KR20230033702A - 조작된 면역 세포 및 이의 용도 - Google Patents

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지앙타오 런
시아오홍 허
옌빈 왕
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난징 바이오흐엥 바이오테크 씨오., 엘티디
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Abstract

본 발명은 (i) 키메라 수용체, 및 (ii) 외인성 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5를 발현하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 이는 개선된 종양 살상 활성을 가지며, 암, 감염 또는 자가면역성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

조작된 면역 세포 및 이의 용도
본 발명은 면역치료 분야에 속한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 (i) 키메라 수용체, 및 (ii) 외인성 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자를 발현하는 조작된 면역 세포에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체이다.
종양 면역 치료는 주로 인간 면역 체계와 종양 미세 환경을 조절하여 최종적으로 자가 면역에 의존하여 종양 세포를 제거한다. 면역 체계는 하나의 통합된 전체이며, 선천성 면역은 종양 면역에서도 매우 중요한 역할을 한다.
수지상 세포 및 대식 세포와 같은 일부 항원 제시 세포는 선천성 면역과 적응성 면역 사이의 가교 역할을 한다. 항원 제시 세포는 종양 항원을 인식하여 적응성 면역 체계에 제시하고 종양 특이적 T 세포를 활성화하여 종양을 제거할 수 있다. 따라서 항원 제시 과정을 강화하여 종양을 죽이는 면역 체계의 효과를 향상시키는 것은 종양 면역의 중요한 연구 방향이다.
CAR 세포 치료는 중요한 종양 세포 면역 요법이다. CAR 세포에 의한 성공적인 종양 제어는 일반적으로 면역 체계의 활성화, CAR 세포의 활성화 및 확장, 활성화된 CAR세포의 종양 조직 침투 및 종양 세포 사멸의 과정을 거쳐야 한다. 그러나 현재 CAR 세포 요법에는 보편적으로 하나의 문제가 존재한다. 즉, 종양 미세 환경이 CAR 세포에 대한 억제 효과가 있어, CAR 세포가 종양 조직에 침투할 수 없게 만든다. 따라서 CAR 세포에 대한 종양 미세 환경의 억제 작용을 감소시키고 CAR 세포의 생존 시간을 향상시키거나, CAR 세포의 상승 작용을 나타내는 다른 면역 세포를 모집하는 방법은 CAR 세포의 치료 효과를 개선하는 데 매우 중요하다.
종래의 1형 수지상 세포(conventional DC1, cDC1)는 수지상 세포의 하위 집단이며 종양 항원을 제시하는 주요 면역 세포이다. 연구 결과에 따르면, cDC1이 종양 관련 항원, 특히 괴사성 세포 관련 항원을 효과적으로 제시하고, 항원 특이성 CD8+T 세포 반응을 효과적으로 유도하며, 체내에서 종양을 사멸시키는 과정에서 매우 중요한 역할을 할 수 있다. 마우스 및 인간의 연구 모두에서, 종양 미세 환경에서 cDC1의 분포가 항종양 면역 반응과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 하나의 중요한 종양 관련 면역 점수의 평가 매개변수이다. cDC1은 마우스 및 인체 내에 비교적 적게 분포되어 있으며, 종양 면역 반응률이 낮은 마우스 및 인간 종양 미세 환경에서는 거의 보이지 않는다. 종양 치료에서 cDC1의 역할을 최적화하는 것은 종양 면역 치료의 효과를 향상시키기 위한 중요한 연구 방향이다.
염증성 케모카인은 관련 면역 세포를 종양 미세 환경으로 모집하고, 세포 상호 작용 및 분자 신호 캐스케이드 반응 구동 측면에서 중요한 역할을 하며, 숙주 항종양 면역 반응의 궁극적인 결과를 결정한다. 연구에 따르면, 대식세포 염증 단백질(MIP)-1 계열 및 관련 단백질은 CCL3(MIP-1a), CCL4(MIP-1b) 및 CCL5(RANTES)로 구성되며, 항원 제시 세포를 직접 모집하여(예를 들어, 수지상 세포를 종양 부위에 모집) 특정 종양 면역 세포 침윤의 주요 결정 요인이 될 수 있다. 또한 문헌에 따르면, 종양 부위에 풍부한 MIP-1 계열 관련 단백질이 종양 부위에 자연 살해 세포(NK)를 모집하여, 종양 부위에 CD103+cDC의 축적을 촉진하고, 케모카인 CXCL9 및 CXCL10의 생성을 증가시키며, 종양 진행을 효과적으로 억제할 수 있다.
따라서 cDC1 수지상 세포를 효과적으로 분화 또는 모집하여 종양 항원 제시 효율을 높이고 유기체의 입양적 면역 반응을 유도하여, CAR 세포 치료의 치료 효능을 향상시킬 수 있는 새로운 면역 치료 수단이 필요하다.
본 발명은 상기 문제를 해결하기 위하여 조작된 면역 세포 및 이의 용도를 제공한다.
제1 양상에 있어서, 본 발명은 (i) 키메라 수용체, 및 (ii) 외인성 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자를 발현하는 새로운 조작된 면역 세포를 제공한다.
일 실시방식에 있어서, CCL3 유전자는 SEQ ID NO: 77 또는 79으로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖거나, 상기 CCL3 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 78 또는 80으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, CCL4 유전자는 SEQ ID NO: 81 또는 83으로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖거나, 상기 CCL4 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 82 또는 84로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, CCL5 유전자는 SEQ ID NO: 85 또는 87로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖거나, 상기 CCL5 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 86 또는 88로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 (iii) 외인성의 인터류킨을 더 발현한다.
일 실시방식에 있어서, 상기 인터류킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, 또는 이들의 서브유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브유닛의 조합이며, 바람직하게는 IL-7이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 인터류킨의 코딩 유전자는 SEQ ID NO: 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, 상기 인터류킨은 SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 조작된 면역 세포에 의해 발현되는 인터류킨, CCL4 또는 CCL5는 프로테아제 가수분해에 저항할 수 있는 융합 단백질 또는 돌연변이체이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체이다. 바람직하게는, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체이며, 여기에는 리간드 결합 도메인, 막횡단 도메인, 보조자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 포함된다. 여기에서, 리간드 결합 도메인은 면역글로불린 분자, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv, 이황화 결합 Fv(sdFv), 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 또는 경쇄 가변 영역(VL), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 나노 항체 및 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드로부터 선택될 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 상기 키메라 수용체는 TSHR, CD19, CD123, CD22, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, AFP, Folate 수용체 α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CS1, CD138, NCAM, Claudin18.2, Prostase, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gploo, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate 수용체 β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos 관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 전립선 특이적 단백질, 서비빈과 텔로머라제, PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된 표적과 결합한다. 바람직하게는, 상기 표적은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD123, CD138, CD171, MUC1, AFP, Folate 수용체 α, CEA, PSCA, PSMA, Her2, EGFR, IL13Ra2, GD2, NKG2D, EGFRvIII, CS1, BCMA, 메소텔린 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, TCRγ 사슬, TCRδ 사슬, CD3ζ 서브유닛, CD3ε 서브유닛, CD3γ 서브유닛, CD3δ 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154 단백질의 막횡단 도메인으로부터 선택된다. 바람직하게는, 막횡단 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD278의 막횡단 도메인으로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d 단백질의 신호전달 도메인으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 보조자극 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, CD94, LTB, ZAP70 및 이들의 조합 단백질로부터 선택된 하나 이상의 보조자극 신호전달 도메인이다. 바람직하게는, 상기 보조자극 도메인은 CD27, CD28, CD134, CD137 또는 CD278의 보조자극 신호전달 도메인 또는 이들의 조합이다.
일 실시방식에 있어서, 외인성의 인터류킨, CCL3, CCL4 및/또는 CCL5의 발현 또는 활성은 구성적 발현이다. 다른 일 실시방식에 있어서, 외인성의 인터류킨, CCL3, CCL4 및/또는 CCL5의 발현 또는 활성은 조건적 발현이다. 예를 들어, 조건적 발현은 외인성 유전자를 유도적, 억제적 또는 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결함으로써 구현된다.
일 실시방식에 있어서, 인터류킨, CCL3, CCL4 및/또는 CCL5는 국소화 도메인과 작동 가능하도록 연결된다. 상기 국소화 도메인은 본 발명의 외인성 유전자를 세포막, 세포질 중 소포체, 골지체, 세포핵 등과 같은 특정 세포 위치 상에서 국소화하고 발현시킬 수 있다. 국소화 도메인은 핵 국소화 신호, 리더 펩티드, 막횡단 도메인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 외인성 유전자 인터류킨, CCL3, CCL4 및/또는 CCL5는 막횡단 도메인과 작동 가능하도록 연결되어, 조작된 면역 세포의 표면에 고정되어 발현된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK 세포 또는 NKT 세포로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 T 세포는 CD4+/CD8+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ T 세포, 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, γδ-T 세포 또는 αβ-T 세포이다. 일 실시방식에 있어서, 면역 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 제대혈줄기세포, 전구세포, 골수줄기세포, 유도만능줄기세포, 전능줄기세포 또는 조혈줄기세포 등과 같은 줄기세포에서 유래한다.
제2 양상에 있어서, 본 발명은 (i) 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 및 (ii) CCL3, CCL4 및/또는 CCL5를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체이며, 보다 바람직하게는 키메라 항원 수용체이다.
일 실시방식에 있어서, 핵산 분자는 인터류킨을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 인터류킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, 또는 이들의 서브유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브유닛의 조합이며, 보다 바람직하게는 IL-7, 이의 서브유닛 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다. 구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 선택된다. 일부 실시방식에 있어서, 해당 벡터는 면역 세포 중 자율 복제의 기점, 선별 마커, 제한 효소 절단 부위, 프로모터, 폴리A 테일(polyA), 3'UTR, 5'UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오퍼레이터, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열 및/또는 단백질 정제 태그 등 요소를 더 포함한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 벡터는 체외 전사된 벡터이다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 키트를 더 제공한다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 더 제공한다.
제3 양상에 있어서, 본 발명은 암, 감염 또는 자가면역 질환을 앓고 있는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에는 상기 피험자에게 유효량의 본 발명에 따른 면역 세포, 핵산 분자, 벡터 또는 약학 조성물을 투여하는 단계가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 암은 고형 종양 또는 혈액 종양이다. 보다 상세하게는, 상기 암은 뇌신경아교종, 모세포종, 육종, 기저세포암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장 및 직장암, 결합조직암, 소화기암, 자궁내막암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암(위장암 포함), 교모세포종(GBM), 간암, 간세포암, 상피내종양, 신장암, 후두암, 간종양, 폐암(예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 아데노이드 폐암 및 편평 폐암), 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암(예를 들어 입술, 혀, 입과 목), 난소암, 췌장암, 전립선암, 중피종, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기암, 타액선암, 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기의 악성 종양, 외음부암, Waldenstrom 마크로글로불린혈증, 림프종(호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하며, 예를 들어 B세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(SL) NHL, 중간 등급/여포성 NHL, 중간 등급 미만성 NHL, 고급 면역모세포성 NHL, 고급 림프모구성 NHL, 고급 소형 비균열 세포성 NHL, 대형 종양 질환 NHL 포함), 맨틀 세포 림프종, AIDS 관련 림프종, 버킷 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 여포성 림프종, MALT 림프종, 변연부 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포 유사 수지상세포종양 등), 백혈병(급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(미분화형 및 부분 분화형 포함), 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수단핵구 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병과 같은 급성 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 단핵구 백혈병과 같은 만성 백혈병; 털상세포백혈병, 전림프구성 백혈병, 형질세포 백혈병, 성인T세포 백혈병, 호산구성 백혈병, 호염기성 백혈병 등과 같은 기타 특수한 유형의 백혈병 포함), 모세포형질세포 유사 수지상 세포 종양, 악성 림프증식성 질환, 골수 발육 이상, 다발성 골수종, 골수 증식 이상, 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 감염에는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충에 의해 발생하는 감염이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 자가면역 질환에는 제1형 당뇨병, 체강 질병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 혈관 염증, 악성 빈혈 및 전신성 홍반성 루푸스 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조작된 면역 세포의 장점은 다음과 같다. 즉, 공동 발현된 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 및 IL7과 같은 선택적 인터류킨은 DC 세포를 종양 부위로 효과적으로 모집하고 조작된 면역 세포의 증식 및 생존 시간을 증가시켜 한편으로는 조작된 면역 세포에 대한 종양 미세 환경의 억제 효과를 감소시키고, 조작된 면역 세포의 종양 살상 능력을 향상시키고, 다른 한편으로는 모집된 DC 세포가 유기체 자체 T 세포의 입양성 면역 인식을 활성화하고, 조작된 면역 세포와 상승 효과를 형성하며 궁극적으로 종양 억제를 강화할 수 있다.
도 1은 Panc02-mCD19 세포의 CD19 발현율이다.
도 2는 유동 세포 계측법에 의해 결정된 CAR-T 세포의 CAR 발현 수준이다.
도 3은 ELISA에 의해 결정된 CAR-T 세포의 IL-7 발현 수준이다.
도 4는 ELISA에 의해 결정된 CAR-T 세포의 CCL4 발현 수준이다.
도 5는 ELISA에 의해 결정된 CAR-T 세포의 CCL5 발현 수준이다.
도 6은 CAR-T 세포가 표적 세포 및 비표적 세포와 공동 배양된 후 IFN-γ 방출 수준이다.
도 7은 CCL4 또는 CCL5를 발현하는 CAR-T 세포를 이용해 마우스 췌장암을 치료한 후, 마우스의 체중 변화 그래프이다.
도 8은 CCL4 또는 CCL5를 발현하는 CAR-T 세포를 이용해 마우스 췌장암을 치료한 후, 마우스의 종양 성장 그래프이다.
도 9는 CCL3을 발현하는 CAR-T 세포를 이용해 마우스 췌장암을 치료한 후, 마우스의 체중 변화 그래프이다.
도 10은 CCL3을 발현하는 CAR-T 세포를 이용해 마우스 췌장암을 치료한 후, 마우스의 종양 성장 그래프이다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
키메라 수용체
본원에서 사용되는 용어 "키메라 용체"는 표적 분자(예를 들어, 리간드)에 특이적으로 결합할 수 있는 세포 표면 상에 발현되는 분자를 의미한다. 이러한 분자는 일반적으로 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 결합 도메인, 표면 분자를 세포 표면에 고정시키는 막횡단 도메인, 및 신호전달을 담당하는 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 일반적인 이러한 키메라 수용체의 예시에는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원 제시에 반응하고 T 세포 활성화에 참여하는 막 단백질 복합체를 의미한다. TCR의 자극은 항원 제시 세포의 주요 조직 적합성 복합 분자(MHC)에 의해 유발되며, 상기 항원 제시 세포는 T 세포에 항원성 펩타이드를 제시하고 TCR 복합체에 결합하여 일련의 세포 내 신호 전달을 유도한다. TCR은 헤테로다이머를 형성하는 6개의 펩타이드 사슬로 구성되며 일반적으로 αβ형과 γδ형으로 나뉜다. 각 펩티드 사슬은 불변 영역과 가변 영역을 포함하며, 여기에서 가변 영역은 특정 항원과 MHC 분자를 결합하는 역할을 한다. TCR의 가변 영역은 리간드 결합 도메인을 포함하거나 리간드 결합 도메인에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 여기에서 리간드 결합 도메인의 정의는 다음과 같다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 인공적으로 구축된 하이브리드 폴리펩티드를 의미한다. 상기 하이브리드 폴리펩티드는 일반적으로 리간드 결합 도메인(예를 들어 항체 또는 항체 단편), 막횡단 도메인, 보조자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 각 도메인 사이는 링커에 의해 연결된다. CAR은 단일 클론 항체의 항원 결합 특성을 이용하여 비MHC 제한 방식으로 T 세포 및 기타 면역 세포의 특이성과 반응성을 선택한 표적으로 재지정할 수 있다. 비MHC 제한 항원 인식은 CAR 세포가 항원 처리와 독립적으로 항원을 인식할 수 있는 능력을 부여하므로, 종양 탈출의 주요 메커니즘을 우회한다. 또한, T 세포에서 발현될 때 CAR은 유리하게 내인성 T 세포 수용체(TCR)의 α 사슬 및 β 사슬과 이합체화하지 않는다.
본원에서 사용되는 "리간드 결합 도메인"은 리간드(예를 들어 항원)에 결합할 수 있는 임의의 구조 또는 기능적 변이체를 의미한다. 리간드 결합 도메인은 항체 구조일 수 있으며, 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체 및 이의 기능적 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 리간드 결합 도메인의 예시에는 면역글로불린 분자, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv, 이황화 결합 Fv(sdFv), 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 또는 경쇄 가변 영역(VL), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 나노 항체 및 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 재조합 피브로넥틴 도메인, DARPIN, affibody, affilin, adnectin, affitin, obodies, repebody, fynomer, alpha body, avimer, atrimer, centyrin, pronectin, anticalin, kunitz형 도메인, Armadillo 반복 단백질 등이 있다. 바람직하게는, 리간드 결합 도메인은 Fab, scFv, 단일 도메인 항체, 나노 항체, 또는 이의 기능적 단편으로부터 선택된다. 본 발명에 있어서, 리간드 결합 도메인은 1가 또는 2가일 수 있고, 하나 이상의 리간드 결합 도메인을 포함하는 단일 특이성, 이중 특이성 또는 다중 특이성 항체일 수 있다.
"Fab"는 면역글로불린 분자가 파파인에 의해 절단된 후 생성된 2개의 동일 단편 중 어느 하나를 지칭한다. 이황화 결합으로 연결된 완전한 경쇄와 중쇄의 N-말단 부분으로 구성되며, 여기에서 중쇄 N-말단 부분은 중쇄 가변 영역과 CH1을 포함한다. 완전한 IgG와 비교하여, Fab는 Fc 단편이 없고, 유동성과 조직 침투 능력이 더 높으며, 항체 효과를 매개하지 않고 항원에 1가로 결합할 수 있다.
"단일쇄 항체" 또는 "scFv"는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이 링커에 의해 연결된 항체이다. 링커의 최적 길이 및/또는 아미노산 조성이 선택될 수 있다. 링커의 길이는 scFv의 가변 도메인 폴딩 및 상호작용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 사실상 비교적 짧은 링커(예를 들어 5-10개 아미노산 사이)를 사용하면 사슬 내 폴딩을 방지할 수 있다. 링커의 크기 및 조성의 선택에 대해서는, 예를 들어 Hollinger et al., 1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448; 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794; 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715를 참조하며, 이는 전체 내용이 참조로 본원에 포함되었다. scFv는 임의의 순서로 연결된 VH 및 VL, 예를 들어 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH를 포함할 수 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 자연적으로 경쇄가 없는 항체를 의미하며, 해당 항체는 하나의 중쇄 가변 영역(VHH)과 "중쇄 항체"라고도 알려진 2개의 기존 CH2 및 CH3 영역을 포함한다.
"나노 항체" 또는 "Nb"는 복제되어 별도로 발현되는 VHH 구조를 의미하며, 이는 원래의 중쇄 항체와 비슷한 구조적 안정성과 항원 결합 활성을 가지고 있으며, 현재 알려진 표적 항원에 결합하는 가장 작은 단위이다.
"기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"이라는 용어는 기본적으로 모체의 아미노산 서열을 포함하지만 해당 모체 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는 변이체를 의미한다. 조건은 상기 변이체가 모체 아미노산 서열의 생물학적 활성을 유지하는 것이다. 일 실시방식에 있어서, 상기 아미노산 변형은 바람직하게는 보존적 변형이다.
본원에서 사용되는 "보존적 변형"이라는 용어는 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 현저한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 의미한다. 이러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 추가 및 결실이 포함된다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 키메라 항원 수용체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있으며, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 포함된다. 보존적 변형은 예를 들어 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 관련된 잔기의 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 선택할 수 있다.
따라서 "기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"은 모체 아미노산 서열과 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가지며, 모체 아미노산의 생물학적 활성, 예를 들어 결합 활성을 유지한다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 2개의(뉴클레오티드 또는 아미노산) 서열이 비교에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도를 의미하며, 통상적으로 백분율로 표시된다. 바람직하게는, 동일성은 비교되는 서열의 전체 길이 상에서 결정된다. 따라서 완전히 동일한 서열의 2개 카피는 100% 동일성을 갖는다. 당업자는 일부 알고리즘이 표준 매개변수를 사용하여 서열 동일성을 결정하는 데 사용될 수 있음을 인식하며, 예를 들어 Blast(Altschul 등(1997)Nucleic Acids Res.25: 3389-3402), Blast2(Altschul 등(1990)J.Mol.Biol.215: 403-410), Smith-Waterman(Smith 등(1981)J.Mol.Biol.147: 195-197) 및 ClustalW가 있다.
리간드 결합 도메인의 선택은 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원과 같은 구체적인 질병 상태와 관련된 표적 세포 상에서 인식되는 세포 표면 마커에 따라 다르다. 따라서 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 리간드 결합 도메인은 TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, Folate 수용체 α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate 수용체 β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos 관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 전립선 특이적 단백질, 서비빈과 텔로머라제, PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 표적과 결합한다. 바람직하게는, 상기 표적은 CD19, CD20, CD22, BAFF-R, CD33, EGFRvIII, BCMA, GPRC5D, PSMA, ROR1, FAP, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CAIX, WT1, NY-ESO-1, CD79a, CD79b, GPC3, Claudin18.2, NKG2D 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된다. 표적화할 항원에 따라, 본 발명의 CAR은 해당 항원에 특이적인 리간드 결합 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CD19가 표적화할 항원인 경우 CD19 항체는 본 발명의 리간드 결합 도메인으로 사용될 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 CD19, CD22 또는 이의 조합을 표적화한다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항-CD19 항체를 포함한다. 여기에는 SEQ ID NO: 1의 1-107번째 또는 SEQ ID NO: 25의 1-107번째로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 서열과 SEQ ID NO: 1의 123-242번째 또는 SEQ ID NO: 25의 123-238번째로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열이 포함된다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 CD22 항체를 포함한다. 여기에는 SEQ ID NO: 27의 1-124번째로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열과 SEQ ID NO: 27의 143-249번째로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 서열이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "막횡단 도메인"은 면역 세포(예를 들어, 림프구, NK 세포 또는 NKT 세포)의 표면에서 키메라 항원 수용체를 발현시킬 수 있고, 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 안내할 수 있는 폴리펩티드 구조를 의미한다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성일 수 있으며, 임의 막결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 키메라 항원 수용체와 표적 항원이 결합하면, 막횡단 도메인은 신호전달을 수행할 수 있다. 특히 본 발명에 적용되는 막횡단 도메인은 예를 들어 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, TCRγ 사슬, TCRδ 사슬, CD3ζ 서브유닛, CD3ε 서브유닛, CD3γ 서브유닛, CD3δ 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 및 이의 기능적 단편으로부터 유래될 수 있다. 또는 막횡단 도메인은 합성된 것일 수 있으며, 주로 류신과 발린 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 막횡단 도메인은 CD8α 사슬 또는 CD28로부터 유래된다. 이는 SEQ ID NO: 3, 5 또는 30으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖거나, 이의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 4, 6 또는 29로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 리간드 결합 도메인와 막횡단 도메인 사이에 위치한 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "힌지 영역"은 일반적으로 막횡단 도메인을 리간드 결합 도메인에 연결하도록 작용하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적으로, 힌지 영역은 리간드 결합 도메인에 더 큰 유연성과 접근성을 제공하는 역할을 한다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역으로부터 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 항체 불변 영역으로부터 전체적으로 또는 부분적으로와 같이 천연 분자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래될 수 있다. 또는 힌지 영역은 자연 발생 힌지 서열에 대응하는 합성 서열이거나, 완전히 합성된 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 실시방식에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8α 사슬, FcγRIIIα 수용체, IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역 부분을 포함하고, 보다 바람직하게는 CD8α, CD28 또는 IgG4로부터의 힌지이며, 이는 SEQ ID NO: 19, 21, 23 또는 36으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 20, 22, 24 또는 35로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 주어진 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 의미한다. 세포내 신호전달 도메인은 리간드 결합 도메인에 의한 항원의 결합 후 일차적인 세포내 신호전달을 담당하여 면역 세포 및 면역 반응의 활성화를 유발한다. 다시 말해, 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나를 활성화시키는 역할을 한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함하여 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체에 포함된 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체 및 보조 수용체의 세포질 서열일 수 있으며, 이는 항원 수용체 결합 후 함께 작용하여 일차 신호전달뿐만 아니라, 이러한 서열의 모든 파생물 또는 변이체 및 동일하거나 유사한 기능을 갖는 모든 합성 서열을 개시한다. 세포내 신호전달 도메인은 많은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, ITAM)를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포내 신호전달 도메인의 비제한적 예시에는 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시방식에 있어서, 본 발명의 CAR의 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 해당 신호전달 도메인은 SEQ ID NO: 11, 13 또는 34로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 12, 14 또는 33으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 하나 이상의 보조자극 도메인을 포함한다. 보조자극 도메인은 상기 보조자극 분자로부터의 세포내 기능적 신호전달 도메인일 수 있고, 여기에는 상기 보조자극 분자의 전체 세포내 부분 또는 이의 기능적 단편이 포함된다. "보조자극 분자"는 T 세포 상에서 보조자극 리간드에 특이적으로 결합함으로써, T 세포의 보조자극 반응(예를 들어, 증식)을 매개하는 동족 결합 배우체를 의미한다. 보조자극 분자에는 MHC 클래스 1 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 보조자극 도메인의 비제한적 예시에는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, CD94, LTB 및 ZAP70의 단백질로부터 선택된 하나 이상의 보조자극 신호전달 도메인이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR의 보조자극 도메인은 4-1BB, CD28, CD27, OX40 또는 이의 조합으로부터 유래한다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 CAR에 함유된 보조자극 도메인은 SEQ ID NO: 7 또는 9로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 해당 보조자극 도메인의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8 또는 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 CAR은 T 세포와 같은 세포에서 발현될 때 신생 단백질이 소포체에 이어서 세포 표면에 지시되도록 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 코어는 단일 α-나선을 형성하는 경향이 있는 긴 길이의 소수성 아미노산 영역을 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 말단에는 통상적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 영역이 있다. 신호 펩티다제는 전좌 동안 또는 완료 후 절단되어 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 그 후, 유리 신호 펩티드는 특정 프로테아제에 의해 소화된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 신호 펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 CD8α, IgG1, GM-CSFRα, B2M 등에서 유래된 신호 펩티드이다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명에 사용될 수 있는 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 15, 17 또는 40으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 해당 신호 펩티드의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 16, 18 또는 39로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 CAR은 CAR의 발현 시간을 조절하기 위한 스위치 구조를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 스위치 구조는 이합체화 도메인의 형태일 수 있으며, 이는 상응하는 리간드에 결합할 때 구조적 변화를 유발하고 세포외 결합 도메인을 노출시켜 표적 항원에 결합할 수 있도록 함으로써 신호 전달 경로를 활성화한다. 또는 스위치 도메인을 사용하여 결합 도메인과 신호 도메인을 각각 연결할 수 있으며, 스위치 도메인이 서로 결합하는 경우에만(예를 들어 유도 화합물의 존재 하에서), 결합 도메인 및 신호 도메인이 이량체에 의해 함께 연결되어 신호 경로를 활성화할 수 있다. 스위치 구조는 마스킹 펩티드 형태일 수도 있다. 마스킹 펩티드는 세포외 결합 도메인을 마스킹하여 표적 항원에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 마스킹 펩티드가 예를 들어 프로테아제에 의해 절단되면, 세포외 결합 도메인이 노출되어 하나의 "일반적인" CAR 구조가 된다. 당업자에게 공지된 다양한 스위치 구성이 본 발명에서 사용될 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 CAR은 자살 유전자를 더 포함할 수 있다. 즉 외인성 물질에 의해 유도될 수 있는 세포사 신호를 발현시켜 필요할 때(예를 들어, 심각한 독성 부작용이 발생할 때) CAR 세포를 제거할 수 있다. 예를 들어, 자살 유전자는 CD20 에피토프, RQR8 등과 같은 삽입된 에피토프 형태일 수 있으며, 필요한 경우 이러한 에피토프를 표적으로 하는 항체 또는 시약을 추가하여 CAR 세포를 제거할 수 있다. 자살 유전자는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK)일 수 있으며, 해당 유전자는 간시클로버 치료에 의해 유도된 세포 사멸을 유발한다. 자살 유전자는 iCaspase-9일 수도 있으며, iCaspase-9의 이량체화는 AP1903 및 AP20187과 같은 화학적 유도 약물에 의해 유도될 수 있으며, 이에 따라 다운스트림 Caspase3 분자를 활성화하고 세포 사멸을 유도한다. 당업자에게 공지된 다양한 자살 유전자는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
CC 케모카인
케모카인은 그 N-말단 시스테인의 배열 방식에 따라 CXC, CC, C, CX3C의 4가지 아족으로 나눌 수 있으며, 여기에서 CC 케모카인은 2개의 인접한 시스테인-시스테인(cys-cys 또는 C-C) 잔기를 포함하여 명명되었다. CC 케모카인의 예시에는 MIP-1α, MIP-1β, CCL5, MCP-1, MCP-2, MCP-3, 1-309 등을 포함하는 CCR1 및 CCR5에 결합하는 것들이 있다.
대식 세포 염증 단백질(MIP)에는 α(MIP-1α, CCL3로도 칭함) 및 β(MIP-1β, CCL4로도 칭함)의 두 가지 주요 형태가 있으며, 지질다당류에 의해 활성화된 대식 세포 배양액에서 최초로 분리되었다. 이 둘은 유사한 서열과 활성을 가지며, 주로 대식 세포, 단핵구, 수지상 세포 등에 의해 생성되고, 모두 세포 표면의 케모카인 수용체 5(CCR5)와 결합되어 염증과 감염에 대한 면역 반응에 참여한다. 연구에 따르면 CCL3 및 CCL4는 결핵 등과 같은 많은 전염병의 숙주 방어 반응에 참여하고 면역 세포의 유도 이동을 매개한다.
RANTES로도 알려진 CCL5는 분자량이 8000인 소분자 단백질이며, 인간 CCL5 단백질의 유전자는 17q11-21에 있다. CCL5는 단량체, 이량체 및 다량체 등 다양한 형태로 존재한다. CCL5는 주로 대식 세포, 활성화된 T 세포, 섬유아세포, 신경아교세포, 상피세포, 내피세포, 혈소판 및 특정 종양 세포에서 발현되며 단핵구, 호산구, 호염기구, T림프구, 자연살해세포 등 다양한 백혈구에 화학주성 또는 자극작용을 한다.
CCL3, CCL4 및 CCL5는 모두 CCR5에 결합하여 미성숙 골수 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, Th1, Treg, NK 및 형질세포 수지상 세포 등과 같은 면역 세포를 모집하여 염증 부위 또는 종양 부위로 이동한다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 (i) 키메라 수용체, 및 (ii) 외인성 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자를 발현한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조작된 면역 세포는 (i) 키메라 항원 수용체, 및 (ii) 외인성 CCL4 및/또는 CCL5 유전자를 발현한다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명에 사용되는 CCL3은 SEQ ID NO: 78 또는 80으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, CCL3의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 77 또는 79로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명에 사용되는 CCL4는 SEQ ID NO: 82 또는 84로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, CCL4의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 81 또는 83으로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명에 사용되는 CCL5는 SEQ ID NO: 86 또는 88로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, CCL5의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 85 또는 87로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
인터류킨
인터류킨은 백혈구에서 생성되며 백혈구 사이에서 기능을 발휘하는 사이토카인의 일종으로 정보 전달, 면역세포 활성화 및 조절, T세포 및 B세포 활성화 매개, 증식 및 분화, 염증 반응에 중요한 역할을 한다. 일반적으로 인터류킨의 생물학적 효과는 해당 수용체에 대한 결합을 통해 구현된다. 예를 들어 IL-7의 생물학적 특성은 IL-7과 그 수용체 IL-7R의 결합에 의해 구현된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 인터류킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, 또는 이들의 서브유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브유닛의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 IL-7 또는 이의 서브유닛이다. IL-2는 주로 T 세포에서 생성되며 자가분비 및 주변분비 방식을 통해 그 효과를 발휘한다. IL-2는 T 세포의 성장을 유지하고 사이토카인 생성을 촉진할 뿐만 아니라, CD8+T 세포와 CD4+T 세포가 세포독성을 발휘하도록 유도한다. 또한 IL-2는 NK 세포 증식을 자극하고, NK 살상 활성을 강화하며, NK 세포가 IFNγ, TNFβ, TGFβ 등의 인자를 생산하도록 촉진하고, 대식 세포를 활성화하며, 대식 세포의 항원 제시 능력 및 표적 세포 살상 능력을 강화할 수 있다. IL-7은 주로 골수 및 흉선기질세포에서 생산되며, 이의 주요 기능은 다음 몇 가지 측면과 관련된다. 즉, 전구체 B 세포의 성장을 촉진하고, 말초 T 세포의 세포사멸을 억제하며, 세포 증식과 지속적인 생존을 유도한다. 또한 수지상 세포와 대식세포의 발달과 기능에 영향을 미치고, 대식세포가 다양한 사이토카인을 분비하도록 유도한다. IL-12는 주로 T세포와 NK세포에 작용한다. 구체적으로, IL-12는 활성화된 T 세포의 증식을 자극하고, Th0 세포의 Th1 세포로의 분화를 촉진한다. CTL 및 NK 세포의 세포독성 활성을 유도하고, IFNγ, TNFα, GMCSF와 같은 사이토카인의 분비를 촉진한다. NK 세포, IL-2Rα, TNF 수용체 및 CD56의 발현을 촉진하고 종양 세포에 대한 ADCC 효과를 강화한다. IL-15는 활성화된 대식 세포, 표피 세포 및 상피 세포와 같은 다양한 세포에 의해 생산될 수 있다. IL-15의 분자 구조는 IL-2와 유사하기 때문에 IL-2R의 β사슬과 γ사슬은 표적 세포에 결합하여 IL-2와 유사한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, T 세포 및 NK 세포의 증식 자극, B 세포의 증식 및 분화 유도 등이 있다. IL-21은 활성화된 CD4+T 세포, NKT 세포, Tfh 세포 및 Th17 세포에 의해 생성되며 IL-2 및 IL-15와 높은 상동성을 갖는다. IL-21은 광범위한 면역 조절 기능을 가지고 있으며 이를 활성화하면 활성화된 CD8+ T 세포의 증식을 촉진하고 NK 세포의 세포 독성 활성을 강화하며 B 세포의 증식 및 분화를 촉진할 수 있다. Th17 세포에서 분비되는 IL-17은 조절 T 세포를 억제하고 호중구와 대식세포를 모집하고 활성화할 수 있는 염증 유발 분자이다. IL-18은 또한 T 세포와 NK 세포에 의해 분비되는 전 염증성 분자이며 활성화된 대식세포도 많은 양의 IL-18을 분비한다. IL-18은 선천성 면역과 입양적 면역의 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. IL-23은 T 세포와 NK 세포에서도 분비되며 IL-23은 Th17 세포 분화를 촉진할 수 있다. 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포는 또한 IL-23에 의해 활성화될 수 있는 낮은 수준의 IL-23 수용체를 발현한다. IL-33의 염기서열은 IL-18과 유사하여 IL-1 수용체 부속 단백질인 IL-RAcP를 통해 수용체 ST2와 결합하여 이종이량체를 형성하고, NF-κB, MAPK 및 기타 신호 경로를 활성화하고 전 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성을 강력하게 유도하여 생물학적 효과를 발휘한다. IL-33은 상피세포, 섬유아세포, 대식세포, 수지상세포 등 다양한 세포에서 발현된다. 연구에 따르면 IL-33은 미성숙 수지상 세포를 자극하여 Treg를 생성하고 Th1 세포가 IFN-γ를 분비하도록 촉진하며 CD69의 발현을 증가시켜 NK, NKT 세포 및 CD8+T 세포를 활성화하고 항종양 면역을 촉진할 수 있다. 연구에 따르면 이러한 인터루킨 단독 또는 조합(예를 들어 IL-33 및 IL-12, IL-7+IL-12, IL-7+IL15 등)이 효과적인 항종양 효과를 발휘할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명에 사용되는 인터류킨은 SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 이의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
외인성 유전자의 발현
본 발명에서 인터루킨, CCL3, CCL4, CCL5 등의 외인성 유전자의 발현은 구성적 발현 또는 조건적 발현일 수 있다.
다른 일 실시방식에 있어서, 외인성의 인터류킨, CCL3, CCL4, CCL5의 발현은 조건적 발현이다. 예를 들어, 필요에 따라, 본 발명의 외인성 유전자는 유도성, 억제성 또는 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 이로써 도입된 외인성 유전자의 발현을 특정 시점 또는 특정 조직 또는 세포 유형 수준에서 조절할 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터, 즉 특정 환경 조건, 발생 조건 또는 유도물의 존재 하에서만 전사를 개시하는 프로모터이다. 이러한 환경 조건은 예를 들어 산성 종양 미세 환경, 저산소성 종양 미세환경 등을 포함한다. 이러한 유도물은 예를 들어 사이클로사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체, 테트라사이클린 유사체를 포함하며, 예를 들어 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데스메틸클로르테트라사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린 및 미노사이클린을 포함한다. 유도성 프로모터는 예를 들어 Lac 오퍼레이터 서열, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열, 갈락토스 오퍼레이터 서열 또는 독시사이클린 오퍼레이터 서열 등을 포함한다. 다른 일 실시방식에 있어서, 프로모터는 억제 가능한 프로모터이다. 즉, 억제 가능한 프로모터에 특이적인 억제인자가 존재하면 세포 내 외래 유전자의 발현이 억제되거나 발현되지 않는다. 억제성 프로모터는 예를 들어 Lac 억제성 요소 또는 테트라사이클린 억제성 요소를 포함한다. 당업자에게 잘 알려진 유도성/억제성 발현 시스템은 본 발명에서 사용될 수 있으며, 여기에는 Tet-on 시스템, Tet-off 시스템, Cre/loxP 시스템 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, 인터류킨, CCL3, CCL4, CCL5는 국소화 도메인과 작동 가능하도록 연결된다. 상기 국소화 도메인은 본 발명의 외인성 유전자를 세포막, 세포질 중 소포체, 골지체, 세포핵 등과 같은 특정 세포 위치 상에서 국소화하고 발현시킬 수 있다. 국소화 도메인은 핵 국소화 신호, 리더 펩티드, 막횡단 도메인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 외인성 유전자 인터류킨, CCL3, CCL4, CCL5는 막횡단 도메인과 작동 가능하도록 연결되어, 조작된 면역 세포의 표면에 고정되어 발현된다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명에서 인터류킨, CCL3, CCL4, CCL5 단백질과 같은 외인성 유전자는 야생형 또는 특정 특성(예를 들어, 단백질 분해에 대한 저항성)을 갖는 융합 단백질 또는 돌연변이일 수 있다.
핵산
본 발명은 (i) 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 및 (ii) CCL3, CCL4 및/또는 CCL5를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 더 제공한다.
일 실시방식에 있어서, 핵산 분자는 (iii) 인터류킨을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 인터류킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, 또는 이들의 서브유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브유닛의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 보다 바람직하게는 IL-7 또는 이의 서브유닛이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 키메라 수용체는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체이며, 바람직하게는 키메라 항원 수용체이다. 키메라 항원 수용체의 정의는 상술한 바와 같다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 서열을 포함하며, 이는 예를 들어 변형되거나 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 각각 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 형태의 선형 또는 원형, 또는 이들의 혼합물(하이브리드 분자 포함)이 있다. 따라서 본 발명에 따른 핵산은 DNA(dsDNA, ssDNA, cDNA와 같은), RNA(dsRNA, ssRNA, mRNA, ivtRNA와 같은), 이들의 조합 또는 유도체(PNA와 같은)를 포함한다. 바람직하게는 상기 핵산은 DNA 또는 RNA, 더욱 바람직하게는 mRNA이다.
핵산은 일반적인 포스포디에스테르 결합 또는 일반적이지 않은 결합(펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 하나 이상의 변형된 염기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 트리틸화된 염기 및 일반적이지 않은 염기(예를 들어 이노신)가 있다. 본 발명의 다중 사슬 CAR이 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 한, 화학적, 효소적 또는 대사적 변형을 포함하는 다른 변형이 고려될 수도 있다. 핵산은 분리된 형태로 제공될 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 핵산은 조절 서열을 포함할 수도 있으며, 예를 들어 전사 제어 요소(프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호 포함), 리보솜 결합 부위, 인트론 등이 있다.
본 발명의 핵산 서열은 코돈 최적화를 수행하여 필요한 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 최적의 발현을 수행하거나, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에서의 발현에 사용할 수 있다. 코돈 최적화는 표적 서열에 존재하는 주어진 물종의 고도로 발현된 유전자 중 일반적으로 드문 코돈을 그러한 물종의 고도로 발현된 유전자 중 일반적인 코돈으로 치환하는 것을 말하며, 치환 전후의 코돈은 동일한 아미노산을 코딩한다. 따라서 최적 코돈의 선택은 숙주 게놈의 코돈 사용 편향에 따라 달라진다.
벡터
본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 더 제공한다. 여기에서, 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 선택적으로 IL-7을 코딩하는 핵산 서열, CCL3의 핵산, CCL4의 핵산을 코딩하고/하거나 CCL5를 코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 벡터에 위치할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 (외인성) 유전 물질을 숙주 세포로 전달하기 위한 비히클로 사용되는 핵산 분자이며, 상기 핵산 분자는 예를 들어 숙주 세포에서 복제 및/또는 발현될 수 있다.
벡터는 일반적으로 표적화 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. "표적화 벡터"는 분리된 핵산을 예를 들어, 특정 표적화 부위의 서열을 사용하여 상동 재조합 또는 하이브리드 재조합효소에 의해 세포 내부로 전달하는 매체이다. "발현 벡터"는 본 발명의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 것과 같은 이종 핵산 서열의 전사 및 적합한 숙주 세포에서의 이들의 mRNA 번역에 사용되는 벡터이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있고 다수가 상업적으로 입수가능하다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 바이러스(예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 등), 파지, 파지미드, 코스미드 및 인공 염색체(BAC 및 YAC 포함)를 포함한다. 벡터 자체는 통상적으로 뉴클레오티드 서열이며, 통상적으로 삽입물(트랜스진)을 포함하는 DNA 서열과 벡터의 "백본" 역할을 하는 비교적 큰 서열이다. 조작된 벡터는 통상적으로 숙주 세포의 자율 복제 기점(폴리뉴클레오티드의 안정적인 발현이 필요한 경우), 선별 마커 및 제한 효소 절단 부위(예를 들어 다중 클론 부위, MCS 등)도 포함한다. 벡터는 프로모터, 폴리A 꼬리(polyA), 3' UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오퍼레이터, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열 및/또는 단백질 정제 태그 등 요소를 더 포함한다. 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 벡터는 체외 전사된 벡터이다.
조작된 면역 세포 및 이의 제조 방법
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 조작된 면역 세포를 더 제공한다. 즉, 본 발명의 조작된 면역 세포는 키메라 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체), CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자, 및 선택적으로 IL-7과 같은 인터류킨을 발현한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 세포"는 하나 이상의 이펙터 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인 분비, ADCC 및/또는 CDC 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 세포는 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구, NK 세포 및/또는 NKT 세포, 또는 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 전능 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포와 같은 줄기 세포로부터 유래되는 면역 세포일 수 있다. 바람직하게는, 면역 세포는 T 세포이다. T 세포는 1차 T 세포와 같이 체외 배양된 T 세포, 또는 Jurkat, SupT1 등과 같이 체외 배양된 T 세포주의 T 세포, 또는 피험자로부터 획득한 T 세포와 같은 임의의 T 세포일 수 있다. 피험자의 예시에는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 트랜스진 물종 포함한다. T 세포는 말초혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다양한 출처에서 얻을 수 있다. T 세포는 농축되거나 정제될 수도 있다. T 세포는 임의 발육 단계에 있는 CD4+/CD8+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, γδ-T 세포, αβ-T 세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않을 수 있다. 바람직한 일 실시방식에 있어서, 면역 세포는 인간 T 세포이다. Ficoll 분리와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 피험자의 혈액으로부터 T 세포를 얻을 수 있다. 본 발명에서, 면역 세포는 조작되어 키메라 항원 수용체 및 외인성 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자, 및 IL-7과 같은 선택적 인터류킨을 발현한다.
당업계에 공지된 통상적인 방법(예를 들어 형질도입, 형질감염, 형질전환 등)을 사용하여 키메라 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자, 및 IL-7과 같은 선택적 인터류킨 유전자를 면역 세포에 도입할 수 있다. "형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)를 표적 세포에 도입하는 과정이다. 한 가지 예시는 RNA 형질감염, 즉 RNA(예를 들어 체외 전사된 RNA, ivtRNA)를 숙주 세포에 도입하는 과정이다. 해당 용어는 주로 진핵 세포의 비바이러스 방법에 사용된다. "형질도입"이라는 용어는 통상적으로 바이러스 매개의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 전달을 설명하는 데 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 통상적으로 세포막에 일시적인 기공 또는 "구멍"을 열어 물질 섭취를 허용하는 것이다. 인산칼슘 사용, 전기천공법, 세포 압출 또는 양이온성 지질을 물질과 혼합하여 세포막과 융합하고 이들의 운반물을 내부의 리포좀에 침착시켜 형질감염을 수행할 수 있다. 진핵 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 예시적인 기술에는 지질 소포-매개 섭취, 열 충격-매개 섭취, 인산칼슘-매개 형질감염(인산칼슘/DNA 공침전), 미세주입 및 전기천공법이 포함된다. 용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)의 박테리아뿐만 아니라 비동물 진핵 세포(식물 세포 포함)로의 비-바이러스 전달을 설명하는 데 사용된다. 따라서 형질전환은 박테리아 또는 비동물성 진핵 세포의 유전적 변형이며, 이는 주변 환경으로부터 세포막에 의한 직접적인 섭취와 외인성 유전 물질의 후속 통합에 의해 생성된다. 변환은 수동 수단으로 수행할 수 있다. 형질전환이 일어나기 위해서는 세포나 박테리아가 수용능 상태에 있어야 한다. 원핵 형질전환의 경우, 기술에는 열충격 매개 섭취, 완전한 세포와 세균 원형질체의 융합, 미세주입 및 전기천공법이 포함될 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 조작된 면역세포의 제조방법을 제공하며, 여기에는 (a) 키메라 수용체를 코딩하는 제1 핵산 서열 또는 이의 코딩된 키메라 수용체; b) CCL3, CCL4 및/또는 CCL5를 코딩하는 제2 핵산 서열 또는 이의 코딩된 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 단백질; 및 (c) 인터류킨을 코딩하는 제3 핵산 서열 또는 이의 코딩된 인터류킨을 상기 면역 세포에 도입하는 단계가 포함된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 성분 (a), (b) 및 (c)는 임의의 순서로 면역 세포에 순차적으로 도입될 수 있다. 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 성분 (a), (b) 및 (c)는 예를 들어 하나 이상의 벡터에 (a), (b) 및 (c)를 클로닝함으로써 면역 세포에 동시에 도입될 수 있다.
핵산 또는 벡터가 면역 세포에 도입된 후, 당업자는 통상적인 기술에 의해 수득된 면역 세포를 증폭 및 활성화할 수 있다.
일 실시방식에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 CD52, GR, dCK, TCR/CD3 유전자(예를 들어 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ), MHC 관련 유전자(HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA) 및 면역 체크포인트 유전자, 예를 들어 PD1, LAG3, TIM3, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3 유전자의 발현이 억제 또는 침묵된 것을 더 포함할 수 있다.
유전자 발현을 억제하거나 유전자를 침묵시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 안티센스 RNA, RNA 디코이, RNA 앱타머, siRNA, shRNA/miRNA, 트랜스-우성-음성 단백질(TNP), 키메라/융합 단백질, 케모카인 리간드, 항감염성 세포 단백질, 세포내 항체(sFv), 뉴클레오시드 유사체(NRTI), 비-뉴클레오시드 유사체(NNRTI), 인테그라제 억제제(올리고뉴클레오티드, 디뉴클레오티드 및 화학제) 및 프로테아제 억제제를 사용하여 유전자 발현을 억제한다. 또한 예를 들어 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE 뉴클레아제 또는 CRISPR 시스템 중의 Cas 효소에 의해 매개된 DNA 단편화를 통해 유전자를 침묵시킬 수도 있다.
키트와 약학 조성물
본 발명은 본 발명의 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 키트를 더 제공한다.
바람직한 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 키트는 설명서를 더 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 활성제로 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 더 제공한다. 따라서 본 발명은 약학 조성물 또는 약물의 제조에서 상기 핵산 분자, 벡터 또는 조작된 면역 세포의 용도를 더 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 피험자 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 적합(즉, 원하지 않는 국소적 또는 전신적 효과를 일으키지 않고 원하는 치료 효과를 이끌어낼 수 있음)한 담체 및/또는 부형제를 의미하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다(참고: Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995). 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예시에는 충전제, 결합제, 붕해제, 코팅제, 흡착제, 접착방지제, 유동보조제, 산화방지제, 향미제, 착색제, 감미제, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이트제, 계면활성제, 희석제, 습윤제, 방부제, 유화제, 코팅제, 등장화제, 흡수 지연제, 안정화제 및 장력 조절제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 부형제의 선택은 본 발명의 원하는 약학 조성물의 제조를 위해 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 약학 조성물에 사용하기 위한 예시적인 부형제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물을 포함한다. 통상적으로, 적합한 부형제의 선택은 특히 사용되는 활성제, 치료할 질병 및 약학 조성물의 원하는 제형에 따라 달라진다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 다양한 투여 경로에 적합하다. 통상적으로, 투여는 비경구적으로 수행된다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 골수내, 척수강내, 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 설하 또는 비강내 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 다양한 형태, 예컨대 고체, 액체, 기체 또는 동결건조 형태로 제조될 수도 있으며, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 겔, 분말, 정제, 용액, 기체 에어로졸 형태, 과립, 환제, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 엘릭시르, 추출물, 팅크 또는 액체 추출물의 형태, 또는 원하는 투여 방법에 사용하기 위해 특별히 적합한 형태일 수 있다. 약제의 제조를 위한 본 발명에 공지된 공정은 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 밀링, 유화, 캡슐화, 포매 또는 동결건조 공정을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 면역 세포를 포함하는 약학 조성물은 통상적으로 용액 형태로 제공되며, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 치료될 질환의 치료 및/또는 예방에 적합한 하나 이상의 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합에 적합한 약제의 바람직한 예시에는 시스플라틴, 메이탄신 유도체, 라첼마이신(rachelmycin), 칼리케아미신(calicheamicin), 도세탁셀, 에토포사이드, 겜시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 나트륨 포르피린 II(sorfimer sodiumphotofrin II), 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레이트 글루쿠로네이트(trimetreate glucuronate), 아우리스타틴 E(auristatin E), 빈크리스틴 및 독소루비신과 같은 항암 약물; 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 외독소 A, DNase 및 RNase와 같은 펩티드 세포 독소; 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이리듐 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213과 같은 방사성 핵종; 항체-지정 효소 전구 약물 등의 전구 약물; 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 촉진 단백질 등과 같은 면역자극제; 항-CD3 항체 또는 이의 단편, 보체 활성제, 이종 단백질 도메인, 동종 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인 및 바이러스/박테리아 펩티드와 같은 항체 또는 이의 단편이 포함된다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 화학 요법, 방사선 요법과 같이 다른 하나 이상의 치료 방법과 조합 사용될 수 있다.
치료 응용
본 발명은 암, 감염 또는 자가면역 질환을 앓고 있는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에는 상기 피험자에게 유효량의 본 발명에 따른 면역 세포 또는 약학 조성물을 투여하는 단계가 포함된다. 따라서 본 발명은 암, 감염 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 핵산 분자, 벡터, 조작된 면역 세포 및 약학 조성물의 용도를 포함한다.
일 실시방식에 있어서, 유효량의 본 발명의 면역 세포 및/또는 약학 조성물은 피험자에게 직접 투여된다.
다른 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 치료 방법은 생체외 치료이다. 구체적으로, 상기 방법은 (a) 면역 세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계, (b) 체외에서 본 발명의 키메라 수용체(예를 들어 키메라 항원 수용체) 및 발현될 외인성 유전자를 상기 면역 세포에 도입하여, 변형된 면역 세포를 획득하는 단계, (c) 상기 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 단계 (a)에서 제공되는 면역 세포는 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포에서 선택되며, 상기 면역 세포는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 피험자의 샘플(특히 혈액 샘플)로부터 얻을 수 있다. 그러나 본 발명의 키메라 항원 수용체 및 외인성 유전자를 발현할 수 있고 본원에 기재된 바와 같이 원하는 생물학적 이펙터로서 기능할 수 있는 다른 면역 세포도 사용될 수 있다. 또한, 통상적으로 선택된 면역 세포는 피험자의 면역계에 적합하다. 즉, 바람직하게는 상기 면역 세포는 면역원성 반응을 유발하지 않는다. 예를 들어, "범용 수용체 세포", 즉 원하는 생물학적 이펙터로서 기능하는 보편적으로 적합하며 체외 성장가능하고 확장 가능한 림프구가 사용될 수 있다. 이러한 세포를 사용하면 피험자 자신의 림프구를 획득 및/또는 제공할 필요가 없다. 단계 (c)의 생체외 도입은 본원에 기술된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 전기천공을 통해 면역 세포에 도입하거나 면역 세포를 바이러스 벡터로 감염시킴으로써 실시할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 전술한 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 생각할 수 있는 다른 방법에는 형질감염 시약(예를 들어, 리포솜) 또는 일시적 RNA 형질감염의 사용이 포함된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 면역 세포는 자가 또는 동종이계 세포이며, 바람직하게는 T 세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK 세포 및/또는 NKT 세포이고, 보다 바람직하게는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "자가"는 개체에서 유래한 임의 물질이 나중에 동일한 해당 개체에 재도입되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "동종이계"는 임의 물질이 해당 물질이 도입된 개체와 동일한 물종의 상이한 동물 또는 상이한 환자로부터 유래된 것을 의미한다. 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 다를 때, 둘 이상의 개체가 서로 동종이계로 간주된다. 어떤 경우에는 동일한 물종에서 유래한 각 개체의 동종이계 물질이 유전자 상에서 항원 상호작용이 발생할 만큼 충분히 다를 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 인간이 아닌 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이러한 예로 제한되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물은 암 동물 모델을 대표하는 피험자로 사용하기에 유리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 피험자는 인간이다.
일 실시방식에 있어서, 상기 암은 리간드 결합 도메인과 결합하는 표적 발현과 관련된 암이다. 예를 들어, 상기 암은 뇌신경아교종, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장 및 직장암, 결합조직암, 소화기암, 자궁내막암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암(위장암 포함), 교모세포종(GBM), 간암, 간세포암, 상피내종양, 신장암, 후두암, 간종양, 폐암(예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 아데노이드 폐암 및 편평 폐암), 림프종(호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종 포함), 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암(예를 들어 입술, 혀, 입과 목), 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기암, 타액선암, 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암과 육종, 및 B세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(SL) NHL, 중간 등급/여포성 NHL, 중간 등급 미만성 NHL, 고급 면역모세포성 NHL, 고급 림프모구성 NHL, 고급 소형 비균열 세포성 NHL, 대형 종양 질환 NHL 포함), 맨틀 세포 림프종, AIDS 관련 림프종, Waldenstrom 마크로글로불린혈증, 만성 골수성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T 세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모세포 형질세포 유사 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프증식성 질환, MALT 림프종, 모세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수 발육 이상, 형질모세포성 림프종, 전백혈병, 형질세포 유사 수지상 세포 종양 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD) 및 기타 표적 발현과 관련된 질병을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 조작된 면역 세포 또는 약학 조성물을 사용해 치료할 수 있는 질병은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 뇌신경아교종, 췌장암, 위암 등으로부터 선택된다.
일 실시방식에 있어서, 상기 감염에는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충에 의해 발생하는 감염이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 자가면역 질환에는 제1형 당뇨병, 체강 질병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 혈관 염증, 악성 빈혈 및 전신성 홍반성 루푸스 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일 실시방식에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 추가적 화학요법제, 생물제제, 약물 또는 치료를 피험자에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 해당 실시방식에서, 화학요법제, 생물제제, 약물 또는 치료는 방사선 요법, 수술, 항체 제제 및/또는 소분자 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
이하 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 당업자는 본 발명의 도면 및 실시예가 단지 예시를 위한 것이며 본 발명을 제한하지 않음을 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 모순되지 않는 경우, 본원의 실시예와 실시예의 특징은 서로 조합될 수 있다.
구체적인 실시방식
실시예 1. 마우스 췌장암 세포주 Panc02-mCD19의 구축
1. pLV-mCD19 플라스미드 제조
마우스 비장 총 mRNA를 템플릿으로 사용하여 역전사 PCR을 통해 마우스 비장 총 cDNA 서열을 획득한 후, PCR을 통해 XbaI 및 SalI 효소 절단 부위를 포함하는 마우스 mCD19 서열을 획득한다. 그 후, mCD19 유전자를 pLVX 벡터(PPL, Cat No.: PPL00157-4a)에 재조합하여 pLV-mCD19 플라스미드를 획득한다.
2. 렌티바이러스 패키징
T175 배양 플라스크에서, 30×106개 세포/플라스크의 밀도로 293T 세포를 10% 태아 소 혈청을 함유하는 30ml의 DMEM 배지에 접종하고, 37℃, 5% CO2 배양상자에서 밤새 배양한다.
멸균 튜브에 3ml Opti-MEM(Gibco, Cat. No.31985-070), 34㎍ pLV-mCD19 플라스미드, 8.5㎍ pMD2.G 벡터(Addgene, Cat. No.12259) 및 17㎍ psPAX2 벡터(Addgene, Cat. No. 12260)를 첨가한다. 그 후 X-treme GENE HP DNA 형질감염 시약(Roche, Cat. No.06366236001) 120μl를 추가하고, 즉시 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 배양한다. 그 후 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 미리 준비된 293T 세포 배양 플라스크에 점적하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 밤새 배양한다. 형질감염 24시간 및 48시간 후 배양물을 수집하고, 합친 후 초원심분리(25000g, 4℃, 2.5h)하여 농축된 pLV-mCD19 렌티바이러스를 획득하며, 이를 -80℃에서 보관한다.
3. Panc02-mCD19 세포주 스크리닝
6-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 10% 태아 소 혈청이 함유된 RPMI-1640 배지(Gibco, Cat. No.C12430500BT), 1×10 6개 마우스 췌장암 세포 Panc02(중국약과대학실험실 증여) 및 200μl pLV-mCD19 렌티바이러스를 첨가하고, 37C℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양한다. 그 후 0.25% 트립신을 사용해 세포를 단일 세포 현탁액으로 소화시키고, 세포를 희석한 후 96-웰 플레이트로 옮겨 단일 클론 세포가 나타날 때까지 배양을 계속한다. 단일 클론 세포를 선택하고, 다시 0.25% 트립신으로 단세포로 소화시키고, 200μl opti-MEM 배지를 사용해 세포를 재현탁한다. APC anti-mouse CD19 항체(Biolegend, Cat. No.115512)를 사용하여, 유세포 분석법으로 감염 효율을 검출하고, CD19 양성 클론을 선별한다. 양성 클론을 3-4회 계대한 후, 다시 CD19의 발현 수준을 유세포 분석법으로 검출한다. 바이러스 감염이 없는 Panc02 세포를 대조군으로 사용한다.
결과는 도 1에 도시된 바와 같다. 최종 선별된 Panc02-mCD19 세포주에서 CD19의 발현율은 100%였다.
실시예 2. CAR-T 세포 제조
1. 레트로바이러스 플라스미드 구축
CD19-scFv(SEQ ID NO: 26), CD8a 힌지 영역 및 막횡단 영역(SEQ ID NO: 35 및 29), 41bb 세포내 도메인(SEQ ID NO: 31) 및 CD3ζ 세포내 도메인(SEQ ID NO: 33)의 코딩 서열 단편을 순차적으로 연결하여 인공 합성하고, 양단에 XhoI/EcoRI 효소 절단 부위를 추가한다. 단편을 MSCV 벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR 플라스미드를 획득한다.
T2A(SEQ ID NO: 37) 및 IL-7(SEQ ID NO: 43)의 코딩 서열 단편을 순차적으로 연결하여 인공 합성하고, 양단에 EcoRI/SalI 효소 절단 부위를 추가한다. 단편을 MSCV-mCD19-CAR 벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-IL-7 플라스미드를 획득한다.
T2A(SEQ ID NO: 37) 및 CCL4(SEQ ID NO: 83)의 코딩 서열 단편을 순차적으로 연결하여 인공 합성하고, 양단에 EcoRI/SalI 효소 절단 부위를 추가한다. 단편을 MSCV-mCD19-CAR 벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-CCL4 플라스미드를 획득한다.
T2A(SEQ ID NO: 37) 및 CCL5(SEQ ID NO: 87)의 코딩 서열 단편을 순차적으로 연결하여 인공 합성하고, 양단에 EcoRI/SalI 효소 절단 부위를 추가한다. 단편을 MSCV-mCD19-CAR 벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-CCL5 플라스미드를 획득한다.
2. 레트로바이러스 제조
T175 배양 플라스크에서, 30×106개 세포/플라스크의 밀도로 293T 세포를 10% 태아 소 혈청을 함유하는 30ml의 DMEM 배지에 접종하고, 37℃, 5% CO2 배양상자에서 밤새 배양하며, 바이러스 패키징에 사용한다.
멸균 튜브에 3ml Opti-MEM(Gibco, Cat. No. 31985-070), 45μg 레트로바이러스 플라스미드(MSCV-mCD19-CAR 플라스미드, MSCV-mCD19-CAR-IL-7 플라스미드, MSCV-mCD19-CAR-CCL4 플라스미드 또는 MSCV-mCD19-CAR-CCL5 플라스미드) 및 15㎍ 패키징 벡터 pCL-Eco(Shanghai Hewu Biotechnology Co., Ltd., Cat. No. P3029)를 첨가한다. 그 후 X-treme GENE HP DNA 형질감염 시약(Roche, Cat. No.06366236001) 120μl를 추가하고, 즉시 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 배양한다. 그 후 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 미리 준비된 293T 세포 배양 플라스크에 점적하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 밤새 배양한다. 형질감염 72시간 후 배양물을 수집하고 원심분리(2000g, 4℃, 10분)하여 레트로바이러스 상청액을 수득한다.
3. CAR-T 세포 제조
마우스 비장으로부터 T 림프구를 분리하고, DynaBeads CD3/CD28CTSTM (Gibco, Cat. No. 40203D)를 사용해 T 세포를 활성화한 후, 37℃, 5% CO2에서 1일 동안 배양한다.
웰당 3×106개 세포/mL의 밀도로 활성화된 T 세포를 RetroNectin으로 밤새 미리 코팅한 24-웰 플레이트에 접종한 후, 500μL의 완전 배지(NT, 대조군), MSCV-mCD19-CAR 바이러스, MSCV-mCD19-CAR-CCL4 바이러스, MSCV-mCD19-CAR-CCL5 바이러스, MSCV-mCD19-CAR-IL-7 바이러스+MSCV-mCD19-CAR-CCL4 바이러스, 또는 MSCV-mCD19-CAR-IL-7 바이러스+MSCV-mCD19-CAR-CCL5 바이러스를 각각 첨가하고, 완전 배지를 2mL까지 보충한다.
24-웰 플레이트를 원심분리기에 넣고 원심 감염을 수행하며, 32°C에서 2시간 동안 2000g에서 원심분리한다. 그 후, 즉시 24-웰 플레이트를 37℃, CO2 배양상자에 놓고 정적 배양을 수행한다. 다음날 새 배지를 교체하고 세포 밀도를 1×106개 세포/mL로 조정한다. 감염 3일 후, 후속 분석을 위해 세포를 수집한다. 수집된 세포는 NT 세포, mCD19-CAR 세포, mCD19-CAR+CCL4 세포, mCD19-CAR+CCL5 세포, mCD19-CAR+IL7+CCL4 세포 및 mCD19-CAR+IL7+CCL5 세포이다.
실시예 3 CAR-T 세포의 발현 검출
1. 세포 표면의 CAR 발현 수준
실시예 2에서 제조한 2×105개의 CAR-T 세포를 꺼내어, 1차 항체로 Goat Anti-Rat IgG(H&L) Biotin(BioVision, Cat. No. 6910-250)을 사용하고, 2차 항체로 APC Streptavidin(BD Pharmingen, Cat. No. 554067)을 사용하고, 유세포 분석법으로 CAR T 세포 상에서 CAR의 발현 수준을 검출하였다. 그 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
대조군에 비해 mCD19-CAR 세포, mCD19-CAR+CCL4 세포, mCD19-CAR+CCL5 세포, mCD19-CAR+IL7+CCL4 세포, 및 mCD19-CAR+IL7+CCL5 세포 중의 CAR 양성 효율은 모두 약 60%이며, 이는 이러한 세포가 모두 CAR을 효과적으로 발현할 수 있음을 나타낸다.
2. IL-7의 발현 수준
실시예 2에서 제조한 CAR-T 세포의 상청액을 수집하고, 제조사의 지시에 따라 Mouse IL-7DuoSet ELISA kit(R&D Systems, Cat. No. DY407)를 이용하여 세포 중의 IL-7 분비 수준을 측정하였다. 그 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
MSCV-mCD19-CAR-IL-7 바이러스로 형질감염된 2가지 CAR T 세포 모두 IL-7을 효과적으로 발현할 수 있음을 알 수 있다.
3. CCL4의 발현 수준
실시예 2에서 제조한 CAR-T 세포의 상청액을 수집하고, 제조사의 지시에 따라 Mouse CCL4 DuoSet ELISA kit(R&D Systems, Cat. No. DY451)를 이용하여 세포 중의 CCL4 분비 수준을 측정하였다. 그 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.
MSCV-mCD19-CAR-CCL4 바이러스로 형질감염된 2가지 CAR T 세포가 CCL4를 효과적으로 발현할 수 있음을 알 수 있다.
4. CCL5의 발현 수준
실시예 2에서 제조한 CAR-T 세포의 상청액을 수집하고, 제조사의 제안에 따라 Mouse CCL5 DuoSet ELISA kit(R&D Systems, Cat. No. DY478)를 이용하여 세포 중의 CCL5 분비 수준을 측정하였다. 그 결과는 도 5에 도시된 바와 같다.
MSCV-mCD19-CAR-CCL5 바이러스로 형질감염된 2가지 CAR T 세포가 CCL5를 효과적으로 발현할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. CAR-T 세포의 IFN-γ 분비 수준 검출
96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 2x105개 세포/100μl의 농도로 NT 세포, mCD19-CAR 세포, mCD19-CAR+IL-7 세포, mCD19-CAR+CCL4 세포, mCD19-CAR+CCL5 세포, mCD19-CAR+IL7+CCL4 세포, 및 mCD19-CAR+IL7+CCL5 세포를 각각 첨가한다. 그 후 각 웰에 1×104개 세포/100 μl의 농도로 표적 Panc02-mCD19 세포 또는 비표적 Panc02 세포를 각각 첨가한다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배양 상청액을 수집한다. 제조사의 제안에 따라, Mouse IFN-gamma DuoSet ELISA 키트(R&D, Cat. No. DY485)를 사용하여 배양물 상청액에서 IFN-γ의 발현 수준을 검출한다.
검출 결과는 도 6에 도시된 바와 같다. 비표적 세포 Panc02에서는 IFN-γ의 방출이 검출되지 않았고, NT 세포는 IFN-γ를 발현하지 않았다. 이는 본 실시예에서 CAR T 세포의 사멸이 모두 특이적임을 나타내는 것을 알 수 있다. 또한 표적 세포를 사멸시킬 때, CAR만을 발현하는 T 세포에 비해, CCL4 또는 CCL5 단독의 추가 발현은 IFN-γ 방출 수준을 낮추는 반면, IL-7+CCL4 또는 IL-7+CCL5의 발현은 IFN-γ 방출 수준을 증가시켰다.
실시예 5. CAR-T 세포의 종양 억제 효과 검증
건강한 C57BL/6 마우스의 왼쪽 앞다리 겨드랑이 아래 부위에, 5×105개의 실시예 1에서 제조한 Panc02-mCD19 췌장암 세포를 피하 접종한다.
췌장암 세포를 접종한 마우스를 각 그룹당 5마리씩 무작위로 6개 그룹으로 나눈다. 종양 부피가 100mm3까지 자라면, 각 마우스에 1×106개의 실시예 2에서 제조한 NT 세포, mCD19-CAR 세포, mCD19-CAR+CCL4 세포, mCD19-CAR+CCL5 세포, mCD19-CAR+IL7+CCL4 세포 및 mCD19-CAR+IL7+CCL5 세포를 꼬리 정맥 주사한다.
실험이 끝날 때까지 마우스의 체중과 종양 부피 변화를 모니터링한다.
마우스의 체중 변화는 도 7에 도시된 바와 같다. CAR-T 세포 투여 후, 각 군 마우스의 체중은 대조군과 유의한 차이가 없음을 알 수 있다. 또한 관찰 주기 동안, 마우스 종양이 1500mm3를 초과하지 않았을 때, 마우스 행동이 활발하고 털 색상이 정상적이었다. 이는 CAR-T 세포의 투여가 마우스에게 명백한 독성 부작용을 나타내지 않음을 보여준다.
마우스의 종양 부피 변화는 도 8에 도시된 바와 같다. NT 세포 및 기존 CAR-T 세포에 비해, CCL4 또는 CCL5만을 발현하는 CAR-T 세포는 항종양 효과를 높일 수 있음을 알 수 있다. 이는 단독의 CCL4 또는 CCL5가 CAR-T 세포와 상승 작용을 나타낼 수 있음을 의미한다. 또한 발명자는 IL-7의 추가 발현이 CAR-T 세포에 대한 CCL4의 촉진 작용을 유의하게 증가시킬 수 있어, 종양 성장을 더욱 유의하게 억제할 수 있음을 예기치 않게 발견하였다. 이에 비해, CCL5에 대한 IL-7의 촉진 작용은 CCL4에 대한 작용보다 낮지만, IL-7+CCL5+CAR의 조합의 종양 억제에 대한 효과는 여전히 단독의 CAR보다 약간 더 우수하였다.
상기 결과는 CCL4, CCL5 또는 이와 IL-7의 조합의 공동 발현이 표적 췌장암 세포에 대한 CAR 발현 조작된 면역 세포의 억제 효과를 효과적으로 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6. CCL3를 발현하는 CAR-T 세포의 종양 억제 효과 검증
실시예 2의 방법에 따라 CCL3을 발현하는 CAR-T 세포를 제조하며, 여기에서 T2A(SEQ ID NO: 37) 및 CCL3(SEQ ID NO: 79)의 코딩 서열 단편을 MSCV-mCD19-CAR 벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-CCL3 플라스미드를 획득하고 이를 레트로바이러스로 패키징한다. 해당 바이러스를 사용해 활성화된 T 세포를 형질감염시켜 mCD19-CAR+CCL3 세포를 획득한다. MSCV-mCD19-CAR-CCL3 바이러스 및 MSCV-mCD19-CAR-IL-7 바이러스를 이용해 활성화된 T 세포를 동시에 형질감염시켜 mCD19-CAR+IL7+CCL3 세포를 획득한다.
실시예 5의 방법에 따라 CAR-T 세포의 종양에 대한 체내 억제 효과를 확인한다. 도 9는 마우스의 체중 변화를 도시하였으며, 이는 CAR-T 세포의 투여가 마우스에 명백한 독성 부작용을 나타내지 않음을 나타낸다. 도 10은 마우스의 종양 부피 변화를 도시하였다. 단독의 CCL3이 CAR-T 세포와 상승 작용을 일으킬 수 있으며, IL7의 추가 발현은 CAR-T 세포에 대한 CCL3의 촉진 작용을 현저하게 증가시켜, 종양 성장을 더욱 현저하게 억제할 수 있음을 알 수 있다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐이며, 본 발명을 한정하려는 것이 아님을 유의해야 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명은 다양한 수정 및 변경이 가능하다. 당업자는 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 등가 대체, 개선 등이 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다는 것을 이해한다.
Sequence Listing <110> NANJING BIOHENG BIOTECH CO., LTD <120> Engineered Immune Cell and Use Thereof <130> BHCN24 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CD19 scFv-1 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu 115 120 125 Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys 130 135 140 Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg 145 150 155 160 Gln Pro Pro Arg 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ttacaccgcg 120 aggaagcttc ctcgcaactt tgtggtagat tactatgaga ccagcagcct ctgctcccag 180 ccagctgtgg tattccaaac caaaagaagc aagcaagtct gtgctgatcc cagtgaatcc 240 tgggtccagg agtacgtgta tgacctggaa ctgaactga 279 <210> 82 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> hCCL4 <400> 82 Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Ala Ala 5 10 15 Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val 35 40 45 Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val 50 55 60 Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser 65 70 75 80 Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn 85 90 <210> 83 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> mCCL4 <400> 83 atgaagctct gcgtgtctgc cctctctctc ctcttgctcg tggctgcctt ctgtgctcca 60 gggttctcag caccaatggg ctctgaccct cccacttcct gctgtttctc ttacacctcc 120 cggcagcttc acagaagctt tgtgatggat tactatgaga ccagcagtct ttgctccaag 180 ccagctgtgg tattcctgac caaaagaggc agacagatct gtgctaaccc cagcgagccc 240 tgggtcactg agtacatgag tgacttggag ttgaactga 279 <210> 84 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mCCL4 <400> 84 Met Lys Leu Cys Val Ser Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala 5 10 15 Phe Cys Ala Pro Gly Phe Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr 20 25 30 Ser Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Leu His Arg Ser Phe Val 35 40 45 Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Lys Pro Ala Val Val 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Ile Cys Ala Asn Pro Ser Glu Pro 65 70 75 80 Trp Val Thr Glu Tyr Met Ser Asp Leu Glu Leu Asn 85 90 <210> 85 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> hCCL5 <400> 85 atgaaggtct ccgcggcagc cctcgctgtc atcctcattg ctactgccct ctgcgctcct 60 gcatctgcct tcccatattc ctcggacacc acaccctgct gctttgccta cattgcccgc 120 ccactgcccc gtgcccacat caaggagtat ttctacacca gtggcaagtg ctccaaccca 180 gcagtcgtct ttgtcacccg aaagaaccgc caagtgtgtg ccaacccaga gaagaaatgg 240 gttcgggagt acatcaactc tttggagatg agctag 276 <210> 86 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> hCCL5 <400> 86 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 87 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> mCCL5 <400> 87 atgaagatct ctgcagctgc cctcaccatc atcctcactg cagccgccct ctgcaccccc 60 gcacctgcct caccatatgg ctcggacacc actccctgct gctttgccta cctctccctc 120 gcgctgcctc gtgcccacgt caaggagtat ttctacacca gcagcaagtg ctccaatctt 180 gcagtcgtgt ttgtcactcg aaggaaccgc caagtgtgtg ccaacccaga gaagaagtgg 240 gttcaagaat acatcaacta tttggagatg agctag 276 <210> 88 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mCCL5 <400> 88 Met Lys Ile Ser Ala Ala Ala Leu Thr Ile Ile Leu Thr Ala Ala Ala 5 10 15 Leu Cys Thr Pro Ala Pro Ala Ser Pro Tyr Gly Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Leu Ser Leu Ala Leu Pro Arg Ala His Val Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Ser Lys Cys Ser Asn Leu Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Arg Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Asn Tyr Leu Glu Met Ser 85 90

Claims (25)

  1. 조작된 면역 세포에 있어서,
    (i) 키메라 수용체, 및 (ii) 외인성 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자를 발현하는 조작된 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CCL3 유전자는 SEQ ID NO: 77 또는 79으로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖거나, 또는 상기 CCL3 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 78 또는 80으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖고;
    CCL4 유전자는 SEQ ID NO: 81 또는 83으로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖거나, 또는 상기 CCL4 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 82 또는 84로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖고;
    CCL5 유전자는 SEQ ID NO: 85 또는 87로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖거나, 상기 CCL5 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 86 또는 88로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 조작된 면역 세포.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포는 (iii) 외인성 인터류킨을 더 발현하는 조작된 면역 세포.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 인터류킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, 또는 이들의 서브유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브유닛의 조합인 조작된 면역 세포.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 인터류킨의 코딩 유전자는 SEQ ID NO: 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, 또는 상기 인터류킨은 SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 조작된 면역 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체인 조작된 면역 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 리간드 결합 도메인, 막횡단 도메인, 보조자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체인 조작된 면역 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 리간드 결합 도메인은 면역글로불린 분자, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv, 이황화 결합 Fv(sdFv), 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 또는 경쇄 가변 영역(VL), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 나노 항체 및 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 리간드 결합 도메인은 TSHR, CD19, CD123, CD22, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, AFP, Folate 수용체 α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CS1, CD138, NCAM, Claudin18.2, Prostase, PAP, ELF2M, Ephrin B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gploo, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate 수용체 β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos 관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 전립선 특이적 단백질, 서비빈과 텔로머라제, PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된 표적과 결합하는 조작된 면역 세포.
  10. 제7항 내지 제9항에 있어서,
    상기 막횡단 도메인은 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, TCRγ 사슬, TCRδ 사슬, CD3ζ 서브유닛, CD3ε 서브유닛, CD3γ 서브유닛, CD3δ 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154 단백질의 막횡단 도메인으로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  11. 제7항 내지 제10항에 있어서,
    상기 세포내 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d 단백질의 신호전달 도메인으로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 보조자극 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, CD94, LTB, ZAP70 및 이들의 조합 단백질로부터 선택된 하나 이상의 보조자극 신호전달 도메인인 조작된 면역 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 CD52, GR, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD247ζ, HLA-I, HLA-II, B2M, PD1, CTLA-4, LAG3 및 TIM3로부터 선택되는 적어도 하나의 불활성화 유전자를 더 포함하는 조작된 면역 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자의 발현은 조건적 발현인 조작된 면역 세포.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CCL3, CCL4 및/또는 CCL5 유전자는 국소화 도메인과 작동 가능하도록 연결되는 조작된 면역 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구, NK 세포 또는 NKT 세포로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD4+/CD8+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ T 세포, 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, γδ-T 세포 또는 αβ-T 세포인 조작된 면역 세포.
  18. 제1항 내지 제17항에 있어서,
    상기 면역 세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 제대혈줄기세포, 전구세포, 골수줄기세포, 유도만능줄기세포, 전능줄기세포 또는 조혈줄기세포에서 유래하는 조작된 면역 세포.
  19. 핵산 분자에 있어서,
    (i) 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 및 (ii) CCL3, CCL4 및/또는 CCL5를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체인 핵산 분자.
  21. 제19항에 있어서,
    인터류킨을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 핵산 분자.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 인터류킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, 또는 이들의 서브유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브유닛의 조합인 핵산 분자.
  23. 벡터에 있어서,
    제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  24. 약학 조성물에 있어서,
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포, 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제23항에 다른 벡터, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  25. 암, 감염 또는 자가면역성 질환을 치료하는 약물의 제조에서 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포, 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제23항에 따른 벡터, 또는 제24항에 따른 약학 조성물의 용도.
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