NO322278B1

NO322278B1 - Loselig CTLA4-molekyl blanding omfattende CTLA4-molekylet, anvendelse derav og in vitro fremgangsmate som involverer CTLA4-molekylet.

Info

Publication number: NO322278B1
Application number: NO19951436A
Authority: NO
Inventors: Jeffrey A Ledbetter; Nitin K Damle; Peter S Linsley; William Brady; Philip M Wallace
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1994-04-15
Filing date: 1995-04-12
Publication date: 2006-09-04
Also published as: IL113343A; FI120041B; AU701310B2; FI20041632A; JPH0847391A; NO951436D0; NO951436L; EP0682039A1; CA2146895C; EP1666498A2; JP2004248677A; FI951801A; IL113343A0; CA2146895A1; EP1666498A3; AU1645895A; FI951801A0; US6090914A

Description

Foreliggende søknad vedrører et løselig CTLA4-molekyl, blanding omfattende CTLA4-molekylet, anvendelse derav og in vitro fremgangsmåte som involverer CTLA4-molekylet,

Gjennom hele denne søknad er det referert til forskjellige publikasjoner. Åpenbaringen av disse publikasjoner i sin helhet er herved inkorporert ved referanse i denne søknad, for mere fullstendig å beskrive den teknologiens tilstand som denne oppfinnelse angår.

Det beskrives ekspresjon av CTLA4-hybridfusjonsproteiner, CTIA4-reseptorgenet, identifikasjon av interaksjonen mellom CTLA4-reseptoren og celler som uttrykker B7-antigen, og fremgangsmåter for regulering av celleinteraksjoner som involverer CTLA4-reseptoren og B7-antigenet.

Kjennetegnet for virveldyrenes immunsystem er evnen til å skille mellom "selvet" og "ikke-selvet" (fremmed). Denne egenskap har ført til utvikling av et system som krever flere signaler for å oppnå optimal immunaktivering (Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54:1-14 (1989)). T-celle-B-celleinteraksjoner er essensielle for immunresponsen. Nivået av mange kohesive molekyler som finnes på T-celler og B-celler, øker under en immunrespons {Springer et al., (1987), supra; Shaw og Shimuzu, Current Opinion in Immunology, utgivere Kindt og Long, 1:92-97 (1988)),* og Hemler, Immunology Today 9:109-113 (1988). Øket nivå av disse molekyler kan hjelpe til å forklare hvorfor aktiverte B-celler er mere effektive til å stimulere antigen-spesifikk T-celleformering enn hvilende B-celler er (Kaiuchi et al., J. Immunol. 131:109-114 (1983); Kreiger et al., J. Immunol. 135:2937-2945 (1985); McKenzie, J. Immunol. 141:2907-2911 (1988); og Hawrylowicz og Unanue, J.. Immunol. 141:4083-4088 (1988)).

Dannelsen av en T-lymfocytt- ("T-celle") immunrespons er en kompleks"prosess som involverer celle-celle-interaksjoner (Springer et al., A. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)), særlig mellom T- og hjelpeceller som B-celler, og produksjon av løselige immunmediatorer (cytokiner eller lymfokiner)

(Dinarello og Mier, New. Engl. Jour. Med. 317:940-945 (1987)).

Denne respons reguleres av flere T-celleoverflatereseptorer, innbefattet T-cellereseptorkomplekset (Weiss et al., Ann. Rev. Immunol. 4:593-619 (1986)) og andre "hjelpe"-overflate-molekyler (Springer et al., (1987) supra). Mange av disse hjelpemolekyler er naturlig forekommende celleoverflate-differensierings- (CD) antigener, definert ved reaktiviteten av monoklonale antistoffer på overflaten av celler (McMichael utgiver, Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)).

Antigen-uavhengige intercellulære interaksjoner som involverer lymfocytthjelpemolekyler, er essensielle for en immunrespons (Springer et al., (1987), supra). F.eks. vil binding av det T-celleassosierte protein, CD2, til sin ligand LFA-3, et bredt uttrykt glykoprotein (som det er gitt en oversikt over hos Shaw og Shimuzu, supra), være viktig for optimalisering av antigenspesifikk T-celleaktivering (Moingeon et al.,.Nature 339:314 (1988)).

Et viktig adhesjonssystem som involverer binding av LFA-1-glykoproteinet som finnes på lymfocytter, makrofager og granulocytter (Springer et al., (1987), supra; Shaw og Shimuzu

(1988), supra) til sine ligander ICAM-1 (Makgoba et al., Nature 33:86-88 (1988)) og ICAM-2 (Staunton et al., Nature 339:61-64 (1989)). T-cellehjelpemolekylene CD8 og CD4 styrker T-celle-adhesjon ved interaksjon med henholdsvis MHC klasse I (Norment et al., (Nature 336:79-81 (1988)) og klasse II (Doyle og Strominger, Nature 330:256-259 (1987)) molekyler. "Homing-reseptorer" er viktige for. kontroll av lymfocyttmigrering (Stoolman, Cell 56:907-910 (1989)).

VLA-glykoproteinene er integriner som synes å mediere lymfocyttfunksjoner som krever adhesjon til ekstracellulære matrikskomponenter (Hemler, supra). CD2/LFA-3, LFA-l/ICAM-1 og ICAM-2, og VLA-adhesjonssysterner er fordelt på mange forskjellige celletyper (Springer et al., (1987), supra; Shaw og Shimuzu, (1988), supra og Hemler, (1988), supra).

Mange in vitro-studier har demonstrert at cytokiner er involvert i dannelsen av alloreaktive effektorceller. F.eks. ble membranbundet IL-4 og løselig IL-4-reseptor administrert separat til mus, og ble vist å øke den lymfoproliferative respons (William C. Fanslow et al., "Regulation of Allo-reactivity in vivo by IL-4 and the soluble IL-4 receptor", J. Immunol. 147:535-540 (1991)). Nærmere bestemt, viste det seg at administrering av IL-4 til BALB/c-mus resulterte i svak økning av den lymfoproliferative respons. Derimot viste det seg at den løselige IL-4-reseptor undertrykket denne respons på allogene celler på en doseavhengig måte. Dessuten var et nøytraliserende antistoff mot IL-4 og et annet mot løselig IL-4-reseptor effektive inhibitorer for den lymfoproliferative respons.

Det ble foreslått for mange år siden at B-lymfocytt-aktivering krever to signaler (Bretscher og Cohn, Science 169:1042-1049 (1970)), og det blir nå antatt at alle lymfocytter krever to signaler for sin optimale aktivering, et antigenspesifikt eller klonalt signal, samt et andre, antigen ikke-spesifikt signal (Janeway, supra). Freeman et al. (J. Immunol. 143(8):27l4-2722 (1989)) isolerte og sekvenserte en cDNA-klon som koder for et B-celleaktiveringsantigen gjenkjent av mAb B7 (Freeman et al., J. Immunol. 138:3260 (1987)). COS-celler transfisert med dette cDNA er blitt vist å bli farget av både merket mAb B7 og mAb BB-1 (Clark et al., Human Immunol. 16:100-113 (1986); Yokochi et al., J. Immunol. 128:-823 (1981)); Freeman et al., (1989) supra; og Freeman et al.,

(1987), supra)). Dessuten er det blitt påvist ekspresjon av dette antigen på.celler av andre linjer, som monocytter (Freeman et al., supra).

De signaler som kreves for en T-hjelpercelle- (Th) anti-genrespons, tilveiebringes av antigenpresenterende celler (APC). Det første signal initieres ved interaksjon av T-cellereseptorkomplekset (Weiss, J. Clin. Invest. 86:1015

(1990)) med antigen presentert i kontekst av klasse II hoved histokompatibilitetskompleks (MHC)-molekyler på APC (Allen, Immunol. Today 8:270 (1987)). Dette antigenspesifikke signal er ikke tilstrekkelig til å generere full respons, og i fravær av et andre signal kan det i virkeligheten føre til klonal inaktivering eller anergi (Schwartz, Science 248:1349 (1990)).

Kravet om et andre "kostimulerende" signal som tilveiebringes av MHC, er blitt demonstrert i flere eksperimentelle systemer (Schwartz, supra; Weaver og Unanue, Immunol. Today 11:49

(1990)) . Den molekylære karakter av disse andre signaler er ikke fullstendig forstått, selv om det er klart i noen til-feller at både løselige moiekyler som interleukin (IL)-l (Weaver og Unanue, supra) og membranreseptorer involvert i intercellulær adhesjon (Springer, Nature 346:425 (1990)), kan tilveiebringe kostimulerende signaler.

CD28-antigen, et homodimert glykoprotein av immuno-globulinsuperfamilien (Aruffo og Seed, Proe. Nati. Acad. Sei. 84:8573-8577 (1987)), er et hjelpemolekyl som finnes på de fleste modne, humane T-celler (Damle et al., J. Immunol. 131:-2296-2300 (1983)). Aktuell evidens antyder at dette molekyl fungerer i en alternativ T-celleaktiveringsmekanisme for-skjellig fra den som initieres av T-cellereseptorkomplekset (June et al., Mol. Cell. Biol. 7:4472-4481 (1987)). Monoklonale antistoffer (mAb) reaktive med CD28-antigen, kan øke de T-celleresponser som initieres av forskjellige polyklonale stimuli (oversikt av June et al., supra). Disse stimulatoriske effekter kan skrive seg fra mAb-indusert cytokinproduksjon (Thompson et al., Proe. Nati. Acad. Sei 86:1333-1337 (1989); og Lindsten et al., Science 244:339-343 (1989)) som en konsekvens av øket mRNA-stabilisering (Lindsten et al.,

(1989), supra). Anti-CD28-mAb kan også ha inhibitoriske effekter, dvs. at de kan blokkere autologe blandede lomfocytt-reaksjoner (Damle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 78:5096-6001

(1981)) og aktivering av antigenspesifikke T-cellekloner (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 16:1289-1296 (1986)).

Studier har vist at CD28 er en motreseptor for B-celleaktiveringsantigenet, B7/BB-1 (Linsley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:5031-5035 (1990)). For letthets skyld skal B7/BB-l-antigenet i det følgende refereres til som "B7-antigenet". B7-ligandene er også medlemmer av immunoglobulin-superfamilien, men har, i motsetning til CD28 og CTLA4, to Ig-domener i sin ekstracellulære region, et N-terminalt variabelt (V)-lignende domene, etterfulgt av et konstant (C)-lignende domene.

Et viktig ikke-spesifikt kostimulatorisk signal blir . avgitt til T-cellen når det finnes minst to homologe B7-familiemedlemmer på APCene, B7-1 (også kalt B7 eller CD80) og B7-2, som begge kan avgi kostimulerende signaler til T-celler via enten CD28 eller CTLA4. Kostimulering gjennom CD28 eller CTLA4 er essensiell for T-celleaktivering siden et løselig Ig-fusjonsprotein av CTLA4 (CTLA4-Ig) med hell er blitt anvendt til blokkering av T-celleaktiveringshendelser in vitro og in vivo. Å unnlate å avgi dette andre signal kan føre til klonal inaktivering eller T-celleanergi.

Interaksjoner mellom CD28 og B7-antigen er blitt karakterisert ved anvendelse av genetiske fusjoner av de ekstracellulære porsjoner av B7-antigen og CD28-reseptor, og immunoglobulin (lg) Cyl (konstant region tunge kjeder) (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)). Immobilisert B7Ig-fusjonsprotein, samt B7-positive CHO-celler, er blitt vist å kostimulere T-celleformering.

T-cellestimulering med B7-positive CHO-celler vil også spesifikt stimulere øket nivå av transkripter for IL-2. Ytterligere studier har vist at anti-CD28-mAb inhiberte IL-2-produksjon indusert i visse T-celleleukemicellelinjer ved cellulære interaksjoner med en B-celleleukemilinje (Kohno et al., Cell. Immunol. 131-1-10 (1990)).

CD2 8 har et enkelt ekstracellulært variabel region (V)-lignende domene (Aruffo og Seed, supra). Et homologt molekyl, CTLA4, er blitt identifisert ved differensial screening av et murint cytolytisk-T-celle-cDNA-bibliotek (Brunet et al., Nature 328:267-270 (1987)).

Transkripter av CTLA4-molekylet er blitt funnet i T-cellepopulasjoner som har cytotoksisk aktivitet, hvilket antyder at CTLA4 kunne fungere i den cytolytiske respons (Brunet et al., supra; og Brunet et al., Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)). Forskere har rapportert kloningen og kartlegg-ingen av et gen for den humane motpart av CTLA4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)) til den samme kromosomale region (2q33-34) som CD28 (Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31:198-201 (1990)). En Ig-fusjpn av CTLA4 binder seg til B7-1 med ca. 20 ganger høyere begjærlighet enn en tilsvarende Ig-fusjon av CD28.

WO 93/00431 tilveiebringer den fullstendige og korrekte DNA-sékvensen som koder for aminosyresekvénsen som tilsvarer CTLA4-reseptorprotein, og identifiserer B7-antigen som en naturlig ligand for CTLA4-reseptoren. Det beskrivese at human CTLA4-reseptorproteinet kodes for av 187 aminosyrer og inkluderer et nylig identifisert N-bundet glykosyleringssete. Denne referansen beskriver også fremgangsmåter for ekspresjon av DNA som et CTLA4-immunglobulin (lg) fusjonsproteinprodukt. Utførelser inkluderer CTLA4Ig-fusjonsprotein, og hybridfusjonsprbteiner inkludert CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonsproteiner. Det tilveiebringes også fremgangsmåter for anvendelser av CTLA4-fusjonsprotein, B7Ig-fusjonsprotein, hybridfusjonsprotein og fragmenter og/eller derivater derav, slik som monoklonale antistoffer reaktive med CTLA4 og B7-antigenet for å regulere cellulære interaksjoner og immunresponser.

Sekvenssammenligning mellom dette humane CTLA4-DNA og det som koder for CD28-proteiner åpenbarer signifikant sekvens-homologi, med den største grad av homologi i jukstamembranen og de cytoplasmatiske regioner (Brunet et al., 1988, supra; Dariavach et al., 1988, supra).

Den høye grad av homologi mellom CD28 og CTLA4, sammen med kolokalisering av deres gener, reiser spørsmål med hensyn til hvorvidt disse molekyler også er funksjonelt beslektede. Siden imidlertid proteinproduktet av CTLA4 enda ikke er blitt uttrykt med hell, vil disse spørsmål forbli ubesvarte.

Ekspresjon av løselige derivater av celleoverflateglyko-proteiner i immunoglobulingensuperfamilien er blitt oppnådd for CD4, reseptoren for HIV-1, og CD28 og B7-reseptorer, ved anvendelse av hybride fusjonsmolekyler bestående av DNA-sekvenser som koder for aminosyrer tilsvarende porsjonene av det ekstracellulære domene av CD4-reseptor sammensmeltet med antistoffdomener (immunoglobulin 7I (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989) (CD4) og Linsley et al., J. Exp. Med. supra (CD28 og B7)).

Det er behov for molekyler som kan identifisere in vitro B7-positive B-celler, dvs. aktiverte B-celler, for leukocytt-typing og FAC-sortering. Videre er det behov for molekyler som kan anvendes til å forebygge avstøtning av organtransplari-tater og inhibere symptomene i forbindelse med lupus erytemat-ose og andre autoimmune sykdommer. I senere tid, har de viktigste terapiene berodd på panimmunosuppresive medikamenter, som cyklosporin A eller monoklonale antistoffer (mAb) mot CD3 for å forebygge avstøtning av organtransplantater eller inhibere lupussymptomer. Uheldigvis må disse medikamenter ofte tas for resten av individets liv, undertrykke hele immun-systemet, og ofte frembringe sekundære helseplager som øket infeksjonsfrekvens og kreft.

Den komplette og korrekte DNA-sekvens som koder for aminosyre-sekvensen tilsvarende CTLA4-reseptorproteinet, og identifiserer B7-antigen (f.eks. B7-1 og B7-2-antigener) som en naturlig ligand for CTLA4-reseptoren beskrives. Også en fremgangsmåte for å uttrykke dette DNA som et CTLA4-immunoglobulin- (lg) fusjonsproteinprodukt beskrives. Utførelser omfatter CTLA4Ig-fusjonsprotein, og hybridfusjons-proteiner omfattende CD28/CTLA4lg-fusjonsproteiner (som det også refereres til heri som CTLA4/CD28lg-fusjonsproteinet). Det beskrives anvendelse av CTLA4-fusjonsproteinet, B7Ig-fusjonsproteinet, hybride fusjonsproteiner, og fragmenter og/eller derivater derav, som monoklonale antistoffer reaktive med CTLA4 og B7-antigenet, for å regulere cellulære interaksjoner og immunresponser.

Det humane CTLA-reseptorprotein, blir som nevnt over kodet av 187 aminosyrer, og innbefatter et nylig identifisert N-bundet glykosyleringssete.

CTLA4Ig-fusjonsproteinet, binder B7-antigenet uttrykt på aktiverte B-celler, og celler av andre linjer, en ligand for CD28-reseptoren på T-celler. CTLA4Ig binder B7-antigen med signifikant høyere affinitet enn B7 som binder seg til CD28-reseptoren. CTLA4Ig-konstruksjonen har en første aminosyresekvens tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4-reseptoren fusjonert til en andre aminosyresekvens tilsvarende det humane Ig-Cyl-domene. Den første aminosyre-sekvens inneholder aminosyrerester fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 125 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4 sammenbundet med en andre aminosyre-sekvens inneholdende aminosyrerester tilsvarende hengsleregionene CH2 og CH3 av humant IgCyl • Fusjonsproteinet fremstilles fortrinnsvis i dimer form. Løselig CTLA4Ig er en potent inhibitor in vitro av T- og B-lymfocyttresponser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et løselig CTLA4-molekyl kjennetegnet ved at det

i) binder et B7-antigen

ii) omfatter en aminosyresekvens som tilsvarer et mutant CTLA4 ekstracellulært område,

iii) hvor aminosyresekvensen tilsvarende det mutant CTLA4 ekstracellulære området omfatter sekvensene Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr og Ala-Ser-Pro-Gly-Lys-Ala-Thr-Glu.

I en foretrukket utførelse kjennetegnes det løselige CTLA4-molekylet ved at aminosyresekvensen tilsvarer mutant CTLA4 ekstracellulært domene omfattende sekvensen Glu-Leu-Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Gly- Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile.

I enda en foretrukken utførelse av foreliggende oppfinnelse kjennetegnes det løselige CTLA4-molekylet ved at aminosyresekvensen tilsvarende det mutant CTLA4 ekstracellulære domene omfatter sekvensen Glu-Leu-Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Gly- Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile-Tyr-Val-Ile-Asp-Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes en blanding som omfatter løselig CTLA4-molekyl ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk bærer.

I et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes anvendelse av et løselig CTLA4-molekyl ifølge oppfinnelsen for fremstilling av en farmasøytisk blanding for behandling av en immunsystem sykdom, en infeksjonssykdom eller kreft.

Foretrukket er immunsystemsykdommen en autoimmun sykdom, en allotransplanat avvisning, en kronisk allergisk reaksjon, en transplantat avvisning eller en transplantat-mot-vert sykdom og den infeksiøse sykdom er en HIV-infeksjon eller HTLV1-infeksjon.

I et fjerde aspekt av foreliggende oppinnelse omfattes en in vitro fremgangsmåte for å regulere binding av et B7-bindende molekyl til et B7-antigen omfattende å kontakte et løselig CTLA4-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse med et B7-antigen.

Ifølge et ytterligere aspekt av oppfinnelsen dekkes en in vitro fremgangsmåte for å regulere CTLA4-positive T-celle interaksjoner med B7-positive celler omfattende å kontakte de B7-positive cellene med et løselig CTLA4-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse i en mengde effektiv til å interferere med reaksjonen av B7-antigenet med CTLA4.

Foretrukket kjennetegnes fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ved at interaksjonen med CTLA4-positive T-celler med B7-positive celler inhiberes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer løselige CTLA4 og hybride fusjonsproteiner derav, f.eks. løselige hybride fusjonsproteiner, som CD28/CTLA4Ig-fusjonsproteiner. Det ekstracellulære domene av CTLA4 er et eksempel på et løselig CTLA4-molekyl. Alternativt vil et molekyl som har det ekstracellulære domene av CTLA4 bundet til en peptidende, være et annet eksempel på et løselig CTLA4-molekyl.

Som et eksempel på et løselig hybridfusjonsprotein, tilveiebringes CD28/CTLA4Ig-fusjonsproteiner som har en første aminosyresekvens tilsvarende fragmenter av det ekstracellulære domene av CD28, bundet til en andre aminosyresekvens tilsvarende fragmenter av det ekstracellulære domene av CTLA4Ig, og en tredje aminosyre-sekvens tilsvarende hengsléregionene CH2 og CH3 av humant IgCyl. Én utførelse av de hybride fusjonsproteiner, er en CD28/CTLA4Ig-fusjonskonstruksjon som har en første aminosyre-sekvens inneholdende aminosyrerester fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 94 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CD28, bundet til en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester fra ca. posisjon 94 til ca. posisjon 125 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4, bundet til den tredje aminosyre-sekvens inneholdende aminosyrerester tilsvarende henglse-regionene CH2 og CH3 av humant IgCyl. Andre utførelser av de hybride fusjonsproteiner er beskrevet i tabellene I og II og eksempel 7.

Det beskrives en fremgangsmåte for å regulere T-celleinteraksjoner med andre celler ved å inhibere interaksjonen av CTLA4-positive T-celler med B7-positive celler ved omsetning av T-cellene med ligander for CTLA4-reseptoren. Ligandene omfatter B7lg-fusjonsprotein, et monoklonalt antistoff reaktivt med CTLA4-reseptor, og antistoff -fragmenter .

Det beskrives en fremgangsmåte for regulering av T-celieinteraksjoner med B7-positive celler, ved anvendelse av en ligand for B7-antigenet. En slik ligand er løselig CTLA4-fusjonsprotein, f.eks. CTLA4lg-fusjonsprotein, ifølge denne oppfinnelse, dets fragmenter eller derivater, løselig CD28/CTLA4-hybridfusjonsprotein, f.eks. det hybride CD28/CTLA4lg-fusjonsprotein, eller et monoklonalt antistoff reaktivt med B7-antigenet.

Det beskrives en fremgangsmåte for behandling av immunsystemsykdommer mediert ved T-celleinteraksjoner med B7-positive celler ved administrering av en ligand reaktiv med B7-antigen for å regulere T-celleinteraksjoner med B7-positive celler. Liganden er CTLA4Ig-fusjonsproeinet, eller CD28/CTIA4Ig-fusjonsproteinhybridet, eller et monoklonalt antistoff reaktivt med B7-antigen.

Et monoklonalt antistoff reaktivt med løselig CTLA4-fusjonsprotein og et monoklonalt antistoff reaktivt med løselig CD28/CTLA4-fusjonsprotein, er beskrevet for anvendelse ved regulering av cellulære interaksjoner.

En.ny ovariecellelinje fra kinesisk hamster som stabilt uttrykker CTLA4lg-fusjonsproteinet, er også beskrevet.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten en in vitro fremgangsmåte for blokkering av B7-interaksjon for regulering av immunresponsen. Denne fremgangsmåte omfatter å bringe lymfocytter i kontakt med et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten en in vitro fremgangsmåte for regulering av en immunrespons som omfatter å bringe B7-positive lymfocytter i kontakt med et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl.

Det beskrives en fremgangsmåte for inhibering av avstøtning av vevstransplantat fra et individ, hvor individet er en mottager av transplantert vev. Denne fremgangsmåte omfatter administrering til individet av et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl.

Det beskrives videre en fremgangsmåte for inhibering av transplantat-mot-vert-sykdom hos et individ, som omfatter administrering til individet av et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl. Fig. 1 er en diagramfremstilling av CTLA4Ig-fusjonskonstruksjoner som beskrevet i eksempel 2 nedenfor. Fig. 2 er et fotografi av en gel oppnådd fra SDS-PAGE kromatografisk rensing av CTLA4Ig som beskrevet i eksempel 2 nedenfor. Fig. 3 beskriver den komplette aminosyresekvens som koder for human CTLA4-reseptor (SEKV. ID NR. 13 og 14) fusjonert til onkostatin M-signalpeptidet (posisjon -25 til -1), og omfattende det nylig identifiserte N-bundede glykosyleringssete (posisjon 109-111), som beskrevet i eksempel 3 nedenfor. Fig. 4 beskriver resultatene av FACS<R->analyse av binding av B7Ig-fusjonsproteinet til CD28- og CTLA4-transfiserte COS-celler som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Fig. 5 beskriver resultatene av FACS<R->analyse av binding av renset CTLA4Ig på B7-antigenpositive (B7<+>) CHO-celler og på en lymfoblastoid cellelinje (PM LCL) som beskrevet i eksempel

. 4 nedenfor.

Fig. 6 er et diagram som illustrerer konkurransebindings-analyse av <lls>J-merket B7Ig til immobilisert CTLA4Ig.som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Fig. 7 er et diagram som viser resultatene av Scatchard-analyse av 129J-merket B7Ig som binder seg til immobilisert CTLA4Ig som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Fig. 8 er et fotografi av en gel fra SDS-PAGE-kromatografi av immunoutfellingsanalyse av B7-positive CHO-celler og PH LCL-celler over f latemerket med <11>SJ som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Fig. 9 et diagram som viser effekten på formering av T-celler av CTLA4Ig som målt ved [<J>H]-tymidininkorporering som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Fig. 10 er et stolpediagram som illustrerer effekten av CTLA4lg på hjelper-T-celle (Tb)-indusert immunoglobulinsekresjon fra humane B-celler som bestemt ved enzymimmunoassay (ELISA) som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Fig. 11A, llB og 11C er strekdiagrammer som viser over-levingen av xenotransplantater av humane pankreasøyer. Fig. 12A, 12B, 12C og 12D er fotografier av histopato-logipreparater av humane øyer transplantert under nyrekapslen hos Bl0-mus. Fig. 13 er et linjediagram som viser forlengelsen av overleving av øyeinnpoding med mAb til humant B7. Fig. 14 er et linjediagram som viser induksjon av donorspesifikk manglende respons på øyimplantatantigener med CTLA4lg. Fig. 15 er et linjediagram som viser antistoffserumtiter-nivå hos mus injisert med sau røde blodceller (SRBC), mAb L6 og rotte-lg, mAb L6 og anti-IL4, CTLAIg og rotte-lg, CTLA4lg og anti-IL4. Y-aksen måler antistoffserumtiteren. X-aksen måler tiden i dager. Den lukkede firkant representerer mus injisert med SRBC på dag 0 og dag 46. Den åpne firkant representerer mus injisert med SRBC ved dag 46. Den lukkede cirkel representerer mus injisert med mAb L6 og rotteimmunoglobulin. Den åpne sirkel representerer mus injisert med mAb L6 og anti-IL4-antistoff. Det lukkede triangel representerer

mus injisert med CTLA4Ig og rotteimmunoglobulin. Det åpne triangel representerer mus injisert med CTLA4Ig og anti-IL4-antistoff.

Fig. 16 er et linjediagram som viser antistoffserumtiter-nivå for mus injisert med KLH, mAb L6 og rotte-lg, mAb L6 og anti-IL4, CTLA4Ig og rotte-Ig, CTLA4Ig og anti-IL4. Y-aksen måler antistoffserumtiteren. X-aksen måler tiden i dager. Den lukkede firkant representerer mus injisert med keyhole limpet hemocyanin (KLH) ved dag 46. Den lukkede sirkel representerer mus injisert med mAb L6 og rotteimmunoglobulin.

Den åpne sirkel representerer mus injisert med mAb L6 og anti-IL4-antistoff. Det lukkede triangel representerer mus injisert med CTLA4Ig og rotteimmunoglobulin. Det åpne triangel representerer mus injisert med CTLA4Ig og anti-IL4-antistoff. Fig. 17 er et diagram som viser sekvenseringsinnrettingen av CD28 og CTLA4-familiemedlemmene. Sekvenser av human (H), mus (M), rotte (R) og kylling- (Ch) CD28 er innrettet med human og mus CTLA4. Restene er nummerert fra N-terminus i det modne protein med signalpeptidene og transmembrandomenene understreket og de CDR-analoge regioner bemerket. Mørklagte områder viser fullstendig konservering av rester, mens områder med lys skygge viser konservative aminosyresubstitusjoner i alle familiemedlemmer. Fig. 18 er et linjediagram som viser CTLA4Ig og CD28Ig-mutanter som binder seg til B7-1. Fig. 19 er et skjematisk kart av CTLA4/CD28Ig hybride fusjonsproteiner. Åpne områder representerer CD28-sekvens; fylte områder reprsenterer CTLA4-sekvens; kryss-skraverte områder representerer begynnelse av IgG Fc (referer også til tabell I). Fig. 20A/B. Et linjediagram som viser at CTLA4/CD28Ig-hybride fusjonsproteiner binder seg med høy begjærlighet til B7-1 CHO-celler. Fig. 21. Molekylmodell av monomert CTLA4Ig v-lignende ekstracellulært domene.

Som anvendt i denne søknad skal følgende ord eller setninger ha de angitte betydninger.

Som anvendt heri skal "blokkering av B7-interaksjon" bety å interferere med bindingen av B7-antigenet til sine ligander som CD28 og/eller CTLA4 og derved forhindre T-celle og B-celle-interaksjon.

Som anvendt heri skal et "B7-bindende molekyl" bety et hvilket som helst molekyl som vil binde B7-antigenet.

Som anvendt heri skal et "IL4-bindende molekyl" bety et hvilket som helst molekyl som vil anerkjenne og binde seg til IL4.

Som anvendt heri skal en "CTLA4-mutant" bety et molekyl som har aminosyrer som er lik aminosyresekvensen av det ekstracellulære domene av CTLA4, slik at molekylet anerkjenner og binder et B7-antigen.

Som anvendt heri skal en "CD28-mutant" bety et molekyl som har aminosyrer som er lik aminosyresekvensen av det ekstracellulære domene av CD28, slik at molekylet anerkjernner og binder et B7-antigen.

Som anvendt heri skal et "CTLA4/CD28-hybridfusjonsprotein" være et molekyl som i det minste har porsjoner av det ekstracellulære domene av både CTLA4 og CD28, slik at molekylet anerkjenner og bindet et B7-antigen.

For at oppfinnelsen beskrevet heri, kan forstås mere fullstendig, er følgende beskrivelse fremsatt.

Det beskrives isolering og ekspresjon av den humane CTLA4-reseptor som finnes på T-celleoverflater, og som binder seg til B7-antigenet uttrykt på aktiverte B-celler, og celler av andre linjer, og ekspresjon av løselige fusjonsproteinprodukter av CTLA4-reseptorgenet. Det beskrives også fremgangsmåter for anvendelse av den uttrykte CTLA4-reseptor til regulering av cellulære interaksjoner, innbefattet T-celleinteraksjoner med B7-positive celler.

Foretrukket blir den komplette og korrekte DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen tilsvarende humant CTLA4-reseptorprotein klonet ved anvendelse av PCR. Det cDNA som inneholder den komplette forutsette kodesekvens for CTLA4, ble sammensatt fra to PCR-fragmenter oppformert fra H38 RNA, og innsatt i ekspresjonsvektoren CDM8, som beskrevet i detalj i eksemplene nedenfor. Isolater ble transfisert i COS-celler og testet for binding av B7Ig, et løselig fusjonsprotein som har en aminosyresekvens tilsvarende det ekstracellulære domene av B7 og en human immunoglobulin (lg) Cyl-region, som beskrevet av Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991).

DNA-sekvensen av ett isolat, betegnet som OMCTLA4, ble deretter bestemt og funnet å svare nøyaktig til den forutsette humane CTLA4-sekvens, fusjonert i N-terminus til signalpeptidet fra onkostatin M. CTLA4-reseptoren blir kodet av 187 aminosyrer (eksklusive signalpeptidet og stoppkodoner) og omfatter et nylig identifisert N-bundet glykosyleringssete i aminosyreposisjonene 109-111 (se fig. 3 nedenfor). CTLA4-reseptoren blir uttrykt ved anvendelse av onkostatin M-signalpeptidet.

I en annen foretrukket utførelse, fremstilles løselige former av proteinproduktet av CTLA4-reseptorgenet (CTLA4Ig) ved anvendelse av fusjonsproteiner som har en første aminosyresekvens tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4 og en andre aminosyresekvens tilsvarende det humane IgCyl-domene.

Klonings- og ekspresjonsplasmider (CDM8 og «LN) ble konstruert inneholdende cDNA som koder for deler av aminosyresekvensen tilsvarende human CTLA4-reseptor basert på cDNA-sekvensen beskrevet heri, hvor det cDNA som koder for en første aminosyresekvens tilsvarende et fragment av det ekstracellulære domene av CTLA4-reseptorgenet, blir bundet til DNA som koder for en andre aminosyresekvens tilsvarende en IgC-region som tillater ekspresjon av CTLA4-reseptorgenet ved å forandre løseligheten av det uttrykte CTLA4-protein.

Løselig CTLA4lg-fusjonsprotein blir således kodet av en første aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 125 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4 bundet til en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester tilsvarende CH2 og CH3-hengsleregionene av humant IgCyl. Fusjonsproteinet fremstilles fortrinnsvis i dimer form. Konstruksjonen ble deretter transfisert i COS eller CHO-celler, og CTLA4Ig ble renset og identifisert som en diraer.

Ifølge praktiseringen kan CTLMIg og CTLA4/CD28-fusjonsproteinhybridet ha aminosyresubstitusjoner i aminosyresekvensen tilsvarende det eksterne domene av CTLA4 for å frembringe molekyler som ville beholde den funksjonelle egenskap hos CTLA4, nemlig det molekyl som har slike substitusjoner vil fremdeles binde B7-antigenet. Disse aminosyresubstitusjoner omfatter, men er ikke nødvendigvis begrenset til, aminosyresubstitusjoner som er kjent på dette området som "konservative".

F.eks. er det et vel etablert prinsipp i proteinkjemien at visse aminosyresubstitusjoner, med tittelen "konservative aminosyresubstitusjoner", ofte kan gjøres i et protein uten å forandre hverken konformasjonen eller funksjonen av proteinet.

Slike forandringer omfatter å substituere hvilket som helst av isoleucin (I), valin (V) og leucin (L) for hvilken som helst annen av disse hydrofobe aminosyrer; asparaginsyre (D) for glutaminsyre (E) og vice versa; glutamin (Q) for asparagin (N) og vice versa; og serin (S) for treonin (T) og vice versa. Andre substitusjoner kan også betraktes som konservative, avhengig av miljøet for den særlige aminosyre og dens rolle i proteinets tredimensjonale struktur. F.eks. kan glycin (G) og alanin (A) ofte være utbyttbare med hverandre, og likeså kan alanin og valin (V).

Metionin (M), som er relativ hydrofob, kan ofte utbyttes med leucin og isoleucin, og av og til med valin. Lysin (K) og arginin (R) er ofte utbyttbare på steder hvor det signifikante trekk av aminosyreresten er dens ladning, og de forskjellige pK'er av disse to aminosyrerester ikke er signifikante. Ytterligere andre forandringer kan betraktes som "konservative" i særlige miljø.

Ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet heri, ble det i virkeligheten frembragt mutanter av det B7-bindende molekyl.

Én mutant omfatter (1) en sekvens som begynner med aminosyren i posisjon 1 og slutter med aminosyren i posisjon 95 av CD28-reseptorproteinet; (2) en sekvens som begynner med aminosyren

i posisjon 95 og slutter med aminosyren i posisjon 125 av det ekstracellulære domene i CTLA4; og (3) en sekvens tilsvarende det humane IgCyl-domene.

Den andre mutant omfatter (1) en sekvens som begynner med aminosyren i posisjon 1 og slutter med aminosyren i posisjon 95 av CD2 8-reseptorproteinet; (2) en sekvens som begynner med aminosyren i posisjon 95 og slutter med aminosyren i posisjon 120 av det ekstracellulære domene av CTLA4; og (3) en sekvens tilsvarende det humane IgCyl-domene.

Det beskrivese en fremgangsmåte for blokkering av B7-interaksjon for å regulere immun-responsen, og som omfatter å bringe lymfocytter i kontakt med et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl. Lymfocyttene kan være B7-positive lymfocytter.

Det beskrives videre en fremgangsmåte for regulering av en immunrespons som omfatter å bringe B7-positive lymfocytter i kontakt med et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl.

Immunresponsen kan være en B-cellerespons som fører til inhibering av antistoffproduksjon. Dessuten kan immunresponsen være en T-cellerespons som fører til inhibering av cellemediert immunitet. Videre kan immunresponsen være en inhibering av lymfocyttformering.

Det beskrives også en fremgangsmåte for inhibering av avstøtning av et vevstrans-plantat fra et individ, hvor individet er en mottager av transplantert vev. Denne fremgangsmåte kan omfatte administrering til individet av et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl.

Det beskrives en fremgangsmåte for inhibering av transplantat-mot-vert-sykdom hos et individ som omfatter administrering til individet av et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl.

Ifølge praktiseringen kan det B7-bindende molekyl være et CTLA4lg-fusjonsprotein. F.eks. kan CTLA4Ig-fusjonsproteinet være et fusjonsprotein som har en første aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 125 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære domene av CTLA4, og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester tilsvarende CH2 og CH3-hengsleregionene av humant immunoglobulin Cyl.

Alternativt kan det B7-bindende molekyl være et løselig CD28/CTLA4-hybridfusjonsprotein. F.eks. kan CD28/CTLA4Ig-fusjonsproteinhybridet være et fusjonsproteinhybrid som har en første aminosyresekvens tilsvarende en porsjon av det ekstracellulære domene av CD28-reseptor fusjonert til en andre aminosyresekvens tilsvarende en porsjon av det ekstracellulære domene av CTLA4-reseptoren og en tredje aminosyresekvens tilsvarende CH2 og CH3-hengsleregionene av humant immunoglobulin Cyl.

Det IL4-bindende molekyl kan videre være et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner og binder seg til IL4. Alternativt vil det IL4-bindende molekyl være en løselig IL4-reseptor som gjenkjenner og binder seg til IL4 (Fanslow et al., 1991).

DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende CTLA4Ig-fusjonsproteinet er deponert hos the American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland, under Budapest-avtalen den 31. mai 1991, og har fått ATCC adgangsnummer: 68629.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer det første proteinprodukt av CTLA4-transkripter i form av et løselig fusjonsprotein. CTLA4Ig-proteinet danner en disulfidsammenbundet dimer som har to underenheter, hvorav hver har en Mr på ca. 50.000, hvilket viser at naturlig CTLA4 sannsynligvis eksisterer på T-celleoverflaten som en disulfidsammenbundet homodimer.

B7-antigen er blitt vist å være en ligand for CD28-reseptor på T-celler (Linsley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, supra). CTLA4-reseptormolekylet synes funksjonelt og strukturelt beslektet med CD28-reseptoren; begge er reseptorer for B-celleaktiveringsantigenet, B7, mens CTLA4 synes å ha høyere affinitet for B7, blant de høyeste hittil rapportert for lymfoide adhesjonssystemer. CTLA4Ig ble imidlertid vist å binde seg kraftigere til B7-positive (B7<+>) cellelinjer enn

CD28Ig. Andre eksperimenter viste at CTLA4 er en høyere affinitetsreseptor for B7-antigen enn CD28-reseptor. Dessuten ble det vist at CTLA4lg binder et enkelt protein på lymfoblastoide celler som er lignende i størrelse med B7-antigenet.

CTLA4lg inhiberte T-celleformering og inhiberte Th-indusert IgM-produksjon.

I en annen foretrukket utførelse, ble det konstruert hybride fusjonsproteiner som har aminosyresekvenser tilsvarende fragmenter av forskjellige reseptorproteiner. F.eks. ble aminosyresekvenser tilsvarende utvalgte fragmenter av de ekstracéllulære domener av CD28 og CTLA4, bundet sammen under dannelse av løselige CD28/CTLA4-hybride fusjonsproteiner, f.eks. et CD28/CTLA4lg-fusjonsprotein. Dette protein ble oppnådd med en første aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester tilsvarende et fragment av det ekstracellulære domene av CD28 bundet til en andre aminosyresekvens tilsvarende et fragment av det ekstracellulære domene av CTLA4Ig og til en tredje aminosyresekvens tilsvarende CH2 og CH3-hengsleregionene av humant IgCyl.

Én utførelse av de hydride fusjonsproteiner er en CD28/- CTLA4Ig-fusjonskonstruksjon som har en første aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 94 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CD28, bundet til en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester fra ca. posisjon 94 til ca. posisjon 125 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4, bundet til en tredje aminosyre-sekvens tilsvarende CH2 og CH3-henglse-regionene av humant IgCyl.

Teknikkene for kloning og ekspresjon av DNA-sekvenser som koder for aminosyresekvensene tilsvarende CTLA4-reseptorproteinet, løselige fusjonsproteiner og hybride fusjonsproteiner, f.eks. syntese av oligonukleotider, PCR, transfor-mering av celler, konstruksjon av vektorer, ekspresjons-systemer og lignende er vel etablert på dette området, og de fleste praktikere er fortrolige med standardkildematerialene for spesifikke betingelser og fremgangsmåter. Følgende avsnitt tilveiebringes imidlertid av praktiske grunner, og bemerkning av modifikasjoner hvor det er nødvendig, og kan tjene som en retningslinje.

Kloning og ekspresjon av kodesekvenser for reseptorer og fusi onsproteiner

Fusjonsproteinkonstruksjoner tilsvarende CD28IgCyl og B7IgCyl for karakterisering av CTLA4Ig ifølge den foreliggende oppfinnelse, og for fremstilling av CD28/CTLA4 hybride fusjonsproteiner, ble fremstilt som beskrevet av Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991), inkorporert ved referanse heri. Alternativt kan cDNA-kloner fremstilles fra RNA oppnådd fra celler som uttrykker B7-antigen og CD28-reseptor basert på kjennskap til de publiserte sekvenser for disse proteiner (Aruffo og Seed, og Freeman, supra) ved anvendelse av standard fremgangsmåter.

CTLA4lg-fusjoner bestående av DNA som koder for aminosyresekvenser tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4 og CH2 og CH3-hengsleregionene i humant IgCyl, ble konstruert ved ligering av PCR-fragmenter. cDNA som koder for aminosyresekvensene blir oppformert ved anvendelse av polymerasekjede-reaksjons- ("PCR") teknikken (U.S. patentene nr. 4.683.195 og 4.683.202 til Mullis et al. og Mullis & Faloona, Methods Enzymol. 154:335-350 (1987)). Det ble oppnådd CTLA4Ig-fusjonspolypeptider som har DNA som koder for aminosyresekvenser inneholdende aminosyrerester fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 125 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4 og DNA som koder for aminosyresekvenser tilsvarende CH2 og CH3-henglseregionene av IgCyl.

Fordi ekspresjonen av CTLA4-reseptorprotein i humane lymfoidceller ikke tidligere har vært rapportert, var det nødvendig å lokalisere en kilde for CTLA4 mRNA. PCR cDNA laget av det totale cellulære RNA fra flere humane leukemi-cellelinjer ble screenet, ved anvendelse som primere, av oligonukleotider fra den publiserte sekvens av CTLA4-genet (Dariavach et al., supra). Av det testede cDNA, ga H38-celler

(en HTLV II-assosiert leukemilinje) det beste utbytte av PCR-produkter med den forventede størrelse. Siden et signalpeptid for CTLA4 ikke ble identifisert i CTLA4-genet, ble N-terminus av den forventede sekvens av CTLA4 fusjonert til signalpeptidet av onkostatin M (Malik et al., Molec. and Cell. Biol. 9:2847 (1989)) i to trinn ved anvendelse av oligonukleotider som beskrevet i eksemplene nedenfor. Produktet av PCR-reaksjonen ble ligert med cDNA som koder for aminosyresekvensene tilsvarende CH2 og CH3-henglseregionene av IgCyl i en ekspresjonsvektor, som CDM8 eller «LN.

For å oppnå DNA som koder for human CTLA4 i full lengde, ble det oppnådd et.cDNA som koder for de transmembrane og cytoplasmatiske domener av CTLA4 ved PCR fra H38-celler, og sammenbundet med et fragment fra CTLA4Ig, oppnådd som beskrevet ovenfor, og som koder for onkostatin M-signalpeptidet sammensmeltet med N-terminus av CTLA4, ved anvendelse av oligonukleotidprimere som beskrevet i eksemplene nedenfor. PCR-fragmenter ble ligert inn i plasmidet CDM8, hvilket resulterte i et ekspresjonsplasmid som koder for CTLA4-genet i full lengde, og betegnet 0MCTLA4.

For konstruksjon av DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende hybride fusjonsproteiner, blir DNA som koder for aminosyrer tilsvarende deler av det ekstracellulære domene av ett reseptorgen, sammenbundet med DNA som koder for aminosyrer tilsvarende deler av det ekstracellulære domene av et annet reseptorgen, og til DNA som koder for aminosyresekvensene tilsvarende CH2 og CH3-hengsleregionene av humant IgCyl ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrevet ovenfor for B7Ig, CD28Ig og CTLA4Ig-konstruksjonene. Således blir f.eks. DNA som koder for aminosyrerester fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 94 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CD28-reseptoren, sammenbundet med DNA som koder for aminosyrererester fra ca. posisjon 94 til ca. posisjon 125 av aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære domene av CTLA4-reseptoren, og med DNA som koder for aminosyresekvensene tilsvarende CH2 og CH3-henglseregionene av humant IgCyl.

For å fremstille store mengder av klonet DNA, blir vektorer inneholdende DNA som koder for fusjonskonstruksjonene ifølge oppfinnelsen, transformert inn i egnede vertsceller,

som f.eks. bakteriecellelinjen E. coli-stammen MC1061/p3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) ved anvendelse av standard fremgangsmåter, og kolonier blir screenet for de hensiktsmessige plasmider.

Klonene inneholdenede DNA som koder for fusjonskontruk-sjoner oppnådd som beskrevet ovenfor, blir deretter transfisert inn i egnede vertsceller for ekspresjon. Avhengig av den anvendte vertscelle gjennomføres transfeksjonen ved anvendelse av standardteknikker hensiktsmessige for slike celler. F.eks. gjennomføres transfeksjon inn i pattedyrceller ved anvendelse av DEAE-dekstranmediert transfeksjon, CaP04-ko-presipitasjon, lipofeksjon, elektroporasjon eller protoplast-fusjon, og andre fremgangsmåter kjent på dette området omfattende: lysozymfusjon eller erytrocyttfusjon, skraping, direkte opptak, osmotisk eller sukrosesjokk, direkte mikroinjeksjon, indirekte mikroinjeksjon som f.eks. via erytro-cyttmediert teknikk, og/eller ved å utsette vertsceller for elektriske strømmer. Ovennevnte liste over transfeksjons-teknikker blir ikke ansett som uttømmende, ettersom andre fremgansmåter for innføring av genetisk informasjon i celler uten tvil vil bli utviklet.

Ekspresjon i eukaryotiske vertscellekulturer avledet fra multicellulære organismer, blir foretrukket {Tissue Cultures, Academic Press, Cruz og Patterson, utgivere (1973)). Disse systemer har en ytterligere fordel ved evnen til å utelate introner, og kan således anvendes direkte til å uttrykke genomiske fragmenter. Anvendelige vertscellelinjer omfatter kinesisk hamster ovari (CHO), apekattnyre (COS), VERO og HeLa-celler. I den foreliggende oppfinnelse, foretrekkes cellelinjer som stabilt uttrykker fusjonskonstruksjonene.

Ekspresjonsvektorer for slike celler vil vanligvis omfatte promotorer og kontrollsekvenser forlikelige med pattedyrceller som f.eks. CMV-promototor (CDM8-vektor) og fjærfe-sarkomavirus (ASV) (jtLN-vektor) . Andre vanlig anvendte tidlige og sene promotorer omfatter dem fra Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature 273:113 (1973)), eller andre viruspromotorer som f.eks. dem avledet fra polyoma, adenovirus 2 og bovint papillomavirus. Den kontrollerbare promotor, hMTII (Karin et al., Nature 299:797-802 (1982)) kan også anvendes. Generelle aspekter av pattedyrcellevertssystem-transformasjoner er beskrevet av Axel (U.S. patent nr. 4.399.216, gitt 16. august 1983). Det synes nå som om "enhancer"-regioner er viktige ved ekspresjonsoptimalisering; disse er vanligvis sekvenser som finnes oppstrøms eller ned-strøms for promotorregionen i ikke-kodende DNA-regioner. Replikasjonsstartområder kan oppnås, om nødvendig, fra virus-kilder. Integrering i kromosomet er imidlertid en vanlig mekanisme for DNA-replikasjon i eukaryoter.

Selv om foretrukne vertsceller for ekspresjon av fusjons-konstruksj onene omfatter eukaryotiske celler som COS eller CHO-celler, kan det anvendes andre eukaryotiske mikrober som verter. Laboratoriestammer av Saccharomyces cerevisiae, bakergjær, er mest anvendt selv om andre stammer som Schizo-saccharomyces pombe kan anvendes. Vektorer som anvender f. eks. 2 \ i replikas jonsstartområdet til Broach, Meth. Enz. 101:307 (1983), eller andre gjærforlikelige replikasjonsstartområder (f.eks. Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Tschempe et al., Gene 10:157 (1980); og Clarke et al., Meth. Enz. 101:300 (1983)) kan anvendes. Kontrollsekvenser for gjærvektorer omfatter promotorer for syntese av glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17:4900 (1978)). Ytterligere promotorer kjent på dette området, omfatter CMV-promotoren som tilveiebringes i CDM8-vektoren (Toyama og Okayama, FEBS 268:-217-221 (1990); promotoren for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)), og de for andre glykolytiske enzymer. Andre promotorer, som har den ytterligere fordel ved transkripsjon kontrollert av vekstbeting-elser, er promotorregionene for alkoholdehydrogenase 2, iso-cytokrom C, syrefosfatase, degradative enzymer i forbindelse med nitrogenmetabolisme, og enzymer ansvarlige for maltose og galaktoseanvendelse. Det blir også antatt at terminator-sekvenser er ønskelige i 3'-enden av kodesekvensene. Slike terminatorer finnes i den 3'-ikke-translaterte region som. følger etter kodesekvensene i gjæravledede gener.

Alternativt kan prokaryote celler anvendes som verter for ekspresjon. Prokaryoter representeres oftest av forskjellige stammer av E. coli; andre mikrobestammer kan imidlertid også anvendes. Vanlig anvendte prokaryote kontrollsekvenser som er definert heri til å inkludere promotorer for transkripsjons-initiering, eventuelt med en operator, sammen med ribosom-bindingssetesekvenser, inkluderer slike vanlig anvendte promotorer som betalaktamase (penicillinase) og laktose- (lac) promotorsystemene (Chang et al., Nature 198:1056 (1977)), tryptofan- (trp) promotorsystemet (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (8:4057 (1980)) og den lambda-avledede PL-promotor og N-genribosombindingssete (Shimatake et al., Nature 292:128

(1981)).

Nukleotidsekvensene som koder for CD28Ig og CTLA4Ig-proteinene, og fusjonshybridproteinene som CD28/CTIjA4Ig, kan uttrykkes i flere forskjellige systemer som fremsatt nedenfor.

cDNA kan skjæres ut ved egnede restriksjonsenzymer og ligeres inn i egnede prokaryote eller eukaryote ekspresjonsvektorer for slik ekspresjon. Fordi CD28 og CTLA4-reseptorproteiner forekommer i naturen som dimerer, blir det antatt at gunstig ekspresjon av disse proteiner krever et ekspresjonssystem som tillater disse proteiner å. dannes som dimerer. Avkuttede versjoner av disse proteiner (dvs. dannet ved innføring av et stoppkodon i sekvensen i en posisjon oppstrøms for den transmembrane region av proteinet) synes ikke å bli uttrykt. Ekspresjonen av CD28 og CTLA4-reseptorer som fusjonsproteiner tillater dimerdannelse av disse proteiner. Ekspresjon av CTLA4-protein som et fusjonsprodukt blir derfor foretrukket i den foreliggende oppfinnelse.

En stabil CHO-linje betegnet kinesisk hamster ovariecellelinje CTLA4Ig-24, blir foretrukket for ekspresjon av CTLA4Ig og er blitt deponert hos ATCC under betingelsene for Budapest-avtalen 31. mai 1991, og gitt ATCC-adgangsnummer 10762.

Ekspresjon av CTLA4-reseptoren ifølge oppfinnelsen blir gjennomført ved transfeksjon av en cellelinje som COS-celler, og påvisning av ekspresjon ved binding av de CTLA4-transfiserte celler til en ligand for CTLA4-reseptoren, f.eks. ved testing for binding av cellene til B7Ig-fusjonsprotein.

Sekvenser av de resulterende konstruksjoner blir bekreftet ved DNA-sekvensering ved anvendelse av kjente fremgangsmåter, f.eks. som beskrevet av Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463 (1977), som videre beskrevet av Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981), eller ved fremgangsmåten til Maxam et al., Methods Enzymol. 65:499 (1980)).

Gjenvinning av proteinprodukter

Som bemerket ovenfor blir CD28 og CTLA4-reseptorgener ikke lett uttrykt som modne proteiner ved anvendelse av direkte ekspresjon av DNA som koder for det avkappede protein.

For å muliggjøre homodimerdannelse, blir DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende de ekstracellulære domener av CD28 og CTLA4, og innbefattet kodonene for en signalsekvens som den for onkostatin M i celler som er i stand til hensikts-messig bearbeiding, sammensmeltet med DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende Fc-domenet i et naturlig dimert protein. Rensing av disse fusjonsproteinprodukter etter utskilling fra cellene blir således lettet ved anvendelse av antistoffer reaktive med anti-immunoglobulindelen av fusjonsproteinene. Når det er sekretert i mediet, blir fusjons-proteinproduktet gjenvunnet ved anvendelse av standardprotein-renseteknikker, f.eks. ved påsetting på protein A-kolonner.

ANVENDELSE

CTLA4lg-fusjonsprotein og/eller fragmenter av fusjonsproteinet kan anvendes til å reagere med B7-positive celler, slik som B-celler, for å regulere immunresponser mediert av T-celleinteraksjoner med de B7-antigenpositive celler eller in vitro for leukocytt-typing for å definere B-cellemodningstrinn og/eller B-celleassosierte sykdommer (Yokochi et al., J. Immuno. 128(2):823). Overflateimmunfarging av leukocytter blir oppnådd ved immunofluorescensteknologi eller immuno-enzymatiske metoder, men andre påvisningsmåter er mulige.

Løselige CTLA4-proteiner og CTLA4/CD28 hybride fusjonsproteiner, og/eller fragmenter og derivater.av disse proteiner, kan også anvendes til å reagere med B7-positive celler, innbefattet B-celler, for å regulere immunresponser mediert av T-celleavhengige B-celleresponser. Betegnelsen "fragment" som anvendt heri, betyr en del av aminosyre-sekvensen som koder for proteinet referert til som "CTLA4".

Et fragment av det løselige CTLA4-protein som kan anvendes, er et polypeptid som har en aminosyresekvens tilsvarende en del av aminosyresekvensen som svarer til CTLA4-reseptoren anvendt til å oppnå det løselige CTLA4-protein som beskrevet heri.

B7-antigenet uttrykt på aktiverte B-celler og celler av andre linjer, og CD28-reseptoren uttrykt på T-celler, kan direkte binde seg til hverandre, og denne interaksjon kan mediere celle-celle-interaksjon. Slike interaksjoner vil direkte utløse CD28-aktiveringsmekanismen i T-celler, og lede til cytokinproduksjon, T-celleformering, og B-celle-differensiering til immunoglobulinproduserende celler. Den aktivering av B-celler som foregår, kan forårsake øket ekspresjon av B7-antigen og ytterliger CD28-stimulering, og føre til en tilstand av kronisk inflammasjon som ved autoimmune sykdommer, allotransplantatavstøtning, transplantat-mot-vert-sykdom eller kroniske, allergiske reaksjoner. Blokkering eller inhibering av denne reaksjon kan være effektiv til å forebygge T-cellecytokinproduksjon og således forebygge eller reversere inflammatoriske reaksjoner.

Løselig CTLA4, f.eks. CTLA4Ig, er vist heri å være en potent inhibitor for in vitro-lymfocyttfunksjoner som krever T- og B-celleinteraksjon. Dette viser viktigheten av interaksjoner mellom B7-antigenet og dets motreseptorer, CTLA4 og/eller CD28. De cytoplasmatiske domener av murin og human CTLA4 ligner hverandre (Dariavach et al., supra, 1988), hvilket antyder at denne region har viktige funksjonelle egenskaper. De cytoplasmatiske domener av CD28 og CTLA4 har også felles homologi.

CTLA4 er en mere potent inhibitor in vitro av lymfocyttresponser enn både anti-BBl eller anti-CD28 mAbs. CTLA4lg har ingen direkte stimulerende effekt.på T-celleformering til å motvirke dens inhibitoriske effekter. CTLA4lg-fusjonsproteinet kan følgelig virke som en bedre inhibitor in vivo enn anti-CD28-monoklonale antistoffer. De immunosuppresive effekter av CTLA4Ig in vitro antyder dets anvendelse i terapi for behandling av autoimmune forstyrrelser som involverer abnormal T-celleaktivering eller Ig-produksjon.

CTLA4lg-fusjonsproteinet er ventet å ha inhibitoriske egenskaper in vivo. Det er således ventet at CTLA4Ig vil virke til å inhibere T-celler på en måte som ligner de effekter som observeres for anti-CD28-antistoffet, under lignende betingelser in vivo. Under betingelser hvor T-celle/B-celleinteraksjoner foregår som et resultat av kontakt mellom T-celler og B-celler, kan binding av innført CTLA4Ig for å reagere med B7-antigenpositive celler, f.eks. B-celler, interfere, dvs. inhibere, T-celle/B-celleinteraksjonene, hvilket resulterer i regulering av immunresponser. På grunn av denne eksklusivt inhibitoriske effekt, forventes CTLA4Ig å være anvendelig in vivo som inhibitor for T-celleaktivitet, over ikke-spesifikke inhibitorer som cyklosporin og gluko-steroider.

I én utførelse kan CTLA4lg-fusjonsproteinet eller CTLA4/- CD28Ig-hybridproteinene, innføres i en egnet farmasøytisk bærer in vivo, dvs. administreres til et humant individ for behandling av patologiske tilstander som immunsystemsykdommer eller kreft.

Innføring av fusjonsproteinet in vivo er ventet å resultere i interferens med T-celleinteraksjoner med andre celler, slik som B-celler, som resultat av binding av liganden til B7-positive celler. Forebyggelse av normale T-celle-interaks joner kan resultere i nedsatt T-celleaktivitet, f.eks. nedsatt T-celleformering. Dessuten er administrering av fusjonsproteinet in vivo ventet å resultere i regulering av in vivo-nivået av cytokiner, innbefattet, men ikke begrenset til, interleukiner, f.eks. interleukin ("IL")-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, vekstfaktorer innbefattet tumorvekstfaktor ("TGF"), kolonistimulerende faktor ("CSF"), interferoner ("IFN'er") og tumornekrosefaktor ("TNF") for å befordre ønskede effekter hos et individ. Når f.eks. fusjonsproteinet innføres in vivo, kan det blokkere produksjon av cytokiner, som bidrar til ondartet vekst, f.eks. av tumorceller. Fusjonsproteinet kan også blokkere formering av virus avhengige av T-celleaktivering, slik som det virus som forårsaker AIDS, HTLV1.

Under noen omstendigheter, som bemerket ovenfor, vil effekten av administrering av CTLA4lg-fusjonsproteinet eller dets fragmenter in vivo være inhibitorisk, hvilket skyldes, blokkering ved fusjonsproteinet av den CTLA4 og CD28 igang-setting som skriver seg fra T-celle/B-cellekontakt. F.eks. kan CTLA4Ig-proteinet blokkere T-celleformering. Innføring av CTLA4lg-fusjonsproteinet in vivo vil således frembringe effekter på både T- og B-cellemediert immunrespons. Fusjonsproteinet kan også administreres til et individ i kombinasjon med innføring ac cytokiner eller andre terapeutiske reagenser.

I en ytterligere utførelse blir andre reagenser, innbefattet derivater reaktive med CTLA4lg-fusjonsproteinet eller CTLA4-reseptoren anvendt til regulering av T-celleinteraksjoner. F.eks. kan antistoffer, og/eller antistoff-fragmenter reaktive med CTLA4-reseptoren, bli screenet for å identifisere dem som er i stand til å inhibere bindingen av CTLA4lg-fusjonsproteinet til B7-antigenet. Antistoffene eller antistoff-fragmentene som Fab eller F(ab')2-fragmentene, kan deretter anvendes til å reagere med T-cellene, f.eks. for å inhibere T-celleformering.

Monoklonale antistoffer reaktive med CTLA4-reseptor, kan produseres av hybridoma fremstilt ved anvendelse av kjente fremgansmåter, som f.eks. de som er innført av Kohler og Milstein (Kohler og Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)), og modifikasjoner derav, for å regulere celleinteraksjoner.

Disse teknikker involerer anvendelse av et dyr som er primet for å produsere et bestemt antistoff. Dyret kan primes ved injeksjon av et immunogen (f.eks. B7Ig-fusjonsproteinet, CTLA4lg-fusjonsproteinet eller CD28/CTLA4Ig-hybridfusjons-proteinet eller andre funksjonelle, løselige former derav) for å frembringe den ønskede immunrespons, dvs. produksjon av antistoffer fra det primede dyr. Et primet dyr er også ett som uttrykker en sykdom. Lymfocytter avledet fra lymfe-knutene, milten eller perifert blod av primede, syke dyr kan anvendes til å søke etter et bestemt antistoff. Lymfocytt-kromosomene som koder for ønskede immunglobuliner, gjøres udødelige ved sammensmelting av lymfocyttene med myeloma-celler, vanligvis i nærvær av et fusjoneringsmiddel som f.eks. polyetylenglykol (PEG). Hvilke som helst av flere myeloma-cellelinjer kan anvendes som fusjonspartner ifølge standardteknikker; f.eks. P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4, eller HLl-653-myelomalinjene. Disse myelomalinjer er til-gjengelige fra ATCC, Rockville, Maryland.

De resulterende celler, som omfatter de ønskede hybridomer, blir deretter dyrket i et selektivt medium som f.eks. HAT-medium, hvori ikke-fusjonerte parenterale myeloma eller lymfocyttceller tilslutt dør. Bare hybridomacellene overlever og kan dyrkes under begrensende fortynningsbetingelser for å oppnå isolerte kloner. Supernatantene av hybridomene blir screenet for tilstedeværelse av den ønskede spesifisitet, f.eks. ved immunoassayteknikk ved anvendelse av CTLA4Ig-proteinet som er blitt anvendt for immunisering. Positive kloner kan deretter bli subklonet under begrensende fortynningsbetingelser, og det fremstilte monoklonale antistoff kan isoleres.

Forskjellige konvensjonelle fremgangsmåter kan anvendes for isolering og rensing av de monoklonale antistoffer for å oppnå dem fri for andre proteiner og forurensninger. Vanlig anvendte fremgangsmåter for rensing av monoklonale antistoffer omfatter ammoniumsulfatutfelling, ionebytterkromatografi, og affinitetskromatografi (Zola et al., i Monoklonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell (redaktør) pp. 51-52 (CRC Press, 1982)). Hybridomer fremstilt ifølge disse fremgangsmåter, kan propageres in vitro eller in vivo (i ascites fluid) ved anvendelse av teknikker kjent i teknologien (Fink et al., Proe. Clin; Pathol., 9:121-33 (1984), fig. 6-1 på s. 123).

Generelt kan den enkelte cellelinje propageres in vitro, f.eks. i laboratoriekulturbeholdere, og dyrkningsmediet inneholdende høye konsentrasjoner av et enkelt spesifikt monoklonalt antistoff, kan høstes ved dekantering, filtrering eller sentrifugering.

Dessuten kan det fremstilles fragmenter av disse antistoffer som inneholder den aktive bindingsregion reaktiv med det ekstracellulære doméne av CTLA4-reseptor, slik som Fab, F(ab')j og Fv-fragmenter. Slike fragmenter kan fremstilles ved anvendelse av teknikker vel etablert på dette området (f.eks. Rousseaux et al. i Metnods Enzymol., 121:663-69, Academic Press (1986)}.

Anti-B7-monoklonale antistoffer fremstilt som beskrevet ovenfor, kan anvendes til å binde seg til B7-antigenet for å inhibere interaksjoner av CD28-positive eller CTLA4-postive T-celler med B7-postive celler. Anti-CTLA4-monoklonale antistoffer kan anvendes til å binde seg til CTLA4-reseptor for å inhibere interaksjonen av CTLA4-positive T-celler med andre celler.

I en annen utførelse, kan CTLA4lg-fusjonsproteinet anvendes til å identifisere ytterligere forbindelser som er i stand til å regulere interaksjonen mellom CTLA4 og B7-antigenet. Slike forbindelser kan omfatte små naturlig forekommende molekyler som kan anvendes til å reagere med B-celler og/eller T-celler. F.eks. kan fermenteringsbuljong bli testet for evnen til å inhibere CTLA4/B7-interaksjoner. Dessuten kan det anvendes derivater av CTLA4lg-fusjonsproteinet som beskrevet ovenfor til å regulere T-celle formering. F.eks kan fragmentene eller derivatene anvendes til å blokkere T-celleformering i graft versus host- (GVH) sykdom som følger med a11ogen benmargt ransp1ant ering.

Den CD28-medierte T-celleformeringsmekanisme er cyklo-sporinresistent, i motsetning til formering drevet av CD3/Ti-cellereseptorkomplekset (June et al., 1987, supra). Cyklosporin er relativt ineffektiv som behandling for GVH-sykdom (Storb, Blood 68:119-125 (1986)). GVH-sykdom blir antatt å bli mediert av T-lymfocytter som uttrykker CD28-antigen (Storb og Thomas, Immunol. Rev. 88:215-238 (1985)). CDLA4lg-fusjonsproteinet kan således være anvendelig alene, eller i kombinasjon med immunosuppresanter som f.eks. cyklosporin, for blokkering av T-celleformering i GVH-sykdom.

Regulering av CTLA4-positive T-celleinteraksjoner med B7-positive celler, innbefattet B-celler, ved fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelse, kan således anvendes til behandling av patologiske tilstander som autoimmunitet, transplantering, infeksjonssykdommer og neoplasi.

B7-bindingsmolekylene og IL4-bindingsmolekylene beskrevet heri, kan være i flere forskjellige doseringsformer som omfatter, men ikke er begrenset til, flytende løsninger eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, stikkpiller, polymere mikrokapsler eller mikroblærer, liposomer, og injeserbare eller infuserbare løsninger. Den foretrukne form avhenger av administrasjonsmåten og den terapeutiske anvendelse.

Den mest effektive administråsjonsmåte og doseringsregime for molekylene ifølge den foreliggende oppfinnelse, vil av-henge av sykdommens alvorlighet og forløp, individets helse og respons på behandling, og den behandlende leges bedømmelse. Følgelig bør doseringen av molekylene titreres til det enkelte individ.

Det innbyrdes forhold mellom doseringer for dyr av forskjellige størrelser og arter og mennesker basert på mg/m<s >overflateareal, er beskrevet av Freireich, E.J., et al., (Quantitative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Cancer Chemother. Rep., 50, nr. 4, 219-244, mai 1966).

Justeringer i doseringsregimet kan gjøres for å optimal-isere den vekstinhiberende respons. Doser kan oppdeles og administreres på daglig basis, eller dosen kan reduseres proporsjonalt avhengig av situasjonen. F.eks. kan flere oppdelte doser administreres daglig, eller dosen kan reduseres proporsjonalt som angitt i den særlige terapeutiske situasjon.

Ifølge praktiseringen, kan en effektiv mengde for behandling av et individ være mellom ca. 0,1 og ca. 10 mg/kg legemsvekt av individet. Den effektive mengde kan også være en mengde mellom ca. 1 og ca. 10 mg/kg legemsvekt av individet.

Fordeler ifølge denne oppfinnelse

Den foreliggende oppfinnesle overvinner problemene i forbindelse med aktuelle terapier vedrørende forebyggelse av avstøtning av vev eller organtransplantater. I motsetning til foreliggende terapier, vil den foreliggende oppfinnelse påvirke bare immunologiske responser mediert av B7-interaksjoner.

F.eks. vil den foreliggende oppfinnelse påvirke de trans-plantatantigenspesifikke T-celler, og således indusere donorspesifikk og antigenspesifikk toleranse. Bindingen av CD28 til sin ligand, B7/BB1 (B7), under T-cellerreseptorengasjement er kritisk for korrekt T-cellesignalering i noen systemer (M.K. Jenkins, P.S. Taylor, S.D. Norton, K.B. Urdahl, J. Immunol. 147:2461 (1991); C.H. June, J.A. Ledbetter, P.S. Linsley, C.B. Thompson, Immunol. Today 11:211 (1990); H. Reiser, G.J. Freeman, Z. Razi-Wolf, CD. Gimmi, B. Benacerraf, L.M. Nadler, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 89:271 (1992); N.K. Damie, K. Klussman, P.S. Linsley, A. Aruffo, J. Immunol. 148:1985 (1992)).

Når interaksjonen av CD28 med sin ligand blir blokkert,

blir antigenspesifikke T-celler uhensiktsmessig indusert i en tilstand av antigenspesifikk T-celleanergi (M.K. Jenkins, P.S. Taylor, S.D. Norton, K.B. Urdahl, J. Immunol. 147:2461 (1991); F.A. Harding, J.G. McArthur, J.A. Gross, D.H. Raulet, J.P. Allison, Nature 356:607 (1992)).

CTLA4lg-fusjonsprotein binder seg til både humant og murint B7 (med en 20 ganger høyere affinitet enn CD28), blokkerer bindingen av CD28 til B7, inhiberer T-celleaktivering, og induserer manglende T-cellerespons in vitro (F.A. Harding, J.G. McArthur, J.A. Gross, D.H. Raulet, J.P. Allison, Nature 356:607 (1992); P.S. Linsley et al., J. Exp. Med. 174:561 (1991)).

Den foreliggende oppfinnelse ville dessuten være anvendelig til å oppnå ekspresjon av et løselig proteinprodukt av det hittil ikke-uttrykte CTLA4-gen, og til å identifisere en naturlig ligand for CTLA4 som er involvert i funksjonelle responser på T-celler. Det løselige proteinprodukt kunne deretter anvendes til regulering av T-celleresponser in vivo for behandling av patologiske tilstander.

Følgende eksempler er gitt for å illustrere den foreliggende oppfinnelse og for å hjelpe en vanlig fagperson til å fremstille og anvende den samme.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av B7Iq og CD28Ig- fus- ionsproteiner

Reseptorimmunoglobulin-C-gamma- (IgCy) fusjonsproteiner B7Ig og CD28Ig ble fremstilt som beskrevet av Linsley et al. i J. Exp. Med. 173:721-730 (1991), inkorporert ved referanse heri. I korthet ble DNA som koder for aminosyresekvenser tilsvarende det respektive reseptorprotein (f.eks. B7), bundet til DNA som koder for aminosyresekvenser tilsvarende CH2 og CH-hengsleregionene av humant IgCyl. Dette ble gjennomført som følger.

Polymerasekiedereaksnon ( PCR)

For PCR, ble DNA-fragmenter oppformert ved anvendelse av primerpar som beskrevet nedenfor for hvert fusjonsprotein. PCR-reaksjonene (0,1 ml sluttvolum) ble kjørt i Ta<q->polymerasebuffer (Stratagene, La Jolla, CA), inneholdende 20 umol hver av dNTP; 50-100 pmol av de angitte primere; templat (1 ng plasmid eller cDNA syntetisert fra < 1 ug total RNA ved anvendelse av vilkårlig heksamerprimer, som beskrevet av Kawasaki i PCR Protocols, Academic Press, pp. 21-27 (1990), inkorporert ved referanse heri); og Taq-polymerase (Stratagene). Reaksjonene ble kjørt på en thermocycler (Perkin Eimer Corp., Norwalk, CT) i 16-30 cykler (en typisk cyklus besto av trinn på 1 minutt ved 94°C, 1-2 minutter ved 50°C og 1-3 minutter ved 72°C) .

Plasmidkonstruksion

Ekspresjonsplasmider inneholdende cDNA som koder for CD28, som beskrevet av Aruffo og Seed, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:8573 (1987), ble fremskaffet av doktorene Aruffo og Seed (Mass General Hospital, Boston, MA). Plasmider inneholdende cDNA som koder for CD5, som beskrevet av Aruffo, Cell 61:1303 (1990), ble fremskaffet av Dr. Aruffo. Plasmider inneholdende cDNA som koder for B7, som beskrevet av Freeman et al., J. Immunol. 143:2714 (1989), ble fremskaffet av Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). For initialforsøk på ekspresjon av løselige former av CD28 og B7, ble det laget konstruksjoner (OMCD28 og OMB7) som beskrevet av Linsley et al., J. Exp. Med., supra, hvori stoppkodoner ble innført oppstrøms for de transmembrane domener, og de naturlige signalpeptider ble erstattet med signalpeptidet fra onkostatin M (Malik et al., Mol. Cell Biol. 9:2847 (1989)). Disse ble laget ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider for rekonstruksjon (OMCD28) eller som primere (OMB7) for PCR. OMCD28 er et CD28 cDNA modifisert for mere effektiv ekspresjon ved å erstatte signalpeptidet med den analoge region fra onkostatin M. CD28Ig og B7Ig-fusjonskonstruksjonene ble laget i to deler. 5'-delene ble laget ved anvendelse av OMCD28 og OMB7 som templater og oligonukleotidet, CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC (SEKV. ID NR.:1), (som koder for aminosyresekvensen tilsvarende onkostatin M-signalpeptidet) som en fremoverprimer, og enten henholdsvis TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTT-AGAAGGTCCGGGAAA (SEKV. ID NR.: 2), eller TTTGGGCTCCTGATCAGGAA-AATGCTCTTGCTTGGTTGT (SEKV. ID NR.: 3) som reverse primere.. Produktene av PCR-reaksjonene ble spaltet med restriksjons-endonukleaser (Hindlll og Bell) som seter innført i PCR-primerne og gelrenset.

3<1->delen av fusjonskonstruksjonene tilsvarende humane IgCyl-sekvenser ble laget ved en koblet revers transkriptase (fra fjærkre myeloblastosevirus; Life Scinces Associates, Bayport, NY)-PCR-reaksjon ved anvendelse av RNA fra en myeloma cellelinje som frembringer human mus kimer mAb L6 (fremskaffet av Dr. P. Fell og M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) som templat. 01igonukleotidet, AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACA-AAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (SEKV. ID NR.: 4),

ble anvendt som fremoverprimer, og CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCG-TGCGACCGCGAGAGC (SEKV. ID NR.: 5) som revers primer. Reaksjonsproduktene ble spaltet med Bell og Xbal og gelrenset.

Endelige konstruksjoner ble satt sammen ved ligering av Hindlll/BclI-spaltede fragmenter inneholdende CD28 eller B7-sekvenser sammen med BelI/Xbal-spaltet fragment inneholdende IgCyl-sekvenser inn i Hindlll/Xbal-spaltet CDM8. Ligeringsproduktene ble transformert inn i MC106l/p3 E. coli-celler, og koloniene ble screenet for de egnede plasmider. Sekvenser av de resulterende konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.

Konstruksjonen som koder for B7, inneholdt DNA som koder for aminosyrer tilsvarende aminosyrerestene fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 215 av det ekstracellulære domene av B7. Konstruksjonen som koder for CD28, inneholdt DNA som koder for aminosyrene tilsvarende aminosyrerestene fra ca. posisjon 1 til ca. posisjon 134 av det ekstracellulære domene av CD28.

CD5Ig ble konstruert på identisk måte, ved anvendelse av

CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (SEKV. ID NR.:

6), som fremoverprimer og ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATG-TGAC (SEKV. ID. NR.: 7) som revers primer. PCR-produktet ble restriksjonsendonukleasespaltet og ligert med IgCyl-fragmentet som beskrevet ovenfor. Den resulterende konstruksjon (CD5lg) kodet for et modent protein som har en aminosyresekvens inneholdende aminosyrerester fra posisjon 1 til posisjon 347 av sekvensen tilsvarende CD5, to aminosyrer innført ved konstruksjonsfremgangsmåten . (aminosyrene DQ), etterfulgt av DNA som koder for aminosyrer tilsvarende IgCyl-hengs le - regionen.

Cellekultur og transfeksioner

COS (apekattnyreceller) ble transfisert med ekspresjohs-plasmider som uttrykker CD28 og B7 ved anvendelse av en modifikasjon av protokollen til Seed og Aruffo (Proe. Nati. Acad. Sei. 84:3365 (1987)), inkorporert ved referanse heri. Cellene ble utsådd i 10S pr. 10 cm diameter dyrkningsskål 18 til 24 timer før transfeksjon. Plasmid-DNA ble tilsatt (ca. 15 ug/skål) i et volum på 5 ml av serumfritt DMEM inneholdende 0,1 mM klorokin og 600 Jig/ml DEAE Dextran, og cellene ble inkubert i 3-3,5 timer ved 37°C. Transfiserte celler ble deretter kort behandlet (ca. 2 minutter) med 10% dimetyl-sulfoksyd i PBS og inkubert ved 37°C i 16-24 timer i DMEM inneholdende 10% FCS. 24 timer etter transfeksjon, ble dyrk-ingsmediet fjernet og erstattet med serum-fritt DMEM (6 ml/skål). Inkuberingen ble fortsatt i 3 dager ved 37°C, hvoretter det brukte medium ble oppsamlet og friskt, serumfritt medium ble tilsatt. Etter ytterligere 3 dager ved 37°C, ble det brukte medium igjen oppsamlet, og cellene ble kastet.

CHO-celler som uttrykker CD28, CD5 eller B7, ble isolert som beskrevet av Linsley et al., (1991) supra, som følger: I korthet ble stabile transfektanter som uttrykker CD28, CD5 eller B7, ble isolert etter kotransfeksjon av dihydrofolat reduktaseutarmet kinesisk hamsterovarie- (dhfr" CHO) celler med en blanding av det hensiktsmessige ekspresjonsplasmid og den valgbare markør, pSV2dhfr (Linsley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:5031 (1990)), inkorporert ved referanse heri. Transfektantene ble deretter dyrket i økende konsentrasjoner av metotreksat til et sluttnivå på 1 |iM og ble holdt i DMEM, supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,2 mM prolin og 1 |1M metotreksat. CHO-linjer som uttrykker høyt nivå av CD28 (CD28<+> CHO) eller B7 (B7<+> CHO) , ble isolert ved flere . runder av fluorescensaktivert cellesortering (FACS<R>) etter indirekte immunofarging med mAbs 9.3 eller BB-1. Oppformerte CHO-celler negative for overflateekspresjon av CD28 eller B7 (dhfr<*> CHO), ble også isolert ved FACS<R> fra CD28-transfiserte populasjoner.

Immunof arging og FACSR- analyse

Transfiserte CHO eller COS-celler eller aktiverte T-celler ble analysert ved indirekte immunofarging. Før farg-ingen ble CHO-cellene fjernet fra sine dyrkingskar ved inkubering i PBS inneholdende 10 mM EDTA. Cellene ble først inkubert med murine mAbs 9.3 (Hansen et al., Immunogenetics 10:247 (1990)) eller BB-1 (Yokochi et al., J. Immunol. 128:823

(1981)), eller med lg-fusjonsproteiner (alle ved 10 ug/ml i DMEM inneholdende 10% FCS) i 1-2 timer ved 4°C. Cellene ble så vasket, og inkubert i ytterligere 0,5-2 timer ved 4°C med et FITC-konjugert andre trinns reagens (geit anti-mus-lg-serum for murine mAb'er, eller geit anti-humant Ig-Cy-serum for fusjonsproteiner (Tago, Inc., Burlingame, CA)). Fluorescensen ble analysert på en FACS IV^-cellesorterer (Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA) utstyrt med en firedekaders logaritmisk forsterker.

Rensing av lg- fusjonsproteiner

Den første, andre og tredje oppsamling av brukt serum-fritt kulturmedium fra transfiserte COS-celler ble anvendt som kilde for rensing av lg-fusjonsproteiner. Etter fjerning av celleavfall ved sentrifugering ved lav hastighet, ble mediet påsett på en kolonne (ca. 200-400 ml medium/ml pakket sjikt-volum) av immobilisert protein A (Repligen Corp., Cambridge, MA) ekvilibrert med 0,05 M natriumcitrat, pH 8,0. Etter påsetting av mediet, ble kolonnen vasket med 1 M kaliumfosfat, pH 8, og bundet protein ble eluert med 0,05 M natriumcitrat, pH 3. Fraksjonene ble oppsamlet og umiddelbart nøytralisert ved tilsetning av 1/10 volum av 2 M Tris, pH 8. Fraksjonene som inneholdt toppen av A280 absorberende materiale, ble slått sammen og dialysert mot PBS før anvendelse. Ekstinksjons-koeffisientene på 2,4 og 2,8 ml/mg for henholdsvis CD28Ig og B7Ig, ble bestemt ved aminosyreanalyse av løsninger med kjent absorbans. Gjenvinningen av rensede CD28Ig og B7Ig-bindings-aktiviteter var nesten kvantitativ som bedømt ved FACS<R->analyse etter indirekte fluorescensfarging av B7<+> og CD28<+->CHO-celler.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av CTLA4lg- fusjonsprotein

En løselig genetisk fusjon som koder for CTLA4Ig mellom det ekstracellulære domene av CTLA4 og et IgCyl-domene, ble konstruert på en måte i likhet med den beskrevet ovenfor for CD28lg-konstruksjonen. Det ekstracellulære domene av CTLA4-genet ble klonet ved PCR ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider tilsvarende den publiserte sekvens (Dariavach et al., Eur. Journ. Immunol. 18:1901-1905 (1988)).

Fordi et signalpeptid for CTLA4 ikke ble identifisert i CTLA4-genet, ble N-terminus av den forutsette sekvens av CTLA4 fusjonert til signalpeptidet i onkostatin M (Malik et al., Mol. and Cell. Biol. 9:2847 (1989)) i to trinn ved anvendelse av overlappende oligonukoleotider. For det første trinn ble oligonukleotidet, CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCA-TGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (SEKV. ID NR.: 8) (som kodet for de C-terminale 15 aminosyrer fra onkostatin M-signalpeptidet fusjonert til de N-terminale 7 aminosyrer i CTLA4) anvendt som fremoverprimer, og TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEKV. ID. NR.: 9) (som koder for aminosyrerestene 119-125 av aminosyresekvensen som koder for CTLA4-reseptoren og inneholder et Bcll-restriksjonsenzymsete, som reversprimer. Templaten for dette trinn var cDNA syntetisert fra 1 ug av total RNA fra H38-celler (en HTLV II-infisert T-celleleukemicellelinje, fremskaffet av doktorene Salahudin og Gallom NCI, Bethesda, MD). En del av PCR-produktet fra det første trinn, ble oppformert om igjen, ved anvendelse av en overlappende fremoverprimer, som koder for den N-terminale del av onkostatin M-signalpeptidet og som inneholder et Hindlll-restriksjons-endonukleasesete, CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGA-GGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEKV. ID NR.: 10) og den samme reverse primer. Produktet av PCR-reaksjonen ble spaltet med HindiII og Bell og ligert sammen med et BelI/Xbal-spaltet cDNA-fragment som koder for aminosyresekvensene tilsvarende CH2 og CH3-hengsleregionene av igCyl inn i den Hindlll/Xbal-spaltede ekspresjonsvektor, CDM8 eller Hindlll/Xbal-spaltede ekspresjonsvektor JtLN (fremskaffet av Dr. Aruffo) .

Et kart over den resulterende CTLA4lg-fusjonskonstruksjon er vist i fig. 1. Sekvensene fremstilt i denne figur, viser bindingene mellom CTLA4 (store bokstaver, ikke-skyggelagte regioner) og signalpeptidet, SP, i onkostatin M (mørkt skyggelagte regioner), og hengslet, H, i IgCyl (stiplede regioner). Aminosyren i.parentes ble innført under konstruksjonen. Stjernene (<*>) angir cystein til serinmustasjoner innført i IgCy-hengsleregionen. Det immunoglobulinsuperfamilie V-lignende domene tilstede i CTLA4, er angitt, og likeså CH2 og CH3-domenene i IgCyl..

Ekspresjonsplasmidene, CDM8, inneholdende CTLA4Ig, ble deretter transfisert inn i COS-celler ved anvendelse av DEAE/- dekstrantransfeksjon ved modifikasjon (Linsley et al., 1991, supra) av protokollen beskrevet av Seed og Aruffo, 1987, supra.

Ekspresjonsplasmidkonstruksjonene (7CLN eller CDM8) inneholdende cDNA som koder for aminosyresekvensen av CTLA4Ig, ble transfisert ved lipofeksjon ved anvendelse av standardfremgangsmåter i dhfr"-CHO-linjer for å oppnå nye cellelinjer som stabilt uttrykker CTLA4Ig.

DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende CTLA4Ig, er deponert hos ATCC under Budapest-avtalen den 31. mai 1991, og har fått ATCC-adgangsnummer 68629.

En foretrukket stabil transfektant, som uttrykker CTLA4Ig, bertegnet kinesisk hamsterovariecellelinje, CTLA4Ig-24, ble laget ved screening av B7-positive CHO-cellelinjer for B7-bindingsaktivitet i mediet ved anvendelse av immunofarging.

Transfektanter ble holdt i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 0,2 mM prolin og 1 jiM metotreksat.

CTLA4Ig-24-CHO-cellelinjen er deponert hos ATCC under Budapest-avtalen den 31. mai 1991, og har fått adgangsnummeret ATCC 10762.

CTLA4Ig ble renset ved protein A-kromatografi fra serum-frie kondisjonerte supernatanter (fig. 2). Konsentrasjoner av CTLA4Ig ble bestemt ved å anta en ekstinksjonskoeffisient ved 280 nm på 1,6 (eksperimentelt bestemt ved aminosyreanalyse av en løsning med kjent absorbans). Molekylvektstandarder (sporene 1 og 3, fig. 2) og prøver (1 ug) av CTLA4Ig (sporene 2 og 4) ble underkastet SDS-PAGE (4-12% akrylamidgradient) under ikke-reduserende betingelser (-JSME, sporene 1 og 2) eller reduserende betingelser (+SME, sporene 3 og 4). Proteinene ble visualisert ved farging med Coomasie Brilliant Blue.

Under ikke-reduserende betingelser migrerte CTLA4Ig som en forbindelse med en Mr på ca. 100.000, og under reduserende betingelser, som en forbindelse med en Mr på ca. 50.000 (fig. 2) . Fordi IgCy-henglsedisulf idene ble eliminert under konstruksjon, vil CTLA4Ig, i likhet med CD28Ig, være en dimer antagelig sammenbundet gjennom en naturlig disulfidbinding.

EKSEMPEL 3

CTLA4- reseptor

For å rekonstrukere DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende det humane CTLA4-gen i full lengde, ble cDNA som koder for aminosyrene tilsvarende et fragment av de transmembrane og cytoplasmatiske domener av CTLA4, klonet ved PCR og deretter sammenbundet med cDNA som koder for aminosyrer tilsvarende et fragment fra CTLA4Ig som tilsvarer onkostatin M-signalpeptidet fusjonert til N-terminus av CTLA4. Fremgangsmåter for PCR og cellekultur og transfeksjoner var som beskrevet ovenfor for eksempel 1 ved anvendelse av COS-celler og DEAE-dektrantransfeksjon.

Fordi ekspresjonen av CTLA4-reseptorprotein i humane lymfoide celler ikke tidligere er blitt rapportert, var det nødvendig å lokalisere en kilde for CTLA4 mRNA. PCR cDNA revers transkribert fra det totale cellulære RNA fra H38-celler, som bemerket ovenfor, ble anvendt for kloning ved PCR.

For dette formål ble anvendt oligonukleotidet

GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (SEKV. ID NR.: 11) (som

koder for de første 11 aminosyrer i den forutsette kodesekvens), som en forover-primer, og

TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (SEKV. ID NR.:

12) (homolog med de siste 8 aminosyrer i CTLA4 og inneholdende et Xbal-sete) som revers primer. Templaten var igjen et cDNA syntetisert fra 1 ug RNA fra H38 celler. Produkter fra PCR-reaksjonen ble spaltet med restriksjonsendonukleasene Ncol og Xbal, og det-resulterende 316 bp-produkt ble gelrenset. Et 340 bp Hindlll/Ncol-fragment fra CTLAIg-fusjonen beskrevet ovenfor, ble også gelrenset, og begge restriksjonsfragmenter ble ligert inn i Hindlll/Xbal-spaltet CDM8 under dannelse av

OMCTLA.

Den resulterende konstruksjon tilsvarte CTLA4 i full lengde (SEKV. ID NR.: 13 og 14) og onkostatin M-signalpeptidet. Konstruksjonen er vist i fig. 3 og ble betegnet OMCTLA4. Sekvensen for CTLA4 vist i fig. 3, adskiller seg fra den forutsette humane CTLA4 DNA-sekvens (Dariavach et al., supra) ved en baseforandring slik at det tidligere rapporterte alanin i aminosyreposisjon 111 av den viste aminosyresekvens, koder for et treonin. Dette treonin er en del av et nylig identifisert N-bundet glykosyleringssete som kan være viktig for vellykket ekspresjon av fusjonsproteinet.

Ligeringsproduktene ble transformert til MCl06l/p3 E. coli-celler, og kolonier ble screenet for de hensiktsmessige plasmider. Sekvenser av de resulterende konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse.

EKSEMPEL 4

Karakterisering av CTLA4Ig

For karakterisering av CTLA4Ig-konstruksjonene, ble det fremstilt flere isolater, CD28Ig, B7Ig og CD5Ig, som beskrevet ovenfor, og de ble transfisert i COS-celler som beskrevet i eksemplene 2 og 3, og ble testet ved FACS<E->analyse for binding av B7Ig. I tillegg til de ovenfor nevnte konstruksjoner, ble det også anvendt CDM8-plasmider inneholdende cDNA som koder for CD7 som beskrevet av Aruffo og Seed, (EMBO Jour. 6:3313-3316 (1987)), inkorporert ved referanse heri.

mAbs

Murine monoklonale antistoffer (mAbs) 9.3 (anti-CD28) og G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), BB-1 (anti-B7-antigen) og rotte-mAb 187.1 (antimus K-kjede) er tidligere beskrevet (Ledbetter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:1384-1388 (1987); Ledbetter et al., Blood 75:1531 (1990); Yokochi et al., supra) og ble renset fra askites før anvendelse. Det hybridoma-produserende mAb OKT8 ble oppnådd fra ATCC, Rockville, MD, og dette mAb ble også renset fra askites før anvendelse. mAb 4G9 (anti-CDl9) ble fremskaffet av Dr. E. Engleman, Stanford University, Palo Alto, CA. Renset human mus chimer mAb L6 (som har en human Cyl Fc-porsjon) var en gave fra Dr. P. Fell og M. Gayle (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).

Immunof arging og FACSR- analyse

Før farging ble COS eller CHO-celler fjernet fra sine dyrkingskar ved inkubering i PBS inneholdende 10 mM EDTA. Cellene ble først inkubert med mAbs eller lg-fusjonsproteiner ved 10 Ug/ml i DMEM inneholdende 10% FBS i 1-2 timer ved 4°C. Cellene ble deretter vasket og inkubert i ytterligere 0,5-2 timer ved 4°C med FITC-konjugert geit anti-mus-immunoglobulin eller med FI TC-konjugert geit anti-humant-IgCy-serum (begge fra Tago, Burlingame, CA). Når binding av begge mAbs og Ig-fusjonsproteiner ble målt i det samme eksperiment, ble FITC-konjugert anti-mus og anti-humant andre trinns reagens blandet sammen før anvendelse. Fluorescens på en total av 10.000 celler ble deretter analysert ved FACS<R>.

Perifer blodlvmfocyttseparasjon og stimulerin<g>

Perifere blodlymfocytter (PBL'er) ble isolert ved sentrifugering gjennom Lymphocyte Separation Medium (Litton Bionetics, Kensington, MD). Alloreaktive T-celler ble isolert ved stimulering av PBL i en primært blandet lymfocyttreaksjon (MLR) . PBL ble dyrket ved loVml bestrålt (5000 rad) T51 LCL.

EBV-transformerte lymfoblastoide cellelinjer (LCL), PM

(Bristol-Myers Squibb Co.) og T51 (Bristol-Myers Squibb Co.) ble holdt i RPMI, supplementert med 10% FBS. Etter 6 dager, ble alloreaktive "blast"-celler konservert ved frysing. Sekundær MLR.ble gjennomført ved dyrking av opptinede alloreaktive blåster sammen med friskt bestrålt T5l LCL i nærvær og fravær av mAbs og lg-fusjonsproteiner. Cellene ble dyrket i 96 brønners flatbunnede plater (4 x 10<*> alloreaktive blåster og 1 x 10<4> bestrålte T51 LCL-celler pr. brønn, i et volum på 0,2 ml) i RPMI inneholdende 10% FBS. Celleformering av kvadruplikate kulturer ble målt ved opptak av [<3>H]-tymidin i løpet av de siste 6 timer av en 2-3 dagers kultur.

PHA-aktiverte T-celler ble fremstilt ved dyrking av PBL'er med 1 Jig/ml PHA (Wellcome, Charlotte, NC) i 5 dager, og 1 dag i medium uten PHA. Levedyktige celler ble oppsamlet ved

sedimentering gjennom lymfocyttseparasjonsmedium før anvendelse. Cellene ble stimulert med mAbs eller transfiserte CHO-celler i 4-6 timer ved 37°C, oppsamlet ved sentrifugering og anvendt til fremstilling av RNA.

CD4<+> T-celler ble isolert fra PBL'er ved separasjon av PBL'er fra friske donorer i T og ikke-T-celler ved anvendelse av sau-erytrocytt-"rosetting"-teknikk og ytterligere separasjon av T-celler ved "panning" i CD4<+->celler som beskrevet av Damle et al., J. Immunol. 139:1501 (1987), inkorporert ved referanse heri.

B-celler ble også renset fra perifert blod ved "panning" som beskrevet av Wysocki og Sato, Proe. Nati. Acad. Sei. 75:2844 (1978), inkorporert ved referanse heri, ved anvendelse av anti-CDl9 mAb 4G9. For å måle Th-indusert Ig-produksjon, ble 10s CD4<+> T-celler blandet med IO<6> CD19<*> B-celler i 1 ml av RPMI inneholdende 10% FBS. Etter dyrking i.6 dager ved 37°C, ble produksjonen av humant IgM målt i kultursupernatantene ved anvendelse av fastfase ELISA som beskrevet av Volkman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:2528 (1981), inkorporert ved referanse heri.

I korthet ble 96 brønners flatbunnede mikrotiter ELISA-plater (Corning, Corning, NY) belagt med 200 ul/brønn av natriumkarbonatbuffer (pH 9,6) inneholdende 10 ug/ml av affinitetsrenset geit anti-humant IgG eller IgM-antistoff (Tago, Burlingame, CA), inkubert over natten ved 4°C, og deretter vasket med PBS, og brønnene ble videre blokkert med

2% PBS (BSA-PBS).

Prøver som skulle analyseres ble tilsatt ved hensikts-messig fortynning til disse brønner og inkubert med 200 |il/- brønn av en 1:1000 fortynning av pepperrotperoksydase (HRP) - konjugert F (ab') 2-fraksjon av affinitetsrenset geit anti-humant IgG eller IgM-antistoff (Tago). Platene ble deretter vasket, og 100 ul/brønn av o-fenylendiamin- (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) løsning (0,6 mg/ml i citratfosfatbuffer med pH 5,5 og 0,045% hydrogenperoksyd). Fargeutviklingen ble stanset med 2 N svovelsyre. Absorbansen ved 490 nm ble målt med en auto-matisert ELISA-plateleser.

Test og kontroilprøver ble kjørt i triplikat, og absorbansverdiene ble sammenlignet med dem som ble oppnådd med kjente IgG eller IgM-standarder kjørt simultant med super-natantprøvehe for å generere standardkurven ved hvis anvendelse konsentrasjonene av IgG i kultursupernatanten ble kvantifisert. Data er uttrykt som ng/ml av lg + SEM av enten tri-plikate eller kvadruplikate kulturer.

Immunoutfellingsanalyse og SDS- PAGE

Celler ble overflatemerket med <135>J og underkastet immuno-utf ellingsanalyse. I korthet ble PHA-aktiverte T-celler overflatemerket med <125>J ved anvendelse av laktoperoksydase og Ha02 som beskrevet av Vitetta et al., J. Exp. Med. 134:242 (1971), inkorporert ved referanse heri. SDS-PAGE-kromatografi ble gjennomført på lineære akrylamidgradientgeler med stablegeler med 5% akrylamid. Gelene ble farget med Coomassie-blått, avfarget, og fotografert eller tørket, og eksponert på røntgenfilm (Kodak XAR-5).

Biningsanalvser

B7Ig ble merket med <125>J til en spesifikk aktivitet på ca. 2 x IO<6> cpm/pmol. 96 brønners plastskåler ble belagt i 16-24 timer med en løsning inneholdende CTLA4Ig (0,5 ug i et volum på 0,05 ml av 10 mM Tris, pH 8). Brønnene ble blokkert med bindingsbuffer (DMEM inneholdende 50 mM BES (Sigma Chemical Co.), pH 6,8, 0,1% BAS og 10% FCS) før tilsetning av en løsning (0,09 ml) inneholdende <125>J B7Ig (ca. 5 x 10s cpm) i nærvær eller fravær av konkurrent. Etter inkubering i 2-3 timer ved 23°C, ble brønnene vasket en gang med bindingsbuf fer, og fire ganger med PBS. Bundet radioaktivitet ble deretter solubilisert ved tilsetning av 0,5 N NaOH, og kvantifisert ved gammatelling.

Binding til B7Ig

Den funksjonelle aktivitet av OMCTLA4-konstruksjonen som koder for det komplette humane CTLA4 DNA-gen, er vist i eksperimentet gjengitt i fig. 4. COS-celler ble transfisert med ekspresjonsplasmidene CD7, OMCD28 og OMCTLA4 som beskrevet ovenfor. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene oppsamlet og inkubert med utelukkende medium (ingen tilsetning) eller med mAbs 9.3, B7Ig, CD5Ig eller G3-7. Cellene ble deretter vasket, og binding ble påvist med en blanding av FITC-konjugert geit anti-mus-Ig og FITC-konjugert geit anti-humant lg andre trinns reagenser. Transfiserte celler ble testet for ekspresjon av de hensiktsmessige celleoverflatemarkører ved indirekte immunofarging, og fluorescensen ble målt ved anvendelse av hjelp av FACS<R->analyse som beskrevet ovenfor.

Som vist i fig. 4, ville mAb 9.3 binde seg til CD28-transfiserte COS-celler, men ikke til CTLA4-transfiserte celler. Motsatt, ville B7Ig-fusjonsproteinet (men ikke kontroll-CD5Ig-fusjonsproteinet) binde seg til både CD28- og CTLA4-transfiserte celler. CD7-transfiserte COS-celler ville binde hverken mAb 9.3 eller noen av fusjonsproteinene. Dette viser at CD28 og CTLA4 begge binder B-celleaktiveringsantigenet, B7. Dessuten ville mAb 9.3 ikke påvisbart binde CTLA4.

Binding av CTLA4lg på B7- positive CHO- celler

For ytterligere å karakterisere bindingen av CTLA4Ig og B7, ble målt bindingsaktiviteten av renset CTLA4lg på B7<+> CHO-celler og på en lymfoblastoid cellelinje (PM LCL) i eksperimentet vist i fig. 5. Oppformerte transfiserte CHO-cellelinjer og PM LCL"er ble inkubert med utelukkende medium (ingen tilsetning) eller en ekvivalent konsentrasjon av humane IgCyl-holdige proteiner (10 ug/ml) av CD5Ig, CD28Ig eller CTLA4lg. Bindingen ble påvist ved FACS<R> etter tilsetning av FITC-konjugerte geit anti-humant lg andre trinns reagenser. Tilsammen 10.000 fargede celler ble analysert ved FACS<R>.

Som vist i fig. 5, ville CD28Ig binde seg til B7<*> CHO-celler, men ikke til PM LCL, en cellelinje som uttrykker et relativt lavt nivå av B7-antigenet (Linsley et al., supra, 1990). CTLA4Ig bandt seg kraftigere til begge cellelinjer enn CD28Ig gjorde, hvilket antyder at det bandt seg med høyere affinitet.. Hverken CD28Ig eller CTLA4lg ville binde seg til CD28<+> CHO-celler.

Affinitet av binding av CTLA4Ig og B7Iq

Den tilsynelatende affinitet av interaksjon mellom CTLA4lg og B7Ig ble deretter målt ved anvendelse av en fast-fasekonkurranse-bindingsanalyse. 96 brønners plastplater ble belagt med CTLA4Ig som beskrevet ovenfor. B7Ig ble radiomerket med <125>J (5 x IO<5> cpm, 2 x IO<6> cpm/pmol) , og tilsatt til en konsentrasjon av 4 nM i nærvær av de angitte konsentrasjoner (fig. 6) av ikke-merket chimert mAb L6, mAb 9.3, mAb BB-1 eller B7Ig. Platebundet radioaktivitet ble bestemt og uttrykt som en prosentsats av radioaktivitet bundet til brønner behandlet uten konkurrent (28.300 cpm). Hvert punkt representerer gjennomsnittet av duplikate bestemmelser; repli-kater varierte vanligvis fra gjennomsnittet med <. 20%. Konsentrasjonene ble beregnet basert på en Mr på 75.000 pr. bindingssete for mAbs og 51.000 pr. bindingssete for B7Ig.

Som vist i fig. 6, konkurrerte bare mAb BB-1 og umerket B7Ig signifikant for <1>25J-B7Ig-binding (halvparten av maksimale effekter ved henholdsvis ca. 22 nM og ca. 175 nM).. Hverken chimert mAb L6 eller mAb 9.3 konkurrerte effektivt ved de testede konsentrasjoner. I andre eksperimenter, var de anvendte konsentrasjoner av mAb 9.3 tilstrekkelige til å inhibere binding av <12>SJ-B7Ig til immobilisert CD28Ig eller til celleoverflateuttrykt CD28 > 90%.

Når konkurransedata fra fig. 6 ble avsatt i et Scatchard-diagram, ble det beregnet en dissosiasjonskonstant, K„, på ca. 12 nM for binding av <l25>J-B7 til immobilisert CTLA4lg (fig. 7) .

Denne verdi er ca. 20 ganger lavere enn den tidligere bestemte Kd for binding mellom <125>J-B7Ig og CD28 (ca. 200 nM)

(Linsley et al., (1991), supra), hvilket viser at CTLA4 er en høyere affinitetsreseptor for B7-antigenet enn CD28-reseptoren.

For å identifisere de molekyler på lymfoblastoide celler som bandt CTLA4lg (fig. 7) , ble <125>J-overflatemerkede celler underkastet immunoutfellingsanalyse (fig. 8). B7<+> CHO og PM LCL-celler ble over f lat erne rket med 125J, og ekstrahert med en ikke-ionisk tensidløsning som beskrevet ovenfor. Alikvoter av ekstrakter inneholdende ca. 1,5 x IO<7> cpm i et volum på 0,1 ml, ble underkastet immunoutfellingsanalyse som beskrevet ovenfor uten noen tilsetning, eller med 2 ug hver av CD28Ig, CTLA4Ig eller CD5Ig. Vaskede immunopresipitater ble deretter analysert med SDS-PAGE (10-20% akrylamidgradinet) under reduserende betingelser. Gelen ble deretter tørket og underkastet autoradiografi. Det venstre panel i fig. 8, viser et autoradiogram oppnådd etter 1 dags eksponering. Det høyre panel i fig. 8, viser et autoradiogram av den samme gel etter 10 dagers eksponering. Autoradiogrammet i det midtre panel i fig. 8, ble også eksponert i 10 dager. Posisjoner for molekylvektstandard er også angitt i denne fig.

Som vist i fig. 8, ble et diffust migrerende (Mr ca. 50.000-75.000; senter i ca. 60.000) radiomerket protein immunoutfelt av CTLA4Ig, men ikke av CD28Ig eller CD5Ig.

Dette molekyl komigrerte med B7-immunoutfelt fra B7<*> CHO-celler med CTLA4Ig, og mye svakere, med CD28Ig. Disse funn viser at CTLA4lg binder et enkelt protein på lymfoblastoide celler som er av lignende størrelse som B7-antigenet.

Inhibering av immunrespons in vitro med CTLA4Iq

Inhibering av formering

Tidligere studier har vist at anti-CD28 mAb, mAb 9.3 og anti-B7 mAb, mAb BB-1, vil inhibere formering av alloantigen-spesifikke Th-celler, så vel som immunoglobulinsekresjon fra alloantigenpresenterende B-celler (Damle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 78:5096 (1981); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol.. 16:1289 (1986)). Fordi CTLA4 er en høyaffinitetsreseptor for B7-antigenet som demonstrert heri, ble løselig CTLA4lg testet for sin evne til å inhibere disse responser. Effekten av CTLA4Ig på T-celleformering ble undersøkt i eksperimentet vist i fig. 9.

Primært blandede lymfocyttreaksjons- (MRL) blåster ble stimulert med bestrålte T51 lymfoblastoidceller (LC) i fravær eller nærvær av konsentrasjoner av murine mAb 9.3 Fab-fragmenter, eller B7Ig, CD28Ig eller CTLA4Ig-immunoglobulin-CY-fusjonsproteiner. Celleformering ble målt ved [<3>H]-tymidin-inkorporering etter 4 dager, og er uttrykt som prosentsatsen av inkorporering av ubehandlede kulturer (21.000 cpm). Fig. 9 viser middelverdiene av kvadruplikate bestemmelser (SEM <. 10%).

Som vist i fig. 9, ville CTLA4Ig inhibere MLR-reaksjonen på en doseavhengig måte ved et maksimum på > 90% med en 1/2 maksimal respons ved ca. 30 ng/ml (ca. 0,8 nM). Fab-fragmentet av mAb 9.3, som tidligere ble vist å være en mere potent inhibitor av MLR enn hele mAb 9.3 (Damle et al., J. Immunol. 140:1753-1761 (1988)), inhiberte også MLR, men ved høyere konsentrasjoner (ca. 800 ng/ml eller ca. 30 nM for 1/2 maksimal respons). B7Ig og CD28Ig ville ikke signifikant inhibere MLR selv ved høyere konsentrasjoner. I et annet eksperiment ville tilsetning av B7Ig sammen med CTLA4Ig delvis overvinne inhiberingen av MLR med CTLA4Ig, hvilket viste at inhiberingen spesifikt skyldes interaksjoner med B7-antigen.

Inhibering av immunoglobulinsekresion

Effekten av CTLA4Ig på hjelper-T-celle (TJ -indusert immunoglobulinsekresjon ble også undersøkt (fig. 10). CD4<+> T-celler ble blandet med allogene CD19<*> B-celler i nærvær eller fravær av de angitte immunoglobulinmolekyler som beskrevet ovenfor. Murine mAbs OKT8, 9.3 og BB-1 ble tilsatt i 20 ug/ml, og lg-fusjonsproteiner i 10 ug/ml. Etter 6 dagers dyrking, ble konsentrasjonene av humant IgM (SEM < 5%) i kultursupernantantene bestemt ved enzymimmunoassay (ELISA) som beskrevet ovenfor. IgM-produksjon av B-celler dyrket i fravær av CD4<+> T-celler var 11 ng/ml.

Som vist i fig. 10, ville CD4<+> T-celler stimulere IgM-produksjon av allogene CD19<+> B-celler (i fravær av CD4<+> T-celler, IgM-nivået ble redusert med 93%). mAb'ene 9.3 og BB-1 inhiberte signifikant Th-indusert IgM-produksjon (henholdsvis 63% og 65% inhibering). CTLA4Ig var enda mere effektiv som inhibitor (89% inhibering) enn disse mAb'er var. Inhibering ved kontroll-Ig-molekyler, mAb 0KT8 og CD5Ig, var mye mindre ( < 30% inhibering). Ingen av disse molekyler inhiberte Ig-produksjonen signifikant målt i nærvær av Staphylococcus aureus enterotoksin B. Lignende resultater ble oppnådd med CD4<* >T-celler og B-celler avledet fra andre donorer. Disse resultater viser at inhiberingen med CTLA4Ig er spesifikk.

De ovennevnte data viser også at CTLA4 og CD28-reseptorer er funksjonelt så vel som strukturelt beslektede. I likhet med CD28, er også CTLA4 en reseptor for B-celleaktiveringsantigenet, B7. CTLA4Ig bandt seg til "<5>J-B7 med en af f initetskonstant, K^, på ca. 12 nM, en verdi ca. 20 ganger høyere enn affiniteten mellom CD28 og B7Ig (ca. 200 nM).

CTLA4 og CD28 kan således tenkes på som henholdsvis høy-affinitets og lavaffinitetsreseptorer, for den samme ligand, B7-antigenet.

Den tilsynelatende affinitet mellom CD28 og B7 ligner på affiniteten rapportert for binding av løselig alloantigen til T-cellereseptoren for et murint T-cellehybridom (ca. 100 nM; Schnek et al., Cell 56:47 (1989)), og har høyere affinitet enn interaksjonene mellom CD2 og LFA3 (Recny et al., J. Biol. Chem. 265:8542 (1990)), eller CD4 og MHC klasse II-molekyler (Clayton et al., Nature 339:548 (1989)). Den tilsynelatende af f initetskonstant, Kd, mellom CTLA4 og B7 er enda høyere, og kan sammenlignes fordelaktig med høyere affinitet mAbs (Kd 2-10.000 nM; Alzari et al., Ann. Rev. Immuno. 6:555 (1988)). Kd mellom CTLA4 og B7 ligner på eller er høyere enn Kd-verdi er for integrinreseptorer og deres ligander (10-2000 nM; Hautanen et al., J. Biol. Chem. 264:1437-1442 (1989); Di Minno et al., Blood, 61:140-148 (1983); Thiagarajan og Kelley, J. Biol. Chem. 263:3035-3038 (1988)). Affiniteten av interaksjonen mellom CTLA4 og B7 er såldes blant de høyeste hittil rapportert for lymfoide adhesjonssysterner.

Disse resultater demonstrerer den første ekspresjon av et funksjonelt proteinprodukt av CTLA4-transkripter. CTLA4Ig, en fusjonskonstruksjon inneholdende det ekstracellulære domene av CTLA4 fusjonert til et IgCyl-domene, danner en disulfidsammenbundet dimer med Mr ca. 50.000 underenheter (fig. 1). Fordi det ikke kunne forutsees at det kunne dannes disulfider mellom kjedene i Ig-delen av denne fusjon, synes det sannsynlig at cysteiner fra CTLA4 er involvert i disulfidbindingsdanneIsen.

Det analoge CD28lg-fusjonsprotein (Linsley et al., supra, 1991) inneholder også disulfidbinding(er) mellom kjedene. Disse resultater antyder at CTLA4-reseptoren, i likhet med CD28 (Hansen et al., Immunogenetics 10:247-260 (1980)), eksisterer på T-celleoverflaten som en disulfidsammenbundet homodimer. Selv om CD28 og CTLA4 er høyt homologe proteiner, er de immunologisk adskilte, fordi anti-CD28 mAb, mAb 9.3 ikke gjenkjenner CTLA4 (fig. 4 og 5).

Det er ikke kjent hvorvidt CTLA4 kan aktivere T-celler ved en signaleringsmekanisme i analogi med CD28. De cyto-plasma ti ske domener av murin og human CTLA4 er identiske (Dariavach et al., supra 1988), hvilket antyder at denne region har viktige funksjonelle egenskaper. De cytoplasmatiske domener av CD28 og CTLA4 har også felles homologi, selv om det er uklart om denne er tilstrekkelig til å gi lignende signaleringsegenskaper til de to molekyler.

CTLA4lg er en potent inhibitor av in vitro-lymfocyttfunksjoner som krever T-celle og B-cellesamarbeid (fig. 9 og 10). Disse funn, sammen med tidligere studier, antyder den fundamentale viktighet av interaksjoner mellom B7-antigen og dets motreseptorer, CD28 og/eller CTLA4, for regulering av både T- og B-lymfocyttresponser. CTLA4Ig burde være et anvendelig reagens for fremtidige undersøkelser av rollen til disse interaksjoner under immunresponser. CTLA4Ig er en mere kraftig inhibitor for in vitro-lymfocyttresponser enn både mAb BB-1 og mAb 9.3 (fig. 9 og 10). Den høyere potens av CTLA4Ig sammenlignet med mAb BB-1, skyldes mest sannsynlig forskjellen i affinitet for B7 mellom disse molekyler (fig. 6). CTLA4lg er også mere potent enn mAb 9.3, trolig fordi det, ulikt mAb, ikke dessuten har direkte stimulatoriske effekter på T-celle-formeringen (June et al., Immunology Today 11:211 (1989)) til å motvirke sine inhibitoriske effekter. De immunosuppresive effekter av CTLA4Ig in vitro antyder at det vil være beret-tiget med fremtidige undersøkelser av mulige terapeutiske effekter av dette molekyl for behandling av autoimmune forstyrrelser som involverer avvikende T-celleaktivering eller lg-produksjon.

Som det vil fremgå for fagfolk på dette området som denne oppfinnelse vedrører, kan den foreliggende oppfinnelse utføres i former forskjellige fra dem som spesifikt er beskrevet ovenfor uten å avvike fra ånden eller essensielle egenskaper for denne oppfinnelse. De særlige utførelser av oppfinnelsen beskrevet ovenfor, skal derfor betraktes som illustrerende.

EKSEMPEL 5

BALB/c (H-2<d>) og C57BL/6 (H-2<d>) hunnmus, 6 til 8 uker gamle, ble levert av The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Humane pankreas øyceller ble renset etter kollagenase-spalting som beskrevet (C. Ricordi et al., Transplantation 52:519 (1991); A.G. Tzakis et al., Lancet 336:402 (1990); C. Ricordi, P.E. Lacy, E.H. Finke, B.J. Olack, D.W. Scharp, Diabetes 37:413 (1988)).

B6 eller BlO-mus, behandlet med streptozocin (175 mg pr. kg legemsvekt) 3 til 5 dager før transplantering og som hadde ikke-fastende plasmaglukosenivå på høyere enn 280 mg/dl (hvorav flesteparten over 300 mg/dl), ble anvendt som mottagere.

Hvert dyr fikk ca. 800 friske humane pankreasøyer med en diameter på 150 um under den venstre renale kapsel (D. Faustman og C. Coe, Science 252:1700 (1991); Y.J. Zeng et al., Transplantation 53:277 (1992)). Behandlingen ble startet umiddelbart etter transplantering.

Kontrolldyr ble behandlet med PBS (heltrukne linjer) eller L6 (prikkede linjer) med 50 ug hver annen dag i 14 dager umiddelbart etter transplantering (fig. 11A) . Øytrans-plantater ble ansett som avstøtt når glukosenivået var høyere enn 250 mg/dl i 3 på hverandre følgende dager. Dyr behandlet med PBS (n = 14) og L6 (n = 8) hadde gjennomsnittlig trans-plantatoverleving på henholdsvis 5,6 og 6,4 dager.

Dyrene ble behandlet med 10 ug CTLA4lg i 14 på hverandre følgende dager umiddelbart etter transplantering (n = 7) (fig.

11B). Tre av syv dyr beholdt sine implantater i > 80 dager. De gjenværende fire dyr hadde en gjennomsnittlig transplantat-overleving på 12,75 dager.

Dyr ble behandlet med 50 ug CTLA4Ig hver annen dag i 14 dager umiddelbart etter transplantering av humane bukspytt-kjerteløyer (fig. 11C). Alle dyrene (n = 12) behandlet med denne dose, beholdt transplantatene gjennom hele analysen (fig. 11C). Utvalgte mus ble nefrektomisert på dagene 21 og 2 9 etter transplanteringen for å bestemme transplantatets funksjon (fig. 11C).

Histologi ble utført på nyrer transplantert med humane øyceller (fig. 12A, 12B, 12C, 12D). Objektglassene ble analysert blindt.

Hematoksylin- og eosinfarging av en kontrollmus implantert med humane langerhanske øyer 29 dager etter transplantering, viste en massiv lymfocyttinfiltrering (fig. 12A).

Det samme vev, farget for insulin, viste ingen påvisbar insulinproduksjon (fig. 12B).

Histologisk undersøkelse av vev fra en CTLA4Ig-behandlet mus 21 dager etter transplantering, viste intakte øyer under nyrekapslen med svært få lymfocytter som infiltrerte det transplanterte vev (fig. 12C). Vevet ble farget med hematoksylin og eosin. Det samme vev fra den CTLA4lg-behandlede mus, farget for insulin, viste produksjon av insulin fra de implanterte øyer (fig. 12D). Lignende resultater ble observert i implantatvev undersøkt på senere tidpunkter. Den øvre, midtre og nedre pilspiss identifiserer henholdsvis nyrekapslen, øyetransplantatet og nyrens parenkyma.

I den histopatologiske undersøkelse ble alt vev fiksert i 10% bufret formalin og bearbeidet, og 5 um snitt ble farget enten med hematoksylin og eosin eller for insulin med avivin-biotinperoksydasemetoden (S.M. Hsu, L. Raine, H. Fanger, J. Histochem, Cytochem, 29:577 (1981)). Forstørrelsen var 122 ganger.

I fig. 13 ble streptozotocinbehandlede dyr transplantert som beskrevet heri ovenfor for fig. 11. Musene ble behandlet enten med PBS (prikkede linjer) eller med mAb til humant B7

(heltrukne linjer) ved en dose på 50 ug hver annen dag i 14 dager (fig. 13). Kontrolldyrene (behandlet med PBS) (n =3) hadde en gjennomsnittlig implantatoverleving på 3,5 dager, mens anti-B7-behandlede dyr (n = 5) beholdt implantatene fra 9 til > 50 dager (fig. 13).

I fig. 14 ble normale glycemiske, CTLA4Ig-behandlede, transplanterte mus (prikkede linjer) nefrektomisert på dag 44 etter transplantering, og umiddelbart transplantert om igjen med enten 1000 første parti donorøyer (prikkede linjer, hele sirkler) eller 1000 andre partiøyer (prikkede linjer, åpne sirkler) under den gjenværende nyrekapsel.

Disse øyer, frosne ved tidspunktet for den første transplantering, ble tint og dyrket i 3 dager før transplantering for å sikre øyfunksjonen. BlO-mus som var blitt behandlet med streptozotocin og hadde et ikke-fastende glukosenivå på større enn 280 mg/dl, ble anvendt som kontroller (heltrukne linjer)

(fig. 14). Ingen behandling ble gitt etter transplantering.

Kontrolldyrene avsøtte både det første parti (hele linjer, lukkede sirkler) og det andre parti (hele linjer, åpne sirkler) øyimplantater på dag 4 etter transplantering (fig.

14). De CTLA4Ig-behandlede mus retransplantert med andre partiøyer, hadde en gjennomsnittlig implantatoverleving på 4,5 dager, mens dyrene retransplantert med første parti donorøyer, beholdt implantatene for så lenge som analysert (> 80 dager)

(fig. 14) .

CTLA4Iq forlenger signifikant humanøyimplantatoverlevinq hos mus på donorspesifikk måte, og tilveiebringer derved en metode til immunosuppresion

C57BL/6 (B6) eller C57BL/10 (B10) mus ble behandlet med streptozotocin for å eliminere B-cellefunksjonen i mus-pankreasøyer. Diabetiske dyr ble implantert under nyrekapslen, og behandling ble startet umiddelbart etter det kirurgiske inngrepet. Overleving av øyimplantatene ble over-våket ved analyse av blodglukosekonsentrasjonen.

Tansplanterte kontrolldyr, behandlet med enten fosfat-bufret saltløsning (PBS) (n = 14) eller L6 (et humant IgGl chimert mAb; n = 8), hadde en gjennomsnittlig implantatoverleving på henholdsvis 5,6 og 6,4 dager (fig. 11A).

Motsatt, ble øyavstøtningen forsinket hos dyr behandlet med CTLA4Ig (10 ug/dag i 14 dager), hvorav fire av de syv dyr hadde moderat forlenget gjennomsnittlig implantatoverleving (12,75 dager), mens de gjenværende tre dyr beholdt normalt glukosenivå i > 80 dager (fig. 11B). Denne endelige økning i glukosekonsentrasjon kan være et resultat av øyutmattelse, fordi det ikke ble observert noen evidens for aktiv celle-avstøtning.

I de tre mus som beholdt øyimplantatene i lengere tid, kan den forbigående økning i glukosekonsentrasjonen omkring dag 21 etter tranplanteringen ha representert en selvbegrenset avstøtningsepisode i overensstemmelse med farmakokinetikken for CTLA4Ig-clearance etter terapi (P.S. Linsley et al., Science 257:792 (1992)).

I påfølgende eksperimenter, ble dosen av CTLA4Ig øket til 50 ug pr. dyr hver annen dag i ca. 14 dager. Denne behandling resulterte i at 100% av dyrene beholdt normal øyfunksjon gjennom hele eksperimentet uten tegn på avstøtningskrise (figl 11C) .

For å bekrefte at insulinproduksjonen skrev seg fra de transplanterte øyer og ikke fra den naturlige musepankreas, nefrektomiserte vi utvalgte dyr på dagene 21 og 29 for å fjerne øyimplantatene (fig. 11C). I disse dyr, økte glukose-konsentras j onene til over 350 mg/dl i løpet av 24 timer, hvilket viser at øy-xenograftet var ansvarlig for å beholde normalt glukosenivå. Det synes som om blokkeringen av CD28-B7-interaksjonen inhiberer avstøtning av xenogene øyimplantater.

Effektene av behandling med den løselige reseptor, nemlig CTLAIg-fusjonsprotein, var ikke et resultat av Fc-binding (L6 forårsaket ingen implantatavstøtning) eller generelle effekter på T-celle eller B-cellefunksjonen in vivo.

Histologisk analyse av øy-xenograft fra kontrollmus (PBS-behandlede) og CTLA4Ig-behandlede mus ble utført (fig. 12A, 12B, 12C, 12D). Øyvevet fra kontrolldyret demonstrerte evidens for immunavstøtning, med en markert lymfocyttisk infiltrering i implantatet og få gjenværende, øyer (fig. 12A).

Immunohistokjemisk farging viste at insulinpositive celler bare sjelden var tilstede, og ingen somatostatin-positive celler var tilstede i det hele tatt (fig. 12B). Motsatt, transplantatvev fra de CTLA4lg-behandlede mus var fritt for eventuelt lymfocyttisk infiltrat (fig. 12C).

Implantatene var intakte med mange øyer synlige. Dessuten hadde B-cellene observert i det humane øyvev, produsert humant insulin (fig. 12D) og somatostatin.

Den humane CTLA4Ig anvendt i denne studie reagerer med både murint og humant B7. Én fordel ved den xenogene trans-plantatmodell er tilgjengeligheten av et mAb for humant B7 som ikke reagerer med mus B7 (T. Yokochi, R.D. Holly, E.A. Clark, J. Immunol. 128:823 (1982)). Rollen til de humane B7-bærende antigenpresenterende celler (APC1 er) kunne såldes undersøkes direkte.

Musene ble transplantert som beskrevet og deretter behandlet med 50 ug mAb for humant B7 hver annen dag i 14 dager etter transplantering. Denne behandling forlenget implantat-overlevingen hos behandlede mus (9 til > 50 dager) sammenlignet med den for kontrollmus (fig. 13). Anti-B7 mAb er ute av stand til å blokkere avstøtning så effektivt som CTLA4Ig.

CTLA4lg-terapien resulterte i implantatakseptering i de fleste mus. Imidlertid kan det hende at dyrene ikke er tolerante. Forbigående immunosuppresjon kan føre til permanent akseptering av øyimplantat på grunn av implantat-adaptering (tap av immunogenisitet som resultat av tapet av APC-funksjon) (L. Hao, Y. Wang, R.G. Gill, K.J. Lafferty, J. Immunol. 139:4022 (1987); K.J. Lafferty, S.J. Prowse, M. Simeonovic, Annu. Rev. Immunol. 1:143 (1983)).

For å differensiere mellom disse muligheter, nefrektomiserte vi utvalgte xenoimplanterte, CTLA4Ig-behandlede mus (dag 40) og retransplanterte dem under den gjenværende nyrekapsel med enten de originale donorøyer (første parti) eller ubeslektede andre parti humane øyer (fig..14).

Streptozotocin-behandlede kontrolldyr, som aldri hadde fått et øyimplantat, ble også transplantert med enten første eller andre parti øyer. Ingen behandling etter transplanteringen ble gitt. Kontrolldyrene avstøtte det første og andre parti øyer på dag 4. De CTLA4lg-behandlede dyr som hadde fått det andre parti øyer, avstøtte disse øyer på dag 5, mens dyrene som fikk første parti donorøyer, beholdt implantatene i

> 80 dager (fig. 14).

Disse resultater antyder at CTLA4lg-behandlingen resulterte i forlenget donorspesifikk manglende respons på de xenogene øyer. Evnen til den murine immunrespons til å skille mellom forskjeller blant de humane øydonorer, understøtter også den direkte gjenkjenning av de polymorfe MHC-produkter uttrykt på de humane øyceller.

EKSEMPEL 6

BALB/c (H-2<d>) og C57BL/6 (H-2<d>) hunnmus, 6 til 8 uker gamle, ble levert fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Monoklonalt antistoff 11B11 er et rotte-IgGl-anti-murint IL-4 (Ohara, J., og W.E. Paul, 1985, Production of a monoclonal antibody to and molecular characterization of B-cell stimulatory factor-1. Nature 315:333) (Verax (Lebanon,

NH) ) .

BALB/c-mus (fem pr. gruppe) ble immunisert intravenøst med IO<8> SRBC alene eller sammen med 200 ug chimer L6 mAb eller humant CTLA4lg-fusjonsprotein. De angitte grupper ble behandlet 2 timer før injeksjon av SRBC ved intraperitoneal injeksjon av 2 ml av enten rotteimmunoglobulin eller rotte-anti-murint IL-4-mAb-llBll ved 5 mg/ml. Behandling med chimer L6 mAb eller CTLA4Ig ble gjentatt daglig i ytterligere 4 dager.

Alle dyrene ble gitt intravenøse injeksjoner av SRBC (fig. 15) eller KLH (fig. 16) på dag 46. Nærmere bestemt skal de lukkede sirkler i fig. 15 representerere mus som ble administrert med bare SRBC på dag 0 og dag 46. De åpne sirkler representerer mus administrert med bare SRBC på dag 46. De gjenværende mus representert i fig. 15, ble videre administrert med SRBC på dag 46. I motsetning, ble musene i fig. 16 administrert med et annet immunogen, KLH, utelukkende på dag 46.

Serumkonsentrasjoner hos mus målt for å ha antistoffer rettet mot SRBC eller KLH, ble bestemt ved ELISA som beskrevet (Linsley et al., Science 1992).

Serumantistofftiter ble beregnet som den fortynning som gir en A450 på fem ganger bakgrunnen. Serumantistofftiterverdier fra fig. 15 ble bestemt fra sammenslåtte sera fra fem mus pr. gruppe, mens serumantistofftiterverdier fra fig. 16 representerer gjennomsnittlige titere for fem enkeltsera. Piler angir injeksjon av SRBC eller KLH på dag 46. Fig. 15 og 16 viser at den immunologiske respons hos mus injisert samtidig med både CTLA4Ig og anti-IL4 (åpne triangler) blir undertrykket på en antigenspesifikk måte. Fig. 15 viser at det ikke er noen stigning i serumanti-stof f titer (dvs. ingen primær eller sekundær immunologisk respons) hos mus injisert samtidig med CTLA4Ig og anti-IL4 og injisert med SRBC på dag 0 og dag 46. Kombinasjonen av CTLA4Ig og anti-IL4 undertrykker en primær og sekundær immunrespons, og induserer langvarig immunologisk manglende respons på SRBC.

Dessuten viser fig. 15 at det ikke er noen primær immunologisk respons hos mus injisert samtidig med CTLA4Ig og kontrollrotte-Ig (Cappel, Organontecknika, Palo Alto, CA). Disse mus har imidlertid en sekundær immunologisk respons etter injeksjon med SRBC på dag 46 (lukkede triangler, fig. 15) .

Fig. 16 viser at administrering av CTLA4Ig og anti-IL4, etterfulgt av et annet immunogen, KLH, på dag 46 hos mus ikke undertrykker en primær immunrespons på KLH hos mus. Isteden viser disse mus en primær immunrespons på KLH (åpne triangler, fig. 16). Mus behandlet med CTLA4Ig og anti-IL4 hadde således en svært spesifikk immunrespons avhengig av antigenet administrert deri.

EKSEMPEL 7

Ved setespesifikk og homolog mutagenese har vi identifisert regioner i CTLA4Ig som er nødvendige for dens binding med høy begjærlighet til B7-1. Det følgende er en beskrivelse av hvordan man lager løselige CTLA4/CD28-hybride fusjonsproteiner som binder B7.

MATERIALER OG METODER

Monoklonale antistoffer mAb' er

Murine mAb'er spesifikke for CTLA4, ble fremstilt og karakterisert som tidligere beskrevet (Linsley et al., J. Ex. Med., (1992) 176:1595-1604). Antistoff 9.3 (anti-CD28) er tidligere beskrevet (Hansen et al., Immunogenetics 10:247-260

(1980)).

Cellekultur

Fremstilling av stabile transfiserte B7-1-positive CHO-celler er tidligere beskrevet (Linsley et al. i J. Exp. Med. 173:721-730 (1991); P.S. Linsley et al., J. Exp. Med. 174:561 (199D).

Celler ble holdt i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,2 mM prolin og 1 UM metotreksat. COS-celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS. CTLA4Ig ble fremstilt i CHO-celler som tidligere beskrevet (eksempel 2) .

CTLA4Iq og CD28Iq- seterettede mutante ekspresionsplasmider

Seterettet mutagenese ble utført på en vektor som koder for løselig chimer form av CTLA4 (CTLA4Ig), hvori det ekstracellulære domene av CTLA4 var genetisk fusjonert til henglse-og de konstante regioner av en human IgG-tung kjede (eksempel 2). CTLA4Ig-seterettede mutanter ble frmstilt ved innkoding av den ønskede mutasjon i overlappende oligonukleotidprimere og dannelse av mutantene ved PCR (Ho et al., 1989, supra) ved anvendelse av CTLA4Ig-plasmidkonstruksjonen som templat.

Det ble fremstilt seks mutanter som kodet for substitusjoner for alanin i det høyt konserverte heksapeptid 98MYPPPY-103 som utgjør en del av det putative CDR-3-lignende domene (fig. 17 og 22) (Ho et al., 1989, supra). Disse mutanter er beskrevet i tabell II.

Dessuten ble det også fremstilt to mutanter som koder for restene P103A og Y104A (henholdsvis MYPPAY OG MYPPPA) fra CD28Ig 99MYPPPY104-heksapeptidet ved anvendelse av CD28Ig som templat, ved samme fremgangsmåte. Disse mutanter er også beskrevet i tabell II.

Primere nødvendige for PCR-reaksjonene, men ikke for innføring av mutasjoner, omfattet (1) en CDM8-fremover (CDM8FP) pimer som koder for en komplementærsekvens oppstrøms for Hindlll-restriksjonssetet i 5'-enden av CDM8-stuffer-regionen, og (2) en revers primer (CDM8RP) som koder for en komplementærsekvens nedstrøms for Xbal-setet i 3'-enden av CDM8-stuf ferregionen.

Disse primere kodet for følgende sekvenser:

CDM8FP:5'-AATACGACTCACTATAGG

CDM8RP:51 -CACCACACTGTATTAACC

PCR-betingelsene besto av 6 minutter ved 94°C, etterfulgt av 25 cykler av 1 minutt ved 94°C, 2 minutter ved 55°C og 3 minutter ved 72°C. Taq-polymerase og reaksjonsbetingelser ble anvendt som antydet av leverandøren (Perkin Eimer Cetus, Emeryville, CA). PCR-produktene ble spaltet med Hindlll og Xbal og ligert inn i HindiII/Xbal-kuttet CDM8-ekspresjonsvektor .

For å bekrefte at de ønskede mutasjoner var blitt innsatt og verifisere fraværet av sekundære mutasjoner, ble hvert CTLA4Ig-mutante fusjonsprotein (et eksempel på et løselig CTLA4-mutant fusjonsprotein) sekvensert ved dideoksykjede-terminerings/ekstensjonsreaksjonen med sekvenasereagenser anvendt ifølge leverandørens anbefalinger (United States Bio-chemical Corp., Cleveland, OH).

Plasmider ble transfisert inn i COS-celler (Aruffo et al., Cell 61:1303 (1990)), og de kondisjonerte media ble anvendt som en kilde for de resulterende Ig-mutante fusjonsproteiner.

CTLA4/ CD28Ia- hybride ekspresionsplasmider

CTLA4/CD28lg-hybride scanningplasmider som koder for konstruksjonene HS2, HS4, HS4-A, HS4-B og HS5 (fig. 19 og tabell I) ble fremstilt ved PCR ved anvendelse av overlappende oligonukleotidprimere utformet for innføring av CTLA4-sekvenser i CD28Ig, samtidig med deletering av den tilsvarende region fra CD28. De samme CDM8-fremover og reverse PCR-primere beskrevet ovenfor, ble også anvendt.

Det følgende er en liste over de CTLA4/CD28-hybride fusjonsproteiner som ble laget.

Hver cDNA-konstruksjon ble genetisk bundet til cDNA som koder for hengsle- og de konstante regioner av et humant IgGl for å lage løselige chimerer.

Et HS6-hybrid ble fremstilt på lignende måte som den beskrevet ovenfor, bortsett fra at den CDRl-lignende region i CTLA4lg ble erstattet med den tilsvarende region fra CD28Ig.

HS7, HS8 og HS9-konstruksjoner ble fremstilt ved å erstatte et ca. 350 basepar Hindlll/Hpal-5'-fragment av henholdsvis HS4, HS4-A og HS4-B, med det ekvivalente cDNA-fragment på lignende måte spaltet fra HS5 for således å inn-føre den CDRl-lignende sløyfe av CTLA4 i de hybrider som alle-rede inneholder den CTLA4 CDR3-1ignende region.

HS10-HS13-konstruksjonene er domenehomologe mutanter som ble fremstilt ved innføring av den CDR2-lignende sløyfe av CTLA4Ig i tidligere konstruerte homologe mutanter. Dette ble gjort ved overlappende PCR-mutågenese, hvorved det ble utformet primere for innføring av CTLA4 CDR2-lignende sekvenser i homologe tempiater, mens man samtidig deleterte den tilsvarende CD28 CDR2-lignende region fra molekylet.

Følgelig tjente HS4 som en templat for å lage HSlO; HS7 tjente som templat for å lage HS11; HS4-A tjente som templat for å lage HS12; og HS8 tjente som templat for å lage HS13 (fig. 19 og tabell I). CDM8-primerne beskrevet ovenfor, ble også anvendt i disse konstruksjoner.

Den HS14-hybride konstruksjon ble fremstilt ved å erstatte den CDR2-lignende sløyfe av CD28 med den ekvivalente sløyfe fra CTLA4lg (fig. 19 og tabell I).

Oligonukleotidprimere utformet for innføring av disse forandringer, ble anvendt i overlappende PCR-mutagenese identisk med den beskrevet for andre mutanter.

PCR-reaksjoner og subkloning i CDM8 ble gjennomført som beskrevet ovenfor. Igjen ble alle mutanter sekvensert ved di deoksykj edet e rmi nering/ekstensjonsreaksjon.

Plasmider som koder for hver av mutantene, ble transfisert inn i COS-celler, og de resulterende løselige lg- . fusjonsproteiner ble kvantifisert i dyrkingsmedier og visualisert ved Westem-blot som beskrevet i følgende avsnitt.

Kvantifisering av de resulterende Iq- fus- ionsproteiner i dyrkingsmedier

Løselige muante fusjonsproteiner ble kvantifisert i en enzymimmunoassay ved å bestemme mengden av lg som er tilstede i serum-frie COS-cellekulturmedia.

Mikrotiterplater (Immulon2; Dynatech Labs., Chantilly, VA) ble belagt med 0,5 ug/ml geit anti-humant IgG (Jackson Immunoresearch Labs., West Chester, PA) i 16-24 timer ved 4°C.

Brønnene ble blokkert i 1 time med prøvefortynningsmiddel (Genetic Systems, Seattle, WA), deretter vasket med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 (PBS-Tw).

COS-cellekulturmedia inneholdende fusjonsproteiner, ble tilsatt i forskjellige fortynninger og inkubert i 1 time ved 22°C. Kjente konsentrasjoner av CTLA4Ig ble også tilsatt til separate brønner på hver plate for en standardkurve.

Etter vasking, ble det tilsatt pepperrotperoksydase (HRP)-konjugert geit anti-humant IgG (Tago, Burlingame, CA) fortynnet 1:12.000 og inkubert i 1 time ved 22°C. Brønnene ble deretter vasket og inkubert med 3,3<1>,5,5<1->tetrametylbenzidin-(TMB) substrat (Genetic Systems) i 15 minutter før reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 1 N H2S04. Optisk tetthet ble målt ved bølgelengdene 450 og 630 nm på en mikro-titerplateleser (Genetic Systems).

Konsentrasjonen av mutant Ig-fugsjonsprotein ble bestemt ved sammenligning med en standardkurve av kjente konsentrasjoner av CTLA4Ig.

Immunoutfelling og Western- blott- analyse

CTLA4/CD28Ig-hybride fusjonsproteiner tilstede i kulturmedia, ble adsorbert til protein A-Sepharose ved inkubering over natten ved 4°C. Perlene ble vasket med PBS inneholdende 0,1% Nonidet-P40 (NP40), deretter ble tilsatt SDS PAGE-prøve-buffer, og det eluerte protein ble påsatt på en SDS-polyakryl-amidgel.

Western-blott-transfer av protein på nitrocellulose ble utført ved standardfremgangsmåter. Nitrocellulosemembraner ble deretter blokkert med PBS inneholdende 0,1% NP40 og 1% ikke-fettholdig tørrmelkpulver.

Etter vasking i PBS-Tw, ble membranene inkubert med alkalisk fosfatasekonjugert geit anti-humant IgG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) fortynnet 1:1000 og inkubert i 1 time ved 22°C. Blottene ble deretter vasket og utviklet ved. anvendelse av standardfremgangsmåter.

B7- positiv CHO- celleenzymimmunoassay

Evnen til CTLA4Ig-mutante fusjonsproteiner og CTLA4/- CD28Ig-hybride fusjonsproteiner til å binde B7-1 stabilt uttrykt på CHO-celler, ble bestemt ved en enzymimmunoassay.

Rundbunnede vevskulturbehandlede 96 brønners mikrotiterplater (Corning, Corning, NY) ble utsådd med B7-l-positive CHO-celler i IO3 celler pr. brønn. To dager senere ble de konfluente celler fiksert i 95% etanol i 15 minutter.

Etter vasking med PBS-Tw, ble mutante lg-fusjonsproteiner tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner og inkubert i 1 time ved 4°C. Etter vasking, ble tilsatt HRP-konjugert geit anti-humant IgG (Tago) fortynnet 1:10.000 og inkubert i 1 time ved 22°C.

Brønnene ble deretter vasket, og TMB-substrat tilsatt som ovenfor og fikk reagere i 30 minutter før reaksjonen ble stanset med 1 N H2S04. Brønnenes absorbans ble målt ved 450 nm.

CD28Iq- seterettet mutant fusionsproteinbindingsassay

Seterettede mutante fusjonsproteiner av CD28Ig ble under-søkt for sin evne til å binde seg til B7-1 ved indirekte enzymimmunoassay.

Brønner i ELISA-plater ble belagt med et chimert fusjonsprotein inneholdende det ekstracellulære domene av humant B7-1 fusjonert med en mus-IgGl-Fc-region i 5 ug/ml i 16 timer ved 4°C. Brønnene ble blokkert i 1 time med prøvefortynningsmiddel (Genetic Systems), deretter vasket med PBS-Tw. COS-cellekulturmedia inneholdende kjente konsentrasjoner av mutant fusjonsprotein, ble tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner og inkubert i 1 time ved 22°C.

Kjente konsentrasjoner av CD28Ig ble også tilsatt til separate brønner på hver plate. Etter vasking ble tilsatt HRP-konjugert geit anti-humant IgG (Tago) fortynnet 1:10.000 og inkubert i 1 time ved 22°C. TMB-substrat ble tilsatt, og optiske tettheter avlest som beskrevet for kvantifisering av lg-fusjonsproteiner i dyrkningsmedier.

mAb- bindinq til Iq- fusionsproteiner

Evnen til anti-CTLA4-mAb'er og anti-CD28-mAb 9.3 til å binde CTLA4/CD28Ig-hybride fusjonsproteiner og CTLA4Ig-mutante fusjonsproteiner ble bestemt ved en enzymimmunoassay.

Brønner i mikrotiterplater (Immulon 2) ble belagt med 0,5 Ug/ml av geit anti-humant IgG (Jackson) i 16-24 timer ved 4°C.

Platene ble blokkert i 1 time med prøvefortynningsmiddel (Genetic Systems), vasket med PPS-Tw, deretter inkubert med lg-fusjonsproteinene i 1 time ved 22°C. Etter vasking, ble brønnene inkubert med mAb ved 1 ug/ml i 1 time ved 22°C.

Etter ytterligere vasking, ble tilsatt HRP-konjugert geit anti-mus-Ig (Tago) fortynnet 1:10.000 og inkubert i 1 time ved 22°C. TMB-substrat ble tilsatt, og optisk tetthet målt som beskrevet ovenfor.

CTLA4- molekylmodell

En omlag tredimensjonal modell av det CTLA4-ekstracellulære domene ble generert basert på. bevaringen av konsensusrester av IGSF-variablelignende domener.

Ved anvendelse av slike IGSF-konsensusrester som "anker-punkter" for sekvensinnrettinger, ble CTLA4-rester tilordnet A, B, C, C, C', D, E, F, G-trådene i en Ig-variabel folde

(Williams/Barclay, 1988, supra) og de sammenbindnede sløyfe-regioner (fig. 22).

CTLA4-modellen ble bygget (henholdsvis. Insightll, Discover, Molecular Modeling and Mechanics Programs, Biosym Technologies, Inc., San Diego) ved anvendelse av den variable tunge kjede av HyHEL-5 (Sheriff et al., 1987 PNAS 84:8075-8079) som templatstruktur. Sidekjedeerstatninger og sløyfe-konformasjoner ble approksimert ved anvendele av konforma-sjonssøking (Bruccoleri et al., 1988 335:564-568).

Flere versjoner av modellen med modifisert tilordning av noen rester til S-tråder eller sløyfer ble testet ved anvendelse av 3D-profilanalyse (Liithy et al., 1992, Nature 336:83-85) for å forbedre den initiale innretting av den CTLA4-ekstracellulære regionsekvens med en IGSF-variabel fold.

RESULTATER

Konstruksjon og bindingsaktivitet av CTLA4Ia og CD28Ig mutante fusjonsproteiner

En sekvensinnretting av forskjellige homologer av CD28 og CTLA4 er vist i fig. 17. I fig. 17 er sekvenser av human (H), mus (M), rotte (R) og kylling (Ch) CD28 innrettet med human og mus-CTL4. Restene er nummerert fra den modne protein-N-terminus med signalpeptidene og transmembrandomenene understreket, og de CDR-analoge regioner bemerket. Mørklagte områder fremhever fullstendig konservering av rester, mens lysskyggede områder fremhever konservative aminosyre-substitus joner i alle familiemedlemmer.

Regioner med sekvenskonservering er spredt gjennom hele de ekstracellulære domener av disse proteiner, med den mest rigorøse konservering observert i det heksapeptide MYPPPY-motiv lokalisert i den CDR3-lignende sløyfe av både CTLA4 og CD28 (fig. 17). Dette antyder en sannsynlig rolle for denne region i interaksjonen med et B7-antigen, f.eks. B7-1 og B7-2.

For å teste denne mulighet, ble det innført seterettede alaninscanningmutasjoner i denne region av CTLA4Ig ved anvendelse av PCR-oligonukleotidprimerrettet mutagenese som derved førte til CTLA4Ig-mutante fusjonsproteiner. På lignende måte ble det innført to alaninmutasjoner i CD28Ig MYPPPY-motivet, hvilket derved resulterte i CD28Ig-mutante fusj onsproteiner.

Alle cDNA-konstruksjoner ble sekvensert for å bekrefte de ønskede mutasjoner før transfeksjon inn i COS-celler. Konsentrasjonene av mutante lg-fusjonsproteiner i- serumfrie COS-cellekulturmedier ble bestemt ved en Ig-kvantifiserings-analyse.

Evnen til hvert CTLA4Ig-mutante fusjonsprotein til å binde seg til B7-1 uttrykt på stabilt transfiserte CHO-celler, ble deretter bestemt ved en indirekte cellebindingsimmuno-assay. Binding av CD28Ig-mutante fusjonsproteiner til B7-1 ble bestemt ved en indirekte enzymimmunoassay. Hver av disse analyser er beskrevet i Materialer og Metoder.

Mutagenese av hver rest av CTLA4Ig MYPPPY-motivet til Ala hadde en dyp effekt på binding til B7-1 som vist i fig. 18.

Fig. 18 viser at mutasjoner i MYPPPY-motivet av CTLA4Ig og CD28Ig vil sprenge bindingen til B7-1. Seterettet mutant-Ig-fusjonsproteiner ble produsert i transienttransfiserte COS-celler, kvantifisert og testet for sin evne til å binde seg til B7-1.

I fig. 18 ble fusjonsproteinkvantifiseringer gjentatt minst to ganger med replikate determinasjoner. Nærmere bestemt viser fig. 18 at CTLA4Ig-mutanter binder seg til stabilt transfiserte, etanolfikserte B7-1+ CHO-celler dyrket til konfluens i ELISA-vevskulturplater. Bindingsdata er uttrykt som gjennomsnittet av duplikate brønner og er representative for minst to eksperimenter.

Y99A og PlOlA-mutanter bandt seg til B7-1, men med betydelig redusert evne i forhold til villtype CTLA4Ig. Motsatt, viste mutantene M98A, P100A, P102A og Y103A et nesten fullstendig tap av binding. Videre ville CD28Ig MYPPPY-mutantene P103A og Y104A ikke ha påvisbar binding til B7-1 immobilisert på brønner i ELISA-plater (fig. 18b).

B7-l-transfiserte CHO-celler som ble inkubert med CTLA4Ig-mutante fusjonsproteiner, merket med anti-humant FITC, og bestemt ved anvendelse av FACSCAN, viste tilsvarende resultater. Disse resultater demonstrerer klart en kritisk rolle for MYPPPY-motivet i både CTLA4lg og CD28Ig-binding til B7-1.

Karakterisering av CTLA4/ CD2 8Ig- hvbride fusjonsproteiner

Siden MYPPPY-motivet er vanlig i både CTLA4Ig og CD28Ig, kan det alene ikke svare for den observerte forskjell i binding til B7-1 som kan observeres med CTLA4Ig og CD28Ig. Bidraget for mindre godt konserverte rester til binding av B7-1 med høy begjærlighet, ble bestemt ved anvendelse av en serie av homologe mutanter.

De tre CDR-lignende regioner i CD28 ble erstattet i forskjellige kombinasjoner med de ekvivalente regioner fra det ekstracellulære CTLA4-domene (fig. 19 og tabell I). Fig. 19 er et kart av CTLA4/CD28Ig-mutante fusjonsproteiner som viser prosent bindingsaktivitet til B7-1+ CHO-celler i forhold til CTLA4Ig. Konserverte cysteinrester (C) er vist i posisjonene henholdsvis 22, 93 og 121 (CTLA4-nummerering). Også vist er posisjonen av MYPPPY-motivet. Åpne arealer representerer CD28-sekvens; fylte arealer representerer CTLA4-sekvens; kryss-skraverte arealer representerer, begynnelse av IgG Fc (det.refereres også til tabell I). Prosent bindingsaktivitet ble bestemt ved å sammenligne bindingskurver (fig. 20a/b) i forhold til CTLA4lg og finne konsentrasjonen av en mutant som er nødvendig for å gi den samme O.D. som finnes for CTLA4Ig. Forholdet av mutantprotein til CTLA4Ig-konsentrasjon ved en bestemt O.D. ble deretter uttrykt som prosent bindingsaktivitet. Minst to A450 avlesninger ble tatt fra den lineære del av CTLA4Ig-bindingskurven, og den gjennomsnittlige prosent bindingsaktivitet bestemt.

Tilsammen 14 hybride cDNA-konstruksjoner ble fremstilt, sekvensert, og transfisert inn i COS-celler. Konsentrasjoner av lg-fusjonsproteiner i serumfrie kulturmedia ble bestemt, og deres elektroforetiske mobilitet sammenlignet ved SDS-PAGE innbefattet Western-blottinganalyse.

Under reduserende betingelser migrerte hvert chimere protein med en relativ molekylmasse i område mellom den for CTLA4Ig (Mr-50 kDa) og CD28Ig (Mr-70 kDa) avhengig av størr-elsen av den utvekslede region.

Under ikke-reduserende betingelser, migrerte proteinene primært i området ioo-140 kDa, hvilket viser at disse fusjonsproteiner eksisterte som disulfidsammenbundede dimerer på tross av mutagenese av cysteinrestene i hengsleregionen av Fc.

Siden fire av de fem konserverte cysteinrester i CTLA4 og CD28 blir antatt å være involvert i intrakjededisulfidbind-inger, var dimerisering av fusjonsproteinene derfor mest sannsynlig å tilskrive den femte konserverte cysteinrest i posisjon 121 i CTLA4 (posisjon 123 i CD28).

Binding av CTLA4/ CD28Ia- hybride fusjonsproteiner til B7- 1

De hybride fusjonsproteiner ble testet for sin evne til å binde seg til B7-1 ved den samme indirekte cellebindings-immunoassay som ble anvendt til å bestemme de setespesifikke CTLA4Ig og CD28lg-mutante fusjonsproteiner.

Under disse betingelser er bindingen mellom CD28Ig og B7-1 knapt påvisbar (fig. 2Oa/b). Erstatning av restene 97 til 125 (den CDR3-lignende utvidede region) av CD28 med de tilsvarende rester av CTLA4, resulterte imidlertid i en størrelsesordenmessig ca. 2,5 gangers økning i binding av CD28Ig-analogen til B7-1 (fig. 20a/b). Fig. 20a/b viser at CTLA4/CD28Ig-mutante fusjonsproteiner demonstrerer involvering av CDR-analoge regioner i binding med høy begjærlighet til B7-1 CHO-celler. Mutantene ble bestemt som beskrevet i fig. 2. Data er uttrykt som gjennomsnittet av duplikate brønner, og er representative for minst tre eksperimenter. Fra disse kurver ble det bestemt prosent bindingsaktivitet i forhold til CTLA4Ig som forklart og vist i fig. 19.

Binding til B7-1 av denne konstruksjon, betegnet HS4 (fig. 19), er ca. fem ganger mindre enn villtype-CTLA4Ig. HS2-hybriden som inkluderer ytterligere N-terminale rester av CTLA4 (aminosyrene 1-22), forbedret ikke evnen til det hybride molekyl til å binde seg til B7-1 i forhold til HS4.

HS6-konstruksjonen som representerer CTLA4lg-sekvensen, bortsett fra at den inneholder den CDRl-lignende region av CD28 (restene 25-32), bandt seg på lignende måte. Den ytterligere inklusjon av den CTLA4 CDRl-lignende region (restene 25-32) i HS4-konstruksjonen (betegnet HS7), viste imidlertid ytterligere forbedret binding, slik at bindingsaffiniteten er ca. 44% av CTLA4Ig (fig. 19).

Motsatt, inklusjon av den CDR2-lignende region av CTLA4 (restene 51-58) i HS4 (konstruksjon HS10), ville ikke ytterligere øke bindingen (fig. 19). Et lignende resultat ble funnet for konstruksjon HS11 som hadde alle tre CDR-lignende regionsekvenser av CTLA4 inkludert i CD28Ig. HSS-hybridet som inneholdt bare det CDRl-lignende domene av CTLA4, bandt seg ved svært lavt nivå.

CTLA4/CD28lg-hybridet HS4-A kodet for CTLA4Ig-restene 96-113 i den C-terminalt utvidede CDR3-lignende region; 9 CTLA4-avledede rester færre enn HS4 (fig. 19 og tabell I). HS4-A bandt B7-l-CH0-celler mindre godt enn HS4 (fig. 19 og 20b). Tilsetning av den CTLA-CDR1-lignende sløyfe (HS8 hybrid), øket imidlertid B7-1-bindingen fra ca. 2% til nesten 60% av vill-typebindingen.

På den annen side, ville tilsetning av den CTLA4-CDR2-lignende sløyfe i HSA4-A (HS12) ikke øke bindingen i forhold til HS4-A; og heller ikke ville tilsetning av alle tre CTLA4-CDR-lignende regioner (HS13, fig. 19).

Et annet hybrid kalt HS4-B, kodet for den CD28-CDR3-lignende region innbefattet MYPPPY-motivet, etterfulgt av CTLA4-restene 114-122 (tabell 1 og fig. 19).

HS4-B og HS4-A hadde en lignende binding til B7-1. I motsetning til HS4-A, ville inklusjonen av den CTLA4-CDR1-lignende sløyfe i HS4-B (HS9) imidlertid ikke forbedre bindingen (fig. 19), hvilket antyder at restene umiddelbart i nærheten av CTLA4lg-MYPPPY-motivet var viktige determinanter i binding med høy begjærlighet.

Monoklonalt antistoffbinding til CTLA4/ CD28Ia- hvbride fusjonsproteiner

Den strukturelle integritet av hvert hybride fusjonsprotein ble undersøkt ved å bestemme deres evne til å binde mAb'er spesifikke for CTLA4 eller CD28 i en enzymimmunoassay.

De CTLA4-spesifikke mAb<1>er 7P8, 11D4 og 10A8 blokkerer lignad-binding (Linsley et al. (1992) supra).

Disse antistoffer bandt seg til hver av de CTLA4Ig-mutante fusjonsproteiner unntatt 11D4 som unnlot å binde seg til P100A og P102A (tabell II). Siden 7F8 og 10A8 bandt seg til disse mutanter, kan mangelen på binding av 11D4 sannsynligvis tilskrives mutagenese som forstyrrer epitopen gjenkjent av 11D4.

Motsatt, hvert antistoff unnlot å binde seg til noe av de homologe scan-hybridfusjonsproteiner unntatt 7F8 som bandt seg til HS6, og 11D4 som bandt seg svakt til HS8. Ettersom mange av disse homologe, hybride fusjonsproteiner i en viss ut-strekning var i stand til å binde seg til B7-1, er det sannsynlig at mangel på binding av antistoffene skyldes spregning av konformasjonelle epitoper dannet av romlig nærliggende, men ikke lineære sekvenser.

Det CD28-spesifikke mAb 9.3 (Linsley et al. (1992) supra) unnlot å binde seg til noe av de CD28-seterettede mutante fusjonsproteiner, men bandt seg til de hybride fusjonsproteiner HS4, HS4-A, HS7 og HS8. Med HS2 ble det observert svakere binding. Ingen binding ble observert med HS5 og HS6-konstruksjonene.

CTLA4- modell

Fig. 21 viser en skjematisk fremstilling av CTLA4-modellen. Tilordningen av CTLA4-restene til CDR-lignende regioner er vist i fig. 17. CTLA4-modellen antyder tilstede-værelsen av en ytterligere (ikke-lg) disulfidbinding mellom restene Cys49 og Cys67, hvilket understøtter likheten mellom CTLA4 og den Ig-variable folding.

De to mulige N-bundede glykosyleringssteder i CTLA4 svarer til løsningsmiddeleksponerte posisjoner i Ig-S-streng-rammeverkregionene. 3D-profilanalyse viste at CTLA4-sekvensen er generelt forlikelig med en Ig-V-folde, selv om den er fjernere beslektet.

Rest Valll5 representerer den siste rest i det CTLA4Ig-lignende domene. Konformasjonen av regionen mellom Val 115 og den membranproksimale Cysl21 som blir antatt å danne CTLA4-homodimeren, er høyst variabel i CD28-familien. Det bilde som fremkommer er at CD28-familiemedlemmer hovedsakelig anvender rester i to av tre CDR-lignende regioner for binding til B7-1.

MYPPPY-motivet representerer et konservativt stillas for binding som synes å bli forsterket ved sin C-terminale for-lengelse, og som blir spesifikt modulert ved den høyst variable CDRl-lignende region. CDR3 og CDRl-lignende regioner berører hverandre romlig i Ig-variable folder. Den CDR2-lignende region er romlig adskilt og bidrar ikke signifikant, i tilfelle CD28-familien, til bindingen til B7-1.

Claims

1. Løselig CTLA4-molekyl, karakterisert ved a t det i) binder et B7-antigen ii) omfatter en aminosyresekvens som tilsvarer et mutant CTLA4 ekstracellulært område, iii) hvor aminosyresekvensen tilsvarende det mutant CTLA4 ekstracellulære området omfatter sekvensene Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr og Ala-Ser-Pro-Gly-Lys-Ala-Thr-Glu.

2. Løselig CTLA4-molekyl i følge krav 1, karakteris ert ved at aminosyresekvensen tilsvarer mutant CTLA4 ekstracellulært domene omfattende sekvensen Glu-Leu-Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Gly- Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile.

3. Løselig CTLA4-molekyl i følge krav 1, karakteris ert ved a t aminosyresekvensen tilsvarende det mutant CTLA4 ekstracellulære domene omfatter sekvensen Glu-Leu-Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Gly- Ile-Gly-Asn-Gly-Thr-Gln-Ile-Tyr-Val-Ile-Asp-Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp.

4.. Løselig CTLA4-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det mutant CTLA4 ekstracellulære domenet er et CTLA4 ekstracellulært domene som har en eller flere aminosyresubstitusjoner.

5. Løselig CTLA4-molekyl i følge krav 4, karakteris ert ved at det CTLA4 ekstracellulære domenet er av human opprinnelse.

6. Løselig CTLA4-molekyl i følge krav 5, karakteris ert ved at det CTLA4 ekstracellulære domenet har sekvensen som begynner med alanin (Ala) i posisjon 1 og slutter med asparaginsyre (Asp) i posisjon 125 av SEQ ID NO : 14.

7. Løselig CTLA4-molekyl i følge et hvilket som helst av de tidligere kravene, karakterisert ved at det løselige CTLA4-molekylet er et CTLA4Ig-fusjonsmolekyl.

8. Løselig CTLA4-molekyl i følge krav 7, karakteris ert ved at Ig-delen er en aminosyresekvens som omfatter aminosyrerestene av løkken, CH2 og CH3-regionene av human immunoglobulin.

9. Løselig CTLA4-molekyl i følge krav 8, karakteris ert ved at det humane immunoglobulin er Cy 1.

10. Løselig CTLA4-molekyl i følge et hvilket som helst av de tidligere kravene, karakterisert ved at B7-antigenet er B7-1.

11. Blanding, karakterisert ved at den omfatter løselig CTLA4-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 10, og en farmasøytisk bærer.

12. Anvendelse av et løselig CTLA4-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 10 for fremstilling av en farmasøytisk blanding for behandling av en immunsystem sykdom, en infeksjonssykdom eller kreft.

13.. Anvendelse i følge krav 12, hvor immunsystem sykdommen er en autoimmun sykdom, en allotransplanat avvisning, en kronisk allergisk reaksjon, en transplantat avvisning eller en transplantat-mot-vert sykdom.

14. Anvendelse i følge krav 12, hvor den infektiøse sykdom er en HIV-infeksjon, eller en HTLV1-infeksjon.

15. In vitro fremgangsmåte for å regulere binding av et B7-bindende molekyl til et B7-antigen omfattende å kontakte et løselig CTLA4-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 10 med et B7-antigen.

16. In vitro fremgangsmåte for å regulere CTLA4-positive T-celle interaksjoner med B7-positive celler omfattende å kontakte de B7-positive cellene med et løselig CTLA4-molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 10 i en mengde effektiv til å interferere med reaksjonen av B7-antigenet med CTLA4.

17. Fremgangsmåte i følge krav 16, karakterisert ved at interaksjonen med CTLA4-positive T-celler med B7-positive celler inhiberes.