JP3722375B2 - Ｃｔｌａ４レセプター、それを含有する融合タンパク質およびそれらの使用 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、CTLA４レセプター遺伝子、前記レセプターとB7抗原を発現する細胞との間の相互作用の同定、およびCTLA４レセプターを含む細胞の相互作用を調節する方法に関する。
発明の背景
脊椎動物の免疫系の特徴は、「自己」と「非自己」とを区別する能力である。この性質は、最適な免疫活性化を達成するために多数のシグナルを必要とする系の進化に導いた（Janeway,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54:1-14(1989)）。Ｔ細胞 Ｂ細胞の相互作用は免疫応答に対して必須である。Ｔ細胞およびＢ細胞上の見いだされる多数の付着分子のレベルは、免疫応答の間に増加する（Springerら、(1987)、前掲；およびShimizu,Current Opinion in Immunology,KindtおよびLong編、1:92-97(1988)）；およびHemler,Immunology Today 9:109-113(1988)）。これらの分子のレベルの増加は、活性化されたＢ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激するとき、休止のＢ細胞よりもいっそう有効である理由の説明を促進することができる（Kaiuchiら、J.Immunol.131:109-114(1983)；Krcigerら、J.Immunol.135:2937-2945(1985)；McKenzie,J.Immunol. 141:2907-2911(1988)；およびHawrylowiczおよびUnanue,J.Immunol.141:4083-4088(1988)）。
Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）の免疫応答の発生は、細胞−細胞の相互作用（Springerら、A.Rev.Immunol. 5:223-252(1987)）、とくにＴ細胞とアクセサリー細胞、例えば、Ｂ細胞との間の相互作用、および可溶性仲介因子（サイトカインまたはリンホカイン）の生産を含む複雑なプロセスである（DinarelloおよびMier,New Engl.Jour.Med. 317:940-945(1987)）。この応答は、Ｔ細胞レセプター複合体（Weissら、Ann.Rev.Innunol. 4:593-619(1986)）および他の「アクセサリー」表面分子（Springerら、(1987)前掲）を含む、いくつかのＴ細胞表面レセプターにより調節される。これらのアクセサリー分子の多数は、細胞の表面上のモノクローナル抗体の反応性により定められる、天然に見いだされる細胞表面の分化（CD）抗原である（McMichacl編、Leukocyte Typing III,Oxford Univ.Press、オックスフォード、ニューヨーク(1987)）。
リンパ球のアクセサリー分子を含む抗原独立の細胞間の相互作用は、免疫応答に対して必須である（Springerら、(1987)前掲）。例えば、Ｔ細胞関連タンパク質CD２のそのリガンドLFA３（広く発現される糖タンパク質（ShawおよびShimuz、前掲の中に概観されている））への結合は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するために重要である（Moigconら、Nature 339:314(1988)）。他の重要な付着系は、リンパ球、マクロファージ収量顆粒球上に見いだされるLFA-１糖タンパク質（Springerら、(1987)前掲；ShawおよびShimuz(1988)前掲）のそのリガンドICAM-１（Makgobaら、Nature 311:86-88(1988)）およびICAM-２（Stauntonら、Nature 339:61-64(1989)）への結合を含む。Ｔ細胞のアクセサリー分子CD８およびCD４は、それぞれ、MHCクラスＩ（Normentら、Nature 336:79-81(1988)）およびクラスII（DoyleおよびStrominger,Nature 330:256-259(1987)）分子との相互作用により、Ｔ細胞の付着を強化する。「ホーミング・レセプター（homing receptor）」はリンパ球の移動のコントロールのために重要である（Stoolman,Cell 56:907-910(1989)）。VLA糖タンパク質は、細胞外マトリックス成分への付着を必要とするリンパ球の機能を仲介するように思われるインテグリン（integrin）である（Hemler、前掲）。CD２／LFA-３，LFA-１／ICAM-１、およびVLA付着系は、広範な種類のタイプの細胞上に存在する（Springerら、(1987)、前掲；ShawおよびShimuz、(1989)、前掲およびHemler、(1988)）、前掲）。
Ｂ−リンパ球の活性化は２つのシグナルを必要とすることがかなり以前に提案され（BretscherおよびCohn,Science 169:1042−1049(1970)）そして現在すべてのリンパ球はそれらの最適な活性化のための２つのシグナル、抗原特異的またはクローナルシグナル、ならびに抗原非特異的シグナルを必要とすると信じられている（Janeway、前掲）。Freemanら（J.Immunol.143(8):2714-2722(1989)）は、mAB B7により認識されるＢ細胞活性化抗原をエンコードするcDNAクローンを単離しそして配列決定した（Freemanら、J.Immunol.138:3260(1987)）。このcDNAでトランスフェクションしたCOS細胞は、標識化mAB B7およびmAB BB−１の両者により染色されることが示された（Clarkら、Human Immunol. 16:100-113(1986)；Yokochiら、J.Immunol.128:823(1981)）；Freemanら、(1989)前掲；およびFreemanら、(1987)、前掲））。さらに、この抗原の発現は他の系統の細胞、例えば、単球上に検出された（Freemanら、前掲）。
Ｔヘルパー細胞（Ｔ_h）抗原の応答のために要求されるシグナルは、抗原を提示する細胞（APC）により提供される。Ｔ細胞レセプター複合体（Weiss,J.Clin,Invest.86:1015(1990)）を、APC上のクラスIIの主要な組織適合性複合体（ＭIIＣ）分子に関係して提示された抗原と相互作用させることによって、第１シグナルは開始される（Allen,Immunol.Today 8:270(1987)）。この抗原特異的シグナルは完全な応答を発生するために不十分であり、そして第２シグナルの存在下に、クローナルの不活性化またはアネルギーに実際に導くことがある（Schwartz,Science 248:1349(1990)）。MHCにより提供される第２「共同刺激（costimulatory）」シグナルについての要件は、ある数の実験の系において証明された（Schwartz，前掲；WeaverおよびUnanue,Immunol.Today 11:49(1990)）。これらの１または２以上のシグナルの分子の性質は完全には理解されないが、ある場合において、可溶性分子、例えば、インターロイキン（IL）−１（WeaverおよびUnanuc，前掲）および細胞間付着に関係する膜レセプターの両者は共同刺激シグナルを提供できることが明らかである。
CD28抗原、すなわち、免疫グロブリン上科のホモ２量体の糖タンパク質（AruffoおよびSeed,Proc.Natl.Acad.Sci.84:8573-8577(1987)）は、ほとんどの成熟ヒトＴ細胞上に見いだされるアクセサリー分子である（Damleら、J.Immunol.131:2296-2300(1983)）。現在の証拠が示唆するように、Ｔ細胞反応複合体により開始されるものと区別される別のＴ細胞活性化の経路において、この分子は機能する（Juneら、Mol.Cell. Bicl.7:4472-4481(1987)）。CD28抗原と反応性モノクローナル抗体（mAb）は、種々のポリクローナルの刺激により開始されるＴ細胞の応答を増強することができる（Juneら、前掲、の中に概観されている）。これらの刺激作用はmAb誘発サイトカインの生産（Thompsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.86:1333-1337(1989)；およびLindstenら、Scicnce 244:339-343(1989)から、mRNA安定化の増加（Lindstenら、(1989)、前掲）の結果として生ずることができる。抗CD28mAbは、また、阻止作用を有することができ、すなわち、それらはオートロガス混合リンパ球反応（Damleら、Proc.Natl.Acad.Sci. 78:5096-6001(1981)）および抗原特異的Ｔ細胞クローンの活性化（Lesslauerら、Eur.J.Immunol.16:1289-1296(1986)）をブロックすることができる。
CD28はＢ細胞活性化抗原であるB7／BB−１のための対レセプターであることが研究において示された（Linsleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5031-5035(1990)）。便宜上、B7／BB−１抗原を以後「B7抗原」と呼ぶ。CD28とB7抗原との間の相互作用は、B7抗原およびCD28レセプターの細胞外部分、および免疫グロブリン（Ig）Ｃγ１（一定領域の重鎖）の遺伝学的融合を使用して特徴づけられた（Linsleyら、J.Exp.Med. 173:721-730(1991）)。同定化B7Ig融合タンパク質ならびにB7陽性CHO細胞は、Ｔ細胞の増殖を共同刺激（constimulate）することが示された。B7陽性CHO細胞によるＴ細胞の刺激は、また、IL−２のための転写レベルの増加を特異的に刺激する。追加の研究において、抗CD28mAbは、ある種のＴ細胞の白血病細胞系においてＢ細胞系白血病系統との細胞の相互作用により誘発されたIL−２の生産を阻止することが示された（Kohnoら、Cell Immunol.131-1-10(1990)）。
CD28は単一の細胞外の可変領域（Ｖ）様ドメインを有する（AruffoおよびSeed、前掲）。相同性分子のCTLA４は、ネズミ細胞溶解性Ｔ細胞のcDNAライブラリーの分別スクリーニングにより同定された（Brunetら、Nature 328:267-270(1987)）。この分子の転写は細胞障害活性を有するＴ細胞の集団の中に見いだされ、CTLA４が細胞溶解性応答において機能するであろうことを示唆した。（Brunetら、前掲；およびBrunetら、Immunol.Rev.103-21-36(1988)）。研究者らの報告によると、CTLA４のヒトの対（Dariavachら、Eur.J.Immunol. 18:1901-1905(1988)）の遺伝子はクローニングされそしてCD28と同一の染色体領域（２ｇ 33-34）にマッピングされた(Lafage-Pochitalodd)ら、Immunogenetics 31:198-201(1990)）。このヒトCTLA４のDNAとCD28タンパク質をエンコードするものとの間の配列の比較は、膜近傍領域および細胞質領域において最高度の相同性をもつ、配列の有意な相同性を明らかにする（Brunetら、1988、前掲；Dariavachら、1988、前掲）。
CD28とCTLA４との間の高度の相同性は、それらの遺伝子の共同局在化と一緒に、これらの分子がまた機能的に関係するかどうかという問題を発生する。しかしながら、CTLA４のタンパク質生産物はまだ首尾よく発現されてきていないので、これらの問題は未解決のままである。
免疫グロブリン遺伝子の上科における細胞表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現は、CD4,HIV-1のレセプター、およびCD28およびB7のレセプターについて、ハイブリッド融合分子を使用して活性化され、これらのハイブリッド融合分子は抗体ドメインに融合されたCD4レセプターの細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をエンコードするDNA配列から成る（免疫グロブリンγＩ（Caponら、Nature 337:525-531(1989)（CD4）およびLinsleyら、J.Exp.Med.、前掲）（CD28およびB7）。
従来発現されていないCTLA４遺伝子の可溶性タンパク質生産物を得ること、およびＴ細胞の機能的応答に関係するCTLA４のための天然のリガンドを同定することは有用であろう。次いで、可溶性タンパク質生産物を使用してＴ細胞のin vivo応答を調節して病理学的状態を処置することができるであろう。
発明の要約
したがって、本発明はCTLA４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードする完全なかつ正しいDNA配列を提供し、そしてCTLA４レセプターのために天然のリガンドとしてB7抗原を同定する。本発明は、また、CTLA４免疫グロブリン（Ig）融合タンパク質生産としてDNAを発現する方法を提供する。本発明の態様は、CTLA４Ig融合タンパク質、およびCD28Ig／CTLA４ Ig融合タンパク質を包含するハイブリッドの融合タンパク質を包含する。また、CTLA４融合タンパク質、B7Ig融合タンパク質、およびそれらの断片および／または誘導体、例えば、CTLA４およびB7抗原と反応性のモノクローナル抗体を使用して細胞の相互作用および免疫応答を調節する方法が提供される。
本発明のヒトCTLA４レセプタータンパク質は187アミノ酸によりコードされ、そして新しく同定されたＮ連鎖グリコシル化部位を包含する。
本発明のCTLA４Ig融合タンパク質は、活性化Ｂ細胞、および他の系統上に発現されたB7抗原、Ｔ細胞上のCD28レセプターのためのリガンドと結合する。CTLA４Igは、CD28レセプターに結合するB7よりも有意により高い親和性でB7抗原と結合する。CTLA４Ig構成体は、ヒトIgＣγ１ドメインに相当する第２アミノ酸配列に融合したCTLA４レセプターの細胞外ドメインに相当する第１アミノ酸配列を有する。第１アミノ酸配列は、アミノ酸配列の約位置１から約位置125のアミノ酸残基を含有し、これらのアミノ酸残基はヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合したCTLA４の細胞外ドメインに相当する。融合タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。可溶性CTLA４IgはＴおよびＢリンパ球の応答の効力のあるin vivoインヒビターである。
また、本発明において、ハイブリッド融合タンパク質、例えば、第１アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質が包含され、この第１アミノ酸配列はCTLA４Igの細胞外ドメインの断片に相当する第２アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸配列に接合したCD28の細胞外ドメインの断片に相当する。ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様は、CD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１から約94のアミノ酸残基を含有する第１アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質であり、CD28の細胞外ドメインはCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94から約位置125のアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列を接合し、CTLA４の細胞外ドメインはヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸残基を含有する第３アミノ酸配列に接合している。
また、本発明において、Ｔ細胞をCTLA４レセプターのリガンドと反応させることによって、CTLA４陽性Ｔ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することによる、他の細胞とのＴ細胞の相互作用を調節する方法が包含される。リガンドはB7Ig融合タンパク質、CTLA４レセプターと反応性のモノクローナル抗体、および抗体断片を包含する。
本発明は、また、B7抗原のためのリガーゼを使用する。B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節する方法を提供する。このようなリガンドは、本発明のCTLA４Ig融合タンパク質、その断片または誘導体、CD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
本発明は、さらに、B7抗原と反応性のリガンドを投与してB7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節することによって、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により仲介される免疫系の疾患を処置する方法を包含する。このリガンドは、CTLA４Ig融合タンパク質、CD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
CTLA４Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体およびCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を、細胞の相互作用の調節における使用について記載する。
CTLA４Ig融合タンパク質を安定に発現する新規なチャイニーズハムスター卵巣細胞系をまた開示する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、下の実施例２に記載するCTLA４Ig融合構成体の線図的表示である。
第２図は、下の実施例２に記載するCTLA４IgのSDS-PAGEクロマトグラフィーの精製から得られたゲルの写真である。
第３図は、下の実施例３に記載する、オンコスタチイン（oncostatin）Ｍシグナルプライマー伸長（位置−25〜−１）に融合したヒトCTLA４レセプター（配列識別番号：13および14）をエンコードし、そして新しく同定されたＮ連鎖グリコシル化部位（位置109〜111）を含む、完全なアミノ酸配列を示す。
第４図は、下の実施例４に記載する、CD28およびCTLA４でトランスフェクションしたCOS細胞へのB7Ig融合タンパク質の結合のFACS^R分析の結果を示す。
第５図は、下の実施例４に記載する、B7抗原陽性（B7⁺）CHO細胞およびリンパ芽球様細胞系（PM-LCL）上の精製したCTLA４Igの結合のFACS^R分析の結果を示す。
第６図は、下の実施例４に記載する、同定化CTLA４Igへの¹²⁵I標識化B7Igの競争結合の分析を示すグラフである。
第７図は、下の実施例４に記載する、同定化CTLA４Igへの¹²⁵I標識化B7Igのスキャッチャード分析の結果を示すグラフである。
第８図は、下の実施例４に記載する、¹²⁵Iで表面標識化したB7陽性CHO細胞およびPM-LCL細胞の免疫沈澱分析のSDS-PAGEクロマトグラフィーからのゲルの写真である。
第９図は、下の実施例４に記載する、〔³Ｈ〕−チミジンの組み込みにより測定した、CTLA４IgのＴ細胞の増殖への作用を示すグラフである。
第10図は、下の実施例４に記載する、酵素のイムノアッセイ（ELISA）により決定した、ヒトＴ細胞によるヘルパーＴ細胞（Ｔ_h）誘発免疫グロブリンの分泌へのCTLA４Igの作用を示す棒グラフである。
発明の詳細な説明
ここに記載する本発明を完全に理解することができるように、次の説明を記載する。
本発明は、Ｔ細胞表面上に見いだされ、活性化Ｂ細胞および他の系統の細胞上に発現されたB7抗原に結合する、ヒトCTLA４レセプターの単離およびクローニング、およびCTLA４レセプター遺伝子の可溶性融合タンパク質生産物の発現に関する。本発明は、また、発現されたCTLA４レセプターを使用して、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を包含する細胞の相互作用を調節する方法を提供する。
好ましい態様において、本発明のヒトCTLA４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードする完全なかつ正しいDNA配列をPCRによりクローニングする。CTLA４の完全な予測されたコーディング配列を含有するcDNAを、下の実施例の中に詳細に記載されているように、H38RNAから増幅されたPCR断片からアセンブリングし、そして発現ベクターCDM8の中に挿入した。単離物をCOS細胞の中にトランスフェクションし、そしてB7Ig、すなわち、Linsleyら、J.Exp.Med. 173:721-730(1991)記載されているように、B7の細胞外ドメインおよびヒト免疫グロブリン（Ig）Ｃγ１領域に相当するアミノ酸配列を有する可溶性融合タンパク質の結合について試験した。
次いで、OMCTLA４と表示する１つの単離物DNA配列を決定し、そしてＮ末端においてオンコスタチインＭからのシグナルペプチドに融合した、予測されたヒトCTLA４配列に正確に相当することが発見された。CTLA４レセプターは187アミノ酸（シグナルペプチドおよび停止コドンを除外する）によりコードされ、そしてアミノ酸位置109-111に新しく同定されたＮ連鎖グリコシル化部位を含む（下の第３図を参照）。オンコスタチインＭのシグナルペプチドを使用して、CTLA４レセプターを発現させる。
他の好ましい態様において、CTLA４の細胞外ドメインに相当する第１アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１ドメインに相当する第２アミノ酸配列を有する融合タンパク質を使用して、CTLA４レセプター遺伝子（CTLA４Ig）のタンパク質生産物の可溶性の形態を調製する。ここに記載するcDNA配列に基づくヒトCTLA４レセプターに相当するアミノ酸配列の部分をエンコードするcDNAを含有するクローニングおよび発現のプラスミド（CDM8およびπLN）を構成し、ここでCTLA４レセプター遺伝子の細胞外ドメインの断片に相当する第１アミノ酸配列をエンコードするcDNAを、発現されたCTLA４タンパク質の可溶性の変更によりCTLA４レセプター遺伝子の発現を可能とするIgＣ領域に相当する第２アミノ酸配列をエンコードするDNAに接合する。こうして、可溶性CTLA４Ig融合タンパク質は第１アミノ酸配列によりコードされ、この第１アミノ酸配列はヒトIgのＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合したCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約125のアミノ酸残基を含有する。融合タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。次いでこの構成体をCOSまたはCHO細胞の中にトランスフェクションし、そしてCTLA４Igを精製しそして２量体として同定した。
CTLA４Ig融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードするDNAは、ブダベスト条約の規定に従いアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collecction）（ATCC）（米国マリイランド州ロックビレ）に1991年５月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号68629を与えられた。
本発明は、可溶性融合タンパク質の形態でCTLA４転写体の第１タンパク質生産物を提供する。CTLA４タンパク質はほぼ50,000サブユニットのＭ_rのジサルファイド連鎖の２量体を形成し、天然のCTLA４がＴ細胞表面上にジサルファイド連鎖ホモ２量体として多分存在することを示す。
B7抗原はＴ細胞上のCD28レセプターのためのリガンドであることが示された（Linsleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、前掲）。CTLA４レセプター分子はCD28レセプターに機能的にかつ構造的に関係すると思われる；両者はＢ細胞活性化抗原のためのレセプターであるが、CTLA４は、リンパ系付着系についてこれまで報告された最高のもの中で、B7に対するより高い親和性を有するように思われる。しかしながら、CTLA４IgはCD28IgよりB７陽性（B7⁺）細胞系にいっそう強く結合することが示された。他の実験において、CTLA４はB7抗原に対してCD28レセプターより高い親和性のレセプターであることが証明された。さらに、CTLA４IgはB7抗原に大きさが類似するリンパ芽球球細胞上の単一のタンパク質に結合することが示された。CTLA４IgはＴ細胞増殖を阻止し、そしてＴ_h誘発IgM生産を阻止した。
他の好ましい態様において、異なるレセプタータンパク質の断片に相当するアミノ酸配列を有するハイブリッド融合タンパク質を構成した。例えば、CD28およびCTLA４の細胞外ドメインの選択した断片に相当するアミノ酸配列を連鎖して、CD28Ig／CTLA４Igハイブリッド融合タンパク質を形成した。こうして、第１アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質が得られ、この第１アミノ酸配列はCTLA４Igの細胞外ドメインの断片に相当する第２アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸配列に接合した、CD28の細胞外ドメインの断片に相当するアミノ酸残基を含有する。ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様は第１アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合構成体であり、この第１アミノ酸配列はCD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位置94のアミノ酸残基を含有し、CD28はCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94〜約位置125のアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合し、CTLA４はヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸配列に接合している。
CTLA４レセプタータンパク質、可溶性融合タンパク質およびハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードするDNA配列をクローニングしそして発現する技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合成、PCR、細胞の形質転換、ベクターの構成、発現系などはこの分野においてよく確立されており、そしてほとんどの熟練者は特定の条件および手順のための標準的源材料をよく知っている。しかしながら、必要に応じて便利および変更の注釈のために次の節を準備し、そしてこれらの節はカイドラインの役Ｈをするであろう。
レセプターおよび融合タンパク質のためのコーディング配列のクローニングおよび発現
本発明のCTLA４Igを特性決定しかつCD28Ig／CTLA４Ig融合ハイブリッドを調製するためのCD28IgＣγ１およびB7IgＣγ１に相当する融合タンパク質の構成体を、Linsleyら、J.Exp.Med. 173:721-730(1991)（これを引用によって加える）に記載されているように調製した。あるいは、B7抗原およびCD28レセプターを発現する細胞から、これらのタンパク質について発表された知識（AruffoおよびSccd、およびFreeman、前掲）に基づいて標準的手順を使用して、cDNAクローンを調製することができる。
CTLA４の細胞外ドメインおよびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するに相当するアミノ酸配列をエンコードするDNAから成るCTLA４Ig融合体を、PCR断片の結合により構成した。アミノ酸をエンコードするcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）技術に従い増幅する（米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号（Mullisら）、およびMullisおよびFaloona,Mcthods Enzymol. 154:335-350(1987)を参照のこと）。CTLA４Ig融合ポリペプチドを構成し、これらのポリペプチドはCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位置125のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列をエンコードするDNA、およびIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をエンコードするDNAを有した。
ヒトリンパ系細胞の中のCTLA４レセプタータンパク質の発現は従来報告されてきていないので、CTLA４のmRNA源を探すことが必要であった。いくつかのヒト白血病細胞系の全体の細胞のRNAから作ったPCRのcDNAを、プライマーとして、CTLA４遺伝子の発表された配列かのオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングした（Dariavachら、前掲）。試験したcDNAのうちで、H38細胞（HTLV II関連白血病系統）は期待したサイズを有するPCR生産物の最良の収量を提供したCTLA４の単一のペプチドはCTLA４遺伝子の中で同定されなかったので、CTLA４の予測された配列のＮ末端をオンコスタチインＭのシグナルペプチド（Malikら、Molec.and Cell.Biol.9:2847(1989)）に、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドを使用して融合した。PCR反応の生産物を、IgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をエンコードするcDNAを使用して、発現ベクター、例えば、CDM8またはπLNの中に結合した。
全長のヒトCTLA４をエンコードするDNAを得るために、CTLA４のトランスメンブレンおよび細胞質ドメインをエンコードするcDNAをH38細胞からPCRにより構成し、そしてCTLA４のＮ末端に融合したオンコスタチインＭシグナルペプチドをエンコードする、前述したように構成した、CTLA４Igからの断片と、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して接合した。PCR断片をプラスミドCDM8の中に結合して、全長のCTLA４をエンコードする発現プラスミドを生成し、そしてこれをOMCTLA４と表示した。
ハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードするDNAを構成するために、１つのレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をエンコードするDNAを、他のレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸エンコードするDNA、およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をエンコードするDNAに、B71g、CD28IgおよびCTLA４Ig構成体について前述した手順を使用して接合する。こうして、例えば、CD28レセプターの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約１位置〜約94位置のアミノ酸残基をエンコードするDNAを、CTLA４レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列の約位置94〜約位置125のアミノ酸残基をエンコードするDNA、およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をエンコードするDNAに接合する。
大量のクローニングしたDNAを生産するために、本発明の融合構成体をエンコードするDNAを含有するベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌細胞系の大腸菌（Ｅ.coli）MC1061／p3株（Invitrogen Corp.、カリフォルニア州サンディエゴ）の中に標準的手順を使用して形質転換し、そしてコロニーを適当なプラスミドについてスクリーニングする。
次いで、前述したようにして得られた融合構成体をエンコードするDNAを含有するクローンを、発現のために適当な宿主細胞の中にトランスフェクションする。使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適当な標準的技術を使用してトランスフェクションを実施する。例えば、哺乳動物細胞中のトランスフェクションは、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、CaPO₄共沈、リポフェクション（lipofection）、エレクトロポレイションまたは原形質体の融合、および他のこの分野において知られている方法により達成し、ここで後者の方法は次のものを包含する：リゾチームの融合または赤血球の融合、スクレイピング、直接的吸収、浸透圧またはスクロースのショック、直接的マイクロインジェクション、間接的マイクロインジェクション、例えば、赤血球仲介技術を介するマイクロインジェクション、および／または宿主細胞を電流に暴露する。遺伝的情報を細胞の中に導入する他の手順は疑いなく開発されるであろうから、上に列挙したトランスフェクションの技術は網羅的であるお考えられない。
多細胞の生物から誘導化された真核生物の宿主細胞の培養物の中の発現は好ましい（Tissure Cultures,Academic Press,CruzおよびPetterson編、(1973)を参照のこと）。これらの系はイントロンをスプライスする能力をもつという追加の利点を有し、こうしてゲノム断片の発現に直接使用することができる。有用な宿主細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サル腎臓（COS）細胞、VERO細胞およびHeLa細胞を包含する。本発明において、融合構成体を安定に発現する細胞系は好ましい。
このような細胞のための発現ベクターは、通常、哺乳動物細胞と適合性のプロモーターおよびコントロール配列、例えば、CMVプロモーター（CDM8ベクター）および鳥類の肉腫ウイルス（ASV）（πLNベクター）を包含する。他の普通に使用される前期および後期のプロモーターは、サルのウイルス40（SV40）（Fiersら、Nature 273:113(1973)）、または他のウイルスのプロモーター、例えば、ポリオーマから誘導化されたもの、アデノウイルス２、およびウシ乳頭腫ウイルスを包含する。コントロール可能なプロモーター、hMTII（Karinら、Nature 299:797-802(1982)）をまた使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換についての一般的面は、Axel（米国特許第4,399,216号、1983年８月16日発行）により記載された。現在明らかなように、「エンハンサー」領域は発現を最適化するとき重要である；これらは、一般に、非コーディング領域の中のプロモーター領域の上流または下流に見いだされる配列である。必要に応じて、複製の由来をウイルス源から得ることができる。しかしがら、染色体中の組み込みは真核生物におけるDNAの複製のための普通のメカニズムである。
融合構成体の発現のために好ましい真核生物の細胞、例えば、COSまたはCHO細胞を包含するが、他の真核生物の微生物を使用できる。サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces ccrevisiae）、イーストの実験室用菌株をたいてい使用するが、他の菌株、例えば、シゾサッカロミセス・ポンペ（Schizosaccharomyces pombe）を使用できる。例えば、Broach,Mcthods Enzymol. 101:307(1983)の２μの複製由来、または他の酵母適合性の複製由来（例えば、Stinchcombら、Nature 282:39(1979)）；Tschempeら、Gene 10:157(1980)；およびClarkeら、Methods Enzymol. 101:300(1983)を参照のこと）を用いるベクターを使用することができる。酵母のベクターのためのコントロール配列は、グリコール分解酵母の合成のためのプロモーターを包含する（Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)；Hollandら、Biochcmistry.17:4900(1978)）。この分野において知られている追加のプロモーターは、CDM8ベクターの中に提供されたCMVプロモーター（ToyamaおよびOkayama,FEBS 268:217-221(1990)；３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（Hitzemanら、J.Biol.Chem. 255:2073）、および他のグリコール分解酵素のためのプロモーターを包含する。成長条件によりコントロールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関連する分解酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関係する酵素のためのプロモーター領域である。また、ターミネーター配列はコーディング配列の３′末端において望ましいと信じられる。このようなターミネーターは、酵母誘導化遺伝子の次の３′−非翻訳領域の中に見いだされる。
あるいは、原核生物の細胞を発現のための宿主として使用することができる。原核生物の細胞は、大腸菌（Ｅ.coli）の種々の株により最も頻繁に発現される；しかしながら、他の微生物の菌株も使用できる。ここにおいて転写開始のためのプロモーターを、必要に応じてオペレーターとともに含むと定義される、普通に使用される原核生物のコントロール配列は、リボソーム結合部位の配列と一緒に、ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモーター系（Changら、Nature 198:1056(1977)）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、核酸の研究（Nucleic Acids Res. 8:4057(1980)）およびラムダ誘導化Ｐ_LプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatakeら、Nature 292:128(1981)）のような普通に使用されているプロモーターを包含する。
CD28IgおよびCTLA４Igタンパク質、および融合ハイゾリッドタンパク質、例えば、CD28Ig／CTLA４Igを後述するように種々の系の中で発現することができる。cDNAを適当な制限酵素で切り出し、そしてこのような発現について適当な原核生物または真核生物の発現ベクターの中に結合することができる。CD28およびCTLA４レセプターのタンパク質は天然に２量体として存在するので、これらのタンパク質の首尾よい発現はこれらのタンパク質を２量体として形成することを可能とする発現系を必要とすると信じられる。これらのタンパク質の切頭バージョン（すなわち、タンパク質のトランスメンブレン領域より上流の位置において配列の中に停止コドンを導入することによって形成される）は発現されると思われない。CD28およびCTLA４レセプターの融合タンパク質としての発現は、これらのタンパク質の２量体の形成を可能とする。こうして、CTLA４タンパク質の融合生産物としての発現は、本発明において好ましい。
チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA４Ig−24と表示する本発明の安定なCHO系はCTLA４Igの発現のために好ましく、そしてブダベスト条約の規定に従いATCCに1991年５月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号10762を与えられた。
本発明のCTLA４レセプターの発現は、細胞系、例えば、COS細胞をトランスフェクションし、そしてCTLA４トランスフェクションした細胞をCTLA４レセプターに結合することによって、例えば、細胞のB7Ig融合タンパク質への結合について経験することによって、発現を検出して達成される。
生ずる構成体の配列は、既知の手順、例えば、Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463(1977)に記載されている、さらにMcssingら、Nucleic Acids Res. 9:309(1981)に記載されている手順を使用するDNAの配列決定によるか、あるいはMaxamら、Mcthods Enzymol.65:499(1980)の方法により確証される。
タンパク質生産物の回収
前述したように、CD28およびCTLA４レセプターの遺伝子は、切頭タンパク質をエンコードするDNAの直接の発現を使用して成熟タンパク質として容易に発現されない。ホモ２量体の形成を可能とするために、CD28およびCTLA４の細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例えば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中のオンコスタチインＭの配列のためのコドンを含むアミノ酸配列をエンコードするDNAを、天然に２量体のタンパク質のFcドメインに相当するアミノ酸配列をエンコードするDNAと融合する。こうして、細胞から分泌された後のこれらの融合タンパク質の生産物の精製は、融合タンパク質の抗免疫グロブリン部分と反応性の抗体を使用して促進される。融合タンパク質の生産物は、培地の中に分泌されると、タンパク質の標準的精製技術、例えば、プロテインＡカラムへの適用により回収される。
使 用
CTLA４Ig融合タンパク質および／またはその融合タンパク質の断片を使用してB7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、B7抗原陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により仲介される免疫反応を調節することができる。
CTLA４Ig融合タンパク質およびCTLA４Ig／CD28Igハイブリッドタンパク質、および／またはこれらのタンパク質の断片および誘導体を、また、使用して、B7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞の応答により仲介される免疫応答を調節することができる。用語「断片」は、ここにおいて使用するとき、「CTLA４」と呼ぶタンパク質をエンコードするアミノ酸配列の部分を意味する。使用できるCTLA４Ig融合のタンパク質の断片は、ここに記載するCTLA４Ig融合タンパク質を得るために使用するCTLA４レセプターに相当するアミノ酸配列のある部分に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
活性化されたＢ細胞および他の系統の細胞上で発現されたB7抗原、およびＴ細胞上で発現されたCD28レセプターを互いに直接結合することができ、そしてこの相互作用は細胞−細胞の相互作用を仲介することができる。このような相互作用は、Ｔ細胞の増殖、および免疫グロブリン生産細胞へのＢ細胞の分化に導く、Ｔ細胞の中のCD28活性化経路を直接トリガーする。起こるＢ細胞の活性化は、B7抗原の発現を増加し、さらにCD28を刺激して、慢性の炎症の状態、例えば、自己免疫疾病、異種移植の拒絶、移植片対宿主の疾患または慢性のアレルギー反応に導くことがある。この反応をブロックまたは阻止することは、Ｔ細胞のサイトカインの調製を防止し、こうして炎症反応を防止または逆転するとき有効であることがある。
CTLA４Igは、ここにおいて、Ｔ細胞およびＢ細胞の相互作用を必要とするin vitroリンパ球機能の効力のあるインヒビターであることが示された。これはB7抗原およびその対レセプター、CTLA４および／またはCD28の間の相互作用の重要性を示す。ネズミおよびヒトのCTLA４の細胞質ドメインは類似し（Dariavachら、前掲、1988)、この領域が重要な機能的性質を有することを示唆する。また、CD28およびCTLA４の細胞質ドメインは相同性を共有する。
CTLA４は、抗BB１または抗CD28モノクローナル抗体よりも、いっそう効力のあるリンパ球の応答のin vitroインヒビターである。CTLA４Igは、その阻止作用と反作用するＴ細胞の増殖に対する直接の刺激作用をもたない。したがって、CTLA４Ig融合タンパク質は抗CD28モノクローナル抗体よりもすぐれたin vivoインヒビターとして働くことができる。CTLA４Igのin vitro免疫抑制作用は、異常なＴ細胞の活性化またはIgの生産を包含する自己免疫疾患の処置の治療におけるその使用を示唆する。
CTLA４Ig融合タンパク質は、in vivo阻止性質を示すことが期待された。こうして、CTLA４Igは、同様なin vivo条件下に抗CD28抗体について観察される作用に類似する方法で、Ｔ細胞を阻止する作用をすることが期待される。Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用がＴ細胞とＢ細胞との間の接触の結果として起こる条件下に、B7抗原陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させために導入されたCTLA４Igの結合は、Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用を妨害、すなわち、阻止して免疫応答の調節を生ずることができる。この独占的な阻止作用のために、CTLA４Igは生体内でＴ細胞の活性のインヒビターとして、非特異的インヒビター、例えば、シクロスポリンまたはグルコステロイドよりも有用であることが期待される。
１つの態様において、CTLA４Ig融合タンパク質またはCTLA４Ig／CD28Igハイブリッドタンパク質は、適当な製剤学的担体と組み合わせてin vivo導入する、すなわち、病理学的状態、例えば、免疫系の疾患または癌の処置のためにヒトの投与することができる。融合のタンパク質のin vivo導入は、Ｔ細胞と他の細胞、例えば、Ｂ細胞との相互作用を、B7陽性細胞へのリガンドの結合の結果として、妨害することが期待される。正常のＴ細胞の相互作用の防止は、Ｔ細胞の活性を減少し、例えば、Ｔ細胞の増殖を減少することができる。さらに、融合タンパク質のin vivo投与はサイトカインのin vivoレベルの調節して被検体において所望の作用を促進することが期待され、ここでサイトカインは次のものを包含するが、これらに限定されない：インターロイキン、例えば、インターロイキン（「IL」）−２，IL−３，IL−４，IL−６，IL−８，成長因子、例えば、腫瘍成長因子（「TFG」）、コロニー刺激因子（「CSF」）、インターフェロン（「IFN」）および腫瘍壊死因子（「TNF」）。例えば、融合タンパク質をin vivo導入するとき、それは悪性の増殖、例えば、腫瘍細胞の増殖に寄与するサイトカインの生産をブロックすることができる。融合タンパク質は、また、Ｔ細胞の活性化に依存するウイルス、例えば、エイズを引き起こすウイルス、HTLV１の増殖をブロックすることができる。
ある環境下に前述したように、CTLA４Ig融合タンパク質またはその断片のin vivo投与の作用は阻止であり、Ｔ細胞／Ｂ細胞の接続から生ずるCTLA４およびCD28のトリガーの融合タンパク質によるブロッキングから生ずる。例えば、CTLA４Igタンパク質はＴ細胞の増殖をブロックすることができる。こうして、CTLA４Ig融合タンパク質のin vivo導入は、Ｔ細胞およびＢ細胞の両者が仲介する免疫応答に対する作用を生成するであろう。また、融合タンパク質をサイトカインまたは他の治療用試薬の導入と組み合わせて被検体に投与することができる。
本発明の追加の態様において、CTLA４Ig融合タンパク質またはCTLA４レセプターと反応性の誘導体を包含する他の試薬を使用してＴ細胞の相互作用を調節する。例えば、CTLA４レセプターと反応性の抗体および／または抗体断片をスクリーニングして、B7抗原へのCTLA４Ig融合タンパク質の広いスペクトルのを阻止することができるものを同定することができる。次いで、抗体または抗体断片、例えば、FabまたはF（ab′）₂断片を使用して、例えば、Ｔ細胞と反応させてＴ細胞の増殖を阻止することができる。
CTLA４レセプターと反応性のモノクローナル抗体は、既知の手順、例えば、KohlerおよびMilstein（KohlerおよびMilstein,Nature,256:495-97(1975)）により導入された手順、およびその変更により生成して、細胞の相互作用を調節することができる。
これらの技術は、特定の抗体を生産するようにプライミングした動物の使用を包含する。動物は免疫原（例えば、B7Ig融合タンパク質、CTLA４Ig融合タンパク質またはCD28Ig／CTLA４Igハイブリッド融合タンパク質）の注入によりプライミングして、所望の免疫応答、すなわち、プライミングされた動物からの抗体の生産を引き出すことができる。また、プライミングされた動物は疾患を発現する動物である。プライミングされた病気の動物のリンパ節、脾臓または末梢血液から誘導化されたリンパ球を使用して、特定の抗体を探索することができる。所望の免疫グロブリンをエンコードするリンパ球の染色体を、一般に融合剤、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）の存在下に、リンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、永久分裂能化する。ある数の骨髄腫細胞系、例えば、P3-NS１／１−Ag４−１，P3−x63−Ag８，653，Sp2／０−Ag14、またはHLI-653骨髄腫系統の任意のものを、標準的技術に従い、融合相手として使用することができる。これらの骨髄腫系統はATCC（米国マリイランド州ロックビレ）から入手可能である。
次いで、所望のハイブリドーマを包含する生ずる細胞を選択培地、例えば、HAT培地の中で成長させ、ここで未融合の親の骨髄腫またはリンパ球の細胞は究極的に死亡する。ハイブリドーマ細胞のみは生き残り、そして制限希釈の条件下に成長して単離されたクローンを得ることができる。ハイブリドーマの上澄み液を、例えば、免疫化に使用したCTLA４Igタンパク質を使用するイムノアッセイ技術により、所望の選択性の存在についてスクリーニングする。次いで、陽性のクローンを制限希釈の条件下にサブクローニングし、そして生成したモノクローナル抗体を単離することができる。
モノクローナル抗体の単離および精製の種々の普通の方法を使用して、他のタンパク質および汚染物質を含有しない抗体を得ることがてきる。モノクローナル抗体を精製する普通に使用されている方法は、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを包含する（Zolaら、Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications, Hurell編、p.51-52（CRC Press,1982を参照のこと）。これらの方法に従い生産されたハイブリドーマは、この分野において知られている技術を使用してin vitroまたはin vivo（腹水の中で）増殖することができる（一般に、Finkら、Prog.Clin.Pathol.,9:121-33(1984),Fig.6-1,p.123を参照のこと）。
一般に、個々の細胞系を、例えば、実験室用容器の中でin vivo増殖させ、そして高い濃度の単一の特定のモノクローナル抗体を含有する培地をデカンテーション、濾過または遠心により収穫することができる。
さらに、CTLA４レセプターの細胞外ドメインと反応性の活性結合領域を含有するこれらの抗体の断片、例えば、Fab,Ｆ（ab′）₂およびFv断片を生成することができる。このような断片は、この分野においてよく確立された技術を使用して生成することができる（例えば、Rousseauxら、Methods Enzymol.121:663-69,Academic Press(1986)を参照のこと）。
前述したようにして調製した抗B7モノクローナル抗体を使用してB7抗原に結合させて、CD28陽性またはCTLA４陽性のＴ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することができる。抗CTLA４モノクローナル抗体を使用してCTLA４レセプターと結合させて、CTLA４陽性Ｔ細胞と他の細胞との相互作用を阻止することができる。
他の態様において、CTLA４Ig融合タンパク質を使用して、CTLA４とB7抗原との間の相互作用を調節できる追加の化合物を同定することができる。このような化合物は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞と反応させるために使用できる天然に見いだされる小さい分子を包含することができる。例えば、発酵ブロスをCTLA４／B7の相互作用を阻止する能力について試験することができる。さらに、前述のCTLA４Ig融合タンパク質の誘導体を使用してＴ細胞の増殖を調節することができる。例えば、断片または誘導体を使用して、異種移植の骨髄の移植に伴う移植片対宿主（GVH）の疾患におけるＴ細胞の増殖をブロックすることができる。CD28仲介Ｔ細胞増殖経路は、CD3／Ｔ細胞のレセプター複合体により与えられる増殖（Juneら、1987、前掲）と対照的に、シクロスポリン耐性である。シクロスポリンはGVH疾患のための処置として比較的無効である（Storb,Blood 68:119-125(1986)）。GVH疾患は、CD28抗原を発現するＴリンパ球により仲介されると考えられる（StorbおよびThomas,Immunol. Rev.88:215-238(1985)）。こうして、CTLA４Ig融合タンパク質は、単独で、あるいは免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンと組み合わせて、GVH疾患におけるＴ細胞の増殖のブロッキングに有用であることができる。
こうして、Ｂ細胞を包含するB7陽性細胞とのCTLA４陽性Ｔ細胞の相互作用の本発明の方法による調節を使用して、病理学的状態、例えば、自己免疫性、移植、感染症および新形成を処置することができる。
次の実施例によって、本発明をさらに説明しかつ当業者による本発明の実施および使用を助ける。これらの実施例は本発明を限定しない。
例 １
B7Ig及びCD28Ig融合タンパク質の調製
レセプター−免疫グロブリンＣγ（IgＣγ）融合タンパク質B7Ig及びCD28Igを、本発明において引用により組込まれる、Linsleyなど.,J.Exp.Med.173:721〜730(1991)により記載されているようにして調製した。簡単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質（たとえばB7）に対応するアミノ酸配列をコードするDNAを、ヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応するアミノ酸配列をコードするDNAに連結した。これは次のようにして達成される。
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）。PCRのために、DNAフラグメントを、個々の融合タンパク質について下記のようにしてプライマー対を用いて増幅した。PCR反応（０.mlの最終体積）を、Tagポリメラーゼ緩衝液（Stratagene,La Jolla,CA）において行ない、ここで前記緩衝液は、個々のdNTP20μモル；前記に示されたプライマー50〜100ｐモル；鋳型（引用により本明細書において組込まれる、Kauasaki,PCR Protocols,Academic Press,21〜27ページ（1990）により記載されるようにして、ランダムヘキサマープライマーを用いて合計≦１μｇのRNAから合成されたプラスミド又はcDNA１ng）；及びTagポリメラーゼ（Stratagene）を含んだ。反応は16〜30回のサイクル（典型的なサイクルは、94℃で１分、50℃で１〜２分及び72℃で１〜３分の段階から成る）のためにサーモサイクラー（Perkin Elmer Corp.Norwalk,CT）上で行なわれた。
プラスミドの構成。Aruffo and Seed,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8573(1987)により記載されるような、CD28をコードするcDNAを含む発現プラスミドが、Drs.Aruffo and Seed(Mass General Hospital Boston,MA)により供給された。Aruffo,Cell 61:1303(1990)により記載されるような、CD５をコードするcDNAを含むプラスミドがDr.Aruffoにより供給された。Freemanなど.,J.Immunol.143:2714(1989)により記載されるような、B7をコードするcDNAを含むプラスミドは、Dr.Freeman(Dana Farber Cancer Institute,Boston,MA)により供給された。CD28及びB7の可溶性形の発現での初期試みのために、構成体をLinsleyなど.,J.Exp.Med.,前記により記載されているようにして製造し（OMCD28及びOMB7）、ここで停止コドンがトランスメンブランドメインの上流に導入され、そして生来のシグナルペプチドがオンコスタチインＭ（oncostatin M）（Malikなど.,Mol.Cell Biol. 9:2847(1989)）からのシグナルペプチドにより置換された。それらは、再構成のための合成オリゴヌクレオチド（OMCD28）を用いて又はPCRのためのプライマー（OMB7）として製造された。OMCD28は、シグナルペプチドをオンコスタチインＭからの類似領域により置換することによってより効果的な発現のために変性されたCD28 cDNAである。CD28Ig及びB7Ig融合構成体を２つに分けて製造した。５′部分を、鋳型としてOMCD28及びOMB7及び前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド、CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC（配列番号１）（オンコスタチインＭシグナルペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする）及び逆方向プライマーとしてTGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA（配列番号２）又は、TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT（配列番号３）のいづれかをそれぞれ用いて製造した。PCR反応の生成物を、PCRプライマーに導入される部位として制限エンドヌクレアーゼ（Hind III及びBcl Ｉ）により切断し、そしてゲル精製した。
ヒトIgＣγ１配列に対応する融合構成体の３′部分を、鋳型として、ヒト−マウスキメラmAB L6を生成する骨髄細胞系（Dr.P.Fell and M.Gayle,Bristol-Myers Squibb Conyany,Pharmaceutical Research Institute,Seattle,WAにより供給される）からのRNAを用いて、連結された逆転写酵素（トリ骨髄芽症ウィルスからの；Life Sciences Associates,Bayport,NY）-PCR反応により製造した。オリゴペプチド、すなわちAAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG（配列番号４）を前方プライマー及びCTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC（配列番号５）を逆方向プライマーとして使用した。反応生成物をBal Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そしてゲル精製した。最終生成物を、IgＣγ１配列を含む、Bcl Ｉ／Xba Ｉ切断されたフラグメントと共に、CD28又はB7配列を含む、Hind III／Bcl Ｉ切断されたフラグメントを、Hind III／Xba Ｉ切断されたCD28中に連結することによってアセンブリーした。連結生成物を用いてMC1061／p3 Ｅ．コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドのためにスクーンした。得られた構成体の配列を、DNA配列決定により確認した。
B7をコードする構成体は、B7の細胞外ドメインの約１位〜約215位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNを含んだ。CD28をコードする構成体は、CD28の細胞外ドメインの約１位〜約134位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNAを含んだ。
CD５Igを、前方プライマーとしてCATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG（配列番号６）及び逆方向プライマーとしてATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC（配列番号７）を用いて、同じ態様で構成した、PCR生成物を制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして上記のようにしてIgＣγ１フラグメントにより連結した。得られた構成体（CD５Ig）は、CD５に対応する配列の１位〜347位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する成熟タンパク質、前記構成工程により導入された２つのアミノ酸（アミノ酸DQ）、次にIgＣγ１領域に対応するアミノ酸をコードするDNAをコードした。
細胞培養及びトランスフェクション。COS（モンキー腎細胞）を、引用により本発明に組込まれる、Seed and Aruffo (Proc.Natl.Acad.Sci. 84:3365(1987))の方法の変法を用いて、CD28及びB7を発現する発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクトする18〜24時間前、10cmの直径の培養皿当たり10⁶個で接種した。プラスミドDNAを、0.1mMのクロロキン（cloroquine）及び600μｇ／mlのDEAE Dextranを含む血清フリーDMEM５mlに添加し（約15μｇ／皿）、そして細胞を37℃で３〜3.5時間インキュベートした。次に、トランスフェクトされた細胞をすぐに、PBS中、10％ジメチルスルホキシドにより処理し（約２分）、そして10％FCSを含むDMEMにおいて37℃で16〜24時間インキュベートした。トランスフェクションの24時間後、培養培地を除去し、そして血清フリーDMEMにより変換した（６ml／皿）。インキュベーションを37℃で３時間続け、この時点で、古い培地を集め、そして新鮮な血清フリー培地を添加した。37℃でさらに３日後、古い培地を再び集め、そして細胞を捨てた。
CD28，CD５又はB7を発現するCHO細胞を、次の通りに、Linsleyなど.,（1991）前記により記載されるようにして単離した：簡単に言及すれば、CD28，CD５又はB7を発現する安定したトランスフェクタントを、適切な発現プラスミド及び選択マーカー、pSV2dhfr（Linsleyなど.,Proc.Natl.,Acad.Sci.USA 87:5031(1990)）の混合物によるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣（dhfr^- CHO）細胞の同時トランスフェクションの後次に、トランスフェクトを、１μＭの最終レベルまでメトトレキヤートの徐々に高まる濃度で増殖し、そして10％ウシ胎児血清（FBS）、0.2mMのプロリン及び１μＭのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持した。高レベルのCD28（CD28⁺ CHO）又はB7（B7⁺ CHO）を発現するCHO系を、mAbs9.3又はBB−１による間接的な免疫染色に従って、複数回の螢光活性化細胞ソーチング（FACS（Ｒ））により単離した。CD28又はB7の表面発現のために陰性の増幅されたCHO細胞をまた、CD28−トランスフェクトされた集団からFACS（Ｒ）により単離した。
免疫染色及びFACS（Ｒ）分析。トランスフェクトされたCHO又はCOS細胞又は活性化されたＴ細胞を、間接的免疫染色法により分析した。染色の前、CHO細胞を、10mMのEDTAを含むPBSにおけるインキュベーションによりそれらの培養器から除去した。細胞をまず、ネズミmAbs9.3（Hansenなど.,Immunogenetics 10:247(1980)）又はBB−１（Yokochiなど.,J.Immunol. 128:823(1981)）と共に、又はIg融合タンパク質（10％のFCSを含むDMEMにおいて10μｇ／mlで）と共に４℃で１〜２時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、そしてさらに0.5〜２時間、４℃で、FITC−接合の第２段階試薬（ネズミmAbsのためにヤギ抗−マウスIg血清又は融合タンパク質のためにヤギ抗−ヒトIgＣγ血清（Tago,Inc.,Burlingama,CA））と共にインキュベートした。螢光を、40対数増幅器（four decade logarithmic amplifier）を備えたFACS IV（Ｒ）細胞ソーター（Becton Dickinson and Co.,Mountain View,CA）上で分析した。
Ig融合タンパク質の精製。トランスフェクトされたCOS細胞からの古い血清フリー培養培地の第１，第２及び第３回収集物を、Ig融合タンパク質の精製のための源として使用した。高速遠心分離により細胞残髄物を除去した後、培地を、0.05Ｍのクエン酸ナトリウム溶液（pH8.0）により平衡化された、固定されたプロテインＡ（Repligen Corp.,Cambridge,MA）のカラム（約200〜400mlの培地／ml充填層体積）に適用した。その培地の適用の後、カラムを１μのリン酸カリウム溶液（pH８）により洗浄し、そして結合されたタンパク質を0.05Ｍのクエン酸ナトリウム溶液（pH３）により溶出した。画分を集め、そしてすぐに、２Ｍのトリス（pH８）１／10体積の添加により中和した。Ａ₂₈₀吸収材料のピークを含む画分をプールし、そして使用の前、PBSに対して透析した。それぞれCD28Ig及びB7Igのための吸光係数は、既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により2.4及び2.8nl／mgであった。精製されたCD28Ig及びB7Ig結合活性の回収率は、B7⁺及びCD28⁺ CHO細胞の間接的な螢光染色の後、FACS（Ｒ）分析により判断される場合、ほぼ定量的であった。
例 ２
CTLA４Ig融合タンパク質の調製
CTLA４の細胞外ドメインとIgＣγ１ドメインとの間にCTLA４Igをコードする可溶性遺伝子融合体を、CD28Ig構成体についての上記方法に類似する方法で構成した。CTLA４遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列（Dariarachなど.,Eur.Jour.Immunol. 18:1901〜1905(1988)）に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRによりクローン化した。
CTLA４のためのシグナルペプチドはCTLA４遺伝子において同定されていないので、CTLA４の示された配列のＮ−末端を、オーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて２段階で、オンコスタチインＭ（Melikなど.,Mol.and Cell.Biol.9:2847(1989)）のシグナルペプチドに融合せしめた。第１段階に関しては、オリゴヌクレオチド、CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC（配列番号８）（CTLA４のＮ末端側の７個のアミノ酸に融合されるコンスタチンＭシグナルペプチドからのＣ末端側の15個のアミノ酸をコードする）を、前方プライマーとして、及びTTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG（配列番号９（Bcl Ｉ制限酵素部位を含み、そしてCTLA４レセプターをコードするアミノ酸配列のアミノ酸残基119〜125をコードする）を逆方向プライマーとして使用した。この段階のための鋳型は、H38細胞（Drs.Salahudin and Gallo,NCI,Bethesda,MDにより供給されるHTLV II感染症Ｔ細胞白血球細胞系）からの合計１μｇのRNAから合成されたcDNAであった。第１段階からのPCR生成物の一部を、オンコスタチインＭシグナルペプチドのＮ末端部分をコードし、そしてHind III制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオーバーラップ前方プライマー、CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC（配列番号10）及び同じ逆方向プライマーを用いて再増幅した。PCR反応の生成物をHind III及びBcl Ｉにより消化し、そして、Bcl Ｉ／Xha Ｉにより切断された、IgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に対応するアミノ酸配列をコードするcDNAフラグメントと共に、Hind III／Xha Ｉ切断された発現ベクター、CDM8又はHind III／Xha Ｉ切断された発現ベクター、πLN（Dr.Aruffoにより供給される）中に連結した。
得られたCTLA４Ig融合構成体の地図は図１に示される。その図に示される配列は、CTLA４（上方の文字、黒くない部分）とコンスタチンＭのシグナルペプチドSP（黒い部分）及びIgＣγ１のヒンジＨ（点描模様の部分）との間の連結を示す。括弧内のアミノ酸は、構成の間に導入された。星印（★）は、IgＣγヒンジ領域に導入されたシステイン〜セリン変異を示す。CTLA４に存在する免疫グロブリンスーパーファミリーＶ−株ドメインは、IgＣγ１のCH２及びCH３ドメインであるように示される。
次に、CTLA４Igを含む発現プラスミド、CDM8を、Seed and Aruffo,1987，前記により記載される方法の変法（Linsleyなど.，1991，前記）により、DEAE／テキストラントランスフェクションを用いてCOS細胞中にトランスフェクトした。
CTLA４Igのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む発現プラスミド構成体（πLN又はCDM8）を、標準方法を用いてのリポフェクションによりdhfr^- CHO系中にトランスフェクトし、CTLA４Igを安定して発現する新規細胞系を得た。
CTLA４Igに対応するアミノ酸配列をコードするDNAは、1991年５月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号68629を得た。
チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA４Ig−24と称する、CTLA４Igを発現する好ましい安定性のトランスフェクタントを、免疫感染色法を用いて、培地におけるB7結合活性についてB7陽性CHO細胞系をスクリーンすることによって製造した。トランスフェクタントは、10％ウシ胎児血清（FBS）、0.2mMのプロリン及び１μＭのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持された。
CTLA４Ig−24CHO細胞系は、1991年５月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号CRL10762を得た。
CTLA４Igを、血清フリーに条件付けられた上清液からプロテインＡクロマトグラフィー処理により精製した（図２）。CTLA４Igの濃度を、280nmで1.6の吸光係数（既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により実験的に決定された）を仮定して、決定した。CTLA４Igのサンプル（１μｇ）（レーン２及び４）及び分子量標準（レーン１及び３、図２）を、非還元条件（−βME、レーン１及び２）又は還元条件（＋βME、レーン３及び４）下でSDS-PAGE（４〜12％のアクリルアミドグラジエント）にゆだねた。タンパク質は、クーマシーブリリアンドブルーによる染色により可視化された。
非還元条件下で、CTLA４IgはMrが約100,000である種として移動し、そして還元条件下でそれは、Mrが約50,000である種として移動した（図２）。IgＣγヒンジのジスルフィドが構成の間に排除されたので、CD28IgのようなCTLA４Igは、生来のジスルフィド結合を通してたぶん連結されたダイマーである。
例 ３
CTLA４レセプター
十分な長さのヒトCTLA４遺伝子に対応するアミノ酸をコードするDNAを再構成するために、CTLA４のトランスメンブラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAを、PCRによりクローン化し、そして次に、CTLA４のＮ−末端に融合されるオンコスタチンＭシグナルペプチドに対応する、CTLA４Igからのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAにより連結した。PCRのための方法、及び細胞培養及びトランスフェクションは、COS細胞及びDEAE−デキストラン トランスフェクションを用いて、例１に記載されている通りであった。
ヒトリンパ球細胞におけるCTLA４レセプタータンパク質の発現はこれまで報告されていないので、CTLA４mRNAの源を示す必要はなかった。上記に示されるような、H38細胞の全体の細胞RNAから逆転写されるPCR cDNAを、PCRによるクローニングのために使用した。この目的のためには、オリゴヌクレオチド、GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG（配列番号11）（推定されるコード配列の初めの11個のアミノ酸をコードする）を、前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG（配列番号12）CTLA４における最後の８個のアミノ酸に相同であり、且つXba Ｉ部位を含む）を使用した。鋳型は再び、H38細胞からの１μｇのRNAから合成されたcDNAであった。PCR反応の生成物を制限エンドヌクレアーゼNco Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そして得られた316 bpの生成物をゲル精製した。上記CTLAIg融合からの340 bpのHind III／Nco Ｉフラグメントをまたゲル精製し、そして両制限フラグメントを、Hind III／Xba Ｉ切断されたCDM8中に連結し、OMCTLAを形成した。
得られる構成体は、完全な長さのCTLA４（配列番号13及び14）及びオンコスタチンＭシグナルペプチドに対応した。その構成体は図３に示され、そしてOMCTLA４と称した。図３に示されるCTLA４のための配列は、示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置111でのこれまで達告されたアラニンがトレオニンをコードするような塩基変化により、推定されるヒトCTLA４DNA配列（Dariavachなど.,前記）とは異なる。このトレオニンは、融合タンパク質の好結果をもたらす発現のために重要である、新しく同定されたＮ−連結グリコシル化部位の一部である。
連結生成物を用いて、MC1061／p3 Ｅ．コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドについてスクリーンした。得られる構成体の配列を、DNA配列分析により確かめた。
例 ４
CTLA４Igの特徴化
CTLA４Ig構成体を特徴づけるために、いくつかの単離体、CD28Ig，B7Ig及びCD５Igを上記のようにして調製し、そして例２及び３に記載されるようにしてCOS細胞をトランスフェクトし、そしてB7Igの結合のためにFACS（Ｒ）分析により試験した。上記構成体の他に、Aruffo and Seed (EMBO Jour.6:3313〜3316(198)）により記載されるようなCD７をコードするcDNAを含むCDM8プラスミドをまた使用した。
mAbs.ネズミモノクローナル抗体（mAba）9.3（抗−CD28）及びG19-４（抗−CD３）、G3−７（抗−CD７），BB−１（抗−B7抗原）及びラットmAb 187.1（抗−マウスＫ鎖）はこれまで記載されており（Ledbetterなど.,Pruc.Natl.Acad.Sci.84:1384〜1388(1987); Ledbetterなど.,Bloud 75:1531(1990); Yokochiなど.,前記）、そして使用の前、腹水から精製した。mAb OKT8を生成するハイブリドーマをATCC,Rockville,MDから得、そしてmAbをまた、使用の前、腹水から精製した。mAb 4G9（抗−CD19）は、Dr.E.Engleman(Stanfurd Uninersity,Palo Altu,(A)により提供された。精製されたヒト−マウスキメラmAb L6（ヒトＣγ１Fc部分を有する）は、Dr.P.Fell and M.Gayle(Bristal-Myers Squibb Pharmacentical Research Institute,Seattle,WA)の贈与である。
免疫染色及びFACS（Ｒ）分析。染色の前、COS又はCHO細胞を、10mMのEDTAを含むPBSにおいてインキュベートすることによってそれらの培養容器から除去した。細胞をまず、mAbs又はIg融合タンパク質と共に、10％FBSを含むDMEMにおいて10μｇ／mlで４℃で１〜２時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、そしてFITC−接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン又はFITC−接合ヤギ抗−ヒトIgＣγ血清（両者とも、Tago,Burlingam,CAからである）と共に、４℃でさらに0.5〜２時間インキュベートした。両mAbs及びIg融合タンパク質の結合が同じ実験において測定される場合、FITC−接合抗−マウス及び抗−ヒト第２段階試薬を、使用の前、一緒に混合した。合計10,000個の細胞に基づく螢光を次に、FACS（Ｒ）により分析した。
末梢血液リンパ球分離及び刺激。末梢血液リンパ球（PBLs）を、リンパ球分離媒体（Litton Bionetics,Kensington,MD）を通しての遠心分離により単離した。アロ反応性Ｔ細胞を、一次混合リンパ球反応（MLR）におけるPBLの刺激により単離した。PBLを、10⁶／mlの照射された（5000ラド）T51 LCLで培養した。EBV-形質転換リンパ球芽細胞系（LCL）,PM(Bristol-Myers Squibb Co.)及びT51(Bristol-Myers Squibb Co.)を、10％FBSにより補充されたRPMIに維持した。６日後、アロ反応性“幼芽”細胞を凍結保存した。二次MLRを、mAbs及びIg融合タンパク質の存在及び不在下で、新鮮な照射T51 LCLと共に融解されたアロ反応性幼芽を培養することによって行なった。細胞を、10％FBSを含むRPMIを含む96ウェル平底プレート（0.2mlの体積、４×10⁴個のアロ反応性幼芽及び１×10⁴個の照射T51 LCL細胞／ウェル）において培養した。四重培養物の細胞増殖を、２〜３日の培養の最後の６時間、〔³Ｈ〕−チミジンの摂取により測定した。
PHA-活性化されたＴ細胞を、１μｇ／mlのPHA(Wellcome,Charlotte,NC)と共にPBLを５日間、培養することによって、及びPHAを欠く培地において１日間、培養することによって調製した。生存細胞を、使用の前、リンパ球分離媒体を通しての沈殿により集めた。細胞をmAbsにより刺激し、又はCHO細胞により37℃で４〜６時間トランスフェクトせしめ、遠心分離により集め、そしてRNAを調製するために使用した。
CD４⁺Ｔ細胞を、健康なドナーからのPBLを、羊赤血球ロゼット技法を用いてＴ及び非−Ｔ細胞に分離し、そしてさらに、Damleなど.,J.Immunol. 139:1501(1987)（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにCD４⁺細胞をパンニングすることによりＴ細胞を分離することによってPBLsから単離した。Ｂ細胞をまた、抗−CD19mAb 4G9を用いて、Wysocki and Sato,Proc.Natl.Acad.Sci. 75:2844(1978)（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにパンニングすることにより末梢血液から精製した。Ｔ_h−誘発されたIg生成を測定するために、10⁶個のCD４⁺Ｔ細胞を、10％のFBSを含むRPMI１mlにおいて10⁶個のCD19⁺Ｂ細胞と共に混合した。37℃での６日間の培養に続いて、ヒトIgMの生成を、Volkmanなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2528(1981)（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにして固相ELISAを用いて培養上清液において測定した。簡単に言及すれば、96−ウェル平底マイクロタイターELISAプレート（Corning,Corning,NY）を、10μｇ／mlのアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG又はIgM抗体（Tago,Burlingame,CA）を含む200μｌ／ウェルの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）により被覆し、４℃で一晩インキュベートし、そして次に、PBSにより洗浄し、そしてウェルをさらに、PBS中、２％BSA（BSA-PBS）によりブロックした。アッセイされるべきサンプルを、それらのウェルに適切な希釈度で添加し、そして200μｌ／ウェルの１：1000希釈度のアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG又はIgM抗体（Tago）のホスラディシュ ペルオキシダーゼ（HRP）−接合Ｆ（ab′）₂画分と共にインキュベートした。次に、プレートを洗浄し、そして100μｌ／ウェルのｏ−フェニレンジアミン（Signa Chemical Co.,St.Louis,MO）溶液（pH5のクエン酸−リン緩衝液１ml当たり0.6ng及び0.045％の過酸化水素）を添加した。色の進行を、２Ｎの硫酸により止めた。490nmでの吸光度を、自動ELISAプレートリーダーにより測定した。試験及び対照サンプルは３通り行なわれ、そして吸光度の値を、培養上清液におけるIgの濃度が定量化される標準曲線を生成するために、上清液サンプルにより同時に行なわれた既知のIgG又はIgM標準により得られた値と比較した。データを、三重反復又は四重反復培養物のIg±SEMのng／mlとして表わされる。
免疫沈殿分析及びSDS PAGE。細胞を、¹²⁵Iにより表面ラベル化し、そして免疫沈殿分析にゆだねた。簡単に言及すれば、PHA-活性化されたＴ細胞を、Vitettaなど.,J.Exp.Med.134:242(1971)（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるように、ラクトペルオキシターゼ及びH₂O₂を用いて¹²⁵Iにより表面ラベル化した。SDS-PAGEクロマトグラフィー処理を、５％のアクリルアミドの積み重ねゲルを有する直線アクリルアミドグラジエントゲル上で行なった。ゲルをクーマシーブルにより染色し、脱色し、そして写真を取り、又は乾燥せしめ、そしてＸ線フィルム（Kodak XAR-5）に露光せしめた。
結合アッセイ。B7Igを、約２×10⁶cpm/pモルの比活性に¹²⁵Iによりラベルした。96のウェルのプラスチック皿を、CTLA４Ig(10mMのトリス（pH８）0.05mlの体積において0.5μｇ）を含む溶液により16〜24時間、被覆した。ウェルを、競争体の存在又は不在下で、¹²⁵I B7Ig（約５×10⁵ cpm）を含む溶液（0.09ml）の添加の前、結合緩衝液（50mMのBES(Sigma Chemical Co),pH6.8,0.1％BAS及び10％FCSを含むDMEM）によりブロックした。23℃で２〜３時間のインキュベーションに続いて、ウェルを結合緩衝液により１度洗浄し、そしてPBSにより４度洗浄した。次に、結合された放射能を0.5ＮのNaOHの添加により溶解し、そしてｒ計数により定量化した。
B7Igへの結合。完全なヒトCTLA４DNA遺伝子をコードするOMCTLA４構成体の官能多活性が、図４に示される実験に示される。COS細胞を、上記のようにして発現プラスミドCD7，OMCD28及びOMCTLA４によりトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を集め、そして培地のみ（添加なし）と共に又はmAbs 9.3,B7Ig,CD５Ig又はG3−７と共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、そして結合性を、FITC−接合ヤギ抗−マウスIg及びFITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第２段階試薬の混合物により検出した。トランスフェクトされた細胞を、間接的免疫染色法により適切な細胞表面マーカーの発現について試験し、そして螢光を上記のようにしてFACS（Ｒ）分析を用いて測定した。
図４に示されるように、mAb 9.3は、CD28−トランスフェクトされたCOS細胞に結合したが、しかしCTLA４−トランスフェクトされる細胞には結合しなかった。対照的に、B7Ig融合タンパク質（但し、対照のCD５Ig融合タンパク質ではない）は、CD28−及びCTLA４−トランスフェクトされた細胞の両者に結合した、CD７−トランスフェクトされたCOS細胞は、mAb 9.3にも融合タンパク質のいづれにも結合しなかった。これは、CD28及びCTLA４の両者がＢ細胞活性化抗原、B7を結合することを示唆する。さらに、mAb 9.3は検出できるほどは、CTLA４を結合しなかった。
B7陽性CHO細胞上へのCTLA４Igの結合。CTLA４Ig及びB7の結合をさらに特徴づけるために、B7⁺ CHO細胞及びリンパ芽球細胞系（PMLCL）上への精製されたCTLA４Igの結合活性を、図５に示される実験において測定した。増幅された、トランスフェクトされたCHO細胞系及びPM LCLを、培地のみ（添加なし）又はCD５Ig，CD28Ig又はCTLA４Igの同濃度のヒトIgＣγ１−含有タンパク質（10μｇ／ml）と共にインキュベートした。結合性を、FITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第二段階試薬の添加に続いて、FACS（Ｒ）により検出した。合計10,000個の染色された細胞を、FACS（Ｒ）により分析した。
図５に示されるように、CD28IgはB7⁺ CHO細胞に結合するが、しかしPM LCLには結合せず、すなわち細胞系は比較的低レベルのB7抗原を発現する（Linsleyなど.,前記，1990）。CTLA４IgはCD28Igよりも両細胞系により強く結合し、これは、それが高い親和性を伴って結合することを示唆する。CD28IgもCTLA４Igも、CD28⁺ CHO細胞に結合しなかった。
CTLA４I及びB7Igの結合の親和性。次に、CTLA４IgとB7Igとの間の相互作用の見掛け親和性を、固相競争結合アッセイを用いて測定した。96−ウェルプラスチック皿を、上記のようにしてCTLA４Igにより被覆した。B7Igを¹²⁵I（５×10⁵ cpm,２×10⁶ cmp/pモル）により放射ラベルし、そして添加し、示される濃度（図６を参照のこと）のラベルされていないキメラmAb L6,mAb 9.3,mAb BB−１又はB7Igの存在下で、４nMの濃度にした。プレート−結合放射能を測定し、そして競争体なしに処理されたウェルに結合される放射能の百分率として表わされた（28,300cpm）。個々の点は二重反復測定の平均を示し；反復試験は一般的に平均から20％以下変化した。濃度を、mAbに関して結合部位当たり75,000のMrに基づいて及びB7Igに関して結合部位当たり51,000のMrに基づいて計算した。
図６に示されるように、mAb BB−１及びラベルされていないB7Igが¹²⁵I−B7Ig結合のために有意に競合した（それぞれ約22nM及び約175nMで最大の半分の効果）。キメラmAb L6もmAb 9.3も、試験された濃度で効果的に競争しなかった。他の実験においては、使用されるmAb濃度は、固定されたCD28Ig又は90％以上、CD28を発現する細胞表面への¹²⁵I−B7Igの結合を阻害するのに十分であった。
図６からの競争データがスキャッチャート プロットでプロットされる場合、約12nMの解離定数Kdが、固定されたCTLA４Igへの¹²⁵I−B7の結合性について計算した（図７）。この値は、¹²⁵I−B7IgとCD28との間で前で測定されたKdよりも約20倍低く（約200 nM）（Linsleyなど，（1991），前記）、これは、CTLA４がCD28がレセプターよりもB7抗原のためにより高い親和性レセプターであることを示唆する。
CTLA４Igを結合したリンパ芽球細胞上の分子を同定するために（図７）、¹²⁵I−表面ラベルされた細胞を、免疫沈殿分析にゆだねた（図８）。B7⁺ CHO及びPM LCL細胞を¹²⁵Iにより表面ラベルし、そして上記のようにして非イオン性界面活性剤溶液により抽出した。約1.5×10⁷ cpmを有する、0.1mlの体積での抽出物のアリコートを、添加を伴わないで、又はそれぞれ２μｇのCD28Ig,CTLA４Ig又はCD５Igを伴って、上記のようにして免疫沈殿分析にゆだねた。次に、洗浄された免疫沈殿物を、還元条件下でSDS-PAGE（10〜20％のアクリルアミドグラジエント）により分析した。次に、ゲルを乾燥せしめ、そしてオートラジオグラフィーにゆだねた。図８の左側のパネルは、１日間の暴露の後に得られたオートラジオグラムを示す。図８の右側のパネルは、10日間の暴露の後の同じゲルのオートラジオグラムを示す。図８の中央のパネルにおけるオートラジオグラムはまた、10日間、暴露された。分子量標準の位置はまた、この図に示される。
図８により示されるように、分散的に移動する（約50,000〜75,000；約60,000での中央）、放射性ラベルされたタンパク質を、CTLA４Igにより（但し、CD28Ig又はCD５Igによってではない）免疫沈殿せしめた。この分子は、CTLA４Igにより、B7⁺ CHO細胞から免疫沈殿されたB7と共に同時移動し、そしてCD28Igより免疫沈殿されたB7と共には、より一層弱く同時移動した。これらの発見は、CTLA４Igが、B7抗原に大きさが類似する、リンパ芽球細胞上の単一タンパク質を結合することを示唆する。
CTLA４Igによるインビトロでの免疫応答の阻害
増殖の阻害。これまでの研究は、抗−CD28 mAb,9.3及び抗−B7mAb,BB−１が、アロ抗原を表わすＢ細胞により、アロ抗原特異的Ｔ_nの増殖及び免疫グロブリン分泌を阻害することを示している（Damle，など.,Proc.Natl.Acad.Sci.78:5096(1981);Lesslauerなど.,Eur.J.Immunol.16:1289(1986)）。CTLA４は本明細書に示されるようにB7抗原のために高い親和性レセプターであるので、可溶性CTLA４Igは、それらの応答を阻害するその能力について試験された。Ｔ細胞増殖に対するCTLA４Igの効果は、図９に示される実験で試験された。
一次混合リンパ球反応（MLR）幼若を、ネズミmAb9.3 Fabフラグメント、又はB7Ig,CD28IgもしくはCTLA４Ig免疫グロブリンＣγ融合タンパク質の濃縮物の不在又は存在下で、照射されたT51リンパ芽球細胞（IC）により刺激した。細胞増殖を、４日後、〔³Ｈ〕−チミジン組込みにより測定し、そして未処理の培養物による組込みの百分率として表わす、（21,000cpm）。図９は、４重反復測定の平均を表わす（SEM≦10％）。
図９に示されるようにCTLA４Igは、約30ng／ml（約0.8nM）で、１／２最大応答を伴って最大90％以上、投与量−依存性態様でMLR反応を阻害した。完全なmAb 9.3よりもより可能性あるMLRのインヒビターであることがこれまで示されている、mAb 9.3のFabフラグメント（Damleなど.,J.Immunol. 140:1753〜1761(1988)）はまた、MLRを阻害したが、しかしその濃度は、より高い濃度（約800 ng／ml又は１／２最大応答のためには約30nM）であった。B7Ig及びCD28Igは、高濃度でさえ、MLRを有意に阻害しなかった。他の実験においては、CTLA４Igと共にB7Igの添加は、CTLA４IgによるMLRの阻害を一部克服し、この事は、その阻害がB7抗原との特異的な相互作用によることを示唆する。
免疫グロブリン分泌の阻害。ヘルパーＴ細胞（Ｔ_n）−誘発性免疫グロブリン分泌に対するCTLA４Igの効果をまた試験した（図10）。CD４⁺Ｔ細胞を、上記のようにして、指示された免疫グロブリン分子の存在又は不在下で、同種CD19⁺Ｂ細胞と共に混合した。ネズミmAbs OKT8,9.3及びBB−１を20μｇ／mlで添加し、そしてIg融合タンパク質を10μｇ／mlで添加した。６日間の培養の後、培養上清液におけるヒトIgMの濃度（SEM＜５％）を、上記のようにして酵素イムノアッセイ（ELISA）により測定した。CD４⁺Ｔ細胞の不在下で培養されたＢ細胞によるIgM生成は11ng／mlであった。
図10に示されるように、CD４⁺Ｔ細胞は同種CD19⁺Ｂ細胞によるIgM生成を刺激した（CD４⁺Ｔ細胞の不在下で、IgMレベルは93％減じられた）。mAbs 9.3及びBB−１は、Ｔ_h−誘発されたIgM生成を有意に阻害した（それぞれ63％及び65％の阻害率）。CTLA４Igは、それらのmAbsよりもインヒビターとしてより効果的であった（89％の阻害率）。対照分子、mAb OKT8及びCD５Igによる阻害は、より低かった（30％以下の阻害率）。それらの分子は、スタフィロコーカル アウレウス（_{Staphylococcal aureus）}エンテロトキシンＢの存在下で測定されるIg生成を有意に阻害しなかった。類似する結果が、他のドナーに由来するＢ細胞及びCD４⁺Ｔ細胞により得られた。それらの結果は、CTLA４Igによる阻害が特異的であることを示す。
上記データはまた、CTLA４及びCD28レセプターが機能的及び構造的に関連していることを示す。CD28のように、CTLA４はまた、Ｂ細胞活性化抗原、B7のためのレセプターでもある。CTLA４Igは、約12nMの親和性定数Kdを伴って¹²⁵I−B7を結合し、その値は、CD28とB7Igとの間の親和性よりも20倍高い（約200nM）。従って、CTLA４及びCD28は、同じリガンド、すなわちB7抗原のために、それぞれ高い及び低い親和性レセプターとして考えられる。
CD28とB7との間の見掛け親和性は、ネズミＴ細胞ハイブリドーマのＴ細胞レセプターへの可溶性アロ抗原の結合について報告される親和性に類似し（約100nM;Schnekなど.,Cell 56:47(1989)）、そしてCD２とLFA3との間（Recnyなど.,J.Biol.Chem.265:8542(1990)）又はCD４とMHCクラスII分子との間（Claytonなど.,Nature 339:548(1989)）の相互作用よりも高い親和性である。CTLA４とB7との間の見掛け親和性定数Kdはさらに大きく、そして好都合には、より高い親和性のmAbsに匹敵する（Ｋ₂２−10,000nM;Alzariなど.,Ann.Rev.Immuno.6:555(1988)）CTLA４とB7との間のKdは、インテグリンレセプター及びそれらのリガンドのKdに類似するか又はそれの値よりも大きい（10〜2000nM:Hautanenなど.,J.Biol.Chem. 264:1437〜1442(1989); Di Minnoなど.,Blood 61:140〜148(1983); Thiagarajan and Kelley,J.Biol.Chem.263:3035〜3038(1988)）。従って、CTLA４とB7との間の相互作用の親和性は、リンパ芽球付着システムについて報告される中で最高である。
それらの結果は、CTLA４転写体の官能的タンパク質生成物の最初の発現を示す。CTLA４Ig、すなわちIgＣγ１ドメインに融合されるCTLA４の細胞外ドメインを含む融合構成体は、約50,000サブユニットのMrのジスルフィド結合ダイマーを形成する（図１）。鎖間ジスルフィドはこの融合のIg部分において形成することが予期されないので、CTLA４からのシステインはジスルフィト結合形成に包含される。同種CD28Ig融合タンパク質（Linsleyなど，前記，1991）はまた鎖間ジスルフィド結合を含む。それらの結果は、CD28のようにCTLA４レセプター（Hansenなど.,Immunogenetics 10:247〜260(1980)）がジスルフィド結合ホモダイマーとしてＴ細胞表面上に存在することを示唆する。CD28及びCTLA４は高い相同性のタンパク質であるが、それらは免疫学的に異なっている。なぜならば抗−CD28mAb,9.3はCTLA４を認識しないからである（図４及び５）。
CTLA４が、CD28に類似するシグナル化路によりＴ細胞を活性化できるかどうかについては知られていない。ネズミ及びヒトCTLA４の細胞質ドメインは同一であり（Dariavach.,前記1988）、これは、この領域が重要な官能性質を有することを示唆する。CD28及びCTLA４の細胞質ドメインはまた、相同性を共有す。但し、これが２つの分子に類似するシグナル性質を付与するために十分であるかいづれかについては不明である。
CTLA４IgはＴ細胞及びＢ細胞協力を必要とするインビトロリンパ球機能の可能性あるインヒビターである（図９及び10）。前記研究と共に、これらの発現は、Ｔ及びＢリンパ球応答を調節することにおいて、B7抗原とそのカウンターレセプター、CD28及び／又はCTLA４との間に相互作用の基本的重要性を示唆する。CTLA４Igは、免疫応答の間、それらの相互作用の役割上、未来の調査のために有用な試薬であるべきである。CTLA４Igは、mAb BB−１又はmAb 9.3のいづれよりもインビトロリンパ球応答のより可能性あるインヒビターである（図９及び10）。mAb BB−１よりもよりCTLA４Igの高い能力は、ほとんどそれらの分子間でのB7のための親和性の差異によると思われる（図６）。CTLA４Igはまた、mAb 9.3よりも可能性がある。なぜならば、たぶん、mAbとは異なって、それはその障害効果を妨害するために、Ｔ細胞増殖に対して直接的な刺激効果を有さないからである（Juneなど.,Immunology Today 11:211(1989)）。インビトロでのCTLA４Igの免疫抑制効果は、未来の研究が、異常なＴ細胞活性化又はIg生成を包含する自己免疫疾患の処置のために、この分子の可能な治療効果を保証されることを示唆する。
本発明が関与する当業者に明らかなように、本発明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示されるもの以外の形で具体化され得る。従って、上記本発明の特定の態様は例示的であると考えられるべきである。本発明の範囲は、例示的であって、本発明を制限するものではない。
配列の列挙
（１）一般情報
（ｉ）出願者：Linsley,Peter S
Ledbetter,Jeffrey A
Damle,Nitin K
（ii）発明の表題：CTLA４レセプター及びその使用法
（iii）配列の数：14
（iv）通信住所：
（Ａ）あて先：Sheldon & Mak
（Ｂ）通り：201 South Lake Avenue,Suite 800
（Ｃ）市：パサデナ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：91101
（ｖ）コンピューター読取りフォーム：
（Ａ）媒体型：プロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible
（Ｃ）操作システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release≠1.0,Version≠1.25
（vi）現在の出願日：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分 類：
（viii）アトニー／エージェントの情報：
（Ａ）名 称：Mandel,SaraLynn
（Ｂ）登録番号：31,853
（Ｃ）参照／ドケット番号：7848
（ix）電信情報：
（Ａ）電 話：（818）796-4000
（Ｂ）テレファックス：（818）795-6321
（２）配列番号１についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：39個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号１：

（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：39個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号２：

（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：39個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号３：

（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：84個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号４：

（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：41個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号５：

（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：47個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号６：

（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：39個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号７：

（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：65個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号８：

（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：33個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号９：

（２）配列番号10についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：72個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号10：

（２）配列番号11についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：33個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号11：

（２）配列番号12についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：45個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（xi）配 列：配列番号12：

（２）配列番号13についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：561個の塩基対
（Ｂ）型 ：核 酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起 源：
（Ａ）生物名：Homo sapiens
（ix）特 徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位 置：1..561
（xi）配 列：配列番号13：

（２）配列番号14についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長 さ：187個のアミノ酸
（Ｂ）型 ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配 列：配列番号14：

Claims (48)

1. 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する単離されたＣＴＬＡ４受容体タンパク質。
2. ＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列の位置１でのアラニンにより開始し、そして位置１２５でのアスパラギン酸で終結する配列番号１４に示される１２５個のアミノ酸を含んで成る、活性化されたＢ細胞上に発現されるＢ７抗原を結合する精製された可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質。
3. 位置１でのアラニンにより開始し、そして位置１８７でのアスパラギンで終結する配列番号１４に示される１８７個のアミノ酸を含んで成る、活性化されたＢ細胞上に発現されるＢ７抗原を結合する精製された可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質。
4. 請求の範囲第２又は３項記載のいずれかのタンパク質、及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る、免疫系疾患、癌またはウイルス感染を処置するため、あるいはＴ細胞増殖または細胞介在性免疫応答を調節するための医薬組成物。
5. 請求の範囲第２又は３項記載のタンパク質をコードする単離された核酸分子。
6. 配列番号１３の配列を有するｃＤＮＡである請求の範囲第５項記載の核酸分子。
7. 位置１でのグアニンにより開始し、そして位置３７５でのシトシンで終結する配列番号１３に示される請求の範囲第５項記載の核酸分子。
8. 請求の範囲第５項記載の核酸分子を含んで成るプラスミド。
9. 宿主細胞に請求の範囲第８項記載のプラスミドを含んで成る宿主ベクター系。
10. 前記宿主細胞が、細菌細胞である請求の範囲第９項記載の宿主ベクター系。
11. 前記宿主細胞が、真核細胞である請求の範囲第９項記載の宿主ベクター系。
12. 可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質の製造方法であって、宿主において前記可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質を生成するために請求の範囲第９項記載の宿主ベクター系を増殖し、そしてそのようにして生成された可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質を回収することを含んで成る方法。
13. ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む単離された可溶性ＣＬＴＡ４タンパク質であって、該タンパク質は活性化されたＢ細胞上に発現されるＢ７抗原に結合し、ここで該ＣＬＴＡ４の細胞外ドメインアミノ酸配列は、位置１でのアラニンにより開始し、そして位置１２５でのアスパラギン酸で終結する配列番号１４に示される、ＣＴＬＡ４タンパク質。
14. ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む単離された可溶性ＣＬＴＡ４タンパク質であって、該タンパク質は活性化されたＢ細胞上に発現されるＢ７抗原に結合し、ここで該ＣＬＴＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、位置２でのメチオニンにより開始し、そして位置１２５でのアスパラギン酸で終結する配列番号１４に示される、ＣＴＬＡ４タンパク質。
15. 非−ＣＴＬＡ４タンパク質配列に連結された請求の範囲第１３または１４項記載の可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質。
16. 前記非−ＣＴＬＡ４タンパク質が免疫グロブリン分子の少なくとも一部である請求の範囲第１５項記載の可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質。
17. 請求の範囲第１３項または１４項記載の精製されたタンパク質。
18. 請求の範囲１３〜１７のいずれか１項記載のタンパク質、及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る、免疫系疾患、癌またはウイルス感染を処置するため、あるいはＴ細胞増殖または細胞介在性免疫応答を調節するための医薬組成物。
19. 請求の範囲第１４項記載のタンパク質をコードする核酸分子。
20. 配列番号１３に示されるｃＤＮＡである請求の範囲第１９項記載の核酸分子。
21. 核酸位置４でのアデニンにより開始し、そして核酸位置３７５でのシトシンで終結する配列番号１３に示される請求項の範囲第２０項記載のｃＤＮＡ。
22. 請求の範囲第１９項記載の核酸分子を含んで成るプラスミド。
23. 宿主細胞に請求の範囲第２２項記載のプラスミドを含んで成る宿主ベクター系。
24. 前記宿主細胞が、細菌細胞である請求の範囲第２３項記載の宿主ベクター系。
25. 前記宿主細胞が、真核細胞である請求の範囲第２３項記載の宿主ベクター系。
26. タンパク質の製造方法であって、宿主において前記タンパク質を生成するために、請求の範囲第２３項記載の宿主ベクター系を増殖し、そしてそのようにして生成されたタンパク質を回収することを含んでなる方法。
27. （ａ）ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを表す配列番号１４のアミノ酸位置１でのアラニンにより開始し、そしてアミノ酸位置１２５でのアスパラギン酸で終結する第１アミノ酸配列、及び（ｂ）ヒト免疫グロブリン分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域から成る第２アミノ酸配列を有する、Ｂ７抗原を結合するＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質。
28. Ｂ７抗原を結合することができる可溶性変異体ＣＴＬＡ４分子であって、（ａ）配列番号１３のヌクレオチド１〜３７５のＤＮＡ配列にコードされ、１もしくは数個のアミノ酸置換を有する、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、および（ｂ）ヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列からなり、（ａ）及び（ｂ）が連結されている、可溶性変異体ＣＴＬＡ４分子。
29. 請求の範囲第２８項記載の可溶性変異体ＣＴＬＡ４分子、ＣＤ２８受容体の細胞外ドメイン、ならびにヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、可溶性融合タンパク質ハイブリッド。
30. 前記ＣＤ２８受容体の細胞外ドメインがＣＤ２８受容体のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含み、そして前記ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインがＣＴＬＡ４のＣＤＲ３領域を含む、請求の範囲第２９項記載のＣＤ２８ Ｉｇ／ＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッド。
31. 前記ＣＤ２８受容体の細胞外ドメインがＣＤ２８受容体のアミノ酸１−９４に対応し、そして前記ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインがＣＴＬＡ４のアミノ酸９５−１２５に対応する、請求の範囲第２９項記載のＣＤ２８ Ｉｇ／ＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッド。
32. 前記ＣＤ２８受容体の細胞外ドメインが前記ＣＤ２８受容体のアミノ酸１−９４に対応し、そして前記ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが前記ＣＴＬＡ４のアミノ酸９５−１２０に対応する、請求の範囲第２９項記載のＣＤ２８ Ｉｇ／ＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッド。
33. 請求の範囲第２７〜３２のいずれか１項記載のタンパク質、及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る、免疫系疾患、癌またはウイルス感染を処置するため、あるいはＴ細胞増殖または細胞介在性免疫応答を調節するための医薬組成物。
34. Ｂ７−陽性細胞とのＴ細胞相互作用により介在される免疫系疾患を処理するために有用な医薬組成物の調製方法であって、医薬的に許容できるキャリヤーと共に、請求の範囲第２、３、１３、１４、２７及び／又は３２記載のタンパク質を混合することを含んで成る方法。
35. 請求の範囲第２７項記載の可溶性ＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。
36. 請求の範囲第２８項記載の可溶性変異体ＣＴＬＡ４分子のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
37. 請求の範囲第２７項記載のＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質を安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞系。
38. ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０７６２である、請求の範囲第３７に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞系。
39. Ｂ７抗原と反応性のＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードする、ＡＴＣＣ番号６８６２９として寄託されたＤＮＡ分子。
40. ＡＴＣＣ番号６８６２９として寄託されたＤＮＡによりコードされる、Ｂ７抗原と反応性のＣＴＬＡ４ Ｉｇ融合タンパク質。
41. Ｂ７−陽性細胞との機能的なＣＴＬＡ４−陽性Ｔ細胞相互作用を調節するためのインビトロ方法であって、前記Ｂ７−陽性細胞と、請求項１３〜１７項または２７〜３２項のいずれかに記載のタンパク質を、ＣＴＬＡ４との内因性Ｂ７抗原の反応を妨げるための有効量で接触せしめることを含んで成る方法。
42. 前記Ｂ７陽性細胞が、Ｂ細胞である、請求の範囲第４１項記載の方法。
43. 前記Ｂ７陽性細胞と前記ＣＴＬＡ４−陽性Ｔ細胞との相互作用が阻害される、請求の範囲第４１項記載の方法。
44. 自己免疫疾患、同種移植片拒絶、慢性のアレルギー反応、移植片拒絶、または移植片対宿主疾患を処置するための医薬組成物であって、配列番号１４のアミノ酸残基１〜１２５に示されるＣＬＴＡ４の細胞外ドメインからなる、Ｂ７抗原を結合することができる可溶性変異体ＣＴＬＡ４分子、または１もしくは数個のアミノ酸置換を有するその改変体、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、医薬組成物。
45. 自己免疫疾患、同種移植片拒絶、慢性のアレルギー反応、移植片拒絶、または移植片対宿主疾患を処置するための医薬組成物であって、配列番号１４に示される、１位でのアラニンにより開始し、１２５位でのアスパラギン酸で終結する、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインからなる、Ｂ７抗原を結合することができる単離された可溶性ＣＴＬＡ４分子、および医薬的に許容できるキャリヤーを含み、該可溶性ＣＴＬＡ４分子は、非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に連結されている、医薬組成物。
46. 自己免疫疾患、同種移植片拒絶、慢性のアレルギー反応、移植片拒絶、または移植片対宿主疾患を処置するための医薬組成物であって、
    ＣＤ２８受容体の細胞外ドメインの一部に対応する第１アミノ酸配列、ＣＴＬＡ４受容体の細胞外ドメインの一部に対応する第２アミノ酸配列、ヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域に対応する第３アミノ酸配列からなり、該第１アミノ酸配列が該第２アミノ酸配列に融合されている、単離された可溶性ＣＬＴＡ４分子、ならびに
    医薬的に許容できるキャリヤー
    を含む、医薬組成物。
47. 自己免疫疾患、同種移植片拒絶、慢性のアレルギー反応、移植片拒絶、または移植片対宿主疾患を処置するための医薬組成物であって、以下の（ａ）および（ｂ）：
    （ａ）配列番号１３のＤＮＡ配列のヌクレオチド１〜３７５によりコードされるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインであって、１もしくは数個のアミノ酸置換を有する、ドメイン、
    （ｂ）ヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列、
    からなる、Ｂ７抗原に結合することができる単離された可溶性変異体ＣＴＬＡ４分子、ならびに医薬的に許容できるキャリヤーを含み、（ａ）は（ｂ）に連結されている、医薬組成物。
48. 自己免疫疾患、同種移植片拒絶、慢性のアレルギー反応、移植片拒絶、または移植片対宿主疾患を処置するための医薬組成物であって、
    配列番号１４に示され、位置２でのメチオニンにより開始し、そして位置１２５でのアスパラギン酸で終結するＣＬＴＡ４の細胞外ドメインからなる、Ｂ７抗原を結合することができる、非−ＣＬＴＡ４タンパク質配列と結合した単離された可溶性ＣＴＬＡ４分子、ならびに医薬的に許容できるキャリヤーを含む、医薬組成物。

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