FI120041B - Liukoisia CTLA4-molekyyleja ja niiden käyttöjä - Google Patents

Description

Liukoisia CTLA4-molekyyleja ja niiden käyttöjä

Jakamalla erotettu suomalaisesta patenttihakemuksesta 951801.

5 Tässä patenttihakemuksessa on viitattu erilaisiin julkaisuihin. Näiden julkaisujen sisällöt on liitetty kokonaisuudessaan tähän patenttihakemukseen tämän keksinnön sen tekniikan tason, jota keksintö koskee, täydelliseksi ymmärtämiseksi.

10 Esillä oleva keksintö koskee CTLÄ4-hybridifuusio- proteiinien ekspressiota, CTLA4-reseptorigeeniä, CTLA4-reseptorin ja B7-antigeenia ekspressoivien solujen interaktion tunnistamista ja menetelmiä, joilla säädellään sellaisia soluinteraktioita, jotka sisältävät CTLA4-resepto-15 rin ja B7-antigeenin.

Keksinnön tausta

Leimallista selkärankaisten immuunisysteemille on sen kyky erottaa "oma" "ei-omasta" (vieraasta). Tämä kyky on johtanut sellaisen systeemin kehittymiseen, joka vaatii 20 useita signaaleja optimaalisen immuuniaktivaation aikaan saamiseksi [Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.

: 54:1 - 14 (1989)]. T-solu-B-solu-interaktiot ovat keskei- • ·· .* siä immuunivasteelle. Monien T-soluista ja B-soluista löy- • · * \ tyvien koheesiomolekyylien tasot nousevat immuunivasteen • · · ’*··] 25 aikana [Springer et ai., (1987), yllä; Shaw ja Shimuzu,

Current Opinion in Immunology, toim. Kindt ja Long, 1:92 -97 (1988); ja Hemler, Immunology Today 9:109 - 113 ♦ ·· (1988)]. Näiden molekyylien kohonneet tasot voivat auttaa selittämään, miksi aktivoidut B-solut ovat tehokkaampia 30 stimuloimaan antigeenispesifisten T-solujen lisääntymistä .***. kuin lepäävät B-solut [Kaiuchi et ai., J. Immunol. 131: ·. 109 - 114 (1983); Kreiger et ai., J. Immunol. 135:2 937 - • · · •••j 2 945 (1985); McKenzie, J. Immunol. 141:2 907 - 2 911 *···* (1988); ja Hawrylowicz ja Unanue, J. Immunol. 141:4 083 - 35 4 088 (1988)].

• · ··· • · • · it· 2 T-lymfosyyttien ("T-solu") immuunivasteen muodostuminen on monimutkainen prosessi, johon ottavat osaa so-lu-solu-interaktiot [Springer et ai., A. Rev. Immunol. 5: 223 - 252 (1987)] erikoisesti T- ja apusolujen, kuten B-5 solujen, välillä ja liukoisten immuunivälittäjäaineiden (sytokiinit tai lymfokiinit) tuotto [Dinarello ja Mier, New Engl. Jour. Med. 317:940 - 945 (1987)]. Tätä vastetta säätelevät useat T-solun pintareseptorit sisältäen T-solu-reseptorikompleksin [Weiss et ai., Ann. Rev. Immunol. 4: 10 593 - 619 (1986)] ja muut "apupintamolekyylit" [Springer et ai., (1987), yllä]. Monet näistä apumolekyyleistä ovat luonnollisesti esiintyviä solupinnan erilaistumisantigee-neja (CD), jotka on määritelty monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuudella solujen pinnalla [McMichael, 15 toim., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)].

Antigeenistä riippumattomat solujen väliset interaktiot, joihin ottavat osaa lymfosyyttien apumolekyylit, ovat keskeisiä immuunivasteelle [Springer et ai., (1987), 20 yllä]. Esimerkiksi T-soluun liittyvän CD2-proteiinin sitoutuminen LFA-3-ligandiinsa, joka on laajasti ekspressoi-. . tu glykoproteiini (yhteenveto julkaisussa Shaw ja Shimuzu, .*.* yllä), on tärkeää antigeenispesifisen T-soluaktivaation • · · * i optimoimiseksi [Moingeon et ai., Nature 339:314 (1988)].

• · · *···* 25 Tärkeä adheesiosysteemi sisältää lymfosyyteistä, *·**· makrofageista ja granulosyyteistä löytyvän LFA-l-glykopro- teiinin sitoutumisen [Springer et ai., (1987), yllä; Shaw ja Shimuzu (1988), yllä] sen ligandeihin ICAM-1 [Makgoba et ai., Nature 331:86 - 88 (1988)] ja ICAM-2 [Staunton et :*·*: 30 ai., Nature 339:61 - 64 (1989)]. T-solujen apumolekyylit

.·**. CD8 ja CD4 vahvistavat T-solun adheesiota reagoimalla MHC

·. luokan I [Norment et ai., Nature 336:79 - 81 (1988)] ja • · · •••| luokan II [Doyle ja Strominger, Nature 330:256 - 259 • ♦ *·..* (1987)] molekyylien kanssa, vastaavasti. "Ohjausresepto- • · « · · • ·· • · ··· • · • · ♦ ·· 3 rit" ovat tärkeitä lymfosyyttimigraation säätelyssä [Stoolman, Cell 56:907 - 910 (1989)].

VLA-glykoproteiinit ovat integriinejä, jotka tuntuvat välittävän sellaisia lymfosyyttitoimintoja, jotka 5 vaativat solunulkoisen matriksin komponenttien adheesion (Hemler, yllä). CD2/LFA-3-, LFA-l/ICAM-1- ja ICAM-2- ja VLA-adheesiosysteemit sisältyvät useisiin erilaisiin solu-tyyppeihin [Springer et ai., (1987), yllä; Shaw ja Shimuzu, (1988), yllä ja Hemler, (1988), yllä].

10 Useissa in vitro tutkimuksissa on osoitettu, että sytokiinit ottavat osaa alloreaktiivisten vaikuttajasolu-jen muodostumiseen. Esimerkiksi membraaniin sitoutunutta IL-4- ja liukoista IL-4-reseptoria annettiin erikseen hiirille ja niiden osoitettiin lisäävän lymfoproliferatiivis-15 ta vastetta [William C. Fanslow et ai., "Regulation of Alloreactivity in vivo by IL-4- and the soluble IL-4 receptor", J. Immunol. 147:535 - 540 (1991)]. Erikoisesti IL-4-reseptorin anto BALB/c-hiirille johti lymfoprolife-ratiivisen vasteen vähäiseen lisääntymiseen. Tälle päin-20 vastaisesti liukoinen IL-4-reseptori suppressor tätä vastetta allogeenisissa soluissa annoksesta riippuvaisella ; tavalla. Lisäksi IL-4-proteiinia vastaan oleva neutraloiva • · · « / vasta-aine ja toinen liukoista IL-4-reseptoria vastaan * ; oleva vasta-aine olivat tehokkaita lymfoproliferatiivisen • · · *··* 25 vasteen inhibiittoreita.

* * Monta vuotta sitten ehdotettiin, että B-lymfosyyt- ..ΙΓ tien aktivaatio vaatii kaksi signaalia [Bretscher ja Cohn, ··· ·...♦ Science 169:1 042 - 1 049 (1970)] ja nyt uskotaan, että kaikki lymfosyytit vaativat kaksi signaalia niiden opti-:T: 30 maalista aktivaatiota varten, antigeenispesifisen tai klo- ;***: naalisen signaalin kuin myös toisen, antigeenille epäspe- • · · *. sifisen signaalin (Janeway, yllä). Freeman et ai. [J. Im- ··· ·**· munol. 143(8):2 714 - 2 722 (1989)] eristivät ja sekven- • · *·;·* soivat cDNA-kloonin, joka kooditti B-soluaktivaatioanti- 35 geeniä, jonka monoklonaalinen vasta-aine B7 tunnisti • ♦ • · · • · • · • · · 4 [Freeman et ai., J. Immunol. 138:3 260 (1987)]. Tällä cDNA:lla transfektoitujen COS-solujen on osoitettu värjäytyvän sekä leimatulla monoklonaalisella vasta-aineella B7 että monoklonaalisella vasta-aineella BB-1 [Clark et ai., 5 J. Immunol 128:823 (1981); Freeman et ai., (1989) yllä; ja Freeman et ai., (1987), yllä]. Lisäksi tämän antigeenin ekspressio on havaittu muuta alkuperää olevissa soluissa, kuten monosyyteissä (Freeman et ai., yllä).

T-auttajasolun (Th) antigeenivasteeseen vaadittavat 10 signaalit ovat antigeeniä sisältävissä soluissa (APC). Ensimmäinen signaali alkaa T-solureseptorikompleksin [Weiss, J. Clin. Invest. 86:1 015 (1990)] interaktiolla antigeenin kanssa, joka on luokan II pääasiallisen histo-kompatibiliteettikompleksimolekyylien (MHC) yhteydessä 15 APC-soluissa [Allen, Immunol. Today 8:270 (1987)]. Tämä antigeenispesifinen signaali ei ole riittävä muodostamaan täyttä vastetta ja toisen signaalin poissaolo voi todellisuudessa johtaa klonaaliseen inaktivaatioon tai energiaan [Schwartz, Science 248:1 349 (1990)]. Toisen "kosti-20 mulatorisen" signaalin, jonka MHC-molekyylit antavat, tarve on osoitettu useissa koesysteemeissä [Schwartz, yllä; · Weaver ja Unanue, Immunol. Today 11:49 (1990)]. Tämän toi- • · · .1 / sen signaalin (näiden toisten signaalien) molekulaarista • · * * luonnetta ei täysin ymmärretä, vaikka onkin täysin selvää • · · *·*·] 25 joissain tapauksissa, että sekä liukoiset molekyylit, ku ten interleukiini-1 (IL-1)(Weaver ja Unanue, yllä), ja ...:* membraanireseptorit, jotka ottavat osaa solujen väliseen • · · adheesioon [Springer, Nature 346:425 (1990)], voivat muodostaa kostimulatoriset signaalit.

:T: 30 CD28, joka on immunoglobuliinisuperryhmän homodi- :***: meerinen glykoproteiini [Aruffo ja Seed, Proc. Natl. Acad.

• · · *. Sei. 84:8 573 - 8 577 (1987)] on apumolekyyli, joka löytyy *::: useimmista kypsistä ihmisen T-soluista [Damle et ai., J.

• · ' *·;·* Immunol. 131:2 296 - 2 300 (1983)]. Tämän hetkiset todis- :/.j 35 teet antavat ehdottaa, että tämä molekyyli toimii vaihto- ··· • » • · ··· 5 ehtoisalla T-soluaktivaatioreitillä, joka eroaa T-solu-reseptorikompleksin aloittamasta reitistä [June et ai., Mol. Cell. Biol. 7:4 472 - 4 481 (1987)]. CD28-antigeenin kanssa reagoivat monoklonaaliset vasta-aineet (mAb:t) voi-5 vat lisätä sellaisia T-soluvasteitä, jotka ovat alkaneet erilaisilla polyklonaalisilla stimuluksilla (yhteenveto julkaisussa June et ai., yllä). Nämä stimulatoriset vaikutukset voivat johtua monoklonaalisen vasta-aineen indusoimasta sytokiinin tuotosta [Thompson et ai., Proc. Natl. 10 Acad. Sei. 86:1 333 - 1 337 (1989); ja Lindsten et ai., Science 244:339 - 343 (1989)] kohonneen mRNA-stabilisaa-tion seurauksena [Lindsten et ai., (1989), yllä]. Monoklo-naalisilla anti-CD28-vasta-aineilla voi myös olla inhibi-torisia vaikutuksia, se tarkoittaa, että ne voivat blokee-15 rata autologiset sekalymfosyyttireaktiot [Damle et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78:5 096 - 6 001 (1981)] ja anti-geenispesifisten T-solukloonien aktivaation [Lesslauer et ai., Eur. J, Immunol. 16:1 289 - 1 296 (1986)].

Tutkimukset ovat osoittaneet, että CD28 on vasta- 20 reseptori B-soluaktivaatioantigeenille B7/BB-1 [Linsley et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5 031 - 5 035 (1990)].

. . Mukavuussyistä B7/BB-l-antigeenia kutsutaan tästä lähtien • *** ,· .* nimellä "B7-antigeeni". B7-ligandit ovat myös immunoglo- • · · • ·* buliinisuperryhmän jäseniä, mutta niillä on, päinvastoin *·«* 25 kuin CD28- ja CTLA4-proteiineilla, kaksi Ig-domeenia nii- ·*’· den solunulkoisella alueella, N-pään variaabelidomeenin (V) kaltainen domeeni, jota seuraa vakiodomeenin (C) kai- • · · • : täinen domeeni.

··· Tärkeä epäspesifinen kostimulatorinen signaali tuo- 30 daan T-soluille, kun on olemassa ainakin kaksi APC-soluis- .·*·. ta löytyvää homologista B7-ryhmän jäsentä, B7-1 (jota kut- ··· sutaan myös nimillä B7 tai CD80) ja B7-2, jotka molemmat ··· ··« voivat tuottaa kostimulatoriset signaalit T-soluille joko *...· CD28- tai CTLA4-proteiinin kautta. Kostimulaatio CD28- tai .‘.J 35 CTLA4-proteiinin kautta on keskeinen T-soluaktivaatiolle, • · • · • · ··· 6 koska CTLA4-proteiinin liukoista Ig-fuusioproteiinia (CTLA4-Ig) on onnistuneesti käytetty blokeeraamaan T-solu-aktivaatiotapahtumat in vitro ja in vivo. Epäonnistuminen tämän toisen signaalin muodostamisessa voi johtaa klonaa-5 liseen inaktivaatioon tai T-solujen energiaan.

CD28- ja B7-antigeenien väliset interaktiot on karakterisoitu käyttäen B7-antigeenin ja CD28-reseptorin solunulkoisten osien ja immunoglobuliini Cgammal -proteiinin (Ig)(raskasketjujen vakioalueita) geneettisiä fuu-10 sioita [Linsley et ai., J. Exp. Med. 173:721 - 730 (1991)]. Immobilisoidun B7Ig-fuusioproteiinin kuin myös B7-positiivisten CHO-solujen on osoitettu kostimuloivan T-solujen lisääntymistä.

T-solustimulaatio B7-positiivisilla CHO-soluilla 15 stimuloi myös spesifisesti IL-2-proteiinin transkriptien kohonneita tasoja. Lisätutkimukset ovat osoittaneet, että monoklonaalinen anti-CD28-vasta-aine inhiboi IL-2-prote-iinin tuottoa, joka oli indusoitunut tietyissä T-soluleu-kemiasolulinjoissa niiden reagoidessa B-soluleukemialinjan 20 solujen kanssa [Kohno et ai., Cell. Immunol. 131:1 - 10 (1990)].

.·, : CD28-proteiinissa on yksi solunulkoinen variaabelin • · · alueen (V) kaltainen domeeni (Aruffo ja Seed, yllä). Homo- * · I loginen molekyyli CTLA4 on tunnistettu jyrsijän sytolyyt- • · · **·. 25 tisten T-solujen cDNA-kirjaston erottavalla seulonnalla [Brunet et ai., Nature 328:267 - 270 (1987)].

• · · CTLA4-molekyylin transkriptit on löydetty T-solu- • · · *...* populaatioista, joilla on sytotoksista aktiivisuutta, joka antaa ehdottaa, että CTLA4 voisi toimia sytolyyttisessä • · · X : 30 vasteessa [Brunet et ai., yllä; ja Brunet et ai., Immunol.

Rev. 103:21 - 26 (1988)]. Tutki-jat ovat julkaisseet ihmi- • M - sen CTLA4-proteiinin vastineen geenin kloonauksen ja kar- Ί" toituksen [Dariavach et ai., Eur. J. Immunol. 18:1 901 - • · " ”·’ 1 905 (1988)] samaan kromosomialueeseen (2q33 - 34) kuin • · i.’·· 35 CD28-geeni [Lafage-Pochitaloff et ai., Immunogenetics 31: • · · • · • · 7 198 - 201 (1990)]. CTLA4-proteiinin Ig-fuusio sitoutuu B7-1-proteiiniin noin 20 kertaa korkeammalla innolla kuin CD28-proteiinin vastaava Ig-fuusio.

Tämän ihmisen CTLA4-DNA:n ja CD28-proteiineja koo-5 dittavien DNA:den sekvenssien vertailu paljastaa merkittävän sekvenssihomologian niin, että suurin homologia-aste on membraanin vieressä olevilla ja sytoplasmisilla alueilla [Brunet et ai., 1988, yllä; Dariavach et ai., 1988, yllä].

10 Korkea homologiataso CD28- ja CTLA4-sekvenssien välillä yhdessä niiden geenien kolokalisaation kanssa nostaa esiin sellaisia kysymyksiä, kuten ovatko nämä molekyylit myös toiminnallisesti toisilleen sukua. Kuitenkin, koska CTLA4-geenin proteiinituotetta ei ole vielä onnistu-15 neesti ekspressoitu, nämä kysymykset jäävät vastausta vaille.

Immunoglobuliinigeenisuperryhmänsolupintaglykopro-teiinien liukoisten johdannaisten ekspressio on toteutettu CD4-proteiinilla, joka on HIV-1-reseptori, ja CD28- ja B7-20 reseptoreilla käyttäen hybridifuusiomolekyylejä, jotka sisältävät DNA-sekvenssit, jotka koodittavat sellaisia aminohappoja, jotka vastaavat osia CD4-reseptorin solunul- • · koisesta domeenista, fuusioituna vasta-ainedomeeneihin • · . [immunoglobuliini gamma 1 (Capon et ai., Nature 337:525 - 25 531 (1989)(CD4) ja Linsley et ai., J. Exp. Med., yllä (CD28 ja B7)].

• · · **;j On olemassa tarve molekyyleistä, jotka voivat tun- • · '···* nistaa in vitro B7-positiiviset B-solut, se tarkoittaa, aktivoidut B-solut, leukosyyttityypitystä ja FACS-solula- • · · V : 30 jittelua varten. Lisäksi on olemassa tarve molekyyleistä, • · · joita voidaan käyttää estämään elinsiirteiden hyljintää ja .:. inhiboimaan niitä oireita, jotka liittyvät punahukkaan ja .···, muihin autoimmuunitauteihin. Menneisyydessä pääasialliset • · **’ terapiat elinsiirteiden hyljinnän estämisessä tai punahu- · · ·.**: 35 kan oireiden inhiboimisessa tukeutuivat panimmunosuppres- • · · • · • · • · · 8 siivisiin lääkkeisiin, kuten syklosporiini Athan tai CD3-proteiinia vastaan oleviin monoklonaalsiin vasta-aineisiin (mAb:t). Valitettavasti näitä lääkkeitä täytyy ottaa säännöllisesti yksilön koko elinikä, ne depressoivat koko im-5 muunisysteemiä ja tuottavat usein sekundaarisia terveys haittoja, kuten kohonneen infektio- ja syöpäfrekvenssin. Keksinnön yhteenveto

Sen mukaisesti esillä oleva keksintö esittää täydellisen ja oikean DNA-sekvenssin, joka koodittaa amino-10 happosekvenssiä, joka vastaa CTLA4-reseptoriproteiinia ja tunnistaa B7-antigeenin (esim. B7-1- ja B7-2-antigeenit) CTLA4-reseptorin luonnolliseksi ligandiksi. Keksintö esittää myös menetelmän DNA:n ekspressoimiseksi CTLA4-immuno-globuliini (Ig) -fuusioproteiinituotteena. Keksinnön suo-15 ritustavat sisältävät CTLA4lg-fuusioproteiinin ja hybridi-fuusioproteiinit, jotka sisältävät CD28/CTLA4lg-fuusiopro-teiinit (jota kutsutaan tässä myös nimellä CTLA4/CD28lg-fuusioproteiini). On myös esitetty menetelmät CTLA4-fuu-sioproteiinin, B/Ig-fuusioproteiinin, hybridifuusioprote-20 iinien ja niiden fragmenttien ja/tai johdannaisten, kuten CTLA4-proteiinin ja B7-antigeenin kanssa reagoivien mono- ;\j klonaalisten vasta-aineiden, käyttämiseksi soluinterakti- • · oiden ja immuunivasteiden säätelemisessä.

• · • · . .·, Keksinnön mukaista ihmisen CTLA-reseptoriproteiinia • · · 25 kooditetaan 187 aminohapon pituisena ja se sisältää vasta- • · . tunnistetun N-sidoksellisen glykosylaatiokohdan.

• · *

Keksinnön mukainen CTLA4lg-f uusioproteiini sitoutuu • · *···’ B7-antigeeni in, jota ekspressoidaan aktivoiduissa B-so- luissa ja muuta alkuperää olevissa soluissa, joka on T- • · · *.· ; 30 solujen CD28-reseptorin ligandi. CTLA4lg sitoutuu B7-anti- ··· geeniin merkittävästi korkeammalla affiniteetillä kuin B7 ♦ sitoutuu CD28-reseptoriin. CTLA4lg-rakenteessa on ensim- .··♦. mäinen aminohapposekvenssi, joka vastaa CTLA4-reseptorin • · *·* solunulkoista domeenia, fuusioituna toiseen aminohapposek- • · *. *: 35 venssiin, joka vastaa ihmisen Ig Cgammal -domeenia. Ensim- ··· • · • · ·*· 9 mäinen aminohapposekvenssi sisältää aminohappojäännökset kohdasta noin 1 kohtaan noin 125 siitä aminohapposekvenssistä, joka vastaa CTLA4-reseptorin solunulkoista domee-nia, yhdistettynä toiseen aminohapposekvenssiin, joka si-5 sältää aminohappojäännökset, jotka vastaavat ihmisen IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Fuusio-proteiinia tuotetaan suositeltavasti dimeerisessä muodossa. Liukoinen CTLA4lg on T- ja B-lymfosyyttivasteiden vahva inhibiittori in vitro.

10 Keksintö sisältää myös liukoisen CTLA4-proteiinin ja sen hybridifuusioproteiinit, esim. liukoiset hybridi-fuusioproteiinit, kuten CD28/CTLA4lg-fuusioproteiinit. CTLA4-proteiinin solunulkoinen domeeni on esimerkki liukoisesta CTLA4-molekyylistä. Vaihtoehtoisesti molekyyli, 15 joka sisältää CTLA4-proteiinin solunulkoisen domeenin kiinnitettynä peptidihäntään, on toinen esimerkki liukoisesta CTLA4-molekyylistä.

Esimerkkinä liukoisesta hybridifuusioproteiinista esillä oleva keksintö esittää CD28/CTLA4Ig-fuusioproteii-20 nit, joissa on ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka vastaa CD28-proteiinin solunulkoisen domeenin fragmentteja, #. . yhdistettynä toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastaa • · · .1 .* CTLA4Ig-proteiinin solunulkoisen domeenin fragmentteja, ja • · · • f kolmanteen aminohapposekvenssiin, joka vastaa ihmisen • · · *·:·* 25 IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Hybri- • ' difuusioproteiinien eräs suoritustapa on CD28/CTLA4lg-fuu- ..ΙΓ siorakenne, jossa on ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka ··· sisältää aminohappo jäännökset kohdasta noin 1 kohtaan noin 94 siitä aminohapposekvenssistä, joka vastaa CD28-proteii-:*·*: 30 nin solunulkoista domeenia, yhdistettynä toiseen aminohap- posekvenssiin, joka sisältää aminohappojäännökset kohdasta ♦ *· *. noin 94 kohtaan noin 125 siitä aminohapposekvenssistä, ··· •••j joka vastaa CTLA4-proteiinin solunulkoista domeenia, yh- • * *···* distettynä kolmanteen aminohapposekvenssiin, joka sisältää :*·.· 35 aminohappojäännökset, jotka vastaavat ihmisen IgCgammal- • · ··· • · • · ··· proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Muut keksinnön hybridifuusioproteiinien suoritustavat on kuvattu taulu koissa I ja II ja esimerkissä 7.

10

Keksintöön on sisällytetty myös menetelmä T-solu-5 interaktioiden säätelemiseksi muiden solujen kanssa, joka sisältää vaiheen, jossa inhiboidaan CTLA4-positiivisten T-solujen reaktiot B7-positiivisten solujen kanssa antamalla T-solujen reagoida CTLA4-reseptorin ligandien kanssa. Li-gandit sisältävät B7Ig-fuusioproteiinin, monoklonaalisen 10 vasta-aineen, joka reagoi CTLA4-reseptorin kanssa, ja vas-ta-ainefragmentit.

Keksintö esittää myös menetelmän T-solujen interaktioiden säätelemiseksi B7-positiivisten solujen kanssa, joka sisältää vaiheen, jossa käytetään B7-antigeenin li-15 gandia. Sellainen ligandi on liukoinen CTLA4-fuusioprote-iini, esim. keksinnön mukainen CTLA4Ig-fuusioproteiini, sen fragmentit tai johdannaiset, liukoinen CD28/CTLA4-hyb-ridifuusioproteiini, esim. CD28/CTLA4Ig-hybridifuusiopro-teiini, tai B7-antigeenin kanssa reagoiva monoklonaalinen 20 vasta-aine.

Keksintö sisältää edelleen menetelmän sellaisten .·. : immuunisysteemitautien hoitamiseksi, joita välittävät T- • · · .1/ soluinteraktiot B7-positiivisten solujen kanssa, joka si- • · * 1 sältää vaiheen, jossa annetaan ligandia, joka reagoi B7- • · · *···[ 25 antigeenin kanssa, T-soluinteraktoiden säätelemiseksi B7- positiivisten solujen kanssa. Ligandi on CTLA4lg-fuusio- ...: proteiini tai CD28/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi tai B7- • 1« ·...· antigeenin kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-aine.

Liukoisen CTLA4-fuusioproteiinin kanssa reagoiva :T: 30 monoklonaalinen vasta-aine ja liukoisen CD28/CTLA4lg-fuu- sioproteiinin kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-aine ·«· *. on kuvattu soluinteraktioiden säätelemiseksi.

• · · *”1 On myös kuvattu uusi kiinanhamsterin munasarjaso- • · *·;·1 lulinja, joka stabiilista ekspressoi CTLA4Ig-fuusioprote- ! 35 iinia.

• · · · • · • · 11

Lisäksi esillä oleva keksintö esittää menetelmän B7-interaktion blokeeraamiseksi immuunivasteen säätelyä varten. Tämä menetelmä sisältää vaiheen, jossa lymfosyytit saatetaan kosketukseen B7-proteiinia sitovan molekyylin ja 5 IL4-proteiinia sitovan proteiinin kanssa.

Lisäksi esillä oleva keksintö esittää menetelmän immuunivasteen säätelemiseksi, joka sisältää vaiheen, jossa saatetaan B7-positiiviset lymfosyytit kosketukseen B7-proteiinia sitovan molekyylin ja IL4-proteiinia sitovan 10 molekyylin kanssa.

Keksintö esittää myös menetelmän kudossiirteen hyl-jinnän inhiboimiseksi potilaassa, joka on siirretyn kudoksen vastaanottaja. Tämä menetelmä sisältää vaiheen, jossa potilaalle annetaan B7-proteiinia sitovaa molekyyliä ja 15 IL4-proteiinia sitovaa molekyyliä.

Esillä oleva keksintö esittää edelleen menetelmän käänteishyljintätaudin inhiboimiseksi potilaassa, joka sisältää vaiheen, jossa potilaalle annetaan B7-proteiinia sitovaa molekyyliä ja IL4-proteiinia sitovaa molekyyliä. 20 Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on kaavioesitys CTLA4Ig-fuusiorakenteista, . jotka on kuvattu esimerkissä 2, jäljempänä.

• ·♦ .1 .* Kuvio 2 on valokuva geelistä, joka saatiin CTLA4Ig- • « · * * proteiinin kromatografisesta puhdistuksesta SDS-PA6E:ssa, • ♦ ♦ ’···* 25 kuten on kuvattu esimerkissä 2, jäljempänä.

* * Kuvio 3 kuvaa ihmisen CTLA4-reseptoria koodittavan täydellisen aminohapposekvenssin (SEQ ID numerot 13 ja • · · 14), joka on fuusioitu onkostatiini M -signaalipeptidiin (kohta -25 - -1) ja joka sisältää vastatunnistetun N-si- :*·*: 30 doksellisen glykosylaatiokohdan (kohta 109 - 111), kuten ;**'j on kuvattu esimerkissä 3, jäljempänä.

··· *. Kuvio 4 kuvaa FACSH-analyysin tulokset, jossa B7Ig- • · · ***! fuusioproteiini sitoutuu CD28- ja CTLA4-proteiinilla • · '···* transfektoituihin COS-soluihin, kuten on kuvattu esimer- 35 kissa 4, jäljempänä.

• · · • · • · ··· 12

Kuvio 5 kuvaa FACSR-analyysin tulokset, jossa puhdistettu CTLA4lg sitoutuu B7-positiivisiin (B7+) CHO-solui-hin ja lymfoblastoidisoluiinjaan (PM LCL), kuten on kuvattu esimerkissä 4, jäljempänä.

5 Kuvio 6 on graafinen esitys, joka kuvaa 125I-leima- tun B7Ig-proteiinin kilpailusitoutumisanalyysin immobili-soituun CTLA4Ig-proteiiniin, kuten on kuvattu esimerkissä 4, jäljempänä.

Kuvio 7 on graafinen esitys, joka esittää Scatc-10 hard-analyysin 125I-leimatun B7Ig-proteiinin sitoutumisesta immobilisoituun CTLA4Ig-proteiiniin, kuten on kuvattu esimerkissä 4, jäljempänä.

Kuvio 8 on valokuva SDS-PAGE-kromatografiageelistä, jossa tehtiin immunosaostusanalyysi B7-positiivisista CHO-15 soluista ja PM LCL -soluista, jotka oli pintaleimattu 125I-leimalla, kuten on kuvattu esimerkissä 4, jäljempänä.

Kuvio 9 on graafinen esitys, joka kuvaa CTLA4lg-proteiinin vaikutuksia T-solujen lisääntymiseen mitattuna [3H]-tymidiinin inkorporaatiolla, kuten on kuvattu esimer-20 kissä 4, jäljempänä.

Kuvio 10 on graafinen pylväsesitys, joka kuvaa S' . CTLA4lg-proteiinin vaikutuksia auttaja-T-solujen (Th) indu- • · · .* soimaan immunoglobuliinieritykseen ihmisen B-soluista mi- • · · * i tattuna entsyymi-immunotestillä (ELISA), kuten on kuvattu • · · 25 esimerkissä 4, jäljempänä.

* * Kuviot 11A, 11B ja 11C ovat graafisia viivaesityk- ..*·’ siä kuvaten ihmisen haimasaarekkeen ksenograftien eloon- jääntiä.

Kuviot 12A, 12B, 12C ja 12D ovat valokuvia histo-:*·*; 30 patologisista objektilaseista, joissa kuvataan B10-hiirten .**·. murtua iskap se Iin alle siirrostettuja ihmisen haimasaarek- • · · ·. keitä.

• · · •••| Kuvio 13 on graafinen viivaesitys, joka esittää • · haimasaarekegraftin eloonjäännin pidentymistä ihmisen B7- • · • « · ♦ ·· • · ··· * · • · ··· 13 proteiinia vastaan olevalla monoklonaalisella vasta-aineella.

Kuvio 14 on graafinen viivaesitys, joka esittää CTLA4lg-proteiinin aiheuttaman luovuttajaspesifisen pas-5 siivisuuden induktion haimasaarekegraftiantigeeneille.

Kuvio 15 on graafinen viivaesitys, joka esittää sellaisten hiirten vasta-aineseerumin tiitteritasot, joihin on injektoitu lampaan punasoluja (SRBC), monoklonaa-lista vasta-ainetta L6 ja rotan Ig-proteiinia, monoklonaa-10 lista vasta-ainetta L6 ja anti-IL4-vasta-ainetta, CTLA4lg- proteiinia ja rotan Ig-proteiinia, CTLA4Ig-proteiinia ja anti-IL4-vasta-ainetta. X-akseli mittaa vasta-aineseerumin tiitteriä. Y-akseli mittaa aikaa vuorokausina. Musta neliö edustaa hiiriä, joihin injektoitiin SRBC-soluja vuorokau-15 sinä 0 ja 46. Valkea neliö edustaa hiiriä, joihin injektoitiin SRBC-soluja vuorokautena 46. Musta ympyrä edustaa hiiriä, joihin injektoitiin monoklonaalista vasta-ainetta L6 ja rotan immunoglobuliinia. Valkoinen ympyrä edustaa hiiriä, joihin injektoitiin monoklonaalista vasta-ainetta 20 L6 ja anti-lL4-vasta-ainetta. Musta kolmio edustaa hiiriä, johin injektoitiin CTLA4lg-proteiinia ja rotan immunoglo- .·. : buliinia. Valkoinen kolmio edustaa hiiriä, joihin injek- • ·· ;·#·] toitiin CTLA4lg-proteiinia ja anti-IL4-vasta-ainetta.

• · I Kuvio 16 on graafinen viivaesitys, joka esittää • · · ***, 25 sellaisten hiirten vasta-aineseerumin tiitteritasot, joi hin on injektoitu KLH-proteiinia, monoklonaalista vasta- ··· •••Σ ainetta L6 ja rotan Ig-proteiinia, monoklonaalista vasta- ainetta L6 ja anti-IL4-vasta-ainetta, CTLA4Ig-proteiinia ja rotan Ig-proteiinia, CTLA4lg-proteiinia ja anti-IL4- ·«· J ϊ : 30 vasta-ainetta. X-akseli mittaa vasta-aineseerumin tiitte- riä. Y-akseli mittaa aikaa vuorokausina. Musta neliö edus- ··· *.# taa hiiriä, joihin injektoitiin Keyhole limpet -hemosyaa- ♦ niiniä (KLH) vuorokautena 46. Musta ympyrä edustaa hiiriä, • · ·;·* joihin injektoitiin monoklonaalista vasta-ainetta L6 ja • « 35 rotan immunoglobuliinia. Valkoinen ympyrä edustaa hiiriä, ··· • · • · ··· 14 joihin injektoitiin monoklonaalista vasta-ainetta L6 ja anti-IL4-vasta-ainetta. Musta kolmio edustaa hiiriä, johin injektoitiin CTLA4lg-proteiinia ja rotan immunoglobulii-nia. Valkoinen kolmio edustaa hiiriä, joihin injektoitiin 5 CTLA4lg-proteiinia ja anti-IL4-vasta-ainetta.

Kuvio 17 on graafinen esitys, joka esittää CD28- ja CTLA4-ryhmien jäsenten sekvenssien alekkain vertailun. Ihmisen (H), hiiren (M), rotan (R) ja kanan (Ch) CD28-pro-teiinien sekvenssejä on verrattu alekkain ihmisen ja hii-10 ren CTLA4-proteiinin kanssa. Jäännökset on numeroitu kypsän proteiinin N-päästä lähtien niin, että signaalipep-tidit ja membraanien läpi menevät domeenit on alleviivattu ja CDRzlle analogiset alueet on osoitettu. Tummaksi varjostetut alueet korostavat jäännösten täydellistä konser-15 vaatiota, kun taas vaalealla varjostetut alueet korostavat konservoituneita aminohapposubstituutioita kaikissa ryhmän jäsenissä.

Kuvio 18 on graafinen viivaesitys, joka esittää CTLA4lg- ja CD28lg-mutanttien sitoutumisen B7-l-proteii-20 niin.

Kuvio 19 on kaaviokartta CTLA4/CD28lg-hybridifuu- .·. : sioproteiineista. Avoimet alueet edustavat CD28-sekvens- • ·· l·,·[ siä; täytetyt alueet edustavat CTLA4-sekvenssiä; ristivii- • · l voin varjostetut alueet edustavat IgG-proteiinin Fc-alueen • · · **\ 25 alkukohtaa (katso myös taulukko I).

Kuviot 20A/B ovat graafisia viivaesityksiä, jotka osoittavat, että CTLA4/CD28lg-hybridifuusioproteiinit si- • ·· *...· toutuvat korkealla innolla B7-l-CH0-soluihin.

Kuvio 21 on molekulaarinen malli monomeerisestä :T: 30 CTLA4lg-proteiinin variaabelin alueen kaltaisesta solunul- :***: koisesta domeenista.

··· *. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus *·· **** Määritelmä • · *·;·* Tässä patenttihakemuksessa käytettyinä seuraavilla 35 sanoilla tai ilmauksilla on spesifioidut merkitykset.

··· • · • · ··· 15 Tässä käytettynä "B7-interaktion blokeeraus" tarkoittaa sitä, että häiritään B7-antigeenin sitoutumista sen ligandeihin, kuten CD28- ja/tai CTLA4-proteiineihin, näin estäen T-solun ja B-solun interaktion.

5 Tässä käytettynä "B7-proteiinia sitova molekyyli" tarkoittaa mitä tahansa molekyyliä, joka sitoutuu B7-anti-geeniin.

Tässä käytettynä "IL4-proteiiniin sitoutuva molekyyli" tarkoittaa mitä tahansa molekyyliä, joka tunnistaa 10 IL4-proteiinin ja sitoutuu siihen.

Tässä käytettynä "CTLA4-mutantti" tarkoittaa molekyyliä, jossa on aminohappoja, jotka ovat samanlaisia kuin CTLA4-proteiinin solunulkoisen domeenin aminohapposekvenssi niin, että molekyyli tunnistaa B7-antigeenin ja sitou-15 tuu siihen.

Tässä käytettynä "CD28-mutantti" tarkoittaa molekyyliä, jossa on aminohappoja, jotka ovat samanlaisia kuin CD28-proteiinin solunulkoisen domeenin aminohapposekvenssi niin, että molekyyli tunnistaa B7-antigeenin ja sitoutuu 20 siihen.

Tässä käytettynä "CTLA4/CD28-hybridifuusioproteii-. ni" on molekyyli, jossa on ainakin osa sekä CTLA4- että .* CD28-proteiinin solunulkoisista domeeneista niin, että • · · * ;* molekyyli tunnistaa B7-antigeenin ja sitoutuu siihen.

• · f *·:·[ 25 Jotta tässä kuvattu keksintö olisi täydellisemmin * * ymmärrettävissä, on esitetty seuraava kuvaus.

Tämä keksintö koskee T-solujen pinnoilta löytyvän • ·· ihmisen CTLA4-reseptorin, joka sitoutuu aktivoitujen B-solujen ja muuta alkuperää olevien solujen ekspressoimaan :*·*: 30 B7-antigeeniin, eristystä ja ekspressiota ja CTLA4-resep- torigeenin liukoisten fuusioproteiinituotteiden ekspres- ··· *. siota. Keksintö esittää myös menetelmät ekspressoidun • · · CTLA4-reseptorin käyttämiseksi soluinteraktioiden sääte- • · *···* lemisessä, sisältäen T-soluinteraktiot B7-positiivisten :*·.· 35 solujen kanssa.

♦ « ··♦ • · • · 16

Suositeltavassa suoritustavassa kloonataan PCR-me-netelmää käyttäen täydellinen ja oikea DNA-sekvenssi, joka koodittaa aminohapposekvenssiä, joka vastaa ihmisen CTLA4-reseptoriproteiinia. CTLA4-proteiinin täydellisen ennus-5 tetun koodittavan sekvenssin sisältävä cDNA koottiin kahdesta PCR-fragmentista, jotka amplifioitiin H38-RNA:sta, ja ne insertoitiin ekspressiovektoriin CDM8, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti esimerkeissä jäljempänä. Isolaa-tit transfektoitiin COS-soluihin ja ne testattiin niiden 10 sitoutumisen suhteen B7Ig-proteiiniin, joka on liukoinen fuusioproteiini, jossa on aminohapposekvenssi, joka vastaa B7-proteiinin solunulkoista domeenia ja ihmisen immunoglo-buliinin (Ig) Cgammal -aluetta, kuten ovat kuvanneet Lins-ley et ai., J. Exp. Med. 173:721 - 730 (1991).

15 Sitten määritettiin yhden isolaatin DNA-sekvenssi, jolle annettiin nimi 0MCTLA4, ja sen havaittiin vastaavan täydellisesti ennustettua ihmisen CTLA4-sekvenssiä, joka oli fuusioitu N-päästä onkostatiini M -proteiinin signaa-lipeptidiin. CTLA4-reseptoria kooditetaan 187 aminohapon 20 pituisena (poislukien signaalipeptidi ja lopetuskodonit) ja se sisältää vastatunnistetun N-sidoksellisen glykosy- .·. : laatiokohdan aminohappokohdissa 109 - 111 (katso kuvio 3, • ·· ;*(/ jäljempänä). CTLA4-reseptoria ekspressoidaan käyttäen on- • ♦ I kostatiini M -signaalipeptidiä.

• · ♦ • · · ***. 25 Toisessa suosoteltavassa suoritustavassa CTLA4-res- eptorigeenin proteiinituotteen liukoiset muodot (CTLA4Ig) *··· valmistetaan käyttäen fuusioproteiienja, joissa on ensim- ··· mäinen aminohapposekvenssi, joka vastaa CTLA4-proteiinin solunulkoista domeenia ja toinen aminohapposekvenssi, joka ··· ί.ϊ · 30 vastaa ihmisen IgCgammal-domeenia.

Kloonaus- ja ekspressioplasmidit (CDM8 ja tiLN) ra-kennettiin niin, että ne sisälsivät cDNA:t, jotka koodit-tivat osia siitä aminohapposekvenssistä, joka vastaa ihm- • · T isen CTLA4-reseptoria perustuen tässä kuvattuun cDNA-sek- • · \*·· 35 venssiin, jossa cDNA, joka koodittaa ensimmäistä aminohap- • · · • · • · ··· 17 posekvenssiä, joka vastaa CTLA4-reseptorigeenin solunul-kolsen domeenin fragmenttia, on yhdistetty DNA;hän, joka koodittaa toista aminohapposekvenssiä, joka vastaa IgC-aluetta, joka sallii CTLA4-reseptorigeenin ekspressoimisen 5 muuttamalla ekspressoidun CTLA4-proteiinin liukoisuutta.

Näin ollen liukoista CTLA4lg-fuusioproteiinia koodi ttaa ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka sisältää aminohappo jäännökset kohdasta noin 1 kohtaan noin 125 siitä aminohapposekvenssistä, joka vastaa CTLA4-proteiinin so-10 lunulkoista domeenia, yhdistettynä toiseen aminohapposek venssiin, joka sisältää aminohappojäännökset, jotka vastaavat ihmisen IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Fuusioproteiini tuotetaan suositeltavasti dimee-risessä muodossa. Sitten rakenne transfektoitiin COS- tai 15 CHO-soluihin ja CTLA4Ig puhdistettiin ja tunnistettiin dimeerinä.

Tämän keksinnön käytännön sovelluksen mukaisesti CTLA4lg-fuusioproteiini ja CTLA4/CD28-fuusioproteiinihyb- ridi voivat sisältää aminohapposubstituutioita siinä ami- 20 nohapposekvenssissä, joka vastaa CTLA4-proteiinin solunul- koista domeenia niin, että tuotetaan molekyylejä, joissa .·. : CTLA4-proteiinin toiminnallinen ominaisuus on säilynyt, • · · j·.·] nimittäin sellaisia substituutioita sisältäviä molekyyle- • · | l jä, jotka yhä sitoutuvat B7-antigeeniin. Nämä aminohappo- **’, 25 substituutiot sisältävät, mutta eivät välttämättä ole ra joittuneet, aminohapposubstituutiot, jotka alalla tunne- ··· •••ϊ taan "konservoituneina" .

···

Proteiinikemian hyvin tunnettu periaate on esimerkiksi se, että tiettyjä aminohapposubstituutioita, joita J 30 kutsutaan "konservoituneiksi aminohapposubstituutioiksi", :***; voidaan usein tehdä proteiiniin ilman, että muutetaan pro- »·· *. teiinin konformaatiota tai toimintaa. Sellaiset muutokset ··· ’IV. sisältävät isoleusiinin (I), valiinin (V) ja leusiinin (L) • « *;* korvaamisen millä tahansa muulla näistä hydrofobisista • · ·.**: 35 aminohapoista, glutamiinihapon (E) korvaamisen asparagii- ··· • ♦ • · ··· 18 nihapolla (D) ja päinvastoin, asparagiinin (N) korvaamisen glutamiinilla (Q) ja päinvastoin ja treoniinin (T) korvaamisen seriinillä (S) ja päinvastoin. Muita substituutioita voidaan myös pitää konservoituneina riippuen tietyn amino-5 hapon ympäristöstä ja sen roolista proteiinin kolmiulotteisessa rakenteessa. Esimerkiksi glysiini (G) ja alaniini (A) voivat usein olla keskenään vaihdettavissa, kuten voivat myös olla alaniini ja väliini (V).

Metioniini (M), joka on suhteellisen hydrofobinen, 10 voidaan usein vaihtaa leusiiniin ja isoleusiiniin ja joskus valiiniin. Lysiini (K) ja arginiini (R) ovat usein vaihdettavissa keskenään kohdissa, joissa aminohappojäännöksen merkittävä ominaisuus on sen varaus ja jossa näiden kahden aminohappojäännöksen eroavat pK-arvot eivät ole 15 merkittäviä. Vielä muitakin muutoksia voidaan pitää "konservoituina" tietyissä ympäristöissä.

Käyttäen tässä kuvattuja menetelmiä tuotettiin todellisuudessa B7-proteiinia sitovan molekyylin mutantteja. Yksi mutantti sisältää (1) sekvenssin, joka alkaa CD28-20 reseptoriproteiinin aminohaposta kohdassa 1 ja loppuu aminohappoon kohdassa 95, (2) sekvenssin, joka alkaa CTLA4- .·. : proteiinin solunulkoisen domeenin aminohaposta kohdassa 95 • ·· .1/ ja loppuu aminohappoon kohdassa 125, ja (3) sekvenssin, * · • l joka vastaa ihmisen IgCgammal-domeenia.

• · m **:\ 25 Toinen mutantti sisältää (1) sekvenssin, joka alkaa CD28-reseptoriproteiinin aminohaposta kohdassa 1 ja loppuu ·»· aminohappoon kohdassa 95, (2) sekvenssin, joka alkaa ··· *...· CTLA4-proteiinin solunulkoisen domeenin aminohaposta koh dassa 95 ja loppuu aminohappoon kohdassa 120, ja (3) sek-ϊ 30 venssin, joka vastaa ihmisen IgCgammal-domeenia.

Esillä oleva keksintö esittää menetelmän B7-inter- ··· *. aktion blokeeraamiseksi immuunivasteen säätelemiseksi, • · · *·*· joka sisältää vaiheen, jossa saatetaan lymfosyytit koske- ♦ · *”·* tukseen B7-proteiinia sitovan molekyylin ja IL4-proteiinia • ♦ • · · • ♦♦ • · ··· • · • · • · · sitovan molekyylin kanssa. Lymfosyytit voivat olla B7-po- sitiivisia lymfosyyttejä.

19

Lisäksi esillä oleva keksintö esittää menetelmän immuunivasteen säätelemiseksi, joka sisältää vaiheen, jos-5 sa saatetaan B7-positiiviset lymfosyytit kosketukseen B7-proteiinia sitovan ja IL4-proteiinia sitovan molekyylin kanssa.

Immuunivaste voi olla B-soluvaste, joka johtaa vas-ta-ainetuoton inhibitioon. Lisäksi immuunivaste voi olla 10 T-soluvaste, joka johtaa soluvälitteisen immuniteetin inhibitioon. Lisäksi immuunivaste voi olla lymfosyyttien lisääntymisen inhibitio.

Esillä oleva keksintö esittää myös menetelmän ku-dossiirteen hyljinnän inhiboimiseksi potilaassa potilaan 15 ollessa kudossiirteen vastaanottaja. Tämä menetelmä voi sisältää vaiheen, jossa potilaalle annetaan B7-proteiinia sitovaa molekyyliä ja IL4-proteiinia sitovaa molekyyliä.

Keksintö esittää edelleen menetelmän käänteishyl-jintätaudin inhiboimiseksi potilaassa, joka sisältää vai-20 heen, jossa potilaalle annetaan B7-proteiinia sitovaa molekyyliä ja IL4-proteiinia sitovaa molekyyliä.

: Tämän keksinnön käytännön sovelluksen mukaisesti • · · B7-proteiinia sitova molekyyli voi olla CTLA4lg-fuusiopro- • · * teiini. CTLA4lg-fuusioproteiini voi olla esimerkiksi fuu- • · · **\ 25 sioproteiini, jossa on ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka sisältää CTLA4-proteiinin solunulkoista domeenia vas- • f · ···: taavan aminohapposekvenssin aminohappojäännökset kohdasta • · · noin 1 kohtaan noin 125, ja toisen aminohapposekvenssin, joka sisältää aminohappojäännökset, jotka vastaavat ihmi- ··· : 30 sen immunoglobuliini Cgammal -proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita.

• « · B7-proteiinia sitova molekyyli voi vaihtoehtoisesti ’*·* olla liukoinen CD28/CTLA4-hybridifuusioproteiini. CD28/CT- • · **;·* LA4-hybridifuusioproteiini voi olla esimerkiksi hybridi- :/.{ 35 fuusioproteiini, jossa on ensimmäinen aminohapposekvenssi, ··· • ♦ • ♦ ··♦ 20 joka vastaa osaa CD28-reseptorin solunulkoisesta domeenis-ta fuusioituna toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastaa osaa CTLA4-reseptorin solunulkoisesta domeenista ja kolmannen aminohapposekvenssin, joka vastaa ihmisen immuno-5 globuliinl Cgammal -proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alu-eita. Lisäksi IL4-proteiinia sitova molekyyli voi olla mo-noklonaalinen vasta-aine, joka spesifisesti tunnistaa IL4-proteiinin ja sitoutuu siihen. Vaihtoehtoisesti IL4-pro-teiinia sitova molekyyli on liukoinen IL4-reseptori, joka 10 tunnistaa IL4-proteiinin ja sitoutuu siihen (Fanslow et ai., 1991).

CTLA4lg-fuusioproteiinia vastaavaa aminohapposekvenssiä koodittava DNA on talletettu 31.5.1991 kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Mary-15 land Budapestin sopimuksen mukaisin sopimusehdoin, ja sen ATCC-koodinumero on 68 629.

Esillä oleva keksintö esittää CTLA4-transkriptien ensimmäisen proteiinituotteen liukoisen fuusioproteiinin muodossa. CTLA4Ig-proteiini muodostaa disulfidisidoksel-20 lisen dimeerin, jossa on kaksi alayksikköä, joista kummankin Mr on noin 50 000, joka osoittaa, että luonnollinen ; CTLA4 on T-solujen pinnalla luultavasti disulfidisidoksel- • ·· .! .* lisena homodimeerinä.

• · · • · * * B7-antigeenin on osoitettu olevan CD28-reseptorin • · · *···] 25 ligandi T-soluissa (Linsley et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

* * USA, yllä). CTLA4-reseptorimolekyyli tuntuu olevan toimin- 9 ..ΙΓ nallisesti ja rakenteellisesti sukua CD28-reseptorille; ··· molemmat ovat reseptoreita B-solujen aktivaatioantigeenil-le B7, kun taas CTLA4-proteiinilla tuntuu olevan korkeampi 30 affiniteetti B7-proteiinille, joka on korkeimpia tähän ;***; asti julkaistuja lymfoidiadheesiosysteemeissä. CTLA4lg- • · « *. proteiinin osoitettiin kuitenkin sitoutuvan vahvemmin B7- • · · positiivisiin (B7+) solulinjoihin kuin CD28lg-proteiinin.

• · *·;·* Muut kokeet osoittivat, että CTLA4-proteiini on korkeamman :\j 35 affiniteetin sisältävä reseptori B7-antigeenille kuin ··· • 9 9 9 99 9 21 CD28-reseptori. Lisäksi CTLA4lg-proteiinin osoitettiin sitoutuvan yksittäiseen proteiiniin lymfoblastoidisoluis-sa, joka on kooltaan samanlainen kuin B7-antigeeni. CTLA4lg inhiboi T-solujen lisääntymistä ja inhiboi Th-solu-5 jen indusoimaa IgM-proteiinin tuottoa.

Toisessa suositeltavassa suoritustavassa rakennettiin hybridifuusioproteiinit, joissa oli aminohapposekvenssit, jotka vastasivat eri reseptoriproteiinien fragmentteja. Esimerkiksi aminohapposekvenssit, jotka vastasi-10 vat CD28- ja CTLA4-proteiinien solunulkoisten domeenien valittuja fargmentteja, liitettiin muodostamaan liukoiset CD28/CTLA4-hybridi£uusioproteiinit, esim. CD28/CTLA4lg-fuusioproteiini. Tämä proteiini saatiin niin, että siinä oli ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka sisälsi amino-15 happojäännökset, jotka vastasivat CD28-proteiinin solunul-koisen domeenin fragmenttia, liitettynä toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastasi CTLA4lg-proteiinin solunulkoi-sen domeenin fragmenttia, ja kolmanteen aminohapposekvenssiin, joka vastasi ihmisen IgCgammal-proteiinin sarana-, 20 CH2- ja CH3-alueita.

Eräs hybridifuusioproteiinien suoritustapa on .·. : CD28/CTLA4lg-fuusiorakenne, jossa on ensimmäinen aminohap- • · · posekvenssi, joka sisältää CD28-proteiinin solunulkoista # · ! domeenia vastaavan aminohapposekvenssin aminohappojäännök- ***. 25 set kohdasta noin 1 kohtaan noin 94, yhdistettynä toiseen aminohapposekvenssiin, joka sisältää CTLA4-proteiinin so- • · · ♦·.: lunulkoista domeenia vastaavan aminohapposekvenssin amino- ··» ·...· happojäännökset kohdasta noin 94 kohtaan noin 125, yhdis tettynä kolmanteen aminohapposekvenssiin, joka vastaa ih-: : : 30 misen IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita.

Menetelmät niiden DNA-sekvenssien kloonaamiseksi ja ··· \ ekspressoimiseksi, jotka koodittavat CTLA4-reseptoripro- teiinia, liukoisia fuusioproteiineja ja hybridifuusiopro- • · '*;·* teiineja vastaavia aminohapposekvenssejä, esim. oligonuk- • · !/·· 35 leotidien synteesi, PCR, solujen transformaatio, vektorei- • · · • · • · • · · 22 den rakennus, ekspressiosysteemit ja niiden kaltaiset menetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja ja useimmat tutkijat tuntevat spesifisten olosuhteiden ja menetelmien standar-dilähtömateriaalit. Seuraavat kappaleet on kuitenkin an-5 nettu mukavuussyistä ja niissä on huomautettu tarpeen mukaan modifikaatioista ja ne voivat toimia ohjenuorana.

Reseptorien ja fuusioproteiinien koodittavien sekvenssien kloonaus ja ekspressio

Fuusioproteiinirakenteet esillä olevan keksinnön 10 CTLA4lg-proteiinin karakterisoimiseksi ja CD28/CTLA4-hyb-ridifuusioproteiinien valmistamiseksi, jotka vastaavat CD28lgCgammal- ja B7IgCgammal-rakenteita, valmistettiin, kuten ovat kuvanneet Linsley et ai., J. Exp. Med. 173:721 - 730 (1991), joka on liitetty tähän viitteeksi. 15 Vaihtoehtoisesti cDNA-kloonit voidaan valmistaa standardi-menetelmiä käyttäen RNAista, joka saadaan soluista, jotka ekspressoivat B7-antigeenia ja CD28-reseptoria, perustuen näiden proteiinien julkaistuihin sekvenssitietoihin (Aruffo ja Seed, ja Freeman, yllä).

20 CTLA4lg-fuusiot, jotka sisälsivät DNA:n, joka koo- ditti aminohapposekvenssejä, jotka vastasivat CTLA4-prote- j iinin solunulkoista domeenia ja ihmisen IgCgammal-proteii- • · · .1 / nin sarana-, CH2- ja CH3-alueita, rakennettiin ligoimalla • · * I PCR-fragmentit. Aminohapposekvenssejä koodittava cDNA am- • · · 25 plifioidaan käyttäen polymeraasiketjureaktiomenetelmää ("PCR" ) [US-patentit nrot 4 683 195 ja 4 683 202, Mullis et ai. ja Mullis & Faloona, Methods Enzymol. 154:335 - 350 ··· (1987)]. Saatiin sellaiset CTLA4lg-fuusiopolypeptidit, joiden DNA-sekvenssi kooditti aminohapposekvenssejä, jotka :T: 30 sisälsivät aminohappojäännökset kohdasta noin 1 kohtaan noin 125 CTLA4-proteiinin solunulkoisen domeenin aminohap- ··· posekvenssistä ja aminohapposekvenssejä, jotka vastasivat IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita.

• · *·;·* Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ekspressiota ihmi- 35 sen lymfoidisoluissa ei ole aiemmin julkaistu, oli tarpeen • · · • · • · • · · 23 paikantaa CTLA4-mRNA-lähde. PCR-cDNA, joka valmistettiin useiden ihmisen leukemiasolulinjojen solujen kokonais-RNArsta, seulottiin käyttäen alukkeina oligonukleotideja, jotka olivat peräisin julkaistusta CTLA4-geenin sekvens-5 sistä (Dariavach et ai., yllä). Testatuista cDNA:sta H38-solut (HTLV II -viruksen sisältävä leukemialinja) antoivat sellaisten PCR-tuotteiden parhaan saannon, joilla oli odotettu koko. Koska CTLA4-proteiinin signaalipeptidiä ei tunnistettu CTLA4-geenissä, CTLA4-proteiinin ennustetun 10 sekvenssin N-pää fuusioitiin onkostatiini M -signaalipep-tidiin [Malik et ai., Molec. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989)] kahdessa vaiheessa käyttäen oligonukleotideja, jotka on kuvattu esimerkeissä, jäljempänä. PCR-reaktiotuo-te ligoitiin sellaisen cDNA:n kanssa, joka kooditti amino-15 happosekvenssejä, jotka vastasivat Ig Cgammal -proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita, ekspressiovektoriin, kuten CDM8 tai ltLN.

Täyspitkää ihmisen CTLA4-proteiinia koodittavan DNA:n saamiseksi CTLA4-proteiinin membraanin läpi meneviä 20 ja sytoplasmisia domeeneja koodittava cDNA saatiin PCR- reaktiolla H38-soluista ja se yhdistettiin CTLA4Ig-frag- .·. : mentin kanssa, joka saatiin kuten yllä on kuvattu, joka • ·« ;·,·! kooditti onkostatiini M -signaalipeptidiä fuusioituna • · ] J CTLA4-proteiinin N-päähän, käyttäen sellaisia oligonukleo- • · · **'. 25 tidialukkeita, kuten on kuvattu esimerkeissä, jäljempänä.

PCR-fragmentit ligoitiin plasmidiin CDM8, joka johti sei- ··· •••j laisen ekspressioplasmidin syntyyn, joka kooditti täyspit- *·..* kää CTLA4-geeniä, ja sille annettiin nimi 0MCTLA4.

Sellaisen DNA:n, joka kooditti hybridifuusioprote- ··· : 30 iineja vastaavaa aminohapposekvenssiä, yhden reseptorigee- :1: nin solunulkoisen domeenin osia vastaavia aminohappoja • · · koodittava DNA liitettiin DNA:hän, joka kooditti toisen reseptorigeenin solunulkoisen domeenin osia vastaavia ami- • · 'Γ* nohappoja, ja sellaiseen DNA:hän, joka kooditti ihmisen • · :.*·· 35 IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaa- ··· • · • · • · · 24 via aminohapposekvenssejä käyttäen sellaisia menetelmiä, jotka on kuvattu yllä B7Ig-, CD28lg- ja CTLA4lg-rakentei-den rakentamiseksi. Näin ollen esimerkiksi DNA, joka koo-ditti CD28-reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappo-5 sekvenssin aminohappojäännöksiä kohdasta noin 1 kohtaan noin 94 liitetään DNA:hän, joka koodittaa CTLA4-reseptorin solunulkoisen domeenin aminohapposekvenssin aminohappo-jäännöksiä kohdasta noin 94 kohtaan noin 125 ja DNA:hän, joka koodittaa ihmisen IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2-10 ja CH3-alueita vastaavia aminohapposekvenssejä.

Kloonatun DNA:n suurten määrien tuottamiseksi vektorit, jotka sisältävät keksinnön mukaisia fuusiorakentei-ta, transformoidaan sopiviin isäntäsoluihin, kuten baktee-risolukantaan E. coli MC1061/p3 (Invitrogen Corp., San 15 Diego, CA), käyttäen standardimenetelmiä ja pesäkkeet seulotaan sopivien plasmidien länäolon suhteen.

Yllä kuvatulla tavalla saadut kloonit, jotka sisältävät fuusiorakenteita koodittavan DNA:n, transfektoidaan sitten sopiviin isäntäsoluihin ekspressiota varten. Riip-20 puen käytetystä isäntäsolusta, transfektio suoritetaan käyttäen standardimenetelmiä, jotka ovat sopivia sellai- .*. : sille soluille. Transfektio nisäkässoluihin saadaan esi- • ·« merkiksi aikaan käyttäen DEAE-dekstraani-välitteistä • · [ lm transfektiota, CaP04-transfektiota, kopresipitaatiota, li- • · · '**. 25 pofektiota, elektroporaatiota tai protoplastifuusiota ja . muita alalla tunnettuja menetelmiä sisältäen: lysotsyymi- ·· · •••j fuusion tai erytrosyyttifuusion, solujen vahingoittamisen • · *···* mekaanisesti, suoran sisäänoton, osmoottisen tai sakkaroo- sisokin, suoran mikroinjektion, epäsuoran mikroinjektion, • · · :.; : 30 kuten erytrosyyttivälitteisillä menetelmillä, ja/tai ai- • · · : : tistamalla isäntäsolut sähkövirroille. Yllä olevaa luet- • · · teloa transfektiomenetelmistä ei tule pitää täydellisenä, 'VA' koska muita menetelmiä geneettisen informaation viemiseksi • · soluihin tullaan epäilemättä kehittämään.

• · • · · • · · • · 1 • · • · • · · 25

Ekspressio eukaryoottisissa isäntäsoluviljelmissä, jotka ovat peräisin monisoluisista organismeista, on suositeltavaa [Tissue Cultures, Academic Press, Cruz ja Patterson, toim., (1973)]. Näillä systeemeillä on se lisäetu, 5 että ne kykenevät silmukoimaan intronit pois ja näin ollen niitä voidaan käyttää suoraan genomisten fragmenttien eks-pressoimiseksi. Käyttökelpoiset isäntäsolulinjat sisältävät kiinanhamsterin munasarjan (CHO), apinan munuais-(COS), VERO- ja HeLa-solut. Esillä olevassa keksinnössä 10 suositaan solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti fuusiorakenteita.

Ekspressiovektorit sellaisia soluja varten sisältävät tavallisesti promoottori- ja säätelysekvenssit, jotka ovat yhteensopivia nisäkässolujen kanssa, kuten esimer-15 kiksi CMV-promoottorin (CDM8-vektori) ja linnun sarkooma-viruksen promoottorin (ASV)(uLN-vektori). Muut yleisesti käytetyt aikaiset ja myöhäiset promoottorit sisältävät Simian virus 40: n (SV40)[Fiers et ai., Nature 273:113 (1973)] ja muut viruspromoottorit, kuten ne, jotka ovat 20 peräisin polyomaviruksesta, adenovirus 2 -viruksesta ja naudan papilloomaviruksesta. Säädeltävää promoottoria .·. : hMTII [Karin et ai., Nature 299:797 - 802 (1982)] voidaan • ·· ' myös käyttää. Yleiset näkökohdat nisäkäsisäntäsolusystee- • · I mien transformaatioista on kuvannut Axel (US-patentti nro • · · ***. 25 4 399 216, joka on julkaistu 16.8.1983). Nyt on ilmeistä, että "tehostaja-alueet" ovat tärkeitä ekspression optimoi- • · · •••i miseksi; nämä ovat yleisesti sekvenssejä, joita löydetään • ·· *...1 2 promoottorialueen ylä- tai alavirrasta ei-koodittavilta DNA-alueilta. Replikaatio-origot voidaan saada, jos on • · · ϊ,ί · 30 tarpeen, viruslähteistä. Integroituminen kromosomiin on : kuitenkin yleinen mekanismi eukaryooteissa DNA-replikaati- ota varten.

'!!! Vaikka suositeltavat isäntäsolut fuusiorakenteiden * · 11 ekspressoimiseksi sisältävät eukaryoottiset solut, kuten • · :.1·· 35 COS- ja CHO-solut, muita eukaryoottisia mikrobeja voidaan • ·· • · • · 2 a 26 käyttää isäntinä. Saccharomyces cerevisiae -hiivan, lei-pomohiivan, laboratoriokannat ovat yleisimmin käytettyjä, vaikka muitakin kantoja, kuten Schizosaccharomyces pompe -kantoja, voidaan käyttää. Vektoreita, joissa on esimer-5 kiksi 2p-replikaatio-origo, Broach, Meth. Enz. 101:307 (1983), tai muita hiivan kanssa yhteensopivia replikaatio-origoja [esimerkiksi Stinchcomb et ai., Nature 282:39 (1979); Tschempe et ai., Gene 10:157 (1980); ja Clarke et ai., Meth. Enz. 101:300 (1983)] voidaan käyttää. Hiivavek-10 toreiden säätelysekvenssit sisältävät promoottorit glyko-lyyttisten entsyymien synteesiä varten [Hess et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland et ai., Biochemistry 17:4 900 (1978)]. Alalla tunnetut muut promoottorit sisältävät CMV-promoottorin, jonka plasmidi CDM8 sisältää 15 [Toyama ja Okayama, FEBS 268:217 - 221 (1990)]; 3-fosfo-glyseraattikinaasipromoottorin [Hitzemann et ai., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)] ja muiden glykolyyttisten entsyymien promoottorit. Muut promoottorit, joilla on sellainen lisäetu, että niistä transkriptiota säädellään kasvatus-20 olosuhteilla, ovat alkoholidehydrogenaasi 2 -promoottori, isosytokromi C -promoottori, happaman fosfataasientsyymin .*. : promoottori, typpimetaboliaan liittyvien degradaatioent- • · syymien promoottorit ja maltoosin ja galaktoosin käytöstä • · [ 1' vastaavien entsyymien promoottorit. Uskotaan myös, että • · · ***. 25 terminaatiosekvenssit ovat toivottavia koodittavien sek- ’ .* venssien 3'-päässä. Sellaisia terminaattoreita löydetään ··· •••j hiivasta peräisin olevien geenien 3'-pään transloimatto- *...* malta alueelta, joka seuraa koodittavia sekvenssejä.

Vaihtoehtoisesti prokaryoottisia soluja voidaan ··· V : 30 käyttää isäntinä ekspressiossa. Useimmiten prokaryootti on E. coli -bakteerin jokin kanta; kuitenkin muitakin mikro-I;. bikantoja voidaan käyttää. Yleisesti käytetyt prokaryoot- tiset säätelysekvenssit, joiden on tässä määritelty sisäl- • · T tävän promoottorit transkription aloitukseen, vaihtoehtoi- • · ·.’·· 35 sesti operaattorin kanssa, yhdessä ribosomin sitoutumis- ··· • · • · ·· · 27 kohdan sekvenssien kanssa, sisältävät sellaiset yleisesti käytetyt promoottorit, kuten beeta-laktamaasi- (penisilli-naasi) ja laktoosipromoottorisysteemit (lac)[Chang et ai., Nature 198:1 056 (1977)], tryptofaanipromoottorisysteemin 5 (trp)[Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)] ja lambda-bakteriofaagista peräisin olevan PL-promoottorin ja N-geenin ribosomin sitoutumiskohdan [Shimatake et ai., Nature 292:128 (1981)].

CD28lg- ja CTLA4lg-proteiineja ja fuusiohybridipro-10 teiineja, kuten CD28/CTLA4lg-proteiinia, koodittavia nuk-leotidisekvenssejä voidaan ekspressoida eri systeemeissä, kuten alla on kuvattu. cDNA voidaan katkaista sopivilla restriktioentsyymeillä ja ligoida sopiviin prokaryootti-siin tai eukaryoottisiin ekspressiovektoreihin sellaista 15 ekspressiota varten. Koska CD28- ja CTLA4-reseptoripro-teiinit ovat luonnossa dimeereinä uskotaan, että näiden proteiinien onnistunut ekspressio vaatii sellaisen eks-pressiosysteemin, joka sallii näiden proteiinien muodostavan dimeerin. Näiden proteiinien lyhennetyt muodot (se 20 tarkoittaa sellaiset, jotka on muodostettu lisäämällä lo-petuskodoni sekvenssin kohtaan, joka on ylävirtaan pro- .·. : teiinin membraanin läpi menevästä alueesta) eivät tunnu • ·· • · :v. ekspressoituvan. CD28- ja CTLA4-reseptorien ekspressio • · | l fuusioproteiineiha sallii näiden proteiinien dimeerin muo- • · · **'. 25 dostumisen. Näin ollen CTLA4-proteiinin ekspressio fuusio- tuotteena on suositeltavaa esillä olevassa keksinnössä.

«*« ···] Keksinnön mukainen CHO-solulinja, jolle on annettu nimi kiinanhamsterin munasarjasolulinja CTLA4Ig-24, on suositeltava CTLA4Ig-proteiinin ekspressoimiseksi ja se on • · · ί.ί · 30 talletettu Budapestin sopimuksen sopimusehtojen mukaisesti :***: ATCC-kokoelmaan 31.5.1991, ja sen ATCC-koodinumero on ··· *·* 10 762.

Keksinnön mukaisen CTLA4-reseptorin ekspressio suo- • · ’V ritetaan transfektoimalla solulinja, kuten COS-solut, ja • · 35 tunnistamalla ekspressio sitomalla CTLA4-transfektoidut ··· • · • · ··· solut CTLA4-reseptorin ligandiin, esimerkiksi testaamalla solujen sitoutuminen B7Ig-fuusioproteiiniin.

28

Tuloksena syntyneiden rakenteiden sekvenssit varmistetaan DNA-sekvensoinilla käyttäen tunnettuja menetel-5 miä, esimerkiksi sellaisia, jotka ovat kuvanneet Sanger et ai., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 74:5 463 (1977), ja edelleen kuvanneet Messing et ai., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981), tai menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Maxam et ai., Methods Enzymol. 65:499 (1980).

10 Proteiinituotteiden talteenotto

Kuten yllä on huomautettu, CD28- ja CTLA4-resepto-rigeenit eivät helposti ole ekspressoitavissa kypsiksi proteiineiksi käyttäen lyhennettyjä proteiineja koodattavan DNA:n suoraa ekspressointia. Homodiraeerin muodostuk-15 sen sallimiseksi DNA, joka koodittaa CD28- ja CTLA4-pro-teiinien solunulkoisia domeeneja vastaavaa aminohapposekvenssiä sisältäen kodonit signaalisekvenssiä varten, kuten onkostatiini M -signaalisekvenssi soluissa, jotka kykenevät sopivaan prosessointiin, fuusioidaan sellaisen DNA:n 20 kanssa, joka koodittaa aminohapposekvenssiä, joka vastaa luonnollisesti dimeerisen proteiinin Fc-domeenia. Solusta .·. : erittymisen jälkeen näiden fuusioproteiinituotteiden puh- *· ** ;·.·] distusta tehostetaan käyttämällä vasta-aineita, jotka rea- • · [ goivat fuusioproteiinien anti-immunoglobuliiniosan kanssa.

• · · ***. 25 Kun fuusioproteiinituote on eritetty alustaan, se otetaan talteen käyttäen standardeja proteiinipuhdistusmenetelmiä, •••j esimerkiksi käyttämällä proteiini A -pylväitä.

Käyttö CTLA4lg-fuusioproteiinia ja/tai sen fragmentteja ··· V * 30 voidaan käyttää reagoimaan B7-positiivisten solujen, kuten B-solujen, kanssa niiden immuunivasteiden säätelemiseksi, joita T-soluinteraktiot B7-antigeenipositiivisten solujen 'IV.' kanssa välittävät, tai in vitro leukosyyttityypitykseen B- * · *!* solujen kypsyysasteiden määritykseen ja/tai B-soluun asso- ♦ · 35 sioituneiden tautien määritykseen [Yokochi et ai., J. Im- ··· • » • · • · · 29 munol. 128(2):823]. Leukosyyttien pinnan immunovärjäys suoritetaan immunofluoresenssimenetelmällä tai immunoent-symaattisilla menetelmillä, mutta muut tunnistuskeinot ovat mahdollisia.

5 Liukoisia CTLA4-proteiineja ja CTLA4/CD28-hybridi- fuusioproteiineja ja/tai näiden proteiinien fragmentteja ja johdannaisia voidaan myös käyttää reagoimaan B7-posi-tiivisten solujen, sisältäen B-solut, kanssa niiden immuunivasteiden säätelemiseksi, joita T-soluista riippuvaiset 10 B-soluvasteet välittävät. Tässä käytettynä termi "fragmentti" tarkoittaa osaa sellaisesta aminohapposekvenssistä, joka koodittaa proteiinia, joka tunnetaan nimellä "CTLA4". Liukoisen CTLA4-proteiinin fragmentti, jota voidaan käyttää, on sellainen polypeptidi, jolla on aminohap-15 posekvenssi, joka vastaa jotain osaa siitä aminohapposekvenssistä, joka vastaa sitä CTLA4-reseptoria, jota käytettiin tässä kuvatun liukoisen CTLA4-proteiinin saamiseksi.

Aktivoiduissa B-soluissa ja muuta alkuperää olevissa soluissa ekspressoitunut B7-antigeeni ja T-soluissa 20 ekspressoitunut CD28-reseptori voivat suoraan sitoutua toisiinsa ja tämä interaktio voi välittää solu-solu-inter- : aktion. Sellaiset interaktiot laukaisevat suoraan CD28- • ·· • · aktivaatioreitin T-soluissa, joka johtaa sytokiinin tuot- • · [ toon, T-solujen lisääntymiseen ja B-solujen erilaistumi- • · · ***. 25 seen immunoglobuliinia tuottaviksi soluiksi. Tapahtuva B- . solujen aktivaatio voi aiheuttaa kohonneen B7-antigeenin ··· •;*j ekspression ja edelleen kohonneen CD28-proteiinin stimu- • · *···' laation, joka johtaa krooniseen tulehdustilaan, kuten au toimmuuni tauteihin, allograftin hyljintään, käänteishyl- ··· V * 30 jintätautiin tai kroonisiin allergiareaktioihin. Tämän ··· ί.,.ί reaktion blokeeraus tai inhibointi voi olla tehokas estä- ,j. mään T-solujen sytokiinin tuottoa ja näin estämään tai peruuttamaan tulehdusreaktiot.

• · *1* Liukoisen CTLA4-proteiinin, esim. CTLA4lg-proteii- • · 35 nin, on tässä osoitettu olevan sellaisten lymfosyyttitoi- • ·· • · • · • · · 30 mintojen vahva inhibiittori in vitro, jotka tarvitsevat T-ja B-soluinteraktion. Tämä osoittaa niiden interaktioiden tärkeyden, jotka tapahtuvat B7-antigeenin ja sen vasta-reseptorien CTLA4 ja/tai CD28 kesken. Jyrsijän ja ihmisen 5 CTLA4-proteiinin sytoplasmiset domeenit ovat samankaltai sia (Dariavach et ai., yllä, 1988), joka antaa ehdottaa, että tällä alueella on tärkeitä toiminnallisia ominaisuuksia. CD28- ja CTLA4-proteiinien sytoplasmiset domeenit ovat myös keskenään homologisia.

10 CTLA4 on vahvempi lymfosyyttivasteiden in vitro inhibiittori kuin monoklonaaliset anti-BBl- tai anti-CD28-vasta-aineet. CTLA4lg-proteiinilla ei ole suoria stimula-torisia vaikutuksia T-solujen lisääntymiseen sen inhibi-toristen vaikutusten kumoamiseksi. Näin ollen CTLA4lg-fuu-15 sioproteiinia voidaan pitää parempana inhibiittorina in vivo kuin monoklonaalisia anti-CD28-vasta-aineita. CTLA4Ig-proteiinin immunosuppressiiviset vaikutukset in vitro antavat ehdottaa, että sitä voitaisiin käyttää terapiassa hoidettaessa autoimmuunitauteja, jotka sisältävät 20 epänormaalin T-soluaktivaation tai Ig-proteiinin tuoton.

CTLA4lg-fuusioproteiinin odotetaan sisältävän inhi- ;*.J bitorisia ominaisuuksia in vivo. Näin ollen odotetaan, • · että CTLA4Ig-proteiini toimii inhiboiden T-soluja samoilla .vaikutustavoilla kuin millä havaitaan anti-CD28-vasta-ai-• · · 25 neiden toimivan samoissa olosuhteissa in vivo. Olosuhteis- • · . sa, joissa T-solu/B-soluinteraktiot tapahtuvat T-solujen «·· ·*” ja B-solujen kosketuksen tuloksena, lisätyn CTLA4lg-pro- • · *···’ teiinin sitoutuminen B7-antigeenipositiivisiin soluihin, esim. B-soluihin, voi häiritä, se tarkoittaa inhiboida, T- ··· : 30 solu/B-soluinteraktioita, joka johtaa immuunivasteiden ··· säätelyyn. Johtuen tästä yksinomaan inhibitorisesta vai- kutuksesta CTLA4Ig-proteiinin odotetaan olevan käyttökel- .···. poinen T-soluaktivaation in vivo inhibiittorina niin, että • · se on parempi kuin epäspesifiset inhibiittorit, kuten syk- • « 35 losporiini ja glukosteroidit.

• · • · ·♦· 31

Eräässä suoritustavassa CTLA4lg-fuusioproteiini tai CTLA4/CD28Ig-hybridiproteiinit voidaan antaa sopivassa farmaseuttisessa kantajassa in vivo, se tarkoittaa, että ne voidaan antaa ihmispotilaalle hoidettaessa sellaisia 5 patologisia tiloja, kuten immuunisysteemitauteja tai syöpää.

Fuusioproteiinin antamisen in vivo odotetaan johtavan T-solujen interaktioiden häiriintymiseen muiden solujen kanssa, kuten B-solujen, joka johtuu ligandin sitou-10 tumisesta B7-positiivisiin soluihin. Normaalien T-soluin-teraktioiden estäminen voi johtaa alentuneeseen T-soluak-tiivisuuteen, esimerkiksi alentuneeseen T-solujen lisääntymiseen. Lisäksi fuusioproteiinin annon in vivo odotetaan johtavan sytokiinien sisältäen, mutta ei rajoittuen, in-15 terleukiinit, esim. interleukiini-2-proteiinin ("IL-2"), IL-2-, IL-4-, IL-6-, IL-8-proteiinien, kasvutekijöiden sisältäen kasvaimen kasvutekijän ("TGF"), pesäkekasvua stimuloivan kasvutekijän ("CSF”), interferonit ("IFN:t") ja kasvaimen nekroositekijän ("THF"), in vivo tasojen sää-20 telyyn haluttujen vaikutusten edistämiseksi potilaassa.

Esimerkiksi, kun fuusioproteiinia annetaan in vivo, se voi blokeerata sellaisten sytokiinien tuoton, jotka ottavat • · :·.·. osaa pahanlaatuiseen kasvuun, esimerkiksi kasvainsolujen . .·. kasvuun. Fuusioproteiini voi myös blokeerata T-solujen • · · 25 aktivaatiosta riippuvaisten virusten lisääntymisen, kuten • · . HTLV1-viruksen, joka aiheuttaa AIDS:n.

··· •••j Joissain tapauksissa, kuten yllä on huomautettu, • · ’···* CTLA4lg-fuusioproteiinin tai sen fragmenttien in vivo an non vaikutus on inhibitorinen, joka johtuu siitä, että ··· V · 30 fuusioproteiini blokeeraa CTLA4- ja CD28-proteiinien tuo- »·· ton aloituksen, joka aiheutuu T-solu/B-solukosketuksesta. .:. CTLA4Ig-proteiini voi esimerkiksi blokeerata T-solun li-

MM

.···. sääntymisen. CTLA4lg-fuusioproteiinin anto in vivo voi • · " *·* näin ollen tuottaa vaikutukset sekä T- että B-soluvälit- • · • · · *. *: 35 teisiin immuunivasteisiin. Fuusioproteiinia voidaan myös ··· • · • · ··· antaa potilaalle yhdessä sytokiinien tai muiden terapeut tisten aineiden kanssa.

32

Keksinnön lisäsuoritustavassa käytetään T-soluin-teraktioiden säätelemiseksi muita reagensseja sisältäen 5 sellaiset johdannaiset, jotka reagoivat CTLA4ig-fuusiopro-teiinin tai CTLA4-reseptorin kanssa. Esimerkiksi CTLA4-reseptorin kanssa reagoivia vasta-aineita ja/tai vasta-ainefragmentteja voidaan seuloa sellaisten tunnistamiseksi, jotka kykenevät inhiboimaan CTLA4lg-fuusioproteiinin 10 sitoutumisen B7-antigeeniin. Vasta-aineita tai vasta-aine-fragmentteja, kuten Fab- tai F(ab' )2-fragmentteja, voidaan sitten käyttää reagoimaan T-solujen kanssa esimerkiksi Ts-olujen lisääntymisen inhiboimiseksi.

CTLA4-reseptorin kanssa reagoivat monoklonaaliset 15 vasta-aineet soluinteraktioiden säätelemiseksi voidaan tuottaa hybridoomilla, jotka valmistetaan tunnetuilla menetelmillä, kuten niillä, jotka ovat kuvanneet Kohler ja Milstein [Kohler ja Milstein, Nature 256:495 - 97 (1975)], ja niiden modifikaatioilla.

20 Nämä menetelmät sisältävät sellaisen eläimen käy tön, joka on immunisoitu tuottamaan tiettyä vasta-ainetta. Eläin voidaan immunisoida injektoimalla immunogeeniä • · ;·.·. (esim. B7Ig-fuusioproteiinia, CTLA4lg-fuusioproteiinia tai • · . CD28/CTLA4lg-hybridifuusioproteiinia tai niiden muita toi- • · · ***. 25 minnallisia liukoisia muotoja) niin, että herätetään ha- ····· .* luttu immuunivaste, se tarkoittaa vasta-aineiden tuotto, ··· ♦··* immunisoidussa eläimessä. Immunisoitu eläin on myös sei- • · *··.' lainen, jolla tauti ilmenee. Immunisoitujen sairaiden eläinten imusolmukkeista, pernoista tai perifeerisestä

f M

V · 30 verestä saatuja lymfosyyttejä voidaan käyttää tietyn vas- ta-aineen hakemiseksi. Haluttuja immunoglobuliineja koo-dittavat lymfosyyttikromosomit tehdään kuolemattomiksi fuusioimalla lymfosyytit myeloomasolujen kanssa yleensä • « fuusioivan aineen, kuten polyetyleeniglykolin (PEG), läsnä • · ·.*·· 35 ollessa. Mitä tahansa useista myeloomasolulinjoista voi- ··· • · • · • · · 33 daan käyttää fuusiokumppanina standardien menetelmien mukaisesti; esimerkiksi P3-NSl/l-Ag4-l-, P3-x63-Ag8.653-, Sp2/0-Agl4-tai HLl-653-myeloomasolulinjoja. Nämä myeloo-masolulinjat ovat saatavissa ATCC-kokoelmasta, Rockville, 5 Maryland.

Tuloksena syntyneitä soluja, jotka sisältävät halutut hybridoomat, kasvatetaan sitten selektiivisessä alustassa, kuten HAT-alustassa, jossa fuusioitumattomat mye-looma- tai lymfosyyttiemosolut lopulta kuolevat. Ainoas-10 taan hybridoomasolut jäävät eloon ja niitä voidaan kasvattaa rajoittavan laimennuksen olosuhteissa niin, että saadaan erilliset kloonit. Hybridoomien supernatantit seulotaan halutun spesifisyyden läsnäolon suhteen esim. immuuni testimenetelmillä käyttäen sitä CTLA4lg-proteiinia, jota 15 käytettiin immunisoimiseen. Sitten positiiviset kloonit voidaan jatkokloonata rajoittavan laimennuksen olosuhteissa ja tuotettu monoklonaalinen vasta-aine voidaan eristää.

Monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseksi ja puhdistamiseksi voidaan käyttää erilaisia tavanomaisia 20 menetelmiä niin, että ne saadaan vapaina muista proteiineista ja kontaminanteista. Yleisesti käytetyt menetelmät .*. : monoklonaalisten vasta-aineiden puhdistamiseksi sisältävät ammoniumsulfaattisaostuksen, ioninvaihtokromatografian ja • · ]eI# affiniteettikromatografian [Zola et ai., Monoclonal Hybr- • ♦ · ***. 25 idoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell * .* (toim.), sivut 51 - 52 (CRC Press, 1982)]. Näiden menetel- ·♦· *··· mien mukaan tuotettuja hybridoomia voidaan lisätä in vitro • · *·..* tai in vivo (askitesnesteessä) käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä [Fink et ai.. Prog. Clin. Pathol. 9:121 - 33 V · 30 (1984), kuvio 6-1 sivulla 123].

:*!*: Yleisesti, yksittäistä solulinjaa voidaan lisätä iji vitro esimerkiksi laboratorioviljelyastioissa ja viljely-alusta, joka sisältää korkeat konsentraatiot yksittäistä • · Ί* spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan kerätä • · • · · • · ♦ • * ··· ♦ · • « ··· 34 dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla vilje-lyalusta.

Lisäksi voidaan tuottaa näiden vasta-aineiden fragmentit, jotka sisältävät aktiiviset sitomisalueet, jotka 5 reagoivat CTLA4-reseptorin solunulkoisen domeenin kanssa, kuten Fab-, F(ab’)2“ ja Fv-fragmentit. Sellaiset fragmentit voidaan tuottaa käyttäen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä [esim. Rousseaux et ai., Methods Enzymol. 121:663 -69, Academic Press (1986)].

10 Yllä kuvatulla tavalla valmistettuja monoklonaali- sia anti-B7-vasta-aineita voidaan käyttää sitoutumaan B7-antigeeniin niin, että inhiboidaan CD28- tai CTLA4-posi-tiivisten T-solujen interaktiot B7-positiivisten solujen kanssa. Monoklonaalisia anti-CTLA4-vasta-aineita voidaan 15 käyttää sitoutumaan CTLA4-reseptoriin niin, että inhiboidaan CTLA4-positiivisten T-solujen interaktiot muiden solujen kanssa.

Toisen suoritustavan mukaisesti CTLA4lg-fuusiopro-teiinia voidaan käyttää tunnistamaan sellaiset lisäyhdis-20 teet, jotka kykenevät säätelemään interaktiota CTLA4-pro-teiinin ja B7-antigeenin välillä. Sellaiset yhdisteet voi-.·. : vat sisältää pienet luonnollisesti esiintyvät molekyylit, joita voidaan käyttää reagoimaan B- ja/tai T-solujen kans- • · l sa. Esimerkiksi fermentaatiolihaliemet voidaan testata • · · • · · 25 niiden kyvyn suhteen inhiboida CTLA4/B7-interaktioita.

.* Lisäksi yllä kuvattuja CTLA4lg-fuusioproteiinin johdannai- ··· "•j siä voidaan käyttää säätelemään T-solujen lisääntymistä.

• · *···* Fragmentteja tai johdannaisia voidaan käyttää esimerkiksi blokeeraamaan T-solujen lisääntyminen käänteishyljintätau- ··· V · 30 dissa (GVH), joka liittyy allogeenisen luuytimen siirtämi- : *: seen.

··· CD28-proteiinin välittämä T-solujen lisääntymis-reitti on syklosporiiniresistentti päinvastoin kuin se • · *1* lisääntyminen, jota ohjaa CD3/Ti-solureseptorikompleksi • · ·.*·· 35 (June et ai., 1987, yllä). Syklosporiini on suhteellisen • · · • · • · ··· 35 tehoton hoidettaessa GVH-tautia [Storb, Blood 68:119 - 125 (1986)]. Sellaisten T-lymfosyyttien, jotka ekspressoivat CD28-antigeenia, ajatellaan välittävän GVH-tautia [Storb ja Thomas, Immunol. Rev. 88:215 - 238 (1985)]. Näin ollen 5 CTLA4lg-fuusioproteiini voi olla käyttökelpoinen yksinään tai yhdessä sellaisten immunosuppressoivien aineiden, kuten syklosporiinin, kanssa blokeeraamaan T-solujen lisääntyminen GVH-taudissa.

Keksinnön menetelmiä voidaan näin ollen käyttää B7-10 positiivisten solujen, sisältäen B-solut, kanssa tapahtuvan CTLA4-positiivisten T-solujen interaktioiden säätelemiseksi hoidettaessa sellaisia patologisia tiloja, kuten autoimmuniteettia, kudossiirteitä, tulehdustauteja ja kasvaimia.

15 Tässä kuvatut B7-proteiinia sitovat ja IL4-prote- iinia sitovat molekyylit voivat olla erilaisissa annosmuo- doissa, jotka sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, nestemäiset liuokset tai suspensiot, tabletit, pillerit, jauheet, peräpuikot, polymeeriset mikrokapselit tai mik- 20 rovesikkelit, liposomit ja injektoitavat tai infusoitavat liuokset. Suositeltava muoto riippuu antotavasta ja tera- .·. : peuttisesta sovelluksesta.

*· *· ··.·. Tehokkain antotapa ja annosaikataulu esillä olevan • * ) keksinnön mukaisille molekyyleille riippuu taudin vakavuu- « · · 25 desta ja kulusta, potilaan terveydentilasta ja vasteesta hoidolle ja hoitavan lääkärin ratkaisusta. Sen mukaisesti ·»· ·;·; molekyyliannokset tulisi titrata yksittäiselle potilaalle.

• * · *.·.* Eri kokoisten ja lajisten eläinten ja ihmisen an nosten keskenäisen suhteen, joka perustuu mg/pinta-ala-m2- ··· V · 30 arvoon, ovat kuvanneet Freireich, E.J. et ai. (Quanti- :**[: tative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in *.e Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Vancer Chemoth- *IV. er., Rep., numero 4, 219 - 244, toukokuu 1966).

• · * · T Annosaikataulun säätöjä voidaan tehdä kasvua inhi- • ♦ V*: 35 hoivan vasteen optimoimiseksi. Annokset voidaan jakaa ja ··· • · • · «·· 36 antaa vuorokausittaan tai annosta voidaan alentaa vastaavasti riippuen tilanteesta. Esimerkiksi useita erillisiä annoksia voidaan antaa vuorokausittain tai annosta voidaan alentaa vastaavasti sen mukaan, mitä spesifinen terapeut-5 tinen tilanne osoittaa.

Keksinnön suosituksen mukaisesti tehokas annos yksilön hoitamiseksi voi olla noin 0,1 - noin 10 mg/kg yksilön kehon painoa. Tehokas annos voi myös olla noin 1 -noin 10 mg/kg yksilön kehon painoa.

10 Keksinnön edut: Esillä oleva keksintö ratkaisee ne ongelmat, jotka liittyvät tämän hetkisiin terapioihin, jotka on ohjattu estämään kudos- tai elinsiirteen hyljin-nän. Päinvastoin kuin tämän hetkiset terapiat, esillä oleva keksintö vaikuttaa ainoastaan sellaisiin immunologisiin 15 vasteisiin, joita välittävät B7-interaktiot.

Esillä oleva keksintö vaikuttaa esimerkiksi kudos- siirreantigeenispesifisiin T-soluihin indusoiden näin luo- vuttajaspesifisen ja antigeenispesifisen vastustuskyvyn.

B7/BBl-ligandin (B7) sitoutuminen CD28-proteiiniin T-solu- 20 reseptorin tarttumisen aikana on kriittistä sopivalle T- solusignaloinnille joissain systeemeissä [M.K. Jenkins, .·. : P.S. Taylor, S.D. Norton, K.B. Urdahl, J. Immunol. 147: • · · ——-—^— ;·„·! 2 461 (1991); C.H. June, J.A. Ledbetter, P.S. Linsley, • · l C.B. Thompson, Immunol. Today 11:211 (1990); H. Reisner, ***. 25 G.J. Freeman, Z. Razi-Wolf, C.D. Gimmi, B. Benacerraf, L.M. Nadler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:271 (1992); • · · ···· N.K. Damie, K. Klussman, P.S. Linsley, A. Aruffo, J.

• · » ——— *...· Immunol. 148:1985 (1992)].

Kun CD28-proteiinin interaktio ligandinsa kanssa • · · :/ : 30 blokeerataan, antigeenispesifiset T-solut indusoituvat epäsopivasti antigeenispesifisen T-solun anergiatilaan [M.K. Jenkins, P.S. Taylor, S.D. Norton, K.B. Urdahl, 3^ *:::* Immunol. 147:2 461 (1991); F.A. Harding, J.G. McArthur, • · ...........

*Γ* J.A. Gross, D.H. Raulet, J.P. Allison, Nature 356:607 :/.: 35 (1992)].

«·« • « • · ««» 37 CTLA4Ig-fuusioproteiini sitoutuu sekä ihmisen että jyrsijän B7-proteiiniin (20 kertaa korkeammalla affiniteetilla kuin CD28), blokeeraa CD28-proteiinin sitoutumisen B7-proteiiniin, inhiboi T-soluaktivaation ja indusoi T-5 solujen passiivisuuden in vitro [F.A. Harding, J.G. McArthur, J.A. Gross, D.H. Raulet, J.P. Allison, Nature 356: 607 (1992); P.S. Linsley et ai., J. Exp. Med. 174:561 (1991)].

Lisäksi esillä oleva keksintö voisi olla käyttökel-10 poinen tähän mennessä ekspressoimattoman CTLA4-geenin liukoisen proteiinituotteen ekspression aikaansaamiseksi ja sen CTLA4-proteiinin luonnollisen ligandin tunnistamiseksi, joka ottaa osaa T-solujen toimintavasteisiin. Liukoista proteiinituotetta voitaisiin sitten käyttää säätelemään 15 T-soluvasteita in vivo patologisten tilojen hoitoa varten.

Seuraavat esimerkit on annettu esillä olevan keksinnön kuvaamiseksi ja auttamaan alan asiantuntijaa tekemään se ja käyttämään sitä. Esimerkkien ei ole tarkoitettu millään tavalla olevan muutoin keksinnön piiriä rajoitta-20 via.

Esimerkki 1 .*. : B7Ig- ja CD28Ig-fuusioproteiinien valmistus • ·

Reseptori-immunoglobuliini C gamma (IgCgamma) -fuu- • · [ sioproteiinit B7Ig ja CD28lg valmistettiin, kuten ovat • · · 25 kuvanneet Linsley et ai., J. Exp. Med. 173:721 - 730 (1991), joka on liitetty tähän viitteeksi.

·*·

Lyhyesti, vastaavan reseptoriproteiinin (esim. B7) • · *·..* aminohapposekvenssejä koodittava DNA liitettiin sellaiseen DNA:hän, joka kooditti aminohapposekvenssejä, jotka vas- ·*♦ ·,· ‘ 30 tasivat ihmisen IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3- :***: alueita. Tämä suoritettiin seuraavasti.

·«· \# Polymeraasiketjureaktio (PCR). PCR-reaktiossa DNA- “.V. fragmentit amplifioitiin käyttäen alukepareja, jotka on • · T* kuvattu alla kullekin fuusioproteiinille. PCR-reaktiot • · J.*·· 35 (lopullinen tilavuus 0,1 ml) suoritettiin Taq polymeraasi ·»· # · • · ··· 38 -puskurissa (Stratagene, La Jolla, CA), joka sisälsi 20 μπιοί kutakin dNTP-nukleotidia, 50 - 100 pmol osoitettuja alukkeita, templaattia [1 ng plasmidia tai cDNA:ta, joka oli syntetisoitu < 1 pg:sta kokonais-RNA:ta käyttäen sa-5 tunnaisheksameerialukkeita, kuten on kuvannut Kawasaki teoksessa PCR Protocols, Academic Press, sivut 21-27 (1990), joka on liitetty tähän viitteeksi], ja Taq poly-meraasia (Stratagene). Reaktiot suoritettiin PCR-koneessa (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) 16 - 30 sykliä (tyypil-10 linen sykli sisälsi vaiheet 1 min 94 °C:ssa, 1-2 min 50 °C:ssa ja 1 - 3 min 72 °C:ssa).

Plasmidin rakennus. CD28-proteiinia koodittavan cDNA:n sisältävät ekspressioplasmidit, jotka ovat kuvanneet Aruffo ja Sedd, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8 573 15 (1987), saatiin tohtori Aruffo'lta ja tohtori Seed'lta (Mass General Hospital, Boston, MA). CD5-proteiinia koodittavan cDNA:n sisältävät plasmidit, jotka on kuvannut Aruffo, Cell 61:1 303 (1990), saatiin tohtori Aruffo'lta. B7-proteiinia koodittavan cDNA:n sisältävät plasmidit, 20 jotka ovat kuvanneet Freeman et ai., J. Immunol. 143:2 714 (1989), saatiin tohtori Freeman'lta (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). Liukoisten CD28- ja B7-muotojen • · ekspression alkuyrityksiä varten tehtiin rakenteet (OMCD28 * · . ja 0MB7), kuten ovat kuvanneet Linsley et ai., J. Exp.

* » · 25 Med., yllä, joissa lopetuskodonit lisättiin membraanien • · . läpi menevien domeenien ylävirtaan ja luonnolliset signaa- ··· *"j lipeptidit korvattiin onkostatiini M -proteiinin signaa- **···: lipeptidillä [Malik et ai.. Mol. Cell. Biol. 9:2 847 (1989)]. Nämä tehtiin käyttäen synteettisiä oligonukleo- ··· ·.· · 30 tide ja rakentamiseen (OMCD28) tai alukkeina PCR-reaktiossa (0MB7). 0MCD28 on CD28-CDNA, joka on modifioitu tehokkaam-paa ekspressiota varten korvaamalla signaalipeptidi ana-logisella alueella onkostatiini M -proteiinista. CD28lg- • · *Γ* ja B7Ig-fuusiorakenteet tehtiin kahdessa osassa. 5'-osat • · ·.*·; 35 valmistettiin käyttäen 0MCD28- ja 0MB7-DNA:ta templaattina ··· • · • · ·«· 39 ja oligonukleotidia CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCA-CAC (SEQ ID numero l)(koodittaa aminohapposekvenssiä, joka vastaa onkostatiini M -signaalipeptidiä) 5'-pään alukkee-na, ja joko oligonukleotidia TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAA-5 GGTCCGGGAAA (SEQ ID numero 2) tai TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAAT-GCTCTTGCTTGGTTGT (SEQ ID numero 3) 3'-pään alukkeina, vastaavasti. PCR-reaktiotuotteet katkaistiin restriktioendo-nukleaaseilla (Hindlll ja Bell), joiden kohdat oli liitetty PCR-alukkeisiin, ja puhdistettiin geelissä.

10 Fuusiorakenteiden 3'-osa, joka vastasi ihmisen IgC- gammal-proteiinin sekvenssejä, tehtiin koplatulla kään-teiskopioijaentsyymi (linnun myeloblastoosiviruksesta;

Life Sciences Associates, Bayport, NY) -PCR -reaktiolla käyttäen templaattina RNArta, joka oli peräisin sellaises-15 ta myeloomasolulinjasta, joka tuotti kimeeristä monoklo-naalista ihmis-hiiri-vasta-ainetta L6 (saatu tohtori P. Fell'Itä ja tohtori M. Gayle'lta, Bristol-Myers Squipp Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA). Oligonukleotidia AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCT-20 GACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (SEQ ID numero 4) käytettiin 5'-pään alukkeena ja oligonukleotidia CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (SEQ ID numero • · 5) 3'-pään alukkeena. Reaktiotuotteet katkaistiin Bell- ja • · . Xbal-entsyymeillä ja puhdistettiin geelissä. Lopulliset • · · 25 rakenteet koottiin ligoimalla HindiII/Bell-katkaistut • · . fragmentit, jotka sisälsivät CD28- tai B7-sekvenssit, yh- ***j dessä BclI/Xbal-katkaistun fragmentin kanssa, joka sisälsi • · *···* IgCgammal-sekvenssit, Hindlll/Xbal-katkaistuun CDM8-plas- midiin. Ligaatiotuotteet transformoitiin E. coli MC1061/p3 ··· — ' *.* ’ 30 -soluihin ja pesäkkeet seulottiin sopivien plasmidien läs- ··· ·...· näolon suhteen. Tuloksena syntyneiden rakenteiden sekvens- sit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

• tn .♦··. B7-proteiinia koodi ttava rakenne sisälsi DNA: n, • · [·’ joka kooditti aminohappoja, jotka vastasivat B7-proteiinin • · · *· " 35 solunulkoisen domeenin aminohappojäännöksiä kohdasta noin ·«· • · • · • · · 40 1 kohtaan noin 215. CD28-proteiinia koodittava rakenne sisälsi DNA:n, joka kooditti aminohappoja, jotka vastasivat CD28-proteiinin solunulkoisen domeenin aminohappoj äännöksiä kohdasta noin 1 kohtaan noin 134.

5 CD5Ig rakennettiin samalla tavalla käyttäen oligo- nukleotidia CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACC-TTG (SEQ ID numero 6) 5'-pään alukkeena ja oligonukleoti-dia ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (SEQ ID numero 7) 3’-pään alukkeena. PCR-tuote digestoitiin restriktio-10 endonukleaaseilla ja ligoitiin yllä kuvattuun IgCgammal-fragmenttiin. Tuloksena syntynyt rakenne (CD5Ig) kooditti kypsää proteiinia, jossa oli aminohapposekvenssi, joka sisälsi aminohappojäännökset CD5-proteiinia vastaavasta sekvenssistä kohdasta 1 kohtaan 347, kaksi aminohappoa, 15 jotka lisättiin rakennusmenetelmän aikana (aminohapot DQ), joita seurasi DNA, joka kooditti IgCgammal-sarana-aluetta vastaavia aminohappoj a.

Soluviljely ja transfektiot. COS-solut (apinan munuaisen solut) transfektoitiin ekspressioplasmideilla, 20 jotka ekspressoivat CD28- ja B7-proteiinia, käyttäen sen menetelmän modifikaatiota, jonka ovat kuvanneet Seed ja

Aruffo [Proc. Natl. Acad. Sei. 84:3 365 (1987)], joka on * *· , ;·.·. liitetty tähän viitteeksi. Solut ympättiin tiheytenä 10 • · ] .·, solua per 10 cm viljelymalja 18 - 24 tuntia ennen trans- • · · ’1. 25 fektiota. Plasmidi-DNA (noin 15 pg/malja) lisättiin 5 ml:n tilavuudessa seerumivapaata DMEM-alustaa, joka sisälsi « · · ”*j 0,1 mM klorokiiniä ja 600 pg DEAE-dekstraania/ml, ja solu- • · ’···* ja inkuboitiin 3-3,5 tuntia 37 eC:ssa. Sitten transfek- toituja soluja käsiteltiin lyhyesti (noin 2 min) PBS:ssä • · · V · 30 olevalla 10 % dimetyylisulfoksidilla ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 16 - 24 tuntia DMEM-alustassa, joka sisälsi 10 % FCS:ia. 24 tuntia transfektion jälkeen viljelyalusta pois-tettiin ja se korvattiin seerumivapaalla DMEM-alustalla • · Ύ (6 ml/malja). Inkubaatiota jatkettiin 3 vuorokautta • · ·.*·: 35 37 °C:ssa, jolloin käytetty alusta kerättiin ja tuoretta • · · • » • · ·*· seerumivapaata alustaa lisättiin. Kun oli inkuboitu 3 vuo rokautta lisää 37 °C:ssa, käytetty alusta kerättiin jäl leen ja solut heitettiin pois.

41 CD28-, CD5- tai B7-proteiinia ekspressoivat CHO-5 solut eristettiin, kuten ovat kuvanneet Linsley et ai., (1991), yllä, seuraavasti. Lyhyesti, CD28-, CD5- tai B7-proteiinia ekspressoivat stabiilit transfektantit eristettiin sen jälkeen, kun dihydrofolaattireduktaasista riippuvaiset kiinanhamsterin munasolut (dhfr'CHO) oli transfek-10 toitu seoksella, jossa oli yhtäaikaa sopivaa ekspressio-plasmidia ja selektiomarkkeria pSV2dhfr [Linsley et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5 031 (1990)], joka on liitetty tähän viitteeksi. Sitten transfektantteja kasvatettiin kohoavissa metotreksaattikonsentraatioissa niin, että 15 lopullinen taso oli 1 μΜ, ja niitä pidettiin yllä DMEM-alustassa, johon oli lisätty 10 % naudan sikiön seerumia (FCS), 0,2 mM proliinia ja 1 μΜ metotreksaattia. Korkeita CD28- (CD28+ CHO) tai B7-tasoja (B7+ CHO) ekspressoivat CHO-linjat eristettiin useilla kierroksilla fluoresenssi-20 aktivoidulla solulajittelulla (FACSR), jota seurasi epäsuora immunovärjäys monoklonaalisella 9,3- tai BBl-vasta-ai- :'.J neella. Sellaiset amplifioidut CHO-solut, jotka olivat • · :*.·. negatiivisia CD28- tai B7-proteiinin (dhfr+ CHO) pintaeks- • · . pression suhteen, eristettiin myös FACSR-menetelmällä CD28- • · · 25 transfektoiduista populaatioista.

• · p . Immunovärj äys ja FACS-analyysi. Transfektoidut CHO- ··· ----— —- — tai COS-solut tai aktivoidut T-solut analysoitiin epäsuo- • · *···* ralla immunovärjäyksellä. Ennen värjäystä CHO-solut pois tettiin niiden viljelyastioista inkuboimalla PBSrssä, joka ·*· V : 30 sisälsi 10 mM EDTA:a. Ensin soluja inkuboitiin jyrsijän • · · :...ί monoklonaalisessa 9,3- [Hansen et ai., Immunogenetics 10: .:. 247 (1980)] tai BB-l-vasta-aineessa [Yokochi et ai., .···. Immunol. 128: 823 (1981)], tai Ig-fuusioproteiinien kanssa • · *·* (kaikkia konsentraationa 10 pg/ml DMEM-alustaa, joka si- 1 2 *: 35 sälsi 10 % FCS:ia) 1-2 tuntia 4 °C:ssa. Sitten solut ··« • · • · 2 42 pestiin ja niitä inkuboitiin 0,5-2 tuntia lisää 4 °C:ssa niin, että läsnä oli FlTC-konjugoltua toisen vaiheen rea-genssia [vuohen anti-hiiri-Ig-seerumi jyrsijän monoklonaa-lisille vasta-aineilla tai vuohen anti-ihmis-IgCgamma-see-5 rurai fuusioproteiineille (Tago, Inc., Burlingame, CA)]. Fluoresenssi analysoitiin FACS IVH -solulajittelijalla (Becton Dickinson and CO., Mountain View, CA), joka oli varustettu neljän dekadin logaritmiamplikaattorilla.

Ig-fuusioproteiinien puhdistus. Käytetyn seerumi-10 vapaan alustan ensimmäistä, toista ja kolmatta keräystä transfektoiduista COS-soluista käytettiin lähteenä Ig-fuusioproteiinien puhdistukseen. Soluroskien poiston jälkeen matalanopeuksisella sentrifugaatiolla alusta laitettiin pylvääseen (noin 200 - 400 ml alustaa/ml pakattua 15 tyynytilavuutta), jossa oli immobilisoitua proteiini A:ta (Repligen Corp., Cambridge, MA), joka oli tasapainotettu 0,05 M natriumsitraatilla, pH 8,0. Alustan lisäyksen jälkeen pylväs pestiin 1 M kaliumfosfaatilla, pH 8, ja sitoutunut proteiini eluoitiin 0,05 M natriumsitraatilla, pH 3. 20 Fraktiot kerättiin ja sen jälkeen neutraloitiin välittömästi lisäämällä 1/10 tilavuudesta 2 M Tris-puskuria, pH

: 8. Fraktiot, jotka sisälsivät absorboivan materiaalin A2B0- ♦ ·· ·Ιλ·\ huipun, yhdistettiin ja ne dialysoitiin PBS:ää vastaan ♦ · l ennen käyttöä. Ekstinktiokertoimet 2,4 ja 2,8 ml/mg • ♦ · **·. 25 CD28lg- ja B7Ig-proteiinille, vastaavasti, määritettiin tunnetun absorbanssin sisältävien liuosten aminohappoana- ··· •••i lyysillä. Puhdistettujen CD28lg- ja B7Ig-proteiinien si- ··♦ toutumisaktiivisuuksien saanto oli lähes kvantitatiivinen määritettynä FACSR-analyysillä B7+- ja CD28+-CHO-solujen 30 epäsuoran fluoresenssivärjäyksen jälkeen.

:***: Esimerkki 2 • · · CTLA4lg-fuusioproteiinin valmistus **” CTLA4lg-proteiinia koodittava liukoinen geneettinen • · *·;·* fuusio rakennettiin CTLA4-proteiinin solunulkoisen domee- • · :.*·· 35 nin ja IgCgammal-domeenin välille samalla tavalla kuin on ·«· • · • · • · · 43 kuvattu yllä CD28lg-rakenteelle. CTLA4-geenin solunulkoi-nen domeeni kloonattiin PCR-reaktiolla käyttäen synteettisiä oligonukleotideja, jotka vastasivat julkaistua sekvenssiä [Dariavach et ai., Eur. Journ. Immunol. 18:1 901 -5 1 905 (1988)].

Koska CTLA4-proteiinin signaalipeptidiä ei oltu tunnistettu CTLA4-geenissä, CTLA4-proteiinin ennustetun sekvenssin N-pää fuusioitiin onkostatiini M -proteiinin signaalipeptidiin [Malik et ai., Mol. Cell. Biol. 9:2 847 10 (1989)] kahdessa vaiheessa käyttäen päällekkäin meneviä oligonukleotideja. Ensimmäisessä vaiheessa oligonukleoti-di a CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCA-CGTGGCCCAGCC (SEQ ID numero 8)(joka kooditti onkostatiini M -signaalipeptidin C-pään 15:ttä aminohappoa fuusioituna 15 CTLA4-proteiinin N-pään 7:ään aminohappoon) käytettiin 5’- pään alukkeena ja oligonukleotidia TTTGGGCTCCTGATCAGAATCT-GGGCACGGTTG (SEQ ID numero 9)(joka kooditti CTLA4-resep-toria koodittavan aminohapposekvenssin aminohappojäännöksiä 119 - 125 ja joka sisälsi BclI-restriktioentsyymikoh-20 dan) 3'-pään alukkeena. Tämän vaiheen templaatti oli cDNA, joka syntetisoitiin 1 pg:sta kokonais-RNA:ta H38-soluista .·. : (HTLV II -viruksella infektoitu T-soluleukemiasolulinja, • ♦♦ ;·.·1 2 3 joka saatiin tohtoreilta Salahudin ja Gallo, NCI, • · I Bethesda, MD). Osa ensimmäisen vaiheen PCR-tuotteesta am- • · ♦ ' ' • ♦ ♦ ***, 25 plif ioitiin uudelleen käyttäen päällekkäin menevää 5' -pään alukettaCTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACG-·«{1 CTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEQ ID numero 10), joka kooditti *·..1 onkostatiini M -signaalipeptidin N-pään osaa ja joka si sälsi Hindlll-restriktioendonukleaasikohdan, ja samaa 3'- ··· li ί 30 pään aluketta. PCR-reaktiotuote digestoitiin Hindlll- ja :[1[: BclI-entsyymeillä ja ligoitiin yhdessä Bcll/xbal-katkais- ’•e tun cDNA-fragmentin, joka kooditti IgCgammal-proteiinin *!!! aminohapposekvenssejä, jotka vastasivat sarana-, CH2- ja • · T CH3-alueita, kanssa HindiII/XbaI-katkaistuun ekspressio- • · • · · • ·· • · ·· 2 • · • · 3 vektoriin CDM8 tai Hindlll/Xbal-katkaistuun ekspressiovek- toriin nLN (joka saatiin tohtori Aruffo'lta).

44

Tuloksena syntyneen CTLA4Ig-fuusiorakenteen kartta on esitetty kuviossa 1. Tässä kuviossa kuvatut sekvenssit 5 esittävät CTLA4-sekvenssin (isot kirjaimet, varjostamat-tomat alueet) ja onkostatiini M -signaalipeptidisekvenssin SP (tummaksi varjostetut alueet) ja IgCgammal-proteiinin sarana-, CH2- ja CH3-sekvenssien (pisteytetyt alueet) liitoskohtia. Sulkeissa oleva aminohappo lisättiin rakennuk-10 sen aikana. Tähdet (*) osoittavat kohtia, joissa kysteiini mutatoitiin seriiniksi, joita tehtiin IgCgamma-proteiinin sarana-alueella. CTLA4-proteiinissa oleva immunoglobulii-nisuurryhmän V-alueen kaltainen domeeni on osoitettu, kuten on osoitettu myös IgCgammal-proteiinin CH2- ja CH3-15 domeenit.

CTLA4lg-sekvenssin sisältävä CDM8-ekspressioplas-midi transfektoitiin sitten COS-soluihin käyttäen DEAE-dekstraanitransfektion modifikaatiota (Linsley et ai., 1991, yllä), joka on modifioitu menetelmästä, jonka ovat 20 kuvanneet Seed ja Aruffo, 1987, yllä.

CTLA4lg-aminohapposekvenssiä koodittavan cDNA:n : sisältävät ekspressioplasmidirakenteet (nLN tai CDM8) • · · transfektoitiin lipofektiolla standardimenetelmiä käyttäen • · | l dhfr" CHO -solulinjoihin sellaisten uusien solulinjojen ***. 25 saamiseksi, jotka stabiilisti ekspressoivat CTLA4Ig-pro- teiinia.

··· ···’ CTLA4lg-proteiinin aminohapposekvenssiä koodittava • · · *...: DNA on talletettu ATCC-kokoelmaan Budapestin sopimuksen sopimusehdoin 31.5.1991 ja sen ATCC-koodinumero on 68 629.

• · · V : 30 Suositeltava stabiili CTLA4Ig-proteiinia ekspres- soiva transfektantti, jolle annettiin nimi kiinanhamsterin munasarjan solulinja CTLA4lg-24, tehtiin seulomalla B7- ‘IV. positiiviset CHO-solulinjat B7-sitoutumisaktiivisuuden • · *;* suhteen alustassa käyttäen immunovärj äystä. Transfektant- • · :.**i 35 teja pidettiin DMEM-alustassa, johon oli lisätty 10 % nau- ··· • · • · ··· 45 dan sikiön seerumia (FBS), 0,2 mM proliinia ja 1 μΜ meto-treksaattia.

CTLA4Ig-24 CHO-solulinja on talletettu ATCC-koko-elmaan Budapestin sopimuksen sopimusehdoin 31.5.1991 ja 5 sen koodinumero on ATCC 10762.

CTLA4Ig-proteiini puhdistettiin proteiini A -kro-matografialla seerumivapaista käytetyistä supernatanteista (kuvio 2). CTLA4lg-proteiinin konsentraatiot määritettiin olettaen ekstinktiokertoimen olevan 280 nm:ssa 1,6 (ko-10 keellisesti määritetty tunnetun absorbanssin sisältävän liuoksen aminohappoanalyysillä). Molekyylipainostandardit (kaistat 1 ja 3, kuvio 2) sekä CTLA4lg-proteiininäytteet (1 pg) altistettiin SDS-PAGE-elektroforeesille (4 - 12 % akryyliamidigradientti) ei-pelkistävissä olosuhteissa 15 (-8ME, kaistat 1 ja 2) tai pelkistävissä olosuhteissa (+ BME, kaistat 3 ja 4). Proteiinit tehtiin silmin näkyviksi värjäämällä Coomassie Brilliant Blue -värillä.

Ei-pelkistävissä olosuhteissa CTLA4lg-proteiini kulki kohdalla, jonka Mr oli noin 100 000, ja pelkistävissä 20 olosuhteissa kohdalla, jonka Mr oli noin 50 000 (kuvio 2). Koska IgCgamma-proteiinin saranan disulfidit poistettiin rakennuksen aikana, CTLA4lg, kuten CD28lg, on dimeeri, • · j·.·. joka on luultavasti liittynyt natiivin disulfidiliitoksen • · [ välityksellä yhteen.

”*. 25 Esimerkki 3 CTLA4-reseptori ···

Sellaisen DNA:n rakentamiseksi, joka kooditti ihmi- • · *···* sen CTLA4-geenin täyspitkää aminohapposekvenssiä, kloonat tiin CTLA4-proteiinin membraanin läpi menevien ja syto- ··· ; 30 plasmisten domeenien aminohappoja koodittava cDNA PCR-re- ··· aktiolla ja sitten se liitettiin yhteen sellaisen cDNA:n kanssa, joka kooditti aminohappoja, jotka vastasivat CTLA4lg-fragmenttia, joka vastasi onkostatiini M -signaa- * · *Γ lipeptidiä fuusioituna CTLA4-proteiinin N-päähän. PCR- ja • · *.*·· 35 soluviljely- ja transfektiomenetelmät tehtiin, kuten yllä ·»· • · • · ··· 46 on esimerkissä 1 kuvattu, käyttäen COS-soluja ja DEAE-dekstraanitransfektiota.

Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ekspressiota ei oltu aiemmin kuvattu ihmisen lymfoidisoluissa, oli tarpeen 5 paikantaa CTLA4-mRNA:n lähde. Yllä kuvattujen H38-solujen kokonais-RNA:sta käänteiskopioitua PCR-cDNA:ta käytettiin kloonaukseen PCR-menetelmällä. Tätä tarkoitusta varten käytettiin oligonukleotidia GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGG-TAGTG (SEQ ID Numero 11)(joka koodittaa ennustetun koodit-10 tavan sekvenssin 11 ensimmäistä aminohappoa) 5’-puolen alukkeena ja oligonukleotidia TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGA-TGGGAATAAAATAAGGCTG (SEQ ID numero 12)(homologinen CTLA4-proteiinin 8 viimeiselle aminohapolle ja sisältää Xbal-kohdan) 3'-puolen alukkeena. Templaatti oli jälleen cDNA, 15 joka oli syntetisoitu 1 pgzsta RNA:ta H38-soluista. PCR-reaktiotuotteet katkaistiin restriktioendonukleaaseilla Ncol ja Xbal ja tuloksena syntynyt 316 emäsparin pituinen fragmentti puhdistettiin geelissä. Yllä kuvatun CTLA4lg-fuusion 340 emäsparin pituinen Hindlll/Ncol-fragmentti 20 puhdistettiin myös geelissä ja molemmat restriktiofragmen- tit ligoitiin HindiII/Xbal-katkaistuun CDM8-vektoriin muo- : dostaen plasmidi OMCTLA.

• ♦ ;·.·. Tuloksena syntynyt rakenne vastasi täyspitkää • ♦ | CTLA4-sekvenssiä (SEQ ID numero 13 ja 14) ja onkostatiini ♦ · * 25 M -signaalipeptidiä. Rakenne on esitetty kuviossa 3 ja . sille annettiin nimi 0MCTLA4. Kuviossa 3 esitetty CTLA4- ··· ···· sekvenssi eroaa ennustetusta ihmisen CTLA4-DNA-sekvenssis- ··· • · *··.* tä (Dariavach et ai., yllä) yhden emäsmuutoksen suhteen niin, että aiemmin julkaistu alaniini esitetyn aminohappo- ··· V ‘ 30 sekvenssin aminohappokohdassa 111 koodittaa treoniinia.

: *: Tämä treoniini on osa vastatunnistettua N-sidoksellista ··· glykosylaatiokohtaa, joka voi olla tärkeä fuusioproteiinin ’”1 onnistuneelle ekspressiolle.

• t *1* Ligaatiotuotteet transformoitiin E. coli MC1061/p3 • · :.*·· 35 -soluihin ja pesäkkeet seulottiin sopivien plasmidien läs- ··· • · • · ··· 47 näolon suhteen. Tuloksena syntyneiden rakenteiden sekvenssit varmistettiin DNA-sekvensointianalyysillä.

Esimerkki 4 CTLA4lg-proteiinin karakterisointi 5 CTLA4lg-rakenteiden karakterisoimiseksi valmistet tiin useita CD28Ig-, B7Ig- ja CD5Ig-isolaatteja, kuten yllä on kuvattu, ja ne transfektoitiin COS-soluihin esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti ja ne testattiin FACSR-analyy-sillä B7Ig-proteiinin sitoutumisen suhteen. Yllä mainit-10 tujen rakenteiden lisäksi käytettiin myös CDM8-plasmideja, jotka sisälsivät CD7-proteiinia koodittavat cDNA:t, kuten ovat kuvanneet Aruffo ja Seed [EMBO Jour. 6:3 313 - 3 316 (1987)], joka on liitetty tähän viitteeksi.

Monoklonaaliset vasta-aineet. Jyrsijän monoklonaa-15 liset vasta-aineet (mAb:t) 9,3 (anti-CD28) ja G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), BB-1 (anti-B7-antigeeni) ja rotan monoklonaalinen vasta-aine 187.1 (anti-hiiri-K-ketju) on kuvattu aiemmin [Ledbetter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 84:1 384 - 1 388 (1987); Ledbetter et ai., Blood 75:1 531 20 (1990); Yokochi et ai., yllä] ja ne puhdistettiin askites- nesteestä ennen käyttöä. Monoklonaalista vasta-ainetta .·. : 0KT8 tuottava hybridooma saatiin ATCC-kokoelmasta, Rock- • ·· •l ville, MD, ja monoklonaalinen vasta-aine puhdistettiin • · * myös askites-nesteestä ennen käyttöä. Monoklonaalinen vas- • · · •*\ 25 ta-aine 4G9 (anti-CD19) saatiin tohtori E. Engleman'lta,

Stanford University, Palo Alto, CA. Puhdistettu kimeerinen • · · •••ϊ monoklonaalinen ihmis-hiiri-vasta-aine L6 (jolla on ihmi- ··· sen Cgammal-proteiinin Fc-osa) oli lahja tohtoreilta P. Fell ja M. Gayle (Bristol-Myers Sguipp Pharmaceutical : 30 Research Institute, Seattle, WA).

:***; Immunovärjäys ja FACSR-analyysi. Ennen värjäystä COS- ja CHO-solut poistettiin viljelyastioistaan inkuboi- ”” maila PBSissä, joka sisälsi 10 mM EDTA:a. Soluja inkuboi- • · ··· tiin ensin monoklonaalisten vasta-aineiden tai Ig-fuusio- • · i/.j 35 proteiinien, joiden konsentraatio oli 10 pg/ml, kanssa ··· • · • · • · · 48 DMEM-alustassa, joka sisälsi 10 % FBS:ia, 1-2 tuntia 4 °C:ssa. Sitten solut pestiin ja niitä inkuboitiin 0,5 -2 tuntia lisää 4 °C:ssa FITC-konjugoidun vuohen anti-hii-ri-immunoglobuliinin tai FITC-konjugoidun vuohen anti-ih-5 mis-IgCgamma-seerumin kanssa (molemmat hankittiin tuotta jalta Tago, Burlingame, CA). Kun sekä monoklonaalisten vasta-aineiden että Ig-fuusioproteiinien sitoutumista mitattiin samassa kokeessa, toisen vaiheen FlTC-konjugoidut anti-hiiri- ja anti-ihmis-reagenssit sekoitettiin yhteen 10 ennen käyttöä. Sitten FACSR-menetelmällä analysoitiin kaiken kaikkiaan 10 000 solun fluoresenssi.

Perifeerisen veren lymfosyyttien erotus ja stimulaatio. Perifeerisen veren lymfosyytit (PBL:t) eristettiin sentrifugoimalla Lymphocyte Separation Medium -alustan 15 (Litton Bionetics, Kensington, MD) läpi. Alloreaktiiviset T-solut eristettiin stimuloimalla PBL-solut primaarisessa sekalymfosyyttireaktiossa (MLR). PBL-soluja kasvatettiin tiheytenä 106 solua/ml yhdessä säteilytettyjen (5 000 rad) T51 LCL-solujen kanssa. EBV-transformoituja lymfoblastoi-20 disolulinjoja (LCL) PM (Bristol-Myers Squipp Co.) ja T51 (Bristol-Myers Squipp Co.) pidettiin yllä RPMI-alustassa, ·\ί johon oli lisätty 10 % FBS:ia. Kuuden vuorokauden kuluttua • · alloreaktiiviset "blastisolut" jäädytettiin ja säilytet- , .·. tiin. Toinen MLR-reaktio suoritettiin viljelemällä sula- • · · 25 tettuja alloreaktiivisia blasteja yhdessä tuoreiden sätei- • · . lytettyjen T51 LCL -solujen kanssa niin, että monoklonaa- • · · liset vasta-aineet ja Ig-fuusioproteiinit olivat läsnä ja • · *···1 2 3 niiden poissaollessa. Soluja viljeltiin 96-kuoppaisilla tasapohjaisilla levyillä (4 x 104 alloreaktiivista blastia • · · V · 30 ja 1 x 104 säteilytettyä T51 LCL -solua/kuoppa 2,0 ml:n • · · tilavuudessa) RPMI-alustassa, joka sisälsi 10 % FBS:ia.

neljän rinnakkaisen viljelmän solujen lisääntyminen mitat- .···. tiin [3H]-tymidiinin käytön suhteen 2-3 vuorokauden vil- • · 11 jelyn viimeisen kuuden tunnin aikana.

• · ♦ ♦ · • ·· 2 • · 3 • t • ♦ ··· 49 PHA-aktivoidut T-solut valmistettiin viljelemällä PBL-soluja viisi vuorokautta PHA:n (Wellcome, Charlotte, NC) kanssa, jonka konsentraatio oli 1 pg/ml, ja yhden vuorokauden alustassa, josta puuttui PHA. Elävät solut kerät-5 tiin sedimentoimalla Lymphocyte Separation Medium -alustan läpi ennen käyttöä. Solut stimuloitiin monoklonaalisten vasta-aineiden tai transfektoitujen CHO-solujen kanssa 4 -6 tuntia 37 °C:ssa, kerättiin sentrifugoimalla ja niitä käytettiin RNA:n valmistamiseksi.

10 CD4+-T-solut eristettiin PBL-soluista erottamalla terveiden luovuttajien PBL-solut T- ja ei-T-soluihin käyttäen lampaan erytrosyyttirosettimenetelmää ja T-solut erotettiin edelleen inkuboimalla CD4+-solujen kanssa, kuten ovat kuvanneet Damle et ai., J. Immunol. 139:1 501 (1987), 15 joka on liitetty tähän viitteeksi.

B-solut puhdistettiin myös perifeerisestä verestä inkuboimalla, kuten ovat kuvanneet Wysocki ja Sato, Proc.

natl. Acad. Sei. 75:2 844 (1978), joka on liitetty tähän viitteeksi, käyttäen monoklonaalista anti-CDl9 vasta-ai- 20 netta 4G9. Th-indusoidun Ig-tuoton mittaamiseksi 106 CD4+- T-solua sekoitettiin 106 CD19+-B-solun kanssa 1 mlzssa .'.J RPMI-alustaa, joka sisälsi 10 % FBS:ia. Kun oli viljelty • · ;·.·. kuusi vuorokautta 37 °C:ssa, ihmisen IgM-proteiinin tuotto mitattiin viljelysupernatanteista käyttäen kiinteäfaasi- • · · 25 ELISA-menetelmää, kuten ovat kuvanneet Volkman et ai., . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2 528 (1981), joka on lii- •”j tetty tähän viitteksi.

• · *·♦·* Lyhyesti, 96-kuoppaiset tasapohjaiset ELISA-mikro- tiitterilevyt (Corning, Corning, NY) päällystettiin 200 ··« V * 30 pl:lla natriumkarbonaattipuskuria (pH 9,6)/kuoppa, joka sisälsi 10 pg affiniteettipuhdistettua vuohen anti-ihmis-);t IgG- tai -IgM-vasta-ainetta/ml (Tago, Burlingame, CA), "II inkuboitiin yli yön 4 °C:ssa ja sitten pestiin PBS:llä ja *1* kuopat blokeerattiin edelleen PBS:ssä olevalla 2 % BSA:lla :N 35 (BSA-PBS).

··· • ♦ • · • · · 50

Testattavat näytteet lisättiin sopivina laimennoksina näihin kuoppiin ja niitä inkuboitiin 1:1 000 laimennoksen kanssa liuosta, jossa oli affiniteettipuhdistetun vuohen anti-ihmis-IgG- tai -IgM-vasta-aineen (Tago) pipar-5 juuriperoksidaasilla (HRP) konjugoitua F(ab' )2-fraktiota, jota oli 200 μΐ/kuoppa. Sitten levyt pestiin ja lisättiin 100 μΐ/kuoppa o-fenyleenidiamiiniliuosta (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0)(0,6mg/ml sitraatti-fosfaattipuskuria, pH 5,5, ja jossa oli 0,045 % vetyperoksidia). Värin kehi-10 tys lopetettiin 2 N rikkihapolla. Mitattiin absorbanssi 490 nm:ssa automaattisella ELISA-levylukijalla.

Testi- ja verrokkinäytteet valmistettiin kolmena rinnakkaisena ja absorbanssiarvoja verrattiin niihin, jotka saatiin tunnetuilla IgG- tai IgM-standardeilla, jotka 15 valmistettiin samanaikaisesti supernatanttinäytteiden kanssa standardikäyrän muodostamiseksi, jota käyttäen vil-jelysupernatanttien Ig-konsentraatiot määritettiin. Tulokset on ilmaistu kolmen tai neljän rinnakkaisen viljelmän arvona ng Ig-proteiinia/ml ± kerkiarvon keskivirhe.

20 Immunosaostusanalyysi ja SDS-PAGE. Solut pintalei- mattiin 1Z5I-leimalla ja ne altistettiin immunosaostusana-.*. J lyysille. Lyhyesti, PHA-aktivoidut T-solut pintaleimattiin jv! 125I-leimalla käyttäen laktoperoksidaasia ja H202:ta, kuten • ♦ | l' ovat kuvanneet Vitetta et ai., J. Exp. Med. 134: 242 ***. 25 (1971), joka on liitetty tähän viitteeksi. SDS-PAGE-kro- matografia suoritettiin lineaarisilla akryyliamidigradi- ··· •••| enttigeeleillä niin, että tiivistysgeelit olivat 5 % ak- • · *···* ryyliamidin suhteen. Geelit värjättiin Coomassie Blue - värillä, ylimääräinen väri poistettiin ja valokuvattiin, ··· V · 30 tai kuivattiin ja valotettiin röntgenfilmille (Kodak XAR- ··· : : 5).

··· '

Sitoutumiskokeet. B7Ig-proteiini leimattiin 125i- leimalla niin, että sen spesifiseksi aktiivisuudeksi tuli • · .

T noin 2 x 10 cpm/pmol. 96-kuoppaiset muovimaljat päällys- • · :.*·· 35 tettiin 16 - 24 tunnin ajan liuoksella, joka sisälsi ··· • · ·«· 51 CTLA4lg-proteiinia (0,5 pg 0,05 ml:n tilavuudessa 10 mM Tris-puskuria, pH 8). Kuopat blokeerattiin sitomispusku-rilla [DMEM, joka sisälsi 50 mM BES-puskuria (Sigma Chemical Co.), pH 6,8, 0,1 % BASria ja 10 % FCS:ia] ennen 5 sellaisen liuoksen lisäystä (0,09 ml), joka sisälsi 125I-B7Ig-proteiinia (noin 5 x 105 cpm) niin, että läsnä oli kilpailijaa tai sitä ei ollut. Kun oli inkuboitu 2-3 tuntia 23 °C:ssa, kuopat pestiin kerran sitomispuskurilla ja neljä kertaa PBS:llä. Sitten sitoutunut radioaktiivi-10 suus liuotettiin lisäämällä 0,5 N NaOH:ia ja määrä mitattiin gammalaskurilla.

Sitoutuminen B7Ig-proteiiniin. 0MCTLA4-rakenteen, joka kooditti ihmisen täydellistä CTLA4-DNA-geeniä, toiminnallinen aktiivisuus osoitetaan kokeessa, joka on esi-15 tetty kuviossa 4. COS-solut transfektoitiin ekspressio-plasmideilla CD7, OMCD28 ja 0MCTLA4, kuten yllä on kuvattu. 48 tunnin kuluttua transfektiosta solut kerättiin ja niitä inkuboitiin ainoastaan alustassa (ei mitään lisäyksiä) tai yhdessä monoklonaalisen vasta-aineen 9,3, B7Ig-20 fuusioproteiinin, CD51lg-fuusioproteiinin tai monoklonaalisen vasta-aineen G3-7 kanssa. Sitten solut pestiin ja .·. : sitoutuminen tunnistettiin seoksella, jossa oli toisen • · · j·.·] asteen reagensseina FlTC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-Ig- • · [ ^ proteiinia ja FITC-konjugoitua vuohen anti-ihmis-Ig-pro- ***. 25 teiinia. Transfektoidut solut testattiin sopivien solupin- tamarkkereiden ekspression suhteen epäsuoralla immunovär- ··· ···: jäyksellä ja fluoresenssi mitattiin käyttäen FACSR-analyy- • · · ·...· siä, kuten yllä on kuvattu.

Kuten kuviossa 4 on esitetty, monoklonaalinen vas- • · · V · 30 ta-aine 9,3 sitoutui CD28-transfektoituihin COS-soluihin, : mutta ei CTLA4-transfektoituihin soluihin. Tälle päinvas- taisesti B7Ig-fuusioproteiini (mutta ei verrokkina oleva CD5lg-fuusioproteiini) sitoutui sekä CD28- ja CTLA4-trans- *“ fektoituhin soluihin. CD7-transfektoidut COS-solut eivät • · :.*·· 35 sitoneet monoklonaalista vasta-ainetta 9,3 eikä fuusiopro- »·· • · • « ··· 52 teiineja. Tämä osoittaa, että CD28- ja CTLA4-proteiini molemmat sitovat B-soluaktivaatioproteiinia B7. Lisäksi monoklonaalinen vasta-aine 9,3 ei tunnistettavasti sitonut CTLA4-proteiinia.

5 CTLA4lg-proteiinin sitoutuminen B7-positiivisiin

CHO-soluihin. CTLA4lg- ja B7-proteiinin sitoutumisen lisä-karakterisoimiseksi puhdistetun CTLA4lg-proteiinin sitou-tumisaktiivisuus B7+-CH0-soluihin ja lymfoblastoidisolulin-jaan (PM LCL) mitattiin kuviossa 5 esitetyllä kokeella. 10 Amplifioituja transfektoituja CHO-solulinjoja ja PM LCL

-soluja inkuboitiin ainoastaan alustassa (ei lisäyksiä) tai ekvivalentissa konsentraatiossa ihmisen IgCgammal-sekvenssejä sisältävissä CD5Ig-, CD28Ig- tai CTLA4lg-prote-iineissa (10 pg/ml). Sitoutuminen tunnistettiin FACSs-ana-15 lyysillä, joka tehtiin sen jälkeen, kun oli lisätty FITC-konjugoitua vuohen anti-ihmis-Ig-proteiinia toisen vaiheen reagenssiksi. Kaiken kaikkiaan 10 000 värjättyä solua analysoitiin FACSR-menetelmällä.

Kuten kuviossa 5 on esitetty, CD28lg-proteiini si-20 toutui B7+-CH0-soluihin, mutta ei PM LCL -solulinjaan, joka ekspressoi suhteellisen matalia B7-antigeenin tasoja : (Linsley et ai., yllä, 1990). CTLA4lg sitoutui vahvemmin • · · molempiin solulinjoihin kuin CD28lg, joka antaa ehdottaa, • · * että se sitoutui korkeammalla affiniteetilla. Ei CD28lg • · · ***. 25 eikä CTLA4lg kumpikaan sitoutunut CD28+-CH0-soluihin.

CTLA4Ig- ja B7Ig-proteiinien sitoutumisaffiniteet- • · · •••J ti. CTLA4Ig-proteiinin ja B7Ig-proteiinin interaktion il-

Ml * ·...· meinen affiniteetti mitattiin sitten käyttäen kompetetii- vista kiinteäfaasisitomistestiä. 96-kuoppaiset muoviset • · · ί.ϊ : 30 maljat päällystettiin CTLA4lg-proteiinilla, kuten on ku- vattu yllä. B7Ig-proteiini leimattiin radioaktiiviseksi 125I-leimalla (5 x 105 cpm, 2 x 106 cpm/pmol) ja lisättiin 4 *"! nM konsentraatioksi niin, että läsnä oli ilmoitetut (kuvio • · • · 6) konsentraatiot leimaamatonta kimeeristä monoklonaalista • · ·.*·· 35 vasta-ainetta L6, 9,3, BB-1, tai B7Ig-proteiinia. Maljaan • · · • · • · ··· 53 sitoutunut radioaktiivisuus määritettiin ja se ilmoitettiin prosenttimääränä siitä radioaktiivisuudesta, joka sitoutui kuoppiin, joita käsiteltiin ilman kilpailijaa (28 300 cpm). Kukin piste edustaa kahden rinnakkaisen määri-5 tyksen keskiarvoa; toistot vaihtelivat yleensä < 20 % keskiarvon molemmin puolin. Konsentraatiot laskettiin perustuen molekyylikokoon Mr 75 000 per sitomiskohta monoklonaa-lisille vasta-aineille ja Mr 51 000 per sitomiskohta B7Ig-proteiinille.

10 Kuten kuviossa 6 on esitetty, ainoastaan monoklo- naalinen vasta-aine BB-1 ja leimaamaton B7lg-proteiini kilpailivat merkittävästi 125I-B7Ig-proteiinin sitoutumisessa (puolet maksimivaikutuksista konsentraatioissa noin 22 nM ja 175 nM, vastaavasti). Ei kimeerinen monoklonaali-15 nen vasta-aine L6 eikä monoklonaalinen vasta-aine 9,3 kilpailleet tehokkaasti testatuissa konsentraatioissa. Toisissa kokeissa käytetyt monoklonaalisen vasta-aineen konsentraatiot olivat riittäviä inhiboimaan 125I-B7Ig-proteii-nin sitoutumisen immobilisoituun CD28lg-proteiiniin tai 20 solun pintaan ekspressoituun CD28-proteiiniin £ 90 prosentilla.

j‘.J Kun kuvion 6 kilpailutestin tulokset merkittiin • · ;·.·. Scatchard-kaavioon, laskettiin 125I-B7-proteiinin immobili- • · . .·. soituun CTLA4lg-proteiiniin tapahtuvan sitoutumisen disso- * · · ^1*. 25 siaatiovakion Kd olevan noin 12 nM (kuvio 7). Tämä arvo on , noin 20-kertaa matalampi kuin aiemmin 125I-B7Ig-proteiinin ··· •”j ja CD28-proteiinin väliselle sitoutumiselle on määritetty *···* (noin 200 nM)(Linsley et ai., 1991, yllä), joka osoittaa, että CTLA4lg on korkeamman affiniteetin sisältävä resepto- • · · V · 30 ri B7-antigeenille kuin CD28-reseptori.

• · ·

Niiden molekyylien (sen molekyylin) määrittämiseksi lymfoblastoidisoluissa, jotka (joka) sitovat (sitoo) CTLA4lg-proteiinia (kuvio 7), 125I-pintaleimatut solut al-*1* tistettiin immunosaostusanalyysille (kuvio 8). B7+-CH0-ja ·/·· 35 PM LCL -solut pintaleimattiin 125I-leimalla ja ne uutettiin ·«· • · • · ··· 54 ionittomalla detergenttiliuoksella, kuten yllä on kuvattu. Uutemäärät, jotka sisälsivät noin 1,5 x 107 cpm 0,1 ml tilavuudessa, altistettiin immunosaostusanalyysille, kuten yllä on kuvattu niin, että ei lisätty mitään tai lisättiin 5 2 pg CD28lg-, CTLA4lg- tai CD5Ig-proteiinia kutakin. Sit ten pestyt immunosaostukset analysoitiin SDS-PAGE-elektro-foreesissa (10 - 20 % akryyliamidigradientti) pelkistävissä olosuhteissa. Sitten geeli kuivattiin ja se altistettiin autoradiografialle. Kuvion 8 vasen paneeli esittää 10 vuorokauden valotuksen jälkeen saatua autoradiogrämmiä. Kuvion 8 oikea paneeli esittää saman geelin autoradiogra-fian 10 vuorokauden valotuksen jälkeen. Kuvion 8 keskimmäisen paneelin autoradiogrammia valotettiin myös 10 vuorokautta. Molekyylipainostandardien kohdat on myös esitet-15 ty tässä kuviossa.

Kuten kuviossa 8 osoitetaan, diffuusisti kulkeva (Mr noin 50 000 - 75 000; keskikohta noin kohdalla 60 000) radioaktiiviseksi leimattu proteiini immunosaostui CTLA4lg-proteiinilla, mutta ei CD28lg- tai CD5Ig-proteii- 20 nilla. Tämä molekyyli kulki yhdessä B7-proteiinin kanssa, joka immunosaostui B7+-CH0-soluista CTLA4lg-proteiinilla, .\J ja paljon heikommin CD28lg-proteiinilla. Nämä havainnot • · ;·.·. osoittavat, että CTLA4lg-proteiini sitoo lymfoblastoidi- • · . .·. soluissa yksittäisen proteiinin, joka on samanlainen kool- • · · 25 taan kuin B7-antigeeni.

• · , In vitro -immuunivasteiden inhibitio CTLA4lg-pro- • · · ···· teiinilla ··· • · *···1 2 3 Solujen lisääntymisen inhibitio. Aiemmat tutkimuk set ovat osoittaneet, että monoklonaalinen anti-CD28-vas- ··1 30 ta-aine 9,3 ja monoklonaalinen anti-B7-vasta-aine BB-1 2 • · · :,..ϊ inhiboivat alloantigeenispesifisten Th-solujen lisääntymis- tä kuin myös immunoglobuliinin eritystä alloantigeenia .···. sisältävistä B-soluista [Damle et ai., Proc. Natl. Acad.

• · “ **’ Sei. 78:5 096 (1981); Lesslauer et ai., Eur. J. Immunol.

*. 1: 35 16:1 289 (1986)]. Koska CTLA4-proteiini on korkean affini- 3 • · ♦ · ··· 55 teetin sisältävä B7-antigeenin reseptori, kuten tässä on esitetty, liukoinen CTLA4lg-proteiini testattiin sen kyvyn suhteen inhiboida näitä vasteita. CTLA4lg-proteiinin vaikutukset T-solujen lisääntymiseen tutkittiin kuviossa 9 5 esitetyllä kokeella.

Primaarisen sekalymfosyttireaktion (MLR) blastit stimuloitiin säteilytetyillä T51-lymfoblastoidisoluilla (LC) niin, että läsnä oli konsentraatiot jyrsijän monoklo-naalisen vasta-aineen 9,3 fragmentteja tai B7Ig-, CD28Ig-10 tai CTLA4lg-immunoglobuliini-Cgamma-fuusioproteiineja, tai niitä ei ollut läsnä. Solujen lisääntyminen mitattiin [3H]-tymidiinin inkorporaatiolla 4 vuorokauden kuluttua ja se on ilmoitettu prosenttina siitä inkorporaatiosta, joka tapahtui käsittelemättömissä viljelmissä (21 000 cpm). 15 Kuvio 9 esittää neljän rinnakkaisen määrityksen keskiarvot (keskiarvon keskivirhe < 10 %).

Kuten kuviossa 9 on esitetty, CTLAIg-proteiini inhiboi MLR-reaktiota annoksesta riippuvaisella tavalla maksimi -inhibition ollessa > 90 % niin, että puolet maksimi-20 vasteesta tapahtui konsentraatiossa, joka oli noin 30 ng/ ml (noin 0,8 nM). Monoklonaalisen vasta-aineen 9,3 Fab- .·. ; fragmentti, jonka aiemmin osoitettiin olevan vahvempi MLR- • · · .1 reaktion inhibiittori kuin kokonaisen monoklonaalisen vas- • · · ’ I ta-aineen 9,3 [Damle et ai., J. Immunol. 140:1 753 - 1 761 • · · •*\ 25 (1988)], inhiboi myös MLR-reaktiota, mutta korkeammissa konsentraatioissa (puolet maksimivasteesta vaati konsent- ··· ··.! raation, joka oli noin 800 ng/ml tai noin 30 nM). B7Ig- ja • · · CD28Ig-proteiinit eivät merkittävästi inhiboineet MLR-reaktiota edes korkeammissa konsentraatioissa. Toisessa ko-: 30 keessa B7Ig-proteiinin lisäys yhdessä CTLA4Ig-proteiinin kanssa osittain poisti CTLA4Ig-proteiinin aiheuttaman MLR- • · · *. reaktion inhibition, joka osoitti, että inhibitio johtui • · · *"* spesifisesti interaktioista B7-proteiinin kanssa.

• · ’*;·* Immunoglobuliinierityksen inhibitio. CTLA4lg-pro- • · ί.*·ί 35 teiinin vaikutukset auttaja-T-solujen (Th) indusoimaan im- ··· • t • · ··· 56 munoglobuliinieritykseen tutkittiin myös (kuvio 10). CD4+-T-solut sekoitettiin yhteen allogeenisten CD19+-B-solujen kanssa niin, että läsnä oli osoitetut immunoglobuliinimo-lekyylit, kuten yllä on kuvattu, tai niitä ei ollut. Jyr-5 sijän monoklonaalisia vasta-aineita 0KT8, 9,3 ja BB-1 lisättiin konsentraatioksi 20 pg/ml, ja Ig-fuusioproteiineja konsentraatioksi 10 pg/ml. Kuuden vuorokauden viljelyn jälkeen määritettiin ihmisen IgM-proteiinin konsentraatiot (keskiarvon keskivirhe < 5 %) viljelysupernatanteista ent-10 syymi-immunotestillä (ELISA), kuten yllä on kuvattu. B-solujen, joita oli viljelty CD4+-T-solujen poissaollessa, IgM-proteiinin tuotto oli 11 ng/ml.

Kuten kuviossa 10 on esitetty, CD4+-T-solut stimuloivat IgM-proteiinin tuottoa allogeenisista CD19*-B-so-15 luista (CD4+-T-solujen poissaollessa IgM-proteiinin tasot alenivat 93 %). Monoklonaaliset vasta-aineet 9,3 ja BB-1 inhiboivat merkittävästi Th-indusoitua IgM-proteiinin tuottoa (63 % ja 65 % inhibitio, vastaavasti). CTLA4Ig oli jopa tehokkaampi inhibiittorina (89 % inhibitio) kuin nämä 20 monoklonaaliset vasta-aineet. Verrokki-Ig-molekyylien, monoklonaalisen vasta-aineen 0KT8 ja CD5Ig-proteiinin, :*·.· aiheuttama inhibitio oli paljon pienempi (< 30 % inhibi- • · JV. tio). Yksikään näistä molekyyleistä ei merkittävästi inhi- • · . .*. boinut Ig-tuottoa, joka mitattiin Staphylococcal aureus • · · 25 -enterotoksiini B -proteiinin läsnäollessa. Samanlaiset • · . tulokset saatiin sellaisilla CD4+-T-soluilla ja B-soluilla, jotka olivat peräisin muista luovuttajista. Nämä tulokset • · **··' osoittavat, että CTLA4lg-proteiinin aiheuttama inhibitio on spesifistä.

··· *.* * 30 Yllä olevat tulokset osoittavat myös, että CTLA4- • · · ·...· ja CD28-reseptorit ovat toiminnallisesti kuin myös raken- .:. teellisesti toisilleen sukua. CD28-proteiinin tavoin CTLA4 • ·· · .···. on myös reseptori B-soluaktivaatioantigeenille B7.

CTLA4Ig-proteiini sitoutui 125I-B7-proteiiniin affiniteet- • · · *· *! 35 tivakiolla Kd, joka oli noin 12 nM, joka arvo on noin 20 • •t • · • · ··· 57 kertaa korkeampi kuin affiniteetti CD28- ja B7Ig-proteii-nien välillä (noin 200 nM). Näin ollen CTLA4- ja CD28-pro-teiineja voidaan pitää korkean ja matalan affiniteetin sisältävinä reseptoreina, vastaavasti, samalle ligandille, 5 joka on B7-antigeeni.

CD28- ja B7-proteiinien välinen ilmeinen affiniteetti on samanlainen kuin se affiniteetti, joka on julkaistu liukoisen alloantigeenin sitoutumiselle jyrsijän T-soluhybridooman T-solureseptoriin [noin 100 nM; Schnek et 10 ai., Cell 56: 47 (1989)] ja se on korkeampi affiniteetti kuin interaktiot CD2- ja LFA3-proteiinien välillä [Recny et ai., J. Biol. Chem. 265:8 542 (1990)] tai CD4- ja MHC luokan II molekyylien välillä [Clayton et ai., Nature 339: 548 (1989)]. CTLA4- ja B7-proteiinin välinen ilmeinen af-15 finiteettivakio Kd on jopa korkeampi ja on verrannollinen korkeampien affiniteettien sisältäviin monoklonaalisiin vasta-aineisiin [Kd 2 - 10 000 nM; Alzari et ai., Ann. Rev. Immuno. 6:555 (1988)]. CTLA4- ja B7-proteiinien välinen Kd on samanlainen tai korkeampi kuin integriinireseptorien ja 20 niiden ligandien väliset Kd-arvot [10 - 20 000 nM; Hautanen et ai., J♦ Biol. Chem. 264:1 437 - 1 442 (1989); Di Minno .*.J et ai., Blood 61:140 - 148 (1983); Thiagarajan ja Kelley, :·.·! J. Biol. Chem. 263:3 035 - 3 038 (1988)]. CTLA4- ja B7- • · 1 \ 1' proteiinien välisen interaktion affiniteetti kuuluu näin • · « ***. 25 ollen korkeimpiin tällä hetkellä julkaistuihin lymfoidiad- heesiosysteemeihin.

···

Tulokset osoittavat CTLA4-transkriptien toiminnal- • · · • · *...* lisen proteiinituotteen ensimmäisen ekspression. CTLA4lg, joka on fuusiorakenne, joka sisältää CTLA4-proteiinin so- ··· · 30 lunulkoisen domeenin fuusioituna IgCgammal-domeeniin, muo- dostaa disulfidisidoksellisen dimeerin, jonka alayksikkö-]·. jen Mr on noin 50 000 (kuvio 1). Koska yhdenkään ketjujen välisen disulfidin ei voitu ennustaa muodostuvan tämän • · • ♦ *Γ* fuusion Ig-osaan tuntuu todennäköiseltä, että CTLA4-pro- • · :.*·· 35 teiinin kysteiinit ottavat osaa disulfidisidoksen muodos- ··· • · • · ··· 58 tukseen. Analoginen CD28Ig-fuusioproteiini (Linsley et ai., yllä, 1991) sisältää myös ketjujen välisen (väliset) disulfidisidoksen (disulfidisidokset). Nämä tulokset antavat ehdottaa, että CTLA4-reseptori, kuten CD28-reseptori 5 [Hansen et ai., Immunogenetics 10:247 - 260 (1980)], on T-solujen pinnalla disulfidisidoksellisena homodimeerinä. Vaikka CD28 ja CTLA4 ovat erittäin homologisia proteiineja, ne ovat immunologisesti erilaisia, koska monoklonaali-nen anti-CD28-vasta-aine 9,3 ei tunnista CTLA4-proteiinia 10 (kuviot 4 ja 5).

Ei tiedetä, voiko CTLA4 aktivoida T-solut analogisella signaalireitiliä kuin CD28. Jyrsijän ja ihmisen CTLA4-proteiinin sytoplasmiset domeenit ovat identtisiä (Dariavach et ai., yllä, 1988), joka antaa ehdottaa, että 15 tämä alue on tärkeä tominnallisia ominaisuuksia varten. CD28- ja CTLA4-proteiinien sytoplasmisissa domeeneissa on myös homologiaa, vaikka onkin epäselvää, riittääkö se saamaan aikaan samanlaiset signalointiominaisuudet näille kahdelle molekyylille.

20 CTLA4lg-proteiini on vahva in vitro inhibiittori sellaisille lymfosyytin toiminnoille, jotka vaativat T- : solujen ja B-solujen yhteistyötä (kuviot 9 ja 10). Nämä • · · ;·.·[ löydöt yhdessä aiempien tutkimusten kanssa osoittavat B7- • · ] ^ antigeenin ja sen vastareseptorien CD28 ja/tai CTLA4 vä- ***. 25 listen interaktioiden keskeisen tärkeyden sekä T- että B- lymfosyyttivasteiden säätelyssä. CTLA4Ig-proteiini voisi ··· olla käyttökelpoinen reagenssi tulevissa tutkimuksissa, ··· ·...· joissa näitä interaktioita tutkitaan immuunivasteiden ai kana. CTLA4lg-proteiini on vahvempi in vitro inhibiittori ··· ί 30 lymfosyyttivasteille kuin monoklonaaliset vasta-aineet BB- 1 tai 9,3 (kuviot 9 ja 10). CTLA4lg-proteiinin suurempi vahvuus monoklonaaliseen vasta-aineeseen BB-1 verrattuna johtuu todennäköisimmin näiden molekyylien affiniteetti- *** erosta B7-proteiinia kohtaan (kuvio 6). CTLA4lg-proteiini • · :.*·· 35 on myös vahvempi kuin monoklonaalinen vasta-aine 9,3, ··· • · • · • · · 59 luultavasti siksi, että toisin kuin monoklonaalisella vasta-aineella, sillä ei ole myöskään suoria stimulatorisia vaikutuksia T-solujen lisääntymiseen [June et ai., Immunology Today 11:211 (1989)], jotka voisivat kumota sen in-5 hibitoriset vaikutukset. CTLA4lg-proteiinin immunosuppres- siiviset vaikutukset in vitro antavat ehdottaa, että tulevat tutkimukset suuntautuvat tämän molekyylin mahdollisiin terapeuttisiin vaikutuksiin hoidettaessa sellaisia autoim-muunihäiriöitä, jotka sisältävät poikkeavan T-soluaktivaa-10 tion tai Ig-tuoton.

Kuten on ilmeistä niille alan asiantuntijoille, joita keksintö koskee, esillä oleva keksintö voidaan suorittaa muissakin muodoissa kuin niissä, jotka on yllä spesifisesti kuvattu ilman, että poiketaan keksinnön hen-15 gestä tai keskeisistä ominaisuuksista. Yllä kuvattuja keksinnön tiettyjä suoritustapoja tulee sen vuoksi pitää kuvaavina eikä rajoittavina. Esillä olevan keksinnön piiri on sellainen kuin on kuvattu liitetyissä patenttivaatimuksissa mieluummin kuin että se olisi rajoitettu edellä ole-20 van kuvauksen sisältämiin esimerkkeihin.

Esimerkki 5 .*.J 6-8 viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c (H-2d) ja C57BL/6 (H-2d) -hiiret hankittiin tuottajalta The • · . Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

• · · 25 Ihmisen haimasaarekkeen solut puhdistettiin kolia- • · . genaasidigestion jälkeen, kuten on kuvattu [C. Ricordi et ··· •**j ai., Transplantation 52:519 (1991); A.G. Tzakis et ai-, *···* Lancet 336:402 (1990); C. Ricordi, P.E. Lacy, E.H. Finke, B.J. Olack, O.H. Scharp, Diabetes 37:413 (1988)].

··· · 30 Vastaanottajina käytettiin B6- tai B10-hiiriä, joi- ··· :...ϊ ta oli käsitelty streptotsokiinilla (175 mg per kg kehon painoa) 3-5 vuorokautta ennen kudoksen siirtoa, ja joi- .···, den ei-paastonaikaisen plasman glukoositasot olivat suu- • ♦ *·* remmat kuin 280 mg/dl (niin, että suurimmalla osalla ne • φ *. *: 35 olivat yli 300 mg/dl).

··» • · • · ··« 60

Kullekin eläimelle annettiin noin 800 tuoretta ihmisen haimasaareketta, jotka olivat halkaisijaltaan 150 pm, vasemman munuaiskapselin alle [D. Faustman ja C. Coe, Science 252:1 700 (1991); Y.J. Zeng et ai., Transplanta-5 tion 53:277 (1992)]. Käsittely aloitettiin heti kudoksen siirroksen jälkeen.

Verrokkieläimiä käsiteltiin PBS:llä (yhtenäiset viivat) tai L6-vasta-aineen (pisteviivat) määrällä 50 pg joka toinen vuorokausi 14 vuorokauden ajan heti kudoksen 10 siirroksen jälkeen (kuvio 11Ά). Haimasaarekesiirteiden katsottiin tulleen hyljityiksi, kun glukoositasot olivat suurempia kuin 250 mg/dl kolmena peräkkäisenä vuorokautena. PBS:llä (n = 14) ja L6-vasta-aineella (n = 8) käsiteltyjen eläinten kudossiirteiden keskimääräinen elinikä 15 oli 5,6 ja 6,4 vuorokautta, vastaavasti.

Eläimiä käsiteltiin 10 pg:lla CTLA4lg-proteiinia 14 peräkkäisenä vuorokautena heti kudoksen siirroksen jälkeen (n = 7)(kuvio 11B). Kolme eläintä seitsemästä säilytti kudossiirteensä > 80 vuorokautta. Jäljelle jääneiden nel-20 jän eläimen kudossiirteen keskimääräinen elinikä oli 12,75 vuorokautta.

Eläimiä käsiteltiin 50 pg:lla CTLA4lg-proteiinia • · ·*·*. joka toinen vuorokausi 14 vuorokauden ajan heti ihmisen • « . .·. haimasaarekekudossiirroksen jälkeen (kuvio 11C). Kaikilla ··· 25 eläimillä (n = 12), joita käsiteltiin tällä annoksella, • · φί< kudossiirteet säilyivät koko analyysin ajan (kuvio 11C).

ΊΥ. Valituilta hiiriltä poistettiin munuaiset vuorokausina 21 • · • · *** ja 29 kudossiirroksen jälkeen kudossiirteen toiminnan ar vioimiseksi (kuvio 11C).

·♦· ' • · · *·* * 30 Ihmisen haimasaarekesoluilla siirrostetuista munu- ♦ ·· ·...· aisista tehtiin histologia (kuviot 12A, 12B, 12C, 12D).

Objektilasit analysoitiin sokkona.

.···. Ihmisen haimasaarekkeilla siirrostettujen verrok- ··· kihiirten hematoksyliini- ja eosiinivärjäykset 29 vuoro- • · · *· '· 35 kautta kudoksen siirroksen jälkeen osoittivat massiivisen • · • · ··· 61 lymfosyytti-infiltraation (kuvio 12A). Sama kudos värjättynä insuliinin suhteen ei osoittanut mitään tunnistettavaa insuliinituottoa (kuvio 12B).

CTLA4lg-käsitellyn hiiren kudoksen histologinen 5 tutkimus 21 vuorokautta kudoksen siirroksen jälkeen osoitti koskemattomien haimasaarekkeiden läsnäolon munuaiskap-selin alla niin, että ainoastaan muutamia lymfosyyttejä oli infiltroitunut siirrostettuun kudokseen (kuvio 12C). Kudos värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Sama 10 kudos CTLA4Ig-käsitellystä hiirestä, joka värjättiin insuliinin suhteen, osoitti siirrostettujen haimasaarekkeiden insuliinin tuoton (kuvio 12D). Samanlaiset tulokset havaittiin kudossiirteessä, jota tutkittiin myöhemmissä aikapisteissä. Ylempi, keskimmäinen ja alempi nuolenkärki 15 osoittavat munuaiskapselin, haimasaarekesiirteen ja munuaisen peruskudoksen, vastaavasti.

Histopatologisessa testissä kaikki kudokset faksattiin 10 % puskuroidussa formaliinissa ja ne prosessoitiin, ja 5 pm leikkeet värjättiin joko hematoksyliinillä tai 20 eosiinilla tai insuliinin suhteen avidiini-biotiini-perok-sidaasimenetelmällä [S.M. Hsu, L. Raine, H. Fanger, ·*·.? Histochem. Cytochem. 29:577 (1981)]. Suurennus oli x 122.

• ·

Kuviossa 13 streptotsotokiinikäsitellyt eläimet • · . .·. siirrostettiin, kuten on kuvattu tässä yllä kuviota 11 i · « 25 varten. Hiiriä käsiteltiin joko PBS:llä (pisteviivat) tai • · . ihmisen B7-proteiinia vastaan olevalla monoklonaalisella ··· *”· vasta-aineella (yhtenäiset viivat), jonka annos oli 50 pg, • · *···* joka toinen vuorokausi 14 vuorokauden ajan (kuvio 13).

Verrokkieläinten (joita käsiteltiin PBS:llä)(n =3) kudos- ··· V * 30 siirteen keskimääräinen elinikä oli 3,5 vuorokautta, kun ··· taas anti-B7-vasta-aineella käsiteltyjen eläinten (n = 5) kudossiirteet säilyivät 9 - > 50 vuorokautta (kuvio 13).

.···. Kuviossa 14 normaalisokeriverisille, CTLA4lg-käsi- • · *** tellyille kudossiirrostetuille hiirille (pisteviivat) teh- • · :.**i 35 tiin munuaisen poisto vuorokautena 44 kudoksen siirrostuk- • · · * t • · ··· 62 sen jälkeen ja ne siirrostettiin välittömästi uudelleen joko 1000 ensimmäisen ryhmän luovuttajan haimasaarekkeella (pisteviivat, mustat ympyrät) tai 1 000 toisen ryhmän haimasaarekkeella (pisteviivat, valkoiset ympyrät) jäljelle 5 jääneen munuaiskapselin alle.

Nämä haimasaarekkeet, jotka sulatettiin ensimmäisen kudossiirroksen tekoaikana, sulatettiin ja niitä viljeltiin 3 vuorokautta ennen kudoksen siirrostamista sen varmistamiseksi, että haimasaarekkeet toimivat. BlO-hiiriä, 10 joita oli käsitelty streptotsotokiinilla ja joiden ei-paastonaikaiset glukoositasot olivat suurempia kuin 280 mg/dl, käytettiin verrokkeina (yhtenäiset viivat)(kuvio 14). Mitään hoitoa ei annettu kudoksen siirroksen jälkeen.

Verrokkieläimet hylkivät sekä ensimmäisen ryhmän 15 (yhtenäiset viivat, mustat ympyrät) että toisen ryhmän (yhtenäiset viivat, valkoiset ympyrät) haimasaarekekudos-siirteet neljänteen vuorokauteen mennessä kudoksen siirroksen jälkeen (kuvio 14). CTLA4lg-käsiteltyjen eläinten, jotka oli siirrostettu uudelleen toisen ryhmän haimasaa-20 rekkeilla, kudossiirteen keskimääräinen elinikä oli 4,5 vuorokautta, kun taas eläinten, jotka oli siirrostettu .·. ; uudelleen ensimmäisen ryhmän luovuttajien haimasaarekkeil- • · · la, säilyttivät kudossiirteet koko analysointia jän (> 80 • · I vuorokautta)(kuvio 14).

• · · ***, 25 CTLA4lg-proteiini pidentää merkittävästi ihmisen haimasaarekekudossiirteen elinikää hiirissä luovuttajaspe- » · * ···· sifisellä tavalla antaen näin lähestymistavan immunosup- • · · pressioon C57BL/6 (B6) tai C57BL/10 (BIO) -hiiriä käsiteltiin ··· V · 30 streptotsotokiinilla hiirten haimasaarekkeen B-solujen toiminnan poistamiseksi. Diabeettisille eläimille tehtiin siirros munuaiskapselin alle ja käsittely aloitettiin heti leikkauksen jälkeen. Haimasaarekekudossiirteiden eloon- • · • · jääntiä tarkkailtiin veren glukoosikonsentraatioiden ana- :M 35 lyysillä.

··· • · • · ··· 63

Kudossiirrostettujen verrokkieläinten, joita käsiteltiin joko fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS)(n = 14) tai L6-vasta-aineella (ihmisen kimeerinen monoklonaalinen IgGl-vasta-aine; n = 8), kudossiirteen 5 keskimääräinen elinikä oli 5,6 ja 6,4 vuorokautta, vastaavasti (kuvio 11A).

Tälle päinvastaisesta haimasaarekkeen hyijintä hidastui eläimissä, joita käsiteltiin CTLA4lg-proteiinilla (10 pg per vuorokausi 14 vuorokauden ajan) niin, että neliö jällä eläimellä seitsemästä oli kohtalaisen pidentynyt kudossiirteen keskimääräinen elinikä (12,75 vuorokautta), kun taas jäljelle jääneet kolme eläintä säilyttivät normaalit glukoositasot > 80 vuorokautta (kuvio 11B). Tämä lopulta tapahtuva kohoaminen glukoosikonsentraatioissa voi 15 johtua haimasaarekkeen nääntymisestä, koska mitään todistetta aktiivisesta soluhyljinnästä ei havaittu.

Niiden kolmen eläimen, joilla haimasaarekekudos-siirteet kestivät kauan, glukoosikonsentraatioiden väliaikainen kohoaminen noin vuorokautena 21 kudoksen siirros-20 tuksen jälkeen voi edustaa itserajoittunutta hyljintäepi-sodia, joka on yhdenmukainen CTLA4lg-proteiinin häviämisen ·\ϊ farmakokinetiikan kanssa terapian jälkeen [P.S. Linsley et ai., Science 257:792 (1992)].

• · ————— . .·, Seuraavissa kokeissa CTLA4lg-proteiinin annosta • · · ***. 25 kohotettiin 50 pg: aan per eläin annettuna joka toinen vuo- • · . rokausi noin 14 vuorokauden ajan. Tämä käsittely johti ··· •;*j siihen, että 100 % eläimistä säilytti haimasaarekkeen nor- • · *···* maalin toiminnan kokeen läpi ilman mitään merkkejä hyl- jintäkriisistä (kuvio 11C).

··· : 30 Sen varmistamiseksi, että insuliinituotto oli pe- • · · :...· räisin siirrostetuista haimasaarekkeista eikä hiiren luon- nollisesta haimasta, valituilta eläimiltä poistettiin mu- .···. nuaiset vuorokausina 21 ja 29 haimasaarekekudossiirteiden • · poistamiseksi (kuvio 11C). Näissä eläimissä glukoosikon- • · *. *: 35 sentraatiot kohosivat tasolle noin 350 mg/dl 24 tunnin ··· • « • ♦ ·«· 64 aikana, joka osoitti, että haimasaarekeksenografti oli vastuussa normaalien glukoositasojen ylläpidosta. Tuntuu siltä, että CD28-B7-interaktion blokeeraaminen inhiboi ksenogeenisen haimasaarekekudossiirteen hyljinnän.

5 Liukoisella reseptorilla, nimittäin CTLA4Ig-fuusio- proteiinilla, saadut hoitovaikutukset eivät johtuneet Fc-osan sitoutumisesta (L6-vasta-aine ei vaikuttanut siirteen hyljintään) tai yleisistä vaikutuksista T-solu- tai B-so-lutoimintoihin in vivo.

10 Tehtiin histologiset analyysit haimasaarekekseno- grafteista verrokki- (PBS:llä käsitellyt) ja CTLA4lg-pro-teiinilla käsitellyistä hiiristä (kuviot 12A, 12B, 12C, 12D). Verrokkieläimen haimasaarekekudoksessa oli merkkejä immuunihyljinnästä niin, että merkittävä lymfosyyttien 15 infiltraatio oli tapahtunut siirteeseen ja muutamiin jäljelle jääneisiin haimasaarekkeisiin (kuvio 12A).

Immunohistologinen värjäys osoitti, että insuliini- positiivisia soluja oli läsnä ainoastaan harvoin ja että somatostatiinipositiivisia soluja ei ollut läsnä ollenkaan 20 (kuvio 12B). Tälle päinvastaisesti CTLA4lg-käsiteltyjen eläinten siirrostettu kudoksessa ei ollut tapahtunut mi- j*.^ tään lymfosyyttien infiltraatiota (kuvio 12C).

• ·

Kudossiirteet olivat koskemattomia niin, että näky- • · • · , .·. vissä oli monia haimasaarekkeita. Lisäksi, ihmisen haima- • · · 25 saarekekudoksessa havaitut B-solut tuottivat ihmisen insu- • · , liinia (kuvio 12D9 ja somatostatiinia.

• · · Tässä tutkimuksessa käytetty ihmisen CTLA4lg-pro- • · *···* teiini reagoi sekä jyrsijän että ihmisen B7-proteiinin kanssa. Eräs ksenogeenisen kudossiirrostusmallin etu on ··· V * 30 sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen saatavuus, joka ··« ϊ.,.Σ reagoi ihmisen B7-proteiinin kanssa, mutta ei reagoi hii- ren B7-proteiinin kanssa [T. Yokochi, R.D. Holly, E.A. Clark, J. Immunol. 128:823 (1982)]. Näin ollen ihmisen B7- • « *Γ antigeeniä sisältävien solujen (APC:t) roolia voidaan tut- ♦ · V*: 35 kia suoraan.

··· • · • · ··· 65

Hiiret siirrostettiin, kuten on kuvattu, ja sitten niitä käsiteltiin 50 pg:lla ihmisen B7-proteiinia vastaan olevaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka toinen vuorokausi 14 vuorokauden ajan kudoksen siirroksen jälkeen.

5 Tämä käsittely pidensi kudossiirteen elinikää käsitellyissä hiirissä (9 - > 50 vuorokautta) verrattuna siihen, joka saatiin verrokkihiirillä (kuvio 13). Monoklonaalinen anti-B7-vasta-aine ei kykene blokeeraamaan hyljintää yhtä tehokkaasti kuin CTLA4Ig-proteiini.

10 CTLA4Ig-terapia aiheutti kudossiirteen hyväksynnän suurimmassa osassa hiiriä. Eläimet eivät kuitenkaan ehkä ole vastustuskykyisiä. Lyhytaikainen immunosuppressio voi johtaa pysyvään haimasaarekekudossiirteen hyväksyntään johtuen siirteen adaptaatiosta (immunogeenisyyden häviä-15 misestä johtuen APC-toiminnan häviämisestä)[L. Hao, Y. Wang, R.G. Gill, K.J. Lafferty, J. Immunol. 139:4 022 (1987); K.J. Lafferty, S.J. Prowse, M. Simeonovic, Annu. Rev. Immunol. 1:143 (1983)].

Näiden mahdollisuuksien erottamiseksi poistettiin 20 munuaiset valituista ksenograftisiirrostetuista CTLA4lg- käsitellyistä hiiristä (vuorokausi 40) ja siirrostettiin uudelleen jäljelle jääneen munuaiskapselin alle joko alku- • · ·1·’. peräisen luovuttajan haimasaarekkeilla (ensimmäinen ryhmä) • · . tai ei-sukua olevan toisen ryhmän ihmisen haimasaarekkeil- • 1 · 1 ....: 25 la (kuvio 14).

• · (.t Streptotsotokiinikäsitellyt verrokkieläimet, jotka *!” eivät koskaan olleet saaneet haimasaarekekudossiirrettä, • · • ♦ ·2 kudossiirrostettiin myös joko ensimmäisen tai toisen ryh män haimasaarekkeilla. Mitään käsittelyä kudossiirroksen ··· • · · *·1 1 30 jälkeen ei annettu. Verrokkieläimet hylkivät ensimmäisen • · · ·...1 ja toisen ryhmän haimasaarekekudossiirteet neljänteen vuo- rokauteen mennessä. Ne CTLA4lg-käsitellyt eläimet, jotka • · · · .···. olivat saaneet toisen ryhmän haimasaarekkeet, hylkivät nämä haimasaarekkeet viidenteen vuorokauteen mennessä, kun • · · 2 '· 35 taas eläimet, jotka olivat saaneet ensimmäisen ryhmän luo- • · · • · • · • · · 66 vuttajan haimasaarekkeet, säilyttivät kudossiirteensä > 80 vuorokautta (kuvio 14).

Nämä tulokset antavat ehdottaa, että CTLA4lg-käsit-tely johti ksenogeenisten haimasaarekkeiden pidentyneeseen 5 luovuttajaspesifiseen passiivisuuteen. Jyrsijän immuunivasteen kyky erottaa erot ihmisen haimasaarekeluovuttaj ien välillä myöskin tukee ihmisen haimasaarekesoluissa eksp-ressoituvien polymorfisten MHC-tuotteiden suoraa tunnistusta.

10 Esimerkki 6 6-8 viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c (H-2d) ja C57BL/6 (H-2d) -hiiret hankittiin tuottajalta The

Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Monoklonaalinen vasta-aine 11B11 on rotan IgGl-an-15 ti-hiiri-lL4-vasta-aine (Ohara, J. ja W.E. Paul, 1985,

Production of a monoclonal antibody to and molecular characterization of B-cell stimulatory factor-1, nature 315:333)(Verax, Lebanon, NH).

BALB/c-hiiret (viisi per ryhmä) immunisoitiin suo- 20 nensisäisesti 10s SRBC-solulla yksinään tai yhdessä 200 pg:n kanssa kimeeristä monoklonaalista L6-vasta-ainetta .’.J tai ihmisen CTLA4lg-fuusioproteiinia. Osoitettuja ryhmiä • · käsiteltiin 2 tuntia ennen SRBC-solujen injektiota injek- • · ] ... toimalla vatsaonteloon 2 ml joko rotan immunoglobuliinia • · · **'. 25 tai rotan monoklonaalista anti-jyrsijä-IL-4-vasta-ainetta . 11B11 konsentraationa 5 mg/ml. Käsittely kimeerisellä mo- • · · •*;j noklonaalisella vasta-aineella L6 tai CTLA4Ig-proteiinilla • · *···* toistettiin päivittäin 4 vuorokauden ajan lisää.

Kaikille eläimille annettiin suonensisäinen injek- • · · · 30 tio SRBC-soluja (kuvio 15) tai KLH-proteiinia (kuvio 16) • · · ϊ.,.ί vuorokautena 46. Spesifisesti kuviossa 15 mustat ympyrät edustavat niitä hiiriä, joille annettiin ainoastaan SRBC- .···. soluja vuorokautena 0 ja 46. Valkoiset ympyrät edustavat • · |·* hiiriä, joille annettiin ainoastaan SRBC-soluja vuorokau- *· *: 35 tena 46. Kuviossa 15 esitetyille jäljelle jääneille hii- • · · • · • · • · · 67 rille annettiin lisää SRBC-soluja vuorokautena 46. Tälle päinvastaisesti kuviossa 16 hiirille annettiin erilaista inununogeeniä, KLH-proteiinia, ainoastaan vuorokautena 46.

Niiden hiirten, joiden mitattiin sisältävän SRBC-5 soluja ja KLH-proteiinia vastaan olevia vasta-aineita, seerumikonsentraatiot määritettiin ELISA-menetelmällä, kuten on kuvattu (Linsley et ai., Science, 1992).

Seerumin vasta-ainetiitterit laskettiin sinä laimennoksena, joka antoi A450-lukeman, joka oli viisinkertai-10 nen taustaan verrattuna. Kuvion 15 seerumin vasta-ainetiitterit määritettiin yhdistetyistä seerumeista viidestä hiirestä per ryhmä, kun taas kuvion 16 seerumin vasta-ainetiitterit edustavat viiden yksittäisen seerumin tiitte-reiden keskiarvoa. Nuolenkärjet osoittavat SRBC- tai KLH-15 injektiota vuorokautena 46.

Kuviot 15 ja 16 osoittavat, että immunologinen vaste niissä hiirissä, joihin injektoitiin yhtäaikaa sekä CTLA4lg- että anti-IL4-proteiinia (valkoiset kolmiot), suppressoituu antigeenispesifisellä tavalla.

20 Kuvio 15 osoittaa, että seerumin vasta-ainetiitte- rissä ei tapahdu mitään nousua (se tarkoittaa, mitään pri-määristä tai sekundaarista immunologista vastetta) niissä • · hiirissä, joihin injektoitiin yhtäaikaa CTLA4lg- ja anti- • · . .·. IL4-proteiinia, ja joihin injektoitiin SRBC-soluja vuoro- • · · 25 kautena 0 ja 46. CTLA4lg- ja anti-IL4-proteiinien yhdis- • · . telmä suppressor primaarista ja sekundaarista immuunivas- • · · w tetta ja indusoi pitkäkestoisen immunologisen passiivisuu- • · **··* den SRBC-soluja vastaan.

Lisäksi kuvio 15 osoittaa, että niissä hiirissä, ··· *.* * 30 joihin injektoitiin yhtäaikaa CTLA4lg-proteiinia ja rotan ··· verrokki-Ig-proteiinia (Cappel, Organontecknika, Palo .:. Alto, CA), ei tapahtunut mitään primaarista immuunivastet- • ·· · .···. ta. Näissä hiirissä tapahtui kuitenkin sekundaarinen im- • · ]·* muunivaste sen jälkeen, kun injektoitiin SRBC-soluja vuo- *. *: 35 rokautena 46 (mustat kolmiot, kuvio 15).

··· • · • · • · · 68

Kuvio 16 osoittaa, että CTLA4lg- ja anti-IL4-proteiinin anto, jota seuraa erilaisen immunogeenin, KLH-pro-teiinin, anto vuorokautena 46, ei hiirissä suppressor primaarista immuunivastetta KLH-proteiinia vastaan. Sen si-5 jaan näissä hiirissä tapahtui primaarinen immuunivaste KLH-proteiinia vastaan (valkoiset kolmiot, kuvio 16). Näin ollen hiirissä, joita käsiteltiin CTLA4lg- ja anti-IL4-proteiineilla, tapahtui erittäin spesifinen immuunivaste, joka oli riippuvainen niille annetusta antigeenistä.

10 Esimerkki 7

Kohdennetulla ja homologiamutageneesillä olemme tunnistaneet ne CTLA4Ig-alueet, joita tarvitaan sen korkean affiniteetin sitoutumiseen B7-1-proteiiniin. Seuraa-vassa on kuvaus siitä, miten tehdään liukoiset CTLA4/CD28-15 fuusioproteiinit, jotka sitoutuvat B7-proteiiniin.

Materiaalit ja menetelmät

Monoklonaaliset vasta-aineet (mAb:t). CTLA4-prote-iinille spesifiset jyrsijän monoklonaaliset vasta-aineet valmistettiin ja ne karakterisoitiin, kuten aiemmin on 20 kuvattu [Linsley et ai., J. Exp. Med. 176:1 595 - 1 604 (1992)]. Vasta-aine 9,3 (anti-CD28) on kuvattu aiemmin [Hansen et ai., Immunogenetics 10:247 - 260 (1980)].

• ·

Soluviljely. Stabiilisti transfektoitujen B7-l-po- • · . .·. sitiivisten CHO-solujen valmistus on kuvattu aiemmin • · · .[**. 25 [Linsley et ai., J. Exp. Med. 173:721 - 730 (1991); P.S.

Linsley et ai., J. Exp. Med. 174:561 (1991)].

**** Soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, johon oli li- • · ***** sätty 10 % naudan sikiön seerumia (FBS), 0,2 mM proliinia ja 1 uM metotreksaattia. COS-soluja kasvatettiin DMEM- ··· :.* * 30 alustassa, johon oli lisätty 10 % FBS:ia. CTLA4lg-proteii- ··« ·...· ni valmistettiin CHO-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu .:. (esimerkki 2).

···· .···. Kohdennetun mutaation sisältäviä CTLA4lg- ja • · '·' CD28Ig-proteiineja ekspressoivat plasmidit. Kohdennettu *.**: 35 mutageneesi suoritettiin vektorilla, joka kooditti CTLA4- ··♦ • · • · ·♦· 69 proteiinin kimeeristä liukoista muotoa (CTLA4Ig), jossa CTLA4-proteiinin solunulkoinen domeeni oli geneettisesti fuusioitu ihmisen IgG-raskasketjun sarana- ja vakioaluei-siin (esimerkki 2). Kohdennetut CTLA4lg-mutaatiot valmis-5 tettiin koodittamalla haluttu mutaatio päällekkäin meneviin oligonukleotidialukkeisiin ja muodostamalla mutantit PCR-reaktiolla (Ho et ai., 1989, yllä) käyttäen CTLA4lg-plasmidirakennetta templaattina.

Valmistettiin kuusi mutanttia, jotka koodittivat 10 alaniinisubstituutioita erittäin konservoituneessa heksa-peptidissä 98MYPPPY103, joka muodostaa osan mahdollisesta CDR3-kaltaisesta domeenista (kuviot 17 ja 22)(Ho et ai., 1989, yllä). Nämä mutantit on kuvattu taulukossa II.

Lisäksi valmistettiin samalla menetelmällä myös 15 kaksi mutanttia, jotka koodittivat CD28lg-proteiinin hek-sapeptidin 99MYPPPY104 jäännöksiä P103A ja Y104A (MYPPAY ja MYPPPA, vastaavasti) käyttäen CD28Ig-proteiinia templaattina. Nämä mutantit on kuvattu myös taulukossa II.

PCR-reaktioihin, mutta ei mutaatioiden lisäämiseen, 20 tarvittavat alukkeet sisälsivät (1) CDM8-plasmidin 5'-puolen alukkeen (CDM8FP), joka kooditti CDM8-plasmidin täyt- :1·.· töalueen 5'-päässä olevan HindiII-restriktiokohdan yläpuo- • · ;1·1; lista komplementaarista sekvenssiä, ja (2) 3'-puolen aluk- • · . .·. keen (CDM8RP), joka kooditti CDM8-plasmidin täyttöalueen • · · 25 3 ' -päässä olevan Xbal-kohdan alapuolista komplementaarista • · . sekvenssiä.

• · · "1I Nämä alukkeet koodittivat seuraavia sekvenssejä: • ·

‘ CDM8FP: 5'-AATACGACTCACTATAGG

CDM8RP: 5'-CACCACACTGTATTAACC

« · · • 1 · *.1 1 30 PCR-reaktio-olosuhteet olivat 6 minuuttia • · · ·...· 94 °C:ssa, jota seurasi 25 sykliä, joka oli 1 minuutti 94 °C:ssa, 2 minuuttia 55 °C:ssa ja 3 minuuttia 72 °C:ssa.

• ·· · .···. Taq polymeraasi ja reaktio-olosuhteet olivat myyjän suo- • · sittelemat (Perkin Elmer Cetus, Emeryville, CA). PCR-tuot- • · · • ·· • · · · • · • · ·»· teet digestoitiin Hindlll- ja Xbal-entsyymeillä ja ne li- goitiin Hindlll/Xbal-katkaistuun CDM8-ekspressiovektoriin.

70

Sen varmistamiseksi, että halutut mutaatiot olivat insertoituneet ja sekundaaristen mutaatioiden poissaolon 5 varmistamiseksi kukin CTLA4lg-mutantti£uusioproteiini (esimerkki liukoisesta CTLA4-mutanttifuusioproteiinista) sekvensoitiin dideoksinukleotideihin perustuvalla ketjun lopetus/pidennysreaktiolla Sequenase-reagensseilla, joita käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (United States 10 Biochemical Corp., Cleveland, OH).

Plasmidit transfektoitiin COS-soluihin [Aruffo et ai., Cell 61:1 303 (1990)] ja käytettyä alustaa käytettiin tuloksena syntyneiden Ig-mutanttifuusioproteiinien lähteenä.

15 CTLA4/CD28lg-hybridiekspressioplasmidit. CTLA4/CD- 28lg-hybridikartoitusplasmidit, jotka koodittivat rakenteita HS2, HS4, HS4-A, HS4-B ja HS5 (kuvio 19 ja taulukko I), valmistettiin PCR-reaktiolla käyttäen päällekkäin meneviä oligonukleotidialukkeita, jotka oli suunniteltu li-20 säämään CTLA4-sekvenssejä CD28Ig-proteiiniin niin, että ne samalla deletoivat ekvivalentin alueen pois CD28-sekvens- ;\· sistä. Käytettiin samoja CDM8-plasmidin 5'- ja 3'-puoleis- • · ;·.·. ia PCR-alukkeita, jotka on kuvattu yllä.

. .·. Seuraava on luettelo valmistetuista CTLA4/CD28-hyb- • · · 25 ridifuusioproteiineista.

• · ··· • ··· ··· • · • · ··· «·· • · · • · « «·· • ♦ • · ··· ··♦ ··♦· ·1· • ♦ • · ··· · • · · • ·· • · ♦ ·· • · • · 71

Nimi Runkorakenne Moditikaatiot HS1 CTLA4 CD28-proteiinin jäännökset 1-24 CD28-proteiinin jäännökset 97-125 HS2 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 1-22 5 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-125 HS3 CDLA4 CD28-proteiinin jäännökset 96-125 HS4 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-123 HS4A CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-113 HS4B CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 114-123 10 HS5 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 25-32 HS6 CTLA4 CD28-proteiinin jäännökset 25-32 HS7 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-123 CTLA4-proteiinin jäännökset 25-32 HS8 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 25-32 15 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-113 HS9 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 25-32 CTLA4-proteiinin jäännökset 114-123 HS10 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-123 CTLA4-proteiinin jäännökset 51-58 20 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-123 HS12 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 51-58 :*·.· CTLA4-proteiinin jäännökset 96-113 • · HS13 CD28 CTLA4-proteiinin jäännökset 25-32 • · . .·. CTLA4-proteiinin jäännökset 51-58 25 CTLA4-proteiinin jäännökset 96-113 • · HS14 CD28 CDLA4-proteiinin jäännökset 51-58 ···· • ·· • · ’···* Kukin cDNA-rakenne liitettiin geneettisesti sellai seen cDNA:han, joka kooditti ihmisen IgGl-proteiinin sara- • ·· *.* : 30 na- ja vakioalueita, liukoisten kimeerien valmistamiseksi.

·»· HS6-hybridi valmistettiin samalla tavalla kuin on kuvattu yllä paitsi, että CDR-1-kaltainen alue CTLA4lg- ··♦· .···. proteiinissa korvattiin CD28lh-proteiinin ekvivalentilla • · ’·* alueella.

• · * · · • ·· • · • · · • · • · • · · 72 HS7-, HS8- ja HS9-rakenteet valmistettiin korvaamalla HS4-, HS4-A- ja HS4-B-rakenteiden noin 350 emäsparin pituinen HindIII/HpaI-5'-fragmentti, vastaavasti, ekvivalentilla cDNA-fragmentilla, joka digestoitiin samalla ta-5 valla HS5-rakenteesta, näin sisällyttämällä CTLA4-proteiinin CDR1-kaltainen silmukka niihin hybrideihin, jotka jo sisälsivät CTLA4-proteiinin CDR3-kaltaisen alueen.

HS10- - HS13-rakenteet ovat domeenihomologiamutant-teja, jotka valmistettiin sisällyttämällä CTLA4Ig-prote-10 iinin CDR2-kaltainen silmukka aiemmiin rakennettuihin ho-mologiamutantteihin. Tämä suoritettiin päällekkäin menevällä PCR-mutageneesillä, jossa alukkeet suunniteltiin niin, että ne sisällyttivät CTLA4-proteiinin CDR2-kaltai-set sekvenssit homologiatemplaatteihin samalla deletoiden 15 ekvivalentin CD28-proteiinin CDR2-kaltaisen alueen moke-lyylistä.

Sen mukaisesti HS4 toimi templaattina rakenteen HS10 valmistukselle; HS7 toimi templaattina HS 11-rakenteen valmistukselle; HS4-A toimi templaattina HS12-rakenteen 20 valmistukselle ja HS8 toimi templaattina HS13-rakenteen valmistukselle (kuvio 19 ja taulukko I). Yllä kuvattuja •*.J CDM8-alukkeita käytettiin myös näissä rakenteissa.

• · HS14-hybridirakenne valmistettiin korvaamalla CD28- • · [ proteiinin CDR2-kaltainen silmukka ekvivalentilla CTLA4Ig- • · · ***. 25 proteiinin silmukalla (kuvio 19 ja taulukko I).

• · . Oligonukleotidialukkeita, jotka oli suunniteltu ··· •••j sisällyttämään nämä muutokset, käytettiin päällekkäin me- • · *···* nevässä PCR-mutageneesissä, joka oli identtinen muille mutanteille kuvatun mutageneesin kanssa.

«·· V * 30 PCR-reaktiot ja jatkokloonaukset CDM8-plasmidiin ··· suoritettiin, kuten on kuvattu yllä. Jälleen kaikki mutan-I:. tit sekvensoitiin dideoksinukleotidiketjulopetus/pidennys- reaktiolla.

• · • · *!* Kutakin mutanttia koodittavat plasmidit transfek- * · 35 toitiin COS-soluihin ja tuloksena syntyneet liukoiset Ig- ♦ ·· • · • · ··· fuusioproteiinit kvantitoitiin viljelyalustassa ja ne teh tiin silmin näkyviksi Western-blot-menetelmällä, kuten on kuvattu seuraavissa kappaleissa.

73

Tuloksena syntyneiden Ig-fuusioproteiinien kvanti-5 taatio viljelyalustoissa. Liukoiset mutanttifuusioprote-iinit kvantitoitiin entsyymi-immuuni testillä määrittämällä se määrä Ig-proteiinia, joka oli läsnä seerumivapaissa COS-soluviljelyalustoissa.

Mikrotiitterilevyt (Immulon2; Dynatech Labs., 10 Chantilly, VA) päällystettiin vuohen anti-ihmis-IgG-pro-teiinilla (Jackson Immunoresearch Labs., West Chester, PA), jonka konsentraatio oli 0,5 pg/ml, 16 - 24 tunnin ajan 4 °C:ssa. Kuopat blokeerattiin yhden tunnin ajan näy-telaimentimella (Genetic Systems, Seattle, WA), sitten ne 15 pestiin PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20 -detergent-tiä (PBS-Tw).

Fuusioproteiineja sisältävät COS-soluviljelyalustat lisättiin eri laimennoksina ja niitä inkuboitiin yksi tunti 22 °C:ssa. CTLA4lg-proteiinin tunnetut konsentraatiot 20 lisättiin myös eri kuoppiin kullekin levylle standardikäy-rää varten.

Pesun jälkeen lisättiin piparjuuriperoksidaasikon- • · :*.·. jugoitua (HRP) vuohen anti-ihmis-igG-proteiinia (Tago, . .·. Burlingame, CA), joka oli laimennettu 1:12 000, ja inku- • · ♦ 25 boitiin yksi tunti 22 °C:ssa. Sitten kuopat pestiin ja • * . niitä inkuboitiin 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiinisubst- ··# ***j raatin (TMB) kanssa (Genetic Systems) 15 minuuttia ennen • · *···* reaktion lopettamista lisäämällä 1 N H2S04: ää. Optinen ti heys mitattiin kahdella aallonpituudella, 450 nm ja 630 ··· *.* * 30 nm, mikrotiitterilevylukijalla (Genetic Systems).

«··

Ig-mutanttifuusioproteiinin konsentraatio määritet- « tiin vertaamalla sitä tunnettujen CTLA4Ig-proteiinikon- φ·*·# sentraatioiden avulla tehtyyn standardikäyrään.

* · *Γ Immunosaostus ja Western-blot-analyysi. Viljely- ·.**: 35 alustoissa läsnäolevat CTLA4/CD28lg-hybridifuusioproteii- • · · • · • · • · · 74 nit absorboitiin proteiini A - Sepharose -matriksiin yli yön inkubaatiolla 4 °C:ssa. Partikkelit pestiin PBSillä, joka sisälsi 0,1 % Nonidet-P40-detergenttiä (NP40), sitten lisättiin SDS-PAGE-näytepuskuria ja eluoitunut proteiini 5 ladattiin SDS-polyakryyliamidigeeliin.

Proteiinin Western-blot-siirto nitroselluloosalle suoritettiin standardimenetelmillä. Nitroselluloosamemb-raanit blokeerattiin sitten PBSillä, joka sisälsi 0,1 % NP40-detergenttiä ja 1 % rasvatonta kuivamaitojauhetta.

10 Kun oli pesty PBS-Tw-liuoksella, membraaneja inku- boitiin alkalisella fosfataasilla konjugoidun vuohen anti-ihmis-IgG-proteiinin kanssa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), joka oli laimennettu 1:1 000, ja inku-boitiin yksi tunti 22 °C:ssa. Sitten blotit pestiin ja ne 15 kehitettiin käyttäen standardimenetelmiä.

B7-positiivisten CHO-solujen entsyymi-immuuni testi ♦ CTLA4Ig-mutanttifuusioproteiinien ja CTLA4/CD28Ig-hybridi-fuusioproteiinien kyky sitoutua B7-l-proteiiniin, joka stabiilisti ekspressoituu CHO-soluissa, määritettiin ent-20 syymi-immuunitestillä.

Käsitellyt pyöreäpohjaiset 96-kuoppaiset kudosvil- .*.J jelymikrotiitterilevyt (Corning, Corning, NY) ympättiin • · B7-l-positiivisilla CHO-soluilla tiheytenä 103 solua/kuop- • · . pa. Kaksi vuorokautta myöhemmin konfluentit solut fiksat- • · · 25 tiin 95 % etanolissa 15 minuuttia.

• · . Kun oli pesty PBS-Tw-liuoksella, Ig-mutanttifuusio- ··* ·*·j proteiinit lisättiin eri konsentraatioina ja niitä inku- • ♦ *···* boitiin yksi tunti 4 °C:ssa. Pesun jälkeen lisättiin HRP- konjugoitua vuohen anti-ihmis-IgG-proteiinia (Tago), joka ··« V · 30 oli laimennettu 1:10 000, ja inkuboitiin yksi tunti 22 °C:ssa.

Sitten kuopat pestiin ja lisättiin TMB-substraat-tia, kuten yllä, ja sen sallittiin reagoida 30 minuuttia • · *1* ennen kuin reaktio lopetettiin 1 N H2S04:llä. Kuoppien ab- • · ·.**: 35 sorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 nm.

··· • · • · ··« 75

Kohdennetun mutaation sisältävän CD28Ig-fuusiopro-teiinin sitoutumistesti. Kohdennetut mutaatiot sisältävät CD28lg-fuusioproteiinit testattiin niiden kyvyn suhteen sitoutua B7-1-proteiiniin epäsuoralla entsyymi-immuunites-5 tiliä.

ELISA-levyjen kuopat päällystettiin kimeerisellä fuusioproteiinilla, joka sisälsi ihmisen B7-l-proteiinin solunulkoisen domeenin fuusioituna hiiren IgGl-proteiinin Fc-alueeseen, konsentraatiolla 5 pg/ml 16 tunnin ajan 10 4 °C:ssa. Kuopat blokeerattiin yhden tunnin ajan näytelai- mentimella (Genetic Systems), sitten ne pestiin PBS-Tw-liuoksella. Tunnetut konsentraatiot mutanttifuusioprote-iineja sisältäviä COS-soluviljelyalustoja lisättiin eri konsentraatioina ja niitä inkuboitiin yksi tunti 15 22 °C:ssa.

Tunnetut konsentraatiot CD28lg-proteiinia lisättiin myös eri kuoppiin kullekin levylle. Pesun jälkeen lisättiin HRP-konjugoitua vuohen anti-ihmis IgG-proteiinia (Tago), joka oli laimennettu 1:10 000, ja inkuboitiin yksi 20 tunti 22 °C:ssa. Lisättiin TMB-substraattia ja optiset tiheydet luettiin samalla tavalla kuin on kuvattu Ig-fuu- ;*.J sioproteiinien kvatitoimiseksi viljelyalustoissa.

• · :*.·. Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutuminen Ia- • · “ 11 ......... 11 ' 1 **— . .·. fuusioproteiineihin. Monoklonaalisten anti-CTLA4-vasta- • · · 25 aineiden ja monoklonaalisen anti-CD28-vasta-aineen 9,3 • · . kyky sitoutua CTLA4/CD28lg-hybridifuusioproteiineihin ja • · · ·*“ CTLA4lg-mutanttifuusioproteiineihin arvioitiin entsyymi- • · ’···* immuuni testillä.

Mikrotiitterilevyjen (Immulon 2) kuopat päällystet- • · · ·.· · 30 tiin vuohen anti-ihmis-IgG-proteiinilla (Jackson), jonka • · · konsentraatio oli 0,5 pg/ml, 16 - 24 tunnin ajan 4 °C:ssa.

.:. Levyt blokeerattiin yhden tunnin ajan näytelaimentimella .···. (Genetic Systems), pestiin PBS-Tw-liuoksella, sitten inku- • · *·* boitiin Ig-fuusioproteiinien kanssa yksi tunti 22 °C:ssa.

• · *. *: 35 Pesun jälkeen kuoppia inkuboitiin monoklonaalisten vasta- ··· • · • · • · · aineiden konsentraation 1 pg/ml kanssa yhden tunnin ajan 22 °C:ssa.

76

Lisäpesun jälkeen lisättiin HRP-konjugoitua vuohen anti-ihmis-IgG-proteiinia (Tago), joka oli laimennettu 5 1:10 000, ja inkuboitiin yksi tunti 22 °C:ssa. Lisättiin TMB-substraattia ja optinen tiheys mitattiin, kuten yllä on kuvattu.

CTLA4-proteiinin molekulaarinen malli. Likimääräinen kolmiulotteinen malli CTLA4-proteiinin solunulkoisesta 10 domeenista muodostettiin perustuen IGSF-proteiinin variaa-belialueen kaltaisten domeenien konsensusjäännöksien konservoi tumi s een .

Käyttäen sellaisia ISGF-konsensusjäännöksiä "ankkurina" sekvenssin alekkain vertailuissa, CTLA4-jäännökset 15 nimettiin Ig-variaabelin laskoksen (Williams/Barclay, 1988, yllä) ja liitossilmukka-alueiden A-, B-, C-, C’-, C'-, D-, E-, F- ja G-juosteiksi (kuvio 22).

CTLA4-malli rakennettiin (InsightII, Discover, mo-lekyylimallitus- ja mekaniikkaohjelmat, vastaavasti, Bio-20 sym Technologies, Inc., San Diego) käyttäen HyHEL-5-pro-teiinin variaabelia raskasketjua (Sheriff et ai., PNAS 84: .*.J 8075 -8079, 1987) templaattirakenteena. Sivuketjujen kor- • · vaukset ja silmukkamuodot arvioitiin käyttäen konformaa- • · . .·. tiohakua (Bruccoleri et ai., 1988, 335:564 - 568).

• · · 25 Mallin useita eri versioita, joissa 8-juosteiden • · . tai silmukoiden joitakin jäännöksiä modifioitiin, testat- ··· tiin käyttäen 3D-profiilianalyysiä (Ltithy et ai., Nature *···* 336:83 - 85, 1992) sen alkuperäisen alekkain vertailun parantamiseksi, jossa verrattiin CTLA4-proteiinin solunul- ··· : 30 koisen alueen sekvenssiä IGSF-proteiinin variaabelin las- ··· ϊ.,.ϊ koksen kanssa.

Tulokset CTLA4Ig- ja CD28lg-mutanttifuusioproteiinien raken- • · *1* nus ja sitoutumisaktiivisuus. CD28- ja CTLA4-proteiinien • · 35 eri homologien sekvenssien alekkain vertailu on esitetty ··· • · • · ··· 77 kuviossa 17. Kuviossa 17 on vertailtu alekkain ihmisen (H), hiiren (M), rotan (R) ja kanan (Ch) CD28-proteiinin sekvenssejä ihmisen ja hiiren CTLA4-proteiinisekvenssien kanssa. Jäännökset on numeroitu kypsän proteiinin N-päästä 5 niin, että signaalipeptidit ja membraanin läpi menevät domeenit on alleviivattu ja CDR-alueelle analogiset alueet on mainittu. Tummaksi varjostetut alueet esittävät täydellisesti konservoituneita jäännöksiä, kun taas vaalealla varjostetut alueet esittävät konservatiivisia aminohappo-10 substituutioita kaikissa ryhmän jäsenissä.

Sekvenssiltään konservoituneet alueet ovat jakautuneet näiden proteiinien solunulkoisiin domeeneihin niin, että aukottomin konservaatio havaitaan MYPPPY-heksapepti-diosassa, joka sijaitsee sekä CTLA4- että CD28-proteiinin 15 CDR3-kaltaisessa silmukassa (kuvio 17). Tämä antaa ehdottaa, että tällä alueella on mahdollinen rooli interaktiossa B7-proteiinin, esim. B7-1- ja B7-2-proteiinin, kanssa.

Tämän mahdollisuuden testaamiseksi tälle CTLA4lg- proteiinin alueelle tehtiin kohdennetut alaniinikartoitus- 20 mutaatiot käyttäen PCR-oligonukleotidialukeohjattua muta- geneesiä CTLA4lg-mutanttifuusioproteiinien valmistamisek- β·# . si. CD28Ig-proteiinin MYPPPY-osaan tehtiin samalla tavalla • ·· ,1.* kaksi alaniinimutaatiota CD28lg-mutanttifuusioproteiinien * ** valmistamiseksi.

• · · *···] 25 Kaikki cDNA-rakenteet sekvensoitiin haluttujen mu taatioiden varmistamiseksi ennen transfektiota COS-solui- ...i hin. Ig-mutanttifuusioproteiinien konsentraatiot seerumi- ··· ·...· vapaassa COS-soluviljelyalustassa määritettiin Ig-kvanti- taatiotestillä.

30 Kunkin CTLA4Ig-mutanttifuusioproteiinin kyky sitou- ·1; tua B7-1 -proteiiniin, joka ekspressoitui stabiilisti • · · transfektoiduissa CHO-soluissa, määritettiin sitten epä- ··· ·”* suoralla solusitoutumisimmuunitestillä. CD28lg-mutantti- • · *···* fuusioproteiinien sitoutuminen B7-l-proteiiniin arvioitiin • · • · · • ·· • · • · • · ··· 78 epäsuoralla entsyymi-immuunitestillä. Kukin näistä testeistä on kuvattu Materiaalit ja menetelmät -osassa.

CTLA4lg-proteiinin MYPPPY-osan kunkin jäännöksen mutageneesillä Ala-jäännökseksi oli perusteellinen vaiku-5 tus sitoutumiseen B7-1-proteiiniin, kuten on esitetty kuviossa 18. Kuvio 18 esittää, että mutaatiot CTLA4Ig- ja CD28lg-proteiinien MYPPPY-osaan tuhoavat sitoutumisen B7-1-proteiiniin. Kohdennettuja mutaatioita sisältäviä Ig-fuusioproteiineja tuotettiin lyhytaikaisesti transfektoi-10 duissa COS-soluissa, ne kvantitoitiin ja testattiin niiden kyvyn suhteen sitoutua B7-l-proteiiniin.

Kuviossa 18 fuusioproteiinien kvantitaatiot toistettiin ainakin kahdesti rinnakkaisilla määrityksillä. Kuvio 18 esittää spesifisesti, että CTLA4Ig-mutantit si-15 toutuivat stabiilisti transfektoituihin etanolifiksattui-hin B7-l+-CH0-soluihin, jotka oli kasvatettu konfluenteiksi ELISA-kudosviljelymaljoilla. Sitoutumistulokset on ilmoitettu kahden rinnakkaisen kuopan keskiarvona ja se edustaa ainakin kahden kokeen tuloksia.

20 Y99A- ja PlOlA-mutantit sitoutuivat B7-l-proteii- niin, mutta melkoisen alentuneella affiniteetilla verrat- .·. : tuna villityypin CTLA4lg-proteiiniin. Tälle päinvastaises- • · · •I .* ti M98A-, P100A-, P102A- ja Y103A-mutanteilta oli sitou- i · · 9 9 « • · | I tumiskyky hävinnyt lähes täydellisesti. Lisäksi CD28lg- ***. 25 proteiinin MYPPPY-mutantit P103A ja Y104A eivät sisältä neet tunnistettavaa sitoutumista B7-1-proteiiniin, joka ··« ··♦· oli immobilisoitu ELISA-levyjen kuoppiin (kuvio 18b).

··· *...· B7-l-transfektoidut CHO-solut, joita inkuboitiin CTLA4Ig-mutanttifuusioproteiinin kanssa, jotka leimattiin ··· : 30 anti-ihmis-FlTC-vasta-aineella ja testattiin käyttäen :***: FACSCAN-systeemiä, osoittivat samanlaiset tulokset. Nämä • · · tulokset osoittavat selvästi MYPPPY-osan kriittisen roolin • · · '”1 sekä CTLA4lg- että CD28Ig-proteiinin sitoutumisessa B7-1- • · *;** proteiiniin.

• · • · · • · · • · • · · • · • · • · · 79 CTLA4/CD28lg-hybridifuusioproteiinien karakterisointi . Koska MYPPPY-osa on yhteinen sekä CTLA4lg- että CD28lg-proteiineissa, se yksinään ei voi selittää havaittuja eroja sitoutumisessa B7-l-proteiiniin, jotka nähtiin 5 CTLA4lg- ja CD28lg-proteiineilla. Vähemmän hyvin konser-voituneiden jäännösten osanotto korkea-affiiniseen sitoutumiseen B7-1-proteiiniin arvioitiin käyttäen homologia-mutanttisarjaa.

CD28-proteiinin kolme CDR-kaltaista aluetta korvat-10 tiin CTLA4-proteiinin solunulkoisen domeenin ekvivalenttien alueiden eri yhdistelmillä (kuvio 19 ja taulukko I). Kuvio 19 on CTLA4/CD28Ig-mutanttifuusioproteiinien kartta, joka esittää sitoutumisaktiivisuusprosentin B7-1+-CH0-soluihin suhteessa CTLA4lg-proteiiniin. Konservoituneet kys-15 teiinijäännökset (C) on esitetty kohdissa 22, 93 ja 121, vastaavasti (CTLA4-numerointi). On myös esitetty MYPPPY-osan sijainti. Avoimet alueet edustavat CD28-sekvenssiä; täytetyt alueet edustavat CTLA4-sekvenssiä; ristiviivoin varjostetut alueet edustavat IgG-proteiinin Fc-osan alkua 20 (katso myös taulukko I). Sitoutumisaktiivisuusprosentit määritettiin vertaamalla sitoutumiskäyriä (kuvio 20 a/b) : suhteessa CTLA4lg-proteiinin vastaavaan ja löytämällä mu- • · tantin sellainen konsentraatio, joka tarvittiin antamaan • · [ e.# sama O.D.-arvo kuin löydettiin CTLA4Ig-proteiinille. Mu- • · · ***. 25 tanttiproteiinin konsentraation suhde CTLA4Ig-proteiinin , konsentraatioon tietyssä O.D.-arvossa ilmoitettiin sitten ··· •••j sitoutumisaktiivisuusprosenttina. Ainakin kaksi A450-luke- • · ’···1 maa otettiin CTLA4Ig-proteiinin sitoutumiskäyrän lineaari selta osalta ja määritettiin keskimääräinen sitoutumisak- ··· : 30 tiivisuusprosentti.

• · «

Kaiken kaikkiaan 14 cDNA-hybridirakennetta valmis-tettiin, sekvensoitiin ja transfektoitiin COS-soluihin. Ig-fuusioproteiinien konsentraatiot seerumivapaassa vil- • · T1 jelyalustassa määritettiin ja niiden elektroforeettista • · • · · • · · • · · · • · • · • · · kulkua verrattiin SDS-PAGE-menetelmällä sisältäen Western- blot- analyysin.

80

Pelkistetyissä olosuhteissa kukin kimeerinen proteiini kulki sellaisen suhteellisen molekyylimassan koh-5 dalla, joka vaihteli CTLA4Ig-proteiinin (Mr 50 kDa) ja CD28lg-proteiinin (Mr 70 kDa) suhteellisen molekyylimassan välissä riippuen vaihdetun alueen koosta.

Ei-pelkistävissä olosuhteissa proteiinit kulkivat pääasiassa 100 - 140 kDa välissä, joka osoitti, että nämä 10 fuusioproteiinit olivat disulfidisidoksellisia dimeerejä huolimatta Fc-osan sarana-alueen kysteiinij äännösten muta-genisoinnista.

Koska CTLA4- ja CD28-proteiinien viidestä konservoi tuneesta kysteiinistä neljän ajatellaan ottavan osaa 15 ketjujen sisäisiin disulfidisidoksiin, fuusioproteiinien dimerisaatio johtui näin ollen todennäköisimmin viidennestä konservoituneesta kysteiinijäännöksestä kohdassa 121 CTLA4-proteiinissa (kohta 123 CD28-proteiinissa).

CTLA4/CD28lg-hybridifuusioproteiinien sitoutuminen 20 B7-1-proteiiniin. Hybridifuusioproteiinit testattiin nii den kyvyn suhteen sitoutua B7-l-proteiiniin samalla epä- .·. : suoralla solusitoutumisimmuunitestillä, jota käytettiin • · · j·.·] testattaessa kohdennettuja mutaatioita sisältäviä CTLA4lg- • · [ l ja CD28lg-fuusioproteiineja.

• · · ’**. 25 Näissä olosuhteissa sitoutuminen CD28lg-proteiinin ja B7-1-proteiinin välillä on juuri ja juuri tunnistetta- • · · ···· vissa (kuviot 20 a/b). Kuitenkin, CD28-proteiinin jäännök- • · · *...* sien 97 - 125 (CDR3-kaltainen pidennetty alue) korvaaminen CTLA4-proteiinin vastaavilla jäännöksillä johti noin kak- ·♦· V · 30 si- ja puolikertaisen suuruusluokan kohoamiseen CD28lg- analogin sitoutumisessa B7-1-proteiiniin (kuvio 20 a/b). Kuvio 20 a/b esittää, että CTLA4/CD28lg-mutanttifuusiopro-teiineissa CDR-alueelle analogiset alueet ottavat osaa • · 1 korkea-affiiniseen sitoutumiseen B7-1-CHO-soluihin. Mutan- * · :.*·· 35 tit testattiin, kuten on kuvattu kuviossa 2. Tulokset on • · · • · • · • · · 81 ilmoitettu kahden rinnakkaisen kuopan keskiarvona ja ne edustavat ainakin kolmea koetta. Näistä käyristä määritettiin sitoutumisaktiivisuusprosentti suhteessa CTLA4lg-pro-teiinin vastaavaan, kuten on selitetty ja esitetty kuvios-5 sa 19.

Tämän rakenteen, jonka nimi oli HS4 (kuvio 19), sitoutuminen B7-1-proteiiniin on noin viisi kertaa pienempi kuin villityypin CTLA4lg-proteiinin. HS2-hybridi, joka sisältää CTLA4-proteiinin N-pään lisäjäännöksiä (aminoha-10 pot 1 - 22), ei parantanut hybridimolekyylin kykyä sitoutua B7-1-proteiiniin verrattuna HS4-rakenteeseen.

HS6-rakenne, joka edustaa CTLA4lg-sekvenssiä paitsi, että se sisältää CD28-proteiinin CDRl-kaltaisen alueen (jäännökset 25 - 32), sitoutui samalla tavalla. Kuitenkin, 15 CTLA4-proteiinin CDRl-kaltaisen alueen (jäännökset 25 - 32) lisäys HS4-rakenteeseen (annettu nimi HS7) osoitti lisätehostuneen sitoutumisen niin, että sitoutumisaffini-teetti on noin 44 % CTLA4lg-proteiinin vastaavasta (kuvio 19).

20 Tälle päinvastaisesti CTLA4-proteiinin CDR2-kaltai- sen alueen (jäännökset 52 - 58) lisäys HS4-rakenteeseen .·. : (rakenne HS10) ei kohottanut sitoutumista lisää (kuvio • · · ·· .* 19). Samanlainen tulos havaittiin rakenteella HS11, jossa • · I oli CTLA4-proteiinin kaikkien kolmen CDR-kaltaisen alueen • · · 25 sekvenssit sisällytettynä CD28lg-proteiinlin. HS5-hybridi, joka sisälsi ainoastaan CTLA4-proteiinin CDRl-kaltaisen ··· ···· domeenin, sitoutui hyvin alhaisilla tasoilla.

• · · :...: CTLA4/CD28Ig-hybridi HS4-A kooditti CTLA4lg-prote- iinin jäännöksiä 96 - 113 C-päästä pidennetyllä CDR3-kal- ··· ί,ϊ Σ 30 täisellä alueella; yhdeksän CTLA4-proteiinista peräisin olevaa jäännöstä vähemmän kuin HS4-rakenteessa (kuvio 19 ja taulukko I). HS4-A sitoutui B7-l-CH0-soluihin vähemmän • · · - ' hyvin kuin HS4-rakenne (kuviot 19 ja 20b). Kuitenkin, • · *;* CTLA4-proteiinin CDRl-kaltaisen silmukan lisäys (HS8-hyb- • · • · · • · · • · ··· ♦ i • · ·«· ridi) kohotti B7-l-proteiiniin sitoutumista noin 2 prosen tista lähes 60 prosenttiin villityypin sitoutumisesta.

82

Toisaalta CTLA4-proteiinin CDR2-kaltaisen silmukan lisäys HS4-A-rakenteeseen (HS12) ei kohottanut sitoutumis-5 ta verrattuna HS4-A-rakenteeseen; kuten ei myöskään tehnyt CTLA4-proteiinin kaikkien kolmen CDR-kaltaisen silmukan lisäys (HS13, kuvio 19).

Toinen hybridi, nimeltään HS4-B, kooditti CD28-pro-teiinin CDR3-kaltäistä aluetta sisältäen MYPPPY-osan, jota 10 seurasi CTLA4-proteiinin jäännökset 114 - 122 (taulukko I ja kuvio 19).

HS4-B- ja HS4-A-rakenteilla oli samanlaiset sitoutumiset B7-1-proteiiniin. Toisin kuin HS4-A-rakenteella, CTLA4-proteiinin CDR1-kaltaisen silmukan lisäys HS4-B-ra-15 kenteeseen (HS9) ei kuitenkaan parantanut sitoutumista (kuvio 19), joka antaa ehdottaa, että CTLA4lg-proteiinin juuri MYPPPY-osan vieressä olevat jäännökset olivat tärkeitä determinantteja korkea-affiiniseen sitoutumiseen.

Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutuminen CTLA-20 4/CD28lg-hybridifuusioproteiineihin. Kunkin hybridifuusio- proteiinin rakenteellista yhtenäisyyttä tutkittiin arvi- .·. : oimalla niiden kyky sitoutua CTLA4-tai CD28-proteiinille • ♦♦ spesifisiin monoklonaalisiin vasta-aineisiin entsyymi-im- • « l muunitestissä. CTLA4-spesifiset monoklonaaliset vasta-ai- • · · 25 neet 7F8, 11D4 ja 10A8 blokeerasivat ligandin sitoutumisen (Linsley et ai., yllä, 1992)).

··· ···· Nämä vasta-aineet sitoutuivat kuhunkin CTLA4lg-mu- ♦ ♦♦ *...· tanttifuusioproteiiniin lukuunottamatta llD4-vasta-ainet- ta, joka ei onnistunut sitoutumaan P100A- ja P102A-pro-: 30 teiineihin (taulukko II). Koska vasta-aineet 7F8 ja 10A8 sitoutuivat näihin mutantteihin, vasta-aineen 11D4 sitou- ··· tumattomuus voi ehkä johtua mutagenisoinnista, joka se- ".V. koitti vasta-aineen 11D4 tunnistaman epitoopin.

• · • · *;* Tälle päinvastaisesti, kukin vasta-aine epäonnistui • · 35 sitoutumisessaan kaikkiin homologiakartoitushybridifuusio- • · · • · • · ·· · 83 proteiineihin lukuunottamatta vasta-ainetta 7F8, joka sitoutui HS6-rakenteeseen, ja vasta-ainetta 11D4, joka sitoutui heikosti HS8-rakenteeseen. Koska moni näistä homo-logiahybridifuusioproteiineista oli jossain määrin kykene-5 vä sitoutumaan B7-l-proteiiniin on todennäköistä, että vasta-aineiden kyvyttömyys sitoutua johtui sellaisten kon-formationaalisten epitooppien tuhoutumisesta, jotka muodostuivat tilan suhteen vierekkäisistä, mutta ei-lineaa-risista, sekvensseistä.

10 CD28-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine 9,3 (Linsley et ai., yllä, 1992) ei onnistunut sitoutumaan kumpaankaan kohdennettuja mutaatioita sisältävään CD28-mutanttifuusioproteiiniin, mutta sitoutui hybridifuusio-proteiineihin HS4, HS4-A, HS7 ja HS8. HS2-rakenteen kanssa 15 havaittiin heikompi sitoutuminen. Mitään sitoutumista ei havaittu HS5- ja HS6-rakenteiden kanssa.

CTLA4-malli. Kuvio 21 esittää kaavioesityksen CTLA4-mallista. CTLA4-jäännösten jakaminen CDR-kaltaisiin alueisiin on esitetty kuviossa 17. CTLA4-malli ehdottaa 20 disulfidilisäsidoksen (ei-Ig-sidos) läsnäolon jäännösten Cys49 ja Cys67 välissä, joka tukee CTLA4-proteiinin ja Ig-proteiinin variaabelin silmukan samankaltaisuutta.

• · CTLA4-proteiinin kaksi mahdollista N-sidoksellista • · . .·. glykosylaatiokohtaa sijoittuvat liuottimille alttiina ole- • · · 25 viin kohtiin Ig-proteiinin ö-juosteen runkoalueille. 3D- • · . profiilianalyysi osoitti, että CTLA4-sekvenssi on kaiken • ·· **" kaikkiaan yhteensopiva Ig-proteiinin V-silmukan kanssa, • · *···' vaikka onkin kaukaisemmin sukua.

Jäännös Väli15 edustaa CTLA4lg-kaltaisen domeenin • · · V * 30 viimeistä jäännöstä. Vai115-jäännöksen ja membraanin vie- • · · ί,.,ϊ reisen Cysl 21 -jäännöksen, jonka ajatellaan muodostavan I:. CTLA4-homodimeerin, välisen alueen konformaatio on erit- täin variaabeli CD28-ryhmässä. Kuva, joka muodostuu on se, • · *1’ että CD28-ryhmän jäsenet käyttävät sitoutumiseen B7-l-pro- • · • · · • · · • · ··· • · • · • · · 84 teiiniin pääasiassa niitä jäännöksiä, jotka sijaitsevat kahdella kolmesta CDR-kaitäisestä alueesta.

MYPPPY-osa edustaa konservoitunutta rakennetta sitoutumiselle, jota sen C-pään pidennys tuntuu auttavan ja 5 jota erittäin variaabeli CDR1-kaltainen alue spesifisesti moduloi. CDR3- ja CDR1-kaltaiset alueet ovat tilan suhteen jatkuvia Ig-proteiinin variaabeleissa silmukoissa. CDR2-kaltainen alue on tilan suhteen kaukana eikä CD28-ryhmän tapauksessa merkittävästi ota osaa sitoutumiseen B7-l-pro-10 teiiniin.

• · ♦ 1 · • ·· • · ·· · • · · • 1 • · ♦ ♦ · • · · ··· • · ··· ···· ··· • · • · ♦ ·· *·· • · · • · · ♦ ·· • · • · ··· ···· ··· • · • · ··· · • · · • ·· • · ♦ ·· • · • · «·· 85 Ö S* ö S* ö S*o & &U 8* & & ö o y ro ι-<ΓΠ*ΗίΓΙ*^ηΗ,Η^ΜΜ'Η^Π« CNCMr^tSCSCStMCSCSCSC^rjCSCSCjrj l i l I | I I I I I I 1 I ·> l I I I »

CO , CO , CO CO

— VO ~ Ό Ξ ^ ·—* *—· ·$£ > > > > >- >

B Ä* B Ä* B B

‘3* P 's* P S’ S' *-i co *-· en r—« »—I *- *-< Ή f—· 7 7 7 7 7 7

0\ OO 0\ CO CO oö M M M g M

7¾¾¾ ‘e? ® Ώ g Ώ ceii

^ £ t? £ S EE ES-5E JS^JiS

- % J2 gUS ·—· m mi »rt *H (O

m 43 m O 0) 03 ϋ 03 43 1 43 -rt afl je *J

, >S>S 3 S3 3 3^3 i! 3 , j m uU*uU u uu u o o o s 35 3 * S o\ σ\ o\ σ\ · eri en σ. ® » ft ck Ϊ! J o £ Q> i.ii i 11 '··'. ij 3 · i > . ΐ ™ p -¾ ö ό ö ό ό § c -h o m vovovovovo “ -h ^ "

01 >>>>> ΐ 5 ^ J

01 q q q q q ^ 3 o ti’u'd'du 8* S g 3 •H e e e e e i {j δ h h & &<& &·& I I 5 3 g

^ in >n in «o »n 5 ^ S

h ..... a g « 3 S

J ·° e S

I.II. .j -H Λ Öcncococncn u S M R 3 »1 w in m ό «. > “ h .5 0} £p £7 £7 :7 g j 9 g rl cd cd oi en cd > f » 2 " +» >>>>> I £ I * e μ o υ y y y 8 3 s » s : ·..* S S g ^ JS ΐ ·· +» 7 t 'f T 7 S « 3 fc

:·.·. g * Λ I ! I

*· ™ «A Ά «Α Ά <A »A «A ϊ > i ^ j

: : .* -¾ 3 > 3 2 5 2 2 5 « S S

··· O* iH b T; ft i ^ ....: 0 g £ EgEEE ΐ s i ΐ " o M co λ « « « a §· « £ ° s • cs 0 q 00000 -h m cj “ _ *:* O 7 7 7 7 7 7 7 lo^A5, ::: f · 5 “ ! » s • · h\ γ-'ιΛ r- rv r** r·*- r·*· 2 λ . „ *j *·· S es JQ R rt c^mcscscs u ti t, § 5 «o a £ a £ a a a a a έ J ΐ : .·:·. ho Q % ww*i w w ,? 3 g * » ::: ο . u £ u 8 u u u u .u s « : s 3 .···. 2 O) 77 77 777 7 7 ϋ. A 3 ° * • · 3 H 3 d a t a

·:· 3 2 3 1 a 5 I

• Zl *5 u O M C

*:* 2 c2 I ij I j .... S Pi -r! , « 0 2 .···. ** ϋ μ * Λ 1? 3 AS g *...* -g 7*7 O — es en ti· • e ^-tcs.cOTfiovo^f^r^cocTv^-·»-*»-*—Mcac

. n3cOCOCOtOCOCOCOCOCOt/3C/3C/5COCOCOC/> QV-HV

:·.: · ^ ϊίϊϊϊ^χίϊϊίΐΓΐϊί £α.*£ * · L a • · · ·Γ| : : w • · · 86

Taulukko II.

CTLA4- ja CD28-proteiineja vastaan olevien monok-lonaalisten vasta-aineiden sitoutuminen . CTLA4Ig- ja CD28Ig-mutanttifuusioproteiineihin ja CTLA4/CD28Ig-hybri-5 difuusioproteiineihin.

Monoklonaaliset anti-CTLA4- Monoklonaaliset-anti- vasta-aineet CD28-vasta-aineet 10 7F8 11D4 10A8 9.3 CTLA41g-mutanttifuusioproteiini AYPPPY +++ +++ +++ MAPPPY ++ + ++ MYAPPY + - + MYPAPY +++ +++ +++ MYPPAY +++ + MYPPPA +++ ++ +++ 15 AAPPPY + ++ +++ CDiLBIg^mutanttifuusioproteeni MYPPAY - MYPPPA - - + CTLA4 f CD2 8Iq-hybridifuusioproteiinit 20 HS1 - HS2 + HS 3 - HS 4 - +++ : ·.: hs5 - HS 6 + : · : hs4-a ++ * ; HS4-B ++ : : : hs7 - +++ 25 HS 8 + +++ ·:··: hs 9 + . HS 10 - - _ ·:· Hsn + 'III HS 12 - : : hsi3 - ·*· HS14 - CTLA4Ig +++ +++ +++ · ... CD28Ig - +++ ♦ 30 ··· • · • ♦ «·· .:. Vasta-aineen sitoutuminen pisteytettiin villityypin pro- ···· .···. teiinilla havaittua Vastaavaksi (+++), taustan ylittäväksi [** ( + ) ja sellaiseksi, jolla ei ollut tunnistettavaa sitou- *. *: 35 tumista (-).

··· • · • » ··· 87

Sekvenssiluettelo (1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Linsley, Peter S

Ledbetter, Jeffrey A Damle, Nitin K Brady, William Wallace, Philip M.

(ii) TITLE OF INVENTION: CTLA4 MOLECULES AND IL4-BINDING

MOLECULES AND USES THEREOF

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 14 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Merchant & Gould (B) STREET: 11150 Santa Monica Blvd., Suite 400 (C) CITY: Los Angeles (D) STATE: California (E) COUNTRY: United States (F) ZIP: 90025-3395 (v) COMPUTER READABLE FORM: • · · ' '.I / (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk i Y (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 ··· • M· :***: (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: .*··. (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: :...· (A) NAME: Adriano, Sarah (B) REGISTRATION NUMBER: 34,470 • « ··· • · • · ··· , 88 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 9643 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (310) 312-9900 (B) TELEFAX: (310) 479-8340 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

• · • · · • · · (vi) ORIGINAL SOURCE: . .·. (A) ORGANISM: Homo sapiens • · · • · · • · * · · *::: (χί) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: • · • · • · · CTAGCCACTG AAGCTTCACC ATGGGTGTAC TGCTCACAC 39 • · · • · · • · · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: • · · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *“ (A) LENGTH: 39 base pairs • · ·.**: (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 89 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: TGGCATGGGC TCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGAAA 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • · « * · · • · • · · : V (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) e · · • · · • · ·

*:··: (iii) HYPOTHETICAL: NO

• · · • · · ·

(iv) ANTI-SENSE: NO

··· (vi) ORIGINAL SOURCE: • · · (A) ORGANISM: Homo sapiens • · • · · • · · • · ···· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

• t I

• · t *:./ TTTGGGCTCC TGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT 39 • · • · ··· , 90 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 84 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: AAGCAAGAGC ATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA CACATCCCCA 60 • · CCGTCCCCAG CACCTGAACT CCTG 84 • · · • · · • · • · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: • · * /l· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 41 base pairs • · · (B) TYPE: nucleic acid . (C) STRANDEDNESS: single • · · #I... (D) TOPOLOGY: linear • · • · · (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · · • · • · • · ·

: (iii) HYPOTHETICAL: NO

• · · • · • · · • · • · • · · 91

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: CTTCGACCAG TCTAGAAGCA TCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C 41 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 47 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

• · • · ·

.I / (iv) ANTI-SENSE: NO

• · · ' * • · • · • · · *·*··[ (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens ··· • ».

• · · · O (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6s :T: CATTGCACAG TCAAGCTTCC ATGCCCATGG GTTCTCTGGC CACCTTG 47 ··· φ · • · ··· ···:* (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: • · · * ' • · • · • · · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs « · · 92 (B) TYPEs nucleic acid (C) STRANDEDNESS! single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE s NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: ATCCACAGTG CAGTGATCAT TTGGATCCTG GCATGTGAC ' 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 65 base pairs (B) TYPE: nucleic acid • · . (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ·«« (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · • · · (iii) HYPOTHETICAL: NO »»· ' ' • · · • · ·

(iv) ANTI-SENSE: NO

• I

··· (vi) ORIGINAL SOURCE: • · *'·'m (A) ORGANISM: Homo sapiens « · · • ·· • · #·· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: , 93 CTCAGTCTGG TCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA GCATGGCAAT GCACGTGGCC 60 CAGCC 65 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: • · • · · • · · • · TTTGGGCTCC TGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG 33 • · · **· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: • · · • · · · ··* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 72 base pairs ··· : (B) TYPE: nucleic acid :[[[: (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • · · · • · · • · (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · • · · • · · • ·

(iii) HYPOTHETICAL: NO

94

(iv) ANTI-SENSE ϊ NO

(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: CTAGCCACTG AAGCTTCACC AATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGGACGCT GCTCAGTCTG 60 GTCCTTGCAC TC 72 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

:/.: (iii) HYPOTHETICAL: NO

·· » • · · • · • ·

; /: (iv) ANTI-SENSE: NO

··· ····· • · (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens • · *·· ··« • · · • · · • · · (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11: • · · • ' • · · · .*··. GCAATGCACG TGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG 33 • · • · · • · ’{'} (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: • · • · • · · 95 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 45 base pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTI-SENSE: NO

(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: TGATGTAACA TGTCTAGATC AATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: • · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ·· · : (A) LENGTH: 561 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ·:*·*: (C) STRANDEDNESS: single *:* (D) TOPOLOGY: linear • · · • · • t (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • ·· • · · • · ·

,1..# (iii) HYPOTHETICAL: NO

« · ···

(iv) ANTI-SENSE: NO

··· « · • · : (vi) ORIGINAL SOURCE: ,*··. (A) ORGANISM: Homo sapiens • · ··· 96 (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 1..561 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: GCA ATG CAC GTG GCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGA GGC 48

Ala Met His Val Ala Gin Pro Ala Vai Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 15 10 15 ATC GCC ÄGC TTT GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG 96 lie Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 20 25 30 GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC 144

Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val -Thr Glu Val 35 40 45 TGT GCG GCA ACC.TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GAT GAT 192

Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp *·/·! 50 55 60 ·· · • · · ψ · • · :TCC ATC TGC ACG GGC ACC tcc agt GGA AAT caa GTG aac CTC ACT ATC 240 ··♦ ·:··: Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie .:. 65 70 75 80 ···· • ·· • · • · ··· ... CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTG GAG 288 • · ·

Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu • · * ’·;·* 85 90 95 «·· ···· :*·*; CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA ACC CAG 336 ··· .* . Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin 100 105 110 • · • » ··♦ 97 ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTC CTC 384

Ile Tyr Val lie Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu 115 120 125 TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTT CTC 432

Trp lie Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 130 135 140 CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCT CTT 480

Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160 ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGT GAA 528

Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT 561

Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe lie Pro lie Asn 180 185 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: :·.·1. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: * .·. (A) LENGTH: 187 amino acids * · · (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear ·“! (ii) MOLECULE TYPE: protein 0 · 0 0 • 0 · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14: ··· ί.ϊ · Ala Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 15 10 15 ··· **.” lie Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu ’·;·1 20 25 30 • · • · · • ·· • ·

Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val 98 35 40 '45

Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly As n Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 50 55 50

Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Vai Asn Leu Thr Ile 65 70 75 80

Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Vai Glu 85 90 95

S

Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin 100 105 110

Ile Tyr Vai Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu 115 120 125

Trp Ile Leu Ala Ala Vai Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 130 135 140 • · • · · • »· / Leu Thr Ala Vai Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu ; f 145 150 155 160 • · · • · · ···

Thr Thr Gly Vai Tyr Vai Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175

Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 180 185 ··· • « · • · · « ··· • · • · ··♦ ··· ··«· • · · • · • · ·· · 1 » • · · • · · • · • ·· • · • · • · ·

Claims (17)

1. Liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että se 5 i) sitoo B7-antigeeniä; ii) käsittää aminohapposekvenssin, joka vastaa mutanttia CTLA4:n solunulkoista domeenia; iii) siinä aminohapposekvenssi, joka vastaa mutanttia CTLA4:n solunulkoista domeenia, käsittää 10 sekvenssit Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr ja Ala-Ser-Pro-Gly-Lys-Ala-Thr-Glu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että aminohappo-sekvenssi, joka vastaa mutanttia CTLA4:n solunulkoista 15 domeenia, käsittää sekvenssin Glu-Leu-Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Gly-Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että aminohappo-sekvenssi, joka vastaa mutanttia CTLA4:n solunulkoista 20 domeenia, käsittää sekvenssin Glu-Leu-Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Gly-lle-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-lle-Tyr-Val-,·. · Ile-Asp-Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp. • M

* 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen • · * I liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että • · · *·*·* 25 mutantti CTLA4:n solunulkoinen domeeni on CTLA4:n solunulkoinen domeeni, jossa on yksi tai useampia amino-happosubstituutioita.

• · · ·...· 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että CTLA4:n 30 solunulkoinen domeeni on peräisin ihmisestä.

;**: 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen liukoinen «·« *. CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että CTLA4: n ··♦ •**| solunulkoisella domeenilla on sekvenssi, joka alkaa • ♦ *···* sekvenssin numero 14 alaniinista asemassa 1 ja päättyy : 35 asparagiinihappoon asemassa 125. ··· • · • · ···

7. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että liukoinen CTLA4-molekyyli on CTLA4Ig-fuusioproteiini.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen liukoinen 5 CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että Ig-osa on aminohapposekvenssi, joka käsittää ihmisen immunoglobu-liinin sarana-, CH2- ja CH3-alueiden aminohappotähteet.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että ihmisen 10 immunoglobuliini on Cyl.

10. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen liukoinen CTLA4-molekyyli, tunnettu siitä, että B7-antigeeni on B7-1.

11. Koostumus, joka sisältää minkä tahansa 15 patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen liukoisen CTLA4- molekyylin ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen liukoisen CTLA4-molekyylin käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka koostumus on tarkoitettu 20 immuunijärjestelmän taudin, tulehdustaudin tai syövän hoitoon.

.·. : 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, • · · 1. tunnettu siitä, että immuunijärjestelmän tauti on • · l autoimmuunitauti, allograftin hyijintä, krooninen aller- • · · 25 ginen reaktio, siirteen hyi j intä tai käänteishylj intä-tauti. • * ·

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, • · · ·...· tunnettu siitä, että infektiotauti on HIV-infek- tio tai HTLVl-infektio. : Γ: 30

15. In vitro -menetelmä B7:ää sitovan molekyylin :***: sitoutumisen B7-antigeeniin säätelemiseksi, t u n - • · · n e t t u siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-10 • · · mukainen liukoinen CTLA4-molekyyli saatetaan kosketukseen • · *·;·* B7-antigeenin kanssa. * · • · · • · · • · • · · • · • · • · ·

16. In vitro -menetelmä CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutusten B7-positiivisten solujen kanssa säätelemiseksi, tunnettu siitä, että B7-positii-viset solut saatetaan kosketukseen jonkin patentti- 5 vaatimuksen 1-10 mukaisen liukoisen CTLA4-molekyylin kanssa määränä, joka on tehokas häiritsemään B7-anti-geenin reaktiota CTLA4:n kanssa.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CTLA4-positiivisten T-solu- 10 jen vuorovaikutus B7-positiivisten solujen kanssa inhiboidaan. • · • · · • · · • · • · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · • · · • · · · • · · • · • ♦ ··· • M • · · • · · 9 99 9 9 9 9 9 9 99 9 9 99 9 9 9 99 9 99 9 9 9 9 9 9 99 • 9 9 9 9 9 « · · 9 9 1 99 9 9 9 9 999