JP2004535402A - 可溶性ｃｔｌａ４突然変異体分子を使って同種異系島移植片を保護する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、有効量の可溶性CTLA4突然変異体分子を患者に投与することにより、特に1型および2型糖尿病などの糖尿病を処置する目的で、島細胞移植拒絶を抑制する方法である。可溶性CTLA4突然変異体分子の一例はL104EA29YIgである。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、島細胞移植拒絶を抑制する分野に関する。特に本発明は、有効量の可溶性CTLA4突然変異体分子を患者に投与することによって1型および2型糖尿病を含む糖尿病を処置する方法に関する。
【０００２】
なお、この明細書では種々の刊行物が引用されている。それらの刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の水準をさらに詳しく説明するためのものであって、引用によってそれらのすべてをこの明細書の記載とする。
【背景技術】
【０００３】
臓器移植は、臓器損傷を伴うさまざまな形の生命にかかわる疾患の好ましい処置方法として取り上げられるようになった。臨床移植成績の改善は、主に、拒絶反応を抑制する目的で次々とより強力な非特異的免疫抑制薬を開発することによって達成されてきた（Lancet, 345:1321-1325 (1995)）。短期成績は改善されたが、長期成績はまだ不十分である。現在のところ、移植された臓器の慢性拒絶と戦うには生涯免疫抑制剤を使用する必要があり、これらの薬剤の使用は心血管疾患、感染および悪性腫瘍の危険を劇的に増大させる。
【０００４】
長期間にわたる免疫抑制を必要とせずに同種異系組織の受容を促進するための方法が開発されれば、生命にかかわるこれら合併症の危険が軽減され、例えば異常ヘモグロビン症、遺伝的免疫不全および自己免疫疾患などの疾患への臓器、組織および細胞移植の応用範囲が著しく広がるだろう。
【０００５】
インスリン依存性糖尿病（IDDM）は世界中で最もよくみられる代謝障害である。米国ではおよそ300〜400人に1人がIDDMに罹患しており、IDDMの罹患率は増加し続けていることが、疫学的研究によって示唆されている。IDDMは、インスリンを産生する膵島細胞のTリンパ球による破壊をもたらす自己免疫応答によって起こる。
【０００６】
IDDMの臨床症状が顕性化した場合、IDDMの臨床症状を制御するために最もよく使用される治療法は、体外からのインスリン補充である。ほとんどのIDDM患者はインスリン補充療法によってある程度正常な生活を送ることができるようになるが、代謝ホメオスタシスを完全に回復させることはインスリン補充療法ではできないため、インスリン補充療法を受けている糖尿病患者には、眼、腎臓、心臓、および他の臓器の機能障害を含む重篤な合併症がよくみられる。
【０００７】
長い間求められてきたIDDM患者の処置は島移植である。しかし、移植されたインスリン産生島細胞は、多くの場合、先に患者自身の島細胞を破壊したものと同じ自己免疫応答によって迅速に破壊される。1990年以降に移植された260例の同種異系移植片のうち、1週間を超えるインスリン非依存性をもたらしたのは12.4％に過ぎず、1年を超えるインスリン非依存性を示したのは8.25％でしかなかった（Linsleyら, Diabetes (1997) 46:1120-3）。これらの処置の大半では、抗リンパ球グロブリンによる抗体誘導とシクロスポリン、アザチオプリンおよび糖質コルチコイドとの併用からなる基本的な治療計画が施された。
【０００８】
どの種の移植法でも、効力と毒性とのバランスが、臨床的に許容できるかどうかにとって重要な因子である。島移植の場合、現行の免疫抑制剤の多くは、特に糖質コルチコイド、およびタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤は、β細胞を損傷したり、末梢インスリン抵抗性を誘導したりすることが、さらにもう一つの問題である（Zengら, Surgery (1993) 113:98-102）。
【０００９】
シロリムス、低用量タクロリムス、およびIL-2レセプターに対するモノクローナル抗体（mAb）を含むステロイドフリーの免疫抑制プロトコール（「エドモントンプロトコール」）が、1型糖尿病患者への島単独移植の治験で使用されている（Shapiro, A.M.J.ら, (2000), N.Eng.J.Med., 343:230-238）。
【００１０】
「エドモントンプロトコール」を使った最近の成功により、島移植を使った糖尿病の処置が再び熱心に取り上げられるようになった。しかし、この治療法のヒトへの適用には、タクロリムスの毒性が制約になりうる。重要なT細胞共刺激シグナル、特にCD28経路を遮断する生物学的薬剤は、同種異系島を保護するための代替物になりうる。CD28経路を遮断する薬剤の例としては、突然変異型CTLA4分子を含む可溶性CTLA4が挙げられるが、これに限定されない。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、CD80および/またはCD86−陽性細胞上のCD80および/またはCD86分子に結合する可溶性CTLA4突然変異体分子を患者に投与することにより、内在性CD80および/またはCD86分子がT細胞上のCTLA4および/またはCD28と結合するのを阻害し、よって重要なT細胞共刺激シグナル、特にCD28経路を遮断することによる、免疫系疾患の処置方法を提供する。
【００１２】
可溶性CTLA4突然変異体分子としては、例えば、CTLA4の細胞外ドメインのうち＋29位のアラニンおよび/または＋104位のロイシンに突然変異を持ち、29位のアラニンがチロシンで置換され、104位のロイシンがグルタミン酸で置換されている分子L104EA29Yが挙げられるが、これに限るわけではない。CTLA4突然変異体分子はその突然変異型タンパク質を可溶性にする部分、例えば免疫グロブリン分子などをさらに含む。
【００１３】
好ましい一態様では、L104EA29YがL104EA29YIg（図3）である。
【００１４】
さらに本発明は、島細胞移植を受けている患者にL104EA29Y（例えばL104EA29YIg）を投与することによって、その患者における島細胞移植拒絶を抑制する方法も提供する。
【００１５】
また本発明は、糖尿病と診断された患者に、L104EA29Y（例えばL104EA29YIg）を含む免疫抑制投与計画を施し、島細胞を移植することによって、その患者の糖尿病を処置する方法も提供する。
【００１６】
さらに本発明は、医薬的に許容され得る担体と、可溶性CTLA4突然変異体、例えばL104EA29Yとを含む医薬組成物も提供する。
【００１７】
発明の詳細な記載
定義
特に断らない限り、この明細書で使用する科学用語および技術用語はすべて、当技術分野で一般的に使用されている意味を持つ。この明細書で使用する以下の単語または句は、以下に指定する意味を持つ。
【００１８】
この明細書にいう「野生型CTLA4」は、天然完全長CTLA4のアミノ酸配列（米国特許第5,434,131号、第5,844,095号、第5,851,795号）、またはその一部であってB7分子（CD80および/またはCD86）を結合するかB7分子（例えばCD80および/またはCD86）を妨害し、その結果としてB7分子がそのリガンドに結合するのを妨げるか、またはB7分子がCTLA4の細胞外ドメインまたはその一部に結合するのを妨げるような任意の部分を持つ。ある態様では、野生型CTLA4は＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるか、または野生型CTLA4は−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わる。別の態様では、野生型CTLA4は、米国特許第5,434,131号、第5,844,095号、第5,851,795号の図3に開示され、この明細書の図1に示す、CTLA4レセプターの187アミノ酸からなる。野生型CTLA4は、N末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびC末端細胞質ドメインを持つ細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインはCD80およびCD86などの標的抗原に結合する。細胞内では、天然野生型CTLA4タンパク質は、N末端にシグナルペプチドを含む未成熟ポリペプチドとして翻訳される。この未成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断および除去を含む翻訳後プロセシングを受けて、未成熟型のN末端とは異なる新たに生成したN末端を持つCTLA4切断産物を生じる。さらなる翻訳後プロセシングが起こって、CTLA4切断産物の新たに生成したN末端から1個または複数個のアミノ酸が除去される場合もありうることは、当業者には理解されるだろう。成熟型のCTLA4分子はCTLA4の細胞外ドメインまたはCD80および/もしくはCD86に結合するその任意の部分を含む。
【００１９】
この明細書にいう「CTLA4の細胞外ドメイン」は、CTLA4レセプターのうち細胞膜の外側に伸びている部分であり、B7分子（例えばCD80および/またはCD86分子）などのCTLA4リガンドを認識し結合するような細胞膜の外側に伸びるCTLA4の任意の部分を包含する。例えば、CTLA4のある細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを含む（図2）。あるいは、CTLA4のある細胞外ドメインは、＋1位のアラニンから＋125位のアスパラギン酸までを含む（図1）。細胞外ドメインにはB7分子（例えばCD80および/またはCD86）を結合するCTLA4の断片または誘導体が包含される。
【００２０】
この明細書にいう「非CTLA4タンパク質配列」または「非CTLA4分子」は、CD80および/またはCD86を結合せず、CTLA4がその標的に結合するのを妨害しない任意の分子と定義される。一例として、免疫グロブリン（Ig）定常領域またはその一部が挙げられるが、これに限定されない。Ig定常領域は、好ましくは、ヒトまたはサルIg定常領域、例えばヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC(ガンマ)1である。Ig定常領域は、そのエフェクター機能が低下するように突然変異させることができる（米国特許第5,637,481号および第6,090,914号）。
【００２１】
この明細書で使用する「可溶性」という用語は、細胞に結合または付着していない（すなわち循環している）任意の分子またはその断片および誘導体をいう。例えばCTLA4、L104EA29YIg、B7またはCD28は、それぞれCTLA4、B7またはCD28の細胞外ドメインに免疫グロブリン（Ig）部分を取り付けることによって、可溶性にすることができる。他の分子としては、パピローマウイルスE7遺伝子産物（E7）、メラノーマ関連抗原p97（p97）またはHIV envタンパク質（env gp120）を挙げることができる。もう一つの選択肢として、CTLA4などの分子は、その膜貫通ドメインを取り除くことによって、可溶性にすることもできる。通例、本発明の方法で使用される可溶性分子は、シグナル（またはリーダー）配列を含まない。
【００２２】
「CTLA4Ig」は、Igテールに接合されたCTLA4の細胞外ドメインまたはCD80および/もしくはCD86を結合するその一部を含む可溶性融合タンパク質である。ある態様は、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わる野生型CTLA4の細胞外ドメイン、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでにわたる免疫グロブリン部分を含む（図2）。CTLA4IgをコードするDNAはAmerican Type Culture Collection（ATCC）（バージニア州20110-2209、マナッサス、ユニバーシティ・ブルバード10801番）にブダペスト条約の規定に基づいて1991年5月31日に寄託され、ATCC受託番号ATCC68629が与えられてる（Linsley, P.ら, 1994 Immunity 1:793-80）。CTLA4Igを発現させるチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株CTLA4Ig-24は1991年5月31日にATCC識別番号CRL-10762としてATCCに寄託された。本発明の方法および/またはキットで使用される可溶性CTLA4Ig分子は、シグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでも含まなくてもよい。通例、本発明の方法および/またはキットでは、本分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００２３】
この明細書にいう「可溶性CTLA4」は非表面結合型（すなわち循環型）CTLA4分子（野生型もしくは突然変異型）またはCTLA4分子のうちB7を結合する任意の機能的部分を意味し、例えば次に挙げる分子などがあるが、これらに限定されない：融合分子を可溶性にする免疫グロブリン（Ig）部分にCTLA4の細胞外ドメインが融合されているCTLA4Ig融合タンパク質（例：ATCC68629）またはその断片および誘導体；パピローマウイルスE7遺伝子産物（CTLA4-E7）、メラノーマ関連抗原p97（CTLA4-p97）またはHIV envタンパク質（CTLA4-env gp120）などの生物学的に活性もしくは化学的に活性なタンパク質の一部と融合もしくは接合されたCTLA4の細胞外ドメインを持つタンパク質またはその断片および誘導体；CD28/CTLA4Igなどのハイブリッド（キメラ）融合タンパク質、またはその断片および誘導体；タンパク質を可溶性にするために膜貫通ドメインが除去されているCTLA4分子（Oaks, M.K.ら, 2000 Cellular Immunology 201:144-153）またはその断片および誘導体。「可溶性CTLA4分子」には、その断片、一部または誘導体、およびCTLA4結合活性を持つ可溶性CTLA4突然変異体分子も包含される。本発明の方法で使用される可溶性CTLA4分子はシグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでも含まなくてもよい。通例、本発明の方法では、本分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００２４】
この明細書にいう「融合タンパク質」は、米国特許第5,434,131号または同第5,637,481号に記載されているような当技術分野で周知の方法を使って一つに接合された1つまたは複数のアミノ酸配列と定義される。接合されたアミノ酸配列は、結果として、一つの融合タンパク質を形成する。
【００２５】
この明細書にいう「CTLA4突然変異体分子」は、CTLA4（好ましくはCTLA4の細胞外ドメイン）中に1個または複数個の突然変異を持っていて、その結果、野生型CTLA4分子に類似しているが同一ではない完全長CTLA4またはその一部（誘導体もしくは断片）であってもよい分子である。CTLA4突然変異体分子はB7分子（例えばCD80もしくはCD86またはその両方）を結合する。突然変異型CTLA4分子には、生物学的または化学的に活性な非CTLA4分子が含まれているか、または生物学的または化学的に活性な非CTLA4分子が結合していてもよい。突然変異体分子は可溶性（すなわち循環型）であってもよいし、表面に結合していてもよい。CTLA4突然変異体分子は、CTLA4の全細胞外ドメインまたはその一部、例えば断片もしくは誘導体を含むことができる。CTLA4突然変異体分子は合成法または組換え法によって製造することができる。
【００２６】
この明細書で使用する用語「突然変異」は、野生型ポリペプチドのヌクレオチド配列中またはアミノ酸配列中の変化である。本発明は野生型CTLA4細胞外ドメイン中の突然変異または変化を提供する。野生型CTLA4配列中の変化には保存的変化および非保存的変化が含まれる。変化は、置換、欠失、付加、または切断を含むアミノ酸変化であってもよい。突然変異体分子は1個または複数個の突然変異を持つことができる。当技術分野ではよく知られているように、ヌクレオチド配列中の突然変異はアミノ酸配列中の突然変異をもたらす場合もあるし、アミノ酸配列中の突然変異をもたらさない場合もある。これに関連して、いくつかのヌクレオチドコドンは同じアミノ酸をコードする。アミノ酸アルギニン（R）をコードするヌクレオチドコドンCGT、CGG、CGCおよびCGA、またはアミノ酸アスパラギン酸（D）をコードするコドンGATおよびGACは、その例である。したがって、あるタンパク質は、ヌクレオチド配列の詳細は異なるにもかかわらず同じ配列を持つタンパク質分子をコードする1つまたは複数の核酸分子によって、コードすることができる。アミノ酸コード配列は以下のとおりである。
【００２７】

【００２８】
「L104EA29YIg」は、アミノ酸変異A29Y（29位のアラニンがチロシンアミノ酸残基で置換されている）およびL104E（＋104位のロイシンがグルタミン酸アミノ酸残基で置換されている）を持つ野生型CTLA4の細胞外ドメイン、またはB7分子を結合するその一部が、Igテールに接合されてなる可溶性CTLA4突然変異体分子である融合タンパク質である（図3に記載；L104EA29YIgをコードするDNAは2000年6月20日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、ATCC番号PTA-2104を割り当てられた）。本発明の方法および/またはキットで使用される可溶性L104EA29YIg分子はシグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでも含まなくてもよい。通例、本発明の方法および/またはキットでは、本分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００２９】
突然変異体分子は1個または複数個の突然変異を持つことができる。「非CTLA4タンパク質配列」または「非CTLA4分子」という用語は、この明細書では、B7を結合せず、かつCTLA4がその標的に結合するのを妨害しない、任意のタンパク質を意味する。一例として、免疫グロブリン（Ig）定常領域またはその一部が挙げられるが、これに限定されない。Ig定常領域は、好ましくは、ヒトまたはサルIg定常領域、例えばヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC(ガンマ)1である。Ig定常領域は、そのエフェクター機能が低下するように突然変異させることができる（米国特許第5,637,481号、第5,844,095号および第5,434,131号）。
【００３０】
この明細書にいう「断片」または「一部」は、ある分子（例えばCTLA4またはCD28）の任意の部分またはセグメント、好ましくはCTLA4もしくはCD28の細胞外ドメイン、またはその分子のうち、その分子の標的（例えばB7分子）を認識し結合する部分またはセグメントである。
【００３１】
「B7」は、この明細書では、CTLA4および/またはCD28を認識し結合しうるB7-1（CD80）（参照によりその全文がこの明細書に組み込まれるFreemanら, 1989, J Immunol. 143:2714-2722）、B7-2（CD86）（参照によりその全文がこの明細書に組み込まれるFreemanら, 1993, Science 262:909-911；参照によりその全文がこの明細書に組み込まれるAzumaら, 1993, Nature 366:76-79）など（ただしこれらに限らない）を含むB7分子ファミリーをいう。
【００３２】
「CD28」は、この明細書では、米国特許出願第5,580,756号および同第5,521,288号（参照によりその全文がこの明細書に組み込まれる）に記載されているように、B7を認識し結合する分子をいう。
【００３３】
この明細書にいう「B7陽性細胞」は、1タイプまたは複数タイプのB7分子をその細胞表面に発現させている任意の細胞である。
【００３４】
この明細書にいう「誘導体」は、親分子と類似する配列を持ち、親分子の活性を有する分子である。例えば、CTLA4の誘導体には、野生型CTLA4の細胞外ドメインに少なくとも70％類似するアミノ酸配列を持ち、B7を認識し結合する可溶性CTLA4分子、例えばCTLA4IgまたはCTLA4突然変異体分子L104EA29YIgが含まれる。
【００３５】
レセプター、シグナルまたは分子を「遮断」または「阻害」するとは、この明細書では、当技術分野で認められている試験によって検出されるそのレセプター、シグナルまたは分子の活性化を妨害することを意味する。例えば、細胞性免疫応答の遮断は、リウマチ性疾患関連症状の減少を決定することによって検出することができる。遮断または阻害は不完全でも完全でもよい。
【００３６】
「B7相互作用を遮断する」とは、この明細書では、B7がそのリガンド、例えばCD28および/またはCTLA4などに結合するのを妨害し、よってT細胞およびB7陽性細胞相互作用を遮ることを意味する。B7相互作用を遮断する薬剤の例としては、CTLA4、CD28またはB7分子（例えばB7-1、B7-2）のいずれかを認識し結合する抗体（またはその一部もしくは誘導体）などの分子、可溶性CTLA4などの分子の可溶型（またはその一部もしくは誘導体）、CTLA4/CD28/B7を介した相互作用による細胞シグナルを妨害するように設計されたペプチド断片または他の小分子などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様では、遮断剤は、CTLA4Ig（ATCC68629）またはL104EA29YIg（ATCC PTA-2104）などの可溶性CTLA4分子、CD28Ig（ATCC68628）などの可溶性CD28分子、B7Ig（ATCC68627）などの可溶性B7分子、抗B7モノクローナル抗体（例えばATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341、ならびにAndersonらの米国特許第6,113,898号およびYokochiら, 1982, J. Immun., 128(2):823-827に記載のモノクローナル抗体）、抗CTLA4モノクローナル抗体（例えばATCC HB-304および参考文献82-83に記載のモノクローナル抗体）および/または抗CD28モノクローナル抗体（例えばATCC HB 11944およびHansen（Hansenら, 1980, Immunogenetics 10:247-260）またはMartin（Martinら, 1984, J. Clin. Immun., 4(1):18-22）が記載したmAb9.3）である。
【００３７】
「免疫系疾患」とは、この明細書では、T細胞とB7陽性細胞との相互作用によって媒介される任意の疾患を意味し、例えば自己免疫疾患、移植関連障害および免疫細胞増殖性疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。免疫系疾患の例には、移植片対宿主疾患（GVHD）（例えば骨髄移植によって起こりうるもの、または寛容の誘導をもたらすもの）、移植片移植拒絶、慢性拒絶および組織または細胞（例えば固形臓器、皮膚、島、筋、肝細胞、ニューロンなど）の同種異系または異種移植に関係する免疫障害などがある。免疫細胞増殖性疾患の例には、乾癬、T細胞リンパ腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性T細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、および自己免疫疾患、例えば狼蒼（例：エリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺腫、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例：インスリン依存性糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（例：慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症、および混合性結合組織病などがあるが、これらに限定されない。
【００３８】
この明細書で使用する「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル、類人猿）、ヒツジ、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスまたはラットなどを包含するが、これらに限定されない。
【００３９】
この明細書にいう「組織移植片」は、レシピエント患者に移植されるある臓器の全部または一部の組織と定義される。一部の態様では、組織は、1個または複数個の固形臓器に由来する。組織または臓器の例には、皮膚、心臓、肺、膵臓、腎臓、肝臓、骨髄、膵島細胞、多能性幹細胞、細胞浮遊液、および遺伝子改変細胞などがあるが、これらに限定されない。組織はドナー対象から取り出すか、またはインビトロで成長させることができる。移植片は自己移植片、同系移植片、同種異系移植片、もしくは異種移植片、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４０】
この明細書にいう「移植拒絶」は、生育可能な移植片組織がレシピエント患者から完全に、またはほぼ完全に失われることと定義される。
【００４１】
この明細書にいう「封入(encapsulation)」は、医学的用途のためにインスリンなどの治療物質を産生し分泌する細胞および/または細胞クラスターを免疫隔離するプロセスと定義される。封入プロセスでは、免疫系による拒絶を避けるために、移植に先立って、細胞および/または細胞クラスターを半透過性膜障壁に入れる。封入膜の分子量カットオフは、免疫グロブリンおよび補体系の溶解因子の内部への拡散は許さないが、それより小さいグルコースやインスリンなどの分子は通過することができるように、封入方法によって制御することができる。膵島細胞の封入方法は米国特許第6,080,412号に記載されている。
【００４２】
「リガンド」という用語は、この明細書では、別の分子を特異的に認識し結合する分子をいう。例えばCTLA4のリガンドはCD80および/またはCD86分子である。
【００４３】
この明細書にいう「CD80および/またはCD86抗原を認識し結合する可溶性リガンド」には、CTLA4Ig、CD28Igまたは他の可溶型CTLA4およびCD28などのリガンド、組換えCTLA4およびCD28、L104EA29YIgなどの突然変異型CTLA4分子、ならびにCD80および/またはCD86抗原を認識し結合する任意の抗体分子、その断片または組換え結合タンパク質が包含される。また、これらの薬剤は「免疫抑制剤」であるとみなされる。
【００４４】
この明細書にいう「共刺激経路(costimulatory pathway)」は、T細胞および抗原提示細胞（APC）上の共刺激シグナルの相互作用によって生じる生化学的経路と定義される。共刺激シグナルはある刺激に対する免疫学的応答の大きさを決定するのに役立つ。ある共刺激シグナルは、T細胞レセプターCD28およびCTLA4とAPC上のCD80および/またはCD86分子との相互作用によってもたらされる。
【００４５】
この明細書にいう「CD80および/またはCD86」には、B7-1（CD80とも呼ばれる）、B7-2（CD86とも呼ばれる）、B7-3（CD74とも呼ばれる）、ならびにB7ファミリー、例えばB7-1、B7-2および/またはB7-3の組み合わせが包含される。
【００４６】
この明細書にいう「共刺激遮断(costimulatory brockade)」は、上述の共刺激経路を妨害または遮断する1つまたは複数の薬剤をある患者に投与するプロトコールと定義される。共刺激遮断を妨害する薬剤の例には、可溶性CTLA4、突然変異型CTLA4、可溶性CD28、抗B7モノクローナル抗体（mAb）、可溶性CD40、および抗gp39 mAbなどがあるが、これらに限定されない。一態様として、L104EA29YIgは、共刺激遮断を妨害する好ましい薬剤である。
【００４７】
この明細書にいう「T細胞枯渇骨髄(T cell depleted bone marrow)」は、抗T細胞プロトコールで処理された骨から取り出された骨髄と定義される。抗T細胞プロトコールは骨髄からT細胞を除去するための手順と定義される。T細胞を選択的に取り除く方法は当技術分野ではよく知られている。抗T細胞プロトコールの一例は、T細胞に対して細胞傷害性であるようなT細胞特異抗体、例えば抗CD3、抗CD4、抗CD5、抗CD8および抗CD90モノクローナル抗体などに、骨髄をばく露することである。あるいは、磁場を使って骨髄からT細胞を除去することができるように、抗体を磁気粒子に結合することもできる。抗T細胞プロトコールのもう一つの例は、骨髄T細胞を抗リンパ球血清または抗胸腺細胞グロブリンにばく露することである。
【００４８】
この明細書にいう「寛容化量のT細胞枯渇骨髄」は、潜在的なドナー反応性T細胞を不活化する目的で患者に投与される初回量のT細胞枯渇骨髄と定義される。
【００４９】
この明細書にいう「移植量のT細胞枯渇骨髄」は、混合造血キメリズムを樹立する目的で患者に投与される後続量のT細胞枯渇骨髄と定義される。したがって、移植量のT細胞枯渇骨髄は、寛容化量のT細胞枯渇骨髄後に投与されることになる。
【００５０】
この明細書にいう「混合造血キメリズム」は、免疫応答が存在しない（または検出できるほどには存在しない）状態でドナーとレシピエントの前駆細胞および成熟細胞（例えば血液由来細胞）が存在することと定義される。
【００５１】
この明細書にいう「ドナー-レシピエントペアリング」は、先に定義された主要組織適合性アレルのパネル（8つのクラスIと12のクラスII）を使った分子タイピングに基づいて定義づけられる（Lobashevsky A,ら, Tissue Antigens 54:254-263, (1999)、Knapp LA,ら, Tissue Antigens 50:657-661, (1997)、Watkins D.I., Crit Rev Immunol 15:1-29, (1995)）。ペアリングはクラスI遺伝子座とクラスII遺伝子座の両方で相異が最大になるようにした。
【００５２】
この明細書にいう患者への「投与」には、例えば静脈内（i.v.）投与、腹腔内（i.p.）投与、筋肉内（i.m.）投与、皮下投与、経口投与、注射による投与、坐剤としての投与、または患者へのミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の植え込みなどが包含されるが、これらに限定されない。
【００５３】
この明細書にいう「医薬的に許容され得る担体」には、反応性薬剤と組み合わせた場合に、反応性薬剤の生物学的活性、例えば結合特異性を保ち、かつ患者の免疫系と反応しない、任意の材料が含まれる。例として、リン酸緩衝食塩溶液などの一般的医薬担体、水、油/水エマルションなどのエマルション、およびさまざまなタイプの湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体として、滅菌溶液、コーティング錠を含む錠剤、およびカプセル剤なども挙げられる。通例、このような担体は、デンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物油脂、ゴム、グリコールなどの賦形剤、または他の既知の賦形剤を含む。また、このような担体には、香料および着色料または他の成分も包含される。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される。
【００５４】
この明細書にいう「免疫抑制剤」は、免疫応答の発生を防止するかまたは患者の免疫系を減弱する1種または複数種類の分子を含む組成物と定義される。前記薬剤は、好ましくは、T細胞増殖を減少させるか、または防止する。一部の薬剤は、T細胞と他の抗原提示細胞（APC）との相互作用を阻害することによって、T細胞増殖を阻害しうる。APCの一例はB細胞である。T細胞とAPCとの相互作用を妨害し、よってT細胞増殖を阻害する薬剤の例には、CD80および/またはCD86抗原のリガンド、CTLA4抗原のリガンド、およびCD28抗原のリガンドなどがあるが、これらに限定されない。CD80および/またはCD86抗原のリガンドの例には、可溶性CTLA4、可溶性CTLA4突然変異体、可溶性CD28、あるいはCD80および/もしくはCD86抗原を認識し結合するモノクローナル抗体またはその断片などがあるが、これらに限定されない。好ましい薬剤の一つはL104EA29YIgである。CTLA4またはCD28抗原のリガンドとしては、例えばCTLA4および/もしくはCD28抗原を認識し結合するモノクローナル抗体またはその断片が挙げられる。CTLA4またはCD28の他のリガンドとして、可溶性CD80および/またはCD86分子、例えばCD80および/またはCD86Igなども挙げられる。CD28とCD80および/またはCD86との相互作用を阻害するには、他の薬剤またはリガンドも使用できることは、当業者にはすぐに理解されるだろう。
【００５５】
免疫抑制剤には、例えばメトトレキセート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンA、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン（sulphasalazopyrine））、金塩、D-ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（REMICADE（登録商標））、エタネルセプト、TNFα遮断薬、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤、および非ステロイド抗炎症薬（NSAID）などが含まれるが、これらに限定されない。NSAIDには、例えばアセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナメート、ナプキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Cox-2阻害剤およびトラマドールなどがあるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明の組成物
本発明は、可溶性CTLA4分子を含む、糖尿病などの免疫疾患を処置するための組成物を提供する。さらに本発明は、糖尿病を処置する目的で、島細胞移植拒絶などの移植拒絶を抑制するための組成物も提供する。さらに本発明は、あるヒトのB7陽性細胞を可溶性CTLA4と接触させることにより、そのヒトのT細胞機能を阻害するがT細胞枯渇は阻害しない、生物学的薬剤を含む組成物を提供する。可溶性CTLA4の例としては、CTLA4Ig、ならびにL104EA29YIg、L104EA29LIg、L104EA29TIg、およびL104EA29WIgなどの可溶性CTLA4突然変異体分子が挙げられる。
【００５７】
突然変異型または野生型配列を持つCTLA4分子は、CTLA4膜貫通セグメントを欠失させることによって、可溶性にすることができる（Oaks, M.K.ら, 2000 Cellular Immunology 201:144-153）。
【００５８】
もう一つの選択肢として、突然変異型または野生型配列を持つ可溶性CTLA4分子は、CTLA4分子を可溶性にする免疫グロブリン(Ig）分子などの非CTLA4部分にCTLA4分子を融合させた融合タンパク質であってもよい。例えば、あるCTLA4融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインに融合されてCTLA4Ig分子（図2）となったCTLA4の細胞外ドメインを含みうる（Linsley, P.S.ら,, 1994 Immunity 1:793-80）。
【００５９】
臨床プロトコールの場合は、免疫グロブリン部分が患者内で有害な免疫応答を誘発しないことが好ましい。好ましい部分は、ヒトまたはサル免疫グロブリン定常領域を含む免疫グロブリン定常領域である。適切な免疫グロブリン領域の一例は、Fcレセプターへの結合もしくは補体依存性細胞障害活性（CDC）を媒介すること、または抗体依存性細胞性細胞障害活性（ADCC）を媒介することなどのエフェクター機能を媒介することができるヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC_γ1である。免疫グロブリン部分はその内部に（例えばCDCまたはADCCなどのエフェクター機能を減少させる目的でCH2ドメイン中に）、免疫グロブリンのFcレセプターへの結合能を増減することによって免疫グロブリンのリガンドへの結合能を調整するような1つまたは複数の突然変異を含みうる。例えば、免疫グロブリン部分中の突然変異として、ヒンジドメイン内のシステイン残基のいずれかまたは全部の変化を挙げることができる。例えば、＋130位、＋136位および＋139位のシステインをセリンで置換する（図24）。免疫グロブリン部分は、図24に示すように、＋148位のプロリンがセリンで置換されていてもよい。さらに、免疫グロブリン部分中の突然変異は、＋144位のロイシンがフェニルアラニンで置換されているか、＋145位のロイシンがグルタミン酸で置換しているか、または＋147位のグリシンがアラニンで置換されていてもよい。
【００６０】
可溶性CTLA4分子または可溶性CTLA4突然変異体分子用の非CTLA4部分には他にも、例えばp97分子、env gp120分子、E7分子、およびova分子などがあるが、これらに限定されない（Dash, B.ら, 1994 J. Gen. Virol. 75(Pt 6):1389-97、Ikeda, T.ら, 1994 Gene 138(1-2):193-6、Falk, K.ら 1993 Cell. Immunol. 150(2):447-52、Fujiska, K.ら 1994 Virology 204(2):789-93）。他の分子も考えられる（Gerard, C.ら 1994 Neurosciece 62(3):721、Byrn, R.ら 1989 63(10):4370、Smith, D.ら, 1987 Science 238:1704、Lasky, L. 1996 Science 233:209）。
【００６１】
本発明は、分子のCTLA4部分の細胞外ドメインのN末端にシグナルペプチド配列が連結されている可溶性CTLA4分子を提供する。シグナルペプチドは、例えばオンコスタチンM（Malikら, 1989, Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853）もしくはCD5（Jones, N.H.ら, 1986 Nature 323:346-349）のシグナルペプチドまたは任意の細胞外タンパク質のシグナルペプチドなど、成熟分子の分泌を可能にする任意の配列であってもよい。本発明の可溶性CTLA4分子は、CTLA4の細胞外ドメインのN末端に連結されたオンコスタチンMシグナルペプチドおよびCTLA4の細胞外ドメインのC末端に連結されたヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）を含むことができる。この分子は、−26位のメチオニンから−1位のアラニンまでのアミノ酸配列を包含するオンコスタチンMシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを有するアミノ酸配列を包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを有するアミノ酸配列を包含する免疫グロブリン部分を持つ。
【００６２】
一態様として、後述の突然変異型CTLA4配列を含む本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は、突然変異型CTLA4断片に融合されたヒトIgC(ガンマ)1（すなわちIgC_γ1）部分を含む融合分子である。可溶性CTLA4突然変異体分子は、CTLA4の細胞外ドメイン中に1つまたは複数の突然変異（例えばアミノ酸の置換、欠失または挿入）を含むことができる。
【００６３】
例えば、可溶性CTLA4突然変異体分子は、＋25位のセリンから＋33位のアルギニンまでによって包含される領域（例えば、標準的な一文字アミノ酸記号で、S25-R33）の内部またはその近傍に、1つまたは複数の突然変異を含むことができる。この突然変異型CTLA4分子は、次の位置のいずれか1つまたは複数にアミノ酸置換を含むことができる：S25、P26、G27、K28、A29、T30、E31、またはR33。
【００６４】
もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、＋95位のグルタミン酸から＋107位のグリシンまでによって包含される領域（例えばE95-G107）の内部またはその近傍に、1つまたは複数の突然変異を含むこともできる。この突然変異型CTLA4分子は、次の位置のいずれか1つまたは複数にアミノ酸置換を含むことができる：K93、L96、M97、Y98、P99、P100、P101、Y102、Y103、L104、G105、I106、およびG107。
【００６５】
さらに本発明は、＋108位のアスパラギンから＋115位のイソロイシンまでによって包含される領域（例えばN108-I115）の内部またはその近傍に、1つまたは複数の突然変異を持つ可溶性CTLA4突然変異体タンパク質も提供する。この突然変異型CTLA4分子は、次の位置のいずれか1つまたは複数にアミノ酸置換を含むことができる：L104、G105、I106、G107、Q111、Y113、またはI115。
【００６６】
一態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、細胞外ドメイン中に一部位突然変異を持つCTLA4断片に融合されたIgCγ1を含む。CTLA4の細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを含む（例えば図1）。CTLA4の細胞外部分は−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを含むことができる（例えば図1）。一部位突然変異の例には、＋104位のロイシンが他の任意のアミノ酸に変化する下記の突然変異が含まれる。
【００６７】

【００６８】
さらに本発明は、Ig C_γ1部分に融合された、2つの突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを有する突然変異体分子も提供する。例として、＋104位のロイシンが別のアミノ酸（グルタミン酸）に変えられ、＋105位のグリシン、＋25位のセリン、＋30位のスレオニン、または＋29位のアラニンを別アミノ酸に変化させる、次のような例が挙げられる。
【００６９】

【００７０】
さらに本発明は、3つの突然変異を含むCTLA4の細胞外ドメインがIg C_γ1部分に融合されている突然変異体分子も提供する。例として、＋104位のロイシンが別のアミノ酸（例えばグルタミン酸）に変化し、＋29位のアラニンが別のアミノ酸（例えばチロシン）に変化し、かつ＋25位のセリンが別のアミノ酸に変化している下記の突然変異体が挙げられる。
【００７１】

【００７２】
可溶性CTLA4突然変異体分子は、その分子のCTLA4部分とIg部分との間に位置する接合部アミノ酸残基を持っていてもよい。接合部アミノ酸は、グルタミンを含む任意のアミノ酸であってもよい。接合部アミノ酸は当技術分野で知られる分子合成法または化学合成法によって導入することができる。
【００７３】
本発明は、CTLA4の細胞外ドメイン中に一部位突然変異を含む可溶性CTLA4突然変異体分子、例えば＋104位のロイシンがそれぞれグルタミン酸またはセリンで置換されるようにそのCTLA4配列が突然変異しているL104EIg（図19に記載）またはL104SIgなどを提供する。一部位突然変異体分子はさらに、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。本突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130位、＋136位および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。あるいは、一部位可溶性CTLA4突然変異体分子は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分を持ってもよい。
【００７４】
本発明は、CTLA4の細胞外ドメイン中に二部位突然変異を含む可溶性CTLA4突然変異体分子、例えば＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換され、＋29位のアラニンがそれぞれチロシン、ロイシン、スレオニンおよびトリプトファンに変化しているL104EA29YIg、L104EA29LIg、L104EA29TIgまたはL104EA29WIgなどを提供する。＋1位のメチオニンに始まって＋357位のリジンで終わり、加えてシグナル（リーダー）ペプチドを持っているL104EA29YIg、L104EA29LIg、L104EA29TIgおよびL104EA29WIgの配列は、それぞれ図3および20〜22に示す配列に含まれている。さらにこれらの二部位突然変異体分子は、＋1位のメチオニンから＋124位までを包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。本突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130位、＋136位および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。あるいは、これらの突然変異体分子は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分を持つこともできる。
【００７５】
本発明は、CTLA4の細胞外ドメイン中に二部位突然変異を含む可溶性CTLA4突然変異体分子、例えば＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換され、＋105位のグリシンがそれぞれフェニルアラニン、トリプトファンおよびロイシンで置換されているL104EG105FIg、L104EG105WIgおよびL104EG105LIgなどを提供する。さらにこれらの二部位突然変異体分子は、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。本突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130位、＋136位および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。あるいは、これらの突然変異体分子は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分を持つこともできる。
【００７６】
本発明は、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む二部位突然変異体分子であるL104ES25RIgを提供する。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋25位のセリンがアルギニンで置換され、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるような突然変異を受ける。あるいは、L104ES25RIgは−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分を持つこともできる。
【００７７】
本発明は、CTLA4の細胞外ドメイン中に二部位突然変異を含む可溶性CTLA4突然変異体分子、例えば＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換され、＋30位のスレオニンがそれぞれグリシンおよびアスパラギンで置換されているL104ET30GIgおよびL104ET30NIgなどを提供する。さらにこれらの二部位突然変異体分子は、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。本突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130位、＋136位および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。あるいは、これらの突然変異体分子は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分を持つこともできる。
【００７８】
本発明は、CTLA4の細胞外ドメイン中に三部位突然変異を含む可溶性CTLA4突然変異体分子、例えば＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換され、＋29位のアラニンがチロシンに変化し、＋25のセリンがそれぞれリジン、アスパラギン酸およびアルギニンに変化しているL104EA29YS25KIg、L104EA29YS25NIg、L104EA29YS25RIgなどを提供する。さらにこれらの三部位突然変異体分子は、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。本突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130位、＋136位および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。あるいは、これらの突然変異体分子は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを包含するCTLA4部分を持つこともできる。
【００７９】
可溶性CTLA4突然変異体分子の他の態様として、B7を結合するキメラCTLA4/CD28ホモログ突然変異体分子が挙げられる（Peach, R.J.ら, 1994 J Exp Med 180:2049-2058）。これらのキメラCTLA4/CD28突然変異体分子の例には、HS1、HS2、HS3、HS4、HS5、HS6、HS4A、HS4B、HS7、HS8、HS9、HS10、HS11、HS12、HS13およびHS14などがある（米国特許第5,773,253号）。
【００８０】
本発明の好ましい態様は、CTLA4Ig（＋1位のメチオニンから始まって＋357位のリジンで終わる図2に示すもの）および可溶性CTLA4突然変異体L104EA29YIg（＋1位のメチオニンから始まって＋357位のリジンで終わる図3に示すもの）などの可溶性CTLA4分子である。
【００８１】
さらに本発明は、本発明の可溶性CTLA4分子に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。一態様として、本核酸分子はDNA（例えばcDNA）またはそのハイブリッドである。CTLA4IgをコードするDNA（図2）は1991年5月31日にバージニア州20110-2209マナッサス、ユニバーシティ・ブルバード10801のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託され、ATCC受託番号ATCC68629を付与されている。L104EA29YIgをコードするDNA（図3に記載の配列）は2000年6月19日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-2104を付与されている。もう一つの選択肢として、核酸分子はRNAまたはそのハイブリッドある。
【００８２】
CTLA4ハイブリッド
本発明は、少なくともCTLA4の細胞外ドメインまたはCD80および/もしくはCD86を結合するその一部を含む可溶性CTLA4突然変異体分子を提供する。CTLA4の細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを含む（例えば図1）。CTLA4の細胞外部分は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを含むことができる（例えば図1）。CTLA4の細胞外部分は＋95位のグルタミン酸から＋120位のシステインまでを含むことができる。CTLA4の細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから＋21位のシステインまでおよび＋95位のグルタミン酸から＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋1位のメチオニンから＋23位のチロシンまでをおよび＋32位のバリンから＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋24位のアラニンから＋31位のグルタミン酸までおよび＋95位のグルタミン酸から＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋24位のアラニンから＋31位のグルタミン酸までおよび＋95位のグルタミン酸から＋112位のイソロイシンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は＋24位のアラニンから＋31位のグルタミン酸までおよび＋113位のチロシンから＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は＋50位のアラニンから＋57位のグルタミン酸までおよび＋95位のグルタミン酸から＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋24位のアラニンから＋31位のグルタミン酸まで、＋50位のアラニンから＋57位のグルタミン酸まで、および＋95位のグルタミン酸から＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外ドメインは＋50位のアラニンから＋57位のグルタミン酸までおよび＋95位のグルタミン酸から＋112位のイソロイシンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋24位のアラニンから＋31位のグルタミン酸まで、＋50位のアラニンから＋57位のグルタミン酸まで、および＋95位のグルタミン酸から＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋24位のアラニンから＋94位のバリンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、−1位のアラニンから＋21位のシステインまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋1位のメチオニンから＋21位のシステインまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋95位のグルタミン酸から＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、−1位のアラニンから＋94位のバリンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋1位のメチオニンから＋94位のバリンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋24位のアラニンから＋31位のグルタミン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、−1位のアラニンから＋23位のチロシンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋1位のメチオニンから＋23位のチロシンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋32位のバリンから＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋113位のチロシンから＋122位のアスパラギン酸までを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋95位のグルタミン酸から＋112位のイソロイシンまでを含むことができる。CTLA4の細胞外部分は、＋50位のアラニンから＋57位のグルタミン酸までを含むことができる。
【００８３】
本発明の分子を製造する方法
CTLA4突然変異体分子は原核細胞で発現させることができる。原核細胞の最も一般的な例は種々の細菌株である。細菌はグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。他の微生物株も使用してもよい。
【００８４】
CTLA4突然変異体分子をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌などの原核細胞中で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することができる。これらのベクターは一般的に使用される原核制御配列を含むことができる。これらの原核制御配列は、この明細書では、リボソーム結合部位配列と共に転写開始用のプロモーターを含み、必要に応じてオペレーターを含んでもよいと定義され、例えばβ-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモーター系（Changら（1977）Nature 198:1056）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら（1980）Nucleic Acids Res. 8:4057）およびラムダ由来のP_LプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位（Shimatakeら（1981）Nature 292:128）などといった一般に使用されるプロモーターを含む。
【００８５】
このような発現ベクターは、ベクターが細菌中で複製することができるように、そしてアンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質の存在下で生育した時に当該プラスミドを保持する細胞を選択することができるように、複製起点と、抗生物質に対する耐性を付与するβ-ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの選択可能マーカーも含むだろう。
【００８６】
発現プラスミドは、さまざまな標準的方法、例えばCaCl₂ショック（Cohen（1972）Proc .Natl.Acad.Sci.USA 69:2110およびSambrookら編「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Press（1989））ならびにエレクトロポレーションなど（ただしこれらに限らない）によって、原核細胞に導入することができる。
【００８７】
本発明の実施態様として、真核細胞も適切な宿主細胞である。真核細胞の例には、初代動物細胞または不死化動物細胞、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシェ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピキア・パストリス）および植物細胞などがある。骨髄腫、COS細胞、CHO細胞は、宿主として使用しうる動物細胞の例である。CHO細胞の具体例には、例えばDG44（Chasinら, 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556、Kolkekar, 1997 Biochemistry 36:10901-10909）、CHO-K1（ATCC No. CCL-61）、CHO-K1 Tet-On細胞株（Clontech）、ECACC85050302であるCHO（CAMR、英国ウィルトシャー・ソールズベリー）、CHOクローン13（GEIMG、イタリア・ジェノバ）、CHOクローンB（GEIMG、イタリア・ジェノバ）、ECACC93061607であるCHO-K1/SF（CAMR、英国ウィルトシャー・ソールズベリー）およびECACC92052129であるRR-CHOK1（CAMR、英国ウィルトシャー・ソールズベリー）などがある。植物細胞の代表例には、タバコ（全植物体、細胞培養またはカルス）、トウモロコシ、ダイズおよびイネ細胞などがある。トウモロコシ、ダイズおよびイネ種子も利用することができる。
【００８８】
CTLA4突然変異体分子をコードするヌクレオチド配列は、真核宿主中で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することもできる。このベクターの調節要素は、使用する真核宿主に応じて変わりうる。L104EA29YIgをコードする核酸分子は、pD16 L104EA29YIg中に含まれ、2000年6月19日に、バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブルバード10801のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託された（ATCC番号PTA-2104）。pD16 L104EA29YIgベクターはpcDNA3ベクター（INVITROGEN）の誘導体である。
【００８９】
一般的に使用される発現ベクター用の真核制御配列は、哺乳類細胞に適合したプロモーターおよび制御配列、例えばCMVプロモーター（CDM8ベクター）およびトリ肉腫ウイルス（ASV）（πLNベクター）などを含む。一般的に使用される他のプロモーターには、例えばシミアンウイルス40（SV40）の初期および後期プロモーター（Fiersら（1973）Nature 273:113）、または他のウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウイルス2およびウシ乳頭腫ウイルス由来のものなどがある。hMTII（Karinら（1982）Nature 299:797-802）などの誘導性プロモーターも使用することができる。
【００９０】
真核生物中でCTLA4突然変異体分子を発現させるためのベクターはエンハンサー領域と呼ばれる配列も持ちうる。これらは遺伝子発現を最適化するのに重要であり、プロモーター領域の上流または下流に見いだされる。
【００９１】
真核宿主細胞用発現ベクターの例には、哺乳類宿主細胞用のベクター（例えばBPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2（Maniatis）；pIRES（Clontech）；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1（Life Technologies）；pVPakcベクター、pCMVベクター、pSG5ベクター（Stratagene））、レトロウイルスベクター（例えばpFBベクター（Stratagene））、pCDNA-3（Invitrogen）またはその改変型、アデノウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター（例えばpESCベクター（Stratagene））などがあるが、これらに限定されない。
【００９２】
CTLA4突然変異体分子をコードするヌクレオチド配列は、真核宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムが複製するときに一緒に複製することができる。あるいは、CTLA4突然変異体分子を保持するベクターが、染色体外複製を可能にする複製起点を持つこともできる。
【００９３】
サッカロミセス・セレビシェでヌクレオチド配列を発現させるには、内因性酵母プラスミド2μ環状DNA由来の複製起点を使用することができる（Broach（1983）Meth. Enz. 101:307）。もう一つの選択肢として、自律的複製を促進することができる酵母ゲノム由来の配列を使用することもできる（例えばStinchcombら（1979）Nature 282:39、Tschemperら（1980）Gene 10:157、およびClarkeら（1983）Meth. Enz. 101:300を参照されたい）。
【００９４】
酵母ベクター用の転写制御配列として、例えば解糖酵素を合成するためのプロモーターが挙げられる（Hessら（1968）J. Adv. Enzyme Reg. 7:149、Hollandら（1978）Biochemistry 17:4900）。当技術分野で知られる他のプロモーターには、例えばCDM8ベクターに含まれているCMVプロモーター（ToyamaおよびOkayama（1990）FEBS 268:217-221）、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Hitzemanら（1980）J. Biol. Chem. 255:2073）および他の解糖酵素のプロモーターなどがある。
【００９５】
他のプロモーターは、環境刺激または細胞の成長培地によって調節することができるので誘導性である。これらの誘導性プロモーターには、例えば熱ショックタンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素異化に関係する酵素、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素の遺伝子に由来するものなどがある。
【００９６】
調節配列はコード配列の3'末端にも置くことができる。これらの配列はメッセンジャーRNAを安定化するように作用しうる。そのようなターミネーターはいくつかの酵母由来遺伝子および哺乳類遺伝子のコード配列に続く3'非翻訳領域に見いだされる。
【００９７】
植物用ベクターおよび植物細胞の代表例には、アグロバクテリウムT_iプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびトマトゴールデンモザイクウイルス（TGMV）などがあるが、これらに限定されない。
【００９８】
哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面はAxelらが記述している（1983年8月16日発行の米国特許第4,399,216号）。哺乳類細胞は、例えばリン酸カルシウム存在下でのトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの方法、またはウイルスベクターによる形質導入によって形質転換することができる。植物および酵母ゲノムに外来DNA配列を導入する方法には、例えば（1）機械的方法、例えば単一細胞またはプロトプラストへのDNAのマイクロインジェクション、DNAの存在下で細胞をガラスビーズと共にボルテックスする方法、またはDNAで覆ったタングステンまたは金球体を細胞またはプロトプラストに撃ち込む方法など、（2）ポリエチレングリコール処理または高圧電気パルスの印加（エレクトロポレーション）により、細胞膜を巨大分子に対して透過性にすることによってDNAを導入する方法、または（3）細胞膜と融合するリポソーム（cDNAを含むもの）の使用などがある。
【００９９】
CTLA4突然変異体分子の発現は当技術分野で知られている方法によって検出することができる。例えば突然変異体分子はSDS-PAGEゲルのクーマシー染色およびCTLA4を結合する抗体を使った免疫ブロッティングによって検出することができる。標準的なタンパク質精製手段、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどを使ってタンパク質の回収を行うことにより、実質的に純粋な産物を得ることができる（R.Scopes「Protein Purification,Principles and Practice」第3版, Springer-Verlag（1994））。
【０１００】
さらに本発明は、この明細書に記載の方法によって製造された可溶性CTLA4突然変異体タンパク質分子を提供する。
【０１０１】
CTLA4Igコドンベース突然変異誘発
一態様として、部位特異的突然変異誘発法および新規スクリーニング法を使って、CD86に対する結合アビディティーを向上させるCTLA4の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。この態様では、CTLA4の細胞外ドメインのうち、セリン25からアルギニン33までの領域、C'鎖（アラニン49およびスレオニン51）、F鎖（リジン93、グルタミン酸95およびロイシン96）、メチオニン97からチロシン102までの領域、チロシン103からグリシン107まで、ならびにグルタミン111、チロシン113およびイソロイシン115のG鎖中の残基に、突然変異を導入した。これらの部位は、キメラCD28/CTLA4融合タンパク質の研究（Peachら, J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058）、どのアミノ酸残基側鎖が溶媒露出しているかを予測するモデル、およびCD28とCTLA4の間で一定の位置にアミノ酸残基の一致または相同性が欠けていることに基づいて選択した。また、特定した残基に空間的に近接（5〜20オングストローム単位）している残基はいずれも、本発明の一部とみなされる。
【０１０２】
CD80および/またはCD86に対するアフィニティーが変化している可溶性CTLA4突然変異体分子を合成しスクリーニングするために、2段階法を採用した。これらの実験では、まず、CTLA4の細胞外ドメインの特定コドンで突然変異のライブラリーを作製し、次にBIAcore解析によってそれらをスクリーニングすることにより、CD80またはCD86に対する反応性が変化している突然変異体を同定した。Biacoreアッセイシステム（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）では、検出器に配置されたデキストラン被覆センサーチップへのCD80IgまたはCD86Igの共有結合が基本的に関わる表面プラズモン共鳴検出器システムを使用する。次に、センサーチップを含むチャンバーに試験分子を注入し、結合する相補的タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子量の変化に基づいて評価することができ、分子量の変化は検出器システムによって測定することができる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物
本発明は、医薬有効量の可溶性CTLA4突然変異体分子を含む免疫系疾患処置用の医薬組成物を包含する。一部の態様では、前記免疫系疾患が、CD28および/またはCTLA4陽性細胞とCD80および/またはCD86−陽性細胞との相互作用によって媒介される。可溶性CTLA4突然変異体分子は、好ましくは、野生型配列を持つ可溶性CTLA4分子および/またはCTLA4の細胞外ドメイン中に1つまたは複数の突然変異を持つ可溶性CTLA4分子である。医薬組成物は可溶性CTLA4またはCTLA4突然変異体タンパク質分子および/または核酸分子、および/または前記分子をコードするベクターを含むことができる。好ましい態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、図3に示すCTLA4の細胞外ドメインのアミノ酸配列を持つ（L104EA29Y）。さらに好ましくは、可溶性CTLA4突然変異体分子は、図3に示すこの明細書に記載のL104EA29YIgである。本組成物はさらに他の治療剤、例えば免疫抑制剤、NSAID、コルチコステロイド、糖質コルチコイド、薬物、毒素、酵素、抗体またはコンジュゲートなど（ただしこれらに限らない）も含みうる。
【０１０４】
本医薬組成物の一態様は、有効量の可溶性CTLA4分子を単独で、または有効量の少なくとも1つの他の治療剤、例えば免疫抑制剤またはNSAIDなどと組み合わせて含む。
【０１０５】
本医薬組成物中の可溶性CTLA4の有効量は、約0.1〜100mg/kg（患者の体重)の範囲をとりうる。もう一つの態様として、有効量は、約0.5〜5mg/kg（患者の体重）、約5〜10mg/kg（患者の体重）、約10〜15mg/kg（患者の体重）、約15〜20mg/kg（患者の体重）、約20〜25mg/kg（患者の体重）、約25〜30mg/kg（患者の体重）、約30〜35mg/kg（患者の体重）、約35〜40mg/kg（患者の体重）、約40〜45mg/kg（患者）、約45〜50mg/kg（患者の体重）、約50〜55mg/kg（患者の体重)、約55〜60mg/kg（患者の体重）、約60〜65mg/kg（患者の体重）、約65〜70mg/kg（患者の体重）、約70〜75mg/kg（患者の体重）、約75〜80mg/kg（患者の体重）、約85〜90mg/kg（患者の体重）、約90〜95mg/kg（患者の体重）、または約95〜100mg/kg（患者の体重）の量であってもよい。ある態様では、有効量は2mg/kg（患者の体重）である。別の態様では有効量は10mg/kg（患者の体重）である。ある態様では、可溶性CTLA4分子の有効量は2mg/kg（患者の体重）である。一態様として、可溶性CTLA4の有効量は、10mg/kg（患者の体重）である。
【０１０６】
患者に投与される免疫抑制剤の量は、その患者に対する薬物の効力およびその患者に対する薬物の毒性（すなわち認容性）を含むいくつかの因子に依存して変動する。
【０１０７】
メトトレキセートは一般的には1週間あたり約0.1〜40mgの量で投与され、一般的投与量は1週間あたり約5〜30mgの範囲である。メトトレキセートは、さまざまな増加量で、すなわち約0.1〜5mg/週、約5〜10mg/週、約10〜15mg/週、約15〜20mg/週、約20〜25mg/週、約25〜30mg/週、約30〜35mg/週、または約35〜40mg/週で投与することができる。一態様として、メトトレキセートを含む免疫抑制剤の有効量は約10〜30mg/週の量である。
【０１０８】
メトトレキセートの有効量は約0.1〜40mg/週の範囲である。一態様として、有効量は約0.1〜5mg/週、約5〜10mg/週、約10〜15mg/週、約15〜20mg/週、約20〜25mg/週、約25〜30mg/週、約30〜35mg/週、または約35〜40mg/週の範囲である。一態様として、メトトレキセートを約10〜30mg/週の量で投与される。
【０１０９】
アルキル化剤シクロホスファミドは、1日あたり約1〜10mg/kg体重の範囲の投与量で投与することができる。
【０１１０】
シクロスポリンAとも呼ばれるシクロスポリン（例えばNEORAL（登録商標））は一般的には1日あたり約1〜10mg/kg体重の範囲の投与量で投与される。1日あたり体重あたり約2.5〜4mgの範囲の投与量が一般的に使用される。
【０１１１】
クロロキンまたはヒドロキシクロロキン（例えばPLAQUENIL（登録商標））は、一般的には1日あたり約100〜1000mgの範囲の投与量で投与される。好ましい投与量範囲は、1日あたり約200〜600mgの範囲である。
【０１１２】
スルファサラジン（例えばAZULFIDINE EN-tab（登録商標））は、一般的には1日あたり約50〜5000mgの範囲の量で投与され、一般的な投与量は、成人の場合、1日あたり約2000〜3000mgである。小児の場合、投与量は一般的には約5〜100mg/kg体重で、1日あたり最大2グラムである。
【０１１３】
金塩は、2つの投与タイプ、すなわち注射または経口投与用に製剤化される。注射用金塩は一般的には2週間ごと〜4週間ごとに約5〜100mgの投与量で処方される。経口投与される金塩は、一般的には、1日あたり約1〜10mgの範囲の投与量で処方される。
【０１１４】
D-ペニシラミンまたはペニシラミン（CUPRIMINE（登録商標））は一般的には1日あたり約50〜2000mgの投与量で投与され、好ましい投与量は1日あたり約125mg〜1日あたり約1500mgである。
【０１１５】
アザチオプリンは一般的には1日あたり約10〜250mgの投与量で投与される。好ましい投与量は1日あたり約25〜200mgの範囲である。
【０１１６】
アナキンラ（例えばKINERET（登録商標））はインターロイキン-1レセプターアンタゴニストである。アナキンラの一般的な投与量範囲は1日あたり約10〜250mgであり、推奨される投与量は1日あたり約100mgである。
【０１１７】
インフリキシマブ（REMICADE（登録商標））は、腫瘍壊死因子αに結合するキメラモノクローナル抗体である。インフリキシマブは一般的には4週間〜8週間ごとに約1〜20mg/kg体重の投与量で投与される。患者に応じて、約3〜10mg/kg体重の投与量を4週間〜8週間ごとに投与することができる。
【０１１８】
エタネルセプト（例えばENBREL（登録商標））は、腫瘍壊死因子（TNF）を結合してTNFとTNFレセプターとの相互作用を遮断する二量体型融合タンパク質である。一般的に投与されるエタネルセプトの投与量は、成人の場合、1週間あたり約10〜100mgであり、好ましい投与量は1週間あたり約50mgである。小児の場合、投与量は1週間あたり約0.1〜50mg/kg体重、最大で1週間あたり約50mgである。
【０１１９】
レフルノミド（ARAVA（登録商標））は一般的には1日あたり約1および100mgの投与量で投与される。一般的な日用量は1日あたり約10〜20mgである。
【０１２０】
また好ましくは、本医薬組成物は、本発明の分子（例えばL104EA29YIgなどの可溶性CTLA4突然変異体分子）と混合したときに本発明の分子の活性を損なわず、かつ患者の免疫系と反応しない、適切な担体および佐剤も含む。適切な担体および佐剤の例には、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および硫酸プロタミンなどの塩類または電解質があるが、これらに限定されない。他の例としては標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩溶液、水、エマルション（油/水エマルションなど）、およびさまざまなタイプの湿潤剤が挙げられる。他の担体として、滅菌溶液、コーティング錠などの錠剤、カプセル剤を挙げることもできる。通例、このような担体は、例えばデンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、植物油脂、ゴム、グリコールまたは他の既知の賦形剤を含む。このような担体には香料および着色料または他の成分も含めることができる。このような担体を含む組成物は周知の従来法によって製剤化することができる。そのような組成物は例えばリポソームなどのさまざまな脂質組成物内およびポリマーマイクロスフェアなどのさまざまなポリマー組成物中に製剤化することもできる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、例えば静脈内（i.v.）投与、腹腔内（i.p.）投与、筋肉内（i.m.）投与、皮下投与、経口投与、坐剤としての投与、または局所接触、またはミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の患者への植え込みなど（ただしこれらに限らない）、通常の投与方法を使って投与することができる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマー製マイクロカプセル、リポソームおよび注射液または注入液など、さまざまな剤形をとることができる。好ましい剤形は投与形式および治療用途に依存する。
【０１２３】
本発明組成物の最も有効な投与形式および投与処置は、疾患の重症度および経過、患者の健康状態および処置に対する反応ならびに処置を行う医師の判断に依存する。したがって本組成物の投与量は患者ごとに調整すべきである。
【０１２４】
可溶性CTLA4突然変異体分子は、患者の体内で内在性B7（例えばCD80および/またはCD86）分子がそれぞれのリガンドと結合するのを遮断するのに十分な量および期間（例えば時間および/または回数）患者に投与しうる。内在性B7/リガンド結合の遮断により、B7陽性細胞（例えばCD80および/またはCD86−陽性細胞）とCD28および/またはCTLA4陽性細胞との相互作用が阻害される。治療剤の投与量は、例えば患部組織のタイプ、処置しようとする自己免疫疾患のタイプ、疾患の重症度、患者の健康状態、その薬剤による処置に対する患者の反応など（ただしこれらに限定されない）、多くの因子に依存する。したがって薬剤の投与量は患者および投与形式によって変動しうる。可溶性CTLA4突然変異体分子は0.1〜20.0mg/kg患者体重/日、好ましくは0.5〜10.0mg/kg/日の量で投与することができる。本発明の医薬組成物の投与はさまざまな時間にわたって実施することができる。一態様として、本発明の医薬組成物は1時間以上にわたって投与することができる。また、疾患の重症度および当技術分野で知られる他の因子によっては投与を繰り返すこともできる。
【０１２５】
本発明の方法
本発明は、CTLA4および/またはCD28へのCD80および/またはCD86の結合を阻害するために、CD80および/またはCD86−陽性細胞上のCD80および/またはCD86分子を結合する可溶性CTLA4またはCTLA4突然変異体分子の有効量を患者に投与することを含む、患者の免疫系疾患および自己免疫疾患を処置する方法を提供する。これらの方法では、本発明の可溶性CTLA4またはCTLA4突然変異体分子を含む治療組成物を、免疫系疾患に関係する症状の少なくとも1つを軽減するのに有効な量で、患者に投与する。あるいは、本発明は、T細胞/B7陽性細胞相互作用を遮断し、よってCD28へのB7の結合などといった共刺激シグナルによるT細胞活性化/刺激を遮断し、その結果としてT細胞アネルギーまたは寛容の誘導を引き起こすことによる免疫系疾患の長期治療法を提供しうる。
【０１２６】
本発明の可溶性CTLA4またはCTLA4突然変異体分子は生体内で阻害特性を示す。T細胞/B7陽性細胞相互作用、例えばT細胞/B細胞相互作用が、T細胞とB7陽性細胞との接触の結果として起こっている条件下で、導入したCTLA4分子がB7陽性細胞、例えばB細胞に結合して反応すると、T細胞・B7陽性細胞相互作用が妨害、すなわち阻害され、結果として免疫応答の調節が起こりうる。可溶性CTLA4分子を投与することによるT細胞応答の阻害は、自己免疫障害の処置にも役立ちうる。多くの自己免疫障害は自己抗原に対して反応性を持つT細胞の不適切な活性化によって起こり、それは、その疾患の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己免疫障害を患っているかまたは自己免疫障害を起こしやすい患者にL104EA29YIg分子を投与することにより、自己反応性T細胞の活性化を防止し、疾患症状を軽減または排除することができる。この方法は、本発明のL104EA29YIg分子を単独で、または他のリガンド、例えばIL-2、IL-4またはγ-インターフェロンと反応するものと一緒に、患者に投与することも含みうる。
【０１２７】
本発明は免疫応答を調節する方法を提供する。免疫応答は、本発明の可溶性CTLA4またはCTLA4突然変異体分子によって、下方調節する（減少させる）ことができる。これは、既に進行中の免疫応答を阻害または遮断することによって起こるか、または免疫応答の誘導の防止を伴いうる。本発明の可溶性CTLA4またはCTLA4突然変異体分子は、T細胞応答を抑制することによって、もしくはT細胞に特異的寛容を誘導することによって、またはその両方によって、例えばTリンパ球増殖およびサイトカイン分泌などの活性化T細胞の機能を阻害しうる。さらに、CTLA4/CD28/B7経路を妨害する本発明の可溶性CTLA4またはCTLA4突然変異体分子は、T細胞増殖および/またはサイトカイン分泌を阻害し、結果として、組織破壊の減少およびT細胞不応答または免疫反応不顕性をもたらしうる。
【０１２８】
さらに本発明は、少なくとも1つの可溶性CTLA4またはCTLA4分子、例えばL104EA29YIgの有効量を、移植前、移植中および/または移植後に患者に投与することを含む、患者における臓器または組織移植片の拒絶を抑制する方法も提供する。もう一つの態様として、本発明の方法は、少なくとも1つの可溶性CTLA4またはCTAL4突然変異体分子を、少なくとも1つの他の治療剤、例えば薬物、毒素、酵素、抗体またはコンジュゲートなど（ただしこれらに限定されない）と組み合わせて、患者に投与することを含む。
【０１２９】
上記の臓器または組織移植片は、移植に適する任意の種類の臓器または組織であってもよい。一態様として、移植される組織は膵臓組織であってもよい。好ましい一態様では、移植組織が膵島細胞である。本発明は、島細胞移植片拒絶を抑制することによって患者の1型および/または2型糖尿病を処置する方法も提供する。
【０１３０】
さらに本発明は、移植組織のレシピエントである患者における膵島移植拒絶を抑制する方法も提供する。通例、組織移植の場合、移植片の拒絶はT細胞がそれを異物と認識することによって開始され、次いで移植片を破壊する免疫応答が起こる。本発明の方法で可溶性CTLA4突然変異体分子を投与すると、T細胞リンパ球の増殖および/またはサイトカイン分泌が阻害され、その結果、組織破壊が減少し、抗原特異的T細胞不応答の誘導が起こり、それが全身的免疫抑制を必要とすることなく長期移植受容をもたらしうる。
【０１３１】
本発明の好ましい一態様では、糖尿病などの免疫系疾患を処置しかつ/または免疫応答を下方調節するために、可溶性CTLA4突然変異体分子L104EA29YIgを使って機能的なCTLA4およびCD28陽性細胞とB7陽性細胞との相互作用を調節する。本発明のL104EA29YIgは、少なくとも2つのアミノ酸変化、すなわち＋104位でのロイシン（L）からグルタミン酸（E）への変化および＋29位でのアラニン（A）からチロシン（Y）への変化、を含む可溶性CTLA4突然変異体分子である。L104EA29YIg分子は上記の2つ以外の突然変異をさらに含んでもよい。
【０１３２】
本方法はさらに、可溶性CTLA4突然変異体分子と共に、基本免疫抑制投与計画を患者に適用することを含むことができる。基本免疫抑制投与計画としては、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、シクロホスファミド、リンパ球免疫グロブリン、抗CD3抗体、Rho（D）免疫グロブリン、副腎皮質ステロイド、スルファサルジン（sulfasalzine）、FK-506、メトキサレン、ミコフェノール酸モフェチル（CELLCEPT）、ウマ抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ATGAM）、ヒト化抗TAC（HAT）、バシリキシマブ（SIMULECT）、ウサギ抗ヒト光線細胞グロブリン（THYMOGLOBULIN）、シロリムス、サリドマイド、メトトレキセート、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、スルファサラゾピリン、レフルノミド、金塩、D-ペニシラミン、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ、エタネルセプト、TNFα遮断薬または炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤などを挙げることができる（ただしこれらに限定されない）。好ましい一態様では、基本免疫抑制投与計画がステロイドフリーである。より好ましくは、基本免疫抑制投与計画はラパマイシンおよび抗ヒトIL-2 R mAbを含む。
【０１３３】
本発明の一態様では、糖尿病などの免疫系疾患を処置するために、B7とCTLA4の間の相互作用を遮断するための分子を、免疫応答を調節するための免疫抑制剤と併用する。B7/CTLA4相互作用を遮断するために使用される分子としては、CTLA4Ig、CTLA4Ig/CD28IgまたはL104EA29YIgなどの可溶性CTLA4、CD28Igなどの可溶性CD28、B7Igなどの可溶性B7（B7-1またはB7-2）、抗CTLA4モノクローナル抗体、抗CD28モノクローナル抗体、または抗B7モノクローナル抗体を挙げることができる。
【０１３４】
本発明によって処置される患者には、例えばヒト、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウスおよびラットなどの哺乳類患者が含まれる。
【０１３５】
本発明は、本発明の治療組成物、例えば可溶性CTLA4分子を単独で、または免疫抑制剤および/または他の治療薬と組み合わせて投与するためのさまざまな局所的または全身的方法を提供する。これらの方法には、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、吸入および皮下法ならびに植え込み型ポンプ、持続注入、遺伝子治療、リポソーム、坐剤、局所接触、小胞、カプセルおよび注射法が含まれる。担体と混合された治療剤は一般的には凍結乾燥して貯蔵され、水または中性pH（pH約7〜8、例えばpH7.5）の緩衝溶液で復元される。
【０１３６】
当技術分野の標準的技法どおりに、本発明の組成物は、任意の医薬的許容できる形態で患者に投与しうる。
【０１３７】
本発明の一実施態様として、本方法は、CD28および/またはCTLA4陽性細胞とB7陽性細胞との相互作用を調節するために本発明の可溶性CTLA4分子を患者に投与することを含む。可溶性CTLA4/B7複合体が形成されるように、B7陽性細胞を本発明の可溶性CTLA4分子またはその断片もしくは誘導体の有効量と接触させる。この複合体は内在性CTLA4およびCD28分子とB7ファミリー分子の間の相互作用を妨害する。
【０１３８】
可溶性CTLA4分子は、患者の体内で内在性B7分子がそれぞれのリガンドと結合するのを遮断するのに十分な量および期間（例えば時間および/または回数）患者に投与しうる。内在性B7/リガンド結合の遮断により、B7陽性細胞とCD28および/またはCTLA4陽性細胞との相互作用が阻害される。
【０１３９】
治療剤の投与量は、例えば患部組織のタイプ、処置しようとする自己免疫疾患のタイプ、疾患の重症度、患者の健康状態、その薬剤による処置に対する患者の反応など（ただしこれらに限定されない）、多くの因子に依存する。したがって薬剤の投与量は各患者および投与形式によって変動しうる。可溶性CTLA4突然変異体分子は約0.1〜100mg/kg患者体重/日の量で投与することができる。
【０１４０】
また本発明は、免疫系疾患を処置するための本発明組成物と他の医薬との併用も包含する。例えば糖尿病は、本発明の分子を、免疫抑制剤、例えばコルチコステロイド、シクロスポリン（Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44(2):151-156）、プレドニゾン、アザチオプリン（R.Handschumacher「Drugs Used for Immunosuppression」1264-1276頁）、TNFα遮断薬またはアンタゴニスト（New England Journal of Medicine, vol.340:253-259, 1999、The Lancet vol.354:1932-39, 1999、Annals of Internal Medicine, vol.130:478-486）、または炎症性サイトカインを標的とする他の任意の生物学的薬剤、非ステロイド抗炎症薬/Cox-2阻害剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾピリン（sulphasalazopryine）、金塩、エタネルセプト、インフリキシマブ、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、タクロリスムス、バシリキシマブ、サイトキサン、インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、酢酸グラチラマー、塩酸ミトキサントロン、アナキンラおよび/または他の生物製剤など（ただしこれらに限らない）と併用して、処置することができる。
【０１４１】
免疫応答を調節するために、可溶性CTLA4分子（好ましくはL104EA29YIg）を以下の薬剤の1つまたは複数と併用することもできる：可溶性gp39（CD40リガンド（CD40L）、CD154、T-BAM、TRAPとも呼ばれる）、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80（例えばATCC68627）、可溶性CD86、可溶性CD28（例えば68628）、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、gp39と反応する抗体（例えばATCC HB-10916、ATCC HB-12055およびATCC HB-12056）、CD40と反応する抗体（例えばATCC HB-9110）、B7と反応する抗体（ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341など）、CD28と反応する抗体（例えばATCC HB-11944またはMartinら（J. Clin. Immun.4(1):18-22, 1980）に記載のmAb 9.3）、LFA-1と反応する抗体（例えばATCC HB-9579およびATCC TIB-213）、LFA-2と反応する抗体、IFN-γと反応する抗体、CD2と反応する抗体、CD48と反応する抗体、任意のICAM（例えばICAM-1（ATCC CRL-2252)、ICAM-2およびICAM-3）と反応する抗体、CTLA4と反応する抗体（例えばATCC HB-304）、Thy-1と反応する抗体、CD56と反応する抗体、CD3と反応する抗体、CD29と反応する抗体、TCRと反応する抗体、VLA-4と反応する抗体、VCAM-1と反応する抗体、LECAM-1と反応する抗体、ELAM-1と反応する抗体、CD44と反応する抗体。一部の態様では、モノクローナル抗体が好ましい。別の態様では、抗体断片が好ましい。この組み合わせに、本発明の可溶性CTLA4分子と1つの他の免疫抑制剤、可溶性CTLA4分子と2つの他の免疫抑制剤、可溶性CTLA4分子と3つの他の免疫抑制剤などが包含されることは、当業者にはすぐに理解されるだろう。最適な組み合わせおよび投与量の決定は、当技術分野で周知の方法を使って決定し、最適化することができる。
【０１４２】
以下に、具体的な組み合わせの例をいくつか挙げる：L104EA29YIgとCD80モノクローナル抗体（mAb）；L104EA29YIgとCD86 mAb；L104EA29YIg、CD80 mAb、およびCD86 mAb；L104EA29YIgとgp39 mAbs；L104EA29YIgとCD40 mAb；L104EA29YIgとCD28 mAb；L104EA29YIg、CD80およびCD86 mAb、ならびにgp39 mAb；L104EA29YIg、CD80およびCD86 mAb、ならびにCD40 mAb；L104EA29YIg、抗LFAl mAb、および抗gp39 mAb。gp39 mAbの一具体例はMR1である。他の組み合わせは当業者にはすぐに認識され、理解されるだろう。
【０１４３】
本発明の可溶性CTLA4分子、例えばL104EA29YIgは、例えば同種もしくは異種移植片の急性もしくは慢性拒絶または炎症性障害もしくは自己免疫障害を処置または予防するために、または寛容を誘導するために、唯一の活性物質として、または免疫調節投与計画に使用される他の薬物または他の抗炎症剤と共に、投与することができる。例えば、本発明の可溶性CTLA4分子は、以下の薬物と併用することができる：カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンAまたはFK506；免疫抑制性マクロライド、例えばラパマイシンまたはその誘導体（例えば40-O-(2-ヒドロキシ)エチルラパマイシン）；リンパ球ホーミング剤、例えばFTY720またはその類似体；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン（azathioprene）、メトトレキセート、レフルノミドまたはその類似体；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；15-デオキシスパガリンまたはその類似体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば、MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150（SLAM）、OX40、4-1BBなどの白血球レセプターまたはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；または他の免疫調節化合物、例えばCTLA4/CD28-Ig、または他の接着分子阻害剤、例えばモノクローナル抗体またはLFA-1アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびVLA-4アンタゴニストなどの低分子量阻害剤。本化合物は、CD40およびそのリガンドを妨害する化合物、例えばCD40に対する抗体およびCD40-Lに対する抗体と併用すると、とりわけ有用である。
【０１４４】
本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えば上述したような他の免疫抑制/免疫調節または抗炎症療法と一緒に投与する場合、同時投与される免疫抑制剤、免疫調節剤または抗炎症性化合物の投与量は、もちろん、使用する併用薬の種類（例えばそれがステロイドであるかシクロスポリンであるか）、使用する薬物、処置しようとする状態などに依存して変動する。
【０１４５】
上記の説明に従って、本発明は、さらなる一側面として、治療有効量の、遊離型または医薬的に許容され得る塩型の本発明可溶性CTLA4分子、例えばCTLA4Igおよび/またはL104EA29YIg、ならびに例えば上述したような免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬薬物である第2医薬物質を、同時にまたは逐次的に、同時投与することを含む、上述の方法を提供する。
【０１４６】
さらに本発明は、免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬、例えばNSAID、糖質コルチコイドまたはコルチコステロイドなどを含む少なくも1つの医薬組成物と同時にまたは逐次的に使用される遊離型または医薬的に許容され得る塩型の可溶性CTLA4分子を含む治療的組合わせ、例えばキット、も提供する。このキットは、その投与に関する説明書を含みうる。本発明のキットは、本発明のどの方法にでも使用することができる。
【０１４７】
もう一つの態様では、可溶性CTLA4を患者に投与し、T細胞枯渇骨髄細胞をその患者に投与することにより、組織または臓器移植片の拒絶を抑制する。T細胞枯渇骨髄の投与は、患者が組織または臓器移植片を受け入れるのとほぼ同時にまたはそれとは異なる時に行うことができる。骨髄の投与をほぼ同時に行うとは、組織または臓器移植片を投与する手技の準備の一部として、骨髄が患者に投与されることを示す。骨髄が臓器移植と全く同時に（すなわち数分以内に）移植される必要はない。
【０１４８】
好ましい態様では、T細胞枯渇骨髄の投与を臓器移植前に行う。一部の態様は、固形臓器移植の1日以内、12時間以内、または6時間以内にT細胞枯渇骨髄を投与することを含む。しかし、結果として得られるT細胞枯渇骨髄の効果が臓器または組織移植との関連で達成される限り、T細胞枯渇骨髄はもっと早く投与することもできる。別の態様として、臓器移植後にT細胞枯渇骨髄を投与することが望ましい場合もある。
【０１４９】
一態様として、本方法は、ある用量のT細胞枯渇骨髄細胞（寛容化量）を患者に投与した後、さらにその被験者に、ある量のT細胞枯渇骨髄細胞（移植量）を追加投与することを含む。ある態様では、免疫抑制剤が、CD80および/またはCD86抗原に対するD28抗原の結合を妨害する少なくとも1タイプまたは複数タイプのリガンドを含む。上述のように、リガンドは、好ましくは、L104EA29YIgなどの突然変異型CTLA4分子である。
【０１５０】
さらに、T細胞枯渇骨髄の量は、日常的実験によって決定し、実験的に最適化することができる。例えば、T細胞枯渇骨髄の量は、所望の効果を達成するのに十分な量を決定するために、日常的な実験で滴定することができる。
【０１５１】
本発明の方法は、可溶性CTLA4突然変異体分子に加えて、T細胞枯渇骨髄を単独で、または1つまたは複数の免疫抑制剤と組み合わせて、2回以上、患者に投与することによって実施することもできる。
【０１５２】
この明細書で述べるように、本発明の方法では、可溶性CTLA4または突然変異型CTLA4分子の投与は、局所投与経路または全身投与経路を含む多くの異なる方法で行うことができる。例えば可溶性CTLA4突然変異体分子は、静脈内、筋肉内、または腹腔内に投与することができる。あるいは、突然変異型CTLA4は、経口投与または皮下投与することもできる。当業者には他の投与も知られている。同様に、T細胞枯渇骨髄は当業者に知られている多くの異なる方法で投与することができる。その一例は静脈内注入による方法である。
【０１５３】
免疫抑制剤は可溶性CTLA4突然変異体の投与前もしくは投与後および/または臓器/組織移植の前もしくは後に投与することができる。骨髄および免疫抑制剤は、好ましくは、可溶性CTLA4突然変異体分子の投与前に投与される。一態様として、初回量のT細胞枯渇骨髄（寛容化量）および免疫抑制剤を、臓器移植とほぼ同時に投与する。
【０１５４】
本発明を具体的に説明するために以下の実施例を記載する。方法論および結果は、処置の目標および使用する手法に依存して変動しうる。以下の実施例は決して本発明の範囲を不当に限定しようとするものではない。
【０１５５】
実施例
実施例１
この実施例では本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子をコードするヌクレオチド配列を作製するために使用した方法を説明する。一部位突然変異体L104EIgを作製し、CD80および/またはCD86にへの結合速度について試験した。テンプレートとしてL104EIgヌクレオチド配列を使用して、二部位突然変異型CTLA4配列L104EA29YIgを作製し、CD80および/またはCD86への結合速度について試験した。
【０１５６】
CTLA4Ig コドンベース突然変異誘発
結合しているCD86分子からの解離速度（「オフ」速度）が遅くなっている突然変異型CTLA4Ig分子を同定するために、突然変異誘発法およびスクリーニング法を開発した。テンプレートとしてCTLA4Ig（米国特許第5,844,095号、第5,851,795号および第5,885,796号、ATCC受託番号68629）を使用して、一部位突然変異体ヌクレオチド配列を作製した。コドンの1位および2位は任意の塩基であってよいが3位はグアニンまたはチミンのみ（XXG/T；NNG/Tともいう）とすることにより、特定cDNAコドンのランダム突然変異誘発用の変異原性オリゴヌクレオチドPCRプライマーを設計した。この方法で、あるアミノ酸をコードする特定のコドンを、20アミノ酸のそれぞれをコードするように、ランダムに突然変異させることができた。この場合、XXG/T突然変異誘発法では、20アミノ酸のそれぞれをコードする32種類のコドンが得られる。CTLA4Igの−M97〜G107（図1または2参照）付近に突然変異をコードしているPCR産物を、SacI/XbaIで消化し、同様に切断したCTLA4Ig πLN発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、一部位CTLA4突然変異体分子L104EIgを作製した。
【０１５７】
CTLA4IgのS25-R33付近の突然変異誘発については、PCRプライマー指定突然変異誘発法によって、まず、このループの5'側にサイレントなNheI制限部位を導入した。PCR産物をNheI/XbaIで消化し、同様に切断したCTLA4IgまたはL104EIg発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、二部位CTLA4突然変異体分子L104EA29YIg（図3）を作製した。具体的には、テンプレートとして一部位CTLA4突然変異体分子L104EIgをコードする核酸分子を使用して、二部位CTLA4突然変異体分子L104EA29YIgを作製した。
【０１５８】
実施例２
実施例1に記載のコンストラクトから発現させた一部位および二部位突然変異型CTLA4ポリペプチドであって、CD80およびCD86抗原に対して非突然変異型CTLA4Ig分子より高い結合アビディティーを示すものを同定するために使用したスクリーニング方法を、以下に説明する。
【０１５９】
最新のインビトロおよびインビボ研究により、CTLA4Ig単独では抗原特異的活性化T細胞のプライミングを完全には遮断できないことが示されている。CTLA4Igと、CD80またはCD86に特異的なモノクローナル抗体とを使ってT細胞増殖の阻害を測定するインビトロ研究により、抗CD80モノクローナル抗体はCTLA4Ig阻害を増強しないことがわかった。しかし、抗CD86モノクローナル抗体は阻害を増強したことから、CTLA4IgはCD86相互作用の遮断にはあまり有効でないことがわかる。これらのデータは、CD80が媒介する細胞応答を阻害するのに必要なCTLA4Ig濃度はCD86が媒介する細胞応答の場合の約1/100であることを示したLinsleyら（Immunity（1994）1:793-801）による初期の知見を裏付けている。これらの知見に基づいて、CD86に対して野生型CTLA4より高いアビディティーを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子は、抗原特異的活性化細胞のプライミングをCTLA4Igよりも良く遮断することができるはずであると推測した。
【０１６０】
そこで、新しいスクリーニング法を使って、上記実施例1に記載の可溶性CTLA4突然変異体分子をスクリーニングして、CD80およびCD86に対する結合アビディティーを向上させるCTLA4の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。「オフ」速度の決定は濃度に依存しないので、このスクリーニング方法は、「オフ」速度が遅くなっていると思われる突然変異体を、タンパク質の精製または定量を行わずに直接同定するための効果的な方法になる（O'Shannessyら（1993）Anal. Biochem., 212:457-468）。
【０１６１】
COS細胞に個々のミニプレップ精製プラスミドDNAをトランスフェクトし、数日間増殖させた。3日調整培養培地を可溶性CD80IgまたはCD86Igで被覆したBIAcoreバイオセンサーチップ（Pharmacia Biotech AB、スウェーデン・ウプサラ）にかけた。突然変異体タンパク質の特異的結合および解離を、表面プラズモン共鳴によって測定した（O'Shannessy,D.J.ら（1993）Anal. Biochem. 212:457-468）。実験は全てBIAcore（商標）またはBIAcore（商標）2000バイオセンサーを使って25℃で行った。リガンドは、標準的なN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドN-ヒドロキシスクシンイミドカップリング法を使って、研究用NCM5センサーチップ（Pharmacia）上に固定化した（Johnsson,B.ら（1991）Anal. Biochem. 198:268-277、Khilko, S.N.ら（1993）J. Biol. Chem 268:5425-15434）。
【０１６２】
スクリーニング法
24穴組織培養プレートで生育したCOS細胞に、突然変異型CTLA4IgをコードするDNAを一過性にトランスフェクトした。分泌された可溶性突然変異型CTLA4Igを含む培養培地を3日後に収集した。
【０１６３】
（Greeneら, 1996, J. Biol. Chem. 271:26762-26771に記載されているように）CD86IgまたはCD80Igで誘導体化したBIAcoreバイオセンサーチップ上に、調整COS細胞培養培地を流し、野生型CTLA4Igに見られる「オフ」速度より遅い「オフ」速度を持つ突然変異体分子を同定した。選択した培地試料に対応するcDNAを配列決定した。また、DNAを調製してCOS細胞一過性トランスフェクションを大規模に行い、そこから培養培地のプロテインA精製によって、突然変異型CTLA4Igタンパク質を調製した。
【０１６４】
BIAcore解析条件および平衡結合データ解析は、J.Greeneら, 1996, J. Biol. Chem. 271:26762-26771されているように、またこの明細書に記載するように行った。
【０１６５】
BIAcore データ解析
分析に先立ってセンサーグラムのベースラインをゼロ応答単位（RU）に標準化した。試料をモック誘導体化フローセルに流して、溶液間のバルク屈折率差によるバックグラウンド応答単位（RU）値を決定した。平衡解離定数（K_d）はR_eq対Cのプロットから計算した。ここに、R_eqは（定常状態応答）−（モック誘導体化チップでの応答）であり、Cは分析物のモル濃度である。結合曲線は市販の非線形カーブフィッティングソフトウェア（Prism、GraphPAD Software）を使って解析した。
【０１６６】
実験データは、まず単一レセプターへの単一リガンド結合のモデル（1部位モデル、すなわち単純なラングミュアー系、A＋B⇔AB）にあてはめて、平衡結合定数（K_d＝[A][B]/[AB]）を式：R＝R_max・C/(K_d＋C)から計算した。次に、データを、リガンド結合の最も簡単な二部位モデル（すなわち、式：R＝R_max1・C/(K_d1＋C)＋R_max2・C/(K_d2＋C)で表される2つの相互作用しない独立した結合部位を持つレセプター）にあてはめた。
【０１６７】
これら2つのモデルの適合度を、実験データとの比較によって目視によって、また平方和のF検定によって統計的に解析した。二部位モデルの方が適合度が有意に高くない限り（p＜0.1）、より単純な一部位モデルをベストフィットとして選択した。
【０１６８】
結合および解離解析はBIA evaluation 2.1ソフトウェア（Pharmacia）を使って行った。結合速度定数k_onは均一な一部位相互作用および並行二部位相互作用の両方を仮定して二通りの方法で計算した。一部位相互作用の場合は、R_t＝R_eq(1-exp^-ks(t-t ₀ ⁾）［式中、R_tは与えられた時刻tにおける応答、R_eqは定常状態応答、t₀は注入を開始した時刻、そしてk_s＝dR/dt＝k_on・Ck_offであって、Cはモノマー結合部位に関して計算した分析物の濃度である］に従ってk_on値を計算した。二部位相互作用の場合は、式：R_t＝R_eq1(1-exp^-ks1(t-t ₀ ⁾）＋R_eq2(1-exp^ks2(t-t ₀ ⁾）に従ってk_on値を計算した。各モデルについて、k_s対Cのプロットの傾き（最大結合の約70％まで）の計算値からk_onの値を決定した。
【０１６９】
解離データは一部位モデル（AB＝A＋B）または二部位モデル（AiBj＝Ai＋Bj）に従って解析し、速度定数（k_off）をベストフィット曲線から計算した。残差が機械のバックグランド（機械によって2〜10RU）より大きい場合（その場合は二結合部位モデルを使用）を除いて、上記結合部位モデルを使用した。レセプター占有の半減期はt_1/2＝0.693/k_offの関係を使って計算した。
【０１７０】
フローサイトメトリー
マウスモノクローナル抗体L307.4（抗CD80）はBecton Dickinson（カリフォルニア州サンホゼ）から購入し、IT2.2（抗B7-0［CD86とも呼ばれる］）はPharmingen（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。免疫染色のために、10mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）中でインキュベートすることによって、CD80陽性および/またはCD86陽性CHO細胞を培養器から取り出した。CHO細胞（1〜10×10⁵個）をまずモノクローナル抗体または免疫グロブリン融合タンパク質と共に10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むDMEM中でインキュベートした後、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン第2段階試薬と共にインキュベートした（Tago、カリフォルニア州バーリンゲーム）。細胞に最終洗浄を施し、FACScan（Becton Dickinson）で解析した。
【０１７１】
SDS-PAGE およびサイズ排除クロマトグラフィー
SDS-PAGEはトリス/グリシン4〜20％アクリルアミドゲル（Novex、カリフォルニア州サンディエゴ）で行った。分析用ゲルはクーマシーブルーで染色し、デジタルスキャニングによって湿ゲルの像を取り込んだ。0.02％NaN₃を含むリン酸緩衝食塩水で平衡化したTSK-GEL G300 SW_XLカラム（7.8×300mm、Tosohaas、ペンシルバニア州モントゴメリービル）を使用し、1.0ml/分の流量で、CTLA4Ig（25μg）およびL104EA29YIg（25μg）をサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０１７２】
CTLA4X _C120S および L104EA29YX _C120S
一本鎖CTLA4X_C120Sは先に記述されているように製造した（Linsleyら（1995）J. Biol. Chem., 270:15417-15424）。簡単に述べると、オンコスタチンM CTLA4（OMCTLA4）発現プラスミドをテンプレートとして使用し、ベクター中の配列に適合するようにフォワードプライマー：GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG（配列番号17）を選択した。またリバースプライマー：GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC（配列番号18）は、CTLA4の細胞外ドメインの最後の7アミノ酸（すなわちアミノ酸118〜124）に相当し、制限酵素部位および停止コドン（TGA）を含んだ。C120S（120位におけるシステインからセリンへの）突然変異はリバースプライマーによって指定した。具体的に述べると、上記リバースプライマーのヌクレオチド配列GCA（ヌクレオチド34〜36）を以下のヌクレオチドの一つで置き換える：AGA、GGA、TGA、CGA、ACTまたはGCT。当業者には理解されるとおり、ヌクレオチド配列GCAはシステインのコドンTGCの逆相補配列である。同様に、ヌクレオチド配列AGA、GGA、TGA、CGA、ACTまたはGCTはセリンのコドンの逆相補配列である。ポリメラーゼ連鎖反応産物をHindIII/XbaIで消化し、発現ベクターπLN（Bristol-Myers Squibb Company、ニュージャージー州プリンストン）中に、向きを決めてサブクローニングした。L104EA29YX_C120Sを同じ方法で製造した。各コンストラクトをDNA配列決定によって確認した。
【０１７３】
高アビディティー突然変異体の同定および生化学的特徴づけ
24個のアミノ酸を突然変異誘発のために選択し、得られた約2300の突然変異型タンパク質を、表面プラズモン共鳴法（SPR；上記の方法）により、CD86Ig結合に関してアッセイした。各部位での突然変異誘発の主な効果を表2に要約する。S25〜R33中の一部のアミノ酸にはランダム突然変異を施してもリガンド結合は変化しないようだった。E31およびR33ならびに残基M97〜Y102の突然変異誘発はリガンド結合の低下をもたらすようだった。残基S25、A29、およびT30、K93、L96、Y103、L104、およびG105の突然変異誘発は、「オン」速度が低下および/または「オフ」速度が低下したタンパク質をもたらした。これらの結果は、S25〜R33領域中の残基およびM97〜Y102中またはその近傍にある残基がリガンド結合に影響するという先の知見を裏付けている（Peachら（1994）J. Exp. Med., 180:2049-2058）。
【０１７４】
部位S25、T30、K93、L96、Y103およびG105の突然変異誘発によって、「オフ」速度がCD86Igより遅い突然変異体がいくつか同定された。しかしこれらの例では、遅い「オフ」速度が遅い「オン」速度によって損なわれるため、CD86Igに対して、野生型CTLA4Igで見られるアビディティーと見かけ上同じ程度の総アビディティーを持つ突然変異体が得られた。また、K93の突然変異誘発はかなりの凝集をもたらしたが、これも観察された速度変化の原因になっていたのだろう。
【０１７５】
L104にランダム突然変異誘発を行った後、COS細胞のトランスフェクションを行い、固定化CD86Ig上で、培養培地試料のSPRによってスクリーニングを行ったところ、「オフ」速度が野生型CTLA4Igのおよそ1/2しかない突然変異体タンパク質を含む培地試料が6つ得られた。これらの突然変異体に対応するcDNAを配列決定したところ、それぞれに、ロイシンからグルタミン酸への突然変異（L104E）をコードすることがわかった。ロイシン104からアスパラギンへの置換（L104D）は、CD86Ig結合に影響を及ぼさないようだった。
【０１７６】
次に、上述したように、今度は野生型CTLA4IgではなくL104EをPCRテンプレートにして、表2に挙げる各部位で突然変異誘発を繰り返した。ここでも固定化CD86Igを使ってSPR解析を行ったところ、アラニン29の突然変異誘発により、「オフ」速度が野生型CTLA4Igのおよそ1/4しかないタンパク質を含む培養培地試料が6つ同定された。最も遅い2つはチロシン置換（L104EA29Y）、2つはロイシン（L104EA29L）、1つはトリプトファン（L104EA29W）、そして1つはスレオニン（L104EA29T）だった。野生型CTLA4Igのアラニン29を単独でランダムに突然変異させても遅い「オフ」速度を持つ突然変異体は同定されないようだった。
【０１７７】
精製したL104EおよびL104EA29YIgの相対分子量および凝集状態をSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。L104EA29YIg（約1μg；レーン3）およびL104EIg（約1μg；レーン2）は、還元条件（約50kDa；＋βME；＋2-メルカプトエタノール）でも非還元条件（約100kDa；−βME）でも、CTLA4Ig（約1μg；レーン1）と見かけ上同じ電気泳動移動度を持っていた（図14A）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、L104EA29YIg（図14C）はCTLA4Ig二量体（図14B）と見かけ上同じ移動度を持つことが証明された。主要ピークはタンパク質二量体に相当し、図14Bで速く溶出するマイナーピークは高分子量凝集体に相当する。CTLA4Igの約5.0％は高分子量凝集体として存在したが、L104EA29YIgまたはL104EIgの凝集を示す証拠は認められなかった。したがって、L104EIgおよびL104EA29YIgに見られたCD86Igへの結合の強化は、突然変異誘発が引き起こした凝集に起因するものではないと考えられた。
【０１７８】
平衡および速度論的結合解析
プロテインAで精製したCTLA4Ig、L104EIg、およびL104EA29YIgに対し、表面プラズモン共鳴法（SPR）を使って、平衡および速度論的結合解析を行った。結果を表1に示す。平衡解離定数観測値（K_d；表1）は、ある濃度範囲（5.0〜200nM）にわたって作成した結合曲線から計算した。L104EA29YIgはL104EIgまたはCTLA4Igよりも強くCD86Igに結合する。L104EA29YIgのK_d（3.21nM）がL104EIg（6.06nM）またはCTLA4Ig（13.9nM）より低いことは、L104EA29YIgの方がCD86Igに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。L104EA29YIgのK_d（3.66nM）がL104EIg（4.47nM）またはCTLA4Ig（6.51nM）よりも低いことは、L104EA29YIgの方がCD80Igに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。
【０１７９】
速度論的結合解析により、CD80に対するCTLA4Ig、L104EIgおよびL104EA29YIg結合の「オン」速度は同じぐらいであり、CD86Igに関する「オン」速度もまたそうであることがわかった（表1）。しかし、これらの分子の「オフ」速度は等しくなかった（表1）。CTLA4Igと比較した場合、L104EA29YIgのCD80Igからの「オフ」速度は約1/2、CD86Igからの「オフ」速度は約1/4だった。L104Eの「オフ」速度はL104EA29YIgとCTLA4Igの中間だった。これらの突然変異の導入は「オン」速度には有意な影響を与えなかったので、L104EA29YIgで観察されたCD80IgおよびCD86Igに対するアビディティーの増加は、主として「オフ」速度の低下によると思われた。
【０１８０】
CD86IgおよびCD80Igに対するL104EA29YIgのアビディティーの増加が、各単量体の二量体としての会合の仕方に突然変異が影響を与えたためかどうか、あるいはアビディティーを増大させる構造変化が各単量体に導入されたかどうかを決定するために、CTLA4およびL104EA29Y細胞外ドメインの一本鎖コンストラクトを、上述のように、そしてLinsleyら（1995）J. Biol. Chem., 270:15417-15424に記載されているように、システイン120をセリンに突然変異させることによって作製した。精製タンパク質CTLA4X_C120SおよびL104EA29YX_C120Sが単量体であることをゲル透過クロマトグラフィーによって明らかにした後（Linsleyら（1995）前掲）、それらのリガンド結合特性をSPRによって解析した。その結果、CD86Igに対する両単量体タンパク質の結合アフィニティーは、それぞれの二量体で観察される結合アフィニティーのおよそ35〜80分の1であることがわかった（表1）。これは、高アビディティーリガンド結合にはCTLA4の二量化が必要であることを示す先に公表されたデータを裏付けている（Greeneら（1996）J. Biol. Chem., 271:26762-26771）。
【０１８１】
L104EA29YX_C120Sは、CD80Igにも、CD86Igにも、CTLA4X_C120Sと比べて約2倍高いアフィニティーで結合した。このアフィニティーの増大は、どちらのリガンドからも解離速度が約1/3に低下したためだった。したがって、L104EA29Yによるリガンド結合の強化は、分子の二量体化に変化があったからではなく、おそらくアビディティーを増大させる構造変化が各モノマー鎖に導入されたためだろう。
【０１８２】
アビディティを増大させる突然変異の位置および構造解析
最近、CTLA4の細胞外IgV様ドメインの溶液構造がNMR分光法によって決定された（Metzlerら（1997）Nature Struct. Biol., 4:527-531）。これにより、三次元フォールドでのロイシン104およびアラニン29の正確な位置特定が可能になった（図15A〜B）。ロイシン104は高度に保存されたMYPPPYアミノ酸配列の近くに位置する。アラニン29は、MYPPPY領域に空間的に隣接するS25〜R33領域のC末端近くに位置する。これら2つの領域の基礎をなす残基間には有意な相互作用があるが、L104とA29の間には、どちらもタンパク質の隣接する疎水コアの一部を構成しているものの、直接的な相互作用はないようである。アビディティーを増大させる2つの突然変異が構造にもたらす結果をモデリングによって評価した。A29Y突然変異はS25〜R33領域とMYPPPY領域の間の溝に容易に収容されることが可能であり、MYPPPY領域のコンフォメーションを安定化する役割を果たしうる。野生型CTLA4では、L104はMYPPPY領域に近いL96およびV94と強い疎水相互作用を形成する。グルタミン酸突然変異がL104に似たコンフォメーションをとることは2つの理由から、まずあり得ない。第1に、S25〜R33領域に有意な摂動を加えずに構造的に長いグルタミン酸側鎖を収容できるほど十分な空間はない。第2に、グルタミン酸側鎖の負電荷を疎水領域中に埋め込むと、エネルギー損失が大きいだろう。モデリング研究によれば、むしろ、グルタミン酸側鎖は表面に飛びだし、表面ではその電荷が溶媒和によって安定化されうると予測される。このようなコンフォメーション変化はG105によって容易に吸収することができ、当該領域中の他の残基にはわずかな歪みしか生じない。
【０１８３】
CD80 または CD86 を発現させる CHO 細胞への高アビディティー突然変異体の結合
安定にトランスフェクトされたCD80+およびCD86+CHO細胞へのCTLA4Igおよび突然変異体分子結合のFACS解析（図9）を、この明細書に記載するように行った。CD80陽性およびCD86陽性CHO細胞を様々な濃度のCTLA4Ig、L104EA29YIgまたはL104EIgと共にインキュベートした後、洗浄した。結合した免疫グロブリン融合タンパク質をフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使って検出した。
【０１８４】
図9に示すように、CD80陽性またはCD86陽性CHO細胞（1.5×10⁵個）を、表示した濃度のCTLA4Ig（■）、L104EA29YIg（○）またはL104EIg（△）と共に23℃で2時間インキュベートし、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。合計5,000個の生細胞での結合をFACScanで解析し（単回測定）し、PC-LYSYSを使ってデータヒストグラムから平均蛍光強度（MFI）を決定した。データを、第2段階試薬のみと共にインキュベートした細胞で測定されたバックグラウンド蛍光（MFI＝7）に対して補正した。対照L6モノクローナル抗体（80μg/ml）は30未満のMFIを示した。これらの結果は4回の独立した実験の代表例である。
【０１８５】
ヒトCD80トランスフェクトCHO細胞へのL104EA29YIg、L104EIgおよびCTLA4Igの結合はほぼ同等である（図9A）。L104EA29YIgおよびL104EIgは、ヒトCD86を安定にトランスフェクトしたCHO細胞に、CTLA4Igよりも強く結合する（図9B）。
【０１８６】
機能アッセイ
ヒトCD4陽性T細胞を免疫磁気ネガティブ選択法によって単離した（Linsleyら（1992）J. Exp. Med. 176:1595-1604）。単離したCD4陽性T細胞を、滴定濃度の阻害剤の存在下にホルボールミリステートアセテート（PMA）＋CD80陽性またはCD86陽性CHO細胞で刺激した。CD4陽性T細胞（8〜10×10⁴個/ウェル）を1nM PMAの存在下で、照射CHO細胞刺激因子と共にまたは同刺激因子なしで培養した。72時間培養の最後の7時間に1μCi/ウェルの[3H]チミジンを添加することにより、増殖応答を測定した。PMA＋CD80陽性CHOまたはCD86陽性CHO刺激T細胞のL104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を行った。結果を図10に示す。L104EA29YIgはCD80陽性PMA処理CHO細胞の増殖をCTLA4Igより強く阻害した（図10A）。L104EA29YIgはCD86陽性PMA処理CHO細胞の増殖の阻害にもCTLA4Igより有効だった（図10B）。したがってL104EA29YIgは、CD80を介したT細胞の共刺激およびCD86を介したT細胞の共刺激のどちらについても、より強力な阻害剤である。
【０１８７】
図11は、上で調製したアロ刺激ヒトT細胞を、CD80およびCD86を発現させるPMと呼ばれるヒトBリンパ芽球腫細胞株（LCL）でさらにアロ刺激した細胞の、L104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を示している（3.0×10⁴個/ウェルのT細胞および8.0×10³個/ウェルのPM）。一次アロ刺激を6日間行った後、細胞に³H-チミジンを7時間パルスし、次いで放射ラベルの取込みを決定した。
【０１８８】
二次アロ刺激は以下のように行った。7日間一次アロ刺激したT細胞をリンパ球分離媒体（LSM）（ICN、オハイオ州オーロラ）上に収集し、24時間休止させた。次に、上と同じ比率のPMを加えることにより、滴定量のCTLA4IgまたはL104EA29YIgの存在下で、T細胞を再び（二次）刺激した。刺激を3日間行った後、細胞に放射標識をパルスし、上記のように収集した。一次アロ刺激T細胞に対するL104EA29YIgの効果を図11Aに示す。二次アロ刺激T細胞に対するL104EA29YIgの効果を図11Bに示す。L104EA29YIgは一次、二次共にT細胞増殖応答をCTLA4Igよりも強く阻害する。
【０１８９】
サイトカイン産生（図12）を測定するために、一対の二次アロ刺激プレートを用意した。3日後にELISAキット（Biosource、カリフォルニア州カマリロ）を使用し、製造者の推奨する条件を使って、培養培地をアッセイした。L104EA29YIgは、二次アロ刺激後のT細胞のIL-2、IL-4およびγ-IFNサイトカイン産生の遮断に関して、CTLA4Igよりも強力であることがわかった（図12A〜C）。
【０１９０】
サル混合リンパ球反応（MLR）に対するL104EA29YIgおよびCTLA4Igの効果を図13に示す。2匹のサルの末梢血単核細胞（PBMC；各サルから3.5×10⁴細胞/ウェル）をリンパ球分離媒体（LSM）で精製し、2μg/mlのフィトヘマグルチニン（PHA）と混合した。細胞を3日間刺激した後、放射標識を16時間パルスしてから収集した。L104EA29YIgはサルT細胞増殖をCTLA4Igよりも強く阻害した。
【０１９１】
平衡定数および見かけの速度定数を以下の表に示す（値は3回の異なる実験から得た平均±標準偏差である）
【表１】

【０１９２】
以下に挙げる部位でのCTLA4Igの突然変異誘発がCD86Ig結合に及ぼす効果を上述のようにSPRによって決定した。主な効果を「＋」記号で示す。
【表２】

【０１９３】
実施例３
この実施例ではドナー膵切除および島単離ならびに動物モデルでの島移植術を説明する。
【０１９４】
材料および方法
動物
飼育下で繁殖された未成熟雄アカゲザル（Macaca mulatta）（約4〜20kg）をレシピエントおよびドナーとして使用した。予め形成されているドナー特異抗体がレシピエントに存在しないことを移植前に確認した。すべてのドナーおよびレシピエント候補を抗CMV抗体について検査し、CMVに関して血清陽性の動物だけをレシピエントとして使用した。
【０１９５】
ドナー膵切除および島単離
ドナー膵切除は移植の1日前に行った。この手技は全身麻酔下（非経口ケタミンと吸入によるイソフルランの併用）で腹部正中切開によって行った。脾臓が膵尾と共に分離されるように、脾腎および脾結腸ひだを分割した。コッヘル操作に続いて、膵頭および十二指腸の第二部を分離した。ヘパリン（200U/kg）を投与した後、大動脈分岐部のすぐ上にカニューレを挿入し、放血した。直ちに網嚢中、膵体の後ろに、アイススラッシュを置いた。膵被膜を傷つけないように注意して、水嚢膵臓の体部および頸部を切開（sharp dissection）によって注意深く切除した。総胆管、主膵管および副膵管を同定して結紮し、膵頭を十二指腸の第二部から切り離した。
【０１９６】
アカゲザル島単離は、自動ヒト島単離法に軽微な変更を加え（Ricordi, (1988) Diabetes, 37:413、Ranuncoli, (2000) Cell Transplant 9:409）、濃度0.47〜0.71mg/mlのLiberase（Roche/Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス）を使って行った。膵消化物からの島の精製には、三層不連続Euroficoll勾配（密度1.108、1.097、1.037；Meditech、バージニア州ハーンドン）およびCobe 2991血球処理装置（Gambro、コロラド州レイクウッド）を使用した。最終島調製物の試料をジチゾン（Sigma、ミズーリ州セントルイス）で染色し、次のサイズ範囲のそれぞれに含まれる島の数を数えることによって調製物を評価した：50〜100、100〜150、150〜200、200〜250、250〜300、300〜350、および350〜400μm。平均直径150μmの島の数を決定するためにデータを数学的に変換し、島当量（islet equivalent：IEQ）として表現した（Ricordi C.ら, Acta Diabetol Lat 27:185-195, 1990）。
【０１９７】
レシピエント膵切除および肝内島細胞移植
移植の少なくとも1週間前に十二指腸切除または脾切除を伴わない全膵切除を行った。脾動脈および脾静脈に沿って膵尾および膵体を解剖し、膵枝だけを結紮し分割することによって、注意深く保存した。下腸間膜静脈および中結腸静脈を同定し、膵体の解剖時に保存しておいた。門脈および上腸間膜静脈を確認し、膵静脈を結紮し、分割した。
【０１９８】
十二指腸を分離し、膵臓に入っている膵十二指腸血管の分枝を結紮し、分割し、十二指腸枝を無傷のままにしておいた。総胆管を同定し、膵頭と十二指腸Cループの間の鈍的剥離時に保存しておいた。主膵管および副膵管を結紮し、分割し、膵臓を腹腔から取り出した。膵切除術の有効性を評価するために、すべての動物を経静脈的グルコース負荷試験にかけた。島移植前はすべてCペプチド陰性であることが証明されていた。
【０１９９】
終夜培養した島を、2.5％ヒト血清アルブミンを添加したRPMI培地1640（Mediatech）からなる移植培地で洗浄し、IEQの数を決定するために計数した。次に、島をペレット化し、200単位のヘパリンを添加した20mlの移植培地に再懸濁した。肝内島移植は、S状結腸静脈または門脈に入る左結腸静脈の分枝に22ゲージ静脈内カテーテルを通して島を重力排液することによって行った。
【０２００】
血中グルコースモニタリング、インスリン投与、および拒絶の定義
空腹時および食後血中グルコースレベルを、毎日2回（朝食前および昼食後）、耳穿刺の後、Glucometer Elite（Bayer、インディアナ州エルクハート）を使って血液検査を行うことによって、モニターした。移植前膵切除動物または同種異系移植片を拒絶した動物の空腹時血糖を300mg/dl未満に保つ試みとして、インスリン（NPH, Ultralente；Eli Lilly、インディアナ州インディアナポリス）を毎日3回投与した。
【０２０１】
実験群および免疫抑制プロトコール
次に挙げる2つの処置プロトコールを試験した。（1）エドモントンプロトコール−タクロリムス、シロリムス、および抗IL-2R mAbを使用（Shapiro, A.M.J.ら, (2000), N. Eng. J. Med., 343:230-238）、および（2）L104EA29Y-エドモントンプロトコール-L104EA29YIg、シロリムス、および抗IL-2R mAb。対照群には、ラパマイシンと抗IL-2Rのみを含む「基本免疫抑制投与計画」で処置したレシピエントを含めた。タクロリムスは、術後0〜14日は0.05mg/kgを1日2回（目標レベル5〜8）、術後15〜120日は0.06mg/kgを毎日（目標レベル3〜5）投与した。L104EA29YIgは、血清トラフレベルが30μg/mlより高く保たれるように、手術中（10mg/kg）、術後4日（15mg/kg）、14日、28日、42日、56日、70日、84日、98日、112日、126日（20mg/kg）に静脈内投与した。キメラ抗ヒトIL-2R mAb（0.3mg/kg iv）は、手術中と術後4日に投与した。シロリムス（Rapamune（登録商標））は、術後0〜50日は1.25mg/kgを1日2回（目標レベル10〜15）、術後50〜100日は1mg/kgを1日2回（目標レベル7ないし10）、そして術後130日までに投与が終わるように徐々に削減した。シロリムス（Rapamune（登録商標））およびタクロリムス（Prograf（登録商標））はEmory University Hospital Pharmacyから購入した。キメラ抗ヒトIL-2R mAb（Simulect（登録商標））はNovartis Pharma AG（スイス・バーゼル）によって提供された。
【０２０２】
剖検
レシピエントはすべて、その死亡時に、Yerkes Veterinary Staffによる完全な剖検を受けた。
【０２０３】
抗ドナー抗体の検出
検出可能なドナー特異的アロ抗体の有無を、フローサイトメトリーを使って決定した。移植前の解析では末梢血白血球を標的細胞とした。移植後のアッセイでは、移植時に得た腸間膜リンパ節から単離された白血球を標的細胞とした。
【０２０４】
統計
実験群間の島移植片の生残日数をマン-フィットニー-ウィルコクソン検定（Armitageら, (1987)「Statistical methods in Medical Research」Blackwell Scientific Publication, オクスフォード）を使って比較した。
【０２０５】
抗ドナー酵素結合イムノスポットアッセイ
レシピエント動物およびドナー動物から得た末梢血白血球を使って、インターフェロン-γ（IFN-γ)酵素結合イムノスポット（ELISpot）アッセイによって、応答を測定した。捕捉抗体マウス抗ヒトIFN-γ（クローンGZ-4；Mabtech、スウェーデン）でコートしたエステルセルロース底プレート（Millipore、マサチューセット州ベッドフォード）に、同数の照射刺激細胞（ドナー白血球）および応答細胞（レシピエント白血球）を加えた。14〜16時間インキュベートした後、ビオチン化マウス抗ヒトIFN-γ（クローン7-B6-1；Mabtech、スウェーデン）を加え、結合していない抗体を除去し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ-アビジンD（Vector、カリフォルニア州バーリンゲーム）を加えた。基質3-アミノ-9-エチルカルバゾール（Sigma）を使ってスポットを発色させた。各スポットはIFN-γ-分泌細胞を表し、これらの細胞の頻度は、生成したスポット数をプレーティングした応答細胞の総数で割ることによって、決定することができる。
【０２０６】
結果
CD28経路遮断に基づく治療法はアカゲザルにおける島同種異系移植片の生残日数を引き延ばす。
レシピエント動物の外科的膵切除によって糖尿病を誘導し、移植前経静脈的グルコース負荷試験によって確認した。ドナー-レシピエントペアリングは、先に定義された主要組織適合性アレルのパネル（8つのクラスIと12のクラスII）を使った分子タイピングに基づいて定義づけた（Lobashevsky A,ら, Tissue Antigens 54:254-263, (1999)、Knapp LA,ら, Tissue Antigens 50:657-661, (1997)、Watkins D.I., Crit Rev Immunol 15:1-29, (1995)）。ペアリングはクラスI遺伝子座とクラスII遺伝子座の両方で相異が最大になるようにした。拒絶は、その後の連続する2回の空腹時血中グルコース値が＞125mg/dlであることと定義した。同種異系島（＞10,000IEQ/Kg）の門脈内注入により、どちらの群でも、糖尿病サルに正常血糖およびインスリン非依存性の初期回復が起こった。
【０２０７】
L104EA29YIg/ラパマイシン/抗IL-2R mAb投与計画による膵切除マカクの処置は、島同種異系移植片の生残日数を有意に引き延ばした（それぞれ204、190、216、＞220および56日）。L104EA29YIg/ラパマイシン/抗IL-2R mAb投与計画を受けた動物は、その空腹時血漿グルコースレベルが示すように、十分なグルコース制御をもたらした（図5および16B）。また、これらの動物はかなり長い期間にわたってインスリン補充療法を必要としなかった（図6）。これに対し、基本投与計画のみ（ラパマイシン/抗IL-2R mAb）を受けた動物は、1週間以内に移植島の拒絶を起こした（図16C）。対照動物は著しく上昇した空腹時血漿グルコースレベルを示した（図5）。また対照動物は島移植から1週間以内にインスリン補充療法を必要とした（図6）。L104EA29YIg投与計画を受けた5匹のうち4匹は、処置期間中、拒絶のない生存を享受した（表3）。経静脈的グルコース負荷試験とインスリンおよびグルコースレベルの測定により、移植後の島機能を確認した（代表的動物、図7および16D）。
【０２０８】
島同種異系移植片の生残日数および処置
【表３】

^*インスリン非依存
ND：タイピングしたアレルには検出されなかった
【０２０９】
移植の100日後に、ラパマイシンの用量を減らし、121日までにゼロに漸減させた。L104EA29YIg単独療法を施している間、動物はインスリン非依存性を保ち続けた。移植の約150日後に、残りの島レシピエントに最後のL104EA29YIgを投与して、一切の免疫抑制療法を止めた。
【０２１０】
予想どおり、治療の中断後約1〜2ヶ月で、レシピエントは高血糖になり、外来インスリン療法が必要になった。組織学的分析で単核細胞浸潤物がみとめられたことから、グルコース制御喪失の病因として拒絶が強く示唆された（図17）。経静脈的グルコース負荷試験では、L104EA29YIg/ラパマイシン/抗IL-2R mAb投与計画を施した試験動物は、島移植後に正常グルコースレベルを示した（図7および16D）。
【０２１１】
抗ドナーIFN-γ産生細胞の頻度を、ELISpotアッセイによって検出し、Immunspotイメージングシステムを使って解析した。基本免疫抑制投与計画のみを受けた動物ではドナー反応性IFNγ産生T細胞の数が有意に増加していた（84±4.6細胞）のに対して、L104EA29YIg投与計画を受けた動物には検出可能な応答がなかった（2±0.56細胞）。
【０２１２】
L104EA29YIg療法は抗ドナーTおよびB細胞応答のプライミングを阻害する。
プライミングされたアロ反応性T細胞の頻度は、IFN-γの産生を単一細胞レベルで判別することが可能なELISpotアッセイを使うことによって効果的に検出することができる。島レシピエントから採取した末梢血試料を、移植前と移植後のさまざまな時点で、ドナー抗原に反応してIFN-γを産生する能力について分析した。基本投与計画だけで処置した動物は、移植1週間後の拒絶と符合する測定可能な抗ドナー応答を迅速に発達させた。これに対し、L104EA29YIg含有投与計画を施した動物における抗ドナーIFNγ産生細胞の頻度は、治療を中止するまでは検出不能だった（代表的動物、図18AおよびB）。このように、L104EA29YIg投与計画は、IFN-γ産生能によって測定される抗ドナーT細胞応答の発生を効果的に遮断した。
【０２１３】
抗ドナー抗体応答の発達を調べるために、フローサイトメトリーを使った。対照群のうち一匹は強い抗ドナーAb応答を発生させたが、もう一匹は検出可能な応答を発達させることができなかった。これはおそらく、抗体応答が測定可能になる前に安楽死させたからだろう（図18C）。これに対して、L104EA29YIg療法を施している間、5匹中4匹は抗体応答を発生させることができなかった。これは、島移植モデルでCTLA4-Igを使った先に報告されている結果（Levisetti, M.G.ら, J Immunol 159:5187-5191, 1997）およびレシピエントが抗ドナー抗体を産生できなかったという腎同種移植片モデルでの我々の経験（Pearson T,ら, (アブストラクト)「Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting Chicago」1997年5月10〜14日, シカゴ, American Society of Transplant Physicians）と合致している。5匹のレシピエントのうち1匹は、L104EA29YIg療法を受けている間に、拒絶エピソードを起こし、続いて抗ドナー抗体応答を発達させた。予想どおり、L104EA29YIg投与計画を受けた残りの4匹は一貫して、拒絶が起こる頃（移植後約200日、L104EA29YIgの最終投与後50日）に、抗ドナー抗体応答を発達させた。
【０２１４】
ブリットル型1型糖尿病患者にとって、島移植は急速に、実施可能な処置選択肢になりつつある。島移植後のインスリン非依存性を成功させるステロイドフリーの免疫抑制投与計画が記載されている最近の報告は、島移植の実用的応用に新たな楽観論をもたらしている。免疫抑制投与計画から糖質コルチコイドを排除することは、1型糖尿病を処置する努力にあって大きな前進であるが、一次免疫抑制をカルシニューリン阻害剤療法に頼ることは、このアプローチの応用範囲を限定することにもなりうる。カルシニューリン阻害剤には、腎毒性、糖尿病、高血圧、脂質代謝異常、および多毛症など、非常に多くの有害な副作用がある（Kahan B.D.ら, N Engl J Med 321:1725-1738, 1989、Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation: the U. S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N Engl J Med 331:1110-1115, 1994、de Mattos AMら, Am J Kidney Disease 35:333-346, 2000）。薬物レベルを低く保ったとしても、重大な副作用が発生しうる。これは、腎機能が既に損なわれていることもある糖尿病患者集団では特にそうであるといえる。実際、エドモントンからの最新の報告では、移植前クレアチニンレベルが軽度に上昇していた2人の患者ではカルシニューリン阻害剤療法を受けている際に腎機能が有意に低下したため、結局はこの薬物を中止する必要に迫られた（Ryan E.A.ら, Diabetes 50:710-719, 2001）。同じ報告では、レシピエントの3分の2が、ある程度のグルコース不耐症を発症し、4分の1はタクロリムスの使用に関係すると思われる明白な移植後糖尿病を発症した。このことから、カルシニューリン阻害剤フリーの免疫抑制投与計画、特に島移植用投与計画が魅力的であり、しかも極めて重要であることが、よく分かる。
【０２１５】
T細胞共刺激経路の遮断は、無毒性免疫抑制投与計画および潜在的免疫原性投与計画の開発にとって、有望な戦略である。このアプローチは薬物投与期間中に「シグナル1」を受け取るT細胞を標的とする。例えば移植前後の期間に行われる処置は、新しい臓器または組織と出会ったときのアロ特異的T細胞を無能にすると考えられるが、他のT細胞は損なわれない（Li Y,ら, Nat Med 5:1298-1302, 1999）。CD28/B7経路の遮断は、自己免疫および移植の実験モデルで、その著しい有望性を示したことから、おそらく自己免疫障害と同種異系免疫障害の両方が存在する島移植では、とりわけ魅力的な免疫抑制標的になっている。大型動物移植モデルにおけるCD28遮断の潜在的可能性はLevisetti MGらによって記載されている（J Immunol 159: 5187-5191, 1997）。CTLA4-Igによる処置は、非ヒト霊長類における島同種異系移植片の生残期間をそれほど長くではないが有意に引き延ばすことがわかった（Levisetti MGら, J Immunol 159: 5187-5191, 1997）。CTLA4-Ig単独療法では、腎同種異系移植片の生残期間はほとんど延長されない（Pearson T.ら, (アブストラクト),「Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago」1997年5月10〜14日, シカゴ, American Society of Transplant Physicians）。最近、非ヒト霊長類モデルにおける島同種異系移植片の長期生残に関する報告がいくつかなされている。抗CD40L mAb療法は、今のところ最も印象的な結果を示しているが、治療の中断は最終的には拒絶をもたらしたので、腎移植モデルを使った実験と同様に、寛容は達成されていない（Kenyon, N.S.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8132-8137 (1999)、Kirk, A.D.ら, Nat. Med. 5, 686-693 (1999））。勇気づけられる一つの報告では、Thomasら（Diabetes 50:1227-1236, (2001)）が、抗CD3免疫毒素および免疫調節剤DSG（15デオキシスパガリン）の使用により、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病霊長類における島生残期間が劇的な延びることを、最近記載している。将来有望ではあるが、これらの報告は、臨床的潜在能力が現時点ではまだ不確かな治療薬を使用している。
【０２１６】
アカゲザル島同種異系移植モデルでCTLA4Igの突然変異体L104EA29YIgを使って得られたインビボデータは、この第2世代分子が親分子よりも強力なT細胞応答阻害剤であることを示すインビトロでの証拠と合致する。CTLA4-Igが乾癬患者の臨床試験で既に効力を示していることを考えると（Abrams, J.R.ら, J Clin. Invest. 103:1243-1252 (1999)）、一次免疫抑制剤としてL104EA29YIgを使用する治験には、強い関心がもたれる。臨床試験の計画を容易にする臨床的に承認された免疫抑制剤（抗IL-2R mAbおよびラパマイシン）とは、相乗的ではないとしても、明らかに適合する。L104EA29YIgを使った最初のヒト治験は慢性リウマチを患っている患者および腎移植を受ける患者で既に進行中である。非ヒト霊長類では認容できない毒性が報告されているので（Montgomery, S.P.ら, Am J Transplant 1 (Suppl. 1) :438, 2001）、タクロリムスに基づくプロトコールとL104EA29YIg投与計画との直接比較は試みなかったが、我々の結果は、L104EA29YIgが一次免疫抑制剤としてタクロリムスと少なくとも同程度に有効である可能性を持つことを示唆している。
【０２１７】
結論
非ヒト霊長類において拒絶からの有意な保護をもたらし島同種異系移植片の生残期間を延長する新規なカルシニューロン阻害剤/ステロイドフリーの免疫抑制投与計画を記載する。生物学的薬剤L104EA29YIgは強力な免疫抑制剤である。エドモントンプロトコールでタクロリムスの代わりにL104EA29YIgを使用することにより、カルシニューリン阻害剤の望ましくない副作用を排除することができる。
【０２１８】
本発明が関係する技術分野の当業者には明らかであるとおり、本発明には、本発明の精神または欠くことのできない特徴から逸脱することなく、上に詳しく開示した態様とは異なる形で具体化することができる。したがって、上述した本発明の具体的態様は例示であって限定ではないとみなすべきである。本発明の範囲は上記の説明に含まれる実施例に限定されるのではなく特許請求の範囲に記載されているとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】オンコスタチンMシグナルペプチドに融合したヒトCTLA4レセプターの全ヌクレオチド配列（配列番号1）およびアミノ酸配列（配列番号2）を表す図。オンコスタチンMシグナルを−25位〜−1位に示す。
【図２】シグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るCTLA4の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列、およびIg領域を有するCTLA4Igのヌクレオチド配列（配列番号3）およびアミノ酸配列（配列番号4）を表す図。
【図３】上記実施例1に記載するように、シグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の突然変異型細胞外ドメイン、およびIg領域を含むCTLA4突然変異体分子（L104EA29YIg）のヌクレオチド配列（配列番号5）およびアミノ酸配列（配列番号6）を表す図。
【図４】上記実施例3に記載するように、正常被験体における空腹時血漿グルコースレベルを表す線グラフ。
【図５】実施例3に記載するように、膵島細胞を移植した膵切除被験体における空腹時血漿グルコースレベルを表す線グラフ。動物には0日目に島細胞を移植し、L104EA29YIgを含む免疫抑制投与計画および基本免疫抑制投与計画（処置）または基本免疫抑制投与計画のみ（対照）で処置した。基本免疫抑制投与計画はラパマイシンおよび抗ヒトIL2Rからなる。
【図６】実施例3に記載するように、島細胞を移植した被験体におけるインスリン要求量を表す線グラフ。動物には0日目に島細胞を移植し、L104EA29YIgを含む免疫抑制投与計画および基本免疫抑制投与計画（処置）または基本免疫抑制投与計画のみ（対照）で処置した。
【図７】実施例3に記載するように、島移植前または島移植後の経静脈的グルコース負荷試験における血中グルコースレベルを表す線グラフ。
【図８】L104EA29YIgインサートを持つベクターpiLN-L104EA29Yの概略図。
【図９】上記実施例2に記載するように、ヒトCD80またはCD86トランスフェクトCHO細胞へのL104EA29YIg、L104EIgおよびCTLA4Igの結合を表すFACSアッセイのデータを表す図。
【図１０】上記実施例2に記載するように、CD80陽性およびCD86陽性CHO細胞の増殖の阻害を表す図。
【図１１】上記実施例2に記載するように、L104EA29YIgが一次および二次アロ刺激T細胞の増殖をCTLA4Igよりも効果的に阻害することを表す図。
【図１２】上記実施例2に記載するように、L104EA29YIgがアロ刺激ヒトT細胞のIL-2（図12A）、IL-4（図12B）およびγ-インターフェロン（図12C）サイトカイン産生をCTLA4Igよりも効果的に阻害することを表す図。
【図１３】上記実施例2に記載するように、L104EA29YIgがフィトヘマグルチニン（PHA）刺激サルT細胞の増殖をCTLA4Igよりも効果的に阻害することを表す図。
【図１４】CTLA4Ig（レーン1）、L104EIg（レーン2）およびL104EA29YIg（レーン3）のSDSゲル（図14A）ならびにCTLA4Ig（図14B）およびL104EA29YIg（図14C）のサイズ排除クロマトグラフ。
【図１５】NMR分光法によって決定された溶液構造から作成したCTLA4細胞外IgV様フォールドのリボン表示。図15Bは、アビディティー強化突然変異L104およびA29の位置と側鎖配向を示すS25-R33領域およびMYPPPY領域の拡大図である。
【図１６】移植前および移植後のLEA29YIg処置同種異系島レシピエント（A）および対照同種異系島レシピエント（B）（代表的動物）の空腹時血中グルコース。動物はすべて移植の少なくとも2週間前に外科的粋切除術を受けた（平均移植前インスリン要求量は8.76±0.18単位/日）。（C）同種異系島の門脈内注入後、レシピエントは迅速に正常血糖になり、外因性インスリンを必要としなくなった。（D）上記実施例3に記載するように、、移植前ならびに移植後1ヶ月および3ヶ月の時点で、経静脈的グルコース負荷試験によって、糖尿病誘発および移植後島機能を確認した。
【図１７】（A）インスリンに関する陽性染色によって確認した機能的移植島の免疫組織像。（B）上記実施例3に記載するように、拒絶を示す単核細胞浸潤物に囲まれている対照投与計画を受けた動物の島。
【図１８】L104EA29Y投与計画による抗ドナーTおよびB細胞応答の抑制を表す図。（A）抗ドナーIFN-ELISpot反応は対照における拒絶のタイミングと一致する（移植後約1週間）。（B）L104EA29Y投与計画は抗ドナーT細胞応答の生成を効果的に抑制する。（C）ラパマイシン抗IL-2R mAbの投与を受けた動物は、拒絶の時点でフローサイトメトリー法によって測定すると、検出可能な抗ドナー抗体を迅速に産生する。（D）L104EA29Yを含む投与計画を受けた島レシピエントは、上記実施例3に記載するように、処置しても検出可能な抗ドナー抗体応答を生じることができない。
【図１９】上記実施例2に記載のL104EIgのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号7〜8）を表す図。
【図２０】L104EA29LIgのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号9〜10）を表す図。
【図２１】L104EA29TIgのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号11〜12）を表す図。
【図２２】L104EA29WIgのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号13〜14）を表す図。
【図２３】シグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るCTLA4の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列、およびIg領域を有するCTLA4Igのヌクレオチド配列（配列番号15）を表す図。
【図２４】シグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るCTLA4の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列、およびIg領域を有するCTLA4Igのアミノ酸配列（配列番号16）を表す図。

Claims (15)

1. 患者における島細胞移植拒絶を抑制する方法であって、上記患者に有効量のCTLA突然変異体分子を投与することを含み、上記患者には、CTLA4突然変異体分子の投与前または投与後に島細胞が移植されることを特徴とする方法。
2. 突然変異型CTAL4分子が、L104EA29YIg（図3）、L104EIg（図19）、L104EA29LIg（図20）、L104EA29TIg（図21）またはL104EA29WIg（図22）である、請求項１記載の方法。
3. 突然変異型CTLA4分子が、CD80および/またはCD86−陽性細胞上のCD80および/またはCD86分子に結合する、請求項１記載の方法。
4. 患者における島細胞移植拒絶を請求項１に記載の方法で抑制することによって糖尿病を処置する方法。
5. 島細胞が、上記患者への投与に先立って封入される、請求項１記載の方法。
6. 移植前、移植中または移植後に有効量の少なくとも1つの免疫抑制剤を上記患者に投与することをさらに含む、請求項１記載の方法。
7. 免疫抑制剤が、ステロイドフリーである、請求項６記載の方法。
8. 免疫抑制剤が、ラパマイシンおよび抗ヒトIL-2R mAbを含む、請求項６記載の方法。
9. 免疫抑制剤が、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、プレドニゾン、アザチオプリン、TOR阻害剤、メトトレキセート、TNFα遮断薬、TNFアンタゴニスト、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾピリン（sulphasalazopryine）、金塩、エタネルセプト、またはアナキンラである、請求項６記載の方法。
10. 突然変異型CTLA4分子が、T細胞/CD80および/またはCD86−陽性細胞相互作用を妨害するL104EA29YIg（図3）である、請求項１記載の方法。
11. 突然変異型CTLA4分子L104EA29YIg（図3）の投与が、局所的または全身的に行われる、請求項１記載の方法。
12. 投与が静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、植込み用ポンプ、持続注入、遺伝子治療、リポソームまたは経口投与による、請求項１１記載の方法。
13. 上記患者が、ヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ヒツジ、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、またはマウスである、請求項１記載の方法。
14. 非ヒト霊長類が、サルである請求項１３記載の方法。
15. T細胞枯渇骨髄細胞を上記患者に投与することをさらに含む、請求項１記載の方法。

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