JP2023534928A - 改変免疫細胞及びその使用 - Google Patents

Abstract

（ｉ）キメラ受容体と、（ｉｉ）外因性のＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５とを発現し、高めた腫瘍殺傷活性を有し、癌、感染又は自己免疫疾患の治療に用いることができる改変免疫細胞を提供する。 【選択図】図１

Description

本発明は免疫治療分野に属する。より具体的に、本発明は、（ｉ）キメラ受容体と、（ｉｉ）外因性のＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子を発現する改変免疫細胞に関する。より好ましくは、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体である。

腫瘍免疫治療は、主に人体免疫システム及び腫瘍微小環境を調整することにより、最終的に自己免疫に頼って腫瘍細胞を除去する。免疫システムは、一つの統合的全体であり、先天性免疫も腫瘍免疫において非常に重要な役割を果たす。

いくつかの抗原提示細胞、例えば樹状細胞及びマクロファージは、先天性免疫と獲得免疫との渡り橋である。抗原提示細胞は、腫瘍抗原を識別し獲得免疫システムに提示し、腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化し、更に腫瘍を除去する。従って、抗原提示過程を増加することにより、腫瘍を殺す免疫系の効果を増加することは、腫瘍免疫の重要な研究課題である。

ＣＡＲ細胞治療は、重要な腫瘍細胞免疫療法である。ＣＡＲ細胞が腫瘍を成功に制御するには、一般的に免疫システムの活性化、ＣＡＲ細胞の活性化及び拡大、活性化したＣＡＲ細胞が腫瘍組織に浸潤し腫瘍細胞を殺すことというプロセスの必要がある。しかしながら、現在、ＣＡＲ細胞療法には、一般的に、ＣＡＲ細胞が腫瘍組織に浸潤できないように、腫瘍微小環境からＣＡＲ細胞への抑制作用があるという問題がある。従って、如何に腫瘍微小環境からＣＡＲ細胞への抑制作用を低減させ、ＣＡＲ細胞の生存時間を改善し、或いは、他の免疫細胞を募集してＣＡＲ細胞と協力させて採用するかということは、ＣＡＲ細胞の治療效果の向上にとって非常に重要である。

従来１型樹状細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＤＣ１，ｃＤＣ１）は、樹状細胞の１種類のサブグループで、腫瘍抗原を提示する主な免疫細胞である。研究した結果、ｃＤＣ１は、腫瘍関連抗原、特に壊死細胞関連抗原を有効的に提示し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を有効的に誘導することができ、インビボでの腫瘍死滅プロセスにおいて非常に重要な役割を果たす。マウス及びヒトの研究によると、いずれもｃＤＣ１の腫瘍微小環境での分布が、抗腫瘍免疫応答と正相関を呈し、重要な腫瘍関連免疫評価の評価パラメータである。ｃＤＣ１は、マウス及びヒトの体内で少なく分布し、腫瘍免疫応答率が低いマウス及びヒト腫瘍微小環境でほとんど見えない。ｃＤＣ１の腫瘍治療における作用は、腫瘍免疫治療効果の向上に関する重要な研究課題である。

炎症ケモカインは、関連免疫細胞が腫瘍微小環境に入るように募集し、細胞相互作用及びシグナル伝達カスケードの駆動等の面で重要な役割を果たし、宿主の抗腫瘍免疫応答の最終結果を決める。研究した結果、マクロファージ炎性タンパク質（ＭＩＰ）－１ファミリー及び関連タンパク質は、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－１ｂ）及びＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）からなり、抗原提示細胞を直接的に募集する（例えば樹状細胞を腫瘍部位まで募集する）ことで、ある腫瘍免疫細胞浸潤の主な決定要因となる。また、レポートによると、腫瘍部位に富むＭＩＰ－１ファミリー関連タンパク質は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を腫瘍部位まで募集し、さらにＣＤ１０３^＋ｃＤＣの腫瘍部位での累積を促進し、ケモカインＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の生成を増加し、腫瘍の進行を有効的に抑制することができる。

従って、腫瘍抗原提示効率を向上させ、体の養子免疫応答を誘導して、ＣＡＲ細胞治療の治療効果を向上するように、ｃＤＣ１樹状細胞を有効的に分化又は募集することができる新たな免疫治療手段の必要がある。

第１様態で、本発明は、（ｉ）キメラ受容体と、（ｉｉ）外因性のＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子と、を発現する新たな改変免疫細胞を提供する。

一実施形態において、ＣＣＬ３遺伝子は、配列番号７７又は７９で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記ＣＣＬ３遺伝子にコードされたペプチドは、配列番号７８又は８０で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する。

一実施形態において、ＣＣＬ４遺伝子は、配列番号８１又は８３で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記ＣＣＬ４遺伝子にコードされたペプチドは、配列番号８２又は８４で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する。

一実施形態において、ＣＣＬ５遺伝子は、配列番号８５又は８７で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記ＣＣＬ５遺伝子にコードされたペプチドは、配列番号８６又は８８で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する。

一実施形態において、前記改変免疫細胞は、（ｉｉｉ）外因性のインターロイキンを更に発現する。

一実施形態において、前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ３３、又はそのサブユニット、又はその組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせであり、好ましくはＩＬ－７である。

一実施形態において、前記インターロイキンのコーディング遺伝子は、配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記インターロイキンは、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する。

一実施形態において、前記改変免疫細胞によって発現されるインターロイキン、ＣＣＬ４又はＣＣＬ５は、タンパク質分解に抵抗可能な融合タンパク質或いは変異体である。

一実施形態において、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体である。好ましくは、前記キメラ受容体はキメラ抗原受容体で、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインである。そのうち、リガンド結合ドメインは、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、直線状抗体、シングルドメイン抗体、ナノ抗体、及び非免疫グロブリン抗原結合足場から選択されても良い。

一実施形態において、前記キメラ受容体は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるターゲットに結合される。好ましくは、前記ターゲットは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＧＤ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、メソテリン及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４等のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ２７８の膜貫通ドメインから選択される。

一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄなどのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される。好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインである。

一実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＣＤ９４、ＬＴＢ、ＺＡＰ７０及びそれらの組み合わせ等のタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインから選択される１つ又は複数の共刺激ドメインである。好ましくは、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ２７８の共刺激シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組み合わせである。

一実施形態において、外因性のインターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５の発現又は活性は、構成式発現である。他の一実施形態において、外因性のインターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５の発現又は活性は、条件式発現である。例えば、外因性遺伝子と、誘導式、抑制式、又は組織特異的プロモーターとを作動可能に連結して条件式発現を実現する。

一実施形態において、インターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５は、局在化ドメインに操作可能に接続されてもよく、前記局在化ドメインは、本発明の外因性遺伝子を特定の細胞位置に局在化して発現することができ、例えば小胞体、ゴルジ体、細胞核等のような細胞膜、細胞質における特定細胞小器官である。局在化ドメインは、核局在化シグナル、案内ペプチド、膜貫通ドメイン等である。一実施形態において、本発明の外因性遺伝子インターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５は、膜貫通ドメインに作動可能に連結されて、改変免疫細胞の表面にアンカして発現する。

一実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。好ましくは、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞又はαβ－Ｔ細胞である。一実施形態において、免疫細胞は、例えば成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞等の幹細胞から派生される。

第２様態で、本発明は、（ｉ）キメラ受容体をコードする核酸配列と、（ｉｉ）ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５をコードする核酸配列とを、含む核酸分子を提供する。好ましくは、前記キメラ受容体はキメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体であり、より好ましくは、キメラ抗原受容体である。

一実施形態において、核酸分子は、さらにインターロイキンをコードする核酸配列を含む。好ましくは、前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ３３、又はそのサブユニット、又はその組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせであり、より好ましくは、ＩＬ－７、そのサブユニット又はその組み合わせである。好ましくは、前記核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。

本発明は、上記核酸分子を含むベクターをさらに提供する。具体的には、前記ベクターは、プラスミド、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、ポリオーマウィルス及びアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）から選択される。いくつかの実施形態において、このベクターは、免疫細胞での自己複製の起源、選択マーカー、制限酵素切断部位、プロモーター、ポリＡテール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペレーター、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグ等のエレメントを更に含む。具体的な一実施形態で、前記ベクターは、インビトロ転写のベクターである。

一実施形態において、本発明は、本発明に記載の改変免疫細胞、核酸分子又はベクターを含むテストキットをさらに提供する。

一実施形態において、本発明は、本発明に記載の改変免疫細胞、核酸分子又はベクター、及び多種薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。

第３様態で、本発明は、前記被験者に対して本発明に記載の免疫細胞、核酸分子、ベクター又は医薬組成物を有効量だけ投与することを含む癌、感染症又は自己免疫疾患を有する被験者を治療する方法を更に提供する。

一実施形態において、前記癌是固形腫瘍又は血液腫瘍である。更具体的には、前記癌は、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳・中枢神経癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸・直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、肝臓癌、肝細胞腫、上皮内腫瘍、腎臓癌、喉頭癌、肝臓腫瘍、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌及び扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば唇、舌、口及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、中皮腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系悪性腫瘍、外陰癌、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、リンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高度リンパ芽球性ＮＨＬ、高度切れ込みの無い小細胞型ＮＨＬ、大塊疾患ＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状突起細胞腫瘍等のホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、例えば急性骨髄芽球性白血病（未分化および部分分化を含む）、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、赤白血病、急性巨核芽球性白血病等の急性非リンパ性白血病のような急性白血病と、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病のような慢性白血病と、有毛細胞白血病、前リンパ球性白血病、形質細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病、好酸球性白血病、好塩基性白血病等の他の特殊なタイプの白血病と、を含む）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、悪性リンパ増殖性疾患、骨髄異形成、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）から選択される。

一実施形態において、前記感染は、ウィルス、細菌、真菌及び寄生虫による感染を含むが、それらに限定されない。

一実施形態において、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、セリアック病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血及び全身性エリテマトーデス等を含むが、それらに限定されない。

本発明の改変免疫細胞のメリットとしては、共発現のＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５並びに任意のインターロイキン、例えばＩＬ７が、ＤＣ細胞を腫瘍部位まで有効的に募集して、改変免疫細胞の増殖及び生存時間を増加し、腫瘍微小環境から改変免疫細胞への抑制作用して、改変免疫細胞の腫瘍殺傷能力を向上させる一方、募集したＤＣ細胞が体自身のＴ細胞の養子免疫認識を活性化し、改変免疫細胞と相乗効果を形成し、最終的に腫瘍への抑制を増加することができる。

Ｐａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞のＣＤ１９発現率である。 フローサイトメトリーによって測定されたＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現レベルである。 ＥＬＩＳＡによって測定されたＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＬ－７発現レベルである。 ＥＬＩＳＡによって測定されたＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＣＬ４発現レベルである。 ＥＬＩＳＡによって測定されたＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＣＬ５発現レベルである。 ＣＡＲ－Ｔ細胞がそれぞれ標的細胞及び非標的細胞とともに共培養したＩＦＮ－γ放出レベルである。 ＣＣＬ４又はＣＣＬ５を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を用いてマウス膵臓癌を治療した後、マウスの体重変化曲線である。 ＣＣＬ４又はＣＣＬ５を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を用いてマウス膵臓癌を治療した後、マウスの腫瘍増殖曲線である。 ＣＣＬ３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を用いてマウス膵臓癌を治療した後、マウスの体重変化曲線である。 ＣＣＬ３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を用いてマウス膵臓癌を治療した後、マウスの腫瘍増殖曲線である。

別段の指定がない限り、本明細書で使用されるすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

キメラ受容体
本明細書で使用されるように、「キメラ受容体」という用語とは、細胞表面に発現され標的分子（例えばリガンド）に特異的に結合されることができる分子を指す。このような分子は、一般的に、リガンドに特異的に結合可能なリガンド結合ドメインと、表面分子を細胞表面にアンカーする膜貫通ドメインと、シグナル伝達を担う細胞内ドメインと、を含む。そのような一般的なキメラ受容体の実例は、例えばＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を含む。

本明細書で使用されるように、「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」という用語とは、抗原提示に応答しＴ細胞活性化に参与する膜タンパク質複合体を指す。ＴＣＲの刺激は、抗原提示細胞における主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）によってトリガーされ、前記抗原提示細胞は、抗原ペプチドをＴ細胞に提示するとともにＴＣＲ複合体に結合して、一連の細胞内シグナル伝達を誘導する。ＴＣＲは、へテロダイマーをそれぞれ形成する６本のペプチド鎖から組成され、一般的にαβ型とγδ型に分ける。各ペプチド鎖は、定常領域及び可変領域を含み、可変領域は、特異的で特定の抗原及びＭＨＣ分子の結合を担う。ＴＣＲの可変領域は、リガンド結合ドメインを含み、又はリガンド結合ドメインに作動可能に連結されることができ、リガンド結合ドメインの定義は下記の通りである。

本明細書で使用されるように、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語とは、人工的に構築されたハイブリッドペプチドを指し、このハイブリッドペプチドは一般的にリガンド結合ドメイン（例えば抗体又は抗体断片）、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、各ドメインの間にリンカーにより連結される。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を用いてＭＨＣ制限なしにＴ細胞と他の免疫細胞の特異性及び反応性を選択されたターゲットに新たにリダイレクトすることができる。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲ細胞に抗原処理に関連しない抗原認識能力を付与するため、腫瘍逃避の主要なメカニズムを迂回する。また、Ｔ細胞内で発現する場合に、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖及びβ鎖と有利的に二量体化しない。

本明細書で使用されるように、「リガンド結合ドメイン」とは、リガンド（例えば抗原）に結合可能な任意の構成又はその機能性バリアントを指す。リガンド結合ドメインは抗体構造であってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、リコンビナント抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ネズミ抗体、キメラ抗体及びその機能性断片を含むが、それらに限定されない。リガンド結合ドメインの実例は、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＶＨとＣＨ１ドメインとからなるＦｄ断片、直線状抗体、シングルドメイン抗体、ナノ抗体、及び非免疫グロブリン抗原結合足場を含むが、それらに限定されなく、例えば組換えフィブロネクチンドメイン、ＤＡＲＰＩＮ、アフィマー、ａｆｆｉｌｉｎ、ａｄｎｅｃｔｉｎ、ａｆｆｉｔｉｎ、ｏｂｏｄｉｅｓ、ｒｅｐｅｂｏｄｙ、ｆｙｎｏｍｅｒ、ａｌｐｈａ ｂｏｄｙ、ａｖｉｍｅｒ、ａｔｒｉｍｅｒ、ｃｅｎｔｙｒｉｎ、ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、Ａｒｍａｄｉｌｌｏリピートプロテイン等である。好ましくは、リガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体、ナノ抗体，又はその機能性断片から選択される。本発明で、リガンド結合ドメインは、単価又はバイナリであってもよいし、１つ又は複数のリガンド結合ドメインを含む単特異性、双特異性又は多特異性の抗体であってもよい。

「Ｆａｂ」とは、免疫グロブリン分子がパパインによって分解されて生じた２つの同一断片のうちのいずれか１つであり、ジスルフィドにより連結された完全軽鎖及び重鎖Ｎ端部分からなり、重鎖Ｎ端部分が重鎖可変領域及びＣＨ１を含む。完全のＩｇＧに比べると、ＦａｂはＦｃ断片を有せず、流動性及び組織浸透能力が高く、且つ抗体効果を介在せずに抗原に単価で結合されることができる。

「単鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とがリンカーにより連結された抗体である。リンカーの最適長さ及び／又はアミノ酸組成を選択することができる。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折り畳み及び相互作用の状況に明らかに影響をもたらす。実際に、短いリンカー（例えば５～１０個のアミノ酸にある）を使用すると、鎖内折り畳みを防止することができる。リンカーの大きさ及び組成の選択について、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、アメリカ専利出願公報番号２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、及びＰＣＴ公報番号ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照し、その全文が引用されて本明細書に合併する。ｓｃＦｖは、例えばＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのような、任意の順序で連結されるＶＨ及びＶＬを含んでもよい。

「シングルドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」とは、軽鎖が自然に欠損している抗体であり、この抗体は１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）と２つの一般的なＣＨ２及びＣＨ３領域のみを含み、「重鎖抗体」と呼ばれる。

「ナノ抗体」又は「Ｎｂ」とは、単独でクローンして発現されたＶＨＨ構造であり、元の重鎖抗体に相当する構造安定性及び抗原との結合活性を有し、現在既知の結合可能な対象抗原の最小単位である。

「機能性バリアント」又は「機能性断片」という用語とは、基本的に親アミノ酸配列を含むが、この親アミノ酸配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾（置換、欠失、挿入など）のバリアントを含有し、条件として前記バリアント親アミノ酸配列の生物活性を保留することである。一実施形態において、前記アミノ酸修飾は、保守的な修飾が好ましい。

本明細書で使用されるように、「保守的な修飾」という用語とは、当該アミノ酸配列を含有する抗体又は抗体断片の結合特徴を明らかに影響又は変更しないアミノ酸修飾を指す。これらの保守的な修飾はアミノ酸置換、添加及び欠失を含む。修飾は、当分野での既知の標準技術、例えば部位特異的変異導入及びＰＣＲ介在の変異導入により、本発明のキメラ抗原受容体に導入される。保守的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換えられることである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当分野で定義され、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、ホルマジンチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。保守的な修飾は、例えば極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は係わる残基の両親媒性の類似性に応じて選択されてもよい。

従って、「機能性バリアント」又は「機能性断片」は、親アミノ酸配列に少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、且つ親アミノ酸の生物活性、例えば結合活性を保留する。

本明細書で使用されるように、「配列同一性」という用語は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列が比較において同一位置で同じ残基を有する程度を表し、且つ一般的にパーセンテージとして表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全体長さで決められる。従って、完全に同じ配列を有する２つのコピーは、１００％の同一性を有する。当業者は、いくつかのアルゴリズムが標準パラメータを用いて配列同一性を特定することに用いられることができ、例えばＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ等（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷであると認識している。

リガンド結合ドメインの選択は、認識対象である具体的な疾患状態に関する標的細胞における細胞表面マーカー、例えば腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原によって決められる。従って、一実施形態において、本発明のリガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ又は複数のターゲットに結合される。好ましくは、前記ターゲットは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される。ターゲティング対象である抗原により、本発明のＣＡＲは、この抗原に対して特異性を有するリガンド結合ドメインを含むように設計されてもよい。例えば、ＣＤ１９がターゲティング対象である抗原であれば、ＣＤ１９抗体は本発明のリガンド結合ドメインとして用いられることができる。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＣＤ２２又はその組み合わせを標的にする。好ましい一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、配列番号１の１～１０７位又は配列番号２５の１～１０７位で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、配列番号１の１２３－２４２位又は配列番号２５の１２３～２３８位で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、含む抗ＣＤ１９抗体を含む。好ましい一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、配列番号２７の１～１２４位で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、配列番号２７の１４３－２４９位で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、を含む抗ＣＤ２２抗体を含む。

本明細書で使用されるように、「膜貫通ドメイン」という用語とは、キメラ抗原受容体を免疫細胞（例えばリンパ球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞）表面で発現させ、且つ免疫細胞の標的細胞に対する細胞応答をガイドするペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然又は合成のものであってもよいし、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。キメラ抗原受容体と標的抗原とが結合される場合に、膜貫通ドメインはシグナル伝達を行うことができる。特に本発明における膜貫通ドメインに適用され、例えばＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びその機能性断片に由来してもよい。或いは、膜貫通ドメインは合成したものであってもよく、且つ主に疎水性残基、例えばロイシンとバリンを含んでもよい。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖又はＣＤ２８に由来し、配列番号３、５又は３０で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列が配列番号４、６又は２９で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域を含んでもよい。本明細書で使用されるように、「ヒンジ領域」という用語は、一般的に膜貫通ドメインをリガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、リガンド結合ドメインに対してより高い柔軟性とアクセス性を提供するように用いられる。ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含んでもよい。ヒンジ領域は、全部又は一部が天然分子に由来し、例えば全部又は一部がＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域に由来し、又は全部又は一部が抗体定常領域に由来してもよい。或いは、ヒンジ領域は、自然に発生するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよいし、又は完全に合成したヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含み、より好ましくはＣＤ８α、ＣＤ２８又はＩｇＧ４からのヒンジであり、配列番号１９、２１、２３又は３６で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、或いは、そのコード配列が配列番号２０、２２、２４又は３５で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

本明細書で使用されるように、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語とは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞が所定機能を行うように指導するタンパク質部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、リガンド結合ドメインが抗原に結合された一次細胞内シグナル伝達を担うことによって、免疫細胞及び免疫反応の活性化を招く。言い換えると、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の正常のエフェクター機能の少なくとも１種類を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はヘルパー活性であってもよく、サイトカインの分泌を含む。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原受容体結合後に一緒に機能して一次シグナル伝達を誘導するＴ細胞受容体及び共受容体の細胞質配列と、これらの配列の任意のデリバティブ又はバリアントと、同一又は類似の機能を有する任意の合成配列であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、沢山の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆｓ，ＩＴＡＭ）を含んでもよい。本発明の細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例は、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものを含むが、それらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んでもよく、このシグナル伝達ドメインは、配列番号１１、１３又は３４で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号１２、１４又は３３で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、１つ又は複数の共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、共刺激分子からの細胞内機能性シグナル伝達ドメインであってもよく、前記共刺激分子の全体細胞内部分、又はその機能断片を含む。「共刺激分子」とは、Ｔ細胞において共刺激リガンドに特異的に結合されることによって、Ｔ細胞の共刺激反応（例えば増殖）を介在する同源結合配偶体を指す。共刺激分子は、ＭＨＣクライス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、それらに限定されない。本発明の共刺激ドメインの非限定的な例は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＣＤ９４、ＬＴＢ及びＺＡＰ７０等のタンパク質に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むが、それらに限定されない。好ましくは、本発明ＣＡＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０又はその組み合わせに由来する。一実施形態において、本発明のＣＡＲに含まれる共刺激ドメインは、配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又は当該共刺激ドメインのコード配列は、配列番号８又は１０で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞、例えばＴ細胞によって発現される場合に、新生タンパク質が小胞体まで導入されてから細胞表面まで導入されるように、シグナルペプチドを含んでもよい。シグナルペプチドのコアは、長い疎水性アミノ酸セグメントを含んでもよく、単独のα－螺旋を形成する傾向がある。シグナルペプチドの末端には、一般的にシグナルペプチダーゼによって認識、カットされたアミノ酸セグメントがある。シグナルペプチダーゼは、移行中又は完成後にカットされ、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質が生成する。その後、遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼに消化される。本発明に適用可能なシグナルペプチドは、当業者によって周知されるものであり、例えばＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲα、Ｂ２Ｍ等から派生されるシグナルペプチドである。一実施形態において、本発明に適用可能なシグナルペプチドは、配列番号１５、１７又は４０で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又は当該シグナルペプチドのコード配列は、配列番号１６、１８又は３９で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲの発現時間をコントロールするようにスイッチ構造をさらに含んでもよい。例えば、スイッチ構造は、二量体化ドメインの形式であってもよく、その対応するリガンドとの結合によりコンフォメーションの変化を引き起こし、細胞外結合ドメインを露出させることにより、それをターゲティング対象抗原に結合させてシグナル伝達通路を活性化する。或いは、スイッチドメインにより結合ドメインとシグナル伝達ドメインをそれぞれ連結し、スイッチドメインが互いに結合される（例えば誘導化合物の存在で）場合のみに、結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインは、二量体によって連結されてシグナル通路を活性化するようにしてもよい。スイッチ構造は、マスキングペプチドの形式であってもよい。マスキングペプチドは、細胞外結合ドメインをマスクし、ターゲティング対象抗原との結合を阻止することができ、例えばプロテアーゼによってマスキングペプチドがカットされた後、細胞外結合ドメインを露出させて、１つの「通常」のＣＡＲ構造とする。当業者の知っている様々なスイッチ構造はいずれも本発明に適用できる。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは自殺遺伝子を含んでもよく、即ち、外因性物質によって誘導される１つの細胞死シグナルを発現させて需要時（例えば深刻な副作用を引き起こす時）にＣＡＲ細胞を除去する。例えば、自殺遺伝子は、插入されたエピトープの形式であってもよく、例えばＣＤ２０エピトープ、ＲＱＲ８等であり、需要時に、これらのエピトープをターゲティングする抗体又は試薬を加入することでＣＡＲ細胞を除去することができる。自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルス チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）であってもよく、この遺伝子は、細胞がガンシクロビルの治療を受けて誘導されて死亡するようにできる。自殺遺伝子はｉＣａｓｐａｓｅ－９であってもよく、例えばＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７等のような化学誘発剤によりｉＣａｓｐａｓｅ－９を二量体化させるように誘導して、下流のＣａｓｐａｓｅ３分子を活性化し、アポトーシスを引き起こす。当業者の知っている様々な自殺遺伝子はいずれも本発明に適用できる。

ＣＣケモカイン
ケモカインは、Ｎ末端システインの並び方式に応じて、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ及びＣＸ３Ｃの４つの亜族に分けてもよく、ＣＣケモカインは、２つの隣接するシステイン－システイン（ｃｙｓ－ｃｙｓ又はＣ－Ｃ）残基を含むため、そう名付けられた。ＣＣケモカインの実例は、ＣＣＲ１及びＣＣＲ５に結合されるものであり、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ５、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、Ｉ－３０９等を含む。

マクロファージ炎性タンパク質（ＭＩＰ）は、α（ＭＩＰ－１α，ＣＣＬ３とも称される）及びβ（ＭＩＰ－１β，ＣＣＬ４とも称される）という２種類の主な形式を有し、最も先にリポ多糖に活性化されたマクロファージ培養液から分離される。この両者は、類似する配列及び活性を有し、主にマクロファージ、単核細胞及び樹状細胞等から生成され、いずれも細胞表面のケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）との結合により炎症及び感染に対する免疫応答に参与する。研究した結果、ＣＣＬ３及びＣＣＬ４は、結核等の沢山の感染症の宿主防御応答に参与し、免疫細胞の有向移動を介在すると表明される。

ＣＣＬ５はＲＡＮＴＥＳとも称され、分子量８０００の小さなタンパク質であり、ヒトＣＣＬ５タンパク質の遺伝子を１７ｑ１１－２１に局在化する。 ＣＣＬ５は、単量体、二量体、ポリマー等の多種の形で存在する。ＣＣＬ５は、主にマクロファージ、活性化Ｔ細胞、線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、内皮細胞、血小板及び特定の腫瘍細胞に発現され、多種の白細胞、例えば単核細胞、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞等に対して走化または刺激の作用を有する。

ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及びＣＣＬ５は、いずれもＣＣＲ５に結合され、免疫細胞を募集し、例えば未成熟の骨髓樹状細胞、単核細胞、マクロファージ、Ｔｈ１、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及び形質細胞様樹状細胞等は、炎症部位又は腫瘍部位まで有向移動する。

一実施形態において、本発明の改変免疫細胞は、（ｉ）キメラ受容体と、（ｉｉ）外因性のＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子とを発現する。より好ましくは、本発明の改変免疫細胞は、（ｉ）キメラ抗原受容体と、（ｉｉ）外因性のＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子とを発現する。

一実施形態において、本発明で使用されるＣＣＬ３は、配列番号７８又は８０で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はＣＣＬ３のコード配列は、配列番号７７又は７９で示される核酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明で使用されるＣＣＬ４は、配列番号８２又は８４で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はＣＣＬ４のコード配列は、配列番号８１又は８３で示される核酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明で使用されるＣＣＬ５は、配列番号８６又は８８で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はＣＣＬ５のコード配列は、配列番号８５又は８７で示される核酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

インターロイキン
インターロイキンは、白細胞から生成され、且つ白細胞間で機能する１種類のサイトカインであり、情報伝達、免疫細胞の活性化と調節、Ｔ細胞、Ｂ細胞の活性化の介在、増殖と分化、および炎症反応において重要な役割を果たす。一般的に、インターロイキンの生物学的効果は、対応する受容体との結合により実現され、例えばＩＬ－７の生物学的特性は、ＩＬ－７とその受容体ＩＬ－７Ｒとの結合により実現される。

一実施形態において、本発明に適用可能なインターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ３３、又はそのサブユニット、又はその組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせ、より好ましくはＩＬ－７又はそのサブユニットを含むが、それらに限定されない。ＩＬ－２は主にＴ細胞から生成され、オートクリンとパラクリンの方式により役割を果たす。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の成長を維持し、サイトカインの発生を促進するだけではなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞傷害性作用を果たすように誘導することができる。また、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞増殖を刺激し、ＮＫ殺傷活性を増強し、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＴＧＦβ等の因子の発生を促進し、マクロファージを活性化し、マクロファージの抗原提示能力及び標的細胞殺傷能力を増強することもできる。ＩＬ－７は主に骨髓及び胸腺間質細胞から生成され、その主要機能として、前駆Ｂ細胞の成長の促進、末梢Ｔ細胞のアポトーシスの抑制、細胞増殖、生き残り続けの誘導、及び樹状細胞、マクロファージの発育と機能への影響、マクロファージによる多種のサイトカインの分泌への誘導に関する。ＩＬ－１２は主にＴ細胞及びＮＫ細胞に作用する。具体的には、ＩＬ－１２は、活化型Ｔ細胞の増殖を刺激し、Ｔｈ０細胞からＴｈ１細胞への分化を促進し、ＣＴＬ及びＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘導しＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭＣＳＦ等のサイトカインの分泌を促進し、ＮＫ細胞、ＩＬ－２Ｒα、ＴＮＦ受容体及びＣＤ５６の発現を促進し、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ効果を増強することができる。ＩＬ－１５は活性化のマクロファージ、表皮細胞及び提示細胞等の多種の細胞から生成されることができる。ＩＬ－１５は分子構造がＩＬ－２に比較的に類似するため、ＩＬ－２Ｒのβ鎖及びγ鎖を標的細胞に結合し、ＩＬ－２に類似する生物学的活性を発揮し、例えばＴ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激し、Ｂ細胞の増殖及び分化等を誘導することができる。ＩＬ－２１は活性化のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｆｈ細胞及びＴｈ１７細胞から生成され、ＩＬ－２、ＩＬ－１５にいずれも高い同源性を有する。ＩＬ－２１は広い免疫調節機能を有し、それを活性化すると、活化型ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強し、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強し、Ｂ細胞の増殖及び分化を促進する。ＩＬ－１７は、Ｔｈ１７細胞から分泌され、炎症誘発性分子であり、調節性Ｔ細胞を抑制し、且つ好中球及びマクロファージを募集し活性化することができる。ＩＬ－１８は、同様に炎症誘発性分子で、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から分泌され、活性化されたマクロファージも大量のＩＬ－１８を分泌する。レポートによると、ＩＬ－１８は、先天性免疫及び養子免疫において重要な役割を果たす。ＩＬ－２３は同様にＴ細胞及びＮＫ細胞から分泌され、ＩＬ－２３はＴｈ１７細胞の分化を促進することができる。樹状細胞、単核細胞、マクロファージは同様に低レベルＩＬ－２３受容体を発現し、ＩＬ－２３によって活性化されることができる。ＩＬ－３３の配列は、ＩＬ－１８に類似し、ＩＬ－１受容体ヘルパータンパク質ＩＬ－ＲＡｃＰにより受容体ＳＴ２に結合され、三者がへテロダイマーを形成し、ＮＦ－κＢ、ＭＡＰＫ等のシグナル通路を活性化し、炎症誘発因子及びケモカインの発生を強く誘導して、生物学的効果を果たす。ＩＬ－３３は、上皮細胞、線維芽細胞、マクロファージ、樹状細胞等を含む多種の細胞で発現される。研究した結果、ＩＬ－３３は、未成熟の樹状細胞にＴｒｅｇを生成させるように刺激し、Ｔｈ１細胞にＩＦＮ－ γを分泌させるように促進し、ＣＤ６９の発現を増加して、ＮＫ、ＮＫＴ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、抗腫瘍免疫を促進することができると表明される。研究した結果、これらのインターロイキンは、単独して又は組み合わせる（例えばＩＬ－３３とＩＬ－１２、ＩＬ－７＋ＩＬ－１２、ＩＬ－７＋ＩＬ１５等）と、有効的な抗腫瘍作用を果たすことができると表明される。

一実施形態において、本発明で使用されるインターロイキンは、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５で示される核酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

外源遺伝子の発現
本発明における外因性遺伝子、例えばインターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５の発現は、組成型発現又は条件式発現であってもよい。

一実施形態において、外因性のインターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５の発現は条件式発現である。例えば、需要に応じて、外因性遺伝子と、誘導式、抑制式、又は組織特異的プロモーターとを作動可能に連結して、特定の時間又は特定の組織、細胞タイプ内において導入された外因性遺伝子の発現レベルをコントロールすることができる。一実施形態において、プロモーターは誘導式プロモーターであり、即ち、特定環境条件、発育条件又は誘導物の存在のみで転写を起動するプロモーターである。このような環境条件は、例えば腫瘍酸性微小環境、腫瘍低酸素微小環境等を含む。このような誘導物は、例えばサイサイクリン、テトラサイクリン又はそれらの類似体を含み、テトラサイクリンの類似体は、例えばクロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デスメチルクロロテトラサイクリン、メトキシサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリンを含む。誘導式プロモーターは、例えばＬａｃオペロン配列、テトラサイクリンオペロン配列、ガラクトースオペロン配列又はドキシサイクリンオペロン配列等を含む。他の一実施形態において、プロモーターは抑制式プロモーターであり、即ち、抑制式プロモーターに対して特異性を有するリプレッサーが存在する場合に、外因性遺伝子の細胞における発現は抑制され又は発現されない。抑制式プロモーターは、例えばＬａｃ抑制式エレメント又はテトラサイクリン抑制式エレメントを含む。当業者の周知する誘導式／抑制式発現システムは本発明に適用でき、Ｔｅｔ－ｏｎシステム、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステム、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム等を含むが、それらに限定されない。

一実施形態において、インターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５は、局在化ドメインに作動可能に連結されることができ、前記局在化ドメインは、本発明の外因性遺伝子を特定の細胞位置に局在化して発現することができ、例えば細胞膜、細胞質における特定の細胞小器官、例えば小胞体、ゴルジ体、細胞核等である。局在化ドメインは、核局在化シグナル、案内ペプチド、膜貫通ドメイン等である。一実施形態において、本発明の外因性遺伝子インターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５は、膜貫通ドメインに作動可能に連結されて、改変免疫細胞の表面にアンカし発現する。

一実施形態において、本発明における外因性遺伝子、例えばインターロイキン、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５タンパク質は、野生型又は特定の性能（例えばタンパク質分解への抵抗）を有する融合タンパク質、或いは変異体であってもよい。

核酸
本発明は、（ｉ）キメラ受容体をコードする核酸配列と、（ｉｉ）ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５をコードする核酸配列と、を含む核酸分子をさらに提供する。

一実施形態において、核酸分子は、（ｉｉｉ）インターロイキンをコードする核酸配列をさらに含む。好ましくは、前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ３３、又はそのサブユニット、又はその組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせ、より好ましくはＩＬ－７又はそのサブユニットを含むが、それらに限定されない。

一実施形態において、前記キメラ受容体は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体、好ましくはキメラ抗原受容体である。キメラ抗原受容体の定義は、上記の通りである。

本明細書で使用されるように、「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの配列、例えば修飾済又は未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡ、それぞれが単鎖及び／又は双鎖の形式である直線状又は環状、又はそれらの混合物（ハイブリッド分子を含む）を含む。故に、本発明に係わる核酸は、ＤＮＡ（例えばｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）、それらの組み合わせ又はデリバティブ（例えばＰＮＡ）を含む。好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡである。

核酸は、通常のホスホジエステル結合又は非通常の結合（例えばアミド結合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で発見されたもの）を含んでもよい。本発明の核酸は、例えばトリチル化塩基と珍しい塩基（例えばイノシン）のような１種類又は複数種類の修飾塩基を含んでもよい。化学、酵素又は代謝修飾を含む他の修飾も想到でき、本発明のマルチチェーンＣＡＲはポリヌクレオチドから発現されればいい。核酸は分離の形式で提供されてもよい。一実施形態において、核酸は、例えば転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロン等の調節配列を含んでもよい。

本発明の核酸配列に対してコドン最適化を行い、所要の宿主細胞（例えば免疫細胞）において最適な発現を行うことができ、或いは、細菌、酵母又は昆虫細胞での発現に用いられる。コドン最適化とは、対象配列に存在する所定の物種の高度発現の遺伝子において一般的に珍しいコドンを、このような物種の高度発現の遺伝子において一般的に普通のコドンに置き換え、置換前後のコドンコードが同一であるアミノ酸を指す。従って、最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドン使用バイアスに決められる。

ベクター
本発明は、本発明に記載の核酸を含むベクターをさらに提供する。そのうち、キメラ受容体をコードする核酸配列、ＩＬ－７をコードする任意の核酸配列、ＣＣＬ３をコードする核酸、ＣＣＬ４をコードする核酸及び／又はＣＣＬ５をコードする核酸配列は１つ又は複数のベクターにあってもよい。

本明細書で使用されるように、「ベクター」という用語は、（外因性）の遺伝子材料を宿主細胞に転移するためのメディエーター核酸分子であり、この宿主細胞において前記核酸分子は、例えばコピーされ、且つ／又は発現されてもよい。

ベクターは一般的にターゲティングベクターと発現ベクターを含む。「ターゲティングベクター」は、例えば同源リコンビナントにより又は特異的標的部位での配列のハイブリッドリコンビナーゼを用いて分離した核酸を細胞内部まで送達する媒体である。「発現ベクター」は、異種核酸配列（例えば、本発明のキメラ抗原受容体ペプチドをコードするそれらの配列）の適合な宿主細胞での転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に用いられるベクターである。本発明に適用できる適当なベクターは当分野で既知されるものであり、たくさん購買され取得されることができる。一実施形態において、本発明のベクターは、プラスミド、ウィルス（例えばレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ、ポリオーマウィルス及びアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）等）、ファージ、ファージミド、コスミド及び人工染色体（ＢＡＣとＹＡＣを含む）を含むが、それらに限定されない。ベクター自身は一般的にヌクレオチド配列であり、一般的に挿入物（遺伝子導入）を含むＤＮＡ配列と、ベクターの「スケルトン」である大きい配列である。改変ベクターには、一般的に宿主細胞での自己複製の起源（ポリヌクレオチドの安定的発現の必要があれば）、選択マーカー及び制限酵素切断部位（例えばマルチクローニングサイト，ＭＣＳ）も含む。ベクターは、プロモーター、ポリＡテール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペレーター、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグ等のエレメントをさらに含んでもよい。具体的な一実施形態で、前記ベクターは、インビトロ転写のベクターである。

改変免疫細胞及びその調製方法
本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む改変免疫細胞をさらに提供する。言い換えると、本発明の改変免疫細胞は、キメラ受容体（例えばキメラ抗原受容体）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子、並びに任意のインターロイキン、例えばＩＬ－７を発現する。

本明細書で使用されるように、「免疫細胞」という用語とは、１種類又は多種のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞の活性への殺傷、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導）を有する免疫システムの任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞であってもよく、或いは、例えば成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髓幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血幹細胞等の幹細胞から派生される免疫細胞であってもよい。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞であってもよく、例えば 原代Ｔ細胞のような体外培養的Ｔ細胞、或いはＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等のようなＴ細胞インビトロで培養されたＴ細胞株からのもの、又は被験者から取得されたＴ細胞である。被験者の実例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらの遺伝子組み換え種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髓、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍の複数のソースから取得されることができる。Ｔ細胞は、濃縮され又は精製されてもよい。Ｔ細胞は、任意の発育段階にあってもよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞等を含むが、それらに限定されない。好ましい一実施形態において、免疫細胞は、ヒトＴ細胞である。当業者に既知される多種技術、例えばＦｉｃｏｌｌ分離を用いて被験者の血液からＴ細胞を取得することができる。本発明で、免疫細胞は、キメラ抗原受容体及び外因性のＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子、及び例えばＩＬ－７のような任意のインターロイキンを発現するように改変される。

本分野で既知の一般的な方法（例えば形質導入、トランスフェクション、形質転換等）を採用し、キメラ受容体（例えばキメラ抗原受容体）ペプチドをコードする核酸配列と、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子と、例えばＩＬ－７のような任意のインターロイキン遺伝子とを免疫細胞に導入することができる。「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。一例としては、ＲＮＡトランスフェクションであり、即ち、ＲＮＡ（例えばインビトロ転写のＲＮＡ，ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞での非ウイルスアプローチに用いられる。「形質導入」という用語は一般的にウィルス介在の核酸分子又はポリヌクレオチドの転移を説明するためのものである。動物細胞のトランスフェクションは、材料摂取を許容するように、一般的に細胞膜の一時的に開かれる孔または「穴」に係わる。リン酸カルシウムを用い、エレクトロポレーション、細胞押し出しにより、又カチオン性脂質と材料とを混合させて細胞膜に融合してそれらのキャリアを内部に沈着する脂質体が生成し、トランスフェクションを行うことができる。真核宿主細胞のトランスフェクションに用いる例示的技術は、脂質ベシクル媒介の取り込み、ヒートショック媒介の取り込み、リン酸カルシウム媒介のトランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。「形質転換」という用語は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）が細菌中、非動物真核細胞（植物細胞を含む）中の非ウィルスへも転移することを説明するためのものである。従って、形質転換は、細菌又は非動物真核細胞の遺伝子変更であり、細胞膜によりその周囲から直接的に取り込んでから外因性の遺伝子材料（核酸分子）に組み込んで生成される。形質転換は、人工手段により実現されてもよい。形質転換の発生のために、細胞又は細菌は有能な状態であればならない。原核形質転換について、技術は、ヒートショック媒介の取り込み、完全細胞の細菌プロトプラストとの融合、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。

従って、本発明は、（ａ）キメラ受容体をコードする第１核酸配列又はそのコードされたキメラ受容体と、ｂ）ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５をコードする第２核酸配列又はそのコードされたＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５タンパク質と、（ｃ）インターロイキンをコードする任意の第３核酸配列又はそのコードされたインターロイキンと、を前記免疫細胞に導入することを含む改変免疫細胞を調製する方法を更に提供する。

一実施形態において、上記フラクション（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を、任意の順序で免疫細胞に順次に導入してもよい。他の一実施形態において、上記フラクション（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を免疫細胞に同時に導入し、例えば（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を１つ又は複数のベクターにクローンしてもよい。

核酸又はベクターを免疫細胞に導入すると、当業者は、一般的な技術により取得した免疫細胞を増幅、活性化することができる。

一実施形態において、本発明の改変免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子（例えばＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ）と、ＭＨＣ関連遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ）と、例えばＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３等の免疫チェックポイント遺伝子と、から選択される少なくとも１種類を含む遺伝子の発現が抑制され又は沈黙する。

遺伝子発現を抑制し又は遺伝子を沈黙させる方法は、当業者に周知される。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ケモカインリガンド、抗感染細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド及び化学剤）及びプロテアーゼ阻害剤を用いて遺伝子の発現を抑制することができる。また、例えば大範囲のヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ酵素によりＤＮＡブレークを介在して、遺伝子を沈黙させることもできる。

テストキット及び医薬組成物
本発明は、本発明の改変免疫細胞、核酸分子又はベクターを含むテストキットをさらに提供する。

好ましい一実施形態において、本発明のテストキットは説明書を更に含む。

本発明は、本発明に記載の改変免疫細胞、核酸分子又はベクターを活性剤として含有し、多種薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。従って、本発明は、医薬組成物又は薬の調製における前記核酸分子、ベクター又は改変免疫細胞の使用をさらにカバーする。

本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される賦形剤」という用語とは、被験者および有効成分と薬理学的および／または生理学的に適合する（即ち、何らかの希望しない局部又は全身の作用を果たすことがなく、所要の治療効果を果たす）ベクター及び／又は賦形剤を指し、本分野で周知される（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５参照）。薬学的に許容される賦形剤の実例は、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、粘着防止剤、流動促進剤、酸化防止剤、香料、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張剤、吸収遅延剤、安定剤および等張化剤を含むが、それらに限定されない。当業者は、適当な賦形剤を選択して本発明の所望の医薬組成物を調製することを知っている。本発明に用いる医薬組成物における例示的賦形剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水である。通常、適当な賦形剤の選択は、特に使用される活性剤、治療対象の疾患及び医薬組成物の所望の剤型によって決められる。

本発明に係わる医薬組成物は、複数の経路で投与される。一般的に、非経口で投与を完了する。非経口投与法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、心室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下、または鼻腔内で投与することを含む。

本発明の医薬組成物は、例えば固体、液体、気体、凍結乾燥形態等の各種形式で調製されることができ、特に軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアゾール、顆粒、丸剤、懸濁液、乳液、カプセル、シロップ、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、液体エキス剤抽出物の形態であってもよく、或いは、特に所要の施用方法に適用する形態である。本発明で既知の薬を製造するプロセスは、例えば、ルーチンの混合、溶解、造粒、糖衣製造、製粉、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスを含んでもよい。例えば本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は一般的に溶液の形態で提供され、且つ好ましくは薬学的に許容される緩衝剤を含む。

本発明に係わる医薬組成物は、治療及び／又は治療対象の疾患の予防に適用する１種類又は多種の他の薬剤と組み合わせて投与されることもできる。組み合わせに適用する薬剤の好ましい実例は、例えばシスプラチン、メイタンシン誘導体、ラチェルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーポルフィリンナトリウムＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチン及びアドリアマイシン等の既知の抗癌薬と、例えばリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、ＤＮＡ酵素及びＲＮＡ酵素等のペプチド細胞毒素と、例えばヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５及びアスタチン２１３等の放射性核種と、例えば抗体指向性酵素プロドラッグのプロドラッグと、例えば血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質等の免疫刺激剤と、例えば抗ＣＤ３抗体又はその断片のような抗体又はその断片と、補体活化剤と、ヘテロタンパク質ドメインと、ホモタンパク質ドメインと、ウイルス／細菌タンパク質ドメインと、ウィルス／細菌ペプチドと、を含む。また、本発明の医薬組成物は、例えば化学療法、放射線療法等の他の１種類又は多種の治療方法と組み合わせて使用されてもよい。

治療への応用
本発明は、前記被験者に対して本発明に記載の免疫細胞又は医薬組成物を有効量だけ投与することを含む癌、感染症または自己免疫疾患を有する被験者を治療する方法を更に提供する。従って、本発明は、癌、感染又は自己免疫疾患を治療する薬の調製における前記核酸分子、ベクター、改変免疫細胞及び医薬組成物の使用を更にカバーする。

一実施形態において、被験者に対して有效量の本発明の免疫細胞及び／又は医薬組成物を直接的に投与する。

別の一実施形態において、本発明の治療方法は、生体外治療である。具体的には、この方法は、（ａ）免疫細胞を含むサンプルを提供するステップと、（ｂ）生体外で本発明のキメラ受容体（例えばキメラ抗原受容体）及び発現対象である外因性遺伝子を前記免疫細胞に導入し、修飾された免疫細胞を取得するステップと、（ｃ）このような需要がある被験者に対して前記修飾された免疫細胞を投与するステップと、を含む。好ましくは、ステップ（ａ）で提供される免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞から選択され、且つ前記免疫細胞は、当分野での既知の一般的方法で被験者のサンプル（特に血液サンプル）から取得されることができる。しかし、本発明のキメラ抗原受容体及び外因性遺伝子を発現し、本明細書に記載の所要の生物効果機能を発揮する他の免疫細胞を使用してもよい。また、一般的に選択された免疫細胞は、被験者の免疫システムに適合し、即ち好ましくは前記免疫細胞は免疫原性応答を誘発しない。例えば、「ユニバーサル受容細胞」、即ち所要の生物効果機能を発揮する普遍的に適合する生体外培養及び増殖のリンパ球を使用してもよい。このような細胞の使用は、被験者自身のリンパ球を取得及び／又は提供する必要がなくなる。ステップ（ｃ）の生体外導入は、エレクトロポレーションを介して本明細書に記載の核酸又はベクターを免疫細胞に導入し、又はウィルスベクターにより免疫細胞を感染することによって実施されることができ、前記ウィルスベクターは、上記したレンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである。想到できる他の方法は、トランスフェクション試剤（例えば脂質体）又は一過性ＲＮＡトランスフェクションの使用を含む。

一実施形態において、前記免疫細胞は、自家又は同種異系の細胞であり、好ましくはＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞、より好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。

本明細書で使用されるように、「自家」という用語とは、個体に由来する任意の材料が後に当該同一個体に再びに導入されるという意味である。

本明細書で使用されるように、「同種異系」という用語とは、任意の材料が当該材料に導入された個体と同一物種の異なる動物又は異なる患者に由来するという意味である。１つ又は複数の遺伝子座の所在する遺伝子が異なる場合に、２つ又はより多い個体が互い同種異系のものであると認定される。いくつかの場合に、同一物種のそれぞれの個体の同種異系材料の遺伝子における相違によっては、抗原相互作用が発生する可能性が高い。

本明細書で使用されるように、「被験者」という用語は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、人間以外の霊長類動物、マウス、ラット、犬、猫、馬又は牛であってもよいが、これらの実例に限定されない。人間以外の哺乳動物は、癌動物モデルを代表する被験者として有利的に用いられる。好ましくは、前記被験者はヒトである。

一実施形態において、前記癌は、リガンド結合ドメインに結合されるターゲット発現に関する癌である。例えば、前記癌は、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳・中枢神経系の癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸・直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、肝臓癌、肝細胞腫、上皮内腫瘍、腎臓癌、喉頭癌、肝臓腫瘍、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌及び扁平上皮癌）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば唇、舌、口及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系悪性腫瘍、外陰癌及び他の癌と肉腫、及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高度リンパ芽球性ＮＨＬ、高度切れ込みの無い小細胞型ＮＨＬ、大塊疾患ＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髓性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成、形質芽細胞性リンパ腫、白血病前症、形質細胞様樹状突起細胞腫瘍、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びにターゲット発現に関する他の疾患を含むが、それらに限定されない。好ましくは、本発明の改変免疫細胞又は医薬組成物を用いて治療する疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、脳神経膠腫、膵臓癌、胃癌等から選択される。

一実施形態において、前記感染は、ウィルス、細菌、真菌及び寄生虫による感染を含むが、それらに限定されない。

一実施形態において、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、セリアック病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血及び全身性エリテマトーデス等を含むが、それらに限定されない。

一実施形態において、前記方法は、前記被験者に１種類又は複数種類の追加の化学療法剤、生物製剤、薬物、又は治療を適用する。この実施形態において、化学療法剤、生物製剤、薬物、又は治療は、放射線療法、手術、抗体試薬及び／又は低分子、並びにそれらの任意の組み合わせから選択される。

以下、図面を参照しながら実例を合わせて本発明を詳細に説明する。説明すべきこととして、当業者は、本発明の図面及びその実施例が例示なものに過ぎず、本発明に対する任意の制限を構成しないと理解するはずである。矛盾しない場合、本出願における実施例及び実施例における特徴は互いに組み合わせることができる。

実施例１ マウス膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ０２－ｍＣＤ１９の構築
１．ｐＬＶ－ｍＣＤ１９プラスミドの調製
マウス脾臓総ｍＲＮＡをテンプレートとして、逆転写ＰＣＲによりマウス脾臓総ｃＤＮＡ配列を取得してから、ＰＣＲによりＸｂａＩ及びＳａｌＩ制限部位を含有するマウスｍＣＤ１９配列を取得する。そして、ｍＣＤ１９遺伝子をｐＬＶＸベクター（ＰＰＬ，Ｃａｔ Ｎｏ．：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に組換、ｐＬＶ－ｍＣＤ１９プラスミドを取得する。

２．レンチウィルス包装
Ｔ１７５培養フラスコで、３０×１０ ^６個の細胞／フラスコの密度で２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含有する３０ｍｌのＤＭＥＭ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで一晩培養する。

無菌管に３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号３１９８５－０７０）、３４μｇのｐＬＶ－ｍＣＤ１９プラスミド、８．５μｇ ｐＭＤ２．Ｇベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２５９）及び１７μｇのｐｓＰＡＸ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２６０）に加入する。そして、１２０μｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試剤（Ｒｏｃｈｅ，商品番号０６３６６２３６００１）を加入し、すぐに混ぜて、室温で１５分間孵化させる。そして、当該プラスミド／ベクター／トランスフェクション試剤混合物を、予め用意した２９３Ｔ細胞の培養フラスコに一滴ずつ加入し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で一晩培養する。トランスフェクション後の２４時間及び４８時間の後に培養物を収集し、組み合わせてから超遠心分離（２５０００ｇ、４℃、２．５ｈ）して、濃縮したｐＬＶ－ｍＣＤ１９レンチウィルスを取得し、それを－８０℃で保存する。

３．Ｐａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞株のスクリーニング
６孔の細胞培養プレートのそれぞれの孔に、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，商品番号Ｃ１２４３０５００ＢＴ）、１×１０^６個のマウス膵臓癌細胞Ｐａｎｃ０２（中国薬科大学実験室からの贈り物）及び２００μｌのｐＬＶ－ｍＣＤ１９レンチウィルスを加入し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で４８時間孵化させる。そして、０．２５％のトリプシンを用いて細胞を単細胞懸濁液に消化し、細胞を稀釈してから９６孔プレートに転移して、モノクローナル細胞が出るまで培養し続ける。モノクローナル細胞を選択して、０．２５％のトリプシンを用いて単細胞に再び消化し、２００μｌのｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で細胞を再懸濁する。ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号１１５５１２）を用いてフローサイトメトリーにより感染効率を測定し、ＣＤ１９陽性クローンを選別する。陽性クローンを３～４回継代してから、フローサイトメトリーによりＣＤ１９発現レベルを測定する。ウィルス感染されていないＰａｎｃ０２細胞をコントロールとする。

結果は、図１に示す。最後に選別されたＰａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞株において、ＣＤ１９発現率は１００％である。

実施例２．ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
１．レトロウィルスプラスミドの構築
順に連結されたＣＤ１９－ｓｃＦｖ（配列番号２６）、ＣＤ８ａヒンジ領域及び膜貫通領域（配列番号３５及び２９）、４１ｂｂ細胞内ドメイン（配列番号３１）及びＣＤ３ζ細胞内ドメイン（配列番号３３）のコード配列断片を人工合成して、両端にＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を加入する。断片をＭＳＣＶベクターにクローンして、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲプラスミドを取得する。

順に連結されたＴ２Ａ（配列番号３７）及びＩＬ－７（配列番号４３）のコード配列断片を人工合成して、両端にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を加入する断片をＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターにクローンして、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７プラスミドを取得する。

順に連結されたＴ２Ａ（配列番号３７）及びＣＣＬ４（配列番号８３）のコード配列断片を人工合成して、両端にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を加入する。順に連結されたＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターをクローンして、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ４プラスミドを取得する。

順に連結されたＴ２Ａ（配列番号３７）及びＣＣＬ５（配列番号８７）のコード配列断片を人工合成して、両端にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を加入する。順に連結されたＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターをクローンして、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ５プラスミドを取得する。

２．レトロウィルスの調製
Ｔ１７５培養フラスコで、３０×１０ ^６個の細胞／フラスコの密度で２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含有する３０ｍｌのＤＭＥＭ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで一晩培養し、ウィルス包装に用いる。

無菌管に３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号３１９８５－０７０）、４５μｇのレトロウィルスプラスミド（ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲプラスミド、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７プラスミド、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ４プラスミド又はＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ５プラスミド）及び１５μｇの包装ベクターｐＣＬ－Ｅｃｏ（上海禾午生物科技有限公司，商品番号Ｐ３０２９）を加入する。そして、１２０μｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試剤（Ｒｏｃｈｅ，商品番号０６３６６２３６００１）を加入し、すぐに混ぜて、室温で１５分間孵化させる。そして、当該プラスミド／ベクター／トランスフェクション試剤混合物、予め用意した２９３Ｔ細胞の培養フラスコに一滴ずつ加入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養する。トランスフェクション後の７２時間の後に培養物を収集し、遠心（２０００ｇ、４℃、１０分間）して、レトロウィルス上澄み液を取得する。

３．ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
マウス脾臓からＴリンパ球を分離し、ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ＣＴＳ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号４０２０３Ｄ）を用いてＴ細胞を活性化してから、３７℃及び５％ＣＯ_２で一日培養する。

孔ごとに３×１０^６の細胞／ｍＬの密度で活性化されたＴ細胞を、予めＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎにより一晩コーティングされた２４孔板において、５００μＬ完全培地（ＮＴ，コントロール）、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲウィルス、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ４ウィルス、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ５ウィルス、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７ウィルス＋ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ４ウィルス、又はＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７ウィルス＋ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ５ウィルスをそれぞれ加入し、完全培地至を２ｍＬまで補充する。

２４孔プレートを遠心分離機に置き遠心感染を行い、３２℃、２０００ｇで２時間遠心する。そして、２４孔プレートを３７℃、ＣＯ _２のインキュベータに置き、静止培養する。翌日、新鮮な培地を変換し、細胞密度を１×１０ ^６個の細胞／ｍＬに調整する。感染の３日後、その後の分析のために細胞を収集する。収集した細胞は、ＮＴ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ４細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ５細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ４細胞、及びｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ５細胞である。

実施例３．ＣＡＲ－Ｔ細胞の発現の測定
１．細胞表面ＣＡＲの発現レベル
実施例２で調製された２×１０ ^５個のＣＡＲ－Ｔ細胞を取り出し、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）Ｂｉｏｔｉｎ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，商品番号６９１０－２５０）を一次抗体とし、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６７）を二次抗体とし、フローサイトメトリーによりＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルを測定し、結果を図２に示す。

このことからわかるように、コントロールに比べると、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ４細胞、 ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ５細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ４細胞、及びｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ５細胞におけるＣＡＲ陽性効率は、いずれも６０％ほどであり、これらの細胞はいずれもＣＡＲを有効的に発現することができると表明される。

２．ＩＬ－７の発現レベル
実施例２で調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上澄み液を収集し、メーカーの提案に応じて、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－７ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔテストキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，商品番号ＤＹ４０７）を用いて細胞中のＩＬ－７分泌レベルを測定し、結果を図３に示す。

このことからわかるように、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７ウィルによるストランスフェクションの２種類のＣＡＲ Ｔ細胞はいずれもＩＬ－７を有効的に発現することができる。

３．ＣＣＬ４の発現レベル
実施例２で調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上澄み液を収集し、メーカーの提案に応じて、Ｍｏｕｓｅ ＣＣＬ４ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔテストキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，商品番号ＤＹ４５１）を用いて細胞中のＣＣＬ４分泌レベルを測定し、結果を図４に示す。

このことからわかるように、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ４ウィルによるストランスフェクションの２種類のＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＣＬ４を有効的に発現することができる。

４．ＣＣＬ５の発現レベル
実施例２で調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の上澄み液を収集し、メーカーの提案に応じて、Ｍｏｕｓｅ ＣＣＬ５ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔテストキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，商品番号ＤＹ４７８）を用いて細胞中のＣＣＬ５分泌レベルを測定し、結果を図５に示す。

このことからわかるように、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ５ウィルスによるトランスフェクションの２種類のＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＣＬ５を有効的に発現することができる。

実施例４．ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌レベルの測定
９６孔の円底板に２×１０ ^５個の細胞／１００μｌの濃度でそれぞれＮＴ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ－７細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ４細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ５細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ４細胞、及びｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ５細胞を加入する。そして、各孔に１×１０ ^４個の細胞／１００μｌの濃度でそれぞれターゲットＰａｎｃ０２－ｍＣＤ１９細胞又は非ターゲットＰａｎｃ０２細胞を加入する。３７℃で’２４時間培養した後、培養物の上澄み液を収集する。メーカーの提案に応じて、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡテストキット（Ｒ＆Ｄ，商品番号ＤＹ４８５）を用いて培養物の澄み液におけるＩＦＮ－γの発現レベルを測定する。

測定結果は、図６に示す。このことからわかるように、非標的細胞Ｐａｎｃ０２においていずれもＩＦＮ－γの解放が検出されていなく、且つＮＴ細胞はＩＦＮ－γを発現せず、本実施例におけるＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷はいずれも特異的なものである。そして、標的細胞を殺傷する場合に、ＣＡＲのみを発現するＴ細胞に比べると、別に単独のＣＣＬ４又はＣＣＬ５を発現すると、ＩＦＮ－γの解放レベルを低下させる一方、ＩＬ－７＋ＣＣＬ４又はＩＬ－７＋ＣＣＬ５を発現すると、ＩＦＮ－γの解放レベルを増加する。

実施例５．ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍抑制効果検証
健康Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左前肢脇の下で、実施例１で調製された５×１０^５個のＰａｎｃ０２－ｍＣＤ１９膵臓癌細胞を皮下で接種する。

膵臓癌細胞が接種されたマウスを組ごとに５匹で、６組にランダムに分ける。腫瘍体積が１００ｍｍ^３まで成長する時に、各マウスの尾静脈へ実施例２で調製された１×１０^６個のＮＴ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ４細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ５細胞、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ４細胞及びｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ５細胞を注射する。

実験が終わるまで、マウスの体重及び腫瘍体積の変化を監視する。

マウスの体重変化は、図７に示す。このことからわかるように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与してから、各組マウスの体重はコントロールに比べて顕著な相違がなく、観察周期において、マウス腫瘍が１５００ｍｍ^３を超えていない場合に、マウスは活発な行動で通常の毛色であるが、これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与によってマウスに顕著な毒性および副作用をもたらすことがない。

マウスの腫瘍体積変化は、図８に示す。このことからわかるように、ＮＴ細胞及び通常のＣＡＲ－Ｔ細胞に比べると、ＣＣＬ４又はＣＣＬ５を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のみが抗腫瘍効果を増加することができるが、単独のＣＣＬ４又はＣＣＬ５は、ＣＡＲ－Ｔ細胞とともに協力効果を発生することができると表明される。また、発明者は、ＩＬ－７をさらに発現すると、ＣＣＬ４からＣＡＲ－Ｔ細胞への促進作用を顕著に増加することができ、よって腫瘍の成長をより顕著に抑制すると思いがけず見つかった。これに比べて、ＩＬ－７はＣＣＬ５に対する促進作用が、ＣＣＬ４に対する作用よりも低いが、ＩＬ－７＋ＣＣＬ５＋ＣＡＲの組み合わせの腫瘍への抑制効果は、相変わらずに単独のＣＡＲよりも僅かによい。

上記の結果は、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５又はこれらのＩＬ－７との組み合わせを共発現すると、ＣＡＲを発現する改変免疫細胞のターゲット膵臓癌細胞への抑制効果を増加することができると表明する。

実施例６．ＣＣＬ３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍抑制効果検証
実施例２に記載の方法によりＣＣＬ３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を調製し、Ｔ２Ａ（配列番号３７）及びＣＣＬ３（配列番号７９）のコード配列断片をＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲベクターにクローンして、ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ３プラスミドを取得するとともにそれをレトロウィルスとして包装する。当該ウィルを用いて活性化されたのＴ細胞に対しトランスフェクションを行ってｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＣＬ３細胞を取得する。ＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＣＣＬ３ウィルス及びＭＳＣＶ－ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＩＬ－７ウィルスを用いて活性化されたＴ細胞に対し同時にトランスフェクションを行って、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＩＬ７＋ＣＣＬ３細胞を取得する。

実施例５に記載の方法によりＣＡＲ－Ｔ細胞から腫瘍への体内抑制効果を検証する。図９はマウスの体重変化を示し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与によりマウスに顕著な毒性および副作用をもたらすことがない。図１０はマウスの腫瘍体積変化を示す。このことからわかるように、単独のＣＣＬ３は、ＣＡＲ－Ｔ細胞とともに協力効果を発生するが、ＩＬ７をさらに発現すると、ＣＣＬ３からＣＡＲ－Ｔ細胞への促進作用を顕著に増加し、腫瘍の成長をより顕著に抑制することができる。

説明すべきこととして、上記は、本発明の好ましい実施例に過ぎなく、本発明を制限するものではなく、当業者にとって、本発明は様々の変更及び変化を行うことができる。当業者によって理解されるように、本発明の思想と原則で行われたいかなる修正、同等置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

Claims (25)

1. （ｉ）キメラ受容体と、（ｉｉ）外因性のＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子とを発現する改変免疫細胞。
2. 前記ＣＣＬ３遺伝子は、配列番号７７又は７９で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記ＣＣＬ３遺伝子にコードされたペプチドは、配列番号７８又は８０で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、ＣＣＬ４遺伝子は、配列番号８１又は８３で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記ＣＣＬ４遺伝子にコードされたペプチドは、配列番号８２又は８４で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、ＣＣＬ５遺伝子は、配列番号８５又は８７で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記ＣＣＬ５遺伝子にコードされたペプチドは、配列番号８６又は８８で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する請求項１に記載の改変免疫細胞。
3. 前記改変免疫細胞は、（ｉｉｉ）外因性のインターロイキンをさらに発現する請求項１又は２に記載の改変免疫細胞。
4. 前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、又はそのサブユニット、又はその組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせである請求項３に記載の改変免疫細胞。
5. 前記インターロイキンのコーディング遺伝子は、配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５で示される核酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、或いは、前記インターロイキンは、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する請求項４に記載の改変免疫細胞。
6. 前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体である請求項１～５のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
7. 前記キメラ受容体は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体である請求項６に記載の改変免疫細胞。
8. 前記リガンド結合ドメインは、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、直線状抗体、シングルドメイン抗体、ナノ抗体、及び非免疫グロブリン抗原結合足場から選択される請求項７に記載の改変免疫細胞。
9. 前記リガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択されるターゲットに結合される請求項７又は８に記載の改変免疫細胞。
10. 前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４等のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される請求項７～９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
11. 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ等のタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される請求項７～１０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
12. 前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＣＤ９４、ＬＴＢ、ＺＡＰ７０及びそれらの組み合わせから選択される１つ又は複数のタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインである請求項７～１１のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
13. 前記免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２４７ζ、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３から選択される少なくとも１種類の不活性遺伝子を更に含む請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
14. 前記ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子の発現は条件式発現である請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
15. 前記ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５遺伝子は局在化ドメインに作動可能に連結される請求項１～１３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
16. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞から選択される請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
17. 前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞又はαβ－Ｔ細胞である請求項１６に記載の改変免疫細胞。
18. 前記免疫細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髓幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血幹細胞から派生される請求項１～１７のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
19. （ｉ）キメラ受容体をコードする核酸配列と、（ｉｉ）ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及び／又はＣＣＬ５をコードする核酸配列と、を含む核酸分子。
20. 前記キメラ受容体はキメラ抗原受容体である請求項１９に記載の核酸分子。
21. インターロイキンをコードする核酸配列を更に含む請求項１９に記載の核酸分子。
22. 前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ３３、そのサブユニット、又はその組み合わせ、又はそのサブユニットの組み合わせである請求項２１に記載の核酸分子。
23. 請求項１９～２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
24. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項２３に記載のベクター、及び多種薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
25. 癌、感染又は自己免疫疾患を治療する薬の調製における請求項１～１８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２３に記載のベクター、又は請求項２４に記載の医薬組成物の使用。