ES2862907T3

ES2862907T3 - Células genéticamente modificadas y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2862907T3
Application number: ES16867445T
Authority: ES
Inventors: Richard Boyd; Alan Trounson; Hiroshi Kawamoto; Peter John Hudson; Runzhe Shu
Original assignee: Cartherics Pty Ltd
Current assignee: Cartherics Pty Ltd
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2036-11-23
Also published as: IL259586B2; CA3004120A1; IL296410A; SG10201912825XA; CN109152824A; EP3380117A4; EP3380117A1; EP3708588A1; AU2016361451A1; MY189819A; JP6976960B2; US11400145B2; CN116121281A; IL259586A; JP2018535701A; JP2022027762A; JP2024028648A; SG11201803493UA; AU2024200108A1; US20180353588A1

Abstract

Un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un resto de reconocimiento de antígeno, una región bisagra, un dominio transmembrana y un resto de activación de células T, en donde: (1) la fracción de reconocimiento de antígeno está operativamente unida a la fracción de activación de células T y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (2) la región bisagra se selecciona de una bisagra de CD8 y una bisagra de CD28; (3) el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y (4) el resto de activación de células T comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.

Description

DESCRIPCIÓN

Células genéticamente modificadas y usos de las mismas

Campo técnico

La presente divulgación se refiere generalmente a una población de células madre (por ejemplo, iPSC o HSC) que comprenden ácidos nucleicos que codifican un receptor de células T y un receptor de antígeno quimérico dirigido a múltiples determinantes antigénicos distintos, por ejemplo, dos determinantes antigénicos tumorales distintos. La presente divulgación también se dirige a una población de células T que coexpresan un receptor de células T y un receptor de antígeno quimérico dirigido a múltiples determinantes antigénicos distintos, tales como dos determinantes antigénicos tumorales distintos. Las células de la presente divulgación pueden derivar de donantes elegidos cuyo tipo de HLA es compatible con sectores importantes de las poblaciones, y son útiles en una amplia diversidad de aplicaciones, en particular en el contexto del tratamiento terapéutico de enfermedades neoplásicas. Antecedentes

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que hace referencia el autor en esta memoria descriptiva se recopilan alfabéticamente al final de la descripción.

La referencia en esta memoria descriptiva a cualquier publicación anterior (o información derivada de ella), o cualquier materia que se conozca, no es, y no debe tomarse, como un reconocimiento o admisión o cualquier forma de sugerencia de que esa publicación anterior (o información derivada de ella) o materia conocida forma parte del conocimiento general común en el campo de trabajo al que se refiere esta memoria descriptiva.

Los tumores malignos o cánceres, crecen de forma descontrolada, invaden tejidos normales y, a menudo, hacen metástasis y crecen en sitios distantes del tejido de origen. En general, los cánceres derivan de una o sólo unas pocas células normales que se han sometido a un proceso poco conocido llamado transformación maligna. Los cánceres pueden surgir de casi cualquier tejido del cuerpo. Aquellos derivados de células epiteliales, llamados carcinomas, son los tipos de cánceres más comunes. Los sarcomas son tumores malignos de tejidos mesenquimales, que surgen de células tales como fibroblastos, células musculares y células grasas. Los tumores malignos sólidos de los tejidos linfoides se denominan linfomas y los tumores malignos de linfocitos de médula ósea y de sangre y otras células hematopoyéticas se denominan leucemias.

El cáncer es una de las tres principales causas de muerte en las naciones industrializadas. A medida que continúan mejorando los tratamientos para las enfermedades infecciosas y la prevención de las enfermedades cardiovasculares y aumenta la esperanza de vida promedio, es probable que el cáncer se convierta en la enfermedad mortal más común en estos países. Por lo tanto, el tratamiento exitoso del cáncer requiere que se retiren o destruyan todas las células malignas sin matar al paciente. Una forma ideal de lograr esto sería inducir una respuesta inmunitaria contra el tumor que discriminaría entre las células del tumor y sus contrapartes celulares normales. Sin embargo, se han intentado enfoques inmunológicos para el tratamiento del cáncer durante más de un siglo con resultados insostenibles.

Los tumores sólidos provocan el mayor número de muertes por cáncer. Los tumores sólidos no suelen ser curables una vez que se han diseminado o "metastatizado" por todo el cuerpo. El pronóstico de los tumores sólidos metastásicos ha mejorado solo marginalmente en los últimos 50 años. La mejor posibilidad de curación de un tumor sólido se basa en la detección temprana seguida del uso de tratamientos locales como cirugía y/o radioterapia cuando el tumor sólido está localizado y no se ha diseminado ni a los ganglios linfáticos que drenan el tumor ni a ningún otro lugar. No obstante, incluso en esta etapa temprana, y particularmente si el tumor se ha diseminado a los ganglios linfáticos de drenaje, es posible que los depósitos microscópicos de cáncer conocidos como micrometástasis ya se hayan diseminado por todo el cuerpo y, posteriormente, provocarán la muerte del paciente. En este sentido, el cáncer es una enfermedad sistémica que requiere tratamientos administrados sistémicamente. Hay una larga historia de intentos de "Bala dorada" con anticuerpos cargados de toxinas para atacar cánceres, aprovechando su capacidad para dirigirse potencialmente a cualquier entidad molecular específica tales como carbohidrato, lípido o proteína, o combinaciones de los mismos. Los anticuerpos, una vez unido a una célula cancerosa, can hacer participar al Complemento o linfocitos NK/K FcR+ e inducir la lisis celular. Desafortunadamente, el tratamiento del cáncer con anticuerpos ha tenido generalmente un éxito moderado, principalmente debido a la unión de baja afinidad, poca eficiencia lítica y su breve longevidad. En su conjunto, estas comprometen la capacidad de los anticuerpos para destruir rápidamente las células cancerosas, aumentando el riesgo de mutación y evasión inmunitaria. Más recientemente, ha habido informes de terapias relacionadas con anticuerpos, incluyendo aquellas basadas en anticuerpos dirigidos con alta afinidad a las moléculas del cáncer y a las moléculas de bloqueo de los puntos de control inmunitarios. Aunque hay algunos éxitos clínicos, particularmente con este último, tales terapias todavía están asociadas con diversas limitaciones.

Por consiguiente, los métodos comunes de tratamiento del cáncer continúan siguiendo el protocolo de escisión quirúrgica (si es posible) usado durante mucho tiempo, seguido de radioterapia y/o quimioterapia, si fuera necesario. La tasa de éxito de esta forma de tratamiento bastante bruta es extremadamente variable, pero generalmente disminuye significativamente a medida que el tumor avanza y hace metástasis. Además, estos tratamientos están asociados con efectos secundarios graves que incluyen desfiguración y cicatrización por cirugía (por ejemplo, mastectomía o amputación de una extremidad), náuseas y vómitos graves por la quimioterapia, y lo más significativo, daño a tejidos normales tales como los folículos pilosos, intestino y médula ósea que se induce como resultado del mecanismo de dirección relativamente inespecífico de los fármacos tóxicos que forman parte de la mayoría de los tratamientos contra el cáncer.

Por consiguiente, existe una necesidad urgente y continua de desarrollar terapias sistémicas mejoradas para los cánceres, en particular cánceres metastásicos.

La generación tímica de las células T convencionales es fundamentalmente necesaria para la defensa contra la infección. Este conjunto de células T de "vigilancia inmunitaria" patrulla el cuerpo para retirar las células dañadas o anormales incluyendo los cánceres. Dado que la producción de células T basadas en el timo se caracteriza por la generación aleatoria del repertorio del receptor de células T (TCR), la timopoyesis también debe incluir procesos de selección muy estrictos que eliminen o silencien funcionalmente aquellas células T del timo en desarrollo con el potencial de atacarse a sí mismas. Esta "auto tolerancia", por lo tanto, restringe la enfermedad autoinmunitaria (Fletcher et al (2011)). Sin embargo, por necesidad, este mismo proceso compromete la vigilancia inmunológica contra los cánceres, dado que los cánceres no inducidos por virus son, por definición, enfermedades del "yo". Esto significa que muchas células T que surgen en el timo, que potencialmente podrían haber sido reactivos con antígenos asociados a tumores, pueden eliminarse antes de entrar en la sangre. Como mínimo, serán numéricamente deficientes y quizás tengan un TCR de baja afinidad. No obstante a esto, las células T claramente son potencialmente un arma importante contra el cáncer; por lo tanto, los desafíos son aumentar su capacidad para detectar el cáncer, expandirlos numéricamente y retener, o mejor, potenciar su poderosa capacidad citolítica. Aunque los anticuerpos y las células T son las armas más lógicas contra el cáncer, su potencial destrucción rápida y eficaz del cáncer no se ha realizado clínicamente. Los avances en la inmunoterapia han evolucionado a través de la ingeniería genética de células T para expresar un novedoso receptor de membrana quimérico que consiste en un fragmento de anticuerpo que se une al antígeno del cáncer, acoplado citoplásmicamente a moléculas de transducción de señales de células T. Estos últimos son comúnmente uno o todos de la cadena TCR Z, CD 28 o Ligando CD40 (Corrigan-Curay et al (2014); Fedorov et al (2014); Perna et al (2014); Curran et al (2015); Curran et al (2012); Dotti et al (2014); Han et al (2013)). Dicho receptor de antígeno quimérico (CAR) que expresa células T (CAR-T) no solo aprovecha las dos armas anticancerígenas más poderosas del sistema inmunitario, sino también supera sus insuficiencias individuales. CAR-T retiene la capacidad potente, focal, lítica celular y evita la dependencia normal del TCR intrínseco para detectar "péptido o péptidos de cáncer" muy raros expresados en las hendiduras de HLA. El repertorio de células T específicas para tales péptidos nominales es muy raro. La porción de anticuerpos del CAR dota a las células T de una especificidad de búsqueda de cáncer y supera la notoriamente pobre efectividad destructiva del cáncer de los anticuerpos circulantes. Por lo tanto, la unión al cáncer está mediada por el dominio de anticuerpos del CAR, que conduce a la transducción de señales citoplasmáticas, desencadenando las rutas líticas de las células T para destruir el cáncer.

Aunque todavía está en su infancia clínica, se están realizando numerosos ensayos CAR-T. Sin embargo, tan prometedor como se piensa, hay varios aspectos de la tecnología CAR-T que son problemáticos y están impidiendo que su eficacia clínica se realice por completo. La más obvia es la tormenta de citocinas que se produce durante la destrucción del cáncer mediada por células T y depende de la carga tumoral. La fiebre es indicativa de la destrucción del cáncer, pero puede dar lugar a efectos secundarios clínicos graves a menos que se gestione cuidadosamente (Davila et al (2014); Casucci et al (2015)). La gestión actual es mediante tratamientos de modulación de citocinas tales como anti-IL6. Además, existe un problema significativo con la deficiencia numérica de las células CAR-T generadas para no solo atacar el cáncer inicial, sino también conservarse en cantidad suficiente en caso de relapso. En la actualidad, los intentos de abordar este problema se basan en el uso excesivo de citocinas inductoras de la proliferación in vitro. Todavía adicionalmente, tan eficaces como las células CAR-T para atacar el cáncer, incluso para los cánceres CD19+, la destrucción del tumor no es 100 % eficaz. Aunque se ha informado hasta un 90 % de capacidad de respuesta para B-ALL, en otros cánceres CD19+ los resultados son mucho menos eficaces. Por consiguiente, a pesar de las alentadoras observaciones en relación con la utilidad de CAR-T, todavía hay problemas importantes que superar antes de que esta tecnología pueda ocupar su lugar como fiable, eficaz y el nuevo estándar dorado en relación con el tratamiento del cáncer.

El documento WO98/18809 describe células CAR-T que expresan un CAR caracterizado por un dominio extracelular capaz de unirse a TAG-72, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático capaz de activar una ruta de señalización. McGuinness et al. (1999; Human Gene Therapy 10: 165-173) describen células CAR-T que expresan un CAR que comprende un dominio extracelular capaz de unirse a TAG-72 y derivado de un anticuerpo monocatenario humanizado CC49, unido a un dominio de señalización CD3Z de un receptor de células T.

En el trabajo que condujo a la presente invención se ha determinado, entre otros, que los problemas aparentemente dispares que existen actualmente en relación con la aplicación terapéutica eficaz de la tecnología CAR-T se pueden resolver cuando las células CAR-T pueden derivar de células madre transfectadas, tales como células madre adultas, en lugar de timocitos transfectados u otros tipos de células somáticas transfectadas. Por ejemplo, mediante la transfección de células madre (como las células madre pluripotentes inducidas ("iPSC") derivadas de células somáticas adultas) con un receptor de antígeno quimérico, el problema de proporcionar suficientes suministros presentes y futuros de células CAR-T dirigidas a un tumor particular se resuelve debido a la fuente continua de células T somáticas derivadas de estas células madre transfectadas que se renuevan automáticamente. Todavía adicionalmente, estas iPSC y, por tanto, las células CAR-T derivadas de ellas, puede seleccionarse previamente de donantes que expresen un haplotipo de HLA homocigótico, en particular homocigótico para un tipo de HLA que se expresa ampliamente en la población, proporcionando de esta manera un medio para generar un banco de células que exhibe una amplia idoneidad para el donante. Todavía adicionalmente, se ha determinado que la generación de una iPSC a partir de una célula T que exhibe una especificidad del receptor de la célula T dirigida a un antígeno de interés significa que los reordenamientos génicos para ese TCR específico para el antígeno del cáncer se incluirán en la iPSC. Todas las células T inducidas a partir de esa iPSC conservarán la especificidad de TCR anti-cáncer. Esto puede ir seguido de la transfección de dicha iPSC con un CAR, permitiendo la posterior diferenciación de la iPSC a una célula T, tales como una célula T CD4+ o CD8+, que muestra de forma estable una especificidad dual por el antígeno al que se dirige el CAR y un TCR dirigido al antígeno al que se dirige la célula T original. Se cree que esto se debe a las acciones de la memoria epigenética. Todavía adicionalmente, también se ha determinado que pueden generarse de forma similar células NKT dobles específicas. Por consiguiente, puede proporcionarse una fuente continua de células T y NKT que se dirigen de manera selectiva y estable a múltiples determinantes antigénicos distintos, tales como múltiples determinantes antigénicos tumorales distintos, permitiendo de ese modo que se efectúe una etapa de tratamiento más terapéuticamente eficaz.

Definiciones

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de" se tomará para indicar que un número entero o grupo de números enteros se ha originado a partir de la especie especificada, pero no necesariamente se ha obtenido directamente de la fuente especificada. Además, como se usan en el presente documento las formas singulares de "un", "y" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

La memoria descriptiva en cuestión contiene información sobre secuencias de aminoácidos preparadas usando el programa PatentIn Versión 3.5, presentadas en el presente documento después de la bibliografía. Cada secuencia de aminoácidos se identifica en el listado de secuencias por el indicador numérico <210> seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, <210> 1, <210> 2, etc.). La longitud, el tipo de secuencia (proteína, etc.) y el organismo de origen de cada secuencia de aminoácidos se indican mediante la información proporcionada en los campos del indicador numérico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se identifican mediante el indicador SEQ ID NO: seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, etc.). El identificador de secuencia al que se hace referencia en la memoria descriptiva se correlaciona con la información proporcionada en el campo indicador numérico <400> en el listado de secuencias, que va seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, <400> 1, <400> 2, etc.). Esto es, SEQ ID NO: 1 como se detalla en la memoria descriptiva se correlaciona con la secuencia indicada como <400> 1 en el listado de secuencias.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un resto de reconocimiento de antígeno, una región bisagra, un dominio transmembrana y un resto de activación de células T, en donde:

(1) la fracción de reconocimiento de antígeno está operativamente unida a la fracción de activación de células T y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

(2) la región bisagra se selecciona de una bisagra de CD8 y una bisagra de CD28;

(3) el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y

(4) el resto de activación de células T comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una célula T que comprende un ácido nucleico de la invención como se define en el presente documento.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula T de la invención como se define en el presente

documento, para su uso como un medicamento.

También se proporciona de acuerdo con la invención una célula T de la invención como se define en el presente

documento, para su uso en el tratamiento de una afección caracterizada por la presencia de una población no

deseada de células en un mamífero, por ejemplo, una afección seleccionada de una afección neoplásica, una

infección por microorganismos (tales como VIH, ETS o bacterias resistentes a los antibióticos) o una afección

autoinmunitaria.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para fabricar una célula madre de mamífero modificada

genéticamente, que comprende:

obtener una célula madre de mamífero que es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR

dirigido a un primer determinante antigénico; e

introducir en la célula madre un ácido nucleico de la invención como se define en el presente documento.

En un aspecto final de la invención, se proporciona un método para producir una célula T, que comprende:

proporcionar una célula madre modificada genéticamente que puede obtenerse de acuerdo con el método de la

invención como se define en el presente documento y diferenciar la célula madre modificada genéticamente en

una célula T.

Otras características y realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas y se describen a

continuación. El sumario de las enseñanzas y la divulgación técnica detallada que se expone a continuación puede,

en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención en sí misma y también puede proporcionar

antecedentes técnicos adicionales para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes

técnicos adicionales proporcionados no están destinados a definir la invención como tal, sino más bien colocarlo en

un contexto técnico más amplio.

SUMARIO DE ENSEÑANZAS TÉCNICAS

En el presente documento se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T

diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un

primer determinante antigénico y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno

quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segu determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto activación de células T. Esta célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un

haplotipo de HLA homocigótico.

También se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la

misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T CD4+ que expresa un TCR dirigido a un primer

determinante antigénico y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno

haplotipo de HLA homocigótico.

Se desvela además una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la

misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T CD8+ que expresa un TCR dirigido a un primer

haplotipo de HLA homocigótico.

También desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma,

cuya célula es una iPSC (célula madre pluripotente inducida) o una HSC (célula madre hematopoyética), es capaz

de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende una

molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un

resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento

de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. Esta célula madre modificada

genéticamente tal como iPSC o HSC puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula en la cual los genes TCR se han sometido a

reorganización.

La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula T o timocito que exprese un TCR ap.

La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula T o timocito que exprese un TCR y§.

La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula T o timocito que exprese un TCR dirigido al primer determinante antigénico, es decir, el mismo determinante antigénico al que se dirige el TCR expresado en una célula T derivada de la célula madre (por ejemplo, iPSC).

La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula T o timocito que es CD8+.

La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula T o timocito que es CD4+.

La célula madre (por ejemplo, iPSC o HSC) puede ser capaz de diferenciarse en una célula T CD4+ que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico. La célula madre (por ejemplo, iPSC o HSC) puede ser capaz de diferenciarse en una célula T CD8+ que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico.

También se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T y en donde los determinantes antigénicos se seleccionan de antígenos tumorales, antígenos de microorganismos o antígenos de células inmunitarias autorreactivas. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

La célula madre puede ser una iPSC. La célula madre puede ser una HSC.

La célula madre puede ser capaz de diferenciarse en una célula T CD4+ o una célula T CD8+.

El TCR puede ser un TCR ap.

La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula T o timocito, preferentemente una célula T CD8+ o un timocito. La célula madre (por ejemplo, iPSC) puede derivar de una célula T CD8+ o timocito que exprese un TCR dirigido al primer determinante antigénico, es decir, el mismo determinante antigénico al que se dirige el TCR expresado en una célula T derivada de la célula madre (por ejemplo, iPSC).

Se desvela además una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico tumoral y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico tumoral, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T y en donde el primer determinante antigénico se selecciona de péptidos reconocidos por TCR tales como WT-1 o EbvLMP2, y el segundo determinante antigénico se selecciona de, por ejemplo, TAG-72, CD19, MAGE o CD47. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico. Las células madre de mamífero modificadas genéticamente (por ejemplo, iPSC o HSC) descritas en el presente documento pueden ser capaces de diferenciarse a una célula T que exprese un TCR dirigido a un primer determinante antigénico (por ejemplo, un primer determinante antigénico tumoral) y comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico (por ejemplo, un segundo determinante antigénico tumoral), operativamente unido a un resto de activación de células T. Esto es, las células madre modificadas genéticamente (por ejemplo, iPSC o HSC) desveladas en el presente documento pueden ser capaces de diferenciarse en células T dirigidas a múltiples, es decir, al menos dos (a saber, dos o más) determinantes antigénicos. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

También se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente capaz de diferenciarse en una célula T dirigida a más de dos determinantes antigénicos.

La célula madre de mamífero modificada genéticamente (por ejemplo, iPSC o HSC) puede ser capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende múltiples (es decir, dos o más) moléculas de ácido nucleico que codifican múltiples receptores de antígenos quiméricos, en donde cada receptor de antígeno quimérico comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

Los determinantes antigénicos múltiples a los cuales se dirigen los receptores de antígenos quiméricos múltiples pueden ser distintos del primer determinante antigénico al que se dirige el TCR expresado en una célula T derivada de la célula madre. Los múltiples determinantes antigénicos a los que pueden dirigirse los múltiples receptores de antígenos quiméricos son distintos, entre sí, y también puede ser distinto el primer determinante antigénico al que se dirige el TCR expresado en una célula T derivada de la madre.

Los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR pueden incluirse en un fragmento de ácido nucleico contiguo. Por ejemplo, los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR pueden colocarse en una construcción o vector que se transfecta en una célula para generar una célula madre de mamífero modificada genéticamente que comprende los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR. Los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR pueden enlazarse entre sí dentro de una unidad de expresión y marco de lectura (por ejemplo, utilizando un péptido autoescindible tal como P2A), de tal manera que inicialmente se produzca un único polipéptido que comprenda múltiples secuencias de polipéptidos CAR y posteriormente se procese para producir múltiples CAR. Los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR pueden colocarse en vectores separados que se usan en la transfección para generar una célula madre de mamífero modificada genéticamente que comprende los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR. En la Figura 11 se representan ejemplos de construcciones de ácido nucleico que codifican CAR y las secuencias ilustrativas para un CAR y diversos dominios adecuados para su uso en un CAR se proporcionan en SEQ ID NO: 1-2 y 7-20.

Para una célula madre de mamífero modificada genéticamente capaz de diferenciarse en una célula T dirigida a más de dos determinantes antigénicos, la célula madre de mamífero genéticamente modificada (por ejemplo, iPSC o HSC) (que opcionalmente expresa al menos un haplotipo de HLA homocigótico), puede ser capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, operativamente unido a un resto de activación de células T y que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno que comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un tercer determinante antigénico. La célula madre modificada genéticamente puede ser capaz de diferenciarse en una célula T dirigida a múltiples determinantes antigénicos, preferentemente múltiples determinantes antigénicos que son distintos entre sí. Puede proporcionarse especificidad antigénica adicional empleando múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR como se describe en el presente documento y/o utilizando múltiples ácidos nucleicos que codifican receptores de unión a antígenos.

El receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de unión a antígeno no señalizador; a saber, el receptor puede estar anclado a la superficie celular y se une al tercer determinante antigénico, pero no transduce la señal a la parte citoplasmática de la célula. El receptor de unión a antígeno puede comprender un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un tercer determinante antigénico, operativamente unido a un dominio transmembrana, pero que carece de un resto de activación de células T.

El receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de unión a antígeno no señalizador dirigido a CD47. Por ejemplo, el receptor de unión a antígeno puede ser una molécula de unión a CD47 no señalizadora, por ejemplo, una molécula de unión a CD47 truncada.

También se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente (por ejemplo, iPSC o HSC), o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico, que comprende (i) una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T y (ii) una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de unión a CD47 no señalizadora, por ejemplo, una molécula de unión a CD47 truncada. La célula madre de mamífero modificada genéticamente (por ejemplo, iPSC o HSC) puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

Se describe además un método para producir una célula madre de mamífero modificada genéticamente (tal como una iPSC o HSC) desvelada en el presente documento.

El método puede comprender obtener una célula madre de mamífero (tal como una iPSC o HSC) que sea capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico, cuya célula madre (por ejemplo, iPSC o HSC), expresa al menos un haplotipo de HLA homocigótico; e introducir en la célula madre (por ejemplo, mediante transfección) una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos, comprendiendo cada receptor de antígeno quimérico un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. El método puede comprender además introducir en la célula madre (por ejemplo, a través de transfección) una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más receptores de unión a antígeno (por ejemplo, receptores de unión a antígeno no señalizadores), comprendiendo cada receptor de unión a antígeno un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico. Como se desvela además en el presente documento, los ácidos nucleicos que codifican múltiples receptores pueden introducirse mediante un único vector o vectores separados.

El método puede comprender obtener un linfocito T o timocito (preferentemente linfocito T CD8+ o timocito) que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y que también expresa al menos un haplotipo de HLA homocigótico; introducir en la célula T o el timocito una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos, comprendiendo cada receptor de antígeno quimérico un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T; y derivar una célula madre (por ejemplo, iPSC) de la célula T o timocito. El método puede comprender además, antes de la etapa de derivar una célula madre de la célula T o timocito, introducir en la célula T o timocito una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más receptores de unión a antígeno (por ejemplo, receptores de unión a antígeno no señalizadores), comprendiendo cada receptor de unión a antígeno un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico. El método puede comprender obtener una HSC (por ejemplo, de la médula ósea o la sangre) que puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico; introducir en la HSC (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican un TCR dirigido a un primer determinante antigénico, (ii) una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos, comprendiendo cada receptor de antígeno quimérico un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico que es diferente del primer determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T; y opcionalmente (iii) una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más receptores de unión a antígeno (por ejemplo, receptores de unión a antígeno no señalizadores), comprendiendo cada receptor de unión a antígeno un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico que es diferente del primer determinante antigénico y diferente del determinante o determinantes antigénicos a los cuales se dirige o dirigen el receptor o receptores de antígenos quiméricos. Como se desvela en el presente documento, los ácidos nucleicos que codifican múltiples receptores pueden introducirse mediante un único vector o vectores separados. Dichas HSC modificadas genéticamente pueden usarse para generar células T que tengan especificidad para múltiples determinantes antigénicos.

También se desvela una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y expresa uno o más receptores de antígenos quiméricos, en donde cada receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. La célula T puede expresar además un receptor de unión a antígeno que comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico. La célula T proporcionada en el mismo puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

Se describe además un método para producir una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y expresa uno o más CAR en donde cada CAR comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T, y opcionalmente también expresa uno o más receptores de unión a antígeno no señalizadores, cada uno de los cuales comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico. El método desvelado en el presente documento puede dirigirse a producir una célula T que exprese al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

También se desvela un método para tratar una afección caracterizada por la presencia de una población no deseada de células en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero un número eficaz de células madre o células T, como se describió anteriormente en el presente documento.

La afección puede ser una afección neoplásica, una infección por microorganismos (tales como VIH, ETS o bacterias resistentes a los antibióticos) o una afección autoinmunitaria.

El método desvelado puede comprender administrar al mamífero un número eficaz de células madre o células T, como se ha definido anteriormente en el presente documento en donde el TCR se dirige a un primer determinante antigénico tumoral y el CAR se dirige a un segundo determinante antigénico tumoral.

El primer determinante antigénico tumoral puede ser WT-1.

El segundo determinante antigénico tumoral puede ser TAG-72, CD19, MAGE o CD47.

Se desvela además el uso de células madre o células T, como se ha definido anteriormente en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección caracterizada por la presencia de una población de células no deseada en un mamífero.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1O. Estimulación y expansión de células T citotóxicas que expresan un TCR específico para el antígeno del tumor de Wilm 1 (WT-1). Se aislaron células de células mononucleares de sangre periférica de sangre completa (PBMC). Las células se activaron en células individuales (A, F, K) donde también se representa el diagrama de dispersión (B, G, L), seguido de células CD3 positivas (conjugadas con APCCy7; C, H, M), seguido de CD8 (conjugadas con PECy7) y CD4 (conjugadas con PerCp; D, I, N), y finalmente en células CD8 solas (E, J, O). La tinción de WT-1 se realizó utilizando tetrámero HLA-A02 específico para el péptido WT-137. Las representaciones son de dos pacientes separados (paciente 1 A-E; paciente 2 F-J) que son HLA-A02 positivos y se comparan con una fluorescencia menos uno (FMO; esta tinción carece de la tinción del tetrámero WT-1, mostrando la tinción de especificidad de WT-137, K-O). Las proporciones que se muestran son un porcentaje de células CD3+. El porcentaje de células T TCR WT-1 aumentó al 1,5 % y al 4,5 % para las dos muestras; en PBMC no estimuladas estas células son muy bajas (por debajo del nivel de detección que usa la tecnología de tetrámero del presente documento). En otros estudios (por ejemplo, Schmeid et al (2015)) son tan pocos como 1 por 10-6 de células CD8+ (intervalo de 3 x 10-7 a 3 x10'6 células).

Figuras 2A-2G. Las células T citotóxicas CD8+ con TCR específicos para el antígeno del Tumor de Wilm 1 (WT-1) son funcionales. La función está representada por la producción de interferón gamma (IFN-y) (Ghanekar et al 2001). La expresión de IFN-y se encontró después de la estimulación específica de WT-1. Las células activadas se activaron en el tetrámero CD8+ y HLA-A02 al fluorocromo conjugado a péptido WT-137-PE. Estas células T citotóxicas con TCR específico para WT-1, cuando se estimulan con WT-1, demostraron tinción de citocinas intracelulares de IFN-^y(conjugadas con el fluorocromo azul pacífico). Las representaciones son de dos pacientes separados (Wt-1 n.° 1 y WT-1 n.° 2) (paciente 1: A-B; paciente 2: C-D) que son HLA-A02 positivos y se comparan con una fluorescencia menos uno (FMO; E-F; esta tinción careció de la tinción del tetrámero WT-1, mostrando la tinción de especificidad de WT-137 (G). Las proporciones que se muestran son un porcentaje de células WT1+CD8+. Más del 80 % de las células T TCR WT-1 produjeron IfNy.

Figura 2H. La adición del inhibidor de LAG 3 (IMP 321) aumenta la frecuencia de células T específicas de WT-1 después de 4 días de estimulación. En este experimento, las células mononucleares de sangre del cordón umbilical purificadas pero no separadas se colocaron en placas, bien solas, bien con anti CD28 solo, con péptido WT-1 (Miltenyi BioTech) y CD28 (1 pg/ml) o bien con péptido WT-1 más IMP321, durante 24 horas y 4 días. No se observaron efectos a las 24 horas (datos no mostrados) pero, consistente con la cinética del efecto de IMP 321 sobre la activación de las células dendríticas (Brigone et al (2007)), hubo una duplicación de las células T CD8+ específicas de WT-1 después de 4 días.

Figura 3. Producción de iPSC a partir de células T TCR específicas de cáncer (por ejemplo, WT-1). Las células T específicas del antígeno del cáncer son extremadamente raras en sangre normal; se revelan por estimulación in vitro con péptido WT-1 unido a células B autólogas que actúan como células presentadoras de antígenos (formadas en líneas de células linfoblásticas (LCL) usando EBV), en presencia de citocinas. Las células T específicas de antígeno de cáncer se muestran como marcadas doblemente con CD8 (para células T citotóxicas) y tetrámero para la unión de HLA-WT-1 al TCR de estas células CD8+. A continuación, estas células se convirtieron en iPSC usando los factores de reprogramación de Yamanaka. Los genes TCR reorganizados específicos para WT-1 se incluyeron en el locus t Cr de las iPSC.

Figura 4. Progresión morfológica de colonias iPSC a linaje hematopoyético y progenitores linfoides después de cultivo durante 1, 5, 9 y 13 días en células de soporte OP9. Nótense grandes números de células de tipo hematopoyético individuales el día 13.

Figura 5. El análisis de citometría de flujo de células derivadas de iPSC después del cultivo durante 13 días sobre células OP9, muestra claramente evidencia de especialización hemopoyética con presencia de células madre hematopoyéticas (HSC) (CD34+ CD43+).

Figura 6. Citometría de flujo para HSC en células derivadas de iPSC después de 13 días de cultivo sobre células OP9 seguido de 9 días de cultivo sobre células OP9 DL-L1. Las células se seleccionaron sobre la viabilidad, expresiones de CD45, después se examinaron células individuales para determinar el contenido de HSC mediante tinción para CD34 y CD43. Nótese la reducción en HSC de > 90 % pre cultivo de OPDL-L1 (Figura 5), a -60 % después de 9 días de cultivo en células OP9DL-L1.

Figura 7. Citometría de flujo para el desarrollo de células T de células derivadas de iPSC después de 13 días de cultivo sobre células OP9 seguido de 9 días de cultivo sobre células OP9 DL-L1. Existe una clara evidencia de compromiso con el linaje de células T con expresión de CD5 y CD7 y las primeras fases del desarrollo de timocitos con células inmaduras (es decir, que carecen de CD3; datos no mostrados) CD4+, "positivas individuales" CD8+ y células "doble positivas" CD4+CD8+.

Figura 8. Citometría de flujo para la diferenciación de HSC y células T en células derivadas de iPSC después de 13 días de cultivo sobre células OP9 seguido de 16 días de cultivo sobre células OP9 DL-L1. Las células T inmaduras que expresan CD4 y/o CD8 todavía estaban claramente presentes y hubo una reducción adicional de HSC del -60 % al -25 %. De forma más importante estaban presentes células CD8+ maduras y expresaban CD3, TCR ap y la cadena p de CD8 (además de CD8a, no mostrado)

Figura 9. Representación esquemática de la inducción de TCR específico de WT-1, células T CD8ap de iPSC derivadas de células T TCR específicas de WT-1 expandidas in vitro. El tratamiento de las células CD4+CD8+ con anticuerpos anti CD3 (niveles bajos) imita la señalización que se produce dentro del timo durante la selección positiva; esto aumentó las células T CD8+ que expresan ambas cadenas CD8a y CD8p.

Figura 10. Las células T Cd8ap, TCR específico de WT-1 inducidas a partir de iPSC derivadas de células T TCR específico de WT-1 expandidas in vitro, retuvieron la función completa (por ejemplo, citotoxicidad para dianas que expresan WT-1) equivalente a las células T originales. La relación efector: diana fue 3:1; se probaron concentraciones graduadas de péptidos WT-1.

Figura 11. Diagrama esquemático de construcciones de receptor de antígeno quimérico y receptor de unión a antígeno. Se ha desarrollado un panel de construcciones de Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), con scFv para cualquiera de TAG 72 o CD19 (como un control positivo). Las construcciones usaron cualquiera de CD8 o CD28 humanos como regiones bisagra y transmembrana y CD28, cadena CD3Z o dominios de señalización de activación citoplasmática 4-1BB. P2A es una secuencia señal que dirige la escisión proteolítica, que en las cinco construcciones principales que se muestran en la Figura 11 libera EGFP como un indicador fluorescente de expresión y en la (sexta) construcción inferior que se muestra en la Figura 11, libera una segunda construcción del receptor CAR que se muestra como Líder (CD8)-scFv (anti-CD47)-bisagra/TM (CD28)-cola de endodominio (CD8) en la cual el Líder se procesará para liberar el scFv anti-CD47 en la superficie anclada por la bisagra/TM y la cola del endodominio no contiene secuencias de señalización. Cualquier ectodominio de unión a CD47 podría usarse con el fin de unirse a CD47 sobre las células diana, incluyendo, por ejemplo, SIRP-alfa. La región bisagra puede contener restos de cisteína para dirigir la dimerización mediante la formación de enlaces disulfuro entre dominios bisagra adyacentes, lo cual es característico de la bisagra CD8 natural, o puede tener los restos de cisteína sustituidos con otros residuos, tales como serina, que no forman enlaces disulfuro y no forman dímeros estabilizados covalentemente. Los ejemplos de secuencias de receptor de unión a CAR y CD47, así como diversas secuencias de dominio adecuadas para su uso en la construcción de un receptor CAR o de unión a antígeno, se establecen en SEQ ID NO: 1-20.

Figura 12. Esquema de transformación de retrovirus. Esquema de los procesos llevados a cabo para generar CAR que contiene construcciones retrovíricas. La construcción CAR se clona en el vector plásmido pSAMEN y se enlaza al indicador fluorescente EGFP mediante un polipéptido autoescindible P2A para separar el CAR y el indicador. Cuando la transducción de la célula tiene éxito, el P2A se expresa y se escinde y el EGFP se identifica mediante citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia.

Figura 13. Esquema de transformación de lentivirus. Esquema de los procesos llevados a cabo para generar CAR que contiene construcciones lentivíricas. La construcción CAR se clona en el vector plásmido pWP1 se enlaza al indicador fluorescente EGFP mediante un polipéptido autoescindible P2A para separar el CAR y el indicador. Cuando la transducción de la célula tiene éxito el P2A se expresa y se escinde y el EGFP se identifica mediante citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia.

Figura 14A. Esquema de la estructura CAR de segunda generación normal. Dominios de unión a scFv a antígenos diana; región de bisagra (tallo) que permite la integración del CAR en la membrana plasmática (la longitud de la bisagra puede influir diferencialmente en la unión de scFv a las células diana); dominios de señalización citoplasmática que inducen la activación de las células T tras el acoplamiento del scFv. La estructura CAR se muestra como un dímero, estabilizado por enlaces disulfuro entre restos de cisteína adyacentes en la región de las bisagras.

Figura 14B. Esquema de un receptor de unión a antígeno no señalizador, un "tallo de fijación" CD47 truncado. La estructura muestra dominios scFv o dominios V individuales para la unión del antígeno CD47, fijado a una región bisagra y transmembrana pero no hay dominios de señalización presentes en el endodominio. Esta construcción permitiría una mayor afinidad de unión de la célula CAR-T a las células cancerosas que expresan altos niveles de CD47. Aunque este receptor también podría unirse a células normales que expresan niveles más bajos de CD47, no habría transducción de señales y, por tanto, no se dañarían las células normales. La región bisagra puede contener restos de cisteína para dirigir la dimerización mediante la formación de enlaces disulfuro entre dominios bisagra adyacentes o puede tener los restos de cisteína sustituidos por otros restos, tales como serina, que no forman enlaces disulfuro y no forman dímeros estabilizados covalentemente.

Figura 15. Análisis de citometría de flujo de células T CD3+ derivadas de PBMC humanas transducidas con CAR que demuestran una transducción exitosa con la construcción CAR de lentivirus TAG72 (20,8 % positivo en comparación con <0,1 % en los controles) y la construcción CAR de lentivirus CD19 (33,9 % positivo).

Figura 16. Análisis de transferencia Western que confirma la expresión de proteínas en células T transfectadas con CAR TAG 27 y CD19.

Figura 17. Destrucción mediada por TAG-72 CAR-T de células diana de cáncer de ovario (TAG72+). Relación efector:diana (E:T) = 1:1. Las células efectoras TAG-72 CAR-T (células positivas para GFP) desarrolladas a partir de células T sanguíneas normales activadas por CD3, se aislaron como > 95 % puras mediante FACS y posteriormente se estimularon para potenciar la actividad citolítica durante 72 h en presencia de aCD3/aCD28 e IL-2 inmovilizadas antes de su uso. El cambio en la impedancia celular (representado aquí como la unidad arbitraria del índice celular) se controló durante 40 h y se comparó con células no transducidas estimuladas CD3+ve aisladas de PBMC y células CAR-T solo con vector estimuladas. Las células TAG72 CAR-T mostraron la mayor destrucción, sin embargo, las células no CAR-T activadas por CD3/CD28 también mostraron destrucción, aunque en un grado mucho menor.

Figura 18. Determinación de la especificidad de la destrucción de TAG-72 CAR-T. Se aislaron TAG-72 y CD19 CAR-T respectivamente mediante FACS y se añadieron inmediatamente a células diana TAG-72alto/CD19bajo sin estimulación in vitro (E:T = 5:1). El cambio en la impedancia celular (representado aquí como la unidad arbitraria del índice celular) se controló durante 15 h. Las células TAG-72 CAR-T mostraron una fuerte destrucción de la línea celular. Las células CD19 CAR-T eran las mismas que los controles de células no CAR T.

Figuras 19A-19B. Análisis de citometría de flujo de la transducción con CAR de células T TCR CD8+ específicas de WT-1 derivadas de iPSC producidas a partir de células T específicas de WT-1. Figura 19A. Las células T TCR específicas de WT-1 se transdujeron con éxito con la construcción del lentivirus CAR TAG72 (31,3% positivo en comparación con <0,1 % en los controles). Figura 19B. Células T TCR específicas de WT-1 derivadas de iPSC formadas a partir de células T TCR específicas de WT-1 transducidas con éxito con construcción CAR de especificidad dual para TAG 72 más CD47 truncada sin señalización (55 % transducidas); transducidas con TAG 72 solo 32 %. Estas células T transducidas contenían 3 especificidades anti-cáncer: WT-1 (TCR); TAG72 (CAR); CD47 no señalizador truncado.

Figura 20A-20I. Función citotóxica de las células T TCR específico de WT-1 y células T TAG 72 CAR/TCR WT-1 específicas dobles. Se incubaron células T TCR específico de WT-1 y células T TAG72 CAR/TCR WT-1 específicas dobles en cultivos de monocapa con la línea celular de cáncer de ovario CAOV4 durante 24 horas para evaluar la citotoxicidad. A pesar de la baja relación efector:diana de 2:1 (necesaria debido al bajo número de efectores obtenidos), hubo destrucción específica con células T TCR WT-1 y esto se aumentó aún más con la transducción con el TAG72 CAR. La técnica se basa en AquaAmine que tiñe las aminas dentro de la célula. Cuando una célula muere o está muriendo, la membrana celular comprometida permite que el tinte se infiltre en la célula y tiñe las aminas con mayor intensidad. Por tanto, la citotoxicidad celular se describe por una mayor intensidad de tinción de las aminas celulares. Nota: las células vivas todavía darán alguna tinción positiva (aunque baja) porque algunas aminas residen en la superficie celular. A, D, G: Células cancerosas CAOV4 solas. B, E, H: Células cancerosas CAOV4 incubadas con células T TCR WT-1. C, F, I: Células T TAG 72 CAR/TCR WT-1 específicas dobles incubadas con células de cáncer de ovario CAOV4. D,E,F: Niveles de Aqua Amine en células CD3-ve seleccionadas (es decir, CAOVA4). Imágenes de contraste de fase de G: Células cancerosas solas, H: células TCR WT-1 no transfectadas con CAR con células cancerosas e I: células T TCR WT-1 transfectadas con TAG-72 y células cancerosas. Aumento de 40x. Las células T TCR WT-1 provocaron aproximadamente un 10% de destrucción (por encima del fondo); las células TAG72 CAR-T provocaron una destrucción adicional del 10 % (es decir, aproximadamente un 20 % por encima del fondo). Los mecanismos dobles de destrucción anti-cáncer son aditivos.

Figuras 21A-21B. Transducción CAR de iPS. Día 5 de crecimiento en capas de alimentación MEF, 4 días después de la incubación con lentivirus CAR. La transducción CAR+ (verde) de virus TAG72, CD19 y GFP se superpusieron en imágenes de campo brillante con un aumento de 20x. Los controles no transducidos no mostraron ninguna señal de GFP. Las imágenes de colonias de iPSC con un aumento de 4x demuestran la presencia de colonias de iPSC en las capas de alimentación de MEF. En cada sistema, se observa que algunas de las colonias de iPSC parecían haber comenzado a diferenciarse espontáneamente. Las iPSC derivadas de fibroblastos transducidas se representan en la Figura 21A. La Figura 21B demuestra la transducción satisfactoria de iPSC derivadas de células T WT-1 con TAG72 CAR. Por lo tanto, estas iPSC se improntaron con éxito para la especificidad de TCR WT-1 y TAG 72.

Figura 22. Análisis de citometría de flujo de la transducción del receptor de antígeno quimérico de iPSC. Estas iPSC derivan de fibroblastos adultos pero pueden ser de cualquier origen incluyendo las células T no seleccionadas, células T CD8+ o células T específicas de antígeno canceroso (por ejemplo, WT-1). Es evidente que existe una población de iPSC fluorescentes transducidas con éxito por TAG 72 o CD19. La superposición de las células transducidas en comparación con los controles no transducidos se muestra en la Figura 23.

Figura 23. Superposición de gráficos de puntos que comparan células de control no transducidas (azul) con cultivos de iPSC transducidos (verde). Los eventos dentro de la selección GFP+ demuestran una transducción exitosa y se presentan como porcentaje de frecuencia de eventos sin restos.

Figura 24. Reformación de colonias iPSC transducidas con CAR después de la clasificación FACS. Las iPSC transducidas con CAR pueden aislarse mediante citometría de flujo (fluorescencia positiva de GFP) y volver a sembrarse en placa para formar colonias estables.

Descripción detallada

La presente invención y divulgación se basan, en parte, en la determinación de que las células T que expresan TCR/CAR dobles, dirigidas a dos determinantes antigénicos distintos, pueden generarse de manera consistente y estable al, por ejemplo, transfectar un casete CAR en una iPSC derivada de una célula T que exhibe especificidad de TCR dirigido a un determinante antigénico de interés. En virtud de las acciones de la memoria epigenética, se ha descubierto que una célula T diferenciada de esta iPSC expresa de forma estable tanto la especificidad de TCR de la célula T somática de la que deriva la iPSC, como un CAR dirigido a un determinante antigénico distinto. La especificidad para determinantes antigénicos adicionales puede lograrse introduciendo en las células ácido nucleico adicional que codifica una molécula o moléculas que se unen a dicho determinante o determinantes antigénicos adicionales. Dicha célula de especificidad múltiple proporciona por lo tanto un resultado terapéutico más eficaz que el disponible actualmente. Por lo tanto, estas determinaciones ahora han permitido el desarrollo de una fuente continua de células T específicas de antígeno doble transformadas de manera estable, en particular, células T citotóxicas CD8+ TCR ap, para su uso en el contexto de cualquier enfermedad que se caracterice por una población celular no deseada, tal como una afección neoplásica, una infección vírica, una infección bacteriana o una enfermedad autoinmunitaria. Este descubrimiento y la generación de células basadas en él, ahora han facilitado la mejora de los regímenes de tratamiento terapéutico dirigidos a tratar tales afecciones, en particular afecciones neoplásicas tales como tumores sólidos o cánceres de sangre (por ejemplo, leucemias), incluyendo enfermedad metastásica.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención está dirigido a un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un resto de reconocimiento de antígeno, una región bisagra, un dominio transmembrana y un resto de activación de células T, en donde:

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula T de la invención como se define en el presente documento, para su uso como un medicamento.

También se proporciona de acuerdo con la invención una célula T de la invención como se define en el presente documento, para su uso en el tratamiento de una afección caracterizada por la presencia de una población no deseada de células en un mamífero, por ejemplo, una afección seleccionada de una afección neoplásica, una infección por microorganismos (tales como VIH, ETS o bacterias resistentes a los antibióticos) o una afección autoinmunitaria.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para fabricar una célula madre de mamífero modificada genéticamente, que comprende:

obtener una célula madre de mamífero que es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico; y

En un aspecto final de la invención, se proporciona un método para producir una célula T, que comprende: proporcionar una célula madre modificada genéticamente que puede obtenerse de acuerdo con el método de la invención como se define en el presente documento y diferenciar la célula madre modificada genéticamente en una célula T.

Otras características y realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas y se describen a continuación.

Esta solicitud desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

La referencia a una "célula T" debe entenderse como una referencia a cualquier célula que comprenda un receptor de células T. En este sentido, el receptor de células T puede comprender uno o más de las cadenas a, p, ^yo 8.

Como entendería la persona experta en la materia, Las células NKT también expresan un receptor de células T y, por lo tanto, también pueden generarse células NKT específicas dobles de acuerdo con la presente invención. La presente invención y divulgación no pretenden limitarse a ninguna subclase particular de células T, aunque la célula

T puede expresar un dímero de TCR a/p. La célula T puede ser una célula T auxiliar CD4+, una célula T asesina c D8+ o una célula NKT. Las células T c D8+ también se conocen como células citotóxicas. Como una parte principal del sistema inmunológico adaptativo, las células T CD8+ escanean el entorno intracelular para dirigirse y destruir, principalmente, células infectadas. Los pequeños fragmentos de péptidos, derivados del contenido intracelular, se procesan y se transportan a la superficie celular donde se presentan en el contexto de las moléculas del MHC de clase I. Sin embargo, más allá de solo responder a infecciones víricas, las células T CD8+ también proporcionan un nivel adicional de vigilancia inmunológica al monitorizar y retirar células dañadas o anormales, incluyendo cánceres.

El reconocimiento de células T CD8+ de un péptido presentado por el MHC I generalmente conduce a la liberación de gránulos citotóxicos o linfocinas o la activación de rutas apoptóticas a través de la interacción FAS/FASL para destruir la célula. La célula T CD4+ T, por otro lado, generalmente reconoce el péptido presentado por las células presentadoras de antígenos en el contexto del MHC de clase II, que conduce a la liberación de citocinas diseñadas para regular las respuestas inmunitarias de las células B y/o células T CD8+. Por consiguiente, a diferencia de las células T citotóxicas, las células T auxiliares no matan directamente las células no deseadas, tales como las células cancerosas, aunque pueden aumentar dicha respuesta, en la medida en que se efectúa por mecanismos de eliminación basados en células T citotóxicas y/o anticuerpos.

Las células T citotóxicas naturales (NKT) son una población especializada de células T que expresan un receptor de células T semiinvariable (TCR a p) y antígenos de superficie típicamente asociados a las células citotóxicas naturales. El TCR en las células NKT es único en el sentido de que reconoce los antígenos de glucolípidos presentados por la molécula CD1d similar al MHC I. La mayoría de las células NKT expresan una cadena alfa de

TCR invariable y una de un pequeño número de cadenas de TCR beta. Los TCR presentes en las células NKT de tipo I reconocen el antígeno alfa-galactosilceramida (alfa-GalCer). Dentro de este grupo, se han identificado subpoblaciones distinguibles, incluyendo células CD4+CD8-, células CD4'CD8+ y células CD47CD8'. Las células

NKT de tipo II (o células NKT no invariables) expresan una gama más amplia de cadenas a de TCR y no reconocen el antígeno alfa-GalCer. Las células NKT producen citocinas con múltiples efectos, a menudo opuestos, por ejemplo, promoviendo la inflamación o bien induciendo la inmunosupresión incluyendo la tolerancia. Como resultado, pueden contribuir a las respuestas inmunitarias antibacterianas y antivíricas, promover la inmunovigilancia relacionada con el tumor e inhibir o promover el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias. Como células citotóxicas naturales, las células NKT también pueden inducir citotoxicidad relacionada con perforina, Fas y TNF. Por consiguiente, debe entenderse que la referencia a las células T genéticamente modificadas de la presente invención y la divulgación incluyen una referencia a las células NKT.

Dado que la producción de células T basadas en el timo se caracteriza por la generación aleatoria del repertorio del receptor de células T (TCR), la timopoyesis también debe incluir procesos de selección muy estrictos que eliminen o silencien funcionalmente aquellas células T del timo en desarrollo con el potencial de atacarse a sí mismas. Esta

"auto tolerancia", por lo tanto, reduce el potencial de enfermedad autoinmunitaria. Sin embargo, por necesidad, este mismo proceso compromete la vigilancia inmunológica contra los cánceres, dado que los cánceres no inducidos por virus son, por definición, enfermedades del "yo". Esto significa que muchas células T que surgen en el timo, que podrían haber sido potencialmente reactivas con antígenos asociados a tumores, pueden eliminarse antes de entrar en la sangre. Como mínimo, serán numéricamente deficientes y quizás expresen un TCR de baja afinidad.

Esta solicitud desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T CD4+ que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto activación de células T. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

También se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T CD8+ que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto activación de células T. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

La célula genéticamente modificada de la presente invención y divulgación, por ejemplo, la célula madre modificada genéticamente (tal como una iPSC o una HSC) o célula T, puede ser homocigótica para al menos un haplotipo de

HLA. El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) representa un conjunto de moléculas de la superficie celular, cuya función principal es unir fragmentos de péptidos derivados de antígenos y presentarlos a las células T. La

familia de genes de MHC se divide en tres subgrupos: clase I, clase II y clase III. Las moléculas de MHC de clase I expresan subunidades p2 y, por lo tanto, solo pueden ser reconocidas por correceptores CD8. Las moléculas de MHC de clase II no expresan subunidades p2 y, por lo tanto, pueden ser reconocidas por los correceptores CD4. De esta manera, Las moléculas del MHC regulan qué tipo de linfocitos pueden unirse a un antígeno dado con alta afinidad, ya que diferentes linfocitos expresan diferentes correceptores de TCR. La diversidad de presentación de antígenos, mediada por los MHC de clases I y II, se logra de al menos tres formas:

(1) el repertorio de MHC de un organismo es habitualmente poligénico (a través de múltiples genes que interactúan);

(2) la expresión de MHC es codominante (de ambos conjuntos de alelos heredados); y

(3) Las variantes del gen del MHC son altamente polimórficas (varían de un organismo a otro dentro de una especie).

Las moléculas de MHC se unen tanto al receptor de células T como a un correceptor CD4/CD8 en los linfocitos T. El epítopo del antígeno que se encuentra en el surco de unión del péptido de la molécula del MHC interactúa con el dominio similar a Ig variable del TCR para desencadenar la activación de las células T. Sin embargo, las moléculas del MHC también pueden actuar como antígenos y pueden provocar una respuesta inmunitaria en el receptor de un tejido o células que expresan un MHC extraño, provocando de esta manera el rechazo del trasplante. Todavía adicionalmente, el trasplante de células inmunocompetentes puede dar como resultado el rechazo del tejido del hospedador, también conocido como enfermedad de injerto contra hospedador. En este sentido, cada célula humana expresa seis alelos del MHC de clase I (un alelo HLA-A, -B y -C de cada padre) y de seis a ocho alelos del MHC de clase II (un HLA-DP y -DQ, y uno o dos HLA-DR de cada padre, y combinaciones de estos). La variación de MHC en la población humana es alta, con al menos 350 alelos para genes HLA-A, 620 alelos para HLA-B, 400 alelos para DR y 90 alelos para DQ. Cualesquiera dos individuos que no sean gemelos idénticos expresarán moléculas del MHC diferentes.

Todas las moléculas del MHC pueden mediar el rechazo del trasplante, pero HLA-C y HLA-DP, que muestran bajo polimorfismo, son menos importantes. El rechazo de trasplantes puede minimizarse intentando hacer coincidir la mayor cantidad posible del repertorio de HLA de la superficie celular entre un donante y un receptor. Una coincidencia completa solo es posible entre gemelos idénticos. Sin embargo, la selección de donantes basándose en la minimización de la incompatibilidad en uno o más de la gama de antígenos HLA expresados en una célula es muy deseable y puede minimizar significativamente los problemas de rechazo. Este es un tema particular abordado por la presente invención y divulgación ya que el método habitual para controlar el rechazo de tejido/célula es la administración de regímenes de tratamiento inmunosupresor, esto no es deseable en el contexto de un régimen de tratamiento basado en la administración de células inmunitarias modificadas genéticamente que se requieren para funcionar a un nivel óptimo de funcionalidad. De acuerdo con la presente invención y divulgación, esto puede lograrse utilizando células, tales como iPSC o células como las células T de las que derivan las iPSC, que son homocigóticas para uno o más haplotipos de MHC, siendo el alelo HLA de interés uno que es un antígeno de trasplante principal y que se expresa preferentemente por una proporción significativa de la población, tal como al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 17 %, al menos el 20 % o más de la población. Cuando el haplotipo HLA homocigótico corresponde a un tipo HLA MHC I o MHC II dominante (en términos de rechazo de tejido), el uso de dicha célula dará como resultado una reducción significativa de los problemas de rechazo de tejido en la población más amplia que recibe las células de la presente invención en el contexto de un régimen de tratamiento. En términos de la presente invención y divulgación, las células modificadas genéticamente pueden ser homocigóticas en relación con un antígeno HLA celular o pueden ser homocigóticas en relación con más de un antígeno HLA, por ejemplo, 2, 3 o más antígenos HLA. Las células modificadas genéticamente pueden ser homocigóticas en relación con un antígeno HLA seleccionado de aquellos listados en la Tabla 1, incluyendo, por ejemplo, HLA A1, B8, C7, DR17, DQ2 o HLA A2, B44, C5, DR4, DQ8 o HLA A3, B7, C7, DR15, DQ6. Las células modificadas genéticamente pueden ser homocigóticas en relación con dos o más antígenos HLA seleccionados de aquellos listados en la Tabla 1, incluyendo, por ejemplo, HLA A1, B8, C7, DR17, DQ2 o HLA A2, B44, C5, DR4, DQ8 o HLA A3, B7, C7, DR15, DQ6.

La expresión "tipo de HLA" debe entenderse por lo tanto que se refiere al complemento de antígenos HLA presentes en las células de un individuo.

La obtención de una célula T HLA homocigótica adecuada para su uso en la generación de una iPSC puede lograrse mediante cualquier método adecuado que incluya, por ejemplo, cribado de una población (por ejemplo, a través de un banco de sangre) para identificar individuos que expresan homocigocidad de HLA y después cribado de células T de ese individuo que exhiben la especificidad de TCR de interés. Estas células T normalmente muy raras pueden estimularse selectivamente por el péptido antigénico específico que reconoce su TCR y aumenta enormemente en frecuencia (por ejemplo, de <0,0001 a 0,2).

Se apreciará por la persona experta en la materia que hay información significativa ampliamente disponible en la bibliografía pública que describe la identificación y utilidad de haplotipos homocigóticos en términos de minimizar el desajuste de HLA donante-receptor en una población de interés dada, permitiendo de esta manera la generación de bancos donantes. Véase, por ejemplo, Pappas et al (2015). En un ejemplo, la Tabla 1 identifica los 15 haplotipos de HLA homocigóticos mejor clasificados en relación con la proporción de la población del RU a la que esto proporciona un desajuste mínimo. Los primeros 8 haplotipos de HLA homocigóticos listados son compatibles con el 49 % de la población. Un ejemplo adicional se describe en la Tabla 2 que detalla los primeros 10 haplotipos clasificados compatibles con la población californiana étnicamente diversa. La Tabla 2 incluye frecuencias de coincidencia para subpoblaciones, incluyendo, negros o afroamericanos, asiáticos e isleños del Pacífico, blancos, hispanos e indios americanos y nativos de Alaska. Aún además, la Tabla 3 describe los 50 haplotipos más frecuentes para HLA-AB-DR, A-B, A-DR y B-DR en la población del norte de China. Se apreciaría que una persona experta en la materia entendería que los datos representados en la Tabla 3 pueden usarse para definir un conjunto de haplotipos homocigóticos que proporcionarían una no coincidencia mínima para la población del norte de China.

Tabla 1. Utilidad de los 15 tipos de HLA-A, -B, -DR homocigóticos mejor clasificados identificados para proporcionar n n in i n i HLA r r l l i n R .

Tabla 2. Las mejores haplolíneas coincidentes cis y trans de la población de California. Abreviaturas AFA, negros o afroamericanos; API, asiáticos e isleños del Pacífico; CAU, blanco (no hispano); CIS, beneficio de coincidencia cis; fexp, frecuencia de coincidencia cis esperada; HIS, Hispano; Ki, número de coincidencias como un recuento o porcentajes del número total de sujetos; NAM, indio americano y nativo de Alaska; TRANS, beneficio de coincidencia trans.

Como se detalla anteriormente en el presente documento, la presente divulgación se basa en la determinación de que una célula madre puede diseñarse de manera consistente y estable para expresar receptores dobles de células T y antígenos quiméricos dirigidos a múltiples antígenos distintos, proporcionando de esta manera una fuente continua de células T que son más terapéuticamente eficaces que las células usadas en los regímenes terapéuticos de tratamiento celular actualmente disponibles. En este sentido, la referencia a una "célula madre" debe entenderse como una referencia a cualquier célula que exhiba la potencialidad de desarrollarse en la dirección de múltiples linajes, dada su particular constitución genética, y formar de esta manera un nuevo organismo o regenerar un tejido o población celular de un organismo. Las células madre que se utilizan de acuerdo con la presente divulgación pueden ser de cualquier tipo adecuado capaz de diferenciarse a lo largo de dos o más linajes e incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias, células madre adultas, células madre del cordón umbilical, células madre hematopoyéticas (HSC), células totipotentes, células progenitoras, células precursoras, células pluripotentes, células multipotentes o células somáticas desdiferenciadas (tales como una célula madre pluripotente inducida). Por "totipotente" se entiende que la célula madre puede auto renovarse. Por "pluripotente" se entiende que la célula madre puede diferenciarse para formar, entre otros, células de cualquiera de las tres capas germinales, siendo estas el ectodermo, el endodermo y el mesodermo.

La célula madre descrita puede ser una célula madre pluripotente inducida (iPSC). La expansión de las células madre adultas no se basa necesariamente en la aparición de una división asimétrica de las células madre con el fin de efectuar tanto la renovación como la diferenciación de las células madre a lo largo de un linaje celular somático específico. En particular, las células madre pluripotentes pueden obtenerse de células T que se inducen a transición a un estado de potencial multilinaje. El desarrollo de tecnología para permitir la desdiferenciación de las células adultas es de gran importancia debido a la dificultad de inducir la renovación y expansión de las células madre in vitro.

En el presente documento se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula madre es una iPSC, es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. Esta iPSC de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

Las iPSC generalmente se generan directamente a partir de células somáticas. La iPSC desvelada puede generarse a partir de una célula que no está diferenciada terminalmente; de hecho, la iPSC puede inducirse en principio a partir de cualquier célula nucleada, incluyendo, por ejemplo, mononucleocitos de células sanguíneas y cutáneas. Por ejemplo, las iPSC desveladas pueden generarse a partir de células T completamente diferenciadas o pueden generarse a partir de células T precursoras, tales como timocitos. En la medida en que el timocito haya reorganizado su TCR y muestre una especificidad antigénica de interés, uno puede buscar generar la iPSC a partir de esta célula. Esto puede ser relevante, por ejemplo, donde la reorganización de TCR particular en cuestión es una que podría esperarse que se seleccione durante la timopoyesis. El experto en la materia apreciará que uno de los factores que complican la respuesta inmunitaria a las células tumorales o las células autorreactivas es que en esta situación se requiere que el sistema inmunitario dirija una respuesta inmunitaria a una propia célula y, por lo tanto, un autoantígeno. Normalmente estas células inmunitarias se seleccionan durante la diferenciación de los linfocitos T en el timo para minimizar la posibilidad de la aparición de una enfermedad autoinmunitaria. En el contexto de afecciones neoplásicas y autoinmunitarias, sin embargo, la célula no deseada es una célula propia y, por consiguiente, los antígenos de la superficie celular a los que puede tratar de dirigirse serán autoantígenos. Una de las ventajas de usar una iPSC a partir de la cual generar una célula T que expresa TCR/CAR dirigida a múltiples determinantes antigénicos distintos es que se ha determinado que las acciones de la memoria epigenética pueden potenciar la diferenciación de una iPSC a una célula T funcional que expresa un TCR dirigido al mismo antígeno que la célula T de la que deriva la iPSC. Sin embargo, en términos de seleccionar una célula que expresa un TCR específico de la cual derivar una iPSC, puede ser difícil identificar una célula T completamente diferenciada adecuada ya que una célula T que expresa un TCR funcional dirigido a un autoantígeno puede haber sido seleccionada durante la timopoyesis. Por lo tanto, puede ser más factible detectar un timocito que exprese la reorganización de TCR de interés, cuyo timocito aún no se ha sometido a una selección negativa para eliminar las células potencialmente autorreactivas.

Una iPSC de esta divulgación puede transfectarse con una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un TCR (tal como genes de TCR reorganizados) dirigidos a un primer determinante antigénico (por ejemplo, un determinante antigénico tumoral).

La célula madre desvelada puede ser una célula madre hematopoyética (HSC). Las células madre hematopoyéticas (HSC) se refieren a las células madre que dan lugar a todas las células sanguíneas de los linajes linfoide y mieloide a través del proceso de hematopoyesis. Las HSC derivan del mesodermo y pueden encontrarse en la médula ósea adulta, la sangre periférica y la sangre del cordón umbilical. Las HSC pueden recolectarse de la médula ósea, la sangre periférica y la sangre del cordón umbilical mediante técnicas establecidas, y se asocian comúnmente con la expresión de CD34+. Las HSC humanas pueden definirse siendo CD34+ CD38- CD90+ CD45RA- (véase Reinisch et al (2015)). Una HSC puede modificarse genéticamente, por ejemplo, transfectada, con uno o más ácidos nucleicos que codifican un TCR dirigido a un primer determinante antigénico, después, posteriormente, se dirige a diferenciarse en una célula T. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más CAR, y opcionalmente ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de unión a antígenos de acoplamiento, también pueden introducirse en una HSC, antes o después de la diferenciación de la HSC en una célula T.

Por tanto, la referencia a un "receptor de células T" (TCR) debe entenderse como una referencia al heterodímero que se encuentra en la superficie de las células T o células NKT que reconocen péptidos presentados por el MHC. Específicamente, las células T CD8+ reconocen el péptido presentado en el contexto del MHC de clase I, mientras que las células T CD4+ reconocen el péptido presentado en el contexto del MHC de clase II. En la mayoría de las células T humanas, el TCR comprende una cadena a y p, mientras que una población menor de células expresa un TCR que comprende un heterodímero y6. El TCR es una proteína heterodimérica anclada a membrana enlazada por disulfuro. Las cadenas ^y, 6, a y p están compuestas por dos dominios extracelulares: una región variable (V) y una región constante (C), que forman parte de la superfamilia de las inmunoglobulinas y que se pliegan para formar láminas p antiparalelas. La región constante es proximal a la membrana celular, seguida de una región transmembrana y una cola citoplasmática corta, mientras que la región variable se une al complejo péptido/MHC. Los dominios variables tanto de la cadena a como de la cadena p de TCR expresan cada uno tres regiones hipervariables o determinantes de complementariedad (CDR), mientras que la región variable de la cadena p tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4) que normalmente no contacta con el antígeno y, por lo tanto, no se considera una CDR. Los procesos para la generación de diversidad de TCR se basan principalmente en la recombinación genética de los segmentos codificados por ADN en las células T precursoras, ya sea recombinación somática V(D)J usando recombinasas RAG1 y RAG2 o conversión génica usando citidina desaminasas. Cada TCR recombinado posee una especificidad antigénica única, determinado por la estructura del sitio de unión al antígeno formado por las cadenas a y p, en el caso de las células T ap, o cadenas y y 6 en el caso de las células T y6. La cadena a del TCR se genera por recombinación VJ, mientras que la cadena p se genera mediante recombinación VDJ. Análogamente, la generación de la cadena y del TCR implica la recombinación VJ, mientras que la generación de la cadena 6 del TCR se produce por recombinación VDJ. La intersección de estas regiones específicas (V y J para la cadena a o ^y; V, D, y J para las cadenas p y 6) corresponde a la región CDR3 que es importante para el reconocimiento de péptidos/MHC. Es la combinación única de los segmentos en esta región, junto con adiciones de nucleótidos palindrómicos y aleatorios, lo que explica la diversidad aún mayor de la especificidad del receptor de células T para péptidos antigénicos procesados.

Por consiguiente, la referencia a un TCR "dirigido" a un determinante antigénico debe entenderse como una referencia a un TCR que se ha sometido a un reordenamiento y que exhibe especificidad por un determinante antigénico, preferentemente un determinante antigénico propio (particularmente un cáncer propio).

Una iPSC desvelada en el presente documento puede derivar de una célula que expresa un TCR reorganizado, preferentemente un TCR ap reorganizado. Los ejemplos de células adecuadas para su uso en la generación de las iPSC de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a células T CD4+, células T CD8+, células NKT, timocitos u otra forma de células T precursoras. La célula puede expresar un TCR ^y6 reorganizado.

También se desvela una iPSC o HSC de mamífero modificada genéticamente o una célula T diferenciada de las mismas, cuya iPSC o HSC es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico, deriva de una célula en la cual los genes del TCR se han sometido a reorganización o se han transducido con los genes reorganizados, y comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. La iPSC o HSC de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

La iPSC puede derivar de una célula T o un timocito.

La iPSC puede derivar de una célula T o timocito que exprese un TCR ap.

La iPSC puede derivar de una célula T o timocito que exprese un TCR ^y6.

Las células madre desveladas pueden haber sido aisladas recientemente de un individuo que es objeto de tratamiento o pueden haber sido obtenidas de una fuente no reciente, tal como de un cultivo (por ejemplo, donde el número de células se expandió y/o las células se cultivaron para hacerlas receptivas a las señales de diferenciación) o un almacén congelado de células, que había sido aislado en algún momento anterior de un individuo o de otra fuente. También debe entenderse que las células descritas, antes de someterse a la diferenciación, puede haber sido sometido a alguna otra forma de tratamiento o manipulación, tales como pero no limitado a purificación, modificación del estado del ciclo celular o la formación de una línea celular tal como una línea de células madre embrionarias. Por consiguiente, la célula puede ser una célula primaria o una célula secundaria. Una célula primaria es aquella que se ha aislado de un individuo. Una célula secundaria es aquella que, tras su aislamiento, se ha sometido a alguna forma de manipulación in vitro tal como la preparación de una línea de células madre embrionarias, antes de la aplicación del método.

En la medida en que las células madre de la presente divulgación sean iPSC, los métodos para generar iPSC son bien conocidos por la persona experta en la materia. En este sentido, y como se detalla anteriormente en el presente documento, las iPSC son células derivadas de un tipo celular más maduro, tales como una célula somática, que se ha transicionado/desdiferenciado de nuevo a un estado pluripotente.

Las iPSC pueden derivarse mediante la introducción de un conjunto específico de genes asociados a la pluripotencia o "factores de reprogramación", en un tipo de célula somática. El conjunto de factores de reprogramación más comúnmente usado (también conocido como factores de Yamanaka) son los genes Oct4 (Pou5f1), Sox2, cMyc y Klf4. Yamanaka demostró en 2006 que la transfección de estos cuatro genes específicos que codifican factores de transcripción convierte células humanas adultas en células pluripotentes. Aunque esta combinación es la combinación más convencional usada para producir iPSC, cada uno de los factores puede reemplazarse funcionalmente por factores de transcripción relacionados, miARN, moléculas pequeñas o incluso genes no relacionados tales como especificadores de linaje. Por ejemplo, la inducción de iPSC después de la transfección de Oct 3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc usando un sistema retrovírico se ha logrado, como también ha sido a través de la transfección de Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 usando un sistema lentivírico. El primer conjunto de factores de transcripción se conoce como los factores de Yamanaka, mientras que los últimos se conocen comúnmente como los factores de Thomson. Como apreciaría la persona experta en la materia, se ha realizado una amplia gama de modificaciones a los vectores de expresión de factores de reprogramación básicos y se han diseñado nuevos modos de administración para aumentar la eficiencia y minimizar o retirar secuencias de vectores que de otro modo podrían integrarse en el genoma de iPSC reprogramado. Estos métodos serían bien conocidos por la persona experta e incluyen, pero no se limitan a:

(i) vectores de reprogramación de casete único con escisión de transgén mediada por Cre-Lox;

(ii) reprogramación mediante virus no integrantes tales como el adenovirus o el virus sendai.

Como alternativa, la expresión de factores de reprogramación como proteínas proporciona un medio para generar iPSC que no se han sometido a integración del ADN del vector introducido en la línea germinal.

También se han desarrollado métodos de reprogramación no víricos. Estos incluyen, pero no se limitan a:

(i) Transfección de ARNm - La capacidad de expresar factores de reprogramación como ARNm ofrece un método para producir iPSC en las cuales no se produce la integración cromosómica de vectores víricos. Warren et al. transcriben ARNm para expresar eficientemente factores de reprogramación (Warren et al (2010)). Añadiendo Lin28 al protocolo de factor de reprogramación de Yamanaka, cultivando al 5 % de O2 e incluyendo ácido valproico en el medio de cultivo celular, puede aumentarse la eficiencia. Los ARNm de factores de reprogramación están disponibles en el mercado.

(ii) Infección/transfección por miARN - Varios grupos de miARN se expresan fuertemente en células madre embrionarias. Cuando se añaden imitaciones sintéticas del miR-302b y/o miR-372 maduro más los cuatro factores de Yamanaka lentivíricos a los fibroblastos MRC5 y BJ-1, la eficiencia de reprogramación aumenta de 10 a 15 veces en comparación con los cuatro factores lentivíricos solos (Subramanyam et al (2011)). También se ha descubierto que ciertos miARN pueden reprogramar células con alta eficiencia sin la presencia de los factores de Yamanaka.

(iii) PiggyBac - PiggyBac es un elemento genético móvil (transposón) que, en presencia de una transposasa, puede integrarse en sitios cromosómicos TTAA y posteriormente escindirse del genoma tras la reexpresión de la transposasa. Cuando se clonan en un vector piggyBac y se cotransfecta en MEF, los factores de Yamanaka pueden reprogramar las células 14-25 días después de la transfección (Kaji et al (2009); Woltjen et al (2009)). El vector piggyBac puede escindirse de las iPSC tras la reexpresión de la transposasa.

(iv) Vectores de minicírculo - Los vectores de minicírculo son vectores mínimos que contienen solo el promotor eucariota y el o los ADNc que se expresarán. Un vector de minicírculo Lin28, GFP, Nanog, Sox2 y Oct4 expresado en células estromales adiposas humanas es capaz de reprogramar las células (Narsinh et al (2011)). (v) Plásmidos episómicos - La expresión transitoria de factores de reprogramación como plásmidos episómicos permite la generación de iPSC. Por ejemplo, los vectores oriP/EBNA pueden construirse con los factores de Yamanaka más Lin28 en un casete y otro vector oriP/EBNA que contiene el antígeno T grande de SV40 (Chuo et al (2011)). Se ha demostrado que estos vectores se expresan en sangre de cordón CD34+, sangre periférica y células mononucleares óseas en medios suplementados con butirato de sodio, dando como resultado colonias de iPSC en 14 días. Los plásmidos transfectados finalmente se pierden.

El experto en la materia también estará familiarizado con métodos complementarios que se sabe que mejoran la eficiencia de programación de las células. Por ejemplo, incluso cuando se usa el mismo método, puede haber variabilidad en la eficiencia de iPSC entre células. Se ha demostrado que diversas moléculas pequeñas mejoran la eficiencia de la reprogramación (Tabla 4).

Tabla 4

Varios mecanismos conocidos permiten que estas moléculas faciliten la reprogramación incluyendo la inhibición de la desacetilación de histonas (Mali et al (2010); Huangfu et al (2008)), el bloqueo de las rutas de señalización de TGFp y MEK (Lin et al (2009); Ichida et al (2009)), la potenciación de la función de modificadores epigenéticos (Esteban et al (2010)), la inhibición de la ruta R^oC^k(Noggle et al (2011)) y la inducción de glucólisis (Zhu et al (2010)). Entre estas pequeñas moléculas, los inhibidores de la histona desacetilasa ácido valproico y butirato de sodio son los más comúnmente usados en los protocolos de reprogramación. También debe tenerse en cuenta que el cultivo de células en oxígeno al 5 % durante el proceso de reprogramación también puede aumentar la eficiencia de la derivación de iPSC (Yoshida et al (2009)). Para las células que son particularmente difíciles de reprogramar, la adición de una pequeña molécula y el cultivo en condiciones hipóxicas pueden producir mejoras. Otra opción es usar un medio acondicionado con células madre embrionarias (ESCM) para inducir la expresión de factores de reprogramación endógenos (Balasubramanian et al (2009)). La eficiencia puede mejorarse además con la adición de ácido valproico. Esta estrategia también puede usarse para mejorar la capacidad de los factores de reprogramación introducidos de manera exógena para aumentar la eficiencia de la reprogramación.

Los métodos para generar o preparar HSC son bien conocidos por la persona experta en la materia. Las HSC pueden obtenerse mediante extracción directa de la médula ósea o de la sangre después de que las HSC se liberen de la médula ósea después de, por ejemplo, tratamiento con moléculas específicas tales como GM-CSF. A continuación, las HSC pueden purificarse a través de la expresión de CD34 en la membrana plasmática mediante, por ejemplo, perlas magnéticas recubiertas con anti-CD34 o clasificación celular mediante citometría de flujo después de marcar con anti CD34 fluorescente. Estas HSC purificadas de esta manera pueden inducirse a la diferenciación de células T usando el sistema OP 9/OP9 DL-L1 descrito en el Ejemplo 3 y las Figuras 3 - 10 inclusive.

La referencia a la célula madre, en particular iPSC o HSC, siendo "capaz" de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un determinante antigénico debe entenderse como una referencia a una célula que bien transcribe y traduce, o bien tiene la capacidad de, transcribir y traducir los genes TCR y después ensamblar el heterodímero TCR como un receptor funcional en la superficie celular. Como apreciaría la persona experta, en la mayoría de las situaciones, una célula madre tal como una iPSC no expresará, en su forma indiferenciada, un TCR. Generalmente se espera que la expresión de TCR se produzca una vez que se haya inducido la diferenciación dirigida a lo largo del linaje de células T. La célula puede ser una que, con o sin modificación genética CAR, pueda inducirse a diferenciarse a una célula T que exprese un TCR funcional. Debe entenderse que la capacidad de la célula para expresar un TCR de una especificidad particular puede habilitarse por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la célula puede haber sido transfectada con genes que codifican las dos cadenas de TCR (por ejemplo, cadena a y p) que, cuando se expresan, se asociarán para formar el heterodímero de TCR. Como alternativa, la célula madre puede ser una que se haya generado a partir de una célula T, un timocito u otra célula en la cual se han reorganizado los genes TCR. Se ha determinado que una iPSC que se ha generado a partir de dicha célula, si se dirige a diferenciarse a una célula T CD4+ o CD8+ en condiciones apropiadas de cultivo celular, expresará la misma especificidad de antígeno TCR que la célula T somática de la que derivó la iPSC. Aún de mayor importancia, y como se analiza con más detalle en lo sucesivo en el presente documento, es que se ha determinado que con o sin transfección de iPSC o HSC con uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más CAR, o las cadenas a y p de un TCR específico de antígeno/MHC de clase I, el linfocito T diferenciado del mismo es capaz de expresar de forma estable tanto un TCR funcional como uno o más CAR (y opcionalmente uno o más receptores de unión a antígeno) y, por lo tanto, está dirigido a dos o más determinantes antigénicos distintos. Por consiguiente, dicha célula madre se considera "capaz" de diferenciarse a una célula T y expresar el TCR requerido sobre la base de que si la iPSC o HSC se proporciona con la señal de diferenciación apropiada, esto se producirá. En este sentido, dado que la reorganización de los genes TCR es un evento genómico completamente independiente, la elección de la subpoblación de células T a partir de la cual generar la iPSC no tiene por qué ser necesariamente la misma que la subpoblación de células T que se busca producir en última instancia mediante la diferenciación dirigida de la iPSC. Por ejemplo, puede seleccionarse una célula T CD4+ que presente una especificidad de TCR apropiada para generar una iPSC. Sin embargo, una vez que se haya generado la iPSC, el experto en la materia puede buscar dirigir la diferenciación de la iPSC a una célula T CD8+. En este caso, en virtud de la memoria epigenética, la célula T CD8+ recién generada exhibirá la funcionalidad de una célula T CD8+ pero la especificidad de TCR será la de la célula T CD4+ de la que derivó la iPSC. Lo contrario también es cierto.

La referencia a inducir la "transición" de una célula somática, tal como una célula T, a un fenotipo potencial multilinaje, tal como una iPSC, debe entenderse como una referencia a la inducción de cambios genéticos, morfológicos y/o funcionales que se requieren para cambiar un fenotipo somático a un fenotipo multilinaje (pluripotente) del tipo definido en el presente documento.

En la medida en que uno pueda optar por hacer que una iPSC sea capaz de producir un TCR a través de la transfección de la célula con ADN que codifica un TCR, se apreciaría que esta transfección puede producirse en cualquier momento, tal como antes de la generación de la iPSC de la divulgación, posteriormente a la generación de la iPSC o puede producirse simultáneamente con la transfección CAR.

Como se detalla anteriormente en el presente documento, una célula somática, en particular una célula T o timocito, puede inducirse a la transición a una célula madre, que es un estado funcional de potencial de diferenciación multilinaje. Por consiguiente, La referencia a una célula que exhibe "potencial de diferenciación multilinaje" o "potencial multilinaje" debe entenderse como una referencia a una célula que exhibe la potencialidad de desarrollarse a lo largo de más de una ruta de diferenciación somática. Por ejemplo, la célula puede ser capaz de generar una gama limitada de tipos de células somáticas, denominándose habitualmente dichas células pluripotentes o multipotentes. Estas células exhiben el potencial de comprometerse con una gama de linajes más limitada que una célula totipotente, siendo esta última una célula que puede desarrollarse en cualquiera de las direcciones de diferenciación intrínsecamente posibles, incluyendo todos los linajes somáticos y los gametos.

Las células que se denominan clásicamente células "progenitoras" o células "precursoras" entran dentro del alcance de la definición de "potencial de diferenciación multilinaje" sobre la base de que, bajo las condiciones estimulantes adecuadas, pueden dar lugar a células de más de un linaje somático. En la medida en que se haga referencia a "célula madre" en el presente documento en términos de las células generadas por el método descrito, esto debe entenderse como una referencia a una célula que exhibe potencial de diferenciación multilinaje como se define en el presente documento.

La característica importante de la célula madre desvelada es que el potencial de diferenciación multilinaje que exhibe la célula incluye la capacidad de diferenciarse en una célula T y expresar un TCR que exhibe especificidad por un antígeno de interés. Si la especificidad de TCR se induce antes o después de que se genere la célula madre (tal como a través de la transfección de la célula madre con ADN que codifica el TCR de interés) es irrelevante. Debe entenderse que las células madre desveladas en el presente documento abarcan todas las células madre que exhiben el potencial diferenciador requerido, independientemente de cuándo o cómo se haya introducido esa capacidad. Todavía adicionalmente, también debe entenderse que las células madre descritas no necesitan ser totipotentes; pueden exhibir la capacidad de diferenciarse a lo largo de más de un linaje de células somáticas siempre que uno de estos linajes sea un linaje de células T.

Como se detalla anteriormente en el presente documento, las células madre proporcionadas por la presente divulgación están modificadas genéticamente. Por "modificada genéticamente" se entiende que la célula es el resultado de alguna forma de manipulación molecular en relación con la que se observa en el contexto de una célula no modificada correspondiente. La célula madre desvelada puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico y, opcionalmente, comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno. Como se desvela en el presente documento, un ácido nucleico que codifica un receptor, ya sea un receptor de antígeno quimérico o un receptor de unión a antígeno, puede introducirse en una célula madre tal como una iPSC o una HSC, o en una célula (por ejemplo, una célula T) de la que deriva una célula madre; y en ambos casos, la célula madre resultante que comprende el ácido nucleico que codifica el receptor se considera en el presente documento como una célula madre modificada genéticamente. Una célula T diferenciada de una célula madre modificada genéticamente y una célula T diseñada para contener un ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno o CAR modificado genéticamente, también se consideran en el presente documento células T genéticamente modificadas.

La referencia a una "molécula de ácido nucleico" debe entenderse como una referencia tanto al ácido desoxirribonucleico como al ácido ribonucleico del mismo. La molécula de ácido nucleico puede ser cualquier forma adecuada de molécula de ácido nucleico que incluye, por ejemplo, una molécula genómica, de ADNc o de ácido ribonucleico. Con este fin, el término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción de ADN o la traducción de ARN que resulta en la síntesis de un péptido, polipéptido o proteína. Una construcción de ADN, por ejemplo, corresponde a la construcción que puede tratar de transfectarse en una célula para la expresión posterior, mientras que un ejemplo de una construcción de ARN es la molécula de ARN transcrita a partir de una construcción de ADN, cuya construcción de ARN simplemente requiere traducción para generar la proteína de interés. La referencia a "producto de expresión" es una referencia al producto producido a partir de la transcripción y traducción de una molécula de ácido nucleico.

La referencia a "receptor de antígeno quimérico" (también conocido como "receptor de células T artificial", "receptor de células T quimérico" e "inmunorreceptores quiméricos") debe entenderse como una referencia a receptores diseñados que injertan un resto de unión a antígeno en una célula efectora inmunitaria. Normalmente, estos receptores se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en una célula T; con la transfección de su secuencia codificante facilitada por vectores retrovíricos. La forma más común de estas moléculas son las fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales, fusionados a una cadena CD3-zeta transmembrana y endodominio. Tales moléculas dan como resultado la transmisión de una señal de la cadena CD3-zeta en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando las células T expresan esta molécula quimérica, reconocen y destruyen las células diana que expresan el antígeno al que se dirige el scFv. Por ejemplo, para dirigirse a las células B malignas, la especificidad de las células T se ha redirigido utilizando un inmunorreceptor quimérico específico para la molécula del linaje B, CD19.

Las porciones variables de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina generalmente se fusionan mediante un enlazador flexible para formar un scFv. Este scFv suele estar precedido por un péptido señal para dirigir la proteína naciente al retículo endoplásmico y la subsiguiente expresión en la superficie, cuyo péptido señal finalmente se escinde. Un espaciador flexible permite que el scFv se oriente en diferentes direcciones para permitir la unión del antígeno. El dominio transmembrana es generalmente una hélice alfa hidrófoba típica derivada habitualmente de la molécula original del endodominio de señalización que sobresale en la célula y transmite la señal deseada. Por consiguiente, la referencia a un "resto de reconocimiento de antígeno" debe entenderse como una referencia a una porción extracelular del receptor que reconoce y se une a un determinante antigénico de interés, esto es, un elemento de unión específico de diana. El dominio de reconocimiento de antígenos suele ser un scFv. Existen, sin embargo, muchas otras alternativas. Por ejemplo, también se ha usado un resto de reconocimiento de antígenos de cadenas sencillas alfa y beta del receptor de células T nativo (TCR), ya que tienen ectodominios sencillos (por ejemplo, ectodominio CD4 para reconocer células infectadas por VIH) y otros componentes de reconocimiento tales como una citocina enlazada (que conduce al reconocimiento de células que portan el receptor de citoquina). De hecho, cualquier resto que se una a una diana dada con una afinidad suficientemente alta puede usarse como dominio de reconocimiento de antígenos. Dichas moléculas son bien conocidas por el experto en la materia y la selección de una molécula apropiada para su uso estaría dentro de los conocimientos del experto en la técnica. En cuanto al diseño de un receptor de antígeno quimérico, en particular el dominio extracelular, la persona experta puede incluir restos adicionales que sean útiles en términos de efectuar una expresión o funcionamiento eficiente. Por ejemplo, y como se detalló anteriormente, la molécula de ácido nucleico que expresa un CAR puede diseñarse para expresar un péptido señal en el extremo N-terminal del resto de reconocimiento de antígeno. Un péptido señal dirige la proteína naciente al retículo endoplásmico. Esto es necesario si el receptor va a glucosilarse y anclarse en la membrana celular. Puede usarse cualquier secuencia de péptido señal eucariota. Generalmente, se usa un péptido señal unido de forma nativa al amino-terminal (por ejemplo, en un scFv con orientación cadena ligera -enlazador - cadena pesada, se usa la señal nativa de la cadena ligera). En otro ejemplo, el dominio extracelular también puede comprender una región espaciadora que puede usarse para enlazar el dominio de reconocimiento de antígeno al dominio transmembrana. Debe ser lo suficientemente flexible como para permitir que el dominio de reconocimiento de antígenos se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento y la unión del antígeno. La forma más sencilla de una región espaciadora es la región bisagra de IgG1. Las alternativas incluyen la región CH2CH3 de inmunoglobulina y porciones de CD3. Para la mayoría de las construcciones basadas en scFv, la bisagra IgG1 es suficiente. Por consiguiente, el término "espaciador" se refiere a cualquier oligo- o polipéptido que funcione para enlazar el dominio transmembrana al dominio extracelular o, el dominio citoplasmático en la cadena polipeptídica. Un dominio espaciador puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente de 10 a 100 aminoácidos y mucho más preferentemente de 25 a 50 aminoácidos. En otro ejemplo más, puede modificarse la región bisagra para cambiar su longitud y por lo tanto lograr beneficios funcionales adicionales. Por ejemplo, en un CAR tradicional que comprende una bisagra CD8 o CD28, puede dejarse una sola Cisteína (Cys) en la bisagra para estabilizar la dimerización en la superficie de las células T. Por tanto, normalmente se muestran dos scFv (bivalentes). En otro ejemplo, puede sustituirse la Cys (por Ser) de modo que el enlace disulfuro estabilizador no pueda formarse, evitando de este modo la dimerización y, por tanto, la activación prematura. La Cys también puede retirarse por completo. Otro diseño es mostrar solo el dominio VH en un CAR y el dominio VL en otro, por lo tanto, el emparejamiento de Cys alineará el VH/VL para formar un Fv monovalente funcional, que se dirige al antígeno de interés.

El resto de reconocimiento de antígeno del receptor de antígeno quimérico descrito está operativamente unido a un resto de activación de células T. Por "resto de activación de células T" se entiende la subregión del receptor que, después del reconocimiento y la unión del antígeno, es responsable de transmitir la señal a la célula T para permitir su activación y la inducción del mecanismo efector. El resto de activación de células T de un CAR se encuentra generalmente dentro del dominio intracelular (o "endodominio") del CAR; por tanto, el dominio intracelular de una molécula CAR también comprende típicamente, o es, su "dominio de señalización intracelular". Un componente de endodominio comúnmente usado es el dominio intracelular de CD3-zeta que contiene 3 ITAM. Esto transmite una señal de activación a la célula T después de que se une el antígeno. Es posible que CD3-zeta no proporcione una señal de activación completamente competente y es deseable una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, pueden usarse CD28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia, o los tres pueden usarse juntos. Debe entenderse que este dominio de señalización intracelular del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria, preferentemente una célula T en la cual se ha expresado el CAR. La expresión "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de la proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula a realizar una función especializada. Aunque habitualmente puede emplearse todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar el dominio entero. En la medida en que se use una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada se puede usar en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de la función efectora. La expresión "dominio de señalización intracelular" pretende por lo tanto incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

Los ejemplos preferidos de dominios de señalización intracelular para su uso en un CAR incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de linfocitos T (TCR) y los co-receptores que actúan en concierto para iniciar la transducción de señales después de la activación del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación total del linfocito T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por lo tanto, puede decirse que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de secuencia de señalización citoplasmática: aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias) y aquellas que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplasmáticas secundarias). Las secuencias de señalización citoplasmática primaria regulan la activación primaria del complejo TCR, ya sea de forma estimulante o inhibitoria. Las secuencias de señalización citoplasmática primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que son de uso particular incluyen aquellos derivados de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Se prefiere particularmente que la molécula de señalización citoplásmica en el CAR comprenda una secuencia de señalización citoplasmática derivada de CD3-zeta.

El dominio citoplasmático del CAR puede diseñarse para que comprenda el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio o dominios citoplásmicos deseados útiles en el contexto del cAr de la invención y divulgación. Por ejemplo, el dominio citoplasmático del CAR puede comprender una porción de cadena CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular que no sea un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta de linfocitos eficaz hacia un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, TIM3, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares. Las secuencias de señalización citoplasmática dentro de la porción de señalización citoplasmática del CAR de la invención pueden estar unidas entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un enlazador corto de oligo- o polipéptido, preferentemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud pueden formar el enlace. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado. El dominio citoplasmático puede diseñarse para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28.

Como se detalla anteriormente en el presente documento, el resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido al resto de activación de células T. Por "operativamente unido" se entiende que el resto de reconocimiento de antígeno está enlazado, unido o asociado de otro modo con el resto de activación de células T, de tal manera que tras la unión del resto de reconocimiento de antígeno al determinante antigénico, se induce una señal a través del resto de activación de la célula T para activar la célula T y permitir que se activen sus funciones efectoras. Esto se consigue, por ejemplo, mediante el diseño de un dominio transmembrana.

Puede usarse el dominio transmembrana que está asociado de forma natural con uno de los dominios en el CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana superficial para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. El dominio transmembrana puede derivar de una fuente natural o de una fuente sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Por ejemplo, las regiones transmembrana pueden derivar de (es decir, comprender al menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 o de una inmunoglobulina tal como IgG4. Como alternativa, el dominio transmembrana puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá restos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. Preferentemente un triplete de fenilalanina, triptófano y valina se encontrará en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. Opcionalmente, un enlazador corto de oligo- o polipéptido, preferentemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado. Normalmente, el dominio transmembrana es una hélice alfa hidrófoba que atraviesa la membrana. Generalmente, se usa el dominio transmembrana del componente más próximo a la membrana del endodominio.

La referencia a un "receptor de unión a antígeno" debe entenderse como una referencia a receptores diseñados que están anclados a la superficie celular y se unen a un antígeno. Similar a los receptores de antígenos quiméricos desvelados en el presente documento, los receptores de unión a antígeno desvelados en el presente documento también comprenden un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico. El resto de reconocimiento de antígeno en un receptor de unión a antígeno puede tomar la misma forma y diseñarse de la misma manera que el resto de reconocimiento de antígeno de un receptor de antígeno quimérico, como se describe en el presente documento. También similar a los receptores de antígenos quiméricos desvelados en el presente documento, el resto de reconocimiento antigénico en un receptor de unión a antígeno está operativamente unido (por ejemplo, a través de una secuencia espaciadora tal como una región bisagra) a un dominio transmembrana, de tal manera que el receptor de unión al antígeno esté anclado a la superficie celular. La secuencia espaciadora y el dominio transmembrana en un receptor de unión a antígeno también pueden diseñarse de la misma manera que la secuencia espaciadora y el dominio transmembrana de un receptor de antígeno quimérico, como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, a diferencia de los receptores de antígenos quiméricos, el receptor de unión a antígeno como se define en el presente documento generalmente no es señalizador y puede incluir una secuencia intracelular que carece de un dominio de activación de células T. Dicho receptor de unión a antígeno no señalizador puede unirse a un antígeno pero no desencadena ninguna transducción de señal en las células T y, por lo tanto, también se denomina "receptor de acoplamiento" o "receptor de anclaje". Determinados ejemplos y realizaciones de receptores de unión a antígenos, tales como un receptor de unión a CD47 no señalizador, se describen con más detalle en el presente documento a continuación.

En la Figura 11 se representan ejemplos de construcciones de ácidos nucleicos que codifican un CAR y/o un receptor de unión a antígeno, y secuencias ilustrativas para CAR y receptor de unión a antígeno, así como varios dominios adecuados para su uso en CAR y/o receptores de unión a antígeno se proporcionan en SEQ ID NO: 1-20.

El experto en la materia apreciará que el mecanismo mediante el cual se introducen estas modificaciones genéticas en la célula puede adoptar cualquier forma adecuada que sea bien conocida y comprendida por los expertos en la materia. Por ejemplo, el material genético generalmente se introduce convenientemente en las células mediante el uso de una construcción de expresión.

Una célula capaz de diferenciarse en una célula T que expresa un TCR (es decir, una célula madre tal como una iPSC o HSC) o una célula que expresa un TCR del que puede derivar una célula madre tal como una iPSC, puede transfectarse con una construcción de expresión que codifica CAR. La construcción de expresión puede comprender una o más regiones de ADN que comprenden un promotor operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR y, opcionalmente, una segunda región de ADN que codifica un marcador seleccionable y, opcionalmente, una tercera región de ADN que codifica una proteína suicida. En este sentido, debe apreciarse que puede diseñarse la construcción con uno o más componentes adicionales, tales como un gen suicida, que la persona experta en la materia consideraría útil, como una cuestión de procedimiento de rutina. En el contexto de las células de la presente divulgación, que se proponen para usarse in vivo para tratar pacientes, la capacidad de controlar la destrucción de las células modificadas genéticamente de la divulgación y, por lo tanto, efectuar su eliminación del ambiente in vivo, es altamente deseable. La transferencia adoptiva de las células de la presente divulgación, particularmente en la medida en que puedan dirigirse a antígenos "propios" tales como antígenos tumorales o antígenos expresados en células autorreactivas, o antígenos a los que puede producirse reactividad cruzada con antígenos propios, no está exento de riesgos. En esta situación, pueden producirse resultados similares a la enfermedad de injerto contra hospedador, donde estas células atacan a las células sanas (no enfermas). En el esquema terapéutico general, estos efectos secundarios pueden ser aún más deseables que la destrucción sistémica no específica de tejido sano que es característica de un tratamiento tal como la quimioterapia o la destrucción incontrolada de tejido sano en un trastorno autoinmunitario. No obstante, destruir las células cancerosas es primordial, pero la capacidad de controlar la destrucción de las células de la presente invención y la divulgación es altamente deseable y puede lograrse de forma rutinaria mediante la técnica muy conocida y ampliamente usada de construir un gen suicida inducible en la construcción génica que se introduce en las células madre/T de la presente invención y divulgación.

El promotor puede ser constitutivo o inducible. Cuando la construcción expresa más de una proteína de interés, estas pueden estar bajo el control de promotores separados o pueden estar bajo el control de un solo promotor, tal como se produce en el contexto de un vector bicistrónico que hace uso de una secuencia IRES para facilitar la traducción de más de un producto proteico, en una forma no fusionada, a partir de un solo transcrito de ARN. La construcción puede diseñarse adicionalmente para facilitar el uso del sistema de expresión génica inducible por corte y empalme mediado por recombinasa Cre.

La referencia a una "construcción de expresión" de ácido nucleico debe entenderse como una referencia a una molécula de ácido nucleico que es transmisible a una célula y está diseñada para someterse a transcripción.

Después la molécula de ARN se transcribe a partir de los mismos. En general, las construcciones de expresión también se denominan por varios términos alternativos, cuyos términos se usan ampliamente de manera intercambiable, incluyendo "casete de expresión" y "vector".

Con fines de introducir ácidos nucleicos que codifiquen múltiples receptores, si el receptor es un CAR, un receptor de unión a antígeno o una combinación de los mismos, los ácidos nucleicos que codifican múltiples receptores pueden colocarse en una construcción que se transfecta en una célula. Los ácidos nucleicos que codifican múltiples receptores pueden incluirse en un vector multicistrónico que hace uso de una secuencia IRES para facilitar la traducción de las proteínas de múltiples receptores. Los ácidos nucleicos que codifican receptores múltiples pueden unirse entre sí dentro de una unidad de expresión y marco de lectura, por ejemplo, utilizando un péptido autoescindible (por ejemplo, P2A) de manera que se produzca inicialmente un único polipéptido que comprenda secuencias de receptores múltiples y posteriormente se procese para producir receptores múltiples. Los ácidos nucleicos que codifican receptores múltiples pueden colocarse en construcciones separadas que se usan en la transfección.

La construcción de expresión de la presente divulgación puede generarse mediante cualquier método adecuado incluyendo técnicas recombinantes o sintéticas. Con este fin, la construcción puede construirse a partir de primeros principios, como ocurriría cuando se utiliza un enfoque completamente sintético, o puede construirse modificando apropiadamente un vector existente. Cuando se adopta el último enfoque, la gama de vectores que podrían utilizarse como punto de partida es extensa e incluye, pero no se limitan a:

(I) Plásmidos: Los plásmidos son pequeños trozos de ADN citoplasmático que se replican independientemente, encontrados generalmente en células procariotas, que son capaces de replicación autónoma. Los plásmidos se usan comúnmente en el contexto de la clonación molecular debido a su capacidad para transferirse de un organismo a otro. Los plásmidos pueden permanecer episómicos o pueden incorporarse al genoma de un hospedador. Algunos ejemplos de plásmidos que uno puede utilizar incluyen pBR322 y pUC derivados de bacterias.

(ii) Bacteriófago: Los bacteriófagos son virus que infectan y se replican en bacterias. Por lo general consisten en un núcleo de ácido nucleico encerrado dentro de una capa de proteína (denominada cápside). Dependiendo del tipo de fago, el ácido nucleico puede ser ADN (monocatenario o bicatenario) o ARN (monocatenario) y pueden ser lineales o circulares. Los fagos pueden ser filamentosos, poliédricos o poliédricos y con cola, las colas tubulares a las que se unen una o más fibras tubulares de la cola. Los fagos generalmente pueden acomodar fragmentos más grandes de ADN extraño que, por ejemplo, los plásmidos. Los ejemplos de fagos incluyen, pero no se limitan a fagos lambda, bacteriófago P1 y fagos T-even (por ejemplo T4) de E. coli.

(iii) Baculovirus: Estos son cualquiera de un grupo de virus de ADN que se multiplican solo en invertebrados y generalmente se clasifican en la familia Baculoviridae. Su genoma consiste en ADN circular bicatenario.

(iv) Virus de mamíferos: Algunos ejemplos de tales virus que infectan a los mamíferos, incluyen lentivirus, virus sendai, retrovirus y virus vaccinia.

(v) Cromosomas artificiales: Cromosomas artificiales tales como cromosomas artificiales de levadura o cromosomas artificiales bacterianos.

(vi) Vectores híbridos tales como cósmidos, fagémidos y fásmidos: Los cósmidos derivan generalmente de plásmidos pero también comprenden sitios cos para el fago lambda, mientras que los fagémidos representan un vector fago-plásmido quimérico. Los fásmidos generalmente también representan una quimera plásmido-fago, pero se definen en virtud del hecho de que contienen orígenes funcionales de replicación de ambos. Por lo tanto, los fásmidos pueden propagarse como plásmido o fago en una cepa hospedadora apropiada.

(vii) Vectores disponibles en el mercado que son ellos mismos generados de forma completa sintéticamente o son versiones modificadas de vectores naturales, tales como los vectores víricos.

El experto en la materia entenderá que la selección de un vector apropiado para la modificación, en la medida en que uno elija hacer esto en lugar de generar sintéticamente una construcción, dependerá de una serie de factores incluyendo el uso final que se le dará a la célula modificada genéticamente. Por ejemplo, cuando va a administrarse la célula in vivo a un ser humano, puede ser menos deseable utilizar determinados tipos de vectores, tales como los vectores víricos. Además, es necesario considerar la cantidad de ADN que se busca introducir en la construcción. Generalmente se entiende que determinados vectores se transfectan más fácilmente en determinados tipos de células. Por ejemplo, la gama de tipos de células que pueden actuar como hospedadores de un plásmido dado puede variar de un tipo de plásmido a otro. En todavía otro ejemplo más, cuanto más grande sea el inserto de ADN que se requiera insertar, más limitada será la elección del vector a partir del cual se genera la construcción de expresión. Con este fin, el tamaño del ADN insertado puede variar dependiendo de factores tales como el tamaño de la secuencia de ADN que codifica la proteína de interés, el número de proteínas que se buscan expresar, el número de marcadores de selección que se utilizan y la incorporación de características tales como regiones polienlazadoras de linealización y similares.

La construcción de expresión desvelada en el presente documento puede ser de cualquier forma incluyendo circular o lineal. En este contexto, una secuencia de nucleótidos "circular" debe entenderse como una referencia a la porción de secuencia de nucleótidos circular de cualquier molécula de nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede ser completamente circular, tal como un plásmido, o puede ser parcialmente circular, tal como la porción circular de una molécula de nucleótido generada durante la replicación del círculo rodante (esto puede ser relevante, por ejemplo, cuando una construcción se está replicando inicialmente, antes de su introducción a una población celular, mediante este tipo de método en lugar de mediante un sistema de clonación celular). En este contexto, la secuencia de nucleótidos "circular" corresponde a la porción circular de esta molécula. Una secuencia de nucleótidos "lineal" debe entenderse como una referencia a cualquier secuencia de nucleótidos que esté en forma esencialmente lineal. La secuencia lineal puede ser una molécula de nucleótidos lineal o puede ser una porción lineal de una molécula de nucleótidos que también comprende una porción no lineal tal como una porción circular. Un ejemplo de una secuencia lineal de nucleótidos incluye, pero no se limita a, una construcción derivada de plásmido que se ha linealizado para facilitar su integración en los cromosomas de una célula hospedadora o una construcción que se ha generado sintéticamente en forma lineal. Con este fin, también debe entenderse que la configuración de la construcción desvelada puede permanecer constante o no. Por ejemplo, una construcción derivada de plásmido circular puede transfectarse en una célula donde permanece un episoma circular estable que sufre replicación y transcripción en esta forma. Sin embargo, en otro ejemplo, la construcción puede ser una que se transfecte en una célula en forma circular pero sufra una linealización intracelular antes de la integración cromosómica. Esta no es necesariamente una situación ideal, ya que tal linealización puede producirse de una manera aleatoria y potencialmente escindir la construcción en una región crucial, volviéndola ineficaz.

Las moléculas de ácido nucleico que se utilizan en el método de la presente divulgación son derivables de cualquier fuente humana o no humana. Las fuentes no humanas contempladas incluyen primates, animales de ganado (por ejemplo, ovejas, cerdos, vacas, cabras, caballos, burros), animal de prueba de laboratorio (por ejemplo, ratones, hámsteres, conejos, ratas, cobayas), animal de compañía doméstico (por ejemplo, perros, gatos), pájaros (por ejemplo, pollo, gansos, patos y otras aves de corral, aves de caza, emús, avestruces) animales salvajes o domesticados cautivos (por ejemplo, bueyes, canguros, dingos), reptiles, peces, insectos, organismos procariotas o ácidos nucleicos sintéticos.

Debe entenderse que las construcciones que codifican el receptor de esta divulgación pueden comprender material de ácido nucleico de más de una fuente. Por ejemplo, considerando que la construcción puede tener su origen en un microorganismo particular, en la modificación de esa construcción para introducir las características definidas en el presente documento, puede introducirse material de ácido nucleico de otras fuentes de microorganismos. Estas fuentes pueden incluir, por ejemplo, ADN vírico o bacteriano (por ejemplo, ADN IRES), ADN de mamífero (por ejemplo, el ADN que codifica un CAR) o ADN sintético (por ejemplo, para introducir sitios de endonucleasa de restricción específicos). Todavía adicionalmente, el tipo de célula en el cual se propone expresar la construcción puede ser diferente de nuevo en el sentido de que no corresponde al mismo organismo que todo o parte del material de ácido nucleico de la construcción. Por ejemplo, no obstante, una construcción que consiste en ADN derivado esencialmente de bacterias y virus puede expresarse en las células madre de mamífero contempladas en el presente documento.

Esta divulgación usa una construcción de ADN que comprende secuencias de un CAR, en donde la secuencia comprende la secuencia de ácido nucleico de un resto de unión a antígeno unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico de un dominio intracelular. Por ejemplo, un dominio intracelular que puede usarse en el CAR incluye, pero no se limita al dominio intracelular de CD3-zeta. El dominio intracelular de un CAR puede incluir el dominio intracelular de CD3-zeta en un enlace operativo al dominio intracelular de CD28. El dominio intracelular de un CAR puede incluir los dominios intracelulares de CD3-zeta, CD28 y OX40, en enlace operativo entre sí.

Los vectores derivados de retrovirus tales como el lentivirus son un ejemplo de vectores adecuados para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Otros virus adecuados incluyen virus Sendai y virus Vaccinia. El vector debería ser adecuado para la replicación e integración en eucariotas. Los vectores de clonación típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada. La tecnología de vectores víricos es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus, que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios convenientes de endonucleasa de restricción y uno o más marcadores seleccionables, (por ejemplo, el documento WO 01/96584; el documento WO 01/29058; y la pat. de EE.UU. N.° 6.326.193).

Se han desarrollado varios sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de administración de genes. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y puede empaquetarse en partículas retrovíricas usando técnicas conocidas en la materia. El virus recombinante puede aislarse después y administrarse a las células madre. Se conocen varios sistemas retrovíricos en la técnica.

Los elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de iniciación transcripcional. Normalmente, estos se localizan en la región de 30-110 pb en dirección 5' del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que varios promotores contienen elementos funcionales en dirección 3' del sitio de inicio también. El espaciado entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven uno con respecto al otro. En el promotor de timidina quinasa (tk), el espaciado entre los elementos promotores puede aumentarse a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción.

Un ejemplo de un promotor adecuado es la secuencia del promotor de citomegalovirus (CMV) temprano inmediato. Esta secuencia del promotor es una secuencia del promotor constitutiva fuerte capaz de dirigir altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica unida operativamente a la misma. Otro ejemplo de un promotor adecuado es el factor de crecimiento de alargamiento - la (EF-la). Sin embargo, también pueden usarse otras secuencias promotoras constitutivas, incluyendo, pero no limitado al promotor temprano del virus del simio 40 (SV40), virus de tumor mamario de ratón (MMTV), promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), promotor MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, pero sin limitación, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina quinasa. Además, la construcción no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. También se contempla el uso de promotores inducibles. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia de polinucleótido de CAR a la cual está unida operativamente cuando se desea dicha expresión, o inactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

Para evaluar la expresión de un polipéptido CAR o porciones del mismo, el vector de expresión que se introducirá en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células que expresan de la población de células que se busca transfectar o infectar a través de vectores víricos. En otros aspectos, el marcador seleccionable puede transportarse en una pieza separada de ADN y puede usarse en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores pueden estar flanqueados con secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células hospedadoras. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares. También puede incluirse una etiqueta de epítopo en el dominio extracelular de una molécula CAR, tales como el polipéptido corto c-myc o FLAG comúnmente usados, preferentemente colocado dentro de la región de la bisagra, para identificar la expresión de CAR mediante agentes de dirección específicos de epítopo tales como anticuerpos usados en combinación, por ejemplo, con citometría de flujo.

Los genes indicadores se usan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen indicador es un gen que no está presente o expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen indicador se analiza en un momento adecuado después de que el ^aDⁿse haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican la luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada, o el gen de la proteína verde fluorescente (por ejemplo., Ui-Tei et al, 2000 FEBS Letters 479: 79 82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse usando técnicas conocidas o pueden obtenerse en el mercado. En general, la construcción con la mínima región flanqueante en 5' que muestra el nivel de expresión más alto del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden estar vinculadas a un gen indicador y pueden usarse para evaluar la capacidad de los agentes de modular la transcripción impulsada por el promotor. Los expertos en la materia apreciarán que puede incorporarse un indicador tal como eGFP (proteína fluorescente verde mejorada) como una extensión de polipéptido C-terminal a un CAR, separados por un péptido que se autoescinde tal como P2A, que liberará el indicador como eGFP intracelularmente.

Los métodos para introducir y expresar genes en una célula se conocen en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, el vector puede introducirse fácilmente en una célula hospedadora por medios físicos, medios químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula hospedadora es la transfección con fosfato de calcio.

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos, se han convertido en el método más ampliamente usado para insertar genes en mamíferos, por ejemplo, en células humanas. Otros vectores víricos pueden derivar de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Véase, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. N.° 5.350.674 y 5.585.362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como los complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ilustrativo para su uso como vehículo de administración es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial).

En el caso de que se busque utilizar un sistema de administración no vírico, un vehículo de administración ilustrativo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedadora. En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado a un lípido. El ácido nucleico asociado a un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, fijado a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto al liposoma como al oligonucleótido, atrapado en un liposoma, formando un complejo con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela o asociado de otra manera a un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no están limitadas a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas o con una estructura "colapsada". También pueden simplemente intercalarse en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos naturales o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotitas de grasa que se dan de manera natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Los lípidos adecuados para su uso pueden obtenerse de fuentes comerciales. Por ejemplo, la dimiristil fosfatidilcolina ("DMPC") puede obtenerse de Sigma, St. Louis, MO; el fosfato de dicetilo ("DCP") puede obtenerse de K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Choi") puede obtenerse de Calbiochem-Behring; el dimiristilfosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos pueden obtenerse de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden almacenarse a aproximadamente -20 °C. El cloroformo se usa como el único disolvente ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una diversidad de vehículos lipídicos sencillos y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos cerrados. Los liposomas pueden caracterizarse por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se auto reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al (1991)). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas de lípidos. También se contemplan los complejos de lipofectaminaácido nucleico.

Independientemente del método usado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula hospedadora, para confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula hospedadora, puede realizarse una diversidad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR o detectando la presencia o ausencia de un péptido en particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y transferencias Western).

El TCR y CAR y los receptores de unión a antígenos en algunos ejemplos, de las células se dirigen cada una a un determinante antigénico. La referencia a "determinante antigénico" debe entenderse como una referencia a cualquier molécula proteica o no proteica expresada por una célula que se busca que se marque como diana por las células T que expresan el receptor de la presente invención y divulgación. Se apreciará que estas son moléculas que pueden ser moléculas "propias" en el sentido de que normalmente se expresan en el cuerpo de un paciente (como se esperaría en algunas células tumorales o células autorreactivas) o pueden ser moléculas no propias como sería de esperar cuando una célula está infectada con un microorganismo (por ejemplo, proteínas víricas). También debe entenderse que el antígeno no se limita a antígenos (propios o no) que son naturalmente capaces de provocar una respuesta inmune de células T o B. En su lugar, la referencia a "antígeno" o "determinante antigénico" es una referencia a cualquier molécula proteica o no proteica que se busca que se marque como diana. Como se detalla anteriormente en el presente documento, la molécula diana puede ser una a la que el sistema inmunitario sea naturalmente tolerante, tal como un antígeno tumoral o un antígeno de células inmunitarias autorreactivas. Sin embargo, puede ser deseable (incluso a la luz de posibles daños colaterales) dirigirse, no obstante, a este antígeno, por ejemplo, para minimizar los efectos secundarios potencialmente aún más graves que podrían observarse con un tratamiento sistémico y altamente inespecífico, tales como quimioterapia o inmunosupresión, o para reducir la duración del tratamiento mediante un tratamiento altamente dirigido y/o para maximizar la posibilidad de destruir todas las células no deseadas. Preferentemente, la molécula se expresa en la superficie celular.

El experto en la materia entenderá que en el contexto de la unión de TCR, el determinante antigénico tomará la forma de un péptido derivado de un antígeno, cuyo péptido se expresa en el contexto del MHC I o MHC II. En el contexto del CAR, dado que el diseño de este receptor se basa en el uso de un dominio de unión de región variable de inmunoglobulina, el receptor reconocerá un epítopo presente en la forma nativa del antígeno. El epítopo puede ser lineal o conformacional. Debe entenderse que el determinante antigénico puede ser cualquier molécula expresada por la célula que se busca que se dirija. Esto es, la molécula a la que se dirige puede expresarse exclusivamente por la célula diana o también puede expresarse también por células no diana. El determinante antigénico puede ser un determinante antigénico no propio o un determinante antigénico que de otro modo se expresa exclusivamente, o en un nivel significativamente más alto que en las células normales, por las células que se busca que sean la diana. Sin embargo, como se analizó anteriormente en el presente documento, dependiendo de la afección o enfermedad que se va a tratar, puede que no siempre sea posible identificar y dirigirse a un determinante antigénico no propio.

La referencia en el presente documento a los receptores TCR/CAR que están dirigidos a un "primer" determinante antigénico y a un "segundo" determinante antigénico debe entenderse como una referencia al hecho de que los receptores están dirigidos a dos regiones epitópicas diferentes. En este sentido, sin embargo, debe entenderse que los receptores pueden dirigirse a epítopos en dos moléculas de superficie celular completamente diferentes o los receptores pueden dirigirse a dos regiones/epítopos diferentes de la misma molécula de superficie celular. En los ejemplos en los cuales se hace referencia a un ^tC^rjunto con múltiples CAR, o cuando se hace referencia a un TCR con uno o más CAR y uno o más receptores de unión a antígenos, debe entenderse que cada receptor está dirigido a un determinante antigénico, y los determinantes antigénicos son preferentemente diferentes entre sí, es decir, los determinantes antigénicos correspondientes a diferentes regiones epitópicas de la misma o diferentes moléculas. También se desvela en el presente documento una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o una célula T diferenciada de la misma, cuya célula expresa al menos un haplotipo de HLA homocigótico, es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende al menos una (es decir, una o más) molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T y, opcionalmente, comprende además un ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno dirigido a un tercer determinante antigénico, y en donde los determinantes antigénicos se seleccionan de antígenos tumorales, antígenos de microorganismos o antígenos de células inmunitarias autorreactivas.

La célula madre puede ser una iPSC. La célula madre puede ser una HSC.

El TCR puede ser un TCR ap.

La célula madre puede ser una iPSC derivada de una célula T o timocito, preferentemente una célula T CD8+ o un timocito.

Como apreciaría la persona experta, la identificación de antígenos que son exclusivos de los tumores es un área de investigación importante, pero respecto de la cual ha habido un progreso limitado. Dado que las células tumorales suelen ser células propias, (en oposición a, por ejemplo, tumores derivados de tejidos de trasplante), se da el caso de que los antígenos que expresan no son solo autoantígenos, sino que es probable que también se expresen por las células no neoplásicas del tejido del que deriva el tumor. Esta es claramente una situación menos que ideal debido a los efectos secundarios (en términos de destrucción de tejido no neoplásico) que pueden surgir cuando un régimen de tratamiento antineoplásico se dirige a dicho antígeno, pero es inevitable. No obstante, se han realizado algunos avances en términos de identificación de antígenos tumorales diana que, incluso si no se expresan exclusivamente por células tumorales, se expresan a niveles más bajos o de otra manera con menos frecuencia en células no neoplásicas.

La selección del resto de unión a antígeno dependerá del tipo particular de cáncer a tratar. Los antígenos tumorales son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, MAGE, LMP-2, CD19, CD20, WT1, antígeno asociado a glioma MART-1, antígeno carcinoembrionario (CEA), gonadotropina coriónica humana p, glucoproteína 72 asociada a tumor (TAG 72), alfafetoproteína (AFP), AFP sensible a lectina, tiroglobulina, RA^gE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilo esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno prostático específico (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prosteína, PSMA, Her2/neu, survivina y telomerasa, antígeno 1 de tumor de carcinoma prostático (PCTA-1), ELF2M, elastasa de neutrófilos, ephrinB2, c D22, factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina. El CD47 (receptor de "no me comas") también es una diana tumoral porque a menudo se expresa altamente en las células cancerosas, en comparación con las células normales, y evita que estas células cancerosas sean atacadas por células del sistema inmunológico, incluyendo, en particular, macrófagos eliminadores.

El antígeno tumoral puede comprender uno o más epítopos asociados a un tumor maligno. Los tumores malignos expresan una cantidad de proteínas que pueden servir como antígenos diana para un ataque inmunitario. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a antígenos específicos de tejido tales como MART-1, WT-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa ácida prostática (PAP) y antígeno prostático específico (PSA) en cáncer de próstata. Otras moléculas diana pertenecen al grupo de moléculas relacionadas con la transformación, tales como el oncogén HER-2/Neu/ErbB-2. Otro grupo de antígenos diana son los antígenos onco-fetales, tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA). En el linfoma de células B, el idiotipo de inmunoglobulina específica de tumor constituye un antígeno de inmunoglobulina verdaderamente específico de tumor que es único para el tumor individual. Los antígenos de diferenciación de células B tales como CD 19, CD20 y CD37 son otros candidatos para antígenos diana en el linfoma de células B.

Los ejemplos no limitantes de antígenos incluyen los siguientes: Antígenos de diferenciación tales como MART-1/MelanA (MART-I), gpIOO (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos multilinaje específicos de tumor tales como M^aG^e-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antígenos embrionarios sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorales únicos resultantes de translocaciones cromosómicas; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; y antígenos víricos, tales como los antígenos del virus Epstein Barr EBVA y los antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH). Otros antígenos grandes, basados en proteínas incluyen CD47, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p1 85erbB2, p180erbB-3, cMet, nm-23Hl, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27. 29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, proteína de unión a TA-90\Mac-2\proteína asociada a la ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS. Las células de la presente invención y divulgación están diseñadas para dirigirse a múltiples, es decir, dos o más, determinantes antigénicos. Como se detalla en el presente documento, los determinantes antigénicos múltiples pueden ser, o incluir, múltiples epítopos de una molécula, o epítopos de múltiples moléculas completamente distintas. La selección de qué determinantes antigénicos múltiples deben marcarse como diana y, además, si deben marcarse como diana por el TCR o el CAR está dentro del conocimiento del experto en la materia. Las células pueden diseñarse para eliminar las células tumorales y los TCR/CAR se dirigen a los antígenos tumorales, en particular TAG 72, MAGE y WT1. Las células pueden diseñarse para eliminar células inmunes autorreactivas y los TCR/CAR se dirigen a receptores idiotípicos de células T o células B.

Se desvela además una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico tumoral y comprende una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más receptores de antígeno quimérico, en donde cada receptor de antígeno quimérico comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico de tumor, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T y en donde los determinantes antigénicos se seleccionan de TAG 72, CD47, CD19, WT-1, MAGE y EBVLMP2.

La célula modificada genéticamente puede dirigirse a TAG72 y WT-1. El CAR puede dirigirse a TAG72 y CD47 y el TCR puede dirigirse a WT-1.

La célula madre puede ser una iPSC. La célula madre puede ser una HSC.

El TCR puede ser un TCR ap.

La célula madre (tal como iPSC) puede derivar de una célula T o timocito, preferentemente una célula T CD8+ o un timocito.

En la medida en que las células se dirijan al tratamiento de neoplasias, se ha desarrollado una amplia gama de CAR para atacar antígenos tumorales conocidos. Un resumen no limitante que ejemplifica algunos de estos CAR, junto con la estructura del receptor, se proporciona en la Tabla 5, a continuación:

Tabla 5

Antígeno diana Neoplasia asociada Tipo de receptor

Receptor de a-folato Cáncer de ovario ScFv-Fc£ RIyCAIX

CAIX Carcinoma de células renales ScFv-Fc£ RIy

CAIX Carcinoma de células renales ScFv-Fc£ RI^y

CD19 Neoplasias malignas de células B ScFv-CD3Z (EBV)

CD19 Neoplasias malignas de células B, CLL ScFv-CD3Z

CD19 B-ALL ScFv-CD28-CD3Z

CD19 ALL CD3Z (EBV)

CD19 ALL post-HSCT ScFv-CD28-CD3Z

CD19 Leucemia, linfoma, CLL ScFv-CD28-CD3Z frente a CD3Z CD19 Neoplasias malignas de células B ScFv-CD28-CD3Z

CD19 Neoplasias malignas de células B post-TCMH ScFv-CD28-CD3Z

CD19 Linfoma folicular refractario ScFv-CD3Z

CD19 B-NHL ScFv -CD3Z

CD19 Neoplasias linfoides de linaje B post-UCBT ScFv-CD28-CD3Z

CD19 CLL, B-NHL ScFv-CD28-CD3Z

CD19 ^{Neoplasias malignas de células}B, CLL, B-_NHLScFv-CD28-CD3Z

CD19 ALL, linfoma ScFv-41BB-CD3Z frente a CD3Z CD19 ALL ScFv-41BB-CD3Z

(continuación)

Antígeno diana Neoplasia asociada Tipo de receptor

CD19 Neoplasias malignas de células B ScFv-CD3Z (Gripe MP-1) CD19 Neoplasias malignas de células B ScFv-CD3Z (VZV)

CD20 Linfomas ScFv-CD28-CD3Z

CD20 Neoplasias malignas de células B ScFv-CD4-CD3Z

CD20 Linfomas de células B ScFv-CD3Z

CD20 Linfoma de células del manto ScFv-CD3Z

CD20 ^{Linfoma de células del manto, B-NHL}

_indolenteCD3 Z /CD137/CD28 CD20 linfomas de células B indolentes ScFv-CD28-CD3Z

CD20 Linfomas de células B indolentes ScFv-CD28-41BB-CD3Z CD22 Neoplasias malignas de células B ScFV-CD4-CD3Z

CD30 Linfomas ScFv-Fc£ RIy

CD30 Linfoma de Hodgkin ScFv-CD3Z (EBV)

CD33 AML ScFv-CD28-CD3Z

CD33 AML ScFv-41BB-CD3Z CD44v7/8 Carcinoma cervical ScFv-CD8-CD3Z

CEA Cáncer de mama ScFv-CD28-CD3Z

CEA Cáncer colorrectal ScFv-CD3Z

CEA Cáncer colorrectal ScFv-FceRlY

CEA Cáncer colorrectal ScFv-CD3Z

CEA Cáncer colorrectal ScFv-CD28-CD3Z

EGP-2 Neoplasias múltiples scFv-CD3Z

EGP-2 Neoplasias múltiples scFv-Fc£ RIy

EGP-40 Cáncer colorrectal scFv-Fc£ RIy

erb-B2 Cáncer colorrectal CD28/4-1BB-CD3Z erb-B2 Mama y otros ScFv-CD28-CD3Z

erb-B2 Mama y otros ScFv-CD28-CD3Z (Gripe) erb-B2 Mama y otros ScFv-CD28mut-CD3Z erb-B2 Cáncer de próstata ScFv-Fc£RlY

erb-B 2,3,4 Mama y otros Heregulina-CD3Z

erb-B 2,3,4 Mama y otros ScFv-CD3Z

FBP Cáncer de ovario ScFv-Fc£RlY

FBP Cáncer de ovario ScFv-Fc£ RIy (aloantígeno) Receptor de acetilcolina

_fetalRabdomiosarcoma ScFv-CD3Z

GD2 Neuroblastoma ScFv-CD28

GD2 Neuroblastoma ScFv-CD3Z

GD2 Neuroblastoma ScFv-CD28-OX40-CD3Z GD2 Neuroblastoma ScFv-CD3Z (VZV)

GD3 Melanoma ScFv-CD3Z

Her2/neu Meduloblastoma ScFv-CD3Z

Her2/neu Neoplasia de pulmón ScFv-CD28-CD3Z Her2/neu Osteosarcoma avanzado ScFv-CD28-CD3Z Her2/neu Glioblastoma ScFv-CD28-CD3Z

IL-13R-a2 Glioma IL-13-CD28-4-1BB-CD3Z IL-13R-a2 Glioblastoma IL-13-CD3Z

(continuación)

Antígeno diana Neoplasia asociada Tipo de receptor

IL-13R-a2 Meduloblastoma IL-13-CD3^

KDR Neovasculatura tumoral S_cF_v-F_ceRI_y

cadena ligera k Neoplasias malignas de células B ScFv-CD3Z

cadena ligera k (B-NHL, CLL) ScFv-CD28-CD3Z frente a CD3Z LeY Carcinomas ScFv-Fc£ RIy

LeY Tumores derivados del epitelio ScFv-CD28-CD3Z

Molécula de adhesión Neuroblastoma _{celular L1}ScFv-CD3Z

MAGE-A1 Melanoma ScFV-CD4-Fc£ RIy

MAGE-A1 Melanoma ScFV-CD28-Fc£ RIy Mesotelina Diversos tumores ScFv-CD28-CD3Z

Mesotelina Diversos tumores ScFv-41BB-CD3^

Mesotelina Diversos tumores ScFv-CD28-41BB-CD3Z Células infectadas por

_{CMV murino}CMV murino Ly49H-CD3Z

MUC1 Mama, Ovario ScFV-CD28-OX40-CD3Z Ligandos NKG2D Diversos tumores NKG2D-CD3Z

Antígeno oncofetal (h5T4) Diversos tumores ScFV-CD3Z (vacunación) PSCA Carcinoma de próstata ScFv-b2c-CD3Z

PSMA Vasculatura de próstata/tumor ScFv-CD3Z

PSMA Vasculatura de próstata/tumor ScFv-CD28-CD3Z

PSMA Vasculatura de próstata/tumor ScFv-CD3Z

^{TAA marcado como diana}Diversos tumores ^{FceRI-CD28-CD3Z (+ a-TAA IgE} _{por mAb IgE mAb)}

TAG-72 Adenocarcinomas scFv-CD3Z

VEGF-R2 Neovasculatura tumoral scFv-CD3Z

Un CAR puede comprender un dominio de reconocimiento de antígeno que comprende un scFv dirigido a CD19 o TAG-72, y una región bisagra (tallo) y una región transmembrana, ambas derivadas de CD28 o CD8, y un endodominio citoplásmico que también deriva de CD28 o CD8 y comprende un resto de activación de células T. El CAR puede incluir una proteína indicadora (tal como EGFP) como extensión polipeptídica C-terminal, unidos por un polipéptido P2A autoescindible para liberar EGFP después de la traducción. Véase, por ejemplo, las Figuras 11 y 14. Se ha determinado además que las células de la presente invención y divulgación se vuelven particularmente eficaces si están diseñadas para expresar un receptor de unión a antígeno no señalizador, por ejemplo, una molécula de unión a CD47 que es incapaz de efectuar la transducción de señales. La expresión de una molécula de unión a CD47 en la superficie celular ancla la célula a la célula neoplásica a la que se dirige, facilitando de esta manera una interacción mejorada del TCR y el CAR con sus respectivos ligandos. En términos del tratamiento de tumores sólidos, en particular, la mayor estabilidad y afinidad de unión de la interacción de la célula permite mejores resultados funcionales, en términos de destrucción de células neoplásicas, en relación con una célula que no expresa la molécula de unión a CD47.

También se desvela una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende (i) una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T y (ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno no señalizador, tales como un receptor de unión a CD47 no señalizador. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

CD47 (también conocido como proteína asociada a integrina) es una proteína transmembrana que en humanos está codificada por el gen CD47. c D47 pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. CD47 está implicado en una diversidad de procesos celulares, incluyendo apoptosis, proliferación, adhesión y migración. Adicionalmente, juega un papel clave en las respuestas inmunitarias y angiogénicas. CD47 se expresa de forma ubicua en células humanas y se ha encontrado que se sobreexpresa en muchas células tumorales diferentes.

CD47 es un receptor de membrana de 50 kDa que comprende un dominio IgV N-terminal extracelular, cinco dominios transmembrana y una cola intracelular C-terminal corta. Hay cuatro isoformas de CD47 empalmadas alternativamente que difieren solo en la longitud de su cola citoplásmica. La forma 2 es la forma más ampliamente expresada que se encuentra en todas las células circulantes e inmunitarias. La segunda isoforma más abundante es la forma 4, que se expresa predominantemente en el cerebro y en el sistema nervioso periférico. Solo los queratinocitos expresan cantidades significativas de la forma 1. Estas isoformas están muy conservadas entre el ratón y el hombre, sugiriendo un papel importante para los dominios citoplásmicos en la función de CD47.

El CD47 es un receptor de trombospondina-1 (TSP-1), una glucoproteína secretada que desempeña un papel en el desarrollo vascular y la angiogénesis. La unión de TSP-1 a CD47 influye en varias funciones celulares fundamentales, incluyendo la migración y adhesión celular, la proliferación celular o la apoptosis, y juega un papel en la regulación de la angiogénesis y la inflamación. CD47 también interactúa con la proteína reguladora de señales alfa (SIRPa), un receptor transmembrana inhibidor presente en las células mieloides. La interacción CD47/SIRPa da lugar a una señalización bidireccional, dando lugar a diferentes respuestas de célula a célula incluyendo la inhibición de la fagocitosis (facilitando el escape de las células cancerosas), estimulación de la fusión célula-célula y activación de células T. Todavía adicionalmente, CD47 interactúa con varias integrinas de membrana, más comúnmente la integrina avb3. Estas interacciones dan como resultado complejos CD47/integrina que afectan a una variedad de funciones celulares, incluyendo la adhesión, propagación y migración.

Sin embargo, aunque CD47 se expresa de forma ubicua, se ha determinado que el aumento del nivel de expresión de CD47 en las células neoplásicas es suficiente para facilitar una mejor respuesta y eliminación de, las células neoplásicas, por moléculas que se dirigen a CD47, antes de cualquier impacto adverso sustancial en células no neoplásicas.

La referencia a un "receptor de unión" dirigido a CD47 debe entenderse como una referencia a cualquier receptor que interaccione con CD47. Esto puede tomar la forma de un receptor de unión a CD47 tal como un fragmento de anticuerpo mostrado en la superficie, por ejemplo, y preferentemente que carece de función de señalización.

Se desvela además una célula madre de mamífero modificada genéticamente, o célula T diferenciada de la misma, cuya célula es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende (i) una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T y (ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno no señalizador, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a CD47. La célula madre de mamífero modificada genéticamente puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

Como se detalla anteriormente en el presente documento, el receptor de unión a CD47 es un receptor no señalizador. Por "no señalización" se entiende que posteriormente a la unión del receptor a CD47 en una célula diana, no se transmite ninguna señal que pueda afectar a la funcionalidad de la célula. En su lugar, el fin del receptor de unión CD47 es proporcionar un mejor anclaje de la célula a una célula diana, mejorando de esta manera la eficacia de unión del t Cr y el CAR que se dirige al resto del antígeno diana, tal como un resto de antígeno tumoral. Por ejemplo, en un diseño de un receptor de unión a antígeno no señalizador, el dominio extracelular del receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno con especificidad de unión a CD47, un dominio de bisagra (tallo), un dominio transmembrana y un dominio intracelular que carece por completo de una función de señalización citoplásmica. Dicho receptor de unión a CD47 no señalizador puede usarse simplemente para la unión, no para señalizar, por lo que puede impulsar el acoplamiento de las células T a las células cancerosas a través de la unión de CD47 y sin la activación no deseada y matar si se une a las células normales que expresan CD47.

El resto de reconocimiento de antígeno de un receptor de unión a CD47 no señalizador puede incluir dominios de tipo anticuerpo tales como scFv, Fv, Fab, etc. y cualquier dominio V dirigido a CD47, incluyendo dominios V individuales de mamíferos y humanos y sus dominios equivalentes (VhH o vNAR), o pueden incluir "andamios de direccionamiento alternativos basados en proteínas" que son bien conocidos en el campo que incluyen, pero no se restringen a, darpinas, anticalinas, knottinas, ImmE7s, aficuerpos, dominios de fibronectina Fn3, etc. El resto de reconocimiento de antígeno también puede incluir uno o más de los dominios similares a V de SIRPa (el ligando natural de CD47). El resto de reconocimiento de antígenos puede incluir un dominio de tipo V natural de SIRPa. El resto de reconocimiento de antígenos puede incluir los tres dominios naturales de tipo V de SIRPa. Una molécula adecuada para su uso para proporcionar un resto de reconocimiento de antígeno en un receptor de unión a CD47 no señalizador puede ser la molécula de scFv Hu5F9-G4 (descrita en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° de Serie 14/656.431). Hu5F9 ha sido diseñado con 3 versiones diferentes de VH (1,2,3) y 3 versiones diferentes de VL (11,12,13), que se muestran en las Figuras 12A, 12B de la Solicitud de patente de EE. UU. N.° de serie 14/656.431, publicada como US 20150183874 A1. Liu et al (PLOS One (2015) 21 de sep; 10 (9): e0137345) describen Hu5F9-G4 donde los dominios V seleccionados eran VH-2 pesados que comprenden 4 cambios de residuos únicos en el marco (que diferencian VH-2 de VH -1,3) y VL-12 ligero que comprende 2 cambios de residuo únicos en la estructura (que diferencian VL-12 de VL-11,13).

La región de bisagra de un receptor de unión a CD47 no señalizador puede ser la secuencia de bisagra SIRPa natural, o las bisagras CD8 o CD28 como se usan típicamente en los CAR, o bisagras alternativas bien conocidas en el campo tales como dominios CD4 o bisagras de péptidos de mucina. La región bisagra puede diseñarse para incluir uno o más restos de Cisteína (Cys) para permitir la dimerización de los receptores. CD28 es una estructura dimérica natural enlazada a través de una única Cys en la región del tallo. Por lo tanto, donde la región del tallo de CD28 se usa como la bisagra del receptor de unión a CD47 no señalizador, la introducción de una Cys adicional puede no ser necesaria, pero puede proporcionar una estabilización adicional para los dímeros.

Se entenderá por los expertos en la materia que la introducción de ácidos nucleicos que codifican un CAR y un receptor de unión a antígeno no señalizador (tales como un receptor de unión a CD47 no señalizador) en una célula (por ejemplo, una célula T o una iPSC ) puede lograrse usando dos vectores de transfección separados, o un solo vector bicistrónico, o un solo gen que codifica una señal de escisión interna para separar el ^cA^rdel receptor de unión al antígeno. La señal de escisión interna puede ser P2A, una secuencia peptídica que dirige la autoescisión para separar el CAR del receptor de unión al antígeno. Un receptor de unión a CD47 no señalizador puede expresarse como una extensión C-terminal de un CAR y separado por un péptido que se autoescinde P2A para separar el CAR y el receptor de unión a CD47 después de la traducción.

Los medios para modificar la célula madre de la presente invención y divulgación, de tal manera que también expresa una molécula de unión a CD47 no señalizadora, se han descrito con un detalle significativo anteriormente en términos de efectuar la expresión de un receptor de antígeno quimérico dirigido a un resto de antígeno tumoral. El experto en la materia entenderá que la transfección y otros métodos para lograr la expresión del receptor que se describen en el presente documento son igualmente aplicables en el contexto de la molécula de unión a CD47. La célula madre puede ser una iPSC. La célula madre puede ser una HSC.

El TCR puede ser un TCR ap.

La célula madre tal como iPSC puede derivar de una célula T o timocito, preferentemente una célula T CD8+ o timocito y, en algunos ejemplos, una célula T CD8+ o timocito con un TCR endógeno dirigido a un antígeno tumoral. La célula madre puede dirigirse a TAG 72 y WT 1. El CAR puede dirigirse a TAG 72 y el TCR puede dirigirse a WT 1. También se describe en el presente documento un método para producir una célula madre de mamífero modificada genéticamente. Los diversos medios para producir una célula madre de mamífero modificada genéticamente, en particular, una iPSC se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Se desvela además una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y un receptor de antígeno quimérico, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T. La célula T puede expresar al menos un haplotipo de h La homocigótico.

La célula T puede expresar múltiples receptores de antígenos quiméricos, en donde cada receptor de antígeno quimérico comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un determinante antigénico, cuyo resto de reconocimiento de antígeno está operativamente unido a un resto de activación de células T.

Los múltiples determinantes antigénicos a los que pueden dirigirse los múltiples receptores de antígenos quiméricos son cada uno distinto del primer determinante antigénico al que se dirige el TCR expresado en la célula T. Los múltiples determinantes antigénicos a los que se dirigen los múltiples receptores de antígenos quiméricos, pueden ser distintos entre sí, y también pueden ser distintos del primer determinante antigénico al que se dirige el TCR expresado en la célula T.

Los múltiples CAR pueden estar codificados por un fragmento de ácido nucleico contiguo. Por ejemplo, los múltiples CAR pueden estar codificados por múltiples ácidos nucleicos colocados en un vector, que se transfecta a una célula para generar finalmente la célula T. Los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR pueden enlazarse entre sí dentro de una unidad de expresión y marco de lectura (por ejemplo, utilizando un péptido autoescindible tal como P2A), de tal manera que inicialmente se produzca un único polipéptido que comprenda múltiples secuencias de polipéptidos CAR y posteriormente se procese para proporcionar múltiples CAR. Los múltiples ácidos nucleicos que codifican CAR pueden colocarse en vectores separados, que se usan en la transfección para generar la célula T. La célula T, que expresa uno o más CAR, puede además expresar al menos uno (es decir, uno o más) receptor de unión a antígeno que comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un tercer determinante antigénico.

El receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de unión a antígeno no señalizador; a saber, el receptor está anclado a la superficie celular de la célula T y se une al tercer determinante antigénico, pero no transduce la señal en la parte citoplásmica de la célula T que afectaría la función de la célula T (por lo tanto, también se denomina receptor de unión al antígeno de señalización de células no T). El receptor de unión a antígeno puede comprender un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un tercer determinante antigénico, operativamente unido a un dominio transmembrana, pero carece de un resto de activación de células T.

El receptor de unión a antígeno puede ser un receptor de unión a antígeno no señalizador dirigido a CD47. Por ejemplo, el receptor de unión a antígeno puede ser una molécula de unión a CD47 no señalizadora.

La célula T puede ser CD4+. La célula T puede ser CD8+.

La célula T puede expresar un TCR ap. La célula T puede expresar un TCR ^y§.

Los múltiples determinantes antigénicos a los que se dirige la célula T, es decir, el primer determinante antigénico al que se dirige el TCR, el determinante o determinantes antigénicos a los cuales se dirigen el receptor o receptores de antígenos quiméricos, y el determinante o determinantes antigénicos a los cuales se dirigen el receptor o receptores de unión a antígenos, si dicho receptor o receptores de unión a antígenos está o están presentes, puede seleccionarse de antígenos tumorales, antígenos de microorganismos o antígenos de células inmunitarias autorreactivas. Los determinantes antigénicos pueden seleccionarse de antígenos tumorales. El determinante antigénico al que se dirige el TCR, puede seleccionarse de péptidos reconocidos por TCR tales como WT-1 o EbvLMP2. Los determinantes antigénicos a los que se dirigen un receptor de antígeno quimérico y un receptor de unión a antígeno, pueden seleccionarse de, por ejemplo, TAG-72, CD19, MAGE o CD47.

La célula T, que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico, y expresa un receptor de antígeno quimérico que comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, operativamente unido a un resto de activación de células T, puede derivar de una iPSC o una HSC.

La iPSC o HSC de la que deriva la célula T, puede ser una iPSC o HSC modificada genéticamente que es capaz de diferenciarse en una célula T que expresa un TCR dirigido al primer determinante antigénico y comprende uno o más ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos, y opcionalmente comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican un receptor o receptores de unión a antígeno. La iPSC o HSC de la que deriva la célula T, puede ser capaz de diferenciarse en una célula T que expresa un TCR dirigido al primer determinante antigénico; y uno o más ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos y, opcionalmente, uno o más ácidos nucleicos que codifican un receptor o receptores de unión a antígenos, se introducen después de que la iPSC o HSC se ha diferenciado en una célula T. La iPSC o HSC de la que deriva la célula T, puede expresar al menos un haplotipo de HLA y la célula T derivada de tal iPSC o HSC también puede expresar al menos un haplotipo de HLA.

La iPSC de la que deriva la célula T, puede derivar ella misma de una célula T o un timocito. La iPSC puede derivar de una célula T CD8+ o un timocito. La iPSC puede derivar de una célula T o timocito, que expresa un TCR dirigido al primer determinante antigénico, es decir, el mismo determinante antigénico al que se dirige el TCR de la célula T derivada de la iPSC.

El valor de las células de la presente invención y la divulgación se basa en dirigir la diferenciación de la célula madre a una célula T CD4+ o CD8+. En este sentido, la referencia a "dirigir" la diferenciación de una célula madre a una célula T debe entenderse que significa que se aplica un sistema de cultivo celular que induce el compromiso de una célula madre con el linaje de células T y la diferenciación a lo largo de ese linaje con una célula T madura. Los medios para efectuar la diferenciación dirigida de una célula madre a lo largo del linaje de células T son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, y como se ejemplifica en el presente documento, se sabe que la introducción de señalización dependiente de Notch en el sistema de cultivo efectúa la diferenciación dirigida de células madre a lo largo del linaje de células T. Todavía adicionalmente, si esta señalización se proporciona a las células madre en el contexto de su cocultivo sobre la capa de células alimentadoras OP-9, se consigue una diferenciación especialmente eficaz. Los ejemplos de ligandos Notch que son adecuados para su uso incluyen, pero no se limitan a, similar a Delta 1 y Delta-4. En este sentido, las células OP-9 han sido diseñadas para expresar similar a Delta 1 (OP9-DL1), proporcionando de esta manera un medio muy conveniente para generar células T a partir de células madre. En otro ejemplo, y como se ejemplifica en el presente documento, las células madre se cultivan primero en condiciones libres de alimentador para generar mesodermo, seguido de co-cultivo en la línea celular OP9-DL1. En el presente documento se ejemplifica un método particularmente preferido para lograr la diferenciación dirigida a células T CD8+.

También se describe un método para producir una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y expresa uno o más CAR, y opcionalmente uno o más receptores de unión a antígeno. La célula T también puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

El método puede comprender la obtención de una célula madre modificada genéticamente (tal como una iPSC o HSC modificada genéticamente) que es capaz de diferenciarse en una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico y comprende uno o más ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos, cada uno dirigido a un determinante antigénico (preferentemente distinto del primer determinante antigénico), y opcionalmente comprende además uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más receptor o receptores de unión a antígeno, cada uno dirigido a un determinante antigénico ( preferentemente distinto del primer determinante antigénico); y diferenciar dicha célula madre modificada genéticamente en una célula T. La célula madre modificada genéticamente también puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

El método puede comprender obtener una célula madre (tal como una iPSC o HSC) que sea capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico; diferenciar la célula madre en una célula T; introducir en la célula T uno o más ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos, cada uno dirigido a un determinante antigénico (preferentemente distinto del primer determinante antigénico) y opcionalmente también uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más receptor o receptores de unión a antígeno, cada uno dirigido a un determinante antigénico (preferentemente distinto del primer determinante antigénico). La célula madre modificada genéticamente (tal como una iPSC o HSC) puede expresar también al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

Independientemente de si un ácido nucleico que codifica CAR se introduce en una célula madre antes de la diferenciación en una célula T o se introduce en una célula T después de la diferenciación de una célula madre, la célula madre (tal como una iPSC) puede derivar ella misma de una célula T o un timocito. Tales células T y timocitos pueden tener un TCR específico para un antígeno nominal, por ejemplo, un antígeno tumoral. La célula madre puede ser una iPSC. La iPSC puede derivar de una célula T CD8+ o un timocito. La iPSC puede derivar de una célula T o timocito que expresa un TCR dirigido al mismo determinante antigénico al que se dirige el TCR expresado en la célula T derivada de la iPSC.

Debe entenderse que la referencia a "mamífero" incluye la referencia a un mamífero tal como, pero no limitado a, un ser humano, primate, animal de ganado (por ejemplo, oveja, vaca, caballo, burro, cerdo), animal de compañía (por ejemplo, perro, gato), animal de prueba de laboratorio (por ejemplo, ratón, conejo, rata, cobaya, hámster), animal salvaje cautivo (por ejemplo, zorro, ciervo). Preferentemente, el mamífero es un ser humano o un primate. Lo más preferentemente, el mamífero es un ser humano.

El desarrollo de la presente invención y la divulgación han facilitado ahora el desarrollo de medios para tratar enfermedades caracterizadas por la presencia de una población celular no deseada, tal como una población neoplásica de células, células infectadas por virus, células inmunes autorreactivas o infección con microorganismos tales como bacterias resistentes a los antibióticos. Más específicamente, las células de la presente invención y la divulgación proporcionan un medio para eliminar estas células de una manera más dirigida que los métodos actuales altamente inespecíficos, tales como la quimioterapia para tratar una afección neoplásica, terapia antiinflamatoria para tratar los síntomas de una enfermedad autoinmunitaria o inmunosupresión para controlar la autoinmunidad. En este sentido, la referencia a una afección de enfermedad "caracterizada por la presencia de una población celular no deseada" debe entenderse como una referencia a cualquier afección, un síntoma o causa del cual es la presencia o el funcionamiento de una población de células que pueden marcarse como diana en virtud de un antígeno de superficie celular expresado y la eliminación de algunas o todas las células que serían beneficiosas para el paciente. El tratamiento de la afección se logra mediante la administración de células T diferenciadas de las células madre de la presente divulgación, el TCR/CAR doble del cual las células T se dirigen a dos o más determinantes antigénicos expresados por las células que se buscan eliminar.

Debe entenderse que las "células" que se buscan eliminar por las células T de la presente invención y la divulgación pueden ser cualquier célula, ya sea propia o no propia. Por ejemplo, en la medida en que las células T de la presente invención y divulgación estén diseñadas para tratar una afección de enfermedad tal como una neoplasia, infección vírica o enfermedad autoinmunitaria, la población diana de células que se busca eliminar son células propias. Sin embargo, en la medida en que la afección que se busca tratar sea, por ejemplo, infección por un microorganismo, tales como bacterias resistentes a los antibióticos o un parásito, la "célula" a eliminar es una célula extraña. En este sentido, la célula puede estar en suspensión (tales como las células leucémicas que están presentes en la circulación) o pueden ser parte de una masa (tales como un tumor o tejido). En la medida en que la afección que se esté tratando sea una infección por microorganismos, las células pueden corresponder a un microorganismo unicelular (tales como muchas bacterias) o pueden ser parte de un organismo multicelular. Las células T de la presente invención y divulgación son útiles para dirigirse a cualquier tipo de célula que se presente en cualquier tipo de formación.

Se desvela además en el presente documento un método para tratar una afección caracterizada por la presencia de una población no deseada de células en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero un número eficaz de células madre o células T diferenciadas a partir de las mismas, como se define anteriormente en el presente documento.

La célula madre puede ser una iPSC o una HSC.

El TCR puede ser un TCR ap.

La célula madre tal como iPSC puede derivar de una célula T o timocito.

La célula puede comprender además una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno no señalizador, en donde el receptor comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a CD47.

También se desvela un método para tratar una afección neoplásica, comprendiendo el método administrar al mamífero un número eficaz de células madre o células T diferenciadas a partir de las mismas, como se ha definido anteriormente en el presente documento en donde el TCR se dirige a un primer determinante antigénico tumoral y el CAR se dirige a uno o más determinante o determinantes antigénicos tumorales adicionales.

El primer determinante antigénico tumoral puede ser WT 1.

El segundo determinante antigénico tumoral puede ser TAG72.

La célula madre modificada genéticamente también puede expresar al menos un haplotipo de HLA homocigótico. La referencia a una "afección neoplásica" debe entenderse como una referencia a una afección caracterizada por la presencia o el desarrollo de crecimientos o agregados de células neoplásicas encapsulados o no encapsulados. La referencia a una "célula neoplásica" debe entenderse como una referencia a una célula que muestra un crecimiento anormal. El término "crecimiento" debe entenderse en su sentido más amplio e incluye una referencia al agrandamiento del tamaño de las células neoplásicas así como a la proliferación.

La expresión "crecimiento anormal" en este contexto pretende ser una referencia al crecimiento celular que, en relación con el crecimiento celular normal, exhibe uno o más de un aumento en el tamaño de las células individuales y la proporción nuclear/citoplasmática, un aumento en la tasa de división celular, un aumento en el número de divisiones celulares, una disminución en la duración del período de división celular, un aumento en la frecuencia de períodos de división celular o proliferación incontrolada y evasión de apoptosis. El significado médico común del término "neoplasia" se refiere a "crecimiento de nuevas células" que resulta como una pérdida de respuesta a los controles de crecimiento normal, por ejemplo, al crecimiento de células neoplásicas. Las neoplasias incluyen "tumores" que pueden ser benignos, pre-malignos o malignos. El término "neoplasia" debe entenderse como una referencia a una lesión, tumor u otra masa encapsulada o no encapsulada u otra forma de crecimiento o agregado celular que comprende células neoplásicas.

El término "neoplasia", en el contexto de la presente invención y la divulgación debe entenderse que incluye referencia a todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células transformadas malignamente, tejidos u órganos independientemente del tipo histopatológico o estado de invasión. El término "carcinoma" es reconocido por aquellos expertos en la materia y se refiere a neoplasias de tejidos epiteliales o endocrinos incluyendo carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas y melanomas del sistema endocrino. El término también incluye carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos por tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un "adenocarcinoma" se refiere a un carcinoma derivado de tejido glandular o en el cual las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles.

Las células neoplásicas que comprenden el neoplasma pueden ser de cualquier tipo celular, derivadas de cualquier tejido, tales como una célula epitelial o no epitelial. La referencia a los términos "neoplasia maligna" y "cáncer" y "carcinoma" en el presente documento debe entenderse como intercambiable.

El término "neoplasia" debe entenderse como una referencia a una lesión, tumor u otra masa encapsulada o no encapsulada u otra forma de crecimiento o agregado celular que comprende células neoplásicas. Las células neoplásicas que comprenden el neoplasma pueden ser de cualquier tipo celular, derivadas de cualquier tejido, tales como una célula epitelial o no epitelial. Los ejemplos de neoplasias y células neoplásicas abarcadas por la presente invención y divulgación incluyen, pero no se limitan a tumores del sistema nervioso central, retinoblastoma, neuroblastoma, tumores pediátricos, cánceres de cabeza y cuello (por ejemplo, cánceres de células escamosas), cánceres de mama y próstata, cáncer de pulmón (cáncer de pulmón de células microcíticas y no microcíticas), cánceres de riñón (por ejemplo, adenocarcinoma de células renales), cánceres esofagogástricos, carcinoma hepatocelular, neoplasias pancreaticobiliares (por ejemplo, adenocarcinomas y tumores de células de los islotes), cáncer colorrectal, cánceres de cuello uterino y anal, cánceres de útero y otros tipos de cáncer del aparato reproductor, cánceres del tracto urinario (por ejemplo, de uréter y vejiga), tumores de células germinales (por ejemplo, tumores de células germinales testiculares o tumores de células germinales de ovario), cáncer de ovario (por ejemplo, cánceres epiteliales de ovario), carcinomas de primario desconocido, neoplasias asociadas a inmunodeficiencia humana (por ejemplo, sarcoma de Kaposi), linternas, leucemias, melanoma maligno, sarcomas, tumores endocrinos (por ejemplo, de la glándula tiroides), mesotelioma y otros tumores pleurales o peritoneales, tumores neuroendocrinos y tumores carcinoides.

La afección neoplásica puede ser una leucemia o un linfoma.

La afección neoplásica puede ser metastásica.

El sujeto que se somete a tratamiento o profilaxis puede ser cualquier ser humano o animal que necesite tratamiento terapéutico o profiláctico. En este sentido, la referencia en el presente documento a "tratamiento" y "profilaxis" debe considerarse en su contexto más amplio. El término "tratamiento" no implica necesariamente que se trate a un mamífero hasta la recuperación total. De manera similar, "profilaxis" no significa necesariamente que el sujeto no contraiga finalmente una enfermedad. Por consiguiente, el tratamiento y la profilaxis incluyen la mejora de los síntomas de una afección particular o la prevención o reducción del riesgo de desarrollar una afección particular. Puede considerarse que el término "profilaxis" reduce la gravedad de la aparición de una afección particular. El "tratamiento" también puede reducir la gravedad de una afección existente.

Por lo tanto, debe entenderse que la presente invención y la divulgación abarcan la reducción o de otra manera la mejora de una afección en un mamífero. Esto debe entenderse como una referencia a la reducción o mejora de uno o más síntomas de enfermedad. Aunque siempre es más deseable lograr la curación de una enfermedad, sin embargo, existe un valor clínico significativo en la desaceleración de la progresión de una enfermedad. Por ejemplo, en el contexto de una infección vírica tales como el VIH o las ETS, incluso si no se puede lograr una curación completa, una reducción en el alcance de la carga vírica y la propagación puede proporcionar un medio para controlar la infección de tal manera que la inmunodeficiencia grave del VIH, por ejemplo, que en última instancia es fatal, no se experimente, y puede lograrse una vida relativamente normal sin los efectos secundarios graves que son característicos de los actuales cócteles de fármacos antivíricos que los pacientes deben tomar. En el contexto específico de las afecciones neoplásicas, las células T de la presente invención y divulgación, cuando se administran a un paciente, regulan negativamente el crecimiento de una neoplasia. La referencia al "crecimiento" de una célula o neoplasia debe entenderse como una referencia a la proliferación, diferenciación y/o mantenimiento de la viabilidad de la célula, mientras que "regular negativamente el crecimiento" de una célula o neoplasia es una referencia al proceso de senescencia celular o a la reducción, prevención o inhibición de la proliferación, diferenciación y/o mantenimiento de la viabilidad de la célula. El crecimiento del sujeto puede ser proliferación y la regulación negativa es destrucción mediada por células T CD8+. En este sentido, la destrucción puede evidenciarse por una reducción en el tamaño de la masa tumoral o por la inhibición de un mayor crecimiento del tumor o por una ralentización del crecimiento del tumor. Las células neoplásicas pueden destruirse por cualquier mecanismo adecuado tales como lisis directa o inducción de apoptosis o algún otro mecanismo que pueda facilitarse por células T CD4+ o CD8+, o células T que carecen de estos marcadores CD4 y CD8. Por lo tanto, debe entenderse que la presente invención y la divulgación abarcan la reducción o de otra manera la mejora de una afección neoplásica en un mamífero. Esto debe entenderse como una referencia a la prevención, reducción o mejora de uno o más síntomas de una afección neoplásica. Los síntomas pueden incluir, pero no se limitan a, dolor en el sitio del crecimiento del tumor o funciones corporales metabólicas o fisiológicas deterioradas debido a la afección neoplásica. Debe entenderse que el método puede reducir la gravedad de uno o más síntomas o eliminar la existencia de uno o más síntomas. El método también se extiende a prevenir la aparición de uno cualquiera o más síntomas.

Por consiguiente, el método de la presente divulgación es útil tanto en términos de terapia como de paliación. Con este fin, debe entenderse que la referencia a "tratamiento" abarca tanto la terapia como los cuidados paliativos. Como entendería la persona experta en la materia, aunque siempre es el resultado más deseable que se cure una afección neoplásica, no obstante, existe un beneficio significativo al poder ralentizar o detener la progresión de la neoplasia, incluso si no está completamente curada. Hay algunas afecciones neoplásicas que, siempre que estén lo suficientemente reguladas negativamente en términos de división celular, no serán fatales para un paciente y con las cuales el paciente aún puede tener una calidad de vida razonable. Todavía adicionalmente, debe entenderse que el método proporciona una alternativa útil a los regímenes de tratamiento existentes. Por ejemplo, en algunas situaciones, el resultado terapéutico del presente método puede ser equivalente a la quimioterapia o la radiación, pero el beneficio para el paciente es un régimen de tratamiento que induce menos efectos secundarios o un período más corto de efectos secundarios y, por lo tanto, el paciente lo tolerará mucho mejor. Como se ha detallado anteriormente, también debe entenderse que el término "tratamiento" no implica necesariamente que un sujeto sea tratado hasta la recuperación total. Por consiguiente, como se ha detallado anteriormente, el tratamiento incluye reducir la gravedad de una afección existente o mejorar los síntomas de una afección o paliación particular. En este sentido, cuando el tratamiento de la presente invención y la divulgación se aplica en el momento en que se está tratando un tumor primario, puede funcionar eficazmente como profiláctico para prevenir la aparición de cáncer metastásico. Por ejemplo, para determinados tipos de tumores sólidos, puede ser aún más conveniente extirpar quirúrgicamente el tumor. Sin embargo, siempre existe el riesgo de que no se pueda extirpar con éxito la totalidad del tumor o de que se escapen algunas células neoplásicas. En este caso, aplicando el método para lisar cualquiera de dichas células neoplásicas, el método se está aplicando eficazmente como profiláctico para prevenir la diseminación metastásica.

Las células desveladas son preferentemente células autólogas que están aisladas y modificadas genéticamente ex vivo y se trasplantan de nuevo al individuo del que se extrajeron originalmente. Sin embargo, debe entenderse que, no obstante, la presente divulgación se extiende al uso de células derivadas de cualquier otra fuente adecuada donde las células exhiben un perfil de histocompatibilidad similar al del individuo que es objeto de tratamiento, de manera que las células transferidas puedan realizar su función de eliminar las células no deseadas, antes de someterse al rechazo inmunológico por parte del hospedador. Por consiguiente, dichas células son eficazmente autólogas en el sentido de que no darían lugar a los problemas de histocompatibilidad que normalmente se asocian al trasplante de células que presentan un perfil de MHC extraño. Debe entenderse que tales células caen dentro de la definición de ser histocompatibles. Por ejemplo, en determinadas circunstancias puede ser deseable, necesario o de importancia práctica que las células se aíslen de un gemelo genéticamente idéntico o se clonen del individuo (en este caso, es probable que las células correspondan a células madre que han sufrido una diferenciación dirigida a un tipo apropiado de célula somática). Las células también pueden haber sido diseñadas para exhibir el perfil de histocompatibilidad principal deseado. El uso de tales células supera las dificultades que se encuentran inherentemente en el contexto de los trasplantes de tejidos y órganos.

Sin embargo, cuando no sea posible o factible aislar o generar células autólogas o histocompatibles, puede ser necesario utilizar células alogénicas. Las células "alogénicas" son aquellas que se aíslan de la misma especie que el sujeto que se está tratando pero que presentan un perfil de MHC diferente. Aunque el uso de tales células en el contexto de la terapéutica podría resultar en problemas de injerto contra hospedador, o rechazo del injerto por parte del hospedador, este problema puede no obstante minimizarse mediante el uso de células que presenten un perfil de MHC que muestre similitud con el del sujeto que está siendo tratado, tal como una población celular que ha sido aislada/generada a partir de un pariente tales como un hermano, padre o hijo o que se haya generado de otro modo de acuerdo con los métodos ejemplificados en el presente documento.

Las células que se usan pueden ser autólogas. Sin embargo, debido a las circunstancias de una situación determinada, puede que no siempre sea posible generar una población de células madre autólogas. Esto puede deberse a cuestiones tales como la urgencia de iniciar el tratamiento o la disponibilidad de instalaciones para efectuar la transformación y la diferenciación dirigida. En este caso, y como se detalla anteriormente en el presente documento, puede ser deseable o necesario usar células singénicas o alogénicas, tales como células que han sido previamente transfectadas y están disponibles como almacén congelado en un banco de células. Tales células, aunque alogénicas, pueden haber sido seleccionadas para la transformación basándose en la expresión de un haplotipo de MHC que exhibe menos inmunogenicidad que algunos haplotipos que se sabe que son altamente inmunogénicos o que de otro modo se ha generado de acuerdo con los métodos ejemplificados en el presente documento.

La referencia a un "número eficaz" significa el número de células necesarias para lograr, al menos parcialmente, el efecto deseado, o retrasar la aparición de, inhibir la progresión o detener por completo la aparición o progresión de la afección particular que se está tratando. Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la afección particular que se está tratando, la gravedad de la afección y los parámetros individuales del paciente incluyendo la edad, condiciones físicas, el tamaño, el peso, el estado fisiológico, el tratamiento concurrente, el historial médico y parámetros relacionados con el trastorno en cuestión. Un experto en la materia podría determinar el número de células de la presente invención y divulgación que constituirían una dosis eficaz, y el modo óptimo de administración de la misma sin experimentación indebida, este último tema se analizará en lo sucesivo en el presente documento. Estos factores son bien conocidos por aquellos expertos en la materia y pueden abordarse con no más que la experimentación rutinaria. Generalmente se prefiere que se use un número máximo de células, esto es, el número seguro más alto de acuerdo con el sano juicio médico. Se entenderá por aquellos expertos habituales en la materia, sin embargo, que puede administrarse un número menor de células por razones médicas, motivos psicológicos o por cualquier otro motivo.

Como se analizó anteriormente en el presente documento, también debe entenderse que aunque el método desvelado se basa en la introducción de células modificadas genéticamente a un individuo que padece una afección como se define en el presente documento, puede que no sea necesariamente el caso de que cada célula de la población presentada al individuo haya adquirido o mantenga la modificación y diferenciación. Por ejemplo, donde se administra una población de células transfectadas y expandidas en total (es decir, las células modificadas o diferenciadas con éxito no se enriquecen), puede existir una proporción de células que no hayan adquirido o retenido la modificación genética y/o la diferenciación de células T deseada. Por lo tanto, la divulgación se logra siempre que la parte relevante de las células introducidas de esta manera constituya el "número eficaz" como se definió anteriormente. Sin embargo, preferentemente, la población de células que se han diferenciado se someterá a la identificación de células diferenciadas y modificadas con éxito, su aislamiento selectivo.

Las células desveladas requieren la introducción en el individuo. Con este fin, las células pueden introducirse mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, las suspensiones de células pueden introducirse mediante inyección directa o dentro de un coágulo de sangre, por lo que las células se inmovilizan en el coágulo, lo que facilita el trasplante. Las células también pueden introducirse mediante implantación quirúrgica. Esto puede ser necesario, por ejemplo, cuando las células existen en forma de injerto de tejido. El sitio del trasplante puede ser cualquier sitio adecuado, por ejemplo, por vía subcutánea. Cuando las células se administran como una suspensión celular encapsulada, las células se fusionarán en una masa. También debe entenderse que las células pueden continuar dividiéndose después del trasplante. En este sentido, la introducción de un gen suicida, como se describió anteriormente, proporciona un medio conveniente para controlar la división en curso.

Las células que se administran al paciente pueden administrarse como dosis únicas o múltiples por cualquier vía adecuada. Preferentemente, y cuando sea posible, se utiliza una sola administración. La administración mediante inyección puede dirigirse a diversas regiones de un tejido u órgano, dependiendo del tipo de tratamiento requerido. En el método desvelado, pueden coadministrarse otras moléculas proteicas o no proteicas con la introducción de las células transfectadas. Por "coadministrado" se entiende la administración simultánea en la misma formulación o en diferentes formulaciones mediante la misma o diferentes rutas o administración secuencial mediante la misma o diferentes rutas. Por administración "secuencial" se entiende una diferencia de tiempo de segundos, minutos, horas o días entre el trasplante de estas células y la administración de las moléculas proteicas o no proteicas. Por ejemplo, dependiendo de la naturaleza de la afección que se esté tratando, puede ser necesario mantener al paciente con un curso de medicación para aliviar los síntomas de la afección hasta que las células trasplantadas se vuelvan integradas y completamente funcionales (por ejemplo, la administración de fármacos antivíricos en el caso de un paciente con VIH). Como alternativa, en el momento en que se trata la afección, puede ser necesario comenzar a usar medicamentos a largo plazo para prevenir la reaparición de la afección. Por ejemplo, cuando el daño fue causado por una afección autoinmunitaria, puede ser necesario el uso continuo de un nivel bajo de fármacos inmunosupresores una vez que se hayan destruido las células autorreactivas.

El método desvelado puede realizarse en aislamiento para tratar la afección en cuestión o bien puede realizarse junto con una o más técnicas adicionales diseñadas para facilitar o aumentar el tratamiento. Estas técnicas adicionales pueden tomar la forma de la coadministración de otras moléculas proteicas o no proteicas o cirugía, como se detalla anteriormente en el presente documento.

También se desvela el uso de células madre o células T diferenciadas de las mismas, como se ha definido anteriormente en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección caracterizada por la presencia de una población de células no deseada en un mamífero.

La célula madre puede ser una iPSC o una HSC.

El TCR puede ser un TCR ap.

La célula madre tal como iPSC puede derivar de una célula T o timocito, preferentemente una célula T CD8+ o un timocito.

Las referencias hechas en el presente documento a "una célula" deben entenderse como una referencia a una célula aislada o una población de células aislada o sustancialmente purificada. En referencia a una población celular, por "sustancialmente pura" se entiende que un tipo de célula relevante representa al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 % o un mayor porcentaje de todas las células de la población celular. Por ejemplo, una población de células es sustancialmente pura para una célula T relevante si dicha célula T representa al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 % o un mayor porcentaje de todas las células de la población celular.

La presente invención y divulgación se describen adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

La presente descripción se ilustra además mediante los siguientes Ejemplos que demuestran el desarrollo de determinadas realizaciones y ejemplos de la presente invención y divulgación, incluyendo células T específicas anticáncer dobles, derivadas de células iPSC o HSC.

EJEMPLO 1: Enriquecimiento de células T específicas de antígeno peptídico de cáncer a partir de sangre Estimulación y expansión de células T TCR específico de WT-1

Las células T específicas de WT-1 son muy raras en la sangre humana normal, pero pueden ampliarse y enriquecerse para ser detectadas. En este contexto, Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Las PBMC recién aisladas se resuspendieron en medio de cultivo de tejidos complementado con suero AB humano, se añaden L-glutamina y anticuerpo monoclonal CD28 para actuar como coestimulante de las células T cuando WT-1 está presente; anti-CD28 solo no activa las células T. Después se estimularon las PBMC con péptidos de Tumor de Wilm 1 (WT-1) durante la noche a 0,6 nmol/ml para cada uno de los cuatro péptidos de WT-1: WT-137 (VLDFAPPGA, SEQ ID NO: 22), WT-1-126 (RMFPNAPYL, SEQ ID NO: 23), WT-1w (SLGEQQYSV, SEQ ID NO: 24) y WT-1235 (CMTWNQMNL, SEQ ID NO: 25), que representan los principales motivos de unión al HLA de Clase I. Los datos presentados en los ejemplos de esta solicitud usaron el péptido WT-1 1-37 como representativo de esta familia de péptidos WT-1. Las células T específicas de WT-1 pueden identificarse con tetrámeros específicos de HLA -WT-1 o mediante la inducción temprana de la molécula de superficie CD137 en células T estimuladas pero no en reposo. CD137 es un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). También se conoce como 4-1BB. Después de 24 36 horas, las células CD137 positivas (es decir, células T estimuladas con WT-1) se separaron magnéticamente usando un separador magnético de células. Se cultivaron células CD137 positivas (TCR específico de WT-1) en medio de expansión de células T que consistía en medio base X-Vivo-15 suplementado con suero AB humano, interleucina 7 recombinante, interleucina 15 e interleucina 21. Las correspondientes células negativas para CD137 se sometieron además a separación magnética de CD3. Las células CD3 negativas (predominantemente células B) se sometieron a tratamiento con mitomicina C y se usaron como células alimentadoras presentadoras de antígeno cargadas con péptido WT-1 para la población CD137 positiva inducida, mientras que las células CD3 positivas restantes (no específicas de WT-1) se hicieron crecer en cultivo para actuar como un tipo de célula T de control para los ensayos funcionales posteriores. Los medios con las citocinas recombinantes se reponían cada dos días.

Para análisis de citometría de flujo, las células se resuspendieron en tampón FACs: 30 pl por 106 células. Se añadieron 10 pl de reactivo de bloqueo FcR a las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 10 pl de tetrámero HLA-A02 WT-1 y las células se incubaron durante 20 minutos a 4 °C protegidas de la luz. Se añadieron 50 pl de cóctel de "Activación de Células T" y las células se incubaron durante 20 minutos a 4 °C protegidas de la luz. Se añadieron 100 pl de tampón FACs más 2 pl de Aqua Amine y las células se incubaron durante 5 minutos y, posteriormente, se centrifugaron a 150 xg durante 5 min. El sobrenadante se aspiró o se decantó y el sedimento se resuspendió en 100 pl de solución BD Cytofix/Cytoperm por muestra y las células se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron en BD/Perm wash. El anticuerpo IFN-y se diluyó 1/100 en solución de BD/Perm wash y se incubó con células durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C. Las células se lavaron en BD/Perm wash y se resuspendieron en tampón FACs antes del análisis de citometría de flujo. La adquisición de datos FACS se realizó en un citómetro Miltenyi Quant.

Las células T con un TCR específico para el péptido WT-1 normalmente tienen una frecuencia muy baja (por ejemplo, Schmeid et al (2015)) mostraron que son tan pocas como 1 por 10-6 células CD8+ (intervalo de 3 x 10-7 a 3 x10'6 células). Siguiendo el protocolo de estimulación descrito anteriormente, las células T específicas de WT-1 TCR aumentaron ~ 100 veces a ~ 3,0 % (WT-1 paciente n.° 11,5 %; Paciente WT-1 n.° 24,0 %; Figura 1).

Análisis funcional de células T TCR WT-1

Las células T expandidas in vitro se estimularon adicionalmente con células presentadoras de antígenos autólogas (células B transformadas con EBV) y se imprimaron con la gama de péptidos WT-1: WT-137 (VLDFAPPGA), WT-1-126 (RMFPNAPYL), WT-1w (SLGEQQYSV) y WT-1235 (CMTWNQMNL). Las células T se examinaron mediante citometría de flujo para determinar la producción de interferón gamma (IFNy) usando el ensayo de perlas fluorescentes. Las células se marcaron doblemente para la especificidad del péptido WT-1 mediante la unión a un tetrámero de péptido WT-1-HLA (véase la Figura 2).

Las células T estimuladas con WT-1 expresaron claramente (80-90 %) interferón gamma (IFNy) (Figura 2), una medida bien reconocida de la función de las células T (por ejemplo, Ghanekar et al (2001)). Para aumentar potencialmente el nivel de activación de las células T CD8 (dirigidas a las células T WT-1), se hizo uso del inhibidor de LAG 3 IMP 321. LAG3 es normalmente un "bloqueo de punto de control", que inhibe la función estimuladora de las células dendríticas (DC) y la respuesta a las DC como células presentadoras de antígenos, por las células CD8 T. Cuando se añade al ensayo de activación de células T específico de WT-1, no hubo efecto de IMP 321 a las 24 horas, pero después de 4 días hubo una duplicación de las células T TCR específicas de CD8+ WT-1 raras (Figura 2H).

EJEMPLO 2: Generación de iPSC a partir de células T de sangre humana

Para la derivación de iPSC a partir de células T de sangre humana, hay una serie de enfoques con diferentes niveles de retención fiel de las propiedades originales de las células T. Las iPSC se han producido a partir de un amplio repertorio de grupos de linfocitos T de sangre periférica (T-iPSC) de un ser humano sano normal. Las células T se pre-activaron, por ejemplo, con el mitógeno p Ha o anticuerpos anti CD3 y anti CD28. Usando casetes de vectores retrovíricos dobles, cada uno de los cuales contiene dos de los factores de reprogramación de Yamanaka (Oct4, Sox 2, KLF, cMyc), se generaron múltiples clones de T-iPSC que fueron validados a nivel celular y molecular, incluyendo citometría de flujo y qRT-PCR para una variedad de marcadores incluyendo Nanog, Oct3/4, SSEA 3.4, TRA-1-60 y TRA-1-81. Su pluripotencia se confirmó mediante la formación de teratomas después de la inyección en la cadena gamma común NOD-SCID-IL -/-(NSGMice). La confirmación del origen de las células T se confirmó mostrando que los genes TCR estaban reorganizados.

La producción de iPSC a partir de células T sanguíneas específicas de WT-1 se resume en la Figura 3.

EJEMPLO 3: Inducción de células T humanas a partir de iPSC

Este Ejemplo muestra la generación de células T genuinas a partir de iPSC. Se demostró que estas células T expresan las características clave de las células T típicas normalmente producidas por el timo. Se demostró que expresan las células T principales apTCR y CD8 con ambas cadenas p y a.

Se han inducido células T a partir de iPSC derivadas de células T de sangre adulta completa o células T CD8+ preseleccionadas, o células T específicas de antígeno (por ejemplo, aquellas específicas para WT-1) (T-iPSC) o fibroblastos adultos. Hay dos fases básicas de especialización a la hematopoyesis (células madre hematopoyéticas o "HSC") y linaje parcialmente linfoide, mediante cultivo en células OP9; transferencia de estas células cultivadas a la línea celular OP modificada genéticamente para expresar la molécula de señalización Notch del ligando 1 similar a Delta (OP9-DL-L1) para la posterior inducción de la diferenciación de células T.

Fase 1- Preparación de células de soporte OP9 y colonias iPSC

Día -8: Las capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina se sembraron en placas de TC recubiertas con gelatina al 0,1 % a 0,3 x 106 (14.250 células/cm2) en 3 ml de medio MEF (DMEM 15 % FCS+ 1 % pen/strep L-glutamina) y se incubó durante la noche. Las células OP9 se prepararon previamente colocándolas en placas de TC de 10 cm recubiertas con gelatina al 0,1 % a 0,25 x 106 células en 11 ml de medio OP9 (aMEM+ 20 % FCS+ 1 % pen/strep).

Día -7: Las células iPS se descongelaron y se colocaron en placas sobre las células MEF y se incubaron a 37 °C al 5 % CO2 durante 7 días.

Fase 2- Conversión de iPSC en células hematopoyéticas

Día 0: Inicio de la especialización hematopoyética. Las colonias de iPS se disociaron y se colocaron en placas sobre OP9 para la diferenciación de HSC. La suspensión de colonias se añadió gota a gota para una distribución uniforme sobre la placa OP9. Se añadió medio de diferenciación fresco los días 1, 5 y 9.

Día 13 Recolección de precursores de HSC inducidos para la diferenciación de células T

Las células cultivadas en la línea celular OP9 se eliminaron suavemente por Colagenasa (solución de trabajo 100 |jg/ml de colagenasa/HBSS; 37 °C durante 1:15 h) y las colonias se rompieron adicionalmente en células individuales mediante tripsina/EDTA al 0,05 % a 37 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron suavemente y se examinaron mediante microscopía de contraste de fase (Figura 4) y mediante citometría de flujo (Figura 5). La naturaleza hematopoyética de las células se confirmó mediante citometría de flujo (Figura 5).

Fase 3: inducción de HSC derivadas de iPSC a células T

Día 13: Inducción de la diferenciación de células T: transferencia de células acondicionadas con OP9 del día 13 (inducidas por hematopoyesis) a células OP9DL-L1.

Para mejorar la eficiencia del contacto con las células OP9DL-L1, las células acondicionadas con OP9 se purificaron para CD34+CD43+ (HSC) y después se colocaron en placa sobre las células OP9 DLL-1 para la primera fase de diferenciación de células T. Un componente crítico del proceso desvelado en el presente documento fue recolectar las células que crecieron inicialmente debajo de las células OP9 DL-L1.

Las células recogidas de los cultivos de OP9 se resuspendieron en medio de cultivo de diferenciación de células T (medio OP9, SCF 5 ng/ml, Flt35 ng/ml, IL-75 ng/ml y vitamina C 100 jM ) y la suspensión se añadió gota a gota a las células OP9 DLL-1 y se incubó a 37 °C. Las células se recolectaron después de 2, 9, 16, 23 y 30 días de cultivo en el OP9 DL-L1 y se sometieron a análisis de citometría de flujo (Figura 6 y Figura 7).

Cuando se examinaron estos cultivos para determinar el desarrollo de células T, hubo una clara evidencia de expresión de los marcadores tempranos CD7 y CD9 y los siguientes marcadores de desarrollo de células T con expresión de CD4 y CD8 (Figura 7). Incluso en esta etapa temprana ya había ~ 10 % de las células que expresaban tanto CD4+ como CD8+; estas células CD4+CD8+ son características de las células T que se desarrollan normalmente en la corteza del timo (Heng et al (2010)).

La citometría de flujo mostró un desarrollo progresivo de células T a partir de la expresión inicial de CD5, CD7+ después CD8+. Más importante aún, las células T inducidas expresaron el fenotipo de células T CD8 "óptimas, producidas en el timo". Expresaron la cadena CD8p además de la cadena CD8a (otros sistemas de inducción de células T informados no inducen la cadena Cd8p óptima, de señalización; por ejemplo, Themeli et al (2013)). Como indicaciones de función también expresaron CD3 con el apTCR. Adicionalmente, estas células estaban presentes ya en el Día 16 de cultivo en células OP9 DL-L1 en comparación con el día 30 en otros sistemas informados.

Fase 4 Desarrollo de células T maduras

Después de unos 7 días adicionales (un total de 13 días sobre células OP9 seguidos de 16 días sobre células OP DL-L1), estas células T en desarrollo hicieron una transición crítica a la expresión del complejo receptor de células T con células T CD8+ claramente positivas para CD3 y el apTCR; además, estas células expresaron el importante Cd8p: estas son las células deseadas para CAR-T. Hubo una reducción adicional correspondiente en HSC CD34+CD43+ (Figura 8).

Este sistema de inducción ha producido de esta manera con éxito células T CD8 maduras a partir de iPSC después de 13 días de cultivo sobre células OP9 seguido de 16 días sobre células OP9DL-L1.

Usando el proceso descrito anteriormente, se produjeron células T que expresan un TCR específico para WT-1 a partir de iPSC que a su vez derivaron de células T CD8+ TCR WT-1 (Figura 9). Estas células T WT-1 derivadas de iPSC tenían una función citotóxica equivalente a las células T originales de las que derivaron las iPSC (Figura 10).

EJEMPLO 4: Desarrollo de construcciones CAR

Un componente de las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) es el componente de reconocimiento de antígeno del CAR mediado por el ectodominio scFv, representado por un Fv monocatenario (scFv) anclado por una bisagra CD8 o CD28 e incluyendo una región transmembrana (TM) y la transducción de señal del CAR a través del endodominio citoplásmico, representado por CD28, 4-1BB y CD3 zeta (CD3Z) cadena. También hay dos sistemas de liberación vírica adecuados: retrovirus y lentivirus. En la Figura 11 se muestran ejemplos de construcciones de receptores de unión a CAR y CD47.

EJEMPLO 5: Estrategias de clonación de vectores de receptores de antígenos quiméricos

En las Figuras 12-13 se ilustran ejemplos de estrategias de clonación de vectores del receptor de antígenos quiméricos. La Figura 14 muestra el ^cA^rde 2a generación de los presentes inventores y la estrategia para una construcción anti-CD47 sin señalización. Las secuencias ilustrativas de receptores de antígenos quiméricos, receptores de unión a antígeno no señalizadores y los diversos dominios de los mismos, se proporcionan en SEQ ID NO: 1-20.

EJEMPLO 6: Transducción del receptor de antígeno quimérico de células T

Producción de lentivirus

Las células 293T se sembraron en placas sobre matraces de 175 cm2 recubiertos con poli-L-lisina (Sigma). Dos horas antes de la transfección, el medio se reemplazó con DMEM suplementado con FCS al 10 %. El ADN del vector de transferencia lentivírico, junto con el ADN de plásmido de empaquetamiento y la envoltura, se combinaron y se mezclaron con Lipofectamine2000. La solución se agitó brevemente en vórtex y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Después de esto, la solución se mezcló de nuevo y después se añadió gota a gota a las células. Los matraces se devolvieron a la incubadora. Seis horas después, se añadió medio de crecimiento fresco. El sobrenadante vírico se recogió después de 48 horas y se aclaró por centrifugación a 1500 rpm durante 5 min a 4 °C, después se pasó a través de un filtro PVDF Millex-HV de 0,45 pm de poro (Millipore). La concentración de lentivirus usando ultracentrifugación se realizó con una centrífuga Sorval Discovery 100 SE usando un rotor AH-629. Se añadieron 30 ml de sobrenadante de virus filtrado a tubos cónicos de polialómero de 36 ml (Beckman). La centrifugación se realizó durante 90 min a 20.000 g. El sobrenadante se retiró por completo y los sedimentos de virus se resuspendieron en 300 pl de PBS y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Generación de células CAR-T

La Figura 11 y SEQ ID NO: 1-6 muestran un panel de construcciones de receptor de antígeno quimérico (CAR) y receptor de unión a CD47 que se han desarrollado, con scFv específico para TAG 72 o CD19 (como control positivo). Estas construcciones usan cualquiera de CD8 o CD28 humanos como región bisagra y CD28, cadena CD3Z o dominios de señalización de activación citoplasmática 4-1BB. Las construcciones de receptores de unión a CAR y CD47 se clonan en vectores lentivíricos como se describe en el párrafo anterior.

La transducción lentivírica óptima de las células T implica su activación en los receptores TCR y coestimuladores. Por consiguiente, el día 0, se recolectaron PBMC frescas por aféresis de donantes sanos, se enriquecieron para células T activadas con el uso de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a perlas paramagnéticas (Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28, Invitrogen, Camarillo, CA, EE.UU.) En una proporción de 3:1 (perlas:células). Las células y las perlas se incubaron conjuntamente durante 1 h a temperatura ambiente, y el enriquecimiento de células CD3+ se realizó con el uso de imán (Invitrogen). Las células de la fracción CD3+ se resuspendieron en medio de iniciación a una concentración de 1 x 106 células/ml en medio de expansión de células T con 100 UI/ml de IL-2. El día 1, se usó RetroNectin para recubrir placas de cultivo celular a una concentración de 2 mg/cm2 en una solución de 10 mg/ml en PBS durante la noche a 4 °C. El día 2, se aspiró la solución de RetroNectin y el mismo volumen de solución de bloqueo, que consiste en seroalbúmina humana al 0,5 % en PBS, se añadió a cada bolsa y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Se aspiró la solución de bloqueo y se lavó cada bolsa con PBS. El sobrenadante lentivírico se descongeló rápidamente y se añadió a cada placa con medio de expansión de células T con 300 UI/ml de IL-2. Los cultivos se volvieron a colocar en la incubadora y se dejaron durante al menos 24 h. El día 4, se detuvo la transducción; las células se resuspendieron en medio de expansión de células T fresco a una concentración de 0,5-1 x106 células/ml. Los cultivos se mantuvieron hasta el día 14 y se suministraron cada dos días con medio de expansión fresco para mantener la concentración celular en 1x 106 células/ml.

Inicialmente, las células T humanas derivadas de la sangre se sometieron a transducción CAR, cuyo éxito se midió mediante citometría de flujo, que representa las células eGFP+ (Figura 15). Esto también fue confirmado por análisis de Transferencia Western (Figura 16).

Evaluación de la funcionalidad de las células CAR-T

Se examinó la capacidad de las células TAG-72 CAR-T (creadas a partir de PBMC normales) para destruir las células cancerosas diana que expresan TAG72 in vitro. Se empleó el sistema de monitorización celular en tiempo real (xCELLigence) para determinar la eficiencia de destrucción de las células CAR-T in vitro. Se depositaron 10.000 - 2x106 células diana/100 pl (por ejemplo, la línea celular de cáncer de ovario TAG72+ CaOV4) en placas RTCA. En algunos casos, puede ser necesario el anclaje de las células diana mediante anti-hCD40 o mediante el pre recubrimiento de la placa con fibronectina humana. Las células diana se mantienen a 37 °C, 5 % de CO2 durante 3 12 h para permitir la fijación celular. Después de la fijación de las células diana, se añadieron células efectoras CAR-T a relaciones efector:diana variables (que van de 1:1 a 10:1). En algunos experimentos, las células efectoras CAR -T se aislaron basándose en la expresión de GFP de las células CAR-T mediante FACS antes de su uso. Los cocultivos se mantuvieron en condiciones óptimas de crecimiento durante al menos 12 h. Se controló la impedancia celular en todo momento; una disminución de la impedancia es indicativa de desprendimiento de células y, en última instancia, muerte celular.

La Figura 17 muestra los resultados de este experimento monitorizado durante 40 horas. La línea celular de cáncer de ovario CaOV4 creció consistentemente durante este período de tiempo (línea azul). Por el contrario, los cultivos suplementados con células T CAR específicas de TAG-72 mostraron una fase de crecimiento inicial que fue significativamente menor que la de las células diana solas, seguido de la eliminación gradual de las células diana a lo largo del tiempo (línea púrpura). Para superar la muerte inespecífica debida a la activación de CD3/CD28, las células TAG 72 CAR-T se aislaron mediante citometría de flujo y se compararon con células CAR-T CD19 y células no CAR-T, sin activación previa de CD3/CD28 (Figura 21). Los datos mostrados en la Figura 21 indican una fuerte especificidad antigénica de las células TAG-72 CAR-T en las primeras 24 horas de cultivo con células cancerosas que expresan TAG-72, dado que los controles negativos del vector solo células T transfectadas y células T no transfectadas no mostraron destrucción de las células cancerosas en este marco de tiempo.

Los estudios anteriores se realizaron en células T policlonales derivadas de sangre periférica. Para demostrar la transducción con CAR de células T monoespecíficas que expresan un TCR específico para un antígeno peptídico canceroso nominal, las células T específicas de TCR WT-1 derivadas de iPSC formadas a partir de TCR específico de WT-1, se transdujeron mediante lentivirus TAG 72 CAR. La Figura 22A muestra la transducción exitosa de CAR de estas células T CD8+ TCR específico de WT-1 derivadas de iPSC producidas a partir de células T específicas de WT-1. El CAR contenía la especificidad del TAG 72. De manera más importante, la Figura 22B muestra la transducción exitosa de células T CD8+ TCR específico de WT-1 derivadas de iPSC producidas a partir de células T específicas de WT-1, con una construcción CAR para TAG 72 y CD47. Esto indica que las células T pueden producirse con tres especificidades para el cáncer: WT-1 (TCR), TAG 72 (CAR) y CD47 (truncado, receptor de unión a CD47).

Los resultados demuestran el desarrollo de TCR específico de cáncer (WT-1) transducido con CAR doble específico derivado de iPSC, que habían derivado ellos mismos a su vez de células T TCR específico de WT-1 de sangre adulta normal.

La Figura 20 muestra que ambos componentes de las células T específicas dobles (que contienen el TCR WT-1 y el CAR TAG72) pueden contribuir a la destrucción de las células cancerosas. Cuando se corrige por muerte celular espontánea, incluso con una relación efector - diana baja (aquí es 2 efectores por 1 célula objetivo), las células WT-1 causaron aproximadamente un 10% de muerte celular y después la adición del CAR TAG72 por transducción provocó una muerta adicional del 10 %.

EJEMPLO 7: Transducción del receptor de antígeno quimérico de iPSC

La producción de células CAR-T multiespecíficas puede lograrse mediante múltiples enfoques, incluyendo la transducción con CAR de células T de sangre existentes (Figura 15) o mediante la transducción de iPSC que después se inducen a células T (que expresan TCR y CAR específicos del cáncer) (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-6). Se han usado múltiples líneas iPSC para progresar con la transducción CAR-T. Estas iPSC podrían derivar de células que no son T o de células T específicas de antígeno canceroso (por ejemplo, WT-1) que retendrían las reordenaciones del gen TCR. Estas iPSC derivaron de fibroblastos adultos o de células T con un TCR endógeno específico para un antígeno de cáncer específico (péptido WT-1).

Las iPSC se transdujeron de manera estable con un solo cistrón, como se muestra en la Figura 14 en la cual el ectodominio CAR comprende un scFv específico para TAG72 (o como control CD19). La región bisagra (tallo) y la región transmembrana derivan de CD28 o CD8 y el endodominio citoplasmático, que comprende dominios de transducción de señales de células T, deriva de la cadena CD28 y TCRZ. El CAR tiene una extensión C-terminal que codifica EGFP unida por un polipéptido P2A autoescindible para separar el CAR y el indicador. Después de la integración vírica, se escindió el P2A y se cuantificó el éxito de la transducción midiendo la fluorescencia del indicador EGFP liberado. La fluorescencia de GFP ilumina el éxito de la transducción. Puede usarse para mostrar la transducción in situ (Figura 21) o para identificar y aislar iPSC transducidas con CAR mediante citometría de flujo (Figura 22, 23).

Estos estudios muestran claramente la capacidad de transducir iPSC con construcciones CAR de lentivirus. La Figura 21A muestra la transducción satisfactoria de iPSC derivada de fibroblastos humanos con un TAG 72 o CD19 que codifica CAR (Figura 21A). La Figura 21B muestra la transducción exitosa de iPSC derivada de células T específicas de TCR WT-1, con TAG72. Por lo tanto cualquier célula T derivada de esta línea expresará una especificidad anticancerígena doble (WT-1 a través de TCR; TAG 72 a través de CAR).

También es posible aislar la iPSC transducida mediante clasificación de células basada en fluorescencia. Las células positivas pueden recolectarse y sembrarse en placa para formar con éxito colonias de iPSC (transducidas con CAR) (Figura 24).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un resto de reconocimiento de antígeno, una región bisagra, un dominio transmembrana y un resto de activación de células T, en donde:

2. Una célula T que comprende un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1.

3. La célula T de la reivindicación 2, en donde dicha célula T expresa al menos un haplotipo de HLA homocigótico.

4. La célula T de cualquiera de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde la célula T expresa

(i) un receptor de células T (TCR) dirigido a un primer determinante antigénico y

(ii) un CAR que comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a un segundo determinante antigénico, en donde el CAR está codificado por un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1.

5. La célula T de la reivindicación 4, en donde la célula T expresa un receptor de unión a antígeno no señalizador que comprende un resto de reconocimiento de antígeno que se dirige a un tercer determinante antigénico.

6. La célula T de la reivindicación 5, en donde el primer determinante antigénico, el segundo determinante antigénico y el tercer determinante antigénico son todos diferentes entre sí.

7. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el primer determinante antigénico se selecciona de antígenos tumorales, por ejemplo WT-1.

8. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el resto de reconocimiento de antígeno en dicho CAR está operativamente unido a dicho resto de activación de células T a través de una región bisagra y un dominio transmembrana, en donde la región bisagra comprende opcionalmente una cisteína que promueve la dimerización del CAR.

9. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde dicho receptor de unión a antígeno no señalizador comprende un resto de reconocimiento de antígeno dirigido a CD47.

10. La célula T de la reivindicación 9, en donde el resto de reconocimiento de antígeno de dicho receptor de unión a antígeno no señalizador está operativamente unido a una región transmembrana a través de una región bisagra.

11. La célula T de la reivindicación 10, en donde la región bisagra comprende un resto de cisteína que promueve la dimerización.

12. La célula T de la reivindicación 10, en donde el receptor de unión al antígeno no señalizador no forma dímeros.

13. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 2-12, para su uso como un medicamento.

14. La célula T de cualquiera de las reivindicaciones 2-12, para su uso en el tratamiento de una afección caracterizada por la presencia de una población no deseada de células en un mamífero, por ejemplo, una afección seleccionada de una afección neoplásica, una infección por microorganismos (tales como VIH, ETS o bacterias resistentes a los antibióticos) o una afección autoinmunitaria.

15. Un método para producir una célula madre de mamífero modificada genéticamente, que comprende: obtener una célula madre de mamífero que es capaz de diferenciarse a una célula T que expresa un TCR dirigido a un primer determinante antigénico; e

introducir en la célula madre un ácido nucleico como se define en la reivindicación 1.

16. Un método para producir una célula T, que comprende:

proporcionar una célula madre modificada genéticamente obtenible de acuerdo con el método de la reivindicación 15 y

diferenciar la célula madre modificada genéticamente en una célula T.