KR101391457B1 - 조성물 및 조성물의 제조 방법 - Google Patents

조성물 및 조성물의 제조 방법 Download PDF

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데이비드 엠. 디디오
로버트 도날드슨
알란 알. 플레셔
헬렌 지. 해거티
데이비드 에이치. 커클리
존 엠. 타보어
리 케이. 테이
팔라이아 탐마나
아조이 벨레이우단
데이비드 이. 스몰린
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토마스 반덴 붐
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조이스 화이트헤드
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Abstract

본 발명은 재조합 CTLA4-Ig 및 그의 변이체를 생산할 수 있는 포유동물 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 CTLA4-Ig를 포함하는 조성물 및 그의 제제를 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 재조합 단백질을 생산할 수 있는 포유동물 세포로부터 CTLA4-Ig를 대량-생산하는 방법 및 CTLA4-Ig를 정제하는 방법을 제공한다.

Description

조성물 및 조성물의 제조 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING A COMPOSITION}
본 특허 출원은 2005년 12월 20일에 출원된 U.S. Serial No. 60/752,267, 2006년 10월 5일에 출원된 U.S. Serial No. 60/849,543, 및 2005년 12월 20일에 출원된 U.S. Serial No. 60/752,150을 우선권으로 주장하며, 이들 모두는 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다. 본원은 또한 2006년 12월 19일에 출원된 발명의 명칭이 "안정한 단백질 제제"인 특허 출원 (Attorney Docket Number 10739 PCT)의 전문을 참고로 포함한다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
상기 특허 개시내용은 저작권 보호를 받는 소재를 포함한다. 미국 특허상표청 특허 파일 또는 기록에 나타나 있는 바와 같이 저작권자는 특허 문헌 또는 특허 내용의 누군가에 의한 복제를 반대하지 않으나, 다른 방법으로 저작권의 모든 권리를 소유한다.
면역글로불린 슈퍼패밀리의 일원인 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA4)는 활성화 T 세포에 의해 발현된 분자이다. CTLA4는 T-세포 공동자극 분자 CD28과 유사하고, 두 분자 모두 항원-제시 세포 (APC) 상에서 B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86)에 결합한다. 그러나, CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전달하는 반면에, CD28은 자극 신호를 전달한다.
CTLA4-Ig 분자는 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA4)의 리간드-결합 도메인과 면역글로불린 (Ig) 중쇄 불변 영역의 융합 단백질이다. 이들 가용성 분자는 다양한 항원-제시 세포 (APC)의 표면 상에서 B7 항원 (CD80 및 CD86)에 결합하고, 따라서 T-세포의 표면 상에서의 B7-1 및 B7-2와 CD28의 기능적 상호작용을 차단함으로써 그의 생리학적 작용을 발휘한다. 이러한 차단은 T-세포 활성화의 억제, 및 따라서 면역 반응의 억제를 초래한다. CTLA4-Ig 분자는 따라서 조직 및/또는 고형 기관 이식 거부반응의 억제 방법, 뿐만 아니라 일반적으로 자가면역을 비롯한 이상조절된 면역 반응에 관련된 질환 또는 장애에 대한 치료 용도를 제공할 수 있다. 예를 들어, CTLA4-Ig 분자는 항-dsDNA 항체의 생성을 억제하고 루푸스 경향 마우스에서의 신장염을 감소시킬 수 있고; 단백뇨증을 감소시키고 진행된 신장염을 앓는 마우스의 생존을 연장시킬 수 있고; 건선 및 류마티스양 관절염의 임상 결과를 개선할 수 있다.
CTLA4-Ig 분자의 치료 유용성을 개선시키기 위해서는, 예를 들어, B7 항원에 대한 분자의 결합활성 및 효능을 증가시킴으로써 T 세포 자극의 억제제로서의 분자의 효능을 증진시킬 수 있는 분자 변이를 측정하는 것이 중요하다. CTLA4-Ig 분자의 결합활성 및 효능에서의 증가는 감소된 양의 CTLA4-Ig 분자를 환자에게 투여하여 목적하는 치료 효과를 달성하는 것 (즉, 보다 적은 용량의 투여)을 가능하게 할 수 있다. CTLA4-Ig 분자의 결합활성 및 효능에서의 증가는 또한 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 환자에게 투여되는 용량의 수 또는 빈도를 감소시킬 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 CTLA4-Ig 조성물을 제조하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 CTLA4-Ig 분자, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 개선된 조성물, 및 CTLA4-Ig 분자 및 다른 재조합 단백질을 생산 (대량 생산 포함)하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
본 발명은 단독으로 기재되어 있든지 또는 특정 조합 또는 순열로 기재되어 있든지, 본원에 기재된 임의의 요소 및 특징의 임의의 순열 및/또는 조합을 포함한다.
세포: 본 발명은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary) 세포 집단을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 각 세포는 30 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 포함한다. 본 발명은 또한 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 각 세포는 30 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 포함하고, 여기서 30 카피 이상은 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 본 발명은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 CTLA4-Ig 발현 카셋트는 약 105회 계대배양에 걸쳐 안정하다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig는 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Koduri R., et al. (Gene, 2001, 280:87-95)] 및 미국 특허 제6,800,457호 및 동 제6,521,419호에 기재된 핵산 서열을 포함하는 발현 카셋트에 의해 코딩된다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig는 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Koduri R., et al. (Gene, 2001, 280:87-95)] 및 미국 특허 제6,800,457호 및 동 제6,521,419호에 기재된 특정 유전자좌에서 세포 집단으로부터 세포 게놈에 통합된 발현 카셋트에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, 집단은 33 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 포함하는 세포의 아집단을 포함하며, 여기서 33 카피 이상은 아집단의 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다.
본 발명은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포 집단의 75％ 이상은 30 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 가지며, 여기서 30 카피 이상은 집단의 75％의 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 본 발명은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포 집단의 85％ 이상은 30 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 가지며, 여기서 30 카피 이상은 집단의 85％의 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 본 발명은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포 집단의 95％ 이상은 30 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 가지며, 여기서 30 카피 이상은 집단의 95％의 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 액체 배양물 1 리터 당 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질보다 많이 생산할 수 있으며, 여기서 CTLA4-Ig는 적합한 탄수화물 특징을 나타내고, 여기서 시알산 대 CTLA4-Ig의 몰비는 1,000 L 이상의 배양 규모에서 약 6 내지 약 14이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 무혈청의 화학적으로 규정된 배지에 적응되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단의 배양물로부터 생산된 CTLA4-Ig는 1.00 ± 0.05 AU mL cm-1 mg-1의 흡광 계수를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은, 배양물에서 성장할 때 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 생산할 수 있으며, 여기서: (a) 약 90％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 약 10％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 약 4％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 383에서 리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 약 96％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 382에서 글리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; 임의로, (e) 약 1％ 미만의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 25에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 클로날 세포의 자손 세포를 제공하며, 여기서 자손 세포는 CTLA4-Ig를 생산한다. 한 실시양태에서, 자손 세포는 5 세대 이상에 걸쳐 클로날 부모 세포를 배양하여 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 10 세대 이상에 걸쳐, 20 세대 이상에 걸쳐, 40 세대 이상에 걸쳐, 50 세대 이상에 걸쳐, 75 세대 이상에 걸쳐, 또는 100 세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 수득된다. 본 발명은 클로날 세포로부터 생산된 세포주를 제공한다. 한 실시양태에서, 세포주는 클론성이다. 본 발명은 하기를 생산할 수 있는 세포주를 제공한다: (a) 서열 10 (아미노산 위치 27에 메티오닌 및 아미노산 위치 382에 글리신; 도 1a 및 1b)의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질; (b) 서열 7 (아미노산 위치 27에 메티오닌 및 아미노산 위치 383에 리신; 도 1a 및 1b)의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질; (c) 서열 9 (아미노산 위치 26에 알라닌 및 아미노산 위치 382에 글리신; 도 1a 및 1b)의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질; (d) 서열 6 (아미노산 위치 26에 알라닌 및 아미노산 위치 383에 리신; 도 1a 및 1b)의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질; (e) 서열 8 (아미노산 위치 25에 메티오닌 및 아미노산 위치 382에 글리신; 도 1a 및 1b)의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질; 또는 (f) 서열 5 (아미노산 위치 25에 메티오닌 및 아미노산 위치 383에 리신; 도 1a 및 1b)의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질. 또 다른 실시양태에서, 세포주는 CTLA4-Ig 융합 단백질을 생산할 수 있으며, 여기서: (a) 약 90％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 약 10％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 약 4％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 383에서 리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 약 96％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 382에서 글리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; 임의로, (e) 약 1％ 미만의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 25에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포주를 배양하여 생산된 CTLA4-Ig 융합 단백질은 1.00 ± 0.05 AU mL cm-1 mg-1의 흡광 계수를 갖는다. 본 발명은 클로날 세포주로부터 유래된 세포 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 기원 클로날 세포주와 비교하여 하나 이상의 추가의 유전자 변화를 포함하며, 여기서 유래된 세포 집단은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 부모 세포와 비교하여 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 10 이상, 15 이상, 또는 20 이상의 추가의 유전자 변화를 포함하며, 여기서 유래된 세포 집단은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 게놈 내 또는 CTLA4-Ig를 코딩하는 재조합 발현 카셋트 내의 하나 이상의 비-보존성 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 내에 하나 이상의 추가의 재조합 핵산을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 변화는 세포 게놈의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변화는 핵산의 세포 게놈에의 또는 항-아폽토시스성 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스 핵산으로서의 부가를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-아폽토시스성 폴리펩티드는 글리코실화에 관련된다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 게놈의 또는 CTLA4-Ig를 코딩하는 재조합 발현 카셋트의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
조성물: 본 발명은 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 8 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 11 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 12 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 13 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 14 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 15 내지 약 17의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 16의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 95％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 98％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이다. 또 다른 실시양태에서, 99％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이다. 또 다른 실시양태에서, 99.5％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이다. 또 다른 실시양태에서, 약 95％ 내지 약 99.5％의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이고 약 0.5％ 내지 약 5％의 분자가 CTLA4-Ig 사량체 또는 고분자량 종이다. 또 다른 실시양태에서, 약 98.6％의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이고 약 1.2％의 분자가 CTLA4-Ig 사량체 또는 고분자량이고, 약 0.7％ 미만의 분자가 CTLA4-Ig 단량체이다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체로 구성된 집단을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 단량체를 실질적으로 함유하지 않는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 사량체를 실질적으로 함유하지 않는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 및 사량체를 실질적으로 함유하지 않는 CTLA4-Ig 단량체 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 각 CTLA4-Ig 이량체의 각 단량체는 3개 이상의 시알산 기를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 각 CTLA4-Ig 이량체의 각 단량체는 3개 이상 내지 8개 이상의 시알산 기를 갖는다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체를 실질적으로 함유하지 않고, 임의로 약 100 그램 초과의 양을 포함하는 CTLA4-Ig 사량체 분자의 정제된 집단을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 단량체를 실질적으로 함유하지 않고, 임의로 약 100 그램 초과의 양을 포함하는 CTLA4-Ig 사량체 분자의 정제된 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 각 사량체 분자는 2쌍의 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 5-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 폴리펩티드의 쌍의 각 일원은 다른 일원에 공유적으로 연결되어 있고, 2쌍의 폴리펩티드는 서로 비공유적으로 결합되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 각 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 각 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 분자와 비교하여 2배 이상 더 높은 CD80 또는 CD86에 대한 결합활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 각 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 분자와 비교하여 2배 이상 더 높은 T 세포 증식 또는 활성화의 억제율을 갖는다. 본 발명은 등전 집중법에 의해 측정된 5.1 이하의 등전점 (pI)을 갖는 CTLA4-Ig의 등전 집중 겔 상에서 시각화가능한 우세한 이소형을 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 등전 집중법에 의해 측정된 5.8 이하의 등전점 (pI)을 갖는 CTLA4-Ig의 등전 집중 겔 상에서 시각화가능한 우세한 이소형을 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, pI는 뉴라미니다제 처리 후에 증가한다. 한 실시양태에서, 조성물은 등전 집중법에 의해 측정된 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 또는 4.5 이하의 등전점 (pI)을 갖는 CTLA4-Ig의 등전 집중 겔 상에서 시각화가능한 우세한 이소형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 40％ 이상의 CTLA4-Ig 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.1 이하의 등전점을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 70％ 이상의 CTLA4-Ig 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.1 이하의 등전점을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 90％ 이상의 CTLA4-Ig 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 약 2.5 이하의 등전점을 나타낸다. 본 발명은 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 4.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 4.3 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 3.3 ± 0.2 내지 약 4.7 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 (a) CTLA4-Ig 분자의 혼합물을 등전 집중 겔 전기영동시키며, 여기서 겔 상의 단일 밴드는 특정 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 나타내는 것인 단계, 및 (b) 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 단리하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 3.5 내지 약 8.3의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 7.2 내지 약 22의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 만노스의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; 및 (b) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; 및 (c) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; 및 (d) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비; 및 (e) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 만노스의 평균 몰비; 및 (f) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 9.589+/-0.3의 NGNA 크로마토그램 피크 및 약 10.543+/-0.3의 NANA 크로마토그램 피크를 나타내는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 도 68에 도시된 바와 같은 탄수화물 프로파일을 나타내는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 도메인 (Domain) I-V (예컨대, I-IV)의 탄수화물 프로파일를 나타내는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 도메인 I은 아시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 II는 모노-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 III은 디-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 IV는 트리-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함한다. 도메인 V는 테트라-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함한다. 한 실시양태에서, 도메인 I에서의 제1 피크 및 도메인 II에서의 주 피크 간의 N-연결된 올리고사카라이드의 체류 시간에서의 차이는 약 22 내지 약 28분이다. 본 발명은 0.5％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 분자가 시스테이닐화되어 있는 CTLA4-Ig 이량체 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 1.0％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 분자가 시스테이닐화되어 있다. 본 발명은 도 8 및 10에 도시된 바와 같은 질량 분광 프로파일을 나타내는, CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 도 20 및 21에 도시된 바와 같은 모세관 전기영동 프로파일을 나타내는, CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 조성물을 제공한다. 본 발명은 본원에 기재된 어느 방법에 의해 수득된 CTLA4-Ig 조성물을 제공한다. 본 발명은 서열 2의 위치 102에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 2의 위치 134에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 2의 위치 233에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 2의 위치 155에서의 세린 아미노산 잔기, 또는 서열 2의 위치 165에서의 세린 아미노산 잔기에서 글리코실화되어 있는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 만노스의 평균 몰비; (f) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; (g) 약 2.4 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2 범위의 등전 집중 겔 상에서의 시각화로부터 측정된 pI; (h) 5 ppm 이하의 MCP-1; (i) 3.0％ 미만의 사량체 (예컨대, 2.5％ 고분자량 종 또는 사량체, 2.0％ 고분자량 종 또는 사량체); (j) 0.5％ 미만의 단량체; (k) 서열 2-8 중 어느 것과 95％ 이상 동일한 아미노산을 갖는 집단의 CTLA4-Ig 폴리펩티드; (l) 집단 내 CTLA4-Ig 분자는 CD80 및 CD86에 결합할 수 있음를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
조성물: 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 2005년 12월 20일에 출원된 미국 특허 출원 제60/752,150호에 기재된 바와 같은 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 CTLA4-Ig를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 말토스, 제일인산나트륨 일수화물, 염화나트륨, 수산화나트륨, 및 멸균수를 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 수크로스, 폴록사머, 제일인산나트륨 일수화물, 무수 제이인산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨, 및 멸균수를 포함한다.
제제 및 키트: 본 발명은 95％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 및 5％ 이하의 CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 98％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 및 2％ 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종 또는 사량체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물은 99％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 및 1％ 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종 또는 사량체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 8.0 몰 이상의 시알산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 약 15.7 내지 약 31 몰의 GlcNAc를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 약 1.6 내지 약 3.2 몰의 GalNAc를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 약 9.3 내지 약 15.5 몰의 갈락토스를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 약 3.6 내지 약 7.9 몰의 푸코스를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 몰 당 약 9.7 몰의 만노스를 포함한다. 본 발명은 또한 (a) 본 발명의 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 함유하는 용기; 및 (b) 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물의 주사용액으로의 재구성에 관한 지침서를 포함하는 제약 키트를 제공한다.
예시적 치료 방법: 본 발명은 T 세포를 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 증식 (또는 활성화)의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 면역 반응의 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 면역 반응의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 항원에 대한 면역 관용의 유도가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 항원에 대한 면역 관용의 유도 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 염증의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 염증의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 류마티스양 관절염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 류마티스양 관절염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 건선의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 건선의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 루푸스의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 루푸스의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 알레르기의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 알레르기의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 이식편 대 숙주 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 이식편 대 숙주 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 이식된 기관의 거부반응의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 이식된 기관의 거부반응의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 다발성 경화증의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 크론병의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 크론병의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 제I형 당뇨병의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 제I형 당뇨병의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 염증성 장 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 염증성 장 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 난소염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 난소염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 사구체신염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 사구체신염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 알레르기성 뇌척수염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 알레르기성 뇌척수염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 중증 근무력증의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 중증 근무력증의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 면역 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약에 제조에 있어서 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단의 용도를 제공한다. 본 발명은 류마티스양 관절염의 치료에서의 사용에 관한 지침서를 포함한 포장물로의 항-류마티스양 관절염 약제의 제조에 있어서 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체 또는 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단의 용도를 제공한다.
예시적 조합 요법: 본 발명은 T 세포를 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 증식 (또는 활성화)의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 면역 반응의 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 면역 반응의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 CTLA4-Ig 조성물을 항원에 대한 면역 관용의 유도가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 항원에 대한 면역 관용의 유도 방법을 제공한다.
CTLA4-Ig의 생산 방법: 본 발명은 (a) 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 확장시키며, 여기서 확장은 시드 배양물로부터 액체 배양물로의 확장이고, 재조합 단백질 농도는 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상인 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 액체 배양물로부터 단리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 액체 배양물은 1,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상, 15,000 L 이상, 20,000 L 이상, 25,000 L 이상, 30,000 L 이상, 40,000 L 이상일 수 있다. 한 실시양태에서, 확장 단계 (a)는 (i) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지 중에서 4회 이상의 계대배양으로 배양시켜 mL 당 생존가능한 세포 약 1.0 x 105개 이상의 세포 밀도를 수득하며, 여기서 각 시딩 단계는 ml 당 약 2 x 105개로 시작하여 ml 당 1백만 내지 2백만개 세포로 진행되고; (ii) 배양물로부터 약 0.5 g/L 이상을 생산하기에 충분한 시간 동안 세포를 배양물 중에서 유지시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질은 당단백질이다. 한 실시양태에서, 단백질은 CTLA4-Ig 단백질이다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 CTLA4-Ig 융합 단백질을 생산할 수 있는 CHO 클로날 세포주의 자손이며, 여기서 CHO 세포는 30 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 그들의 게놈 내에 안정하게 통합한다. 한 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 30％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 40％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 50％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 60％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 70％, 또는 80％ 또는 90％ 또는 95％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다.
추가의 실시양태에서, 4회 이상의 계대배양은 (i) ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 50 mL 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계, (ii) ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 10 L 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계; (iii) ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 100 L 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계; 및 (iv) ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 200 L의 배양 용량으로 성장시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 갈락토스를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지에 첨가한다. 한 실시양태에서, 유지는 (i) 배양 온도를 37±2℃에서 34±2℃로 낮추고; (ii) 배양 온도를 34±2℃에서 32±2℃로 낮추는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 5일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 6일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 7일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 8일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 9일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 10일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 11일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 12일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 13일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 14일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 15일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 16일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 17일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 18일 이상 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 18일 이하 동안 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 배양물의 세포 밀도가 액체 배양물 mL 당 약 30 x 105 내지 약 79 x 105개의 세포일 때까지 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다.
본 발명은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상이도록, 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물이 CTLA4-Ig 단백질 또는 이량체 몰 당 약 6.0 몰 이상의 NANA를 함유하는 경우에만 수행되는 것인 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상이도록, 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물이 mL 당 약 33 x 105 내지 약 79 x 105개 세포의 세포 밀도를 갖는 경우에만 수행되는 것인 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상이도록, 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 20％, 또는 약 30％, 또는 약 38％ 미만으로 감소되지 않는 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상이도록, 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 내독소가 액체 배양물 mL 당 약 76.8 EU 이하인 경우에만 수행되는 것인 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상이도록, 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 바이오버든 (bioburden)이 액체 배양물 mL 당 1 콜로니 형성 단위 미만인 경우에만 수행되는 것인 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 액체 배양물은 5,000 L 이상, 10,000 L 이상, 15,000 L 이상, 20,000 L 이상, 25,000 L 이상, 30,000 L 이상, 40,000 L 이상, 50,000 L 이상, 60,000 L 이상의 용량일 수 있다.
본 발명은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상이도록, 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 하기 조건: (i) 액체 배양물이 단백질 몰 당 약 6.0 몰 이상의 NANA를 함유하는 조건, (ii) 액체 배양물이 mL 당 약 33 x 105 내지 약 79 x 105개 세포의 세포 밀도를 갖는 조건, (iii) 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 20％, 또는 약 38％ 미만으로 감소되지 않는 조건, 또는 (iv) 배양물 중의 CTLA4-Ig의 양이 0.5 g/L 초과인 조건 중 2개 이상이 부합되는 경우에만 수행되는 것인 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 단리는 (i) 세포 배양 상청액을 수득하는 단계; (ii) 상청액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 용출된 단백질 생성물을 수득하는 단계; (iii) 단계 (ii)의 용출된 단백질 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 농축된 단백질 생성물을 수득하는 단계; (iv) 농축된 단백질 생성물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 용출되고 농축된 단백질 생성물을 수득하는 단계; 및 (v) 단계 (iv)의 용출되고 농축된 단백질 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)에서 수득된 농축된 단백질 생성물은 임의의 고분자량 오염물의 백분율이 25중량％ 미만임을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 75 mM HEPES 및 약 360 mM NaCl을 포함하고, 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 325 mM NaCl을 포함하고, 약 7.0의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 850 mM NaCl을 포함하고, 약 7.0의 pH를 갖는 단일 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 약 25 mM Tris 및 약 250 mM NaCl을 포함하고, 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 약 100 mM 글리신을 포함하고 약 3.5의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (v)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 120 mM NaCl 내지 약 130 mM NaCl을 포함하고 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (v)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 200 mM NaCl을 포함하고 약 8.0의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민 관능기를 갖는 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 수지는 4차 아민 관능기를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸, 또는 이소아밀 관능기를 갖는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 관능기는 페닐 관능기이다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 단백질 A를 함유하는 칼럼을 사용하여 수행한다.
본 발명은 정제된 CTLA4-Ig가 (a) CTLA4-Ig 이량체 mg 당 약 38 ng의 MCP-1을 갖고, (b) 2.5 중량％ 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종 (예컨대, 사량체)을 포함하도록 CTLA4-Ig를 액체 세포 배양물로부터 정제하는 것을 포함하는, CTLA4-Ig의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 자손 세포 또는 CHO 세포를 확장시키며, 여기서 확장은 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로의 확장이고, CTLA4-Ig 농도는 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상인 단계; 및 (b) CTLA4-Ig를 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 크로마토그래피는 적어도 페닐 관능기를 갖는 소수성 상호작용 수지를 갖는 칼럼 상에서 수행되고, 단리는 약 25 mM HEPES 및 약 850 mM NaCl을 포함하고, 약 7.0의 pH를 갖는 단일 세척 완충액을 사용하여 수행되는 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계를 포함하는 것인 CTLA4-Ig의 생산 방법을 제공한다.
CTLA4-Ig 분자는 베타 폴리펩티드 분자를 포함한다. CTLA4A29YL104E-Ig는 베타 폴리펩티드 분자이다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 조성물 또는 베타 폴리펩티드 분자 조성물, 및 개선된 조성물의 생산 (대량 생산 포함) 방법에 관한 것이다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 분자, 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 개선된 조성물, 및 베타 폴리펩티드 분자 및 다른 재조합 당단백질의 개선된 생산 (대량 생산 포함) 방법에 관한 것이다.
베타 폴리펩티드 및 다른 당단백질의 생산 방법: 본 발명은 (a) 재조합 당단백질을 분비하는 포유동물 세포를 확장시키며, 여기서 확장은 시드 배양물로부터 약 10,000 L 이상의 액체 배양물로의 확장이고, 재조합 단백질 농도는 액체 배양물 L 당 약 0.5 그램 이상이고, 확장은 (i) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지 중에서 4회 이상의 계대배양으로 배양시켜 mL 당 생존가능한 세포 약 1.0 x 105개 이상의 세포 밀도를 수득하며, 여기서 각 시딩 단계는 ml 당 약 2 x 105개로 시작하여 ml 당 약 1백만 내지 2백만개 세포로 진행되고, 배양은 (1) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 접종 배지 중에서 약 15일 내지 약 25일 동안 배양하고; 이어서 (2) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 기본 배지 중에서 mL 당 세포 약 4백만개 이상의 세포 밀도에 이를 때까지 배양하는 것을 포함하는 것인 단계; 및 (ii) 배양물로부터 재조합 단백질을 약 0.5 g/L 이상 생산하기에 충분한 시간 동안 세포를 배양물 중에서 유지시키는 단계를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 약 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하는 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 재조합 당단백질을 분비하는 포유동물 세포를 확장시키며, 여기서 확장은 시드 배양물로부터 약 10,000 L 이상의 액체 배양물로의 확장이고, 재조합 단백질 농도는 액체 배양물 L 당 약 0.5 그램 이상이고, 확장은 (i) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지 중에서 4회 이상의 계대배양으로 배양시켜 mL 당 생존가능한 세포 약 1.0 x 105개 이상의 세포 밀도를 수득하며, 여기서 각 시딩 단계는 ml 당 약 2 x 105개로 시작하여 ml 당 약 1백만 내지 2백만개 세포로 진행되는 것인 단계; 및 (ii) 배양물로부터 재조합 단백질을 약 0.5 g/L 이상 생산하기에 충분한 시간 동안 세포를 배양물 중에서 유지시키며, 여기서 유지는 (1) 배양 온도를 37±2℃에서 34±2℃로 낮추고; (2) 다가음이온성 화합물을 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 약 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하는 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 재조합 당단백질을 분비하는 포유동물 세포를 확장시키며, 여기서 확장은 시드 배양물로부터 약 10,000 L 이상의 액체 배양물로의 확장이고, 재조합 단백질 농도는 액체 배양물 L 당 0.5 그램 이상인 단계; 및 (b) 재조합 단백질을 약 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 (i) 단계 (a)의 배양물의 가용성 분획물을 수득하고; (ii) 가용성 분획물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 용출된 단백질 생성물을 수득하고; (iii) 단계 (ii)의 용출된 단백질 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 용출되고 농축된 단백질 생성물을 수득하고; (iv) 농축된 단백질 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 농축된 단백질 생성물을 수득하는 것을 포함하는 것인 단계를 포함하는, 재조합 당단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단백질은 CTLA4-Ig를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단백질은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단백질은 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16을 갖는 베타 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 4회 이상의 계대배양은 (i) ml 당 세포 약 1백만 내지 약 2.5백만개의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 50 mL 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계, (ii) ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 10 L 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계; (iii) ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 100 L 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계; 및 (iv) ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 200 L의 배양 용량으로 성장시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리는 (i) 단계 (a)의 배양물의 가용성 분획물을 수득하고; (ii) 가용성 분획물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 용출된 단백질 생성물을 수득하고; (iii) 단계 (ii)의 용출된 단백질 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 용출되고 농축된 단백질 생성물을 수득하고; (iv) 농축된 단백질 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 농축된 단백질 생성물을 수득하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (iv)에서 수득된 농축된 단백질 생성물은 임의의 고분자량 다량체의 백분율이 25중량％ 미만임을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 50 mM HEPES 및 약 135 mM NaCl을 포함하고, 약 7의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 50 mM HEPES 및 약 200 mM NaCl을 포함하고, 약 7의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iv)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 약 50 mM HEPES 및 약 1.2 M (NH4)2SO4를 포함하고, 약 7의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 약 25 mM NaH2PO4 및 약 150 mM NaCl을 포함하고, 약 7.5의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 약 250 mM 글리신을 포함하고 약 3의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민 관능기를 갖는 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 수지는 4차 아민 관능기를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸, 또는 이소아밀 관능기를 갖는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 관능기는 페닐 관능기이다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 단백질 A를 함유하는 칼럼을 사용하여 수행한다.
또 다른 실시양태에서, 확장은 (i) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지 중에서 4회 이상의 계대배양으로 배양시켜 mL 당 생존가능한 세포 약 1.0 x 105개 이상의 세포 밀도를 수득하며, 여기서 각 시딩 단계는 ml 당 약 2 x 105개로 시작하여 ml 당 약 1백만 내지 2백만개 세포로 진행되고, (ii) 배양물로부터 재조합 단백질을 약 0.5 g/L 이상 생산하기에 충분한 시간 동안 세포를 배양물 중에서 유지시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 배양은 (i) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 접종 배지 중에서 약 15일 내지 약 25일 동안 배양하고; 이어서 (ii) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 기본 배지 중에서 mL 당 약 4백만개 이상의 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 배양하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 유지는 (i) 배양 온도를 37±2℃에서 34±2℃로 낮추고; (ii) 다가음이온성 화합물을 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 다가음이온성 화합물은 덱스트란 술페이트이고 덱스트란 술페이트는 약 50 mg/ml의 최종 농도로 배양물에 첨가된다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 5일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 6일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 7일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 8일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 9일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 10일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 11일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 12일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 13일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 14일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 15일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 16일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 17일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 18일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 19일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 20일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 21일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 22일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 23일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 24일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 25일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 26일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 27일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 28일 이상 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 28일 이하 동안 34±2℃의 범위 내에서 유지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 배양물의 세포 밀도가 액체 배양물 mL 당 세포 약 30 x 105 내지 약 79 x 105개일 때까지 32±2℃의 범위 내에서 유지시킨다.
한 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 30％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 40％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 50％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 60％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 70％, 또는 80％ 또는 90％ 또는 95％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다.
한 실시양태에서, 갈락토스를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지에 첨가한다. 또 다른 실시양태에서, 단리는 액체 배양물이 단백질의 몰 당 약 6 몰 이상의 시알산을 함유하는 경우에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 단리는 액체 배양물이 단백질의 몰 당 약 5.2 내지 약 7.6 몰의 시알산을 함유하는 경우에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 단리는 액체 배양물이 mL 당 약 33 x 105 내지 약 79 x 105개 세포의 세포 밀도를 갖는 경우에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 단리는 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 37％ 미만으로 감소되지 않는 경우에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 단리는 내독소가 액체 배양물 mL 당 약 4.8 EU 이하인 경우에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 단리는 바이오버든이 액체 배양물 mL 당 약 1 콜로니 형성 단위 (cfu/ml) 미만인 경우에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 단리는 하기 조건: (i) 액체 배양물이 단백질 몰 당 약 6 몰 이상의 시알산을 함유하는 조건, (ii) 액체 배양물이 mL 당 약 33 x 105 내지 약 79 x 105개 세포의 세포 밀도를 갖는 조건, (iii) 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 37％ 미만으로 감소되지 않는 조건, 또는 (iv) 배양물 중의 당단백질의 양이 약 0.46 g/L 내지 약 0.71 g/L인 조건 중 2개 이상이 부합되는 경우에 수행된다.
한 실시양태에서, 포유동물 세포는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 임의 조합물을 생산하는 차이니즈 햄스터 난소 클로날 세포주의 자손이며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16을 포함하고, 차이니즈 햄스터 난소 세포는 각각 서열 3을 포함하는 30 카피 이상의 발현 카셋트를 그들의 게놈 내에 안정하게 통합한다. 한 실시양태에서, 액체 배양물은 본 발명의 생산 세포주의 세포 또는 세포의 자손 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 의해 제공된 방법에 의해 수득된 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16을 포함하는 베타 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 방법에 의해 수득된 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16을 포함하는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 방법에 의해 수득된 베타 폴리펩티드를 제공한다.
세포: 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포를 제공한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 베타 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16을 포함한다. 본 발명은 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 아미노산 서열을 코딩하는 발현 카셋트를 포함하는 핵산을 포함하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 발현 카셋트는 서열 3을 포함한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 베타 폴리펩티드는 부다페스트 조약의 규정 하에 2000년 6월 19일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection: ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110)에 기탁된 ATCC 수탁 번호 PTA-2104를 갖는 플라스미드로부터 유래된 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다.
본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 각 세포는 30 카피 이상의 베타 폴리펩티드 발현 카셋트를 포함한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 각 세포는 30 카피 이상의 베타 폴리펩티드 발현 카셋트를 포함하고, 여기서 30 카피 이상은 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 베타 폴리펩티드 발현 카셋트는 약 105회 계대배양에 걸쳐 안정하다. 한 실시양태에서, 베타 폴리펩티드는 세포 게놈 내로 통합된 발현 카셋트에 의해 코딩된다.
본 발명은 베타 폴리펩티드를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포 집단의 75％ 이상은 세포 당 30 카피 이상의 베타 폴리펩티드 발현 카셋트를 가지며, 여기서 30 카피 이상은 집단의 75％의 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포 집단의 85％ 이상은 세포 당 30 카피 이상의 베타 폴리펩티드 발현 카셋트를 가지며, 여기서 30 카피 이상은 집단의 85％의 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 생산하는 클로날 차이니즈 햄스터 난소 세포 집단을 제공하며, 여기서 세포 집단의 95％ 이상은 세포 당 30 카피 이상의 베타 폴리펩티드 발현 카셋트를 가지며, 여기서 30 카피 이상은 집단의 95％의 각 세포의 게놈 내 단일 부위에서 통합된다. 한 실시양태에서, 발현 카셋트는 ATCC 수탁 번호 PTA-2104로서 기탁된 플라스미드로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 발현 카셋트는 서열 3의 서열을 갖는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 액체 배양물 1 리터 당 약 0.5 그램 이상의 베타 폴리펩티드를 생산하며, 여기서 베타 폴리펩티드는 1,000 L 이상의 배양 규모에서 약 5.5 내지 약 8.5의 시알산 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰비를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 액체 배양물 1 리터 당 5 그램 이상, 10 그램 이상 또는 20 그램 이상의 베타 폴리펩티드를 생산한다. 또 다른 실시양태에서, 베타 폴리펩티드는 1,000 L 이상의 배양 규모에서 약 5 내지 약 10의 시알산 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰비를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 무혈청의 화학적으로 규정된 배지에 적응되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단의 배양물로부터 생산된 베타 폴리펩티드는 1.0 ± 0.05 AU mL cm-1 mg-1의 흡광 계수를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은, 배양물에서 성장할 때 베타 폴리펩티드를 생산하며, 여기서: (a) 약 90％의 또는 약 80％의 베타 폴리펩티드는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 약 10％ 또는 약 20％의 베타 폴리펩티드는 잔기 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 약 4％ 내지 약 8％의 베타 폴리펩티드는 잔기 383에서 리신으로 종결되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 약 92％ 내지 약 96％의 베타 폴리펩티드는 잔기 382에서 글리신으로 종결되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; 임의로, (e) 약 1％ 미만의 베타 폴리펩티드는 잔기 25에서 메티오닌으로 개시되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 세포 집단의 자손 세포를 제공하며, 여기서 자손 세포는 베타 폴리펩티드를 생산한다. 한 실시양태에서, 자손 세포는 5 세대 이상에 걸쳐, 10 세대 이상에 걸쳐, 20 세대 이상에 걸쳐, 40 세대 이상에 걸쳐, 50 세대 이상에 걸쳐, 75 세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 27 세대 동안 세포를 배양하여 수득된다.
본 발명은 본 발명에 의해 제공된 임의의 세포로부터 생산된 세포주를 제공한다. 한 실시양태에서, 세포주는 클론성이다. 한 실시양태에서, 세포주는 하기를 생산한다: (a) 서열 16 (서열 4의 아미노산 위치 27에 메티오닌 및 아미노산 위치 382에 글리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (b) 서열 13 (서열 4의 아미노산 위치 27에 메티오닌 및 아미노산 위치 383에 리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (c) 서열 15 (서열 4의 아미노산 위치 26에 알라닌 및 아미노산 위치 382에 글리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (d) 서열 12 (서열 4의 아미노산 위치 26에 알라닌 및 아미노산 위치 383에 리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (e) 서열 11 (서열 4의 아미노산 위치 25에 메티오닌 및 아미노산 위치 383에 리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (f) 서열 14 (서열 4의 아미노산 위치 25에 메티오닌 및 아미노산 위치 382에 글리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; 또는 (g) 이들의 임의의 조합물. 한 실시양태에서, 세포주는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 생산하며, 여기서: (a) 약 90％ 또는 약 80％의 베타 폴리펩티드는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 약 10％ 또는 약 20％의 베타 폴리펩티드는 잔기 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 약 4％ 내지 약 8％의 베타 폴리펩티드는 잔기 383에서 리신으로 종결되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 약 92％ 내지 약 96％의 베타 폴리펩티드는 잔기 382에서 글리신으로 종결되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; 임의로, (e) 약 1％ 미만의 베타 폴리펩티드는 잔기 25에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포주를 배양하여 생산된 베타 폴리펩티드는 1.0 ± 0.05 AU mL cm-1 mg-1의 흡광 계수를 갖는다.
본 발명은 본 발명의 세포로부터 유래된 세포 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 집단이 유래된 본 발명의 세포와 비교하여 하나 이상의 추가의 유전자 변화를 포함하며, 여기서 세포는 베타 폴리펩티드를 생산한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은 집단이 유래된 본 발명의 세포와 비교하여 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 20 이상의 추가의 유전자 변화를 포함하며, 여기서 세포는 베타 폴리펩티드를 생산한다. 한 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 게놈 내 또는 베타 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카셋트 내의 하나 이상의 비-보존성 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 내에 하나 이상의 추가의 재조합 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 게놈의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변화는 핵산의 세포 게놈에의 또는 항-아폽토시스성 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스 핵산으로서의 부가를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-아폽토시스성 폴리펩티드는 글리코실화에 관련된다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 게놈의 또는 베타 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카셋트의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단은, 배양물에서 성장할 때 하기를 생산하다: (a) 서열 16 (서열 4의 아미노산 위치 27에 메티오닌 및 아미노산 위치 382에 글리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (b) 서열 7 (서열 4의 아미노산 위치 27에 메티오닌 및 아미노산 위치 383에 리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (c) 서열 15 (서열 4의 아미노산 위치 26에 알라닌 및 아미노산 위치 382에 글리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (d) 서열 12 (서열 4의 아미노산 위치 26에 알라닌 및 아미노산 위치 383에 리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (e) 서열 11 (서열 4의 아미노산 위치 25에 메티오닌 및 아미노산 위치 383에 리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; (f) 서열 14 (서열 4의 아미노산 위치 25에 메티오닌 및 아미노산 위치 382에 글리신)의 아미노산 서열을 갖는 베타 폴리펩티드; 또는 (g) 이들의 임의의 조합물.
조성물: 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 약 5 내지 약 10의 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비를 갖는, 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비는 약 5.5 내지 약 8.5이다. 한 실시양태에서, 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비는 약 5.2 내지 약 7.6이다. 본 발명은 베타 폴리펩티드의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 약 6의 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비를 갖는, 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 95％ 초과의 폴리펩티드는 이량체로 형성된다. 한 실시양태에서, 98％ 초과, 99％ 초과, 또는 99.5％ 초과의 폴리펩티드는 이량체로 형성된다. 또 다른 실시양태에서, 약 95％ 내지 약 99.5％의 폴리펩티드는 이량체로 형성되고 약 0.5％ 내지 약 5％의 폴리펩티드는 사량체 또는 고분자량 종으로 형성된다. 또 다른 실시양태에서, 약 98.6％의 폴리펩티드는 이량체로 형성되고 약 1.2％의 폴리펩티드는 사량체 또는 고분자량 종으로 형성되고 약 0.7％ 미만의 폴리펩티드는 단량체이다. 또 다른 실시양태에서, 약 95％의 폴리펩티드는 이량체로 형성되고 약 4％의 폴리펩티드는 사량체 또는 고분자량 종으로 형성되고 약 1％의 폴리펩티드는 베타 폴리펩티드 이량체의 단리된 집단이고, 여기서 각 폴리펩티드 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 집단은 베타 폴리펩티드 단량체를 실질적으로 함유하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 집단은 베타 폴리펩티드 사량체를 실질적으로 함유하지 않는다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 이량체 및 사량체를 실질적으로 함유하지 않는 베타 폴리펩티드 단량체의 단리된 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 각 베타 폴리펩티드 이량체의 각 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고 2.5개 이상의 시알산 기를 갖는다.
본 발명은 베타 폴리펩티드의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 CTLA4-Ig 표준물과 비교하여 B7 결합 분석에서 약 70％ 내지 약 130％의 효능을 갖는, 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 상기 분석은 표면 플라즈몬 공명을 측정하는 것을 포함한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 표준물과 비교하여 인간 세포 IL-2 억제 분석에서 약 50％ 내지 약 150％의 효능을 갖는, 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 사량체 또는 고분자량 종의 정제된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 집단은 베타 폴리펩티드 이량체를 실질적으로 함유하지 않으며, 임의로 집단은 약 100 그램 초과인 양을 포함한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 사량체 또는 고분자량 종의 정제된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 집단은 베타 폴리펩티드 단량체를 실질적으로 함유하지 않으며, 임의로 집단은 약 100 그램 초과인 양을 포함한다. 한 실시양태에서, 각 사량체 분자는 2쌍의 베타 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 각 폴리펩티드 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드 쌍의 각 일원은 다른 일원에 공유적으로 연결되어 있고, 2쌍의 폴리펩티드는 서로 비공유적으로 결합되어 있다. 한 실시양태에서, 각 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 각 사량체 분자는 베타 폴리펩티드 이량체와 비교하여 2배 이상 더 높은 CD80 또는 CD86에 대한 결합활성을 가지며, 여기서 이량체의 각 폴리펩티드 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각 사량체 분자는 서열 2의 서열을 포함하는 CTLA4-Ig 사량체 분자와 비교하여 2배 이상 더 높은 CD80 또는 CD86에 대한 결합활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 각 사량체 분자는 베타 폴리펩티드 이량체와 비교하여 2배 이상 더 높은 T 세포 증식 또는 활성화의 억제율을 가지며, 여기서 이량체의 각 폴리펩티드 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각 사량체 분자는 서열 2의 서열을 포함하는 CTLA4-Ig 사량체 분자와 비교하여 2배 이상 더 높은 T 세포 증식 또는 활성화의 억제율을 갖는다.
본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 조성물은 등전 집중법에 의해 측정된 5.5 이하의 등전점 (pI)을 갖는 등전 집중 겔 상에서 시각화가능한 우세한 이소형을 포함한다. 한 실시양태에서, pI는 뉴라미니다제 처리 후에 증가한다. 한 실시양태에서, 40％ 이상의 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.3 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, 70％ 이상의 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.3 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, 90％ 이상의 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.3 이하의 등전점을 나타낸다. 본 발명은 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 단리된 집단을 제공한다. 본 발명은 약 4.5 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 단리된 집단을 제공한다. 본 발명은 약 4.7 ± 0.2 내지 약 5.1 ± 0.2의 pI를 갖는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 단리된 집단을 제공한다. 본 발명은 (a) 베타 폴리펩티드의 혼합물을 등전 집중 겔 전기영동시키며, 여기서 겔 상의 단일 밴드는 특정 pI를 갖는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 집단을 나타내는 것인 단계, 및 (b) 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 집단을 단리하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하며, 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하는, 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 약 2.7 내지 약 3.6의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 약 6.4 내지 약 7.0의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 약 14 내지 약 16의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 만노스의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 분자는 약 5 내지 약 10의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; 및 (b) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 분자는 (a) 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; 및 (c) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 분자는 (a) 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; 및 (d) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 6.4 내지 약 7.0의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비; 및 (e) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 6.4 내지 약 7.0의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 14 내지 약 16의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 만노스의 평균 몰비; 및 (f) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 8 내지 약 17의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (b) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; 및 (c) 도 8과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일을 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 8 내지 약 17의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (b) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; (c) 도 8과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일; 및 (d) 약 5％ 미만의 베타 폴리펩티드 사량체 함량을 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; 및 (b) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (b) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; 및 (c) 약 5％ 미만의 베타 폴리펩티드 사량체 함량을 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; 및 (b) 도 8과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일을 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; 및 (b) 도 8과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일을 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; 및 (b) 약 5％ 미만의 베타 폴리펩티드 사량체 또는 고분자량 종 함량을 특징으로 한다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 (a) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; 및 (b) 약 5％ 미만의 베타 폴리펩티드 사량체 또는 고분자량 종 함량을 특징으로 한다.
본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 도 8과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 도메인 I - IV의 탄수화물 프로파일을 나타내고, 도메인 I은 아시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 II는 모노-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 III은 디-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 IV는 트리-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함한다. 한 실시양태에서, 도메인 I에서의 제1 피크 및 도메인 II에서의 주 피크 간의 N-연결된 올리고사카라이드의 체류 시간에서의 차이는 약 11 내지 약 13분이다. 한 실시양태에서, 도메인 III 및 IV의 합은 전체 탄수화물 프로파일의 약 25％ 내지 약 36％를 차지한다.
본 발명은 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드 단량체는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 약 0.5％ 이상의 분자는 시스테이닐화되어 있다. 본 발명은 베타 폴리펩티드의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 집단은 도 11에 도시된 바와 같은 질량 분석 프로파일을 나타낸다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 약 5.5 내지 약 8.5의 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비를 갖는, 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자는 생산 세포주의 세포로부터 생산된다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 서열 4의 위치 102에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 4의 위치 134에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 4의 위치 233에서의 아스파라긴 아미노산 잔기에서 글리코실화되어 있다. 본 발명은 베타 폴리펩티드를 포함하는 단리된 조성물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 분자는 (a) 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 6.4 내지 약 7.0의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 14 내지 약 16의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 만노스의 평균 몰비; (f) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; (g) 약 2.4 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2 범위의 등전 집중 겔 상에서의 시각화로부터 측정된 pI; (h) 5 ppm 이하의 MCP-1; (i) 5％ 미만의 사량체 또는 고분자량 종; (j) 1％ 미만의 베타 폴리펩티드 단량체; 및 (k) 서열 4, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 중 어느 것과 95％ 이상 동일한 아미노산을 갖는 집단의 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자를 특징으로 하고, 집단 내의 베타 폴리펩티드는 CD80 및 CD86에 결합할 수 있다. 본 발명은 베타 폴리펩티드 또는 그의 제약 등가물의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하고, 분자의 집단은 (a) 약 24 내지 약 28의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 6.4 내지 약 7.0의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 14 내지 약 16의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 만노스의 평균 몰비; (f) 약 5.5 내지 약 8.5의 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 시알산의 평균 몰비; (g) 약 2.4 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2 범위의 등전 집중 겔 상에서의 시각화로부터 측정된 pI; (h) 5 ppm 이하의 MCP-1; (i) 5％ 미만의 베타 폴리펩티드 사량체 또는 고분자량 종; (j) 1％ 미만의 단량체; 및 (k) 서열 4, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 중 어느 것과 95％ 이상 동일한 아미노산을 갖는 집단의 베타 폴리펩티드를 특징으로 하고, 집단 내의 베타 폴리펩티드 분자는 CD80 및 CD86에 결합할 수 있다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 2005년 12월 20일에 출원된 미국 특허 출원 제60/752,150호에 기재된 바와 같은 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 베타 폴리펩티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 더 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 수크로스, 제일인산나트륨 일수화물, 염화나트륨, 수산화나트륨, 염산 및 멸균수를 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 수크로스, 폴록사머, 제일인산나트륨 일수화물, 무수 제이인산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨 및 멸균수를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 동결건조된다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드, 수크로스, 제일인산나트륨 일수화물, 염화나트륨, 수산화나트륨 및 염산을 포함하는 동결건조된 조성물을 제공한다.
제제 및 키트: 본 발명은 95％ 이상의 베타 폴리펩티드 이량체 및 5％ 이하의 베타 폴리펩티드 사량체 (고분자량 종)를 포함하는, 동결건조된 베타 폴리펩티드 혼합물을 제공하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 98％ 이상의 베타 폴리펩티드 이량체 및 2％ 이하의 베타 폴리펩티드 사량체 (고분자량 종)를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 99％ 이상의 베타 폴리펩티드 이량체 및 1％ 이하의 베타 폴리펩티드 사량체 (고분자량 종)를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 5 몰 이상의 시알산을 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 베타 폴리펩티드 이량체 (고분자량 종)의 몰 당 약 24 내지 약 28 몰의 GlcNAc를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 약 2.7 내지 약 3.6 몰의 GalNAc를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 약 11 내지 약 13 몰의 갈락토스를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 약 6.4 내지 약 7.0 몰의 푸코스를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 몰 당 약 14 내지 약 16 몰의 만노스를 포함한다. 본 발명은 또한 (a) 본 발명의 동결건조된 베타 폴리펩티드 혼합물을 함유하는 용기; 및 (b) 동결건조된 베타 폴리펩티드 혼합물의 주사용액으로의 재구성에 관한 지침서를 포함하는 제약 키트를 제공한다.
예시적 치료 방법: 본 발명은 T 세포를 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 증식, 활성화 또는 둘 다의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 면역 반응의 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 면역 반응의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 면역 장애의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 면역 장애의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 항원에 대한 면역 관용의 유도가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 항원에 대한 면역 관용의 유도 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 염증의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 염증의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 류마티스양 관절염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 류마티스양 관절염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 건선의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 건선의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 루푸스의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 루푸스의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 알레르기의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 알레르기의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 이식편 대 숙주 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 이식편 대 숙주 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 이식된 기관의 거부반응의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 이식된 기관의 거부반응의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 이식된 조직의 거부반응의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 이식된 조직의 거부반응의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 이식된 세포의 거부반응의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 이식된 세포의 거부반응의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이식된 세포는 골수 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 이식된 세포는 도세포(islet cell)이다. 또 다른 실시양태에서, 이식된 세포는 인슐린-생산 췌장 도세포이다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 다발성 경화증의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 다발성 경화증의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 크론병의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 크론병의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 제I형 당뇨병의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 제I형 당뇨병의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 염증성 장 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 염증성 장 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 난소염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 난소염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 사구체신염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 사구체신염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 알레르기성 뇌척수염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 알레르기성 뇌척수염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 중증 근무력증의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 중증 근무력증의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하는 것이고, 약 5 내지 약 10의 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비를 갖는, 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 집단의 면역 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약에 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 본 발명은 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16의 서열을 포함하는 것이고, 약 5 내지 약 10의 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비를 갖는, 베타 폴리펩티드 또는 베타 폴리펩티드 분자의 집단의 류마티스양 관절염의 치료에서의 사용에 관한 지침서를 포함한 포장물로의 항-류마티스양 관절염 약제의 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 집단은 약 5.5 내지 약 8.5의 시알산 기 대 베타 폴리펩티드 이량체 또는 베타 폴리펩티드 분자의 평균 몰비를 갖는다.
예시적 조합 요법: 본 발명은 T 세포를 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 증식, 활성화 또는 둘 다의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 면역 반응의 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 면역 반응의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 베타 폴리펩티드 조성물을 항원에 대한 면역 관용의 유도가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 항원에 대한 면역 관용의 유도 방법을 제공한다.
도 1a 및 1b는 CTLA4-Ig 분자에 대한 발현 카셋트의 부분의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타낸다. 또한 나타낸 것은 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열 (서열 2)이다. 상기 발현 카셋트로부터 생성될 수 있는 CTLA4-Ig 분자에는 하기 잔기의 아미노산 서열을 갖는 분자가 포함된다: (i) 서열 2의 26-383, (ii) 서열 2의 26-382, (iii) 서열 2의 27-383, (iv) 서열 2의 26-382, (v) 서열 2의 25-382, 및 (vi) 서열 2의 25-383. 발현 카셋트는 하기 영역을 포함한다: (a) 온코스타틴 M 신호 서열 (서열 1의 뉴클레오티드 11-88; 서열 2의 아미노산 1-26); (b) 인간 CTLA4의 세포외 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 89-463; 서열 2의 아미노산 27-151); (c) 변형된 힌지 영역 (서열 1의 뉴클레오티드 464-508; 서열 2의 아미노산 152-166), 변형된 인간 IgG1 CH2 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 509-838; 서열 2의 아미노산 167-276), 및 인간 IgG1 CH3 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 839-1159; 서열 2의 아미노산 277-383)을 포함하는 인간 IgG1 불변 영역의 변형된 부분 (서열 1의 뉴클레오티드 464-1159; 서열 2의 아미노산 152-383).
도 2는 CTLA4A29YL104E-Ig에 해당하는 핵산 (상위 열) 및 아미노산 (하위 열) 서열을 나타낸다. 아미노산 서열은 도 1에 나타낸 서열로부터의 아미노산 변화를 함유하는데, 여기서 상기 변화는 서열 2의 것과 비교하여 위치 29 (A 내지 Y) 및 위치 104 (L 내지 E)에 존재하고, 아미노산 잔기의 번호매김은 "+1"로 표시된 메티오닌 (M)에서 시작된다. CTLA4A29YL104E-Ig의 뉴클레오티드 서열은 이 도면에서 위치 79 (즉, M 아래 "+1"로 표시된 위치)의 A에서 시작하여 뉴클레오티드 위치 1149 (서열 3)의 A까지로 나타낸다. 특히, CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 위치 79의 뉴클레오티드에서 서열 3으로 지정된 위치 1149의 뉴클레오티드까지이다. 도 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 서열 23으로 지정되고, 온코스타틴 M 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
도 3은 온코스타틴 M 프로서열 (진한 이탤릭체 참조)을 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다. CTLA4A29YL104E-Ig 분자인, 생성될 수 있는 폴리펩티드에는 하기 잔기의 아미노산 서열을 갖는 분자가 포함된다: (i) 서열 4의 26-383, (ii) 서열 4의 26-382, (iii) 서열 4의 27-383, (iv) 서열 4의 26-382, (v) 서열 4의 25-382, 및 (vi) 서열 4의 25-383.
도 4는 N-연결된 글리코실화 부위 (N76, N108, 및 N207), C120-C120 디술피드 결합, 및 CTLA-4 도메인 내에 만들어진 2종의 아미노산 치환 (L104E 및 A29Y)과 함께 나타낸 CTLA4A29YL104E-Ig의 모델이다.
도 5는 CTLA4A29YL104E-Ig의 이론적 cDNA-유도 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다. 2종의 아미노산 치환이 CTLA-4 세포외 도메인 내에 만들어져 (L104E 및 A29Y) CTLA4A29YL104E-Ig를 생성시킨다. 서열에서는 N-연결된 글리코실화 부위와 함께 온코스타틴 M의 신호 펩티드 (프로서열)가 확인된다.
도 6은 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플의 염소 항-인간 IgG Fc 항체에 대한 결합을 도시한 그래프이다. CTLA4A29YL104E-Ig 샘플의 결합은 비변형된 센서칩 표면과 비교한 상기 표면에서 얻어진 반응을 측정함으로써 검출되었다. 다양한 로트는 3종의 상이한 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플을 나타낸다.
도 7은 동적 광 산란 검출 (DSL)에 의한 2-칼럼 SEC의 오버레이 및 SEC 상의 체류 시간에 의해 결정된 바와 같은 CTLA4-Ig HIC 클리닝 피크의 다량체, 사량체, 및 이량체 분획에 해당하는 겉보기 분자량을 나타내는 그래프이다.
도 8a (상위) 및 8b (하위)는 HIC 클리닝 피크로부터 단리되고 정제된 글리코실화 CTLA4-Ig 분자의 분획 (서열 2 단량체 포함)의 대표적인 IEF 겔을 나타낸다. 상위 겔에 대한 로딩 순서는 다음과 같다: 레인 1, pI 마커 (아머샴); 레인 2, CLTA4-Ig 이량체 표준; 레인 3, 단백질 A 용출액; 레인 4, 다량체; 레인 5, 사량체; 레인 6, 이량체. 하부 겔에 대한 로딩 순서는 다음과 같다: 레인 1, pI 마커 (아머샴); 레인 2, 레인 2, CLTA4-Ig 이량체 표준; 레인 3, 사량체; 레인 4, 분리된 사량체. 패널은 사량체가 이량체보다 덜 시알릴화되었음을 나타낸다.
도 9는 서열 2의 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 이량체 상에서 관찰된 탄수화물의 상대량 및 우세한 탄수화물 구조를 나타낸다. 도면에서 아미노산 잔기 번호매김은 서열 2와 일치하지 않는다. 도면에서 아미노산 잔기 번호매김을 서열 2와 일치시키기 위해서는 26을 더하는 계산법이 필요한데, 즉 N76은 N102이다.
도 10은 의도적으로 공백으로 두었다.
도 11은 서열 2 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 이량체의 대표적인 IEF 겔 (pH 4.0 내지 6.5)을 나타낸다. 레인 1 및 5는 보정 표준을 나타내고, 레인 2, 3, 4는 각각 20 μg/μl의 CLTA4-Ig 이량체를 나타낸다.
도 12는 서열 4 단량체를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체의 대표적인 IEF 겔 (pH 4.0 내지 6.5)을 나타낸다. 레인 1 및 8은 보정 표준을 나타내고, 레인 2 내지 7은 각각 10 μg/μl의 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체를 나타낸다.
도 13은 서열 2의 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자 집단의 N-연결된 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 탄수화물은 당펩티드로부터 수집하고, LC/MS PGC N-연결된 올리고사카라이드 기술을 사용하여 분리하였다. 크로마토그램은 각각의 N-연결 부착 부위에 대한 집단 프로파일을 제공한다. A) T5 펩티드로부터의 Asn76 (서열 2의 Asn102) 탄수화물 및 B) T7 펩티드로부터의 Asn108 (서열 2의 Asn134) 탄수화물은 둘 다 모노- 및 멀티-시알릴화 종 중의 분포를 나타낸다. C) T14 펩티드로부터의 Asn207 (서열 2의 Asn233) 탄수화물은 우세한 아시알릴화(asialylated) 종으로 구성된다. D) CTLA4-Ig 분자에 대한 N-연결된 탄수화물의 분포를 나타낸다. E) T5 펩티드로부터의, 선택된 미처리 스펙트럼은 도시된 2-안테나형 모노시알릴화 구조에 해당하는 주요 피크를 나타낸다. F) T14로부터의, 선택된 미처리 스펙트럼은 2-안테나형 아시알로(asialo) 구조에 해당하는 주요 피크를 나타낸다. G) 선택된 미처리 스펙트럼은 3-안테나형 디-시알릴화 구조에 해당하는, 64.23분에서의 피크와 함께 공용출되는 부수 종으로 이루어진다. H) 선택된 미처리 스펙트럼은 2-안테나형 디-시알릴화 구조에 해당하는, 64.23분에서 피크인 주요 종을 나타낸다.
도 14a 내지 b는 산성 용출 조건 (0.05％ TFA)하 PGC 크로마토그래피로부터의, CTLA4-Ig 서열 2 단량체의 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일의 UV 및 TIC 트레이스를 나타낸다. 도 14a의 트레이스는 산성 용출 조건 (0.05％ TFA)하 PGC 크로마토그램에 대한 음이온 총 카운트 (TIC)를 나타낸다. 도 14b의 트레이스는 산성 용출 조건 (0.05％ TFA)하 PGC 크로마토그램에 대한 206 nm에서의 UV 트레이스를 나타낸다.
도 15a 내지 b는 염기성 용출 조건 (0.4％ NH4OH)하 PGC 크로마토그래피로부터의, CTLA4-Ig 서열 2 단량체의 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일의 UV 및 TIC 트레이스를 나타낸다. 도 15a의 트레이스는 염기성 용출 조건 (0.4％ NH4OH)하 PGC 크로마토그램에 대한 음이온 총 카운트 (TIC)를 나타낸다. 도 15b의 트레이스는 염기성 용출 조건 (0.4％ NH4OH)하 PGC 크로마토그램에 대한 206 nm에서의 UV 트레이스를 나타낸다.
도 16은 서열 4를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자에 대한 비교용 N-연결된 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 4종의 올리고사카라이드 도메인이 관찰된다: 도메인 I은 아시알릴화 종을 함유하고, 도메인 II, III, 및 IV는 각각 모노-시알릴화, 디-시알릴화 및 트리-시알릴화 종을 함유한다. 올리고사카라이드를 크로마토그래피로 단리하고 이를 질량 분광분석법으로 분석하여 도메인을 결정하였다.
도 17은 서열 2 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자의 N-연결된 올리고사카라이드의 HPAEC-PAD 프로파일을 나타낸다. 도메인은 올리고사카라이드에 대한 시알산 함량이 증가하는 순서로 나타낸다. 도메인 I, II, III 및 IV는 각각 0, 1, 2, 및 3개의 시알산을 갖는 올리고사카라이드 구조를 함유한다. 피크 표지는 PGC 프로파일링으로부터 수집된 피크의 HPAEC-PAD 프로파일링에 의해 배정된 올리고사카라이드 구조를 나타낸다. 탄수화물 구조의 구조 확인은 이전의 결정과 일치한다.
도 18a 내지 b는 서열 2의 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자의 PGC 프로파일을 나타낸다. 프로파일은 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이 제조된 탄수화물 분해 혼합물의 직접 주입으로부터 얻는다. 직접 주입으로, 130분에 용출되는 구조 P4144가 검출된다. 테트라-시알릴화 구조 P4144는 주입 전에 단리된 올리고사카라이드의 프로파일에서는 관찰되지 않는다.
도 19는 서열 2 단량체의 T9 단편에 대한 LC/MS 역회선 양성 전자분무 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼은 3개의 주요 O-연결된 구조를 도해한다. 스펙트럼은 O-연결된 구조 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1과 일치하는 당 사다리를 갖는 염기 펩티드를 도해한다. 스펙트럼의 진한 부분은 스펙트럼의 진하지 않은 부분에 비해 10배 강화된 것으로, (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2 및 (GalNAc)1(GlcNAc)1(Gal)2(NeuAc)2를 갖는 2개의 추가의 O-연결된 구조를 도해한다.
도 20은 서열 2 단량체 서열을 갖는 CTLA4-Ig 단일쇄의 O-연결된 탄수화물 구조의 부착 지점 및 상대적인 양을 나타낸다. 각 부위에서의 상대적인 양은 둘 이상의 직교 기술에 의해 생성된 데이타를 나타내며, 가변성이 있다. 공유결합 시스테이닐화의 위치 또한 도시되었다.
도 21은 매개체 플라스미드 piLN-huCTLA4-Ig의 맵을 도시한다. 상기 플라스미드는 제한 효소 부위 HindIII 및 XbaI에 의해 플랭킹된 인간 CTLA4-Ig 분자 (huCTLA4-Ig)를 코딩할 수 있는 서열 (즉, 서열 1)을 포함한다.
도 22는 플라스미드 pD16LEA29Y의 맵을 도시한다. 상기 플라스미드는 인간 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 코딩할 수 있는 서열 (즉, 서열 4)을 포함한다.
도 23은 1D5-100A1 (예를 들어, 클론 17)로부터 유도된 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 발현하는 CHO 세포로부터 추출된 DNA의 서던 블롯 사진이다. 좌측에서 우측으로의 겔에 대한 레인은 다음과 같다: 레인 M, DNA 분자량 마커; 레인 N, EcoRI/XbaI 분해된 비형질감염된 CHO DNA (5 mg); 레인 1, EcoRI/XbaI 분해된 비형질감염된 CHO DNA (2.5 μg) + 1 ng pcSDhuCTLA4-Ig; 레인 2, EcoRI/XbaI 분해된 비형질감염된 CHO DNA (2.5 μg) + 0.5 ng pcSDhuCTLA4-Ig; 레인 3, EcoRI/XbaI 분해된 비형질감염된 CHO DNA (2.5 μg) + 0.25 ng pcSDhuCTLA4-Ig; 레인 4, EcoRI/XbaI 분해된 비형질감염된 CHO DNA (2.5 μg) + 0.125 ng pcSDhuCTLA4-Ig; 레인 5, EcoRI/XbaI 분해된 비형질감염된 CHO DNA (2.5 μg) + 0.0625 ng pcSDhuCTLA4-Ig; 레인 6, EcoRI/XbaI 분해된 비형질감염된 CHO DNA (2.5 μg) + 0.03125 ng pcSDhuCTLA4-Ig; 레인 7, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: MCB (5.0 μg); 레인 8, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030618A-01 (5.0 μg); 레인 9, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030712A-01 (5.0 μg); 레인 10, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030801A-01 (5.0 μg); 레인 11, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: MCB (2.5 μg); 레인 12, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030618A-01 (2.5 μg); 레인 13, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030712A-01 (2.5 μg); 레인 14, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030801A-01 (2.5 μg); 레인 15, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: MCB (1.25 μg); 레인 16, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030618A-01 (1.25 μg); 레인 17, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030712A-01 (1.25 μg); 레인 18, EcoRI/XbaI 분해된 DNA: EPCB 로트 번호 C20030801A-01 (1.25 μg).
도 24는 생산-규모 배양 공정의 플로우 다이아그램을 도시한다. 상기 공정은 25,000 L 생산 생물반응기 내에서 재조합 단백질의 대량-생산을 가능하게 한다.
도 25는 NGNA 및 NANA 시스템 적합성 표준의 대표적인 크로마토그램을 나타낸다. ~9.7분에서의 피크는 NGNA이고, ~10.7분에서의 피크는 NANA이다.
도 26은 서열 2 단량체를 포함하는 가수분해된 CTLA4-Ig 분자의 대표적인 크로마토그램을 나타낸다. ~8.4분에서의 피크는 용매 피크이다. ~9.6분에서의 피크는 NGNA이다. ~10.5분에서의 피크는 NANA이다. ~11.3분에서의 피크는 가수분해 조건으로 인해 분해된 NANA이다. NANA 및 분해된 NANA의 면적 카운트는 NANA 몰비의 계산을 위해 합하였다.
도 27a, 27b, 및 27c는 CTLA4-Ig 시스테이닐화된 펩티드의 MALDI 스펙트럼을 나타낸다. MALDI 스펙트럼은 서열 2의 Cys146을 함유하는 CTLA4-Ig 트립신/키모트립신 단편에 대해 얻었다. 도 27a는 시스테이닐화 변형을 도해하는 단일쇄 펩티드 스펙트럼을 나타낸다. 도 27b는 환원 후 단일쇄 펩티드의 스펙트럼을 나타내며, 변형이 Cys146에서 발생함을 증명한다. 도 27c는 환원된 단일쇄 펩티드의 알킬화를 나타내며, 이는 시스테이닐화가 Cys146에서 발생함을 증명한다.
도 28은 벡터 pcSD를 생성하기에 유용한 클로닝 도식을 나타낸다. pcDNA3는 CMV 프로모터, 앰피실린 내성 유전자 및 대장균에 대한 복제 기원을 함유하는 3.821 Kb 단편을 단리하기 위해 제한 효소 NaeI로 분해하였다. pSV2-dhfr은 SV40 프로모터 및 dhfr 유전자를 함유하는 1.93 Kb 단편을 단리하기 위해 제한 효소 PvuII 및 BamHI로 분해하여, 블런트-말단으로 만들었다. pcSD를 생성하기 위해, 두 단편을 라이게이션하였다. 플라스미드 pcSD의 맵은 도면의 하부에 나타낸다.
도 29는 발현 벡터 pcSDhuCTLA4-Ig를 생성하기에 유용한 클로닝 도식을 나타낸다. pcSD는 제한 효소 EcoRV 및 XbaI로 분해하였다. piLN-huCTLA4-Ig는 제한 효소 HindIII로 분해하여, 블런트-말단으로 만든 다음, 제한 효소 XbaI로 분해하여 1.2 Kb huCTLA4-Ig 단편을 단리하였다. pcSDhuCTLA4-Ig를 생성하기 위해, CTLA4-Ig 단편을 분해된 pcSD 벡터에 라이게이션하였다. 플라스미드 pcSDhuCTLA4-Ig의 맵은 도면의 하부에 나타낸다. 상기 플라스미드를 선형화하여 기능성 dhfr 유전자를 갖지 않는 CHO 세포에 형질감염시켰다. 플라스미드는 기능성 dhfr 유전자를 함유하기 때문에, 세포 생존에 근거하여 안정한 형질감염체를 선택할 수 있다. pcSDhuCTLA4-Ig는 CMV 프로모터, 인간 CTLA4-Ig 분자 (huCTLA4-Ig)를 코딩할 수 있는 서열 (즉, 서열 1) 및 BGH로부터의 폴리(A) 꼬리 서열을 포함하는 발현 카셋트를 갖는다.
도 30은 상대적 형광 단위 (RFU) 대 시간 (분)으로서 도시된 시스템 적합성 아미노 모노사카라이드의 전기영동도를 나타낸다.
도 31은 상대적 형광 단위 (RFU) 대 시간 (분)으로서 도시된 시스템 적합성 중성 모노사카라이드의 전기영동도를 나타낸다.
도 32는 표지된 펩티드를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig의 트립신분해 펩티드 맵을 나타낸다. 표 23은 표지된 펩티드와 상응한다.
도 33은 CTLA4A29YL104E-Ig의 노던 혼성화 분석을 나타낸다. 패널 A는 브롬화에티듐-염색된 아가로스 겔을 나타내는데, 여기서 레인 M은 RNA 마커이고; 레인 1은 전체 CHO RNA이고; 레인 2는 전체 MCB RNA이고; 레인 3은 전체 EPCB RNA이다. 패널 B는 대응하는 자가방사선상으로, 여기서 레인 M은 RNA 마커이고; 레인 1은 전체 CHO RNA이고; 레인 2는 전체 MCB RNA이고; 레인 3은 전체 EPCB RNA이다.
도 34a 내지 c는 크기 배제 크로마토그램을 도시하는데, 이는 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체를 고분자량 종과 저분자량 종으로 구분한다.
도 35는 쿠마시 블루로 염색한 CTLA4A29YL104E-Ig의 SDS-PAGE (환원 및 비-환원) 분석을 나타낸다. 레인 1은 분자량 마커의 로딩이고; 레인 2, 7, 및 12는 블랭크이고; 레인 3 내지 6은 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 (환원)이고; 레인 8 내지 11은 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 (비-환원)이다.
도 36은 은-염색한 CTLA4A29YL104E-Ig의 SDS-PAGE (환원 및 비-환원) 분석을 나타낸다. 레인 1은 분자량 마커의 로딩이고; 레인 2, 7, 및 12는 블랭크이고; 레인 3 내지 6은 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 (환원)이고; 레인 8 내지 11은 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 (비-환원)이다.
도 37은 트립신 및 키모트립신 분해의 조합을 사용한 비-환원된 CTLA4A29YL104E-Ig의 펩티드 맵을 도시한다.
도 38은 트립신 및 엘라스타제 분해의 조합을 사용한 비-환원된 CTLA4A29YL104E-Ig의 펩티드 맵을 도시한다.
도 39는 항-CTLA4-Ig 또는 항-CTLA-4 반응을 갖는 환자를 도시한 다이아그램이다. 전체 CTLA4-Ig 분자 (CTLA-4 및 Ig 부분) 및 CTLA-4 부분만에 대한 항체 반응을 실시예 32에 약술된 바와 같은 분석 A 및 B를 사용하여 측정하였다.
도 40은 면역원성 상태에 의한 청소율 분포 및 중심 구획의 용량을 나타내는 도식이다.
도 41은 본 발명의 방법에 의해 생산된 약물 재료 10 mg/kg을 투여한 원숭이에서의 시간 경과에 따른 평균 (SD) CTLA4-Ig 혈청 농도의 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 42는 대조군 및 분해된 CTLA4-Ig 물질로부터 정제된 단백질 A (MAbSelect)의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 크로마토그램의 그래프이다.
도 43은 분해 처리된 물질 (ii)을 대조군 (i)과 비교한 N-글리칸 분석의 그래프이다.
도 44는 평균 CTLA4-Ig 혈청 농도 [μg/ml] 대 시간 (71일에 걸쳐)을 도시한 그래프이다.
도 45는 상대적 형광 단위 (RFU) 대 시간 (분)으로서 도시된 중성 모노사카라이드의 전기영동도를 도시한다.
도 46은 상대적 형광 단위 (RFU) 대 시간 (분)으로서 도시된 아미노 모노사카라이드의 전기영동도를 도시한다.
도 47은 서열 4를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자에 대한 비교 N-연결된 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 4개의 올리고사카라이드 도메인을 관찰한 결과, 도메인 I은 아시알릴화 종을 함유하는 한편, 도메인 II, III, 및 IV는 모노-시알릴화, 디-시알릴화 및 트리-시알릴화 종을 각각 함유한다.
도 48은 CTLA4A29YL104E-Ig와 1:1로 혼합된 CTLA4-Ig의 모세관 전기영동성 분리의 그래프이다. 주 피크 이동 시간은 대략 0.8분 떨어져 있다.
도 49는 가수분해된 CTLA4A29YL104E-Ig 물질의 크로마토그램이며, 여기서 NANA 피크는 3.4분에서 관찰된다.
도 50은 포유동물 단백질에서 발견되는 수가지의 다양한 N-연결된 탄수화물 구조를 도시한다. 모든 쇄는 2개의 GlcNAc 및 3개의 만노스 잔기를 함유하는 공통의 코어 구조를 공유한다.
도 51은 당단백질의 시알릴화의 함수 (NANA 비)로서 CTLA4-Ig 노출 (AUC)을 도시하는 그래프이다.
도 52는 CTLA4-Ig의 탄수화물 프로파일의 함수로서 CTLA4-Ig 노출 (AUC)을 도시하는 그래프이다. 다수의 피크가 4개 또는 5개의 도메인으로 분할되는 음이온 교환 HPLC에 의해 생성되었다. 도메인 1 및 2는 대부분 아시알릴화 및 모노-시알릴화 구조인 한편, 도메인 3 및 4는 대부분 디- 및 트리-시알릴화 구조이다.
도 53은 표지된 펩티드를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig의 트립신분해 펩티드 맵을 나타낸다. 표 56은 표지된 펩티드와 상응한다.
도 54는 서열 2를 포함하는 CTLA4-Ig 분자에 대한 비교 N-연결된 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 4개의 올리고사카라이드 도메인을 관찰한 결과, 도메인 I은 아시알릴화 종을 함유하는 한편, 도메인 II, III, 및 IV는 모노-시알릴화, 디-시알릴화 및 트리-시알릴화 종을 각각 함유한다.
도 55a-d는 HPAEC-PAD에 의한 CTLA4-Ig 및 펩티드 T5, T7, 및 T14의 올리고사카라이드 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 56은 PGC (Hypercarb) 칼럼으로부터 수득된 CTLA4-Ig의 표지된 올리고사카라이드 프로파일을 도시하는 그래프이다.
도 57은 Y 축 상의 원숭이 AUC 및 X 축 상의 탄수화물 프로파일로부터의 도메인 I 및 II에 제시된 바와 같은 N-연결된 글리코실화의 백분율을 나타내는 약동학적 데이타의 그래프를 도시한다. 예를 들어, 실시예 3, 44, 22 및 37에서의 N-연결된 탄수화물 프로파일을 측정하는 방법을 참조한다. 도메인 I 및 II의 백분율이 증가할 때 (그리고 도메인 III, IV 및 V의 백분율이 감소할 때), 청소율은 증가한다. 음성 대조군인 저함량의 시알산을 갖는 CTLA4-Ig은 매우 신속하게 청소됨을 주목한다. CTLA4-Ig 변이체인 LEA (CTLA4-IgA29YL104E-Ig)은 상기 그래프에 포함됨을 주목한다.
도 58a 및 58b는 (예컨대 실시예 3, 44, 22 및 37에 기재된 것과 같은 방법으로 수득된) CTA4-Ig로부터 방출된 N-연결된 탄수화물의 N-연결된 탄수화물 크로마토그램의 트레이스를 도시한다. 도 58a에서의 트레이스는 배양물에 첨가된 추가의 갈락토스 부재 하에서의 배양 방법으로 생산된 CTLA4-Ig의 분석으로부터의 것이다. 도 58b에서의 트레이스는 배양물에 첨가된 갈락토스를 함유하였다. 각 도메인에서의 N-연결된 탄수화물의 백분율은 삽입표에 제시된다.
도 59는 (예컨대 실시예 3, 44, 22 및 37에 기재된 것과 같은 방법으로 수득된) CTA4-Ig로부터 방출된 N-연결된 탄수화물의 N-연결된 탄수화물 크로마토그램의 트레이스를 도시한다. 이는 8일째에 배양물에 첨가된 갈락토스의 존재 하에서의 배양 방법으로 생산된 CTLA4-Ig의 분석으로부터의 것이다. 상기 트레이스는 배양물에 첨가된 추가의 갈락토스 부재 하에서의 배양 방법으로 생산된 CTLA4-Ig의 분석으로부터의 것이다. 각 도메인에서의 N-연결된 탄수화물의 백분율은 삽입표에 제시된다.
도 60은 (예컨대 실시예 3, 44, 22 및 37에 기재된 것과 같은 방법으로 수득된) CTA4-Ig로부터 방출된 N-연결된 탄수화물의 N-연결된 탄수화물 크로마토그램의 트레이스를 도시한다. 이는 14일째에 배양물에 첨가된 갈락토스의 존재 하에서의 배양 방법으로 생산된 CTLA4-Ig의 분석으로부터의 것이다. 상기 트레이스는 배양물에 첨가된 추가의 갈락토스 부재 하에서의 배양 방법으로 생산된 CTLA4-Ig의 분석으로부터의 것이다. 각 도메인에서의 N-연결된 탄수화물의 백분율은 삽입표에 제시된다.
도 61a 및 61b는 (예컨대 실시예 3, 44, 22 및 37에 기재된 것과 같은 방법으로 수득된) CTA4-Ig로부터 방출된 N-연결된 탄수화물의 N-연결된 탄수화물 크로마토그램의 트레이스를 도시한다. 도 61a는 첨가된 갈락토스 부재 하에서의 배양 방법으로 생산된 CTLA4-Ig의 분석으로부터의 것이고, 도 61b는 14일째에 배양물에 첨가된 갈락토스의 존재 하에서의 분석으로부터의 것이다. 상기 트레이스는 배양물에 첨가된 추가의 갈락토스 부재 하에서의 배양 방법으로 생산된 CTLA4-Ig의 분석으로부터의 것이다. 각 도메인에서의 N-연결된 탄수화물의 백분율은 삽입표에 제시된다.
도 62는 (예컨대 실시예 3, 44, 22 및 37에 기재된 것과 같은 방법으로 수득된) CTA4-Ig로부터 방출된 N-연결된 탄수화물의 N-연결된 탄수화물 크로마토그램의 트레이스를 도시한다. 상기 트레이스는 저함량의 시알산을 갖는 CTLA4-Ig 물질의 컷을 생산하는, QFF 칼럼의 세척 단계로부터 회수된 CTLA4-Ig 물질로부터 수득되었다. 도 61, 60 및 59에 제시된 트레이스와 비교하여, 도메인 I 및 II의 상대적 양은 증가되고, 도메인 III 및 IV는 감소된다. 각 도메인에서의 N-연결된 탄수화물의 백분율은 삽입표에 제시된다.
도 63은 T8이 용매 프론트의 말단에서 용출하고 T9가 T27의 숄더에서 용출하는 것을 나타내는 CTLA4-Ig의 트립신분해 펩티드 맵을 제시한다.
도 64는 CTLA4-Ig로부터의 당펩티드 T8에 상응하는 전체 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 65는 CTLA4-Ig로부터의 당펩티드 T9에 상응하는 전체 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 66은 CTLA4-Ig로부터의 당펩티드 T9에 대한 MALDI-TOF 데이타를 나타내는 그래프이다.
도 67a-b는 CTLA4-Ig부터의 산화된 및 천연 트립신분해 펩티드의 이온 크로마토그램 및 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 68은 전형적인 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일 (도메인 I, II, III, IV 및 V, 및 로트 평균 5％ 내의 피크 1A 및 1B)을 도시한다. 피크 1A, 1B 및 1C는 G0, G1 및 G2의 아시알로 N-연결된 올리고사카라이드 구조를 나타낸다. 프로파일에 대한 데이타는 하기 표에 직접 나타낸다. 실시예 44 참조.
Figure 112011097388832-pat00001

Figure 112011097388832-pat00002

도 69는 CTLA4-Ig의 등전 집중 겔을 도시한다. 밴드는 하기를 특징으로 한다:
Figure 112011097388832-pat00003

도 70은 CTLA4-Ig의 대표적인 등전 집중 겔 정량 분석 리포트를 도시한다. 겔의 정량화를 수행하였으며, 데이타는 다음과 같다:
Figure 112011097388832-pat00004

도 71a는 가드 칼럼이 장착된 TOSO HAAS 3000 SWXL 칼럼 상에서의 시스템 적합성 표준물의 전형적 20 μL 주입을 도시한다. 도 71b는 가드 칼럼이 장착된 TOSO HAAS 3000 SWXL 칼럼 상에서의 CTLA4-Ig 참고 물질의 전형적 20 μL 주입을 도시한다.
도 72 - 쿠마시 블루 염색 폴리아크릴아미드 (4-20) 겔 전기영동에 의한 CTLA4-Ig의 SDS-PAGE 분석의 디지털로 획득된 영상의 예
Figure 112011097388832-pat00005

도 73은 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE의 정량 분석 리포트의 예를 도시한다.
도 74는 도 73에서의 염색된 SDS-PAGE 겔의 정량 분석을 나타내는 표를 제시한다.
도 75는 분자량 마커에 대한 주 밴드 및 예상된 부 밴드의 이동 위치를 나타내는 CTLA4-Ig 쿠마시 블루 염색된 겔의 SDS-PAGE 분석의 증강된 영상의 예이다.
도 76은 CTLA4-Ig 참고/표준 물질의 대표적인 N-연결된 탄수화물 프로파일의 도식이다. 이는 워터스 (Waters) 시스템 상에서의 수행의 대표적인 탄수화물 프로파일이다. 체류 시간은 시스템 의존성이다.
도 77은 대표적인 스타키오스 시스템 적합성 크로마토그램의 도식이다.
도 78은 가수분해된 CTLA4-Ig 물질의 대표적인 크로마토그램의 트레이스이다.
도 79는 CTLA4A29YL104E-Ig 쿠마시 블루 염색된 폴리아크릴아미드 (4-20％) 겔 전기영동 쿠마시 블루 염색의 SDS- PAGE 분석의 스캐닝된 겔 영상을 도시한다.
Figure 112011097388832-pat00006

도 80은 수거 단계의 플로우 다이아그램을 도시한다. 실시예 28 참조.
도 81은 아미노 모노사카라이드의 시스템 적합성의 전기영동도를 도시한다. 실시예 16 참조.
도 82는 Y 축 상의 원숭이 AUC 및 X 축 상의 탄수화물 프로파일로부터의 도메인 I 및 II에 제시된 바와 같은 N-연결된 글리코실화의 백분율을 나타내는 약동학적 데이타의 그래프를 도시한다. 예를 들어, 실시예 3, 44, 22 및 37에서의 N-연결된 탄수화물 프로파일을 측정하는 방법을 참조한다. 도메인 I 및 II의 백분율이 증가할 때 (그리고 도메인 III, IV 및 V의 백분율이 감소할 때), AUC는 증가한다. 음성 대조군인 저함량의 시알산을 갖는 CTLA4-Ig은 매우 신속하게 청소됨을 주목한다. 변이체 CTLA4-Ig 분자인 CTLA4-IgA29YL104E-Ig (LEA로 명시)는 상기 그래프에 포함됨을 주목한다.
도 83은 Y 축 상의 원숭이 AUC 및 X 축 상의 (탄수화물 프로파일로부터 측정된) 도메인 III 및 IV에 제시된 바와 같은 N-연결된 글리코실화의 백분율을 나타내는 약동학적 데이타의 그래프를 도시한다. 도메인 III 및 IV의 백분율이 증가할 때, AUC는 증가한다. 음성 대조군인 저함량의 시알산을 갖는 CTLA4-Ig은 매우 신속하게 청소됨을 주목한다. 예를 들어, 실시예 3, 44, 22 및 37에서의 N-연결된 탄수화물 프로파일을 측정하는 방법을 참조한다. 변이체 CTLA4-Ig 분자인 CTLA4-IgA29YL104E-Ig (LEA로 명시)는 상기 그래프에 포함됨을 주목한다.
도 84는 Y 축 상의 원숭이 AUC 및 X 축 상의 탄수화물 프로파일로부터의 도메인 III 및 IV에 제시된 바와 같은 N-연결된 글리코실화의 백분율을 나타내는 약동학적 데이타의 또 다른 그래프를 도시한다. 도메인 III 및 IV의 백분율이 증가할 때, AUC는 증가한다. 음성 대조군인 저함량의 시알산을 갖는 CTLA4-Ig은 매우 신속하게 청소됨을 주목한다. 예를 들어, 실시예 3, 44, 22 및 37에서의 N-연결된 탄수화물 프로파일을 측정하는 방법을 참조한다. 변이체 CTLA4-Ig 분자인 CTLA4-IgA29YL104E-Ig (LEA로 명시)는 상기 그래프에 포함됨을 주목한다.
도 85는 CTLA4-Ig 표준물의 트립신분해 맵을 도시한다. 피크 할당에 대한 실시예 65의 말미의 표를 참조한다. 소형 피크 라벨링된 T1+A는 N-말단 알라닌 잔기에 의해 확장된 T1 트립신분해 펩티드이다. 소형 피크 라벨링된 T31+K는 C-말단 리신 잔기에 의해 확장된 T31 트립신분해 펩티드이다.
도 86은 CTLA4-Ig 표준물 + 5 몰％의 T6ox 인디케이터 펩티드, Met(O) 85 (84-93)로 스파이킹된 CTLA4-Ig 표준물의 트립신분해 맵에 대한 280 nm 데이타의 오버레이를 도시한다. 실시예 65 참조.
도 87는 CTLA4-Ig 표준물 + 5 몰％의 T26deaml 인디케이터 펩티드, 이소Asp294(281-302)로 스파이킹된 CTLA4-Ig 표준물의 트립신분해 맵에 대한 215 nm 데이타의 확장된 뷰를 도시한다. 실시예 65 참조.
CTLA4-Ig 분자는 자가면역 및 알레르기와 같은 비정상적인 면역증식성 및 면역반응성 현상과 관련된 장애를 비롯한 다양한 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 예를 들어, 특정 글리코실화 변형, 특정 탄수화물 프로파일 또는 특징, 특정 다량체 구조, 및/또는 특정 결합활성 강도를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 포함하는 CTLA4-Ig 조성물을 제공한다. CTLA4-Ig 분자, 그의 용도 및 방법을 또한 기재하고 있는 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌에는 미국 특허 제5,434,131호; 동 제5,851,795호; 동 제5,885,796호; 동 제5,885,579호; 및 동 제7,094,874호가 포함된다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 대량 생산 및 배양 방법을 통해 다량의 CTLA4-Ig 분자를 생산할 수 있는 세포주를 제공한다. 본 발명의 한 특정 세포주는 특정 글리코실화 및 탄수화물 프로파일을 갖도록 CTLA4-Ig 분자를 대량 생산할 수 있는 클로날 세포주이다. ATCC 수탁 번호 68629를 갖는 이종성 및 비-클로날 세포 집단과 비교하여 (전체 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,434,131호 참조), 본 발명의 클로날 세포주는 보다 일관되거나 보다 일정한 글리코실화 또는 탄수화물 프로파일을 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 분비할 수 있다. 추가로, ATCC 수탁 번호 68629를 갖는 이종성 및 비-클로날 세포 집단과 비교하여 본 발명의 클로날 세포주는, 본 발명의 클로날 세포주가 세포의 게놈 중 단일 부위에 통합되는 CTLA4-Ig 발현 카셋트의 높은 카피수를 갖도록 선택되는 것에 부분적으로 기인하여, 보다 많은 양의 CTLA4-Ig 분자를 분비할 수 있다.
본 발명은 CTLA-4 결합 도메인의 B7 결합 영역 내에 다음과 같은 2종의 아미노산 치환을 만듦으로써 CTLA4-Ig (서열 2)의 결합활성 및 효능을 증가시킬 수 있다는 발견을 제공한다: (i) 서열 2의 위치 29에서 알라닌을 티로신으로 치환 (A29Y), 및 (ii) 서열 2의 위치 104에서 리신을 글루타메이트로 치환 (L104E). 본 발명은 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부에 연결된, B7 결합 활성을 갖고 서열 24 중의 아미노산 서열 (A29Y 및 L104E 돌연변이를 갖는 CTLA4 세포외 도메인)을 포함할 수 있는 베타 폴리펩티드를 포함하는, "베타 폴리펩티드 분자"로 지칭되는 CTLA4-Ig 분자의 아속을 제공한다.
[서열 24]
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[서열 18] - CTLA4 세포외 도메인
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용어
본원에 사용된 바와 같은 용어 "클로날"은 단일 세포로부터 확장된 세포 집단을 의미한다. CTLA4-Ig 분자를 발현시킬 수 있는 세포주 또는 클로날 세포 집단과 관련하여, 클로날 세포주 또는 집단은 CTLA4-Ig 분자를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 세포의 집단에서 단리된 단일 세포로부터 확장된다. 형질감염된 세포의 집단은 이종성 집단일 수 있다. 집단 내 모든 세포가 단일 형질감염체에서 유래된 것이라는 점에서, 클로날 세포주 또는 집단은 동종성인 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "B7-1"은 CD80을 의미하고; 용어 "B7-2"는 CD86을 의미하고; 용어 "B7"은 B7-1 및 B7-2 (CD80 및 CD86) 중 하나 또는 둘 다를 의미한다. 용어 "B7-1-Ig" 또는 "B7-1Ig"는 CD80-Ig를 의미하고; 용어 "B7-2-Ig" 또는 "B7-2Ig"는 CD86-Ig를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CTLA4-Ig" 또는 "CTLA4-Ig 분자" 또는 "CTLA4Ig 분자" 또는 "CTLA4-Ig 단백질" 또는 "CTLA4Ig 단백질"은 호환적으로 사용되고, CTLA4 세포외 도메인 및 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부를 갖는 하나 이상의 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하는 단백질 분자를 의미한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, CTLA4-Ig 폴리펩티드는 서열 18의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, CTLA4 세포외 도메인 및 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 야생형 또는 돌연변이형일 수 있거나 변형될 수 있다. 돌연변이형 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 돌연변이형 CTLA4 세포외 도메인을 포함하는 CTLA4-Ig 폴리펩티드이다. 돌연변이형 CTLA4Ig 분자는 하나 이상의 돌연변이형 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, CTLA4 세포외 도메인 및 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 인간 또는 마우스를 비롯한 포유동물일 수 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이형 CTLA4 세포외 도메인은 도 1 또는 서열 18에 나타낸 CTLA4 세포외 도메인과 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이형 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 도 1에 도시된 바와 같은 면역글로불린 (g) 불변 영역과 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 폴리펩티드는 추가의 단백질 도메인을 더 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 CTLA4-Ig 폴리펩티드의 단량체를 의미할 수 있고, 폴리펩티드의 다량체 형태, 예컨대 이량체, 사량체 및 육량체 등 (또는 다른 고분자량 종)을 의미할 수도 있다. CTLA4-Ig 분자는 또한 CD80 및/또는 CD86에 결합할 수도 있다. CTLA4-Ig 분자는 돌연변이형 CTLA4Ig 분자, 예컨대 "베타 폴리펩티드 분자", 예를 들어 CTLA4A29YL104E-Ig를 포함한다. 예를 들어, CTLA4-Ig는 CTLA4-Ig 분자를 포함하고, CTLA4A29YL104E-Ig는 베타 폴리펩티드 분자 (돌연변이형 CTLA4-Ig 분자의 예)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CTLA4 세포외 도메인"은 B7-1 (CD80) 및/또는 B7-2 (CD86)에 결합하는, 서열 18에 나타낸 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질 도메인을 의미한다. 특정 실시양태에서, CTLA4 세포외 도메인은 서열 18에 나타낸 아미노산과 동일한 것인, 서열 2의 아미노산 27-150과 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 일치하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 서열 2의 아미노산 151은 정션 아미노산이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "베타 폴리펩티드"는 (1) 위치 29에서 아미노산이 티로신으로 돌연변이되고, 위치 104에서 아미노산이 글루타메이트로 돌연변이되며, 임의로 다양한 추가의 돌연변이를 갖는 서열 18의 아미노산 서열, 및 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하고; (2) CD80 및/또는 CD86에 결합할 수 있는 돌연변이형 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 의미한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 베타 폴리펩티드는 CTLA4A29YL104E-Ig의 세포외 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열 (서열 24에 나타낸 바와 같은 것)을 포함한다. 베타 폴리펩티드의 비제한적 예에는 벨라타셉트 및 서열 4 및 11 내지 16이 포함된다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 야생형 또는 돌연변이형일 수 있거나 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부는 인간 또는 마우스를 비롯한 포유동물일 수 있다. 베타 폴리펩티드의 추가의 비제한적 예에는 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부에 하나 이상의 아미노산 돌연변이 (예를 들어, 서열 4의 시스테인 120의 치환)를 포함하는 베타 폴리펩티드 및 서열 18의 하나 이상의 아미노산 위치 25, 30, 93, 96, 103 또는 105에서 추가 돌연변이를 포함하는 베타 폴리펩티드가 포함된다. 베타 폴리펩티드 분자는 베타 폴리펩티드를 포함한다. 베타 폴리펩티드 분자는 베타 폴리펩티드의 단량체 및 베타 폴리펩티드의 다량체 형태, 예컨대 이량체, 사량체 및 육량체 등을 의미할 수 있다. 예를 들어, 벨라타셉트는 베타 폴리펩티드 분자를 포함한다. 베타 폴리펩티드 분자는, 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 2006년 10월 5일에 출원된 미국 가출원 제60/849,543호에 추가로 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "글루타메이트" 및 "글루탐산"은 호환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이량체"는 함께 연결되거나 결합된 2개의 CTLA4-Ig 폴리펩티드 또는 단량체로 구성된 CTLA4-Ig 단백질 또는 CTLA4-Ig 분자를 의미한다. 이량체의 단량체들 사이의 연결은 비공유적 연결 또는 상호작용, 공유적 연결 또는 상호작용, 또는 둘 다일 수 잇다. CTLA4-Ig 이량체의 예는 도 4에 나타나 있다. 2개의 동일한 단량체로 구성된 CTLA4-Ig 단백질 또는 CTLA4-Ig 분자는 동종이량체이다. CTLA4-Ig 동종이량체는 또한 서열이 약간 상이할 수 있는 2개의 단량체를 포함하는 분자도 포함한다. 동종이량체는 함께 결합된 단량체가 실질적으로 동일한 서열을 갖는 이량체를 포함한다. 동종이량체를 포함하는 단량체는 상당한 구조 상동성을 공유한다. 예를 들어, 서열에서의 차이는 단량체의 N-말단 프로세싱 변형에 기인한 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "보존성 돌연변이"는 한 아미노산을 동일한 부류의 다른 것에 대해 치환하는 핵산 서열에서의 변화를 의미한다 (예를 들어, 한 비극성 아미노산의 다른 것, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌에 대한 치환; 또는 한 극성 아미노산의 다른 것에 대한 치환, 예컨대 아르기닌의 리신에 대한 치환, 글루탐산의 아스파르트산에 대한 치환 또는 글루타민의 아스파라긴에 대한 치환).
본원에 사용된 바와 같은 "비-보존성 돌연변이"는 한 아미노산을 상이한 부류의 다른 것에 대해 치환하는 핵산 서열에서의 변화를 의미한다 (예를 들어, 염기성 아미노산, 예컨대 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의, 산성 아미노산, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 치환). 예를 들어, 한 아미노산은 다른 아미노산과 그 크기, 전하, 극성, 반응성 또는 다른 특징에 있어서 생화학적으로 상이할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "단리된"은 그의 천연 환경에서 벗어난 분자 및 분자가 천연적으로 발생한 곳과 상이한 환경에 있는 분자, 또는 해당 물질 (예를 들어, 단백질)이 구성성분으로부터 생성된 조성물, 혼합물 또는 수집물 중에 우세한 종 (예를 들어, 단백질 종)으로 존재하도록 (예를 들어, 몰 기준으로, 조성물 중의 여타 개별적인 종보다 풍부함), 그의 환경의 다른 구성성분으로부터 부분적으로 또는 완전하게 회복되거나 분리된 물질 (예를 들어, 단백질)을 의미한다. 예를 들어, 제제는 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95％ 초과의 단리된 CTLA4-Ig로 이루어질 수 있다. "단리된"은 CTLA4-Ig 분자와 분자가 천연적으로 발생한 환경이 다른 CTLA4-Ig 분자의 혼합물을 배제하지 않는다. "단리된"은 그의 환경, 예컨대 세포 배양물, 뱃치 배양 또는 생물반응기 등으로부터 회복시킨 CTLA4-Ig와 조합한 제약상 허용되는 부형제를 배제하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리하는"은 단리된 CTLA4-Ig 분자를 얻기 위한 과정 또는 방법을 수행하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "가용성 CTLA4"는 생체내에서 순환할 수 있는 분자 또는 세포막에 결합하지 않는 CTLA4를 의미한다. 예를 들어, 가용성 CTLA4는 Ig에 연결된 CTLA4의 세포외 영역을 포함하는 CTLA4-Ig를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포 배양물의 가용성 분획물"은 세포 배양물의 불용성, 미립자 또는 고체 구성성분, 예컨대 세포, 세포막 및 핵 이외의, 또는 이들을 실질적으로 함유하지 않는, 세포 배양물의 액체 부분을 의미한다. 가용성 분획물은, 예를 들어 세포 배양물의 원심분리 후 생성된 상청액 또는 세포 배양물의 여과 후 생성된 여과액일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 카셋트"는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 5' 조절 영역 (예를 들어, 프로모터) 및 임의로 비번역 3' 말단 영역 (예를 들어, 종결 코돈 및 폴리아데닐화 서열)을 갖는 핵산을 의미한다. 적절한 조건하에서, 발현 카셋트에 의해 코딩된 폴리펩티드는 발현 카셋트에 의해 생성된다. 발현 카셋트는 또한 숙주 세포의 게놈 내 특정 부위로 발현 카셋트가 표적 통합된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Koduri et al., (2001) Gene 280:87-95] 참조). 예를 들어, ATCC 수탁 번호 PTA-2104로서 기탁된 플라스미드로부터 유도된 CTLA4A29YL104E-Ig 폴리펩티드 발현 카셋트는 CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 발현 카셋트의 일례이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 정제된"은 그의 천연 환경으로부터 제거되고 (예를 들어, 단리되고), 천연적으로 결합된 다른 성분, 예컨대 세포 물질 또는 배양 배지가 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 99.5％, 또는 99.9％ 이상 없는 CTLA4-Ig 분자 또는 CTLA4-Ig 분자의 선택된 집단을 포함하는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 재조합적으로 생성된 CTLA4-Ig 단백질 분자와 관련하여, 용어 "실질적으로 정제된"은 CTLA4-Ig 단백질 분자에 당해 서열 2의 폴리펩티드 또는 서열 2의 돌연변이형 폴리펩티드가 아닌 단백질 분자가 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 99.5％, 또는 99.9％ 이상 없도록, 생성 환경으로부터 제거된 CTLA4-Ig 단백질 분자를 포함하는 조성물을 의미할 수도 있다. "실질적으로 정제된"은 CTLA4-Ig 분자 (예컨대 이량체)와 다른 CTLA4-Ig 분자 (예컨대 사량체)의 혼합물을 배제하지 않는다. "실질적으로 정제된"은 그의 천연 환경으로부터 벗어난 CTLA4-Ig 분자와 조합한 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대규모 공정"은 용어 "산업-규모 공정"과 호환적으로 사용된다. 용어 "배양 용기"는 "생물반응기", "반응기" 및 "탱크"와 호환적으로 사용된다.
"액체 배양물"은 지지체 상에서 성장시키거나 액체 영양 배지에 현탁되어 성장하는 세포 (예를 들어, 세균, 식물, 곤충, 효모 또는 동물 세포)를 의미한다.
"시드 배양물"은 보다 큰 용량의 배양 배지에 심는 데 사용하기 위해 성장시킨 세포 배양물을 의미한다. 시드 배양물은 배양물에서 성장하는 세포 (예를 들어, 현탁액에서 성장시킨 세포)의 수를 확장시키기 위해 보다 큰 용량의 배지에 심기 위해서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "배양하는"은 정의되거나 제어된 조건하에 시험관내에서 하나 이상의 세포를 성장시키는 것을 의미한다. 정의될 수 있는 배양 조건의 예에는 온도, 기체 혼합물, 시간 및 배지 제형이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "확장하는"은 배양물 내에 보다 많은 수의 세포를 얻을 목적으로 시험관내에서 하나 이상의 세포를 배양하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "집단"은 하나 이상의 측정가능하거나 검출가능한 특성의 존재 또는 부재를 특징으로 하는 둘 이상의 분자 ("분자의 집단") 또는 세포 ("세포의 집단")의 군을 의미한다. 동종성 집단에서, 집단 내 분자 또는 세포는 동일하거나 실질적으로 동일한 특성 (예를 들어, 클로날 세포주의 세포)을 특징으로 한다. 이종성 집단에서, 집단 내 분자 또는 세포는 동일하거나 실질적으로 동일한 하나 이상의 특성을 특징으로 하고, 여기서 세포 또는 분자는 또한 동일하지 않은 특성을 나타낼 수도 있다 (예를 들어, 실질적으로 유사한 평균 시알산 함량을 갖지만 유사하지 않은 만노스 함량을 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단).
본원에 사용된 바와 같은 "고분자량 응집체"는 3개 이상의 CTLA4-Ig 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자를 의미하는 "고분자량 종"과 호환적으로 사용된다. 예를 들어, 고분자량 응집체는 사량체, 오량체 또는 육량체일 수 있다.
"퍼센트 (％) 수율"은 실제 수율을 이론상 수율로 나누어 100을 곱한 값을 의미한다. 실제 수율은 그램 또는 몰 (예를 들어, 몰 수율) 단위의 중량으로 주어질 수 있다. 이론상 수율은 이상적인 또는 수학적으로 계산된 수율로서 주어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "MCP-1의 양"은 (1) MCP-1 (단핵구 화학주성 단백질-1, 특히 햄스터 MCP-1) 단독의 양, 또는 (2) "MCP-1형" 단백질의 양을 의미하고, 여기서 "MCP-1형" 단백질에는 MCP-1과 함께, MCP-1과 상동성인 단백질, MCP-1의 단편, 및/또는 MCP-1과 상동성인 단백질의 단편 (예를 들어, 각각의 상기 경우에서, MCP-1의 검출에 대한 항체 (예를 들어, 폴리클로날 ELISA) 분석과 교차반응할 수 있는 것)이 포함된다. MCP-1 (및/또는 MCP-1과 상동성인 단백질, MCP-1의 단편, 및/또는 MCP-1과 상동성인 단백질의 단편)의 부재는 MCP-1 양의 범위와 관련하여 최저 한도가 제공되지 않는 것으로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 "글리코실화 함량"은 단백질 분자, 예컨대 CTLA4-Ig 분자같은 당단백질에 공유적으로 부착된 N-연결된 또는 O-연결된 당 잔기의 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질에 대한 시알산의 몰비"는 단백질 (CTLA4-Ig 분자) 또는 이량체의 몰당 시알산 분자의 몰의 수로서 계산되어 주어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "당단백질"은 하나 이상의 당 잔기의 첨가를 비롯한 하나 이상의 탄수화물의 첨가에 의해 변형된 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시알릴화"는 당단백질을 비롯한 단백질에 대한 시알산 잔기의 첨가를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "당단백질 이소형"은 등전 집중 (IEF) 겔 전기영동 또는 혼합물 중에서 상이한 단백질을 그의 분자량, 전하 및/또는 다른 특징에 의해 구별하는 다른 적합한 방법에 의해 측정된 바와 같은 그의 탄수화물 및 시알산 함량을 특징으로 하는 분자를 의미한다. 예를 들어, IEF 겔 상에서 관찰된 별개의 각 밴드는 특정 등전점 (pI)을 갖고, 따라서 동일한 순수 전체 전하를 갖는 분자를 나타낸다. 당단백질 이소형은 별개의 밴드일 수 있고, 여기서 각 밴드는 특정 pI를 갖는 분자의 집단일 수 있다.
"면역 관용"은 사람이 일반적으로 반응하는 특정 항원 또는 항원의 군에 대한 무반응 상태 (예를 들어, T 세포가 항원에 대해 더 이상 반응하지 않는 상태)를 의미한다.
"효능"은 리간드 농도 함수로서의 반응 측정값을 의미한다. 예를 들어, 작동제 효능은 최대 효과의 절반 (EC50)을 생성하는 리간드 농도로서 정량화된다. 효능의 비제한적인 약리학상 정의에는 친화성 및 효력의 구성요소가 포함되는데, 여기서 효력은 한번 결합된 반응을 되살리는 약물의 능력이다. 효능은 친화성과 관련이 있지만, 효능과 친화성은 약물 작용의 상이한 측정값이다.
본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체"는 약리학상 활성제를 위한 비히클을 의미한다. 담체는 활성제의 기능을 종료시키지 않고 활성제의 표적 부위로의 전달을 촉진한다. 담체의 적합한 형태의 비제한적 예에는 용액, 크림, 겔, 겔 에멀젼, 젤리, 페이스트, 로션, 고약, 스프레이, 연고, 산제, 고형 혼합물, 에어로졸, 에멀젼 (예컨대, 유중수 또는 수중유), 겔 수용액, 수용액, 현탁액, 도포제, 팅크제, 및 국소 투여에 적합한 패치가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 문구 "제약상 허용되는 조성물" (또는 "제약 조성물")은 예컨대 인간에 대한 제약상 투여에 허용되는 조성물을 의미한다. 이러한 조성물은 불순물인 물질을 제약상 투여에 허용되는 수준을 초과하지 않는 수준 (이러한 불순물의 부재를 포함하는 수준)으로 포함할 수 있고, 임의의 활성제(들) 외에, 예를 들어 이러한 조성물을 투여가 용이하도록 제형화하기 위한 제약상 허용되는 부형제, 비히클, 담체 및 다른 불활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제약상 허용되는 CTLA4-Ig 조성물은 MCP-1 또는 DNA를, 이들 물질이 인간에 대한 투여에 허용되는 수준인 한, 포함할 수 있다.
"약물 재료"는 제약 조성물에 함유된 활성 제약 성분이다. 용어 "약물 재료"는 용액 및/또는 완충된 형태의 활성 제약 성분을 포함한다. "약물 제품"은 제약상 투여를 위해 제형화된 약물 재료를 함유한 제약 조성물이다. 약물 재료 및/또는 약물 제품을 의미할 수 있는, 실시예 및 본원의 다른 곳에 포함된 분석의 목적을 위한, 분석될 수 있는 예시적 약물 재료 및 약물 제품은 이하와 같다.
서열 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 18을 포함하는 CTLA4Ig 분자에 대한 예시적 약물 재료는 완충 수용액 (25 mM 인산나트륨, 5O mM 염화나트륨, pH 7.5) 형태인, 농도 50 mg/ml의 CLTA4-Ig 단백질이다.
서열 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 18을 포함하는 CTLA4Ig 분자에 대한 예시적 약물 제품은 250 mg 동결건조 CTLA4-Ig 단백질, 500 mg 말토스, 17.2 mg 제일인산나트륨, 및 14.6 mg 염화나트륨, pH 7.0-8.0; 또는
동결건조 CTLA4 - Ig 단백질 (250 mg / 바이알 ) 약물 제품의 조성
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완충 수용액 (25 mM 인산나트륨, 1O mM 염화나트륨, pH 7.5)이다.
서열 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 24를 포함하는 CTLA4Ig 분자에 대한 예시적 약물 제품:
동결건조 CLTA4 A29YL104E - Ig 100 mg / 바이알 약물 제품의 조성
Figure 112011097388832-pat00010
본원에 사용된 바와 같은 용어 "배양 배지" 및 "세포 배양 배지" 및 "영양공급 배지" 및 "발효 배지"는 세포, 특히 포유동물 세포를 성장시키고/거나 유지시키기 위해 사용되는 영양 용액을 의미한다. 제한 없이, 이들 용액은 보통 하나 이상의 하기 범주로부터의 하나 이상의 구성성분을 제공한다: (1) 통상적으로는 글루코스와 같은 탄수화물 형태인 에너지원; (2) 모든 필수 아미노산, 및 통상적으로는 20종의 아미노산에 시스테인을 더한 염기성 셋트; (3) 저농도로 요구되는 비타민 및/또는 다른 유기 화합물; (4) 유리 지방산 또는 지질, 예를 들어 리놀레산; 및 (5) 미량 요소, 여기서 미량 요소는 전형적으로는 저농도, 통상적으로는 마이크로몰 범위로 요구되는 무기 화합물 또는 천연 발생 요소로 정의된다. 영양 용액은 임의의 하기 범주로부터 하나 이상의 구성성분을 선택하여 보충할 수 있다: (1) 호르몬 및 다른 성장 인자, 예컨대 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 및 표피 성장 인자; (2) 염, 예를 들어 마그네슘, 칼슘, 및 포스페이트; (3) 완충액, 예컨대 HEPES; (4) 뉴클레오시드 및 염기, 예컨대 아데노신, 티미딘, 및 히폭산틴; (5) 단백질 및 조직 가수분해물, 예를 들어 정제 젤라틴, 식물 재료 또는 동물 부생성물로부터 얻을 수 있는 펩톤 또는 펩톤 혼합물; (6) 항생제, 예컨대 겐타마이신; (7) 세포 보호제, 예를 들어 플루오닉 폴리올; 및 (8) 갈락토스.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "접종"은 배양을 시작하기 위한 배양 배지에의 세포의 첨가를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 세포 배양물의 "성장기"라는 용어는 세포가 최초로 빠르게 분열하는 대수적 세포 성장의 기간 (예를 들어, 대수기)을 의미한다. 이 시기 동안, 생존가능한 세포의 밀도 증가율은 여타 시점보다 높다.
본원에 사용된 바와 같은 세포 배양물의 "생산기"라는 용어는 세포 성장이 정체되거나 거의 일정한 수준으로 유지되는 기간을 의미한다. 생존가능한 세포의 밀도는 주어진 기간 동안 대략 일정하게 유지된다. 대수적 세포 성장은 종결되고, 단백질 생산이 생산기 동안의 주요 활동이다. 이 시기의 배지는 일반적으로 연속적인 단백질 생산을 지지하고 목적하는 당단백질 생성물을 달성하기 위해 보충된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현" 또는 "발현하다"는 세포 내에서 발생하는 전사 및 번역을 의미하기 위해 사용된다. 숙주 세포 내 생성물 유전자의 발현 수준은 세포에 존재하는 대응하는 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생성되는 생성물 유전자가 코딩하는 단백질의 양 중 하나 또는 둘 다를 기초로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "글리코실화"는 폴리펩티드 쇄 내의 특이적 부위에서의 단백질에 복합 올리고사카라이드 구조의 부가를 의미한다. 단백질의 글리코실화 및 첨가된 탄수화물의 후속적 처리는 단백질 폴딩 및 구조, 단백질 반감기를 비롯한 단백질 안정성, 및 단백질의 기능적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질 글리코실화는 변형이 일어나는 서열 환경에 의해 2부류, 즉 O-연결된 글리코실화 및 N-연결된 글리코실화로 분류될 수 있다. O-연결된 폴리사카라이드는 히드록실기, 통상적으로 세린 또는 트레오닌 잔기의 히드록실기에 연결된다. O-글리칸은 모든 세린 및 트레오닌 잔기에 부가되는 것은 아니다. O-연결된 올리고사카라이드는 통상적으로 1안테나형 또는 2안테나형이며, 즉 이들은 1개 또는 2개 이상의 분지 (안테나)를 포함하고, 1종 내지 4종의 당 잔기를 포함하며, 이들은 하나씩 차례로 부가된다. N-연결된 폴리사카라이드는 아스파라긴의 아미드 질소에 부착된다. 2종의 트리펩티드 서열 중 1종, 즉 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)의 일부인 아스파라긴만이 글리코실화에 대한 표적이다. N-연결된 올리고사카라이드는 1개 내지 4개의 분지를 가질 수 있으며, 이는 1-, 2-, 3-, 4-안테나형으로 불린다. N- 및 O-연결된 올리고사카라이드에서 발견되는 당 잔기의 구조는 상이하다. 이러한 상이함에도 불구하고, N- 및 O-연결된 폴리사카라이드 양쪽의 각 분지 상의 말단 잔기는 시알산 캡핑으로 불리는 시알산 분자 변형에 의해 변형될 수 있다. 시알산은 다른 올리고사카라이드에 연결될 수 있는 특유한 9개-탄소 모노사카라이드의 패밀리에 대한 통상 명칭이다. 2개의 패밀리 일원은 Neu5Ac 또는 NANA로 약칭되는 N-아세틸 뉴라민산, 및 Neu5Gc 또는 NGNA로 약칭되는 N-글리콜릴 뉴라민산이다. 인간에서 가장 통상적인 형태의 시알산은 NANA이다. N-아세틸뉴라민산 (NANA)은 CTLA4-Ig 분자에 존재하는 1차 시알산 종이다. 그러나, 소수이지만, 검출가능한 수준의 N 글리콜릴뉴라민산 (NGNA)이 또한 CTLA4-Ig 분자 내에 존재하다는 것을 주목해야 한다. 더욱이, 본원에 기재된 방법을 이용하여 NANA 및 NGNA 양쪽에 대한 시알산의 몰수를 측정할 수 있으며, 따라서 NANA 및 NGNA 양쪽의 수준이 CTLA4-Ig 분자에 대해 측정되고 보고된다. N- 및 O-연결된 올리고사카라이드는 상이한 수의 분지를 가지며, 이는 시알산 분자가 부착될 수 있는 상이한 수의 위치를 제공한다. N-연결된 올리고사카라이드는 시알산에 대해 4개까지의 부착 위치를 제공할 수 있는 한편, O-연결된 올리고사카라이드는 시알산 부착에 대해 2개의 부위를 제공할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대규모 공정"은 용어 "산업-규모 공정"과 호환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "배양 용기"는 "생물반응기", "반응기" 및 "탱크"와 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "작업 용액(들)"은 방법에서 사용되는 용액을 의미한다. 작업 용액의 비제한적 예는 완충액을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "참고 물질"은 방법에서 표준물로서 사용되는 물질을 의미한다. 예를 들어, 참고 물질은 실험 샘플을 비교할 수 있는 표준물로서 사용될수 있다.
물질의 부재는 최저 한도가 하기 물질의 양의 범위와 관련하여 제공되지 않는 것으로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 배양물과 관련하여 언급된 온도는 생물반응기의 온도를 조절하는 기기 상에 설정된 온도를 가리킨다. 물론, 액체 배양물 그 자체의 온도는 생물반응기에 대해 온도를 조절하는 기기 상에 설정된 온도를 취할 수 있다. 온도가 인큐베이터의 선반 상에서 유지되는 세포 배양물을 나타내는 경우에, 이와 같이 온도는 인큐베이터의 선반 온도를 가리킨다.
본 발명의 비제한적 실시양태:
본 발명은 CTLA4-Ig 분자의 조성물 및 돌연변이형 CTLA4-Ig 분자, 예컨대 CTLA4A29YL104E-Ig의 조성물을 제공한다. 본 발명은 특정 특징, 예컨대 특정량의 세균 내독소, 바이오버든, 특정 범위 내의 pI (또는 특정 범위의 pI에서의 특정 IEF 밴드), 특정량의 단량체 (단일쇄), 이량체 또는 고분자량 종 (예컨대 사량체), 특정 트립신분해 펩티드 프로파일, SDS-PAGE 상에서의 특정 셋트의 주요 밴드, 특정 DNA 함량, 특정 최대치를 초과하지 않는 MCP-1의 양, 특정 최대치를 초과하지 않는 세포 단백질의 양, 특정 최대치를 초과하지 않는 Triton X-100의 양, 특정 최대치를 초과하지 않는 단백질 A의 양, N-연결된 탄수화물의 특정 프로파일, 특정 아미노 모노사카라이드 조성물 (GlcNac, GalNAc), 특정 중성 모노사카라이드 조성물 (갈락토스, 푸코스, 만노스), 특정량의 B7 결합, 특정량의 IL-2 억제 세포 분석에서의 활성, 및/또는 특정 시알산 조성물 (NANA, NGNA) (각 경우에, 상기 특정량은 범위 또는 범위들일 수 있음)을 갖는 조성물을 제공한다. 본 발명은 상기 특징 중 임의의 하나를 갖거나, 또는 상기 특징 중 하나 이상 내지 임의의 모든 가능한 순열 또는 조합으로 상기 특징 모두를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 단리된 또는 실질적으로 정제된 형태이거나, 또는 단리된 또는 실질적으로 정제된 형태가 아닌 본 발명의 모든 조성물을 포함한다. 본 발명은 제약 조성물인 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자의 초기 집단을 포함하는 액체 배양 배지로부터 CTLA4-Ig 분자의 단리된 집단을 포함하는 조성물을 수득하는 방법에 관한 것이며, 여기서 (1) 초기 집단의 CTLA4-Ig 분자는 하나 이상의 시알산 잔기를 가지고, (2) CTLA4-Ig 분자 당 시알산 잔기의 수는 초기 집단 내에서 변화하고, (3) 초기 집단은 CTLA4-Ig 이량체 및 고분자량 응집체를 포함하는 것이고, 상기 방법은 (a) 액체 배양 배지를 CTLA4-Ig 분자를 발현하는 포유동물 세포의 배양물로부터 수거하는 단계; (b) CTLA4-Ig 분자를 세포 성분으로부터 분리하는 단계; (c) CTLA4-Ig 이량체를 CTLA4-Ig 고분자량 응집체로부터 분리하는 단계; 및 (d) CTLA4-Ig 분자를 둘 이상의 분획물로 분리하며, 여기서 하나 이상의 분획물은 하나 이상의 다른 분획물과 비교하여 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 몰비가 더 큰 것인 단계를 포함하고, 단계 (b), (c) 및 (d)를 동시에 또는 임의의 순서대로 수행하여 상기 조성물을 수득한다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)에서의 수거는 액체 배양물의 가용성 분획물을 수득하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (c) 및 (d)는 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 상이한 시알산 함량을 갖는 CTLA4-Ig 분자의 분획물을 수득하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 조성물 중의 MCP-1 함량을 감소시키는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 서열 2, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 서열 4, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 보다 큰 몰비를 갖는 (d)에서의 분획물은 약 8 내지 약 14의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 평균 몰비는 약 8 내지 약 11, 약 8 내지 약 10, 또는 약 8 내지 약 9이다.
본 발명은 (i) CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 생산하는 포유동물 세포를 포함하는 액체 배양물의 가용성 분획물을 수득하는 단계; (ii) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iii) 단계 (ii)의 조성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축된 조성물을 수득하는 단계; (iv) 단계 (iii)의 조성물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 추가로 농축된 조성물을 수득하는 단계; 및 (v) 단계 (iv)의 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 분자의 단리 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 단계 (ii)에서 수득된 조성물은 (a) CTLA4-Ig 분자의 몰당 평균 6.0 내지 10.1 몰의 NANA, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 25.7 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)에서 수득된 조성물은 (a) CTLA4-Ig 분자의 몰당 평균 6.8 내지 11.4 몰의 NANA, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.5 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다. 추가의 실시양태에서, 단계 (iv)에서 수득된 조성물은 (a) CTLA4-Ig 분자의 몰당 평균 8.0 내지 11.0의 NANA, 및 (b) 2.5 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (v)에서 수득된 조성물은 (a) CTLA4-Ig 분자의 몰당 평균 8.0 내지 11.9 몰의 NANA, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출 (SPD)에 의해 측정된 2.0 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, SPD의 예는 A 280 nm에서일 수 있다.
본 발명은 또한 (i) CTLA4-Ig 분자를 생산하는 포유동물 세포를 포함하는 액체 배양물의 가용성 분획물을 수득하는 단계, 및 임의의 순서대로, (ii) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iii) 가용성 분획물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iv) 가용성 분획물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; 및 (v) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 분자의 조성물의 단리 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) CTLA4-Ig 분자를 생산하는 포유동물 세포를 포함하는 액체 배양물의 가용성 분획물을 수득하는 단계; (ii) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iii) 단계 (ii)의 단백질 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축된 조성물을 수득하는 단계; (iv) 단계 (iii)의 단백질 생성물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 추가로 농축된 조성물을 수득하는 단계; 및 (v) 단계 (iv)의 단백질 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 단리하는 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물의 단리 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 방법의 단계 (ii)에서 수득된 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물은 (a) 6.0 내지 10.1의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.5 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (iii)에서 수득된 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물은 (a) CTLA4-Ig 고분자량 종이 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정하였을 때, 약 2.5 면적％ 미만이고, (b) 세포 단백질이 약 95 ng/ml 미만이고, (c) MCP-1이 약 5 ppm 미만임을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (iii)에서 수득된 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물은 (a) 6.8 내지 11.4의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.5 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다. 추가의 실시양태에서, 방법의 단계 (iv)에서 수득된 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물은 (a) 8.0 내지 11.0의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.5 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (iii)에서 수득된 조성물은 CTLA4-Ig 고분자량 종이 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정하였을 때 2.5％ 면적 백분율 미만임을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (v)에서 수득된 조성물은 (a) 8.0 내지 11.9의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.0 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 또 다른 측면에서, (i) CTLA4-Ig 분자를 생산하는 포유동물 세포를 포함하는 액체 배양물의 가용성 분획물을 수득하는 단계, 및 임의의 순서대로, (ii) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iii) 가용성 분획물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iv) 가용성 분획물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; 및 (v) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (iii)에서 수득된 조성물은, CTLA4-Ig 고분자량 종의 백분율이 약 2.5 면적％ 미만이고, 세포 단백질이 95 ng/ml 미만이고, MCP-1이 약 5 ppm 미만임을 특징으로 하는 것인, CTLA4-Ig 분자의 조성물의 단리 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) CTLA4-Ig 분자를 생산하는 포유동물 세포를 포함하는 액체 배양물의 가용성 분획물을 수득하는 단계, 및 임의의 순서대로, (ii) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iii) 가용성 분획물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iv) 가용성 분획물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계; 및 (v) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축되고 용출된 조성물을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (iii)에서 수득된 조성물은, CTLA4-Ig 고분자량 종의 백분율이 약 2.5 면적％ 미만이고, 세포 단백질이 95 ng/ml 미만이고, MCP-1 및 MCP-1-유사 물질이 약 5 ppm 미만이고, NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비가 약 8.0 내지 약 12임을 특징으로 하는 것인, CTLA4-Ig 분자의 조성물의 단리 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 벙법의 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 75 mM HEPES 및 약 360 mM NaCl을 포함하고 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 850 mM NaCl을 포함하고 약 7.0의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 추가의 실시양태에서, 방법의 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 850 mM NaCl을 포함하고 약 7.0의 pH를 갖는 단일 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 추가의 실시양태에서, 방법의 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 약 25 mM Tris 및 약 250 mM NaCl을 포함하고 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 약 100 mM 글리신을 포함하고 약 3.5의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (v)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 120 mM NaCl 내지 약 130 mM NaCl을 포함하고 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (v)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 200 mM NaCl을 포함하고 약 8.0의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민 관능기를 포함하는 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼을 사용하여 수행한다. 특정 실시양태에서, 수지는 4차 아민 관능기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸, 또는 이소아밀 관능기를 포함하는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행한다. 특정 실시양태에서, 관능기는 페닐 관능기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 단백질 A를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하여 수행한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자를 액체 세포 배양물로부터 정제하는 것을 포함하며, 여기서 정제된 CTLA4-Ig 조성물은 (a) CTLA4-Ig 분자 mg 당 제약상 허용되는 양의 MCP-1, 및 (b) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.5 면적％ 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 포함하는 것인, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 양의 MCP-1은 CTLA4-Ig 분자 mg 당 약 40 내지 약 0.5 ng을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약상 허용되는 양의 MCP-1은 CTLA4-Ig 분자 mg 당 약 35 내지 약 0.5 ng을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제약상 허용되는 양의 MCP-1은 CTLA4-Ig 분자 mg 당 약 10 내지 약 0.5 ng을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 방법의 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 용출된 단백질 생성물 중의 MCP-1을 감소시킬 수 있는 수지를 포함하는 칼럼을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행하며, 여기서 수지는 (a) CTLA4-Ig 이량체를 CTLA4-Ig 고분자량 종으로부터 분리할 수 있거나; (b) 용출된 CTLA4-Ig 분자 중의 시알산 함량을 증가시킬 수 있거나; 또는 (c) 항목 (a) 및 (b)를 둘 다 가능하게 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii) 또는 단계 (iv), 또는 두 단계 모두의 음이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 수지를 사용하여 수행하며, 여기서 수지는 (a) 용출된 조성물 중의 CTLA4-Ig 고분자량 응집체 함량을 감소시킬 수 있거나; (b) 용출된 조성물 중의 시알산 함량을 증가시킬 수 있거나; 또는 (c) 항목 (a) 및 (b)를 둘 다 가능하게 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) CTLA4-Ig 분자를 생산하는 포유동물 세포를 포함하는 액체 배양물의 가용성 분획물을 수득하는 단계, 및 임의의 순서대로; (ii) 가용성 분획물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iii) 가용성 분획물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출되고 농축된 조성물을 수득하는 단계; 및 (iv) 가용성 분획물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출되고 농축된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물의 단리 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계를 처음에 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 방법의 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 단백질 A를 포함하는 수지를 사용하여 수행한다. 추가의 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 구아니딘을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 추가의 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 우레아를 포함하는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출된 조성물 중의 CTLA4-Ig 이량체의 증가를 초래한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 수거된 액체의 가용성 분획물을 수득하는 단계; (ii) 가용성 분획물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출된 조성물을 수득하는 단계; (iii) 단계 (ii)의 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 용출되고 농축된 조성물을 수득하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)으로부터의 조성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 추가로 농축된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 CTLA4-Ig 분자를 생산하는 포유동물 세포 배양물로부터 수거된 액체로부터 단리하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법의 단계 (iv)에서 수득된 조성물은 고분자량 종의 백분율이 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정하였을 때, 약 2.5 면적％ 미만이고, 세포 단백질의 백분율이 약 95 ng/ml 미만이고, MCP-1의 백분율이 약 5 ppm 미만임을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 50 mM HEPES 및 약 135 mM NaCl을 포함하고 약 7의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 추가의 실시양태에서, 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 50 mM HEPES 및 약 200 mM NaCl을 포함하고 약 7의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 특정 실시양태에서, 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸, 또는 이소아밀 관능기를 포함하는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행한다. 추가의 실시양태에서, 단계 (iv)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 약 50 mM HEPES 및 약 1.2 M (NH4)2SO4를 포함하고 약 7의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 약 25 mM NaH2PO4 및 약 150 mM NaCl을 포함하고 약 7.5의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 약 250 mM 글리신을 포함하고 약 3의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민 관능기를 포함하는 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼을 사용하여 수행한다. 특정 실시양태에서, 수지는 4차 아민 관능기를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸, 또는 이소아밀 관능기를 포함하는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행한다. 한 실시양태에서, 관능기는 페닐 관능기를 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 단백질 A를 포함하는 수지를 사용하여 수행한다. 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득된 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 서열 2, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 서열 4, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 서열 17의 핵산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 발현 플라스미드를 제공한다. 본 발명은 약 5.5 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 단백질의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 5 내지 약 10의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 6 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 8 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 8 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 8 내지 약 11의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 7 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 7 내지 약 11의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 11 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 12 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 13 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 14 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 15 내지 약 17의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 16의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 10의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 6의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 시알산은 N-아세틸 뉴라민산 (NANA)이다. 본 발명은 약 8 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 1.5 이하의 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA) 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 0.5 내지 약 1.5의 NGNA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 1.0 내지 약 1.5의 NGNA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 6 내지 약 18의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자 몰 당 시알산 약 6 내지 약 12의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다.
본 발명은 분자의 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열을 포함하고, CTLA4-Ig 분자 몰 당 시알산 약 5.5 내지 약 9.5의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 몰 당 시알산의 몰비는 산 가수분해 및 HPLC에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 서열 2, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 서열 4, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정하였을 때 CTLA4-Ig 분자의 95％ 이상이 CTLA4-Ig 이량체인, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 98％ 이상은 CTLA4-Ig 이량체이다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 99％ 이상은 CTLA4-Ig 이량체이다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 99.5％ 이상은 CTLA4-Ig 이량체이다. 한 실시양태에서, 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정하였을 때 CTLA4-Ig 분자의 약 95％ 내지 약 99.5％는 CTLA4-Ig 이량체이고, 분자의 약 0.5 면적 백분율 내지 약 5 면적 백분율은 CTLA4-Ig 고분자량 종이다. 한 실시양태에서, 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정하였을 때 분자의 약 98.6％는 CTLA4-Ig 이량체이고, 분자의 약 1.2 면적 백분율은 CTLA4-Ig 고분자량 종이고, 분자의 약 0.7 면적 백분율 미만운 CTLA4-Ig 단량체이다. 한 실시양태에서, 분자의 약 0.3％ 미만은 5종 이상의 CTLA4-Ig 단량체를 포함하는 다량체이다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체로 본질적으로 이루어진 조성물을 제공한다. 본 발명은 집단이 CTLA4-Ig 단량체를 실질적으로 함유하지 않는, CTLA4-Ig 분자로 본질적으로 이루어진 조성물을 제공한다. 본 발명은 집단이 CTLA4-Ig 고분자량 종을 실질적으로 함유하지 않는, CTLA4-Ig 분자로 본질적으로 이루어진 조성물을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 및 고분자량 종을 실질적으로 함유하지 않는 CTLA4-Ig 단량체로 본질적으로 이루어진 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 각 CTLA4-Ig 이량체의 각 단량체는 3개 이상의 시알산 기를 갖는다. 한 실시양태에서, 각 CTLA4-Ig 이량체의 각 단량체는 2.5개 이상의 시알산 기를 갖는다. 한 실시양태에서, 각 CTLA4-Ig 이량체의 각 단량체는 3개 이상 내지 8개 이상의 시알산 기를 갖는다.
한 실시양태에서, 각 CTLA4-Ig 이량체의 각 단량체는 2.5개 이상 내지 5개 이상의 시알산 기를 갖는다. 한 실시양태에서, 각 이량체는 2개의 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하고, 각 폴리펩티드는 서열 5 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 조성물은 서열 2, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 서열 4, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체를 실질적으로 함유하지 않는, CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 단량체를 실질적으로 함유하지 않는, CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 약 100 그램 초과의 양으로 존재한다. 한 실시양태에서, 각 사량체는 2쌍의 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 5 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 각 사량체는 2쌍의 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 각 폴리펩티드는 서열 11 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 각 사량체는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 본 발명은 MCP-1을 실질적으로 함유하지 않는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 25 ppm 이하의 MCP-1을 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 10 ppm 이하의 MCP-1을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 약 0.2 ng/ml의 MCP-1 내지 약 10 ng/ml의 MCP-1을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 약 0.2 ng/ml의 MCP-1 내지 약 10 ng/ml의 MCP-1, 및 (b) 25 ng/ml 이하의 CHO 단백질 또는 10 ng/ml 이하의 CHO 단백질을 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 약 20 pg/ml 이하의 DNA를 포함한다.
본 발명은 대상체에게 약 10 mg/kg의 정맥내 용량을 투여하였을 때, 약 44400 μg.h/ml의 곡선 아래 면적 (AUC); 약 0.09 L/kg의 분포 부피; 약 292 μg/ml의 피크 농도 (Cmax); 및 약 0.23 ml/h/kg의 청소율을 나타낼 수 있는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 본 발명은 등전 집중법에 의해 측정된 5.1 ± 0.2 이하의 등전점 (pI)을 갖는 등전 집중 겔 상에서 시각화가능한 CTLA4-Ig 분자의 우세한 이소형을 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물의 평균 pI는 뉴라미니다제 처리 후에 증가한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 40％ 이상은 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.1 ± 0.2 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 70％ 이상은 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.1 ± 0.2 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 90％ 이상은 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.1 ± 0.2 이하의 등전점을 나타낸다. 본 발명은 약 3.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 4.3 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 3.3 ± 0.2 내지 약 4.7 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 실질적으로 정제된다. 본 발명은 (a) CTLA4-Ig 분자의 혼합물을 등전 집중 겔 전기영동시키며, 여기서 겔 상의 단일 밴드는 특정 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 나타내는 것인 단계, 및 (b) 약 3.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 단리하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 약 3.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 등전 집중법에 의해 측정된 5.5 ± 0.2 이하의 등전점 (pI)을 갖는 등전 집중 겔 상에서 시각화가능한 우세한 이소형을 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물의 평균 pI는 뉴라미니다제 처리 후에 증가한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 40％ 이상은 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.3 ± 0.2 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 70％ 이상은 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.3 ± 0.2 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 90％ 이상은 등전 집중법에 의해 측정된 약 5.3 ± 0.2 이하의 등전점을 나타낸다. 본 발명은 약 3.0 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 4.5 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 4.7 ± 0.2 내지 약 5.1 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 실질적으로 정제된다.
본 발명은 (a) CTLA4-Ig 분자의 혼합물을 등전 집중 겔 전기영동시키며, 여기서 겔 상의 단일 밴드는 특정 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 나타내는 것인 단계, 및 (b) 약 3.0 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 단리하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.2 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 약 17 내지 약 28의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 17 내지 약 25의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 분자의 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열을 포함하는 것인, 약 24 내지 약 28의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 1.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 분자의 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열을 포함하는 것인, 약 2.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 분자의 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열을 포함하는 것인, 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 3.5 내지 약 8.3의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 분자의 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열을 포함하는 것인, 약 6.4 내지 약 7.0의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 7.7 내지 약 22의 만노스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 분자의 각 폴리펩티드가 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열을 포함하는 것인, 약 14 내지 약 16의 만노스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 몰비는 모세관 전기영동에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 몰비는 모세관 전기영동에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 몰비는 모세관 전기영동에 의해 측정된다.
한 실시양태에서, 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 몰비는 모세관 전기영동에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, 만노스 대 CTLA4-Ig 분자의 몰비는 모세관 전기영동에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 하나 이상의 탄수화물이 분자에 효소작용에 의해 부착됨으로써 수득된다. 본 발명은 시험관내에서 효소작용에 의해 분자에 부착된 탄수화물 잔기를 포함하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (b) 약 6 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (c) 약 6 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (d) 약 6 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (e) 약 6 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 만노스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (f) 약 6 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 24 내지 약 28의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (b) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 24 내지 약 28의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (c) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 24 내지 약 28의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (d) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 24 내지 약 28의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (d) 약 6.4 내지 약 7.0의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (e) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 24 내지 약 28의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 2.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (d) 약 6.4 내지 약 7.0의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (e) 약 14 내지 약 16의 만노스 대 CTLA4-Ig 단백질의 평균 몰비; 및 (f) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 단백질의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열 2 또는 4의 위치 102에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 2 또는 4의 위치 134에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 2 또는 4의 위치 233에서의 아스파라긴 아미노산 잔기, 서열 2 또는 4의 위치 155에서의 세린 아미노산 잔기, 또는 서열 2 또는 4의 위치 165에서의 세린 아미노산 잔기에서 글리코실화되어 있는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 글리코실화 전체 부위의 약 2％ 이상이 O-연결된 글리코실화인, 글리코실화되어 있는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 약 9.6 ± 0.3의 NGNA 크로마토그램 피크 및 약 10.5 ± 0.3의 NANA 크로마토그램 피크를 나타내는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 도 68과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일을 나타내는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 도 68에 도시된 바와 같은 탄수화물 프로파일을 나타내는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 도메인 I 내지 IV의 탄수화물 프로파일을 나타내는 CTLA4-Ig 분자로 본질적으로 이루어지며, 여기서 도메인 I은 아시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 II는 모노-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 III은 디-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 IV는 트리-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 V는 테트라-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 상기 프로파일은 CTLA4-Ig로부터 방출된 올리고사카라이드의 크로마토그램인 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 도메인 I에서의 제1 피크 및 도메인 II에서의 주 피크 간의 N-연결된 올리고사카라이드의 체류 시간 차이는 약 10 내지 약 12분이다. 한 실시양태에서, 도메인 I에서의 제1 피크 및 도메인 II에서의 주 피크 간의 N-연결된 올리고사카라이드의 체류 시간 차이는 약 11 내지 약 13분이다. 한 실시양태에서, 도메인 III 및 IV의 글리코실화는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 N-연결된 글리코실화의 약 25％ 내지 약 36％를 차지한다. 한 실시양태에서, 도메인 I의 글리코실화는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 N-연결된 글리코실화의 약 24.5％ 내지 약 35.2％를 차지한다. 한 실시양태에서, 도메인 II의 글리코실화는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 N-연결된 글리코실화의 약 26.3％ 내지 약 34.1％를 차지한다. 한 실시양태에서, 도메인 III의 글리코실화는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 N-연결된 글리코실화의 약 21.9％ 내지 약 31.5％를 차지한다. 한 실시양태에서, 도메인 IV 및 도메인 V의 글리코실화는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 N-연결된 글리코실화의 약 7.9％ 내지 약 18.6％를 차지한다.
한 실시양태에서: (a) 도메인 I은 약 31％ 이상의 면적 백분율을 나타내거나; (b) 도메인 II는 약 33％ 이상의 면적 백분율을 나타내거나; (c) 도메인 III은 약 24％ 이상의 면적 백분율을 나타내거나; (iv) 도메인 IV는 약 9.4％ 이상의 면적 백분율을 나타내거나; 또는 (v) 도메인 V는 약 67％ 이상의 면적 백분율을 나타내며, 여기서 면적은 CTLA4-Ig로부터 방출된 올리고사카라이드의 크로마토그램으로부터 측정된다.
한 실시양태에서: (a) 도메인 I이 약 5개 이상의 피크를 나타내거나; (b) 도메인 II가 약 5개 이상의 피크를 나타내거나; (c) 도메인 III이 약 5개 이상의 피크를 나타내거나; (d) 도메인 IV가 약 6개 이상의 피크를 나타내거나; (e) 도메인 V가 약 6개 이상의 피크를 나타내며, 여기서 피크는 크로마토그램 상에 나타난다. 조성물에서 도메인 I은 2개 이상의 피크를 나타내고, 제1 피크는 약 4.5％의 최소 면적 및 약 11.2％의 최대 면적을 가지고, 제2 피크는 약 8.7％의 최소 면적 및 약 11.8％의 최대 면적을 갖는다.
한 실시양태에서, 도메인 III 및 IV는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 약 25％ 내지 약 36％의 면적 백분율을 나타낸다. 한 실시양태에서, 도메인 I은 HPAEC에 의해 측정하였을 때 약 24.5％ 내지 약 35.2％의 면적 백분율을 나타낸다. 한 실시양태에서, 도메인 II는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 약 26.3％ 내지 약 34.1％의 면적 백분율을 나타낸다. 한 실시양태에서, 도메인 III은 HPAEC에 의해 측정하였을 때 약 21.9％ 내지 약 31.5％의 면적 백분율을 나타낸다. 한 실시양태에서, 도메인 IV는 HPAEC에 의해 측정하였을 때 약 7.9％ 내지 약 18.6％의 면적 백분율을 나타낸다.
본 발명은 (a) 폴리펩티드의 약 80％가 2안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (b) 폴리펩티드의 약 14％가 3안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (c) 폴리펩티드의 약 6％가 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 갖는, CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, N-연결된 글리코실화는 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피-펄스형 전류 검출 (HPEAC-PAD)에 의해 측정된다. 본 발명은 (a) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (b) 약 6 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 6 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 3％ 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종 면적 백분율을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 6 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (c) 약 1.5 이하의 NGNA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 (a) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 6 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 3 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 응집체 함량; 및 (d) 도 68과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 6 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 3 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 응집체 함량; 및 (d) HPAEC에 의해 측정된, N-연결된 글리코실화의 적어도 약 29.8％ 내지 약 50.1％의 도메인 III, IV 및 V에서의 글리코실화 함량을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 6 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 3 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 분자는 추가로 약 8 내지 약 12의 NANA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 분자는 추가로 (a) 약 80％의 2안테나형 N-연결된 글리코실화; (b) 약 14％의 3안테나형 N-연결된 글리코실화; 및 (c) 약 6％의 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 분자는 (a) 서열 10의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 위치 27에서 메티오닌 및 아미노산 위치 382에서 글리신); (b) 서열 7의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 위치 27에서 메티오닌 및 아미노산 위치 383에서 리신); (c) 서열 9의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 위치 26에서 알라닌 및 아미노산 위치 382에서 글리신); 및 (d) 서열 6의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 위치 26에서 알라닌 및 아미노산 위치 383에서 리신) 중 하나 이상의 임의의 조합을 더 포함한다. 한 실시양태에서, (a) 분자의 약 90％는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 분자의 약 10％는 잔기 번호 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 분자의 약 4％는 잔기 번호 383에서 리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 분자의 약 96％는 잔기 번호 382에서 글리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 (a) 폴리펩티드의 약 80％가 2안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (b) 폴리펩티드의 약 14％가 3안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (c) 폴리펩티드의 약 6％가 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (d) NGNA 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비가 1.5 이하인, CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 폴리펩티드의 약 80％가 2안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (b) 폴리펩티드의 약 14％가 3안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (c) 폴리펩티드의 약 6％가 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (d) GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비가 약 15 내지 약 35인, CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 폴리펩티드의 약 80％가 2안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (b) 폴리펩티드의 약 14％가 3안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (c) 폴리펩티드의 약 6％가 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (d) GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비가 약 1.7 내지 약 3.6인, CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (b) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 (a) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 5 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 5 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종 함량; 및 (d) 도 68과 실질적으로 동일한 탄수화물 프로파일을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 5 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종 함량; 및 (d) HPAEC에 의해 측정된, N-연결된 글리코실화의 적어도 약 29.8％ 내지 약 50.1％의 도메인 III, IV 및 V에서의 글리코실화 함량을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 (a) 약 11 내지 약 13의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 5.5 내지 약 9.5의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; 및 (c) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 약 5 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종 함량을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 분자는 추가로 (a) 약 80％의 2안테나형 N-연결된 글리코실화; (b) 약 14％의 3안테나형 N-연결된 글리코실화; 및 (c) 약 6％의 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 분자는 (a) 서열 16의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 위치 27에서 메티오닌 및 아미노산 위치 382에서 글리신); (b) 서열 13의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 위치 27에서 메티오닌 및 아미노산 위치 383에서 리신); (c) 서열 15의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 위치 26에서 알라닌 및 아미노산 위치 382에서 글리신); 및 (d) 서열 12의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 위치 26에서 알라닌 및 아미노산 위치 383에서 리신) 중 하나 이상의 임의의 조합을 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, (a) 분자의 약 90％는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 분자의 약 10％는 잔기 번호 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (c) 분자의 약 4％는 잔기 번호 383에서 리신으로 종결되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 분자의 약 96％는 잔기 번호 382에서 글리신으로 종결되는 서열 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 (a) 폴리펩티드의 약 80％가 2안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (b) 폴리펩티드의 약 14％가 3안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (c) 폴리펩티드의 약 6％가 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (d) CTLA4-Ig 단백질 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비가 약 24 내지 약 28인, CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 폴리펩티드의 약 80％가 2안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (b) 폴리펩티드의 약 14％가 3안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (c) 폴리펩티드의 약 6％가 4안테나형 N-연결된 글리코실화를 가지고; (d) GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비가 약 2.7 내지 약 3.6인, CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 실질적으로 정제된 조성물이다. 본 발명은 CTLA4-Ig 분자의 약 2.5％ 이하가 산화된, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 분자의 약 2.0％ 이하가 탈아미드화된, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 분자의 0.5％ 이상이 시스테이닐화된, CTLA4-Ig 이량체 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 분자의 1.0％ 이상이 시스테이닐화된다. 본 발명은 도 64, 65 또는 67과 실질적으로 동일한 질량 분석 프로파일을 나타내는, CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 도 48과 실질적으로 동일한 모세관 전기영동 프로파일을 나타내는, CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 만노스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (f) 약 6 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (g) 약 2.4 ± 0.2 내지 약 5.0 + 0.2 범위의 등전 집중 겔 상의 시각화로부터 측정된 pI; (h) 3 ppm 이하의 MCP-1; (i) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.5 면적 백분율 미만의 고분자량 종; (j) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 0.5 면적 백분율 미만의 단량체; (k) 서열 5 내지 10 중 어느 것과 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 폴리펩티드; (l) CD80 및 CD86에 결합할 수 있는 CTLA4-Ig 분자를 특징으로 하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 분자의 집단이 (a) 약 15 내지 약 35의 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 만노스 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (f) 약 6 내지 약 12의 시알산 대 CTLA4-Ig 분자의 평균 몰비; (g) 약 3.4 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2 범위의 등전 집중 겔 상의 시각화로부터 측정된 pI; (h) 5 ppm 이하의 MCP-1; (i) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 2.5 면적 백분율 미만의 고분자량 종; (j) 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 0.5 면적 백분율 미만의 단량체; (k) 서열 5 내지 10 중 어느 것과 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 폴리펩티드; (l) CD80 및 CD86에 결합할 수 있는 CTLA4-Ig 분자를 특징으로 하는 것인, CTLA4-Ig 분자 또는 그의 제약 등가물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 7.4％ 이하의 면역원성의 발생률을 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역원성의 발생률은 약 2.1％ 내지 약 7.4％이다. 한 실시양태에서, 면역원성의 발생률은 3.7％ 이하이다. 한 실시양태에서, 면역원성의 발생률은 3.0％ 이하이다. 한 실시양태에서, 면역원성의 발생률은 약 2.8％ 내지 약 3.0％이다. 본 발명은 조성물을 인간에게 투여한 후에 CTLA4-Ig 분자에 결합하는 항체의 생산이 인간에서 7.4％ 이하의 발생률로 일어나는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 발생률은 약 2.1％ 내지 약 7.4％이다. 한 실시양태에서, 발생률은 3.7％ 이하이다. 한 실시양태에서, 발생률은 3.0％ 이하이다. 한 실시양태에서, 발생률은 약 2.8％ 내지 약 3.0％이다. 본 발명은 조성물을 인간에게 투여한 후에 CTLA4-Ig 분자의 CTLA4 부분에 결합하는 항체의 생산이 인간에서 4.9％ 이하의 발생률로 일어나는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 발생률은 약 0.5％ 내지 약 4.9％이다. 한 실시양태에서, 발생률은 1.2％ 이하이다. 한 실시양태에서, 발생률은 1.0％ 이하이다. 한 실시양태에서, 발생률은 약 0.9％ 내지 약 1.0％이다. 한 실시양태에서, 발생률은 효소-연결된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, 발생률은 전기화학발광 분석법 (ECL)에 의해 측정된다.
본 발명은 조성물을 인간에게 투여한 후에 CTLA4-Ig 분자를 중화시키는 항체의 생산이 CTLA4-Ig 분자의 CTLA4 부분에 결합되는 항체를 갖는 인간의 75％ 이하의 발생률로 일어나는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 단리된 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 발생률은 40 내지 75％이다. 한 실시양태에서, 발생률은 40％ 이하이다. 한 실시양태에서, 발생률은 세포-기반 루시퍼라제 리포터 분석법에 의해 측정된다.
본 발명은 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 액체 배양물이 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 약 6.0 몰 이상의 NANA를 나타내는 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 방법은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 액체 배양물이 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 약 5.2 내지 약 7.6 몰의 시알산을 나타내는 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 방법은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물이 mL 당 33 x 105 내지 약 79 x 105개 세포의 세포 밀도를 갖는 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 38％ 이상인 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 37％ 이상인 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 방법은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 내독소가 액체 배양물 mL 당 약 76.8 EU 이하인 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 방법은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 내독소가 액체 배양물 mL 당 약 4.8 EU 이하인 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 바이오버든이 액체 배양물 mL 당 1 콜로니 형성 단위 미만인 경우에만 수행되는 것인 단계를 포함하는, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 하기 조건: (i) 액체 배양물이 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 약 6.0 몰 이상의 NANA를 함유하는 조건, (ii) 액체 배양물이 mL 당 33 x 105 내지 약 79 x 105개 세포의 세포 밀도를 갖는 조건, (iii) 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 38％ 이상인 조건, 또는 (iv) CTLA4-Ig 단백질의 수율이 액체 배양물 리터 당 CTLA4-Ig 단백질 약 0.5 그램 초과인 조건 중 2개 이상이 부합되는 경우에만 수행되는 것인 단계를 포함하며, 여기서 (i)에서의 NANA 농도 및 (iv)에서 수율은 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정되는 것인, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정된 바 CTLA4-Ig 단백질이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질의 수율로 생산될 때까지, CTLA4-Ig 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) CTLA4-Ig 단백질을 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 단리하며, 여기서 단리는 여기서 단리는 하기 조건: (i) 액체 배양물이 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 약 5.2 내지 약 7.6 몰의 시알산을 함유하는 조건, (ii) 액체 배양물 중에서의 세포 생존도가 약 37％ 이상인 조건, 또는 (iii) CTLA4-Ig 단백질의의 수율이 액체 배양물 리터 당 약 0.5 그램 초과의 CTLA4-Ig 단백질인 조건 중 2개 이상이 부합되는 경우에 수행되는 것인 단계를 포함하며, 여기서 (i)에서의 시알산 함량 및 (iii)에서 수율은 액체 배양물의 분취액의 평가에 의해 측정되는 것인, CTLA4-Ig 단백질의 생산 방법을 제공한다.
서열:
서열 1 [CTLA4-Ig 뉴클레오티드 서열, 도 1 참조]
서열 2 [CTLA4-Ig 아미노산 서열, 도 1 참조]
서열 3 [CTLA4A29YL104E-Ig 뉴클레오티드 서열은 도 2에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 79 내지 1149를 포함한다]
서열 23은 도 2에 나타낸 전체 뉴클레오티드 서열이다. 이 뉴클레오티드 서열은 프로서열에 대한 코딩 서열을 포함한다.
서열 4 [CTLA4A29YL104E-Ig 아미노산 서열, 도 3, 프로서열 없음]
서열 5 [서열 2의 아미노산 25 내지 383]
Figure 112011097388832-pat00011
서열 6 [서열 2의 아미노산 26 내지 383]
Figure 112011097388832-pat00012
서열 7 [서열 2의 아미노산 27 내지 383]
Figure 112011097388832-pat00013
서열 8 [서열 2의 아미노산 25 내지 382]
Figure 112011097388832-pat00014
서열 9 [서열 2의 아미노산 26 내지 382]
Figure 112011097388832-pat00015
서열 10 [서열 2의 아미노산 27 내지 382]
Figure 112011097388832-pat00016
서열 11 [서열 4의 아미노산 25 내지 383]
Figure 112011097388832-pat00017
서열 12 [서열 4의 아미노산 26 내지 383]
Figure 112011097388832-pat00018
서열 13 [서열 4의 아미노산 27 내지 383]
서열 14 [서열 4의 아미노산 25 내지 382]
Figure 112011097388832-pat00020
서열 15 [서열 4의 아미노산 26 내지 382]
Figure 112011097388832-pat00021
서열 16 [서열 4의 아미노산 27 내지 382]
Figure 112011097388832-pat00022
서열 17
서열 18 [CTLA4 세포외 도메인 서열]
Figure 112013088754718-pat00448
서열 19
Figure 112011097388832-pat00024
CTLA4-Ig 단량체 및 다량체
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1 (도 1a)을 포함하는 발현 카셋트를 갖는 세포주를 제공한다. 이러한 발현 카셋트는 CHO 세포를 비롯한 포유동물 세포에서 발현될 때, 발현 카셋트로부터 생성된 단백질이 하기 잔기의 아미노산 서열을 가질 수 있도록 N- 및 C-말단 변이체를 생성시킬 수 있다: (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382; (iii) 서열 2의 27 내지 383, 또는 (iv) 서열 2의 27 내지 382, 또는 임의로 (v) 서열 2의 25 내지 382, 또는 (vi) 서열 2의 25 내지 383 (도 1a). 이들 단백질은 본원에서 "서열 2 단량체" 또는 "서열 2의 서열을 갖는" 단량체로서 지칭될 수 있다. 이들 서열 2 단량체는 이량체 조합이, 예를 들어 하기를 포함할 수 있도록 이량체화될 수 있다: (i) 및 (i); (i) 및 (ii); (i) 및 (iii); (i) 및 (iv); (i) 및 (v); (i) 및 (vi); (ii) 및 (ii); (ii) 및 (iii); (ii) 및 (iv); (ii) 및 (v); (ii) 및 (vi); (iii) 및 (iii); (iii) 및 (iv); (iii) 및 (v); (iii) 및 (vi); (iv) 및 (iv); (iv) 및 (v); (iv) 및 (vi); (v) 및 (v); (v) 및 (vi); 및 (vi) 및 (vi). 이들 상이한 이량체 조합은 또한 서로 회합하여 사량체 CTLA4-Ig 분자를 형성할 수도 있다. 이들 단량체, 이량체, 사량체 및 다른 다량체는 본원에서 "서열 2 단백질" 또는 "서열 2의 서열을 갖는" 단백질로서 지칭될 수 있다. 세포주는 이들 변이체를 번역 즉시 생성할 수 있지만, 변이체는 보다 전형적으로는 세포 내 번역 작용 후의 생성물일 수 있다. 세포주는 또한 CTLA4-Ig 분자를 분비한다. 아바타셉트는 서열 2 단백질을 의미한다.
CTLA4-Ig 분자는, 예를 들어 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 또는 다른 다량체 형태의 CTLA4-Ig 단백질을 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는 하나 이상의 CTLA4의 세포외 도메인 및 면역글로불린 불변 영역과의 단백질 융합체를 포함할 수 있다. CTLA4-Ig 분자는, 예를 들어 CTLA4 세포외 도메인 및 면역글로불린 불변 영역 서열과 관련하여, 야생형 또는 돌연변이형 서열을 가질 수 있다. CTLA4-Ig 단량체 단독, 또는 이량체, 사량체 또는 다른 다량체 형태는 글리코실화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 적어도 특정 백분율의 이량체 또는 다른 다량체 분자를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체가 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 99.5％ 초과인 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 95％ 내지 약 99.5％의 CTLA4-Ig 이량체 및 약 0.5％ 내지 약 5％의 CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 집단은 약 98 ％ CTLA4-Ig 이량체, 약 1.5％ CTLA4-Ig 사량체 및 약 0.5％ CTLA4-Ig 단량체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 집단이 CTLA4-Ig 단량체 분자를 실질적으로 함유하지 않는 것인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. CTLA4-Ig 단량체 분자를 실질적으로 함유하지 않는다는 것은 1％, 0.5％, 또는 0.1％ 미만의 단량체를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 의미할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 집단이 이량체보다 큰 CTLA4-Ig 다량체, 예컨대 사량체, 육량체 등 (예컨대, 고분자량 종)을 실질적으로 함유하지 않는 것인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 이량체보다 큰 CTLA4-Ig 다량체 분자를 실질적으로 함유하지 않는다는 것은 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％, 또는 0.1％ 미만의 이량체보다 큰 CTLA4-Ig 다량체 (예컨대, 고분자량 종)를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 의미할 수 있다.
CTLA4-Ig 단량체 분자는, 예를 들어 하기의 아미노산 서열을 가질 수 있다: (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, 또는 (iv) 서열 2의 27 내지 382, 또는 임의로 (v) 서열 2의 25 내지 382, 또는 (vi) 서열 2의 25 내지 383. 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 발현 카셋트가 CHO 세포 내에서 발현될 때, 발현되는 우세한 단량체 형태는 메티오닌의 N-말단 아미노산 잔기 (서열 2의 잔기 27)를 갖고, 이는 야생형 인간 CTLA4의 N-말단 아미노산 잔기에 해당한다. 그러나, 서열 1은 또한 온코스타틴 M 신호 서열 (서열 1의 뉴클레오티드 11 내지 88)에 대한 코딩 서열을 포함하기 때문에, 서열 1로부터의 발현 단백질은 온코스타틴 M 신호 서열을 함유한다. 신호 서열은 세포질로부터의 단백질 방출 또는 세포의 분비 과정 동안 발현 단백질로부터 절단된다. 그러나, 절단은 서열 2의 아미노산 잔기 26과 27 사이의 절단 (잔기 27의 N-말단을 생성함)에 대립하는 것으로서의, 서열 2의 아미노산 잔기 25와 26 사이의 절단 (잔기 26의 N-말단을 생성함, 즉 "Ala 변이체") 또는 서열 2의 아미노산 잔기 24와 25 사이의 절단 (잔기 25의 N-말단을 생성함, 즉 "Met-Ala 변이체")과 같이 N-말단 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, Met-Ala 변이체는 CTLA4-Ig 분자의 혼합물 중에 약 1％로 존재할 수 있고, Ala 변이체는 CTLA4-Ig 분자의 혼합물 중에 약 8-10％로 존재할 수 있다. 또한, 서열 1로부터의 발현 단백질은 불완전 프로세싱으로 인해 C-말단 변이체를 가질 수 있다. 우세한 C-말단은 서열 2의 잔기 382에서의 글리신이다. CTLA4-Ig 분자의 혼합물 중에, C-말단에 리신 (서열 2의 잔기 383)를 갖는 단량체는, 예를 들어 약 4-5％로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 하기와 같은 서열 5의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 25 내지 383과 동일한 것)을 갖는다.
[서열 5]
Figure 112011097388832-pat00025
또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 하기와 같은 서열 6의 아미노산 서열 (서열 2의 서열 2의 26 내지 383과 동일한 것)을 갖는다.
[서열 6]
Figure 112011097388832-pat00026
또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 하기와 같은 서열 7의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 27 내지 383과 동일한 것)을 갖는다.
[서열 7]
Figure 112011097388832-pat00027
또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 하기와 같은 서열 8의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 25 내지 382와 동일한 것)을 갖는다.
[서열 8]
Figure 112011097388832-pat00028
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 하기와 같은 서열 9의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 26 내지 382와 동일한 것)을 갖는다.
[서열 9]
Figure 112011097388832-pat00029
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 하기와 같은 서열 10의 아미노산 서열 (서열 2의 아미노산 27 내지 382와 동일한 것)을 갖는다.
[서열 10]
Figure 112011097388832-pat00030
CTLA4-Ig 단량체 분자는 인간 CTLA4의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 2의 아미노산 27 내지 151을 코딩하는 서열 1의 뉴클레오티드 89 내지 463인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 인간 CTLA4의 돌연변이형 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 보존성 아미노산 변화가 일어나도록 서열 1의 뉴클레오티드 89 내지 463에 대한 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 1의 뉴클레오티드 89 내지 463과 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 일치하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
CTLA4-Ig 단량체 분자는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이 불변 영역은 불변 영역의 일부일 수 있고; 이 불변 영역은 야생형 또는 돌연변이형 서열을 가질 수 있다. 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE로부터 유래할 수 있다. 불변 영역은 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄로부터 유래할 수 있다. 불변 영역이 IgG, IgD 또는 IgA 분자로부터 유래한 경우, 상기 불변 영역은 하나 이상의 하기 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다: CL, CH1, 힌지, CH2 또는 CH3. 불변 영역이 IgM 또는 IgE로부터 유래한 경우, 상기 불변 영역은 하나 이상의 하기 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다: CL, CH1, CH2, CH3 또는 CH4. 한 실시양태에서, 불변 영역은 IgG, IgD, IgA, IgM 또는 IgE로부터 유래한 하나 이상의 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 이량체는 2개의 단량체로 구성되는데, 여기서 각 단량체는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있고, 여기서 서열은 하기 아미노산 서열일 수 있다: (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 2의 25 내지 383. 이러한 CTLA4-Ig 단량체는 서열 2의 위치 146에서의 시스테인 아미노산 잔기를 거쳐 인간 CTLA4 서열의 세포외 도메인을 통하여 이량체화될 수 있다.
CTLA4-Ig 분자는 IgM 또는 IgA 불변 영역 도메인과 J 쇄 단백질과의 상호작용을 통해 다량체화될 수 있다. IgM 및 IgA는 통상적으로 추가의 폴리펩티드 쇄, J 쇄와 회합하여 다량체로서 생성된다. 오량체성 IgM에서, 단량체는 CH3 도메인에서 서로에 및 CH4 도메인을 통해 J 쇄에 디술피드 결합에 의해 가교될 수 있다. IgM은 또한 다량체화가 각각에의 디술피드 결합을 통해 달성된 J 쇄가 결여된 육량체를 형성할 수 있다. 이량체성 IgA에서, 단량체는 각각에 대해서는 아니고 그들의 CH3 도메인을 통한 J 쇄에의 디술피드 결합을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 이량체, 오량체, 및 육량체를 비롯한 CTLA4-Ig 다량체를 제공하며, 여기서 Ig 부분은 IgM 불변 영역 또는 그의 부분 또는 IgA 불변 영역 또는 그의 부분을 포함한다. 상기 IgM 또는 IgA를 기초로 하는 CTLA4-Ig 다량체는 J 쇄를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자 (CTLA4 진뱅크 수탁 번호 I13253)는 변형된 인간 IgG1 힌지 영역 (서열 1의 뉴클레오티드 464-508; 서열 2의 아미노산 152-166)을 포함하며, 여기서 서열 2의 아미노산 잔기 156, 162, 및 165에서의 세린은 야생형 서열에 존재하는 시스테인으로부터 조작되었다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 단량체 분자는 변형된 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 CH3 영역 (서열 1의 뉴클레오티드 509-838 및 서열 2의 아미노산 167-276을 갖는 변형된 인간 IgG1 CH2 도메인; 서열 1의 뉴클레오티드 839-1159 및 서열 2의 아미노산 277-383을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 집단은 공개 번호 US 2002/0182211 A1로서 공개된 U.S. 특허 출원의 도 7, 8, 또는 9 중 임의의 하나 이상 및 공개 번호 US20030083246 및 US20040022787로서 공개된 U.S. 특허 출원 (상기 특허 출원 각각은 전문이 참고로 본원에 포함되어 있음)에서 도시된 서열을 갖는 단량체를 포함한다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 사량체 분자는 CTLA4-Ig 폴리펩티드의 2쌍 또는 2개의 이량체를 포함하며, 여기서 각 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 가진다: (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 2의 25 내지 383. 폴리펩티드 쌍의 각 일원 또는 이량체는 각각의 일원에 공유적으로 연결되어 있고, 2쌍의 폴리펩티드는 사량체를 형성함으로써 서로와 비-공유적으로 회합되어 있다. 상기 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 대한 CTLA4-Ig 이량체 (이들의 단량체는 상기 아미노산 서열 중 하나를 가짐)의 결합 친화성 또는 결합활성보다 2배 이상 더 높은 결합활성으로 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 대한 야생형 CTLA4의 결합 친화성 또는 결합활성보다 2배 이상 더 높은 결합활성으로 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 이러한 보다 높은 결합활성은 면역 장애 및 하기한 다른 질환의 치료에서, 뿐만 아니라 조직 및/또는 고형 기관 이식 거부반응의 억제에서 보다 높은 효능을 부여할 수 있다. 또한, 보다 높거나 또는 향상된 결합활성은 약물의 보다 높은 효능의 결과를 낳을 수 있다. 예를 들어, CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 치료 조성물은 동일한 양의 CTLA4-Ig 단량체를 갖는 치료 조성물보다 높은 결합활성을 가지며, 따라서 보다 높은 효능을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 (이들의 단량체는 상기 아미노산 서열 중 하나를 가짐)와 비교하여 T 세포 증식에 대해 2배 이상 더 높은 억제율을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사량체 분자는 야생형 CTLA4 분자와 비교하여 T 세포 증식에 대해 2배 이상 더 높은 억제율을 가질 수 있다.
CTLA4 A29YL104E -Ig 단량체, 이량체, 및 다량체
CTLA4A29YL104E-Ig는 CTLA4-Ig의 변형된 형태이다 (도 1a; 서열 1-2). 변형은 도 2에 도시된 바와 같은 2종의 아미노산 치환 (L104E 및 A29Y) (도 3에서의 아미노산 위치 55 및 130에 상응함; 서열 4)을 초래하는 점 돌연변이로 이루어진다. CTLA4-Ig에 비해, CTLA4A29YL104E-Ig (예를 들어, 서열 5-10)은 대략 2배의 증가된 결합활성으로 CD80 (B7-1)에 결합하고, 대략 4배의 증가된 결합활성으로 CD86 (B7-2)에 결합한다. CTLA4A29YL104E-Ig는 T 세포 증식, 사이토킨 생산, 및 천연 킬러 세포에 의한 표적 세포의 CD28-의존성 사멸을 억제하는 데 있어서 CTLA4-Ig보다 대략 10배 더 효과적이다. CTLA4A29YL104E-Ig는 B7-1 매개된 T 세포 증식을 적당히 억제하지만, B7-2 매개된 T 세포 증식을 차단하는 데 있어서는 CTLA4-Ig보다 현저하게 보다 더 효능적이다. 증가된 효능은 B7-2를 단독으로 차단하거나 또는 B7-1 및 B7-2를 둘 다 차단하든지 간에 유사하며, 이는 CTLA4A29YL104E-Ig의 증진된 면역조절 활성이 B7-2를 차단하는 데 있어서의 증진된 효능에 기인하는 것으로 추측됨을 제시한다.
CTLA4A29YL104E-Ig는 유전자 조작된 융합 단백질이며, 이는 변형된 인간 CTLA-4의 기능성 결합 도메인 및 IgG1 부류의 인간 면역글로불린의 Fc 도메인으로 이루어진다 (도 3A-B). CTLA-4 도메인의 B7 결합 영역 내에 2종의 아미노산 치환이 만들어져 (L104E 및 A29Y) CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 생성한다. CTLA4A29YL104E-Ig 이량체는 2개의 글리코실화 CTLA4A29YL104E-Ig 쇄로 구성된다. 이는 쇄간 디술피드 결합을 통해 연결된 공유 이량체로서 존재한다. CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 분자 모델은 도 4에 제시되어 있다. CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 매트릭스-보조 레이저 탈착 비행시간형 (MALDI-TOF) 질량 분석에 의해 측정된 대략 91,800 Da의 평균 질량을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 3을 포함하는 발현 카셋트를 갖는 세포주를 제공한다. 상기 발현 카셋트는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 발현될 때, N- 및 C-말단 변이체의 생산을 초래하여, 발현 카셋트로부터 생산된 폴리펩티드는 잔기: (i) 서열 4의 26-383, (ii) 서열 4의 26-382; (iii) 서열 4의 27- 383, 또는 (iv) 서열 4의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열 4의 25-382, 또는 (vi) 서열 4의 25-383의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이들 폴리펩티드는 "서열 4 단량체," 또는 "서열 4 서열을 갖는" 단량체로서 지칭될 수 있다.
이들 서열 4 단량체는 이량체화되어, 이량체 조합물은, 예를 들어: (i) 및 (i); (i) 및 (ii); (i) 및 (iii); (i) 및 (iv); (i) 및 (v); (i) 및 (vi); (ii) 및 (ii); (ii) 및 (iii); (ii) 및 (iv); (ii) 및 (v); (ii) 및 (vi); (iii) 및 (iii); (iii) 및 (iv); (iii) 및 (v); (iii) 및 (vi); (iv) 및 (iv); (iv) 및 (v); (iv) 및 (vi); (v) 및 (v); (v) 및 (vi); 및, (vi) 및 (vi)를 포함할 수 있다. 이들 상이한 이량체 조합물은 또한 서로 회합하여 사량체 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 형성할 수 있다. 이들 단량체, 이량체, 사량체, 및 다른 다량체는 본원에서 "서열 4 폴리펩티드" 또는 "서열 4 서열을 갖는" 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 세포주는 번역시 이들 변이체를 즉시 생산할 수 있는 한편, 변이체는 보다 전형적으로 세포 내에서 번역후 작용의 생성물일 수 있다. 이량체는 함께 공유적으로 연결되거나, 함께 비-공유적으로 연결되거나, 상기 두 방식으로 연결될 수 있다. 본 발명은 함께 공유적으로 결합된 이량체로 본질적으로 이루어진 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 50％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체가 공유적으로 연결된 단량체로 구성된 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 CTLA4-Ig 이량체가 공유적으로 연결된 단량체로 구성된 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 분자가 우세하게 이량체 형태로 존재하고, 이량체가 우세하게 공유 연결에 의해 형성된 것인 CTLA4-Ig 분자의 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 대부분의 CTAL4-Ig 이량체가 공유적으로 연결된 것인 조성물을 제공한다. 조성물 중의 CTLA4-Ig 이량체의 일부 분획물이 비-공유적으로 연결되는 것은 가능하다.
CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 예를 들어, 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 또는 다른 다량체 형태의 CTLA4A29YL104E-Ig를 포함할 수 있다. CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 변형된 CTLA4의 하나 이상의 세포외 도메인 (서열 18) 및 면역글로불린 불변 영역과의 단백질 융합을 포함할 수 있다. CTLA4A29YL104E-Ig 분자는, 예를 들어, 변형된 CTLA4 세포외 도메인 및 면역글로불린 불변 영역 서열과 관련된 돌연변이형 서열을 가질 수 있다. CTLA4A29YL104E-Ig 단량체는 단독으로, 또는 이량체, 사량체 또는 다른 다량체 형태로 글리코실화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 특정 백분율 이상의 이량체 또는 다른 다량체 분자를 가지는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체가 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 99.5％를 초과하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 95％ 내지 약 99.5％의 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 및 약 0.5％ 내지 약 5％의 CTLA4A29YL104E-Ig 사량체를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 약 95％ 내지 약 99.5％의 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체, 0.5％ 내지 약 2.5％의 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체 및 약 0.5％ 내지 약 5％의 CTLA4A29YL104E-Ig 사량체를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단은 약 96％의 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체, 약 2.5％의 CTLA4A29YL104E-Ig 사량체, 및 약 0.5％의 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체를 실질적으로 함유하지 않는, CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. CTLA4A29YL104E-Ig 단량체를 실질적으로 함유하지 않는다는 것은 1％, 0.5％, 또는 0.1％ 미만의 단량체를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 지칭할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 이량체보다 큰 CTLA4A29YL104E-Ig 다량체, 예컨대 사량체, 육량체 등을 실질적으로 함유하지 않는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 이량체보다 큰 CTLA4A29YL104E-Ig 다량체를 함유하지 않는다는 것은 이량체보다 큰 CTLA4A29YL104E-Ig 다량체를 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％, 또는 0.1％ 미만으로 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 지칭할 수 있다.
CTLA4A29YL104E-Ig 단량체는, 예를 들어, (i) 서열 4의 26-383, (ii) 서열 4의 26-382, (iii) 서열 4의 27-383, 또는 (iv) 서열 4의 27-382, 또는 임의로 (v) 서열 4의 25-382, 또는 (vi) 서열 4의 25-383의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 서열 3 또는 23의 핵산 서열을 포함하는 발현 카셋트가 CHO 세포 내에서 발현될 때, 발현된 우세한 단량체 형태는 인간 CTLA4의 N-말단 아미노산 잔기에 상응하는 메티오닌의 N-말단 아미노산 잔기 (서열 4의 잔기 27)를 갖는다. 그러나, 서열 23은 또한 온코스타틴 M 신호 서열에 대한 코딩 서열 (서열 23의 뉴클레오티드 11-88)을 포함하기 때문에, 서열 23으로부터의 발현된 단백질은 온코스타틴 M 신호 서열을 함유한다.
신호 서열은 세포질로부터의 단백질 방출, 또는 세포의 분비의 과정 동안 발현된 단백질로부터 절단된다. 그러나, 절단은 N-말단 변이체를 생성시킬 수 있으며, 예컨대 (아미노산 위치 27에서 Met 잔기로 개시하는 N-말단을 생성하는) 서열 4의 아미노산 잔기 26 및 27 사이의 절단에 대립하는 것으로서의, (잔기 26의 N-말단, 즉 "Ala 변이체"를 생성하는) 서열 4의 아미노산 잔기 25 및 26 사이의 절단, 또는 (잔기 25의 N-말단, 즉 "Met-Ala 변이체"를 생성하는) 서열 4의 아미노산 잔기 24 및 25 사이의 절단이 있다. 예를 들어, Met-Ala 변이체는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 혼합물 중에 약 1％ 존재할 수 있고, Ala 변이체는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 혼합물 중에 약 10-20％ 존재할 수 있다.
또한, 서열 3을 포함하는 핵산으로부터 발현된 단백질은 불완전한 프로세싱으로 인한 C-말단 변이체를 가질 수 있다. 우세한 C-말단은 서열 4의 잔기 382에서의 글리신이다. CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 혼합물에서, C-말단에 리신을 갖는 단량체 (서열 4의 잔기 383)는 예를 들어, 약 4-8％로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 하기와 같은 서열 11의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 25 내지 383과 동일한 것)을 포함한다:
[서열 11]
Figure 112011097388832-pat00031
또 다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 하기와 같은 서열 12의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 26 내지 383과 동일한 것)을 포함한다:
[서열 12]
Figure 112011097388832-pat00032
추가의 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 하기와 같은 서열 13의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 27 내지 383과 동일한 것)을 포함한다:
[서열 13]
Figure 112011097388832-pat00033
또 다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 하기와 같은 서열 14의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 25 내지 382와 동일한 것)을 포함한다:
[서열 14]
Figure 112011097388832-pat00034
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 하기와 같은 서열 15의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 26 내지 382와 동일한 것)을 갖는다:
[서열 15]
Figure 112011097388832-pat00035
추가의 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 하기와 같은 서열 16의 아미노산 서열 (서열 4의 아미노산 27 내지 382와 동일한 것)을 포함한다:
[서열 16]
Figure 112011097388832-pat00036
CTLA4A29YL104E-Ig 단량체는 인간 CTLA4의 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 2종의 아미노산 치환은 CTLA-4 도메인 (L104E 및 A29Y) (도 5)에서 이루어진다. 한 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 4의 아미노산 27-151를 코딩하는 서열 23의 뉴클레오티드 89-463의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 인간 CTLA4의 돌연변이형 서열 (예컨대 서열 4의 아미노산 27-151에서의 단일, 이중, 및 삼중 부위 돌연변이체)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 23의 뉴클레오티드 89-463에 대한 뉴클레오티드 변화를 포함하여 보존성 아미노산 변화가 일어나도록 할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 23의 뉴클레오티드 89-463에 대한 뉴클레오티드 변화를 포함하여 비보존성 아미노산 변화가 일어나도록 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열 23의 뉴클레오티드 89-463과 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
CTLA4A29YL104E-Ig 단량체는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이러한 불변 영역은 불변 영역의 부분일 수 있다. 이러한 불변 영역은 또한 야생형 또는 돌연변이형 서열을 가질 수 있다. 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE 유래일 수 있다. 불변 영역은 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄일 수 있다. 불변 영역이 IgG, IgD, 또는 IgA 분자 유래일 경우에, 불변 영역은 하나 이상의 하기 불변 영역 도메인: CL, CH1, 힌지, CH2, 또는 CH3을 포함할 수 있다. 불변 영역은 IgM 또는 IgE 유래일 수 있고, 불변 영역은 하나 이상의 하기 불변 영역 도메인: CL, CH1, CH2, CH3, 또는 CH4를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 불변 영역은 IgG. IgD, IgA, IgM 또는 IgE 유래의 하나 이상의 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 이량체는 2개의 단량체로 구성되며, 여기서 각 단량체는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 서열은 (i) 서열 4의 26-383, (ii) 서열 4의 26-382, (iii) 서열 4의 27-383, (iv) 서열 4의 27-382, (v) 서열 4의 25-382, 및 (vi) 서열 4의 25-383의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체는 서열 4의 위치 146에서의 시스테인 아미노산 잔기 (또는 도 5의 위치 120에서의 시스테인 아미노산 잔기)에 의해 인간 CTLA4 서열의 세포외 도메인을 통해 이량체화할 수 있다.
CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 IgM 또는 IgA 불변 영역 도메인과 J 쇄 단백질과의 상호작용을 통해 다량체화할 수 있다. IgM 및 IgA는 통상적으로 추가의 폴리펩티드 쇄, J 쇄와 회합하여 다량체로서 생성된다. 오량체성 IgM에서, 단량체는 CH3 도메인에서 서로에 및 CH4 도메인을 통해 J 쇄에 디술피드 결합에 의해 가교될 수 있다. IgM은 또한 다량체화가 각각에의 디술피드 결합을 통해 달성된 J 쇄가 결여된 육량체를 형성한다. 이량체성 IgA에서, 단량체는 각각에 대해서는 아니고 그들의 CH3 도메인을 통한 J 쇄에의 디술피드 결합을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 이량체, 오량체, 및 육량체를 비롯한 CTLA4A29YL104E-Ig 다량체를 제공하며, 여기서 Ig 부분은 IgM 불변 영역 또는 그의 부분 또는 IgA 불변 영역 또는 그의 부분을 포함한다. 상기 IgM 또는 IgA를 기초로 하는 CTLA4-Ig 다량체는 J 쇄를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 단량체는 변형된 인간 IgG1 힌지 영역 (서열 23의 뉴클레오티드 464-508; 서열 4의 아미노산 152-166)을 포함하며, 여기서 서열 4의 위치 156, 162, 및 165에서의 세린 잔기는 야생형 서열에 존재하는 시스테인 잔기로부터 조작되었다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 단량체는 변형된 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 CH3 영역 (서열 1의 뉴클레오티드 509-838 및 서열 2의 아미노산 167-276을 갖는 변형된 인간 IgG1 CH2 도메인; 서열 1의 뉴클레오티드 839-1159 및 서열 2의 아미노산 277-383을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단은 본원에 참고로 전문이 포함된 U.S. 특허 출원 공개 번호 U.S. 2002/0039577, U.S. 2003/0007968, U.S. 2004/0022787, U.S. 2005/0019859 및 U.S. 2005/0084933, 및 미국 특허 제7,094,874에 제시된 서열을 갖는 단량체를 포함한다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 사량체는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 2쌍 또는 2개의 이량체를 포함하며, 여기서 각 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 가진다: (i) 서열 4의 26 내지 383, (ii) 서열 4의 26 내지 382, (iii) 서열 4의 27 내지 383, (iv) 서열 4의 27 내지 382, (v) 서열 4의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 4의 25 내지 383. 폴리펩티드 쌍의 각 일원 또는 이량체는 각각의 일원에 공유적으로 연결되어 있고, 2쌍의 폴리펩티드는 사량체를 형성함으로써 서로와 비-공유적으로 회합되어 있다. 상기 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 대한 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 (이들의 단량체는 상기 아미노산 서열 중 하나를 가짐)의 결합활성보다 2배 이상 더 높은 결합활성으로 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다.
이러한 보다 높은 결합활성은 면역 장애 및 하기한 다른 질환의 치료에서, 뿐만 아니라 조직 및/또는 고형 기관 이식 거부반응의 억제에서 보다 높은 효능을 부여할 수 있다. 또한, 보다 높거나 또는 향상된 결합활성은 약물의 보다 높은 효능의 결과를 낳을 수 있다. 예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 사량체를 포함하는 치료 조성물은 동일한 양의 CTLA4-Ig 단량체를 갖는 치료 조성물보다 높은 결합활성을 가지며, 따라서 보다 높은 효능을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 (이들의 단량체는 상기 아미노산 서열 중 하나를 가짐)와 비교하여 T 세포 증식에 대해 2배 이상 더 높은 억제율을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 사량체 분자는 CTLA4 사량체 분자와 비교하여 T 세포 증식에 대해 2배 이상 더 높은 억제율을 가질 수 있다.
CTLA4-Ig 및 CTLA4 A29YL104E -Ig 분자의 특성화
T 세포 증식은 당업계에 공지된 표준 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식을 평가하는 가장 흔한 방법 중 하나는, TCR에 대한 항원 또는 효능제적 항체를 통해 T 세포를 자극하는 것, 및 예를 들어 증식 중인 T 세포에 삼중수소화 티미딘 (3H-TdR)의 혼입을 측정하거나, 또는 T 세포 증식에 의해 배양물에 방출된 사이토킨의 양을 측정하는 것이다. 그에 따라서, T 세포 활성화 또는 증식에 대한 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 억제 효과는 측정될 수 있다.
CTLA4-Ig 분자의 친화성은 단일 리간드 (CD80, CD86, 또는 CD80Ig 또는 CD86Ig 융합 단백질 포함)에 대한 분자의 결합 강도이다. 리간드에 대한 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 친화성은, 예를 들어 표면 플라즈몬 기술 기반의 결합 상호작용 분석 (BIA)을 이용함으로써 측정될 수 있다. 이는 결합 강도를 측정하는 것 이외에, 결합 역학 (예컨대, 결합 및 해리 속도 상수)의 실시간 측정을 가능케 한다. 얇은 금속 필름 (표면 매트릭스가 이에 공유결합 부착됨)이 코팅된 유리 슬라이드로 이루어진 센서 칩은 반응물 (즉, CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig) 중 하나, 또는 리간드 중 하나로 코팅되어 있다. 다른 반응물을 함유하는 용액을 그 표면 상에 유동시킨다. 연속적인 광선이 표면의 다른 면을 향하게 하고, 그 반사 각도를 측정한다. 리간드에 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig가 결합할 때 광선의 공명 각도가 변화한다 (센서의 반응성 면에 가까운 매질의 굴절률에 따라 달라지며, 또한 매질 중 용해된 물질의 농도에 정비례함). 이는 후속적으로 컴퓨터를 사용하여 분석한다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 결합 실험은 비아코어 기기(BIAcore instrument) (스웨덴 웁살라 소재 비아코어 아게(BIAcore AG) 제품) 상에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 수행될 수 있다. CTLA4-Ig는 1차 아민기에 의해 비아코어 센서 칩 상의 카르복시메틸화 덱스트란 매트릭스에 공유결합 연결되어, 센서 칩에 CTLA4-Ig를 고정시킬 수 있다. 별법으로, 항-불변 영역 항체를 사용하여 CTLA4-Ig를 Ig 단편을 통해 간접적으로 센서 표면에 고정할 수 있다. 그 후, 리간드를 칩에 첨가하여, 리간드에 대한 CTLA4-Ig 결합을 측정한다. 친화성 측정은, 예를 들어 문헌 [van der Merwe, P. et al., J. Exp. Med. (1997) 185 (3):393-404] (전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 대로 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 결합 실험은 상기 기재된 대로 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 이용하여 수행될 수 있다 (도 6; 실시예 21 참고).
또한, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 결합활성을 측정할 수 있다. 결합활성은 다수의 부위에서 두 분자 또는 세포의 서로에 대한 결합 강도의 총 합으로 정의될 수 있다. 결합활성은 분자 상 한 부위에서 그의 리간드에 대한 결합 강도인 친화성과 구별된다. 이론에 구애되지 않고, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 결합활성이 높을수록 T-세포 증식 및 활성화에 대한 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 억제 효능이 증가될 수 있다. 예를 들어, 두 부류의 고체 상 분석 [a) 경쟁적 억제 분석 및 b) 용출 분석]에 의해 결합활성을 측정할 수 있다. 둘 모두에서, 리간드는 고체 지지체에 결합된다. 경쟁적 억제 분석에서는, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자가 다른 농도의 유리 리간드와 함께 고정 농도로 용액에 첨가되고, 고체 상 결합을 50％ 억제하는 리간드의 양이 측정된다. 리간드가 덜 요구될수록, 결합활성이 더 강하다. 용출 분석에서는, 리간드가 용액에 첨가된다. 평형 상태를 획득한 후, 카오트로프(chaotrope) 또는 변성제 (예를 들어, 이소티오시아네이트, 우레아 또는 디에틸아민)을 다양한 농도로 첨가하여 CTLA4-Ig/리간드 상호작용 또는 CTLA4A29YL104E-Ig/리간드 상호작용을 교란시킨다. 이후, 용출에 저항하는 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 양을 ELISA로 측정한다. 결합활성이 높을수록, 특정량의 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 용출시키는데 더 많은 카오트로픽제가 요구된다. CTLA4-Ig 분자 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 이종성 혼합물의 상대적인 결합활성은 결합활성 지수 (AI) (결합된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 50％를 용출하기 위해 요구되는 용출제의 농도와 동일)로 나타낼 수 있다. 용출제의 다양한 농도에서 용출된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 백분율을 측정함으로써 데이타의 정밀한 분석을 수행할 수 있다.
페닐 세파로스 4 패스트 플로우(Phenyl Sepharose 4 Fast Flow) 칼럼 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 방법을 사용하여, HIC 정제 단계에서 용출되는 CTLA4-Ig 고분자량 종의 양을 감소시킬 수 있다 (실시예 15 참고). 따라서, HIC 칼럼으로부터의 클리닝 피크는 CTLA4-Ig HMW 종이 풍부하다. 예를 들어, 정제용 단일 또는 직렬 칼럼 SEC HPLC를 사용하여 HIC 클리닝 피크 물질로부터 이량체, 사량체 및 다량체 아집단을 정제할 수 있다. 한 실시양태에서, 정제된 구성성분은 CTLA4-Ig 이량체, 사량체 및 육량체이다. HIC 클리닝 피크에 존재하는 CTLA4-Ig 고분자량 구성성분의 특성화는 정적 및 동적 광 산란 기술에 의해 실시될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 방법 단계 추적에서 채취한 샘플은 다양한 샘플링 시점에서 이량체, 사량체 및 다량체의 존재를 나타내었다. 육량체 종은 "클리닝 피크의 개시" 및 "클리닝 피크 최대 OD"에 상응하는 샘플에서만 검출될 수 있다. 십량체 종은 "클리닝 피크 최대 OD"에서만 검출되었다. 멀티앵글 광 산란 (MALS)을 준 탄성 광 산란 (QELS) 검출과 함께 이용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통한 분획화에 의해 분자량 및 유체역학 반경 형성을 측정할 수 있다.
세포주로부터 생성된 CTLA4-Ig 분자와 관련하여, SEC는 단백질 A 용출액이 다량체, 사량체 및 이량체 성분의 혼합물임을 보여준다. 정제용 직렬 SEC 칼럼에서 이러한 혼합물의 분획화는 다량체, 사량체 및 이량체 종의 단리를 가능케 한다. 단리된 분획의 SEC 분석에서 각 구성성분에 대한 면적 회수율은, 각 분획에 대해 93 내지 98％의 동일성(homogeneity)을 나타낸다. 한 측면에서, 개별 구성성분의 정제는, CTLA4-Ig 이량체의 물리화학적 특성과 CTLA4-Ig HMW 물질의 구성성분의 물리화학적 특성의 비교를 가능케 한다. 도 7은 겉보기 분자량을 나타내고; 이는 CTLA4-Ig HIC 클리닝 피크의 다량체, 사량체 및 이량체 분획에 해당하며, 동적 광 산란 검출 (DSL)과의 SEC 및 SEC에서의 체류 시간에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, HIC 클리닝 피크로부터 정제된 구성성분의 생체특이적 결합 활성을 비아코어 기반 고정 B7-1Ig 결합 분석에 의해 측정된 결합 활성과 비교할 수 있다. 또 다른 측면에서, HIC 클리닝 피크로부터 단리된 구성성분에 대한 시알산 몰비는 4.9 내지 7.6의 범위인 반면, CTLA4-Ig 분자 또는 이량체 (HIC 클리닝 피크에서는 없음)의 시알산 몰비는 8 내지 10의 범위이다. IEF 겔에 의한 분석은, CTLA4-Ig 이량체의 이동과 비교해서 HIC 클리닝 피크로부터 정제된 CTLA4-Ig 이소형의 감소된 이동성을 나타낸다. 이는 CTLA4-Ig HIC 클리닝 피크 분획에 대해 관찰된 더 낮은 시알산 몰비와 일치한다 (도 8).
세포 배양 조건의 선택은 재조합 단백질 생성물의 단일쇄 (즉, 단량체) 및 고분자량 종 (즉, 이량체, 사량체 등)의 형성에 영향을 줄 수 있다. 또한, 성장 조건 (배지 조성물을 포함하나 이에 제한되지는 않음)은 단일쇄의 형성 및 시스테이닐화의 수준에 영향을 미칠 수 있는 인자이다. 이는 디술피드 결합 감소를 초래하는 작용제의 존재의 결과일 것이다. CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 분비하는 세포에 직접 시스테인을 보충하거나 시스테인 함유 배지를 보충함으로써 단일쇄 및 고분자량 종의 빠른 형성을 초래할 수 있다. 상기 속도는 첨가된 시스테인의 양에 비례한다. 또 다른 실시양태에서는, 유리 술프히드릴과 반응하는 화합물인 요오도아세트아미드를 보충하여, 디술피드 결합에 의존적인 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 고분자량 종의 형성을 차단한다.
예를 들어, 요오도아세트아미드 감수성 및 비-감수성 고분자량 경로는 두 개의 매우 다른 주 기전을 강조하며, 이에 의해 고분자량 종이 CTLA4-Ig에서 형성될 수 있다. CTLA4-Ig 용액에 높은 농도 (0.5 M)의 염을 보충함으로써 지속적이고, 빠른 속도로 고분자량을 형성한다. EDTA, 콘에시드졸(ConAcidSol) II 및 이스톨레이트(yeastolate)는 단일쇄 형성을 소폭으로 증가시킨다 (실시예 5 참고).
특정 실시양태에서, 본 발명은 고분자량 CTLA4-Ig 집단을 생성시키는 방법을 제공하며, 여기서 혼합물이 약 0.3, 0.4, 0.45, 0.5, 또는 0.6 M을 초과하는 염 농도를 갖도록 CTLA4-Ig의 단량체 또는 이량체를 우세하게 함유하는 혼합물에 높은 농도의 염을 보충한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 또는 95％ 이상의 CTLA4-Ig 사량체 분자를 갖는 CTLA4-Ig 집단을 포함하는 혼합물을 생성시킨다.
한 실시양태에서, 본 발명은, 시스테이닐화되도록 Cys146에 변형을 포함하는 CTLA4-Ig 단일쇄 종의 집단을 제공한다 (실시예 4 참고). 시스테이닐화는 번역 후의 변형이며, 여기서 폴리펩티드쇄 내의 시스테인은, 디술피드 결합을 통한 다른 시스테인의 부착에 의해 변형된다. 단백질의 시스테이닐화는 MHC 계열-I 제한 바이러스성 결정자(determinant)의 면역원성 및 항원성을 비롯한 단백질 생활성(bioactivity)을 변형시키는데 관련되어 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 90 또는 95％ 이상의 시스테이닐화 단일쇄 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 집단은 약 1％ 이하의 CTLA4-Ig 단량체 분자를 갖거나, 또는 또 다른 실시양태에서는, 0.6％ 미만의 CTLA4-Ig 단량체 분자를 갖는다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비가 약 5 내지 약 18인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이고, Y는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 또는 6.0이고, Y는 약 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0이고, Y는 약 11.0, 11.5, 12.0, 12.5 또는 13.0이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 6 내지 약 14, 약 7 내지 약 13, 약 8 내지 약 12, 또는 약 9 내지 약 11이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 5 내지 약 9, 약 5.5 내지 약 9.5, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 10, 또는 약 7 내지 약 10이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 5 이상이거나, 또는 8 이상이다. 특정 실시양태에서, 시알산은 N-아세틸 뉴라민산 (NANA)이다.
본 발명은, CTLA4-Ig 분자에 대한 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA)의 평균 몰비가 2.5 이하, 2.0 이하, 1.5 이하, 1.0 이하, 또는 0.5 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 CTLA4-Ig 이량체가 93.0 면적 백분율 이상, 93.5 면적 백분율 이상, 94.0 면적 백분율 이상, 94.5 면적 백분율 이상, 95.0 면적 백분율 이상, 95.5 면적 백분율 이상, 96.0 면적 백분율 이상, 96.5 면적 백분율 이상, 또는 97.0 면적 백분율 이상인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다 (크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정함). 특정 실시양태에서, 조성물은 CTLA4-Ig 이량체가 95.0 면적 백분율 이상이고, 고분자량 종이 4.0 면적 백분율 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함한다 (크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정함). 특정 실시양태에서, 조성물은 CTLA4-Ig 이량체가 95.0 면적 백분율 이상이고, 고분자량 종이 5.0 면적 백분율 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함한다 (크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정함).
본 발명은 CTLA4-Ig 단량체 (즉, 단일쇄)가 2.0 면적 백분율 이하, 1.5 면적 백분율 이하, 1.0 면적 백분율 이하, 또는 0.5 면적 백분율 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다 (크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정함).
본 발명은 CTLA4-Ig 고분자량 종 (예컨대, 사량체)이 5.0 면적 백분율 이하, 4.5 면적 백분율 이하, 4.0 면적 백분율 이하, 3.5 면적 백분율 이하, 3.0 면적 백분율 이하, 2.5 면적 백분율 이하, 2.0 면적 백분율 이하, 1.5 면적 백분율 이하, 1.0 면적 백분율 이하, 또는 0.5 면적 백분율 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다 (크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정함). 특히, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 농축 조성물 (예컨대, 피하 투여를 위한 조성물)이 관련된 특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 10 면적 백분율 이하, 9 면적 백분율 이하, 8 면적 백분율 이하, 7 면적 백분율 이하, 6 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종을 가진다 (크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정함).
본 발명은 MCP-1 또는 MCP-1-유사 물질을 50 ppm 이하, 40 ppm 이하, 38 ppm 이하, 30 ppm 이하, 20 ppm 이하, 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 4 ppm 이하, 3 ppm 이하, 2 ppm 이하 또는 1 ppm 이하의 양으로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 MCP-1 또는 MCP-1-유사 물질을 CTLA4-Ig 분자 mg 당 50 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 40 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 38 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 30 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 20 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 10 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 4 ng 이하의, CTLA4-Ig 분자 mg 당 3 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 2 ng 이하, 또는 CTLA4-Ig 분자 mg 당 1 ng 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 분자 및 소정의 MCP-1 (MCP-1의 부재 포함)을 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 제공한다.
본 발명은, CTLA4-Ig 분자에 대한 갈락토스의 평균 몰비가 약 6 내지 약 19인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서 CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y이며, 여기서 X는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18이고, Y는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 갈락토스의 평균 몰비는 약 X 내지 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0이고, Y는 약 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15,0, 15.5 또는 16.0이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 갈락토스의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 또는 8.0이고, Y는 약 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5 또는 19.0이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 갈락토스의 평균 몰비는 약 7 내지 약 15, 약 8 내지 약 14, 약 9 내지 약 13, 약 10 내지 약 12이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 갈락토스의 평균 몰비는 약 7 내지 약 18, 약 8 내지 약 17, 약 9 내지 약 17, 약 9 내지 약 16, 또는 약 10 내지 약 15이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 갈락토스의 평균 몰비는 8 이상이다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자에 대한 푸코스의 평균 몰비가 약 0.5 내지 약 12인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 4.5이고, Y는 약 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 10.5이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 푸코스의 평균 몰비는 약 X 내지 Y (X 및 Y 포함)이고, 여기서 X는 약 2.9, 3.1, 3.3, 3.5, 3.7, 3.9, 또는 4.1이고, Y는 약 7.9, 8.1, 8.3, 8.5, 8.7, 8.9 또는 9.1이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 푸코스의 평균 몰비는 약 X 내지 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 1.0, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 2.3 또는 2.5이고, Y는 약 8.7, 8.9, 9.1, 9.3, 9.6, 9.9, 10.1, 10.3 또는 10.5이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 푸코스의 평균 몰비는 약 3.3 내지 약 8.5, 약 3.5 내지 약 8.3, 약 3.7 내지 약 8.1, 약 3.9 내지 약 7.9이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 푸코스의 평균 몰비는 약 1.5 내지 약 9.5, 약 1.7 내지 약 9.3, 약 1.9 내지 약 9.1, 또는 약 2.1 내지 약 8.9이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 푸코스의 평균 몰비는 1.7 이상이다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자에 대한 만노스의 평균 몰비가 약 5 내지 약 25인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21이고, Y는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 만노스의 평균 몰비는 약 X 내지 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 6.5, 7.0, 7.5, 7.7, 7.9, 8.1, 8.3, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5 또는 12.0이고, Y는 약 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 20.5, 21.0, 21.5, 22.0, 22.5, 23, 23.5 또는 24.0이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 만노스의 평균 몰비는 약 X 내지 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 8, 8.5, 9.0, 9.5 10.0 또는 11.0이고, Y는 약 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5 또는 20.0이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 만노스의 평균 몰비는 약 6 내지 약 23, 약 7 내지 약 22, 약 7.7 내지 약 22, 약 8 내지 약 21, 약 9 내지 약 20, 약 10 내지 약 19, 약 11 내지 약 19, 및 약 11 내지 약 17이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 만노스의 평균 몰비는 약 8 내지 약 19, 약 9 내지 약 18, 약 10 내지 약 17, 또는 약 11 내지 약 16이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 만노스의 평균 몰비는 7 이상이다.
본 발명은 산화된 종이 5.0 면적 백분율 이하, 4.5 면적 백분율 이하, 4.0 면적 백분율 이하, 3.5 면적 백분율 이하, 3.0 면적 백분율 이하, 2.5 면적 백분율 이하, 2.0 면적 백분율 이하, 1.5 면적 백분율 이하, 1.0 면적 백분율 이하, 또는 0.5 면적 백분율 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 탈아미드화 종이 5.0 면적 백분율 이하, 4.5 면적 백분율 이하, 4.0 면적 백분율 이하, 3.5 면적 백분율 이하, 3.0 면적 백분율 이하, 2.5 면적 백분율 이하, 2.0 면적 백분율 이하, 1.5 면적 백분율 이하, 1.0 면적 백분율 이하, 또는 0.5 면적 백분율 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 산화된 종이 3.5 면적 백분율 이하이고, 탈아미드화 종이 2.5 면적 백분율 이하인 CTLA4-Ig 분자를 포함한다.
본 발명은 세균 내독소 LAL을 CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.7 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.6 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.5 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.42 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.4 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.35 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.3 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.25 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.20 EU 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.15 EU 이하, 또는 CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.05 EU 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 바이오버든을 2 CFU/10 mL 이하, 1.5 CFU/10 mL 이하, 1 CFU/10 mL 이하, 또는 0.5 CFU/10 mL 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 DNA를 CTLA4-Ig 분자 mg 당 25 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 20 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 15 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 10 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 5.0 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 4.0 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 3.5 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 3.0 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 2.5 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 1.5 pg 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 1.0 pg 이하, 또는 CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.5 pg 이하, 또는 CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.20 pg 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 세포 단백질 (예컨대, CHO 단백질 또는 CHOP)을 CTLA4-Ig 분자 mg 당 200 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 150 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 125 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 100 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 90 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 80 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 70 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 60 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 50 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 40 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 30 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 25 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 20 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 15 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 10 ng 이하, 또는 CTLA4-Ig 분자 mg 당 5 ng 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 세포 단백질을 200 ppm 이하, 150 ppm 이하, 125 ppm 이하, 100 ppm 이하, 90 ppm 이하, 80 ppm 이하, 70 ppm 이하, 60 ppm 이하, 50 ppm 이하, 40 ppm 이하, 30 ppm 이하, 25 ppm 이하, 20 ppm 이하, 15 ppm 이하, 10 ppm 이하, 또는 5 ppm 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 트리톤-X (예컨대, 트리톤 X-100)를 CTLA4-Ig 분자 mg 당 4.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 3.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 3.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 2.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 2.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 1.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 1.0 ng 이하, 또는 CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.5 ng 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 트리톤-X를 4.0 ppm 이하, 3.5 ppm 이하, 3.0 ppm 이하, 2.5 ppm 이하, 2.0 ppm 이하, 1.5 ppm 이하, 1.0 ppm 이하, 또는 0.5 ppm 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 단백질 A를 CTLA4-Ig 분자 mg 당 8.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 7.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 7.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 6.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 6.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 5.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 5.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 4.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 4.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 3.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 3.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 2.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 2.0 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 1.5 ng 이하, CTLA4-Ig 분자 mg 당 1.0 ng 이하, 또는 CTLA4-Ig 분자 mg 당 0.5 ng 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 단백질 A를 8.0 ppm 이하, 7.5 ppm 이하, 7.0 ppm 이하, 6.5 ppm 이하, 6.0 ppm 이하, 5.5 ppm 이하, 5.0 ppm 이하, 4.5 ppm 이하, 4.0 ppm 이하, 3.5 ppm 이하, 3.0 ppm 이하, 2.5 ppm 이하, 2.0 ppm 이하, 1.5 ppm 이하, 1.0 ppm 이하, 또는 0.5 ppm 이하로 포함하는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자에 대한 GlcNAc의 평균 몰비가 약 10 내지 약 40인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 GlcNAc의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 10 내지 39 중 임의의 정수이고, Y는 11 내지 40 중 임의의 정수이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 GlcNAc의 평균 몰비는 약 X 내지 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이고, Y는 약 32, 33, 34, 35, 36 또는 37이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 GlcNAc의 평균 몰비는 약 12 내지 약 35, 약 13 내지 약 35, 약 14 내지 약 35, 약 15 내지 약 35이다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자에 대한 GalNAc의 평균 몰비가 약 0.5 내지 약 7.0인 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 GalNAc의 평균 몰비는 약 X 내지 약 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0이고, Y는 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 6.0, 7.0 또는 8.0이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 GalNAc의 평균 몰비는 약 X 내지 Y (X 및 Y 포함)이며, 여기서 X는 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0이고, Y는 약 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1 또는 4.2이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 GalNAc의 평균 몰비는 약 0.7 내지 약 4.1, 약 0.8 내지 약 4.0, 약 0.9 내지 약 3.9, 약 1.0 내지 약 3.8, 또는 약 1.1 내지 약 3.7이다. 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자에 대한 GalNAc의 평균 몰비는 약 1.6 내지 약 3.7, 약 1.7 내지 약 3.6, 약 1.8 내지 약 3.5, 또는 약 1.9 내지 약 3.4이다.
본 발명은, 등전 집중 겔 (IEF 겔) 상에서 측정했을 때 약 4.3 내지 약 5.6의 pI 범위내에 약 10개 내지 약 22개의 밴드; 약 4.3 내지 약 5.3의 pI 범위내에 약 90％ 내지 약 110％의 누적 밴드 강도 및 약 4.5 내지 약 5.2의 pI 범위내에 약 3개의 주요 밴드와 같은 pI 범위내 밴드를 나타내는, CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 약 4.3 내지 약 5.6의 범위내 밴드는 약 5개 내지 약 30개, 약 6개 내지 약 29개, 약 7개 내지 약 28개, 약 8개 내지 약 27개, 약 9개 내지 약 26개, 약 10개 내지 약 25개, 약 11개 내지 약 24개, 약 12개 내지 약 23개, 약 13개 내지 약 22개, 약 14개 내지 약 21개, 약 15개 내지 약 20개, 약 16개 내지 약 19개, 약 17개 내지 약 20개, 약 18개 내지 약 19개이다.
글리코실화 CTLA4-Ig 및 CTLA4 A29YL104E -Ig 분자 및 그의 집단
제한 없이, 글리코실화는 폴리펩티드 쇄 내의 특정 부위에서 단백질에 복합 올리고사카라이드 구조의 첨가를 지칭할 수 있다. 단백질의 글리코실화 및 첨가된 탄수화물의 후속 처리는 단백질 폴딩 및 구조, 단백질 반감기를 비롯한 단백질 안정성 및 단백질의 기능적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질 글리코실화는 개질이 일어나는 서열 관계 덕택으로 두 부류, O-연결된 글리코실화 및 N-연결된 글리코실화로 나뉠 수 있다. O-연결된 폴리사카라이드는 히드록실기에 연결되며, 통상적으로 세린 또는 트레오닌 잔기의 히드록실기에 연결된다. O-글리칸은 모든 세린 및 트레오닌 잔기에 첨가되지는 않는다. O-연결된 올리고사카라이드는 통상적으로 1안테나형 또는 2안테나형 (즉, 이들은 1개 또는 최대 2개의 분지 (안테나)를 포함함)이고, 1 내지 4개의 다른 종류의 당 잔기를 포함하며, 이들은 하나씩 첨가된다.
N-연결된 폴리사카라이드는 아스파라긴의 아미드 질소에 부착된다. 두 트리펩티드 서열 [아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)] 중 하나의 부분인 아스파라긴만이 글리코실화에 대한 표적이다. N-연결된 올리고사카라이드는 1-, 2-, 3-, 4-안테나형으로 지칭되는 1 내지 4개의 분지를 가질 수 있다. N- 및 O-연결된 올리고사카라이드의 구조 및 각각에서 발견되는 당 잔기는 상이하다. 이러한 차이에도 불구하고, N- 및 O-연결된 폴리사카라이드의 각 분지의 말단 잔기는 시알산 분자에 의해 개질 (시알산 캡핑(capping)이라 지칭됨)될 수 있다. 시알산은, 다른 올리고사카라이드에 연결될 수 있는 고유 9-탄소 모노사카라이드 패밀리에 대한 관용 명칭이다. 두 패밀리 일원은 N-아세틸 뉴라민산 (Neu5Ac 또는 NANA로 약칭됨) 및 N-글리콜릴 뉴라민산 (Neu5Gc 또는 NGNA로 약칭됨)이다.
인간에 있어서 시알산의 가장 일반적인 형태는 NANA이다. N-아세틸뉴라민산 (NANA)은 CTLA4-Ig 분자에 존재하는 주 시알산 종이다. 그러나, 미량이지만 검출가능한 수준의 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA) 또한 CTLA4-Ig 분자에 존재한다는 것을 유의해야 한다. 또한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 NANA 및 NGNA 둘 모두에 대한 시알산의 몰수를 측정할 수 있으므로, CTLA4-Ig 분자에 대한 NANA 및 NGNA 둘 모두의 수준이 측정 및 기록된다. N- 및 0-연결된 올리고사카라이드는 다른 수의 분지를 가지며, 이는 시알산 분자가 부착될 수 있는 다른 수의 위치를 제공한다. N-연결된 올리고사카라이드는 시알산에 대해 4개 이하의 부착 위치를 제공할 수 있으며, O-연결된 올리고사카라이드는 시알산 부착을 위한 2개의 부위를 제공할 수 있다.
글리코실화 단백질 (당단백질) (이들 다수가 재조합 DNA 기법에 의해 제조됨)은 진단제 및 치료제로서 대단히 유익하다. 세포 표면의 여러 진핵생물 막횡단 단백질 및 분비 단백질은 N-연결된 및 O-연결된 탄수화물 기를 혼입하기 위해서 번역 후 개질된다. N-연결된 올리고사카라이드는 펩티드 모티프(motif) Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)의 일부인 경우 아스파라긴 잔기에 부착된다. O-연결된 올리고사카라이드는 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착된다. N-연결된 및 O-연결된 올리고사카라이드의 구조 및 각각에서 발견된 당 잔기는 상이할 수 있다. 둘 모두에서 공통적으로 발견되는 당의 한 유형은 N-아세틸뉴라민산 (NANA; 하기에서 시알산으로 지칭됨)이다. 통상적으로, 시알산은 N-연결된 및 O-연결된 올리고사카라이드 둘 모두의 말단 잔기이다. 당단백질은 그의 음의 전하로 인해 산성 특성을 나타낼 수 있다.
글리코실화 단백질은 단백질 폴딩을 증대시키고, 세포 분류(sorting) 및 이동(trafficking)을 조절하고, 단백질 응집을 방지하고, 세포-세포 유착을 조정하고, 단백질분해에 대한 저항성을 증진시키는 역할을 하는 것으로 여겨진다. 진핵생물 유기체에서, 글리코실화의 성질 및 정도는 수용체 매개 내포작용 및 제거가 관련된 과정에 의해 당단백질 치료제의 순환 반감기 및 생활성에 큰 영향을 나타낼 수 있다. 수용체-매개 시스템은 올리고사카라이드의 다양한 당 구성성분을 인지함으로써 혈청 당단백질을 제거하는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 당단백질의 말단 시알산 기는 흡수, 반감기 및 혈청 청소율에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 글리코실화단백질의 말단 시알산 구성성분을 유지하는 당단백질 생성 전략은 단백질의 생체이용률 및 혈청 반감기를 보다 증진시킬 수 있다. 재조합 당단백질 합성과 관련하여 몇몇 생성 공정 파라미터, 특히 다양한 생성 전략에 있어서 배지 조성 및 온도 변화의 효과가 연구되고 있다.
(i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382 (v) 서열 2의 25 내지 382, 또는 (vi) 서열 2의 25 내지 383 잔기의 아미노산 서열을 갖는 단량체로 구성된 CTLA4-Ig 이량체는 약 78,000 내지 약 79,000 Da의 예상되는 이론적 분자량을 가질 수 있다. 그러나, MALDI-TOF에 의해 수득된 이러한 이량체의 분자량은 대략 91,000 Da이다. 대략 13,000 내지 14,000 Da (이는 한 실시양태에서, 이러한 특정 CTLA4-Ig 단량체 분자 질량의 대략 15％에 해당함)의 이러한 분자량 차이는 적어도 부분적으로 글리코실화로 인한 것이다. 상기 특정된 단량체는 3개의 N-연결된 글리코실화 부위 (펩티드 맵핑에 의해 서열 2의 102, 134, 및 233의 아스파라긴 잔기에서 일어나는 것으로 확인됨)를 갖는다. 아스파라긴을 통해 연결된 탄수화물 분자는 효소 펩티드-N 글리코시다제 F (PNGase F)를 사용하여 선택적으로 절단될 수 있다. 한 예에서, 서열 2의 27 내지 383을 갖는 단량체를 PNGase F로 처리하면, 대략 80,200 Da의 분자량을 갖는 종이 생성되며, 단량체의 이론적 분자량이 약 80,200이므로 상기 처리는 불명의 1,400 Da (80,200 - 78,800 = 1,400)이 O-연결된 글리코실화로 인한 것일 수 있음을 시사한다. 글리코실화 부위의 가능성을 가진 다수의 세린 및 트레오닌 잔기가 존재하나, 2개의 O-연결된 부위만 확인되었다 (서열 2의 Ser155 및 Ser165). 한 실시양태에서, 상기 2개의 부위에 부착된 우세한 글리칸은 HexNAc-Hex-NeuAc이다.
예를 들어, 도 9는 서열 2로부터의 서열을 갖는 단량체 (즉, (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382), (v) 서열 2의 25 내지 382, 또는 (vi) 서열 2의 25 내지 383 중 하나의 서열을 갖는 단량체)로 구성된 CTLA4-Ig 분자의 N-연결된 및 O-연결된 탄수화물 구조의 전반적 개관을 도시하며, 한 실시양태에서, 도시한 탄수화물 특징을 갖는 이러한 분자는, 실시예 14 내지 15에 기술되고 도 10에 도시한 생성 방법에 따라 본 발명의 세포주 또는 그의 자손에 의해 생성된다. 각 부위에 대해 열거된 주요 구조는 직교(orthogonal) 기술 (본원 참고)에 기초한 것이다. 각 구조에 대해, 이러한 실험 도중에 관찰된 구조의 예상 백분율이 존재한다. 이러한 백분율은 직교 기술로부터 최상의 예상치를 나타낸다.
(i) 서열 4의 26 내지 383, (ii) 서열 4의 26 내지 382, (iii) 서열 4의 27 내지 383, (iv) 서열 4의 27 내지 382, (v) 서열 4의 25 내지 382, 또는 (vi) 서열 4의 25 내지 383 잔기의 아미노산 서열을 갖는 단량체로 구성된 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체는 약 78,000 내지 약 79,000 Da의 예상되는 이론적 분자량을 가질 수 있다. MALDI-TOF에 의해 수득된 이러한 이량체의 분자량은 대략 91,500 Da이다. 대략 12,000-13,000 Da의 분자량 차이는 적어도 부분적으로 글리코실화로 인한 것이다. 상기 특정된 단량체는 3개의 N-연결된 글리코실화 부위 (펩티드 맵핑에 의해 서열 4의 102, 134 및 233의 아스파라긴 잔기 (도 4의 N76, N108 및 N207)에서 일어나는 것으로 확인됨)를 갖는다. 아스파라긴을 통해 연결된 탄수화물 분자는 효소 펩티드-N 글리코시다제 F (PNGase F)를 사용하여 선택적으로 절단될 수 있다. 글리코실화 부위의 가능성을 가진 다수의 세린 및 트레오닌 잔기가 존재하나, 3개의 O-연결된 부위만 확인되었다 (서열 4의 Ser149, Ser155 및 Ser165 (실시예 22의 표 25 참고)). 한 실시양태에서, 상기 부위에 부착된 우세한 글리칸은 HexNAc-Hex-NeuAc이다.
특정 실시양태에서, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 본 발명의 배양 방법에 의해 생산될 수 있는 당단백질이다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 당단백질은 분자의 대략 15％ (w/w)를 차지하는 올리고사카라이드에 의해 개질된다. 이러한 올리고사카라이드는 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질의 약물동역학 (PK) 파라미터에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 다른 올리고사카라이드 프로파일이 단백질의 안정성 및 분해에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, O-연결된 올리고사카라이드는 면역글로불린 불변 영역의 힌지 영역에서의 자가분해를 방지함으로써 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 안정성을 증진시킬 수 있다.
CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단에서 올리고사카라이드 분포는 세포 배양 및 공정의 복잡성으로 인해 불균일할 수 있다. 글리코실화 부위가 완전 점유 내지 비점유 상태이며 특정 부위는 여러 다른 올리고사카라이드 구조로 분포될 수 있다는 사실로 인하여 불균일성이 존재할 수 있고, 추가로 시알산 개질 패턴에 있어서 가변성을 나타낼 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 상 제1 시알산 잔기는 N-아세틸 뉴라민산 (NeuAc, NANA)이고, 제2 시알산 잔기는 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA)이다. 시알산의 하전성 및 복합체 시알산-함유 구조는 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 각각의 다중 이소형을 초래할 수 있으며, 여기서 이러한 이소형은 등전 집중 (IEF) 프로파일로 분명하게 알 수 있다. 예를 들어, CTLA4-Ig의 IEF 프로파일에 대해 도 11 및 실시예 3을 참고한다. 부가적으로, CTLA4A29YL104E-Ig의 IEF 프로파일에 대해 도 12 및 실시예 22를 참고한다.
한 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어 IEF에 의해 측정될 수 있는 등전점 (pI)이 5.1 또는 5.0 이하인 우세한 CTLA4-Ig 이소형을 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 IEF에 의해 측정될 수 있는 등전점 (pI)이 5.5 이하인 우세한 CTLA4A29YL104E-Ig 이소형을 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단이 제공된다 (도 12).
한 실시양태에서, 본 발명은 pI가 약 4.2 내지 약 5.7, 약 4.25 내지 약 5.5, 약 4.3 내지 약 5.3, 또는 약 4.5 내지 약 5.2인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 pI가 약 4.45 내지 약 5.30인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 pI가 약 4.3 내지 약 5.1인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 pI가 약 4.45 내지 약 5.0인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가, IEF로 측정시 약 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 3.0, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2 또는 2.1 (이들 값은 ± 0.2의 표준 편차를 가질 수 있음) 이하의 등전점을 나타내는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자의 집단에 IEF 겔 전기영동을 실시하고, 겔 상의 단일 밴드가 특정 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 아집단을 나타내고, 겔로부터 그 밴드를 잘라내어 특정 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 아집단을 단리하고, 후속적으로 잘라낸 겔 밴드로부터 단백질을 정제하는 것을 포함하는, pI가 약 4.45 내지 약 5.30, 약 4.45 내지 약 5.1, 또는 약 4.45 내지 약 5.0인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제조하는 방법을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 pI가 약 4.5 내지 약 5.2인 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 pI가 약 4.7 내지 약 5.1인 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 pI가 약 2.0 내지 약 5.2인 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가, IEF로 측정시 약 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1 또는 3.0 (이들 값은 ± 0.2의 표준 편차를 가질 수 있음) 이하의 등전점을 나타내는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단에 IEF 겔 전기영동을 실시하고, 겔 상의 단일 밴드가 특정 pI를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 아집단을 나타내고, 겔로부터 그 밴드를 잘라내어 특정 pI를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 아집단을 단리하고, 후속적으로 잘라낸 겔 밴드로부터 단백질을 정제하는 것을 포함하는, pI가 약 4.5 내지 약 5.2, 약 4.7 내지 약 5.1, 또는 약 2.0 내지 약 5.2인 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제조하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자 몰수에 대한 시알산 기의 몰수의 평균 몰비가 약 6 내지 약 32, 약 8 내지 약 32, 약 11 내지 약 30, 약 12 내지 약 20, 약 13 내지 약 19, 약 14 내지 약 18, 약 15 내지 약 17, 약 6 내지 약 16, 약 8 내지 약 16, 약 8 내지 약 14, 약 8 내지 약 12인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
일부 실시양태에서, 25 ppm 이하 내지 10 ng/mg 이하의 최대 허용가능한 CHO 숙주 세포 단백질은 CTLA4-Ig 분자의 조성물의 특성을 규명한다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 조성물은 2.5 pg/mg 이하 내지 1.0 pg/mg 이하의 수준의 숙주 세포 DNA를 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 조성물은 1.0 ng/mg 이하 또는 1.0 ppm 이하의 수준의 트리톤 X-100을 특징으로 한다. 트리톤 X-100의 농도는 워터스(Waters) OASIS-HLB 고체-상 추출을 이용한 다음, 물로 세척하여 잔류 단백질을 제거하는 트리톤 X-100 추출에 의해 측정될 수 있다. 결합된 트리톤 X-100를 아세토니트릴에 의한 용출로 제거한다. 아세토니트릴 용출액을, SAS 하이퍼실(Hypersil) 5 μm 칼럼 및 아세토니트릴:물 (80:20)로 이루어진 이동상을 이용하여 역상 크로마토그래피에 의해 분석한다. 225 nm에서의 UV 흡광도에 의해 검출한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 조성물은 2.5 면적％ 이하의 산화 및 2.0 면적％ 이하의 탈아미드화를 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 조성물은 3.0 면적％ 이하의 산화 및 2.5 면적％ 이하의 탈아미드화를 특징으로 한다. 산화 및 탈아미드화의 정량을 위해 트립신 펩티드 맵핑 방법을 사용하였다. CTLA4-Ig 단백질 중 Met85의 메티오닌 술폭시드로의 산화 면적 백분율을 정량화하는 RP-HPLC 트립신 맵핑 분석을 사용하여 산화율 (％) 데이타를 측정하였다. T6 트립신 펩티드 (Met85를 함유하는 잔기 84-93로 구성됨) 및 상응하는 산화 트립신 펩티드인 T6ox (Met(O)85 함유)에 대한 RP-HPLC 트립신 맵의 UV 피크 면적을 측정하여 방법 중 산화율 (％)을 수득하였다. Met(O)85에 대한 Met85의 산화 면적 백분율은 T6ox 피크의 면적 백분율에 정비례한다: 산화율 (％) = 100 * AT6ox/(AT6ox + AT6) (여기서, AT6 = T6 트립신 펩티드(84-93)에 대한 피크 면적; AT6ox = T6ox 트립신 펩티드, Met(O)85(84-93)에 대한 피크 면적). 산화 및 탈아미드화의 면적 백분율을 정량화하는 RP-HPLC 트립신 맵핑 분석을 사용하여 수득한 탈아미드화율 (％) 데이타는, T26 트립신 펩티드 (Asn294를 함유하는 잔기 281-302로 구성됨) 및 상응하는 탈아미드화 트립신 펩티드 (이소Asp294를 함유하는 T26deam1)에 대한 RP-HPLC 트립신 맵의 UV 피크 면적을 측정함으로써 수득된다. 그리고, 이소Asp294에 대한 Asn294의 탈아미드화 면적 백분율은 T26deam1 피크의 면적 백분율에 정비례한다: 여기서, AT26 = T26(281-302)에 대한 피크 면적; AT26deam1 = T26deam1, 이소Asp294(281-302)에 대한 피크 면적; AT26deam2 = T26deam2, Asp299(281-302)에 대한 피크 면적; AT26deam3 = T26deam3, Asp294(281-302)에 대한 피크 면적; AT26deam4 = T26deam4, Asu294(281-302)에 대한 피크 면적.
또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 조성물은 CTLA4-Ig 단백질 몰수에 대한 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)의 몰수가 15 내지 35, 또는 CTLA4-Ig 단백질 몰수에 대한 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)의 몰수가 1.7 내지 3.6인 것을 특징으로 한다. 아미노 모노사카라이드는 산 가수분해에 의한 단백질로부터의 방출 후 모세관 전기영동 (CE)에 의해 정량화된다. 방출된 아미노 모노사카라이드를 재-아세틸화하고, 아미노피렌 트리술폰산 (APTS)으로 형광표지하여 검출 및 정량화를 용이하게 한다. N-아세틸만노스아민을 샘플 및 아미노 모노사카라이드 표준에 첨가하여 내부 표준으로 이용한다. 샘플 중 아미노 모노사카라이드의 피크 면적을 내부 표준을 사용하여 표준화하고, 표준의 이들 각각의 표준화된 아미노 모노사카라이드 피크 면적과 비교하여 정량화한다. 이어서, CTLA4-Ig 분자에 대한 각 모노사카라이드의 몰비를 계산한다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 조성물은 하기 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일 내역을 특징으로 한다.
N-연결된 올리고사카라이드 프로파일 내역
Figure 112011097388832-pat00037
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 조성물은 중성 모노사카라이드임을 특징으로 하며, 여기서 조성물은 대략 하기의 비율을 갖는다.
CTLA4-Ig 단백질 몰 당 갈락토스: 8.0 내지 17 몰
CTLA4-Ig 단백질 몰 당 푸코스: 3.5 내지 8.3 몰
CTLA4-Ig 단백질 몰 당 만노스: 7.7 내지 22 몰
또는
CTLA4-Ig 단백질 몰 당 갈락토스: 9.0 내지 17 몰
CTLA4-Ig 단백질 몰 당 만노스: 11 내지 19 몰
예시적인 중성 모노사카라이드 조성: 단백질 몰 당 갈락토스, 푸코스 및 만 노스의 몰
Figure 112011097388832-pat00038
예시적인 시알산 (단백질 몰 당 NANA )
Figure 112011097388832-pat00039
또 다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 조성물에 대한 모노사카라이드 몰비 범위는 다음과 같다: 단백질 몰 당 만노스 약 10 내지 20 몰; 단백질 몰 당 푸코스 약 4.2 내지 7.0 몰; 및 단백질 몰 당 갈락토스 약 9.2 내지 17 몰. 또 다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 조성물은 단백질 몰 당 NANA가 약 5.0 내지 10.0 몰인 NANA의 몰비를 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 조성물은 단백질 몰 당 NGNA가 1.5 몰 미만인 NGNA 몰비를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 시알산 몰비의 편차율 (％)은 15％ 이하, 20％ 이하 또는 30％ 이하이다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 집단은 각각 3개 이상의 시알산 기를 갖는 CTLA4-Ig 단량체를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자의 집단은 각각 3 내지 8개의 시알산 기를 갖는 CTLA4-Ig 단량체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가 약 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1 또는 3.0 이하의 등전점을 나타내는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체 몰수에 대한 NANA 몰수의 평균 몰비가 약 6 내지 약 16, 약 6 내지 약 14, 약 6 내지 약 12, 약 8 내지 약 12, 약 8 내지 약 14, 약 8 내지 약 16인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체의 몰수에 대한 NGNA 몰수의 평균 몰비가 약 2, 1.8, 1.6, 1.5, 1.4, 1.0, 0.8 또는 0.5 이하인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 이량체 몰수에 대한 시알산 기 몰수의 평균 몰비가 약 5.5 내지 약 8.5인 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 이량체 몰수에 대한 시알산 기 몰수의 평균 몰비가 약 5 내지 약 10인 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단은 각각 2.5개 이상의 시알산 기를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단은 각각 2.5 내지 5개의 시알산 기를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 집단의 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체 몰수에 대한 아미노 모노사카라이드 및/또는 중성 모노사카라이드 및/또는 시알산의 몰수의 평균 몰비에 의해 구별되는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 집단의 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 이량체 몰수에 대한 아미노 모노사카라이드 및/또는 중성 모노사카라이드 및/또는 시알산의 몰수의 평균 몰비에 의해 구별되는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 집단을 제공한다. 아미노 모노사카라이드에는 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc) 및 N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc)이 포함된다. 중성 모노사카라이드에는 만노스, 푸코스 및 갈락토스가 포함된다. 시알산에는 N-아세틸 뉴라민산 (NANA) 및 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA)이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc 몰수의 평균 몰비가 약 10 내지 약 40, 약 15 내지 약 35, 약 15 내지 약 25, 또는 약 15 내지 약 20인 것을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가, 약 40, 38, 35, 30, 25, 20, 18 또는 15 이하인 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GlcNAc 몰수의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GalNAc 몰수의 평균 몰비가 약 1.5 내지 약 8.5, 약 1.7 내지 약 3.0, 약 1.7 내지 약 4.0, 약 1.7 내지 약 5.0, 약 1.7 내지 약 6.0, 약 1.7 내지 약 7.0, 약 1.7 내지 약 8.0, 또는 약 1.7 내지 약 8.3인 것을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가, 약 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4.0, 3.8, 3.6, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.7 또는 1.5 이하인 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 GalNAc 몰수의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 갈락토스 몰수의 평균 몰비가 약 7.5 내지 약 20.0, 약 8.0 내지 약 19.0, 약 8 내지 약 18.0, 약 8.0 내지 약 17.0, 약 8.5 내지 약 17.0, 또는 약 9.0 내지 약 17.0인 것을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가, 약 20.0, 19.0, 18.0, 17.O, 16.0, 15.0, 14.0, 13.0, 12.0, 11.0, 10.0, 9.0, 8.5, 8.0 또는 7.5 이하인 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 갈락토스의 몰수의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 푸코스 몰수의 평균 몰비가 약 3 내지 약 8.5, 약 3.5 내지 약 8.5, 약 3.5 내지 약 8.3, 약 3.5 내지 약 8.0, 약 3.5 내지 약 7.5, 또는 약 3.5 내지 약 7.0인 것을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가, 약 8.5, 8.3, 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.2 또는 3.0 이하인 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 푸코스 몰수의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자의 몰 당 만노스 몰수의 평균 몰비가 약 7 내지 약 23, 약 7.5 내지 약 23, 약 7.7 내지 약 23, 약 7.7 내지 약 22.5, 약 7.7 내지 약 22, 약 7.7 내지 약 20, 약 7.7 내지 약 18, 약 7.7 내지 약 16, 약 8.0 내지 약 16.0, 약 9.0 내지 약 17.0, 약 10 내지 약 19.0, 또는 약 11 내지 약 19.0인 것을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 집단내 분자가, 약 23, 22.5, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.7, 7.5, 7.3 또는 7 이하인 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체 몰 당 만노스 몰수의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 예컨대 생활성을 유지하면서 혈청으로부터의 청소율이 감소됨으로 인해 유발되거나 이로써 입증되는, 곡선 아래 면적 (AUC)으로 측정시 증가된 PK 값 (예를 들어, 증가된 노출)을 나타내는 글리코실화 CTLA4-Ig 집단을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생활성을 유지하면서 혈청으로부터의 청소율이 감소됨으로 입증되는, 증가된 약물동역학 (PK) 값을 나타내는 글리코실화 CTLA4A29YL104E-Ig 집단을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 추가의 글리코실화 부위를 갖는 가용성 CTLA4-Ig 분자의 유사체를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 추가의 글리코실화 부위를 갖는 가용성 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 유사체를 제공한다. 추가의 글리코실화 부위는 시알릴화될 수 있는 추가의 탄수화물 구조에 대한 부착 위치를 제공한다. 증가된 시알 함량은 증가된 PK 값, 및/또는 증가된 당단백질 안정성을 초래할 수 있다. 시알산 함량이 높을수록 유익하다. 시알산을 더 첨가하기 위해 효소를 사용하는 시험관내 정제-후 방법을 수행하여 본 발명의 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 추가의 실시양태를 생성할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 본원에 개시된 하나의 범위를 본원에 개시된 하나 이상의 범위와 함께 포함한다. 본 발명의 실시양태는 본원에 개시된 CTLA4-Ig의 특징 또는 특성 하나를 본원에 개시된 CTLA4-Ig의 하나 이상의 특징 또는 특성과 함께 포함한다.
CTLA4-Ig 및 CTLA4 A29YL104E -Ig 당단백질의 분석 및 단리 방법
본원에 기재된 하기 방법을 사용하여 집단의 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 이량체 몰 당 아미노 모노사카라이드 및/또는 중성 모노사카라이드 및/또는 시알산 몰수의 평균 몰비를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 당 프로파일에 기초하여 특정 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 구별하거나, 동정하거나, 또는 단리할 수 있다.
배양된 세포에서 분비되는 당단백질은 배양 배지 또는 상청액으로부터 단리될 수 있다. 당업계에 공지되고 실시되거나 본원에 기재된 단리 및 정제 방법을 사용하여 전체 세포 배양 기간이 끝나고 원하는 대로 세포에 의해 생성된 당단백질을 수집하고, 회수하고, 단리하고/거나 정제하거나, 또는 실질적으로 정제한다.
한 실시양태에서, 세포에 의해 발현되나 세포에 의해 분비되지는 않는 본 발명의 당단백질은 또한, 예컨대 세포 용해물을 제조하고, 당단백질을 단리하고/거나, 당업계에 공지되고 실시되는 방법 및 하기 추가로 기재된 방법을 사용하여 세포로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 세포 배양 공정에 의해 생성되는 당단백질은 다양한 탄수화물 분석 기술에 의해 분석될 수 있는 복합체 탄수화물을 포함한다. 예를 들어, 당업계에 공지된 렉틴 블로팅과 같은 기술은 말단 만노스, 또는 갈락토스와 같은 다른 당의 비율을 나타낸다. 시알산에 의한 1-, 2-, 3-, 또는 4-안테나형 올리고사카라이드의 말단은, 무수 히드라진 또는 효소적 방법 및 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의한 올리고사카라이드의 분획을 이용하여 단백질로터 당을 방출시킴으로 확인할 수 있다.
당단백질에서 발견되는 당체 결합의 두가지 주요한 유형은 N- 및 O-연결이다. N-글리코실화는 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 대한 글리칸의 공유 결합에 의해 생성된다. O-당체 연결은 글리칸에 대한 세린, 트레오닌, 히드록시리신 또는 히드록시프롤린의 히드록실기의 공유 결합에 의해 생성된다. 당단백질의 탄수화물 잔기는 숙주-％원체 상호작용, 혈청으로부터의 청소율 및 다른 조직의 표적화를 비롯한 다수의 분자 인지 현상에 관련된다. CTLA4-Ig 및 CTLA4A29YL104E-Ig 분자와 관련하여, 탄수화물 잔기는 최소한 CTLA4-Ig 분자와 CD80 또는 CD86 사이의 결합, 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자와 CD80 또는 CD86 사이의 결합에 영향을 미칠 수 있다.
탄수화물 구조는 전형적으로 발현된 단백질 상에서 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물로서 존재한다. N-연결된 및 O-연결된 탄수화물은 이들의 코어 구조가 근본적으로 다르다. N-연결된 글리코실화는 펩티드쇄의 아스파라긴 잔기에 대한 GlcNAc를 통한 탄수화물 잔기의 부착을 지칭한다. 한 실시양태에서, N-연결된 탄수화물 모두는 공통적인 Man1-6(Man1-3)Manβ-4Glc-NAcβ1-4GlcNAcβ-R 코어 구조를 함유하며, 이러한 코어 구조내 R은 아스파라긴 잔기를 나타낸다. 생성된 단백질의 펩티드 서열은 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인을 함유할 것이며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다.
대조적으로, O-연결된 탄수화물은 트레오닌 또는 세린의 히드록실기에 부착된 GalNAc를 함유하는 공통적인 코어 구조를 특징으로 한다. 가장 중요한 N-연결된 및 O-연결된 탄수화물은 복합체 N- 및 O-연결된 탄수화물이다. 이러한 복합체 탄수화물은 몇가지의 안테나형 구조를 함유한다. 1-, 2-, 3-, 및 4-안테나형 구조는 말단 시알산의 첨가에 중요하다. 이러한 외부 쇄 구조는 단백질 생성물의 탄수화물을 포함하는 특정한 당 및 결합에 대한 추가의 부위를 제공한다.
치료적 당단백질은 대체로 재조합 DNA 세포 배양물 기술을 이용하여 생성된다. 세포 배양물내 단백질 글리코실화 분포는 pH, 세포 밀도, 영양물 농도 및 대사물 농도의 변화에 의해 영향을 받을 수 있다. 환경 효과에 대한 글리칸 분포의 민감도로 인해 재생가능한 생성물의 제조를 보장하기 위해 생성물 진행 및 생성 동안 글리칸 분포를 주의깊이 모니터링하는 것이 필요하다.
치료용 재조합-유도 당단백질의 개발로 인해 그의 탄수화물 구조의 특성을 규명하고, 프로파일링하기 위한 방법에 대한 요구가 증가하였다. 존재하는 올리고사카라이드 구조를 식별하고, 올리고사카라이드 조성물의 일관성을 모니터링하고, 세포 배양 또는 생성 공정의 변화가 원인일 수 있는 변화를 평가하고, 다른 세포주의 발현의 결과로 일어나는 글리코실화의 변화를 식별하기 위해, 천연 단백질과 비교한 재조합 단백질의 초기 특성화에 올리고사카라이드 맵핑이 사용되었다.
탄수화물 구조적 분포를 평가할 수 있는 다양한 기술이 존재한다. 이러한 기술에는 광범위한 검출 기술과 조합된 겔-여과, 크로마토그래피 및 전기영동성 분리 기술이 포함된다. 샘플량이 제한적이면, 검출을 개선하기 위해 당단백질은 대체로 형광 시약 (예컨대, 2-아미노벤조산 및 2-아미노피리딘)으로 유도체화된다. 그러나, 유도체의 유도체화 및 정제는 시간 소모적일 수 있다. 샘플 크기가 문제가 아니라면, 탄수화물 구조적 분포의 직접 평가가 가능하다.
당단백질의 올리고사카라이드 함량 분석
특정 당단백질은 탄수화물의 이종성을 나타낼 수 있다. 이종성은 여러 수준으로 나타날 수 있다. 글리코실화 부위는 완전 점유 내지 비점유 상태로 다양할 수 있고, 임의의 특정 부위는 다수의 다양한 올리고사카라이드 구조가 차지할 수 있으며, 여기서 각 구조는 시알산 분자, 예컨대 NANA 또는 NGNA에 의해 개질될 수 있다.
본 발명의 단백질의 탄수화물 함량은 본원의 실시예에 기재된 방법을 비롯한 당업계에 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다. 글리코실화 분석을 위한 몇가지 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 상황에 있어서 유용하다. 이러한 방법은 생성된 펩티드에 부착된 올리고사카라이드의 동정 및 조성과 관련한 정보를 제공한다. 본 발명과 관련하여 유용한 탄수화물 분석 방법에는 렉틴 크로마토그래피; 펄스형 전류 검출 (HPAEC-PAD) (고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 전하에 기초하여 올리고사카라이드를 분리함)과 조합된 고성능 음이온-교환 크로마토그래피; NMR; 질량 분석법; HPLC; 다공성 흑연화 탄소 (GPC) 크로마토그래피가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
올리고사카라이드를 방출하는 방법은 공지되어 있다. 상기 방법에는 1) 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-α-갈락토시다제를 사용하여 흔히 수행되는 효소적 방법; 2) 심한 염기성 환경을 이용하여 주로 O-연결된 구조를 방출시키는 β-제거 방법; 및 3) 무수 히드라진을 사용하여 N- 및 O-연결된 올리고사카라이드 둘 모두를 방출시키는 화학적 방법이 포함된다. 분석 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 1. 모든 완충 염을 제거하기 위해 탈이온수로 샘플을 투석한 다음 동결건조시킴; 2. 무수 히드라진으로 올리고사카라이드쇄 그대로 방출시킴; 3. 무수 메탄올성 HCl로 올리고사카라이드쇄 그대로 처리하여 개별 모노사카라이드를 O-메틸 유도체로 유리시킴; 4. 임의의 1차 아미노 기의 N-아세틸화; 5. 유도체화시켜 퍼-O-트리메틸실릴 메틸 글리코시드를 수득함; 6. CP-SIL8 칼럼 상 모세관 기체-액체 크로마토그래피 (GLC)에 의해 상기 유도체들을 분리시킴; 7. GLC 및 질량 분석기로부터 공지된 표준과 비교한 체류 시간에 의해 개별 글리코시드 유도체의 확인; 8. 내부 표준 (13-O-메틸-D-글루코스)으로 FID에 의해 개별 유도체를 정량함.
중성 및 아미노 당의 존재는 펄스형 전류 검출 (HPAEC-PAD 탄수화물 시스템; 디오넥스 코퍼레이션(Dionex Corp.))과 조합한 고성능 음이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 당은 100℃에서 6시간 동안 20％ (v/v) 트리플루오로아세트산 중에서 가수분해시킴으로써 방출될 수 있다. 이어서, 가수분해물을 동결건조 또는 스피드-백(Speed-Vac) (사반트 인스트러먼츠(Savant Instruments))로 건조시킨다. 이어서, 잔기를 1％ 나트륨 아세테이트 삼수화물 용액에 용해시키고, HPLC-AS6 칼럼 상에서 분석한다 (문헌 [Anumula et al., 1991, Anal. Biochem., 195:269-280]에 기재된 대로).
별법으로, 면역블롯 탄수화물 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에서, 단백질-결합 탄수화물은, 하젤벡(Haselbeck) 등 (1993, Glycoconjugate J., 7:63)에 의해 기재된 산화 면역블롯 절차에 기초한 상업용 글리칸 검출 시스템 (베링거)을 사용하여 검출된다. 니트로셀룰로스 막 대신 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 단백질을 이동시키고, 블로킹 완충액이 10 mM Tris 완충액 (pH 7.4) 중 5％ 소 혈청 알부민을 0.9％ 염화나트륨과 함께 함유한다는 것을 제외하고는 제조자에 의해 추천되는 염색 프로토콜을 따른다. 알칼리성 포스파타제 접합체 (베링거)에 연결된 항-디곡시제닌 항체 (Tris 완충된 식염수 중 1:1000 희석물)로 100 mM Tris 완충액 (pH 9.5, 100 mM 염화나트륨 및 50 mM 염화마그네슘을 함유함) 중 포스파타제 기질, 4-니트로블루 테트라졸륨 클로라이드 0.03％ (w/v) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스테이트 0.03％ (w/v)를 사용하여 검출을 수행한다. 탄수화물 함유 단백질 밴드는 통상적으로 약 10 내지 15분 후에 시각화된다.
또한, 단백질과 조합된 탄수화물은 펩티드-N-글리코시다제 F에 의한 분해로 절단될 수 있다. 상기 절차에 따라, 잔류물을 완충액 (0.18％ SDS, 18 mM 베타-머캅토에탄올, 90 mM 포스페이트, 3.6 mM EDTA 함유, pH 8.6) 14 μL에 현탁시키고, 100℃에서 3분 동안 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 대략 이등분한다. 한 부분을 추가로 처리하지 않고, 대조군으로 사용한다. 다른 부분을 약 1％ NP-40 세제로 조정한 다음, 펩티드-N-글리코시다제 F (베링거) 0.2 단위를 첨가한다. 두 부분을 37℃에서 2시간 동안 가온한 다음, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석한다.
당단백질의 글리칸 맵핑은 더욱더 많이 받아들여지고 있다. 본원에 기재된 방법은 글리칸 유형 말단의 올리고사카라이드, 시알릴화의 정도 및 탄수화물의 비-환원 말단 상 분지의 수의 특성화를 신속하게 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 특정 올리고사카라이드 프로파일을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 집단을 제공한다. 올리고사카라이드 프로파일링은 올리고사카라이드의 크로마토그래피 분리에 이어, 검출 및 상대적 정량화에 의해 전형적으로 실시된다. 크로마토그래프 프로파일링의 대안으로, 온라인(online) 탈염 후 ESI 주입에 의한 올리고사카라이드의 직접 분석이 있다.
PGC에 의한 올리고사카라이드 프로파일링은 CTLA4-Ig 분자로부터의 N-연결된 올리고사카라이드의 특성을 규명하기 위해 사용될 수 있다. O-아세틸화 시알산 기를 함유하는 구조적 계열을 비롯하여 CTLA4-Ig 분자 (서열 2)로부터 확인된 31개의 구조적 계열의 올리고사카라이드가 존재한다. 구조적 계열 확인은 MS/MS 및 양이온 방식 MS를 사용하여 달성된다. 구조적 계열의 상대적 정량화는 206 nm에서 UV 트레이스의 통합을 통해 가능하다. 개별 N-연결 부위로부터 아집단 프로파일의 비교는 공지되어 있으며, N-연결 부위 사이의 유의한 집단 차이를 나타낸다. PGC를 사용한 올리고사카라이드 프로파일링은 보다 전통적인 프로파일링 방법 (예컨대, HPAEC)에 대한 훌륭한 대안으로서 정보를 편리하게 제공한다.
서열 2의 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자의 N-연결된 구조
CTLA4-Ig 다량체 또는 이량체 상의 쇄 당 (즉, 단량체 당) 3개의 N-연결된 글리코실화 부위가 존재하며, 여기서 단량체는 서열 2로부터의 서열, 예를 들어 (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 또는 (vi) 서열 2의 25 내지 383을 갖는다. 부위에 따른 글리코실화의 변화는 단백질을 트립신으로 분해하여 N-연결된 글리칸을 함유하는 펩티드 단편을 단리함으로써 분석한다. 단백질 상의 N-연결된 글리코실화 부위는 트립신 단편 5, 7 및 14에 함유된 Asn102, Asn134 및 Asn233에 각각 위치한다. 단리된 펩티드 단편으로부터 N-연결된 올리고사카라이드의 효소적 방출에 이어, 방출된 올리고사카라이드의 PGC 프로파일링은 도 13에 도시한 프로파일을 초래한다. Asn233 (트립신 단편 14, T14)에서 방출된 글리칸의 프로파일로부터 올리고사카라이드 집단이 아시알로 구조 (구조는 시알산을 가지지 않음)에 풍부하다는 것이 명백하다. Asn102 및 Asn134 (T5 및 T7)에 부착된 글리칸으로부터의 올리고사카라이드 프로파일은 시알릴화 구조의 대부분을 함유한다.
당단백질로부터 방출된, 단리된 올리고사카라이드를 다공성 흑연화 탄소 LC/UV/MS 시스템에 직접 주입한다. 도 14 및 15는 산성 및 염기성 첨가제를 함유하는 아세토니트릴 구배에 의해 생성된 전형적인 PGC 프로파일의 TIC 및 UV 크로마토그램을 도시한다. 대부분의 경우, 단일 크로마토그래프 피크로부터의 질량 스펙트럼은 단일 올리고사카라이드에 대한 다수의 피크를 함유한다. 30개의 올리고사카라이드 구조적 계열은 TFA를 함유하는 용출 프로파일로부터 확인된다. 16개의 올리고사카라이드 구조적 계열만이 NH4OH를 함유하는 용출 프로파일로부터 확인된다. N-아세틸뉴라민산 (NANA) 대신 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA)으로 치환되고, 시알산 아세틸화의 정도가 다른 변이체 구조가 각 구조적 계열 내에 존재한다. 올리고사카라이드 계열에 대한 이온 계수의 비교로부터 정량적 정보만 얻을 수 있으나, 4개의 도메인 각각의 주요 구조적 계열이 P2100, P2111, P2122 및 P3133이라는 것이 명백하다. 이는 206 nm에서 UV 트레이스로부터 수득된 통합 값과 일치한다. 추가적인 구조적 확인은 양이온 질량 분석기로부터 수득될 수 있다. 양이온 방식 이온화는 주로 당체 결합에서 올리고사카라이드의 소스(source) 단편화를 촉진시킨다. 음이온 질량 스펙트럼에 의해 측정시 올리고사카라이드가 우수하게 분리되므로, 양이온 방식으로부터의 단편화 스펙트럼은 양이온 MS/MS 스펙트럼을 모방한다. 도메인 III (디-시알릴화 구조)은 유의한 양의 O-아세틸화 구조 P2122-Ac를 함유한다. 양이온 m/s 데이타는 구조 상 시알산 중 하나의 O-아세틸화를 지지한다. 시알산 잔기 중 가장 흔한 O-아세틸화 부위는 C-7 및 C-9 위치이다 (문헌 [Shi WX, Chammas R., Varki A., J. Biol. Chem. 271 (1996) 15130-15188]). 생리학적 세포외 pH에서, C-7 위치의 O-아세틸 에스테르는 자발적으로 C-9로 이동한다. 따라서, 가장 가능성이 높은 O-아세틸화 부위는 C-9이다.
N-연결된 올리고사카라이드 함량의 분석: 분석 기술은 비제한적 실시양태에서 하이퍼카르브(Hypercarb) 칼럼을 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 N-연결된 올리고사카라이드를 절단하고 단리하는 것을 포함할 수 있다. 글리칸을 하이퍼카르브 크로마토그래피하여 단리하고, 특정 당단백질을 개질하는 탄수화물의 유형을 측정하는 HPAEC-PAD 분석에 의해 분석할 수 있다. 또한, 다공성 흑연화 탄소 (PGC)를 사용하는 액체 크로마토그래피/질량 분광법 (LC/MS)에 의해 N-연결된 올리고사카라이드의 분석적 특성화를 달성할 수 있다. 또한, 탄수화물 분석에는 탄수화물 구조를 포함하는 펩티드를 측정하기 위한 트립신, Asp-N 및 트립신/키모트립신 펩티드 맵핑이 포함될 수 있다.
일련의 직교 질량 분광법 및 HPAEC-PAD 기술을 사용하여 N-연결된 올리고사카라이드 구조를 분석할 수 있다 (실시예 참고). 이러한 기술에는 몇 차례의 엔도펩티다제 절단에 이은 LC/MS/MS 분석이 포함된다. 서열 2로부터의 서열을 갖는 CTLA4-Ig 단량체와 관련하여, N-연결된 글리코실화의 주요 부위 3개는 LC/MS 및 LC/MS/MS 전자분무 이온화를 사용하여 특성을 규명하고, 각 N-연결 부위의 주요 구조를 측정한다. 이러한 데이타를 도 9에 요약하였다. Asn102, Asn134 및 Asn233에서 N-연결된 올리고사카라이드에는 3개 이상의 주요 부착 위치가 존재한다. 또한, Asn233은 시알산 기를 함유하지 않는 (당시 약 80％ 정도 일어남) N-연결된 구조의 집단을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
당펩티드의 LC/MS, 올리고사카라이드의 LC/MS, 및 HPAEC-PAD에 의해 측정된 CTLA4-Ig의 N-연결된 올리고사카라이드 구조: N-연결된 탄수화물은 Asn - X - Ser/Thr의 컨센서스(consensus) 서열 모티프와 관련된다. 상기 서열은 하기 서열 중 하나를 갖는 CTLA4-Ig 단량체쇄 상에 3회 나타난다: (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 2의 25 내지 383. 컨센서스 서열 모티프는 서열 2 중 Asn102Leu103Thr104; Asn134Gly135Thr136; 및 Asn233Ser234Thr235에서 나타난다. 컨센서스 서열에 기초하여, 하기 단량체 서열 중 하나 또는 두개로 형성된 이량체 분자 당 6개의 N-연결된 탄수화물 부위가 존재한다: (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 2의 25 내지 383.
N-연결된 탄수화물은 3가지 일반적인 종류인 고농도-만노스, 하이브리드 및/또는 복합체일 수 있다. 당펩티드 분석에 대한 LC/MS 기술이 발달되어 있다. 단량체 ((i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 2의 25 내지 383 중 하나의 서열을 가짐)의 트립신 내단백질분해성(endoproteolytic) 절단은 N-연결된 글리코실화를 함유하는 3개의 펩티드를 초래한다. 3개의 모든 N-연결된 부위는 탄수화물 구조가 차지한다. 서열 2의 아미노산 65 내지 109에 해당하는 트립신 단편 T5는 Asn102 상에 글리코실화를 함유한다. 서열 2의 아미노산 120 내지 154에 해당하는 트립신 단편 T7은 Asn134 상에 글리코실화를 함유한다. 서열 2의 아미노산 229 내지 237에 해당하는 트립신 단편 T14는 Asn233 상에 글리코실화를 함유한다.
각 부위의 글리코실화의 특정 유형을 결정하기 위해, 단백질 분해 및 분리의 규모를 증가시킨 다음, T5, T7 및 T14 펩티드를 수집함으로써 각 특정 부위로부터 탄수화물을 수득하였다. 관심의 대상인 트립신 펩티드 피크를 PNGase F로 처리하고, 하이퍼카르브 칼럼 상의 LC/MS에 의해 분석하였다. 결과는 각 부위에서 복합체 2-, 3-, 및 4-안테나형 구조의 이종성 집단을 나타내었다. 이를 도 13에 나타낼 수 있으며, 여기서 크로마토그래피는 당을 5개의 도메인인 아시알로, 모노-시알로, 디-시알로, 트리-시알로 및 테트라-시알로 구조 (각각 도메인 I, II, III, IV 및 V로 지칭됨)로 분리한다. Asn102 (T5) 탄수화물에 대한 크로마토그램 (도 13의 패널 A)은 그 부위에서 일련의 모노- 및 디-시알로 구조를 도시한다. Asn134 (T7)에 대한 크로마토그램 (도 13의 패널 B)은 2개의 주요 디-시알로 구조를 모노-시알로 구조 집단과 함께 도시한다. Asn233 (T14)에 대한 크로마토그램 (도 13의 패널 C)은 소규모 시알릴화를 도시한다. N-연결된 탄수화물 부위 각각에 대한, MS 스펙트럼 및 상응하는 구조가 각 크로마토그램의 주요 피크에 나타난다 (도 13의 패널 E, F, H 참고). 도 13의 패널 D에서, CTLA4-Ig의 전체 N-연결된 탄수화물 프로파일이 크로마토그램에서 나타난다. 선택된 피크의 질량 및 구조가 표 1에 열거되어 있다. 펩티드 맵의 상세한 분석에 의해 올리고사카라이드 LC/MS 데이타가 지지되었다. Asn102 (T5 펩티드)는 2-안테나형, 아시알릴화 구조부터 4-안테나형, 테트라-시알릴화 구조에 이르는 가장 큰 정도의 탄수화물 이종성을 갖는다. Asn134 (T7 펩티드)는 주로 2-안테나형 구조를 함유한다. 이 부위는 Asn102 부위에 비해 훨씬 적은 이종성을 함유한다. Asn233 (T14 펩티드) 부위는 소규모 시알릴화를 함유한다. 또한, 세번째 분석 기술인 HPAEC-PAD를 사용하여 2개의 직교 LC/MS 결과를 지지하였다.
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전체 N-연결된 탄수화물의 집단을 HPAEC-PAD를 이용하여 분석하였다. 이러한 방법으로 수득된 데이타를 표 2 및 3에 열거하였다. 표 2에서, 트리-시알로 도메인에 대한 아시알로의 상대 면적 백분율을 각 부위 (서열 2의 Asn102, Asn134 및 Asn233)에 열거한다. 표 3에서, 올리고사카라이드 도메인 면적 백분율을 올리고사카라이드 전체 집단의 분율로서 열거한다.
Figure 112011097388832-pat00041
Figure 112011097388832-pat00042
전체 글리코실화를 추정.
당펩티드의 LC/MS, 올리고사카라이드의 LC/MS 및 HPAEC-PAD에 의해 측정된 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 N-연결된 올리고사카라이드 구조: N-연결된 탄수화물은 Asn - X - Ser/Thr의 컨센서스 서열 모티프와 관련된다. 상기 서열은 하기 서열 중 하나를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체쇄 상에 3회 나타난다: (i) 서열 4의 26 내지 383, (ii) 서열 4의 26 내지 382, (iii) 서열 4의 27 내지 383, (iv) 서열 4의 27 내지 382, (v) 서열 4의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 4의 25 내지 383. 컨센서스 서열 모티프는 서열 4 중 Asn102Leu103Thr104; Asn134Gly135Thr136; 및 Asn233Ser234Thr235에서 나타난다. 컨센서스 서열에 기초하여, 하기 단량체 서열 중 하나 또는 두개로 형성된 이량체 분자 당 6개의 N-연결된 탄수화물 부위가 존재한다: (i) 서열 4의 26 내지 383, (ii) 서열 4의 26 내지 382, (iii) 서열 4의 27 내지 383, (iv) 서열 4의 27 내지 382, (v) 서열 4의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 4의 25 내지 383.
N-연결된 탄수화물은 3가지 일반적인 종류인 고농도-만노스, 하이브리드 및/또는 복합체일 수 있다. 당펩티드 분석에 대한 LC/MS 기술이 발달되어 있다. 단량체 ((i) 서열 4의 26 내지 383, (ii) 서열 4의 26 내지 382, (iii) 서열 4의 27 내지 383, (iv) 서열 4의 27 내지 382, (v) 서열 4의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 4의 25 내지 383 중 하나의 서열을 가짐)의 트립신 내단백질분해성 절단은 N-연결된 글리코실화를 함유하는 3개의 펩티드를 초래한다 (실시예 22의 표 25 참고). 3개의 모든 N-연결된 부위는 탄수화물 구조가 차지한다. 서열 4의 아미노산 65 내지 109에 해당하는 트립신 단편 T5는 Asn102 상에 글리코실화를 함유한다. 서열 4의 아미노산 120 내지 154에 해당하는 트립신 단편 T7은 Asn134 상에 글리코실화를 함유한다. 서열 4의 아미노산 229 내지 237에 해당하는 트립신 단편 T14는 Asn233 상에 글리코실화를 함유한다 (실시예 22의 표 25 참고).
각 부위의 글리코실화의 특정 유형을 결정하기 위해, 단백질 분해 및 분리의 규모를 증가시킨 다음, T5, T7 및 T14 펩티드를 수집함으로써 각 특정 부위로부터 탄수화물을 수득하였다. 관심의 대상인 트립신 펩티드 피크를 PNGase F로 처리하고, 하이퍼카르브 칼럼 상의 LC/MS에 의해 분석하였다. 결과는 각 부위에서 복합체 2-, 3-, 및 4-안테나형 구조의 이종성 집단을 나타내었다. 이를 도 16에 나타낼 수 있으며, 여기서 크로마토그래피는 당을 4개의 도메인인 아시알로, 모노-시알로, 디-시알로 및 트리-시알로 구조 (각각 도메인 I, II, III 및 IV로 지칭됨)로 분리한다. 분석가능하며, 글리코실화 분자, 또는 글리코실화 분자를 포함하는 집단 또는 조성물 사이에 비교가능한 탄수화물 프로파일의 특징에는 피크 면적 백분율, 도메인 면적 백분율, 밸리(valley) 간 거리 또는 피크 간 거리가 포함된다.
CTLA4-Ig N-연결된 올리고사카라이드의 LC/MS 특성화
LC/MS 다공성 흑연화 탄소 (PGC) 크로마토그래피는 N-연결된 올리고사카라이드를 프로파일링하는 방법이며, 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC) 보다 몇가지 장점을 제공할 수 있다. 이러한 장점 중 일부는 다음과 같다; 분해 혼합물로부터의 직접 프로파일링은 샘플 손실 및 붕괴를 최소화한다; 직접 MS 접촉은 올리고사카라이드의 신속한 특성화 및 분석 방법을 제공한다; PGC 크로마토그래피를 통해 증가된 분할은 두 도메인-간 비교를 가능케하고, 보다 미묘한 도메인-내 분석을 가능케한다.
LC/MS PGC 방법은 글리칸 유형 말단의 올리고사카라이드의 신속한 프로파일링 및 특성화, 시알릴화의 정도 및 탄수화물의 비-환원 말단 상 분지화를 측정하게 한다. 이어서, 음이온 방식 MS 스펙트럼은 최소 올리고사카라이드 단편화로 해석하기 간단한 데이타를 생성하며, 포지티브 방식 이온화는 구조적 계열 확인을 가능케한다. 본원에 기재된 방법은 당단백질의 분해 혼합물 전체 및 유도체화를 필요로하지 않는 앞서 단리된 올리고사카라이드 샘플에도 적용될 수 있다. 사용되는 크로마토그래피 이동상은 보다 상세한 특성화를 위한 추가 조작 없이, 프로파일로부터 피크를 수집하게 하고, 건조한 상태까지 농축할 수 있게 한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig의 N-연결된 올리고사카라이드의 특성을 규명하기 위해 상기 방법이 사용된다. LC/MS PGC 방법을 사용하여, 서열 2로부터의 서열 (예컨대, 서열 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)을 갖는 단량체로 구성된 CTLA4-Ig 분자 상에서 31개의 구분된 계열의 올리고사카라이드를 확인할 수 있다.
고 pH 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC)는 유도체화를 필요로 하지 않고 당단백질로부터 방출된 올리고사카라이드를 프로파일링하기 위해 널리 사용되어 왔다. HPAEC의 고도 분할, 및 분리가 존재하는 당 잔기의 유형, 결합 유형 및 글리칸의 크기에 영향을 받는다는 사실은 이 기술을 널리 사용하는 이유이다. 분리에서 우선 인자는 전하이며, 고도로 하전된 올리고사카라이드는 덜 하전된 글리칸 보다 늦게 용출한다. 크로마토그래프 프로파일은 대체로 하전된 종, 전형적으로 글리칸 상의 시알산 잔기의 수에 의해 정의된 도메인으로 분류된다 (도 17).
공지되지 않은 올리고사카라이드의 구조에 관한 더 많은 정보를 획득하기 위해 HPAEC 피크를 수집할 수 있으며, 탈염시키고 MS 및/또는 NMR에 의해 특성을 규명할 수 있다. 올리고사카라이드 분포의 HPAEC-PAD 프로파일링에서 한가지 고려할 사항은 검출 방식에 따라 변화가 존재한다는 것이다. 전기화학적 세포 노화 및 전극 표면 부착은 프로파일 변화를 초래한다. 또한, HPAEC를 펄스형 전류 검출과 함께 사용하는 경우 (HPAEC-PAD), 올리고사카라이드 구조 및 시알릴화의 정도는 검출 세포 간 변화를 일으킬 수 있다는 것이 보고되어 있다. 이러한 변화는, 공정 변화의 효과를 평가하고, 뱃치 대 뱃치 일관성을 측정하기 위해 사용되는 정량적 결과 및 상대적인 정량적 결과에 영향을 미칠 수 있다. 그 속도와 특이성 때문에, 질량 분광법 (MS)은 당단백질의 올리고사카라이드 프로파일링 평가 기술로 대중성을 얻어왔다. 비록 MS 프로파일이 아노머성 배위(configuration) 또는 분지화 패턴을 직접적으로 측정하기 위해 사용될 수는 없으나, MS 데이타는 구조적 계열을 식별하고, 당형태 분포의 정성적 변화를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
효소적으로 방출된 N-연결된 올리고사카라이드에 대한 다공성 흑연화 탄소 (PGC) 크로마토그래피 프로파일링 방법은 자외선 (UV) 및 질량 분석 (MS) 검출 모두를 사용하여, 효소적 분해 혼합물 또는 단리된 올리고사카라이드로부터 직접적으로 N-연결된 올리고사카라이드를 프로파일링하고 특성을 규명한다. 상기 방법을 사용하여 CTLA4-Ig 당단백질로부터 방출된 올리고사카라이드를 프로파일링하고, 특성을 규명할 수 있다. LC/MS PGC 방법은 생성 공정으로 인한 올리고사카라이드의 일관성 및 공정 변형으로 인한 올리고사카라이드 분포의 임의의 변화를 평가할 수 있다. CTLA4-Ig 분자의 N-연결된 올리고사카라이드의 크로마토그래피 미량분석에서, 효소적으로 방출된 N-연결된 올리고사카라이드는 PGC 칼럼에 의해 시알릴화 증가 및 크기 증가순으로 지속적으로 분리될 수 있다. 존재하는 구조의 범위 및 각 구조 계열의 상대적인 양은 MS 및 UV 분석을 조합하여 측정될 수 있다 (실시예 3).
LC/MS PGC 방법을 최적화하기 위해 질량 스펙트럼 조건을 최적화하는 것이 유용할 수 있다. 최적화에는, 올리고사카라이드 검출에 대한 용매 조성물의 효과 및 MS 이온화 파라미터의 효과를 평가하기 위한 표면 맵핑 실험의 셋트가 포함될 수 있다. 평가를 위한 용매 조성물 파라미터에는 백분율 아세토니트릴 (용량 기준) 및 용출 첨가제 (트리플루오로아세트산 및 수산화암모늄)가 포함된다. 평가를 위해 평가되는 MS 이온화 파라미터에는 전자분무 공급원에 대한 용매제거(desolvation) 온도, 모세관 전압 및 콘(cone) 전압 설정이 포함된다.
이온화 파라미터는 신호 반응에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 표면 맵핑 측정으로 인한 모델을 사용하여, 크로마토그래피 측정 동안 이온화 파라미터를 설정하였다. 용매제거 온도 및 콘 전압이 높은 값일 수록 반응이 커진다. 최적 모세관 전압은 용출 첨가제에 따라 달라지며, TFA를 함유하는 용매 시스템은 약간 더 높은 최적 모세관 전압을 갖는다. 가장 큰 효과를 갖는 인자는 아세토니트릴의 용량 백분율이며, 아세토니트릴 함량이 높을 수록 반응이 커진다.
다공성 흑연화 탄소 크로마토그래피
다공성 흑연화 탄소 (PGC)는 고체 상 추출을 위해 올리고사카라이드를 탈염시키는데 사용되어 왔다. 또한, PGC는 산성 및 염기성 용출 조건 모두에서 올리고사카라이드 분리를 위한, 효과적인 크로마토그래피 매질인 것으로 공지되어 있다. 서열 2로부터의 단량체 서열을 갖는 CTLA4-Ig 분자로부터 효소적으로 방출된 올리고사카라이드의 산성 및 염기성 프로파일링을 위한 크로마토그래피 조건이 개발되어 있다. 각 조건은 UV 및 MS 검출 모두에 적합하다. 주입 실험에서 관찰된 바와 같이, 산성 용출 조건은 염기성 조건에서보다 더 높은 MS 민감도를 초래한다. TFA 부가물로 검출했을 때, 산성 조건에서 용출된 중성 올리고사카라이드에 대한 MS 반응은 염기성 조건하에 용출된 상응하는 피크의 강도보다 5 내지 9배이다. 산성 올리고사카라이드에 대한 신호 반응에서의 차이는 덜 인상적인데, 평균적으로 모노시알릴화 글리칸에 대한 신호 반응이 3배이고, 디-시알릴화 글리칸에 대한 신호 반응은 같다. NH4OH 용출 크로마토그램 (도 15a-b)에 비해 TFA 용출 크로마토그램 (도 14a-b)의 피크 수 증가는 올리고사카라이드의 아노머 형태 분리의 결과이다. TFA 구배로부터 용출된 개별 피크의 수집 및 농축은, 재-주입시 단일 피크가 동일한 질량의 두 피크로 분할되게 한다. PGC 칼럼으로부터 올리고사카라이드의 염기성 용출은 보다 간단한 프로파일을 나타낸다 (도 15a-b). 염기성 용출 조건은 완전한 아노머 분리를 초래하지 않으나, 유의한 피크 확장이 관찰된다. 피크 분할은 칼럼 온도의 증가 (아노머 형태의 내부변화를 가속화시킬 것임)에 의해 증가될 수 있다 (문헌 [Itoh S., et al., J. Chromatogr. A. 2002 968(1-2), 89-100]). 그러나, 검출된 올리고사카라이드에 대한 민감도 (이온 계수)는 산성 용출 조건에 비해 감소된 채로 유지된다. 암모늄 아세테이트와 같은 염의 첨가는 민감도를 증가시키킬 수 있는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Churms SC, J. Chromatogr. A. 500(1990) 555-583]).
암모늄 아세테이트, 암모늄 트리플루오로아세테이트 또는 암모늄 포르메이트를 첨가하면 반응이 증가되나, 또한 비대칭 피크가 확장된다. UV 검출로 첨가된 염으로 인한 피크 확장 및 전위 간섭 때문에, 염을 첨가하는 것은 관심을 끄는 옵션이 아니다. 아노머 분리를 제거하기 위한 다른 방법은 올리고사카라이드를 상응하는 알디톨로 환원시키는 것이다.
민감도 및 크로마토그래피 분할이 클수록 산성 용출 조건이 올리고사카라이드 프로파일링에 대해 유용하다. 루나(Luna) C18 칼럼으로 이루어진 특정 프로파일링 시스템은 2개의 이중-위치 6개 포트 밸브를 통해 하이퍼카르브 5 μM 칼럼 (100 x 4.6 mm)과 조합된다. 하이퍼카르브 칼럼을, Q-ToF 마이크로 (마이크로매스(Micromass)), 표준 ESI 프로브와 연결된 UV 검출기 (워터스(Waters) 2996 PDA)에 조합한다. 적절한 스위치 조절을 통해, 하이퍼카르브 칼럼을 단독으로 사용하여 예비정제된 CTLA4-Ig 샘플을 프로파일링하거나, 분해 혼합물을 하이퍼카르브 칼럼과 연결된 루나 C18 상에 분해 혼합물을 직접 주입하여 분해 혼합물을 프로파일링할 수 있다. 전형적으로, 10 내지 20 nmol의 단백질로부터 방출된 N-연결된 올리고사카라이드로부터 프로파일을 수득한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대표적인 피크를 갖는 크로마토그램 중 임의의 하나 이상에 따른 크로마토그램을 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 서열 2로부터의 서열의 단량체를 갖는 CTLA4-Ig 분자에 대한 대표적인 올리고사카라이드 프로파일 크로마토그램이 도 13, 도 14a-b, 도 15a-b (PGC), 도 17 (HPAEC/PAD) 및 도 18a-b에 도시되어 있다. 이들 크로마토그래피 프로파일 모두 올리고사카라이드 구조를 함유하는 4개의 구별된 도메인으로 구분될 수 있다 (나중에 용출되는 도메인의 시알릴화 정도가 증가함). PGC 크로마토그래피 시스템은 질량 검출기와 직접 접촉시킨다. 잡음 비율에 대한 질량 분할 및 신호는 낮은 백분율로 존재하는 올리고사카라이드에도 허용가능하다. 개별 올리고사카라이드 구조의 크로마토그래피 분할은 HPAEC에 비해 PGC 크로마토그래피 분리에서 더 크게 나타난다.
HPAEC 방법으로부터 피크를 수집하는 것은 탈염을 요구하며, 사용되는 높은 pH는 피크의 정확한 구조적 확인을 간섭할 수 있는 필링(peeling) 반응의 가능성을 도입한다. PGC 크로마토그래피에서 사용된 크로마토그래피 조건은 염이 없으므로, 용출된 올리고사카라이드 피크를 수집하여, 최소 조작으로 농축시킬 수 있다. 이는 용출된 피크의 수집 및 농축에 이어, 수집된 올리고사카라이드를 HPAEC 시스템 상에 주입하는 것을 가능케한다. 수집된 올리고사카라이드를 HPAEC-PAD 시스템 상에 재-주입하는 것은 HPAEC 프로파일에 존재하는 피크 일부의 구조적 지정을 가능케한다 (도 17). 음이온 교환 칼럼 상의 불완전한 피크 분할로 인해, 단리된 피크 모두 HPAEC 프로파일로 맵핑될 수 없다.
분해 혼합물의 직접 주입으로 인한 프로파일 및 동일한 단백질 샘플로부터 단리된 올리고사카라이드에 대한 프로파일은 동일하지 않다. 직접 주입으로 인한 프로파일 (도 18a-b)은 다른 아노머 비율을 가지며, 수집된 올리고사카라이드의 농축이 아노머화를 증가시킴을 시사한다. 보다 중요하게는, 직접 주입으로 인한 프로파일은 테트라-시알릴화 구조에 해당하는 피크를 함유한다. 이러한 구조는 수집되고 단리된 올리고사카라이드의 프로파일에서 확인되지 않는다. 단축된 분석 시간 이외에도, 분해 혼합물로부터의 직접 프로파일링함으로써 수집 및 농축 동안의 글리칸 붕괴를 피할 수 있어서 올리고사카라이드 분포를 보다 정확하게 표현할 수 있다.
상대적 정량화
주입 샘플 상에서 수행된 표면 맵핑은, 아세토니트릴의 용량 백분율이 용출 올리고사카라이드의 이온화 효율에 유의한 영향을 미친다는 점을 시사한다. 이동상에서 신호 강도가 아세토니트릴 함량에 좌우됨에 따라, MS에 의한 올리고사카라이드의 상대적 정량화가 용출 피크의 체류 시간에 좌우된다. 칼럼 조건의 변화는 PGC 칼럼 상에서의 용출 시간에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 이유로, 이온 크로마토그램 용출 프로파일로부터 일관된 상대적 정량화를 달성하는 것은 어려울 것이다. 206 nm에서의 UV 트레이스는 이온 트레이스와 동일한 정도로 용매 조성의 영향을 받지 않아야 한다. UV 트레이스를 이용하여 상대적 정량화를 수행하였고, 이온 트레이스는 오직 특성 분석 및 정성적 비교를 위해서만 이용하였다. 단일 당단백질 로트로부터 단리된 올리고사카라이드에서의 반복된 주입 결과, 정량된 4개의 올리고사카라이드 도메인 각각에서 4％ 미만의 상대적 표준 편차 (％RSD)가 나타났다.
서열 2의 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자에서의 O-연결된 구조
CTLA4-Ig 분자는 N-연결된 탄수화물 이외에도, O-연결된 탄수화물을 함유할 수 있다. O-연결된 올리고사카라이드 구조는 일련의 직교 질량 분광 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 이러한 기술에는 수회의 엔도펩티다제 절단에 이은 LC/MS/MS 분석이 포함된다.
서열 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터의 한 서열을 갖는 단량체로 형성된 CTLA4-Ig 분자와 관련하여, 정확한 질량의 전자분무 이온화법을 이용하여 2개의 주요 O-연결된 글리코실화 부위를 특성 분석하고, 각 O-연결 부위에서의 주요 구조를 결정하였다. 이들 데이타는 도 9에 요약되어 있다. 데이타는 3개의 주요 O-연결된 구조, 즉 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1; (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2; (GalNAc)1(GlcNac)1(Gal)2(NeuAc)2와 부합한다. 각 구조는 각 부위에서 다양한 양으로 관측된다. 이들 양은 비교적 정량적이며, 다중 분석으로부터 얻어진 데이타에 해당한다. O-연결된 올리고사카라이드는 CTLA4-Ig에 상당한 양의 시알산을 부여한다. 쇄 당 2개의 주요 O-연결된 올리고사카라이드 부착 지점이 존재한다. O-연결된 올리고사카라이드에서의 제1 발생 부위는 Ser165이고, 이는 시간의 약 95％를 점유한다. O-연결된 올리고사카라이드에서의 제2 발생 부위는 Ser155/156이고, 이는 시간의 25％를 점유한다. 본원에 제공된 직교 데이타는 CTLA4-Ig 분자 상에 존재하는 우세 탄수화물 구조에 대한 개요를 제공하며, 도 9에 요약되어 있다.
일반적으로, O-연결된 탄수화물의 구조적 이질성은 N-연결된 탄수화물의 경우보다 매우 크다. 또한, O-연결 부착에 대한 컨센서스 서열이 존재하지 않는다. 따라서, O-연결된 올리고사카라이드 구조의 특성 분석에서 이용하기 위한 일련의 직교 기술 (LC/MS 무손상 분석법 및 LC/MS 당펩티드 분석법)을 개발하였다.
에드만 (Edman) 분해 및 MALDI에 기초하여, O-연결 부위는 Ser165인 것으로 보고되었다 (서열 2 기준). Ser165 글리코실화의 존재 여부에 대한 직접적인 데이타를 수득하기 위해, T9 펩티드 상에서 b' 및 y" 이온 시리즈를 이용한 MS/MS 서열 분석을 수행하였다 (하기 표 4 및 5 참조). 표 4에는 상이한 4가지 글리코실화 상태의 T9 펩티드에서의 이온 시리즈가 열거되어 있다. 4가지 상태 모두에서, b' 이온 시리즈 b1 내지 b6 이온은 일치한다. 그러나, b' 이온 시리즈 b7 내지 bmax는 b7에서의 글리코실화 상태가 달라짐에 따라 변화한다 (Ser165). 확인차, 상응하는 y" 이온 시리즈를 보고한다. 4가지 y" 이온 시리즈 모두에서, y1 내지 y19 이온은 완전히 일치한다. 그러나, y" 이온 시리즈 y20 내지 ymax는 y20에서의 글리코실화 상태가 달라짐에 따라 변화한다 (Ser139). b' 및 y" 이온 시리즈는 함께, 에드만 서열 분석이 시사하는 바 (즉, Ser139가 T9 펩티드 상에서의 제1 O-연결된 글리코실화 부위임)를 뒷받침한다. T9는 다수의 세린 및 트레오닌 잔기를 함유하는 펩티드이다.
표 4는 O-연결된 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1 래더 (ladder)가 있거나 없는 T9 펩티드 상에서의 LC/MS/MS b' 및 y" 이온을 제공한다. b' 이온 시리즈의 경우, b7까지 모든 스펙트럼이 일치한다 (이후, 각 시리즈 위에 열거된 O-연결된 탄수화물 구조에 따라 스펙트럼이 달라짐). y' 이온 시리즈의 경우, y19까지 모든 스펙트럼이 일치한다 (이후, 각 시리즈 위에 열거된 O-연결된 탄수화물 구조에 따라 스펙트럼이 달라짐).
Figure 112011097388832-pat00043
상응하는 서열 번호. 아미노산 서열 및 이론적 질량을 갖는 O-연결된 당펩티드 단편
효소 효소 단편 서열 단편 아미노산 서열
(서열 2)		 비변형 질량
트립신 T9 159-184 THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK 2688.44
AspN D8 150-156 DQEPKSS 790.36
Tryp/chrmo N/A 159-171 THTSPPSPAPELL 1345.7
Ser165에서의 O-연결된 탄수화물 구조는 3개의 주요 종의 이종성 집단을 나타낸다. 도 19에서, T9 당펩티드는 디컨볼루션된 스펙트럼에서 관측된다. 2689.11 amu에서의 펩티드에 대한 이론적 질량과 일치하는, 2689.2 amu에서의 기재 피크가 존재한다. 스펙트럼에서는 3개의 주요 O-연결된 구조가 나타난다. 스펙트럼에서는 O-연결된 구조 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1과 일치하는 당 래더를 갖는 기재 펩티드가 나타난다. 스펙트럼의 확대된 진한 부분은 10배 강화된 것이며, (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2 및 (GalNAc)1(GlcNAc)1(Gal)2(NeuAc)2와 일치하는 2개의 또다른 O-연결된 구조를 나타낸다.
질량 분광법을 이용하여 각 O-연결된 종의 상대량을 측정하였다. 도 19에서, (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1 글리칸은 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2 글리칸과 함께 10:1 비율로 관측되고, (GalNAc)1(GalNAc)1(Gal)2(NeuAc)2 글리칸과 함께 30:1 비율로 관측된다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명은 10:1의 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1 글리칸 대 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2 글리칸 비율을 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 집단을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 30:1의 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1 글리칸 대 (GalNAc)1(GalNAc)1(Gal)2(NeuAc)2 글리칸 비율을 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 집단을 제공한다. (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2 글리칸은 (HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)2 글리칸과 함께 20:1 비율로 관측된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 20:1의 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2 글리칸 대 (HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)2 글리칸 비율을 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 집단을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 이 단락에 기재된 상기 비율 모두를 포함하는 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 또한, 음이온 전자분무 스펙트럼에서는 상기 3개의 우세 구조가 확인되며, 각각의 상대량은 도 9에 제시되어 있다.
서열 2의 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자와 관련하여, 제2 O-연결 부위는 Ser165 부위 이외에도 Ser155 또는 Ser156에서 관측된다. 이 부위는 Ser155/156으로 지칭된다. Ser155/156을 함유하는 D8 펩티드를 AspN 분해물로부터 생성하였고, 이는 서열 2의 아미노산 150-156에 상응한다. 펩티드를 분리하고, LC/MS에 의해 검출한다. D8 O-연결된 당펩티드에 대한 스펙트럼 (본원에 제시되어 있지 않음)에서는, 790.8 amu에서의 이론적 질량과 일치하는 790.2 amu에서의 기재 피크가 나타난다. 스펙트럼에서는 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1 구조와 부합하는 일련의 이온 및 펩티드 이온이 나타난다. 펩티드는 우세하게 비-글리코실화 상태이며, 글리코실화 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1 종은 대략 22％ 피크 면적을 구성한다.
일련의 직교 질량 분광법 기술을 이용하여 CTLA4-Ig 단일쇄의 O-연결된 올리고사카라이드 구조를 특성 분석하였다. 상기 기술에는 엔도펩티다제 절단, 및 2개의 우세 O-연결된 글리코실화 부위에 대한 LC/MS 분석 (각 O-연결 부위에서의 우세 구조를 결정하기 위한 전자분무 이온화가 이용됨)이 포함된다. 데이타는 도 20에 요약되어 있다 4개의 우세 O-연결된 구조, 즉 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1; (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2; (HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)2; (HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)3이 존재할 수 있다. 이들 구조는 각 부위에서 다양한 양으로 검출된다. CTLA4-Ig 단일쇄의 95％ 초과는 적어도 (HexNAc)2 (Gal)2(NeuAc)2를 갖는다.
O-연결된 탄수화물을 확인하고, 덜 우세한 구조를 찾기 위한 또다른 분석법을 개발하였다. 이 기술에서는, 트립신 및 키모트립신 공동-분해법을 이용하여, MS/MS에 의해 THTSPPSPAPELL (서열 2의 아미노산 159-171)인 것으로 확인되는 펩티드를 생성하였다. 이 펩티드로부터, 1개의 모노시알릴화 O-연결된 종, 2개의 디-시알릴화 O-연결된 종 및 1개의 트리-시알릴화 O-연결된 종이 확인되었다. 트리-시알릴화 종에 대한 최종적인 구조는 규정되지 않았으나, 2가지의 가능성, 즉 코어 2 구조와 3개의 시알산, 또는 2개의 코어 1 구조 (2개의 상이한 아미노산 잔기 상에 존재함)를 함유하는 펩티드가 제안된다.
상보적인 기술인 무손상 MS 분석을 이용하여 CTLA4-Ig 분자의 이종성 O-연결 글리코실화의 존재 여부를 확인하였다. CTLA4-Ig 이량체 및 CTLA4-Ig 단일쇄를 PNGase F로 처리하여 N-연결된 올리고사카라이드를 분리하였다. 이후, 분자를 질량 분광측정기에 의해 검출하고, 상응하는 이온을 스펙트럼으로 디컨볼루션하였다. 단일쇄 물질의 경우, 우세 글리칸 조성은 (HexNAc)2(Hex)2(NeuAc)2이고, 표준 조성은 우세하게는 (HexNAc)1(Hex)1(NeuAc)l이다. 글리코실화 조성은 LC/MS 펩티드 분석 동안에 관측된 것들과 일치한다. O-연결된 글리코실화 패턴에서의 변화 이외에도, 2개의 주요 변형이 관측되었다. 113 ± 4 u의 질량 이동이 단일쇄 비-환원 종과 환원된 CTLA4-Ig 표준 사이에서 관측된다. DTT로 환원시 113 ± 4 u의 질량 이동은 사라진다. 이량체 물질의 경우, 생성된 이온 외피 (ion envelope)를 79944 amu에서의 주요 피크 (2개의 (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1 구조의 존재 여부에 상응함)를 갖는 스펙트럼 (본원에 제시되어 있지 않음)으로 디컨볼루션하였다. 다음으로 가장 큰 피크 (80600 amu)는 3개의 O-연결 구조, 또는 1개 이하의 분지된 O-연결 구조의 조합에 상응한다. 세번째로 가장 큰 피크는 4개의 O-연결된 구조, 또는 2개 이하의 분지된 O-연결 구조를 함유하는 조합에 상응한다.
시알산 함량의 측정
당단백질 특성 분석의 또다른 측면은 시알산을 측정하는 것이다. 시알산 함량은 당단백질의 상징적인 특징일 수 있다. 본 발명의 당단백질의 시알산 함량은 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 시알산은 3벌 이상의 샘플을 사용하는 직접 비색 방법 (문헌 [Yao et al., 1989, Anal. Biochem., 179:332-335])에 의해 개별적으로 측정될 수 있다. 시알산 측정의 또다른 방법에는 티오바르바투르산 (TBA)을 사용하는 방법 (문헌 [Warren et al., 1959, J. Biol. Chem., 234:1971-1975]에 기재되어 있음)이 포함된다. 또다른 방법에는 (예컨대, 문헌 [H. K. Ogawa et al., 1993, J. Chromatography, 612:145-149]에 기재되어 있는) 고성능 크로마토그래피가 포함된다.
한 실시양태에서, N-아세틸 뉴라민산 (NANA) 및 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA)의 양을 측정하는 방법은 관심 당단백질의 산 가수분해 처리를 통해 수행된다 (예를 들어, 실시예 3 참조). 상기 방법에서, NANA 및 NGNA는 산 가수분해에 의해 단백질로부터 분리된다. 한 실시양태에서는, 정제에 적합한 방법에 의해 당단백질을 실질적으로 정제한다. 방출된 NANA 및 NGNA를 레젝스 (Rezex) 모노사카라이드 RHM 칼럼 상에서 HPLC에 의해 분리하고, UV 흡광법 (206 nm)에 의해 검출한다. 현행 NANA 및 NGNA 표준의 반응 인자에 기초하여 NANA 및 NGNA를 정량화한다. 그 결과는 단백질에 대한 NANA 및 NGNA 각각의 몰비 (MR)로서 보고될 수 있다.
시알산 함량의 측정을 위한 산 가수분해 방법의 목적은 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 중에서 단백질에 대한 시알산 (NANA 및 NGNA) 총량의 비율 (몰비)을 측정하는 것이다. 그러나, 이와 같은 시알산 몰비에는 결합 및 유리 상태의 NANA 및 NGNA가 포함된다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 몰비 결과는 비-가수분해 NANA 및 NGNA 표준과 가수분해된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 사이에서 NANA 및 NGNA 피크 면적의 비교를 토대로 얻어진다. NANA 및 NGNA의 가수분해된 표준도 사용될 수 있다.
예를 들어, 서열 2 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 분자에 대한 몰비가 얻어졌다. 가수분해가 없는 경우, NANA 및 NGNA 표준의 크로마토그램에서의 관심 피크는 단일 피크로서 나타난다. NANA 표준 및 CTLA4-Ig 샘플이 가수분해된 경우, 생성된 크로마토그램에서는 NANA가 주요 피크로서, 이어서 가까이에 작은 숄더 (shoulder) 피크 (주요 피크 면적의 10％ 미만; "분해된 NANA"로 지칭됨)로서 나타나고, 가수분해의 유무 하에서 동일한 농도의 NANA 표준의 경우, 매우 유사한 피크 면적 (분해물 포함)이 나타났다. 가수분해된 NGNA 표준에서의 NGNA 피크 면적이 대략 8 내지 9％ 감소된 것으로 나타났음에도 불구하고, 분해된 NGNA 종에 대한 크로마토그램에서는 피크가 명확하게 나타나지 않는다. 질량 분광법 (MS) 실험 결과, 가수분해된 NANA 표준 및 가수분해된 CTLA4-Ig 샘플에서의 "NANA 분해물"은 NANA로부터의 18 달톤의 손실 (물)로 인한 것임이 입증되었다. 따라서, 상기 방법에는 가수분해된 CTLA4-Ig에서의 NANA 피크 통합시에 작은 숄더 피크가 포함되는 것이 적절하다. 또한, 18 달톤의 손실과 함께 가수분해시, NGNA가 분해된다는 것을 MS 실험에 의해 입증하였다. NGNA 분해물은 NANA 및 NANA 분해물 사이에서 용출되었다 (따라서, UV는 이를 검출하지 않았음). CTLA4-Ig 물질의 경우, NGNA 함량은 NANA 함량의 대략 5％이고, 결과적으로 NGNA 분해물의 공동-용출은 NANA 피크 면적을 0.5％ 미만으로 변화시킨다 (이는 NANA 피크 면적의 변동 범위 내에 있음). 상기 방법의 경우, 분해된 NGNA의 면적이 NGNA 결과값에 포함될 수 없고, 따라서 NGNA 결과는 10％ 미만으로 낮을 수 있다 (또한, 상기 방법의 변동가능성 내에 있음).
NGNA는 NANA보다 면역원성이 높은 것으로 판단되기 때문에, 낮은 NGNA 몰비를 함유하는 재조합 치료제에 대한 임상적인 선호가 존재한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자 집단에서 우세한 시알산은 NGNA가 아닌 NANA이고, 이 집단에서 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체 1몰 당 시알산 몰수의 몰비는 약 5 내지 약 18이다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단에서 우세한 시알산은 NGNA가 아닌 NANA이고, 이 집단에서 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 이량체 1몰 당 시알산 몰수의 몰비는 약 5.5 내지 약 8.5이다.
CTLA4-Ig 및 CTLA4 A29YL104E -Ig 발현 카셋트
본 발명은 CTLA4-Ig 분자를 코딩하는 핵산을 제공하며, 이는 한 실시양태에서 발현 카셋트이다. 또한, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자를 코딩하는 핵산은 발현 카셋트 내에 함유된다. 또다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자를 코딩하는 핵산은, 서열 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 플라스미드로부터 유래된 발현 카셋트 내에 함유된다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 코딩하는 핵산은 발현 카셋트 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 코딩하는 핵산은, ATCC 수탁 번호 PTA-2104로 기탁된 플라스미드로부터 유래된 발현 카셋트 내에 함유된다.
본 발명의 핵산은 발현가능한 포맷 (예컨대, 발현 카셋트)의 관심 cDNA, cDNA-유사, DNA 또는 RNA 핵산 분자일 수 있고, 이는 천연 프로모터 또는 그의 유도체, 또는 완전 이종성 프로모터로부터 발현될 수 있다. 또한, 관심 핵산은 안티센스 RNA를 코딩할 수 있다. 관심 핵산은 단백질 (예를 들어, 당단백질, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질)을 코딩할 수 있고, 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
한 실시양태에서, CTLA4 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 핵산은 T 세포 게놈 DNA로부터, 또는 활성화 T 림프구에 존재하는 mRNA로부터 얻어질 수 있다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 핵산도 T 세포 게놈 DNA로부터, 또는 활성화 T 림프구에 존재하는 mRNA로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 관심 단백질, 예를 들어 CTLA4 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 유전자는 게놈 라이브러리 또는 cDNA로부터 당업자가 실시하는 표준 프로토콜에 따라 클로닝될 수 있다. (예를 들어, CTLA4 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는) cDNA는 적합한 세포주로부터 전 mRNA를 단리함으로써 얻어질 수 있다. 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 전 mRNA로부터 이중 가닥 cDNA를 마련할 수 있고, 이어서 적합한 박테리오파지 벡터 또는 플라스미드로 삽입할 수 있다. 또한, 유전자는 당업계에서 잘 확립된 PCR 기술을 이용하여 클로닝할 수 있다. 한 실시양태에서, CTLA4 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 유전자는 본 발명에 제공된 뉴클레오티드 서열 정보에 따라 PCR을 통해 클로닝될 수 있다.
또다른 실시양태에서, CTLA4 또는 CTLA4A29YL104E-Ig cDNA를 함유하는 DNA 벡터는 PCR 반응에서 주형으로서 기능할 수 있고, 이때 관심 영역을 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 그 영역을 포함하는 단리된 DNA 단편을 수득할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, CTLA4 cDNA에서 표적화된 관심 영역은 CTLA4의 세포외 도메인, 예를 들어 인간 CTLA4의 세포외 도메인일 수 있다. 특정 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig cDNA에서 표적화된 관심 영역은 서열 2의 아미노산 위치 55 및 130 (예를 들어, 서열 18 참조)에서 아미노산 변화를 갖는 CTLA4의 세포외 도메인, 예를 들어 상기 기재된 아미노산 변화를 갖는 인간 CTLA4의 세포외 도메인일 수 있다.
본 발명의 문맥에서의 융합 단백질을 발현시키기 위해, 한 실시양태의 키메라 유전자 융합물 (예를 들어, CTLA4-면역글로불린 (CTLA4-Ig) 융합 단백질 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 융합 단백질을 코딩하는 유전자)에는 뉴클레오티드 서열이 포함되고, 이는 키메라 유전자의 전사 및 번역시 새롭게 합성된 융합 단백질의 분비를 지시하는 신호 서열을 코딩한다. 한 실시양태에서, 고유 CTLA4 신호 서열 (예컨대, 문헌 [Harper, K. et al., 1991, J. Immunol. 147, 1037-1044]에 기재된 인간 CTLA4 신호 서열)이 사용될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 이종성 신호 서열은 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 분비 (예를 들어, 온코스타틴-M 신호 서열 (문헌 [Malik N. et al., 1989, Mol Cell Biol 9(7), 2847-2853]) 또는 면역글로불린 신호 서열)를 지시하는 데 사용될 수 있다. 당업자는, 표준 재조합 DNA 기술에 의해, 예컨대 CTLA4를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에서 신호 서열의 프레임내 (in-frame) 라이게이션을 수행함으로써, 신호 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 키메라 유전자 융합물에 삽입할 수 있음을 알 것이다.
부다페스트 조약의 규정 하에, CTLA4-Ig 융합 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, U.S.A.)에 1991년 5월 31일자로 기탁되었다. 상기 DNA에는 ATCC 수탁 번호 68629가 배정되었다. 또한, CTLA4A29YL104E-Ig에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 플라스미드는 부다페스트 조약의 규정 하에, 2000년 6월 19일자로 ATCC에 기탁되었다. 기탁된 플라스미드에는 ATCC 수탁 번호 PTA-2104가 배정되었다. 기탁된 플라스미드는 pD16 LEA29Y 및 pD16 L104EA29Y로도 지칭된다. CTLA4A29YL104E-Ig는 미국 특허 7,094,874 및 동시 계류중인 미국 특허 출원 번호 09/579,927, 60/287,576 및 60/214,065, 및 국제 특허 공보 WO 01/923337 A2에도 기재되어 있고, 이들 문헌 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 발현 벡터는, 벡터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질 (예를 들어, 융합 단백질, 예컨대 CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig 분자 등)을 생성하기 위해 진핵 세포 (예를 들어, 효모, 포유동물 또는 곤충 세포) 또는 원핵 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 당업자는, 원핵세포에서의 원하는 단백질 생성물의 발현이 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 갖는 이. 콜라이에서 가장 자주 수행됨을 알 것이다. 특정한 이. 콜라이 발현 벡터 (당업계에 융합-벡터로도 알려져 있음)는, 통상적으로 수많은 아미노산 잔기를 발현된 재조합 단백질의 N-말단에 첨가하도록 설계된다. 상기 융합 벡터는 다음과 같은 3가지 기능을 수행할 수 있다: 1) 목적하는 재조합 단백질의 가용성 증가; 2) 관심 재조합 단백질 발현의 증가; 및 3) 친화성 정제시 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질 정제 보조. 융합 발현 벡터의 특정 예로는, 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 원하는 단백질에 융합시키는 a) pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia); b) 6x-His를 관심 재조합 단백질에 융합시키는 pcDNA™3.1/V5-His A B ＆ C (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, U.S.A.); 및 c) 말토스 E 결합 단백질을 표적 재조합 단백질에 융합시키는 pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass., U.S.A.)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 공정 및 방법에 따른 배양에 적합한 세포는 도입된 발현 벡터 (구조물), 예컨대 플라스미드 등을 함유할 수 있다. 발현 벡터 구조물은 형질감염, 리포좀-매개 형질감염 (lipofection), 형질전환, 주입, 전기천공 또는 감염을 통해 도입될 수 있다. 발현 벡터는, 배양 공정에서의 발현 및 생성을 위한 단백질을 코딩하는 코딩 서열 또는 그의 부분을 함유할 수 있다. 이러한 발현 벡터에는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 성분이 포함될 수 있다. 생성된 단백질 및 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 발현 벡터 및 적절한 전사 및 번역 제어 요소는, 당업자에게 잘 알려져 실시되는 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합 (문헌 [J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.] 및 [F. M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, N.Y]에 기술되어 있음)이 포함된다.
선별가능한 마커는 재조합 발현 벡터 (예를 들어, 플라스미드)에서 사용될 수 있고, 상기 벡터는 세포 게놈으로 안정하게 통합되어, 벡터-함유 세포에 내성을 부여한다. 그 결과, 적절한 선별 배지에서 이들을 선별할 수 있다. 히폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HGPRT), 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV TK) (문헌 [Wigler et al., 1977, Cell, 11:223]; [Szybalska and Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202]) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (AP-RT), (문헌 [Lowy et al., 1980, Cell, 22:817]) 유전자 (이들은 각각 hgprt-, tk- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있음) (이에 제한되지는 않음)를 비롯한 수많은 선별 시스템이 사용될 수 있다.
또한, 발현 벡터 내에 함유될 수 있는 마커 유전자의 다음과 같은 비제한적 예들이 항-대사물질 내성에 대한 선별 기준으로서 이용될 수 있다: 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (문헌 [Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072]); 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (문헌 [Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3-57]; 및 [O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:1527]); 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (문헌 [Santerre et al., 1984, Gene, 30:147]); 및 아미노글리코시드 G418에 대한 내성을 부여하는 neo (문헌 [Clinical Pharmacy, 12:488-505]; [Wu and Wu, 1991, Biotherapy. 3:87-95]; [Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.. 32:573-596]; [Mulligan, 1993, Science, 260:926-932]; [Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem,. 62:191-21]; [May, 1993. TIB Tech. 11 (5):155-215]). 당업계에 통상적으로 알려져 있는 재조합 DNA 기술은 목적하는 재조합 세포 클론을 마련하는 데 통상적으로 적용될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, NY (1993)]; [Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]; [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley ＆ Sons, NY (1994)]; [Colberre-Garapin et al., 1981. J. MoI. Biol., 150:1]에 기재되어 있고, 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발현된 단백질 분자의 발현 수준은 발현 벡터의 증폭을 통해 증가될 수 있다 (검토를 위해서는 문헌 [Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987] 참조). 관심 단백질을 발현하는 발현 벡터 시스템에서의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양 배지에 존재하는 억제제의 수준이 증가되면 마커 유전자의 카피 수가 증가할 것이다. 증폭된 영역이 단백질-코딩 유전자와 관련이 있기 때문에 단백질 생성량이 동시에 증가할 것이다 (문헌 [Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257]). 선별가능한 마커 글루타민 신타제 (GS) 또는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터는 각각, 약물 메티오닌 술폭시민 또는 메토트렉세이트의 존재 하에 증폭될 수 있다. 이러한 벡터의 장점은 세포주, 예를 들어 뮤린 골수종 세포주 (NSO) 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 DG44 (각각, 글루타민 신타제-음성 및 디히드로폴레이트 리덕타제-음성임)가 사용될 수 있다는 점이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 가용성 CTLA4 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 융합 단백질 분자를 코딩하는 핵산 서열은, 진핵 숙주에서 외래 서열을 발현하도록 설계된 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 벡터의 조절성 성분은, 사용하도록 선택된 진핵 숙주에 따라 달라질 수 있다. 진핵 숙주 세포에서 가용성 CTLA4 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 발현하는 데 사용되는 벡터는 단백질 발현의 최적화를 위한 인핸서 서열을 포함할 수 있다.
발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입함으로써, 포유동물 세포 (예컨대, BHK 세포, VERO 세포, CHO 세포 등)가 발현 벡터 (예를 들어, CTLA4-Ig 융합 단백질 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터)를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터를 포함하고, 당업계에 공지된 방법을 통해 발현 벡터가 도입될 수 있는 숙주 세포를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 발현 벡터는, 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현이 가능하게 되는 방식으로 1개 이상의 조절 서열에 연결된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재된 바와 같이, 적절한 숙주 세포에서 관심 단백질의 발현을 지시하도록 선별될 수 있다. 조절 서열은 다음을 포함할 수 있다: 인핸서, 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 여타 발현 제어 요소. 당업자는, 발현 벡터의 설계가 형질감염될 숙주 세포의 선택, 및/또는 발현될 원하는 단백질의 유형 및/또는 양과 같은 인자에 좌우될 수 있음을 알 것이다.
클로닝 및 발현 플라스미드 (예를 들어, pcSD 및 piLN)는 실시예 11에 기재된 바와 같이 구축된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 플라스미드 pSV2dhfr-로부터 단리된 DNA 단편은 발현 벡터 pcSD를 생성하는 pcDNA3 벡터 백본에 라이게이션된다. 벡터 pcSD는 다음과 같은 특징부로 이루어진다: 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 이어서 다중 클로닝 부위 (MCS); 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열; 선별 및 증폭을 위한 마우스 dhfr cDNA 서열; 암피실린 내성 유전자; 및 이. 콜라이에서 선별 및 유지를 위한 pUC 복제개시점. 인간 CTLA4 수용체의 세포외 도메인의 단편에 상응하는 아미노산 서열 부분을 코딩하는 cDNA를 함유하는 벡터 piLN은 실시예 11에 기재된 바와 같이 구축되고, 이때 제1 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA는 제2 아미노산 서열을 코딩하는 DNA에 결합되고, 이는 발현된 CTLA4 단백질의 가용성 변화에 의해 CTLA4 수용체 유전자의 발현이 가능한 IgC 영역에 상응한다 (도 1, 및 CTLA4 세포외 부분 및 IgG1 불변 영역에 상응하는 잔기에 대한 도 1의 간단한 설명 참조). 한 실시양태에서, 온코스타틴 M 신호 펩티드 서열은 CTLA4의 세포외 도메인에 상응하는 아미노산 서열에 융합될 수 있고, 이어서 도 1에 기재된 바와 같은 Ig 도메인 (예를 들어, 인간 IgCγ1 도메인)에 상응하는 제2 아미노산 서열에 융합된다. 온코스타틴 M 신호 서열은 가용성 형태의 CTLA4 유전자 (예를 들어, CTLA4-Ig) 단백질 생성물이 생성될 수 있도록 한다.
CTLA4-면역글로불린 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 pcSD 발현 벡터를 구축하기 위해 당업계에 공지된 방법 (예를 들어, 제한 부위 서브클로닝)이 이용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태를 위한 출발 물질은, 실시예 11에 기재된 클로닝 벡터 piLN으로부터 분해 및 절단된 DNA 단편일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 벡터로부터 절단된 DNA 단편은 온코스타틴 M 신호 서열 및 CTL4Ig 융합 단백질의 아미노산 서열을 함유하며, 상기 DNA 단편은 분해된 pcSD 벡터에 라이게이션된다. 온코스타틴 M-CTLA4-Ig DNA 단편은 CMV 프로모터와, BGH 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열을 함유하는 카셋트 사이에 삽입될 수 있다. 이에 따라, CTLA4-Ig 유전자 생성물이 pcSDhuCTLA4-Ig로 명명된 플라스미드 (도 21; 서열 17)에서 CMV 프로모터의 제어 하에 놓일 것이다.
또한, 클로닝 및 발현 플라스미드 (예를 들어, pD16LEA29Y)는 인비트로젠 (Invitrogen) 플라스미드 pcDNA3으로부터 유래될 수 있다. 벡터 pD16LEA29Y (도 22)는 다음과 같은 특징부를 포함한다: pcDNA3으로부터의 네오마이신 내성 유전자는 인핸서가 없는 (약화된) SV40 프로모터의 제어 하에 뮤린 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자로 대체되었음; CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 유전자는 CMV 프로모터로부터 발현되고, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 유전자로부터 나옴; 관심 유전자를 위한 발현 카셋트는 전사 종결 서열에 의해 플랭킹됨 (즉, 5' → 프로모터 및 3' → 폴리 A 부위); 벡터는 2개의 개별적인 제한 부위 폴리링커, 즉 관심 유전자의 클로닝을 위한 하나의 폴리링커 (3' → 프로모터) 및 형질감염 전의 벡터 선형화를 위한 하나의 폴리링커 (5' → 프로모터)를 함유함; 벡터는 이. 콜라이에서 플라스미드 전파를 위한 ColEl 복제개시점 및 암피실린 내성 유전자를 함유함; 및 CTLA4A29YL104E-Ig 서열 (서열 3)은 온코스타틴 M 신호 펩티드 뒤에 있고, 벡터 pD16LEA29Y로 알려져 있는 발현 벡터에서 조립됨.
인간 CTLA4 수용체의 세포외 도메인의 단편에 상응하는 아미노산 서열의 부분을 코딩하는 cDNA를 함유하는 벡터가 구축되고 (서열 2), 이때 위치 55의 아미노산 Ala는 아미노산 Tyr로 대체되고, 위치 130의 아미노산 Leu는 아미노산 Glu로 대체된다 (도 3). 이러한 아미노산 변화는 서열 4를 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 아미노산 서열에서 나타난다. 제1 아미노산 서열 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 서열)을 코딩하는 cDNA는 제2 아미노산 서열을 코딩하는 DNA에 결합되고, 이는 발현된 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질의 가용성 변화에 의해 CTLA4A29YL104E-Ig 수용체 유전자의 발현이 가능한 IgC 영역에 상응한다 (도 3, 및 CTLA4 세포외 부분 및 IgG1 불변 영역에 상응하는 잔기에 대한 도 3의 간단한 설명 참조).
한 실시양태에서, 온코스타틴 M 신호 펩티드 서열은 CTLA4의 세포외 도메인에 상응하는 아미노산 서열에 융합될 수 있고, 이어서 도 3에 기재된 바와 같은 Ig 도메인 (예를 들어, 인간 IgCγ1 도메인)에 상응하는 제2 아미노산 서열에 융합된다. 온코스타틴 M 신호 서열은 가용성 형태의 CTLA4 유전자 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig) 단백질 생성물이 생성될 수 있도록 한다.
세포주의 생성을 위한 안정한 형질감염
다량의 클로닝된 DNA를 생성하기 위해, 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등)을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 적합한 숙주 세포 (예를 들어, 세균 세포)로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환을 위한 세균 세포의 특정 비제한적 예로는 세균 세포주인 이. 콜라이 균주 DH5α 또는 MC1061/p3 (Invitrogen Corp., San Diego, Calif., U.S.A.)이 포함되고, 이는 당업계에서 실시되는 표준 절차에 의해 형질전환될 수 있고, 이후에 콜로니는 적절한 플라스미드 발현을 위해 스크리닝될 수 있다.
진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포를 위한 발현 벡터는, 포유동물 세포와의 상용성이 있는 프로모터 및 제어 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 조절 요소는 예를 들어, pcSD 또는 pD16LEA29Y 벡터에 위치한 CMV 프로모터, 또는 piLN 벡터에 위치한 조류 육종 바이러스 (ASV)일 수 있다. 통상적으로 사용되는 그밖의 초기 및 후기 프로모터에는 원숭이 바이러스 40 (SV 40)로부터 유래된 것들 (문헌 [Fiers et al., 1973, Nature 273:113]), 또는 여타 바이러스 프로모터, 예컨대 소 유두종 폴리오마, 및 아데노바이러스 2 바이러스로부터 유래된 것들이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 당업계에 공지된 여타 프로모터 이외에도, 조절가능한 프로모터인 hMTII (문헌 [Karin et al., 1982, Nature 299:797-802])가 사용될 수 있다. 배양 곤충 세포 (예를 들어, SF 9 세포)에서의 재조합 단백질 발현의 경우, 이용가능한 특정 배큘로바이러스 벡터에는 pVL 시리즈 (문헌 [Lucklow, V. A., and Summers, M. D., 1989, Virology 170:31-39]) 및 pAc 시리즈 (문헌 [Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165])가 포함된다. 또한, 당업자는 인핸서 영역 (비-코딩 DNA 영역에서 프로모터 영역의 상류 또는 하류에 위치하는 서열)도 발현 최적화에 있어서 중요하다는 점을 알 것이다. (예를 들어, 플라스미드 DNA의 도입을 위해 원핵 숙주를 이용하는 경우) 필요하다면, 바이러스 공급원으로부터의 복제개시점을 사용할 수 있다. 그러나, 염색체 통합은 진핵 유기체에서 DNA 복제를 위한 보편적인 메카니즘이다.
본 발명의 실시양태에서 원하는 단백질 (예를 들어, 융합 단백질, 당단백질 등)의 발현을 위해 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)가 사용되지만, 여타 진핵 유기체도 숙주로서 사용될 수 있다. 출아 효모인 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) (제빵 효모 또는 맥주 효모로도 알려져 있음)의 실험실 균주 및 여타 효모 균주, 예컨대 분열 효모인 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)가 사용될 수 있다. 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)을 코딩하는 DNA를 함유하는 효모 벡터의 경우, 문헌 [Broach, Meth. Enz. 101:307 (1983)]의 2μ 복제개시점 또는 효모와의 사용성이 있는 그밖의 복제개시점 (예를 들어, 문헌 [Stinchcomb et al., 1979, Nature 282:39]; [Tschempe et al., 1980, Gene 10:157]; 및 [Clarke et al., 1983, Meth. Enz. 101:300])이 이용될 수 있다. 효모 벡터 내에 함유된 조절 요소는 해당 (glycolytic) 효소의 합성을 위한 프로모터일 수 있다 (문헌 [Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149]; [Holland et al., 1978, Biochemistry 17:4900]).
당업자는 성장 조건이 상기 조절가능한 유전자의 전사를 조절할 수 있는 여타 프로모터도 사용할 수 있을 것이며, 여기에는 다음과 같은 비제한적 예가 포함될 수 있다: 이소사이토크롬 C, 알콜 데히드로게나제 2, 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소, 산 포스파타제, 및 질소 대사와 관련된 분해 효소. 포유동물 발현 시스템과 유사하게, 효모 발현 벡터에서의 종결 서열은 또한, 코딩 서열의 3' 말단에서 바람직하고, 효모-유래 유전자에서 오픈 리딩 프레임에 이어진 3' 비-번역 영역에 위치한다. 효모 (예를 들어, 에스. 세레비시아)에서의 재조합 단백질 발현에 적합한 효모 벡터의 특정 비제한적 예로는 pMFa (문헌 [Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943]), pJRY88 (문헌 [Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123]), pYepSec1 (문헌 [Baldari et al., 1987, Embo J. 6:229-234]), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif., U.S.A.), 및 pRS 효모 벡터 군에 속하는 벡터들이 포함된다.
상기 기재된 바와 같이 얻어진, 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등)을 코딩하는 DNA를 함유하는 클론, 예를 들어 세균 클론은 목적하는 생성물의 발현을 위해 적합한 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포로 형질감염될 수 있다. 형질감염 기술은, 상기 숙주 세포에 적절한 당업계에서 확립된 표준 기술에 의해 수행되며, 형질감염 기술은 사용되는 숙주 세포에 좌우된다. 예를 들어, 포유동물 세포 형질감염은 리포좀-매개 형질감염, 원형질체 융합, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, CaPO4 공침전, 전기천공, 직접 미세주입, 및 당업계에 알려져 있는 여타 방법 (스크레이핑 (scraping), 직접 흡수, 삼투압 또는 수크로스 쇼크, 리소자임 융합 또는 적혈구 융합, 간접 미세주입, 예컨대 적혈구-매개 기술, 및/또는 숙주 세포에 전류를 가하는 방법이 포함될 수 있음)에 의해 달성될 수 있다. 유전자 정보를 숙주 세포에 도입하는 여타 기술이 개발될 것이므로, 상기 언급된 형질감염 방법 목록은 전부가 아닌 것으로 간주된다.
다세포 유기체 (예를 들어, 포유동물 기원)로부터 유래된 진핵 숙주 세포에서 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등)을 코딩하는 DNA의 발현은 본 발명의 문맥 내에서 특히 이용된다 (문헌 [Tissue Cultures, Academic Press, Cruz and Patterson, Eds. (1973)]). 다세포 유기체로부터 유래된 숙주 세포는 인트론을 스플라이싱할 수 있는 능력을 가지므로, 게놈 DNA 단편을 발현하기 위해 직접 사용될 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, 유용한 숙주 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), BHK 세포, 원숭이 신장 (COS), VERO 및 HeLa 세포가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서는 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등)을 안정하게 발현하는 세포주가 사용된다. 한 실시양태에서, 관심 당단백질을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터 (예를 들어, pcSDhuCTLA4-Ig, pD16LEA29Y 등)로 포유동물 세포주 (예컨대, CHO 세포주)를 (예를 들어, 전기천공에 의해) 형질감염시킨다. 한 실시양태에서, 관심 당단백질은 CTLA4-Ig 단백질, 예를 들어 서열 1의 뉴클레오티드 서열의 일부에 의해 코딩되는, 서열 2에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CTLA-Ig 단백질(들)일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 관심 당단백질은 CTLA4A29YL104E-Ig, 예를 들어 서열 23의 뉴클레오티드 서열의 일부에 의해 코딩되는, 서열 4에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig일 수 있다.
재조합 단백질, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig는 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포 (예를 들어, CHO, BHK, VERO 또는 NSO 세포), 곤충 세포 (예를 들어, 배큘로바이러스 벡터 사용) 또는 효모 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 문맥 내에서, 당업자는 그밖의 적합한 숙주 세포, 예컨대 앞서 기재된 것들을 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합 융합 단백질 (예컨대, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)의 (원핵 보다는) 진핵 발현이 이용된다. 진핵 세포, 예컨대 CHO 세포에서 진핵 재조합 단백질, 예컨대 인간 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 발현은 부분 및/또는 완전 글리코실화, 및 쇄내 또는 쇄간 디술피드 결합의 형성을 일으킬 수 있다. 목적하는 단백질의 일시적인 증폭 및 발현을 위해, 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터는 당업계에 공지된 형질감염 방법에 의해 진핵 세포로 전달되나, 세포 게놈으로 통합되지는 않는다. 형질감염 유전자의 발현은 16 내지 96 시간 이내에 측정될 수 있다. 포유동물 세포 (예컨대, COS 세포)는 벡터 (예컨대, pCDM8)과 함께 사용되어 목적하는 단백질을 일시적으로 발현할 수 있다 (문헌 [Gluzman, Y., 1981, Cell 23:175-182; Seed, B., 1987, Nature 329:840]).
포유동물 세포의 안정한 형질감염을 위해서는 세포의 일부분이 DNA를 그의 게놈으로 통합시킬 수 있으며 성공적인 통합은 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 방법에 좌우될 수 있다는 점은 당업계에 알려져 있다. 목적하는 단백질의 안정한 증폭 및 발현을 위해, 관심 단백질 (예를 들어 융합 구조물, 당단백질 등, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터는 진핵 세포 (예컨대, 포유동물 세포)의 게놈으로 안정하게 통합되고, 그 결과 형질감염된 유전자가 안정하게 발현된다. 관심 단백질을 코딩하는 유전자를 안정하게 발현하는 클론을 확인 및 선별하기 위해, 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 항생제에 대한 내성)가 관심 유전자와 함께 숙주 세포에 도입될 수 있다. 당업자가 사용하는 선별가능한 마커는 약물, 예컨대 G418 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 것들일 수 있다. 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자는 별개의 플라스미드 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있거나, 동일한 플라스미드 상에서 관심 유전자로서 도입될 수 있다. 관심 유전자를 함유하는 세포는 약물 선별법 (선별가능한 마커 유전자가 도입된 세포는 상기 약물의 존재 하에 생존하지만, 선별가능한 마커 유전자가 도입되지 않은 세포는 사멸함)에 의해 확인될 수 있다. 이후, 목적하는 단백질의 생성을 위해 생존 세포를 스크리닝할 수 있다 (예를 들어, CTLA4-Ig 단백질 또는 CTLA4A29YL104E-Ig).
앞서 기재된 바와 같이, 디히드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) 유전자의 발현이 결여된 CHO 세포는 뉴클레오시드가 첨가된 경우에만 생존할 수 있다. 상기 세포가 dhfr 유전자를 함유하는 DNA 벡터로 안정하게 형질감염되면, 필요한 뉴클레오시드를 생성할 수 있게 된다. 당업자는, 항-대사물질인 메토트렉세이트의 존재 하에 dhfr를 선별가능한 마커로 사용함으로써 dhfr 및 형질감염된 관심 유전자 (예를 들어, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)의 유전자가 용이하게 증폭된다는 점을 알 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서는, 포유동물 세포, 예컨대 CHO dhfr 세포가 발현 벡터, 예컨대 pcSDhuCTLA4-Ig (실시예 11 내지 13) 또는 pD16LEA29Y로 형질감염되어, 안정하게 증폭될 수 있으며 목적하는 단백질 생성물 (예컨대, 각각 CTLA4-Ig 또는 베타 p CTLA4A29YL104E-Ig 올리펩티드)을 안정하게 발현할 수 있는 세포 집단을 생성한다. 또다른 실시양태에서, 안정한 형질감염을 위해 dhfr-음성 세포주 DG44 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA, U.S.A.)가 사용될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 형질감염은 전기천공을 통해 달성될 수 있다.
당업계에서 용이하게 실시되고 있는 바와 같이, 형질감염된 포유동물 세포 (예를 들어, dhfr-음성 CHO 세포)를 형질감염후 1 내지 2일간 혈청을 함유하는 비-선별 배지에서 유지시킨다. 이후, 세포를 트립신으로 처리하고, 선택적인 압박 (예를 들어, 메토트렉세이트와 같은 약물) 하에 혈청-함유 배지에 다시 플레이팅한다. 개별적인 콜로니가 시각화될 수 있을 때까지, 세포를 선별 혈청-함유 배지 (선별 배지는 자주 변화됨)에서 2 내지 3주간 배양하여 파편 및 사멸된 세포를 제거한다. 이후, 당업계에 확립된 방법, 예컨대 ELISA 또는 면역침전법을 통해 목적하는 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등)을 높은 수준으로 발현하는 생성자를 확인하기 위해, 개별 콜로니를 트립신 처리하고, 추가의 전파 및 증폭을 위해 선별 배지의 존재 하에 다중 웰 플레이트에 도입할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, dhfr-음성 CHO 세포 (예를 들어, DG44 세포)의 형질감염을 위해 상기 기재된 방법을 수행하여 재조합 관심 단백질 (예를 들어, CTLA4-Ig 단백질)을 발현하는 안정한 세포주를 마련한다 (예를 들어, 실시예 12 및 13 참조). 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig를 발현하는 안정한 세포주가 마련되었다 (실시예 23 참조).
본 발명의 안정한 CHO 세포주는 (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 2의 25 내지 383의 서열을 갖는 CTLA4-Ig 단량체로서의 TLA4-Ig 단백질 분자를 안정하게 발현한다. 상기 세포주는 다량체 형태 (예컨대, 이량체, 사량체 등)로서 존재할 수 있는 CTLA4-Ig 분자 집단을 분비할 수 있으며, 이러한 다량체 형태는 서열 2의 다양한 단량체 서열을 가질 수 있다. 상기 세포주에 통합된 발현 카셋트는 서열 1을 포함하며, pcSDhuCTLA4-Ig 내에 함유된다.
또한, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig를 안정하게 발현하는 안정한 CHO 세포주를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 세포주는 (i) 서열 4의 26 내지 383, (ii) 서열 4의 26 내지 382, (iii) 서열 4의 27 내지 383, (iv) 서열 4의 27 내지 382, (v) 서열 4의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 4의 25 내지 383의 서열을 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체를 발현한다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포주는 다량체 형태 (예컨대, 이량체, 사량체 등)로서 존재할 수 있는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 분비할 수 있으며, 이러한 다량체 형태는 서열 4의 다양한 단량체 서열을 가질 수 있다. 상기 세포주에 통합된 발현 카셋트는 서열 3을 포함하며, pD16LEA29Y 내에 함유된다.
클로날 세포 집단의 생성을 위한 서브클로닝
원하는 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등)의 생성자로서 확인된 세포를 세포 배양물로부터 단리하고, 이어서 배양 배지가 혈청을 함유할 수 있는 생성-등가 조건 하에 증폭시킨다. 당업계에 공지된 서브클로닝 방법, 예컨대 반고형 한천 클로닝 (이에 제한되는 않음)을 이용할 수 있다. 이후, 얻어진 안정한 재조합 세포 클론을 혈청 및 동물 생성물이 없는 조건 하에 증식시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 목적하는 단백질 생성물 (예를 들어, CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig 등)을 발현하는 안정한 세포 클론은, 혈청-함유 배지에서 재조합 원래 세포 클론을 배양하고 세포를 혈청 및 동물 생성물이 없는 배지에 다시 적용시킨 후에 얻어진 세포 배양물로부터 재조합 세포 클론을 수득함으로써 달성된다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig를 발현하는 세포 클론은 50세대 이상에 걸쳐 혈청 및 동물 생성물이 없는 배지에서 계속 배양될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 세포 클론은 75세대 이상에 걸쳐 상기 기재된 바와 같이 계속 배양될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 상기 세포 클론은 100세대 이상에 걸쳐 혈청 및 동물 생성물이 없는 배지에서 계속 배양될 수 있다.
추가의 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig를 발현하는 세포 클론은 27세대 이상에 걸쳐 혈청 및 동물 생성물이 없는 배지에서 계속 배양될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포 클론은 75세대 이상에 걸쳐 상기 기재된 바와 같이 계속 배양될 수 있다. 또한, 상기 세포 클론은 100세대 이상에 걸쳐 혈청 및 동물 생성물이 없는 배지에서 배양될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자를 생성하는 세포주를 제공하고, 이때 상기 세포주는 100세대 이후에도 안정하며, 세포주 안정성에는 다음이 포함된다: (1) 제100 세대의 배가 시간: 약 24.5 ± 2.6 시간 미만; (2) 제100 세대에서의 세포 생존률: 95％ 초과; (3) 5 L 생물반응기에서 CTLA4-Ig에 대한 생성 역가: 제100 세대에서 1.69 mg/mL 초과; (4) 제105 세대에서 단백질에 대한 시알산의 몰비: 약 9.3 내지 약 11.0.
본 발명의 안정한 재조합 세포 클론은 단리된 형태로 존재하며, 이때 단리는 당업계에서 실시되는 방법 (예를 들어, 반고형 한천 (soft agar) 클로닝 또는 제한 희석 클로닝 등)에 따라 수행될 수 있다. 본 발명에서, 안정한 재조합 세포 클론은 재조합 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)로부터 유래되고, 이는 현탁 상태 또는 점착 상태에서 성장할 수 있다. 본 발명의 세포주에 의해 발현되는 재조합 단백질은 치료제 당단백질, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig일 수 있다. 본 발명에 따르면, 진핵 세포 (예컨대, 포유동물 CHO 세포, DG44 세포, 또는 dhfr-음성 CHO 세포)로부터 유래된 안정한 재조합 세포 클론이 유용하며, 이들은 재조합 당단백질, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 DNA 서열을 함유하고, 재조합 당단백질을 여러 세대에 걸쳐 안정하게 발현할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등, 예컨대 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)을 안정하게 발현하는 포유동물 숙주 세포 집단이 혈청 및 동물 생성물이 없는 조건 하에 안정하게 형질감염된 세포의 증폭을 통해 얻어진다. 본 발명에 따르면, 재조합 세포 클론은 예를 들어, 105세대 이상에 걸쳐 혈청 및 동물 생성물이 없는 배양 배지에서 안정하다는 점을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 클로날 세포 집단은 CTLA4-Ig 분자를 생성한다. 이러한 CTLA4-Ig 분자 집단의 특정한 특징들 중 일부가 하기 표 6에 열거되어 있다. 적어도, CTLA4-Ig 분자 집단은 2개의 단량체 분자 [각각 다음 서열 중 하나를 가질 수 있음: (i) 서열 2의 26 내지 383, (ii) 서열 2의 26 내지 382, (iii) 서열 2의 27 내지 383, (iv) 서열 2의 27 내지 382, (v) 서열 2의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 2의 25 내지 383]를 포함하는 CTLA4-Ig 이량체 분자를 포함할 수 있다. 따라서, CTLA4-Ig 분자 집단은 동종이량체 또는 이종이량체를 우세하게 포함할 수 있다. 상기 집단은 동종이량체 및 이종이량체 둘 다를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 표 6에 제시된 특징들을 갖는 CTLA4-Ig 분자 또는 그의 제약 등가물의 집단을 제공한다. 본원에 사용된 제약 등가물에 있어서, 정부 기관 (예컨대, FDA)이 이해하는 바와 같이, 분자 집단은 원래 집단 (표준 집단)의 경우와 동등한, 환자를 치료하기 위한 안전성 및 효능 프로파일을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 CTLA4-Ig 집단은 표 6에 제시된 특징들을 가질 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 CTLA4-Ig 분자 집단은 표 6에 제시된 특징들 또는 이들의 등가물을 단독으로, 또는 이들의 임의의 조합 또는 변형 형태로 가질 수 있다.
또한, 또다른 실시양태에서, 관심 클론은 발현된 재조합 생성물 및 그의 생화학적 특징 (예를 들어, 특정 흡광 계수 값을 갖는 CTLA4-Ig)에 따라 특성 분석될 수 있다. 흡광 계수 값 (흡수율 값 (as)으로도 지칭될 수 있음)은 이론적으로 또는 실험적으로 유도될 수 있다. 280 nm에서 CTLA4-Ig의 흡수율 값 (as)은 아래에 상세하게 기재된 바와 같이, 문헌 [Mach et al., Analytical Biochemistry, Vol. 200, pp. 74-80, 1992]의 방법에 의해 1.01 mL·mg-1cm-1인 것으로 측정되었다.
하기 식 1을 이용하여 몰 흡수율 (ε)을 측정하였다.
식 1: ε = [(디술피드 결합의 수 × 134) + (트립토판 잔기의 수 × 5,540) + (티로신 잔기의 수 × 1,480)]
CTLA4-Ig는 9개의 디술피드 결합, 8개의 트립토판 잔기 및 32개의 티로신 잔기를 가지므로, 하기 식 2에 제시된 바와 같이 몰 흡수율 (ε) 92,886 M-1cm-1이 얻어진다.
식 2: ε = (9 × 134) + (8 × 5,540) + (32 × 1,480)] = 92,886 M-1cm-1
몰 흡수율 (ε)을 분자량 (하기 식 3에 제시된 바와 같이 MALDI-TOF에 의해 측정됨)으로 나누어 흡수 상수 (as)를 계산하였다.
식 3: as =ε/분자량 = 92,886 M-1cm-1 / 92,278 Da = 1.01 mL·mg-1cm-1
아미노산 분석법을 이용하여, (서열 2를 포함하는) CTLA4-Ig 물질의 2개 로트 상에서 이론적으로 유도된 흡수율 값을 실험적으로 측정된 흡수율 값과 비교하였다. 실험적으로 측정된 평균 흡수 상수는 1.00 ± 0.05 mL·mg-1cm-1이다. 상기 실험 값은 이론값 1.01 mL·mg-1cm-1이 실험적 측정의 오차 범위 내에 있음을 입증한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 약 1.00 ± 0.05 mL·mg-1cm-1의 흡수율 값 또는 흡광 계수를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 생성하는 세포주를 제공한다.
본 발명에 따르면, 관심 재조합 클론은 또한, 관심 단백질 (예를 들어, 융합 구조물, 당단백질 등, 예컨대 CTLA4-Ig)을 코딩하는 DNA 서열이 부위의 개수에 따라 숙주 세포 게놈으로 통합된다는 점을 특징으로 할 수 있다. 당업자는, 표준 서던 하이브리드화 기술에 의해 상기 분석이 수행될 것임을 알 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 대략 1.2 kb의 단일 하이브리드화 단편을 각 EcoRI에서 검출하였고, 본 발명의 재조합 세포 클론으로부터 게놈 DNA의 XbaI 제한 분해물을 제조하였다 (예상된 크기의 CTLA4-Ig 유전자와 일치함) (서던 하이브리드; 도 23). 도면 내용은 플라스미드의 단일 통합 부위와 부합하고, 서던 하이브리드화 분석에 의해 검출될 수 있는 CTLA4-Ig 유전자에서는 삽입 또는 결실이 없다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자를 생성할 수 있는 CHO 세포 집단을 제공하며, 이때 상기 집단의 각 세포는 CTLA4-Ig 단백질을 코딩하는 핵산 30 카피 이상을 포함하고, 여기서 30 카피 이상은 세포 게놈내 단일 부위에서 직렬로 통합되고, 세포 집단은 클론성이다. 또다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자를 생성할 수 있는 CHO 세포 집단은, 집단내 세포의 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％가 CTLA4-Ig 단백질을 코딩하는 핵산 30 카피 이상을 포함하는 것인 집단을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 도 10 또는 실시예 14에 따른 조건에서 배양시, 생성 단계에서 세포 배양물 1 L 당 적어도 1.0, 1.3, 1.6, 1.8, 2.0 또는 2.5 g의 CTLA4-Ig 분자의 양으로, 서열 2를 포함하는 CTLA4-Ig 분자를 생성하는 세포주를 제공한다.
본 발명에 따르면, 현탁 배양 상태에서 성장시에 배양 상청액으로 분비되는 분자 집단을 생성할 수 있는, 목적하는 단백질 (예를 들어, CTLA4-Ig 단백질)을 발현하는 포유동물 세포주 (예를 들어, dhfr-음성 CHO 세포주)가 생성된다. 상기 분자 집단은 예를 들어, 하기 표 6에 열거된 특징들 중 하나 이상 또는 모두를 가질 수 있다.
CTLA4-Ig의 예시적인 특징
특징
1 N-말단 서열 서열 2의 aa 26 (Ala)
서열 2의 aa 27 (Met)
2 C-말단 서열 서열 2의 aa 382 (Gly)
서열 2의 aa 383 (Lys)
3 B7 결합 70 내지 130％
4 pI 4.3 내지 5.6
5 시알산 비율
NANA
NGNA		 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 8.0몰 이상
CTLA4-Ig 분자 1몰 당 8.0 내지 12.0몰
CTLA4-Ig 분자 1몰 당 1.5몰 이하
6 이량체 95％ 이상
7 HMW 종 (예를 들어, 사량체) 4.0％ 이하
8 저분자량 종 (예를 들어, 단량체) 0.5％ 이상
9 흡광 계수 1±0.05 mL/mg·cm
10 유리 술프히드릴 기 1몰 당 0.24 이하의 유리 티올
11 아미노 모노사카라이드 조성: GlcNAc CTLA4-Ig 분자 1몰 당 15 내지 35몰
12 아미노 모노사카라이드 조성: GalNAc CTLA4-Ig 분자 1몰 당 1.7 내지 8.3몰
13 중성 모노사카라이드 조성: 갈락토스 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 8 내지 17몰
14 중성 모노사카라이드 조성: 푸코스 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 3.5 내지 8.3몰
15 중성 모노사카라이드 조성: 만노스 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 7.7 내지 22몰
표 6에 있어서, CTLA4-Ig 이량체의 백분율, HMW 종 (예를 들어, CTLA4-Ig 다량체, 예컨대 사량체)의 백분율 및 LMW 종 (예를 들어, CTLA4-Ig 단량체)의 백분율은 CTLA4-Ig 분자 집단을 기준으로 한다. 표 6에 기재된 당의 몰 및 시알산의 몰은 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체의 몰을 기준으로 한다. 표 6에 기재된 B7 결합의 백분율은 앞서 기재된 BIA코어 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 수행된 CTLA4-Ig 결합 실험을 기초로 한다 (백분율은 B7 결합과 CTLA4-Ig 대조군을 비교한 값임).
한 실시양태에서, 포유동물 세포주 (예컨대, dhfr-음성 CHO 세포주)는 표 6의 특징 번호 1 내지 5가 나타나는 CTLA4-Ig 분자 집단을 생성한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 포유동물 세포주는 표 6의 특징 번호 1 내지 10이 나타나는 CTLA4-Ig 분자 집단을 생성한다. 또다른 실시양태에서, 포유동물 세포주는 표 6의 특징 번호 1 내지 15가 나타나는 CTLA4-Ig 분자 집단을 생성한다. 추가의 실시양태에서, CTLA4-Ig 상의 유리 술프히드릴 기의 양은 분자 당 약 0.20 이하의 유리 티올이다.
형질감염된 포유동물 세포 (예를 들어, dhfr-음성 CHO 세포) 집단이 분비한 목적하는 단백질 (예를 들어, CTLA4-Ig 단백질)을 함유하는 세포 배양물 상청액의 정제시, 상기 분자 집단은 추가의 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 분자 집단은 표 6에 열거된 특징 이외에도, 다음과 같은 특징들 중 하나 이상 또는 모두를 가질 수 있다: 약 7.0 내지 8.0의 pH 범위; 인간 세포 IL-2 활성을 50 내지 150％ 억제할 수 있는 능력; 최종 정제 생성물 중에 존재하는 단핵구 화학주성 단백질 (MCP-1): 5 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 이하; 최종 정제 생성물 중에 존재하는 DNA의 농도: 2.5 pg/mg CTLA4-Ig 이량체 이하; 최종 정제 생성물 중에 존재하는 CHO 숙주 세포 단백질: 50 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 이하; 최종 정제 생성물 중 트리톤 (Triton) X-100의 농도: 1.0 ppm 이하; 단백질 A의 양: 5 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 이하; 최종 정제 생성물 중 세균 내독소의 양: 0.3 EU/mg CTLA4-Ig 이량체 이하; 및 최종 정제 생성물 중 바이오버든의 양: 3.0 CFU/10 mL 이하.
한 실시양태에서, 단핵구 화학주성 단백질 (MCP-1)은 최종 정제 생성물 중에 3 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 이하로 존재하고, 최종 정제 생성물 중에 존재하는 DNA의 농도는 1.0 pg/mg CTLA4-Ig 이량체 이하이고, 최종 정제 생성물 중에 존재하는 CHO 숙주 세포 단백질은 10 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 이하이고, 단백질 A의 양은 1 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 이하이고, 최종 정제 생성물 중 세균 내독소의 양은 0.15 EU/mg CTLA4-Ig 이량체 이하이고, 최종 정제 생성물 중 바이오버든의 양은 1.0 CFU/10 mL 이하이고, pH 범위는 약 7.2 내지 7.8이다. 특정 실시양태에서, 단핵구 화학주성 단백질 (MCP-1)은 최종 정제 생성물 중에 1 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 이하로 존재한다. 추가의 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 인간 세포 IL-2 활성을 60 내지 140％ 억제한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 클로날 세포 집단은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 생성한다. 이러한 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단의 특정한 특징들 중 일부가 하기 표 7에 열거되어 있다. 적어도, CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단은 2개의 단량체 분자 [각각 다음 서열 중 하나를 가질 수 있음: (i) 서열 4의 26 내지 383, (ii) 서열 4의 26 내지 382, (iii) 서열 4의 27 내지 383, (iv) 서열 4의 27 내지 382, (v) 서열 4의 25 내지 382, 및 (vi) 서열 4의 25 내지 383]를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 분자를 포함할 수 있다. 따라서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단은 동종이량체 또는 이종이량체, 또는 이들의 임의의 혼합물을 우세하게 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 표 7에 제시된 특징들을 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 그의 제약 등가물의 집단을 제공한다. 본원에 사용된 제약 등가물에 있어서, 정부 기관 (예컨대, FDA)이 이해하는 바와 같이, 분자 집단은 원래 집단 (표준 집단)의 경우와 동등한, 환자를 치료하기 위한 안전성 및 효능 프로파일을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 CTLA4A29YL104E-Ig 집단은 표 7에 제시된 특징들을 가질 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단은 표 7에 제시된 특징들 또는 이들의 등가물을 단독으로, 또는 이들의 임의의 조합 또는 변형 형태로 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 생성할 수 있는 CHO 세포 집단을 제공하며, 이때 상기 집단의 각 세포는 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질을 코딩하는 핵산 30 카피 이상을 포함하고, 여기서 30 카피 이상은 세포 게놈내 단일 부위에서 직렬로 통합되고, 세포 집단은 클론성이다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 생성할 수 있는 CHO 세포 집단은, 집단내 세포의 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％가 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질을 코딩하는 핵산 30 카피 이상을 포함하는 것인 집단을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 도 24 또는 실시예 19 및 20에 따른 조건에서 배양시, 생성 단계에서 세포 배양물 1 L 당 적어도 22, 22.5, 23, 27.5 또는 28 g의 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 양으로, 서열 4를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 생성하는 세포주를 제공한다.
본 발명에 따르면, 현탁 배양 상태에서 성장시에 배양 상청액으로 분비되는 분자 집단을 생성할 수 있는, 목적하는 단백질 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 단백질)을 발현하는 포유동물 세포주 (예를 들어, dhfr-음성 CHO 세포주)가 생성된다. 상기 분자 집단은 예를 들어, 하기 표 7에 열거된 특징들 중 하나 이상 또는 모두를 가질 수 있다.
CTLA4A29YL104E-Ig의 예시적인 특징
특징
1 N-말단 서열 서열 4의 aa 26 (Ala)
서열 4의 aa 27 (Met)
2 C-말단 서열 서열 4의 aa 382 (Gly)
서열 4의 aa 383 (Lys)
3 B7 결합 70 내지 130％
4 pI 4.5 내지 5.5
5 시알산 비율 총 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 5.0몰 이상
6 이량체 95％ 이상
7 HMW 종 (예를 들어, 사량체) 4％ 이하
8 LMW 종 (예를 들어, 단량체) 1％ 이하
9 아미노 모노사카라이드 조성: GlcNAc 총 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 23 내지 28몰
10 아미노 모노사카라이드 조성: GalNAc 총 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 2.7 내지 3.6몰
11 중성 모노사카라이드 조성: 갈락토스 총 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 11 내지 13몰
12 중성 모노사카라이드 조성: 푸코스 총 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 6.4 내지 7.0몰
13 중성 모노사카라이드 조성: 만노스 총 CTLA4-Ig 분자 1몰 당 14 내지 16몰
표 7에 있어서, CTLA4A29YL104E-Ig 이량체의 백분율, HMW 종 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 다량체, 예컨대 사량체)의 백분율, 및 LMW 종 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 단량체)의 백분율은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 기준으로 한다. 표 7에 기재된 당의 몰 및 시알산의 몰은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 이량체의 몰을 기준으로 한다. 표 7에 기재된 B7 결합의 백분율은 앞서 기재된 BIA코어 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 수행된 CTLA4A29YL104E-Ig 결합 실험을 기초로 한다 (백분율은 B7 결합과 CTLA4A29YL104E-Ig 대조군을 비교한 값임).
한 실시양태에서, 포유동물 세포주 (예컨대, dhfr-음성 CHO 세포주)는 표 7의 특징 번호 1 내지 5가 나타나는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 생성한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 포유동물 세포주는 표 7의 특징 번호 1 내지 10이 나타나는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 생성한다. 또다른 실시양태에서, 포유동물 세포주는 표 7의 특징 번호 1 내지 13이 나타나는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단을 생성한다.
형질감염된 포유동물 세포 (예를 들어, dhfr-음성 CHO 세포) 집단이 분비한 목적하는 단백질 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig)을 함유하는 세포 배양물 상청액의 정제시, 상기 분자 집단은 추가의 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 분자 집단은 표 7에 열거된 특징 이외에도, 다음과 같은 특징들 중 하나 이상 또는 모두를 가질 수 있다: 최종 정제 생성물 중에 존재하는 단핵구 화학주성 단백질 (MCP-1): 5 ng/mg CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 이하; 최종 정제 생성물 중에 존재하는 DNA의 농도: 2.5 pg/mg CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 이하; 및 최종 정제 생성물 중에 존재하는 CHO 숙주 세포 단백질: 50 ng/mg CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 이하.
일반적인 세포주 배양
본 발명에 따르면, 당업자에게 통상적으로 알려져 있는 바와 같이, 포유동물 세포는 목적하는 단백질, 예를 들어 당단백질을 생성하도록 배양된다. 관심 당단백질을 발현하는 포유동물 세포는 글리코실화와 가장 관련이 있는 번역후 변형이 만족스러운 조건 하에 생체 내에서 발생하도록 적절한 효소를 발현해야 하거나, 발현하도록 조작되어야 한다. 이러한 효소에는 N- 및 O-연결된 탄수화물의 첨가 및 완성을 위해 필요한 효소, 예컨대 N-연결된 올리고사카라이드에 대해 문헌 [Hubbard and Ivatt, Ann. Rev. Biochem., 50:555-583(1981)]에 기재된 것들이 포함된다. 임의로, 상기 효소에는 올리고사카릴트랜스퍼라제, 알파-글리코시다제 I, 알파-글리코시다제 II, ER 알파(1,2)만노시다제, 골지 알파-만노시다제 I, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I, 골지 알파-만노시다제 II, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II, 알파 (1,6)푸코실트랜스퍼라제, 베타 (1,4)갈락토실트랜스퍼라제, 및 적절한 시알릴트랜스퍼라제가 포함된다.
아폽토시스 (프로그래밍된 세포 사멸)의 지연은 세포 배양 공정 동안의 세포 생존률을 증가시키는 효과를 가질 수 있다. 아폽토시스의 감소 및 이에 따른 특정 세포 수명의 증가는 세포 배양물로부터의 단백질 생성량을 증가시킬 수 있다. 아폽토시스 현상은 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포)에 하나 이상의 항-아폽토시스성 단백질을 도입합으로써 세포에서 억제될 수 있고, 이때 상기 단백질은 아폽토시스 경로를 따라 정확한 지점에서 세포내 아폽토시스를 억제한다. 아폽토시스의 또다른 억제 방법은 세포내 미토콘드리아로부터의 전구-아폽토시스성 (pro-apoptotic) 분자 방출을 억제하는 것이다. 당업계에 공지된 전구-아폽토시스성 단백질 변이체, 예컨대 우성-음성 형태의 카스파제-9가 세포내 아폽토시스의 억제제로서 사용될 수 있다. 이러한 변이체 단백질은 세포에 도입되어 프로그래밍된 세포 사멸을 지연시킬 수 있다. 또한, 세포 아폽토시스의 억제는 특정 세포가 단백질을 생성하는 시간을 연장시키고, 이에 따라 특정 세포에 의한 목적하는 단백질 생성량이 전반적으로 증가된다. 카스파제 억제제 (예컨대, X-연결된 아폽토시스 억제제 (XIAP) 또는 그의 변이체) 또는 항-아폽토시스성 유전자 (예를 들어, Bcl-2 및 Bcl-xL 또는 이들의 변이체)를 코딩하는 여러 유전자는 유전자조작된 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포, VERO 세포, BHK 세포 등)로 형질감염될 수 있다 (문헌 [Sauerwald, T. et al., 2003, Biotechnol Bioeng. 81:329-340]; [Sauerwald, T. et al., 2002, Biotechnol Bioeng. 77:704-716]; [Mastrangelo, A. et al., 2000, Biotechnol Bioeng. 67:544-564]; [Kim, N. et al., 2002, J Biotechnol. 95:237-248]; [Figueroa, B. et al., 2001, Biotechnol Bioeng. 73:211-222]).
한 실시양태에서, 재조합 단백질을 생성하는 포유동물 세포는 항-아폽토시스성 유전자 (예컨대, bcl-2)를 함유하는 벡터로 형질감염될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 재조합 포유동물 세포는 카스파제 억제제를 코딩하는 유전자, 상기 기재된 바와 같은 전구-아폽토시스성 분자 변이체를 코딩하는 유전자, 또는 항-아폽토시스성 활성을 갖는 것으로 당업자에게 알려져 있는 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는 플라스미드로 형질감염될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 목적하는 재조합 단백질 (예컨대, 치료제 단백질)의 전반적인 생성물 품질이 증진될 수 있다 (예를 들어, 증진된 글리코실화). 재조합 단백질의 글리코실화를 증가시키기 위해, 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포, VERO 세포, BHK 세포 등)을, 단백질의 글리코실화에 관여하는 하나 이상의 효소 (예컨대, α2,3-시알릴트랜스퍼라제, β1,4-갈락토실트랜스퍼라제 등)를 코딩하는 핵산으로 형질감염시킬 수 있다 (문헌 [Weikert et al., 1999, Nature Biotechnol 17:1116-21]). 한 실시양태에서, β1,4-갈락토실 트랜스퍼라제를 코딩하는 플라스미드가 관심 단백질을 발현하는 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 또다른 실시양태에서, α2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 플라스미드가 관심 단백질을 발현하는 포유동물 세포에 도입될 수 있다.
배양되는 숙주 세포에 따라 다양한 배양 파라미터가 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 위한 적절한 배양 조건은 당업계에 잘 알려져 있거나 (문헌 [Cleveland et al., J. Immunol. Methods, 56: 221-234 (1983)]), 또는 당업자에 의해 결정될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: New York, 1992)] 참조), 선택된 특정 숙주 세포에 따라 달라진다.
제한 없이, 세포 배양 배지 (예컨대, 접종 배지, 영양공급 배지, 기본 배지 등)는 세포, 특히 포유동물 세포의 성장 및/또는 유지에 사용되는 영양 용액을 의미할 수 있다. 일반적으로, 이러한 용액은 다음 범주들 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 제공한다: (1) 에너지원 (통상적으로 탄수화물 (예컨대, 글루코스)의 형태임); (2) 모든 필수 아미노산 및 통상적으로 20개의 기본 아미노산 세트 + 시스테인; (3) 비타민 및/또는 여타 유기 화합물 (낮은 농도로 요구됨); (4) 유리 지방산 또는 지질, 예를 들어 리놀레산; 및 (5) 미량 요소 (통상적으로, 매우 낮은 농도 (통상적으로 마이크로몰 범위)로 요구되는 무기 화합물 또는 자연 발생 요소로서 정의됨). 영양 용액에는 다음 범주들 중 임의의 것으로부터 선택된 하나 이상의 성분이 선택적으로 보충될 수 있다: (1) 호르몬 및 그밖의 성장 인자, 예컨대 혈청, 인슐린, 트랜스페린 및 표피 성장 인자; (2) 염, 예를 들어 마그네슘, 칼슘 및 포스페이트; (3) 완충액, 예컨대 HEPES; (4) 뉴클레오시드 및 염기, 예컨대 아데노신, 티미딘 및 히폭산틴; (5) 단백질 및 조직 가수분해물, 예를 들어 펩톤 또는 펩톤 혼합물 (정제 젤라틴, 식물 재료 또는 동물 부산물로부터 얻어질 수 있음); (6) 항생제, 예컨대 겐타마이신; (7) 세포 보호제, 예를 들어 플루오닉 폴리올; 및 (8) 갈락토스. 기본 배지의 일례는 세포 성장 기본 배지일 수 있다. 접종 배지의 일례는 접종 세포 성장 기본 배지일 수 있다. 영양공급 배지의 일례는 생산형 생물반응기 영양공급 배지일 수 있다.
시판중인 배지가 사용될 수 있고, 여기에는 예를 들어, 최소 필수영양 배지 (MEM, Sigma, St. Louis, Mo., U.S.A.); 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, Sigma); 햄 F10 배지 (Sigma); 하이클론 세포 배양 배지 (HyClone, Logan, Utah, U.S.A.); RPMI-1640 배지 (Sigma); 및 화학적으로 규정된 (CD) 배지 (특정 세포 유형을 위해 제조된 배지),예컨대, CD-CHO 배지 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., U.S.A.)가 포함된다. 필요하거나 원하는 경우, 이들 배지 중 임의의 배지에는 앞서 정의된 보충 성분 또는 요소 (임의의 성분 포함)가 필요에 따라 적절한 농도 또는 양으로 보충될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 포유동물 세포 배양물은 배양할 특정 세포에 적합한 배지에서 제조된다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는, 일반적으로 임의의 포유동물 공급원으로부터의 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청 (FBS))이 없는, 상기 언급된 것들 중 하나일 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 포유동물 세포 배양물은 화학적으로 규정된 시판 (CD)-CHO 배지 (하기 표 15에 명시된 추가 성분이 보충됨)에서 성장할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 포유동물 세포 배양물은 CD-CHO 배지 (하기 표 20 또는 21에 명시된 추가 성분이 보충됨)에서 성장할 수 있다.
본 발명의 방법은 수많은 세포 유형을 배양하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포는 동물 또는 포유동물의 세포이다. 또다른 실시양태에서, 세포는 다량의 목적하는 단백질을 발현 및 분비할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 세포는 다량의 관심 당단백질을 발현하고 배양 배지에 분비할 수 있다. 또한, 동물 또는 포유동물 세포는 분자적으로 변형되어 관심 단백질을 발현 및 분비할 수 있다. 숙주 세포에 의해 생성된 단백질은 숙주 세포에 대해 내생성이거나 상동성일 수 있다. 또한, 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성 (예를 들어, 외래성)일 수 있고, 이때 관심 단백질을 코딩하는 유전자 정보는 당업계 표준 방법 (예를 들어, 전기천공, 형질감염 등)을 통해 숙주 세포에 도입된다. 한 실시양태에서, 포유동물 당단백질은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포에 의해 생성되고 배양 배지에 분비될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 생성 방법, 예를 들어 실시예 14 및 도 10에 제시된 대량 생성 방법에 의해 생성된 CTLA4-Ig 분자 집단을 제공한다. 상기 방법에 의해 고분자량 (HMW)의 CTLA4-Ig 분자가 생성될 수 있다 (예를 들어, 실시예 14 및 15 참조). 또다른 실시양태에서, 본원에 논의된 생성 방법, 예컨대 실시예 19 및 20, 및 도 10에 제시된 대량 생성 방법에 의해 생성된 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단이 제공된다. 상기 방법에 의해 고분자량 (HMW)의 CTLA4A29YL104E-Ig 분자가 생성될 수 있다 (예를 들어, 실시예 19 및 20 참조). 특정 실시양태에서, HMW 종은 소정의 생성 방법, 예를 들어 화학적으로 규정된 (CD)-CHO1 발효 공정에 의해 생성된 분자 또는 이량체의 약 15 내지 25％일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 CD-CHO1 발효 공정에 의해 생성된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig HMW 성분의 단리, 정제 및 특성 분석 방법을 제공한다. CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig HMW 성분은 다량체 (즉, 사량체, 육량체 등)이고, 이들은 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체보다 높은 분자량을 갖는다.
다량의 관심 당단백질을 함유할 수 있고, 발현할 수 있고, 후속의 단리 및/또는 정제를 위한 배양 배지에 분비할 수 있는 동물 또는 포유동물 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 예컨대 CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (문헌 [Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet. 12:555-556]; [Kolkekar et al., 1997, Biochemistry. 36:10901-10909]; 및 WO 01/92337 A2), 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포 (CHO/dhfr-, 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216]) 및 dpl2.CHO 세포 (미국 특허 5,721,121); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 (COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포 (예컨대, 293 세포, 또는 현탁 배양 상태에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL-10); 원숭이 신장 세포 (CV1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251]); 인간 경추 암종 세포 (HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포 (MDCK5, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL-75); 인간 간암 세포 (HEP-G2, HB 8065); 마우스 유두 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포 (문헌 [Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68]); MCR 5 세포; FS4 세포가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 측면에서는 CHO 세포, 특히 CHO/dhfr- 및 CHO DG44 세포가 사용된다.
본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있는 포유동물 당단백질의 비제한적인 예로는 사이토킨, 사이토킨 수용체, 성장 인자 (예컨대, EGF, HER-2, FGF-α, FGF-β, TGF-α, TGF-β, PDGF, IGF-I, IGF-2, NGF, NGF-β); 성장 인자 수용체, 예를 들어 융합 또는 키메라 단백질이 포함된다. 다른 예로는 성장 호르몬 (예컨대, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬); 인슐린 (예컨대, 인슐린 A 쇄 및 인슐린 B 쇄), 프로인슐린; 에리트로포이에틴 (EPO); 콜로니 자극 인자 (예컨대, G-CSF, GM-CSF, M-CSF); 인터류킨 (예컨대, IL-I 내지 IL-12); 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF) 및 그의 수용체 (VEGF-R); 인터페론 (예컨대, IFN-α, β 또는 γ); 종양 괴사 인자 (예컨대, TNF-α 및 TNF-β) 및 이들의 수용체인 TNFR-1 및 TNFR-2; 트롬보포이에틴 (TPO); 트롬빈; 뇌 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP); 클로팅 인자 (예컨대, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란츠 (von Willebrands) 인자 등); 항-클로팅 인자; 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직 유형 TPA; 난포 자극 호르몬 (FSH); 황체형성 호르몬 (LH); 칼시토닌; CD 단백질 (예컨대, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19 등); CTLA 단백질 (예컨대, CTLA4); T-세포 및 B-세포 수용체 단백질; 골 형태발생 단백질 (BNP, 예컨대 BMP-1, BMP-2, BMP-3 등); 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF); 뉴로트로핀, 예컨대 3-6; 레닌; 류마티스성 인자; RANTES; 알부민; 렐락신; 대식세포 억제 단백질 (예컨대, MIP-1, MIP-2); 바이러스 단백질 또는 항원; 표면 막 단백질; 이온 채널 단백질; 효소; 조절 단백질; 항체; 면역조절성 단백질 (예컨대, HLA, MHC, B7 군); 휘귀 수용체; 수송 단백질; 수페록시드 디스무타제 (SOD); G-단백질-커플링된 수용체 단백질 (GPCR); 신경조절성 단백질; 단백질 및 펩티드 (예컨대, A-베타)와 관련된 알츠하이머 질환, 및 당업계에 알려진 여타 단백질이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있는 적합한 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드로는 융합 단백질, 폴리펩티드, 키메라 단백질, 및 상기 단백질 및 폴리펩티드의 임의의 것의 단편 또는 부분, 또는 돌연변이체, 변이체 또는 유사체가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 방법은 서열 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 변이체인 CTLA4-Ig 분자를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 잔기 55 (A55Y) 및 130 (L130E) (서열 2로부터의 are로 지칭되는 잔기)에서 하나 이상의 변화를 갖는 단량체를 포함할 수 있다. 미국 특허 공보 US 2002/0182211 A1 (그 전문에 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 CTLA4-Ig 변이체 및 돌연변이체에 대한 기재를 참조한다. 또다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 변이체는 CTLA-4 영역 내의 돌연변이 또는 Ig 영역 내의 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CTLA4rIg 변이체 분자는 서열 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 적어도 약 70％, 약 75％, 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％ 또는 약 99％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 변이체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 변이체는 이량체를 형성할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 변이체는 비-돌연변이 CTLA4-Ig 분자 집단이 나타내는 것과 유사한 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 변이체 분자는 서열 2에 존재하는 동일한 잠재적 N-연결된 및 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는다. 또다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 변이체 분자는 서열 2에 존재하는 동일한 N-연결된 및 O-연결된 글리코실화 부위를 갖고, 추가의 글리코실화 부위를 갖는다. 돌연변이에는 뉴클레오티드 결실, 삽입, 첨가; 아미노산 결실, 치환, 첨가; 핵산 구조 이동 (이에 제한되지는 않음)이 포함될 수 있고, 치환은 비보존성 (예컨대, 트립토판으로 치환된 글리신) 또는 보존성 치환 (예컨대, 이소류신 대신 치환된 류신)일 수 있다.
CTLA4-Ig 변이체 분자로는 CTLA4-L104EA29YIg (서열 2에 따라 잔기 번호매김 시스템 사용, 본원에서 CTLA4-L104EA29YIg는 CTLA4-L130EA55YIg로 지칭됨), 및 미국 특허 출원 번호 09/865,321 (미국 특허 공보 번호 US 2002/0182211), 60/214,065 및 60/287,576; WO 01/92337 A2; 미국 특허 6,090,914, 5,844,095 및 5,773,253; 및 문헌 [R. J. Peach et al., 1994, J Exp Med, 180:2049-2058]에 기재된 CTLA4-Ig 변이체 분자들이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 CTLA4-Ig 변이체 분자는 CTLA4-Ig 변이체 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 세포로부터 분비될 수 있다.
CTLA4-Ig 변이체인 L130EA55Y-Ig는 CTAL4-Ig 분자와 유사한 구조를 갖는 유전자조작된 융합 단백질이다. L130EA55Y-Ig는 변형 인간 CTLA-4의 기능성 세포외 결합 도메인 및 IgG1 부류의 인간 면역글로불린의 Fc 도메인을 갖는다. 두 아미노산 변형 [L104EA29Y 변이체의 위치 104 (L104E) (서열 2의 위치 130에 상응함)에서 류신 → 글루탐산, 및 L104EA29Y 변이체의 위치 29 (A29Y) (서열 2의 위치 55에 상응함)에서 알라닌 → 티로신]이 CTLA-4 도메인의 B7 결합 영역에서 발생하여 L130EA55Y를 생성하였다. L130EA55Y-Ig는 대략 45,700 달톤을 각각 갖는 2개의 동종 글리코실화 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있고, 이들은 1개의 쇄간 디술피드 결합 및 비-공유결합성 (non-covalent) 상호작용에 의해 서로 결합된다. L130EA55Y-Ig를 코딩하는 DNA는 부다페스트 조약의 규정 하에 2000년 6월 20일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 L104EA29Y-Ig를 코딩하는 DNA로서 기탁되었다. 상기 DNA에는 ATCC 수탁 번호 PTA-2104가 할당되었다. 또한, L104EA29Y-Ig (본 출원에서 L130EA55Y-Ig에 상응함)는 동시 계류중인 미국 특허 출원 번호 09/579,927, 60/287,576, 60/214,065 및 09/865,321, 및 WO/01/923337 A2에 기재되어 있고, 이들 문헌 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
재조합 단백질 L130EA55Y-Ig는, 서열 2에서 아미노산 위치 55의 Ala 및 아미노산 위치 130의 Leu를 갖는 CTLA4-Ig 단량체와 비교시에 오직 2개의 아미노산 (아미노산 위치 55의 Tyr 및 아미노산 위치 130의 Glu)이 다르고, 이들 두 돌변연이는 N- 또는 O-연결된 글리코실화에 영향을 미치지 않기 때문에, L130EA55Y-Ig를 포함하는 CTLA4-Ig 변이체 분자 집단은 야생형 CTLA4-Ig를 포함하는 집단과 동일한 프로파일 또는 매우 유사한 글리코실화 프로파일을 가질 수 있다. 또한, 재조합 단백질 L130EA55Y-Ig는, 서열 2에서 아미노산 위치 55의 Ala 및 아미노산 위치 130의 Leu를 갖는 CTLA4-Ig 단량체와 비교시에 오직 2개의 아미노산 (아미노산 위치 55의 Tyr 및 아미노산 위치 130의 Glu)이 다르기 때문에, 본 발명의 방법은 표 6에 기재된 유사한 특징을 갖는 L130EA55Y-Ig를 생성할 수 있어야 한다.
또한, 본 발명의 방법은 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 변이체인 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig는 서열 3에서 하나 이상의 변화를 갖는 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 그밖의 CTLA4A29YL104E-Ig 분자에 대한 설명은 미국 특허 출원 공보 US 2002/0039577, US 2003/0007968, US 2004/0022787, US 2005/0019859 및 US 2005/0084933, 및 미국 특허 7,094,8874에 기재되어 있고, 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig는 CTLA-4 영역 (서열 18) 내의 하나 이상의 돌연변이 또는 Ig 영역 내의 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 서열 11, 12, 13, 14, 15 또는 16과 적어도 약 70％, 약 75％, 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％ 또는 약 99％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig는 이량체를 형성할 수 있다. 추가의 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig는 비-돌연변이 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단이 나타내는 것과 유사한 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 서열 4에 존재하는 동일한 잠재적 N-연결된 및 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는다. 또다른 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 서열 4에 존재하는 동일한 N-연결된 및 O-연결된 글리코실화 부위를 갖고, 추가의 글리코실화 부위를 갖는다. 돌연변이에는 뉴클레오티드 결실, 삽입, 첨가; 아미노산 결실, 치환, 첨가; 핵산 구조 이동 (이에 제한되지는 않음)이 포함될 수 있고, 치환은 비보존성 (예컨대, 트립토판으로 치환된 글리신) 또는 보존성 치환 (예컨대, 이소류신 대신 치환된 류신)일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 변이체 분자 집단은 목적하는 단백질 (예를 들어, L130EA55Y-Ig 단백질 등)을 코딩하는 유전자를 발현하는 포유동물 세포 (예를 들어, dhfr-음성 CHO 세포) (본 발명의 대량 생성 방법에 따라 현탁 상태에서 성장됨)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 따르면, 포유동물 세포에 의해 생성된 재조합 CTLA4-Ig 변이체 단백질은 본원에 기재된 수거 파라미터에 따라 회수될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 포유동물 세포에 의해 생성된 재조합 CTLA4-Ig 변이체 단백질은 본 발명에 기재된 정제 절차에 따라 정제될 수 있다 (실시예 15).
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 분자 집단은 목적하는 단백질 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig)을 코딩하는 유전자를 발현하는 포유동물 세포 (예를 들어, dhfr-음성 CHO 세포) (본 발명의 대량 생성 방법에 따라 현탁 상태에서 성장됨)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 따르면, 포유동물 세포에 의해 생성된 재조합 CTLA4A29YL104E-Ig는 본원에 기재된 수거 파라미터에 따라 회수될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 포유동물 세포에 의해 생성된 재조합 CTLA4A29YL104E-Ig는 본 발명에 기재된 정제 절차에 따라 정제될 수 있다 (실시예 19 및 20).
세포 배양 및 일반적인 배양 공정의 유형
관심 단백질, 예를 들어 당단백질, 융합 단백질 등은 목적하는 단백질 생성물을 발현하는 세포를 다양한 세포 배양 조건 하에 성장시킴으로써 생성될 수 있다. 당업자는, 단백질 생성을 위한 세포 배양 및 배양 공정에는 3종의 일반 유형, 즉 연속 배양, 뱃치 배양 및 영양공급-뱃치 배양 (이에 제한되지는 않음)이 포함될 수 있음을 알 것이다. 연속 배양 공정의 경우, 배양 기간 동안 새로운 배양 배지 보충물 (예를 들어, 영양공급 배지)이 세포에 공급되며 기존의 배양 배지는 제거된다. 또한, 연속 배양 동안에 생성된 생성물은, 예를 들어 1일 기준으로 또는 연속적으로 수거될 수 있다. 세포가 생존하고 환경 및 배양 조건이 유지되는 한, 세포는 연속 배양 공정에서 원하는 만큼 배양 상태를 유지할 수 있다.
뱃치 배양 공정의 경우, 세포는 배지에 최초 배양되고, 이 배양 배지는 교체, 제거 또는 보충되지 않는다. 배양 공정 동안 또는 배양 공정이 완료되기 전까지 새로운 배지가 세포에 "공급"되지 않고, 따라서 영양물이 고갈될 때까지 배양이 계속된다. 단백질 생성물은 배양 공정이 완료되었을 때 수거된다.
영양공급-뱃치 배양 공정의 경우, 배양 공정 시간은 배양 공정 동안 배양 배지에 새로운 배지를 1일 수회 (또는 연속적으로) 공급함으로써 증가될 수 있다. 이 공정에서, 세포에는 배양 기간 동안 새로운 배지, 즉 "영양공급 배지"가 공급된다. 영양공급-뱃치 배양에는 앞서 기재된 다양한 영양공급 일정 (예를 들어, 매일, 격일 등; 하루에 1회 초과 또는 하루에 1회 미만 등)이 포함될 수 있다. 또한, 영양공급-뱃치 배양에는 영양공급 배지가 연속적으로 공급될 수 있다. 이후, 배양/생성 공정이 완료되었을 때 관심 단백질 생성물이 수거된다.
포유동물 숙주 세포에 의해 생성된 단백질 (예를 들어, 당단백질)의 소규모 또는 대규모 생성을 위한 세포 배양 시스템이 본 발명의 문맥에서 유용하다. 당업자는, 실험실 규모의 배양 방법에서 통상적으로 조직 배양 접시, 스피너 플라스크 및 T-플라스크가 사용됨을 알 것이다. 대규모 배양 (예컨대, 500 L, 5000 L, 10,000 L, 20,000 L 등)에 이용될 수 있는 공정에는 중공 섬유 (hollow fiber) 생물반응기, 유동층 생물반응기, 교반형 탱크 생물반응기 시스템 또는 롤러 병 배양이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 마지막 두 공정은 미립담체의 존재 또는 부재 하에 이용될 수 있다.
상기 시스템은 뱃치, 영양공급-뱃치 또는 연속 방식으로 작동될 수 있다. 생성 규모 배양의 경우, 교반형 탱크 생물반응기는 그의 융통성으로 인해 선정되는 시스템이다. 이러한 반응기에서는 기체 버블 스파징 또는 임펠러를 이용한 기계적 교반을 통한 진탕에 의해 현탁 상태에서 세포가 유지될 수 있다. 교반형 탱크 생물반응기는 큰 생성-규모 용량 (예를 들어, 20,000 리터)까지 규모 확장될 수 있고, 다양한 공급 방식으로 작동될 수 있다. 상기 시스템에서는 넓은 표면적의 세포 성장 및 대사 폐기물, 산소 및 영양물의 효율적인 이동을 제공되고, 반응기 내에서 성분들의 연속 교반 또는 혼합을 통해 세포가 바닥에 침강되는 것을 방지함으로써 반응기 전반에 걸쳐 균일 환경이 유지된다. 목적하는 당단백질의 생성을 위해, 본 발명은 D-갈락토스를 함유하는 영양공급 배지가 매일 공급되는 교반형 탱크 생물반응기에서 유지되는 대규모의 영양공급-뱃치 세포 배양을 포함한다. 또한, 또다른 실시양태에서, 영양공급-뱃치 세포 배양은, 단백질 글리코실화에 중요한 제한적인 세포 배양 영양물, 예컨대 글루코스 및 글루타민을 적합한 농도로 함유하는 공급 배지가 매일 공급되는 교반형 탱크 생물반응기에서 유지될 수 있다 (문헌 [Chee et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 89:164-177]).
관심 단백질을 생성하는 배양물의 세포는, 고려되는 특정 포유동물 숙주 세포 및 특정 생성 계획에 가장 적합한 임의의 절차 또는 루틴에 따라 전파될 수 있다. 확장 및 성장을 위해 최대화된 기간 동안 세포 배양물의 성장기에서 포유동물 숙주 세포 집단의 확장 또는 성장을 증진시키도록 세포 배양물 조건이 개발될 수 있다. 세포 배양물의 성장기에는, 세포가 대부분 신속하게 분할되는 기하급수적 (exponential) 세포 성장 기간 (예를 들어, 대수기)이 포함된다. 이 기간 동안에는 생존가능한 세포의 밀도 증가율이 다른 모든 시점에서보다 높다.
또한, 소정 기간 세포 배양물의 생산기 동안 단백질 생성을 증진하기 위한 세포 배양물 조건이 개발될 수 있다. 세포 배양물의 생산기에는, 세포 성장이 정지되거나 (stationary) 거의 일정한 수준에서 유지되는 기간이 포함된다. 생존가능한 세포의 밀도는 주어진 기간에 걸쳐 거의 일정하게 유지된다. 대수적인 (logarithmic) 세포 성장이 종결되고, 단백질 생성은 생산기 동안의 주요 활동이다. 일반적으로, 이 기간의 배지는 연속적인 단백질 생성을 지원하여 목적하는 당단백질 생성물을 얻도록 보충된다.
배양 조건, 예컨대 온도, pH, 용해 산소 (DO2) 등은 당업자에게 알려져 있는, 포유동물 숙주 세포의 배양에서 사용되는 조건이다. 포유동물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포의 배양에 적절한 온도 범위는 30 내지 40 ℃이고, 한 실시양태에서 약 37 ℃이다. 일반적으로, pH는 산 또는 염기를 사용하여 약 6.5 및 7.5 사이의 수준으로 조정한다. 적합한 DO2는 공기 포화도의 5 내지 90％이다. 이러한 배양 조건은, 목적하는 단백질 또는 당단백질 생성물을 생성하는 포유동물 세포의 배양을 용이하게 하도록 이용될 수 있다.
포유동물 숙주 세포 집단은 성장기 배양 상태에서 확장 및 성장될 수 있고, 이때 (가능하게는 저장기로부터 분리된) 세포를 성장 촉진 및 높은 생존률에 적합한 배양 배지에 접종한다. 이후, 새로운 배양 배지를 숙주 세포 배양물에 첨가함으로써 적합한 기간 동안 세포가 생산기에서 유지될 수 있다. 생산기 동안, 세포는 단백질 생성의 증진을 위해 다양한 온도 이동 (temperature shift)을 겪을 수 있다. 다중 온도 이동 배양 공정은 미국 특허 출원 10/742,564 (2003년 12월 18일자 출원) 및 10/740,645 (2003년 12월 18일자 출원)에 기재되어 있다. 이들 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본 발명에서, 세포 배양 공정을 포함하는 2회 이상의 온도 이동은 배양 공정 또는 생성 공정이 완료될 때까지, 배양 상태에서 생존하는 생존가능한 세포의 수를 증가시킬 수 있다. 배양의 생산기 동안, 생존 세포의 수가 증가할 수록, 생성되는 단백질 또는 당단백질 생성물의 양이 증가될 수 있고, 이에 따라 공정 완료시 단백질 생성물의 양이 증가된다.
본 발명의 특정 측면은, 세포가 관심 당단백질을 생성하기 위한, 표 14 및 15에 기재된 영양공급 배지 (D-갈락토스를 포함함)가 매일 공급되는 대규모 (예를 들어, 500 L, 5000 L, 10000 L 등) 영양공급-뱃치 방식의 포유동물 세포 배양을 포함한다. 이 실시양태에서 생성된 단백질의 품질을 높이기 위해, 2회 이상의 온도 이동을 배양 기간 동안 수행하여, 온도 이동이 이용되지 않거나 단 1회의 온도 이동이 이용될 때의 수준 이상으로 단백질 생산기를 확장시킬 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 세포가 관심 당단백질 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig)을 생성하기 위한, 표 22에 기재된 영양공급 배지 (D-갈락토스를 포함함)가 하루에 1회 이상 공급되는 대규모 (예를 들어, 500 L, 5000 L, 10000 L 등) 영양공급-뱃치 방식의 포유동물 세포 배양을 포함한다. 또한, 당단백질의 품질을 높이기 위해, 1회 이상의 온도 이동을 배양 기간 동안 수행하여, 온도 이동이 이용되지 않을 때의 수준 이상으로 단백질 생산기를 확장시킬 수 있다. 또한, 온도 이동과 동시에 덱스트란 술페이트가 배양물에 첨가될 수 있다.
생물반응기에서 재조합 단백질의 대량 생산
본 발명은, 특히 진핵 세포가 발현하는 원하는 단백질 생성물을 대규모 또는 산업 규모의 양으로 생산하기 위한, 진핵 세포의 통상적인 교반형 탱크 생물반응기 배양 방법 (예를 들어, 20000 L 세포 배양 용량)을 제공한다. 배양 공정은 현탁 상태에서 성장하는 진핵 세포의 영양공급-뱃치 배양 공정 및 배양 상청액의 수거이고, 이때 관심 단백질을 발현하는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포는 원하는 단백질 생성물을 배양 배지에 분비한다.
본 발명은, 특히 포유동물 세포가 발현하는 원하는 단백질 생성물을 다량으로 생산하기 위한, 포유동물 세포의 대규모 배양 방법을 포함한다. 상기 방법은
(i) 세포를 무혈청 배양 배지를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T-175 플라스크)에 접종하고, 적어도 세포가 최소 교차-시딩 (cross-seeding) 밀도에 도달할 때까지 (밀도는 후속 배양 용량에서 세포의 충분한 전파에 요구되는 예정된 값임) 시드 배양물 (예를 들어, 보다 큰 용량의 접종에 사용되는 출발 배양물)을 전파하는 단계;
(ii) 전파된 시드 배양물을, 동물-유래 성분이 없는 배양 배지를 함유하는 대형 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병 또는 세포 백)에 옮겨 배양물을 확장시키는 단계;
(iii) 확장된 시드 배양물을 무혈청 배양 배지를 함유하는 대규모 배양 용기에 옮겨, 세포 배양물을 추가로 전파하는 단계; 및
(iv) 적어도 상기 세포가 표적 밀도에 도달하거나 특정 생화학적 특징을 나타낼 때까지, 동물-유래 성분이 없는 배지에서 대규모 배양물을 유지하는 단계에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 (iv) 배양 배지를 수거하고, 그 배지를 새로운 배지로 교체하는 단계를 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 포유동물 세포의 대규모 배양 방법은
(i) 세포를 무혈청 배양 배지를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T-175 플라스크)에 접종하고, 적어도 세포가 최소 교차-시딩 밀도에 도달할 때까지 (밀도는 후속 배양 용량에서 세포의 충분한 전파에 요구되는 예정된 값임) 시드 배양물 (예를 들어, 보다 큰 용량의 접종에 사용되는 출발 배양물)을 전파하는 단계;
(ii) 전파된 시드 배양물을, 동물-유래 성분이 없는 배양 배지 (예를 들어, 접종 배지)를 함유하는 대형 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병 또는 세포 백)에 옮겨 배양물을 확장시키는 단계;
(iii) 확장된 시드 배양물을 무혈청 배양 배지 (예를 들어, 기본 배지)를 함유하는 대규모 배양 용기 (예컨대, 1000 L 생물반응기)에 옮겨, 세포 배양물을 추가로 전파하는 단계; 및
(iv) 적어도 상기 세포가 표적 밀도에 도달하거나 특정 생화학적 특징을 나타낼 때까지, 동물-유래 성분이 없는 배지 (예를 들어, 영양공급 배지)에서 대규모 배양물을 유지하는 단계에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (v) 배양 배지를 수거하고, 사용된 배지를 새로운 배지로 교체하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은, 대규모 양의 원하는 단백질 생성물의 생성을 위해, 동물-유래 성분이 없는 임의 조성의 배지에서 임의의 세포 유형에 적용될 수 있고, 본 발명에서는 다음 두 공정 중 하나, 또는 이들의 변형이 이용될 수 있다: a) 미립담체 공정 또는 b) 현탁 세포 공정. 세포, 예를 들어 포유동물 세포의 배양시에 한 공정이 이용될 수 있고, 이는 두 개별적인 기간, 즉 성장기 및 생산기에서 수행된다. 또한, 본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 대규모 양의 단백질 생성을 위해 동물-유래 성분 (특정 비제한적 예: 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 FBS)을 함유하는 임의 조성의 배지가 사용될 수 있다.
당업자들은 미립담체 방법 (표준 미립담체 방법 또는 관류 미립담체 방법으로 제한되지 않음)를 세포 배양에 사용될 수 있음을 이해하며, 여기서 세포는 거대다공질 담체에 부착 및/또는 고정화된다. 표준 미립담체 방법에서, 세포는 무혈청 배양 배지를 함유하는 시드 배양 용기에 접종되며, 상기 세포가 최소 시딩 밀도에 이를 때까지 증식된다. 후속적으로, 증식된 시드 배양물을 무혈청 배양 배지 및 미립담체를 함유하는 대규모의 배양 용기로 옮긴다. 이러한 성장기에서, 예를 들어 거대다공질 담체를 사용하는 방법의 경우, 담체로의 세포 이동에 의해 담체가 완전히 집락형성될 때까지 세포를 미립담체에서 성장시킨다.
배지 교환은 미립담체가 배양 용기의 바닥으로 침강하는 경우 일어날 수 있으며, 이 이후 미리 측정된 백분율의 탱크 부피를 제거하고, 상응하는 백분율 탱크 부피의 신선한 배지를 용기에 첨가한다. 이후, 미립담체를 배양 배지에 재현탁시킨다. 당업자들은 배지 제거 및 대체 과정을 미리 측정된 간격, 예를 들어 매 24시간 마다 반복할 수 있으며, 이에 의해 대체된 배지의 양은 세포 밀도에 의존하며, 전형적으로 탱크 부피의 25 내지 80％일 수 있음을 이해한다. 세포 밀도가 단백질 발현에 적합한 미리 측정된 값에 도달하는 경우, 탱크에서 60 내지 90％의 탱크 배지를 24시간마다 교환할 수 있다. 당업자들은 생산기에서도 상기 언급된 배지 교환 ％ 값을 종종 사용한다.
생산기 동안, 미립담체를 탱크의 바닥으로 침강시켜 배양 배지를 교환할 수 있으며, 이 이후 선택된 ％의 탱크 부피를 제거하고, 상응하는 탱크 부피％, 예를 들어 상기 기재된 것과 같은 60 내지 95％의 신선한 배양 배지를 용기에 첨가한다. 이후, 미립담체를 배양 배지에 재현탁시키고, 배지 제거 및 대체 과정을 매일 반복할 수 있다.
미립담체 관류 방법은 표준 미립담체 방법와 공통점이 있으며, 또한 성장/확장 및 생산기에서 작동된다. 두 방법의 주요 차이는 배양 배지를 교환하기 위해 사용되는 방법이다. 표준 미립담체 방법에서는 정의된 양의 탱크 부피, 예를 들어 60 내지 95％의 총 탱크 부피가 모두 한번에 교환되는 반면, 관류 방법에서는 배지가 연속적으로 첨가된다. 본질적으로, 소정 탱크 부피％의 배지가 미리 측정된 길이의 시간에 걸쳐 단계적으로 교환되는 반면, 배지는 용기에서 이탈하도록 하되 미립담체는 탱크 내에 유지되도록 하는 분리 장치 (또는 관류 장치)의 사용에 의해 미립담체를 용기에 유지시킨다. 상기 방법에서의 성장기는 단계적 배지 교환을 제외하고는 표준 미립담체 방법에 대해 기재된 것과 같다.
현탁 세포 방법에 대한 2가지 비-제한적인 선택에는 현탁 세포 관류 방법 및 현탁 세포 뱃치 방법이 있다. 관류 방법에서, 배양 배지 내의 세포는 담체에 고정되지 않고 자유롭게 현탁되며, 미립담체 방법과 같이, 2가지 다른 기 (예를 들어, 성장기 및 생산기)에서 작동될 수 있다. 현탁 세포-관류 방법의 성장기 동안, 무혈청 배양 배지를 함유하는 시드 배양 용기로 세포를 접종시키며, 표적 교차-시딩 밀도에 이를 때까지 세포를 증식시킨다. 이후, 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 대규모의 배양 용기로 증식된 시드 배양물을 옮기고, 단백질 발현에 적합한 미리 측정된 세포 밀도 값에 이를 때까지 증식시킬 수 있다. 신선한 배양 배지로의 배양 용기의 연속 관류를 수행하여, 배지 교환 과정을 실행한다.
현탁 세포 뱃치 방법에서, 세포 배양은 a) 단순 뱃치 방법 또는 b) 영양공급-뱃치 방법의 비 제한적인 형식을 통해 수행할 수 있다. 단순 뱃치 방법에서, 세포는 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 시드 배양 용기로 접종되며, 세포가 미리 측정된 교차-시딩 밀도에 이를 때까지 증식된다. 후속적으로, 무혈청 배양 배지를 함유하는 대규모 배양 배지로 증식된 시드 배양물을 옮기고, 배양 배지 내의 영양소가 소모될 때까지 배양 용기를 작동시킨다. 영양공급-뱃치 방법에서, 영양소의 농축된 용액 (예를 들어, 공급 배지)을 탱크에 공급하는 것은 상기 배양 방법의 배지에서의 영양소 공급을 연장할 수 있으며, 이에 따라 공정 시간을 연장하며, 궁극적으로 배양 용기 내의 목적 단백질의 생산의 증가를 유도한다. 공급 배지를 첨가하는 방법은 다양할 수 있다. 이는 단일 펄스 볼루스 (1일 1회, 2회, 3회 등) 중 하나로서 첨가하거나, 또는 24시간에 걸쳐 단계적으로 공급할 수 있다. 이러한 공급은 임의의 영양소의 소모 이전의 시행의 종료시 수거되도록 관심 있는 분비된 단백질 생성물을 함유할 수 있는 대규모 배양 용기 및 배지에서 세포가 증식되도록 할 수 있다. 모든 내용물을 용기로부터 제거하는 대신에, 당업자들은 탱크 부피의 일부만을 제거할 것이다 (약 80％일 수 있음).
영양공급-뱃치 방법의 선택적 측면은 온도 이동의 사용이다. 이러한 방법에서, 생산기 동안 작동 온도로서 사용되는 온도는 성장기 동안 사용되는 온도에 비해 낮다. 영양공급-뱃치 방법, 예를 들어 본 발명에서 사용되는 방법에 대한 상기 온도 범위는 사용되는 특정 세포주의 성장에 적합한 온도에서의 초기 성장기, 이어서 미리 측정된 세포 밀도에서의 작동 온도의 감소로 이루어져 있을 수 있다.
한 실시양태에서, 대규모 영양공급-뱃치 배양 공정을 위한 방법에는 (i) 무혈청 배양 배지를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T-175 플라스크)에 세포를 접종하고, 시드 배양물을 성장에 적합한 온도에서 적어도 세포가 미리 측정된 교차-시딩 밀도에 이를 때까지 증식시키는 단계; (ii) 적합한 온도에서 배양물을 확장시키기 위해 증식된 시드 배양물을 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 보다 큰 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병 (roller bottle) 또는 세포 백 (bag)으로 옮기는 단계; (iii) 확장된 시드 배양물을 무혈청 배양 배지를 함유하는 대규모의 배양 용기로 옮겨 적합한 온도에서 세포 배양물을 추가적으로 증식시키는 단계; 및 (iv) 적어도 상기 세포가 표적 밀도 또는 임계 시간에 이를 때까지 신선한 공급 배지로 매일 대체하면서 동물-유래 성분이 결핍된 배지 내에서 단백질 발현에 적합한 감소된 온도에서 대규모 배양물을 유지시키는 단계를 포함한다.
(iv)에서의 신선한 공급 배지로의 대체 단계는 미리 측정된 부피, 예를 들어 80％의 탱크 부피의 제거 및 동일한 부피의 신선한 공급 배지로의 대체를 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 대규모 영양공급-뱃치 배양 공정을 위한 방법은 (i) 무혈청 배양 배지를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T-175 플라스크)에 세포를 접종시키고, 성장에 적합한 온도에서 적어도 세포가 미리 측정된 교차-시딩 밀도에 이를 때까지 시드 배양물을 증식시키는 단계; (ii) 배양물을 적합한 온도에서 확장시키기 위해 증식된 시드 배양물을 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 보다 큰 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병 또는 세포 백)로 옮기는 단계; (iii) 확장된 시드 배양물을 무혈청 배양 배지를 함유하는 대규모 배양 배지 (예를 들어, 1000 L 생물반응기)로 옮겨, 적합한 온도에서 세포 배양물을 추가적으로 증식시키는 단계; 및 (iv) 적어도 상기 세포가 표적 밀도 또는 임계 시간에 이를 때까지 신선한 배양 배지로 매일 대체하면서 동물-유래 성분이 결핍된 배지내에서 단백질 발현에 적합한 감소된 온도에서 대규모 배양을 유지시키는 단계를 포함한다.
(iv)에서의 신선한 공급 배지로의 대체 단계는 미리 측정된 부피, 예를 들어 약 80％의 탱크 부피를 제거하고, 이를 동일한 부피의 신선한 공급 배지로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 영양공급-뱃치 방법에서 배양되는 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포이며, 이는 원하는 단백질 생성물을 발현한다. 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지 (실시예 13)를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T-175 플라스크)에 접종시키고, 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 35 내지 39℃에서 3 내지 4일 동안 세포가 미리 측정된 교차-시딩 밀도 (예를 들어, 6.0×106개 이상의 생존 세포를 갖거나, 또는 여기서 최종 배양 생존도는 80％ 이상임)에 이를 때까지 증식시킨다. 이후, 증식된 시드 배양물을 대략 3 내지 4일 동안 적합한 온도 (예를 들어, 약 35 내지 39℃)에서 확장 동안 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 큰 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병)로 옮긴다. 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 1-2×106 생존 세포/ml 이상을 갖거나, 또는 여기서 최종 배양 생존도는 80％ 이상임)에 이를 때까지 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 35 내지 39℃에서 3 내지 4일 동안 무혈청 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지를 함유하는 보다 큰 배양 용기 (예를 들어, 20 L 세포 백, 100 L 세포 백 등)에서 세포 배양물을 추가로 확장시킨다. 한 실시양태에서, 접종물 확장은 최소 4회 계대배양을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 접종물 확장은 20회 이하의 계대배양을 포함한다.
이후, 확장된 시드 배양물을 사용하여 무혈청 배양 배지 (예를 들어, CD-CHO 배지)를 함유하는 대규모 배양 탱크 (예를 들어, 1000 L, 4000 L 생물반응기 등)에 접종하여, 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 1-2×106 생존 세포/ml 이상을 갖거나, 또는 여기서 최종 세포 배양 생존도는 80％ 이상임)에 이를 때까지 적합한 온도, 예를 들어 약 35 내지 39℃에서 3 내지 6일 동안 세포 배양물을 추가로 증식시킨다. 후속적으로, 대규모 배양물 (예를 들어, 생물반응기 등 내의 10,000 L, 15,000 L, 20,000 L 배양물 등)을 단백질 발현 및 분비된 단백질 생성물의 생산에 적합한, 성장 온도 미만의 온도 (예를 들어, 약 33 내지 35℃에서 3 내지 4일 동안, 및 약 31 내지 33℃에서 6 내지 8일 동안)에서 무혈청 배양 배지에서 유지시키며, 여기서 배지는 공급 배지 (예를 들어, eRDF 배지, 실시예 14)이다. 공급 배지를 매일 신선한 공급 배지로 대체하며, 이에 의해 신선한 공급 배지로의 탱크의 대체는 미리 측정된 부피, 예를 들어 80％의 탱크 부피를 제거하고, 탱크를 동일한 부피의 신선한 공급 배지로 대체하는 것을 포함한다. 상기 세포가 시간 길이, 표적 세포 밀도 또는 생화학적 단백질 특성 (예컨대, 앞서 기재된 것과 같은 NANA 몰비)일 수 있는 (이에 제한되지는 않음) 생산 파라미터의 표적 값에 이를 때까지 상업적 규모의 배양물을 유지시켰으며, 여기서 상기 생존 세포 밀도는 3.0 내지 8.0×106 세포/ml일 수 있으며; NANA 몰비는 6.0 이상일 수 있고; 최종 세포 배양 생존도는 30％ 이상일 수 있으며; 최종 단백질 생성물 역가는 0.5 g/L 이상일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 영양공급-뱃치 방법에서 배양된 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포이며, 이는 목적 단백질 생성물 (예를 들어, CTLA4-Ig 분자)을 발현한다. CHO 세포를 무혈청 배양 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T- 175 플라스크)에 접종시키고, 미리 측정된 교차 시딩 밀도 (예를 들어, 10.0×106개 이상의 생존 세포를 갖거나, 또는 여기서 최종 배양 생존도는 84％ 이상임)에 이를 때까지 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 37℃에서 3 내지 4일 동안 세포를 증식시킨다. 이후, 증식된 시드 배양물을 약 4일 동안 적합한 온도 (대략 37℃)에서 확장 동안 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 큰 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병)로 옮긴다. 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 1-2×106 생존 세포/ml 이상을 갖거나, 또는 여기서 최종 배양 생존도는 91％ 이상임)에 이를 때까지 세포 배양물을 성장에 적합한 온도 (예를 들어, 약 37℃)에서 4일 동안 무혈청 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지를 함유하는 보다 큰 배양 용기 (예를 들어, 20 L 세포 백, 100 L 세포 백 등)에서 추가로 확장시킨다. 접종물 확장은 최소 7회 계대배양을 포함할 수 있다.
이후, 확장된 시드 배양물을 사용하여 무혈청 배양 배지, 예를 들어, CD-CHO 배지)를 함유하는 대규모 배양 탱크 (예를 들어, 4000 L 생물반응기)에 접종시켜, 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 1-2×106 생존 세포/ml 이상을 갖거나, 또는 여기서 최종 세포 배양 생존도는 86％ 이상임)에 이를 때까지 세포 배양물을 적합한 온도, 예를 들어 약 37℃에서 5 내지 6일 동안 추가로 증식시킨다. 후속적으로, 상업적 규모의 배양물 (예를 들어, 생물반응기 내의 20,000 L 배양물)을 성장 온도 이하의 온도에서 무혈청 배양 배지에서 유지시키며, 여기서 배지는 공급 배지 (예를 들어, eRDF 배지)이고, 이는 단백질 발현 및 분비된 단백질 생성물 (예를 들어, CTLA4-Ig)의 생성에 적합하다. 상업적 규모의 배양물을 먼저 4일 동안 37℃에서 약 34℃로 낮추고, 이후 온도를 8일 동안 약 34℃에서 약 32℃로 낮추어 제2 온도 이동시킨다. 공급 배지를 매일 신선한 공급 배지로 대체하였으며, 이에 의해 생물반응기 탱크에서 공급 배지를 대체하는 것은 미리 측정된 부피, 예를 들어 80％의 탱크 부피의 제거, 및 동일한 부피의 신선한 공급 배지로의 대체를 포함한다. 상기 CHO 세포 및/또는 분비된 단백질 생성물이 하기 비제한적인 생산 파라미터의 표적 값에 이를 때까지 상업적 규모를 유지시킨다. 생존 세포 밀도 4.0-7.0×106 세포/ml; NANA 몰비 8.0 이상; 최종 세포 배양 생존도 38％ 이상; 및 최종 단백질 생성물 역가 0.6 g/L 이상.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 영양공급-뱃치 방법에서 배양되는 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포이며, 이는 목적 단백질 생성물을 발현한다. 포유동물 세포를 무혈청 배양 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지 (실시예 19)를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T-175 플라스크)에 접종시키고, 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 35℃ 내지 약 39℃에서 3 내지 4일 동안, 또는 약 36℃ 내지 약 38℃에서 약 4일 이하 동안 세포가 미리 측정된 교차-시딩 밀도 (예를 들어, 1.5×106 이상의 세포 밀도를 갖거나, 또는 여기서 최종 배양 생존도는 약 80％ 이상임)에 이를 때까지 증식시켰다. 이후, 증식된 시드 배양물을 약 3 내지 4일, 또는 약 4일 이하 동안 적합한 온도 (예를 들어, 약 35℃ 내지 약 39℃, 또는 약 36℃ 내지 약 38℃)에서 확장 동안 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 큰 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병)로 옮겼다. 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 약 1.5×106 생존 세포/ml 이상, 또는 여기서 최종 배양 생존도가 80％ 이상임)에 이를 때까지 세포 배양물을 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 35℃ 내지 약 39℃, 또는 약 36℃ 내지 약 38℃에서 약 3 내지 4일 또는 약 4일 이하 동안 무혈청 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지를 함유하는 보다 큰 배양 용기 (예를 들어, 20 L 세포 백, 100 L 세포 백 등)에서 추가적으로 확장시킨다. 한 실시양태에서, 접종물 확장은 최소 4회 계대배양을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 접종물 확장은 20회 이하의 계대배양을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, CD-CHO 배지는 CD-CHO 접종 배지이다.
이후, 확장된 시드 배양물을 사용하여, 무혈청 배양 배지 (예를 들어, CD-CHO 배지, 예컨대 CD-CHO 접종 배지 및/또는 CD-CHO 기초 배지)를 함유하는 대규모 배양 탱크 (예를 들어, 1000 L, 4000 L 생물반응기)에 접종시켜, 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 2.3×106 생존 세포/ml, 또는 여기서 최종 세포 배양 생존도는 약 88％ 이상임)에 이를 때까지 적합한 온도, 예를 들어 약 35℃ 내지 약 39℃, 또는 약 36℃ 내지 약 38℃에서 약 3 내지 약 6일, 또는 약 4 내지 약 5일, 또는 약 4.7일, 또는 약 113시간 이하 동안 세포 배양물을 증식시켰다.
후속적으로, 상업적 규모의 배양물 (예를 들어, 생물반응기 내의 10,000 L, 15,000 L, 20,000 L, 30,000 L 배양물 등)을 단백질 발현 및 분비된 단백질 생성물의 생산에 적합한 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 약 3 내지 약 6일, 또는 약 4 내지 약 5일 동안 무혈청 배양 배지에서 유지시켰으며, 여기서 상기 배지는 공급 배지 (예를 들어, eRDF 배지, 실시예 19)이다. 별법으로, 다가음이온 화합물 (예를 들어, 예컨대 덱스트란 술페이트)을 무혈청 배양 배지에서 유지된 배양물에 첨가할 수 있으며, 여기서 상기 배지는 하기 및 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공보 제2005/0019859호에서 기재된 것과 같은 공급 배지 (예를 들어, eRDF 배지, 실시예 19)이다. 동시에, 배양물을 단일 온도 저하 단계 (예를 들어, 약 3 내지 약 14일, 또는 약 10 내지 약 13일, 또는 약 234 내지 약 304시간 동안 약 32℃ 내지 약 36℃)에 적용시킬 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 배양은 또한 동시에 다중 온도 저하 단계 (예를 들어, 약 33℃ 내지 약 35℃에서 약 3 내지 6일 동안, 및 약 31℃ 내지 약 33℃에서 약 6 내지 8일 동안)에 적용시킬 수 있다. 상기 기재된 방법은 단백질 발현 및 분비된 단백질 생성물의 생산에 적합하다.
상기 기재된 경우에서의 공급 배지는 매일 (1일 1회, 2회, 3회 등), 또는 매 몇일마다 신선한 공급 배지로 대체될 수 있다. 신선한 공급 배지로의 탱크 대체는 미리 측정된 부피, 예를 들어 80％의 탱크 부피를 제거하고, 탱크를 동일한 부피의 신선한 공급 배지로 대체하는 것을 포함한다. 상기 세포가 시간, 표적 세포 밀도 또는 생화학적 단백질 특성 (예컨대, 앞서 기재된 것과 같은 NANA 몰비)일 수 있는 (이에 제한되지는 않음) 생성 파라미터의 표적 값에 이를 때까지 상업적 규모의 배양물을 유지시키며, 여기서 생존 세포 밀도는 3.0-8.0×106 세포/ml일 수 있고; NANA 몰비는 5.0 이상, 또는 약 6, 또는 약 5.2 내지 약 7.6일 수 있고; 최종 세포 배양 생존도는 약 30％ 이상, 또는 약 37％ 이상일 수 있으며; 최종 단백질 생성 역가는 약 0.46 내지 약 0.71 g/L, 0.5 g/L 이상, 또는 20 g/L 이상일 수 있다.
본 발명에 따르면, 다가음이온 화합물의 지연된 첨가를 포함하는 세포 배양 방법이 제공된다. 상기 방법은 다가음이온 화합물을 접종 이후 소정 시간 (예를 들어, 배양 방법의 성장기 또는 생산기 동안)에서 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 다가음이온 화합물의 지연된 첨가는 증가된 세포 생존도를 달성한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 관심 있는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 다가음이온 화합물을 접종 이후 소정 시간에서 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.
다가음이온 화합물에는 덱스트란 술페이트 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich; 미주리주 세인트 루이스 (St. Louis, Mo.) 소재)에서 시판됨), 헤파린 (시그마-알드리치에서 시판됨), 헤파란 술페이트 (시그마-알드리치에서 시판됨), 만난 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 (시그마-알드리치에서 시판됨), 데르마탄 술페이트 (시그마-알드리치에서 시판됨), 케라탄 술페이트 (시그마-알드리치에서 시판됨), 히알루로네이트 (시그마-알드리치에서 시판됨), 폴리(비닐 술페이트) (시그마-알드리치에서 시판됨), 카파-카라기난 (시그마-알드리치에서 시판됨), 및 수라민 (시그마-알드리치에서 시판됨)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 화합물은 열거된 공급원으로부터 쉽게 이용가능하거나, 또는 당업자들에게 알려진 수단을 통해 쉽게 얻을 수 있다. 이러한 화합물은 나트륨염을 비제한적으로 비롯한 염의 형태로 종종 이용가능하되, 비-염 형태로도 이용할 수 있다. 다가음이온 화합물에는 염 형태, 예컨대 나트륨 염을 비제한적으로 비롯한 그의 모든 형태가 포함된다.
특히 유용한, 본 발명의 다가음이온 화합물의 비제한적인 예에는 폴리술페이트화된 화합물; 덱스트란 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 만난 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 케라탄 술페이트, 폴리(비닐 술페이트), 카파-카라기난 및 수라민이 포함된다. 한 실시양태에서, 다가음이온 화합물은 덱스트란 술페이트이다. 덱스트란 술페이트는 5,000 내지 500,000 Da의 평균 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 5,000 Da의 분자량을 갖는 덱스트란 술페이트를 사용한다.
본 발명의 방법에 따라서, 다가음이온 화합물을 특정 세포 배양 기간 (예를 들어, 접종 이후 소정 시간, 예컨대 성장기 또는 생산기) 동안 한번에, 2회, 3회 또는 또 다른 횟수로 세포 배양물에 첨가할 수 있다. 하나 이상의 다가음이온 화합물은 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 다가음이온 화합물의 임의의 주어진 단일 첨가는 하나 이상의 다가음이온 화합물의 첨가를 포함할 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 다가음이온 화합물의 첨가가 있는 경우, 상이한 첨가로 상이한 다가음이온 화합물을 첨가할 수 있다. 다가음이온 화합물을 비롯한 추가의 화합물 및 물질을 다가음이온 화합물의 첨가 이전에, 함께, 또는 이후에 특정 시간 동안 또는 이외 시간에 첨가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일, 예를 들어 1회의 다가음이온 화합물의 첨가가 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나의 다가음이온 화합물을 첨가한다.
다가음이온 화합물은 임의의 방법에 의해 세포 배양물에 첨가할 수 있다. 다가음이온 화합물의 첨가 방법에는 물에의 용해, 배양 배지에의 용해, 공급 배지에의 용해, 적합한 배지에의 용해, 및 얻어지는 형태에서의 용해가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 특히, 다가음이온 화합물을 물에 용해하여 첨가한다. 본 발명에 따르면, 다가음이온 화합물을 첨가하여, 배양물에서의 농도를 적합한 수준으로 만든다. 비제한적인 예로서, 다가음이온 화합물을 1 내지 1000 mg/L, 1 내지 200 mg/L, 1 내지 100 mg/L, 또는 25 내지 75 mg/L의 농도로 첨가한다. 세포 배양물에 첨가되는 다가음이온 화합물의 특히 유용한 농도에는 약 25-200 mg/L; 약 25-100 mg/L; 및 약 50-100 mg/L가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 배양에 첨가되는 다가음이온 화합물의 농도는 약 50 mg/L이다. 또 다른 실시양태에서, 배양에 첨가되는 다가음이온 화합물의 농도는 약 100 mg/L이다.
본 발명의 방법은 다가음이온 화합물의 첨가 이후 임의의 길이의 시간 동안 배양을 시행할 수 있다는 것을 제공한다. 배양 시행 시간은 관련된 인자, 예컨대 회수가능한 단백질의 양 및 품질, 및 관심 있는 단백질의 회수를 복잡하게 하는 세포 용해로부터 얻어진 상청액에서의 세포 종 (예를 들어, 단백질 및 DNA)의 오염 수준을 기준으로 당업자들에 의해 측정될 수 있다. 세포 배양 방법의 몇몇 실시양태에서, 다가음이온 화합물을 접종 이후 소정 시간 (예를 들어, 세포 배양 방법의 성장기, 또는 세포 배양 방법의 생산기 동안)에서 첨가한다. 다가음이온 화합물을 성장 기 동안, 또는 대략 종료시인 접종 이후 시간에서 첨가한다. 특히, 다가음이온 화합물을 생산기 동안, 예를 들어 생산기의 개시인 접종 이후 소정 시간에서 첨가한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 영양공급-뱃치 방법에서 배양된 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO세포이며, 이는 바람직한 단백질 생성물 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 분자)을 발현한다. CHO 세포를 무혈청 배양 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지 (예컨대, CD-CHO 접종 배지)를 함유하는 시드 배양 용기 (예를 들어, T-175 플라스크)에 접종시키고, 세포가 미리 측정된 교차 시딩 밀도 (예를 들어, 1.5×106개 이상의 생존 세포를 갖거나, 또는 여기서 최종 배양 생존도는 80％ 이상임)에 이를 때까지 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 37℃에서 약 3 내지 4일 동안 증식시킨다. 이후, 증식된 시드 배양물을 약 4일 동안 적합한 온도 (약 37℃)에서 확장 동안 동물-유래 성분이 결핍된 배양 배지를 함유하는 큰 배양 용기 (예를 들어, 롤러 병)로 옮겼다. 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 1.5×106개 이상의 생존 세포를 갖거나, 또는 여기서 최종 배양 생존도는 80％ 이상임)에 이를 때까지 세포 배양물을 성장에 적합한 온도 (예를 들어, 약 37℃)에서 약 4일 동안 무혈청 배지, 예를 들어 CD-CHO 배지 (예컨대 CD-CHO 접종 배지)를 함유하는 보다 큰 배양 용기 (예를 들어, 20 L 세포 백, 100 L 세포 백 등)에서 추가로 확장시킨다. 접종물 확장은 최소 7회 계대배양을 포함할 수 있다.
이후, 확장된 시드 배양물을 사용하여 무혈청 배양 배지 (예를 들어, CD-CHO 배지, 예컨대 CD-CHO 기초 배지)를 함유하는 대규모의 배양 탱크 (예를 들어, 1000 L, 4000 L 생물반응기 등)에 접종하여, 세포가 표적 시딩 밀도 (예를 들어, 약 2.3×106 생존 세포/ml 이상을 갖거나, 또는 여기서 최종 세포 배양 생존도는 88％ 이상임)에 이를 때까지 적합한 온도, 예를 들어 약 37℃에서 약 5 내지 6일 동안 세포 배양물을 추가로 증식시킨다. 후속적으로, 상업적 규모의 배양물 (예를 들어, 생물반응기에서 10,000 L, 15,000 L 또는 20,000 L 배양물 등)을 성장 온도 미만의 온도에서 무혈청 배양 배지에서 유지시키며, 여기서 상기 배지는 공급 배지이고, 이는 단백질 발현 및 분비된 단백질 생성물 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig)의 생산에 적합하다.
상업적 규모의 배양물을 예를 들어 약 4일 동안 약 37℃에서 약 34℃로 낮춘다. 온도를 낮추는 경우 다가음이온 화합물을 배양물에 동시에 첨가할 수 있다. 별법으로, 상업적 규모의 배양물을 약 12일 동안 약 35℃ 내지 37℃에서 약 32℃ 내지 36℃로 낮추고, 다가음이온 화합물을 온도를 낮추면서 배양물에 동시에 첨가한다.
상기 기재된 경우에서의 공급 배지는 매일 (1일 1회, 2회, 3회 등), 또는 매 수일마다 신선한 공급 배지로 교체될 수 있다. 신선한 공급 배지로의 탱크 대체는 미리 측정된 부피, 예를 들어 80％의 탱크 부피를 제거하고, 동일한 부피의 신선한 공급 배지로 탱크를 대체하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 예를 들어 글루코스 농도가 1 g/L로 낮아질 때까지 공급 배지를 약 2 내지 3일 동안 매일 첨가한다. 또 다른 실시양태에서, 공급 배지를 매 8시간, 예를 들어 글루코스 농도가 1 g/L에 이를 때마다 첨가한다. 상기 CHO 세포 및/또는 분비된 단백질 생성물이 하기 비제한적인 생성 파라미터의 표적 값에 이를 때까지 상업적인 규모를 유지시킨다. NANA 몰비 약 6.0, 또는 약 5.2 내지 약 7.6; 최종 세포 배양 생존도 37％ 이상; 및 최종 단백질 생성 역가 약 0.46 내지 약 0.71 g/L.
본 발명의 실시양태에서, 배양되는 세포는 포유동물 세포, 또는 CHO (예를 들어, ATCC CCL 61), HEK293 (예를 들어, ATCC CRL 1573; 문헌 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59- 72, 1977] 참조), COS-1 (예를 들어, ATCC CRL 1650), DG44 (CHO 세포주; 문헌 [Cell, 33: 405, 1983] 및 [Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986] 참조), 및 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포주를 비제한적으로 비롯한 수립된 포유동물 세포주일 수 있다. 다른 유용한 비제한적인 예는 골수종, 3T3 세포, 나말와 (Namalwa) 세포, 및 골수종과 다른 세포와의 융합체가 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 돌연변이 세포 또는 재조합 세포, 예컨대 예를 들어 유래된 세포 형태 이외의 단백질의 번역 후 변형을 촉매하는 상이한 스펙트럼의 효소 (예를 들어, 대사 효소, 예컨대 글리코실 트랜스퍼라제 및/또는 글리코시다제)를 발현하는 세포일 수 있다. 본 발명의 한 특정 측면에서, 특히 CHO/dhfr-세포를 이용한다.
세포 배양 확장에 사용되는 배양 용기는 에를렌마이어 (Erlenmyer) 플라스크, T-175 플라스크, 롤러 병 및 세포 백일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 대규모 배양 용기는 예를 들어 용기의 바닥으로부터 공기를 도입하는 방법에 의해진탕을 얻는 공기리프트 반응기 또는 통상적인 임펠러 형태에 의해 진탕을 얻는 통상적인 교반 탱크 반응기 (CSTR)일 수 있다. 특정 한계 내로 제어되는 파라미터 중에는 온도, pH, 및 용해된 산소 분압 (DOT)이 있다. 상기 시스템 내의 온도 조절 매질은 물이며, 필요에 따라 가열 또는 냉각시킬 수 있다. 물을 세포 배양 배지 내에 침지된 피핑 코일 (piping coil)을 통해 통과시키거나, 또는 용기를 둘러싸는 재킷을 통해 통과시킬 수 있다. 예를 들어, 필요한 경우 세포 배양 배지에 염기를 첨가하거나, 또는 상부 공간 기체에서 CO2 농도를 변화시켜 pH를 조절할 수 있다. DOT는 순수 산소, 또는 공기 또는 그의 혼합물로 스파징하여 유지시킬 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 재조합 단백질 (즉, 포유동물 세포가 정상적으로 발현하지 않거나 또는 과다발현하는 단백질, 여기서 상기 재조합 단백질은 세포 또는 세포의 모체로 형질감염되는 발현 벡터 또는 구축물을 통해 세포에서 발현됨)을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물에서 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키는 단계의 2 단계 이상을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 단백질을 액체 배양물 1 리터 당 0.5 그램 이상의 농도로 생산하고, 이어서 액체 배양물로부터 단백질을 정제하도록 상기 방법을 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 액체 배양물 1 리터 당 약 0.46 내지 약 0.71 그램 이상의 농도로 재조합 단백질을 생산하고, 이후 액체 배양물로부터 단백질을 정제한다.
한 실시양태에서, 확장 단계는 (i) 무혈청 배지에서 4회 계대배양 이상으로 세포를 배양하여 1 mL 당 약 1.0×105개의 생존 세포 이상의 세포 밀도를 얻는 단계; 및 (ii) 약 0.5 이상의 재조합 단백질을 제조하기에 충분한 시간 동안 배양물에서 세포를 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 계대배양의 횟수는 36회 계대배양을 초과하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 계대배양의 횟수는 36회 계대배양을 초과할 수 있으며, 여기서 세포는 재조합 단백질에 대한 핵산 코딩의 복제 횟수, 세포 생존도 및 배가 시간에 대하여 생산 중에 안정하다.
약 0.5 내지 약 1.3 g/L 이상의 재조합 단백질을 생산하기에 충분한 시간은 세포 생존도가 5％, 10％, 25％, 30％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 미만으로 떨어지지 않는 정도, 및/또는 세포 세대 수가 50, 75, 100, 105 또는 125세대를 초과하지 않는 정도의 임의의 양의 시간일 수 있다. 또한 유지 단계는 온도 이동 단계, 예컨대 배양 온도를 먼저 37 ± 2℃에서 34 ± 2℃로, 이후 시간에서 34 ± 2℃에서 32 ± 2℃로 낮추는 단계를 포함할 수 있다. 32 ± 2℃의 온도를 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 또는 100일 이상 동안 유지시킬 수 있다. 32 ± 2℃의 온도를 적어도 20, 50, 75 또는 100 세포 생성 이상 동안 유지시킬 수 있다. 배양물의 세포 밀도가 액체 배양물 1 mL 당 약 30 내지 약 100×105개 세포가 될 때까지 32 ± 2℃의 온도를 유지시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상이 되도록 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 확장시키는 단계; 및 (b) 액체 배양물이 (i) 단백질 (이 경우 당단백질) 1 mol 당 약 6.0 mol 이상의 NANA를 함유하며/거나; (ii) 1 mL 당 약 33 내지 약 79×105개 세포 밀도를 가지고/거나; (iii) 액체 배양물에서의 세포 생존도가 약 38％ 미만이 아니거나 약 38％ 이상이며/거나; (iv) 내독소가 액체 배양물 1 mL 당 약 76.8 EU 이하이고/거나; (v) 바이오버든이 액체 배양물 1 mL 당 1 콜로니 형성 단위 미만인 경우 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키는 단계를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 확장 단계는 (i) 무혈청 배지에서 4회 계대배양 이상으로 세포를 배양하여 1 mL 당 약 1.0×106 생존 세포 이상의 세포 밀도를 얻는 단계; 및 (ii) 액체 배양물 1 L 당 약 0.46 내지 약 0.71 그램 이상의의 재조합 단백질을 생산하기에 충분한 시간 동안 세포를 배양물에서 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 계대배양의 횟수는 36회 계대배양을 초과하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 계대배양의 횟수는 36회 계대배양을 초과할 수 있으며, 여기서 세포는 재조합 단백질에 대한 핵산 코딩의 복제 횟수, 세포 생존도 및 배가 시간에 대하여 생산 중에 안정하다.
약 0.46 내지 약 0.71 g/L의 재조합 단백질을 생산하기에 충분한 시간은 세포 생존도가 5％, 10％, 25％, 30％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 미만으로 떨어지지 않는 정도, 및/또는 세포 세대 수가 27, 50, 75, 100, 105 또는 125세대를 초과하지 않는 정도의 임의의 양의 시간일 수 있다. 또한, 유지 단계는 온도 이동 단계, 예컨대 배양물의 온도를 먼저 37 ± 2℃에서 34 ± 2℃로 낮추는 단계를 포함할 수 있다. 34 ± 2℃의 온도는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 또는 100일 이상 동안 유지시킬 수 있다. 별법으로, 유지 단계는 온도 이동 단계, 예컨대 배양물의 온도를 37 ± 2℃에서 34 ± 2℃로 낮추는 단계일 수 있다.
온도 저하가 시작되면서 다가음이온 화합물을 배양물에 첨가할 수 있다. 배양물에 첨가되는 다가음이온 화합물의 농도는 약 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 12.5 mg/L, 15 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L 또는 1000 mg/L일 수 있다. 32 ± 2℃의 온도는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 또는 100일 이상 동안 유지시킬 수 있다. 34 ± 2℃의 온도는 20, 27, 50, 75 또는 100세대 이상의 세포 생성 동안 유지시킬 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 리터 당 약 0.46 내지 약 0.71 그램 이상이 되도록 시드 배양물에서 약 10,000 L 이상의 액체 배양물로 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 확장하는 단계; 및 (b) 액체 배양물이 (i) 단백질 (이 경우 당단백질) 1 몰 당 NANA 약 6 몰을 함유하고/거나; (ii) 액체 배양물에서의 세포 생존도가 약 37％ 이상이고/거나; (iii) 내독소가 액체 배양물 1 mL 당 약 4.8 EU 이하이고/거나; (iv) 바이오버든이 액체 배양물 1 mL 당 1 콜로니 형성 단위 미만인 경우 약 10,000 L 액체 배양물의 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 방법에 의해 생성된 재조합 단백질은 분비된 단백질, 당단백질, 사이토킨, 호르몬, CTLA4-Ig 단백질 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질일 수 있다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 본 발명에 의해 제공된 세포의 자손 또는 서브클론이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 세포는 본 발명의 세포주로부터 유래된 세포의 자손 또는 서브클론이다. 추가의 실시양태에서, 포유동물 세포는 서열 1을 포함하는 발현 카셋트로 형질감염된 세포로부터의 클론 집단이다. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 서열 3을 포함하는 발현 카셋트로 형질감염된 세포로부터의 클론 집단이다.
배양물로부터 재조합 단백질을 정제하기 위한 일반 기법
세포 배양 방법의 단백질 생산기에 따라, 관심 있는 단백질, 예를 들어 당단백질을 당업자들에 의해 이해되는 기법을 사용하여 세포 배양 배지로부터 회수한다. 특히, 비록 상기 관심 있는 단백질은 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수도 있지만, 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수한다. 먼저, 배양 배지 또는 용해물을 원심분리하여, 세포 파편 및 입자를 제거한다. 후속적으로, 바람직한 단백질을 당업계에 잘 알려진 하기 비-제한적인 정제 절차로 오염물질 DNA, 가용성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제한다. SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 에탄올 침전; 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼에서의 분획; 역상 HPLC; 실리카 또는 음이온-교환 수지, 예컨대 QAE 또는 DEAE에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 예를 들어 세파덱스 G-75™ 칼럼을 사용하는 겔 여과; 및 오염물질, 예컨대 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스™ 칼럼. 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF), 또는 프로테아제 억제제 칵테일 믹스 (cocktail mix)의 첨가 또한 정제 동안의 단백질 분해의 억제에 유용할 수 있다. 관심 있는 단백질, 예를 들어 당단백질에 적합한 정제 방법은 재조합 세포 배양물에서의 발현시 단백질의 특성에서의 변화에 대한 설명을 위해 또 다른 방법을 필요로 할 수 있음을 당업자들은 인식할 것이다.
당단백질의 탄수화물 기에 대해 선택하는 정제 기법 및 방법 또한 본 발명 내에서 유용성이 있다. 예를 들어, 이러한 기법에는 HPLC, 또는 양이온- 또는 음이온-교환 수지를 사용하는 이온-교환 크로마토그래피가 포함되며, 여기서 탄수화물을 선택하는 것에 따라서 보다 염기성 또는 보다 산성인 분획물이 수집된다. 또한, 이러한 기법의 사용은 오염물질의 동시 제거를 유도할 수 있다.
본 발명에서, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 융합 단백질 생성 가능한 CHO 세포는 CHO 특정 배지에서의 현탁액으로서 미리측정된 세포 밀도로 성장된다. 후속적으로, 무혈청 발현 배지에서의 현탁액에서 성장된 CHO 세포는 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 생성하며, 이는 CHO 세포에 의해 배양 배지로 분비된다. 세포 현탁액을 원심분리를 통해 제거하고, 이후 CTLA4-Ig 세포를 표준 정제 기법에 의해 제거된 배양 상청액으로부터 분리시킬 수 있다. 보다 높은 순도 및 균질도의 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 개별적으로 또는 함께 얻기 위한 적합한 정제 절차의 비제한적인 예에는 세파로스에서의 친화성 크로마토그래피; 음이온-교환 칼럼 (AEC)에서의 분획; 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)가 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 생산 방법으로부터 CTLA4-Ig 분자 또는 다른 단백질 (당단백질을 포함함)을 단리시키는 것은 적어도 하기 단계를 포함할 수 있다. (i) 세포 배양 상청액을 얻는 단계; (ii) 상청액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜, 용출된 단백질 생성물을 얻는 단계; (iii) 단계 (ii)의 용출된 단백질 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜, 농축된 단백질 생성물을 얻는 단계; (iv) 농축된 단백질 생성물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜, 용출되고 농축된 단백질 생성물을 얻는 단계; 및 (v) (iv)의 용출되고 농축된 단백질 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계. 단계 (iii)에서 얻어진 농축된 단백질 생성물은 예를 들어 임의의 HMW 단백질 또는 오염물질의 백분율이 5, 10, 15 또는 25％ 미만이라는 특징을 가질 수 있다. 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 약 25-100 mM HEPES 및 약 300-900 mM NaCl을 포함하며, 약 7.0-8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 예를 들어 약 7.0의 pH를 가지며 약 25 mM HEPES 및 약 850 mM NaCl을 포함하는 단일 세척 완충액, 또는 약 8.0의 pH를 가지며 약 25 mM Tris 및 약 250 mM NaCl을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 약 3.5의 pH를 가지며 약 100 mL 글리신을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (v)의 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 약 8.0의 pH를 가지며 약 25 mM HEPES, 및 약 120 mM NaCl 내지 약 130 mM NaCl을 포함하는 세척 완충액, 또는 약 8.0의 pH를 가지며 약 25 mM HEPES 및 약 200 mM NaCl을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민 관능기를 갖는 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iii)의 소수성 상호작용 칼럼은 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸 또는 이소아밀 관능기를 갖는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법으로부터 CTLA4A29YL104E-Ig 분자 또는 다른 단백질 (당단백질이 포함됨)을 단리하는 것은 적어도 하기 단계를 포함할 수 있다. (i) 세포 배양 상청액을 얻는 단계; (ii) 상청액을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜, 용출된 단백질 생성물을 얻는 단계; (iii) 단계 (ii)의 용출된 단백질 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜, 농축된 단백질 생성물을 얻는 단계; 및 (iv) 농축된 단백질 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피하여, 감소된 고분자량 (HMW) 단백질 착물을 갖는 용출되고 농축된 생성물을 얻는 단계. 단계 (iv)에서 얻어진 농축된 단백질 생성물은 예를 들어 임의의 HMW 단백질 또는 오염물질의 백분율이 5, 10, 15 또는 25％ 미만이라는 특징을 가질 수 있다. 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 약 3.0의 pH를 가지며 약 250 mM 글리신을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (ii)의 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 약 7.5의 pH를 가지며 약 25 mM NaH2PO4 및 약 150 mM NaCl을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 약 50 mM HEPES 및 약 135 mM NaCl을 포함하며 약 7.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 약 50 mM HEPES 및 약 200 mM NaCl을 포함하며 약 7.0의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iv)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 예를 들어 약 7.0의 pH를 가지며 약 50 mM HEPES 및 약 1.2 M (NH4)2SO4를 포함하는 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민 관능기를 갖는 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼을 사용하여 수행할 수 있다. 단계 (iv)의 소수성 상호작용 칼럼은 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸 또는 이소아밀 관능기를 갖는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 정제된 CTLA4-Ig가 단핵구 화학주성 단백질-1 (MCP-1)이 실질적으로 없도록 액체 세포 배양물로부터 CTLA4-Ig 분자를 정제하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 분자의 제약상 허용되는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 0.5 ppm 이하의 MCP-1, 1 ppm 이하의 MCP-1, 2 ppm 이하의 MCP-1, 3 ppm 이하의 MCP-1, 4 ppm 이하의 MCP-1, 5 ppm 이하의 MCP-1, 6 ppm 이하의 MCP-1, 7 ppm 이하의 MCP-1, 8 ppm 이하의 MCP-1, 9 ppm 이하의 MCP-1, 또는 10 ppm 이하의 MCP-1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물에서의 MCP-1의 양은 정제된 CTLA4-Ig의 1 중량％, 0.5 중량％ 또는 0.1 중량％를 초과할 수 없다. 또 다른 실시양태에서, QFF 용출액 액체에 50, 45, 40, 38, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 ng/mL 미만의 MCP-1이 있는 경우 CTLA4-Ig의 조성물은 실질적으로 MCP-1이 없다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 정제된 CTLA4-Ig가 실질적으로 MCP-1이 없으며, 2.5％ 미만의 CTLA4-Ig 사량체를 포함하도록 액체 세포 배양물로부터 CTLA4-Ig 분자를 정제하기 위한 방법을 제공한다.
조성물에서의 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-1)의 양은 ELISA 방법을 사용하여 정량할 수 있다. 코팅 항체는 염소 항-마우스 MCP-1 IgG 항체이다. 2차 항체는 토끼 항-래트 MCP-1 IgG 항체이다. 검출은 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG 항체 및 기질 TMB를 사용하여 달성된다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 시약은 포획된 단백질의 양에 대한 비례하여 발현하는 비색 반응을 생성한다. ELISA는 물질 표준 곡선에 대한 MCP-1 수준을 정량한다. 한 실시양태에서, MCP-1은 조성물로 정량되며, MCP-1 수준은 0 0.097 ng/mg 내지 0.014-0.154 ng/mg 범위 내에 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 정제된 CTLA4A29YL104E-Ig가 실질적으로 단핵구 화학주성 단백질-1 (MCP-1)이 없도록 액체 세포 배양물로부터 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 정제하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, MCP-1의 양은 정제된 CTLA4A29YL104E-Ig의 1 중량％, 0.5 중량％ 또는 0.1 중량％를 초과할 수 없다. 또 다른 실시양태에서, HIC 용출액 액체 중에 50, 45, 40, 38, 35 또는 30 ng/mL 미만의 MCP-1이 있는 경우 CTLA4A29YL104E-Ig은 실질적으로 MCP-1이 없다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 정제된 CTLA4A29YL104E-Ig가 실질적으로 MCP-1이 없으며, 2.5％ 미만의 CTLA4A29YL104E-Ig 사량체를 포함하도록 액체 세포 배양물로부터 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 정제하기 위한 방법을 제공한다.
세포 배양물로부터의 당단백질 회수 및 정제
본 발명은 불순한 세포-배양 상청액, 관심 있는 당단백질 (예컨대, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)을 함유하는 단백질 풀 및 바람직하지 않은 오염물질로부터 당단백질 (예를 들어, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig)을 분리하기 위한 일련의 단계를 기재한다. CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질의 정제를 위한 출발 물질로서 불순한 세포-배양 상청액을 사용할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 당단백질 및 바람직하지 않은 오염물질을 함유하는 불순한 세포-배양 상청액을 음이온-교환 배지에 적용한다. 불순한 세포-배양 상청액에 존재하는 CTLA4-Ig 당단백질이 음이온-교환 배지에 결합한다. 이후, 음이온-교환 배지를 세척하여, 임의의 결합되지 않은 물질을 음이온-교환 배지로부터 제거한다. 결합되지 않은 물질을 제거한 이후 CTLA4-Ig 당단백질을 용출시키고, 용출액을 수집한다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 및 바람직하지 않은 오염물질을 함유하는 불순한 세포-배양 상청액을 친화성 크로마토그래피 배지에 적용시킨다. 불순한 세포-배양 상청액에 존재하는 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질이 친화성 크로마토그래피 배지에 결합한다. 이후, 친화성 크로마토그래피 배지를 세척하여, 임의의 결합되지 않은 물질을 음이온-교환 배지로부터 제거한다. 결합되지 않은 물질을 제거한 이후, CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질을 용출시키고, 용출액을 수집한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 예를 들어 Q-세파로스 XL 칼럼 (지이 헬스케어 (GE Healthcare))를 사용하는 Q-세파로스 음이온-교환 크로마토그래피 (AEC)를 이용하여 수거 물질로부터 CTLA4-Ig 당단백질을 분리시키며, 대량의 오염물질을 감소시킨다. 이러한 칼럼은 수거된 세포 배양 배지의 분획을 위해 포유동물 세포 배양물로부터 CTLA4-Ig 당단백질의 정제에서의 초기 단계로서 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 정제 단계 이후 Q-세파로스 음이온-교환 크로마토그래피, 예를 들어 Q-세파로스 패스트 플로우 (Fast Flow) (지이 헬스케어)를 사용할 수 있다. 음이온 교환 칼럼의 매우 높은 유동 특성은 CTLA4-Ig 당단백질이 칼럼과 결합하도록 조건을 조절하여 큰 부피의 CTLA4-Ig 당단백질 또는 수거된 세포 배양 배지가 후속적인 크로마토그래피 단계, 예컨대 SP-세파로스 또는 HIC 이전에 용이하게 농축되도록 한다. 약 5 내지 9, 특히 약 8의 pH의 세척 완충액에 대하여, 75 mM HEPES 및 360 mM NaCl 농축물이 유용하다. 통상적으로 약 5 내지 8, 특히 약 7의 pH의 용출 완충액에 대하여, 25 mM HEPES 및 325 mM NaCl 농축물이 유용하다.
수거된 배양 배지로부터 CTLA4-Ig 당단백질을 분리하기에 적합한 수지는 고정화된 아민 관능기를 갖는 것이었다. 예를 들어 지이 헬스케어사의 Q-세파로스 패스트 플로우 수지 상의 4차 아민 관능기 수지가 가장 유용하며, 여기서 4차 암모늄 리간드가 높은 공극률의 가교된 아가로스에 결합된다. 또한, 예를 들어 지이 헬스케어사의 DEAE 세파로스 패스트 플로우 수지 상의 1차, 2차 및 3차 아민 관능기 수지가 유용하며, 여기서 3차 디에틸아미노에틸 리간드가 높은 공극률의 가교된 아가로스에 결합된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 음이온-교환 배지로부터의 CTLA4-Ig 당단백질-함유 용출액을 수집하고, 이후 소수성 상호작용 수지와 접촉시킨다. 하기 기재된 것과 같이, CTLA4-Ig 당단백질-함유 부피를 HIC 칼럼 및 수집된 풀을 통해 통과시키며, 이를 추가로 정제할 수 있으며, 이후 음이온-교환 수지에 결합시킨다.
HIC는 포유동물 세포 배양물로부터의 고분자량 물질 및 다른 단백질 불순물로부터 바람직한 CTLA4-Ig 당단백질 이량체를 분리하는데 유용하다. 예를 들어, CTLA4-Ig-발현-CHO 세포 배양물은 CTLA4-Ig 당단백질의 고분자량 응집물을 함유한다. 또한, CHO 세포 단백질 불순물이 포유동물 세포 배양 배지에서 발견된다. 이러한 바람직하지 않은 생성물은 환자에서 원치 않는 항원 반응을 생성하며, 불량한 생성물 품질 또는 활성에 기여할 수 있었다. HIC는 CTLA4-Ig 당단백 이량체가 칼럼을 통과하며 나머지 생성물이 HIC 수지에 결합하는 것을 통해 소수성 변형체, CTLA4-Ig 당단백질 HMW 착물로부터의 CTLA4-Ig 당단백질 이량체, 및 CHO 단백질 불순물을 효과적으로 분리한다. 이에 따라, 실질적으로 이들 종이 없으며, 특히 또 다른 크로마토그래피 단계, 예컨대 음이온-교환 크로마토그래피에 적합한 CTLA4-Ig 당단백질 풀을 얻을 수 있다. HIC와 함께 사용하기 위한 CTLA4-Ig 당단백질 혼합물의 공급원은 포유동물 세포 배양물, 예를 들어 CHO 세포 배양물이다. 특히, 배양물은 1회 이상의 앞서 논의된 것과 같은 이전 정제 단계를 적용시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, HIC 방법을 변형하여 다른 당단백질 (예를 들어, CTLA4-Ig HMW 착물)의 풀을 수집할 수 있다. HMW 응집물은 HIC 수지 (예를 들어, CTLA4-Ig 사량체 등을 포함함)에 결합할 수 있다. 이러한 HMW 착물은 보다 큰 결합활성을 가지며, CTLA4-Ig 이량체 단독에 비해 생체내에서 보다 효과적으로 결합한다. 이에 따라, 당업자들은 HIC의 CTLA4-Ig 풀을 용출시켜 CTLA4-Ig HMW 응집물의 풀을 얻을 수 잇다.
CTLA4-Ig 당단백질 형태를 분리시키는데 가장 유용한 HIC 수지는 고정화된 페닐 관능기를 갖는 수지이다. 페닐-HIC 중, 지이 헬스케어의 페닐 세파로스 패스트 플로우 하이 서브 (High Sub) (고 치환)가 가장 유용하다. 토소하스 (TosoHaas)의 페닐 토요페릴 (Toyopearl) 배지 및 TSK 페닐 5PW가 사용할 수 있는 다른 페닐-HIC 수지의 비제한적인 예이다. 다른 HIC 관능기에는 프로필, 옥틸, 알콕실, 부틸 및 이소아밀 잔기가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 페닐 세파로스 4 패스트 플로우 칼럼 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 방법을 사용하여 HIC 정제 단계 (실시예 15 및 실시예 20 참조)에서 용출된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 고분자량 종의 양을 감소시킬 수 있다. 이에 따라, HIC 칼럼으로부터의 클리닝 피크 (cleaning peak)가 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig HMW 종에서 농축된다.
HIC 정제 단계로부터의 CTLA4-Ig 당단백질을 함유하는 결합되지 않은 분획물을 추가의 정제 방법, 예컨대 친화성 크로마토그래피에 적용시키고, 얻어진 용출액을 이후 음이온 교환 배지에 적용할 수 있다. CTLA4-Ig 당단백질은 음이온-교환 수지에 결합하며, 이를 후속적으로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거한다. 결합되지 않은 단백질을 제거한 이후, CTLA4-Ig 당단백질을 제2 음이온-교환 수지로부터 용출시킨다. 용출액을 수집하고, 추가로 농축시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피, 예를 들어 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 (지이 헬스케어)를 사용하여 추가로 CTLA4-Ig 당단백질을 농축시키며, 이는 추가로 음이온-교환 크로마토그래피 단계, 예를 들어 Q-세파로스 패스트 플로우 (지이 헬스케어)로 이어질 수 있다. 또한, 친화성 크로마토그래피 단계는 CHO 단백질의 수준 및 단핵구 화학주성 단백질 (MCP-1, 케모카인) 불순물을 감소시킬 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 흡착성 분리를 포함하며, 여기서 정제되는 관심 있는 분자, 예를 들어 CTLA4-Ig 당단백질이 몇몇 매트릭스 또는 수지에 고정화된 리간드에 특이적이며 가역적으로 결합한다. 친화성 정제 칼럼의 몇몇 비제한적인 예에는 렉틴; 친화성 태그 (예를 들어, GST 칼럼 또는 6X-His 칼럼); 스트렙타비딘; 헤파린; 또는 항체 (예를 들어, 단백질 A 칼럼 또는 단백질 G 칼럼)가 포함된다. 특히, 본 발명은 단백질 A 수지를 CTLA4-Ig 당단백질 결합에 이용한다. 약 5 내지 9, 보다 효과적으로는 약 8의 pH의 세척 완충액에 대하여, 25 mM Tris 및 250 mM NaCl 농축물이 유용하다. 약 2 내지 5, 보다 효과적으로는 약 3.5의 pH의 용출 완충액에 대하여, 100 mM 글리신 농축물이 유용하다. 이후, 친화성 크로마토그래피 용출액을 중화시키고, 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 로딩하며, Q-세파로스 패스트 플로우가 가장 유용하다.
상기 회수/초기 정제 단계 이후 생성물에서의 단백질 A, DNA 및 바람직하지 않은 CTLA4-Ig 당단백질 종의 수준을 추가로 감소시키기 위하여, 또 다른 이온-교환 단계를 정제 절차로 도입할 수 있다. 본 발명은 시판되는 이온-교환 칼럼, 예컨대 지이 헬스케어사의 Q-세파로스 패스트 플로우 칼럼 또는 지이 헬스케어사의 DEAE 세파로스 패스트 플로우 칼럼을 이용할 수 있다. 본원에서 측정된 것과 같이, 수거된 배양 배지로부터 CTLA4-Ig 당단백질을 분리하기에 가장 적합한 수지는 고정화된 아민 관능기를 갖는 수지였다. 다른 유용한 기는 4차 아민 관능기 수지, 예를 들어 지이 헬스케어사의 Q-세파로스 패스트 플로우 칼럼 내의 수지이며, 여기서 4차 암모늄 리간드가 높은 공극률의 가교된 아가로스에 결합된다. 또한, 1차, 2차 및 3차 아민 관능기 수지, 예를 들어 지이 헬스케어사의 DEAE 세파로스 패스트 플로우 칼럼 내의 수지가 유용하며, 여기서 3차 디에틸아미노에틸 리간드가 높은 공극률의 가교된 아가로스에 결합된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 강한 음이온 교환기를 이용하는 칼럼, 예컨대 Q-세파로스 패스트 플로우 칼럼을 이용한다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 당단백질 용출액을 음이온 교환 칼럼, 예를 들어 Q-세파로스 패스트 플로우에 로딩한다. 칼럼을 세척하고, 후속적으로 CTLA4-Ig 당단백질을 음이온 교환 칼럼으로부터 용출시킨다. 약 5 내지 9, 한 실시양태에서 8의 pH의 세척 완충액에 대하여, 25 mM HEPES 및 100-140 mM NaCl 농축물이 유용하다. 약 5 내지 9, 또는 또 다른 실시양태에서 8의 pH의 용출 완충액에 대하여, 25 mM HEPES 및 200 mM NaCl 농도가 유용하다. 음이온-교환 배지로부터 용출된 CTLA4-Ig 당단백질을 정용여과 또는 당업자들에게 알려진 기타 적합한 방법에 의해 회수, 농축 및 세척하여, 최종 정제된 CTLA4-Ig 당단백질 생성물을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 CTLA4-Ig 당단백질 생성물은 고순도이며, 예를 들어 95％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체를 함유하고, 5％ 이하의 CTLA4-Ig HMW 생성물을 함유하며, 1％ 이하의 CTLA4-Ig 단량체를 함유한다.
추가적으로, 정제 방법은 포유동물 세포주의 세포 배양 배지에 잠재적으로 존재할 수 있는 바이러스 및/또는 레트로바이러스를 불활성화 및/또는 제거하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 카오트로프 (chaotrope), 예컨대 우레아 또는 구아니딘, 디터전트, 추가의 한외여과/정용여과 단계, 통상적인 분리, 예컨대 이온-교환 또는 크기 배제 크로마토그래피, pH 익스트림 (pH extreme), 가열, 프로테아제, 유기 용매 또는 그의 임의의 조합으로 처리하는 것을 비제한적으로 포함하는 유의한 수의 바이러스 청소 단계가 이용가능하다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피, 예를 들어 맙셀렉트 (MabSelect) 단백질 A 세파로스 수지 (지이 헬스케어)를 이용하여 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질을 포획하며, 이는 추가로 음이온-교환 단계, 예를 들어 Q-세파로스 패스트 플로우 (지이 헬스케어)로 이어질 수 있다. 또한, 친화성 크로마토그래피 단계는 CHO 단백질 및 단핵구 화학주성 단백질 (MCP-1, 케모카인) 불순물의 수준을 감소시킬 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 흡착성 분리를 포함하며, 여기서 정제되는 관심 있는 분자, 예를 들어 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질이 몇몇 매트릭스 또는 수지에 고정화된 리간드에 특이적이며 가역적으로 결합한다. 친화성 정제 칼럼의 몇몇 비제한적인 예에는 렉틴; 친화성 태그 (예를 들어, GST 칼럼 또는 6X-His 칼럼); 스트렙타비딘; 헤파린; 또는 항체 (예를 들어, 단백질 A 칼럼 또는 단백질 G 칼럼)가 포함된다. 특히, 본 발명은 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질에 결합하기 위해 단백질 A 수지를 이용한다. 약 5 내지 9, 보다 효과적으로는 약 7.5의 pH의 세척 완충액에 대하여, 25 mM Tris, 25 mM NaH2PO4 및 250 mM NaCl 농축물이 유용하다. 약 2 내지 5, 보다 효과적으로는 약 3.5의 pH의 용출 완충액에 대하여, 100-300 mM 글리신 농축물이 유용하다. 이후, 친화성 크로마토그래피 용출액을 중화시키고, 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 로딩시킬 수 있으며, Q-세파로스 패스트 플로우가 가장 유용하다.
상기 회수/초기 정제 단계 이후 생성물에서의 단백질 A, DNA 및 바람직하지 않은 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 종의 수준을 추가로 감소시키기 위해, 이온-교환 단계를 정제 절차에 도입할 수 있다. 본 발명은 시판 이온-교환 칼럼, 예컨대 지이 헬스케어사의 Q-세파로스 패스트 플로우 칼럼, Q-세파로스 XL 칼럼 (지이 헬스케어) 또는 지이 헬스케어사의 DEAE 세파로스 패스트 플로우 칼럼을 이용할 수 있다. CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 분리에 가장 적합한 수지는 고정화된 아민 관능기를 갖는 수지이다. 다른 유용한 군은 4차 아민 관능기 수지, 예를 들어 지이 헬스케어사의 Q-세파로스 패스트 플로우 칼럼 내의 수지이며, 여기서 4차 암모늄 리간드는 높은 공극률의 가교된 아가로스에 결합된다. 또한, 1차, 2차 및 3차 아민 관능기 수지, 예를 들어 지이 헬스케어사의 DEAE 세파로스 패스트 플로우 칼럼 내의 수지가 유용하며, 여기서 3차 디에틸아미노에틸 리간드는 높은 공극률의 가교된 아가로스에 결합된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 강한 음이온 교환기를 이용하는 칼럼, 예컨대 Q-세파로스 패스트 플로우 칼럼을 이용한다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 용출액을 음이온 교환 칼럼, 예를 들어, Q-세파로스 패스트 플로우에 로딩한다. 칼럼을 세척하고, 후속적으로 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질을 음이온 교환 칼럼으로부터 용출시킨다. 약 5 내지 9, 한 실시양태에서 7의 pH의 세척 완충액에 대하여, 25-55 mM HEPES 및 100-140 mM NaCl 농축물이 유용하다. 약 5 내지 9, 또는 또 다른 실시양태에서 7의 pH의 용출 완충액에 대하여, 25-50 mM HEPES 및 200 mM NaCl 농축물이 유용하다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 음이온-교환 배지로부터 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질-함유 용출액을 수집하고, 이후 소수성 상호작용 수지와 접촉시킨다. HIC는 포유동물 세포 배양물로부터의 고분자량 물질 및 다른 단백질 불순물로부터 바람직한 CTLA4A29YL104E-Ig 이랑체를 분리하는데 유용하다. 예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig-발현-CHO 배양물은 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질의 고분자량 응집물을 함유한다. 또한, CHO 세포 단백질 불순물이 포유동물 세포 배양 배지에서 발견된다. 이러한 바람직하지 않은 생성물은 환자에서 원치 않는 항체 반응을 생성하며, 불량한 생성물 품질 또는 활성에 기여할 수 있다.
HIC는 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 이량체가 칼럼을 통해 통과하며 나머지 생성물이 HIC 수지에 결합하는 것을 통해 소수성 변형체, CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 HMW 착물로부터의 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 이량체 및 CHO 단백질 불순물을 효과적으로 분리한다. 이에 따라, 실질적으로 이들 종이 없는 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 풀을 얻을 수 있다. HIC와 함께 사용하기 위한 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 혼합물의 공급원은 포유동물 세포 배양물, 예를 들어 CHO 세포 배양물이다. 특히, 배양물은 이전에 논의된 것과 같은 하나 이상의 이전 정제 단계를 적용시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, HIC 방법을 변형하여 다른 당단백질 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig HMW 착물)의 풀을 수집할 수 있다. HMW 응집물은 HIC 수지 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 사량체 등을 포함함)에 결합할 수 있다. 이러한 HMW 착물은 보다 큰 결합활성을 가지며, CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 단독에 비해 생체내에서 보다 효과적으로 결합한다. 이에 따라, 당업자들은 HIC의 CTLA4A29YL104E-Ig 풀을 용출하여 CTLA4A29YL104E-Ig HMW 응집물의 풀을 얻을 수 있다.
HIC 배지로부터 용출된 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질을 정용여과 또는 당업자들에게 알려진 다른 적합한 방법에 의해 회수, 농축 및 세척하여, 최종 정제된 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 생성물을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 생성물은 고순도이며, 예를 들어 95％ 이상의 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체를 함유하며, 5％ 이하의 CTLA4A29YL104E-Ig HMW 생성물을 함유하고, 1％ 이하의 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체를 함유한다.
CTLA4A29YL104E-Ig 당단백질 형태를 분리하기에 가장 유용한 HIC 수지는 고정화된 페닐 관능기를 갖는 수지이다. 페닐-HIC 수지 중, 지이 헬스케어사의 페닐 세파로스 패스트 플로우 하이 서브 (고 치환)가 가장 유용하다. 토소하스사의 페닐 토요페릴 배지 및 TSK 페닐 5PW가 사용될 수 있는 다른 페닐-HIC 수지의 비제한적인 예이다. 다른 HIC 관능기에는 프로필, 옥틸, 알콕실, 부틸 및 이소아밀 잔기가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
추가적으로, 정제 방법은 포유동물 세포주의 세포 배양 배지에 잠재적으로 존재할 수 있는 바이러스 및/또는 레트로바이러스를 불활성화 및/또는 제거하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 카오트로프, 예컨대 우레아 또는 구아니딘, 디터전트, 추가의 한외여과/정용여과 단계, 통상적인 분리, 예컨대 이온-교환 또는 크기 배제 크로마토그래피, pH 익스트림, 가열, 프로테아제, 유기 용매 또는 그의 임의의 조합물로 처리하는 것을 비제한적으로 포함하는 상당한 수의 바이러스 청소 단계가 이용가능하다.
한 실시양태에서, 농축 및 정용여과 단계에 적용하는 정제된 CTLA4-Ig 분자를 2 L 바이오테이너® 병, 50 L 바이오프로세스 백 또는 임의의 다른 적합한 용기에 충전시킬 수 있다. 상기 용기 내의 CTLA4-Ig 분자는 동결 이전에 약 2℃ 내지 8℃에서 약 60일 동안 저장할 수 있다. 2℃ 내지 8℃에서의 정제된 CTLA4-Ig의 연장된 저장은 CTLA4-Ig 사량체의 비율의 증가를 유도할 수 있다. 따라서, 장기 저장을 위하여 CTLA4-Ig 분자를 약 -70℃에서 동결시키고, 이후 약 -40℃의 온도에서 저장할 수 있다. 동결 온도는 약 -50℃ 내지 약 -90℃로 변할 수 있다. 동결 시간은 변할 수 있으며, CTLA4-Ig 분자를 함유하는 용기의 부피 및 동결기에 로딩되는 용기의 수에 크게 의존한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 2 L 바이오테이너 (Biotainer®) 병 내에 있다. 동결기 내에 4개 미만의 2 L 바이오테이너® 병을 로딩하는 것은 약 14 내지 약 18시간의 동결 시간이 필요할 수 있다. 4개 이상의 병을 로딩하는 것은 약 18 내지 약 24시간 이상의 동결 시간을 요구할 수 있다. 동결된 CTLA4-Ig 분자를 갖는 용기를 약 -35℃ 내지 약 -55℃의 온도에서 저장한다.
약 -35℃ 내지 약 -55℃의 온도에서의 저장 시간은 변할 수 있으며, 18시간 정도로 짧을 수 있다. 동결된 CTLA4-Ig 분자를 제어 방식으로 해동시킬 수 있다. 동결된 CTLA4-Ig 분자의 해동을 제어하고, 약 20℃ 내지 약 24℃의 온도에서 인큐베이터에서 수행할 수 있다. 해동 단계의 지속 시간은 인큐베이터의 로딩에 따르며, 여기서 4개 미만의 2 L 바이오테이너® 병의 로딩은 약 24시간 미만의 해동 시간을 요구할 수 있다. CTLA4-Ig 분자를 포함하는 해동된 용액을 혼합하여, 잠재적인 농도 구배를 피할 수 있다. 이에 따라, 해동은 제어된 온도 인큐베이터에서 수행할 수 있으며, 이는 또한 CTLA4-Ig를 함유하는 용기를 진탕시킨다. 진탕 속도는 약 40 내지 약 80 rpm일 수 있다. 추가적으로, 해동된 CTLA4-Ig 분자를 추가로 5 내지 10분 동안 약 3 rpm의 회전 속도에서 혼합할 수 있다. CTLA4-Ig를 포함하는 제약 조성물의 생산 동안, 해동된 CTLA4-Ig 분자를 2℃ 내지 8℃에서 저장하고, 분취하고, 동결건조시킬 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 비제한적인 예로서 대규모로 제조되는 다른 치료용 당단백질의 정제에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 포유동물 세포 배양물에서의 하나 이상의 글리코실화된 변형체를 갖는 다른 당단백질의 제조에 적용할 수 있다. 당업자들은 상이한 당단백질의 생산을 위한 예시된 방법의 적합화의 과정에서 필요할 수 있는 변형을 이해할 것이다.
제제 및 키트
또한, 본 발명은 동결건조된 혼합물로서 임의의 기재된 CTLA4-Ig 분자를 제공한다. 동결건조된 CTLA4-Ig를 포함하는 제제는 하기 3가지 기본 성분을 추가로 포함할 수 있다. (1) 다른 재조합 단백질 또는 소형 분자 (예컨대, 면역 억제제)를 비롯한 추가의 활성 성분; (2) 부형제; 및 (3) 용매. 부형제에는 양호한 동결건조된 케이크 특성 (벌크화제) 및 또한 단백질의 동결건조보호 및/또는 동결보호 (안정화제), pH의 유지 (완충제) 및 생물학적 활성 (활성 성분 안정성, 예컨대 단백질 안정성을 포함함)의 실질적인 유지를 위한 저장 동안의 올바른 단백질 형태의 유지를 제공하기 위한 제약상 허용되는 작용제가 포함된다. 부형제에 대하여, 제제의 예에는 하나 이상의 완충제, 벌크화제, 단백질 안정화제 및 항미생물제가 포함될 수 있다. 당 및 폴리올을 용액에서의 비특이적 단백질 안정화제로서 동결-해동 및 동결-건조 중에 사용할 수 있다. 중합체를 사용하여 용액에서의 단백질을 동결-해동 및 동결-건조 동안 안정화시킬 수 있다. 한 대중적인 중합체는 혈청 알부민이며, 이는 동결보호제 및 동결건조보호제 둘 모두로서 사용되어 왔다. 한 실시양태에서, 본 발명은 알부민 트리 (tree)인 제제를 제공한다. 여러 염을 벌크화제로서 사용할 수 있다. 염 벌크화제의 예에는 예를 들어 NaCl, MgCl2 및 CaCl2가 포함된다. 특정 아미노산을 동결방지제 및/또는 동결건조보호제 및/또는 벌크화제로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 아미노산에는 글리신, 프롤린, 4-히드록시프롤린, L-세린, 나트륨 글루타메이트, 알라닌, 아르기닌 및 리신 히드로클로라이드가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 pH 범위를 커버하는 많은 완충제가 제제에서의 선택시 이용가능하다. 완충제에는 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 글리신, 히스티딘, 포스페이트 (나트륨 또는 칼륨), 디에탄올아민 및 Tris가 포함된다. 완충제는 동결건조 이전에 허용되는 범위 내로 용액 pH를 유지하는 작용제를 포함한다. 제제는 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 2005년 12월 20일자로 출원된 미국 특허 출원 제60/752,150호에 이미 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 90％, 95％, 99％ 또는 99.5％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체를 포함하는 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 90％, 95％, 99％ 또는 99.5％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체, 및 5％, 4％, 3％, 2％ 또는 1％ 이하의 CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 90％, 95％, 99％ 또는 99.5％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체, 5％, 4％, 3％, 2％ 또는 1％ 이하의 CTLA4-Ig 사량체, 및 2％, 1.5％, 1.0％, 0.8％, 0.5％ 또는 0.3％ 이하의 CTLA4-Ig 단량체를 포함하는 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 1 몰 당 시알산 8.0 몰 이상을 포함하는 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 CTLAIg 분자 또는 이량체 1 몰 당 약 15 내지 약 35 몰의 GlcNac; CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 1 몰 당 약 5 몰의 GalNac; CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 1 몰 당 약 5 몰 내지 약 20 몰의 갈락토스; CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 1 몰 당 약 2 내지 약 10 몰의 푸코스; 및/또는 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 분자 1 몰 당 약 5 내지 15 몰의 만노스를 포함하는 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 제공한다.
CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료는 대략 7.5의 pH에서 25 mM 인산나트륨 및 10 mM 염화나트륨 완충액 중 대략 25 mg/mL (22.5-27.5 mg/mL) 농도의 수용액으로서 이용가능하다. CTLA4A29YL104E-Ig는 수용액에서 고분자량 종을 형성하는 경향을 갖는다. 이에 따라, 약물 제품에서 형성할 수 있는 고 분자량 종의 수준을 최소화하기 위해 동결 건조된 생성물을 개발하였다. 여러 부형제, 예컨대 말토스, 수크로스 및 아미노산, 예컨대 L-아르기닌 히드로클로라이드를 CTLA4A29YL104E-Ig의 동결 건조 동안에 잠재적 동결건조보호제로서 스크리닝하였다. 수크로스가 가장 효과적인 동결건조보호제로서 밝혀졌다. 수크로스 대 단백질 비의 증가가 단백질 안정성을 개선시켰음을 추가로 관찰하였다. 동결건조되는 단백질 용액에 대해 2:1 (중량:중량)의 수크로스:단백질 비를 선택하였다. 동결건조된 약물 제품은 적절한 안정성 및 만족스러운 구성 거동을 갖는다.
치료 방법
본 발명에 따르면, B7 양성 세포와의 T 세포 상호작용에 의해 매개된 질환은 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 제약상 허용되는 제제를 투여하여 치료할 수 있다. 조작된 포유동물 세포주 (예를 들어, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 DNA를 함유하는 dhfr-음성 차이니즈 햄스터 난소 세포주)에 의해 분비된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 특정 글리코실화 프로파일을 갖는 분자 집단일 수 있다. 본원에서 명시된 것과 같이, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자가 T 세포 활성 및/또는 증식에 대한 보다 큰 억제를 제공할 수 있도록 하기 위해 특정 글리코실화 프로파일은 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig에 영향을 미칠 수 있다. 본원에서 언급된 것과 같이, 특정 글리코실화 프로파일은 세포주 및 생산 방법에 의해 영향을 받을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 특정 실시양태에서, 일반적으로 임의의 T-세포 의존성 질환 또는 장애, 및 임의의 T-세포 의존성 자가면역 질환 또는 장애, 보다 구체적으로는 T 세포 림프종, T 세포 급성 림프모세포성 백혈병, 고환 혈관중심성 T 세포 림프종, 양성 림프구성 맥관염, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 이식편 이식 거부반응과 관련된 면역 장애, 건선, 염증, 알레르기, 난소염, 염증성 장 질환, 사구체신염, 뇌척수염, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환, 애디슨 질환, 크론 질환, 쇠그렌 증후군, 홍반성 루푸스, 원발성 점액수종, 악성 빈혈증, 자가면역 위축성 위염, 류마티스양 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 항사구체 기저막 증후군, 중증 근무력증, 천포창, 다발성 경화증, 교감성 안염, 자가면역 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈증, 특발성 혈소판감소증, 원발성 담즙성 간경변, 만성 작용 간염, 궤양성 대장염, 경피증, 다발근육염, 및 혼합성 결합 조직 질환을 비제한적으로 비롯한 T-세포 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 본 발명은 본원에서 기재된 제조 방법에서의 세포주에 의해 생성된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자를 제공한다.
본 발명은 T 세포 증식 또는 활성화의 억제, 대상체 또는 시험관내에서의 면역 반응의 억제, 및 대상체에서의 면역 장애의 치료 또는 대상체에서 항원에 대한 면역 관용의 유도를 위한 방법에서의 임의의 기재된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig의 용도를 제공한다. 면역 관용은 특정 항원에 대한 림프계 조직의 특정 비-반응을 발달시키는 면역 반응의 한 형태이며, 여기서 관용의 부재에서, 항원은 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 관용을 유도하며 거부의 가능성을 감소시키기 위해 본 발명의 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자, 및 조성물을 사용하여 이식받는 대상체를 치료할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이식은 기관 이식, 조직 이식 또는 세포 이식이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 이식은 골수 세포 또는 섬 세포를 포함한다.
본 발명은 임의의 상기 언급된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 임의의 개시된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 언급된 질환 또는 장애의 치료를 위한 또 다른 작용제와의 동시투여에서의 임의의 개시된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 용도를 제공한다. 본 발명의 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 예를 들어 정맥내, 피하 및/또는 흡입에 의해 대상체에 투여할 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여에 적용가능한 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 제제는 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 2005년 12월 20일자로 출원된 미국 일련번호 제60/752,150호에 기재되어 있다. 또한, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 제제에는 리포좀-계 제제가 포함되며, 여기서 상기 리포좀은 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104-Ig 분자를 표적 세포 또는 조직에 전달할 수 있다. 또한, CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 유전자 발현 카셋트를 포함하는 바이러스 벡터의 투여에 의해 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104-Ig 분자를 표적 세포 또는 조직에 전달할 수 있다. CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104-Ig 분자 집단의 투여 및 투여량은 US20030083246 및 US20040022787로서 공개된 미국 특허 출원, 및 또한 계류중인 2005년 4월 6일자로 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제60/668,774호에 기재되어 있으며, 상기 문헌 모두는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 액상 용액제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 좌약제, 중합체성 마이크로캡슐제 또는 마이크로비히클, 리포좀, 및 주사용 또는 주입용 용액제를 비제한적으로 비롯한 여러 투여 형태일 수 있다. 형태는 투여 방식 및 치료 용도에 따른다. 본 발명의 분자에 대한 효과적인 투여 방식 및 투여 요법은 질환의 중증도 및 과정, 대상체의 건강 상태 및 치료에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 따른다. 따라서, 분자의 투여량은 각각의 대상체에 대해 적정되어야 한다. 여러 크기 및 종의 동물, 및 mg/표면적 mg2에 기초한 인간에 대한 투여량의 상관관계는 문헌 [Freireich, E. J., et al. (Quantitative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Cancer Chemother, Rep.. 50, No.4, 219-244, May 1966)]에 의해 기재되어 있다. 투여량 처방에서 조절하여, 성장 억제 반응을 최적화시킬 수 있다.
용량은 1일 기준으로 분할 및 투여될 수 있거나, 또는 용량을 상황에 따라 비례하여 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 여러 분할된 용량을 1일 또는 1개월당 투여할 수 있거나, 또는 용량을 특정 치료 상황에 의해 지정된 것과 같이 비례하여 감소할 수 있다. 한 실시양태에서, 매 1개월, 매 1주, 매 1일, 1일 2회, 약 매 10시간, 약 매 6시간, 약 매 4시간, 약 매 2시간, 약 매 1시간 투여된다. 본 발명의 실시에 따르면, 대상체의 치료에 유효한 양은 대상체 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg일 수 있다. 또한, 유효량은 대상체 체중 1 kg 당 약 1 내지 약 10 mg 사이의 양일 수 있다. 또한, 본 발명의 CTLA4-Ig 또는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자는 생체내 임상 용도를 가질 수 있다. 이들은 몇몇 면역결핍 상태의 진단 또는 예후, 백혈병 및 림프종의 표현형 분석, 및 기관 이식에 이은 면역 변화의 모니터링에서의 B7 양성 세포의 산정을 위해 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 조성물의 전달은 주사, 경구 전달, 스프레이 또는 기타 특정 분산액의 흡입, 피하 주사, 정맥내 전달, 국소 전달, 좌약제, 안구 전달, 비내 또는 경구 전달을 통해 달성될 수 있다. 상기 조성물은 리포좀 또는 다른 막-유사 전달 비히클내로의 캡슐화를 통해 전달될 수 있다. 조성물은 미리 조성물로 처리된 혈액 또는 기타 체액을 통해 전달되고, 이후 후속적으로 대상체로 수혈할 수 있다.
<서열>
서열 17은 pcSDhuCTLA4Ig를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
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서열 18은 인간 CTLA4의 세포외 도메인의 아미노산 서열이다.
Figure 112011097388832-pat00049
추가의 비-제한적인 실시양태
본 발명은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 차이니즈 햄스터 난소 클론 세포 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 액체 배양물 1 리터 당 0.5 그램 이상의 CTLA4-Ig 단백질을 생산할 수 있으며, 여기서 CTLA4-Ig는 시알산 대 CTLA4-Ig 이량체의 몰비가 1,000 L 이상의 배양물 규모에서 약 6 내지 약 14인 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 무혈청의 화학적으로 규정된 배지에 적응되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 집단의 배양물로부터 생산된 CTLA4-Ig는 1.00 ± 0.05 AU mL cm-1 mg-1의 흡광 계수를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 배양물에서 성장된 경우, 세포 집단은 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 생산할 수 있으며, 여기서 (a) 약 90％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 약 10％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며; (c) 약 4％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 383에서 리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 약 96％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 382에서 글리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며; 임의로 (e) 약 1％ 미만의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 25에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 상기 기재된 세포의 자손 세포를 제공하며, 여기서 자손 세포는 CTLA4-Ig를 생산한다. 한 실시양태에서, 자손 세포는 5세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 얻어진다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 10세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 얻어진다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 20세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 얻어진다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 40세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 얻어진다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 50세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 얻어진다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 75세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 얻어진다. 또 다른 실시양태에서, 자손 세포는 100세대 이상에 걸쳐 세포를 배양하여 얻어진다.
본 발명은 상기 기재된 임의의 세포로부터 생성된 세포주를 제공한다. 한 실시양태에서, 세포는 클론성이다. 또 다른 실시양태에서, 세포주는 (a) 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 27에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 382에서의 글리신); (b) 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 27에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 383에서의 리신); (c) 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 26에서의 알라닌 및 아미노산 위치 382에서의 글리신); (d) 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 26에서의 알라닌 및 서열 2의 아미노산 위치 383에서의 리신); (e) 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 25에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 383에서의 리신); 또는 (f) 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 25에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 382에서의 글리신)을 생성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 세포주는 CTLA4-Ig 융합 단백질을 생성할 수 있으며, 여기서 (a) 약 90％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 27에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (b) 약 10％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 26에서 알라닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며; (c) 약 4％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 383에서 리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; (d) 약 96％의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 382에서 글리신으로 종결되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며; 임의로 (e) 약 1％ 미만의 CTLA4-Ig 폴리펩티드는 잔기 번호 25에서 메티오닌으로 개시되는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포주 배양으로부터 생산되는 CTLA4-Ig 융합 단백질은 1.00 ± 0.05 AU mL cm-1 mg-1의 흡광 계수를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포로부터 유래된 세포 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포 집단은 원래의 형질감염된 세포와 비교하여 하나 이상의 추가의 유전자 변화를 포함하며, 여기서 유래된 세포 집단은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 집단은 원래의 형질감염된 세포와 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26개 이상의 추가의 유전자 변화로 이루어지며, 여기서 유래된 세포 집단은 CTLA4-Ig를 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 게놈 또는 CTLA4-Ig를 코딩하는 재조합 발현 카셋트에서의 하나 이상의 비-보존성 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 내에 하나 이상의 추가의 재조합 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 변화는 세포 게놈의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 변화는 헥산의 세포 게놈에의 또는 항-아폽토시스성 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스 핵산으로서의 부가를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-아폽토시스성 폴리펩티드는 글리코실화에 관련된다.
한 실시양태에서, 유전자 변화는 세포 게놈 또는 CTLA4-Ig를 코딩하는 재조합 발현 카셋트의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 배양물에서 성장되는 경우, 세포 집단은 (a) 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 27에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 382에서의 글리신); (b) 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 27에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 383에서의 리신); (c) 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 26에서의 알라닌 및 아미노산 위치 382에서의 글리신); (d) 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 26에서의 알라닌 및 아미노산 위치 383에서의 리신); (e) 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 25에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 383에서의 리신); 또는 (f) 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 CTLA4-Ig 융합 단백질 (서열 2의 아미노산 위치 25에서의 메티오닌 및 아미노산 위치 382에서의 글리신)을 생산할 수 있다.
본 발명은 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 8 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 11 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 12 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 13 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 14 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 15 내지 약 17의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 16의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다.
본 발명은 95％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체인 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 98％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이다. 한 실시양태에서, 99％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이다. 한 실시양태에서, 99.5％ 초과의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이다. 한 실시양태에서, 약 95％ 내지 약 99.5％의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이며, 약 0.5％ 내지 약 5％의 분자가 CTLA4-Ig 사량체이다. 한 실시양태에서, 약 98.6％의 분자가 CTLA4-Ig 이량체이며, 약 1.2％의 분자가 CTLA4-Ig 사량체이고, 약 0.7％ 미만의 분자가 CTLA4-Ig 단량체이다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체로 이루어진 집단을 제공한다. 본 발명은 실질적으로 CTLA4-Ig 단량체가 없는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 실질적으로 CTLA4-Ig 사량체가 없는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 실질적으로 CTLA4-Ig 이량체 및 사량체가 없는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 각각의 CTLA4-Ig 이량체의 각각의 단량체는 3개 이상의 시알산 기를 갖는다.
한 실시양태에서, 각각의 CTLA4-Ig 이량체의 각각의 단량체는 3개 이상 내지 8개 이상의 시알산 기를 갖는다. 본 발명은 실질적으로 CTLA4-Ig 이량체가 없으며, 임의로 약 100 그램 초과인 양을 포함하는, CTLA4-Ig 사량체 분자의 정제된 집단을 제공한다. 본 발명은 실질적으로 CTLA4-Ig 단량체가 없으며, 임의로 약 100 그램 초과의 양을 포함하는, CTLA4-Ig 사량체 분자의 정제된 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 각각의 사량체 분자는 2쌍의 CTLA4-Ig 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 각각의 폴리펩티드는 서열 3 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 폴리펩티드 쌍의 각각의 일원은 다른 일원과 공유적으로 연결되며, 2쌍의 폴리펩티드는 서로 비-공유 결합된다. 한 실시양태에서, 각각의 사량체 분자는 CD80 또는 CD86에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 분자와 비교하여 CD80 또는 CD86에 대한 2배 초과의 결합활성을 갖는다. 한 실시양태에서, 각각의 사량체 분자는 CTLA4-Ig 이량체 분자와 비교하여 2배 이상의 더 높은 T 세포 증식 또는 활성화의 억제율을 갖는다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 등전 집중법에 의해 측정된 바와 같은 5.1 이하의 등전점 (pI)를 갖는 CTLA4-Ig의 등전 집중법 겔 상에서 시각화가능한 우세한 이소형을 포함한다. 한 실시양태에서, pI는 뉴라미니다제 처리 이후 증가한다. 한 실시양태에서, 40％ 이상의 CTLA4-Ig 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 바와 같이 약 5.1 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, 70％ 이상의 CTLA4-Ig 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 바와 같이 약 5.1 이하의 등전점을 나타낸다. 한 실시양태에서, 90％ 이상의 CTLA4-Ig 분자는 등전 집중법에 의해 측정된 바와 같이 약 2.5 이하의 등전점을 나타낸다. 본 발명은 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 4.3 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 3.3 ± 0.2 내지 약 4.7 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) CTLA4-Ig 분자의 혼합물을 등전 집중법 겔 전기영동시키며, 여기서 겔에서의 단일 밴드는 특정 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 나타내는 것인 단계; 및 (b) 약 2.0 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2의 pI를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 단리하여 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명은 약 17 내지 약 25의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GalNAc의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 CTLA4-Ig 분자는 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 갈락토스의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 갈락토스의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 3.5 내지 약 8.3의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 푸코스의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 7.2 내지 약 22의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 만노스의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; 및 (b) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; 및 (c) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; 및 (d) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 푸코스의 평균 몰비; 및 (e) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 만노스의 평균 몰비; 및 (f) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비를 특징으로 하는 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 약 9.589+/-0.3의 NGNA 크로마토그램 피크 및 약 10.543+/-0.3의 NANA 크로마토그램 피크를 나타낸다. 본 발명은 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 CTLA4-Ig 분자는 도 7에 나타낸 것과 같은 탄수화물 프로파일을 나타낸다. 본 발명은 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 CTLA4-Ig 분자는 도메인 I 내지 IV의 탄수화물 프로파일을 나타내며, 여기서 도메인 I은 아시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 II는 모노-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하며, 도메인 III은 디-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함하고, 도메인 IV는 트리-시알릴화 올리고사카라이드를 나타내는 피크를 포함한다. 한 실시양태에서, 도메인 I에서의 제1 피크 및 도메인 II에서의 주요 피크 사이의 N-연결된 올리고사카라이드의 체류 시간에서의 차이는 약 22 내지 약 28분이다. 본 발명은 CTLA4-Ig 이량체 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 CTLA4-Ig 이량체 분자의 0.5％ 이상은 시스테이닐화되어 있다. 또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 이량체 분자의 1.0％ 이상은 시스테이닐화되어 있다. 본 발명은 도 8 및 10에서 나타낸 것과 같은 질량 분광 프로파일을 나타내는, CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 도 20 및 21에서 나타낸 것과 같은 모세관 전기영동 프로파일을 나타내는, CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 조성물을 제공하며, 여기서 CTLA4-Ig 이량체는 시판 세포주의 세포로부터 생산된다. 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 얻어진 CTLA4-Ig 조성물을 제공한다. 본 발명은 서열 2의 위치 102에서의 아파라긴 아미노산 잔기, 서열 2의 위치 134에서의 아파라긴 아미노산 잔기, 서열 2의 위치 233에서의 아파라긴 아미노산 잔기, 서열 2의 위치 155에서의 세린 아미노산 잔기, 또는 서열 2의 위치 165에서의 세린 아미노산 잔기에서 글리코실화되어 있는 CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 이량체 1 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 만노스의 평균 몰비; (f) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비; (g) 약 2.4 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2 범위의 등전 집중법 겔에서의 시각화로부터 측정된 바와 같은 pI; (h) 5 ppm 이하의 MCP-1; (i) 2.5％ 미만의 사량체; (j) 0.5％ 미만의 단량체; (k) 임의의 서열 2 내지 8중 어느 것과 95％ 이상 동일한 아미노산을 갖는 집단의 CTLA4-Ig 폴리펩티드; (l) 집단 내의 CTLA4-Ig 분자가 CD80 및 CD86에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, CTLA4-Ig 분자의 집단을 제공한다. 본 발명은 (a) 약 15 내지 약 35의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GlcNAc의 평균 몰비; (b) 약 1.7 내지 약 3.6의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 GalNAc의 평균 몰비; (c) 약 8 내지 약 17의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 갈락토스의 평균 몰비; (d) 약 3.5 내지 약 8.3의 이량체 1 몰 당 푸코스의 평균 몰비; (e) 약 7.2 내지 약 22의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 만노스의 평균 몰비; (f) 약 6 내지 약 12의 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 시알산의 평균 몰비; (g) 약 2.4 ± 0.2 내지 약 5.0 ± 0.2 범위의 등전 집중법 겔에서의 시각화로부터 측정된 바와 같은 pI; (h) 5 ppm 이하의 MCP-1; (i) 2.5％ 미만의 사량체; (j) 0.5％ 미만의 단량체; (k) 임의의 서열 2 내지 8 중 어느 것과 95％ 이상 동일한 아미노산을 갖는 집단의 CTLA4-Ig 폴리펩티드; (l) 집단 내의 CTLA4-Ig 분자가 CD80 및 CD86에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, CTLA4-Ig 분자 또는 그의 제약 등가물의 집단을 제공한다. 본 발명은 유효량의 CTLA4-Ig 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 유효량의 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물을 소정 양의 말토스 일수화물을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 추가로 제약상 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 말토스, 제일인산나트륨 일수화물, 염화나트륨, 수산화나트륨 및 멸균수를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 수크로스, 폴록사머, 제일인산나트륨 일수화물, 무수 제2인산나트륨, 염화나트륨, 수산화나트륨, 및 멸균수를 추가로 포함한다.
본 발명은 95％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 및 5％ 이하의 CTLA4-Ig 사량체를 포함하는 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 혼합물은 98％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 및 2％ 이하의 CTLA4-Ig 사량체를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 99％ 이상의 CTLA4-Ig 이량체 및 1％ 이하의 CTLA4-Ig 사량체를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 8.0 몰 이상의 시알산을 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 약 15.7 내지 약 31 몰의 GlcNAc를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 약 1.6 내지 약 3.2 몰의 GalNAc를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 약 9.3 내지 약 15.5 몰의 갈락토스를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 약 3.6 내지 약 7.9 몰의 푸코스를 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 CTLA4-Ig 이량체 1 몰 당 약 9.7 몰의 만노스를 포함한다. 본 발명은 (a) 특허청구범위 제1항의 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물을 함유하는 용기; 및 (b) 동결건조된 CTLA4-Ig 혼합물의 주사용액으로의 재구성에 관한 지침서를 포함하는 제약 키트를 제공한다.
본 발명은 T 세포 증식 (또는 활성화)를 억제하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 T 세포를 유효량의 CTLA4-Ig 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 조성물을 면역 반응의 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 조성물을 질환 또는 장애를 치료하기 위한 양으로 투여하여 대상체에서 항원에 대한 면역 관용을 유도하기 위한 방법, 대상체에서 염증을 치료하기 위한 방법, 류마티스양 관절염을 치료하기 위한 방법, 대상체에서 건선을 치료하기 위한 방법, 대상체에서 루푸스를 치료하기 위한 방법, 대상체에서 알레르기를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법, 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법, 대상체에서 이식된 기관의 거부반응을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법, 대상체에서 다발성 경화증을 치료하기 위한 방법, 대상체에서 제I형 당뇨병을 치료하기 위한 방법, 대상체에서 염증성 장 질환을 치료하기 위한 방법, 대상체에서 난소염을 치료하기 위한 방법, 대상체에서 사구체신염을 치료하기 위한 방법, 대상체에서 알레르기성 뇌척수염을 치료하기 위한 방법, 또는 대상체에서 중증 근무력증을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체와 조합할 수 있다. 본 발명은 면역 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단의 용도를 제공한다. 본 발명은 류마티스양 관절염의 치료에서의 사용에 관한 지침서를 포함한 포장물로의 항-류마티스양 관절염 약제의 제조에 있어서 약 6 내지 약 18의 시알산 기 대 CTLA4-Ig 이량체의 평균 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 분자의 집단의 용도를 제공한다. 본 발명은 T 세포 증식 (또는 활성화)를 억제하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 조성물과 T세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역 반응의 억제가 필요한 대상체에게 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 대상체에서 항원에 대한 면역 관용을 유도하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 메토트렉세이트와 조합한 유효량의 특허청구범위 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 조성물을 면역 관용의 유도가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 확장시키며, 여기서 확장은 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로의 확장이고, 재조합 단백질 농도는 액체 배양물 1 L 당 0.5 g 이상인 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)의 확장은 (i) 세포를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지 중에서 4회 이상의 계대배양으로 배양시켜, 1 mL 당 약 1.0×105개 이상의 생존 세포의 세포 밀도를 얻으며, 여기서 각각의 시딩 단계는 1 ml 당 약 2×105개에서 시작하여 1 ml 당 1-2 백만개의 세포까지 진행되고; (ii) 배양물로부터 약 0.5 g/L 이상을 생산하기에 충분한 시간 동안 배양물 중에서 세포를 유지시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질은 당단백질이다. 한 실시양태에서, 단백질은 CTLA4-Ig 단백질이다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 자손 세포이다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 CTLA4-Ig 융합 단백질을 생산할 수 있는 CHO 클로날 세포주의 자손이며, 여기서 상기 CHO 세포는 30 카피 이상의 CTLA4-Ig 발현 카셋트를 그의 게놈내에서 안정하게 통합한다. 한 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 30％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 한 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 40％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 한 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 50％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 한 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 60％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 한 실시양태에서, 충분한 시간은 세포 생존도가 70％, 80％, 90％ 또는 95％ 미만으로 감소되지 않는 시간이다. 한 실시양태에서, 4회 이상의 계대배양은 (i) 1 ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 50 mL 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계; (ii) 1 ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 10 L 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계; (iii) 1 ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 100 L 이상의 배양 용량으로 성장시키는 단계; 및 (iv) 1 ml 당 약 1백만 내지 약 2.5백만개 세포의 세포 밀도에 이를 때까지 세포를 200 L의 배양 용량으로 성장시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 갈락토스를 무혈청의 화학적으로 규정된 배지에 첨가한다. 한 실시양태에서, 유지는 (i) 배양물의 온도를 37 ± 2℃에서 34 ± 2℃로 낮추는 단계; 및 (ii) 배양물의 온도를 34 ± 2℃에서 32 ± 2℃로 낮추는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 온도를 5일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 6일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 7일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 8일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 9일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 10일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 11일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 12일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 13일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 14일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 15일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 16일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 17일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 18일 이상 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 온도를 18일 이하 동안 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 한 실시양태에서, 배양물의 세포 밀도가 액체 배양물 1 mL 당 약 30×105 내지 79×105개 세포일 때까지 온도를 32 ± 2℃ 범위에서 유지시킨다. 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상이도록 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키며, 여기서 단리는 액체 배양물이 단백질 1 몰 당 약 6.0 몰 이상의 NANA를 함유하는 경우에만 일어나는 것인 단계를 포함한다. 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상이도록 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키며, 여기서 상기 단리는 액체 배양물이 1 mL 당 약 33×105 내지 약 79×105의 세포 밀도를 갖는 경우 일어나는 것인 단계를 포함한다.
본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상이도록 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키며, 여기서 상기 단리는 액체 배양물에서의 세포 생존도가 약 20％, 또는 약 30％, 또는 약 38％ 이하로 감소되지 않는 경우 일어나는 것인 단계를 포함한다. 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 단계는 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상이도록 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키며, 여기서 상기 단리는 내독소가 액체 배양물 1 mL 당 76.8 EU 이하인 경우에 일어나는 것인 단계를 포함한다. 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상이도록 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물으로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키며, 여기서 상기 단리는 바이오버든이 액체 배양물 1 mL 당 1 콜로니 형성 단위 미만인 경우에만 일어나는 것인 단계를 포함한다. 본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 (a) 재조합 단백질 농도가 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상이도록 재조합 단백질을 분비하는 포유동물 세포를 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로 확장시키는 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키며, 여기서 상기 단리는 (i) 액체 배양물이 단백질 1 몰 당 약 6.0 몰 이상의 NANA를 함유하는 조건; (ii) 액체 배양물이 1 mL 당 약 33×105 내지 약 79×105개 세포의 세포 밀도를 갖는 조건; (iii) 액체 배양물에서의 세포 생존도가 약 20％, 또는 약 38％ 이하로 감소되지 않는 조건; 또는 (iv) 배양물에서의 CTLA4-Ig의 양이 0.5 g/L 초과인 조건 중 2개 이상을 충족시키는 경우에만 일어나는 것인 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 단리는 (i) 세포 배양 상청액을 얻는 단계; (ii) 상청액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시켜, 용출된 단백질 생성물을 얻는 단계; (iii) 단계 (ii)의 용출된 단백질 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시켜, 농축된 단백질 생성물을 얻는 단계; (iv) 농축된 단백질 생성물을 친화성 크로마토그래피에 적용시켜, 용출되고 농축된 단백질 생성물을 얻는 단계; 및 (v) (iv)의 용출되고 농축된 단백질 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (iii)에서 얻어진 농축된 단백질 생성물은 임의의 고분자량 다량체의 백분율이 25 중량％ 미만임을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 75 mM HEPES 및 약 360 mM NaCl을 포함하며, 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 325 mM NaCl을 포함하며, 약 7.0의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 850 mM NaCl을 포함하며, 약 7.0의 pH를 갖는 단일 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 25 mM Tris 및 약 250 mM NaCl을 포함하며, 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 약 100 mM 글리신을 포함하며, 약 3.5의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 (v)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES, 및 약 120 mM NaCl 내지 약 130 mM NaCl을 포함하며, 약 8.0의 pH를 갖는 세척 완충액을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 (v)의 음이온 교환 크로마토그래피는 약 25 mM HEPES 및 약 200 mM NaCl을 포함하며, 약 8.0의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 (ii)의 음이온 교환 크로마토그래피는 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민 관능기를 갖는 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 수지는 4차 아민 관능기를 갖는다. 한 실시양태에서, 단계 (iii)의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐, 옥틸, 프로필, 알콕시, 부틸 또는 이소아밀 관능기를 갖는 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 관능기는 페닐 관능기이다. 한 실시양태에서, 단계 (iv)의 친화성 크로마토그래피는 단백질 A를 함유하는 칼럼을 사용하여 수행된다. 한 실시양태에서, 정제된 CTLA4-Ig가 (a) CTLA4-Ig 이량체 1 mg 당 약 38 mg의 MCP-1을 가지며, (b) 2.5 중량％ 미만의 CTLA4-Ig 사량체를 포함하도록 액체 세포 배양물로부터 CTLA4-Ig를 정제하는 것을 포함하는, CTLA4-Ig 생산 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 액체 세포 배양물은 본 발명의 세포 또는 자손 세포를 포함한다. 본 발명은 CTLA4-Ig의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) CTLA4-Ig를 생산할 수 있는 임의의 시판 세포주 또는 CHO 세포의 자손 세포를 확장시키며, 여기서 상기 확장은 시드 배양물로부터 10,000 L 이상의 액체 배양물로의 확장이고, CTLA4-Ig 농도는 액체 배양물 1 L 당 0.5 그램 이상인 단계; 및 (b) 10,000 L 이상의 액체 배양물로부터 CTLA4-Ig를 단리시키며, 여기서 상기 크로마토그래피는 적어도 페닐 관능기를 갖는 소수성 상호작용 수지를 갖는 칼럼 상에 있으며, 단리는 약 25 mM HEPES 및 약 850 mM NaCl을 포함하며 약 7.0의 pH를 갖는 단일 세척 완충액을 사용하여 수행되는 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계를 포함하는 것인 단계를 포함한다.
실시예
본 발명의 보다 완전한 이해를 촉진시키기 위해 여러 실시예를 하기 제공한다. 하기 실시예는 본 발명을 준비 및 실시하는 방식의 예를 예시한다. 그러나, 본 발명의 범주는 이들 실시예에 개시된 특정 실시양태로 제한되지 않으며, 이는 또 다른 방법을 이용하여 유사한 결과를 얻을 수 있기 때문에 예시만을 목적으로 한다.
하기 실시예는 하나 이상의 서열 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열을 포함하는 CTLA4-Ig 분자에 관한 것이다. 이들 실시예는 제한하려고 하지 않으며, 당업자들은 상기 실시예가 Ig-슈퍼패밀리 단백질의 일부와 관련되거나 또는 일부를 포함하는 다른 CTLA4-Ig 분자, 다른 당단백질 및 다른 단백질로 확장 및 적용될 수 있다는 것을 이해한다.
하기 표는 CTLA4-Ig 및 CTLA4A29YL104E-Ig에 관한 예를 제시한다.
Figure 112011097388832-pat00050
Figure 112011097388832-pat00051
약어:
15 N 15 나노미터
A280 280 nm에서의 흡광도
CTLA4-Ig 세포독성 T-림프구 항원-4 면역글로불린; CTLA-4 Ig
API 활성 제약 성분
AU 흡광도 단위
B7 CTLA-4 수용체 리간드
cfu 콜로니 형성 단위
CHO 차이니즈 햄스터 난소
CHOP 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포 단백질
CV 칼럼 부피
약물 재료 충전 약물 재료 농축/정용여과 및 충전 단계
ELISA 효소-연결된 면역흡착 분석법
EU 내독소 단위
Fc 항원의 불변 영역
GalNAc N-아세틸-갈락토사민
GlcNAc N-아세틸-글루코사민
HEPES 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산
HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피; 페닐 세파로스™ 패스트 플로우
HMW 고분자량
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
IgG1 G1 계열에서의 면역글로불린
IPC 공정 관리
LAL 리물루스 아메보사이트 (Limulus Amebocyte) 용해물
MBR(s) 마스터 뱃치 기록
MCP-1 단핵구 화학주성 단백질 1
MTX 메토트렉세이트
MW 분자량
N/A 해당 없음
NANA N-아세틸뉴라민산; 시알산; SA
NMWC 분획 분자량
OD 광학 밀도
PAR 검증 허용 범위
플라노바 바이러스 제거 필터, 공경 15 nm
PP(s) 방법 파라미터
PQ 성능 적격성 평가
psi 제곱인치 당 파운드
psid 제곱인치 당 파운드, 차이
psig 제곱인치 당 파운드, 게이지
QFF Q 세파로스™ 패스트 플로우
QXL Q 세파로스 익스트림 로드 (Extreme Load)
rPA 재조합 단백질 A 세파로스 패스트 플로우
SA 시알산; N-아세틸뉴라민산; NANA
SDS-PAGE 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
SOP 표준 작업 절차
Tris 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄
Triton X-100 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올; 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르
UF 한외여과
UV 자외선
v/v 부피 당 부피
VF 바이러스성 여과; 나노미터 여과
VI 바이러스 불활성화
실시예 1: 플라스미드 pcSDhuCTLA4-Ig에서의 CTLA4-Ig 코딩 서열의 확인
pcSDhuCTLA4-Ig에 존재하는 CTLA4-Ig 유전자의 주석이 있는 핵산 서열 및 상응하는 CTLA4-Ig의 추론된 아미노산 서열을 도 1에 나타낸다. CTLA4-Ig 분자를 발현할 수 있는 안정한 형질감염체를 생성하기 위해 pcSDhuCTLA4-Ig 핵산을 CHO 세포에 형질감염시켰다 (실시예 12 참조). 형질감염체를 스크리닝하고, 특정 형질감염체를 서브클로닝하거나 확장시켜, 클로날 세포주를 생성하였다.
DMA 서열 데이타의 분석은 플라스미드 구축 동안 생성된 접합이 설계된 것과 같으며, 중합효소 연쇄 반응에서 사용되는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 CTLA4-Ig 서열의 올바른 온코스타틴 (oncostatin) M 신호 서열 업스트림을 생성하였음을 확인하였다. 융합 단백질의 힌지 영역에서 바람직한 시스테인으로부터 세린으로의 변화 (서열 2의 위치 156, 162 및 165)를 확인하였다. 이러한 아미노산 잔기는 도 1에서 별표와 함께 볼드로 지정하였다. 서열 2의 위치 174에서의 프롤린에서 세린으로의 추가의 아미노산 변화 또한 검출하였다. 이러한 변화는 중합효소 연쇄 반응에 의한 IgG1 cDNA 합성 동안에 도입되었다. 상기 아미노산 잔기 또한 도 1에서 별표와 함께 볼드로 지정하였다.
DNA 서열 데이타의 분석은 인간 CTLA4 및 인간 IgG1 일정 영역의 공개된 뉴클레오티드 서열과 비교한 경우 하나의 추가의 차이를 확인하였다. CTLA4 코딩 영역의 아미노산 110에서의 코돈은 GCC (알라닌) 보다는 ACC (트레오닌)로서 확인되었다.
실시예 2: CTLA4-Ig 제제
250 mg/바이알의 주입용 CTLA4-Ig 조성물은 정맥내 (IV) 투여를 위한 멸균 비-발열 냉동건조물이다. CTLA4-Ig 분자의 집단을 15 cc 타입 I 플린트 튜빙 (fli tubing) 유리 바이알에 포장하였다. 각 바이알을 20 mm 다이쿄 (Daikyo) 회색 부틸 D-21-7-S/B2-TR 플루오로-수지 코팅된 마개로 막고, 20 mm 알루미늄, 백색, 플립-오프 실 (flip-off seal)로 밀봉하였다.
각각의 단일-사용 바이알은 CTLA4-Ig 조성물 250 mg를 함유하며, 이는 멸균 주사용수 (USP)로 구성되며, 사용시에 0.9％ 염화나트륨 주사액 (USP)로 추가로 희석시킨다. 250 mg/바이알의 주입용 CTLA4-Ig의 조성 및 각 성분의 기능은 하기 표에 열거되어 있다.
CTLA4-Ig의 조성
성분 기능 바이알 당 mg
CTLA-Ig 활성 성분 262.5
말토스 일수화물 벌크화제/안정화제 525
제일인산나트륨 일수화물b 완충제 18.1
염화나트륨b 이온 강도 조절 15.3
염산 pH 조절 pH를 대략 7.5로 조절
수산화나트륨 pH 조절
b상기 성분은 CTLA4-Ig 조성물 용액에 존재한다.
CTLA4-Ig 조성물은 pH 7.5에서 25 mM 인산나트륨 완충액 및 50 mM 염화나트륨 중에서 대략 50 mg/mL CTLA4-Ig를 함유한다. 초기 개발 동안, 상기 완충 시스템은 pH, 완충액 형태, 완충액 농도 및 염화나트륨 농도의 기능과 같은 물리적 및 화학적 안정성의 평가를 기준으로 선택되었다. CTLA4-Ig 용액의 안정성은 5 내지 9의 pH 범위에서 연구되었다. 결과는 고분자량 종의 형성이 pH 의존적이며, 최대 안정성의 pH 범위가 7 내지 8 사이라는 것을 나타내었다. 별도의 측정에서, 완충액 형태 및 농도의 효과를 평가하였으며, 여기서 CTLA4-Ig 조성물은 pH 8에서의 인산나트륨 또는 Tris 완충액 중에 동일하게 안정하게 된다는 것이 밝혀졌다. 추가적으로, 10 내지 100 mL 농도 사이의 완충액 농축물은 2 내지 8℃에서의 CTLA4-Ig 조성물의 안정성에 임의의 영향을 주지 않았다. 유사하게, 30 내지 500 mM 농도 사이의 염화나트륨의 존재는 2 내지 8℃에서에서 저장된 CTLA4-Ig 조성물의 용액 상태 안정성에 영향을 미치지 않았다.
이러한 결과를 기초로, pH 7.5에서 25 mM 인산나트륨 완충액 및 50 mM 염화나트륨 중 10 mg/mL인 CTLA4-Ig 조성물을 50 mg/바이알 강도에서의 제제에 대해 선택하였다. CTLA4-Ig 농도는 이후 동일한 완충액 조성물에서 50 mg/mL로 변하여, 200 내지 250 mg/바이알 강도를 갖는 CTLA4-Ig 조성물을 개발하도록 하였다.
주입용 CTLA4-Ig는 인산나트륨 완충액 및 염화나트륨 이외에 말토스로 제제화되었다. 상기 생성물에서 사용되는 부형제의 기능은 상기 표에 열거되어 있다.
무기염, 예컨대 염화나트륨 및 인산나트륨 완충액 성분의 존재는 동결 시스템의 유리 전이 온도 (Tg')를 낮춘다. 게다가, pH 7.5에서 동일계내 형성되는 2염기성 인산나트륨은 동결 동안 선택적 결정화를 겪으며, 이는 동결된 용액의 미세-환경적 pH를 감소시킨다. 이러한 이유를 기초로, 최소량의 염화나트륨 및 인산나트륨 완충액을 선택하여, 동결건조 과정에 대한 그의 영향을 최소화하였다. 말토스를 안정화제로서 첨가하며, 이는 약물 제품의 동걸건조 동안 및 후속적인 저장까지 동결보호제 및 동결건조보호제로서 작용한다. 250 mg/바이알의 주입용 CTLA4-Ig 조성물은 항미생물제 보존제가 없는 멸균 단일 사용 바이알이다.
실시예 3: CTLA4-Ig 조성물의 탄수화물 함량 분석
상기 방법의 목적은 CTLA4-Ig N-연결된 올리고사카라이드의 크로마토그래피 프로파일을 제공하는 것이다. 상기 절차를 사용하여 CTLA4-Ig 샘플 (총 결합 더하기 유리)에서의 N-아세틸 뉴라민산 (NANA) 및 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA) 대 단백질의 몰비를 얻을 수 있다. NANA 및 NGNA는 시알산의 2가지 형태이다. CTLA4-Ig 단백질에서의 글리코실화는 N-연결된 올리고사카라이드를 함유한다. 예를 들어, 이러한 올리고사카라이드는 22시간의 과정에 걸쳐 PNGase F로의 효소적 가수분해에 의해 분리될 수 있다. 유리 올리고사카라이드는 전기화학적 검출을 이용하여 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 개략한다. 펄스형 전류 검출 (HPAEC-PAD)과 함께 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 N-연결된 올리고사카라이드에 대한 탄수화물 프로파일을 평가하였다. MS와 커플링된 다공성 흑연화 탄소 (PGC) 크로마토그래피를 사용하여 이들 프로파일을 확인하고, 구조 정보를 얻었다. 이러한 절차는 서열의 CTLA4-Ig에 대한 예이다.
N-연결된 올리고사카라이드 단리: PNGase F를 사용하는 효소적 가수분해에 의해 CTLA4-Ig로부터 아스파라긴-연결된 (N-연결된) 올리고사카라이드의 분해를 수행하였다. 탈글리코실화를 수행하기 위해, 먼저 CTLA4-Ig를 환원시키고 변성시켰다. 0.5％ SDS 및 1％ 베타-머캅토에탄올을 함유하는 5 mM 인산나트륨 완충액 176 μL 중 CTLA4-Ig 1 내지 2 mg를 100℃에서 2분 동안 가열하고, 이후 상온으로 냉각시켰다. 냉각된 혼합물에 10％ NP-40 16 μl을 첨가하였다. 샘플을 잘 혼합하고, PNGase F (50,000 U/mL, 50 mM 인산나트륨 완충액 중) 40 μl을 첨가하였다. 샘플을 잘 혼합하고, 38℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 효소적으로 방출된 올리고사카라이드 (글리칸)를 1.0 mL/분의 유속에서 써모 하이퍼카르브 (Thermo HyperCarb) 칼럼 (4.6×100 mm; 5 μL)과 커플링된 페노메넥스 루나 C18 칼럼 (4.6×150 mm; 5 μL)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하였으며, 단리를 위해 사용된 크로마토그래프는 워터스 (Waters) 2996 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스 (Waters Alliance) 2695였다. 칼럼을 먼저 0.05％ 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 평형화시켰다. 샘플의 주입 이후, 12％ 아세토니트릴 중 0.05％ TFA의 용매 조성으로 15분에서 종결하는 아세토니트릴의 구배를 개시하였다. 이후, 글리칸을 60％ 아세토니트릴 중 0.05％ TFA로의 단계 구배로 하이퍼카르브 칼럼으로부터 용출시켰다. 206 nm에서의 UV 흡광도에 의해 모니터링하면서 글리칸을 수집하였으며, 진공 하에 농축 건조시켰다. 후속적인 주입 이전에, 루나 C18 칼럼을 40％ 아세토니트릴, 40％ 이소프로판올, 20％ 물 중 0.05％ TFA로 세척하였다.
NANA 원액 (N-아세틸 뉴라민산; 1 mg/mL)의 제조. 중요 사항: 칭량 이전에 NANA 표준을 실온으로 가온시킨다. 이를 이행하지 않는 경우 표준에서의 수분 응축을 유도할 것이다. 바람직한 양을 얻기에 충분한 시간만 개봉하고, 이후 병을 단단히 재밀봉하고, 동결기로 반환하고, 건조제와 함께 저장한다. 3 내지 10 mg의 N-아세틸 뉴라민산을 정확하게 칭량한다. 최대 0.1 mg까지 기록한다. 칭량지/보트를 사용하여 칭량을 수행한 경우 적절한 크기의 용기로 옮긴다. 충분한 양의 HPLC 등급수를 첨가하여, 1 mg/mL 용액의 농도를 수득한다. 용해될 때까지 교반 바로 또는 볼텍싱에 의해 혼합한다. 2 내지 8℃ 사이에서 3개월까지 폴리프로필렌 튜브에서 저장한다.
NGNA 원액 (N-글리콜릴 뉴라민산; 1 mg/mL)의 제조. 중요 사항: 칭량 이전에 NGNA 표준을 실온으로 가온시킨다. 이를 이행하지 않는 경우 원액에서의 수분 응축을 유도할 것이다. 바람직한 양을 얻기에 충분한 시간만 개봉하고, 이후 병을 단단히 재밀봉하고, 동결기로 반환하고, 건조제와 함께 저장한다. 3 내지 10 mg (최대 0.1 mg의 N-아세틸 뉴라민산까지 기록함)을 정확하게 칭량한다. 최대 0.1 mg까지 기록한다. 칭량지/보트를 사용하여 칭량을 수행한 경우 적절한 크기의 용기로 옮긴다. 적절한 부피의 HPLC 등급수를 첨가하여, 1 mg/mL 용액의 표적 농도를 수득한다. 용해될 때까지 교반 바로 또는 볼텍싱에 의해 혼합한다. 2 내지 8℃ 사이에서 3개월까지 폴리프로필렌 튜브에서 저장한다.
시스템 적합성 용액. 각각의 1 mg/mL의 NANA 및 NGNA 원액 0.050 ml을 적절한 용기에서 HPLC 등급수 0.900 mL에 첨가한다. 볼텍싱에 의해 혼합한다. 2 내지 8℃에서 3개월까지 저장한다. N-아세틸 뉴라민산 작동 용액 (0.050 mg/mL). 1 mg/mL NANA 원액 0.050 mL을 정확하게 측정하고, HPLC 등급수 0.950 mL에 첨가한다. 볼텍싱에 의해 혼합한다. 사용 시에 2중으로 제조한다. N-글리콜릴 뉴라민산 작업 용액 (0.050 mg/mL). 1 mg/mL NGNA 원액 0.050 ml을 정확하게 측정하고, HPLC 등급수 0.950 mL에 첨가한다. 볼텍싱에 의해 혼합한다. 사용 시에 2중으로 제조한다.
샘플 및 가수분해 블랭크의 제조. 분석 증명서 (COA)로부터 CTLA4-Ig 물질에 대한 단백질 농도를 얻는다. HPLC 등급수 0.190 ml을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하여 가수분해 블랭크의 단일 샘플을 제조한다. HPLC 등급수를 사용하여 샘플 및 CTLA4-Ig 참고 물질의 1 mg/mL 용액 2개를 제조한다. 볼텍싱에 의해 혼합한다.
샘플, CTLA4-Ig 참고 물질 및 가수분해 블랭크의 가수분해. 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 참고 물질 및 샘플의 2중 제조물에 대한 가수분해를 수행한다. 비고: 가열 블록과 완전히 조화하는 마이크로 원심분리 튜브를 사용하는 것이 중요하다. 1 M H2SO4 0.010 ml을 샘플 및 CTLA4-Ig 참고 물질의 1 mg/mL 희석액 및 가수분해 블랭크 0.190 mL에 첨가한다. 볼텍싱에 의해 혼합하고, 뚜껑-자물쇠 또는 테이프에 의해 뚜껑을 고정시킨다. 마이크로 원심분리 튜브를 1시간 ± 2분 동안 80℃ ± 2℃ 가열 블록에 둔다. 인큐베이션 이후, 튜브를 가열 블록으로부터 제거하고, 튜브를 마이크로 원심분리기에 두고, 샘플을 튜브의 바닥쪽으로 회전시킨다. 가수분해된 용액을 오토샘플 바이알로 분취하고, 주입을 위해 오토샘플러에 둔다.
기기 조건. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 제조한다. 하기 조건을 설정한다. 0.6 mL/분의 유속 및 40℃의 온도에서 1시간 이상 동안 칼럼을 평형화시킨다.
Figure 112011097388832-pat00052
시스템 적합성. 기기 블랭크로서 이동상의 주입으로 분석을 시작하여 시스템 기준을 평가하였으며, 이는 평평하며 안정해야 한다. 기준이 평평하며 안정하지 않은 경우, 추가의 블랭크 주입이 이루어져야 한다. 비고: 기준선의 이동은 0.25 AU를 초과하여서는 안된다. 시스템 적합성 용액의 3회 반복 주입을 수행한다. 분할 (R) 및 이론단 (N)을 계산한다.
제1 시스템 적합성 주입을 사용하여, 하기 방정식을 사용하여 이론단의 수 (N)를 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00053
식 중,
N = 이론단 계수값이고;
t = NANA 피크의 체류 시간, 분이고;
W = 기준에서의 NANA 피크 너비, 분이다.
CTLA4-Ig 참고 물질 및 샘플에서의 NANA 및 NGNA의 몰을 계산한다. NANA 및 NGNA 표준을 각 전개의 시작 및 종료에서 주입한다. NANA 및 NGNA의 반복된 주입에 대해 면적 계수값을 평균한다. 하기 방정식에서 이 면적을 사용한다.
아바타셉트 참고 물질 또는 샘플에서의 NANA 또는 NGNA의 몰 =
Figure 112011097388832-pat00054
식 중,
X = 섹션 7.3.1에서 계산된 작업 용액에서의 NANA 또는 NGNA의 몰이고;
Y = 각각의 제조에 대한 아바타셉트 참고 물질 또는 샘플에서의 NANA 또는 NGNA의 면적 계수값 (비고: NANA에 대해 통합하기 위한 피크에 대하여 섹션 7.2 및 도 3을 참조함)이고;
Z = 작업 용액에서의 반복된 NANA 또는 NGNA의 평균 면적이다.
한 실시양태에서, NGNA 및 NANA 피크 사이의 분할은 1.3 초과이어야 한다. 이론단 계수값은 4000 이상이어야 한다. NANA 피크의 면적 계수값의 ％RSD로서 평가되는 시스템 적합성 주입 재현성은 3％ 미만이어야 한다. 이론단 계수값은 4000 이상이어야 한다. NANA 피크의 면적 계수값의 ％RSD로서 평가되는 시스템 적합성 주입 재현성은 3％ 미만이어야 한다.
펄스형 전류 검출과 함께 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC-PAD)에 의한 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일링
디오넥스 카보팩 (Dionex Carbopack) PA1 (4×250 mm) 음이온 교환 칼럼 및 디오넥스 카보팩 가드 칼럼을 이용하여 워터스 464 전기화학 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스로 이루어진 크로마토그래피 시스템 상에서 단리된 올리고사카라이드의 HPAEC를 수행하였다. 200 mM 수산화나트륨 중 나트륨 아세테이트 구배 (주입 시점에서의 0 mM으로부터 60분에서의 225 mM로 나트륨 아세테이트의 농도가 증가함)를 사용하여 올리고사카라이드 샘플을 용출시켰다. 전기화학 검출기를 E1 = 0.05 V (t1 = 0.4 sec), S = 0.75 V (t2 = 0.2 sec), E3 = -0.15 V (t3 = 0.4 sec)의 펄스 전위로 펄스 방식 하에 시행하였다. 검출 셀은 금색 작업 전극, 스테인레스강 반극 및 은/염화은 참고 전극으로 구성되어 있었다.
이러한 방법은 CTLA4-Ig 샘플에서의 단백질로부터 방출된 N-연결된 올리고사카라이드의 HPAEC (고 pH 음이온 교환 크로마토그래피) 올리고사카라이드 프로파일을 측정하기 위한 절차를 기재한다. 상기 방법의 목적은 CTLA4-Ig, 예컨대 CTLA4-Ig 약물 재료 N-연결된 올리고사카라이드의 크로마토그래피 프로파일을 제공하기 위한 것이며, 이는 CTLA4-Ig 분자의 상이한 조성물 사이의 비교 분석에 사용될 수 있다. CTLA4-Ig 단백질에서의 글리코실화는 N-연결된 올리고사카라이드를 함유한다. 이들 올리고사카라이드는 22시간에 걸쳐 PNGase F (펩티드: N-글리코시다제 F)로의 효소적 가수분해에 의해 분리된다. 유리 올리고사카라이드를 전기화학적 검출을 이용하는 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 프로파일링한다.
Figure 112011097388832-pat00055
약물 재료의 올리고사카라이드 프로파일을 참고 물질의 동시 전개 샘플에 대하여 평가한다. 결과를 참고 표준에서의 동일한 피크로부터의 선택된 도메인 및 피크의 편차 (％)로서 기록한다.
음이온 교환 크로마토그래피에 의한 올리고사카라이드 프로파일에 대한 크로마토그래피 조건
Figure 112011097388832-pat00056
비고: 대략 2시간 동안, 또는 기준선이 주입 전에 안정화될 때까지 분석 유속에서 초기 이동상으로 칼럼 및 검출기를 평형화시킨다.
Figure 112011097388832-pat00057
HPAEC 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일링에 대한 이동상의 제조
HPAEC 용출액 1: 500 mM 나트륨 아세테이트 (NaOAc). HPLC 등급수 400 ml을 함유하는 500 mL 눈금 실린더로 20.51 ± 0.05 g의 나트륨 아세테이트 (무수)를 계량투입한다. HPLC 등급수로 부피를 500 mL가 되게 하고, 완전히 혼합될 때까지 플라스틱 혈청용 피펫을 사용하여 5분 동안 교반하였다. 0.2 μm 나일론 필터를 통해 용액을 여과한다. 1 L 용출액 병으로 옮긴다. 병을 느슨하게 캡핑하고, 헬륨으로 20분 동안 스파징한다. 캡을 꽉 막고, 병을 헬륨으로 가압한다. 용액을 실온에서 3주까지 헬륨 하에 저장한다.
HPAEC 용출액 2: 400 mM 수산화나트륨 (NaOH). 1 L 눈금 실린더를 사용하여 HPLC 등급수 960 ml을 측정하고, 깨끗한 1 L 용출액 병에 옮긴다. 혈청용 플라스틱 피펫을 사용하여, 10 N NaOH 40.0 ml을 용출액 병에 바로 첨가하고, 용출액을 회전시켜 혼합한다. 병을 느슨하게 캡핑하고, 20분 동안 헬륨으로 스파징한다. 캡을 꽉 막고, 병을 헬륨으로 가압한다. 용액을 실온에서 3주까지 헬륨 하에 저장한다.
HPAEC 용출액 3: HPLC 등급수. 1 L 용출액 병을 대략 1 L의 HPLC 등급수로 채운다. 용출액 병을 시스템에 두고, 느슨하게 캡핑하고, 대략 20분 동안 스파징한다. 캡을 꽉 막고, 병을 헬륨으로 가압한다. 용액을 실온에서 3주까지 헬륨 하에 저장한다.
50 mM 인산나트륨 완충액, 0.02％ 나트륨 아지드, pH = 7.5.
NaH2PO4·H2O 6.9 g
NaN3 0.2 g
H2O 1.0 리터 최종 부피
NaH2PO4·H2O 6.9 g ± 0.1 g 및 NaN3 0.2 g를 계량하고, 자석 교반 바로 연속 혼합하여 1 L 시약 병에서 HPLC 등급 H2O 800 mL에 용해시킨다. pH 미터를 사용하여, 10 M NaOH를 사용하여 용액의 pH를 7.5로 조절한다. 1 L 눈금 실린더를 사용하여 최종 부피를 1.0 L가 되도록 한다. 용액을 실온에서 6개월까지 저장한다.
50 mM 인산나트륨 완충액, 0.02％ 나트륨 아지드, pH = 7.5에서의 PNGase F 효소 작동 원액.
50 mM 인산나트륨 완충액
0.02％ 나트륨 아지드, pH = 7.5. 1.8 mL
키트로부터의 PNGase F, 카탈로그 번호 P0704L 0.2 mL
50 mM 인산나트륨 완충액, 0.02％ 나트륨 아지드, pH 7.5 1.8 ml을 극저온 바이알 1.8 mL에 피펫으로 첨가한다. 키트로부터의 PNGase F 0.2 ml을 첨가하고, 철저하게 혼합한다. 용액을 -20℃ 이하에서 6개월까지 저장한다. 동결 이전에 용액을 분취할 수 있다.
외부 시스템 적합성 표준. 스타키오스 원액 (1.25 mg/mL). 스타키오스 0.125 g를 칭량지에서 칭량한다. 분석용 저울을 사용하고, 100 mL 부피 플라스크로 옮긴다. HPLC 등급수로 표시까지 채우고, 철저하게 혼합한다. 2 mL 부분으로 날진 (Nalgene)의 극저온바이알 (cryovial)에 분취한다. 용액을 -20℃ 이하에서 6개월까지 저장한다.
스타키오스 시스템 적합성 표준 (12.5 μg/mL). 1.25 mg/mL 원액 1 ml을 100 mL 부피 플라스크에 피펫으로 옮긴다. HPLC 등급수로 표시 부분까지 채우고, 철처하게 혼합한다. 200 μL 부분씩 0.65 mL 마이크로푸지 (microfuge) 튜브에 분취한다. 튜브를 대략적으로 표지된 저장 박스 내에 둔다. 6개월 이하 동안 -20℃ 이하에서 시스템 적합성 용액을 저장한다.
표준 및 샘플 제조
참고 물질 제조. 동결건조된 라피게스트 SF 1 mg를 함유하는 바이알에 0.02％ 나트륨 아지드, pH 7.5를 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액 625 μl을 첨가한다. 0.65 mL 에펜도르프 튜브에 완충액을 함유하는 라피게스트 SF 120 μl을 첨가한다. 참고 물질 (약 50 mg/mL) 40 μl을 첨가한다. 최종 라피게스트 SF 농도는 0.12％ w/v이어야 한다. PNGase F 작업 원액 40 μl을 첨가하고, 철저하게 혼합하고, 샘플을 아래쪽으로 회전시키고, 38 ± 2℃에서 22 ± 2시간 동안 둔다 (수조 또는 얼라이언스 오토샘플러 구획). 샘플을 마이크로콘 (microcon) YM-10 원심분리 필터에 피펫으로 옮기고, 30분 동안 13,000 g에서 원심분리한다. HPLC 물 200 μl을 필터에 두고, 추가로 30분 동안 13,000 g에서 원심분리에 의해 여액으로 세정한다. 합쳐진 여액을 15초 동안 볼텍싱하고, 샘플을 10초 동안 원심분리한다. 피펫을 사용하여, 얻어진 용액 (약 380 uL)을 HPLC 토털 리커버리 오토샘플러 바이알로 옮긴다 (항목 1.15).
샘플 제조. 0.65 mL 에펜도르프 튜브에 완충액을 함유하는 라피게스트 SF 120 μl을 첨가한다. 단백질 샘플 40 μl을 첨가한다 (상기 부피는 CTLA4-Ig 1 내지 2 mg과 동등하다고 생각하여야 함). 최종 라피게스트 SF 농도는 0.12％ w/v이어야 한다. PNGase F 작업 원액 40 μl을 첨가하고, 10초 동안 볼텍싱하여 철저하게 혼합한다. 샘플을 아래쪽으로 회전시키고, 38 ± 2℃에서 22 ± 2시간 동안 둔다 (수조 또는 얼라이언스 오토샘플러 구획). 샘플을 마이크로콘 YM-10 원심분리 필터에 피펫으로 옮기고, 30분 동안 13,000 g에서 원심분리한다. HPLC 물 200 μl을 필터에 두고, 추가로 30분 동안 13,000 g에서 원심분리에 의해 여액으로 세정한다. 합쳐진 여액을 15초 동안 볼텍싱하고, 샘플을 10초 동안 원심분리한다. 얻어진 용액 (약 380 uL)을 HPLC 토털 리커버리 오토샘플러 바이알로 옮긴다 (항목 1.15).
시스템 적합성
전기화학 검출기 셀 안정화. 외부 스타키오스 시스템 적합성 표준 (12.5 μg/mL) 30 μl을 주입한다. 스타키오스에 대한 피크 높이가 800 nA 이상임을 보장한다. 셀로부터 과도한 전기적 노이즈가 없으며, 기준선이 평평하도록 한다. 대표적인 시스템 적합성 크로마토그램을 도 2에 나타낸다. 스타키오스 감도 또는 기준선이 허용가능하지 않은 경우, 완충액 조성물을 확인하거나, 전극을 깨끗하게 하거나, 또는 전극을 교체한다. 과도한 노이즈가 존재하는 경우, 셀을 확인하여 모든 공기 방울을 제거하도록 한다. 셀을 재안정화시키고, 스타키오스 표준을 재주입한다.
이론단 (N). 하기 식을 사용하여 스타키오스 표준을 기준으로 이론단의 수 (N)를 측정한다. 엠파워 데이타 분석 시스템을 통해 수행하거나 또는 수동으로 수행할 수 있다. N = 16 (t/W)2
식 중,
t: 주입 시간으로부터 최대 높이에서의 피크 용출 시간까지 측정된 체류 시간이고;
W: 기준에 대한 측면의 외삽에 의한 피크의 너비이다.
N은 6000 이상이어야 한다. 만일 이론단 계수값이 6000 미만인 경우, 전개 구배를 조절하거나 칼럼을 교체한다.
테일링 계수 (T). 하기 식을 사용하여 스타키오스 피크를 기준으로 칼럼 테일링 계수 (I)를 측정한다. 엠파워 데이타 분석 시스템을 통해 수행하거나 또는 수동으로 수행하 수 있다. T = (W0.05/2f).
식 중,
W0.05: 5％의 높이 (0.05h)에서의 피크의 너비이고;
f: W0.05에서의 피크의 가장자리로부터 피크의 정점까지의 측정값 (너비)이다.
T는 1.2 이하이어야 한다. 테일링 계수가 1.2 초과인 경우, 완충액 조성물을 확인하거나, 칼럼을 교체하거나, 또는 기재된 것과 같이 칼럼을 세척하고 시스템 적합성 표준을 재주입하여야 한다.
스타키오스 시스템 적합성 표준 체류 시간 검증. 체류 시간은 시스템 의존적이다. 스타키오스 시스템 적합성 표준은 18.5 ± 2.0분의 체류 시간을 나타내어야 한다. CTLA4-Ig 표준 물질. 샘플의 주입 이전에 주입된 제1 브래킷 (bracketing) 참고 물질로부터 탄수화물 프로파일을 관찰한다. 탄수화물 프로파일은 도 1에서 나타낸 것과 유사하여야 한다. 절대 체류 시간은 시스템 의존적이다. 도메인 I에서의 제1 피크 (피크 1A) 및 도메인 III에서의 주요 피크 (피크 3) 사이의 체류 시간에서의 차이가 22분 내지 28분 사이가 되도록 한다. 피크의 도해가 도 1에서 얻어진 것과 닮지 않은 경우 적절한 행동을 취하고 (예를 들어, 기기 기능을 확인하고, 칼럼을 세척하고, 완충액을 확인/대체하고, 칼럼을 대체함), 재-평가한다. 하기 절차를 사용하여 칼럼을 세척할 수 있다. 셀을 끄고, 칼럼을 80％ 용출액 1, 20％ 용출액 2로 5분 동안, 이어서 50％ 용출액 1, 50％ 용출액 2로 10분 동안 세척한다. 칼럼 및 셀을 초기 조건에서 재-평형화시키고 (셀을 켜고), 재-평가한다.
주입 순서
단리된 올리고사카라이드의 주입 순서를 아래와 같이 설정한다.
스타키오스 표준 (30 μL)
참고 물질 (60 μL)
샘플 (60 μL)
참고 물질 (60 μL)
브래킷 참고 물질 주입의 사이에 5개 이하의 샘플을 전개하는 것이 추천된다.
데이타 분석
크로마토그램 생성. 참고 물질 및 샘플에 대한 크로마토그램을 엠파워에서 생성한다. 피크 도해 및 기준선이 도 76에 나타낸 것과 유사하도록 통합 파라미터를 설정하며, 통합 선이 수동으로 배치하는데 필요할 수 있다. 나타낸 상대 도메인 면적 및 상대 피크 면적에 대한 계산을 수행한다. CTLA4-Ig 물질, 및 반복된 주입이 이루어진 경우 각각의 샘플에 대한 이들 파라미터에 대한 평균 값을 측정한다. 참고 물질에 대하여, 모든 반복의 평균에 대해 각각의 반복에 대한 도메인 I, II, III, 피크 1A 및 1B에 대한 상대 편차를 측정한다.
샘플 프로파일 대 참고 물질 프로파일의 비교. 시각 비교. 샘플 및 참고 물질 모두가 동일한 수의 도메인 및 주요 피크를 갖는 경우 측정한다. 주요 피크는 도 76에서 표지된 피크이다 (피크 1A, 1B, 1C, 1D, 2, 3 및 4). 상대적 정량화 비교. 샘플의 상대 면적을 브래킷 CTLA4-Ig 주입으로부터의 평균 상대 면적과 비교한다. 평균 CTLA4-Ig 물질 값과 이들 면적의 상대적 차이를 측정한다. 계산값 - 도메인 면적％ (상대 도메인 면적). 참고 물질 및 샘플에 대한 프로파일의 도메인에 대해 도메인 면적％을 계산한다. 도메인 면적의 패턴에 대해 도 76을 참고한다. 도 76에서의 예에 따라, 하기 정보 및 식을 사용하여 도메인 비(％)를 계산한다 (체류 시간은 시스템 의존적이며 도 76에서의 결과를 반영함).
도메인 I: 대략의 체류 시간 18-24분 (피크 1A-1E)에서의 피크 면적의 합계.
도메인 II: 26-38분으로부터의 피크의 합계
도메인 III: 39-50분으로부터의 피크의 합계
도메인 IV: 51-64분으로부터의 피크의 합계
도메인 V: 65-75분으로부터의 피크의 합계
비고 : 도메인에 대한 체류 시간대는 매일의 크로마토그래피 수행에서의 변형에 따라 이동할 것이다. 이에 따라 시간을 조절한다.
Figure 112011097388832-pat00058
또한, 도메인 I-III에 대하여, 브래킷 참고 물질 주입, 및 또한 반복된 주입이 이루어지는 경우 샘플에서의 평균 값을 계산한다.
피크 면적％ (상대 피크 면적). 참고 물질 및 샘플에 대한 프로파일의 피크 1A, 1B, 1C 및 3에 대해 피크 면적％을 계산한다. 피크 면적의 패턴에 대해 도 1을 참고하며, 체류 시간은 시스템 의존적이다. 하기 정보 및 식을 사용하여 피크 비 (％)를 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00059
각각의 피크 1A 및 1B에 대하여, 브래킷 참고 물질 주입, 및 또한 반복된 주입이 이루어지는 경우 샘플에서의 평균 값 또한 계산한다. 평균 참고 물질 값과의 차이 (％)를 계산한다. 하기 식을 사용하여, 참고 물질에 대한 샘플의 도메인 I-III, 피크 1A 및 1B의 평균 상대 면적에서의 차이 (％)를 계산한다.
차이％ = |RM - S| / RM × 100
식 중,
RM = 참고 물질에 대한 관심 있는 평균 상대 면적 값이고;
S = 샘풀에 대한 관심 있는 평균 상대 면적 값이고;
| | = 절대 값이다.
예시적인 값. 허용가능한 전개에 대하여, 예시적 값은 충족되어야 하며, 샘플에 대한 모든 주입은 성공적으로 일어나야 한다. 추가적으로, 각각의 브래킷 참고 물질 주입에 대해, 도메인 I, II 및 III에 대한 도메인 면적％ 및 피크 1A 및 1B에 대한 피크 면적％는 그의 평균 값의 15％ 내에 있어야 한다.
HPAEC-PAD에 의한 분석: N-연결된 올리고사카라이드를 CTLA4-Ig 분자로부터 분해시키고, HPAEC-PAD에 의해 분석하였다. 존재하는 시알산의 양을 기초로 올리고사카라이드를 4개 도메인으로 용출시켰다. 올리고사카라이드 표준의 이동을 기준으로 도메인을 입증하였으며, MS에 의해 확인하였다. 도메인 I은 아시알릴화 종을 나타낸다. 도메인 II, III 및 IV는 각각 모노-, 디- 및 트리-시알릴화 종을 나타낸다. 3개 N-연결된 부위에서의 올리고사카라이드의 구조를 특성분석하기 위해, 펩티드 T5, T7 및 T14를 각각 단리시켰다 (이들 펩티드의 확인에 대해 표 59를 참조한다). CTLA4-Ig의 트립신 분해를 사용하고, 이들 3개 펩티드에 상응하는 피크를 수동으로 수집하여 이를 수행하였다.
단리된 펩티드를 PNGase F로 처리하여, 올리고사카라이드를 방출시켰으며, 이를 후속적으로 정제하고, HPAEC-PAD에 의해 분석하였다. 펩티드 T5는 양호한 프로파일을 생성하지 않았는데, 그의 극단적인 소수성으로 인한 정제의 어려움 때문이다. 트립신 분해 이후 역상 크로마토그래피 단계로부터의 상기 펩티드의 낮은 회수율로 인해 분해된 올리고사카라이드의 양이 적었다.
Figure 112011097388832-pat00060
Figure 112011097388832-pat00061
ND 검출되지 않음.
NE 트립신 분해로부터 예상되지 않음 (이들 중량은 분해, 비특이적 분해로부터 예상되지 않았음).
a 트립신 펩티드 T5, T7 및 T14는 N-연결된 글리코실화를 갖는다. 열거된 질량은 글리코실화 없는 펩티드의 질량이다.
b 트립신 펩티드 T8 및 T9는 O-연결된 글리코실화를 갖는다. 열거된 질량은 글리코실화 없는 펩티드의 질량이다.
c 글리코실화 펩티드의 상이한 글리코형태에 상응하는 여러 상이한 질량을 측정하였다.
CTLA4-Ig로부터의 N-연결된 탄수화물 및 3개 펩티드 모두에 대한 HPAEC-PAD 프로파일을 도 55a-d에 나타낸다. 패널 A는 CTLA4-Ig 분자의 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일을 나타내는 반면, 패널 B, C 및 D는 각각 T5, T7 및 T14에 대한 프로파일을 나타낸다. 각각의 펩티드에 주입된 올리고사카라이드의 양은 공정으로 인해 상이하다. 펩티드 T5에서 검출되는 대부분의 올리고사카라이드는 모노- 및 디-시알릴화된 올리고사카라이드로 구성된다. T7의 프로파일은 주로 모노-, 디-, 및 몇몇 아- 및 트리-시알릴화된 글리칸 종을 함유한다. 오직 소량의 트리-시알릴화된 구조만을 T5에서 검출할 수 있다. 펩티드 T14는 주로 아시알릴화된 올리고사카라이드, 및 소량의 모노- 및 디-시알릴화 올리고사카라이드로 구성된다.
HPAEC-PAD에 의해 얻어진 결과는 부위-특이적 N-연결된 글리코실화에 대한 정보를 제공한다. CTLA4-Ig의 CTLA4 영역으로부터의 N-연결된 올리고사카라이드는 CTLA4-Ig의 Fc 영역으로부터의 N-연결된 올리고사카라이드에 비해 보다 큰 비율의 시알릴화된 종을 함유한다.
CTLA4-Ig의 트립신, Asp-N 및 트립신/키모트립신 펩티드 맵핑: CTLA4-Ig를 변성시키고, 6 M 구아니딘 및 5 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하는 50 mM Tris 완충액 (pH 8.0)에서 환원시켰다. 50℃에서 20분 인큐베이션한 이후, 요오도아세트아미드 (IAA)를 10 mM의 최종 농도로 첨가하여, 유리 티올을 알킬화하고, 50℃에서 추가로 20분 동안 어두운 곳에서 계속 인큐베이션하였다. 환원 및 알킬화된 혼합물을 탈염 칼럼 (아머샴 (Amersham) NAP-5)에 로딩하고, 이후 50 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH 8.0 또는 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5 중 하나로 틈새 부피로 용출시켰다. 탈염에 이어서, 2개 상이한 프로테아제 (트립신 또는 Asp-N)를 사용하여 환원/알킬화된 CTLA4-Ig를 분해하였다. 트립신 및 키모트립신 분해에 대하여, CTLA4-Ig는 환원시키지도 알킬화시키지도 않는다.
트립신 분해에 대하여, 서열 등급 트립신 (로슈 (Roche), 2％, w/w, 효소/단백질)을 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. Asp-N 분해에 대하여, 서열 등급 Asp-N (로슈, 4％, w/w, 효소/ 단백질)을 첨가하고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 트립신/키모트립신 분해에 대하여, 서열 등급 트립신 (프로메가 (Promega), 4％, w/w, 효소/단백질)을 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 이후 α-키모트립신 (시그마, 4％, w/w, 효소/단백질)을 첨가하고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 분해 이후 모든 샘플을 동결기에 두었다.
얻어진 펩티드 혼합물을 0.120 mL/분에서 워터스 얼라이언스 HPLC 워크스테이션 상의 워터스 아틀란티스 (AtlantisTM) dC18 칼럼 (2.1×250 mm)으로부터 구배 용출에 의해 분리시켰다. 칼럼을 질량 스펙트럼의 수집을 위한 이온-스프레이 공급원이 장착된 워터스 마이크로매스 (Micromass) Q-Tof microTM 질량 분광계에 직접 연결하였다. 또한, 펩티드 혼합물을 동일한 HPLC 워크스테이션을 사용하여 0.7 mL/분에서 배리안 폴라리스 (Varian Polaris) C18 칼럼 (4.6×250 mm) 상에서 분리시켰다. 칼럼을 용매 A (물 중 0.02％ TFA)로 평형화시키고, 용매 B (물 중 95％ 아세토니트릴/0.02％)의 농도를 증가시켜 펩티드를 용출시켰다. 후-칼럼 스플리터 (splitter) 벨브를 사용하여 15％의 흐름을 Q-Tof 워크스테이션으로 향하게 하였으며, 이를 양성 TOF 모드 (m/z 100-2000)에서 시행하였다. 사용되는 전형적인 이온 스프레이 전압은 3000 V였다.
MS에 의한 CTLA4-Ig 분석: CTLA4-Ig를 100 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8로 최종 농도 0.7 mg/mL로 희석시켰다. PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))를 100 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8로 최종 농도 17 U/μL로 30배 희석시켰다. 동일한 부피 (각각 60 μL)의 희석된 정제된 발효 샘플 및 희석된 글리코시다제 용액을 혼합하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
얻어진 탈글리코실화된 CTLA4-Ig (2 μg)를 중합체-기재 (폴리스티렌 및 폴리 N-비닐-2-피롤리디논의 공중합체) 워터스 오아시스 (Oasis®) 역상 추출 카트리지 칼럼 (2.1×20 mm)에 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 0.2 mL/분의 유속에서 5분 동안 5％ 용매 B (용매 A: 물 중 1％ 포름산, 용매 B: 아세토니트릴 중 1％ 포름산)로 세척하여 탈염시켰으며, 용출액은 페기물로 전환되었다. 5분의 종료시, 빠른 구배 (10분 내에 5％ 용매 B에서 95％ 용매 B)가 칼럼의 외부로의 CTLA4-Ig의 용출을 시작하였으며, 여기서 용출은 흐름 분할 (사용된 크로마토그래피 시스템은 워터스 2996 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스 2695임) 이후 45 μL/분에서 질량 분광계 (워터스 마이크로매스 Q-Tof microTM)로 향하게 하였다.
Q-Tof microTM에 대한 모세관 전압은 3 kV로 설정하였으며, 샘플 콘 (cone) 전압을 40 V로 설정하였다. 매 0.9초에서의 스캔을 1 스캔으로 평균하였으며, 스캔간 시간은 0.1초였다. Q-Tof 분석기는 m/z 800 내지 2500으로 스캔한다. 최대 피크 높이 (TIC 크로마토그램)의 절반 이상의 위치에 해당하는 스펙트럼을 워터스 MassLynxTM 소프트웨어를 사용하여 합친다. 합쳐진 스펙트럼을 워터스 MaxEntl 디콘볼루션 (deconvolution)하였다. 분할을 1 Da/채널에서 설정하였으며, 단일 가우스 손상 모델을 0.5-1 Da 사이에서 선택된 높이의 절반에서의 너비로 선택하였다. 좌측 피크 및 우측 피크에 대한 최소 강도 비를 모두 50％에서 설정하였다.
다공성 흑연화 탄소 (PGC)를 사용하는 액체 크로마토그래피/질량 분광 (LC/MS)에 의한 N-연결된 올리고사카라이드 분석: 단리된 올리고사카라이드를 워터스 2996 광다이오드 어레이 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스 2695 HPLC 시스템을 사용하여 다공성 흑연화 칼럼 (써모 하이퍼카르브; 4.6×100 mm)에서 분리시켰다. 0.05％ TFA 중 증가하는 비율의 아세토니트릴의 2-단계 구배를 사용하여 올리고사카라이드 분리를 달성하였다. 구배의 제1 단계에서, 아세토니트릴 백분율은 주입시의 9.6％로부터 80분에서의 24％로 변화하였다. 제2 구배 단계에서, 아세토니트릴 백분율은 80분에서의 24％로부터 110분에서의 60％로 변화하였다. 0.2 mL/분의 유속을 내내 사용하였다. 용출 스트림을 206 nm에서의 UV 검출에 의해 모니터링하고, 질량 확인을 위해 워터스 마이크로매스 Q-Tof microTM을 사용하여 질량 분광에 의해 분석하였다.
LC/MS PGC 방법에 의한 탄수화물 분석: 단백질의 탈글리코실화에 의한 올리고사카라이드 단리를 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (매사추세츠수 베벌리 (Beverly, MA))를 사용하는 효소적 가수분해에 의해 수행하였다. 탈글리코실화에 대하여, 0.15％ (w/v) 라피게스트 SF (워터스 코포레이션)를 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액 160 μL 중 1 내지 2 mg 당단백질을 100℃에서 2분 동안 가열하여 변성시켰다. 냉각된 용액을 혼합하고, PNGase F (50,000 U/mL, 50 mM 인산나트륨 완충액 중, pH 7.5) 40 μl을 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 이어서 38℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 효소적으로 방출된 올리고사카라이드를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 역상 액체 크로마토그래피를 1.0 mL/분의 유속에서 써모 하이퍼카르브 5 μL (4.6×100 mm, 페노메넥스 (캘리포니아주 토랜스 (Torrance, CA))와 커플링된 페노메넥스 루나 5 μL C18 칼럼 (4.6×150 mm, 페노메넥스 (캘리포니아주 토랜스))에서 수행하였다. 칼럼을 0.05％ 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 평형화시키고, 이후 주입하였다. 샘플 주입 (분해 혼합물 150 μL) 이후, 아세토니트릴의 구배를 개시하고, 15분 및 12％ 아세토니트릴 중 0.05％ TFA의 용매 조성에서 종결하였다. 이후, 글리칸을 60％ 아세토니트릴 중 0.05％ TFA로 세척하여 하이퍼카르브 칼럼으로부터 용출시켰다. 글리칸을 206 nm에서의 UV 흡광도에 의해 검출하였다. 하이퍼카르브 세척물로부터 용출된 피크를 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켰다. 후속적인 주입 이전에, 루나 C18 칼럼을 40％ 아세토니트릴, 40％ 이소프로판올, 20％ 물 중 0.05％ TFA로 세척하였다.
PGC 로의 단리된 올리고사카라이드의 프로파일링
단리된 올리고사카라이드의 PGC 크로마토그래피에 사용되는 시스템은 하이퍼카르브 칼럼 (2.1×100 mm)을 이용하는 워터스 2996 광다이오드 어레이 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스로 구성된다. 올리고사카라이드 샘플을 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출시켰다.
산성 이동상 용출: 0.05％ 트리플루오로아세트산 (TFA) 중 아세토니트릴 구배. 증가하는 아세토니트릴의 2단계 구배를 올리고사카라이드의 크로마토그래피 분리에 사용하였다. 주입 시의 9.6％에서 80분에서의 24％로 증가하는 아세토니트릴 부피 백분율의 초기 선형 구배에 이어서 80분에서의 24％에서 110분에서의 60％로 증가하는 아세토니트릴 부피 백분율의 제2 구배를 실시한다. 0.15 ml/분의 유속을 구배 내내 사용하였다. 용출 스트림을 워터스 UV 검출기로 206 nm에서 모니터링하고, 이어서 질량 확인을 위해 마이크로매스 Q-Tof Micro로 모니터링하였다. ESI 프로브에 대한 이온화 파라미터는 하기와 같이 설정하였다. 모세관 전압 = 3 kV, 콘 전압 = 45 V, 공급원 온도 80℃, 및 탈용매화 온도 175℃.
염기성 이동상 용출: 0.4％ 수산화암모늄 (NH4OH) 중의 아세토니트릴 구배를 올리고사카라이드의 크로마토그래피 분리에 사용하였다. 0.15 mL/분의 유속에서 주입 시의 10.4％에서 150분에서의 28％로 증가하는 아세토니트릴 부피 백분율의 선형 구배를 사용하여 프로파일을 생성하였다. 워터스 UV 검출기, 이어서 질량 확인을 위한 마이크로매스 Q-Tof Micro로 206 nm에서 용출 스트림을 모니터링하였다. ESI 프로브에 대한 이온화 파라미터를 하기와 같이 설정하였다. 모세관 전압 = 3 kV, 콘 전압 = 45 V, 공급원 온도 80℃, 및 탈용매화 온도 175℃.
PGC로의 올리고사카라이드 분해 혼합물의 직접 프로파일링: 올리고사카라이드 분해 혼합물의 PGC 크로마토그래피에 사용되는 시스템은 루나 C18 및 하이퍼카르브 다공성 흑연 칼럼 (4.6×100 mm, Thermo) 모두가 달린 워터스 얼라이언스로 구성된다. 시스템을 워터스 2996 광다이오드 어레이 검출기 및 Q-ToF Micro (마이크로매스)와 조화시켰다. PNGase F를 사용하여 효소적 가수분해에 의해 단백질의 탈글리코실화를 수행하였다. 탈글리코실화를 위해, 0.15 중량％ 라피게스트 SF (워터스 코포레이션)를 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액 160 μL 중에서의 1 및 2 mg 사이의 당단백질을 100℃에서 2분 동안 가열하여 변성시켰다. 냉각된 용액을 잘 혼합하고, PNGase F (50,000 U/mL, 50 mM 인산나트륨 완충액 중, pH 7.5) 40 μl을 첨가하였다. 샘플을 혼합하고, 이후 38℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 효소적으로 방출된 올리고사카라이드를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 프로파일링하였다. 역상 액체 크로마토그래피를 1.0 mL/분의 유속에서 써모 하이퍼카르브 칼럼 5 μL (4.6×100 mm)와 함께 커플링된 페노메넥스 루나 5|u C18 칼럼 (4.6×150 mm)에서 수행하였다. 칼럼을 0.05％ 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 평형화시켰다. 샘플 주입 (분해 혼합물 150 |iL) 이후, 아세토니트릴의 구배를 개시하고, 11분 및 9％ 아세토니트릴 중 0.05％ TFA의 용매 조성에서 종결하였다. 칼럼 스위치를 사용하여 하이퍼카르브 칼럼을 단리시켰으며, 이후 글리칸을 증가하는 아세토니트릴 백분율의 선형 구배로 하이퍼카르브 칼럼으로부터 용출시킨다. 주입 시점에서의 9％에서 160분에서의 36％로의 증가하는 아세토니트릴 백분율의 초기 구배를 사용하였다. 제2 구배는 160분에서의 36％에서 170분에서의 60％ 아세토니트릴로의 증가하는 아세토니트릴 부피 백분율을 포함하였다. 0.15 mL/분의 유속을 용출 구배를 통해 사용하였다. 글리칸을 206 nm에서의 UV 흡광도 및 400-3000 m/z의 질량 범위를 스캐닝하는 MS에 의해 검출하였다. MS 파라미터를 하기 값으로 설정하였다. 모세관 전압 3 kV, 콘 전압 45 V. 후속적인 주입 이전에 루나 C18 칼럼을 40％ 아세토니트릴, 40％ 이소프로판올, 20％ 물 중 0.05％ TFA로 세척하였다.
다공성 흑연화 탄소 크로마토그래피에 의한 분석: 도메인 I-IV로부터의 올리고사카라이드의 구조를 MS와 커플링된 다공성 흑연화 탄소 크로마토그래피 (PGC)를 사용하여 조사하였다. N-연결된 올리고사카라이드를 CTLA4-Ig로부터 단리시키고, 이전의 HPAEC-PAD 섹션에서 기재된 것과 같이 정제하였다. UV 검출기를 갖는 하이퍼카르브 (PGC), 이어서 Q-TOF ESI/MS를 사용하여 올리고사카라이드를 분석하였다. PNGase F 분해에 의해 CTLA4-Ig로부터 방출된 N-연결된 올리고사카라이드의 PGC 프로파일을 명시된 도메인과 함께 도 56에 나타낸다. 용출 순서는 HPAEC-PAD에서 관찰된 것과 동일하다. 얻어진 구조를 하기 표 60에 나타낸다.
표 60에 표시된 올리고사카라이드를 명명하기 위한 명명법을 아래에 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00062
회색 음영 면적은 N-연결된 올리고사카라이드 코어 구조를 나타내며, 여기서 P는 PNGase F 분해를 나타내며, 후속적인 자리는 각각 만노스 (원형), 푸코스 (아래를 가리키는 삼각형), 갈락토스 (우측을 가리키는 삼각형) 및 시알산 잔기 (별형)를 나타낸다. N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc)은 사각형으로 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00063
Figure 112011097388832-pat00064
도메인 I에서, 3개 아시알릴화 올리고사카라이드 (구조 P2100, P2110, P2120)에 상응하는 6개 피크를 확인하였다. 예상된 구조 및 측정된 질량 간의 113 돌턴 질량 차이는 트리플루오로아세트산 (TFA) 첨가생성물의 검출 때문이다. P2100에 대응하는, 1,463의 동일한 질량을 갖는 상이한 피크는 이들이 아마도 상이한 아노머라는 것을 나타낸다.
도메인 II에서, 각각 1개 시알산 잔기 (N-아세틸뉴라민산, NANA)를 함유하는 2안테나형 및 3안테나형 올리고사카라이드 (각각 구조 P2111, P2121 및 P3131)에 해당하는 6개 피크를 확인하였다.
도메인 III에서, 각각 2개 시알산 잔기 (NANA)를 함유하는 3개 2안테나형, 3안테나형 및 4안테나형 올리고사카라이드 (각각 구조 P2122, P3132 및 P4142)에 해당하는 6개 피크를 확인하였다.
도메인 IV에서, 각각 3개 시알산 잔기 (NANA)를 함유하는 2개 3안테나형 및 4안테나형 올리고사카라이드 (구조 P3133 및 P4133)에 해당하는 2개 피크를 확인하였다.
CTLA4-Ig 분자의 산 가수분해 처리에 의한 시알산 몰 대 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체 몰의 몰비의 측정 (도 25 및 26 참조)
상기 방법에서, NANA 및 NGNA를 산 가수분해에 의해 단백질로부터 분해한다. 방출된 NANA 및 NGNA를 레젝스 (Rezex) 모노사카라이드 RHM 칼럼에서 HPLC에 의해 분리하고, UV 흡광도 (206 nm)에 의해 검출한다. NANA 및 NGNA 표준의 동시 수행의 반응 인자를 기초로 NANA 및 NGNA를 정량한다. 시험 결과는 단백질에 대한 NANA 및 NGNA 각각의 몰비 (MR)로서 보고된다. 상기 분석은 결합 및 비결합된 시알산의 총 몰 수를 측정한다.
상기 분석에서 사용되는 시약, 기기 및 크로마토그래피 조건: 1 M 황산 H2SO4 (원액) 및 5 mM H2SO4 이동상 이동 완충액; NANA 표준 용액 1 mg/ml; NGNA 표준 용액 1 mg/ml. 얼라이언스 크로마토그래피 시스템 - 일체형 오토샘플러를 갖는 워터스 코포레이션 2695 분리 모듈; 레젝스 모노사카라이드 RHM 칼럼 - 8 마이크로미터, 7.8×300 mm, 페노메넥스, 7.8×50 mm 가드 칼럼, 페노메넥스가 장착됨; 검출기 - 워터스 코포레이션 996 광다이오드 어레이 검출기 또는 워터스 코포레이션 2487 2중 파장 흡광도 검출기. 크로마토그래피 파라미터; 유속 - 0.600 mL/분; 이동상 - 5 mM H2SO4; 주입 부피 - 5 μL; 표적 농도 - 1 mg/ml; 전개 시간 25분; 칼럼 온도 - 40°C; 오토샘플러 온도 - 4°C; 파장 - 206 nm; 체류 시간 NANA (시스템 의존적) - 10.8분 (+ 또는 - 1분), 체류 시간 NGNA (시스템 의존적) - 9.8분 (+ 또는 - 1분).
시스템 적합성 표준: 1 mg/mL의 각각의 NANA 및 NGNA를 적절한 용기 내에서 H2O 900 μL에 첨가한다. 4℃에서 3개월까지 저장한다. N-아세틸 뉴라민산 작업 표준 (0.05 mg/mL); N-글리콜릴 뉴라민산 작업 표준 (0.05 mg/mL).
샘플 및 CTLA4-Ig 표준 물질의 가수분해: 샘플 및 CTLA4-Ig 표준 물질을 가수분해를 위해 H2O 중 1 mg/mL로 희석시킨다. 1 M H2SO4 10 μL를 1 mg/mL의 희석된 샘플 및 CTLA4-Ig 190 μL에 첨가하여 CTLA4-Ig 샘플 및 CTLA4-Ig 표준 물질을 가수분해한다. 가수분해를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 2중으로 수행한다. 뚜껑-자물쇠 또는 테이프에 의해 뚜껑을 고정시킨다. 튜브를 볼텍싱에 의해 혼합하고, 1시간 동안 80℃ 가열 블록에 두었다. 인큐베이션 이후, 튜브를 가열 블록으로부터 제거하고, 실온에서 3분 동안 냉각시키고, 빠른 회전용 원심분리에 두어 튜브 바닥으로 샘플을 수집한다. 튜브로부터, 가수분해된 용액의 50 μl을 샘플 바이알로 분취하였으며, 이를 주입을 위해 냉각된 오토샘플러에 둔다. 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 190 μL 물에 10 μL 1 M H2SO4를 첨가하여 가수분해 블랭크를 단일 제조로서 만든다. 블랭크를 샘플로서 처리한다.
시스템 적합성: 시스템 적합성을 확인하기 위해 시스템 적합성 표준의 6회 반복된 주입 (각각 5 μL)을 주입하고, 이어서 가수분해 블랭크 (5 μL)를 1회 주입하였다. 최종 시스템 적합성 표준 주입을 사용하여, 허용되는 값이 1.3보다 큰 분할 (R), 및 이론단 (N) (허용되는 이론단 계수값은 4000 이상이어야 함)을 각각 계산하였다. 최종 5회 시스템 적합성 반복을 사용하여, NANA 계수값의 재현성을 계산하고, 가수분해 블랭크를 평가하였다.
분할: 최종 시스템 적합성 표준 주입을 사용하여, 하기 식을 사용하여 피크 분할을 계산하였다. R=2(T2-T1)/(W2+W1). 식 중, R은 분할이고, T2는 NANA 피크 (피크 2)의 체류 시간이고, T1은 NGNA 피크 (피크 1)의 체류 시간이고, W2는 피크 2의 측면에 접하도록 그려진 선의 기준선에서의 너비이며, W1은 피크 1의 측면에 접하도록 그려진 선의 기준선에서의 너비이다. 도 25는 전형적인 시스템 적합성 주입을 도시한다.
이론단 (N): 최종 시스템 적합성 표준 주입을 사용하여, 하기 방정식을 사용하여 이론단 계수값 (N)을 계산하였다. N=16(RT2/W). 식 중, N은 이론단 계수값이고, RT는 분 단위의 NANA 피크의 체류 시간이며, W는 NANA 피크의 측면에 접하도록 그려진 선의 기준선에서의 너비이다.
시스템 적합성 표준의 최종 5회 주입을 사용하여 NANA에 대한 평균 면적 계수값 및 그의 표준 편차를 계산하였다. 상대 표준 편차는 3％ 이하였다. 가수분해 블랭크는 NANA 및 NGNA의 체류 시간을 갖는 임의의 유의한 피크가 없었다.
주입 순서: NANA 및 NGNA 작동 표준 각각의 1회 주입, 이어서 가수분해된 CTLA4-Ig 샘플 물질 (2중 샘플), 이어서 가수분해된 CTLA4-Ig 물질을 주입하였다. CTLA4-Ig 전개를 완료한 이후, NANA 및 NGNA 작업 표준 각각을 1회 주입하였다.
작업 표준에 주입된 NANA 또는 NGNA의 몰을 측정하기 위해, 하기 방정식을 사용한다. NANA 또는 NGNA 몰 = (C)(P)(I)/MW. 식 중, C는 작업 표준에서의 NANA 및 NGNA의 농도이고, P는 표준의 순도이며, I는 주입 부피이고, MW는 분자량이다 (NANA에 대해 309.2 g/몰, NGNA에 대해 325.3 g/몰).
CTLA4-Ig 샘플에서의 NANA 및 NGNA의 몰을 측정하기 위해, 하기 방정식을 사용한다. 샘플에서의 NANA 또는 NGNA 몰 = (X)(Y)/Z. 식 중, X는 NANA 및 NGNA의 작업 표준에서의 몰 수이고, Y는 CTLA4-Ig 샘플에서의 NANA 및 NGNA의 평균 계수값이며, Z는 작업 표준에서의 2중 NANA 및 NGNA의 평균 영역이다. 표준의 2중 주입으로부터, NANA 및 NGNA 표준의 면적 계수값은 10％ RSD 미만을 가져야 한다.
각 샘플에 주입된 양을 측정하기 위해, 하기 방정식을 사용한다. 단백질 몰 = (C)(D)(I)/MW. 식 중, C는 g/ml 단위의 CTLA4-Ig 이량체의 농도이고 (UV 분석으로부터 얻어짐), D는 가수분해용 희석 (0.95)이고, I는 주입 부피 (0.005 ml)이고, MW는 질량 분광으로부터 측정된 것과 같은 CTLA4-Ig 이량체의 분자량 (92,439 g/mol)이다.
NANA 또는 NGNA 대 CTLA4-Ig 단백질의 몰비 (MR)를 하기 방정식에 의해 계산한다. MR=A/B. 식 중, A는 NANA 또는 NGNA의 몰 수이고, B는 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체의 몰 수이다.
시알산, NANA 및 NGNA 대 CTLA4-Ig 단백질의 몰비 (MR)를 하기 방정식에 의해 계산한다. MR = (A+B)/C. 식 중, A는 NANA의 몰 수이고, B는 NGNA의 몰 수이며, C는 CTLA4-Ig 분자 또는 이량체의 몰 수이다. 2중의 CTLA4-Ig 샘플 및 CTLA4-Ig 표준 물질은 NANA에 대한 몰비에서 10％ RSD 미만을 가져야 한다.
시알산 함량을 측정하는 가수분해 방법에 의해 측정된 반응의 선형성: NANA 반응은 0.5 μg/mL (약 0.1％ 명목 NANA 표준 = NANA-QL) 내지 98.7 μg /mL (약 200％ 명목 NANA 표준)의 범위에서의 NANA 표준 농도에 대하여 선형임을 입증하였다. NGNA 반응은 5.0 μg /mL (약 10％ 명목 NGNA 표준) 내지 82.0 μg /mL (약 160％ 명목 NGNA 표준)의 범위에서의 NGNA 표준 농도에 대하여 선형임을 입증하였다.
가수분해된 CTLA4-Ig 물질로부터의 NANA의 반응은 0.25 mg/mL (25％ 명목 CTLA4-Ig 양) 내지 2.0 mg/mL CTLA4-Ig (200％ 명목 CTLA4-Ig 양) 범위에서의 단백질 농도에 대하여 선형이다. 가수분해된 CTLA4-Ig 물질로부터의 NGNA의 반응은 0.25 mg/mL (25％ 명목 CTLA4-Ig 양) 내지 2.0 mg/mL CTLA4-Ig (200％ 명목 CTLA4-Ig 양) 범위에서의 단백질 농도에 선형이다.
시알산 함량을 측정하는 가수분해 방법의 정확도: NANA 또는 NGNA 표준이 첨가된 CTLA4-Ig 물질 (1 mg/mL)에 대해 정확도를 입증하였다.
시알산 함량을 측정하는 가수분해 방법의 정밀도: 인증 실험은 기기 정밀도 (％RSD < 3％), 샘플 제조에 대한 반복성 (％RSD < 4％), 및 상이한 샘플 제조, 상이한 일, 상이한 기기 및 상이한 분석자에 걸친 재현성 (NANA에 대하여 ％RSD < 6％, NGNA에 대하여 ％RSD < 12％)을 입증하였다. NANA 및 NGNA 몰비는 보고된 결과의 각각 10％ 및 20％의 범위 내에서 정밀하다고 고려되었다.
시알산 함량을 측정하는 가수분해 방법의 범위: 상기 분석을 위한 작업 범위는 0.49 mg/mL 내지 3.87 mg/mL의 CTLA4-Ig 물질이라고 나타났다.
시알산 함량을 측정하는 가수분해 방법의 검출 한계 (DL): 광다이오드 어레이 검출기 (PDA; HPLC 시스템 1)의 사용시 NANA 및 NGNA 표준에 대한 개개의 DL 값은 각각 0.464 μg/mL 및 0.402 μg/mL이었으며; 2중 파장 검출기 (HPLC 시스템 2)의 사용시 NANA 및 NGNA에 대한 개개의 DL 값은 각각 0.131 μg/mL 및 0.111 μg/mL이었다. 시알산 종 둘 모두에 대해서 최소 민감성 검출기의 사용을 기초로 한 방법의 DL은 NANA 및 NGNA에 대하여 0.5 μg/mL이었다.
시알산 함량을 측정하는 가수분해 방법의 정량 한계 (QL): 광다이오드 어레이 검출기 (PDA; HPLC 시스템 1)의 사용시 NANA 및 NGNA에 대한 개개의 QL 값은 각각 1.68 μg/mL 및 1.52 μg/mL이었으며, 2중 파장 검출기 (HPLC 시스템 2)의 사용시 NANA 및 NGNA에 대한 QL 값은 각각 0.48 μg/mL 및 0.41 μg/mL이었다. 시알산 종 모두에 대하여 최소 민감성 검출기의 사용을 기초로 한 방법의 QL은 NANA 및 NGNA에 대하여 1.7 μg/mL이었다.
견고성/강건성: 상기 방법은 샘플 48시간 냉동된 용액 안정성, 차이 칼럼의 사용, 상이한 NANA 및 NGNA 로트의 사용, 및 농도의 ± 5％ 변화를 갖는 이동상의 사용에 대해 강건한 것으로 입증되었다.
IEF 겔 전기영동: 당단백질의 pI는 뉴라미니다제로의 처리 이전 또는 이후에 시알산을 제거하여 측정할 수도 있다. 하기 뉴라미니다제 처리에 따른 pI에서의 증가는 당단백질에서의 시알산의 존재를 나타낸다. IEF 겔을 사용하여 등전점, CTLA4-Ig의 이소형의 수를 측정할 수 있다. IEF 겔 전개에 대한 안정한 시스템은 멀티포어 (Multiphore) II 전기영동 시스템, 및 pH 4.0 내지 6.5의 IEF 겔 (아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences))이다. 애노드 완충액은 하기 조성을 갖는다. 0.5 M 인산 중 0.1 M 글루탐산. 캐소드 완충액은 하기 조성을 갖는다. 0.1 M 베타-알라닌. 전압이 300 V 이상에 이를 때까지 IEF 겔을 일정한 전력 (25 와트) 및 전류 (25 mAmps) 하에 미리 집중시킨다. 적절한 농도의 IEF 보정 표준 및 샘플을 로딩하고, 겔을 2.5시간 동안 최대 2000 V로 일정한 전력 (25 와트) 및 전류 (25 mAmps) 하에 유출시킨다. IEF 겔의 고정 및 코마시 블루 염색 이후, 단백질 밴드가 덴시토미터 (densitometer)에 의해 시각화된다. CTLA4-Ig 이량체 제조의 전형적인 IEF 겔을 도 11에 나타낸다.
실시예 4: CTLA4-Ig의 단일쇄 (단량체)의 단리 및 특성분석
천연 단일쇄 CTLA4-Ig의 제조: 본 발명의 방법에 의해 제조된 CTLA4-Ig 재조합 단백질의 샘플을 직렬로된 2개 21.5×300 mm TSK 겔® G3000SWXL 정제용 칼럼 (토소 바이오사이언스 (Tosoh Bioscience; 펜실베이니아주 몽고메리 (Montgomery, PA))에서의 2695 얼라이언스 HPLC (워터스 (매사추세츠주 밀포드 (Milford, MA))을 사용하는 비-변성 SEC에 의해 분리하였다. 약 50 mg/mL에서의 샘플의 30회 주입 (각각 1.0 mL)을 1.0 mL/분의 유속에서 0.2 M NaH2PO4, 0.9％ NaCl, pH 7.0로 이루어진 이동상을 사용하여 등용매 조건 하에 분리하였다. 샘플을 워터스 2996 PDA 검출기를 사용하여 280 nm의 흡광도에서 모니터링하였다. 워터스 밀레니움 (Millennium) 4.0™ 및 엠파워 프로ⓒ 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다. 90 내지 150분 폭시 (Foxy) 200 자동화된 분획물 수집기에서 분획물을 수집하였다 (각각 1.0 mL). 분획물 16 내지 39 (105 mL에서 시작하고, 129 mL에서 종료함)를 풀링하고, 3500 MW의 컷오프로 센트리콘 (centricon) 농축기를 사용하여 농축시켰다.
AKTA익스플로러 (explorer™) (아머샴 바이오사이언시스)에서 이동상으로서 pH 6.0에서의 200 mM NaH2PO4, 6.0 M 구아니딘 히드로클로라이드를 사용하여 2.0 mL/분의 등용매 유속에서 하이로드 (HiLoad) 26/60 슈퍼덱스 (Superdex) 200 prep 등급 칼럼 (아머샴 바이오사이언시스 (뉴저지주 피츠카타웨이 (Piscataway, NJ))을 사용하여 변성 조건 하에 샘플 (2.0 mL, 약 4 mg/mL)을 추가로 크로마토그래피하였다. 분획물 12-16을 수집하고, 풀링하고, HiPrep 26/10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언시스)을 사용하여 200 mM NaH2PO4, pH 6.0으로 완충액 교환하고, 최종적으로 농축시켰다.
유도된 단일쇄 CTLA4-Ig의 제조: 유도된 단일쇄 CTLA4-Ig를 본 발명의 방법에 의해 제조된 CTLA4-Ig 재조합 단백질의 변성, 환원 및 알킬화를 통해 제조하였다. 구아니딘 히드로클로라이드 (0.684 g)를 1.5 mL 에펜도르프 원심분리 튜브에 계량 투입하고, 200 mM NaH2PO4, pH 6.0 512 μl을 첨가하고, 구아니딘 히드로클로라이드가 완전히 용해될 때까지 볼텍싱하였다. CTLA4-Ig 물질 (농도: 50 mg/mL) 238 μl을 상기 튜브에 첨가하여 CTLA4-Ig 재조합 단백질을 변성시키고, 볼텍싱하여, 6.0 M 구아니딘 히드로클로라이드 중 약 10.0 mg/mL의 CTLA4-Ig 최종 농도를 얻었다. 1.0 M DTT 2.6 μl을 첨가하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하여 변성된 단백질을 환원시켰다. 이후, 0.047 g 요오도아세트아미드 고체를 샘플 혼합물에 첨가하고, 이어서 볼텍싱하고, 37℃에서 60분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하여 환원된 단백질을 알킬화하였다. AKTA익스플로러™에서 pH 6.0에서 200 mM NaH2PO4, 6.0 M 구아니딘 히드로클로라이드를 사용하여 2.0 mL/분의 등용매 유속으로 하이로드 26/60 슈퍼덱스 200 prep 등급 칼럼을 사용하여 변성 조건 하에 샘플 (각 주입 동안 약 4.0 mg/mL에서 2.0 mL)을 크로마토그래피하였다. 얻어진 단일쇄 분획물 (9-12)을 수집하고, 풀링하고, HiPrep 26/10 탈염 칼럼에서 200 mM NaH2PO4, pH 6.0으로 완충액 교환하고, 농축시켰다.
천연 및 유도된 단일쇄 CTLA4-Ig의 MALDI-TOF 질량 분광 분석: 단일쇄 샘플 (20 μL)을 탈염시키고, C4 집팁 (ZipTip; 밀리포어 (Millipore; 매사추세츠주 빌레리카 (Billerica, MA)))으로 농축시키고, 이후 신나핀산으로 포화된 0.1％ TFA과 함께 80％ 아세토니트릴 20 μL로 용출시켰다. 혼합물 (1.0 μL)을 MALDI 샘플 플레이트의 웰에 스팟팅하고, 공기 건조시키고, 이후 질량 분광계에 두었다. 질소 레이저 (337 nm)를 사용하는 옴니플렉스 (OmniFlex) 질량 분광계 (부르커 (Bruker; 매사추세츠주 달토닉스 (Daltonics, MA)))를 사용하여 MALDI-MS 스펙트럼을 획득하였다. 샘플을 20 kV의 가속 전압 및 200 ns의 지연 시간을 사용하는 지연된 여기에 의해 반사성 양이온 모드에서 분석하였다. 총 250회 단일-샷 스펙트럼을 각 샘플에 대해 합쳤다. 트립시노겐 (23982 m/z), 단백질 A (44613 m/z) 및 소 알부민 (66431 m/z)의 혼합물을 사용하여 외부 보정을 달성하였다.
변성 (구아니딘 HCl) 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 단일쇄 분석: 시간 과정 동안 상이한 지점에서 수집된 세포 배양물 성장으로부터의 CTLA4-Ig 상청액을 HPLC 분석을 위해 제조하였다. 구아니딘 히드로클로라이드 (말린크로트 베이커 인크. (Mallinckrodt Baker Inc.)) 0.114 g를 0.65 mL 에펜도르프 마이크로원심분리 튜브에 계량투입하고, 시간 과정 CTLA4-Ig 샘플 125 ul을 첨가하고, 볼텍싱하여 구아니딘 HCl을 완전히 용해시켜 샘플을 제조한다. 이후, 250 mM 요오도아세트아미드 1.8 ul을 즉시 첨가하고, 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
TSK 칼럼 보호 (SWXL, 6.0 mm ID×4.0 cm)을 갖는 직렬 TSK-겔®G3000SWXL 크기 배제 칼럼 (7.8 mm ID×30 cm)을 2996 광다이오드 어레이 검출기를 갖는 워터스 2695 분리 모듈에서 수행되는 단일쇄 SEC 분석에 사용한다. 각 샘플 25 μl을 이동상으로서 200 mM 인산나트륨, 6.0 M 구아니딘 히드로클로라이드 pH 6.0으로 평형화되는 칼럼에 주입한다. 단백질을 0.5 mL/분의 유속으로 칼럼에서 분리하고, 얻어진 크로마토그램을 60분 시간대에 걸쳐 수집한다. 엠파워 프로 소프트웨어를 사용하여 개개 피크 (단량체, 단일쇄 등)의 종합 및 정량화를 수행한다. HPLC 시스템이 올바르게 작동하는 것을 보장하기 위해, 샘플의 주입 이전 및 이후에 이동상, 단백질 샘플 완충액, 시스템 적합성 표준 및 현재 CTLA4-Ig 물질로 주입한다. 시스템 적합성 표준 크로마토그래피에 대한 피크 분할 및 플레이트 계수값을 계산한다.
LC/MS 펩티드 분석에 의한 CTLA4-Ig 단일쇄의 시스테이닐화의 분석: CTLA4-Ig를 변성시키고, 6 M 구아니딘 및 5 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하는 50 mM Tris 완충액 (pH 8.0)에서 환원시켰다. 50℃에서 20분 인큐베이션한 이후, 요오도아세트아미드 (IAM)를 10 mM의 최종 농도로 첨가하여 유리 티올을 알킬화시키고, 50℃에서 추가로 20분 동안 어두운 곳에서 계속 인큐베이션하였다. 환원 및 알킬화된 혼합물을 탈염 칼럼 (아머샴, NAP-5)에 로딩하고, 이후 50 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH 8.0 또는 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5 중 하나로 틈새 부피로 용출시켰다. 탈염 이후, 2개 상이한 프로테아제 (트립신 또는 Asp-N)를 사용하여 환원/알킬화된 CTLA4-Ig를 분해시켰다. 또한, CTLA4-Ig 물질을 환원 및 알킬화 없이 트립신/키모트립신 분해시켰다.
트립신 분해에 대하여, 서열 등급 트립신 (프로메가, 2％, w/w, 효소/단백질)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. Asp-N 분해에 대하여, 서열 등급 Asp-N (로슈, 2％, w/w, 효소/단백질)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 트립신/키모트립신 분해에 대하여, 서열 등급 트립신 (프로메가, 2％, w/w, 효소/단백질)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 이후 a-키모트립신 (시그마, 4％, w/w, 효소/단백질)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 분해 이후, 모든 샘플을 동결시켰다 (-20℃).
얻어진 펩티드 혼합물을 0.12 mL/분에서 워터스 얼라이언스 HPLC 워크스테이션에서의 워터스 아틀란티스TM dC18 칼럼 (2.1×250 mm)으로부터의 구배 용출에 의해 분리시켰다. 칼럼을 질량 스펙트럼 수집용 이온-스프레이 공급원이 장착된 워터스 마이크로매스 Q-Tof microTM 질량 분광계에 직접 연결하였다. 또한, 펩티드 혼합물을 동일한 HPLC 워크스테이션을 사용하여 0.70 mL/분에서 배리안 폴라리스 C18 칼럼 (4.6×250 mm)에서 분리시켰다. 칼럼을 용매 A (물 중 0.02％ TFA)로 평형화시키고, 용매 B (물 중 95％ 아세토니트릴/0.02％ TFA)의 농도를 증가시켜 펩티드를 용출시켰다. 후-칼럼 스플리터 밸브를 사용하여, 유량의 15％를 Q-Tof 워크스테이션으로 향하게 하였으며, 이를 양성 TOF (비행 시간) 모드 (m/z 100-2000)에서 시행하였다. 사용된 전형적인 이온 스프레이 전압은 3000 V였다.
환원시의 113 ± 4 u의 손실은 단백질에 대한 공유 디술피드 변형이 있음을 시사한다. 시스테이닐화에 대한 예측된 이동은 119.14 u이다. 그러나, 111.14 u의 실제 질량 손실이 단일쇄 종의 환원시 예상된다. 119.14 u의 손실은 시스테인의 제거로부터 유래되며, 8 u의 획득은 8개 내부 쇄 시스테인 (서열 2의 Cys47, 74, 92, 118, 197, 157, 303, 361)의 환원시 8개의 양성자의 첨가로부터 유래된다. 이에 따라, 원형 질량에 대한 추가의 113 ± 4 u는 시스테인 아미노산으로의 시스테이닐화에 상응한다. 가장 잘 변형되는 시스테인은 Cys146인데, 쇄간 디술피드 결합이 원형 MALDI 데이타를 기준으로 단일쇄 종에 부재하기 때문이다. LC/MS 펩티드 분석을 사용하여 Cys146을 함유하는 펩티드를 검사하여, 환원 및 비환원된 물질은 단일쇄 물질에 비해 상이한 체류 시간 및 질량을 나타낸다는 것을 발견하였다. 시스테이닐화를 확인하기 위해, Cys146을 함유하는 단일쇄 펩티드를 수집하고, MALDI를 사용하여 분석하였다.
Cys146을 함유하는 수집된 피크는 Cys146의 시스테이닐화를 갖는 펩티드에 대한 1787.51 u의 예상된 질량에 따라서 1787.48 u의 질량을 갖는다 (도 27, 패널 A). 환원한 이후, 이 펩티드는 시스테인의 손실인 119.14 u의 예상된 손실에 따라서 119.11 u를 손실한다 (도 27, 패널 B). 이후, 물질을 57.03 u의 예상된 질량 획득에 따라서 56.99 u의 이동을 생성하는 요오도아세트아미드로 추가적으로 조작한다 (도 27, 패널 C).
실시예 5: 단량체 또는 다량체 CTLA4-Ig 형성의 조작
단일쇄 형성에 대한 배지 및 배지 성분의 효능 효과: 상이한 배지 및 배지 성분의 효능 효과를 단일쇄 형성에 대해 측정한다. CTLA4-Ig 분자를 37℃에서 여러 배지 및 개개 배지 요소와 함께 60분에 걸쳐 인큐베이션하고, 직렬 칼럼 변성 SEC에 의해 단일쇄 형성에 대해 분석한다. 10 mM 시스테인의 제형 완충액에 첨가시 단일쇄 형성에 대한 극도의 효능제 반응이 발견된다. 시스테인의 첨가에 따른 약 6시간에서 정점에 도달하는 단일쇄 형성에서의 급격한 증가가 있다. 이러한 반응은 나머지 56시간에 걸쳐 서서히 감소한다. 추가적으로, +30％ gal 공급은 단일쇄 형성에서 보다 점진적이되 여전히 상대적으로 빠른 증가에 영향을 미쳤다. +30％ gal 공급은 갈락토스 및 117E의 조성물이다. 이러한 혼합물을 매일 첨가하여 세포에 공급한다. 상기 실험에서 시스테인이 117E와 무관하게 인공적으로 다량 도입되어, 측정할 필요가 있으며, 이러한 117E 성분은 단일쇄 형성에서 포함될 수 있는 것을 측정할 수 있다.
117E의 특정 성분 및 다른 배지를 60분에 걸쳐 CTLA4-Ig와 함께 인큐베이션하고, 직렬 칼럼 변성 SEC에 의해 단일쇄 형성에 대해 분석하였다. 상기 배지에의 조사는 가능한 디술피드 환원 성분 및/또는 억제제를 중심으로 하며, 이는 쇄간 디술피드가 존재하지 않는다는 것을 나타내는 이전 실험을 기초로 단일쇄 형성에 영향을 미칠 것이다. 117E의 요소는 몇몇 시험된 디술피드; 리포산, 시스틴, 시스테인, 메티오닌 및 글루타티온에 대한 감소 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 다시, 시스테인의 제형 완충액에 첨가시 단일쇄 형성에 대한 극도의 효능제 반응이 발견된다. 시스테인의 첨가에 따라 약 6시간에서 정점에 도달하는 단일쇄 형성에서의 급격한 증가가 있다. 이러한 반응은 나머지 56시간에 걸쳐 서서히 감소한다. 주요 단일쇄 형성은 배지를 함유하는 시스테인, 시스테인, 이스톨레이트 (yeastolate) 및 발효 배지와 함께 일어난다. 기타 황 함유 성분, 예컨대 메티오닌 및 글루타티온은 단일쇄 형성에 대해 거의 영향을 미치지 않는다. 관찰된 염화암모늄의 영향이 없다.
이에 따라, 본 발명은 단백질의 단일쇄:이량체 형태의 비를 제공하기 위한 방법을 포함하고, 이러한 단백질은 이량체 및 또한 단일쇄 형태로 존재할 수 있으며, (1) 상기 단백질을 발현하는 세포를 배양하기 위한 액체 세포 배양 배지를 제공 및/또는 유지 (예컨대, 단계 (2) 동안)시키며, 여기서 이량체 형성의 감소 또는 억제 가능한 작용제 (예컨대, 시스테인)의 농도를 선택하여 상기 비를 제공하는 단계; 및 (2) 상기 세포를 배양하여, 상기 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 액체 세포 배양 배지에서의 이러한 작용제 (예를 들어, 시스테인)의 농도의 첨가 및/또는 증가는 이러한 단백질의 보다 큰 단일쇄:이량체 형태의 비를 제공하며, 반면 액체 세포 배양 배지에서의 이러한 작용제 (예를 들어, 시스테인)의 농도의 제거, 감소 또는 탈락은 상기 단백질의 단일쇄:이량체 형태의 비를 감소시킨다.
상기 방법의 한 특정 실시양태는 상기 단백질이 쇄간 디술피드 결합의 형성을 통해 이량체 형성 가능한 당단백질, 예컨대 본 발명의 CTLA4-Ig 분자인 것이다.
고분자량 형성에 대한 높은 염의 효능제 효과: 정제 단계 동안, CTLA4-Ig를 여러 시간 동안 높은 염 농도에 노출시킨다. 높은 염 농도의 효과를 고분자량 형성에 대해 측정한다. CTLA4-Ig (약 50 mg/mL)을 500 mM 인산나트륨, pH = 6.0의 존재 하에 37℃에서 인큐베이션한다. 고 농도의 인산나트륨에서 효능제 효과가 있으며, 대부분 사량체인 고분자량 형태에서의 지속된 빠른 증가가 100시간에 걸쳐 관찰된다.
이에 따라, 본 발명은 단백질의 응집물:이량체 형태의 비를 감소시키기 위한 방법을 포함하며, 이러한 단백질은 이러한 단백질의 처리 (예컨대, 정제) 동안 응집물 및/또한 이량체 형태로 존재할 수 있으며, 비-응집 염 용액인 하나 이상의 액체의 사용을 포함한다. "비-응집 염 용액"은 그에 용해된 소정 농도의 염을 함유하는 액체를 의미하며, 이는 보다 고 농도의 상기 염을 함유하는 동일한 액체에 비해 응집물의 형성에서 보다 낮은 효과가 있다.
본 방법의 한 특정 실시양태는 상기 단백질이 쇄간 디술피드 결합, 예컨대 본 발명의 CTLA4-Ig 분자의 형성을 통해 이량체 형성할 수 있는 당단백질인 것이다.
단일쇄 형성에 대한 길항 효과: 이전 모델링 실험은 시스테인 함유 성분의 첨가에 의한 단일쇄 형성에 대한 보다 크고 빠른 효과를 입증하였다. 시스테인은 유리 술프히드릴을 함유하는 아미노산이다. 술프히드릴이 단일쇄의 형성에 포함되는 경우, 길항 화합물의 사용을 통해 차단하여야 한다. 이러한 화합물 중 하나는 요오도아세트아미드이다. 요오도아세트아미드는 임의의 유리 술프히드릴과 빠른 방식으로 반응하여 비가역적 티오에테르 결합을 형성하는 수용성 화합물이다. CTLA4-Ig를 37℃에서 여러 배지, 시스테인 및 요오도아세트와 60분에 걸쳐 인큐베이션하고, 직렬 칼럼 변성 SEC에 의해 단일쇄 형성에 대하여, 및 직렬 칼럼 비-변성 SEC에 의해 HMW에 대하여 분석한다. 요오도아세티미드는 단일쇄 형성을 차단할 뿐만 아니라 CTLA4-Ig 조성물 및 높은 염 모두에서 응집물 형성을 차단한다. 요오도아세트아미드는 낮은 시알산 단량체에서 응집물 형성을 차단하지 않는다. 그러나, 낮은 시알산 물질에서 형성된 응집물의 양은 CTLA4- Ig 조성물에서 형성된 양과 비교가능하다.
상기 모델은 이전에 잘 이해되지 않았던 메카니즘에 대한 통찰을 제공한다. 확인된 CTLA4-Ig 방법에서의 응집물 형성의 2개 이상의 주요 경로가 있음을 나타낸다. 다량의 응집물을 생성하는 제1 경로에서, 유리 술프히드릴 시스테인이 단일쇄 종의 형성에 대한 효능제로서 작용한다. 시스테인의 효능 효과는 요오도아세트아미드의 첨가에 의해 차단될 수 있다. 놀랍게도, 요오도아세트아미드는 단일쇄 형성 뿐만 아니라 고분자량 형성에 대한 길항제이다. 상기 방법은 하향식 정제 동안 발효에 비해 증가된 양의 시알산을 함유하는 조성물을 생성하도록 고안된다는 것을 주목하여야 한다. 제2 경로에서, 적은 양의 시알산을 함유하는 아종은 단일쇄 또는 응집물의 형성에 대해 요오도아세트아미드에 영향을 받지 않는다.
이에 따라, 본 발명은 이량체, 및 또한 단일쇄 형태로 존재할 수 있는 단백질의 단일쇄:이량체 형태의 비를 감소시키기 위한 방법을 포함하며, (1) 상기 단백질을 발현하는 세포의 배양을 위한 액체 세포 배양 배지를 제공 및/또는 유지 (예컨대, 단계 (2) 중)시키며, 이러한 배지는 단일쇄 형성에 대해 길항인 작용제 (예컨대, 요오도아세트아미드)를 함유하는 단계, (2) 상기 세포를 배양하여 상기 단백질을 발현하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 응집물, 및 또한 이량체 형태로 존재할 수 있는 단백질의 응집물:이량체 형태의 비를 감소시키기 위한 방법을 포함하며, (1) 상기 단백질을 발현하는 세포의 배양을 위한 액체 세포 배양 배지를 제공 및/또는 유지 (예컨대, 단계 (2) 중)시키며, 이러한 배지는 응집물 쇄 형성에 대해 길항이고/거나 단일쇄 형성에 대해 길항인 작용제 (예컨대, 요오도아세트아미드)를 함유하는 단계, 및 (2) 상기 세포를 배양하여 상기 단백질을 발현하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 특정 실시양태는 상기 단백질이 쇄간 디술피드 결합의 형성을 통해 이량체 형성가능한 당단백질, 예컨대 본 발명의 CTLA4-Ig 분자인 것이다.
이들 데이타를 기초로, 응집물 형성을 위한 2개 이상의 경로가 CTLA4-Ig에서 유도된다고 생각하는 것은 곤란하지 않다. 주요 경로에서, 단일쇄는 아직 완전히 명확하지 않은 메카니즘을 통한 응집물의 형성에 포함된다. 단일쇄 형성에 무관한 제2 부 경로는 응집물의 형성에 포함된다. 이들 경로는 크로마토그래피 분리할 수 있는 3개 이상의 고분자량 종 형태가 있는 이유에 대한 설명을 도울 수 있다. 모델이 있으며, 임의의 실제 효과 및 효과 정도를 측정하기 위해 실제 발효 과정 동안 시험되어야 한다. 이러한 데이타를 기초로, 현재 발효 과정 및 시스테인이 없는 발효의 시험에 대해 고려하여야 한다.
실시예 6: CTLA4-Ig 이량체 및 사량체
B7-1Ig에 결합하는 CTLA4-Ig 이량체 및 사량체
본 발명은 B7-1Ig에 결합하는 CTLA4-Ig 이량체 및 사량체를 평가하기 위한 방법을 제공한다. 물리적 특성 (예를 들어, 확산 계수, 분자량, 결합 원자가) 및 기기 작동 파라미터 (예를 들어, 유속, 칩 밀도)는 비아코어 (Biacore) 분석 결과에 영향을 미칠 수 있다. 물질 이동 한계 하에, 사량체의 결합 속도는 동일한 몰 농도에 대하여 이량체에 비해 20％ 느리다. 특정 유속에서, 사량체 분자가 이량체와 비교하여 보다 덜 효율적으로 매트릭스에 침투되는 것이 가능하다. 고 밀도 B7-1Ig 고정화된 칩 하에, 사량체 및 이량체의 경쟁적 결합은 비교가능한 억제 곡선을 나타낸다. 이는 이론적 사량체 원자가 (4) 대 이량체 원자가 (2)가 B7-1Ig에의 결합에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 사량체의 몰 농도는 이량체 표준 곡선을 기준으로 계산할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, B7-1Ig에의 사량체의 결합은 이량체과 비교하여 동일한 용량 의존성 반응을 갖는 것을 발견하였다.
사량체 및 이량체의 결합 효능의 비교는 표준 및 샘플의 제조에 사용된 측정 단위에 의해 영향을 받을 수 있다. 2000 ng/mL의 농도에서 사량체 및 이량체 샘플을 비교할 수 있다. 질량 기준 (ng/mL)에 대하여, 각 종은 동일한 종의 표준 곡선을 사용하여 대략 100％의 결합 효능을 나타낸다. 그러나, 사량체의 결합 효능은 이량체 표준 곡선에 대해 측정한 경우 반감되었으며, 이량체의 결합 효능은 사량체 표준 곡선에 대해 측정된 경우 2배 이상이 되었다. 비아코어 기기가 질량을 기준으로 분자 상호작용을 검출하기 때문에, 동일한 농도 (ng/mL)의 사량체 및 이량체로부터의 신호 공명 단위 (RU)는 동일하여야 한다. 비록 검출 시스템이 질량의 함수이지만, 분자 사이의 상호작용은 몰 기준으로 일어난다. 이에 따라, CTLA4-Ig 이량체 및 CTLA4-Ig 사량체의 몰 농도는 2000 ng/mL에서 각각 21.6 nM 및 10.8 nM이다. 몰 농도를 사용하여, CTLA4-Ig 이량체 및 CTLA4-Ig 사량체 샘플 모두 이량체 표준 곡선에 대한 비교가능한 결합 효능을 나타낸다. CTLA4-Ig 사량체 표준 곡선에 대한 동일한 몰 농도 방법을 사용하여, CTLA4-Ig 이량체 샘플은 사량체 샘플에 비해 결합 효능에서 추가의 30％ 증가를 나타낸다. 이러한 관찰은 고 농도에서의 사량체 표준 곡선의 경사의 감소 때문이며, 주어진 초기 결합 속도에 대한 보다 높게 계산된 농도를 유도한다. 이러한 관찰에 대한 한 설명은 물질 이동의 효과이다.
물질 이동 제한 실험은 초기 결합 속도가 동일한 수의 분자에 대해 CTLA4-Ig 이량체보다 대략 20％ 느리다는 것을 나타낸다 (즉, 사량체의 결합 속도는 이량체와 0.8배 상이함). 이러한 관찰된 차이는 두 종의 분자량, 및 칩의 표면에 대한 분자의 확산에 대한 그의 효과 때문이다. 분자의 확산 계수는 분자량의 세제곱근에 역으로 비례한다. 보다 낮은 확산 계수는 보다 느린 분자의 이동을 나타낼 것이다. 각각의 분자량을 기초로, CTLA4-Ig 사량체의 계산된 확산 계수는 CTLA4-Ig 이량체의 확산 계수의 0.8배이거나, 또는 반대로 이량체의 확산 계수는 사량체의 확산 계수의 1.25배이다. 실험 데이타는 이러한 관찰과 일치하며, 여기서 CTLA4-Ig 이량체는 몰 농도를 사용하는 CTLA4-Ig 사량체 표준 곡선으로부터 계산된 것과 같은 133％의 효능을 나타낸다. 고-밀도 칩에 대한 물질 이동 한계는 보다 낮은 유속 및 보다 낮은 분석물 농도에서 보다 현저하다. 유속이 증가하기 때문에, 이량체는 사량체에 비해 보다 빠른 초기 결합 속도를 나타낸다. 이에 따라, 사량체의 증가된 분자량 및 보다 낮은 확산 계수는 이랑체에 비해 초기 결합 속도 차이에 기여한다.
B7-1Ig에 대한 CTLA4-Ig 사량체 및 이량체의 경쟁적 결합은 사량체 및 이량체가 물질 이동 제한된 조건 하에 유사한 결합 원자가를 나타낸다는 것을 나타낸다. 이량체 또는 사량체와 초기에 결합된 B7-1Ig 칩으로의 추가의 효과는 보다 낮은 결합 가능성을 나타낸다. 이러한 관찰은 제한된 결합 부위 이용률 때문이 아닌데, 추가의 이량체가 CTLA4-Ig 이량체 또는 CTLA4-Ig 사량체와 초기에 결합된 B7-1Ig 칩에 결합할 수 있기 때문이다. 매트릭스로의 제한된 침투는 사량체 결합에서의 관찰된 감소를 설명할 수 있다.
분자가 비아코어에 결합하는 성질은 결과의 해석에 영향을 미친다. 사량체 및 이량체 분자는 물질 이동 한계의 조건 하에서 그의 분자 크기의 차이로 인해 상이한 속도로 확산한다. 추가적으로, 고 밀도 칩의 표면에 대한 입체 장애는 후속 분자의 매트릭스로의 침투에 영향을 미친다.
비아코어에서 농도 분석을 수행하는 경우, 물리적 특성, 예컨대 분자량, 확산 계수 및 각 종의 결합을 고려하는 것이 필요하다. 관심 있는 분석물과의 비교에 사용되는 표준은 동일한 물질이어야 한다. 그러나, 표준 및 샘플 모두가 몰 기준으로 표현되는 경우 사량체를 이량체 표준에 대해 분석할 수도 있으며, 여기서 분자 크기를 고려한다. 제시된 데이타는 B7-1Ig에의 CTLA4-Ig 이량체 및 CTLA4-Ig 사량체의 결합이 비교가능하다는 것을 나타낸다.
CTLA4-Ig 이량체 및 사량체 모두 유사한 회합 속도 (Kon)를 나타낸다. 그러나, 사량체는 결합 부위의 수에서의 증가로 인한 결합활성에서 비롯된 보다 느린 해리 속도 (koff)를 나타낸다.
최대 결합 용량 (Rmax)이 50 내지 150 RU의 범위 내에 있도록 2개 단백질, 예컨대 리간드 및 수용체 사이의 결합 역학 분석을 대략 600 내지 800 RU의 저 밀도의 리간드로 고정화된 칩을 사용하는 비아코어에서 수행할 수 있다. 저 밀도 칩의 목적은 결합활성 및 물질 수송의 효과를 최소화하기 위한 것이다. 개개 결합 부위 발생의 해리에서와 같이 이용가능한 리간드의 밀접으로 인해 다가 분석물이 칩의 표면에 결합되어 남아 있는 경우 결합활성이 관찰된다. 칩의 표면 및 벌크 용액 사이의 분석물 농도에서의 유의한 차이가 있는 경우 물질 수송이 관찰된다.
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 분자는 단일쇄간-디술피드 결합에 의해 연결된 2개 단일쇄 분자로 이루어진 이량체이며, B7 분자에 대한 2개 결합 부위를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 광 산란 SEC 및 SDS-PAGE에 의해 확인된 것과 같은 CTLA4-Ig 사량체의 형성은 잠재적으로 4개 결합 부위를 갖는 분자를 유도한다. 정제된 단량체 및 이량체의 결합 역학을 CTLA4-Ig 이량체 물질과 통계적으로 비교한다. kon 속도 (p 값 > 0.05)에서 유의한 차이가 없다. 사량체의 koff 속도는 이량체의 koff 속도와 유의하게 상이하다. HIC 클리닝 피크로부터 정제된 이량체의 koff 속도는 CTLA4-Ig 이량체 물질의 koff 속도와 유의하게 상이하지 않다. 이에 따라, 사량체는 이량체에 비해 보다 느리게 해리하며, 분자 당 증가된 수의 결합 부위로 인한 결합활성 효과를 나타낸다.
사량체는 구아니딘 처리에 의해 이량체로 펼쳐지고 해리될 수 있다. 이러한 구아니딘-처리된 CTLA4-Ig 이량체를 분석하였으며, 상기 결과는 그의 결합 역학 특성이 생리학적 조건 하에 형성된 CTLA4-Ig 이량체의 특성과 유사하였음을 나타낸다. 이러한 관찰은 이량체 및 사량체 사이의 koff 속도에서 관찰된 차이가 분자의 결합 원자가 및 특정 비아코어 방법의 본질적인 성질과 관련되어 있다는 가설을 지지하며, 여기서 결합활성은 결합 역학에서 역할을 한다.
HIC 클리닝 피크로부터 CTLA4-Ig 물질의 친화성 정제:
단백질 A-세파로스 친화성 크로마토그래피: HIC 클리닝 피크 500 ml을 0.22 마이크로미터 1 L 여과 시스템 (코닝 (Corning; 뉴욕주 코닝 (Corning, NY), 파트 번호 430517))을 통해 여과하고, pH 7.4에서 포스페이트 완충 염수 (시그마, 미주리주 세인트 루이스 (St. Louis, MO), P-4417)로 미리 평형화시킨 단백질 A-세파로스 칼럼 (5 cm×15 cm)에 로딩하였다. 칼럼을 PBS, pH 7.4 700 mL로 세척하고, 100 mM 글리신, pH 3.5로 용출시켰다. 50 mL의 분획물 각각을 2.0 M Tris, pH 10 0.5 mL의 수집 튜브에 첨가하여 수집 중에 중화시켰다. 분획물을 280 nm 흡광도에서 분석하고, 풀링하고, 센트리프레프 (centriprep) YM-3 카트리지 (밀리포어 코포레이션, 매사추세츠주 베드포드 (Bedford, MA), 파트 번호 4203)를 사용하여 농축시켰다. 정제된 단백질 용액을 -70℃에서 저장하였다.
PROSEP-rA (재조합 단백질 A) 친화성 크로마토그래피: HIC 클리닝 피크 500 ml을 0.22 마이크로미터 1 L 여과 시스템 (코닝, 코닝, NY, 파트 번호 430517)을 통해 여과하고, 250 mM 염화나트륨을 함유하는 25 mM Tris, pH 8.0으로 미리 평형화시킨 PROSEP-rA 고용량 (밀리포어 코포레이션, 매사추세츠주 베드포드) 칼럼 (25 mm×28 cm)에 25 mL/분의 유속에서 로딩하였다. 워터스 2767 샘플 매니저 (Sample Manager) 및 워터스 2996 광다이오드 어레이 검출기가 장착된 워터스 PrepLC 시스템을 상기 크로마토그래피에 사용하였다. 칼럼을 25 mL/분의 유속에서 30분 동안 25 평형 완충액으로 세척하고, 30분 동안 25 mL/분의 유속에서 100 mM 아세테이트, pH 3.0으로 용출시켰다. 10 mL의 분획물 각각을 튜브에 미리 첨가된 2.0 M Tris, pH 10 50 ul에서의 수집에 의해 용출 동안 중화시켰다. 280 nm에서 높은 흡광도를 갖는 분획물을 풀링하고, 센트리프레프 YM-3 카트리지 (밀리포어 코포레이션, 매사추세츠주 베드포드, 파트 번호 4203)를 사용하여 농축시켰다. 정제된 단백질 용액을 -70℃에서 저장하였다.
크기 배제 크로마토그래피: 워터스 2996 광다이오드 어레이 검출기 (매사추세츠주 밀포드), 및 밀레니움32 버전 3.20 또는 엠파워 소프트웨어에 의해 수집되는 폭시 200 분획물 수집기가 장착된 워터스 얼라이언스 2695 분리 모듈에서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 직렬 토소 바이오사이언스 (펜실베이니아주 몽고메리) TSK G3000 SW (21.5 mm×300 mm) 및 직렬 TSK G3000 SWXL (7.8 mm×300 mm) 칼럼을 정제용 및 분석용 SEC 각각에 대해 사용하였다. 용출된 단백질을 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 모니터링하였다.
이량체, 사량체 및 다량체의 정제용 단리를 단백질 A 정제된 HIC 클리닝 피크 물질의 SEC에 의해 달성하였다. 단백질 A 용출액의 30개 샘플 (각각 약 10 mL)을 1 mL/분의 유속에서 0.9％ 염화나트륨을 함유하는 100 mM 제일인산나트륨 완충액 pH 7.0의 이동상을 사용하는 정제용 직렬 SEC 칼럼에 주입하였다. 분획물을 각각의 30개 주입에 대해 90 내지 160분으로부터 매분마다 수집하였다. 단일 주입에 대한 전개 시간은 180분이었다.
각 분획물을 직렬 칼럼 분석용 크기 배제 HPLC에 의해 조사하였다. 분획물 13-15 (다량체를 함유함), 분획물 22 및 23 (사량체를 함유함), 및 분획물 43-49 (이량체를 함유함)를 풀링하였다. 정제된 다량체, 사량체 및 이량체 분획물을 동적 광 산란 분석 (DSL)과 함께 분석용 2개 칼럼 SEC에서 조사하였다.
HIC 클리닝 피크의 CTLA4-Ig 성분 및 고정화된 B7-1Ig에 대한 정제된 성분의 생물특이적 결합 분석: 고정화된 B7-1Ig (CM5 칩에의)에 대한 CTLA4-Ig의 생물특이적 결합을 SPR 기재 비아코어 C 바이오센서 (비아코어, AB, 뉴저지주 피츠카타웨이)를 사용하여 측정하였다. CTLA4-Ig 물질을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. B7-1Ig를 활성화된 CM5 센서 칩에서 5000 내지 10,000 공명 단위 (RU)의 밀도에서 고정화시켰다. CTLA4-Ig 참고 표준, 품질 대조군 및 샘플을 B7-1Ig 센서 칩 표면 상에서 20 μL/분의 유속으로 주입하여, 센서그램을 생성하였다. 고정화된 B7-1Ig에의 CTLA4-Ig의 초기 결합 속도 (RU/s)를 고 밀도 B7-1Ig 표면에서 확산-제한된 조건 하에 측정하였으며, 이는 샘플에서의 CTLA4-Ig의 활성 농도와 직접적인 상관관계가 있다. 표준, 품질 대조군 샘플 및 알려지지 않는 샘플 농도를 125-8000 ng/mL의 명목 영역에서 RU 대 CTLA4-Ig 농도를 플로팅하여 생성된 표준 곡선으로부터 삽입하였다. 최종 결과를 결합 (알려지지 않은 1개 샘플의 평균 농도/2000)×100 (％)로서 표현하였다.
분자량 및 수력학적 반지름의 측정: TSK3000 SWXL 칼럼 및 상응하는 가드 칼럼으로 SEC 분리를 수행하였다. 이동상은 0.8 mL/분에서의 용출에 대한 등용매 조건을 사용하는 25 mM HEPES, 850 mM NaCl, pH 7.0으로 구성된다. HPLC 분석을 상온에서 수행하였으며, 샘플을 분석 동안 4℃에서 유지되었다. 분자량 측정을 15가지 구별되는 산란 각을 이용하여 와이어트 던 (Wyatt Dawn) EOS에 도입하여, 각 종에 대한 광 산란의 각 변화를 측정하였다. 짐 (Zimm) 플로팅 형식을 분자량 측정에 사용하였으며, 여기서 각 종에 대한 슬라이스를 분자량에 대해 평균하였다. 절대 분자량 측정에 사용되는 특정 반사율 증가 (dn/dc) 값은 a) 및 옵티랩 (Optilab) DSP 간섭계 (RI)를 사용하여 측정된 0.189였다. 수력학적 반지름 (Rh) 측정을 흐름 셀과 약 90°각에 위치된 광자 상관기 QELS 검출기와 직렬로 수행하였다. 병진 확산 상수를 상기 시그널로부터 측정하였으며, 아인슈타인-스톡스 관계 (Einstein-Stokes relationship)를 사용하여 Rh를 계산하였다. 데이타 분석을 와이어트 테크놀로지의 아스트라 (Astra) 소프트웨어 버전 4.90을 사용하여 달성하였다.
이량체 및 사량체 종에 대한 분자량 및 수력학적 반지름 값은 각각 86 내지 91 kDa 및 172 내지 199 kDa이 되는 것을 발견하였다. 클리닝 피크 샘플은 분자량에 의한 육량체 및 십량체에 해당하는 추가의 HMW 종을 함유하는 것으로 관찰되었다. 이량체 종에 대한 수력학적 반지름의 범위는 3.8 내지 4.7 nm이다. 이종 사량체 종의 수력학적 반지름의 범위는 5.7 nm 내지 6.2-6.3 nm였다.
표면 플라즈몬 공명을 사용하는 CTLA4-Ig 이량체 및 사량체의 B7-1Ig에의 결합: 농도 분석: B7-1Ig에 대한 농도 분석을 여러 CTLA4-Ig 종의 약간 변형된 방법 7441-42에 따라 비아코어 3000 기기 (비아코어, 뉴저지주 피츠카타웨이)에서 수행하였다. 변형에는 하기가 포함된다. 비아코어 C 대신 비아코어 3000을 사용하였다. 유속은 20 μL/분 대신 10 μL/분이었다. 샘플을 15초가 아닌 60초 동안 주입하였다. 100 mM NaCl (재생 완충액)을 함유하는 10 mM 나트륨 시트레이트의 3회의 짧은 30초 (15 μL) 펄스에 의해, 이어서 물의 1회 30초 펄스에 의해 센서 칩 표면을 0 μL/분에서 재생시켰다.
CM5 센서 칩을 6000-12000 공명 단위 (RU)의 표적 밀도로 향하도록 아세테이트 완충액, pH 5.0 중 20 μg/mL의 농도에서 B7-1Ig로 고정화시켰다. HBS-EP 완충액 중에서 CTLA4-Ig 물질을 62.5-8000 ng/mL (0.675-86.3 nM)의 농도로, 및 이량체를 25-16000 ng/mL (0.675- 86.3 nM)의 농도로 연속 희석시켜 표준을 제조하였다. 단량체 또는 이량체 중 하나로 이루어진 시험 샘플을 약 2000 ng/mL의 표적 농도로 희석시키고, 비아코어에서 분석하였다. CTLA4-Ig 물질 (> 98％ 단랑체) 또는 정제된 이량체 중 하나의 표준 곡선을 사용하여 BIA평가 소프트웨어 (버전 4.0.1) 에 의해 농도를 측정하였다. 결합 효능을 A280 nm에 의해 측정된 농도에 의해 나누어진 비아코어에서 측정된 농도의 백분율로서 계산한다.
주어진 표면에의 분자의 결합 속도는 농도의 함수이며, 이는 알려지지 않은 농도를 측정하도록 한다. CTLA4-Ig 이량체는 CTLA4-Ig 사량체에 비해 농도 함수 (ng/mL)로서 보다 빠른 결합 속도를 나타낸다.
CTLA4-Ig 이량체 및 사량체의 결합 효력을 표 7에 요약한다. ng/ml을 기초로, 이량체 샘플의 결합 효력을 이량체 표준 곡선으로부터 계산하며, 99.5％가 됨을 발견하였으며, 반면 사량체 샘플의 등량 농도는 47.2％이다. 역으로, 이량체 샘플의 결합 효능을 사량체 표준 곡선으로부터 계산하며, 266％가 됨을 발견하였으며, 반면 사량체 샘플의 등량 농도는 103％이다. 그러나, 이량체 및 사량체가 몰 농도 (nM)로 표현하는 경우, 두 종 모두의 결합 효력은 비교가능하다. 이량체 표준 곡선으로부터 계산된 이량체 및 사량체의 결합 효력은 각각 99.4％ 및 94.3％이다. 사량체 표준 곡선에 대하여, 각각 133％ 및 103％이다. 이량체 및 사량체의 표준 곡선은 몰 농도를 기준으로 비교가능하다.
Figure 112011097388832-pat00065
결합 원자가: CTLA4-Ig 이량체 (25-1600 nM) 또는 사량체 (25-400 nM)를 여러 몰비에서 B7-1Ig와 3분 동안 미리 혼합하고, 이후 혼합물을 9392 RU의 밀도로 고정화된 B7-1Ig 칩에서 10 μL/분의 유속에서 주입하였다. 각 주입 이후 재생 완충액의 3회 30초 펄스, 이어서 물의 1회 30초 펄스에 의해 칩을 재생시켰다. 각 주입의 종료시 얻어진 RU를 비교하였다.
이론적으로, 이량체 분자의 결합 원자가는 2이고, 각 단일쇄는 1개 결합 부위로 이루어져 있다. 사량체 분자는 2개 이량체 분자로 이루어져 있고, 이에 따라 4의 결합 원자가를 갖는다. 이량체 및 사량체의 겉보기 결합 원자가를 측정하기 위해, 경쟁 분석을 설계하고, 비아코어 3000에서 수행하였다. 실험에서, 분석물을 3분 동안 여러 몰비에서 B7-1Ig와 미리 혼합하고, 이후 혼합물을 1분 동안 10 μL/분의 유속에서 B7-1Ig 칩 (9392 RU)에 주입하였다. 하기 표 10은 증가하는 몰 양의 B7-1Ig로 경쟁적으로 억제되는 이량체 또는 사량체 중 하나의 백분율을 나타낸다. 1.25 (B7-1Ig) 대 1 (이량체 또는 사량체)의 몰비에서, 유의한 차이가 경쟁 억제에서 96.1％에서의 단량체 및 84.9％에서의 이량체로 관찰되었다. 그러나, 이량체 및 사량체는 유사한 억제 곡선을 나타내며, 이는 원자가가 대략적으로 동일하다는 것을 시사한다. 추가적으로, 이랑체 및 사량체 둘 모두는 또한 보다 적은 밀도 칩을 사용하여 유사한 억제 프로파일을 나타내었다.
Figure 112011097388832-pat00066
B7-1Ig 칩의 포화: CTLA4-Ig 이량체 또는 사량체 (200, 1000 또는 8000 ng/mL)를 먼저 고밀도 B7-1Ig 칩 (6738 RU)에서 1분 동안 10 μL/분으로 주입하고, 이어서 단량체 또는 이량체 중 하나 (200, 1000 또는 8000 ng/mL)로 일련의 7회 1분 주입하였다. 재생 완충액을 4회 25 μL 주입하고, 이어서 물을 25 μL 주입하여 각 조건 이후 칩을 재생시켰다. 각 주입의 종료시 얻어진 RU를 비교하였다.
이량체 또는 사량체 중 하나를 표면 재생 없이 이량체 또는 사량체 중 하나로 미리 코팅된 B7-1Ig 표면에 반복적으로 주입하였다. 사량체와의 초기 결합은 결합으로부터 후속적인 이량체 주입을 저해하지 않았으나, 추가적인 사량체 주입은 이량체 주입에 비해 유의하게 감소된 결합 속도를 유도한다. 이량체와의 초기의 결합, 이어서 후속의 이량체 주입은 포화에 따라 증가된 결합을 유도한다. 이량체 밀 코팅된 칩에의 사량체의 후속 주입은 결합에서의 점진적인 감소를 나타내어, 칩으로부터의 분자의 해리 및 매트릭스에의 사량체 침투의 결핍을 나타낸다. 유사한 결과가 200 ng/mL 또는 8000 ng/mL 중 하나의 CTLA4-Ig 분자의 초기 주입으로 관찰되었다.
CTLA4-Ig 사량체는 B7-1Ig 수용체에 대한 보다 높은 결합활성을 가짐: 정제된 칼럼의 버려진 부분, 예컨대 HIC 및 QFF 칼럼의 클리닝 피크를 비롯한 CTLA4-Ig 종을 정제하고, 그의 결합 역학을 비아코어에서 분석하였다.
HIC 클리닝 피크로부터 CTLA4-Ig 종: 고분자량 종, 예컨대 DNA를 제거하기 위해 HIC 칼럼을 CTLA4-Ig 생산에서 사용한다. HIC 칼럼으로부터의 클리닝 피크로부터의 CTLA4-Ig 종을 후속 정제 및 역학 분석에 사용할 수 있다. HIC 클리닝 피크를 단백질 A 칼럼을 통해 통과시켜, 모든 CTLA4-Ig 종을 포획하고, 존재할 수 있는 다른 불순물을 제거하였다. 모든 CTLA4-Ig 종 (즉, 이량체, 사량체, 육량체/다량체)의 혼합물로 이루어진, 단백질 A 칼럼으로부터의 용출액은 명확한 kon 및 koff 속도를 나타내며, 이는 CTLA4-Ig 이량체 표준과 비교가능하였다. 2-칼럼 SEC에 의한 단백질 A 용출액의 분리는 하기 표 11에 요약된 것과 같은 kon 및 koff를 갖는 3개 CTLA4-Ig 종: 이량체, 사량체 및 육량체/다량체를 유도한다. HIC 클리닝 피크로부터의 정제된 이량체의 시알산 함량은 CTLA4-Ig 이량체에 비해 낮다.
하기 표 11에서, 75 내지 200 nM의 샘플 농도를 B7-1Ig 칩 (694 RU)에 대해 시험하였다. HIC 클리닝 피크로부터 정제된 CTLA4-Ig 종은 CTLA4-Ig 참고에 비해 보다 낮은 결합을 나타내었다. 분리된 사량체는 CTLA4-Ig 참고와 비교가능한 kon 및 koff 속도를 가졌다.
Figure 112011097388832-pat00067
CTLA4-Ig 이량체 표준의 7회 관찰, 및 정제된 이량체 및 사량체의 14회 관찰을 기초로 스튜던츠 T-검정을 사용하여 데이타의 통계적 분석을 수행하였다. 정제된 이량체 또는 사량체 중 하나와 CTLA4-Ig 이량체 표준과의 비교에서는 kon 속도에서 차이가 없었다. 그러나, 참고를 정제된 사량체와 비교한 경우 koff 속도 및 KD는 통계적으로 유의하였다 (표 12). 정제된 사량체와 정제된 이량체의 비교에서, kon 및 koff 둘 모두, 및 또한 KD는 통계적으로 상이하였다. 비록 데이타가 이량체 및 사량체로 분류하였지만, 개개의 샘플의 분류 (즉, 앞부분, 뒷부분 등)는 그의 결합 역학에 영향을 미칠 수 있는 약간의 상이한 특성을 가질 수 있다는 것을 지적하여야 한다. 이량체에 대하여, kon 및 koff는 평균하면 각각 3.3 ± 1.0×105 M-1s-1 및 8.8 ± 3.5×10-3s-1이다. 사량체의 kon 및 koff는 각각 2.6 ± 0.8×105 M-1s-1 및 3.1 ± 1.4×10-3S-1이었다.
하기 표 12에서, 이량체 (n = 14) 및 사량체 (n = 14) 및 CTLA4-Ig 이량체 표준 (n = 7)을 분석하였다.
Figure 112011097388832-pat00068
OFF 클리닝 피크로부터의 CTLA4-Ig 종: QFF 칼럼은 생성물로부터 잔류 불순물을 제거하기 위해 사용되는 최종 정제 칼럼이다. CTLA4-Ig 종을 2-칼럼 SEC 방법을 사용하여 QFF 칼럼의 클리닝 피크로부터 단리하고, 비아코어 3000에서 분석하였다. 데이타는 이러한 "QFF 클리닝 피크" 샘플의 결합 역학이 CTLA4-Ig 이량체 표준과 유사함을 나타내었다. 추가적으로, QFF 클리닝 피크로부터 정제된 이량체 및 사량체 모두 조성물로부터 정제된 것과 비교하여 유사한 결합 역학을 가졌다. 추가적으로, 정제된 단량체 분획물의 시알산 함량은 CTLA4-Ig 이량체 표준보다 컸다.
구아니딘 처리 (사량체의 이량체화): 구아니딘으로의 처리, 이어서 포스페이트 완충액으로의 투석에 의해 사량체를 이량체로 전환시킬 수 있으며, 분석 SEC에 의해 이량체로서 존재하는 것을 확인할 수 있었다. HIC 클리닝 피크로부터 "이량체화된" 사량체의 역학 분석은 그의 kon 및 koff 속도가 CTLA4-Ig 이량체와 유사함을 나타내었다.
실시예 7: MS 전자분무 이온화 (ESI)에 의한 원형 분석
CTLA4-Ig를 0.7 mg/mL의 최종 농도까지 100 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8로 희석시켰다. PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 17 단위/μL의 최종 농도까지 100 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8로 30배 희석시켰다. 동일한 부피 (각각 60 μ)의 희석된 샘플 및 희석된 글리코시다제 용액을 혼합하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
얻어진 탈글리코실화된 CTLA4-Ig (2 μL)를 워터스 오아시스® 역상 추출 카트리지 칼럼 (2.1×20 mm)에 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 5분 동안 0.2 mL/분의 유속에서 5％ 용매 B (용매 A: 물 중 1％ 포름산, 용매 B: 아세토니트릴 중 1％ 포름산)로 세척하여 탈염시켰으며, 용출액을 폐기물로 전환하였다. 5분의 종료시, 빠른 구배 (10분에서의 5％ 용매 B로부터 95％ 용매 B)는 칼럼 외부로의 CTLA4-Ig의 용출을 시작하였으며, 흐름 분할 (사용된 크로마토그래피 시스템은 워터스 2996 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스 2695 였음) 이후 이러한 용출액을 45 μL/분에서 질량 분광계 (워터스 마이크로매스 Q-Tof microTM)로 향하게 하였다.
Q-Tof microTM에 대한 모세관 전압을 3 kV로, 샘플 콘 전압을 40 V로 설정하였다. 스캔 (매 0.9초)을 1회 스캔으로 평균하였으며, 스캔간 시간은 0.1초였다. Q-Tof 분석기는 m/z 800 내지 2500을 스캔한다. 최대 피크 높이의 절반 보다 높은 부분에 해당하는 스펙트럼을 워터스 MassLynxTM 소프트웨어를 사용하여 합쳤다. 합쳐진 스펙트럼을 워터스 MaxEntl 디콘볼루션하였다. 분할을 1 Da/채널로 설정하였으며, 단일 가우스 손상 모델을 0.5-1 Da 사이의 절반 높이 설정에서의 너비로 선택하였다. 좌 피크 및 우 피크에 대한 최소 강도 비는 둘 모두 50％로 설정하였다.
실시예 8: 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (MALDI-TOF)
질소 레이저 (337 nm)를 사용하여 옴니플렉스™ (부르커, 매사추세츠주 달토닉스)에서 MALDI-MS 스펙트럼을 얻었다. 단백질 샘플을 탈염 없이 사용하거나, 또는 C4 집팁® 피펫 팁 (밀리포어, 매사추세츠주 베드포드) 형태로의 고체 상 추출을 사용하여 탈염시켰다. 피펫 팁을 사용 전에 아세토니트릴-물 (1:1 v/v)로 적시고, 0.1％ 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 평형화시켰다. 이후, 피펫으로부터 샘플 10 μl을 3회 흡입 및 방출시켜 피펫 팁을 로딩하였다. 로딩된 샘플을 0.1％ TFA 10 μL로 3회 세척하였다. 탈염된 단백질 샘플을 아세토니트릴 대 물 (1 :1 v/v)의 10 μL로 피펫으로부터 용출시켰다. 샘플 (탈염된 또는 완충액 함유 중 하나) 1 μL을 매트릭스 용액 1 μL와 혼합하고, 혼합물 1 μl을 스테인레스강 표적에 두어 샘플을 스팟팅하였다. 매트릭스 용액은 0.1％ TFA를 함유하는 1:1 물 대 아세토니트릴 (v/v) 중 시나프산의 포화 용액이었다. 혼합물을 MALDI 샘플 플레이트에 스팟팅하고, 공기 건조시키고, 이후 질량 분광기에 두었다. 모든 단백질 샘플을 20 kV의 가속 전압 및 200나노초의 지연 시간을 사용하여 지연된 추출에 의해 선형 양이온 모드로 분석하였다. 총 400개 단일-샷 스펙트럼을 각 샘플로부터 축적하였다. 트립시노겐 (23982 m/z), 단백질 A (44613 m/z) 및 소 알부민 (66431 m/z)을 함유하는 표준 단백질의 혼합물을 사용하여 외부 보정을 달성하였다.
펩티드의 MALDI-TOP MS 분석
펩티드 혼합물을 역상 크로마토그래피에 의해 분리하고, 크로마토그래피 피크로부터의 분획물을 수집하고, 증발 건조시켰다. 샘플을 25 mM 포스페이트 완충액 pH 7.5 50 μL에 녹였다. DTT를 5 mM의 최종 농도로 첨가하고, 분획물을 50℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 환원 이후, IAM을 10 mM 최종 농도로 첨가하고, 50℃에서 추가로 20분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다.
질소 레이저 (337 nm)를 사용하여 옴니플렉스 (부르커, 매사추세츠주 달토닉스)에서 MALDI-MS 스펙트럼을 얻었다. 샘플 1 μL을 매트릭스 용액 1 μL와 혼합하여 샘플을 제조하였다. 매트릭스 용액은 0.1％ TFA를 갖는 1 대 1 물:아세토니트릴 중에서의 α-시아노-4-히드록시신남산의 포화 용액이었다. 혼합물을 MALDI 샘플 플레이트 벽에 스팟팅하고, 공기 건조시키고, 이후 질량 분광기에 위치시켰다. 모든 펩티드를 20 kV의 가속 전압 및 200나노초의 지연 시간을 사용하여 지연된 추출에 의해 반사 양이온 모드에서 분석하였다. 총 100개 단일-샷 스펙트럼을 각 샘플로부터 축적하였다. 안지오텐신 II (1046.54 m/z), 안지오텐신 I (1296.68 m/z), 물질 P (1347.74 m/z), 봄베신 (1619.82 m/z), ACTH 클립 1-17 (2093.09 m/z), ACTH 클립 18-39 (2465.20 m/z) 및 소마토스타틴 (3147.47 m/z)을 함유하는 표준 펩티드의 혼합물을 사용하여 외부 보정을 달성하였다.
실시예 9: CTLA4-Ig 단일쇄 및 다량체 종에 대한 배지 및 배지 성분 효과의 분석
CTLA4-Ig 이량체, 낮은 시알산 부-분획물, 높은 시알산 부-분획물, 단량체 앞부분 및 CTLA4-Ig의 단량체 종을 제조하고, 정제하였다. 0 내지 60시간 이상의 시간에 따른 단일쇄 및 고분자량 형성에 대한 배지 및 배지 성분의 효과를 측정하도록 설계된 일련의 모델링 실험에서 이들 샘플을 사용하였다. 제제 완충액, 요오도아세트아미드, 인산나트륨, 염화암모늄, 기초 배지, 발효 배양물, 배지 177e, 배지 농축된 산 용액 I, 배지 농축된 산 용액 II, 인슐린, EDTA, 시스테인, 리포산, 글루타티온, 메티오닌 및 이스톨레이트 단독 및 조합의 효과를 시험하였다.
실시예 10: 크기에 의한 CTLA4-Ig 분자의 분석
변성 조건을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 방법을 상이한 크기의 단백질 종의 정량에 대해 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 변성 조건을 사용하는 직렬 SEC 방법을 CTLA4-Ig 단일쇄 종의 정량에 대해 이용할 수 있다. 단일쇄 CTLA4-Ig 종은 쇄간 디술피드 가교가 결핍된 종일 수 있다. 정제 방법 동안 단리된 단일쇄 CTLA4-Ig 종은 천연 단일쇄 CTLA4-Ig로도 불린다. CTLA4-Ig 이량체의 환원 및 알킬화에 의해 생성된 정제된 단일쇄는 유도된 단일쇄로도 불린다. 천연 및 유도된 단일쇄 CTLA4-Ig는 동일한 특성을 갖는다.
물질:
제일인산칼륨 (KH2PO4) ACS 등급
수산화칼륨 (KOH) 45％ w/w 용액 ACS 등급
염화나트륨 (NaCl) ACS 등급
보정된 가변형 단일 피펫, 100 _L
레이닌 (Rainin; 카탈로그 번호 P-100)
물 (H2O) HPLC 등급
2.0 mL 극저온 바이알 날진, (카탈로그 번호 5000-0020)
진한 염산 (HCl) 피셔 (Fisher; 카탈로그 번호 A144-212)
수산화나트륨, (NaOH) 10 N 용액
제이.티.베이커 (J.T.Baker; 카탈로그 번호 5674-02)
1000 mL 필터 유닛 (Filter Unit) 0.22 mm 코닝, (카탈로그 번호 430517)
폴리프로필렌 15 mL 시험 튜브 팔콘 (Falcon; 카탈로그 번호 352097)
나트륨 아지드 (NaN3) ACS 등급
제일인산나트륨, 일수화물 (NaH2PO4-H2O)
수산화칼륨 (KOH) 펠렛
기기 및 조건
HPLC 시스템 워터스 2695 분리 모듈
칼럼 토소 하스 5 μTSK 3000 SWXL, 300 mm×7.8 mm I.D. (파트 번호 08541)
가드 칼럼 토소 하스 5 μTSK 3000 SWXL, 40 mm×6.0 mm I.D. (파트 번호 08543)
검출기 워터스 2487 2중 파장 검출기 파장 280 nm 유속 1 mL/분
통합 시스템 엠파워
주입 부피 20 μL
분석 표적 농도 10 mg/mL
이동상 0.2 M KH2PO4, 0.9％ NaCl, pH 6.8 (KOH)
분석 전개 시간 20분
칼럼 온도 상온
샘플 온도 4℃
체류 시간 단량체 8.7분 ± 1.0분, HMW 종 7.5분 ± 1.0분, 존재하는 경우 MW 종은 단량체 피크 이후 용출할 것이다.
시약
4 N 수산화칼륨 (4 N KOH) (100 mL)
기재된 것과 같은 하기 제조법 중 하나를 사용한다.
HPLC 등급수 40 mL 및 45％ w/w KOH 용액 11.6 ml을 100 mL 부피 플라스크에 첨가한다. 부피를 HPLC 등급수로 100 mL가 되도록 한다.
100 mL 부피 플라스크에 HPLC 등급수 80 ml을 첨가하고, KOH 펠렛 22.4 g를 칭량하고, 완전히 용해될 때까지 자기적으로 교반한다. 부피를 HPLC 등급수로 100 mL가 되도록 한다.
용액을 250 mL 유리 시약 병으로 옮긴다. 반전시켜 잘 혼합한다. 실온에서 1년까지 저장한다.
이동상 (0.2 M KH2PO4, 0.9％ NaCl, pH 6.8)
KH2PO4 27.2 g 및 NaCl 9.0 g를 1000 mL 비커에 계량투입한다.
자석 교반 바로의 연속 혼합을 사용하여 용액을 HPLC 등급수 800 mL에 용해시킨다.
pH 미터를 사용하여, 용액의 pH를 4 N KOH 용액을 사용하여 6.8로 조절한다. pH가 6.8을 초과하는 경우, 진한 HCl로 조절한다.
1000 mL 눈금 실린더를 사용하여 최종 부피를 1 리터로 만든다. 0.22 μm 필터 유닛을 통해 용액을 여과한다.
1000 mL 유리 시약 병으로 옮기고, 5 +/- 1분 동안 진공 탈기하면서 초음파처리한다. 각 사용 전에 탈기한다.
실온에서 1개월까지 저장한다.
2 N 수산화나트륨 (2 N NaOH)
10 NaOH 20 ml을 100 mL 유리 눈금 실린더로 옮긴다.
HPLC 물로 부피를 100 mL로 만든다.
용액을 250 mL 유리 시약 병으로 옮긴다. 반전시켜 잘 혼합한다. 실온에서 1년까지 저장한다.
NaH2PO4-H2O 3.45 g 및 NaCl 2.92 g를 칭량하고, 교반 바로 혼합하면서 HPLC 등급수 900 mL에 용해시켰다. pH 미터를 사용하여, 용액의 pH를 2 N NaOH로 7.4로 조절하였다. pH가 7.4를 초과하는 경우, 진한 HCl로 조절한다.
1000 mL 눈금 실린더를 사용하여 최종 부피를 1 리터로 만들었다. 0.22 μm 필터 유닛을 통해 용액을 여과한다.
2 내지 8℃에서 6개월까지 저장한다.
칼럼 저장 완충액 (물 중 0.05％ w/v NaN3)
나트륨 아지드 50 ± 5 mg를 칭량하고, 자기 교반 바로 1000 mL 비커에 첨가한다.
HPLC 등급수 500 ml을 비커에 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 교반한다.
물로 부피를 1 L로 만든다. 0.22 μm 필터 유닛을 통해 용액을 여과하고, 1000 mL HPLC 시약 병에 붓는다.
실온에서 6개월까지 저장한다.
고분자량 종 및 시스템 적합성 표준의 제조
가열 내지 비가열된 CTLA4-Ig 참고 물질의 3배 희석, 및 15％ 내지 30％ 고분자량 종 면적 양 (％)을 제공할 것이다. 15 mL 팔콘 시험 튜브에서, CTLA4-Ig 희석 완충액을 사용하여 참고 물질 대략 3 ml을 10.0 ± 1.0 mg/mL로 제조한다. CTLA4-Ig의 초기 농도는 COA로부터이다. 그 값으로부터 10.0 ± 1.0 mg/mL 희석액을 만든다. 제조된 희석된 참고 물질 1.0 ml을 1 mL 피펫을 사용하여 2.0 mL 극저온바이알에 옮기고, 이를 67 ± 2℃에서 45 ± 2분 동안 수조에서 가열한다. 제조된 가열된 참고 물질을 1 mL 피펫을 사용하여 15 mL 시험 튜브로 다시 옮긴다. 천천히 총 10회 동안 1 mL 부피의 시험 튜브의 내용물을 피펫으로 옮긴다. 이는 시스템 적합성 표준이다. 저장 조건: -80 ± 5℃에서 1년까지 저장하기 위해 2.0 mL 극저온바이알 중에서 시스템 적합성 표준의 150 μL 분취액을 제조한다. 참고 물질의 초기 농도를 얻고, 상기 값으로부터 10.0 ± 1.0 mg/ml 희석액을 만든다. 참고 물질 최소 100 μl 및 적절한 양의 희석 완충액을 사용하여, 최종 농도 10.0 ± 1.0 mg/ml을 달성한다. 희석액에 대해 하기 방정식을 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00069
CTLA4-Ig 약물 재료에 대하여, 샘플의 최소 100 μL 분취액 및 적절한 양의 희석 완충액을 사용하여 단백질 농축물로부터 10.0 ± 1.0 mg/mL 희석액을 만들어, 10.0 ± 1.0 mg/mL의 최종 농도를 달성한다. 희석액에 대해 하기 방정식을 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00070
일단 10.0 ± 1.0 mg/mL로 희석시키고, 샘플을 24시간까지 2℃ 내지 8℃에서 저장할 수 있다. CTLA4-Ig 약물 제품에 대하여, 샘플의 최소 200 μL 분취액 및 적절한 양의 희석 완충액을 사용하여 단백질 농축물로부터 10.0 ± 1.0 mg/mL 희석액을 제조하여, 10.0 ± 1.0 mg/mL의 최종 농도를 달성한다. 희석액에 대해 하기 방정식을 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00071
1개 용매 저장기에 이동상을 두고, 다른 쪽에 HPLC 등급수를 둔다. 초음파 처리 및 진공 탈기 이후 전개한다. 검출기를 켜고, 15분 동안 가온시키고, 이후 전개한다. 새로운 또는 현재 칼럼을 분석을 위해 사용하기 이전에, 20분 이상 동안 HPLC 등급수로 칼럼을 플러싱하고, 이어서 20분 이상 동안 이동상 완충액 평형화시킨다. 1.0 mL/분의 유속을 사용한다. 시스템 적합성 표준의 150 μL 분취액을 해동하고, 이를 오토샘플러 바이알에 첨가하고, 바이알을 오토샘플러에 둔다. 상기 표준 20 μl을 상기 조건 하에 주입한다.
대략 7.5분에서 용출하는 고분자량 종의 백분율을 하기 식에 따라 측정한다 (하기 식에서, 단량체는 실질적으로 이량체를 나타냄).
Figure 112011097388832-pat00072
식 중,
A = 고분자량 종의 피크 면적이고;
B = 단량체의 피크 면적이다.
면적 (％) 고분자량 종은 15％ 이상이어야 한다. 15％ 미만인 경우, 추가의 농축된 고분자량 종을 상기 시스템 적합성 표준에 첨가한다. 분할 (R) 측정 및 체류 시간 평가. 시스템 적합성 표준 20 μl을 주입한다. 고분자량 종 (체류 시간 대략 7.5분) 및 단량체 피크 (체류 시간 대략 8.7분) 사이의 분할을 하기 방정식을 사용하여 계산한다 (하기 식에서, "단량체"는 실질적으로 이량체를 나타냄).
Figure 112011097388832-pat00073
식 중,
t1 = 고분자량 종의 체류 시간이고;
t2 = 단량체의 체류 시간이고;
W1 = 고분자량 종의 피크 너비이고;
W2 = 단량체의 피크 너비이다.
기준선에 대한 피크의 상대적으로 직선인 부분을 외삽한 이후 피크 너비를 피크의 저부에서 분으로 측정한다. 체류 시간 및 피크 너비는 동일한 단위로 측정된다. 한 실시양태에서, (R)은 1.2 이상이어야 하고, 피크에 대한 체류 시간은 8.7 ± 1.0분이어야 한다.
이론단 수 (N) 측정
시스템 적합성 표준 크로마토그램으로부터, 하기 방정식에 따라서 이론단 수 (N)를 계산하여 칼럼의 효율을 측정한다.
Figure 112011097388832-pat00074
식 중,
t = 단량체의 체류 시간 (분)이고;
w = 기준선에 대한 피크의 측면을 외삽하여 얻어진 단량체의 기준선에서의 너비 (분)이다.
CTLA4-Ig 물질을 총 육 (6)회 주입하였다. 10 mg/mL 참고 물질 200 μl을 오토샘플러 바이알에 분취하고, 바이알을 오토샘플러에 두고, 6회 주입한다. 크로마토그래피하고, 각각의 크로마토그래피에 대하여 이량체 피크 면적을 계산한다. 6개 크로마토그래피로부터 이량체 피크 면적을 합치고, 평균, 표준 편차 및 ％RSD를 하기 방정식에 따라 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00075
식 중,
X1,2,3.... = 일련의 데이타에서의 특정 값이고;
nx = 일련의 값 (x)이다.
5.4.4.2 표준 편차는 하기와 같이 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00076
식 중,
n = 일련의 데이타에서의 값 (x)의 수이고;
x = 일련의 데이타에서의 한 값이다.
5.4.4.3 ％ 상대 표준 편차 (RSD)를 하기와 같이 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00077
주입 순서의 예
Figure 112011097388832-pat00078
피크의 종합
5.5 내지 11.8분에서의 크로마토그래피에서의 모든 피크 면적을 종합한다. 크로마토그램의 기준선을 확대하여 모든 LMW 및 HMW 종의 총 면적이 종합에 포함되도록 보장한다. 대조군에서의 피크에 해당하는 샘플에서의 피크는 무시한다. 포함 부피 피크 (11.8-13.5분) 및 이후 피크를 본 계산에서 고려하지 않는다. 그러나, 포함 부피에서의 면적이 총 면적의 0.1％ 이상인 경우, 언급해야 한다. 이량체 피크는 8.7 ± 1.0분에서 용출하고, 고분자량 종 피크는 7.5 ± 1.0분에서 용출하며, 저분자량 종 (예를 들어, 존재하는 경우 단량체)는 이량체 피크 이후 용출할 것이다. 0.1 면적％의 총 피크 면적을 초과하여 280 nm 흡광도를 갖는 고분자량 종, 이량체 또는 저분자량 종이 아닌 임의의 피크를 주목해야 한다. 면적 백분율을 하기와 같이 계산한다 (본 실시예에서 "아바타셉트 단량체"에 대한 참고는 CTLA4-Ig 이량체를 나타냄).
7.2.1
Figure 112011097388832-pat00079
7.2.2
Figure 112011097388832-pat00080
면적％ 단량체 = 100 - (면적％ HMW + 면적％ LMW)
식 중,
A = 아바타셉트 단량체 피크 면적이고;
B = 아바타셉트 단량체 미만의 체류 시간을 갖는 모든 피크의 총 면적이고;
C = 아바타셉트 단량체 초과의 체류 시간을 갖는 모든 피크의 총 면적 (포함 부피를 배제함)이다.
6.0×40 mm 가드 칼럼을 이용하여 직렬로 위치하는 2개 7.8×300 mm TSK 겔 G3000SWXL™ 칼럼 (토소 바이오사이언스 (펜실베이니아주 몽고메리))에서의 워터스 얼라이언스® 2695 (매사추세츠주 밀포드)를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 샘플을 분리하였다. 25 마이크로리터의 각각의 정제된 샘플을 주입하고, 1.0 mL/분에서 0.1 M Na2HPO4, 0.1 M Na2SO4, pH 6.8을 사용하여 등용매 조건 하에 분리시켰다. 996 PDA (광다이오드 어레이) 검출기 (워터스, 매사추세츠주 밀포드)를 사용하여 샘플을 280 nm에서 검출하고, 밀레니움 4.0™ 크로마토그래피 소프트웨어 (워터스, 매사추세츠주 밀포드)를 사용하여 분석하였다.
변성 분석 직렬 크기 배제 크로마토그래피로부터의 천연 및 유도된 단일쇄 물질의 중첩된 크로마토그램은 각각 27.96 ± 0.02 및 27.99 ± 0.02의 평균 체류 시간 (6회 반복)을 나타낸다. 천연 단일쇄에 대한 평균 피크 면적은 495525.0 ± 9589.6이라는 것을 알았으며, 유도된 단일쇄에 대한 평균 피크 면적은 463311.8 ± 7997.2이다 (표 13). 천연 및 유도된 단일쇄 물질의 중첩된 MALDI-TOF 스펙트럼은 약 15000 질량 단위의 기준선 너비와 함께 매우 브로드한 피크를 갖는다. 이는 두 샘플 모두에서의 글리코실화의 불균일성 때문이라고 예상된다. 각 질량 스펙트럼에서의 단일쇄 피크의 정점을 사용하여 평균 질량을 계산하였다. 천연 및 유도된 CTLA4-Ig 단일쇄에 대한 평균 질량은 6개 복제의 분석을 기초로 각각 45694.426 ± 297.735 및 45333.086 ± 264.778 질량 단위였다 (표 14). 천연 단일쇄 질량은 유도된 단일쇄에 비해 높을 것으로 예상되며, 이는 천연 단일쇄 상에서 서열 여분의 시스테인 (잔류물 질량 103 돌턴)이 있으며, 반면 유도된 단일쇄는 단일쇄간 디술피드 가교의 선택적 환원, 및 아세틸기를 첨가하는 알킬화의 결과이다 (질량 58 돌턴).
이들 데이타는 천연 및 유도된 물질이 직렬 변성 SEC 크로마토그래피 및 MALDI-TOF 분석에 의해 동일한 결과를 생성함을 나타낸다. 이러한 결과는 천연 및 유도된 CTLA4-Ig 단일쇄 물질 사이의 공통점을 입증한다.
Figure 112011097388832-pat00081
Figure 112011097388832-pat00082
폴리펩티드 쇄 내의 시스테인의 존재는 분자내 또는 분자간일 수 있는 디술피드 결합의 형성을 가능하게 하여, 이량체 또는 다량체 단백질 착물의 형성을 유도한다. CTLA4-Ig는 각 쇄의 C146 사이의 하나의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 이량체로서 존재한다 (여기서, 이량체는 하기 서열 중 임의의 하나를 갖는 2개의 단량체로 이루어진다. (i) 서열 2의 26-383, (ii) 서열 2의 26-382; (iii) 서열 25의 27-383 (iv) 서열 2의 26-382, (v) 서열 2의 25-382, 및 (vi) 서열 2의 25-383). 상기 디술피드 결합의 환원은 비-공유 정전기력에 의해 서로 연결된 2개 동등한 단백질 쇄의 형성을 유도할 수 있다. 정전기력을 압도하거나 또는 정전기력보다 큰 변성 조건을 적용시키는 경우, 이러한 CTLA4-Ig는 완전히 해리되어 대략 46 kDa의 2개 동일한 단백질 구조를 유도할 수 있다. 얻어진 구조는 단일쇄 또는 단량체로도 지칭된다. 변성 조건 하에 직렬 칼럼 크기 배제 크로마토그래피 전개하여 단일쇄의 존재를 모니터링할 수 있다.
CTLA4-Ig 분자의 부집단은 Cys146에서의 변형을 함유하며, 주요 집단에 존재하는 디술피드 연결이 유리 시스테인 아미노산으로 변한다 (시스테이닐화로도 지칭됨). CTLA4-Ig는 주로 대략 92,000의 분자량을 갖는 단백질이다. 이는 2개 글리코실화된 폴리펩티드 쇄로 이루어지며, 이는 Cys146에서의 1개 쇄간 디술피드 결합 및 비-공유 상호작용에 의해 서로 고정된다 (CTLA4-Ig "이량체"로도 지칭됨). 정제된 단백질은 불균질 집단으로서 존재하며, 글리코실화와 같은 변형체 및 N- 및 C-말단에서의 변이체를 함유한다.
CTLA4-Ig 분자의 구별되는 집단이 존재하며, 이는 쇄간 디술피드 결합 연결이 결핍된다. 이러한 비-공유 연결된 집단은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 생성된 앞부분의 이량체 피크 내에 존재한다. 앞부분의 이량체는 쇄간 디술피드 결합이 부족하다는 것을 알게 되었다. 쇄간 디술피드 결합이 부족한 CTLA4-Ig 종을 Cys146에서의 시스테이닐화에 의해 변형시키며, 이러한 변형은 ESI-MS 원형 데이타를 기초로 99％ 초과의 단일쇄 종에서 일어난다. Cys146 시스테이닐화 및 O-연결된 탄수화물의 농축은 CTLA4-Ig 단일쇄 종에서의 2개 주요 변형이다. 앞부분 이량체에 변성 크기 배제 크로마노그래피하여, CTLA4-Ig 단일쇄 피크의 단리를 유도한다. 정제된 앞부분 단량체 분자를 고체 상 추출 (SPE)하거나 또는 하지 않고 CTLA4-Ig와 비교하고, MALDID에서 분석한다. 정제된 앞부분 단량체는 SPE-처리된 종에 대한 47005 u 또는 비-처리된 종에 대한 46897 u 중 하나에서의 주 종; SPE-처리된 종에 대한 95070 u 또는 비-처리된 종에 대한 96172 u 중 하나에서의 부 종인 2개 우세한 종을 함유한다. 또한, CTLA4-Ig 물질은 SPE-처리된 종에 대한 91518 u 또는 비-처리된 종에 대한 91143 u 중 하나에서의 주 종; SPE-처리된 종에 대한 45660 u 또는 비-처리된 종에 대한 46014 u 중 하나에서의 부 종인 2개 우세한 종을 함유한다.
Figure 112011097388832-pat00083
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 조성물은 이량체, 고 MW 종 및 저 MW 종 (단량체, 단일쇄)의 크기 균일성 (HPLC) 분석에서와 같이 하기 특성을 갖는다.
· ≥ 97.0％ 이량체
· ≤ 2.0％ HMW 종
· ≤ 0.5％ LMW 종 (예를 들어, 단량체, 단일쇄)
또 다른 실시양태에서, CTLA4-Ig 조성물은 하기 특징적인 각 종의 양을 갖는다.
· ≥ 95.5％ 이량체
· ≤ 3.0％ HMW 종
· ≤ 0.5％ LMW 종 (예를 들어, 단량체, 단일쇄)
공정 CD-CHO1 배치의 SE-HPLC 분석의 요약
Figure 112011097388832-pat00084
단량체 (％)은 방법 CD-CHO1을 사용하여 제조된 약물 재료에 대해 98.4 내지 99.8％ 범위였으며, 평균 값은 99.4％였다. HMW 종 백분율은 0.2 내지 1.6％로 변하였다. 평균 값은 0.6％으며, CV는 45.7％였다. 95％ 허용 구간은 이량체에 대해 98.7％ 이상, 및 HMW 종에 대해 1.3％ 이하였다. 배치의 HMW 종 (％)은 0.4％의 최소값으로부터 2.1의 최대값으로 변하였다. HMW 종의 평균 (％)은 0.8％였으며, CV％는 40％였다. 모든 경우에서, LMW 또는 단량체 종은 검출 한계 (DL = 0.1％) 미만이었다. 방법 CD-CHO1에 의해 제조된 CTLA4-Ig에 대한 95％ 허용 구간 (집단의 99％ 면적％에 대한 적용 범위를 제공함)은 HMW 종에 대해 각각 1.3 및 1.8％ 이하였다. 방법 CD-CHO1로부터의 약물 재료에서 이량체에 대한 95％ 허용 구간은 각각 98.7％ 및 96.5％였다.
CTLA4-Ig 이량체에 대한 합쳐진 데이타의 요약
Figure 112011097388832-pat00085
상기 표는 0.6％의 평균을 갖는 0.2 내지 2.1％ 범위의 HMW 종 (％)을 나타낸다. 이량체는 94.8％ 내지 99.8％의 범위를 가지며, 평균 값은 99.3％이고, 0.3％의 정밀도를 갖는다. 이량체에 대한 부위-사이, 부위-내 및 총-부위 변화는 0.3 내지 0.5％였다. HMW에 대한 부위-사이 변화는 26.4％였다. 부위-내 및 총-부위 변화는 HMW 종 (％)에 대해 각각 44.2 및 51.4％였다. 이량체 (97.3％) 및 HMW 종 (1.8％)에 대한 95％ 허용 구간은 명세서 내에 있었다.
실시예 11: 벡터 제조
pcSD 발현 벡터의 제조: 발현 벡터 pcSD를 도 28에서 나타낸 것과 같이 시판되는 pcDNA3 벡터 (인비트로겐 (Invitrogen; 캘리포니아주 칼스백 (Carlsbag, CA))로부터 제조하였다. 제한 엔도뉴클라제 Nae I로 분해시켜 네오마이신 내성 유전자 카셋트를 플라스미드 pcDNA3으로부터 제거하였다. 제한 엔도뉴클라제 Nae I은 둔단 (blunt-end)을 생성한다. DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리시키고, 3.821 kb pcDNA3 벡터 백본을 겔로부터 정제한다. 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) 및 SV40 프로모터를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한 엔도뉴클라제 Pvu II 및 BamH I로 플라스미드를 분해시켜 플라스미드 pSV2-dhfr로부터 단리시켰다. dhfr 유전자 카셋트에 해당하는 1.93 kb 단편을 분리시키고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하였다. BamH I 분해에 의해 생성된 3-프라임 함몰단을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편을 사용하여 충전하여, 둔단을 생성하였다. 상기 단리된 단편을 둔단의 3.8 kb pcDNA3 벡터 백본으로 라이게이션하여, 발현 벡터 pcSD를 생성하였다. 상기 발현 벡터는 하기의 특징을 갖는다. 다중 클로닝 부위로 이어지는 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열, 선택 및 증폭을 위한 마우스 dhfr cDNA 서열, 및 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서의 선택 및 유지를 위한 암피실린 내성 유전자 및 pUC 복제 기원.
pcSDhuCTLA4-Ig 발현 벡터의 구축: CTLA4-Ig 단백질을 코딩하는 서열을 함유하는 1.2 킬로베이스 (kb) DNA 단편을 제한 효소 Hind III 및 Xba I로 분해시켜 플라스미드 pCDM8-CTLA4-Ig로부터 단리시켰다. 1.2 kb Hind III/Xba I 단편을 이전에 제한 효소 Hind III 및 Xba I로 분해된 벡터 piLN으로 라이게이션하였다. piLN-huCTLA4-Ig로 지정된 얻어진 플라스미드 구축물을 도 21에 나타낸다. piLN-huCTLA4-Ig 플라스미드를 최종 발현 벡터 pcSDhuCTLA4-Ig의 구축에서 사용되는 CTLA4-Ig 코딩 서열의 공급원으로서 사용하였다.
CTLA4-Ig 유전자의 발현을 위한 최종 벡터를 도 29에 나타낸 것과 같이 구축하였다. CTLA4-Ig 유전자를 함유하는 1.2 kb DNA 단편을 2단계 제한 분해 절차에 의해 플라스미드 piLN-huCTLA4-Ig로부터 단리시켰다. 플라스미드 piLN-huCTLA4-Ig를 먼저 제한 효소 Hind III으로 분해시켰다. 얻어진 3-프라임 함몰단을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 (Klenow) 단편으로 처리하여 충전하였다. 이후, 플라스미드를 제한 효소 Xba I로 분해시켜, CTLA4-Ig 유전자를 함유하는 1.2 kb 단편을 방출시켰다. 이 단편을 정제하고, pcSD의 제한 분해로부터 단리된 EcoR V 및 Xba I 단편으로 라이게이션시켰다. CMV 프로모터, 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열을 함유하는 카셋트 사이의 pcSD의 다중 클로닝 부위에 EcoR V 및 Xba I 제한 부위를 위치시킨다. 이를 CMV 프로모터의 제어 하에 CTLA4-Ig 유전자 단편에 위치시켰다. 상기 플라스미드를 pcSDhuCTLA4-Ig로 나타내며, 서열 1을 포함한다.
실시예 12: 안정한 세포주를 얻기 위한 CTLA4-Ig 발현 벡터의 형질감염
본 실시예 및 실시예 13은 새롭게 형질감염된 세포 집단을 기재하며, 이로부터 개개 클론을 선택 및 확장시켰으며, 이에 따라 확장된 클론은 기탁 번호 CRL-10762로서 ATCC로 기탁된 세포와 상이하다. CTLA4-Ig에 해당하는 아미노산을 코딩하는 DNA (ATCC 기탁 번호 68629를 갖는 DNA)를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 이전 CHO 세포주는 미국 특허 제5,434,131호에 기재되어 있다. 요약하면, ATCC 기탁 번호 68629 하에 기탁된 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드 (예를 들어, pCDM8)를 표준 절차를 사용하여 리포펙션 (lipofection)에 의해 dhfr 음성-CHO 세포로 형질감염시켜, CTLA4-Ig를 안정하게 발현하는 세포주를 얻었다. 면역염색을 사용하여 배지에서 B7 결합 활성에 대한 B7 양성 CHO 세포주의 스크리닝은 CTLA4-Ig를 발현하는 안정한 형질감염체를 유도한다. 형질감염된 세포의 이러한 불균질 집단을 차이니즈 햄스터 난소 세포주, CTLA4-Ig-24로 지정하였으며, ATCC 기탁 번호 CRL-10762를 갖는 1991년 5월 31일자의 부다페스트 조약 하에 ATCC로 기탁되었다.
차이니즈 햄스터 난소 세포주, DG44는 효소 디히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자의 결실을 함유한다. 발현 플라스미드 pcSDhuCTLA4-Ig는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 (dhfr)의 복제체를 함유한다. DG44 게놈으로의 플라스미드 pcSDhuCTLA4-Ig의 삽입은 dhfr 결실의 기능적 상보성을 유도한다. 이러한 기능적 상보성을 메토트렉세이트 (MTX)의 존재 하의 형질감염체의 선택 및 dhfr 및 인접 유전자의 증폭에 사용할 수 있다.
도 29에서 나타낸 것과 같이 pcSDhuCTLA4-Ig 발현 플라스미드로 세포주 DG44를 형질감염시켜 인간 CTLA4-Ig-분비 세포주 1D5를 구축하였다. 플라스미드 DNA를 당업계에 알려진 표준 절차를 사용하여 전기천공에 의해 DG44 세포로 도입하였다. 5％ (v/v) 투석된 우태아 혈청으로 보강된 최소 필수 배지 (MEM; JRH 바이오사이언즈, 인크. (Biosciences, Inc.; 캔자스주 (Kansas)))를 사용하여 형질감염체를 선택하였다. 형질감염체로부터의 배양 상청액을 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 인간 IgG 생산에 대해 스크리닝하였다. Fc-특이적 염소 항-인간 Igg를 포획 항체로서 사용하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG 항체를 사용하여 인간 IgG를 검출하였다. 보다 높은 수준의 인간 CTLA4-Ig 유전자를 발현하는 형질감염체를 추가 증폭을 위해 선택하였다.
MTX를 배양 배지에 100 nM의 최종 농도에서 첨가하여 선택된 형질감염체의 유전자 증폭을 달성하였다. MTX는 디히드로폴레이트 리덕타제의 경쟁적 억제제로서 작용하는 폴산 유사체이다. MTX의 배지에의 첨가는 dhfr 유전자의 다중 복제체 및 상승된 수준의 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유하는 형질감염체를 선택하도록 한다. 인접 CTLA4-Ig 유전자의 다중 복제체 또한 함유하는 형질감염치를 인간 IgG 특이적 ELISA 방법을 사용하여 확인하였다. 1D5로 표시된 CTLA4-Ig-생산 클론을 일부 실시예 13에서 기재된 추가 개발을 위해 선택하였다.
실시예 13: 안정하게 형질감염된 세포의 서브클로닝
세포주 1D5를 연한천 클로닝에 적용시켰다. 연한천 클로닝으로부터 유래된 서브클론을 ELISA 방법을 사용하여 인간 IgG 생산에 대해 분석하였다. 선택된 서브클론을 CTLA4-Ig 생성 및 성장 특성에 대해 평가하였다. 1D5-100A1로 표시된 선도 서브클론을 선택하였다.
1D5-100A1 세포주를 동물-공급 원료 물질을 함유하는 DE 배지 (JRH 바이오사이언즈, 인크. (캔자스주))로부터 CD-CHO로 표시된 화학적으로 규정된 배지에 적응시켰다 (표 15). CD-CHO 배지는 인비트로겐 코포레이션 (캘리포니아주 칼스백)에 의해 제조된 전용의 무-동물 성분 배지이다.
Figure 112011097388832-pat00086
세포주 1D5-100A1를 배양하고, 표준 조직 배양 프로토콜에 따라서 DE 배지에서 계대배양하였다. 이후, 세포를 50％ DE 배지 및 50％ CD-CHO 배지로 구성된 배지로 옮겼다. 상기 배지에서 수회 계대배양 이후, 세포를 100％ CD-CHO 배지를 함유하는 T-플라스크에 옮겼다. 세포를 수회 계대배양 동안 100％ CD-CHO 배지에서 성장시켰다. 이후, 적응된 세포를 제한 희석에 의해 클로닝하였다.
CD-CHO-적응된 1D5-100A1 세포주로부터의 세포를 무혈청 배지를 사용하여 제한 희석에 의해 클로닝하였다. 1D5-100A1 세포를 보강된 MCDB 배지를 함유하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 1 세포/웰의 표적에서 시딩하였다. MCDB는 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스)에 의해 배급된 화학적으로 규정된 배지 배합물이다. MCDB 배지를 4 mM 글루타민, 500 μg/mL 재조합 인간 인슐린, 100 nM MTX 및 10％ 적응용 배지로 보강하였다. 적응용 배지는 MCDB 배지에서 성장된 CD-CHO 적응된 1D5-100A1 세포주의 배양물로부터의 필터-멸균된 상청액이었다.
단일 콜로니를 함유하는 웰을 확인하고, ELISA 방법을 사용하여 클론을 CTLA4-Ig 생성에 대해 평가하였다. 선택된 클론을 96-웰 마이크로타이터 플레이트로부터 6-웰 세포 배양 플레이트로 확장시켰다. 배양을 25 cm T-플라스크 및 이후 롤러 병으로 확장시켰다.
롤러 병 배양물을 CTLA4-Ig 역가, CTLA4-Ig 시알산 함량 및 성장에 대해 평가하였다. 생물반응기에서의 추가의 평가 및 추가의 특성화를 위해 3개 클론을 선택하였다. -80℃에서 저장된 클론 세포주 1D5-100A1.17의 동결된 바이알 연구 원액을 사용하여 세포 은행을 생성하였다.
실시예 14: 영양공급-뱃치 방법을 통한 생물반응기에서의 CTLA4-Ig의 생산
CTLA4-Ig를 발현하는 현탁 포유동물 세포의 상업적 규모의 배양: 본 실시예는 dhfr-음성 CHO 세포 배양된 현탁액으로부터의 서열 2 단량체를 포함하는 CTLA4-Ig 분자의 생산을 기재한다. 본 실시예에 기재된 방법을 분비된 단백질, 예컨대 사이토킨 및 기타 호르몬, Ig 슈퍼패밀리의 구성원이거나 또는 Ig 슈퍼패밀리 단백질의 일부를 포함하는 분비된 단백질, 및 CHO 세포에서 발현된 일반적으로 임의의 단백질을 비제한적으로 비롯한 다른 재조합 단백질의 생산에 대해 적용 및 확장시킬 수 있다. CTLA4-Ig 배양 단계에 대한 방법 흐름도를 도 10에서 나타낸다.
배양물 플라스크 (예를 들어, T-175 및 에를렌마이어 플라스크), 롤러 병 및 세포 백을 CTLA4-Ig 배양 방법의 접종물 확장 단계 동안 사용하여 동결된 바이알로부터 연속적으로 증식시켜, 20,000 L 생물반응기에 접종하기에 충분한 수의 생존 세포를 제공하였다.
세포의 단일 바이알을 액체 질소 저장 동결기의 증기상으로부터 제거하고, 37℃에서의 수조에서 해동시켰다. 바이알의 전체 내용물을 무균적으로 멸균 15 mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮겼다. CD-CHO 배지를 첨가하여 최종 부피가 10 mL이 되었다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 10 mL의 CD-CHO 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 CD-CHO 배지 10 mL를 함유하는 T-175 플라스크로 옮긴다. T-175 플라스크에서의 생존 세포 밀도 및 배양물의 생존도 (％)를 측정한다. 84％ 초과의 상기 단계에서의 생존도 (％)에 대한 기준을 입증하였다. CD-CHO 배지를 T-175 플라스크에 첨가하여, 1.7-2.6×105 세포/mL의 표적 생존 세포 밀도를 달성한다.
T-175 플라스크를 37℃에서 최대 4일 동안 6％ 이산화탄소 분위기에서 인큐베이션하여, 6×106개 이상의 생존 세포 이상의 표적 최종 세포 수를 달성한다. T-175 플라스크 단계에 이어서, 도 10에서 나타낸 것과 같이 일련의 진탕 플라스크, 1 L 및 2 L 롤러 병을 사용하여 배양물을 확장시킨다. 각각의 계대배양에서, 세포를 2.0×105 생존 세포/mL의 표적 밀도로 시딩하며, 여기서 배양물은 최종 배양 세포 생존도 80％ 이상을 갖는 것을 표적으로 한다. 배양물을 37℃에서 최대 4일 동안 6％ 이산화탄소 분위기하에 CD-CHO 배지에서 인큐베이션한다.
추가로 1000 L 생물반응기에 접종하기 위해, 배양물의 확장이 일련의 세포 백 (20 L, 100 L 및 200 L)에서 일어난다. 2 L 롤러 병 접종물 확장 단계로부터의 세포 배양 물질을 풀링하여, 2.0×105 생존 세포/mL의 표적 시딩 밀도에서 20 L 세포 백에 접종한다. 1.0 내지 2.0×106 세포/mL 및 80％ 이상의 최소 세포 생존도 (％)의 2 L 롤러 병 접종물 확장 단계에서의 최종 생존 세포 밀도를 위한 조건을 수립하였다. 접종시, 20 L 세포 백 배양을 37℃에서 최대 4일 동안 6％ 이산화탄소의 분위기에서 CD-CHO 배지에서 인큐베이션한다. 각각의 후속적인 계대배양 (100 L 및 200- L 세포 백)에 대하여, 세포를 2.0×105 생존 세포/mL의 표적 밀도로 시딩하였으며, 여기서 배양물은 80％ 이상의 최종 배양 세포 생존도를 갖는 곳에서 표적화하였다. 배양물을 37℃에서 최대 4일 동안 6％ 이산화탄소의 분위기하에 CD-CHO 배지에서 인큐베이션한다. 1.0 내지 2.0×106 세포/mL의 20 L, 100 L 및 200 L 세포 백 접종 확장 단계에서의 최종 생존 세포 밀도, 및 80％ 초과의 최소 세포 생존도 (％)에 대한 예시적인 값을 수립하였다. 이들 예시적인 값은 충분한 수의 생존 세포를 사용하여 1000 L 생물반응기에 접종하였음을 보장한다.
CTLA4-Ig 생산의 1000 L 및 4000 L 시드 생물반응기 접종물 확장 단계의 목적은 20,000 L 생산 생물반응기에 접종하기에 충분한 수의 생존 세포를 제공하기 위한 것이다.
CD-CHO 세포 배양 배지를 사용하여 시드 생물반응기를 뱃치식으로 작동시켰다. 온도, pH, 용해된 산소, 압력, 진탕, 및 공기, 산소 및 이산화탄소에 대한 기체 유속을 분산 제어 시스템 (DCS)에 의해 제어하였으며, 시드 생물반응기에서 배양의 최적 성장을 위한 조건을 제공한다. 시드 생물반응기를 37℃에서 작동시켰다. 배양 샘플을 생존 세포 밀도, 생존도 (％) 및 대사물질 농도의 측정을 위해 시드 생물반응기로부터 제거한다.
1000 L 시드 생물반응기를 1.0 내지 3.0×105 생존 세포/mL의 표적 초기 생존 세포 밀도까지 200 L 세포 백 확장 단계로부터의 접종물로 접종하였다. 배양물을 37℃에서 최대 5일 동안 CD-CHO 배지에서 인큐베이션한다. 1000 L 시드 생물반응기 접종물 확장 단계에서의 최종 생존 세포 밀도에 대한 값의 예는 1.0 내지 2.0×106 세포/mL이고, 최대 세포 생존도 (％)는 80％ 이상이다.
4000 L 시드 생물반응기를 1.0 내지 3.0×105 생존 세포/mL의 표적 초기 생존 세포 밀도까지 1000 L 시드 생물반응기 확장 단계로부터의 접종물로 접종한다. 배양을 37℃에서 최대 6일 동안 CD-CHO 배지에서 인큐베이션한다. 4000 L 시드 생물반응기 접종물 확장 단계에서의 최종 생존 세포 밀도에 대한 값의 예는 1.0 내지 2.0×106 세포/mL이고, 최대 세포 생존도 (％)는 80％ 이상이다. 이러한 값의 예는 충분한 수의 생존 세포를 사용하여 20,000 L 생산 생물반응기에 접종하였음을 보장한다.
20,000 L 시드 생물반응기를 1.0 내지 1.8×105 생존 세포/mL의 표적 초기 생존 세포 밀도까지 4000 L 시드 생물반응기 확장 단계로부터의 접종물로 접종한다. 배양물을 37℃에서 최대 6일 동안 CD-CHO 배지에서 인큐베이션한다. 20,000 L 시드 생물반응기 접종물 확장 단계에서의 최종 생존 세포 밀도에 대한 값의 예는 1.0 내지 2.0×106 세포/mL이고, 최소 세포 생존도 (％)는 80％ 이상이다. 이러한 값의 예는 20,000 L 생산 생물반응기에서의 생산기 개시 이전에 충분한 수의 생존 세포를 사용하는 것을 보장한다.
CTLA4-Ig의 상업적 규모의 생산: 20,000 L 생산 생물반응기에서 일어나는 본 발명의 생산기는 고품질 및 다량의 CTLA4-Ig 단백질을 생산하며, 이는 2 단계 온도 이동을 갖는 배양 시행을 포함한다. 37℃에서 최대 6일 동안 CD-CHO 배지에서 인큐베이션된 20,000 L 배양물 (상기 기재된 것과 같음)을 6일째 (대수 성장기의 종료)에서 37℃에서 34℃로의 온도 이동에 적용시킨다. 37℃에서 34℃로의 온도 이동 12시간 이후, CD-CHO 배지를 변형된 eRDF 공급 배지 (인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스백; 표 16, 17)로 보강하고, 상기 공급을 볼루스 (1％ w/w)로서 생산 반응기에 매일 제공한다.
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Figure 112011097388832-pat00088
20,000 L 배양물을 34℃에서 최대 4일 동안 매일 eRDF 공급 배지로 보강된 CD-CHO 배지에서 인큐베이션한다. 10일째에, 20,000 L 배양물을 34℃에서 32℃로의 제2 T-이동에 적용시킨다. 생산 생물반응기내의 20,000 L 생산 배양물을 32℃에서 최대 8일 동안 유지시켰다. 18일째에, 배양 샘플을 하기 예시적인 값에 대해 분석하였다. 20,000 L 시드 생물반응기 생산 단계에서의 생존 세포 밀도 3.0 내지 8.0×106 세포/mL; 최소 세포 생존도 (％) 38％ 이상; 최종 시알산 몰비 (이외의 곳에 기재됨) 6 이상; 및 최종 CTLA4-Ig 단백질 생성물 역가 0.5 내지 1.3 g/L. 이들 예시적인 값은 충분한 품질 및 양의 단백질 생성물이 재조합 CHO 세포주에 의해 생성되며 20,000 L 포유동물 세포 배양물이 수거되기에 용이하다는 것을 보장한다.
생산기 동안의 생물반응기에서의 배양물은 하기와 같이 변형된 eRDF 배지 (표 16, 17)를 사용하여 매일 볼루스 공급이 주어진다. 초기 온도 이동 (37℃에서 24℃)의 시작 12시간 이후, 최소 1％ 배양 용량을 공급 배지로서 첨가하며, 글루코스 수준이 3 g/L 미만으로 떨어지는 경우, 계산된 부피를 첨가하여 글루코스 수준이 다시 3 g/L가 되도록 한다.
생산기는 20,000 L 규모에서 18일의 지속 기간을 가졌다. 분석을 위해 샘플을 생산 생물반응기로부터 1일 기준으로 취하였다. 예를 들어, 세포 계수에 사용되는 샘플을 트리판 블루 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)로 염색하였다. 현미경 하에 생존 염색된 세포를 계수하기 위한 혈구계산기를 사용하여 세포 계수 및 세포 생존도 측정을 수행하였다. 대사물질의 분석을 위해, 추가의 샘플 분취액을 2000 rpm (4℃)에서 20분 동안 원심분리하여, 세포를 펠릿화시켰다. 당업계에서 통상적으로 실시되는 기법 및 프로토콜을 사용하여, 상청액을 단백질 역가. 시알산, 글루코스, 락테이트, 글루타민 글루타메이트, pH, pO2, pCO2, 암모니아 및 LDH에 대해 분석하였다.
실시예 15: 재조합 CTLA4-Ig의 정제
CTLA4-Ig 정제를 위한 QXL 음이온 교환 크로마토그래피: CTLA4-Ig 방법에서의 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 Q 세파로스 익스트림 로드 (QXL) 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 사용한다. 상기 수지는 지이 헬스케어 (위스콘신주 워키쇼 (Waukesha, WI; 이전 명칭 아머샴 바이오사이언시스))에 의해 공급된다. QXL 크로마토그래피 단계는 추가의 하향식 처리를 위한 수거 작동 단계로부터의 공정 물질로부터 CTLA4-Ig 이량체를 포획 및 농축하기 위한 것이다.
1.0-2.0 m 내부 직경 칼럼을 약 643 L 내지 1018 L의 부피에 해당하는 7 내지 30 cm의 높이까지 QXL 수지로 패킹하였다. 칼럼은 패킹된 칼럼의 이론단 (HETP) 및 비대칭 (As)과 동등한 높이를 측정하여 사용에 대해 검정한다. 0.02 내지 0.08 cm의 HETP 및 0.8 내지 1.2의 As를 QXL 칼럼의 검정에 사용한다.
QXL 칼럼 작동은 상온에서 수행한다. 정화된 세포 배양 배양액을 평형화된 QXL 칼럼에 로딩한다. QXL 크로마토그래피 단계를 99.4 L/분의 최대 유속을 사용하여 수행한다. 칼럼 주입구 압력은 35 psig 미만을 유지한다. QXL 칼럼에 대한 최대 CTLA4-Ig 단백질 로딩은 수지 1 리터 당 CTLA4-Ig 28 그램이다.
먼저, QXL 크로마토그래피 칼럼을 1 N 수산화나트륨 용액으로 위생 처리 한다. 위생 처리를 2 내지 4 칼럼 부피 (CV)의 1 N 수산화나트륨 용액을 사용하여 수행한다. 칼럼 배출액의 전도도가 169 ± 33 mS/cm와 동일하고, 칼럼을 60 내지 120분에서 유지시키는 경우 위생 처리가 완료된다.
위생 처리 단계 이후, 칼럼을 75 mM HEPES, 360 mM 염화나트륨, pH 8.0 완충액으로 평형화시킨다. 최소 3 CV의 평형 완충액이 칼럼을 통과하며, 배출액의 pH가 8.0 ± 0.2이고, 배출액의 전도도가 13.4 ± 1.0 mS/cm인 경우 평형화가 완료된다.
수거 작동 단계로부터의 공정 물질을 QXL 칼럼에 로딩한다. 칼럼을 최소 10 CV의 세척 완충액 (75 mM HEPES, 360 mM NaCl, pH 8.0)으로 세척하였으며, 칼럼 배출액의 280 nm에서의 흡광도 (A280)를 세척 단계의 종료시 측정한다. 이후, CTLA4-Ig를 25 mM HEPES, 325 mM NaCl 또는 850 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 칼럼으로부터 용출시킨다. A280이 세척 단계의 종료시의 AU 값을 넘어 0.02 흡광도 단위 (AU) 이상으로 증가하는 경우 용출액을 수집 용기로 전화시킨다. 용출 피크의 후방 모서리의 A280이 1.0 AU 미만의 값으로 감소할 때까지 용출액을 수집한다.
8 이상의 시알산 몰 대 CTLA4-Ig 단백질 몰의 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 이량체 생성물을 수집하며, CTLA4-Ig 고분자량 물질의 풀은 25.7％이하로 존재한다. 이후, 사량체를 함유하는 CTLA4-Ig 고분자량 물질을 본원에서 기재된 치료 방법을 위한 별도 물질로서 사용하기 위해 추가로 정제할 수 있다.
CTLA4-Ig 정제를 위한 페닐 세파로스 FF HIC: 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계는 페닐 세파로스 패스트 플로우 수지 (지이 헬스케어, 위스콘신주 워키쇼, 이전 명칭 아머샴 바이오사이언시스))를 사용한다. HIC 단계는 QXL 생산 풀에 존재하는 CTLA4-Ig 고분자량 물질의 수준을 감소시킨다. CTLA4-Ig 이량체는 HIC 단계에 사용되는 로딩 조건 하에서 HIC 수지에 결합하지 않는다.
1.0 내지 2.0 m 내부 직경 칼럼을 약 680 내지 852 L의 부피에 해당하는 18 내지 22 cm 높이까지 페닐 세파로스 패스트 플로우 수지로 패킹한다. 칼럼을 패킹된 칼럼의 HETP 및 AS를 측정하여 사용에 대해 검정한다. HIC 칼럼의 자격 부여를 위해 0.02 내지 0.08 cm의 HETP 및 0.8 내지 1.2의 AS를 이용한다.
HIC 칼럼 작동은 상온에서 수행된다. QXL 칼럼 단계로부터의 용출액 풀을 평형화된 HIC 칼럼에 추가 처리 없이 로딩한다. 65.4 L/분의 최대 유속 및 13 psig 이하의 작동 압력에서 HIC 단계를 작동시킨다. HIC 칼럼에 적용되는 최대 CTLA4-Ig 단백질 로딩은 수지 1 리터 당 CTLA4-Ig 단백질 10.0 g이다. QXL 용출액 풀에 존재하는 CTLA4-Ig 단백질의 양을 기초로 HIC 단계의 다중 주기를 이용할 수 있다.
먼저, HIC 칼럼을 1 N 수산화나트륨 용액으로 위생 처리한다. 2 내지 4 CV의 1 N 수산화나트륨 용액이 칼럼을 통해 통과하는 경우 위생 처리가 완료된다. 이후, 칼럼을 60 내지 120분 동안 유지시켜, 위생 처리를 보장한다.
위생 처리 단계 이후, 칼럼을 75 mM HEPES, 2.55 M 염화나트륨, pH 7.0 완충액으로 평형화시킨다. 최소 3 CV의 평형 완충액이 칼럼을 통해 통과하며, 배출액의 pH가 7.0 ± 0.3이고, 전도도가 71.5 내지 75.5 mS/cm인 경우 평형화가 완료된다.
QXL 단계로부터의 용출액을 평형화된 HIC 칼럼에 적용한다. 이후, 배출액의 A280이 0.8 내지 1.0 AU로 감소할 때까지 칼럼을 체이스 (chase) 평형 완충액으로 세척한다. HIC 단계의 각 주기로부터의 CTLA4-Ig 단백질-함유 배출액을 0.2 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 통상의 스테인레스강 수집 용기로 여과한다. 이 HIC 생산 풀을 2 내지 8℃에서 수집 용기에서 유지시킨다. 수집 용기에서의 최대 유지 시간은 3일이다.
8 이상의 시알산 몰 대 CTLA4-Ig 단백질 몰의 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 이량체 생성물을 수집하며, CTLA4-Ig 고분자량 물질의 풀은 2.5％ 이하로 존재한다.
CTLA4-Ig 정제를 위한 재조합 단백질 A 친화성 크로마토그래피: 하향식 CTLA4-Ig 제조 방법에서 사용되는 재조합 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 친화성 수지 (rPA)를 지이 헬스케어 (위스콘신주 워키쇼 (이전 명칭 아머샴 바이오사이언시스))로부터 얻었다. rPA 칼럼 크로마토그래피 단계는 CTLA4-Ig 단백질을 추가로 정제한다. 이 단계는 DNA 및 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-I)을 비롯한 숙주 세포 단백질을 제거한다.
80 내지 140 cm 내부 직경 칼럼을 약 339 내지 372 L의 부피에 해당하는 18 내지 25 cm 높이까지 rPA 수지로 패킹한다. 패킹된 칼럼의 HETP 및 AS를 측정하여 칼럼을 사용에 대해 검정한다. 0.02 내지 0.08 cm HETP 및 0.8 내지 1.2 AS를 칼럼의 검정에 이용한다. 수지 수명 연구에서 수립된 rPA 수지에 대한 최대 사용 횟수는 60이다.
rPA 칼럼 작동은 상온에서 수행한다. 바이러스 불활성 생성물 풀을 평형화된 rPA 칼럼에 로딩한다. rPA 단계를 26.7 L/분의 최대 유속 및 13 psig 미만의 작동 압력에서 작동시킨다. rPA 칼럼에 적용되는 최대 CTLA4-Ig 단백질 로딩은 수지 1 리터 당 CTLA4-Ig 단백질 25 g이다.
rPA 칼럼을 25 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 평형화시킨다. 최소 3V의 평형 완충액이 칼럼을 통해 통과하며, 배출액의 pH 및 전도도 값이 각각 7.8 내지 8.2 및 23.0 내지 27.0 mS/cm인 경우 평형화가 완료되었다.
바이러스 불활성 단계 생성 풀을 평형화된 rPA 칼럼에 적용한다. rPA 크로마토그래피 단계에는 2개 세척 단계가 포함된다. 최소 5 CV의 25 mM Tris, 250 mM NaCl, 0.5％ 트리톤 X-100, pH 8.0 완충액을 사용하여 제1 세척 단계를 수행하여, 약하게 결합된 물질을 rPA 칼럼으로부터 제거한다. 25 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8.0 완충액을 사용하여 제2 세척 단계를 수행한다. 제2 세척 단계는 최소 5 CV를 사용하여, rPA 칼럼으로부터 잔류 트리톤 X-100을 제거한다.
CTLA4-Ig 단백질을 100 mM 글리신, pH 3.5 완충액으로 rPA 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출시킨다. A280이 기준선 위로 0.2 AU 초과하여 증가하는 경우 용출액을 수집 용기로 전환시켰다. 칼럼 배출액을 0.2 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 진탕기가 장착된 수집 용기로 여과한다. 용출액을 용출 피크의 후방 모서리의 A280이 0.02 AU 미만의 값으로 감소할 때까지 수집한다. 용출액 풀의 pH를 2 M HEPES, pH 8.0 완충액으로 pH 7.5 ± 0.2까지 조절한다. rPA 크로마토그래피 단계 생성물 풀을 2 내지 8℃에서 최대 3일 동안 방치시킨다.
8 이하의 시알산 몰 대 CTLA4-Ig 단백질 몰의 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 이량체 생성물을 수집하며; CTLA4-Ig 고분자량 물질의 풀이 2.5％ 이하로 존재하며, 38 ng/mL 이하의 MCP-1의 풀이 존재한다.
CTLA4-Ig 정제를 위한 QFF 음이온 교환 크로마토그래피: 하향식 CTLA4-Ig 생산 방법에서의 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 Q 세파로스 패스트 플로우 (QFF) 음이온 교환 크로마토그래피 수지 (지이 헬스케어 (위스콘신주 워키쇼 (이전 명칭 아머샴 바이오사이언시스))를 사용한다. QFF 크로마토그래피 단계의 목적은 잔류 단백질 A의 수준을 감소시키고, 바이러스 여과 단계 생성물 풀로부터 숙주 세포 DNA의 추가의 감소를 제공하기 위한 것이다. 또한, QFF 칼럼 단계를 사용하여 QFF 크로마토그래피 단계 생성물 풀의 시알산 대 CTL4-Ig 몰비를 제어하며, 공정의 CTLA4-Ig 물질 수준의 추가의 제어를 제공한다. CTLA4-Ig HMW 물질의 감소를 위한 주요 공정 제어 지점은 HIC 단계이다.
60 내지 140 cm 내부 직경 칼럼을 약 536 내지 667 L에 해당하는 28 내지 35 cm의 높이까지 QFF 수지로 패킹한다. 패킹된 칼럼의 HETP 및 AS의 측정에 의해 칼럼을 사용에 대해 검정한다. 0.02 내지 0.08 cm의 HETP 및 0.8 내지 1.2의 AS를 칼럼의 검정에 이용한다.
QFF 칼럼 작동은 상온에서 수행한다. 바이러스 여과 단계 생성물 풀을 평형화된 QFF 칼럼에 로딩한다. 38.7 L/분의 최대 유속 및 35 psig 미만의 작동 압력에서 QFF 단계를 작동시킨다. QFF 칼럼에 적용되는 최대 CTLA4-Ig 단백질 로딩은 수지 1 리터 당 CTLA4-Ig 단백질 25 g이다.
먼저, QFF 크로마토그래피 칼럼을 1 N 수산화나트륨 용액으로 위생 처리한다. 2 내지 4 CV의 1 N 수산화나트륨 용액을 사용하여 위생 처리를 수행한다. 칼럼 배출물의 전도도가 136 내지 202 mS/cm와 동일하며, 칼럼을 60 내지 120분 동안 방치시키는 경우 위생 처리가 완료된다.
위생 처리 단계 이후, 칼럼을 25 mM HEPES, 100 mM 염화나트륨, pH 8.0 완충액으로 평형화시킨다. 최소 4 CV의 평형 완충액이 칼럼을 통해 통과하며, 배출액의 pH가 7.7 내지 8.3이고, 전도도가 10.5 내지 12.9 mS/cm인 경우 평형화가 완료된다.
바이오프로세스 백에 함유된 바이러스 여과 단계 생성물 풀을 멸균 스테인레스강 수집 용기로 옮긴다.
바이러스 여과 단계 생성 풀을 평형화된 QFF 칼럼에 적용한다. QFF 크로마토그래피 단계에는 2개 세척 단계가 포함된다. 제1 세척 단계는 최소 5.0 CV의 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, pH 8.0 완충액을 사용하여 수행된다. 제2 세척 단계는 최소 5.0 CV의 25 mM HEPES, 130 mM NaCl, pH 8.0 완충액을 사용하여 수행된다.
CTLA4-Ig 이량체를 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, pH 8.0 완충액을 사용하여 QFF 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출시켰다. 배출액의 A280이 증가하기 시작하는 경우 용출액 수집을 개시하였다. 용출 동안, 칼럼 배출액을 0.2 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 스테인레스강 수집 용기로 여과한다. 용출 피크의 후방 모서리의 흡광도가 기준 위 0.2 AU 이하로 감소할 때까지 용출액을 수집한다. 이후, 수집 용기를 2 내지 8℃로 냉각시킨다. 2 내지 8℃에서의 QFF 크로마토그래피 단계 생성물 풀에 대한 최대 방치 시간은 3일이다.
8 이상의 시알산 몰 대 CTLA4-Ig 단백질 몰의 몰비를 갖는 CTLA4-Ig 이량체 생성물을 수집하며; CTLA4-Ig 고분자량 물질의 풀은 2.5％ 이하로 존재하고; CTLA4-Ig 저분자량 물질 (예를 들어, CTLA4-Ig 단량체)의 풀은 0.5％ 이하로 존재하며; 9.5 ng/mL 미만의 MCP-1의 풀이 존재한다.
폴 필트론 (Pall Filtron) TFF 시스템을 하향식 CTLA4-Ig 생산 방법의 농축 및 정용여과 단계에서 사용한다. 본 단계의 목적은 QFF 크로마토그래피 단계 생성물 풀을 45 내지 55 g/L로 농축시키며, QFF 크로마토그래피 단계에서 사용되는 용출 완충액을 CTLA4-Ig 조성물에 사용되는 최종 완충액으로 교환하는 것이다. 농축된 CTLA4-Ig 단백질 생성물 풀을 0.2 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터를 통해 50 L 바이오프로세스 백으로 옮긴다.
실시예 16: 아미노 모노사카라이드의 CTLA4-Ig-몰비 측정
본 실시예는 CTLA4-Ig 샘플에서 아미노 모노사카라이드 (N-아세틸 갈락토사민, N-아세틸 글루코사민) 대 단백질의 몰비를 얻기 위한 방법을 제공한다
기기: 모세관 전기영동 시스템 베크만 (Beckman) P/ACE MDQ CE 시스템; 검출기 베크만 레이저-유도-형광 (LIF) 검출 시스템 (P/ACE MDQ와 커플링됨); 비코팅 모세관 (i.d. 25 μm; o.d. 360 μm), 27-31 cm 총 길이, P/ACE MDQ 또는 5510 폴리마이크로 테크놀로지즈 (PolyMicro Technologies), Cat. No. TSP025375; Maxi-Mix 혼합기 써모일 (Thermolyne), (VWR 카탈로그 번호 58810-185) 중 하나가 설비됨.
시약:
가수분해 용액 (4 N HCl 수용액)
6 N HCl 160 mL 및 HPLC 등급수 80 ml을 250 mL 유리병에 첨가한다.
교반하여 잘 혼합한다.
2 내지 8℃에서 6개월까지 저장한다.
유도체화 용액 I (0.1 M APTS 수용액)
HPLC 등급수 192 μL을 유리 바이알에서 APTS 분말 10 mg에 첨가한다.
바이알을 5 내지 10초 볼텍싱하여 APTS를 완전히 용해시킨다.
-20℃에서 1년까지 저장한다.
유도체화 용액 II (1 M 아세트산 및 0.25 M NaBH 3 CN)
아세트산 20 μl을 0.4 mL 원심분리 튜브에서 HPLC 등급수 320 μL에 희석 (17배 희석)시켜, 1 M 아세트산 용액을 제조한다.
NaBH3CN 2.0 ± 0.5 mg를 극저온 바이알에 계량투입한다.
하기 식을 사용하여 적절한 부피의 1 M 아세트산 용액을 첨가하여, 0.25 M NaBH3CN을 제조한다. 부피 (μL) = 103×(NaBH3CN의 중량 (mg))/(62.84 g/mol×0.25 mol/L)
· 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaBH3CN)는 어두운 곳에서 데시케이터내에 저장하여야 한다. · 원본 시약 병의 반복된 개봉을 피하기 위해, 하기와 같이 저장용 시약을 일련의 2.0 mL 극저온바이알에 세분하는 것이 추천된다. · 니트륨 시아노보로하이드라이드 1.0 g ± 0.2 mg를 2.0 mL 극저온바이알에 계량투입한다. 원본 병으로부터 전체 함량의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 이러한 방식으로 분취한다. · 꽉 막고, 시약 이름, 로트 번호 및 6개월 만료 일자와 함께 순서대로 (1, 2, 3 등) 극저온바이알에 라벨을 붙인다. · 수분을 막기 위해 바이알을 파라필름으로 밀봉하여야 한다. · 나트륨 시아노보로하이드라이드를 유도체화 용액 II에 3회 이하로 동일한 극저온바이알로부터 계량 투입한다. 상기 및 극저온바이알 순서 번호를 실험실 조사표에 기록한다. · CE 프로파일에서 관찰되는 시약 피크 또는 불량한 라벨링 중 하나가 극저온바이알의 반복된 개방 이후 또는 특정 로트의 나트륨 시아노보로하이드라이드와 함께 나타날 수 있다. 상기 결과를 초래하는 경우, 사용되는 극저온바이알을 버리고, 다음 순서 번호의 극저온바이알 또는 새로운 로트의 나트륨 시아노보로하이드라이드로부터의 시약 중 하나를 계량투입한다.
재-아세틸화 완충액 (25 mM 중탄산나트륨, pH 9.5)
중탄산나트륨 0.210 ± 0.02 g를 깨끗한 100 mL 투명 유리 비커에 계량투입한다.
HPLC 등급수 90 ml을 첨가하고, 염이 완전히 용해될 때까지 교반 플레이트에서 혼합한다.
10 N NaOH로 pH를 9.5 ± 0.1로 조절한다.
HPLC 등급수를 첨가하여, 최종 부피 100 ml을 만든다. 용액을 여과하고 (단계 1.26), 실온에서 3개월까지 저장한다.
전개 완충액 (60 ± 5 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25)
나트륨 테트라보레이트 1.21 ± 0.02 g를 100 mL 투명 유리 비커에 계량투입한다.
HPLC 등급수 90 ml을 첨가하고, 교반 플레이트에서 염이 완전히 용해될 때까지 혼합한다.
10 N NaOH로 pH를 9.25 ± 0.10으로 조절한다.
HPLC 등급수를 첨가하여 60 ± 5 mM의 최종 농도에 대해 최종 부피 100 ml을 만든다.
55 mM 용액에 대하여, 1.11 g (± 0.02) 나트륨 테트라보레이트를 칭량하고, 용해 및 적정에 대해 상기 지시를 따른다.
65 mM 용액에 대하여, 1.31 g (± 0.02) 나트륨 테트라보레이트를 칭량하고, 용해 및 적정에 대해 상기 지시를 따른다.
실온에서 3개월까지 저장한다. 피크 분할을 수행하는 경우 (R 값 <1.0), 신선한 완충액을 제조한다.
선택 사항: 60 mM (± 5 mM)의 최종 농도를 위해 초순수 120 mL를 150 mM 나트륨 테트라보레이트 완충액 80 mL에 첨가하여 테트라보레이트 완충액 용액 (MicroSolv)을 희석시킨다. 10 N NaOH로 적정하여 용액의 pH를 9.25 (± 0.1)로 만든다.
55 mM 테트라보레이트 용액에 대하여, 150 mM 나트륨 테트라보레이트 완충액 66 ml을 초순수 114 mL로 희석시킨다. 상기와 같이 적정한다.
65 mM 테트라보레이트 용액에 대하여, 150 mM 나트륨 테트라보레이트 완충액 78 ml을 초순수 102 mL로 희석시킨다. 상기와 같이 적정한다.
용액을 실온에서 최대 3개월 동안 저장한다. 피크 분할을 수행하는 경우 (R 값 <1.0), 신선한 완충액을 제조한다.
모세관 세정 용액
N NaOH 용액
10 N NaOH 용액 1 ml을 HPLC 등급수 9 ml을 함유하는 15 mL 눈금 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 볼텍싱하여 잘 혼합한다.
용액을 실온에서 6개월까지 저장한다.
N HCl 용액:
6 N HCl 용액 1 ml을 HPLC 등급수 5 ml을 함유하는 15 mL 눈금 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 볼텍싱하여 잘 혼합한다.
용액을 실온에서 6개월까지 저장한다.
3.6.3 80％ 메탄올 용액:
HPLC 등급 메탄올 8 mL을 2 mL HPLC 등급수를 함유하는 15 mL 눈금 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 볼텍싱하여 잘 혼합한다.
용액을 실온에서 6개월까지 보관한다.
모노사카라이드 표준 원액
N-아세틸 글루코사민 (GalNAc)
GalNAc 5 ± 1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확하게 계량 투입한다.
HPLC 등급수 1 ml을 첨가하고, 용해될 때까지 볼텍싱하여 잘 혼합한다.
용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
N-아세틸 갈락토사민 (GlcNAc)
GlcNAc 5 ± 1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확하게 계량 투입한다.
HPLC 등급수 1 ml을 첨가하고, 용해될 때까지 볼텍싱하여 잘 혼합한다.
용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
N-아세틸 만노사민 (ManNAc)
ManNAc 5 ± 1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알로 정확하게 계량 투입한다.
HPLC 등급수 1 ml을 첨가하고, 용해될 때까지 볼텍싱하여 잘 혼합한다.
용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
모노사카라이드 표준 원액을 -20℃에서 1년까지 저장한다.
모노사카라이드 작업 용액 I: 내부 표준 작업 용액
HPLC 등급수 1980 μl을 이미 함유하는 2 mL 극저온 바이알에 ManNAc 원액 20 μl을 첨가하여, ManNAc 원액을 HPLC 등급수로 100배 희석시킨다. 대략 5 내지 10초 볼텍싱한다.
내부 표준 작업 용액을 2 내지 8℃에서 6개월까지 저장한다.
모노사카라이드 작업 용액 II: 아미노 혼합 표준 작업 용액
HPLC 등급수 1960 μl을 함유하는 2.0 mL 극저온 바이알에, GalNAc 및 GlcNAc의 원액을 각각 20 μL 첨가한다. 대략 5 내지 10초 볼텍싱한다.
아미노 혼합 표준 작업 용액을 2 내지 8℃에서 6개월까지 저장한다.
샘플 및 참고 물질 용액
동결된 단백질 샘플을 2 내지 8℃에서 해동시키고, 반전시켜 서서히 혼합한다.
샘플 및 참고 물질 모두를 HPLC 등급수로 약 1.0 mg/mL까지 희석시킨다. 3자리 유효 숫자로 농도를 기재한다.
CE 전개 조건
전개 완충액 (단계 2.5) 60 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25
모세관 카트리지 온도 25℃
전압 25-30 kV, (+) 모드
검출기 조건 LIF 검출기, 여기: 488 nm, 방출: 520 nm.
샘플 주입 압력 주입 모드, 0.5 PSI에서 20 s
전개 시간 10분
샘플 저장 10℃
절차
비고: 10 μL 피펫 및 마이크로팁을 사용하여 샘플 부피 10 μL를 옮기고, 적절한 크기의 피펫을 사용하여 다른 시약을 옮긴다 (단계 2.10 내지 2.14에서의 범위 참조).
가수분해
0.65 mL 원심분리 튜브에, ManNAc 작업 용액 10 μL 및 4 N 가수분해 용액 (단계 3.1) 200 μl을 첨가한다. 이는 시스템 블랭크 역할을 한다.
0.65 mL 원심분리 튜브에, ManNAc 작업 용액 10 μL 및 아미노 혼합 표준 용액 (단계 3.9) 10 μl을 첨가한다. 추가로 4 N 가수분해 용액 200 μl을 첨가한다. 이는 정량 및 시스템 적합성에 대한 모노사카라이드 표준의 역할을 한다. 2중으로 제조한다.
0.65 mL 원심분리 튜브에, ManNAc 작업 용액 10 μL 및 CTLA4-Ig 참고 물질 용액 (대략 1 mg/mL) 10 μL을 첨가한다.
추가로 4 N HCl 용액 200 μl을 첨가한다. 2중으로 제조한다.
0.65 mL 원심분리 튜브에서, ManNAc 작업 용액 10 μL 및 샘플 용액 (대략 1 mg/mL) 10 μL을 첨가한다. 추가로 4 N HCl 용액 200 μl을 첨가한다. 2중으로 제조한다.
샘플을 대략 10초 동안 볼텍싱하고, 대략 5 내지 10초 동안 원심분리한다. 샘플을 96-위치 바이알 대에 두고, 95℃에서 6시간 동안 오븐에서 인큐베이션한다.
가수분해 이후, 가수분해된 샘플을 -20℃에서 10분 동안 두어, 냉각시킨다.
임의의 응축물이 바닥에 집중될 때까지 가수분해된 샘플을 간단하게 원심분리한다 (고속으로 5-10초). 샘플을 스피드백 (SpeedVac)에서 증발 건조시킨다.
비고: 스피드백 가열을 끄고, 증발 속도를 "저"로 설정한다.
각 샘플을 HPLC 등급수 100 μL에 녹이고, 10 내지 15초 볼텍싱한다. 샘플을 스피드백에서 증발 건조시킨다.
비고: 스피드백 가열을 끄고, 증발 속도를 "저"로 설정한다.
재-아세틸화
각 샘플을 M6 재-아세틸화 완충액 10 μL로 녹이고, 5 내지 10초 볼텍싱하여, 잘 혼합한다. M3 재-아세틸화 시약 4 μl을 각 튜브에 첨가한다. 대략 5 내지 10초 동안 볼텍싱한다. 얼음에서 30분 동안 인큐베이션한다.
비고: 재-아세틸화 완충액 (M6) 및 시약 (M3)은 각각 사내에서 제조된 25 mM NaHCO3 (20 μL 첨가) 및 아세트산 무수물 (4 μL 첨가)로 대체될 수 있다.
샘플을 스피드백에서 증발 건조시킨다.
비고: 스피드백 가열을 끄고, 증발 속도를 "저"로 설정한다.
각 샘플을 HLPC 등급수 100 μL로 녹이고, 10 내지 15초 볼텍싱한다. 샘플을 스피드백에서 증발 건조시킨다.
비고: 스피드백 가열을 끄고, 증발 속도를 "저"로 설정한다.
유도체화
마이크로 원심분리기를 오븐에 두어 55℃의 오븐 온도로 평형화시킨다.
각 샘플을 유도체화 용액 I (0.1 M APTS 용액, 단계 3.2) 10 μL로 녹인다. 대략 5 내지 10초 볼텍싱한다.
유도체화 용액 II (1 M HAc 및 0.25 M NaBH3CN, 단계 3.3) 5 μl을 첨가한다. 대략 5 내지 10초 볼텍싱하고, 원심분리한다.
샘플 바이알을 미리 가온된 원심분리기에 재빨리 로딩하고, 원심분리기를 다시 55℃ 오븐에 둔다. 2000 rpm에서 원심분리하면서 3시간 동안 인큐베이션한다. 이는 바이알 표면에서의 용매의 응축을 막는다.
기기 준비
새로운 모세관을 설치하면서, 하기 단계를 사용하여 고압 모드 (80 PSI)에서 세정한다.
1 N NaOH, 20분
HPLC 등급수, 10분
60 mM 나트륨 테트라보레이트 완충액 10분
작동
기기 작동 이전에, 세척/세정 순서를 시행하여 모세관을 세정한다.
이후, 시스템 적합성 표준 (모노사카라이드 표준)을 시행하여, 시스템이 안정하도록 한다.
1 N NaOH 사용은 상이한 제조사로부터의 모세관의 내부를 에칭할 수 있으며, 전개 동안의 이동 시간에서의 이동의 원인이 될 수 있다. 최종 피크 (GlcNAc)의 이동 시간이 10.0분 초과되는 것을 유도하는 경우, 단계 2 세정에 대해 1 N NaOH를 0.1 N NaOH 또는 HPLC 등급수로 대체하는 것이 필요할 수 있다.
동등한 모세관을 사용하며, 상기 세척 절차가 충분하기 않은 경우, 최종 피크 (GlcNAc)가 10.0분의 예시적인 값 내에 있도록 80％ 메탄올 및/또는 1 N HCl을 사용하는 것이 필요할 수 있다.
주입용 제조
유도체화 이후, 샘플을 실온으로 냉각시킨다. 응축물이 튜브의 바닥으로 모일 때까지 대략 10초 실온에서 원심분리한다.
HPLC 등급수 85 μl을 각 튜브에 첨가하여, 각 샘플의 최종 부피가 100 μL가 된다. 5 내지 10초 볼텍싱한다.
각 튜브로부터의 샘플 10 μl을 CE 마이크로 바이알로 옮기고, HPLC 등급수 190 μl을 각 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 동안 볼텍싱한다.
세정 단계 및 주입 순서:
비고: 매 4회 주입 마다, CE 전개 완충액을 새롭게 제조된 CE 전개 완충액으로 교환한다 (이온 고갈 효과 때문). 40 psi에서 모세관 세정을 수행한다.
Figure 112011097388832-pat00089
Figure 112011097388832-pat00090
Figure 112011097388832-pat00091
Figure 112011097388832-pat00092
시스템 적합성
비고: 달리 명시되지 않는다면 먼저 시스템 적합성 표준의 주입을 사용하여 시스템 적합성 값을 측정한다.
제1 시스템 적합성의 전기영동도는 도 81에 나타낸 것과 유사하여야 하며, 여기서 피크 1은 GalNAc이고; 피크 2는 ManNAc이며; 피크 3은 GlcNAc이다.
비고: 베크만 PACE MDO 이외의 CE 기기가 사용되고 있는 경우, 모세관의 길이는 분리 모세관을 담지하는 카트리지의 여러 형태로 인해 본 방법에서 구체화된 것과 상이할 수 있다. 이는 분석물 이동 시간, 및 또한 피크 강도에서 변화를 유빌할 것이다.
2개 이웃 피크 사이의 분할을 하기 식에 따라 기기에 의해 제1 시스템 적합성 표준에 대해 계산할 수 있다.
Figure 112011097388832-pat00093
식 중,
R - 분할이고;
t2, t1 - 2개 이웃 피크 각각의 이동 시간이고;
W1, W2 - 2개 이웃 피크의 기준선에서의 각각의 피크 너비이다.
R 값은 1.0 이상이어야 한다. R이 1.0 미만인 경우, 모세관을 세척/세정 순서로 세정하며, 문제가 지속되는 경우, 오래된 완충액을 새롭게 제조된 전개 완충액으로 교체하거나 또는 모세관을 교체한다. 최종 시스템 적합성 주입에 대하여, 최종 피크 (GlcNAc)는 하기 식을 사용하여 1.4 미만의 테일링 계수를 가져야 한다.
T = W0.05/2f
식 중,
T - 테일링 계수이고;
W0.05 - 5％ 높이에서의 피크의 너비이고
f - 피크 최대에서의 피크 전방의 너비이다.
T가 1.4 이상인 경우, 모세관을 세척/세정 순서로 세정하며, 문제가 지속되는 경우, 오래된 완충액을 새롭게 제조된 전개 완충액으로 교체하거나 또는 모세관을 교체한다.
반복된 주입은 하기 예시적인 값을 나타낸다.
■ GlcNAc 대 MaNAc의 피크 면적 비: RSD ≤ 10％ (단계 7.1에서 계산됨)
■ GlcNAc의 이동 시간은 10.0분 이하이어야 한다.
■ 프로파일은 도 81과 동등하여야 하며, 여기서 3개 피크가 관찰되며, 내부 표준 (ManNAc)은 2번 피크이다.
임의의 상기 예시적 값이 샘플 시험 전에 도달하지 않는 경우, GlcNAc의 이동 시간이 10.0분 초과인 경우 먼저 전압을 증가시킨다. 이후, 피크 면적 비가 10％ 초과인 경우, pH를 확인하는 신선한 CE 완충액을 제조하거나 또는 모세관을 교체한다. 기기를 조절한 이후, 시스템 적합성 주입을 반복한다. 피크 프로파일의 분석시, ManNac의 피크 높이에서의 유의한 감소가 일어나는 경우, LIF 모듈 내의 광섬유 케이블이 잘못 연결되지 않았는지 확인하도록 조사한다.
내부 표준 및 모노사카라이드 표준 성분의 피크 면적 비를 비교하여 모노사카라이드 표준 RSD (％)를 측정한다. 각 모노사카라이드 성분에 대한 피크 면적을 각 모노사카라이드 표준 주입에 대한 내부 표준의 피크 면적으로 나눈다. 2개 브래킷 표준에 대한 GalNAc 및 GlcNAc에 대한 RSD (％)를 계산한다. RSD는 10％ 이하여야 한다. 이러한 평균화 예시적인 값이 만족시키지 않는 경우, 모세관을 세정하거나 상기와 같이 교체하여야 한다.
계산
내부 표준 (ManNAc)에 대한 GalNAc 및 GlcNAc의 피크 면적 비의 계산. 상기 예시적인 값을 만족시키도록 먼저 4개 시스템 적합성 표준의 반복된 주입에 대해 사용하고, 샘플 이전 및 이후 주입된 모든 브래킷 시스템 적합성 표준에 대해 동일한 계산을 수행한다.
피크 면적 비 = 각 모노사카라이드 성분 (GlcNAc, GalNAc)에 대한 피크 면적을 각각의 시스템 적합성 표준 주입에 대한 내부 표준 (ManNAc)의 피크 면적으로 나눈다.
Figure 112011097388832-pat00094
시스템 적합성 표준에서의 GlcNAc 및 GalNAc에 대한 피크 면적 비의 평균을 계산한다. 또한, 표준 편차 (S.D.) 및 상대 표준 편차 (％) (％RSD)를 계산한다.
예시적인 값: GlcNAc의 피크 면적 비에 대한 RSD ≤ 10％
샘플 이전 및 이후에 주입된 2개 브래킷 시스템 적합성 표준: GlcNAc 및 GalNAc의 피크 면적 비에 대한 RSD ≤ 10％. 이러한 예시적인 값의 평균화를 만족시키지 않는 경우 (RSD > 10％), 모세관을 세정 절차로 재-세정하는 것이 필요하며, 상기 샘플 및 브래킷 모노사카라이드 표준을 다시 전개하는 것이 필요하다. 예시적인 값의 평균화를 여전히 만족시키지 않는 경우, 모세관을 교환하고 세정한다. 샘플 및 브래킷 모노사카라이드 표준을 다시 전개한다.
Figure 112011097388832-pat00095
식 중,
n - 샘플에서의 측정값의 수이고;
x - 각각의 측정값이다.
Figure 112011097388832-pat00096
GalNAc/단백질의 몰비의 계산
Figure 112011097388832-pat00097
식 중,
RGalNAc = GalNAc 대 단백질의 몰비이고;
AGalNAc = 샘플에서의 GalNAc의 피크 면적 (μV·sec)이고;
AManNAc = 샘플에서의 ManNAc의 피크 면적 (μV·sec)이고;
AManNAc0 = 모노사카라이드 표준에서의 ManNAc의 피크 면적 (μV·sec) 평균이고;
AGalNAc0 = 모노사카라이드 표준에서의 GalNAc의 피크 면적 (μV·sec) 평균이고;
VGalNAc0 = 가수분해 동안 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유된 GalNAc의 부피 (μL)이고;
CGalNAc0 = 가수분해 동안 사용되는 단량체 작업 용액에 함유된 GalNAc의 농도 (mg/mL)이고;
Vp = 가수분해 동안 사용된 단백질 샘플의 부피 (μL)이고;
Cp = 가수분해 동안 사용된 단백질 샘플의 농도 (mg/mL)이고;
MW아바타셉트 = 분석 증명서 (COA)에서와 같은 아바타셉트 참고 물질의 분자량이고;
MWGlcNAc = GalNAc의 분자량 (221.2 돌턴)이다.
표준 브래킷
CTLA4-Ig 물질 및 샘플의 몰비를 계산하는 경우, 모두 8개의 브래킷 시스템 적합성 표준을 사용한다. 이 방정식에서의 포함물에 대한 피크 면적을 평균한다. 이는 먼저 3개 샘플에 대해 사용된다. 모든 다른 샘플에 대해, 몰비 계산을 위해 이후의 4개 브래킷 모노사카라이드 표준 및 이전의 4개의 브래킷 모노사카라이드 표준의 평균 피크 면적을 항상 사용한다.
GlcNAc/단백질의 몰비의 계산
Figure 112011097388832-pat00098
식 중,
RGlcNAc = GlcNAc 대 단백질의 몰비이고;
AGlcNAc = 샘플에서의 GlcNAc의 피크 면적 (μV·sec)이고;
AManNAc = 샘플에서의 ManNAc의 피크 면적 (μV·sec)이고;
AManNAc0 = 모노사카라이드 표준에서의 ManNAc의 피크 면적 (μV·sec) 평균이고;
AGlcNAc0 = 모노사카라이드 표준에서의 GlcNAc의 피크 면적 (μV·sec) 평균이고;
VGlcNAc0 = 가수분해 동안 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유된 GlcNAc의 부피 (μL)이고;
CGlcNAc0 = 가수분해 동안 사용되는 단량체 작업 용액에 함유된 GlcNAc의 농도 (mg/mL)이고;
Vp = 가수분해 동안 사용된 단백질 샘플의 부피 (μL)이고;
Cp = 가수분해 동안 사용된 단백질 샘플의 농도 (mg/mL)이고;
MWCTLA4-Ig = CTLA4-Ig 참고 물질의 분자량이고;
MWGlcNAc = GlcNAc의 분자량 (221.2 돌턴)이다.
예시적인 값. 2개 브래킷, 아미노 시스템 적합성 피크 면적 비 RSD (％)는 10％를 초과해서는 않된다. 참고 물질에서의 아미노 모노사카라이드에 대한 평균 몰비는 바로 하기 표에서 구체화된 범위 내에 있어야 한다. 각각의 성분에 대하여, 4개 결과에 대한 ％RSD는 25％ 이하여야 한다.
표 - CTLA4-Ig 참고 물질의 몰비 범위
Figure 112011097388832-pat00099
실시예 17: 모세관 전기영동 (CE)에 의한 아미노모노사카라이드 (GalNAc 및 GlcNAc)의 몰비의 측정
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 조성물은 단백질 1 몰 당 약 15 내지 35 몰의 GlcNAc 및 단백질 1 몰 당 약 1.7 내지 3.6 몰의 GalNac를 갖는 특성을 갖는다. 하기 실시예는 이러한 몰비를 측정하는 방법을 기재한다.
시약: 가수분해 시약 (4 N HCl); 유도체화 용액 I (0.1 M 8-아미노-1,3,6, 트리술폰산, 트리나트륨 염 (APTS) 수용액); 유도체화 용액 II (1 M 아세트산 중 0.25 M NaBH3CN); 재-아세틸화 완충액 (25 mM 중탄산나트륨, pH 9.5); 전개 완충액 (60 ± 5 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 세정 용액 (1 N NaOH; 1 N HCl; 80％ 메탄올); 5 mg/ml의 농도에서의 GalNAc, GlcNAc 및 ManNAc의 모노사카라이드 표준 원액; 모노사카라이드 작업 용액 I: 내부 표준 작업 용액은 ManNAc 원액의 100배 희석액임; 모노사카라이드 작업 용액 II: GalNAc 및 GlcNAc 원액의 100배 희석액인 아미노 혼합 표준 작업 용액.
기기: CE 시스템은 베크만 P/ACE MDQ CE 시스템임; 검출기: P/ACE MDQ)와 커플링된 베크만 레이저 유도 (LIF) 검출 시스템; 비코팅 모세관 (i.d. 25μm, o.d. 360μm) 27-31 cm 총 길이, P/ACE MDQ가 설비됨.
모세관 전기영동 전개 조건: 전개 완충액 (60 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 카트리지 온도: 25℃; 전압: 25-30 kV, (+) 모드; 검출기 조건: LIF 검출기, 488 nm에서 여기, 520 nm에서 방출; 샘플 주입: 가압 주입 모드, 0.5 PSI에서 20 s; 전개 시간: 10분; 샘플 저장: 10℃.
가수분해: ManNAc 작업 용액 10 μL 및 4 N HCl 200μl을 혼합하여 시스템 블랭크를 제조하였다. ManNAc 작업 용액 10 μL 및 아미노 혼합 표준 용액 10 μl을 4 N HCl 200μL와 혼합하여 모노사카라이드 표준을 제조하였다. ManNAc 작업 용액 10 μL 및 CTLA4-Ig 이량체 (대략 1 mg/ml) 10 μl을 4 N HCl 200μL와 혼합하여 시험 샘플을 제조하였다. 모든 튜브를 10초 동안 볼텍싱하고, 10초 동안 원심분리시키고, 이어서 95℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 가수분해 단계 이후, 샘플을 -20℃에서 10분 동안 두어 냉각시킨다. 샘플을 10초 동안 아래로 회전시키고, 스피드백에서 증발 건조시켰다.
재-아세틸화: 가수분해 및 건조된 샘플을 HPLC 등급수 100 μL로 녹였다. M6 재-N-아세틸화 완충액 (Glyko) 10 μL 및 M3 재-아세틸화 시약 (Glyko) 4μl을 첨가하고, 이어서 혼합 및 얼음에서의 인큐베이션 (30분)에 의해, 녹여진 샘플을 재아세틸화하였다. 샘플을 10초 동안 아래로 회전시키고, 스피드백에서 증발 건조시켰다.
유도체화: 녹여진 샘플 (HPLC 등급수 100 μL)을 55℃로 평형화시키고, 이어서 유도체화 용액 I 10 μl을 첨가하고, 간단히 혼합하고, 유도체화 용액 II 5 μl을 첨가하였다. 샘플을 미리 가온된 원심분리기에 로딩하고, 2000 rpm에서 원심분리하면서 55℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다.
CE 주입: 유도체화 이후 샘플의 최종 부피가 HPLC 등급수의 첨가에 의해 100 μL가 되었으며, 샘플 10 μl을 HPLC 등급수 190μL과 함께 CE 마이크로 바이알로 옮겼다. 샘플 주입 이전에, CE 카트리지를 HPLC 등급수로 철처하게 세정하고 (1-3분 전개 시간), 이어서 세정액을 세정 완충액으로 평형화시켰다 (5분 전개 시간). 초기 세정에 이어서, 분석용 모노사카라이드 표준 및 샘플을 CE 카트리지에 주입하였다 (10분 전개 시간). 각 표준 또는 시험 샘플의 주입 전개에 따라서, CE 카트리지를 세정하고, HPLC 등급수 및 전개 완충액으로 평형화시켰다. 시스템 적합성의 전기영동도는 도 30과 유사하여야 한다.
계산: 내부 표준 ManNAc에 대한 GalNAc 및 GLCNAc의 피크 면적 비를 계산한다.
피크 면적 비 = 모노사카라이드 피크 면적 (GalNAc 또는 GlcNAc)/ManNAc 피크 면적
식 중, 피크 면적 비에 대한 상대 표준 편차 (RSD)는 10％ 이하이다.
모노사카라이드 (예를 들어, GalNAc) 대 CTLA4-Ig 단백질의 비의 계산:
Figure 112011097388832-pat00100
식 중,
RatioGalNAc = GalNAc 대 단백질의 몰비이고;
AGalNAc = GalNAc 샘플에서의 피크 면적 (μV·sec)이고;
AManNAc = ManNAc 샘플에서의 피크 면적 (μV·sec)이고;
AManNAc0 = 모노사카라이드 표준에서의 ManNAc의 피크 면적 (μV·sec) 평균이고;
AGalNAc0 = 모노사카라이드 표준에서의 GalNAc의 피크 면적 (μV·sec) 평균이고;
VGalNAc0 = 가수분해 동안 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유된 GalNAc의 부피 (μL)이고;
CGalNAc0 = 가수분해 동안 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유된 GalNAc의 농도 (mg/mL)이고;
Vp = 가수분해 동안 사용되는 단백질 샘플의 부피 (μL)이고;
Cp = 가수분해 동안 사용되는 단백질 샘플의 농도 (mg/ml)이고;
MWCTLA4-Ig = CTLA4-Ig 이량체의 분자량이고;
MWGalNAc = 221.2 돌턴이다.
Figure 112011097388832-pat00101
실시예 18: 모세관 전기영동 (CE)에 의한 천연 모노사카라이드 (만노스, 푸 코스 및 갈락토스)의 몰비의 측정
시약: 가수분해 용액 (2 M 트리플루오로아세트산 (TFA)); 유도체화 용액 I (0.1 M 8-아미노-1,3,6, 트리술폰산, 트리나트륨 염 (APTS) 수용액); 유도체화 용액 II (1 M 아세트산 중 0.25 M NaBH3CN); 전개 완충액 (60 ± 5 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 세정 용액 (1 N NaOH; 1 N HCl; 80％ 메탄올); 5 mg/ml의 만노스 (Man), 푸코스 (Fuc), 갈락토스 (Gal) 및 크실로스 (Xyl)의 모노사카라이드 표준 원액; 모노사카라이드 작업 용액 I: 내부 표준 작업 용액은 Xyl 원액의 100배 희석액임; 모노사카라이드 작업 용액 II: 중성 혼합 표준 작업 용액, Man, Fuc 및 Gal 원액의 100배 희석액.
기기: CE 시스템은 베크만 P/ACE MDQ CE 시스템임; 검출기: P/ACE MDQ)와 커플링된 베크만 레이저 유도 (LIF) 검출기 시스템; 비코팅된 모세관 (i.d. 25μm, o.d. 360μm) 27-31 cm 총 길이, P/ACE MDQ가 설비됨.
모세관 전기영동 전개 조건: 전개 완충액 (60 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 카트리지 온도: 25℃; 전압: 25-30 kV, (+) 모드; 검출기 조건: LIF 검출기, 488 nm에서 여기, 520 nm에서의 방출; 샘플 주입: 가압 주입 모드, 0.5 PSI에서 20 s; 전개 시간: 10분; 샘플 저장: 10℃.
가수분해: 크실로스 작업 용액 10 μL 및 2 M TFA 200 μl을 혼합하여 시스템 블랭크를 제조하였다. 크실로스 작업 용액 10 μL 및 중화 혼합 표준 용액 10 μl을 2 M TFA 200 μL와 함께 혼합하여 모노사카라이드 표준을 제조하였다. 크실로스 작업 용액 10 μL 및 CTLA4-Ig 이량체 (대략 1 g/ml) 10 μl을 2 M TFA 200 μL와 함께 혼합하여 시험 샘플을 제조하였다. 모든 튜브를 10초 동안 볼텍싱하고, 10초 동안 원심분리하고, 이어서 95℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 가수분해 단계 이후, 샘플을 -20℃에서 10분 동안 두어 냉각시켰다. 샘플을 10초 동안 아래로 회전시키고, 스피드백에서 증발 건조시켰다.
유도체화: 샘플을 HPLC 등급수 100 μL로 녹이고, 55℃로 평형화시키고, 이어서 유도체화 용액 I 10 μl을 첨가하고, 간단히 혼합하고, 유도체화 용액 II 5 μl을 첨가하였다. 샘플을 미리 가온된 원심분리기에 로딩하고, 2000 rpm에서 원심분리하면서 55℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다.
CE 주입: 유도체화 이후 샘플의 최종 부피가 HPLC 등급수의 첨가에 의해 100 μL가 되었으며, 샘플 10 μl을 HPLC 등급수 190 μL과 함께 CE 마이크로 바이알로 옮겼다. 샘플 주입 이전에, CE 카트리지를 HPLC 등급수로 철처하게 세정하고 (1-3분 전개 시간), 이어서 세정액을 세정 완충액으로 평형화시켰다 (5분 전개 시간). 초기 세정에 이어서, 분석용 모노사카라이드 표준 및 샘플을 CE 카트리지에 주입하였다 (15분 전개 시간). 각각의 표준 또는 시험 샘플의 주입 전개에 이어서, CE 카트리지를 세정하고, HPLC 등급수 및 전개 완충액으로 평형화시켰다. 시스템 적합성의 전기영동도는 도 31과 유사하여야 한다.
계산: 내부 표준 크실로스에 대한 Man, Gal 및 Fuc의 피크 면적 비의 계산.
피크 면적 비 = 모노사카라이드 피크 면적 (Gal, Fuc 또는 Man)/크실로스 피크 면적
여기서, 피크 면적 비에 대한 상대 표준 편차 (RSD)는 10％ 이하이다.
모노사카라이드 (예를 들어, Man) 대 CTLA4-Ig 단백질의 비의 계산
Figure 112011097388832-pat00102
식 중,
RatioMan = Man 대 단백질의 몰비이고;
AMan = 샘플에서의 Man에서의 피크 면적 (μV.sec)이고;
AXyl = 샘플에서의 Xyl에서의 피크 면적 (μV.sec)이고;
AXyl0 = 모노사카라이드 표준에서의 Xyl의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고;
AManO = 모노사카라이드 표준에서의 Man의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고;
VManO = 가수분해 동안 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유된 만노스의 부피 (μL)이고;
CManO = 가수분해 동안 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유된 만노스의 농도 (mg/ml)이고;
Vp = 가수분해 동안 사용되는 단백질 샘플의 부피 (μL)이고;
Cp = 가수분해 동안 사용되는 단백질 샘플의 농도 (mg/ml)이고;
MWCTLA4-Ig = CTLA4-Ig 이량체의 분자량이고;
MWMan = 180.2 돌턴이다.
Figure 112011097388832-pat00103
실시예 19: CTLA4 A29YL104E -Ig의 제조
CTLA4A29YL104E-Ig 는 유전자 변형된 융합 단백질이며, 이는 변형된 인간 CTLA-4의 기능적 결합 도메인 및 IgG1 계열의 인간 면역글로불린의 Fc 도메인으로 이루어진다. 2개 아미노산 치환이 CTLA-4 도메인의 B7 결합 영역 (L104E 및 A29Y)에서 이루어져, 상기 분자를 생성한다. 각각 357개 아미노산의 2개 글리코실화된 폴리펩티드 쇄가 포함된다. 이는 쇄간 디술피드 결합을 통해 연결된 공유 이량체로서 존재한다. CTLA4A29YL104E-Ig는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분광에 의해 측정된 것과 같이 대략 91,800 Da의 평균 질량을 갖는다.
CTLA4A29YL104E-Ig는 CTLA4-Ig의 변형된 형태이다. 변형은 2개 아미노산 치환체 (L104E 및 A29Y)를 유도하는 점 돌연변이로 구성된다. CTLA4-Ig에 비해, CTLA4A29YL104E-Ig는 약 2배 증가된 결합활성으로 CD80 (B7-1)에 결합하며, 약 4배 증가된 결합활성으로 CD86 (B7-2)에 결합한다. CTLA4A29YL104E-Ig는 T 세포 증식, 사이토킨 생성, 및 자연 살해 세포에 의한 표적 T 세포의 CD28 의존성 사멸의 억제에서 아바타셉트에 비해 대략 10배 더 효과적이다. CTLA4A29YL104E-Ig는 B7-1 매개된 T 세포 증식의 완만한 억제를 유도하지만, B7-2 매개된 T 세포 증식 차단에서 보다 현저하게 강력하다. 본 실시에는 서열 4를 포함하는 CTLA4A29YL104E-Ig 분자의 생산을 기재한다. 본 실시예에서 기재된 방법을 분비된 단백질, 예컨대 사이토킨 및 다른 호르몬, Ig 슈퍼페닐리의 구성원이거나 또는 Ig 슈퍼패밀리 단백질의 일부를 포함하는 분비된 단백질, 및 CHO 세포에서 발현된 일반적으로 임의의 단백질을 비제한적으로 비롯한 다른 재조합 단백질의 생성에 적용 및 확장할 수 있다.
CTLA4A29YL104E-Ig 배양 단계에 대한 방법 흐름도를 도 24에 나타낸다. CTLA4A29YL104E-Ig를 5000 L 생산 생물반응기에서 대략 4000 L의 작업 부피로 생산한다. 약물 재료의 한 배치를 세포 은행으로부터의 단일 바이알로부터 유래된 단일 생산 생물반응기로부터 생성한다. 생산 방법은 접종물 확장, 생산 세포 배양 및 하향식 정제로 이루어진 3단계를 포함한다. 무-동물 성분 배지를 사용하여 접종물 확장 단계를 수행한다. 또한, D-갈락토스의 사용을 제외하고는 무-동물 성분 배지에서 생성 세포 배양 단계를 수행한다.
세포 배양 배지. 모든 배지를 적절한 크기의 깨끗한 배지 용기에서 제조하고, 여과에 의해 멸균시켰다. 접종물 확장 동안 이용되는 배지의 조성을 하기 표에서 제시한다.
접종물 세포 성장 기초 배지 성분 농도
Figure 112011097388832-pat00104
접종물 세포 성장 기초 배지
Figure 112011097388832-pat00105
시드 및 생산 생물반응기 세포 성장 기초 배지
Figure 112011097388832-pat00106
생산 생물반응기 공급 배지
Figure 112011097388832-pat00107
접종물 확장
세포 은행으로부터의 동결된 바이알을 제어된 온도에서 해동시키고, 원심분리하여 동결방지제 매질을 제거한다. 세포를 접종물 배지에 재현탁시키고, T-플라스크에서 회수하였다. 80％의 해동 이후 최소 세포 생존도가 예시적인 값이다. 온도 및 이산화탄소를 T-플라스크 인큐베이션 단계 동안 제어한다. 1.0×107개 세포의 생존 세포 수를 얻을 때까지 T-플라스크를 인큐베이션하고, 내용물을 진탕 플라스크로 옮긴다. 일련의 진탕 플라스크를 통해 배양물을 확장시켜, 원하는 접종물 부피를 달성한다. 진탕 플라스크 계대배양에 대한 시딩 밀도 범위는 1.0 내지 3.0×105 세포/mL이다. 진탕 플라스크 인큐베이션 단계 동안 온도, 이산화탄소 및 진탕기 속도를 제어한다. 1.5 내지 3.0×105 세포/mL의 생존 세포 밀도 범위에 이를 때까지 진탕 플라스크 배양물을 멸균 접종물 이동 용기로 풀링한다. 최종 진탕 플라스크 접종물 확장 단계로부터의 대략 20 리터를 140 L 시드 생물반응기로 옮겨 0.2 내지 1.0×106 생존 세포/mL의 초기 세포 밀도 범위를 달성한다.
시드 생물반응기 작동
대략 90 리터의 작업 부피를 갖는 140 L 시드 생물반응기를 배치 모드로 작동시킨다. 140 L 시드 생물반응기에서의 온도, pH, 압력 및 용해된 산소 농도를 분산 제어 시스템 (DCS)을 사용하여 모니터링 및 제어한다. 140 L 시드 생물반응기로부터 샘플을 매일 얻어, 세포 성장을 모니터링한다. 140 L 생물반응기의 시딩 밀도 범위는 0.2 내지 1.0×106 생존 세포/mL이다. 1.5×106 세포/mL 이상의 생존 세포 밀도가 달성되는 경우, 140 L 시드 생물반응기 배양물을 사용하여 1100 L 시드 생물반응기에 접종한다. 140 L 시드 생물반응기 단계의 지속 시간은 대략 3일이다. 1100 L 시드 생물반응기에서의 초기 표적 생존 세포 밀도는 0.4 내지 1.5×106 생존 세포/mL이다.
1100 L 시드 생물반응기는 260 리터의 초기 배양 용량을 함유한다. 1100 L 시드 생물반응기를 배치 모드에서 작동시킨다. 1100 L 시드 생물반응기에서의 온도, pH, 압력 및 용해된 산소 농도를 DCS를 사용하여 모니터링 및 제어한다. 생존 세포 밀도가 1.5×106 세포/mL 이상에 이르는 경우 배양물의 부피를 기초 배지로 900 리터까지 증가시킨다. 1100 L 시드 생물반응기로부터 매일 샘플을 얻어 세포 성장을 모니터링한다. 생존 세포 밀도가 2.0×106 세포/mL 이상에 이르는 경우 1100 L 시드 생물반응기 배양물을 사용하여 5000 L 생산 생물반응기에 접종한다. 1100 L 시드 생물반응기 단계의 지속 시간은 대략 4일이다. 5000 L 생산 생물반응기에서의 초기 표적 생존 세포 밀도는 0.4 내지 1.5×106 생존 세포/mL이다.
생산 생물반응기 작동
5000 L 생산 생물반응기는 3000 리터의 초기 배양 용량을 함유한다. DSC를 사용하여 모니터링 및 제어된 온도, pH, 압력 및 용해된 산소 농도로 5000 L 생산 생물반응기를 영양공급-뱃치식으로 작동시켰다. 덱스트란 술페이트의 볼루스를 배양에 대략 72시간에서 첨가한다. 생산 생물반응기의 작동 동안, 배양 온도 설정치는 144 ± 8시간에서 37℃에서 34℃로 이동한다. 온도 이동 및 덱스트란 술페이트 첨가를 수행하여, 5000 L 생산 생물반응기 단계에서 높은 세포 생존도의 지속 시간을 연장시킨다. 생물반응기로부터 샘플을 얻어, 세포 성장 및 생존도, 글루코스, 락테이트 및 암모니아 농도를 모니터링한다. 또한, 샘플을 CTLA4A29YL104E-Ig 농도, 및 시알산 대 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 몰비에 대해 시험한다. 공급 배지를 생물반응기에 첨가하여, 원하는 글루코스 농도를 유지시킨다. 생산 생물반응기에 대한 1차 수거 기준은 시알산 대 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 몰비이다. 6 이상의 표적 시알산 대 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 몰비에서 생산 생물반응기를 수거한다. 5000 L 생산 생물반응기 단계의 지속 시간은 대략 14일이다. 5000 L 생산 생물반응기의 수거 부피는 대략 4000 리터이다.
세포 제거 및 생산 농도
0.65 μm 막을 사용하는 접선류 마이크로여과에 의해 배양 배양액으로부터 세포를 제거한다. 마이크로여과 투과액을 30 kDa 명목 분획 분자량 (NMWCO) 막을 사용하여 접선류 한외여과에 의해 농축시킨다. 막횡단 압력 및 유속을 마이크로여과 및 한외여과 단계 동안 제어한다. 이후, 0.2 μm 단일-사용 필터를 통한 최종 여과와 함께 농축물을 일련의 막 필터를 통해 통과시킨다. 0.5 M Tris 용액의 첨가에 의해 농축물의 pH를 8.0으로 조절한다. 마이크로여과 및 한외여과 필터는 다중-사용된다. 마이크로여과 필터를 차아염소산나트륨 및 트리톤 X-100으로 세척하고, 인산에서 저장한다. 한외여과 필터를 차아염소산나트륨 및 수산화나트륨으로 세척하고, 수산화나트륨에서 저장한다.
실시예 20: 재조합 CTLA4 A29YL104E -Ig의 정제
실시예 20-A : CTLA4A29YL104E-Ig의 정제 방법의 예를 하기 흐름도에서 나타내며, 정제 방법의 기재를 본 실시예에 의해 제공한다.
Figure 112011097388832-pat00108
바이러스 불활성화
정화된 농축된 수거 물질의 pH를 0.5 M Tris 용액의 첨가에 의해 8.0으로 조절한다. 20％ 트리톤 X-100를 최종 농도 0.5％ (v/v)로 첨가하여 잠재적 불특정 바이러스성 작용제를 불활성화시킨다. 트리톤 X-100-처리된 단백질 용액을 2시간 이상 동안 혼합한다.
친화성 크로마토그래피
맙셀렉트 (MabSelect) 단백질 A 수지의 칼럼 (지이 헬스케어, 이전 명칭 아머샴 바이오사이언시스)을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 바이러스 불활성 단계로부터의 공정 물질로부터 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질을 포획하며, 주요 불순물로부터 벨라타셉트 단백질을 분리한다.
맙셀렉트 단백질 A 칼럼을 25 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 완충액으로 평형화시킨다. 친화성 수지의 동적 결합 용량은 350 cm/시간의 선속도에서 수지 1 리터 당 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 25 g이다. 157 L 칼럼 백은 대략 3.9 kg의 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질에 결합할 수 있다.
트리톤 X-100-처리된 공정 물질을 맙셀렉트 단백질 A 칼럼에 적용하며, 상기 칼럼을 최소 3 칼럼 부피 (CV)의 평형 완충액으로 세척하여, 약하게 보유된 불순물을 제거한다. 이들 불순물에는 사이토킨 단핵구 화학주성 단백질-1 (MCP-1) 및 트리톤 X-100이 포함된다. 이후, CTLA4A29YL104E-Ig 단백질을 250 mM 글리신, pH 3.0 완충액으로 칼럼으로부터 용출시킨다. CTLA4A29YL104E-Ig 단백질은 대략 2 내지 3 CV의 용출 완충액 중에서의 좁은 피크로서 용출하며, pH를 급격하게 증가시키기 위해 2 M HEPES, pH 7.5 완충액을 함유하는 탱크로 수집하며, 이에 의해 벨라타셉트 고분자량 (HMW) 종의 형성을 최소화시킨다.
음이온 교환 크로마토그래피
Q-세파로스 패스트 플로우 (QFF) 수지 (지이 헬스케어)를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피를 1차적으로 사용하여 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질의 보다 고도로 시알화된 종의 양을 농축시킨다. 맙셀렉트 단백질 A 칼럼으로부터의 pH 조절된 벨라타셉트 생성물 풀을 주사용수 (WFI)로 대략 2배 희석시키고, 이후 QFF 칼럼에 적용한다.
QFF 칼럼을 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 평형화시킨다. pH 및 전도도 조절된 맙셀렉트 단백질 A 단계 생성물 풀을 QFF 칼럼에 적용하며, 상기 칼럼을 최소 3 CV의 평형 완충액으로 세척하여, 약하게 결합된 불순물을 제거한다. 이후, 칼럼을 50 mM HEPES, 140 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 세척하여, 낮은 시알산 함량을 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 종을 제거한다. 후속적으로, CTLA4A29YL104E-Ig의 보다 고도로 시알화된 종을 5 CV 이하의 50 mM HEPES, 200 mM NaCl, pH 7.0 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출시킨다.
소수성 상호작용 크로마토그래피
토요페릴 페닐 650 M 수지 (토소 바이오사이언스)를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 1차적으로 사용하여 QFF 크로마토그래피 단계로부터의 생성물 풀에서의 CTLA4A29YL104E-Ig HMW 종의 양을 감소시킨다. HIC 칼럼에 적용하기 이전에, 50 mM HEPES5 pH 7.0 완충액 및 50 mM HEPES, 3.6 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액을 사용하여 QFF 크로마토그래피 단계 생성 풀을 희석시켜, 대략 135 mS/cm의 전도도 및 QFF 생성물 풀 중에서의 1 g/L 이하의 CTLA4A29YL104E-Ig 농도를 달성한다.
HIC 칼럼을 50 mM HEPES, 1.2 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액으로 평형화시킨다. 농도 및 전도도 조절된 CTLA4A29YL104E-Ig QFF 크로마토그래피 단계 생성 풀을 칼럼에 적용시킨다. 이후, 칼럼을 50 mM HEPES, 1.2 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액으로 세척하여, 약하게 결합된 불순물을 제거한다. 50 mM HEPES, 0.55 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액을 사용하여 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질을 HIC 칼럼으로부터 용출시킨다.
바이러스 여과
HIC 단계로부터의 CTLA4A29YL104E-Ig 생성물 풀의 농축 및 정용여과는 한외여과 (UF)에 의해 달성된다. UF 단계는 30-kDa NMWCO 막 및 25 mM NaH2PO4, 10 mM NaCl, pH 7.5 완충액을 이용한다. UF 단계에 이어서, 15-nm 플라노바 (Planova) 막 (아사이 가세이 (Asahi Kasei))을 사용하여 바이러스 여과 단계를 실시한다. 이후, CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 생성 풀을 30 kDa NMWCO 막을 사용하여 UF에 의해 25 g/L의 단백질 농도로 조절한다.
칼럼 위생 처리 및 저장
맙셀렉트 단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 0.1 N NaOH 용액을 사용하여 위생 처리하고, 25 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 완충액으로 세척하여 pH를 낮추고, 이후 20％ 에탄올에서 2 내지 8℃에서 저장한다. QFF 크로마토그래피 칼럼을 1 N NaOH 용액으로 위생 처리하고, 실온에서 0.1 N NaOH 용액 중에서 저장한다. HIC 칼럼을 0.1 N NaOH 용액으로 위생 처리하고, 20％ 에탄올로 세척하고, 실온에서 20％ 에탄올 중에서 저장한다.
실시예 20-B: 그러한 정제 방법의 추가적 예는 하기와 같다:
바이러스 불활성화
정화시킨 농축된 수거 물질의 pH를 0.5 M Tris 용액을 첨가하여 8.0으로 조정하였다. 잠재적 우발성 바이러스제는 20％ 트리톤 X-100을 최종 농도 0.5％ (v/v)로 첨가하여 불활성화시켰다. 트리톤 X-100-처리된 단백질 용액을 2시간 이상 혼합하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig 정제를 위한 단백질 A 친화성 크로마토그래피: 맙셀렉트(MabSelect) 단백질 A 수지 칼럼 (GE 헬스케어(GE Healthcare), 이전에는 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)로도 공지됨)을 사용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 바이러스 불활성화 단계에서 공정내 물질로부터 CTLA4A29YL104E-Ig를 포착하고, 대부분의 불순물로부터 CTLA4A29YL104E-Ig를 분리하였다.
140 cm 내부 직경 칼럼을 맙셀렉트 PrA 수지로 약 339 내지 372 L의 용량을 나타내는 18 내지 25 cm의 높이까지 팩킹하였다. 팩킹된 칼럼의 HETP 및 As를 결정함으로써 칼럼을 사용하기 위해 정성화하였다. 0.02 내지 0.08 cm의 HETP 및 0.8 내지 1.2의 As를 칼럼의 정성화에 이용하였다.
맙셀렉트 PrA 칼럼 조작을 주변 온도에서 수행하였다. 바이러스 불활성화 생성물 풀을 평형화된 맙셀렉트 PrA 칼럼으로 로딩하였다. 맙셀렉트 PrA 단계를 최대 유속 26.7 L/min 및 조작 압력 13 psig 이하에서 조작하였다. 맙셀렉트 PrA 칼럼에 적용된 최대 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 로딩은 선속도 350 cm/시간에서 수지 1 리터 당 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 25 g이었다. 칼럼 베드는 대략 3.9 kg의 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질과 결합할 수 있다.
맙셀렉트 PrA 칼럼을 25 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 완충액으로 평형화시켰다. 최소 3 CV의 평형화 완충액이 칼럼을 통과하고, 유출액의 pH 및 전도율 값이 각각 7.3 내지 7.7 및 14.5 내지 17.5 mS/cm인 때에 평형화가 완료되었다.
트리톤 X-100-처리된 공정내 물질을 평형화된 맙셀렉트 PrA 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 최소 3 CV의 25 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 0.5％ 트리톤 X-100, pH 7.5 완충액으로 세척하여 맙셀렉트 PrA 칼럼으로부터 약하게 보유된 불순물을 제거하였다. 이들 불순물은 사이토킨 단핵구 주화성 단백질-1 (MCP-1) 및 트리톤 X-100을 포함한다. 25 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 완충액을 사용하여 후속적 세척 단계를 수행하여 맙셀렉트 PrA 칼럼으로부터 잔여 트리톤 X-100을 제거하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig를 맙셀렉트 PrA 크로마토그래피 칼럼으로부터 250 mM 글리신, pH 3.0 완충액으로 용출시켰다. A280이 기준선 위로 0.2 AU 이상 증가할 때, 용출액을 수집 용기로 전환시켰다. 칼럼 유출액을 0.2 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 교반기가 장착된 수집 용기로 여과하였다. 용출 피크 뒷전의 A28O이 0.2 AU 이하의 값으로 감소될 때까지 용출액을 수집하였다. CTLA4A29YL104E-Ig를 대략 2 내지 3 CV의 용출 완충액에서 좁은 피크로 용출시켰다. pH를 신속하게 증가시켜 CTLA4A29YL104E-Ig 고분자량 (HMW) 종의 형성을 최소화하기 위해, 용출액 풀의 pH를 2 M HEPES, pH 7.5 완충액으로 pH 7.5 ± 0.2로 조정하였다. 맙셀렉트 PrA 크로마토그래피 단계 생성물 풀을 최대 5일 동안 주변 온도에서 유지하였다. 생성물 풀은 저장을 위해 냉각시킬 수 있으며; CTLA4A29YL104E-Ig의 안정성 프로파일은 5℃ 및 22℃에서 동일하였다. 생성물은 5일까지 저장할 수 있다.
CTLA4A29YL104E-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비가 약 6, 또는 약 5.2 내지 약 7.6인 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 생성물을 수집하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig 정제를 위한 QFF 음이온 교환 크로마토그래피: Q-세파로스 패스트 플로우 (QFF) 수지 (GE 헬스케어)를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피를 주로 이용하여 CTLA4A29YL104E-Ig의 보다 고도로 시알릴화된 종의 양을 풍부화시킬 뿐만 아니라, 잔여 단백질 A 수준을 감소시켰다. 맙셀렉트 단백질 A 칼럼으로부터 pH-조정된 CTLA4A29YL104E-Ig 생성물 풀을 QFF 칼럼에 적용하기 전에 주사용수 (WFI)로 대략 두배 희석하였다.
80 cm 내부 직경 칼럼을 QFF 수지로 약 136 내지 176 L의 용량을 나타내는 27 내지 35 cm의 높이까지 팩킹하였다. 칼럼을 사용하기 위해 팩킹된 칼럼의 HETP 및 As를 결정함으로써 정성화하였다. 0.02 내지 0.08 cm의 HETP 및 0.8 내지 1.2의 비대칭 (As)을 칼럼의 정성화를 위해 이용하였다.
QFF 칼럼 조작을 주변 온도에서 수행하였다. QFF 칼럼을 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 평형화시켰다. pH- 및 전도율-조정된 맙셀렉트 단백질 A 단계 생성물 풀을 QFF 칼럼에 적용하였다. QFF 단계를 최대 유속 16.4 L/min (196 cm/h) 및 최대 조작 압력 35 psi에서 조작하였다.
칼럼을 1 N NaOH 용액으로 사용하기 전 및 후에 모두 멸균하였다. 최소 2 칼럼 용량의 수산화나트륨 용액을 칼럼으로 통과시켰다. 이어서, 칼럼을 60 내지 120분 동안 정치시켰다. 용액 및 칼럼 유출액에 대한 허용가능한 전도율 범위는 136 내지 202 mS/cm이었다.
칼럼을 최소 5 칼럼 용량의 50 mM HEPES, 50 mM 염화나트륨, pH 7.0 완충액으로 평형화시켰다. 이 완충액에 대한 pH 및 전도율 범위는 각각 6.8 내지 7.2, 및 5.0 내지 7.0 mS/cm이었다. 이들 범위를 또한 사용하여 칼럼이 평형화되었는지 결정하였다.
pH- 및 전도율-조정된 맙셀렉트 단백질 A 단계 생성물 풀을 QFF 칼럼에 적용하고, 칼럼을 최소 3 CV의 평형화 완충액으로 세척하여 약하게 결합된 불순물을 제거하였다. 이어서, 칼럼을 50 mM HEPES, 135 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 세척하여 낮은 시알산 함량을 갖는 CTLA4A29YL104E-Ig 종을 제거하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig의 보다 고도로 시알릴화된 종을 50 mM HEPES, 200 mM NaCl, pH 7.0 완충액을 사용한 QFF 크로마토그래피 칼럼로부터 용출시켰다. 용출 완충액이 칼럼에 처음 적용될 때, 용출액 수집을 시작하였다. 용출하는 동안, 칼럼 유출액을 0.2 μm 필터를 통해 수집 용기로 여과하였다. 용출 피크 뒷전의 흡광도가 기준선 위로 0.2 AU 이하 감소될 때까지 용출액을 수집하였다. CTLA4A29YL104E-Ig를 5 CV 이하의 50 mM HEPES, 200 mM NaCl, pH 7.0 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출시켰다. 이어서, 수집 용기를 2℃ 내지 8℃로 냉각시켰다. QFF 크로마토그래피 단계 생성물 풀에 대한 최대 유지 시간은 2℃ 내지 8℃에서 3일이었다.
CTLA4A29YL104E-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비가 약 6, 또는 약 5.2 내지 약 7.6인 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 생성물을 수집하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig 정제를 위한 페닐 세파로스 FF HIC: 토요펄(Toyopearl) 페닐 650 M 수지 (토소 바이오사이언시즈(Tosoh Biosciences))를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 주로 이용하여 QFF 크로마토그래피 단계로부터의 생성물 풀에서 CTLA4A29YL104E-Ig HMW 종의 양을 감소시켰다.
100 cm 내부 직경 칼럼을 페닐 세파로스 페닐 650 M 수지로 약 141 내지 173 L의 용량을 나타내는 18 내지 22 cm 높이까지 팩킹하였다. 칼럼을 사용하기 위해 팩킹된 칼럼의 HETP 및 As를 결정함으로써 정성화하였다. 0.02 내지 0.08 cm의 HETP 및 0.8 내지 1.2의 As를 HIC 칼럼의 정성화를 위해 이용하였다.
HIC 칼럼 조작을 주변 온도에서 수행하였다. HIC 칼럼에 적용하기 전에, QFF 크로마토그래피 단계 생성물 풀을 50 mM HEPES, pH 7.0 완충액 및 50 mM HEPES, 3.6 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액을 사용하여 희석하여 QFF 생성물 풀에서 대략 135 mS/cm의 전도율 및 1 g/L 이하의 CTLA4A29YL104E-Ig 농도를 달성하였다. HIC 단계를 최대 유속 22.7 L/min (173 cm/h) 및 최대 조작 압력 45 psi에서 조작하였다. HIC 단계의 다중 주기를 QXL 용출액 풀에 존재하는 CTLA4A29YL104E-Ig의 양을 기준으로 이용할 수 있다.
HIC 칼럼을 1 N 수산화나트륨 용액으로 우선 멸균하였다. 2 내지 4 CV의 1 N 수산화나트륨 용액이 칼럼을 통과할 때 멸균이 완료되었다. 이어서, 칼럼을 60 내지 120분 동안 유지하여 멸균을 보증하였다.
멸균 단계 이후에, HIC 칼럼을 50 mM HEPES3 1.2 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액으로 평형화시켰다. 최소 3 CV의 평형화 완충액이 칼럼을 통과하고 유출액의 pH는 7.0 ± 0.3이고, 전도율은 대략 135 mS/cm인 때에 평형화가 완료되었다.
농도- 및 전도율-조정된 CTLA4A29YL104E-Ig QFF 크로마토그래피 단계 생성물 풀을 칼럼에 적용하였다. 이어서, 칼럼을 50 mM HEPES, 1.2 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액으로 세척하여 약하게 결합된 불순물을 제거하였다. CTLA4A29YL104E-Ig를 50 mM HEPES, 0.55 M 황산암모늄, pH 7.0 완충액을 사용한 HIC 칼럼으로부터 용출시켰다. 이 HIC 생성물 풀을 수집 용기에서 2℃ 내지 8℃로 유지시켰다. 수집 용기에서 최대 유지 시간은 3일이었다.
CTLA4A29YL104E-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비가 약 6, 또는 약 5.2 내지 약 7.6인 CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 생성물; CTLA4A29YL104E-Ig 고분자량 물질의 풀이 2.5％ 이하에서 존재하고; CTLA4A29YL104E-Ig 저분자량 물질 (예를 들어 CTLA4A29YL104E-Ig 단량체)의 풀이 0.5％ 이하에서 존재하고; MCP-1 ≤9.5 ng/mL의 풀이 존재하였다.
바이러스 여과. HIC 단계로부터의 CTLA4A29YL104E-Ig 생성물 풀의 농축 및 정용여과는 한외여과 (UF)에 의해 달성하였다. UF 단계는 30-kDa NMWCO 막 및 25 mM NaH2PO4, 10 mM NaCl, pH 7.5 완충액을 이용하였다. UF 단계에 이어 15-nm 플라노바 (Planova) 막 (아사히 카세이 (Asahi Kasei))을 사용한 바이러스 여과 단계를 거쳤다. 이어서, CTLA4A29YL104E-Ig 생성물 풀을 30-kDa NMWCO 막을 사용하여 UF에 의해 25 g/L의 단백질 농도로 조정하였다.
팔 필트론 (Pall Filtron) TFF 시스템을 다운스트림 CTLA4A29YL104E-Ig 생성 공정의 농축 및 정용여과 단계에서 사용하였다. 이 단계의 목적은 HIC 크로마토그래피 단계 생성물 풀을 45 내지 55 g/L로 농축시키고, HIC 크로마토그래피 단계에서 사용된 용출 완충액을 CTLA4A29YL104E-Ig 조성물에 대해 사용된 최종 완충액으로 교환하는 것이다. 농축된 CTLA4A29YL104E-Ig 생성물 풀을 0.2 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터를 통해 50-L 생물공정 백으로 옮겼다.
실시예 21: 생물학적 활성 - 표면 플라즈몬 공명에 의한 CTLA4 A29YL104E -Ig의 B-7IG 공동-수용체로의 생물-특이적 결합의 결정
표면 플라즈몬 공명 (B7 결합)
이 방법은 표면 플라즈몬 공명에 의한 CTLA4A29YL104E-Ig의 대표적인 B7 공동-수용체로의 결합을 측정하는 것이다. B7Ig를 고밀도에서 1차 아미노기를 통해 활성화된 CM5 센서칩의 표면에 고정시켰다. CTLA4A29YL104E-Ig 물질, 정성 대조군, 및 샘플을 0.125 내지 8 ng/mL의 농도로 희석하고, B7Ig 표면 상에 주입하여 결합 센서그램을 생성하였다. 고정된 B7Ig에 대한 CTLA4A29YL104E-Ig 결합의 초기 비율 (기울기)을 이 B7Ig 표면에서 질량 이전 (확산) 제한된 조건 하에 측정하였다. 초당 공명 단위 (RU/s)의 초기 결합률은 활성 농도와 직접 서로 관련이 있다. CTLA4A29YL104E-Ig 물질의 결합률을 농도에 대해 점으로 표시한 참고 표준 곡선을 이용하여, 샘플의 결합률을 활성 농도로 전환시켰다. 최종 결과를 CTLA4A29YL104E-Ig 물질에 대한 샘플의 결합률로 나타냈다.
CTLA4A29YL104E-Ig에서 인간 IgG1 Fc 영역의 존재가 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 이용하여 검출되었다. SPR은 생물특이적 상호작용의 실시간 측정을 가능하게 하였다. 인간 IgG의 Fc 영역에 특이적인 항체 단편 (염소 F(ab')2 항-인간 IgG Fc)을 센서칩의 표면에 공유적으로 고정시켰다. CTLA4A29YL104E-Ig 샘플의 결합은 비변형된 센서 칩 표면과 비교하여 이 표면에서 얻어진 반응을 측정함으로써 검출하였다. 공정 B, 공정 C 및 공동-혼합물에 결합된 공명 단위의 결과는 도 6 및 표 23에 제시된 바와 같이 비교가능하다.
SPR을 이용한 CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료 로트에서 인간 IgG Fc의 검출
로트 번호 항-Fc 항체에 결합된 RU 비변형된 표면에 결합된 RU
로트 A 1295 1
로트 B 1309 1
공동-혼합물 1268 1
인간 세포 IL 2 억제 분석
상기 방법은 항-CD3 및 B 세포로 자극하는 경우, CTLA4A29YL104E-Ig에 의해 T 세포로부터 IL-2 생성의 억제에 기초한다. IL-2 프로모터의 조절 하에 루시페라제 유전자와 함께 세포감염된 주르카트(Jurkat) T 세포를 다양한 농도의 CTLA4A29YL104E-Ig의 존재 하에 다우디(Daudi) B 세포 및 항-CD3으로 공동 자극하였다. 공동-자극은 IL-2 프로모터를 활성화시키고, 또한 루시페라제 단백질을 생성하였다. 생성된 발광성 신호는 루시페라제 분석 시스템을 이용하여 측정하였다. 이 시스템에서, CTLA4A29YL104E-Ig는 루시페라제 활성에서 투여량-의존성 감소를 초래하였다.
공정 B 로트 000929-278, 공정 C 로트 224818-2004-007 및 공동-혼합물 로트 55128-162에 대한 결과를 표 24에 제시된 바와 비교할 수 있다. EC50 값, 기울기 인자, 및 상부 및 하부 점근선은 표준 편차 1 내에서 세 샘플 모두에 대해 유사하였다. 이는 공정 C 및 공정 B로부터의 CTLA4A29YL104E-Ig가 시험관내 효능 분석에서 비교가능하게 작용한다는 것을 나타낸다.
시험관내 잠재력 생물분석에서 인간 IL-2 프로모터 매개된 루시페라제 활성의 비교. 본 발명의 공정에 대한 투여 반응 곡선 파라미터
로트 번호 EC50 (ng/mL) 기울기 인자 상부 점근선 (CPS) 하부 점근선 (CPS)
공정 A 19.1±1.9 -0.91±0.06 85,000±15,000 30,000±6,000
공동-혼합물 21.5±2.7 -0.93±0.08 88,000±16,000 29,000±5,000
공정 B 21.8±1.4 -0.91±0.09 81,000±17,000 27,000±7,000
물질:
- 센서 칩 CM5, 보증된 등급 비아코어(Biacore) (카달로그 번호 BR-1000-13)
- HBS-EP 완충액 BIA 보증된 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, .005％ v/v
- 계면활성제 P20 비아코어 (카달로그 번호 BR-1001-88)
- 아민 커플링 키트 BIA 보증된 115 mg N-히드록시숙신이미드 (NHS), 750 mg 1-에틸-3-(3 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), 10.5 mL 에탄올아민 HCl 비아코어 (카달로그 번호 BR-1000-50)
- PC 병용가능한 컴퓨터 비아코어를 포함한 비아코어 C 장비 (카달로그 번호 BR-1100-51)
- 비아코어 C 장비, 버젼 1.0.1로 제공된 바와 같은 비아코어 C 제어 소프트웨어 비아코어.
보증된 아민 커플링 키트 BIA: 키트는 하나의 바이알 각각이: 115 mg NHS, 750 mg EDC, 및 10.5 mL 에탄올아민을 함유하였다. 각각의 바이알을 제조업자의 지시에 따라 제조하였다. 200 μL 용량의 NHS 및 EDC 용액을 적합한 크기 및 캡의 개별 플라스틱/유리 바이알로 분취하였다. 이들 용액은 -20℃에서 저장하는 경우, 2개월 동안 안정하였다. 200 μL의 에탄올아민을 적합한 크기 및 캡의 개별 플라스틱/유리 바이알로 분취하였다. 이 용액은 2 내지 8℃에서 저장하고, 제조업자의 지시에 따라 안정하였다.
유동 세포로의 우수한 결합을 보증하기 위해, 유동 세포를 1주일 동안 또는 286 주입 중 먼저 도달하는 때까지 사용할 것이다. 신규 유동 세포를 각각의 주가 시작할 때 고정시킬 것이다. 샘플 시험을 위한 제조에서 B7.1 Ig의 고정화. 비고: 분석을 위해 200 μL의 모든 용액을 7 mm 비아코어 튜브로 분취하였다. B7.1 Ig를 함유하는 하나의 바이알을 주변 온도에서 해동시켰다. 10 mM 아세테이트 pH 5.0 완충액 (1.7)을 사용하여 B7.1 Ig를 희석하여 3000-9000 공명 단위 (RU)의 표면 질량을 달성하였다. EDC, 및 NHS의 각각 1개의 바이알 (200μL)을 주변 온도로 해동시켰다. 냉장고에서 에탄올아민 HCl를 꺼내고, 실온으로 가온되도록 두었다. 비아코어 소프트웨어로부터: "Immobilization Wizard"로부터 선택된 공개된 프로젝트 "B7 Ig Immobilization"을 열었다. 공개된 파일 "B7 Immob.blw"를 열었다. "Next"를 클릭하여 위자드(Wizard) 및 확인 또는 변화 선택을 통해 단계를 밟았다. "User Information" 하에 유동 세포를 선택하고, "Notebook" 탭에서 실험 정보를 제공하였다. 약술한 바와 같은 샘플 선반에 시약 및 리간드 바이알을 두었다. 지시사항을 검토하였다. 주형 파일을 "B7 Immob BIOQC# Date Initials Chip # Flow cell #.blw"로 저장하였다. "Start"를 클릭하여 고정화를 시작하였다. 결과 파일을 "B7 Immob BIOQC# Date Initial chip # flow cell # .blr"로 저장하였다. 분석이 끝났을 때, 위자드 결과 및 센서그램을 출력하였다.
실시예 22; CTLA4 A29YL104E -Ig 조성물의 탄수화물 함량 분석, 트립신의 펩티드 맵핑 및 IEF
트립신의 분해 펩티드 맵핑
이 트립신 분해 방법에서, CTLA4A29YL104E-Ig 샘플을 구아니딘-HCl을 사용하여 변성시키고, DTT 및 IAA를 사용하여 환원시키고, 알킬화시켰다. 샘플을 NAP-5 칼럼을 사용하여 탈염하고, 트립신으로 분해시켰다. 분해 혼합물을 역상 (C18) 크로마토그래피에 의해 분리하고, 215 nm에서 UV 흡광도에 의해 피크를 검출하였다.
시약: 이동상 A 용액 (물 중 0.02％ 트리플루오로아세트산 (TFA) (v/v)); 이동상 B 용액 (95％ ACN (아세토니트릴) 및 5％ 물 중 0.02％ TFA (v/v)); 알킬화제 (200 mM 요오도아세트아미드 (IAA)); 희석 완충액 (100 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8.0); 변성 완충액 (8 M 구아니딘, 50 mM Tris, pH 8.0); 분해 완충액 (50 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH 8.0); 환원제 (100 mM DTT).
장비: (등가의 장비가 사용될 수 있음) NAP-5 칼럼 (아머샴 카달로그 번호 17-0853-02); HPLC 칼럼 가열기; 칼럼 가열기 및 UV 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스 (Water's Alliance) HPLC 시스템.
절차의 개관
CTLA4 A29YL104E -Ig
↓
변성/환원/알킬화된 단백질
↓
탈염된 단백질
↓
분해된 단백질
↓
맵 프로파일 및 MS 정보
환원 및 알킬화: 샘플 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 등)을 최종 용량 100 μL (1 mg)이 될 때까지 물을 첨가하여 10 mg/ml로 희석하였다. 560 μl의 변성 완충액 및 35 μL의 환원제 (100 mM DTT)를 100 μl의 샘플에 첨가하고, 혼합하고, 미세원심분리관에서 3초 동안 스핀 다운시켰다. 이어서, 샘플을 50℃에서 20±2분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 35 μL의 알킬화제 (200 mM IAA)를 각각의 샘플에 첨가하고, 다시 혼합하고, 미세원심분리관에서 3초 동안 스핀 다운시켰다. 이어서, 샘플을 알루미늄 호일로 덮고, 50℃에서 20±2분 동안 인큐베이션시켰다. 3 칼럼 용량 (약 7-8 mL)의 분해 완충액을 부어 NAP-5 칼럼을 평형화시킨 후, 500 μl의 환원된 및 알킬화된 혼합물을 NAP-5 칼럼에 부어 칼럼을 통해 액체가 마르게 하였다. 이어서, 1 mL의 분해 완충액을 함유한 칼럼의 샘플을 용출시켜 샘플을 NAP-5 칼럼으로부터 수집하였다.
분해: 샘플을 20 μL의 트립신 (0.5 μg/μL)으로 38℃의 수조에서 4시간 (± 0.5시간) 동안 분해시켰다. 분해가 완료되면, 샘플을 2.5 μL의 TFA로 산성화시켰다. 이어서, 샘플을 후속적 분석을 위해 오토샘플러 바이알에 넣었다.
장비 방법: 장비 방법이 하기 제시되어 있다:
Figure 112011097388832-pat00109
칼럼을 최초 주입 전에 25분 동안 100％ 이동상 A 완충액으로 평형화시켰다. 칼럼 온도를 37℃로, 오토샘플러 온도를 4℃에서 유지하면서, UV 흡광도를 215 nm에서 모니터링하였다. 이동상 A 완충액 블랭크를 최초 시스템 적합성 표준 전에 러닝하여, 이후에 각각 샘플의 단일 50 μL를 주입하였다. 참조 물질 주입은 매 6회 샘플 주입을 괄호로 묶어야 한다.
이론단의 수: 이론단의 수로 평가된 칼럼 효율은 하기 방정식에 따라 체류 시간 및 피크의 너비를 이용하여 정량적으로 측정할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00110
식 중:
"w"는 기준선에 대해 상대적으로 직선인 면을 외삽법에 의해 측정한 기준선에서의 피크 너비이고, "t"는 피크 최대의 용출 시간에 대한 주입시간으로부터 측정된 피크의 체류 시간이다.
N이 50000 미만인 경우, 칼럼을 다시 평형화시킨다.
분할: 두 피크, 예를 들어 도 32에 제시된 바와 같은 피크 T2 및 피크 T12 간의 분할 (R)은 하기 방정식을 이용하여 결정할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00111
식 중:
t1, t2 = 단편 피크 T2 및 피크 T12 각각의 체류 시간
w1, w2 = 체류 시간 t1 및 t2 각각을 갖는 피크의 기준선에서 접선-한정된 피크 너비.
R이 1.5 미만인 경우에는 칼럼을 다시 평형화시키고, 문제가 지속되는 경우에는 칼럼을 교체해야 한다.
도 32 및 표 25는 CTLA4A29YL104E-Ig의 트립신 분해로부터 얻은 펩티드 단편을 제시한다. 약 50분에서 펩티드 T7 및 T9를 나타내는 영역은 때때로 불완전한 샘플 분해를 반영하고, 피크는 그날그날 상이한 성질을 나타낼 수 있으나; 1회 수행 내에서 모든 샘플은 비교가능성을 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00112
Figure 112011097388832-pat00113
Figure 112011097388832-pat00114
등전 집중
등전 집중 (IEF)을 이용하여 약물 재료 및 약물 제품 둘 다에서 CTLA4A29YL104E-Ig의 다양한 동족체의 등전점 (pI)을 평가하였다. 이 방법은 4.0-6.5의 pH 구배에서 파마시아 바이오테크 암폴린 (Pharmacia Biotech Ampholine; 등록상표) PAG플레이트 및 멀티포어 II 플랫베드 (Multiphore II Flatbed) 전기영동 시스템을 사용하였다. 샘플 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 등)을 밀리-Q 워터로 희석하고, 샘플 어플리케이션 스트립을 사용하여 겔에 직접 로딩하였다. 음극 스트립에 침지된 100 mM β-알라닌 및 양극 스트립에 침지된 100 mM 글루탐산/500 mM 인산을 사용하여 전압 상승 하에 겔을 2.5시간 동안 집중시켰다. 집중 후에, 술포살리실산/트리클로로아세트산을 사용하여 겔을 고정시킨 후, 쿠마시 블루 염색 시스템을 사용하여 염색하였다. 염색한 후, 습윤 겔을 레이저-기반 밀도계를 사용하여 50 또는 100 μm 공간 분할 및 4096 수준 정도의 광학 밀도 분할에서 디지털 영상 파일로 스캐닝하였다. CTLA4A29YL104E-Ig를 pI 4.5 내지 5.5로부터 10 내지 15개의 밴드 범위로 집중시켰다.
겔 (pH 4.0-6.5)에서 원래의 CTLA4A29YL104E-Ig의 등전 집중은 도 12에 도시된 바와 같은 공정 C 로트 224818-2004-007, 공정 B 로트 000929-287 및 공동-혼합물 로트 55128-162에 대한 4.6-5.5의 pI 범위에서 유사한 밴드 패턴을 생성하였다. 이 절차는 공정 B 및 C 물질이 동일한 IEF 겔 상에서 분석하는 경우에 비교가능하다는 것을 나타낸다.
등전 집중 표준물은 배경으로부터 용이하게 구분되어야 한다 (도 12 참조).
Figure 112011097388832-pat00115
CTLA4A29YL104E-Ig는 약 4.5 내지 약 5.5의 pI 범위를 갖는 다중 밴드 (>10)로 확인되었다 (도 32).
CTLA4A29YL104E-Ig는 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA4)의 변형된 리간드-결합 도메인 및 인간 IgG1 중쇄의 불변 영역으로 구성된 제2 세대 CTLA4-Ig 융합 당단백질이다. 이 신규 분자는 면역억제제로서의 치료 용도를 갖는다. CTLA4A29YL104E-Ig는 등전 집중 (IEF)에 의해 분할될 수 있는 다중 전하 동족체를 함유한다. CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료 및 약물 제품의 분석을 위해 IEF 방법을 개발하였다. 암폴린 (Ampholine; 등록상표) PAG 플레이트 pH 4.0-6.5 멀티포어 II 플랫베드 전기영동 시스템에서 CTLA4A29YL104E-Ig를 조사하기 위해 이 방법을 사용하였다. CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료, 약물 제품, 및 참조 물질을 밀리-Q 워터로 희석하고, 겔로 직접 로딩하였다. 음극 스트립에 침지된 100 mM β-알라닌 및 양극 스트립에 침지된 100 mM 글루탐산/500 mM 인산을 사용하여 전압 상승 하에 겔을 2.5시간 동안 집중시켰다. 집중 후, 겔을 고정하고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 염색된 겔을 레이저 밀도계에 의해 스캐닝하고, 겔 밴드의 반-정량 분석을 디지털 영상 파일로 수행하였다.
물질:
암폴린 PAG 플레이트 겔 pH 4.0-6.5 GE 헬스케어 (카달로그 번호 80-1124-81)
IEF 전극 스트립 6 x 280 mm GE 헬스케어 (카달로그 번호 80-1004-40)
샘플 어플리케이션 조각 GE 헬스케어 (카달로그 번호 80-1129-46)
설비:
멀티포어 II 전기영동 시스템 GE 헬스케어 (카달로그 번호 18- 1018-06)
냉각 플레이트 125 x 260 mm GE 헬스케어 (카달로그 번호 80-1106-54)
전력 공급기 NOVEX (기본 모델 3540)
BioRad (모델 PAC3000)
온도조절 순환기 VWR (모델 13271-074/ 1160S 1160A)
회전 진탕기 IKA (모델 KS250/260)
개인용 밀도계 SI GE 헬스케어 (모델 375)
이미지퀀트(ImageQuant)TL GE 헬스케어
소프트웨어
시약 제조:
양극 완충액 용액 (100 mL): 0.5 M 인산 중 0.1 M 글루탐산; 3.4 mL 85％ 인산; 1.47 ± 0.02 g 글루탐산; 밀리-Q 워터. 글루탐산을 50 mL의 밀리-Q 워터에 첨가하였다. 85％ 인산을 적당량 첨가하여 100 mL가 되도록 하고, 교반하여 혼합하였다. 6개월의 유효기간을 설정하고, 4℃에서 저장하였다.
음극 완충액 용액 (100 mL): 0.1 M β-알라닌, 0.9 ± 0.02 g β-알라닌, 밀리-Q 워터. 적당량의 시약에 밀리-Q 워터를 100 mL가 될 때까지 넣고, 교반하여 혼합하였다. 6개월의 유효기간을 설정하고, 4℃에서 저장하였다.
고정 용액 (2000 mL): 12％ 트리클로로아세트산 중 3.5％ 5-술포살리실산, 240 ± 5.0 g 트리클로로아세트산, 70 ± 2.0 g 5-술포살리실산, 밀리-Q 워터. 적당량의 시약 및 첨가하여 2000 mL가 되도록 밀리-Q 워터를 합하였다. 3개월의 유효기간을 설정하고, 실온에서 저장하였다.
장치 및 겔 제조. 멀티포어 II 전기영동 유닛의 냉각 플랫폼을 멀티-템프 (Multi-Temp) 온도조절 순환기에 연결하고, 온도를 10℃로 설정하였다. 순환기가 10±2℃가 되도록 두었다. 겔을 냉장고에서 꺼냈다. 가위를 사용하여, 겔/겔 지지체는 자르지 않도록 하면서 외피의 네 면 모두를 따라서 조심스럽게 잘랐다. 대략 1.0 mL의 밀리-Q 워터를 냉각 플랫폼의 한 가장자리에 첨가하였다. 겔/겔 지지체의 한 가장자리를 물에 담가 겔의 전체 가장자리로 물이 이동하게 하였다. 냉각 플랫폼에 겔을 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 도포하였다. 투명한 필름을 겔의 표면으로부터 제거하였다. 각각의 전극 스트립을 대략 3.0 mL의 적합한 전극 용액에 침지하였다 (바로 밑의 표). 전극 스트립을 겔의 상부 및 하부 가장자리로부터 대략 10 mm에 적용하였다. 음극 스트립을 냉각 플랫폼의 (-) 표시에 가장 가깝게 두고, 양극 스트립은 (+) 표시에 가장 가깝게 두었다. 전극 스트립을 적용한 후에, 스트립을 겔 지지체와 접촉하지 않도록 하면서 겔에 맞도록 잘랐다.
전극 용액 및 전기영동 파라미터 설정
Figure 112011097388832-pat00116
샘플 어플리케이션 조각을 음극 스트립의 대략 10 mm 위에 적용하였다. 바로 위의 표에 한정된 전기영동 파라미터를 사용하여, 전압이 300 V가 될 때까지 겔을 예비-집중시켰다.
IEF pI 마커 및 염색 대조군 제조. IEF pI 마커를 100 μL의 밀리-Q 워터로 재구성하였다. 탄산 탈수효소 II 염색 대조군을 1000 μL 밀리-Q 워터로 재구성하여 1.0 mg/mL 원액을 만들었다. 10 μL의 원액 (1.0 mg/mL)을 90 μL 밀리-Q 워터에 최종 로딩 농도 0.10 mg/mL가 되도록 첨가하였다.
샘플 제조. CTLA4A29YL104E-Ig 참조 물질 및 샘플을 2 mg/mL의 농도로 희석하였다. 실시예: CTLA4A29YL104E-Ig 샘플이 25 mg/mL의 농도를 갖는 경우, 하기 희석을 이용하여 최종 로딩 농도 2 mg/mL를 제조하였다:
10 μL (25 mg/mL의) + 115 μL 밀리-Q 워터 = 2 mg/mL
비고: 샘플 농도가 2.0 mg/mL 이하인 경우, 희석하지 않고 샘플을 로딩한다.
겔 로딩. 겔을 로딩하여 러닝 패턴을 기준으로 샘플 확인을 촉진하였다. 겔을 대칭적으로 로딩하지 않는다. IEF pI 마커, 염색 대조군, CTLA4A29YL104E-Ig 참조 물질, 및 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플을 바로 밑의 표에 약술된 바와 같이 로딩하였다. 모든 샘플을 샘플 어플리케이션 조각에 로딩하였다.
겔 로딩 패턴
Figure 112011097388832-pat00117
겔 공정. 전극 홀더를 멀티포어 II 유닛 상에 놓고, 전극을 겔 상의 전극 스트립의 중심에 정렬하였다. 전극 홀더로부터의 두 전극을 기준 유닛에 연결하고, 안전 뚜껑을 제자리에 놓았다. 접착 테이프를 사용하여, 안전 뚜껑에 있는 구멍을 막아 겔이 건조해지지 않게 하였다. 전극을 전력 공급기에 연결하였다. 적합한 전압, 전류, 및 전력에서 전기영동을 러닝하였다. 전기영동이 완료된 경우, 전력 공급기를 끄고, 안전 덮개 및 전극 홀더를 제거하였다. 겔에서 전극 스트립 및 샘플 어플리케이션 조각을 조심스럽게 제거하였다. 냉각 플레이트에서 전체 겔 및 겔 지지체를 제거하고, 200 mL 고정 용액을 함유하는 280 x 180 x 40 mm 파이렉스 (Pyrex; 상표명) 디쉬에 놓았다. 디쉬를 플라스틱 랩으로 덮고, 실온에서 최소 20분 동안 회전 진탕기에 놓았다. 비고: 겔은 최대 1시간 동안 고정되어야 한다. 고정이 완료될 때, 겔을 대략 200 mL의 밀리-Q 워터로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 병을 수회 뒤집어서 겔코드 블루 염색 시약 용액을 혼합하였다. 시약의 동종성 샘플을 사용하여 분배하기 전에 염색 시약을 혼합하는 것이 중요하다. 대략 200 mL의 염색 시약을 디쉬에 첨가하였다. 디쉬를 플라스틱 랩으로 덮고, 실온에서 18 내지 20시간 동안 회전 진탕기에 놓아서 최적 밴드 발달을 달성하였다. 염색이 완료되었을 때, 염색 시약을 대략 200 mL 밀리-Q 워터로 대체하여 겔을 세척하였다. 최적의 결과를 위해 1-2 시간 동안 최소 3회 물 교환을 하였다.
겔 스캐닝 및 분석. 바로 아래 표에 한정된 스캔 파라미터를 이용하여 겔을 스캐닝하였다. 겔 분석을 스캐닝된 영상 파일에서 수행하였다.
겔 스캐닝 및 분석 파라미터
Figure 112011097388832-pat00118
비고: 표 3은 겔 영상의 분석에 대한 일반적인 지침을 약술하고 있다. 각각의 밴드 검출 파라미터의 적합한 조정에서 상세한 정보에 대해 이미지퀀트 TL (v2003.03) 매뉴얼 및 스크린에 대한 지시사항을 참조한다.
겔 영상 파일 (스캐닝된 미가공 데이타)을 <1D Gel Analysis>으로부터 이미지퀀트TL로 열었다. 모든 밴드가 명백히 눈에 보일 때까지 툴바의 <Contrast> 및 밑의 <Image Histogram> 파라미터로 갔다. <Lane Creation>을 선택하고, <Manual>을 선택하여 <Nurnber of Lane>을 분석하도록 설정하였다. <Lane ％ Width>를 100％까지 조정하여 겔 레인을 덮었다. 경우에 따라, 단일 레인을 적절히 정렬하였다. <Rolling Ball> 방법을 이용하여 배경을 차감하였다. 이는 IEF 겔 영상 분석에 필수적이지 않다. 표 3에 열거된 초기 <Minimum Slope>, <Noise Reduction> 및 <％Maximum Peak> 설정을 이용하여 밴드를 검출하였다. 이들 값의 조정은 밴드를 정확하게 확인하는 데 필요하다. 임의의 미확인 밴드 및 오확인 밴드를 수동으로 보정하였다. pH/pI 4.0-6.5 겔에 대해 시스템 적합성 부분에 열거된 표지된 마커로부터의 표준 pI 마커를 사용하여 밴드 pI 값을 컴퓨터로 처리하였다. 교정 및 표준화 단계를 수행하지 않았다. 추가적 계산 및 보고를 위해 측정 윈도우 내에 함유된 데이타를 엑셀 시트로 옮겼다. 엑셀 데이타를 허가된 스프레드시트로 옮겨 보고 결과에 대한 정량 분석을 수행하였다.
시스템 적합성. 등전 집중 표준 (pI 마커)은 배경으로부터 용이하게 구별되며, 스캐닝된 겔 영상의 시각적 정밀검사에 의해 제한된 왜곡을 나타내야 한다 (열거된 pI 마커에 대해 바로 밑의 표 참조).
등전 집중 표준
Figure 112011097388832-pat00119
비고: 겔의 pH/pI 범위가 4.0-6.5이므로, 등전 집중 표준 중 일부만 겔 상에 나타날 것이다. 3.50, 4.55, 5.20, 및 5.85에서 pI 마커를 확인하고, 겔에서 표지하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig 참조 물질 및 시험 품목의 밴드 패턴은 스캐닝된 겔 영상의 시각적 정밀검사에 의해 제한된 왜곡을 나타내야 한다. 낮은 수준의 단백질 로딩 (1.0 μg)에서 탄산 탈수효소 II (pI 5.4)의 염색 대조군을 사용하여 일관된 겔 염색을 증명하였다. 밴드는 스캐닝된 겔 영상의 시각적 정밀검사에 의해 배경으로부터 용이하게 구별되어야 한다. CTLA4A29YL104E-Ig 참조 물질은 밴드 강도 1.0％ 이상, pI 범위 4.5 내지 5.6 내의 8개 내지 15개의 밴드를 함유해야 한다. pI 범위 4.5 내지 5.6 내의 CTLA4A29YL104E-Ig 참조 물질 밴드는 95％ 이상의 누적 백분율 강도를 가져야 한다.
데이타 계산. 참조 물질에 대한 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플의 누적 백분율 강도를 계산하기 위해 하기 방정식을 이용하였다:
Figure 112011097388832-pat00120
예시: 샘플이 95％의 ％ 밴드 강도 (pI 4.5-5.6)를 갖고, 참조 물질이 100％의 ％ 밴드 강도 (pI 4.5-5.6)를 갖는 경우, 누적％ 강도는 95％일 것이다.
한 실시양태에서 CTLA4A29YL104E-Ig 물질은 상대적 밴드 강도 1.0％ 이상, pI 범위 4.5 - 5.6 내의 밴드를 가질 것이다. CTLA4A29YL104E-Ig 물질은 pI 범위 4.5 - 5.6 내의 CTLA4A29YL104E-Ig 참조 물질에 대한 누적 백분율 강도를 갖는다.
실시예 23: 세포주의 세포감염 및 발생
전기천공법 전에, 발현 벡터 pD16LEA29Y는 BstBI 효소로 선형화하여 병용가능한 4 bp 돌출부를 생성하였다. 선형화된 벡터 및 자른 청어 정액 운반자 DNA (운반자로서)를 에탄올과 공침전시키고, DG44 세포로 전기천공법을 수행하기 위해 PF CHO 배지 (JRH 바이오사이언시즈 (JRH Biosciences)) 중에서 무균적으로 현탁시켰다.
전기천공법에 이어, 세포를 비선택적 배지에서 회수되도록 두었다. 이어서, 세포를 500 ng/mL의 레콤불린 (깁코), 4 mM L-글루타민 (깁코) 및 메토트렉세이트 (ICN)를 함유하는 PF CHO의 선택적 배지 중에서 96 웰 플레이트로 시딩하였다.
이 플레이팅으로부터의 CTLA4A29YL104E-Ig 생성 세포주를 배지에 첨가된 메토트렉세이트 (MTX) 농도의 다음 진행을 이용한 발현 증폭을 위해 선택하였다:
20 nM =≫ 50 nM => 100 nM => 25O nM => 50O nM => 1 μM MTX.
전체 CTLA4A29YL104E-Ig 발현 플라스미드를 세포 게놈으로 통합하였다.
생성 세포주 선택
최적 수행의 제한 희석 클로닝을 2회 순환 후에 최종 생성 세포주 GF1.1.9를 단리하고, 증폭된 마스터 웰 세포주를 증폭시켰다. 세포주 GF1.1.9의 선택은 성장 패턴, 역가, 및 감소된 양의 고분자량 구성성분 및 다른 클론으로부터 생성된 물질에 비해 높은 시알산 함량을 함유한 생성물에 기초한다.
실시예 24: CTLA4 A29YL104E -Ig의 유전학적 특성화
게놈 안정성 연구
세포 은행에서 유래된 세포로부터 단리한 DNA 및 RNA를 사우던 및 노던 혼성화 분석, 및 CTLA4A29YL104E-Ig 코딩 서열에 대한 cDNA 시퀀싱에 이용하였다. 결과를 CTLA4A29YL104E-Ig로부터 얻은 결과와 비교하였다.
노던 혼성화 분석, 및 cDNA 시퀀싱 측정에 대한 결과는 하기에 나타내었다.
노던 혼성화 분석
세포 은행으로부터의 세포로 접종된 배양액을 확장시키고, 노던 혼성화 분석을 위해 RNA를 단리하는 데 사용하였다. 시험관내 세포 연령을 넘어선 대표 세포 대략 27 세대로 제조한 배양액을 CTLA4A29YL104E-Ig 생성 공정에서 사용하였다. 전체 RNA를 CTLA4A29YL104E-Ig 세포 은행, 및 확장된 CTLA4A29YL104E-Ig 세포로부터의 세포로부터 유래된 세포로부터 추출하였다. 모 CHO 세포주로부터의 전체 RNA를 이용한 대조군을 또한 이들 실험에서 사용하였다. 대략 5 μg의 전체 RNA를 변성 조건 하에 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 겔 중의 RNA를 나일론 막으로 블롯팅하고, CTLA4A29YL104E-Ig 유전자를 함유하는 32P-표지된 1.2 kb HindIII/XbaI DNA 단편과 혼성화시켰다. 프로브로 사용된 1.2 kb HindIII/XbaI DNA 단편을 플라스미드 pD16LEA29Y로부터 단리하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig 유전자 프로브에 혼성화된 대략 1.7 킬로베이스의 mRNA 종을 도 33에 도시된 바와 같이 세포 은행으로부터의 전체 RNA 샘플에서 검출하였다. 패널 A 및 패널 B는 브롬화에티듐-염색된 아가로스 겔 및 상응하는 자가방사선상을 각각 나타내는 도 33에 제시되어 있다.
이들 결과는 CTLA4A29YL104E-Ig를 코딩하는 오직 하나의 전사체가 CTLA4A29YL104E-Ig 확장된 세포 은행으로부터 유래한 배양액에서 발현된다는 것을 나타낸다. 또한, 세포 은행을 이용하여 얻은 결과와 비교하여 이들 샘플에서 CTLA4A29YL104E-Ig mRNA 전사체에서 검출가능한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 25: 크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 방법은 280 nm에서 검출되는 가드 칼럼이 장착된 7.8 mm x 300 mm 토소하스 (TosoHaas) TSK-3000 SWXL 칼럼을 사용하여 CTLA4A29YL104E-Ig 조성물을 분석하기 위해 개발되었다. CTLA4A29YL104E-Ig를 단량체 (단일쇄), 이량체, 또는 고분자량 종 (예컨대, 사량체)을 비롯한 생성물 동질성에 대해 평가하였다. 방법은 공칭 농도 약 10 mg/mL에서 우수한 정밀도 (<2％)를 나타내었고, 약 0.5-15 mg/mL (r2 = 0.999)에서 선형이었다. DL (검출 한계)은 약 2.26 Φg/mL이고, QL (정량화 한계)는 약 7.53 Φg/mL이었다. 이들 가용성 CTLA4-Ig 분자는 면역억제제로서 잠재적 치료 용도를 갖는, 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA4)의 리간드 결합 도메인 및 인간 IgGl 중쇄의 불변 영역으로 이루어진 융합 단백질이다. 이들 화합물은 다양한 항원-제시 세포 (APC)의 표면에서 B7 항원 (CD80 및 CD86)으로의 결합을 통해 그의 생리학적 효과를 미치며, 이와 같이 B7.1 및 B7.2의 기능성 상호작용은 T-세포의 표면에서 CD28로 차단한다. 이러한 차단은 T-세포 활성화, 즉, 면역 반응을 억제한다. LEA29Y는 CTLA4Ig와 Leu104 - glu 및 Ala29 - Try의 두 아미노산 잔기에서만 상이하며, 분자는 B7.1 및 B7.2 항원에 대해 유의하게 상이한 결합활성을 갖는다. LEA29Y는 모 CTLA4Ig와 비교하여 인간 형태의 B7.2 (CD86)에 대해 5 내지 10배 더 큰 결합활성, 및 인간 B7.1 (CD80)에 대해 유사한 결합활성을 나타낸다.
가드 칼럼 및 280 nm의 검출기가 장착된 TSK-3000 SWXL 칼럼 (7.8 mm x 300 mm)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료의 동질성에 대해 분석하였다. CTLA4A29YL104E-Ig 이량체, 고분자량 (HMW) 및 저분자량 (LMW) 종은 분화되었다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 CTLA4A29YL104E-Ig의 생성물 동질성에 대해 평가하였다. 도 34a-c는 공정 B, 공정 C 및 공동-혼합물 로트에 대한 CTLA4A29YL104E-Ig의 SEC 크로마토그램을 제시하고 있다. CTLA4A29YL104E-Ig의 SEC는 공정 C 물질은 99.8 면적 백분율 이량체이고, 0.2 면적 백분율 HMW 종이며, 검출가능한 LMW 종은 없음을 나타낸다. 이들 결과는 공정 B 물질 (이량체 97.4 면적 백분율, HMW 2.6 면적 백분율, 및 LMW <DL)과 비교가능하다.
시약: 4 N KOH (100 mL); 시스템 적합성 표준 (HPLC 등급수에서 용해된 분자량 마커); 이동상 러닝 완충액 (0.2 M KH2PO4, 0.9％ NaCl, pH 6.8); 4 N NaOH; 희석 완충액 (25 mM NaH2PO4-H2O, 10 mM NaCl, pH 7.5)
장비 및 조건 - 등가의 장비로 치환될 수 있다:
펌프 종류 워터스 모델 600
칼럼 5 :m TSK 3000 SWXL, 40 mm x 6.0 mm I.D. 가드 칼럼이 장착된 토소 하스 5 :m TSK 3000 SWXL, 300 mm x 7.8 m I.D. 휴렛 팩커드 (Hewlett Packard), (카달로그 번호 79912S3-597), 휴렛 팩커드, (카달로그 번호 79912S3-527)
검출기 워터스 모델 486. 15분 가온되도록 둠.
파장 280 nm
유속 1 mL/분
통합 시스템 VG 멀티크롬 (Multichrom)
주입 시스템 워터스 모델 717 및 4℃의 냉장고가 장착된 오토샘플러
주입 용량 2O mL
분석 표적 농도 10 mg/mL
이동상 0.2 M KH2PO4, 0.9％ NaCl, KOH로 pH 6.8
분석 러닝 시간 20분
칼럼 온도 주변 온도
체류 시간 CTLA4A29YL104E-Ig 약 8.5±0.5분, 고분자량 종 약 7.5±0.5분
표준 및 샘플 (10 mg/ml)을 표지된 오토샘플러 바이알에서 50 ml 용량으로 제조하였다. 샘플을 동일하게 2개 제조하였다.
계산
분할 (R) 결정 및 체류 시간 평가: 20 mL의 시스템 적합성 표준을 주입하여, 그러한 표준 (예를 들어, 한 피크, 체류 시간 약 8.5분을 갖는 피크 1, 두 번째 피크, 체류 시간 약 10분을 갖는 피크 2)을 사용하여 평가된 크로마토그램 유전자로부터의 두 피크 간의 분할을 하기 방정식을 이용하여 계산하였다:
Figure 112011097388832-pat00121
식 중:
t1 = 피크 1의 체류 시간
t2 = 피크 2의 체류 시간
W1 = 피크 1의 피크 너비
W2 = 피크 2의 피크 너비
Figure 112011097388832-pat00122
=2.12∃1.3
피크 너비는 피크의 상대적으로 직선면을 기준선에 대해 외삽법을 수행한 후, 피크를 기준으로 너비 (분으로 표시)와 동일하다. 체류 시간 및 피크 너비는 동일한 단위로 측정하였다.
R은 ∃ 1.3이어야 하고, 피크에 대한 체류 시간은 ~ 8.5 ∀ 0.5분이어야 한다.
이론단의 수 결정: 시스템 적합성 표준 크로마토그램으로부터, 이론단의 수를 하기 방정식에 따라 계산함으로써 칼럼의 효율을 결정할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00123
식 중:
(t) = 피크 2의 체류 시간 (분)
(W) = 도 1에 제시된 바와 같이 피크의 면을 기준선에 대해 외삽법을 수행함으로써 얻은 피크 2의 기준선에서의 너비 (분).
N은 ∃ 2500이어야 한다.
피크의 통합: 크로마토그램에서 피크 면적은 통합하였다 (예를 들어, 도 34a-c). CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 피크는 약 8.5분에서 있었고, 고분자량 종 피크는 7.4분에서 있었다.
면적 백분율은 하기 공식에 따라 계산할 수 있다:
면적％M 이량체
100 - (면적％ 고분자량 종 + 면적％ 저분자량 종)
Figure 112011097388832-pat00124
식 중:
A = CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 피크 면적
B = CTLA4A29YL104E-Ig 이량체보다 적은 체류 시간을 갖는 모든 피크의 총 면적
C = CTLA4A29YL104E-Ig 이량체 피크보다 큰 체류 시간을 갖는 모든 피크의 총 면적 (함유물 용량은 제외함).
총 면적 카운트의 ％ RSD (함유물 용량은 제외함)를 결정하였다. 총 면적 카운트의 ％ RSD는 2％ 이하여야 한다. 면적이 2707 면적 카운트보다 작은 경우, 리포트는 # DL (검출 한계) (약 2.26 μg/mL)로 나타난다. 면적 카운트가 2707-9014인 경우, 리포트는 # QL (정량화 한계) (약 7.53 μg/mL)로 나타난다. 면적 카운트가 3 9014인 경우, 리포트는 거의 10％로 나타난다.
실시예 26; SDS-PAGE 및 디술피드 결합
나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
CTLA4A29YL104E-Ig의 분석을 위한 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 절차를 순도 시험으로 이용하였다. 샘플을 디티오트레이톨 (DTT)의 존재 (환원) 또는 부재 (비-환원) 하에 Tris-HCl (pH 6.8), SDS, 수크로스, 및 브로모페놀 블루 샘플 완충액 중에서 제조하였다. 샘플을 8O℃ 수조에서 2분 동안 두고, 프리-캐스트, 구배 (4-20％) 폴리아크릴아미드 SDS 겔에서 Tris-글리신 SDS 러닝 완충액을 사용하여 전기영동시켰다. 전기영동 후에, 겔을 고정시키고, 쿠마시 블루 또는 실버 염색 시스템을 사용하여 염색하였다. 비-환원된 CTLA4A29YL104E-Ig는 명백한 대략 분자량이 -104 kD인 하나의 큰 밴드로 관찰되었다. CTLA4A29YL104E-Ig는 명백한 대략 분자량이 약 53 kD인 하나의 주요 밴드로 관찰되었다.
공정 B 로트 000929-278, 공정 C 로트 224818-2004-007 및 공동-혼합물 로트 551218-162의 샘플을 환원 및 비-환원 조건 하에 4-20％ 구배 SDS-PAGE 겔을 사용하여 전기영동적으로 분할하였다. 겔을 도 35 및 도 36에 도시된 바와 같은 쿠마시 또는 실버 염색으로 분리적으로 염색하였다. 비-환원된 CTLA4A29YL104E-Ig의 SDS-PAGE는 온전한 단량체를 나타내는 대략 104 kDa에서 주요 밴드를 나타냈다. 전자 재생성에서 용이하게 보이지 않는 3개의 마이너 밴드는 또한 약 200, 65, 및 53 kDa에서 관찰되었다. CTLA4A29YL104E-Ig의 환원된 샘플은 단일쇄 형태를 나타내는 대략 53 kDa에서 주요 밴드를 나타내고, 약 150 kDa에서 마이너 밴드를 나타냈다. 이러한 비교는 3회 시험된 물질은 동일한 겔에서 분석한 경우와 비교가능함을 시사한다.
디술피드 결합
디술피드 결합은 로트 224818-2004-007을 사용하여 공정 C 약물 재료에 대해 특성화하였다. CTLA4A29YL104E-Ig의 각각의 쇄는 9개의 시스테인을 함유한다. 이들은 Cys21, Cys48, Cys66, Cys92, Cysl20, Cysl71, Cys231, Cys277 및 Cys335이다. 환원 및 비-환원 CTLA4A29YL104E-Ig 둘 다의 온-라인 LC/MS/MS로의 펩티드 맵핑을 이용하여 CTLA4A29YL104E-Ig에서 분자내 및 분자간 디술피드 연결의 부위를 확인하였다.
비-환원된 CTLA4A29YL104E-Ig의 펩티드 맵핑으로부터 얻은 펩티드 및 예상되고 관찰되는 MW의 목록은 표 27에 제시되어 있다.
비-환원된 펩티드 맵에서 특정 피크의 부재 및 환원된 펩티드 맵에서 새로운 피크의 존재는 Cys21-Cys92, Cysl71-Cys231 및 Cys277-Cys335의 디술피드 결합에 상응하는 세 가지 디술피드-연결된 펩티드: T2-T6, T11-T17, 및 T25-T30의 증거를 제공한다. 펩티드 T5 및 T7은 상대적으로 고분자량을 가지며, N-연결된 탄수화물을 함유하고, 이는 디술피드 연결이 위치하기 어렵게 한다. 보다 짧고 탄수화물-없는 펩티드를 생성하기 위해, CTLA4A29YL104E-Ig는 트립신 및 키모트립신의 혼합물로 분해시켰다. 추가의 키모트립신 절단의 결과로서, T7은 35-아미노산 펩티드로부터 N-연결된 탄수화물이 제거된 T7'-T7'로 지칭된 15-아미노산 펩티드로 짧아졌다. 디술피드-연결된 펩티드 T7'-T7'은 비-환원 맵에서 나타났다 (도 37 참조). T7'-T7'에서 MS/MS로 그의 서열 및 Cys120-Cys120에서 쇄간 디술피드 연결을 확인하였다.
Figure 112011097388832-pat00125
트립신 및 키모트립신의 혼합물로의 처리는 또한 트립신만으로 CTLA4A29YL104E-Ig의 가수분해에서 관찰된 다른 디술피드 연결된 펩티드의 보다 짧은 버젼에 상응하는 단편 형성을 초래한다. 이들은 표 28에 제시되어 있다.
Figure 112011097388832-pat00126
CTLA4A29YL104E-Ig의 트립신 및 키모트립신의 혼합물로의 분해는 T7-T7에서 디술피드 쌍을 성립하고, 트립신 만으로 분해시 관찰되는 디술피드 결합을 확인시켰다. 그러나, 이 효소 혼합물은 역시 당펩티드인 펩티드 T5에서 아무 효과도 갖지 않았다. T5로부터 N-연결된 탄수화물을 제거하기 위해, CTLA4A29YL104E-Ig를 도 38에 도시된 바와 같이 트립신 및 엘라스타제의 혼합물로 분해시켰다. 효소의 이 혼합물은 표 29에 제시된 바와 같은 (T5'-T5")로 지칭된 보다 짧은 펩티드를 생성하는 네 상이한 부위에서 T5를 가수분해하였다. 이 생성된 펩티드를 확장된 질량 1259 Da를 가지며, Cys46-Cys66에 상응하는 디술피드 연결을 함유한다. 비-환원된 CTLA4A29YL104E-Ig의 트립신 및 엘라스타제의 혼합물로의 가수분해로부터 얻은 펩티드 맵 프로파일은 도 38에 제시되어 있고, 펩티드 T5'-T5"의 서열은 표 29에 제시되어 있다.
Figure 112011097388832-pat00127
결과는 CTLA4A29YL104E-Ig가 위치 Cys21-Cys92 (T2-T6), Cys48-Cys66 (하나의 단일 펩티드 T5에 상응함), Cysl71-Cys231 (T11-T17) 및 Cys277-Cys335 (T25-T30)에서 네 분자간 디술피드 연결, 및 위치 Cysl20-Cysl20 (T7-T7)에서 한 쇄간 디술피드 연결을 가짐을 나타낸다. 데이타는 총 18개의 시스테인 잔기를 보고하였다. 불일치염기쌍은 관찰되지 않았다.
실시예 27: CTLA4 A29YL104E -Ig 제형
주입용 CTLA4A29YL104E-Ig, 100 mg/바이알은 멸균 비-발열성 동결건조물이었다. 약물 제품의 조성물은 표 30에 제시되어 있다. 이는 백색에서 회백색이며, I형 유리 바이알에서 제공된 전체 또는 단편 케익을 그레이 부틸 마개로 덮고, 알루미늄 씰로 밀봉하였다. 이 생성물은 바이알, 니들, 및 시린지 홀드업을 차지하는 10％ 넘치는 양을 포함하였다.
투여 전에, 주입용 CTLA4A29YL104E-Ig, 100 mg/바이알을 4.2 mL의 멸균수 주사용수, USP로 구성하여 농도 25 mg/mL가 되도록 하였다. 이는 5％ 덱스트로스 주입, USP 또는 0.9％ 염화나트륨 주입, USP로 1 mg/mL만큼 낮은 농도로 추가로 희석할 수 있다. 구성된 및 희석된 용액을 투명, 무색 및 눈에 보이는 검사상으로 특정 물질이 필수적으로 없었다.
주입용 CTLA4A29YL104E-Ig, 100 mg/바이알의 조성
구성성분 기능 바이알 당 양 (mg)
CTLA4A29YL104E-Ig 활성 성분 110a
수크로스 동결건조보호제 220
제일인산나트륨 일수화물 완충제 15.18
염화나트륨 이온 강도 조정제 2.55
1 N 수산화나트륨 pH 조정제 7.5±2까지
1 N 염산 pH 조정제 7.5±2까지
주사용수b 용매 5.5 mL까지 충분량
a 각각의 바이알은 바이알, 니들, 및 시린지 홀드업에 대해 10％ 넘치는 양을 함유한다.
b 동결건조 동안 제거됨
동결건조된 냉동 용액의 유리 전이 온도는 -28.9℃로 결정하였다. 동결 건조 연구를 다양한 선반 온도에서 수행하여 생성물 품질을 보증하지 않으면서 주요 건조 동안 가능한 가장 높은 선반 온도를 결정하였다. 이들 연구에 기초하여, CTLA4A29YL104E-Ig의 동결-건조 동안 주요 건조 단계를 위해 -20℃의 선반 온도를 선택하였다. 동결-건조 주기의 끝무렵, 바이알을 감압 하에 마개로 닫았다.
생성 공정은 동결 건조기 챔버에서 동결건조를 위한 벌킹 용액 (적합한 부형제와 함께)을 함유하는 냉동 바이알을 포함한 후, 조절된 온도 및 압력 하에 냉동된 물의 승화시켰다. 생성물 품질을 떨어뜨리지 않으면서 효율적인 승화를 가지기 위해 챔버에서 온도 및 압력 조건을 최적화시켰다.
용액과 다양한 생성물 접촉 표면의 병용가능성 및 팩키징 구성성분을 연구하였다. 용액은 스테인리스 스틸 316L, 실리콘 튜브인 아크로디스크 (Acrodisc; 상표명), HT 투프린 (Tuffryn) (폴리술폰), 밀리포어 (Millipore) PVDF (폴리비닐렌 플루오라이드) 필터 막 및 선택된 용기 밀폐 시스템과 병용가능한 것으로 밝혀졌다.
주입용 CTLA4A29YL104E-Ig, 100 mg/바이알은 15 cc I형 수석 튜브 유리 바이알로 포장하고, 20 mm 다이쿄 그레이 부틸 D-21-7-S/B2-TR 플루로-수지 코팅된 마개로 닫고, 20 mm 알루미늄 플립-오프 씰로 밀봉하였다.
CTLA4A29YL104E-Ig 주입용 바이알 선택은 5.5 mL의 가득찬 용량을 기준으로 하여 유효한 동결-건조를 보증하고, 20 mm 다이쿄 (Daikyo) 그레이 부틸 D-21-7-S/B2-TR 플루로-수지 코팅된 마개 선택은 병용가능성 데이타에 기초하였다.
광범위한 사용 시간 적합성 연구를 수행하였다. 멸균 주사용수와 함께 25 mg/mL로 구성된 CTLA4A29YL104E-Ig 주입용 100 mg/mL를 15℃ 내지 25℃ (59℉-77℉)의 주변 실온에서 실내등 하에 24시간 동안 저장할 수 있다. 희석된 0.9％ 염화나트륨 주입 (보통 식염수/NS) 또는 5％ 덱스트로스 주입 (D5W)으로 1 mg/ml 또는 10 mg/mL로 더 희석된 경우 구성된 용액은 PVC 또는 인트라 비아 (Intra Via) PVC-무함유 백 중에서 15℃ 내지 25℃ (59℉-77℉)의 주변 실온에서 실내등 하에 저장하고, 24시간 동안 효능 손실이 없거나 또는 고분자량 종이 증가함을 나타내었다. 희석된 용액은 투여 전에 0.2 μm 또는 1.2 μm 혼합된 셀룰로스/아세테이트 필터를 통해 여과해야 한다. 희석된 용액은 0.2 μm 및 1.2 μm 혼합된 셀룰로스/아세테이트 필터와 병용가능하다.
생성물은 실리콘과 병용불가능하다. 생성물은 실리콘과 접촉하면 눈에 보이는 입자를 형성한다. 따라서, 실리콘 처리된 표면, 예컨대 실리콘처리된 시린지와의 접촉은 피해야한다.
실시예 28: CTLA4-IG 생산 공정
CTLA4-Ig는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 사용하여 대규모 세포 배양물에서 분비된 단백질로 생성하였다. CTLA4-Ig 생성 공정은 일련의 플라스크 및 시드 생물반응기 접종 확장 단계를 이용하여 시작하였다. 최종 시드 생물반응기의 내용물을 이용하여 5000-L 생산 생물반응기를 접종하였다. 5000-L 생산 생물반응기로부터의 세포 배양물 수거물을 정화시키고, 정밀여과 및 한외여과에 의해 농축시켰다. 세포-무함유 수거 물질을 다운스트림 공정를 위한 제조에서 pH 및 전도율에 대해 조정하였다. CTLA4-Ig는 일련의 크로마토그래피 및 여과 단계를 이용하여 정제하였다. 다운스트림 CTLA4-Ig 생성 공정은 음이온 교환 크로마토그래피 두 단계, 소수성 상호작용 크로마토그래피 한 단계 및 친화성 크로마토그래피 한 단계를 포함한다. 이들 단계의 목적은 CTLA4-Ig 단백질을 정제하여, 고분자량 CTLA4-Ig 물질을 제거하고, CTLA4-Ig 약물 재료의 시알산 함량을 조절하는 것이다. 다운스트림 공정 단계는 또한 바이러스 불활성화 단계 및 바이러스 여과 단계를 포함하여 잠재적 우발성 바이러스제를 청소하였다. 정제된 CTLA4-Ig 약물 재료를 2-L 폴리카르보네이트 병에 채우고, -40℃의 표적 온도에서 저장하기 전에 -70℃의 표적 온도에서 냉동시켰다. 냉동된 약물 재료를 해동시켰다.
N-아세틸뉴라민산 (NANA)은 CTLA4-Ig 약물 재료에 존재하는 주요 시알산 종이다. 이 섹션에서 시알산에 대한 언급은 이 종을 특히 나타낸다. N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA)의 적은 수준이 또한 CTLA4-Ig 약물 재료에 존재한다. NANA 및 NGNA 둘 다의 수준을 최종 CTLA4-Ig 약물 재료에 대해 측정하였다. CTLA4-Ig 생성 공정에 대한 공정흐름도가 하기 제시되어 있다.
Figure 112011097388832-pat00128
CTLA4-Ig는 대략 작업 용량이 4300 L인 5000-L 생산 생물반응기에서 제조하였다. CTLA4-Ig 약물 재료의 한 뱃치를 세포 은행으로부터의 단일 바이알로부터 유래한 단일 생산 생물반응기로 구성하였다. 업스트림 세포 배양물 생성 공정은 세포 은행으로부터의 세포의 단일 바이알을 사용하여 시작하였다. 바이알을 해동하고, 전체 내용물을 사용하여 세포 배양물 성장 배지를 함유하는 T-플라스크를 시딩하였다. 이어서, 세포를 일련의 스피너 플라스크에서 확장시켰다. 최종 스피너 플라스크 접종 확장 단계로부터의 플라스크를 이용하여 140-L 시드 생물반응기를 접종하였다. 140-L 시드 생물반응기는 작업 용량이 대략 100 L였다. 140-L 시드 생물반응기의 내용물을 이용하여 1100-L 시드 생물반응기를 접종하였다. 1100-L 시드 생물반응기는 작업 용량이 대략 600 L였다. 1100-L 시드 생물반응기의 내용물을 이용하여 5000-L 생산 생물반응기를 시딩하였다. 세포를 5000-L 생산 생물반응기에서 대략 14일 동안 배양하였다. 생산 생물반응기 단계에 이어, 단일 생물반응기로부터의 세포 배양물 배양액을 추가의 공정을 위해 수거 용기로 옮겼다. 접선 유동 정밀여과 (MF) 유닛을 사용하여 숙주 세포 및 세포 잔해로부터 분비된 CTLA4-Ig 단백질을 분리하였다. 이어서, CTLA4-Ig 단백질-함유 MF 투과액을 한외여과 (UF)에 의해 농축시키고, 제1 크로마토그래피 단계를 위한 제조에서 pH 및 전도율에 대해 조정하였다.
CTLA4-Ig 약물 재료를 위한 정제 및 다운스트림 공정 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 바이러스 불활성화, 친화성 크로마토그래피, 접선 유동 UF 농축 및 정용여과, 바이러스 여과, 2차 음이온 교환 크로마토그래피 및 UF 농축 및 정용여과로 이루어진다. HIC 단계는 처리할 CTLA4-Ig의 양에 따라서 CTLA4-Ig 뱃치 당 다중 주기를 이용하였다. 다중 HIC 단계 주기로부터의 공정내 물질을 후속적 바이러스 불활성화 단계를 위해 풀링하였다. 상이한 로트로부터의 공정내 물질은 풀링하지 않았다. 다중 바이러스 필터를 병행하여 사용하여 CTLA4-Ig의 단일 로트를 처리하였다. 바이러스 여과에 이어, 여과액을 추가적 공정을 위해 풀링하였다.
CTLA4-Ig의 각각의 로트를 0.2 μm 필터를 통해 2-L 폴리카르보네이트 (PC) 병으로 여과하고, 2℃ 내지 8℃에서 일시적으로 저장하였다. CTLA4-Ig의 2-L PC 병을 표적 온도 -70℃에서 냉동시킨 후, 표적 온도 -40℃에서 저장하였다. 약물 재료의 병을 22℃ 내지 24℃의 인큐베이터에서 해동시키고, 선적하기 전에 2℃ 내지 8℃로 냉각시켰다.
생산
CTLA4-Ig를 차이니즈 (Chinese) 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 사용하여 대규모 세포 배양물에서 생산하였다. CTLA4-Ig 업스트림 생성 공정을 세포 은행으로부터의 냉동된 바이알의 해동으로 시작하였다. 배양액을 T-플라스크에서 증식시킨 후, 일련의 스피너 플라스크에서 배양하였다. 이들 배양액을 140-L 시드 생물반응기로 옮겼다. 140-L 시드 생물반응기로부터의 배양액을 1100-L 시드 생물반응기로 옮겼다. 1100-L 시드 생물반응기로부터의 배양액을 사용하여 5000-L 생산 생물반응기를 접종하였다. 생산 생물반응기를 CTLA4-Ig 단백질에 대한 표적 시알산의 몰비를 기준으로 주로 수거하였다. 세포 배양물 수거물을 정화시키고, 정밀여과 (MF) 및 한외여과 (UF)의 조합을 이용하여 농축시켰다. 최종적으로, 농축된 세포-무함유 수거 물질을 조정하여 다운스트림 공정을 위한 제조에서 특정 전도율 및 pH를 달성하였다.
세포 배양물 및 영양공급 배지 제조
고체 및 액체 배지 구성성분을 중량을 재고, 측정하였다. 두 세포 배양물 배지를 공정에서 사용하였다. 배지 127-G를 T-플라스크, 스피너 플라스크, 시드 생물반응기 및 생산 생물반응기 단계에서 사용하였다. 배지 117-E를 생산 생물반응기 단계에서 영양공급 배지로 사용하였다. 배지 127-G의 조성물은 바로 밑의 표에 제시되어 있다.
Figure 112011097388832-pat00129
배지 117-E의 조성물이 하기 제시되어 있다.
Figure 112011097388832-pat00130
e-RDF-1 배지의 조성물은 하기와 같다:
Figure 112011097388832-pat00131
표는 하기에 계속된다:
Figure 112011097388832-pat00132
공정에서 T-플라스크 및 스피너 플라스크에서 사용된 127-G 세포 배양 배지를 혼합을 위한 교반기 및 용량 결정을 위한 점진적 시야 유리가 장착된 배양 용기에서 제조하였다. T-플라스크 및 스피너 플라스크 접종 확장 단계에서 사용된 배지 127-G의 뱃치 크기는 75 L이었다. 배지 127-G를 주사용수 (WFI)를 사용하여 제조하였다. 고체 및 액체 배지 구성성분을 WFI에 첨가하였다. 각각의 성분의 첨가 후에 배지를 필요한 기간 동안 혼합하였다. WFI를 첨가하여 배지의 최종 뱃치 용량을 75 L가 되도록 하였다. 샘플을 최종 배지 제조액으로부터 제거하고, 배지가 한정된 허용 기준을 충족하는 것을 보증하기 위해 샘플의 글루코스 농도, pH, 및 삼투압을 측정하였다. 배지를 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 멸균 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜 (PETG) 병으로 분배하였다. T-플라스크 및 스피너 플라스크 접종 확장 단계를 위해 제조된 배지 127-G를 2 내지 8℃에서 최대 42일 동안 저장하였다. 140-L 및 1 100-L 시드 생물반응기 단계를 위한 배지 127-G를 혼합을 위한 교반기가 장착된 용기에서 제조하였다. 140-L 시드 생물반응기 단계에서 사용된 배지 127-G의 뱃치 크기는 120 L이었다. 140-L 시드 생물반응기에 대한 배지를 제조하기 위해 사용된 용기에 용량 결정을 위해 점진적 시야 유리를 장착하였다. 1100-L 시드 생물반응기 단계에서 사용된 배지 127-G의 뱃치 크기는 600 kg이었다. 1100-L 시드 생물반응기에 대한 배지를 제조하기 위해 사용된 용기에 중량 결정을 위해 차압 전송기를 장착하였다.
필요한 용량의 배지 127-G를 연속되는 0.2 및 0.1 μm 필터를 통해 140-L 및 1100-L 시드 생물반응기로 옮겼다. 140-L 및 1100-L 시드 생물반응기 단계를 위해 제조된 배지 127-G는 37℃에서 최대 48시간 동안 유지할 수 있다. 배지는 4℃에서 추가의 84시간 동안 유지할 수 있다.
5000-L 생산 생물반응기 단계에서 사용된 127-G 및 117-E 세포 배양물 배지 의 제조.
5000-L 생산 생물반응기 단계를 위한 배지 127-G를 교반기 및 중량 결정을 위한 차압 전송기가 장착된 배지 제조 용기에서 제조하였다. 5000-L 생산 생물반응기 단계에서 사용된 배지 127-G의 뱃치 크기는 2900 kg이었다. 필요한 용량의 배지 127-G를 연속되는 0.2 μm 및 0.1 μm 필터를 통해 5000-L 생산 생물반응기로 옮겼다. 5000-L 생산 생물반응기 단계를 위해 제조한 배지 127-G는 37℃에서 최대 48시간 동안 유지할 수 있다. 배지는 4℃에서 추가의 84시간 동안 유지할 수 있다.
영양공급 배지 117-E를 혼합을 위한 교반기가 장착된 배지 제조 용기 및 중량 결정을 위한 차압 전송기에서 제조하였다. 5000-L 생산 생물반응기 단계에서 사용된 배지 117-E의 뱃치 크기는 1800 kg이었다. 배지 117-E 구성성분을 배지 제조 용기에서 특정 중량의 WFI에 첨가하였다. 각각의 성분의 첨가 후에 배지를 필요한 기간 동안 혼합하였다. WFT를 첨가하여 배지를 특정 최종 중량이 되도록 하였다. 한정된 허용 기준을 충족시키는 것을 보증하기 위해, 샘플을 최종 배지 제조액으로부터 제거하여 샘플의 글루코스 농도, pH, 및 삼투압을 측정하였다. 필요한 용량의 배지 117-E를 연속되는 0.2 μm 내지 0.1 ∝m 필터를 통해 영양공급 배지 유지 탱크로 옮겼다. 5000-L 생산 생물반응기 단계에서 제조된 배지 1 17-E는 37℃에서 최대 2일 동안 유지할 수 있다. 배지는 4℃에서 추가의 4일 동안 유지할 수 있다.
T-플라스크에서의 접종원 확장 단계 및 스피너 플라스크 접종원 확장 단계
CTLA4-Ig 생성 공정의 T-플라스크 및 스피너 플라스크 접종 확장 단계의 목적은 세포 은행 바이알로부터 세포를 연속적으로 증식시켜 충분한 수의 생존가능한 세포를 제공하여 140-L 시드 생물반응기를 접종하는 것이다. 세포 은행으로부터의 단일 바이알을 액체 질소 저장 냉동기로부터 꺼내서, 37℃의 수조에서 해동시켰다. 바이알의 전체 내용물을 멸균 15-mL 원뿔형 원심분리 튜브로 무균적으로 옮겼다. 배지 127-G를 첨가하여 최종 용량이 10 mL가 되게 하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 10 mL의 127-G 세포 배양 배지에서 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 10 mL의 배지 127-G를 함유하는 T-175 플라스크에 옮겼다. T-175 플라스크에서 생존가능한 세포 밀도 및 배양액의 생존가능률을 결정하였다. 이 단계에서 생존가능률 84％ 이상을 성립하였다. 배지 127-G를 T-175 플라스크에 첨가하여 표적 생존가능한 세포 밀도 2.1 x 105 세포/mL를 달성하였다.
T-175 플라스크를 37℃에서 6％ 이산화탄소 대기에서 최대 4일 동안 인큐베이션시켜 표적 최종 세포 수를 1.80 x 107 생존가능한 세포를 달성하였다. T-175 플라스크 단계에 이어, 배양액을 일련의 0.25-L, 1-L, 및 3-L 스피너 플라스크 단계를 이용하여 확장하였다. 각각의 계대배양에서, 세포를 2.0 x 105 생존가능한 세포/mL의 표적 밀도에서 시딩하였다. 스피너 플라스크 배양액을 37℃에서 6％ 이산화탄소 대기 하에 인큐베이션시켰다.
최종 3-L 스피너 플라스크 접종 확장 단계로부터의 세포 배양물 물질을 멸균된 20-L 접종 이동 용기에서 풀링하였다. 3-L 스피너 플라스크 접종 확장 단계에서 최종 생존가능한 세포 밀도 1.0 내지 2.0 x 106 세포/mL 및 최소 세포 생존가능률 80％ 이상을 성립하였다. 이들 예시값은 충분한 수의 생존가능한 세포를 사용하여 140-L 시드 생물반응기를 접종하는 것을 보증한다. 총 용량 12 L 내지 18 L의 최종 3-L 스피너 플라스크 접종 확장 단계로부터의 풀링된 세포 배양물을 사용하여 140-L 시드 생물반응기를 접종하였다.
140-L 및 1100-L 시드 생물반응기 접종원 확장 단계
CTLA4-Ig 생성 공정의 140-L 및 1100-L 시드 생물반응기 접종 확장 단계의 목적은 충분한 수의 생존가능한 세포를 제공하여 5000-L 생산 생물반응기를 접종하는 것이다. 시드 생물반응기를 세포 배양 배지 127-G를 사용하여 뱃치 방식으로 조작하였다. 온도, pH, 용해된 산소, 압력, 교반 및 공기, 산소, 및 이산화탄소에 대한 기체 유속을 분산 제어 시스템 (DCS)에 의해 조절하여 시드 생물반응기에서 배양액의 최적 성장을 위한 조건을 제공하였다. 시드 생물반응기를 37℃에서 조작하였다. 배양액 샘플을 생존가능한 세포 밀도, 생존가능률 및 대사산물 농도의 측정을 위해 시드 생물반응기로부터 제거하였다.
140-L 시드 생물반응기를 3-L 스피너 플라스크 접종 확장 단계로부터의 풀링된 접종물로 표적 초기 생존가능한 세포 밀도 2.0 x 105 세포/mL로 접종하였다. 1100-L 시드 생물반응기 접종 확장 단계에서 최종 생존가능한 세포 밀도 1.0 내지 2.5 x 106 세포/mL 및 최소 세포 생존가능률 80％ 이상을 성립하였다. 이들 허용 기준은 충분한 수의 생존가능한 세포를 사용하여 5000-L 생산 생물반응기를 접종하는 것을 보증한다. 1100-L 시드 생물반응기로부터의 세포 배양물을 5000-L 생산 생물반응기로 옮겨 표적 초기 생존가능한 세포 밀도 1.5 x 105 세포/mL를 달성하였다.
생산 생물반응기 단계
5000-L 생산 생물반응기 단계의 목적은 생존가능한 세포의 수를 확장하여 CTLA4-Ig 단백질을 생성하는 것이다. 생산 생물반응기 단계 기간은 대략 14일이다. 1100-L 시드 생물반응기로부터의 접종원을 세포 배양 배지 127-G를 함유하는 5000-L 생산 생물반응기로 시딩하였다. 생산 생물반응기를 영양공급-뱃치 방식으로 조작하였다. 온도, pH, 용해된 산소, 압력, 교반 및 공기, 산소, 및 이산화탄소에 대한 기체 유속을 DCS에 의해 조절하여 배양액의 최적 성장 및 생산 생물반응기에서 CTLA4-Ig 단백질의 생성을 위한 조건을 제공하였다.
5000-L 생산 생물반응기 단계 동안 삼 단계 온도 조절 전략을 이용하여 세포 성장 및 CTLA4-Ig 생성을 최적화시켰다. 생산 생물반응기의 초기 인큐베이션 온도는 37℃에서 조절하여 최적 세포 성장을 달성하였다. 생산 생물반응기에서 생존가능한 세포 밀도가 4.0 x 106 세포/mL로 달성되거나, 접종시로부터 144시간째 중 먼저 도달한 때에 온도를 34℃로 낮추었다. 온도를 240시간째에 32℃로 낮추고, 수거할 때까지 32℃에서 유지하였다. 매일 샘플을 5000-L 생산 생물반응기로부터 얻어 세포 성장, 세포 생존가능성, 대사산물 농도, CTLA4-Ig 역가 및 CTLA4-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비를 모니터링하였다.
배지 117-E의 생산 생물반응기로의 공급은 접종시로부터 12 내지 24시간째에 시작하였다. 배지 117-E를 매일 첨가하여 영양공급 배지 117-E의 배양 용량 또는 충분한 용량에 1％ (v/v)의 영양공급 배지의 표적을 달성하여 글루코스 농도가 3 g/L가 되도록 하였다. 이 영양공급 전략은 배양액에 충분한 수준의 글루코스 및 다른 영양물을 제공하여 생산 생물반응기 단계 동안 CTLA4-Ig 단백질의 생성을 지속시킨다.
배지 117-E는 D-갈락토스를 보충하여 CTLA4-Ig 단백질의 증가된 글리코실화를 촉진하였다. 갈락토스 보충은 CTLA4-Ig 단백질의 말단 시알산 함량의 증가를 초래한다. CTLA4-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비는 CTLA4-Ig 생성 공정에서 중요한 수거 기준이다.
세-단계 전략을 또한 생산 생물반응기에서 용해된 산소 및 교반 속도를 조절하기 위해 사용하였다. 30 rpm의 초기 교반 속도는 물리적 조건의 균일성을 보증하며, 5000-L 생산 생물반응기 내의 세포의 정착을 방지한다. 40％의 초기 용해된 산소 설정치는 충분한 수준의 용해된 산소의 유효성을 보증하여 생산 생물반응기에서 배양액의 성장을 지지한다. 용해된 산소 및 교반 속도에 대한 설정치는 접종시부터 96시간째에 50％ 및 40 rpm으로 각각 증가하였다. 접종시로부터 120시간째에, 용해된 산소에 대한 설정치 및 교반 속도는 60％ 및 50 rpm으로 각각 추가로 증가하였다. 이 전략은 충분한 수준의 용해된 산소를 보증하여 생산 생물반응기 단계 동안 세포 배양물을 유지한다. CTLA4-Ig 단백질의 역가는 생산 생물반응기 단계의 과정 동안 증가하였다. 배양 생존가능성을 이 단계의 과정을 통해 모니터링하였다. CTLA4-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비를 접종 6일째부터 수거시까지 1일 2회 모니터링하였다. CTLA4-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비는 접종시부터 8일 정도에서 대략 10에서 피크를 나타낸 후, 생산 생물반응기 단계의 남은 기간 동안 점진적으로 감소하였다. 냈다. 생산 생물반응기에 대한 주된 수거 기준은 CTLA4-Ig 단백질에 대한 시알산의 몰비이다. 생산 생물반응기를 CTLA4-Ig 단백질에 대한 표적 시알산의 몰비 8.0에서 수거하였다.
38％의 최소 세포 생존가능성 값은 또한 배양액의 수거를 위해 성립하였다. 이들 수거 기준은 CTLA4-Ig 약물 재료로의 다운스트림 공정에 대한 공정내 수거 물질의 일관성을 보증한다. CTLA4-Ig 업스트림 생성 공정에서 생산 생물반응기의 수거를 통한 접종 확장의 시작으로부터 세포 생성의 총수는 대략 38 세대였다. 공정에서 사용된 세포주는 세포주 안정성 연구에서 105 세대에 대해 안정한 것으로 증명되었다.
수거 조작 단계
수거 조작 단계의 목적은 수거 물질로부터 세포 및 세포 잔해를 제거하고, 추가적 다운스트림 공정을 위해 CTLA4-Ig 단백질을 함유하는 공정내 스트림을 농축시키는 것이다. 수거 물질을 처리하기 전에 MF 및 UF 시스템을 멸균하였다. MF 및 UF 시스템을 과초산 용액으로 플러싱하였다. 이어서, MF 및 UF 시스템을 표백 용액 및 수산화나트륨 용액으로 각각 처리하였다. 최종적으로, MF 및 UF 시스템을 보유물 및 투과액의 3 μS/cm 이상의 전도율이 달성될 때까지 WFI로 플러싱하였다. 세포 배양물 배양액을 5000-L 생산 생물반응기로부터 수거 용기로 옮겼다. 0.65 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 막이 있는 접선 유동 MF를 CTLA4-Ig 단백질을 함유하는 공정내 수거 물질로부터 세포 및 세포 잔해를 제거하기 위해 사용하였다. 세포-무함유 MF 투과액을 투과액 용기에 수집하였다. 세포-무함유 MF 투과액을 30 킬로달톤 (kDa) 공칭 분자량 컷오프의 폴리에테르술폰 막을 사용하여 접선 유동 UF에 의해 동시에 농축시켰다. UF 투과액을 MF 공정 단계를 위한 정용여과 배지로서 사용하였다. 0.1 N 인산 용액을 MF 시스템의 저장을 위해 사용하였다. 0.1 N 수산화나트륨 용액을 UF 시스템의 저장을 위해 사용하였다. 온도, 투과액 및 보유 유속 및 막 압력을 모니터링하여 MF 및 UF 조작 동안 조절하였다. 유속을 여과 스키드 상에 존재하는 인-라인 유량계에 의해 측정하였다. 센서를 이용하여 압력 및 온도를 측정하였다. MF 보유물 유속 163 내지 235 L/min 및 MF 막 압력 ≤ 3.8 psig 을 성립하였다. 이들 값은 수거 조작 단계의 수행에서 일관성을 보증한다.
수거 조작에서 최종 단계는 정화시킨 및 농축된 공정내 수거 물질의 pH 및 전도율 조정이다. 농축된 공정내 수거 물질의 pH 및 전도율을 조정하여 첫 번째 다운스트림 크로마토그래피 공정 단계 동안 CTLA4-Ig 단백질을 포착하였다. 2 M Tris 용액을 첨가하여 pH를 8.0으로 조정하고, WFI를 첨가하여 농축된 투과액의 전도율을 10 mS/cm로 감소시켰다. 이어서, 농축된 및 조정된 공정내 수거 물질을 0.2 μm 1회용 필터를 함유하는 3개의 병렬 및 하나의 연속 필터 하우징을 통해 여과하고, 다운스트림 정제 영역에서 서지 탱크로 옮겼다.
CD-CHO 배지의 조성
구성성분 농도
CD-CHO 25x 산 가용성물질 I 40.0 mL/L
CD-CHO 25x 산 가용성물질 II 40.0 mL/L
CD-CHO 25x 농축염 I 40.0 mL/L
CD-CHO 25x 농축염 II 40.0 mL/L
L-글루타민 0.585 g/L
r-인간 인슐린 (10 mg/mL 용액) 0.1 mL/L
메토트렉세이트 (25 mg/mL 용액) 0.0018 mL/L
중탄산나트륨 2.22 g/L
주사용수 필요한 만큼
1 M HCl 용액 pH를 조정하는 데 필요한 만큼
10 N NaOH 용액 pH를 조정하는 데 필요한 만큼
eRDF 영양공급 배지의 조성
구성성분 농도
eRDF-1 배지 16.80 g/L
덱스트로스 30.9 g/L
D-갈락토스 12.6 g/L
L-글루타민 4.10 g/L
r-인간 인슐린 (10 mg/mL 용액) 1.00 mL/L
TC 이스톨레이트 5 g/L
주사용수 필요한 만큼
1 M HCl 용액 pH를 조정하는 데 필요한 만큼
10 N NaOH 용액 pH를 조정하는 데 필요한 만큼
변형된 50％ CD-CHO 배지의 조성
구성성분 농도
CD-CHO 25x 산 가용성물질 I 20.0 mL/L
CD-CHO 25x 산 가용성물질 II 20.0 mL/L
CD-CHO 25x 농축 염 I 20.0 mL/L
CD-CHO 25x 농축 염 II 20.0 mL/L
D-갈락토스 0.4 g/L
r-인간 인슐린 (10 mg/mL 용액) 0.05 mL/L
중탄산나트륨 1.11 g/L
주사용수 필요한 만큼
1 M HCl 용액 pH를 조정하는 데 필요한 만큼
10 N NaOH 용액 pH를 조정하는 데 필요한 만큼
실시예 29- CTLA4-Ig 정제 공정
실시예 28에 기재된 수거 조작 단계로부터의 최종 pH- 및 전도율-조정된 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 1차로 처리하였다. 이어서, 이 1차 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 생성물 풀을 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 이용하여 처리하였다. 이어서, CTL A4-Ig-함유 물질을 트리톤 X-100으로 처리하여 잠재적 우발적 바이러스제를 불활성화시켰다. 트리톤 X-100- 처리된 물질을 재조합 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계를 이용하여 처리하였다. 재조합 단백질 A 크로마토그래피 단계로부터의 생성물 풀을 농축시키고, 정용여과하였다. 이어서, 잠재적 우발적 바이러스제의 제거를 위한 바이러스 여과 단계를 수행하였다. 여과액을 2차 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 추가로 정제하였다. 최종적으로, 정제된 CTLA4-Ig 단백질을 농축시키고, 최종 약물 재료 완충액으로 정용여과하였다.
CTLA4-Ig는 IgGl 부류의 인간 세포독성 T-림프구 항원-4의 기능성 결합 도메인 및 인간 모노클로날 면역글로불린의 Fc 도메인로 이루어진 유전학적으로 조작한 융합 단백질이다. CTLA4-Ig 이량체는 단일 디술피드 결합을 통해 공유 결합된 각각 대략 46 kDa의 2개의 상동 글리코실화 폴리펩티드 쇄로 이루어졌다. CTLA4-Ig 생성 공정의 다운스트림 단계에 대한 공정흐름도가 제시되어 있다. CTLA4-Ig를 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 사용하여 5000-L 생산 생물반응기에서 생성하였다.
다운스트림 CTLA4-Ig 생성 공정에서 크로마토그래피 및 여과 단계를 주변 온도에서 수행하였다. 공정내 물질을 공정 단계 동안 2 내지 8℃에서 저장하였다. 다운스트림 공정을 수거 조작 단계로부터의 공정내 수거 물질의 수령으로 시작하였다. 이 물질을 Q 세파로스 (상표명) 익스트림 로드 (QXL) 수지를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통해 1차 처리하였다. QXL 칼럼은 수거 물질로부터 CTLA4-Ig 단백질을 포착하는 역할을 한다. QXL 칼럼 포착 단계는 또한 다운스트림 공정을 위한 용량 감소를 달성하였다.
QXL 생성물 풀은 페닐 세파로스 패스트 플로우 수지를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 칼럼을 통과시켰다. 이 단계 동안, CLTA4-Ig 고분자량 (HMW) 물질 및 차이니즈 햄스터 난소 숙주 세포 단백질 (CHOP)은 칼럼에 결합하였다. CLTA4-Ig 이량체 단백질은 HIC 수지에 결합하지 않고, 칼럼을 통과하였다. HIC 단계에 이어, 트리톤 (등록상표) X-100 세정제를 사용한 바이러스 불활성화 (VI)를 수행하여 잠재적 우발적 바이러스제를 불활성화시켰다. 다음 단계는 재조합 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 (rPA) 수지 친화성 칼럼을 이용하였다. 이 크로마토그래피 단계에서, CHOP 및 단핵구 주화성 단백질 1 (MCP-1)의 수준은 감소되었다. rPA 단계는 바이러스 청소 단계로 정의된다. 친화성 크로마토그래피 단계에 이어, CLTA4-Ig 단백질을 농축시키고, 30 kDa 한외여과 (UF) 막을 사용하여 정용여과하고, 플라노바 (Planova; 상표명) 15 nm 필터를 통해 처리하여 잠재적 우발적 작용제를 제거하였다. 바이러스 여과 (VF) 단계가 완료되면, CLTA4-Ig 단백질을 Q 세파로스 패스트 플로우 (QFF) 수지를 사용하여 2차 음이온 교환 칼럼 상에서 처리하였다. QFF 크로마토그래피 단계는 잔여 재조합 단백질 A 및 DNA 수준을 감소시켰다. QFF 단계는 바이러스 청소 단계로 정의한다. 최종적으로, CLTA4-Ig 단백질을 농축시키고, 25 mM 인산나트륨, 50 mM NaCl, pH 7.5의 용액에 대해 30 kDa UF 막을 사용하여 정용여과하였다. 이어서, CLTA4-Ig 약물 재료는 최종 충전 단계 전에 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다.
Figure 112011097388832-pat00133
공정-관련 불순물 CHOP, MCP-1, 잔여 재조합 단백질 A, DNA 및 트리톤 X-100은 CTLA4-Ig 생성 공정의 특정 다운스트림 공정 단계에서 감소하였다. 작용 한계가 있는 PP는 각각의 불순물에 대한 공정내 제어 포인트에서 성립하였다. 생성물 풀 CHOP 및 MCP-1은 rPA 크로마토그래피 단계에 대해 PP로서 확인하였다. 생성물 풀 잔여 재조합 단백질 A 리간드, DNA 및 트리톤 X-100은 QFF 크로마토그래피 단계에 대해 PP로서 확인하였다. 인슐린의 공지된 구조 및 크로마토그래피 보유를 기준으로, HIC, rPA 및 QFF 단계는 상호작용의 직교 방식을 기준으로 인슐린의 유의한 청소를 제공해야 한다. 또한, 분자량 5.8 kDa인 인슐린은 수거 및 다운스트림 공정에서 30 kDa 농축/정용여과 세 단계에 의해 청소되어야 한다. rPA 단계는 메토트렉세이트 (MTX)의 3.0 log10 초과 청소를 제공하였다. 또한, 분자량 0.455 kDa의 MTX는 수거 및 다운스트림 공정에서 30 kDa 농축/정용여과 세 단계에 의해 청소되어야 한다. 인슐린 및 MTX를 발효 배지에 고정된 양으로 첨가하고, 다운스트림 공정 전에 5000-L 발효 공정 동안 세포 대사의 기능으로서 소모되었다. 인슐린 및 MTX를 다운스트림 공정에서 다중 포인트에서 측정하였다. 각각의 이들 포인트에서 인슐린 및 MTX 수준은 완료된 여태까지의 러닝에 대한 정량화 수준 이하였다.
완충액: 완충액 제조의 목적은 예시값, 작용 한계 및 경고 한계를 충족하는 다운스트림 공정 완충액을 생성하는 것이다. 일관된 완충액 품질은 재현가능한 크로마토그래피 수행을 보증하기 위해 필수적이다. CTLA4-Ig 공정 CD-CHO1의 다운스트림 단계는 17개의 완충액 및 용액을 필요로 하였다. 완충액 및 용액을 제조하고, 로트 내에서 특정 공정 단계를 위해 사용하였다. CTLA4-Ig 공정내 물질과 접촉한 완충액을 유의한 공정 완충액으로 고려하였다. 생성물-접촉 완충액은 평형화, 세척, 용출 및 생성물 풀 조정 완충액을 포함한다. 청소 및 멸균 단계 및 크로마토그래피 스키드에서 자외선 (UV) 검출기의 기능성 시험에서 사용된 완충액 및 용액은 광범위한 특정 범위를 갖는다. 이들 완충액 및 용액에 대한 넓은 특정 범위 및 생성물 접촉의 부재로 인해, PP를 이들 완충액 및 용액으로 지칭하지 않았다. 10개의 생성물-접촉 완충액 및 상응하는 예시값으로 한정된 PP를 요약하였다. 이들 완충액에 대한 최대 유지 시간 한계는 3일이고, 이는 완충액 용기 유지 연구로부터 유래하였으며, 완충액 안정성 연구에 의해 지지되었다. 생성물-접촉 완충액은 또한 상응하는 경고 한계를 갖는 PP로 지칭하였다. 이들 완충액에 대한 PP 및 상응하는 경고 한계가 존재하였다. CTLA4-Ig 공정내 물질과 접촉하게 되지 않는 완충액 및 용액은 경고 또는 작용 한계를 갖는 PP로 지칭되며, 이는 존재하였다. 비 생성물-접촉 완충액 및 용액은 내독소에 대해 시험하지 않았는데, 이는 이들이 칼럼 멸균 단계가 뒤따르는 멸균 용액 또는 크로마토그래피 수지 청소 완충액 또는 용액이기 때문이다.
Q 세파로스 익스트림 로드 음이온 교환 크로마토그래피 단계.
음이온 교환 크로마토그래피를 GE 헬스케어 (이전에는 아머샴 바이오사이언시즈)로부터의 QXL 수지를 사용하여 수행하였다. 1.0 m 내부 직경 칼럼을 QXL 수지로 133 내지 188 L의 용량을 나타내는 17 내지 24 cm의 높이까지 팩킹하였다. 팩킹된 칼럼의 이론단 (HETP) 및 비대칭 (As)과 동등한 높이를 결정함으로써 칼럼을 사용하기 위해 정성화하였다. 0.02 내지 0.08 cm의 HETP 및 0.8 내지 1.2의 As가 QXL 칼럼의 정성화를 위해 필요하였다. QXL 칼럼은 공정내 수거 물질로부터 CTLA4-Ig 단백질을 포착하는 역할을 하였다. QXL 포착 단계는 또한 추가적 다운스트림 공정를 위해 용량 감소를 달성하였다. QXL 칼럼 조작을 주변 온도에서 수행하였다. 정화시킨 세포 배양물 배양액을 평형화 QXL 칼럼에 로딩하였다. QXL 크로마토그래피 단계는 최대 유속 28 L/min을 사용하여 수행하였다. 칼럼 주입 압력은 35 psig 이하로 유지하였다. QXL 칼럼에 대한 최대 아바타셉트 단백질 적재량은 수지 1 리터 당 아바타셉트 28 그램이었다. 칼럼을 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 평형화시켜 제조하였다. 칼럼 평형화에 이어, 수거 물질을 280 nm에서 유출액의 UV의 흡수를 지속적으로 모니터링하면서 칼럼 상에서 로딩하였다. 로드 어플리케이션에 이어, 칼럼을 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 세척하였다. CTLA4-Ig 단백질을 25 mM HEPES, 850 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 칼럼으로부터 용출시켰다. 바로 밑의 표는 Q 세파로스 익스트림 로드 크로마토그래피 단계를 위한 공정 파라미터를 제시한다.
Figure 112011097388832-pat00134
수거 유지 시간은 성립된 경고 한계로 공정 일관성을 보증한다. 예비-여과 생성물 풀 바이오버든 파라미터는 경고 및 작용 한계를 10 cfu/mL 미만 및 100 cfu/mL 미만으로 각각 그 사이에 할당하였다. 작용 한계에 의해 한정된 6개의 QXL PP는 칼럼 높이, 유속, 세척 완충액 전도율, 용출 피크 끝 광학 밀도 (OD), 단계 수율 및 로드 바이오버든이다. 충분한 용량의 수지를 제공하도록 칼럼 높이 범위를 성립하여 수거 물질로부터 생성물을 포착하였다. 이 파라미터에 대한 작용 한계를 데이타로부터 성립하였다. 유속은 크로마토그래피 단계의 일관성 및 수행을 보증하기 위한 중요한 인자이다. 이는 QXL 단계에 대해 최대 작용 한계를 갖는 PP로 한정된다. 세척 완충액 전도율은 QXL 수지로부터 약하게 결합된 불순물을 제거하기 위해 성립하였다. 스케일-다운 범위 연구는 이 파라미터가 QXL 단계의 일관성을 유지하는 데 중요한 인자임을 결정하였다. 용출 피크 끝 OD는 생성물 풀에서 CTLA4-Ig HMW 물질의 수준을 최소화하도록 한정하였다. CTLA4-Ig HMW 물질을 용출 피크의 끝에서 용출시켰다. 단계 수율 작용 한계는 QXL 단계에 대한 공정 일관성을 보증한다. 유속, 용출 피크 끝 OD 및 단계 수율 PP에 대한 작용 한계를 성립하였다. 로드 바이오버든은 작용 한계 1 cfu/mL 미만으로 할당하였다. 12개의 QXL PP는 제공된 바와 같은 경고 한계에 의해 한정된다.
공정에서 완충액 pH 및 전도율 값을 모니터링하였다. 제조시에 pH 및 전도율 예시값을 충족시키지 않은 완충액은 불합격시키고, 완충액 로트를 버렸다. QXL 단계를 위해, 평형화 완충액 전도율 및 pH, 세척 완충액 pH, 및 용출 완충액 전도율 및 pH를 한정하였다. 칼럼 주입 압력은 결합-및-용출 크로마토그래피 단계 동안 일관성을 보증한다. QXL 단계를 최대 압력 한계 35 psig에서 수행하였다. 압력 한계 35 psig은 제조업자의 설명서에 따라 QXL 수지의 압축을 방지하였다. 생성물 풀 전도율은 경고 한계를 갖는 PP이다. 생성물 풀 전도율의 경고 한계를 할당하여 QXL 생성물 풀에서 CTLA4-Ig HMW 물질 및 CHOP가 후속적 HIC 칼럼에 효과적으로 결합함을 보증하였다. 경고 한계 58.5 내지 69.1 mS/cm를 성립하였다. 생성물 풀 역가, 시알산 (SA) N-아세틸뉴라민산 (NANA) 몰비, CTLA4-Ig HMW 물질 및 CHOP의 경고 한계를 할당하여 공정 일관성을 보증하였다. 생성물 풀 역가 및 SA 경고 한계를 성립하였다.
수거 조작 단계로부터의 공정내 물질을 QXL 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 최소 10 CV의 세척 완충액 (25 mM HEPES, 120 mM NaCl, pH 8.0)으로 세척하고, 280 nm (A280)에서 칼럼 유출액의 흡광도를 세척 단계가 끝날 때 측정하였다. 이어서, 아바타셉트를 칼럼으로부터 25 mM HEPES, 850 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 용출시켰다. A280이 세척 단계가 끝날 때 AU 값 위로 ≥ 0.02 흡광도 단위 (AU)로 증가할 때, 용출액을 수집 용기로 전환시켰다. 용출 피크 뒷전의 A28O이 ≤ 1.0 AU 값으로 감소할 때까지 용출액을 수집하였다. 용출 완충액을 용출액 수집 용기로 직접 첨가하여 용출액 표적 중량 600 ± 10 kg을 달성하였다. 용출액 수집 용기에서 교반 속도 30 ± 5 rpm으로 내용물이 잘 혼합된 것을 보증하였다. 5분 이상 혼합한 후에, 수집 용기의 내용물을 0.2 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 유지 용기로 직접 여과하였다. 추가의 ε 50 kg의 용출 완충액을 수집 용기에 첨가한 후, 0.2 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 동일한 유지 용기로 여과하였다. 유지 용기의 내용물을 2℃ 내지 8℃에서 72시간 정도 동안 저장하였다.
[표 5]
Figure 112011097388832-pat00135
페닐 세파로스 패스트 플로우 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계
HIC 단계의 주목적은 QXL 생성물 풀에 존재하는 CTLA4-Ig 고분자량 종 (예컨대, 사량체)의 수준을 감소시키는 것이다. CTLA4-Ig 사량체는 HIC 단계에서 사용되는 로딩 조건 하에 HIC 수지에 결합하지 않는다.
HIC 단계를 GE 헬스케어로부터의 페닐 세파로스 패스트 플로우 수지를 사용하여 수행하였다. HIC 칼럼은 CTLA4-Ig HMW 물질 및 CHOP에 결합함으로써, CTLA4-Ig 단백질 스트림에서 그의 농도를 감소시켰다. HIC 칼럼을 25 mM HEPES, 850 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 평형화시켜 제조하였다. QXL 단계로부터의 CTLA4-Ig 생성물 풀을 평형화 칼럼을 적용하였다. 로드 어플리케이션에 이어, 25 mM HEPES, 850 mM NaCl, pH 7.0 완충액을 칼럼에 적용하였다. CTLA4-Ig을 유통 (flowthrough) 및 칼럼 추적 분획에서 칼럼으로부터 수집하였다. HIC 칼럼은 다중 주기로 조작하여 QXL 생성물 풀에서 CTLA4-Ig의 총질량에 따라 달라지는 CTLA4-Ig의 단일 로트를 처리하였다. 칼럼은 주기 및 로트 사이에 청소하고 멸균하였다.
HIC 로드 바이오버든 PP를 경고 및 작용 한계에 의해 한정하였다. HIC 로드 바이오버든 PP를 그 사이에 경고 및 작용 한계 < 10 cfu/mL 및 < 100 cfu/mL, 각각으로 할당하였다. 칼럼에 대해 한정된 5가지 HIC 값은 칼럼 높이, 유속, 추적 끝 OD, 단계 수율 및 로딩 유지 시간이다. 칼럼 높이를 결정하여 충분한 수지 용량을 제공하여 로트 당 1, 2 또는 3 주기에서 QXL 칼럼으로부터 용출 풀을 처리하였다. 이 파라미터에 대한 작용 한계를 데이타로부터 성립하였다. 유속은 크로마토그래피 단계의 일관성 및 수행을 보증하기 위한 중요한 인자이다. 이는 최대 작용 한계를 갖는 공정 파라미터로서 HIC 단계에 대해 한정된다. 추적 끝 OD를 한정하여 생성물 풀에서 CTLA4-Ig HMW 물질의 수준을 최소화하였다. CTLA4-Ig HMW 물질을 생성물 피크 끝에서 용출시켰다. 공정 단계 수율은 HIC 단계에 대한 공정 일관성을 보증한다. 유속, 추적 끝 OD 및 단계 수율 PP에 대한 작용 한계를 성립하였다. 로딩 유지 시간에 대한 작용 한계는 공정 일관성을 보증한다. 5일 이하의 로딩 유지 시간 PP의 작용 한계는 생성물 용기 유지 시간 연구 및 생화학 안정성 연구에 의해 지지하였다. 9가지 HlC PP를 제공된 바와 같은 경고 한계에 의해 한정하였다. 다운스트림 공정에서 완충액 pH 및 전도율 파라미터는 PP를 경고 한계로 확인하였다. 제조시 pH 및 전도율 예시값을 충족하지 않는 완충액은 불합격시키고, 완충액 로트를 버렸다. HIC 단계를 위해, 평형화/추적 완충액의 전도율 및 pH는 PP를 경고 한계로 한정하였다.
칼럼 주입 압력은 크로마토그래피 단계 동안 일관성을 보증한다.
HIC 단계를 최대 압력 한계 13 psig에서 수행하였다. 압력 한계 13 psig를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 HIC 수지의 압축을 방지하였다. 생성물 풀 역가 및 SA 경고 한계는 공정 일관성을 보증하고, PAR 보고에서 성립하였다. 생성물 풀 DNA, CHOP 및 MCP-1는 이 단계에서 경고 한계로 설정하여 후속적 rPA 단계에서 그의 제거의 정량화를 용이하게 하였다.
[표 7]
Figure 112011097388832-pat00136
바이러스 불활성화 단계 : HIC 단계로부터의 생성물 풀에서 잠재적 우발적 바이러스제의 불활성화는 20％ 트리톤 X-100을 최종 농도 0.5％ (v/v)로 첨가함으로써 달성하였다. 세정제-처리된 용액을 혼합하고, 다음 단계로 진행하기 전에 1 내지 4시간 동안 22±3℃에서 유지하였다. VI 단계에 한정된 5개의 PP가 존재하였다. 20％ 트리톤 X-100 첨가 파라미터의 상한은 3.8％였다. 바이러스 불활성화 단계에 대한 공정 파라미터를 제시하는 바로 밑의 표를 참고한다.
Figure 112011097388832-pat00137
[표 9]
Figure 112011097388832-pat00138
재조합 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 친화도 단계.
친화도 크로마토그래피를 GE 헬스케어로부터의 고정된 rPA 수지를 사용하여 수행하였다. rPA 크로마토그래피 단계를 CHOP, MCP-1 및 잠재적 우발적 바이러스제의 수준을 감소시킴으로써 CTLA4-Ig 단백질을 추가로 정제하였다. 친화성 크로마토그래피 칼럼을 25 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 평형화시켰다. 칼럼의 평형화 후에, VI 단계로부터의 트리톤 X-100 처리된 물질을 친화성 크로마토그래피 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 25 mM Tris, 250 mM NaCl, 0.5％ 트리톤 X-100, pH 8.0 완충액으로 1차 세척하고, 이어서 25 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 2차 세척하였다. CTLA4-Ig 단백질을 칼럼으로부터 100 mM 글리신, pH 3.5 완충액으로 용출시켰다. 친화성 칼럼의 생성물 풀의 pH를 2 M HEPES, pH 8.0 완충액으로 7.5 ± 0.2로 조정하였다. rPA 단계에 대해 한정된 4가지 PP는 표 10에 제시되어 있다. rPA 크로마토그래피 단계는 바이러스 청소 단계로서 확인되었고, 이와 같이, 칼럼 베드 높이는 21 내지 25 cm의 예시값을 갖는 새로운 PP로서 성립하였다. 생성물 풀 CHOP 및 생성물 풀 MCP-1은 rPA 단계에 대한 PP로 이전에 확인하였다. 이들 불순물은 작용 한계를 갖는 PP로 한정된다. 재조합 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피 단계에 대한 공정 파라미터를 제시하는 바로 밑의 표를 참고한다.
Figure 112011097388832-pat00139
rPA 단계에 대한 세 PP는 제공된 바와 같이 경고 및 작용 한계 둘 다에 의해 한정된다. 로딩 유지 시간은 PAR 보고에서 성립한 경고 한계으로 공정 일관성을 보증한다. 로딩 유지 시간에 대한 작용 한계는 공정 일관성을 보증한다. 48시간 이하의 로딩 유지 시간 PP의 작용 한계는 생성물 용기 유지 시간 연구 및 생화학 안정성 연구에 의해 지지된다. 범위 연구는 용출 완충액 pH가 rPA 생성물 풀에서 CTLA4-Ig HMW 물질의 수준에 영향을 미치는 유의한 인자임을 확인하였다. 용출 완충액 pH에 대한 경고 한계를 성립하였다. 용출 완충액 pH에 대한 작용 한계는 스케일-다운 범위 연구로부터 성립하였다. rPA 로드 바이오버든 PP는 경고 및 작용 한계를 10 cfu/mL 미만 및 100 cfu/mL 미만 각각으로 그 사이에 할당하였다.
작용 한계에 의해 한정된 7가지 rPA PP는 칼럼 주입 압력, 유속, 단계 수율, 생성물 풀 초기 pH, 생성물 풀 HMW, 생성물 풀 CHOP 및 생성물 풀 MCP-1이다. 13 psig 이하의 압력 한계를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 rPA 수지의 압축을 방지하였다. 유속은 크로마토그래피 단계의 일관성 및 수행을 보증하는 중요한 인자이다. 이는 rPA 단계에 대한 최대 작용 한계를 갖는 PP로서 한정된다. 단계 수율 및 생성물 풀 초기 pH에 대한 작용 한계는 rPA 단계에 대한 공정 일관성을 보증한다. 유속 및 생성물 풀 초기 pH에 대한 작용 한계를 성립하였다. CTLA4-Ig HMW 물질의 잠재적 형성은 피크 용출 동안 이 파라미터에 대해 2.5％ 이하의 작용 한계의 한정을 필요로 한다. 66 내지 108％의 작용 한계 범위를 rPA 수지의 단일 로트로부터 평균 ± 3 표준 편차 데이타를 이용하여 성립하였다. 이 범위는 수지 수명 연구에서 관찰된 단계 수율과 일치한다. 공정-관련 불순물 CHOP 및 MCP-1은 rPA 단계에 대한 PP로서 이전에 확인하였다. 이 보고에서, 이들 불순물은 작용 한계를 갖는 PP로서 한정하였다. 생성물 풀 CHOP 및 MCP-1은 예시값을 갖는 CQA로 한정하여 이들 공정-관련 불순물의 제어를 보증하였다. 12가지의 rPA PP는 제공된 바와 같이 경고 한계에 의해 한정하였다. 다운스트림 공정에서 완충액 pH 및 전도율 파라미터는 경고 한계를 갖는 PP로서 확인하였다. 제조시 pH 및 전도율 예시값을 충족시키지 않은 완충액은 불합격시키고, 완충액 로트를 버렸다. rPA 단계를 위해, 평형화/세척 2 완충액 전도율 및 pH, 세척 1 완충액 전도율 및 pH, 및 용출 완충액 전도율을 경고 한계를 갖는 PP로서 한정하였다.
[표 11]
Figure 112011097388832-pat00140
농축/정용여과 및 바이러스 여과 단계. rPA 칼럼으로부터 용출시키고, 생성물 풀을 농축시켜 CTLA4-Ig 농도 한계를 갖는 표적 용량을 달성하였다. 이어서, 농축을 수행하여 30 kDa 공칭 분자량 컷오프 (NMWC) 막을 갖는 UF 시스템을 이용하여 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 정용여과하였다. 정용여과에 이어, 필터 트레인을 사용하여 잠재적 우발적 바이러스 입자를 제거하였다. 필터 트레인은 0.2 μm 필터, 0.1 μm 필터 및 15 nm 막 필터 (플라노바 15 N 필터)로 이루어져 있다. VF 단계에서 사용된 필터 (0.2 μm. 0.1 μm, 및 15 nm)는 단일-용도 필터이다. UF후 CTLA4-Ig 농도 및 플라노바 차압에 대한 범위의 상한은 이들 조건을 이용하여 증명된 바이러스 청소를 기준으로 증가하였다. 바이러스 여과 단계에 대한 공정 파라미터를 제시하는 하기 표를 참조한다.
Figure 112011097388832-pat00141
[표 13]
Figure 112011097388832-pat00142
Q 세파로스 패스트 플로우 음이온 교환 크로마토그래피 단계.
QFF 크로마토그래피 단계의 목적은 잔여 단백질 A 수준을 감소시키고, 바이러스 여과 단계 생성물 풀로부터의 숙주 세포 DNA의 추가적 감소를 제공하는 것이다. QFF 칼럼 단계를 또한 이용하여 QFF 크로마토그래피 단계 생성물 풀의 CTLA4-Ig 분자 또는 단백질에 대한 시알산의 몰비를 제어하고, HMW 물질 수준의 추가적 제어를 제공하였다. QFF 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 또한 잔여 재조합 단백질 A3 숙주 세포 DNA, 트리톤 X-100 및 잠재적 우발적 바이러스제를 제거할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피는 GE 헬스케어로부터의 QFF 수지를 사용하여 수행하였다. QFF 칼럼을 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 평형화시켰다. 칼럼 평형화 후에, 플라노바 여과액을 QFF 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 1차 세척한 후, 25 mM HEPES, 130 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 2차 세척하였다. CTLA4-Ig 단백질을 칼럼으로부터 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, pH 8.0 완충액으로 용출시켰다.
Figure 112011097388832-pat00143
QFF 로드 바이오버든 값은 각각 < 10 cfu/mL 또는 < 100 cfu/mL이다. 작용 한계에 의해 한정된 12가지의 QFF PP는 QFF 생성물 풀에서 유속, 세척 2 완충액 전도율, 용출 완충액 전도율, 로딩 유지 시간, 단계 수율, 및 잔여 단백질 A, DNA, 트리톤 X-100, SA, HMW, CHOP 및 MCP-1의 수준이다. 유속은 크로마토그래피 단계의 일관성 및 수행을 보증하는 것으로 고려되는 인자이다. 이는 PAR 보고에서 성립된 최대 작용 한계를 갖는 공정 파라미터로서 QFF 단계에 대해 한정된다. 세척 2 및 용출 완충액의 전도율 값은 작용 한계를 갖는 PP인데, 이는 단계 수율 및 생성물 품질을 결정하는 데 중요하기 때문이다. 이들 파라미터에 대한 작용 한계는 스케일-다운 QFF 범위 연구 동안 결정하였다. 로딩 유지 시간에 대한 작용 한계는 공정 일관성을 보증한다. 5일 미만의 로딩 유지 시간 PP에 대한 작용 한계는 생성물 용기 유지 시간 연구 및 생화학 안정성 연구에 의해 지지된다. 단계 수율은 QFF 단계에 대한 공정 일관성을 보증한다. 정성 파라미터, 생성물 풀 SA, HMW, CHOP 및 MCP-1은 최종 크로마토그래피 단계에서 단단히 조절되야 한다. 단계 수율에 대한 작용 한계, 및 QFF 생성물 풀에서 SA, CHOP 및 MCP-1의 수준을 성립하였다. 공정-관련 불순물 잔여 단백질 A, DNA 및 트리톤 X-100은 QFF 단계에 대해 PP로서 이전에 확인하였다. 이들 불순물은 작용 한계를 갖는 PP로서 한정하였다. 잔여 단백질 A, DNA 및 트리톤 X-100은 예시값을 갖는 CQA로서 한정하여 이들 공정-관련 불순물의 대조군을 보증하였다. 이 실시예에서, 생성물 풀 HMW에 대한 작용 한계를 ≤ 2.5 내지 ≤ 2.0％로부터 수정하였다.
다운스트림 공정에서 완충액 pH 및 전도율 파라미터는 경고 한계를 갖는 PP로서 확인하였다. 제조시 pH 및 전도율 예시값을 충족시키지 않은 완충액은 불합격시키고, 완충액 로트를 버렸다. QFF 단계에 대해, 평형화 완충액 전도율 및 pH, 세척 1 완충액 전도율 및 pH, 세척 2 완충액 pH 및 용출 완충액 pH는 경고 한계를 갖는 PP로 한정하였다. 이들 한계를 성립하였다. 칼럼 주입 압력은 결합-및-용출 크로마토그래피 단계 동안 일관성을 보증하였다. QFF 단계는 제조업자의 설명서에 따라 최대 압력 한계인 35 psig에서 수행하였다. 파라미터 세척 1 완충액 용량, 세척 2 완충액 용량, 생성물 풀 역가 및 생성물 풀 용량은 경고 한계를 할당하여 공정 일관성을 보증하였다.
[표 15]
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Figure 112011097388832-pat00145
농축/정용여과 및 충전 단계. QFF 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 생성물 풀을 농축시키고, 30 kDa NMWC 막을 갖는 UF 시스템을 사용하여 25 mM 인산나트륨, 50 mM NaCl, pH 7.5 완충액으로 를 수행하였다. 정용여과된 농축물을 0.2 μm 필터를 통해 멸균 용기로 여과하고, 2 내지 8℃에서 저장하였다. 약물 재료는 경우에 따라, -70℃에서 냉동시키고 -40℃에서 저장할 수 있다. 농축/정용여과 및 충전 단계에 대해 한정된 단일 PP가 존재하였다. 약물 재료 농축/정용여과 및 충전 단계에 대한 공정 파라미터를 제시하는 바로 밑의 표를 참조한다.
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UF II 생성물 풀 바이오버든 PP는 경고 및 작용 한계를 < 10 cfu/mL 및 < 50 cfu/mL 각각으로 그 사이에 할당하였다. 농축/정용여과 및 충전 단계에 대한 작용 한계에 의해 한정된 6가지 PP는 제공된 바와 같이 정용여과 용량, 여과액을 전도율 및 pH, 단계 수율, 로딩 유지 시간, 및 공정 수율이다. 정용여과 용량의 하한을 성립하여 충전 단계 전에 CTLA4-Ig 단백질의 최종 약물 재료 완충액으로의 완충액 교환의 완료를 보증하였다. 여과액 전도율 및 여과액 pH는 일관된 약물 재료 제형을 추가로 보증한다. 단계 수율은 농축/정용여과 및 충전 단계에 대한 공정 일관성을 보증하였다. 정용여과 용량, 여과액을 전도율 및 pH, 및 단계 수율에 대한 작용 한계를 성립하였다. 로딩 유지 시간에 대한 작용 한계는 공정 일관성을 보증하였다. 5일 이하의 UF II 로딩 유지 시간은 생성물 용기 유지 시간 연구 및 생화학 안정성 연구에 의해 지지된다. 공정 수율 작용 한계 20 내지 62％가 권고된다. 2가지 PP는 제공된 바와 같이 경고 한계에 의해 한정되어 단계에 대해 공정 일관성을 보증하였다.
[표 17]
Figure 112011097388832-pat00147
실시예 30: 약물 재료 최종 충전 단계
CTLA4-Ig의 농축 및 정용여과 II 단계의 완료 후에, CTLA4-Ig 약물 재료를 클래스 100 환경 내에서 300-L 생물공정 백으로부터 예비-멸균된 2-L 및 10-L 바이오테이너 PC 병으로 충전하였다.
각각의 병의 외부를 70％ 이소프로판올 용액으로 소독하였다. 각각의 병의 캡 주변으로부터 씰을 제거하여 병을 충전하기 전에 열었다. 계산을 뱃치에 기록하여 충전 중량이 2-L 병에 대해 500 그램 내지 1950 그램 및 10-L 병에 대해 7500 그램 내지 10200 그램임을 보증하였다. 약물 재료는 연동 펌프를 사용하여 단일-용도 0.45/0.2 μm 필터 및 충전 벨을 통해 바이오테이너 병으로 분배하였다. 병을 캡으로 닫고, 캡을 특정 토크 셋팅에 튼튼하게 조였다. 각각의 충전된 병의 캡을 테이프로 밀봉하고, 테이프에 이니셜 및 날짜를 썼다. 각각의 병을 정보 및 충전 날짜, 로트 내에 순차적 수의 충전된 병 및 조작자의 이니셜을 확인하도록 표지하였다.
충전 공정 동안, 공기 및 표면 미생물 모니터링 및 입자 계수를 수행하였다. 약물 재료 샘플을 충전 조작 동안 얻었다. 내독소 시험을 위한 제1 병의 충전 전에 한 샘플을 얻었다. 내독소 시험을 위한 추가의 샘플을 충전 공정의 중간 및 말기에 얻었다. 충전 공정 동안, 약물 재료 방출 시험을 위해 샘플을 얻었다.
실시예 31: 면역원성 연구
CTLA4-Ig는 인간 면역글로불린 (Ig) G1의 변형된 Fc (힌지, CH2 및 CH3 도메인) 부분에 연결된 인간 세포독성 T-림프구-회합 항원 4 (CTLA-4)의 세포외 도메인으로 이루어진 가용성 융합 단백질이다. 이는 류마티스양 관절염 (RA)의 치료에 대해 승인받은, 완전한 T-세포 활성화를 위해 사용된 CD80/CD86:CD28 공동-자극 신호를 선택적으로 조절하는 신규 부류의 작용제 중 최초의 물질이다. RA에서, 공지되지 않은 항원이 주요 조직적합성 복합체를 통해 존재하고, 공동-자극 신호의 존재 하에 자가반응성 T 세포를 활성화시키는 것이 요구된다. 후속적으로, 활성화 T 세포는 다운스트림 면역 세포를 모으고 활성화시키며, 염증 및 관절 파열을 유도하는 세포 공정을 편성하고 유지시킨다 (문헌 [Choy and Panayi (2001) N Engl J Med, 344(12):907-916]).
치료 재조합 생물학적 작용제, 예컨대 CTLA4-Ig는 면역성일 수 있으며, 따라서 항체 반응을 유도하는 잠재력을 갖는다. 생물학적 작용제에 대한 면역원성은 비이론적 충격 안전성, 효능 및 약물동력학적일 수 있다. 생물학적 요법의 항체-매개된 청소는 약물 수준의 감소를 초래할 수 있으며, 효능 감소를 초래한다. 항체 반응은 또한 약물의 약리학적 표적에 대한 결합을 방지할 수 있으며, 이는 또한 효능을 감소시킬 것이다. 이는 시간 경과에 따라 투여량 단계적 확대가 필요한 소위 '도즈 크립 (dose creep)'을 유도할 수 있다. 도즈 크립은 RA의 치료에서 항-TNF 항체, 인플릭시맙의 연장된 사용으로 보고되었으며 (문헌 [Anderson (2005) Semin Arthritis Rheum, 34(5 Suppl1): 19-22]) 및 이는 최근 특정 환자에서 임상적 효능의 감소를 유도하는 항-인플릭시맙 항체의 결과로서 나타났다 (문헌 [Haraoui et al., (2006) J Rheumatol, 33(1):31-36]).
여기서, 항-CTLA4-Ig 및 항-CTLA-4 항체의 형성, 및 CTLA4-Ig 치료의 효능 및 안전성에서 그의 잠재적 효과를 조사하였다. CTLA4-Ig는 그 자체에 대한 면역 반응을 억제하는 것으로 보이기 때문에, 선택적 공동-자극 조절제 및 비-임상적 모델에서 관찰된 반응으로서의 그의 활성에 기초하여, 면역원성 수준에서 1-2 투여 안하는 것 또는 중단 요법의 효과를 또한 조사하였다. 최종적으로, 혈청반응양성 샘플을 항체 활성의 중화에 대해 조사하였다.
물질 및 방법
연구 평가
CTLA4-Ig가 RA 환자에서 면역성 반응을 유도하는지 결정하기 위해, 항체 반응을 메토트렉세이트 (MTX) 또는 항-TNF 요법에 대해 부적절한 반응을 나타내는 환자를 포함하여 2,237명의 RA 환자에서 6회 DB 및 4회 OL 연구 기간을 포함하는 다중 상 II 및 III 임상적 시도를 통해 평가하였다. 한 연구 (상 IIa)는 또한 단일요법으로서 RA의 치료를 위해 CTLA4-Ig를 평가하였다 (표 40). 샘플은 일반적으로 치료를 통해, 및 마지막 투여일로부터 56 및/또는 85일 동안 CTLA4-Ig의 청소를 위한 충분한 시간을 두어 예비-연구를 평가하였다.
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* OL, 비조절된 기간 동안 대상체는 DB, 플라시보-제어된 연구 기간을 완료한 사람들의 하위 세트이다.
예비 말초-주입 역사건 (AE), 총체적 AE 및 중증 AE (SAE)의 발생률 및 유형, 및 비연속성을 CTLA4-Ig 또는 CTLA-4에 대한 양성 항체 반응을 발달시킨 환자에서 조사하였다. 효능에서 면역원성의 효과를 또한 양성 항체 반응인 환자에서 어메리칸 칼리지 오브 류마톨로지 (American College of Rheumatology; ACR) 20 및 헬스 어세스먼트 퀘스처너리 (Health Assessment Questionnaire) 반응을 평가함으로써 조사하였다.
면역원성 분석
염기성 분석 포맷: 인간, 특히 RA 집단의 혈청에서 CTLA4-Ig의 Fc 부분에 대한 높은 선재성 가교-반응성으로 인해, 두 지정-포맷 효소-연결된 면역흡착 분석법 (ELISA)을 이용하여 항체 반응을 평가하였다. 항-CTLA4-Ig 분석은 분자의 모든 부분에 대한 항체 반응을 측정하였으나, 낮은 민감도를 가졌다. 항-CTLA-4 분석은 Ig 영역을 제거하여 이로써 보다 큰 민감도를 부여하는 오직 CTLA-4 부분에 대한 항체 반응을 측정하였다. 두 분석을 모두 종점 역가 (EPT) 포맷 (분석 A) 또는 스크리닝 포맷 (분석 B)에서 이용하였다.
분석 A 포맷: 상 II 이중맹검 임상적 면역원성 분석 방법
상 II RA 시험 동안 사용된 항-CTLA4-Ig 분석 및 the 항-CTLA-4 분석을 총괄하여 분석 A로 지칭하였다. 분석 A에서, CTLA4-Ig 또는 CTLA-4를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 흡착시킨 후, 이를 시험 혈청 (1:10으로 출발하여 3배 연속적 희석)과 함께 인큐베이션시켰다. 결합 항체를 알칼리-포스파타제 접합된 항-인간 항체 칵테일 (사우던 바이오테크 (Southern Biotech; Birmingham, US))을 사용하여 검출하고, p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP) 기질을 사용하여 시각화하였다. 인간 항-CTLA4-Ig 항체 또는 양성 대조군 혈청이 이용불가능하기 때문에, 시노몰구스 원숭이에서 생성된 CTLA4-Ig-특이적인 항-혈청을 사용하여 이들 분석을 입증하였다. 각각의 분석으로부터의 결과를 EPT 값으로 표현하였다. 환자의 EPT가 개인의 전투여 (1일) EPT와 비교하여 둘 이상의 연속적 희석 (9배 이상)에 의해 증가되는 경우에, 환자는 혈청전환된 것으로 고려하였다.
분석 B 포맷: 상 III 및 상 II 표지-공개 임상적 면역원성 분석 방법
상 III 시험, 및 2년 상 II OL 기간을 위해, 항-CTLA4-Ig 및 항-CTLA-4 분석 둘 다를 변형시켜 비-특이적 배경, 개선 민감도를 감소시키고, 양성 결정 방법을 바꾸고, 이를 총괄하여 분석 B로 지칭하였다. 이들 분석은 또한 시노몰구스 원숭이 항-혈청으로부터 정제된 CTLA4-Ig-특이적 항체를 사용하여 입증하였다. 각각의 ELISA에 대해, CTLA4-Ig (0.25 μg/mL) 또는 CTLA-4 (0.5 μg/mL)로 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 1:400으로 희석된 시험 혈청과 함께 2시간 동안 22 ± 5℃에서 인큐베이션시키거나 (항-CTLA4-Ig), 또는 희석된 1:25로 희석시켜 2시간 동안 32-40℃에서 인큐베이션시켰다 (항-CTLA-4). 1차 인큐베이션 후에, 결합된 항체를 홀스래디쉬-퍼옥시다제 (HRP) 접합된 항-인간 항체 칵테일에 이어 테트라메틸벤지딘 기질로 검출하였다.
항-CTLA4-Ig 분석에 대한 결과는 투여후 샘플 OD 값을 동일한 플레이트 상에서 분석한 상응하는 투여전 샘플 OD 값으로 나누어 계산한 후/전 비율로 나타내었다. 양성은 플라시보-처리된 RA 환자 샘플을 사용하여 성립한 컷-오프 값을 기준으로 한다. 비율 수치가 컷-오프 미만인 경우, 샘플은 음성으로 고려하고, 역가 값 <400으로 보고하였다. 이 컷-오프를 초과하는 임의의 값은 조건부 양성으로 고려하였다.
항-CTLA-4 분석에 대한 결과를 평균 환자 혈청 샘플 OD를 동일한 플레이트에서 음성 대조군의 평균 OD로 나누어 계산한 '비율 1' 값으로 나타내었다. 양성은 음성 대조군으로서 플라시보-처리된 RA 환자로부터 풀링된 혈청을 사용하여 성립된 값을 기준으로 하였다. 값이 특정 컷-오프 미만인 경우, 샘플은 음성으로 고려하고, 역가 값 <25으로 보고하였다. 이 컷-오프를 초과하는 임의의 값은 조건부 양성으로 고려하였다.
확인 분석
각각의 분석 (항-CTLA4-Ig 및 항-CTLA-4) 및 각각의 분석 포맷 (분석 A 및 B)에서 조건부 양성 샘플 확인을 면역소모 분석으로 평가하여 반응의 특이성을 결정하였다. 항-CTLA4-Ig 양성 샘플을 대략 40 μg/mL의 CTLA4-Ig (분자의 CTLA-4 부분), 다른 비관련 Ig 융합 단백질 (CD40Ig) 또는 비관련 단백질 (난백알부민)과 함께 예비-인큐베이션시켜 항-CTLA4-Ig 반응이 유도될 수 있는 분자의 영역 (CTLA-4, Ig 또는 연접 영역)을 확인하였다. 항-CTLA-4 양성 샘플을 유사하게 CTLA4-Ig, the CTLA-4 부분 또는 난백알부민과 함께 예비-인큐베이션시켜 항-CTLA-4 반응의 특이성을 확인하였다. 예비-인큐베이션 후에, 모든 샘플을 상기 기재된 동일한 원 분석 포맷으로 재분석하였다. 예비-인큐베이션이 비처리된 샘플과 비교하여 예비-인큐베이션시킨 샘플의 OD의 ≥30％ 감소를 초래한 샘플은 확인된 양성으로 고려하였다. 확인한 경우에, 샘플을 적정하여 특정 분석의 컷-오프와 동일한 비율 값을 초래하는 혈청 희석을 확인하고, 이 값을 EPT로서 보고하였다.
중화-항체 활성 평가
생물분석을 수행하여 T 세포 표면에서 CD80/86을 결합으로부터 이를 방지함으로써 CTLA4-Ig의 활성을 억제하거나 중화시키기 위한 (CD80/86로의 결합을 억제함) CTLA-4에 대한 약물-특이적 항체로 환자 샘플의 능력을 평가하였다. 인터루킨 (IL)-2 프로모터의 제어 하에 루시페라제 유전자를 발현하는 안정한 주르카트 T-세포 세포감염체를 항-CD3 항체의 존재 하에 다우디 B-세포로 공동-자극하였다. 항-CD3 항체와 조합하여 주르카트 T 세포에서 CD28 및 다우디 B 세포에서 CD80/86 간의 상호작용을 통해 매개된 이 공동-자극은 IL-2 프로모터를 활성화시켜 루시페라제 유전자의 전사 증가를 유도하고, 따라서 루시페라제 단백질 발현을 증가시킨다. 발광성 신호를 루시페라제 분석 시스템을 이용하여 측정하였다. CTLA4-Ig는 CD80/86:CD28 상호작용을 차단하기 때문에, CTLA4-Ig의 세포 혼합물로의 첨가는 이 IL-2 프로모터 활성화를 차단하고, 형광을 감소시키는 반면에, 중화 항체와 예비-인큐베이션은 공동-자극 상호작용을 회복시키고, 형광 증가를 초래할 것이다.
CTLA4-Ig 중화 항체 활성은 CTLA4-Ig 반응을 1:25 투여후 혈청반응양성 혈청의 존재 하에 생물분석으로 0.1, 0.25 또는 0.5 μg/mL의 농도에서 결정하고, 그에 상응하는 1일째 샘플의 존재하의 반응과 통계적으로 비교하여 평가하였다. 생물분석에서 CTLA4-Ig-중화 활성을 갖는 항-인간 CTLA-4 뮤린 모노클로날 항체 (11D4)를 각각의 분석 수행에서 양성 대조군으로 사용하였다. 생물분석 시험 방법에서의 고유의 한계로 인해, CTLA4-Ig 수준이 ≤1 μg/mL로 존재하는 투여후 샘플만 평가하였는데, 보다 높은 약물 수준은 중화 반응을 방해하고, 추가적 샘플 희석액은 분석 민감도를 감소시킬 것이기 때문이다.
약물동력학적 평가
집단 약물동력학적 (POPPK) 분석을 양성 면역 반응을 확인한 상 II/III 실험의 DB 기간으로부터의 환자의 혈청 샘플 데이타에서 수행하였다. 입증된 POPPK 모델을 개별 환자 혈청 농도 데이타에 적용하여 개별 PK 파라미터 값의 최대 사후 베이시안(Bayesian) 측정치를 얻었다. 청소의 분포, 용량 측정, 곡선 (AUC) 값 하에 전략-상태 역역, 및 약물의 최소 농도를 이들 환자에 대해 신체 투여후 (Cmin) 값에서 면역 반응을 발달시키지 않은 동일한 실험으로부터의 환자의 보다 큰 데이타 세트에서 이들 값의 분포와 비교하였다.
결과
항-CTLA4-Ig의 발생률 및 항-CTLA-4 반응
총 2,237명의 환자는 전- 및 후-기준선 혈청 샘플 둘 다를 가졌고, 평가에 적합하였다. 이들 중, 62명 (2.8％)의 환자가 분석 A 또는 B를 이용하여 측정한 바와 같이 항-CTLA4-Ig 또는 항-CTLA-4 반응의 증거를 가졌다 (도 39). 환자는 아무도 CTLA4-Ig의 Fc 및 CTLA-4 도메인 둘 다에 대한 면역 반응을 증명하지 않았다. 세 명의 환자는 연접 영역에 대한 반응을 나타냈다. 보다 민감한 분석 B를 이용한 경우에, CTLA4-Ig에 대한 항체 반응이 1,990명의 환자 중 60명 (3.0％)에서 검출되었다 (도 39).
상 III 연구 (n=1,764)에서 평가된 환자 중, 203명은 DB 또는 OL 기간 동안 CTLA4-Ig 요법을 중단하거나, 또는 후속적 OL 연구 기간으로 진입하지 않고, 요법의 중단 후 56 및/또는 85일째에 혈청을 수집하였다. 203명의 환자 중, 15명 (7.4％)은 CTLA4-Ig (전체 분자; n=5, 2.5％) 또는 CTLA-4 (n=10, 4.9％; 표 42)에 대해 면역양성 반응을 나타냈다. 상 III DB 기간을 완료하고 OL 치료를 지속하는 나머지 1,561명의 RA 환자 중, 40명 (2.6％) 중 33 (2.1％)은 CTLA4-Ig에 대해, 7명 (0.4％)은 CTLA-4에 대해 DB 또는 OL 기간 동안 양성 항체 반응을 나타냈다. 흥미롭게도, 단일요법으로서의 CTLA4-Ig의 상 IIa 연구에서, 어떤 환자도 CTLA4-Ig 또는 분자의 CTLA-4 부분에 대해 혈청전환되지 않았으나, 덜 민감한 분석 A 포맷을 이용하였다.
총 191명 환자는 DB 및 OL 기간에서 이들의 참여 사이에 CTLA4-Ig가 없는 30일 기간을 가졌다. 이들 중, 3명 (1.6％)의 환자는 CTLA4-Ig에 대해 양성 항체 반응을 나타내고, 1명 (0.5％)의 환자는 OL 기간 동안 CTLA-4에 대해 양성 항체 반응을 나타냈다 (표 41). 혈청을 또한 연구 약물을 1-2 투여를 하지 않고 연구 기간의 임의의 시점에서 다시 시작한 587명의 RA 환자로부터 분석하였다. 이들 환자 중, 15명 (2.6％)은 CTLA4-Ig에 대한 양성 항체 반응을 나타내고, 7명 (1.2％)은 CTLA-4에 대한 양성 항체 반응을 나타냈다 (표 41).
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면역원성에서 동시적 메토트렉세이트의 효과
총 2451명의 환자는 동시에 MTX를 투여받고, 493명의 환자는 받지 않았다. 총체적으로, CTLA4-Ig에 대해 양성 항체 반응을 나타내는 환자의 백분율은 이들이 동시에 MTX를 투여받거나 받지 않거나 일반적으로 유사하였다 (2.3％ 대 1.4％) (표 42).
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CTLA4-Ig의 안전성 및 효능에서 면역원성의 강한 영향
모든 양성 환자에 대한 AE, SAE, 말초-주입 AE의 비율을 평가하였으나, 면역원성 및 안전성 간의 어떠한 관계도 관찰되지 않았다. 유사하게, 면역원성 및 효능 간의 관계도 관찰되지 않았으나, 이들 데이타의 해석은 혈청전환된 환자의 수가 제한되었으므로 한정된다.
항-CTLA-4 항체의 중화 활성
20명의 환자로부터의 24개의 혈청 샘플을 항-CTLA-4 항체 스크리닝 분석으로 항-CTLA-4 반응에 대해 양성으로 확인하였다. 이들 중, 14개의 샘플 (13명의 환자로부터 수집함)은 중화 생물분석에서 평가를 위한 예시값 (≤1 μg/mL CTLA4-Ig)을 충족하였다. 이들 13개의 샘플 중, 1개는 투여후 56일째에 양성이었고, 10개는 투여후 85일째에 양성이었다. 14개 샘플 중 9개 (8명의 환자로부터 얻음)는 중화 항체 활성을 나타냈다. 한 환자에서 패혈증을 제외하고, 이들 8명의 환자에서 요법과 관련되거나 관련될 수 있는 것으로 고려되는 혈청전환시기 또는 그 근처에서 이들 환자에게서 보고된 의학적으로 유의한 AE는 없었다. 우세한 수의 샘플이 중화 항체의 평가에 적합한 기간인 연구 중단 이후의 기간 (중단 후 56 및 85일) 동안 효능 데이타를 수집하지 않았다. 따라서, 효능에서 중화 항체의 효과를 평가할 수 없었다.
약물동력학적 평가
약물동력학적 파라미터를 상 II/III 실험의 DB 기간 동안 양성 항체 반응을 나타내는 32명의 환자 중 31명에 대해 평가하였다. PK 분석을 위한 혈청 샘플을 꼭 양성 면역 반응을 문서화한 날 수집할 필요는 없다. DB 연구 기간으로부터의 환자 데이타의 집단 PK 모델링은, 31명의 면역양성 환자에서 예상된 PK 파라미터가 양성 면역 반응을 나타내지 않는 환자의 보다 큰 집단 (n=386)에서의 파라미터와 비교가능하다는 것을 시사한다. 혈청전환이 문서화된 DB 기간 동안 연구일에서 저점(trough) 혈청 농도는 대부분의 혈청 농도가 5 내지 20 μg/mL인 1.16 내지 24.21 μg/mL의 범위였다. 혈청전환은 혈청 저점 수준에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. 면역원성 상태에 의한 청소의 분포 및 중심 구획의 용량은 도 40에 제시되어 있다.
MSD 전기화학적 발광 분석 . 약물 (약물 내성)의 존재 하에 항체를 검출하기 위한 결합 면역원성 분석의 민감도 및 검출 능력을 개선하기 위한 노력에서, CTLA4-Ig에 대한 항-약물 항체를 메조-스케일 디스커버리(Meso-Scale Discovery; MSD) 기술을 이용함으로써 모니터링하기 위한 새로운 세대의 면역원성 분석이 개발되었다. 이 새로운 기술은 마이크로플레이트의 전극 표면에서 시작한 전기화학적 자극과 함께 빛을 방사하는 표지를 사용한다. MSD 포맷은 ELISA 포맷과 비교하여 약물의 존재 하에 항체를 검출하는 데 증진된 민감도 및 보다 우수한 능력을 갖는 것으로 나타났다. 이 용액-상 기술은 표지된 약물이 혈청에서 다른 약물과 보다 효과적으로 경쟁하도록 하고, ELISA 포맷에 대해 보다 큰 역학 범위, 잡음 비율에 대한 신호, 및 증가된 표면 용량을 갖는다. 포착된 시약으로서 분자의 CTLA4 부분 또는 전체 분자를 사용한 전류 ELISA와 달리, 새로운 분석은 아바딘-코팅된 MSD 플레이트에 첨가하기 전에 환자 샘플과 함께 인큐베이션시킨 비오틴화 및 루테늄-표지된 CTLA4-Ig 분자를 사용한 가교 분석이다. 루테늄 태그에 의해 방사된 전기화학적 발광 신호를 MSD 장비를 사용하여 측정하였다. 입증된 분석 컷-포인트를 기준으로 양성 샘플은 MSD 분석에서 CTLA4-Ig, CTLA4-T, 또는 CD40Ig로 면역소모에 의해 추가로 평가하여 양성을 확인하고, CTLA4-Ig 분자의 어떤 부분이 면역성 반응을 유도하는지, 종점 역가가 한정됨을 증명할 것이다.
실시예 32: 원숭이에서 약물동력학적 파라미터
한 집단 당 6마리 암컷 시노몰구스 원숭이에게 CD-CHO1 공정으로부터 생성된 CTLA4-Ig의 단일 정맥내 10-mg/kg 투여량을 투여하였다. 6마리 암컷 원숭이의 대조군에게 염수 (1 ml/kg)를 제공하였다. CTLA4-Ig의 생물활성을 평가하기 위해, 모든 원숭이를 투여 30분 전에 T-세포-의존성 항원 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH) 10 mg/animal로 근육내에서 면역화시켰다.
동물을 처리 후에 6주 동안 관찰하였다. 혈액 샘플을 투여전; 투여후 3 및 30분; 1, 2, 4, 8, 24, 및 48 시간; 및 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36, 및 43일 경과 후에 얻어서 약물동력학적 프로파일을 결정하고 비교하였다. 약물동력학적 보고에서, 이들 연구일은 0, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 및 42일에 각각 상응하였다. 혈청 샘플을 CTLA4-Ig에 대해 ELISA 방법에 의해 분석하였다. 비교가능한 혈액 샘플을 동일한 날 대조군 동물로부터 수집하여 경우에 따라, 항-KLH 항체 반응을 평가하기 위해 사용하였다. 연구전 및 그 후 매주 CTLA4-Ig-처리된 동물로부터 얻은 혈청에서 CTLA4-Ig-특이적 항체 형성의 평가를 수행하였다. KLH-특이적 항체 형성을 면역화 전 및 면역화 후 4주 동안 그 후 매주 모든 동물로부터 얻은 혈청 샘플에서 측정하였다. 평가에 대한 추가의 예시값은 생존, 임상적 징후, 물리적 검사 (신경학적, 호흡 속도 및 청진 평가를 포함함), 체중, 체온, 및 음식 소비를 포함한다.
임상적-병리학적 평가를 연구 전 및 45일째에 수행하였다. 모든 동물은 연구 완료 후에 다시 가둬두었다.
Figure 112011097388832-pat00152
약물-특이적 항체 반응이 CD-CHOl-공정 물질로 처리된 6마리 원숭이 중 3마리에서 29일째에 또는 그 이후에 나타났다 (표 43; 도 41). CD-CHOl 공정 물질로 처리된 원숭이에서 혈액 우레아 질소 (BUN)의 최소 증가 (20％) 및 혈청 칼륨의 증가 (14％)는 생리학적으로 또는 독성학적으로 의미가 없는데, 이는 상기 수치가 BUlM에 대해서만 과거 대조군 범위의 가장자리 밖에 있고 혈청 크레아티닌의 동시적 증가가 없었기 때문이다. 임상적 병리학적 파라미터에서 다른 변화는 나타나지 않았다. KLH 항체 반응의 현저한 억제 (≥94％의 피크 대조군 반응)를 CD-CHO1 공정 물질을 투여한 원숭이에서 관찰하였다. CTLA4-Ig 혈청 수준이 29일째에 또는 그 이후에 대략 1 μg/mL의 면역억제 수준 밑으로 떨어질 때까지 면역원성은 현저하게 지연되었다.
임상적 병리학적. 혈액 샘플을 투여 전 공복상태 동물의 대퇴 정맥으로부터 (-13일째) 및 마지막 약물동력학적 블리딩 (45일째)으로 수집하였다. 소변검사를 18시간 예비-연구에서 수집된 소변 (-13일째) 및 마지막 약물동력학적 샘플링 (45일째)에서 수행하였다. 하기 분석 파라미터를 측정하였다: 혈액학: 헤모글로빈, 헤마토크리트, 적혈구 계수, 평균 미립자 용량, 평균 미립자 헤모글로빈, 평균 미립자 헤모글로빈 농도, 망상적혈구 계수, 총 및 분화 백혈구 계수, 혈소판 계수, 및 말초 혈액 도말표본에서 세포 형태학의 평가를 결정하였다. 응고: 프로트롬빈 시간, 활성 부분 트롬보플라스틴 시간, 및 혈장 피브리노겐을 결정하였다. 혈청 화학: 우레아 질소, 크레아티닌, 글루코스, 총 콜레스테롤, 총 단백질, 알부민, 글로불린, 알부민/글로불린 비율, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알칼리 포스파타제, 총 빌리루빈, 트리글리세리드, 감마 글루타밀트랜스퍼라제, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 클로라이드, 및 포스포러스를 측정하였다. 소변검사: 배설물, 특정 중력, pH, 색상 및 외관, 및 글루코스, 단백질, 케톤, 빌리루빈, 잠혈, 및 우로빌리노겐의 정성적 측정을 결정하였다. 요침전물을 현미경으로 조사하였다.
특이적 항체 반응. 비교가능한 크기의 약물-특이적 항체 반응이 CD-CHO1 공정 물질로 처리된 6마리 원숭이 중 3마리에서 29째에 또는 그 이후에 일어났다. 예상한 바와 같이, 공정과 함께 면역원성은 29일째에 또는 그 이후에 CTLA4-Ig 혈청 수준이 대략 1 μg/mL의 면역억제 수준 밑으로 떨어질 때까지 현저하게 지연되었다. CD-CHO1 공정 물질을 제공받은 원숭이에 대한 평균 CTLA4-Ig-특이적 항체 반응은 36일째에 양성이 되었고, 43일째에 최고였다 (평가된 마지막 시점). CD-CHO1 공정 물질을 제공받은 개별 원숭이에서 피크 항체 역가는 23 내지 10,448의 범위였다.
실시예 33: 칼럼내 해체
친화성 크로마토그래피 수지를 통한 해체 공정이 유용하며, 포유동물 세포에서 생성된 모든 IgG-Fc 기반 재조합 분자에 적용가능성을 갖는다. 카오트로프는 고분자량 단백질 또는 물질을 분해시키기 위해 사용될 수 있다. 이 해체는 임의의 그러한 단백질에 대해 칼럼내 수행될 수 있다. 이 실시예는 예시적 물질: 즉, CTLA4-Ig에서 해체 공정을 수행하기 위한 방법을 제공한다.
생산 생물반응기에서 생산된 CTLA4-Ig 고분자량 (HMW) 물질은 용액에서 (뱃치 방식) 또는 친화성 크로마토그래피 단계 (칼럼내 방식)와 함께 카오트로픽제를 사용함으로써 기능성 CTLA4-Ig 이량체로 부분적으로 전환될 수 있다. 이 공정은 "해체"로 나타낸다. 해체된 CTLA4-Ig 물질의 분석적 특성화 연구를 기초하여, 해체된 물질은 해체 공정을 수행하지 않은 대조군 물질과 생화학적으로 비교가능하다고 여겨진다.
본 발명의 CTLA4-Ig 분자를 생성하는 발효 공정에서, 대략 20 내지 25％의 생성된 CTLA4-Ig 단백질은 HMW 물질 형태 (즉, 집합체)일 수 있다. 따라서, 이 물질의 부분을 기능성 이량체로서 회수하는 것은 > 10％의 총체적 공정 수율 증진의 잠재력을 갖는다.
뱃치 방식 해체 공정
해체는 중간 농도의 카오트로픽제, 예컨대 구아니딘 히드로클로라이드 또는 우레아로 처리한 후, 저염 리폴딩 완충액으로 신속히 희석하여 to help the 분자가 그의 원래의 형태가 되도록 도움으로써 뱃치 방식 (용액 중에서)으로 증명하였다.
단백질 A를 사용하여 정제된 CTLA4-Ig (맙셀렉트를 사용한 수지)를 최종 농도 약 4 내지 5 mg/ml로 조정하여 이들 뱃치 실험에 대한 출발 물질로서 사용하였다. 이어서, 이를 1:1 용량 비율로 2x 농축된 카오트로픽 완충액과 접촉시켜 최종 카오트로프 농도 1-3 M (구아니딘 히드로클로라이드에 대해) 및 2-7 M (우레아에 대해)을 달성하였다. 구아니딘 히드로클로라이드 농도 > 2 M 및 우레아 농도 > = 4 M이 CTLA4-Ig HMW 물질의 해체를 일으키는 데 효과적이었다. 이들 실험을 위해 사용된 이동상은 6.5 - 7.0의 pH 범위에서 포스페이트 완충 시스템이었다. 해체 반응물은 50 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8.5로 이루어진 리폴딩 완충액으로 신속하게 희석 (1:5의 용량 비율로)하여 켄칭시켰다. 뱃치 해체 실험에서, 50 내지 60％의 HMW 물질을 > 95％ 단계 수율을 갖는 CTLA4-Ig 이량체로 전환시켰다. 해체 단계에 이어 관찰된 HMW 물질 수준의 감소가 도 42에 제시되어 있다.
칼럼내 해체 공정
뱃치 해체 공정의 스케일-업 동안 잠재적 탱크 및 혼합 한계를 극복하기 위해, 단백질 A 포착 단계 및 해체 단계를 합한 공정을 평가하였다. 이 공정은 단백질 A 단계에 대한 용출 완충액으로 카오트로픽 용액을 사용한 후, 용출 풀을 리폴딩/희석 완충액으로 수집하는 것을 포함한다.
해체 효율에서 유사한 수행을 뱃치 및 칼럼내 공정을 이용하여 관찰하였다. 칼럼내 해체 공정은 공정 단계의 수를 감소시키는 분명한 이점을 가질 것이다. 칼럼내 해체 단계를 이용한 단백질 단계를 위한 실험 세부사항을 하기 표에 요약하였다. 사용된 수지: 맙셀렉트 (GE 헬스케어); 칼럼 베드 높이: 20-25 cm
Figure 112011097388832-pat00153
다운스트림 공정으로의 혼입 가능성
샘플 3-칼럼 정제 트레인을 수행하여 칼럼내 단백질 A 해체 단계의 사용 및 비사용 하에 최종 공정 물질을 생성하였다. 두 정제 트레인으로부터 얻은 크로마토그래피 단계 수율이 표 44에 제공되어 있다.
해체의 존재 및 부재 하에 3 칼럼 공정에 대한 크로마토그래피 수율
공정 단계
 단계 수율 (％)
3-칼럼 공정 (대조군) 칼럼내 해체 단계의 존재 하에 3-칼럼 공정
단백질 A 95 95
HIC 60 69
AEX 84 87
총제적 크로마토그래피 수율 48 58
샘플 3-칼럼 공정에서 해체 단계의 혼입은 공정 수율에서 대략 10％ 개선을 초래하였다. 두 공정 서열로부터의 생성물 풀을 분석하여 생성된 CTLA4-Ig 물질의 생화학 비교가능성을 평가하였다.
두 생성물 풀의 MALDI-TOF에 의해 분석한 N-글리칸을 도 43에 제시하였다. 이 분석에 기초하여, 물질은 비교가능한 것으로 여겨진다. 이 MALDI-TOF 결과는 HPLC-기준 N-글리칸 분석 방법을 이용하여 확인하였다. HPLC 분석은 대조군 및 해체된 최종 공정 물질 간의 2안테나형 시알산 피크에서의 1.7％ 미만 상이함을 증명하였다.
트립신의 펩티드 맵핑을 또한 두 생성물 풀에서 수행하여 정제된 물질에 존재하는 탈아미드화 및 산화 펩티드 백분율을 정량화하였다. 결과 (표 45에 요약됨)는 두 샘플에 대한 비교가능한 탈아미드화 및 산화 수준을 증명한다.
펩티드 맵 결과
샘플 T26 탈아민화 부위 (％ 영역) T6 산화 부위 (％ 영역)
대조군 3-칼럼 공정 0.76 0.35
해체 단계와 함께 3-칼럼 공정 0.69 0.33
표준 물질 (5 g/L) 0.94 0.37
또한, B7-결합 분석 결과는 대조군 및 칼럼내 해체된 물질에 대해 각각 101％ 및 98％였다.
IgG-Fc 기재 재조합 분자, 예컨대 포유동물 세포에 의해 생성된 것의 해체 방법은 집합체 형태의 상기 분자를 포함하는 조성물을 카오트로픽제 (예컨대, 구아니딘 히드로클로라이드 또는 우레아)와 그러한 집합체 분자의 적어도 한 부분을 해체하기에 충분한 양 및 시간으로 접촉시키는 단계에 이어, 임의로 분자의 상기 해체된 부분을 리폴딩 리폴딩 및/또는 켄칭제와 접촉시키는 단계 (예컨대, 그러한 분자가 원래의 형태로 다시 돌아가도록 저염 리폴딩 완충액으로 신속히 희석함으로써)를 포함한다. 카오트로픽제와의 접촉은, 예를 들어 뱃치, 반-뱃치 또는 연속 방식 뿐만 아니라, 예를 들어 용액 중에서 (예컨대, 뱃치 방식으로), 또는 크로마토그래피 단계와 함께, 예컨대 친화성 크로마토그래피 단계 (칼럼내 방식) 동안 수행될 수 있다.
칼럼내 정제, 예컨대 단백질 A 포착 단계와 상기 해체 방법을 조합한 공정은 총체적 공정 효율을 증진시킬 수 있으며, 본 발명의 또 다른 실시양태이다. 따라서, 본 발명은 집합체 형태의 그러한 분자를 포함하는 조성물을 카오트로픽제 (예컨대 구아니딘 히드로클로라이드 또는 우레아)와 상기 집합체 분자의 적어도 한 부분을 해체시키기에 충분한 양 및 시간으로 접촉시키며, 상기 접촉은 예컨대 상기 카오트로픽제가 상기 칼럼의 용출을 위한 용액 (예컨대, 단백질 A 칼럼에 대한 용출 완충액)에서 사용된 크로마토그래피 칼럼에서 일어나는 단계에 이어, 임의로 분자의 상기 해체된 부분을 리폴딩 및/또는 켄칭제와 접촉시키는 단계 (예컨대, 분자가 원래의 형태로 돌아가도록 저염 리폴딩 완충액으로 신속하게 희석함으로써)를 포함하는 IgG-Fc 기재 재조합 분자, 예컨대 포유동물 세포에 의해 생성된 것의 해체 방법을 고려한다.
그러한 카오트로픽제와 접촉될 조성물은 집합체 형태 이외의 형태 (예컨대, 단일쇄 형태 또는 이량체)인 IgG-Fc 기재 재조합 분자를 포함할 수 있으며, 또한 집합체 형태인 상기 분자를 포함한다.
IgG-Fc 기재 분자의 예는 당단백질 예컨대 본 발명의 CTLA4-Ig 분자를 포함할 수 있다.
실시예 34: 약물동력학
활성 류마티스 관절염에 걸려 메토트렉세이트를 투여중인 대상체에게 정맥내 투여된 두 상이한 투여량의 CTLA4-Ig의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위한 상 2B, 다중심, 무작위추출, 이중맹검, 플라시보-제어된 연구: 이 연구에서, 대상체에게 2 상이한 투여량 (2 및 10 mg/kg)의 CTLA4-Ig 또는 플라시보와 함께 MTX를 투여하였다. CTLA4-Ig를 본 발명의 공정에 따라 생성하고, 200 mg의 CTLA4-Ig를 함유하는 개별 바이알로 공급하였다. CTLA4-Ig를 대상체에게 1, 15, 및 30일째, 및 매 30일 그 이후에 1년 동안 정맥내 투여하였다. 다중 투여량 PK는 60 내지 90일의 투여 간격 동안 부위-특이적 PK 하위연구에 등록된 대상체로부터 얻은 혈청 농도 대 시간 데이타로부터 유래하였다. PK 하위연구에서 대상체를 위해, 혈액 샘플을 투여전 60일에 수집하고, PK 프로파일은 60일째에 시작하여 30분 (CTLA4-Ig 주입의 끝에 상응함), 주입 시작 후 4시간, 그 이후에 매주 90일째까지 수집하였다. 총 90명의 대상체를 PK 하위연구에 참여시키기 위해 등록하였다. 그러나, 60 내지 90일 간격 사이의 완성된 PK 프로파일을 29명의 대상체로부터 얻었다 (15명의 대상체는 2 mg/kg으로 투여하고; 14명의 대상체는 10 mg/kg으로 투여함).
PK 파라미터의 요약이 표 46에 제공되어 있다. 연구 결과는 Cmax 및 AUC(TAU) (여기서, TAU = 30일임) 둘 다 투여량에 비례하는 방식으로 증가하였음을 나타냈다. 공칭 투여량의 1:5 비율로의 증가에 대해, Cmax의 기하학적 평균은 1:5.2의 비율로 증가한 한편, AUC(TAU)에 대한 기하학적 평균은 1:5.0의 비율로 증가하였다. 또한, T-HALF, CLT, 및 Vss 값은 투여량에 독립적인 것으로 여겨졌다. 이들 RA 대상체에서, 평균 T-HALF, CLT, 및 Vss 값은 각각 13일 근처, 약 0.2 mL/h/kg, 및 약 0.07 L/kg이다. 적은 Vss는 CTLA4-Ig가 세포외액 용량에 주로 한정됨을 나타낸다. 최초 주입 후 2 및 4주, 이어서 그 후에 1개월에 1회 투여 개요를 기준으로, CTLA4-Ig에 대한 안정-상태 조건은 세 번째 달 투여량에 의해 달성하였다. 또한, 투여 개요의 결과로서, 혈청 농도는 처리 최초 2개월 동안 안정-상태 저점 농도 이상이었다. 60, 90, 및 180일째 저점 (Cmin) 값의 비교는 CTLA4-Ig가 매달 투여 후에 축적된 것으로 나타나지 않았음을 나타냈다. IV 한달 투여량 2 및 10 mg/kg CTLA4-Ig를 투여받은 모든 대상체에 대한 평균 Cmin 안정-상태 값은 각각 4.4 내지 6.7 μg/mL 및 22.0 내지 28.7 μg/mL이다.
Figure 112011097388832-pat00154
RA 환자에서 다중 정맥내 주입 후, CTLA4-Ig의 약물동력학은 2 mg/kg 내지 10 mg/kg의 투여 범위에 걸쳐 Cmax 및 AUC의 비례적인 증가를 나타내었다. 10 mg/kg에서, 혈청 농도는 24 (1-66) mcg/mL의 평균 (범위) 관통 농도를 가지면서 제60일까지 정적-상태에 도달하는 것으로 관찰되었다. RA 환자에서 1개월 간격으로 10 mg/kg으로의 반복 처리를 계속하였을 때 CTLA4-Ig의 전신 축적은 나타나지 않았다.
RA 환자에서의 집단 약물동력학 분석 결과, 체중이 증가할 수록 CTLA4-Ig의 청소율이 상승하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 연령 및 성별 (체중에 대해 보정하였을 때)은 청소율에 영향을 미치지 않았다. 공존하는 메토트렉세이트 (MTX), 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 코르티코스테로이드, 및 TNF 차단제는 CTLA4-Ig 청소율에 영향을 미치지 않았다.
실시예 35: CE에 의한 만노스, 푸코스, 및 갈락토스의 몰비의 측정
LEA2 CTLA4A29YL104E-Ig 중 중성 모노사카라이드 함량의 정량 분석을 위해 모세관 전기영동 방법이 개발되었다. CTLA4A29YL104E-Ig 샘플로부터 중성 모노사카라이드, 예컨대 만노스, 푸코스, 및 갈락토스를 고온 조건 (2M 트리플루오로아세트산, 95℃에서 6시간)에서 산성 가수분해에 의해 방출시킨다. 그 후, 방출된 중성 모노사카라이드를 촉매로서 아세트산, 및 환원 시약으로서 NaBH3CN의 존재하에 (67 mM APTS, 330 mM HAc, 83 mM NaBH3CN, 55℃에서 3시간) 아미노피렌 트리술폰산 (APTS)으로 형광 표지시킨다. 크실로스를 각 샘플에 첨가하며, 이는 내부 표준으로서 기능한다. 상기 내부 표준의 피크 면적에 대한 각 중성 모노사카라이드의 피크 면적의 비율을 정량화를 위해 이용하였다.
시약: 가수분해 용액 (2M 트리플루오로아세트산 (TFA)); 유도체화 용액 I (0.1M 8-아미노-1,3,6, 트리술폰산, 3나트륨염 (APTS) 수용액); 유도체화 용액 II (1M 아세트산 중 0.25M NaBH3CN); 전개 완충액 (60 ± 5 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 세정 용액 (1N NaOH; 1N HCl; 80％ 메탄올); 만노스 (Man), 푸코스 (Fuc), 갈락토스 (Gal), 및 크실로스 (Xyl)의 10 mg/ml 농도의 모노사카라이드 표준 원액; 모노사카라이드 작업 용액 I: 내부 표준 작업 용액은 Xyl 원액의 100배 희석액임; 모노사카라이드 작업 용액 II: 중성 혼합 표준 작업 용액, Man, Fuc 및 Gal 원액의 100배 희석액.
장비: CE 시스템은 베크만(Beckman) P/ACE MDQ CE 시스템; 검출기: P/ACE MDQ와 커플링된 베크만 레이저 유도 (LIF) 검출 시스템; P/ACE MDQ를 수용하는, 전체 길이 27 내지 31 cm의 코팅되지 않은 모세관 (내경 25 ㎛, 외경 360 ㎛)이다.
모세관 전기영동 전개 조건: 전개 완충액 (60 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 카트리지 온도: 25℃; 전압: 25-30 kV, 포지티브 모드; 검출기 조건: LIF 검출기, 488nm에서 여기, 520m에서 방출; 샘플 주입: 압력 주입 방식, 0.5 PSI에서 20s; 전개 시간: 10분; 샘플 보관: 10℃.
가수분해: 크실로스 작업 용액 10 ㎕ 및 2M TFA 200 ㎕를 혼합하여 시스템 블랭크를 제조하였다. 크실로스 작업 용액 10 ㎕ 및 중성 혼합 표준 용액 10 ㎕를 2M TFA 200 ㎕와 혼합하여, 모노사카라이드 표준을 제조하였다. 크실로스 작업 용액 10 ㎕ 및 샘플 10 ㎕ (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig, 대략 1 mg/ml)를 2M TFA 200 ㎕와 혼합하여 시험 샘플을 제조하였다. 모든 튜브를 10초 동안 와동시키고, 10초 동안 원심분리한 후, 95℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 가수분해 단계 이후, 샘플을 -20℃에서 10분 동안 방치하여 냉각시켰다. 샘플을 10초 동안 회전시키고, 스피드백(SpeedVac)에서 증발 건조시켰다.
유도체화: 샘플을 유도체화 용액 I 10 ㎕로 재구성하였다. 샘플을 간단히 혼합하고, 유도체화 용액 II 5 ㎕을 첨가하였다. 샘플을 예비 가온된 원심분리기에 로딩하고, 55℃에서 3시간 동안 2000 rpm에서 원심분리하면서 인큐베이션하였다.
CE 주입: 유도체화 후, HPLC 등급용수의 첨가에 의해 샘플의 최종 부피가 100 ㎕가 되었고, 샘플 10 ㎕를 HPLC 등급용수 190 ㎕와 함께 CE 마이크로 바이알에 옮겼다. 샘플 주입 전에 CE 카트리지를 HPLC 등급용수로 철저히 세정한 후 (전개 시간 1 내지 3분), 전개 완충액으로 평형화 세정하였다 (전개 시간 5분). 초기 세정 후, 모노사카라이드 표준 및 분석용 샘플을 CE 카트리지 (전개 시간 15분)에 주입하였다. 각각의 표준 또는 시험 샘플을 주입 전개한 후, CE 카트리지를 세정하고, HPLC 등급용수 및 전개 완충액으로 평형화하였다 (표 51). 시스템 적합성의 전기영동도는 도 45와 유사해야 하며, 상기 도에서 피크 1은 만노스; 피크 2는 크실로스; 피크 3은 푸코스; 피크 4는 갈락토스이다.
장비 방법
시간 사건 값 지속 시간 요약 설명
세정-압력 40.0 psi 3.00분 전향 물 세정
세정-압력 40.0 psi 5.00분 전향 전개 완충액 세정
주입-압력 0.5 psi 20.00초 오버라이드,
전향		 주입
0.00분 분리-전압 30 kV 15.00분 0.17분 램프,
정상 극성		 분리
0.05분 자동 제로
15.00분 정지 데이타
15.00분 종료
시스템 적합성 :
시스템 적합성의 전기영동도는 도 45에 도시된 것과 유사해야 하며, 상기 도에서 피크 1은 만노스; 피크 2는 크실로스; 피크 3은 푸코스; 피크 4는 갈락토스이다.
베크만 MDQ 시스템 이외의 CE 장비를 사용한 경우, 모세관의 길이는 이 방법에 명시된 것과 다를 수 있다. 이는 분석물 이동 시간 및 피크 강도에서의 편차를 야기할 것이다. 그러나, 모노사카라이드 분석물의 피크 패턴은 동일하게 유지되어야 한다.
제1 시스템 적합성 표준에 대한 2개의 이웃 피크 사이의 해상도는 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
R = 2(t2-t1)/(W1+W2)
상기 식에서,
R은 해상도이고,
t2 및 t1은 2개의 각 이웃 피크의 이동 시간이고,
W1 및 W2는 2개의 각 이웃 피크의 기준선에서의 피크 폭이다.
R 값은 1.0 이상이어야 한다. R이 1.0 미만인 경우, 세척/세정의 순서를 이용하여 모세관을 세정한다. 문제가 지속되면, 이전의 완충액을 새로 제조한 전개 완충액으로 교체하거나, 모세관을 교체한다.
마지막 시스템 적합성 주입의 경우, 마지막 피크 (갈락토스)는 하기 식에 따라 테일링 계수(tailing factor)가 1.4 미만이어야 한다.
T = W0.05/2f
상기 식에서,
T는 테일링 계수이고,
W0.05는 높이의 5％에서의 피크이고,
f는 최대 피크에서 피크 전방의 폭이다.
T가 1.4 이상인 경우, 세척/세정의 순서로 모세관을 세정하고, 문제가 지속되면, 이전의 완충액을 새로 제조한 전개 완충액으로 교체하거나, 모세관을 교체한다. 갈락토스 및 크실로스의 피크 면적비는 RSD가 10％ 이하이어야 한다. 갈락토스의 이동 시간은 15.0분 이하이어야 한다. 전기영동도 프로파일은 도 45와 동등해야 한다.
모노사카라이드 표준 백분율 RSD는, 각각의 모노사카라이드 구성성분의 피크 면적을 각각의 모노사카라이드 표준 주입의 내부 표준의 피크 면적으로 나누고, 내부 표준 및 모노사카라이드 표준 구성성분의 피크 면적비를 비교함으로써 결정될 수 있다. RSD 백분율은 만노스, 푸코스, 및 갈락토스에 대해 계산될 수 있다. RSD는 10％ 이하이어야 한다.
중성 모노사카라이드 대 단백질의 몰비의 측정
각각의 중성 모노사카라이드 대 단백질의 몰비를 측정하기 위해, 내부 표준 크실로스에 대한 중성 모노사카라이드 (예를 들어, Man, Gal 및 Fuc)의 피크 면적비를 하기 식에 따라 계산할 수 있다. 예를 들어, 피크 면적비는 크실로스 피크 면적으로 나눈 모노사카라이드 피크 면적 (Gal, Fuc 또는 Man)과 동일하며, 여기서 피크 면적비에 대한 상대적인 표준 편차 (RSD)는 10％ 이하이다. 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다.
만노스/단백질의 몰비의 경우:
Figure 112011097388832-pat00155
상기 식에서,
Rman은 만노스 대 단백질의 몰비이고,
Aman은 샘플 중 만노스의 피크 면적 (μV.sec)이고,
Axyl은 샘플 중 크실로스의 피크 면적 (μV.sec)이고,
Axyl0은 모노사카라이드 표준 중 크실로스의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
Aman0은 모노사카라이드 표준 중 만노스의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
Vman0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 만노스의 부피 (㎕)이고,
Cman0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 만노스의 농도 (mg/ml)이고,
Vp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 부피 (㎕)이고,
Cp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 농도 (mg/ml)이고,
MWLEA29Y는 LEA29Y (또는 CTLA4A29YL104E-Ig)의 분자량 (91,232 Da)이고,
만노스의 MW는 180.2 달톤이다.
푸코스/단백질의 몰비의 경우:
Figure 112011097388832-pat00156
Rfc는 푸코스 대 단백질의 몰비이고,
Afuc는 샘플 중 푸코스의 피크 면적 (μV.sec)이고,
Axyl은 샘플 중 크실로스의 피크 면적 (μV.sec)이고,
Axyl0은 모노사카라이드 표준 중 크실로스의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
Afuc0은 모노사카라이드 표준 중 푸코스의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
Vfuc0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 푸코스의 부피 (㎕)이고,
Cfuc0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 푸코스의 농도 (mg/ml)이고,
Vp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 부피 (㎕)이고,
Cp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 농도 (mg/ml)이고,
MWLEA29Y는 LEA29Y (또는 CTLA4A29YL104E-Ig)의 분자량 (91,232 Da)이고,
푸코스의 MW는 164.2 달톤이다.
갈락토스/단백질의 몰비의 경우:
Figure 112011097388832-pat00157
Rgal는 갈락토스 대 단백질의 몰비이고,
Agal는 샘플 중 갈락토스의 피크 면적 (μV.sec)이고,
Axyl은 샘플 중 크실로스의 피크 면적 (μV.sec)이고,
Axyl0은 모노사카라이드 표준 중 크실로스의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
Agal0은 모노사카라이드 표준 중 갈락토스의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
Vgal0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 갈락토스의 부피 (㎕)이고,
Cgal0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 갈락토스의 농도 (mg/ml)이고,
Vp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 부피 (㎕)이고,
Cp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 농도 (mg/ml)이고,
MWLEA29Y는 LEA29Y (또는 CTLA4A29YL104E-Ig)의 분자량 (91,232 Da)이고,
갈락토스의 MW는 180.2 달톤이다.
모노사카라이드 대 CTLA4 A29YL104E -Ig 단백질의 평균 몰비
모노사카라이드 범위
만노스 11-23
푸코스 4.2-7.5
갈락토스 9.2-18
실시예 36: CE에 의한 GalNAc 및 GlcNAc의 몰비의 측정
6개의 N-연결된 글리코실화 부위 및 1개 이상의 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질인 CTLA4A29YL104E-Ig 중 아미노 모노사카라이드 함량의 정량 분석을 위해 모세관 전기영동 방법이 개발되었다. N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc) 및 N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc)을 비롯한 아미노 모노사카라이드를 고온 조건 (4N HCl, 95℃에서 6시간)에서 산성 가수분해에 의해 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플로부터 방출시킨다. 방출된 아미노 모노사카라이드를 30분 동안 아세트산 무수물과 함께 인큐베이션하여 재-아세틸화시킨다. 그 후, 이들을 촉매로서 아세트산 및 환원 시약으로서 NaBH3CN의 존재하에 (67 mM APTS, 330 mM HAc, 83 mM NaBH3CN, 55℃에서 3시간) 아미노피렌 트리술폰산 (APTS)으로 형광 표지한다. N-아세틸 만노사민을 각 샘플에 첨가하였고, 이는 내부 표준으로서 기능한다. 상기 내부 표준에 대한 각각의 아미노 모노사카라이드의 피크 면적비는 정량화를 위해 이용된다.
시약: 가수분해 용액 (4N HCl); 유도체화 용액 I (0.1M 8-아미노-1,3,6, 트리술폰산, 3나트륨염 (APTS) 수용액); 유도체화 용액 II (1M 아세트산 중 0.25M NaBH3CN); 재-아세틸화 완충액 (25 mM 나트륨 비카르보네이트, pH 9.5); 전개 완충액 (60 ± 5 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 세정 용액 (1N NaOH; 1N HCl; 80％ 메탄올); GalNAc, GlcNAc, 및 ManNAc의 10 mg/ml 농도의 모노사카라이드 표준 원액; 모노사카라이드 작업 용액 I: 내부 표준 작업 용액은 ManNAc 원액의 100배 희석액임; 모노사카라이드 작업 용액 II: 아미노 혼합 표준 작업 용액, GalNAc 및 GlcNAc 원액의 100배 희석액임.
장비: CE 시스템은 베크만 P/ACE MDQ CE 시스템; 검출기: P/ACE MDQ와 커플링된 베크만 레이저 유도 (LIF) 검출 시스템이다.
모세관 전기영동 전개 조건: 전개 완충액 (60 mM 나트륨 테트라보레이트, pH 9.25); 모세관 카트리지 온도: 25℃; 전압: 25-30 kV, 포지티브 모드; 검출기 조건: LIF 검출기, 488nm에서 여기, 520m에서 방출; 샘플 주입: 압력 주입 방식, 0.5 PSI에서 20s; 전개 시간: 10분; 샘플 보관: 10℃.
가수분해: ManNAc 작업 용액 10 ㎕ 및 4N HCl 200 ㎕를 혼합하여 시스템 블랭크를 제조하였다. ManNAc 작업 용액 10 ㎕ 및 아미노 혼합 표준 용액 10 ㎕를 4N HCl 200 ㎕와 혼합하여, 모노사카라이드 표준을 제조하였다. ManNAc 작업 용액 10 ㎕ 및 샘플 10 ㎕ (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig, 대략 1 mg/ml)를 4N HCl 200 ㎕와 혼합하여 시험 샘플을 제조하였다. 모든 튜브를 10초 동안 와동시키고, 10초 동안 원심분리한 후, 95℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 가수분해 단계 이후, 샘플을 -20℃에서 10분 동안 방치하여 냉각시켰다. 샘플을 10초 동안 회전시키고, 스피드백에서 증발 건조시켰다.
재-아세틸화: 가수분해되고 건조된 샘플을 재-아세틸화 완충액 20 ㎕ 및 아세트산 무수물 4 ㎕로 재구성한 후, 얼음상에서 30분 동안 인큐베이션하면서 혼합하였다. 샘플을 10초 동안 회전시키고, 스피드백에서 증발 건조시켰다. 샘플을 각각 HPLC 등급용수 100 ㎕로 재구성하고, 스피드백에서 증발 건조시켰다.
유도체화: 재구성된 샘플 (유도체화 용액 I HPLC 10 ㎕)을 유도체화 용액 II 5 ㎕을 첨가하였다. 혼합한 후, 샘플을 예비 가온된 원심분리기에 로딩하고, 55℃에서 3시간 동안 2000 rpm에서 원심분리하면서 인큐베이션하였다.
CE 주입: 유도체화 후, HPLC 등급용수의 첨가에 의해 샘플의 최종 부피가 100 ㎕가 되었고, 샘플 10 ㎕를 HPLC 등급용수 190 ㎕와 함께 CE 마이크로 바이알에 옮겼다. 샘플 주입 전에 CE 카트리지를 HPLC 등급용수로 철저히 세정한 후 (전개 시간 1 내지 3분), 전개 완충액으로 평형화 세정하였다 (전개 시간 5분). 초기 세정 후, 모노사카라이드 표준 및 분석용 샘플 CE 카트리지 (전개 시간 10분)에 주입하였다. 각각의 표준 또는 시험 샘플을 주입 전개한 후, CE 카트리지를 세정하고, HPLC 등급용수 및 전개 완충액으로 평형화하였다. 시스템 적합성의 전기영동도는 도 46과 유사해야 하며, 상기 도에서 피크 1은 GalNAc; 피크 2는 ManNAc; 피크 3은 GlcNAc이다.
장비 방법
시간 사건 값 지속 시간 요약 설명
세정-압력 40.0 psi 3.00분 전향 물 세정
세정-압력 40.0 psi 5.00분 전향 전개 완충액 세정
주입-압력 0.5 psi 20.00초 오버라이드,
전향		 주입
0.00분 분리-전압 30 kV 10.00분 0.17분 램프,
정상 극성		 분리
0.05분 자동 제로
10.00분 정지 데이타
10.00분 종료
시스템 적합성 :
시스템 적합성의 전기영동도는 도 46에 도시된 것과 유사해야 하며, 상기 도피크 1은 GalNAc; 피크 2는 ManNAc; 피크 3은 GlcNAc이다.
베크만 MDQ 시스템 이외의 CE 장비를 사용한 경우, 모세관의 길이는 이 방법에 명시된 것과 다를 수 있다. 이는 분석물 이동 시간 및 피크 강도에서의 편차를 야기할 것이다. 그러나, 모노사카라이드 분석물의 피크 패턴은 동일하게 유지되어야 한다.
제1 시스템 적합성 표준에 대한 2개의 이웃 피크 사이의 해상도는 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
R = 2(t2-t1)/(W1+W2)
상기 식에서,
R은 해상도이고,
t2 및 t1은 2개의 각 이웃 피크의 이동 시간이고,
W1 및 W2는 2개의 각 이웃 피크의 기준선에서의 피크 폭이다.
R 값은 1.0 이상이어야 한다. R이 1.0 미만인 경우, 세척/세정의 순서를 이용하여 모세관을 세정한다. 문제가 지속되면, 이전의 완충액을 새로 제조한 전개 완충액으로 교체하거나, 모세관을 교체한다.
마지막 시스템 적합성 주입의 경우, 마지막 피크 (GalNAc)는 하기 식에 따라 테일링 계수가 1.4 미만이어야 한다.
T = W0.05/2f
상기 식에서,
T는 테일링 계수이고,
W0.05는 높이의 5％에서의 피크이고,
f는 최대 피크에서 피크 전방의 폭이다.
T가 1.4 이상인 경우, 세척/세정의 순서로 모세관을 세정하고, 문제가 지속되면, 이전의 완충액을 새로 제조한 전개 완충액으로 교체하거나, 모세관을 교체한다. GalNAc 및 ManNAc의 피크 면적비는 RSD가 10％ 이하이어야 한다. GalNAc의 이동 시간은 10.0분 이하이어야 한다. 전기영동도 프로파일은 도 46과 동등해야 한다.
모노사카라이드 표준 백분율 RSD는, 각각의 모노사카라이드 구성성분의 피크 면적을 각각의 모노사카라이드 표준 주입의 내부 표준의 피크 면적으로 나누고, 내부 표준 및 모노사카라이드 표준 구성성분의 피크 면적비를 비교함으로써 결정될 수 있다. RSD 백분율은 GalNAc 및 GlcNAc에 대해 계산될 수 있다. RSD는 10％ 이하이어야 한다.
아미노 모노사카라이드 대 단백질의 몰비의 측정
각각의 아미노 모노사카라이드 대 단백질의 몰비를 측정하기 위해, 내부 표준 ManNAc에 대한 중성 모노사카라이드 (예를 들어, GalNAc 및 GlcNAc)의 피크 면적비를 하기 식에 따라 계산할 수 있다. 예를 들어, 피크 면적비는 ManNAc 피크 면적으로 나눈 모노사카라이드 피크 면적 (GalNAc 및 GlcNAc)과 동일하며, 여기서 피크 면적비에 대한 상대적인 표준 편차 (RSD)는 10％ 이하이다. 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다.
GalNAc/단백질의 몰비의 경우:
Figure 112011097388832-pat00158
상기 식에서,
RGalNAc은 GalNAc 대 단백질의 몰비이고,
AGalNAc은 샘플 중 GalNAc의 피크 면적 (μV.sec)이고,
AManNAc은 샘플 중 ManNAc의 피크 면적 (μV.sec)이고,
AManNAc0은 모노사카라이드 표준 중 ManNAc의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
AGalNAc0은 모노사카라이드 표준 중 GalNAc의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
VGalNAc0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 GalNAc의 부피 (㎕)이고,
CGalNAc0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 GalNAc의 농도 (mg/ml)이고,
Vp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 부피 (㎕)이고,
Cp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 농도 (mg/ml)이고,
MWLEA29Y는 LEA29Y (또는 CTLA4A29YL104E-Ig)의 분자량 (91,232 Da)이고,
GalNAc의 MW는 221.2 달톤이다.
GlcNAc/단백질의 몰비의 경우:
Figure 112011097388832-pat00159
RGlcNAc는 GlcNAc 대 단백질의 몰비이고,
AGlcNAc는 샘플 중 GlcNAc의 피크 면적 (μV.sec)이고,
AManNAc은 샘플 중 ManNAc의 피크 면적 (μV.sec)이고,
AManNAc0은 모노사카라이드 표준 중 ManNAc의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
AGlcNAc0은 모노사카라이드 표준 중 GlcNAc의 피크 면적 (μV.sec) 평균이고,
VGlcNAc0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 GlcNAc의 부피 (㎕)이고,
CGlcNAc0은 가수분해에 사용된 모노사카라이드 작업 용액 중에 함유된 GlcNAc의 농도 (mg/ml)이고,
Vp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 부피 (㎕)이고,
Cp는 가수분해에 사용된 단백질 샘플의 농도 (mg/ml)이고,
MWLEA29Y는 LEA29Y (또는 CTLA4A29YL104E-Ig)의 분자량 (91,232 Da)이고,
GlcNAc의 MW는 221.2 달톤이다.
모노사카라이드 대 CTLA4 A29YL104E -Ig 단백질의 평균 몰비
모노사카라이드 범위
GalNAc 2.0-3.2
GlcNAc 18-32
실시예 37: 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 CTLA4 A29YL104E -Ig의 N- 연결된 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일링
당단백질에 존재하는 탄수화물 구조체는 그들의 기능 및 생체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 당단백질의 재조합적으로 제조된 뱃치의 탄수화물의 구조적 일관성을 모니터링하는 것이 중요하다. 여기서는, CTLA4A29YL104E-Ig에 존재하는 N-연결된 (아스파라긴-연결된) 탄수화물을 모니터링한다. 이 방법에서, 올리고사카라이드를 PNGase F (펩티드: N-글리코시다제 F)를 이용한 효소적 분해에 의해 절단하고, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC)에 의해 분리하고, 전기화학적 검출 (통합 전류측정법)에 의해 모니터링한다. 생성된 크로마토그램은 N-연결된 탄수화물 프로파일이며, 여기서, CTLA4A29YL104E-Ig 샘플의 프로파일은 이와 동일해야 한다.
역상 및 흑연 탄소 HPLC에 의한 올리고사카라이드의 단리를 위한 이동상 시약: 용출액 1: HPLC 등급용수 중 0.05％ 트리플루오로아세트산 (TFA); 용출액 2: 60％ 아세토니트릴 (ACN), 40％ HPLC 수 (60:40, ACN:H2O) 중 0.05％ TFA; 용출액 3: 40％ 아세토니트릴, 40％ 이소프로판올 (IPA), 20％ HPLC 수 (40:40:20, ACN:IPA:H2O) 중 0.05％ TFA.
HPAEC 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일링을 위한 이동상의 제조를 위한 시약: 용출액 1: 500 mM 아세트산나트륨 (NaOAc); 용출액 2: 400 mM 수산화나트륨 (NaOH); 밀리-Q 워터; 4M 수산화나트륨 (대략 4M NaOH); 50 mM 인산나트륨 완충액, 0.02％ 아지드화나트륨, pH = 7.5; 50 mM 인산나트륨 완충액 중 PNGase F 효소 작업 원액, 0.02％ 아지드화나트륨, pH = 7.5; 스타키오스 원액 (1.25 mg/mL); 스타키오스 시스템 적합성 표준 (12.5 μg/mL).
장비 및 조건 - (등가의 장비로 대체가능함)
장비:
얼라이언스(Alliance) HPLC 시스템: 보정된 온도-조절 오토샘플러 (37℃), 레오다인(Rheodyne) 스위칭 밸브 장치 및 UV 검출기를 구비함, 워터스 코퍼레이션(Waters Corporation)
시너지(Synergi) 6-칼럼 선별기: 페노메넥스(Phenomenex) (카탈로그 번호 AV0-6080)
칼럼 1: 루나(Luna) 5μ, C18(2) 4.6 x 150 mm: 페노메넥스 (카탈로그 번호 00F-4252-EO)
칼럼 2: 하이퍼카르브(HyperCarb) 5μ 4.6 mm x 100 mm: 페노메넥스 (카탈로그 번호 CHO-3301)
디오넥스(Dionex) DX-500 HPLC 시스템: GP50 구배 펌프 AS50 오토샘플러 (냉장), 용출액 데가스(Degas) 모듈 액체 크로파토그래피, 모듈, ED40 검출기, 적합한 컴퓨터 시스템 상의 DX-LAN 피크넷 소프트웨어 (버젼 5.1 또는 업그레이드)를 포함함, 디오넥스 코퍼레이션(Dionex Corporation)
칼럼: 카르보팩(CarboPac) PA-1 4 x 250 mm: 디오넥스 코퍼레이션 (카탈로그 번호 35391)
가드 칼럼: 카르보팩 PA-1 4 x 50 mm: 디오넥스 코퍼레이션 (카탈로그 번호 43096)
밀레니엄 데이타 수집 시스템: 버젼 3.2
샘플 제조: 1.7 mL 에펜도르프 튜브에, 0.02％ Na아지드를 함유하는 50 mM Na포스페이트 완충액 80 ㎕, pH 7 및 샘플 (CTLA4A29YL104E-Ig 총 2 mg에 대해 약 25 μg/㎕ 등) 80 ㎕을 첨가한 후, 10배 변성 완충액 (5％ SDS, 10％ β-머캅토에탄올) 16 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 철저히 혼합하고, 이어서 2분 동안 비등시켜 단백질을 변성시켰다. 바이알을 실온으로 냉각한 다음, NP4O (10％) 16 ㎕ 및 PNGase F 작업 원액 40 ㎕을 첨가하고, 이어서 혼합하였다. 샘플을 37℃에서 24 ± 2시간 동안 인큐베이션한 후, HPLC 장비로의 즉시 주입을 위해 HPLC 오토샘플러 바이알로 옮겼다.
올리고사카라이드 단리를 위한 크로마토그래피 조건:
칼럼 온도: 주위 온도 (22-25℃)
유속 프로그램: 30.0분, 1.0 mL/분으로 시작
30.0 내지 35.0분, 1.0-2.0 mL/분
35.0 내지 40.0분, 2.0-1.0 mL/분
40.0 내지 50.0분, 1.0 mL/분
50.0 내지 60.0분, 1.0-0.1 mL/분
이동상 및 구배 조건:
1: 0.05％ TFA
2: ACN/H2O (60:40) 중 0.05％ TFA
3: ACN/IPA/H2O (40/40/20) 중 0.05％ TFA
구배 프로그램:
Figure 112011097388832-pat00160
오토샘플러 온도: 37℃
주입 용량: 100 ㎕
전개 시간: 50분
데이타 수집 시간: 50분
6 칼럼 스위칭 밸브에 대한 칼럼 스위칭 사건 및 워터스 얼라이언스 레오다인 장치:
Figure 112011097388832-pat00161
음이온 교환 크로마토그래피에 의한 올리고 프로파일을 위한 크로마토그래피 조건:
칼럼 온도: 주위 온도 (22-25 ℃)
유속: 1 mL/분
이동상 및 구배 조건:
1: 500 mM NaOAc
2: 400 mM NaOH
3: 밀리-Q 워터
구배 프로그램:
하기 일부 구배 단계에 대한 제2 값은, 시스템 적합성 표준의 체류 시간을 조정하기 위해 구배를 조정할 수 있는 정도를 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00162
ED40 검출기 설정:
방식: 통합 전류측정법
적용된 전위:
Figure 112011097388832-pat00163
범위: 200 nC
아날로그 출력 설정: 출력 = 오프셋
제로 위치 = 5％ 총 규모
전압 총 규모 = 1.0 v
상승 시간 = 1초
극성 = +
오토샘플러 온도: 4℃
주입 용량: 30 ㎕
전개 시간: 80분
시스템 적합성 (SS) 표준의 RT에 따른 대략적 체류 시간 (RT; 분)
Figure 112011097388832-pat00164
CTLA4A29YL104E-Ig 샘플은 도 47의 크로마토그램에 도시된 탄수화물 프로파일을 가질 수 있다. 도 47에서 확인되는 바와 같이, 각 도메인의 체류 시간은 대략 다음과 같아야 한다:
도메인 I (피크 1A, 1B, 1C, 1D 및 1E): 10 내지 17분
도메인 II: 21 내지 29분
도메인 III: 33 내지 43분
도메인 IV: 48 내지 56분
체류 시간은 시스템 의존적이며, 스타키오스와 유사하게 이동하여야 한다.
계산
이론적 플레이트 (N): 이론적 플레이트의 개수 (N)는 하기 식을 이용하여 스타키오스 피크에 기초하여 측정될 수 있다. 이는 밀레니엄 데이타 분석 시스템을 통해 수행하거나, 수작업으로 수행할 수도 있다.
N = 16(t/W)2
상기 식에서,
t는 주입 시간으로부터 최대 높이에서의 피크 용출까지 측정한 체류 시간이고,
W는 기준선에 대한 측면 외삽에 의한 피크 폭이다.
N은 6000 이상이어야 한다. 플레이트 개수가 6000 미만이면, 칼럼을 교체해야 한다.
테일링 계수 (T): 칼럼 테일링 계수 (T)는 하기 식을 이용하여 스타키오스 피크에 기초하여 계산될 수 있다. 이는 밀레니엄 데이타 분석 시스템을 통해 수행하거나, 수작업으로 수행할 수도 있다.
T = (W0.05/2f)
상기 식에서,
W0.05는 높이의 5％ (0.05h)에서의 피크 폭이고,
f는 W0.05에서의 피크 전면 단부로부터 최대 높이에서의 피크 중간까지의 측정치 (폭)이다.
T는 1.2 이하이어야 한다. 테일링 계수가 1.2 초과인 경우, 완충액 조성물을 평가하고, 칼럼을 교체하거나 세척해야 한다.
％ 도메인 면적:
도메인 I: 대략 체류 시간 10 내지 15분에서 피크 면적의 합계 (피크 1A 내지 1E; 예를 들어 도 47)
도메인 II: 21 내지 27분에서 피크 면적의 합계
도메인 III: 34 내지 40분에서 피크 면적의 합계
도메인 IV: 45 내지 56분에서 피크 면적의 합계
Figure 112011097388832-pat00165
주 피크 면적 백분율: 5개의 주 피크 각각에 대한 ％ 피크 면적은 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다: 피크 1A, 1B, 1C, 2 (분할되지 않은 2가지 종), 3 (분할되지 않은 2가지 종), 및 4.
Figure 112011097388832-pat00166
실시예 38; 약물 재료 및 약물 제품 중 CTLA4 A29YL104E -Ig의 모세관 전기영동 동정
CTLA4A29YL104E-Ig는 면역억제 활성을 가진 수용성 당단백질이다. 코팅되지 않은 융합 실리카 모세관을 이용하는 모세관 전기영동 방법을 이용하여 CTLA4A29YL104E-Ig를 동정하였다. 샘플 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 등)을 70℃에서 5분 동안 가열한 다음, 214 nm로 설정된 UV 검출에 의해 즉시 분석하여, 동정을 확인하였다.
추가로, CTLA4A29YL104E-Ig 및 CTLA4-Ig 물질의 1:1 혼합물을 혼합하고 주입하여, 2가지 단백질이 분리되고 구별될 수 있음을 확인하였다. 이 방법은 샘플로의 CTLA4A29YL104E-Ig의 이동 시간을 비교함으로써 CTLA4A29YL104E-Ig와 CTLA4-Ig를 구별할 수 있게 한다.
장비 (등가의 장비로 교체가능함):
모세관 전기영동 장비: 베크만 P/ACE MDQ
검출기 모듈: 214 nm에서 UV
모세관: 폴리마이크로 테크놀로지즈 인크.(Polymicro Technologies Inc.), 360 ㎛ 외경/75 ㎛ 내경, 코팅되지 않음 (부품 번호 2000019, TSP075375)
모세관 윈도우 마커: 마이크로솔브 테크놀로지(MicroSolve Technology) (카탈로그 번호 07200-S)
시약 및 용액: 전개 완충액 (14.4 mM 붕산나트륨; 17.3 mM 나트륨 도데실 술페이트; 2.0％ 아세토니트릴); 포스페이트 희석 완충액 (22.3 mM 제이인산나트륨; 4.2 mM 제일인산나트륨; 53.4 mM 염화나트륨); 보레이트 희석 완충액 (83.5 mM NaBO2, pH 9.6); 참조 또는 샘플 작업 용액 (포스페이트 희석 완충액 중 10±1 mg/mL 샘플); 참조 또는 샘플 주입 용액 (10.0 ㎕ 샘플 + 50 ㎕ 보레이트 희석 완충액); 샘플 1:1 CTLA4-Ig-CTLA4A29YL104E-Ig 혼합물 용액 (10.0 ㎕ CTLA4-Ig 샘플 + 10.0 ㎕ CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 + 50㎕ 보레이트 희석 완충액); 주입 용액.
전개 조건:
UV 검출기 파장: 214 nm
데이타 속도: 4 Hz
피크 폭 (포인트): 16 내지 25
주입: 10초 (0.5 psi)
전체 길이*: 약 60 cm
모세관 효과적 길이**: 약 50 cm
모세관 카트리지 온도: 15℃
전압: 19kV 내지 23kV
전개 시간: 15분
* 전체 길이: 모세관 입구에서부터 출구까지
** 효과적인 길이: 모세관 입구에서부터 검출 윈도우까지
주 피크의 CTLA4-Ig 샘플 이동 시간은 약 11.0 ± 0.4분이다. 주 피크의 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 이동 시간은 약 12.0 ± 0.4분이다. 각 샘플간의 주 피크 이동 시간은 0.6분 이상의 간격이어야 한다 (도 48).
실시예 39: CTLA4 A29YL104E -Ig에 대한 N-아세틸뉴라민산 및 N- 글리콜릴 뉴라민 산 함량 측정을 위한 가수분해 및 HPLC 분석
재조합 단백질에서의 시알릴화 정도는 약물동력학 및 청소율에 영향을 미칠 수 있다. CTLA4A29YL104E-Ig는 N- 및 O-연결된 탄수화물 부위를 둘 다 갖는 재조합 단백질이다. 이들 부위를 차지하는 글리칸은 다양한 정도의 시알릴화를 갖는다. 시알릴화의 구조적 불균일성 외에도, 개별 시알산의 함량은 로트마다 다를 수 있다. 따라서, 시알산 대 단백질의 비율의 전반적인 측정치를 수득한다.
CTLA4A29YL104E-Ig에 존재하는 N-아세틸 뉴라민산 (NANA) 및 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA) 함량을 실험하였다. 시알산을 산 가수분해에 의해 단백질로부터 유리시킨 다음, DMB로 형광 표지한다. 표지된 시알산을 RP-HPLC C-18 칼럼 상에서 분리하고, 동시에 전개한 시알산 표준의 반응 계수로부터 정량화한다. 데이타 분석 및 보고 값 (NANA 또는 NGNA 대 단백질의 몰비로서)은 이 실시예 방법 내에서 구체화한다. 이 실시예는 CTLA4A29YL104E-Ig에 존재하는 N-아세틸 뉴라민산 (NANA) 및 N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA)의 양을 측정하는데 이용된 방법을 기재한다. 시알산을 산 가수분해에 의해 단백질로부터 유리시킨다. 그 후, 방출된 NANA 및 NGNA를 1,2-디아미노-4,5-메틸렌옥시벤젠 (DMB)으로 형광 표지한다. 표지된 시알산을 RP-HPLC C-18 칼럼 상에서 분리하고, 형광 검출 (Ex = 373 nm, Em = 448 nm)한다. NANA 및 NGNA를 동시에 전개한 NANA 및 NGNA 표준의 반응 계수에 기초하여 정량화한다. 시험 결과는 각각 NANA 대 단백질, 및 NGNA 대 단백질의 몰비 (MR)로 보고한다.
시약 및 용액: 1.0 M H2SO4; 50 mM H2SO4; 형광 표지 시약 (18 mM 나트륨 히드로술파이트 (Na2S2O4), 7％ 2-머캅토에탄올, 7 mM 1,2-디아미노-4,5-메틸렌-디옥시벤젠 디히드로클로라이드 (DMB)); 이동상 전개 완충액 A (20％ 메탄올); 이동상 전개 완충액 B (70％ 메탄올); N-아세틸 뉴라민산 표준 용액 (1 mg/mL); N-글리콜릴 뉴라민산 표준 용액 (1 mg/mL); 시스템 적합성 표준 (물 900 ㎕ 중 NANA 또는 NGNA 50 ㎕ 용액); 샘플 용액 (예를 들어, 2 mg/ml CTLA4A29YL104E-Ig 등); NANA 작업 원액 표준 용액 (원액을 50 μg/mL으로 희석); NGNA 작업 원액 표준 용액 (원액을 50 μg/mL으로 희석).
가수분해: 각각 20 ㎕의 NANA 표준, NGNA 표준, CTLA4A29YL104E-Ig, 및 시스템 적합성 표준 용액을 별도의 1.5 mL 원심분리 튜브에 분취하고, 50 mM 황산 용액 200 ㎕를 각 바이알에 첨가하였다. 내용물을 부드럽게 혼합하고, 80℃에서 1시간 ± 5분 동안 인큐베이션하였다. 가수분해가 완료되면, 샘플을 신속히 원심분리하였다.
형광 표지: 형광 표지 시약 (200 ㎕)을 각 샘플에 첨가하고, 철저히 혼합하였다. 그 후, 샘플을 암실에서 80℃에서 45 ± 5분 동안 인큐베이션한 다음 냉각하였다.
장비 및 크로마토그래피 조건 (등가의 장비로 교체가능함):
3원 펌프 시스템: 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 모델 1090
RP C-18 HPLC 칼럼, 4.6 x 50 mm, 3 μ: 존스 크로마토그래피(Jones Chromatography) (카탈로그 번호 4M5313)
형광 검출기: 휴렛 팩커드 모델 1046A
오토샘플러: 4℃로의 냉장기를 구비한 휴렛 팩커드 모델 1090
통합 시스템: VG/멀티크롬
HPLC 켐스테이션 (DOS 시리즈): 휴렛 팩커드
크로마토그래피 파라미터
유속: 1.0 mL/분
이동상 A: 20％ MeOH/물
이동상 B: 70％ MeOH/물
선형 구배:
Figure 112011097388832-pat00167
주입 용량: 10 ㎕
전개 시간: 6분
칼럼 온도: 실온
체류 시간 (NANA): 3.1 ± 0.5분
체류 시간 (NGNA): 2.3 ± 0.5분
최대 압력: 300 bar
여기 파장: 373 nm
방출 파장: 448 nm
PMT 득점: 8
HPLC 시스템: 워터스 2690/2695 분리 모듈 또는 등가물
형광 검출기: 워터스 2475 멀티 파장 형광 검출기 또는 등가물
데이타 획득: 워터스 밀레니엄 32 또는 엠파워(Empower)
칼럼: 루나 5 μ, C 18, 100 A, 150 x 4.6 mm, 페노메넥스 (카탈로그 번호 00F-4252-E0)
디지털 열 블록: WVR (카탈로그 번호 13259-056) 또는 등가물
미니 원심분리: WVR (모델 번호 C-1200) 또는 등가물
이동상 A: 10％ (v/v) MeOH/90％ 물
이동상 B: 70％ (v/v) MeOH/30％ 물
유속: 1 mL/분
주입 용량: 10 ㎕
전개 시간: 30분
칼럼 온도: 실온
여기 파장: 373 nm
방출 파장: 448 nm
득점: 1
용출 구배:
Figure 112011097388832-pat00168
시알산 표준의 제조 (약 5 mM). N-아세틸 뉴라민산 (NANA, MW = 309.3) 표준 (약 5 mM). N-아세틸 뉴라민산 154.5 ± 1.0 mg을 100 mL 용량측정 플라스크에 정확히 계량 첨가한다. 용해시키고, 증류수를 이용하여 부피를 적정량으로 하고, 잘 혼합한다. 용액을 2 mL 극저온 바이알에 분취한다.
Figure 112011097388832-pat00169
P = NANA의 순도 - 벤더(Vendor) COA (즉, 99％ = 0.99).
N-글리콜릴 뉴라민산 (NGNA MW = 325.7) 표준 (약 0.25 mM). N-글리콜릴 뉴라민산 8.0 ± 1.0 mg을 100 mL 용량측정 플라스크에 정확히 계량 첨가한다. 용해시키고, 증류수를 이용하여 부피를 적정량으로 하고, 잘 혼합한다. 용액을 2 mL 극저온 바이알에 분취한다.
Figure 112011097388832-pat00170
P = NGNA의 순도 - 벤더 COA (즉, 99％ = 0.99). 분취한 시알산 표준물은 6개월 이상 동안 -20℃에서 보관할 수 있다.
시알산 표준 혼합물의 제조. 시스템 적합성 및 정량화 (50 μM NANA, 1 μM NGNA)를 위한 시알산 표준 혼합물. 5 mM NANA 1 mL, 0.25 mM NGNA 400 ㎕를 100 mL 용량측정 플라스크에 첨가한다. 증류수를 이용하여 부피를 적정량으로 하고, 잘 혼합한다. 시알산 표준 혼합물을 2 mL 극저온 바이알에 분취한다. 분취한 시알산 표준 혼합물은 6개월 이상 동안 -20℃에서 보관할 수 있다.
샘플 및 참고 물질의 제조. 동결된 단백질 샘플을 2 내지 8℃로 해동하고, 잘 혼합한다. 샘플 및 참고 물질 둘 다 대략 0.5 mg/mL CTLA4A29YL104E-Ig로 희석한다 (예를 들어, 단백질 농도 = 25.0 mg/ml, 단백질 50.0 ㎕를 물 2450 ㎕에 첨가한다). 희석된 시험 샘플 및 참고 물질을 5분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 입자를 제거한다.
가수분해. 블랭크: 2.0 mL 원심분리 튜브에 증류수 50 ㎕ 및 50 mM 황산 200 ㎕을 첨가한다. 이는 블랭크로서 기능한다. 시스템 적합성 및 정량화를 위한 시알산 표준. 2.0 mL 원심분리 튜브에 시알산 표준 혼합물 50 ㎕ 및 50 mM 황산 200 ㎕을 첨가한다. 2벌식으로 준비한다. Std1 및 Std2로 표시한다. 참고 물질: 2.0 mL 원심분리 튜브에 희석된 CTLA4A29YL104E-Ig 참고 물질 50 ㎕ (약 0.5 mg/mL), 및 50 mM 황산 200 ㎕를 첨가한다. 2벌식으로 준비하고, RM1 및 RM2로 표시한다. 시험 샘플: 2.0 mL 원심분리 튜브에 희석된 CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료 50 ㎕ (약 0.5 mg/mL), 및 50 mM 황산 200 ㎕을 첨가한다. 2벌식으로 준비한다. S1-1, S1-2, S2-1, S2-2, S3-1, S3-2 등으로 표시한다. 샘플을 대략 5초 동안 와동시키고, 대략 5 내지 10초 동안 원심분리한다. 샘플을 가열 블록에 놓고, 80℃ ± 5℃에서 1시간 ± 5분 동안 인큐베이션한다. 가수분해된 샘플을 실온으로 냉각한다. 가수분해된 샘플을 간단히 원심분리하여, 튜브에 압축되게 한다 (고속에서 약 10초).
유도체화. 가열 블록을 80℃ ± 5℃로 예열한다. 형광 표지 시약 200 ㎕를 가수분해된 각 샘플에 첨가한다. 대략 5초 동안 와동시키고, 약 10초 동안 원심분리한다. 샘플을 80℃ ± 5℃의 가열 블록에 40 ± 5분 동안 둔다. 표지 용액이 빛에 민감하기 때문에, 가열 블록을 알루미늄 호일로 차폐시킨다. 유도체화된 샘플을 실온으로 냉각시킨다. 샘플을 대략 10초 동안 와동 및 원심분리하여, 튜브에 압축되게 한다.
주입을 위한 제조. 분석하기 전에 칼럼을 이동상으로 평형화시킨다. 충분한 샘플 (100 내지 200 ㎕)를 각각의 원심분리 튜브로부터 제한된 삽입물을 가진 오토샘플러 바이알로 전달한다. 10개 샘플 주입을 위한 전형적인 오토샘플러 로딩은 다음과 같다:
Figure 112011097388832-pat00171
Std1 및 Std2가 시알산 표준 혼합물 용액의 제제인 경우, RM1 및 RM2는 대조군 샘플에 대한 제제이고, S는 샘플 주입이다. 처음 4회의 (샘플 번호 2 & 3) 시알산 표준 (Std1) 주입은 시스템 적합성 목적을 위해 사용될 것이다. 샘플 번호 3 (Std1) 및 샘플 번호 4 (Std2)의 4회 주입은 계산을 위해 사용될 것이다. 추가의 샘플 주입의 경우, 오토샘플러 로딩 5 내지 16을 반복한다.
시스템 적합성. 시스템 적합성 샘플의 크로마토그램 프로파일은 도 49에 도시된 크로마토그램과 유사해야 한다. 시스템 적합성 표준 (Std1)의 제1 주입의 경우, NGNA 및 NANA에 대한 USP 해상도 (R)는 1.5 이상이어야 한다. 시스템 적합성 표준 (Std1)의 4회 주입은 하기 예시 값을 충족해야 한다: NANA에 대한 피크 면적의 RSD는 5％ 이상이어야 한다. NGNA에 대한 피크 면적의 RSD는 10％ 이하이어야 한다. NGNA 피크의 이동 시간은 11.3 ± 2.0분에서 용출되어야 한다. NANA 피크의 이동 시간은 16.0 ± 2.5분에서 용출되어야 한다. 4회의 표준 주입 (Std1, 샘플 번호 3) 및 (Std2, 샘플 번호 4)에 대한 피크 면적의 RSD는 10％ 이하이어야 한다. 상기 순서로부터 모든 종류의 표준 주입에 대한 피크 면적의 RSD는 15％ 이하이어야 한다.
HPLC 시스템의 제조: 칼럼을 98％ 완충액 A 및 2％ 완충액 B를 이용하여 15분 동안 1 mL/분으로 평형화하였다. 형광 표지된 시스템 적합성 용액 10 ㎕를 시스템에 주입하였다. 그 후, 피크 해상도 및 이론적 플레이트의 개수를 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00172
상기 식에서,
R은 해상도이고,
T1은 N-글리콜릴뉴라민산의 체류 시간 (분)이고,
T2는 N-아세틸뉴라민산의 체류 시간 (분)이고,
W1은 N-글리콜릴뉴라민산의 기준선에서 피크 폭 (분)이고,
W2는 NANA의 기준선에서 피크 폭 (분)이다.
해상도는 31.5이어야 한다.
이론적 플레이트의 개수는 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00173
상기 식에서,
N는 이론적 플레이트의 개수이고,
T2는 N-아세틸뉴라민산의 체류 시간 (분)이고,
W2는 N-아세틸뉴라민산의 기준선에서 피크 폭 (분)이다.
이론적 플레이트의 개수는 2000이어야 한다. CTLA4A29YL104E-Ig 가수분해 프로파일 크로마토그램은 도 49와 유사해야 한다.
샘플을 하기 순서에 따라 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 분석하였다: 먼저, NANA 및 NGNA 표준을 샘플 주입에 의해 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig 등), 경우에 따라 2벌식으로 주입한다. 샘플 분석 후, 칼럼을 20분 동안 0.5 mL/분으로 이동상 B로 세척하였다. 경우에 따라, 칼럼을 역전시켰다.
시알산 (NANA 또는 NGNA) 대 단백질의 몰비 (MR)의 측정.
시알산 대 단백질의 몰비는 밀레니엄 또는 엠파워 소프트웨어에 의해 계산할 수 있다.
희석 계수:
Figure 112011097388832-pat00174
상기 식에서,
V단백질은 첨가된 단백질 원액의 부피 (㎕)이고,
V물은 첨가된 물의 부피 (㎕)이다.
단백질 작업 용액 (가수분해에 사용된 단백질) 농도 (μM):
Figure 112011097388832-pat00175
상기 식에서,
C단백질은 단백질 작업 용액의 농도 (μM)이고,
CA280은 단백질 원액의 A280 농도 (mg/ml)이고,
MWCTLA4A29YL104E-Ig는 CTLA4A29YL104E-Ig의 분자량, 91232 Da이다.
단백질 작업 용액 중 시알산의 농도 (μM):
Figure 112011097388832-pat00176
상기 식에서,
C미지는 미지 샘플 중 시알산 (NANA 또는 NGNA)의 농도이고,
Cstd는 표준 중 시알산 (NANA 또는 NGNA)의 농도 (μM)이고,
Au는 미지 샘플 중 시알산 (NANA 또는 NGNA)의 피크 면적이고,
Astd는 표준 중 시알산 (NANA 또는 NGNA)의 피크 면적이다.
시알산 (NANA 또는 NGNA) 대 단백질의 몰비 (M.R.):
Figure 112011097388832-pat00177
시알산 대 단백질의 전체 몰비 (TSA)의 계산:
TSA = NANA 몰비 + NGNA 몰비
두 가지 종류의 NANA 표준의 면적 카운트에 대한 상대적 표준 편차는 10％ 미만이어야 한다. 두 가지 종류의 NGNA 표준의 면적 카운트에 대한 상대적 표준 편차는 10％ 미만이어야 한다. 두 개의 독립적 가수분해물의 면적 카운트에 대한 상대적 표준 편차는 10％ 미만이어야 한다.
한 실시양태에서, CTLA4A29YL104E-Ig 중 시알산에 대한 평균 몰비는 하기 표에 직접 명시한 범위 내이어야 한다.
Figure 112011097388832-pat00178
두 개의 샘플 제제에 대한 참고 물질 및 샘플 중 시알산의 몰비의 ％ 편차는 15％ 이하, 20％ 이하, 25％ 이하, 30％ 이하, 또는 35％ 이하이어야 한다.
실시예 40: CTLA4 A29YL104E -Ig에 대한 생물검정을 기초로 한 시험관내 세포
T 세포는 활성화 및 후속적인 증식을 위해 두 가지 신호를 필요로 한다. 첫번째 신호는 항원 펩티드와 TCR-CD3 복합체의 상호작용에 의해 제공된다. 두번째 공동-자극 신호는 T 세포상의 CD28과 항원-제시 세포상의 B7 단백질의 상호작용에 의해 제공된다. 상기 두 신호를 수용한 후, T 세포는 사이토카인 인터루킨 2 (IL-2)를 분비한다. IL-2의 방출은 세포의 활성화 및 증식을 유도한다. CTLA4A29YL104E-Ig, 가용성 면역억제 화합물 또한 항원 제시 세포상의 B7 단백질에 결합하여, CD28과의 기능적 상호작용을 차단하고, IL-2 생산에 필요한 공동-자극 신호를 제공한다.
이 방법에서, IL-2 프로모터의 제어하에 루시페라제 유전자로 트랜스펙션된 Jurkat T 세포는 항-CD3의 존재하에 Daudi B 세포와 함께 공동-자극된다. 이러한 공동-자극은 IL-2 프로모터를 활성화시키고, 이는 루시페라제 단백질을 생산한다. 생성된 발광 신호는 루시페라제 분석 시스템을 이용하여 측정한다. 이 시스템에서, CTLA4A29YL104E-Ig는 루시페라제 활성을 용량-의존적으로 감소시킨다.
이 방법은 IL-2 생성에 필요한 공동-자극 신호에 대한 CTLA4A29YL104E-Ig의 효과를 실험한다. 가용성 CTLA4A29YL104E-Ig의 존재는 T 세포와 항원-제시 세포 사이의 신호전달을 차단한다. 이 신호 없이는, IL-2가 생산되지 않으며, 따라서 T 세포의 클론 확장이 저해된다. 루시페라제 유전자를 가진 벡터는 IL-2 프로모터를 이용하여 생성하였다. 그 후, Jurkat T 세포를 이 리포터 벡터로 트랜스펙션시켰다. 양성 클론인 Jurkat.CA를 선별하여 이 방법에 사용하였다.
이 생물검정은 항-CD3 및 B 세포 (Daudi)로 트랜스펙션된 T 세포 (Jurkat.CA)를 자극하는 것을 포함한다. B 세포에 의해 제공되는 공동-자극은 CTLA4A29YL104E-Ig의 첨가에 의해 개시된다. Jurkat.CA 및 Daudi 세포를 96 웰을 갖는 백색 불투명 편평-바닥 플레이트의 웰에 시딩하고, 상이한 농도의 CTLA4A29YL104E-Ig의 존재하에 항-CD3로 자극하였다. 37℃에서 16 내지 20시간 동안 인큐베이션한 후, 루시페라제 활성에 대해 웰을 분석하였다. CTLA4A29YL104E-Ig에 의한 공동-자극의 억제는 루시페라제 활성을 용량-의존적으로 감소시키는 것으로 확인된다.
시약: Daudi 세포 배양 배지 (RPMI 1640 중 10％ 소 태아 혈청, 1％ MEM 나트륨 피루베이트); Jurkat.CA 세포 배양 배지 (RPMI 1640 중 10％ 소 혈청, 1％ MEM 나트륨 피루베이트, 400 μg/mL 게네티신); 생물검정 배지 (Daudi 세포 배양 배지 중 0.2 μg/mL 항-CD3 항체 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신 용액); 분석 시스템으로부터의 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시페라제 용액 (프로메가(Promega), 카탈로그 번호 E2620).
장비: 니콘(Nikon), 디아포트(Diaphot) 200 도립 현미경; 팩카드 탑카운트(Packard TopCount) NXT 발광측정기; 테칸 제네시스(Tecan Genesis) 액체 취급기; 코울터(Coulter) Vi-세포 세포 계수기; 지마크(Zymark) 래피트플레이트(RapidPlate)-96.
절차
Figure 112011097388832-pat00179
작업 용액의 제조: 생물검정 배지 중 CTLA4A29YL104E-Ig 용액 3 mL (5000 ng/mL).
Daudi 세포 배양 배지. RPMI 1640 300 mL를 1L 코닝(Corning) 여과 장치에 첨가한다. 그 후, 소 태아 혈청 100 mL 및 MEM 나트륨 피루베이트 10 mL를 첨가한다. 충분한 RPMI 1640을 첨가하여 1 리터가 되게 한다. 여과하고, 4℃에서 1달까지 보관한다.
Jurkat.CA 세포 배양 배지. RPMI 1640 300 mL를 1L 코닝 여과 장치에 첨가한다. 그 후, 소 혈청 100 mL, MEM 나트륨 피루베이트 10 mL, 및 게네티신 8 mL를 50 mg/mL (최종 농도는 400 μg/mL)로 첨가한다. 충분한 RPMI 1640을 첨가하여 1 리터가 되게 한다. 여과하고, 4℃에서 1달까지 보관한다.
생물검정 배지. Daudi 세포 배양 배지 (2.1) 100 mL를 100 mL 배지 바틀에 첨가한다. 그 후, 항-CD3 항체를 0.2 μg/mL 농도의 페니실린-스트렙토마이신 용액 (1.11) 1 mL에 첨가한다. 뒤집어서 부드럽게 혼합하고, 실온에서 8시간이 넘지 않게 보관한다.
브라이트-글로 루시페라제 용액. 시스템 (1.21)에 기재된 바와 같이, 분석 완충액을 루시페라제 기질에 첨가하고 뒤집어서 혼합함으로써 용액을 제조한다. 이 시약은 2시간 내에 사용되어야 하거나, -20℃에서 4주까지 빛을 차단하여 보관되어야 한다.
세포주 유지. 세포 계수기를 이용하여 Jurkat.CA 및 Daudi 세포주 둘 다에 대해 mL 당 세포의 개수를 측정한다. 세포는 1 x 105 내지 1.5 x 106 세포/mL이어야 한다. 12 x 106 Jurkat.CA 세포 및 12 x 106 Daudi 세포를 멸균 원심분리 튜브에서 합한다. 세포를 약 125 x g에서 실온에서 10분 동안 원심분리한다. 세포 엉김이 보이지 않을 때까지 혈청학적 피펫을 이용하여 반복해서 부드럽게 피펫팅함으로써, 세포를 Daudi 세포 배양 배지 (2.1) 9 mL 중에서 철저히 재현탁하여, 2.7 x 106 세포/mL 농도를 제공한다. 세포 계수기 상에서 세포를 계수하여 상기 세포 농도를 확인한다. 재현탁 세포를 96 웰 플레이트 (1.3)의 웰에 75 mL/웰 (200,000 세포/웰)로 시딩한다. 37℃, 5％ CO2, 및 85％ 습도로 설정된 인큐베이터에서 플레이트를 인큐베이션하고, 이 동안 표준, 정성 대조군, 및 샘플을 제조한다. 공칭 농도의 표준, 정성 대조군, 및 샘플 1 및 2를 위한 CTLA4A29YL104E-Ig의 제조. 표준 곡선에 사용하기 위해 생물검정 배지 (2.3) 5000 ng/mL 중 CTLA4A29YL104E-Ig 물질 작업 용액 3 mL를 제조한다. 정성 대조군 곡선에 사용하기 위해 생물검정 배지 (2.3) 5000 ng/mL 중 CTLA4A29YL104E-Ig 물질 작업 용액 3 mL를 제조한다. 샘플 곡선에 사용하기 위해 생물검정 배지 (2.3) 5000 ng/mL 중 2개의 CTLA4A29YL104E-Ig 물질 작업 용액 3 mL를 각각 제조한다. (CTLA4A29YL104E-Ig 샘플에 대한 대략적 농도는 8점 곡선을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 상대적인 효능 값은 측정된 농도가 유효할 때 5.5에 기재된 바와 같이 보정될 수 있다).
8점 곡선은, 2500, 100, 50, 25, 12.5, 5, 2.5, 및 0.05 ng/mL의 플레이트로 2배 희석한 후, 분석 최종 농도를 위해 하기 표 55에 기재된 바와 같이 5000, 200, 100, 50, 25, 10, 5, 및 0.1 ng/mL CTLA4A29YL104E-Ig의 농도에서 표준, 정성 대조군 및 샘플에 대해 제조하였다.
Figure 112011097388832-pat00180
두 개의 맵을 사용할 수 있다. 랜덤 플레이트 맵은 설정을 위해 액체 취급기를 필요로 한다. 정렬된 플레이트 맵은 나란히 3세트를 가지며, 순차적 정렬 레이아웃에서 첨가된 시험 제품에 대해 각각의 곡선 점을 갖는다. 랜덤 플레이트 맵을 위해, 하기 플레이트 맵에 기재된 바와 같이 세포 함유 플레이트 (4.5)의 적절한 웰에 각각의 용액 (4.8) 75 ㎕를 첨가한다. 정렬된 플레이트 맵을 위해, 하기 플레이트 맵에 기재된 바와 같이 세포 함유 플레이트 (4.5)의 적절한 웰에 각각의 용액 (4.8) 75 ㎕를 첨가한다.
두 개의 맵을 사용할 수 있다. 랜덤 플레이트 맵은 설정을 위해 액체 취급기를 필요로 한다. 정렬된 플레이트 맵은 이웃하는 3벌식이며 순차적 정렬 레이아웃에서 첨가된 시험 제품에 대해 각각의 곡선 점을 갖는다. 랜덤 플레이트 맵을 위해, 하기 플레이트 맵에 기재된 바와 같이 세포 함유 플레이트 (4.5)의 적절한 웰에 각각의 용액 (4.8) 75 ㎕를 첨가한다. 정렬된 플레이트 맵을 위해, 하기 플레이트 맵에 기재된 바와 같이 세포 함유 플레이트 (4.5)의 적절한 웰에 각각의 용액 (4.8) 75 ㎕를 첨가한다.
플레이트(들)를 탑실-A (TopSeal-A) (1.22)로 밀봉하였다. 밀봉을 제자리에서 단단하게 하였다. 공기 갭이 없도록 하여야 했다. 플레이트(들)를 37℃, 5％ CO2, 및 85％ 습도의 인큐베이터 설정점에서 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트(들) 및 브라이트-글로 루시페라제 용액 (2.4)을 장비 온도로 평형화시켰다. 150 ㎕의 브라이트-글로 루시페라제 용액을 각각의 웰에 동시에 첨가하고 혼합하였다. 혼합 직후에 플레이트를 탑카운트 NXT에 두고 암실에서 10분 동안 평형화시켰다. 발광 신호를 웰 당 1초 집적률로 또는 사용되는 특정 유형의 발광측정기에 따라 적합하게 탑카운트 NXT에서 측정하였다. 탑카운트 NXT로부터의 출력을 기록하였다. 정렬된 플레이트 맵을 사용할 때, 2개의 플레이트가 판독될 것이다. 제1 플레이트 (상부 우측)는 상부 좌측 코너에서 웰 A1로 판독될 것이다. 제2 플레이트 (역전)는 하부 우측 코너에서 웰 A1로 판독될 것이다.
생물검정 비순차적 플레이트 맵 셋업:
Figure 112011097388832-pat00181
Stnd: 웰 내에서 2500 내지 0.05 ng/mL 최종 농도의 표준물. QC: 웰 내에서 2500 내지 0.05 ng/mL 최종 농도의 정성 대조군. Smp1, Smp2: 웰 내에서 2500 내지 0.05 ng/mL 최종 농도의 샘플 1 및 2.
생물검정 순차적 플레이트 맵 셋업:
Figure 112011097388832-pat00182
Stnd: 웰 내에서 2500 내지 0.05 ng/mL 최종 농도의 표준물. QC: 웰 내에서 2500 내지 0.05 ng/mL 최종 농도의 정성 대조군. Smp1, Smp2: 웰 내에서 2500 내지 0.05 ng/mL mL 최종 농도의 샘플 1 및 2.
200,000개 세포를 96웰 플레이트의 웰 당 첨가하고 37℃, 5％ CO2, 및 85％ 습도에서 인큐베이션하였다. 12 x 106개 Jurkat.CA 세포 및 12 x 106개 Daudi 세포를 멸균 원심분리 튜브에서 합하였다. 세포를 ~125 x g에서 10분 동안 실온에서 원심분리하고 일회용 피펫으로 반복하여 온화하게 피펫팅하여 농도 2.7 x 1O6개 세포/mL를 제공하여 세포 클럼프가 시각화될 때까지 9 mL의 Daudi 세포 배양 배지에 완전히 재현탁시켰다. 표 55로부터의 각각의 용액 75 ㎕를 세포를 함유하는 플레이트의 적합한 웰에 첨가하였다. 다음, 플레이트(들)를 탑실-A로 밀봉하고 37℃, 5％ CO2, 및 85％ 습도에서 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 및 브라이트-글로 루시페라제 용액을 장비 온도로 평형화시킨 후에, 150 ㎕의 브라이트-글로 루시페라제 용액을 각 웰에 동시에 첨가하고 혼합하였다. 혼합 직후에 플레이트를 탑카운트 NXT에 두고 암실에서 10분 동안 평형화시켰다. 발광 신호를 웰 당 1초 집적률로 또는 사용되는 특정 유형의 발광측정기에 따라 적합하게 탑카운트 NXT에서 측정하였다.
탑카운트 NXT로부터의 출력을 기록하고, 표준 분석 프로그램으로 판독하고, 데이타를 그들의 대수 (밑 10)를 취해 변환하였다. 각 품목으로부터 변환된 데이타를 하기 방정식에 제시된 4개 파라미터 로지스틱 모델에 핏팅하였다:
방정식 1:
Figure 112011097388832-pat00183
식 중:
A는 곡선의 상부 평탄역이고, D는 곡선의 하부 평탄역이고, B는 기울기 인자이고, C는 A 및 D의 평균과 동일한 효과를 생성하는 농도이다.
R2 통계, 및 적합성 결여 (lack-of-fit) F-검정을 각 품목에 대해 계산할 수 있다. 표준 물질과 비교한 시험 품목의 최소, 최대, 및 기울기의 비를 또한 계산할 수 있다. 또한, 상기 비에 대한 신뢰 구간을 또한 산정할 수 있다.
각 품목에 대한 상대적 효능은 참조 품목으로부터의 데이타와 조합한 관심 품목으로부터의 데이타에 대한 단일 방정식을 핏팅함으로써 측정할 수 있다.
Figure 112011097388832-pat00184
식 중,
A, B 및 D 파라미터는 참조 및 시험 품목 둘 다에 대해 공통적이고, CR은 참조 파라미터이고, CA는 시험 품목 파라미터이고, 비 CR/CA는 상대적 효능이다. 위첨자 I는 인디케이터 변수이다. 이는 데이타가 관심 품목으로부터 유래되는 경우에는 1로 설정되고 데이타가 표준 물질로부터 유래되는 경우에는 0으로 설정된다.
각 시험 품목의 상대적 효능은 백분율 척도로 나타내고, 상대적 효능은 프로그램으로부터의 출력으로서 제공된다.
근사 농도로 수득된 상대적 효능값의 조정: 샘플 수취 및 정확한 단백질 농도의 수득 간의 시간 지체로 인해, 샘플은 근사 농도에서 분석법에서 시험하고, 정확한 농도가 측정된 경우에 결과를 조정할 수 있다. 이러한 조정은 하기 방정식 2를 사용하여 수행하며, 여기서 분석법에서 측정된 상대적 효능에 사용된 CTLA4A29YL104E-Ig 농도의 비를 곱하여 측정된 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 농도로 분석을 셋업한다.
방정식 2:
Figure 112011097388832-pat00185
예:
샘플을 분석법에서 25 mg/mL의 단백질 농도에서 시험하였다.
측정된 상대적 효능은 105％였다.
측정된 CTLA4A29YL104E-Ig 농도는 25.5 mg/mL인 것으로 측정되었다.
보고가능한 상대적 효능 = (105 * 25) / 25.5 = 103％.
표준 물질: 출력의 표준물에 대한 EC5O 값은 5 내지 35 ng/mL 사이이어야 한다. 2500 ng/mL 내지 0.05 ng/mL 농도 표준물 (범위) 사이의 차이는 초 당 ≥40,000 카운트 (CPS)여야 한다. 참조물에 대한 R-제곱값은 0.95보다 커야 한다.
표 9에서의 시험 품목 상대적 효능값은 참조 표준물의 25 내지 175％ 사이여야 하며, 이는 분석의 범위이다. 상대적 효능값은 상기 범위 밖이고, 따라서 상기 범위 내에 들도록 샘플을 희석하거나 또는 농축시켜 샘플을 재분석하여야 한다.
Daudi B 세포주:
공급원: Daudi 세포를 ATCC로부터 입수하였다. 마스터 뱅크를 64 바이알로 구성되도록 생성시켰다. 작업 뱅크를 4회 계대배양 후에 마스터 뱅크 바이알로부터 창출하였다. (비고: 0회 계대배양은 해동으로 간주하고, 3회의 추가 계대배양을 작업 뱅크 생성 전에 수행하였다).
배지: Daudi 세포를 10％ 소 태아 혈청 및 1％ 나트륨 피루베이트로 보충된 RPMI 1640 배지 (HEPES 및 L- 글루타민 함유)에서 성장시켰다.
인큐베이터 조건: 세포를 통기된 T-플라스크 중에 37℃, 5％ CO2, 및 70-90％ 습도에서 유지시켰다.
해동 프로토콜: 세포의 바이알을 액체 질소 냉동기로부터 제거하여 37℃ 수조에서 해동시켰다. 내용물을 10 mL의 배양 배지와 혼합하였다. 세포를 카운팅한 다음, 125 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 수집하였다. 원심분리 후에, 상청액을 제거하고, 세포를 신선한 배지에 3 x 105개 생존가능한 세포/mL로 현탁시켰다. 세포를 이 시점에서 계대배양 0으로 한정하였다.
성장 특성: 세포주는 현탁액에서 성장한다.
계대배양: 배양물을 계대 사이에 5일 이하의 간격으로 1주일에 2회 계대배양에 의해 유지시켰다. 세포를 0.5 x 105 내지 2 x 105개의 생존가능한 세포/mL로 신선한 배지를 함유한 통기된 T-플라스크에서 계대배양하였다. 세포는 1.5 x 106개 세포/mL를 초과하는 밀도에 이르지 않아야 한다. 세포는 트립판 블루 염색에 의해 측정될 때 80％ 초과로 시각화되어야 한다. 데이타 및 계대배양 회수는 계대배양 후에 T-플라스크 상에서 표지되어야 한다.
더블링 시간: 더블링 시간은 18 내지 26시간 범위이다.
계대배양 제한: 작업 뱅크로부터의 세포는 생물검정에서 사용하기 전에 3회 계대배양해야 하며, 즉 이들은 3회 이상 계대배양되어야 한다. 세포는 20회 계대배양 동안 배양물에 단지 유지되어야 한다. 새로운 작업 바이알은 이때 해동되어야 한다.
동결 프로토콜: 세포를 냉동바이알에서 5 내지 10 x 106개 세포/mL로 동결시킨다. 냉동보호 배지를 완전 배양 배지를 5％ (v/v) DMSO로 보충함으로써 제조한다. 세포를 1℃/분의 속도로 액체 질소 온도 (~190℃)에 도달할 때까지 동결시킨다.
Jurkat.CA T 세포주:
공급원: Jurkat.CA T 세포를 CTLA4-Ig 분자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 3회 계대배양 후에 마스터 뱅크 바이알로부터 창출하였다. (비고: 0회 계대배양은 해동으로 간주하고, 2회의 추가 계대배양을 작업 뱅크 생성 전에 수행하였다).
배지: Jurkat.CA 세포를 최종 농도 400 μg/mL로 게네티신 (G418 술페이트)이 보충된 10％ 소 태아 혈청 및 1％ 나트륨 피루베이트로 보충된 RPMI 1640 배지 (HEPES 및 L- 글루타민 함유)에서 성장시켰다.
인큐베이터 조건: 세포를 통기된 T-플라스크 중에 37℃, 5％ CO2, 및 70-90％ 습도에서 유지시켰다.
해동 프로토콜: 세포의 바이알을 액체 질소 냉동기로부터 제거하여 37℃ 수조에서 해동시켰다. 내용물을 10 mL의 배양 배지와 혼합하였다. 세포를 카운팅한 다음, 125 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 수집하였다. 원심분리 후에, 상청액을 제거하고, 세포를 신선한 배지에 3 x 105개 생존가능한 세포/mL로 현탁시켰다. 세포를 이 시점에서 계대배양 0으로 한정하였다.
성장 특성: 세포주는 현탁액에서 성장한다.
계대배양: 배양물을 계대 사이에 5일 이하의 간격으로 1주일에 2회 계대배양에 의해 유지시켰다. 세포를 0.5 x 105 내지 2 x 105개의 생존가능한 세포/mL로 신선한 배지를 함유한 통기된 T-플라스크에서 계대배양하였다. 세포는 1.5 x 106개 세포/mL를 초과하는 밀도에 이르지 않아야 한다. 세포는 트립판 블루 염색에 의해 측정될 때 80％ 초과로 시각화되어야 한다. 데이타 및 계대배양 회수는 계대배양 후에 T-플라스크 상에서 표지되어야 한다.
더블링 시간: 더블링 시간은 18 내지 26시간 범위이다.
계대배양 제한: 작업 뱅크로부터의 세포는 생물검정에서 사용하기 전에 3회 계대배양해야 하며, 즉 이들은 3회 이상 계대배양되어야 한다. 세포는 20회 계대배양 동안 배양물에 단지 유지되어야 한다. 새로운 작업 바이알은 이때 해동되어야 한다.
동결 프로토콜: 세포를 냉동바이알에서 5 내지 10 x 106개 세포/mL로 동결시킨다. 냉동보호 배지를 완전 배양 배지를 5％ (v/v) DMSO로 보충함으로써 제조한다. 세포를 1℃/분의 속도로 액체 질소 온도 (~190℃)에 도달할 때까지 동결시킨다.
실시예 41: 플라즈몬 공명 (BIAcore)에 의한 B7.1-Ig 수용체에의 CTLA4A29YL104E-Ig의 생체-특이적 결합표면
B7.1Ig 수용체에의 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플의 상대적 결합을 BIAcore 장비를 사용하는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다. 상기 분석에서, CTLA4A29YL104E-Ig는 APC 세포 막 단백질 B7.1로부터 유래된 B7.1Ig 면역글로불린 융합 단백질에 결합하였다. B7.1수용체를 고밀도로 활성화된 센서 칩의 표면에 고정화시킨 후에, CTLA4A29YL104E-Ig 물질, 정성 대조군, 및 샘플을 희석시켜 결합 센서그램을 생성시켰다. 고정화된 B7.1Ig 표면에 대한 CTLA4A29YL104E-Ig의 초기 결합률 (기울기)/결합된 공명 단위 (RU)를 상기 고밀도 B7.1Ig 표면에 대한 물질 전달 (확산) 제한 조건 하에서 측정하였다. 초 당 공명 단위 (RU)에서 초기 결합률은 생활성 농도와 직접 상관관계가 있다. 샘플의 결합률은 참조 표준 곡선을 이용하여 활성 농도로 계산하며, 여기서 CTLA4A29YL104E-Ig 물질을 농도에 대해 플롯팅하였다. 최종 결과를 CTLA4A29YL104E-Ig 물질에 상대적인 샘플의 백분율 결합률 또는 농도로서 표현하였다.
시약: 인증된 아미노 커플링 키트 BIA (각 1개의 바이알을 함유하는 키트: 115 mg N-히드록시숙신이미드 (NHS), 750 mg N-에틸-N'-(3-디메틸) (EDC), 및 에탄올아민); 재생 완충액 (10 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 4.0);
장비: PC 호환 컴퓨터가 장착된 BIAcore C 장비 (BIAcore (Catalot No.BR-1100-51)); BIAcore C 컨트롤 소프트웨어 버젼 1.0.2; BIAcore 평가 소프트웨어 1.0; BIAcore 96-웰 마이크로타이터 플레이트 U-형 BIAcore (카탈로그 번호 BR-1005-03); BIAcore 96-웰 마이크로 플레이트 호일스 플레이트 실러 (카탈로그 번호 BR-1005-78).
방법 개요:
Figure 112011097388832-pat00186
물질
센서 칩 CM5, 인증 등급: BIAcore AB (카탈로그 번호 BR- 1000-12)
BIAcore C 장비 핸드북: BIAcore (카탈로그 번호 BR-1005-11)
HBS 완충액 BIA 인증 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA 0.005％ v/v 계면활성제 P20: BIAcore (카탈로그 번호 BR1001-88)
BIA표준화 용액 (40％ 글리세롤 용액): BIAcore AB (카탈로그 번호 BR-1002-22)
인증된 아민 커플링 키트 BIA 115 mg N-히드록시숙신이미드 750 mg N-에틸-N'-(3-디메틸): BIAcore (카탈로그 번호 BR-1000-50)
염화나트륨 (NaCl): Sigma (카탈로그 번호 S-9888)
아세테이트 완충액 pH 5.0: BIAcore (카탈로그 번호 BR-1003-51)
나트륨 시트레이트 (C6H3Na3O): Sigma (카탈로그 번호 S-4641)
염산 (HCl): Fisher Scientific (카탈로그 번호 A144-212)
BIAcore 유지 키트: BIAcore (카탈로그 번호 BR-1006-67)
시약
인증된 아민 커플링 키트 BIA. 키트는 각 1개의 바이알을 함유한다: 115 mg N-히드록시숙신이미드, 750 mg N-에틸-N'-(3-디메틸) 및 에탄올아민. 각 용액을 제조업자의 지시사항에 따라 분취하고 하기 지시한 바와 같이 저장한다:
11.5 mg/ml N-히드록시숙신이미드 (NHS)의 분취액은 -200℃에서 저장한다. 이들 동결된 분취액은 제조일로부터 2개월간 유효하다. 75 mg/ml 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)의 분취액은 -200℃에서 저장한다. 이들 동결된 분취액은 제조일로부터 2개월간 유효하다. 1.0 M 에탄올아민-HCl의 분취액은 pH 8.5, -200℃에서 저장한다. 이들 동결된 분취액은 제조일로부터 2개월간 유효하다. 재생 완충액 (10 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 4.0). 1.5 ± 0.1 g 나트륨 시트레이트 및 2.9 ± 0.1 g NaCl을 분석적으로 계량한다. 500 mL 밀리-Q 워터에 첨가하고 1 N HCl로 pH를 4.0으로 조정한다. 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과한 다음, 500 mL를 45 mL씩 50 mL 코니칼 튜브에 분취한다. 용액은 2-8℃에서 저장시 제조일로부터 6개월간 유효하다.
장비
PC 호환 컴퓨터 장착 BIAcore C 장비: BIAcore (Catalot No.BR-1100-51)
BIAcore C 컨트롤 소프트웨어: BIAcore, BIAcore C 장비와 함께 공급, 버젼 1.0.2
평가 소프트웨어: BIAcore, BIAcoreC 장비와 함께 공급, 버젼 1.0
pH 측정기: ORION, 모델 720A+
센서 칩의 제조. 새로운 센서 칩 CM5를 장비의 검출기 창치 상의 카셋트 포트에 삽입한다. 시스템을 BIAcore C 핸드북에 기재된 바와 같이 HBS-EP 완충액을 사용하여 프라이밍시킨다.
방법 기능을 위한 BIAcore C 장비의 작동.
BIAcore C 장비를 BIAcore C Control 소프트웨어 장착된 마이크로소프트 윈도우 환경하의 호환 PC 컴퓨터로부터 컨트롤한다. 작업 지시사항, "BIAcore C 장비의 작동" 및 "BIAcore C 장비의 교정 및 유지"를 참조한다.
B7.1Ig의 고정화 방법
B7.1Ig의 제조: B7.1Ig를 함유하는 바이알을 22.5 ± 5℃에서 해동하고, 1O mM 아세테이트 pH 5.0 완충액울 희석제로서 사용하여 3000-9000 RU를 고정화시키는 농도로 희석시켰다. EDC, NHS, 및 에탄올아민의 바이알을 각각 기재된 바와 같이 아민 커플링 키트로부터 해동시켰다. 다음에, 시약 및 리간드 바이알을 BIAcore 프로그램에서 지시된 바와 같이 샘플 랙에 위치시키고, 고정화를 BIAcore 장비 지시사항에 따라 개시하였다.
CTLA4 A29YL104E - Ig 표준 곡선의 제작
표준물 및 샘플 (예컨대 CTLA4A29YL104E-Ig 등)을 실온에서 해동시켰다. 표준물을 사용하여 표준 곡선의 표적 농도 (250, 500, 1000, 2000, 4000, 및 8000 ng/mL)로 희석시켰다.
농도가 25 mg/mL인 표준물 샘플 (예컨대 CTLA4A29YL104E-Ig 물질 원액)의 희석을 위해, 하기 희석을 수행할 수 있다:
i. 20 ㎕ 내지 980 ㎕의 HBS-EP의 첨가에 의해 1/50 (500 μg/mL) 희석
ii. 30 ㎕의 500 μg/mL 내지 908 ㎕의 HBS-EP의 첨가에 의해 16 μg/mL 희석
iii. 250 ng/mL로 1/2 단계로 일련의 희석 (500 ㎕의 이전 희석물 + 500 ㎕의 HBS-EP)
각 표준물은 2가지 기울기 값을 생성하는 2중 주입으로 분석할 수 있다.
정성 대조군 샘플. CTLA4A29YL104E-Ig의 정성 대조군 (QC) 샘플을 HBS-EP 완충액 중에서 3가지 표적 농도 수준 750, 2500, 및 5000 ng/mL으로 제조하고, 7 mm 플라스틱 바이알 내에서 200 ㎕ 분취액으로서 -800℃에서 동결시켰다. QC 샘플 중의 CTLA4A29YL104E-Ig 농도를 3가지 독립적 농도 분석 실험에서 상기 방법을 이용하여 측정하였다. 각 실험에서 모든 QC 샘플 주입은 공칭 농도의 ±20％ 내에서 측정시 허용되어야 한다. 정성화되고 동결된 QC 샘플은 제조후 6개월간 유효하다. 실험일에, 3종의 QC 샘플의 각 1개의 바이알을 실온에서 해동시켰다. QC 샘플을 방법 위자드에 기재된 바와 같이 샘플 랙 위치에 두고 각 QC를 3벌 주입으로 분석하였다. 달리, QC를 분석일에 신선하게 제조할 수 있다.
CTLA4A29YL104E-Ig 시험 샘플. CTLA4A29YL104E-Ig 샘플은 분석 범위 (750 내지 5000 ng/mL) 내의 농도로 희석시켜야 한다. 기지의 근사 CTLA4A29YL104E-Ig 농도를 갖는 샘플은 2000 ng/mL의 표적 농도로 희석시켜야 한다. 샘플을 실온에서 해동시킨 후에, 이들을 HBS-EP 완충액을 사용하여 2000 ng/mL의 표적 농도로 희석시킨다. 샘플 희석액은 BIAcore 인증 폴리프로필렌 시험 튜브 또는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 분석물용으로 제조할 수 있다. 하기는 CTLA4A29YL104E-Ig 시험 샘플의 희석 예이다:
샘플을 실온에서 해동시킨 후에, CTLA4A29YL104E-Ig 샘플을 분석 범위 (750 내지 5000 ng/mL) 내의 농도로 희석시켰다. 기지의 근사 CTLA4A29YL104E-Ig 농도를 갖는 샘플을 HBS-EP 완충액을 사용하여 BIAcore 인증 폴리프로필렌 시험 튜브 또는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 2000 ng/mL의 표적 농도로 희석시켜야 한다.
하기는 CTLA4A29YL104E-Ig 샘플 (농도 = 25.0 mg/mL)의 희석 예이다:
i. 20 ㎕ 내지 980 ㎕의 HBS-EP의 첨가에 의해 1/50 (500 μg/mL) 희석
ii. 30 ㎕의 500 μg/mL 내지 720 ㎕의 HBS-EP의 첨가에 의해 1/25 (20 μg/mL) 희석
iii. 100 ㎕의 900 μg/mL 내지 920 ㎕의 HBS-EP의 첨가에 의해 1/10 (2 μg/mL) 희석
각 희석액을 완만한 속도로 2-4초 동안 와동시킨다. 샘플을 3벌씩 제조하고 (샘플 원액으로부터의 3종의 독립적인 희석액), 각 희석액을 1회 주입으로 분석한다. 샘플을 3벌씩 제조하고 (샘플 원액으로부터의 3종의 독립적인 희석액), 각 희석액을 1회 주입으로 분석한다.
BIAcore C 소프트웨어를 사용한 분석 개시: BIAcore C 컨트롤 소프트웨어를 열고 File->Project->Published->8164-2->Concentration Analysis Wizard를 선택하고, "Next"를 클릭하고 수행할 분석에 적합한 공개된 템플레이트, 예를 들어 "CTLA4A29YL104E-Ig Sample Concentration Analysis, blw"를 선택한다. 계획된 분석에 대해 최대수의 샘플을 입력한다. 상기 수의 샘플은 반복하여 포함하며, 예를 들어, 8종의 샘플을 3벌로 분석하기 위해 숫자 24를 입력하여야 한다. B7.1Ig 리간드가 고정화된 유동 세포 (1-4)를 선택한다. "Next"를 클릭하고 샘플 ID, 희석 계수, 및 반복수를 입력한다. "Next"를 클릭하고 바이알 위치를 체크한다. 이 시점에 바이알의 위치를 목적하는 지점으로 이동시킬 수 있다. "Next"를 클릭하고 "분석을 위한 제조" 스크린 상의 분석을 위한 셋업 및 선택을 확인한다. "Next"를 클릭하여 스크롤 다운한다. 표준물, QC, 재생 용액, 및 시험 샘플을 적합한 위치에 둔다. "Start"를 클릭하여 분석을 분석을 개시한다.
데이타 평가. BIAcore C 소프트웨어를 개시하고 재생된 BIAcore file***.blr를 연다. 다음, "View" 메뉴로부터 "Wizard Results"를 선택하여 데이타를 평가한다.
B7.1Ig 표면에 대한 예시적 값
활성화 유동 세포 상에 고정화된 B7.1Ig의 질량은 RU (공명 단위)로서 표현하였다. 표면 질량은 최적 분석 수행을 위해 3000 내지 9000 RU이어야 한다. 표면 질량은 상기 예시적 값에 부합하지 않을 경우에, 활성화 시간 (EDC/NHS 주입) 또는 B7.1Ig 농도의 조정이 있을 수 있고, 또 다른 유동 세포를 고정화시킬 수 있다.
기준선 드리프트에 대한 예시적 값
각 전개의 기준선 드리프트를 리간드의 고정화 표면 질량에 대한 각각의 사이클 사이의 기준선의 백분율 변화 ("절대 반응 값")으로서 계산하였다. 전개의 임의의 2사이클 사이의 가장 큰 백분율 변화는 ≤ 5.0％이어야 한다. 예를 들어: 사이클 20에서의 기준선이 13500 RU인 경우에, 사이클 23에서의 기준선이 13650 RU이고, B7.1Ig 표면 밀도가 6000 RU인 경우에, 기준선 드리프트 = (13650-13500)/6000x 100 = 2.5％이다.
표준물에 대한 예시적 값
예시적 값은 500 ng/mL 이상의 표준 곡선 농도에 적용한다. 표준 곡선을 결정하기 위해 사용된 각 표준 농도에서의 각 기울기 값에서의 값들의 변이 계수 (％ CV)는 ±10％ 이내여야 한다. 각 표준 농도에서의 평균 계산 농도 값 (ng/mL)은 표적 (공칭) 값의 15％ 이내여야 한다. 계산된 농도 및 표적 (공칭 농도) 사이의 차이는 표적 (공칭) 농도로 나누고 100을 곱할 수 있다. 예를 들어, 표준 500 ng/mL에서, BIAcore C 계산된 농도는 510 ng/mL이다. ％ 편차는 하기와 같이 계산될 것이다: (510 ng/mL - 500 ng/mL ) / 500 ng/mL x 100％ = 2.0％.
QC 샘플에 대한 예시적 값: 각 QC 샘플 표적 농도에 대한 3벌 계산된 농도 값의 ％ CV는 ±10％ 이내여야 한다. QC 샘플 결과는 9개 QC 측정치 중 7개 이상에 대한 각 표적 값의 ±15％ 이내여야 한다. 2500 ng/mL 수준에서의 처음과 마지막 QC 주입 사이의 기울기 값에서의 차이는 ±5.0％ 이내여야 한다. 예를 들어, 처음 기울기 값은 10.366 RU/s이고, 마지막 기울기 값은 10.230 RU/s이고, 백분율 차이는 다음과 같다:
(10.366-10.230) / 10.366 x 100％ = 1.3％
시험 샘플에 대한 예시적 값
각 시험 샘플 표적 농도에 대해 수득된 3벌 관찰치의 ％ CV는 20％ 이내여야 한다. 샘플에 대한 기울기 값은 방법의 범위 내여야 한다: 정성 대조군 샘플에서의 평균 기울기 1 < 샘플 평균 기울기< 정성 대조군 샘플의 평균 기울기 3.
샘플 결과 계산
CTLA4A29YL104E-Ig 물질에 대한 시험 샘플의 백분율 결합을 측정하기 위해, 각 시험 샘플에 대한 농도 값을 표준 곡선으로부터 ng/mL 단위로 계산하였다. BIAcore 장비의 결과 위자드는 각 샘플에 입력된 희석 계수를 기초로 한 mg/mL 단위로 비희석된 샘플 중의 CTLA4A29YL104E-Ig 농도를 계산한다.
백분율 결합의 측정: 시험된 각 샘플에 대한 계산된 평균 농도에 100을 곱하고 280 nm에서 측정된 흡광도 (A280)에 의해 측정된 바와 같은 샘플의 보고된 단백질 농도로 나눌 수 있다. 값은 표준 샘플에 대한 백분율 결합으로서 가장 근접한 전체 값으로 백분율 결합으로 보고될 수 있다. 예를 들어, 샘플을 희석 계수 12,500 (대략 25 mg/mL의 샘플 단백질 농도)으로 희석시켰다. 샘플의 3벌 주입으로부터의 계산된 평균 CTLA4A29YL104E-Ig 농도는 25.3 mg/mL이다. 샘플에 대한 A280은 24.2 mg/mL이다. 표준 샘플에 대한 계산된 백분율 결합은 다음과 같을 수 있다: 25.3 mg/mL/24.2 mg/mL x 100％ = 104.545 ％.
CTLA4A29YL104E-Ig 고정화 위자드 템플레이트 고정화 주입 파라미터
Figure 112011097388832-pat00187
고정화 보고 시점
Figure 112011097388832-pat00188
실시예 42: CTLA4-Ig의 탄수화물 분석 데이타와 약물동력학 데이타와의 상관 관계
CTLA4-Ig 상의 탄수화물 구조는 CTLA4-Ig 치료 조성물의 약물동력학 (PK)에서 중요한 역할을 한다. 수가지 분석 방법이 이들 탄수화물 구조를 특성화하기 위해 개발되었다. 하기 2종의 분석 파라미터는 청소율과 상당히 상관관계가 있다: 시알산 (NANA) 대 CTLA4-Ig 단백질 비 및 탄수화물 프로파일로부터의 백분율 도메인 III 및 IV. 제3 파라미터 (모노사카라이드 분석으로부터의 갈락토스 대 만노스 비)가 또한 상당히 상관관계가 있는 것으로 보인다. 예를 들어, 이들 파라미터에 대한 상세사항은 다음과 같을 수 있다:
NANA:CTLA4-Ig 단백질 비 ≥8.0
탄수화물 프로파일 도메인 III 및 IV ≥25％ (방법 1)
갈락토스:만노스 비 ≥0.65
CTLA4-Ig 발효 공정에서의 중요한 단계는 본원에 구체화된 특성을 포함하는 최종 생성물의 수율 (타이터)를 최대화할 수 있는 수거 파라미터의 선택일 수 있다 (표 6 참조). 파라미터 중 하나 (NANA:단백질 비)는 수거 파라미터 중 하나로 사용하기에 충분히 신속하고 정확하다. 약 8.0의 NANA 대 CTLA4-Ig 단백질의 표적 몰비는 대부분의 수거물이 7.0 초과의 NANA 비를 가질 것이라는 것을 보증할 수 있다. 정제 동안의 증대는 후속적으로 9.0 초과의 NANA 비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 생산할 수 있다.
CTLA4-Ig는 수개의 N-연결된 및 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. N-연결된 탄수화물 구조는 전형적으로 2- 또는 3-안테나형이고, 충분히 시알릴화된 경우에, 탄수화물 NANA-Gal-GlcNAc로 말단화된다. 대부분의 분자는 단지 부분적으로 시알릴화되고, Gal 또는 GlcNAc로 말단화된 일부 탄수화물 쇄를 함유한다. 말단 시알산 (NANA) 잔기의 부재는 혈류로부터 증가된 노출 비율을 유도하는 인자이다. 본 실시예에서, 데이타는 말단 갈락토스가 또한 신속한 청소율로부터 특정 보호를 제공한다는 것을 제시하는 것으로 나타낸다.
글리코실화를 평가하기 위해 사용되는 일차 파라미터는 NANA:CTLA4-Ig 단백질 몰비이다. 원숭이 PK 연구는 허용되는 청소율이 6.9의 NANA 비를 갖는 CTLA4-Ig 분자를 사용하여 달성될 수 있다는 것을 제시하였다. 원숭이에서 시험된 공정 Y CTLA4-Ig 물질 (Y 공정으로부터 수득된 CTLA4-Ig 조성물)의 제1 로트는 7.1의 NANA 비를 갖는다. 놀랍게도, 6.9의 NANA 비를 갖는 CTLA4-Ig 물질보다 2배 신속하게 청소된다는 것이 밝혀졌다. 2종의 샘플의 모노사카라이드 분석의 리뷰는 X 공정 물질이 CD-CHO 공정 물질보다 갈락토스를 상당히 더 갖는다는 것을 제시하였다. 공급물 (CD-CHO1)에서 갈락토스를 포함하는 공정을 개발하였다. 상기 공정에 의해 생산된 CTLA4-Ig는 Y 공정 물질보다 갈락토스 및 시알산을 둘 다 더 높은 수준으로 가졌다. CD-CHO1 공정으로부터의 물질에 대한 분석 및 PK 데이타를 하기에서 논의하고 공정 Y 및 공정 X 물질과 비교하였다.
분석 방법
탄수화물 프로파일 분석은 전체 탄수화물 구조의 효소적 제거 및 그들의 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리로 구성된다. 탄수화물 피크는 거의 각 구조에서의 시알산 잔기의 수를 기초로 하여 4개 또는 5개 클러스터 ("도메인")로 분할된다. 도메인 I은 거의 아시알릴화되고, 도메인 II는 모노시알릴화되고, 도메인 III은 디-시알릴화되고, 도메인 IV는 트리-시알릴화되고 도메인 V는 테트라-시알릴화된다. 각 피크 또는 도메인 아래 면적을 측정하고 모든 피크 아래의 전체 면적의 백분율로서 보고할 수 있다.
청소율은 원숭이에 10 mg/kg의 CTLA4-Ig를 주입하여 측정한 다음, 28일간에 걸쳐 혈청 농도를 감소시켰다. 청소율이 측정된 "곡선 아래 면적" 또는 AUC와 관련된다. AUC는 청소율과 관련되고, 보다 높은 청소율은 보다 작은 AUC와 관련되고 보다 낮은 청소율은 보다 큰 AUC 값과 관련된다. 보다 높은 값은 CTLA4-Ig의 보다 늦은 청소율을 나타낸다.
도 50은 포유동물 단백질에서 발견된 수개의 많은 N-연결된 탄수화물 구조를 도시한다. 모든 쇄는 2개의 GlcNAc 및 3개의 만노스 잔기를 함유하는 공통의 코어 구조를 공유한다. 이들 코어로부터, 2개 내지 4개의 쇄는 3개의 구조: -GlcN Ac-Gal-NANA, -GlcNAc-Gal, 또는 -GlcNAc (도 50, 구조 (1), (2), 및 (3)) 중 하나로 이루어져 연장한다. 말단 시알산 (NANA)이 혈류로부터의 단백질의 청소율을 증가를 유도하는 것으로 추정된다. NANA 비가 동일하게 유지됨에도 불구하고 (표 56 - 도 51-52에서 각각 샘플 CTLA4-Ig S1 및 CTLA4-Ig (-) Gal), CTLA4-Ig의 청소율이 원숭이 PK 연구 (표 56)에서 2배인 것은 놀랍다. 상이한 배지에서 제조된 샘플 사이에 관찰된 한가지 차이점은 공정 Y에 의해서보다 공정 X에 의해 제조된 샘플 (CTLA4-Ig)에서 상당히 높은 갈락토스-대-단백질 몰비이다. 이는 청소율이 처음에 GlcNAc 잔기에 의해 측정되고, 말단 갈락토스가 일부 보호를 제공할 수 있다는 것을 제시하였다. CTLA4-Ig의 갈락토실화를 증가시키기 위해, 갈락토스를 Y 공정을 위한 공급물에 첨가하였다. 새로운 공정 (CD-CHO1; 도 51-52에서의 CTLA4-Ig S2)은 생물반응기에서 CTLA4-Ig의 갈락토스 및 NANA 몰비를 상당히 증가시켰다.
추가의 원숭이 PK 연구를 수행하였다. 이 연구는 3가지 공정 (공정 X, 공정 Y, 및 CD-CHO1 공정; 도 51-52에서 각각 CTLA4-Ig S1, CTLA4-Ig (-) Gal, 및 CTLA4-Ig S2)에 의해 생산된 CTLA4-Ig 생성물을 포함하였다. 또한, 매우 낮은 NANA 비를 갖는 CTLA4-Ig (정제 절차에서 세척 단계에서 회수됨; 도 62 참조)를 시험하였다. 지금까지 시험된 모든 샘플로부터의 분석 및 PK 데이타를 표 56에 기재하였다. 가장 최근 PK 연구 (표 56)에서, 확대된 공정 Y 발효 시행 (CTLA4-Ig S3)으로부터 생산된 CTLA4-Ig를 평가하였다.
도 51은 4가지 연구에서의 모든 샘플에 대한 NANA 비 및 원숭이 PK AUC 값 사이의 상관관계를 도시한다. Y 공정 (도 51에서의 CTLA4-Ig (-) Gal) 및 CD-CHO1 공정 (도 51에서의 CTLA4-Ig S2)에 의해 제조된 샘플은 이들 파라미터 사이에 강력한 상관관계를 나타내며, 이는 NANA 비가 CTLA4-Ig의 청소율에 상당한 영향을 미친다는 것을 제시한다. 이들 시점에 대한 추세선의 분석은 NANA = 9일 때, Y (CTLA4-Ig (-) Gal) 또는 CD-CHO1 (CTLA4-Ig S2) 공정에 의해 제조된 CTLA4-Ig이 공정 X 물질 (CTLA4-Ig S1)과 거의 동일한 속도로 제거될 것이라는 것을 제시한다. NANA 비를 8로 감소시키면 원숭이 PK에서의 AUC가 약 25％ 감소하는 한편, 비를 10으로 증가시키면 AUC가 약 25％ 증가한다. Y (CTLA4-Ig (-) Gal) 및 CD-CHO1 (CTLA4-Ig S2) 공정과 관련하여 NANA와 AUC 사이에 강력한 상관관계가 있음에도 불구하고, NANA 비가 9인 CD-CHO1 물질 (CTJLA4-lg S2)과 동일한 청소율을 갖는 X 물질 (CTLA4-Ig S1)에 대한 NANA가 7임을 상기하는 것이 중요하다. 따라서, NANA 비는 단지 CTLA4-Ig의 청소율을 결정하는 데 원인이 되는 것만이 아니다.
표 56. CTLA4-Ig의 탄수화물 평가. M-1은 CTLA4-Ig 물질을 방법 1을 이용하여 분석하였다는 것을 나타내고, M-2는 CTLA4-Ig 물질을 경미하게 상이한 방법 2를 이용하여 분석하였다는 것을 나타낸다. "PA"는 발효 브로쓰로부터의 단백질 A - 정제된 샘플인 물질을 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00189
Figure 112011097388832-pat00190
Figure 112011097388832-pat00191
Figure 112011097388832-pat00192
또다른 원숭이 PK 연구 (표 56)를 수행하여 세 가지 상이한 과정 (공정 X, 공정 Y, 및 CD-CHO1 공정)으로 제조된 CTLA4Ig의 청소율을 비교하였다. 또한, 매우 낮은 NANA 비율을 갖는 CTLA4Ig (정제 절차 (PA)에서 세척 단계로 회수된 것)이 상기 연구에 포함되었다. 50 L 생물반응기 또는 5000 L 생물반응기 중 하나에서 CD-CHO 과정으로 제조된 CTLA4Ig은 X 공정 물질과 근접한 NANA 몰비를 가졌고, PK 연구에서, 둘 다 공정 X 값의 약 절반인 AUC 값을 가졌다. CD-CHO1 과정으로 제조된 CTLA4Ig는 공정 X 물질보다 높은 NANA 비율 (9.9 대 6.9) 및 약 30％ 높은 AUC 값을 가지고, 더 느린 청소율을 나타내었다. 보다 불량하게 시알릴화 및 갈락토실화된 세척 물질 (NANA = 2.3)은 매우 빠르게 청소되었다 (공정 X 물질의 경우 15753인 것에 비해 AUC = 2337 시-㎍/ml).
또다른 원숭이 PK 연구 (표 56)는 5,00O L 생물반응기에서 CD-CHO1 과정으로 제조되고 상이한 날에 수거된 CTLA4Ig를 비교하였다. 발효 작업 과정 동안, NANA 비율은 전형적으로 약 8일에 피크였고, 그 다음 점차적으로 감소하였다. 2회의 작업으로부터, 12일, 14일 및 16일에 분취액을 제거한 후 정제하였다. 정제 후, NANA 비율은 8.8 내지 10.0 범위이었다. 12일 및 14일 샘플 (NANA = 각각 9.8 및 10.0)은 공정 X 물질보다 20-30％ 높은 AUC 값을 가졌다. 16일 샘플 (NANA = 8.8)은 공정 X 물질과 거의 동일한 AUC 값을 가졌다.
CTLA4-Ig의 글리코실화를 평가하기 위한 다른 분석적 도구는 탄수화물 프로파일이다. 전체의 N-연결된 탄수화물 구조를 효소적으로 제거하고, 음이온 교환 HPLC로 분리하였다. 다수의 피크가 생성되었고, 이를 4개 또는 5개의 도메인으로 분할하였다 (도 58-62 참조). 도메인 I 및 II는 주로 아시알릴화 및 모노-시알릴화된 구조인 반면, 도메인 III 및 IV 및 V는 주로 디- 및 트리- 및 테트라-시알릴화된 구조였다.
도메인 III 및 IV에서 총 프로파일의 백분율은 공정 X 물질을 비롯하여 모든 샘플에 대한 AUC와 잘 상관된다는 것이 경험적으로 관찰되었다 (도 52). 이들 도메인에서의 대부분의 구조는 완전히 시알릴화 및 갈락토실화될 것이라고 예측되었다. M-1 군으로부터의 데이타를 이용하여, 약 29％의 도메인 III 및 IV 백분율이 공정 X 물질과 동일한 청소율을 가져야 한다. 방법 2로부터의 도메인 III 및 IV 데이타는 전형적으로 방법 1로 얻어진 데이타보다 약 4％ 낮았다 (21％ 대 25％).
또한, 도메인 I 및 II에서 총 프로파일의 백분율도 모든 샘플에 대한 AUC와 잘 상관된다고 관찰되었다 (도 57). 이들 도메인에서의 대부분의 구조는 주로 아시알릴화 및 모노-시알릴화된 구조라고 예측되었다. 도 57은 도메인 I 및 II의 백분율이 높은 샘플에 비해 도메인 I 및 II의 백분율이 낮은 샘플에서 청소율이 더 높음을 보여 준다. 도메인 I 및 II의 감소된 글리코실화는 도메인 III 및 IV에서의 펩티드 글리코실화의 존재 증가 (추측)와 상관된다.
CTLA4Ig의 청소율을 예측하기 위해 시알산 대 단백질 몰비를 전통적으로 사용해 왔지만, 상이한 발효 매질로 인해 원숭이 PK 연구에서 동일한 NANA 비율을 갖지만 상이한 청소율을 갖는 분자가 생산되었다. 청소율을 예측하는 보다 좋은 방법을 개발하기 위하여, 2개의 다른 분석 데이타 셋트 (모노사카라이드 분석 및 탄수화물 프로파일)를 평가하고 원숭이 PK 데이타와 비교하였다. 가장 예측적인 분석 파라미터는 CTLA4Ig의 갈락토실화 정도였다. 상기 분석의 분석 변화성을 감소시키기 위하여, 갈락토스 몰비를 만노스 몰비에 대해 정규화하였다. 생성된 Gal:Man 비율은 공정 X 물질을 비롯하여 모든 샘플에 대해 원숭이 PK 연구로부터의 AUC 결과와 잘 상관되었다. 상기 결과는 CTLA4Ig의 청소율을 분자상의 노출된 말단 GlcNAc 잔기의 수로 일차적으로 측정한 모델과 일치하였다. 상기 모델이 옳은 경우, 갈락토실화의 정도는 시알화보다 양호하게 청소율을 예측해야 한다. 약물동력학적 유사성을 보증하기 위하여 (AUC는 X 공정으로부터의 물질의 75％ 초과), 0.65 초과인 갈락토스 대 만노스 비율 Gal:Man에 대한 세부사항이 정제된 벌크 CTLA4-Ig 약물 재료 (BDS)에 대해 추천된다.
Y 공정 또는 CD-CHO1 과정으로 제조된 물질만을 분석하는 경우, NANA 대 단백질 몰비는 청소율을 정확하게 예측할 수 있다. 그러나, 이 관계는 X 공정으로 제조된 물질에는 적용되지 않는다. X 공정 물질과 유사하기 위하여, Y 공정 또는 CD-CHO1 과정으로 제조된 CTLA4-Ig는 2 단위 더 높은 NANA 비율을 가져야 한다 (CD-CHO1에 대한 NANA = 9는 X 공정 물질에 대한 NANA = 7과 유사함). 시알산 분석은 정확하고 빠른 선회 시간을 가지기 때문에, 발효 작업 동안 CTLA4Ig의 질을 모니터링하는 인-프로세스 분석 도구로서 유용하다.
유사한 약물동력학을 유지하기 위하여 (AUC는 참고물질의 75％ 초과), 8 초과의 NANA의 세부사항이 정제된 BDS에 대해 추천된다. 이 값은 또한 발효 작업물을 수거하기 위한 합리적인 표적을 나타낸다. 정제 과정이 시알산 비율을 2 단위 이상으로 증가시킬 수 있으므로, 수거 표적을 NANA = 8에 설정하는 것은 NANA = 7 이상의 정확한 수거 값을 보증할 것이다. 정제 과정은 상기 값을 NANA = 9 이상으로 증가시킬 수 있고, 이는 공정 X 물질과 유사하고, 상기 추천된 BDS의 최소 기재보다 높다.
도메인 III 및 IV 아래 백분율 면적을 AUC와 비교했을 때, 탄수화물 프로파일은 또한 공정 X 물질 및 공정 Y 물질 모두에 대해 원숭이 PK 결과를 잘 예측하였다. 도메인 III 및 IV는 완전히 시알릴화 및 갈락토실화된 탄수화물 구조로 주로 이루어진다.
도메인 II 및 IV의 AUC 값, NANA 값, Gal 값, 및 AUC 총합의 총 백분율 사이의 상관관계를 보여줄 수 있도록 표 56에서의 데이타를 추가로 제시할 수 있다. 아래를 참조한다:
Figure 112011097388832-pat00193
상기 표는 도메인 III (및 IV)의 총합과 조성물의 PK 결과 사이에 상관관계가 존재함을 나타낸다. 도메인 III 및 IV 및 V의 AUC는 CTLA4-Ig 단백질의 몰에 대한 NANA 및 Gal의 몰비와 직접적으로 연관된다. 그러므로, 본 발명은 탄수화물 프로파일이 18 내지 약 37 AUC ％의 도메인 III 및 IV의 총합 또는 도메인 III, IV 및 V의 총합을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 도메인 II, IV 및 V의 총합은 약 19 내지 약 36, 약 20 내지 약 35, 약 21 내지 약 34, 약 22 내지 약 33, 약 23 내지 약 32, 약 24 내지 약 31, 약 25 내지 약 30, 약 26 내지 약 29, 약 27 내지 약 28 AUC ％이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도메인 III이 19 ± 4의 총 AUC ％를 갖고, 도메인 IV가 7 ± 4의 총 AUC ％를 갖는 것을 특징으로 하는 CTLA4-Ig 조성물을 제공한다.
실시예 43: CTLA4-Ig의 트립신작용 펩티드 맵핑
형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 유도된 CTLA4-Ig는 대략 92500 달톤의 분자량을 갖는 당단백질이다. 펩티드 맵핑은 단백질 1차 구조의 신원을 결정하기 위한 가장 민감한 방법이며, 번역후 변형을 검출하는 데 유용하다. 단백질은 구아니딘-HCl을 사용하여 변성시키고, 환원시키고, DTT 및 IAA을 사용하여 알킬화시켰다. NAP-5 칼럼 및 분해 혼합물을 사용하여 탈염된 단백질을 역상 (C18) 크로마토그래피로 분석하였다. 215 nm에서의 UV 흡광도로 피크 검출을 수행하였다.
시약: 이동상 A 용액 (물 중 0.02 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA) (v/v)); 이동상 B 용액 (95 ％ ACN (아세토니트릴) 및 5 ％ 물 (v/v) 중 0.02 ％ TFA); 알킬화제 (200 mM 요오도아세트아미드 (IAA)); 희석 완충액 (100 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8.0); 변성 완충액 (8 M 구아니딘, 50 mM TRIS, pH 8.0); 분해 완충액 (50 mM TRIS, 10 mM CaCl2, pH 8.0); 환원제 (100 mM DTT).
기구사용법: (등가의 기구를 사용할 수 있음) NAP-5 칼럼 (아머샴, 촉매 번호 17-0853-02); HPLC 칼럼 히터; 칼럼 히터 및 UV 검출기가 있는 워터스 얼라이언스 HPLC 시스템.
환원 및 알킬화: 물을 100 ㎕ (1 mg)의 최종 용량까지 첨가함으로써 샘플 (예를 들어, CTLA4A29YL104E-Ig, 표준 등)을 10 mg/ml로 희석하였다. 변성 완충액 560 ㎕ 및 환원제 (100 mM DTT) 35 ㎕를 샘플 100 ㎕에 첨가하고, 혼합하고, 미량원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 이어서, 샘플을 50℃에서 20분±2분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 알킬화제 (200 mM IAA) 35 ㎕를 각 샘플에 첨가하고, 다시 샘플을 혼합하고, 미량원심분리기에서 3초 동안 회전시켰다. 그 후, 샘플을 50℃에서 20분±2분 동안 암소에서 인큐베이션하였다. 분해 완충액 3 칼럼 용량 (약 7-8 mL)을 부어 NAP-5 칼럼을 평형화한 후, 환원 및 알킬화된 혼합물 500 ㎕를 NAP-5 칼럼상에 부어 액체가 칼럼을 통해 배출되게 하였다. 이어서, 분해 완충액 1 mL가 있는 칼럼 밖으로 샘플을 용출시켜 샘플을 NAP-5 칼럼으로부터 수집하였다.
분해: 샘플을 38℃ 수조에서 트립신 (0.5 ㎍/㎕) 20 ㎕로 4시간 (+ 0.5시간) 동안 분해시켰다. 분해 완료 후, 샘플을 TFA 2.5 ㎕로 산성화하였다. 이어서, 샘플을 다음 분석을 위해 오토샘플러 바이알에 넣었다.
기구 작동법: 기구 작동법은 아래에 나타낸다:
Figure 112011097388832-pat00194
칼럼을 첫번째 주입 전 25분 동안 100％ 이동상 A 완충액으로 평형화하였다. 칼럼 온도를 37℃에서, 오토샘플러 온도를 4℃에서 유지하면서 UV 흡광도를 215 nm에서 모니터링하였다. 첫번째 시스템 적합성 표준 이전에 이동상 A 완충액 블랭크를 진행시키고, 그 후 각 샘플의 단일 50 ㎕ 주입을 진행시켰다. 참고 물질 주입은 모든 6개의 샘플 주입을 총괄해야 한다. CTLA4-Ig 샘플에 대해 생성된 펩티드 맵 크로마토그램을 도 53으로 도시한다. 최초 및 총괄적 참고 물질 크로마토그램 사이의 피크 T2, T3, T15, 및 T19 (도 53 및 표 57)에 대한 체류 시간 차이는 ±0.5분이어야 한다.
Figure 112011097388832-pat00195
이론단 수: 이론단의 수로서 평가되는 칼럼 효율은 하기 식에 따라 체류 시간 및 피크 폭을 사용하여 정량적으로 측정할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00196
상기 식에서,
"w"는 상대적으로 직선인 쪽을 기준선까지 외삽함으로써 측정된 기준선에서의 피크 폭이고, "t"는 주입 시간에서 최대 피크 용출 시간까지 측정된 피크의 체류 시간이다.
N < 50000인 경우, 칼럼을 재평형화한다.
분할: 2개의 피크, 예를 들어 도 53에 나타난 바와 같은 피크 T30와 피크 T12 사이의 분할 (R)을 하기 식을 이용하여 측정할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00197
상기 식에서,
t1, t2 = 각각 단편 피크 T30 및 피크 T12의 체류 시간,
w1, w2 = 각각 체류 시간 t1 및 t2를 갖는 피크의 기준선에서의 탄젠트-정의된 피크 폭.
R < 1.5인 경우 칼럼을 재평형화해야 하고, 문제가 계속되면 칼럼을 교체해야 한다.
실험값: 시험품 및 참고 물질에서의 피크 T3, T15, 및 T19에 대한 상대적 피크 면적들 사이의 차이는 10.0％ 이하이어야 한다. 피크의 상대적 피크 면적은 피크 T2의 피크 면적 중의 백분율로서 표현되는 피크 면적으로 정의된다. 시험품 및 초기 시스템 적합성 참고물의 상대적 피크 면적 차이는 하기 나타낸 바와 같이 수득하였다. 상대적 피크 면적 (Rsx)은 하기 식을 이용하여 시험품의 크로마토그램에서 피크 T3, T15, 및 T19 각각에 대해 계산할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00198
상기 식에서,
RSX = 크로마토그램에서 피크 X의 상대적 피크 면적,
ASX = 샘플에서 피크 X의 면적, 및
AS2 = 샘플에서 피크 T2의 면적.
유사하게, 상대적 피크 면적 (RRX)은 표준물의 크로마토그램에서 피크 T3, T15, 및 T19 각각에 대해 계산할 수 있다. 그 후, 샘플 및 표준물에서의 상대적 피크 면적 차이 (DX)를 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다:
Figure 112011097388832-pat00199
단일 추가 피크가 샘플에 존재하는 경우, 피크 T11과 비교했을 때 그 피크에 대한 상대적 피크 높이는 하기 식을 이용하여 측정할 수 있다:
상대적 피크 높이 RT = (HT/H11)*100
상기 식에서,
HT = 체류 시간 t분을 갖는 피크의 높이
H11 = 크로마토그램에서 가장 높은 피크인 피크 T11의 높이.
한 실시양태에서, 신규 피크의 상대적 피크 높이가 5.0％ 이하인 경우, 프로파일은 CTLA4-Ig 표준물의 프로파일과 합치한다고 여겨진다. 신규 피크의 상대적 피크 높이가 5.0％ 초과인 경우, 프로파일은 CTLA4-Ig 표준 물질의 프로파일과 합치하지 않는다고 여겨진다.
메티오닌 술폭시드에 대한 단백질에서의 Met85의 면적 백분율 산화를 정량하는 RP-HPLC 트립신작용 맵핑 분석을 이용하여 백분율 산화 데이타를 수득하였다. 상기 방법에서의 산화율(％)은 Met85를 함유하는 잔기 84-93으로 이루어진 T6 트립신작용 펩티드 및 Met(O)85를 함유하는 상응하는 산화된 트립신작용 펩티드, T6ox에 대한 RP-HPLC 트립신작용 맵에서 UV 피크 면적을 측정함으로써 수득하였다. Met85에서 Met(O)85로의 면적 백분율 산화는 T6ox 피크의 면적 백분율에 비례하였다:
산화율(％) = 100 * AT6ox/ (AT6ox + AT6)
상기 식에서,
AT6 = T6 트립신작용 펩티드, (84-93)에 대한 피크 면적.
AT6ox = T6ox 트립신작용 펩티드, Met(O)85(84-93)에 대한 피크 면적.
탈아미드화율(％) 데이타는, Asn294를 함유하는 잔기 281-302로 이루어진 T26 트립신작용 펩티드 및 isoAsp294를 함유하는 상응하는 탈아미드화된 트립신작용 펩티드, T26deam1에 대한 RP-HPLC 트립신작용 맵에서의 UV 피크 면적을 측정함으로써 수득되는 상기 분석에서의 탈아미드화의 면적 백분율 산화를 정량하는 RP-HPLC 트립신작용 맵핑 분석의 사용으로 수득하였다. Asn294에서 isoAsp294로의 면적 백분율 탈아미드화는 T26deam1 피크의 면적 백분율에 비례하였다:
Figure 112011097388832-pat00200
상기 식에서,
AT26 = T26, (281-302)에 대한 피크 면적,
AT26deam1 = T26deam1, isoAsp294(281-302)에 대한 피크 면적,
AT26deam2 = T26deam2, Asp299(281-302)에 대한 피크 면적,
AT26deam3 = T26deam3 , Asp294(281-302)에 대한 피크 면적,
AT26deam4 = T26deam4, Asu294(281-302)에 대한 피크 면적.
실시예 44: 전기화학적 검출을 이용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 CTLA4-Ig N-연결된 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일링
당단백질에 존재하는 탄수화물 구조는 그의 기능 및 생체내 청소율에 영향을 줄 수 있다. 그러므로, 재조합적으로 제조된 당단백질 뱃치들의 탄수화물의 구조적 일관성을 모니터링하는 것이 중요하다. CTLA4-Ig는 N-연결된 및 O-연결된 (세린-연결된) 글리코실화 부위를 둘 다 함유하는 재조합 단백질이다. 여기서, CTLA4-Ig에 존재하는 N-연결된 (아스파라긴-연결된) 탄수화물을 모니터링한다. 상기 방법에서, 올리고사카라이드를 PNGase F (펩티드: N-글리코시다제 F)를 이용한 효소 분해로 절단한 후, 2-칼럼 시스템에서 역상 HPLC로 단리하고, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC)로 분리하고, 전기화학적 검출 (통합 전류측정)로 모니터링하였다. 생성된 크로마토그램은 N-연결된 탄수화물 프로파일이고, 여기서 CTLA4-Ig 샘플의 프로파일은 이와 유사해야 한다.
상기 방법은 CTLA4-Ig 샘플로부터 방출된 N-연결된 올리고사카라이드의 HPAEC 올리고사카라이드 프로파일을 측정하는 절차를 기재한다. 상기 방법의 목적은 둘 사이의 비교 분석에 사용할 수 있는 CTLA4-Ig 약물 재료 N-연결된 올리고사카라이드의 크로마토그래피 프로파일을 제공하는 것이다. CTLA4-Ig상의 글리코실화는 N-연결된 올리고사카라이드를 함유한다. 상기 올리고사카라이드를 22시간에 걸쳐 PNGase F로의 효소적 가수분해로 유리시켰다. 유리 올리고사카라이드를 전기화학적 검출을 이용하는 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 프로파일링하였다. 약물 재료의 올리고사카라이드 프로파일을 참고 물질의 동시 작업 샘플에 대해 평가하였다. 결과를 참고물 표준에서의 동일한 피크로부터 선택된 도메인 및 피크의 백분율 편차로서 보고하였다.
Figure 112011097388832-pat00201
물질. 달리 상술하지 않는 한 등가의 물질로 치환될 수 있다.
Figure 112011097388832-pat00202
기구사용 및 조건. 달리 상술하지 않는 한 등가의 기구를 사용할 수 있다.
기구사용:
Figure 112011097388832-pat00203
음이온-교환 크로마토그래피에 의한 올리고사카라이드 프로파일을 위한 크로마토그래피 조건
칼럼 온도 29℃
유속 1 mL/분
이동상 및 구배 조건 구배 프로그램
Figure 112011097388832-pat00204
워터스 2465 설정
모드 펄스
엠파워 설정 범위 = 5 μA
E1=+0.05 V E2=+0.75 V E3=-0.15V
t1=400 msec t2=200 msec t3=400 msec
샘플링 시간(ts)=100 msec
시간 상수(필터)t=0.1 sec
오프셋 범위=5％
극성도 +
온도=29℃
비고: 대략 2시간 동안, 또는 주입하기 전에 기준선이 안정할 때까지, 칼럼 및 검출기를 분석 유속에서 초기 이동상으로 평형화시킨다.
오토샘플러 온도
설정 온도: 4℃
주입 용량 60 ㎕
전개 시간 100분
각 도메인에서의 우세한 피크 (도 1 참조)의 대략적 체류 시간 (RT; 분); 값은 시스템 적합성 (SS) 표준의 RT에 따라 달라질 수 있음
근사 RT (분)
Figure 112011097388832-pat00205
전극 세척 (워터스 2465). 검출기 매뉴얼에서의 세척 지시를 따랐다. 전극(들)의 표면에 윤을 내기 위하여 유동 세포 키트에 제공되는 다이아몬드 슬러리를 사용하였다. 윤내기로 허용되는 결과를 얻지 못한다면, 전극을 새로운 유동 세포 키트로 대체하였다. 새로운 스페이서 (50 μm)를 사용하여 유동 세포를 재건설하였다.
시약. 비고: 부분별 절차에 따라 모든 시약 제제를 표지하고 문서화하였다.
HPAEC 올리고사카라이드 탄수화물 프로파일링을 위한 이동상의 제조.
HPAEC 용출액 1: 500 mM 아세트산나트륨 (NaOAc). 아세트산나트륨 (무수) 20.51 ± 0.05 g을 HPLC 등급수 400 mL를 함유하는 500 mL 눈금 실린더로 칭량하였다. HPLC 등급수를 이용하여 용량을 500 mL로 하고, 완전히 혼합될 때까지 플라스틱 혈청학용 피펫을 이용하여 5분 동안 교반하였다. 용액을 0.2 μm 나일론 필터를 통해 여과하였다. 1 L 용출액 병으로 옮겼다. 병 뚜껑을 느슨하게 닫고, 헬륨으로 20분 동안 스파징하였다. 뚜껑을 조이고, 병을 헬륨으로 가압하였다. 용액을 헬륨 하에 3주 이하 동안 실온에서 저장하였다.
HPAEC 용출액 2: 400 mM 수산화나트륨 (NaOH). 1 L 눈금 실린더를 사용하여, HPLC 등급수 960 mL를 측정하고, 깨끗한 1 L 용출액 병으로 옮겼다. 혈청학용 플라스틱 피펫을 이용하여, 10 N NaOH 40.0 mL를 용출액 병으로 직접 첨가하고, 용출액을 돌려(swirl) 혼합하였다. 병 뚜껑을 느슨하게 닫고, 헬륨으로 20분 동안 스파징하였다. 뚜껑을 조이고, 병을 헬륨으로 가압하였다. 용액을 헬륨 하에 3주 이하 동안 실온에서 저장하였다.
HPAEC 용출액 3: HPLC 등급수. 1 L 용출액 병에 HPLC 등급수 대략 1 L를 넣었다. 용출액 병을 시스템에 놓고, 뚜껑을 느슨하게 닫고, 대략 20분 동안 스파징하였다. 뚜껑을 조이고, 병을 헬륨으로 가압하였다. 용액을 헬륨 하에 3주 이하 동안 실온에서 저장하였다.
50 mM 인산나트륨 완충액, 0.02％ 아지드화나트륨, pH = 7.5. 아지드화나트륨 (NaN3)은 흡입 (독성) 및 피부 접촉 (자극) 을 피하기 위해 조심스럽게 취급해야 한다. 추가의 요건에 대해서는 MSDS 시트를 참고하였다. NaN3을 칭량한 후, 저울 영역을 완전히 세척해야 한다.
NaH2PO4·H2O 6.9 g
NaN3 0.2 g
H2O 1.0 리터 최종 용량
NaH2PO4·H2O 6.9 g ± 0.1 g 및 NaN3 0.2 g을 칭량하고, 1 L 시약병에서 자석 교반 막대로의 계속적인 교반을 이용하여 HPLC 등급 H2O 800 mL에 용해하였다. pH 미터를 이용하여, 10 M NaOH를 이용하여 용액의 pH를 7.5로 조정하였다. 1 L 눈금 실린더를 이용하여 최종 용량을 1.0 리터로 하였다. 용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장하였다. 50 mM 인산나트륨 완충액 중의 PNGase F 효소 작업 원액, 0.02％ 아지드화나트륨, pH = 7.5.
50 mM 인산나트륨 완충액
0.02％ 아지드화나트륨, pH = 7.5. 1.8 mL
카탈로그 번호 P0704L인 키트로부터의 PNGase F 0.2 mL
50 mM 인산나트륨 완충액 1.8 mL, 0.02％ 아지드화나트륨, pH 7.5를 1.8 mL 극저온 바이알에 피펫팅하였다. 키트로부터의 PNGase F 0.2 mL를 첨가하고, 완전히 혼합하였다. 용액을 -20℃ 이하에서 6개월 이하 동안 저장하였다. 용액을 동결 전 분취할 수 있다.
외부 시스템 적합성 표준. 스타키오스 원액 (1.25 mg/mL): 스타키오스 0.125 g을 칭량지에서 칭량하였다. 분석 저울을 이용하여 100 mL 용량측정 플라스크로 옮겼다. HPLC 등급수를 표시까지 채우고 완전히 혼합하였다. 날젠(Nalgene) 크리오바이알로 2 mL 부분으로 분취하였다. 용액을 -20℃ 이하에서 6개월 이하 동안 저장하였다.
스타키오스 시스템 적합성 표준 (12.5 ㎍/mL): 1.25 mg/mL 원액 1 mL를 100 mL 용량측정 플라스크로 피펫팅하였다. HPLC 등급수를 표시까지 채우고 완전히 혼합하였다. 0.65 mL 마이크로퓨지 튜브로 200 ㎕ 부분으로 분취하였다. 튜브를 대략적으로 표지된 저장 박스에 놓았다. 시스템 적합성 용액을 -20℃ 이하에서 6개월 이하 동안 저장하였다.
표준 및 샘플 제조.
참고 물질 제조. 동결건조된 라피제스트(RapiGest) SF 1 mg을 함유하는 바이알에, 0.02％ Na아지드, pH 7.5를 함유하는 50 mM Na포스페이트 완충액 625 ㎕를 첨가하였다. 비고: 라피제스트 SF를 함유하는 완충액의 단일 풀을 샘플 셋트 내 모든 샘플에 대해 사용해야 한다. 라피제스트 SF의 몇몇 바이알은 적절한 용량을 제공하기 위하여 재구성되고 합해질 수 있다. 0.65 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 라피제스트 SF를 함유하는 완충액 120 ㎕를 첨가하였다. 참고 물질 (약 50 mg/mL) 40 ㎕를 첨가하였다. 최종 라피제스트 SF 농도는 0.12 ％ w/v이어야 한다. PNGase F 작업 원액 40 ㎕를 첨가하고, 완전히 혼합하고, 샘플를 회전 침강시키고, 38 ± 2℃에서 22 ± 2시간 동안 (수조 또는 알리안스 오토샘플러 구획) 두었다. 샘플을 마이크로콘 YM-10 원심분리 필터로 피펫팅하고, 13,000 g에서 30분 동안 원심분리하였다. 필터에 HPLC 수 200 ㎕를 넣고, 추가의 30분 동안 13,000 g에서 원심분리하여 여액을 세정하였다. 합한 여액을 15초 동안 와동시키고, 샘플을 10초 동안 원심분리하였다. 피펫을 이용하여, 생성된 용액 (약 380 ㎕)을 HPLC 총 회수 오토샘플러 바이알로 옮겼다.
샘플 제조: 0.65 mL 에펜도르프 튜브에 라피제스트 SF를 함유하는 완충액 120 ㎕를 첨가하였다. 단백질 샘플 40 ㎕을 첨가하였다 (이 용량은 CTLA4-Ig 1 내지 2 mg와 동등해야 한다). 최종 라피제스트 SF 농도는 0.12 ％ w/v이어야 한다. PNGase F 작업 원액 40 ㎕를 첨가하고, 10초 동안 와동시켜 완전히 혼합하였다. 샘플을 회전 침강시키고, 38 ± 2℃에서 22 ± 2시간 (수조 또는 알리안스 오토샘플러 구획) 두었다. 샘플을 마이크로콘 YM-10 원심분리 필터로 피펫팅하고, 13,000 g에서 30분 동안 원심분리하였다. 필터에 HPLC 수 200 ㎕를 넣고, 추가의 30분 동안 13,000 g에서 원심분리하여 여액을 세정하였다. 합한 여액을 15초 동안 와동시키고, 샘플을 10초 동안 원심분리하였다. 생성된 용액 (약 380 ㎕)을 총 회수 HPLC 오토샘플러 바이알로 옮겼다.
전기화학적 검출기 세포 안정화: 외부 스타키오스 시스템 적합성 표준 (12.5 ㎍/mL) 30 ㎕를 주입하였다. 스타키오스에 대한 피크 높이가 800 nA 이상이도록 보장하였다. 세포로부터의 과도한 전기 소음이 없고 기준선이 평평하도록 보장하였다. 스타키오스 민감도 또는 기준선이 불허되는 경우, 완충액 조성물을 확인하고, 전극을 세척하거나 전극을 교체하였다. 과도한 소음이 존재하는 경우, 세포를 확인하여 모든 공기 버블을 제거하였음을 보장하였다. 세포를 재안정시키고, 스타키오스 표준을 재주입하였다. 문제가 지속된다면, 다른 적절한 방법을 취하거나 상관에게 연락하였다.
이론단 (N): 하기 식을 이용하여 스타키오스 피크를 바탕으로 이론단의 수 (N)를 측정하였다. 이는 엠파워 데이타 분석 시스템을 통해 수행하거나, 수동으로도 수행할 수 있다.
N = 16 (t/W)2
상기 식에서,
t: 주입 시간부터 최대 높이에서의 피크 용출 시간까지 측정된 체류 시간
W: 측면에서 기준선으로 외삽함으로 인한 피크 폭.
N은 6000 이상이어야 한다. 플레이트 계수가 6000 미만인 경우, 유동 구배를 조정하거나 칼럼을 교체한다.
테일링 계수 (T): 하기 식을 이용하여 스타키오스 피크를 바탕으로 칼럼 테일링 계수 (T)를 측정하였다. 이는 엠파워 데이타 분석 시스템을 통해 수행하거나, 수동으로도 수행할 수 있다.
T = (W0.05/2f)
상기 식에서,
W0.05: 높이의 5％ (0.05h)에서의 피크 폭.
f: W0.05 에서의 피크의 전방 등(edge)에서 피크의 정점까지의 측정 (폭).
T는 1.2 이하이어야 한다. 테일링 계수가 1.2 초과인 경우, 완충액 조성물을 확인하고, 칼럼을 교체하거나 칼럼을 세척하고, 시스템 적합성 표준을 재주입한다.
스타키오스 시스템 적합성 표준 체류 시간 증명: 체류 시간은 시스템 의존적이다. 스타키오스 시스템 적합성 표준은 18.5 ± 2.0분의 체류 시간을 나타내어야 한다.
CTLA4-Ig 참고 물질 - 샘플 주입 전에 주입된 첫번째 일괄화 참고 물질로부터 탄수화물 프로파일을 관찰하였다. 탄수화물 프로파일은 도 68에 나타난 것과 유사해야 한다. 절대적 체류 시간은 시스템 의존적이다. 도메인 I에서의 제1 피크 (피크 1A)와 도메인 III에서의 주 피크 (피크 3) 사이의 체류 시간 차이는 22분 내지 28분이도록 보장한다. 피크의 도해가 도 68에서 얻어진 것과 유사하지 않은 경우, 적절한 행동을 취하고 (예를 들어 기구의 기능 확인, 칼럼 세척, 완충액 세척/교체, 칼럼 교체) 재평가하였다. 하기 절차를 사용하여 칼럼을 세척할 수 있다: 세포를 중지시키고(turn off), 칼럼을 80％ 용출액 1, 20％ 용출액 2로 5분 동안, 이어서 50％ 용출액 1, 50％ 용출액 2로 10분 동안 세척하였다. 칼럼 및 세포 (세포는 작동하는(turn on) 상태임)를 초기 조건에서 재평형화시키고, 재평가하였다.
주입 서열:
단리된 올리고사카라이드의 주입 서열을 하기와 같이 설정하였다:
스타키오스 표준 (30 ㎕)
참고 물질 (60 ㎕)
샘플(들) (60 ㎕)
참고 물질 (60 ㎕)
일괄화 참고 물질 주 사이에 5개 이하의 샘플을 유동시키는 것이 추천된다.
데이타 분석: 크로마토그램을 프로세싱하였다. 엠파워에서 참고 물질 및 샘플에 대한 크로마토그램을 프로세싱하였다. 피크 도해 및 기준선이 도 68에 나타난 것과 유사하도록 통합 파라미터를 설정하고, 통합 선은 수동으로 위치시킬 필요가 있을 수 있다. 상대적 도메인 면적 및 상대적 피크 면적에 대한 계산을 수행하였다 (도 68의 간단한 설명 및 본 실시예의 끝에 포함된 표 참조). 반복적으로 주입한 경우, 참고 물질 및 각 샘플에 대한 이들 파라미터의 평균 값을 측정하였다.
참고 물질의 경우, 모든 반복의 평균에 대하여 각 반복에 대한 도메인 I, II, III, 피크 1A 및 1B의 상대 편차를 측정하였다.
샘플의 프로파일과 참고 물질 프로파일의 비교.
시각적 비교는 샘플 및 참고 물질 둘 다 동일한 수의 도메인 및 1차 피크를 갖는지를 측정한다. 1차 피크는 도 68의 기재에서 표지된 피크 (피크 1A, 1B, 1C, 1D, 2, 3 및 4)이다. 상대적 정량화 비교. 샘플의 상대적 면적 (도메인 I, II, 및 III 및 피크 1A, 및 1B; 반복적 주입을 행한 경우, 샘플은 그의 평균 값을 사용함)을 일괄화 참고 물질 주입으로부터 얻은 평균 상대적 면적과 비교하였다. 평균 참고 물질 값으로부터 얻은 이들 면적의 상대적 차이를 측정하였다.
계산. ％ 도메인 면적 (상대적 도메인 면적): 참고 물질 및 샘플에 대한 프로파일의 도메인에 대한 ％ 도메인 면적을 계산하였다. 도메인 면적의 패턴에 대해서는 도 68을 참조한다. 도 68에서의 실시예에 따라, 하기 정보 및 식을 이용하여 도메인 백분율 비율을 계산하였다 (체류 시간은 시스템 의존적이고, 도 68에서의 결과를 반영하였다.):
도메인 I: 대략적인 체류 시간 18-24분에서의 피크 면적의 총합 (피크 1A- 1E)
도메인 II: 26-38분의 피크 총합
도메인 III: 39-50분의 피크 총합
도메인 IV: 51-64분의 피크 총합
도메인 V: 65-75분의 피크 총합
비고: 도메인에 대한 체류 시간 윈도우는 1일 크로마토그래피 수행에서 변수에 따른 이동일 것이다. 그에 따라 시간을 조정하였다.
Figure 112011097388832-pat00206
도메인 I-III의 경우에도, 반복 주입을 행한 경우 샘플에서 뿐만 아니라 일괄화 참고 물질 주입에서도 평균 값을 계산하였다.
％ 피크 면적 (상대적 피크 면적). 참고 물질 및 샘플에 대한 프로파일 중 피크 1A, 1B, 1C, 및 3에 대한 ％ 피크 면적을 계산하였다. 피크 면적의 패턴에 대해서는 도 68을 참조한다. 체류 시간은 시스템 의존적이었다. 하기 정보 및 식을 이용하여 피크 백분율 비율을 계산하였다:
Figure 112011097388832-pat00207
피크 1A 및 1B 각각에 대해서도, 반복 주입을 행한 경우 샘플에서 뿐만 아니라 일괄화 참고 물질 주입에서도 평균 값을 계산하였다.
평균 참고 물질 값들로부터의 백분율 차이 계산. 하기 식을 이용하여, 참고 물질과 비교한 샘플의 도메인 I-III, 피크 1A 및 1B의 평균 상대적 면적에서의 백분율 차이를 계산하였다:
Figure 112011097388832-pat00208
상기 식에서,
RM = 참고 물질에 대한 관심 평균 상대적 면적 값
S = 샘플에 대한 관심 평균 상대적 면적 값
｜ ｜ = 절대값
결과: 보고할 결과는 도메인 I, 도메인 II, 도메인 II, 피크 1A 및 피크 1B에 대한 참고 물질로부터의 계산된 백분율 차이이다. 참고 물질 및 샘플 둘 다에 대한 통합 대표적 크로마토그램을 포함하였다. 샘플 및 참고 물질 (일괄화 주입의 평균) 둘 다에 대한 백분율의 10분의 1로 도메인 I-III 및 피크 1A 및 1B의 상대 면적 백분율을 포함시켰다. 추가로, 일괄화 참고 물질 주입 각각에 대해서, 도메인 I, II 및 III에 대한 ％ 도메인 면적 및 피크 1A 및 1B에 대한 ％ 피크 면적은 그의 평균 값의 15％ 이내이어야 한다.
도 57-62, 68, 76 및 82-84는 본원에 기재된 바와 같은, N-연결된 올리고사카라이드 프로파일로부터 얻은 데이타를 나타낸다. 도 68은 전형적인 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일 (로트 평균의 5％ 내의 도메인 I, II, III, IV 및 V, 및 피크 1A 및 1B)을 도시한다. 피크 1A, 1B 및 1C는 GO, G1 및 G2의 아시알로 N-연결된 올리고사카라이드 구조를 나타낸다.
도 68은 CTLA4-Ig 조성물에 대한 전형적인 N-연결된 탄수화물 프로파일을 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00209
상기의 표는 CTLA4-Ig의 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일에 대한 표로 만든 데이타를 나타낸다.
하기의 표는 CTLA4-Ig의 관찰 범위를 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00210
실시예 45: CTLA4-Ig에 대한 시험관내 세포 기준 생분석
T 세포는 활성화 및 그 후의 증식을 위해 2개의 신호를 필요로 한다. 첫번째 신호는 TCR-CD3 복합체와 항원성 펩티드의 상호작용으로 제공된다. 두번째 공동-자극 신호는 T 세포 상의 CD28과 항원-제시 세포 상의 B7 단백질 사이의 상호작용으로 발생된다. 이들 두 신호를 받으면, T 세포는 사이토킨 인터류킨 2 (IL-2)을 분비한다. IL-2의 방출은 세포 활성화 및 증식을 유도한다. 가용성 면역억제 화합물인 CTLA4-Ig는 또한 항원 제시 세포 상의 B7 단백질과 결합하여, CD28과의 기능적 상호작용을 차단하고 IL-2 생산에 필수적인 공동-자극 신호를 막는다.
상기 방법에서, IL-2 프로모터의 제어 하에 루시퍼라제 유전자로 형질감염된 주르캣(Jurkat) T 세포를 항-CD3의 존재하에 다우디(Daudi) B 세포로 공동자극하였다. 공동-자극은 IL-2 프로모터를 활성화시키고, 이는 차례로 루시퍼라제 단백질을 생산한다. 생성된 발광 신호를 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 측정하였다. 상기 시스템에서, CTLA4-Ig는 루시퍼라제 활성에서의 용량-의존적 감소를 제공하였다.
상기 방법은 IL-2 생산에 필요한 공동-자극 신호에 대한 CTLA4-Ig의 효과를 조사한다. 가용성 CTLA4-Ig의 존재는 T 세포와 항원-제시 세포 사이의 신호전달을 막는다. 상기 신호 없이, IL-2는 생산되지 않으므로, T 세포의 클로날 확장을 막는다. 루시퍼라제 유전자가 있는 벡터는 IL-2 프로모터를 이용하여 생성하였다. 이어서, 주르캣 T 세포를 상기 리포터 벡터로 형질감염시켰다. 양성의 클론, 주르캣.CA를 선별하고 방법에 사용하였다.
상기 생물분석은 항-CD3이 있는 형질감염된 T 세포 (주르캣.CA) 및 B 세포 (다우디)를 자극하는 것을 포함한다. B 세포에 의해 제공되는 공동-자극을 CTLA4-Ig의 첨가로 억제하였다. 주르캣.CA 및 다우디 세포를 96웰 백색 불투명 평평-바닥 플레이트의 웰로 시딩하고, 상이한 농도의 CTLA4-Ig의 존재하에 항-CD3으로 자극하였다. 37℃에서 16 내지 20시간 인큐베이션 후, 웰을 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다. CTLA4-Ig에 의한 공동-자극의 억제는 루시퍼라제 활성에서 용량-의존적 감소로서 나타났다.
시약: 다우디 세포 배양 배지 (RPMI 1640 중의 10％ 소 태아 혈청, 1％ MEM 피루브산나트륨); 주르캣.CA 세포 배양 배지 (RPMI 1640 중의 10％ 송아지 혈청, 1％ MEM 피루브산나트륨, 400 ㎍/mL 제네티신); 생물분석 배지 (다우디 세포 배양 배지 중 0.2 ㎍/mL 항-CD3 항체 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신 용액); 분석 시스템으로부터의 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시퍼라제 용액 (프로메가, 카탈로그 번호 E2620).
기구사용: 니콘(Nikon), 디아포트(Diaphot) 200 역전 현미경; 팩커드 탑카운트(Packard TopCount) NXT 발광분석기; 테칸 제네시스 리퀴드 핸들러(Tecan Genesis Liquid Handler); 카울터(Coulter) Vi-Cell 세포 계수기; 지마크 래피드플레이트(Zymark RapidPlate)-96.
절차의 흐름 차트:
Figure 112011097388832-pat00211
작업 용액의 제조: 생물분석 배지 중 CTLA4-Ig 용액 (5000 ng/mL) 3 mL.
8개 점의 곡선을 표준, 품질 대조군, 및 샘플에 대해, 분석에서의 최종 농도에 관하여 하기 표 58에 나타낸 바와 같이, CTLA4-Ig 100, 4, 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 및 0.002 ㎍/mL의 농도 (플레이트로 2배 희석 후 50, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 및 0.001 ㎍/mL임)로 제조하였다.
Figure 112011097388832-pat00212
96 웰 플레이트의 웰 당 200,000개의 세포를 첨가하고, 37℃, 5％ CO2, 및 85％ 습도에서 인큐베이션하였다. 12 x 106개의 주르캣.CA 세포 및 12 x 106개의 다우디 세포를 멸균 원심분리 튜브에서 합하였다. 세포를 약 125 x g에서 10분 동안 실온에서 원심분리하고, 세포 덩어리가 보이지 않을 때까지 혈청학용 피펫으로 반복적으로 온화하게 피펫팅함으로써 다우디 세포 배양 배지 9 mL 중에 완전히 재현탁시켜 2.7 x 106개의 세포/mL의 농도를 수득하였다. 표 58로부터의 각 용액 75 ㎕를 세포를 함유하는 플레이트의 적절한 웰로 첨가하였다. 이어서, 플레이트(들)을 탑실(TopSeal)-A로 밀봉하고, 37℃, 5％ CO2, 및 85％ 습도에서 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 및 브라이트-글로 루시퍼라제 용액을 기구 온도로 평형화시킨 후, 브라이트-글로 루시퍼라제 용액 150 ㎕을 각 웰에 동시에 첨가하고 혼합하였다. 이어서, 암소에서 10분 동안 평형화를 위해 혼합한 직후 플레이트를 탑카운트(TopCount) NXT에 두었다. 이어서, 웰 당 1초 통합을 이용하여 또는 사용된 발광분석기의 구체적인 종류에 대해 적절하게 발광 신호를 탑카운트 NXT에서 측정하였다.
탑카운트 NXT로부터의 결과를 기록하고, 표준 분석 프로그램으로 판독하고, 데이타를 그의 로그 (밑은 10)를 취하여 변환하였다. 각 물품으로부터의 변환된 데이타를 하기 식으로 나타내는 바와 같은 4-파라미터 기호논리학적 모델에 적용시켰다:
[식 1]
Figure 112011097388832-pat00213
상기 식에서,
A는 곡선의 상부 평탄구역이고, D는 곡선의 하부 평탄구역이고, B는 기울기 인자이고, C는 A 및 D의 평균과 동일한 효과를 제공하는 농도이다.
R2 통계치 및 맞춤-없는(lack-of-fit) F-시험을 각 물품에 대해 계산할 수 있다. 표준 물질에 대한 시험품의 최소, 최대 및 기울기 비율도 계산할 수 있다. 또한, 상기 비율에 대한 신뢰 간격도 산정할 수 있다.
각 물품의 상대적 효능은 단일 식을 참고 물품으로부터 얻은 데이타와 합쳐진 관심 물품으로부터 얻은 데이타에 적용시켜 측정하였다.
[식 2]
Figure 112011097388832-pat00214
상기 식에서,
A, B 및 D 파라미터는 참고품 및 시험품 모두에 공통적이고, CR은 참고 파라미터이고, CA는 시험품 파라미터이고, 비율 CR/CA는 상대적 효능이다. 윗첨자 I는 가변 지표이다. 데이타가 관심 물품으로부터 얻어진 경우 1로 설정하고, 데이타가 CTLA4-Ig 물질로부터 얻어진 경우 0으로 설정하였다.
각 시험품의 상대적 효능을 백분율 규모로 번역하고, 상대적 효능을 프로그램으로부터의 결과로서 수득하였다.
분석된 8개의 데이타 셋트 각각으로부터의 출력물의 8개 상대적 효능 결과를 평균낼 수 있고, 표준 편차를 각각 식 3 및 4를 이용하여 계산할 수 있다. 평균 결과를 가장 근접한 정수로 반올림된 "백분율 상대적 효능"으로 보고하였다.
[식 3]
Figure 112011097388832-pat00215
[식 4]
Figure 112011097388832-pat00216
상기 식에서,
8은 효능 측정의 개수이고,
x = 개별 측정이다.
대략적인 농도로 얻어진 상대적 효능 값의 조정: 샘플 수령과 정확한 단백질 농도 수득 사이의 시간 지체 때문에, 샘플을 대략적인 농도로 분석에서 시험하고, 정확한 농도가 측정되었을 때 결과를 조정할 수 있다. 상기 조정은 하기 식 5를 사용하여 수행하며, 여기서 상기 분석에서 측정된 상대적 효능에, 측정된 CTLA4-Ig 샘플 농도에 대한 분석을 설정하기 위해 사용된 CTLA4-Ig 농도의 비율을 곱하였다.
[식 5]
Figure 112011097388832-pat00217
실시예:
샘플은 분석에서 25 mg/mL의 단백질 농도로 시험하였다.
측정된 상대적 효능은 105％이었다.
측정된 CTLA4-Ig 농도는 25.5 mg/mL인 것으로 측정되었다.
보고가능한 상대적 효능 = (105 * 25) / 25.5 = 103％.
시험품 상대적 효능 값은 참고 표준의 25 내지 175％이어야 하며, 이는 분석 범위 내이다. 상대적 효능 값이 상기 범위 밖인 경우, 샘플을 상기 범위에 속하도록 희석 또는 농축하거나, 샘플을 재분석해야 한다.
실시예 46; O-연결된 올리고사카라이드의 구조적 특성화
CTLA4-Ig의 O-연결된 글리코실화는 펩티드 맵핑, 이어서 ESI-MS/MS, 및 MALDI-TOF로 특성화였다.
ESI-MS/MS와 펩티드 맵핑에 의한 T8 및 T9의 분석
핀니간(Finnigan) 이온 포획 질량 분광측정기를 사용하는 인-라인 ESI-MS/MS를 이용하는 트립신작용 분해 방법의 변형된 수동 버전을 수행하여 O-연결된 당펩티드 T8 및 T9를 특성화하였다 (펩티드 신원에 대해서는 표 59를 참조함).
도 63은 T8이 용매 전방의 말단에서 용출되고, T9가 T27의 어깨에서 용출됨을 나타내는 CTLA4-Ig의 트립신작용 펩티드 맵을 나타낸다.
펩티드 T8의 전체 질량 스펙트럼을 도 64에 나타내며, 여기서 피크 436.2는 단일-하전된 비변형된 펩티드 T8의 예상 MW에 상응하고, 피크 1092.2는 단일-하전된 글리코실화 T8의 MW에 상응한다. 주요 피크 및 그의 구조 (T8-HexNAc-Hex-NeuAc)에 상응하는 질량를 표 61에 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00218
펩티드 T9의 전체 질량 스펙트럼을 도 65에 나타내며, 여기서 소정 범위의 이종성 당형태에 상응하는 당펩티드의 이중- 및 삼중-하전 이온이 보인다. 주요 피크 1115.9는 HexNAc-Hex-NeuAc를 갖는 삼중-하전된 T9 글리코실화의 MW에 상응한다. 피크 1213.0 및 1334.8은 각각 HexNAc(NeuAc)-Hex-NeuAc 및 (HexNAc-Hex- NeuAc)2로 글리코실화된 삼중-하전된 T9의 분자량에 상응한다 (표 62). 우세한 당형태는 모노시알화 T9-HexNAc-Hex-NeuAc인 반면, 다른 당형태는 훨씬 낮은 비율로 존재하였다.
Figure 112011097388832-pat00219
O-연결된 부위를 측정하기 위하여, CTLA4-Ig의 펩티드 맵핑을 상기 실시예 4에 기재한 바와 같이 수행하고, 분획 T8-9 (트립신에 의한 불완전한 분해로 인한 것)를 수집하고, 에드만(Edman) 서열분석에 적용시켰다. 서열분석 데이타는 제1 주기에서 Ser 이외의 여분의 피크가 나타남을 보여주었다. 여분의 피크의 체류 시간은 임의의 표준 아미노산의 피크와 일치하지 않았는데, 이는 T8 (Ser 129)에서 위치 1의 Ser이 변형되어 O-연결된 글리칸을 함유함을 암시한다. Ser 및 여분의 피크 모두의 존재는 Ser이 부분적으로 변형되었음을 나타낸다. 이는 T8에 대한 MS 데이타와 일치한다. 서열분석 실험에서는 또한 T9에서의 O-연결된 부위가 Ser 139로서 나타난다. 결론적으로, 2개의 O-연결된 글리코실화 부위는 아미노산 잔기 세린 129 및 세린 139로 확인되었다. 상기 두 부위에 부착된 우세한 글리칸은 HexNAc-Hex-NeuAc이었다.
T9 펩티드의 MALDI-TOF 분석
펩티드 T9의 MALDI-TOF 분석은 몇몇 당형태의 존재를 증명한다 (도 66). MW가 2690.8인 피크는 T9 단편과 일치하였다. MW가 2893.7인 피크는 T9 및 HexNAc과 상관되었다. MW가 3055.7인 피크는 T9 및 HexNAc-Hex와 상관되었다. MW가 3345.8인 피크는 T9 및 HexNAc-Hex-NANA를 나타내었다. 모노사카라이드 분석을 바탕으로, 갈락토스 및 N-아세틸 갈락토사민이 T9에서 검출되었으므로, T9에서의 주요 O-연결된 종은 GalNAc-Gal-NANA일 것으로 가정되었다. 펩티드 T8의 MALDI-TOF 분석은 낮은 회수 수율 때문에 수행하지 않았다.
실시예 47: CTLA4-Ig에서의 산화 및 탈아미드화 변이
산화 및 탈아미드화는 펩티드 및 단백질의 공통된 생성물 변이이다. 이는 발효, 수거 / 세포 분류, 정제, 약물 재료 / 약물 제품 저장 동안 및 샘플 분석 동안 발생할 수 있다.
단백질 산화는 전형적으로 단백질에 하나 이상의 산소 원자가 화학적 첨가되는 것을 특징으로 한다. 몇몇 아미노산, Met, Cys, Tyr, His 및 Trp는 다른 천연 아미노산에 비해 산화에 더욱 민감하다. 산화에 대한 가장 높은 민감도를 갖는 아미노산은 메티오닌이다. 지금까지 확인된 주된 단백질 산화는 메티오닌의 술폭시드 변이체로의 산화였다. 단백질에서의 산화는 몇몇 상이한 메카니즘에 의해 유도될 수 있다. 공통된 산화 메카니즘은 광노출 또는 전이 금속 촉매로 인해 발생한다.
탈아미드화는 가수분해될 수 있는 숙신이미드 중간체를 형성하는, 단백질로부터의 NH3 손실이다. 숙신이미드 중간체는 모 펩티드의 17 u 질량 감소를 야기한다. 후속적 가수분해는 18 u 질량 증가를 야기한다. 숙신이미드 중간체의 단리는 수성 조건하에서의 불안정성 때문에 어렵다. 따라서, 탈아미드화는 전형적으로 1 u 질량 증가로서 검출가능하다. 아스파라긴의 탈아미드화는 아스파르트산 또는 이소아스파르트산을 발생시킨다. 탈아미드화율에 영향을 주는 파라미터로는 pH, 온도, 용매 유전 상수, 이온 강도, 일차 서열, 국소적 폴리펩티드 형상, 및 3차 구조가 포함된다. 펩티드 쇄에서 Asn에 인접한 아미노산 잔기는 탈아미드화율에 영향을 준다. 단백질 서열에서 Asn 다음의 Gly 및 Ser는 탈아미드화에 대한 보다 높은 민감성을 야기한다.
물질 및 방법
샘플: CTLA4-Ig 표준물
CTLA4-Ig의 트립신/Asp-N/트립신 및 키모트립신 펩티드 맵핑: 단백질을 변성시키고, 6 M 구아니딘 및 5 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하는 50 mM Tris 완충액 (pH 8.0)에서 환원시켰다. 50℃에서 20분 인큐베이션 후, 요오도아세트아미드 (IAM)를 10 mM의 최종 농도로 첨가하고, 샘플을 암소에서 50℃에서 추가의 20분 동안 인큐베이션하였다. 환원 및 알킬화된 혼합물을 NAP-5 칼럼으로 로딩한 후, 50 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH 8.0로 용출시켰다. 서열 등급 트립신 (2％ w/w, 효소 : 단백질)을 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. Asp-N 분해의 경우에, 서열 등급 Asp-N (4％ w/w, 효소 : 단백질)을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
트립신 및 키모트립신 분해의 경우, 단백질은 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.5 중에 존재하였다. 서열 등급 트립신 (4％, w/w, 효소 : 단백질)을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 키모트립신 (4％, w/w, 효소 : 단백질)을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 분해 후 -20℃에서 저장하였다.
펩티드 혼합물을 워터스 알리안스 HPLC 워크스테이션 (워터스, 매사추세츠주 밀포드 소재) 상에서 0.120 mL/분으로 아틀란티스(Atlantis) C18 칼럼 (2.1 x 250 mm)으로부터의 구배 용출로 분리하였다. 칼럼을 전자분무 이온화 분무 공급원이 장착된 Q-Tof 마이크로 (워터스, 매사추세츠주 밀포드 소재)에 직접 연결하고, 질량 스펙트럼을 수집하였다. Asp-N 펩티드 맵핑의 경우에, 펩티드 혼합물을 동일한 HPLC 워크스테이션을 사용하여 0.7 mL/분으로 배리안 C18 칼럼 (4.6 x 250 mm) 상에서 분리하였다. 칼럼을 용매 A (물 중 0.02％ TFA)로 평형화시키고, 펩티드를 용매 B (물 중 95％ 아세토니트릴/0.02％ TFA)의 농도를 증가시킴으로써 용출시켰다. 칼럼-후 스플리터 밸브를 사용하여 유출의 15％를 Q-Tof 마이크로로 향하게 하였다. 기구를 포지티브 모드 (m/z 100-2000)에서 작동시켰다. 모세관 전압은 3000 V로 설정하였다.
펩티드의 MS/MS 분석: 역상 크로마토그래피로부터의 분획을 수집하고, 유속 20 ㎕/분으로 Q-Tof 마이크로로 주입하였다. 개별 펩티드에 최적화된 충돌 에너지 (25 내지 42 eV의 범위)를 이용하여 MS/MS 스펙트럼을 수득하였다.
결과
CTLA4-Ig의 산화: CTLA4-Ig는 단일쇄 당 7개의 메티오닌을 가졌다: Met1, Met53, Met54, Met85, Met97, Met162 및 Met338. 펩티드 맵핑을 이용하여 세 부위 각각에서 산화성 생성물 변이체를 확인하였다. 트립신작용 펩티드 맵핑 기술 (도 67 A-B)을 사용하여 Met1, Met85 및 Met162의 산화를 확인하였다. Met338의 산화는 검출되지 않았다. Met53, Met54 또는 Met97을 함유하는 트립신작용 단편은 이종성 JV-연결된 탄수화물을 함유하는 큰 펩티드였다. 이들 펩티드는 산화의 확인 및 상대적 정량화가 불가능하였다. 그러므로, 보다 짧은 비-글리코실화 펩티드를 생산하는 다중 효소를 이용한 단백용해를 수행하였다. Asp-N 펩티드 EVCAATYMMGN (46-56) 및 트립신작용 / 키모트립신작용 펩티드 MYPPPY (97-102)를 사용하여 Met53, Met54 및 Met97의 산화를 측정하였다. 발췌된 이온 크로마토그램의 피크 면적 백분율에 따라 메티오닌 산화의 상대적 정량화를 계산하였다. 산화된 펩티드의 상대량을 표 63에 나열하였다. 단일쇄 당 7개의 CTLA4-Ig 메티오닌 중 6개에서의 산화가 검출되었다. 피크 A 및 B는 펩티드 EVCAATYMMGN (46-56) (피크 3)의 단일 산화 형태이었다. 피크 2A 및 2B로부터의 펩티드는 동중원소(isobaric)이었고, 비변형된 펩티드 질량에 비해 16 u의 질량 증가를 가졌다. 각 피크는 상이한 Met에서의 산화를 나타내었다. 산화도는 두 부위에서 상이하였다.
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* AT1 산화의 작용이 부수적이기 때문에, AT1 산화의 백분율은 CTLA4-Ig 산화의 추정치의 계산에 포함시키지 않음.
CTLA4-Ig 메티오닌 산화의 총 추정량은 CTLA4-Ig에 대해 2.0％로 계산되었다. 이는 각 부위에서의 산화 총 백분율을 더하고, 메티오닌의 총수인 7로 나눠 계산하였다. MS/MS 분석을 표 63에 나열한 산화 및 천연 펩티드에서 수행하였다.
모든 펩티드 (D5는 예외)를 MS/MS를 이용하여 서열분석하였다. 산화된 아미노산은 b 및 y 이온 시리즈 내의 질량 차이에 의해 측정하였다. 산화 및 천연 T1 펩티드의 MS/MS 스펙트럼은 m/z 741.4 및 733.4에서 이중 하전된 전구체 이온을 수반한다. 질량 차이는 8 u (이중 하전 상태의 경우)이며, 이는 하전 상태에 대해 교정했을 때 16 u이다. 트립신작용 펩티드 T1 (1-14)은 Met1 잔기를 함유한다. 천연 펩티드 및 그의 산화된 유도체는 역상 크로마토그래피에 의해 분리된 기준선이다. T1 및 그의 유도체의 이중 하전된 이온에 대한 이온 크로마토그램을 도 67a-b에 나타낸다. b 및 y 이온 시리즈는 충돌로 유도되는 해리에서 생산되는 우세한 이온이다. y6-y13 이온은 동일한 변형된 및 비변형된 이온 질량을 갖는다. 산화된 펩티드의 b2 이온은 천연 펩티드의 상응하는 b2 이온보다 16 u 더 높다. 펩티드 질량과 함께 얻어진 b 및 y 이온 시리즈는 T1 펩티드에서 변형된 아미노산으로서 메티오닌 1을 확인하였다. 동일한 방법으로, AT1, T6, T10, 및 MYPPPY (97-102) 펩티드에서의 Met 산화를 확인하였다.
CTLA4-Ig의 탈아미드화: CTLA4-Ig는 단일쇄 당 15개 아스파라긴을 갖는다. 3개의 아스파라긴은 N-연결된 탄수화물 구조에 부착된다고 알려져 있다. 펩티드 맵핑을 이용하여 다른 12개 Asn 잔기에서 발생하는 탈아미드화를 확인하고 이를 상대적으로 정량하였다. Asn186, Asn225, Asn271, Asn294 및 Asn344의 탈아미드화를 LC/MS 트립신작용 펩티드 맵으로 확인하였다 (표 64). 발췌된 이온 크로마토그램의 피크 면적 백분율에 따라 아스파라긴 탈아미드화의 상대적 정량화를 계산하였다. 탈아미드화된 펩티드의 상대량을 표 64에 나열하였다. CTLA4-Ig 아스파라긴 탈아미드화의 총 추정량은 CTLA4-Ig에 대해 0.3％인 것으로 계산되었다. 이는 각 부위에서의 탈아미드화 총 백분율을 더하고, 15로 나눠 계산하였다. MS/MS 분석을 표 64에 나열한 탈아미드화된 펩티드 및 천연 펩티드에서 수행하였다.
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b 및 y 이온 시리즈 내의 질량 차이에 의해 탈아미드화된 아미노산을 측정하였다. 예를 들어, 펩티드 T15에 대해 2개의 탈아미드화된 피크가 존재하는 경우, 질량은 905.0 u이다. 피크 1은 천연 피크 전에 용출되며, 피크 3은 천연 피크 후에 용출된다. 트립신작용 펩티드 및 그의 탈아미드화된 형태는 역상 칼럼에서 분리되는 기준선이다. MS/MS 분석을 트립신작용 펩티드에서 수행하고, 탈아미드화된 펩티드를 표 64에 나열하였다. 피크 1-3은 동일한 y1 및 y2 이온을 함유하였고, 이는 C-말단 아미노산이 모든 세 피크에 대해 동일함을 나타내었으나, 피크 1 및 3으로부터의 y3-y14 이온은 피크 2로부터의 상응하는 이온보다 1 u 더 높았다. y2와 y3 사이의 질량 차이는 피크 2의 경우 114 u이었고, 이는 Asn 잔기와 상응하였다. 피크 1 및 3에 대한 115 u는 Asn 잔기 질량에 비해 1 u 질량 증가였고, 이는 아스파르트산 또는 이소아스파르트산 중 하나에 상응하였다. 동일한 방법으로, T12, T25, T26 및 T30에서의 탈아미드화를 확인하고, 단편 이온으로 변형 부위를 확인하였다.
CTLA4-Ig의 엔도펩티다제 절단의 LC/MS 및 LC/MS/MS 분석으로부터 아스파라긴 탈아미드화 및 메티오닌 산화를 측정하였다. 변형된 펩티드와 비변형된 펩티드 사이의 질량 이동에 의해 변형을 확인하였다. 변형된 아미노산은 MS/MS 서열분석으로 확인하였다. 단일쇄 당 6개의 메티오닌 산화 및 5개의 아스파라긴 탈아미드화가 CTLA4-Ig 물질에서 작은 백분율로 존재하였다. CTLA4-Ig Met1, Met53, Met54, Met85, Met97, 및 Met162이 모두 산화된 것으로 밝혀졌다. CTLA4-Ig로부터 측정된 이들 산화는 모든 CTLA4-Ig 메티오닌 중 2.5％ 미만으로 존재하는 것으로 밝혀졌다. CTLA4-Ig Asn186, Asn225, Asn271, Asn294, 및 Asn344는 모두 낮은 양으로 탈아미드화된 것으로 밝혀졌다. CTLA4-Ig로부터 측정된 이들 탈아미드화는 모든 CTLA4-Ig 아스파라긴 중 0.5％ 미만으로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 48 - CTLA4-Ig 및 CTLA4 A29YL104E -Ig에 대한 세균 내독소 분석
한 실시양태에서, CTLA4-Ig 조성물 약물 재료는 0.15 EU/mg 이하의 세균 내독소를 갖는다. CTLA4-Ig를 USP<85>를 바탕으로 리물러스 아메보사이트 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate) (LAL) 겔 응고 기술을 이용하여 세균 내독소의 존재에 대해 분석하였다. 분석 준비 및 적용시에, 전체적인 미생물 오염을 피하기 위하여 시편을 취급함에 있어 주의를 기울이고, 표면상에 존재할 수 있는 외래 내독소를 파괴하기 위하여, 사용되는 임의의 용기 또는 용구를 예컨대 검증 주기를 이용하여 건조-가열 오븐에서 가열함으로써 처리하였다.
LAL 시약: (어소시에이츠 오브 케이프 코드, 인크.(Associates of Cape Cod, Inc.) 또는 등가물)
동결건조된 리물러스 아메보사이트 라이세이트 (LAL) 시약, 예컨대 피로텔(Pyrotell)은 제조사의 지시에 따라 저장해야 한다. 재구성된 LAL 시약은 1개월 이하 동안 동결상태로 유지할 수 있으며, 1회 초과로 해동 또는 동결해서는 안된다.
내독소 표준: (어소시에이츠 오브 케이프 코드, 인크. 또는 등가물) 시험에 사용되는 대조군 표준 내독소 (CSE)는 참고 표준 내독소 (RSE)에 대해 추적가능하고 표준화되어야 한다. 내독소의 재구성되지 않은 용기를 냉장고에 저장하고, 일단 재구성하면, 더 긴 기간 동안의 증명으로 적합한 재활성이 나타나지 않는 한 14일 이하 동안 2℃-8℃에서 보유할 수 있다.
생산 로트의 시험
생성물 억제의 결여 또는 LAL 절차의 증진은 각 약물 제제에 대해 입증되어야 한다. 생산 로트의 시험은 생산의 처음, 중간 및 끝을 나타내는 3개의 개별 단위를 이용하여 수행하였다. 이들 단위는 개별적으로 또는 한데 모아 작업할 수 있다. 용균물의 표지된 민감도로서 CSE (또는 RSE)의 양으로 두 번 접종된, 시험 농도에서의 샘플의 대표적인 양성 생성물 대조군이 정당한 시험을 위해 포함되어야 한다. 최종 생성물/용균물 용액이 pH 6.0 내지 8.0 범위에 존재하도록, 멸균 내독소-비함유 HCl, NaOH 또는 적합한 완충액을 이용하여 pH를 조정하였다. 몇몇 상황에서는, pH 조정의 대안으로서 완충제, 예컨대 피로졸을 사용하는 것이 도움이 될 수 있다. 구체적인 사용에 대해서는 제조사의 지침을 주지한다.
용균물 재구성을 위한 완충제의 사용
완충제, 예컨대 피로졸 (어소시에이츠 오브 케이프 코드, 인크.)은 시험에 사용되는 용균물을 재구성하기 위해 사용되고, 용균물의 완충 역량을 증폭시키도록 고안된다. 피로졸-재구성된 용균물은 달리 산 또는 염기로 pH 조정이 요구될 수 있거나 pH 조정시 침전되는 샘플 또는 샘플 희석액을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 시험 샘플과 배합될 때, 피로졸-재구성된 용균물은 분홍색을 나타내고, 이는 pH가 확인 시험을 위한 범위 내에 있음을 나타낸다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 색은 황색 또는 자색일 것이며, 이 경우 시험 샘플은 추가의 pH 조정이 요구될 수 있다. 구체적인 방법은 용균물 재구성을 위한 피로졸의 사용을 지시할 것이다.
용균물 재구성을 위한 글루칸-억제 완충액의 사용
글루칸-억제 완충액, 예컨대 글루카쉴드(Glucashield) (어소시에이츠 오브 케이프 코드, 인크.)는 시험에 사용되는 용균물을 재구성하기 위해 사용되고, 잠재적인 글루칸 방해를 차단하도록 고안된다. 글루카쉴드-재구성된 용균물은 글루칸 오염을 함유할 수 있는 샘플 또는 샘플 희석액을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 글루칸 오염에 의한 방해는 특정 시험 물질에서의 거짓 양성을 제공할 수 있으므로, 글루카쉴드-재구성된 용균물을 사용하는 것은 방해를 차단하거나 감소시켜 거짓 양성의 수를 감소시킬 수 있다. 구체적인 방법은 용균물 재구성을 위한 글루카쉴드의 사용을 지시할 것이다.
샘플 희석액
샘플에서 내독소 농도의 수준을 어림잡기 위하여 필요하다면, 멸균 내독소-비함유 물 중 샘플의 적절한 일련의 희석물을 제조하였다. 시험할 각 제제 0.1 mL를 2개의 멸균 내독소-비함유 10 x 75 mm 유리 시험 튜브 각각에 첨가하고 와동시켰다.
표준 곡선을 위한 내독소 표준 용액의 제조
제조사의 지시에 따라 내독소 바이알을 내독소-비함유 물로 재구성하였다. 바이알을 와동 혼합기에서 30분 동안 간헐적으로 격렬히 혼합하였다. 농축물을 2℃-8℃의 냉장고에 4주 이하 동안 보관하였다. 와동 혼합기를 사용하여 사용 전 3분 이상 동안 격렬히 혼합하였다. 내독소 원액의 농도를 확인하기 위하여 제조사의 분석 증명서를 참고하고, 예컨대 하기 실시예로 표준 내독소 희석 시리즈 (종료점을 괄호로 표시함)를 제조하였다:
0.5 mL (1000 EU/mL) + 9.5 mL 내독소-비함유 물 = 50 EU/mL
5.0 mL (50 EU/mL) + 5.0 mL 내독소-비함유 물 = 25 EU/mL
1.0 mL (25 EU/mL) + 9.0 mL 내독소-비함유 물 = 2.5 EU/mL
1.0 mL (2.5 EU/mL) + 9.0 mL 내독소-비함유 물 = 0.25 EU/mL
5.0 mL (0.25 EU/mL) + 5.0 mL 내독소-비함유 물 = 0.125 EU/mL
5.0 mL (0.125 EU/mL) + 5.0 mL 내독소-비함유 물 = 0.06 EU/mL
5.0 mL (0.06 EU/mL) + 5.0 mL 내독소-비함유 물 = 0.03 EU/mL
5.0 mL (0.03 EU/mL) + 5.0 mL 내독소-비함유 물 = 0.015 EU/mL
반드시, 다음 희석을 진행하기 전 30초 이상 동안 각 희석액을 격렬히 와동시켰다. 사용된 희석제의 음성 물 대조군을 포함시켰다. 0.125 EU/mL, 0.06 EU/mL, 0.03 EU/mL, 0.015 EU/mL 농도 (또는 다른 곡선) 및 음성 물 대조군 각각의 0.1 mL를 2개의 멸균 내독소-비함유 10 x 75 mm 유리 시험 튜브 각각에 첨가하고 와동시켜 2개의 반복 곡선을 수득하였다.
LAL 시약 용액의 제조
동결건조된 LAL 시약을 냉동고에서 꺼냈다. 내독소-비함유 물 (재구성 완충액을 사용하기 위한 구체적인 방법에 의해 달리 지시되지 않는 한) 5.0 mL를 바이알에 무균적으로 첨가하였다. 바이알을 돌리거나 굴려 시약을 용해시켰다.
양성 생성물 대조군의 제조
모든 생성물은 양성 생성물 대조군과 시험해야 한다. 양성 대조군의 제조에 대한 지침에 대해서는 적용가능한 구체적 방법을 참조한다. 지침이 제공되지 않는다면, 시험 수준의 생성물과 함께 내독소 스파이크를 용균물 민감도 수준의 2배로 함유하는 양성 생성물 대조군을 제조하였다. 주입용 물 또는 고품질 공정 물을 시험하는 경우, 샘플에 첨가될 때 내독소 농도가 LAL 용액 민감도의 2배이도록, 재구성된 내독소 표준의 희석물을 이용하였다. 예를 들어, 용균물 민감도 = 0.06 EU/mL인 경우, 2.5 EU/mL 내독소 용액 0.1 mL를 시험 샘플 (LAL 용액에 첨가되는 형태) 1.9 mL에 첨가한다 = 0.125 EU/mL. 내독소 용액의 용량은 0.1 mL 이하이고, 총 희석은 1:20 이상이었다.
시험 절차
1. LAL 시약 용액 0.1 mL를 튜브간에 교차오염시키지 않도록 주의하면서, 시험 샘플 튜브 및 내독소 표준 튜브 각각에 무균적으로 분배하였다. 비고: 임의의 잔여 시약은 냉동고에 약 -10℃ 내지 -25℃에 두었다.
2. 생성물-용균물 혼합물의 혼합 지침에 대해서는 구체적인 용균물 설명서를 참조하였다.
3. 각 튜브를 37℃±1℃에서 유지되는 인큐베이션 장치, 예컨대 수조 또는 가열 블록에 놓았다. 인큐베이션 시작 시간 및 수조 또는 가열 블록의 온도를 기록하였다.
4. 각 튜브를 교란되지 않게 60 ± 2분 동안 인큐베이션하였다.
5. 인큐베이션 후, 인큐베이션 종료 시간을 기록하고, 튜브를 온화하게 180° 역전시켜 각 튜브를 관찰하였다. 양성 결과는 조심스럽게 역전시켰을 때 단단히 남아 있는 단단한 겔로 표시되며, 음성 결과는 이러한 겔의 부재 또는 완전성이 유지되지 않는 점성의 겔의 형성을 특징으로 하였다. 튜브를 조심스럽게 취급하며, 거짓 음성 관찰을 야기시킬 수 있는 진동을 받지 않도록 하였다.
평가
양성 결과를 제공하는 각 반복 시리즈에서의 최저 농도를 종료점이라 지칭하였다. 하기 절차에 의해 상기 시험에 대한 기하학적 평균 종료점을 계산하였다: 기하학적 평균 = 겔화 종료점의 로그 총합의 안티로그를 반복 종료점 분석의 수로 나눔. 시험은 기하학적 평균 종료점이 표지된 용균물 민감도의 2배 희석 이내에 존재하고, 양성 생성물 대조군이 양성이고, 음성 물 대조군이 음성인 경우 유효하였다. 표지된 용균물 민감도를 시험된 아이템의 희석 인자와 결합된 양성 또는 음성 결과와 비교함으로써, 시험 아이템 내에서 또는 시험 아이템 상에서 대략적인 세균 내독소 수준을 측정하였다. 상기 제품은 개별 논문 또는 명세서에 상술된 내독소 수준에서 단단한 겔의 형성이 없는 경우 시험 요건을 만족시켰다.
CTLA4 A29YL104E -Ig에 대한 방법
본 방법은 동력학적 탁도측정 LAL 방법을 이용하여 CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료 및 약물 제품의 샘플에서 세균 내독소를 정량하기 위하여 사용하였다. 결과는 EU/mL 및 EU/mg 약물 제품 등가량으로서 보고하였다.
용어:
LAL - 리물러스 아메보사이트 라이세이트
CSE - 대조군 표준 내독소
EU - 미국 약전 내독소 단위
EU/mg - 미국 약전 내독소 단위/밀리그램
EU/mL - 미국 약전 내독소 단위/밀리리터
LRW - LAL 시약 수
리물러스 아메보사이트 라이세이트 탁도측정 (피로텔-T (등록상표)) 용액. 피로텔-T (등록상표) 및 피로졸 (등록상표)의 바이알을 개봉 전 30분 동안 실온으로 가온하였다. 피로텔-T (등록상표)에서 금속 봉인을 제거하고, 마개를 무균적으로 제거하였다. 피로텔-T (등록상표)를 5.0 mL 피로졸 (등록상표) 재구성 완충액으로 재구성하였다. 병을 온화하게 돌려 완전히 용해될 때까지 혼합하였다. 사용 직전에 완충액을 재구성하였다. 재구성된 피로텔-T (등록상표)는 24시간 이하 동안 2-8℃에서 유지할 수 있다. 용기의 상부를 파라필름(Parafilm) (등록상표) 층으로 덮었다.
대조군 표준 내독소 용액. CSE (1.2)의 바이알을 개봉 전 30분 동안 실온으로 가온하였다. 바이알에서 금속 봉인을 제거하고, 마개를 무균적으로 제거하였다. 마개를 공기가 들어갈 정도로만 조심스럽게 들어올려 진공을 해제하였다. 대조군 표준 내독소 (CSE)를 LRW (1.4) 5.0 mL로 재구성하였다. 파라필름 (등록상표)으로 봉인하였다. 실온에서 30-60분에 걸쳐 5-10분 간격으로 1분 동안 격렬히 와동시켰다. 이제, CSE는 사용할 준비가 되었다. 피로텔-T (등록상표)의 구체적인 로트에 대한 바이알 당 대조군 표준 내독소 (CSE) 효능 (USP-EU 단위)을 수득하기 위하여 제조사의 분석 증명서를 참조하였다. 바이알 중 CSE의 USP-EU/mL를 계산하였다. 재구성된 CSE를 30일 동안 2-8℃에서 유지할 수 있다. 각각의 사용 후, 새로운 파라필름 (등록상표)으로 용기를 봉인하였다.
실시예:
LRW 5.0 mL로 재구성된 6,000 USP-EU/바이알의 효능을 갖는 바이알의 경우, 효능은 1,200 USP-EU/mL일 수 있었다.
Figure 112011097388832-pat00222
분석 파라미터를 피로소프트(Pyrosoft)-11 (등록상표) 소프트웨어에 위치시켰다. 일반적인 파라미터. 파라미터를 하기 표에 나타낸 바와 같은 일반적 시험 정보 탭에 위치시켰다.
일반적 시험 정보
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선택사항
Figure 112011097388832-pat00224
튜브 할당 - 실시예
Figure 112011097388832-pat00225
표준 곡선 농도를 제조하였다. 대조군 표준 내독소 (CSE, 2.2) 작업 원액을 4 USP-EU/mL로 제조하였다. CSE의 작업 용액을 4 EU/mL 효능으로 제조하였다. 식 1을 이용하여 희석에 필요한 LRW의 용량을 계산하였다. CSE 용액 (2.2) 20 ㎕를 폴리스티렌 튜브 (1.9)에서 적절한 양 (식 1)의 LRW (1.4)에 첨가하였다. 희석물을 30초 동안 와동시켰다.
예시:
1,200 EU/mL 효능인 CSE 용액의 경우, CSE 용액 20 ㎕를 LRW 5,980 ㎕에 첨가하였다.
Figure 112011097388832-pat00226
CSE 작업 원액을 0.64 EU/mL로 제조하였다. 폴리스티렌 튜브에서 4 USP-EU/mL의 CSE 원액 1.6 mL를 LRW 8.4 mL에 첨가하여 0.64 USP-EU/mL 효능의 CSE 작업 용액을 제조하였다. 30초 동안 와동시켰다.
표준 원액을 제조하였다. 표준 원액을 폴리스티렌 튜브에서 CSE 작업 용액으로부터 0.128, 0.064, 0.032, 0.016, 0.008, 및 0.004 EU/mL로 제조하였다. 희석 후 각 튜브를 30초 동안 와동시켰다. 희석 계획안을 하기 표에 나타내었다.
표준 원액용 희석 계획안
Figure 112011097388832-pat00227
* 반응 튜브에서는 최종 2배 희석이 발생하였다.
샘플 제조. 약물 재료 샘플 제조. 샘플 희석액을 0.25 mg/mL로 제조하였다. 하기 식을 이용하여 희석에 필요한 LRW의 용량을 계산하였다. 샘플 용기의 상부를 조심스럽게 제거하고, 폴리스티렌 튜브에서 샘플 50 ㎕를 적절한 양 (하기 식)의 LRW에 첨가하여 0.25 mg/mL 용액을 만들었다. 샘플을 30초 동안 와동시켰다. 샘플 용기의 상부를 파라필름 (등록상표) 층으로 덮었다.
예시:
농도가 24.7 mg/mL인 샘플의 경우, 샘플 50 ㎕ (0.05 mL)를 물 4.89 mL에 첨가하였다.
식 2:
Figure 112011097388832-pat00228
약물 제품 동결건조 샘플 제조. 비고: 단일 약물 제품 로트는 3개의 별개의 샘플, "처음", "중간", 및 "끝"으로 이루어진다. 제품 확인 (PI) 설명서에 따라 약물 제품의 바이알을 LAL 시약 수로 재구성하였다. 재구성된 샘플을 0.25 mg/mL로 희석하였다. 식 2를 이용하여 희석에 필요한 LRW의 용량을 계산하였다. 샘플 용기의 상부를 조심스럽게 제거하고, 폴리스티렌 튜브에서 샘플 50 ㎕를 적절한 양 (식 2)의 LRW에 첨가하여 0.25 mg/mL 용액을 만들었다. 샘플을 30초 동안 와동시켰다. 샘플 용기의 상부를 파라필름 (등록상표) 층으로 덮었다.
약물 제품의 즉시-사용가능한(Ready-to-Use) 샘플 제조. 샘플을 0.25 mg/mL로 희석하였다. 식 3을 이용하여 희석에 필요한 LRW의 용량을 계산하였다. 샘플 용기의 상부를 조심스럽게 제거하고, 폴리스티렌 튜브에서 샘플 10 ㎕를 적절한 양 (식 3)의 LRW에 첨가하여 0.25 mg/mL 용액을 만들었다. 샘플을 30초 동안 와동시켰다. 샘플 용기의 상부를 파라필름 (등록상표) 층으로 덮었다.
예시:
농도가 125.0 mg/mL인 샘플의 경우, 샘플 10 ㎕ (0.01 mL)를 물 4.99 mL에 첨가하였다.
식 3:
Figure 112011097388832-pat00229
약물 제품의 즉시-사용가능한 플라시보. 플라시보 (125 mg/mL의 공칭 약물 제품 단백질 농도로 존재하는 것처럼)를 0.25 mg/mL로 희석하였다. 이는 1:500 희석과 등가이다. 식 3을 이용하여 희석에 필요한 LRW의 용량을 계산하였다. 샘플 용기의 상부를 조심스럽게 제거하고, 폴리스티렌 튜브에서 샘플 10 ㎕를 적절한 양 (식 3)의 LRW에 첨가하여 0.25 mg/mL 등가 용액을 만들었다.
양성 물 대조군. 0.032 EU/mL 표준 100 ㎕를 반응 튜브에서 LRW 100 ㎕에 첨가하여 표준 곡선으로부터 양성 대조군을 제조하였다.
반응 튜브 셋업 - 실시예
Figure 112011097388832-pat00230
피로텔-T (등록상표) 시약을 첨가하였다. 피로텔-T (등록상표) 용액 50 ㎕를 각 반응 튜브 (음성 대조군, 표준, 샘플, 스파이크 샘플, 및 양성 물 대조군)에 반복 피펫터로 첨가하였다. 각 튜브를 1-2초 동안 와동시키고, 이를 피로스 키네틱스(Pyros Kinetix) 기구에서 할당된 웰 (표 1)에 삽입하였다.
데이타 분석.
분석. 피로소프트 (등록상표)-11 소프트웨어는 모든 표준, 대조군, 및 샘플의 자동분석을 수행할 것이고, 작업 완료시 샘플 결과를 EU/mL로 보고할 것이다. 각 반복 샘플을 2개의 평균 값으로 보고하였다. 한 쌍의 두개의 튜브 중 하나가 피로소프트 (등록상표)-11 소프트웨어로 검출되지 않는다면, 그 튜브를 추가의 데이타 분석에서 배제하여, 결과를 다시 계산할 수 있다. 스파이크 회수 (양성 샘플 대조군)는 샘플 중 내독소의 양 및 샘플로 스파이크된 내독소의 양 (0.016 EU/mL)을 바탕으로 계산될 것이다.
EU/mL 값을 희석된 약물 재료 또는 약물 제품 샘플의 EU/mg 값으로 전환시켰다.
원 데이타를 EU/mL로 수득하고, 단백질의 EU/mg로 보고하였다. EU/mL를 EU/mg으로 전환시키기 위하여, 내독소 값 (EU/mL)을 단백질 농도 (0.125 mg/mL)로 나누었다. 결과를 하나의 유효 숫자로 보고하였다.
예시:
분석에서 0.23 EU/mL를 갖는 샘플의 경우, 보고가능한 EU/mg 값은 2 EU/mg (1.8을 하나의 유효 숫자로 반올림함)일 것이다.
Figure 112011097388832-pat00231
약물 재료 샘플에 대한 결과. 결과를 하나의 유효 숫자로 측정하였다. 분석의 QL는 0.02 EU/mg이었다. 샘플이 0.02 EU/mg 이하인 경우, 보고가능한 결과는 [<QL, (QL=0.02 EU/mg)]이었다. 약물 제품 샘플에 대한 결과. 약물 제품의 각 로트 ("처음", "중간", 및 "끝")에 대한 3개 샘플의 평균 (EU/mg)은 유효 숫자 하나인 약물 제품 샘플에 대한 보고가능한 결과이었다. 로트에 대한 하나 이상의 샘플이 <QL (0.02 EU/mg)인 경우, 평균을 계산하기 위하여 0.02 EU/mg의 값을 사용할 것이다. 평균 보고가능한 결과가 0.02 EU/mg 이하인 경우, 보고가능한 결과는 [<QL, (QL = 0.02 EU/mg)]이었다.
예시:
Figure 112011097388832-pat00232
상기 실시예의 경우, 약물 제품 플라시보는 125 mg/mL의 공칭 약물 제품 농도에서의 0.02 EU/mg와 등가인 3 EU/mL로 보고될 수 있다.
시스템 적합성. 약물 재료 샘플은 폴리스티렌 용기에 2-8℃에서 수용되어야 한다. 샘플에 상이한 용기에 상이한 온도에서 수용되는 경우, 이들은 분석에 사용되지 못할 수 있다. 표준 곡선에 대한 측정 계수 (r2)는 0.99 이상이어야 한다. r2 값이 0.99 미만인 경우, 분석은 유효하지 않으며 반복되어야 한다. 음성 대조군에 대한 평균 측정된 내독소 농도는 0.002 EU/mL 미만이어야 한다. 음성 대조군이 0.002 EU/mL 이상인 경우, 분석은 유효하지 않으며 반복되어야 한다. 스파이크된 샘플 값은 기대값의 50-200％ 범위 내에 속해야 한다. 스파이크된 샘플 값이 기대값의 49％ 이하 또는 201％ 이상인 경우, 분석은 유효하지 않으며 반복되어야 한다. 양성 물 대조군에 대한 평균 측정된 내독소 농도는 표준 곡선에서 동일한 농도의 50-200％ 범위 내에 속해야 한다. 양성 물 대조군 값이 기대값의 49％ 이하 또는 201％ 이상인 경우, 분석은 유효하지 않으며 반복되어야 한다. 샘플에 대한 내독소 값은 내독소 표준 곡선의 범위 (0.002 내지 0.064 USP-EU/mL) 내에 속해야 한다. 샘플이 0.002 EU/mL 미만인 경우, 이는 분석의 QL 아래이고, 단락 5.4에 따라 보고된다. 샘플이 0.064 USP-EU/mL 초과인 경우, 샘플을 분석 범위로 더 희석시켜야 한다.
실시예 49 - CTLA4-Ig에 대한 미생물 한계 시험 (바이오버든)
본 방법은 존재하는 생존가능한 호기성 미생물 수의 평가 및 지정된 미생물 종으로부터의 유리를 위한 시험 절차를 제공한다. 한 실시양태에서, CTLA4-Ig 조성물은 1 CFU/10 mL 이하의 수준으로 바이오버든을 가져야 한다. 시험물의 제조 및 적용에서, 시편의 취급시 무균 조치를 관찰하였다. 용어 "성장"은 생존가능한 미생물의 존재 및 추정되는 증식으로 정의된다. 시험 결과의 정당성은 적용되는 시험 시편이 스스로 시험 조건하에서, 존재할 수 있는 미생물의 성장을 억제하지 않음을 증명하는 것에 크게 의존한다. 상기 증명은, 시험이 시험되는 물질에 존재해야 하는 상기 유기체 종류의 성장을 억제하지 않을 것을 보장하기 위하여, 시험될 물질의 적절히 제조된 시편을 적절한 공격 유기체의 별개의 생존가능한 배양물로 공격하는 것을 포함해야 한다. 시험에 사용되는 임의의 베타-락탐 생성물의 상기 부분은 검증된 절차에 따라 적합한 양의 페니실리나제로 처리해야 한다.
희석 유체 및 배지
1. 배양 배지 및 희석 유체의 제조. 배양 배지 및 희석 유체를 제조할 수 있거나, 또는 제조사 또는 배급사의 지시에 따라 재구성되는 경우, 유사한 성분을 갖고/거나 본원에 제공된 방식으로부터 수득되는 것과 유사한 배지를 제공한다면, 탈수된 배양 배지를 사용할 수 있다. 상기 방식에 의한 배지 제조시, 가용성 고체를 필요하다면 가열을 이용하여 물에 용해시켜 완전한 용액을 수득하고, 사용할 준비가 되었을 때 염산 또는 수산화나트륨 용액을 배지 내 목적하는 pH를 얻기에 충분한 양으로 첨가하였다. 배지는 입증된 멸균 절차를 이용하여 오토클레이브에서 멸균해야 한다. 25℃ ± 2℃에서 멸균 후 pH를 측정하였다.
성장 촉진
a) 각 배지의 2벌의 시험 용기를 100개 미만의 미생물로 접종하고, 하기 상술하는 조건에 따라 인큐베이션함으로써 오토클레이브된 배지의 각 뱃치를 그의 성장 촉진 능력에 대해 시험하였다. 유기체는 ATCC로부터 수령된 그대로의 배양물로부터 5회 이하로 계대배양될 수 있다.
b) 세균의 경우 48-72시간 및 진균의 경우 5일 내에 성장의 증거가 보이는 경우, 시험 배지는 만족스러웠다. 성장 촉진 시험을 물질 시험에 대한 시험 배지의 사용과 동시에 수행할 수 있다. 그러나, 물질 시험은 상기 성장 촉진이 성공적이지 않은 경우 무효라고 여겨진다.
Figure 112011097388832-pat00233
총 호기성 미생물 계수 또는 총 합해진 곰팡이 및 효모 계수를 위한 절차
a) 샘플 제조. 구체적인 방법으로 달리 지시하지 않는 한, 시험을 위한 시편은 하기와 같이 제조하였다. 어떤 시험을 수행하는지에 따라 배지 및 인큐베이션 절차에 대한 추가의 정보에 대해서는 하기 적절한 단락을 참조한다.
i) 벌크 분말 및 원료 물질 - 샘플 10 그램 또는 10 mL를 멸균 포스페이트 완충액 pH 7.2 90 mL 중에 용해 또는 현탁시켰다. 잘 혼합하고, 1.0 mL를 2개의 멸균 페트리 디쉬 각각에 옮겼다.
ii) 캡슐 - 2개의 캡슐 외피 및 그의 내용물을 멸균 포스페이트 완충액 (pH 7.2) 20 mL로 무균적으로 옮겼다. 수조 (대략 45℃)를 약 10분 동안 가온하였다. 현탁액이 균일해질 때까지 격렬히 진탕하고, 1.0 mL를 2개의 멸균 페트리 디쉬 각각에 옮겼다.
iii) 현탁액용 산제 - 라벨 지시사항에 따라 희석제로서 멸균 포스페이트 완충액 pH 7.2를 이용하여 샘플을 재구성하였다. 잘 진탕하고, 1.0 mL를 2개의 멸균 페트리 디쉬 각각에 옮겼다.
iv) 용액/현탁액 - 1.0 mL를 2개의 멸균 페트리 디쉬 각각에 옮겼다.
v) 정제 - 4개의 정제 (경질 정제는 먼저 멸균 막자사발 및 막자로 분쇄해야 함)를 멸균 포스페이트 완충액 pH 7.2 20 mL로 옮겼다. 정제가 완전히 붕해 또는 용해될 때까지 잘 진탕하고, 1.0 mL를 2개의 멸균 페트리 디쉬 각각에 옮겼다.
vi) 캡슐 외피 - 25개 캡슐 외피를 멸균 포스페이트 완충액 (pH 7.2) 100 mL로 옮기고, 용해되도록 간헐적으로 진탕시키면서 수조 (대략 45℃)에서 약 15분 동안 가온하였다. 잘 진탕하고, 1.0 mL를 2개의 멸균 페트리 디쉬 각각에 옮겼다.
vii) 연고 - 멸균 용기에, 로트 전체에서 얻은 3개의 샘플 각각으로부터 대략 5 mL를 모으고 혼합하였다. 상기 모아진 샘플 0.1 mL를 10개 페트리 디쉬 각각으로 옮겼다. 구부러지는 멸균 유리 막대 (하키 막대)의 도움으로 샘플을 배지 표면에 스프레딩하였다. "총 호기성 계수"에 기재된 바와 같이, 각 플레이트에 대해 별개의 멸균 막대를 이용하여 인큐베이션하였다.
b) 막 여과. 주입 평판 절차의 대안으로서, 적합한 입증된 막 여과 시험 절차를 사용할 수 있다. 이는 억제 물질을 함유하는 생성물에 특히 유용할 수 있다.
c) 재시험. 의심스러운 결과를 하기 임의의 절차로 확인하기 위한 목적으로, 최초 샘플 크기를 적절한 희석제 조정과 함께 2회 및 1/2회 (최소) 이용하여 재시험을 수행할 수 있다.
총 호기성 미생물 계수를 위한 시험
1. 시험할 샘플을 기재된 바와 같이 제조하였다. 각 플레이트에, 용융되고 대략 45℃로 냉각된 멸균 TSA 15-20 mL를 첨가하였다. 각 디쉬를 덮고, 디쉬를 온화하게 기울이거나 돌려 샘플을 한천과 혼합시키고 내용물을 실온에서 고체화시켰다. 플레이트를 역전시키고, 30℃-35℃에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다.
2. 인큐베이션 후, 플레이트를 확대 장치, 예컨대 퀘벡 콜로니 카운터(Quebec Colony Counter)를 사용하여 성장에 대해 검사하고, 콜로니의 수를 계수하고, 물질 설명서에 명시된 바와 같이 결과를 단위 기준으로 (정제, 캡슐, mL, 그램 등 당) 계산하고, 물질 설명서에 대한 허용성을 평가하였다.
3. 세균 오염을 그램 염색 및 현미경 형태에 의해 추가로 특성화하였다. 그램-음성 세균 및 그램-양성 코쿠스를 생화학적 시험 (또는 다른 적합한 확인 수단)에 적용시켰다.
비고: 콜로니를 계수할 때, 콜로니 성장을 시험할 물질과 구별하는 것을 용이하게 하기 위하여, 미생물 성장 관찰 증진제로서 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC) 2％ 용액을 사용하는 것이 때때로 권해진다. TTC는 무색의 산화-환원 지표로서, 살아 있는 세포에서 발견되는 환원당에 의해 수소화되는 경우 적색으로 변함으로써 콜로니를 진적색으로 변하게 한다. TTC를 사용하기 위하여, 페트리 플레이트를 2％ 용액 대략 1 mL로 채우고, 플레이트를 30℃-35℃에서 대략 2시간 동안 인큐베이션하였다. 미생물 콜로니는 플레이트에 존재하는 다른 물질로부터 확연하게 드러날 것이므로, 보다 쉽게 계수할 수 있다.
C. 총 합한 곰팡이 및 효모 계수를 위한 시험. 1. 시험할 샘플을 기재된 바와 같이 제조하였다. 각 플레이트에, 용융되고 대략 45℃로 냉각된 멸균 TSA 15-20 mL를 첨가하였다. 각 디쉬를 덮고, 디쉬를 온화하게 기울이거나 돌려 샘플을 한천과 혼합시키고 내용물을 실온에서 고체화시켰다. 플레이트를 역전시키고, 20℃-25℃에서 5 내지 7일 동안 인큐베이션하였다. [비고: 플레이트 내 곰팡이의 분산으로 실제 존재하는 것보다 더 높은 계수가 수득될 수 있으므로, 인큐베이션 동안 플레이트를 교란시키지 말 것.]
2. 인큐베이션 후, 플레이트를 확대 장치, 예컨대 퀘벡 콜로니 카운터를 사용하여 성장에 대해 검사하고, 콜로니의 수를 계수하고, 물질 설명서에 명시된 바와 같이 결과를 단위 기준으로 (정제, 캡슐, mL, 그램 등 당) 계산하고, 물질 설명서에 대한 허용성을 평가하였다.
3. 진균 오염을 그램 염색 및 현미경 형태에 의해 추가로 특성화하였다. 적절한 경우, 효모를 생화학적 시험 (또는 다른 적합한 확인 수단)에 적용시켰다.
반대되는 유기체의 부재를 시험하기 위한 절차
a) 샘플 제조 - 구체적인 방법으로 달리 지시되지 않는 한, 총 호기성 및 총 합한 곰팡이 및 효모에 대한 샘플 제조 단락에서 상기 기재한 바와 같이, 시험을 위한 샘플을 제조하였다. 어떤 시험을 수행하는지에 따라 추가의 정보에 대해서는 하기 적절한 단락을 참조한다.
b) 막 여과 - 예비농축(preenrichment) 절차의 대안으로서, 적합한 입증된 막 여과 시험 절차를 사용할 수 있다. 이는 억제 물질을 함유하는 생성물에 특히 유용할 수 있다.
c) 재시험 - 의심스러운 결과를 하기 임의의 절차로 확인하기 위한 목적으로, 최초 샘플 크기를 적절한 희석제 조정과 함께 2회 및 1/2회 (최소) 이용하여 재시험을 수행할 수 있다.
B. 스타필로코쿠스 아우레우스 및 슈도모나스 아에루기노사의 부재에 대한 시험. 샘플에 TSB를 첨가하여 100 mL를 만들고, 혼합하고, 30℃-35℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 성장에 대해 검사하고, 존재하는 경우 접종 루프를 이용하여, 일부를 선별 배지에 스트리킹하고, 인큐베이션하고, 하기 나열된 특징에 대해 검사하였다 (개별 반응 시험을 시판 확인 키트로 대체할 수 있음):
Figure 112011097388832-pat00234
* 대표적인 감수성 콜로니를 선별 한천에서 0.5 mL 포유동물 (바람직하게는 토끼 또는 말) 혈장을 함유하는 개별 튜브로 옮기고, 37℃에서 인큐베이션하고, 3 내지 4시간에서, 그리고 그 후 응집을 위한 24시간 이하의 적합한 간격으로 검사하였다.
Figure 112011097388832-pat00235
* 안료 시험의 경우, 대표적인 민감성 콜로니를 센트리미드 한천에서 PSF 및 PSP 디쉬로 스트리킹하였다. 덮고 35℃±2℃에서 최소 3일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 UV 광 아래에서 검사하였다.
** 옥시다제 시험의 경우, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드로 함침된 스트립 또는 디쉬로 옮김으로써 임의의 감수성 콜로니를 확인하였다. 분홍색이 자주색으로 변하는 발전이 없는 경우, 샘플은 슈도모나스 아에루기노사의 부재에 대한 요건을 만족시킨다. 허용되는 방식으로 수행한다고 입증되어 있는 시판 시험 키트도 또한 사용할 수 있음을 주지한다.
성장이 관찰되지 않거나, 발견된 콜로니 중 어느 것도 상기 표에 나열된 셋트의 특징과 부합되지 않는다면, 샘플은 상기 유기체의 부재에 대한 시험 요건을 만족하는 것이다.
살모넬라 종 및 에쉐리키아 콜라이의 부재에 대한 시험
샘플을 유체 락토스 배지 총 100 mL를 함유하는 멸균 용기에 옮기고, 30℃-35℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하였다. 온화하게 진탕시키고, 성장에 대해 검사하였다. (개별 반응 시험을 시판 확인 키트로 대체할 수 있음) a) 살모넬라 - 성장이 유체 락토스 배지에 존재하는 경우:
1. 1.0 mL 부분을 유체 셀레니트-시스틴 배지 및 유체 테트라티오네이트 배지의 10 mL 튜브에 옮기고, 혼합하고, 30℃-35℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하였다.
2. 접종 루프를 이용하여, 일부를 두 배지 모두에서 브릴리안트 그린 한천 배지, 크실로스-리신-데스옥시콜레이트 한천 배지, 및 비스무스 술피트 한천 배지로 스트리킹하였다. 덮고, 역전시키고, 30℃-35℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하고, 하기 나열된 형태학적 특징에 대해 검사하였다:
Figure 112011097388832-pat00236
3. 먼저 경사 표면을 스트리킹한 후, 와이어를 표면 아래로 잘 찌름으로써 감수성 콜로니를 트리플-당-철-한천 배지의 고층(butt) 경사 튜브에 옮김으로써 추가의 확인을 수행할 수 있다. 30℃-35℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하고, 검사하였다. 어떠한 튜브도 알칼리성 (적색) 경사 및 산성 (황색) 고층 (동시적인 고층의 흑색화가 있거나 없음)의 증거를 나타내지 않는다면, 샘플은 살모넬라 속의 부재에 대한 시험 요건을 만족시킨다.
b) 에쉐리키아 콜라이 - 성장이 유체 락토스 배지에 존재하지 않는다면: 1. 접종 루프를 이용하여, 일부를 맥콘키(MacConkey) 한천 배지로 스트리킹하였다. 덮고, 역전시키고, 30℃-35℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하였다.
2. 생성된 콜로니가 벽돌색-적색 외관을 나타내지 않고 (침전된 담즙의 가능한 주위 구역이 있음), 그램 음성 간균 (코코-바실루스)이라면, 샘플은 에쉐리키아 콜라이의 부재에 대한 시험 요건을 만족시킨다.
3. 콜로니가 상기 기재와 일치한다면, 이들을 레빈-에오신-메틸렌 블루 한천 배지로 옮겼다. 디쉬를 닫고, 역전시키고, 30℃-35℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션하였다. 콜로니 중 어느 것도 반사광 아래에서의 특징적인 금속성 광택 및 투과광 아래에서의 청흑색 외관 모두를 나타내지 않는다면, 샘플은 에쉐리키아 콜라이의 부재에 대한 시험 요건을 만족시킨다.
배지 형식
1. 포스페이트 완충액 pH 7.2
a) 원액: 제일인산칼륨 34.0 g; 물 (증류수 또는 탈이온수) 1000 mL; 수산화나트륨 TS 175 mL. 제일인산칼륨 34 그램을 1000 mL 용량측정 플라스크에 함유된 물 약 500 mL에 용해시켰다. 수산화나트륨 TS (약 175 mL)를 첨가하여 pH 7.1-7.3으로 조정하고, 물을 용량까지 첨가하고, 혼합하였다. 멸균하고, 사용할 때까지 냉장하에 (2℃-8℃) 저장하였다.
b) 작업 용액. 사용하기 위해, 원액을 1 내지 800의 비율로 물로 희석하고, 멸균하였다.
2. TSA (트립티카제 소이 한천/대두-카세인 분해 한천). 카세인의 췌장 분해물 15.0 g; 대두 가루의 파파익(Papaic) 분해물 5.0 g; 염화나트륨 5.0 g; 한천 15.0 g; 물 1000 mL; 멸균 후 pH: 7.3 ± 0.2.
3. TSB (트립티카제 소이 브로쓰/대두-카세인 분해 한천). 카세인의 췌장 분해물 17.0 g; 대두 가루의 파파익 분해물 5.0 g; 염화나트륨 5.0 g; 제이인산칼륨 2.5 g; 덱스트로스 2.5 g; 물 1000 mL; 멸균 후 pH: 7.3 ± 0.2;
4. SDA (사브로 덱스트로스 한천); 덱스트로스 40 g; 동물 조직의 펩신 분해물 및 카세인의 췌장 분해물의 동일 부 혼합물 10.0 g; 한천 15.0 g; 물 1000 mL; 혼합하고, 끓여 용액을 만듬; 멸균 후 pH: 5.6 ± 0.2.
5. FLM (유체 락토스 배지). 소 추출물 3.0 g; 젤라틴의 췌장 분해물 5.0 g; 락토스 5.0 g; 물 1000 mL; 멸균 후 가능한 한 빨리 냉각시켰다. 멸균 후 pH: 7.1 ± 0.2.
실시예 50 - CTLA4-Ig의 등전 집중 겔 분석
본 실시예의 목적은 CTLA4-Ig의 등전점, 이소형의 수, 및 미세이질성을 측정하는 것이다.
물질
IEF 보정(calibration) 키트 (pH 3 내지 10), (아머샴 파마시아, 카탈로그 번호 17-0471-01) 또는 (pH 2.5 내지 6.5), (아머샴 파마시아, 카탈로그 번호 17-0472-01).
암폴린(Ampholine) PAG플레이트 겔: pH 4.0 내지 6.5, (아머샴 파마시아, 카탈로그 번호 80-1124-81).
IEF 샘플 적용기, (아머샴 파마시아, 카탈로그 번호 80-1129-46).
IEF 전극 스트립, (아머샴 파마시아, 카탈로그 번호 80-1104-40).
인산 (85％), (EMD, 카탈로그 번호 PX0995-6).
장치
멀티포어(Multiphor) II 전기영동 시스템, (GE 헬스케어, 카탈로그 번호 18-1018-06).
시약 제조
음극 완충액 용액 (0.5 M 인산 중의 0.1 M 글루탐산) (여기에 침지된 심지는 석판의 (+)쪽에 위치함).
실시예:
3.4 mL 85％ 인산.
1.47 g ±0.02 g 글루탐산.
HPLC 등급수.
상기 시약들을 100 mL 눈금 실린더에서 합하고, HPLC 등급수로 100 mL로 하고, 뚜껑을 덮고 수회 역전시켜 혼합하였다.
용액을 2-8℃에서 6개월 이하 동안 저장하였다.
양극 완충액 용액 (0.1 M β-알라닌) (여기에 침지된 심지는 석판의 (-)쪽에 위치함).
실시예:
0.9 g ±0.02 g β- 알라닌.
HPLC 등급수.
상기 시약들을 100 mL 눈금 실린더에서 합하고, HPLC 등급수로 100 mL로 하고, 뚜껑을 덮고 수회 역전시켜 혼합하였다.
용액을 2-8℃에서 6개월 이하 동안 저장하였다.
고정 용액 (12％ 트리클로로아세트산 중의 3.5％ 5-술포살리실산).
실시예:
240 g ± 5.0 g 트리클로로아세트산.
70 g ± 2.0 g 5-술포살리실산.
2000 mL HPLC 수.
상기 시약들을 합쳐 2000 mL 용량으로 만들었다.
용액을 실온에서 3개월 이하 동안 저장하였다.
염색 용액:
겔코드(GelCode) 블루 시약 용액을 사용 직전에 병을 수회 온화하게 역전시키거나 돌림으로써 혼합하였다.
비고: 균질한 시약 샘플을 사용한다는 것을 보장하도록, 붓거나 분배하기 전에 염색 시약을 혼합하는 것이 중요하다.
염색 대조군 제조:
탄산 탈수효소 II를 HPLC 등급수로 재구성하여 1.0 mg/mL 원액을 만들었다.
원액 10 ㎕를 HPLC 등급수 90 ㎕와 합하여 0.10 ㎍/㎕ 작업 용액을 얻었다.
0.10 ㎍/㎕ 용액 10 ㎕을 겔에 로딩하였다 (1.0 ㎍ 로드).
절차
샘플 희석
HPLC 수 중 샘플 및 참고 물질의 20 ㎍/10 ㎕ 용액을 제조하였다.
Figure 112011097388832-pat00237
예시:
Figure 112011097388832-pat00238
기구 및 겔 제조
멀티포어 II 전기영동 단위의 냉각 플레이트를 항온 순환기에 연결하고, 온도를 10 ± 2℃에 설정하였다.
비고: 순환기 20분 이상 동안 상기 온도에 도달시켰다.
겔을 냉장고에서 꺼냈다. 겔/겔 지지체를 확실히 절단시키지 않으면서 봉투의 측면을 따라 조심스럽게 절단하였다.
냉각 플랫폼의 한 쪽 끝에 대략 1.0 mL HPLC 등급수를 첨가하였다.
모세관 작용이 겔의 전체 끝을 거슬러 물을 보유하도록 겔/겔 지지체의 한 쪽 끝을 물에 넣었다. 확실히 공기 버블이 갇히지 않도록 하여, 느리게, 냉각 플랫폼을 따라 겔을 적용시켰다. 필요하다면, 추가의 HPLC 등급수를 적용시킬 수 있다.
겔 표면에서 투명 필름을 제거하였다.
한 전극을 음극 완충액 용액에 침지시키고, 냉각 플랫폼의 (+) 표지에 가장 가까운 겔의 끝에 위치시켰다.
한 전극을 양극 완충액 용액에 침지시키고, 냉각 플랫폼의 (-) 표지에 가장 가까운 겔의 다른 쪽에 위치시켰다.
전극 스트립을 적용시킨 후, 스트립이 겔 지지체가 아니라 겔의 끝에서 끝나도록, 새로운 면도날을 사용하여 여분을 조심스럽게 절단하였다.
샘플 적용 조각과 겔 사이에 양호한 접촉이 확실히 존재하도록 하면서, 샘플 적용 조각을 냉각 플랫폼의 (-) 표지에 가장 가까운 쪽에 적용시켰다. 비고: IEF 샘플 적용기가 양극 완충액 침지된 스트립을 건드리지 않고, 양극 완충액의 심지를 돋우지 않고, 각 샘플이 별도로 진행되는 것을 보장하도록 충분히 분리되어 있음을 확인한다. 샘플 적용기는 석판 겔에 단단히 위치해야 한다.
멀티포어 II 단위의 전극 홀더를 위치시키고, 겔 상의 전극 스트립의 중심을 따라 전극을 정렬시켰다. 두 전극을 전극 홀더에서 기준 단위까지 연결하고, 안전 뚜껑을 제 자리에 위치시켰다. 접착 테이프를 사용하여, 안전 뚜껑의 구멍을 덮어 겔이 건조되지 않게 하였다. 전극을 전력 공급원에 연결시켰다.
전압이 300 V 이상에 도달할 때까지, 겔을 하기 설정으로 설정된 전력 공급원에 예비집중시켰다.
[표 1]
Figure 112011097388832-pat00239
겔 로딩
겔을 예비집중시킨 후, 전력 공급원을 끄고, 안전 뚜껑을 제거하고, 전극을 분리시키고, 전극 홀더를 멀티포어 II 단위에서 제거하였다.
샘플을 샘플 적용기 상에 특정 순서로 로딩하였다. 이 절차를 위해, 확실히 (-) 양극 완충액 스트립 측이 분석물에 가장 가깝도록 하였다.
샘플을 우측에서 좌측으로 로딩하였다. 먼저 IEF 보정 표준 (레인 1 & 2)을 2개 이상, 참고 물질 (레인 3)을 1개, 시험 샘플 #1 (레인 4)을 1개, 염색 대조군 제제 (레인 5)를 1개, 시험 샘플 #2 (레인 6)을 1개, 참고 물질 (레인 7)을 1개 및 IEF 보정 표준 (레인 8)을 1개 적용하였다.
참고 물질 (레인 9)의 1개 적용, 시험 샘플 #3 (레인 10)의 1개 적용, 염색 대조군 제제 (레인 11)의 1개 적용, 시험 샘플 #4 (레인 12)의 1개 적용, 참고 물질 (레인 13)의 1개 적용 및 IEF 보정 표준 (레인 14)의 1개 적용을 적용시킴으로써 제3 및 제4 샘플을 첨가하였다. 레인 15 내지 20을 이용하여 제5 및 제6 샘플을 동일한 패턴을 반복함으로써 샘플 3 및 4로서 적용하였다. 샘플 로딩 패턴은 표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2]
Figure 112011097388832-pat00240
전기영동. 겔을 로딩할 때, 멀티포어 II 단위의 전극 홀더를 위치시키고, 겔 상의 전극 스트립의 중심을 따라 전극을 정렬시켰다. 두 전극을 전극 홀더에서 기준 단위까지 연결하고, 안전 뚜껑을 제 자리에 위치시켰다. 접착 테이프를 사용하여, 안전 뚜껑의 구멍을 덮어 겔이 건조되지 않게 하였다. 전극을 전력 공급원에 연결시켰다. 적절한 전압, 전류 및 전압 설정을 설정하고 작동을 시작하였다.
[표 3]
Figure 112011097388832-pat00241
겔을 작동시킨 후, 전력 공급원을 끄고, 안전 뚜껑을 제거하고, 전극을 분리시키고, 전극 홀더를 멀티포어 II 단위에서 제거하였다.
전극 스트립 및 샘플 적용기를 겔로부터 조심스럽게 제거하였다.
비고: 석판 겔을 고정 용액에 직접 위치시키고, 전극 스트립 및 적용 조각을 겔에 띄울 수 있다.
겔/겔 지지체를 냉각 플레이트에서 제거하고, 겔을 젖은 상태로 유지시키기에 충분한 용량의 고정 용액 (단계 3.3)을 함유하는 편평 접시에 위치시켰다. 플라스틱 랩으로 덮고, 궤도 플랫폼을 장착시키고, 20 - 60분 동안 인큐베이션하였다. 시작 및 중지 시간을 IEF 워크시트에 기록하였다.
비고: 너무 오래 동안 고정 상태로 둔 IEF 겔은 때때로 층이 갈라진다. 이는 고정 시간을 대략 1시간으로 제한함으로써 피한다.
4.5 겔 염색.
고정 후, 겔을 젖은 상태로 유지시키기에 충분한 용량의 HPLC 등급수로 겔을 3 x 5분 세정하였다. 시작 및 중지 시간을 IEF 워크시트에 기록하였다.
사용 전 겔코드 블루 염색 시약 용액을 혼합한 후 (단계 3.4), 겔을 젖은 상태로 유지시키기에 충분한 용량의 염색제에 겔을 위치시켰다. 15-24시간 동안 단단히 밀봉된 용기에서 인큐베이션하여 시약 증발을 막았다. 시작 및 중지 시간을 IEF 워크시트에 기록하였다.
염색 용액을 HPLC 등급수로 대체함으로써 염색된 겔을 탈염색시켰다. 1-2시간의 기간에 걸쳐 겔을 3회 이상의 물 교체로 세정하였다. 시작 및 중지 시간을 IEF 워크시트에 기록하였다. 탈염색 후, 겔은 스캐닝할 준비가 되었다.
비고: IEF 겔상의 배경 염색을 감소시키기 위하여 추가의 세척이 요구될 수 있다.
시스템 적합성
등전 집중 표준은 배경으로부터 쉽게 구별되어야 한다. 4.0 내지 6.5의 pI 값으로 이동하는 단백질 표준은 겔 상에서 시각화가 가능하다. pI가 상기 범위 밖인 단백질 표준은 겔 상에서 시각화되지 않는다. 3.50, 4.55, 5.20, 및 5.85에서 pI 마커를 확인하고, 겔 영상에 표지하였다.
[표 4]
Figure 112011097388832-pat00242
낮은 수준의 단백질 로딩 (1.0 ㎍)에서의 탄산 탈수효소 II 표준 (pI 5.4)의 염색 대조군을 겔 염색 일관성의 가시화를 위해 사용하였다. 상기 밴드는 스캐닝된 겔 영상의 시각적 검사에 의해 배경으로부터 쉽게 구별되어야 한다.
CTLA4-Ig 참고 물질은 4.3 내지 5.6의 pI 범위 내에 10-22개 밴드로 열거되어야 한다.
CTLA4-Ig 참고 물질의 가장 두드러진 밴드의 누적 백분율 세기는 4.3 내지 5.3의 pI 범위 내에 90％ 이상이어야 한다.
참고 물질의 경우, 시각적 검사로, pI 마커 4.5 - 5.2 사이에 집중된 3개의 주요 밴드가 존재함을 확인한다 (주요 밴드 패턴에 대해서는 도면 참조).
겔 스캐닝 및 분석
전기영동 및 염색 후, 모든 겔을 농도계를 이용하여 스캐닝하였다. 영상 파일을 컴퓨터 로컬 하드 드라이브/네트워크에 저장하고, 로컬 면적 네트워크를 통해 수록하였다. 이미지퀀트 TL 소프트웨어 (V2003.03)를 이용하여 스캐닝된 겔 영상의 분석을 수행하였다. 스캐닝 및 분석 파라미터를 표 5에 나열하였다. 스캔을 실시하고, 부분별 절차를 이용하여 정량하였다.
[표 5]
Figure 112011097388832-pat00243
비고: 상기 절차는 겔 영상 분석을 위한 기본 단계를 제공한다. 표에서의 스캔 파라미터를 정의한다. 표에서의 밴드 검출 파라미터는 제안된 최초 설정이다. 겔의 물리적 특성 변화 (예컨대 염색/탈염색 후 겔 수축) 및 겔 밴드 형상 및 이동의 변화 때문에 밴드를 정확하게 확인하기 위하여 밴드 검출 파라미터의 조정이 필수적일 수 있다. 임의의 미확인 또는 오확인 밴드를 수동적으로 교정하였다.
표에 정의된 스캔 파라미터를 이용하여 겔을 스캔하였다. 겔의 모든 분석 및 평가는 스캐닝된 영상으로부터 행하였다. 이미지퀀트TL에서 <ID 겔 분석>으로부터 겔 영상 파일 (스캐닝된 원 데이타)을 열었다. 툴바 상의 <콘트라스트>로 가서, 밴드가 명확히 시각화될 때까지 <이미지 히스토그램> 파라미터를 낮추었다. <레인 생성>을 선택하고, <매뉴얼>을 선택하여 <레인의 수>가 분석되도록 설정하였다. <레인 ％ 폭>을 100％ 이하로 조정하여 겔 레인을 커버하였다. 필요하다면 단일 레인을 적절히 정렬하였다. <롤링 볼> 방법을 사용하여 배경을 뺐다. 표 3에 나열된 최초 <최소 기울기>, <소음 감소>, <％ 최대 피크> 설정을 이용하여 밴드를 검출하였다. 밴드를 정확히 확인하기 위해서는 상기 값들의 조정이 필수적이다. pH/pI 4.0-6.5 겔에 대해 시스템 적합성 단락에 나열된 표지된 마커로부터의 표준 pI 마커를 이용하여 밴드 pI 값을 산정하였다. 보정 및 정규화 단계는 건너 뛰었다. 4.3 내지 5.6 pI 범위 내의 밴드의 수를 세었다. 추가 문서화 및 보고를 위해, 결과를 엑셀 시트로 옮겼다. 참고 물질에 대한 샘플의 누적 백분율 세기의 계산. 비고: 샘플에 대한 누적 백분율 세기는 레인에 존재하는 모든 밴드의 100％와 비교할 때의, 4.3-5.3의 pI 범위 내에 있는 밴드의 백분율이다. 하기 식을 참고 물질에 대한 샘플의 누적 백분율 세기의 계산에 사용해야 한다:
Figure 112011097388832-pat00244
비고: 겔 로딩 패턴과 관련하여, 샘플 옆의 참고 물질을 계산에 사용해야 한다. 참고 물질이 100％의 누적 값을 갖고, 샘플이 95％ 값을 갖는 경우, 샘플 상대적 백분율은 95/100*100 = 95％이다. 참고 물질이 95％의 누적 값을 갖고, 샘플이 100％ 값을 갖는 경우, 샘플 상대적 백분율은 100/95*100 = 105％이다.
결과 보고
4.3 - 5.6의 pI 범위 내에서 센 밴드의 수를 보고하였다. 4.3 - 5.6의 pI 범위 내의 CTLA4-Ig 참고 물질 세기에 대한 누적 백분율 세기를 보고하였다 (상기 방법에서 정의된 정량적 IEF 겔 분석에 대한 보고서 예에 대해서는 도면을 참조). 참고 물질 (주요 밴드 패턴에 대해서는 도 1 참조)에 대해 pI 마커 4.5 - 5.2 사이에 집중된 3개의 주요 밴드가 존재한다는 것을 시각적 검사로 확인하고, pI 마커 4.5 - 5.2 내에서 관찰되는 주요 밴드의 수를 보고하였다. 참고 물질에 대해 pI 마커 4.5 - 5.2 사이에 신규 유의한 밴드가 존재하지 않는다는 것을 시각적 검사로 확인하였다.
특정 실시양태에서, 상기 방법의 결과는 4.3 - 5.6, 또는 4.3 - 5.3의 pI 범위에서의 밴드를 나타낼 것이며, 여기에서 10 내지 22개의 밴드 및 90 - 110％의 누적 밴드 강도가 확인된다. 다른 실시양태에서, pI 범위는 3개의 주요 밴드를 갖는 4.5 - 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, pI 범위는 10 내기 22개 밴드를 갖는 4.3 - 5.6이다. 또 다른 실시양태에서, pI 범위는 95 - 105％의 누적 밴드 강도를 갖는 4.3 - 5.3이다. 또 다른 실시양태에서, pI 범위는 2개의 두드러진 밴드를 갖는 4.5 - 5.2이다.
실시예 51: CTLA4-Ig의 SDS-PAGE
본 실시예는 SDS-PAGE에 의한 환원 및 비환원 조건 모두 하에서의 CTLA4-Ig의 검사를 보여준다.
물질
Tris-글리신 (Tris-Gly) SDS 샘플 완충액 2X (인비트로젠, 카탈로그 번호 LC2676).
NuPAGE 샘플 환원제 10X (인비트로젠, 카탈로그 번호 NP0004).
4-20％ Tris-글리신 겔 - 1.0 mm x 12 웰 (인비트로젠, 카탈로그 번호 EC60252BOX).
Tris-글리신 SDS 유동 완충액 10X (인비트로젠, 카탈로그 번호 LC2675).
마크 12™ 광범위 비염색된 표준 (인비트로젠, 카탈로그 번호 LC5677).
겔코드 블루 염색 시약 (쿠마시 블루), (피어스, 카탈로그 번호 24590: 500 mL 카탈로그 번호 24592: 3.5 L).
실버스냅(SilverSnap) (등록상표) 염색 키트 II (은 염색) (피어스, 카탈로그 번호 24612).
기구사용:
Xcell 슈어록 미니(SureLock Mini) 세포 (인비트로젠, 카탈로그 번호 EI0001).
전기영동을 위한 전력 공급원 (OWL 분리 시스템, 카탈로그 번호 OSP-300).
시약:
쿠마시 블루 염색용 고정 용액 (HPLC 등급수 중의 50％ 메탄올 및 7％ 아세트산).
실시예:
교반 막대를 함유하는 적절한 크기의 눈금 용기에,
메탄올 500 mL를 첨가하였다.
아세트산 70 mL를 첨가하였다.
HPLC 등급수로 용량을 1000 mL로 조정하였다.
실온에서 6개월 이하 동안 저장하였다.
쿠마시 블루 염색 (겔코드 블루).
용기로부터 바로 사용하였다. 겔을 덮기에 충분한 양 (작은 트레이에서 하나의 미니 겔 (10 x 10 cm)에 대해 대략 50 mL)을 첨가하였다.
2-8℃에서 1년 이하 동안 저장하였다.
은 염색 고정 용액 (HPLC 등급수 중의 30％ 에탄올 및 10％ 아세트산).
교반 막대를 함유하는 적절한 크기의 눈금 용기에, 에탄올 300 mL를 첨가하였다. 아세트산 100 mL를 첨가하였다. HPLC 등급수로 용량을 1000 mL로 조정하였다. 용액을 혼합하고, 실온에서 6개월 이하 동안 저장하였다. 겔 세척 용액 (10％ 에탄올).
50 mL 원심분리 튜브에 인핸서 (은 염색 키트) 1.0 mL를 첨가하였다. 은 염색 (은 염색 키트) 50 mL를 첨가하였다. 튜브 뚜껑을 닫고, 3 내지 5초 동안 온화하게 와동시켜 혼합하였다. 현상제 작업 용액. 사용 직전 제조하였다.
50 mL 원심분리 튜브에 인핸서 (은 염색 키트) 1 mL를 첨가하였다. 현상제 (은 염색 키트) 50 mL를 첨가하였다. 튜브 뚜껑을 닫고, 3 내지 5초 동안 온화하게 와동시켜 혼합하였다. 1X Tris-글리신 SDS 유동 완충액. 사용일에 제조하였다. 눈금 실린더에, 900 mL HPLC 등급수를 첨가하였다. 100 mL Tris-글리신-SDS 10X 유동 완충액을 첨가하였다. 상기 시약을 합하고, 파라필름 (등록상표)으로 덮고, 수 회 역전시켜 혼합하였다.
염색 대조군. HPLC 등급수 1 mL를 트립신 억제제 (염색 대조군) 2 mg을 함유하는 바이알에 첨가하였다. 이로써 -20℃에서 6개월 동안 안정한 2 ㎍/㎕ 원액을 수득할 것이다. 수많은 동결 해동 주기로 인한 분해를 막기 위하여, 50 ㎕ 분취액을 작은 튜브로 옮기고, -20℃에서 저장하였다. 원액 25 ㎕를 HPLC 등급수 75 ㎕에 첨가하여 0.5 ㎍/㎕ 용액을 수득하였다. 0.5 ㎍/㎕ 용액 40 ㎕를 HPLC 등급수 160 ㎕에 첨가하여 농도 0.1 ㎍/㎕를 만들었다. 0.1 ㎍/㎕ 용액 10 ㎕, 2X TrisGly 샘플 완충액 50 ㎕, 및 HPLC 등급수 40 ㎕를 미량원심분리 튜브에 첨가하였다. 트립신 억제제 염색 대조군의 최종 농도는 0.01 ㎍/㎕이었다. 방출에 대해 분석되고 쿠마시 블루로 염색된 샘플을 10 ㎕ 당 10 mg의 농도로 로딩하였다.
쿠마시 블루 겔의 경우, 참고 물질 및 샘플을 HPLC 등급수 중에 10 ㎍/㎕의 농도로 희석하였다. 실시예: 50 ㎍/㎕ 참고 물질 샘플 용액 80 ㎕ + HPLC 등급수 320 ㎕를 첨가하였다. 비환원 샘플의 경우, 10 ㎍/㎕ 용액 농도 10 ㎕를 2X Tris-Gly 샘플 완충액 50 ㎕ 및 HPLC 등급수 40 ㎕로 미량원심분리 튜브로 첨가하였다. 환원 샘플의 경우, 10 ㎍/㎕ 용액 10 ㎕를 2X TrisGly 샘플 완충액 50 ㎕, HPLC 등급수 30 ㎕ 및 10X 환원제 10 ㎕에 첨가하였다. 은 염색된 겔의 경우, 10 ㎍/㎕ 용액을 HPLC 등급수 중에서 1 ㎍/㎕로 추가 희석하였다. 실시예: 10 ㎍/㎕ 용액 40 ㎕ + 360 ㎕ HPLC 등급수를 첨가하였다. 비환원 샘플의 경우, 1 ㎍/㎕ 용액 10 ㎕를 미량원심분리 튜브에서 2X TrisGly 샘플 완충액 50 ㎕ 및 HPLC 등급수 40 ㎕에 첨가하였다. 환원 샘플의 경우, 1 ㎍/㎕ 용액 10 ㎕, 2X TrisGly 샘플 50 ㎕, HPLC 등급수 30 ㎕ 및 10X 환원제 10 ㎕를 미량원심분리 튜브에 첨가하였다. 블랭크의 경우, 2X TrisGly 샘플 완충액 50 ㎕ 및 HPLC 등급수 50 ㎕를 미량원심분리 튜브에서 합하였다.
[표 6]
Figure 112011097388832-pat00245
겔(들)을 포장에서 벗기고, 외부를 HPLC 등급수로 세정하여 폴리아크릴아미드 조각을 제거하였다. 조심스럽게 웰 콤(well comb)을 제거하고, 필요하다면 확실히 웰을 겔 로딩 팁과 일직선이도록 하였다. 웰을 HPLC 등급수로 채우고, 물이 웰에서 제거되도록 가볍게 쳤다. 웰 세정을 2회 더 반복하였다. 5.2 짧은 플레이트 면이 내부 챔버를 마주하도록 겔을 XCell 기구로 삽입하였다. 단 하나의 겔을 사용하는 경우, 플렉시유리 플레이트를 반대 쪽에 삽입하였다. 내부 및 외부 챔버를 형성하면서 겔(들)을 단단히 고정시켰다. 내부 챔버를 1X Tris-글리신 SDS 유동 완충액으로 채웠다. 누출에 대해 확인한 후, 외부 챔버를 1X Tris-글리신 SDS 유동 완충액으로 채웠다. 모든 겔은 하나 이상의 블랭크 레인 및 하나의 분자량 마커 레인을 함유해야 한다. 쿠마시 블루 염색된 겔에 대해서만 염색 대조군을 첨가하였다. 겔 로딩 팁을 사용하였다. 환원 샘플과 비환원 샘플 사이에 하나 이상의 "블랭크"를 로딩하였다. 분자량 마커를 환원 샘플로서 취급하였다. 이는 환원제의 탈색으로 인한 비환원 샘플의 환원을 막는 데 도움을 줄 것이다. Xcell 기구의 상부를 부착시키고, 전극을 전력 공급원에 연결시켰다. 전류를 겔 당 25 mAmp로 조정하고, 전압 (v) 및 전력 (w)을 최대로 설정하였다. 2개의 겔을 작동시키는 경우, 전류를 50 mAmp로 설정하였다. 1개의 기구에서 2개의 겔을 또는 동일한 전력 공급원에서 여러개의 Xcell 기구를 작동시키는 경우, 전류를 조정하였다. 60 ± 5분 동안 또는 완충액 전방이 이용가능한 이동 거리의 80％ 이상 이동했을 때까지 전기영동시켰다. 시작 시간 및 중지 시간을 워크시트에 기록하였다. 겔 나이프로 들어올림으로써 겔을 보유하고 있는 2개의 플라스틱 플레이트를 조심스럽게 분리시켰다. 겔의 분리 후, 염색 절차를 수행하였다.
쿠마시 블루 염색 - 겔을 쿠마시 블루 고정 용액 (50％ 메탄올 및 7％ 아세트산) 50 mL 중에 15분 동안 놓았다. 겔을 HPLC 등급수 약 100 mL로 5분 동안 3회 총 15분 동안 세정하였다. 쿠마시 블루 염색을 겔(들)에 직접 첨가하고, 15 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 쿠마시 블루 염색 시약을 HPLC 등급수 100 mL로 대체함으로써 염색된 겔을 탈염색시켰다. 탈염색 1시간 후, 겔은 스캐닝할 준비가 되었다.
겔 스캐닝 및 분석. 전기영동 및 염색 후, 농도계를 이용하여 겔을 스캐닝하였다. 영상 파일을 컴퓨터 로컬 하드 드라이브 및/또는 네트워크에 저장하고, 로컬 면적 네트워크를 통해 수록하였다. 이미지퀀트 TL 소프트웨어 (v2003.03)를 이용하여 스캐닝된 겔 영상의 분석을 수행하였다. 스캔을 실시하고, 부분별 절차를 이용하여 정량하였다.
[표 4]
Figure 112011097388832-pat00246
시각적 검사에 의해, 환원된 CTLA4-Ig의 주요 밴드는 55,400 Da 분자량 마커 (글루탐산 탈수소효소)에 근접한 위치로 이동하는 넓은 밴드로서 나타나야 한다.
실시예 52 - 효소-연결된 면역흡착 분석법에 의한 CTLA4 A29YL104E -Ig 약물 재료 에서의 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포 단백질 불순물의 측정
본 실시예는 시험 샘플에서 CD-CHO1 잔류 숙주 세포 단백질 (HCP)의 오염 수준을 정량하기 위한 효소-연결된 면역흡착 분석법 (ELISA)을 기재한다. 토끼 폴리클로날 항-CD CHO1 HCP IgG를 미세역가 플레이트에서 먼저 코팅하였다. HCP 참고 표준, 품질 대조군 및 CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료 샘플을 결합된 토끼 항-CD CHO1 HCP IgG와 함께 인큐베이션하였다. 미세역가 플레이트를 세척한 후, 폴리클로날 토끼 항-CD CHO1 HCP 비오틴 IgG 항체를 첨가하며, 이는 초기 단계 동안 포획된 HCP에 결합된다. 미세역가 플레이트를 세척하여 비결합 폴리클로날 항체를 제거하였다. 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제를 첨가하고, 미세역가 플레이트를 다시 세척하여 임의의 비결합 접합된 항체를 제거하였다. 이어서, TMB 크로모겐을 첨가하여 비색계 반응을 수득하였다. 반응을 황산으로 종결시키고, 흡광도를 450 nm에서 96-웰 마이크로플레이트 판독기에서 측정하였다. 포획된 HCP의 양에 비례하여 색이 나타났다. 4.11 ng/mL 내지 3000 ng/mL의 범위에서 흡광도 대 HCP 농도를 플롯팅함으로써 생성된 표준 곡선을 바탕으로 샘플 농도를 측정하였다.
차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (DG44)를 CTLA4A29YL104E-Ig의 생산에 사용하였다. CD-CHO1 단백질 (HCP)의 생산을 위하여, DG44 세포를 재조합 벡터 pD16으로 안정하게 형질감염시키고, 갈락토스 및 레콤불린(Recombulin)으로 보충된 CD-CHO1 배지에서 성장시켰다. 효소-연결된 면역흡착 분석법의 상기 버전을 위한 폴리클로날 항체를 CD-CHO1 HCP 물질 농축물로 면역화된 뉴질랜드 백색 토끼에서 생성시켰다. 토끼 항체를 친화성 정제시키고 (단백질 A), 이어서 포스페이트 완충 염수로 투석하고 농축하였다. 토끼 항-CD-CHO1 항체의 IgG 분획 대략 50 mg을 N-히드록시술포숙신이미드 에스테르 화학을 이용하여 비오틴화하였다. 비변형된 토끼 항-CHO1 항체를 사용하여 96-웰 미세역가 플레이트를 코팅하였다. 이는 비오틴화된 토끼 항-CD-CHO1 항체에 의해 검출되는 CD-CHO1 HCP를 포획하였다. 스트렙타비딘 양고추냉이 퍼옥시다제 접합체는 비오틴에 결합하였고, TMB 크로모겐과의 비색계 반응을 이용하여 CD-CHO1 HCP를 정량하였다.
상기 방법은 CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료 물질의 방출 시험을 위하여 효소-연결된 면역흡착 분석법에 의해 CD-CHO1 숙주 세포 단백질의 잔류 수준을 정량적으로 측정하기 위해 고안되었다.
방법 개요
Figure 112011097388832-pat00247
토끼 항-CD-CHO1 항체를 비오틴화 시약으로서 술포숙신이미딜-6 (비오틴아미도) 헥사노에이트를 갖는 비오틴화 키트를 이용하여 비오틴화하였다. 술포-NHS-LC-비오틴을 갖는 피어스(PIERCE) 제조의 비오틴화 시약 (제품 # 21335)을 사용할 수 있다. 항체를 비오틴화 시약을 공급하는 제조사의 매뉴얼상에서의 추천에 따라 표지하였다. 공급된 크기 배제 칼럼에서의 표지 및 분리 후, 비오틴 도입을 측정하고, 샘플을 50 ㎕ 이하의 분취액으로 -70℃ 이하에서 동결하였다. 최종 생성물의 비오틴/IgG 비율은 2 내지 4이어야 한다. -70℃ 이하에서 저장하였다.
플레이트 코팅. 미세역가 플레이트를 코팅하기 위해 사용될 탄산염 완충액 중 정제된 토끼 항-CD-CHO1 HCP IgG의 8 ㎍/mL 용액을 제조하였다 (용액 12 mL가 미세역가 플레이트 당 요구됨). 상기 용액 100 ㎕를 보정된 멀티채널 피펫터를 사용하여 이뮬론(Immulon) 4 미세역가 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 미세역가 플레이트를 파라필름으로 덮고, 4℃에서 18 ± 2시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트 세척 및 차단. 플레이트를 플레이트 세척 기구를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 시블록(SeaBlock) 300 ㎕를 보정된 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다. 15 mL 눈금 멸균 폴리프로필렌 튜브에서 CD-CHO1 단백질 참고 표준 및 품질 대조군 샘플의 농축액을 제조하였다. 참고 물질 및 품질 대조군 샘플을 테크노바(Teknova) 희석액 (1.21)을 사용하여 희석하였다. 하기 예시에 나열된 농도로 실험일에 표준 농축액을 제조하였다:
표준 곡선 샘플에 대한 희석 (매일의 제조에 대한 예시)
CD-CHO1 단백질의 원액 농도는 5.7 mg/mL이었다.
희석 A: 26.3 ㎕ (5.7 mg/mL) + 4.973 mL PTB 희석액 = 30 ㎍/ml
희석 B: 0.6 mL (30 ㎍/mL) + 5.4 mL 희석액 3000 ng/mL
2 mL (3000 ng/mL) + 4 mL 희석액 1000 ng/mL
2 mL (1000 ng/mL) + 4 mL 희석액 333.3 ng/mL
2 mL (333.3 ng/mL) + 4 mL 희석액 111.1 ng/mL
2 mL (111.1 ng/mL) + 4 mL 희석액 37.0 ng/mL
2 mL (37.0 ng/mL) + 4 mL 희석액 12.3 ng/mL
2 mL (12.3 ng/mL) + 4 mL 희석액 4.11 ng/mL
0 + 4 mL 희석액 0 ng/mL
QC 농도 분석, 저장, 및 유효기간
3개의 상이한 표적 농도 (25, 100, 및 700 ng/mL)인 품질 대조군 (QC) 샘플을 제조하고, 분석일에 신선하게 사용하거나, 다량을 제조하고, -70℃ 이하에서 분취액으로 동결하여 저장하였다. 동결된 분취액을 3개의 독립적인 실험으로 분석하였다. 3개 실험으로부터의 평균 결과를 3개 QC 샘플 각각에 대한 분석 증명서 (COA)에 보고하였다. 실험일에, 동결된 QC 샘플을 해동시키고, 하기 기재한 바와 같이 분석하였다. 각 QC를 해동시킨 후, 샘플을 2-4초의 중간 속도로 와동시켰다. 동결된 QC 샘플은 제조일 후 6개월까지 유효하였다. 이들을 COA에 보고된 공칭 농도로 사용하였다. 신선하게 제조된 QC는 제조 후 24시간까지 유효하였다.
품질 대조군 (QO) 샘플에 대한 희석 (예시)
희석 A: 26.3 ㎕ (5.7 mg/mL) + 4.973 mL 희석액 = 30 ㎍/mL
233 ㎕ (30 ㎍/mL) + 9.767 mL 희석액 = 700 ng/mL (QC 1)
1.43 mL (700 ng/mL) + 8.57 mL 희석액 = 100 ng/mL (QC 2)
2.5 mL (100 ng/mL) + 7.5 mL 희석액 = 25 ng/mL (QC 3)
샘플 제조. 약물 재료 샘플을 대략 12.5, 6.25, 및 3.125 mg/mL로 희석하였다.
희석 A: 400 ㎕ 샘플 (약 25 mg/mL) + 400 ㎕ 희석액 = 12.5 mg/mL
희석 B: 400 ㎕ (약 12.5 mg/mL) + 400 ㎕ 희석액 = 6.25 mg/mL
희석 C: 400 ㎕ (약 6.25 mg/mL) + 400 ㎕ 희석액 = 3.125 mg/mL
플레이트 세척. 플레이트를 플레이트 세척기를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 표준 농도, 샘플 및 QC 샘플 각각의 웰 당 100 ㎕를 차단되고 세척된 플레이트에 3벌로 첨가하였다. 각각의 QC 농도를 플레이트 당 총 6개 웰에 2회 첨가하였다. 제안되는 배치에 대해서는 "부착 방법"에서의 플레이트 맵을 참조한다. 22.5 ± 5℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계를 5회 반복하였다. 토끼 항-CD-CHO1 HCP 비오틴을 테크노바 완충액 2 ㎍/mL로 희석하였다. 용액을 중간 속도로 대략 2-4초 와동시켰다. 웰 당 100 ㎕를 첨가하였다. 22.5 ± 5℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계를 5회 반복하였다. 스트렙타비딘-HRP (SA-HRP)를 테크노바 완충액 중에 적절히 희석하였다 (실시예: 1/20,000 희석은 통상적으로 허용되는 흡광도 판독을 야기함). SA-HRP 희석물 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 22.5 ± 5℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TMB 크로모겐을 냉장고에서 꺼내고, 플레이트 당 최소 10 mL를 적합한 용기로 따라내었다. 어두운 장소에 두고, 실온이 되게 하였다. 세척 단계를 5회 반복하였다. TMB 크로모겐 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 22.5 ± 5℃에서 대략 2분 동안 인큐베이션하였다. 1 N H2SO4 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 크로모겐 반응을 중지시켰다. 중지 용액을 동일한 순서로 플레이트에 첨가하고, 크로모겐도 또한 첨가하여 각 웰에서 효소와 크로모겐의 동일한 반응 횟수를 보장하였다. 적절한 96 웰 플레이트 판독기에서 630 nm의 기준 파장으로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
데이타 분석. 소프트맥스(Softmax) 프로그램 템플레이트 "CHO1 Elisa template.ppr"을 평균 값, 표준 편차, ％CV, 계산된 농도, 곡선 맞춤 파라미터 등을 생성하도록 설정하였다. 표준 곡선. 4-파라미터 곡선 맞춤 함수를 이용하여 참고 표준 데이타를 표준 곡선에 맞추었다:
Y = ((A - D)/ (1+(X/C＾B)) + D
상기 식에서:
Y = 흡광도 값 (A450-A630)
A = 최소 점근선에 상응하는 흡광도 값
D = 최대 점근선에 상응하는 흡광도 값
C = 최대 점근선 값과 최소 점근선 값 사이의 절대차의 절반 (변곡점)에 상응하는 흡광도.
B = 곡선의 변곡점에서의 기울기
X= CD-CHO1 HCP의 농도
소프트맥스 프로그램 템플레이트 "CHO1 Elisa template.ppr"는 계산된 평균을 이용하여 표준에 대한 회귀선의 상관 계수 (R2)를 측정한다.
예시적 값. 표준, QC, 및 샘플에 대한 결과가 하기 나열된 예시적 값을 만족하는 지를 측정하였다. 표준에 대한 예시적 값. 표준 곡선에 대한 상관 계수 (R2)는 0.99 이상이어야 한다. 0 ng/mL 표준 농도에 대한 평균 배경은 0.2 흡광도 단위 이하이어야 한다. 0 및 QL (12.3 ng/mL) 미만의 농도를 제외하고 표준 곡선의 7개의 공칭 농도 중 2개 이상이 조건 6.1.4 및 6.1.5를 만족시키지 않는 경우, 분석은 무효라고 간주하며, 반복해야 한다. 0 및 QL (12.3 ng/mL) 미만의 농도를 제외하고 표준 곡선를 측정하기 위해 사용된 각 표준 농도에서의 계산값의 평균 (ng/mL)은 표적 (공칭) 값의 20％ 이내이어야 한다. 0 및 QL (12.3 ng/mL) 미만의 농도를 제외하고 각 표준 농도에서 3벌의 흡광도 값의 편차의 계수 (％CV)는 20％ 미만이어야 한다. 적어도 2개의 합동 데이타 점이 계산에 이용가능함을 보장하기 위하여, 표준, 품질 대조군 및 샘플을 3벌의 웰에 로딩하였다. 각 3벌의 값을 별도로 분석하였다. 표적에서 가장 멀리 위치한 값을 제외하였다. 곡선을 재계산하고, 예시적 값을 재분석하였다.
예시:
Figure 112011097388832-pat00248
25 ng/mL의 표적 값에서 가장 먼 단일 값은 12 ng/mL이었다. 3벌에서 12 ng/mL 값을 제거함으로써, 남아 있는 값의 평균은 예시적 값 모두를 만족시켰다. 남아 있는 2개의 값의 평균이 예시적 값을 여전히 만족시키지 않음을 보여 준다면, 단일 점을 제거하고, 곡선을 재계산하였다.
예시:
Figure 112011097388832-pat00249
평균 값은 어떤 값이 제거되는 지에 상관 없이 표적으로부터 20％ 초과이므로, 단일 점을 곡선으로부터 제거하고, 곡선을 재계산할 것이다.
QC 샘플에 대한 예시적 값. QC 샘플은 기재된 농도에서 6개 웰의 셋트이다. QC 샘플에 대해 6개 웰 중 적어도 4개가 허용될 QC 샘플에 대한 공칭의 20％ 이내이어야 한다. 모든 3개의 QC 샘플이 허용되어야 한다. 이들 예시적 값이 만족하지 않는다면, 분석을 반복해야 한다.
시험 샘플에 대한 예시적 값. 분석된 시험 샘플에 대한 흡광도 값은 가장 높은 QC보다 작아야 한다. 이 값이 가장 높은 QC를 초과하는 경우, 시험 샘플을 700 내지 12.3 ng/mL의 평균 값을 수득하도록 충분히 희석해야 한다. 모든 희석물에 대한 흡광도가 분석의 QL 미만인 것이 아니라면, 3개의 샘플 희석액 (12.5, 6.25, 및 3.125 mg/mL) 중 적어도 하나는 기록가능한 결과에 대한 표준 곡선의 범위 내에 속해야 한다. 이 경우, 시험 샘플은 <QL로 보고하였다. QL보다 크고 분석 범위 내에 속하는 샘플 희석액의 3벌의 흡광도 값의 평균은 20％ 미만의 CV를 나타내야 한다.
샘플에서 CD-CHO1 HCP 농도의 계산 및 결과 보고. 샘플에서 CD-CHO1 HCP 농도의 계산. 평균 샘플 결과를 적절한 희석 인자 (즉 2, 4, 및 8)로 곱하여 희석물 각각에 대한 비희석 샘플에서의 CD CHO1 HCP의 농도를 ng/mL 단위로 수득하였다. 분석 범위 내에 속하는 상기 희석물의 결과에 대한 평균을 측정하였다. 결과를 보고된 CTLA4A29YL104E-Ig 단백질 농도 (mg/mL)로 나누어 CTLA4A29YL104E-Ig의 CD CHO1 HCP의 농도를 ng/mg 단위로 수득하였다.
예시적 계산:
평균 샘플 결과: 235 ng CD-CHO1 HCP/mL = 9.4 ng/mg
단백질 농도: 25.0 mg/mL
비고: ng CD-CHO1 HCP/ mg 생성물 (ng/mg)은 백만당 부 (ppm)와 등가이다.
실시예 53: 효소-연결된 면역흡착 분석법에 의한 CTLA4 A29YL104E -Ig에서의 단백 질 A 수준 측정
상기 효소-연결된 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 CTLA4A29YL104E-Ig 시험 샘플에서 단백질 A의 오염 수준을 정량하였다. 토끼 항-단백질 A를 먼저 미세역가 플레이트에 코팅하였다. 단백질 A 참고 표준, 품질 대조군, 회수 대조군, 및 CTLA4A29YH04E-Ig 샘플을 결합된 토끼 항-단백질 A IgG와 함께 인큐베이션하였다. 미세역가 플레이트를 세척한 후, 비오틴화된 모노클로날 항-토끼 단백질 A IgG 항체를 첨가하는데, 이는 초기 단계 동안 포획된 단백질 A에 결합된다. 미세역가 플레이트를 세척하여 비결합 모노클로날 항체를 제거하였다. 이어서, 1시간 인큐베이션 후 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제를 첨가하고, 미세역가 플레이트를 다시 세척하여 임의의 비결합 접합된 항체를 제거하였다. 이어서, TMB 크로모겐을 첨가하여 비색계 반응을 수득하였다. 반응을 황산으로 종결시키고, 광학 밀도를 450 nm에서 96-웰 마이크로플레이트 판독기에서 측정하였다. 포획된 단백질 A의 양에 비례하여 색이 나타났다. 0.188 ng/mL 내지 12 ng/mL의 범위에서 광학 밀도 대 단백질 A 농도를 플롯팅함으로써 생성된 표준 곡선을 바탕으로 샘플 농도를 측정하였다.
방법 개요
Figure 112011097388832-pat00250
항체 포획과 플레이트 코팅. 코팅 완충액 중 토끼 항-단백질 A 항체의 1 ㎍/mL 용액을 제조하고, 코스타(Costar) 미세역가 플레이트의 각 웰에 상기 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 4℃에서 18 ± 2시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트 세척 및 차단. 플레이트를 플레이트 세척기를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 수퍼블록™ 200 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 미세역가 플레이트를 60분 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다. 참고 표준의 제조. 적절한 양의 단백질 A 참고 물질을 적절한 용량의 아세테이트 완충액에 혼합시켜 참고 표준을 제조하였다. 용액을 중간 속도로 대략 2-4초 와동시켰다. 미세역가 플레이트를 첨가하기 전 참고 표준, 품질 대조군, 및 회수 대조군 샘플을 10분 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다.
실시예: 참고 물질 단백질 A, 원액 농도 2.3 mg/mL
1:200 10 ㎕ (2.3 mg/mL) + 1990 ㎕ (아세테이트 완충액) = 11500 ng/mL
1:479 10 ㎕ (11500 ng/mL) + 4780 ㎕ (아세테이트 완충액) = 24 ng/mL
2 mL (24 ng/mL) + 2 mL (아세테이트 완충액) = 12 ng/mL
2 mL (12 ng/mL) + 2 mL (아세테이트 완충액) = 6 ng/mL
2 mL (6 ng/mL) + 2 mL (아세테이트 완충액) = 3 ng/mL
2 mL (3 ng/mL) + 2 mL (아세테이트 완충액) = 1.5 ng/mL
2 mL (1.5 ng/mL) + 2 mL (아세테이트 완충액) = 0.75 ng/mL
2 mL (0.75 ng/mL) + 2 mL (아세테이트 완충액) = 0.375 ng/mL
2 mL (0.375 ng/mL) + 2 mL (아세테이트 완충액) = 0.188 ng/mL
0 mL + 2 mL (아세테이트 완충액) = 0 ng/mL
각 표준 농도를 3벌로 분석하였다. 샘플을 부착 방법에 기재된 바와 같은 미세역가 플레이트에 놓았다. 품질 대조군 샘플의 제조. 단백질 A의 품질 대조군 (QC) 샘플을 0.5, 2, 및 5 ng/mL의 3가지 표적 농도 수준으로 아세테이트 완충액 중에서 제조하였다. 이들은 실험일에 신선하게 제조하거나, 다량 제조하여 750 ㎕ 분취액으로 -70℃ 이하에서 동결시켰다. 동결된 QC 샘플 중의 단백질 A 농도는 상기 방법을 이용하여 3개의 독립적인 단백질 A ELISA 실험으로 예비측정하였고, 평균 농도 결과는 각 QC 샘플에 대한 분석 증명서에 "공칭" QC 농도로 보고하였다.
실험일에, 3개의 QC 샘플 각각 하나의 바이알을 실온에서 해동시켰다. 각 QC 농도를 2회 분석하였다 (농도 당 2개의 3벌의 분석물로). QC 샘플을 부착 방법에 기재된 바와 같은 미세역가 플레이트에 놓았다.
참고 물질 단백질 A, 2.3 mg/mL
1:200 10 ㎕ (2.3 mg/mL) + 1990 ㎕ (아세테이트 완충액) = 11500 ng/mL
1:479 10 ㎕ (11500 ng/mL) + 4780 ㎕ (아세테이트 완충액) = 24 ng/mL
833.3 ㎕ (24 ng/mL) + 3.166 mL (아세테이트 완충액) = 5 ng/mL (QCl)
1.600 mL (5 ng/mL) + 2.4 mL (아세테이트 완충액) = 2 ng/mL (QC2)
1 mL (2 ng/mL) + 3 mL (아세테이트 완충액) = 0.5 ng/mL (QC3)
시험 샘플의 제조. 아세테이트 완충액 (pH 3.5)을 이용하여 폴리프로필렌 튜브 중에 CTLA4A29YL104E-Ig 시험 샘플의 2.5 mg/mL, 1.25 mg/mL, 및 0.625 mg/mL 농도를 제조하였다. 시험 샘플을 미세역가 플레이트에 첨가하기 전 대략 10분 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다.
플레이트 세척. 플레이트를 플레이트 세척기를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 플레이트 세척기는 0 침지 시간을 가지고 300 ㎕ 세척 완충액으로 웰을 채우도록 설정되어야 한다. 각 참고 표준, 품질 대조군, 회수 대조군, 및 시험 샘플 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다. 단계를 반복하였다. 각각의 새로운 로트에 대한 최적화로 지시되는 바와 같이, 비오틴화된 항-단백질 A 항체를 테크노바 희석제로 목적하는 농도로 희석하였다. 예를 들어, 모노클로날 항-단백질 A 비오틴 접합체에 대해서는 1:64,000 희석물을 제조하고, 중간 속도에서 와동시키고, 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 100 ㎕를 첨가하였다. 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
각각의 새로운 로트에 대한 최적화로 지시되는 바와 같이, 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제를 테크노바 희석제로 목적하는 농도로 희석하였다. 예를 들어, 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제에 대해 1:80,000 희석물을 제조하였다. 중간 속도에서 와동시키고, 각 웰에 100 ㎕를 첨가하고, 30분 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다. 단계를 반복하나, 5회 세척하였다. 100 ㎕ TMB 크로모겐을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 대략 2분 동안 인큐베이션하였다. 표준 곡선에 대해 가장 높은 농도에 대한 광학 밀도는 0.980 내지 1.400이어야 한다. 1 N H2SO4 100 ㎕/웰을 첨가하여 크로모겐 반응을 중지시켰다. 중지 용액을 동일한 순서로 플레이트에 첨가하고, 크로모겐도 또한 첨가하여 각 웰에서 효소와 크로모겐의 동일한 반응 횟수를 보장하였다. 적절한 96 웰 플레이트 판독기에서 630 nm의 기준 파장으로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
데이타 분석. 소프트맥스 프로그램 템플레이트는 평균, 표준 편차, 및 ％CV 등을 생성하므로, 단백질 A 효소-연결된 면역흡착 분석법에 대해서는 이를 참조한다. 데이타 분석 단락에서 수행된 계산 모두는 소프트맥스 프로에서의 단백질 A Elisa template.ppr을 이용하여 수행할 것이다.
분석된 각각의 참고물 및 샘플 농도에 대해 얻어진 3벌의 흡광도 값 (Abs)을 평균 내었다. 상기 형태의 비칭량된 4개의 파라미터 회귀를 이용하여 단백질 A 표준에 대한 데이타를 모델링하였다:
Figure 112011097388832-pat00251
상기 식에서,
Abs = 흡광도
min = 최소 점근선에 상응하는 흡광도 값
max = 최대 점근선에 상응하는 흡광도 값
ED50 = 최대 점근선 값과 최소 점근선 값 사이의 절대차의 절반에 상응하는 흡광도.
B = 곡선 형태의 변곡점에서의 기울기
C = 단백질 A의 농도
예시적 값. 표준에 대한 예시적 값. 정량 한계 (QL) 미만의 값은 단지 곡선의 맨 가장자리를 확립하는 것을 도와주기 위해 사용되므로, 표준에 대한 예시적 값은 QL의 값 또는 그 이상의 값에 적용된다. 표준 곡선에 대한 상관 계수 (R2)는 0.99 이상이어야 한다. 0 ng/mL 표준 농도에 대한 평균 배경은 0.08 흡광도 단위 이하이어야 한다. 0 및 QL을 제외하고는 표준 곡선을 측정하는 데 사용되는 각 표준 농도에서의 계산값의 평균 (ng/mL)은 표적 (공칭) 값의 15％ 내에 존재해야 한다. 표준 곡선의 QL의 3벌의 흡광도 값의 평균은 20％ 미만의 ％CV를 나타내어야 하고, 표적의 20％ 내에 존재해야 한다.
실시예 54 - CTLA4 A29YL104E -Ig에서 MCP-1 유사 단백질의 측정을 위한 효소-연 결된 면역흡착 분석법
상기 효소-연결된 면역흡착 분석법은 CTLA4A29YL104E-Ig에서 MCP-1 유사 단백질의 농도를 측정하기 위해 수행한다. 표준 곡선 (0.4 내지 25.6 ng/mL), 품질 대조군, 및 시험 샘플의 농도를 염소 항-마우스 MCP-1 흡수된 미세역가 플레이트에 적용시키고, 60분 동안 주위 온도 (22.5 ± 5℃)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 제2 항체 (토끼 항-래트 MCP-1 IgG)를 첨가하고, 60분 동안 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 염소 항-토끼 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제를 각 웰에 첨가하고, 30분 동안 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, TMB 크로모겐을 첨가하여 비색계 반응을 수득하였다. 반응을 1N H2SO4로 중지시키고, 광학 밀도를 96-웰 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서 측정하고, 데이타를 4-파라미터 회귀 곡선을 이용하여 모델링하였다. 이어서, MCP-1 유사 단백질의 농도를 MCP-1 참고 물질에 대한 각 시험 샘플에 대해 계산하였다. 농도는 표준 곡선 및 비희석 샘플 농도에 대해 얻어진 결과를 나누어 샘플 mg 당 MCP-1 유사 단백질의 ng 단위 (백만당 부, ppm)로 보고하였다. 상기 방법은 인-프로세스 정제된 약물 재료, 및 약물 제품을 비롯한 세포 배양물로 유도되는 생물학적 샘플 중의 MCP-1 유사 불순물의 측정을 허용한다. MCP-1 유사 단백질은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물에서 생성된 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. CHO 세포로부터 정제된 MCP-1 유사 불순물에 결합하는 2개의 폴리클로날 항체를 확인하였다. 항체는 쥐과 및 래트 MCP-1 (무손상)에 대해 지시되며, 둘 다 상기 보고서에서 증명된 CHO 세포로부터의 MCP-1 유사 단백질과 교차 반응하였다.
플레이트 코팅. 코팅물의 경우, 염소 항-마우스 MCP-1 항체를 코팅 완충액으로 5 ㎍/mL로 희석하였다. 플레이트를 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 밀봉재로 덮고, 22.5 ± 5℃에서 12 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 세척. 플레이트를 플레이트 세척기를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 세척기는 0 침지 시간을 가지고 300 ㎕/웰로의 3회 세척으로 설정되어야 한다. 다르게는, 플레이트를 수동 세척할 수 있다. 용액 300 ㎕를 보정된 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 가볍게 쳐 개수대(sink)로 웰을 비우고, 종이 타월에 온화하게 털었다. 3회 반복하였다.
플레이트 차단. 보정된 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 코팅 안정화제 & 차단 완충액 300 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 1 내지 2시간 동안 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트 세척 및 저장. 플레이트를 4.2 하에 기재된 바와 같은 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 플레이트를 웰 당 300 ㎕ 코팅 완충액으로 채우고, 플레이트 밀봉재로 덮고, 암소에서 2-8℃에서 1주 이하 동안 저장하였다.
표준물의 제조. MCP-1 유사 단백질 원액으로부터, PTB 중의 25.6 ng/mL 용액을 제조하고, 희석제로 PTB를 사용하여 연속 희석 단계 (1:2)로 거기에서 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 및 0 ng/mL로 희석하였다. 다르게는, 다량의 표준물을 제조함으로써 동결된 표준물을 사용할 수 있다. 분취하고, -70℃ 내지 -80℃에서 저장하였다. 반복 동결/해동을 피하였다. 동결된 표준물은 3개의 독립적인 효소-연결된 면역흡착 분석법 작업에서의 품질 대조군에 대해 정량하는 것이 요구된다. 동결된 표준 및 QC는 각각의 작업에서 허용되어야 한다. 3개의 허용되는 작업의 완료 후, 분석 증명서가 발행되었다. 동결된 표준물은 그의 공칭 농도로 사용될 것이다. 이들은 제조일로부터 3개월 동안 유효하였다.
0.97 mg/mL의 원액 농도를 갖는 MCP-1 참고물에 대한 실시예:
PTB 중 5200 ng/mL의 2.5 mL 제조:
13.4 mL 원액 + 2.487 mL 희석액
b) PTB 중 25.6 ng/mL의 160 mL 제조:
788 mL 원액 a + 160 mL 희석액
대략 2-3초 동안 튜브를 와동시킨 후 2-3회 온화하게 역전시킴으로써 각 용액을 혼합하였다.
품질 대조군. 품질 대조군 (QC)은 PTB에서 17.7 ng/mL, 5.3 ng/mL, 및 1.2 ng/mL의 공칭 농도로 제조된 MCP-1 유사 단백질이다. 다량의 QC를 제조하고, 분취하고, -70℃ 내지 -80℃에서 3개월 이하 동안 저장하였다. 반복되는 동결/해동을 피하였다. 품질 대조군은 3번의 독립적인 효소-연결된 면역흡착 분석법 작업에서 표준 곡선에 대해 검정받았다. QC는 각각의 작업에서 허용되어야 한다. 3번의 허용가능한 작업을 종료한 후, 각 허용되는 QC에 대한 평균 결과를 보고하고, 분석 증명서를 발행하였다. QC는 그의 계산된 농도로 사용될 것이다. 이들은 제조일로부터 3개월 동안 유효하였다. 0.97 mg/mL의 원액 농도를 갖는 MCP-1 참고물로부터의 동결된 QC 희석물 제조에 대한 실시예:
a) PTB 중 5200 ng/mL의 2.5 mL 제조:
13.4 mL 원액 + 2.487 mL 희석액
b) 하기와 같이 MCP-1 유사 단백질 품질 대조군 샘플의 최종 희석물을 제조하였다:
Figure 112011097388832-pat00252
대략 2-3초 동안 와동시킨 후 2-3회 온화하게 역전시킴으로써 각 용액을 혼합하였다. 다르게는, QC를 분석일에 신선하게 제조할 수 있다.
시험 샘플. 시험 샘플 200 ㎕를 PTB 200 ㎕에 첨가함으로써 시험 샘플을 제조하고, 2 - 4초 동안 와동시켰다. 참고 표준, 품질 대조군 (x2), 및 시험 샘플을 플레이트에 웰 당 100 ㎕로 3벌로 첨가하고, 1시간 동안 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다 (외부 웰은 사용하지 않음). 분석에 사용되는 플레이트에 대한 충분한 용량에 2 ㎍/mL의 농도로 PTB 완충액 중의 제2 토끼 항-래트 MCP-1 항체를 제조하였다. 용액을 대략 2 - 4초 와동시켰다. 세척을 반복하나, 5회 세척하였다. 제2 항체 용액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 60분 동안 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다. 희석제로 PTB를 사용하여, 제3 염소 항-토끼 HRP 접합체 용액 (예를 들어 1:20,000 희석물 또는 적절한 희석물)을 제조하였다. 용액을 대략 2 - 4초 동안 와동시켰다. 세척을 반복하였다. 100 ㎕ HRP 접합체를 각 웰에 첨가하고, 암소에서 30분 동안 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다. 세척을 반복하였다. TMB 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 암소에서 3 - 6분 동안 또는 적절한 색이 발현될 때까지 22.5 ± 5℃에서 인큐베이션하였다. 1N H2SO4 100 ㎕를 크로모겐 첨가를 수행한 것과 동일한 순서로 첨가하여 크로모겐 반응을 중지시켰다. 적절한 96 웰 플레이트 판독기에서 630 nm의 기준 파장으로 450 nm에서 광학 밀도를 판독하였다.
데이타 정리
프로토콜 파일 MCP-1.ppr이 있는 소프트맥스™ 소프트웨어를 이용하여 상기 형태의 비칭량된 4개의 파라미터 회귀를 이용하여 표준 곡선을 구축하였다.
Figure 112011097388832-pat00253
상기 식에서,
A = 최소 점근선에 상응하는 흡광도450 값.
D = 최대 점근선에 상응하는 흡광도450 값.
c = 최대 점근선 값과 최소 점근선 값 사이의 절대차의 절반에 상응하는 농도.
B = 곡선의 직선 부분의 대략적인 기울기.
x = 참고 표준의 농도.
표준 곡선, 품질 대조군, 및 시험 샘플에 대한 허용되는 데이타를 갖는 샘플에 대해서만 결과를 보고하였다.
표준에 대한 예시적 값. 정량 한계 (QL) 미만의 값은 단지 곡선의 맨 가장자리를 확립하는 것을 도와주기 위해 사용되므로, 표준에 대한 예시적 값은 QL (0.8 ng/mL)의 값 또는 그 이상의 값에 적용시켰다. 평균 배경 (0 ng/mL 표준)은 0.1 흡광도 단위 이하이어야 한다. 표준 곡선을 측정하는 데 사용되는 각 표준 농도에서의 평균 배경-계산된 MCP-1 농도 (ng/mL)는 표적 (공칭) 값의 15％ 내에 존재해야 한다. 표준 곡선을 측정하기 위해 사용되는 각 표준 농도에서의 3벌의 A450 값의 편차의 계수 (％CV)는 15％ 이하이어야 한다. 표준 곡선의 QL에서 3벌의 A450 값의 평균은 20％ 이하의 ％CV를 나타내어야 하고, 표적 (공칭 농도, 0.8 ng/mL)의 20％ 내로 역계산되어야 한다. 평균을 계산하는 데 사용된 3벌의 각 값은 별도로 분석될 것이다. 평균에서 가장 멀리 있는 값은 제외하고, 곡선을 재계산하고, 예시적 값을 재분석할 것이다. 남아 있는 2개 값의 평균이 예시적 값을 여전히 만족시키지 않음을 보여 준다면, 단일 점을 제거하고, 곡선을 재계산하였다.
QC 샘플에 대한 예시적 값. QC 샘플은 기재된 농도의 3개 웰의 셋트로서 정의되므로, 상기 방법에 기재된 3개의 공칭 농도에 대해, 총 6개 QC 샘플이 존재한다. QC 샘플에 대한 3개의 웰 중 적어도 2개의 역계산된 농도는 허용될 QC 샘플에 대한 미리 측정된 표적 농도 (COA 참조)의 20％ 내에 존재해야 한다. 6개 QC 샘플 중 적어도 4개가 허용되어야 하며, 6개 QC 샘플 중 적어도 2개 (동일한 농도의 2개가 아님)가 불허될 수 있고, 18개 QC 샘플 웰 중 6개 이하가 각각의 표적 농도로부터 20％ 넘게 벗어날 수 있다. 예시적 값이 만족되지 않으면, 분석을 반복해야 한다.
시험 샘플에 대한 예시적 값. 평균 계산된 MCP-1 농도는 가장 높은 QC의 농도보다 낮아야 한다. 평균 계산된 MCP-1 농도가 0.8 ng/mL (QL) 이상인 경우, 3벌의 측정의 ％CV는 20％ 이하이어야 한다. 상기 조건이 만족되지 않으면, 샘플 결과는 무효하고 반복되어야 한다. 상기 기준이 만족되지 않으면, 평균 MCP-1 농도는 최종 결과를 계산하기 위해 사용하였다. 계산된 MCP-1 농도가 0.8 ng/mL (QL) 미만인 경우, 샘플을 < QL으로 보고하고, "0.8 ng/mL 미만"의 값을 최종 결과의 계산에 사용하였다.
실시예 55 - 정량 폴리머라제 쇄 반응에 의한 CTLA4 A29YL104E -Ig 및 CTLA4-Ig에 서의 CHO DNA의 검출
상기 절차는 실시간 정량 폴리머라제 쇄 반응 (qPCR) 분석을 이용하여 약물 재료의 샘플에서 잔류 CHO DNA를 검출하기 위해 개발되었다. PCR은 DNA의 혼합물의 복제이다. 구체적인 CHO PCR 생성물은 분석 동안 축적되기 때문에, 상기 분석은 이를 검출하기 위한 형광 프로브를 사용한다. PCR 생성물의 증폭율은 샘플에 존재하는 출발 DNA의 양과 직접 비례한다.
DNA 값의 피코그램/밀리그램으로의 전환. pg/mL 값을 280 nm에서의 흡광도로 측정된 샘플 농도로 나누었다. 50 mg/mL의 단백질 농도를 갖는 샘플에 대한 실시예 계산 및 바이오릴라이언스(Bioreliance)로부터의 보고 값 = 0.67 fg/㎕. 단계 1 : pg/mL로의 전환 = 0.67 pg/mL. 단계 2: pg/mg로의 전환 = (0.67 pg/mL / 50.0 mg/mL) = 0.013 pg/mg.
실시예 56: SDS-PAGE에 의한 CTLA4 A29YL104E -Ig의 분석
본 실시예는 CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료 및 약물 제품에 대한 순도의 평가를 위한 CTLA4A29YL104E-Ig의 분석을 기재한다. CTLA4A29YL104E-Ig는 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA4)의 변형된 리간드 결합 도메인 및 인간 IgG의 Fcγ1 영역으로 이루어진 유전자조작된 융합 단백질이다. CTLA4A29YL104E-Ig는 약 92 킬로달톤의 분자량을 가지며, 97 킬로달톤 (비환원) 또는 55 킬로달톤 (환원)의 겉보기 분자량을 갖는다. 4-20％ 구배 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 상의 CTLA4A29YL104E-Ig의 전기영동은 주요 단량체 종을 고분자량 종 (응집물, 이량체, 및 고차 다량체) 뿐 아니라 임의의 저분자량 종 (분해 단편)과 구별시킨다. 쿠마시 블루 염색된 겔의 농도계측 스캐닝 및 이미지퀀트TL™ 정량화로 단백질 순도를 측정하였다. 결과를 환원 및 비-환원된 조건하의 CTLA4A29YL104E-Ig의 순도 (％)로 보고하였다.
시약
비고: 모든 시약은 등가의 대체물로 대체될 수 있다. 1X Tris-글리신-SDS 유동 완충액. Tris-글리신-SDS 10X 유동 완충액 100 mL를 1 리터 눈금 실린더에 첨가하였다. 밀리-Q 또는 HPLC 등급수로 1 리터까지 채웠다. 덮고, 수 회 역전시켜 혼합하였다. 상기 시약은 분석일에 제조해야 한다. 비고: 필요하다면 추가의 용량을 제조하였다.
쿠마시 블루 염색 시약. 겔코드 블루 염색 시약 용액을 병을 수회 온화하게 역전시키거나 기울이고 돌림으로써 사용 직전에 혼합하였다. 이러한 혼합은 수동 펌프가 있는 3.5 L 겔코드 용기 (카탈로그 번호 24592)를 사용하는 경우 특히 중요하다. 용액을 혼합시키기 위해 병을 진탕시키지 않는다. 비고: 용액이 균질한 것을 보장하기 위해 분산 전 염색 시약을 혼합하는 것이 중요하다.
고정 용액: 물 중 50％ 메탄올 / 7％ 아세트산. 500 mL 메탄올 및 70 mL 아세트산을 1 리터 눈금 실린더에서 합하였다. 밀리-Q 수로 1 리터까지 채우고 혼합하였다. 고정 용액은 실온에서 6개월 이하 동안 안정하였다. 비고: 고정 용액은 화학 발연 후드에서 제조해야 한다.
염색 대조군 제조. 밀리-Q 수를 이용하여 2 mg/mL 원액이 되도록 트립신 억제제를 재구성하였다. 50 ㎕ 분취액을 제조하고, -30 ± 10℃에서 6개월 이하 동안 동결하였다. 하기 희석 계획을 이용하여 원액 단백질 용액을 작업 농도로 희석하였다:
원액 25 ㎕ + 75 ㎕ 밀리-Q 수 = 0.5 ㎍/㎕
0.5 ㎍/㎕ 40 ㎕ + 160 ㎕ 밀리-Q 수 = 100 ng/㎕
하기 표를 이용하여 염색 대조군 로딩 용액을 제조하였다.
Figure 112011097388832-pat00254
염색 대조군 제제 10 ㎕ 로딩으로 100 ng의 단백질 로드를 수득할 것이다.
표준 및 샘플 제조
고정 공정, GLP/GMP 약물 재료, 약물 제품, 또는 안정성 샘플에 대한 로딩 패턴. 쿠마시 블루 염색된 겔에 대한 희석. 시험품 및 참고 물질을 1.0 ㎍/㎕의 작업 농도로 희석하고, 하기 표에 기재한 바와 같은 분자량 마커로 환원 및 비환원 모두를 로딩하였다.
Figure 112011097388832-pat00255
1 블랭크 = 1 X NR 샘플 완충액 10 ㎕ 로딩
비고: 염색 대조군 밴드는 시스템 적합성을 평가하기 위한 시각적 검사용 스캐닝된 겔 영상에 포함된다. 염색 대조군 밴드는 겔 보고의 일관성을 유지하기 위해 절단된 겔 영상에는 존재하지 않는다.
샘플 제조 및 전기영동. 10 ㎍/레인 단백질 로딩을 위한 샘플 희석액. 하기 방법에 따라, 10 ㎍/10 ㎕ 로딩을 위한 샘플을 제조하였다. 밀리-Q 수를 희석제로 사용하여, 시험 샘플 및 참고 물질을 10 mg/mL CTLA4A29YL104E-Ig로 희석하였다. 대략적인 농도를 계산에 사용할 수 있다. 예를 들어: CTLA4A29YL104E-Ig 약물 재료의 샘플이 25 mg/mL의 농도를 갖는다면, 1:2.5 희석물을 제조하였다 (샘플 40 ㎕를 밀리-Q 수 60 ㎕에 첨가함). 하기 표에 따라 전기영동을 위한 최종 샘플을 제조하였다. 상기 희석을 위해서는 마이크로퓨지 튜브를 사용하였다.
Figure 112011097388832-pat00256
비고: 필요하다면 단백질 용액 및 밀리-Q 수의 용량을 100 ㎕의 최종 용량을 달성하도록 조정하였다. 비고: 샘플 농도가 10 mg/mL 미만인 경우, 상기 표에 따라 최종 샘플을 제조하였다. 단백질 용액 및 물의 용량을 조정하여 겔 상의 단백질 로드를 최대화하였다.
샘플 가열. 샘플 희석액을 제조한 후, 마이크로퓨지 튜브를 닫고, 튜브를 와동시켜 용액을 혼합하였다. 샘플(들)을 수조에서 80 ± 5℃에서 2.0 ± 0.5분 동안 (보정된 타이머 사용) 가열하였다. 샘플(들)을 히터에서 꺼내고, 실온으로 냉각시켰다. 튜브를 수회 역전시켜 튜브의 상부 및 측면에서 응축물을 제거하였다.
기구 및 겔 제조. 겔을 포장에서 꺼내고, 확실히 웰 벽이 똑바로 서 있도록 하여 조심스럽게 콤(comb)을 제거하였다. 필요하다면 웰을 겔 로딩 팁과 일직선이도록 할 수 있다. 짧은 유리 플레이트가 내부 챔버를 바라보도록 겔을 전기영동 단위로 삽입하였다. 단 하나의 겔을 사용해야 하는 경우, 플렉시유리 플레이트를 반대 쪽에 삽입하였다. 내부 및 외부 챔버를 형성하면서 겔(들)을 단단히 고정시켰다. 내부 챔버를 1X Tris-글리신 SDS 유동 완충액으로 채웠다. 누출에 대해 확인한 후, 외부 챔버를 1X Tris-글리신 SDS 유동 완충액으로 채웠다. 웰을 1X Tris-글리신-SDS 유동 완충액이 있는 피펫을 사용하여 온화하게 세정하여 임의의 잔류 아크릴아미드를 제거하였다. 웰이 완전히 깨끗해지고 뚜렷해 질 때까지 웰 세정을 반복하였다.
샘플 로딩. 겔 로딩 팁을 사용하여, 각 웰을 샘플 10 ㎕로 로딩하였다. 모든 블랭크 레인을 1X 비환원 샘플 완충액 10 ㎕로 채웠다. 이는 환원제의 탈색으로 인한 비환원 샘플의 환원을 막는 데 도움을 줄 것이고, 모든 겔 전반에 걸쳐 유사한 염 농도를 유지할 것이다.
전기영동. 겔 박스 덮개를 부착하고, 전극을 전력 공급원에 연결하였다. 전류를 25 mAmp/겔 (mA)로 조정하고, 전압 (v) 및 전압 (w)을 최대로 설정하였다. 비고: 전력 공급 설정은 제조사에 따라 달라질 수 있다. 25 mA/겔을 달성하도록 설정을 조정하였다. 60분 동안 또는 샘플 완충액 염료 전방이 겔의 최하부에 도달할 때까지 겔을 전기영동시켰다. 전력 공급원을 끄고, 뚜껑을 제거하고, 겔(들)을 장치에서 꺼냈다. 플라스틱 플레이트를 조심스럽게 들어올렸다. 플라스틱 플레이트를 염색 기술을 위한 적절한 고정 용액 상에 부착된 겔로 고정시켰다. 겔을 플라스틱 플레이트에서 제거할 때까지 겔을 용액으로 가라앉혔다.
겔 고정. 비고: 모든 단계를 궤도 진탕기 상에서 온화하게 진동시키면서 실온에서 수행하였다. 비고: 시약 증발을 막기 위해 단단히 밀봉된 용기에서 염색을 수행하였다. 비고: 언급된 용량을 사용할 수 있지만, 겔이 모든 단계에서 완전히 커버되는 것이 필수적이다. 겔 및 염색 트레이의 크기는 필요한 용량을 측정할 때 고려해야 한다. 전기영동 후, 고정 용액 (50％ 메탄올/ 7％ 아세트산 용액) 50 mL를 15분 동안 첨가하였다. 겔을 밀리-Q 수 약 100 mL로 각각 5분 동안 3회 세정하였다. 쿠마시 염색 시약 용액을 사용 전 혼합하고, 8 x 10 cm 미니 겔에 대해 50 mL를 첨가하였다. 보다 큰 트레이를 사용하는 경우 추가의 시약이 필요할 수 있다. 궤도 진탕기를 20 ± 1시간 동안 사용하여 트레이를 온화하게 진탕하였다. 일관성을 위하여, 모든 겔을 동일한 작업에서 동일한 기간 동안 염색하였다. 쿠마시 염색 시약을 밀리-Q 수 100 mL로 대체하여 탈염색하였다. 탈염색 1시간 후, 겔은 스캐닝할 준비가 되었다.
겔 스캐닝 및 분석
전기영동 및 염색 후, 모든 겔을 농도계를 이용하여 스캐닝하고, 이미지퀀트TL™ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 영상 파일을 컴퓨터 로컬 하드 드라이브에 저장하고, 로컬 면적 네트워크를 통해 수록하였다. 스캐닝 및 분석 파라미터를 하기 표에 나열하였다.
Figure 112011097388832-pat00257
비고: 상기 표에서의 스캔 파라미터는 스캐닝 동안 변화되어서는 안된다. 밴드 검출 파라미터, 레인 ％ 폭 (75％로 설정) 및 배경 교정 (200 반지름으로 설정)이 모든 스캐닝된 겔 영상 분석에 대해 추천된다 (문서화를 위해 임의의 변화가 필요할 것이다). 염색/탈염색 후 겔의 물리적 특성 차이, 예컨대 겔 수축 또는 겔 밴드 형상의 차이로 인해 밴드를 정확하게 확인하기 위하여 최소 기울기, 소음 환원, 및 ％ 최대 피크 파라미터의 조정이 필요할 수 있다. 임의의 미확인 또는 오확인 밴드를 수동으로 교정하였다. 밴드 검출 파라미터에 대한 추가의 정보에 대해서는 이미지퀀트TL (v2003.03) 매뉴얼 및 온-스크린 지시를 참조한다.
상기 표에 나열된 스캔 파라미터를 이용하여 겔을 스캔하였다. 겔의 모든 분석 및 평가는 스캐닝된 영상으로부터 행하였다. 이미지퀀트TL 소프트웨어에서 <ID 겔 분석>으로부터 겔 영상 파일 (스캐닝된 영상)을 열었다. 툴바 상의 <콘트라스트>로 가서, 모든 밴드의 분명한 가시화를 위해 겔 영상을 증진시키기 위하여 <이미지 히스토그램 - 높음> 파라미터를 0.3으로 낮추었다. 비고: 상기 단계는 다음 분석에 대한 겔 영상의 용이한 가시화를 위한 것이며, 정량적 결과에 영향을 주지 않는다. 겔 밴드의 시각적 평가 또는 겔 보고의 목적으로 증진된 겔 영상을 사용하지 말 것. <레인 생성>을 선택하고, <매뉴얼>을 선택하여 <레인의 수>가 분석되도록 설정하였다. <레인 ％ 폭>을 75％로 설정하였다. 필요하다면 단일 레인을 적절히 정렬하였다. <롤링 볼> 방법을 사용하여 배경을 뺐다. 배경을 정확하게 산정하기 위하여, <반지름>을 200으로 설정하였다. 표 4에 나열된 최초 <최소 기울기>, <소음 감소>, <％ 최대 피크> 설정을 이용하여 밴드를 검출하였다. 밴드를 정확히 확인하기 위해서는 상기 값들의 조정이 필수적일 수 있다. 임의의 미확인 또는 오확인 밴드를 수동으로 평가하였다. 하기 나열된 분자량 마커를 이용하여 밴드 분자량을 측정하였다. 보정 및 정규화 단계는 건너 뛰었다. 추가 문서화 및 보고를 위해, 분자량, 밴드 용량, 및 밴드 ％를 비롯한 결과를 엑셀 시트로 옮겼다. 표 5에 나열된 12개 분자량 표준 중 11개가 배경으로부터 쉽게 구별되어야 한다 (도 79). 비고: 인슐린 B 쇄 (3,500 Da) 및 인슐린 A 쇄 (2,500 Da)가 단일 넓은 밴드로 나타날 수 있거나, 인슐린 A 쇄가 겔 상에서 시각으로 확인되지 않을 수 있다.
Figure 112011097388832-pat00258
상기 실시예에서, 비환원 (단량체) 및 환원 (단일쇄) 둘 다에 대해 시험품의 주요 밴드는 CTLA4A29YL104E-Ig 참고 물질과 겔 상에서 동일한 상대적 위치로 존재해야 한다. 도 79 참조. 100 ng/로드에서 대두 트립신 억제제 (21,500 Da) 표준의 염색 대조군은 스캐닝된 겔 영상에서 시각화되어야 한다 (도 79, 레인 12). 보통 55,400 Da 분자량 마커와 근접하게 관찰되는 (단일쇄임) 비환원 조건하에서의 부수적 밴드를 제외하고는, 쿠마시 블루 염색된 겔에서 임의의 추가 밴드의 상대적 백분율 세기는 참고 물질에 대해 2％ 이하이어야 한다. 비고: 주요 밴드의 분자량 추정은 그의 비정규 분포 때문에 정확하게 측정할 수 없다. 환원 참고 물질의 시각적 검사는 55,400 Da 분자량 마커와 근접한 위치로 이동하는 단일 넓은 밴드를 수득하는 것이다 (도 79 참조). 환원 주요 밴드에 대한 순도(％)는 97％ 이상이어야 한다. 비환원 참고 물질 주요 밴드의 시각적 검사는 97,400 Da 및 116,300 Da 분자량 마커와 근접한 위치로 이동하는 단일 넓은 밴드를 수득해야 한다 (도 79, 레인 2). 참고 물질 주요 밴드의 순도(％)는 97％ 이상이어야 한다. 비환원 참고 물질 주요 밴드의 시각적 검사는 97,400 Da 및 116,300 Da 분자량 마커와 근접한 위치로 이동하는 단일 넓은 밴드를 수득해야 한다 (도 79, 레인 2). 참고 물질 주요 밴드의 순도(％)는 97％ 이상이어야 한다.
실시예 57 - CTLA4 A29YL104E -Ig에서 트리톤 X-100의 정량적 측정을 위한 HPLC 방법
트리톤 X-100은 HPLC에 의해 CTLA4A29YL104E-Ig의 단백질 샘플에서 낮은 ppm 수준 (<10 ppm)으로 측정된다. 상기 방법은 트리톤 X-100을 고상 추출 배지로 추출하고, 그 후 물로 세척하여 잔류 단백질을 제거하고, 트리톤 X-100을 아세토니트릴로 용출시키는 것을 포함한다. 아세토니트릴 용출물을 피노메넥스 하이퍼실 C1 칼럼 및 아세토니트릴:물 (80:20)로 이루어진 이동상을 이용하여 크로마토그래피하였다. UV로 225 nm에서 검출하였다. 상기 방법은 검출 한계가 0.25 ppm로서, 1-22 ppm에서 직선이었다. 잠재적 면역억제제인 CTLA4A29YL104E-Ig는 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA4)의 리간드 결합 도메인 및 인간 IgG1 중쇄의 불변 영역으로 이루어진 2세대 융합 단백질이다. 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-100은 CTLA4A29YL104E-Ig의 정제에서 바이러스 불활성화를 위해 사용하였다. 트리톤 X-100이 제거되더라도, 단백질로부터 계면활성제의 잔류 수준 또는 부재는 제품 품질 및 조절 목적으로 확립되도록 요구된다. 상기 목적을 위해, 미량 수준의 트리톤 X-100을 검출하고 정량할 수 있는 방법이 개발되었다. 트리톤 X-100을 SPE 배지 상에서 단백질로부터 추출하고, HPLC에 의한 분석을 위해 아세토니트릴로 용출시켰다.
표준 제조
블랭크. 상기 방법으로 미리 분석되고 검출가능한 수준의 트리톤 X-100을 함유하지 않는다고 밝혀진 임의의 샘플 또는 참고 표준을 블랭크로서 사용해야 한다. 블랭크 및 샘플에서의 단백질 농도는 유사해야 한다. 블랭크는 샘플(들)과 함께 작업되어야 한다.
원액 표준 용액. 10.0 ∀ 1.0 mg 트리톤 X-100을 100 mL 용량측정 플라스크로 정확하게 칭량하고, 물로 용량까지 희석하고, 혼합하였다. 비고: 트리톤 X-100는 물 중에 서서히 용해된다. 완전한 용해에 대해 (전형적으로 15분 후) 사용 전 용액을 검사하였다. 트리톤 X-100은 물보다 점성이어서, 용해되지 않은 양은 물의 존재하에 시각화되었다.
작업 표준 용액. 트리톤 X-100 표준 원액 25 ㎕를 CTLA4A29YL104E-Ig 블랭크 0.5 mL에 스파이킹하였다. 와동 또는 다른 적절한 수단으로 완전히 혼합하였다. 상기 작업 표준 용액은 트리톤 X-100 대략 5 ppm (또는 5 ㎍/mL wt.vol.)을 함유하였다. 비고: 표준 용액은 매일 새롭게 제조해야 한다.
샘플 제조. 샘플은 그대로 사용하였다. 블랭크는 샘플(들)과 함께 작업되어야 한다. 표준 및 샘플 용액으로부터 트리톤 X-100를 추출하였다. 하기 기재된 추출 단계는 Hg 3-5 인치의 진공 하에 수행하였다.
고상 추출 (SPE) 배지의 활성화. 진공 다기관(manifold)의 뚜껑을 들어 올리고, 시험 튜브를 다기관 내부의 선반에 놓았다. 이들은 "폐기" 시험 튜브이었다. 뚜껑을 교체하고, 튜브를 진공 다기관에 놓고, 각 SPE 튜브 밑에 "폐기" 시험 튜브가 확실히 존재하도록 하였다. 아세토니트릴 1 mL를 각 튜브에 첨가하고, 아세토니트릴이 배지 베드를 통과할 때까지 진공을 튜브에 적용시켰다. 단계를 반복하였다. 표준/샘플 매트릭스로부터 SPE 배지에서 트리톤 X-100을 농축시켰다. 별개로 활성화된 SPE 튜브에, 작업 표준 용액, 샘플, 및 블랭크 각각 0.50 mL를 피펫팅하였다. 용액이 배지 베드를 통과할 때까지 진공을 SPE 튜브에 적용시켰다. SPE 베드에서 잔류 단백질을 제거하였다. 물 1 mL를 각 SPE 튜브에 첨가하고, 물이 배지 베드를 통과할 때까지 진공을 튜브에 적용시켰다. 단계를 반복하였다. SPE 베드로부터 트리톤 X-100을 용출시켰다. 다기관에 진공을 꺼 단위가 정상압이 되게 하였다. 표준 및 샘플 SPE 튜브가 여전히 부착된 상태로 다기관의 뚜껑을 온화하게 들어 올렸다. "폐기" 시험 튜브를 한 셋트의 미리표지된 시험 튜브 (표준, 블랭크, 및 샘플에 대해)로 교체하여 임의의 트리톤 X-100을 수집하였고, 이는 다음 단계에서 SPE 베드로부터 용출될 수 있었다. 이는 용출 시험 튜브였다. 각 샘플, 블랭크, 및 표준 SPE 베드가 각각의 용출 시험 튜브를 아래에 확실히 보유하도록 하면서 다기관의 뚜껑을 교체하였다. 0.50 mL 아세토니트릴을 각 SPE 튜브에 첨가하고, 모든 아세토니트릴이 배지 베드를 통과할 때까지 진공을 튜브에 적용시켰다. 다기관에 진공을 끄고, 뚜껑을 들어 올려 용출물 시험 튜브를 회수하였다. 크로마토그래피 시스템으로의 주입을 위해 표준, 샘플, 및 블랭크의 아세토니트릴 용출물을 오토샘플러 바이알에 넣었다.
시스템 적합성
주입 시작 전에 약 1시간 동안 이동상으로 칼럼/시스템을 평형화한다. 표준 용액의 크로마토그램을 수득한다. 트리톤 X-100에 대한 체류시간은 5
Figure 112011097388832-pat00259
1분이이어 한다. 트리톤 X-100에 대한 칼럼 효율은 이론단수의 단수 N으로서 평가하여 >2000 단/칼럼이어야 하며, 이는 하기 방정식에 따라 계산하는 경우이다:
Figure 112011097388832-pat00260
여기서,
t는 트리톤 X-100 피크의 체류시간이고, w는 기준선에 대해 피크 측면을 외삽하여 수득한 트리톤 X-100 피크의 기준선에서의 폭이다. 표준 용액을 3회 이상 주입한다. 최종 3회 주입의 면적 계수의 백분율 RSD는 3.0％ 이하이어야 한다.
기준 및 샘플 크로마토그램으로부터 블랭크 크로마토그램을 빼고, 하기 계산에 따라 진행한다: 트리톤 X-100의 농도 (ppm)=
Figure 112011097388832-pat00261
여기서,
Figure 112011097388832-pat00262
실시예 58 - CTLA4-Ig 조성물 CHO 세포 DNA 함량을 측정하기 위한 분석
이 절차는 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 분석을 사용하여 CTLA4-Ig 약물 재료의 샘플 중의 잔여 CHO DNA를 검출하기 위해 계발되었다. PCR은 DNA 혼합물의 복제이다. 이 분석은 특정 CHO PCR 생성물을 검출하는 형광생성 프로브를 사용하였는데, 이는 이것이 분석 동안 누적되기 때문이다. PCR 생성물의 증폭 속도는 샘플에 존재하는 출발 DNA 양에 직접적으로 비례한다. 목적은 CTLA4-Ig 조성물의 샘플 중의 CHO 게놈 DNA의 양을 검출하는 것이다.
샘플은 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석에 의해 생물학적 샘플 중의 CHO DNA를 검출함으로써 분석된다. 계산을 수행하고, 결과는 pg/mg 단위로 2개의 유의한 값으로 나타난다. 결과가 분석의 정량화 한계 미만인 경우에는, 결과를 < Q.L.로서 보고하고, 분석의 Q.L.은 기록한다. DNA 값을 피코그램/밀리그램로 전환한다. pg/mL 값을 280 nm에서의 흡광도로 측정한 샘플의 농도로 나눈다. 단백질 농도 50 mg/mL인 샘플에 대한 실시예 계산 및 바이오릴라이언스(Bioreliance)로부터의 보고된 값 = 0.67 fg/μL. 단계 1 : pg/mL로 전환 = 0.67 pg/mL 단계 2: pg/mg으로 전환 = (0.67 pg/mL / 50.0 mg/mL) = 0.013 pg/mg.
실시예 59 - 생물학적 샘플 및 CTLA4-Ig 조성물 중의 MCP-1 단백질의 측정
실시예는 생물학적 샘플 및 CTLA4-Ig 샘플 중의 잔여 MCP-1-유사 단백질을 정량하기 위해 사용되는 방법을 나타낸다.
재료:
Figure 112011097388832-pat00263
시약
포스페이트 완충 염수 (PBS, 10 mM 포스페이트 완충액, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.3 내지 7.5). 제조자 사용법에 따라 병에서 제조한다. 충분한 크기의 용기에 HPLC 등급수, PBS 펠렛 및 교반 막대를 넣는다. 교반 플레이트 상에서 펠렛 및 염이 용해될 때까지 혼합한다. pH 7.3 내지 7.5를 필요에 따라 수산화나트륨 또는 염산으로 조정한다. 잘 혼합될 때까지 교반한다. 1회용 0.22 μm 필터 유닛을 통해 여과한다. 용액을 2 내지 8℃에서 제조일로부터 30일 이하 동안 저장한다.
MCP-1 (단핵구 화학주성 단백질-1)은 손상 및 감염 부위에 단핵구를 동원하는데 중요한 역할을 수행하는 인간 단백질이다. 단백질은 상동성 및 MCP-1에 대한 항체와의 교차-반응성에 기초하여 MCP-1-유사로서 고려될 수 있다. ELISA에 사용되는 항체만 표적 단백질의 부분을 인식하기 때문에 MCP-1의 말단절단 형태는 기술적으로 활성이 아닐지라도 분석에서 반응할 수 있다. 따라서, 분석이 전장 MCP-1 및 올바른 에피토프를 함유한 MCP-1의 임의의 변이체를 검출하도록 분석에서 반응하는 햄스터 MCP-1의 임의의 변이체를 정량할 것이다. 폴리클로날 항체 혼합물을 사용함으로써 다수의 에피토프가 나타날 것이 더욱 가능성 있음에 유의한다.
세척 용액 (1.0 mM 포스페이트 완충액, 137 mM NaCl, 0.27 mM KCl, pH 7.3 내지 7.5, 0.01％ v/v 트윈 20을 함유함). 증류수 또는 HPLC 등급수 4.0 L에 교반 막대, 2개 PBS 정제, 28.8 g의 NaCl, 및 0.4 mL의 트윈 20을 첨가한다. 모든 함유물이 용해될 때까지 완만히 혼합한다. pH 7.3 내지 7.5를 필요에 따라 수산화나트륨 또는 염산으로 조정한다. 2 내지 8℃에서 제조일로부터 30일 이하 동안 저장한다.
희석제 (PBS, pH 7.3 내지 7.5, 1％ w/v BSA, 및 0.05％ v/v 트윈 20 함유). (시판 입수가능한 희석제를 사용하는 변법임을 유의함). 포스페이트 완충 염수 4 L에, 교반 막대, 40 g의 BSA 및 2 mL의 트윈 20을 첨가한다. 모든 함유물이 용해될 때까지 완만히 혼합한다. 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 미개봉 저장 또는 개봉후 7일 저장하는 경우에 2 내지 8℃에서 제조일로부터 30일 이하 동안 저장한다.
플레이트 코팅 시약. 제조자 사용법에 따라 염소 항-마우스 MCP-1 항체의 몇몇 바이알을 재구성하고, 수회 완만히 뒤집어 혼합하고, 합한다. 분취액을 제조하고, -20℃에서 1년 이하 동안 (제조자 유효 기간을 초과하지 않음) 저장한다. 반복되는 동결 해동을 피한다. 달리, 동결건조된 샘플 바이알은 -20℃에서 6개월 초과 동안 저장할 수 있다. 재구성시에, 항체를 2 내지 4℃에서 1개월 동안 저장할 수 있다.
2차 시약. 제조자 사용법에 따라 토끼 항-래트 MCP-1 항체의 1개 바이알을 재구성하고, 수회 완만히 뒤집어서 혼합한다. 용액을 2 내지 8℃에서 4주 이하 동안 저장한다. 달리, 동결건조된 샘플 바이알은 -20℃에서 1년 초과 동안 안정하다.
3차 시약. 몇몇 바이알의 염소 항-토끼 IgG (H+L) HRP를 합하고, 수회 완만히 뒤집어서 혼합한다. 분취액을 제조하고, -20℃에서 2년 이하 동안 (제조자 유효 기간을 초과하지 않음) 저장한다. 반복되는 동결 해동을 피한다. 해동된 경우에는 바이알을 2 내지 8℃에서 30일 이하 동안 저장할 수 있다.
표준물의 제조. MCP-1-유사 단백질 스톡으로부터 희석제 중의 25.6 ng/mL 용액을 제조하고, 그로부터 계단 희석 (2배) 단계로 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 및 0.4로 희석한다. 0 ng/mL 표준물은 희석되지 않은 희석제이다.
0.97 mg/mL의 스톡 농도를 갖는 MCP-1 참고 물질을 사용하여 표준물을 제조하는 예:
b) (용액 A) 희석제 중의 5200 ng/mL의 2.5 mL 제조:
13.4 uL 스톡 + 2.487 mL 희석제
c) (용액 B) 희석제 중의 25.6 ng/mL의 3.9 mL 제조:
19.2 uL 스톡 a + 3.881 mL 희석제
하기 정의된 용량으로 잔존 표준물을 제조한다:
Figure 112011097388832-pat00264
각 용액을 대략 2 내지 3초 동안 중간 설정에서 와동하고, 이어서 2 내지 3회 완만히 뒤집음으로써 각 용액을 혼합한다.
품질 대조군 샘플의 제조. 품질 대조군 (QC) 샘플을 희석제 중의 MCP-1 유사 단백질의 바이알로부터 제조한다. 동결을 위한 하기 품질 대조군 샘플을 제조하는 520 ng/mL 용액 스톡 농도를 제조한다: 11.0 ng/mL, 5.3 ng/mL, 및 1.2 ng/mL. 하기 표에 기재한 바와 같이 희석한다.
스톡 농도 0.97 mg/mL를 갖는 MCP-1 참고 물질을 사용하여 QC를 제조하는 예:
a) (용액 A) 희석제 중의 5200 ng/mL의 2.5 mL를 제조한다:
13.4 uL 스톡 + 2.487 mL 희석제
b) (용액 B) 희석제 중의 520 ng/mL의 5.0 mL를 제조한다:
500 uL 스톡 + 4.500 mL 희석제
c) 하기와 같이 MCP-1 유사 단백질 QC 샘플의 최종 희석물을 제조한다:
Figure 112011097388832-pat00265
각 용액을 대략 2 내지 3초 동안 중간 설정에서 와동하고, 이어서 2 내지 3회 완만히 뒤집음으로써 각 용액을 혼합한다.
시험 샘플의 제조. 각 시험 샘플은 희석된 시험 물질로 이루어진다. 시험 샘플은 시험 샘플 200 μL을 희석제 200 μL에 첨가함으로써 제조한다. 각 용액은 중간 설정에서 대략 2 내지 3초 동안 와동하고, 이어서 2 내지 3회 완만히 뒤집음으로써 혼합한다.
절차. 플레이트 코팅. 염소 항-마우스 MCP-1 항체를 PBS로 5 μg/mL로 희석한다. 항체 및 PBS 용액은 중간 설정에서 대략 2 내지 3초 동안 와동하고, 이어서 2 내지 3회 완만히 뒤집음으로써 혼합한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 이 용액 100 μL를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 플레이트 봉쇄기로 덮고, 실온에서 12 내지 18시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트 세척. 플레이트는 세척 용액으로 플레이트 세척기를 사용하여 3회 세척한다. 세척기를 0 침액 시간과 함께 300 μL/웰 및 3회 세척으로 설정한다. 달리, 플레이트는 손수 세척할 수 있다. 세척 용액 300 μL를 각 플레이트의 각 웰에 다중채널 파이펫기기를 사용하여 첨가한다. 가볍게 쳐서 싱크대로 제거하고 종이 타월 상에서 완만히 빨아들이게 하여 웰을 비운다. 3회 반복한다. 플레이트 블로킹. CSBB 300 μL를 각 웰에 다중채널 파이펫기기를 사용하여 첨가한다. 플레이트를 대략 60 ±10분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 샘플 첨가. 참조 표준물, 품질 대조군 (각 농도의 2 셋트), 및 시험 샘플을 플레이트에 3벌로 100 μL/웰 첨가하고, 대략 60 ±10분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 외부 웰은 사용하지 않는다. 2차 토끼 항-래트 MCP-1 항체를 제조한다. 토끼 항-래트 MCP-1 항체 스톡을 2 μg/mL로 또는 분석에 사용되는 플레이트에 충분한 용량으로 희석물 중의 (로트 등가 시험 또는 COA에 따라) 적절한 희석으로 희석한다. 용액을 대략 2 내지 4초 중간 설정에서 와동한다. 플레이트 세척을 반복하지만 5회 세척한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 2차 항체 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 60 ±10분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 3차 염소 항-토끼 HRP 접합체 용액 (0.5 μg/mL 또는 적절한 희석)을 희석제로 제조한다. HRP 접합체를 중간 설정에서 대략 2 내지 3초 동안 와동하고, 이어서 2 내지 3회 완만히 뒤집음으로써 혼합한다. 시약 자격부여를 위해 부문별 SOP에 따라 확립된 농도로 희석한다. 플레이트 세척을 5회 반복한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 HRP 접합체 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온 암실에서 대략 30 ±5분 동안 인큐베이션한다. 플레이트 세척을 5회 반복한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 TMB 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 주위 온도 암실에서 대략 2.5 내지 4분 동안 인큐베이션한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 100 μL의 1.0N H2SO4를 TMB 첨가와 동일한 순서로 첨가함으로써 TMB 반응을 정지시킨다. 광학 밀도를 450 nm에서 630 nm의 참조 파장과 함께 96-웰 플레이트 판독기 상에서 판독한다.
모범 값. 표준물에 대한 모범 값은 정량적 한도 (QL) (0.8 ng/mL) 이상의 이들 값에 적용하며, 이는 QL 미만 값은 곡선 극단의 설정을 돕는데만 사용되기 때문이다. 하기 계산을 사용하는 평균 배경 (0 ng/mL 표준물)은 ≤0.1 흡광도 단위이어야 한다.
Figure 112011097388832-pat00266
여기서, X1,2,3 = 데이타 셋트 중의 특정 값
N = 데이타 셋트 중의 값 수
표준 곡선을 측정하기 위해 사용되는, 0, 0.4 및 QL (0.8 ng/mL)을 제외한 각 표준 농도는 표적 (공칭) 값의 15％ 이내이어야 한다. 표준 곡선을 측정하기 위해 사용되는, 0, 0.4 및 QL (0.8 ng/mL)을 제외한 각 표준 농도에서의 3벌 AB450 값의 변동 계수 (％CV)는 ≤15％이어야 한다. CTLA4-Ig 조성물의 시험 샘플에 대한 중간 계산 MCP-1 농도는 ≤ 11.0 ng/mL이어야 한다. 평균 계산 MCP-1 농도가 ≥ 0.8 ng/mL (분석 QL)인 경우에 3벌 측정의 ％CV를 계산하고, 모범 값은 ≤ 20％이어야 한다. 모범 값이 부합되는 경우에, 평균 MCP-1 농도를 사용하여 ppm으로 계산한다. 계산된 MCP-1 농도는 ≤ 0.8 ng/mL (분석 QL)인 경우에 샘플은 < QL로서 보고되고, 값 "< 0.8 ng/mL"를 사용하여 ppm으로 계산한다. 3벌 측정의 ％CV는 고려되지 않는다.
QC 샘플은 소정의 농도에서 3개 웰의 셋트로서 정의되기 때문에, 이 방법에서 언급되는 3개 공칭 농도의 경우에 총 6개의 QC 샘플이 있다. QC 샘플에 대한 3개 웰 중 2개 이상의 농도는 허용되는 QC 샘플에 대한 언급된 공칭 농도의 20％를 가져야 한다. 18개 QC 샘플 측정 중 12개 이상은 그의 각 표적 값의 20％ 이내이어야 한다. 18개 QC 샘플 (동일한 농도에서 3개가 아님) 중 6개는 각 공칭 값으로부터 20％ 이상 이탈할 수 있다. 6개 QC 샘플 중 4개 이상은 허용되어야 한다. 2개는 불허용으로 받아들여지며, 이는 모두 동일한 농도가 아님을 나타낸다.
데이타 평가. 프로토콜 파일 MCP-1.ppr을 사용하며 소프트맥스(Softmax)(상표명) 소프트웨어를 사용하여 형태의 비가중 4개 파라미터 회귀를 사용함으로써 표준 곡선을 작제한다.
Figure 112011097388832-pat00267
여기서,
A = 최소 점근선에 상응하는 흡광도450 값
D = 최대 점근선에 상응하는 흡광도450 값
c = 최대 점근선 값과 최소 점근선 값 간의 절대 차이의 1/2에 상응하는 농도
b = 곡선의 직선 부위의 근접 경사도
x = 참조 표준물의 농도
MCP-1-유사 단백질의 농도 계산. 시험 샘플 중의 MCP-1 유사 단백질의 양은 소프트맥스 플레이트 판독기 소프트웨어를 사용하여 계산할 수 있다. 하기 예는 어떻게 최종 결과가 보고될 수 있는가를 설명한다. 각 샘플의 2배 희석을 분석한다. 계산된 농도를 적절한 희석 계수 (2)로 곱하여 비-희석 시험 물질 중의 농도를 얻는다.
예시:
1) 희석된 시험 샘플은 10.0 ng/mL이다.
비-희석 시험 물질 중의 MCP-1 유사 단백질 농도는 하기와 같음:
10 ng/mL x 2 = 20 ng/mL MCP-1
2) 희석된 샘플 결과는 "<0.8 ng/mL"이다.
비-희석 시험 물질 중의 MCP-1 유사 단백질 농도는 하기와 같음:
"<0.8 ng/mL" x 2 = "<1.6 ng/mL" MCP-1
최종 결과를 샘플 1 mg당 MCP-1-유사 단백질 (ng) (ppm)로 보고하기 위해 비-희석된 샘플 농도에 의해 상기 수득한 결과를 나눈다.
예시:
1) 시험 샘플 단백질 농도 = 50 mg/mL
MCP-1 유사 단백질 농도 = 200 ng/mL:
200 ng/mL MCP-1 / 50 mg/mL = 4 ng/mg
샘플은 4 ppm (백만분율)으로서 보고한다.
2) 시험 샘플 단백질 농도 = 50 mg/mL
MCP-1 유사 단백질 농도 = "<1.6 ng/mL":
"<1.6 ng/mL" MCP-1 / 50 mg/mL = "<0.032 ng/mg"
샘플은 "<QL,(<0.032 ppm)"로서 보고한다.
실시예 60: CTLA4-Ig 약물 재료 물질의 방출 시험을 위한 ELISA에 의한 CD- CH01 단백질의 측정 잔여 수준의 분석
카르보네이트 완충액. 교반 막대를 함유한 적합한 용기에 HPLC 등급수와 함께 2개 카르보네이트 완충액 캡슐의 함유물 200 mL를 첨가한다. 교반 플레이트를 사용하여 물질이 용액 중에 용해될 때까지 혼합한다. pH 측정기를 사용하여 필요에 따라 1 N NaOH 또는 H2SO4를 사용함으로써 pH를 9.6으로 조정한다. 교반 플레이트를 사용하여 용액을 최소 5분 동안 혼합한다. 용액을 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 용액을 2 내지 8℃에서 30일 이하 동안 저장하고, 부문 절차에 따라 표지한다.
세척 완충액 (0.05％ v/v 트윈 20을 함유하는 PBS, pH 7.4). HPLC 등급수의 4 L 병에 교반 막대, 20개 PBS 정제를 첨가하고, 2 mL의 트윈 20을 첨가한다. 교반 플레이트를 사용하여 물질이 용액 중에 용해될 때까지 혼합한다. pH 측정기를 사용하여 필요에 따라 1 N NaOH 또는 1 N HCl를 사용함으로써 pH를 7.4로 조정한다. 교반 플레이트를 사용하여 용액을 최소 5분 동안 혼합한다. 용액 2 내지 8℃에서 30일 이하 동안 저장하고, 부문 절차에 따라 표지한다.
스트렙타비딘-HRP. 0.5 mL의 HPLC 등급수를 스트렙타비딘-HRP의 바이알에 첨가한다. 혼합을 위해 바이알 뚜껑을 닫고, 완만히 대략 10초 동안 와동한다. 0.5 mL의 글리세롤을 스트렙타비딘-HRP의 바이알에 첨가한다. 혼합한다. 용액을 깨끗한 파스퇴르 파이펫으로 끌어당김으로써 용액 투명도를 확인한다. 용액이 투명하지 않는 경우에, 3.3.2에 따라 혼합하고, 3.3.5를 용액이 투명해질 때까지 반복한다. 부문 절차에 따라 스트렙타비딘 HRP의 로트에 사용될 적절한 희석 계획안을 결정한다. 20 μL 용량을 0.5 mL 스크류 캡 튜브에 분취한다. 뚜껑을 닫아 세포 저장 박스에 둔다. 용액을 -20℃에서 365일 이하 동안 저장하고, 부문 절차에 따라 표지한다.
정지 용액 (1 N H2SO4). 흄 후드에서 적합한 컨테이너를 교반 플레이트 상에 둔다. 교반 막대를 첨가한다. HPLC 등급수 485.6 mL를 첨가한다. 교반 플레이트를 켜서 물 교반을 개시한다. 서서히 14.4 mL의 진한 H2SO4를 첨가한다. 용액은 90일 동안 실온에서 저장하는 경우에 안정하다. 용액을 부문 절차에 따라 표지한다.
절차. 플레이트 코팅. 미량역가 플레이트를 코팅하기 위해 카르보네이트 완충액 중의 정제된 토끼 항-CD CD CHO1 항체의 8 μg/mL 용액을 제조한다 (10 mL의 용액이 1개 미량역가 플레이트당 요구됨). 이 용액 100 μL를 이뮬론(Immulon) 4 미량역가 플레이트의 각 웰에 다중채널 파이펫기기를 사용하여 첨가한다. 미량역가 플레이트를 파라필름으로 덮고, 2 내지 8℃에서 18 ±2시간 동안 인큐베이션한다.
플레이트 세척. 플레이트를 세척 완충액 300 μL로 플레이트 세척 기구를 사용하여 3회 세척한다 (달리, 플레이트는 다중채널 파이펫기기를 사용하여 손수 세척될 수 있음). 최종 세척 후에, 플레이트는 뒤집어서 경질 표면 상에 둔 종이 타월에 가볍게 쳐야 한다.
플레이트 블로킹. 다중채널 파이펫을 사용하여 시블록(SeaBlock) 300 μL를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 암실에서 1시간 (± 6분) 동안 실온에서 인큐베이션한다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸거나 또는 캐비닛 또는 서랍에 둘 수 있다. 하기 희석 과정에 따라 15 mL 계량 멸균 폴리프로필렐 튜브에서 테크노바(Teknova) 희석제를 사용하여 표준 곡선 샘플을 제조한다. 비고: 하기 희석 과정은 5개 플레이트에 대한 것이다. 분석의 플레이트 수에 맞게 용량을 조정한다. 분석 증명서 (COA)로부터의 CD-CHO1 단백질 참조 표준물 (Ref Std)의 단백질 농도를 얻는다. CD-CHO1 단백질 Ref Std의 30 μg/mL 용액을 제조한다. CD-CHO1 단백질 Ref Std의 요구 용량을 계산하여 30 μg/mL 용액을 얻는다. CD-CHO1 단백질 Ref Std에 대한 최소 전달 용량은 10 μL이어야 한다.
수학식:
Figure 112011097388832-pat00268
비고: 단위는 상용가능하게 한다.
예시:
Figure 112011097388832-pat00269
목적하는 용량으로부터 CD-CHO1 단백질 Ref Std의 요구 용량을 뺌으로써 희석제의 용량을 계산한다.
수학식: (목적 용량)-(Ref Std 용량) = (희석제 용량)
예시: 10.0 mL - 0.012 mL = 9.988 mL 희석제
CD-CHO1 단백질 Ref Std의 계산된 용량을 계산된 희석제 용량을 함유하는 15 mL 멸균 튜브에 첨가한다. 튜브 뚜껑을 닫고, 2 내지 4초 사이로 설정하여 와동한다. 잔존 표준물을 제조한다. 하기 표를 예로서 나타낸다:
Figure 112011097388832-pat00270
튜브 뚜껑을 닫은 후에, 각 희석 단계를 수행하고, 다음 희석 단계 진행 전에 2 내지 4초 동안 완만히 와동한다.
하기 희석 과정에 따라 15 mL 계량 멸균 폴리프로필렐 튜브에서 테크노바 희석제를 사용하여 품질 대조군 (QC) 용액을 제조한다. 분석 증명서 (COA)로부터 CD-CHO1 단백질 참고 물질 (Ref Mat)의 단백질 농도를 수득한다. CD-CHO1 단백질 참조 표준물 (Ref Mat)의 30 μg/mL 용액을 제조한다. 튜브 뚜껑을 닫고, 2 내지 4초 동안 사이로 설정하여 와동한다. 농도 700, 100, 및 25 ng/mL의 QC 용액을 제조한다. 모범 희석 과정을 하기에 나타낸다:
Figure 112011097388832-pat00271
각 QC 용액에 대한 튜브 뚜껑을 닫고, 완만히 2 내지 4초 동안 와동한다. 품질 대조군 용액을 분석일에 새롭게 제조할 수 있거나 또는 이를 분취하여 동결시킬 수 있다. 3개 독립 실험에서의 3개 QC 용액의 실제 농도를 측정한다. 각 QC 용액에 대한 3개 실험으로부터의 결과를 평균하고, 3개 QC 용액의 각각에 대한 COA를 발부한다. 이들 실험적으로 결정된 QC 농도는 CTLA4-Ig 샘플에 대한 분석을 수행하는 경우에 표적 값으로서 사용되어야 한다. -70℃에서 분취액을 사용하기 위한 준비로 QC 용액을 저장한다. QC 용액은 제조 6개월 후에 만기가 된다. 분석일에 저장고로부터 QC 용액을 들어내고, 실온에서 해동한다. 해동된 QC 용액을 중간 설정에서 사용전 2 내지 4초 동안 와동한다.
샘플 제조. 각 CTLA4-Ig 샘플에 대해 희석제 중에서 분석될 용액 대략 12.5 mg/mL은 약물 재료 샘플 250 μL를 희석제 750 μL에 첨가함으로써 제조한다. 튜브 뚜껑을 닫고, 완만히 2 내지 4초 동안 와동한다. 각 CTLA4-Ig 샘플에 대해 분석될 용액 6.25 mg/mL은 용액 12.5 mg/mL의 400을 400 μL의 희석제를 함유한 튜브에 첨가함으로써 제조한다. 튜브 뚜껑을 닫고, 완만히 2 내지 4초 동안 와동한다. 각 CTLA4-Ig 샘플에 대해 분석될 용액 3.125 mg/mL은 용액 6.25 mg/mL의 400을 400 μL의 희석제를 함유한 튜브에 첨가함으로써 제조한다. 튜브 뚜껑을 닫고, 완만히 2 내지 4초 동안 와동한다. 세척 단계를 반복하여 플레이트를 세척한다. 각 표준 농도, 샘플, 및 QC 용액의 웰당 3벌로 100 μL를 블로킹 및 세척된 플레이트에 첨가한다. 각 QC 용액을 1개 플레이트당 6개 웰에 2회 첨가한다. 1시간 (± 6분) 동안 암실에서 실온에서 인큐베이션한다. 세척을 5회 반복한다. 스트렙타비딘-HRP를 냉동장치로부터 들어내어 실온이 되게 한다. 토끼 항-CD CHO1-비오틴 항체를 테크노바 완충액 중의 2 μg/mL로 희석한다. 용액을 중간 설정에서 대략 2 내지 4초 와동한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 1웰당 100 μL를 첨가한다. 1시간 (± 6분) 동안 실온 암실에서 인큐베이션한다. 스트렙타비딘-HRP를 부문 절차에 따라 시약 로트의 자격부여에 기초한 분석에 사용하기 위해 확립된 농도로 희석한다. 뚜껑을 닫고, 용액을 중간 설정에서 대략 2 내지 4초 와동한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 100 μL의 스트렙타비딘-HRP 희석물을 각 웰에 첨가한다. 실온 암실에서 1시간 (+ 6분) 동안 인큐베이션한다. 반복한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 100 μL의 TMB 크로모젠을 각 웰에 첨가한다. 주위 온도에서 2분 (± 12초) 동안 인큐베이션한다. 다중채널 파이펫을 사용하여 정지 용액 (1 N H2SO4)을 100 μL/웰 첨가한다. 각 웰에서 크로모젠이 효소와 동일한 반응 시간을 확실히 가지도록 크로모젠을 첨가하였을 때 정지 용액을 동일한 순서로 플레이트 및 웰에 첨가한다. 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus) 플레이트 판독기를 사용하여 630 nm의 참조 파장과 함께 450 nm에서의 흡광도를 적절한 96 웰 플레이트 판독기 상에서 측정한다.
데이타 평가. 소프트맥스 프로그램 템플릿을 참조하여 평균, 표준 편차 및 ％CV 등을 산출한다. 각 모범 값은 각 참조물, QC 및 분석된 샘플 희석액에 대해 얻은 3벌 흡광도 값을 사용하여 결정한다. 표준 곡선을 산출한다. 형태의 4-파라미터 회귀를 사용하여 참조 표준물 데이타를 작성한다.
Figure 112011097388832-pat00272
여기서,
AB = 450 나노미터에서의 흡광도
A = 최소 점근선에 상응하는 흡광도 값
D = 최대 점근선에 상응하는 흡광도 값
c = 최대 점근선 값과 최소 점근선 값 간의 절대 차이의 1/2에 상응하는 농도
B = 곡선의 직선 부위의 근접 경사도
x = CD-CHO1 참고 물질의 농도
상기 수학식을 사용하여 계산된 평균을 사용함으로써 표준물에 대한 회귀선의 결정 계수 (R2)를 결정한다. 샘플 중의 CD-CHO1 농도를 계산한다. 중간 샘플 결과를 적절한 희석 계수 (즉, 4, 8, 및 16)와 곱하여 원래 샘플 중의 CD-CHO1의 농도 (ng/ml)를 얻는다. 결과를 보고된 CTLA4-Ig 단백질 농도 (mg/ml)로 나누어서 CD-CHO1의 농도를 CTLA4-Ig의 ng/mg으로 얻는다. 결과 모두의 평균을 측정하며, 이들은 모두 표준 곡선의 범위 내에 속한다. 희석 계수를 적용함으로써 비-희석된 샘플 중의 CD-CH01 단백질 농도를 계산한다. CTLA4-Ig 샘플 농도에 상대적인 CD-CHO1 단백질 농도를 측정하기 위해 비-희석된 농도로 나눈다.
예시적 계산:
Figure 112011097388832-pat00273
비고: ng CD CHO1/mg 생성물 (ng/mg)은 백만분율 (ppm)에 상당한다.
모범 값. 표준물에 대한 모범 값. 표준 곡선에 대한 결정 계수 (R2)는 ≥ 0.99이어야 한다. 0 ng/mL 표준물에 대한 평균 배경은 ≤ 0.10 흡광도 단위이어야 한다. 0 및 QL (12.3 ng/mL) 미만의 농도를 제외한 표준 곡선을 측정하기 위해 사용되는 각 표준 농도에서의 계산된 값 (ng/mL)의 평균은 소프트웨어로 측정하여 표적 (공칭) 값의 20％ 내이어야 한다. 0 및 QL (12.3 ng/mL) 미만의 농도를 제외한 표준 곡선을 측정하기 위해 사용되는 각 표준 농도에서의 3벌 흡광도 값의 변동 계수 (％CV)은 소프트웨어로 측정하여 20％ 미만이어야 한다. 2 이상의 합치 데이타 지점이 확실히 계산에 사용될 수 있게 하기 위해 표준물, 품질 대조군, 및 샘플을 3벌로 웰에 로딩한다. 각 3벌 값을 개별적으로 분석한다. 표적으로부터 가장 먼 곳에 있는 값을 제외한다.
예시:
Figure 112011097388832-pat00274
표적 값 50 ng/mL로부터 가장 먼 단일 값은 25 ng/mL이었다. 3벌로부터 25 ng/mL 값을 제거함으로써 남은 값들의 평균은 모든 모범 값에 충족한다.
남은 2개 값의 평균이 여전히 모범 값을 충족하지 못하는 것으로 나타나는 경우에는 단일 지점을 제거하고, 곡선을 다시 계산한다.
예시:
Figure 112011097388832-pat00275
평균 값은 표적 값이 제거되어 단일 지점이 곡선으로부터 제외되고, 곡선이 다시 계산될 것과 관련 없이 표적으로부터 >20％이다. 표준 곡선 상의 2개 지점만 제거될 수 있다.
QC 샘플에 대한 모범 값. QC 샘플은 이 방법 (총 6개 QC 샘플이 있음)에는 언급되는 3개 공칭 농도에 대한 소정의 농도에서 3개 웰의 셋트로서 정의된다. QC 샘플에 대한 3개 웰 중 2개 이상은 허용가능할 QC 샘플에 대한 공칭의 20％ 이내이어야 한다. 6개 QC 샘플 중의 4개 이상은 그들의 각 표적 농도의 20％ 이내이어야 한다; 6개 QC 샘플 중 2개 (동일한 농도에서의 2개는 아님)는 소프트웨어로 계산하여 공칭으로부터 20％ 편차를 초과할 수 있다. 18개 QC 샘플 웰 중 6개 이하의 편차는 각 표적 농도의 20％를 초과할 수 있다.
시험 샘플에 대한 모범 값. 분석된 시험 샘플에 대한 평균 흡광도는 표준 곡선 상의 최고점 미만이어야 한다. 샘플의 평균 흡광도가 평균 흡광도 3000 ng/mL 표준물을 초과하는 경우에, 시험 샘플은 3000 내지 12.3 ng/mL의 평균 흡광도를 얻도록 충분히 희석하여야 한다. 3개 샘플 희석액 (12.5, 6.25 및 3.125 mg/mL) 중 1개 이상의 평균 흡광도는 모든 희석물의 평균 흡광도가 QL (12.3 ng/mL 표준물)의 평균 흡광도 미만이 아니라면 보고가능한 결과에 대한 표준 곡선의 범위 이내이어야 한다. 이 경우에, 시험 샘플은 < QL로서 보고된다. QL 초과이고, 표준 곡선의 범위 이내인 샘플 희석액의 3벌 흡광도 값의 평균은 소프트웨어로 측정하여 20％ 미만의 CV를 나타내야 한다. 3벌 흡광도 중 하나를 제거하고, 재계산하는 경우에 CV가 여전히 > 20％이거나 또는 2개 샘플 희석액이 20％ 초과인 흡광도의 CV를 가지고, 표준 곡선의 범위 내에 속한다면 분석에서 이 샘플을 반복하여야 한다.
실시예 61 - CTLA4-Ig 조성물 중의 트리톤 X-100의 잔여량에 대한 분석.
물질
Figure 112011097388832-pat00276
기구 사용
Figure 112011097388832-pat00277
시약의 제조
이동상 제조: 아세토니트릴:물(80:20). 1 L 경우에, 800 mL의 아세토니트릴 및 200 mL의 정제수 또는 HPLC 등급수를 교반 막대로 완전히 혼합한다. 0.2 μm 나일론 필터를 통해 여과한다. 인라인 탈기장치, 예컨대 얼라인스(Alliance) 시스템 또는 헬륨 살포를 사용하여 이동상을 탈기시킨다. 새롭게 매일 제조한다.
2 N NaOH. 80 ±1 g의 고체 NaOH를 칭량하고, 1 L 플라스크에 정량적으로 옮긴다. 정제수 또는 HPLC 등급수로 상기 용량에 이르게 한다. 교반 막대로 잘 혼합하고, 0.22 μm 필터 기기를 통해 여과한다. 달리, 10 N NaOH 용액을 계단 희석한다. 6개월 이하 실온에서 저장한다.
약물 재료 완충액. NaH2PO4-H20 3.45 g 및 NaCl 2.92 g을 칭량하여 1 L 플라스크로 정량적으로 옮긴다. 대략 800 mL의 정제수 또는 HPLC 등급수를 첨가한다. 교반 막대로 잘 혼합하고, 정제수 또는 HPLC 등급수로 상기 용량에 이르게 한다. 2 N NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 조정한다. 0.22 μm 필터 유닛을 통해 용액을 여과한다. 4℃에서 4개월 이하 저장한다.
표준물 샘플 블랭크의 제조. 미리 분석하여 검출가능한 수준의 트리톤 X-100을 함유하지 않는 것으로 확인된 임의의 CTLA4-Ig 샘플 또는 참고 물질이 샘플 블랭크로서 사용될 수 있다. 샘플 블랭크 단백질은 샘플(들)과 함께 전개되어야 한다. 트리톤 X-100을 서서히 물에 용해한다. 사용 전에 완전 용해를 위해 용액을 시험한다 (전형적으로 15분 후에). 트리톤 X-100이 물보다 점성이어서 용해되지 않은 양은 물의 존재하에 눈에 보인다.
10.0 μg/mL 트리톤 X-100 스톡 표준물 #1의 제조. 10.0 ±1.0 mg 트리톤 X-100을 100 mL 용량측정 플라스크에 정확히 칭량 첨가하고, 물로 상기 용량으로 희석하고; 교반 막대로 완만히 혼합한다. TX100 스톡 표준물 A로서 표지한다. 10 mL의 TX100 스톡 표준물 A를 100 mL 용량측정 플라스크 내에 취한다. 물로 상기 용량으로 희석한다. TX100 스톡 표준물 #1로서 표지한다. 매일 새롭게 제조한다.
10.0 μg/mL 트리톤 X-100 스톡 표준물 #2의 제조. 10.0 ±1.0 mg 트리톤 X-100을 100 mL 용량측정 플라스크에 정확히 칭량 첨가하고, 물로 상기 용량으로 희석하고; 교반 막대로 완만히 희석한다. TX100 스톡 표준물 B로서 표지한다. 10 mL의 TX100 스톡 표준물 B를 100 mL 용량측정 플라스크 내에 취한다. 물로 상기 용량으로 희석한다. TX100 스톡 표준물 #2로서 표지한다. 매일 새롭게 제조한다.
TX100 시스템 적합성 평가 용액 #1 (SS#1)의 제조. TX100 스톡 표준물 #1로부터 300 μL의 TX100 스톡 표준물 #1을 300 μL의 아세토니트릴로 희석함으로써 5.0 μg/mL TX100 시스템 적합성 평가 용액을 제조한다. 아래 위로 파이펫팅함으로써 잘 혼합한다.
TX100 시스템 적합성 평가 용액 #2 (SS#2)의 제조. TX100 스톡 표준물 #2로부터 300 μL의 TX100 스톡 표준물 #1을 300 μL의 아세토니트릴로 희석함으로써 5.0 μg/mL TX100 시스템 적합성 평가 용액을 제조한다. 아래 위로 파이펫팅함으로써 잘 혼합한다.
TX100 통과 대조군, 제한 표준물, 실패 대조군의 제조. TX 스톡 표준물 #1로부터 하기 표에서 확인되는 용액을 제조한다.
Figure 112011097388832-pat00278
샘플의 제조. 샘플을 농축 또는 희석 없이 사용한다.
절차: 트리톤 X-100을 표준물 및 샘플 용액으로부터 추출한다. 비고: 하기 기재되는 추출 단계를 3 내지 3.5 인치 Hg의 진공하에 수행한다.
고상 추출 (SPE) 매질의 활성화. 진공 매니폴드의 뚜껑을 올리고, 매니폴드 내의 선반에 12 x 75 mm 빈 시험관을 둔다. 이들을 "폐기" 시험관이다. 뚜껑을 제자리에 두고, SPE 카트리지를 진공 매니폴드 상에 두어, 확실히 각 SPE 튜브 밑에 "폐기" 시험관이 있도록 한다. 1000 μL의 아세토니트릴을 각 SPE 카트리지에 첨가하고, 모든 아세토니트릴이 매질층을 통과할 때까지 진공을 가한다. 추가 1000 μL의 아세토니트릴로 반복한다. 500 μL의 정제수 또는 HPLC 등급수를 각 SPE 카트리지에 첨가하고, 모든 물이 매질층을 통과할 때까지 진공을 가한다. 추가 500 μL의 정제수 또는 HPLC 등급수로 반복한다.
제한 표준물 및 대조군에 대한 SPE 매질 상의 트리톤 X-100의 농축. 각 제한 표준물, 통과 대조군, 실패 대조군 블랭크, 및 샘플 500 μL를 개별 활성화된 SPE 카트리지에 파이펫 첨가한다. 각 용액이 매질층을 통해 완전히 통과할 때까지 SPE 튜브에 진공을 가한다.
SPE 층으로부터의 잔여 단백질의 제거. 1000 μL의 물을 각 SPE 카트리지에 첨가하고, 튜브에 물이 매질층을 통해 통과할 때까지 진공을 가한다. 추가 1000 μL의 물로 상기 단계를 반복한다.
SPE 층으로부터의 트리톤 X-100의 용출. 매니폴드에 진공을 중단하여 단위 압력을 0으로 방출시킨다. 여전히 부착된 SPE 카트리지와 함께 매니폴드의 뚜껑을 완만히 올린다. "폐기" 시험관을 미리-표지된 "용출" 시험관 또는 오토샘플러 바이알 (미리-표지된 제한 표준물, 통과 대조군, 실패 대조군, 블랭크 및 샘플)로 교체하여 SPE 층으로부터 용출되는 임의의 트리톤 X-100을 수집한다. 매니폴드의 뚜껑을 제자리에 두어 각 제한 표준물, 통과 대조군, 실패 대조군, 블랭크, 및 샘플 SPE 카트리지가 하부에 각 용출 시험관 또는 오토샘플러 바이알을 확실하게 가지도록 한다. 아세토니트릴 500 μL를 각 SPE 카트리지에 첨가하고, 모든 아세토니트릴이 매질층을 통해 통과할 때까지 튜브에 진공을 가한다. 매니폴드에 진공을 중단하고, 뚜껑을 올려서 용출 시험관 또는 오토샘플러 바이알을 회수한다. 용출 시험관을 사용하는 경우에, 제한 표준물, 통과 대조군, 실패 대조군, 블랭크, 및 샘플의 아세토니트릴 용출액을 크로마토그래피 시스템 주입용 오토샘플러 바이알에 둔다. 오토샘플러 바이알을 사용하여 용출액을 수집하는 경우에, 바이알을 직접적으로 크로마토그래피 시스템에 둔다.
전개 조건
파장 225 nm
민감도 0.1 AUFS
이동상 아세토니트릴: 물 (80:20)
유속 0.8 mL/분
주입 용량 25 μL
칼럼 온도 주위 온도 (20-25℃)
대략적 체류시간 트리톤 X-100: 5.0 ±1분
총 전개 시간 10분
오토샘플러 온도 10 ±4℃
시스템 적합성. 크로마토그래피 시스템을 설정하고; 램프를 가온하고, 분석 전에 1시간 이상 동안 이동상으로 시스템을 평형화한다. SS #1을 최소 4회 주입한다. 달리 특정되지 않는 한 모든 시스템 적합성 분석에 제2 SS #1 주입을 사용한다. 트리톤 X-100에 대한 체류시간은 5.0 ±1분이었다. X-100에 대한 칼럼 효율은 이론단수의 단수 (N)로서 평가하여 하기 방정식에 따라 계산하는 경우에 ≥ 2000 단수/칼럼이어야 한다:
Figure 112011097388832-pat00279
여기서,
t = 주입 시간 대 피크 최고 용출 시간으로부터 계산한 트리톤 X-100 피크의 체류시간.
w = 피크의 측면을 기준선에 외삽함으로써 측정한 트리톤 X-100 피크의 폭.
트리톤 X-100 피크와 가장 가까운 인접 피크 (존재하는 경우에) 간의 분할도는 ≥1이어야 한다.
Figure 112011097388832-pat00280
여기서,
t = 표준물 중의 트리톤 X-100 피크 및 인접 피크의 체류시간.
W = 피크 측면을 기준선에 외삽함으로써 얻은 피크의 기저의 상응하는 폭
하기 방정식을 사용하여 최종 3개 SS#1 주입의 반응 계수를 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00281
여기서,
A = 트리톤 X-100 피크의 면적
W = 상응하는 TX100 스톡 표준 용액의 제조에 사용되는 트리톤 X-100의 질량 (mg)
SS#1의 최종 3회 주입의 반응 계수는 ≤ 10％의 상대 표준 편차 (RSD)를 가져야 한다. 하기 방정식을 사용하여 ％RSD를 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00282
Figure 112011097388832-pat00283
여기서,
n = 샘플 중의 측정 수
x = 개개의 측정치
SS#2의 단일 주입의 반응 계수를 SS#1의 최종 3회 주입의 평균 반응 계수와 비교한다. SS#2 반응 계수와 3개 SS#1의 평균 반응 계수 간의 차이율은 ≤ 10％이어야 한다. 하기 방정식을 사용하여 차이율을 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00284
여기서,
RF1 = 3회 SS#1 주입의 평균 반응 계수
RF2 = SS#2의 반응 계수
SPE-후 샘플 블랭크를 단일 주입한다. 트리톤 X-100 수준을 확인한 경우에 샘플 블랭크를 2회 초과하여 주입한다. 트리톤 X-100이 존재하는 경우에 CTLA4-Ig 약물 재료를 제거하고, 신규 제한 표준물 및 대조군을 이전에 분석하고 검출가능하지 않은 수준의 트리톤 X-100을 함유하는 것으로 밝혀진 신규 로트의 CTLA4-Ig 약물 재료와 함께 제조한다. 상기 모범 값이 충족되지 않는 경우에, 또다른 시간 동안 칼럼의 평형화를 연장하고, 표준 용액을 재주입한다. 모범 값이 여전히 충족되지 않는 경우에, 하기 단계를 수행한다. 누출을 확인하여 모든 배관 연결이 확실히 안전하도록 하게 한다. 연장된 평형화가 작업을 수행하지 않는 경우에 이동상의 유기 함량을 조절하고/거나 이동상의 신규 뱃치를 만들어 SS#1 및 SS#2를 다시 제조한다. 연장된 평형화 및/또는 이동상 조정이 모범 값을 충족시키지 못하는 경우에 칼럼을 바꾼다. 반복 전에 1시간 이상 동안 평형화한다.
주입 순서. HPLC 시스템의 예비 평형화 및 상기의 성공적인 전개. SPE-후 약물 재료 완충액을 단일 주입하고, 검정 블랭크로서는 상기 부문을 참조한다. 트리톤 X-100 반응이 없음을 관찰한다. 피크가 트리톤 X-100 피크의 체류시간에 존재하는 경우에 반응이 관찰되지 않을 때까지 블랭크 주입을 계속한다. SPE-후 CTLA4-Ig 약물 재료를 단일 주입하고, 샘플 블랭크로서는 상기 부문을 참조한다. 트리톤 X-100 반응이 없음을 관찰한다. 데이타 프로세싱 수행 전에 이 크로마토그램을 표준물, 대조군 및 샘플 크로마토그램으로부터 뺄 것이다. 통과 대조군, 제한 표준물, 실패 대조군을 2벌 주입한다. 약물 재료 완충액을 단일 주입하고, 트리톤 X-100 반응이 없음을 관찰하여야 한다. 샘플을 2벌 주입한다. 샘플 주입은 제한 표준물의 2벌 주입 및 약물 재료 완충액의 1벌 주입으로 브래킷됨(bracketed)으로써 브래킷된 제한 표준물과 약물 재료 주입 간에 샘플 주입을 10회 미만 수행한다. 전개 종결은 2벌 주입의 제한 표준물 및 1벌 주입의 약물 재료 완충액 블랭크로 완료되어야 한다.
데이타 프로세싱. 데이타 프로세싱 수행 전에 샘플 블랭크 주입의 크로마토그램을 모든 표준물, 대조군 및 샘플 크로마토그램으로부터 뺀다. 제한 표준물, 대조군, 및 샘플 크로마토그램 중의 트리톤 X-100 피크가 확실히 적절하게 통합되게 한다. 존재하는 경우에 샘플 중의 트리톤 X-100 피크는 제한 표준물과 동일한 체류시간 윈도우 내에 속해야 한다. 2벌 주입의 각 셋트의 피크 면적을 평균한다. 2벌 주입은 ≤ 10％의 피크 면적의 차이율(％)을 가져야 한다. 제한 표준물, 통과 대조군, 또는 실패 대조군의 2벌 주입이 이 기준에 부합되지 않는 경우에 전체 전개는 무효로 고려되고, 반복이 필요할 것이다. 샘플 실패 대조군의 2벌 주입이 이 기준에 부합되지 않는 경우에, 샘플은 무효로 고려되고, 반복이 필요할 것이다. 모든 다른 샘플, 대조군, 및 표준물은 이들이 ≤ 10％ 기준에 부합하는 만큼 유효한 것으로 고려된다. 최종 주입을 포함하는 모든 브래킷된 제한 표준물 중의 트리톤 X-100 피크에 대한 평균 피크 면적은 제한 표준물의 초기 평균 피크 면적의 10％ 이내이어야 한다. 임의의 중간 제한 표준물이 10％ 비교 요건에 부합되지 않는 경우에, 최종 통과 제한 표준물이 무효한 것으로 고려되어 재분석된 후에 모든 샘플이 분석된다.
제한 표준물, 통과 대조군, 실패 대조군 샘플의 평가. 제한 표준물, 통과 대조군, 및 실패 대조군에 대한 평균 트리톤 X-100 피크 면적을 비교한다. 실패 대조군 샘플의 피크 면적은 제한 표준물의 것보다 크야 한다. 통과 대조군 샘플의 피크 면적은 제한 표준물의 것보다 작아야 한다. 양 조건이 부합되는 경우에, 샘플의 평가를 지속한다.
샘플의 평가. 제한 표준물의 평균 트리톤 X-100 피크 면적은 하기와 같이 트리톤 X-100 스톡 표준물 #1의 제조에서 칭량된 물질의 양을 차지하도록 교정되어야 한다:
AL = ALS X (10.00 mg/Wt.)
여기서,
AL = 0.5 μg/mL 제한 표준물로 교정된 피크 면적
ALS = 브래킷된 제한 표준물의 평균 트리톤 X-100 피크 면적
비고: AL은 0.5 μg/mL 제한 표준물에서 교정된 면적이고, 샘플에 대한 비교용으로 사용할 것이다.
샘플로부터의 평균 트리톤 X-100 피크 면적을 AL에 비교한다. 피크 면적이 ≤ AL인 경우에 샘플은 상술 사항을 통과한다. 피크 면적이 > AL인 경우에, 샘플은 상술 사항의 통과에 실패한다. 상술 사항을 통과하는 결과는 "<0.50 ppm"로서 또는 상술 사항 통과를 실패하는 결과는 ">0.50 ppm"로서 또는 달리 통상적 보고에 의해 요구되는 것과 같이 보고한다.
실시예 62 - CTLA4-Ig 약물 재료 물질 중의 잔여 단백질 A의 양을 정량하는 분석.
물질
Figure 112011097388832-pat00285
시약
카르보네이트 코팅 완충액. 적합한 용기에 첨가한다; 교반 막대를 첨가한다. 500 mL의 HPLC 등급수 또는 밀리포어 물을 첨가한다. 5개 카르보네이트 캡슐의 함유물을 첨가한다. 잘 혼합될 때까지 교반한다. 확인하고, NaOH (1.16) 또는 HCl (1.23)로 pH를 9.6 ±0.1로 조정한다. 용액을 500 mL 필터 멸균 시스템에 붓는다. 진공을 가하여 용액을 여과 멸균한다. 무균 조건하에 필터 유닛을 제거하고, 병 뚜껑을 닫는다. 용액은 2 내지 8℃에서 저장하는 경우에 30일 동안 안정하다. 용액을 "카르보네이트 코팅 완충액"으로서 표지한다. 세척 완충액: (PBS + 0.05％ 트윈 20): HPLC 등급수 또는 밀리포어 물의 4 L 병에 첨가한다; 교반 막대를 첨가한다. 20개 PBS 정제를 첨가한다. 2.0 mL의 트윈 20을 첨가한다. 확인하고, NaOH 또는 HCl로 pH를 7.4 ±0.1로 조정한다. 교반 플레이트를 사용하여 잘 혼합될 때까지 교반한다. 용액은 2 내지 8℃에서 저장하는 경우에 30일 동안 안정하다. 용액을 "세척 완충액"으로서 표지한다. 희석 없이 VWR로부터의 1.000 노르말 황산 사용 또는 정지 용액 (1 N H2SO4). 흄 후드에 적합한 컨테이너를 교반 플레이트 상에 둔다: 교반 막대를 첨가한다. 485.6 mL의 HPLC 등급수 또는 밀리포어 물을 첨가한다. 교반 플레이트를 켜서 물의 교반을 개시한다. 서서히 14.4 mL의 진한 H2SO4를 첨가한다. 용액은 실온에서 저장시에 30일 동안 안정하다. 컨테이너를 "정지 용액"으로서 표지한다.
아세테이트 완충액 (0.5M 아세트산, 0.1 M 염화나트륨, 0.1％ 트윈 20, pH 3.5). 흄 후드에서 적합한 컨테이너를 교반 플레이트 상에 둔다: 교반 막대를 첨가한다. 400 mL의 HPLC 등급수 또는 밀리포어 물을 첨가한다. 교반 플레이트를 켜서 물의 교반을 개시한다. 서서히 14.8 mL의 진한 빙초산을 첨가한다. 잘 혼합될 때까지 교반한다. 염화나트륨 2.9 g을 첨가한다. 잘 혼합될 때까지 교반한다. 확인하고, NaOH 또는 HCl로 pH를 3.5 ±0.1로 조정한다. 트윈 20 0.5 mL를 첨가한다. 잘 혼합될 때까지 교반한다. HPLC 등급수 또는 밀리포어 물로 최종 용량 500 mL로 조정한다. 잘 혼합될 때까지 교반한다. 용액은 2 내지 8℃에서 저장시에 30일 동안 안정하다. 컨테이너를 "아세테이트 완충액"으로서 표지한다.
토끼 항-단백질 A 항체. 냉장고로부터 바이알을 제거하고, 실온에 이르도록 한다. 2.0 mL의 HPLC 등급수 또는 밀리포어 물을 첨가한다. 20 μL 용량으로 0.5 mL 스크류 캡 튜브에 분취한다. 뚜껑을 닫아 세포 저장 박스에 둔다. 용액은 -20℃에서 저장시에 365일 동안 안정하다. 비오틴화된 항-단백질 A 항체. 냉장고로부터 바이알을 제거하고, 실온에 이르도록 한다. 1.0 mL의 HPLC 등급수 또는 밀리포어 물을 첨가한다. 60 μL 용량으로 2.0 mL 스크류 캡 튜브에 분취한다. 뚜껑을 닫아 세포 저장 박스에 둔다. 용액은 -20℃에서 저장시에 365일 동안 안정하다.
스트렙타비딘-HRP. 0.5 mL의 HPLC 등급수 또는 밀리포어 물을 스트렙타비딘-HRP의 바이알에 첨가한다. 혼합하기 위해 바이알 뚜껑을 닫고, 완만히 대략 10초 동안 와동한다. 0.5 mL의 글리세롤을 스트렙타비딘-HRP의 바이알에 첨가한다. 바이알 뚜껑을 닫고, 완만히 바이알을 수회 뒤집는다. 청결한 파스퇴르 파이펫 내로 빨아들임으로써 용액 투명도를 확인한다. 20 μL 용량으로 0.5 mL 스크류 캡 튜브에 분취한다. 뚜껑을 닫아 세포 저장 박스에 둔다. 용액은 -20℃에서 저장시에 365일 동안 안정하다.
표준물의 제조. 분석 증명서 (COA)로부터의 단백질 A 참고 물질 (ref mat)의 단백질 농도를 얻는다. 스톡 단백질 A 용액을 실온에서 해동함으로써 단백질 A ref mat의 11,500 ng/mL 용액을 제조한다. 단백질 A ref mat의 요구 용량을 계산하여 11,500 ng/mL 용액을 얻는다. 최소 전달 용량은 10 μL이어야 한다.
수학식:
Figure 112011097388832-pat00286
비고: 단위는 상용가능하게 한다.
예시 :
Figure 112011097388832-pat00287
목적하는 용량으로부터 단백질 A ref mat의 요구 용량을 뺌으로써 아세테이트 완충액 (3.4)의 용량을 계산한다.
수학식: (목적 용량) - (Ref Std 용량) = (희석제 용량)
예시: 1O.O mL - 0.920 mL = 9.180 mL 희석제
단백질 A ref mat의 계산된 용량을 계산된 아세테이트 완충액 용량을 함유하는 15 mL 멸균 튜브에 첨가한다. 튜브 뚜껑을 닫는다. 2 내지 4초 동안 완만히 와동한다 (볼텍스 제니(Vortex Genie) 2 상에서 4로 설정함). 하기 정의되는 용량을 사용하여 잔존 표준물을 제조한다:
Figure 112011097388832-pat00288
튜브 뚜껑을 닫은 후에, 각 희석 단계를 수행하고, 다음 희석 단계 진행 전에 2 내지 4초 동안 완만히 와동한다. 미량역가 플레이트에 첨가하기 전에 참조 표준물 및 품질 대조군 샘플을 10분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 각 표준 농도는 3벌 웰로 분석한다.
시험 샘플의 제조. 농도 5 mg/mL, 2.5 mg/mL 및 1.25 mg/mL의 CTLA4-Ig 시험 샘플을 폴리프로필렐 튜브에서 아세테이트 완충액을 사용하여 제조한다. 희석물 제조를 위해 사용하기 전에 CTLA4-Ig 샘플을 실온에서 해동한다. 시험 샘플의 요구 용량을 계산하여 5.0 mg/mL 용액을 얻는다. 최소 전달 용량은 10 μL이어야 한다.
수학식:
Figure 112011097388832-pat00289
예시:
Figure 112011097388832-pat00290
5.1.3 목적하는 용량으로부터 시험 샘플의 요구 용량을 뺌으로써 아세테이트 완충액의 용량을 계산한다.
수학식: (목적 용량) - (시험 샘플 용량) = (희석제 용량)
예시: 1.0 mL - 0.200 mL = 0.800 mL 희석제
시험 샘플의 계산된 용량을 계산된 아세테이트 완충액 용량을 함유하는 15 mL 멸균 튜브에 첨가한다. 튜브 뚜껑을 닫고, 2 내지 4초 동안 완만히 와동하고 (볼텍스 제니 2 상에서 4로 설정함), 시험 샘플을 미량역가 플레이트에 첨가하기 전에 10분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
품질 대조군 샘플의 제조. COA로부터 단백질 A 참고 물질의 단백질 농도를 수득한다. 단백질 A ref mat의 11,500 ng/mL 용액을 제조한다. 품질 대조군 (QC) 샘플을 하기 표에 기재된 바와 같이 제조한다.
Figure 112011097388832-pat00291
700 μL 용량을 2.0 mL 스크류 캡 튜브에 분취한다. 뚜껑을 닫아 세포 저장 박스에 둔다. 용액을 -70℃ 이하에서 저장시에 180일 동안 안정하다. QC 샘플 중의 단백질 A 농도를 하기에 의해 예비 측정한다: 3회 독립적인 단백질 A ELISA 분석을 이 방법을 이용하여 수행한다. 18개 결과 (3개의 독립적인 분석 회수의 분석당 6 웰)를 평균할 것이다. 각 QC 샘플에 대한 단백질 A 농도는 각 제조에 배당될 것이다. 실험일에, 각 QC 샘플의 1개 바이알을 실온에서 해동하거나 또는 단백질 A의 스톡 바이알로부터 새롭게 QC 샘플을 제조한다. 2 내지 4초 동안 완만히 와동한다 (볼텍스 제니 2 상에서 4로 설정함).
절차. 포획 항체를 사용하는 플레이트 코팅. 제조자 COA로부터의 토끼 항-단백질 A 항체의 단백질 농도를 얻는다. 토끼 항-단백질 A 항체의 요구 용량을 계산하여 10 mL의 100 μg/mL 용액을 얻는다. 최소 전달 용량은 10 μL이어야 한다.
수학식:
Figure 112011097388832-pat00292
비고: 단위는 상용가능하게 한다.
예시:
Figure 112011097388832-pat00293
목적하는 용량으로부터 토끼 항-단백질 A 항체의 요구 용량을 뺌으로써 희석제의 용량을 계산한다.
수학식: (목적 용량) - (항체 용량) = (희석제 용량)
예시: 3.0 mL - 0.012 mL = 2.988 mL 희석제
토끼 항-단백질 A 항체의 계산된 용량을 계산된 희석제 용량을 함유하는 15 mL 멸균 튜브에 첨가한다. 튜브 뚜껑을 닫고, 완만히 2 내지 4초 동안 와동한다. 수학식을 사용하여 코팅 완충액 중의 토끼 항-단백질 A 항체의 1 μg/mL 용액을 제조한다. 이 용액 100 μL를 이뮬론 IV 미량역가 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 2 내지 8℃에서 18 ±2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트는 세척 완충액 300 μL 및 0 침액 시간의 플레이트 세척기를 사용하여 세척 용액으로 3회 세척한다. 달리, 플레이트는 다중채널 파이펫기기를 사용하여 세척될 수 있다. 다중채널 파이펫을 사용하여 200 μL의 수퍼블록(SuperBlock)(상표명)을 각 웰에 첨가한다. 미량역가 플레이트를 암실에서 60분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 세척을 반복한다. 100 μL의 각 참조 표준물, 품질 대조군 및 시험 샘플을 분석 플레이트에 첨가한다. 미량역가 플레이트를 암실에서 60분 ±10분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 세척을 반복한다. 제조자 COA로부터 비오틴 항-단백질 A 항체의 단백질 농도를 얻는다. 희석제 중의 비오틴 항-단백질 A 항체의 1.0 mg/mL 용액 1.0 mL를 제조한다. 중간 설정에서 와동한다. 50 μL의 1 mg/mL 용액 (7.9.1)을 0.950 mL의 희석제에 첨가한다. 중간 설정에서 와동한다. 150 μL의 50 μg/mL 용액 (7.9.3)을 14.850 mL의 희석제에 첨가한다. 100 μL를 각 웰에 다중채널 파이펫기기를 사용하여 첨가한다. 실온에서 60분 동안 ±10분 인큐베이션한다. 세척을 반복한다. 스트렙타비딘-HRP를 하기와 같이 희석한다: 10 μL의 스트렙타비딘-HRP를 0.990 μL의 희석제에 첨가하여 0.01 mg/mL 스트렙타비딘-HRP를 수득한다. 중간 설정에서 와동한다. 80 μL의 0.01 mg/ml 스트렙타비딘-HRP를 39.920 mL의 희석제에 첨가한다. 중간 설정에서 와동한다. 100 μL를 각 웰에 다중채널 파이펫기기를 사용하여 첨가한다. 30분 ±5분 동안 실온에서 인큐베이션한다. TMB를 냉장고로부터 들어내고, TMB의 1개 플레이트당 최소 10 mL를 적합한 컨테이너로 경사분리한다. 암실에 두고, 실온에 이르도록 한다. 세척을 5회 반복한다. TMB 크로모젠 100 μL를 각 웰에 첨가한다. 대략 2분 ±1분 동안 인큐베이션한다. 100 μL/웰의 정지 용액을 첨가함으로써 크로모젠 반응을 중지시킨다. 각 웰에서 크로모젠이 효소와 동일한 반응 시간을 확실히 가지도록 크로모젠을 첨가하였을 때 정지 용액을 동일한 순서로 플레이트 및 웰에 첨가한다. 450 nm에서의 흡광도 (AB)를 630 nm의 참조 파장과 함께 측정한다.
모범 값. 표준 곡선에 대한 모범 값. 표준물에 대한 모범 값은 정량적 한도 (QL) (0.8 ng/mL) 이상의 이들 값에 적용하며, 이는 QL 미만 값은 곡선 극단의 설정을 돕는데만 사용되기 때문이다. 표준 곡선에 대한 결정 계수 (R2)는 ≥0.99이어야 한다. 0 ng/mL 표준물에 대한 평균 배경은 ≤0.08 흡광도 단위이어야 한다. 표준 곡선을 측정하기 위해 사용되는, 0 및 QL을 제외한 각 표준 농도에서의 계산된 값 (ng/mL)의 평균은 소프트웨어에 의해 측정하여 표적 (공칭) 값의 15％ 이내이어야 한다. 표준 곡선을 측정하기 위해 사용되는, 0 및 QL을 제외한 각 표준 농도에서의 3벌 AB450 값의 변동 계수 (％CV)는 소프트웨어에 의해 측정하여 ≤15％이어야 한다. 표준 곡선의 QL의 3벌 흡광도 값의 평균은 소프트웨어에 의해 측정하여 20％ 미만의 ％CV를 나타내고, 표적의 20％ 이내이어야 한다. 2 이상의 합치 데이타 지점이 확실히 계산에 사용될 수 있게 하기 위해 표준물, 대조군, 및 샘플을 3벌로 웰에 로딩한다. 평균을 계산하기 위해 사용되는 각 3벌 값을 개별적으로 분석할 것이다.
예를 들어:
Figure 112011097388832-pat00294
표적 값 2.5 ng/mL로부터 가장 먼 단일 값은 1.2 ng/mL이었다. 3벌로부터 1.2 ng/mL 값을 제거함으로써 남은 값들의 평균은 모든 모범 값을 충족한다. 재계산시에 또다른 지점이 모범 값을 충족하지 않는 경우에 분석은 유효하지 않고 다시 수행하여야 한다. 남은 2개 값의 평균이 여전히 모범 값을 충족하지 않는 것으로 나타나는 경우에 단일 지점 (모두 3개 웰)을 제거하고, 곡선을 재계산한다.
QC 샘플에 대한 모범 값. QC 샘플은 (총 18웰인 경우에) 총 6개 QC 샘플이 있는 이 방법에 언급되는 3개 공칭 농도에 대한 소정의 농도에서 3개 웰의 셋트로서 정의된다. QC 샘플에 대한 3개 웰 중 2개 이상은 허용가능할 QC 샘플에 대한 공칭의 20％ 이내이어야 한다. 6개 QC 샘플 중의 4개 이상은 허용가능하여야 한다; 6개 QC 샘플 중 2개 (동일한 농도에서의 2개는 아님) 및 18개 QC 샘플 웰 중 6개 이하의 편차는 각 표적 농도의 20％를 초과할 수 있다.
시험 샘플에 대한 모범 값. 분석된 시험 샘플의 3벌 각 값은 소프트웨어로 계산하여 상기 농도에서의 평균 값의 20％ 이내이어야 한다. 2개 이상의 평균 AB450 값이 표준 곡선 상의 최고점 초과이기 때문에 계산할 수 없는 경우에 샘플은 3개 값 중 2개 이상이 표준 곡선 상으로 떨어질 때까지 최고 희석에서 재분석되어어야 한다. 각 시험 샘플 표적 농도에 대해 얻어진 3벌 측정치의 ％CV는 소프트웨어로 계산하여 ≤20％이어야 한다.
계산. 평균, 표준 편차 및 ％CV를 산출하는 단백질 A ELISA에 대한 소프트맥스 프로그램 템플릿을 참조한다. 각 참조물 및 분석된 샘플 농도에 대해 수득한 3벌 흡광도 (AB) 값을 평균한다. 형태의 비가중 4개 파라미터 회귀를 사용함으로써 단백질 A 표준물에 대한 데이타를 작제한다:
Figure 112011097388832-pat00295
여기서,
min = 최소 점근선에 상응하는 AB 값
max = 최대 점근선에 상응하는 AB 값
ED5O = 최대 점근선 값과 최소 점근선 값 간의 절대 차이의 1/2에 상응하는 AB
B = 곡선의 직선 부위의 근접 경사도
C = 단백질 A의 농도
샘플 중의 단백질 A 농도의 계산. 평균 샘플 결과를 적절한 희석 계수 (즉, 2, 4, 및 8)로 곱하여 원래 샘플 중의 단백질 A 농도 (ng/mL)를 얻는다. 결과를 보고된 CTLA4-Ig 단백질 농도 (mg/mL)로 나누어서 CTLA4-Ig 중의 단백질 A 농도 (ng/mg)를 얻는다.
예시적 계산:
Figure 112011097388832-pat00296
비고: ng 단백질 A/mg CTLA4-Ig (ng/mg)은 백만분율 (ppm)에 상당한다.
샘플의 단백질 A 농도 (Ng/mL)에 대한 계산. 시험 샘플 중의 단백질 A의 양은 회귀 방정식을 사용하는 최근 소프트맥스 소프트웨어를 사용하여 계산한다. 각 샘플에 대한 3개 희석물을 분석한다. 계산된 농도를 적절한 희석 계수로 곱하여 초기 시험 샘플 중의 농도를 얻는다.
실시예:
시험 샘플의 농도는 50 mg/mL이다.
샘플 희석액 희석 계수
5 mg/mL 10
2.5 mg/mL 20
1.25 mg/mL 40
5 mg/mL 샘플 - 단백질 A의 ELISA 데이타 측정 농도는 10 ng/mL이다.
10 ng/mL x 10 (희석 계수) = 시험 샘플 중의 100 ng/mL 단백질 A
2.5 mg/mL 샘플 - 단백질 A의 ELISA 데이타 측정 농도는 5.0 ng/mL이다.
5 ng/mL x 20 (희석 계수) = 시험 샘플 중의 100 ng/mL 단백질 A
1.25 mg/mL 샘플 - 단백질 A의 ELISA 데이타 측정 농도는 2.5 ng/mL이다
2.5 ng/mL x 40 (희석 계수) = 시험 샘플 중의 100 ng/mL 단백질 A
3개 값으로부터 평균 농도를 계산한다.
결과의 보고. 결과는 달리 "ppm" (w/w)으로서 나타내지 않는 한 "총 단백질 (w/w％), ng 단백질 A/mg 총 단백질"로 보고될 수 있다.
실시예:
0.0001 ％w/w = 1 ng/mg = 1 ppm (w/w)
실시예 계산:
Figure 112011097388832-pat00297
QL의 AB450 (0.188 ng/mL)보다 작은 AB450 값을 나타내는 샘플은 "QL 미만"으로서 보고되어야 한다. QL의 AB450 (0.188 ng/mL)보다 큰 AB450 값을 나타내는 샘플은 백만분율 (ppm)로서 가장 가까운 정수로 보고되어야 한다.
실시예:
샘플 농도는 50 mg/mL이다. 분석된 최고 샘플 농도는 5 mg/mL (1/10 희석)이다. 샘플의 AB450은 QL보다 작다.
QL = 0.188 ng/mL
≤ 0.188 ng/5 mg
≤ 0.04 ng/mg
"≤, QL = 0.04 ppm"으로서 보고한다
실시예 63: CTLA4-Ig 약물 재료 샘플 중의 단백질에 대한 아미노 모노사카라 이드 (N-아세틸 갈락토사민, N-아세틸 글루코사민)의 몰비를 얻는 방법.
시약
가수분해 용액 (4 N HCl 수용액). 160 mL의 6 N HCl 및 80 mL의 HPLC 등급수를 250 mL 유리 병에 첨가한다. 교반하여 잘 혼합한다. 2 내지 8℃에서 6개월 이하 동안 저장한다. 유도체화 용액 I (0.1 M APTS 수용액). 192 μL의 HPLC 등급수를 유리 바이알 중의 APTS 분말 10 mg에 첨가한다. 바이알을 5 내지 10초 와동하여 APTS를 완전히 용해한다. -20℃에서 1년 이하 동안 저장한다.
유도체화 용액 II (1 M 아세트산 및 0.25 M NaBH3CN). 0.4 mL 원심분리기 튜브에서 아세트산 20 μL를 HPLC 등급수 320 μL로 희석하여 (17배 희석) 1 M 아세트산 용액을 제조한다. NaBH3CN 2.0±0.5 mg을 극저온 바이알에 칭량 첨가한다. 하기 수학식을 이용하여 적절한 용량의 1 M 아세트산 용액을 첨가하여 0.25 M NaBH3CN을 제조한다. 용량 (μL) = 103 x (NaBH3CN 질량 (mg))/(62.84 g/mol x 0.25 mol/L). 비고: 사용 직전에 제조한다. 소듐 시아노보로히드라이드 (NaBH3CN)는 암실에서 건조용기 내에 저장되어야 한다. 저장용 2.0 mL 크리오(cryo) 바이알에 시리즈로 세분하여 하기와 같이 원래 시약병의 반복되는 개방을 피하는 것이 권유된다: 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 g ±0.2 mg을 2.0 mL 크리오바이알에 칭량 첨가한다. 원래 병으로부터의 소듐 시아노보로히드라이드의 전체 함량을 이 방식으로 분취한다. 뚜껑을 단단히 닫고, 시약 명칭, 로트 번호, 및 6개월 유효 기간과 함께 크리오바이알을 연속하여 (1, 2, 3 등)으로 표지한다. 바이알은 파라필름으로 밀봉하여 습기를 차단하여야 한다. 동일한 크리오바이알로부터 유도체화 용액 II를 위한 소듐 시아노보로히드라이드를 3회 미만 칭량 배분한다. 이에 주의하고, 랩 작업표 상의 크리오바이알 순서 번호에 주의한다. CE 프로파일에서 관찰되는 시약 피크 또는 불충분한 표지는 크리오바이알 또는 소듐 시아노보로히드라이드의 특정 로트와 함께 반복된 개봉 후에 발생할 수 있다. 이것이 결과에 영향을 미치는 경우에, 사용되는 크리오바이알을 제거하고, 크리오바이알로부터 시약을 다음 순서 번호 또는 소듐 시아노보로히드라이드의 신규 로트로부터의 시약을 칭량 배분한다.
재-아세틸화 완충액 (25 mM 중탄산나트륨, pH 9.5). 0.210 ±0.02 g의 중탄산나트륨을 청결한 100 mL 유리 비커에 칭량 첨가한다. 90 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 염이 완전히 용해될 때까지 교반 플레이트 상에서 혼합한다. 10 N NaOH로 pH를 9.5 ±0.1로 조정한다. HPLC 등급수를 첨가하여 최종 용량 100 mL를 만든다. 용액을 여과하고, 실온에서 3개월 이하 동안 저장한다. 전개 완충액 (60 ±5 mM 사붕산나트륨, pH 9.25). 사붕산나트륨 1.21 ±0.02 g을 100 mL 청결한 유리 비커에 칭량 첨가한다. 90 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 염이 완전히 용해될 때가지 교반 플레이트 상에서 혼합한다. 10 N NaOH로 pH를 9.25 ±0.10로 조정한다. HPLC 등급수를 첨가하여 최종 농도 60 ±5 mM인 최종 용량 100 mL를 만든다. 55 mM 용액의 경우에 사붕산나트륨 1.11 g (± 0.02)을 칭량 첨가하고, 용해 및 적정에 대한 상기 지시에 따른다. 65 mM 용액의 경우에 사붕산나트륨 1.31 g (± 0.02)을 칭량 첨가하고, 용해 및 적정에 대한 상기 지시에 따른다. 실온에서 3개월 이하 동안 저장한다. (시스템 적합성 부문에서 정의된 바와 같이) 피크 분할이 달성되는 경우에 (R 값 < 1.0) 새롭게 완충액을 제조한다. 임의 단계: 사붕산 염 완충액 용액 (MicroSolv)은 초순수 120 mL를 최종 농도 60 mM (± 5 mM)를 위한 150 mM 사붕산나트륨 완충액 80 mL에 첨가함으로써 희석한다. 10 N NaOH로 적정하여 용액 pH를 9.25 (± 0.1)에 이르게 한다. 55 mM 사붕산 염 용액의 경우에 66 mL의 150 mM 사붕산나트륨 완충액을 114 mL의 초순수에 희석 첨가한다. 상기와 같이 적정한다. 65 mM 사붕산 염 용액의 경우에, 78 mL의 150 mM 사붕산나트륨 완충액을 102 mL의 초순수에 희석 첨가한다. 상기와 같이 적정한다. 용액을 실온에서 최대 3개월 동안 저장한다. (시스템 적합성 부문에서 정의된 바와 같이) 피크 분할이 달성되는 경우에 (R 값 < 1.0) 새롭게 완충액을 제조한다.
모세관 세정 용액.
1 N NaOH 용액: 1 mL의 10 N NaOH 용액을 9 mL의 HPLC 등급수를 함유한 15 mL 계량 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동하여 잘 혼합한다. 용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장한다.
1 N HCl 용액: 1 mL의 6 N HCl 용액을 5 mL의 HPLC 등급수를 함유한 15 mL 계량 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동하여 잘 혼합한다. 용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장한다. 80％ 메탄올 용액: HPLC 등급 메탄올 8 mL를 HPLC 등급수 2 mL를 함유한 15 mL 계량 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동하여 잘 혼합한다. 용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장한다.
모노사카라이드 표준물 스톡 용액:
N-아세틸 글루코사민 (GalNAc). GalNAc 5 ±1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확히 칭량하여 첨가한다. 1 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 용해될 때가지 와동에 의해 잘 혼합한다. 용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
N-아세틸 갈락토사민 (GlcNAc): GlcNAc 5 ±1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확히 칭량하여 첨가한다. 1 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 용해될 때가지 와동에 의해 잘 혼합한다. 용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
N-아세틸 만노스아민 (ManNAc): ManNAc 5 ±1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확히 칭량하여 첨가한다. 1 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 용해될 때가지 와동에 의해 잘 혼합한다. 용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
모노사카라이드 표준물 스톡 용액을 -20℃에서 1년 이하 동안 저장한다:
모노사카라이드 작업 용액 I: 내부 표준물 작업 용액. 1980 μL의 HPLC 등급수를 이미 함유한 2 mL 극저온 바이알에 20 μL의 ManNAc 스톡 용액을 첨가하여 ManNAc의 스톡 용액을 HPLC 등급수로 100배 희석한다. 대략 5 내지 10초 와동한다. 내부 표준물 작업 용액을 2 내지 8℃에서 6개월 이하 동안 저장한다.
모노사카라이드 작업 용액 II: 아미노 믹스 표준물 작업 용액. 1960 μL의 HPLC 등급수를 함유한 2.0 mL 극저온 바이알에 GalNAc 및 GlcNAc의 스톡 용액 20 μL를 각각 첨가한다. 대략 5 내지 10초 와동한다. 아미노 믹스 표준물 작업 용액을 2 내지 8℃에서 6개월 이하 동안 저장한다.
샘플 및 참고 물질 용액. 단백질 샘플을 2 내지 8℃에서 해동 동결하고, 뒤집어서 완만히 혼합한다. HPLC 등급수를 사용하여 샘플 및 참고 물질 모두를 약 1.0 mg/mL로 희석한다. 농도를 3개의 유의한 값들로 만드는 것에 주의한다.
CE 전개 조건.
전개 완충액 (단계 2.5) 60 mM 사붕산나트륨, pH 9.25
모세관 카트리지 온도 25℃
전압 25-30 kV, 포지티브 모드
검출기 조건 LIF 검출기, 여기: 488nm,
방출: 520 nm.
샘플 주입 압력 주입 모드, 0.5 PSI에서 20초
전개 시간 10분
샘플 저장 10℃
절차
가수분해. 0.65 mL 원심분리 튜브에 ManNAc 작업 용액 10 μL 및 4 N 가수분해 용액 200 μL를 첨가한다. 이는 시스템 블랭크로서 제공된다. 0.65 mL 원심분리 튜브에 10 μL의 ManNAc 작업 용액 및 10 μL의 아미노 믹스 표준 용액을 첨가한다. 추가로 200 μL의 4N 가수분해 용액을 첨가한다. 이는 정량화 및 시스템 적합성에 대한 모노사카라이드 표준물로서 제공된다. 2벌로 제조한다. 0.65 mL 원심분리 튜브에 10 μL의 ManNAc 작업 용액 및 10 μL의 CTLA4-Ig 참고 물질 용액 (대략 1 mg/mL)을 첨가한다. 추가로 200 μL의 4N HCl 용액을 첨가한다. 2벌로 제조한다. 0.65 mL 원심분리 튜브에 10 μL의 ManNAc 작업 용액 및 10 μL의 샘플 용액 (대략 1 mg/mL)을 첨가한다. 추가로 200 μL의 4N HCl 용액을 첨가한다. 2벌로 제조한다. 샘플을 대략 10초 동안 와동하고, 대략 5 내지 10초 동안 원심분리한다. 샘플을 96-위치 바이알 선반에 두고, 오븐에서 95℃에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 가수분해 후에 가수분해된 샘플을 -20℃에서 10분 동안 두어 냉각시킨다. 임의의 응축물이 튜브 하부로 강제될 때까지 (최고 속도에서 5 내지 10초) 가수분해된 샘플을 잠시 동안 원심분리한다. SpeedVac에서 샘플을 증발 건조시킨다. 각 샘플을 100 μL의 HPLC 등급수로 재구성시키고, 10 내지 15초 와동한다. SpeedVac에서 샘플을 증발 건조시킨다.
재-아세틸화. 각 샘플을 10 μL의 M6 재-아세틸화 완충액으로 재구성시키고, 5 내지 10초 와동하여 잘 혼합한다. 4 μL의 M3 재-아세틸화 시약을 각 튜브에 첨가한다. 대략 5 내지 10초 동안 와동한다. 빙상에서 30분 동안 인큐베이션한다. SpeedVac에서 샘플을 증발 건조시킨다. 각 샘플을 100 μL의 HPLC 등급수로 재구성시키고, 10 내지 15초 와동한다. SpeedVac에서 샘플을 증발 건조시킨다.
유도체화. 마이크로 원심분리기를 오븐 내에 두어 오븐 온도 55℃로 평형화한다. 각 샘플을 10 μL의 유도체화 용액 I (0.1 M APTS 용액)으로 재구성시킨다. 대략 10 내지 15초 와동한다. 5 μL의 유도체화 용액 II (1 M HAc 및 0.25 M NaBH3CN)을 첨가한다. 대략 5 내지 10초 와동하고, 원심분리한다. 샘플 바이알을 예비-가온된 원심분리기에 신속하게 로딩하고, 55℃ 오븐 중의 원심분리 배면에 둔다. 3시간 동안 인큐베이션하며 2000 rpm에서 원심분리한다. 이는 바이알 표면 상의 용매의 응축을 차단한다.
기구 제조.
5.4.1 신규 모세관을 설치하며, 고압 모드 (80 PSI)에서 하기 단계를 사용하여 세정한다: 20분 동안 1 N NaOH; 10분 동안 HPLC 등급수. 10분 동안 60 mM 사붕산나트륨 완충액.
일일 작동
각 일일 작동 전에 세척/세정 순서를 전개하여 모세관을 세정한다.
시스템이 확실히 적합하게 하기 위해 이어서 시스템 적합성 표준물 (모노사카라이드 표준물)을 전개한다.
1 N NaOH를 사용하여 상이한 판매인으로부터의 모세관의 내부를 에칭하고, 전개 전체에 걸쳐 이동시간에서의 이동을 유도할 수 있다. 이것이 최종 피크 (GlcNAc)의 이동시간을 10.0분 이상으로 유도하는 경우에 1 N NaOH를 단계 2 세정에 대한 HPLC 등급수 또는 0.1 N NaOH로 교체할 필요가 있을 수 있다.
동등한 모세관 및 상기 세척 절차가 적절하지 않는 경우에 80％ 메탄올 및/또는 1 N HCl을 사용하여 최종 피크 (GlcNAc)가 모범 값 10.0분 내에 속하도록 하게 할 필요가 있을 수 있다.
주입물의 제조
유도체화 후에 샘플을 실온으로 냉각시킨다. 응축물이 튜브 하부로 강제될 때까지 대략 10초 실온에서 원심분리한다.
85 μL의 HPLC 등급수를 각 튜브에 첨가하여 각 샘플 최종 용량을 100 μL에 이르게 한다. 5 내지 10초 와동한다.
각 튜브로부터의 샘플 1O μL를 CE 마이크로 바이알로 옮기고, HPLC 등급수 190 μL를 각 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동한다.
세정 단계 및 주입 순서:
비고: 매 4회 주입의 경우에 CE 전개 완충액을 새롭게 제조한 CE 전개 완충액으로 바꾼다 (이온 고갈 효과 때문). 모세관 세정을 40 psi에서 수행한다.
Figure 112011097388832-pat00298
Figure 112011097388832-pat00299
Figure 112011097388832-pat00300
*비고: 3개 이하의 샘플에 대해 2벌로 상기 순서를 반복하고, 모노사카라이드 표준물의 각 제조의 2개 주입물을 브래킷한다. 3개 군으로 배치된 샘플에 대해 모두 8개 시스템 적합성 표준물 주입을 사용한다. 3개 이상의 샘플을 전개하는 경우에, 상기 순서에 나타낸 바와 같이 19번에서 시작하여 추가의 샘플을 전개한다. 표의 47번 내지 53번에 나타낸 바와 같이 시스템 적합성 (모노사카라이드 표준물)을 전개함으로써 순서를 완료한다.
**샘플을 CTLA4-Ig 참고 물질의 각 제조의 2개 주입물과 브래킷한다.
시스템 적합성 주의: 시스템 적합성 값은 달리 특정되지 않는 한 시스템 적합성 표준물의 제1 주입을 사용하여 측정한다. 제1 시스템 적합성의 전기영동도는 도 1 (여기서, 피크 1은 GalNAc이고; 피크 2는 ManNAc이고; 피크 3은 GlcNAc임)에 나타낸 것과 유사하여야 한다. 비고: 벡크만(Beckman PACE MDQ) 이외의 CE 기구를 사용하는 경우에 모세관 길이는 분리 모세관을 보유하는 카트리지의 다양한 구성 때문에 이 방법에 특정된 것과 상이할 수 있었다. 이는 분석물 이동시간 뿐만 아니라 피크 강도에서 변동을 유도할 수 있었다.
2개 인접 피크 간의 분할은 하기 방정식에 따른 기구에 의해 제1 시스템 적합성 표준물에 대해 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00301
여기서,
R = 분할도
t2, t1 = 2개 인접 피크의 각 이동시간
W1, W2 = 2개 인접 피크의 각 기준선에서의 피크 폭
R 값은 ≥1.0이어야 한다. R < 1.0인 경우에, 모세관을 세척/세정 순서로 세정하고; 문제가 지속되는 경우에 오래된 완충액을 새롭게 제조한 전개 완충액으로 대체하거나 또는 모세관을 교체한다.
최종 시스템 적합성 주입의 경우에 최종 피크 (GlcNAc)는 하기 수학식을 이용하여 테일링(tailing) 계수 <1.4를 가져야 한다:
T=W0.05/2f
여기서,
T = 테일링 계수
W0.05 = 높이의 5％에서의 피크 폭
f = 피크 최대에서의 피크 전면의 폭
T ≥ 1.4인 경우에, 모세관을 세척/세정 순서로 세정하고; 문제가 지속되는 경우에 오래된 완충액을 새롭게 제조한 전개 완충액으로 대체하거나 또는 모세관을 교체한다.
6.1 시스템 적합성 표준물의 반복 주입은 하기 모범 값을 충족하여야 한다:
■ GlcNAc 대 MaNAc의 피크 면적 비율: RSD ≤ 10％ (단계 7.1에서 계산됨)
■ GlcNAc의 이동시간은 ≤10.0분이어야 한다.
■ 프로파일은 3개 피크가 관찰되고 내부 표준물 (ManNAc)이 번호 2 피크인 도 1에 상당하여야 한다.
임의의 상기 모범 값이 샘플 시험 전에 충족되지 않는 경우에 GlcNAc의 이동시간이 10.0분을 초과한다면 전압을 증가시킨다. 다음에, 피크 면적 비율이 >10％인 경우에 새롭게 CE 완충액을 제조하여 그의 pH를 특정하게 하거나 또는 모세관을 교체한다. 기구 조정 후에, 시스템 적합성 주입을 반복한다. 피크 프로파일을 분석하는 경우에 ManNac의 피크 높이에서 유의한 감소가 발생한다면 LIF 모듈이 잘못 정렬되지 않도록 광섬유 케이블을 확인하여 특정하게 한다.
내부 표준물 구성성분과 모노사카라이드 표준물 구성성분의 피크 면적 비율을 비교하여 모노사카라이드 표준물 백분율 RSD를 측정한다. 각 모노사카라이드 구성성분에 대한 피크 면적을 각 모노사카라이드 표준물 주입에 대한 내부 표준물의 피크 면적으로 나눈다. 2개의 브래킷된 표준물과 GalNAc 및 GlcNAc에 대한 백분율 RSD를 계산한다. RSD는 ≤10％이어야 한다. 이 평균 모범 값이 충족되지 않는 경우에 이어서 모세관을 상기와 같이 세척하거나 또는 교체한다.
계산
내부 표준물 (ManNAc)에 상대적인 GalNAc와 GlcNAc의 피크 면적 비율을 계산한다. 제1 4개 시스템 적합성 표준물의 반복 주입을 사용하여 모범 값을 충족하도록 하고 샘플(들) 전후에 주입된 브래킷된 시스템 적합성 표준물 모든 것에 대해 동일하게 계산한다.
피크 면적 비율 = 각 모노사카라이드 구성성분 (GlcNAc, GalNAc)에 대한 피크 면적을 각 시스템 적합성 표준물 주입에 대한 내부 표준물 (ManNAc)의 피크 면적으로 나눔.
Figure 112011097388832-pat00302
시스템 적합성 표준물 중의 GlcNAc 및 GalNAc에 대한 피크 면적 비율의 평균을 계산한다. 또한, 표준 편차 (S.D.) 및 상대 표준 편차 백분율 (％RSD)을 계산하다.
모범 값: GlcNAc의 피크 면적 비율에 대한 RSD (≤10％). 샘플(들) 전후에 주입한 2개의 브래킷된 시스템 적합성 표준물: GlcNAc 및 GalNAc의 피크 면적 비율에 대한 백분율 RSD ≤ 10％.
이 평균 모범 값이 충족되지 않는 경우에 (RSD > 10％), 이어서 모세관은 세정 절차로 재-세정하고, 이들 샘플 및 브래킷된 모노사카라이드 표준물을 다시 전개하는 것이 필요하다. 평균 모범 값이 여전히 충족되지 않는 경우에 언급한 바와 같이 모세관을 교체하고 세정한다. 샘플 및 브래킷된 모노사카라이드 표준물을 다시 전개한다.
Figure 112011097388832-pat00303
여기서,
n = 샘플에서의 측정 수
x = 개개의 측정치
Figure 112011097388832-pat00304
GalNAc/단백질의 몰비를 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00305
여기서,
RGalNAc = GalNAc 대 단백질의 몰비
AGalNAc = 샘플 중의 GalNAc의 피크 면적 (μV·초)
AManNAc = 샘플 중의 ManNAc의 피크 면적 (μV·초)
AManNAcO = 모노사카라이드 표준물 중의 ManNAc의 피크 면적 (μV·초) 평균
AGalNAcO = 모노사카라이드 표준물 중의 GalNAc의 피크 면적 (μV·초) 평균
VGalNAcO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 GalNAc의 용량 (μL)
CGalNAcO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 GalNAc의 농도 (mg/mL)
Vp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 용량 (μL)
Cp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 농도(mg/mL)
MWCTLA4-Ig = CTLA4-Ig 참고 물질의 분자량
MWGalNAc = GalNAc의 분자량 (221.2 달톤)
표준물 브래킷. CTLA4-Ig 참고 물질 및 샘플의 몰비를 계산하는 경우에 모두 8개의 브래킷된 시스템 적합성 표준물을 사용한다. 포함물에 대한 피크 면적을 이 방정식으로 평균한다. 이는 제1 3개 샘플에 사용되어야 한다. 모든 다른 샘플의 경우에 항상 몰비 계산을 위해 다음 4개의 브래킷된 모노사카라이드 표준물 및 이전 4개의 브래킷된 모노사카라이드 표준물의 평균 피크 면적을 사용한다.
GlcNAc/단백질의 몰비를 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00306
여기서,
RGlcNAc = GlcNAc 대 단백질의 몰비
AGlcNAc = 샘플 중의 GlcNAc의 피크 면적 (μV·초)
AManNAc = 샘플 중의 ManNAc의 피크 면적 (μV·초)
AManNAcO = 모노사카라이드 표준물 중의 ManNAc의 피크 면적 (μV·초) 평균
AGlcNAcO = 모노사카라이드 표준물 중의 GlcNAc의 피크 면적 (μV·초) 평균
VGlcNAcO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 GlcNAc의 용량 (μL)
CGlcNAcO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 GlcNAc의 농도 (mg/mL)
Vp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 용량 (μL)
Cp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 농도(mg/mL)
MWCTLA4-Ig = COA에 따른 CTLA4-Ig 참고 물질의 분자량
MWGlcNAc = GlcNAc의 분자량 (221.2 달톤)
모범 값. 2개의 브래킷된 아미노 시스템 적합성 표준물 피크 면적 비율에 대한 백분율 RSD는 10％를 초과하지 않아야 한다. 참고 물질 중의 아미노 모노사카라이드에 대한 평균 몰비는 특정된 범위 이내이어야 한다. 각 구성성분의 경우에 4개 결과 (2벌 제조물의 2벌 주입)에 대한 ％RSD는 </= 25％이어야 한다.
CTLA4-Ig 참고 물질의 몰비 범위
Figure 112011097388832-pat00307
결과 보고. CTLA4-Ig 분자당 GalNAc 분자 수 및 CTLA4-Ig 분자당 GlcNAc 분자 수로서 평균 결과를 보고한다. 보고 몰비는 2개의 유의한 값을 나타낸다. 각 구성성분에 대해 4개 결과 (2벌 제조물의 2벌 주입)에 대한 ％RSD는 </= 25％이어야 한다.
실시예 64: CTLA4-Ig 약물 재료 샘플 중의 단백질에 대한 중성 모노사카라이 드 (만노스, 푸코스, 갈락토스)의 몰비를 얻는 방법.
시약
가수분해 용액 (2 M TFA 수용액). 148 μL의 TFA 및 852 μL의 HPLC 등급수를 1.7 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동한다. 필요에 따라 용량을 확대한다. 사용 직전에 용액을 제조한다.
유도체화 용액 I (0.1 M APTS 수용액). HPLC 등급수 192 μL를 유리 바이알 중의 APTS 10 mg 분말에 첨가한다. 병을 5 내지 10초 와동하여 APTS를 완전히 용해한다. -20℃에서 1년 이하 동안 저장한다.
유도체화 용액 II (1 M 아세트산 및 0.25 M NaBH3CN). 아세트산 20 μL를 0.4 mL 원심분리기 튜브 에서 HPLC 등급수 320 μL로 희석하여 (17배 희석) 1 M 아세트산 용액을 만든다. NaBH3CN 2.0±0.5 mg을 극저온 바이알에 칭량 첨가한다. 하기 수학식을 사용하여 적절한 용량의 1 M 아세트산 용액을 첨가하여 0.25 M NaBH3CN을 만든다.
용량 (μL) = 103 χ (NaBH3CN 질량 (mg))/62.84 g/mol x 0.25 mol/L).
·소듐 시아노보로히드라이드 (NaBH3CN)는 암실에서 건조용기 내에 저장되어야 한다.
·저장용 2.0 mL 크리오바이알에 시리즈로 세분하여 하기와 같이 원래 시약병의 반복되는 개방을 피하는 것이 권유된다
·소듐 시아노보로히드라이드 1.0 g ±0.2 mg을 2.0 mL 크리오바이알에 칭량 첨가한다. 원래 병으로부터의 소듐 시아노보로히드라이드의 전체 함량을 이 방식으로 분취한다.
·뚜껑을 단단히 닫고, 시약 명칭, 로트 번호, 및 6개월 유효 기간과 함께 크리오바이알을 연속하여 (1, 2, 3 등)으로 표지한다.
·바이알은 파라필름으로 밀봉하여 습기를 차단하여야 한다.
·동일한 크리오바이알로부터 유도체화 용액 II를 위한 소듐 시아노보로히드라이드를 3회 미만 칭량 배분한다. 이에 주의하고, 랩 작업표 상의 크리오바이알 순서 번호에 주의한다.
·CE 프로파일에서 관찰되는 시약 피크 또는 불충분한 표지는 크리오바이알 또는 소듐 시아노보로히드라이드의 특정 로트와 함께 반복된 개봉 후에 발생할 수 있다. 이것이 결과에 영향을 미치는 경우에, 사용되는 크리오바이알을 제거하고, 크리오바이알로부터 시약을 다음 순서 번호 또는 소듐 시아노보로히드라이드의 신규 로트로부터의 시약을 칭량 배분한다.
전개 완충액 (60 ±5 mM 사붕산나트륨, pH 9.25)
사붕산나트륨 1.21 ±0.02 g을 100 mL 청결한 유리 비커에 칭량 첨가한다.
90 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 염이 완전히 용해될 때가지 교반 플레이트 상에서 혼합한다.
10 N NaOH로 pH를 9.25 ±0.10로 조정한다.
HPLC 등급수를 첨가하여 최종 농도 60 mM (± 5 mM)인 최종 용량 100 mL를 만든다.
55 mM 용액의 경우에 사붕산나트륨 1.11 g (± 0.02)을 첨가하고, 용해 및 적정에 대한 상기 지시에 따른다.
65 mM 용액의 경우에 사붕산나트륨 1.31 g (± 0.02)을 첨가하고, 용해 및 적정에 대한 상기 지시에 따른다.
실온에서 3개월 이하 동안 저장한다. (시스템 적합성 부문에서 정의된 바와 같이) 피크 분할이 달성되는 경우에 (R 값 < 1.0) 새롭게 완충액을 제조한다.
임의 단계: 사붕산 염 완충액 용액 (MicroSolv)은 초순수 120 mL를 최종 농도 60 mM (± 5 mM)를 위한 150 mM 사붕산나트륨 완충액 80 mL에 첨가함으로써 희석한다. 10 N NaOH로 적정하여 용액 pH를 9.25 (± 0.1)에 이르게 한다.
55 mM 사붕산 염 용액의 경우에 66 mL의 150 mM 사붕산나트륨 완충액을 114 mL의 초순수에 희석 첨가한다. 상기와 같이 적정한다.
65 mM 사붕산 염 용액의 경우에, 78 mL의 150 mM 사붕산나트륨 완충액을 102 mL의 초순수에 희석 첨가한다. 상기와 같이 적정한다.
용액을 실온에서 최대 3개월 동안 저장한다. (시스템 적합성 부문에서 정의된 바와 같이) 피크 분할이 달성되는 경우에 (R 값 < 1.0) 새롭게 완충액을 제조한다.
모세관 세정 용액
1 N NaOH 용액:
1 mL의 10 N NaOH 용액을 9 mL의 HPLC 등급수를 함유한 14 mL 계량 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동하여 잘 혼합한다.
용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장한다.
1 N HCl 용액:
1 mL의 6 N HCl 용액을 5 mL의 HPLC 등급수를 함유한 15 mL 계량 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동하여 잘 혼합한다.
용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장한다.
80％ 메탄올 용액:
HPLC 등급 메탄올 8 mL를 HPLC 등급수 2 mL를 함유한 15 mL 계량 플라스틱 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동하여 잘 혼합한다.
용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장한다.
모노사카라이드 표준물 스톡 용액:
만노스 (Man)
만노스 5 ±1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확히 칭량하여 첨가한다.
1 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 5 내지 10초 와동함으로써 잘 혼합한다.
용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
푸코스 (Fuc)
푸코스 5 ±1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확히 칭량하여 첨가한다.
1 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 5 내지 10초 와동함으로써 잘 혼합한다.
용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
갈락토스 (Gal)
갈락토스 5 ±1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확히 칭량하여 첨가한다.
1 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 5 내지 10초 와동함으로써 잘 혼합한다.
용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
크실로스 (XyI)
크실로스 5 ±1 mg를 2.0 mL 극저온 바이알에 정확히 칭량하여 첨가한다.
1 mL의 HPLC 등급수를 첨가하고, 5 내지 10초 와동함으로써 잘 혼합한다.
용액의 정확한 농도 (mg/mL)를 기록한다.
모노사카라이드 표준물 스톡 용액을 -20℃에서 1년 이하 동안 저장한다.
모노사카라이드 작업 용액 I: 내부 표준물 작업 용액. 내부 표준물 작업 용액을 제조하기 위해 1980 μL의 HPLC 등급수를 이미 함유한 2 mL 극저온 바이알에 20 μL의 크실로스 스톡 용액을 첨가하여 크실로스의 스톡 용액을 HPLC 등급수로 100배 희석한다. 대략 5 내지 10초 와동한다. 내부 표준물 작업 용액을 2 내지 8℃에서 6개월 이하 동안 저장한다.
모노사카라이드 작업 용액 II: 중성 믹스 표준물 작업 용액. 1960 μL의 HPLC 등급수를 함유한 2.0 mL 극저온 바이알에 만노스, 푸코스, 및 갈락토스의 스톡 용액 20 μL를 각각 첨가한다. 대략 5 내지 10초 와동한다. 이 내부 표준물 작업 용액을 2 내지 8℃에서 6개월 이하 동안 저장한다.
샘플 및 참고 물질 용액. 단백질 샘플을 2 내지 8℃에서 해동 동결하고, 뒤집어서 완만히 혼합한다. HPLC 등급수를 사용하여 샘플 및 참고 물질 모두를 약 1.0 mg/mL로 희석한다.
CE 전개 조건
전개 완충액 60 mM 사붕산나트륨, pH 9.25
모세관 카트리지 온도 25℃
전압 25-30 kV, 포지티브 모드
검출기 조건 LIF 검출기, 여기: 488nm,
방출: 520 nm.
샘플 주입 압력 주입 모드, 0.5 PSI에서 20초
전개 시간 15분
샘플 저장 10℃
절차
가수분해. 0.65 mL 원심분리 튜브에 크실로스 작업 용액 10 μL 및 2M TFA 용액 200 μL를 첨가한다. 이는 시스템 블랭크로서 제공된다. 0.65 mL 원심분리 튜브에 10 μL의 크실로스 작업 용액 및 10 μL의 중성 믹스 표준 용액을 첨가한다. 추가로 200 μL의 2M TFA 용액을 첨가하고 3 내지 4초 동안 와동한다. 이는 정량화 및 시스템 적합성에 대한 모노사카라이드 표준물로서 제공된다. 2벌로 제조한다. 0.65 mL 원심분리 튜브에 10 μL의 크실로스 작업 용액 및 10 μL의 CTLA4-Ig 참고 물질 용액 (대략 1 mg/mL)을 첨가한다. 추가로 200 μL의 2M TFA 용액을 첨가하고 3 내지 4초 동안 와동한다. 2벌로 제조한다. 0.65 mL 원심분리 튜브에 10 μL의 크실로스 작업 용액 및 10 μL의 샘플 용액 (대략 1 mg/mL)을 첨가한다. 추가로 200 μL의 2M TFA 용액을 첨가하고 3 내지 4초 동안 와동한다. 2벌로 제조한다. 샘플을 대략 20초 동안 와동하고, 대략 5 내지 10초 동안 원심분리한다. 샘플을 96-위치 바이알 선반에 두고, 오븐에서 95℃에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 가수분해 후에 샘플을 -20℃에서 10분 동안 두어 냉각시킨다. 임의의 응축물이 튜브 하부로 강제될 때까지 (최고 속도에서 5 내지 10초) 가수분해된 샘플을 잠시 동안 원심분리한다. SpeedVac에서 샘플을 증발 건조시킨다. 각 샘플을 100 μL의 HPLC 등급수로 재구성시키고, 10 내지 15초 와동한다. SpeedVac에서 샘플을 증발 건조시킨다.
유도체화. 마이크로 원심분리기를 오븐 내에 두어 오븐 온도 55℃로 평형화한다. 각 샘플을 10 μL의 유도체화 용액 I (0.1 M APTS 용액)으로 재구성시킨다. 대략 10 내지 15초 와동한다. 5 μL의 유도체화 용액 II (1 M HAc 및 0.25 M NaBH3CN)을 첨가한다. 대략 5 내지 10초 와동하고, 원심분리한다. 샘플 바이알을 예비-가온된 원심분리기에 신속하게 로딩하고, 55℃ 오븐 중의 원심분리 배면에 둔다. 3시간 동안 인큐베이션하며 2000 rpm에서 원심분리한다. 이는 바이알 표면 상의 용매의 응축을 차단한다.
기구 제조: 신규 모세관을 설치하며, 고압 모드 (80 PSI)에서 하기 단계를 사용하여 세정한다:
20분 동안 1 N NaOH.
10분 동안 HPLC 등급수.
10분 동안 60 mM 사붕산나트륨 완충액.
세척/세정 순서를 전개하여 모세관을 세정한다. 시스템이 확실히 적합하게 하기 위해 이어서 시스템 적합성 표준물 (모노사카라이드 표준물)을 전개한다. 1 N NaOH를 사용하여 상이한 판매인으로부터의 모세관의 내부를 에칭하고, 전개 전체에 걸쳐 이동시간에서의 이동을 유도할 수 있다. 이것이 최종 피크 (갈락토스)의 이동시간을 15.0분 이상으로 유도하는 경우에 1 N NaOH를 단계 2 세정에 대한 HPLC 등급수 또는 0.1 N NaOH로 교체할 필요가 있을 수 있다. 동등한 모세관 및 상기 세척 절차가 적절하지 않는 경우에 80％ 메탄올 및/또는 1 N HCl을 사용하여 최종 피크 (갈락토스)가 모범 값 15.0분 내에 속하도록 하게 할 필요가 있을 수 있다.
주입물의 제조: 유도체화 후에 샘플을 실온으로 냉각시킨다. 응축물이 튜브 하부로 강제될 때까지 대략 10초 실온에서 원심분리한다. 85 μL의 HPLC 등급수를 각 튜브에 첨가하여 각 샘플 최종 용량을 100 μL에 이르게 한다. 5 내지 10초 와동한다. 각 튜브로부터의 샘플 1O μL를 CE 마이크로 바이알로 옮기고, HPLC 등급수 190 μL를 각 튜브에 첨가한다. 5 내지 10초 와동한다.
세정 단계 및 주입 순서:
Figure 112011097388832-pat00308
Figure 112011097388832-pat00309
Figure 112011097388832-pat00310
*비고: 3개 이하의 샘플에 대해 2벌로 상기 순서를 반복하고, 모노사카라이드 표준물의 각 제조의 2개 주입물을 브래킷한다. 3개 군으로 배치된 샘플에 대해 모두 8개 시스템 적합성 표준물 주입을 사용한다. 3개 이상의 샘플을 전개하는 경우에, 상기 순서에 나타낸 바와 같이 19번에서 시작하여 추가의 샘플을 전개한다.
**샘플을 CTLA4-Ig 참고 물질의 각 제조의 2개 주입물과 브래킷한다.
시스템 적합성. 제1 시스템 적합성의 전기영동도는 피크 1이 만노스이고; 피크 2가 크실로스이고; 피크 3이 푸코스이고; 피크 4가 갈락토스인 것과 유사하여야 한다. 비고: 벡크만(Beckman PACE MDQ) 이외의 CE 기구를 사용하는 경우에 모세관 길이는 분리 모세관을 보유하는 카트리지의 다양한 구성 때문에 이 방법에 특정된 것과 상이할 수 있었다. 이는 분석물 이동시간 뿐만 아니라 피크 강도에서 변동을 유도할 수 있었다.
2개 인접 피크 간의 분할은 하기 방정식에 따른 기구에 의해 제1 시스템 적합성 표준물에 대해 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00311
여기서,
R = 분할도
t2, t1 = 2개 인접 피크의 각 이동시간
W1, W2 = 2개 인접 피크의 각 기준선에서의 피크 폭
R 값은 ≥1.0이어야 한다. R < 1.0인 경우에, 모세관을 세척/세정 순서로 세정하고; 문제가 지속되는 경우에 오래된 완충액을 새롭게 제조한 전개 완충액으로 대체하거나 또는 모세관을 교체한다.
최종 시스템 적합성 주입의 경우에 최종 피크 (갈락토스)는 하기 수학식을 이용하여 테일링 계수 <1.4를 가져야 한다:
T=W0.05/2f
여기서,
T = 테일링 계수
W0.05 = 높이의 5％에서의 피크 폭
f = 피크 최대에서의 피크 전면의 폭
T ≥ 1.4인 경우에, 모세관을 세척/세정 순서로 세정하고; 문제가 지속되는 경우에 오래된 완충액을 새롭게 제조한 전개 완충액으로 대체하거나 또는 모세관을 교체한다.
시스템 적합성 표준물의 반복 주입은 하기 모범 값을 충족하여야 한다:
● 갈락토스 대 크실로스의 피크 면적 비율: RSD ≤ 10％
● 갈락토스의 이동시간은 ≤15.0분이어야 한다.
● 프로파일은 4개 피크가 관찰되고 내부 표준물 (크실로스)이 번호 2 피크인 도 1에 상당하여야 한다.
임의의 상기 모범 값이 충족되지 않는 경우에 갈락토스의 이동시간이 15.0분을 초과한다면 먼저 전압을 증가시킨다. 다음에, 피크 면적 비율이 >10％인 경우에 새롭게 CE 완충액을 제조하여 그의 pH를 특정하게 하거나 또는 모세관을 교체한다.
기구 조정 후에, 시스템 적합성 주입을 반복한다. 피크 프로파일을 분석하는 경우에 크실로스의 피크 높이에서 유의한 감소가 발생한다면 LIF 모듈이 잘못 정렬되지 않도록 광섬유 케이블을 확인하여 특정하게 한다. 내부 표준물 구성성분과 모노사카라이드 표준물 구성성분의 피크 면적 비율을 비교하여 모노사카라이드 표준물 백분율 RSD를 측정한다. 각 모노사카라이드 구성성분에 대한 피크 면적을 각 모노사카라이드 표준물 주입에 대한 내부 표준물의 피크 면적으로 나눈다. 2개의 브래킷된 표준물에 대한 만노스, 푸코스, 및 갈락토스의 백분율 RSD를 계산한다. RSD는 ≤10％이어야 한다. 이 평균 모범 값이 충족되지 않는 경우에 이어서 모세관을 상기와 같이 세정하거나 또는 교체하여야 한다. 샘플 및 브래킷된 모노사카라이드 표준물은 반복 수행이 요구된다.
계산. 내부 표준물 (크실로스)에 상대적인 Man, Fuc 및 Gal의 피크 면적 비율을 계산한다. 제1 4개 시스템 적합성 표준물의 반복 주입을 사용하여 모범 값을 충족하도록 하고 샘플(들) 전후에 주입된 브래킷된 시스템 적합성 표준물 모두에 대해 동일하게 계산한다. 피크 면적 비율 = 각 모노사카라이드 구성성분 (Man, Fuc, 및 Gal)에 대한 피크 면적을 각 시스템 적합성 표준물 주입에 대한 내부 표준물 (크실로스)의 피크 면적으로 나눔.
Figure 112011097388832-pat00312
시스템 적합성 표준물 중의 Man, Fuc 및 Gal에 대한 피크 면적 비율의 평균을 계산한다. 또한, 표준 편차 (S.D.) 및 상대 표준 편차 백분율 (％RSD)을 계산하다. 모범 값: 갈락토스의 피크 면적 비율에 대한 RSD (<10％). 샘플(들) 전후에 주입한 2개의 브래킷된 시스템 적합성 표준물:
Man, Fuc, 및 Gal의 피크 면적 비율에 대한 백분율 RSD ≤ 10％.
이 평균 모범 값이 충족되지 않는 경우에 (RSD > 10％), 이어서 모세관은 세정 절차로 재-세정하고, 이들 샘플 및 브래킷된 모노사카라이드 표준물을 다시 전개하는 것이 필요하다. 평균 모범 값이 여전히 충족되지 않는 경우에 모세관을 교체하고 세정한다. 샘플 및 브래킷된 모노사카라이드 표준물을 다시 전개한다.
Figure 112011097388832-pat00313
여기서,
n = 샘플에서의 측정 수
x = 개개의 측정치
Figure 112011097388832-pat00314
만노스/단백질의 몰비를 계산한다.
Figure 112011097388832-pat00315
여기서,
RMan = 만노스 (Man) 대 단백질의 몰비
AMan = 샘플 중의 Man의 피크 면적 (μV·초)
AXyl = 샘플 중의 크실로스 (Xyl)의 피크 면적 (μV·초)
AXylO = 모노사카라이드 표준물 중의 Xyl의 피크 면적 (μV·초) 평균
AManO = 모노사카라이드 표준물 중의 Man의 피크 면적 (μV·초) 평균
VManO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 Man의 용량 (μL)
CManO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 Man의 농도 (mg/mL)
Vp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 용량 (μL)
Cp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 농도(mg/mL)
MWCTLA4-Ig = 분석 증명서 (COA)에 따른 CTLA4-Ig 참고 물질의 분자량
MWMan = 만노스의 분자량 (180.2 달톤)
브래킷된 표준물. CTLA4-Ig 참고 물질 및 샘플의 몰비를 계산하는 경우에 모두 8개의 브래킷된 시스템 적합성 표준물을 사용한다. 포함물에 대한 피크 면적을 이 방정식으로 평균한다. 이는 제1 3개 샘플에 사용되어야 한다. 모든 다른 샘플의 경우에 항상 몰비 계산을 위해 다음 4개의 브래킷된 모노사카라이드 표준물 및 이전 4개의 브래킷된 모노사카라이드 표준물의 평균 피크 면적을 사용한다.
푸코스/단백질의 몰비를 계산한다.:
Figure 112011097388832-pat00316
여기서,
RFuc = 푸코스 (Fuc) 대 단백질의 몰비
AFuc = 샘플 중의 Fuc의 피크 면적 (μV·초)
AXyl = 샘플 중의 크실로스 (Xyl)의 피크 면적 (μV·초)
AXylO = 모노사카라이드 표준물 중의 Xyl의 피크 면적 (μV·초) 평균
AFucO = 모노사카라이드 표준물 중의 Fuc의 피크 면적 (μV·초) 평균
VFucO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 Fuc의 용량 (μL)
CFucO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 Fuc의 농도 (mg/mL)
Vp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 용량 (μL)
Cp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 농도(mg/mL)
MWCTLA4-Ig = 분석 증명서 (COA)에 따른 CTLA4-Ig 참고 물질의 분자량
MWFuc = 푸코스의 분자량 (164.2 달톤)
갈락토스/단백질의 몰비를 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00317
여기서,
RGal = 갈락토스 (Gal) 대 단백질의 몰비
AGal = 샘플 중의 Gal의 피크 면적 (μV·초)
AXyl = 샘플 중의 크실로스 (Xyl)의 피크 면적 (μV·초)
AXylO = 모노사카라이드 표준물 AGalO 중의 Xyl의 피크 면적 (μV·초) 평균
VGalO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 Gal의 용량 (μL)
CGalO = 가수분해에 사용되는 모노사카라이드 작업 용액에 함유되는 Gal의 농도 (mg/mL)
Vp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 용량 (μL)
Cp = 가수분해에 사용되는 단백질 샘플의 농도(mg/mL)
MWCTLA4-Ig = 분석 증명서 (COA)에 따른 CTLA4-Ig 참고 물질의 분자량
MWGal = 갈락토스의 분자량 (180.2 달톤)
비고: CTLA4-Ig 참고 물질 및 샘플의 몰비를 계산하는 경우에 최종 시스템 적합성 표준물 및 다음 브래킷된 시스템 적합성 표준물 제조물를 사용한다. 포함물에 대한 피크 면적을 이 방정식으로 평균한다. 이는 제1 6개 샘플에 사용되어야 한다. 모든 다른 샘플의 경우에 항상 몰비 계산을 위해 2개의 브래킷된 모노사카라이드 표준물의 평균 피크 면적을 사용한다.
모범 값. 2개의 브래킷된 중성 시스템 적합성 표준물 피크 면적 비율에 대한 백분율 RSD는 10％를 초과하지 않아야 한다. 참고 물질 중의 중성 모노사카라이드에 대한 평균 몰비는 하기 표에 특정된 범위 이내일 수 있다. 각 구성성분의 경우에 4개 결과 (2벌 제조물의 2벌 주입)에 대한 ％RSD는 </= 25％이어야 한다.
CTLA4-Ig 참고 물질의 몰비 범위
Figure 112011097388832-pat00318
결과 보고. CTLA4-Ig 분자당 만노스 분자 수, CTLA4-Ig 분자당 푸코스 분자 수 및 CTLA4-Ig 분자당 갈락토스 분자 수로서 평균 결과를 보고한다. 보고 몰비는 2개의 유의한 값을 나타낸다. 각 구성성분에 대해 4개 결과 (2벌 제조물의 2벌 주입)에 대한 ％RSD는 </= 25％이어야 한다.
실시예 65 - CTLA4-Ig 산화 및 탈아미드화의 트립신분해 맵핑 정량화
본 방법의 목적은 편람식의 트립신분해 펩티드 맵핑 절차를 메티오닌 산화 및 아스파라긴 탈아미드화의 특정 검출 및 정량화와 함께 사용하여 CTLA4-Ig의 로트간 균일성(lot-to-lot consistency)을 모니터링하는 것이다. 펩티드 맵핑은 단백질을 단백질가수분해 또는 다른 단편화에 의해 펩티드 단편의 잘-정의된 셋트를 생성하고, 이어서 통상적으로 HPLC로 분석하는 것을 포함한다. 크로마토그램 또는 펩티드 맵은 단백질의 화학 구조의 매우 작은 변화 조차에도 매우 민감하여서 번역후 변형을 검출 및 특성화하는데 유용하다. CTLA4-Ig 단백질 샘플은 8M 구아니딘-HCl 완충액에서 변성되고, 시스틴 디술피드 브릿지는 디티오트레이톨로 환원되고, 단백질분해 효소 트립신으로 분해하기 전에 요오도아세트아미드로 S-알킬화된다. 트립신분해 펩티드의 생성된 혼합물을 이어서 215 및 280 nm에서의 UV 검출과 함께 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석한다. 일부 약어는 하기에 열거한다:
Figure 112011097388832-pat00319
화학 제품 및 시약
이동상 A - HPLC 등급수 중의 0.1％ TFA
TFA의 1 mL 앰플의 전체 함량을 HPLC 등급수 1000 mL에 옮기고, 완전히 혼합하여 0.1％ TFA (이동상 A)를 제조한다. 0.1％ TFA를 실온에서 2개월 이하 동안 저장할 수 있다.
이동상 B - 80％ ACN 및 20％ HPLC 등급수 중의 0.1％ TFA
TFA의 1 mL 앰플의 전체 함량을 아세토니트릴 800 mL 및 HPLC 등급수 200 mL에 옮기고, 완전히 혼합하여 80％ ACN 중의 0.1％ TFA (이동상 B)를 제조하며, 이는 실온에서 2개월 이하 동안 저장할 수 있다.
희석 완충액 - 100 mM TRIS, 25 mM NaCl, pH 7.6
트리즈마(Trizma) 프리-셋 결정(Pre-Set Crystal)(pH 7.6) 14.0 g 및 NaCl 1.46 g은 HPLC 등급수 1000 mL에 상기 용액을 자기 교반 플레이트 상에서 교반함으로써 용해한다. 상기 용액을 0.2 μm 필터 유닛을 통해 여과한다. 상기 용액을 2 내지 8℃에서 2개월 이하 동안 저장한다.
변성 완충액 - 8 M 구아니딘, 50 mM TRIS, pH 8.0
구아니딘 히드로클로라이드 152.8 g 및 트리즈마 프리-셋 결정 (pH 8) 1.4 g은 HPLC 등급수 90 mL에 상기 용액을 자기 교반 플레이트 상에서 교반함으로써 용해한다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정하고 HPLC 등급수를 사용하여 최종 용량 200 mL에 이르게 한다. 상기 용액을 0.2 μm 필터 유닛을 통해 여과한다. 상기 용액을 실온에서 6개월 이하 동안 저장한다.
소화 완충액 - 50 mM TRIS, 10 mM CaCl2, pH 7.6
트리즈마 프리-셋 결정 (pH 7.6) 7.0 g 및 CaCl2 1.47 g은 HPLC 등급수 1000 mL에 상기 용액을 자기 교반 플레이트 상에서 교반함으로써 용해한다. 상기 용액을 0.2 μm 필터 유닛을 통해 여과한다. 상기 용액을 2 내지 8℃에서 2개월 이하 동안 저장한다.
환원제 - 200 mM 디티오트레이톨 (DTT)
DTT 30.8 ±0.2 mg에 사용 직전에 물 1000 μL를 첨가하고, 용해될 때까지 와동한다. 용액은 제조시로부터 24시간 후에 만기가 된다.
알킬화 시약 - 400 mM 요오도아세트아미드 (IAM)
요오도아세트아미드 74.0 ±0.5 mg에 사용 직전에 물 1000 μL를 첨가하고, 용해될 때까지 와동한다. 용액은 제조시로부터 24시간 후에 만기가 된다.
1.0 M HCl
HPLC 등급수를 사용하여 진한 염산 8.7 mL를 100 mL로 희석한다. 상기 용액을 실온에서 2개월 이하 동안 저장한다.
표준물 및 대조군
T6ox 펩티드 표준물, 30 μM
T6ox 트립신분해 펩티드 합성 표준물은 Ala-Met(O)-Asp-Thr-Gly-Leu-Tyr-Ile-Cys-Lys·2TFA (FW 1358.4, 순도 ~95중량％)이다. 단단히 밀봉된 채 고체를 -20℃에서 저장하고, 항상 건조기에서 실온으로 가온하여 습기 흡수를 차단한다. T6ox 1.0 ±0.1 mg을 칭량 배분하고, 정확한 중량을 기록하고, 소화 완충액 1.50 mL에 용해한다. 200 mM DTT 40 uL를 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 둔다. 실온으로 냉각하고, 400 mM 요오도아세트아미드 48 μL를 첨가하고, 실온 암실에서 30분 동안 알킬화한다. 소화 완충액을 사용하여 최종 용량 24.5 mL로 희석하여 30 ±3 μM 표준 용액을 수득한다. 30 μM T6ox 표준물의 분취액 1 mL를 -70℃에서 24개월 이하 동안 저장한다.
T26deaml 펩티드 표준물, 30 μM
T26deaml 트립신분해 펩티드 합성 표준물은 Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-isoAsp-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys·2TFA (FW 2773.7, 순도 ~85 중량％)이다. 단단히 밀봉된 채 고체를 -20℃에서 저장하고, 항상 건조기에서 실온으로 가온하여 습기 흡수를 차단한다. T26deaml 1.0 ±0.1 mg을 칭량 배분하고, 정확한 중량을 기록하고, 소화 완충액 중의 30％ v:v 아세토니트릴 1 mL에 용해한다. 최종 용량 10.7 mL로 희석하여 30 ±3 μM 표준 용액을 수득한다. 30 μM T26deaml 표준물의 분취액 1 mL를 -70℃에서 24개월 이하 동안 저장한다.
표준물 및 샘플의 제조
환원 및 알킬화
펩티드 맵핑에 대한 단백질 농도 범위는 대략 20 mg/mL이다. 단백질 농도가 >20 mg/mL인 경우에 희석 완충액을 사용하여 샘플을 최종 농도 대략 20 mg/mL로 희석한다. 100 μL 이상의 희석된 용액을 제조한다. 1.7 mL 원심분리기 튜브에서 20 mg/mL (2 mg) CTLA4-Ig 용액 (샘플 또는 참고 물질) 100 μL를 변성 완충액 550 μL에 첨가한다. 200 mM 환원 시약 35 μL를 첨가하고, 튜브를 3 내지 5초 동안 와동하고, 이어서 대략 3초 동안 원심분리한다. 튜브를 37℃에서 20 ±2분 동안 인큐베이션한다. 400 mM 알킬화 시약 38.5 μL를 각 튜브에 첨가하고, 3 내지 5초 동안 와동하고, 이어서 대략 3초 동안 원심분리한다. 샘플을 실온 암실에서 20 ±2분 동안 인큐베이션한다. NAP-5 칼럼을 정치한다. 샘플당 1개 칼럼을 사용한다. 샘플을 IAM에서 인큐베이션하며 NAP-5 칼럼을 7.5 mL의 소화 완충액으로 평형화한다. 부위 절차에 따라 유출물을 제거한다. 환원 및 알킬화된 혼합물 500 μL를 NAP-5 칼럼 상으로 첨가하여 칼럼을 통해 액체를 제거한다. 부위 절차에 따라 유출물을 제거한다. 소화 완충액 1.0 mL를 NAP-5 칼럼에 첨가하고, 유출물을 1.7 mL 원심분리기 튜브에 수집하고, 완만히 수집 유출물을 혼합한다.
소화. 소화될 샘플 또는 참고 물질의 각 mL에 대해 1개 트립신 바이알 (20 μg) 및 1개의 추가 트립신 바이알을 각각 트립신 완충액 (효소가 공급됨) 86 μL로 재구성하여 0.25 μg/μL를 수득한다. 트립신 바이알의 함유물을 함께 1개 바이알 내로 모은다. 각 샘플을 샘플 1 mL당 상기 모은 트립신 용액 80 μL로 37℃에서 120 ±12분 동안 소화한다. 분해 완료 시에, 샘플 1 mL당 샘플을 1.0 M HCl 40 μL로 산성화하고, 3 내지 5초 동안 와동한다. 샘플 및 참고 물질의 각 소화물 100 μL를 오토샘플러 바이알에 파이펫 첨가한다. 30 μM T6ox 펩티드 표준물 5 μL 및 30 μM T26deaml 펩티드 표준물 5 μL와 혼합한 참고 물질 소화물 95 μL를 함유한 추가의 시스템 적합성 대조군을 제조하여 5％ T6ox 및 5％ T26deaml가 스파이킹된 소화물을 수득한다. 모든 바이알을 오토샘플러에 5 ±5℃에서 HPLC 분석을 위해 둔다. 남은 모든 소화물 샘플을 -70℃에서 저장한다.
크로마토그래피 조건
하기 표는 유속 및 크로마토그래피 구배를 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00320
칼럼을 55℃에서 100％ 이동상 A로 제1 주입 전에 25분 이상 동안 평형화한다. UV 흡광도를 215 nm 및 280 nm에서 모니터링한다. 칼럼으로부터 검출기로의 배관은 확산 밴드-광역화를 최소화하기 위해 내부 직경이 ≤ 0.01이어야 한다. 칼럼 온도를 55 ±2℃에서 유지한다. 오토샘플러 온도를 5 ±5℃에서 유지한다. 이동상 A를 블랭크 주입으로서 사용한다. 샘플 (1회에 10개 이하)을 참고 물질 주입과 브래킷한다. 하기 표는 크로마토그래피 분석에 대한 주입 순서를 나타낸다. 5％ T6ox 및 5％ T26deaml 펩티드 표준물 (그에 대해 28 μL가 주입됨)이 스파이킹된 참고 물질로 이루어진 대조군 샘플을 제외하여 모든 주입 용량이 25 μL임에 유의한다:
Figure 112011097388832-pat00321
모범 값.
모범 값. 참고 물질에 대한 펩티드 맵 프로파일은 215 nm 및 280 nm 트레이스에 대한 유의한 피크의 번호, 상대적인 크기 및 용출 순서에 관해 도 1에 나타내는 크로마트그램과 시각적으로 상용성이어야 한다. 초기 및 브래킷된 참고 물질에서의 피크 T4, T25, 및 T27에 대한 체류시간 차이는 ±0.5분을 초과하지 않아야 한다. 이론단수의 단수 (N)는 ≥100,000이어야 한다. N < 100,000인 경우에 칼럼을 재-평형화한다. 문제가 지속되는 경우에 칼럼을 교체한다. 분할도 (R)는 T2 및 T12 피크에 대해 ≥1.5이어야 한다. R < 1.5인 경우에 칼럼을 재-평형화한다. 문제가 지속되는 경우에 칼럼을 교체한다. 5％ T6ox 및 T6deaml로 스파이킹된 참조 표준물의 280 nm 크로마토그램은 도 85에 도시된 바와 같이 ~33.0분에서 용출되는 T6ox 피크에 대해 증가됨을 나타내야 한다. 5％ T6ox 및 T6deaml로 스파이킹된 참조 표준물의 215 nm 크로마토그램은 도 87에 도시된 바와 같이 ~66.5분에서 용출되는 T26deaml 피크에 대해 증가됨을 나타내야 한다.
샘플 모범 값. 제1 참고 물질 주입 및 샘플의 크로마토그램은 T6ox 및 T26deam (개별적으로 보고됨)에 대해 산화 및/또는 탈아미드화된 피크를 제외한 215 nm 및 280 nm 트레이스에 대한 유의한 피크의 번호, 상대적인 크기 및 용출 순서에 관해 도 85에 표지된 피크를 나타내는 바와 같이 시각적으로 상용성이어야 한다. 샘플에서의 피크 T4, T25, 및 T27에 대한 체류시간은 제1 참고 물질 주입의 상응하는 피크에 대한 체류시간의 ±0.5분 이내이어야 한다.
계산. 비고: 달리 특정되지 않는 한 이들 계산에 대해 215 nm 데이타를 사용한다. 브래킷된 참고 물질 전개 중의 피크 T4, T25, 및 T27 (도 85)의 체류시간은 0.5분 이상 상이하지 않아야 한다 (도 85).
이론단수의 단수. 이론단수의 단수 (N)로서 평가되는 칼럼 효율은 하기 방정식에 따라 체류시간 및 참고 물질 전개로부터의 피크 T27의 폭 (도 85)을 사용하여 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00322
여기서,
w = 기준선에 상대적인 직선면을 외삽하여 측정한 기준선에서의 피크 폭,
t = 피크 최대의 용출 시간에 대한 주입 시간으로부터 측정한 피크 T27의 체류시간.
분할도. 피크 T12와 피크 T2 (도 85) 간의 분할도 (R)는 하기 방정식을 이용하여 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00323
여기서,
t1, t2 = 피크 T12 및 피크 T2의 각 체류시간
W1, W2 = 체류시간 t1 및 t2를 각각 갖는 피크의 기준선에서의 탄젠트-정의 피크 폭
모든 샘플 및 표준물의 경우에 하기와 같이 280 nm 피크 면적 데이타로부터 Met85의 산화율을 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00324
여기서,
AT6 = 280 nm 트레이스에서의 T6, (84-93)에 대한 피크 면적
AT6ox = 280 nm 트레이스에서의 T6ox, Met(O)85(84-93)에 대한 피크 면적
모든 샘플 및 표준물의 경우에 도 87에 나타낸 데이타와 같이 215 nm 피크 면적에 대한 Asn294의 탈아미드화율을 계산한다:
Figure 112011097388832-pat00325
여기서,
AT26 = 215 nm 트레이스에서의 T26, (281-302)에 대한 피크 면적
AT26deam1 = 215 nm 트레이스에서의 T26deam1, isoAsp294(281-302)에 대한 피크 면적
AT26deam2 = 215 nm 트레이스에서의 T26deam2, Asp299(281-302)에 대한 피크 면적
AT26deam3 = 215 nm 트레이스에서의 T26deam3, Asp294(281-302)에 대한 피크 면적
AT26deam4 = 215 nm 트레이스에서의 T26deam4, Asu294(281-302)에 대한 피크 면적
CTLA4-Ig 트립신분해 소화물의 이론적으로 예상되는 단편 (도 85 참조)
Figure 112011097388832-pat00326
* N-연결된 탄수화물을 함유함
** O-연결된 탄수화물을 함유함
실시예 66 - 건강한 단일 투여 인간 연구
단일 부위 램덤 단일-투여 연구는 건강한 대상체에서의 CTLA4-Ig (CD-CHO1에 의해 생산됨) 프로세서의 약동학을 평가하기 위해 사용되었다. 포함 및 제외 모범 값을 충족하는 13명의 대상체에 임상적 연구 단위로 수행하고, 공정 CD-CHO1에 의해 생산되는 CTLA4-Ig를 30분에 걸쳐 10 mg/kg의 단일 정맥내 주입으로서 투여한다. 각 대상체를 주입후 24시간 동안 임상적 연구 단위로 관찰하였다. 혈액 샘플은 CTLA4-Ig의 정량화를 위해 71일 이하 동안 투여 후에 특정 시점에서 수집하였다. 대상체를 약동학으로 평가하였다: 각 대상체에 대한 Cmax, Tmax, AUC(INF), T-HALF, CLT, 및 Vss를 혈청 농도 대 시간 데이타로부터 얻었다. CTLA4-Ig를 200 mg/바이알 배합물로서 공급하였다. 건강한 대상체에 CTLA4-Ig 10 mg/kg의 30-분 IV 주입을 수행하였다. PK 측정치, 안전성, 및 면역원성 측정치를 투여 후에 71일에 걸쳐 특정 시점에서 평가하였다.
통계 방법:
샘플 크기: 13명 대상체의 샘플 크기는 기하 평균의 비율 예측이 CTLA4-Ig에 대한 Cmax의 참값의 15％ 이내 및 AUC(INF)의 참값의 10％ 이내일 것인 90％ 신뢰도를 제공하였다. 통계 분석: 대상체 인구통계, 신체 검사, 실험실 데이타, 및 활력 징후를 요약하였다. 부작용 발생률을 신체 시스템 및 중증도에 의해 표로 작성하였다. CTLA4-Ig의 Cmax 및 AUC(INF)의 경우에 공정 CD-CHO1에 대한 집단 기하 평균의 비율에 대한 90％ 신뢰 구간이 log(Cmax) 및 log(AUC)에 대한 변동 분석의 결과로부터 계산되었다.
약동학 결과: 약동학 결과를 인가된 비-구획 분석 프로그램으로 측정하였다. 약동학 파라미터는 공정 CD-CHO1 CTLA4-Ig로 투여된 13명의 대상체로부터 얻었다. 하기 표는 건강한 대상체의 CTLA4-Ig에 대한 약동학 파라미터를 열거한다. 하기 표는 CTLA4-Ig 약동학 파라미터에 대한 요약 통계치를 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00327
CTLA4-Ig는 건강한 대상체에서 대략 17일의 평균 T-HALF 값을 가지고, 이는 건선 대상체 (10 내지 18일) 및 류마티스양 관절염 환자 (대략 13일)에서 얻은 반감기와 일치한다. 관찰된 평균 Vss 값 0.09 내지 0.10 L/kg은 CTLA4-Ig가 대부분 혈관계에 한정되고 혈관외 공간으로 유의하게 분포되지 않았음을 나타냈다.
하기 표는 대상체당 혈청 농도 (ng/ml)를 나타낸다.
Figure 112011097388832-pat00328
CTLA4-Ig에 대한 혈청 분석
총 25개 분석 전개의 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 혈청 샘플을 CTLA4-Ig에 대해 분석하였다. 모든 분석 결과는 샘플 분석 전에 설정된 모범 값을 충족하였고, 이는 ELISA 방법이 연구 샘플 중의 CTLA4-Ig의 정량화에 정확하고 정밀함을 나타냈다. 혈청 중의 CTLA4-Ig에 대한 표준 곡선 파라미터의 요약 및 평균 QC 데이타를 표 48에 나타낸다. CTLA4-Ig에 대한 분석 QC의 전개간 변이도 (between-run variability) 및 전개내 변이도 (within-run variability)는 각각 4.5％ 및 3.5％ CV이었다. 분석 QC 샘플의 평균 관찰 농도는 공칭 값으로부터 ±8.9％ 미만의 편차를 가졌다 (표 48).
[표 48]
인간 혈청 중의 CTLA4-Ig의 분석에 대한 품질 대조군 데이타의 요약
Figure 112011097388832-pat00329
CTLA4-Ig의 약동학
공정에 의한 모든 대상체에 대한 CTLA4-Ig 혈청 농도의 평균 및 표준 편차를 바로 밑의 표에 나타낸다. 71일에 걸친 평균 CTLA4-Ig 혈청 농도 대 시간 프로파일을 도 44에 나타낸다.
CTLA4-Ig에 대한 평균 혈청 농도 대 시간 데이타 (ng/ml)
Figure 112011097388832-pat00330
약동학 파라미터에 대한 요약 통계치 (Cmax, AUC(INF), CLT, Vss, Tmax, 및 T-HALF)를 표 50에 나타낸다. 상기 결과는 본 발명의 방법으로부터 생산된 CTLA4-Ig가 대략 17일 (범위 7 내지 25일)의 평균 T-HALF 값을 가졌음을 나타냈다. 관찰된 Vss 값 0.09 내지 0.10 L/kg은 CTLA4-Ig가 세포외 유체 용량에 대부분 한정되었음을 나타냈다.
[표 50]
본 발명의 방법에 의해 생산된 CTLA4-Ig의 약동학 파라미터에 대한 요약 통계치
Figure 112011097388832-pat00331
상기 결과는 본 발명의 방법에 의해 생산된 CTLA4-Ig에 대한 평균 T-HALF가 대략 17일였음을 나타냈다. 분포 값의 청소율 및 용량 모두를 또한 표 50에 나타낸다.
단일 정맥내 주입 10 mg/kg 후의 건강한 성인 대상체 및 다중 정맥내 주입 10 mg/kg 후의 RA 환자 중의 CTLA4-Ig의 약동학을 표 47에 나타낸다.
[표 47]
정맥내 주입(들) 10 mg/kg 후의 건강한 대상체 및 RA 환자 중의 약동학 파라미터 (평균, 범위)
Figure 112011097388832-pat00332
a다중 정맥내 주입은 1일, 15일, 30일, 이후 매달 투여하였다.
실시예 67 - 플라스미드 pcSDhuCTLA4Ig의 DNA 서열
Figure 112011097388832-pat00333
Figure 112011097388832-pat00334
Figure 112011097388832-pat00335
Figure 112011097388832-pat00336
Figure 112011097388832-pat00337
Figure 112011097388832-pat00338
Figure 112011097388832-pat00339
Figure 112011097388832-pat00340
Figure 112011097388832-pat00341
Figure 112011097388832-pat00342
Figure 112011097388832-pat00343
Figure 112011097388832-pat00344
상기 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67은 특히 서열 1 , 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 18을 갖는 CTLA4-Ig 단백질에 속하고, 상기 실시예 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 52, 53, 54, 55, 56, 57은 특히 서열 4, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 갖는 CTLA4-Ig 단백질에 속한다. 본 명세서에 기재한 바와 같이, 실시예 중의 이들 단백질에 관련된 방법 및 그의 용도는 본 발명의 다른 CTLA4-Ig 단백질에 관련된 방법 및 그의 용도에 대한 실례가 될 수 있다.
본 발명의 CTLA4-Ig 분자를 포함하는 모범적인 및 비제한적 조성물에는 하기와 같은 조성물이 포함된다:
(1) CTLA4-Ig 분자는 서열 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 18 중 임의의 하나 이상을 포함하고, CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출 (실시예 10에 나타낸 측정 방법)로 측정하여 약 5.0 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종 (또는 CTLA4-Ig 사량체)이다. 더욱 특히, 본 발명은 하나 이상의 하기 특징을 추가로 갖는 조성물을 제공한다:
세균 내독소 0.35 EU/mg 또는 76.8 EU/mL CTLA4-Ig 분자의 최대량 (세균 내독소가 부재일 수 있음)을 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 48에 나타나 있음;
최대 바이오버든 1 CFU/1O mL 또는 1 CFU/mL (바이오버든이 부재일 수 있음)를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 49에 나타나 있음;
(CTLA4-Ig 분자 또는 상기 조성물로서) (a) 약 4.3 내지 약 5.6의 pI 범위를 갖는 약 10 내지 22개 밴드, 약 4.3 내지 약 5.3의 pI 범위에서의 누적 밴드 강도 90％ 내지 110％, 및 약 4.5 내지 약 5.2의 pI 범위에서의 약 3개 주요 밴드, 또는 (b) 5.1 이하이고 90％ 이상의 CTLA4-Ig 분자가 약 5.3 이하의 pI를 나타내는 pI를 갖는 우성 CTLA4-Ig 이소형을 제공하며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 50에 나타나 있음;
3.5 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 분자가 그의 산화된 종이고, 2.5 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 분자가 그의 탈아미드화된 종이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 47에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정하여 95.0 면적 백분율 이상의 CTLA4-Ig 이량체이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 10에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정하여 5.0 면적 백분율 미만의 CTLA4-Ig 고분자량 종 (또는 CTLA4-Ig 사량체)이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 10에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정하여0.5 면적 백분율 이하의 저분자량 종 (또는 CTLA4-Ig 단량체)이거나 또는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정하여 0.5 면적 백분율 미만의 저분자량 종 (또는 CTLA4-Ig 단량체)이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 10에 나타나 있음;
최대량의 DNA 2.5 피코그램/mg CTLA4-Ig 분자 또는 2.5 피코그램/mg CTLA4-Ig 이량체 (DNA가 부재일 수 있음)를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 58에 나타나 있음;
최대량의 MCP-1 3.0 ng/mg 총 CTLA4-Ig 분자, 5 ppm, 또는 5 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 (MCP-1이 부재일 수 있음)를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 59에 나타나 있음;
최대량의 숙주 세포 단백질 (세포 단백질로서도 공지됨) 25 ng/mg CTLA4-Ig 분자 또는 50 ng/mg CTLA4-Ig 이량체 (숙주 세포 단백질 또는 세포 단백질이 부재일 수 있음)를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 60에 나타나 있음;
최대량의 트리톤 X-100 1.0 ng/mg CTLA4-Ig 분자 (트리톤-X가 부재일 수 있음)를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 61에 나타나 있음;
최대량의 단백질 A 5.0 ng/mg CTLA4-Ig 분자 (단백질 A가 부재일 수 있음)를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 62에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 15 내지 약 35이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 63에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 1.7 내지 약 3.6이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 63에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 8.0 내지 약 17며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 64에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 3.5 내지 약 8.3며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 64에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 만노스 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 7.7 내지 약 22며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 64에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 시알산 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 8.0 이상, 예컨대 약 8.0 내지 약 12.0이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 16에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 NANA 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 8.0 이상, 예컨대 약 8.0 내지 약 12.0이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 16에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 N-연결된 글리코실화되어 도메인 I의 면적 백분율이 약 24.5％ 내지 약 35.2％를 나타내거나, 도메인 II의 면적 백분율이 약 26.3％ 내지 약 34.1％를 나타내거나, 도메인 III의 면적 백분율이 약 21.9％ 내지 약 31.5％를 나타내거나, 또는 도메인 IV 및 도메인 V의 면적 백분율이 약 7.9％ 내지 약 18.6％를 나타내며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 44에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 NGNA 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 1.5 이하이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 16에 나타나 있음.
본 발명은 단리되거나 또는 실질적으로 정제된 것과 같은 상기 조성물을 제공한다. 본 발명은 제약 조성물 또는 제약상 허용되는 조성물과 같은 상기 조성물을 제공한다. 본 발명은 이들 특징의 임의의 순열 또는 조합을 갖는 상기 조성물을 제공한다.
본 발명은 단리되거나 또는 실질적으로 정제된 것과 같은 조성물을 제공한다. 본 발명은 제약 조성물 또는 제약상 허용되는 조성물과 같은 조성물을 제공한다. 본 발명은 이들 특징의 임의의 순열 또는 조합을 갖는 조성물을 제공한다:
(2) CTLA4-Ig 분자는 서열 4, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 또는 24 (예를 들어 CTLA4A29YL104E-Ig) 중 임의의 하나 이상을 포함하고, CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정하여 5.0 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 고분자량 종 (또는 CTLA4-Ig 사량체) (이들에 대한 측정 방법은 실시예 25에 나타나 있음)이다. 더욱 특히, 본 발명은 하기 특징 중 하나 이상을 추가로 갖는 조성물을 제공한다:
CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정하여 95.0 면적 백분율 이상의 CTLA4-Ig 이량체이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 25에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출로 측정하여 1.0 면적 백분율 이하의 CTLA4-Ig 저분자량 종 (또는 CTLA4-Ig 단량체)이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 25에 나타나 있음;
(CTLA4-Ig 분자 또는 상기 조성물로서) 약 4.5 내지 약 5.6의 pI 범위를 갖는 약 8 내지 15개 밴드 및 4.5 내지 5.6의 pI 범위에서 누적 밴드 강도 95％ 내지 105％를 제공하며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 22에 나타나 있음;
최대량의 DNA 약 2.5 pg/mg CTLA4-Ig 분자를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 55에 나타나 있음;
최대량의 단백질 A 5 ng/mg CTLA4-Ig 분자를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 53에 나타나 있음;
최대량의 MCP-1 5 ng/mg CTLA4-Ig 분자를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 54에 나타나 있음;
최대량의 숙주 세포 단백질 (세포 단백질로서도 공지됨) 50 ng/mg CTLA4-Ig 분자를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 52에 나타나 있음;
최대량의 세균 내독소 0.42 EU/mg CTLA4-Ig 분자를 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 48에 나타나 있음;
최대 바이오버든 1 CFU/ml을 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 49에 나타나 있음;
최대량의 트리톤 X-100 2 ppm을 초과하지 않으며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 57에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 시알산 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 5.0 이상, 예컨대 약 5.0 내지 약 9.0 또는 약 5.0 내지 약 10.0이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 39에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 NANA 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 5.0 이상, 예컨대 약 5.0 내지 약 9.0 또는 약 5.0 내지 약 10.0이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 39에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 GalNAc 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 0.8 내지 약 4.0이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 36에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 GlcNAc 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 14 내지 약 35이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 36에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 갈락토스 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 8.0 내지 약 14이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 35에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 푸코스 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 1.7 내지 약 9.3이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 35에 나타나 있음;
CTLA4-Ig 분자는 만노스 대 CTLA4-Ig 분자 (또는 CTLA4-Ig 이량체)의 평균 몰비 (몰/몰 단백질로서 나타냄)가 약 9 내지 약 18이며; 이 특징의 측정 방법은 실시예 35에 나타나 있음;
본 발명은 단리되거나 또는 실질적으로 정제된 것과 같은 상기 조성물을 제공한다. 본 발명은 이들 특징의 임의의 순열 또는 조합을 갖는 상기 조성물을 제공한다.
상기 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67은 특히 상기 (1)의 CTLA4-Ig 단백질에 속하지만 본 명세서에 기재한 바와 같이, 이들 실시예 중의 단백질에 관련된 방법 및 그의 용도는 본 발명의 다른 CTLA4-Ig 단백질에 관련된 방법 및 그의 용도에 대한 실례가 될 수 있다.
상기 실시예 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 52, 53, 54, 55, 56, 57은 특히 상기 (2)의 CTLA4-Ig 단백질에 속하지만 본 명세서에 기재한 바와 같이, 이들 실시예 중의 단백질에 관련된 방법 및 그의 용도는 본 발명의 다른 CTLA4-Ig 단백질에 관련된 방법 및 그의 용도에 대한 실례가 될 수 있다.
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Claims (18)

  1. (a) 액체 배양 배지를 세포독성 T-림프구 항원-4 면역글로불린(CTLA4-Ig) 분자를 발현하는 포유동물 세포의 배양물로부터 수거하는 단계;
    (b) CTLA4-Ig 분자를 세포 성분으로부터 분리하는 단계;
    (c) 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 조성물 중 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1)을 감소시키는 단계;
    (d) 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 CTLA4-Ig 이량체를 CTLA4-Ig 고분자량 응집체로부터 분리하는 단계; 및
    (e) 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 CTLA4-Ig 분자를 둘 이상의 분획물로 분리하며, 여기서 하나 이상의 분획물은 하나 이상의 다른 분획물과 비교하여 CTLA4-Ig 분자에 대한 시알산의 몰비가 더 큰 것인 단계
    를 포함하는, 세포독성 T-림프구 항원-4 면역글로불린(CTLA4-Ig) 분자의 초기 집단을 포함하는 액체 배양 배지로부터 CTLA4-Ig 분자의 단리된 집단을 포함하는 조성물을 수득하는 방법이며,
    여기서, (1) 초기 집단의 CTLA4-Ig 분자는 하나 이상의 시알산 잔기를 가지고, (2) CTLA4-Ig 분자 당 시알산 잔기의 수는 초기 집단 내에서 변화하고, (3) 초기 집단은 CTLA4-Ig 이량체 및 고분자량 응집체를 포함하고, (4) 액체 배양 배지는 MCP-1을 함유하는 것이고,
    단계 (b), (c), (d) 및 (e)를 동시에 또는 임의의 순서대로 수행하여 상기 조성물을 수득하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조성물의 CTLA4-Ig 분자는 CTLA4-Ig 분자에 대한 N-아세틸뉴라민산(NANA)의 평균 몰비가 8.0 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 조성물의 CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 CTLA4-Ig 고분자량 응집체가 2.5 면적 백분율 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조성물이 CTLA4-Ig 분자 mg 당 3 ng 이하의 MCP-1의 양을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 조성물의 CTLA4-Ig 분자는 CTLA4-Ig 분자에 대한 N-아세틸뉴라민산(NANA)의 평균 몰비가 5.0 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 조성물의 CTLA4-Ig 분자는 크기 배제 크로마토그래피 및 분광광도계 검출에 의해 측정된 CTLA4-Ig 고분자량 응집체가 4.0 면적 백분율 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 조성물이 5 ppm 이하의 MCP-1을 포함하는 것인 방법.
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