JP3394240B2 - 適当にグリコシル化されたポリペプチドの製造方法 - Google Patents

適当にグリコシル化されたポリペプチドの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、真核細胞を培養し、培地または
/および細胞からペプチドを単離することによって適当
にグリコシル化されたポリペプチドを製造する方法に関
する。この方法では、所望のグリコシル化ポリペプチド
が、内因性遺伝子の活性化を用いた組換えによって、ま
たは細胞により自然に生産され得る。
【０００２】培養真核細胞による糖蛋白質の製造は、一
般に市販の培地中で行われる。ポリペプチドに所望のグ
リコシル化が起きるためには、特定の基質を培地に添加
する必要がある場合がある。これは、特開平6-292 592
に、例としてヒトのIgM抗体を少量（＜1000 ml）で低い
開始細胞密度（5 x 104細胞/ml）にて、短時間培養（48
h）を行ったバッチプロセスが記載されている。この場
合、たとえばCHO細胞のような哺乳類細胞における抗体
の組換え生産には、一般的なグルコースの代わりにフル
クトース、マンノース、ガラクトース、N-アセチルグル
コサミン、リボース、フコース、N-アセチルガラクトサ
ミン等の別の糖が使用されている。さらに、細胞をまず
グルコースを含む培地で培養し、その後、別の糖を含む
培地で置き換える、複数の段階を持つ培養方法が開示さ
れている。
【０００３】しかし、特開平6-29592に説明される方法
には、重大な問題点がある。細胞培養中、糖が消費され
るために培地中の糖濃度は、常に変化しているので、ポ
リペプチドが常に高度にグリコシル化されるとは保証さ
れない。さらに、細胞の代謝のために開始時の基質濃度
は継続的に低下するので、所望のグリコシル化に一定の
基質濃度が必要な場合には、バッチプロセスは不適当で
ある。また、高細胞密度と高レベルのグリコシル化に必
要な高濃度の糖は、発酵の開始時にすでに提供される必
要があるが、しかしながらこれは細胞の増殖を阻害する
ため、得られる細胞密度には限界が生じる。したがっ
て、上述の日本特許出願公開公報に記述される方法で
は、高度にグリコシル化されたポリペプチドの経済的な
製造は不可能である。
【０００４】培養中に栄養溶液を添加するフィーディン
グを行うバッチプロセス(フェッド・バッチ(fed-batc
h))による真核細胞の培養は公知である。この種の方法
では、適当なフィーディングによって、細胞を高密度
で、より長時間培養することができる。その一例として
は、必須アミノ酸のグルタミンを連続的、限定的にフィ
ーディングして、細胞の増殖が改善されるものがある
（Ljunggrenら、Biotech. Lett. 12 (1990), 705-71
0）。グルタミンのフィーディングの目的は、動物細胞
に対して毒性を持つアンモニウムの形成を低下させるこ
とである（Mirabetら、Biotechnol. Bioeng. 56 (199
7), 530-537）。
【０００５】ガウリツェック（Gawlitzek）ら（Biotech
nol. Bioeng. 57 (1998), 518-528）は、培養真核細胞B
HK-21の培地中でアンモニウムイオンまたはグルコサミ
ンの濃度が上昇すると、培養細胞の分泌する組換え糖蛋
白質中のN-結合炭水化物構造の複雑さが増すと記述して
いる。しかし、この結果はボリス（Borys）ら（Biotech
nol. Bioeng. 43 (1994), 505-514）またはアンダーソ
ン（Andersen）およびグーチー（Goochee）ら（Biotech
nol. Bioeng. 47 (1995), 95-105）の、培地中のアンモ
ニウム濃度の上昇によってグリコシル化が阻害されると
いう結果と一致しない。したがって、培養中のアンモニ
ウム形成の制御は、独立した局面にすぎず、したがって
適当にグリコシル化された蛋白質の経済的な製造には十
分ではないことは明からである。
【０００６】ポリペプチドのグリコシル化のレベルは、
その生物活性に大きく影響し得る。これは、以下のエリ
スロポエチン(EPO)の例で説明される。EPOは赤血球の生
産を刺激する、ヒトの糖蛋白質である。EPOは健常人の
血漿中に非常に低濃度でしか存在しないので、この方法
で大量のEPOを提供するのは不可能である。EP-B-0 148
605およびEP-B-0 205 564は、CHO細胞における組換えヒ
トEPOの製造を記載している。EP-B-0 148 605に記載さ
れるEPOは、尿中のEPOよりも分子量が大きく、O-グリコ
シル化されていない。EP-B-0 205 564に記載されるCHO
細胞のEPOは、現在は大量に純粋な形で入手できる。
【０００７】さらに、再生不良性貧血の患者の尿由来の
ヒトEPOの単離は既知である（Miyakeら、J. Biol. Che
m. 252 (1977), 5558-5564）。
【０００８】組換えEPOおよび尿のEPOは、シアリル化の
レベルの異なる種々のアイソフォームの混合物として単
離される。これらのEPOアイソフォームは、異なる等電
点を持ち、等電点電気泳動法またはキャピラリー電気泳
動法によって分離できる（Tsaoら、Biotech. Bioeng. 4
0 (1992), 1190-1196; Nietoら、Anal. Commun. 33 (19
96), 425-427; Tranら、J. Chromatogr. 542 (1991), 4
59-471; Bietotら、J. Chromatogr. 759 (1997), 177-1
84; Watsonら、Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393参
照）。シアル酸の数が最高のアイソフォームは比活性が
最大で、シアル酸の数が最低のアイソフォームは活性が
最小である(例、Imaiら、Eur. J. Biochem. 194 (199
0), 457-462; EP-A-0 428 267参照)。
【０００９】タケウチ（Takeuchi）ら（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822）は、生物活性と
シアル酸含量との関係ならびにバイアンテナおよびテト
ラアンテナ炭水化物構造の比率を記述している。さらに
タケウチ（Takeuchi）らは、EPO炭水化物構造中に存在
するN-アセチルラクトサミン2糖ユニットは、生物活性
とは相関がないと結論づけている。
【００１０】フクダ（Fukuda）ら（Blood 73 (1989), 8
4-89）は、生物活性に重要な貢献をする血液循環からの
EPOの除去速度を調べ、比較的多数のN-アセチルラクト
サミンユニットを持つEPOのほうが、ラクトサミンユニ
ットを持たないEPOよりも早く循環血中から除去される
と結論づけた。モリモト（Morimoto）ら（Glycoconjuga
te J. 13 (1996), 1093-1120）は、モノＱクロマトグラ
フィーを用いて、個々の画分が少数のアイソフォームの
みからなるようにEPOアイソフォームを分離した。これ
らの画分を用いた実験では、すべての画分中にすべての
構造が同等に分布していることが示された。バイアンテ
ナ構造もしくはトリアンテナ構造の含有量、またはN-ア
セチルラクトサミンユニットの含有量と比活性との間に
は相関は見られなかった。
【００１１】このように、該先行技術は、糖の構造、特
にシアル酸の含量と生物活性との間に一般的な相関があ
ることを示す。
【００１２】驚くべきことに、高密度の細胞の発酵中に
炭水化物を含む基質を細胞の要求にしたがって連続的に
フィーディングしたり、または／および培養中に少なく
とも2つの炭水化物の混合物を使用すると、高レベルに
グリコシル化された、EPOのような所望の蛋白質が高収
量で得られることが見出された。
【００１３】したがって、本発明の第1の局面は、真核
細胞からグリコシル化ポリペプチドを単離する方法であ
って、真核細胞を適当な培地で培養し、所望のポリペプ
チドを細胞または/および培養上清から単離するもので
あり、培地に少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ
の炭水化物の混合物を添加することを特徴とする方法に
関する。
【００１４】炭水化物は、好ましくは、グルコース、グ
ルコサミン、リボース、フルクトース、ガラクトース、
マンノース、スクロース、ラクトース、マンノース-1-
リン酸、マンノース-1-硫酸、およびマンノース-6-硫酸
のような単糖類および二糖類からなる群より選択され
る。栄養培地は、たとえば、グルコースまたは/および
マンノースまたは/およびガラクトースを含むものが適
当である。特に良い結果は、たとえば質量比1:(0.5〜
3):(1〜5)、特に1:(0.7〜2.4):(1.8〜4.0)でグルコー
ス、ガラクトースおよびマンノースの混合物を含む栄養
培地で得られ、各炭水化物のD(+)型が使用されるのが特
に好ましい。発酵中のすべての糖の培地中の総濃度は、
好ましくは0.1〜10 g/lの範囲で、特に好ましくは2〜6
g/lの範囲である。炭水化物の混合物は、以下にさらに
詳しく説明されるように、好ましくは細胞の各々の要求
に依存して添加される。
【００１５】本発明の第2の局面は、真核細胞からグリ
コシル化ポリペプチドを単離する方法である。この方法
では、真核細胞が適当な培地で培養され、所望のポリペ
プチドが細胞または/および培養上清から単離される
が、この方法は、細胞のそれぞれの要求に応じて、個々
の培養細胞株につき少なくとも1つの必須アミノ酸また
は/および少なくとも1つの炭水化物を含む栄養素が、培
養時に調節されながら且つ要求に応じて添加されるとい
う特徴を持つ。
【００１６】需要に応じて栄養素を添加することができ
るように、細胞の栄養要求性およびその消費速度と相関
するパラメーターの濃度を、連続的またはたとえば少な
くとも1日1回といった適当な間隔で測定する。このよう
にすると、細胞に必要な栄養を定量的または/および定
性的に決定し、適当な組成と量とを培地に添加すること
が可能になる。そのようなパラメーターは、グルタミ
ン、アンモニウム、グルコースまたは/およびラクトー
スの濃度、特にグルタミン濃度のような栄養素または細
胞の代謝産物であり得る。
【００１７】調節され需要に応じた栄養分の添加が行わ
れる結果、大きな発酵槽（容積 ＞ 1 l、たとえば50〜1
0,000 l）内で高細胞密度（回収時の細胞密度 ＞ 10 x
105細胞/ml、および好ましくは ＞ 20 x 105細胞/ml）
の発酵でも、グリコシル化をかなり向上できる。
【００１８】本発明のこの局面にしたがって添加される
栄養素は、グルタミンまたは/およびトリプトファンの
ような必須アミノ酸または/および炭水化物で、好まし
くはさらに非必須アミノ酸、ビタミン、微量元素、塩ま
たは/およびたとえばインスリンのような増殖因子を含
む。栄養素は好ましくは少なくとも1つの必須アミノ酸
および少なくとも1つの炭水化物を含む。これらの栄養
素は、好ましくは溶解した状態で発酵培養液に計量しな
がら添加する。この栄養素は好ましくは少なくともグル
タミンおよび炭水化物、特に上記の少なくとも2つの炭
水化物の混合物を含む。グルコース、ガラクトースおよ
びマンノースの混合物が特に好ましくは使用される。ま
た、細胞の増殖期全体に渡って、需要に応じて、すなわ
ち培養液中で測定される選択されたパラメーターの濃度
に応じて、栄養素が添加されることが好ましい。
【００１９】栄養溶液中のグルタミンと炭水化物の量比
は、好ましくは発酵槽中の消費比率に対応するように選
択される。これによって、発酵槽中の個々の基質の濃度
が実質的に一定に維持され得る。グルタミンの濃度は、
好ましくは培地中で、 ＜ 150 mg/l である値に維持さ
れ、培地中のアンモニウム濃度が≧2.3 mmol/l になる
のを予防する。発酵中の糖の総濃度は、すでに説明した
ように、好ましくは0.1〜10 g/lで、特に好ましくは2〜
6 g/lの範囲である。
【００２０】使用する栄養溶液は、糖全体量に対するグ
ルタミンの質量比が好ましくは1:3〜20で、特に好まし
くは1:5〜15となる範囲でグルタミンを含む。グルタミ
ンならびにグルコース、ガラクトース、およびマンノー
スの3つの糖を含む栄養溶液を使用する場合には、グル
タミンと糖の質量比は、好ましくは1:(1〜3):(1〜5):(2
〜8)および特に好ましくは1:(1.5〜2.2):(1.5〜3.6):(4
〜6)である。
【００２１】本発明に係る方法は、任意のグリコシル化
ポリペプチドの製造に基本的に適している。しかし、本
発明に係る方法によって、特にポリペプチドのシアリル
化のレベルが上昇するので、1つまたはいくつかのシア
ル酸残基を持つポリペプチドが適している。また、アン
テナ構造にも影響を与えることが可能である。
【００２２】本発明に係る方法は、特に治療に使用する
ポリペプチドの製造に適している。これは、その生物活
性および薬効がグリコシル化、および特にシアリル化の
レベルまたは/およびアンテナ構造に依存するためであ
る。たとえば、グリコシル化ポリペプチドは、リンホカ
イン、サイトカイン、免疫グロブリン、およびホルモン
（例えばEPO、トロンボポエチン(TPO)、G-CSF、GM-CS
F、インターロイキン、インターフェロン、血液凝固因
子および組織プラスミノゲン活性化因子）のような生理
学的に活性な糖蛋白質からなる群より選択され得る。ポ
リペプチドは、天然のヒトのポリペプチドまたはそのよ
うなヒトポリペプチドの組換え変異蛋白質であり得る。
グリコシル化ポリペプチドEPOは特に好ましい。
【００２３】培養に用いる細胞は、原則的には酵母細胞
または昆虫細胞のような任意の真核細胞で良い。しか
し、真核細胞は好ましくは、たとえばCHOもしくはBHKの
ようなハムスターに由来する細胞または特にヒト細胞の
ような哺乳類細胞である。また、真核細胞は、ヒト細胞
株HeLaS3（Puckら、J. Exp. Meth. 103 (1956), 273-28
4）、Namalwa（Nadharniら、Cancer 23 (1969), 64-7
9）、HT1080（Rasheedら、Cancer 33 (1973), 1027-103
3）のような動物もしくはヒト由来の連続培養細胞株ま
たはそれから由来する細胞株が好ましい。所望のポリペ
プチドは、 (a) 天然の内因性遺伝子の発現によって、 (b) 活性化した内因性遺伝子の発現によって、または/
および (c) 外因性遺伝子の(組換えによる)発現によって、 培養細胞から製造できる。
【００２４】たとえば、欧州特許出願第97 112 640.4号
に開示される大量のEPOを生産することのできる細胞株
のように、所望のポリペプチドが相同組換えによって内
因性遺伝子の発現の活性化により製造される細胞が特に
好ましい。
【００２５】細胞は基本的に、任意の望ましい方法で培
養できる。しかし、懸濁培養が好ましい。さらに、例え
ば最高１％(v/v)または特に無血清培地といった血清含
量の低い培地、例として無血清・低蛋白質発酵培地（国
際公開公報第96/35718号参照）にて細胞を培養すること
が好ましい。適当な培地の例には、適当な添加物、たと
えばRPMI 1640、DMEM、F12またはcRDFを含む基本培地が
ある。本発明に係る方法では、大型発酵槽、すなわち培
養容積が1 l以上、好ましくは10 l以上、たとえば50 l
〜10,000 lでの培養が可能である。また、本発明に係る
方法では、高細胞密度の発酵が可能であり、増殖期の後
（回収時）の細胞密度が10x 105細胞/ml以上、および特
に好ましくは20 x 105細胞/ml以上である。
【００２６】培養は好ましくは要求に応じてフィーディ
ングを行う反復バッチプロセスで行う。これは増殖期の
後に培養液の一部を回収し、培養液の残りは発酵槽に残
し、その後これに作業容積まで新しい培地を充填する。
本発明に係る方法を用いると、非常に高い収量で所望の
グリコシル化ポリペプチドを回収することができる。し
たがって、回収時の濃度は、たとえば培地1 l 当たり所
望のポリペプチドが少なくとも30 mg、および特に少な
くとも40 mgである。
【００２７】本発明の別の局面は、真核細胞からグリコ
シル化ポリペプチドを単離する方法である。この方法で
は、真核細胞を適当な培地で培養し、細胞または/およ
び培養上清から所望のポリペプチドを単離し、この方法
は培養温度が≦35.5℃、好ましくは33〜35℃で行われる
という特徴を持つ。驚くべきことに、所望のグリコシル
化されたポリペプチドの割合は、培養時の温度を低下さ
せるとかなり上昇することがわかった。
【００２８】本発明は、HeLa S3細胞におけるEPOの製造
に関する以下の図面および実施例によって、さらに説明
される。
【００２９】実施例1 インビボにおけるEPOの比活性の
決定 EPOのインビボでの生物活性に重要な要素は、たとえば
炭水化物鎖の合計数に対するテトラアンテナ構造の数、
EPO分子の1つのグリコシル化部位に対するN-アセチルラ
クトサミンユニットの数、およびEPO 1分子あたりのシ
アル酸含有量のような、グリコシル化の度合いである。
末端結合したシアル酸の数に対応して最高14のアイソフ
ォームが生じ、これはたとえばキャピラリーゾーン電気
泳動(CZE)によってその電荷に基づいて分離できる。最
も酸性の高度にシアリル化したアイソフォーム1〜5によ
り、EPOのインビボ生物活性が決定される。
【００３０】赤血球前駆細胞の増殖と分化に対するEPO
の用量依存活性は、EPO投与後の血中の網状赤血球の増
加によって、マウスにおいてインビボで決定された。
【００３１】このために、種々の用量の分析するEPO試
料およびEPO標準（EPO WHO標準に標準化）が、それぞれ
8匹のマウスに非経口的に投与された。その後マウスは
定められた一定の条件下に置かれた。EPO投与の4日後に
マウスrから血液が採取され、網状赤血球がアクリジン
オレンジで染色された。赤血球30,000あたりの網状赤血
球数は、フローサイトメーターでマイクロ蛍光定量法に
よって赤色蛍光ヒストグラムを分析して決定した。
【００３２】生物活性は、リンダ（Linder, 「Planen un
d Auswerten von Versuchen」 , 第3版、1969，Birkenha
user Verlag, Basel）の記述した平行直線を用いた濃度
のペアでの決定方法にしたがって、種々の用量の試料と
標準の網状赤血球数から計算した。
【００３３】実施例2 シアル酸残基含有量の決定 シアル酸含有量は、アルスロバクター・ウレアファシエ
ンス（Arthrobacter ureafaciens）（A. ureaf., Boehr
inger Mannheim）のノイラミニダーゼによってシアル酸
を酵素切断した後、HPAEC-PAD（パルス電流検出つきの
高pH陰イオン交換クロマトグラフィー）およびDionexシ
ステムを用いたクロマトグラフィーで決定した。
【００３４】種々のCHOおよびヒト細胞株（例、HeLa S
3）由来のEPO 22μgを含む各調製物を、5 mM リン酸ナ
トリウム緩衝液（pH 7.2）中でEPO濃度で0.2 mg/mlにな
るように調整した。各調製物の半分を用いて、RP-HPLC
によってEPOの正確な量を決定した。A. ureaf由来のノ
イラミニダーゼ5 mM Uを試料の残り半分に添加し、37℃
で一晩（約18時間）インキュベートした。その後、消化
反応液を半分に分割し、H2Oで20倍に希釈し500μlとし
て、その内の50μl（約27 pmolのEPOに対応）をDionex
システムに添加した。この際、以下のクロマトグラフィ
ーパラメーターが使用された。
【００３５】添加した試料中のシアル酸の量は、同様に
分析したシアル酸標準（Boehringer Mannheim）の値か
ら得た検量線を用いて決定した。シアル酸含有量（mol
シアル酸/mol EPO）は、シアル酸量の決定結果（Dionex
システム）およびRP-HPLCで決定した使用したEPO量から
計算された。
【００３６】実施例3 バイアンテナ、トリアンテナ、
およびテトラアンテナの炭水化物構造の比率の決定 N-結合炭水化物構造は、Dionexシステム上でHPAEC-PAD
によりクロマトグラフィー分析した。CHOおよびヒト細
胞株（例えば、HeLa S3）由来のEPO試料のアシアロオリ
ゴ糖は、N-グリコシダーゼF（Boehringer Mannheim）お
よびA. ureaf.由来のノイラミニダーゼ（Boehringer Ma
nnheim）を用いた酵素切断によって単離した。
【００３７】反応液あたり約30μgのEPOをMicroCon超遠
心ユニット（Amicon、排除サイズ10 kD）を用いて脱塩
し、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）によって
0.3 mg/mlの濃度に調整した。その後、1 UのN-グリコシ
ダーゼFおよび10 mUのノイラミニダーゼを各反応液に添
加し、37℃で一晩（約18時間）インキュベートした。切
断したオリゴ糖からEPOポリペプチド部分を分離するた
めに、インキュベーション後に反応液をUltrafree遠心
ユニット（Millipore、排除サイズ10 kD）を用いて遠心
し、Ultrafreeユニットを20μlのH2Oで2度洗った。濾過
液中のオリゴ糖にH2Oを加えて150μlにし、その内の100
μlをDionexシステムで分析した。この際、以下のクロ
マトグラフィーパラメーターが使用された。
【００３８】複合型N-糖のクロマトグラムのピークは、
標準オリゴ糖（Oxford Glyco Systems）により同定し、
EPOのオリゴ糖を酵素エンド-β-ガラクトシダーゼまた
はフコシダーゼにより酵素消化した後、Dionexシステム
で分析することによって確認した。バイアンテナ、トリ
アンテナ、およびテトラアンテナ構造の割合は、ピーク
面積全体（バイアンテナ、トリアンテナ、およびテトラ
アンテナ構造のピーク面積の合計）に対する対応するN-
糖構造のピーク面積を用いて計算した。
【００３９】実施例4 N-アセチルラクトサミンユニッ
トの含有量と付加的N-アセチルラクトサミンユニット
（リピート）の平均含有量の決定 EPOのN-結合型炭水化物構造（例えばコアの炭水化物構
造）におけるN-アセチルラクトサミンユニットの総数
は、実施例3の実験のクロマトグラムのピーク面積から
計算された。
【００４０】1つの炭水化物鎖あたりのN-アセチルラク
トサミンユニットの平均含有量の数(n)は、以下のよう
にして計算された。 式中、 % (bi) = 炭水化物鎖の総数に対するバイアンテナ構造
の割合 %(tri) = 付加的N-アセチルラクトサミンユニットのな
いトリアンテナ構造の割合 %(tetra) = 付加的N-アセチルラクトサミンユニットの
ないテトラアンテナ構造の割合 %(tri + 1r) = 1つの付加的N-アセチルラクトサミンユ
ニットを持つトリアンテナ構造の割合 %(tetra + 1r) = 1つの付加的N-アセチルラクトサミン
ユニットを持つテトラアンテナ構造の割合 %(tri + 2r) = 2つの付加物N-アセチルラクトサミンユ
ニットを持つトリアンテナ構造の割合 %(tetra + 2r) = 2つの付加的N-アセチルラクトサミン
ユニットを持つテトラアンテナ構造の割合
【００４１】さらなる重要なパラメーターは、いわゆる
リピートとしてコアの炭水化物鎖に結合できるN-アセチ
ルラクトサミンユニットの量である。リピートの含有量
は、炭水化物構造の合計（bi + tri + tetra = 100%）
に対する繰り返しを含む炭水化物構造の割合として記述
できる。このリピートの割合は、CHO細胞およびヒト細
胞由来のEPO試料において異なる可能性がある。
【００４２】実施例5 要求にしたがった調節されたフ
ィーディングのEPOの生物活性への影響 要求に応じたフィーディングを行うリピートバッチプロ
セス（リピート・フェッド・バッチ）によって36.5℃で
培養を行った。この無血清・低蛋白質培地は攪拌発酵槽
（総作業容積10L）に入れ、接種培養液で1度接種した。
接種後の細胞密度は、3±1 x 105生細胞/mlの範囲だっ
た。
【００４３】144±24時間の増殖期の後、培養液の一部
を回収した。残りの培養液は発酵槽に残し、次の増殖期
の接種材料とした。そのために、発酵槽を再び新しい培
地で作業容積まで充填した。
【００４４】EPOを含む培養上清は、発酵培養液の遠心
によって得られた。
【００４５】増殖期の間、栄養溶液は連続的に培養液に
添加された。そのために、栄養溶液を入れた保存容器が
発酵槽に取り付けられた。栄養溶液には、アミノ酸、ビ
タミン、インスリン、微量元素、塩、グルタミン、およ
び炭水化物が含まれていた。2つの発酵は、以下のよう
に行われた。
【００４６】発酵Aでは、栄養溶液には糖としてD-(+)-
グルコースが含まれており、発酵Bでは、糖はD-(+)-グ
ルコース、D-(+)-ガラクトースおよびD-(+)-マンノース
が含まれていた。発酵Bでは、グルタミンと糖の質量比
は、1:2.2:3.6:6だった。栄養溶液中の各糖の濃度は、
7.2〜18 g/lの間だった。
【００４７】発酵Bにおける培養液中のグルタミン濃度
は定時的に分析され、消費量が計算された。栄養溶液の
瞬間流量は、細胞の栄養要求量と一致させた。発酵Aで
は、グルタミン濃度は調節変数として使用されなかっ
た。発酵Bの栄養溶液には、D-(+)-グルコース、D-(+)-
ガラクトースおよびD-(+)-マンノースが2:3:5の質量比
で含まれていた。発酵槽のすべての糖の濃度は、対応す
るフィーディングによって培養期間を通して2〜6 g/lの
範囲に維持された。
【００４８】細胞密度は、回収時には20 x 105細胞/ml
以上、典型的には30±10 x 105細胞/mlにまで増殖中に
変化した。
【００４９】回収した培養液中のヒトエリスロポエチン
の濃度は、たとえばELISAによって決定した。この蛋白
質のアイソフォームの分布比率は、たとえばキャピラリ
ーゾーン電気泳動法(CZE)による分離によって決定し
た。
【００５０】表1は、グルコースを含む栄養溶液をフィ
ーディングした発酵Aと、グルコース、マンノース、お
よびガラクトースを含む栄養溶液を要求に応じて調節し
てフィーディングした発酵Bとの、EPOアイソフォームの
分布を比較したものである。発酵BにおけるEPOアイソフ
ォームの含有量は、発酵Aの対応するアイソフォームに
対する割合として計算した。後者は、各々100％に標準
化した。このデータは、発酵Aと比較して、発酵中にか
なり高い割合で、グリコシル化レベルの高い望ましいEP
Oアイソフォーム2〜4が得られることを示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】フィーディングによって得られたアイソフ
ォームパターンは、栄養溶液を要求に応じて調節してフ
ィーディングした発酵からの連続する4回の回収で再現
可能であった。
【００５３】実施例6 培養温度の変化のEPOの生物活性
への影響 手順は、温度が36.5℃の代わりに35.0℃で、発酵が1000
lで行われたという以外は、実施例5（発酵B）において
要求に応じた調節されたフィーディングを行うフェッド
・バッチ分割プロセスで説明されている。
【００５４】表2は、それぞれに栄養溶液を調節してフ
ィーディングした36.5℃の発酵Cと35.0℃の発酵DとのEP
Oアイソフォームの分布を比較したものである。発酵Dの
EPOアイソフォームの含有量は、発酵Cの対応するアイソ
フォームに対する割合として計算した。後者は、各々10
0％に標準化した。このデータは、温度を低下させるこ
とにより、酸性のEPOアイソフォーム2〜4をかなり増加
できることを示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】実施例7 培地の炭水化物組成の変化のEPO
生物活性への影響 以下に説明する過程は、フィーディング培地中の炭水化
物供給を変化させることにより、ヒトエリスロポエチン
の性質を変化させることが可能であることを示す。
【００５７】上記の過程において、用いる培地の組成が
異なる２つの変法を示す（以下に示す発酵Eおよび発酵
F）。
【００５８】いずれの調製物でも、培地の調製は改変eR
DF培地に基づいている。血清は使用されなかったが、組
換えインスリン（唯一の蛋白質添加物）、および無血清
培地または無蛋白質培地で通常使用される他の添加物
（例えば、亜セレン酸塩、プトレッシン、ハイドロコル
チゾン、硫酸鉄）が使用された。
【００５９】フィーディング栄養溶液も、改変eRDF培地
に基づくが、KCl、Na2HPO4、およびNaClの塩を含まな
い。
【００６０】発酵EとFとの差は、フィーディング培地に
種々の単糖類を添加する点が主に異なる。
【００６１】発酵E： 発酵Eには、通常の糖D-(+)-グルコースが使用された。
最初の濃度は3 g/lだった。グルコースを含む栄養溶液
を適切にフィーディングすることにより、培養液中のグ
ルコース濃度は培養期間全体に渡って3±0.5 g/lに維持
された。
【００６２】培養期間は通常100±20時間だった。回収
時のEPOの濃度は、通常40±10 mg/lだった。
【００６３】発酵F： D-(+)-グルコースに加えて、糖D-(+)-ガラクトースおよ
びD-(+)-マンノースも、発酵Fのフィーディング培地に
およそ1:2:3の質量比で添加された。培養中は、適切な
フィーディングによりすべての糖の濃度は0.25 g/lと3.
5 g/lの間に維持された。
【００６４】培養期間は通常100±20時間だった。回収
時のEPOの濃度は、通常40±10 mg/lだった。
【００６５】培養上清からエリスロポエチンが精製され
た。精製手順は、糖蛋白質の関連するアイソフォームの
分布が影響を受けないようにデザインした。
【００６６】精製エリスロポエチンのアイソフォームの
分布は、前記のようにして決定された。ヒトエリスロポ
エチンのアイソフォームの炭水化物構造および回収した
培養上清におけるアイソフォームの分布は、発酵Eと発
酵Fで異なっていた。発酵Fのほうが、発酵Eに比べてア
イソフォーム2、3、および4の比率がかなり高かった。
この差は、単糖類のマンノースとガラクトースをフィー
ディングしたことによる（図1参照）。
【００６７】正常マウステスト（実施例1）によって決
定された生物活性は、EPOアイソフォームの分布および
炭水化物構造とに相関している（図2）。培養上清Eおよ
びFから得られたEPO試料の炭水化物構造は、CZEおよびH
PAEC分析で解析された。
【００６８】2つのEPO試料についてアンテナ構造（バイ
アンテナ構造、トリアンテナ構造、およびテトラアンテ
ナ構造の含有量）、N-アセチルラクトサミンユニットの
含有量（LE）、シアル酸含有量（SA）ならびにLEおよび
SAの積が表3に示されている。
【００６９】
【表３】
【００７０】 ［図面の簡単な説明］
【図１】 個々のEPOアイソフォームの相対比率が、培
地に添加する炭水化物に依存することを示す。
【図２】 EPO試料の生物活性が、培地に添加する炭水
化物に依存することを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウォーレリウス クラウス ドイツ国 ペンツベルグ クルフールス ト−マックス−シエドルング 19 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/505 C12P 21/02 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳類細胞または昆虫細胞が適当な培地
    で培養され、所望のポリペプチドが細胞または／および
    培養上清から単離される、哺乳類細胞または昆虫細胞か
    らの、シアル酸含有量が増加した、グリコシル化エリス
    ロポエチン混合物（ただし該混合物は、エリスロポエチ
    ン１分子当たりのシアル酸含有量の異なるグリコシル化
    エリスロポエチンアイソフォームの混合物である）の単
    離方法であって、培養培地に少なくとも２つの炭水化物
    の混合物が添加される方法。
  2. 【請求項２】 グルコース、マンノース、または／およ
    びガラクトースを含む炭水化物混合物が使用される、請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 炭水化物が細胞のそれぞれの要求に応じ
    て添加される請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 培養が≦35.5℃の温度で行われる、請求
    項１〜３のいずれかに記載の方法。
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