PT1576182E

PT1576182E - Optimizador da qualidade do produto em processos de cultura celular de mamíferos destinados à produção de proteínas

Info

Publication number: PT1576182E
Application number: PT03808535T
Authority: PT
Inventors: Bernhard M Schilling; Scott Gangloff; Dharti Kothari; Kirk Leister; Linda Matlock; Stephen G Zegarelli; Christoph E Joosten; Jonathan O Basch; Sivakesava Sakhamuri; Steven S Lee
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2011-01-21
Also published as: CY1111358T1; ES2354610T5; EP1576182A4; MXPA05006522A; AU2003303394B2; KR20050103466A; CO5590971A2; US20050084933A1; KR101088223B1; CN1820080A; JP2006511224A; CN100402660C; SI1576182T1; US20080070280A1; AU2003303394A1; DK1576182T4; EP1576182B1; EP1576182A2; ATE488600T1; ES2354610T3

Description

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Descrição "Optimizador da qualidade do produto em processos de cultura celular de mamíferos destinados à produção de proteínas" A presente invenção reivindica a prioridade em relação ao pedido provisório norte-americano n.° 60/436050 requerido a 23 de Dezembro de 2002, e que se anexa por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a novos métodos e processos para a cultura de células de mamíferos que produzem um produto proteico, preferivelmente um produto proteico glicosilado com um maior e optimizado teor de ácido siálico. A realização dos métodos e processos de cultura celular nos seus variados aspectos resulta numa quantidade e qualidade mais elevadas do produto, conforme medido pelo teor de ácido siálico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A cultura celular animal, notavelmente a cultura de células de mamíferos, é preferivelmente usada para a expressão de proteínas glicosiladas e produzidas de forma recombinante para aplicações terapêuticas e/ou profiláticas. Os padrões de glicosilação de glicoproteínas recombinantes são importantes pois as cadeias laterais de oligossacarídeos das glicoproteínas afectam a função das -2- proteínas, bem como as interacções intramoleculares entre as diferentes regiões de uma proteína. Tais interacções intramoleculares estão envolvidas na conformação das proteínas e na estrutura terciária da glicoproteína. (Veja-se, por exemplo, A. Wittwer et al., 1990, Biochemistry, 29:4157-4180; Hart, 1992, Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Goochee et al., 1991, Bio/Technol., 9:1347-1355, e R. B. Parekh, 1991, Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754). Além disso, os oligossacarídeos podem funcionar para direccionar um determinado polipeptídeo para determinadas estruturas com base em determinados receptores celulares de hidratos de carbono. (Μ. P. Bevilacqua et al., 1993, J. Clin. Invest., 91:379-387; R. M. Nelson et al., 1993, J. Clin. Invest., 91:1157-1166; K. E. Norgard et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 1068-1072, e Y. imai et al., 1993, Nature, 361-555-557). O componente terminal de ácido siálico de uma cadeia lateral oligossacarídea de uma glicoproteína caracteriza-se por exercer um efeito sob diversos aspectos e propriedades de uma glicoproteína, incluindo a absorção, solubilidade, estabilidade térmica, semi-vida sérica e depuração ('"clearance") sérica, bem como sob a sua estrutura/comportamento físico e químico e sua imunogenicidade. (A. Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-100; R. B. Parekh, Id., Goochee et al., Id., J. Paulson et al., TIBS, 14:272-276, e A. Kobata, 1992, Eur. J. Blochem., 209:483-501; E. Q. Lawson et al., 1983, Arch. Blochem. Biophys., 220:572-575, e E. Tsuda et al., 1990, Eur. J. Biochem., 188:405-411).

No geral, os níveis de expressão de proteínas em sistemas baseados em culturas celulares de mamíferos são -3- consideravelmente menores do que nos sistemas de expressão microbiana, por exemplo, sistemas de expressão de bactérias ou de leveduras. No entanto, as células bacterianas ou de leveduras são limitadas na sua capacidade para expressarem de forma óptima produtos proteicos de elevado peso molecular, para o enrolamento adequado de uma proteína com uma estrutura estérica complexa e/ou proporcionar as modificações pós-traducionais necessárias para madurar uma glicoproteína expressa, afectando, assim, a imunogenicidade e a taxa de "clearance" do produto.

Como consequência das limitações das culturas de células de animais ou mamíferos, especialmente de células de animais ou mamíferos que produzem produtos recombinantes, foi investigada a manipulação de uma variedade de parâmetros, incluindo a utilização de recipientes de cultura de larga escala, a alteração das condições básicas de cultura, tais como a temperatura de incubação, a concentração de oxigénio dissolvido, pH e semelhantes, o uso de diferentes tipos de meios e aditivos nos meios, e o aumento da densidade das células cultivadas. Além disso, o processo de desenvolvimento de culturas de cálulas de mamíferos beneficiaria dos avanços na capacidade de prolongar o período (total) de cultura para aumentar a concentração final do produto ao mesmo tempo que se mantém a elevada qualidade do produto. Um parâmetro da qualidade do produto importante é o teor e completude da estrutura de glicosilação de um produto polipeptídico, sendo o conteúdo de ácido siálico vulgarmente usado como medida da qualidade da glicoproteína.

Os períodos (totais) dos processos de cultura celular, em especial os processos não contínuos, são geralmente -4- limitados pela viabilidade remanescente das células, que tipicamente diminui ao longo do decorrer do periodo. É, por isso, desejável a extensão máxima possivel de altas viabilidades celulares. As questões relacionadas com a qualidade do produto também oferecem uma motivação para minimizar as reduções da densidade das células viáveis e manter uma elevada viabilidade celular, já que a morte celular pode libertar sialidases no sobrenadante da cultura, o que pode reduzir o conteúdo de ácido siálico da proteína expressa. As questões relacionadas com a purificação da proteína oferecem uma outra motivação para minimizar a redução da densidade das células viáveis e a manutenção de uma viabilidade celular elevada. A presença de detritos celulares e os conteúdos de células mortas na cultura podem produzir um impacto negativo na capacidade de isolar e/ou purificar o produto proteico no final do período de cultura. Ao manter as células viáveis por um período de cultura mais longo regista-se uma redução concomitante na contaminação do meio de cultura por proteínas e enzimas celulares, por exemplo, proteases e sialidases celulares, que podem provocar a degradação e a redução da qualidade da glicoproteína produzida pelas células.

Foram investigados vários parâmetros para se obter uma viabilidade celular elevada em culturas celulares. Um parâmetro dizia respeito a uma única redução da temperatura da cultura após cultura inicial a 37°C (por exemplo, Roessler et ai., 1996, Enzyme and Microbial Technology, 18:423-427; patentes de invenção norte-americanas n.° 5705364 e 5721121 de T. Etcheverry et al., 1998; patente de invenção norte-americana n.° 5976833 de K. Furukawa et al., -5- 1999; patente de invenção norte-americana n.° 5851800 de L. Adamson et al.; patente de invenção n.° WO 99/61650 e WO 00/65070 de Genentech, Inc.; patente de invenção n.° WO 00/36092 de Biogen, Inc., e patente de invenção norte-americana n.° 4357422 de Girard et al.).

Outros parâmetros investigados diziam respeito à adição de componentes à cultura. Ficou comprovado que o inibidor do factor de crescimento suramina prevenia a apoptose durante o crescimento exponencial de células CHO Kl:CycE (Zhangi et al., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325). No entanto, a suramina não protegia contra a apoptose durante a fase de morte. Consequentemente, a suramina conseguiu manter uma alta viabilidade durante a fase de crescimento, mas não permitiu uma extensão da longevidade da cultura. Os mesmos autores registaram que na linha celular CHO 111-10PF, o sulfato de dextrano e sulfato polivinilo podiam, tal como a suramina, aumentar a densidade e a viabilidade das células viáveis do dia 3 relativamente à cultura de controlo. No entanto, o efeito do sulfato de dextrano ou sulfato de polivinilo durante a fase de morte não foi registado. Também se comprovou que a suramina, o sulfato de dextrano e o sulfato de polivinilo eram eficazes na prevenção da agregação celular.

Suplementou-se heparina ao meio de cultura celular animal a fim de adaptar as linhas celulares dependentes de "ancoragem" às condições de suspensão (por exemplo, patente de invenção norte-americana n.° 5348877 de McKenna e Granados, 1994). Sabe-se que a heparina se liga aos factores de crescimento, tal como o factor de crescimento semelhante ao factor de crescimento epidérmico ligado a heparina (HB-EGF; Raab e Klagsbrun, Biochim. Biophys. Acta -6- 1997, 1333, F179-F199). Os proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) da superfície celular supostamente optimizam a ligação HB-EGF e a bioactividade de determinados tipos celulares incluindo das células CHO de tipo selvagem (Raab e Klagsbrun, 1997) . [0 sulfato de heparano apenas difere da heparina no facto de este possuir menos grupos N- e O-sulfato e mais grupos N-acetil (McKenna e Granados, 1994). Na presente descrição, os sulfatos de heparina e heparano são considerados equivalentes e são genericamente designados por heparina]. Foi proposto, relativamente ao factor de crescimento FGF-2 ligado à heparina, que a ligação ao HSPG aumenta a concentração local de FGF-2 na superfície celular, que, por sua vez, aumenta a probabilidade de o FGF-2 se ligar aos receptores tirosina cinase das células (Raab e Klagsbrun, 1997) . Foi comprovado que o pentosano polissulfato pode bloquear a acção dos factores de crescimento ligados à heparina em células cultivadas (Zugmaier et al., J. Nat. Câncer Inst. 1992, 84, 1716-1724) . A literatura relacionada com patentes de invenção de sulfato de dextrano em cultura celular animal está associada à suplementação de sulfato de dextrano a um meio com o objectivo de: 1) Optimizar a velocidade de crescimento e aumentar o número de duplicações de população antes da senescência das células endoteliais humanas (patentes de invenção norte-americanas n.° 4994387 e 5132223 de Levine et al., 1991, 1992); 2) Aumentar o rendimento de proteína recombinante em linhas celulares de mamíferos (patentes de invenção norte-americanas n.° 5318898 de Israel, 1994); 3) Induzir a suspensão unicelular em linhas celulares de insectos (patentes de invenção -7- norte-americanas n.° 5728580 de Shuler e Dee, 1996); 4) Aumentar a actividade promotora de crescimento do factor de crescimento de hepatócitos humano e suprimir a sua degradação (patentes de invenção norte-americanas n.° 5545722 e 5736506 de Naka, 1996 e 1998); 5) Aumentar a densidade das células viáveis e a expressão de proteínas recombinantes (patente de invenção n.° WO 98/08934 de Gorfien et al., 1997).

Em todos os casos reportados referentes à presença ou suplementação de sulfato de dextrano num meio, o sulfato de dextrano estava presente ao longo do período de cultura desse mesmo meio. Em caso algum foram registados benefícios de uma adição controlada. Contudo, nunca se registou que o sulfato de dextrano pode atrasar o despoletar da fase de morte, prolongar a fase de crescimento ou interromper a fase de morte.

Com uma concentração crescente de produto na cultura, pode observar-se nos processos da cultura celular que a qualidade do produto diminui, conforme determinado pelo teor de ácido siálico medido da glicoestrutura de oligossacarídeo. Geralmente, existe um limite inferior para um teor de ácido siálico, conforme determinado pelos estudos de depuração de fármacos. A elevada abundância de uma proteína produzida por células em cultura, de forma óptima, é acompanhada por uma elevada qualidade da proteína que é, em último caso, recuperada para um determinado fim. Tal qualidade da proteína está correlacionada com o nível e completude de uma estrutura de glicosilação da proteína, sendo o conteúdo de ácido siálico usado como medida de tais parâmetros. -8-

Registou-se que a adição de D-galactose (4 g/1) ao meio basal de uma cultura celular de pequena escala, por exemplo, bioreactores de 2 litros (2 1), aumentou a glicosilação da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal (MAb) produzido pelas células cultivadas. (S. Weikert et al., "Engineering CHO Cells to Maximize Sialic Acid Content of Recombinant Protein", artigo apresentado na Reunião "Protein Expression", promovida pelo Cambridge Healthtech Institute, 5 e 6 de Abril de 2001, McLean, VA) . Conforme registado, a galactose foi providenciada sob a forma de um aditivo único a culturas de pequena escala, e não sob a forma de um aditivo ao meio de alimentação providenciado ao longo de todo o período de cultura. O relatório não contém qualquer reconhecimento dos obstáculos envolvidos na sialilação de uma glicoproteína produzida em culturas mantidas a larga escala (por exemplo, superior a 2 litros). A patente de invenção WO 01/59075 Al (Genentech, Inc.) descreve um processo para uma sialilação melhorada ou optimizada de glicoproteinas através da introdução nas células em cultura de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma UDP-GicNac2-epimerase mutada, que é uma enzima limitadora da velocidade na via biosintética de um açúcar nucleotídico específico, CMP-ácido siálico. Da mesma forma, X. Gu e D. Wang (1998, Biotech. Bioeng., 58(6): 642-648) descreve a suplementação de um meio de cultura com ManNac, um percursor específico da síntese do ácido siálico, para aumentar a disponibilidade do CMP-ácido siálico e optimizar a sialilação do produto.

De forma idêntica à patente de invenção WO 01/59075 Al, X. Gu e D. I. C. Wang (1998, Biotech. Bioeng., 58(6):642-648) descrevem que a suplementação de N- -9- acetilmanosamina (ManNAc) no meio de cultura aumentou o "pool" de CMP-ácido siálico nas células e, por fim, o teor de ácido siálico na IFN-Yglicoproteína em culturas de 20 ml. A suplementação de ManNAc envolveu uma adição inicial deste componente às culturas antes da análise da sialilação do produto produzido após 96 horas de cultura. A patente de invenção WO 01/59089 A2 (Genentech, Inc.) descreve a optimização da actividade CAD intracelular em células produtoras de glicoproteínas tornadas resistentes aos inibidores CAD. Este pedido internacional de patente de invenção descreve que CAD se refere ao complexo multienzimático polipeptidico (sintetase do carbamoil fosfato (CPS II), aspartato transcarbamoilase e diidroorotase) que cataliza as primeiras três reacções na biossintese de pirimidinas, especialmente UMP, que é convertido em UTP. Aparentemente, as células resistentes ao CAD aumentaram as "pools" de UTP e aumentaram os níveis de UDP-galactose juntamente com uma maior glicosilação dos produtos proteicos; a UDP-galactose é um conhecido substrato na via de glicosilação.

Os produtos de proteínas produzidos de forma recombinante que são adequadamente glicosilados e sialilados estão a tornar-se cada vez mais importantes nas áreas clínicas e médicas para uso na terapêutica, tratamentos e profilaxia. Assim, o desenvolvimento de processos fiáveis de cultura celular que obtenham, de forma económica e eficaz, uma maior concentração final de produto proteico, em conjunção com um alto nível de qualidade do produto, conforme determinado pelo teor de ácido siálico, preenche uma lacuna e um objectivo necessário na arte. -10-

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a novos processos para a produção de proteínas, preferencialmente produtos de proteína recombinante, mais preferencialmente produtos de glicoproteína, através de culturas de células animais ou de mamíferos. Os processos de cultura de células desta invenção atingem vantajosamente um teor mais alto e melhor de ácido siálico quanto ao produto de glicoproteína produzido pelas células cultivadas e isso graças ao recurso a uma estratégia de alimentação recentemente desenvolvida que inclui a adição de D-galactose à cultura.

Um dos aspectos desta invenção consiste em proporcionar processos de cultura de células para a produção de produtos de proteína, preferencialmente produtos de glicoproteína, e mais preferencialente produtos de glicoproteína recombinante, nos quais o teor siálico das glicoproteínas é aumentado e melhorado graças às condições e parâmetros de cultura utilizados nos processos de cultivo. Em conformidade com um aspecto preferencial desta invenção, o teor siálico das glicoproteínas produzidas é aumentado e melhorado através do uso de um método de alimentação no qual a D-galactose é adicionada à cultura num alimento, preferencialmente um meio de alimento. De acordo com um aspecto relacionado e próprio desta invenção, a D-galactose é adicionada diariamente às células durante todo o período de cultura, levando ao aumento do teor de D-galactose do produto e à adição de mais fracções de ácido siálico à estrutura da glicoproteína e aumentando, desta forma, a qualidade do produto final de glicoproteína. -11-

Outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um método eficaz para reverter o problema do decréscimo da sialilação da glicoproteina, problema que se verifica frequentemente na produção alargada de proteínas mediante o aumento da escala do reactor, ou seja, o volume da cultura de células e o tamanho do reactor. 0 processo de alimentação de culturas em grande escala de células que produzem um produto de glicoproteina com quantidades efectivas de sialilação de D-galactose permite reverter o "efeito de escala" supramencionado. A produção de grandes quantidades de glicoproteina altamente sialiladas pelas células, independentemente da escala do reactor, é também ela alcançada.

Um aspecto adicional da presente invenção é que esta proporciona um método para aumentar a sialilação das glicoproteínas produzidas pelas células cultivadas. Este método envolve a adição de galactose, preferencialmente D-galactose, como alimento, de preferência num meio de alimentação. Outro aspecto prende-se com um processo de cultura de células para a produção de proteínas, no qual a galactose é distribuída na cultura, por exemplo, todos os dias, ou intermitentemente, dia sim dia não, de três em três dias, de quatro em quatro dias, e afins. 0 meio de alimentação que contém D-galactose pode ser adicionado às culturas uma ou mais vezes por dia. Os regimes de alimentação preferenciais incluem uma alimentação diária da cultura através de um bólus com o meio de alimentação e uma alimentação contínua por gotejamento ou infusão do meio de alimentação nas culturas de células. Noutros aspectos, a D-galactose pode ser alimentada à cultura a qualquer um dos intervalos supramencionados e de uma maneira diferente do -12- meio de alimentação. A título de exemplo, mas não limitativo, a cultura pode ser alimentada com D-galactose num meio ou num meio de cultura diferente de um meio de em alimentação, ou a D-galactose pode ser alimentada à cultura em água. A título de exemplo, mas não restritivo, a cultura pode ser alimentada com D-galactose, bem como com um meio de alimentação, ou seja, pode haver mais do que uma composição a ser alimentada.

Noutro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um processo de cultura de células para o aumento da produção de proteínas e do teor de ácido siálico da glicoproteína produzida. 0 processo preserva ainda e sustém um alto nível de sialilação da proteína produzida, bem como uma viabilidade celular. Este aspecto da invenção abrange uma variante na qual são utilizados processos de cultivo que envolvem uma ou mais alterações da temperatura durante o período de cultivo das células, em conjunto com a alimentação das culturas com D-galactose. Neste aspecto, os métodos de cultura de células com alteração da temperatura sustentam uma elevada viabilidade celular durante a duração do período de realização da cultura. As duas ou mais alterações de temperatura podem também permitir que as células sejam mantidas em cultura por um período de tempo que pode vantajosamente alargar o período de execução da cultura de modo a atingir um aumento da titulação e uma qualidade elevada do produto pretendido, caracterizada pelo teor de ácido siálico. Os métodos que envolvem tal alargamento do período de execução da cultura incluem, por exemplo, um período total da cultura de células equivalente a duas, três ou quatro semanas, ou mais (cerca de 14 a 30 dias, ou mais), em comparação com um período de cultura -13- padrão ou de duas semanas (cerca de 10-14 dias). Como recentemente proporcionado pelos processos de cultura de células desta invenção, uma combinação das alterações da temperatura e da alimentação das células com D-galactose, preferencialmente num meio de alimentação e de preferência diariamente, resulta num processo melhorado para a produção de uma quantidade e qualidade aumentadas e melhoradas de um produto de glicoproteina sialilado pelas células em cultura. O método é particularmente vantajoso para culturas de células em "fed-batch".

Em vários outros aspectos da presente invenção, são utilizadas múltiplas alterações da temperatura, de preferência múltiplas alterações reguladas da temperatura que abrangem duas ou mais descidas de temperatura, na cultura de células de mamíferos para produzir um produto de proteína pretendido, em particular um produto de glicoproteina. Duas ou mais (isto é, pelo menos duas) mudanças de temperatura, que podem ser levadas a cabo após a fase de crescimento da cultura, abrangem os processos deste aspecto da invenção. Com pelo menos duas alterações de temperatura, de preferência com incrementos de aproximadamente quatro dias entre as alterações, é possível atingir uma elevada produção de proteína com um elevado teor de ácido siálico concomitante quanto ao produto de proteína pretendido. As múltiplas alterações de temperatura que incluem os métodos de cultivo podem atingir uma qualidade e quantidade elevadas de produto de proteína, bem como sustentar uma viabilidade celular durante a duração do período de cultivo. Um parâmetro preferencial associado aos processos de cultura de células com alterações de temperatura, como é aqui descrito, prende-se com a -14- alimentação de culturas com D-galactose, de preferência com um meio de alimentação complementado para conter D-galactose. 0 regime de alimentação ao qual é dada maior preferência é um regime de alimentação diário.

Em conformidade com os métodos de cultivo de células com alterações de temperatura caracteristicos desta invenção, a combinação de uma segunda, terceira alteração ou diminuição adicional da temperatura com uma primeira alteração de temperatura possibilita que as culturas de células mantenham uma elevada viabilidade celular e prevejam, numa variante da invenção, um alargamento da fase de produção durante a qual a titulação do produto de proteína é aumentada e a qualidade do produto, como é caracterizada pelo teor de ácido siálico, continue elevada até ao final do período de execução da cultura. A execução da cultura, como é aqui utilizada, refere-se ao período de cultivo, de preferência a todo o período de cultura. Como é proporcionada por esta invenção, a alimentação de uma cultura de células que, durante a sua execução, não abrange nenhuma alteração de temperatura, ou apenas uma única alteração de temperatura, com D-galactose, de preferência com um meio de alimentação que contém D-galactose, atinge uma quantidade e qualidade elevadas de produto de proteína, medidas pela sialilação do produto produzido, (ver, por exemplo, a Figura 1, na qual foi utilizado, diariamente, um alimento por bólus). A duração de todo o período de execução da cultura pode ser tão breve quanto até após a segunda alteração da temperatura (por exemplo, cerca de 10 a 14 dias) a tão extensa como cerca de 28 ou 30 dias, ou mais. Para um período de execução da cultura que abrange três (ou mais) alterações de -15- temperatura, a duração de todo o período de execução pode ser tão breve quanto precisamente após a terceira (ou a última) alteração de temperatura (por exemplo, cerca de 14 a 21 dias) a tão extensa como cerca de 28 a 30 dias ou mais. Por conseguinte, em conformidade com os métodos da presente invenção, as células podem ser cultivadas durante um período total de execução de mais de 10 dias, de mais de 14 dias ou de mais de 21 dias. Preferencialmente, o período de execução da cultura pode durar, pelo menos, de cerca de 10 a 14 dias a cerca de 21 a 30 dias, ou mais. O período total de execução do cultivo pode abranger duas, três, quatro ou mais etapas de alterações de temperatura. A título de exemplo, mas não limitativo, uma alteração de temperatura em duas etapas é realizada da seguinte maneira: a temperatura da cultura é, inicialmente, mantida nos 37 °C, ou por volta dos 37 °C, do dia 0 até ao 6.° dia, sensivelmente; do 6.° dia, sensivelmente, ao 10.° dia, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 34°C ou por volta dos 34°C, e do 10.° dia, sensivelmente, em diante, isto é, até ao 14.°-28.° dia, sensivelmente, até ao 14°-18° dia, sensivelmente, ou até ao final do período de execução da cultura, a temperatura da cultura é mantida nos 32°C ou por volta dos 32°C. Em conformidade com esta invenção, o procedimento de cultura com alteração de temperatura em três etapas inclui o seguinte formato exemplificativo mas não restritivo: a temperatura de cultura de células é controlada nos 37°C, ou por volta dos 37 °C, do dia 0 ao 6o dia, sensivelmente; do 6o dia, sensivelmente, ao 10° dia, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 34°C, ou por volta dos 34°C; do 10° dia, sensivelmente, ao 14° dia, sensivelmente, a -16- temperatura da cultura é mantida nos 32°C, ou por volta dos 32°C; e do 14° dia, sensivelmente, em diante, isto é, ao 21°-30° dia, sensivelmente, ou mais, isto é, até ao final do período de execução, a temperatura da cultura é mantida nos 30°C, ou por volta dos 30°C.

Assim, a utilização dos presentes métodos de cultivo de células que abrangem duas ou mais alterações de temperatura, nos quais uma quantidade e qualidade elevadas de produção de proteína são atingidas, é não só benéfica para os períodos de execução da cultura que têm durações "mais curtas", isto é, padrão (por exemplo, cerca de 10 a 14 dias), mas também para os períodos de execução da cultura que podem perdurar mais tempo do que o período padrão da produção. Tais períodos mais longos da execução do cultivo são possíveis porque os métodos desta invenção proporcionam um alargamento da fase inicial ou padrão da produção de proteína por células cultivadas (a fase de produção inicial ou padrão ocorre, geralmente, por volta do 6° dia ao 140 dia).

Por exemplo, com esta invenção, ao utilizar duas, três ou mais alterações de temperatura no período de execução da cultura, a qualidade e quantidade elevadas da produção de proteínas e a viabilidade celular podem ser mantidas e sustentadas por um período total de execução de cerca de 10-14 dias a um período total de execução de cerca de 21-28 dias, ou mais, em comparação com a produção de proteínas e a qualidade do produto em culturas que não recorrem a alterações de temperatura ou, quando muito, que recorrem apenas a uma alteração de temperatura.

Noutro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona métodos de cultura de células que incluem mais -17- de duas ou mais alterações de temperatura, como acima descrito. Em tais períodos de execução de alterações multi-etapas da temperatura, as células são essencialmente cultivadas da mesma maneira que aquela que é descrita para um período de cultivo em três etapas, e descidas de temperatura adicionais são executadas até ao final do período de cultura. Por exemplo, uma quarta alteração de temperatura, isto é, uma diminuição de temperatura, pode ser executada após a terceira alteração de temperatura do período de cultura, durante o qual a temperatura da célula é mais uma vez alterada, passando de cerca de 30°C a cerca de 28°C ou 29°C, de preferência cerca de 29°C, por volta dos dias 15-19, de preferência no dia 18, a contar do início da cultura. Alterações adicionais de temperatura podem ser incluídas no método de cultura de células, sendo as células mantidas a uma temperatura mais baixa, isto é, <29°C, para um alargamento subsequente da produção de proteína até o final da execução, de preferência por mais de 28-30 dias. Em todos os casos, a proteína produzida pelas células no final do período de cultivo é, geralmente, restaurada, isto é, isolada e/ou substancialmente purificada, como pretendido, utilizando-se, para esse efeito, técnicas levadas a cabo de forma rotineira e praticadas na arte como aqui descritas. Além disso, o teor de ácido siálico é verificado através de métodos convencionais.

Num aspecto particular, a presente invenção proporciona um processo (ou método) no qual a titulação final do produto é melhorada, e o teor de ácido siálico da glicoproteína produzida é mais alto, através da utilização de um processo de alteração de temperatura de duas ou mais -18- etapas. Em conformidade com este aspecto particular, a combinação de duas ou mais alterações de temperatura reguladas sustém uma viabilidade celular elevada da cultura, permitindo, desta forma, um alargamento da fase de produção durante a qual a titulação do produto, de preferência o produto recombinante, é aumentada e a qualidade do produto, como é caracterizada pelo teor de ácido siálico, é mantida a um nível elevado. Tal alteração de temperatura em duas ou mais etapas pode minimizar o compromisso prevalecente entre a titulação da proteína e o teor de ácido siálico na produção do produto durante o processo de cultura de células. Assim, as alterações de temperatura proporcionam um efeito positivo, melhorando um importante parâmetro de realização do processo de cultivo, isto é, o produto matemático da "titulação no fim (ou seja, final)" x "ácido siálico no fim (ou seja, final)" (titulação final x ácido siálico final). Nos processos de cultivo de duas ou mais etapas, as células são preferencialmente alimentadas com um meio que contém D-galactose, numa quantidade que admite altos níveis de sialilação do produto de proteína, mesmo em amplas culturas mantidas para lá dos períodos alargados de cultivo, por exemplo, superiores a cerca de duas semanas ou mais.

Por conseguinte, noutro aspecto particular para um método de cultivo em duas etapas, como é aqui descrito, as células são mantidas em cultura desde o dia 0 até ao dia 6, sensivelmente, a uma temperatura de 37°C, ou por volta dos 37°C; por volta do dia 6, a temperatura da cultura de célula é inferior a 34°C, ou próxima dos 34°C, e por volta do dia 10, a temperatura é mais uma vez reduzida, até aos 32°C, ou por volta dos 32°C. Num aspecto de tal método de -19- alteração de temperatura em duas etapas, a fase de produção é alargada para lá do dia 14, sensivelmente, e continua até ao final do periodo total da cultura, por exemplo, até ao dia 21, sensivelmente, ou até ao dia 28 a 30, sensivelmente, periodo durante o qual as células são mantidas em cultura a uma temperatura inferior de 32°C, ou próxima dos 32°C. O produto de proteína pode ser restabelecido no final da fase alargada de produção, como é descrito mais adiante.

Outro aspecto ainda da presente invenção consiste em proporcionar um método para aumentar a viabilidade das células em cultura ao submeter as células a duas ou mais alterações de temperatura durante o período de execução da cultura. Uma condição, tal como duas ou mais alterações de temperatura, suscitará uma melhoria da viabilidade celular se a viabilidade celular na cultura for superior por um período de tempo em que se verifica tal condição, comparativamente a um período de tempo em que não se verifica essa condição. Segundo este aspecto, os métodos de cultivo de células com duas ou mais alterações de temperatura, como são aqui descritos, permitem que as células permaneçam viáveis por períodos de tempo melhorados, isto é períodos de tempo que ultrapassam o período padrão de produção. Como é aqui abordado, uma consequência benéfica da viabilidade celular melhorada das células cultivadas prende-se com a produção de maiores quantidades de produto (ou com uma qualidade elevada) no final do período de cultivo, sob condições que são favoráveis para a manutenção de células viáveis.

Outro aspecto desta invenção é que o aumento da viabilidade das células, resultante da prática de métodos -20- de cultivo de células com duas ou mais alterações de temperatura, se correlaciona com a diminuição da quantidade de detritos de células e com o teor de células mortas ou de células moribundas libertadas na cultura por um período de tempo mais longo, por exemplo, proteases celulares e sialidases, que podem causar a degradação e a diminuição definitiva da qualidade da glicoproteína desejada produzida pelas células.

Noutros aspectos desta invenção, os processos de cultivo que envolvem a adição retardada de um composto polianiónico são utilizados em conjunto com a alimentação de culturas com D-galactose. Noutro aspecto desta invenção, os processos de cultivo que envolvem a adição retardada de um composto polianiónico e os processos de cultura que envolvem duas ou mais alterações de temperatura são utilizados em conjunto com a alimentação da D-galactose das culturas.

Nestes aspectos que envolvem a adição retardada de um composto polianiónico à cultura de células, a adição retardada de um composto polianiónico atinge uma melhoria da viabilidade celular. O composto polianiónico preferencial é o sulfato de dextrano. O composto polianiónico é adicionado à cultura num momento posterior à inoculação.

Num aspecto da invenção que envolve a adição retardada de um composto polianiónico, um composto polianiónico é adicionado à cultura num momento posterior à inoculação que é anterior ao início da fase de morte inicial, ou durante a fase inicial de crescimento, ou durante a segunda metade da fase inicial de crescimento, ou por volta do final da fase inicial de crescimento. Em conformidade com este aspecto da -21 - invenção, a fase de crescimento é alargada e/ou o início da fase de morte é adiado por um período de tempo equivalente a vários dias. Além disso, uma vez que a fase de morte celular teve início, a taxa de morte é grandemente diminuída.

Noutro aspecto, o composto polianiónico é adicionado à cultura durante a fase inicial de morte celular. Em conformidade com este aspecto da invenção, a morte celular é suspensa por um período de tempo, tal como vários dias.

Noutro aspecto preferencial desta invenção e como é aqui descrito mais adiante, os processos de cultura de células recentemente desenvolvidos, que envolvem uma alimentação com um meio de alimentação que contém D-galactose, são especialmente adequados para a produção de moléculas solúveis CTLA4 e de moléculas mutantes solúveis CTLA4, tais como CTLA4Ig e Ll04EA29YIg. Nas variantes preferenciais, as moléculas solúveis CTLA4 e as moléculas mutantes solúveis CTLA4 são produzidas em grande quantidade e qualidade por células hospedeiras geneticamente manipuladas para expressar e produzir essas proteínas. (Ver Exemplos 1-5). As variantes preferenciais da presente invenção incluem o cultivo de células que produzem CTLA4Ig e Ll04EA29Ylg, usando múltiplas alterações de temperatura associadas à alimentação das culturas com um meio de alimentação, que contém D-galactose, durante a execução da cultura para atingir grandes quantidades de produtos de CTLA4lg e Ll04EA29YIg de elevada qualidade, conforme determinado pelas medições de ácido siálico dos produtos finais. Outras variantes preferenciais incluem processos de cultivo com múltiplas alterações de temperatura em conjunto com a alimentação das culturas de células com um meio de -22- alimentação que contém D-galactose numa quantidade eficaz para atingir produtos de CTLA4lg e Ll04EA29Ylg que tenham um elevado teor de ácido siálico, como aqui descrito. Outra variante preferencial inclui o cultivo de células que produzem moléculas solúveis CTLA4Ig e moléculas mutantes solúveis CTLA4lg, tais como CTLA4Ig e Ll04EA29YIg, utilizando uma adição retardada de um composto polianiónico, associada a uma alimentação das culturas com um meio de alimentação que contém D-galactose. Outras variantes preferenciais incluem o cultivo de células que produzem CTLA4Ig e L104EA29YIg, utilizando a adição retardada de um composto polianiónico e múltiplas alterações de temperatura associadas à alimentação das culturas com um meio de alimentação que contém D-galactose.

Aspectos, características e vantagens subsequentes da presente invenção serão avaliados em consequência de uma leitura da descrição pormenorizada da invenção e de uma análise dos desenhos/figuras.

Descrição dos desenhos/figuras A Figura 1 apresenta os resultados da utilização de um regime de alimentação que contém D-galactose no meio de alimentação durante o processo de cultura de células num reactor numa escala de de 50 litros para obter um produto de glicoproteina, nomeadamente a proteína de fusão CTLA4lg. Como se pode observar na Figura 1, o grau de sialilação aumentou com uma concentração mais alta (12,5g/L) de D-galactose num meio de alimentação num reactor numa escala de 50 litros. Além disso, um subsequente aumento da concentração de D-galactose no meio de alimentação para -23- 20,0 g/L não tem nenhum efeito positivo na sialilação das proteínas. A Figura 2 representa o impacto da D-galactose na titulação do produto num período total de cultura de células de 21 dias num reactor numa escala de 50 litros, sendo utilizados os métodos de cultivo e de alimentação da presente invenção. Como se pode observar na Figura 2, não se verificou que o aumento da titulação (isto é, a produtividade específica de uma célula) fosse significativamente afectado pela adição de D-galactose. A Figura 3 apresenta a concentração residual de D-galactose da cultura de células da invenção, como uma concentração de 12,5 g/L de D-galactose no meio de alimentação, o que se verificou ser óptimo em reactores numa escala 50 litros e de 5000 litros. Durante a fase de produção, quando a titulação é aumentada (isto é, dias 6-21), a concentração residual de D-galactose na cultura foi preferencialmente A 0,25 g/L. A Figura 4 representa o efeito de escala observado durante o aumento do processo de cultura de células numa escala de 5000 litros para a produção de CTLA4Ig.

Verificou-se que sialilação da glicoproteína diminui com o aumento da escala do reactor. A Figura 5 representa a inversão do efeito de escala após a adição de 1215g/L de D-galactose no meio de alimentação com uma alimentação diária. A técnica de alimentação de D-galactose permite a produção de grandes quantidades de CTLA4Ig em reactores de produção em grande escala. A Figura 6 mostra o impacto de perfis distintos de alteração de temperatura sobre a viabilidade celular para -24- células cultivadas num reactor numa escala de 5 litros (5L) . Estes resultados foram obtidos a partir das experiências aqui descritas no Exemplo 5. Efectua-se uma comparação entre métodos de cultivo que não envolvem nenhuma alteração de temperatura ("sem Alt-T"), que envolvem apenas uma mudança de temperatura ("uma só Alt-T") e que envolvem duas descidas de temperatura ("duas Alt-T"). A Figura 7 mostra o impacto de diferentes perfis de alteração de temperatura sobre a viabilidade celular para células cultivadas n um reactor numa escala de 50 litros (50 L) . Estes resultados foram obtidos a partir das experiências aqui descritas no Exemplo 5. Efectua-se uma comparação entre os métodos de cultivo que envolvem três reduções de temperatura ("três Alt-T") e os métodos que envolvem duas descidas de temperatura ("duas Alt-T"). A Figura 8 representa uma sequência nucleotidica e uma sequência de aminoácidos codificada de CTLA4Ig que tem um péptido sinal, uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem do domínio extracelular de CTLA4lg que começa na metionina na posição +1 para o ácido aspártico na posição +124, ou que começa na alanina na posição -1 para o ácido aspártico na posição +124, e uma região Ig. A Figura 9 representa uma sequência nucleotidica e uma sequência de aminoácidos codificada de uma molécula mutante CTLA4 (L104EA29YIg) que tem um péptido sinal, um domínio extracelular mutado de CTLA4 que começa na metionina na posição +1 e termina num ácido aspártico na posição +124, ou que começa na alanina na posição -1 e termina no ácido aspártico na posição +124, e uma região Ig. A Figura 10 representa uma sequência de ácido nucleico e uma sequência completa de aminoácidos codificada de um -25- receptor humano de CTLA4 (referida aqui como CTLA4 de tipo selvagem) fundidos ao péptido sinal de oncostatina M (posição -26 a -2). (Patentes de invenção n.° 5434131 e 5844095) . A Figura 11 mostra o impacto da adição retardada de sulfato de dextrano sobre a densidade das células viáveis, sobre a densidade das células totais e sobre a viabilidade numa cultura na qual o sulfato de dextrano foi adicionado no final da fase inicial de crescimento. Estes resultados foram obtidos através das experiências descritas, aqui, no Exemplo 8. Efectua-se uma comparação entre culturas nas quais o sulfato de dextrano foi adicionado no final da fase inicial de crescimento e culturas nas quais não foi adicionado sulfato de dextrano. Os valores médios são representados graficamente; as barras de erros representam um desvio-padrão. A Figura 12 mostra o impacto da adição retardada de sulfato de dextrano sobre a taxa de morte celular. Trata-se de uma representação logarítmica das densidades das células viáveis. Estes resultados foram obtidos a partir das experiências aqui descritas no Exemplo 8. Efectua-se uma comparação entre culturas nas quais foi adicionado sulfato de dextrano no final da fase inicial de crescimento, e culturas nas quais não foi adicionado sulfato de dextrano. Os valores médios são representados graficamente. As barras de erro representam um desvio padrão. A Figura 13 mostra o impacto da adição retardada de sulfato de dextrano sobre a densidade das células viáveis, sobre a densidade das células totais e sobre a viabilidade numa cultura na qual foi adicionado sulfato de dextrano durante a fase inicial de crescimento. Estes resultados -26- foram obtidos a partir das experiências aqui descritas no Exemplo 9. Efectua-se uma comparação entre uma cultura na qual foi adicionado sulfato de dextrano durante a fase inicial de morte celular e uma cultura na qual não foi adicionado sulfato de dextrano. A Figura 14 mostra o impacto da adição retardada de sulfato de dextrano sobre a densidade de células viáveis, sobre a densidade das células totais e sobre a viabilidade numa cultura na qual foi adicionado sulfato de dextrano durante a fase inicial de morte celular. Estes resultados foram obtidos a partir das experiências aqui descritas no Exemplo 10. Efectua-se uma comparação entre uma cultura na qual foi adicionado sulfato de dextrano durante a fase inicial de morte celular e uma cultura na qual não foi adicionado sulfato de dextrano. A Figura 15 mostra a densidade de células viáveis, a densidade das células totais e a viabilidade em culturas nas quais foi adicionado sulfato de dextrano no dia 0 da cultura. Estes resultados foram obtidos através de experiências aqui descritas no Exemplo 11. A Figura 16 mostra a densidade de células viáveis e a viabilidade em culturas nas quais foi adicionado sulfato de dextrano em três momentos distintos (dia 3, dia 4 e dia 5) da fase inicial de crescimento. Estes resultados foram obtidos a partir das experiências descritas, aqui, no Exemplo 12. A Figura 17 mostra o impacto de diferentes perfis de alterações de temperatura sobre a densidade de células viáveis. Estes resultados foram obtidos a partir das experiências aqui descritas no Exemplo 13. Efectua-se uma comparação entre os métodos de cultivo que não envolvem -27- nenhuma alteração de temperatura ("sem Alt-T"), que envolvem uma única alteração de temperatura ("uma Alt-T") e que envolvem duas descidas de temperatura ("duas Alt-T"). A Figura 18 mostra o impacto de diferentes perfis de alterações de temperatura sobre a viabilidade. Estes resultados foram obtidos a partir das experiências aqui descritas no Exemplo 13. Efectua-se uma comparação entre os métodos de cultivo que não envolvem nenhuma alteração de temperatura ("sem Alt-T"), que envolvem uma única alteração de temperatura ("uma Alt-T") e que envolvem duas descidas de temperatura ("duas Alt-T"). A Figura 19 mostra o impacto de diferentes perfis de alterações de temperatura sobre a titulação. Estes resultados foram obtidos através das experiências aqui descritas no Exemplo 13. Efectua-se uma comparação entre métodos de cultivo que não envolvem nenhuma alteração de temperatura ("sem Alt-T"), que envolvem uma única alteração de temperatura ("uma Alt-T") e que envolvem duas descidas de temperatura ("duas Alt-T").

Descrição minuciosa da invenção A presente invenção descreve novos processos para a produção de uma molécula solúvel CTLA4 na cultura de células CHO. 0 cultivo de células realizado em conformidade com esta invenção atinge uma melhoria e o aumento do teor de ácido siálico da glicoproteina produzida pelas células cultivadas, proporcionando assim um produto de proteína de alta qualidade no final do período de execução do cultivo. -28-

Processos de cultivo que incluem uma alimentação com D-galactose

Esta invenção diz respeito a um processo (método) melhorado para a preparação de glicoproteínas, em particular glicoproteínas recombinantes, através de culturas de células de mamíferos, nas quais o teor de ácido siálico da glicoproteína produzida é aumentado pelo uso de uma estratégia de alimentação recentemente descrita na qual a D-galactose é alimentada nas culturas, de preferência num meio de alimentação. A D-galactose é fornecida às culturas de células pelo que a D-galactose está presente nas culturas numa quantidade eficaz para atingir e manter uma elevada sialilação da proteína produzida até ao final do período de execução do cultivo. Como é aqui descrito, uma variedade de regimes de alimentação é abrangida pela presente invenção de modo a resultar na presença de D-galactose residual na cultura durante a duração do período de execução do cultivo.

De acordo com esta invenção, a adição de D-galactose à estrutura de glicoproteínas de uma proteína produzida foi identificada como sendo uma etapa de limitação da sialilação do produto. Verificou-se que a presença de uma quantidade efectiva de D-galactose no meio de alimentação para lá do curso do processo de cultivo resulta no aumento do teor de D-galactose do produto. 0 que, por sua vez, resultou na adição de mais fracções de ácido siálico quanto à estrutura de glicoproteínas da proteína, o que, por conseguinte, aumentou a qualidade do produto. Para manter e/ou sustentar o grau elevado de sialilação do produto, é preferível manter a estratégia de alimentação de D-galactose durante todo o período de execução da cultura. Os -29- processos e métodos da presente invenção adequam-se a culturas de células numa pequena escala (por exemplo, de 50 litros a 100 litros) e numa grande escala (por exemplo, 500 litros ou mais). Além disso, os métodos da presente invenção adequam-se, em particular, às células em crescimento e mantidas como culturas em "fed-batch", em pequena e grande escalas, como é descrito mais adiante. Além disso, uma variedade de meios de cultura, como são conhecidos na arte, pode ser utilizada nos métodos de cultivo desta invenção. Os meios de cultivo adequados são descritos mais adiante.

Uma vantagem da presente invenção é que os custos de produção de proteínas são reduzidos pelo aumento geral da qualidade (por exemplo, em conformidade com a medição do teor de ácido siálico) do produto final como é alcançado através dos métodos de cultivo aqui descritos. Numa variante preferencial, um elevado teor de ácido siálico do produto foi mantido durante todo o período de cultura quando foi incluída D-galactose no meio de alimentação fornecido à cultura de células, de preferência diariamente. (Ver, por exemplo, os Exemplos 1 e 2). O que é interessante é que uma interrupção ou descontinuação da alimentação de D-galactose no 10° dia do período de execução da cultura levou à inversão da elevada qualidade do produto e à formação de espécies inferiores de proteínas sialiladas. (Exemplo 2). Além disso, a adição de D-galactose às culturas de células, de preferência culturas em grande escala, que produzem uma dada proteína, por exemplo a CTLA4Ig, através do meio e alimentação, foi capaz de reverter um efeito de escala prejudicial observado (por exemplo, o aumento do tamanho do reactor) quanto à -30- qualidade do produto. A reversão do efeito de escala foi mais significativa quando a galactose esteva presente no meio de alimentação diário das culturas. Na ausência da adição de D-galactose quanto ao meio de alimentação, o grau de sialilação da glicoproteina diminuiu com o aumento da escala do reactor.

Por conseguinte, uma variante preferencial da invenção inclui a manutenção da estratégia de alimentação de D-galactose durante todo o período de execução da produção, de preferência com uma alimentação diária, para permitir a produção de uma grande quantidade de glicoproteínas altamente sialiladas independentemente da escala do reactor. Proporcionar uma alimentação contendo D-galactose, de preferência um meio de alimentação que inclui D-galactose, a um nível efectivo de sialilação durante todo o processo de cultura de células suscita, vantajosamente, uma inversão dos efeitos do aumento da escala e previne uma diminuição da sialilação de proteínas e a formação de espécies inferiores de produto de glicoproteina sialilada. Por exemplo, durante o aumento de escala dos processos de cultura de células em vários milhares de litros do volume do reactor, é possível observar que a qualidade do produto, até certo ponto determinada pelo grau de sialilação da glicoproteina, diminui com o aumento da escala do reactor. Esta observação pode dever-se a um nível de pressão mais alto experimentado pela cultura a uma escala maior, o que tem impacto sobre o metabolismo da D-galactose da célula. Como é aqui exemplificado, a adição de D-galactose à cultura através de um meio de alimentação mais do que uma vez durante o período de execução da cultura (por exemplo, diariamente) foi capaz de reverter ou de anular tal efeito -31- nocivo do aumento da escala e de possibilitar a produção de glicoproteina de alta qualidade e características de sialilação, independentemente do tamanho do reactor utilizado. Assim, a presença de um nível constante de D-galactose numa alimentação, de preferência num meio de alimentação, é particularmente vantajosa para culturas de células em grande escala que tenham efeitos de escala mais marcados.

Uma concentração efectiva de D-galactose enquanto componente numa alimentação, de preferência no meio de alimentação da cultura de células, melhora, aumenta, mantém e/ou sustenta um elevado teor de ácido siálico do produto durante o período da produção. A quantidade de D-galactose adequada a ser usada no meio de alimentação pode ser determinada pelo profissional competente com base no tamanho do reactor e no volume da cultura. Os métodos da presente invenção são adequados para todas as escalas de reactor nos quais a produção de proteínas ocorre, incluindo mas não se limitando a uma pequena e grande escala de produção, e a uma escala do reactor, por exemplo culturas em grande escala ou culturas à escala comercial, por exemplo, superiores a 50 litros, de preferência superiores a 500 litros. Por exemplo, os métodos de alimentação de galactose são aplicáveis a culturas à escala de produção, que tenham, por exemplo, um volume de cerca de 50 litros (50 L) ou menos, bem como a culturas à escala de um reactor, as quais podem ter um volume de várias centenas ou vários milhares de litros.

De acordo com os métodos desta invenção, a concentração de galactose no meio de alimentação é preferencialmente distribuída numa quantidade que proporciona um nível -32- sustentado ou mantido de D-galactose na cultura, ou no reactor, durante o processo de cultivo. Uma quantidade de D-galactose adequada a ser utilizada no meio de alimentação inclui desde cerca de 1 g/L a cerca de 50 g/L, de preferência cerca de 3 g/1 a cerca de 25 g/L, e ainda mais preferencialmente cerca de 3 g/L a cerca de 20 g/L. A titulo de exemplo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, 12,5 g/L de D-galactose no meio de alimentação é a quantidade adequada a ser utilizada no método de cultivo da invenção, em particular, por exemplo, para uma escala de reactor de 50 litros. Para além disso, é preferível que a concentração residual de galactose no meio de cultura utilizado para o cultivo de células (por exemplo, num reactor ou num recipiente de cultivo) seja mantida e sustentada durante o período de execução do cultivo numa quantidade de cerca de 0,1-10 g/L, preferencialmente, cerca de 0,1-5 g/L, mais preferencialmente, cerca de 0,2-5 g/L, mais preferencialmente, cerca de 0,2-2,5 g/L, ainda mais preferencialmente, cerca de 0,5-2 g/L, e o mais preferencialmente cerca de 0,5-1,0 g/L. Estas concentrações residuais de galactose no meio de cultura aplicam-se quer a galactose seja alimentada através de um meio de alimentação, quer de outra forma.

As culturas de células são alimentadas com um meio de alimentação que contém D-galactose, utilizando-se, para esse efeito, diversos planos ou regimes de alimentação para distribuir ou manter a D-galactose nas culturas, em quantidades que sustêm uma concentração efectiva de D-galactose na sialilação e melhora e aumenta a sialilação da glicoproteina. Em geral, os métodos de cultivo da presente invenção incluem a alimentação de culturas de células com -33- D-galactose no meio de alimentação mais do que uma vez durante o período de execução da cultura. É necessário entender que o volume da cultura, para o qual contribuiu o meio de alimentação no final do período de execução de uma cultura, inclui aproximativamente 30-60% do volume original da cultura.

As culturas de células podem ser alimentadas diariamente com D-galactose, ou segundo outra periodicidade, por exemplo menos do que uma vez por dia, e a intervalos diferentes, de preferência a intervalos programados, incluindo dia sim dia não, de três em três dias, de quatro em quatro dias, e afins. Por exemplo, a alimentação das culturas de células com D-galactose, de preferência com um meio de alimentação que contém D-galactose, pode ser efectuada uma vez por dia, mais do que uma vez por dia, ou menos do que uma vez por dia, e pode ocorrer uma vez, duas vezes ou mais do que duas vezes, por exemplo três, quatro, cinco ou mais vezes, durante o período total de execução da cultura. Numa variante, as células são alimentadas com D-galactose mais do que uma vez.

Esta invenção inclui igualmente uma planificação da alimentação contínua, envolvendo, por exemplo, uma infusão contínua de D-galactose, preferencialmente um meio de alimentação contendo D-galactose. Em tal regime de alimentação contínua, as culturas recebem D-galactose, de preferência num meio de alimentação, por exemplo como um "gotejamento" distribuído continuamente, ou infusão, ou outra adição automatizada à cultura, de forma temporizada, regulada e/ou programada de forma a atingir e manter a quantidade adequada de galactose na cultura. O regime de -34- alimentação preferencial inclui uma alimentação uma vez por dia através de um bólus com D-galactose, de preferência com um meio de alimentação que contém D-galactose em cada dia do periodo de execução da cultura, desde o inicio desse periodo de execução da cultura até ao dia da colheita das células.

Em conformidade com a invenção, a D-galactose pode ser alimentada à cultura de células em qualquer um dos intervalos supramencionados e isso de uma maneira diferente do meio de alimentação. A titulo de exemplo não restritivo, a D-galactose pode ser alimentada num meio ou num meio de cultura diferente do meio de alimentação, ou a D-galactose pode ser alimentada à cultura em água. A título de exemplo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a cultura pode ser alimentada com D-galactose e também pode sê-lo com um meio de alimentação, ou seja, pode haver mais do que uma composição a ser alimentada.

Como é aqui utilizado, o termo "alimento" refere-se a qualquer uma das substâncias elaboradas para uma cultura após inoculação.

Como é aqui utilizado, o termo "inoculação" refere-se à adição de células a um meio inicial para dar início à cultura.

Conforme aqui utilizadas, as expressões "meio de alimento" e "meio de alimentação" referem-se a um meio que contém um ou mais nutrientes que são adicionados à cultura que se inicia em algum momento após a inoculação.

Como é a aqui utilizada, a expressão "meio basal" refere-se ao meio inicial ao qual as células são adicionadas para dar início à cultura. -35-

Noutras duas das suas variantes, a presente invenção abrange um método de cultura de células ou um processo de aumento da sialilação de um produto de glicoproteína produzido pela cultura de células, incluído a adição de galactose, por exemplo a D-galactose, ao meio de cultivo. Uma variante relacionada abrange um método de cultura de células no qual a D-galactose é distribuída na cultura durante a duração do período de execução da produção, e, de preferência, está presenta no meio de alimentação. Uma variante preferencial remete para os processos de células de cultivo que abrangem uma alimentação diária da cultura com um meio que contém D-galactose. 0 prazo de utilização da galactose para as células a serem cultivadas, como é distribuída por este método, de preferência distribuída mais do que uma vez durante o período de execução da cultura, mais preferencialmente diariamente, leva a melhor sobre o potencial para uma quantidade restritiva de galactose na cultura, permitindo, por conseguinte, a formação de glicoproteína com amplas porções de ácido siálico adicionadas à estrutura, aumentando, assim, a sialilação do produto final e a reversão do problema de efeito de aumento da escala acima mencionada.

De acordo com esta invenção, verifica-se um aumento da sialilação da proteína de cerca de 1,2 a 1,5 vezes, em média, quando as culturas são alimentadas com D-galactose durante o período de execução da cultura, comparativamente com culturas de células em que não se verifica a alimentação de D-galactose ou com culturas nas quais a alimentação com D-galactose é descontínua ou interrompida antes do final do período de execução da cultura. -36-

Numa variante preferencial que envolve a cultura de células que produzem moléculas de glicoproteínas CTLA4 solúveis, tais como a CTLA4lg, e moléculas mutantes CTLA4 solúveis, tais como a Ll04EA29YIg, como descrito mais adiante, uma concentração efectiva de D-galactose para manter um alto teor de ácido siálico do produto durante o periodo de execução da produção esteve presente no meio de alimentação e foi alimentada diariamente à cultura de células. (Exemplo 2). Para ilustrar isso, uma quantidade efectiva de D-galactose no meio de alimentação é constituída por cerca de 1 g/L a cerca de 50 g/L, preferencialmente cerca de 3 g/L a cerca de 25 g/L, mais preferencialmente cerca de 3 g/L a cerca de 20 g/L. Uma quantidade de 12,5 g/L de D-galactose no meio de alimentação é particularmente apropriada para uma utilização em culturas em grande escala (por exemplo, 50 litros) em conformidade com o método da invenção. A adição de D-galactose à estrutura de glicoproteínas CTLA4lg foi determinada pela etapa restritiva do grau de sialilação do produto. Uma interrupção ou a descontinuidade do alimento de D-galactose leva à inversão e à formação de um produto de glicoproteina CTLA4Ig com uma sialilação inferior. Por conseguinte, a inclusão de D-galactose no meio de alimentação diário foi preferencialmente mantida durante o período de execução da produção e sustenta um produto totalmente sialilado de alta qualidade.

Verificou-se que a adição diária de D-galactose no meio de alimentação para culturas em larga escala que produzem CTLA4Ig atinge uma inversão do efeito prejudicial do aumento de escala que se verificou quanto à qualidade do produto final. Mais especificamente, na ausência de D- -37- galactose no meio de alimentação, o grau de sialilação da glicoproteina CTLA4ig diminuiu com o aumento da escala do reactor. A adição diária de D-galactose a culturas a grande escala que produzam CTLA4Ig permitiu a produção de grandes quantidades de glicoproteinas altamente sialiladas, independentemente da escala do reactor. Métodos de cultivo incluindo uma alimentação com galactose em combinação com alterações de temperatura durante o período de execução da cultura

Outras variantes desta invenção dizem respeito aos processos de cultivo de células, que envolvem duas ou mais alterações de temperatura, que atingem um aumento da viabilidade celular e que podem resultar no alargamento das fases de produção para o produto e no aumento do produto, bem como numa elevada qualidade do produto como é avaliado pelo teor de ácido siálico. Os processos de cultivo de células e os métodos que envolvem duas ou mais alterações de temperatura são divulgados nos pedidos de patente de invenção norte-americana n.° 60/436101, registado no dia 23 de Dezembro de 2002, e da patente norte-americana n.° 10/, registada, concomitantemente, em anexo, cujos conteúdos são aqui incluídos como referência e são descritos mais adiante. Tais métodos de cultivo com alteração de temperatura podem ser utilizados, sem qualquer inconveniente, em combinação com processos de alimentação com galactose, como são aqui descritos, de modo a resultarem em elevados níveis de qualidade e quantidade do produto final. -38-

Em conformidade com os métodos de cultivo com alteração de temperatura, a combinação de duas ou mais alterações de temperatura, preferencialmente descidas de temperatura, durante o período de cultivo de células, pode possibilitar uma elevada quantidade e qualidade do produto de proteína a ser produzido pelas células no final do período de cultivo, comparativamente com métodos de cultivo que não incluem nenhuma alteração de temperatura, ou que incluem apenas uma alteração de temperatura. A título ilustrativo, conforme ilustrado no Exemplo 5, demonstrou-se que um processo de cultivo com duas ou três alterações de temperatura produz um aumento da quantidade de proteína (por exemplo, titulação final) comparativamente com um processo em que não se verifica nenhuma alteração de temperatura ou no qual se verifica apenas uma mudança de temperatura, independentemente da duração do período de execução da cultura.

Em variantes adicionais da presente invenção, são utilizadas alterações multi-etapas e reguladas da temperatura no cultivo de células de mamíferos para produzir um produto de proteína pretendido, em particular um produto de glicoproteína. Mais preferencialmente, as células produzem uma proteína recombinante, um polipéptido ou um produto de péptido. No entanto, nalguns casos, as células podem produzir, activamente, ou produzir em quantidade excessiva, um produto endógeno ou natural que pode ser colhido ou recuperado a seguir à consecução da presente invenção. Como é aqui descrito, duas ou mais alterações de temperatura, preferencialmente descidas de temperatura controladas, levadas a cabo em intervalos de tempo apropriados durante o período de cultivo, podem ser -39- usadas nos processos desta invenção de modo a atingir uma elevada produção de proteínas com um elevado teor concomitante de ácido siálico.

Segundo os métodos e processos de cultivo de células desta invenção (também referenciados por execução da produção ou execução de fermentação), as células cultivas em conjunção com duas ou mais alterações de temperatura durante o período de execução do cultivo podem produzir uma elevada quantidade de produto, de alta qualidade, durante a execução, conforme é avaliado pela titulação final e pelo teor de ácido siálico no final da execução. A quantidade e qualidade elevadas da produção de proteínas, associada aos métodos desta invenção, são obtidas em relação a métodos nos quais não se verifica nenhuma alteração de temperatura, ou, quando muito, apenas uma alteração de temperatura, independentemente do facto do período de execução da cultura ser posto em prática durante um tempo de execução total de 10-14 dias ou superior a 14 dias. Além disso, em consequência às duas ou mais alterações de temperatura durante o processo de cultivo, as células podem ser mantidas em cultura por um período de tempo que alarga essencialmente a fase de produção padrão ou inicial. Geralmente, uma fase de produção padrão ou inicial tem uma duração de 6 a 14 dias. Durante o alargamento da fase de produção dos presentes métodos de cultivo que envolvem duas ou mais alterações de temperatura, é alcançado um aumento da produção de uma proteína de alta qualidade.

Ainda em conformidade com os presentes métodos de cultivo, as células podem ser cultivadas durante um período de execução total superior a cerca de 10 dias, superior a cerca de 14 dias, superior a cerca de 21 dias ou superior a -40- cerca de 28 dias, preferencialmente um periodo de execução de cerca de 14 a 30 dias, ou mais. Por exemplo, num período de execução de cultura próprio desta invenção, que abrange duas ou mais alterações de temperatura, a duração de toda a execução pode ser tão breve como logo após a segunda (ou última) alteração de temperatura (por exemplo, cerca de 14 dias) ou tão longa como cerca de 21 a 30 dias ou mais, preferencialmente cerca de 28 dias ou mais.

Numa variante da presente invenção, o alargamento da fase de produção está associado a múltiplas alterações de temperaturas que abrangem os métodos de cultivo de células desta invenção. De acordo com os novos métodos de cultura de células desta invenção, a combinação de uma segunda, terceira ou subsequente alteração de temperatura não só possibilita que as culturas de células produzam uma elevada quantidade e qualidade do produto durante toda a duração do período de execução da cultura, mas também que a cultura sustenha uma elevada viabilidade celular durante todo o período de execução e/ou durante toda a fase alargada de produção até ao final do período de execução da cultura. Durante o período de execução da cultura, incluindo a fase alargada de produção, a titulação do produto de proteína é aumentada e a qualidade do produto, caracterizado pelo teor de ácido siálico, permanece elevada.

Mais particularmente, numa das suas variantes específicas, a presente invenção abrange métodos de cultura de células que alargam a fase de produção inicial da produção de proteína pelas células cultivadas (isto é, a fase de produção padrão que abarca cerca de 6-14 dias é alargada). Ao recorrer a duas ou mais alterações de temperatura no período de execução da cultura, segundo esta -41 - invenção, alcança-se um alargamento da fase de produção que passa a ter cerca de 14-21 dias. Com três (ou mais) alterações de temperatura durante o período de execução da cultura, este é alargado, passando a ter cerca de 21-28 ou 30 dias, ou mais, com, concomitantemente, produções mais elevadas de produto de proteína de elevada qualidade (por exemplo, alto teor de ácido siálico), (por exemplo, Exemplo 5) .

Assim, a presente invenção combina vantajosamente os métodos de cultura de células com duas ou mais alterações de temperatura, segundo esta invenção, com a inclusão de um regime de alimentação que inclui a adição de D-galactose ao meio de alimentação. Ao incluir a D-galactose como constituinte no meio de alimentação, verificou-se um significativo aumento da sialilação do produto durante todo o processo de cultura de células e foram produzidos níveis elevados de proteína sialilada no final do período de execução do cultivo.

Numa vertente específica desta invenção, o processo de cultivo de células (ou fermentação) inclui uma descida de temperatura em duas etapas, na qual as células são mantidas a três temperaturas distintas durante todo o período de execução do cultivo. Nesta vertente, o período total de cultivo de células tem uma duração superior a cerca de 10 dias, mais especificamente cerca de 14 a 28 dias ou mais, ou seja, cerca de duas a três semanas, ou mais, antes da obtenção do produto final de proteína (e da medição do teor de ácido siálico). Por exemplo, neste tipo de método em duas etapas, as células são mantidas numa primeira temperatura correspondente a cerca de 36°C a 38°C, preferencialmente 37°C, ou próxima dos 37°C, durante um -42- período de cultivo inicial a decorrer do dia 0 até, sensivelmente, o 6° dia. Subsequentemente, do dia 5, sensivelmente, ao dia 7, preferencialmente do dia 6 ao dia 10, sensivelmente, cultura é mantida a uma segunda temperatura correspondente a cerca de 33°C a 35°C, preferencialmente 34°C, ou próxima dos 34°C. A seguir à cultura das células a uma temperatura de 34°C ou próxima dos 34°C, a temperatura é alterada uma segunda vez (mudança de temperatura secundária) para uma terceira temperatura de cerca de 31°C a 33°C, preferencialmente, 32°C, ou próxima dos 32°C. A mudança de temperatura secundária ocorre no 6° dia, ou por volta do 6o dia, até ao 14° dia, preferencialmente do 10° dia, sensivelmente, ao 14° dia, sensivelmente, mais preferencialmente no 10° dia, ou por volta do 10° dia, o que, em várias vertentes, pode ser durante a fase padrão de produção, durante a fase de crescimento ou durante a fase de morte celular.

Preferencialmente, há, aproximativamente, um incremento de quatro dias entre a primeira e a segunda alteração de temperatura, mais preferencialmente incrementos de quatro dias. As células são mantidas a uma temperatura de 32°C, ou próxima dos 32 °C, até ao final de todo o periodo de execução da cultura, por exemplo, por um periodo de tempo superior a cerca de 10 dias, mais especificamente, até cerca de 12-18 dias, ou até cerca de 14-18 dias, ou até cerca de 14-28 dias ou 30 dias, ou mais. No final do processo de cultivo, o produto de proteína é geralmente isolado e/ou purificado, a partir do material flutuante da cultura, se o produto for segregado para o meio de cultura.

Em alternativa, nos métodos de cultivo, desta invenção, com múltiplas alterações de temperatura, a temperatura pode -43- ser, em primeiro lugar, reduzida com base na fase de cultura. A primeira alteração de temperatura ocorre, preferencialmente, no início da fase de morte celular. Numa vertente, a temperatura é, em primeiro lugar, reduzida em simultâneo com o abrandamento do crescimento das células. Por exemplo, a temperatura é alterada, passando de 37°C, ou cerca de 37°C, a 34°C, ou cerca de 34°C, quando as células já não se encontram na sua fase exponencial de crescimento e quando a cultura se encontra na fase estacionária, por exemplo, no 6o dia, ou por volta do 6o dia, da cultura. Nesse momento, a concentração de células viáveis atingiu uma densidade adequada de células para a produção de proteína, preferencialmente a produção melhorada de proteína, por exemplo, cerca de 2-12 x 106 célula/ml, tal como 2-9 x 106 células/ml, 3-7 x 106 células/ml, 4-5 X 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x 106 células/ml, 4-6 x 106 células/ml, 6-8 x 106 células/ml, 8-10 x 106 células/ml ou 10-12 x 106 células/ml. Sem querer estar sujeito à teoria, é possível que abrandamento do crescimento das células esta correlacionado com a depleção de nutrientes e/ou componentes particulares do meio de cultura de células, por exemplo, limitação de nitrogénio no meio.

Noutra vertente, a primeira alteração de temperatura ocorre durante a fase de crescimento, por exemplo quando a concentração de células viáveis é de cerca de 2-12 x 106 células/ml, tais como 2-9 x 106 células/ml, 3-7 x 10ê células/ml, 4-5 χ 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x 106 células/ml, 4-6 χ 106 células/ml, 6-8 χ 106 células/ml, 8-10 χ 106 células/ml ou 10-12 χ 106 células/ml. -44-

Noutra vertente específica que abrange um processo de cultivo com alteração de temperatura em duas etapas, as células são cultivadas durante um período de execução de 14 dias durante o qual as temperaturas da cultura são mantidas a 37°C, ou por volta dos 37°C, do dia 0 ao dia 6. Do dia 6, sensivelmente, ao dia 10, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 34°C ou por volta dos 34°C, e do dia 10, sensivelmente, ao dia 14, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 32°C ou por volta dos 32°C. Como outra vertente, as células são cultivadas durante um período de cerca de 21 dias, durante o qual a temperatura da cultura é mantida nos 37°C, ou por volta dos 3°C, do dia 0 ao dia 6; do dia 6, sensivelmente, ao dia 10, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 34°C, ou por volta dos 34°C; e do dia 10, sensivelmente, ao dia 21, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 32°C ou por volta dos 32°C. Como outra vertente ainda, as células são cultivadas durante um período de cerca de 28 dias, durante o qual a temperatura da cultura é mantida nos 37°C, ou por volta dos 37°C, do dia 0 ao dia 6, sensivelmente; do dia 6, sensivelmente, ao dia 10, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 34°C, ou por volta dos 34°C; e do dia 10, sensivelmente, ao dia 28, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 32°C ou por volta dos 32°C. A presente invenção também abrange vertentes nas quais os métodos de cultivo de células incluem métodos de cultivo de células que englobe três ou mais alterações de temperaturas. Numa vertente que inclui um processo de cultivo com alterações de temperatura em três etapas, as células são inicialmente cultivas a uma primeira -45- temperatura de cerca de 36°C a 38°C, preferencialmente a 37°C ou por volta dos 37°C durante cerca de 6 dias; subsequentemente, a temperatura da cultura é alterada e mantida a cerca de 33° até 35°C, preferencialmente, a 34°C, ou por volta dos 34 °C, para um determinado período de tempo; uma segunda alteração de temperatura para cerca de 31°C a 33°C, preferencialmente, para 32°C, ou por volta dos 32°C, ocorre subsequentemente. Uma terceira alteração da temperatura para uma temperatura igual a 29°C até 31°C, preferencialmente, a 30°C, ou por volta dos 30°C, segue-se ao período de cultivo a 32°C ou por volta dos 32°C; em seguida, a temperatura é mantida nos 30°C, ou por volta dos 30°C, até ao final do período de execução.

Noutras vertentes, subsequentes alterações de temperatura, preferencialmente descidas de temperatura, podem ser efectuadas após a terceira alteração de temperatura do método de cultura. Por exemplo, uma quarta alteração de temperatura pode verificar-se após a terceira alteração no dia ou por volta do dia 15-20, preferencialmente no dia ou por volta do dia 19 a partir do início da cultura. A quarta descida de temperatura mantém a temperatura da cultura nos 28°C, ou por volta dos 28°C, até aos 29°C, preferencialmente nos 29°C, e aumenta o período de execução da cultura que passa a ultrapassar os 28 dias, sensivelmente, por exemplo, cerca de 28-32 dias ou mais, altura em que o produto é obtido.

Como no procedimento da execução da cultura com alteração da temperatura em duas etapas, segundo esta invenção, a primeira alteração de temperatura nos processos com múltiplas alterações de temperatura da presente invenção pode ocorrer quando as células tiverem -46- essencialmente interrompido o seu crescimento e se tiverem tornado ou estiverem praticamente estacionárias. Por exemplo, a alteração de temperatura é efectuada quando a concentração de células viáveis é igual a cerca de 2-12 x 106 células/ml, tais como 2-9 x 106 células/ml, 3-7 x 106 células/ml, 4-5 x 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x IO6 células/ml, 4-6 x IO6 células/ml, 6-8 x 106 células/ml, 8-10 x 106 células/ml ou 10-12 x 106 células/ml. Em alternativa, a primeira alteração de temperatura ocorre durante a fase de crescimento, por exemplo quando a concentração de células viáveis corresponde a cerca de 2-12 x 106 células/ml, tais como 2-9 x 106 células/ml, 3-7 x 106 células/ml, 4-5 x 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x 106 células/ml, 4-6 x 106 células/ml, 6-8 x 106 células/ml, 8-10 x 106 células/ml ou 10-12 x 106 células/ml.

Numa vertente preferencial, o processo multi-etapas de cultivo de células inclui três alterações controladas e reguladas da temperatura durante um período de cultivo de cerca de três a quatro semanas, por exemplo, 21-30 dias ou mais, preferencialmente, 28 dias ou mais, proporcionando um alargamento da produção do produto pelas células em cultivo. Para exemplificar, o processo de alteração de temperatura em três etapas inclui um período inicial de cultivo que vai do dia 0 até ao dia 6, sensivelmente, durante o qual as células são cultivadas a uma temperatura de 37°C, ou próxima dos 37°C. Do dia 6, sensivelmente, ao dia 10, sensivelmente, as células são cultivadas a 34°C, ou por volta dos 34°C. Do dia 10, sensivelmente, ao dia 14, sensivelmente, a temperatura da cultura é mantida nos 32°C, ou por volta dos 32°C, e a partir do dia 14, sensivelmente, -47- em diante, ou seja, do dia 21, sensivelmente, ao dia 30 ou mais, ou até ao final da execução, a temperatura da cultura é mantida nos 30°C, ou por volta dos 30°C. Por conseguinte, no processo de cultura, desta invenção, com alteração de temperatura em três etapas, a fase de produção pode também ser alargada para produzir uma titulação final superior e uma viabilidade celular superior para um período de tempo superior a 14 dias, sensivelmente, em contraste com a fase padrão de produção de cerca de 6 a 14 dias com apenas uma ou sem nenhuma alteração de temperatura. Vantajosamente, a fase de produção e a viabilidade celular podem ser subsequentemente alargadas pelo método de mudança de temperatura em três etapas, ou seja, para cerca de três semanas ou mais, com uma subsequente alta qualidade do produto, como é avaliada pelo teor de ácido siálico.

Nas várias vertentes da presente invenção, a segunda alteração de temperatura para 32°C, ou por volta dos 32°C, permite uma quantidade e qualidade superiores das proteínas no final do período de execução da cultura, e está também associado a um alargamento da produção de proteínas durante um período de execução cuja duração pode ultrapassar as duas semanas, sensivelmente. As duas ou mais alterações de temperatura permitem que a cultura estabilize um lento decréscimo da viabilidade celular que pode ocorrer, durante as duas semanas anteriores, na cultura. Outra alteração ainda da temperatura, dos 32°C, ou por volta dos 32°C, para os 30°C, ou por volta dos 30°C, regulada em cerca de duas semans, ou aproximadamente, proporciona um subsequente alargamento da fase de produção, prologando, assim, a fase de produção da cultura de células até ao final do período de execução do cultivo, por exemplo, até cerca do dia 21 ao -48- dia 30 ou mais, enquanto mantém a viabilidade celular sem sacrificar a qualidade (determinada pela medição da sialilação) do produto produzido. (Ver Exemplo 5, Tabelas 2 e 3). Alterações adicionais de temperatura podem alargar a produção de células para lá da produção dos periodos de execução com duas ou três alterações de temperatura.

Noutras vertentes, a presente invenção diz respeito (l)ao processo de cultivo de células, (ii) a um método de aumento da produção de proteínas, preferencialmente associado ao aumento da viabilidade celular, (iii) a um método de melhoramento da sialilação de um produto de proteína, (iv) a um método de melhoramento da viabilidade celular ou (v) a um método de alargamento da produção de proteínas, envolvendo duas ou mais alterações de temperatura, incluindo: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse a uma temperatura de, ou próxima de 37°C, sob condições e durante um período de tempo que permitam o crescimento de células; uma descida da temperatura da cultura de células e cultivo de células para uma terceira temperatura igual ou próxima dos 32 °C num momento durante a fase padrão de produção de cerca de 6 dias a 14 dias, por exemplo, em dez dias, ou sensivelmente dez dias, a partir do início da cultura até ao final do período de cultivo. Como já foi aqui referido, o período de cultivo pode incluir um tempo total de execução superior a 10 dias, superior a 14 dias, superior a 21 dias ou superior a 28-30 dias. A seguir à cultura das células a 32°C, ou seja, no final do período de execução da cultura, obtém-se o produto de proteína produzido, preferencialmente uma glicoproteína. -49-

Noutras vertentes, a presente invenção diz respeito (i) a um processo de cultivo de células, (ii) a um método para aumentar a produção de proteínas, preferencialmente associado ao aumento da viabilidade celular, (iii) a um método para melhorar a sialilação do produto de proteína, (iv) a um método para melhorar a viabilidade celular ou a um método para alargar a produção de proteínas, envolvendo duas ou mais alterações de temperatura, incluindo: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse a uma temperatura de, ou próxima de, 37°C, sob condições e durante um período de tempo que permitam o crescimento de células; uma descida da temperatura da cultura de células e o cultivo de células a uma segunda temperatura para ou próxima dos 34 °C, a partir do dia 5, sensivelmente, até ao dia 7; uma nova descida de temperatura da cultura de células e o cultivo das células a uma terceira temperatura igual ou próxima dos 32°C a partir do dia 6, sensivelmente, até ao dia 14, por exemplo, em ou por volta de 10 dias a partir do início da cultura até ao final do período de cultivo. Como já foi aqui referido, o período de cultivo pode abranger uma duração total de execução superior a 10 dias, superior a 14 dias, superior a 21 dias ou superior a 38-30 dias. A seguir à cultura das células aos 32°C, ou seja, no final do período de execução da cultura, obtém-se o produto de proteína produzido, preferencialmente uma glicoproteína.

Noutra das suas vertentes, a presente invenção proporciona métodos de cultura subsequentes que abrangem outra descida de temperatura de 32°C, ou por volta dos 32°C, para 30°C, ou por volta dos 30°C, em 14 dias, ou sensivelmente, desde o início da cultura até ao final do -50- processo de cultivo, alargando, por conseguinte, o período de cultura para lá da fase padrão de produção. Para um alargamento subsequente da produção de proteínas durante o processo de cultura, bem como da viabilidade celular, o método pode incluir uma quarta descida de temperatura dos 30°C, ou sensivelmente, para os 29°C, ou sensivelmente, em cerca de 15 dias, ou sensivelmente, a 19 dias, preferencialmente 18 dias, a partir do início da cultura até ao final do processo de cultivo.

As alterações de temperatura desta invenção ocorrem, geralmente, no dia 6, ou sensivelmente no dia 6, do período de cultura, o que pode ser durante ou após a fase de crescimento da cultura, e, por conseguinte, em incrementos de aproximadamente 4 dias, preferencialmente incrementos de 4 dias. Nalgumas vertentes, a regulação das alterações da temperatura pode aproximar-se do início (por exemplo, no 6o dia, ou por volta do 6o dia), do meio (por exemplo, no 10° dia, ou por volta do 10° dia) e do final (por exemplo, no 14° dia, ou por volta do 14° dia) da fase padrão de produção. Os processos ou métodos de cultivos, segundo esta invenção, nos quais a titulação final e o teor de ácido siálico de uma glicoproteína produzida são melhorados pela utilização de um perfil multi-etapas (por exemplo, duas etapas, três etapas ou mais) de alteração de temperatura, a combinação de pelo menos duas alterações reguladas de temperatura possibilita que toda a execução da cultura seja efectuada por um período de tempo superior a 10 dias, superior a 21 dias ou superior a 28 dias ou mais, sem que a titulação final e a sialilação do produto sejam sacrificadas. -51-

Em conformidade com os processos de cultivo desta invenção, as duas ou mais mudanças de temperatura sustentam a elevada viabilidade celular da cultura e podem possibilitar uma titulação mais elevada e uma qualidade mais elevada da proteína a ser produzida num período de execução de cultura, e isso em comparação com uma execução que ocorre durante o mesmo período de tempo mas que não inclui duas ou mais alterações de temperatura. Além disso, as duas ou mais alterações de temperatura podem permitir que a fase de produção da cultura seja alargada ultrapassando a fase padrão de produção e/ou a produção de uma cultura na qual não se verifica nenhuma alteração de temperatura ou, quando muito, na qual se verifica apenas uma alteração de temperatura. Tais alterações multi-etapas da temperatura, tais como duas alterações de temperatura ou mais etapas, podem minimizar o compromisso prevalecente entre a titulação ("titulação final") e o teor de ácido siálico na produção de um produto de proteína no processo de cultura de células. Assim, as alterações de temperatura proporcionam um efeito positivo sobre o melhoramento do produto matemático de "titulação final x ácido siálico final", o que ultrapassa o processo de produção de proteína. incluindo ainda a alimentação das

Numa vertente particular, a presente invenção diz respeito (i) ao processo de cultivo de células, (ii) a um método de aumento da produção de proteínas ou (iii) a um método de melhoramento da viabilidade celular, em conjunção com um aumento e um melhoramento da sialilação de um dado produto de proteína, a glicoproteína, incluindo duas ou mais etapas de alteração de temperatura, conforme descrito anteriormente, e, -52- células, preferencialmente diariamente com D-galactose, preferencialmente com um meio complementado para conter D-galactose, numa concentração constante que resulta no aumento da sialilação do produto de glicoproteina no final do periodo de execução do cultivo. **um processo de cultura de células para a produção de proteínas, incluindo: células hospedeiras de cultivo que produzem uma proteína de interesse numa cultura de células sob condições que permitam a produção de proteínas; a alimentação das células com D-galactose; e a adição de um composto polianiónico às cultura de células num momento posterior à inoculação. Numa vertente particular, a invenção diz respeito ao processo de cultura de células para a produção de proteínas, incluindo: células hospedeiras de cultivo que produzem uma proteína de interesse na cultura de células sob condições que permitam a produção de proteínas; o cultivo de células hospedeiras a uma temperatura de 37°C, ou próxima dos 37°C, sob condições e durante um período de tempo que permitam o crescimento das células; o cultivo das células a uma segunda temperatura igual ou próxima dos 34°C; o cultivo de células a uma terceira temperatura igual ou próxima dos 32°C; e a alimentação das células com D-galactose.

Vertentes adicionais de acordo com a presente invenção de processos de cultura de células que envolvem duas ou mais alterações de temperatura

Numa vertente desta invenção, é abrangido um processo de cultivo com múltiplas alterações de temperatura, incluindo células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse a uma primeira temperatura igual ou -53- próxima dos 37°C, sob condições e por um período de tempo que permitam o crescimento celular. A seguir ao período de crescimento celular, as células são cultivadas a uma segunda temperatura igual ou próxima dos 34°C quando se verifica o abrandamento do crescimento das células que se tornam, aproximativamente, estacionárias. Subsequentemente, as células são cultivadas a uma terceira temperatura igual ou próxima dos 32°C durante a fase padrão de produção, ou seja, no dia 6, sensivelmente, até ao dia 14, sensivelmente. As células são alimentadas diariamente. No final do processo de cultivo, é possível obter o produto de proteína produzido.

Segundo uma vertente preferencial desta invenção, as células são cultivadas num processo "batch-fed" que abrange diversas fases, nomeadamente a fase de crescimento, durante a qual as células são cultivadas a uma primeira temperatura igual ou próxima dos 37°C, a fase inicial ou padrão de produção, durante a qual as células são cultivadas a uma segunda temperatura igual ou próxima dos 34 °C e a uma terceira temperatura igual ou próxima dos 32°C de modo a proporcionar um alargamento da fase de produção de proteínas, o que pode incluir uma quarta temperatura, igual ou próximas dos 30°C, e, por conseguinte, opcionalmente, descidas de temperatura adicionais, tais como para ou próximas dos 29°C. No caso da execução de alterações de temperatura em duas ou mais etapas, próprias desta invenção, o alargamento da produção de proteínas está relacionado com duas ou mais descidas de temperatura. As culturas são preferencialmente alimentadas com um meio de alimentação que contém D-galactose, e isso diariamente ou continuamente. Como é aqui descrito, um alargamento da fase -54- de produção inclui uma sucessiva descida da temperatura da cultura a diferentes intervalos, duas ou mais vezes à seguir à primeira alteração de temperatura a partir dos 37°C, ou sensivelmente, para os 34°C, ou sensivelmente. Relativamente a nenhuma alteração de temperatura, ou a somente uma alteração de temperatura, verifica-se um aumento da produção de proteínas e uma alta qualidade do produto (como é avaliado pelo teor de ácido siálico no produto final) através da prática destes métodos que abrangem duas ou mais descidas de temperatura durante o período de execução do cultivo.

Durante a fase de crescimento da cultura de células, ou seja, a partir do dia 0 até cerca do dia 6, a densidade celular aumenta à medida que as células estão, geralmente, a dividir-se rapidamente neste período de crescimento exponencial das células, ou fase log. Quanto à ausência de crescimento associada aos métodos de cultivo de células e de produção de proteínas presente nalguns aspectos desta invenção, nenhuma quantidade significativa de produto de produto de proteína é produzida durante a fase de crescimento durante a qual o crescimento celular é essencialmente maximizado no âmbito de condições de crescimento apropriadas. Assim, como consequência das limitações de nutriente na cultura, as células entram geralmente numa fase estacionária por volta dos dias 4 a 6, durante os quais o rápido crescimento celular estagna e/ou diminui. Nestes métodos de cultivo, a fase de produção de proteínas inicia-se quando o crescimento celular chegou essencialmente ao fim (por exemplo, no dia 6, sensivelmente, até ao dia 10, sensivelmente). (Exemplo 4). -55-

Em conformidade um o método de cultivo de uma vertente preferencial, quando as células atingem a fase estacionária no dia 6, sensivelmente, há uma descida de temperatura dos 37°C, ou por volta dos 37°C, para os 34°C, ou por volta dos 34°C. Subsequentemente, num momento próximo do ponto intermédio entre a primeira alteração de temperatura (por volta do 6o dia) e o início do alargamento da fase de produção (por volta do 14° dia), há uma nova descida de temperatura dos 34°C, ou por volta dos 34°C, para os 32°C, ou por volta dos 32°C. A segunda alteração de temperatura possibilita a estabilização da viabilidade celular, a qual, geralmente, diminui gradualmente até ao dia 14 inclusivamente; por conseguinte, inicia-se um alargamento da fase de produção (no dia 14, sensivelmente, ao dia 21, sensivelmente, ao dia 30 ou mais, preferencialmente para o dia 21, sensivelmente, para o dia 28 ou mais). Como já aqui foi descrito anteriormente, outras alterações de temperatura, por exemplo uma terceira, quarta ou mais, podem ser utilizadas durante a fase alargada de produção do período de execução da cultura. Métodos de cultivo incluindo uma alimentação com galactose em combinação com uma adição retardada de um componente

Outras vertentes desta invenção dizem respeito a processos de cultivo que incluem a adição retarda de um composto polianiónico. Os métodos de cultivo de células que abrangem a adição retardada de um composto polianiónico são divulgados no pedido de patente de invenção norte-americana n.°, registada concomitantemente em anexo, cujos conteúdos -56- são aqui integrados por referência, e que são descritos mais adiante. Tal adição retardada de um composto polianiónico pode ser utilizada juntamente com os processos de alimentação com galactose, aqui descritos.

Segundo as vertentes da presente invenção que envolvem a adição retardada de um composto polianiónico, o processo inclui a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento após a inoculação. A adição retardada de um composto polianiónico alcança um aumento da viabilidade celular comparativamente com aquela que se pode observar na ausência da adição de um composto polianiónico ou comparativamente com aquela que se pode observar quando um composto polianiónico é adicionado no momento da inoculação.

Assim, numa vertente, a invenção diz respeito ao processo de cultivo de células, incluindo: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação.

Verificou-se (ver Exemplo 8), na aplicação da presente invenção, o aumento da percentagem da viabilidade celular da cultura de células. A percentagem de viabilidade celular, também designada por viabilidade celular, é a percentagem de células viáveis relativamente ao número total de células. Uma condição, tal como a adição retarda de um composto polianiónico, suscita o aumento da viabilidade celular se a viabilidade celular na cultura for superior durante um período de tempo na presença da condição comparativamente à ausência dessa condição.

Assim, noutras vertentes, a invenção diz respeito (1) ao processo de cultivo de células e (2) a um método para -57- aumentar a viabilidade celular numa cultura, incluindo: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células após a inoculação; em que a viabilidade celular da cultura de células é aumentada.

Os compostos polianiónico incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, o sulfato de dextrano (disponível na Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), sulfato de heparano (disponível na Sigma-Aldrich), sulfato de manano, sulfato de condroitina (disponíveis na Sigma- Aldrich) , sulfato de dermatano (disponível na Sigma- Aldrich) , sulfato de queratano (disponível na Sigma- Aldrich) r hialuronato (disponível na Sigma- Aldrich) , poli ( (s)sulfato de vinil) (disponível na Sigma- Aldrich) f hialuronato (disponível na Sigma- Aldrich) , poli ( (s)sulfato de vinil )(disponível na Sigma-

Aldrich),K-carrageno (disponível na Sigma-Aldrich)e seramina (disponível na Sigma-Aldrich). Os compostos estão facilmente disponíveis junto das fontes listadas, ou podem ser facilmente obtidas através de meios conhecidos por aqueles que são versados nesta arte. Estes compostos estão frequentemente disponíveis sob a forma de sal, incluindo, mas não se limitando ao sal de sódio, mas podem também ser utilizados noutras formas além de sal. Um composto polianiónico inclui todas as formas, incluindo mas não se limitando às formas de sal, como os sais de sódio.

Os compostos polianiónico preferenciais são os compostos polisulfatados, incluindo mas não se limitando a: sulfato de dextrano, heparina, sulfato de heparano, sulfato de xilofuranose, sulfato de curdlana, sulfato de galactose de curdlana, sulfato de arabinose de curdlana, sulfato de -58- manano, sulfato de condroítina, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, poli( (s)sulfato de vinil), K-carrageno e suramina. Aquele que tem maior preferência é o sulfato de dextrano. 0 sulfato de dextrano pode ter um peso molecular médio de 5000 a 500 000 Da. Dá-se preferência a um sulfato de dextrano com um peso molecular de 5 000 Da.

Segundo a invenção, um composto polianiónico é adicionado num momento posterior à inoculação, ou seja, este não se encontra presente no meio basal nem está presente no momento da inoculação. Preferencialmente, o composto polianiónico é adicionado no dia 1 da cultura ou posteriormente. A inoculação ocorre no dia 0.

Segundo a invenção, um composto polianiónico pode ser adicionado à cultura de células uma vez, duas vezes, três vezes ou diversas versas durante o período de tempo específico (por exemplo, num momento posterior à inoculação). Um ou mais compostos polianiónico podem ser utlizados em conjunto, ou seja, qualquer determinada adição simples de um composto polianiónico pode incluir a adição de um ou mais compostos polianiónicos. Da mesma forma, se houver mais do que uma adição de um composto polianiónico, diferentes compostos polianiónicos poderão ser adicionados às diferentes adições. Compostos e substâncias adicionais, incluindo compostos polianiónicos, podem ser adicionados antes à cultura, juntamente com ou após a adição de um composto polianiónico - quer durante, ou não, do período de tempo especificado. Numa vertente preferencial, há uma simples adição, isto é, a adição de um composto polianiónico ocorre uma vez. Numa vertente preferencial, um composto polianiónico é adicionado. -59-

Segundo a invenção, um composto polianiónico pode ser adicionado por qualquer meio à cultura de células. Os meios de adição de um composto polianiónico incluem mas não se limitem à dissolução em água, à dissolução num meio de cultura, à dissolução num meio de alimento, à dissolução num meio apropriado, e sob a forma como este é obtido. Preferencialmente, um composto polianiónico é adicionado dissolvido em água.

Segundo esta invenção, um composto polianiónico é adicionado para levar a concentração na cultura a um nível apropriado. A título de exemplo, mas não limitativo, um composto é adicionado a uma concentração de 1-1000 mg/1, 1-200 mg/1, 1-100 mg/1 ou 25-75 mg/1. Preferencialmente, um composto polianiónico é adicionada a uma concentração de 25-200 mg/1 ou 25-100 mg/1, mais preferencialmente de cerca de 50-100 mg/1 ou 50-100 mg/1, mais preferencialmente de cerca de 50 mg/1 ou de cerca de 100 mg/1, sendo o mais preferível 50 mg/1 ou 100 mg/1.

De acordo com a invenção, a execução da cultura pode ter qualquer duração após a adição de um composto polianiónico. O tempo de duração da execução da cultura pode ser determinado por alguém competente na arte, com base em factores relevantes, tais como a quantidade e qualidade de proteína recuperável e o nível de contaminação das espécies celulares (por exemplo, proteínas e DNS) nas matérias flutuantes que resultam na lise celular, a qual dificulta a recuperação da proteína com interesse.

Em vertentes particulares do processo de cultivo de células e do método de aumento da viabilidade celular, no âmbito desta invenção, um composto polianiónico é adicionado num momento posterior à inoculação que antecede -60- o início da fase inicial de morte celular. Preferencialmente, um composto polianiónico é adicionado num momento posterior à inoculação, durante a fase inicial de crescimento. Mais preferencialmente, um composto polianiónico é adicionado durante a segunda metade da fase inicial de crescimento. Mais preferencialmente, um composto polianiónico é adicionado no final ou por volta do final da fase inicial de crescimento. A fase inicial de crescimento refere-se à fase de crescimento que é observada na ausência da adição especificada de um composto polianiónico. A fase inicial de morte refere-se à fase de morte que é observada na ausência da adição especificada de um composto polianiónico. A fase inicial de crescimento pode concluir-se aquando do início da fase inicial de morte, ou pode verificar-se uma fase estacionária, com qualquer duração, entre a fase inicial de crescimento e a fase inicial de morte.

Numa vertente específica, numa cultura de células na qual a fase inicial de crescimento decorre do dia 0 ao dia 6 e a fase inicial de morte inicia-se no dia 7, numa vertente particular um composto polianiónico é adicionado num momento posterior à inoculação e antes do dia 7. Numa vertente específica, um composto polianiónico é adicionado após a inoculação e durante o dia 6. Numa vertente específica, um composto polianiónico é adicionado entre os dias 1 e 6. Noutra vertente específica, um composto polianiónico é adicionado no dia 4, 5 ou 6. Noutras vertentes específicas, um composto polianiónico é adicionado por volta do dia 6 ou no dia 6.

Verificou-se (ver Exemplos 8 e 12) que, quando um composto polianiónico é adicionado num momento posterior à -61- inoculação e antes do início da fase inicial de morte, a fase de crescimento pode ser alargada para lá da fase inicial de crescimento. Uma fase de crescimento que se prolonga para lá da fase inicial de crescimento tem uma duração mais longa do que a fase inicial de crescimento, ou seja, é mais duradoura do que a fase de crescimento observada na ausência da adição de um composto polianiónico. Preferencialmente, durante a fase alargada de crescimento, atinge-se um valor mais alto quanto à densidade celular comparativamente ao valor da densidade celular que é alcançado durante a fase inicial de crescimento.

Assim, noutras vertentes, a invenção diz respeito (1) ao processo de cultivo de células e (2) a um processo para alargar a fase de crescimento de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação que é anterior ao início da fase inicial de morte, em que a fase de morte é alargada. Em vertentes mais particulares, a invenção diz respeito (1) ao processo de cultivo de células e (2) ao processo que visa o alargamento da fase de crescimento de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação que ocorre durante a fase inicial de crescimento; em que a fase de crescimento é alargada. Em vertentes mais particulares, a invenção diz respeito (1) ao processo de cultivo de células e (2) a um processo que visa o alargamento da fase de crescimento de uma cultura de -62- células, incluindo: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células durante a segunda metade da fase inicial de crescimento; em que a fase de crescimento é alargada. Noutras vertentes particulares, a invenção diz respeito (1) ao processo de cultivo de células e (2) a um processo para o alargamento da fase de crescimento de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células no final ou por volta do final da fase inicial de crescimento, em que a fase de crescimento é alargada. A fase de crescimento pode ser alargada para qualquer período de tempo que ultrapasse a duração da fase inicial de crescimento. Apenas a título de exemplo, a fase de crescimento pode ser alargada por 1-10 dias, 2-9 dias, 3-dias ou cerca de 5 dias. Preferencialmente, a fase de crescimento é alargada por um ou mais dias, mais preferencialmente por dois ou mais dias, mais preferencialmente por três ou mais dias, mais preferencialmente por quatro ou mais dias. Por exemplo, no Exemplo 6 a fase de crescimento é alargada até ao dia 11, sendo que a fase inicial de crescimento vai até ao dia 6. Assim, no Exemplo 8, a fase de crescimento foi alargada por 5 dias para lá da duração da fase inicial de crescimento. À fase de crescimento alargada pode suceder a fase de morte ou uma fase estacionária. Do mesmo modo, à fase de crescimento inicial pode suceder a fase de morte ou uma fase estacionária. -63-

Verificou-se (ver Exemplos 8 e 12) que, quando um composto polianiónico é adicionado num momento posterior à inoculação e anterior ao inicio da fase inicial de morte, o inicio da fase de morte pode ser atrasado para lá do inicio da fase inicial de morte, isto é, para lá do inicio da fase de morte observada na ausência de um composto polianiónico. Uma fase de morte cujo inicio é retardado começa mais tarde do que a fase inicial de morte.

Assim, noutras vertentes, a invenção diz respeito (1) a um processo de cultivo de células e (2) a um processo para o retardamento da fase de morte de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação que é anterior ao início da fase inicial de morte; em que o início da fase de morte é retardado. Em vertentes mais particulares, a invenção diz respeito (1) a um processo de cultivo de células e (2) um processo para o retardamento da fase de morte de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação que ocorre durante a fase inicial de crescimento; em que o início da fase de morte é retardado. Em vertentes mais particulares, a invenção diz respeito (1) a um processo de cultivo de células e (2) a um processo para o retardamento da fase de morte de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células durante a segunda metade da fase inicial de crescimento; em que o -64- início da fase inicial de morte é retardado. Noutras vertentes particulares, a invenção diz respeito a um processo para o retardamento da fase de morte de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células no final ou por volta do final da fase inicial de crescimento; em que o início da fase de morte é retardada. 0 início da fase de morte pode ser retardado por qualquer período de tempo. Apenas a título de exemplo, o início da fase de morte pode ser retardado por 1-10 dias, 2-9 dias, 3-8 dias ou cerca de 5 dias. Preferencialmente, o início da fase de morte é retardado por um ou mais dias, mais preferencialmente por dois ou mais dias, mais preferencialmente por três ou mais dias, o mais preferencialmente por quatro ou mais dias. Noutra vertente particular do processo de cultura de células e do método que visa aumentar a viabilidade celular, próprios da invenção e acima descritos, um composto polianiónico é adicionado num momento posterior à inoculação que ocorre durante a fase inicial de morte.

Verificou-se (vejam-se os Exemplos 9 e 10) que, quando um composto polianiónico é adicionado durante a fase inicial de morte, a fase de morte pode ser suspensa. Suspender a fase de morte significa interromper, durante um determinado período de tempo, a diminuição da densidade das células viáveis que se observa na ausência da adição de um composto polianiónico. A suspensão pode ocorrer imediatamente após a adição de um composto polianiónico ou pode ocorrer num momento mais tardio. Quando a fase de morte é suspensa, a seguir pode ocorrer uma fase de -65- crescimento ou uma fase estacionária. Eventualmente, claro, a cultura entrará novamente numa fase de morte.

Assim, noutras vertentes, a invenção diz respeito (1) a um processo de cultivo de células e (2) a um processo para a suspensão da fase de morte de uma cultura de células que inclui: células hospedeiras de cultivo que expressam uma proteína de interesse e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à fase inicial de morte; em que a fase de morte é retardada. A fase de morte pode ser suspensa durante qualquer período de tempo antes que a fase de morte seja novamente iniciada. Apenas a título de exemplo, a fase de morte pode ser retardada por 1-20 dias, 2-18 dias, 5-15 dias ou 8-13 dias. Preferencialmente, a fase de morte é suspensa por um ou mais dias, mais preferencialmente por dois ou mais dias, mais preferencialmente por três ou mais dias, o mais preferencialmente por quatro ou mais dias. A continuidade da suspensão da morte não é necessariamente implícita, isto é, pode haver diminuições "locais" no perfil de densidade das células viáveis entre dois períodos de continuidade ou de aumento da densidade das células viáveis. O tempo de execução dos processos de cultura de células, em particular processos não contínuos, é geralmente limitado pela densidade das células viáveis remanescentes, a qual diminui durante a fase de morte. Tempos de execução mais extensos podem permitir que titulações mais altas do produto sejam atingidas. O retardamento da fase de morte, incluindo o alargamento da fase de crescimento, tanto quanto possível, ou a suspensão da fase de morte, é, por conseguinte, desejável. As preocupações com a qualidade do produto proporcionam também -66- uma motivação para adiar ou suspender a fase de morte, visto que a morte celular pode libertar sialidases nas matérias flutuantes da cultura, o que pode reduzir o teor de ácido siálico da proteina expressa. As preocupações com a purificação da proteina proporcionam outra motivação para o retardamento ou a suspensão da fase de morte. A presença de detritos celulares e os conteúdos de células mortas na cultura podem ter consequências negativas sobre a capacidade de isolar e/ou purificar o produto de proteina no final do período de execução do cultivo.

Em vertentes particulares, qualquer um dos processos de cultivo de células, aqui descritos, que envolvem duas ou mais alterações de temperatura e qualquer um dos processos de cultura de células, aqui descritos, que envolvem a adição retardada de um composto polianiónico são utilizados em conjunto numa cultura de células. Em vertentes particulares, a invenção diz respeito (i) a um processo de cultivo de células e (ii) a um processo para o aumento da viabilidade celular, incluindo: a) células hospedeiras de cultivo, as quais produzem uma proteína de interesse a uma temperatura igual ou próxima dos 37°C sob condições e a qualquer período de tempo que permitam o crescimento celular; b) uma descida da temperatura da cultura de células e o cultivo de células a uma segunda temperatura igual ou próxima dos 34°C a partir do dia 5, sensivelmente, ao dia 7; (c) uma nova descida da temperatura da cultura de células e o cultivo de células a uma terceira temperatura igual ou próxima dos 32°C a partir do dia 6, sensivelmente, até ao dia 14; e (d) a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação. -67-

Numa vertente particular, a presente invenção diz respeito a um processe de cultivo de células que inclui a adição retardada de um composto polianiónico, como descrito acima e mais adiante, incluindo a alimentação das células com D-galactose. Noutra vertente particular, a presente invenção diz respeito ao processo de cultivo de células que inclui a adição retardada de um composto polianiónico, como acima descrito, duas ou mais alterações de temperatura, como acima descrito, e a alimentação das células com D-galactose. Assim, numa vertente particular, a invenção diz respeito a um processo de cultura de células para a produção de proteínas, incluindo: células hospedeiras de cultivo, as quais produzem uma proteína de interesse na cultura de células sob condições que permitem a produção de proteínas, a alimentação das células com D-galactose e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação. Noutra vertente particular, a invenção diz respeito a um processo de cultura de células para a produção de proteínas, incluindo: células hospedeiras de cultivo, as quais produzem uma proteína de interesse numa cultura de células sob condições que permitem a produção de proteínas, o cultivo de células hospedeiras a uma temperatura igual ou próxima dos 37°C sob condições e por um período de tempo que permitam o crescimento celular, o cultivo de células a uma segunda temperatura igual ou próxima dos 34°C, o cultivo de células a uma terceira temperatura igual ou próxima dos 32°C, a alimentação das células com D-galactose e a adição de um composto polianiónico à cultura de células num momento posterior à inoculação. -68- Técnicas e procedimentos relacionados com a purificação e análise da glicoproteína

Nos métodos de cultivo abrangidos pela presente invenção, a proteína produzida pelas células é geralmente colectada, recuperada, isolada e/ou purificada, ou substancialmente purificada, conforme aquilo que é pretendido, no final de todo o período de cultura de células, usando-se, para esse efeito, métodos de isolamento e de purificação conhecidos e praticados na arte. Preferencialmente, a glicoproteína que é segregada a partir das células cultivadas é isolada do meio de cultura ou das matérias flutuantes; contudo, a proteína também pode ser recuperada das células hospedeiras, por exemplo, lisados de células, usando-se métodos que são conhecidos e praticados na arte, conforme descritos abaixo.

Os hidratos de carbono complexos, que abrangem a glicoproteína produzida pelos processos desta invenção, podem ser analisados em conformidade com procedimentos habituais, se desejado, através de técnicas convencionais para a análise dos hidratos de carbono. Por exemplo, técnicas tais como o "blotting" da lectina, sobejamente conhecida na arte, revelam porções terminais de manose ou de outros açúcares tais como a galactose. A terminação de oligossacarideos mono-, bi-, tri- ou tetra-antenários por ácidos siálico pode ser confirmada pela libertação de açúcares da proteína através de hidrazina anidra ou de métodos enzimáticos e a destilação fraccionada de oligossacarideos através da cromatografia de permuta iónica, da cromatografia da exclusão do tamanho ou de outros métodos que são bem conhecidos na arte. -69- 0 pl da glicoproteína pode também ser medido, antes ou após o tratamento com neuraminidase, para remover os ácidos siálico. Um aumento do pl após o tratamento com neuraminidase indica a presença de ácidos siálico na glicoproteína. As estruturas de hidrato de carbono ocorrem geralmente na proteína expressa como hidratos de carbono ligados a N ou a 0. Os hidratos de carbono ligados a N ou a 0 diferem, principalmente, em termos de estruturas centrais. A glicosilação ligada a N diz respeito à ligação de uma fracção hidrato de carbono, via GIcNAc, a um resíduo de asparagina na cadeia peptídica. Todos os hidratos de carbono ligados a N contêm uma estrutura comum de Manl-6(Manl-3)Manpi-4GIcNAcpi-4GIcNAcp-R, onde R na estrutura central representa um resíduo de asparagina. A sequência peptídica da proteína produzida conterá asparagina-x-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteín, onde X corresponde a qualquer aminoácido excepto prolina.

Pelo contrário, os hidratos de carbono ligado a 0 caracterizam-se por uma estrutura central comum, a qual corresponde a GalNAc ligada ao grupo hidroxilo de uma treonina ou serina. Dos hidratos de carbono ligados a N ou a 0, os mais importantes são os hidratos de carbono ligados a N ou a 0 complexos. Tais hidratos de carbono complexos contêm diversas estruturas antenárias. As estruturas exteriores mono-, bi-, tri- e tetra- são importantes para a adição de ácidos siálicos terminais. Tais estruturas de cadeia exteriores proporcionam outros lugares adicionais para os açúcares e ligações específicas que abrangem os hidratos de carbono dos produtos de proteína.

Os hidratos de carbono resultantes podem ser analisados por qualquer método conhecido na arte. Diversos métodos são -70- conhecidos na arte para a análise da glieosilação e são úteis no âmbito da presente invenção. Estes métodos proporcionam informações relativas à identidade e à composição do oligossacarideo ligado ao péptideo produzido. Os métodos para a análise do hidrato de carbono úteis relativamente à presente invenção incluem mas não se limitam à cromatografia da lectina, à cromatografia líquida de alta resolução com detecção amperométrica de pulso ou HPAEC-PAD, que recorre a uma cromatografia de permuta iónica de alta resolução de pH para separar os oligossacarídeos com base na carga, à ressonância magnética nuclear ou RMN, à espectrometria de massa, à cromatografia líquida de alta resolução ou HPLC, à cromatografia de permeação de gel ou GPC, à análise composicional de monossacarídeos e à digestão enzimática sequencial.

Além disso, os métodos para a libertação de oligossacarídeos são conhecidos e praticados na arte. Estes métodos incluem 1) métodos enzimáticos, os quais são geralmente realizados através do uso de peptídeo-N-glicosidase F/endo-p-galactosidase, 2) métodos de eliminação de β, usando um ambiente alcalino desfavorável para libertar essencialmente estruturas ligadas a O e 3) métodos químicos, usando hidrazina anidra para libertar oligossacarídeos ligados a N ou a O. As análises podem ser realizadas através do recurso às seguintes etapas: 1. Diálise da amostra contra água desionizada para remover todos os sais dos tampões, seguida de liof ilização; 2. Libertação de cadeias intactas de oligossacarídeos com hidrazina anidra; 3. Tratamento das cadeias intactas de oligossacarídeos com HC1 metanólico anidro para libertar monossacarídeos individuais como derivados de O-metil; N- -71 - acetilação de quaisquer grupos amino primários; 5. Derivatização para produzir per-O-trimetilsilil-metil glicosídeos; 6. Separação desses derivados por cromatografia de gás liquido de coluna capilar (GLC) numa coluna CP-SIL8; 7. Identificação dos derivados de glicosídeos individuais por tempo de retenção a partir de uma GLV e de uma espectroscopia de massa, comparativamente com os padrões conhecidos; 8. Quantificação de derivados individuais através de FIG com um padrão interno (13-0-metil-D-glucose).

Os açúcares neutros e amino podem ser determinados através de uma cromatografia de permuta iónica de alta resolução associada a uma detecção amperométrica pulsada (HPAE-PAD Carbohydrate System; Dionex Corp.) . Por exemplos, os açúcares podem ser libertados por hidrólise em 20% de ácido trifluoroácetico (v/v) a 100°C durante 6 horas. São então realizadas hidrólises por liofilização ou com Speed-Vac (Savant Instruments). Os resíduos são então dissolvidos numa solução de 1% de acetato de sódio trihidrato e analisados numa coluna de HPLC-AS6 (como é descrito por Anumula et al., 1991, Anal. Biochem, 195:269-280).

Em alternativa, é possível efectuar uma análise com hidrato de carbono para Imunoblot. Neste procedimento, os hidratos de carbono de proteínas são detectados através da utilização de um sistema de detecção comercial de glicanas (Boehringer), o qual se baseia no procedimento oxidativo por Imunoblot descrito por Haselbelck et al. (1993, Glyconjugate J., 7:63). O protocolo de coloração recomendado pelo fabricante é seguido excepto no que diz respeito à proteína que é transferida para uma membrana de difluoreto de polivinildieno em vez de uma membrana de -72- nitrocelulose e os tampões de bloqueio contêm 5% de albumina de soro bovino num tampão Tris 10 mM, pH 7.4, com 0.9% de cloreto de sódio. A detecção é efectuada com anticorpos anti-digoxigenina ligados com um conjugado de fosfatase alcalina (Boehringer), uma diluição de 1:1000 em tampão Tris salino, usando os substratos da fosfatase, cloreto de 4-nitroazul de tetrazólio, 0,03% (a/v) e 5-bromo-4 cloreto-3 indoil-fosfato 0,03% (a/v) em lOOmM de tampão Tris, pH 9,5, contendo 100 mM de cloreto de sódio e 50 mM de cloreto de magnésio. As bandas de proteínas que contêm hidratos de carbono são geralmente visualizadas em cerca de 10 a 15 minutos.

Os hidratos de carbono associadas a proteínas também podem ser analisados através da digestão com peptídeo N-glicosidase F. Em conformidade com este procedimento, o resíduo é suspenso em 14p.L de um tampão que contém 0.18% de SDS, 18mM de beta mercaptoetanol, 90 mM de fosfato, 3,6 mM de ácido etilenodiaminotetracético ou EDTA, a um pH de 8,6, e aquecido a 100°C durante 3 minutos. Após o arrefecimento à temperatura ambiente, a amostra é dividia em duas partes iguais. Uma parte, a qual não é posteriormente tratada, serve de controlo. A outra parte é ajustada para cerca de 1% de detergente np-40, seguindo-se a adição de 0,2 unidades de peptídeo-N-glicosidade F (Boehringer). Ambas as amostras são aquecidas a 37°C durante 2 horas e seguidamente analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS.

Além disso, o teor de ácido siálico do produto de glicoproteína é medido através de métodos convencionais. Por exemplo, o ácido siálico pode ser determinado separadamente através de um método colorimétrico directo -73- (Yao et al., 1989, Anal. Biochem., 179:332-335), preferencialmente usando-se amostras triplicadas. Outro método para a determinação do ácido siálico inclui o uso de ácido tiobarbitúrico (TBA), como é descrito por Warren et al., 1959, J. Biol. Chem., 234:1971-1975). Outro método ainda inclui a cromatografia de alta resolução, como é descrito por H.K. Ogawa et al., 1993, J. Chromatografia, 612:145-149.

Para exemplificar, para a recuperação, isolamento e/ou purificação da glicoproteína, o meio de cultura de células ou lisato de células é centrifugado para remover as células particulares e os detritos celulares. 0 produto de polipeptideo desejado é isolado ou purificado à distância das proteínas solúveis contaminantes e dos polipeptídeos através de técnicas de purificação apropriadas. Os seguintes procedimentos proporcionam uma exemplificação, embora não limitativa, dos métodos de purificação para as proteínas: separação ou fraccionamento em colunas de imunoafinidade ou permuta iónica; precipitação em etanol; cromatografia em fase reversa; cromatografia em resina, tal como a resina sílica, ou resina catiónica, por exemplo, DEAE; focagem isoeléctrica; SDS-PAGE; precipitação sem ulfato de amónio; utilizando uma filtração em gel, por exemplo, Sephadex G-75, Sepharose; cromatografia com A-sepharose para a remoção dos contaminantes de imunoglobina; e afins. Outros aditivos, tais como os inibidores da protease (por exemplo, PMSF ou proteinase K), podem ser utilizados para inibir a degradação proteolítica durante a purificação. 0 profissional qualificado deverá compreender que os métodos de purificação para um dado polipeptideo de interesse pode exigir modificações que permitirão -74- alterações quanto ao polipeptídeo expresso de forma recombinada na cultura de células. É dada uma particular preferência aos procedimentos de purificação que podem seleccionar hidratos de carbono e valorizar o ácido siálico, isto é, a cromatografia de permuta iónica em gel, ou HPLC usando resinas catiónica ou aniónicas, nas quais a(s) fracção(ões) mais ácida(s) são colectadas. Células, proteínas e cultura de células

Nos processos ou métodos de cultura de células desta invenção, as células podem ser mantidas numa grande diversidade de meios de cultura de células, isto é, meios basais de cultura, como são convencionalmente conhecidos na arte. Por exemplo, os métodos são aplicáveis para um uso com grandes volumes de células mantidas num meio de cultura de células, ao qual podem ser acrescentados nutrientes e afins. Geralmente, "o meio de cultivo de células" (também designado por "meio de cultura") é uma expressão que é percebida pelo profissional nesta arte e sabe-se que se refere a uma solução de nutrientes na qual as células, preferencialmente células animais ou mamíferas, crescem e o qual proporciona, geralmente, pelo menos um ou mais componentes de entre os seguintes: uma fonte de energia (comummente sob a forma de um hidrato de carbono como a glucose); todos os aminoácidos essenciais e, geralmente, os vinte aminoácidos básicos, mais cisteina; vitaminas e/ou outros compostos orgânicos geralmente exigidos em baixas concentrações; lípidos ou ácidos gordos livres, por exemplo, ácido linoléico; e oligoelementos, por exemplo, compostos inorgânicos ou elementos que ocorrem naturalmente -75- que são geralmente exigidos em concentrações muito baixas, geralmente numa escala micromolar. 0 meio de cultura de células também pode ser complementada para conter uma diversidade de componentes opcionais, tais como hormonas e outros factores de crescimento, por exemplo, insulina, transferrina, factor de crescimento epidérmico, soro e afins; sais, por exemplo, cálcio, magnésio e fosfato, e tamoões, por exemplo, HEPES; nucleósidos e bases, por exemplo, adenosina, timidina, hipoxantina; e hidrolisado de proteína e nos tecidos, por exemplo, proteína animal hidrolisada (peptona ou mistura de peptona, a qual pode ser obtida a partir de subprodutos animais, gelatina purificada ou material fabril); antibióticos, por exemplo, gentamicina; e agentes protectores das células, por exemplo, poliol Pluronic (Pluronic F68) . É dada preferência a um meio nutricional das células que não contenha soro nem produtos ou ingredientes de origem animal.

Como é avaliado pelo profissional, as células animais ou mamíferas são cultivadas num meio adequado para que as células particulares sejam cultivadas e que possa ser determinado pela pessoa competente na arte sem nenhuma experimentação indevida. Os meios disponíveis no comércio podem ser utilizados e incluem, por exemplo, Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma, St. Louis, MO, EUA); Meio Ham FIO (Sigma); Meio de Dulbeco / Modificado de Eagle (DMEM, Sigma); Meio RPMI-1640 (Sigma); meio de cultura de células HyClone (HyClone, Logan, UT, EUA); e meio definido quimicamente (CD), o qual é formulado para determinados tipos de células, por exemplo, Meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Aos meios acima mencionados, que servem de exemplo, podem ser adicionados os componentes ou -76- ingredientes adicionais acima descritos, incluindo componentes opcionais, em concentrações ou quantidades adequadas, conforme necessário ou desejado, e como é do conhecimento e praticado por aqueles que têm competência quanto aos procedimentos habituais na arte.

Além disso, as condições da cultura de células adequadas para os métodos da presente invenção são aquelas que são geralmente utilizadas e conhecidas por cultivo "batch", "fed-batch" ou continuo de células, com especial atenção para o pH, por exemplo, cerca de 6,5 a cerca de 7,5, o oxigénio dissolvido (02), por exemplo, entre cerca de 5-90% de saturação do ar e dióxido de carbono (C02), agitação e humidade, além da temperatura. A titulo de exemplo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, um médio de cultivo de células adequado para os processos "fed-batch" da presente invenção incluem um Meio CD-CHO modificado (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e um meio de alimentação, que contém preferencialmente D-galactose (por exemplo, Exemplos 1 e 3) .

As células animais, as células mamíferas, as células cultivadas, as células hospedeiras animais ou mamíferas, as células hospedeiras, as células recombinantes, as células hospedeiras recombinantes, e afins, são, todas elas, expressões que remetem para as células que podem ser cultivadas em conformidade com os processos desta invenção. Tais células são, geralmente, linhas de células obtidas ou derivadas de mamíferos e podem crescer e sobreviver quando são colocadas quer numa cultura monomolecular ou numa cultura de células em suspensão num meio que contém nutrientes adequados e/ou factores de crescimento. Os factores de crescimento e nutrientes necessários para o -77- crescimento e a manutenção de culturas de células particulares podem ser prontamente determinada de forma empírica por aqueles que possuem competências na arte relevante, como é descrito, por exemplo, por Bames e Sato (1980, Cellf 22:649), in Mammalian Cell Culture, Ed. J.P. Mather, Plenum Press, Nova Iorque, NY, 1984, e na patente de invenção norte-americana n.° 5721121.

Diversos tipos de células podem ser cultivados segundo os métodos da presente invenção. As células são, geralmente, células animais ou mamíferas que podem expressar e segregar, ou que podem ser manipuladas a nível molecular para expressar e segregar, grandes quantidades de uma determinada proteína, mais particularmente uma glicoproteína de interesse, no meio de cultura. Compreender-se-á que a glicoproteína produzida por uma célula hospedeira pode ser endógena ou homóloga à célula hospedeira. Em alternativa, e preferencialmente, a glicoproteína é heteróloga, isto é, exterior à célula hospedeira, por exemplo, uma glicoproteína produzida e segregada por uma célula hospedeira num ovário de hamster chinês (CHO). Também preferencialmente, as glicoproteínas mamíferas, isto é, aquelas que são originariamente obtidas ou derivadas de um organismo mamífero, são alcançadas pelos métodos da presente invenção e são preferencialmente segregadas pelas células no meio de cultura.

Os exemplos de glicoproteínas mamíferas que podem ser vantajosamente produzidas pelos métodos desta invenção incluem, sem nenhuma limitação, citocinas, receptores de citocinas, factores de crescimento (por exemplo, EGF, HER-1, FGF-a, FGF-β,TGF-a, TGF-β, PDGF.IGF-1, IGF-1, NGF, NGF-β), receptores de factores de crescimento, incluindo -78- proteínas de fusão ou quiméricas. Outros exemplos não limitativos incluem hormonas de crescimento (por exemplo, hormona de crescimento humana, hormona de crescimento bovina), insulina (por exemplo, cadeia A de insulina e cadeia B de insulina), proinsulina, eritropoietina (EPO), factores de estimulação de colónia (por exemplo, G-CSF, GM-CSF, M-CSF), interleucina (por exemplo, IL-1 até IL-12), factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e o seu receptor (VEGF-R); interferões (por exemplo, IFN-α, β ou γ), factor de necrose tumoral (por exemplo, TNF-α e TNF-β) e os seus receptores, TNFR-1 e TNFR-2, trombopoietina (TPO), trombina, peptideo natriurético cerebral (BNP), factores de coagulação (por exemplo, Factor VIII, Factor IV, factor von Willebrands e afins), factores anticoagulantes, activador do plasminogénio dos tecidos (TPA), por exemplo, urocinase ou urina humana ou tipo de tecido TPA, hormona de estimulação folicular (FSH), hormona luteinizante (LH), calcitonina, proteínas CD (por exemplo, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19, etc.), proteínas CTLA (por exemplo, CTLA4), proteínas receptoras da célula T e da célula B; proteínas morfogenéticas dos ossos (BNP, por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, etc.), factores neurotróficos, por exemplo, factor neurotrófico derivado dosossos (BNDF), neurotrofinas, por exemplo, 3-6, renina, factor reumatóide, RANTES, albumina, relaxina, proteína inibitória de macrógofos (por exemplo, MIP-1, MIP-2), proteínas virais ou antígenos, proteínas a superfície de membranas, proteínas de canais iónicos, enzimas, proteínas reguladoras, anticorpos, proteínas imunomodulatórias (por exemplo, HLA, MHC, a família B7), receptores passivo, proteínas de transporte, superóxido dismutase (SOD); -79- proteínas receptoras acopladas à proteína G (GPCR), proteínas neuromudolatórias, proteínas e peptídeos associados à Doença de Alzheimer (por exemplo, A-beta), e outros como são conhecidos na arte. As proteínas de fusão e os polipeptídeos, as proteínas quiméricas e os polipeptídeos, bem como os fragmentos ou porções, ou mutantes, ou variantes, ou análogas de qualquer uma das proteínas e polipeptídeos acima mencionados estão também incluídos entre as proteínas, polipeptídeos e peptídeos adequados que podem ser produzidos pelos métodos da presente invenção.

Os exemplos não limitativos de células hospedeiras de animais ou de mamíferas para abrigar, expressar ou produzir proteínas para um subsequente isolamento e/ou purificação incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), tais como CH0-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet. 12:555-556; Kollekar et al., 1997,

Biochemistry, 36:10901-10909; e WO 01/92337 A2), células de CHO negativas de dihidrofolate redutase (CHO/-DHFR, Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216) e células CHO dpl2 (patente de invenção norte-americana n.° 5721121), células renais CVl de macaco transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL-1651), células renais embrionárias humanas (por exemplo, células 293 ou células 293 subclonadas para um crescimento numa cultura em suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59); células renais de hamster bebé (BHK,ATCC CCL-10), células renais de macaco (CVl, ATCC CCL-70), células renais de macaco verde de África (VERO-75, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81), células de Sertoli de rato (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251), células de carcinomas cervicais -80- humanas (HELA, ATCC CCL-2), células renais de cão (MDCK, ATCC CCL-34), células pulmonares humanas (W 138, ATCC CCL-75), células de hepatomas humanas (HEP-G2, HB 8065), células de cancro da mama de rato (MMT 060562, ATCC CCL-51), células do fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442), células TRI (Mather, 1982, Annals NY Acad., Sei., 383:44-68), células MCR 5, células FS4. As células aos quais é dada preferência são as células CHO, em particular as células CHO/-DHFR.

As células apropriadas para o cultivo relativo aos métodos e processos da presente invenção podem conter vectores de expressão (construções) introduzidos, por exemplo, via transformação, transfecção, infecção ou injecção, tais como plasmídeos e afins, que contêm sequências de codificação ou suas porções que codificam as proteínas para expressão e produção no processo de cultura. Tais vectores de expressão contêm os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificante introduzida. Os métodos que são bem conhecidos e praticados pelos indivíduos competentes na arte podem ser utilizados para construir vectores de expressão que contenham sequências que codifiquem as proteínas os poliptídeos produzidos, assim como os elementos de controlo transcricionais e traducionais adequados. Estes métodos incluem técnicas in vitro de ADN recombinante, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vitro. Tais técnicas são descritas em j. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nova Iorque e em F.M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.I. -81 -

Os elementos de controlo, ou sequências reguladoras, são aquelas regiões não traduzidas do vector, por exemplo, intensificadores, promotores, regiões 5' e 3' não traduzidas, que interagem com as proteínas celulares hospedeiras para levar a cabo a transcrição e tradução. Tais elementos podem variar na sua potência e especificidade. Dependendo do sistema vectorial e da célula hospedeira utilizados, qualquer número de elementos adequados de transcrição e tradução, incluindo os promotores constitutivos e induzíveis, podem ser usados. Nos sistemas de células de mamíferos, são preferíveis os promotores de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Os elementos para uso nos sistemas de expressão de proteínas são concebidos para conterem pelo menos um promotor, uma sequência intensificadora (opcional nos sistemas de expressão de mamíferos) e outras sequências conforme necessário ou exigido para uma transcrição e regulação adequados da expressão do gene (por exemplo, iniciação transcripcional e sequências de terminação, origem de locais de replicação, sequências de poliadenilação, por exemplo, a sequência poli A da Hormona de Crescimento Bovina (BGH)).

Conforme será evidente aos versados na arte, a selecção do vector adequado, por exemplo, plasmídeo, componentes para a transcrição, expressão e isolamento adequados das proteínas produzidas em sistemas de expressão eucarióticos (por exemplo, de mamíferos) é conhecida, determinada e praticada pelos versados na arte. A expressão de proteínas pelas células cultivadas de acordo com os métodos da presente invenção pode ser colocada sob o controlo de promotores como os promotores virais, por -82- exemplo, citomegalovírus (CMV), vírus do sarcoma de Rous (RSV), fosfoglicerol quinase (PGK), timidina quinase (TK) ou o promotor da α-actina. Além disso, os promotores regulados conferem inducibilidade através de determinados compostos ou moléculas, por exemplo, o elemento de resposta glucocorticóide (GRE) de vírus tumoral mamário de rato (MMTV) é induzido por glucocorticóides (V. Chandler et al., 1983, Cell, 33:489-499). Da mesma forma, podem ser usados promotores específicos do tecido ou elementos regulatórios (G. Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646), se necessário ou desejado.

Os elementos de expressão podem ser introduzidos nas células através de uma variedade de métodos de transferência de genes conhecidos dos versados na arte, por exemplo, métodos convencionais de transfecção genética, como a co-precipitação de fosfato de cálcio, transfecção liposomal, microinjecção, electroporação e transdução por infecção ou virai. A escolha do método insere-se na competência do versado na arte. Será evidente aos versados na arte que um ou mais elementos que transportam sequências de ADN para expressão em células podem ser transfectados para as células de forma que os produtos de expressão são subsequentemente produzidos na e/ou obtidos nas células.

Num aspecto particular, os sistemas de expressão de mamíferos contendo as sequências adequadas de controlo e regulatórias são preferíveis para uso em células de mamíferos que expressam proteínas da presente invenção. As sequências eucarióticas de controlo convencionalmente usadas para a geração de vectores de expressão de mamíferos incluem os promotores e as sequências de controlo compatíveis com células de mamíferos como, por exemplo, o -83- promotor (vector CDM8) do citomegalovírus (CMV) e o vector jiLN do vírus do sarcoma aviário (ASV) . Outros promotores vulgarmente usados incluem os promotores precoces e tardios do vírus 40 dos símios (SV40) (Fiers et al., 1973, Nature, 273:113), ou outros promotores virais como aqueles derivados do polioma, Adenovírus 2 e papilomavírus bovino. Um promotor indutível, como o HMTII (Karin et al., 1982, Nature, 299:797-802) também pode ser usado.

Exemplos de vectores de expressão adequados para células hospedeiras eucarióticas incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, vectores células hospedeiras de mamíferos (por exemplo, BPV-1, pHyg, pSV2, Ptk2 (Maniatis), pIRES (Clontech) , pRc/CMV2, pRC/RSV, PSFV1 (Life Technologies), vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores Psg5 (Stratagene), vectores retrovirais (por exemplo, vectores pFB (Statagene)), pcDNA-3 (Invitrogen), vectores adenovirais, vectores de vírus associado a Adeno, vectores baculovírus, vectores de leveduras (por exemplo, vectores pESC (Stratagene)) ou formas modificadas de qualquer um dos anteriores. Os vectores também podem conter sequências optmizadores a montante ou a jusante das sequências da região promotora para optimização da expressão génica.

Um marcador de seleccão também pode ser usado num vector recombinante (por exemplo, um plasmídeo) para conferir resistência às células que acolhem (preferivelmente, que integraram estavelmente) o vector para permitir a sua selecção em meio de selecção adequado. Podem ser usados vários sistemas de selecção, incluindo, sem que tal constitual qualquer tipo de limitação, os genes da timidina cinase do Vírus do Herpes Simplex (HSV TK) -84- (Wigler et al., 1977, Cell, 11:223), da fosforibosiltransferade hipoxantina-guanina (HGPRT) (Szybalska e Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 48:202) e da adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell, 22:817), que podem ser utilizados em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. A resistência anti-metabolitos também pode ser usada como base da selecção para os seguintes exemplos não limitativos de genes marcadores: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:357; e 0'Hare et al. , 1981, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 78:1527), gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mullgan e Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78:2072), neo, que confere resistência ao aminoglicosideo G418 (Clinicai Pharmacy, 12:488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Ver. Biochem, 62:191-21; May, 1993, TIB TECH, 11(5) : 155-215; e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., 1984, Gene, 30:147). Os métodos convencionalmente conhecidos na tecnologia de ADN recombinante podem ser aplicadas para seleccionar os clones celulares recombinantes desejados, e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Krigler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. -85-

Biol., 150:1, que são incorporados por referência na sua totalidade.

Além disso, os níveis de expressão de uma molécula de proteína expressa podem ser aumentados por amplificação vectorial (para consulta, veja-se Bebbington e Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mamalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, Nova Iorque, 1987). Quando um marcador no sistema vectorial expressando uma proteína é amplificável, um aumento do nível de inibidor presente na cultura celular hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Já que a região amplificada está associada ao gene codificador da proteína, a produção da proteína irá concomitantemente aumentar (Crouse et al.r 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257).

Os vectores que acolhem a glutamina sintase (GS) ou diidrofolato redutase (DHFR) que codificam o ácido nucleico sob a forma de marcadores seleccionáveis podem ser amplificados na presença dos fármacos metionina sulfoximina ou metotrexato, respectivamente. Uma vantagem dos vectores baseados na glutamina sintase reside na disponibilidade de linhas celulares (por exemplo, a linha celular de mieloma murino NSO) negativas quanto à glutamina sintase. Os sistemas de expressão da glutamina sintase também funcionam em células que expressam a glutamina sintade (por exemplo, células CHO) ao providenciar um inibidor adicional para impedir o funcionamento do gene endógeno.

Os vectores que expressam DHFR como marcador seleccionável incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, o plasmídeo pSV2-dhfr (Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1:854 (1981). Os vectores que expressam a -86- glutamina sintase como marcador seleccionável incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, o vector de expressão pEE6 descrito em Stephens e Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res., 17:7110. Um sistema de expressão da glutamina sintase e componentes do mesmo são descritos em detalhe nas publicações PCT: WO87/04462, WO86/05807, WO89/01036, W089/10404 e WO91/06657, que são incorporadas por referência na sua totalidade. Além disso, os vectores de expressão da glutamina sintase que podem ser usados de acordo com a presente invenção estão comercialmente disponíveis em vários fornecedores, incluindo, por exemplo, a Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).

Numa variante particular, a sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula solúvel de CTLA4 ou uma molécula solúvel mutante de CTLA4 pode ser inserida num vector concebido para expressar sequências num hospedeiro eucariótico. Os elementos reguladores do vector podem variar de acordo com o hospedeiro eucariótico. Os vectores que expressam CTLA4 solúvel ou CTLA4 solúvel mutante em células hospedeiras eucarióticas podem incluir sequências optimizadoras para optimização da expressão de proteína.

Tipos de culturas celulares

Com fins de um melhor entendimento, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, será evidente ao versado na arte que as culturas celulares e os períodos (totais) de cultura para a produção de proteínas podem incluir três tipos gerais, nomeadamente cultura contínua, cultura em "batch" e cultura em "fed-batch". Numa cultura contínua, por exemplo, o suplemento de meio de cultura -87- fresco (ou seja, meio de alimentação) é providenciado às células durante o período de cultura, enquanto que o meio de cultura velho é removido diariamente e o produto é colhido, por exemplo, em regime diário ou contínuo. Numa cultura contínua, o meio de alimentação pode ser adicionado diariamente e de forma contínua, ou seja, em gotejamento ou infusão. Nas culturas contínuas, as células podem permanecer em cultura durante o período de tempo desejado, desde que as células permaneçam vivas e se mantenham as condições ambientais e de cultura.

Nas culturas em "batch", as células são inicialmente cultivadas em meio e este meio não é removido, substituído ou suplementado, ou seja, as células não são "alimentadas" com novo meio, durante ou antes do final do período de cultura. 0 produto desejado é colhido no final do período de cultura.

Relativamente às culturas em "fed-batch", o período total de cultura é aumentado através do suplemento de meio de cultura uma ou mais vezes por dia (ou continuamente) com meio fresco durante o período, ou seja, as células são "alimentadas" com novo meio ("meio de alimentação") durante o período de cultura. As culturas em "fed-batch" podem incluir os vários regimes de alimentação e os horários supra descritos, por exemplo, diariamente, dia sim, dia não, de 2 em 2 dias, etc., mais do que uma vez por dia, ou menos do que uma vez por dia, etc. Além disso, as culturas em "fed-batch" podem ser alimentadas de forma contínua com meio de alimentação. 0 produto desejado é, então, colhido no final do período de cultura/produção. A presente invenção preferivelmente abrange culturas celulares em "fed-batch", com alimentação diária de meio de alimentação -88- contendo D-galactose, no qual os dois ou mais desvios de temperatura durante o período de cultura resultam numa produção de proteínas de elevada qualidade e podem prolongar a fase de produção de proteína para além daquela que ocorre quando não se usa qualquer desvio de temperatura, ou quando se usa apenas um desvio de temperatura. Os processos de cultura com múltiplos desvios de temperatura são descritos em pedidos de patente de invenção norte-americanos da Série n.° 60/436101, requerido no dia 23 de Dezembro de 2002, e da série n.° 10/, requerido concomitantemente com a mesma, cujos conteúdos são incorporados por referência na sua totalidade.

Nos aspectos da invenção que envolvem dois ou mais desvios de temperatura, dois ou mais desvios de temperatura que incluem os processos de cultura celular da presente invenção, resultam em células mais viáveis sobreviventes na cultura até ao final do processo ou do período total de cultura. Quanto maior for o número de células sobreviventes, maior será a quantidade de proteína produzida num processo não associado ao crescimento de produção de proteína, tal como alguns daqueles que aqui se exemplificam. Assim, no final do processo, resulta uma maior quantidade acumulada de um produto desejado. A velocidade de produção de proteína ou glicoproteína por células individuais na cultura (ou seja, a produtividade celular específica) não é afectada ou aumentada pelos desvios de temperatura nos processos de cultura da invenção (por exemplo, Exemplo 6) . Por outro lado, nos processos de cultura associados ao crescimento, a proteína é essencialmente produzida por células em crescimento durante a fase de crescimento da cultura. -89-

De acordo com a presente invenção, a cultura celular pode ser levada a cabo, e as glicoproteinas podem ser produzidas por células, sob condições para a produção de proteínas em larga ou pequena escala, usando recipientes de cultura e/ou aparelhos de cultura que são convencionalmente utilizados na cultura celular de animais ou mamíferos. Conforme será apreciado pelos versados na arte, os pratos de cultura de tecidos, "T-flasks" e pratos de centrifugação são tipicamente usados à escala laboratorial. Para realizar culturas à larga escala (por exemplo, 500 1, 5000 1 e semelhantes), podem ser usados procedimentos que incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, um bioreactor de leito fluidizado, um bioreactor de fibra oca, cultura em frascos rotativos ou um bioreactor de agitação. Podem ou não ser usados microsuportes com os sistemas de frascos rotativos ou com os sistemas de bioreactor de agitação. Os sistemas podem ser operados em modo de "batch", contínua ou "fed-batch". Além disso, o aparelho ou sistema de cultura pode ou não estar equipado com um separador celular usando filtros, gravidade, força centrífuga e semelhantes.

Fases da cultura celular e parâmetros associados O termo "inoculação" refere-se à adição de células ao meio inicial para dar início à cultura. A fase de crescimento de uma cultura é a fase durante a qual a densidade da célula viável em qualquer ponto temporal é mais elevada do que qualquer outro ponto temporal anterior. -90- A fase estacionária de uma cultura é a fase durante a qual a densidade da célula viável é aproximadamente constante (ou seja, dentro do intervalo de erro da medição) ao longo de um periodo de tempo de qualquer extensão. A fase de morte de uma cultura é a fase que se segue à fase de crescimento ou à fase estacionária, e durante a qual a densidade da célula viável em qualquer ponto temporal é inferior a qualquer outro ponto temporal anterior durante essa fase.

Num processo de cultura associada ao crescimento, como os casos em que um composto polianiónico provoca uma fase de crescimento prolongada, a fase de produção pode ter início durante a fase de crescimento extensa.

Num processo de cultura não associada ao crescimento, a fase de produção da cultura celular pode ser a fase estacionária.

Preferivelmente, o meio de cultura é suplementado ("alimentado") durante a fase de produção para apoiar a produção continua de proteína, em especial numa fase de produção prolongada, e para obter amplas quantidades de um produto de glicoproteína de alta qualidade (conforme exemplificado e/ou determinado por um elevado nível de teor de ácido siálico após recuperação da proteína). A alimentação pode ocorrer em regime diário, ou de acordo com outros regimes para promover a viabilidade celular e a produção de proteína.

Durante uma fase de produção prolongada a temperaturas que são alteradas por forma a serem inferiores à(s) temperatura(s) nas fases de crescimento e nas fases de produção iniciais, as células são alimentadas e mantêm-se viáveis. Tal facto resulta na produção de um produto de -91- proteínas durante um período total prolongado ou mais longo do que aquele que ocorre à temperatura de cultura inicial, ou quando a temperatura é alterada apenas uma vez. 0 processo de cultura, de acordo com a presente invenção, pode resultar numa sobrevivência celular mais viável até ao final do período de cultura. Dessa forma, nalgumas variantes, quanto maior for o número de células sobreviventes, maior será o número de células que produzirão o produto desejado. Tal resulta, por sua vez, numa superior quantidade acumulada de produto no final do processo de cultura, sendo que a velocidade de produção pelas células individuais, ou seja a produtividade específica das células, se mantém inalterada. (Veja-se, por exemplo, o Exemplo 4). A produtividade especifica das células ou a velocidade específica das células, conforme conhecido na arte, tipicamente refere-se à velocidade de expressão específica do produto produzido por célula, por medição de massa ou volume celular. A produtividade específica das células é medida em gramas de proteína produzida por célula por dia, por exemplo, e pode ser medida de acordo com um método integral que envolve as seguintes fórmulas: dP/dt ss qp X, P = qp ío Xdt em que qp é a constante da produtividade específica das células, X é o número de células ou volume celular, ou -92- equivalentes de massa celular, e dP/dt é a velocidade da produção de proteínas. Assim, qp pode ser obtido através de um gráfico de concentração do produto versus integral temporal de células viáveis (jV Xdt "dias de células viáveis"). De acordo com esta fórmula, quando a quantidade de glicoproteína produzida é exibida em contraposição com os dias de células viáveis, a curva é equivalente à velocidade específica das células. As células viáveis podem ser determinadas através de diversas medições, por exemplo, biomassa, velocidade de absorção de 02, lactase desidrogenase (LDH), volume de hematócrito ou turvação. (por exemplo, patente de invenção norte-americana n.° 5705364 de T. Etcheverry et al.).

Produção de moléculas de CTLA4 solúveis e de moléculas de CTLA4 mutantes através de métodos de cultura da presente invenção

Noutras variantes incluídas na presente invenção, são utilizados métodos de cultura celular para produzir uma molécula de CTLA4 solúvel ou uma molécula de CTLA4 mutante solúvel, conforme infra descrito. Uma molécula de CTLA4 solúvel é, preferivelmente, uma proteína de fusão CTLA4, preferivelmente uma CTLA4Ig. Mais preferivelmente, é CTLA4Ig que inclui aminoácidos -1 a 357 ou +1 a 357 conforme mostrado na FIG. 8. Mais preferivelmente é CTLA4Ig composto por aminoácidos -1 a 357 conforme mostrado na FIG. 8. Uma molécula de CTLA4 mutante solúvel é preferivelmente Ll04EA29YIg que inclui aminoácidos -1 a 357 ou +1 a 357 conforme mostrado na FIG. 9, mais preferivelmente composta por aminoácidos -1 a 357 ou +1 a 357 conforme mostrado na -93- FIG. 9. Os métodos de cultura celular com alteração de temperatura de dois e três passos envolvendo fases de produção prolongadas para produção de proteína e alimentação com meio contendo D-galactose, são especialmente adequados para gerarem grandes quantidades de moléculas de CTLA4 solúveis e moléculas de CTLA4 mutantes solúveis de alta qualidade, por parte das suas células hospedeiras em cultura.

Numa variante preferida, CTLA4Ig é produzido por células hospedeiras recombinantes. A proteína de fusão de CTLA4Ig pode ser produzida de forma recombinante por células CHO transfectadas com um vector contendo a sequência de ADN que codifica o CTLA4Ig. (Veja-se a patente de invenção norte-americana n.° 5844095 de P. S. Linsley et al., e os Exemplos aqui apresentados). A proteína de fusão CTLA4Ig é produzida em grande quantidade e é adequadamente sialilada quando cultivada de acordo com os processos multi-etapas de alteração de temperatura da presente invenção. A invenção obtém a produção de elevados níveis de produto de proteína recuperável, por exemplo, produto de proteína CTLA4Ig sialilada. Numa outra variante preferida, a molécula mutante de CTLA4 solúvel Ll04EA29YIg que inclui aminoácidos -1 a 357 ou +1 a 357, conforme mostrado na FIG. 9, é produzida através dos métodos de cultura celular da presente invenção.

Um ligando da CTL4 é uma molécula B7. Conforme utilizado, o termo "ligando" refere-se a uma molécula que reconhece especificamente e se liga a uma outra molécula. A interacção de uma molécula com o seu ligando pode ser regulada pelos produtos dos processos de cultura da presente invenção. Por exemplo, a interacção da CTLA4 com o -94- seu ligando B7 pode ser bloqueada através da administração de moléculas de CTLA4lg. Enquanto outros exemplos, a interacção do Factor de Necrose Tumoral (TNF) com o seu ligando, o receptor TNF (TNFR), pode ser bloqueado através da administração de etanercept ou outras moléculas de bloqueio TNF/TNFR. A CTLA4 de tipo selvagem ou "CTLA4 não mutada" possui a sequência de aminoácido de CTLA4 "full length" de ocorrência natural, conforme mostrado na FIG. 10 (e também conforme descrito nas patentes de invenção norte-americanas n.° 5434131, 5844095 e 58151795, incorporadas por referência na sua totalidade), ou qualquer porção da mesma que reconheça e se ligue a uma molécula B7, ou interfira com uma molécula B7, de forma que a ligação a CD28 e/ou a CTLA4 (por exemplo, CD28 e/ou CTLA4 endógeno) é bloqueada. A CTLA4 de tipo selvagem inclui determinadas porções, incluindo, por exemplo, o domínio extracelular da CTLA4 de tipo selvagem que começa com metionina na posição +1 e termina com ácido aspártico na posição +124, ou o domínio extracelular da CTLA4 de tipo selvagem que começa com alanina na posição -1 e termina com ácido aspártico na posição +124, conforme mostrado na FIG. 10. A CTLA4 de tipo selvagem de ocorrência natural é uma proteína da superfície celular com um domínio extracelular N-terminal, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático C-terminal. O domínio extracelular liga-se a uma molécula alvo, tal como uma molécula B7. Na célula, a proteína CTLA de tipo selvagem é traduzida sob a forma de um polipeptídeo imaturo, que inclui um peptídeo sinal na extremidade amino ou N-terminal. O polipeptídeo imaturo sofre um processo pós-traducional que inclui a clivagem e -95- remoção do peptídeo sinal para gerar um produto de clivagem de CTLA4 com uma extremidade N-terminal nova que difere da extremidade N-terminal da forma imatura. Os versados na arte verificarão que pode ocorrer um processo pós-translaccional que remove um ou mais aminoácidos da extremidade N-terminal nova do produto de clivagem da CTLA4. A proteína CTLA4 madura pode começar com metionina na posição +1 ou alanina na posição -1. A forma madura da molécula CTLA4 inclui o domínio extracelular ou qualquer porção da mesma, que se liga a B7. A expressão "molécula CTLA4 mutante", conforme usada, refere-se a uma molécula que inclui CTLA4 de tipo selvagem conforme mostrado na FIG. 10, ou qualquer porção ou derivado da mesma, que possui uma mutação ou múltiplas mutações, na sequência da CTLA4 de tipo selvagem, preferivelmente no domínio extracelular da CTLA4 de tipo selvagem, e se liga a B7. Uma molécula mutante de CTLA4 possui uma sequência que é semelhante, mas não idêntica, à sequência da molécula da CTLA4 de tipo selvagem, mas ainda assim se liga a B7. As mutações podem incluir um ou mais resíduos de aminoácidos substituídos por um aminoácido com uma estrutura conservativa (por exemplo, uma leucina substituída por uma isoleucina) ou não conservativa (por exemplo uma glicina substituída por triptofano) ou propriedades químicas, deleções de aminoácidos, adições, mutação por deslocamento da grelha de leitura ("frameshift") ou truncagem.

As moléculas mutantes de CTLA4 podem incluir uma molécula não-CTLA4 da mesma ou anexada à mesma, ou seja, proteínas de fusão de CTLA4 mutantes. As moléculas mutantes podem ser solúveis (ou seja, circulantes) ou podem estar ligadas a -96- uma superfície celular (ligadas à membrana). As moléculas mutantes de CTLA4 incluem Ll04EA29Yig e aquelas descritas no pedido de patente de invenção norte-americana números 09/865321, 60/214065 e 60/287576, na patente de invenção WO 01/92337 A2, nas patentes de invenção norte-americana números 6090914, 5844095 e 5773253 e conforme descrito em R. J. Peach et al., 1994, J. Exp. Med. 180:2049-2058. As moléculas mutantes de CTLA4 podem ser produzidas de forma sintética ou recombinante. A CTLA4Igé uma proteína de fusão solúvel que inclui um domínio extracelular da CTLA4 de tipo selvagem, ou uma porção da mesma, que se liga a B7, unida a uma molécula de imunoglobina (Ig), ou uma porção da mesma. O domínio extracelular de CTLA4 ou porção da mesma está ligada a uma fracção Ig que inclui toda ou parte de uma molécula de imunoglobina, preferivelmente toda ou uma porção de uma região constante de imunoglobulina tal como toda ou uma porção de igCyl (IgGamal), IgCy2 (lgGama2), IgCY3 (igGama3), igCY4 (lgGama4), igCp (igCmu), igCal (igcalfal), lgCa2 (Igcalfa2), IgCõ (IgCdelta) ou IgCs (IgCepsilon), tornando a molécula de fusão solúvel. A fracção Ig pode incluir os domínios de charneira CH2 e CH3, ou os domínios CH 1, CH2 e CH3 de charneira, das regiões constantes supra mencionadas ou outras regiões constantes. Preferivelmente, a fracção Ig é humana ou de macaco e inclui os domínios de charneira CH2 e CH3. Mais preferivelmente, a fracção Ig inclui os domínios de charneira CH2 e CH3 de igCyl· ou é composta pelos domínios de charneira CH2 e CH3 de IgCyl· humano. Numa fracção 1 de CTLA4Ig, a região constante Ig ou porção da mesma pode ser mutada, resultando, assim, numa redução das suas funções efectoras (veja-se, a titulo de -97- exemplo, as patente de invenção norte-americanas números 5637481, 5844095 e 5434131). Conforme usado, os termos "fracção Ig", "região constante Ig", "domínio Ig C(constante), IgCyl (IgGamal), IgCy2 (IgGama2), IgCY3 (IgGama3), IgCY4 (IgGama4), IgCp (IgCmu), IgCal (IgCalphal), lgCa2 (lgCalfa2), IgCõ (igCdelta) ou igCs (IgCepsilon), incluem as seguências nativas e seguências que foram mutadas, tal como, por exemplo, sequências com mutações na região constante que reduzem a função efectora.

Uma determinada variante relacionada com a CTLA4 inclui o dominio extracelular da CTLA4 de tipo selvagem que começa com metionina na posição +1 e termina com ácido aspártico na posição +124, ou começa com alanina na posição -1 e ácido aspártico na posição +124, um resíduo de aminoácido glutamina na posição +125 e uma porção de imunoglobulina que inclui ácido glutâmico na posição +126 até lisina na posição +357, conforme mostrado na FIG. 8. O ADN que codifica esta CTLA4lg foi depositado a 31 de Maio de 1991, na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, nos termos do Tratado de Budapeste, e foi acordado o número de acesso ATCC 68629; P. Linsley et al., 1994, Immunity 1:793-80. Uma linha celular CHO que expressa CTLA4ig foi depositada a 31 de Maio de 1991 na ATCC sob o número de identificação CRL-10762. As moléculas de CTLA4Ig solúveis produzidas de acordo com os métodos descritos podem ou não incluir uma sequência peptídica sinal (líder). As FIG. 8 e 9 incluem uma ilustração de uma sequência peptídica sinal (líder). Tipicamente, as moléculas não incluem um peptído sinal.

Ll04EA29YIg é uma proteína de fusão que é uma molécula mutante de CTLA4 solúvel que inclui um domínio extracelular -98- de CTLA4 de tipo selvagem com alterações de aminoácidos A29Y (um resíduo de aminoácido tirosina substitui uma alanina na posição 29) e L104E (um resíduo de aminoácido glutâmico substitui uma leucina na posição +104) ligadas a uma cauda Ig. A FIG. 9 ilustra a Ll04EA29YIg. A sequência de aminoácido de Ll04EA29Ylg inclui alanina na posição -1 a lisina na posição de aminoácido +357 conforme ilustrado na FIG. 9. Em alternativa, a sequência de aminoácido de L104EA29YIg inclui metionina na posição de aminoácido -1 a lisina na posição de aminoácido +357, conforme ilustrado na FIG. 9. Ll04EA29YIg inclui um resíduo de aminácido glutamina na posição +125 e uma porção Ig que inclui ácido glutâmico na posição +126 até lisina na posição +357. O ADN que codifica Ll04EA29YIg foi depositado a 20 de Junho de 2000 na American Type Culture Collection (ATCC), nos termos do Tratado de Budapeste, e foi acordado o número de acesso ATCC PTA-2104. 104EA29YIg é descrito nos pedidos de patente de invenção norte-americanas pendentes com os números de série 09/579927, 60/287576 e 60/214065, e na patente de invenção WO 01/923337 A2, que são incorporados por referência na sua totalidade. As moléculas solúveis de Ll04EA29YIg produzidas pelos métodos de cultura da presente invenção podem ou não incluir uma sequência peptídica sinal (líder). Tipicamente, as moléculas produzidas de acordo com a invenção não incluem uma sequência peptídica sinal.

Conforme usado, o termo "solúvel" refere-se a qualquer molécula, ou fragmento da mesma, não ligado a uma célula, ou seja, circulando. Por exemplo, CTLA4, B7 ou CD28 podem ser tornadas solúveis anexando uma fracção Ig ao domínio extracelular de CTLA4, B7 ou CD28, respectivamente. Em alternativa, uma molécula como CTLA4 pode ser tornada -99- solúvel através da remoção do seu domínio transmembranar. Tipicamente, as moléculas solúveis de acordo com a invenção não incluem uma sequência sinal (ou líder). A expressão "molécula solúvel de CTLA4" refere-se a uma molécula não ligada à superfície celular (ou seja, circulante) que inclui CTLA4 de tipo selvagem ou qualquer porção ou derivado que se liga a B7, incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, proteínas de fusão CTLA4 solúveis, tais como as proteínas de fusão CTLA4Ig (por exemplo, ATCC 68629), em que o domínio extracelular de CTLA4 está fundido a uma fracção ig que é toda ou uma porção de uma molécula Ig, preferivelmente toda ou uma porção de uma região constante Ig, como toda ou uma porção de lgCyl (lgGamal), lgCY2 (lgGama2), lgCY3 (lgGama3), lgCY4 (lgGama4), lgCp (lgCmu), lgCal (lgCalphal), lgCa2 (lgCalpha2), lgCõ (lgCdelta) ou lgCs (lgCepsilon), que tornam a molécula de fusão solúvel, proteínas de fusão CTLA4 solúveis nas quais o domínio extracelular é fundido ou ligado a uma porção de uma proteína biologicamente ou quimicamente activa, como o gene do papilomavírus E7 (CTLA4-E7), o antigénio associado ao melanona p97 (CTLA4-p97) ou a proteína env HIV (CTLA4-env gpl20), conforme descrito na patente de invenção norte-americana n.° 5844095, incorporada por referência na sua totalidade, proteínas de fusão híbridas (quiméricas) como a CD28/CTLA4Ig conforme descritas na patente de invenção norte-americana n.° 5434131, incorporada por referência na sua totalidade, moléculas de CTLA4 com o domínio transmembranar removido para tornar a proteína solúvel (veja-se, por exemplo, M. S. Oaks et al.r 2000, Cellular -100 -

Immunology, 201:144-153, incorporado por referência na sua totalidade), a molécula mutante CTLA4 solúvel Ll04EA29Ylg.

Uma molécula CTLA4 solúvel também pode ser uma molécula mutante de CTLA4 solúvel. As moléculas CTLA4 solúveis produzidas de acordo com a presente invenção podem ou não incluir uma sequência peptidica sinal (líder). O peptideo sinal ser qualquer sequência que permita a secreção da molécula, incluindo o peptideo sinal de oncostatina M (Malik et al., 1989, Molec. Cell. Biol., 9:2847-2853) ou CD5 (N. H. Jones et al.r 1986, Nature, 323:346-349), ou o petídeo sinal de qualquer proteína extracelular. A molécula CTLA4 solúvel produzida pelos processos de cultura da invenção podem incluir o peptideo sinal de oncostatina M ligado à extremidade N-terminal do domínio extracelular de CTLA4. Tipicamente, na invenção, as moléculas não incluem uma sequência peptidica sinal. A proteína de fusão CTLA4, conforme usada, refere-se a uma molécula que inclui o domínio extracelular da CTLA4 de tipo selvagem, ou uma porção da mesma, que se liga a B7, fundida a uma fracção não CTLA4 que torna a molécula de CTLA4 solúvel, tal como uma fracção Ig. Por exemplo, uma proteína de fusão CTLA4 pode incluir o domínio extracelular de CTLA4 fundida a toda ou a uma porção de uma região constante Ig. Exemplos de domínios constantes Ig (ou porções dos mesmos) que podem ser ligados a CTLA4 incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, todos aqueles supra enumerados. A proteína de fusão CTLA4 também pode ser uma molécula mutante CTLA4.

Conforme usado, o termo "fracção não CTLA4" refere-se a uma molécula ou porção da mesma que não se liga a CD80 e/ou CD86 e não interfere com a ligação de CTLA4 ao seu -101 - ligando. Exemplos incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, uma fracção Ig que é toda ou uma porção de uma molécula Ig, uma porção de uma proteina biológica ou quimicamente activa como o gene E7 do papilomavirus (CTLA4-E7), o antigénio p97 associado ao melanoma (CTLA4-p97) ou a proteina env do HIV (CTLA4-env gpl20) (conforme descrito na patente de invenção norte-americanas da série 5844095, incorporada por referência na sua totalidade). Exemplos de fracções Ig incluem todo ou uma porção de um domínio constante de imunoglobulina, tal como lgCyl (lgGamal), lgCy2 (lgGama2), lgCY3 (lgGama3), lgCY4 (lgGama4), lgCp (lgCmu), lgCal (lgCalphal), lgCa2 (lgCalpha2), lgCõ (lgCdelta) ou lgCe (lgCepsilon) . A fracção Ig pode incluir os domínios de charneira CH2 e CH3, ou o domínio CHI, ou os domínios de charneira CH2 e CH3 das regiões constantes supra mencionadas ou de outras regiões constantes. Preferivelmente, a fracção Ig é humana ou de macaco e inclui os domínios de charneira CH2 e CH3. Mais preferivelmente, a fracção ig inclui os domínios de charneira CH2 e CH3 de lgCYl ou é composta pelos domínios de charneira CH2 e CH3 de lgCYl humano. Numa fracção Ig de CTLA4Ig, a região constante Ig ou porção da mesma pode ser mutada, resultando, assim, numa redução das suas funções efectoras (veja-se, a título de exemplo, as patente de invenção norte-americanas números 5637481, 5844095 e 5434131) . O domínio extracelular da CTLA4 refere-se a qualquer porção de CTLA4 de tipo selvagem que reconhece e se liga a B7. Por exemplo, um domínio extracelular de CTLA4 inclui metionina na posição +1 e ácido aspártico na posição +124 (FIG. 10). Por exemplo, um domínio extracelular de CTLA4 -102- inclui alanina na posição -1 e ácido aspártico na posição + 124 (FIG. 10) .

Conforme usado, o termo "mutação" refere-se a uma alteração da sequência nucleotidica ou de aminoácido de uma molécula de tipo selvagem, por exemplo, uma alteração do ADN e/ou das sequências de aminoácidos do domínio extracelular da CTLA4 de tipo selvagem. Uma mutação no ADN pode alterar o codão, levando a uma alteração na sequência de aminoácido codificada. Uma alteração do ADN pode incluir substituições, deleções, inserções, "splicing" alternativo ou truncagens. Uma alteração do aminoácido pode incluir substituições, deleções, inserções, adições, truncagens ou erros de processamento ou clivagem da proteína. Em alternativa, as mutações numa sequência nucleotidica podem resultar numa mutação silenciosa da sequência de aminoácidos, como é bem sabido na arte. Tal como é também sabido, alguns codões nucleotídicos codificam o mesmo aminoácido. Exemplos incluem codões nucleotídicos CGU, CGG, CGC e CGA, que codificam o aminoácido, arginina (R), ou codões GAU e GAC que codificam o aminoácido ácido aspártico (D) .

Assim, uma proteína pode ser codificada por uma ou mais moléculas de ácido nucleico que diferem na sua sequência nucleotidica específica, mas ainda assim codificam as moléculas de proteínas com sequências idênticas. A molécula mutante pode ter uma ou mais do que uma mutação. Para orientação, a sequência de codificação do aminoácido é a seguinte: -103-

Aminoácido Símbolo Símbolo de uma letra Codões Alanina Ala A GCU, GCC, GCA, GCG Cisteína Cys C UGU, UGC Ácido aspártico Asp D GAU, GAC Ácido glutâmico Glu E GAA, GAG Fenilalanina Phe F UUU, UUC Glicina Gly G GGU, GGC, GGA, GGG Histidina His H CAU, CAC Isoleucina lie I AUU, AUC, AUA Lisina Lys K AAA, AAG Leucina Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAU, AAC Prolina Pro P CCU, CCC, CCA, CCG Glutamina Gin Q CAA, CAG Arginina Arg R CGU, CGC, CGA. CGG, AGA, AGG Serina Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC Treonina Thr T ACU, ACC, ACA, ACG Valina Vai V GUU, GUC, GUA, GUG -104-

Triptofano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAU, UAC

Conforme usado, um fragmento ou porção é qualquer parte ou segmento de uma molécula. Para CTLA4 ou CD28, um fragmento ou porção é preferivelmente o domínio extracelular de CTLA4 ou CD28, ou uma parte ou segmento do mesmo, que reconhece e se liga a B7 ou interfere com uma B7 de forma que esta bloqueia a ligação a CD28 e/ou a CTLA4. Igualmente, conforme usado, o termo "correspondente" significa que partilha a identidade sequencial. O termo "B7", conforme usado, refere-se a qualquer membro da família de moléculas B7 incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a B7-1 (CD80) (Freeman et al., 1989, J. Immunol., 143-2714-2722, incorporada por referência na sua totalidade), B7-2 (CD86) (Freeman et al., 1993, Science, 262:909-911, incorporada por referência na sua totalidade, Azuma et al., 1993, Nature, 366:76-79, incorporada por referência na sua totalidade) que reconhece e se liga a CTLA4 e/ou CD28. O termo "CD28" refere-se à molécula que reconhece e se liga a B7 conforme descrito nas patentes de invenção norte-americanas da série n.° 5580756 e 5521288 (incorporadas por referência na sua totalidade). Conforme usado, o termo "células B7 positivas" inclui quaisquer células com um ou mais tipos de moléculas B7 expressas na superfície celular.

Conforme usado, o termo "derivado" refere-se a uma molécula que partilha similitude sequencial e actividade com a sua molécula mãe. Por exemplo, um derivado de CTLA4 inclui uma molécula solúvel de CTLA4 com uma sequência de aminoácido com pelo menos 7 0% de similitude com o domínio -105- extracelular da CTLA4 de tipo selvagem, e que reconhece e se liga a B7, por exemplo, CTLA4ig ou a molécula mutante de CTLA4 solúvel L104EA29YIg. Um derivado refere-se a qualquer alteração na sequência de aminoácido e/ou qualidade quimica do aminoácido, por exemplo, análogos de aminoácidos.

Conforme usado, a expressão "regular uma resposta imune" significa activar, estimular, regular, inibir, bloquear, reduzir, atenuar, ou modificar a resposta imune. Diversas doenças auto-imunes podem ser tratadas através da regulação de uma resposta imune, por exemplo, através da regulação das interacções funcionais de células positivas de CTLA4 e/ou CD28 com células positivas da B7. Por exemplo, um método para regular uma resposta imune inclui o contacto de células positivas da B7 com uma molécula solúvel de CTLA4, tais como aquelas produzidas de acordo com a presente invenção, para formar complexos solúveis CTLA4/B7, em que a molécula solúvel de CTLA4 interfere com a reacção de uma molécula CTLA4 e/ou C28 endógena com uma molécula B7. Os termos "bloquear" ou "inibir" um receptor, sinal ou molécula, conforme referido, significa interferir com a activação do receptor, sinal ou molécula, conforme detectado por um teste convencional. O bloqueio ou inibição pode ser parcial ou total.

Conforme usado, o termo "bloquear a interacção da B7" refere-se à interferência com a ligação da B7 aos seus ligandos, como CD28 e/ou CTLA4, obstruindo, assim, as interacções das células T e das células positivas da B7. Exemplos de agentes que bloqueiam as interacções da B7 incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, as moléculas como um anticorpo (ou porção do mesmo) que reconhece e se liga a qualquer uma das moléculas CTLA4, -106 - CD28 ou B7 (por exemplo, B7-1, B7-2), uma forma solúvel (ou porção da mesma) das moléculas, tais como CTLA4 solúvel, um fragmento peptídico ou outra pequena molécula concebida para interferir com o sinal celular através de uma interacção mediada por CTLA4/CD28/B7. Numa variante preferida, o agente de bloqueio é uma molécula solúvel de CTLA4, tal como a CTLA4Ig (ATCC 68629) ou Ll04EA29YIg (ATCC PTA-2104), uma molécula solúvel de CD28, tal como CD281g (ATCC 68628), uma molécula B7 solúvel, tal como B7-Ig (ATCC 68627), um anticorpo monoclonal anti-B7 (por exemplo, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 e anticorpos monoclonais conforme descritos na patente de invenção norte-americana n.° 6113898 ou em Yokochi et al., 1982, J. Immunol., 128(2):823-827), um anticorpo monoclonal anti-CTLA4 (por exemplo, ATCC HB-304 e anticorpos monoclonais conforme descritos nas referências 82-83) e/ou um anticorpo monoclonal anti-CD28 (por exemplo, ATCC HB 11944 e MAb 9.3, conforme descrito em Hansen et al., 1980, Immunogenetics, 10:247-260, ou Martin et al., 1984, J. Clin. Immunol., 4(1):18-22). O bloqueio das interacções da B7 pode ser detectado através de testes convencionais, tal como a determinação da redução de sintomas associados a doenças imunes (por exemplo, doenças reumáticas), a determinação de uma redução nas interacções entre células T/B7, ou a determinação de uma redução na interacção da B7 com CTLA4/CD28. O bloqueio pode ser parcial ou total.

Também conforme utilizado, o termo "quantidade eficaz de uma molécula" refere-se a uma quantidade que bloqueia a interacção da molécula com o seu ligando. Por exemplo, uma quantidade eficaz de uma molécula que bloqueia a interacção -107 - da B7 com CTLA4 e/ou CD28 corresponde à quantidade de molécula que, quando ligada às moléculas B7 das células positivas da B7, inibe as moléculas B7 de se ligarem a ligandos endógenos, tal como a CTLA4 e CD28. Em alternativa, uma quantidade eficaz de uma molécula que bloqueia a interacção da B7 com CTLA4 e/ou CD28 é a quantidade da molécula que, quando ligada às moléculas das células T da CTLA4 e/ou CD28, inibe as moléculas da B7 de se ligarem a ligandos endógenos como CTLA4 e CD28. A inibição ou bloqueio pode ser parcial ou completo.

Quanto aos protocolos clínicos, é preferível que a fracção Ig de uma proteína de fusão, tal como CTLA4Ig ou CTLA4Ig mutante, não provocam uma resposta imune prejudicial num indivíduo. A fracção preferida é toda ou uma porção da região constante Ig, incluindo as regiões constantes Ig humanas ou de primatas. Exemplos de regiões Ig adequadas incluem lgCyl (lgGamal), lgCY2 (lgGama2), lgCY3 (lgGama3), lgCY4 (lgGama4), lgCp (lgCmu), lgCal (lgCalphal), lgCa2 (lgCalpha2), lgCõ (lgCdelta) ou lgCs (lgCepsilon), incluindo os domínios de charneira de CH2 e CH3, ou o domínio CHI, ou os domínios de charneira CH2 e CH3, envolvidos nas funções efectoras tal como a ligação aos receptores Fc, a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou a citotoxicidade dependente de anticorpos mediada pelas células (ADCC). A fracção Ig pode ter uma ou mais mutações (por exemplo, no domínio CH2 para reduzir as funções efectoras como CDC ou ADCC), em que a mutação modula a capacidade de Ig se ligar ao seu ligando através do aumento ou redução da capacidade do Ig se ligar aos receptores Fc. Por exemplo, as mutações na fracção Ig podem incluir alterações em alguns ou em todos os seus -108 - resíduos de cisteína no interior do domínio de charneira. Por exemplo, conforme mostrado na FIG. 8, as cisteínas nas posições +130, +136 e +139 são substituídas por serina. A fracção Ig também pode incluir a proteína na posição +148 substituída por uma serina, conforme ilustrado na FIG. 8. Além disso, as mutações na fracção Ig podem incluir a leucina na posição +144 substituída por fenilalanina, leucina na posição +145 substituída por ácido glutâmico ou glicina na posição +147 substituída por alanina.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos descrevem aspectos específicos da invenção a fim de ilustrar a invenção e proporcionar uma descrição dos presentes métodos aos versados na arte. Os exemplos não devem ser interpretados como limitativos da invenção, já que estes meramente apresentam uma metodologia e exemplificação específica que são úteis para a compreensão e prática da invenção e dos seus vários aspectos.

Os Exemplos 1 e 2, conforme apresentados, descrevem experiências relacionadas com os processos de cultura celular envolvendo uma alimentação de galactose utilizada em combinação com múltiplas alterações de temperatura. Os Exemplos 3-6 descrevem experiências relacionadas com os processos de cultura celular envolvendo alterações de temperatura durante a cultura, sem alimentação de galactose. Os Exemplos 7-13 descrevem experiências relacionadas com os processos de cultura celular envolvendo uma adição controlada de composto polianiónico em -109 - combinação com alimentação de galactose e múltiplas alterações de temperatura. EXEMPLO 1

Este Exemplos descreve o processo de cultura com alimentação contínua de D-galactose para a cultura de células recombinantes que produzem a proteína de fusão CTLA4Ig exemplificada, conforme descrito no Exemplo 2.

As células foram expandidas em meio CD-CHO modificado (Invitrogen, CA) contendo glutamina, bicarbonato de sódio, insulina e metotrexato (Quadro 1) usando frascos T-75 e frascos centrifugadoras de 250, 500 e 1000 mL. Os "T-flasks" e os frascos centrifugadores foram incubados a 37°C e 6% de C02.

Quadro 1

Componente modificado do meio CD-CHO Concentração CD-CHO 25x Ácidos I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L CD-CHO 25x Ácidos II (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L CD-CHO 25x Sais I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L CD-CHO 25x Sais II (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L L-glutamina (Invitrogen) 0,585 g/L Insulina r-humana (10 mg/mL) (Invitrogen) 0,1 ml/L Metotrexato (solução de 20 mM) (ICN, Costa Mesa, CA) 5 μΙ/L Bicarbonato de sódio (Mallenkrodt Baker, Phillipsburg, NJ) 2,22 g/L

Após suficiente inoculação, transferiu-se a cultura para um bioreactor de 5 ou 50 L com um volume de trabalho -110 - de 3 ou 30 L, respectivamente, do mesmo meio. A densidade de "seeding" inicial era de 200 000 células viáveis/mL. O recipiente de 5 L era um reactor de vidro equipado com uma turbina marítima (Applikon, Foster City, CA), o recipiente de 50 L era um reactor de aço inoxidável (Feldmeier, Syracuse, NY) equipado com duas turbinas marítimas, um sistema de aquisição de dados usando uma temperatura, pH e execuções DO com software Fix32 da Intellution. Os caudais de gás foram controlados através de rotâmetros. O ar foi introduzido no reactor através de uma frita submersa (diâmetro de poros: 5 pm) e através do espaço cabeça do reactor para remoção do CO2. Introduziu-se oxigénio molecular através da mesma frita para controlo DO. Introduziu-se C02 através da mesma frita para controlo do pH do lado de alta pressão. O controlo do pH do lado de baixa pressão foi realizado através da adição de 1 N de NaOH. A cultura no bioreactor foi alimentada com um bólus diário usando um meio eRDF modificado (Invitrogen, CA), (Quadro 2) contendo glucose, glutamina, insulina, "yeastolate" TC (Becton Dickinson) e D-galactose da seguinte forma: com início um dia após a inoculação, adicionou-se um mínimo de 1% do volume de cultura como meio de alimentação; se o nível de glucose fosse inferior a 3 g/L, adicionou-se um volume calculada para que o nível de glucose regressasse a 3 g/L. O processo de fermentação teve uma duração de 14 a 21 dias. Retiraram-se as amostras diariamente do reactor. Marcou-se a amostra usada para contagem celular com azul de triptano (Sigma, MO) . Procedeu-se à contagem celular e à determinação da viabilidade celular através de hemocitómetro/microscópio. -111 -

Para a análise dos metabolitos, centrifugou-se uma amostra adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para separação celular. Analisou-se o sobrenadante quanto aos seguintes parâmetros: titulação, ácido siálico, glucose, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amónia e LDH.

Quadro 2

Componente modificado de meio eRDF Concentração eRDF (Invitrogen, Carlsbad, CA) 16,8 g/L dextrose (VWR-Mallenkrodt Baker) 30,94 g/L L-glutamina (Invitrogen) 4,1 g/L insulina r-humana 1 ml/L TC Yeastolate (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 5 g/L D-galactose (Ferro-Pfanstiehl, 0; 0,3; 12,5 ou Waukegan, IL) 20,0 g/L

Produziram-se culturas celulares a larga escala num reactor de 5000 L com um volume de trabalho de 4500 L usando reactores de aço inoxidável (Feldmeier, NY) com um rácio de 3:1 equipado com três turbinas marítimas. A cultura inoculada foi expandida das centrifugadoras para semear os reactores, sendo que a densidade inicial de "seeding" à escala de 5000 L foi de 150-200 000 células viáveis/mL. Os métodos experimentais relacionados com as culturas de larga escala e com os controlos foram idênticos àqueles descritos relativamente aos processos de 5 L e 50 L. -112 - EXEMPLO 2

Este Exemplo descreve a cultura de células que produzem CTLA4Ig, conforme mostrado na FIG. 3 como -1 a 357 ou +1 a 357 (DNA codificante depositado sob o número ATCC 68629), usando vários conjuntos de condições de cultura experimentais para comparações relacionadas com os parâmetros finais de titulação e com os parâmetros finais de ácido siálico do produto proteico. Estes resultados foram obtidos a partir de um método de cultura celular que envolveu um processo de dois passos com alteração de temperatura e um regime de alimentação diário no qual estava presente uma quantidade eficaz sustentadora de ácido siálico de D-galactose no meio de alimentação. Observou-se uma melhoria da qualidade do produto.

As condições de cultura nos bioreactores de 5, 50 e 5000 L foram controladas da seguinte forma: pH a 7.0, oxigénio diluído a 40-60%, agitação a 30-50 rpm, contrapressão a 5 psi (pressão ambiente dos reactores de vidro de 5 L). Utilizou-se um método de cultura celular com duas alterações de temperatura que incluiu uma primeira temperatura de 37°C, reduzida para uma segunda temperatura de 34°C no 6.° dia e para uma terceira temperatura de 32°C no dia 10.

Descrição dos conjuntos experimentais

Conjunto experimental I: cultura de 5 L com meio de alimentação sem qualquer D-galactose;

Conjunto experimental II: cultura de 5 L com meio de alimentação com 12,5 g/L de D-galactose; -113-

Conjunto experimental III: cultura de 50 L com meio de alimentação sem qualquer D-galactose;

Conjunto experimental IV: cultura de 50 L com meio de alimentação com 3,0 g/L de D-galactose; (No Conjunto experimental IV, a alimentação de D-galactose foi descontinuada no 10.° dia, tendo-se usado um meio de alimentação regular (sem D-galactose) a partir do dia 11 ao dia 16);

Conjunto experimental V: cultura de 50 L com meio com 12,5 g/L de D-galactose;

Conjunto experimental VI: cultura de 50 L com meio com 20,0 g/L de D-galactose;

Conjunto experimental VII: cultura de 5000 L com meio de alimentação sem qualquer D-galactose; e

Conjunto experimental VIII: cultura de 5000 L com meio de alimentação com 12,5 g/L de D-galactose.

Conforme observado a partir dos resultados apresentados no Quadro 3, a utilização de 12,5 g/L de D-galactose no meio de alimentação aumentou significativamente o teor de ácido siálico do produto numa escala de 5, 50 e 5000 L comparativamente com os controlos, nos quais não se inclui qualquer D-galactose na alimentação. Além disso, a adição de 3 g/L de D-galactose numa escala de 50 L, que foi descontinuada no 10.° dia, teve um impacto positivo temporário sobre o teor de sialilação (Conjunto experimental VI, Quadro 3 e FIG. 1), mas os niveis de ácido siálico diminuíram pouco depois do 10.° dia. O nivel de sialilação aumentou com uma concentração mais elevada de D-galactose (12,5 g/L) no meio de alimentação em escala de 50 L (Conjunto experimental V, -114 -

Quadro 3, FIG. 1). Esta conclusão apoia uma maior concentração de alimentação de D-galactose no meio e um regime de alimentação diário que utiliza um meio de alimentação que inclui D-galactose.

Quadro 3

Exemplo #: Escala do reactor [L] Estratégia alimen tação de SA (NANA) [razão molar de proteína total] Galactose [razão molar de proteína total] Titulação [g/L] I 5 sem D-galactose no meio de 7,5 8, 8 1,8 alimentação (12. ° dia) (12.° dia) (14.0 dia) II 5 12,5 g/L de D- galactose no 9,1 15, 9 (12.0 1,9 meio de (12.0 dia) dia) (14. ° dia) alimentação III 50 sem D-galactose 6,1 (13. O 9,2 (13. ° 1,4 (13. ° no meio de dia) dia) dia) alimentação 5,0 (16. O 8,1 (16.0 2,0 (16.0 dia) dia) dia) IV 50 3, 0 g/L de D- galactose no 7,8 1,2 (13. ° meio de (13.0 dia) n/a dia) alimentação; alimentação de 5,5 1,9 (16. ° D-galactose (16. 0 dia) n/a dia) descontinuada no 10.° dia V 50 12,5 g/L de D- 9,4 (14. 0 13,3 (14. 0 1,4 (14. 0 galactose no dia) dia) dia) meio de 8,2 (20 . 0 14, 4 (20. ° alimentação dia) dia) 2,4 (20. ° dia) VI 50 2 0,0 g/L de D- 8,4 (14. 0 14, 5 (14. 0 1,4 (14. o galactose no dia) dia) dia) meio de 6,2 (21. 0 11,2 (21. ° 2,7 (21. ° alimentação dia) dia) dia) -115- VII 5000 sem D-galactose no meio de alimentação 5,3 (12.° dia) 9,1 (12.° dia) 0,85 (12.° dia) VIII 5000 12,5 g/L de D-galactose no meio de alimentação 9,7 (14.° dia) 11,5 (14.° dia) 0,80 (14.° dia)

De acordo com estas experiências, a adição de D-galactose não afectou significativamente a produtividade especifica das células (ou seja, aumento da titulação) (FIG. 2). Um outro aumento da concentração de D-galactose na alimentação, para 20,0 g/L, não apresentou quaisquer efeitos benéficos adicionais (Conjunto Experimental vi, Quadro 3, FIG. 1). A FIG. 3 mostra a concentração residual de D-galactose na cultura numa concentração de 12,5 g/L de D-galactose na alimentação, que se concluiu ser óptima nas escalas de 50 L e 5000 L. Durante a fase de produção, quando a titulação aumentou (ou seja, nos 6.° e 21.° dias), a concentração residual de D-galactose na cultura teve de ser mantida a > 0,25 g/L. A FIG. 4 ilustra o efeito observado durante o aumento do processo de cultura celular para 5000 L para a produção de CTAL41g. A sialilação da glicoproteina diminuiu com o aumento da escala do reactor. A FIG. 5 mostra a inversão do efeito de escala após a adição de 12,5 g/L de D-galactose no meio de alimentação. A técnica de alimentação diária de D-galactose permitiu a produção de maiores quantidades de CTLA4Ig altamente sialilada em reactores de larga escala, á 50 L, por exemplo, 5000 L. -116- EXEMPLO 3

Este Exemplo diz especificamente respeito aos processos de cultura celular com alteração de temperatura conforme descritos nos Exemplos 4-6 e proporciona materiais e reagentes utilizados nos processos de alteração de temperatura para a cultura de células recombinantes que produzem a proteina de fusão CTLA4Ig. 1. Meio de cultura celular 0 meio de cultura celular basal usado para todas as fases da inoculação celular e para crescimento de culturas em bioreactores, incluindo reactores de produção de 5 litros (5 L) e 50 litros (50 L), foi um meio CD-CHO modificado contendo glutamina, bicarbonato de sódio, insulina e metotrexato (Invitrogen, Carlsbad, CA, veja-se o Quadro 1). O pH do meio foi ajustado a 7.0 com 1 N de NC1.

Para a alimentação de células no processo em "fed-batch", utilizou-se um meio de alimentação modificado, ou seja, meio eRDF-1 (Invitrogen), contendo glucose, glutamina, insulina e TC Yeastolate (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), (Quadro 2). Para estas experiências, não estava presente galactose no meio de alimentação. O pH do meio de alimentação foi ajustado a 7.0 com 1 N de NaOH após a adição de todos os componentes. 2. Fase de produção no bioreactor O bioreactor de produção foi inicialmente operado como um bioreactor "batch", com temperatura, pressão, pH e -117 - oxigénio diluído permanentemente vigiados e controlados. A condição da cultura foi avaliada através da medição da densidade das células viáveis e da concentração de vários metabolitos essenciais. 0 processo de alimentação foi iniciado um dia depois da inoculação. 0 remanescente da fermentação foi levado a cabo em modo "fed-batch".

Foram usados bioreactores de 5 L (reactor de vidro com uma turbina marítima) e de 50 L (reactor de aço inoxidável com duas turbinas marítimas) (veja-se o Exemplo 4) . O sistema de aquisição de dados (Fix 32 da Intellution) registou a temperatura, pH e oxigénio diluído (DO) ao longo das experiências. Os caudais de gás foram controlados através de rotâmetros. O ar foi introduzido no reactor através de uma frita submersa (diâmetro de poros: 5 pm) e através do espaço cabeça do reactor para remoção do CO2. Introduziu-se oxigénio molecular através da mesma frita para controlo do DO. Introduziu-se C02 através da mesma frita para controlo do pH. 3. Estratégia de alimentação 24 horas após a inoculação, adicionou-se um mínimo diário de 1% de volume de cultura de meio de alimentação eRDF-1 no bioreactor se a concentração de glucose era ^ 3,0 g/L. Nos casos em que a concentração de glucose era inferior a 3,0 g/L, o volume de alimentação diária por bólus era calculada de forma a levar a concentração de glucose de novo para os 3,0 g/L. Registou-se a quantidade diária de alimentação em folhas de "batch". -118 - 4. Amostragem

Removeram-se as amostras das células do reactor em regime diário. Marcou-se a amostra usada para contagem celular com azul de triptano (Sigma, St. Louis, MO). Procedeu-se à contagem celular e à determinação da viabilidade celular através de hemocitometria usando um microscópio. Para a análise dos metabolitos, centrifugou-se uma amostra adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para separação celular. Analisou-se o sobrenadante quanto aos seguintes parâmetros: titulação, ácido siálico, glucose, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amónia e LDH. Congelaram-se amostras adicionais de "back-up" a -20°C. EXEMPLO 4

Este Exemplo descreve a produção de CTLA4lg, conforme mostrado como -1 a 357 na FIG. 8 (ADN codificante depositado sob 0 número ATCC 68629) de células CHO cultivadas . 0 Exemplo descreve ainda um processo da presente invenção para a produção de proteína CTLA4Ig em grandes quantidades e com elevada qualidade, envolvendo a realização de culturas com alterações de temperatura em dois ou três passos e períodos totais de cultura de 14, 21 ou 28-30 dias. A alteração de temperatura (Alt-T) de 37 °C para 34°C ocorreu no 6.° dia (final da fase de crescimento logarítmica) e uma segunda Alt-T de 34°C para 32°C ocorreu no 10.° dia. A experiência foi concluída no 14.°, 21.° e 28.° dias, e a alteração em dois passos, a temperatura foi controlada aos 32°C desde a alteração no 10.° dia até ao -119 - final da experiência. Quanto à alteração em três passos, a temperatura foi controlada aos 30°C a partir do dia da alteração até ao final da experiência. Os processos descritos resultaram numa titulação final aumentada do produto de proteina, numa maior viabilidade celular final e numa maior produtividade volumétrica, comparativamente com uma as experiências com uma só alteração de temperatura ou sem qualquer alteração de temperatura. De acordo com a invenção, as segunda e terceiras alterações de temperatura prolongaram a extensão da experiência do processo normal de fermentação (cultura) para duas ou três semanas (ou superior), ao mesmo tempo que mantiveram elevadas viabilidades celulares. Observou-se um aumento quase linear da titulação do produto ao longo do período de produção.

As células CHO usadas para expressão de CTLA4ig foram expandidas em meio CD-CHO modificado contendo glutamina, bicarbonato de sódio, insulina e metotrexato (veja-se o Exemplo 3) usando "T-flasks" (Corning, Corning, NY) e frascos centrifugadores de 250 e 500 mL (Bellco, Vineland, NJ) . Os "T-flasks" e os frascos centrifugadores foram incubados a 37°C em 6% de C02. Após suficiente inoculação, transferiu-se a cultura para um bioreactor de 5 L (Applikon, Foster City, CA) ou de 50 L (Feldmeier, Syracuse, NY) com um volume de trabalho de 3 L ou 30 L, respectivamente, do meio supra descrito. A densidade inicial do "seeding" foi de cerca de 2 x 105 células viáveis/ml. O recipiente de 5 L era um reactor de vidro equipado com uma turbina marítima (Applikon, Foster City, CA), o recipiente de 50 L era um reactor de aço inoxidável (Feldmeier, Syracuse, NY) equipado com duas turbinas marítimas. Um sistema de aquisição de dados usando o -120- software Fix32 da Intellutio registou a temperatura, pH e execuções DO ao longo das experiências. Os caudais de gás foram controlados através de rotâmetros (Cole Parmer, Vernon Hills, IL). O ar foi introduzido no reactor através de uma frita submersa (diâmetro de poros: 5 pm) e através do espaço cabeça do reactor para remoção do C02. Introduziu-se oxigénio molecular através da mesma frita para controlo do DO. Introduziu-se C02 através da mesma frita para controlo do pH do lado de alta pressão. O controlo do pH do lado de baixa pressão foi realizado através da adição de 1 N de NaOH. Sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os intervalos aceitáveis do pH variam entre 6 e 9, preferivelmente entre 6,9 e 7,2, e os intervalos de osmolalidade situavam-se entre 200 a 500 mOsm, preferivelmente entre 280-340 mOsm. A cultura no bioreactor foi alimentada com um bólus diário usando um meio eRDF modificado (Invitrogen, CA) contendo glucose, glutamina, insulina e TC "yeastolate" (Becton Dickinson) conforme descrito no Exemplo 3, da seguinte forma: com inicio um dia após a inoculação, adicionou-se um mínimo de 1% do volume de cultura como meio de alimentação, no caso de o nivel de glucose ser inferior a 3 g/L, adicionou-se um volume calculado para que o nível de glucose retomasse os 3 g/L. O processo de fermentação teve uma duração de 21 dias numa escala de 50 L. A duração mais prolongada da cultura em escala de 50 L estava correlacionada com as alterações de temperatura dessa mesma experiência. Retiraram-se as amostras diariamente do reactor para análise. Por exemplo, marcou-se a amostra usada para contagem celular com azul de triptano (Sigma, MO) . Procedeu-se à contagem celular e à -121 - determinação da viabilidade celular através de hemocitómetro e contaram-se as células viáveis marcadas recorrendo a um microscópio. Para a análise dos metabolitos, centrifugou-se uma amostra aliquota adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para "peletizar" as células. Analisou-se o sobrenadante quanto aos seguintes parâmetros: titulação da proteína, ácido siálico, glucose, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amónia e LDH, usando técnicas e protocolos convencionalmente praticados na arte. EXEMPLO 5

Este Exemplo descreve e apresenta os resultados das avaliações comparativas para avaliar os procedimentos de cultura com várias alterações de temperatura, incluindo os métodos de cultura com múltiplos passos, realizados de acordo com um aspecto da presente invenção. Determinou-se a titulação final (em g/L) do produto glicoproteínam, bem como o teor final de ácido siálico da proteína, a viabilidade celular no final das experiências (viabilidade celular final) e a densidade celular no final das experiências (densidade final das células viáveis).

As experiências i-A, I-B e I-C, Il-A, Ii-B e Il-C, e III-A, III-B e III-C referem-se à mesma cultura celular com o mesmo perfil de alteração de temperatura avaliado em diferentes momentos, ou seja, para I-A, II-A e II-A, o produto e os parâmetros celulares foram avaliados após 14 dias, para i-B, Il-B e III-B após 21 dias e para i-C, Il-C e III-C após 28 dias. Estas experiências foram realizadas num reactor de 5 L no qual as condições de cultura foram controladas da seguinte forma: pH 7.0, oxigénio diluído a -122 - 40%, agitação a 60 rpm e temperatura inicial a 37 °C. Os dados foram obtidos a partir de fermentações de cultura celular em "fed-batch" de acordo com os métodos da presente invenção.

As Experiências I, II e II foram concebidas da seguinte forma:

Experiência I: a temperatura da cultura celular foi controlada a 37 °C a partir do dia 0 ao 21.° dia (sem alteração de temperatura).

Experiência II: a temperatura da cultura celular foi controlada a 37°C a partir do dia 0 ao 6.° dia, e a 34 °C a partir do 6.° dia ao 21.° dia (uma só alteração de temperatura).

Experiência III: a temperatura da cultura celular foi controlada a 37 °C a partir do dia 0 ao 6.° dia, e a 34 °C a partir do 6.° dia ao 10.° dia e a 32 °C a partir do 10.° dia até ao 21.° dia (procedimento de dupla alteração de temperatura da presente invenção).

As Experiências IV-A e V-A mostram os resultados da titulação, da viabilidade celular final e da densidade celular final avaliada após uma cultura de 14 dias com uma fase de produção inicial; as Experiências IV-B e V-B mostram estes resultados avaliados após uma cultura de 21 dias com uma fase de produção prolongada, e as Experiências IV-C e V-C mostram os resultados avaliados após uma cultura de 28 dias com uma segunda fase de produção prolongada. As Experiências IV e V foram levadas a cabo num bioreactor de 50 L no qual as condições de cultura eram controladas da -123 - seguinte forma: pH 7.0, oxigénio diluido a 40%, agitação a 30 rpm e temperatura inicial a 37°C.

As Experiências IV e V foram concebidas da seguinte forma:

Experiência IV: a temperatura da cultura celular foi controlada a 37°C a partir do dia 0 ao 6.° dia, e a 34°C a partir do 6.° dia ao 10.° dia e a 32°C a partir do 10.° dia até ao 28.° dia (procedimento de dupla alteração de temperatura da presente invenção). Experiência V: a temperatura da cultura celular foi controlada a 37 °C a partir do dia 0 ao 6.° dia, e a 34 °C a partir do 6.° dia ao 10.° dia, a 32 °C a partir do 10.° dia até ao 14.° dia e a 30°C a partir do 14.° dia até ao 28.° dia (procedimento de tripla alteração de temperatura da presente invenção).

As Experiências V-A, V-B e V-C referem-se à mesma cultura celular com o mesmo perfil de alteração de temperatura avaliado em diferentes momentos, ou seja, para V-A, o produto e os parâmetros celulares foram avaliados após 14 dias, para V-B após 21 dias e para V-C após 28 dias.

As Experiências I-V representam cinco experiências de cultura diferentes conforme supra descrito. Conforme descrito, as experiências de 14 dias são designadas por "A", as experiências de 21 dias são designadas por "B", enquanto que as experiências de 28 dias são designadas por "C" . O Quadro 4 apresenta os resultados das Experiências que demonstram o impacto dos diferentes perfis de alteração -124 - de temperatura na produção de CTLA4Ig por células em cultura em reactor de 5 L,

Quadro 4

Expe ri ência # Escala do reac tor (L) Alteração da tempe-ratu-ra Titu lação final (g/L) Titu lação final (%) (Exp. I-A definida a 100%) SA final (NANA*) (razão molar) SA titulação final* (NANA) Via bili dade final (%) Densi dade celular final (xl0s células/ mL) Titulação do produto, viabilidade celular final e densidade celular final avaliada após experiência de 14 dias com fase de produção inicial (padrão) I-A 5 37 °C (0-14 dias) sem Alt-T 0,73 100 7,3 5,3 56 0,8 II-A 5 37 °C (0-6 dias) 34°C (6-14 dias) Alt-T única 1,30 178 8,1 10, 5 82 1,5 III-A 5 37 °C (0-6 dias)34°C (6-14 dias)32°C (10-14 dias) 2 Alt-T 2,30 315 7,6 17,5 81 3,1 Titulação do produto, viabilidade celular final e densidade celular final avaliada após experiência de 21 dias com fase de produção prolongada I-B 5 37 °C (0-21 dias) sem Alt-T 1,30 178 6, 6 8, 6 20 0,3 II-B 5 37 "C (0-6 dias)34 ° C (6-21 dias) Alt-T única 2,70 370 5,3 14,3 28 0,4 III-B 5 37 °C (0-6 3,50 480 6,5 22,8 57 1,7 -125- dias)34 ° C (6-14 dias)32 ° C (10-21 dias) 2 Alt-T *: "NANA" (ácido N-amino-N-neuraminico) refere-se ao ácido siálico (SA). "NANA final" refere-se ao NANA do produto no final da cultura. 0 Quadro 5 apresenta os resultados das Experiências que demonstram o impacto dos diferentes perfis de alteração de temperatura na produção de CTLA4Ig pelas células em cultura em reactor de 50 L.

Quadro 5

Experiência # Escala do reactor [L] Alteração de temperatura Titu-lação final (g/L) Viabilidade celular final (%) Densidade celular final (xlO6 células/ mL) Titulação do produto, viabilidade celular final e densidade celular final avaliadas após experiência de 14 dias com fase de produção inicial (padrão) IV-A 50 37 °C (0-6 dias)34°C (6-10 dias)32 °C (10-14 dias) 2 Alt-T 1,4 95 5,5 V-A 50 37 °C (0-6 dias)34 °C (6-10 dias)32 "C (10-14 dias)30 °C (14-21 dias) 3 Alt-T 1,4 91 5,4 Titulação do produto, viabilidade celular final e densidade celular final avaliadas após experiência de 21 dias com fase de produção prolongada IV-B 50 37 °C (0-6 dias)34 °C (δ-10 dias)32 °C 2,5 67 2,5 -126 - (10-21 dias) 2 Alt-T V-B 50 37 "C (0-6 dias)34 °C (6-10 dias)32 ° C (10-14 dias)30 °C (14-21 dias) 3 Alt-T 2, 6 82 3,2 Titulação do produto, viabilidade celular final e densidade celular final avaliadas após experiência de 28 dias com fase de produção prolongada IV-C 50 37 °C (0-6 dias)34 °C (β-10 dias)32 ° C (10-28 dias) 2 Alt-T 2,8 47 1,1 v-c 50 37 °C (0-6 dias)34 °C (β-10 dias)32 °C (10-14 dias)30°C (14-28 dias) 3 Alt-T 3,1 69 1,4

Conforme demonstrado pelas experiências deste Exemplo, concluiu-se que os perfis com múltiplas alterações de temperatura mantinham uma elevada viabilidade celular ao longo do processo de cultura. Mais especificamente, no Quadro 4, a Experiência III-B mostra que o uso de perfil de duas mudanças de temperatura temporizadas mantinha uma elevada viabilidade celular (veja-se também a FIG. 6) ao longo do processo de cultura de 21 dias (incluindo a fase de produção prolongada), permitindo que a titulação atingisse 3,5 g/L com um teor de ácido siálico elevado de 6,5 [razão molar]. 0 sucesso do procedimento de cultura de dois passos também pode ser evidenciado pelo elevado valor -127 - do produto matemático da "titulação final x ácido siálico final" .

Por outro lado, o processo de cultura sem qualquer alteração de temperatura (Quadro 4, Experiência I-B) levou a um declínio precoce da viabilidade celular. Além disso, o uso de uma única alteração de temperatura (Quadro 4, Experiência II-B) provou render uma titulação final mais reduzida, menor quantidade de ácido siálico final e um produto final "titulação final x ácido siálico" mais baixo comparativamente com o perfil e processo de duas alterações de temperatura de acordo com a presente invenção.

Além disso, os resultados apresentados no Quadro 5 que envolvem culturas celulares levadas a cabo num reactor de 50 L demonstram as vantagens da técnica de cultura com múltiplas alterações de temperatura da presente invenção. A terceira alteração de temperatura para 30°C foi temporizada para ocorrer no 14.° dia. Em especial, os benefícios de uma tripla alteração de temperatura quanto à viabilidade celular e titulação final (Quadro 5, Experiência V-C, também FIG. 7) podem ser aferidas em comparação com uma dupla alteração de temperatura. De acordo com os presentes métodos, a tripla alteração de temperatura prolongou a viabilidade celular e, consequentemente, a produção de proteínas relativamente aos métodos sem alteração ou com uma só alteração de temperatura, conforme pode ser observado no Quadro 5, em especial, por exemplo, quanto às culturas prolongadas de 21 e 28 dias. Graças ao efeito de aumento ("scale-up"), que é comum nas culturas celulares, a geração de titulação no reactor de 50 L provou ser algo mais lenta do que no reactor de 5 L. No entanto, é imediatamente perceptível que tal efeito não elimina as -128 - vantagens das culturas com duas ou mais alterações de temperatura, conforme providenciado pela presente invenção.

Conforme evidenciado pelos resultados apresentados no Exemplo 5, obtiveram-se resultados significativamente mais positivos na titulação final e na viabilidade celular nas culturas cuja alteração de temperatura foi realizada no 6.° dia, no final da fase de crescimento logarítmica, comparativamente com o controlo na ausência de alteração de temperatura. Conforme observado nos resultados, a produtividade volumétrica duplicou mediante o uso de uma só alteração de temperatura. Uma segunda alteração de temperatura no 10.° dia resultou numa viabilidade celular mais elevada e numa maior produtividade volumétrica (aproximadamente o triplo comparativamente com as experiências sem qualquer alteração de temperatura), enquanto que a qualidade do produto permaneceu elevada, conforme determinado pelo teor de ácido siálico do produto de glicoproteina. EXEMPLO 6

Este Exemplo apresenta dados que mostram que o processo de cultura celular que inclui duas reduções de temperatura de acordo com a presente invenção não exerce um efeito estatisticamente significativo sobre a quantidade de proteína, por exemplo, CTLA4Ig, produzida por célula por unidade temporal. De acordo com os métodos de cultura celular (fermentação) com múltiplas alterações de temperatura, a produção geral de proteína no processo é o resultado do maior número de células viáveis no final do processo. Como sobrevive um maior número de células durante -129 - um período de tempo mais extenso, mais células viáveis produzem a proteína desejada no final do processo, isso, por sua vez, resulta numa maior quantidade de proteína produzida no final do processo ou cultura. 0 Quadro 6 ilustra a produtividade celular específica em vários momentos no processo incluído na presente invenção. A produtividade celular específica é determinada pela fórmula supra apresentada. 0 processo de cultura concebido para a produção de CTLA4Ig, outras moléculas solúveis de CTLA4, e moléculas mutantes solúveis de CTLA4 é, assim, um processo não associado ao crescimento no qual a produção de proteína tem início no ou por volta do 6.° dia, ou seja, aproximadamente no início da fase estacionária, seguindo-se um exponencial crescimento celular. Os dados apresentados no Quadro 6 dizem respeito às experiências realizadas no Exemplo 5.

Quadro 6

Exemplo / Parâmetro Alt-T Produção de proteína celular específica (Tempo) Quantidade de produção de proteína celular específica I—A / Sem Alt-T Após 14 dias 44,7 pg/célula/dia I-B / Sem Alt-T Após 14 dias 64,1 pg/célula/dia II—A /1 Alt-T Após 14 dias 55,5 pg/célula/dia II-B /1 Alt-T Após 21 dias 60,9 pg/célula/dia III—A /2 Alt-T Após 14 dias 47,5 pg/célula/dia III-B /2 Alt-T Após 21 dias 51,9 pg/célula/dia -130- A produtividade celular especifica no Quadro 6 foi calculada usando as medições da densidade e titulação celular, conforme supra descrito. Tal como será evidente aos versados na arte, as medições da densidade celular geralmente possuem cerca de 10-20% de desvio-padrão (SD), ou seja, um SD elevado, e são pouco precisas. Assim sendo, a determinação da densidade celular especifica possui um desvio-padrão correspondente de 10-20%. Assim, tendo em conta o SD elevado envolvido neste tipo de cálculos, a quantidade de produto produzido por célula por dia nos diferentes periodos de cultura não difere significativamente entre um processo sem qualquer Alt-T, com uma Alt-T ou com duas Alt-T. Os níveis elevados de proteína de alta qualidade produzida através dos processos de cultura celular providenciados pela presente invenção, e o aumento geral da produção de proteína, são atribuídos aos números elevados de células viáveis que sobrevivem ao longo de todo o processo de cultura que inclui múltiplas reduções de temperatura. EXEMPLO 7

Exemplo 7A O Exemplo 7A proporciona materiais e reagentes utilizados nos processos da presente invenção para cultura das células recombianantes que produzem a Ll04EA29YIg exemplificada, conforme descrito nos Exemplos 7B-13. 1. Meio de cultura celular o meio de cultura celular basal usado para todas as fases da inoculação celular foi o meio CD-CHO modificado contendo glutamina, bicarbonato de sódio, insulina e metotrexato (Invitrogen, Carlsbad, CA) -131- conforme exemplificado no Quadro 6. 0 pH do meio foi ajustado a 7.0 com 1 N de HC1. O meio de cultura celular basal usado para crescimento das culturas em bioreactores, incluindo reactores de 5 litros (5 L), 10 litros (10 L) e 50 litros (50 L), foi também o meio CD-CHO modificado mostrado no Exemplo 6, excepto pelo facto de não ter

metotrexato. 0 pH do meio foi ajustado a 7 HC1. Quadro 7 . 0 com 1 N de Componente de meio CD-CHO modificado Concentração CD-CHO 25x Ácidos I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L CD-CHO 25x Ácidos II (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L CD-CHO 25x Sais I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L CD-CHO 25x Sais II (Invitrogen, Carlsbad, CA) 40 ml/L L-glutamina (Invitrogen) 0,585 g/L Insulina r-humana (Invitrogen) 0,1 ml/L Metotrexato (solução de 20 mM) (ICN, Costa Mesa, CA) 5 μΙ/L Bicarbonato de sódio (Mallenkrodt Baker, Phillipsburg, NJ) 2,2 g/L

Em todos os Exemplos, excepto no Exemplo 10, para alimentação das células no processo de "fed-batch", utilizou-se um meio de alimentação modificado, ou seja, meio eRDF-1 (Invitrogen) contendo glucose, glutamina, insulina e TC Yeastolate (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), conforme mostrado no Quadro 8. Ajustou-se o pH do meio -132 - de alimentação a 7.0 com 1 N de NaOH após a adição de todos os componentes.

Quadro 8

Componente de meio eRDF modificado Concentração eRDF-I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 16,8 g/L Dextrose (VWR-Mallenkrodt Baker) 30,94 g/L L-glutamina (Invitrogen) 4,1 g/L Insulina r-humana (10 mg/mL) (Invitrogen) 1 ml/L TC Yeastolate (Becton Dickinson, Franklin 5 g/L Lakes, NJ) D-galactose (Ferro-Pfanstiehl, Waukegan, IL) 12,5 g/L

Quanto ao Exemplo 10, o meio de alimentação foi aquele supra descrito com uma modificação: o eRDF-1 encontrava-se a uma concentração de 25,2 g/L. 2. Fase de produção no bioreactor O bioreactor de produção foi inicialmente operado como um bioreactor "batch", com temperatura, pressão, pH e oxigénio diluido permanentemente vigiados e controlados. A condição da cultura foi avaliada através da medição da densidade das células viáveis e da concentração de vários metabolitos essenciais. O processo de alimentação foi iniciado um dia depois da inoculação. O remanescente da fermentação foi levado a cabo em modo "fed-batch".

Foram usados bioreactores de 5 L (reactor de vidro com uma turbina marítima) e de 50 L (reactor de aço inoxidável com duas turbinas marítimas) (veja-se o Exemplo 2). O sistema de aquisição de dados (Fix 32 da Intellution) -133- registou a temperatura, pH e oxigénio diluído (DO) ao longo das experiências. Os caudais de gás foram controlados através de rotâmetros. 0 ar foi introduzido no reactor através de uma frita submersa (diâmetro de poros: 5 μπι) e através do espaço cabeça do reactor para remoção do C02. Introduziu-se oxigénio molecular através da mesma frita para controlo do DO. Introduziu-se C02 através da mesma frita para controlo do pH. 3. Estratégia de alimentação 24 horas após a inoculação, adicionou-se um mínimo diário de 1% de volume de cultura de meio de alimentação eRDF-1 no bioreactor se a concentração de glucose era á 3,0 g/L. Nos casos em que a concentração de glucose era inferior a 3,0 g/L, o volume de alimentação diária por bólus era calculado de forma a levar a concentração de glucose de novo para os 3,0 g/L. Registou-se a quantidade diária de alimentação em folhas de "batch". 4. Amostragem

Removeram-se as amostras das células do reactor em regime diário. Marcou-se a amostra usada para contagem celular com azul de triptano (Sigma, St. Louis, MO). Procedeu-se à contagem celular e à determinação da viabilidade celular através de hemocitometria usando um microscópio ou através de contador automático de células

Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Alemanha). Para a análise dos metabolitos, centrifugou-se uma amostra adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para separação celular. -134-

Analisou-se o sobrenadante quanto aos seguintes parâmetros: titulação, ácido siálico, glucose, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amónia e LDH. Congelaram-se amostras adicionais de "back-up" a -20°C.

Exemplo 7B

Este Exemplo 7B descreve a produção de Ll04EA29YIg, apresentado como -1 a 357 ou +1 a 357 na FIG. 9 (DNA codificante depositado na ATCC sob o número PTA-2104), de células CHO cultivadas.

Este Exemplo também descreve um processo da presente invenção que envolve a adição de um composto polianiónico, mais especificamente, sulfato de dextrano, a uma cultura celular.

As células CHO usadas para expressão de Ll04EA29YIg foram expandidas em meio CD-CHO modificado (Invitrogen, CA) contendo glutamina, bicarbonato de sódio, insulina e metotrexato usando "T-flasks" e frascos agitados ("shake flasks"). Os "T-flasks" e os frascos agitados foram incubados a 37°C em 6% de C02. Após suficiente inoculação, transferiu-se a cultura para bioreactores de 5 L ou 10 L usando o meio CD-CHO modificado conforme supra descrito, excepto sem metotrexato. A densidade inicial do "seeding" foi de 200 000 células viáveis ou 106 células/ml.

Os recipientes de 5 L e 10 L eram reactores de vidro equipados com uma e duas turbinas marítimas (Applikon, CA). Os caudais de gás foram controlados através de rotâmetros. O ar foi introduzido no reactor através de uma frita submersa (diâmetro de poros: 5 pm) e através do espaço cabeça do reactor para remoção do C02. Introduziu-se -135- oxigénio molecular através da mesma frita para controlo do DO. Introduziu-se CO2 através da mesma frita para controlo do pH do lado de alta pressão. 0 controlo do pH do lado de baixa pressão foi realizado através da adição de 1 N de NaOH ou Na2C03. A cultura no bioreactor foi alimentada com um bólus diário usando um meio eRDF modificado (Invitrogen, CA) contendo glucose, glutamina, insulina e TC "yeastolate" (Becton Dickinson) da seguinte forma: com inicio um dia após a inoculação, adicionou-se um mínimo de 1% do volume de cultura como meio de alimentação, no caso de o nível de glucose ser inferior a 3 g/L, adicionou-se um volume calculado para que o nível de glucose retomasse os 3 g/L.

Em todos os exemplos, excepto o Exemplo 13, a temperatura foi controlada a 37°c a partir do dia 0 até ao dia 6, a 34°C a partir do dia 6 até ao dia 10, e a 32°C a partir do dia 10 em diante. O processo de fermentação teve uma duração típica de 14 a 19 dias. Retiraram-se as amostras diariamente do reactor para análise. Marcou-se a amostra usada para contagem celular com azul de triptano (Sigma, MO) . Procedeu-se à contagem celular e à determinação da viabilidade celular com um contador automático de células CEDEX (Innovatis AG, Bielefeld, Alemanha). Analisou-se o sobrenadante quanto aos seguintes parâmetros: titulação da LEA29Y, glucose, lactato, glutamina, glutamato, pH, p02, pC02, amónia.

Dissolveu-se sulfato de dextrano (sal sódico de dextrano com peso molecular médio de 5000 Da, Sigma, MO) em água ou em meio. Filtrou-se a solução e adicionou-se ao reactor numa concentração de 50 mg/L. O volume da adição -136 - constituiu no máximo 2% do volume de trabalho do reactor no momento em que ocorreu a adição. EXEMPLO 8

Este Exemplo descreve e apresenta os resultados de um estudo comparativo para avaliar o efeito da adição de composto polianiónico, mais especificamente sulfato de dextrano, num momento após a inoculação.

Bioreactores de 5 L e 10 L foram inoculados com 0,2 x 106 células/mL de células produtoras de L104EA29Y.

As Experiências 8a e 8b foram concebidas da seguinte forma:

Exemplo 8a: não se adicionou sulfato de dextrano às culturas (culturas de controlo: 4 culturas em bioreactores de 5 L, 4 culturas em bioreactores de 10 L) .

Exemplo 8b: adicionou-se sulfato de dextrano numa concentração de 50 mg/L às culturas no 6.° dia (DS culturas 6.° dia: 2 culturas em bioreactores de 5 L, 1 cultura em bioreactor de 10 L).

Os perfis de viabilidade média, de densidade celular média e de densidade celular total, e seus desvios-padrão dos Exemplos 8a e 8b são registados na Figura 11.

Nas culturas de controlo, observou-se um achatamento da densidade celular entre os dias 6 e 7, correspondendo à fase estacionária. Observou-se um declínio da densidade e da viabilidade celular após o 7.° dia (em média) para as culturas de controlo, correspondendo à fase de morte. Quando se adicionou sulfato de dextrano às culturas no 6.° -137 - dia, a fase de crescimento prolongou-se até ao 11.° dia. A densidade das células viáveis atingiu uma media de 5,2 x 106 células/mL, versus 3,5 x 106 células/mL para o controlo. A viabilidade manteve-se acima dos 90% durante esta fase de crescimento prolongada. Após o 11.° dia, a densidade das células viáveis e a densidade celular total entrou em declínio de forma proporcional, indicando lise celular e, consequentemente, o índice de viabilidade manteve-se acima dos 90% até ao 15.° dia. A Figura 12 é uma representação logarítmica das densidades das células viáveis sob a forma de função temporal para culturas com adição de sulfato de dextrano e para experiências de controlo. As taxas de morte (dadas pelas curvas das densidades das células viáveis no Figura 11) diferiram consoante a presença ou ausência de sulfato de dextrano. Na presença de sulfato de dextrano, a taxa de morte ocorria aproximadamente entre o dia 12 e o dia 19, num valor de 0,0012 h”1. Por outro lado, a taxa de morte na média dos controlos situava-se entre os dias 8 e 12, num valor de 0, 0024 h_1. Assim, o sulfato de dextrano adicionado no 6.° dia abrandou a taxa de morte celular durante a fase de morte.

Apesar dos efeitos benéficos do sulfato de dextrano supra descritos, a titulação de L104EA29YIg foi semelhante, com ou sem adição de sulfato de dextrano (Quadro 9).

Quadro 9: Impacto da adição de sulfato de dextrano no 6.° dia na titulação de Ll04EA29YIg no 14.° dia. -138 -

Condição N. 2 de experiências Titulação média 14.2 dia Desvio-padrão da titulação Processo de controlo 8 1, 60 0,18 Sulfato de dextrano 6.° dia 3 1,57 0,13 0 nível da sialilação de Ll04EA29YIg nas diferentes experiências é registado no Quadro 10. Dada a variabilidade significativa das experiências, pode considerar-se que a sialilação de Ll04EA29YIg não é significativamente afectada pela adição de sulfato de dextrano no 6.° dia.

Quadro 10: Impacto da adição de sulfato de dextrano no 6.° dia sobre a sialilação de Ll04EA29YIg.

Condição Experiência # Razão molar ΝΆΝΆ Processo de controlo 1 6,8 (14) Processo de controlo 2 5,5 (14) Processo de controlo 3 5,7 (15) Processo de controlo 4 5,5 (15) Processo de controlo 5 5,5 (15) Processo de controlo 6 6,3 (16) Sulfato de dextrano 6.° dia 7 5,4 (14) Sulfato de dextrano 6.° dia 8 6,9 (14) Sulfato de dextrano 6.° dia 9 6,9 (16) -139 -

Este Exemplo mostra o efeito da adição de sulfato de dextrano a uma cultura celular que se encontra na fase de morte.

Um bioreactor de 5 L com células produtoras de Ll04EA29YIg foi inoculado a uma densidade de 106 células/mL, e a fase de morte teve inicio no 5.° dia. Adicionou-se sulfato de dextrano no 6.° dia. 0 perfil de viabilidade, densidade das células viáveis e densidade celular total é apresentado na Figura 13. A adição de sulfato de dextrano no 6.° dia em tal cultura poderia prevenir a ocorrência de um declínio da densidade das células viáveis até ao 17.° dia. Assim, quando se adiciona sulfato de dextrano durante a fase de morte, a morte celular pode ser detida durante vários dias.

Nesta experiência, obteve-se uma titulação de 1,9 g/L com uma razão molar NANA de 6,6 no 14.° dia. EXEMPLO 10

Um bioreactor de 10 L com células produtoras de Ll04EA29YIg foi inoculado a uma densidade de 0,2 x 106 células/mL. Neste exemplo particular, a alimentação diária incluía uma formulação mais concentrada e, como resultado, o surgimento da fase de morte foi protelada até ao 10.° dia (Figura 14) . Não se adicionou sulfato de dextrano até ao 14.° dia.

O perfil de viabilidade, densidade das células viáveis e densidade celular total é apresentado na Figura 14. A -140 - adição de sulfato de dextrano no 14.° dia permitiu uma estabilização da densidade de células viáveis durante um período de 4 dias, após o qual a cultura foi descontinuada.

Este exemplo é uma outra ilustração da detenção da morte celular durante a fase de morte após adição de sulfato de dextrano à cultura. EXEMPLO 11

Este Exemplo mostra o efeito da adição de sulfato de dextrano no dia 0. O efeito da adição controlada de sulfato de dextrano pode ser visto através da comparação do efeito verificado nesta experiência com os efeitos registados noutras experiências nas quais a adição de sulfato de dextrano foi adiada.

Dois bioreactores de 5 L foram inoculados com 0,2 x 106 células/mL de células produtoras de L104EA29YIg e adicionou-se sulfato de dextrano a uma concentração de 50 mg/L no mesmo dia que a inoculação (dia 0). O perfil de viabilidade, densidade das células viáveis e densidade celular total é apresentado na Figura 15. Nenhuma das culturas atingiu uma densidade celular mais elevada do que as culturas sem adição de sulfato de dextrano (comparem-se as Figuras 11 e 15) . As células entraram na fase de morte no dia 7 ou 8, em oposição ao dia 11 quando se adiciona dextrano de sulfato no 6.° dia (comparem-se as Figuras 11 e 15) . As titulações de Ll04EA29YIg obtidas no dia 14 destas experiências foram de 0,57 g/L (experiência # 1) e 0,86 g/L (experiência # 2), valores significativamente inferiores às titulações obtidas no processo de controlo ou no processo com adição de sulfato de dextrano no 6.° dia (veja-se o Exemplo 8). -141 -

Estes resultados demonstram a importância do momento da adição de sulfato de dextrano nos resultados dessa mesma adição.

Sem que tal seja comprovado pela teoria, sugerimos que os efeitos observados da adição de sulfato de dextrano e sua dependência do "timing" da adição podem ser explicados pela ligação do sulfato de dextrano a diversos factores autócrinos de forma semelhante à ligação do pentosano polissulfato aos factores de crescimento ligados à heparina (Zugmaier et al., 1992). Sugerimos que o sulfato de dextrano se liga a estes factores no seu domínio ligado à heparina, que se torna indisponível para ligação aos proteoglicanos de sulfato de heparano da superfície celular. Como resultado, os factores ligados ao sulfato de dextrano não se concentram na superfície celular, o que reduz amplamente a probabilidade da sua ligação aos seus receptores. 0 efeito prático é que estes factores deixam de exercer a sua acção normal nas células. Nos primeiros dias após a inoculação, as células produziram alguns factores de crescimento, cuja função é sinalizar o crescimento celular. 0 sulfato de dextrano adicionado no dia 0 liga-se irreversivelmente àquelas factores assim que estes são produzidos. No entanto, a ligação do sulfato de dextrano àqueles factores não afecta de forma adversa o crescimento celular, possivelmente porque as células são capazes de responder através do aumento da produção de factor de crescimento. Posteriormente, durante a fase de crescimento, a produção de factores de crescimento cessa, e as células começam a produzir factores autócrinos de diferentes tipos, cujo efeito em altas concentrações é sinalizar o final da fase de crescimento e o surgimento da morte celular. Estes -142 - factores acumulam-se numa baixa concentração no dia 0 chegando posteriormente a uma alta concentração. Nessa altura, estes factores sinalizam eficazmente as células para pararem de crescer e para entrarem nas fases estacionária e de morte. Sugerimos que o sulfato de dextrano preferencialmente se liga a estes factores que sinalizam a morte, desactivando a sua função de sinalização e permitindo uma extensão da fase de crescimento. A indução continua destes factores parece ser necessária para a morte celular prosseguir, sendo que as células que entraram na fase de morte podem ser programadas para uma fase estacionária quando os factores sinalizadores da morte são desactivados pelo sulfato de dextrano (Exemplos 9 e 10), mesmo tão tardiamente como o 14.° dia de cultura. Por outro lado, o sulfato de dextrano adicionado no dia 0 e que se liga aos factores de crescimento, ainda se encontra ligado a estes factores no final da fase de crescimento, tornando-o indisponível para se ligar às moléculas sinalizadoras da morte. Assim, a extensão da fase de crescimento e o surgimento tardio da morte celular não ocorrem no caso das culturas em que o sulfato de dextrano é adicionado no dia 0 (Exemplo 11), tal como acontece quando o sulfato de dextrano é adicionado no final da fase de crescimento.

Pensa-se que a suspensão do crescimento celular e o surgimento da morte celular no dia 11 em culturas suplementadas com sulfato de dextrano no 6.° dia no Exemplo 6 advém de mecanismos diferentes da indução por factores autócrinos ligados ao sulfato de dextrano. Possivelmente, a exaustão de determinados nutrientes no meio após 11 dias de crescimento pode ser responsável pelo final da fase de crescimento nestas culturas. -143 - EXEMPLO 12

Este Exemplo compara o efeito da adição de sulfato de dextrano em três momentos diferentes durante a fase inicial de crescimento.

Culturas de células produtoras de Ll04EA29YIg foram inoculadas em bioreactores de 5 L numa densidade de 106 células/mL. Adicionou-se sulfato de dextrano às culturas numa concentração de 50 mg/L em diferentes momentos. Numa cultura, adicionou-se o sulfato de dextrano no dia 3, numa outra no dia 4 e na terceira no dia 5.

Os perfis de viabilidade e de densidade das células viáveis são registados na Figura 16. Obtiveram-se altas densidades de células viáveis (> 107 células/mL) nos três casos (dia 3, 4 ou 5), mas as adições anteriores (dia 3 ou 4) não impediram um declínio na densidade das células viáveis imediatamente após a fase de crescimento. Por outro lado, a adição no dia 5 estabilizou a densidade das células viáveis durante 4 dias após a fase de crescimento. Nos pontos temporais após 250 h, a densidade das células viáveis na cultura com adição de sulfato de dextrano no dia 5 foi sempre superior ou igual (dentro do erro de medição) à densidade da cultura com adição de sulfato de dextrano no dia 4, e a a densidade das células viáveis na cultura com adição de sulfato de dextrano no dia 4 foi sempre superior ou igual (dentro do erro de medição) à densidade da cultura com adição de sulfato de dextrano no dia 3. Assim, partindo deste exemplo, parece que o tempo óptimo para a adição de -144 - sulfato de dextrano é no final da fase de crescimento inicial (referente à fase de crescimento que seria observada na ausência de qualquer adição de sulfato de dextrano). A adição precoce pode prolongar a fase de crescimento mas não será tão eficaz quanto a estabilização da densidade das células viáveis após a fase de crescimento prolongada induzida pelo sulfato de dextrano, enquanto que a adição posterior (durante a fase de morte) irá estabilizar a densidade das células viáveis mas poderá falhar em providenciar um aumento substancial da densidade das células viáveis (vejam-se os Exemplos 9 e 10) . Assim sendo, no dia 14, obteve-se uma titulação de 2,7 g/L com adição de sulfato de dextrano no dia 5, enquanto que foram obtidas titulações de 2,6 g/L com adição de sulfato de dextrano no dia 3 ou 4, e obteve-se uma titulação de 1,9 g/L com adição de sulfato de dextrano no dia 6 (no Exemplo 9). As razões molares NANA foram de 6,3; 6,6; 6,0 e 6,6 respectivamente nas experiências supra mencionadas, mostrando que as titulações mais elevadas obtidas com "timing" óptimo de adição de sulfato de dextrano advieram com um nivel consistente de sialilação. EXEMPLO 13

Este Exemplo mostra o efeito de uma e duas alterações de temperatura numa cultura que produz Ll04EA29YIg. A cultura também é sujeita a adição controlada de sulfato de dextrano.

Inocularam-se reactores de 5 L numa densidade de 200 000 células/mL. -145-

Aplicaram-se duas, uma ou nenhuma alteração de temperatura. Nos casos de uma só alteração de temperatura, a temperatura é alterada de 37 °C para 34°C no dia 6. Nos casos de duas alterações de temperatura, a temperatura é alterada de 37°C para 34°C no dia 6 e de 34°C para 32°C no dia 10. Em todos os casos, o sulfato de dextrano foi adicionado no dia 6. O caso de duas alterações de temperatura é a média das três experiências, e os desvios-padrão são apresentados com barras. A densidade das células viáveis, a viabilidade e a titulação são registadas nas Figuras 17, 18 e 14, respectivamente.

Os resultados mostram os benefícios de aplicar apenas uma alteração de temperatura. No caso em que a temperatura é mantida a 37°C ao longo da experiência, a cultura entra na fase de morte no dia 10, e a redução da densidade das células viáveis e da viabilidade é acentuada. Consequentemente, existe uma redução clara ma produtividade volumétrica da Ll04EA29Yig após 12 dias em cultura. Para as culturas de 14 dias ou mais longas, é evidente que as culturas com uma ou duas alterações de temperatura irão ficar aquém da cultura com temperatura constante em termos de titulação.

No caso em que é implementada apenas uma alteração de temperatura (no dia 6, a 34°C), observa-se uma marcada redução da densidade das células viáveis e da viabilidade após o dia 16. A cultura em que é implementada uma segunda alteração da temperatura (no dia 10, a 32°C) não apresenta um declínio tão marcado da densidade de células viáveis e da viabilidade após o dia 16. Nas culturas com mais de 18 dias, a produtividade volumétrica é claramente inferior -146 - àquela da cultura com duas alterações de temperatura. Por outro lado, a produtividade volumétrica na cultura com apenas uma alteração de temperatura é superior do que aquela na cultura com duas alterações de temperatura em culturas entre os dias 11 e 15.

Como conclusão, a primeira alteração de temperatura é benéfica independentemente do tempo de colheita desejado, enquanto que o beneficio da segunda alteração de temperatura depende do tempo de colheita pretendido e dos requisitos de viabilidade para o processamento a jusante eficaz. A ausência de uma segunda alteração de temperatura permitirá a obtenção de uma titulação superior até ao dia 20, mas para as culturas que se estendem por mais de 20 dias, a experiência com duas alterações de temperatura irá ficar aquém da experiência com uma alteração de temperatura em termos de titulação. Além disso, deverá ter-se em conta que as colheitas com mais de 12 dias conterão uma quantidade superior de produtos de lise celular no caso de uma alteração de temperatura do que no caso de duas alterações de temperatura, o que pode complicar o processamento a jusante. A profunda redução da densidade das células viáveis observada após 12 dias no caso de um perfil com uma alteração de temperatura pode constituir um problema para a qualidade do produto, já que a correspondente morte celular pode libertar no sobrenadante uma quantidade significativa de sialidases que podem reduzir a sialilação do produto.

Os conteúdos de todas as patentes de invenção publicadas e atribuídas, pedidos de patentes, PCT's publicados e pedidos, artigos, obras, referências e manuais de referência e de instruções norte-americanos, e resumos -147 - conforme referenciado ou citado, são incorporados referência na sua totalidade para uma descrição completa do estado da arte em que se insere a invenção -147 - por mais -148 -

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição us 43605002 P [0001] us 5705364 A [0008] [0159] us 5721121 A, T. Etcheverry [0008][0130][0133] us 5976833 A, K. Furukawa [0008] us 5851800 A, L. Adamson [0008] wo 9961650 A [0008] wo 0065070 A [0008] wo 0036092 A [0008] us 4357422 A, Girard [0008] us 5348877 A, McKenna e Granados [0010] us 4994387 A [0011] us 5132223 A [0011] us 5728580 A [0011] us 5545722 A [0011] us 5736506 A, Naka [0011] wo 9808934 A, Gorfien [0011] wo 0159075 AI [0015][0016] wo 0159089 A2 [0017] us 5434131 A [0040][0163][0167][0171] [0174] -149 - • US 5844095 A [0008][0040][0161][0163][0166][0167][0171] [0174] • US 60436101 B [0061][0149] • WO 0192337 A2 [0133][0166] • WO 8704462 A, [0145] • WO 8605807 A [0145] • WO 8901036 A [0145] • WO 8910404 A [0145] • US 5851795 A [0163] • US 865321 A [0166] • US 60214065 A [0166][0169] • US 60287576 A [0166][0169] • US 6090914 A [0166] • US 5773253 A [0166] • US 563781 A [0167] [0174] • US 579927 A [0169] • WO 01923337 A2 [0169] • US 55800756 A [0179] • US 5521288 A [0179] • US 6113898 A [0182]

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Lisboa, 14/01/2011

Claims

-1- Reivindicações 1. Processo de cultura celular para a produção de uma molécula solúvel de CTLA4, que inclui: a) cultivar células CHO que produzem uma molécula solúvel de CTLA4 na cultura celular sob condições que permitem a produção de CTLA4; e b) alimentar as células com D-galactose.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a o passo de alimentação b) ocorre num regime diário.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a o passo de alimentação b) ocorre num regime continuo.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a alimentação ocorre mais do que uma vez por dia.
5. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a alimentação ocorre com menor frequência do que diariamente.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a D-galactose é alimentada às células no meio de alimentação.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o meio de alimentação contém D-galactose numa quantidade de cerca de 1 a 50 g/L.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o meio de alimentação contém D-galactose numa quantidade de -2- cerca de 3 a 25 g/L e preferivelmente numa quantidade de cerca de 12,5 g/L.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a D-galactose é sustentada ou mantida na cultura celular numa concentração de cerca de 0,1 a 10 g/L.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a cultura celular é uma cultura em larga escala.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que a cultura celular em larga escala é superior a cerca de 50 L.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que a cultura celular em larga escala é de 500 L ou superior.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a sialilação da CTLA4 produzida é aumentada • 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a molécula de CTLA4 solúvel é uma proteina de fusão CTLA4 solúvel.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a molécula da proteína de fusão CTLA4 solúvel inclui a sequência de aminoácido que começa com metionina na posição +1 ou alanina na posição -1 e termina com ácido aspártico na posição 124, conforme ilustrado na figura 8. -3-

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que a proteína de fusão CTLA4 solúvel é CTLA4lg.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que a proteína de fusão CTLA4 solúvel é CTLA4Ig que inclui os aminoácidos -1 a 357 ou +1 a 357, conforme ilustrado na FIG. 8.

18. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que a proteína de fusão CTLA4 solúvel é codificada pelo ADN depositado na ATCC sob o número de acesso 68629.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a molécula CTLA4 solúvel é uma molécula mutante de CTLA4 solúvel.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a molécula mutante de CTLA4 solúvel inclui a sequência de aminoácido que começam com metionina na posição +1 ou alanina na posição -1 e termina com ácido aspártico na posição 124, conforme ilustrado na FIG. 9.

21. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a molécula mutante de CTLA4 solúvel é codificada pelo ADN depositado na ATCC sob o número de acesso PTA-2104.

22. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que a molécula mutante de CTLA4 solúvel é Ll04EA29YIg que inclui aminoácidos -1 a 357 ou +1 a 357, conforme ilustrado na FIG. 9. -4-

23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, que inclui: c) cultivar as células CHO a uma temperatura de ou próxima de 37°C sob condições e durante um periodo de tempo que permitam o crescimento celular; d) a seguir, cultivar as células a uma segunda temperatura de ou próxima de 34°C; e e) a seguir, cultivar as células a uma terceira temperatura de ou próxima de 32°C.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, que inclui: c) cultivar as células CHO a uma temperatura de ou próxima de 37 °C sob condições e durante um periodo de tempo que permitam o crescimento celular; d) cultivar as células CHO a uma segunda temperatura de ou próxima de 34°C com inicio aproximadamente no dia 6 da cultura; e e) cultivar as células CHO a uma terceira temperatura de ou próxima de 32°C com inicio aproximadamente no dia 10 da cultura.

25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, que inclui: c) adicionar composto polianiónico à cultura celular num momento após a inoculação.

26. Processo de acordo com qualquer uma das -5- reivindicações 23 ou 24, que inclui: f) adicionar composto polianiónico à cultura celular num momento após a inoculação.

27. Processo de acordo com qualquer reivindicação 25 ou 26, em que o composto polianiónico é sulfato de dextrano.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reinvindicações 1 a 27, que inclui a purificação da molécula CTLA4 solúvel. Lisboa, 14/01/2011 -1/19-

Periodo de cultura [dias] Fig. 1 - 2/19 -

Período de cultura [dias] Fig. 2 -3/19-

Fig. 3 - 4/19 -

Período de cultura [dias] Fig. 4 -5/19-

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Período de cultura [dias] Fig. 5 - 6/19 - Viabilidade celular [%]

Período de cultura [dias] Fig. 6 -7/19- Viabilidade celular [%]

0 I "T I-1 I I I 1111-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-T““1-1-1-1-Ί-1-7 0123456789 10111213141516171819202122232425262728 Período de cultura [dias] Fig. 7 FIQ. % - 8/19 - ATCOGnOXACTSCTCACXCACAflSAÕSCrCCTCAflTCTOCTCCrrgCACTCCTCrWCCA Η··β··Ϋ*·Ι(**1··Τ·ι,ί"·Η··Τ**1**1*·8·*1*,,ν**1*·Α··Ιι··Ιι··?»·Ρ·· AflC&JSflOGAGCATOSCXAJOCACOTOOCCCAQCCTCCTSTCGTAÇIOCCCAOCACCCSA 3__M—A*-S—Μ—A--Μ—B—V—A--Q—P—A—V-.V—t—A--5—S—R— *1 SOCATCOCTAOCrrTQTOTOTGWJTATCCATCTCCASSCAAAOCCACraACGTCOSSfiTe 9.·:..ν··3·.Ν·ν··0··Β.·Τ··λ··3··{»β·>Ι!·4··Τ·>Κ··ν··Ε.·ν·. ACACTGCTTCCOCAOOCTGACAOCCAOGTGACTCAACTCTGTGCOCCAACCTACATGATO T—V—1—R—Q—A—D—S—Q—V—T—B--V—C--A—A—T—Y—Μ—K— G6GUUtTSU5CTaACCTTCCIASAroATTeCATC30CAcbcSCACCTCe*flTaGAAATCAA ——C—Τ^**β—6—ff—Q·— CTGttACCTCACTAXCCAAOSACTSAGSGGQtfGSACAGSQSACXCTACATCTeCAAQCTa ν-·Κ*·1··Ι··Ι··0··β··Ι)··ϊ··Α··Η*·5··Τ··,β··Ιτ·ϊ··Ι··0·*Κ··Τ·* QAeCTCATSTACCCACO3CCKXACTACCTQ90CA3A99CAAe0SAACCOU3Arm2eXA s--i—μ—γ—p—p—p—γ—γ—ύ—α—x—s—b—ο—τ—q—z—γ—v— ATTSAXCCASAACCCTGCCCACAXTCTSAXCAeSAeGGCAAATCITCTGACAAAACXCAC I-_B—P--g--P~C~P.~D~S~D~Q~R~P~K~S~S~D-*K— CCAAAACOCAACGACACCCTCATQArCTCCCaQACCCCTQAOflTCACATOOaTOOTOCTe ?—K--P--K—D—T—L—M—·!—S—R—T—P—K—V—T~C—V—V—V— SACSICABCCACSAAfiACCCTSASgTCAAgrTCRACWgTAOglOGACCOOOXGSAflgTq D—V—S—B—8—B—P—R—V—K—F—ff—Η—Y—V—D~Q—V—B—V— CAXAATQCCAAGACAAASCCeCGOGAGQAGCAeXACAACAGCACQTACCeGSTOSXCMC H—ff—λ—K—T—JC—P—R—8—8—Q—Y—K—3—T—Y—R—V—V—5— GTCCXCACC0TCCT0CACCAflQACT93CTGAATS0CAA0SA0TRCAAGT3CAAg0TCrCC ν«>Ιι«·Τ*·ν*·Ι(··Β·β0"β0·*ν|'*Ιι**ί"Μδ|**Κ*42··Υ··Κ··0··Ε··ν··5·· AACAAAOCCCTCCCAGGCCCCATCfiAGAAAACCATCTCCAAÀaCCAAAOSGCAGCCCCGA Η—K—A—1—P—A— P~ X—8—X—T—X—S—X— A— X—0—Q—P--R— GAACCACASGXCIXACACCCTGCCCCCAITCCCGGGRXGAGCTGACCAAGAACGAGGTCASC CWACCTOCCTOOTCAAAQQÇTrCTATCCCAGCGACATCCCCSTOSACròSGAGAGCAAT L—T—C—Σι—V—X—C—P—Y—P—3—D—X—A—V—8—V—8—S—N— SOeCAflCQOfiAflAACAACrAOAfiACCACOCCTCCCOTCCrUGACrCCGACOGCTCCTTC Q—Q—p—g—ff—B—T—X—T—T—P—?—V—&—D—3—D—<3—3;—F— TTCCTCTACAOCAAGCICACCCTeGACAAQAGCACGTWCMCASOaQAACOTCTTCTCA P—1—Y—3—K—L—γ—V—D—X—3—R—K--Q—Q—β—Μ—V—P—S--^ TOCTCCOTGATOCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCSGAAGAflCCTCrCCCTQrCT C—3—V—M—ff—S--A—L—B—K—B~Y—7—Q—X—8—XÍ—S—X.—3— CC903tAAATGA P——Q—K—· *19 •r · ♦42 ♦14 ♦ 102 ♦ 34 ♦ 152 ♦ 54 ♦233 ♦ 74 *252 ♦94 ♦342 *114 ♦402 ♦134 ♦462 ♦1S4 ♦522 ♦174 ♦5B2 ♦194 ♦642 ♦214 *702 ♦ 334 ♦762 ♦3S4 ♦ Θ22 ♦ 274 . ♦ 552 ♦294 ♦ 943 ♦314 ♦1002 ♦334 ♦ 1062 ♦354
- 9/19 - ATCagPCTACTCCTCACACASJUaiACGCTCCTCAGT^^^ClTrCCACTCCTSTTTCCA Μ.-β—V—L·—I/—T—0—R—T—L--L--S—If—V—L—A—L—L—P--P— AOCASQâCGAOCATQOCAAT9CACQTQ9CCCA0CC?QC?QTQeTACT99cm3CA0COGA 5»«Μ»·Α—'S--M--A--N--H—V—A--Q--P*-A«-V--V—L--A—-3--S—B·· • ♦! · OCCATGCCrAflCTTT3T3TSTGASTAT5CATCTCCAGGCAAATATACraAOOTCCG05TO 0— X—A—S—?—7—C—8—V—A—s—P—S--R—T—T—B—V—R—V-- ACAflTGCrrUPSCAOgCTSACAOCCAflCTGACTSAAgTCTflTGOSflCAACCrACATflATO T—V—fc— a—Q..A—D—S—Q..V—T—Ϊ—V—C~A—A~T—Y—Μ—M— GCCAATGAOWGACClTCCTAfiAICATTCCATCTXACOaSCACCTCCAfiTCeAAATCAA GTQAACCTCACTATCCAAeSACTQAQQSCCATGSAGACeQGACTCtACATCIGCAAâSTe ν··β··1τ·Τ·*Ι**0**9>,*ί··ϊ'*Α-'·Μ'·0"ΓΒ>δΒ*1*'ϊ*Ί·ΒΟ**Κ"'ν·* GAGCTamSTACCCACCOCCATACTACOAQCOCATAÍWCAACWAAOCCASAmAiaTA Ι··(··||η{··ί·Βί»·ρ··Χ»Χ··Ι··|]··Ι··3··ΙΓΜ9*ΒΤ··0··Ζ··¥··ν·· ATfffllTCeACAAeCCTOCC»aAgTCJ6AJCAOGAOCCCAAATCrrcrGACAAAACTCAe 1— D—p..f-.p.-c-.p-rp—s—D--fl—B—P—K-S—S—D—X—T—H— χ··β··ΡΜρ··3Β<·Ρ*·λ·ΒΙ*ΒΚΗΐΓΒ2ίΒ*0*”β**3*β3ν*Τ**Ν*Χ**Ρ*Β?** CCAAAACCCAAGGACACCCtCAISATCXCCCOSACCOCTGAOeiCACATOCOTOaTOOTe P--E-* F—K—-D--T—I*--Μ—Σ—S~R»»7"P—B—V—T—C—-V—V—V-- SACOTeAOÇCACOAACACCCTeAOOTCAAeTT^ACTGeTACUrSGACOSCCTGeAOeie D—V—fl—Η—B—0—P—8—V—B—P—S—W—Ϊ—V—D—C--7—B—V— CA2AATSCCAAfiACAAA0CC0C0QSA0eA0CAGTACAACACCAC8TAC0STST08TCASC Η—B—A—K—T—Κ--P«-R—B—B—Q—X*—M—S—T—T—R—7—V—S— CTCCrCACCSTCCTOCRCOGGACrosCTSAAÍSSCAAOGÀCTRCAACTGCRAQCTCTCC V—fc—T-«V—t--B—li—K--0--K—5—t—R—C—B--7—S—- AACAAAGCCCrCCCASCCCCCAXQSASAAAACCATCTCCAAAOCCAAAOOOCAOCOCCSA H—B»»A—L--P-»A«*P--I—Β··Κ·*Τ—Ibb3-bK—A-»Kbb(1»bQ—P--R·- SAACOCAOOTSTACACCCTOOCCCCATCCCGBGATCABCTSACCAAfiAACCACSTCACC Ϊ—P--C—V—X»«7—ÍI--P--P—3—B--D—S—·1--Τ—K—N--Q—V—3— CTGAOCT3CCTO3TCAAAQGCTTCTA3,CCCAGCSACA.TCGCC0TGGAGTO3aAGAQCAAT I#—T--C—I»—V—IC—0-«-P—Y—P-*S—D—X—A—V—R—W—E—3—H— ψ GWGACCCGGAGAACAACTACAAfiACCACGÇCrCCCCTecroGACXCCGACSGCTCCTrC O—Q-»P—B--H—H*-Y--K—T—T—P—P—V—L—D—S—D--S-*S—Γ— nCCTCTACA3CAAOCTCAC03TO<3ACAAQAGCA3aTOOCA3CAOOOGAACGTCTTCrCA p-.I^.y.-S—K—t—T--V—O—K—3—R—tf—0--Q—β~Η—V—P—S» TGCTCCGTGATGCATSA0GCTCTGCACAACCACTACACGCA5AAGAGCCTCTCCCTCTCT C—Η—B—A—L--H—»—Η—Y—T—Ô--X—S—t—S—t—3— OCGSGTAAATQA P—a—K—i •w *7 +43 «14 «103 «34 «1C3 «54 «222 +74 +203 «54 *343 «124 +4Ò2 +234 +4Í3 «154 «S23 ♦174 ♦582 ♦194 «542 «214 ♦702 ♦234 ♦752 ♦254 ♦022 ♦374 ♦852 ♦394 ♦943 ♦314 ♦1003 ♦334 ♦1063 ♦354 -10/19 - PÉPTIDO SINAL DE ONCOSTATINA M N C 7 b b T 9 8 ATC CCT STA CTC CTC ACA CAC ACC A b l r P 5 H A CCA CTC CTC ITT CCA ACC ATC CCC Q P A 7 V b A s CAC CCT CCT GTC CTA CSC GCC ACC 7 C 8 Y A SP c CTC TCT GAG TXT GCA TCT CCA CCC T 7 b 8 9 A D s ACA CTC CTT CCC CAC CCT CAC ACC λ T Y N KGM 8 CCA ACC TAC ATC ATS CCC AA* CAC 1 C τ e *55 S ATC TCP ACC GCC ACC TCC ACT CCA Q 3 b r A H O T CAA CCA CTC ACC CCC ATC GAC ACC 8 b Η Y P 9 P Y CAC CSC ATC TAC CCA CCS CCA TAC T »9 X Y 7X0 P ACC CAC ATT TA* CTA An GA* CCA r b b w X b A A TTC CTC CTC TCG ATC CIT CCA CCA Y s P b b T A 7 TA* ACC TTT CTC CSC ACA CCT OT X X a 9 b * T e AAA ACA ACC CCT CTT ACA ACA CGG T 8 P 8 C 8 K 9 ACA CAC CCA CAA TC* CAA AAC CAA L L S L 7 L CTC CTC ACT CTC GTC CTT 45 -t *1 X Λ M R 7 A ATS SCA ATS CAC CTC GCC 99 a c x a s r CCA CCC ATC CCC ACC TTT 135 A* T * 7 * 7 -GCC ACT CAC CTC CSC CTC 180 7 T 8 7 C A CTC ACT OAA CTC TCT CCC 225 T r b D D 5 ACC TTC CTA CAT GAT TCC 270 9 7 H b T X CAA CTO AAC CTC ACT ATC 315 b Y I C X 7 CTC TAC ATC TCC AAC CTC 350 LOCAL DE GLICOSILAÇÃO b Ο X C <H S CTC GCC ASA CCC AAC CCA 405 P C 7 0 3 D CCS TCC CCA CAT TCT CAC 450 s s c b p r ACT TCC CGS TTC TTT TTT 495 b S X H b X TTC ACC AAÀ ATS CIA AAC 540 T 7 X n 7 P TA* Cie AAA ATC CCC CCA 585 9 P Y 7 X P CAC CCT TA* TTT ATT CCC 830 X IV AXC AAT FIG.
10 835 -11/19- Viabilidade [%]

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Tempo [h] Fig.
11 -12/19- celular Γ106

Tiempo [h] Fig.
12 -13/19- Viabilidade [%]

Densidade celular [106 células/mL] Tempo [h] Fig.
13 -14/19-

Densidade celular [106 células/mL] Fig.
14 -15/19- Viabilidade [%]

0 50 100 150 200 250 300 350 400 Tempo [h] Fig.
15 -16/19-

Densidade celular [106 células/mL] Viabilidade DS dia 3 Viabilidade DS dia 4 -«-Viabilidade - Dia 5 -0-Células viáveis - DS dia 3-Δ- Células viáveis - DS dia 4-o-Células viáveis - DS dia 5 Fig.
16 -17/19-

Fig.
17 -18/19-

Fig.
18 -19/19-

Tempo [hrs] Fig. 19