JP2003096097A - Ｃｔｌ４ａレセプター、それを含有する融合タンパク質およびそれらの使用 - Google Patents

Ｃｔｌ４ａレセプター、それを含有する融合タンパク質およびそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、従来発現されていないCTLA４遺伝
子の可溶性タンパク質生産物を得ること、およびＴ細胞
の機能的応答に関係するCTLA４のための天然のリガンド
を同定することを課題する。さらに、本発明は、可溶性
タンパク質生産物を使用してＴ細胞のinvivo 応答を調
節して病理学的状態を処置することを課題とする。 【解決手段】 活性化されたB細胞上に発現されるB7抗
原を結合する、CTLA4の細胞外ドメインを有する単離さ
れた可溶性CTLA4分子。CTLA4の細胞外ドメインから成る
第１アミノ酸配列、及びヒト免疫グロブリン分子のヒン
ジ、CH2及びCH3領域から成る第２アミノ酸配列を有す
る、B7抗原を結合するCTLA4Ig融合タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、活性化されたB細
胞上に発現されるB7抗原を結合する、CTLA4の細胞外ド
メインを有する、単離された可溶性CTLA4分子に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】脊椎動物の免疫系の特徴は、「自己」と
「非自己」とを区別する能力である。この性質は、最適
な免疫活性化を達成するために多数のシグナルを必要と
する系の進化に導いた（Janeway, Cold SpringHarbor S
ymp. Quant. Biol. 54 : 1-14(1989)) 。Ｔ細胞 Ｂ細
胞の相互作用は免疫応答に対して必須である。Ｔ細胞お
よびＢ細胞上に見いだされる多数の付着分子のレベル
は、免疫応答の間に増加する（Springerら、（1987）、
前掲；およびShimizu,Current Opinion in Immunology,
KindtおよびLong編、１：92-97 (1988)) ；およびHeml
er, ImmunologyToday ９：109-113 (1988)) 。
【０００３】これらの分子のレベルの増加は、活性化さ
れたＢ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激すると
き、休止のＢ細胞よりもいっそう有効である理由の説明
を促進することができる（Kaiuchi ら、J. Immunol. 13
1 : 109-114 (1983) ; Krcigerら、J. Immunol.135 : 2
937-2945 (1985) ; McKenzie, J. Immunol. 141 : 2907
-2911 (1988) ; およびHawrylowiczおよびUnanue, J. I
mmunol. 141 : 4083-4088 (1988)) 。
【０００４】Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）の免疫応答の発
生は、細胞−細胞の相互作用（Springerら、A. Rev. Im
munol.５：223-252 (1987)) 、とくにＴ細胞とアクセサ
リー細胞、例えば、Ｂ細胞との間の相互作用、および可
溶性仲介因子（サイトカインまたはリンホカイン）の生
産を含む複雑なプロセスである（DinarelloおよびMier,
New Engl. Jour. Med. 317 : 940-945 (1987))。この
応答は、Ｔ細胞レセプター複合体（Weissら、Ann. Rev.
Innunol.４：593-619 (1986)) および他の「アクセサ
リー」表面分子（Springerら、（1987）前掲）を含む、
いくつかのＴ細胞表面レセプターにより調節される。こ
れらのアクセサリー分子の多数は、細胞の表面上のモノ
クローナル抗体の反応性により定められる、天然に見い
だされる細胞表面の分化（CD）抗原である（McMichacl
編、Leukocyte Typing III ，Oxford Univ. Press 、
オックスフォード、ニューヨーク（1987))。
【０００５】リンパ球のアクセサリー分子を含む抗原独
立の細胞間の相互作用は、免疫応答に対して必須である
（Springerら、（1987）前掲）。例えば、Ｔ細胞関連タ
ンパク質CD２のそのリガンドLFA ３（広く発現される糖
タンパク質（ShawおよびShimuz、前掲の中に概観されて
いる））への結合は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を最適
化するために重要である（Moigconら、Nature 339 : 31
4（1988))。他の重要な付着系は、リンパ球、マクロフ
ァージ収量顆粒球上に見いだされるLFA-１糖タンパク質
（Springerら、（1987）前掲；ShawおよびShimuz(1988)
前掲）のそのリガンドICAM-1（Makgoba ら、Nature 31
1 : 86-88 (1988)) およびICAM−２(Stauntonら、Natur
e 339 : 61-64 (1989)) への結合を含む。
【０００６】Ｔ細胞のアクセサリー分子CD８およびCD４
は、それぞれ、MHCクラスＩ（Norment ら、Nature 336
: 79-81 (1988)) およびクラスII（Doyle およびStrom
inger, Nature330 : 256-259 (1987)) 分子との相互作
用により、Ｔ細胞の付着を強化する。「ホーミング・レ
セプター（homing receptor)」はリンパ球の移動のコン
トロールのために重要である（Stoolman,Cell 56 : 907
-910 (1989))。VLA 糖タンパク質は、細胞外マトリック
ス成分への付着を必要とするリンパ球の機能を仲介する
ように思われるインテグリン（integrin)である（Hemle
r、前掲）。CD２／LFA-３，LFA-１／ICAM-1、およびVLA
付着系は、広範な種類のタイプの細胞上に存在する（S
pringerら、（1987）、前掲；ShawおよびShimuz、(198
9)、前掲およびHemler、（1988))、前掲）。
【０００７】Ｂ−リンパ球の活性化は２つのシグナルを
必要とすることがかなり以前に提案され（Bretscher お
よびCohn, Science 169 : 1042−1049 (1970))そして現
在すべてのリンパ球はそれらの最適な活性化のための２
つのシグナル、抗原特異的またはクローナルシグナル、
ならびに抗原非特異的シグナルを必要とすると信じられ
ている（Janeway、前掲）。Freeman ら（J. Immunol. 1
43 (8) : 2714-2722 (1989))は、mAB B7により認識され
るＢ細胞活性化抗原をコードするcDNAクローンを単離し
そして配列決定した（Freemanら、J. Immunol. 138 : 3
260 (1987))。
【０００８】このcDNAでトランスフェクションしたCOS
細胞は、標識化mAB B7およびmAB BB−１の両者により染
色されることが示された（Clark ら、Human Immunol. 1
6 :100-113 (1986)；Yokochi ら、J. Immunol. 128 : 8
23 (1981)) ; Freeman ら、（1989）前掲；およびFreem
anら、（1987）、前掲))。さらに、この抗原の発現は他
の系統の細胞、例えば、単球上に検出された（Freeman
ら、前掲）。
【０００９】Ｔヘルパー細胞（Ｔh ) 抗原の応答のため
に要求されるシグナルは、抗原を提示する細胞（APC)に
より提供される。Ｔ細胞レセプター複合体（Weiss,J. C
lin,Invest. 86 : 1015 (1990)) を、 APC上のクラスII
の主要な組織適合性複合体（ＭIIＣ）分子に関係して提
示された抗原と相互作用させることによって、第１シグ
ナルは開始される（Allen,Immunol. Today 8 : 270 (19
87)) 。この抗原特異的シグナルは完全な応答を発生す
るために不十分であり、そして第２シグナルの存在下
に、クローナルの不活性化またはアネルギーに実際に導
くことがある(Schwartz, Science 248 : 1349 (199
0))。
【００１０】MHC により提供される第２「共同刺激（co
stimulatory)」シグナルについての要件は、ある数の実
験の系において証明された（Schwartz,前掲；Weaverお
よびUnanue, Immunol. Today 11 : 49 (1990))。これら
の１または２以上のシグナルの分子の性質は完全には理
解されないが、ある場合において、可溶性分子、例え
ば、インターロイキン（IL）−１（WeaverおよびUnanu
c,前掲）および細胞間付着に関係する膜レセプターの両
者は共同刺激シグナルを提供できることが明らかであ
る。
【００１１】CD28抗原、すなわち、免疫グロブリン上科
のホモ２量体の糖タンパク質（AruffoおよびSeed,Proc.
Natl. Acad. Sci. 84 : 8573-8577 (1987))は、ほとん
どの成熟ヒトＴ細胞上に見いだされるアクセサリー分子
である（Damleら、J. Immunol. 131 : 2296-2300 (198
3)) 。現在の証拠が示唆するように、Ｔ細胞反応複合体
により開始されるものと区別される別のＴ細胞活性化の
経路において、この分子は機能する（Juneら、Mol.Cel
l. Bicl. 7 : 4472-4481 (1987)) 。CD28抗原と反応性
のモノクローナル抗体（mAb)は、種々のポリクローナル
の刺激により開始されるＴ細胞の応答を増強することが
できる（Juneら、前掲、の中に概観されている）。
【００１２】これらの刺激作用はmAb 誘発サイトカイン
の生産（Thompsonら、Proc.Natl. Acad. Sci. 86 : 133
3-1337 (1989) ; およびLindstenら、Scicnce 244: 33
9-343 (1989)から、mRNA安定化の増加 (Lindstenら、(1
989)、前掲）の結果としてを生ずることができる。抗CD
28mAb は、また、阻止作用を有することができ、すなわ
ち、それらはオートロガス混合リンパ球反応（Damle
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096-6001 (1981))
および抗原特異的Ｔ細胞クローンの活性化（Lesslauer
ら、Eur. J. Immunol. 16 : 1289-1296 (1986)) をブロ
ックすることができる。
【００１３】CD28はＢ細胞活性化抗原であるB7／BB−１
のための対レセプターであることが研究において示され
た（Linsleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 503
1-5035 (1990)) 。便宜上、B7／BB−１抗原を以後「B7
抗原」と呼ぶ。CD28とB7抗原との間の相互作用は、B7抗
原およびCD28レセプターの細胞外部分、および免疫グロ
ブリン（Ig）Ｃγ１（一定領域の重鎖）の遺伝学的融合
を使用して特徴づけられた（Linsleyら、J. Exp. Med.
173 : 721-730 (1991))。
【００１４】同定化B7Ig融合タンパク質ならびにB7陽性
CHO細胞は、Ｔ細胞の増殖を共同刺激（costimulate)す
ることが示された。B7陽性CHO 細胞によるＴ細胞の刺激
は、また、IL−２のための転写レベルの増加を特異的に
刺激する。追加の研究において、抗CD28mAbは、ある種
のＴ細胞白血病細胞系においてＢ細胞系白血病系統との
細胞の相互作用により誘発されたIL−２の生産を阻止す
ることが示された（Kohno ら、CellImmunol. 131-1-10
(1990))。
【００１５】CD28は単一の細胞外の可変領域（Ｖ）様ド
メインを有する（AruffoおよびSeed、前掲)。相同性分
子のCTLA４は、ネズミ細胞溶解性Ｔ細胞のcDNAライブラ
リーの分別スクリーニングにより同定された（Brunet
ら、Nature 328 :267-270 (1987))。この分子の転写は
細胞障害活性を有するＴ細胞の集団の中に見いだされ、
CTLA４が細胞溶解性応答において機能するであろうこと
を示唆した(Brunetら、前掲；およびBrunetら、Immuno
l. Rev. 103-21-36 (1988)) 。
【００１６】研究者らの報告によると、CTLA４のヒトの
対(Dariavach ら、Eur. J.Immunol. 18 : 1901-1905
(1988)) の遺伝子はクローニングされそしてCD28と同一
の染色体領域（２ｇ33-34) にマッピングされた(Lafage
-Pochitalodd)ら、Immunogenetics 31 : 198-201(199
0)) 。このヒトCTLA４のDNA とCD28タンパク質をコード
するものとの間の配列の比較は、膜近傍領域および細胞
質領域において最高度の相同性をもつ、配列の有意な相
同性を明らかにする（Brunetら、1988、前掲；Dariavac
hら、1988、前掲）。
【００１７】CD28とCTLA４との間の高度の相同性は、そ
れらの遺伝子の共同局在化と一緒に、これらの分子がま
た機能的に関係するかどうかという問題を発生する。し
かしながら、CTLA４のタンパク質生産物はまだ首尾よく
発現されてきていないので、これらの問題は未解決のま
まである。
【００１８】免疫グロブリン遺伝子の上科における細胞
表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現は、CD4, HIV
-1のレセプター、およびCD28およびB7のレセプターにつ
いて、ハイブリッド融合分子を使用して活性化され、こ
れらのハイブリッド融合分子は抗体ドメインに融合され
たCD4レセプターの細胞外ドメインの部分に相当するア
ミノ酸をコードするDNA 配列から成る（免疫グロブリン
γ１（Capon ら、Nature 337 :525-531 (1989)(CD4)お
よびLinsley ら、J. Exp. Med.、前掲）(CD28およびB7)
。
【００１９】従来発現されていないCTLA４遺伝子の可溶
性タンパク質生産物を得ること、およびＴ細胞の機能的
応答に関係するCTLA４のための天然のリガンドを同定す
ることは有用であろう。次いで、可溶性タンパク質生産
物を使用してＴ細胞のinvivo応答を調節して病理学的状
態を処置することができるであろう。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、従
来発現されていないCTLA４遺伝子の可溶性タンパク質生
産物を得ること、およびＴ細胞の機能的応答に関係する
CTLA４のための天然のリガンドを同定することを課題す
る。さらに、本発明は、可溶性タンパク質生産物を使用
してＴ細胞のinvivo 応答を調節して病理学的状態を処
置することを課題とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】発明の要約 したがって、本発明はCTLA４レセプタータンパク質に相
当するアミノ酸配列をコードする完全なかつ正しいDNA
配列を提供し、そしてCTLA４レセプターのために天然の
リガンドとしてB7抗原を同定する。本発明は、また、CT
LA４免疫グロブリン（Ig）融合タンパク質生産としてDN
Aを発現する方法を提供する。本発明の態様は、CTLA４I
g融合タンパク質、およびCD28Ig／CTLA４ Ig 融合タン
パク質を包含するハイブリッドの融合タンパク質を包含
する。また、CTLA４融合タンパク質、B7Ig融合タンパク
質、およびそれらの断片および／または誘導体、例え
ば、CTLA４およびB7抗原と反応性のモノクローナル抗体
を使用して細胞の相互作用および免疫応答を調節する方
法が提供される。
【００２２】本発明のヒトCTLA４レセプタータンパク質
は187アミノ酸によりコードされ、そして新しく同定さ
れたＮ連鎖グリコシル化部位を包含する。
【００２３】本発明のCTLA４Ig融合タンパク質は、活性
化Ｂ細胞、および他の系統上に発現されたB7抗原、Ｔ細
胞上のCD28レセプターのためのリガンドと結合する。CT
LA４Igは、CD28レセプターに結合するB7よりも有意によ
り高い親和性でB7抗原と結合する。
【００２４】CTLA４Ig構成体は、ヒトIgＣγ１ドメイン
に相当する第２アミノ酸配列に融合したCTLA４レセプタ
ーの細胞外ドメインに相当する第１アミノ酸配列を有す
る。第１アミノ酸配列は、アミノ酸配列の約位置１から
約位置125のアミノ酸残基を含有し、これらのアミノ酸
残基はヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相
当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合
したCTLA４の細胞外ドメインに相当する。融合タンパク
質は好ましくは２量体の形態で生産される。可溶性CTLA
４IgはＴおよびＢリンパ球の応答の効力のあるinvivo
インヒビターである。
【００２５】また、本発明において、ハイブリッド融合
タンパク質、例えば、第１アミノ酸配列を有するCD28Ig
／CTLA４Ig融合タンパク質が包含され、この第１アミノ
酸配列はCTLA４Igの細胞外ドメインの断片に相当する第
２アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およ
びCH３領域に相当する第３アミノ酸配列に接合したCD28
の細胞外ドメインの断片に相当する。
【００２６】ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様
は、CD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約
位置１から約94のアミノ酸残基を含有する第１アミノ酸
配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質であり、
CD28の細胞外ドメインはCTLA４の細胞外ドメインに相当
するアミノ酸配列の約位置94から約位置125のアミノ酸
残基を含有する第２アミノ酸配列を接合し、CTLA４の細
胞外ドメインはヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３
領域に相当するアミノ酸残基を含有する第３アミノ酸配
列に接合している。
【００２７】また、本発明において、Ｔ細胞をCTLA４レ
セプターのリガンドと反応させることによって、CTLA４
陽性Ｔ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することに
よる、他の細胞とのＴ細胞の相互作用を調節する方法が
包含される。リガンドはB7Ig融合タンパク質、CTLA４レ
セプターと反応性のモノクローナル抗体、および抗体断
片を包含する。
【００２８】本発明は、また、B7抗原のためのリガーゼ
を使用する、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節す
る方法を提供する。このようなリガンドは、本発明のCT
LA４Ig融合タンパク質、その断片または誘導体、CD28Ig
／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗
原と反応性のモノクローナル抗体である。
【００２９】本発明は、さらに、B7抗原と反応性のリガ
ンドを投与してB7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節
することによって、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用に
より仲介される免疫系の疾患を処置する方法を包含す
る。このリガンドは、CTLA４Ig融合タンパク質、CD28Ig
／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗
原と反応性のモノクローナル抗体である。
【００３０】CTLA４Ig融合タンパク質と反応性のモノク
ローナル抗体およびCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質と
反応性のモノクローナル抗体を、細胞の相互作用の調節
における使用について記載する。
【００３１】CTLA４Ig融合タンパク質を安定に発現する
新規なチャイニーズハムスター卵巣細胞系をまた開示す
る。
【００３２】１つの局面において、本発明は、B7抗原と
反応性である図３（配列番号13及び14）に示されるアミ
ノ酸配列によりコードされるCTLA４レセプタータンパク
質を提供する。
【００３３】別の局面において、本発明は、CTLA４の細
胞外ドメインに対応するアミノ酸残基を含む第１アミノ
酸配列及びヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及
びCH３領域に対応するアミノ酸残基を含む第２アミノ酸
配列を有するB7抗原と反応性であるCTLA４Ig融合タンパ
ク質を提供する。
【００３４】別の局面において、本発明は、CTLA４の細
胞外ドメインに対応するアミノ酸配列の約１位〜約125
位のアミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列及びヒト免疫
グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応す
るアミノ酸残基を含む第２アミノ酸配列を有するB7抗原
と反応性のCTLA４Ig融合タンパク質を提供する。
【００３５】別の局面において、本発明は、B7抗原と反
応性であり、そしてATCC No.68629を有するCTLA４Ig融
合タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするDNA
を提供する。
【００３６】別の局面において、本発明は、CTLA４の細
胞外ドメインのフラグメントに対応する第２アミノ酸配
列に融合されるCD28の細胞外ドメインのフラグメントに
対応する第１アミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣγ
１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応する第３アミノ酸
配列を有するB7抗原と反応性のハイブリッド融合タンパ
ク質を提供する。
【００３７】別の局面において、本発明は、B7陽性細胞
により機能的CTLA４陽性Ｔ細胞相互作用を調節するため
の方法であって、CTLA４と内因性B7抗原との反応により
B7抗原を妨害するためにリガンドと前記B7陽性細胞とを
接触せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００３８】１つの実施形態において、前記リガンドが
CTLA４の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む融合タ
ンパク質である。
【００３９】別の実施形態において、前記リガンドが、
CTLA４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列の約１
位〜約125 位のアミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列及
びヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領
域に対応するアミノ酸残基を含む第２アミノ酸配列を有
するCTLA４Ig融合タンパク質である。
【００４０】別の実施形態において、前記B7陽性細胞が
前記CTLA４Ig融合タンパク質のフラグメント又は誘導体
と接触せしめられる。
【００４１】１つの実施形態において、前記リガンドが
B7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
【００４２】別の実施形態において、前記抗体が抗−BB
１モノクローナル抗体である。
【００４３】１つの実施形態において、前記B7陽性細胞
がＢ細胞である。
【００４４】１つの実施形態において、前記B7陽性細胞
と前記CTLA４−陽性Ｔ細胞との相互作用が阻害される。
【００４５】１つの実施形態において、前記リガンド
が、CTLA４レセプターの細胞外ドメインの一部に対応す
る第２アミノ酸配列に融合されるCD28レセプターの細胞
外ドメインの一部に対応する第１アミノ酸配列及びヒト
免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対
応する第３アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合
タンパク質ハイブリッドである。
【００４６】別の局面において、本発明は、他の細胞と
のCTLA４−陽性Ｔ細胞相互作用を調節するための方法で
あって、CTLA４のためのリガンドとCTLA４−陽性Ｔ細胞
とを接触することによってB7陽性細胞と前記Ｔ細胞との
相互作用を阻害することを含んで成る方法を提供する。
【００４７】１つの実施形態において、前記リガンドが
B7Ig融合タンパク質である。
【００４８】１つの実施形態において、前記リガンドが
CTLA４と反応性のモノクローナル抗体である。
【００４９】別の実施形態において、前記リガンドが前
記モノクローナル抗体のフラグメントである。
【００５０】別の局面において、本発明は、B7陽性細胞
により、Ｔ細胞相互作用により仲介される免疫システム
疾患を処理するための方法であって、前記B7陽性細胞に
よりＴ細胞相互作用を調節するためにB7抗原のためのリ
ガンドを患者に投与することを含んで成る方法を提供す
る。
【００５１】１つの実施形態において、前記リガンドが
CTLA４Ig融合タンパク質である。
【００５２】１つの実施形態において、前記リガンドが
CD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質ハイブリッドである。
【００５３】１つの実施形態において、前記リガンドが
B7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
【００５４】１つの実施形態において、前記Ｔ細胞相互
作用が阻害される。
【００５５】別の局面において、本発明は、CTLA４Ig融
合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を提供す
る。
【００５６】別の局面において、本発明は、CD28Ig／CT
LA４Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を
提供する。
【００５７】別の局面において、本発明は、ATCC No.10
762 を有し、そしてCTLA４Ig融合タンパク質を安定して
発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞系を提供す
る。
【００５８】
【発明の実施の形態】ここに記載する本発明を完全に理
解することができるように、次の説明を記載する。
【００５９】本発明は、Ｔ細胞表面上に見いだされ、活
性化Ｂ細胞および他の系統の細胞上に発現されたB7抗原
に結合する、ヒトCTLA４レセプターの単離およびクロー
ニング、およびCTLA４レセプター遺伝子の可溶性融合タ
ンパク質生産物の発現に関する。本発明は、また、発現
されたCTLA４レセプターを使用して、B7陽性細胞とのＴ
細胞の相互作用を包含する細胞の相互作用を調節する方
法を提供する。
【００６０】好ましい態様において、本発明のヒトCTLA
４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をコー
ドする完全なかつ正しいDNA 配列をPCR によりクローニ
ングする。CTLA４の完全な予測されたコーディング配列
を含有するcDNAを、下の実施例の中に詳細に記載されて
いるように、H38RNAから増幅されたPCR断片からアセン
ブリングし、そして発現ベクターCDM8の中に挿入した。
単離物をCOS 細胞の中にトランスフェクションし、そし
てB7Ig、すなわち、Linsleyら、J. Exp. Med.173 : 721
-730 (1991) 記載されているように、B7の細胞外ドメイ
ンおよびヒト免疫グロブリン（Ig）Ｃγ１領域に相当す
るアミノ酸配列を有する可溶性融合タンパク質の結合に
ついて試験した。
【００６１】次いで、OMCTLA４と表示する１つの単離物
のDNA配列を決定し、そしてＮ末端においてオンコスタ
チインＭからのシグナルペプチドに融合した、予測され
たヒトCTLA４配列に正確に相当することが発見された。
CTLA４レセプターは187アミノ酸（シグナルペプチドお
よび停止コドンを除外する）によりコードされ、そして
アミノ酸位置109-111 に新しく同定されたＮ連鎖グリコ
シル化部位を含む（下の第３図を参照）。オンコスタチ
インＭのシグナルペプチドを使用して、CTLA４レセプタ
ーを発現させる。
【００６２】他の好ましい態様において、CTLA４の細胞
外ドメインに相当する第１アミノ酸配列およびヒトIgＣ
γ１ドメインに相当する第２アミノ酸配列を有する融合
タンパク質を使用して、CTLA４レセプター遺伝子（CTLA
４Ig）のタンパク質生産物の可溶性の形態を調製する。
ここに記載するcDNA配列に基づくヒトCTLA４レセプター
に相当するアミノ酸配列の部分をコードするcDNAを含有
するクローニングおよび発現のプラスミド（CDM8および
πLN）を構成し、ここでCTLA４レセプター遺伝子の細胞
外ドメインの断片に相当する第１アミノ酸配列をコード
するcDNAを、発現されたCTLA４タンパク質の可溶性の変
更によりCTLA４レセプター遺伝子の発現を可能とするIg
Ｃ領域に相当する第２アミノ酸配列をコードするDNAに
接合する。
【００６３】こうして、可溶性CTLA４Ig融合タンパク質
は第１アミノ酸配列によりコードされ、この第１アミノ
酸配列はヒトIgのＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域
に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に
接合したCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配
列の約位置１〜約125のアミノ酸残基を含有する。融合
タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。次
いでこの構成体をCOSまたはCHO 細胞の中にトランスフ
ェクションし、そしてCTLA４Igを精製しそして２量体と
して同定した。
【００６４】CTLA４Ig融合タンパク質に相当するアミノ
酸配列をコードするDNAは、ブダベスト条約の規定に従
いアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collcction)(ATCC)（米国マリイ
ランド州ロックビレ）に1991年５月31日に受託され、そ
してATCC受け入れ番号68629を与えられた。
【００６５】本発明は、可溶性融合タンパク質の形態で
CTLA４転写体の第１タンパク質生産物を提供する。CTLA
４タンパク質はほぼ50,000サブユニットのＭr のジサル
ファイド連鎖の２量体を形成し、天然のCTLA４がＴ細胞
表面上にジサルファイド連鎖ホモ２量体として多分存在
することを示す。
【００６６】B7抗原はＴ細胞上のCD28レセプターのため
のリガンドであることが示された（Linsleyら、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA、前掲）。CTLA４レセプター分子
はCD28レセプターに機能的にかつ構造的に関係すると思
われる；両者はＢ細胞活性化抗原のためのレセプターで
あるが、CTLA４は、リンパ系付着系についてこれまで報
告された最高のもの中で、B7に対するより高い親和性を
有するように思われる。しかしながら、CTLA４IgはCD28
IgよりB7陽性（B7+ ) 細胞系にいっそう強く結合するこ
とが示された。他の実験において、CTLA４はB7抗原に対
してCD28レセプターより高い親和性のレセプターである
ことが証明された。さらに、CTLA４IgはB7抗原に大きさ
が類似するリンパ芽球球細胞上の単一のタンパク質に結
合することが示された。CTLA４IgはＴ細胞増殖を阻止
し、そしてＴh 誘発IgM 生産を阻止した。
【００６７】他の好ましい態様において、異なるレセプ
タータンパク質の断片に相当するアミノ酸配列を有する
ハイブリッド融合タンパク質を構成した。例えば、CD28
およびCTLA４の細胞外ドメインの選択した断片に相当す
るアミノ酸配列を連鎖して、CD28Ig／CTLA４Igハイブリ
ッド融合タンパク質を形成した。こうして、第１アミノ
酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質が得ら
れ、この第１アミノ酸配列はCTLA４Igの細胞外ドメイン
の断片に相当する第２アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１
のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸
配列に接合した、CD28の細胞外ドメインの断片に相当す
るアミノ酸残基を含有する。
【００６８】ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様
は第１アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合構成
体であり、この第１アミノ酸配列はCD28の細胞外ドメイ
ンに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位置94のアミ
ノ酸残基を含有し、CD28はCTLA４の細胞外ドメインに相
当するアミノ酸配列の約位置94〜約位置125のアミノ酸
残基を含有する第２アミノ酸配列に接合し、CTLA４はヒ
トIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第
３アミノ酸配列に接合している。
【００６９】CTLA４レセプタータンパク質、可溶性融合
タンパク質およびハイブリッド融合タンパク質に相当す
るアミノ酸配列をコードするDNA配列をクローニングし
そして発現する技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合
成、PCR 、細胞の形質転換、ベクターの構成、発現系な
どはこの分野においてよく確立されており、そしてほと
んどの熟練者は特定の条件および手順のための標準的源
材料をよく知っている。しかしながら、必要に応じて便
利および変更の注釈のために次の節を準備し、そしてこ
れらの節はカイドラインの役Ｈをするであろう。
【００７０】レセプターおよび融合タンパク質のための
コーディング配列のクローニングおよび発現 本発明のCTLA４Igを特性決定しかつCD28Ig／CTLA４Ig融
合ハイブリッドを調製するためのCD28IgＣγ１およびB7
IgＣγ１に相当する融合タンパク質の構成体を、Linsle
yら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991)(これを引用
によって加える）に記載されているように調製した。あ
るいは、B7抗原およびCD28レセプターを発現する細胞か
ら、これらのタンパク質について発表された知識（Aruf
foおよびSccd、およびFreeman、前掲）に基づいて標準
的手順を使用して、cDNAクローンを調製することができ
る。
【００７１】CTLA４の細胞外ドメインおよびヒトIgＣγ
１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するに相当する
アミノ酸配列をコードするDNAから成るCTLA４Ig融合体
を、PCR 断片の結合により構成した。アミノ酸をコード
するcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR 」）技術に
従い増幅する（米国特許第4,683,195号および米国特許
第4,683,202 号（Mullisら）、およびMullisおよびFalo
ona, Mcthods Enzymol. 154: 335-350 (1987) を参照の
こと）。CTLA４Ig融合ポリペプチドを構成し、これらの
ポリペプチドはCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミ
ノ酸配列の約位置１〜約位置125のアミノ酸残基を含有
するアミノ酸配列をコードするDNA 、およびIgＣγ１の
ヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列を
コードするDNA を有した。
【００７２】ヒトリンパ系細胞の中のCTLA４レセプター
タンパク質の発現は従来報告されてきていないので、CT
LA４のmRNA源を探すことが必要であった。いくつかのヒ
ト白血病細胞系の全体の細胞のRNAから作ったPCR のcDN
Aを、プライマーとして、CTLA４遺伝子の発表された配
列かのオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングし
た（Dariavach ら、前掲）。試験したcDNAのうちで、H3
8細胞（HTLV II関連白血病系統）は期待したサイズを有
するPCR 生産物の最良の収量を提供した。
【００７３】CTLA４の単一のペプチドはCTLA４遺伝子の
中で同定されなかったので、CTLA４の予測された配列の
Ｎ末端をオンコスタチインＭのシグナルペプチド（Mali
kら、Molec. and Cell. Biol. 9 : 2847 (1989))に、下
の実施例に記載するオリゴヌクレオチドを使用して融合
した。PCR反応の生産物を、IgＣγ１のヒンジ、CH２お
よびCH３領域に相当するアミノ酸配列をコードするcDNA
を使用して、発現ベクター、例えば、CDM8またはπLNの
中に結合した。
【００７４】全長のヒトCTLA４をコードするDNAを得る
ために、CTLA４のトランスメンブレンおよび細胞質ドメ
インをコードするcDNAをH38 細胞からPCR により構成
し、そしてCTLA４のＮ末端に融合したオンコスタチイン
Ｍシグナルペプチドをコードする、前述したように構成
した、CTLA４Igからの断片と、下の実施例に記載するオ
リゴヌクレオチドのプライマーを使用して接合した。PC
R断片をプラスミドCDM8の中に結合して、全長のCTLA４
をコードする発現プラスミドを生成し、そしてこれをOM
CTLA４と表示した。
【００７５】ハイブリッド融合タンパク質に相当するア
ミノ酸配列をコードするDNA を構成するために、１つの
レセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するア
ミノ酸をコードするDNA を、他のレセプター遺伝子の細
胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDN
A、およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域
に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に、B7Ig、CD
28IgおよびCTLA４Ig構成体について前述した手順を使用
して接合する。こうして、例えば、CD28レセプターの細
胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約１位置〜約94
位置のアミノ酸残基をコードするDNAを、CTLA４レセプ
ターの細胞外ドメインのアミノ酸配列の約位置94〜約位
置125 のアミノ酸残基をコードするDNA 、およびヒトIg
Ｃγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ
酸配列をコードするDNAに接合する。
【００７６】大量のクローニングしたDNAを生産するた
めに、本発明の融合構成体をコードするDNA を含有する
ベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌細胞系の大腸
菌（Ｅ．coli）MC1061／p3株（InvitrogenCorp. 、カリ
フォルニア州サンディエゴ）の中に標準的手順を使用し
て形質転換し、そしてコロニーを適当なプラスミドにつ
いてスクリーニングする。
【００７７】次いで、前述したようにして得られた融合
構成体をコードするDNA を含有するクローンを、発現の
ために適当な宿主細胞の中にトランスフェクションす
る。使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適
当な標準的技術を使用してトランスフェクションを実施
する。例えば、哺乳動物細胞中のトランスフェクション
は、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、Ca
PO4 共沈、リポフェクション（lipofection)、エレクト
ロポレイションまたは原形質体の融合、および他のこの
分野において知られている方法により達成し、ここで後
者の方法は次のものを包含する：リゾチームの融合また
は赤血球の融合、スクレイピング、直接的吸収、浸透圧
またはスクロースのショック、直接的マイクロインジェ
クション、間接的マイクロインジェクション、例えば、
赤血球仲介技術を介するマイクロインジェクション、お
よび／または宿主細胞を電流に暴露する。遺伝的情報を
細胞の中に導入する他の手順は疑いなく開発されるであ
ろうから、上に列挙したトランスフェクションの技術は
網羅的であるお考えられない。
【００７８】多細胞の生物から誘導化された真核生物の
宿主細胞の培養物の中の発現は好ましい（Tissure Cult
ures, Academic Press, CruzおよびPatterson編、（197
3）を参照のこと）。これらの系はイントロンをスプラ
イスする能力をもつという追加の利点を有し、こうして
ゲノム断片の発現に直接使用することができる。有用な
宿主細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細
胞、サル腎臓（COS)細胞、VERO細胞およびHeLa細胞を包
含する。本発明において、融合構成体を安定に発現する
細胞系は好ましい。
【００７９】このような細胞のための発現ベクターは、
通常、哺乳動物細胞と適合性のプロモーターおよびコン
トロール配列、例えば、CMV プロモーター（CDM8ベクタ
ー）および鳥類の肉腫ウイルス（ASV)（πLNベクター）
を包含する。他の普通に使用される前期および後期のプ
ロモーターは、サルのウイルス40（SV40）(Fiersら、Na
ture273 : 113 (1973)) 、または他のウイルスのプロモ
ーター、例えば、ポリオーマから誘導化されたもの、ア
デノウイルス２、およびウシ乳頭腫ウイルスを包含す
る。
【００８０】コントロール可能なプロモーター、hMTII
（Karin ら、Nature 299 : 797-802(1982))をまた使用
することができる。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換に
ついての一般的面は、Axel（米国特許第4,399,216号、1
983年８月16日発行）により記載された。現在明らかな
ように、「エンハンサー」領域は発現を最適化するとき
重要である；これらは、一般に、非コーディング領域の
中のプロモーター領域の上流または下流に見いだされる
配列である。必要に応じて、複製の由来をウイルス源か
ら得ることができる。しかしがら、染色体中の組み込み
は真核生物におけるDNAの複製のための普通のメカニズ
ムである。
【００８１】融合構成体の発現のために好ましい真核生
物の細胞、例えば、COS またはCHO細胞を包含するが、
他の真核生物の微生物を使用できる。サッカロミセス・
セレビシアエ（Saccharomycesccrevisiae)、イーストの
実験室用菌株をたいてい使用するが、他の菌株、例え
ば、シゾサッカロミセス・ポンペ（Schizosaccharomyce
spombe)を使用できる。例えば、Broach, Mcthods Enzym
ol. 101 : 307 (1983)の２μの複製由来、または他の酵
母適合性の複製由来（例えば、Stinchcombら、Nature28
2 : 39 (1979)) ; Tschempeら、Gene 10 : 157 (1980)
;およびClarkeら、MethodsEnzymol. 101 : 300 (1983)
を参照のこと）を用いるベクターを使用することができ
る。
【００８２】酵母のベクターのためのコントロール配列
は、グリコール分解酵母の合成のためのプロモーターを
包含する（Hessら、J. Adv. Enzyme Reg. 7 : 149 (196
8) ;Hollandら、Biochcmistry.17 : 4900 (1978)) 。こ
の分野において知られている追加のプロモーターは、CD
M8ベクターの中に提供されたCMV プロモーター（Toyama
およびOkayama,FEBS 268 : 217-221 (1990) ;３−ホス
ホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（Hitzem
anら、J.Biol. Chem. 255 : 2073)) 、および他のグリ
コール分解酵素のためのプロモーターを包含する。
【００８３】成長条件によりコントロールされる転写の
追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファタ
ーゼ、窒素の代謝に関連する分解酵素、およびマルトー
スおよびガラクトースの利用に関係する酵素のためのプ
ロモーター領域である。また、ターミネーター配列はコ
ーディング配列の３′末端において望ましいと信じられ
る。このようなターミネーターは、酵母誘導化遺伝子の
次の３′−非翻訳領域の中に見いだされる。
【００８４】あるいは、原核生物の細胞を発現のための
宿主として使用することができる。原核生物の細胞は、
大腸菌（Ｅ．coli）の種々の株により最も頻繁に発現さ
れる；しかしながら、他の微生物の菌株も使用できる。
ここにおいて転写開始のためのプロモーターを、必要に
応じてオペレーターとともに含むと定義される、普通に
使用される原核生物のコントロール配列は、リボソーム
結合部位の配列と一緒に、ベーターラクタマーゼ（ペニ
シリナーゼ）およびラクトース（lac)プロモーター系
（Changら、Nature 198 : 1056 (1977)) 、トリプトフ
ァン（trp)プロモーター系（Goeddel ら、核酸の研究
（NucleicAcids Res. 8 : 4057 (1980)) およびラムダ
誘導化Ｐl プロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結
合部位（Shimatake ら、Nature 292 : 128 (1981))のよ
うな普通に使用されているプロモーターを包含する。
【００８５】CD28IgおよびCTLA４Igタンパク質、および
融合ハイゾリッドタンパク質、例えば、CD28Ig／CTLA４
Igを後述するように種々の系の中で発現することができ
る。cDNAを適当な制限酵素で切り出し、そしてこのよう
な発現について適当な原核生物または真核生物の発現ベ
クターの中に結合することができる。CD28およびCTLA４
レセプターのタンパク質は天然に２量体として存在する
ので、これらのタンパク質の首尾よい発現はこれらのタ
ンパク質を２量体として形成することを可能とする発現
系を必要とすると信じられる。これらのタンパク質の切
頭バージョン（すなわち、タンパク質のトランスメンブ
レン領域より上流の位置において配列の中に停止コドン
を導入することによって形成される）は発現されると思
われない。CD28およびCTLA４レセプターの融合タンパク
質としての発現は、これらのタンパク質の２量体の形成
を可能とする。こうして、CTLA４タンパク質の融合生産
物としての発現は、本発明において好ましい。
【００８６】チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA４
Ig−24と表示する本発明の安定なCHO 系はCTLA４Igの発
現のために好ましく、そしてブダベスト条約の規定に従
いATCCに1991年５月31日に受託され、そしてATCC受け入
れ番号10762を与えられた。
【００８７】本発明のCTLA４レセプターの発現は、細胞
系、例えば、COS細胞をトランスフェクションし、そし
てCTLA４トランスフェクションした細胞をCTLA４レセプ
ターに結合することによって、例えば、細胞のB7Ig融合
タンパク質への結合について経験することによって、発
現を検出して達成される。
【００８８】生ずる構成体の配列は、既知の手順、例え
ば、Sangerら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74 : 5463
(1977) に記載されている、さらにMcssingら、Nucleic
Acids Res. 9 : 309 (1981) に記載されている手順を使
用するDNA の配列決定によるか、あるいはMaxamら、Mct
hods Enzymol. 65 : 499 (1980)の方法により確証され
る。
【００８９】タンパク質生産物の回収 前述したように、CD28およびCTLA４レセプターの遺伝子
は、切頭タンパク質をコードするDNAの直接の発現を使
用して成熟タンパク質として容易に発現されない。ホモ
２量体の形成を可能とするために、CD28およびCTLA４の
細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例え
ば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中のオ
ンコスタチインＭの配列のためのコドンを含むアミノ酸
配列をコードするDNAを、天然に２量体のタンパク質のF
cドメインに相当するアミノ酸配列をコードするDNA と
融合する。こうして、細胞から分泌された後のこれらの
融合タンパク質の生産物の精製は、融合タンパク質の抗
免疫グロブリン部分と反応性の抗体を使用して促進され
る。融合タンパク質の生産物は、培地の中に分泌される
と、タンパク質の標準的精製技術、例えば、プロテイン
Ａカラムへの適用により回収される。
【００９０】使 用 CTLA４Ig融合タンパク質および／またはその融合タンパ
ク質の断片を使用してB7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反
応させて、B7抗原陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により
仲介される免疫応答を調節することができる。
【００９１】CTLA４Ig融合タンパク質およびCTLA４Ig／
CD28Igハイブリッドタンパク質、および／またはこれら
のタンパク質の断片および誘導体を、また、使用して、
B7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、Ｔ細胞依存
性Ｂ細胞の応答により仲介される免疫応答を調節するこ
とができる。用語「断片」は、ここにおいて使用すると
き、「CTLA４」と呼ぶタンパク質をコードするアミノ酸
配列の部分を意味する。使用できるCTLA４Ig融合のタン
パク質の断片は、ここに記載するCTLA４Ig融合タンパク
質を得るために使用するCTLA４レセプターに相当するア
ミノ酸配列のある部分に相当するアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
【００９２】活性化されたＢ細胞および他の系統の細胞
上で発現されたB7抗原、およびＴ細胞上で発現されたCD
28レセプターを互いに直接結合することができ、そして
この相互作用は細胞−細胞の相互作用を仲介することが
できる。このような相互作用は、Ｔ細胞の増殖、および
免疫グロブリン生産細胞へのＢ細胞の分化に導く、Ｔ細
胞の中のCD28活性化経路を直接トリガーする。起こるＢ
細胞の活性化は、B7抗原の発現を増加し、さらにCD28を
刺激して、慢性の炎症の状態、例えば、自己免疫疾病、
異種移植の拒絶、移植片対宿主の疾患または慢性のアレ
ルギー反応に導くことがある。この反応をブロックまた
は阻止することは、Ｔ細胞のサイトカインの調製を防止
し、こうして炎症反応を防止または逆転するとき有効で
あることがある。
【００９３】CTLA４Igは、ここにおいて、Ｔ細胞および
Ｂ細胞の相互作用を必要とするinvitroリンパ球機能の
効力のあるインヒビターであることが示された。これは
B7抗原およびその対レセプター、CTLA４および／または
CD28の間の相互作用の重要性を示す。ネズミおよびヒト
のCTLA４の細胞質ドメインは類似し（Dariavachら、前
掲、1988）、この領域が重要な機能的性質を有すること
を示唆する。また、CD28およびCTLA４の細胞質ドメイン
は相同性を共有する。
【００９４】CTLA４は、抗BB１または抗CD28モノクロー
ナル抗体よりも、いっそう効力のあるリンパ球の応答の
invitroインヒビターである。CTLA４Igは、その阻止作
用と反作用するＴ細胞の増殖に対する直接の刺激作用を
もたない。したがって、CTLA４Ig融合タンパク質は抗CD
28モノクローナル抗体よりもすぐれたinvivo インヒビ
ターとして働くことができる。CTLA４Igのin vitro免疫
抑制作用は、異常なＴ細胞の活性化またはIgの生産を包
含する自己免疫疾患の処置の治療におけるその使用を示
唆する。
【００９５】CTLA４Ig融合タンパク質は、invivo 阻止
性質を示すことが期待された。こうして、CTLA４Igは、
同様なin vivo 条件下に抗CD28抗体について観察される
作用に類似する方法で、Ｔ細胞を阻止する作用をするこ
とが期待される。Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用がＴ細胞と
Ｂ細胞との間の接触の結果として起こる条件下に、B7抗
原陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させために導入され
たCTLA４Igの結合は、Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用を妨
害、すなわち、阻止して免疫応答の調節を生ずることが
できる。この独占的な阻止作用のために、CTLA４Igは生
体内でＴ細胞の活性のインヒビターとして、非特異的イ
ンヒビター、例えば、シクロスポリンまたはグルコステ
ロイドよりも有用であることが期待される。
【００９６】１つの態様において、CTLA４Ig融合タンパ
ク質またはCTLA４Ig／CD28Igハイブリッドタンパク質
は、適当な製剤学的担体と組み合わせてinvivo 導入す
る、すなわち、病理学的状態、例えば、免疫系の疾患ま
たは癌の処置のためにヒトの投与することができる。融
合タンパク質のin vivo 導入は、Ｔ細胞と他の細胞、例
えば、Ｂ細胞との相互作用を、B7陽性細胞へのリガンド
の結合の結果として、妨害することが期待される。正常
のＴ細胞の相互作用の防止は、Ｔ細胞の活性を減少し、
例えば、Ｔ細胞の増殖を減少することができる。
【００９７】さらに、融合タンパク質のinvivo 投与は
サイトカインのin vivoレベルの調節して被検体におい
て所望の作用を促進することが期待され、ここでサイト
カインは次のものを包含するが、これらに限定されな
い：インターロイキン、例えば、インターロイキン
（「IL」）−２，IL−３，IL−４，IL−６，IL−８，成
長因子、例えば、腫瘍成長因子（「TFG」）、コロニー
刺激因子（「CSF 」）、インターフェロン（「IFN 」）
および腫瘍壊死因子（「TNF 」）。例えば、融合タンパ
ク質をin vivo 導入するとき、それは悪性の増殖、例え
ば、腫瘍細胞の増殖に寄与するサイトカインの生産をブ
ロックすることができる。融合タンパク質は、また、Ｔ
細胞の活性化に依存するウイルス、例えば、エイズを引
き起こすウイルス、HTLV１の増殖をブロックすることが
できる。
【００９８】ある環境下に、前述したように、CTLA４Ig
融合タンパク質またはその断片のinvivo 投与の作用は
阻止であり、Ｔ細胞／Ｂ細胞の接触から生ずるCTLA４お
よびCD28のトリガーの融合タンパク質によるブロッキン
グから生ずる。例えば、CTLA４Igタンパク質はＴ細胞の
増殖をブロックすることができる。こうして、CTLA４Ig
融合タンパク質のinvivo 導入は、Ｔ細胞およびＢ細胞
の両者が仲介する免疫応答に対する作用を生成するであ
ろう。また、融合タンパク質をサイトカインまたは他の
治療用試薬の導入と組み合わせて被検体に投与すること
ができる。
【００９９】本発明の追加の態様において、CTLA４Ig融
合タンパク質またはCTLA４レセプターと反応性の誘導体
を包含する他の試薬を使用してＴ細胞の相互作用を調節
する。例えば、CTLA４レセプターと反応性の抗体および
／または抗体断片をスクリーニングして、B7抗原へのCT
LA４Ig融合タンパク質の広いスペクトルのを阻止するこ
とができるものを同定することができる。次いで、抗体
または抗体断片、例えば、FabまたはＦ（ab′）2 断片
を使用して、例えば、Ｔ細胞と反応させてＴ細胞の増殖
を阻止することができる。
【０１００】CTLA４レセプターと反応性のモノクローナ
ル抗体は、既知の手順、例えば、KohlerおよびMilstein
(KohlerおよびMilstein, Nature, 256 : 495-97 (197
5))により導入された手順、およびその変更により生成
して、細胞の相互作用を調節することができる。
【０１０１】これらの技術は、特定の抗体を生産するよ
うにプライミングした動物の使用を包含する。動物は免
疫原（例えば、B7Ig融合タンパク質、CTLA４Ig融合タン
パク質またはCD28Ig／CTLA４Igハイブリッド融合タンパ
ク質）の注入によりプライミングして、所望の免疫応
答、すなわち、プライミングされた動物からの抗体の生
産を引き出すことができる。また、プライミングされた
動物は疾患を発現する動物である。
【０１０２】プライミングされた病気の動物のリンパ
節、脾臓または末梢血液から誘導化されたリンパ球を使
用して、特定の抗体を探索することができる。所望の免
疫グロブリンをコードするリンパ球の染色体を、一般に
融合剤、例えば、ポリエチレングリコール（PEG)の存在
下に、リンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、
永久分裂能化する。ある数の骨髄腫細胞系、例えば、P3
−NS１／１−Ag４−１，P3−ｘ63−Ag８，653,Sp2／０
−Ag14、またはHLI-653骨髄腫系統の任意のものを、標
準的技術に従い、融合相手として使用することができ
る。これらの骨髄腫系統はATCC（米国マリイランド州ロ
ックビレ）から入手可能である。
【０１０３】次いで、所望のハイブリドーマを包含する
生ずる細胞を選択培地、例えば、HAT 培地の中で成長さ
せ、ここで未融合の親の骨髄腫またはリンパ球の細胞は
究極的に死亡する。ハイブリドーマ細胞のみは生き残
り、そして制限希釈の条件下に成長して単離されたクロ
ーンを得ることができる。ハイブリドーマの上澄み液
を、例えば、免疫化に使用したCTLA４Igタンパク質を使
用するイムノアッセイ技術により、所望の選択性の存在
についてスクリーニングする。次いで、陽性のクローン
を制限希釈の条件下にサブクローニングし、そして生成
したモノクローナル抗体を単離することができる。
【０１０４】モノクローナル抗体の単離および精製の種
々の普通の方法を使用して、他のタンパク質および汚染
物質を含有しない抗体を得ることがてきる。モノクロー
ナル抗体を精製する普通に使用されている方法は、硫酸
アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、お
よびアフィニティクロマトグラフィーを包含する（Zola
ら、Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques a
ndApplications, Hurell編、p. 51-52 (CRC Press, 198
2 を参照のこと）。これらの方法に従い生産されたハイ
ブリドーマは、この分野において知られている技術を使
用してinvitroまたはin vivo （腹水の中で）増殖する
ことができる（一般に、Finkら、Prog.Clin. Pathol.,
9 : 121-33(1984), Fig. 6-1, p. 123 を参照のこ
と）。
【０１０５】一般に、個々の細胞系を、例えば、実験室
用容器の中でin vivo 増殖させ、そして高い濃度の単一
の特定のモノクローナル抗体を含有する培地をデカンテ
ーション、濾過または遠心により収穫することができ
る。
【０１０６】さらに、CTLA４レセプターの細胞外ドメイ
ンと反応性の活性結合領域を含有するこれらの抗体の断
片、例えば、Fab，Ｆ（ab′）2 およびFv断片を生成す
ることができる。このような断片は、この分野において
よく確立された技術を使用して生成することができる
（例えば、Rousseauxら、Methods Enzymol. 121 : 663-
69, Academic Press (1986) を参照のこと）。
【０１０７】前述したようにして調製した抗B7モノクロ
ーナル抗体を使用してB7抗原に結合させて、CD28陽性ま
たはCTLA４陽性のＴ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻
止することができる。抗CTLA４モノクローナル抗体を使
用してCTLA４レセプターと結合させて、CTLA４陽性Ｔ細
胞と他の細胞との相互作用を阻止することができる。
【０１０８】他の態様において、CTLA４Ig融合タンパク
質を使用して、CTLA４とB7抗原との間の相互作用を調節
できる追加の化合物を同定することができる。このよう
な化合物は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞と反応させる
ために使用できる天然に見いだされる小さい分子を包含
することができる。例えば、発酵ブロスをCTLA４／B7の
相互作用を阻止する能力について試験することができ
る。
【０１０９】さらに、前述のCTLA４Ig融合タンパク質の
誘導体を使用してＴ細胞の増殖を調節することができ
る。例えば、断片または誘導体を使用して、異種移植の
骨髄の移植に伴う移植片対宿主（GVH)の疾患におけるＴ
細胞の増殖をブロックすることができる。CD28仲介Ｔ細
胞増殖経路は、CD３／Ｔ細胞のレセプター複合体により
与えれる増殖（Juneら、1987、前掲）と対照的に、シク
ロスポリン耐性である。シクロスポリンはGVH疾患のた
めの処置として比較的無効である（Storb, Blood68 : 1
19-125 (1986)) 。GVH 疾患は、CD28抗原を発現するＴ
リンパ球により仲介されると考えられる（StorbおよびT
homas, Immunol. Rev. 88：215-238 (1985)) 。こうし
て、CTLA４Ig融合タンパク質は、単独で、あるいは免疫
抑制剤、例えば、シクロスポリンと組み合わせて、GVH
疾患におけるＴ細胞の増殖のブロッキングに有用である
ことができる。
【０１１０】こうして、Ｂ細胞を包含するB7陽性細胞と
のCTLA４陽性Ｔ細胞の相互作用の本発明の方法による調
節を使用して、病理学的状態、例えば、自己免疫性、移
植、感染症および新形成を処置することができる。
【０１１１】次の実施例によって、本発明をさらに説明
しかつ当業者による本発明の実施および使用を助ける。
これらの実施例は本発明を限定しない。
【０１１２】
【実施例】例 １ B7Ig及びCD28Ig融合タンパク質の調製 レセプター−免疫グロブリンＣγ（IgＣγ）融合タンパ
ク質B7Ig及びCD28Igを、本発明において引用により組込
まれる、Linsley など., J. Exp.Med. 173 : 721 〜730
(1991)により記載されているようにして調製した。簡
単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質（たとえ
ばB7）に対応するアミノ酸配列をコードするDNAを、ヒ
トIgＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応するアミ
ノ酸配列をコードするDNA に連結した。これは次のよう
にして達成される。
【０１１３】ポリメラーゼ鎖反応（PCR)。PCRのため
に、DNA フラグメントを、個々の融合タンパク質につい
て下記のようにしてプライマー対を用いて増幅した。PC
R 反応（０．mlの最終体積）を、Tagポリメラーゼ緩衝
液（Stratagene, La Jolla, CA）において行ない、ここ
で前記緩衝液は、個々のdNTP20μモル；前記に示された
プライマー50〜100ｐモル；鋳型（引用により本明細書
において組込まれる、Kauasaki, PCR Protocols, Acade
mic Press, 21 〜27ページ（1990）により記載されるよ
うにして、ランダムヘキサマープライマーを用いて合計
≦１μｇのRNAから合成されたプラスミド又はcDNA１n
g）；及びTag ポリメラーゼ（Stratagene)を含んだ。反
応は、16〜30回のサイクル（典型的なサイクルは、94℃
で１分、50℃で１〜２分及び72℃で１〜３分の段階から
成る）のためにサーモサイクラー（PerkinElmer Corp.
Norwalk, CT) 上で行なわれた。
【０１１４】プラスミドの構成。Aruffo and Seed, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573 (1987)により記載
されるような、CD28をコードするcDNAを含む発現プラス
ミドが、Drs.Aruffo and Seed (Mass General Hospital
Boston, MA)により供給された。Aruffo, Cell 61: 13
03（1990）により記載されるような、CD５をコードする
cDNAを含むプラスミドがDr. Aruffoにより供給された。
Freeman など.,J.Immunol.143 : 2714 (1989) により記
載されるような、B7をコードするcDNAを含むプラスミド
は、Dr. Freeman (Dana FarberCancer Institute, Bost
on, MA)により供給された。
【０１１５】CD28及びB7の可溶性形の発現での初期試み
のために、構成体をLinsleyなど.,J. Exp. Med.,前記に
より記載されているようにして製造し（OMCD28及びOMB
7)、ここで停止コドンがトランスメンブランドメインの
上流に導入され、そして生来のシグナルペプチドがオン
コスタチインＭ（oncostatinM）（Malik など., Mol. C
ell Biol. 9 : 2847 (1989)) からのシグナルペプチド
により置換された。それらは、再構成のための合成オリ
ゴヌクレオチド（OMCD28）を用いて又はPCRのためのプ
ライマー（OMB7）として製造された。OMCD28は、シグナ
ルペプチドをオンコスタチインＭからの類似領域により
置換することによってより効果的な発現のために変性さ
れたCD28cDNA である。CD28Ig及びB7Ig融合構成体を２
つに分けて製造した。
【０１１６】５′部分を、鋳型としてOMCD28及びOMB7及
び前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド、 CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC （配列番号１）（オンコスタチインＭシグナルペプチド
に対応するアミノ酸配列をコードする）及び逆方向プラ
イマーとして TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA（配列番号
２） 又は、TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT（配
列番号３）のいづれかをそれぞれ用いて製造した。PCR
反応の生成物を、PCR プライマーに導入される部位とし
て制限エンドヌクレアーゼ（HindIII 及びBcl Ｉ）によ
り切断し、そしてゲル精製した。
【０１１７】ヒトIgＣγ１配列に対応する融合構成体の
３′部分を、鋳型として、ヒト−マウスキメラmABL6を
生成する骨髄細胞系（Dr. P. Fell and M. Gayle, Bris
tol-Myers Squibb Conyany,Pharmaceutical Research I
nstitute, Seattle, WA により供給される）からのRNA
を用いて、連結された逆転写酵素（トリ骨髄芽症ウィル
スからの；LifeSciences Associates, Bayport, NY)-PC
R反応により製造した。
【０１１８】オリゴペプチド、すなわちAAGCAAGAGCATTT
TCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGT
CCCCAGCACCTGAACTCCTG（配列番号４）を前方プライマー
及びCTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC（配
列番号５）を逆方向プライマーとして使用した。反応生
成物をBal Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そしてゲル精製
した。最終生成物を、IgＣγ１配列を含む、BclＩ／Xba
Ｉ切断されたフラグメントと共に、CD28又はB7配列を
含む、HindIII ／Bcl Ｉ切断されたフラグメントを、Hi
ndIII ／Xba Ｉ切断されたCD28中に連結することによっ
てアセンブリーした。連結生成物を用いてMC1061／p3
Ｅ．コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプ
ラスミドのためにスクーンした。得られた構成体の配列
を、DNA配列決定により確認した。
【０１１９】B7をコードする構成体は、B7の細胞外ドメ
インの約１位〜約215位のアミノ酸残基に対応するアミ
ノ酸をコードするDNを含んだ。CD28をコードする構成体
は、CD28の細胞外ドメインの約１位〜約134 位のアミノ
酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNAを含んだ。
【０１２０】CD５Igを、前方プライマーとしてCATTGCAC
AGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG（配列番号
６）及び逆方向プライマーとしてATCCACAGTGCAGTGATCAT
TTGGATCCTGGCATGTGAC （配列番号７）を用いて、同じ態
様で構成した。PCR生成物を制限エンドヌクレアーゼ消
化し、そして上記のようにしてIgＣγ１フラグメントに
より連結した。得られた構成体（CD５Ig）は、CD５に対
応する配列の１位〜347位のアミノ酸残基を含むアミノ
酸配列を有する成熟タンパク質、前記構成工程により導
入された２つのアミノ酸（アミノ酸DQ）、次にIgＣγ１
領域に対応するアミノ酸をコードするDNAをコードし
た。
【０１２１】細胞培養及びトランスフェクション。COS
(モンキー腎細胞）を、引用により本発明に組込まれ
る、Seed and Aruffo (Proc. Natl. Acad.Sci. 84 : 33
65 (1987))の方法の変法を用いて、CD28及びB7を発現す
る発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞
を、トランスフェクトする18〜24時間前、10cmの直径の
培養皿当たり106 個で接種した。プラスミドDNA を、0.
１mMのクロロキン（cloroquine) 及び600 μｇ／mlのDE
AE Dextranを含む血清フリーDMEM５mlに添加し（約15μ
ｇ／皿）、そして細胞を37℃で３〜3.５時間インキュベ
ートした。
【０１２２】次に、トランスフェクトされた細胞をすぐ
に、PBS 中、10％ジメチルスルホキシドにより処理し
（約２分）、そして10％FCS を含むDMEMにおいて37℃で
16〜24時間インキュベートした。トランスフェクション
の24時間後、培養培地を除去し、そして血清フリーDMEM
により変換した（６ml／皿）。インキュベーションを37
℃で３時間続け、この時点で、古い培地を集め、そして
新鮮な血清フリー培地を添加した。37℃でさらに３日
後、古い培地を再び集め、そして細胞を捨てた。
【０１２３】CD28，CD５又はB7を発現するCHO細胞を、
次の通りに、Linsley など., (1991)前記により記載さ
れるようにして単離した：簡単に言及すれば、CD28，CD
５又はB7を発現する安定したトランスフェクタントを、
適切な発現プラスミド及び選択マーカー、pSV2dhfr(Lin
sleyなど.,Proc. Natl., Acad. Sci. USA 87 : 5031(19
90))の混合物によるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャ
イニーズハムスター卵巣（dhfr- CHO)細胞の同時トラン
スフェクションの後次に、トランスフェクトを、１μＭ
の最終レベルまでメトトレキヤートの徐々に高まる濃度
で増殖し、そして10％ウシ胎児血清（FBS)、0.２mMのプ
ロリン及び１μＭのメトトレキヤートにより補充された
DMEMに維持した。
【０１２４】高レベルのCD28（CD28+ CHO)又はB7（B7+
CHO)を発現するCHO 系を、mAbs9.３又はBB−１による間
接的な免疫染色に従って、複数回の螢光活性化細胞ソー
チング（FACS（Ｒ))により単離した。CD28又はB7の表面
発現のために陰性の増幅されたCHO細胞をまた、CD28−
トランスフェクトされた集団からFACS（Ｒ）により単離
した。
【０１２５】免疫染色及びFACS（Ｒ）分析。トランスフ
ェクトされたCHO 又はCOS 細胞又は活性化されたＴ細胞
を、間接的免疫染色法により分析した。染色の前、CHO
細胞を、10mMのEDTAを含むPBSにおけるインキュベーシ
ョンによりそれらの培養器から除去した。細胞をまず、
ネズミmAbs9.３（Hansenなど., Immunogenetics 10:247
(1980))又はBB−１（Yokochi など., J. Immunol. 128
: 823 (1981))と共に、又はIg融合タンパク質（10％の
FCSを含むDMEMにおいて10μｇ／mlで）と共に４℃で１
〜２時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、そし
てさらに０５〜２時間、４℃で、FITC−接合の第２段階
試薬（ネズミmAbsのためにヤギ抗−マウスIg血清又は融
合タンパク質のためにヤギ抗−ヒトIgＣγ血清（Tago,I
nc., Burlingama, CA))と共にインキュベートした。螢
光を、40対数増幅器（four decade logarithmicamplifi
er) を備えたFACS IV(Ｒ）細胞ソーター（Becton Dicki
nson and Co., Mountain View, CA ）上で分析した。
【０１２６】Ig融合タンパク質の精製。トランスフェク
トされたCOS 細胞からの古い血清フリー培養培地の第
１，第２及び第３回収集物を、Ig融合タンパク質の精製
のための源として使用した。高速遠心分離により細胞残
髄物を除去した後、培地を、0.05Ｍのクエン酸ナトリウ
ム溶液（pH8.０）により平衡化された、固定されたプロ
テインＡ（RepligenCorp., Cambridge, MA)のカラム
（約200 〜400 mlの培地／ml充填層体積）に適用した。
その培地の適用の後、カラムを１μのリン酸カリウム溶
液（pH８）により洗浄し、そして結合されたタンパク質
を0.05Ｍのクエン酸ナトリウム溶液（pH３）により溶出
した。
【０１２７】画分を集め、そしてすぐに、２Ｍのトリス
（pH８）１／10体積の添加により中和した。Ａ280 吸収
材料のピークを含む画分をプールし、そして使用の前、
PBSに対して透析した。それぞれCD28Ig及びB7Igのため
の吸光係数は、既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析によ
り2.４及び2.８nl／mgであった。精製されたCD28Ig及び
B7Ig結合活性の回収率は、B7+ 及びCD28+ CHO 細胞の間
接的な螢光染色の後、FACS（Ｒ）分析により判断される
場合、ほぼ定量的であった。例 ２ CTLA４Ig融合タンパク質の調製 CTLA４の細胞外ドメインとIgＣγ１ドメインとの間にCT
LA４Igをコードする可溶性遺伝子融合体を、CD28Ig構成
体についての上記方法に類似する方法で構成した。CTLA
４遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列（Dariar
achなど., Eur.Jour. Immunol. 18 : 1901〜1905 (198
8))に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR に
よりクローン化した。
【０１２８】CTLA４のためのシグナルペプチドはCTLA４
遺伝子において同定されていないので、CTLA４の示され
た配列のＮ−末端を、オーバーラップオリゴヌクレオチ
ドを用いて２段階で、オンコスタチインＭ（Melikな
ど., Mol. and Cell. Biol. 9 :2847 (1989))のシグナ
ルペプチドに融合せしめた。第１段階に関しては、オリ
ゴヌクレオチド、CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCA
TGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC（配列番号８）（CTL
A４のＮ末端側の７個のアミノ酸に融合されるコンスタ
チンＭシグナルペプチドからのＣ末端側の15個のアミノ
酸をコードする）を、前方プライマーとして、及びTTTG
GGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG（配列番号９）（Bcl
Ｉ制限酵素部位を含み、そしてCTLA４レセプターをコー
ドするアミノ酸配列のアミノ酸残基119 〜125 をコード
する）を逆方向プライマーとして使用した。
【０１２９】この段階のための鋳型は、H38細胞（Drs.
Salahudin and Gallo, NCI, Bethesda, MDにより供給さ
れるHTLVII感染性Ｔ細胞白血球細胞系）からの合計１μ
ｇのRNAから合成されたcDNAであった。第１段階からのP
CR 生成物の一部を、オンコスタチインＭシグナルペプ
チドのＮ末端部分をコードし、そしてHindIII 制限エン
ドヌクレアーゼ部位を含むオーバーラップ前方プライマ
ー、CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGA
CGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC（配列番号10）及び同じ逆
方向プライマーを用いて再増幅した。PCR反応の生成物
をHindIII 及びBcl Ｉにより消化し、そしてBcl Ｉ／Xh
a Ｉにより切断された、IgＣγ１のヒンジ、CH２および
CH３領域に対応するアミノ酸配列をコードするcDNAフラ
グメントと共に、HindIII／Xha Ｉ切断された発現ベク
ター、CDM8又はHindIII ／Xba Ｉ切断された発現ベクタ
ー、πLN（Dr. Aruffoにより供給される）中に連結し
た。
【０１３０】得られたCTLA４Ig融合構成体の地図は図１
に示される。その図に示される配列は、CTLA４（上方の
文字、黒くない部分）とコンスタチンＭのシグナルペプ
チドSP（黒い部分）及びIgＣγ１のヒンジＨ（点描模様
の部分）との間の連結を示す。括弧内のアミノ酸は、構
成の間に導入された。星印（★）は、IgＣγヒンジ領域
に導入されたシステイン〜セリン変異を示す。CTLA４に
存在する免疫グロブリンスーパーファミリーＶ−株ドメ
インは、IgＣγ１のCH２及びCH３ドメインであるように
示される。
【０１３１】次に、CTLA４Igを含む発現プラスミド、CD
M8を、Seedand Aruffo, 1987, 前記により記載される方
法の変法（Linsley など., 1991,前記）により、DEAE／
テキストラントランスフェクションを用いてCOS細胞中
にトランスフェクトした。
【０１３２】CTLA４Igのアミノ酸配列をコードするcDNA
を含む発現プラスミド構成体（πLN又はCDM8）を、標準
方法を用いてのリポフェクションによりdhfr- CHO 系中
にトランスフェクトし、CTLA４Igを安定して発現する新
規細胞系を得た。
【０１３３】CTLA４Igに対応するアミノ酸配列をコード
するDNAは、1991年５月31日、ブタペスト条約に基づい
てATCCに寄託され、そしてATCC受託番号68629 を得た。
【０１３４】チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA４
Ig−24と称する、CTLA４Igを発現する好ましい安定性の
トランスフェクタントを、免疫染色法を用いて、培地に
おけるB7結合活性についてB7陽性CHO細胞系をスクリー
ンすることによって製造した。トランスフェクタント
は、10％ウシ胎児血清（FBS)、0.２mMのプロリン及び１
μＭのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持さ
れた。
【０１３５】CTLA４Ig−24CHO 細胞系は、1991年５月31
日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そして
ATCC受託番号10762を得た。
【０１３６】CTLA４Igを、血清フリーに条件付けられた
上清液からプロテインＡクロマトグラフィー処理により
精製した（図２）。CTLA４Igの濃度を、280nmで1.６の
吸光係数（既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により実
験的に決定された）を仮定して、決定した。CTLA４Igの
サンプル（１μｇ）（レーン２及び４）及び分子量標準
（レーン１及び３、図２）を、非還元条件（−βME、レ
ーン１及び２）又は還元条件（＋βME、レーン３及び
４）下でSDS-PAGE（４〜12％のアクリルアミドグラジエ
ント）にゆだねた。タンパク質は、クーマシーブリリア
ンドブルーによる染色により可視化された。
【０１３７】非還元条件下で、CTLA４IgはMrが約100,00
0である種として移動し、そして還元条件下でそれは、M
rが約50,000である種として移動した（図２）。IgＣγ
ヒンジのジスルフィドが構成の間に排除されたので、CD
28IgのようなCTLA４Igは、生来のジスルフィド結合を通
してたぶん連結されたダイマーである。例 ３ CTLA４レセプター 十分な長さのヒトCTLA４遺伝子に対応するアミノ酸をコ
ードするDNAを再構成するために、CTLA４のトランスメ
ンブラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応する
アミノ酸をコードするcDNAを、PCR によりクローン化
し、そして次に、CTLA４のＮ−末端に融合されるオンコ
スタチンＭシグナルペプチドに対応する、CTLA４Igから
のフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAに
より連結した。PCRのための方法、及び細胞培養及びト
ランスフェクションは、COS 細胞及びDEAE−デキストラ
ン トランスフェクションを用いて、例１に記載されて
いる通りであった。
【０１３８】ヒトリンパ球細胞におけるCTLA４レセプタ
ータンパク質の発現はこれまで報告されていないので、
CTLA４mRNAの源を示す必要はなかった。上記に示される
ような、H38細胞の全体の細胞RNA から逆転写されるPCR
cDNAを、PCR によるクローニングのために使用した。
この目的のためには、オリゴヌクレオチド、GCAATGCACG
TGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG（配列番号11）（推定される
コード配列に初めの11個のアミノ酸をコードする）を、
前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、TG
ATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG（配列
番号12）CTLA４における最後の８個のアミノ酸に相同で
あり、且つXba Ｉ部位を含む）を使用した。
【０１３９】鋳型は再び、H38 細胞からの１μｇのRNA
から合成されたcDNAであった。PCR反応の生成物を制限
エンドヌクレアーゼNco Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そ
して得られた316 bpの生成物をゲル精製した。上記CTLA
Ig融合からの340bpのHindIII／Nco Ｉフラグメントをま
たゲル精製し、そして両制限フラグメントを、HindIII
／Xba Ｉ切断されたCDM8中に連結し、OMCTLAを形成し
た。
【０１４０】得られる構成体は、完全な長さのCTLA４
（配列番号13及び14）及びオンコスタチンＭシグナルペ
プチドに対応した。その構成体は図３に示され、そして
OMCTLA４と称した。図３に示されるCTLA４のための配列
は、示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置111でのこれ
まで達告されたアラニンがトレオニンをコードするよう
な塩基変化により、推定されるヒトCTLA４DNA 配列（Da
riavach など.,前記）とは異なる。このトレオニンは、
融合タンパク質の好結果をもたらす発現のために重要で
ある、新しく同定されたＮ−連結グリコシル化部位の一
部である。
【０１４１】連結生成物を用いて、MC1061／p3 Ｅ．コ
リ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミ
ドについてスクリーンした。得られる構成体の配列を、
DNA配列分析により確かめた。例 ４ CTLA４Igの特徴化 CTLA４Ig構成体を特徴づけるために、いくつかの単離
体、CD28Ig，B7Ig及びCD５Igを上記のようにして調製
し、そして例２及び３に記載されるようにしてCOS細胞
をトランスフェクトし、そしてB7Igの結合のためにFACS
（Ｒ）分析により試験した。上記構成体の他に、Aruffo
and Seed (EMBOJour. 6 : 3313〜3316 (198)) により
記載されるようなCD７をコードするcDNAを含むCDM8プラ
スミドをまた使用した。
【０１４２】mAbs. ネズミモノクローナル抗体（mAba）
9.３（抗−CD28）及びG19-４（抗−CD３）、G3−７（抗
−CD７），BB−１（抗−B7抗原）及びラットmAb187.1
(抗−マウスＫ鎖）はこれまで記載されており（Ledbett
er など., Pruc. Natl. Acad.Sci. 84 :1384 〜1388
（1987) ; Ledbetter など., Bloud 75 : 1531 (1990);
Yokochi など.,前記）、そして使用の前、腹水から精
製した。mAbOKT8を生成するハイブリドーマをATCC, Roc
kville, MD から得、そしてmAb をまた、使用の前、腹
水から精製した。mAb 4G9(抗−CD19）は、Dr.E. Englem
an (Stanfurd Uninersity, Palo Altu, (A)により提供
された。精製されたヒト−マウスキメラmAbL6（ヒトＣ
γ１Fc部分を有する）は、Dr.P. Fell and M. Gayle (B
ristal-Myers Squibb Pharmacentical Research Instit
ute,Seattle, WA) の贈与である。
【０１４３】免疫染色及びFACS（Ｒ）分析。染色の前、
COS 又はCHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBS においてイ
ンキュベートすることによってそれらの培養容器から除
去した。細胞をまず、mAbs又はIg融合タンパク質と共
に、10％FBSを含むDMEMにおいて10μｇ／mlで４℃で１
〜２時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、そ
してFITC−接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン又はFITC
−接合ヤギ抗−ヒトIgＣγ血清（両者とも、Tago,Burli
ngam, CA からである）と共に、４℃でさらに0.５〜２
時間インキュベートした。両mAbs及びIg融合タンパク質
の結合が同じ実験において測定される場合、FITC−接合
抗−マウス及び抗−ヒト第２段階試薬を、使用の前、一
緒に混合した。合計10,000個の細胞に基づく螢光を次
に、FACS（Ｒ）により分析した。
【０１４４】末梢血液リンパ球分離及び刺激。末梢血液
リンパ球（PBLs）を、リンパ球分離媒体（Litton Bione
tics, Kensington, MD) を通しての遠心分離により単離
した。アロ反応性Ｔ細胞を、一次混合リンパ球反応（ML
R)におけるPBLの刺激により単離した。PBL を、106 ／m
lの照射された（5000ラド）T51 LCL で培養した。EBV-
形質転換リンパ球芽細胞系（LCL)，PM（Bristol-MyersS
quibb Co.) 及びT51 (Bristol-Myers Squibb Co.)を、1
0％FBS により補充されたRPMIに維持した。６日後、ア
ロ反応性“幼芽”細胞を凍結保存した。
【０１４５】二次MLR を、mAbs及びIg融合タンパク質の
存在及び不在下で、新鮮な照射T51LCL と共に融解され
たアロ反応性幼芽を培養することによって行なった。細
胞を、10％FBS を含むRPMIを有する96ウェル平底プレー
ト（0.２mlの体積、４×104個のアロ反応性幼芽及び１
×104 個の照射T51 LCL 細胞／ウェル）において培養し
た。四重培養物の細胞増殖を、２〜３日の培養の最後の
６時間、〔3Ｈ〕−チミジンの摂取により測定した。
【０１４６】PHA-活性化されたＴ細胞を、１μｇ／mlの
PHA(Wellcome, Charlotte, NC)と共にPBL を５日間、培
養することによって、及びPHA を欠く培地において１日
間、培養することによって調製した。生存細胞を、使用
の前、リンパ球分離媒体を通しての沈殿により集めた。
細胞をmAbsにより刺激し、又はCHO細胞により37℃で４
〜６時間トランスフェクトせしめ、遠心分離により集
め、そしてRNA を調製するために使用した。
【０１４７】CD４+ Ｔ細胞を、健康なドナーからのPBL
を、羊赤血球ロゼット技法を用いてＴ及び非−Ｔ細胞に
分離し、そしてさらに、Damle など., J. Immunol.139
: 1501 (1987)（引用により本明細書に組込まれる）に
より記載されるようにCD４+細胞をパンニングすること
によりＴ細胞を分離することによってPBLsから単離し
た。Ｂ細胞をまた、抗−CD19mAb 4G9 を用いて、Wysock
i and Sato, Proc.Natl.Acad. Sci. 75 : 2844 (1978)
(引用により本明細書に組込まれる）により記載される
ようにパンニングすることにより末梢血液から精製し
た。
【０１４８】Ｔh −誘発されたIg生成を測定するため
に、106 個のCD４+ Ｔ細胞を、10％のFBS を含むRPMI１
mlにおいて106 個のCD19+ Ｂ細胞と共に混合した。37℃
での６日間の培養に続いて、ヒトIgM の生成を、Volkma
nなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2528 (198
1)(引用により本明細書に組込まれる）により記載され
るようにして固相ELISAを用いて培養上清液において測
定した。簡単に言及すれば、96−ウェル平底マイクロタ
イターELISA プレート（Corning, Corning, NY) を、10
μｇ／mlのアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG
又はIgM 抗体（Tago,Burlingame, CA) を含む200 μｌ
／ウェルの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.６）により被覆
し、４℃で一晩インキュベートし、そして次に、PBSに
より洗浄し、そしてウェルをさらに、PBS 中、２％BSA
(BSA-PBS) によりブロックした。
【０１４９】アッセイされるべきサンプルを、それらの
ウェルに適切な希釈度で添加し、そして200 μｌ／ウェ
ルの１：1000希釈度のアフィニティー精製されたヤギ抗
−ヒトIgG 又はIgM 抗体（Tago）のホスラディシュ ペ
ルオキシダーゼ（HRP)−接合Ｆ（ab′）2 画分と共にイ
ンキュベートした。次に、プレートを洗浄し、そして10
0 μｌ／ウェルのｏ−フェニレンジアミン（Signa Chem
ical Co., St. Louis,MO)溶液（pH５のクエン酸−リン
酸緩衝液１ml当たり0.６ng及び0.045％の過酸化水素）
を添加した。色の進行を、２Ｎの硫酸により止めた。
【０１５０】490 nmでの吸光度を、自動ELISAプレート
リーダーにより測定した。試験及び対照サンプルは３通
り行なわれ、そして吸光度の値を、培養上清液における
Igの濃度が定量化される標準曲線を生成するために、上
清液サンプルにより同時に行なわれた既知のIgG又はIgM
標準により得られた値と比較した。データを、三重反
復又は四重反復培養物のIg±SEM のng／mlとして表わさ
れる。
【０１５１】免疫沈殿分析及びSDSPAGE。細胞を、125I
により表面ラベル化し、そして免疫沈殿分析にゆだね
た。簡単に言及すれば、PHA-活性化されたＴ細胞を、Vi
tettaなど.,J. Exp. Med. 134 : 242 (1971)（引用によ
り本明細書に組込まれる）により記載されるように、ラ
クトペルオキシターゼ及びH2O2を用いて125Iにより表面
ラベル化した。SDS-PAGEクロマトグラフィー処理を、５
％のアクリルアミドの積み重ねゲルを有する直線アクリ
ルアミドグラジエントゲル上で行なった。ゲルをクーマ
シーブルにより染色し、脱色し、そして写真を取り、又
は乾燥せしめ、そしてＸ線フィルム（KodakXAR-5)に露
光せしめた。
【０１５２】結合アッセイ。B7Igを、約２×106 cpm/ｐ
モルの比活性に125Iによりラベルした。96のウェルのプ
ラスチック皿を、CTLA４Ig（10mMのトリス（pH８）0.05
mlの体積において0.５μｇ）を含む溶液により16〜24時
間、被覆した。ウェルを、競争体の存在又は不在下で、
125I B7Ig（約５×105 cpm)を含む溶液（0.09ml）の添
加の前、結合緩衝液（50mMのBES (Sigma Chemical Co),
pH6.８，0.１％BAS及び10％FCSを含むDMEM) によりブ
ロックした。23℃で２〜３時間のインキュベーションに
続いて、ウェルを結合緩衝液により１度洗浄し、そして
PBS により４度洗浄した。次に、結合された放射能を0.
５ＮのNaOHの添加により溶解し、そしてｒ計数により定
量化した。
【０１５３】B7Igへの結合。完全なヒトCTLA４DNA 遺伝
子をコードするOMCTLA４構成体の官能多活性が、図４に
示される実験に示される。COS 細胞を、上記のようにし
て発現プラスミドCD７，OMCD28及びOMCTLA４によりトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、
細胞を集め、そして培地のみ（添加なし）と共に又はmA
bs 9.３，B7Ig，CD５Ig又はG3−７と共にインキュベー
トした。次に細胞を洗浄し、そして結合性を、FITC−接
合ヤギ抗−マウスIg及びFITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第２
段階試薬の混合物により検出した。トランスフェクトさ
れた細胞を、間接的免疫染色法により適切な細胞表面マ
ーカーの発現について試験し、そして螢光を上記のよう
にしてFACS（Ｒ）分析を用いて測定した。
【０１５４】図４に示されるように、mAb9.３は、CD28
−トランスフェクトされたCOS 細胞に結合したが、しか
しCTLA４−トランスフェクトされる細胞には結合しなか
った。対照的に、B7Ig融合タンパク質（但し、対照のCD
５Ig融合タンパク質ではない）は、CD28−及びCTLA４−
トランスフェクトされた細胞の両者に結合した。CD７−
トランスフェクトされたCOS細胞は、mAb 9.３にも融合
タンパク質のいづれにも結合しなかった。これは、CD28
及びCTLA４の両者がＢ細胞活性化抗原、B7を結合するこ
とを示唆する。さらに、mAb9.３は検出できるほどは、C
TLA４を結合しなかった。
【０１５５】B7陽性CHO 細胞上へのCTLA４Igの結合。CT
LA４Ig及びB7の結合をさらに特徴づけるために、B7+ CH
O 細胞及びリンパ芽球細胞系（PMLCL)上への精製された
CTLA４Igの結合活性を、図５に示される実験において測
定した。増幅された、トランスフェクトされたCHO細胞
系及びPM LCLを、培地のみ（添加なし）又はCD５Ig，CD
28Ig又はCTLA４Igの同濃度のヒトIgＣγ１−含有タンパ
ク質（10μｇ／ml）と共にインキュベートした。結合性
を、FITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第二段階試薬の添加に続
いて、FACS（Ｒ）により検出した。合計10,000個の染色
された細胞を、FACS（Ｒ）により分析した。
【０１５６】図５に示されるように、CD28IgはB7+ CHO
細胞に結合するが、しかしPM LCLには結合せず、すなわ
ち細胞系は比較的低レベルのB7抗原を発現する（Linsle
y など.,前記，1990）。CTLA４IgはCD28Igよりも両細胞
系により強く結合し、これは、それが高い親和性を伴っ
て結合することを示唆する。CD28IgもCTLA４Igも、CD28
+ CHO 細胞に結合しなかった。
【０１５７】CTLA４Ig及びB7Igの結合の親和性。次に、
CTLA４IgとB7Igとの間の相互作用の見掛け親和性を、固
相競争結合アッセイを用いて測定した。96−ウェルプラ
スチック皿を、上記のようにしてCTLA４Igにより被覆し
た。B7Igを125I（５×105 cpm, ２×106 cpm/ｐモル）
により放射ラベルし、そして添加し、示される濃度（図
６を参照のこと）のラベルされていないキメラmAbL6, m
Ab 9.３，mAb BB−１又はB7Igの存在下で、４nMの濃度
にした。プレート−結合放射能を測定し、そして競争体
なしに処理されたウェルに結合される放射能の百分率と
して表わされた（28,300cpm)。個々の点は二重反復測定
の平均を示し；反復試験は一般的に平均から20％以下変
化した。濃度を、mAbに関して結合部位当たり75,000のM
rに基づいて及びB7Igに関して結合部位当たり51,000のM
rに基づいて計算した。
【０１５８】図６に示されるように、mAbBB−１及びラ
ベルされていないB7Igが125I−B7Ig結合のために有意に
競争した（それぞれ約22nM及び約175 nMで最大の半分の
効果）。キメラmAb L6もmAb 9.３も、試験された濃度で
効果的に競争しなかった。他の実験においては、使用さ
れるmAbの濃度は、固定されたCD28Ig又は90％以上、CD2
8を発現する細胞表面への125I−B7Igの結合を阻害する
のに十分であった。
【０１５９】図６からの競争データがスキャッチャート
プロットでプロットされる場合、約12nMの解離定数Kd
が、固定されたCTLA４Igへの125I−B7の結合性について
計算した（図７）。この値は、125I−B7IgとCD28との間
で前で測定されたKdよりも約20倍低く（約200nM）（Lin
sley など, (1991), 前記）、これは、CTLA４がCD28レ
セプターよりもB7抗原のためにより高い親和性レセプタ
ーであることを示唆する。
【０１６０】CTLA４Igを結合したリンパ芽球細胞上の分
子を同定するために（図７）、125I−表面ラベルされた
細胞を、免疫沈殿分析にゆだねた（図８）。B7+ CHO 及
びPMLCL細胞を125Iにより表面ラベルし、そして上記の
ようにして非イオン性界面活性剤溶液により抽出した。
約1.５×107 cpm を有する、0.１mlの体積での抽出物の
アリコートを、添加を伴わないで、又はそれぞれ２μｇ
のCD28Ig，CTLA４Ig又はCD５Igを伴って、上記のように
して免疫沈殿分析にゆだねた。
【０１６１】次に、洗浄された免疫沈殿物を、還元条件
下でSDS-PAGE (10〜20％のアクリルアミドグラジエン
ト）により分析した。次に、ゲルを乾燥せしめ、そして
オートラジオグラフィーにゆだねた。図８の左側のパネ
ルは、１日間の暴露の後に得られたオートラジオグラム
を示す。図８の右側のパネルは、10日間の暴露の後の同
じゲルのオートラジオグラムを示す。図８の中央のパネ
ルにおけるオートラジオグラムはまた、10日間、暴露さ
れた。分子量標準の位置はまた、この図に示される。
【０１６２】図８により示されるように、分散的に移動
する（約50,000〜75,000；約60,000での中央）、放射性
ラベルされたタンパク質を、CTLA４Igにより（但し、CD
28Ig又はCD５Igによってではない）免疫沈殿せしめた。
この分子は、CTLA４Igにより、B7+ CHO 細胞から免疫沈
殿されたB7と共に同時移動し、そしてCD28Igより免疫沈
殿されたB7と共には、より一層弱く同時移動した。これ
らの発見は、CTLA４Igが、B7抗原に大きさが類似する、
リンパ芽球細胞上の単一タンパク質を結合することを示
唆する。CTLA４Igによるインビトロでの免疫応答の阻害 増殖の阻害 。これまでの研究は、抗−CD28 mAb, 9.３及
び抗−B7 mAb, BB−１が、アロ抗原を表わすＢ細胞に
より、アロ抗原特異的Ｔn の増殖及び免疫グロブリン分
泌を阻害することを示している（Damle, など., Proc.
Natl. Acad. Sci. 78 : 5096 (1981) ; Lesslauerな
ど., Eur. J. Immunol. 16 : 1289 (1986)) 。CTLA４は
本明細書に示されるようにB7抗原のために高い親和性レ
セプターであるので、可溶性CTLA４Igは、それらの応答
を阻害するその能力について試験された。Ｔ細胞増殖に
対するCTLA４Igの効果は、図９に示される実験で試験さ
れた。
【０１６３】一次混合リンパ球反応（MLR)幼若を、ネズ
ミmAb9.３ Fabフラグメント、又はB7Ig，CD28Igもしく
はCTLA４Ig免疫グロブリンＣγ融合タンパク質の濃縮物
の不在又は存在下で、照射されたT51リンパ芽球細胞（I
C）により刺激した。細胞増殖を、４日後、〔 3Ｈ〕−
チミジン組込みにより測定し、そして未処理の培養物に
よる組込みの百分率として表わす、（21,000cpm)。図９
は、４重反復測定の平均を表わす（SEM ≦10％）。
【０１６４】図９に示されるように、CTLA４Igは、約30
ng／ml（約0.８nM）で、１／２最大応答を伴って最大90
％以上、投与量−依存性態様でMLR反応を阻害した。完
全なmAb 9.３よりもより可能性あるMLR のインヒビター
であることがこれまで示されている、mAb 9.３のFab フ
ラグメント（Damleなど., J. Immunol. 140 : 1753〜17
61 (1988))はまた、MLR を阻害したが、しかしその濃度
は、より高い濃度（約800ng／ml又は１／２最大応答の
ためには約30nM）であった。B7Ig及びCD28Igは、高濃度
でさえ、MLR を有意に阻害しなかった。他の実験におい
ては、CTLA４Igと共にB7Igの添加は、CTLA４IgによるML
Rの阻害を一部克服し、この事は、その阻害がB7抗原と
の特異的な相互作用によることを示唆する。
【０１６５】免疫グロブリン分泌の阻害。ヘルパーＴ細
胞（Ｔn ）−誘発性免疫グロブリン分泌に対するCTLA４
Igの効果をまた試験した（図10）。CD４+ Ｔ細胞を、上
記のようにして、指示された免疫グロブリン分子の存在
又は不在下で、同種CD19+ Ｂ細胞と共に混合した。ネズ
ミmAbs OKT8, 9.3及びBB−１を20μｇ／mlで添加し、そ
してIg融合タンパク質を10μｇ／mlで添加した。６日間
の培養の後、培養上清液におけるヒトIgMの濃度（SEM
＜５％）を、上記のようにして酵素イムノアッセイ（EL
ISA)により測定した。CD４+ Ｔ細胞の不在下で培養され
たＢ細胞によるIgM 生成は11ng／mlであった。
【０１６６】図10に示されるように、CD４+ Ｔ細胞は同
種CD19+ Ｂ細胞によるIgM 生成を刺激した（CD４+ Ｔ細
胞の不在下で、IgM レベルは93％減じられた）。mAbs
9.3及びBB−１は、Ｔh −誘発されたIgM 生成を有意に
阻害した（それぞれ63％及び65％の阻害率）。CTLA４Ig
は、それらのmAbsよりもインヒビターとしてより効果的
であった（89％の阻害率）。対照分子、mAbOKT8及びCD
５Igによる阻害は、より低かった（30％以下の阻害
率）。それらの分子は、スタフィロコーカル アウレウ
ス（Staphylococcalaureus)エンテロトキシンＢの存在
下で測定されるIg生成を有意に阻害しなかった。類似す
る結果が、他のドナーに由来するＢ細胞及びCD４+ Ｔ細
胞により得られた。それらの結果は、CTLA４Igによる阻
害が特異的であることを示す。
【０１６７】上記データはまた、CTLA４及びCD28レセプ
ターが機能的及び構造的に関連していることを示す。CD
28のように、CTLA４はまた、Ｂ細胞活性化抗原、B7のた
めのレセプターでもある。CTLA４Igは、約12nMの親和性
定数Kdを伴って125I−B7を結合し、その値は、CD28とB7
Igとの間の親和性よりも20倍高い（約200nM）。従っ
て、CTLA４及びCD28は、同じリガンド、すなわちB7抗原
のために、それぞれ高い及び低い親和性レセプターとし
て考えられる。
【０１６８】CD28とB7との間の見掛け親和性は、ネズミ
Ｔ細胞ハイブリドーマのＴ細胞レセプターへの可溶性ア
ロ抗原の結合について報告される親和性に類似し（約10
0nM；Schnekなど.,Cell 56 : 47 (1989))、そしてCD２
とLFA3との間（Recny など.,J. Biol.Chem. 265 : 8542
(1990))又はCD４とMHC クラスII分子との間（Clayton
など., Nature 339 :548 (1989))の相互作用よりも高い
親和性である。
【０１６９】CTLA４とB7との間の見掛け親和性定数Kdは
さらに大きく、そして好都合には、より高い親和性のmA
bsに匹適する（Ｋ2 ２−10,000nM；Alzariなど.,Ann. R
ev.Immuno. 6 : 555 (1988)) CTLA４とB7との間のKd
は、インテグリンレセプター及びそれらのリガンドのKd
に類似するか又はそれの値よりも大きい（10〜2000nM：
Hautanenなど.,J. Biol. Chem. 264 : 1437 〜1442 (19
89) ; Di Minnoなど., Blood 61 :140〜148 (1983) ; T
hiagarajan and Kelley, J. Biol. Chem. 263 :3035〜3
038 (1988))。従って、CTLA４とB7との間の相互作用の
親和性は、リンパ芽球付着システムについて報告される
中で最高である。
【０１７０】それらの結果は、CTLA４転写体の官能的タ
ンパク質生成物の最初の発現を示す。CTLA４Ig、すなわ
ちIgＣγ１ドメインに融合されるCTLA４の細胞外ドメイ
ンを含む融合構成体は、約50,000サブユニットのMrのジ
スルフィド結合ダイマーを形成する（図１）。鎖間ジス
ルフィドはこの融合のIg部分において形成することが予
期されないので、CTLA４からのシステインはジスルフィ
ト結合形成に包含される。同種CD28Ig融合タンパク質
（Linsleyなど, 前記，1991）はまた鎖間ジスルフィド
結合を含む。それらの結果は、CD28のようにCTLA４レセ
プター（Hansenなど.,Immunogenetics 10 : 247〜260(1
980)) がジスルフィド結合ホモダイマーとしてＴ細胞表
面上に存在することを示唆する。CD28及びCTLA４は高い
相同性のタンパク質であるが、それらは免疫学的に異な
っている。なぜならば抗−CD28mAb,9.3はCTLA４を認識
しないからである（図４及び５）。
【０１７１】CTLA４が、CD28に類似するシグナル化路に
よりＴ細胞を活性化できるかどうかについては知られて
いない。ネズミ及びヒトCTLA４の細胞質ドメインは同一
であり（Dariavach.,前記 1988)、これは、この領域が
重要な官能性質を有することを示唆する。CD28及びCTLA
４の細胞質ドメインはまた、相同性を共有す。但し、こ
れが２つの分子に類似するシグナル性質を付与するため
に十分であるかいづれかについては不明である。
【０１７２】CTLA４IgはＴ細胞及びＢ細胞協力を必要と
するインビトロリンパ球機能の可能性あるインヒビター
である（図９及び10）。前記研究と共に、これらの発現
は、Ｔ及びＢリンパ球応答を調節することにおいて、B7
抗原とそのカウンターレセプター、CD28及び／又はCTLA
４との間に相互作用の基本的重要性を示唆する。CTLA４
Igは、免疫応答の間、それらの相互作用の役割上、未来
の調査のために有用な試薬であるべきである。
【０１７３】CTLA４Igは、mAbBB−１又はmAb 9.３のい
づれよりもインビトロリンパ球応答のより可能性あるイ
ンヒビターである（図９及び10）。mAb BB−１よりもよ
りCTLA４Igの高い能力は、ほとんどそれらの分子間での
B7のための親和性の差異によると思われる（図６）。CT
LA４Igはまた、mAb9.３よりも可能性がある。なぜなら
ば、たぶん、mAb とは異なって、それはその阻害効果を
妨害するために、Ｔ細胞増殖に対して直接的な刺激効果
を有さないからである（Juneなど.,ImmunologyToday 11
: 211 (1989)) 。インビトロでのCTLA４Igの免疫抑制
効果は、未来の研究が、異常なＴ細胞活性化又はIg生成
を包含する自己免疫疾患の処置のために、この分子の可
能な治療効果を保証されることを示唆する。
【０１７４】本発明が関与する当業者に明らかなよう
に、本発明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示さ
れるもの以外の形で具体化され得る。従って、上記本発
明の特定の態様は例示的であると考えられるべきであ
る。本発明の範囲は、例示的であって、本発明を制限す
るものではない。
【０１７５】本発明はＢ７抗原のためのリガンドとして
ＣＴＬＡ４レセプターを同定する。ヒトＣＴＬＡ４レセ
プター遺伝子をコードする完全なアミノ酸配列が提供さ
れる。免疫グロブリン融合タンパク質としてＣＴＬＡ４
を発現し、ハイブリッドＣＴＬＡ４融合タンパク質を調
製し、そしてＴ細胞相互作用及びそのような相互作用に
より介在される免疫応答を抑制するために、可溶性融合
タンパク質、そのフラグメント及び誘導体、たとえばＢ
７及びＣＴＬＡ４と反応性のモノクローナル抗体を調製
するための方法が提供される。
【０１７６】
【発明の効果】従って、本発明によって、従来発現され
ていないCTLA４遺伝子の可溶性タンパク質生産物を得ら
れ、そしてＴ細胞の機能的応答に関係するCTLA４のため
の天然のリガンドが同定される。本発明はまた、可溶性
タンパク質生産物を使用してＴ細胞のinvivo 応答を調
節して病理学的状態を処置することを可能にする。
【０１７７】
【配列表】 配列の列挙 （１）一般情報 （ｉ）出願者：Linsley,Peter S Ledbetter,Jeffrey A Damle,Nitin K Brady,William （ii）発明の表題：CTLA４レセプター及びその使用法 （iii ）配列の数：14 （iv）通信住所： （Ａ）あて先：Sheldon& Mak （Ｂ）通り：201South Lake Avenue, Suite 800 （Ｃ）市：パサデナ （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：91101 （ｖ）コンピューター読取りフォーム： （Ａ）媒体型：プロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：IBMPC compatible （Ｃ）操作システム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：PatentInRelease ≠1.０，Version ≠1.25 （vi）現在の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分 類： （viii）アトニー／エージェントの情報： （Ａ）名 称：Mandel,SaraLynn （Ｂ）登録番号：31,853 （Ｃ）参照／ドケット番号：7848 （ix）電信情報： （Ａ）電 話： (818)796-4000 （Ｂ）テレファックス：(818) 795-6321 （２）配列番号１についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：39個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号１： CTAGCCACTGAAGCTTCACC ATGGGTGTAC TGCTCACAC 39 （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：39個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号２： TGGCATGGGCTCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGAAA 39 （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：39個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号３： TTTGGGCTCCTGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT 39 （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：84個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号４： AAGCAAGAGCATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA CACATCCCCA 60 CCGTCCCCAGCACCTGAACT CCTG 84 （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：41個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号５： CTTCGACCAGTCTAGAAGCA TCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C 41 （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：47個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号６： CATTGCACAGTCAAGCTTCC ATGCCCATGG GTTCTCTGGC CACCTTG 47 （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：39個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号７： ATCCACAGTGCAGTGATCAT TTGGATCCTG GCATGTGAC 39 （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：65個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号８： CTCAGTCTGGTCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA GCATGGCAAT GCACGTGGCC 60 CAGCC 65 （２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：33個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号９： TTTGGGCTCCTGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG 33 （２）配列番号10についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：72個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号10： CTAGCCACTGAAGCTTCACC AATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGGACGCT GCTCAGTCTG 60 GTCCTTGCAC TC 72 （２）配列番号11についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：33個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号11： GCAATGCACGTGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG 33 （２）配列番号12についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：45個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （xi）配 列：配列番号12： TGATGTAACATGTCTAGATC AATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG 45 （２）配列番号13についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：561 個の塩基対 （Ｂ）型 ：核 酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：DNA （ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起 源： （Ａ）生物名：Homosapiens （ix）特 徴： （Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位 置：1..561 （xi）配 列：配列番号13： GCA ATG CAC GTGGCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGA GGC 48 Ala Met His ValAla Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 1 5 10 15 ATC GCC AGC TTTGTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG 96 Ile Ala Ser PheVal Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 20 25 30 GTC CGG GTG ACAGTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC 144 Val Arg Val ThrVal Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val 35 40 45 TGT GCG GCA ACCTAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GAT GAT 192 Cys Ala Ala ThrTyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 50 55 60 TCC ATC TGC ACGGGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA GTG AAC CTC ACT ATC 240 Ser Ile Cys ThrGly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile 65 70 75 80 CAA GGA CTG AGGGCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTG GAG 288 Gln Gly Leu ArgAla Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu 85 90 95 CTC ATG TAC CCACCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA ACC CAG 336 Leu Met Tyr ProPro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln 100 105 110 ATT TAT GTA ATTGAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTC CTC 384 Ile Tyr Val IleAsp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu 115 120 125 TGG ATC CTT GCAGCA GTT AGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTT CTC 432 Trp Ile Leu AlaAla Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 130 135 140 CTC ACA GCT GTTTCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCT CTT 480 Leu Thr Ala ValSer Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160 ACA ACA GGG GTCTAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGT GAA 528 Thr Thr Gly ValTyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 AAG CAA TTT CAGCCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT 561 Lys Gln Phe GlnPro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 180 185 （２）発明番号14についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ：187 個のアミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配 列：配列番号14： Ala Met His ValAla Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 1 5 10 15 Ile Ala Ser PheVal Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 20 25 30 Val Arg Val ThrVal Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val 35 40 45 Cys Ala Ala ThrTyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 50 55 60 Ser Ile Cys ThrGly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile 65 70 75 80 Gln Gly Leu ArgAla Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu 85 90 95 Leu Met Tyr ProPro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln 100 105 110 Ile Tyr Val IleAsp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu 115 120 125 Trp Ile Leu AlaAla Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 130 135 140 Leu Thr Ala ValSer Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160 Thr Thr Gly ValTyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 Lys Gln Phe GlnPro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 180 185
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、下の実施例２に記載するCTLA４Ig融
合構成体の線図的表示である。
【図２】第２図は、下の実施例２に記載するCTLA４Igの
SDS-PAGEクロマトグラフィーの精製から得られたゲルの
写真である。
【図３】第３図は、下の実施例３に記載する、オンコス
タチイン（oncostatin) Ｍシグナルプライマー伸長（位
置−25〜−１）に融合したヒトCTLA４レセプター（配列
識別番号：13および14）をコードし、そして新しく同定
されたＮ連鎖グリコシル化部位（位置109〜111)を含
む、完全なアミノ酸配列を示す。
【図４】第４図は、下の実施例４に記載する、CD28およ
びCTLA４でトランスフェクションしたCOS 細胞へのB7Ig
融合タンパク質の結合のFACSR 分析の結果を示す。
【図５】第５図は、下の実施例４に記載する、B7抗原陽
性（B7+ ) CHO 細胞およびリンパ芽球様細胞系（PM-LC
L) 上の精製したCTLA４Igの結合のFACSR 分析の結果を
示す。
【図６】第６図は、下の実施例４に記載する、同定化CT
LA４Igへの125I標識化B7Igの競争結合の分析を示すグラ
フである。
【図７】第７図は、下の実施例４に記載する、同定化CT
LA４Igへの125I標識化B7Igのスキャッチャード分析の結
果を示すグラフである。
【図８】第８図は、下の実施例４に記載する、125Iで表
面標識化したB7陽性CHO細胞およびPM-LCL細胞の免疫沈
澱分析のSDS-PAGEクロマトグラフィーからのゲルの写真
である。
【図９】第９図は、下の実施例４に記載する、〔 3Ｈ〕
−チミジンの組み込みにより測定した、CTLA４IgのＴ細
胞の増殖への作用を示すグラフである。
【図１０】第10図は、下の実施例４に記載する、酵素の
イムノアッセイ（ELISA)により決定した、ヒトＴ細胞に
よるヘルパーＴ細胞（Ｔh ）誘発免疫グロブリンの分泌
へのCTLA４Igの作用を示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェフリー エー． レッドベター アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ アトル，ノースウェスト ワンハンドレッ ドサーティーンス プレイス 306 (72)発明者 ナイティン ケイ． ダムル アメリカ合衆国，ワシントン 98056，レ ントン，サウスイースト シックスティス プレイス 11717 (72)発明者 ウィリアム ブラディ アメリカ合衆国，ワシントン 98021，ボ セル，トゥハンドレッドナインティーンス プレイス サウスウェスト 618 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA80 CA01 CA04 CA06 CA07 DA02 EA04 FA10 GA13 GA18 HA01 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 DA86 EA20 EA22 EA28 EA50 FA72 FA74 GA21

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 活性化されたB細胞上に発現されるB7抗
    原を結合する、CTLA4の細胞外ドメインを有する単離さ
    れた可溶性CTLA4分子。
  2. 【請求項２】 CTLA4の細胞外ドメインを含む第１アミ
    ノ酸配列、及びヒト免疫グロブリン分子のヒンジ、CH2
    及びCH3領域を含む第２アミノ酸配列を有する、B7抗原
    を結合するCTLA4Ig融合タンパク質。
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