JP2010506581A - タンパク質変異体 - Google Patents
タンパク質変異体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010506581A JP2010506581A JP2009532897A JP2009532897A JP2010506581A JP 2010506581 A JP2010506581 A JP 2010506581A JP 2009532897 A JP2009532897 A JP 2009532897A JP 2009532897 A JP2009532897 A JP 2009532897A JP 2010506581 A JP2010506581 A JP 2010506581A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ctla
- variant
- amino acid
- polypeptide
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
効力が改善された本発明のCTLA−4変異体は、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)において1カ所以上の以下の位置:17位、26位、28位、29位、54位、59位、66位、70位、71位、86位、及び94位に突然変異を有することができる。
安定性が改善された本発明のCTLA−4変異体は、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)において1カ所以上の以下の位置:17位、26位、43位、46位、49位、59位、61位、62位、71位、81位、及び94位に突然変異を有することができる。
好ましいCTLA−4変異体は、CTLA−4の1以上のCDRループの構造及び/又は方向に影響を及ぼす位置に1個以上の(例えば1個、2個、3個、4個、5個、10個、又はそれより多い)突然変異を有することができる。そのような突然変異には、アミノ酸置換を含めることができる。
一般に、本発明による核酸は単離型及び/又は精製型の単離物として提供され、汚染物質を全く含まないか実質的に含まない。核酸は、全体的に又は部分的に合成物であっても、ゲノムDNA、cDNA、又はRNAを含んでいてもよい。
導入後、例えば宿主細胞(細胞は形質転換細胞の子孫である可能性が高いが、実際に形質転換された細胞を含んでいてもよい)を遺伝子発現条件下で培養することによって、核酸からの発現を引き起こすか又は可能にすることができ、それによりコードされたポリペプチドが産生される。ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドとカップリングして発現される場合、細胞から培地へ分泌され得る。発現による産生後、ポリペプチドは、宿主細胞及び/又は培地から単離し及び/又は精製することができ、場合によっては、その後、要望通り、例えば、1種以上の医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、又は担体(例えば以下を参照されたい)を含めた医薬組成物のように、1種以上の追加成分を含んでいてもよい組成物の製剤に用いることができる。
本発明の更なる側面によれば、親CTLA−4ポリペプチドと比較して効力及び/又は安定性が改善されたCTLA−4変異体の作製方法が提供され、前記方法は:
コードする核酸からの発現により、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)における2カ所以上の以下の位置:17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位に親CTLA−4ポリペプチドと比較して突然変異を有するCTLA−4変異体を作製し;そして
親CTLA−4ポリペプチドと比較して改善された効力及び/又は安定性に関してCTLA−4変異体を試験する、
ことを含む。
本方法を実施する者は、親又は出発CTLA−4ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することによって、例えば考察されるような1個以上のアミノ酸の置換及び/又は挿入によって、CTLA−4変異体を準備する先行工程を更に実施することができる。各種の異なるCTLA−4変異体を準備し、例えば、さまざまなCTLA−4変異体から本発明にしたがって所望される特性を有する1種以上のCTLA−4変異体を同定するために、所望の活性について試験することができる。通常、CTLA−4のアミノ酸配列の変更は、CTLA−4をコードする核酸のコード配列を変更することによってなされるであろう。1個以上のヌクレオチドを変更して、1個以上のコドン及びこれによりコードされたアミノ酸を変更することができる。本明細書のいずれかに記載のように、そして当該技術分野に熟練した者に明らかなように、CTLA−4ポリペプチドのコード配列及びこれによりコードされたアミノ酸配列を変化させるために、突然変異誘発のための好適技術、特に定方向突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を使用することができる。
親CTLA−4ポリペプチドをコードする核酸を突然変異させて、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)における2カ所以上の以下の位置:17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位に変更されたアミノ酸配列を有する1種以上のCTLA−4変異体をコードする配列を有する1種以上の核酸を準備し;
核酸を発現させてCTLA−4変異体を産生し;
親CTLA−4ポリペプチドと比較して改善された効力及び/又は安定性に関し、産生されたCTLA−4変異体を試験する、
ことを含む。
突然変異を受けるCTLA−4ポリペプチドは、本明細書に開示の突然変異セットを含むことができ、配列番号1、2、3、4、5、6、及び7から選択されるアミノ酸配列を有することができる。突然変異を受けるCTLA−4ポリペプチドは、配列番号8及び9から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
本発明のCTLA−4変異体を同定し又は入手した後、単離型及び/又は精製型で提供することができ、要望通りに使用することができ、そして医薬的に許容可能な賦形剤又は担体などの少なくとも1種の追加成分を含む組成物に製剤化することができる。CTLA−4変異体をコードする核酸を用いて、その後の使用ための変異体を作製することができる。上述のとおり、そのような核酸は例えば最初に提供されたライブラリー又は多様集団から単離することができ、そしてそこからCTLA−4変異体を作製し、同定した。
親CTLA−4ポリペプチドの1以上のCDRループの構造及び/又は方向に影響を及ぼす2カ所以上のバーニア位置を同定し;そして
2カ所以上のバーニア位置に、親CTLA−4ポリペプチドと比較してCTLA−4変異体のB7分子への結合能を高める突然変異を提供する、
ことを含む。バーニア位置は、好ましくは、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)における以下の位置:26位、28位、71位、及び94位から選択することができる。親CTLA−4ポリペプチドは、配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4であるか、又はその突然変異体若しくは変異体であり得る。親CTLA−4ポリペプチドは配列番号9のアミノ酸配列を有していてもよい。
したがって、治療方法は、提供されるようなCTLA−4変異体の投与を含むことができ、医薬組成物はそのようなCTLA−4変異体を含み、そして投与用医薬の製造におけるそのようなCTLA−4変異体の使用、例えば医薬又は医薬組成物の作製方法における使用は、CTLA−4変異体を医薬的に許容可能な賦形剤とともに製剤化することを含む。
本発明による医薬組成物、及び本発明にしたがった使用のための医薬組成物には、活性成分に加えて、医薬的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当該技術分野に熟練した者に周知の他の物質を含めることができる。そのような物質は、非毒性で活性成分の有効性を妨げないものである必要がある。担体又は他の物質の厳密な性質は投与経路に依存するであろう。それは好適経路であり得るが、最もありそうなのは注射(針を使用するもの又は使用しないもの)、特に皮下注射である。他の好ましい投与経路には、吸入による投与又は経鼻投与が含まれる。
本明細書のいずれかに記載の全ての文献は援用される。
ライブラリーの構築
CTLA−4 cDNAはインビトロジェンから入手した。CTLA−4の二量体化を防ぐため、二量体化界面におけるシステイン121をセリンへ突然変異させた。成熟配列をリボソームディスプレイの直鎖状鋳型に再構築し、その後これをライブラリーの作製に用いた。DNAレベルでは、mRNAへの効率的転写のためにT7プロモーターを5’端に付加した。mRNAレベルでは、構築体に原核リボソーム結合部位(シャイン−ダルガーノ配列)を含有させた。3’端にgIIIの一部を付加してスペーサーとして作用させた(非特許文献22)。製造者のプロトコールにしたがい(BDバイオサイエンス)、変異性PCRを用いて変異体ライブラリーを作製したところ、エラー率は8.1ヌクレオチド突然変異/分子であった。これは、1分子あたり4個の突然変異、及びおよそ2.5×1010変異体分子のライブラリーを導入した。
非特許文献22に記載のようにして、ヒトB7−1(R&Dシステムズ、140−B1)及び/又はB7−2(R&Dシステムズ、141−B2)の濃度を低下させながらリボソームディスプレイ親和性に基づいた選択を行った。簡潔に言えば、各選択ラウンドに関し、ライブラリーをB7分子とともにインキュベーションし、Fc融合B7をプロテインGコーティング常磁性ビーズ(ダイナル M280)(登録商標)へカップリングさせ、結合した三次複合体(mRNA−リボソーム−scFv)を磁気分離により回収し、一方、未結合複合体は洗浄により除去した。次に結合したCTLA−4をコードするmRNAを非特許文献22に記載のようにしてRT−PCRにより取り出し、選択のあいだに存在するヒトB7の濃度を低下させながら(5ラウンドにわたり50nM〜10pM)選択プロセスを繰り返した。
単一細胞アッセイで試験するために、変異体を最初にミディアムスループット形式で発現させた。次に確認アッセイのための材料を提供するために、このうちの当たりを大規模で発現させた。
候補CTLA−4変異体を親野生型及びLEA29Y対照と平行して発現させた。トランスフェクションの2日前、HEK−EBNA293細胞を、10%FBS(インビトロジェン、10100−147)及び1%非必須アミノ酸(インビトロジェン、11140−035)含有D−MEM(インビトロジェン、41966)を用いて2.5×105/ウェルの濃度で12ウェルプレートに蒔き、加湿インキュベーター内で37℃、5%CO2にて増殖させた。トランスフェクションの直前に使用済み培地を吸引し、1ml/ウェルの5%FBS含有D−MEMに交換した。トランスフェクションすべき各ウェルに対し、4μgのプラスミドDNAをD−MEM中の5μgのリポフェクタミン2000(インビトロジェン、11668−019)と混合し、ウェルに加える前に室温で45分間インキュベーションした。プレートを加湿インキュベーター内で37℃、5%CO2にて一晩インキュベーションした。次の朝、トランスフェクション培地を吸引し、8mM L−グルタミン(インビトロジェン、25030−024)、2%HTサプリメント(インビトロジェン、41065−012)、1%Optimab A(インビトロジェン、11908−035)、及び1%Optimab B(インビトロジェン、11909−033)を含有する1.5ml/ウェルのCD−CHO培地(インビトロジェン、10743−011)に交換し、次に加湿インキュベーター内で37℃、5%CO2にて5日間インキュベーションし、増殖培地中でタンパク質を発現させた。発現後、タンパク質を含有する使用済み培地を1500×gにて5分間の遠心分離によって浄化し、精製するまで4℃で保存した。96ウェル形式のMiniTrak(登録商標)液体処理ロボット(パーキンエルマー)にて、PhyTip(登録商標)プロテインA親和性カラム(Phynexus、PTP−92−20−01、樹脂床容量20μl)を用いてマイクロスケールタンパク質精製を行った。浄化した粗上清をPhyTip(登録商標)カラムに通した;次にこれを200μlのD−PBS、200μlの140mM NaClで洗浄し、100μlの100mM HEPES(pH3.0)、140mM NaClで溶出させ、100μlの200mM HEPES(pH8.0)、140mM NaClで中和した。
候補CTLA−4変異体を親野生型及びLEA29Y対照と平行して発現させた。トランスフェクションの2日前、HEK−EBNA293−6E細胞(Durocherらより入手)を0.99%プルロニック(登録商標)(インビトロジェン、24040−032)及び0.05%ジェネティシン(登録商標)(インビトロジェン、10131)含有フリースタイル293培地(インビトロジェン、12338−018)中に5×105/mlの濃度で蒔き、加湿振盪インキュベーター内で120rpm、37℃、5%CO2にて増殖させた。トランスフェクションの直前に細胞を1500×gにて遠心分離し、次に新鮮な0.99%プルロニック(登録商標)及び0.05%ジェネティシン(登録商標)含有フリースタイル293培地に再懸濁させて1×106/mlの濃度にした。各CTLA−4変異体に関し、50ml容量のこれらの細胞を、フリースタイル293培地中にて50μgのプラスミドDNAを200μgのポリエチレンイミン(ポリサイエンス社、直鎖状25kDa、9002−98−6)と混合し、室温にて1時間インキュベーションし、50mlの細胞を含有する250mlフラスコに加えることによってトランスフェクションした。培養物を加湿振盪インキュベーター内で120rpm、37℃、5%CO2にて5日間増殖させ、増殖培地中でタンパク質を発現させた。発現後、タンパク質を含有する使用済み培地を1500×gにて5分間の遠心分離によって浄化し、精製するまで4℃で保存した。ASPEC XL4液体処理ロボット(ギルソン)を用いて精製した。0.5ml床容量のプロテインA樹脂(バイオセプラ、Ceramic Hyper DF、20078−28)を親和性カラムに注入し、50mM Tris・Cl(pH8.0)、250mM NaClで平衡化した。50mlの浄化した粗上清サンプルそれぞれを1本のプロテインAカラムに通し、15mlの50mM Tris・Cl(pH8.0)、250mM NaClで洗浄し、1.15mlの100mMクエン酸ナトリウム(pH3.0)で溶出させ、100μlの2M Tris・Cl(pH10.0)で中和した。中和した溶出物を、D−PBS(インビトロジェン、14190−094)で平衡化したNAP−10カラム(GEヘルスケア、17−0854−01)を用いて1.5mlのD−PBSにバッファー交換した。
フィトヘマグルチニン(PHA)存在下におけるJurkat細胞及びRaji細胞の共培養によりIL−2を産生させる。PHAはJurkat細胞上のTCRを活性化し、CD28を介した更なる必須活性化シグナルがRaji細胞上のB7−1及びB7−2リガンドによって提供される。その後IL−2をELISAで検出する。IL−2産生は、Raji細胞上のB7−1及びB7−2へ結合しているCTLA−4によって減弱化される。Jurkat細胞はECACから、Raji細胞はECCACから入手し、供給されたプロトコールにしたがって維持した。アッセイ培地は10%v/vウシ胎仔血清含有RPMIで構成された。各アッセイの前に、300×gにて5分間の遠心分離によってJurkat及びRajiを沈殿させ、培地を吸引除去し、最終濃度2×106/mlとなるように細胞をアッセイ培地に再懸濁させた。CTLA−4変異体(2重)をアッセイ培地で所望の濃度に希釈した。このアッセイでは、変異体及び野生型をCTLA−4−Fc型で試験したため、CTLA−4変異体及びCTLA−4ヒト野生型は、121位にシステインを有していた。次に50μlの再懸濁細胞のそれぞれを、各アッセイポイントへ加え、合計アッセイ容量を250μl/ウェルとした。アッセイプレートを、5%CO2下、37℃で24時間インキュベーションした。次に産生されたIL−2を、DELFIA(登録商標)ユーロピウム読み出しに変換されているDuoset ELISA(R&Dシステムズ、カタログ番号DY202)で検出した。
Raji細胞はB7−1及びB7−2を発現する。各B7受容体に対するCTLA−4変異体の効果を評価するために、B7−1又はB7−2を特異的抗体によって選択的にブロックした。4種の変異体及び野生型のB7−1受容体及びB7−2受容体に対する相対活性を、Jurkat細胞(T細胞)及びRaji細胞(B細胞)アッセイにおいて、PHA存在下、それぞれ抗B7−2抗体及び抗B7−1抗体で受容体をブロックすることにより評価した。Jurkat細胞及びRaji細胞は供給されたプロトコールにしたがって維持した。アッセイ培地は10.0%v/vウシ胎仔血清含有RPMIで構成された。各アッセイの前に、300×gにて5分間の遠心分離によってJurkat及びRajiを沈殿させ、培地を吸引除去し、最終濃度2×106/mlとなるように細胞をアッセイ培地に再懸濁させた。CTLA−4変異体(3重)をアッセイ培地で所望の濃度に希釈した。このアッセイでは、変異体及び野生型をCTLA−4−Fc型で試験したため、CTLA−4変異体及びCTLA−4ヒト野生型は121位にシステインを有していた。次に50μlの再懸濁細胞のそれぞれを、5nMの抗B7−1(R&Dシステムズ、カタログ番号Mab140)又は抗B7−2(R&Dシステムズ、カタログ番号Mab141)とともに各アッセイポイントへ加え、合計アッセイ容量を250μl/ウェルとした。アッセイプレートを、5%CO2下、37℃で24時間インキュベーションした。次に産生されたIL−2を、DELFIA(登録商標)ユーロピウム読み出しに変換されているDuoset ELISA(R&Dシステムズ、カタログ番号DY202)で検出した。
1次アミノ酸配列から、アクセルリスソフトウェア社製DS Modeller 1.1(登録商標)を用いてCTLA−4変異体構造のモデリングを行った。簡潔に言えば、ヒトCTLA−4及びB7.1の×線結晶構造1i8L(非特許文献23)において変異体CTLA−4の配列をCTLA−4の配列と並べることによって、ソフトウェアで相同性モデリングを行った。モデルの可視化はPYMOL(DeLano、2002)を用いて行った。モデルは、CTLA−4変異体D06(配列番号1)とB7−1との相互作用を示す図4に描写する。
モデリングD06(配列番号1)は、B7−1及びB7−2の結合に重要であることが知られているCDR3ループ内の残基位置にほとんど変化がないことを示している。しかしながら、構造モデルにおける突然変異の試験及び他の免疫グロブリンV様ドメインとの比較により、有益な突然変異は好適な作用メカニズムを有する証拠を提供している。
実施例1に記載の第2相ライブラリーを改善された安定性に関して選択した。CTLA−4変異体及びヒト野生型は121位にセリンを有しているため単量体型であった。DTTの存在下及び非存在下にて、非特許文献28に記載のようにしてin vitro翻訳及び選択を実施した。安定性によって選択されたライブラリーをB7−1とともにインキュベーションした後、融合タンパク質を捕捉し、磁気分離により結合複合体を回収し、一方、未結合複合体は洗浄により除去した。次に、結合したCTLA−4変異体をコードするmRNAをRT−PCRにより回収し、選択プロセスを繰り返した。DTT濃度を増加させて3ラウンドの選択を行った。
1次安定性RIA(ラジオイムノアッセイ)を用い、非特許文献28に記載のようにしてCTLA−4変異体を安定性についてスクリーニングした。簡潔に言えば、各変異体に関し、直鎖状DNA鋳型を増幅させ、転写し、mRNAをG25セファデックス(登録商標)カラムで精製し、定量した。各変異体に関し、35S−標識メチオニン存在下におけるin vitro翻訳を30℃で30分間にて2重に設定し、一方は非還元条件、他方は10mM DTT(ジチオスレイトール)中とした。0.05%Tween20及び翻訳と同一濃度のDTTを含有するPBSで翻訳を停止させた。翻訳混合物を、B7−1でコーティングしたプレート上で1時間室温にてインキュベーションした。プレートを、0.05%Tween20(登録商標)含有PBSにて3回、PBSにて3回洗浄した。残留放射能を0.1Mトリエチルアミンで溶出させ、液体シンチレーションカウンターで定量した。変異体の安定性の程度を%残留結合として、即ち、DTT存在下における結合シグナルをDTT非存在下における結合シグナルで割り、100を掛けて計算した。変異体が安定であるほど、%残留結合は大きい。
ラウンド3のCTLA−4変異体を配列決定した。3種のより安定な変異体の配列を、配列番号5、6、及び7として以下に記載する。
Claims (44)
- ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)において2カ所以上の以下の位置:17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位に突然変異を有するCTLA−4変異体であって、該CTLA−4変異体は、前記位置にヒト野生型CTLA−4のアミノ酸(配列番号8)を有するCTLA−4ポリペプチドと比較して改善された効力及び/又は改善された安定性を有し、改善された効力とは、B細胞によって活性化されたT細胞を用いたIL−2産生アッセイにおいてIC50が少なくとも2倍低下することであり、改善された安定性とは、10mM DTT存在下におけるB7−1又はB7−2への結合シグナルを、DTT非存在下におけるB7−1又はB7−2への結合シグナルで割り、100を掛けたものとして計算される残留結合が少なくとも10%であることである、前記CTLA−4変異体。
- 配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4と比較して改善された効力及び/又は改善された安定性を有する、請求項1に記載のCTLA−4変異体。
- ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)において1カ所以上の以下の位置:26位、28位、71位、及び94位に突然変異を有する、請求項1又は2に記載のCTLA−4変異体。
- 前記位置のいずれか1カ所に提供される残基が、以下の表:
- 親CTLA−4ポリペプチドに対して10個以下の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで、親CTLA−4ポリペプチドは、配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4であるか、又は17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位のそれぞれにヒト野生型CTLA−4のアミノ酸(配列番号8)を有するその突然変異体若しくは変異体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 親CTLA−4ポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4である、請求項5に記載のCTLA−4変異体。
- 配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4において、以下の突然変異セット:
(i)I17S、S26P、G28S、L59S、S71L、K94E;
(ii)S26P、M54V、L59S、S71F、K94E;
(iii)I17V、S26P、K29N、L59S、I66T、S71F、M86V、K94E;
(iv)S26P、L59S、T70I、S71F、M86T、K94E;
(vii)S26P、C49W、L59S、L62P、S71F、Q81R、K94E;
(v)I17T、S26P、C49Y、L59S、F61S、S71F、K94E;
(vi)S26P、S43G、T46S、L59S、S71F、Q81R、K94E、
から成る群より選択される突然変異セットを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。 - 配列番号1、2、3、4、7、5、及び6から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 効力が改善された、請求項1に記載のCTLA−4変異体。
- ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)において、1カ所以上の以下の位置:17位、26位、28位、29位、54位、59位、66位、70位、71位、86位、及び94位に突然変異を有する、請求項9に記載のCTLA−4変異体。
- 17位、26位、28位、29位、54位、59位、66位、70位、71位、86位、及び94位のいずれか1カ所に提供される残基が、以下の表:
- 残基26はPであり、残基59はSであり、残基71はF又はLであり、そして残基94はEである、請求項11に記載のCTLA−4変異体。
- 親CTLA−4ポリペプチドに対して10個以下の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで、親CTLA−4ポリペプチドは、配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4であるか、又は17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位のそれぞれにヒト野生型CTLA−4のアミノ酸(配列番号8)を有するその突然変異体若しくは変異体である、請求項9〜12のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4において、以下の突然変異セット:
(1)I17S、S26P、G28S、L59S、S71L、K94E;
(2)S26P、M54V、L59S、S71F、K94E;
(3)I17V、S26P、K29N、L59S、I66T、S71F、M86V、K94E;
(4)S26P、L59S、T70I、S71F、M86T、K94E、
から成る群より選択される突然変異セットを含む、請求項9〜13のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。 - 配列番号1、2、3、及び4から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項9〜14のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 安定性が改善された、請求項1に記載のCTLA−4変異体。
- ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)において、1カ所以上の以下の位置:17位、26位、43位、46位、49位、59位、61位、62位、71位、81位、及び94位に突然変異を有する、請求項16に記載のCTLA−4変異体。
- 17位、26位、43位、46位、49位、59位、61位、62位、71位、81位、及び94位のいずれか1カ所に提供される残基が、以下の表:
- 残基26はPであり、残基59はSであり、残基71はFであり、そして残基94はEである、請求項18に記載のCTLA−4変異体。
- 親CTLA−4ポリペプチドに対して10個以下の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで、親CTLA−4ポリペプチドは、配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4であるか、又は17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位のそれぞれにヒト野生型CTLA−4のアミノ酸(配列番号8)を有するその突然変異体若しくは変異体である、請求項16〜19のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4において、以下の突然変異セット:
(7)S26P、C49W、L59S、L62P、S71F、Q81R、K94E;
(5)I17T、S26P、C49Y、L59S、F61S、S71F、K94E;
(6)S26P、S43G、T46S、L59S、S71F、Q81R、K94E、
から成る群より選択される突然変異セットを含む、請求項16〜20のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。 - 配列番号7、5、及び6から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項16〜21のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 可溶性ポリペプチドである、請求項1〜22のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 更なるポリペプチドに融合した、請求項1〜23のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体の少なくとも細胞外ドメインを含む融合タンパク質。
- 更なるポリペプチドが免疫グロブリン部分を含む、請求項24に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体をコードする核酸。
- 請求項26に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項27に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体を含む組成物。
- 医薬的に許容可能な賦形剤を含む、請求項29に記載の組成物。
- ヒト又は動物の身体の治療方法に用いるための、請求項1〜23のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体。
- 関節リウマチ、多発性硬化症、及び/又は全身性エリテマトーデスの治療に用いるための、請求項31に記載のCTLA−4変異体。
- 関節リウマチ、多発性硬化症、及び/又は全身性エリテマトーデスの治療に用いるための医薬の製造における、請求項1〜23のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体の使用。
- 親CTLA−4ポリペプチドと比較して効力及び/又は安定性が改善されたCTLA−4変異体の作製方法であって:
コードする核酸からの発現により、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)における2カ所以上の以下の位置:17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位に親CTLA−4ポリペプチドと比較して突然変異を有するCTLA−4変異体を作製し;そして
親CTLA−4ポリペプチドと比較して改善された効力及び/又は安定性に関してCTLA−4変異体を試験する、
ことを含む、前記方法。 - 試験前にCTLA−4変異体を単離する工程を含む、請求項34に記載の方法。
- 親CTLA−4ポリペプチドと比較して効力及び/又は安定性が改善されたCTLA−4変異体の同定方法又は入手方法であって:
親CTLA−4ポリペプチドをコードする核酸を突然変異させて、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)における2カ所以上の以下の位置:17位、26位、28位、29位、43位、46位、49位、54位、59位、61位、62位、66位、70位、71位、81位、86位、及び94位に変更されたアミノ酸配列を有する1種以上のCTLA−4変異体をコードする配列を有する1種以上の核酸を準備し;
核酸を発現させてCTLA−4変異体を産生し;
親CTLA−4ポリペプチドと比較して改善された効力及び/又は安定性に関し、産生されたCTLA−4変異体を試験する、
ことを含む、前記方法。 - 変更されたアミノ酸配列を有するCTLA−4変異体のライブラリー又は多様集団を作製し、試験する、請求項36に記載の方法。
- 親CTLA−4ポリペプチドと比較して効力が改善されたCTLA−4変異体の作製方法であって:
親CTLA−4ポリペプチドの1以上のCDRループの構造及び/又は方向に影響を及ぼす2カ所以上のバーニア位置を同定し;そして
2カ所以上のバーニア位置に、親CTLA−4ポリペプチドと比較してCTLA−4変異体のB7分子への結合能を高める突然変異を提供する、
ことを含む、前記方法。 - 2カ所以上のバーニア位置が、ヒト野生型CTLA−4のアミノ酸配列(配列番号8)における以下の位置:26位、28位、71位、及び94位から選択される、請求項38に記載の方法。
- 親CTLA−4ポリペプチドが、配列番号8のアミノ酸配列を有するヒト野生型CTLA−4である、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 親CTLA−4ポリペプチドが、ヒト野生型CTLA−4の突然変異体又は変異体であり、親CTLA−4ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号8と異なる、請求項34〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 親CTLA−4ポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸配列を有するベラタセプトのアミノ酸配列を有する、請求項41に記載の方法。
- それを必要とする個体へ、請求項1〜23のいずれか1項に記載のCTLA−4変異体を投与することを含む、治療方法。
- 治療が、関節リウマチ、多発性硬化症、及び/又は全身性エリテマトーデスの治療である、請求項43に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0620934.0A GB0620934D0 (en) | 2006-10-20 | 2006-10-20 | Protein variants |
PCT/GB2007/004023 WO2008047150A2 (en) | 2006-10-20 | 2007-10-22 | Protein variants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010506581A true JP2010506581A (ja) | 2010-03-04 |
JP2010506581A5 JP2010506581A5 (ja) | 2010-12-09 |
Family
ID=37508123
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009532897A Ceased JP2010506581A (ja) | 2006-10-20 | 2007-10-22 | タンパク質変異体 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8088736B2 (ja) |
EP (1) | EP2076536A2 (ja) |
JP (1) | JP2010506581A (ja) |
AU (1) | AU2007311608A1 (ja) |
CA (1) | CA2666778A1 (ja) |
GB (1) | GB0620934D0 (ja) |
WO (1) | WO2008047150A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015523328A (ja) * | 2012-05-11 | 2015-08-13 | メディミューン,エルエルシー | Ctla−4バリアント |
JP2020536552A (ja) * | 2017-10-10 | 2020-12-17 | アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | Ctla−4変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
US20150010550A1 (en) | 2004-07-15 | 2015-01-08 | Xencor, Inc. | OPTIMIZED Fc VARIANTS |
DK2325207T3 (en) | 2004-11-12 | 2017-06-06 | Xencor Inc | Fc variants with altered binding to FcRn |
US8367805B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
DK2222697T3 (da) | 2007-11-01 | 2013-03-11 | Perseid Therapeutics Llc | Immunsuppressive polypeptider og nukleinsyrer |
AU2014250683B2 (en) * | 2007-11-01 | 2015-11-26 | Astellas Pharma Inc. | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
KR20190064664A (ko) | 2008-10-02 | 2019-06-10 | 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 | Cd86 길항제 다중-표적 결합 단백질 |
US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
JP5705242B2 (ja) | 2010-02-19 | 2015-04-22 | ゼンコア インコーポレイテッド | 新規ctla4−ig免疫アドヘシン |
TW201134481A (en) | 2010-03-12 | 2011-10-16 | Abbott Biotherapeutics Corp | CTLA4 proteins and their uses |
EP3101035B1 (en) * | 2014-01-28 | 2021-10-06 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | Bifunctional fusion protein, preparation method therefor, and use thereof |
JP2018512856A (ja) | 2015-04-17 | 2018-05-24 | アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | 調整可能な親和性を有する免疫調節タンパク質 |
WO2017034244A1 (ko) * | 2015-08-21 | 2017-03-02 | 한양대학교 산학협력단 | 중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
US11351224B2 (en) | 2015-08-21 | 2022-06-07 | Iucf-Hyu (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) | Pharmaceutical composition for preventing and treating transplant rejection |
US11053295B2 (en) | 2015-08-21 | 2021-07-06 | Iucf-Hyu (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) | Peptides having effects of preventing or treating central nervous system diseases and pharmaceutical compositions for preventing or treating central nervous system diseases containing same as active ingredient |
MA43552A (fr) | 2016-04-15 | 2018-11-07 | Alpine Immune Sciences Inc | Protéines immunomodulatrices à variants de cd80 et leurs utilisations |
AU2019372675A1 (en) * | 2018-11-02 | 2021-02-04 | Beijing Vdjbio Co., Ltd. | Modified CTLA4 and methods of use thereof |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0847391A (ja) * | 1994-04-15 | 1996-02-20 | Bristol Myers Squibb Co | Ctla4分子及びil4結合分子並びにそれらの使用 |
JPH08506247A (ja) * | 1993-07-09 | 1996-07-09 | アムジェン ボールダー インコーポレイテッド | 組換えctla4ポリペプチドおよびその製造方法 |
JPH09202800A (ja) * | 1995-07-21 | 1997-08-05 | Bristol Myers Squibb Co | Ctla4変異体分子およびそれの使用 |
JP2001510473A (ja) * | 1997-01-31 | 2001-07-31 | ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー | 可溶性ctla4突然変異分子とその用途 |
JP2004511213A (ja) * | 2000-05-26 | 2004-04-15 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 可溶性ctla4突然変異体分子およびその用途 |
JP2004517806A (ja) * | 2000-07-03 | 2004-06-17 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 可溶性ctla4分子を使用するリウマチ疾患の処置方法 |
JP2004535402A (ja) * | 2001-05-23 | 2004-11-25 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 可溶性ctla4突然変異体分子を使って同種異系島移植片を保護する方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004535364A (ja) | 2001-01-26 | 2004-11-25 | エモリー・ユニバーシティ | 臓器移植の免疫寛容を誘発し、異常血色素症を処置する方法 |
-
2006
- 2006-10-20 GB GBGB0620934.0A patent/GB0620934D0/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-10-22 EP EP07824272A patent/EP2076536A2/en not_active Withdrawn
- 2007-10-22 CA CA002666778A patent/CA2666778A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-22 AU AU2007311608A patent/AU2007311608A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-22 WO PCT/GB2007/004023 patent/WO2008047150A2/en active Application Filing
- 2007-10-22 JP JP2009532897A patent/JP2010506581A/ja not_active Ceased
- 2007-10-22 US US12/446,216 patent/US8088736B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08506247A (ja) * | 1993-07-09 | 1996-07-09 | アムジェン ボールダー インコーポレイテッド | 組換えctla4ポリペプチドおよびその製造方法 |
JPH0847391A (ja) * | 1994-04-15 | 1996-02-20 | Bristol Myers Squibb Co | Ctla4分子及びil4結合分子並びにそれらの使用 |
JP2004248677A (ja) * | 1994-04-15 | 2004-09-09 | Bristol Myers Squibb Co | Ctla4分子及びil4結合分子並びにそれらの使用 |
JPH09202800A (ja) * | 1995-07-21 | 1997-08-05 | Bristol Myers Squibb Co | Ctla4変異体分子およびそれの使用 |
JP2001510473A (ja) * | 1997-01-31 | 2001-07-31 | ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー | 可溶性ctla4突然変異分子とその用途 |
JP2004511213A (ja) * | 2000-05-26 | 2004-04-15 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 可溶性ctla4突然変異体分子およびその用途 |
JP2004517806A (ja) * | 2000-07-03 | 2004-06-17 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 可溶性ctla4分子を使用するリウマチ疾患の処置方法 |
JP2004535402A (ja) * | 2001-05-23 | 2004-11-25 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 可溶性ctla4突然変異体分子を使って同種異系島移植片を保護する方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN5009015817; CARRENO, B.M. et al.: JOURNAL OF IMMUNOLOGY Vol.165, No.3, 20000801, P.1352-1356 * |
JPN5009015818; LARSEN, C.P. et al.: AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION Vol.5, No.3, 200503, P.443-453, BLACKWELL MUNKSGAARD * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015523328A (ja) * | 2012-05-11 | 2015-08-13 | メディミューン,エルエルシー | Ctla−4バリアント |
JP2020536552A (ja) * | 2017-10-10 | 2020-12-17 | アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | Ctla−4変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8088736B2 (en) | 2012-01-03 |
AU2007311608A1 (en) | 2008-04-24 |
CA2666778A1 (en) | 2008-04-24 |
EP2076536A2 (en) | 2009-07-08 |
WO2008047150A3 (en) | 2009-01-15 |
GB0620934D0 (en) | 2006-11-29 |
US20100322893A1 (en) | 2010-12-23 |
WO2008047150A2 (en) | 2008-04-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2010506581A (ja) | タンパク質変異体 | |
EP3283508B1 (en) | Immunomodulatory proteins with tunable affinities | |
JP6228971B2 (ja) | Ctla−4バリアント | |
CN103172750B (zh) | 免疫抑制性多肽与核酸 | |
CN107709355B (zh) | 单链cd40受体激动剂蛋白 | |
US8039589B1 (en) | B7-DC variants | |
AU2016323069A1 (en) | Tunable variant immunoglobulin superfamily domains and engineered cell therapy | |
KR20190065189A (ko) | T 세포 수용체 | |
CN112638406A (zh) | 白介素-2变体及其使用方法 | |
CZ20023892A3 (cs) | Rozpustné molekuly mutantu CTLA4 a jejich použití | |
KR20190135546A (ko) | 단일-쇄 trail-수용체 작용제 단백질 | |
CN113474367A (zh) | 结合cd3和hla-a*02限制性肽的半衰期延长的immtac | |
KR20210010896A (ko) | 이기능성 결합 폴리펩타이드 | |
CN114728040A (zh) | 新型白介素-2变体及其双功能融合分子 | |
CN113795502B (zh) | Cd80变体蛋白及其应用 | |
JP6980196B2 (ja) | Hla−b57オープンコンフォーマー | |
AU2016341402A1 (en) | Single-chain GITR-receptor agonist proteins | |
CN110115758B (zh) | Pik3ip1蛋白在调节t细胞反应和制备抗肿瘤药物中的应用 | |
KR20240053675A (ko) | sBCMA 변이체 및 이의 FC 융합 단백질을 이용한 IgA, IgM 및/또는 IgG의 생산 감소 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101022 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101022 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20121016 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121017 |
|
AA92 | Notification that decision to refuse application was cancelled |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971092 Effective date: 20121030 |