の急上昇パターンを誘導する。測定可能な疾患が低下した患者では、血清中の炎症性サイトカインレベルのより劇的な急上昇が見られた。
ＢＰＸ−１０１およびＡＰ１９０３を用いた処置により、臨床的な全身免疫応答および抗原特異的な全身免疫応答の両方が引き出される。処置により、グリーソンスコアが７を超える被験体においてさえ、部分奏効または完全奏効、または進行の遅延のいずれかの有意な結果が得られた。ＢＰＸ−１０１およびＡＰ１９０３による処置の前、またはその後に化学療法を組み合わせた処置が相乗効果を有すると思われた。特定の被験体において、肺、肝臓、骨、およびリンパ節における転移性前立腺癌の病変の軽減と同様に腫瘍血管系および腫瘍サイズの縮小が明らかであった。
（実施例１６）
癌患者の生活の質の改善
末期癌患者は、通常、その生活の質の著しい低下を経験する。生活の質の問題としては、例えば、悪液質、疲労、および貧血が挙げられる。貧血、疲労、または貧血の症状を減少させるために、患者の生活の質を改善することができる。
消耗症候群としても公知の悪液質は、末期癌の患者において度々起こる。この用語は、癌患者において見られる体重減少、筋萎縮、疲労、および衰弱を説明するために使用され、また、死亡についての正の危険因子である。患者における悪液質のレベルを決定するために使用される臨床的測定としては、例えば、握力、ヘモグロビンのレベル、アルブミン、Ｃ反応性タンパク質、および疲労（例えば、ＦＡＣＩＴ−Ｆ、疲労を評価する質問表によって測定する）が挙げられる。
ＩＬ−６を遮断する化合物の使用は、悪液質の特定の症状を緩和することが報告されている。ＩＬ−６は、多くの癌および炎症性疾患、例えば、関節リウマチなどに関係づけられる。化合物ＡＬＤ−５１８は、臨床試験において進行癌の患者に与えると、疲労を逆転させ、ヘモグロビンを増加させ、かつアルブミンを増加させることが報告されたヒト化抗ＩＬ−６モノクローナル抗体である。握力の増加傾向も示された。Ｃ反応性タンパク質のレベルの低下も示された。Ｃｌａｒｋｅ， Ｓ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２７：１５ｓ （ｓｕｐｐｌ．； ａｂｓｔｒ． ３０２５）。癌に関連した貧血、悪液質、および疲労に使用するＡＬＤ−５１８のより大規模な臨床研究では、ＡＬＤ−５１８の投与により、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均小体ヘモグロビン、およびアルブミンが増加することが報告された。Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２８−７ｓ （ｓｕｐｐｌ．； ａｂｓｔｒ． ７６３１）。
関節リウマチについての臨床試験における他の抗ＩＬ−６抗体としては、例えば、エルシリモマブ（ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）およびＣＮＴＯ１３６が挙げられる。ＩＬ−６を遮断する他の方法は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を遮断することを含む。アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ）としても公知のトシリズマブは、ＩＬ６−Ｒを対象とするヒト化モノクローナル抗体である。炎症性疾患、例えば、関節リウマチなどを処置するための化合物が示されている。
本方法の形質導入またはトランスフェクトされた細胞、化合物、または核酸、およびリガンドを投与することにより、癌患者の生活の質が向上し得る。
生活の質の改善とは、貧血、悪液質、または疲労の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの症状が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％緩和されることを意味する。例えば、患者のヘモグロビンレベルがｘである場合、生活の質の改善としては、例えば、処置後に患者のヘモグロビンが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％上昇することが挙げられる。症状の緩和としては、例えば、ヘモグロビンが上昇すること、ヘマトクリットが上昇すること、体重が増加すること、アルブミンが上昇すること、Ｃ反応性タンパク質が減少すること、疲労が低下すること、および握力が増加することが挙げられる。
生活の質の指標である症状を測定することとは、貧血、悪液質、または疲労の症状を測定することまたは評価することを意味する。例えば、患者のヘモグロビンレベル、または患者の握力を測定することができる。
本明細書において参照されている特許、特許出願、刊行物および文書のそれぞれの全体が、本明細書によって参照により組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物および文書を引用することは、前述のいずれもが先行技術に関係することを認めるものではなく、これらの刊行物または文書の内容または日付に関してどんな容認も構成するものでもない。
当該技術の基本的な態様から逸脱することなく前述のものに改変を行うことができる。当該技術は、１つまたは複数の特定の実施形態を参照してかなり詳細に記載されているが、当業者は、本出願に詳細に開示されている実施形態に変化を生じさせてよく、それでもこれらの改変および改良は当該技術の範囲および主旨であることを理解されよう。
本明細書において適切に例示的に記載されている技術は、本明細書に詳細に開示されていない要素（複数可）のいずれがなくとも実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと交換することができる。使用されている用語および表現は、説明する用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現を使用することによって、示され、記載されている特徴の等価物またはその部分はいずれも排除されず、特許請求された技術の範囲内で種々の改変が可能である。「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という用語は、要素のうちの１つ、または要素のうちの２つ以上のいずれかについて記載されていることが文脈上明らかでない限り、それが修飾する要素のうちの１つまたは複数を指し得る（例えば、「ａ（１つの）試薬」は、１つまたは複数の試薬を意味し得る）。本明細書で使用される「約」という用語は、基になるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラス１０％またはマイナス１０％）を指し、一連の値の最初に「約」という用語を使用することにより、値のそれぞれが修飾される（すなわち、「約１、２および３」とは、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の体重は、９０グラムから１１０グラムの間の体重を含んでよい。さらに、値の列挙が本明細書に記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）その列挙は、それらの中間の値および小数値の全てを含む（例えば、５４％、８５．４％）。したがって、本技術は代表的な実施形態および任意選択の特徴によって詳細に開示されているが、当業者は本明細書に開示されている概念の改変および変形を用いることができ、そのような改変および変形は本技術の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
当該技術のある特定の実施形態は、続く請求項（複数可）に記載されている。

Claims (60)

  1. 被験体における７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を処置するための組合せ物であって、
    （ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞であって、
    該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
    該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
    該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に、前立腺癌抗原が負荷されている、抗原提示細胞と、
    （ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドと
    を含み、
    該抗原提示細胞およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与され、該グリーソンスコアが７以上であることを特徴とする、組合せ物。
  2. 被験体における７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を処置するための組合せ物であって、
    （ａ）キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前立腺癌抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、組成物と、
    （ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドと
    を含み、
    該組成物およびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与され、該グリーソンスコアが７以上であることを特徴とする、組合せ物。
  3. 被験体における７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を処置するための組合せ物であって、
    （ａ）キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前立腺癌抗原をコードするポリヌクレオチドであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ポリヌクレオチド、および前立腺癌抗原をコードする該ポリヌクレオチドが、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ポリヌクレオチドと、
    （ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドと
    を含み、
    該ポリヌクレオチドおよびリガンドが、該被験体における該前立腺癌を処置するのに有効な量で投与され、該グリーソンスコアが７以上であることを特徴とする、組合せ物。
  4. 被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するための組合せ物であって、該被験体が７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を有し、該組合せ物は、
    （ａ）キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前立腺癌抗原をコードするポリヌクレオチドであって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、該キメラタンパク質をコードする該ポリヌクレオチド、および前立腺癌抗原をコードする該ポリヌクレオチドが、アデノウイルスベクターを用いて送達される、ポリヌクレオチドと、
    （ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドと
    を含み、
    該ポリヌクレオチドおよびリガンドが、該多量体リガンドを投与した１２週後までに７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を有する該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与されることを特徴とする、組合せ物。
  5. 被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するための組合せ物であって、該被験体が７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を有し、該組合せ物は、
    （ａ）形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞であって、
    該抗原提示細胞が、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸で形質導入またはトランスフェクトされており、
    該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、
    該形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞に前立腺特異的膜抗原が負荷されている、抗原提示細胞と、
    （ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドと
    を含み、
    該抗原提示細胞およびリガンドが、該多量体リガンドを投与した１２週後までに７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を有する該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与されることを特徴とする、組合せ物。
  6. 被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するための組合せ物であって、該被験体が７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を有し、該組合せ物は、
    （ａ）キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前立腺特異的膜抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、該キメラタンパク質が、膜ターゲティング領域、多量体リガンド結合領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、組成物と、
    （ｂ）該多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドと
    を含み、
    該組成物およびリガンドが、該多量体リガンドを投与した１２週後までに７以上のグリーソンスコアを有する前立腺癌を有する該被験体における腫瘍血管新生を軽減または緩徐化するのに有効な量で投与されることを特徴とする、組合せ物。
  7. 前記腫瘍血管新生が、前立腺において軽減される、請求項４または５に記載の組合せ物。
  8. 前記腫瘍血管新生が、肝臓、リンパ節、骨、または肺において縮小される、請求項４または５に記載の組合せ物。
  9. 前記前立腺癌抗原または腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原である、請求項１から８のいずれかに記載の組合せ物。
  10. 前記膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、および受容体の膜貫通配列からなる群から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の組合せ物。
  11. 前記膜ターゲティング領域が、ミリストイル化領域である、請求項１から９のいずれかに記載の組合せ物。
  12. 前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性のリンカードメインにより隔てられた重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む単鎖抗体、ならびにこれらが変異した配列からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の組合せ物。
  13. 前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、請求項１から１２のいずれかに記載の組合せ物。
  14. 前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６類似体リガンドである、請求項１から１３のいずれかに記載の組合せ物。
  15. 前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、請求項１から１４のいずれかに記載の組合せ物。
  16. 前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１から１５のいずれかに記載の組合せ物。
  17. 前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、請求項１３に記載の組合せ物。
  18. 前記キメラタンパク質が、ＭｙＤ８８ポリペプチド、またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドをさらに含む、請求項１から１７のいずれかに記載の組合せ物。
  19. 前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号６のペプチド配列もしくはその断片を有するか、または配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる、請求項１８に記載の組合せ物。
  20. 少なくとも２用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドが、前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項１、５、７から１９のいずれかに記載の組合せ物。
  21. 少なくとも１用量の前記抗原提示細胞および前記リガンドが、前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項１、５、７から１９のいずれかに記載の組合せ物。
  22. 前記少なくとも２用量が、各用量の間に１０〜１８日間を置いて、前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項２０に記載の組合せ物。
  23. 抗原提示細胞の各用量が、４×１０６個の細胞を含む、請求項１、５、７から２２のいずれかに記載の組合せ物。
  24. 抗原提示細胞の各用量が、１２．５×１０６個の細胞を含む、請求項１、５、７から２２のいずれかに記載の組合せ物。
  25. 抗原提示細胞の各用量が、２５×１０６個の細胞を含む、請求項１、５、７から２２のいずれかに記載の組合せ物。
  26. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１、５、７から２５のいずれかに記載の組合せ物。
  27. 前記抗原提示細胞が、Ｂ細胞である、請求項１、５、７から２５のいずれかに記載の組合せ物。
  28. 前記抗原提示細胞が、アデノウイルスベクターでトランスフェクトされる、請求項１、５、７から２７のいずれかに記載の組合せ物。
  29. 前記抗原提示細胞が、Ａｄ５ｆ３５ベクターでトランスフェクトされる、請求項１、５、７から２８のいずれかに記載の組合せ物。
  30. 前記形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、該細胞に抗原を接触させることにより、該抗原が負荷される、請求項１、５、７から２９のいずれかに記載の組合せ物。
  31. 前記形質導入またはトランスフェクトされた抗原提示細胞は、該抗原提示細胞を、抗原をコードする核酸で形質導入またはトランスフェクトすることにより、該抗原が負荷される、請求項１、５、７から２９のいずれかに記載の組合せ物。
  32. 前記前立腺特異的膜抗原が、配列番号４のアミノ酸配列もしくはその断片を含むか、または配列番号３のヌクレオチド配列もしくはその断片によりコードされる、請求項９に記載の組合せ物。
  33. 前記抗原をコードする前記ポリヌクレオチド、および前記キメラタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、異なる核酸または同じ核酸に存在する、請求項２、３、４および６のいずれかに記載の組合せ物。
  34. 前記抗原をコードする前記ポリヌクレオチド、および前記キメラタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、異なるアデノウイルスベクターまたは同じアデノウイルスベクターに存在する、請求項２、３、４および６のいずれかに記載の組合せ物。
  35. 前記組成物が、粒子をさらに含み、前記組成物が、推進力により投与されることを特徴とする、請求項２および６のいずれかに記載の組合せ物。
  36. 少なくとも２用量の前記組成物および前記リガンドが、前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項２および６のいずれかに記載の組合せ物。
  37. 少なくとも２用量の１以上の前記アデノウイルスベクターおよび前記リガンドが、前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項３、４および３４のいずれかに記載の組合せ物。
  38. 前記組合せ物が、化学療法剤と組み合わせて投与されることを特徴とし、前記抗原提示細胞または組成物、リガンド、および該化学療法剤が、前記被験体における前記前立腺癌を処置するのに有効な量で投与されることを特徴とする、請求項１から３７のいずれかに記載の組合せ物。
  39. 前記化学療法剤が、タキサンである、請求項３８に記載の組合せ物。
  40. 前記化学療法剤が、ドセタキセルまたはカバジタキセルである、請求項３８に記載の組合せ物。
  41. 前記前立腺癌が、転移性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢感受性前立腺癌、局所進行前立腺癌、および限局性前立腺癌からなる群から選択される、請求項１から３および３２のいずれかに記載の組合せ物。
  42. 前記被験体において、前立腺癌の進行が防止されるか、または前立腺癌の進行が遅延されることを特徴とする、請求項１から３、３２および４１のいずれかに記載の組合せ物。
  43. 前立腺癌の進行が少なくとも６カ月間防止されるかまたは遅延される、請求項４２に記載の組合せ物。
  44. 前立腺癌の進行が少なくとも１２カ月間防止されるかまたは遅延される、請求項４２に記載の組合せ物。
  45. 前記前立腺癌のグリーソンスコアが８以上である、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  46. 前記被験体が、前記多量体リガンドを投与した３カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す、請求項１から３、３２および４１から４５のいずれかに記載の組合せ物。
  47. 前記被験体が、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに、部分奏効または完全奏効を示す、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  48. 前記被験体における血清ＰＳＡレベルが、前記多量体リガンドを投与した３カ月後までに２０％低下される、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  49. 前記被験体における血清ＰＳＡレベルが、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに２０％低下される、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  50. 前記前立腺癌の腫瘍サイズが、前記多量体リガンドを投与した３カ月後までに２０％縮小される、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  51. 前記前立腺癌の腫瘍サイズが、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに２０％縮小される、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  52. 前記前立腺癌の腫瘍血管新生が、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに２０％軽減される、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  53. 前記前立腺癌の腫瘍血管新生が、前記多量体リガンドを投与した９カ月後までに２０％軽減される、請求項１から３、３２および４１から４４のいずれかに記載の組合せ物。
  54. 前記被験体がヒトである、請求項１から５３のいずれか一項に記載の組合せ物。
  55. 前記抗原が、前立腺特異的膜抗原である、請求項１から５３のいずれか一項に記載の組合せ物。
  56. 前記抗原をコードするポリヌクレオチドを前記被験体に投与しないことを除き、前記組合せ物が抗原ポリペプチドと組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項２、３、４、６および３３から５５のいずれか一項に記載の組合せ物。
  57. 前記抗原が、前立腺特異的膜抗原である、請求項５６に記載の組合せ物。
  58. 腫瘍血管新生が、前記多量体リガンドを投与した１２週後までに前記被験体において軽減または緩徐化される、請求項１から３および９から５７のいずれか一項に記載の組合せ物。
  59. 腫瘍血管新生が、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに前記被験体において軽減または緩徐化される、請求項１から３および９から５７のいずれか一項に記載の組合せ物。
  60. 腫瘍血管新生が、前記多量体リガンドを投与した６カ月後までに前記被験体において軽減または緩徐化される、請求項４から６のいずれか一項に記載の組合せ物。
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