KR20230042691A - 키메라 항원 수용체에 대한 신규한 작제물 - Google Patents

키메라 항원 수용체에 대한 신규한 작제물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230042691A
KR20230042691A KR1020237000130A KR20237000130A KR20230042691A KR 20230042691 A KR20230042691 A KR 20230042691A KR 1020237000130 A KR1020237000130 A KR 1020237000130A KR 20237000130 A KR20237000130 A KR 20237000130A KR 20230042691 A KR20230042691 A KR 20230042691A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
domain
car
macrophages
extracellular
cells
Prior art date
Application number
KR1020237000130A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 클리킨스키
니콜라스 미누톨로
니콜라스 앤더슨
Original Assignee
카리스마 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 카리스마 테라퓨틱스 인코포레이티드 filed Critical 카리스마 테라퓨틱스 인코포레이티드
Publication of KR20230042691A publication Critical patent/KR20230042691A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464436—Cytokines
    • A61K39/464441—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/52—CD40, CD40-ligand (CD154)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

본 개시내용은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역 세포 및 CAR을 포함하는 면역 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

키메라 항원 수용체에 대한 신규한 작제물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 6월 4일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/034,873호; 2020년 6월 26일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/044,934호; 및 2020년 9월 24일자로 출원된 미국 가출원 제63/082,584호에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
암, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 전신성 아밀로이드증, 프라이온병, 심혈관 질환, 죽상동맥경화증, 섬유증을 포함하는 많은 질환 및 장애에 대해 면역요법이 조사되었지만, 직면한 기능적 제한 사항은 여전히 해결이 필요하다.
따라서, 특정 항원을 표적화하도록 최적화된 새로운 치료 양식의 개발에 대한 필요성이 존재한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 (a) 세포외 도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 변형된 면역 세포를 제공하며, 여기서 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함한다. 다양한 CAR이 다수의 세포 유형에서 다수의 적응증의 치료를 위해 개발되었지만, 본 개시내용은 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포에서 CAR 및/또는 이펙터 활성을 최대화하는 것이 맞춤형 CAR 구성 요소의 사용을 필요로 한다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은, 예를 들어, 다양한 암, 질환 또는 중추신경계 장애(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병 및/또는 ALS), 심혈관 질환, 섬유증 등을 포함하는 임의의 다양한 병태를 치료하는 데 특히 유용한 이와 같은 CAR 및 지지제, 모이어티, 및 보조 조성물의 몇 가지 예를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (a) 세포외 도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 세포내 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 전달하는 단계를 포함하는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 변형시키는 방법을 제공하며, 여기서 바이러스 벡터는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되고, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 (a) 내지 (c)를 포함하는 키메라 조작된 수용체(CAR)를 포함하며, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 전달한 CAR을 포함하는 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 증가된 CAR 발현을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1 내지 약 50의 감염다중도(MOI)로 전달된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10의 MOI로 전달된다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 전달한 CAR을 포함하는 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 초과의 증가된 CAR 발현을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 연장된 기간 동안 CAR 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, CAR 발현의 연장된 기간은 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 또는 그 초과 동안이다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 증가된 이펙터 활성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 증가된 종양 살해 능력 또는 식세포작용을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터(예를 들어, Ad5 벡터, 예를 들어, Ad5f35))를 전달한 CAR을 포함하는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 M1 표현형에 대해 증가된 분극화를 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터(예를 들어, Ad5 벡터, 예를 들어, Ad5f35))를 전달한 CAR을 포함하는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 M1 표현형의 하나 이상의 마커의 증가된 발현을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, M1 표현형의 하나 이상의 마커는 CD86, CD80, MHC II, IL-1R, TLR2, TLR4, iNOS, SOCS3, CD83, PD-L1, CD69, MHC I, CD64, CD32, CD16, IL1R, IFIT 패밀리 구성원, 또는 ISG 패밀리 구성원 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개를 포함하거나, 이들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개이다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 하나 이상의 염증성 사이토카인의 증가된 생성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-12, IL-18, IL-8, IL-2, IL-23, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-2, IL-8, IL33, CCL3, CXCL12, CCL22, CCL4, CXCL10 또는 CCL2 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개를 포함하거나, 이들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개이다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 감소된 SIRPα 활성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용한 SIRPα의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터-기반 뉴클레아제(TALEN), 또는 메가뉴클레아제 중 하나 이상이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9, Cas12a 또는 C2c2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 항-SIRPα 항체로 처리되었다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 항-SIRPα 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 SIRPα를 하향 조절하는 하나 이상의 siRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 FcR 세포외 도메인을 포함하고/하거나, CAR의 막횡단 도메인은 FcR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나, CAR의 세포내 도메인은 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 FcR 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인은 함께 전장 FcR을 구성한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 톨-유사 수용체(TLR) 세포외 도메인을 포함하고/하거나, CAR의 막횡단 도메인은 TLR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나, CAR의 세포내 도메인은 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 TLR 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인은 함께 전장 TLR을 구성한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 (d) 하나 이상의 세포외 리더 도메인, (e) 하나 이상의 세포외 힌지 도메인, 및 (f) 하나 이상의 세포내 공동 자극 도메인 중 하나 이상을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 리더 도메인은 CD8 세포외 리더 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 항원 결합 도메인은 scFv, 센티린(centyrin) 또는 다르핀(darpin)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 힌지 도메인은 CD28 세포외 힌지 도메인, CD8a 세포외 힌지 도메인 또는 IgG4 세포외 힌지 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 CD28, CD8a, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TRL1, TLR2, TLR3, TRL4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타, FcR γ, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88, V/I/LxYxxL/V, SIRPa, CD45, Siglec-10, PD1, SHP-1, SHP-2, KIR-2DL, KIR-3DL, NKG2A, CD170, CD33, BTLA, CD32b, SIRPb, CD22, PIR-B, LILRB1, 41BBL(TNFSF9), CD27, OX40L, CD32b, CD11b, ITGAM, SLAMF7, CD206, CD163, CD209, Dectin-2, IL1R, IL2R, IL3R, IL4R, IL5R, IL6R, IL7R, IL8R, IL9R, IL10R, IL11R, IL12R, IL13R, IL14R, IL15R, IL17R, IFNaR, IFNgR, TNFR, CSF1R, CSF2R, Dap10, CD36, Dectin-1, ICOSL 및/또는 Syk 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 세포내 공동 자극 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태의 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (a) 세포외 도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 세포내 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물(예를 들어, 바이러스 벡터)을 제공하며, 여기서 핵산 작제물은 (a) 내지 (c)를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 핵산 작제물은 (e) 하나 이상의 세포외 리더 도메인, (f) 하나 이상의 세포외 힌지 도메인, (g) 하나 이상의 세포내 공동 자극 도메인, (h) 절단 펩타이드, 및 (i) 하나 이상의 펩타이드 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 펩타이드는 P2A, F2A, E2A 또는 T2A 펩타이드이거나 이를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태의 핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태의 방법에 의해 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태의 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 면역 세포를 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 세포외 도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 세포내 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 면역 세포에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 면역 세포는 (a) 내지 (c)를 포함하는 키메라 조작된 수용체를 포함하고, 변형된 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 감소된 SIRPα 활성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 항-HER2 scFv, CD8 힌지, CD8 막횡단 도메인, 또는 CD3-제타 세포내 신호전달 도메인 중 1, 2, 3 또는 4개를 포함하는 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 이를 발현한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 CD8a 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 (a) 내지 (c)를 인코딩하는 핵산 작제물을 전달하는 것은 바이러스 벡터를 이용한 형질도입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노-연관 바이러스 벡터는 Ad5 벡터(예를 들어, Ad5f35 바이러스 벡터)이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용한 SIRPα의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터-기반 뉴클레아제(TALEN), 또는 메가뉴클레아제 중 하나 이상이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9, Cas12a 또는 C2c2 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 항-SIRPα 항체로 처리되었다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 항-SIRPα 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 SIRPα를 하향 조절하는 하나 이상의 siRNA를 포함한다.
도면은 단지 설명을 위한 것이며, 제한하고자 함이 아니다.
도 1a 내지 도 1b는 본 명세서에 기재된 작제물로 형질감염된 대식세포로부터의 HER2 발현을 나타내는 그래프(도 8 내지 44 참조). 살아 있는 세포 백분율 및 CAR: HER2 발현은 선택된 샘플(도 1a) 및 모든 샘플(도 1b)에 대한 도트 플롯으로 나타나 있다.
도 2a 내지 도 2b는 본 명세서에 기재된 작제물로 형질감염된 단핵구로부터의 HER2 발현을 나타내는 그래프(도 8 내지 44 참조). 살아 있는 세포 백분율 및 CAR: HER2 발현은 선택된 샘플(도 2a) 및 모든 샘플(도 2b)에 대한 도트 플롯으로 나타나 있다.
도 3a 내지 도 3d는 CAR 대식세포의 CAR 발현, CAR+ 백분율, 생존 백분율, 및 종양 살해 능력을 나타내는 그래프.
도 4a 내지 도 4c는 키메라 FcR(CFR) 및 톨-유사 항원 수용체(TAR) 대식세포의 CFR 및 TAR 발현, CFR+ 및 TAR+ 백분율, 및 생존 백분율을 나타내는 그래프.
도 5a 내지 도 5b는 대식세포 및 CAR 대식세포를 CD40 리간드(CD40L)와 함께 인큐베이션한 후 종양 살해 능력(도 5a) 및 M1 및 M2 마커의 발현 유도(도 5b)를 나타내는 그래프.
도 6a 내지 도 6b는 대식세포 및 CAR 대식세포를 4-1BB와 함께 인큐베이션한 후 종양 살해 능력(도 6a) 및 M1 및 M2 마커의 발현 유도(도 6b)를 나타내는 그래프.
도 7a 내지 도 7b는 대식세포 및 CAR 대식세포를 4-1BB 리간드(4-1BBL)와 함께 인큐베이션한 후 살해 능력 능력(도 7a) 및 M1 및 M2 마커의 발현 유도(도 7b)를 나타내는 그래프.
도 8 내지 도 117은 상기 도면에 도시된 것들을 포함하는 예시적인 키메라 항원 수용체(CAR) 작제물의 개략도.
도 118은 CAR029, CAR061, CAR062, CAR063, CAR064, CAR071, CAR072, CAR074, CAR074, CAR077, CAR078, CAR079, CAR080 및 CAR081을 발현하는 CAR 대식세포의 생존 백분율을 나타내는 그래프.
도 119는 CAR029, CAR061, CAR062, CAR063, CAR064, CAR071, CAR072, CAR074, CAR074, CAR077, CAR078, CAR079, CAR080 및 CAR081로 형질감염된 대식세포에 대한 CAR 발현의 백분율을 나타내는 그래프.
도 120은 CAR029, CAR061, CAR062, CAR063, CAR064, CAR071, CAR072, CAR074, CAR074, CAR077, CAR078, CAR079, CAR080 및 CAR081로 형질감염된 대식세포에 대한 CAR 발현의 강도(MFI)를 나타내는 그래프.
도 121a 내지 도 121f는 사이토카인으로 처리한 후 CAR 대식세포 생존력(도 121a 및 도 121c), 표시된 표면 마커 평균 형광 강도(도 121b, 도 121d, 도 121e 및 도 121f)를 설명하는 예시적인 그래프.
도 122는 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포에서 CAR 발현의 지속성을 설명하는 예시적인 그래프.
도 123a 및 도 123b는 CAR mRNA로 형질감염시키고 다양한 IFN-β 농도로 처리한 후 CAR 대식세포 생존력, CAR 발현 및 평균 형광 강도(도 123a) 및 M1 마커의 유도(도 123b)를 설명하는 예시적인 그래프.
도 124a 및 도 124b는 CAR mRNA로 전기천공하고 IFN-β로 처리하고 2일(도 124a) 또는 7일(도 124b) 후 CAR 대식세포 M2 및 M1 마커 평균 형광 강도를 설명하는 예시적인 그래프.
도 125a 내지 도 125c는 CAR 대식세포의 항종양 기능을 설명하는 예시적인 그래프. 도 125a는 다양한 농도의 IFN-β로 프라이밍하거나 프라이밍하지 않고 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포로부터의 결과를 나타낸다. 도 125b는 다양한 변형을 포함하는 CAR mRNA로 형질감염되고 IFN-β로 처리된 대식세포로부터의 결과를 나타낸다. 도 125c는 CAR mRNA로 형질감염되고 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포로부터의 결과를 나타낸다.
도 126은 사이토카인 분비에 대한 인터페론으로 CAR 대식세포를 처리하는 효과를 설명하는 예시적인 그래프.
도 127a 내지 도 127c는 대식세포에서의 CAR mRNA 지속성 및 CAR 대식세포 기능성의 지속 기간에 대한 인터페론으로의 처리 효과를 설명하는 예시적인 그래프. 도 127a는 인터페론 사이토카인으로 처리된 CAR 대식세포에서 생존력 및 CAR 발현의 테스트로부터의 결과를 나타낸다. 도 127b 및 도 127c는 CAR mRNA로 전기천공되고 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포와 함께 배양된 암 세포로부터의 종양 성장 결과를 나타낸다.
도 128a 내지 도 128c는 대식세포 생존력, CAR 발현, M1 마커 발현, 및 CAR 대식세포 기능성에 대한 인터페론으로의 처리 효과를 설명하는 예시적인 그래프. 도 128a는 CAR mRNA로 형질감염되고 인터페론으로 처리된 대식세포의 생존력, CAR 발현 및 M1 마커 발현을 나타낸다. 도 128b 및 도 128c는 CAR mRNA로 전기천공되고 인터페론 사이토카인으로 처리된 대식세포와 함께 배양된 암 세포로부터의 종양 살해 결과를 나타낸다.
도 129는 형질감염된 대식세포에 대한 IFN-γ의 효과를 설명하는 예시적인 그래프.
도 130a 내지 도 130c는 CAR 대식세포에 대한 RNaseL 저해제의 효과를 설명하는 예시적인 그래프. 도 130a는 IFN-γ 및 RNaseL 저해제인 수니티닙으로 처리한 후 형질감염된 대식세포에서의 mCherry 발현을 나타낸다. 도 130b는 수니티닙으로 처리된 CAR 대식세포와 함께 배양된 암 세포에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 130c는 수니티닙으로 처리된 CAR 대식세포의 종양 살해 활성을 나타낸다.
도 131은 mCherry를 인코딩하는 mRNA 및 RNaseL 저해제인 ABCE1을 인코딩하는 mRNA로 공동-형질감염된 대식세포의 대식세포 생존력 및 mCherry 발현을 설명하는 예시적인 그래프.
도 132는 CD28 힌지 도메인을 포함하는 예시적인 CAR 작제물의 개략도.
도 133a 내지 도 133e는 CAR 대식세포의 CAR+ 백분율, CAR 발현, 생존 백분율 및 종양 살해 능력을 나타내는 그래프.
도 134는 CAR 대식세포에 의한 TNFα 및 IL6 분비를 나타내는 그래프.
도 135는 예시적인 CAR 작제물의 개략도.
도 136은 0 내지 50의 MOI로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포 및 VPX 렌티바이러스 없이 형질도입된 대식세포에서 CAR 작제물(항-HER2 scFv, CD8 힌지, CD8 막횡단 도메인, 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 CTX_001; 도 8)의 발현을 나타내는 그래프. 형질도입되지 않은(UTD) 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 137은 MOI 1, MOI 5 및 MOI 10으로 30일에 걸쳐 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001의 생존력(생존 %) 및 CAR 발현(CAR %)을 나타내는 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 138은 형질도입 후 제4일, 제7일, 제15일, 제22일 및 제29일에 MOI 1, MOI 5 및 MOI 10으로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 α트라스트주맙-AF647을 사용한 CTX_001의 표면 단백질 발현을 나타내는 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 139는 MOI 1, MOI 5 및 MOI 10으로 30일에 걸쳐 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001의 생존력(생존) 및 CAR 발현(CAR+)의 평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 140은 4일 및 7일 후 MOI 1, MOI 5 및 MOI 10으로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001의 살해 기능을 나타내는 일련의 그래프. 이펙터 대식세포 대 표적 종양 세포의 상이한 비율(E:T)은 4:1, 2:1, 1:1 및 1:2였다. 통합 강도는 종양 부담을 나타낸다. 종양 세포와 대식세포 공동 배양 72시간 후의 결과가 그래프로 나타나 있다. UTD 대식세포 및 대식세포가 없는 AU565 HER2+ 유방암 세포는 대조군이었다.
도 141a 내지 도 141b는 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 α트라스투주맙-AF647을 사용하여 평가된 CTX_001 및 CTX_003(항-HER2 scFv, CD8 힌지, 및 CD8 막횡단 도메인을 포함하는 CAR; 도 10)의 표면 단백질 발현을 나타내고(도 141a) MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001 및 CTX_003의 생존력(생존 %) 및 CAR 발현(CAR %)을 나타내는(도 141b) 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 142는 α트라스투주맙-AF647을 사용하여 평가된 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001 및 CTX_003의 생존력(생존) 및 CAR 발현(CAR+)을 나타내는 일련의 MFI 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 143은 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 M2 대식세포 마커(CD163 및 CD206) 및 M1 대식세포 마커(CD80 및 CD86)의 MFI의 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 144는 CD80 및 CD86을 사용하여 평가된 Ad5f35를 이용한 형질도입에 비해 VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 대식세포의 M1 분극화를 나타내는 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 145는 형질도입 후 7일째 및 형질도입 후 21일째에 SKOV3 난소 암종 세포에 대한 VPX 렌티바이러스 또는 Ad5f35로 형질도입된 CTX_001 대식세포의 살해 기능을 나타내는 일련의 그래프. E:T의 비율은 4:1이었다. UTD 대식세포 및 대식세포가 없는 SKOV3 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 146은 72시간에 걸쳐 AU565 세포에 대하여 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 살해 기능을 나타내는 일련의 그래프. E:T의 상이한 비율은 4:1 및 1:2였다. UTD 대식세포 및 대식세포가 없는 AU565 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 147은 SKOV3 난소 암종 세포에 대하여 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 살해 기능을 나타내는 일련의 그래프. E:T의 비율은 4:1이었다. UTD 대식세포 및 대식세포가 없는 SKOV3 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 148은 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입되고 24시간 동안 플레이트결합된 HER2와 함께 또는 없이 배양된 CTX001 또는 CTX_003 대식세포에 의한 TNFα 및 IL-6의 생성을 나타내는 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 149는 21일에 걸쳐 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001 및 CTX_003의 생존력(생존 %) 및 CAR 발현(CAR+ %)을 나타내는 일련의 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 150은 α트라스투주맙-AF647을 사용하여 평가된 21일에 걸쳐 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001 및 CTX_003의 생존력(생존) 및 CAR 발현(CAR+)을 나타내는 일련의 MFI 그래프. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 151은 형질도입 후 21일째 및 72시간에 걸쳐 개시된 AU565 세포에 대하여MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 살해 기능을 나타내는 일련의 그래프. E:T의 상이한 비율은 4:1 및 1:2였다. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 152는 형질도입 후 21일째 및 72시간에 걸쳐 개시된 SKOV3 세포에 대하여 MOI 2 및 MOI 5로 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 살해 기능을 나타내는 일련의 그래프. E:T의 비율은 4:1이었다. UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 153a 내지 d는 MOI 2, 5 또는 10으로 VPX 렌티바이러스를 사용하여 CTX_001로 CD14+ 단핵구를 형질도입한 후 생존력(도 153a), CAR 발현 백분율(도 153b), CAR 발현의 MFI(도 153c) 및 CAR 발현 히스토그램(도 153d)을 나타내는 일련의 그래프. Ad5f35 형질도입된 CAR 단핵구 및 CAR 대식세포가 비교자로 나타나 있다. UTD 대식세포를 또한 CAR 발현 히스토그램에 대한 대조군으로 사용하였다.
도 154a 내지 d는 SIRPα-APC % POS(도 154a) 및 MFI(도 154b), 유세포 분석(도 154c) 및 세포 생존력(도 154d)에 의해 평가된 2개의 공여체에서 CTX_001 대식세포에서의 SIRPα 넉아웃을 나타내는 일련의 그래프. 리보핵단백질(RNP) 농도는 유세포 분석(312 및 1250㎚)을 제외하고 165, 312, 625 및 1250nM이었다. 비처리(NT) CAR 대식세포 또는 Cas9만을 대조군으로 사용하였다.
도 155a 내지 d는 유세포 분석을 사용하여 SIRPα를 표적화하는 Cas9 및 gRNA가 있는 CTX_001 대식세포에서 SIRPα 넉아웃(도 155a), 유세포 분석을 사용하여 SIRPα 넉아웃 대식세포에서 CTX_001의 발현(도 155b), 12시간에 걸쳐 SKOV-3 난소 암종 세포의 SIRPα 넉아웃 CTX_001 대식세포에 의한 식세포작용(도 155c), 곡선하 면적으로 정량화된 12시간에 걸쳐 측정된 총 식세포작용(도 155d)을 나타내는 일련의 그래프. 비처리(NT) CAR 대식세포, gRNA 단독, 및 UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 156a 내지 d는 유세포 분석을 사용하여 SIRPα를 표적화하는 Cas9 및 gRNA가 있는 CTX_001 대식세포에서 SIRPα 넉아웃(도 156a), 유세포 분석을 사용하여 SIRPα 넉아웃 대식세포에서 CTX_001의 발현(도 156b), 12시간에 걸쳐 HCC-1954 인간 유방암 세포의 SIRPα 넉아웃 CTX_001 대식세포에 의한 식세포작용(도 156c), 곡선하 면적으로 정량화된 12시간에 걸쳐 측정된 총 식세포작용(도 156d)을 나타내는 일련의 그래프. NT CAR 대식세포, gRNA 단독, 및 UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
도 157a 내지 e는 유세포 분석을 사용하여 SIRPα를 표적화하는 Cas9 및 gRNA가 있는 상이한 공여체 세포로부터의 CTX_001 대식세포에서 SIRPα 넉아웃(도 157a), 유세포 분석을 사용하여 SIRPα 넉아웃 대식세포에서 CTX_001의 발현(도 157b), 정규화된 종양 부담에 의해 표시된 24시간에 걸쳐 nuclight 녹색 형광 단백질을 발현하는 SKOV-3 세포를 살해하는 SIRPα 넉아웃 CTX_001 대식세포(도 157c), 표적 종양 세포의 50%를 소거하는 데 필요한 시간에 기반한 종양 살해 동역학(도 157d), 및 12시간에 걸쳐 측정된 총 식세포작용(도 157e)을 나타내는 일련의 그래프. NT CAR 대식세포, gRNA 단독, 및 UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
정의
본 발명이 더 쉽게 이해되도록, 먼저 특정 용어를 하기에 정의한다. 다음 용어 및 기타 용어에 대한 추가적인 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 제시된다. 본 발명의 배경을 설명하고 그 실행에 관한 추가적인 상세 내용을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 간행물 및 기타 참조 자료는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
단수 표현은 본 명세서에서 관자의 문법적 대상 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대략 또는 약: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약"은 하나 이상의 관심이 있는 값에 적용될 때 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되어 있거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한(이와 같은 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함) 언급된 참조 값의 (더 크거나 더 작은) 어느 방향으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
활성화: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극되었거나 이펙터 기능을 발휘하도록 자극된 세포, 예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생산, 사이토카인 분비, 식세포작용, 세포 신호전달(예를 들어, 유전자 발현 변화), 표적 세포 살해, 대사 변화, 염증 매개체의 생산, 증식, 후성적 재프로그래밍, 대식세포의 표현형 전환(예를 들어, M1 분극화), 전종양(pro-tumor) 또는 M2 대식세포의 억제, 전종양 또는 M2 대식세포의 표현형 전환, 및/또는 항원 처리 및 제시와 연관될 수 있다.
활성화된 단핵구/대식세포/수지상 세포: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화된 단핵구/대식세포/수지상 세포"는 특히 세포 분열을 겪고 있거나 이펙터 기능을 발휘하는 단핵구/대식세포/수지상 세포를 지칭한다. 용어 "활성화된 단핵구/대식세포/수지상 세포"는 특히 이펙터 기능을 수행하고 있거나 식세포작용, 사이토카인 분비, 증식, 유전자 발현 변화, 대사 변화, 염증 매개체의 생산, 증식, 후성적 재프로그래밍, 대식세포의 표현형 전환(예를 들어, M1 분극화), 전종양 또는 M2 대식세포의 억제, 전종양 또는 M2 대식세포의 표현형 전환, 및 기타 기능을 포함하여, 휴식 상태에서 보이지 않는 임의의 활성을 발휘하고 있는 세포를 지칭한다.
작용제: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"(또는 "생물학적 작용제" 또는 "치료제")는 본 명세서에 기재된 변형된 세포에 의해 표적으로 발현, 방출, 분비 또는 전달될 수 있는 분자를 지칭한다. 작용제는 핵산, 항생제, 항염증제, 항체 또는 이의 단편, 항체 작용제 또는 이의 단편, 성장 인자, 사이토카인, 효소, 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 합성 분자, 유기 분자(예를 들어, 소분자), 탄수화물, 지질, 호르몬, 마이크로솜, 이들의 유도체 또는 변이체, 이들 중 하나 이상을 포함하는 제형 또는 조성물, 및 이들의 임의의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 작용제는 임의의 세포 모이어티, 예컨대, 수용체, 항원 결정기, 또는 표적 또는 표적 세포 상에 존재하는 다른 결합 부위에 결합할 수 있다. 작용제는 세포 내로 작용할 수 있는 세포로 확산되거나 운반될 수 있다.
항체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 대한 특이적 결합을 부여하기에 충분한 표준 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 자연에서 생성된 온전한 항체는 일반적으로 "Y-형" 구조로 지칭되는 구조로 서로 회합하는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드(각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드(각각 약 25 kD)를 포함하는 대략 150 kD의 사량체 작용제이다. 각각의 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개 아미노산 길이), 즉 아미노-말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 끝에 위치함)과 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 카복시-말단 CH3(Y 줄기의 바닥에 위치함))을 포함한다. "스위치"로 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 영역과 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지 부분과 연결한다. 이 힌지 영역에 있는 2개의 이황화 결합은 온전한 항체에서 2개의 중쇄 폴리펩타이드를 서로 연결한다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 즉 아미노-말단 가변(VL) 도메인과 이어서 카복시-말단 불변(CL) 도메인을 포함하며, 이들은 다른 "스위치"에 의해 서로 분리된다. 온전한 항체 사량체는 중쇄와 경쇄가 단일 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있는 2개의 중쇄-경쇄 이량체를 포함하며; 2개의 다른 이황화 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여 이량체가 서로 연결되어 사량체가 형성된다. 자연적으로 생성된 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 자연 항체의 각각의 도메인은 압축된 역평행 베타 배럴에서 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트(예를 들어, 3-, 4- 또는 5-가닥 시트)로 형성된 "면역글로불린 접힘"을 특징으로 하는 구조를 가진다. 각각의 가변 도메인은 "상보성 결정 영역"(CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로 알려진 3개의 초가변 루프와 4개의 다소 불변인 "프레임워크" 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 자연 항체가 접힐 때, FR 영역은 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄와 경쇄 둘 다의 CDR 루프 영역은 3차원 공간에서 함께 결합되어 Y 구조의 끝에 위치한 단일 초가변 항원 결합 부위를 형성한다. 자연적으로 발생하는 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소에 결합하고, 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 이펙터 세포를 포함하는 이펙터 세포의 수용체에도 결합한다. Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 다른 결합 속성은 글리코실화 또는 다른 변형을 통해 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, CAR의 구성 요소로서) 본 발명에 따라 생산 및/또는 이용되는 항체는 변형되거나 조작된 글리코실화를 가지는 Fc 도메인을 포함하여 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자연 항체에서 발견되는 바와 같은 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체는 이와 같은 폴리펩타이드가 자연적으로 생산되는지(예를 들어, 항원에 반응하는 유기체에 의해 생성됨), 또는 재조합 조작, 화학적 합성, 또는 다른 인공 시스템 또는 방법론에 의해 생산되는지 여부에 관계없이 "항체"로 지칭되고/되거나 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 다클론성이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성이다. 일부 실시형태에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징인 불변 영역 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 항체 서열 요소는 당업계에 알려진 바와 같이 인간화된 것, 영장류화된 것, 키메라 등이다. 더욱이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 (달리 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한) 적절한 실시형태에서 항체의 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 표현으로 이용하기 위한 임의의 당업계에 알려지거나 개발된 작제물 또는 형식을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체는 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중-특이성 항체(예를 들어, Zybodies® 등); Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 분리된 CDR 또는 이들의 세트와 같은 항체 단편; 단일 사슬 Fv; 폴리펩타이드-Fc 융합물; 단일 도메인 항체(예를 들어, IgNAR 또는 이의 단편과 같은 상어 단일 도메인 항체); 카멜로이드 항체; 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®); 소형 모듈형 면역약제(Small Modular ImmunoPharmaceuticals; "SMIPTM"); 단일 사슬 또는 직렬 다이아바디(TandAb®); VHH; Anticalin®; Nanobody® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®; Avimer®; DART; TCR-유사 항체; Adnectin®; Affilin®; Trans-body®; Affibody®; TrimerX®; MicroProtein; Fynomer®, Centyrin®; 및 KALBITOR®로부터 선택되는 형식이지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 항체는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 기[예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜 등])을 포함할 수 있다.
항체 작용제: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 작용제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 작용제는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징인 하나 이상의 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 당업계에 알려진 바와 같이 인간화된 것, 영장류화된 것, 키메라 등인 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 실시형태에서, 용어 "항체 작용제"는 항체의 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 표현으로 이용하기 위한 임의의 당업계에 알려지거나 개발된 작제물 또는 형식 중 하나 이상을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체는 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중-특이성 항체(예를 들어, Zybodies® 등); Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 분리된 CDR 또는 이들의 세트와 같은 항체 단편; 단일 사슬 Fv; 폴리펩타이드-Fc 융합물; 단일 도메인 항체(예를 들어, IgNAR 또는 이의 단편과 같은 상어 단일 도메인 항체); 카멜로이드 항체; 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®); 소형 모듈형 면역약제(Small Modular ImmunoPharmaceuticals; "SMIPTM"); 단일 사슬 또는 직렬 다이아바디(TandAb®); VHH; Anticalin®; Nanobody® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®; Avimer®; DART; TCR-유사 항체; Adnectin®; Affilin®; Trans-body®; Affibody®; TrimerX®; MicroProtein; Fynomer®, Centyrin®; 및 KALBITOR®로부터 선택되는 형식이지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 기[예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜 등])을 포함할 수 있다. 많은 실시형태에서, 항체 작용제는 아미노산 서열이 상보성 결정 영역(CDR)으로서 당업자에 의해 인식되는 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함하며; 일부 실시형태에서 항체 작용제는 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR(예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 비교하여 서열이 동일하거나 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가, 또는 치환되지만 포함된 CDR이 그 외에는 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 가진다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1 내지 5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가, 또는 치환되지만 포함된 CDR이 그 외에는 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 가진다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 치환되어 있지만 포함된 CDR이 그 외에는 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 가진다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1 내지 5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가, 또는 치환되지만 포함된 CDR이 그 외에는 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 가진다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 면역글로불린-결합 도메인과 상동성이거나 또는 대체로 상동성인 결합 도메인을 가지는 폴리펩타이드 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩타이드가 아니고/아니거나 이를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 면역글로불린 구조적 요소(예를 들어, 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 수용체 또는 다른 자연적으로 발생하는 분자)를 포함하지 않는 분자 또는 조성물이거나 이를 포함할 수 있다.
항체 단편: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭하고 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 및 이의 인간 및 인간화 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체 중쇄: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 중쇄"는 자연적으로 발생하는 입체형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다.
항체 경쇄: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 경쇄"는 자연적으로 발생하는 입체형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다.
합성 항체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현되는 항체를 지칭한다. 이 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질을 발현하는 항체, 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용 가능하고 당업계에 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득하였다.
항원: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발할 수 있는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 특정 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 인코딩될 필요가 없음을 이해할 것이다. 본 발명이 하나 초과의 유전자의 부분적 뉴클레오타이드 서열의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다는 것과 이러한 뉴클레오타이드 서열이 원하는 면역 반응을 유발하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것은 용이하게 알 수 있다. 더욱이, 숙련된 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원이 합성되어 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것은 용이하게 알 수 있다. 이와 같은 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
항종양 효과: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항종양 효과"는 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 또는 암 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선으로 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 종양 발생을 처음부터 예방하는 본 발명의 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
자가: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자가"는 나중에 동일한 개체로 재도입될 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
동종이계: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동종이계"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 이식편(예를 들어, 세포 집단)을 지칭한다.
이종발생: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종발생"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편(예를 들어, 세포 집단)을 지칭한다.
암: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 이상 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 암은 갑상선 수질 암종이다.
보존적 서열 변형: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 상당한 영향을 미치지 않거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이와 같은 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 표준 기법에 의해 다양한 실시형태와 양립 가능한 항체에 변형을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 항체는 본 명세서 기재된 기능 검정을 사용하여 항원에 결합하는 능력에 대해 테스트될 수 있다.
공동 자극 리간드: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공동 자극 리간드"는 단핵구/대식세포/수지상 세포 상에서 동족 공동 자극 분자에 특이적으로 결합하여, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단핵구/대식세포/수지상 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어, APC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 지칭한다. 공동 자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동 자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 공동 자극 리간드는 또한 특히 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드(이에 제한되지 않음)와 같은 단핵구/대식세포/수지상 세포에 존재하는 공동 자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
세포독성: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포독소에 의한" 또는 "세포독성"은 세포를 살해하거나 손상시키는 것을 지칭한다. 일 실시형태에서, 대사적으로 향상된 세포의 세포독성이 개선되며, 예를 들어, 대식세포의 세포용해 활성이 증가된다.
유효량: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유효량" 및 "치료적 유효량"은 호환 가능하며, 본 명세서에 기재된 바와 같이 특정 생물학적 결과를 달성하거나 치료적 또는 예방적 이익을 제공하기에 효과적인 화합물, 제형, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이와 같은 결과는 당업계에 적합한 임의의 수단에 의해 측정된 바와 같은 항종양 활성을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
이펙터 기능: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이펙터 기능" 또는 "이펙터 활성"은 면역 세포의 자극에 반응하여 면역 세포에 의해 수행되는 특정 활성을 지칭한다. 예를 들어, 식세포작용에 의해 세포 파편, 외래 물질, 미생물, 암세포 및 기타 건강에 해로운 세포를 빨아들여 소화하는 대식 세포의 이펙터 기능.
인코딩: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인코딩"은 정의된 뉴클레오타이드 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열을 가지는 생물학적 과정 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성에서, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형의 역할을 하는 특정 뉴클레오타이드 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산한다면 유전자는 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥은 둘 다 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
내인성: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "내인성"은 특정 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 유래이거나 내부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
외인성: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 특정 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 외부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
확장: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "확장"은 단핵구/대식세포 수의 증가에서와 같이 수의 증가를 지칭한다. 일 실시형태에서, 생체외에서 확장된 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포는 배양물에 원래 존재하는 수에 비해 수가 증가한다. 또 다른 실시형태에서, 생체외에서 확장된 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포는 배양물에서 다른 세포 유형에 비해 수가 증가한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체외"는 살아있는 유기체(예를 들어, 인간)로부터 제거되고 유기체 외부에서(예를 들어, 배양 접시, 시험관, 또는 생물반응기에서) 증식된 세포를 지칭한다.
발현: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"이라는 용어는 핵산 서열로부터 임의의 유전자 산물의 생성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 전사체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열의 발현은 다음 중 하나 이상을 포함한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생성(예를 들어, 전사에 의함); (2) RNA 전사체의 가공(예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 형성); (3) RNA의 폴리펩타이드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역 후 변형.
발현 벡터: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스(예를 들어, Ad5 벡터, 예를 들어, Ad5f35))와 같은 당업계에 알려진 모든 발현 벡터를 포함한다.
상동성: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩타이드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 중합체 분자는 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 경우 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 중합체 분자는 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 유사한 경우(예를 들어, 상응하는 위치에서 관련된 화학적 특성을 가지는 잔기를 포함) 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 어느 잔기가 상이한 서열에서 서로 "상응"하는지를 고려할 때 한 서열에서 상이한 서열에 대해 지정된 길이의 갭을 허용하는 것을 포함하여, 서열의 상동성 정도를 결정하기 위해 서열의 비교를 허용하는 다양한 알고리즘이 이용 가능하다. 예를 들어, 2개의 핵산 서열 사이의 상동성 백분율의 계산은 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 해당하지 않는 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 특정 실시형태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 그 다음 상응하는 뉴클레오타이드 위치의 뉴클레오타이드를 비교한다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드에 의해 점유되면, 분자는 해당 위치에서 동일하고; 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 상응하는 위치와 유사한 뉴클레오타이드에 의해 점유되면, 분자는 해당 위치에서 유사하다. 두 서열 사이의 상동성 백분율은 갭의 수와 각각의 갭의 길이(이는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 함)를 고려하여 서열이 공유하는 동일하고 유사한 위치의 수의 함수이다.
동일성: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 특히 2개의 아미노산 분자 사이, 예컨대, 2개의 폴리펩타이드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에 동일한 잔기를 가지는 경우; 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드 분자 각각의 위치가 아르기닌에 의해 점유되는 경우, 이들 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 아미노산 서열이 정렬에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 가지는 정도 또는 동일성은 종종 백분율로 표시된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 일치하거나 동일한 위치의 수의 직접적인 함수이며; 예를 들어, 2개 서열의 위치 중 절반(예를 들어, 길이가 10개 아미노산인 중합체의 5개 위치)이 동일한 경우, 2개 서열은 50% 동일하고; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 일치하거나 동일한 경우, 2개 아미노산 서열은 90% 동일하다.
실질적 동일성: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 비교를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개 서열이 상응하는 위치에 동일한 잔기를 포함하는 경우, 이들 서열은 일반적으로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노에 대한 BLASTP, 갭 BLAST(gapped BLAST) 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램으로 이용 가능한 것을 포함하여, 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 서열은 상응하는 잔기의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이 잔기의 관련 스트레치에 대해 동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 실시형태에서, 관련 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 초과의 잔기이다. CDR의 맥락에서, "실질적인 동일성"에 대한 언급은 전형적으로 아미노산 서열이 참조 CDR과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 CDR을 지칭한다.
면역글로불린: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질 부류를 지칭한다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 지칭된다. 이 부류의 단백질에 포함되는 5가지 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 침, 눈물, 모유, 위장 분비물, 기도 및 비뇨생식관의 점액 분비물과 같은 체액 분비물에 존재하는 1차 항체이다. IgG는 가장 일반적인 순환 항체이다. IgM은 대부분의 대상체에서의 1차 면역 반응에서 생산되는 주요 면역글로불린이다. 이는 응집, 보체 고정, 및 기타 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이며, 박테리아 및 바이러스에 대한 방어에 중요하다. IgD는 알려진 항체 기능이 없지만 항원 수용체 역할을 할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알레르겐에 노출 시 비만 세포와 호염기구로부터 매개체 방출을 유발함으로써 즉각적인 과민성을 매개하는 면역글로불린이다.
면역 반응: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 림프구가 항원 분자를 외래 물질로 식별하고 항체 형성을 유도하고/하거나 림프구를 활성화시켜 항원을 제거할 때 발생하는 항원에 대한 세포 반응을 지칭한다.
단리된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거된 어떤 것을 지칭한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
렌티바이러스: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하며; 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있어 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스에서 유래된 벡터는 생체내에서 상당한 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
변형된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형된"은 본 발명의 분자 또는 세포의 변화된 상태 또는 구조를 지칭한다. 분자는 화학적, 구조적, 및 기능적으로를 포함하여 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 세포는 핵산 도입을 통해 변형될 수 있다.
조절: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "조절"은 치료 또는 화합물의 부재 하에 대상체에서의 반응 수준과 비교하여, 및/또는 그 외에는 동일하지만 치료되지 않은 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 대상체에서의 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 지칭한다. 이 용어는 천연 신호 또는 반응을 교란시키고/시키거나 이에 영향을 미침으로써 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
작동 가능하게 연결된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이가 기능적으로 연결되어 후자의 발현을 초래하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하며, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우 동일한 리딩 프레임에 있다.
과발현된 종양 항원: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"은 특정 조직 또는 기관 유래의 정상 세포에서의 발현 수준에 비해 환자의 해당 조직 또는 기관 내 고형 종양과 같은 질환 영역 유래의 세포에서 종양 항원의 비정상적인 수준의 발현을 지칭한다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양을 가지는 환자는 당업계에 알려진 표준 검정법에 의해 결정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 사슬을 지칭한다. 또한 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 호환 가능하다. 당업자는 핵산이 모노머 "뉴클레오타이드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오타이드라는 일반 상식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수단, 즉 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈 유래의 핵산 서열의 클로닝, 일반적인 클로닝 기술 및 PCR™ 등의 사용, 및 합성 수단에 의한 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에서 이용 가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
폴리펩타이드: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 전형적으로 펩타이드 결합에 의해 연결된 잔기(예를 들어, 아미노산)의 임의의 중합체 사슬을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 사람의 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생성된다는 점에서 조작된 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 또는 둘 다를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 아미노산만 또는 비-천연 아미노산만을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 D-아미노산, L-아미노산, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 L-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, 예를 들어, 폴리펩타이드의 N-말단, 폴리펩타이드의 C-말단, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 측쇄를 변형시키거나 이에 부착되는, 하나 이상의 펜던트 기 또는 다른 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이와 같은 펜던트 기 또는 변형은 아세틸화, 아마이드화, 지질화, 메틸화, 페길화 등 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 고리형일 수 있고/있거나, 고리형 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 고리형이 아니고/아니거나 어떠한 고리형 부분을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 선형이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 스테이플링된(stapled) 폴리펩타이드일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드, 활성, 또는 구조의 이름에 첨부될 수 있으며; 이와 같은 경우 상기 용어는 관련 활성 또는 구조를 공유하는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되며, 따라서 폴리펩타이드의 동일한 부류 또는 패밀리의 구성원으로 간주될 수 있다. 이와 같은 각각의 부류에 대해, 본 명세서는 아미노산 서열 및/또는 기능이 알려진 부류 내의 예시적인 폴리펩타이드를 제공하고/하거나 당업자는 이를 알고 있을 것이며; 일부 실시형태에서, 이와 같은 예시적인 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 부류 또는 패밀리에 대한 참조 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 부류 또는 패밀리의 구성원은 부류의 참조 폴리펩타이드와(일부 실시형태에서는 부류 내의 모든 폴리펩타이드와) 상당한 서열 상동성 또는 동일성을 나타내고/나타내거나, 공통 서열 모티프(예를 들어, 특징적인 서열 요소)를 공유하고/하거나 (일부 실시형태에서는 비슷한 수준 또는 지정된 범위 내에서) 공통 활성을 공유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 구성원 폴리펩타이드는 적어도 약 30 내지 40%인 참조 폴리펩타이드와의 서열 상동성 또는 동일성의 전체 정도를 나타내며, 이는 종종 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 초과하고/하거나 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과인 매우 높은 서열 동일성을 나타내는 적어도 하나의 영역(예를 들어, 일부 실시형태에서 특징적인 서열 요소이거나 이를 포함할 수 있는 보존된 영역)을 포함한다. 이와 같은 보존된 영역은 보통 적어도 3 내지 4개, 종종 최대 20개 이상의 아미노산을 포함하고; 일부 실시형태에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 초과의 인접 아미노산의 적어도 하나의 스트레치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유용한 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드의 단편을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 폴리펩타이드는 복수의 단편을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 이들 각각은 관심이 있는 폴리펩타이드에서 발견되는 것보다 서로에 대해 상이한 공간적 배열로 동일한 모 폴리펩타이드에서 발견되어(예를 들어, 모체에서 직접 연결된 단편은 관심이 있는 폴리펩타이드에서 공간적으로 분리될 수 있거나 그 반대일 수 있고/있거나, 단편이 관심이 있는 폴리펩타이드에서 모체와 상이한 순서로 존재할 수 있음), 관심이 있는 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드의 유도체가 된다.
단백질: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩타이드(즉, 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 스트링)를 지칭한다. 단백질은 아미노산 이외의 모이어티를 포함할 수 있고/있거나(예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸 등일 수 있음), 달리 가공되거나 변형될 수 있다. 당업자는 "단백질"이 세포에 의해 생성된 완전한 폴리펩타이드 사슬(신호 서열을 가지거나 가지지 않음)일 수 있거나, 이의 특징적인 부분일 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 단백질이 때때로, 예를 들어, 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결되거나 다른 수단에 의해 회합된 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 폴리펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 다를 포함할 수 있고 당업계에 알려진 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 포함할 수 있다. 유용한 변형은, 예를 들어, 말단 아세틸화, 아마이드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 용어 "펩타이드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산 길이를 가지는 폴리펩타이드를 지칭하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체, 항체 단편, 이의 생물학적 활성 부분, 및/또는 이의 특징적인 부분이다.
신호 전달 경로: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호를 전송하는 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포의 원형질막을 가로질러 신호를 전송할 수 있는 분자 및 분자 복합체를 포함한다.
단일 사슬 항체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 사슬 항체"는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편이 조작된 아미노산 범위를 통해 Fv 영역에 연결되는 재조합 DNA 기법에 의해 형성된 항체를 지칭한다. 미국 특허 제4,694,778호; 문헌[Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041]에 기재된 것을 포함하여, 단일 사슬 항체를 생성하는 다양한 방법이 알려져 있다.
특이적으로 결합하다: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항원 결합 도메인, 예컨대, 항체 작용제와 관련하여, 용어 "특이적으로 결합하다"는 특정 항원을 인식하지만 샘플 중 다른 분자를 실질적으로 인식하지 않거나 이에 결합하지 않는 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제를 지칭한다. 예를 들어, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제는 또한 하나 이상의 종 유래의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이와 같은 종간 반응성은 그 자체로 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제의 분류를 특이적인 것으로 변경하지 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이와 같은 교차 반응성은 그 자체로 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제의 분류를 특이적인 것으로 변경하지 않는다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제, 단백질 또는 펩타이드와 제2의 화학종의 상호작용과 관련하여, 상호작용이 화학종의 특정 구조(예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 따라 달라지며; 예를 들어, 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다는 것을 의미하는 데 사용될 수 있다. 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A" 및 항원 결합 도메인 또는 항체 작용제를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리되고, 표지되지 않은 A)를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
자극: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자극"은 자극 분자(예를 들어, FcR 복합체, TLR 복합체, 또는 TCR/CD3 복합체)와 그의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되어 Fc 수용체 기구 또는 합성 CAR을 통한 신호 전달과 같으나 이에 제한되지 않는 신호 전달 사건을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 TGF-베타의 하향조절, 및/또는 세포골격 구조의 재구성 등과 같은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 자극 분자는 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함하는 FcR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자극 분자는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함하는 TLR 세포외 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 대식세포, 수지상 세포, B-세포 등) 또는 종양 세포 상에 존재할 때 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포 상의 동족 결합 파트너(본 명세서에서 "자극 분자"로 지칭됨)와 특이적으로 결합하여 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 세포에 의한 반응을 매개할 수 있는 리간드를 지칭한다. 자극 리간드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 톨-유사 수용체(TLR) 리간드, 항-톨-유사 수용체 항체, 작용제, 및 단핵구/대식세포 수용체에 대한 항체를 포함한다. 추가적으로, 인터페론-감마와 같은 사이토카인은 대식세포의 강력한 자극제이다.
대상체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간, 비-인간 포유동물, 비-인간 영장류, 영장류, 실험실 동물, 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 고양이, 개)을 지칭한다. 일부 실시형태에서 인간 대상체는 성인, 청소년, 또는 소아 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같이 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 본 명세서에 열거된 암 또는 종양을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태에 걸리기 쉬우며; 일부 실시형태에서, 민감한 대상체는 질환, 장애 또는 병태가 발병할 경향이 있고/있거나 증가된 위험(참조 대상체 또는 집단에서 관찰된 평균 위험과 비교하여)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 특정 증상(예를 들어, 질환의 임상 징후) 또는 질환, 장애, 또는 병태의 특성을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태의 어떠한 증상이나 특성을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법을 투여받고/받거나 투여받은 적이 있는 개체이다.
실질적으로 정제된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어, 세포에 적용될 때, 용어 "실질적으로 정제된"은 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연적으로 발생하는 상태에서 일반적으로 회합된 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 회합된 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 실시형태에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
표적: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적"은 치료가 필요하거나 예를 들어 항체(또는 이의 단편) 또는 CAR에 의해 우선적으로 결합되는 신체 내의 세포, 조직, 기관 또는 부위를 지칭한다.
표적 부위: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합이 발생하기에 충분한 조건 하에서 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 일부를 정의하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
T 세포 수용체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원의 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 참여하는 막 단백질의 복합체를 지칭한다. TCR은 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합된 항원 인식을 담당한다. TCR은 알파(a) 및 베타(β) 사슬의 이종이량체를 포함하지만, 일부 세포에서는 TCR이 감마 및 델타(γ/δ) 사슬을 포함한다. TCR은 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있으며, 이들 형태는 구조적으로 유사하지만 해부학적 위치와 기능이 구별된다. 각각의 사슬은 2개의 세포외 도메인, 즉 가변 도메인과 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TCR은, 예를 들어, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 감마 델타 T 세포를 포함하여 TCR을 포함하는 임의의 세포 상에서 변형될 수 있다.
치료: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 치료 및/또는 예방을 지칭한다. 치료 효과는 질환 상태의 억제, 관해, 또는 근절에 의해 얻어진다.
형질감염된: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상 세포 및 그 자손을 포함한다.
치료하다: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", 또는 "치료하는"은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생률 및/또는 중증도의 부분적 또는 완전한 경감, 개선, 발병 지연, 저해, 예방, 완화, 및/또는 감소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 병태의 징후 또는 특징을 나타내지 않는 대상체에게 치료가 투여될 수 있다(예를 들어, 예방적일 수 있음). 일부 실시형태에서, 치료는, 예를 들어, 질환, 장애 및/또는 병태와 연관된 병리의 발병 위험을 감소시키기 위한 목적으로, 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 또는 경미한 징후 또는 특징만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 질환, 장애, 또는 병태의 확립된, 중증, 및/또는 말기 징후를 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
종양: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양"은 세포 또는 조직의 비정상적 성장을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성, 및/또는 비-전이성인 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양은 암과 연관되거나, 암의 징후이다. 일부 실시형태에서, 종양은 분산성 종양 또는 액체 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양일 수 있다.
벡터: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 폴리라이신 화합물, 리포솜 등과 같이 핵산을 세포로 전달하는 것을 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범주에 대한 불변의 제한으로 해석되어서는 안 됨을 이해하여야 한다. 따라서 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라, 해당 범위 내의 개별 수치값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6과 같은 하위 범위뿐만 아니라, 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
상세한 설명
면역 세포
본 개시내용은 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 변형된 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR을 포함하는 면역 세포는, (a) 세포외 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인), (b) 막횡단 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 막횡단 도메인), 및 (c) 세포내 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 도메인)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 면역 반응, 예를 들어, 면역 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 세포의 예는 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 호중구, 호산구, 비만 세포, 혈소판, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포, T-림프구, 또는 B-림프구를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 공급원은 대상체로부터 얻을 수 있다. 대상체의 예는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 이들의 유전자이식 종을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포 집단은 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 및/또는 이들의 전구체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 집단은 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포, 또는 세포주의 정제된 집단을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 활성화되고, 예를 들어, 면역 세포는, 예를 들어, 불활성 세포에 비해 증가된 사이토카인 생산, 케모카인 생산, 식세포작용, 세포 신호전달, 표적 세포 살해, 및/또는 항원 제시를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 활성화된 면역 세포는, 예를 들어, 불활성 세포에 비해, 유전자 발현의 변화, 예를 들어, 전염증성 유전자 발현(예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 또는 IL-1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 유도를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 활성화된 면역 세포는 세포 분열을 겪고 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포의 표적화된 이펙터 활성은 CD47 및/또는 SIRPα 활성의 저해에 의해 향상된다. CD47 및/또는 SIRPα 활성은 면역 세포를 항-CD47 또는 항-SIRPα 항체로 처리하거나 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 저해될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 대상체로부터 수득(예를 들어, 단리)된다. 면역 세포는 자가 조직이거나 동종이계 또는 보편적 공여체로부터 공급받을 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 탯줄, 종양 및/또는 배아 줄기 세포(ESC)와 같은 유도 만능 줄기 세포를 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 Ficoll 분리와 같이 숙련된 기술자에게 알려진 임의의 수의 분리 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 세척되고 다양한 완충액(예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS)) 또는 배양 배지에 재현탁될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구)의 농축은 소성 부착(plastic adherence)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 농축 후, 면역 세포(예를 들어 단핵구)의 분화는 GM-CSF를 이용한 자극을 포함한다. 일부 실시형태에서, 혈액 세포(예를 들어, 단핵구, 림프구, 혈소판, 혈장, 및/또는 적혈구)를 포함하는 조성물, 예컨대, 백혈구성분채집술 조성물(예를 들어, 류코팩(leukopak))이 농축을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 백혈구성분채집 조성물(예를 들어, 류코팩)은 건강한 인간 공여체 유래의 샘플을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구)의 성분채집술 후 GM-CSF를 이용한 동원이 이어진다. 특정 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구)의 선택은 마이크로비드(예를 들어, CliniMACS Prodigy 장치 상의 MACS® MicroBeads)를 사용하는 CD14 양성 선택을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 전구체(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 대한 전구체)는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용된다. 면역 세포 전구체는 생체내 또는 생체외에서 면역 세포로 분화될 수 있다. 전구체 면역 세포의 비-제한적인 예는 조혈 줄기 세포, 공통 골수 전구 세포, 골수모세포, 단일모세포, 전단핵구, 또는 이들의 중간체를 포함한다. 예를 들어, 유도 만능 줄기 세포는 단핵구, 대식세포, 및/또는 수지상 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 말초 혈액, 섬유아세포, 피부, 각질형성세포, 또는 신장 상피 세포와 같은 정상적인 인간 조직으로부터 유래될 수 있다. 자가, 동종이계, 또는 범용 공여체 iPSC는 골수 계통(예를 들어, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 또는 이의 전구체)으로 분화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 예를, 들어 적혈구를 용해시키고 림프구 및 적혈구를 고갈시킴으로써, 예컨대, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해, 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 면역 세포는 제대 조직으로부터 단리될 수 있다. 면역 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CD34, CD3, CD4, CD8, CD56, CD66b, CD19 또는 CD20을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 항원을 발현하는 세포가 고갈될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 음성 선택에 의한 면역 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 특유한 표면 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 세포 선택은 또한 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론성 항체 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석을 포함할 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같이 원하는 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 집단을 단리하는 동안, 면역 세포 농도 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)이 변할 수 있다. 세포와 비드의 최대 접촉 면적을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시형태에서, 투여 전에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함함)는 전염증제로 처리된다. 일부 실시형태에서, 전염증제로의 처리는 본 명세서에 기재된 면역 세포의 항종양 활성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 전염증제로의 처리는 본 명세서에 기재된 면역 세포에서 M1 표현형(예를 들어, M2에서 M1 표현형으로의 전환)을 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 전염증제는 CD40 효현제(예를 들어, CD40L)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 전염증제는 41BB-리간드 효현제(예를 들어, 4-1BB)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 전염증제는 CD40 효현제(예를 들어, CD40L) 및 41BB-리간드 효현제(예를 들어, 4-1BB)이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 본 명세서에 기재된 CAR(예를 들어, 하나 이상의 세포외 도메인, 하나 이상의 막횡단 도메인, 및 하나 이상의 세포내 도메인을 포함하는 CAR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 전염증제로 처리되었다. 일부 실시형태에서, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 동일한 유형의 변형되지 않은 세포에 비해 증가된 항종양 활성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 전염증제는 CD40 효현제(예를 들어, CD40L)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 전염증제는 41BB-리간드 효현제(예를 들어, 4-1BB)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 전염증제는 CD40 효현제(예를 들어, CD40L) 및 41BB-리간드 효현제(예를 들어, 4-1BB)이거나 이를 포함한다. 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 CAR(예를 들어, 하나 이상의 세포외 도메인, 하나 이상의 막횡단 도메인, 및 하나 이상의 세포내 도메인을 포함하는 CAR)을 포함하는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 변형시키는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 하나 이상의 전염증제로 처리하여 동일한 유형의 변형되지 않은 세포에 비해 증가된 항종양 활성을 나타내는 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 전염증제는 CD40 효현제(예를 들어, CD40L)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 전염증제는 41BB-리간드 효현제(예를 들어, 4-1BB)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 전염증제는 CD40 효현제(예를 들어, CD40L) 및 41BB-리간드 효현제(예를 들어, 4-1BB)이거나 이를 포함한다. 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함함)는 전염증제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함함)는 전염증제와 실질적으로 동시에, 전염증제 전, 또는 후에 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 전염증제와의 투여는 본 명세서에 기재된 면역 세포의 항종양 활성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 전염증제와의 투여는 본 명세서에 기재된 면역 세포에서 M1 표현형(예를 들어, M2에서 M1 표현형으로의 전환)을 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, 전염증제는 CD40 효현제(예를 들어, CD40L)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 전염증제는 41BB-리간드 효현제(예를 들어, 4-1BB)이거나 이를 포함한다.
대식세포
대식세포는 병원체 또는 종양 세포와 같은 표적 세포의 검출, 식세포작용, 및 파괴에 특화된 면역 세포이다. 대식세포는 선천성 면역계의 강력한 이펙터이며 적어도 3가지의 분명한 항종양 기능, 즉 죽고 죽어가는 세포, 미생물, 암세포, 세포 파편, 또는 기타 외래 물질의 식세포작용; 종양 세포에 대한 세포독성; 및 적응 면역 반응을 조직하기 위한 종양 항원의 제시를 할 수 있다.
축적된 증거는 대식세포가 수많은 암의 종양 미세환경에 풍부하고 집합적으로 종양-연관 대식세포(TAM)로 지칭되는 다수의 표현형을 채택할 수 있음을 시사한다. 종양 미세환경의 면역억제 특성은 전형적으로 더 많은 M2-유사 TAM을 생성하며, 이는 항종양 면역 반응의 일반적인 억제에 추가로 기여한다. 그러나, 최근 연구는 TAM이 전염증성 신호를 통해 "재프로그래밍"될 수 있고, M2 표현형에서 더 많은 M1 표현형으로의 전환이 생산적인 항종양 면역 반응과 연관되어 있음을 확인하였다. 내인성 TAM을 M1-유형 세포로 전환하도록 유도하고 M2로 전복될 수 없는 대식세포의 조작으로 항종양 면역요법을 크게 향상시키고 해당 분야에서 상당한 발전을 나타낼 것이다.
일부 실시형태에서, 대식세포는 미분화 또는 M0 대식세포를 포함하거나 미분화 또는 M0 대식세포이다. 특정 실시형태에서, 대식세포는 CD14, CD16, CD64, CD68, CD71 또는 CCR5 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하거나 발현한다. 다양한 자극에 대한 노출은 M0 대식세포가 몇 가지 분명한 집단으로 분극화하도록 유도할 수 있으며, 이는 대식세포 표현형 마커, 사이토카인 생산 및/또는 케모카인 분비에 의해 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대식세포는 분극화된 대식세포이거나 이를 포함한다. 고전적인 활성화 조건 하에서, M0 대식세포는 LPS, IFNγ 및 GM-CSF와 같은 전염증성 신호에 노출될 수 있으며, M1 대식세포로 분극화할 수 있다. 일반적으로, M1 대식세포는 Th1 및 Th17 T 세포 반응과 같은 전염증성 면역 반응과 연관되어 있다. 다른 자극에 대한 노출은 대식세포를 "대체적으로 활성화된" 또는 M2 대식세포의 다양한 그룹으로 분극화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대식세포는 M1 대식세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대식세포는 M1 대식세포의 하나 이상의 마커(예를 들어, CD86, CD80, MHC II, IL-1R, TLR2, TLR4, iNOS, SOCS3, CD83, PD-L1, CD69, MHC I, CD64, CD32, CD16, IL1R, IFIT 패밀리 구성원, 또는 ISG 패밀리 구성원 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개)를 발현한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 비교적 높은 수준의 하나 이상의 염증성 사이토카인(예를 들어, IL-1, TNF, IL-12, IL-18, IL-23, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-2, IL-6, IL-8 또는 IL33 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개) 또는 케모카인(예를 들어, CC 또는 CXC 케모카인 중 하나 또는 둘 다)(예를 들어, CXC 케모카인 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개; 예를 들어, CC 케모카인 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개; 예를 들어, CX3C 케모카인 중 하나, 예를 들어, C 케모카인 중 하나 또는 둘 다)을 분비한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 면역 반응 및/또는 염증을 자극한다. 일부 실시형태에서, 대식세포는 M2 대식세포(예를 들어, M2a, M2b, M2c 및 M2d 대식세포)이거나 이를 포함한다. M2a 대식세포는 IL-4, IL-13 및/또는 진균 감염에 의해 유도될 수 있다. M2b 대식세포는 IL-1R 리간드, 면역 복합체 및/또는 LPS에 의해 유도될 수 있다. M2c 대식세포는 IL-10 및/또는 TGFβ에 의해 유도될 수 있다. M2d 대식세포는 IL-6 및/또는 아데노신에 의해 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 대상체에서 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 대식세포는 M2 대식세포의 하나 이상의 마커(예를 들어, CD206, CD163 또는 CD209 중 1, 2 또는 3개)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 하나 이상의 항-염증성 사이토카인(예를 들어, IL-10 또는 TGFβ 중 하나 또는 둘 다)의 증가된 분비를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 대식세포는 적어도 하나의 상향조절된 M1 마커 및/또는 적어도 하나의 하향조절된 M2 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 M1 마커(예를 들어, HLA DR, CD86, CD80, PD-L1, CD83, CD69, MHC I, CD64, CD32, CD16, IL1R, IFIT 패밀리 구성원, 및/또는 ISG 패밀리 구성원)는 대식세포에서 상향조절된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 M2 마커(예를 들어, CD206, CD163 및/또는 CD209)는 대식세포에서 하향조절된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 증가된 식세포작용을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 종양 세포에 대해 증가된 세포독성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 증가된 종양 항원 제시(예를 들어, 식세포작용 후 제시) 및/또는 증가된 항원 가공을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, (예를 들어, 식세포작용, 용해, 아폽토시스, 또는 종양 살해 사이토카인(예를 들어, TNFα)의 생산에 의해) 증가된 종양 살해를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 유리한 유전자(예를 들어, CD80, CD86, MHC-I, MHC-II, CD40, 41BBL, TNF, IFNa, IFNb, IFNg, IL2, IL12, IL6, IL8, IL1b 및/또는 CXCL12)의 증가된 발현 또는 불리한 유전자(예를 들어, CD163, CD206, TGFb, IL10 및/또는 IL4)의 감소된 발현 중 하나 또는 둘 다를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 증가된 ROS 생성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, (예를 들어, 인터페론 신호전달 경로, TH1 경로, PTEN 신호전달, PI3K 신호전달, MTOR 신호전달, TLR 신호전달, CD40 신호전달, 41BB 신호전달, 41BBL 신호전달, 대식세포 성숙 신호전달, 수지상 세포 성숙 신호전달, CD3-제타 신호전달, FcR γ 신호전달, CD64 신호전달, CD32a 신호전달, CD32c 신호전달, CD16a 신호전달, TLR1 신호전달, TLR2 신호전달, TLR3 신호전달, TLR4 신호전달, TLR5 신호전달, TLR6 신호전달, TLR7 신호전달, TLR8 신호전달, TLR9 신호전달, ALK 신호전달, AXL 신호전달, DDR2 신호전달, EGFR 신호전달, EphA1 신호전달, INSR 신호전달, cMET 신호전달, MUSK 신호전달, PDGFR 신호전달, PTK7 신호전달, RET 신호전달, ROR1 신호전달, ROS1 신호전달, RYK 신호전달, TIE2 신호전달, TRK 신호전달, VEGFR 신호전달, CD40 신호전달, CD19 신호전달, CD20 신호전달, 41BB 신호전달, CD28 신호전달, OX40 신호전달, GITR 신호전달, TREM-1 신호전달, TREM-2 신호전달, DAP12 신호전달, MR 신호전달, ICOS 신호전달, MyD88 신호전달, V/I/LxYxxL/V 신호전달, SIRPa 신호전달, CD45 신호전달, Siglec-10 신호전달, PD1 신호전달, SHP-1 신호전달, SHP-2 신호전달, KIR-2DL 신호전달, KIR-3DL 신호전달, NKG2A 신호전달, CD170 신호전달, CD33 신호전달, BTLA 신호전달, CD32b 신호전달, SIRPb 신호전달, CD22 신호전달, PIR-B 신호전달, 및/또는 LILRB1 신호전달의) 대사 재프로그래밍을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 세포 생존 메커니즘의 유도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 세포 사멸 메커니즘의 유도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 식세포 관문에 대한 증가된 저항성, 수송을 돕기 위한 케모카인 수용체의 증가된 발현, 다른 면역 세포를 동원하기 위한 케모카인의 증가된 발현, ECM 분해 효소(예를 들어, 종양 ECM을 분해하고/하거나 항-섬유화 활성을 나타내는 MMP)의 증가된 발현, 또는 증가된 증식 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, CAR 발현의 개선된 지속 기간, 세포 표면에서 CAR의 개선된 안정성, CAR 발현의 증가된 수준, 또는 CAR의 감소된 배경 활성 중 1, 2, 3 또는 4개를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 대상체에서 (예를 들어, 감염원의) 감염을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 감염원은 바이러스, 원생동물(예를 들어, 트리파노소마, 말라리아, 또는 톡소플라스마), 박테리아(예를 들어, 마이코박테리움, 살모넬라, 또는 리스테리아), 진균(예를 들어, 칸디다(Candida)), 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.. 일부 실시형태에서, 바이러스는 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 또는 E형 간염), 레트로바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, HIV1 또는 HIV2), T 세포 백혈병 바이러스, 림프친화성 바이러스(예를 들어, HTLV1 또는 HTLV2), 단순 포진 바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스 1형 또는 2형), 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 폴리오 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 엔테로바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스(예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스, 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스, 또는 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)), 에볼라 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 또는 이들의 변종 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 대식세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 대식세포에 비해, 대상체(예를 들어, 신경퇴행성 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 섬유성 질환, 아밀로이드증, 또는 이들의 조합이 있는 대상체)에서 적어도 하나의 단백질 응집체의 식세포작용을 통해 기존 응집체의 형성을 감소시키고/시키거나 분해시킨다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 타우병증, a-시누클레오병증, 초로기 치매, 노인성 치매, 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비(PSP), 피크병, 원발 진행성 실어증, 전두측두엽 치매, 피질기저핵 치매, 파킨슨병, 루이소체 치매, 다운 증후군, 다계통 위축증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 힐러보르덴-슈파츠 증후군, 폴리글루타민병, 삼핵산 반복 질환, 및 프라이온병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염증성 질환은 전신 홍반성 루프스, 혈관염, 류마티스 관절염, 치주염, 궤양성 대장염, 부비동염, 천식, 결핵, 크론병, 만성 감염, 유전성 주기열, 악성종양, 전신 혈관염, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 수포성 표피박리증, 순환성 호중구감소증, 면역결핍, 머클-웰스(MWS) 병 및 가족성 지중해열(FMF)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 아밀로이드증은 원발성 아밀로이드증(AL), 이차성 아밀로이드증(AA), 가족성 아밀로이드증(ATTR), 베타-2 마이크로글로불린 아밀로이드증, 국소적 아밀로이드증, 중쇄 아밀로이드증(AH), 경쇄 아밀로이드증(AL), 원발성 전신성 아밀로이드증, ApoAI 아밀로이드증, ApoAII 아밀로이드증, ApoAIV 아밀로이드증, 아포지질단백질 C2 아밀로이드증, 아포지질단백질 C3 아밀로이드증, 각막 락토페린 아밀로이드증, 트랜스타이레틴-관련 아밀로이드증, 투석 아밀로이드증, 피브리노겐 아밀로이드증, Lect2 아밀로이드증(ALECT2), 및 라이소자임 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 심혈관 질환은 죽상 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 말초 동맥 질환, 고혈압성 심장 질환, 대사 증후군, 고혈압, 뇌혈관 질환 및 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 섬유성 질환은 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 간경변증, 낭포성 섬유증, 경피증, 심장 섬유증, 방사선-유발 폐 손상, 지방간염, 사구체 경화증, 간질성 폐 질환, 간 섬유증, 종격 섬유증, 후복막강 섬유증, 골수 섬유증 및 피부 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단핵구
단핵구는 혈액, 골수, 및 비장에서 순환하는 다능성 세포이며, 일반적으로 정상 상태에서는 증식하지 않는다. 단핵구는 직경이 약 10 내지 30 ㎛의 범위에서 크기가 상당히 다양할 수 있다. 단핵구에 있어서 핵 대 세포질의 비율은 약 2:1 내지 약 1:1의 범위일 수 있다. 전형적으로, 단핵구는, 예컨대 감염 동안, 혈액에서 조직으로의 이동을 매개하는 케모카인 수용체 및 병원체 인식 수용체를 포함한다. 단핵구는 염증성 사이토카인을 생성하고, 세포 및/또는 독성 분자를 흡수하며, 수지상 세포 또는 대식세포로 분화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단핵구는 하나 이상의 표현형 마커를 포함하거나 발현한다. 인간 단핵구 세포에 대한 예시적인 표현형 마커는 CD9, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD15, CDw17, CD31, CD32, CD33, CD35, CD36, CD38, CD43, CD49b, CD49e, CD49f, CD63, CD64, CD65s, CD68, CD84. CD85, CD86, CD87, CD89, CD91, CDw92, CD93, CD98, CD101, CD102, CD111, CD112, CD115, CD116, CD119, CDwl2lb, CDw123, CD127, CDw128, CDw131, CD147, CD155, CD156a, CD157, CD162 CD163, CD164, CD168, CD171, CD172a, CD180, CD206, CD131a1, CD213 2, CDw210, CD226, CD281, CD282, CD284 및 CD286을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 마우스 단핵구 세포에 대한 예시적인 표현형 마커는 CD11a, CD11b, CD16, CD18, CD29, CD31, CD32, CD44, CD45, CD49d, CD115, CD116, Cdw131, CD281, CD282, CD284, CD286, F4/80 및 CD49b를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 단핵구는 CD11b, CD14 또는 CD16 중 1, 2 또는 3개를 포함한다. 특정 실시형태에서, 단핵구는 CD14+ CD16- 단핵구, CD14+ CD16+ 단핵구 또는 CD14- CD16+ 단핵구를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단핵구는 대식세포로 분화한다. 일부 실시형태에서, 단핵구는 수지상 세포(DC)로 분화한다. 단핵구는 당업계에 알려진 임의의 기법에 의해 대식세포 또는 DC로 분화될 수 있다. 예를 들어, 단핵구의 대식세포로의 분화는 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)에 의해 유도될 수 있다. 단핵구의 DC로의 분화는 IL-4와 함께 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)에 의해 유도될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 또는 IL-1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 증가된 분비를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 증가된 식세포작용을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 향상된 생존을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 대식세포(예를 들어, M1 또는 M2 대식세포)로의 향상된 분화를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, DC(예를 들어, 상주 또는 이동하는 DC 및/또는 림프계 및 비-림프계 조직에서)로의 향상된 분화를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 종양 세포에 대해 증가된 세포독성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 증가된 종양 항원 제시(예를 들어, 식세포작용 후 제시) 및/또는 증가된 항원 가공을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, (예를 들어, 식세포작용, 용해, 아폽토시스, 또는 종양 살해 사이토카인(예를 들어, TNFα)의 생산에 의해) 증가된 종양 살해를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 유리한 유전자의 증가된 발현 또는 불리한 유전자의 감소된 발현 중 하나 또는 둘 다를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 증가된 ROS 생성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 대사 재프로그래밍을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 세포 생존 메커니즘의 유도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 세포 사멸 메커니즘의 유도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, 식세포 관문에 대한 증가된 저항성, 수송을 돕기 위한 케모카인 수용체의 증가된 발현, 다른 면역 세포를 동원하기 위한 케모카인의 증가된 발현, ECM 분해 효소(예를 들어, 종양 ECM을 분해하고/하거나 항-섬유화 활성을 나타내는 MMP)의 증가된 발현, 또는 증가된 증식 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 단핵구는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 단핵구에 비해, CAR 발현의 개선된 지속 기간, 세포 표면에서 CAR의 개선된 안정성, CAR 발현의 증가된 수준, 또는 CAR의 감소된 배경 활성 중 1, 2, 3 또는 4개를 나타낸다.
수지상 세포
수지상 세포(DC)는 면역 반응을 개시하고 자가-항원에 대한 면역계의 내성을 유지하는 데 관여하는 골수 유래의 특화된 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 림프계 및 비-림프계 기관 둘 다에서 발견될 수 있으며 일반적으로 림프계 또는 골수 계통에서 발생하는 것으로 생각된다.
일부 실시형태에서, DC는 하나 이상의 표현형 마커를 포함하거나 발현한다. DC에 대한 예시적인 표현형 마커는 CD11c, CD83, CD1a, CD1c, CD141, CD207, CLEC9a, CD123, CD85, CD180, CD187, CD205, CD281, CD282, CD284, CD286 및 부분적으로 CD206, CD207, CD208 및 CD209를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
미성숙 DC는 항원 포획 능력이 높지만 상대적으로 낮은 T 세포 자극 능력을 특징으로 할 수 있다. 염증 매개체는 DC 성숙을 촉진시킨다. DC가 성숙 단계에 도달하면, 미성숙 DC에 비해 항원 포획 능력의 감소 및/또는 T 세포를 자극하는 능력의 증가와 같은 특성의 극적인 변화가 있다. 일부 실시형태에서, DC는 미성숙 DC이거나 이를 포함한다. 다른 실시형태에서, DC는 성숙한 DC이거나 이를 포함한다.
이론에 구애받고자 하지 않지만, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하도록 DC 세포를 변형시키면 성숙한 DC가, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 증가된 항원 포획 능력 및 T 세포 자극을 동시에 나타내도록 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 종양 항원 제시, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 증가된 종양 항원 제시를 매개한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는 종양 T 세포 자극, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해 증가된 T 세포 자극을 매개한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 또는 IL-1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 증가된 분비를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 증가된 식세포작용을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 증가된 종양 항원 제시(예를 들어, 식세포작용 후 제시), 증가된 항원 가공, 증가된 항원 교차 제시, 증가된 T 세포 프라이밍, 및/또는 T 세포의 자극을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 유리한 유전자의 증가된 발현 또는 불리한 유전자의 감소된 발현 중 하나 또는 둘 다를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 증가된 ROS 생성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 대사 재프로그래밍을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 세포 생존 메커니즘의 유도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 세포 사멸 메커니즘의 유도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, 식세포 관문에 대한 증가된 저항성, 수송을 돕기 위한 케모카인 수용체의 증가된 발현, 다른 면역 세포를 동원하기 위한 케모카인의 증가된 발현, ECM 분해 효소(예를 들어, 종양 ECM을 분해하고/하거나 항-섬유화 활성을 나타내는 MMP)의 증가된 발현, 또는 증가된 증식 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 포함하거나 발현하는 DC는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR이 없는 DC에 비해, CAR 발현의 개선된 지속 기간, 세포 표면에서 CAR의 개선된 안정성, CAR 발현의 증가된 수준, 또는 CAR의 감소된 배경 활성 중 1, 2, 3 또는 4개를 나타낸다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 이펙터 세포 상에서 발현되도록 조작되고 세포를 특이적으로 표적화하고/하거나 항원에 결합하는 인공 세포 표면 수용체를 지칭한다. CAR은, 예를 들어, 입양 세포 전달을 이용한 치료법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포는 환자로부터(예를 들어, 혈액, 종양 또는 복수액으로부터) 제거되고 이들이 특정 형태의 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, CAR은 항원, 예를 들어, 종양 연관 항원에 특이적으로 발현되었다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 세포, 예를 들어, 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 그 안에 CAR을 발현함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, 여기서 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 세포외 리더 도메인, 하나 이상의 세포외 힌지 도메인 및 하나 이상의 세포내 공동 자극 도메인 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 세포외 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 도메인 또는 힌지를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포내 도메인과 막횡단 도메인 사이에 스페이서 도메인 또는 힌지를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "스페이서 도메인" 또는 "힌지"는 막횡단 도메인을 세포외 도메인 또는 폴리펩타이드 사슬의 세포내 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 스페이서 도메인 또는 힌지는 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포내 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 링커의 예는 글리신-세린 이중체를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR을 포함하는 면역 세포는 안전 스위치(예를 들어, 온 스위치, 및 오프 스위치, 자살 스위치), 논리 게이트, 예를 들어, AND 게이트(예를 들어, 2개 이상의 CAR, 이들 각각은 완전한 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포) 활성화 또는 기능을 위해 두/모든 CAR의 활성화가 필요하도록 하나 이상의 신호전달 도메인이 결여되어 있음), OR 게이트(예를 들어, 2개 이상의 CAR, 이들 각각은 세포내 도메인, 예컨대, CD3ζ 및 공동 자극 도메인을 가짐), 및/또는 NOT 게이트(예를 들어, 2개 이상의 CAR, 이 중 하나는 다른 CAR[들]dml 기능을 길항하는 저해성 도메인을 포함함)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 제어 시스템을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 CAR을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 단리된 핵산 서열)을 포함하는 면역 세포를 제공하며, 여기서 핵산 서열은 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및 세포내 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 세포는 CAR을 발현하는 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포이다.
일부 실시형태에서, CAR은 면역 세포에서의 발현을 위해 CAR의 다른 도메인, 예컨대, 막횡단 도메인 또는 세포내 도메인에 작동 가능하게 연결된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산은 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산은 세포내 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, CAR을 포함하는 면역 세포의 이펙터 활성은 CAR의 항원 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항원을 포함하는 표적 세포에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 표적 세포에 대한 표적화된 이펙터 활성은 식세포작용, 표적화된 세포 독성, 항원 제시, 또는 사이토카인 분비이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)에서 항-식세포 신호전달을 저해하는 적어도 하나의 도메인(예를 들어, 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및/또는 세포내 도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은, CAR이 없는 동일한 유형의 세포에 비해, 예를 들어, CD47 및/또는 SIRPα 활성의 저해를 향상시킴으로써, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 이펙터 활성을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 CD47에 결합하고, 예를 들어, 우성 음성 수용체의 역할을 하여 SIRPα 활성(예를 들어, CD47 싱크)을 저해한다. 일부 실시형태에서, SIRPα에 결합하는 본 명세서에 기재된 CAR은, 예를 들어, 활성화 수용체를 포함한다(예를 들어, CD3z 세포내 도메인을 포함함). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 CD47과 SIRPα의 적어도 하나의 상호작용을 저해한다. 일부 실시형태에서, CAR은 식세포 논리 게이트이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함하거나 발현함)는 SIRPα(예를 들어, 우성 음성 SIRPα 또는 SIRPα의 고-친화도 조작 변이체(예를 들어, CV1)), 5F9 scFv, B6H12 scFv(예를 들어, 인간화된 B6H12 scFv), PD1(예를 들어, 우성 음성 PD1 또는 HAC-I), 항-PD1 scFv(예를 들어, E27 또는 더발루맙), Siglec(예를 들어, Siglec-10, Siglec-9, 및/또는 Siglec-11) 및/또는 SHP-1의 적어도 하나의 변이체 또는 단편을 포함하거나 발현한다. 일부 실시형태에서, 변이체 또는 단편은 돌연변이된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 또는 단편은 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하지 않거나 발현하지 않는다(예를 들어, 면역 세포는 항-CD47 scFv, CD8 힌지 도메인, 및 CD8 막횡단을 포함하거나 발현함). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함하거나 발현함)는 우성 음성 수용체, 예를 들어, 저해 관문을 차단하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 절단 펩타이드(예를 들어, P2A, F2A, E2A 및/또는 T2A 펩타이드) 및 항-식세포 신호전달의 적어도 하나의 저해성 도메인을 포함하는 적어도 하나의 제2 CAR을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 제2 CAR은 SIRPα(예를 들어, SIRPα의 고-친화도 조작된 변이체(예를 들어, CV1)), 5F9 scFv, B6H12 scFv(예를 들어, 인간화된 B6H12 scFv), 또는 CD47 결합 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 제2 CAR은 SIRPα 막횡단 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 CAR은 힌지 도메인(예를 들어, CD8 힌지 도메인)을 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 제2 CAR은 (i) 리더 서열(예를 들어, CD8 리더); ii) 세포외 도메인(예를 들어, SIRPα, CV1, 5F9 scFv, 또는 B6H12 scFv(예를 들어, 인간화된 B6H12 scFv) 세포외 도메인); 및 ii) 막횡단 도메인(예를 들어, SIRPα 막횡단 도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 절단 펩타이드(예를 들어, P2A 펩타이드) 및 적어도 하나의 마커 단백질(예를 들어, CD20 또는 이의 단편, CD19 또는 이의 단편, NGFR 또는 이의 단편, 합성 펩타이드 및/또는 형광 단백질)을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 포함하거나 발현함)는 하나 이상의 포스파타제 데드 도메인(예를 들어, 포스파타제 데드 Shp1, 포스파타제 데드 72-5ptase(INPP5E), 포스파타제 데드 Shp2, 및/또는 포스파타제 데드 SHIP-1 도메인) 및/또는 구성적 활성 키나제 도메인(예를 들어, 구성적 활성 LYN 도메인)을 포함하거나 발현한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 절단 펩타이드(예를 들어, P2A, F2A, E2A 및/또는 T2A 펩타이드) 및 하나 이상의 포스파타제 데드 도메인(예를 들어, 포스파타제 데드 Shp1, 포스파타제 데드 72-5ptase(INPP5E), 포스파타제 데드 Shp2, 및/또는 포스파타제 데드 SHIP-1 도메인) 및/또는 구성적 활성 키나제 도메인(예를 들어, 구성적 활성 LYN 도메인)을 더 포함한다.
세포외 도메인
본 개시내용은 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 Fc 수용체(FcR) 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 톨-유사 수용체(TLR) 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 리더 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 FcR 세포외 도메인, TLR 세포외 도메인, 리더 도메인, 항원 결합 도메인 및 힌지 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
FcR 세포외 도메인
일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 전장 FcR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 전장 FcR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인(또는 이의 일부)은 인간 FcR 세포외 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함한다.
TLR 세포외 도메인
일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인은 전장 TLR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인은 전장 TLR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인(또는 이의 일부)은 인간 TLR 세포외 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다.
리더 도메인
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 세포외 리더 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 핵산은 세포외 리더 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지만, 세포외 리더 도메인은 CAR이 면역 세포에서 발현되기 전에 CAR로부터 절단된다. 일부 실시형태에서, 세포외 리더 도메인은 인간 세포외 리더 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 리더 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 리더 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 리더 도메인은 CD8 세포외 리더 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 리더 도메인은 자극 또는 공동 자극 도메인(예를 들어, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88 도메인) 유래의 리더 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인
일부 실시형태에서, CAR은, 예를 들어, 표적 세포 상의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 기생충 감염, 자가면역 질환 및/또는 암 세포와 연관된 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포에서 세포 표면 마커로서 작용하는 항원을 인식한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 종양 항원, 예컨대, 관심이 있는 종양 또는 암에 특이적인 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서 종양 항원은 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1(또한 CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 강글리오사이드 G2(GD2); 강글리오사이드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원(PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1); Fms-유사 타이로신 키나제 3(FLT3); 종양-연관 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신(Testisin) 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-beta); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 회합(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제(PAP); 돌연변이된 신장 인자 2(ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체), 탄산 무수화효소 IX(CAIX); 프로테아솜(프로솜(Prosome), 마크로페인(Macropain)) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 절단점 클러스터 영역(BCR) 및 Abelson 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1(Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 타이로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오사이드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량-흑색종-연관 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드(OAcGD2); 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질-결합 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1(PLAC1); globoH 글라이코세라마이드의 육당류 부분(GloboH); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3); 파넥신 3(PANX3); G 단백질-결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종-연관 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치하는 ETS 전위-변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 생존; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MART1); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 절단점; 아폽토시스의 흑색종 저해제(ML-IAP); ERG(막횡단 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍형성 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 타이로시나제-관련 단백질 2(TRP-2); 사이토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC-결합 인자(징크 핑거 단백질)-유사(BORIS 또는 각인된 부위의 조절원(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍형성 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제(LCK); A 키나아제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2(SSX2); 진행성 당화 최종산물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 편재 1(RU1); 신장 편재 2(RU2); 레구메인(legumain); 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 내장 카복실 에스테라제; 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸(Glypican)-3(GPC3); Fc 수용체-유사 5(FCRL5); 또는 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1(IGLL1)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 종양 항원은 ERBB2(Her2/neu)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 종양 항원은 PSMA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 종양 항원은 메조텔린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 접힘오류 단백질 항원 또는 단백질 응집체의 단백질, 예컨대, 관심이 있는 질환/장애에 특이적인 단백질에 결합한다. 일부 실시형태에서, 질환/장애는 신경퇴행성 질환/장애, 염증성 질환/장애, 심혈관 질환/장애, 섬유성 질환/장애, 또는 아밀로이드증(예를 들어, 면역글로불린 경쇄 또는 트랜스타이레틴의 단백질 응집체에 의해 매개됨)이다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 질환/장애는 타우병증, a-시뉴클레오병증, 초로기 치매, 노인성 치매, 알츠하이머병(베타-아밀로이드의 단백질 응집체에 의해 매개됨), 17번 염색체에 연관된 파킨슨병(FTDP-17), 진행성 핵상 마비(PSP), 피크병, 원발 진행성 실어증, 전두측두엽 치매, 피질기저핵 치매, 파킨슨병, 치매를 동반한 파킨슨병, 루이소체 치매, 다운 증후군, 다계통 위축증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 힐러보르덴-슈파츠 증후군, 폴리글루타민병, 삼핵산 반복 질환, 가족성 영국형 치매(Familial British dementia), 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 증후군, 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈(아이슬란드형)(HCHW A-I), 산발성 치명적 불면증(sFI), 가변적 프로테아제-민감성 프리온병증(Variably Protease-Sensitive Prionopathy; VPSPr), 가족성 덴마크형 치매(Familial Danish dementia), 및 프리온병(예컨대, 크로이츠펠트-야콥병(CJD) 및 변종 크로이츠펠트-야콥병(vCJD))으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 항원에 결합하는 임의의 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 단클론성 항체, 다클론성 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 비-인간 항체, 또는 이의 임의의 단편, 예를 들어, scFv이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 앱타머, 다르핀, 센티린, 자연적으로 발생 또는 합성 수용체, 어피바디, 또는 다른 조작된 단백질 인식 분자이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 포유동물 항체 또는 이의 단편이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 전체적으로 또는 부분적으로 CAR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인은 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 이의 단편(예를 들어 scFv)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 이중특이성 CAR이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중특이성 CAR을 포함하고/하거나 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 면역 세포는 2개의 항원이 존재하도록 요구함으로써 표적외 및/또는 표적내 조직외 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 이중특이성 CAR을 포함하고/하거나 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하며, 여기서 CAR은 단독으로는 변형된 세포의 활성화를 매개하기에 불충분하지만, 함께 상승 작용을 나타내어 변형된 세포의 활성화를 자극하는 별개의 신호를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이와 같은 구성은 'AND' 논리 게이트로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 CAR을 포함하고/하거나 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 면역 세포는 하나의 항원이 존재하고 제2의 정상 단백질 항원이 세포의 활성이 자극되기 전에 부재하는 것을 요구함으로써 표적외 및/또는 표적내 조직외 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이와 같은 구성은 'NOT' 논리 게이트로 지칭될 수 있다. AND 게이트와 달리, NOT 게이트 CAR-변형 세포는 단일 항원에 결합함으로써 활성화된다. 그러나, 제2 항원에 대한 제2 수용체의 결합은 CAR을 통해 지속되는 활성화 신호를 무시하는 기능을 한다. 전형적으로, 이와 같은 저해성 수용체는 정상 조직에서는 풍부하게 발현되지만 종양 조직에는 부재하는 항원에 대해 표적화 될 것이다.
힌지 도메인
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 세포외 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 힌지 도메인은 인간 세포외 힌지 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 힌지 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 힌지 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 힌지 도메인은 CD8a 세포외 힌지 도메인 또는 IgG4 또는 CD28 세포외 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 힌지 도메인은 CD28 세포외 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 힌지 도메인은 CAR의 물리화학적 매개변수, 예를 들어, 종양 항원에 대한 최적의 크기(예를 들어, 저해성 분자의 배제를 허용함), 최적의 유연성, 최적의 단백질 접힘, 최적의 단백질 안정성, 최적의 결합, 최적의 동종이량체화, 및/또는 동종이량체화의 결여를 최적화한다.
막횡단 도메인
일부 실시형태에서, CAR은, 예를 들어, 세포외 도메인을 세포내 도메인에 연결하는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 자연적으로 CAR의 하나 이상의 다른 도메인(들)과 회합된다. 일부 실시형태에서, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해, 다른 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 대한 결합을 피하도록 막횡단 도메인이 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 자연적으로 발생하는 것 또는 합성 공급원으로부터 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서 막횡단 도메인은 자연적으로 발생하는 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 인간 막횡단 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 CD28, CD8a, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TRL1, TLR2, TLR3, TRL4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88, CD3-제타, FcR γ, V/I/LxYxxL/V, SIRPa, CD45, Siglec-10, PD1, SHP-1, SHP-2, KIR-2DL, KIR-3DL, NKG2A, CD170, CD33, BTLA, CD32b, SIRPb, CD22, PIR-B, LILRB1, CD36 또는 Syk 막횡단 도메인을 포함한다.
FcR 막횡단 도메인
일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 전장 FcR 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 전장 FcR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 인간 FcR 막횡단 도메인, 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함한다.
TLR 막횡단 도메인
일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 전장 TLR 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 전장 TLR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 인간 TLR 막횡단 도메인, 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다.
세포내 도메인
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 인간 세포내 도메인, 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인 및/또는 다른 세포질 도메인은 CAR이 발현되는 세포(예를 들어, 면역 세포)의 활성화를 담당한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인은 상기 CAR을 포함하는 면역 세포에서 신호 활성화 및/또는 형질도입을 담당한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인은 신호 활성화 및/또는 형질도입을 담당하는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 공동 자극 분자 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인은 이중 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인은 2개 초과의 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 표면 수용체의 세포질 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 공동 자극 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 면역 세포에서 신호 전달을 개시하도록 작용하는 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인은 CD3, Fc 입실론 RI 감마 사슬, 이의 임의의 유도체 또는 변이체, 동일한 기능적 능력을 가지는 이의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합으로부터의 적어도 하나의 신호전달 도메인과 같은, 하나 이상의 공동 자극 분자의 임의의 부분을 포함한다.
FcR 세포내 도메인
일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 전장 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 전장 FCR 세포내 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 인간 FcR 세포내 도메인, 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c(Fc 감마 RIIc), CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함한다.
TLR 세포내 도메인
일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 전장 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 전장 TLR 세포내 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 인간 TLR 세포내 도메인, 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함한다.
신호전달 도메인
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호전달 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 신호전달 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타, FcR γ, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88, V/I/LxYxxL/V, SIRPa, CD45, Siglec-10, PD1, SHP-1, SHP-2, KIR-2DL, KIR-3DL, NKG2A, CD170, CD33, BTLA, CD32b, SIRPb, CD22, PIR-B, LILRB1, Syk, 41BB 리간드(41BBL; TNFSF9), CD27, OX40L, CD32b, CD11b, ITGAM, SLAMF7, CD206, CD163, CD209, Dectin-2, 또는 하나 이상의 사이토카인 수용체 신호전달 도메인(예를 들어, IL1R, IL2R, IL3R, IL4R, IL5R, IL6R, IL7R, IL8R, IL9R, IL10R, IL11R, IL12R, IL13R, IL14R, IL15R, IL17R, IFNaR, IFNgR, TNFR, CSF1R, CSF2R, Dap10, CD36, Dectin-1 또는 ICOSL 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인은 이중 신호전달 도메인을, 예컨대, 41BB, CD28, ICOS, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, CD116 수용체 베타 사슬, CSF1-R, LRP1/CD91, SR-A1, SR-A2, MARCO, SR-CL1, SR-CL2, SR-C, SR-E, CR1, CR3, CR4, dectin 1, DEC-205, DC-SIGN, CD14, CD36, LOX-1, CD11b를 임의의 조합으로 상기 단락에 열거된 임의의 신호전달 도메인과 함께 포함한다.
공동 자극 도메인
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "공동 자극 분자" 또는 "공동 자극 도메인"은 초기 자극을 높이거나 약화시키는 데 사용되는 면역 세포의 분자를 지칭한다. 예를 들어, TLR 또는 CD47/SIRPα 축과 같은 병원체-연관 패턴 인식 수용체는 각각 초기 자극을 높이거나 약화시키는 면역 세포 상의 분자이다. 일부 실시형태에서, 공동 자극 도메인은 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD86, 공통 FcR 감마, FcR 베타(Fc 입실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체(TCR), CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 본 명세서에 기재된 기타 공동 자극 분자, 이들의 임의의 유도체, 변이체, 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 가지는 공동 자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 공동 자극 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성인 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 공동 자극 도메인은 특정 면역 세포 유형(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 변형된 면역 세포)에 대해 내인성이 아닌 도메인일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "공동 자극 신호"는 면역 세포 상의 CAR의 활성화와 같은 1차 신호와 조합하여 면역 세포의 활성화를 야기하는 신호를 지칭한다.
절단 펩타이드
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 절단 펩타이드는 세포에서 재조합 단백질의 절단을 유도할 수 있는 펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 절단 펩타이드는 2A 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 절단 펩타이드는 P2A, F2A, E2A 또는 T2A 펩타이드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산은 하나 이상의 절단 펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산은 또한 하나 이상의 세포내 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열 및 하나 이상의 펩타이드 작용제를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 핵산의 번역은 절단 펩타이드에 의해 하나 이상의 펩타이드 작용제로부터 분리된 하나 이상의 세포내 도메인을 포함하는 단백질을 생성한다. 일부 실시형태에서, 제1 프로모터는 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 작동 가능하게 연결되고 제2 프로모터는 펩타이드 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, CAR, 및 선택적으로 하나 이상의 펩타이드 작용제를 포함하는 핵산 서열은 내부 리보솜 유입점(IRES) 서열을 더 포함한다. IRES 서열은 번역의 개시를 용이하게 하는 mRNA에 대한 캡-독립적 리보솜 결합을 개시하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다.
펩타이드 작용제
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 펩타이드 작용제는 면역 세포에서 CAR과 공동 발현되는 펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 작용제는 화학량론적 균형 및 CAR의 최적 신호전달을 보장하기 위해 CAR과 공동 발현된다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 작용제는 동일한 펩타이드 작용제와 동종이량체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 작용제는 상이한 펩타이드 작용제와 함께 이종이량체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산은 하나 이상의 펩타이드 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 작용제는 FcR 감마 사슬이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 작용제는 임의의 펩타이드, 단백질, 수용체, 분비 항체 또는 이의 단편(예를 들어, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, 또는 나노바디)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 작용제는 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, IFNa, IFNb, IFN-y, GMCSF, 또는 MCSF), CD40-L, 우성 음성 SIRPa, 우성 음성 PD1, 우성 음성 CD45, 우성 음성 SIGLEC 10, 또는 우성 음성 LILRB를 포함한다.
Fc 수용체(FcR)
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 FcR 세포외 도메인을 포함하고/하거나, CAR의 막횡단 도메인은 FcR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나, CAR의 세포내 도메인은 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 FcR 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인은 함께 전장 FcR을 구성한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인은 함께 전장 FcR의 일부를 구성한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 전장 FcR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 막횡단 도메인은 전장 FcR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, FcR 세포내 도메인은 전장 FcR 세포내 도메인의 일부를 포함한다.
톨-유사 항원 수용체(TLR)
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 톨-유사 수용체(TLR) 세포외 도메인을 포함하고/하거나 CAR의 막횡단 도메인은 TLR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나 CAR의 세포내 도메인은 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 TLR 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인은 함께 전장 TLR을 구성한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인은 함께 전장 TLR의 일부를 구성한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포외 도메인은 전장 TLR 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 막횡단 도메인은 전장 TLR 막횡단 도메인의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 세포내 도메인은 전장 TLR 세포내 도메인의 일부를 포함한다.
핵산 작제물
본 개시내용은 특히 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 면역 세포는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 외인성 핵산 분자)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 핵산 분자는 (a) 세포외 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인), (b) 막횡단 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 막횡단 도메인), 및 (c) 세포내 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 도메인)을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로 축퇴 형태이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 형태에서 인트론(들)을 포함할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다. 용어 "인코딩"은 뉴클레오타이드(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열을 가지는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형의 역할을 하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 특정 뉴클레오타이드 서열 고유의 특성 및 이로 인한 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥은 둘 다 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 이종 핵산 서열의 발현을 초래하는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이가 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우 동일한 리딩 프레임에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단편" 또는 "부분"은 전체의 별개의 부분을 포함하지만 전체 구조에서 발견되는 하나 이상의 모이어티가 결여된 구조를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 단편은 이와 같은 별개의 부분으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조적 요소 또는 모이어티로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 단편은 전체 뉴클레오타이드에서 발견되는 바와 같이 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 또는 그 초과의 단량체 단위(예를 들어, 핵산)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 단편은 전체 뉴클레오타이드에서 발견되는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 단량체 단위(예를 들어, 잔기)를 포함하거나 이로 이루어진다. 전체 물질 또는 실체는 일부 실시형태에서 전체의 "모체"로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 DNA 분자, RNA 분자, 또는 이의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 이의 단편을 인코딩하는 메신저 RNA(mRNA) 전사체이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR 또는 이의 단편을 인코딩하는 DNA 작제물을 포함하거나 상기 작제물이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR의 전부 또는 단편은, 예를 들어, 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 다양한 코돈 최적화 방법이, 예를 들어, 미국 특허 제5,786,464호 및 제6,114,148호에 개시된 바와 같이 당업계에 알려져 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지미드, 레트로트랜스포존(예를 들어 피기백 또는 슬리핑 뷰티(sleeping beauty)), 부위 지정 삽입 벡터(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, Cas9, Cas12a 또는 C2c2 중 하나 이상을 포함하는 CRISPR/Cas 시스템), Zn 핑거 뉴클레아제, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 주형 공여체 DNA의 삽입을 위한 TALEN), 자살 발현 벡터, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 벡터를 포함한다. 벡터는 진핵생물에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함할 수 있다.
벡터는 복제 기점, 프로모터 서열(예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터), 및/또는 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함할 수 있다(예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 제6,326,193호 참조, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨). 벡터는 또한, 예를 들어, 분비를 촉진하기 위한 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자(예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소(예를 들어, SV40 기원 및 /또는 ColE1), 선별을 가능하게 하는 요소(예를 들어, 암피실린 저항성 유전자 및/또는 제오신 마커), 및/또는 리포터 유전자(예를 들어, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산의 발현은 CAR 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산을 발현 벡터의 프로모터에 작동 가능하게 연결함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 프로모터(예를 들어, 구성적 프로모터)는 연장 인자-1α 프로모터(EF-1α) 프로모터, 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(MoMuLV) 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 또는 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로싸이오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 또한 전사 개시 빈도를 조절하기 위해 추가적인 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 바이러스 벡터이거나 이를 포함한다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY]에 기재되어 있다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 미국 특허 제9,149,519호 또는 국제 공개 WO 2017/044487에 기재된 바와 같음, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 아데노바이러스는 이중 가닥 DNA를 포함하는 대규모 바이러스 패밀리이다. 이들 바이러스는 바이러스 RNA, DNA 및 단백질을 합성하기 위해 숙주의 세포 기구를 사용하여 숙주 세포의 핵 내에서 복제한다. 아데노바이러스는 복제 및 비-복제 세포 둘 다에 영향을 미치고, 큰 이식유전자를 수용하며, 숙주 세포 게놈에 통합되지 않고 단백질을 코딩하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 Ad2 벡터 또는 Ad5 벡터(예를 들어, Ad5f35 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 헬퍼-의존성 Ad5F35 아데노바이러스 벡터)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. AAV 시스템은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994); Cotten et al., P.N.A.S. U.S.A., 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); 및 Asokan A, et al., Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012)] 참조). 재조합 AAV(rAAV) 벡터를 생성하고 사용하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기재되어 있다.
AAV1, AAV2, AAV3(예를 들어, AAV3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11뿐만 아니라, 이들의 변이체를 포함하여 여러 AAV 혈청형이 특성화되었다. 일반적으로, 임의의 AAV 혈청형은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 혈청형은 특정 조직에 대한 향성을 갖는다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 최근에 상동 재조합(HR) 동안 공여체 주형 DNA의 역할을 하는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여 높은 수준의 정확한 게놈 편집을 용이하게 하는 것으로 나타났다.
일부 실시형태에서, 벡터는 감마레트로바이러스 벡터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재된 바와 같음, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨). 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 설치류 백혈병 바이러스(MLV), 비장 병소 형성 바이러스(SFFV), 및 골수 증식성 육종 바이러스(MPSV), 및 이들로부터 유래된 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 CAR, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR, 및 제2 CAR, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 상이한 CAR을 인코딩하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR 및 제2 CAR을 인코딩하는 2개 이상의 핵산 서열은, 예를 들어, 동일한 프레임에서 단일 폴리펩타이드 사슬로서, 단일 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 CAR은 1개 이상의 절단 펩타이드 부위(예를 들어, 자동-절단 부위 또는 세포내 프로테아제에 대한 기질)에 의해 분리된다. 특정 실시형태에서, 절단 펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1(P2A) 펩타이드, 토세아 아사인아 바이러스(Thosea asigna virus)(T2A) 펩타이드, 말 비염 A 바이러스(E2A) 펩타이드, 구제역 바이러스(F2A) 펩타이드, 또는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 CAR, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 CAR과 공동 발현되는 적어도 하나의 유전자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 사이토카인(예를 들어, TNF, IL-12, IFN, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 및/또는 IL-1) E는 본 명세서에 기재된 자극 리간드(예를 들어, CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 효현제 또는 항체, 및/또는 B7-H3 리간드)를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 특히 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"치료적 유효량", "면역학적 유효량", "항-면역 반응 유효량", 또는 "면역 반응-저해 유효량"이 지시될 때, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포) 를 포함하는 약제학적 조성물의 정확한은 환자(대상체)의 연령, 체중, 면역 반응, 및 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 중성 완충 식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함하는 완충액; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스, 덱스트란, 또는 만니톨; 단백질, 폴리펩타이드, 또는 아미노산(예를 들어, 글리신); 항산화제; 킬레이트제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 오염물이 실질적으로 없으며, 예를 들어, 검출 가능한 수준의 오염물(예를 들어, 내독소)이 없다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 치료 또는 예방할 질환, 장애, 또는 병태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환, 장애, 또는 병태의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투약량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들 조성물은, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투약 형태, 예컨대, 액체 용액(예를 들어, 주사 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포솜, 및 좌약을 포함한다. 바람직한 조성물은 주사 또는 주입 용액일 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 경동맥, 또는 복강내 투여용으로 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내) 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내 주입 또는 주사용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 근육내 또는 피하 주사용으로 제형화된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기법을 사용하여 투여하기 위해 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 보통 주사 또는 주입에 의한 경장 및 국부 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 종양내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 약 104 내지 약 109개 세포/㎏ 체중(예를 들어, 약 105 내지 약 106개 세포/㎏ 체중)(해당 범위 내 모든 정수 값을 포함함)의 투약량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 용량은 적어도 약 1×106, 약 1.1×106, 약 2×106, 약 3.6×106, 약 5×106, 약 1×107, 약 1.8×107, 약 2×107, 약 5×107, 약 1×108, 약 2×108, 약 5×108, 약 1×109, 약 2×109, 또는 약 5×109개 세포를 포함한다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 또한 특정 투약량으로 여러 번 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 최적의 투약량 및 치료 요법은 질환, 장애, 또는 병태의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료법을 조정함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여한 다음, 이어서 혈액을 다시 뽑고(또는 성분채집술을 수행하고), 수집된 면역 세포를 활성화시킨 다음, 활성화된 면역 세포를 대상체에게 재주입하는 것이 요망될 수 있다. 이 과정은 여러 번, 예를 들어, 몇 주마다 수행될 수 있다. 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 약 10㏄ 내지 약 400㏄의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 약 20㏄, 약 30㏄, 약 40㏄, 약 50㏄, 약 60㏄, 약 70㏄, 약 80㏄, 약 90㏄ 또는 약 100㏄의 채혈로부터 활성화된다. 이론에 구애받고자 하지 않지만, 본 명세서에 기재된 바와 같이 다중 채혈 및 재주입을 포함하는 방법은 특정 면역 세포 집단을 선별할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 제2 요법과 조합하여(예를 들어, 전, 동시에 또는 후에) 투여된다. 예를 들어, 제2 요법은 항바이러스 요법(예를 들어, 시도포비르, 인터류킨-2, 사이타라빈(ARA-C), 또는 나탈리주맙), 키메라 항원 수용체-T 세포(CAR-T) 요법, T-세포 수용체(TCR)-T 세포 요법, 화학요법, 방사선, 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린, 아자싸이오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, FK506 항체, 또는 글루코코르티코이드), 길항제(예를 들어, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA4 길항제, CD47 길항제, SIRPa 길항제, CD40 효현제, CSF1/CSF1R 길항제, 또는 STING 효현제 중 하나 이상), 또는 면역제거제(immunoablative agent)(예를 들어, 항-CD52 항체(예를 들어, 알렘투주맙), 항-CD3 항체, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228 또는 방사선 조사)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 화학요법제(예를 들어, 플루다라빈, 외부 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 리툭산)를 사용하는 골수 이식 또는 림프구 제거 요법과 조합하여(예를 들어, 전, 동시에 또는 후에) 투여된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식으로 표준 치료를 받는다. 특정 실시형태에서, 이식 후 대상체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 주입을 받는다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 수술 전 또는 후에 투여될 수 있다.
대상체에게 투여되는 전술한 임의의 요법의 투약량은 치료되는 질환, 장애 또는 병태에 따라 그리고 특정 대상체에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투약량의 조정은 당업계에서 허용되는 관행에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 알렘투주맙의 용량은 일반적으로 성인의 경우 약 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎일 것이며, 보통 약 1일 내지 약 30일의 기간 동안 매일 투여되며, 예를 들어, 하루에 약 1 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 일일 용량일 것이다(예를 들어, 미국 특허 제6,120,766호에 기재된 바와 같음, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨).
치료 방법
본 개시내용은 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물을 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애(예를 들어, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료적 유효량의 약제학적 조성물이 질환 또는 장애를 가지는 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하거나 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법으로 치료될 대상체는 포유동물, 예를 들어, 영장류, 예를 들어, 인간(예를 들어, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애를 가지거나 가질 위험이 있는 환자)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 대상체에 대해 자가, 동종이계 또는 이종발생일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료제, 절차, 또는 방식과 조합하여 본 명세서에 기재된 투약 요법에 따라 대상체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 종양 또는 암과 연관된 질환, 신경퇴행성 질환 또는 장애, 염증성 질환 또는 장애, 심혈관 질환 또는 장애, 섬유성 질환 또는 장애, 아밀로이드증과 연관된 질환, 및 이들의 조합을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물로 대상체에서 암 또는 종양을 치료(예를 들어, 암 또는 종양의 진행을 감소, 저해, 또는 지연시키는 것 중 하나 이상)하는 방법이 제공된다. 대상체는 성인 또는 소아 암 형태를 가질 수 있다. 암은 초기, 중기, 또는 말기에 있거나, 전이성 암일 수 있다. 암은 고형 종양, 혈액암(예를 들어, 백혈병, 림프종, 또는 골수종, 예를 들어, 다발성 골수종), 또는 전이성 병변을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 고형 종양의 예는 악성종양, 예를 들어, 육종 및 암종, 예를 들어, 다양한 기관계의 선암종, 예컨대, 폐, 유방, 난소, 림프계, 위장관(예를 들어, 결장), 항문, 생식기 및 비뇨생식관(예를 들어, 신장, 요로상피세포, 방광 세포, 전립선), 인두, CNS(예를 들어, 뇌, 신경 또는 신경아교세포), 두경부, 피부(예를 들어, 흑색종, 예를 들어, 피부 흑색종), 췌장, 및 뼈(예를 들어, 척삭종)에 영향을 미치는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 암은 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)(예를 들어, 편평 조직 및/또는 비-편평 조직이 있는 비소세포 폐암(NSCLC), 또는 NSCLC 선암종), 또는 소세포 폐암(SCLC)), 피부암(예를 들어, 머켈 세포 암종 또는 흑색종(예를 들어, 진행성 흑색종)), 난소암, 중피종, 방광암, 연조직 육종(예를 들어, 혈관주위세포종(HPC)), 골암(골육종), 신장암(kidney cancer)(예를 들어, 신장암(renal cancer)(예를 들어, 신장 세포 암종)), 간암(예를 들어, 간세포 암종), 담관암종, 육종, 골수이형성 증후군(MDS), 전립선암, 유방암(예를 들어, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 또는 Her2/neu 중 하나, 둘 또는 전부를 발현하지 않는 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암), 결장직장암(예를 들어, 재발성 결장직장암 또는 전이성 결장직장암, 예를 들어, 미소부수체 불안정 결장직장암, 미소부수체 안정 결장직장암, 미스매치 회복 능숙 결장직장암, 또는 미스매치 회복 결핍 결장직장암), 비인두암, 십이지장암, 자궁내막암, 췌장암, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)), 항문암, 위식도암, 갑상선암(예를 들어, 역형성 갑상선 암종), 자궁경부암(예를 들어, 자궁경부의 편평 세포 암종), 신경내분비 종양(NET)(예를 들어, 비정형 폐 카르시노이드 종양), 림프증식성 질환(예를 들어, 이식 후 림프증식성 질환), 림프종(예를 들어, T 세포 림프종, B 세포 림프종, 또는 비호지킨 림프종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 또는 백혈병(예를 들어, 골수성 백혈병 또는 림프성 백혈병)으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 암은 뇌종양, 예를 들어, 교모세포종, 신경교육종, 또는 재발성 뇌종양이다. 일부 실시형태에서, 암은 췌장암, 예를 들어, 진행성 췌장암이다. 일부 실시형태에서, 암은 피부암, 예를 들어, 흑색종(예를 들어, II 내지 IV기 흑색종, HLA-A2 양성 흑색종, 절제 불가능한 흑색종, 또는 전이성 흑색종), 또는 머켈 세포 암종이다. 일부 실시형태에서, 암은 신장암, 예를 들어, 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 전이성 신장 세포 암종)이다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 예를 들어, 전이성 유방 암종 또는 IV기 유방 암종, 예를 들어, 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 일부 실시형태에서, 암은 바이러스-연관 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 항문관 암(예를 들어, 항문관의 편평 세포 암종)이다. 일부 실시형태에서, 암은 자궁경부암(예를 들어, 자궁경부의 편평 세포 암종)이다. 일부 실시형태에서, 암은 위암(예를 들어, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 양성 위암, 또는 위 또는 위-식도 접합부 암종)이다. 일부 실시형태에서, 암은 두경부암(예를 들어, HPV 양성 및 음성 두경부의 편평세포암(SCCHN))이다. 일부 실시형태에서, 암은 비인두암(NPC)이다. 일부 실시형태에서, 암은 결장직장암, 예를 들어, 재발된 결장직장암, 전이성 결장직장암, 예를 들어, 미세부수체 불안정 결장직장암, 미세부수체 안정 결장직장암, 미스매치 회복 능숙 결장직장암, 또는 미스매치 회복 결핍 결장직장암이다.
일부 실시형태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시형태에서, 암은 백혈병, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 백혈병, 또는 급성 백혈병이다. 일부 실시형태에서, 암은 림프종, 예를 들어, 호지킨 림프종(HL), 비호지킨 림프종, 림프구성 림프종, 또는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)(예를 들어, 재발 또는 불응성 HL 또는 DLBCL)이다. 일부 실시형태에서, 암은 골수종, 예를 들어, 다발성 골수종이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 면역 반응을 향상시키거나 조절하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애를 가지거나 가질 위험이 있는 대상체)에서 면역 반응을 향상, 자극, 또는 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 대상체는 면역손상되었거나 면역손상될 위험이 있다. 예를 들어, 대상체는 화학요법 치료 및/또는 방사선 요법을 받고 있거나 받았다.
일부 실시형태에서, 대상체는 염증성 장애(예를 들어, 만성 또는 급성 염증성 장애)를 가지거나, 발병할 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 자가면역 질환 또는 장애를 가지거나, 발병할 위험이 있다. 본원에 기재된 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 자가면역 질환은 알츠하이머병, 천식(예를 들어, 기관지 천식), 알레르기(예를 들어, 아토피성 알레르기), 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 죽상 동맥 경화증, 베체트병, 셀리악병, 심근증, 크론병, 간경변증, 당뇨병, 당뇨망막병증, 습진, 섬유근육통, 섬유근염, 사구체신염, 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 길랭-바레 증후군, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 골관절염, 다발연골염, 건선, 류마티스 관절염, 패혈증, 뇌졸중, 혈관염, 인공호흡기-유발 폐 손상, 이식 거부, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 열, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 또는 베게너 육아종증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 투여는 임의의 편리한 방식(예를 들어, 주사, 섭취, 수혈, 흡입, 피하주입, 또는 이식)으로 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 경동맥, 피하, 정맥내, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 비경구로(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내) 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 대상체의 염증 부위, 국소 질환 부위, 림프절, 장기, 종양, 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
면역 세포 변형 방법
방법은 (a) 세포외 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 도메인), (b) 막횡단 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 막횡단 도메인), 및 (c) 세포내 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 도메인)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을, 면역 세포가 (a) 내지 (c)를 포함하는 CAR을 포함하게 되도록, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 (d) 세포외 리더 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 리더 도메인), (e) 세포외 힌지 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포외 힌지 도메인), 또는 (f) 세포내 공동 자극 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포내 공동 자극 도메인) 중 1, 2 또는 3개를 추가로 인코딩한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 물리적, 화학적, 또는 생물학적 방법에 의해 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입하기 위한 물리적 방법은 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 작제물은 전기천공(Amaxa Nucleofector-II®(Amaxa Biosystems, 독일 쾰른 소재), ECM 830 BTX(Harvard Instruments, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재), Gene Pulser II®(BioRad, 미국 콜로라도주 덴버 소재), 또는 Multiporator®(Eppendort, 독일 함부르크 소재))을 포함하여, 상업적으로 이용 가능한 방법을 사용하여 면역 세포에 도입될 수 있다. 핵산 작제물은 또한 mRNA 형질감염, 예를 들어, 양이온성 리포솜-매개 형질감염, 리포펙션, 중합체 캡슐화, 펩타이드-매개 형질감염, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템(biolistic particle delivery system), 예컨대, "유전자 총"을 사용하여 면역 세포에 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨).
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)에 삽입하는 데 널리 사용되었다. 바이러스 벡터는 또한 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스(예를 들어, Adf535), 또는 아데노-연관 바이러스로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨). 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스는 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 딸 세포에서의 증식을 가능하게 하는 장기 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 지질-기반 시스템(예를 들어, 수중유 에멀션, 마이셀, 혼합 마이셀, 나노입자, 리포솜, 및 리포펙타민-핵산 복합체)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물의 전달을 위한 예시적인 시스템은 지질-기반 시스템이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 지질 이중층 내에 산재되어 있거나, 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포좀에 포획되거나, 리포솜과 복합체를 형성하거나, 지질을 포함하는 용액 또는 현탁액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 마이셀과 복합체를 형성하거나, 그렇지 않으면 지질과 회합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 지질은 자연적으로 발생하거나 합성 지질일 수 있다. 지질은 또한 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 다이미리스틸 포스파티딜콜린은 Sigma(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 입수할 수 있고; 다이세틸 포스페이트는 K & K Laboratories(미국 뉴욕주 플레인뷰 소재)로부터 입수할 수 있으며; 콜레스테롤은 Calbiochem-Behring으로부터 입수할 수 있고; 다이미리스틸 포스파티딜글리세롤은 Avanti Polar Lipids, Inc.(미국 앨라배마주 버밍햄 소재)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올의 지질 원액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다.
면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 작제물의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정법이 수행될 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 검정법은 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR, 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학적 검정법; 및 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해, 특정 펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 생화학적 검정법을 포함한다.
CAR을 인코딩하는 핵산의 VPX 매개 바이러스 전달
본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)는 제한 인자인 SAMHD1의 발현 때문에 렌티바이러스 형질도입에 대해 불응성일 수 있으며, 이는 역전사에 이용 가능한 뉴클레오타이드 트라이포스페이트를 고갈시킨다. 예를 들어, SAMHD1은 데옥시뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 세포내 풀을 고갈시킴으로써 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 복제를 제한할 수 있다. 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 및 HIV-2와 연관된 보조 단백질인 바이러스 단백질 X(Vpx)는 SAMHD1의 분해를 유도한다. Vpx의 사용은 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)에 대한 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터를 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징된 바이러스 벡터는, 예를 들어, 적어도 하나의 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 바이러스 벡터로 형질감염된 동일한 유형의 면역 세포에 비해, 본 명세서에 기재된 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포)의 형질감염을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Vpx 렌티바이러스는 CAR 서열의 게놈 통합을 야기하여, 키메라 항원 수용체(CAR)의 장기적이고 영구적인 발현을 가능하게 할 수 있다. CAR이 세포내 공간으로 정기적으로 재순환되는 막횡단 단백질이라는 점을 고려하면, Vpx-렌티바이러스로 CAR의 영구적인 세포 표면 발현의 증명은 해당 분야에서 주목할 만한 발전이다. Vpx-렌티바이러스로 형질도입된 대식세포는 바이러스 형질도입에 의해 표현형에 영향을 받지 않으며, 이는 표현형 가소성을 가지는 CAR 대식세포의 생산을 가능하게 하는 발견이다. 다른 바이러스 벡터(예컨대, Ad5f35)는 전염증성 표현형인 M1을 유도하는 반면, Vpx-렌티바이러스는 M1/M2 표현형에 영향을 미치지 않으며, 이는 기준선에서 전염증성 기능/독성을 가지지 않을 수 있는 M0 CAR 대식세포 생성물을 가능하게 한다. Vpx-렌티바이러스로 형질도입된 CAR 대식세포는 표현형 가소성을 유지하고 사이토카인, 효현제, 펩타이드, 배양 배지, 및 기타 요인을 이용하여 M1 또는 M2 표현형으로 추가로 분극화될 수 있다. Vpx-렌티바이러스로 형질도입된 CAR 대식세포는 전염증성 신호(예를 들어, 하나 이상의 전염증성 사이토카인, 예를 들어, LPS, IFNa, IFNb, IFNγ, CpG, CD40L, GM-CSF, TNFa, IL-6 또는 STING 리간드(STING-L) 중 하나 이상)에 노출될 수 있고 M1 대식세포로 분극화될 수 있다. Vpx-렌티바이러스로 형질도입된 CAR 대식세포는 면역억제 신호(예를 들어, 하나 이상의 면역억제 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10, IL-13 또는 TGFb 중 하나 이상) 및/또는 적어도 하나의 프로스타글란딘 또는 적어도 코르티코스테로이드 중 하나 또는 둘 다)에 노출되고 M2 대식세포로 분극화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 Vpx 단백질과 함께 패키징된다(예를 들어, 국제 공개 WO 2017/044487에 기재된 바와 같음, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, Vpx는 비리온-연관 단백질(예를 들어, 바이러스 복제를 위한 보조 단백질)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vpx 단백질은 인간 면역결핍 바이러스 2형(HIV-2)에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, Vpx 단백질은 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)는 Vpx 단백질로 패키징된 렌티바이러스 벡터로 형질감염된다. 일부 실시형태에서, Vpx는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)의 적어도 하나의 항바이러스 인자를 저해한다.
일부 실시형태에서, Vpx 단백질로 패키징된 렌티바이러스 벡터는, 예를 들어, Vpx 단백질로 패키징되지 않은 렌티바이러스 벡터에 비해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)의 증가된 형질감염 효율을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, Ad2 벡터 또는 Ad5 벡터(예를 들어, Ad5f35 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 헬퍼-의존성 Ad5F35 아데노바이러스 벡터))로 형질감염되기 전에 적어도 하나의 VPX mRNA로 전기천공되거나 형질감염되거나 둘 다이다.
변형 동안 면역 세포의 처리 및 배양
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 변형시키는 과정 동안 면역 세포를 처리하는 하나 이상의 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 시험관내에서 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절자로 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 처리하는 단계를 포함한다. 시험관내에서 전사된(IVT) mRNA는 다양한 엔도좀 선천성 면역 수용체(톨-유사 수용체 3(TLR3), TLR7 및 TLR8) 및 세포질 선천성 면역 수용체(단백질 키나제 RNA-활성화(PKR), 레티노산-유도 유전자 I 단백질(RIG-I), 흑색종 분화-연관 단백질 5(MDA5) 및 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타제(OAS))에 의해 인식된다. 이러한 상이한 경로를 통한 신호전달은 1형 인터페론(IFN), 종양 괴사 인자(TNF), 인터류킨-6(IL-6), IL-12와 연관된 염증 및 전사 프로그램 캐스케이드의 활성화를 초래한다. 전반적으로, 이들은 특정 면역 반응을 유도할 수 있는 전염증성 미세환경을 형성한다. 더욱이, 진핵세포 번역 개시 인자 2α(eIF2α) 인산화에 의한 번역 속도 저하, 리보뉴클레아제 L(RNaseL)에 의한 향상된 RNA 분해, 및 자가-증폭 mRNA의 과발현 및 복제 저해와 같은 하류 효과는 IVT mRNA의 약동학 및 약력학과 관련이 있다.
일부 실시형태에서, 시험관내에서 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절자는 RNase 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내에서 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절자는 RNaseL, RNase T2 또는 RNase1 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내에서 전사된 mRNA에 의해 활성화된 경로의 조절자는 RNaseL 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNaseL 저해제는 수니티닙을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNaseL 저해제는 ABCE1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 RNaseL 저해제로 처리하는 것은 RNaseL 저해제로 처리되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서의 mRNA 안정성에 비해 변형된 면역 세포에서의 mRNA 안정성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 RNaseL 저해제로 처리하는 것은 RNaseL 저해제로 처리되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서의 CAR 발현에 비해 변형된 면역 세포에서의 CAR 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 RNaseL 저해제로 처리하는 것은 RNaseL 저해제로 처리되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에서의 이펙터 활성에 비해 변형된 면역 세포에서의 이펙터 활성을 증가시킨다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 면역 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 처리하는 단계는 면역 세포에 mRNA를 전달하는 단계 전에 일어난다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNFα, IL-6, STNGL, LPS, CD40 효현제, 4-1BB 리간드, 재조합 4-1BB, CD19 효현제, TLR 효현제(예를 들어, TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8 또는 TLR-9), TGF-β(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, 또는 TGF-β3), 글루코코르티코이드, 면역 복합체, 인터류킨-1 알파(IL-1α), IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-20, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM), TNF-β, CD154, 림포톡신 베타(LT-β), A 증식-유도 리간드(APRIL), CD70, CD153, 글루코코르티코이드-유도 TNF 수용체 리간드(GITRL), 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14(TNFSF14), OX40L(CD252), TALL-1(종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 13B - TNFSF13B), TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL), TNF-관련 약한 아폽토시스 유도제(TW EAK), TNF-관련 활성화-유도 사이토카인(TRANCE), 에리스로포이에틴(Epo), 갑상선 퍼옥시다제 전구체(Tpo), FMS-관련 타이로신 키나제 3 리간드(FLT-3L), 줄기 세포 인자(SCF), 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF), 메로조이트 표면 단백질(MSP), 뉴클레오타이드-결합 올리고머화 도메인-포함 단백질(NOD) 리간드(예를 들어, NOD1, NOD2, 또는 NOD1/2 효현제), RIG-I-유사 수용체(RLR) 리간드(예를 들어, 5'ppp-dsRNA, 3p-hpRNA, 폴리(I:C), 또는 폴리(dA:dT)), C형 렉틴 수용체(CLR) 리간드(예를 들어, 커들란(curdlan), β-글루칸, HKCA, 라미나린, 푸스툴란(pustulan), 스클레로글루칸(scleroglucan), WGP 분산성, WGP 가용성, 자이모산, 자이모산 고갈, 푸르푸르만(furfurman), b-GlcCer, GlcC14C18, HKMT, TDB, TDB-HS15, 또는 TDM), 고리형 다이뉴클레오타이드 센서 리간드(예를 들어, C-Gas 효현제 또는 인터페론 유전자 자극제(STING) 리간드), 인플라마좀 유도제(예를 들어, 명반, ATP, CPPD 결정, 헤모조인, MSU 결정, Nano-SiO2, 니제리신 또는 TDB), 아릴 탄화수소(AhR) 리간드(예를 들어, FICZ, 인디루빈, ITE, 또는 L-카이누레닌), 알파-단백질 키나제 1(ALPK1) 리간드, 다중-PRR 리간드, NFKB/NFAT 활성화제(예를 들어, 콘카발린 A, 이오노마이신, PHA-P, 또는 PMA) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IFN-β를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 단계는 면역 세포에 mRNA를 전달하는 단계 후에 일어난다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 상대적으로 변형된 면역 세포의 생존력을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 생존력을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 단백질(예를 들어, CAR) 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 단백질(예를 들어, CAR) 발현 수명을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 이펙터 활성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 변형된 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)를 배양하는 것은 사이토카인 또는 면역 자극 재조합 단백질과 함께 배양되지 않은 동일한 유형의 변형된 면역 세포에 비해 변형된 면역 세포의 M1 분극화를 증가시킨다.
GenBank 수탁 번호를 포함하여 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조문헌은 전문이 참조에 의해 원용된다. 추가적으로, 물질, 방법, 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 실시예는 설명 목적으로만 제공된다. 어떤 식으로든 개시내용의 범주나 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법을 당업자에게 설명하기 위해 제공되며, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 키메라 항원 수용체(CAR) 대식세포 및 단핵구
CAR 이식유전자는 DNA, mRNA, 또는 화학적으로 변형된 mRNA를 이용한 전기천공 또는 형질감염을 통해 또는 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 대체 바이러스 벡터를 사용한 바이러스 형질도입을 통해 단핵구 또는 대식세포 내로 도입될 수 있다. CAR의 발현은 유세포 분석, 실시간 PCR, 또는 형광 현미경 검사를 통한 항원 특이적 염색을 사용하여 확인될 것이다. 이러한 기법은 또한 CAR 발현의 강도 및 동역학을 결정하는 데 사용될 것이다.
대식세포의 표면에서 발현되는 CAR 작제물은 표적 양성 세포주에 대한 종양 식세포작용 검정 및/또는 종양 살해 검정에서 활성에 대해 테스트될 것이다. 표적 세포의 식세포작용 및/또는 살해를 유발하는 작제물은 사이토카인 분비, 케모카인 분비, 면역 세포 동원 능력, 표현형 변경(즉, M1/M2로의 자가-분극화), 및 T 세포 자극/항원 제시 기능에 대해 테스트될 것이다.
표 1은 본 명세서에 기재된 CAR 구성 요소에 사용되는 예시적인 mRNA 및 폴리펩타이드 서열을 나타낸다. CAR 구성 요소의 예시적인 CAR 작제물은 도 8 내지 117 및 도 135에 나타나 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 2: 1차 인간 대식세포 및 단핵구의 바이러스 형질도입
렌티바이러스 생성을 위해, HEK293T 세포를 10% FBS 및 1% pen/strep이 보충된 10㎖ DMEM 배지에 3.5×106개 세포/10 ㎝ 플레이트로 도말하였다. 밤새 성장시킨 후, 인산칼슘 형질감염을 사용하여 플레이트를 pVSV-G(2.5㎍), RSV-Rev(2.5㎍), PMDL-Chp6(10㎍), pVPX(1㎍), 및 원하는 삽입 서열(14㎍)을 포함하는 렌티바이러스 전달 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 16시간 후에 상청액을 버리고 6㎖ DMEM을 첨가하였다. 형질감염 48시간 후 상청액을 수확한 다음, 1,200×g에서 5분 동안 원심분리하고, 0.45㎜ 필터를 통해 여과하였다. 바이러스는 나중에 사용할 수 있도록 -80℃에서 보관하였다.
1차 인간 대식세포의 렌티바이러스 형질도입을 위해, 1차 인간 대식세포를 주어진 밀도로 도말하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 렌티바이러스를 명시된 감염다중도(MOI)로 대식세포 배양물에 첨가하였다. 48 내지 72시간 후, 배지를 교환하고 형질도입된 대식세포를 다양한 검정에 사용하였다.
실시예 3: 단핵구 및 대식세포로부터의 수용체 발현
CD14+ 단핵구 유래 대식세포를 배양 배지(10 ng/㎖의 GM-CSF를 포함하는 10 내지 20% FBS-TEX-MACS)와 함께 도말하고 밤새 배양하였다. 120nM의 CAR mRNA를 형질감염시키고 37℃ 배양 배지에서 하루 동안 인큐베이션한 다음, CAR 발현을 유세포 분석에 의해 rHER2 결합으로 검출하였다. CAR 및 키메라 FcR(CFR)로 형질감염된 세포의 약 60 내지 70%, 및 톨-유사 항원 수용체(TAR)로 형질감염된 세포의 40 내지 60%가 생존하였다(도 1a). CAR: HER2 발현은 CAR로 형질감염된 세포에서 40 내지 60% 양성이었고, CFR 및 TAR로 형질감염된 세포에서 30 내지 40% 양성이었다(도 1b). CAR1 및 CAR13 발현은 1차 인간 대식세포의 다른 작제물 중에서 두드러졌다.
MACS 비드로 정제된 CD14+ 단핵구를 배양 배지에서 밤새 방치한다. 40nM의 CAR mRNA를 형질감염시키고 세포를 37℃에서 3일 동안 인큐베이션한 다음, 유세포 분석에 의해 rHER2 결합으로 CAR 발현을 검출하였다. Ad5f35를 양성 대조군으로 사용하였다. CAR 및 TAR로 형질감염된 세포의 약 50 내지 80%, 및 CFR로 형질감염된 세포의 40 내지 60%가 생존하였다(도 2a). CAR: HER2 발현은 CAR, CFR 및 TAR로 형질감염된 단핵구에서 15 내지 30% 양성이었다(도 2b). 이러한 결과는 CAR, CFR 및 TAR mRNA가 1차 인간 단핵구에서 발현될 수 있음을 나타내지만; 발현 강도는 대식세포보다 훨씬 낮다.
실시예 4: CAR 대식세포의 수용체 발현 및 종양 세포 살해
수용체 발현 대식세포를 생성하기 위해, 1차 인간 대식세포를 1.0×105 내지 1.0×109개 세포/㎖의 농도로 50 내지 500nM mRNA(또는 mRNA 스톡을 기준으로 가능한 최고 농도)를 포함하는 EP 완충액에 현탁시키고 전기천공하였다. 세포를 카세트에서 제거하고, 20% FBS가 포함된 TexMACS 배지에 도말한 다음 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 유세포 분석에 의해 rHER2 결합으로 24시간 후에 CAR, CFR, 및 TAR 발현 MFI, 및 백분율을 검출하였다. Live/Dead Aqua를 사용하여 생존 백분율을 검출하였다. 살해를 위해, 대식세포를 Her2+ CRL2351-NucGFP 종양 세포와 2:1 E:T 비율로 공동 배양하고 Incucyte®를 통해 72시간 동안 모니터링하였다. 종양 세포 사멸은 시간 0에 대해 웰당 통합된 GFP 강도에 의해 계산하였다.
발현 및 CAR+ 백분율은 CAR 작제물에 걸쳐 가변적이었다(도 3a 및 도 3b 및 도 119 및 도 120). mRNA 전기천공법은 생존 백분율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 3c 및 도 118). CFR 또는 TAR 작제물 어느 것도 종양 세포 살해에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 작제물 CAR001(CD8 리더, HER2 scFv, CD8 힌지, CD8 TM, 및 CD3z IC를 포함하는 CAR), CAR003(CD8 리더, HER2 scFv, CD8 힌지, 및 CD8 TM을 포함하는 CAR), CAR007(CD8 리더, 4D5 scFv, IgG4 힌지, CD8 TM, 및 CD3z IC를 포함하는 CAR), CAR013(CD8 리더, HER2 scFv, CD8 힌지, CD64 TM, 및 CD64 ICD를 포함하는 CAR), CAR017(CD8 리더, HER2 scFv, CD8 힌지, CD64 TM, CD64 ICD, P2A, 및 FCER1G를 포함하는 CAR), 및 CAR039(CD8 리더, HER2 scFv, CD8 힌지, TLR4 TM, 및 TLR4 ICD를 포함하는 CAR)는 1차 인간 대식세포에서 발현되었고 살해 기능이 입증되었다(도 3d).
발현 및 CFR과 TAR + 백분율은 작제물에 걸쳐 가변적이었다(도 4a 및 b). mRNA 전기천공법은 생존 백분율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 4c).
실시예 5: CAR 발현의 평가
CAR 발현 기간은 유세포 분석에 의해 평가될 수 있다. CAR 대식세포는 96웰 플레이트의 웰에 도말될 수 있다. 항-Her2 CAR 발현을 측정하기 위해, BSA가 보충된 PBS와 같은 완충액과 함께 His-태그된 재조합 Her2 단백질을 세포에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션시킨다. 그 다음 세포를 300×g에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 제거한다. 그 다음 PBS에서 5분 동안 Human TruStain FcX(BioLegend, Cat 422302)와 같은 Fc 차단 용액을 사용하여 Fc-수용체를 차단한다. Fc 차단 후, 세포 생존력 및 기타 표면 마커에 대한 염색을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세포 생존력은 LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(Invitrogen, Cat L34957)를 사용하여 결정될 수 있다. 추가적으로, His Tag APC-접합 항체(R&D Systems, Cat IC050A)와 같은 항-His 항체를 첨가한다. CAR의 발현은 유세포 분석을 통해 결정되며, 먼저 단일 세포 집단에 게이팅한 다음, 살아있는 세포를 선별하고, 최종적으로 세포의 APC 형광을 측정한다. CAR을 발현하는 세포는 항-His 항체에 노출되지 않은 대조군 세포보다 APC 채널에서 더 밝을 것이다. CAR-양성 세포의 밝기는 발현 정도를 결정하는 반면, 시간 경과에 따른 반복 측정을 통해 시간 경과에 따른 CAR의 발현을 추적할 수 있다.
면역형광을 위해, 세포를 유리 슬라이드에서 적절하게 배양할 수 있다. 그 다음 배지를 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척한다. 그 다음 세포를 4% 파라폼알데하이드 또는 메탄올을 사용하여 고정할 수 있다. 고정액에서 인큐베이션의 정확한 시간은 정체성에 따라 달라질 것이다. 정확한 시간이 지나면, 고정액을 제거하고 세포를 다시 PBS로 3회 세척한다. 세포내 염색이 요망되는 경우, 이제 세포를 PBS 중 1% Triton X-100(ThermoFisher, Cat BP151-100)에서 인큐베이션한 다음, PBS에서 3회 세척한다. 이제 PBS 중 BSA와 같은 차단 용액을 세포에 추가하고 60분 동안 차단시킨다. 그 다음 차단 용액을 제거하고 세포를 세척한다. 형광색소 접합 항체를 제조업체의 지침에 따라 희석하고 밤새 세포에 결합시킨다. 그 다음 항체 용액을 제거하고 세포를 세척한다. 마지막으로, DAPI를 포함하는 ProLong™ Diamond Antifade Mountant(Invitrogen, Cat P36966)와 같은 마운팅 용액을 세포에 적용하고 커버슬립을 상단에 놓는다. 이를 영상화 전에 24시간 동안 건조시킨다. 형광 현미경을 통해 영상화를 수행한다. CAR을 발현하는 세포는 형광단에 대한 적절한 채널에서 CAR을 발현하지 않는 세포보다 더 밝을 것이다.
RTPCR의 경우, 제조업체의 지침에 따라 1단계 키트 RTPCR 키트(SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit, Invitrogen Cat 11732-020)를 사용하여 대식세포를 용해하고 RNA를 수집할 수 있다. CAR에 특이적인 프라이머를 검정에 사용할 것이다. CAR에 대한 mRNA가 있는 대식세포는 RTPCR 검정에서 신호를 나타낼 것인 반면, 형질도입되지 않은 대식세포는 신호를 나타내지 않을 것이다.
실시예 6: CAR 기능성 평가
세포의 유동 식세포작용 검정을 위해, 제조업체의 지침에 따라 표적 양성 및 표적 음성 종양 세포를 CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit(Invitrogen, Cat C34554)로 표지하거나 세포를 GFP와 같은 형광 단백질을 발현하도록 조작하였다. 그 다음 CAR-발현 및 대조군 대식세포를 U-바닥 96웰 플레이트에 1:1의 대식세포:종양 세포 비율로 도말하고 4시간 동안 배양한다. 인큐베이션의 종료시, 세포를 웰에서 제거하고 유세포 분석을 위해 염색한다. 패널은 CD11b와 같은 생존 염료 및 대식세포 특이적 마커를 포함한다. 살아있는 세포에 대한 게이팅 시, CD11b/CFSE 이중 양성인 세포는 세포를 식세포한 것으로 추정되는 대식세포이다. CAR 대식세포는 CAR이 없는 대식세포와 비교하여 표적 양성 종양 세포와 함께 배양할 때 이중 양성 세포의 백분율이 증가하여야 한다. 추가적으로, 대식세포를 표적 음성 세포와 함께 배양하였을 때 식세포작용의 양에 큰 변화가 없는 것으로 식세포작용의 특이성이 나타난다.
비드를 사용하는 유동 식세포작용 검정을 위해, 폴리스타이렌 비드는 CAR의 표적 또는 무관한 단백질로 기능화될 수 있다. 추가적으로, 이러한 비드는 pH-반응성 염료인 pHrodo™ Red, SE(Invitrogen, Cat P36600)로 표지화된다. 산성화 시, 염료의 형광 수준이 증가한다. 그 다음 비드를 CAR 및 형질도입되지 않은 대식세포와 함께 배양한다. 일정 시간 후, 대식세포를 CD11b와 같은 생존 염료 및 대식세포 특이적 마커를 사용하여 유세포 분석을 위해 제거하고 염색할 수 있다. 살아있는 세포에 대한 게이팅 시, CD11b/pHrodo 이중 양성인 세포는 비드를 식세포한 것으로 추정되는 대식세포이다. CAR 대식세포는 CAR이 없는 대식세포와 비교하여 표적 양성 비드와 함께 배양할 때 이중 양성 세포의 백분율이 증가하여야 한다. 추가적으로, 대식세포를 표적 음성 비드와 함께 배양하였을 때 식세포작용의 양에 큰 변화가 없는 것으로 식세포작용의 특이성이 나타난다.
세포의 Incucyte® 분석을 위해, GFP와 같은 형광 단백질을 발현하는 표적-양성 종양 세포를 96웰 플레이트에서 CAR 및 형질도입되지 않은 대식세포와 함께 배양한다. 이펙터 대식세포와 표적 종양 세포 사이의 비율은, 0:1 E:T 표적 세포 단독 대조군과 함께, 10:1 E:T에서 1:10 E:T까지 다양하다. 대식세포의 수는 웰당 10e3개 대식세포로 일정하게 유지된다. 4시간마다 측정되는 시간 경과에 따른 형광의 변화를 측정하여 배양에서 발생하는 종양 세포 살해의 양을 결정할 수 있다. 추가적으로, 이미지 분석 기법을 사용하여 배양액에서 대식세포의 위치를 결정하고 또한 종양 세포를 식세포한 대식세포의 수를 결정할 수 있다. CAR 대식세포는 형질전환되지 않은 대식세포 또는 종양 세포 단독 대조군과 비교하여, 증가된 살해와 함께 대식세포 및 종양 세포의 증가된 공동 국소화를 나타내어야 한다.
비드의 Incucyte® 분석을 위해, CAR에 대한 단백질 표적을 보유하는 pHrodo 기능화된 비드는 96웰 플레이트의 웰에서 CAR 및 형질도입되지 않은 대식세포 둘 다에 첨가된다. 대식세포를 웰당 20e3의 농도로 도말하고 비드를 5:1의 비드 대 대식세포 비율로 첨가한다. pHrodo의 형광을 30분마다 측정하여 5시간 동안 측정한다. 초기 시점과 1시간 시점 사이의 형광 증가 비율을 식세포작용이 일어나는 양을 결정하는 데 사용한다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대조군보다 더 많은 형광 변화를 가질 것으로 예상된다.
식세포작용 후 항원 가공 및 제시를 위해, T 세포 확장, IL2 방출, IFNg 방출, TNFa 방출 및/또는 CD69 상향조절이 분석될 수 있다. 특정 항원(예를 들어, 오브알부민)에 반응하는 것으로 알려진 T 세포 클론을 얻고 배양할 수 있다. 종종, 이러한 클론은 뮤린 세포이다. MHC가 T 세포와 일치하는 뮤린 CAR 대식세포를 CAR-표적 수용체와 알려진 항원을 둘 다 발현하는 암세포와 함께 배양한다. 그 다음 대식세포를 분리하고 T 세포와 공동 배양할 수 있다. 대식세포에 의해 항원이 제시되면, T 세포는 IL2(사이토카인 측정 기법을 통해 측정될 수 있음)를 분비하고 증식(세포 수 계수 또는 CFSE 희석을 통해 측정될 수 있음)할 것이다. 추가적으로, 활성화된 T 세포를 항원-발현 세포주와 T 세포의 공동 배양을 통해 세포독성 기능을 확인할 수 있다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대식세포 대조군과 비교하여 T 세포에서 더 많은 증식과 사이토카인 생산 증가를 유발할 것으로 예상된다.
식세포작용 이외의 다른 방식으로 종양 살해를 또한 평가할 수 있다. 컨디셔닝된 배지에서, CAR 대식세포와 표적-양성 세포를 대식세포가 표적 세포를 감지하고 반응할 수 있도록 일정 기간(예를 들어, 24시간) 동안 함께 공동 배양할 수 있다. 종양 세포 수 사이의 비율은 종양 세포에서 표적 단백질의 발현 수준에 따라 달라질 수 있다. 원하는 시간이 경과한 후, CAR 대식세포에서 상청액을 제거하고 상청액에 남아있는 임의의 세포를 0.22 미크론 필터를 통한 여과 또는 원심분리를 통해 제거한다. 그 다음 여과된 상청액을 CAR 대식세포와 함께 배양되지 않은 다른 암 세포에 배치한다. 종양 세포 생존력 및 증식의 결과적인 변화는 세포 계수, 유세포 분석, MTT/XTT 검정, 또는 현미경 검사를 통해 측정할 수 있다. CAR 대식세포는 동일한 표적 양성 세포주와 함께 배양된 형질전환되지 않은 대식세포의 상청액과 비교할 때 상청액과 함께 배양된 종양 세포의 사멸 또는 성장 속도의 감소를 유발하여야 한다.
표적+/표적-/CAR mac의 공동 배양을 위해, CAR 대식세포, 표적 양성 세포, 및 표적 음성 세포를 함께 공동 배양한다. 예를 들어 상이한 형광 단백질의 발현과 같이 표적 양성 세포와 표적 음성 세포를 구별할 수 있는 방법이 있어야 한다. 시간 경과에 따라, 현미경 검사 또는 유세포 분석을 통해 상이한 세포 유형의 상대적인 수를 결정할 수 있다. 표적 양성 세포가 있거나 없는 CAR 대식세포와 표적 음성 세포의 성장을 비교하면 식세포작용을 사용하지 않는 종양 세포 살해에 대한 통찰력을 얻게 된다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대식세포와 비교하여 표적 음성 세포주의 증가된 사멸 또는 성장 속도의 감소를 나타낼 것으로 예상될 것이다. 추가적으로, 또한 표적 양성 세포의 존재 여부에 따라 CAR 대식세포와 함께 배양된 표적 음성 세포 사이에도 차이가 있을 것으로 예상된다.
유세포 분석에 의한 유리한 사이토카인의 생성을 위해, CAR 대식세포를 표적 음성 대조군과 함께 표적 양성 세포 또는 표적 양성 비드와 공동 배양할 수 있다. 특정 시간 후, 배양액의 상청액을 수확하고 여과 또는 원심분리를 통해 떠돌이 세포를 제거할 수 있다. 원하는 사이토카인은 상청액에서 다양한 사이토카인의 농도를 측정하는 유세포 분석-기반 사이토카인 비드 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 비드를 제조업체의 지침에 따라 염색한다. 이와 같은 시스템의 일례는 BioLegend LEGENDplex 시스템이다. 추가적으로, 배양 시스템으로부터의 CAR 대식세포는 유세포 분석을 사용하는 세포내 사이토카인 염색의 사용을 통해 사이토카인 생성에 대해 수확 및 염색될 수 있다. Fixation/Permeabilization Solution Kit(BD, Cat 554714)와 같은 제조업체의 지시에 따라 세포를 고정, 투과 및 염색할 수 있다. 표적 양성 세포 또는 비드와 함께 배양된 CAR 대식세포는 표적 단백질로 자극되지 않은 형질도입되지 않은 대식세포 또는 CAR 대식세포와 비교하여 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인을 나타내어야 한다.
ELISA/MSD 분석을 위해, CAR 대식세포를 표적 음성 대조군과 함께 표적 양성 세포 또는 표적 양성 비드와 공동 배양할 수 있다. 특정 시간 후, 배양액의 상청액을 수확하고 여과 또는 원심분리를 통해 떠돌이 세포를 제거할 수 있다. 일례는 24시간 동안 8:1의 대식세포 대 표적 비율일 것이다. 배양 기간 후, 상청액을 제거하고 제조업체의 지시에 따라 ELISA 사이토카인 키트(예를 들어, IL-1 베타 Human Instant ELISA™ Kit, Invitrogen Cat BMS224INST)를 사용하여 용액에 존재하는 사이토카인의 양을 측정할 수 있다. 추가적으로, 제조업체의 지시에 따라 MesoScaleDiscovery QuickPlex 시스템을 사용하여 사이토카인을 측정할 수 있다. 표적 양성 세포 또는 비드와 함께 배양된 CAR 대식세포는 표적 단백질로 자극되지 않은 형질도입되지 않은 대식세포 또는 CAR 대식세포와 비교하여 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인을 나타내어야 할 것으로 예상된다.
유세포 분석에 의한 ROS 생성을 위해, CAR 대식세포를 표적 음성 대조군과 함께 표적 양성 세포 또는 표적 양성 비드와 공동 배양할 수 있다. 형질도입되지 않은 대식세포를 동일한 조건 하에서 배양할 수 있다. 활성산소종(ROS) 생성 측정은 Total Reactive Oxygen Species(ROS) Assay Kit 520 nm(Invitrogen, Cat 88-5930-74)와 같은 유세포 분석-기반 키트를 사용하여 측정될 수 있다. 세포는 제조업체의 지침에 따라 준비될 수 있다. 표적 양성 세포 또는 비드와 함께 배양된 CAR 대식세포는 표적 음성 세포 또는 비드와 함께 배양된 CAR 대식세포 및 표적 양성 또는 음성 세포 또는 비드와 함께 배양된 형질도입되지 않은 대식세포보다 더 높은 수준의 ROS를 나타낼 것으로 예상된다. 추가적인 방법은 문헌[Dikalov & Harrison. Antioxid Redox Signal. 2014;20(2):372-382]에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
식세포작용 관문에 대한 저항성을 위해, CAR 대식세포를 다양한 수준의 CD47 또는 다른 항-식세포작용 리간드를 가지는 표적 양성 비드 또는 세포와 공동 배양할 수 있다. 비드는 기능화하는 데 사용되는 단백질 양의 차이를 통해 CD47 또는 기타 항-식세포작용 리간드 수준을 용이하게 변경할 수 있다. 세포에서 항-식세포작용 리간드의 수준을 변경하는 것은 shRNA 또는 CRISPR/Cas9 시스템의 사용과 같은 유전 공학을 필요로 한다. 식세포작용의 양은 상기 섹션에 개괄된 바와 같이, 현미경 검사 또는 유세포 분석을 통해 정량화될 수 있다. CAR과 형질도입되지 않은 대식세포 둘 다 CD47 또는 기타 항-식세포작용 리간드의 양이 증가함에 따라 식세포작용이 덜 나타날 것으로 예상된다. 지배적인 음성 수용체(예컨대, 절두된 SIRPa)를 발현하도록 조작된 대식세포는 CAR 및 형질도입되지 않은 유형 둘 다에 대해, 이와 같은 지배적인 음성 수용체가 결여된 대식세포와 비교하여 증가된 수준의 식세포작용을 나타내어야 한다.
CD47 차단과 비교하기 위해, 뮤린 클론 B6H12와 같은 차단 항체를 사용하여 CD47의 작용을 차단할 수 있다. 표적 양성 또는 음성 세포의 표면에 있는 CD47의 양을 변경하면 다양한 수준의 식세포작용이 가능할 것이다. CD47 차단 항체의 용량-적정 곡선은 다양한 양의 차단 항체와 함께 표적 양성 및 표적 음성 세포를 배양함으로써 결정될 수 있다. CAR과 형질도입되지 않은 대식세포를 둘 다 사용하는 식세포작용 검정은 형질도입되지 않은 세포와 비교하여 주어진 수준의 CD47 차단에서 더 낮은 수준의 저해를 나타냄으로써 Car 대식세포가 CD47에 대해 덜 민감하다는 것을 나타내어야 한다. 대조적으로, 표적 음성 세포는 CAR과 형질변환되지 않은 대식세포 사이에 차이를 나타내지 않을 것이다.
수송을 돕기 위한 케모카인 수용체의 발현을 위해, 케모카인 수용체의 발현은 CAR 대식세포에 대한 특이적 항체의 결합을 통해 측정될 수 있으며, 이는 이어서 유세포 분석기를 사용하여 측정될 수 있다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대식세포와 비교하여 더 높은 수준과 더 다양한 케모카인 수용체를 나타낼 것으로 예상된다.
CAR 및 형질도입되지 않은 대식세포는 용해될 수 있고 RNA는 RNA 시퀀싱 기법을 위해 수확될 수 있다. 세포 내에서 발현된 RNA 전사체의 비교는 어떤 수용체가 세포에서 발현되는지를 결정하게 할 수 있다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대식세포와 비교하여 더 높은 수준과 더 다양한 케모카인 수용체를 나타낼 것으로 예상된다.
웨스턴 블롯팅을 위해, CAR 및 형질도입되지 않은 대식세포를 배양하고, 용해한 다음, 총 단백질을 수집할 수 있다. 그 다음 이 단백질을 전기장에서 겔을 통한 이동성을 통해 크기별로 분류한 다음, 막으로 옮긴다. 특정 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 막을 염색할 수 있으며, 이러한 염색을 통해 단백질의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대식세포와 비교하여 더 높은 수준과 더 다양한 케모카인 수용체를 나타낼 것으로 예상된다.
다른 면역 세포를 동원하기 위한 케모카인의 발현을 위해, CAR 대식세포를 표적 음성 대조군과 함께 표적 양성 세포 또는 표적 양성 비드와 공동 배양할 수 있다. 특정 시간 후, 배양액의 상청액을 수확하고 여과 또는 원심분리를 통해 떠돌이 세포를 제거할 수 있다. 원하는 사이토카인은 상청액에서 다양한 사이토카인의 농도를 측정하는 유세포 분석-기반 사이토카인 비드 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 비드를 제조업체의 지침에 따라 염색한다. 이와 같은 시스템의 일례는 BioLegend LEGENDplex 시스템이다. 추가적으로, 배양 시스템으로부터의 CAR 대식세포는 유세포 분석을 사용하는 세포내 사이토카인 염색의 사용을 통해 사이토카인 생성에 대해 수확 및 염색될 수 있다. Fixation/Permeabilization Solution Kit(BD, Cat 554714)와 같은 제조업체의 지시에 따라 세포를 고정, 투과 및 염색할 수 있다. 표적 양성 세포 또는 비드와 함께 배양된 CAR 대식세포는 표적 단백질로 자극되지 않은 형질도입되지 않은 대식세포 또는 CAR 대식세포와 비교하여 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인을 나타내어야 한다.
ELISA/MSD의 경우, CAR 대식세포를 표적 음성 대조군과 함께 표적 양성 세포 또는 표적 양성 비드와 공동 배양할 수 있다. 특정 시간 후, 배양액의 상청액을 수확하고 여과 또는 원심분리를 통해 떠돌이 세포를 제거할 수 있다. 일례는 24시간 동안 8:1의 대식세포 대 표적 비율일 것이다. 배양 기간 후, 상청액을 제거하고 제조업체의 지시에 따라 ELISA 사이토카인 키트(예를 들어, IL-1 베타 Human Instant ELISA™ Kit, Invitrogen Cat BMS224INST)를 사용하여 용액에 존재하는 사이토카인의 양을 측정할 수 있다. 추가적으로, 제조업체의 지시에 따라 MesoScaleDiscovery QuickPlex 시스템을 사용하여 사이토카인을 측정할 수 있다. 표적 양성 세포 또는 비드와 함께 배양된 CAR 대식세포는 표적 단백질로 자극되지 않은 형질도입되지 않은 대식세포 또는 CAR 대식세포와 비교하여 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인을 나타내어야 할 것으로 예상된다.
트랜스웰 검정의 경우, CAR 대식세포를 표적 음성 대조군과 함께 표적 양성 세포 또는 표적 양성 비드와 공동 배양할 수 있다. 추가적으로, 대식세포와 표적 세포를 대조군으로 별도로 배양할 수 있다. 충분한 인큐베이션 후, 예를 들어, 48시간 후, 상청액을 수확하고 남아있는 세포를 여과를 통해 제거할 수 있다. CD3 양성 T 세포와 같은 면역 세포의 정제된 하위집단을 제조업체의 지침에 따라 CFSE로 표지화할 수 있다. 트랜스웰 삽입물(예를 들어, 3.0㎛ 기공의 폴리카보네이트 막이 있는 HTS Transwell®-96 Permeable Support, Corning Cat. 3386)은 피브로넥틴 또는 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질로 기능화될 수 있다. 기질 단백질을 용액으로 만들고 37C에서 30분 동안 막에 도포한다. 그 다음 남은 용액을 제거하고 막을 PBS로 세척한다. 그 다음 CFSE 표지화 세포를 무혈청 배지에 재현탁시키고 삽입물의 윗면에 놓는다. 이들 세포를 20분 동안 정착시키고 부착시킨다. 그 다음 막의 바닥면이 수집된 상청액에 노출되도록 삽입물을 옮긴다. 세포를 적어도 2시간 동안 이동시킨다. 인큐베이션 기간 후, 삽입물을 제거하고 상청액을 포함하는 바닥 플레이트의 웰의 형광을 측정한다. CAR 대식세포는 형질도입되지 않은 대조군과 비교하여 더 높은 동원도를 나타낼 것으로 예상된다. 추가적으로, 표적 양성 세포와 함께 배양된 CAR 대식세포는 표적 음성 세포와 함께 배양된 CAR 대식세포보다 표지된 면역 세포를 더 잘 동원할 것으로 예상된다.
CFSE 희석에 의한 증식의 경우, 대식세포를 제조업체의 지시에 따라 CFSE 염색으로 표지화할 수 있다. 그 다음 이러한 표지된 대식세포를 적절한 기간 동안 배양할 수 있다. 세포 내 CFSE 희석 수준을 사용하여 대식세포의 증식 정도를 결정할 수 있다.
MTT/XTT 검정의 경우, 세포를 도말하고 MTT(ThermoFisher, Cat V13154) 또는 XTT(ThermoFisher, Cat X12223) 검정에 대한 제조업체의 지침을 사용하여 검정을 실행한다.
유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 대식세포를 생산하기 위해, 문헌[Ackermann et al. Nat Commun. 2018;9(1):5088; Zhang et al. Circ Res. 2015;117(1):17-28; Mucci et al. Stem Cell Reports. 2018;11(3):696-710; Shi et al. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2019;48(1):e74; Takata et al. 2017;47(1):183-198.e6; 및 Cao et al. Stem Cell Reports. 2019;12(6):1282-1297]에 기재된 바와 같은 방법을 사용할 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. IPSC를 준비하기 위해, 렌티바이러스를 이용한 형질도입은 분화 전에 수행될 수 있다.
실시예 7: 대식세포의 프라이밍
Her2-제타 CAR 발현 대식세포를 생성하기 위해, 1차 인간 대식세포를 90×106개 세포/㎖의 농도로 300nM mRNA(TriLink)를 포함하는 EP 완충액(MaxCyte)에 현탁시켰다. 100㎕의 세포 혼합물을 전기천공 카세트(OC100x2; MaxCyte)에 첨가하고 실험 T 세포 1 설정을 사용하여 전기천공하였다. 세포를 카세트에서 제거하고, UpCell 플레이트(Thermo Scientific)에 20% FBS(Gibco)를 포함하는 3㎖의 TexMACS 배지(Miltenyi Biotech)에 도말한 다음, 37C 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
재조합 CD40 리간드(Peprotech), 4-1BB 리간드(Enzo Life Sciences), 및 4-1BB 수용체(Peprotech)를 100 ㎍/㎖의 스톡 농도로 분자 등급의 물에 재현탁시켰다. 그 다음 원액을 사용하여 2 내지 0.002 ㎍/㎖ 범위의 PBS에서 작업 용액을 만들었다. 100 uL의 작업 용액을 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 방치하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 실온에서 30분 동안 두었다. 세포를 플레이트에서 분리하고, NC-200 자동 세포 계수기(Chemomtech)를 사용하여 계수한 다음, 10% FBS가 포함된 TexMACS 배지에 재현탁시켰다. 단백질이 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척한 다음, 10% FBS가 포함된 TexMACS 배지 100 uL의 최종 부피에 대식세포를 첨가하였다. 플레이트를 37C 및 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 3시간 후, 핵 GFP를 발현하는 10,000개의 CRL-2351 세포를 각각의 웰에 첨가하였다. GM-CSF의 최종 농도는 모든 웰에서 10 ng/㎖였다. Incucyte® 분석(Essen Bioscience)을 사용하여 세포 용해를 검출하였다. 종양 세포 사멸은 시간 0에 대해 웰당 통합된 GFP 강도에 의해 계산하였다.
세포 표면 단백질의 검출을 위해, 200uL TexMACS 배지 + 10% FBS + 10 ng/㎖ GM-CSF의 최종 부피에서 효현제 분자로 코팅된 웰에 대식세포를 도말하고 37C 및 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 300㎕ Accutase(Sigma)에서 30분 동안 인큐베이션하고 염색을 위해 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 세포를 RT에서 20분 동안 20 ㎍/㎖ Her2-His를 포함하는 FACS 완충액에서 인큐베이션한 다음, RT에서 10분 동안 Human TruStain FcX에서 인큐베이션하였다. 다음 패널을 사용하여 표면 단백질 염색을 수행하였다: CD80-FITC, CD86-PE, CD163-APC-Cy7, CD206-BV421, 항-His-APC, Aqua Live/Dead. Attune NxT 유세포 분석기(Thermo Fischer)를 사용하여 표면 단백질 발현의 검출을 완료하였다.
CD40L로 CAR 대식세포를 처리하면 대식세포 및 CAR 대식세포의 종양 살해 능력이 상당히 개선되었다(도 5a). CD40L을 이용한 프라이밍은 또한 mRNA 형질도입된 CAR 대식세포에서 M1 표현형을 유도하였다(도 5b). 4-1BB 및 4-1BBL로의 처리는 CD40L보다 덜 강력하지만 유사한 결과를 유발하였다(도 6a 내지 도 6b 및 도 7a 내지 도 7b). 이들 결과는 CD40L과 같은 CD40 효현제로 CAR 대식세포를 전처리 또는 프라이밍하면 효능이 증가할 수 있고 CD40 효현제와 함께 CAR 대식세포를 포함하는 병용 요법이 효능을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 8: M1 분극화는 mRNA 지속성 및 대식세포/CAR-대식세포 기능을 향상시킨다
m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 HER2 CAR mRNA로 인간 대식세포를 전기천공하였다. 세포를 IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IFN-감마와 지질다당류(LPS), TNF-알파, IL-6 또는 STING 리간드(STING-L)와 같은 M1 표현형을 유도하는 사이토카인과 함께 최대 48시간 동안 배양한 다음 사이토카인을 세척하여 제거하고 신선한 배지를 첨가하였다. CAR 발현 및 M1 마커 발현을 형질감염 후 제2일 및 제7일에 측정하였다. 형광 표지된 HER2+ 유방암 세포(CRL2351)를 대식세포를 형질감염시키고 2일 후에 HER2 CAR 대식세포와 공동 배양하였다. 4시간마다 Incucyte® 라이브 이미징 현미경에서 형광을 통해 암 세포 성장을 모니터링하였다. 이펙터(CAR 대식세포) 대 표적(암 세포) 비율은 5:1이었다.
도 121a에 나타낸 바와 같이, 테스트한 인터페론 사이토카인은 제2일에 CAR로 형질감염된 대식세포의 생존력을 저하시키지 않았다. 놀랍게도, IFN-β로 처리된 대식세포는 대조군 배지, IFN-α 또는 IFN-γ로 처리된 대식세포보다 더 높은 CAR 발현을 나타내었다(도 121b). 도 121c에 나타낸 바와 같이, 인터페론 사이토카인을 이용한 대식세포의 처리는 제7일에 CAR로 형질감염된 대식세포의 생존력을 저하시키지 않았다. 놀랍게도, IFN-β로 처리된 대식세포는 대조군 배지, IFN-α, 또는 IFN-γ로 처리된 대식세포보다 더 높은 CAR 발현을 나타내었으며, 이는 IFN-β가 인간 대식세포에서 CAR과 같은 mRNA 인코딩 이식유전자의 발현 기간을 개선시킨다는 것을 입증한다(도 121d). 추가적으로, IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ를 이용한 mRNA로 형질감염된 CAR 대식세포의 처리는 M1 표현형의 유도(CD86 발현을 기반으로 함; 도 121e) 및 M2 마커의 감소(CD163 발현을 기반으로 함; 도 121f)를 야기하였다. IFN-β는 평가된 인터페론 중 가장 강력한 M1 표현형을 야기하였으며, M1 표현형은 처리 후 적어도 7일 동안 지속되었다(도 121e).
실시예 9: CAR 발현, CAR 대식세포 기능, M1 표현형 마커 및 사이토카인 생성에 대한 IFN 처리의 효과
인터페론 처리가 상이한 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염된 대식세포에 차등적으로 영향을 미치는지를 결정하기 위해 5개의 상이한 mRNA 변형을 또한 테스트하였다. 인간 대식세포를 상이한 mRNA 변형을 포함하는 HER2 CAR mRNA로 전기천공하였다. CAR 발현 및 M1 마커를 전기천공 후 제4일에 Flow Cytometry(Attune)에 의해 검출하였다. 그 다음 제4일에 CAR 대식세포 세포를 5:1의 이펙터(CAR 대식세포) 대 표적(암세포) 비율로 Nuc-Light로 표지된 HER2+ 유방암 세포주(CRL2351)와 공동 배양하였다. 4시간마다 Incucyte® 라이브 이미징 현미경에서 형광을 통해 암 세포 성장을 모니터링하였다.
CAR 지속성에 대한 IFN-β의 영향을 추가로 평가하기 위해, HER2 CAR을 인코딩하는 m6AGCap1/PsU mRNA로 전기천공된 인간 대식세포를 제2일 및 제7일에 평가하였다. IFN-β 처리는 IFN-β로 처리되지 않은 CAR 대식세포와 비교하여 제7일에 CAR 발현율을 상당히 개선시켰다(도 122).
개선된 CAR 발현에 대한 IFN-β 처리의 효과를 검증하고 IFN-β 농도를 최적화하기 위해, M6AGCap1/PsU 변형된 mRNA로 형질감염된 대식세포를 0, 3, 10, 30, 또는 100 ng/㎖ IFN-β로 4시간 동안 처리하고, 생존력, CAR 백분율, 및 CAR MFI를 전기천공 후 제4일 및 제7일에 평가하였다. 인간 대식세포에 의한 CAR 발현에 대한 IFN-β의 용량-의존적 효과가 관찰되었다(도 123a). 실시예 4에 기재된 바와 같이, IFN-β로 CAR 대식세포를 처리하면 M1 표현형이 유도되었고, 따라서 효과가 용량 의존적인지를 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 도 123b에 나타낸 바와 같이, M1 마커인 CD80, CD86 및 HLA-DR의 유도는 IFN-β 용량-의존적이었다.
대식세포 표현형이 가소성인 것으로 간주되고, IL-10과 같은 면역억제성 사이토카인이 M2 표현형을 유도하는 것으로 알려져 있다는 점을 고려하여, IFN-β 처리 또는 미처리 HER2 CAR mRNA로 형질감염된 대식세포에 대한 IL-10 처리의 영향을 평가하였다. IFN-β 처리된 CAR 대식세포는 IL-10의 효과에 저항하였고 M2 마커인 CD163을 발현하지 않은 반면, 대신 처리하고 48시간 후(도 124a) 및 IL-10으로 처리하고 7일 후(도 124b)에 M1 마커인 CD86의 발현을 유지하였다. IFN-β 프라이밍된 CAR 대식세포는 또한 다른 M2 유도 인자에도 저항하였다.
IFN-β로 프라이밍하거나 프라이밍하지 않고 HER2 CAR을 인코딩하는 mRNA로 형질감염된 대식세포의 항-종양 기능을 평가하기 위해, 형질도입되지 않은(UTD) 또는 CAR 대식세포를 0, 3, 10, 30 또는 100 ng/㎖의 IFN-β로 4시간 또는 20시간 동안 프라이밍하였다. 그 다음 이들 이펙터 세포를 3:1 또는 1.5:1의 이펙터 대 표적 비율로 HER2+ 유방암 세포주 CRL2351-GFP와 공동 배양하고 Incucyte® 라이브 이미징 현미경을 사용하여 GFP 발현을 기반으로 항-종양 활성을 측정하였다. IFN-β 프라이밍은 CAR 대식세포가 암 세포를 살해하는 능력을 개선시켰다(도 125a). IFN-β 처리가 변형을 포함하는 mRNA로 CAR 대식세포 항-종양 활성을 개선시켰는지 여부를 평가하기 위해, IFN-β 처리 유무에 관계없이 독특한 변형을 포함하는 mRNA로 전기천공된 대식세포의 항-종양 활성을 평가하였다. IFN-β 처리는 5 moU mRNA로 형질감염된 것을 제외하고 모든 CAR 대식세포에 대하여 항-종양 활성을 개선시켰다(도 125b). 개선된 mRNA-형질감염된 CAR 대식세포 항-종양 효과가 모든 인터페론에 보편적인지 또는 인터페론 베타에만 있는지를 평가하기 위해 M6AGCap1/PsU mRNA로 전기천공된 대식세포를 IFN-알파, 베타, 또는 감마로 처리하고 암세포 살해 능력에 대해 평가하였다. IFN-β로 처리된 CAR 대식세포는 IFN-α 또는 IFN-γ보다 더 큰 효과로 최고의 암세포 살해를 야기하였다(도 125c).
대식세포의 인터페론 처리가 다른 항-종양 기능을 개선시키는지 여부를 평가하기 위해, HER2+ 유방암 세포와의 공동 배양 후 인터페론 처리되거나 처리되지 않은 mRNA 형질감염된 HER2 CAR 대식세포의 사이토카인 분비를 평가하였다. m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 150nM HER2 CAR mRNA로 인간 대식세포를 전기천공하였다. 3:1의 이펙터(CAR 대식세포) 대 표적(암세포) 비율에서 대식세포를 CAR mRNA로 형질감염한 후 HER2+ 유방암 세포(CRL2351)를 CAR 대식세포와 공동 배양하였다. 암세포와 대식세포를 공동 배양하고 48시간 후에 상청액을 수집하고 Meso Scale Discovery(MSD) 기기를 사용하여 사이토카인 수준을 측정하였다. 도 126에 나타낸 바와 같이, 대식세포를 IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ로 처리하면 대식세포로부터 사이토카인 IL-6, IL-8 및 TNFα의 분비가 증가하였다.
인터페론을 이용한 처리가 대식세포에서 CAR mRNA 지속성을 추가로 개선시킬 수 있는지 및 CAR 대식세포 기능성이 확장될 수 있는지를 결정하기 위해 추가적인 연구를 수행하였다. 인간 대식세포를 m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 300nM CAR mRNA로 전기천공하였다. 세포를 20 ng/㎖ IFN과 함께 24시간 동안 배양한 다음 세포를 세척하여 사이토카인을 제거하였다. CAR 발현을 형질감염 후 제2일에 Flow Cytometry(Attune)에 의해 검출하였다. 그 다음 세포를 3:1의 이펙터 대 표적 비율에서 Nuc-Light 표지된 HER2+ 유방암 세포주(CRL2351)와 공동 배양하였다. Incucyte® 라이브 이미징 현미경에서 형광을 통해 암 세포 성장을 모니터링하였다. 대식세포에서의 CAR 발현 및 M1 마커를 형질감염 후 제7일에 유세포 분석(Attune)에 의해 검출하였다.
도 127a에 나타낸 바와 같이, CAR mRNA로 형질감염시키고 2일 후, CAR 대식세포 생존력 및 CAR 발현은 IFN-γ로 처리된 대식세포를 제외하고 매우 높았다. 추가적으로, 도 127b 및 도 127c에 나타낸 바와 같이, IFN 처리는 CAR 대식세포의 표적 세포 살해 활성을 향상시켰다. 도 127c는 암세포와 대식세포가 72시간 동안 공동 배양된 후 표적 세포 살해를 나타낸다. IFN을 이용한 처리는 또한 대식세포 생존력, CAR 발현, M1 마커 발현, 및 CAR 대식세포 기능에 영향을 미쳤다. 도 128a에 나타낸 바와 같이, 형질감염된 대식세포를 IFN-β로 처리하면 이후 제7일 시점에서 인터페론으로 처리되지 않은 대식세포에 비해 증가된 세포 생존력, HER2 CAR 발현 및 M1 마커인 CD80, CD86 및 HLA-DR의 발현이 야기되었다. 도 128a는 모든 대식세포가 제7일에 높은 생존력을 가졌으나, IFN-β 처리된 대식세포가 상당한 차이로 최고 수준의 CAR을 발현하였음을 나타낸다. 도 128b는 전기천공 후 제7일에 암세포 살해 검정에서 테스트된 모든 CAR 대식세포 중에서, IFN-β로 처리된 것이 최고 수준의 암 살해(종양 성장의 가장 큰 감소)를 야기하였음을 나타낸다. 대식세포를 전기천공하고 7일 후에, 대식세포를 표적 암세포와 72시간 동안 공동배양하였다. 도 128c에 나타낸 바와 같이, 모든 인터페론은 인터페론으로 처리되지 않은 CAR 대식세포와 비교하여 CAR 대식세포의 암세포 살해 활성을 개선시켰다.
실시예 10: 형질감염된 대식세포는 IFNγ에 대해 민감하다
인간 대식세포를 m6AGCap1 및 PsU 또는 N1mPsU 변형을 포함하는 mCherry mRNA로 형질감염시킨 다음, 상이한 용량의 IFN-γ와 함께 1일 동안 배양하였다. Incucyte® 라이브 이미징 현미경에서 mCherry 발현을 모니터링하였다. 도 129에 나타낸 바와 같이, IFN-γ는 대식세포가 mRNA로 형질감염되었을 때 mCherry mRNA 발현을 감소시켰다.
시험관내에서 전사된 mRNA는 다양한 엔도좀 선천성 면역 수용체(예를 들어, 톨-유사 수용체(TLR) 3, TLR7 및 TLR8) 및 세포질 선천성 면역 수용체(단백질 키나제 RNA-활성화(PKR), 레티노산-유도 유전자 I 단백질(RIG-I), 흑색종 분화-연관 단백질 5(MDA5) 및 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타제(OAS))에 의해 인식된다. 이러한 상이한 경로를 통한 신호전달은 1형 인터페론(IFN), 종양 괴사 인자(TNF), 인터류킨-6(IL-6), IL-12와 연관된 염증 및 전사 프로그램 캐스케이드의 활성화를 초래한다. 전반적으로, 이들은 특정 면역 반응을 유도할 수 있는 전염증성 미세환경을 형성한다. 더욱이, 진핵세포 번역 개시 인자 2α(eIF2α) 인산화에 의한 번역 감소, 리보뉴클레아제 L(RNaseL)에 의한 향상된 RNA 분해, 자가-증폭 mRNA 복제의 과발현 및 저해와 같은 하류 효과는 모두 IVT mRNA의 약동학 및 약력학과 관련이 있다.
TLR 경로를 통한 IFN-γ의 활성화는 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타제(OAS)를 활성화시킬 수 있으며, 이는 2'-5'-올리고아데닐레이트(2-5A)를 생성하고, 이는 결국 RNaseL을 활성화시켜 RNA 분해 및 아폽토시스를 야기할 수 있다.
실시예 11: CAR 대식세포에 대한 RNaseL 저해제인 수니티닙 및 ABCE1의 효과
RNaseL 저해제가 형질감염된 mRNA의 IFN-γ-유도 불안정성을 구제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 대식세포를 m6AGCap1 및 PsU 변형을 포함하는 mCherry mRNA의 형질감염 2시간 전에 1μM 수니티닙(RNaseL 저해제)으로 처리하였다. 그 다음 형질감염된 세포를 상이한 투약량의 IFN-γ와 함께 하루 동안 배양하였다. Incucyte® 라이브 이미징 현미경에서 mCherry 발현을 모니터링하였다. 도 130a에 나타낸 바와 같이, 수니티닙은 mRNA의 IFN-γ-유도 분해를 구제하였다.
RNAse L 저해가 mRNA-형질감염된 CAR 대식세포의 항종양 기능을 개선시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 대식세포를 변형을 포함하는 mRNA로 형질감염시키고 암세포 살해 검정에서 이펙터 세포로서 평가하기 전에 수니티닙으로 전처리하였다. 1nM 수니티닙으로 전처리된 CAR 대식세포는 수니티닙으로 전처리되지 않은 CAR 대식세포 또는 수니티닙으로 처리되거나 처리되지 않은 형질감염되지 않은 대조군 대식세포보다 더 높은 암세포 살해를 야기하였다(도 130b). 48시간 CRL2351 유방암 세포 살해 검정에서 수니티닙-프라이밍된 CAR 대식세포의 개선된 암 살해 능력이 도 130c에 나타나 있다.
또 다른 RNaseL 저해제(RLI 또는 ABCE1)의 효과를 또한 테스트하여 개념을 추가로 검증하였다. 인간 대식세포를 m6AGCap 1 및 PsU 변형을 포함하는 mCherry를 인코딩하는 mRNA 및 ABCE1을 인코딩하는 mRNA로 공동 형질감염시켰다.
도 131에 나타낸 바와 같이, ABCE1 공동 발현은 전기천공 48시간 후 관심이 있는 mRNA-인코딩 이식유전자의 발현을 상당히 개선시켰다. ABCE1로 공동 형질감염된 대식세포의 생존력은 영향을 받지 않았고 높게 유지되었다. ABCE1 공동 형질감염은 mCherry 발현을 약 2배 증가시켰고, 수니티닙으로의 전처리는 이 효과를 추가로 향상시켰다.
실시예 12: CD28 힌지 도메인을 포함하는 CAR 대식세포의 수용체 발현 및 종양 세포 살해
이 실시예에서, CD8 리더, 4D5 scFv, CD28 힌지 도메인, CD28 막횡단 도메인, 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인(CTX_219)을 포함하는 CAR 작제물을 생성하였다(도 132). 그 다음 CTX_219의 발현을 CD28 힌지 도메인 및 CD28 막횡단 도메인 대신에 CD8 힌지 도메인 및 CD8 막횡단 도메인을 가지는 동일한 CAR 작제물과 비교하였다(CTX_001; 도 8). CTX_219의 종양 살해 능력을 CTX_001 및 또한 CTX_001과 동일하지만 세포내 신호전달 도메인이 결여된 CAR 작제물(CTX_003)과 비교하였다.
1차 인간 대식세포를 1.0×105 내지 1.0×109개 세포/㎖의 농도로 50 내지 500nM mRNA를 포함하는 EP 완충액에 현탁시키고 전기천공하였다. 세포를 카세트에서 제거하고, 도말한 다음 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 유세포 분석에 의해 rHER2 결합으로 24시간 후에 CAR 발현 MFI, 및 백분율을 검출하였다. 24시간 후 Live/Dead Aqua를 사용하여 생존 백분율을 검출하였다. 살해를 위해, 대식세포를 Her2+ CRL2351-NucGFP 종양 세포와 2:1 E:T 비율 또는 1:1 E:T 비율로 공동 배양하고 Incucyte®를 통해 72시간 동안 모니터링하였다. 종양 세포 사멸은 시간 0에 대해 웰당 통합된 GFP 강도에 의해 계산하였다.
발현 및 CAR+ 백분율은 CD28 힌지 도메인을 포함하는 CAR 작제물(CTX_219), CD8 힌지 도메인을 포함하는 CAR 작제물(CTX_001), 및 세포내 신호전달 도메인이 결여된 CAR 작제물(CTX_003; 도 133a 내지 도 133c 참조)에 대해 비슷하였다. 생존 백분율은 또한 CTX_219 및 CTX_001에 대해 비슷하였다(도 133d). 놀랍게도, CD28 힌지 도메인을 포함하는 CAR 작제물(CTX_219)은 CTX_001 및 CTX_003 대조군에 비해 향상된 살해 기능을 나타내었다(도 133e). 이들 데이터는 CD28 힌지 도메인을 포함하는 CAR 작제물이 CD8 힌지 도메인을 포함하는 CAR 작제물에 비해 대식세포에 의한 개선된 종양 세포 살해를 초래하였음을 나타낸다.
CTX_001 및 CTX_003에 비해 CTX_219를 포함하는 대식세포에 의한 TNFα 및 IL6 분비를 측정하였다. 이펙터 세포를 1:1의 E:T 비율로 24시간 동안 HER2+ 표적 세포와 공동 배양하였다. 상청액을 수확하고 제조업체의 지침에 따라 MSD Pro-Inflammatory Panel 1(Meso Scale Discovery)을 사용하여 TNFα 및 IL6 농도를 측정하였다. 놀랍게도, CD28 힌지 도메인(CTX_219)을 포함하는 CAR 작제물은 IL6 생성을 추가로 증가시키지 않으면서 TNFα 분비를 상당히 증가(CTX_001보다 약 5배 더 높음)시킴을 나타내었다(도 134). 이들 데이터는 CD28 힌지 도메인을 포함하는 CAR 작제물이 염증성 사이토카인인 IL6의 생성을 증가시키지 않으면서 CD8 힌지 도메인을 포함하는 CAR 작제물에 비해 종양 살해 사이토카인인 TNFα의 분비를 개선시켰음을 나타낸다.
실시예 13: CAR을 포함하는 대식세포의 VPX-매개 렌티바이러스 형질도입
CAR 발현을 위한 대식세포의 렌티바이러스 형질도입을 위해, 대식세포를 해동시키고 10㎖ 완전 배지(CM)의 플레이트에서 10 ㎝당 5 내지 10e6개 세포의 밀도로 도말하였다. 2 내지 3시간 휴지 후, VPX 렌티바이러스 입자를 CM으로 희석하고 지정된 MOI에서 대식세포에 첨가하였다. 렌티바이러스를 첨가하고 24시간 후에 배지를 완전히 교체하였다.
본 명세서에 기재된 실험을 위한 대식세포의 수확을 위해, 10 ㎝ 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 4C에서 30분 동안 두었다. 세포를 플레이트에서 제거하고, 펠릿화한 다음, CM에 재현탁시켰다. 세포 수를 측정하고, 대식세포를 실험에 사용하거나 나중 시점을 위해 재도말하였다.
CAR 대식세포의 평가를 위한 기능 검정
살해 검정을 위해, 특정 대식세포 대 표적 비율(E:T)을 달성하기 위해 대식세포를 규정된 밀도로 CM 100uL의 96웰 플레이트에 도말하였다. 1 내지 2시간 휴지 시간 후, nucLight GFP를 발현하는 10,000개의 종양 세포를 100uL CM에 재현탁시키고 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 Incucyte®에 넣고 종양 세포 첨가 후 약 1시간을 시작으로 4시간마다 영상화하였다. 살해는 시간 0 스캔에 대한 통합된 GFP 강도로 정의되었다. 이들 검정에 사용된 종양 세포는 AU565 HER2+ 유방암 및 SKOV3 난소 암종 세포였다.
사이토카인 분비 연구를 위해, 가용성 Her2-His를 0.2 ug/uL의 농도로 분자 등급의 물에 용해하였다. 그 다음 Her2-His를 명시된 농도로 PBS에 희석하였다. 100uL의 Her2-His 희석액을 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4C에서 밤새 보관하고 이어서 PBS로 2회 세척하였다. 50,000개의 대식세포를 200uL CM의 최종 부피로 각각의 웰에 첨가하였다. 대식세포를 첨가하고 약 24시간 후 상청액을 수확하고 추가 평가를 위해 -20C에 보관하였다. MSD U-Plex 키트를 사용하여 사이토카인 검출을 수행하였다.
세포 표면 단백질 및 CAR 발현의 검출을 위해, 세포를 RT에서 10분 동안 Human TruStain FcX를 함유하는 FACS 완충액에서 인큐베이션하였다. 다음 패널을 사용하여 표면 단백질 염색을 수행하였다: CD80-FITC, CD86-PE, CD163-APC-Cy7, CD206-BV421, 항-트라스투주맙-APC, 및 Aqua Live/Dead. Attune NxT 유세포 분석기(Thermo Fischer)를 사용하여 표면 단백질 발현 검출을 완료하고 FlowJo에서 분석하였다.
VPX 및 비-VPX 렌티바이러스를 비교하는 CAR 발현의 검출을 위해, 세포를 RT에서 20분 동안 20 ㎍/㎖ Her2-His를 포함하는 FACS 완충액에서 인큐베이션한 후, 실온에서 10분 동안 Human TruStain FcX에서 인큐베이션하였다. 다음 패널을 사용하여 표면 단백질 염색을 수행하였다: CD80-FITC, CD86-PE, CD163-APC-Cy7, CD206-BV421, 항-His-APC, Aqua Live/Dead. Attune NxT 유세포 분석기(Thermo Fischer)를 사용하여 표면 단백질 발현 검출을 완료하고 FlowJo에서 분석하였다.
CAR 대식세포의 VPX를 사용한 렌티바이러스 형질도입 결과
VPX 첨가는 대식세포에서 CAR 작제물(CTX_001)의 발현을 상당히 증가시켰다(도 136). CTX_001은 항-HER2 scFv, CD8 힌지, CD8 막횡단 도메인, 및 CD3-제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다(도 8). VPX-기반 형질도입은 MOI 5 내지 50에서 약 20% CAR(%)로 VPX 없이 형질도입된 동일한 CAR(CTX_001)에 비해 MOI 5에서 40% 초과, MOI 10에서 60% 초과, MOI 50에서 80% 초과, MOI 50에서 90% 초과로 CAR(%)을 증가시켰다.
다음으로, MOI 적정으로 VPX-렌티바이러스 형질도입에 대해 시간 경과에 따라 생존력 및 CAR 발현을 평가하였다. VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CAR-M은 생존성이 매우 높고 30일에 걸쳐 CTX-001을 발현하는 것으로 나타났다(도 137). 1, 5 및 10의 MOI에서 VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CAR-M은 약 80% 내지 약 100% 범위의 생존율(%)로 약 30일의 기간에 걸쳐 생존할 수 있었다. CAR% 발현은 MOI 1에서 MO1 5 및 10으로 증가하였다. 형질도입되지 않은(UTD) 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
또한 시간 경과에 따른 표면 단백질의 분석을 위해 α트라스투주맙-AF647을 사용하여 VPX-렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001에 대해 CAR 발현을 평가하였다. 제4일, 제7일, 제15일, 제22일, 및 제29일에 있어서 MOI 5 및 10에서 발현 증가와 함께 CAR 세포 표면 발현이 MOI 1, MOI 5 및 MOI 10에서 나타났다(도 138). UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다.
CAR 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 또한 시간 경과에 따른 표면 단백질 분석을 위해 α트라스투주맙-AF647을 사용하여 VPX-렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001에 대해 평가하였다. VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CAR 대식세포는 생존력이 매우 높고 30일 기간에 걸쳐 CTX-001을 발현하는 것으로 나타났다(도 139). 따라서, VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CAR 대식세포는 적어도 29일 동안 CAR 발현을 유지하였다.
VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 대식세포의 살해 기능을 또한 평가하였다. 이펙터 대식세포 대 표적 종양 세포의 비율(E:T)은 4:1, 2:1, 1:1 및 1:2였다. 통합 강도는 종양 부담을 나타낸다. UTD 대식세포 및 대식세포가 없는 AU565 세포(HER2+ 유방암 세포주)를 대조군으로 사용하였다. 살해 기능은 4일 후 모든 E:T 비율 및 1, 5 및 10의 MOI에서 CTX_001 대식세포에 대해 명백하였으며, 이는 7일 후에 지속되었다(도 140). 특히, MOI 5 및 MOI 10의 CTX_001 대식세포는 모든 E:T 비율에서 유사한 수준의 살해 기능을 나타내었다. 공동 배양 72시간 후의 항-종양 활성을 플롯팅하였다.
다음으로, 임상 형질도입에 대한 MOI 범위를 조사하였다. CD3-제타 도메인(CTX_001)이 있는 CAR과 CD3-제타 도메인이 없는 CAR(CTX_003; 항-HER2 scFv, CD8 힌지, 및 CD8 막횡단 도메인을 포함하는 CAR; 도 10)을 조사하였다. MOI 2 및 MOI 5는 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에서 CTX_001 및 CTX_003의 CAR 세포 표면 발현을 초래하였다(도 141a). VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포는 생존 가능하고 UTD 대식세포에 비해 각각의 CAR을 발현하는 것으로 나타났다(도 141b). VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 대식세포는 MOI 2보다 MOI 5에서 더 높은 CAR 수준을 발현하는 것으로 나타났다(도 142). VPX 렌티바이러스에 의한 형질도입은 또한 CD80 및 CD86 발현을 기반으로 하는 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 중간 정도의 용량-의존적 M1 분극화 및 CD163과 CD206 발현의 감소를 초래하였다(도 143).
VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 대식세포의 분극화를 Ad5f35에 의한 아데노-연관 바이러스 형질도입과 비교하기 위한 실험을 또한 수행하였다. VPX-렌티바이러스가 아닌 Ad5f35를 이용한 형질도입은 M1 마커인 CD80 및 CD86을 유도하였다(도 144). VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 대식세포는 또한 형질도입 후 제7일 및 형질도입 후 제21일에 Ad5f35 형질도입된 CTX_001 대식세포에 비해 더 지속적인 항-종양 활성을 나타내었다(도 145). 이러한 결과는 일부 경우에 VPX-렌티바이러스가 사용될 때 M1 유도 없이 대식세포에서 동등한 CAR 발현을 위해 상이한 바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 대식세포 가소성의 유지 및 표현형의 후속 제어를 허용한다는 것을 입증한다. 따라서, VPX-렌티바이러스는 M0 CAR 대식세포를 만드는 데 사용될 수 있다. 이어서, Vpx-렌티바이러스 유래 M0 CAR 대식세포는 M1 또는 M2로 분극화되어 M1 또는 M2로 분극화된 조작된 대식세포 또는 CAR 대식세포를 만들 수 있다. 이와 같은 CAR 대식세포는 또한 표현형 변화를 유도하기 위해 CAR 작제물 내의 신호전달 도메인을 인코딩할 수 있다. 이와 같은 CAR 대식세포는 M1 사이토카인(예를 들어, IFNa, IFNb, IFNg, LPS, 또는 TLR 효현제) 또는 M2 사이토카인(예를 들어, IL4, IL10, IL13, 또는 TGFb) 사이토카인으로 프라이밍되어 선택된 표현형을 가지는 CAR 대식세포를 만들 수 있다. 이와 같은 CAR 대식세포는 M1 또는 M2 표현형을 유도하기 위해 전사 인자, 면역 리간드, 또는 분비된 사이토카인으로 조작될 수 있다.
VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 살해 기능도 또한 AU565 및 SKOV3 세포에서 MOI 2 및 MOI 5에서 평가하였다. AU565의 경우 E:T 비율은 4:1 및 1:2였다. VPX 렌티바이러스로 형질도입 7일 후, MOI 2 및 MOI 5로 형질도입된 CTX_001 대식세포는 대조군으로서 UTD 및 AU565 세포를 이용하여 4:1 및 2:1의 E:T 비율에서 유사한 살해 능력을 나타내었다(도 146). SKOV3의 경우 E:T 비율은 4:1이었다. VPX 렌티바이러스로 형질도입 7일 후, MOI 2 및 MOI 5로 형질도입된 CTX_001 대식세포는 대조군으로서 UTD 및 SKOV3 세포를 이용하여 4:1의 E:T 비율에서 유사한 살해 능력을 나타내었다(도 147).
VPX 렌티바이러스로 CTX_001 및 CTX_003 대식세포를 형질도입한 후 염증성 사이토카인 생성도 또한 조사하였다. CTX_001 및 CTX_003 대식세포를 VPX 렌티바이러스로 형질도입하고 플레이트-결합 HER2 유무에 관계없이 24시간 동안 배양하였다. VPX 렌티바이러스로 형질도입 7일 후, MOI 2 및 MOI 5로 형질도입된 CTX_001 대식세포는 HER2의 존재 하에 증가된 TNFα 및 IL-6 생성과 함께 염증성 사이토카인 분비의 차이를 나타내었다(도 148).
다음으로, MOI 2 및 MOI 5로 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 VPX-렌티바이러스 형질도입에 대해 시간 경과에 따라 생존력 및 CAR 발현을 평가하였다. VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포는 생존력이 매우 높고 21일 기간 동안 CTX-001 및 CTX_003을 발현하는 것으로 나타났다(도 149). UTD 대식세포를 대조군으로 사용하였다. 또한 시간 경과에 따른 세포 표면 단백질 분석을 위해 α트라스투주맙-AF647을 사용하여 VPX-렌티바이러스로 형질도입된 대식세포에 대해 CTX-001 및 CTX_003 CAR 발현의 MFI를 평가하였다. VPX-렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포는 생존력이 매우 높고 21일 기간 동안 CTX-001 및 CTX-003을 발현하는 것으로 나타났다(도 150).
VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CTX_001 및 CTX_003 대식세포의 살해 기능도 또한 시간 경과에 따라 AU565 및 SKOV3 세포에서 MOI 2 및 MOI 5에서 평가하였다. 살해 검정은 형질도입 21일 후에 개시하였다. AU565의 경우 E:T 비율은 4:1 및 1:2였다. VPX 렌티바이러스로 형질도입 21일 후, MOI 2 및 MOI 5로 형질도입된 CTX_001 대식세포는 대조군으로서 UTD 및 AU565 세포를 이용하여 72시간에 걸쳐 4:1 및 2:1의 E:T 비율에서 유사한 살해 능력을 나타내었다(도 151). SKOV3의 경우 E:T 비율은 4:1이었다. VPX 렌티바이러스로 형질도입 21일 후, MOI 2 및 MOI 5로 형질도입된 CTX_001 대식세포는 대조군으로서 UTD 및 SKOV3 세포를 이용하여 4:1의 E:T 비율에서 유사한 살해 능력을 나타내었다(도 152).
CTX_001의 발현(도 8) 및 VPX 렌티바이러스 형질도입 후 단핵구에서의 생존력도 또한 조사하였다. CD14+ 인간 단핵구를 해동시키고, 세척한 다음 계수하였다. 6웰 Upcell 플레이트에 3e6개 세포/웰, UTD로 또는 적절한 MOI에서 렌티바이러스를 첨가하여 세포를 도말하였다. 세포를 제5일에 공급하였고, 유세포 분석을 위해 제7일에 수확하였다. Ad5f35 형질도입을 사용하여 형질도입된 CAR 대식세포 및 CAR 단핵구를 대조군으로 사용하였다. CAR 단핵구는 Ad5f35 형질도입된 CAR 단핵구 및 CAR 대식세포를 생존력의 비교자로서 사용하여 MOI 2, 5 또는 10에서 VPX 렌티바이러스로 형질도입 후 생존력이 있었다(도 153a). MOI 2, 5 및 10에서 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CAR 단핵구는 Ad5f35 형질도입된 CAR 단핵구 및 CAR 대식세포를 생존력의 비교자로서 사용하여 MOI 2에서 27.6%, MOI 5에서 51.3%, 및 MOI 10에서 66.3%로 CAR 발현의 백분율(%) 증가를 나타내었다(도 153b). MOI 2, 5 및 10에서 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CAR 단핵구는 또한 Ad5f35 형질도입된 CAR 단핵구 및 CAR 대식세포를 비교자로서 사용하여 MOI가 증가함에 따라 CAR 발현의 평균 형광 강도(MFI) 증가를 나타내었다(도 153c). MOI 2, 5, 및 10에서 VPX 렌티바이러스로 형질도입된 CD14+ 단핵구의 CAR 발현 히스토그램은 또한 Ad5f35 형질도입된 CAR 단핵구 및 CAR 대식세포를 비교자로서 사용하여 MOI가 증가함에 따라 CAR 발현 증가를 나타내었다(도 153d). UTD 대식세포를 또한 CAR 발현 히스토그램에 대한 대조군으로 사용하였다. 이러한 결과는 단핵구가 VPX 렌티바이러스 형질도입 후 CAR을 발현함을 입증하고 단핵구가 대식세포 단계에서 CAR 발현을 유지할 것임을 나타낸다.
실시예 14: CAR 대식세포의 향상된 식세포작용을 위한 SIRPα 넉아웃
면역 관문 SIRPα와 CD47의 상호작용은 대식세포 식세포작용을 저해한다. 따라서, CAR을 발현하는 대식세포는 종양으로부터 상반되는 호(pro)- 및 항-식세포 신호를 수신한다. 본 명세서에 제시된 결과는 SIRPα의 넉아웃이 CAR 대식세포 살해 및 식세포작용을 개선시켰음을 입증한다.
대식세포를 해동시키고 1일 후 리보핵단백질(RNP) 형성을 수행하고 대식세포와 혼합하였다. 정제된 Cas9 단백질을 실온에서 10 내지 20분 동안 3개의 gRNA 칵테일과 함께 인큐베이션하였다. 사용된 gRNA 서열은 인간 SIRPα에 대한 Synthego의 "유전자 넉아웃 키트" 유래의 것이었다(표 2). Cas9 대 총 gRNA의 1:3 비율(따라서 칵테일 중 Cas9 대 각각의 개별 gRNA의 1:1 비율)을 사용하였다. EP 완충액에서 대식세포와 혼합된 RNP는 최종 농도가 3e7 내지 8e7개 세포/㎖에 대해 2.5μM Cas9 RNP였다. 대식세포를 MaxCyte 전기천공 카세트에서 전기천공하였다. 배양물의 회수 후, 유전자 넉아웃이 단백질 발현 수준에서 효과를 나타낼 수 있도록 전기천공 후 적어도 3일 후에 세포를 분석하였다. 그 다음 SIRPα 발현을 분석하고 기능 검정을 수행하였다.
Figure pct00004
2개의 상이한 공여체(HCC 163264 및 HCC 151560) 유래의 신선한 대식세포를 실험 시작 1일 전에 획득하고, 대식세포를 제0일에 표시된 RNP 농도에서 Cas9로 전기천공하고, SIRPα의 발현을 제3일에 평가하였다. 유세포 분석법을 사용하여 대식세포 표면에서 SIRPα에 대한 면역염색을 수행하였다. 결과는 2명의 공여체에서 SIRPα가 용량-의존적 방식으로 대식세포에서 넉아웃될 수 있음을 나타내었다(도 154a 내지 b). 결과는 312nM RNP에서 유세포 분석 플롯에서 2개의 별개의 CAR 대식세포 집단을 나타내었으며(도 154c), 이는 SIRPα 유전자가 넉아웃되거나 그렇지 않도록 Cas9에 의한 유전자 넉아웃의 양단간의 특성을 뒷받침하여, SIRPα 발현의 구배가 아닌 이원 집단을 야기한다. 중요하게도, SIRPα 넉아웃은 세포 생존력에 영향을 미치지 않았다(도 154d).
SIRPα 넉아웃은 또한 SKOV-3 난소 암종 세포에서 CAR 대식세포 식세포작용을 향상시키는 것으로 나타났다. 대식세포를 해동시키고 Cas9 RNP로 전기천공하기 1일 전에 CTX_001(항-HER2 scFv, CD8 힌지, CD8 막횡단 도메인, 및 CD3-제타 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR; 도 8)을 인코딩하는 아데노바이러스로 형질도입하였다. 3일 후, SIRPα의 발현을 평가하고, SKOV-3을 이용한 식세포작용 검정을 시작하였다. 이들 결과는 SIRPα를 표적화하는 Cas9 및 gRNA를 가지는 CTX_001 대식세포에서 SIRPα 넉아웃을 나타낸다(도 155a). CTX_001은 형질도입된 대식세포에서 발현되었다(도 155b). CTX_001 대식세포는 12시간에 걸쳐 식세포작용을 나타내었으며, 이는 Incucyte® 분석을 통해 pHrodo-green 신호를 사용하여 측정되었다(도 155c). 12시간에 걸쳐 측정된 총 식세포작용을 곡선 아래 면적으로 정량화하였다(도 155d). 대식세포에서 CAR 발현과 함께 SIRPα 넉아웃은 가장 큰 식세포작용을 초래한 반면, SIRPα 넉아웃 단독으로는 UTD 대식세포에서 식세포작용을 크게 향상시키지 않았다.
SIRPα KO는 또한 HCC-1954 인간 유방암 세포에서 CAR 대식세포 식세포작용을 향상시키는 것으로 나타났다. 대식세포를 해동시키고 Cas9 RNP로 전기천공하기 1일 전에 CTX_001을 인코딩하는 아데노바이러스로 형질도입하였다. 3일 후, SIRPα의 발현을 평가하고, HCC-1954를 이용한 식세포작용 검정을 시작하였다. 이들 결과는 SIRPα를 표적화하는 Cas9 및 gRNA를 가지는 CTX_001 대식세포에서 SIRPα 넉아웃을 나타낸다(도 156a). CTX_001은 형질도입된 대식세포에서 발현되었다(도 156b). CTX_001 대식세포는 12시간에 걸쳐 식세포작용을 나타내었으며, 이는 Incucyte® 분석을 통해 pHrodo-green 신호를 사용하여 측정되었으며, 이 때 y-축 상에 크기가 다시 조정된 하부 플롯은 CTX_001 대식세포가 모든 UTD 그룹보다 더 많은 식세포작용을 나타냄을 보여준다(도 156c). 12시간에 걸쳐 측정된 총 식세포작용을 곡선 아래 면적으로 정량화하였다(도 156d). 이러한 결과는, 대조군 gRNA가 식세포작용을 증가시켰지만, 대식세포에서 CAR 발현과 함께 SIRPα 넉아웃이 여전히 식세포작용 신호의 가장 큰 생성자였음을 입증한다.
SIRPα 넉아웃은 또한 상기 실험에서와 상이한 공여체 세포 유래의 대식세포를 사용하여 SKOV-3 난소 암종 세포에서 CAR 대식세포 살해를 향상시키는 것으로 나타났다. Cas9 RNP로 전기천공하기 1일 전에 대식세포를 해동시키고 전기천공 3일 후에 CTX_001을 인코딩하는 아데노바이러스로 형질도입하였다. 2일 후, SIRPα의 발현을 평가하고, SKOV-3을 이용한 식세포작용 검정을 시작하였다. 이들 결과는 SIRPα를 표적화하는 Cas9 및 gRNA를 가지는 CTX_001 대식세포에서 SIRPα 넉아웃을 나타낸다(도 157a). CTX_001은 형질도입된 대식세포에서 발현되었다(도 157b). 24시간에 걸쳐 Incucyte® 분석을 통해 측정된 nuclight 녹색 형광 단백질을 발현하는 SKOV-3 세포의 성장으로 SKOV-3 살해를 측정하였다(도 157c). 인간 CAR 대식세포의 SIRPα 넉아웃은 표적 종양 세포의 50% 소거에 필요한 시간을 기반으로 하여 종양 살해의 동역학을 증가시켰다(도 157d). 전체 식세포작용을 12시간에 걸쳐 측정하였다(도 157e). 대식세포에서 CAR 발현과 함께 SIRPα 넉아웃은 가장 큰 식세포작용을 초래한 반면, SIRPα 넉아웃 단독으로는 UTD 대식세포에서 식세포작용을 크게 향상시키지 않았다. 식세포작용 결과는 제2 공여체를 사용하여 일관되었다. SIRPα 넉아웃 CAR 대식세포는 SIRPα 넉아웃이 없는 CAR 대식세포보다 더 빨리 살해하는 것으로 나타났다.
본 명세서에 제시된 이러한 결과는 1차 인간 CAR 대식세포에서 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 고효율 SIRPα 넉아웃과 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 SIRPα 넉아웃이 1차 인간 CAR 대식세포에서 일관되게 수행될 수 있음을 입증한다. 이러한 결과는 SIRPα 넉아웃이 없는 CAR 대식세포와 비교하여 SIRPα 넉아웃 CAR 대식세포에 의한 증가된 식세포작용 및 살해를 나타내는 기능적 데이터와 쌍을 형성한다. 2개의 개별 공여체 및 실험 실행에서, SIRPα 넉아웃은 CAR 대식세포에 의한 SKOV-3 세포의 식세포작용을 증가시켰다. 특히, CAR을 발현하지 않는 대식세포의 SIRPα 넉아웃은 식세포작용 또는 종양 살해를 증가시키지 않았으며; 따라서 효과는 시너지 효과로 간주될 수 있다.
등가물
본 개시내용에 대한 다양한 변경, 수정, 및 개선이 당업자에게 용이하게 일어날 것이라는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 이와 같은 변경, 수정 및 개선은 본 개시내용의 일부인 것으로 의도되고, 본 발명의 사상 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 예로서 제공되며, 본 개시내용에 기재된 임의의 발명은 하기 청구범위에 의해 상세히 추가로 기재된다.
당업자는 본 명세서에 기재된 검정 또는 기타 공정에서 얻은 값에 기인하는 편차 또는 오류의 전형적인 표준을 이해할 것이다. 본 발명의 배경을 설명하고 이의 실시에 관한 추가적인 상세내용을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 간행물, 웹사이트 및 기타 참조 자료는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> CARISMA THERAPEUTICS INC. <120> NOVEL CONSTRUCTS FOR CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> 2012851-0100 <140> PCT/US2021/035991 <141> 2021-06-04 <150> 63/082,584 <151> 2020-09-04 <150> 63/044,934 <151> 2020-06-26 <150> 63/034,873 <151> 2020-06-04 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gagcccgccg gcccggcccc 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gugcuuaccu gaccaggcgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 cgggctcagg cctctcagac 20 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (80)

  1. 면역 세포로서,
    (a) 세포외 도메인,
    (b) 막횡단 도메인, 및
    (c) 세포내 도메인
    을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하되,
    상기 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하는, 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CAR의 세포외 도메인은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 FcR 세포외 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 막횡단 도메인은 FcR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 세포내 도메인은 FcR 세포내 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 FcR 세포외 도메인, 상기 FcR 막횡단 도메인 및 상기 FcR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 FcR 도메인이거나 이를 포함하는, 면역 세포.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 세포외 도메인, 상기 FcR 막횡단 도메인 및 상기 FcR 세포내 도메인은 함께 전장 FcR을 구성하는, 면역 세포.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 세포외 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 막횡단 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 세포내 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 CAR의 세포외 도메인은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 톨-유사 수용체(TLR) 세포외 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 막횡단 도메인은 TLR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 세포내 도메인은 TLR 세포내 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 TLR 세포외 도메인, 상기 TLR 막횡단 도메인 및 상기 TLR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 TLR 도메인이거나 이를 포함하는, 면역 세포.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 세포외 도메인, 상기 TLR 막횡단 도메인 및 상기 TLR 세포내 도메인은 함께 전장 TLR을 구성하는, 면역 세포.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 세포외 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 막횡단 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 세포내 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  16. 제1항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는,
    (d) 하나 이상의 세포외 리더 도메인,
    (e) 하나 이상의 세포외 힌지 도메인, 및
    (f) 하나 이상의 세포내 공동 자극 도메인
    중 하나 이상을 더 포함하는, 면역 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 리더 도메인은 CD8 세포외 리더 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 항원 결합 도메인은 scFv, 센티린(centyrin) 또는 다르핀(darpin)을 포함하는, 면역 세포.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 힌지 도메인은 CD28 세포외 힌지 도메인, CD8a 세포외 힌지 도메인 또는 IgG4 세포외 힌지 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 CD28, CD8a, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TRL1, TLR2, TLR3, TRL4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 막횡단 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타, FcR γ, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88, V/I/LxYxxL/V, SIRPa, CD45, Siglec-10, PD1, SHP-1, SHP-2, KIR-2DL, KIR-3DL, NKG2A, CD170, CD33, BTLA, CD32b, SIRPb, CD22, PIR-B, LILRB1, 41BBL(TNFSF9), CD27, OX40L, CD32b, CD11b, ITGAM, SLAMF7, CD206, CD163, CD209, Dectin-2, IL1R, IL2R, IL3R, IL4R, IL5R, IL6R, IL7R, IL8R, IL9R, IL10R, IL11R, IL12R, IL13R, IL14R, IL15R, IL17R, IFNaR, IFNgR, TNFR, CSF1R, CSF2R, Dap10, CD36, Dectin-1, ICOSL 및/또는 Syk 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 세포내 공동 자극 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  26. 핵산 작제물로서,
    (a) 세포외 도메인,
    (b) 막횡단 도메인, 및
    (c) 세포내 도메인
    을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하되, 상기 핵산 작제물은 (a) 내지 (c)를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는, 핵산 작제물.
  27. 제26항에 있어서,
    (e) 하나 이상의 세포외 리더 도메인,
    (f) 하나 이상의 세포외 힌지 도메인,
    (g) 하나 이상의 세포내 공동 자극 도메인,
    (h) 절단 펩타이드, 및
    (i) 하나 이상의 펩타이드 작용제
    를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 더 포함하는, 핵산 작제물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 절단 펩타이드는 P2A, F2A, E2A 또는 T2A 펩타이드인, 핵산 작제물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 핵산 작제물을 포함하는, 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  31. 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서,
    제24항, 제25항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항의 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 면역 세포를 변형시키는 방법으로서,
    (a) 세포외 도메인,
    (b) 막횡단 도메인, 및
    (c) 세포내 도메인
    을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 면역 세포에 전달하는 단계를 포함하되,
    변형된 면역 세포는 (a) 내지 (c)를 포함하는 키메라 조작된 수용체를 포함하고, 그리고
    상기 변형된 면역 세포는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  33. 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 변형시키는 방법으로서,
    (a) 세포외 도메인,
    (b) 막횡단 도메인, 및
    (c) 세포내 도메인
    을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 전달하는 단계
    를 포함하되,
    상기 바이러스 벡터는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되고,
    변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 (a) 내지 (c)를 포함하는 키메라 조작된 수용체(CAR)를 포함하며, 그리고
    상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 전달한 CAR을 포함하는 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 증가된 CAR 발현을 나타내는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이거나 이를 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 약 1 내지 약 50의 감염다중도(MOI)로 전달되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10의 MOI로 전달되는, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 전달한 CAR을 포함하는 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 초과의 증가된 CAR 발현을 나타내는, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 연장된 기간 동안 CAR 발현을 나타내는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, CAR 발현의 상기 연장된 기간은 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 또는 그 초과 동안인, 방법.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 증가된 이펙터 활성을 나타내는, 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 증가된 종양 살해 능력 또는 식세포작용을 나타내는, 방법.
  42. 제33항 내지 41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 전달한 CAR을 포함하는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 M1 표현형에 대해 증가된 분극화를 나타내지 않는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 적어도 하나의 Vpx 단백질로 패키징되지 않은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 전달한 CAR을 포함하는 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 M1 표현형의 하나 이상의 마커의 증가된 발현을 나타내지 않는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 M1 표현형의 하나 이상의 마커는 CD86, CD80, MHC II, IL-1R, TLR2, TLR4, iNOS, SOCS3, CD83, PD-L1, CD69, MHC I, CD64, CD32, CD16, IL1R, IFIT 패밀리 구성원, 또는 ISG 패밀리 구성원 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개를 포함하거나, 이들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개인, 방법.
  45. 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 하나 이상의 염증성 사이토카인의 증가된 생성을 나타내는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-12, IL-18, IL-8, IL-2, IL-23, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-2, IL-8, IL33, CCL3, CXCL12, CCL22, CCL4, CXCL10 또는 CCL2 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개를 포함하거나, 이들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개인, 방법.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 변형되지 않은 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포에 비해 감소된 SIRPα 활성을 나타내는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용한 SIRPα의 결실을 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터-기반 뉴클레아제(TALEN), 또는 메가뉴클레아제 중 하나 이상이거나 이를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 Cas9, Cas12a 또는 C2c2를 포함하는, 방법.
  51. 제47항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 항-SIRPα 항체로 처리된, 방법.
  52. 제47항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 하나 이상의 항-SIRPα 항체를 포함하는, 방법.
  53. 제47항에 있어서, 상기 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포는 SIRPα를 하향 조절하는 하나 이상의 siRNA를 포함하는, 방법.
  54. 제33항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR의 세포외 도메인은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 FcR 세포외 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 막횡단 도메인은 FcR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 세포내 도메인은 FcR 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, FcR 세포외 도메인, FcR 막횡단 도메인 및 FcR 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 FcR 세포외 도메인, 상기 FcR 막횡단 도메인 및 상기 FcR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 FcR 도메인이거나 이를 포함하는, 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 세포외 도메인, 상기 FcR 막횡단 도메인 및 상기 FcR 세포내 도메인은 함께 전장 FcR을 구성하는, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 세포외 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함하는, 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 막횡단 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함하는, 방법.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcR 세포내 도메인은 CD64(FcγRI), CD32a(FcγRIIa), CD32b(FcγRIIb), CD32c, CD16a(FcγRIIIa), CD16b(FcγRIIIb), FcεRI, FcεRII 또는 FcαRI(CD89) 도메인을 포함하는, 방법.
  61. 제33항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR의 세포외 도메인은 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 톨-유사 수용체(TLR) 세포외 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 막횡단 도메인은 TLR 막횡단 도메인을 포함하고/하거나, 상기 CAR의 세포내 도메인은 TLR 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 CAR은 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 세포외 결합 도메인, TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 TLR 세포외 도메인, 상기 TLR 막횡단 도메인 및 상기 TLR 세포내 도메인 중 하나 이상은 인간 TLR 도메인이거나 이를 포함하는, 방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 세포외 도메인, TLR 막횡단 도메인 및 TLR 세포내 도메인은 함께 전장 TLR을 구성하는, 방법.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 세포외 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함하는, 방법.
  66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 막횡단 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함하는, 방법.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 세포내 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 도메인을 포함하는, 방법.
  68. 제33항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR은,
    (d) 하나 이상의 세포외 리더 도메인,
    (e) 하나 이상의 세포외 힌지 도메인, 및
    (f) 하나 이상의 세포내 공동 자극 도메인
    중 하나 이상을 더 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 리더 도메인은 CD8 세포외 리더 도메인을 포함하는, 방법.
  70. 제33항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 항원 결합 도메인은 scFv, 센티린 또는 다르핀을 포함하는, 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포외 힌지 도메인은 CD28 세포외 힌지 도메인, CD8a 세포외 힌지 도메인 또는 IgG4 세포외 힌지 도메인을 포함하는, 방법.
  72. 제33항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 CD28, CD8a, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TRL1, TLR2, TLR3, TRL4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 또는 TLR9 막횡단 도메인을 포함하는, 방법.
  73. 제33항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 도메인은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타, FcR γ, CD64, CD32a, CD32c, CD16a, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, ALK, AXL, DDR2, EGFR, EphA1, INSR, cMET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR1, ROS1, RYK, TIE2, TRK, VEGFR, CD40, CD19, CD20, 41BB, CD28, OX40, GITR, TREM-1, TREM-2, DAP12, MR, ICOS, MyD88, V/I/LxYxxL/V, SIRPa, CD45, Siglec-10, PD1, SHP-1, SHP-2, KIR-2DL, KIR-3DL, NKG2A, CD170, CD33, BTLA, CD32b, SIRPb, CD22, PIR-B, LILRB1, 41BBL(TNFSF9), CD27, OX40L, CD32b, CD11b, ITGAM, SLAMF7, CD206, CD163, CD209, Dectin-2, IL1R, IL2R, IL3R, IL4R, IL5R, IL6R, IL7R, IL8R, IL9R, IL10R, IL11R, IL12R, IL13R, IL14R, IL15R, IL17R, IFNaR, IFNgR, TNFR, CSF1R, CSF2R, Dap10, CD36, Dectin-1, ICOSL 및/또는 Syk 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 세포내 공동 자극 도메인을 포함하는, 방법.
  76. 제33항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는,
    (e) 하나 이상의 세포외 리더 도메인,
    (f) 하나 이상의 세포외 힌지 도메인,
    (g) 하나 이상의 세포내 공동 자극 도메인,
    (h) 절단 펩타이드, 및
    (i) 하나 이상의 펩타이드 작용제
    를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 더 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 절단 펩타이드는 P2A, F2A, E2A 또는 T2A 펩타이드인, 방법.
  78. 제33항 내지 제77항 중 어느 한 항의 방법에 의해 변형된 대식세포, 단핵구 또는 수지상 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  80. 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    제78항 또는 제79항의 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020237000130A 2020-06-04 2021-06-04 키메라 항원 수용체에 대한 신규한 작제물 KR20230042691A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063034873P 2020-06-04 2020-06-04
US63/034,873 2020-06-04
US202063044934P 2020-06-26 2020-06-26
US63/044,934 2020-06-26
US202063082584P 2020-09-24 2020-09-24
US63/082,584 2020-09-24
PCT/US2021/035991 WO2021248061A1 (en) 2020-06-04 2021-06-04 Novel constructs for chimeric antigen receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230042691A true KR20230042691A (ko) 2023-03-29

Family

ID=78830599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237000130A KR20230042691A (ko) 2020-06-04 2021-06-04 키메라 항원 수용체에 대한 신규한 작제물

Country Status (11)

Country Link
US (3) US11312939B2 (ko)
EP (1) EP4161536A1 (ko)
JP (1) JP2023529841A (ko)
KR (1) KR20230042691A (ko)
CN (1) CN115867294A (ko)
AU (1) AU2021285992A1 (ko)
BR (1) BR112022024228A2 (ko)
CA (1) CA3184807A1 (ko)
IL (1) IL298693A (ko)
MX (1) MX2022015062A (ko)
WO (1) WO2021248061A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
KR20180028533A (ko) * 2015-07-28 2018-03-16 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 키메릭 항원 수용체를 발현하는 변형된 단핵세포/대식세포 및 그의 용도
AU2021285992A1 (en) 2020-06-04 2023-01-05 Carisma Therapeutics Inc. Novel constructs for chimeric antigen receptors
JP2023549140A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド 操作されたキメラ融合タンパク質組成物およびその使用方法
CN114854692B (zh) * 2022-04-02 2023-11-10 北京默赛尔生物科技有限责任公司 Car-巨噬细胞及其制备方法
WO2023245074A2 (en) * 2022-06-14 2023-12-21 Purdue Research Foundation Car-expressing pluripotent stem cell-derived neutrophils loaded with drug nanoparticles and uses thereof

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE338124T1 (de) 2000-11-07 2006-09-15 Hope City Cd19-spezifische umgezielte immunzellen
WO2003070905A2 (en) 2002-02-15 2003-08-28 Zycos, Inc. Electroporation methods for introducing bioactive agents into cells
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
JP4843613B2 (ja) 2004-10-13 2011-12-21 クルセル ホランド ベー ヴェー 改良されたアデノウイルスベクターおよびその使用方法
CA2583843C (en) 2004-10-13 2010-09-21 Crucell Holland B.V. Improved adenoviral vectors and uses thereof
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
MX2009008918A (es) 2007-02-23 2009-09-14 Baylor Res Inst Activacion de celulas que presentan antigeno humano a traves de clec-6.
EP2279253B1 (en) 2008-04-09 2016-11-16 Maxcyte, Inc. Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells
WO2010037135A2 (en) 2008-09-29 2010-04-01 The Regents Of The University Of California Compounds for reversing and inhibiting protein aggregation, and methods for making and using them
SG183497A1 (en) 2010-02-25 2012-09-27 Abt Holding Co Modulation of macrophage activation
JP5975983B2 (ja) 2010-04-16 2016-08-23 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 固形腫瘍を処置するための方法
NZ612512A (en) 2010-12-09 2015-03-27 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CN104126009B (zh) 2011-10-07 2019-05-10 国立大学法人三重大学 嵌合抗原受体
US9149519B2 (en) 2012-01-17 2015-10-06 New York University Chimeric human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) with enhanced dendritic cell and macrophage tropism comprising the simian immunodeficiency virus (SIV) minimal Vpx packaging domain
US9221908B2 (en) 2012-12-12 2015-12-29 Vasculox, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
EP2970985A1 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to modify cells for therapeutic objectives
US9745368B2 (en) * 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
EP3097117B1 (en) 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
EP3186284B1 (en) 2014-08-28 2022-04-06 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
US9777064B2 (en) 2015-03-17 2017-10-03 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices, DE CAR polypeptides, side CARs and uses thereof
JP6985934B2 (ja) 2015-04-29 2021-12-22 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 操作された造血幹細胞／前駆細胞及び非ｔエフェクター細胞、ならびにその使用
CN104829733B (zh) 2015-05-25 2018-06-05 广州百暨基因科技有限公司 抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用
GB201509413D0 (en) 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
US20170216354A1 (en) 2015-06-12 2017-08-03 Batu Biologics, Inc. Clinically useful non-antigen pulsed dendritic cells
CA2986604A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
JP7057748B2 (ja) 2015-07-16 2022-04-20 イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド 遺伝子改変された抗第三者中枢性メモリーｔ細胞および免疫療法におけるその使用
KR20180028533A (ko) 2015-07-28 2018-03-16 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 키메릭 항원 수용체를 발현하는 변형된 단핵세포/대식세포 및 그의 용도
US11352439B2 (en) 2015-08-13 2022-06-07 Kim Leslie O'Neill Macrophage CAR (MOTO-CAR) in immunotherapy
JP6959909B2 (ja) 2015-09-09 2021-11-05 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） 免疫療法のためのマクロファージの遺伝子組換え
EP3334764A2 (en) 2015-10-13 2018-06-20 Brigham Young University Macrophage chimeric antigen receptor (moto-car) in imunotherapy
TWI587190B (zh) 2015-11-04 2017-06-11 友達光電股份有限公司 觸控顯示裝置及其移位暫存器
ES2862907T3 (es) 2015-11-27 2021-10-08 Cartherics Pty Ltd Células genéticamente modificadas y usos de las mismas
EP3901258A1 (en) 2016-01-11 2021-10-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of immunotherapy
US10875919B2 (en) 2016-04-26 2020-12-29 Alector Llc Chimeric receptors and methods of use thereof
CN109844536B (zh) * 2016-09-26 2023-04-14 豪夫迈·罗氏有限公司 预测对pd-1轴抑制剂的响应
US11286306B2 (en) * 2016-12-09 2022-03-29 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. TLR9-binding chimeric antigen receptors
US10415017B2 (en) * 2017-05-17 2019-09-17 Thunder Biotech, Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
SG11202007171PA (en) 2018-02-02 2020-08-28 Univ Pennsylvania Modified monocytes/macrophages/dendritic cells expressing chimeric antigen receptors and uses in diseases and disorders associated with protein aggregates
EP3844184A4 (en) * 2018-08-31 2022-09-28 The Trustees of the University of Pennsylvania ACTIVATION OF ANTIGEN PRESENT CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
US20210340219A1 (en) * 2018-09-07 2021-11-04 Sotio, LLC Chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules modulating intracellular lactate concentrations and therapeutic uses thereof
AU2021285992A1 (en) 2020-06-04 2023-01-05 Carisma Therapeutics Inc. Novel constructs for chimeric antigen receptors

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022024228A2 (pt) 2023-02-07
US11739297B2 (en) 2023-08-29
US20220000918A1 (en) 2022-01-06
US20220002675A1 (en) 2022-01-06
CA3184807A1 (en) 2021-12-09
EP4161536A1 (en) 2023-04-12
MX2022015062A (es) 2023-04-10
CN115867294A (zh) 2023-03-28
IL298693A (en) 2023-02-01
WO2021248061A1 (en) 2021-12-09
JP2023529841A (ja) 2023-07-12
US11312939B2 (en) 2022-04-26
AU2021285992A1 (en) 2023-01-05
US20220000917A1 (en) 2022-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019214163B2 (en) Chimeric antigen receptor (CAR) binding to BCMA, and uses thereof
US11312939B2 (en) Constructs for chimeric antigen receptors
EP2884999B1 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
JP2023534928A (ja) 改変免疫細胞及びその使用
WO2019084288A1 (en) METHODS FOR DESIGNING CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTOR EXPRESSION CELLS
US20230235286A1 (en) Mrna transfection of immune cells
WO2021030153A2 (en) Engineered t cell receptors and uses thereof
US20230242638A1 (en) Chimeric antigen receptor targeting cldn18.2 and use thereof
CN115427439A (zh) 用于双靶标嵌合抗原受体t细胞疗法的蛋白酶开关
WO2023107593A2 (en) In vivo delivery to immune cells
JP2023509765A (ja) 工学的修飾ｔ細胞、その調製および応用
JP2024505564A (ja) 自己分極化免疫細胞
WO2024006281A2 (en) Switch receptors and modified immune cells
WO2024030583A2 (en) Novel constructs for chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2024076927A2 (en) Novel anti-mesothelin chimeric antigen receptors and modified immune cells
US20240131068A1 (en) Car-t constructs comprising a novel cd19 binder combined with il18 and methods of using the same
WO2021115333A1 (zh) 一种融合蛋白及表达此蛋白的工程化免疫细胞及其应用
WO2024086191A2 (en) Car-t constructs comprising a novel cd19 binder combined with il18 and methods of using the same
JP2023509590A (ja) 工学的修飾ｔ細胞、その調製および応用
CA3174248A1 (en) Codon-optimized nucleotide sequences encoding an ap-1 transcription factor