JP2004248677A - Ctla4分子及びil4結合分子並びにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 リンパ球とB7との相互作用をブロックすることにより免疫応答を制御するために使用するためのIL−4−結合分子及びCTLA−4結合分子を含んで成る組成物。
【選択図】 なし
Description
T細胞のアクセサリー分子CD8およびCD4は、それぞれ、MHC クラスI(Norment ら、Nature 336:79-81 (1988)) およびクラスII(Doyle およびStrominger, Nature 330 : 256-259 (1987))分子との相互作用により、T細胞の付着を強化する。「ホーミング・レセプター(homing receptor)」はリンパ球の移動のコントロールのために重要である(Stoolman, Cell 56 : 907-910 (1989)) 。
CD28はB細胞活性化抗原であるB7/BB−1のための対レセプターであることが研究において示された(Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5031-5035 (1990)) 。便宜上、B7/BB−1抗原を以後「B7抗原」と呼ぶ。
B7リガンドはまた免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員であるが、しかしそれらの細胞外領域中の2つのIgドメイン、CD28及びCTLA4とは異り、N−末端可変(V)−様ドメインであって、これに定常(C)−様ドメインが続く。
B7陽性CHO 細胞によるT細胞の刺激は、また、IL−2のための転写レベルの増加を特異的に刺激する。追加の研究において、抗CD28mAb は、ある種のT細胞白血病細胞系においてB細胞系白血病系統との細胞の相互作用により誘発されたIL−2の生産を阻止することが示された(Kohno ら、Cell Immunol. 131-1-10 (1990))。
このヒトCTLA4のDNA とCD28タンパク質をエンコードするものとの間の配列の比較は、膜近傍領域および細胞質領域において最高度の相同性をもつ、配列の有意な相同性を明らかにする(Brunetら、1988、前掲;Dariavach ら、1988、前掲)。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーにおける細胞表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現は、CD4, HIV-1のレセプター、およびCD28およびB7のレセプターについて、ハイブリッド融合分子を使用して活性化され、これらのハイブリッド融合分子は抗体ドメインに融合されたCD4 レセプターの細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をエンコードするDNA 配列から成る(免疫グロブリンγ1(Capon ら、Nature 337 : 525-531 (1989)(CD4)およびLinsley ら、J. Exp. Med.、前掲)(CD28 およびB7) 。
本発明のヒトCTLA4レセプタータンパク質は187 アミノ酸によりコードされ、そして新しく同定されたN連鎖グリコシル化部位を包含する。
可溶性ハイブリッド融合タンパク質の例として、本発明は、CD28の細胞外ドメインの断片に相当する第1アミノ酸配列、該第1アミノ酸配列に連結された、CTLA4Igの細胞外ドメインの断片に相当する第2アミノ酸配列、並びにヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列、を有するCD28/CTLA4Igを提供する。
本発明は、また、B7抗原のためのリガーゼを使用する、B7陽性細胞とのT細胞の相互作用を調節する方法を提供する。このようなリガンドは、本発明のCTLA4Ig融合タンパク質、例えば、CTLA4Ig融合タンパク質、その断片または誘導体、可溶性CD28/CTLA4ハイブリッド融合タンパク質、例えばCD28/CTLA4Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
CTLA4融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体およびCD28/CTLA4Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を、細胞の相互作用の調節における使用について記載する。
さらに、本発明は、免疫応答を調節するためB7相互作用を遮断するための方法を提供する。この方法には、B7−結合分子及びIL4結合分子とリンパ球を接触させる段階が含まれている。
さらに、本発明は、B7−結合分子及びIL4−結合分子とB7陽性リンパ球を接触させる段階を含む免疫応答を調節するための方法を提供する。
本発明はさらに、患者に対しB7−結合分子及びIL4−結合分子を投与する段階を含む、患者体内の移植片対宿主病を阻害するための方法をも提供する。
定義
本出願中で使用する以下の語い又は熟語は規定通りの意味を有する。
ここで用いる「B7相互作用を遮断する」というのは、CD28及び/又はCTLA4といったそのリガンドに対するB7抗原の結合に干渉しかくしてT細胞とB細胞の相互作用を妨害することを意味する。
本明細書で使用する場合、「B7−結合分子」はB7抗原を結合するあらゆる分子のことを意味する。
本明細書で使用する場合、「IL4結合分子」は、IL4を認識しこれに結合することになるあらゆる分子のことを意味する。
本明細書において使用する場合、「CD28変異体」はCD28の細胞外ドメインのアミノ酸配列に類似するアミノ酸を有する分子であって、B7抗原を認識しそしてそれに結合する分子を意味する。
本明細書において使用する場合「CTLA4/CD28ハイブリッド融合タンパク質」は、CTLA4及びCD28の両者の細胞外ドメインの少なくとも部分を有する分子であって、B7抗原を認識しそしてそれに結合する分子である。
本書で記述する発明をより良く理解することができるように、以下の説明を提供する。
本発明は、B7−結合分子及びIL4結合分子とリンパ球を接触させることを含む、免疫応答を調節するべくB7相互作用を遮断するための方法を提供する。リンパ球は、B7陽性リンパ球であってよい。
免疫応答は、抗体産生の阻害という結果をもたらすB細胞応答でありうる。付加的には、免疫応答は、細胞性免疫の阻害を結果としてもたらすT細胞応答であってもよい。さらに免疫応答は、リンパ球増殖の阻害であってもよい。
同様に、本発明は、移植組織の被移植者である患者による組織移植片の拒絶を阻害するための方法をも提供する。この方法は、患者に対してB7−結合分子及びIL4−結合分子を投与することを含むことができる。
本発明の態様に従うと、CTLA4結合分子はCTLA4Ig融合タンパク質であってよい。例えば、CTLA4Ig融合タンパク質は、CTLA4の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列のほぼ位置1から位置125 までのアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリンCγ1のヒンジ、CH2及びCH3領域に対応するアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を有する融合タンパク質でありうる。
CTLA4Ig融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA は、ブダベスト条約の規定に従いアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collcction)(ATCC) (米国マリイランド州ロックビレ)に1991年5月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号68629 を与えられた。
B7抗原はT細胞上のCD28レセプターのためのリガンドであることが示された(Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、前掲)。CTLA4レセプター分子はCD28レセプターに機能的にかつ構造的に関係すると思われる;両者はB細胞活性化抗原のためのレセプターであるが、CTLA4は、リンパ系付着系についてこれまで報告された最高のもの中で、B7に対するより高い親和性を有するように思われる。
こうして、このタンパク質が得られ、このタンパク質は、CD28の細胞外ドメインの断片に相当するアミノ酸残基を含有する第1アミノ酸配列、この第1アミノ酸配列に連結された、CTLA4Igの細胞外ドメインの断片に相当する第2アミノ酸配列、並びにヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列を有する。
本発明のCTLA4Igを特性決定しかつCD28/CTLA4ハイブリッド融合タンパク質を調製するためのCD28IgCγ1およびB7IgCγ1に相当する融合タンパク質の構成体を、Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991)(これを引用によって加える)に記載されているように調製した。あるいは、B7抗原およびCD28レセプターを発現する細胞から、これらのタンパク質について発表された知識(AruffoおよびSccd、およびFreeman 、前掲)に基づいて標準的手順を使用して、cDNAクローンを調製することができる。
遺伝的情報を細胞の中に導入する他の手順は疑いなく開発されるであろうから、上に列挙したトランスフェクションの技術は網羅的であると考えられない。
チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA4Ig−24と表示する本発明の安定なCHO 系はCTLA4Igの発現のために好ましく、そしてブダベスト条約の規定に従いATCCに1991年5月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号10762 を与えられた。
生ずる構成体の配列は、既知の手順、例えば、Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463 (1977) に記載されている、さらにMcssing ら、Nucleic Acids Res. 9 : 309 (1981) に記載されている手順を使用するDNA の配列決定によるか、あるいはMaxam ら、Mcthods Enzymol. 65 : 499 (1980)の方法により確証される。
前述したように、CD28およびCTLA4レセプターの遺伝子は、切頭タンパク質をエンコードするDNA の直接の発現を使用して成熟タンパク質として容易に発現されない。ホモ2量体の形成を可能とするために、CD28およびCTLA4の細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例えば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中のオンコスタチインMの配列のためのコドンを含むアミノ酸配列をエンコードするDNA を、天然に2量体のタンパク質のFcドメインに相当するアミノ酸配列をエンコードするDNA と融合する。
CTLA4Ig融合タンパク質および/またはその融合タンパク質の断片を使用してB7陽性細胞、例えば、B細胞と反応させて、B7抗原陽性細胞とのT細胞の相互作用により仲介される免疫応答を調節することができ、あるいは、インビトロで、白血球のタイプ分けのために使用してB細胞成熟段階及び/又はB細胞関連疾患を定義することができる(Yokochiら、J. Immunol. 128 (2) : 823)。白血球の表面免疫染色は、免疫蛍光法又は免疫酵素法により行われるが、他の検出手段も可能である。
融合タンパク質のin vivo 導入は、T細胞と他の細胞、例えば、B細胞との相互作用を、B7陽性細胞へのリガンドの結合の結果として、妨害することが期待される。正常のT細胞の相互作用の防止は、T細胞の活性を減少し、例えば、T細胞の増殖を減少することができる。
これらの技術は、特定の抗体を生産するようにプライミングした動物の使用を包含する。動物は免疫原(例えば、B7Ig融合タンパク質、CTLA4Ig融合タンパク質またはCD28Ig/CTLA4Igハイブリッド融合タンパク質)の注入によりプライミングして、所望の免疫応答、すなわち、プライミングされた動物からの抗体の生産を引き出すことができる。また、プライミングされた動物は疾患を発現する動物である。
一般に、個々の細胞系を、例えば、実験室用容器の中でin vivo 増殖させ、そして高い濃度の単一の特定のモノクローナル抗体を含有する培地をデカンテーション、濾過または遠心により収穫することができる。
他の態様において、CTLA4Ig融合タンパク質を使用して、CTLA4とB7抗原との間の相互作用を調節できる追加の化合物を同定することができる。このような化合物は、B細胞および/またはT細胞と反応させるために使用できる天然に見いだされる小さい分子を包含することができる。
ここで記述されているB7結合分子及びIL4結合分子は、溶液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座薬、重合体マイクロカプセル又は微小嚢、リポソーム及び注射液又は輸液を含むもののこれらに限定されるわけではないさまざまな用量決定形態をしていてよい。好ましい形態は、投与様式及び治療的利用分野によって異なる。
表面積1m2 あたりのmg数に基づくさまざまなサイズ及び種の動物及び人間に対する服用量の相互関係は、Freireich, E. J et al.によって記述されている(マウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル及びヒトにおける抗ガン剤の毒性の定量比較、Cancer Chemother, Rep., 50, No.4, 219-244, 1966 年5月)。
発明の利点:本発明は、組織又は器官の移植片の拒絶を防止することに向けられた現行の療法に付随する問題を克服する。現行の療法とは対照的に、本発明はB7相互作用により媒介される免疫応答のみに影響を及ぼす。
次の実施例によって、本発明をさらに説明しかつ当業者による本発明の実施および使用を助ける。これらの実施例は本発明を限定しない。
レセプター−免疫グロブリンCγ(IgCγ)融合タンパク質B7Ig及びCD28Igを、本発明において引用により組込まれる、Linsley など., J. Exp. Med. 173 : 721 〜730 (1991)により記載されているようにして調製した。簡単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質(たとえばB7)に対応するアミノ酸配列をコードするDNA を、ヒトIgCγ1のヒンジ、CH2及びCH3領域に対応するアミノ酸配列をコードするDNA に連結した。これは次のようにして達成される。
PCR のために、DNA フラグメントを、個々の融合タンパク質について下記のようにしてプライマー対を用いて増幅した。PCR 反応(0.1mlの最終体積)を、Tag ポリメラーゼ緩衝液(Stratagene, La Jolla, CA)において行ない、ここで前記緩衝液は、個々のdNTP20μモル;前記に示されたプライマー50〜100 pモル;鋳型(引用により本明細書において組込まれる、Kauasaki, PCR Protocols, Academic Press, 21 〜27ページ(1990)により記載されるようにして、ランダムヘキサマープライマーを用いて合計≦1μgのRNA から合成されたプラスミド又はcDNA1ng);及びTag ポリメラーゼ(Stratagene) を含んだ。反応は、16〜30回のサイクル(典型的なサイクルは、94℃で1分、50℃で1〜2分及び72℃で1〜3分の段階から成る)のためにサーモサイクラー(Perkin Elmer Corp. Norwalk, CT) 上で行なわれた。
Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573 (1987)により記載されるような、CD28をコードするcDNAを含む発現プラスミドが、Drs. Aruffo and Seed (Mass General Hospital Boston, MA) により供給された。Aruffo, Cell 61 : 1303 (1990)により記載されるような、CD5をコードするcDNAを含むプラスミドがDr. Aruffoにより供給された。Freeman など.,J. Immunol. 143 : 2714(1989)により記載されるような、B7をコードするcDNAを含むプラスミドは、Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA)により供給された。
ヒトIgCγ1配列に対応する融合構成体の3′部分を、鋳型として、ヒト−マウスキメラmAB L6を生成する骨髄細胞系(Dr. P. Fell and M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Conyany, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WAにより供給される)からのRNA を用いて、連結された逆転写酵素(トリ骨髄芽症ウィルスからの;Life Sciences Associates, Bayport, NY)-PCR反応により製造した。
AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG(配列番号4)を前方プライマー及びCTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (配列番号5)を逆方向プライマーとして使用した。反応生成物をBal I及びXba Iにより切断し、そしてゲル精製した。
CD5Igを、前方プライマーとして
CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (配列番号6)及び逆方向プライマーとしてATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (配列番号7)を用いて、同じ態様で構成した。PCR 生成物を制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして上記のようにしてIgCγ1フラグメントにより連結した。
COS(モンキー腎細胞)を、引用により本発明に組込まれる、Seed and Aruffo (Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 3365 (1987))の方法の変法を用いて、CD28及びB7を発現する発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクトする18〜24時間前、10cmの直径の培養皿当たり106 個で接種した。
トランスフェクトされたCHO 又はCOS 細胞又は活性化されたT細胞を、間接的免疫染色法により分析した。染色の前、CHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBS におけるインキュベーションによりそれらの培養器から除去した。細胞をまず、ネズミmAbs9.3 (Hansenなど., Immunogenetics 10 : 247 (1980))又はBB−1(Yokochi など., J. Immunol. 128 : 823 (1981))と共に、又はIg融合タンパク質(10%のFCS を含むDMEMにおいて10μg/mlで)と共に4℃で1〜2時間インキュベートした。
トランスフェクトされたCOS 細胞からの古い血清フリー培養培地の第1,第2及び第3回収集物を、Ig融合タンパク質の精製のための源として使用した。高速遠心分離により細胞残髄物を除去した後、培地を、0.05Mのクエン酸ナトリウム溶液(pH8.0)により平衡化された、固定されたプロテインA(Repligen Corp., Cambridge, MA)のカラム(約200 〜400 mlの培地/ml充填層体積)に適用した。
CTLA4の細胞外ドメインとIgCγ1ドメインとの間にCTLA4Igをコードする可溶性遺伝子融合体を、CD28Ig構成体についての上記方法に類似する方法で構成した。CTLA4遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列(Dariarach など., Eur. Jour. Immunol. 18 : 1901〜1905 (1988))に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR によりクローン化した。
CTLA4のためのシグナルペプチドはCTLA4遺伝子において同定されていないので、CTLA4の示された配列のN−末端を、オーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて2段階で、オンコスタチインM(Melik など., Mol. and Cell. Biol. 9 : 2847 (1989))のシグナルペプチドに融合せしめた。
CTLA4Igのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む発現プラスミド構成体(πLN又はCDM8)を、標準方法を用いてのリポフェクションによりdhfr- CHO 系中にトランスフェクトし、CTLA4Igを安定して発現する新規細胞系を得た。
チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA4Ig−24と称する、CTLA4Igを発現する好ましい安定性のトランスフェクタントを、免疫染色法を用いて、培地におけるB7結合活性についてB7陽性CHO 細胞系をスクリーンすることによって製造した。トランスフェクタントは、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.2 mMのプロリン及び1μMのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持された。
CTLA4Igを、血清フリーに条件付けられた上清液からプロテインAクロマトグラフィー処理により精製した(図2)。CTLA4Igの濃度を、280 nmで1.6 の吸光係数(既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により実験的に決定された)を仮定して、決定した。CTLA4Igのサンプル(1μg)(レーン2及び4)及び分子量標準(レーン1及び3、図2)を、非還元条件(−βME、レーン1及び2)又は還元条件(+βME、レーン3及び4)下でSDS-PAGE(4〜12%のアクリルアミドグラジエント)にゆだねた。タンパク質は、クーマシーブリリアンドブルーによる染色により可視化された。
十分な長さのヒトCTLA4遺伝子に対応するアミノ酸をコードするDNA を再構成するために、CTLA4のトランスメンブラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAを、PCR によりクローン化し、そして次に、CTLA4のN−末端に融合されるオンコスタチンMシグナルペプチドに対応する、CTLA4Igからのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAにより連結した。PCR のための方法、及び細胞培養及びトランスフェクションは、COS 細胞及びDEAE−デキストラン トランスフェクションを用いて、例1に記載されている通りであった。
この目的のためには、オリゴヌクレオチド、GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (配列番号11)(推定されるコード配列に初めの11個のアミノ酸をコードする)を、前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (配列番号12)CTLA4における最後の8個のアミノ酸に相同であり、且つXba I部位を含む)を使用した。
CTLA4Ig構成体を特徴づけるために、いくつかの単離体、CD28Ig,B7Ig及びCD5Igを上記のようにして調製し、そして例2及び3に記載されるようにしてCOS 細胞をトランスフェクトし、そしてB7Igの結合のためにFACS(R)分析により試験した。上記構成体の他に、Aruffo and Seed (EMBO Jour. 6 : 3313〜3316 (198)) により記載されるようなCD7をコードするcDNAを含むCDM8プラスミドをまた使用した。
染色の前、COS 又はCHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBS においてインキュベートすることによってそれらの培養容器から除去した。細胞をまず、mAbs又はIg融合タンパク質と共に、10%FBS を含むDMEMにおいて10μg/mlで4℃で1〜2時間インキュベートした。
末梢血液リンパ球(PBLs)を、リンパ球分離媒体(Litton Bionetics, Kensington, MD) を通しての遠心分離により単離した。アロ反応性T細胞を、一次混合リンパ球反応(MLR)におけるPBL の刺激により単離した。PBL を、106 /mlの照射された(5000ラド)T51 LCL で培養した。EBV-形質転換リンパ球芽細胞系(LCL),PM(Bristol-Myers Squibb Co.) 及びT51 (Bristol-Myers Squibb Co.)を、10%FBS により補充されたRPMIに維持した。
細胞を、125Iにより表面ラベル化し、そして免疫沈殿分析にゆだねた。簡単に言及すれば、PHA-活性化されたT細胞を、Vitetta など., J. Exp. Med. 134 : 242 (1971)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるように、ラクトペルオキシターゼ及びH2O2を用いて125Iにより表面ラベル化した。
SDS-PAGEクロマトグラフィー処理を、5%のアクリルアミドの積み重ねゲルを有する直線アクリルアミドグラジエントゲル上で行なった。ゲルをクーマシーブルにより染色し、脱色し、そして写真を取り、又は乾燥せしめ、そしてX線フィルム(Kodak XAR-5)に露光せしめた。
B7Igを、約2×106 cpm/pモルの比活性に125Iによりラベルした。96のウェルのプラスチック皿を、CTLA4Ig(10mMのトリス(pH8)0.05mlの体積において0.5 μg)を含む溶液により16〜24時間、被覆した。ウェルを、競争体の存在又は不在下で、125I B7Ig (約5×105 cpm)を含む溶液(0.09ml)の添加の前、結合緩衝液(50mMのBES (Sigma Chemical Co), pH6.8, 0.1%BAS 及び10%FCS を含むDMEM) によりブロックした。23℃で2〜3時間のインキュベーションに続いて、ウェルを結合緩衝液により1度洗浄し、そしてPBS により4度洗浄した。次に、結合された放射能を0.5 NのNaOHの添加により溶解し、そしてr計数により定量化した。
完全なヒトCTLA4DNA 遺伝子をコードするOMCTLA4構成体の官能多活性が、図4に示される実験に示される。COS 細胞を、上記のようにして発現プラスミドCD7,OMCD28及びOMCTLA4によりトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を集め、そして培地のみ(添加なし)と共に又はmAbs 9.3,B7Ig,CD5Ig又はG3−7と共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、そして結合性を、FITC−接合ヤギ抗−マウスIg及びFITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第2段階試薬の混合物により検出した。トランスフェクトされた細胞を、間接的免疫染色法により適切な細胞表面マーカーの発現について試験し、そして螢光を上記のようにしてFACS(R)分析を用いて測定した。
CTLA4Ig及びB7の結合をさらに特徴づけるために、B7+ CHO 細胞及びリンパ芽球細胞系(PM LCL) 上への精製されたCTLA4Igの結合活性を、図5に示される実験において測定した。増幅された、トランスフェクトされたCHO 細胞系及びPM LCLを、培地のみ(添加なし)又はCD5Ig,CD28Ig又はCTLA4Igの同濃度のヒトIgCγ1−含有タンパク質(10μg/ml)と共にインキュベートした。結合性を、FITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第二段階試薬の添加に続いて、FACS(R)により検出した。合計10,000個の染色された細胞を、FACS(R)により分析した。
次に、CTLA4IgとB7Igとの間の相互作用の見掛け親和性を、固相競争結合アッセイを用いて測定した。96−ウェルプラスチック皿を、上記のようにしてCTLA4Igにより被覆した。B7Igを125I(5×105 cpm, 2×106 cpm/pモル)により放射ラベルし、そして添加し、示される濃度(図6を参照のこと)のラベルされていないキメラmAb L6, mAb 9.3, mAb BB−1又はB7Igの存在下で、4nMの濃度にした。
増殖の阻害
これまでの研究は、抗−CD28 mAb, 9.3 及び抗−B7mAb, BB−1が、アロ抗原を表わすB細胞により、アロ抗原特異的Tn の増殖及び免疫グロブリン分泌を阻害することを示している(Damle,など., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096 (1981);Lesslauer など., Eur. J. Immunol. 16 : 1289 (1986)) 。CTLA4は本明細書に示されるようにB7抗原のために高い親和性レセプターであるので、可溶性CTLA4Igは、それらの応答を阻害するその能力について試験された。T細胞増殖に対するCTLA4Igの効果は、図9に示される実験で試験された。
B7Ig及びCD28Igは、高濃度でさえ、MLR を有意に阻害しなかった。他の実験においては、CTLA4Igと共にB7Igの添加は、CTLA4IgによるMLR の阻害を一部克服し、この事は、その阻害がB7抗原との特異的な相互作用によることを示唆する。
ヘルパーT細胞(Tn )−誘発性免疫グロブリン分泌に対するCTLA4Igの効果をまた試験した(図10)。CD4+ T細胞を、上記のようにして、指示された免疫グロブリン分子の存在又は不在下で、同種CD19+ B細胞と共に混合した。ネズミmAbs OKT8, 9.3及びBB−1を20μg/mlで添加し、そしてIg融合タンパク質を10μg/mlで添加した。6日間の培養の後、培養上清液におけるヒトIgM の濃度(SEM <5%)を、上記のようにして酵素イムノアッセイ(ELISA)により測定した。CD4+ T細胞の不在下で培養されたB細胞によるIgM 生成は11ng/mlであった。
それらの結果は、CTLA4転写体の官能的タンパク質生成物の最初の発現を示す。CTLA4Ig、すなわちIgCγ1ドメインに融合されるCTLA4の細胞外ドメインを含む融合構成体は、約50,000サブユニットのMrのジスルフィド結合ダイマーを形成する(図1)。鎖間ジスルフィドはこの融合のIg部分において形成することが予期されないので、CTLA4からのシステインはジスルフィト結合形成に包含される。同種CD28Ig融合タンパク質(Linsley など, 前記,1991)はまた鎖間ジスルフィド結合を含む。
生後6〜8週間の雌のBALB/c (H-2d ) 及び C57BL/6 (H-2d ) マウスを、The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) から得た。
記述されたとおり、コラゲナーゼ消化の後ヒト膵島細胞を精製した(C. Ricordi et al. 移植 52:519 (1991);A. G. Tzakis et al. Lancet 336:402 (1990);C. Ricordi, P. E. Lacy, E. H. Finke, B. J. Olack, D. W. Scharp, 糖尿病 37:413 (1988)) 。
各々のマウスは、左副腎の下に直径150 μmの約800 個の新鮮なヒト膵島を受けた (D. Faustman and C. Coe, Science 252 :1700 (1991) ;Y. J. Zeng et al. 移植 53:277 (1992)) 。処置は、移植直後に開始された。
移植直後連続14日間、動物を10μgのCTLA4Igで処置した(n=7)(図12) 。7匹のうち3匹の動物がその移植片を80日以上維持した。残りの4匹の動物は12.75 日という平均移植片生残期間を有していた。
ヒト膵島細胞の移植を受けた腎臓に対して組織検査を行なった(図14) 。スライドを無差別に分析した。
移植後29日目のヒト膵島移植を受けた対照マウスのヘマトキシリン及びエオシン染色は、大きいリンパ球浸潤を示した (図14のA)。インシュリンについて染色された同じ組織は、検出可能なインシュリン産生を全く示さなかった(図14のB)。
最初の移植の時点で凍結されていたこれらの膵島を解凍し、膵島の機能を確認するため移植より前3日間にわたり培養した。ストレプトゾトシンで処置され280 mg/dlという非絶食グルコースレベルを示したB10マウスを対照として用いた( 実線)(図16) 。移植後はいかなる処置も施さなかった。
マウスの膵島のB dell 機能を除去するため、 C57BL/6 (B6)又は C57BL/10 (B10)マウスをストレプトゾトシンで処置した。副腎下で糖尿病の動物に対して移植を施し、外科手術後直ちに処置を開始した。血中グルコース濃度の分析により膵島移植片の生残を監視した。
これとは対照的に、CTLA4Igでの処置を受けた動物 (14日間1日14μg) における膵島拒絶は遅らされ、7匹の動物のうち5匹は平均移植片生残期間の穏やかな延長を示し (12.75 日) 、一方残りの3匹の動物は80日以上の間正常なグルコースレベルを維持した (図12) 。活発な細胞拒絶の証拠は全く観察されなかったため、グルコース濃度におけるこの増大は膵島消耗の結果でありうる。
その後の実験においては、約14日間隔日で動物一匹あたりのCTLA4Ig用量は50μgまで増大された。この処置の結果、100 %の動物は拒絶発症の兆候を全く示さず実験全体を通して正常な膵島機能を維持することになった (図13) 。
対照 (PBS 処置された)マウス及びCTLA4Ig処置されたマウスからの膵島異種移植片の経時的分析を行なった(図14) 。対照動物からの膵島組織は、移植片内への著しいリンパ球浸潤物を伴い、膵島をほとんど残さない状態で、免疫拒絶の証拠を示した (図14のA)。
移植片は、数多くの膵島が見える状態で無傷であった。さらに、ヒト膵島組織内に見られるB細胞はヒトインシュリン(図14のD)及びソマトスタチンを産生した。
記述通りマウスを移植し、次に移植後14日間隔日にヒトB7に対するMAb 50μgを用いて処置した。この処置は、対照マウスに対するものに比べて処置を受けたマウスにおける移植片生残期間を延長した (9日から50日以上にまで)(図15) 。抗B7MAb はCTLA4Igと同じように有効に拒絶を遮断することができない。
生後6〜8週目の雌のBALB/c (H-2d ) 及び C57BL/6 (H-2d ) マウスを、Jackson Laboratory (BarHarbor, ME)から入手した。
モノクローナル抗体11B11 は、ラットIgG1抗マウスIL−4である(Ohara, J.,及びW. E. Paul, 1985, B細胞刺激因子−1に対するモノクローナル抗体の産生とその分子特徴づけ。Nature 315:333) (Verax (Lebanon, NH))。
バックグラウンドの5倍のA450 を与える希釈液として、血清抗体力価を計算した。図15からの血清抗体力価値は、1グループにつき5匹のマウスからのプールした血清から決定されており、一方図16からの血清抗体力価値は5つの個々の血清の平均力価を表わしている。矢印は、46日目におけるSRBC又はKLH 注射を表わす。
図17は、CTLA4Ig及び抗−IL4の同時注射を受け0日目及び46日目にSRBCの注射を受けたマウスにおいて血清抗体力価の上昇が全く存在しない (すなわち、一次的又は二次的免疫応答が全くない) ことを示している。CTLA4Ig及び抗−IL4 の組合せは、一次及び二次免疫応答を抑制し、SRBCに対する長く持続する免疫学的不応答を誘導する。
部位特異的な相同性突然変異誘発により、我々は、B7−1に対するその活性度の高い結合にとって必要であるCTLA4Ig内の領域を同定した。以下に記すのは、B7を結合する可溶性CTLA4/CD28ハイブリッド融合タンパク質の作り方の説明である。
モノクローナル抗体(mAbs)。前述のとおり、CTLA4に特異的なマウスのmAb を調製し特徴づけした(Linsley et al.,J. Ex. Med., (1992) 176 :1595-1604)。抗体9.3 (抗−CD28)については以前に記述されてきた(Hansen et al., Immunogenetics 10 :247-260 (1980)) 。
安定した形でトランスフェクションを受けたB7−1陽性 CHO細胞の調製については、以前に記述されてきた(Linsley et al.,J. Exp. Med. 中、173 :721 〜730(1991) ;P, S, Linsley et al.,J. Exp. Med. 174:561 (1991)) 。
10%のウシ胎児血清(FBS)、0.2 mMのブロリン及び1μMのメトトレキセートで補足されたDMEM中に細胞を維持した。 COS細胞を、10%のFBS で補足されたDMEM内で成長させた。CTLA4Igを前述のとおり CHO細胞内で調製した(例2)。
部位特異的突然変異誘発は、CTLA4の細胞外ドメインがヒト IgG重鎖のヒンジ部及び定常部に遺伝子的に融合されている(例2)CTLA4の可溶性キメラ形(CTLA4Ig)をコードするベクターに対して行なわれた。CTLA4Ig部位と部位特異的突然変異体は、重複するオリゴヌクレオチドプライマ内の望まれる突然変異をコードし、鋳型としてCTLA4Igプラスミド構成体を用いてPCR (Ho et al.,1989, 前出)により突然変異体を生成することによって調製された。
推定上の CDR3様ドメイン(図19〜21及び26)の一部を成すきわめて保存度の高いヘキサペプチド98MYPPPY103 の中のアラニンに対する置換をコードする6つの突然変異体を調製した(Ho. et al. ,1989, 前出)。これらの突然変異体については、表IIに記述されている。
PCR反応のために必要とされるものの、突然変異を導入するためには必要とされないプライマ−には、(1) CDM8スタッファ(中火部断片)領域の5′未満でHind III制限部位の上流の相補的配列をコードする CDM8順方向( CDM8FP) プライマ−及び(2) CDM8スタッファ領域の3′未満で XbaI部位の下流の相補的配列をコードする逆方向プライマ(CDM8RP)が含まれていた。
CDM8FP:5′−AATACGACTCACTATAGG
CDM8RP:5′−CACCACACTGTATTAACC
PCR条件は、94℃で6分とそれに続く94℃で1分、55℃で2分及び72℃で3分の25サイクルから成っていた。売り主(Perkin Elmer Cetus, Emeryville,CA) により提案されている通りに、Taq ポリメラーゼ及び反応条件を使用した。 PCR産物をHind III及び XbaIで消化し、Hind III/ XbaI−切断された CDM8発現ベクターに連結させた。
COS細胞の中にプラスミドをトランスフェクションし(Aruffo et al.,Cell 61 :1303 (1990))、結果として得られるIg突然変異体融合タンパク質のための供給源として、順化培地を使用した。
以下に示すのは、作製されたCTLA4/CD28ハイブリッド融合タンパク質のリストである。
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HS1 CTLA4 CD28の1〜24
CD28の93〜125
HS2 CD28 CTLA4の1〜22
CTLA4の96〜125
HS3 CTLA4 CD28の96〜125
HS4 CD28 CTLA4の96〜123
HS4A CD28 CTLA4の96〜113
HS4B CD28 CTLA4の114 〜123
HS5 CD28 CTLA4の25〜32
HS6 CTLA4 CD28の25〜32
HS7 CD28 CTLA4の96〜123
CTLA4の25〜32
HS8 CD28 CTLA4の25〜32
CTLA4の96〜113
HS9 CD28 CTLA4の25〜32
CTLA4の114 〜123
HS10 CD28 CTLA4の96〜123
CTLA4の51〜58
HS11 CD28 CTLA4の25〜32
CTLA4の51〜58
CTLA4の96〜123
HS12 CD28 CTLA4の51〜58
CTLA4の96〜113
HS13 CD28 CTLA4の25〜32
CTLA4の51〜58
CTLA4の96〜113
HS14 CD28 CTLA4の51〜58
CTLA4Ig内の CDR−1様の領域がCD28Igからの等価領域を置換された点を除いて、上述のものと類似した要領でHS6ハイブリッドを調製した。
それぞれHS4,HS4−A及びHS4−Bの約350 塩基対のHind III/ HpaI5′フラグメントをHS5から同様に消化された等価cDNAと置換しかくしてCTLA4の CDR1様のループをすでにCTLA4 CDR3様領域を含むハイブリッド内に導入することによって、HS7,HS8及びHS9構成体をそれぞれ調製した。
従って、HS4はHS10を作るための鋳型として役立った。HS7はHS11を作るための鋳型として役立った。HS4−AはHS12を作るための鋳型として役立った。そしてHS8はHS13を作るための鋳型として役立った(図23及び表I)。上述の CDM8プライマ−をこれらの構築においても使用した。
これらの変化を導入するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマ−を、その他の突然変異体について記述されたものと同じ PCR突然変異誘発を重複する上で利用した。
PCR反応及び CDM8へのサブクローニングは、上述の通りに行なった。ここでも全ての突然変異体は、ジデオキシ鎖終結/拡張反応によって配列決定された。
培地内の結果として得られたIg融合タンパク質の定量
血清を含まない COS細胞培地の中に存在するIgの量を決定することにより、酵素免疫検定において可溶性突然変異融合タンパク質を定量した。
融合タンパク質を含む COS細胞培地をさまざまな希釈度で付加し、22℃で1時間インキュベートした。標準曲線のため、各平板上の分離したウエルに対して既知の濃度のCTLA4Igも付加した。
既知の濃度のCTLA4Igの標準曲線との比較により、突然変異体Ig融合タンパク質の濃度を決定した。
培地中に存在するCTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質を、4℃で一晩インキュベートすることによりプロテインA−セファロースに吸着させた。溶球を0.1 %のNonidet-P40 (NP40)を含むPBS で洗浄し、次にSDSPAGE 試料緩衝液を付加し、溶出したタンパク質をSDS ポリアクリルアミドゲル上に投入した。
ニトロセルロース上へのタンパク質のウエスタンブロットトランスファを、標準的手順により実施した。その後ニトロセルロース膜を、0.1 %のNP40及び1%の脱脂粉乳を含むPBS を用いて遮断した。
PBS-Tw内での洗浄の後、膜を1:1,000 の割合で希釈されたアルカリホスファターゼでコンジュゲートされたヤギ抗ヒトIgG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) を用いて1時間22℃でインキュベートした。次にブロットを標準的手順を用いて洗浄し展開させた。
CTLA4Ig突然変異体融合タンパク質及びCTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質が有する、 CHO細胞上で安定した形で発現されたB7−1を結合する能力は、酵素免疫検定によって決定された。
丸底の組織培養処理された96ウエルのマイクロタイター平板(Corning, Corning-NY)に1ウエルにつき103 の細胞の割合でB7−1陽性 CHO細胞を播種した。2日後に、集密的細胞を、15分間95%のエタノール中で定着させた。
PBS-Twでの洗浄の後、さまざまな濃度で突然変異体Ig融合タンパク質を付加し、これを4℃で1時間インキュベートした。洗浄後、1:10,000で希釈したHRP コンジュゲートされたヤギ−抗ヒトIgG (Tago) を付加し、1時間22℃でインキュベートした。
次にウエルを洗浄し、上述のとおりTMB 基質を付加し、30分間反応させてから、1NのH2SO4 を用いて反応を停止させた。ウエルの吸光度を450nm で測定した。
間接的酵素免疫検定により、B7−1に結合するその能力について、CD28Igの部位特異的突然変異体融合タンパク質を検定した。
ELISA 平板のウエルを、4℃で16時間5μg/mlの割合でマウス IgG1 Fc 領域に融合されたヒトB7−1の細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質でコーティングした。ウエルを1時間標本希釈剤(Genetic Systems) で遮断し、次にPBS-Twで洗浄した。突然変異体融合タンパク質を既知の濃度で含む COS細胞培地をさまざまな濃度で付加し、22℃で1時間インキュベートした。
既知の濃度のCD28Igも同様に各平板上の分離したウエルに付加した。洗浄の後、1:10,000で希釈した HRPコンジュゲートされたヤギ抗ヒトIgG を付加し、22℃で1時間インキュベートした。 TMB基質を付加し、培地中のIg融合タンパク質の定置について記述された通りに光学密度を読み取った。
CTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質とCTLA4Ig突然変異体融合タンパク質を結合する抗−CTLA4mAb 及び抗−CD28mAb9.3の能力を、酵素免疫検定によって評価した。
マイクロタイター平板のウエル(Immulon 2) を、4℃で16〜24時間0.5 μg/mlのヤギ抗ヒトIgG (Jackson) でコーティングした。平板を標本希釈剤( (Genetic Systems) で1時間遮断し、PBS-Twで洗浄し、次に22℃で1時間Ig融合タンパク質を用いてインキュベートした。洗浄後、ウエルを22℃で1時間1μg/mlでmAb を用いてインキュベートした。
CTLA4分子モデル。IGSF変量様ドメインのコンセンサス残基の保存基づいて、CTLA4細胞外ドメインの近似の三次元モデルを生成した。
かかるIGSFコンセンサス残基を配列アライメントのための「アンカーポイント」として用いて、CTLA4残基を、Ig可変折畳みのA,B,C,C′,C″,D,E,F,Gストランド(Williams/Barclay, 1988,前出)及び連結用ループ領域(図26)に割り当てた。
IGSF可変折畳みとのCTLA4細胞外領域配列の初期アライメントを改善するため3Dプロファイル分析(Luethy et al., 1992, Nature 336 :83-85)を用いてβストランド又はループに対するいくつかの残基を修正済みアライメントを伴うモデルのいくつかのバージョンを試験した。
CTLA4Ig及びCD28Ig突然変異体融合タンパク質の構築及び結合活性。
CD28及びCTLA4のさまざまな相同体の配列アライメントが図19〜21に示されている。図19〜21では、ヒト(H)、マウス(M)、ラット(R)及びニワトリ(Ch) のCD28の配列がヒト及びマウスのCTLA4と整列させられている。残基は、シグナルペプチドをもつ成熟タンパク質N未満から番号づけされ、膜内外ドメインに下線が付加され、 CDR類似領域が記されている。暗影のついた部域は、残基の完全な保存を強調しており、一方明影のついた部域は、全てのグループ構成員における保存的アミノ酸置換を強調している。
この可能性を試験するため、部位特異的アラニン走査突然変異を、 PCRオリゴヌクレオチドプライマ特異的突然変異誘発を用いてCTLA4Igのこの領域の中に導入し、かくして結果としてCTLA4Ig突然変異体融合タンパク質を得た。同様にして、CD28Ig MYPPPYモチーフ内に2つのアラニン突然変異を導入し、かくしてCD28Ig突然変異体融合タンパク質という結果を得た。
安定した形でトランスフェクションを受けた CHO細胞上で発現されたB7−1に結合する各CTLA4Ig突然変異体融合タンパク質の能力を、次に間接的細胞結合免疫検定によって決定した。B7−1に対するCD28Ig突然変異体融合タンパク質の結合は、間接的酵素免疫検定によって評価された。これらの検定の各々については材料と方法の項で記述されている。
MYPPYモチーフはCTLA4Ig及びCD28Igの両方に共通であることから、それだけではCTLA4Ig及びCD28Igについて見られるB7−1に対する結合に関して観察された差異を説明することはできない。活性度の高い結合B7−1に対する比較的低い保存度の残基の貢献を、一連の相同体突然変異体を用いて評価した。
CD28の3つの CDR様領域を、さまざまな組合せで、CTLA4細胞外ドメイン(図23及び表I)からの等価領域と置換した。図23は、CTLA4-Ig との関係におけるB7−1+ CHO細胞に対する結合活性%を示すCTLA4/CD28Ig突然変異体融合タンパク質の地図である。保存されたシステイン残基(C)はそれぞれ位置22,93及び121 に示されている(CTLA4番号付け)。同様に示されているのは、MYPPPYモチーフの位置である。白色部域はCD28配列を表わしている。
合計14のハイブリッドcDNA構成体を調製し、配列決定し COS細胞内にトランスフェクションした。血清を含まない培地内のIg融合タンパク質の濃度を決定し、ウエスタンブロット分析を含むSDS-PAGEによりその電気泳動移動度を比較した。
非還元条件下では、タンパク質は、基本的に100 〜140KDaの間で移動し、このことはすなわちこれらの融合タンパク質がFcのヒンジ部内のシステイン残基の突然変異誘発にもかかわらずジスルフィド結合した2量体として存在したということを表わしている。
B7−1に対するCTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質の結合。部位特異的CTLA4Ig及びCD28Ig突然変異体融合タンパク質を検定するのに用いられたものと同じ間接的細胞結合免疫検定により、B7−1に対するその結合能力について、ハイブリッド融合タンパク質を試験した。
CD28の CDR1様領域(残基25〜32) を含んでいる点を除いてCTLA4Ig配列を表わすHS6構成体は、同様に結合した。しかしながらHS4構成体(HS7と呼ぶ)の中へCTLA4 CDR1−様領域(残基25〜32) の付加的な内容は、さらに改善された結合を示し、結合親和力はCTLA4Igの約44%となる(図23)。
CTLA4/CD28IgハイブリッドHS4−Aは、C末端で拡張された CDR3様領域内でCTLA4Ig残基96〜113 、すなわちHS4よりも9つのCTLA4由来残基だけ少ない残基、をコードした(図23及び表I)。HS4Aは、HS4ほどB7−1 CHO細胞を結合しなかった(図23及び25)。ただし、CTLA4 CDR1様のループ(HS8ハイブリッド)を付加することにより、野生型結合の約2%から60%近くまでB7−1結合が増大した。
もう1つのHS4−Bと呼ばれるハイブリッドは、MYPPPYモチーフとそれに続くCTLA4残基 114〜122 を含むCD28 CDR3様領域をコードした(表I及び図23)。
HS4−B及びHS4−Aは、B7−1に対する類似の結合を示した。しかしながらHS4−Aとは異なり、HS4−B(HS9)内へのCTLA4 CDR1−様ループの内含は結合を改善せず(図23)、CTLA4Ig MYPPPY モチーフの直ぐ隣りの残基が、高活性度の結合において重要な決定要因であることを示唆していた。
CTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質に対するモノクローナル抗体結合。
これらの抗体はP100A 及びP102A に結合できなかった。11D4を除いて(表II)。CTLA4Ig突然変異体融合タンパク質の各々に結合した。7F8 及び10A8はこれらの突然変異体に結合したことから、11D4による結合の欠如はおそらく、11D4により認識されるエピトープを混乱させる突然変異誘発のせいであると考えることができる。
CD28に特異的なmAb9.3(Linsley et al.,(1992)前出)は、CD28部位特異的突然変異体融合タンパク質のいずれにも結合できないかったが、ハイブリッド融合タンパク質HS4,HS4−A,HS7及びHS8に結合した。HS2については、より弱い結合が見られた。HS5及びHS6構成体についてはいかなる結合も見られなかった。
図26は、CTLA4モデルの図表示を表わしている。図19〜21には、 CDR様領域に対するCTLA4残基の割当てが示されている。CTLA4モデルは、CTLA4とIg可変折畳みの類似性を裏付づける残基Cys49 とCys67 の間の付加的な(非Ig)ジスルフィド結合の存在を示唆している。
CTLA4内の2つの考えられるN結合したグリコシル化部位は、Igβ−ストランドフレーム枠領域の溶剤露呈位置に認められる。3D−プロフィール分析は、CTLA4配列が、より遠い関係をもつものの IgV−折畳みと全体的に相容性をもつことを示した。
MYPPPYモチーフは、そのC末端拡張により増大させられると思われかつ非常に可変的な CDR1様領域により特異的に変調される結合のための保存された骨格を表わす。 CDR3及び CDR1様領域は、Ig可変折畳みの中で空間的に隣接している。 CDR2様領域は空間的に遠く隔たり、CD28グループの場合、B7−1への結合に対し大きな貢献を果していない。
本発明が関与する当業者に明らかなように、本発明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示されるもの以外の形で具体化され得る。従って、上記本発明の特定の態様は例示的であると考えられるべきである。本発明の範囲は、例示的であって、本発明を制限するものではない。
Claims (68)
- CD28細胞外ドメイン、又は前記細胞外ドメインのCDR3領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列を含んで成り、ここで前記突然変異が、アミノ酸配列AYPPPY, MAPPPY, MYAPPY, MYPAPY, MYPPAY, PYPPPA又はAAPPPYへのMYPPPYアミノ酸配列の変更である可溶性変異体B7−結合分子。
- 前記B7−結合分子が、CD28分子である請求項1記載の可溶性変異体B7−結合分子。
- 前記B7−結合分子が、CTLA4分子である請求項1記載の可溶性変異体B7−結合分子。
- そのCTLA4細胞外ドメインのCDR3−様領域又はCDR3−様拡張領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部の対応するアミノ酸配列を含んで成るB7抗原を結合する可溶性CTLA4変異体分子。
- そのCTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項4記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- そのCTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項4記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- i.そのCTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
ii. そのCTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項4記載の可溶性CTLA4変異体分子。 - 前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項4記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR1−様領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項5記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR2−様領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項6記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR1−様領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR2−様領域における1又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項5記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- (b)ヒト免疫グロブリンのヒンジ、CH2及びCH3領域のアミノ酸残基を含んで成る第2アミノ酸配列をさらに含んで成る請求項4〜11のいずれか1項記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記ヒト免疫グロブリンがCγ1である請求項12記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4のCDR1−様領域が、位置1でのイソロイシンで開始し、そして位置49でのバリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置58でのロイシンで開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項9記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4のCDR2−様領域が、位置1でのイソロイシンで開始し、そして位置24でのチロシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置33でのフェニルアラニンで開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項10記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4のCDR2−様領域が、位置1でのイソロイシンで開始し、そして位置24でのチロシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置31でのフェニルアラニンで開始し、そして位置115でのイソロイシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項10記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4のCDR1−様領域が、位置1でのイソロイシンで開始し、そして位置115でのイソロイシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項11記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4のCDR1−様領域が、位置1でのイソロイシンで開始し、そして位置24でのチロシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置97でのグルタミン酸で開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項7記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置97でのグルタミン酸で開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項7記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様領域における突然変異が、前記MYPPPYアミノ酸配列における突然変異である請求項1記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記突然変異が、MYPPPY配列におけるアミノ酸残基のいずれかのアニリンによる置換である請求項20記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 前記突然変異が、アミノ酸配列AYPPPY, MAPPPY, MYAPPY, MYPAPY, MYPPAY, PYPPPA又はAAPPPYへの前記MYPPPYアミノ酸配列の変更である請求項20記載の可溶性CTLA4変異体分子。
- 請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子及びIL4結合分子を含んで成る組成物。
- 前記IL4結合分子が、IL4を特異的に認識し、そしてそれに結合するモノクローナル抗体である請求項23記載の組成物。
- 前記IL4結合分子が、可溶性IL4受容体である請求項23記載の組成物。
- リンパ球とのB7相互作用を阻止することによる免疫応答の調節への使用のための、請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 前記リンパ球がB7陽性リンパ球である請求項26記載の医薬組成物。
- 前記免疫応答が、抗体生成の阻害をもたらすB細胞応答又は細胞介在性免疫性の阻害をもたらすT細胞応答であり、又は前記免疫応答がリンパ球増殖の阻害である請求項26記載の医薬組成物。
- 自己免疫疾患の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 同種移植片拒絶の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- アレルギー反応の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 対象における移植片拒絶の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 対象における対宿主性移植片病の阻害のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 対象におけるリウマチ様関節炎の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 癌の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- ウィルス感染の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 前記ウィルス感染が、HIV感染である請求項36記載の医薬組成物。
- 前記ウィルス感染が、HTLV1感染である請求項36記載の医薬組成物。
- 免疫系疾患の処理のための請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- 細胞介在性免疫応答の調節に使用のためへの請求項23〜25のいずれか1項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
- リンパ球とのB7相互作用を阻止することにより免疫応答を調節するためへの使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 前記リンパ球がB7陽性リンパ球である請求項41記載の医薬組成物。
- 前記免疫応答が、抗体生成の阻害をもたらすB細胞応答又は細胞介在性免疫性の阻害をもたらすT細胞応答であり、又は前記免疫応答がリンパ球増殖の阻害である請求項41記載の医薬組成物。
- 移植された組織の受容体である対象における移植片拒絶を阻止することにへの使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 対宿主性移植片病の阻害への使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 免疫系疾患の処理への使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 癌の処理への使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- T細胞増殖の調節への使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- サイトカインレベルの調節への使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 前記サイトカインが、インターロイキンである請求項49記載の医薬組成物。
- 前記サイトカインが、増殖因子である請求項49記載の医薬組成物。
- 前記増殖因子が、腫瘍増殖因子である請求項51記載の医薬組成物。
- 前記増殖因子が、コロニー刺激因子である請求項51記載の医薬組成物。
- 前記増殖因子が、インターフェロンである請求項51記載の医薬組成物。
- 前記増殖因子が、腫瘍懐死因子である請求項51記載の医薬組成物。
- ウィルス感染の処理のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 前記ウィルス感染が、HIV感染である請求項56記載の医薬組成物。
- 前記ウィルス感染が、HTLV1感染である請求項56記載の医薬組成物。
- 細胞−介在性免疫応答の調節への使用のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 自己免疫疾患の処理のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 同種移植片拒絶の処理のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 慢性アレルギー反応の処理のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- 対象におけるリウマチ様関節炎の処理のための請求項1〜22のいずれか1項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
- B7抗原へのB7−結合分子の結合を調節するための方法であって、B7抗原と、請求項1〜22のいずれか1項記載の組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
- B7陽性細胞との機能的CTLA4陽性T細胞相互作用を調節するための方法であって、前記B7陽性細胞と、請求項1〜22のいずれか1項記載の組成物とを、CTLA4との内因性B7抗原の反応を妨げるのに効果的な量で接触せしめることを含んで成る方法。
- 前記B7陽性細胞がB細胞である請求項65記載の方法。
- 前記CTLA4−陽性T細胞と前記B7陽性細胞との相互作用が阻害される請求項65記載の方法。
- B7陽性細胞とのT細胞相互作用により介在される免疫系疾患の処理方法であって、前記B7陽性細胞とのT細胞相互作用を調節するために効果的な量、請求項1〜22のいずれか1項記載の組成物を、対象に投与することを含んで成る方法。
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