CN106589132A - 组合物和用于生产组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合物和用于生产组合物的方法。本发明提供了能够生产重组CTLA4‑Ig及其变体的哺乳动物细胞。本发明还提供了包含CTLA4‑Ig的组合物及其制剂。本发明进一步提供了用于从哺乳动物细胞大量生产CTLA4‑Ig和用于纯化CTLA4‑Ig的方法，所述哺乳动物细胞能够生产这种重组蛋白质。

Description

组合物和用于生产组合物的方法
本申请是国际申请日为2006年12月19日的国际申请PCT/US2006/049074进入中国、申请号为200680053116.5的题为“组合物和用于生产组合物的方法”的发明专利申请的分案申请。
本专利申请要求下述专利的优先权：于2005年12月20日提交的美国系列号60/752,267、于2006年10月5日提交的美国系列号60/849,543、和于2005年12月20日提交的美国系列号60/752,150，所有所述专利在此整体引入作为参考。本申请还将于2006年12月19日提交的专利申请整体引入作为参考，所述专利申请的名称为“Stable ProteinFormulations”，代理号为10739PCT。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物都在此整体引入作为参考。
本专利公开内容包含受版权保护的材料。版权所有者不反对任何人复制如在美国专利与商标局(U.S.Patent and Trademark Office)专利档案或记录中出现的专利文件或专利公开内容，但在其他方面保留任何和所有版权。
技术领域和背景技术
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)，免疫球蛋白超家族的成员，是由活化的T细胞表达的分子。CTLA4类似于T细胞共刺激分子CD28，并且2种分子都与抗原呈递细胞(APCs)上的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)结合。然而，CTLA4将抑制信号传递给T细胞，而CD28传递刺激信号。
CTLA4-Ig分子是细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)的配体结合结构域和免疫球蛋白(Ig)重链恒定区的融合蛋白。这种可溶性分子通过下述发挥其生理作用：与各种抗原呈递细胞(APC)表面上的B7抗原(CD80和CD86)结合，从而阻断B7-1和B7-2与T细胞表面上的CD28的功能性相互作用。这种阻断导致T细胞活化的抑制，且因此抑制免疫应答。CTLA4-Ig分子因此可以提供用于抑制组织和/或实体器官移植排斥的方法，以及用于一般而言涉及失调的免疫应答的疾病或病症包括自身免疫的治疗用途。例如，CTLA4-Ig分子可以抑制抗dsDNA抗体的产生且减少易患狼疮的小鼠中的肾炎；可以减少具有晚期肾炎的小鼠中的蛋白尿且延长存活；并且可以改善关于牛皮癣和类风湿性关节炎的临床结果。
为了改善CTLA4-Ig分子的治疗有效性，重要的是确定可以制备以增强分子作为T细胞刺激的抑制剂的功效的分子改变，例如，通过增加分子对于B7抗原的抗体亲抗原性和效力。CTLA4-Ig分子的抗体亲抗原性和效力中的增加可以允许给患者施用减少量的CTLA4-Ig分子以达到所需疗效(即，较低剂量的施用)。CTLA4-Ig分子的抗体亲抗原性和效力中的增加还可以减少给患者施用的剂量数目或剂量频率以达到所需疗效。
发明内容
本发明涉及改善的组合物和用于生产CTLA4-Ig组合物的方法。本发明涉及CTLA4-Ig分子、包含CTLA4-Ig分子的改善的组合物、以及用于生产(包括大量生产)CTLA4-Ig分子和其他重组蛋白质的改善的方法。
本发明包括本文描述的任何元件和特征的任何排列和/或组合，无论是单独还是以某些组合或排列进行描述。
细胞：本发明提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体。本发明提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，每个细胞包含CTLA4-Ig表达盒的30个或更多拷贝。本发明还提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，每个细胞包含CTLA4-Ig表达盒的30个或更多拷贝，其中所述30个或更多拷贝整合在每个细胞的基因组中的单个位点上。本发明提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中CTLA4-Ig表达盒在约105次传代中是稳定的。在一个实施方案中，CTLA4-Ig由包含核酸序列的表达盒编码，其由Koduri R.等人(Gene，2001，280：87-95)以及在美国专利号6,800,457和6,521,419中得到描述，所述参考文献在此整体引入作为参考。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig由整合到来自细胞群体的细胞基因组内的特定基因座上的表达盒编码，其由Koduri R.等人(Gene，2001，280：87-95)以及在美国专利号6,800,457 和6,521,419中描述，所述参考文献在此整体引入作为参考。在一个实施方案中，群体包含细胞的亚群，所述细胞包含CTLA4-Ig表达盒的33个或更多拷贝，其中所述33个或更多拷贝整合在亚群的每个细胞的基因组中的单个位点上。
本发明提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中至少75％的细胞群体具有CTLA4-Ig表达盒的30个或更多拷贝，其中所述30个或更多拷贝整合在75％群体的每个细胞的基因组中的单个位点上。本发明提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中至少85％的细胞群体具有CTLA4-Ig表达盒的30个或更多拷贝，其中所述30个或更多拷贝整合在85％群体的每个细胞的基因组中的单个位点上。本发明提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中至少95％的细胞群体具有CTLA4-Ig表达盒的30个或更多拷贝，其中所述30个或更多拷贝整合在95％群体的每个细胞的基因组中的单个位点上。在一个实施方案中，细胞群体能够生产大于0.5或更多克CTLA4-Ig蛋白质/升液体培养物，并且其中CTLA4-Ig显示出可接受的碳水化合物特征，其中在1,000L或很大的培养规模上唾液酸与CTLA4-Ig的摩尔比为约6－约14。在另一个实施方案中，细胞群体已适应无血清、化学成分确知培养基。在另一个实施方案中，由细胞群体的培养物生产的CTLA4-Ig具有1.00±0.05AU mL cm-1 mg-1的消光系数。在另一个实施方案中，当在培养物中生长时，细胞群体能够生产CTLA4-Ig多肽，其中：(a)约90％的CTLA4-Ig多肽包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(b)约10％的CTLA4-Ig多肽包含从残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(c)约4％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，(d)约96％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和任选地，(e)约小于1％的CTLA4-Ig多肽包含从残基编号25处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
本发明提供了克隆细胞的后代细胞，其中所述后代细胞生产CTLA4-Ig。在一个实施方案中，后代细胞由培养克隆亲代细胞经过至少5代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少10代、经过至少20代、经过至少40代、经过至少50代、经过至少75代、或经过至少100代而获得。本发明提供了由克隆细胞生产的细胞系。在一个实施方案中，细胞系是克隆的。本发明提供了能够生产下述的细胞系：(a)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列(氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸；图1A和1B)的CTLA4-Ig融合蛋白；(b)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列(氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸；图1A和1B)的CTLA4-Ig融合蛋白；(c)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列(氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸；图1A和1B)的CTLA4-Ig融合蛋白；(d)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列(氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸；图1A和1B)的CTLA4-Ig融合蛋白；(e)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列(氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸；图1A和1B)的CTLA4-Ig融合蛋白；或(f)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列(氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸；图1A和1B)的CTLA4-Ig融合蛋白。在另一个实施方案中，细胞系能够生产CTLA4-Ig融合蛋白，其中：(a)约90％的CTLA4-Ig多肽包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(b)约10％的CTLA4-Ig多肽包含从残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(c)约4％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，(d)约96％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和任选地，(e)约小于1％的CTLA4-Ig多肽包含从残基编号25处的甲硫氨酸开始的SEQID NO：2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，由培养细胞系生产的CTLA4-Ig融合蛋白具有1.00±0.05AUmL cm-1 mg-1的消光系数。本发明提供了衍生自克隆细胞系的细胞群体。在实施方案中，与最初的克隆细胞系比较，细胞群体由至少一种另外的遗传改变组成，且其中衍生的细胞群体能够生产CTLA4-Ig。在另一个实施方案中，与亲代细胞比较，细胞群体由至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少10种、至少15种或至少20种另外的遗传改变组成，且其中衍生的细胞群体能够生产CTLA4-Ig。在一个实施方案中，遗传改变包含在细胞基因组或编码CTLA4-Ig的重组表达盒中的至少一种非保守突变。在另一个实施方案中，遗传改变包含细胞内的至少一种另外的重组核酸。在进一步的实施方案中，改变包含细胞基因组的突变。在另一个实施方案中，改变包含给细胞基因组添加核酸或作为反式核酸，所述核酸编码抗细胞凋亡多肽。在另一个实施方案中，抗细胞凋亡多肽涉及糖基化。在另一个实施方案中，遗传改变包含细胞基因组或编码CTLA4-Ig的重组表达盒的至少一种突变。
组合物：本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约8－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约11－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约12－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约13－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约14－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约15－约17的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约16的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了其中超过95％的分子是CTLA4-Ig二聚体的CTLA4-Ig分子群体。在一个实施方案中，超过98％的分子是CTLA4-Ig二聚体。在另一个实施方案中，超过99％的分子是CTLA4-Ig二聚体。在另一个实施方案中，超过99.5％的分子是CTLA4-Ig二聚体。在另一个实施方案中，约95％－约99.5％的分子是CTLA4-Ig二聚体，且约0.5％－约5％的分子是CTLA4-Ig四聚体或高分子量种类。在另一个实施方案中，约98.6％的分子是CTLA4-Ig二聚体，且约1.2％的分子是CTLA4-Ig四聚体或高分子量种类，且约小于0.7％的分子是CTLA4-Ig单体。本发明提供了由CTLA4-Ig二聚体组成的群体。本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4-Ig单体的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4-Ig四聚体的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了基本上不含CTLA4-Ig二聚体和四聚体的CTLA4-Ig单体分子群体。在一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少3个唾液酸基团。在另一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少3个唾液酸基团－至少8个唾液酸基团。本发明提供了CTLA4-Ig四聚体分子的纯化群体，所述群体基本上不含CTLA4-Ig二聚体，且任选地，其中所述群体包含超过约100克的量。本发明提供了CTLA4-Ig四聚体分子的纯化群体，所述群体基本上不含CTLA4-Ig单体，且任选地，其中所述群体包含超过约100克的量。在一个实施方案中，每个四聚体分子包含2对CTLA4-Ig多肽，其中每个多肽具有选自SEQ ID NOS：5－10的氨基酸序列，且其中多肽对的每个成员与另一个成员共价连接，且其中2对多肽彼此非共价结合。在另一个实施方案中，每个四聚体分子能够与CD80或CD86结合。在进一步的实施方案中，与CTLA4-Ig二聚体分子相比较，每个四聚体分子具有对于CD80或CD86的至少2倍的较大抗体亲抗原性。在另一个实施方案中，与CTLA4-Ig二聚体分子相比较，每个四聚体分子具有至少2倍的较大T细胞增殖或活化抑制。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述组合物包含在CTLA4-Ig的等电聚焦凝胶上可视的优势同工型，如通过等电聚焦测定的，所述同工型具有小于或等于5.1的等电点，pI。在一个实施方案中，本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述组合物包含在CTLA4-Ig的等电聚焦凝胶上可视的优势同工型，如通过等电聚焦测定的，所述同工型具有小于或等于5.8的等电点，pI。在一个实施方案中，pI在神经氨酸酶处理后增加。在一个实施方案中，组合物包含在CTLA4-Ig的等电聚焦凝胶上可视的优势同工型，如通过等电聚焦测定的，所述同工型具有小于或等于5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5的等电点，pI。在另一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少40％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.1的等电点。在另一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少70％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.1的等电点。在另一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少90％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约2.5的等电点。本发明提供了具有约2.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约4.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约4.3±0.2－约5.0±0.2 的pI的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约3.3±0.2－约4.7±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了用于制备组合物的方法，所述组合物包含具有约2.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子，所述方法包括：(a)对CTLA4-Ig分子的混合物实施等电聚焦凝胶电泳，其中在凝胶上的单个条带表示具有特定pI的CTLA4-Ig分子群体，和(b)分离具有约2.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体，以便制备组合物。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或其对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或其对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或其对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或其对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约7.2－约22的甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或其对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或其对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(b)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(d)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(e)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；和(f)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述组合物显示约9.589+/-0.3的NGNA层析谱峰，和约10.543+/-0.3的NANA层析谱峰。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子显示如图68中所示的碳水化合物概况。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子显示结构域I－IV(例如，I－IV)的碳水化合物概况，其中结构域I包含代表无唾液酸化的寡糖的峰，结构域II包含代表单唾液酸化的寡糖的峰，结构域III包含代表双唾液酸化的寡糖的峰，且结构域IV包含代表三唾液酸化的寡糖的峰。结构域V包含代表四唾液酸化的寡糖的峰。在一个实施方案中，结构域I中的第一个峰和结构域II中的主峰之间N联寡糖的保留时间中的差异为约22－约28分钟。本发明提供了包含CTLA4-Ig二聚体分子的组合物，其中至少0.5％的CTLA4-Ig二聚体分子是半胱氨酰化的。在一个实施方案中，至少1.0％的CTLA4-Ig二聚体分子是半胱氨酰化的。本发明提供了CTLA4-Ig分子群体，其中所述群体显示如图8和10中所示的质谱法概况。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中所述群体显示如图20和21中所示的毛细管电泳概况。本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子的组合物。本发明提供了通过本文描述的任何方法获得的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了CTLA4-Ig分子群体，其中所述分子在下述残基上是糖基化的：SEQ ID NO：2的第102位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：2的第134位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：2的第233位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ IDNO：2的第155位处的丝氨酸氨基酸残基，或SEQ ID NO：2的第165位处的丝氨酸氨基酸残基。
本发明提供了CTLA4-Ig分子群体，其中所述分子群体的特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(f)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比；(g)如由等电聚焦凝胶上可视化测定的，约2.4±0.2－约5.0±0.2的pI；(h)小于或等于5ppm的MCP-1；(i)小于3.0％的四聚体(例如，2.5％的高分子量种类或四聚体，2.0％的高分子量种类或四聚体；(j)小于0.5％的单体；(k)具有与SEQ ID NOS：2－8中的任何一个至少95％等同的氨基酸的群体的CTLA4-Ig多肽；(l)其中群体内的CTLA4-Ig分子能够与CD80和CD86结合。
组合物：本发明提供了包含有效量的本发明的CTLA4-Ig分子和药学上可接受的载体的组合物。本发明提供了包含如于2005年12月20日提交的美国申请号60/752,150中描述的赋形剂的组合物。在一个实施方案中，组合物包括CTLA4-Ig。在一个实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。在另一个实施方案中，组合物进一步包含麦芽糖、一代磷酸钠一水合物、氯化钠、氢氧化钠和无菌水。在另一个实施方案中，组合物包含蔗糖、泊洛沙姆、一代磷酸钠一水合物、无水二代磷酸钠、氯化钠、氢氧化钠和无菌水。
制剂和试剂盒：本发明提供了冻干的CTLA4-Ig混合物，其包含至少95％的CTLA4-Ig二聚体和不超过5％的CTLA4-Ig四聚体。在一个实施方案中，混合物包含至少98％的CTLA4-Ig二聚体和不超过2％的CTLA4-Ig高分子量种类或四聚体。在另一个实施方案中，混合物包含至少99％的CTLA4-Ig二聚体和不超过1％的CTLA4-Ig高分子量种类或四聚体。在另一个实施方案中，混合物包含至少8.0摩尔唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子。在另一个实施方案中，混合物包含约15.7－约31摩尔GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子。在另一个实施方案中，混合物包含约1.6－约3.2摩尔GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子。在另一个实施方案中，混合物包含约9.3－约15.5摩尔半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子。在一个实施方案中，混合物包含约3.6－约7.9摩尔岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子。在一个实施方案中，混合物包含约9.7摩尔甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或分子。本发明还提供了药物试剂盒，其包含：(a)包含本发明的冻干的CTLA4-Ig混合物的容器；和(b)用于将冻干的CTLA4-Ig混合物重构成用于注射的溶液的说明书。
举例说明性的治疗方法：本发明提供了用于抑制T细胞增殖(或活化)的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物接触。本发明提供了用于抑制受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于诱导受试者中针对抗原的免疫耐受的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的炎症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的牛皮癣的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的狼疮的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的变态反应的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的移植器官排斥的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的多发性硬化的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的Crohn氏病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的I型糖尿病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的炎性肠病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的卵巢炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的肾小球肾炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的变应性脑脊髓炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的重症肌无力的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物。
本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体在制备用于免疫病症的治疗和/或预防性处理的药物中的用途。本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体或分子的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体在制备抗类风湿性关节炎剂中的用途，所述抗类风湿性关节炎剂连同关于其在类风湿性关节炎治疗中的用途的说明书一起在包装中。
举例说明性的组合疗法：本发明提供了用于抑制T细胞增殖(或活化)的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物接触，所述组合物与氨甲蝶呤组合。本发明提供了用于抑制受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物，所述组合物与氨甲蝶呤组合。本发明提供了用于诱导受试者中针对抗原的免疫耐受的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的CTLA4-Ig组合物，所述组合物与氨甲蝶呤组合。
用于生产CTLA4-Ig的方法：本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到液体培养物，其中重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从液体培养物中分离重组蛋白质。液体培养物可以是至少1,000L、至少5,000L、至少10,000L、至少15,000L、至少20,000L、至少25,000L、至少30,000L、至少40,000L。在一个实施方案中，步骤(a)的扩增包含：(i)在无血清、化学成分确知培养基中将细胞培养至少4代，以便获得至少约1.0x105活细胞/mL的细胞密度，其中每个种子阶段以约2x105/ml开始且进行至1－2百万细胞/ml；(ii)使细胞在培养物中维持足以由培养物生产至少约0.5g/L的时间。在一个实施方案中，蛋白质是糖蛋白。在一个实施方案中，蛋白质是CTLA4-Ig蛋白质。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是能够生产CTLA4-Ig融合蛋白的CHO克隆细胞系的后代，其中CHO细胞具有稳定整合在其基因组中的CTLA4-Ig表达盒的至少30个拷贝。在一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到30％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到40％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到50％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到60％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到70％或80％或90％或95％以下的时间。
在进一步的实施方案中，至少4次传代包含：(i)在至少50mL的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度，(ii)在至少10L的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度；(iii)在至少100L的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度；和(iv)在200L的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度。在一个实施方案中，将半乳糖加入无血清、化学成分确知培养基中。在一个实施方案中，维持包含(i)使培养物的温度从37±2℃降低至34±2℃；和(ii)使培养物的温度从34±2℃降低至32±2℃。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少5天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少6天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少7天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少8天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少9天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少10天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少11天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少12天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少13天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少14天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少15天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少16天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少17天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少18天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内最高达18天。在另一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内，直至培养物的细胞密度为约30x105－约79x105细胞/mL液体培养物。
本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在液体培养物包含大于或等于约6.0摩尔NANA/摩尔CTLA4-Ig蛋白质或二聚体时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在液体培养物具有约33x105－约79x105细胞/mL的细胞密度时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离在液体培养物中的细胞生存力不降到约20％、或约30％、或约38％以下时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在内毒素小于或等于约76.8EU/mL液体培养物时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在生物负荷小于1集落形成单位/mL液体培养物时发生。本发明的液体培养物可以是至少5,000L、至少10,000L、至少15,000L、至少20,000L、至少25,000L、至少30,000L、至少40,000L、至少50,000L、至少60,000L的体积。
本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在满足下述条件中的至少2个时发生：(i)液体培养物包含大于或等于约6.0摩尔NANA/摩尔蛋白质，(ii)液体培养物具有约33x105－约79x105细胞/mL的细胞密度，(iii)液体培养物中的细胞生存力不降到约20％、或约30％、或约38％以下，或(iv)培养物中的CTLA4-Ig的量大于0.5g/L。在一个实施方案中，分离包含：(i)获得细胞培养上清液；(ii)对上清液实施阴离子交换层析，以获得洗脱的蛋白质产物；(iii)对步骤(ii)的洗脱的蛋白质产物实施疏水作用层析，以便获得富集的蛋白质产物；(iv)对富集的蛋白质产物实施亲和层析，以获得洗脱且富集的蛋白质产物；和(v)对(iv)的洗脱且富集的蛋白质产物实施阴离子交换层析。在另一个实施方案中，步骤(iii)中获得的富集的蛋白质产物的特征在于任何高分子量污染物的百分比都小于25重量％。在另一个实施方案中，步骤(ii)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约75mM HEPES和约360mM NaCl，且具有约8.0的pH。在另一个实施方案中，步骤(ii)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约25mMHEPES 和约325mM NaCl，且具有约7.0的pH。在另一个实施方案中，步骤(iii)的疏水作用层析使用单一洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约850mM NaCl，且具有约7.0的pH。在另一个实施方案中，步骤(iv)的亲和层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM Tris和约250mM NaCl，且具有约8.0的pH。在另一个实施方案中，步骤(iv)的亲和层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约100mM甘氨酸，且具有约3.5的pH。在另一个实施方案中，步骤(v)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约120mM NaCl－约130mM NaCl，且具有约8.0的pH。在另一个实施方案中，步骤(v)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约25mM HEPES和约200mM NaCl，且具有约8.0的pH。在另一个实施方案中，步骤(ii)的阴离子交换层析使用具有阴离子交换树脂的柱来进行，所述阴离子交换树脂具有伯、仲、叔或季胺官能团。在另一个实施方案中，树脂具有季胺官能团。在另一个实施方案中，步骤(iii)的疏水作用层析使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。在另一个实施方案中，官能团是苯基官能团。在另一个实施方案中，步骤(iv)的亲和层析使用包含A蛋白的柱来进行。
本发明提供了用于制备CTLA4-Ig的方法，所述方法包括从液体细胞培养物中纯化CTLA4-Ig，从而使得纯化的CTLA4-Ig(a)具有约38ng MCP-1/mg CTLA4-Ig二聚体，和(b)包含少于2.5重量％CTLA4-Ig高分子量种类(例如，四聚体)。本发明提供了用于生产CTLA4-Ig的方法，所述方法包括：(a)扩增能够生产CTLA4-Ig的后代细胞或CHO细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物，其中CTLA4-Ig浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig，其中层析在具有疏水作用树脂的柱上，所述疏水作用树脂具有至少苯基官能团，其中所述分离包括使用单一洗涤缓冲液来进行疏水作用层析的步骤，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约850mM NaCl，且具有约7.0的pH。
CTLA4-Ig分子包括β多肽分子。CTLA4A29YL104E-Ig是β多肽分子。本发明涉及用于生产(包括大量生产)β多肽组合物或β多肽分子组合物和改善的组合物的方法。本发明涉及β多肽分子、包含β多肽分子的改善的组合物、以及用于生产(包括大量生产)β多肽分子和其他重组糖蛋白的改善的方法。
用于生产β多肽和其他糖蛋白的方法：本发明提供了用于生产重组糖蛋白的方法，所述方法包括：(a)扩增分泌重组糖蛋白的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少约10,000L的液体培养物，其中重组蛋白质浓度为至少约0.5克/L液体培养物；其中所述扩增包含：(i)在无血清、化学成分确知培养基中将细胞培养至少4代，以便获得至少约1.0x105活细胞/mL的细胞密度，其中每个种子阶段以约2x105/ml开始且进行至1－2百万细胞/ml，其中所述培养包含：(1)使细胞在无血清、化学成分确知接种物培养基中培养约15天－约25天；随后(2)在无血清、化学成分确知基础培养基中培养细胞直至达到约至少4百万细胞/mL的细胞密度；和(ii)使细胞在培养物中维持足以由培养物生产至少约0.5g/L的重组蛋白质的时间；和(b)从至少约10,000L液体培养物中分离重组蛋白质。
本发明提供了用于生产重组糖蛋白的方法，所述方法包括：(a)扩增分泌重组糖蛋白的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少约10,000L的液体培养物，其中重组蛋白质浓度为至少约0.5克/L液体培养物；其中所述扩增包含：(i)在无血清、化学成分确知培养基中将细胞培养至少4代，以便获得至少约1.0x105活细胞/mL的细胞密度，其中每个种子阶段以约2x105/ml开始且进行至1－2百万细胞/ml；和(ii)使细胞在培养物中维持足以由培养物生产至少约0.5g/L的重组蛋白质的时间，其中所述维持包含：(1)使培养物的温度从37±2℃降低至34±2℃；(2)向培养物中添加聚阴离子化合物；和(b)从至少约10,000L液体培养物中分离重组蛋白质。
本发明提供了用于生产重组糖蛋白的方法，所述方法包括：(a)扩增分泌重组糖蛋白的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少约10,000L的液体培养物，其中重组蛋白质浓度为至少约0.5克/L液体培养物；和(b)从至少约10,000L液体培养物中分离重组蛋白质；其中所述分离包含：(i)获得步骤(a)的培养物的可溶性级分；(ii)对可溶性级分实施亲和层析，以获得洗脱的蛋白质产物；(iii)对步骤(ii)的洗脱的蛋白质产物实施阴离子交换层析，以便获得洗脱且富集的蛋白质产物；和(iv)对富集的蛋白质产物实施疏水作用层析，以获得富集的蛋白质产物。
在本发明的一个实施方案中，蛋白质包含CTLA4-Ig。在另一个实施方案中，蛋白质包含β多肽或β多肽分子。在另一个实施方案中，蛋白质包含具有SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的β多肽。
在本发明的一个实施方案中，至少4次传代包含：(i)在至少50mL的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度；(ii)在至少10L的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度；(iii)在至少100L的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度；和(iv)在200L的培养体积中培养细胞直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度。
在本发明的一个实施方案中，分离包含：(i)获得步骤(a)的培养物的可溶性级分；(ii)对可溶性级分实施亲和层析，以获得洗脱的蛋白质产物；(iii)对步骤(ii)的洗脱的蛋白质产物实施阴离子交换层析，以便获得洗脱且富集的蛋白质产物；和(iv)对富集的蛋白质产物实施疏水作用层析，以获得富集的蛋白质产物。
在一个实施方案中，步骤(iv)中获得的富集的蛋白质产物的特征在于任何高分子量多聚体的百分比小于25重量％。在另一个实施方案中，步骤(iii)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约50mM HEPES和约135mM NaCl，且具有约7的pH。在另一个实施方案中，步骤(iii)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约50mM HEPES和约200mM NaCl，且具有约7的pH。在另一个实施方案中，步骤(iv)的疏水作用层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约50mM HEPES和约1.2M(NH4)2SO4，且具有约7的pH。在另一个实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM NaH2PO4和约150mM NaCl，且具有约7.5的pH。在另一个实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约250mM甘氨酸且具有约3的pH。在另一个实施方案中，步骤(iii)的阴离子交换层析使用具有阴离子交换树脂的柱来进行，所述阴离子交换树脂具有伯、仲、叔或季胺官能团。在另一个实施方案中，树脂具有季胺官能团。在另一个实施方案中，步骤(iii)的疏水作用层析使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。在另一个实施方案中，官能团是苯基官能团。在另一个实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用包含A蛋白的柱来进行。
在另一个实施方案中，扩增包含：(i)在无血清、化学成分确知培养基中将细胞培养至少4代，以便获得至少约1.0x105活细胞/mL的细胞密度，其中每个种子阶段以约2x105/ml开始且进行至1－2百万细胞/ml；和(ii)使细胞在培养物中维持足以由培养物生产至少约0.5g/L的重组蛋白质的时间。在另一个实施方案中，培养包含：(i)使细胞在无血清、化学成分确知接种物培养基中培养约15天－约25天；随后(ii)在无血清、化学成分确知基础培养基中培养细胞直至达到约至少4百万细胞/mL的细胞密度。
在另一个实施方案中，维持包含(i)使培养物的温度从37±2℃降低至34±2℃；和(ii)向培养物中添加聚阴离子化合物。在一个实施方案中，聚阴离子化合物是硫酸葡聚糖，且其中所述硫酸葡聚糖以约50mg/ml的终浓度加入培养物中。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃范围内至少5天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少6天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少7天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少8天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少9天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少10天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少11天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少12天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少13天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少14天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少15天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少16天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少17天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少18天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少19天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少20天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少21天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少22天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少23天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少24天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少25天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少26天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少27天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内至少28天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内最高达28天。在另一个实施方案中，温度维持在34±2℃的范围内，直至培养物的细胞密度为约30x105－约79x105细胞/mL液体培养物。
在一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到30％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到40％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到50％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到60％以下的时间。在另一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到70％或80％或90％或95％以下的时间。
在一个实施方案中，将半乳糖加入无血清、化学成分确知培养基中。在另一个实施方案中，分离在液体培养物包含大于或等于约6摩尔唾液酸/摩尔蛋白质时发生。在另一个实施方案中，分离在液体培养物包含约5.2－约7.6摩尔唾液酸/摩尔蛋白质时发生。在另一个实施方案中，分离在液体培养物具有约33x105－约79x105细胞/mL的细胞密度时发生。在另一个实施方案中，分离在液体培养物中的细胞生存力不降到约37％以下时发生。在另一个实施方案中，分离在内毒素小于或等于约4.8EU/mL液体培养物时发生。在另一个实施方案中，分离在生物负荷小于约1集落形成单位/mL(cfu/ml)液体培养物时发生。在另一个实施方案中，分离仅在满足下述条件中的至少2个时发生：(i)液体培养物包含大于或等于约6.0摩尔唾液酸/摩尔蛋白质，(ii)液体培养物具有约33x105－约79x105细胞/mL的细胞密度，(iii)液体培养物中的细胞生存力不降到约37％以下，或(iv)培养物中的糖蛋白的量为约0.46g/L－约0.71g/L。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是生产β多肽或β多肽分子的任何组合的中国仓鼠卵巢克隆细胞系的后代，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16，其中所述中国仓鼠卵巢细胞各自具有具有稳定整合在其基因组中的表达SEQ ID NO：3的表达盒的至少30个拷贝。在一个实施方案中，液体培养物包含本发明的生产细胞系的细胞或所述细胞的后代细胞。
本发明提供了通过由本发明提供的方法获得的包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的β多肽。本发明提供了包含β多肽或β多肽分子的组合物，其中每种多肽包含通过由本发明提供的方法获得的SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16。本发明提供了通过由本发明提供的方法获得的β多肽。
细胞：本发明提供了包含编码β多肽或β多肽分子的核酸的克隆中国仓鼠卵巢细胞。本发明提供了生产β多肽或β多肽分子的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体。在一个实施方案中，β多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16。本发明提供了包含核酸的克隆中国仓鼠卵巢细胞，所述核酸包含编码SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的氨基酸序列的表达盒。在一个实施方案中，表达盒包含SEQ ID NO：3。本发明提供了生产β多肽或β多肽分子的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中所述β多肽由衍生自具有ATCC登记号PTA-2104的质粒的核苷酸序列表达，所述质粒(Plasmid L104EA29YIg)根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)规定于2000年6月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA，20110-2209 USA)。
本发明提供了生产β多肽或β多肽分子的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，每种细胞包含β多肽表达盒的30个或更多拷贝。本发明提供了生产β多肽或β多肽分子的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，每种细胞包含β多肽表达盒的30个或更多拷贝，其中所述30个或更多拷贝整合在每个细胞的基因组中的单个位点上。本发明提供了生产β多肽或β多肽分子的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中β多肽表达盒在约105次传代中是稳定的。在一个实施方案中，β多肽由整合到细胞基因组内的表达盒编码。
本发明提供了生产β多肽的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中至少75％的细胞群体具有β多肽表达盒的30个或更多拷贝/细胞，其中所述30个或更多拷贝整合在75％群体的每个细胞的基因组中的单个位点上。本发明提供了生产β多肽的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中至少85％的细胞群体具有β多肽表达盒的30个或更多拷贝/细胞，其中所述30个或更多拷贝整合在85％群体的每个细胞的基因组中的单个位点上。本发明提供了生产β多肽的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体，其中至少95％的细胞群体具有β多肽表达盒的30个或更多拷贝/细胞，其中所述30个或更多拷贝整合在95％群体的每个细胞的基因组中的单个位点上。在一个实施方案中，表达盒衍生自作为ATCC登记号PTA-2104保藏的质粒。在另一个实施方案中，表达盒包含具有SEQ ID NO：3的序列的核酸。在一个实施方案中，细胞群体生产至少约0.5克β多肽/L液体培养物，且其中所述β多肽在1,000L或更大的培养规模上具有约5.5－约8.5的唾液酸与β多肽二聚体或β多肽分子的摩尔比。在另一个实施方案中，细胞群体生产至少5、至少10或至少20克β多肽/L液体培养物。在另一个实施方案中，β多肽在1,000L或更大的培养规模上具有约5－约10的唾液酸与β多肽二聚体或β多肽分子的摩尔比。在另一个实施方案中，细胞群体已适应无血清、化学成分确知培养基。在另一个实施方案中，由细胞群体的培养物生产的β多肽具有1.0±0.05AU mL cm-1 mg-1的消光系数。在另一个实施方案中，当在培养物中生长时，细胞群体生产β多肽，其中：(a)约90％或约80％的β多肽包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(b)约10％或约20％的β多肽包含从残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(c)约4％－约8％的β多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO：4的氨基酸序列，(d)约92％－约96％的β多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；和任选地，(e)约小于1％的β多肽包含从残基编号25处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
本发明提供了本发明的细胞群体的后代细胞，其中所述后代细胞生产β多肽。在一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少5、至少10、至少20、至少40、至少50、至少75代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞27代而获得。
本发明提供了由本发明提供的任何细胞产生的细胞系。在一个实施方案中，细胞系是克隆的。在一个实施方案中，细胞系生产：(a) 具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列(SEQID NO：4的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的β多肽；(b)具有SEQID NO：13的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的β多肽；(c)具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的β多肽；(d)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列(SEQID NO：4的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的β多肽；(e)具有SEQID NO：11的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的β多肽；(f)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的β多肽；或(g)其任何组合。在一个实施方案中，细胞系生产β多肽或β多肽分子，其中：(a)约90％或约80％的β多肽包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(b)约10％或约20％的β多肽包含从残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(c)约4％－约8％的β多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(d)约92％－约96％的β多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；和任选地，(e)约小于1％的β多肽包含从残基编号25处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个实施方案中，其中由培养细胞系产生的β多肽具有1.0±0.05AU mL cm-1 mg-1的消光系数。
本发明提供了衍生自本发明的细胞的细胞群体。在一个实施方案中，与群体由其衍生的本发明的细胞相比较，细胞群体包含至少一种另外的遗传改变，且其中所述细胞生产β多肽。在另一个实施方案中，与群体由其衍生的本发明的细胞相比较，细胞群体包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或至少20种另外的遗传改变，且其中所述细胞生产β多肽。在一个实施方案中，遗传改变包含在细胞基因组或编码β多肽的表达盒中的至少一种非保守突变。在另一个实施方案中，遗传改变包含细胞内的至少一种另外的重组核酸。在另一个实施方案中，遗传改变包含细胞基因组的突变。在另一个实施方案中，遗传改变包含给细胞基因组添加核酸或作为反式核酸，且其中所述核酸编码抗细胞凋亡多肽。在另一个实施方案中，抗细胞凋亡多肽涉及糖基化。在另一个实施方案中，遗传改变包含细胞基因组或编码β多肽的表达盒的至少一种突变。在另一个实施方案中，当在培养物中生长时，细胞群体生产：(a)具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的β多肽；(b)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的β多肽；(c)具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的β多肽；(d)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的β多肽；(e)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的β多肽；(f)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的β多肽；或(g)其任何组合。
组合物：本发明提供了β多肽或β多肽分子的分离的群体，其中每种多肽包含SEQID NO：11、12、13、14、15或16的序列，具有约5－约10的唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。在一个实施方案中，唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比为约5.5－约8.5。在一个实施方案中，唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比为约5.2－约7.6。本发明提供了β多肽的分离的群体，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，具有约6的唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了β多肽的分离的群体，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且超过95％的多肽形成二聚体。在一个实施方案中，超过98％、超过99％、或超过99.5％的多肽形成二聚体。在另一个实施方案中，约95％－约99.5％的多肽形成二聚体，且约0.5％－约5％的多肽形成四聚体或高分子量种类。在另一个实施方案中，约98.6％的多肽形成二聚体，且约1.2％的多肽形成四聚体或高分子量种类，且约小于0.7％的多肽是单体。在另一个实施方案中，约95％的多肽形成二聚体，且约4％的多肽形成四聚体或高分子量种类，且约1％的多肽是β多肽二聚体的分离的群体，其中每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列。在一个实施方案中，群体基本上不含β多肽单体。在另一个实施方案中，群体基本上不含β多肽四聚体。本发明提供了基本上不含β多肽二聚体和四聚体的β多肽单体的分离的群体。在一个实施方案中，每种β多肽二聚体的每个单体包含SEQ IDNO：11、12、13、14、15或16的序列且具有至少2.5个唾液酸基团。
本发明提供了β多肽的分离的群体，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，与CTLA4-Ig标准相比较，在B7结合测定中具有约70％－约130％的效力，其中所述测定包括测量表面等离子体共振。本发明提供了β多肽的分离的群体，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，与标准相比较，在人细胞IL-2抑制测定中具有约50％－约150％的效力。本发明提供了β多肽四聚体或高分子量种类的纯化的群体，其中每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，所述群体基本上不含β多肽二聚体，且任选地，其中所述群体包含超过约100克的量。本发明提供了β多肽四聚体或高分子量种类的纯化的群体，其中每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，所述群体基本上不含β多肽单体，且任选地，其中所述群体包含超过约100克的量。在一个实施方案中，每个四聚体分子包含2对β多肽，其中每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中多肽对的每个成员与另一个成员共价连接，且其中2对多肽彼此不共价结合。在一个实施方案中，每个四聚体分子能够与CD80或CD86结合。在一个实施方案中，与β多肽二聚体相比较，每个四聚体分子具有对于CD80或CD86至少2倍的较大抗体亲抗原性，其中二聚体的每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列。在另一个实施方案中，与包含SEQ ID NO：2的序列的CTLA4-Ig四聚体分子相比较，每个四聚体分子具有对于CD80或CD86至少2倍的较大抗体亲抗原性。在另一个实施方案中，与β多肽二聚体相比较，每个四聚体分子具有至少2倍的较大T细胞增殖或活化抑制，其中二聚体的每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列。在另一个实施方案中，与包含SEQ IDNO：2的序列的CTLA4-Ig四聚体分子相比较，每个四聚体分子具有至少2倍的较大T细胞增殖或活化抑制。
本发明提供了包含β多肽或β多肽分子的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ IDNO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述组合物包含在等电聚焦凝胶上可视的优势同工型，如通过等电聚焦测定的，所述优势同工型具有小于或等于5.5的等电点，pI。在一个实施方案中，pI在神经氨酸酶处理后增加。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少40％的β多肽或β多肽分子显示小于或等于约5.3的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少70％的β多肽或β多肽分子显示小于或等于约5.3的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少90％的β多肽或β多肽分子显示小于或等于约5.3的等电点。本发明提供了具有约2.0±0.2－约5.2±0.2的pI的β多肽或β多肽分子的分离群体。本发明提供了具有约4.5±0.2－约5.2±0.2的pI的β多肽或β多肽分子的分离群体。本发明提供了具有约4.7±0.2－约5.1±0.2的pI的β多肽或β多肽分子的分离群体。本发明提供了用于制备组合物的方法，所述组合物包含具有约2.0±0.2－约5.2±0.2的pI的β多肽或β多肽分子，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，所述方法包括：(a)对β多肽的混合物实施等电聚焦凝胶电泳，其中在凝胶上的单个条带表示具有特定pI的β多肽或β多肽分子的群体，和(b)分离具有约2.0±0.2－约5.2±0.2的pI的β多肽或β多肽分子群体，以便制备组合物。
本发明提供了包含β多肽或β多肽分子的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ IDNO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于约2.7－约3.6的GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于约6.4－约7.0的岩藻糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于约14－约16的甘露糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述分子的特征在于约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述分子的特征在于约5－约10的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(b)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述分子的特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(c)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述分子的特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(d)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(d)约6.4－约7.0的岩藻糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(e)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ IDNO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(d)约6.4－约7.0的岩藻糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(e)约14－约16的甘露糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(f)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约8－约17的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(c)与图8基本上相同的碳水化合物概况。本发明提供了包含β多肽或β多肽分子的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约8－约17的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(c)与图8基本上相同的碳水化合物概况；和(d)小于约5％的β多肽四聚体含量。本发明提供了包含β多肽或β多肽分子的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(b)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(c)小于约5％的β多肽四聚体含量。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(b)与图8基本上相同的碳水化合物概况。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(b)与图8基本上相同的碳水化合物概况。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(b)小于约5％的β多肽四聚体或高分子量种类含量。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽的特征在于：(a)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；和(b)小于约5％的β多肽四聚体或高分子量种类含量。
本发明提供了包含β多肽或β多肽分子的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ IDNO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽显示与图8基本上相同的碳水化合物概况。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述多肽显示结构域I－IV的碳水化合物概况，其中结构域I包含代表无唾液酸化的寡糖的峰，结构域II包含代表单唾液酸化的寡糖的峰，结构域III包含代表双唾液酸化的寡糖的峰，且结构域IV包含代表三唾液酸化的寡糖的峰。在一个实施方案中，结构域I中的第一个峰和结构域II中的主峰之间N联寡糖的保留时间中的差异为约11－约13分钟。在一个实施方案中，结构域III和IV的总和包含约25％－约36％的总碳水化合物概况。
本发明提供了包含β多肽二聚体或β多肽分子的分离的组合物，其中每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中至少0.5％的分子是半胱氨酰化的。本发明提供了β多肽的分离的群体，其中每个多肽单体包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述群体显示如图11中所示的质谱法概况。本发明提供了β多肽或β多肽分子的分离的群体，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，具有约5.5－约8.5的唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比，其中所述β多肽二聚体或β多肽分子由生产细胞系的细胞生产。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，其中所述多肽在下述残基上是糖基化的：SEQ ID NO：4的第102位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：4的第134位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：4的第233位处的天冬酰胺氨基酸残基。本发明提供了包含β多肽的分离的组合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述分子的特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(d)约6.4－约7.0的岩藻糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(e)约14－约16的甘露糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(f)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(g)如由等电聚焦凝胶上可视化测定的，约2.4±0.2－约5.2±0.2的pI；(h)小于或等于5ppm的MCP-1；(i)小于5％的四聚体或高分子量种类；(j)小于1％的β多肽单体；和(k)具有与SEQ ID NOS：4、11、12、13、14、15或16中的任何一个至少95％等同的氨基酸的群体的β多肽或β多肽分子，其中群体内的β多肽能够与CD80和CD86结合。本发明提供了β多肽的分离的群体，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述分子群体的特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(d)约6.4－约7.0的岩藻糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(e)约14－约16的甘露糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(f)约5.5－约8.5的唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比；(g)如由等电聚焦凝胶上可视化测定的，约2.4±0.2－约5.2±0.2的pI；(h)小于或等于5ppm的MCP-1；(i)小于5％的四聚体或高分子量；(j)小于1％的单体；和(k)具有与SEQ IDNOS：4、11、12、13、14、15或16中的任何一个至少95％等同的氨基酸的群体的β多肽，其中群体内的β多肽分子能够与CD80和CD86结合；或其药学等价物。
本发明提供了包含有效量的本发明的β多肽和药学上可接受的载体的组合物。本发明提供了包含如美国申请号60/752,150中描述的赋形剂的组合物；所述美国申请于2005年12月20日提交。在一个实施方案中，组合物包括β多肽分子。在一个实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂、佐剂或载体。在一个实施方案中，组合物进一步包含蔗糖、一代磷酸钠一水合物、氯化钠、氢氧化钠、盐酸和无菌水。在另一个实施方案中，组合物进一步包含蔗糖、泊洛沙姆、一代磷酸钠一水合物、无水二代磷酸钠、氯化钠、氢氧化钠和无菌水。在一个实施方案中，组合物是冻干的。本发明提供了包含有效量的本发明的β多肽、蔗糖、一代磷酸钠一水合物、氯化钠、氢氧化钠和盐酸的冻干组合物。
制剂和试剂盒：本发明提供了冻干的β多肽混合物，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，包含至少95％β多肽二聚体，和不超过5％β多肽四聚体(高分子量种类)。在一个实施方案中，混合物包含至少98％β多肽二聚体，和不超过2％β多肽四聚体(高分子量种类)。在一个实施方案中，混合物包含至少99％β多肽二聚体，和不超过1％β多肽四聚体(高分子量种类)。在一个实施方案中，混合物包含至少5摩尔唾液酸/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子。在一个实施方案中，混合物包含约24－约28摩尔GlcNAc/摩尔β多肽二聚体(高分子量种类)。在一个实施方案中，混合物包含约2.7－约3.6摩尔GalNAc/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子。在一个实施方案中，混合物包含约11－约13摩尔半乳糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子。在一个实施方案中，混合物包含约6.4－约7.0摩尔岩藻糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子。在一个实施方案中，混合物包含约14－约16摩尔甘露糖/摩尔β多肽二聚体或β多肽分子。本发明还提供了药物试剂盒，其包含：(a)包含本发明的冻干的β多肽混合物的容器；和(b)用于将冻干的β多肽混合物重构成用于注射的溶液的说明书。
举例说明性的治疗方法：用于抑制T细胞增殖、活化或两者的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的本发明的β多肽组合物接触。本发明提供了用于抑制受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的免疫病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于诱导受试者中针对抗原的免疫耐受的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本方法提供了用于治疗受试者中的炎症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本方法供了用于治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的牛皮癣的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的狼疮的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的变态反应的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的移植器官排斥的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的移植组织排斥的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗或预防受试者中的移植细胞排斥的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。在一个实施方案中，移植细胞是骨髓细胞。在另一个实施方案中，移植细胞是胰岛细胞。在另一个实施方案中，移植细胞是胰岛素生产性胰岛细胞。本发明提供了用于治疗受试者中的多发性硬化的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的Crohn氏病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的I型糖尿病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的炎性肠病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的卵巢炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的肾小球肾炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的变应性脑脊髓炎的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。本发明提供了用于治疗受试者中的重症肌无力的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物。
本发明提供了β多肽或β多肽分子群体在制备用于免疫病症的治疗和/或预防性处理的药物中的用途，其中每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述群体具有约5－约10的唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。本发明提供了β多肽或β多肽分子群体在制备抗类风湿性关节炎剂中的用途，其中每种多肽包含SEQID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中所述群体具有约5－约10的唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比，所述抗类风湿性关节炎剂连同关于其在类风湿性关节炎治疗中的用途的说明书一起在包装中。在一个实施方案中，群体具有约5.5－约8.5的唾液酸基团与β多肽二聚体或β多肽分子的平均摩尔比。
举例说明性的组合疗法：本发明提供了用于抑制T细胞增殖、活化或两者的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的本发明的β多肽组合物接触，所述组合物与氨甲蝶呤组合。本发明提供了用于抑制受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物，所述组合物与氨甲蝶呤组合。本发明提供了用于诱导受试者中针对抗原的免疫耐受的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的β多肽组合物，所述组合物与氨甲蝶呤组合。
附图说明
图1A－1B呈现了关于CTLA4-Ig分子的表达盒的部分的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。还显示了由该核酸编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。可由这种表达盒生产的CTLA4-Ig分子包括具有下述残基的氨基酸序列的分子：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的26－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382和(vi)SEQ ID NO：2的25－383。表达盒包含下述区域：(a)制瘤素M信号序列(SEQID NO：1的核苷酸11－88；SEQ ID NO：2的氨基酸1－26)；(b)人CTLA4的胞外结构域(SEQ IDNO：1的核苷酸89－463；SEQ ID NO：2的氨基酸27－151)；(c)人IgG1恒定区的经修饰的部分(SEQ ID NO：1的核苷酸464－1159；SEQ ID NO：2的氨基酸152－383)，包括经修饰的铰链区(SEQ ID NO：1的核苷酸464－508；SEQ ID NO：2的氨基酸152－166)，经修饰的人IgG1 CH2结构域(SEQ ID NO：1的核苷酸509－838；SEQ ID NO：2的氨基酸167－276)，和人IgG1CH3结构域(SEQ ID NO：1的核苷酸839－1159；SEQ ID NO：2的氨基酸277－383)。
图2呈现了对应CTLA4A29YL104E-Ig的核酸(顶部行)和氨基酸(底部行)序列。氨基酸序列包含来自图1中所示的序列的氨基酸变化，其中与SEQ ID NO：2的那种相比较，所述变化在第29位(A至Y)和第104位(L至E)处，其中氨基酸残基的编号从标记为“+1”的甲硫氨酸(M)处开始。CTLA4A29YL104E-Ig的核苷酸序列显示于该图中，从第79位(即，在M下由“+1”标记的位置)处的A开始直到在核苷酸位置1149处的A(SEQ ID NO：3)。特别地，编码CTLA4A29YL104E-Ig的核苷酸序列从第79位处的核苷酸到第1149位处的核苷酸，命名为SEQ IDNO：3。显示于图2中的全长核苷酸序列命名为SEQ ID NO：23，且包括编码制瘤素M信号肽的核酸序列。
图3呈现了包括制瘤素M前序列(参见粗体斜体字)的CTLA4A29YL104E-Ig分子的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。可以生产的是CTLA4A29YL104E-Ig分子的多肽包括具有下述残基的氨基酸序列的分子：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ IDNO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的26－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382和(vi)SEQ IDNO：4的25－383。
图4是与N联糖基化位点(N76、N108和N207)、C120-C120二硫键、和CTLA-4结构域中进行的2个氨基酸置换(L104E和A29Y)一起显示的CTLA4A29YL104E-Ig模型。
图5表示CTLA4A29YL104E-Ig的理论cDNA衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。2个氨基酸置换在CTLA-4胞外结构域中进行(L104E和A29Y)，以产生CTLA4A29YL104E-Ig。该序列鉴定制瘤素M的信号肽(前序列)连同N联糖基化位点。
图6是描绘CTLA4A29YL104E-Ig样品与山羊抗人IgG Fc抗体的结合的曲线图。CTLA4A29YL104E-Ig样品的结合通过与未修饰的传感器芯片表面相比较，测量在这个表面上获得的应答进行检测。各种批次表示3种不同的CTLA4A29YL104E-Ig样品。
图7是显示表观分子量的曲线图，所述表观分子量对应于如通过2柱SEC覆盖测定的CTLA4-Ig HIC清除峰(cleaning peak)的多聚体、四聚体或二聚体级分，所述2柱SEC覆盖伴有动态光散射检测(DSL)和SEC上的保留时间。
图8A(顶部)和8B(底部)显示从HIC清除峰中分离和纯化的糖基化CTLA4-Ig分子(包含SEQ ID NO：2单体)的级分的代表性IEF凝胶。顶部凝胶的加样顺序为：泳道1，pI标记(Amersham)；泳道2，CTLA4-Ig二聚体标准；泳道3，A蛋白洗脱物；泳道4，多聚体；泳道5，四聚体；泳道6，二聚体。底部凝胶的加样顺序为：泳道1，pI标记(Amersham)；泳道2，泳道2，CTLA4-Ig二聚体标准；泳道3，四聚体；泳道4，解离的四聚体。该小图显示四聚体比二聚体更少唾液酸化。
图9显示在包含SEQ ID NO：2单体的CTLA4-Ig二聚体上观察到的占优势的碳水化合物结构和碳水化合物的相对量。该图中的氨基酸残基编号与SEQ ID NO：2不一致。为了使该图中的氨基酸残基编号与SEQ ID NO：2一致，编号需增加26，即N76是N102。
图10显示用于命名表60中显示的寡糖的命名法。灰色阴影区域显示N联寡糖核心结构，其中P代表PNGase F消化，且后面的数字分别描述甘露糖(圆圈)、岩藻糖(向下指的三角)、半乳糖(向右指的三角)、和唾液酸残基(星形)的数目。N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)由方形表示。
图11显示包含SEQ ID NO：2单体的CTLA4-Ig二聚体的代表性IEF凝胶(pH 4.0－6.5)。泳道1和5显示校准标准，泳道2、3、4各自显示20μg/μl CTLA4-Ig二聚体。
图12显示包含SEQ ID NO：4单体的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体的代表性IEF凝胶(pH4.0－6.5)。泳道1和8显示校准标准，泳道2－7各自显示10μg/μl CTLA4A29YL104E-Ig二聚体。
图13显示包含SEQ ID NO：2的单体的CTLA4-Ig分子群体的N联碳水化合物概况。使用LC/MS PGC N联寡糖技术从糖肽收集碳水化合物且分离。层析谱提供了关于每个N联附着位点的群体概况。A)来自T5肽的Asn76(SEQ ID NO：2的Asn102)碳水化合物和B)来自T7肽的Asn108(SEQ ID NO：2的Asn134)碳水化合物，都显示在单和多唾液酸化的种类中的分布。C)来自T14肽的Asn207(SEQ ID NO：2的Asn 233)由占优势地无唾液酸化的种类组成。D)显示关于CTLA4-Ig分子的N联碳水化合物的分布。E)来自T5肽的所选择的原始谱显示对应于所述双触角单唾液酸化的结构的主峰。F)来自T14的所选择的原始谱显示对应于双触角脱唾液酸的结构的主峰。G)所选择的原始谱由与64.23分钟时的峰共洗脱的次要种类组成，所述次要种类对应于三触角双唾液酸化的结构。H)所选择的原始谱揭示在64.23分钟时的峰中的主要种类，所述主要种类对应于双触角双唾液酸化的结构。
图14A－B显示在酸性洗脱条件(0.05％TFA)下来自PGC层析的CTLA4-Ig SEQ IDNO：2单体的N联寡糖概况的UV和TIC脉迹。图14A的脉迹显示在酸性洗脱条件(0.05％TFA)下关于PGC层析谱的阴离子总计数(TIC)。图14B的脉迹显示在酸性洗脱条件(0.05％TFA)下关于PGC层析谱在206nm处的UV脉迹。
图15A－B显示在碱性洗脱条件(0.4％NH4OH)下来自PGC层析的CTLA4-Ig SEQ IDNO：2单体的N联寡糖概况的UV和TIC脉迹。图15A的脉迹显示在碱性洗脱条件(0.4％NH4OH)下关于PGC层析谱的阴离子总计数(TIC)。图15B的脉迹显示在碱性洗脱条件(0.4％NH4OH)下关于PGC层析谱在206nm处的UV脉迹。
图16表示包含SEQ ID NO：4的CTLA4A29YL104E-Ig分子的比较N联寡糖碳水化合物概况。观察到4种寡糖结构域：结构域I包含无唾液酸化的种类，而结构域II、III和IV分别包含单唾液酸化、双唾液酸化和三唾液酸化的种类。以层析方式分离寡糖和通过质谱法对其进行分析测定了结构域。
图17显示包含SEQ ID NO：2单体的CTLA4-Ig分子的N联寡糖的HPAEC-PAD概况。结构域以关于寡糖的唾液酸含量渐增的顺序显示。结构域I、II、III和IV分别包含具有0、1、2和3个唾液酸的寡糖结构。峰标记表示通过从PGC概况分析中收集的峰的HPAEC-PAD概况分析指定的寡糖结构。碳水化合物结构的结构鉴定与先前的测定一致。
图18A－B显示包含SEQ ID NO：2单体的CTLA4-Ig分子的PGC概况。该概况得自如实施例3中所述制备的碳水化合物消化混合物的直接注射。直接注射导致在130分钟时洗脱的结构P4144的检测。四唾液酸化的结构P4144在注射前分离的寡糖概况中未观察到。
图19呈现关于SEQ ID NO：2单体的T9片段的LC/MS去褶合(deconvoluted)正电喷射谱。该谱举例说明3种主要的O联结构。该谱举例说明了具有与O联结构(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1一致的糖梯的基础肽。相对于该谱的非粗体部分，该谱的粗体部分已增强10倍，且举例说明了具有(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2和(GalNAc) 1(GlcNAc)1(Gal)2(NeuAc)2的2种另外的O联结构。
图20显示具有SEQ ID NO：2单体序列的CTLA4-Ig单链的O联碳水化合物结构的附着点和相对群体。每个位点上的相对量显示由2种或更多正交技术产生的数据且实施变异性。共价半胱氨酰化的位置也得到描绘。
图21描绘中间质粒piLN-huCTLA4-Ig的图。这种质粒已包含侧接限制酶位点HindIII和XbaI的可以编码人CTLA4-Ig分子(huCTLA4-Ig)的序列(即，SEQ ID NO：1)。
图22描绘质粒pD16LEA29Y的图。这种质粒包含可以编码人CTLA4A29YL104E-Ig分子(即，SEQ ID NO：4)的序列。
图23是从CHO细胞中提取的DNA的DNA印迹的照片，所述CHO细胞表达衍生自1D5-100A1(例如，克隆17)的CTLA4-Ig表达盒。凝胶泳道从左到右为：泳道M，DNA分子量标记；泳道N，EcoRI/XbaI消化的未转染的CHO DNA(5mg)；泳道1，EcoRI/XbaI消化的未转染的CHODNA(2.5μg)+1ng pcSDhuCTLA4-Ig；泳道2，EcoRI/XbaI消化的未转染的CHO DNA(2.5μg)+0.5ng pcSDhuCTLA4-Ig；泳道3，EcoRI/XbaI消化的未转染的CHO DNA(2.5 μg)+0.25ngpcSDhuCTLA4-Ig；泳道4，EcoRI/XbaI消化的未转染的CHO DNA(2.5μg)+0.125ngpcSDhuCTLA4-Ig；泳道5，EcoRI/XbaI消化的未转染的CHO DNA(2.5μg)+0.0625ngpcSDhuCTLA4-Ig；泳道6，EcoRI/XbaI消化的未转染的CHO DNA(2.5μg)+0.03125ngpcSDhuCTLA4-Ig；泳道7，EcoRI/XbaI消化的DNA：MCB(5.0μg)；泳道8，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030618A-01(5.0μg)；泳道9，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030712A-01(5.0μg)；泳道10，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030801A-01(5.0μg)；泳道11，EcoRI/XbaI消化的DNA：MCB(2.5μg)；泳道12，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030618A-01(2.5μg)；泳道13，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030712A-01(2.5μg)；泳道14，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030801A-01(2.5μg)；泳道15，EcoRI/XbaI消化的DNA：MCB(1.25μg)；泳道16，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030618A-01(1.25μg)；泳道17，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030712A-01(1.25μg)；泳道18，EcoRI/XbaI消化的DNA：EPCB批号C20030801A-01(1.25μg)。
图24描绘生产规模的培养方法的流程图。这个方法允许在25,000-L生产生物反应器中大量生产重组蛋白质。
图25显示NGNA和NANA系统适合性标准的代表性层析谱。在～9.7分钟时的峰是NGNA，且在～10.7分钟时的峰是NANA。
图26显示包含SEQ ID NO：2单体的水解的CTLA4-Ig分子的代表性层析谱。在～8.4分钟时的峰是溶剂峰。在～9.6分钟时的峰是NGNA。在～10.5分钟时的峰是NANA。在～11.3分钟时的峰是降解的NANA，由水解条件产生。将NANA和降解的NANA的面积计数组合用于计算NANA摩尔比。
图27A、27B和27C显示CTLA4-Ig半胱氨酰化的肽的MALDI谱。获得对于包含SEQ IDNO：2的Cys146的CTLA4-Ig胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶片段的MALDI谱。图27A显示举例说明半胱氨酰化修饰的单链肽谱。图27B显示还原后的单链肽的谱，且证实修饰在Cys146处发生。图27C显示还原的单链肽的烷化，这证实半胱氨酰化在Cys146处发生。
图28呈现用于产生载体pcSD的克隆方案。pcDNA3用限制酶NaeI 进行消化，以分离包含CMV启动子、氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌(E.coli)的复制起点的3.821Kb片段。pSV2-dhfr用限制酶PvuII和BamHI进行消化，以分离包含SV40启动子和dhfr基因的1.93Kb片段，且随后进行平端化。为了产生pcSD，将2个片段连接。质粒pcSD的图显示于该图的底部。
图29呈现用于产生表达载体pcSDhuCTLA4-Ig的克隆方案。pcSD用限制酶EcoRV和XbaI进行消化。piLN-huCTLA4-Ig用限制酶HindIII进行消化，平端化，且随后用限制酶XbaI进行消化，以分离1.2Kb huCTLA4-Ig片段。为了产生pcSDhuCTLA4-Ig，将CTLA4-Ig片段连接到消化的pcSD载体。质粒pcSDhuCTLA4-Ig的图显示于该图的底部。将这种质粒线性化且转染到不含功能性dhfr基因的CHO细胞内。因为质粒包含功能性dhfr基因，所以稳定的转染子可以基于细胞存活进行选择。pcSDhuCTLA4-Ig具有包含下述的表达盒：CMV启动子、可以编码人CTLA4-Ig分子(huCTLA4-Ig)的序列(即，SEQ ID NO：1)和来自BGH的聚腺苷酸尾序列。
图30显示描述为相对荧光单位(RFU)对时间(分钟)的系统适合性氨基单糖的电泳图。
图31显示描述为相对荧光单位(RFU)对时间(分钟)的系统适合性中性单糖的电泳图。
图32表示具有标记的肽的CTLA4A29YL104E-Ig的胰蛋白酶肽图。表23与标记的肽对应。
图33显示CTLA4A29YL104E-Ig的RNA杂交分析。小图A描绘溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶，其中泳道M是RNA标记；泳道1是总CHO RNA；泳道2是总MCB RNA；和泳道3是总EPCB RNA。小图B是相应的放射自显影图，其中泳道M是RNA标记；泳道1是总CHO RNA；泳道2是总MCBRNA；和泳道3是总EPCB RNA。
图34A－C描绘尺寸排阻层析谱，其使CTLA4A29YL104E-Ig二聚体与高和低分子量种类区分开。
图35显示用考马斯蓝染色的CTLA4A29YL104E-Ig的SDS-PAGE(还原和非还原型)分析。泳道1用分子量标记加样；泳道2、7和12是空白；泳道3－6是CTLA4A29YL104E-Ig样品(还原型)；泳道8－11是CTLA4A29YL104E-Ig样品(非还原型)。
图36显示实施银染色的CTLA4A29YL104E-Ig的SDS-PAGE(还原和非还原型)分析。泳道1用分子量标记加样；泳道2、7和12是空白；泳道3－6是CTLA4A29YL104E-Ig样品(还原型)；泳道8－11是CTLA4A29YL104E-Ig样品(非还原型)。
图37描绘使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶组合消化的非还原CTLA4A29YL104E-Ig的肽图。
图38描绘使用胰蛋白酶和弹性蛋白酶组合消化的非还原CTLA4A29YL104E-Ig的肽图。
图39是描绘具有抗CTLA4-Ig或抗CTLA-4应答的患者的图表。如实施例32中所述，使用测定A和B测定针对完整CTLA4-Ig分子(CTLA-4和Ig部分)和仅CTLA-4部分的抗体应答。
图40是证实由免疫原性状态的清除率分布和中央区室的体积的示意图。
图41是证实在施用通过本发明的方法生产的10mg/kg药品的猴中随着时间过去的平均(SD)CTLA4-Ig血清浓度的概况的曲线图。
图42是从对照和解聚的CTLA4-Ig材料中纯化的A蛋白(MAbSelect)的尺寸排阻层析(SEC)层析谱的曲线图。
图43是使解聚处理的材料(ii)与对照(i)相比较的N聚糖分析的曲线图。
图44是描绘平均CTLA4-Ig血清浓度[μg/ml]对时间(经过71天)的曲线图。
图45显示描绘为相对荧光单位(RFU)对时间(分钟)的中性单糖的电泳图。
图46显示描绘为相对荧光单位(RFU)对时间(分钟)的氨基单糖的电泳图。
图47表示关于包含SEQ ID NO：4的CTLA4A29YL104E-Ig分子的比较N联寡糖碳水化合物概况。观察到4种寡糖结构域，其中结构域I包含非唾液酸化的种类，而结构域II、III和IV分别包含单唾液酸化、双唾液酸化和三唾液酸化的种类。
图48是与CTLA4A29YL104E-Ig 1：1混合的CTLA4-Ig的毛细管电泳分离的曲线图。主峰迁移时间为间隔约0.8分钟。
图49是水解的CTLA4A29YL104E-Ig材料的层析谱，其中NANA峰在3.4分钟时观察到。
图50描绘在哺乳动物蛋白质中发现的各种N联碳水化合物结构中的几种。所有链共享包含2个GlcNAc和3个甘露糖残基的共同核心结构。
图51是描绘作为糖蛋白(NANA比)的唾液酸化函数的CTLA4-Ig暴露(AUC)的曲线图。
图52是描绘作为CTLA4-Ig的碳水化合物概况函数的CTLA4-Ig暴露(AUC)的曲线图。大量峰由阴离子交换HPLC产生，其分解成4种或5种结构域。结构域1和2主要是无唾液酸化和单唾液酸化的结构，而结构域3和4主要是双和三唾液酸化的结构。
图53表示具有标记的肽的CTLA4A29YL104E-Ig的胰蛋白酶肽图。表56与标记的肽对应。
图54表示关于包含SEQ ID NO：2的CTLA4-Ig分子的比较N联寡糖碳水化合物概况。观察到4种寡糖结构域，其中结构域I包含非唾液酸化的种类，而结构域II、III和IV分别包含单唾液酸化、双唾液酸化和三唾液酸化的种类。
图55A－D是表示通过HPAEC-PAD的CTLA4-Ig以及肽T5、T7和T14的寡糖概况的曲线图。
图56是描绘得自PGC(Hypercarb)柱的CTLA4-Ig的标记的寡糖概况的曲线图。
图57描绘药物代谢动力学数据的曲线图，显示在Y轴上的猴AUC以及如来自X轴上的碳水化合物概况的结构域I和II中所示的N联糖基化的百分比。参见例如实施例3、44、22和37中测定N联碳水化合物概况的方法。随着结构域I和II的百分比增加(以及结构域III、IV和V的百分比减少)，清除率增加。注意到阴性对照，具有低唾液酸的CTLA4-Ig被非常快速地清除。应当指出CTLA4-Ig变体，LEA(CTLA4-IgA29YL104E-Ig)包括在这个曲线图中。
图58A和58B描绘从CTLA4-Ig中释放的N联碳水化合物(如得自例如实施例3、44、22和37中的那些方法)的N联碳水化合物层析谱的脉迹。图58A中的脉迹来自在不向培养物中添加另外的半乳糖的培养法中产生的CTLA4-Ig的分析。图58B中的脉迹的确已向培养物中添加半乳糖。每个结构域中的N联碳水化合物的百分比显示于插入表中。
图59描绘从CTLA4-Ig中释放的N联碳水化合物(如得自例如实施例3、44、22和37中的那些方法)的N联碳水化合物层析谱的脉迹。这来自在第8天时向培养基中添加半乳糖的培养法中产生的CTLA4-Ig的分析。这种脉迹来自在不向培养物中添加另外的半乳糖的培养法中产生的CTLA4-Ig的分析。每个结构域中的N联碳水化合物的百分比显示于插入表中。
图60描绘从CTLA4-Ig中释放的N联碳水化合物(如得自例如实施例3、44、22和37中的那些方法)的N联碳水化合物层析谱的脉迹。这来自在第14天时向培养物中添加半乳糖的培养法中产生的CTLA4-Ig的分析。这种脉迹来自在不向培养物中添加另外的半乳糖的培养法中产生的CTLA4-Ig的分析。每个结构域中的N联碳水化合物的百分比显示于插入表中。
图61A和61B描绘从CTLA4-Ig中释放的N联碳水化合物(如得自例如实施例3、44、22和37中的那些方法)的N联碳水化合物层析谱的脉迹。图61A来自在不添加半乳糖的培养法中产生的CTLA4-Ig的分析，且图61B来自其中在第14天时向培养物中添加半乳糖的分析。这种脉迹来自在不向培养物中添加另外的半乳糖的培养法中产生的CTLA4-Ig的分析。每个结构域中的N联碳水化合物的百分比显示于插入表中。
图62描绘从CTLA4-Ig中释放的N联碳水化合物(如得自例如实施例3、44、22和37中的那些方法)的N联碳水化合物层析谱的脉迹。这种脉迹得自从QFF柱的洗涤步骤中回收的CTLA4-Ig材料，产生具有低唾液酸的CTLA4-Ig材料的部分(cut)。与图61、60和59中显示的脉迹相比较，结构域I和II的相对量增加，并且结构域III和Iv减少。每个结构域中的N联碳水化合物的百分比显示于插入表中。
图63显示CTLA4-Ig的胰蛋白酶肽图，指出T8在溶剂前部结束时洗脱，且T9在T27肩部时洗脱。
图64是表示对应于来自CTLA4-Ig的糖肽T8的全质谱的曲线图。
图65是表示对应于来自CTLA4-Ig的糖肽T9的全质谱的曲线图。
图66是表示对应于来自CTLA4-Ig的T9肽片段的MALDI-TOF 数据的曲线图。
图67A-B描绘了来自CTLA4-Ig的氧化和天然胰蛋白酶肽的离子层析谱和质谱。
图68描绘了一般的N联寡糖概况(结构域I、II、III、IV和V，以及在5％的批平均值内的峰1A和1B)。峰1A、1B和1C表示G0、G1和G2的脱唾液酸N联寡糖结构。关于该概况的数据在正下方的表中。参见实施例44。
峰名称 RT 面积 ％面积
1 结构域I 19.413 47807873 31.3
2 结构域II 29.076 50746179 33.2
3 结构域III 42.819 36640805 24.0
4 结构域V 67.546 3421324 2.2
5 结构域IV 55.899 14331509 9.4
6 峰1A 19.413 11115168 7.3
7 峰1B 20.290 16331761 10.7
8 峰1C 21.032 13507144 8.8
9 峰2 21.925 4285962 2.8
10 22.685 2567838 1.7
11 29.076 2808537 1.8
12 30.763 27989176 18.3
13 31.577 19948466 13.0
14 42.819 4555254 3.0
15 峰3 43.823 22213064 14.5
16 46.626 9872487 6.5
17 55.899 3898179 2.5
18 峰4 57.368 6789516 4.4
19 60.333 3643813 2.4
20 67.546 3421324 2.2
图69描绘CTLA4-Ig的等电聚焦凝胶。条带的特征在于：
图70描绘CTLA4-Ig的代表性等电聚焦凝胶定量分析报告。进行凝胶的定量且数据如下：
图71A描绘在配备保护柱的TOSO HAAS 3000 SWXL柱上的系统适合性标准的一般20μL注射。图71B描绘在配备保护柱的TOSO HAAS 3000 SWXL柱上的CTLA4-Ig参照材料的20μL注射。
图72－CTLA4-Ig通过考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺(4-20)凝胶电泳的SDS-PAGE分析的数字获得图像的例子
图73描绘关于考马斯蓝染色的SDS-PAGE的定量分析报告的例子。
图74显示阐述图73中染色的SDS-PAGE凝胶的定量分析的表。
图75描绘CTLA4-Ig考马斯蓝染色的凝胶的SDS-PAGE分析的增强图像的例子，用于举例说明相对于分子量标记的主要和预期的次要条带的迁移位置。
图76是CTLA4-Ig参照/标准材料的代性N联碳水化合物概况的描述。这是在Waters系统上运行的代表性碳水化合物概况。保留时间是系统依赖性的。
图77是代表水苏糖系统适合性层析谱的描述。
图78是水解的CTLA4-Ig材料的代表性层析谱的脉迹。
图79描绘CTLA4A29YL104E-Ig考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺(4-20％)凝胶电泳考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析的扫描(ccanned)凝胶图像。
图80描绘收获步骤的流程图，参见实施例28。
图81描绘氨基单糖的系统适合性的电泳图。参见实施例16。
图82描绘药物代谢动力学数据的曲线图，显示在Y轴上的猴AUC以及如来自X轴上的碳水化合物概况的结构域I和II中所示的N联糖基化的百分比。参见例如实施例3、44、22和37中测定N联碳水化合物概况的方法。随着结构域I和II的百分比增加(以及结构域III、IV和V的百分比减少)，AUC增加。注意到阴性对照，具有低唾液酸的CTLA4-Ig被非常快速地清除。应当指出突变型CTLA4-Ig分子，CTLA4-IgA29YL104E-Ig(命名为LEA)包括在这个曲线图中。
图83描绘药物代谢动力学数据的曲线图，显示在Y轴上的AUC以及如X轴上的结构域III和IV(如由N联碳水化合物概况测定的)中所示的N联糖基化的百分比。随着结构域III和IV的百分比增加，AUC增加。注意到阴性对照，具有低唾液酸的CTLA4-Ig被非常快速地清除。参见例如实施例3、44、22和37中测定N联碳水化合物概况的方法。应当指出突变的CTLA4-Ig分子，CTLA4-IgA29YL104E-Ig(命名为LEA)包括在这个曲线图中。
图84描绘药物代谢动力学数据的另一个曲线图，显示在Y轴上的AUC以及如来自X轴上的碳水化合物概况的结构域III和IV中所示的N联糖基化的百分比。随着结构域III和IV的百分比增加，AUC增加。注意到阴性对照，具有低唾液酸的CTLA4-Ig被非常快速地清除。参见例如实施例3、44、22和37中测定N联碳水化合物概况的方法。应当指出突变的CTLA4-Ig分子，CTLA4-IgA29YL104E-Ig(命名为LEA)包括在这个曲线图中。
图85描绘CTLA4-Ig标准的胰蛋白酶图，关于峰分配参见在实施例65结束时的表。标记为T1+A的小峰是通过N末端丙氨酸残基延伸的T1胰蛋白酶肽。标记为T31+K的小峰是通过N末端赖氨酸残基延伸的T31胰蛋白酶肽。
图86描绘关于CTLA4-Ig标准加掺加了5摩尔％T6ox指示剂肽，Met(O)85(84-93)的CTLA4-Ig标准的胰蛋白酶图280nm数据的覆盖。参见实施例65。
图87描绘关于CTLA4-Ig标准加掺加了5摩尔％T26deaml指示剂肽，isoAsp294(281-302)的CTLA4-Ig标准胰蛋白酶图的215nm数据的扩大视图。参见实施例65。
图88描绘的流程图显示了CTLA4A29YL104E-Ig纯化方法的例子。参见实施例20-A。
图89显示了实施例22中胰蛋白酶消化肽作图的程序概括。
图90显示了CTLA4-Ig生产方法的工艺流程图。参见实施例28。
图91显示了用于CTLA4-Ig生产方法的下游步骤的工艺流程图。参见实施例29。
图92显示了关于CTLA4A29YL104E-Ig的体外基于细胞的生物测定的程序。参见实施例40。
图93显示了经由表面等离子体共振(BIAcore)测定CTLA4A29YL104E-Ig与B7.1-Ig受体的生物特异性结合的方法概述。参见实施例41。
图94显示了关于CTLA4-Ig的体外基于细胞的生物测定的程序流程图。参见实施例45。
图95显示了通过ELISA测定CTLA4A29YL104E-Ig药品中的中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白质杂质的方法概述。参见实施例52。
图96显示了通过ELISA测定CTLA4A29YL104E-Ig的A蛋白水平的方法概述。参见实施例53。
图97显示了质粒pcSDhuCTLA4Ig的DNA序列。参见实施例67。
具体实施方式
CTLA4-Ig分子可以用于治疗各种病症，包括涉及异常免疫增生和免疫反应性现象的病症如自身免疫和变态反应。本发明提供了包含例如CTLA4-Ig分子群体的CTLA4-Ig组合物，所述CTLA4-Ig分子群体具有特定糖基化修饰、具有特定碳水化合物概况或特征、具有特定多聚结构、和/或具有特定抗体亲抗原性强度。同样描述CTLA4-Ig分子、其用途和方法的在此整体引入作为参考的文件包括美国专利号5,434,131；5,851,795；5,885,796；5,885,579；和7,094,874。
本发明还提供了能够经由本文提供的大量生产和培养法生产大量CTLA4-Ig分子的细胞系。本发明的一种具体细胞系是可以用于大量生产CTLA4-Ig分子的克隆细胞系，从而使得它具有特定糖基化和碳水化合物概况。与具有ATCC登记号68629(参见美国专利号5,434,131，其在此整体引入作为参考)的异质和非克隆细胞群体相比较，本发明的克隆细胞系可以分泌具有更一致或更均匀的糖基化或碳水化合物概况的CTLA4-Ig分子群体。此外，与具有ATCC登记号68629的异质和非克隆细胞群体相比较，本发明的克隆细胞系可以分泌更大量的CTLA4-Ig分子，部分是因为本克隆细胞系进行选择以具有高拷贝数目的整合到细胞的基因组中的单个位点内的CTLA4-Ig表达盒。
本发明提供了下述发现：CTLA4-Ig(SEQ ID NO：2)的抗体亲抗原性和效力可以通过在CTLA-4结合结构域的B7结合区中进行2个氨基酸置换得到增加：(i)SEQ ID NO：2的第29位处的丙氨酸替换为酪氨酸(A29Y)，和(ii)SEQ ID NO：2的第104位处的赖氨酸替换为谷氨酸(L104E)。本发明提供包含β多肽的CTLA4-Ig分子的亚属，称为“β多肽分子”，其具有B7结合活性且可以包含与免疫球蛋白恒定区或其部分连接的SEQ ID NO：24中的氨基酸序列(具有A29Y和L104E突变的CTLA4胞外结构域)。
[SEQ ID NO：24]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVTDPEPCPDSD
[SEQ ID NO：18]－CTLA4胞外结构域
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
术语
如本文所使用的，术语“克隆”指由单细胞扩增的细胞群体。就能够表达CTLA4-Ig分子的克隆细胞系或克隆细胞群体而言，克隆细胞系或群体由从细胞群体中分离的单细胞扩增，所述细胞群体用编码CTLA4-Ig分子的表达载体转染。细胞的转染的群体可以是异质群体。克隆细胞系或群体可以视为在群体中的所有细胞来自单个转染子的意义上是同质的。
如本文所使用的，术语“B7-1”指CD80；术语“B7-2”指CD86；且术语“B7”指B7-1和B7-2(CD80和CD86)中的任一个或两者。术语“B7-1-Ig”或“B7-1Ig”指CD80-Ig；术语“B7-2-Ig”或“B7-2Ig”指CD86-Ig。
如本文所使用的，术语“CTLA4-Ig”或“CTLA4-Ig分子”或“CTLA4Ig分子”或“CTLA4-Ig蛋白质”或“CTLA4Ig蛋白质”可互换使用，且指包含至少CTLA4-Ig多肽的蛋白质分子，所述CTLA4-Ig多肽具有CTLA4胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分。在某些实施方案中，例如，CTLA4-Ig多肽包含至少SEQ ID NO：18的氨基酸序列。在某些实施方案中，CTLA4胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分可以是野生型，或突变型或修饰的。突变的CTLA4-Ig多肽是包含突变的CTLA4胞外结构域的CTLA4-Ig多肽。突变的CTLA4Ig分子包含至少突变的CTLA4-Ig多肽。在某些实施方案中，CTLA4胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分可以是哺乳动物，包括人或小鼠。在某些实施方案中，突变的CTLA4胞外结构域可以具有氨基酸序列，其与图1或SEQ ID NO：18中所示的CTLA4胞外结构域至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同。在某些实施方案中，突变的免疫球蛋白恒定区或其部分可以具有与如图1中所示的免疫球蛋白(g)恒定区至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同的氨基酸序列。多肽可以进一步包含另外的蛋白质结构域。CTLA4-Ig分子可以指CTLA4-Ig多肽的单体，并且还可以指多肽的多聚体形式，如二聚体、四聚体和六聚体等(或其他高分子量种类)。CTLA4-Ig分子还能够与CD80和/或CD86结合。CTLA4-Ig分子包括突变的CTLA4Ig分子，例如“β多肽分子”，例如CTLA4A29YL104E-Ig。例如，CTLA4-Ig包含CTLA4-Ig分子，且CTLA4A29YL104E-Ig包含β多肽分子(突变的CTLA4-Ig分子的例子)。
如本文所使用的，术语“CTLA4胞外结构域”指包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列的全部或部分的蛋白质结构域，其与B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)结合。在某些实施方案中，CTLA4胞外结构域可以包含具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸27－150至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同，这与SEQID NO：18中所示的氨基酸相同。SEQ ID NO：2的氨基酸151是接头氨基酸。
如本文所使用的，术语“β多肽”指突变的CTLA4-Ig多肽，其(1)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，其中第29位处的氨基酸突变成酪氨酸，且第104位处的氨基酸突变成谷氨酸，任选具有各种另外修饰，和免疫球蛋白恒定区或其部分；和(2)能够与CD80和/或CD86结合。在某些实施方案中，例如，β多肽包含至少CTLA4A29YL104E-Ig的胞外结构域的氨基酸序列(如SEQ ID NO：24中所示)。β多肽的非限制性例子包括贝拉塔赛(belatacept)以及SEQ IDNOS：4和11－16。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其部分可以是野生型、或突变型或修饰的。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其部分可以是哺乳动物的，包括人或小鼠。β多肽的另外非限制性例子包括在免疫球蛋白恒定区或其部分中包含一个或多个氨基酸突变(例如，SEQ ID NO：4的半胱氨酸120的置换)的β多肽，和在SEQ ID NO：18的氨基酸位置25、30、93、96、103或105中的一个或多个处包含进一步突变的β多肽。β多肽分子包含β多肽。β多肽分子可以指β多肽的单体和β多肽的多聚体形式，例如二聚体、四聚体和六聚体等。例如贝拉塔赛包含β多肽分子。β多肽分子在于2006年10月5日提交的美国临时申请号60/849,543中进一步得到描述，所述申请在此整体引入作为参考。
如本文所使用的，术语“谷氨酸(glutamate)”和“谷氨酸(glutamic acid)”可互换使用。
如本文所使用的，术语“二聚体”指由连接或结合在一起的2个CTLA4-Ig多肽或单体组成的CTLA4-Ig蛋白质或CTLA4-Ig分子。二聚体的单体之间的键可以是非共价键或相互作用、共价键或相互作用、或两者。CTLA4-Ig二聚体的例子显示于图4中。由2个相同单体组成的CTLA4-Ig蛋白质或CTLA4-Ig分子是同二聚体。CTLA4-Ig同二聚体还包含这样的分子，其包含在序列中可能略微不同的2个单体。同二聚体包含其中连接在一起的单体具有基本上相同的序列的二聚体。构成同二聚体的单体共享相当大结构同源性。例如，序列中的差异可以是由于单体的N末端加工修饰。
如本文所使用的，“保守突变”指用一个氨基酸置换相同种类的另一个的核酸序列中的改变(例如，一个非极性氨基酸置换另一个，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；或一个极性氨基酸置换另一个，例如精氨酸置换赖氨酸，谷氨酸置换天冬氨酸或谷氨酰胺置换天冬酰胺)。
如本文所使用的，“非保守突变”指一个氨基酸置换不同种类的另一个的核酸序列中的改变(例如，用酸性氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸置换一个碱性氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。例如，基于大小、电荷、极性、反应性或氨基酸的其他这种特征，氨基酸可以在生物化学上不同于另一个氨基酸。
如本文所使用的，“分离的”指从其天然环境中取出且处于不同于其中分子天然存在的环境中的分子，或从其环境的其他组分中部分或全部回收或分离的物质(例如，蛋白质)，从而使得物质(例如，蛋白质)是所得到的组合物、混合物或组分集合中存在的占优势的种类(例如，蛋白质种类)(例如，在摩尔基础上它比组合物中任何其他个别种类更丰富)。例如，制剂可以由超过约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或或95％分离的CTLA4-Ig组成。“分离的”不排除CTLA4-Ig分子与来自其中分子天然存在的环境的其他CTLA4-Ig分子的混合物。“分离的”不排除与CTLA4-Ig组合的药学上可接受的赋形剂，其中CTLA4-Ig已从其环境例如细胞培养物、分批培养物或生物反应器等中回收。如本文所使用的，“分离”指执行过程或方法以获得分离的CTLA4-Ig分子。
如本文所使用的，术语“可溶性CTLA4”意指可以在体内循环的分子或不与细胞膜结合的CTLA4。例如，可溶性CTLA4可以包括CTLA4-Ig，其包括与Ig连接的CTLA4的胞外区。
如本文所使用的，术语“细胞培养物的可溶性级分”指不同于或基本上不含细胞培养物的不溶性、颗粒或固体组分例如细胞、细胞膜和核的细胞培养物的液体部分。可溶性级分可以是例如细胞培养物离心后所得到的上清液，或细胞培养物过滤后所得到的滤液。
如本文所使用的，术语“表达盒”指具有与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接的至少5'调节区(例如，启动子)和任选地非翻译的3'终止区(例如，终止密码子和聚腺苷酸化序列)的核酸。在合适的条件下，由表达盒编码的多肽由表达盒生产。表达盒还可以具有使表达盒靶向整合到宿主细胞的基因组中的特定位点内的一种或多种核苷酸序列(例如，参见Koduri等人(2001)Gene 280：87-95)。例如，衍生自保藏为ATCC登记号PTA-2104的质粒的CTLA4A29YL104E-Ig多肽表达盒是编码CTLA4A29YL104E-Ig的表达盒的一个例子。
如本文所使用的，术语“基本上纯化的”指包含CTLA4-Ig分子或选择的CTLA4-Ig分子群体的组合物，其从其天然环境中取出(例如，分离)且至少90％不含、91％不含、92％不含、93％不含、94％不含、95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含、99.5％不含或99.9％不含与之天然结合的其他组分，例如细胞材料或培养基。例如，就重组生产的CTLA4-Ig蛋白质分子而言，术语“基本上纯化的”还可以指包含CTLA4-Ig蛋白质分子的组合物，其从生产环境中取出，从而使得蛋白质分子至少90％不含、91％不含、92％不含、93％不含、94％不含、95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含、99.5％不含或99.9％不含并非目的SEQ ID NO：2的多肽或SEQ ID NO：2的突变多肽的蛋白质分子。“基本上纯化的”不排除CTLA4-Ig分子(例如二聚体)与其他CTLA4-Ig分子(例如四聚体)的混合物。“基本上纯化的”不排除与CTLA4-Ig分子组合的药学上可接受的赋形剂或载体，其中CTLA4-Ig分子已从其天然环境中取出。
如本文所使用的，术语“大规模方法”可与术语“工业规模方法”互换使用。术语“培养容器”可与“生物反应器”、“反应器”和“槽”互换使用。
“液体培养物”指在支持物上生长，或在液体营养培养基中悬浮生长的细胞(例如，细菌、植物、昆虫、酵母或动物细胞)。
“种子培养物”指为了用于接种更大体积的培养基而生长的细胞培养物。种子培养物可以用于接种更大体积的培养基，以扩增在培养中生长的细胞数目(例如，悬浮生长的细胞)。
如本文所使用的，“培养”指在限定或受控条件下使一种或多种细胞体外生长。可以限定的培养条件的例子包括温度、气体混合物、时间和培养基配方。
如本文所使用的，“扩增”指为了获得更大数目的培养细胞而在体外培养一种或多种细胞。
如本文所使用的，“群体”指其特征在于一种或多种可测量或可检测性质的存在或不存在的2种或更多分子(“分子群体”)或细胞(“细胞群体”)群。在均质群体中，群体中的分子或细胞的特征在于相同或基本上相同的性质(例如，克隆细胞系的细胞)。在异质群体中，群体中的分子或细胞的特征在于相同或基本上相同的至少一种性质，其中细胞或分子还可以显示并不相同的性质(例如，具有基本上相似的平均唾液酸含量但具有不相似的甘露糖含量的CTLA4-Ig分子群体)。
如本文所使用的，“高分子量聚集物”可与“高分子量种类”互换使用，以指包含至少3个CTLA4-Ig单体的CTLA4-Ig分子。例如，高分子量聚集物可以是四聚体、五聚体或六聚体。
“百分比(％)产量”指实际产量除以理论产量且将值乘以100。实际产量可以作为以克或摩尔表示(例如，摩尔产量)的重量而给出。理论产量可以作为理想或数学计算的产量而给出。
如本文所使用的，“MCP-1的量”指(1)单独的MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1，特别是仓鼠MCP-1)的量，或(2)“MCP-1样”蛋白质的量，其中“MCP-1样”蛋白质包括MCP-1，连同与MCP-1同源的蛋白质、MCP-1的片段、和/或与MCP-1同源的蛋白质的片段(例如，在上述情况的每一种中，如可以与抗体(例如，多克隆ELISA)测定交叉反应以用于检测MCP-1)。预期了不存在MCP-1(和/或与MCP-1同源的蛋白质、MCP-1的片段、和/或与MCP-1同源的蛋白质的片段)的情况，其中就MCP-1的量的范围而言没有提供下限。
如本文所使用的，“糖基化含量”指与蛋白质分子共价附着的N联或O联糖残基的量，例如如同CTLA4-Ig分子的糖蛋白。
如本文所使用的，术语“唾液酸与蛋白质的摩尔比”作为唾液酸分子的摩尔数目/摩尔蛋白质(CTLA4-Ig分子)或二聚体进行计算且给出。
如本文所使用的，术语“糖蛋白”指通过添加一种或多种碳水化合物，包括添加一个或多个糖残基进行修饰的蛋白质。
如本文所使用的，术语“唾液酸化”指给蛋白质，包括糖蛋白添加唾液酸残基。
如本文所使用的，术语“糖蛋白同工型”指特征在于其碳水化合物和唾液酸含量的分子，如通过用于经由其分子量、电荷和/或其他特征区分混合物中的不同蛋白质的等电聚焦(IEF)凝胶电泳或其他合适的方法测定的。例如，在IEF凝胶上观察到的每种不同条带代表具有特定等电点(pI)且因此具有相同的净总电荷的分子。糖蛋白同工型可以是在IEF凝胶上观察到的不同条带，其中每个条带可以是具有特定pI的分子群体。
“免疫耐受”指人通常对其响应的特异性抗原或抗原群的无应答性状态(例如，其中T细胞不再响应抗原的状态)。
“效力”指应答作为配体浓度函数的测量。例如，激动剂效力定量为产生半数最大作用(EC50)的配体浓度。效力的非限制性药理学定义包括亲和力和功效的组分，其中功效是药物一旦结合引起应答的能力。效力与亲和力相关，但效力和亲和力是药物作用的不同测量。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”指用于药理学活性剂的媒介物。载体促进活性剂递送至靶位点而不使试剂的功能终止。合适形式的载体的非限制性例子包括溶液、乳膏、凝胶、凝胶乳剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、油膏、喷雾剂、软膏、粉末、固体混合物、气溶胶、乳剂(例如，油包水或水包油)、凝胶水溶液、水溶液、悬浮液、搽剂、酊剂和适合于局部施用的贴剂。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的组合物”(或“药物组合物”)指对于例如给人类的药物施用可接受的组合物。除任何一种或多种活性剂外，此种组合物可以包括在不超过药物施用的可接受水平的水平上的杂质的物质(此种水平包括不存在此种杂质的情况)，并且可以包括药学上可接受的赋形剂、媒介物、载体和其他无活性成分，例如以配制此种组合物用于易于施用。例如，药学上可接受的CTLA4-Ig组合物可以包括MCP-1或DNA，只要那些物质在对于给人的施用可接受的水平上。
“药品”是包含在药物组合物中的活性药物成分。术语“药品”包括以溶液和/或缓冲形式的活性药物成分。“药物产品”是包含配制用于药物施用的药品的药物组合物。对可能涉及药品和/或药物产品的实施例和本文其他地方包含的测定而言，示例性药品和药物产品可以如下进行测定。
关于包含SEQ ID NO：2、5、6、7、8、9、10或18的CTLA4Ig分子的示例性药品是溶于缓冲水溶液(25mM磷酸钠、50mM氯化钠、pH 7.5)的浓度为50mg/ml的CTLA4-Ig蛋白质。
关于包含SEQ ID NO：2、5、6、7、8、9、10或18的CTLA4Ig分子的示例性药物产品是250mg冻干的CTLA4-Ig蛋白质、500mg麦芽糖、17.2mg一代磷酸钠和14.6mg氯化钠，pH 7.0－8.0；或
冻干的CTLA4-Ig蛋白质(250mg/小瓶)药物产品的组成
缓冲水溶液(25mM磷酸钠、10mM氯化钠、pH 7.5)。
关于包含SEQ ID NO：4、11、12、13、14、15、16或24的CTLA4Ig分子的示例性药物产品：
冻干的CLTA4A29YL104E–Ig 100mg/小瓶药物产品的组成
组分 量/小瓶(mg)
CLTA4A29YL104E-Ig 110
蔗糖 220
一代磷酸钠一水合物 15.18
氯化钠 2.55
1N氢氧化钠 调整至pH 7.5
1N盐酸 调整至pH 7.5
如本文所使用的，术语“培养基”和“细胞培养基”和“进料培养基”和“发酵培养基”指用于生长和或维持细胞，特别是哺乳动物细胞的营养物溶液。无限制地，这些溶液通常提供来自一种或多种下述种类的至少一种组分：(1)能源，通常为碳水化合物例如葡萄糖的形式；(2)所有必需氨基酸，且通常为20种氨基酸加半胱氨酸的基本组；(3)以低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；(4)游离脂肪酸或脂质，例如亚油酸；和(5)痕量元素，其中痕量元素定义为一般以极低浓度，通常为微摩尔范围需要的无机化合物或天然存在的元素。营养物溶液可以选择性补加有来自任何下述种类的一种或多种组分：(1)激素和其他生长因子例如血清、胰岛素、运铁蛋白和表皮生长因子；(2)盐，例如镁、钙和磷酸盐；(3)缓冲液，例如HEPES；(4)核苷和碱基例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；(5)蛋白质和组织水解产物，例如可以得自纯化的明胶、植物材料或动物副产品的蛋白胨或蛋白胨混合物；(6)抗生素，例如庆大霉素；(7)细胞保护剂，例如多聚醇(pluronic polyol)；和(8)半乳糖。
如本文所使用的，术语“接种”指将细胞加入培养基中以起始培养。
如本文所使用的，术语细胞培养的“生长期”指其中细胞主要快速分裂的指数细胞生长时间段(例如，对数期)。在这个期过程中，活细胞密度中的增长率高于任何其他时间点。
如本文所使用的，术语细胞培养的“生产期”指细胞生长固定或维持在接近恒定水平的时间段。活细胞的密度在给定时间段内保持大约恒定。对数细胞生长已终止，并且蛋白质生产是生产期间的基本活性。在这时一般补加培养基以支持连续的蛋白质生产且达到所需糖蛋白产物。
如本文所使用的，术语“表达”用于指在细胞内发生的转录和翻译。宿主细胞中的产物基因的表达水平可以基于存在于细胞中的相应mRNA的量或经由通过细胞生产的产物基因编码的蛋白质的量，或两者进行确定。
如本文所使用的，“糖基化”指在多肽链内的特定位点上给蛋白质添加复合寡糖结构。蛋白质的糖基化和添加的碳水化合物的后续加工可以影响蛋白质折叠和结构、蛋白质稳定性包括蛋白质半衰期、和蛋白质的功能性质。蛋白质糖基化可以依靠其中修饰发生的序列背景分成2类：O联糖基化和N联糖基化。O联多糖与羟基，通常与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接。O聚糖并非给每个丝氨酸和苏氨酸残基添加。O联寡糖通常是单或双触角的，即它们包含一个或至多2个分支(触角)，且包含一个接一个添加的1－4个不同类的糖残基。N联多糖与天冬酰胺的酰胺氮附着。只有2种三肽序列――天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)之一的部分的天冬酰胺是糖基化的靶。N联寡糖可以具有1－4个分支，称为单、双、三、四触角。在N和O联寡糖中发现的结构和糖残基不同。尽管存在那种差异，N和O联多糖的每个分支上的末端残基可以由唾液酸分子进行修饰，这种修饰称为唾液酸加帽。唾液酸是独特的9碳单糖家族的通用名，其可以与其他寡糖进行连接。2个家族成员是N-乙酰神经氨酸，缩写为Neu5Ac或NANA，和N-羟乙酰神经氨酸，缩写为Neu5Gc或NGNA。唾液酸在人中的最常见形式是NANA。N-乙酰神经氨酸(NANA)是存在于CTLA4-Ig分子中的主要唾液酸种类。然而，应当指出较少但可检测水平的N羟乙酰神经氨酸(NGNA)也存在于CTLA4-Ig分子中。此外，本文描述的方法可以用于测定对于NANA和NGNA的唾液酸摩尔数，且因此NANA和NGNA的水平就CTLA4-Ig分子进行测定和报道。N和O联寡糖具有不同数目的分支，其提供唾液酸分子可以与之附着的不同位置数目。N联寡糖可以提供用于唾液酸的最高达4个附着位置，而O联寡糖可以提供用于唾液酸附着的2个位点。
如本文所使用的，术语“大规模方法”可与术语“工业规模方法”互换使用。术语“培养容器”可与“生物反应器”、“反应器”和“槽”互换使用。
如本文所使用的，短语“工作溶液”指在方法中使用的溶液。工作溶液的非限制性例子包括缓冲液。
如本文所使用的，“参照材料”指在方法中用作标准的材料。例如，参照材料可以用作实验样品将与之进行比较的标准。
预期了物质不存在的情况，其中就此类物质的量的范围而言没有提供下限。
如本文所使用的，关于细胞培养所述的温度指在调节生物反应器的温度的仪器上的温度设定。当然，液体培养物自身的温度将采用在调节生物反应器的温度的仪器上的温度设定。当温度指维持在培养箱中的架子上的细胞培养时，温度随后指培养箱的架子温度。
本发明的非限制性实施方案
本发明提供了CTLA4-Ig分子的组合物和突变的CTLA4-Ig分子例如CTLA4A29YL104E-Ig的组合物。本发明提供了具有某些特征的组合物，所述特征例如一定量的细菌内毒素，生物负荷，一定范围内的pI(或在一定范围pI内的某些IEF条带)，一定量的单体(单链)、二聚体或高分子量种类(例如，四聚体)，一定的胰蛋白酶肽概况，SDS-PAGE上的主要条带的一定组，一定的DNA含量，不超过某一最大值的MCP-1的量，不超过某一最大值的细胞蛋白质的量，不超过某一最大值的Triton X-100的量，不超过某一最大值的A蛋白的量，N联碳水化合物的某一概况，一定的氨基单糖组成(GlcNac、GalNAc)，一定的中性单糖组成(半乳糖、岩藻糖、甘露糖)，一定量的B7结合，在IL-2抑制细胞测定中一定量的活性，和/或一定的唾液酸组成(NANA，NGNA)，在每种情况下其中所述一定量可以是一个或多个范围。本发明提供了具有任何一种上述特征，或超过一种上述特征，最高至包括以任何和所有可能的排列或组合的所有上述特征的组合物。本发明包括以分离或基本上纯化形式，或并非分离或基本上纯化形式的本发明的所有组合物。本发明提供了作为药物组合物的组合物。
在一个方面，本发明涉及用于获得组合物的方法，所述组合物包含来自液体培养基的CTLA4-Ig分子的分离的群体，所述培养基包含CTLA4-Ig分子的原始群体，其中(1)原始群体的CTLA4-Ig分子具有一个或多个唾液酸残基，(2)唾液酸残基的数目/CTLA4-Ig分子在原始群体内有变化，和(3)原始群体包含CTLA4-Ig二聚体和高分子量聚集物，并且所述方法包括(a)收获来自表达CTLA4-Ig分子的哺乳动物细胞培养物的液体培养基；(b)使CTLA4-Ig分子与细胞组分分离；(c)使CTLA4-Ig二聚体和CTLA4-Ig高分子量聚集物分离；和(d)将CTLA4-Ig分子分成2个或更多级分，其中与至少一个另外级分比较，至少一个部分具有更大的唾液酸与CTLA4-Ig分子的摩尔比，且其中步骤(b)、(c)和(d)同时或以任何顺序进行，以便获得所述组合物。
在本发明方法的一个实施方案中，步骤(a)中的收获包括获得液体培养物的可溶性部分。在另一个实施方案中，该方法的步骤(c)和(d)包括柱层析的使用，以便获得具有不同唾液酸含量的CTLA4-Ig分子的级分。在另外一个实施方案中，该方法进一步包括柱层析的使用，以减少组合物中的MCP-1含量。
在本发明方法的一些实施方案中，CTLA4-Ig分子包含具有SEQ ID NO：2、5、6、7、8、9或10的一种或多种多肽。在其他实施方案中，CTLA4-Ig分子包含具有SEQ ID NO：4、11、12、13、14、15或16的一种或多种多肽。
在本发明方法的一些实施方案中，(d)中具有更大的唾液酸与CTLA4-Ig分子的摩尔比的级分显示约8－约14的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在具体实施方案中，平均摩尔比为约8－约11、约8－约10、或约8－约9。
本发明提供了用于分离CTLA4-Ig分子的方法，所述方法包括：(i)获得包含哺乳动物细胞的液体培养物的可溶性级分，所述哺乳动物细胞生产CTLA4-Ig分子的组合物；(ii)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以获得包含CTLA4-Ig分子的洗脱的组合物；(iii)对步骤(ii)的组合物实施疏水作用层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集的组合物；(iv)对(iii)的组合物实施亲和层析，以获得包含CTLA4-Ig分子的进一步富集的组合物；和(v)对(iv)的组合物实施阴离子交换层析。在一个实施方案中，步骤(ii)中获得的组合物的特征在于：(a)平均6.0－10.1摩尔NANA/摩尔CTLA4Ig分子；和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于或等于25.7面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在另一个实施方案中，步骤(iii)中获得的组合物的特征在于：(a)平均6.8－11.4摩尔NANA/摩尔CTLA4Ig分子；和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于或等于2.5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在进一步的实施方案中，步骤(iv)中获得的组合物的特征在于：(a)平均8.0－11.0摩尔NANA/摩尔CTLA4-Ig分子；和(b)小于或等于2.5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在另一个实施方案中，步骤(v)中获得的组合物的特征在于：(a)平均8.0－11.9摩尔NANA/摩尔CTLA4-Ig分子；和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测(SPD)所测定的，小于或等于2.0面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在一个实施方案中，SPD的例子可以在A 280nm处。
本发明还提供了用于分离CTLA4-Ig分子的组合物的方法，其包括：(i)获得包含生产CTLA4-Ig分子的哺乳动物细胞的液体培养物的可溶性级分，和以任何顺序，(ii)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；(iii)对可溶性级分实施疏水作用层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；(iv)对可溶性级分实施亲和层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；和(v)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物。在另一个方面，本发明提供了用于分离包含CTLA4-Ig分子的组合物的方法，所述方法包括：(i)获得包含生产CTLA4-Ig分子的哺乳动物细胞的液体培养物的可溶性级分；(ii)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以获得包含CTLA4-Ig分子的洗脱的组合物；(iii) 对步骤(ii)的蛋白质产物实施疏水作用层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集的组合物；(iv)对(iii)的蛋白质产物实施亲和层析，以获得包含CTLA4-Ig分子的进一步富集的组合物；和(v)对(iv)的蛋白质产物实施阴离子交换层析，以便分离包含CTLA4-Ig分子的组合物。
在一个实施方案中，该方法的步骤(ii)中获得的包含CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于：(a)6.0－10.1的NANA与CTLA4Ig分子的平均摩尔比，和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于或等于2.5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在另一个实施方案中，步骤(iii)中获得的包含CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于：(a)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig高分子量种类小于约2.5面积％，(b)细胞蛋白质小于约95ng/ml，和(c)MCP-1小于约5ppm。在另外的实施方案中，步骤(iii)中获得的包含CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于：(a)6.8－11.4的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比，和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于或等于2.5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在进一步的实施方案中，步骤(iv)中获得的包含CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于：(a)8.0－11.0的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比，和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于或等于2.5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在另外一个实施方案中，步骤(iii)中获得的组合物的特征在于，如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig高分子量种类小于2.5％的面积百分比。在另外一个实施方案中，步骤(v)中的包含CTLA4-Ig分子的蛋白质组合物的特征在于：(a)8.0－11.9的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比，和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于或等于2.0面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。
在另一个方面，本发明还提供了用于分离CTLA4-Ig分子的组合物的方法，其包括：(i)获得包含生产CTLA4-Ig分子的哺乳动物细胞的液体培养物的可溶性级分，和以任何顺序，(ii)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；(iii)对可溶性级分实施疏水作用层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；(iv)对可溶性级分实施亲和层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；和(v)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物，其中步骤(iii)中获得的组合物的特征在于CTLA4-Ig高分子量种类的百分比小于约2.5面积％，细胞蛋白质小于95ng/ml，且MCP-1小于约5ppm。
在另外一个方面，本发明提供了用于分离CTLA4-Ig分子的组合物的方法，所述方法包括：(i)获得包含生产CTLA4-Ig分子的哺乳动物细胞的液体培养物的可溶性级分，和以任何顺序，(ii)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；(iii)对可溶性级分实施疏水作用层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；(iv)对可溶性级分实施亲和层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物；和(v)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的富集且洗脱的组合物，其中步骤(iii)中获得的组合物的特征在于CTLA4-Ig高分子量种类的百分比小于约2.5面积％，细胞蛋白质小于95ng/ml，MCP-1小于约5ppm，且NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约8.0－约12。
在一个实施方案中，该方法的步骤(ii)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约75mM HEPES和约360mM NaCl，且具有约8.0的pH。在另一个实施方案中，本发明步骤(ii)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约25mM HEPES和约850mM NaCl，且具有约7.0的pH。在另外的实施方案中，该方法的步骤(iii)的疏水作用层析使用单一洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约850mM NaCl，且具有约7.0的pH。在进一步的实施方案中，该方法的步骤(iv)的亲和层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM Tris和约250mM NaCl，且具有约8.0的pH。在另外一个实施方案中，该方法的步骤(iv)的亲和层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约100mM甘氨酸，且具有约3.5的pH。在另外一个实施方案中，该方法的步骤(v)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约120mM NaCl－约130mM NaCl，且具有约8.0的pH。在另外一个实施方案中，该方法的步骤(v)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约25mM HEPES和约200mMNaCl，且具有约8.0的pH。在另外一个实施方案中，该方法的步骤(ii)的阴离子交换层析使用具有阴离子交换树脂的柱来进行，所述阴离子交换树脂包含伯、仲、叔或季胺官能团。在具体实施方案中，树脂包含季胺官能团。在另外一个实施方案中，该方法的步骤(iii)的疏水作用层析使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂包含苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。在具体实施方案中，官能团包含苯基官能团。在另外一个实施方案中，该方法的步骤(iv)的亲和层析使用包含A蛋白的亲和层析树脂来进行。
在另外一个方面，本发明提供了用于制备包含CTLA4-Ig分子的组合物的方法，其包括从液体细胞培养物中纯化CTLA4-Ig分子，其中纯化的CTLA4-Ig组合物包含(a)药学上可接受的量的MCP-1/mg CTLA4-Ig分子，和(b)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于2.5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在一个实施方案中，药学上可接受的量的MCP-1包含约40－约0.5ng/mg CTLA4-Ig分子。在另一个实施方案中，药学上可接受的量的MCP-1包含约35－约0.5ng/mg CTLA4-Ig分子。在另外的实施方案中，药学上可接受的量的MCP-1包含约10－约0.5ng/mg CTLA4-Ig分子。在进一步的实施方案中，该方法的步骤(iv)的亲和层析使用柱来进行，所述柱包含能够还原洗脱的蛋白质产物中的MCP-1的树脂。在另外一个实施方案中，该方法的步骤(iii)的疏水作用层析使用疏水作用树脂来进行，其中所述树脂能够(a)使CTLA4-Ig二聚体与CTLA4-Ig高分子量种类分离；(b)增加洗脱的CTLA4-Ig分子的唾液酸含量；或(c)(a)和(b)两者。在另外一个实施方案中，步骤(ii)或步骤(iv)或两者的阴离子交换层析使用阴离子交换树脂来进行，其中所述树脂能够(a)减少洗脱的组合物的CTLA4-Ig高分子量聚集物含量；(b)增加洗脱的组合物的唾液酸含量；或(c)(a)和(b)两者。
在另一个方面，本发明提供了用于分离包含CTLA4-Ig分子的组合物的方法，所述方法包括：(i)获得包含生产CTLA4-Ig分子的哺乳动物细胞的液体培养物的可溶性级分，和以任何顺序；(ii)对可溶性级分实施亲和层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的洗脱的组合物；(iii)对可溶性级分实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的洗脱且富集的组合物；和(iv)对可溶性级分实施疏水作用层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的洗脱且富集的组合物。在一个实施方案中，亲和层析步骤首先进行。在另一个实施方案中，该方法的步骤(ii)的亲和层析使用包含A蛋白的树脂来进行。在另外的实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用包含胍的洗脱缓冲液来进行。在进一步的实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用包含尿素的洗脱缓冲液来进行。在另外一个实施方案中，步骤(ii)的亲和层析导致包含CTLA4-Ig分子的洗脱组合物中CTLA4-Ig二聚体的增加。
在另外一个方面，本发明提供了用于从收获自哺乳动物细胞培养物的液体中分离包含CTLA4-Ig分子的组合物的方法，其中所述细胞生产CTLA4-Ig分子，所述方法包括：(i)获得收获的液体的可溶性级分；(ii)对可溶性级分实施亲和层析，以获得包含CTLA4-Ig分子的洗脱的组合物；(iii)对步骤(ii)的组合物实施阴离子交换层析，以便获得包含CTLA4-Ig分子的洗脱且富集的组合物；和(iv)对来自步骤(iii)的组合物实施疏水作用层析，以获得包含CTLA4-Ig分子的进一步富集的组合物。在一个实施方案中，该方法的步骤(iv)中获得的组合物的特征在于：如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，高分子量种类的百分比小于约2.5面积％，和细胞蛋白质的百分比小于约95ng/ml，和MCP-1的百分比小于约5ppm。在另一个实施方案中，步骤(iii)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约50mM HEPES和约135mM NaCl，且具有约7的pH。在另外的实施方案中，步骤(iii)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约50mM HEPES和约200mM NaCl，且具有约7的pH。在具体实施方案中，步骤(iii)的疏水作用层析使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂包含苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。在进一步的实施方案中，步骤(iv)的疏水作用层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约50mM HEPES和约1.2M(NH4)2SO4，且具有约7的pH。在另外一个实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM NaH2PO4和约150mM NaCl，且具有约7.5的pH。在另外一个实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约250mM甘氨酸且具有约3的pH。在另一个实施方案中，步骤(iii)的阴离子交换层析使用具有阴离子交换树脂的柱来进行，所述阴离子交换树脂包含伯、仲、叔或季胺官能团。在具体实施方案中，树脂包含季胺官能团。
在一个实施方案中，步骤(iii)的疏水作用层析使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂包含苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。在一个实施方案中，官能团包含苯基官能团。在一个实施方案中，步骤(ii)的亲和层析使用包含A蛋白的树脂来进行。本发明提供了通过本发明的任何方法获得的包含CTLA4-Ig分子的组合物。在一个实施方案中，组合物包含具有SEQ ID NO：2、5、6、7、8、9或10的一种或多种多肽。在一个实施方案中，组合物包含具有SEQ ID NO：4、11、12、13、14、15或16的一种或多种多肽。本发明提供了具有SEQ ID NO：17的核酸序列的CTLA4-Ig表达质粒。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约5.5－约18的唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约5－约10的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约6－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约8－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约8－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约8－约11的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约7－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约7－约11的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约11－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约12－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约13－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约14－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约15－约17的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约16的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约10的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约6的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约8－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有小于或等于约1.5的N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约0.5－约1.5的NGNA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约1.0－约1.5的NGNA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约6－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中分子的每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中CTLA4-Ig分子的特征在于约5.5－约9.5的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一个实施方案中，唾液酸/摩尔CTLA4-Ig分子的摩尔比通过酸水解和HPLC进行测定。在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子包含具有SEQID NO：2、5、6、7、8、9或10的一种或多种多肽。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子包含具有SEQ ID NO：4、11、12、13、14、15或16的一种或多种多肽。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的基本上纯化的组合物，其中大于或等于95％的CTLA4-Ig分子是CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，大于或等于98％的CTLA4-Ig分子是CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，大于或等于99％的CTLA4-Ig分子是CTLA4-Ig二聚体。
在一个实施方案中，大于或等于99.5％的CTLA4-Ig分子是CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，约95％－约99.5％的CTLA4-Ig分子是CTLA4-Ig二聚体，且约0.5面积％－约5面积％的分子是CTLA4-Ig高分子量种类。在一个实施方案中，如通过尺寸排阻层析和分光光度法计检测所测定的，约98.6％的分子是CTLA4-Ig二聚体，且约1.2面积％的分子是CTLA4-Ig高分子量种类，且约小于0.7面积％的分子是CTLA4-Ig单体。在一个实施方案中，约小于约0.3％的分子是包含5个或更多CTLA4-Ig单体的多聚体。本发明提供了基本上由CTLA4-Ig二聚体组成的组合物。本发明提供了基本上由CTLA4-Ig分子组成的组合物，其中群体基本上不含CTLA4-Ig单体。本发明提供了基本上由CTLA4-Ig分子组成的组合物，其中群体基本上不含CTLA4-Ig高分子量种类。本发明提供了基本上由CTLA4-Ig单体组成的组合物，其基本上不含CTLA4-Ig二聚体和高分子量种类。在一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少3个唾液酸基团。在一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少2.5个唾液酸基团。在一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少3个唾液酸基团－至少8个唾液酸基团。
在一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少2.5个唾液酸基团－至少5个唾液酸基团。在一个实施方案中，每种二聚体包含2个CTLA4-Ig多肽，其中每个多肽具有选自SEQ ID NOS：5－16的氨基酸序列。在一个实施方案中，组合物包含具有SEQID NO：2、5、6、7、8、9或10的一种或多种多肽。在一个实施方案中，组合物包含具有SEQ IDNO：4、11、12、13、14、15或16的一种或多种多肽。本发明提供了包含CTLA4-Ig四聚体的分离的组合物，其基本上不含CTLA4-Ig二聚体。本发明提供了包含CTLA4-Ig四聚体的分离的组合物，其基本上不含CTLA4-Ig单体。在一个实施方案中，组合物作为大于约100克的量存在。在一个实施方案中，每个四聚体包含2对CTLA4-Ig多肽，其中每个多肽具有选自SEQ IDNOS：5－10的氨基酸序列。在一个实施方案中，每个四聚体包含2对CTLA4-Ig多肽，其中每个多肽具有选自SEQ ID NOS：11－16的氨基酸序列。在一个实施方案中，每个四聚体能够与CD80或CD86结合。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的药学上可接受的组合物，其中组合物基本上不含MCP-1。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的药学上可接受的组合物，其中组合物包含不超过约25ppm MCP-1。在一个实施方案中，组合物包含不超过10ppm MCP-1。在一个实施方案中，组合物包含约0.2ng/ml MCP-1－约10ng/ml MCP-1。在一个实施方案中，本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的药学上可接受的组合物，其中组合物包含(a)约0.2ng/ml MCP-1－约10ng/ml MCP-1，和(b)不超过25ng/ml CHO蛋白质或不超过10ng/ml CHO蛋白质。在一个实施方案中，组合物包含不超过约20pg/ml DNA。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其中，当以约10mg/kg的静脉内剂量施用于受试者时，CTLA4-Ig分子能够显示：约44400μg.h/ml的曲线下面积(AUC)；约0.09L/kg的分布体积；约292μg/ml的峰浓度(Cmax)；和约0.23ml/h/kg的清除率。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其中组合物包含在等电聚焦凝胶上可视的CTLA4-Ig分子的优势同工型，如通过等电聚焦测定的，所述同工型具有小于或等于5.1±0.2的等电点，pI。在一个实施方案中，组合物的平均pI在神经氨酸酶处理后增加。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少40％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.1±0.2的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少70％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.1±0.2的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少90％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.1±0.2的等电点。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其具有约3.0±0.2－约5.0±0.2的pI。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其具有约4.3±0.2－约5.0±0.2的pI。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其具有约3.3±0.2－约4.7±0.2的pI。在一个实施方案中，组合物是基本上纯化的。本发明提供了用于制备组合物的方法，组合物包含具有约3.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子，所述方法包括：(a)对CTLA4-Ig分子的混合物实施等电聚焦凝胶电泳，其中在凝胶上的单个条带表示具有特定pI的CTLA4-Ig分子群体，和(b)分离具有约3.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体，以便制备组合物。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其中组合物包含在等电聚焦凝胶上可视的优势同工型，如通过等电聚焦测定的，所述同工型具有小于或等于5.5±0.2的等电点，pI。在一个实施方案中，组合物的平均pI在神经氨酸酶处理后增加。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少40％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.3±0.2的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少70％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.3±0.2的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少90％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.3±0.2的等电点。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其具有约3.0±0.2－约5.2±0.2的pI。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其具有约4.5±0.2－约5.2±0.2的pI。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其具有约4.7±0.2－约5.1±0.2的pI。在一个实施方案中，组合物是基本上纯化的。
本发明提供了用于制备组合物的方法，所述组合物包含具有约2.0±0.2－约5.2±0.2的pI的CTLA4-Ig分子，所述方法包括：(a)对CTLA4-Ig分子的混合物实施等电聚焦凝胶电泳，其中在凝胶上的单个条带表示具有特定pI的CTLA4-Ig分子群体，和(b)分离具有约3.0±0.2－约5.2±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体，以便制备组合物。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约17－约28的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约17－约25的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子的每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中CTLA4-Ig分子的特征在于约24－约28的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子的每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中CTLA4-Ig分子的特征在于约2.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子的每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中CTLA4-Ig分子的特征在于约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约3.5－约8.3的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子的每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中CTLA4-Ig分子的特征在于约6.4－约7.0的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子的特征在于约7.7－约22的甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子的每种多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16的序列，且其中CTLA4-Ig分子的特征在于约14－约16的甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
在一个实施方案中，GlcNAc与CTLA4-Ig分子的摩尔比通过毛细管电泳进行测定。在一个实施方案中，GalNAc与CTLA4-Ig分子的摩尔比通过毛细管电泳进行测定。在一个实施方案中，半乳糖与CTLA4-Ig分子的摩尔比通过毛细管电泳进行测定。
在一个实施方案中，岩藻糖与CTLA4-Ig分子的摩尔比通过毛细管电泳进行测定。在一个实施方案中，甘露糖与CTLA4-Ig分子的摩尔比通过毛细管电泳进行测定。在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子通过一种或多种碳水化合物与分子的酶促附着来获得。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子包含在体外与分子酶促附着的碳水化合物残基。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(b)约6－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)约6－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(d)约6－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(e)约6－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(f)约6－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(b)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(d)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(d)约6.4－约7.0的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(e)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约24－约28的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约2.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(d)约6.4－约7.0的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(e)约14－约16的甘露糖与CTLA4-Ig蛋白质的平均摩尔比；和(f)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子在下述残基上是糖基化的：SEQ ID NO：2或4的第102位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：2或4的第134位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：2或4的第233位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ IDNO：2或4的第155位处的丝氨酸氨基酸残基，或SEQ ID NO：2或4的第165位处的丝氨酸氨基酸残基。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子是糖基化的，并且其中至少约2％的糖基化总质量是O联糖基化。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物显示约9.6±0.3的NGNA层析谱峰，和约10.5±0.3的NANA层析谱峰。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子显示与图68基本上相同的碳水化合物概况。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子显示如图68中所示的碳水化合物概况。本发明提供了基本上由CTLA4-Ig分子组成的组合物，其中CTLA4-Ig分子显示结构域I－IV的碳水化合物概况，其中结构域I包含代表无唾液酸化的寡糖的峰，结构域II包含代表单唾液酸化的寡糖的峰，结构域III包含代表双唾液酸化的寡糖的峰，结构域IV包含代表三唾液酸化的寡糖的峰，且结构域V包含代表四唾液酸化的寡糖的峰，且其中所述概况是由CTLA4-Ig释放的寡糖的层析谱。在一个实施方案中，结构域I中的第一个峰和结构域II中的主峰之间N联寡糖的保留时间中的差异为约10－约12分钟。在一个实施方案中，结构域I中的第一个峰和结构域II中的主峰之间N联寡糖的保留时间中的差异为约11－约13分钟。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域III和IV的糖基化包含约25％－约36％的N联糖基化。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域I的糖基化包含约24.5％－约35.2％的N联糖基化。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域II的糖基化包含约26.3％－约34.1％的N联糖基化。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域III的糖基化包含约21.9％－约31.5％的N联糖基化。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域IV和结构域V的糖基化包含约7.9％－约18.6％的N联糖基化。
在一个实施方案中：(a)结构域I显示至少约31的面积百分比；(b)结构域II显示至少约33的面积百分比；(c)结构域III显示至少约24的面积百分比；(iv)结构域IV显示至少约9.4的面积百分比；(v)结构域V显示至少约67的面积百分比；或其中所述面积根据由CTLA4-Ig释放的寡糖的层析谱进行测量。
在一个实施方案中：(a)结构域I显示至少约5个峰；(b)结构域II显示至少约5个峰；(c)结构域III显示至少约5个峰；(d)结构域IV显示至少约6个峰，或(e)结构域V显示至少约6个峰，且其中所述峰在层析谱上显示。组合物，其中结构域I显示至少2个峰，其中第一个峰具有约4.5％的最小面积和约11.2％的最大面积，且其中第二个峰具有约8.7％的最小面积和约11.8％的最大值。
在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域III和IV显示约25％－约36％的面积百分比。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域I显示约24.5％－约35.2％的面积百分比。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域II显示约26.3％－约34.1％的面积百分比。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域III显示约21.9％－约31.5％的面积百分比。在一个实施方案中，如通过HPAEC测量的，结构域IV显示约7.9％－约18.6％的面积百分比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig多肽的组合物，其中：(a)约80％的多肽具有双触角N联糖基化；(b)约14％的多肽具有三触角N联糖基化；和(c)约6％的多肽具有四触角N联糖基化。在一个实施方案中，N联糖基化通过具有脉冲电流检测的高pH阴离子交换层析(HPEAC-PAD)进行测定。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(b)约6－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约6－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约3％的CTLA4-Ig高分子量种类面积百分比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约6－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)小于或等于约1.5的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约6－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约3面积％的CTLA4-Ig高分子量聚集物含量；和(d)与图68的那种基本上相同的碳水化合物概况。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约6－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约3面积％的CTLA4-Ig高分子量聚集物含量；和(d)如通过HPAEC测定的，至少约29.8％－约50.1％N联糖基化的结构域III、IV和V中的糖基化含量。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约6－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约3面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。在一个实施方案中，分子的进一步特征在于约8－约12的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
在一个实施方案中，分子的进一步特征在于：(a)约80％的双触角N联糖基化；(b)约14％的三触角N联糖基化；和(c)约6％的四触角N联糖基化。在一个实施方案中，分子进一步包含下述中的一种或多种的任何组合：(a)SEQ ID NO：10的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)；(b)SEQ ID NO：7的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)；(c)SEQ IDNO：9的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)；和(d)SEQ ID NO：6的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)。在一个实施方案中，(a)约90％的分子包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(b)约10％的分子包含从残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(c)约4％的分子包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ IDNO：2的氨基酸序列；和(d)约96％的分子包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明提供了包含CTLA4-Ig多肽的组合物，其中：(a)约80％的多肽具有双触角N联糖基化；(b)约14％的多肽具有三触角N联糖基化；(c)约6％的多肽具有四触角N联糖基化；和(d)小于或等于1.5的NGNA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig多肽的组合物，其中：(a)约80％的多肽具有双触角N联糖基化；(b)约14％的多肽具有三触角N联糖基化；(c)约6％的多肽具有四触角N联糖基化；和(d)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig多肽的组合物，其中：(a)约80％的多肽具有双触角N联糖基化；(b)约14％的多肽具有三触角N联糖基化；(c)约6％的多肽具有四触角N联糖基化；和(d)约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(b)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类；和(d)与图68的那种基本上相同的碳水化合物概况。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类；和(d)如通过HPAEC测定的，至少约29.8％－约50.1％N联糖基化的结构域III、IV和V中的糖基化含量。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约11－约13的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约5.5－约9.5的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；和(c)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于约5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类含量。在一个实施方案中，分子的进一步特征在于：(a)约80％的双触角N联糖基化；(b)约14％的三触角N联糖基化；和(c)约6％的四触角N联糖基化。在另一个实施方案中，分子进一步包含下述中的一种或多种的任何组合：(a)SEQ ID NO：16的氨基酸序列(SEQ IDNO：4的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)；(b)SEQ ID NO：13的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)；(c)SEQ ID NO：15的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)；和(d)SEQ ID NO：12的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)。在另一个实施方案中，(a)约90％的分子包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(b)约10％的分子包含从残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(c)约4％的分子包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；和(d)约96％的分子包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQID NO：4的氨基酸序列。本发明提供了包含CTLA4-Ig多肽的组合物，其中：(a)约80％的多肽具有双触角N联糖基化；(b)约14％的多肽具有三触角N联糖基化；(c)约6％的多肽具有四触角N联糖基化；和(d)约24－约28的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig蛋白质的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig多肽的组合物，其中：(a)约80％的多肽具有双触角N联糖基化；(b)约14％的多肽具有三触角N联糖基化；(c)约6％的多肽具有四触角N联糖基化；和(d)约2.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在另一个实施方案中，组合物是基本上纯化的组合物。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中小于或等于约2.5％的CTLA4-Ig分子是氧化的。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中小于或等于约2.0％的CTLA4-Ig分子是脱酰胺的。本发明提供了包含CTLA4-Ig二聚体分子的组合物，其中至少0.5％的CTLA4-Ig二聚体分子是半胱氨酰化的。在一个实施方案中，至少1.0％的CTLA4-Ig二聚体分子是半胱氨酰化的。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体显示与图64、65或67基本上相同的质谱法概况。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体显示与图48基本上相同的毛细管电泳概况。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物的特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(f)约6－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(g)如由等电聚焦凝胶上可视化测定的，约2.4±0.2－约5.0±0.2的pI；(h)小于或等于3ppm的MCP-1；(i)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于2.5面积％的高分子量种类；(j)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于0.5面积％的单体；(k)具有与SEQ ID NOS：5－10中的任何一个至少95％等同的氨基酸的CTLA4-Ig多肽；(l)能够与CD80和CD86结合的CTLA4-Ig分子。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子群体的特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(f)约6－约12的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比；(g)如由等电聚焦凝胶上可视化测定的，约3.4±0.2－约5.0±0.2的pI；(h)小于或等于5ppm的MCP-1；(i)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于2.5面积％的高分子量种类；(j)如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于0.5面积％的单体；(k)具有与SEQ ID NOS：5－10中的任何一个至少95％等同的氨基酸的CTLA4-Ig多肽；(l)能够与CD80和CD86结合的CTLA4-Ig分子；或其药学等价物。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其具有小于或等于7.4％的免疫原性发生率。在一个实施方案中，免疫原性的发生率为约2.1％－约7.4％。在一个实施方案中，免疫原性的发生率小于或等于3.7％。在一个实施方案中，免疫原性的发生率小于或等于3.0％。在一个实施方案中，免疫原性的发生率为约2.8％－约3.0％。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其中，在给人施用组合物后，与CTLA4-Ig分子结合的抗体的产生在人中以小于或等于7.4％的发生率发生。在一个实施方案中，发生率为约2.1％－约7.4％。在一个实施方案中，发生率小于或等于3.7％。在一个实施方案中，发生率小于或等于3.0％。在一个实施方案中，发生率为约2.8％－约3.0％。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其中，在给人施用组合物后，与CTLA4-Ig分子的CTLA4部分结合的抗体的产生在人中以小于或等于4.9％的发生率发生。在一个实施方案中，发生率为约0.5％－约4.9％。在一个实施方案中，发生率小于或等于1.2％。在一个实施方案中，发生率小于或等于1.0％。在一个实施方案中，发生率为约0.9％－约1.0％。在一个实施方案中，发生率在酶联免疫吸附测定(ELISA)中进行测量。在一个实施方案中，发生率在电化学发光测定(ECL)中进行测量。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的分离的组合物，其中，在给人施用组合物后，中和CTLA4-Ig分子的抗体的产生在具有与CTLA4-Ig分子的CTLA4部分结合的抗体的人中以小于或等于75％的发生率发生。在一个实施方案中，发生率为40－75％。在一个实施方案中，发生率小于或等于40％。在一个实施方案中，发生率在基于细胞的萤光素酶报道基因测定中进行测量。
本发明提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在液体培养物显示大于或等于约6.0摩尔NANA/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子时发生，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的。该方法还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在液体培养物显示约5.2－约7.6摩尔唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子时发生，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的。该方法还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在液体培养物具有约33x105活细胞/mL液体培养物－约79x105细胞/mL液体培养物的细胞密度时发生。本发明还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在液体培养物中的细胞生存力不小于约38％时发生。本发明还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在液体培养物中的细胞生存力不小于约37％时发生。该方法还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在内毒素小于或等于约76.8EU/mL液体培养物时发生，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的。该方法还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在内毒素小于或等于约4.8EU/mL液体培养物时发生，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的。本发明还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离仅在生物负荷小于1集落形成单位/mL液体培养物时发生，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的。本发明还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在满足下述条件中的至少2个时发生：(i)液体培养物包含大于或等于约6.0摩尔NANA/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子；(ii)液体培养物具有约33x105活细胞/mL液体培养物－约79x105活细胞/mL液体培养物的细胞密度；(iii)液体培养物中的细胞生存力不小于约38％；或(iv)CTLA4-Ig蛋白质的得率大于约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物，其中(i)中的NANA浓度和(iv)中的得率通过评估液体培养物的等分试样而测定。本发明还提供了用于生产CTLA4-Ig蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增生产CTLA4-Ig蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物的，直至CTLA4-Ig蛋白质以至少约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物的得率生产，如通过评估液体培养物的等分试样而测定的；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig蛋白质，其中所述分离在满足下述条件中的至少2个时发生：(i)液体培养物包含约5.2－约7.6摩尔唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子；(ii)液体培养物中的细胞生存力不小于约37％；或(iii)CTLA4-Ig蛋白质的得率大于约0.5克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物，其中(i)中的唾液酸含量和(iii)中的得率通过评估液体培养物的等分试样而测定。
序列：
SEQ ID NO：1[CTLA4-Ig核苷酸序列，参见图1]
SEQ ID NO：2[CTLA4-Ig氨基酸序列，参见图1]
SEQ ID NO：3[CTLA4A29YL104E-Ig核苷酸序列包含图2中所示核酸序列的核苷酸79－1149]
SEQ ID NO：23是图2中所示的全长核苷酸序列。这个核苷酸序列包括关于前序列的编码序列。
SEQ ID NO：4[CTLA4A29YL104E-Ig氨基酸序列，图3，不含前序列]
SEQ ID NO：5[SEQ ID NO：2的氨基酸25－383]
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SEQ ID NO：6[SEQ ID NO：2的氨基酸26－383]
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SEQ ID NO：7[SEQ ID NO：2的氨基酸27－383]
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SEQ ID NO：8[SEQ ID NO：2的氨基酸25－382]
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SEQ ID NO：9[SEQ ID NO：2的氨基酸26－382]
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SEQ ID NO：10[SEQ ID NO：2的氨基酸27－382]
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SEQ ID NO：11[SEQ ID NO：4的氨基酸25－383]
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SEQ ID NO：12[SEQ ID NO：4的氨基酸26－383]
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SEQ ID NO：13[SEQ ID NO：4的氨基酸27－383]
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SEQ ID NO：14[SEQ ID NO：4的氨基酸25－382]
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SEQ ID NO：15[SEQ ID NO：4的氨基酸26－382]
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO：16[SEQ ID NO：4的氨基酸27－382]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO：17
SEQ ID NO：18[CTLA4胞外结构域序列]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
SEQ ID NO：19
5’-AGAAAAGGGGCTGGAGAGATGGCTCAGTGGTTAAGAGCA-3'
SEQ ID NOS:20-22
SEQ ID NO:20--5’-GTACTCAGG
SEQ ID NO:21--AGTCAGAGAC
SEQ ID NO:22--CGGCAGATCTCTGTGAGTTTGAGGCCAGCCTGG
TCTACAAAGCAAGTT-3'
CTLA4-Ig单体和多聚体
在某些实施方案中，本发明提供了具有包含SEQ ID NO：1(图1A)的表达盒的细胞系。此种表达盒当在哺乳动物细胞包括CHO细胞中表达时，可以导致N和C末端变体的生产，从而使得由表达盒生产的蛋白质可以具有下述残基的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、或(iv)SEQ ID NO：2的27－382、或任选地(v)SEQ ID NO：2的25－382、或(vi)SEQ ID NO：2的25－383(图1A)。这些蛋白质在本文中可以称为“SEQ ID NO：2单体”、或“具有SEQ ID NO：2序列的”单体。这些SEQID NO：2单体可以二聚化，从而使得二聚体组合可以包括例如：(i)和(i)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(i)和(vi)；(ii)和(ii)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(ii)和(vi)；(iii)和(iii)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iii)和(vi)；(iv)和(iv)；(iv)和(v)；(iv)和(vi)；(v)和(v)；(v)和(vi)；以及,(vi)和(vi)。这些不同的二聚体组合还可以彼此结合以形成四聚体CTLA4-Ig分子。这些单体、二聚体、四聚体和其他多聚体在本文中可以称为“SEQ ID NO：2蛋白质”或“具有SEQ ID NO：2序列的”蛋白质。尽管细胞系可以紧在翻译后生产这些变体，但变体更一般地可以是细胞中翻译后作用的产物。细胞系还分泌CTLA4-Ig分子。阿巴西普(Abatacept)指SEQ ID NO：2蛋白质。
CTLA4-Ig分子可以包括例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其他多聚体形式的CTLA4-Ig蛋白质。CTLA4-Ig分子可以包含具有CTLA4的至少胞外结构域和免疫球蛋白恒定区的蛋白质融合物。CTLA4-Ig分子可以具有野生型或突变型序列，例如，相对于CTLA4胞外结构域和免疫球蛋白恒定区序列。单独地，或二聚体、四聚体或其他多聚体形式的CTLA4-Ig单体可以是糖基化的。
在一些实施方案中，本发明提供了具有至少一定百分比的二聚体或其他多聚体分子的CTLA4-Ig分子的群体。例如，本发明提供了超过90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％CTLA4-Ig二聚体的CTLA4-Ig分子群体。在一个实施方案中，本发明提供了包含约95％－约99.5％CTLA4-Ig二聚体、和约0.5％－约5％CTLA4-Ig四聚体的CTLA4-Ig分子群体。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子群体包含约98％的CTLA4-Ig二聚体、约1.5％的CTLA4-Ig四聚体、和约0.5％的CTLA4-Ig单体。
在一个实施方案中，本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4-Ig单体分子的CTLA4-Ig分子的群体。基本上不含CTLA4-Ig单体分子可以指具有少于1％、0.5％或0.1％单体的CTLA4-Ig分子的群体。
在一个实施方案中，本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4-Ig多聚体的CTLA4-Ig分子的群体，所述CTLA4-Ig多聚体大于二聚体，例如四聚体、六聚体等(例如，高分子量种类)。基本上不含大于二聚体的CTLA4-Ig多聚体分子可以指具有少于6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％大于二聚体形式的CTLA4-Ig多聚体(例如，高分子量种类)的CTLA4-Ig分子的群体。
CTLA4-Ig单体分子可以具有例如，下述氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、或(iv)SEQ ID NO：2的27－382、或任选地(v)SEQ ID NO：2的25－382、或(vi)SEQ ID NO：2的25－383。当包含SEQ IDNO：1的核酸序列的表达盒在CHO细胞中进行表达时，表达的占优势的单体形式具有甲硫氨酸的N末端氨基酸残基(SEQ ID NO：2的残基27)，其对应野生型人CTLA4的N末端氨基酸残基。然而，因为SEQ ID NO：1还包括制瘤素M信号序列(SEQ ID NO：1的核苷酸11－88)的编码序列，所以由SEQ ID NO：1表达的蛋白质包含制瘤素M信号序列。信号序列在从细胞质的蛋白质输出，或分泌到细胞外的过程期间与表达的蛋白质切开。但切割可以导致N末端变体，例如SEQ ID NO.2的氨基酸残基25和26之间的切割(导致残基26的N末端，即“Ala变体”)，或SEQ ID NO.2的氨基酸残基24和25之间的切割(导致残基25的N末端，即“Met-Ala变体”)，与SEQ ID NO.2的氨基酸残基26和27之间的切割(导致残基27的N末端)相对比。例如，Met-Ala变体可以以约1％存在于CTLA4-Ig分子的混合物中，且Ala变体可以以约8－10％存在于CTLA4-Ig分子的混合物中。此外，由于不完全加工，由SEQ ID NO：1表达的蛋白质可以具有C末端变体。占优势的C末端是在SEQ ID NO：2的残基382处的甘氨酸。在CTLA4-Ig分子的混合物中，具有在C末端处的赖氨酸(SEQ ID NO：2的残基383)的单体可以例如以约4－5％存在。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子具有如下SEQ ID NO：5的氨基酸序列(这与SEQID NO：2的氨基酸25－383相同)：
[SEQ ID NO:5]
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子具有如下SEQ ID NO：6的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：2的氨基酸26－383相同)：
[SEQ ID NO:6]
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子具有如下SEQ ID NO：7的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：2的氨基酸27－383相同)：
[SEQ ID NO:7]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子具有如下SEQ ID NO：8的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：2的氨基酸25－382相同)：
[SEQ ID NO:8]
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子具有如下SEQ ID NO：9的氨基酸序列(这与SEQID NO：2的氨基酸26－382相同)：
[SEQ ID NO:9]
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子具有如下SEQ ID NO：10的氨基酸序列(这与SEQID NO：2的氨基酸27－382相同)：
[SEQ ID NO:10]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
CTLA4-Ig单体分子可以包含人CTLA4的胞外结构域。在一个实施方案中，胞外结构域可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸89－463的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸27－151。在另一个实施方案中，胞外结构域可以包含人CTLA4的突变体序列。在另一个实施方案中，胞外结构域可以包含对SEQ ID NO：1的核苷酸89－463的核苷酸变化，从而使得进行保守氨基酸变化。在另一个实施方案中，胞外结构域可以包含与SEQ ID NO：1的核苷酸89－463至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
CTLA4-Ig单体分子可以包含人免疫球蛋白的恒定区。这个恒定区可以是恒定区的部分；这个恒定区可以具有野生型或突变型序列。恒定区可以来自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。恒定区可以来自免疫球蛋白的轻链或重链。当恒定区来自IgG、IgD或IgA分子时，恒定区可以包含下述恒定区结构域中的一个或多个：CL、CH1、铰链、CH2或CH3。当恒定区来自IgM或IgE时，恒定区可以包含下述恒定区结构域中的一个或多个：CL、CH1、CH2、CH3或CH4。在一个实施方案中，恒定区可以包含来自IgG、IgD、IgA、IgM或IgE的一个或多个恒定区结构域。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig二聚体包含2个单体，其中每个单体可以具有相同或不同的氨基酸序列，且其中序列可以是下述的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、和(vi)SEQ ID NO：2的25－383。此种CTLA4-Ig单体可以通过人CTLA4序列的胞外结构域经由SEQ ID NO：2的第146位处的半胱氨酸氨基酸残基二聚化。
CTLA4-Ig分子可以通过IgM或IgA恒定区结构域与J链蛋白质的相互作用多聚化。IgM和IgA通常作为与另外的多肽链——J链结合的多聚体而生产。在五聚IgM中，单体在CH3结构域中通过二硫键彼此交联，并且通过CH4结构域与J链交联。IgM也可以形成缺乏J链的六聚体，其中多聚化通过与各自的二硫键来达到。在二聚IgA中，单体具有经由其CH3结构域与J链而不是彼此的二硫键。因此，在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig多聚体，包括二聚体、五聚体和六聚体，其中Ig部分包含IgM恒定区或其部分或IgA恒定区或其部分。基于IgM或IgA的此种CTLA4-Ig多聚体可以包括J链。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig单体分子(CTLA4Genbank登记号I13253)包含经修饰的人IgG1铰链区(SEQ ID NO：1的核苷酸464－508；SEQ ID NO：2的氨基酸152－166)，其中SEQ ID NO：2的氨基酸残基156、162和165处的丝氨酸已由野生型序列中存在的半胱氨酸进行工程改造。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig单体分子包含经修饰的人IgG1 CH2区和野生型CH3区(经修饰的人IgG1 CH2结构域具有SEQ ID NO：1的核苷酸509－838和SEQ ID NO：2的氨基酸167－276；人IgG1 CH3结构域具有SEQ ID NO：1的核苷酸839－1159和SEQ ID NO：2的氨基酸277－383)。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子群体包含具有作为公开号US2002/0182211A1公开的美国专利申请的图7、8或9中任何一个或多个，以及作为公开号US20030083246和US20040022787公开的美国专利申请中所示的序列，所述专利申请各自整体在此引入作为参考。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig四聚体分子包含2对CTLA4-Ig多肽或2个CTLA4-Ig多肽的二聚体，其中每个多肽具有下述氨基酸序列之一：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ IDNO：2的25－382、和(vi)SEQ ID NO：2的25－383。多肽对或二聚体的每个成员与另一个成员共价连接，且2对多肽与彼此非共价结合从而形成四聚体。此种四聚体分子能够与CD80或CD86结合。在另一个实施方案中，此种四聚体分子可以与CD80或CD86结合，其抗体亲抗原性为CTLA4-Ig二聚体(其单体具有上述氨基酸序列之一)与CD80或CD86的抗体亲抗原性的至少2倍。在另一个实施方案中，此种四聚体分子可以与CD80或CD86结合，其抗体亲抗原性为野生型CTLA4与CD80或CD86的结合亲和力或抗体亲抗原性的至少2倍。此种更大的抗体亲抗原性可以促成治疗免疫病症和如下所述的其他疾病，以及抑制组织和/或实体器官移植排斥中的更高功效。此外，更大或改善的抗体亲抗原性可以产生更高药物效力的结果。例如，包含CTLA4-Ig四聚体的治疗组合物将具有比相同量的具有CTLA4-Ig单体的治疗组合物更高的抗体亲抗原性，且因此更高的效力。在另一个实施方案中，与CTLA4-Ig二聚体(其单体具有上述氨基酸序列之一)相比较，此种四聚体分子可以具有对T细胞增殖的至少2倍的较大抑制。在另一个实施方案中，与野生型CTLA4分子相比较，此种四聚体分子可以具有对T细胞增殖至少2倍的较大抑制。
CTLA4 A29YL104E -Ig单体、二聚体和多聚体
CTLA4A29YL104E-Ig是CTLA4-Ig(图1A；SEQ ID NOS：1－2)的修饰形式。修饰由导致如图2中所示的2个氨基酸置换(L104E和A29Y)的点突变(对应于图3中的氨基酸位置55和130；SEQ ID NO：4)组成。相对于CTLA4-Ig，CTLA4A29YL104E-Ig(例如，SEQ ID NOS：5－10)以约2倍增加的抗体亲抗原性结合CD80(B7-1)，和以约4倍增加的抗体亲抗原性结合CD86(B7-2)。CTLA4A29YL104E-Ig在抑制T细胞增殖、细胞因子生产、和通过天然杀伤细胞的CD28依赖性靶细胞杀伤方面比CTLA4-Ig约10倍更有效。CTLA4A29YL104E-Ig引起B7-1介导的T细胞增殖适度的抑制，但在阻断B7-2介导的T细胞增殖方面明显比CTLA4-Ig更有效。增加的效力是可比较的，无论是单独阻断B7-2还是阻断B7-1和B7-2两者，从而暗示CTLA4A29YL104E-Ig增强的免疫调谐活性最可能归于增强的阻断B7-2的效力。
CTLA4A29YL104E-Ig是基因工程改造的融合蛋白，其由经修饰的人CTLA-4的功能结合结构域和IgG1类的人免疫球蛋白的Fc结构域组成(图3A－B)。2个氨基酸置换在CTLA-4结构域的B7结合区域(L104E和A29Y)中进行，以产生CTLA4A29YL104E-Ig分子。CTLA4A29YL104E-Ig二聚体包含2条糖基化的CTLA4A29YL104E-Ig链。它作为通过链间二硫键连接的共价二聚体存在。CTLA4A29YL104E-Ig分子的分子模型显示于图4中。CTLA4A29YL104E-Ig分子具有约91,800Da的平均质量，如通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法测定的。
在某些实施方案中，本发明提供了具有包含SEQ ID NO：3的表达盒的细胞系。此种表达盒当在哺乳动物细胞例如CHO细胞中表达时，可以导致N和C末端变体的生产，从而使得由表达盒生产的多肽可以具有下述残基的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、或(iv)SEQ ID NO：4的27－382、或任选地(v)SEQ ID NO：4的25－382、或(vi)SEQ ID NO：4的25－383。这些多肽在本文中可以称为“SEQ ID NO：4单体”、或“具有SEQ ID NO：4序列的”单体。
这些SEQ ID NO：4单体可以二聚化，从而使得二聚体组合可以包括例如：(i)和(i)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(i)和(vi)；(ii)和(ii)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(ii)和(vi)；(iii)和(iii)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iii)和(vi)；(iv)和(iv)；(iv)和(v)；(iv)和(vi)；(v)和(v)；(v)和(vi)；以及,(vi)和(vi)。这些不同的二聚体组合还可以彼此结合以形成四聚体CTLA4A29YL104E-Ig分子。这些单体、二聚体、四聚体和其他多聚体在本文中可以称为“SEQ ID NO：4多肽”或“具有SEQ ID NO：4序列的”多肽。尽管细胞系可以紧在翻译后生产这些变体，但变体更一般地可以是细胞中翻译后作用的产物。二聚体可以共价连接在一起，非共价连接在一起，或两者。本发明提供了基本上由共价结合在一起的二聚体组成的组合物。例如，本发明提供了其中至少50％的CTLA4-Ig二聚体由共价连接的单体构成的组合物。本发明还提供了其中至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CTLA4-Ig二聚体由共价连接的单体构成的组合物。本发明还提供了CTLA4-Ig分子的组合物，其中分子占优势地为二聚形式，且二聚体占优势地由共价键形成。例如，本发明提供了其中大多数CTLA4-Ig二聚体共价连接的组合物。组合物中的CTLA4-Ig二聚体的某些级分非共价连接，这是可能的。
CTLA4A29YL104E-Ig分子可以包括例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其他多聚体形式的CTLA4A29YL104E-Ig。CTLA4A29YL104E-Ig分子可以包含具有经修饰的CTLA4的至少胞外结构域(SEQ ID NO：18)和免疫球蛋白恒定区的蛋白质融合物。CTLA4A29YL104E-Ig分子可以具有突变型序列，例如，相对于经修饰的CTLA4胞外结构域和免疫球蛋白恒定区序列。单独地，或二聚体、四聚体或其他多聚体形式的CTLA4A29YL104E-Ig单体可以是糖基化的。
在某些实施方案中，本发明提供了具有至少一定百分比的二聚体或其他多聚体分子的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体。例如，本发明提供了超过90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％CTLA4A29YL104E-Ig二聚体的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在一个实施方案中，本发明提供了包含约95％－约99.5％CTLA4A29YL104E-Ig二聚体和约0.5％－约5％CTLA4A29YL104E-Ig四聚体的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含约95％－约99.5％CTLA4A29YL104E-Ig二聚体、约0.5％－约2.5％CTLA4A29YL104E-Ig单体、和约0.5％－约5％CTLA4A29YL104E-Ig四聚体的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子群体包含约96％的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体、约2.5％的CTLA4A29YL104E-Ig四聚体和约0.5％的CTLA4A29YL104E-Ig单体。
在一个实施方案中，本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4A29YL104E-Ig单体的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体。基本上不含CTLA4A29YL104E-Ig单体可以指具有少于1％、0.5％或0.1％单体的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体。
在另一个实施方案中，本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4A29YL104E-Ig多聚体的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体，所述CTLA4A29YL104E-Ig多聚体大于二聚体，例如四聚体、六聚体等。基本上不含大于二聚体的CTLA4A29YL104E-Ig多聚体可以指具有少于6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％大于二聚体的CTLA4A29YL104E-Ig多聚体的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体。
CTLA4A29YL104E-Ig单体可以具有例如，下述氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、或(iv)SEQ ID NO：4的27－382、或任选地(v) SEQ ID NO：4的25－382、或(vi)SEQ ID NO：4的25－383。当包含SEQID NO：3或23的核酸序列的表达盒在CHO细胞中进行表达时，表达的占优势的单体形式具有甲硫氨酸的N末端氨基酸残基(SEQ ID NO：4的残基27)，其对应于人CTLA4的N末端氨基酸残基。然而，因为SEQ ID NO：23还包括制瘤素M信号序列(SEQ ID NO：23的核苷酸11－88)的编码序列，所以由SEQ ID NO：23表达的蛋白质包含制瘤素M信号序列。
信号序列在从细胞质的蛋白质输出，或分泌到细胞外的过程期间与表达的蛋白质切开。但切割可以导致N末端变体，例如SEQ ID NO：4的氨基酸残基25和26之间的切割(导致残基26的N末端，即“Ala变体”)，或SEQ ID NO：4的氨基酸残基24和25之间的切割(导致残基25的N末端，即“Met-Ala变体”)，与SEQ ID NO：4的氨基酸残基26和27之间的切割(导致从氨基酸位置27处的Met残基开始的N末端)相对比。例如，Met-Ala变体可以以约1％存在于CTLA4A29YL104E-Ig分子的混合物中，且Ala变体以约10－20％存在于CTLA4A29YL104E-Ig分子的混合物中。
此外，由于不完全加工，由包含SEQ ID NO：3的核酸表达的蛋白质可以具有C末端变体。占优势的C末端是在SEQ ID NO：4的残基382处的甘氨酸。在CTLA4A29YL104E-Ig分子的混合物中，具有在C末端处的赖氨酸(SEQ ID NO：4的残基383)的单体可以例如以约4－8％存在。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子包含如下SEQ ID NO：11的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：4的氨基酸25－383相同)：
[SEQ ID NO:11]
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPLEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子包含如下SEQ ID NO：12的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：4的氨基酸26－383相同)：
[SEQ ID NO:12]
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
在进一步的实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子包含如下SEQ ID NO：13的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：4的氨基酸27－383相同)：
[SEQ ID NO:13]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子包含如下SEQ ID NO：14的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：4的氨基酸25－382相同)：
[SEQ ID NO:14]
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子包含如下SEQ ID NO：15的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：4的氨基酸26－382相同)：
[SEQ ID NO:15]
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
在进一步的实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子包含如下SEQ ID NO：16的氨基酸序列(这与SEQ ID NO：4的氨基酸27－382相同)：
[SEQ ID NO:16]
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
CTLA4A29YL104E-Ig单体可以包含人CTLA4的胞外结构域，其中在CTLA-4结构域中进行2个氨基酸置换(L104E和A29Y)(图5)。在一个实施方案中，胞外结构域可以包含SEQ IDNO：23的核苷酸89－463的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：4的氨基酸27－151。在另一个实施方案中，胞外结构域可以包含人CTLA4的突变序列(例如，SEQ ID NO：4的氨基酸27－151中的单重、双重和三重位点突变体)。在另一个实施方案中，胞外结构域可以包含对SEQ IDNO：23的核苷酸89－463的核苷酸变化，从而使得进行保守氨基酸变化。在进一步的实施方案中，胞外结构域可以包含对SEQ ID NO：23的核苷酸89－463的核苷酸变化，从而使得进行非保守氨基酸变化。在另一个实施方案中，胞外结构域可以包含与SEQ ID NO：23的核苷酸89－463至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
CTLA4A29YL104E-Ig单体可以包含人免疫球蛋白的恒定区。这个恒定区可以是恒定区的部分。这个恒定区还可以具有野生型或突变型序列。恒定区可以来自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。恒定区可以来自免疫球蛋白的轻链或重链。当恒定区来自IgG、IgD或IgA分子时，恒定区可以包含下述恒定区结构域中的一个或多个：CL、CH1、铰链、CH2或CH3。当恒定区来自IgM或IgE时，恒定区可以包含下述恒定区结构域中的一个或多个：CL、CH1、CH2、CH3或CH4。在一个实施方案中，恒定区可以包含来自IgG、IgD、IgA、IgM或IgE的一个或多个恒定区结构域。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig二聚体包含2个单体，其中每个单体可以具有相同或不同的氨基酸序列，且其中序列可以是下述的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382、和(vi)SEQ ID NO：4的25－383。此种CTLA4A29YL104E-Ig单体可以通过人CTLA4序列的胞外结构域经由SEQ ID NO：4的第146位处的半胱氨酸氨基酸残基(或图5的第120位处的半胱氨酸氨基酸残基)二聚化。
CTLA4A29YL104E-Ig分子可以通过IgM或IgA恒定区结构域与J链蛋白质的相互作用多聚化。IgM和IgA通常作为与另外的多肽链——J链结合的多聚体而生产。在五聚IgM中，单体在CH3结构域中通过二硫键彼此交联，并且通过CH4结构域与J链交联。IgM也可以形成缺乏J链的六聚体，其中多聚化通过与各自的二硫键来达到。在二聚IgA中，单体具有经由其CH3结构域与J链而不是彼此的二硫键。因此，在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4A29YL104E-Ig多聚体，包括二聚体、五聚体和六聚体，其中Ig部分包含IgM恒定区或其部分或IgA恒定区或其部分。基于IgM或IgA的此种CTLA4A29YL104E-Ig多聚体可以包括J链。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig单体包含经修饰的人IgG1铰链区(SEQ IDNO：23的核苷酸464－508；SEQ ID NO：4的氨基酸152－166)，其中SEQ ID NO：4的第156、162和165位处的丝氨酸残基已由野生型序列中存在的半胱氨酸进行工程改造。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig单体包含经修饰的人IgG1 CH2区和野生型CH3区(经修饰的人IgG1 CH2结构域具有SEQ ID NO：1的核苷酸509－838和SEQ ID NO：2的氨基酸167－276；人IgG1 CH3结构域具有SEQ ID NO：1的核苷酸839－1159和SEQ ID NO：2的氨基酸277－383)。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子群体包含具有美国专利申请公开号U.S.2002/0039577、U.S.2003/0007968、U.S.2004/0022787、U.S.2005/0019859和U.S.2005/0084933，以及美国专利号7,094,874中所示的序列的单体，所述专利文件各自整体在此引入作为参考。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig四聚体包含2对CTLA4A29YL104E-Ig分子或2个CTLA4A29YL104E-Ig分子的二聚体，其中每个多肽具有下述氨基酸序列之一：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382、和(vi)SEQ ID NO：4的25－383。多肽对或二聚体的每个成员与另一个成员共价连接，且2对多肽与彼此非共价结合从而形成四聚体。此种四聚体分子能够与CD80或CD86结合。在另一个实施方案中，此种四聚体分子可以与CD80或CD86结合，其抗体亲抗原性为CTLA4A29YL104E-Ig二聚体(其单体具有上述氨基酸序列之一)与CD80或CD86的结合抗体亲抗原性的至少2倍。
此种更大的抗体亲抗原性可以促成治疗免疫病症和如下所述的其他疾病，以及抑制组织和/或实体器官移植排斥中的更高功效。此外，更大或改善的抗体亲抗原性可以产生更高药物效力的结果。例如，包含CTLA4A29YL104E-Ig四聚体的治疗组合物将具有比相同量的具有CTLA4A29YL104E-Ig单体的治疗组合物更高的抗体亲抗原性，且因此更高的效力。在另一个实施方案中，与CTLA4A29YL104E-Ig二聚体(其单体具有上述氨基酸序列之一)相比较，此种四聚体分子可以具有对T细胞增殖至少2倍的较大抑制。在另一个实施方案中，与CTLA4-Ig四聚体分子相比较，此种四聚体分子可以具有对T细胞增殖至少2倍的较大抑制。
CTLA4-Ig和CTLA4 A29YL104E -Ig分子的表征
T细胞增殖可以使用本领域已知的标准测定进行测量。例如，评估T细胞增殖的最常见方法之一是经由抗原或针对TCR的拮抗性抗体刺激T细胞，且测量例如增殖T细胞中掺入的氚标记胸苷(3H-TdR)或经由增殖T细胞释放到培养物内的细胞因子的量。因此可以测量CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子对T细胞活化或增殖的抑制作用。
CTLA4-Ig分子的亲和力是分子与单个配体包括CD80、CD86、或CD80Ig或CD86Ig融合蛋白结合的强度。CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig与配体的亲和力可以例如通过使用基于表面等离子体技术的结合相互作用分析(BIA)进行测量。除测量结合强度外，它允许实时测定结合动力学，例如结合和解离速率常数。表面基质与之共价附着的、由用薄金属膜包被的载玻片组成的传感器芯片，用相互作用物(interactant)之一即CTLA4-Ig、CTLA4A29YL104E-Ig、或配体之一进行包被。允许包含另一相互作用物的溶液流经其表面。连续光束对准表面的另一侧，并且测量其反射角。CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig与配体结合时，光束的共振角改变(因为它依赖于接近于传感器的反应侧的培养基的折射率，这依次与培养基中溶解的材料的浓度正相关)。它随后借助于计算机进行分析。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig结合实验可以通过表面等离子体共振(SPR)在BIAcore仪器(BIAcore AG，Uppsala，瑞典)上进行。CTLA4-Ig可以通过伯胺基团与BIAcore传感器芯片上的羧甲基化的葡聚糖基质共价偶联，从而使CTLA4-Ig固定化至传感器芯片。可替代地，抗恒定区抗体可以用于经由Ig片段使CTLA4-Ig间接固定化至传感器表面。其后，将配体加入芯片中，以测量与配体结合的CTLA4-Ig。亲和力测量可以例如如van derMerwe，P.等人，J.Exp.Med.(1997)185(3)：393-404中所述来进行，所述参考文献整体在此引入作为参考。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig结合实验可以如上所述使用表面等离子体共振(SPR)技术来进行(图6；参见实施例21)。
还可以测量CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子的抗体亲抗原性。抗体亲抗原性可以定义为2种分子或细胞在多个位点上与彼此结合的强度总和。抗体亲抗原性不同于亲和力，所述亲和力是分子上的1个位点与其配体结合的强度。不受理论束缚，CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子较高的抗体亲抗原性可以导致经由CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子对T细胞增殖和活化的抑制的增加的效力。抗体亲抗原性可以例如通过2类固相测定进行测量：a)竞争性抑制测定，和b)洗脱测定。在2种测定中，配体与固体支持体附着。在竞争性抑制测定中，CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子随后在溶液中以固定浓度，连同不同浓度的游离配体一起加入，并且测定使固相结合抑制50％的配体的量。需要的配体越少，抗体亲抗原性越强。在洗脱测定中，配体在溶液中加入。获得平衡状态后，离液剂或变性剂(例如异硫氰酸酯、尿素或二乙胺)以不同浓度加入，以破坏CTLA4-Ig/配体相互作用或CTLA4A29YL104E-Ig/配体相互作用。其后用ELISA测定耐得住洗脱的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig的量。抗体亲抗原性越高，洗脱一定量的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig所需的离液剂越多。CTLA4-Ig分子或CTLA4A29YL104E-Ig的异质混合物的相对抗体亲抗原性可以表示为抗体亲抗原性指数(AI)，等于洗脱50％结合的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子所需的洗脱剂浓度。数据的精确分析可以通过测定在洗脱剂的不同浓度时洗脱的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig百分比来进行。
苯基琼脂糖4快速流动(Phenyl Sepharose 4 Fast Flow)柱层析，疏水作用层析(HIC)方法可以用于减少HIC纯化步骤中洗脱的CTLA4-Ig高分子量种类的量(参见实施例15)。因此，来自HIC柱的清除峰富含CTLA4-Ig HMW种类。例如，制备型单或串联柱SEC HPLC可以用于纯化来自HIC清除峰材料的二聚体、四聚体和多聚体亚群。在一个实施方案中，纯化的组分是CTLA4-Ig二聚体、四聚体和六聚体。HIC清除峰中存在的CTLA4-Ig的高分子量组分的表征可以通过静态和动态光散射技术来进行。在疏水作用层析(HIC)方法步骤追踪时获取的样品揭示在各个取样点时二聚体、四聚体和多聚体的存在。六聚体种类可以仅在对应于“清除峰的起始”和“清除峰最大OD”的样品中检测到。十聚体种类仅在“清除峰最大OD”中检测到。摩尔质量和流体动力学半径形成可以采用与准弹性光散射(QELS)检测偶联的多角光散射(MALS)，通过分级分离经由尺寸排阻层析(SEC)进行测定。
就由细胞系生产的CTLA4-Ig分子而言，SEC显示A蛋白洗脱物是多聚体、四聚体和二聚体组分的混合物。这种混合物在制备型串联SEC柱上的分级分离使得能够分离大量多聚体、四聚体和二聚体种类。关于分离的级分的SEC分析中的每种组分的面积百分比回收导致对于每种级分93－98％的同质性。在一个方面，个别组分的纯化使得能够比较CTLA4-IgHMW材料的组分与CTLA4-Ig二聚体的那些的物理化学性质。图7显示表观分子量，其对应于CTLA4-Ig HIC清除峰的多聚体、四聚体和二聚体级分，如通过SEC用动态光散射检测(DSL)和在SEC上的保留时间测定的。在一个实施方案中，来自HIC清除峰的纯化组分的生物特异性结合活性与通过基于BIAcore的固定化B7-1Ig结合测定所测定的结合活性可比较。在另一个方面，关于从HIC清除峰中分离的组分的唾液酸摩尔比为4.9－7.6，而CTLA4-Ig分子或二聚体(不在HIC清除峰中)的唾液酸摩尔比为8－10。通过IEF凝胶分析指出与CTLA4-Ig二聚体的迁移相比较，由HIC清除峰纯化的CTLA4-Ig同工型的移动性减少。这与对于CTLA4-IgHIC清除峰级分观察到的较低的唾液酸摩尔比一致(图8)。
细胞培养条件的选择可以影响重组蛋白质产物的单链(即，单体)和高分子量种类(即，二聚体、四聚体等)的形成。生长条件还包括但不限于培养基组成，是可以影响单链形成和半胱氨酰化水平的因素。这可能是导致二硫键还原的试剂存在的结果。给分泌CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig的细胞补加直接地半胱氨酸或包含半胱氨酸的培养基可以导致单链和高分子量种类的快速形成。速率与添加的半胱氨酸的量成比例。在另一个实施方案中，与游离巯基反应的化合物——碘乙酰胺的补加阻断依赖于二硫键的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig高分子量种类的形成。
例如，碘乙酰胺敏感性和非敏感性高分子量途径强调CTLA4-Ig中可以形成高分子量种类的2种主要和明显不同的机制。给CTLA4-Ig溶液补加高盐浓度(0.5M)导致持续、快速的高分子量形成率。EDTA、ConAcidSol II和酵母自溶液(yeastolates)适度地增加单链形成(参见实施例5)。
在某些实施方案中，本发明提供了用于生产高分子量CTLA4-Ig群体的方法，其中占优势地包含CTLA4-Ig单体或二聚体的混合物补加有高盐，从而使得混合物具有超过约0.3、0.4、0.45、0.5或0.6M的盐浓度。在一个实施方案中，此种方法产生包含CTLA4-Ig群体的混合物，所述CTLA4-Ig群体具有至少50％、55％、60％、65％、70 ％、75％、80％、85％、90％或95％CTLA4-Ig四聚体分子。
在一个实施方案中，本发明提供了包含在Cys146上的修饰的CTLA4-Ig单链种类的群体，从而使得它是半胱氨酰化的(参见实施例4)。半胱氨酰化是翻译后修饰，其中多肽链内的半胱氨酸通过经由二硫键附着另一个半胱氨酸进行修饰。蛋白质的半胱氨酰化已牵涉修饰蛋白质生物活性，包括MHC I类限制的病毒决定簇的免疫原性和抗原性。在一个实施方案中，本发明提供了包含至少1、5、10、15、20、25、50、75、90或95％半胱氨酰化的单链CTLA4-Ig分子的组合物。在本发明的另一个实施方案中，CTLA4-Ig群体具有不超过约1％CTLA4-Ig单体分子，或在另一个实施方案中，小于0.6％CTLA4-Ig单体。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约5－约18的唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一些实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17，且Y为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。在其他实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为约4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，且和Y为约8.0、8.5、9.0、9.5或10.0。在其他实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为约6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0，且Y为约11.0、11.5、12.0、12.5或13.0。在其他实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约6－约14、约7－约13、约8－约12、或约9－约11。在其他实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约5－约9、约5.5－约9.5、约6－约9、约6－约10、或约7－约10。在其他实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比大于或等于5、或大于或等于8。在某些实施方案中，唾液酸是N乙酰神经氨酸(NANA)。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有小于或等于2.5、小于或等于2.0、小于或等于1.5、小于或等于1.0、或小于或等于0.5的N羟乙酰神经氨酸(NGNA)与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是大于或等于93.0面积百分比、大于或等于93.5面积百分比、大于或等于94.0面积百分比、大于或等于94.5面积百分比、大于或等于95.0面积百分比、大于或等于95.5面积百分比、大于或等于96.0面积百分比、大于或等于96.5面积百分比、或大于或等于97.0面积百分比的CTLA4-Ig二聚体。在一些实施方案中，组合物包含CTLA4-Ig分子，其中如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是大于或等于95.0面积百分比的CTLA4-Ig二聚体、和小于或等于4.0面积百分比的高分子量种类。在一些实施方案中，组合物包含CTLA4-Ig分子，其中如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是大于或等于95.0面积百分比的CTLA4-Ig二聚体、和小于或等于5.0面积百分比的高分子量种类。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子具有小于或等于2.0面积百分比、小于或等于1.5面积百分比、小于或等于1.0面积百分比、小于或等于0.5面积百分比的CTLA4-Ig单体(即，单链)。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子具有小于或等于5.0面积百分比、小于或等于4.5面积百分比、小于或等于4.0面积百分比、小于或等于3.5面积百分比、小于或等于3.0面积百分比、小于或等于2.5面积百分比、小于或等于2.0面积百分比、小于或等于1.5面积百分比、小于或等于1.0面积百分比、或小于或等于0.5面积百分比的CTLA4-Ig高分子量种类(例如，四聚体)。在一些实施方案中，特别是涉及包含CTLA4-Ig分子的浓缩组合物的那些(例如，用于皮下施用的那些)，如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子具有小于或等于10面积百分比、小于或等于9面积百分比、小于或等于8面积百分比、小于或等于7面积百分比、小于或等于6面积百分比的CTLA4-Ig高分子量种类。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于50ppm、小于或等于40ppm、小于或等于38ppm、小于或等于30ppm、小于或等于20ppm、小于或等于10ppm、5ppm、小于或等于4ppm、小于或等于小于或等于3ppm、小于或等于2ppm或小于或等于1ppm的MCP-1或MCP-1样材料的量。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于50ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于40ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于38ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于30ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于20ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于10ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于4ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于3ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于2ng/mg CTLA4-Ig分子或小于或等于1ng/mg CTLA4-Ig分子的MCP-1或MCP-1样材料。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子和MCP-1的量(包括MCP-1的不存在)的组合物，其中所述组合物是药学上可接受的组合物。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约6－约19的半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一些实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，其中X为约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18，且Y为约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在其他实施方案中，半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－Y，包括X和Y，其中X为约6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0，且Y为约12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5或16.0。在其他实施方案中，半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为约6.0、6.5、7.0、7.5或8.0，且Y为约15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5或19.0。在其他实施方案中，半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约7－约15、约8－约14、约9－约13、或约10－约12。在其他实施方案中，半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约7－约18、约8－约17、约9－约17、约9－约16、或约10－约15。在其他实施方案中，半乳糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比大于或等于8。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约0.5－约12的岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一些实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或4.5，且Y为约7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0或10.5。在其他实施方案中，岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－Y，包括X和Y，其中X为约2.9、3.1、3.3、3.5、3.7、3.9或4.1，且Y为约7.9、8.1、8.3、8.5、8.7、8.9或9.1。在其他实施方案中，岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－Y，包括X和Y，其中X为约1.0、1.5、1.7、1.9、2.1、2.3或2.5，且Y为约8.7、8.9、9.1、9.3、9.6、9.9、10.1、10.3或10.5。在其他实施方案中，岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约3.3－约8.5、约3.5－约8.3、约3.7－约8.1、约3.9－约7.9。在其他实施方案中，岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约1.5－约9.5、约1.7－约9.3、约1.9－约9.1、或约2.1－约8.9。在其他实施方案中，岩藻糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比大于或等于1.7。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约5－约25的甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一些实施方案中，唾液酸与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21，且Y为约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在其他实施方案中，甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－Y，包括X和Y，其中X为约6.5、7.0、7.5、7.7、7.9、8.1、8.3、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0，且和Y为约17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23、23.5或24.0。在其他实施方案中，甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－Y，包括X和Y，其中X为约8、8.5、9.0、9.510.0或11.0，且Y为约17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0。在其他实施方案中，甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约6－约23、约7－约22、约7.7－约22、约8－约21、约9－约20、约10－约19、约11－约19、和约11－约17。在其他实施方案中，甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约8－约19、约9－约18、约10－约17、或约11－约16。在其他实施方案中，甘露糖与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比大于或等于7。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有小于或等于5.0面积百分比、小于或等于4.5面积百分比、小于或等于4.0面积百分比、小于或等于3.5面积百分比、小于或等于3.0面积百分比、小于或等于2.5面积百分比、小于或等于2.0面积百分比、小于或等于1.5面积百分比、小于或等于1.0面积百分比、或小于或等于0.5面积百分比的氧化种类。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有小于或等于5.0面积百分比、小于或等于4.5面积百分比、小于或等于4.0面积百分比、小于或等于3.5面积百分比、小于或等于3.0面积百分比、小于或等于2.5面积百分比、小于或等于2.0面积百分比、小于或等于1.5面积百分比、小于或等于1.0面积百分比、或小于或等于0.5面积百分比的脱酰胺种类。在某些实施方案中，组合物包含CTLA4-Ig分子，其中CTLA4-Ig分子具有小于或等于3.5面积百分比的氧化种类和小于或等于2.5面积百分比的脱酰胺基种类。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于0.7EU/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于0.6EU/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于0.5EU/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于0.42EU/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于0.4EU/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于0.35EU/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于0.3EU/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于0.25EU/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于0.20EU/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于0.15EU/mg CTLA4-Ig分子、或小于或等于0.05EU/mg CTLA4-Ig分子的细菌内毒素LAL。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于2CFU/10mL、小于或等于1.5CFU/10mL、小于或等于1CFU/10mL、或小于或等于0.5CFU/10mL的生物负荷。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于25pg/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于20pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于15pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于10pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于5.0pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于4.0pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于3.5pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于3.0pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于2.5pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于1.5pg/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于1.0pg/mg CTLA4-Ig分子、或小于或等于0.5pg/mg CTLA4-Ig分子、或小于或等于0.20pg/mlCTLA4-Ig分子的DNA。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于200ng/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于150ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于125ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于100ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于90ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于80ng/mg CTLA4-Ig分子、70ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于60ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于50ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于40ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于30ng/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于25ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于20ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于15ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于10ng/mg CTLA4-Ig分子、或小于或等于5ng/mg CTLA4-Ig分子的细胞蛋白质(例如，CHO蛋白质或CHOP)。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于200ppm、小于或等于150ppm、小于或等于125ppm、小于或等于100ppm、小于或等于90ppm、小于或等于80ppm、70ppm、小于或等于60ppm、小于或等于50ppm、小于或等于40ppm、小于或等于30ppm、小于或等于25ppm、小于或等于20ppm、小于或等于15ppm、小于或等于10ppm、或小于或等于5ppm的细胞蛋白质。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于4.0ng/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于3.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于3.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于2.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于2.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于1.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于1.0ng/mg CTLA4-Ig分子、或小于或等于0.5ng/mgCTLA4-Ig分子的Triton-X(例如，Triton X-100)。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于4.0ppm、小于或等于3.5ppm、小于或等于3.0ppm、小于或等于2.5ppm、小于或等于2.0ppm、小于或等于1.5ppm、小于或等于1.0ppm或小于或等于0.5ppm的Triton-X。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于8.0ng/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于7.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于7.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于6.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于6.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于5.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于5.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于4.5ng/mgCTLA4-Ig分子、小于或等于4.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于3.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于3.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于2.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于2.0ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于1.5ng/mg CTLA4-Ig分子、小于或等于1.0ng/mgCTLA4-Ig分子或小于或等于0.5ng/mg CTLA4-Ig分子的A蛋白。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中组合物包含小于或等于8.0ppm、小于或等于7.5ppm、小于或等于7.0ppm、小于或等于6.5ppm、小于或等于6.0ppm、小于或等于5.5ppm、小于或等于5.0ppm、小于或等于4.5ppm、小于或等于4.0ppm、小于或等于3.5ppm、小于或等于3.0ppm、小于或等于2.5ppm、小于或等于2.0ppm、小于或等于1.5ppm、小于或等于1.0ppm或小于或等于0.5ppm的A蛋白。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约10－约40的GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一些实施方案中，GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为10－39的任何整数，且Y为11－40的任何整数。在其他实施方案中，GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－Y，包括X和Y，其中X为约12、14、14、15、16或17，且Y为约32、33、34、35、36或37。在其他实施方案中，GlcNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约12－约35、约13－约35、约14－约35、约15－约35。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig分子具有约0.5－约7.0的GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在一些实施方案中，GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－约Y，包括X和Y，其中X为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0，且Y为3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、.46、4.7、4.8、4.9、5.0、6.0、7.0或8.0。在其他实施方案中，GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约X－Y，包括X和Y，其中X为约0.6、0.7、0.8、0.9或1.0，且Y为约3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1或4.2。在其他实施方案中，GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约0.7－约4.1、约0.8－约4.0、约0.9－约3.9、或约1.0－约3.8、或约1.1－约3.7。在其他实施方案中，GalNAc与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比为约1.6－约3.7、约1.7－约3.6、约1.8－约3.5、或约1.9－约3.4。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中如在等电聚焦凝胶(IEF凝胶)上测定的，CTLA4-Ig组合物显示如下pI范围中的条带：约4.3－约5.6的pI范围中的约10个－约22个条带；约4.3－约5.3的pI范围中的约90％－约110％的累积条带强度，和约4.5－约5.2的pI范围中的约3个主要条带。在一个实施方案中，约4.3－约5.6范围中的条带为约5个－约30个、约6个－约29个、约7个－约28个、约8个－约27个、约9个－约26个、约10个－约25个、约11个－约24个、约12个－约23个、约13个－约22个、约14个－约21个、约15个－约20个、约16个－约19个、约17个－约20个、约18个－约19个。
糖基化的CTLA4-Ig和CTLA4 A29YL104E -Ig分子及其群体
不加限制地，糖基化可以指在多肽链内的特定位点上给蛋白质添加复合寡糖结构。蛋白质的糖基化和添加的碳水化合物的后续加工可以影响蛋白质折叠和结构、蛋白质稳定性包括蛋白质半衰期、和蛋白质的功能性质。蛋白质糖基化可以依靠其中修饰发生的序列背景分成2类：O联糖基化和N联糖基化。O联多糖与羟基，通常与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接。O聚糖并非给每个丝氨酸和苏氨酸残基添加。O联寡糖通常是单或双触角的，即它们包含一个或至多2个分支(触角)，且包含一个接一个添加的1－4个不同类的糖残基。
N联多糖与天冬酰胺的酰胺氮附着。只有2种三肽序列——天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)之一的部分的天冬酰胺是糖基化的靶。N联寡糖可以具有1－4个分支，称为单、双、三、四触角。在N和O联寡糖中发现的结构和糖残基不同。尽管存在那种差异，N和O联多糖的每个分支上的末端残基可以由唾液酸分子进行修饰，这种修饰称为唾液酸加帽。唾液酸是独特的9碳单糖家族的通用名，其可以与其他寡糖进行连接。2个家族成员是N-乙酰神经氨酸，缩写为Neu5Ac或NANA，和N-羟乙酰神经氨酸，缩写为Neu5Gc或NGNA。
在人中最常见的唾液酸形式是NANA。N-乙酰神经氨酸(NANA)是存在于CTLA4-Ig分子中的主要唾液酸种类。然而，应当指出较少但可检测水平的N羟乙酰神经氨酸(NGNA)也存在于CTLA4-Ig分子中。此外，本文描述的方法可以用于测定对于NANA和NGNA的唾液酸摩尔数，且因此NANA和NGNA的水平就CTLA4-Ig分子进行测定和报道。N和O联寡糖具有不同数目的分支，其提供唾液酸分子可以与之附着的不同位置数目。N联寡糖可以提供用于唾液酸的最高达4个附着位置，而O联寡糖可以提供用于唾液酸附着的2个位点。
其中许多已通过重组DNA技术法生产的糖基化蛋白(糖蛋白)作为诊断和治疗剂具有极大的利益。定向于细胞表面的许多真核跨膜蛋白和分泌的蛋白进行翻译后修饰，以掺入N联和O联碳水化合物基团。当天冬酰胺残基是肽基序Asn-X-Ser/Thr的部分时，N联寡糖与它们附着，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。O联寡糖与丝氨酸或苏氨酸残基附着。N联和O联寡糖的结构以及各自中发现的糖残基可以不同。在两者上共同发现的一类糖是N-乙酰神经氨酸(NANA；在下文中称为唾液酸)。通常，唾液酸是N联和O联寡糖的末端残基。由于其负电荷，糖蛋白可以显示酸性。
糖基化蛋白据说在增加蛋白质折叠、调节细胞分选和运输、预防蛋白质聚集、介导细胞-细胞粘附、和增加对蛋白酶解的抗性方面起作用。在真核生物中，通过涉及受体介导的胞容和清除的过程，糖基化的性质和程度可以对糖蛋白治疗剂的循环半衰期和生物活性具有深刻影响。受体介导的系统被认为通过识别寡糖的各种糖组分在清除血清糖蛋白中起主要作用。糖蛋白的末端唾液酸基团可以影响吸收、半衰期和血清清除率。因此，维持糖基化蛋白的末端唾液酸组分的糖蛋白生产策略，可以更好地增加蛋白质的生物利用率和血清半衰期。关于重组糖蛋白合成的几种生产过程参数已得到研究，特别是培养基组成和温度变化在各种生产策略中的作用。
由具有下述残基的氨基酸序列的单体组成的CTLA4-Ig二聚体可以具有约78,000－约79,000道尔顿的预测理论MW：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、或(vi)SEQ ID NO：2的25－383。然而，通过MALDI-TOF 获得的此种二聚体的MW为约91,000道尔顿。MW中约13,000－14,000道尔顿的这种差异至少部分是由于糖基化，在一个实施方案中，所述糖基化占这种特定CTLA4-Ig单体分子约15％的质量。上文指定的单体具有3个N联糖基化位点，其已通过肽作图证实在SEQ ID NO：2的残基102、134和233处的天冬酰胺上发生。通过天冬酰胺连接的碳水化合物分子可以使用肽N糖苷酶F(PNGase F)进行选择性切割。在一种情况下，用PNGase F处理具有SEQ ID NO：2的序列27－383的单体导致MW约80,200道尔顿的种类，且因为这种单体的理论MW为约80,200，所以处理暗示未计入的1,400道尔顿(80,200-78,800＝1,400)可能是由于O联糖基化。尽管存在具有成为糖基化位点潜能的众多丝氨酸和苏氨酸残基，但只鉴定了2个O联位点：SEQ ID NO：2的Ser155和Ser165。在一个实施方案中，与这2个位点附着的占优势的聚糖是HexNAc-Hex-NeuAc。
例如，图9呈现在CTLA4-Ig分子上的N联和O联碳水化合物结构的全图，所述CTLA4-Ig分子包含具有来自SEQ ID NO：2的序列的单体(即，具有下述序列之一的单体：(i)SEQ IDNO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ IDNO：2的27－382)、(v)SEQ ID NO：2的25－382、或(vi)SEQ ID NO：2的25－383，其中在一个实施方案中，具有所示碳水化合物特征的此种分子通过本发明的细胞系或其后代，根据实施例14－15中所述以及图10中所示的生产方法进行生产。关于每个位点列出的主结构基于正交技术(参见本文)。对于每种结构，存在在这些实验期间观察到的那种结构的估计百分比。这些百分比表示来自正交技术的最佳估计。
由具有下述残基的氨基酸序列的单体组成的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体可以具有约78,000－约79,000道尔顿的预测理论MW：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382、或(vi)SEQ ID NO：4的25－383。然而，通过MALDI-TOF获得的此种二聚体的MW为约91,500道尔顿。MW中约12,000－13,000道尔顿的这种差异至少部分是由于糖基化。上文指定的单体具有3个N联糖基化位点，其已通过肽作图证实在SEQ ID NO：4的残基102、134和233处(图4的N76、N108和N207)的天冬酰胺上发生。通过天冬酰胺连接的碳水化合物分子可以使用肽N糖苷酶F(PNGase F)进行选择性切割。尽管存在具有成为糖基化位点潜能的众多丝氨酸和苏氨酸残基，但只鉴定了3个O联位点：SEQ ID NO：4的Ser149、Ser155和Ser165(参见实施例22中的表25)。在一个实施方案中，与这些位点附着的占优势的聚糖是HexNAc-Hex-NeuAc。
在某些实施方案中，CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子是可以通过本发明的培养法生产的糖蛋白。在一个实施方案中，CTLA4-Ig糖蛋白用代表约15％(w/w)分子的寡糖进行修饰。这些寡糖可以在CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白的药物代谢动力学(PK)参数中起重要作用。此外，不同的寡糖概况可以影响蛋白质的稳定性和降解。例如，O联寡糖可以通过预防免疫球蛋白恒定区的铰链区中的自溶来增强CTLA4A29YL104E-Ig分子的稳定性。
由于细胞培养和方法的复杂性，在CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体上的寡糖分布在性质中可以是异质的。由于糖基化位点被完全占据至未占据和下述事实，可以存在异质性：任何特定位点可以填充有许多不同的寡糖结构的事实，这可以进一步显示唾液酸修饰的模式中的变化。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子上的主要唾液酸部分是N乙酰神经氨酸(NeuAc，NANA)，且次要唾液酸部分是N羟乙酰神经氨酸(NGNA)。唾液酸的带电性质和复杂的含唾液酸结构可以分别导致CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig的多重同工型，其中此种同工型在等电聚焦(IEF)概况中可以是明显的。例如，关于CTLA4-Ig的IEF概况参见图11和实施例3。此外，关于CTLA4A29YL104E-Ig的IEF概况参见图12和实施例22。
在一个实施方案中，本发明提供了具有占优势的CTLA4-Ig同工型的CTLA4-Ig分子群体，所述CTLA4-Ig同工型具有小于或等于5.1或5.0的等电点(pI)，这可以例如通过IEF进行测定。在另一个实施方案中，提供了具有占优势的CTLA4A29YL104E-Ig同工型的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体，所述CTLA4A29YL104E-Ig同工型具有小于或等于5.5的等电点(pI)，这可以例如通过IEF进行测定(图12)。
在一个实施方案中，本发明提供了具有约4.2－约5.7、约4.25－约5.5、约4.3－约5.3或约4.5－约5.2的pI的CTLA4-Ig分子群体。在另一个实施方案中，本发明提供了具有约4.45－约5.30的pI的CTLA4-Ig分子群体。在进一步的实施方案中，本发明提供了具有约4.3－约5.1的pI的CTLA4-Ig分子群体。在具体实施方案中，本发明提供了具有约4.45－约5.0的pI的CTLA4-Ig分子群体。在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中如通过IEF测定的，群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子显示小于或等于约5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1或2.1的等电点(这些值可以具有±0.2的标准差)。在一个实施方案中，本发明提供了用于制备CTLA4-Ig分子的群体的方法，所述CTLA4-Ig分子具有约4.45－约5.30或约4.45－约5.1或约4.45－约5.0的pI，其中所述方法包括对CTLA4-Ig分子的群体实施IEF凝胶电泳，其中凝胶上的单个条带表示具有特定pI的CTLA4-Ig分子的亚群，并且通过从凝胶中切割条带和随后从切割的凝胶条带中纯化蛋白质来分离具有特定pI的CTLA4-Ig分子的亚群。
在进一步的实施方案中，本发明提供了具有约4.5－约5.2的pI的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在其他实施方案中，本发明提供了具有约4.7－约5.1的pI的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在另一个实施方案中，本发明提供了具有约2.0－约5.2的pI的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体，其中如通过IEF测定的，群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子显示小于或等于约5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0的等电点(这些值可以具有±0.2的标准差)。在一个实施方案中，本发明提供了用于制备CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体的方法，所述CTLA4-Ig分子具有约4.5－约5.2；约4.7－约5.1；约2.0－约5.2的pI，其中所述方法包括对CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体实施IEF凝胶电泳，其中凝胶上的单个条带表示具有特定pI的CTLA4A29YL104E-Ig分子的亚群，并且通过从凝胶中切割条带和随后从切割的凝胶条带中纯化蛋白质来分离具有特定pI的CTLA4A29YL104E-Ig分子的亚群。
在某些实施方案中，本发明提供了具有摩尔唾液酸基团与摩尔CTLA4-Ig分子的下述平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体：约6－约32、约8－约32、约11－约30、约12－约20、约13－约19、约14－约18、约15－约17、约6－约16、约8－约16、约8－约14、约8－约12。
在一些实施方案中，≤25ppm至≤10ng/mg的最大可容许CHO宿主细胞蛋白质表征CTLA4-Ig分子的组合物。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于在≤2.5pg/mg至≤1.0pg/mg水平上的宿主细胞DNA。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于在≤1.0ng/mg或≤1.0ppm水平上的Triton X-100。Triton X-100的浓度可以通过使用Waters OASIS-HLB固相萃取，萃取Triton X-100，随后用水洗涤以去除残留蛋白质进行测定。结合的Triton X-100通过用乙腈洗脱来去除。乙腈洗脱物通过反相层析进行分析，使用SAS Hypersil 5μm柱和由乙腈：水(80：20)组成的移流相。检测经由在225nm处的UV吸光度进行。在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于≤2.5面积％的氧化和≤2.0面积％的脱酰胺。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于≤3.0面积％的氧化和≤2.5面积％的脱酰胺。胰蛋白酶肽作图法用于定量氧化和脱酰胺。百分比氧化数据通过利用RP-HPLC胰蛋白酶作图测定进行测定，所述测定定量CTLA4-Ig蛋白质中的Met85至甲硫氨酸亚砜的面积百分比氧化。该方法中的百分比氧化通过测量RP-HPLC胰蛋白酶图中的UV峰面积而获得，该UV峰关于包含含有Met85的残基84－93的T6胰蛋白酶肽，和相应的含有Met(O)85的氧化胰蛋白酶肽T6ox。Met85至Met(O)85的面积百分比氧化与T6ox峰的面积百分比成比例：百分比氧化＝100*AT6ox/(AT6ox+AT6)，其中AT6＝关于T6胰蛋白酶肽，(84－93)的峰面积。AT6ox＝关于T6ox胰蛋白酶肽，Met(O)85(84-93)的峰面积。百分比脱酰胺数据通过测量RP-HPLC胰蛋白酶图中的UV峰面积而获得，该UV峰关于包含含有Asn294的残基281－302的T26胰蛋白酶肽，和相应的含有isoAsp294的脱酰胺的胰蛋白酶肽T26deam1，所述数据通过使用定量面积百分比氧化和脱酰胺的RP-HPLC胰蛋白酶作图测定获得。随后，Asn294至isoAsp294的面积百分比脱酰胺与T26deam1峰的面积百分比成比例：其中AT26＝关于T26,(281－302)的峰面积，AT26deam1＝关于T26deam1，isoAsp294(281－302)的峰面积。AT26deam2＝关于T26deam2，Asp299(281－302)的峰面积。AT26deam3＝关于T26deam3，Asp294(281－302)的峰面积。AT26deam4＝关于T26deam4，Asu294(281－302)的峰面积。
在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于15－35摩尔：摩尔CTLA4-Ig蛋白质的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，或1.7－3.6摩尔：摩尔CTLA4-Ig蛋白质的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。氨基单糖在经由酸水解从蛋白质中释放后通过毛细管电泳(CE)进行定量。释放的氨基单糖是重乙酰化的，并且用氨基芘三磺酸(APTS)进行荧光标记以促进其检测和定量。将N-乙酰甘露糖胺加入样品和氨基单糖标准中以充当内部标准。样品中的氨基单糖的峰面积使用内部标准进行标准化，并且通过与其在标准中各自标准化的氨基单糖峰面积比较进行定量。随后计算每种单糖相对于CTLA4-Ig分子的摩尔比。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于下述N联寡糖概况说明：
N联寡糖概况说明
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物的特征在于其中组合物具有约下述比的中性单糖：
半乳糖：8.0－17摩尔：摩尔CTLA4-Ig蛋白质
岩藻糖：3.5－8.3摩尔：摩尔CTLA4-Ig蛋白质
甘露糖：7.7－22摩尔：摩尔CTLA4-Ig蛋白质，或
半乳糖：9.0－17摩尔：摩尔CTLA4-Ig蛋白质
甘露糖：11－19摩尔：摩尔CTLA4-Ig蛋白质。
举例说明性中性单糖组合物：半乳糖、岩藻糖和甘露糖的摩尔：摩尔蛋白质
举例说明性唾液酸(NANA：摩尔蛋白质)
在另一个实施方案中，关于CTLA4A29YL104E-Ig组合物的单糖摩尔比范围如下：甘露糖约10－20摩尔/摩尔蛋白质；岩藻糖约4.2－7.0摩尔/摩尔蛋白质；和半乳糖约9.2－17摩尔/摩尔蛋白质。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig组合物的特征在于约5.0－10.0摩尔NANA/摩尔蛋白质的NANA摩尔比。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig组合物的特征在于<1.5摩尔NGNA/摩尔蛋白质的NGNA摩尔比。在一些实施方案中，关于唾液酸的摩尔比的％偏差为≤15％或≤20％或≤30％。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的群体可以包含各自具有至少3个唾液酸基团的CTLA4-Ig单体。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的群体包含各自具有3－8个唾液酸基团的CTLA4-Ig单体。
在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子显示小于或等于约5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0的等电点。
在一些实施方案中，本发明提供了具有摩尔NANA与摩尔CTLA4-Ig分子或二聚体的下述平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体：约6－约16、约6－约14、约6－约12、约8－约12、约8－约14、约8－约16。
在其他实施方案中，本发明提供了具有小于或等于约2、1.8、1.6、1.5、1.4、1.0、0.8或0.5的摩尔NGNA与摩尔CTLA4-Ig分子或二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。
在具体实施方案中，本发明提供了具有约5.5－约8.5的摩尔唾液酸基团与摩尔CTLA4A29YL104E-Ig分子或二聚体的平均摩尔比的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在另一个实施方案中，本发明提供了具有约5－约10的摩尔唾液酸基团与摩尔CTLA4A29YL104E-Ig分子或二聚体的平均摩尔比的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体可以包含各自具有至少2.5个唾液酸基团的CTLA4A29YL104E-Ig单体。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体包含各自具有2.5－5个唾液酸基团的CTLA4A29YL104E-Ig单体。
在其他实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其通过群体的摩尔氨基单糖和/或中性单糖和/或唾液酸与摩尔CTLA4-Ig分子或二聚体的平均摩尔比加以区别。在具体实施方案中，本发明提供了CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体，其通过群体的摩尔氨基单糖和/或中性单糖和/或唾液酸与摩尔CTLA4A29YL104E-Ig分子或二聚体的平均摩尔比加以区别。氨基单糖包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。中性单糖包括甘露糖、岩藻糖和半乳糖。唾液酸包括N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)。
在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其特征在于约10－约40、约15－约35、约15－约25、或约15－约20的摩尔GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在另一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子的特征在于小于或等于约40、38、35、30、25、20、18或15的摩尔GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
在另一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其特征在于约1.5－约8.5、约1.7－约3.0、约1.7－约4.0、约1.7－约5.0、约1.7－约6.0、约1.7－约7.0、约1.7－约8.0或约1.7－约8.3的摩尔GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在另一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子的特征在于小于或等于约8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4.0、3.8、3.6、3.5、3.0、2.5、2.0、1.7或1.5的摩尔GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
在进一步的实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其特征在于约7.5－约20.0、约8.0－约19.0、约8－约18.0、约8.0－约17.0、约8.5－约17.0或约9.0－约17.0的摩尔半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在另一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子的特征在于小于或等于约20.0、19.0、18.0、17.0、16.0、15.0、14.0、13.0、12.0、11.0、10.0、9.0、8.5、8.0或7.5的摩尔半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
在进一步的实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其特征在于约3－约8.5、约3.5－约8.5、约3.5－约8.3、约3.5－约8.0、约3.5－约7.5或约3.5－约7.0的摩尔岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在另一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子的特征在于小于或等于约8.5、8.3、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.2或3.0的摩尔岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
在进一步的实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其特征在于约7－约23、约7.5－约23、约7.7－约23、约7.7－约22.5、约7.7－约22、约7.7－约20、约7.7－约18、约7.7－约16、约8.0－约16.0、约9.0－约17.0、约10－约19.0或约11－约19.0的摩尔甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。在另一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中群体中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的分子的特征在于小于或等于约23、22.5、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9.5、9、8.5、8、7.7、7.5、7.3或7的摩尔甘露糖/摩尔CTLA4-Ig分子或二聚体或对CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
在一个实施方案中，本发明提供了糖基化的CTLA4-Ig群体，其显示例如起因于或如通过从血清中减少的清除同时保留生物活性证实的增加的PK值，例如增加的暴露，如通过曲线下面积(AUC)测量的。在另一个实施方案中，本发明提供了糖基化的CTLA4A29YL104E-Ig群体，其显示如通过从血清中减少的清除同时保留生物活性证实的增加的药物代谢动力学(PK)值。
在一些实施方案中，本发明提供了可溶性CTLA4-Ig分子的类似物，其具有另外的糖基化位点。在其他实施方案中，本发明提供了可溶性CTLA4A29YL104E-Ig分子的类似物，其具有另外的糖基化位点。另外的糖基化位点提供了用于可以被唾液酸化的另外碳水化合物结构的附着点。增加的唾液酸含量可以导致增加的PK值，和/或增加的糖蛋白稳定性。较高的唾液酸含量是有利的。可以进行使用酶以添加另外的唾液酸的体外纯化后方法，以产生本发明的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子的进一步实施方案。
本发明的实施方案包括与本文公开的任何一个或多个范围组合的本文公开的任何一个范围。本发明的实施方案包括与本文公开的CTLA4-Ig的任何一种或多种特征或性质组合的本文公开的CTLA4-Ig的任何一种特征或性质。
用于分析和分离CTLA4-Ig和CTLA4 A29YL104E -Ig糖蛋白的方法
本文描述的下述方法可以用于基于各种糖概况区别、鉴定或分离特定的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子群体，所述糖概况包括但不限于，群体的摩尔氨基单糖和/或中性单糖和/或唾液酸/摩尔CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子或二聚体的平均摩尔比。
由培养的细胞分泌的糖蛋白可以从培养基或上清液中进行分离。需要时，在总细胞培养期结束时，使用如本领域已知和实践的或如本文描述的分离和纯化方法，由细胞产生的糖蛋白进行收集、回收、分离和/或纯化、或基本上纯化。在一个实施方案中，由细胞表达但不由细胞分泌的本发明的糖蛋白仍可以从细胞中进行回收，例如，经由制备细胞裂解物和分离糖蛋白、和/或使用本领域已知和实践的以及如下文进一步描述的方法。
由本发明的细胞培养方法产生的糖蛋白包含可以通过碳水化合物分析的各种技术进行分析的复合碳水化合物。例如，技术例如本领域众所周知的凝集素印迹揭示末端甘露糖或其他糖例如半乳糖的比例。由唾液酸结束单、双、三或四触角寡糖可以通过下述加以证实，使用无水肼或酶促法从蛋白质中释放糖，以及通过离子交换层析、尺寸排阻层析、或本领域已知的其他方法分级分离寡糖。
存在在糖蛋白中发现的2个主要类型的糖苷键，N和O联。N糖基化通过使聚糖与天冬酰胺残基的酰胺氮共价连接来生成。O糖苷键通过使丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基与聚糖共价连接来生成。糖蛋白的碳水化合物部分涉及众多分子识别现象，包括宿主-病原体相互作用、从血清中清除和不同组织的靶向。就CTLA4-Ig和CTLA4A29YL104E-Ig分子而言，碳水化合物部分可以至少影响CTLA4-Ig分子与CD80或CD86，或CTLA4A29YL104E-Ig分子与CD80或CD86之间的结合。
碳水化合物结构一般作为N联或O联碳水化合物存在于表达的蛋白质上。N联和O联碳水化合物主要在其核心结构方面不同。N联糖基化指碳水化合物部分经由GlcNAc与肽链中的天冬酰胺残基附着。在一个实施方案中，N联碳水化合物都包含共同的Man1-6(Man1-3)Manβ1-4Glc-NAcβ1-4GlcNAcβ-R核心结构，其中这个核心结构中的R表示天冬酰胺残基。产生的蛋白质的肽序列将包含天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。
相比之下，O联碳水化合物的特征在于共同的核心结构，其包含与苏氨酸或丝氨酸的羟基附着的GalNAc。在N联和O联碳水化合物中，最重要的是复合N和O联碳水化合物。此种复合碳水化合物包含几个触角结构。单、双、三和四触角结构对于末端唾液酸的添加是重要的。此种外部链结构提供了关于特定糖和键的另外位点，所述糖和键包含蛋白质产物的碳水化合物。
治疗糖蛋白通常使用重组DNA细胞培养技术进行生产。细胞培养中的蛋白质糖基化分布可以受pH、细胞密度、营养物浓度和代谢物浓度中的变化影响。聚糖分布对环境作用的敏感性使得必须在产物发展和生产期间小心地监控聚糖分布，以确保制造可重复的产物。
用于治疗用途的重组体衍生的糖蛋白的开发已导致对其碳水化合物结构进行表征和概况分析的方法的渐增的需要。寡糖作图已在重组蛋白质的最初表征期间使用，以供与天然蛋白质比较，以鉴定存在的寡糖结构，以监控寡糖组成的一致性，以评估可以由细胞培养或生产过程中的改变引起的变化，和鉴定由于在不同细胞系中表达而发生的糖基化中的变化。
多种技术可以用于评估碳水化合物结构分布。这些包括与广泛范围的检测技术偶联的凝胶过滤、层析和电泳分离技术。如果样品量是有限的，那么糖蛋白通常用荧光试剂例如2-氨基苯甲酸和2-氨基吡啶衍生以便改善检测。然而，衍生物的衍生和纯化可以是费时的。当样品大小不是问题时，碳水化合物结构分布的直接评估是可能的。
糖蛋白的寡糖含量的分析
特定糖蛋白可以显示碳水化合物的异质性。异质性可以在几个水平上看出：糖基化位点可以在完全占据到未占据之间变动，并且任何特定位点可以填充有许多不同的寡糖结构，其中每个结构可以通过唾液酸分子例如NANA或NGNA进行修饰。
本发明的蛋白质的碳水化合物含量可以通过本领域已知的方法进行分析，包括本文实施例中描述的方法。关于糖基化分析的几种方法是本领域已知的并且在本发明的背景中有用。这些方法提供了关于与生产的肽附着的寡糖特性和组成的信息。与本发明结合用于碳水化合物分析的方法包括但不限于，凝集素层析；与脉冲电流检测组合的高效阴离子交换层析(HPAEC-PAD)，所述HPAEC使用高pH阴离子交换层析以基于电荷分离寡糖；NMR；质谱法；HPLC；多孔石墨化碳(GPC)层析。
用于释放寡糖的方法是已知的。这些方法包括1)酶促法，其通常使用肽-N-糖苷酶F/内切-α-半乳糖苷酶进行；2)β消除法，使用严苛的碱性环境以主要释放O联结构；和3)使用无水肼以释放N和O联寡糖的化学方法。用于分析的方法可以包括下述步骤：1.样品针对去离子水透析以去除所有缓冲盐，随后冻干。2.用无水肼释放完整的寡糖链。3.用无水甲醇HCl处理完整的寡糖链以释放作为O-甲基衍生物的个别单糖。4.任何伯氨基的N-乙酰化。5.衍生化以产生全-O-三甲基甲硅烷基甲基糖苷。6.在CP-SIL8柱上通过毛细管气-液层析(GLC)分离这些衍生物。7.与已知标准相比较，通过来自GLC和质谱法的保留时间鉴定个别糖苷衍生物。8.通过FID由内部标准(13-O-甲基-D-葡萄糖)定量个别衍生物。
中性和氨基糖的存在可以通过使用与脉冲电流检测组合的高效阴离子交换层析(HPAEC-PAD Carbohydrate System；Dionex Corp.)进行测定。例如，糖可以通过在20％(v/v)三氟乙酸中于100℃水解6小时得到释放。水解产物随后通过冻干或用Speed-Vac(SavantInstruments)进行干燥。随后将残渣溶解于1％乙酸钠三水合物溶液中，且在HPLC-AS6柱上进行分析(如由Anumula等人，1991，Anal.Biochem.，195：269-280描述的)。
可替代地，可以进行免疫印迹碳水化合物分析。在这个程序中，蛋白质结合的碳水化合物使用商业聚糖检测系统(Boehringer)进行检测，所述检测系统基于由Haselbeck等人(1993，GlycoconjugateJ.，7：63)描述的氧化免疫印迹程序。遵照由制造商推荐的染色规程，除了将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜而不是硝化纤维素膜，以及封闭缓冲液包含溶于具有0.9％氯化钠的10mM Tris缓冲液，pH 7.4的5％牛血清清蛋白。检测用与碱性磷酸盐缀合物连接的抗地高辛配基抗体(Boehringer)来进行，在Tris缓冲盐水中1：1000稀释，使用溶于100mM Tris缓冲液，pH 9.5的磷酸酶底物，氯化4-氮蓝四唑，0.03％(w/v)和5-溴-4-氯-3-吲哚基(indoyl)-磷酸盐0.03％(w/v)，所述Tris缓冲液包含100mM氯化钠和50mM氯化镁。包含碳水化合物的蛋白质条带通常在约10－15分钟时显现。
与蛋白质结合的碳水化合物也可以通过用肽N-糖苷酶F消化进行切割。根据这个程序，将残渣悬浮于包含0.18％SDS、18mMβ-巯基乙醇、90mM磷酸盐、3.6mM EDTA在pH 8.6下的14μL缓冲液中，且于100℃加热3分钟。冷却至室温后，将反应混合物分成大约相等的2份。未进一步处理的1份充当对照。将另一份调整至约1％NP-40去污剂，随后添加0.2单位肽N-糖苷酶F(Boehringer)。2份均于37℃加温2小时且随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
糖蛋白的聚糖作图变得日益被接受。本文描述的方法允许在碳水化合物的非还原端上的聚糖类型、唾液酸化的程度和分支数目方面快速表征寡糖。因此，在某些实施方案中，本发明提供了特征在于特定寡糖概况的CTLA4-Ig群体。寡糖概况分析一般通过寡糖的层析分离随后检测和相对定量来完成。层析概况分析的可替代方案是在线脱盐后通过ESI灌注直接分析寡糖。
通过PGC的寡糖概况分析可以用于表征来自CTLA4-Ig分子的N联寡糖。存在由CTLA4-Ig分子(SEQ ID NO：2)鉴定的31个结构种类的寡糖，包括包含O-乙酰化的唾液酸基团的结构种类。结构种类验证通过使用MS/MS和正离子模式MS来达到。结构种类的相对定量通过积分在206nm处的UV脉迹是可能的。来自个别N联位点的亚群概况的比较是已知的，从而揭示N联位点之间显著的群体差异。使用PGC的寡糖概况分析提供了关于更传统的概况分析法例如HPAEC方便的信息丰富的可替代方案。
包含SEQ ID NO：2的单体的CTLA4-Ig分子中的N联结构
在CTLA4-Ig多聚体或二聚体上每条链(即，每个单体)存在3个N联糖基化位点，其中单体具有来自SEQ ID NO：2的序列，例如(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、或(vi)SEQ ID NO：2的25－383)。糖基化中经由位点的变异通过从蛋白质的胰蛋白酶消化中分离包含N联聚糖的肽片段进行分析。蛋白质上的N联糖基化位点位于Asn102、Asn134和Asn233上，分别包含在胰蛋白酶片段5、7和14中。N联寡糖从分离的肽片段中的酶促释放，随后为释放的寡糖的PGC概况分析导致图13中所示的概况。由从Asn233(胰蛋白酶片段14，T14)中释放的聚糖的概况可见的，寡糖群体中富含脱唾液酸结构(不含唾液酸的结构)。来自附着在Asn102和Asn134(T5和T7)上的聚糖的寡糖概况包含大量唾液酸化的结构。
将由糖蛋白释放的分离的寡糖直接注射入多孔石墨化碳LC/UV/MS系统内。图14和15显示通过包含酸性和碱性添加剂的乙腈梯度产生的一般PGC概况的TIC和UV层析谱。在大多数情况下，来自单个层析峰的质谱包含关于单个寡糖的质量峰。30个寡糖结构种类由包含TFA的洗脱概况鉴定。只有16个寡糖结构种类由包含NH4OH的洗脱概况鉴定。在每个结构种类中，存在包含N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)代替N-乙酰神经氨酸(NANA)的置换以及不同程度的唾液酸乙酰化的变体结构。尽管由关于寡糖种类的离子计数比较只能获得定性信息，但显然4种结构域各自内的主要结构种类是P2100、P2111、P2122和P3133。这与得自在206nm处的UV脉迹的积分值一致。进一步的结构验证可以得自正离子质谱图。正离子模式电离促进寡糖的来源断裂，主要在糖苷键上。因为如通过负离子质谱测定的，存在寡糖的良好分离，所以来自正离子模式的断裂的谱模拟正离子MS/MS谱。结构域III(双唾液酸化的结构)包含显著量的O-乙酰化的结构P2122-Ac。正离子m/s数据支持结构上的唾液酸之一的O-乙酰化。唾液酸残基最常见的O-乙酰化位点在C-7和C-9位置处(Shi WX，Chammas R.，VarkiA.，J.Biol.Chem.271(1996)15130-15188)。在生理学胞外pH时，在C-7上的O-乙酰酯自发地移动至C-9。因此最可能的O-乙酰化位点是C-9。
N联寡糖含量的分析：分析技术可以包含通过柱层析切割和分离N联寡糖，所述柱层析在非限制性实施方案中使用Hypercarb柱。实施Hypercarb层析的聚糖被分离，且可以通过HPAEC-PAD进行分析，所述分析测定修饰特定糖蛋白的碳水化合物的类型。N联寡糖的分析型表征还可以通过液相层析/质谱法(LC/MS)来完成，使用多孔石墨化碳(PGC)。碳水化合物分析还可以包括胰蛋白酶、Asp-N、和胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶肽作图，以测定包含碳水化合物结构的肽。
N联寡糖结构可以使用一系列正交质谱法和HPAEC-PAD技术进行分析(参见实施例)。这些技术包括几种内肽酶切割随后为LC/MS/MS分析。关于具有来自SEQ ID NO：2的序列的CTLA4-Ig单体，使用LC/MS和LC/MS/MS电喷射离子化表征N联糖基化的3个主要位点，并且测定在每个N联位点上的主要结构。这些数据概括于图9中。在Asn102、Asn134和Asn233上存在关于N联寡糖的至少3个主要附着点。此外，发现Asn233包含约80％的时间发生的N联结构的群体，所述N联结构不包含唾液酸基团。
通过糖肽的LC/MS、寡糖的LC/MS和HPAEC-PAD测定的CTLA4-Ig的N联寡糖结构：N联碳水化合物与Asn-X-Ser/Thr的共有序列基序结合。这种序列在具有下述序列之一的CTLA4-Ig单体链上出现3次：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、和(vi)SEQ ID NO：2的25－383。共有序列基序在SEQ ID NO：2中下述残基上出现：Asn102Leu103Thr104；Asn134Gly135Thr136；和Asn233Ser234Thr235。基于共有序列，存在6个N联碳水化合物位点/二聚体分子，所述二聚体分子由下述单体序列中的任何一个或2个形成：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、和(vi)SEQ ID NO：2的25－383。
N联碳水化合物可以具有3个一般变种：高甘露糖、混合物(hybrid)和/或复合物。用于糖肽分析的LC/MS技术得到开发。单体(具有下述序列之一：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、和(vi)SEQ ID NO：2的25－383)的胰蛋白酶内切蛋白酶解切割导致包含N联糖基化的3种肽。所有3个N联位点都填充有碳水化合物结构。对应于SEQID NO：2的氨基酸65－109的胰蛋白酶片段T5包含在Asn102上的糖基化。对应于SEQ ID NO：2的氨基酸120－154的胰蛋白酶片段T7包含在Asn134上的糖基化。对应于SEQ ID NO：2的氨基酸229－237的胰蛋白酶片段T14包含在Asn233上的糖基化。
为了测定每个位点上的糖基化的具体类型，通过增加蛋白质消化和分离的等级随后收集T5、T7和T14肽从每个特定位点获得碳水化合物。目的胰蛋白酶肽峰用PNGase F进行处理且加工用于通过LC/MS在Hypercarb柱上分析。结果显示在每个位点上复合的双、三和四触角结构的异质群体。这些可以在图13中看出，其中层析使糖分成5种结构域：脱唾液酸、单唾液酸、双唾液酸、三唾液酸和四唾液酸结构(分别称为结构域I、II、III、IV和V)。关于Asn102(T5)碳水化合物的层析谱(图13小图A)举例说明在位点上的一系列单和双唾液酸结构。关于Asn134(T7)的层析谱(图13小图B)举例说明具有单唾液酸结构群体的2个主要双唾液酸结构。关于Asn233(T14)的层析谱(图13小图C)举例说明很少的唾液酸化。对于每个N联碳水化合物位点，显示了关于每个层析谱中的主峰的MS谱和相应结构(参见图13，小图E、F、H)。在图13，小图D中，CTLA4-Ig的总N联碳水化合物概况显示于层析谱中。所选峰的质量和结构列举于表1中。寡糖LC/MS数据得到肽图的深入分析的支持。Asn102(T5肽)具有从双触角，无唾液酸化的结构至四触角，四唾液酸化的结构的最大程度的碳水化合物异质性。Asn134(T7肽)主要包含双触角结构。这个位点包含比Asn102位点少得多的异质性。Asn233(T14肽)位点包含很少的唾液酸化。还应用第三种分析技术HPAEC-PAD以支持2个正交LC/MS发现。
表1：使用LC/MS法观察到的主要N联结构和所选的次要复合结构
*脱唾液酸种类检测为TFA加合物。
总N联碳水化合物的群体使用HPAEC-PAD进行分析。通过这种方法获得的数据列举于表2和3中。在表2中，列出了在每个位点(SEQ ID NO：2的Asn102、Asn134和Asn233)内的脱唾液酸至三唾液酸结构域的相对面积百分比。在表3中，寡糖结构域面积百分比作为整个寡糖群体的分数列出。
表2：通过HPAEC-PAD观察到的关于每种结构域的面积百分比
表3：表示为表2数据集的加权平均值的关于每种结构域的面积百分比。
假定完全糖基化。
通过糖肽的LC/MS、寡糖的LC/MS和HPAEC-PAD测定的CTLA4A29YL104E-Ig分子的N联寡糖结构：N联碳水化合物与Asn-X-Ser/Thr的共有序列基序结合。这种序列在具有下述序列之一的CTLA4A29YL104E-Ig单体链上出现3次：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382、和(vi)SEQ ID NO：4的25－383。共有序列基序在SEQ ID NO：4中下述残基上出现：Asn102Leu103Thr104；Asn134Gly135Thr136；和Asn233Ser234Thr235。基于共有序列，存在6个N联碳水化合物位点/二聚体分子，所述二聚体分子由下述单体序列中的任何一个或2个形成：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382、和(vi)SEQ ID NO：4的25－383。
N联碳水化合物可以具有3个一般变种：高甘露糖、混合物和/或复合物。用于糖肽分析的LC/MS技术得到开发。单体(具有下述序列之一：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ IDNO：4的25－382、和(vi)SEQ ID NO：4的25－383)的胰蛋白酶内切蛋白酶解切割导致包含N联糖基化的3种肽(参见实施例22中的表25)。所有3个N联位点都填充有碳水化合物结构。对应于SEQ ID NO：4的氨基酸65－109的胰蛋白酶片段T5包含在Asn102上的糖基化。对应于SEQID NO：4的氨基酸120－154的胰蛋白酶片段T7包含在Asn134上的糖基化。对应于SEQ ID NO：4的氨基酸229－237的胰蛋白酶片段T14包含在Asn233上的糖基化(参见实施例22中的表25)。
为了测定每个位点上的糖基化的具体类型，通过增加蛋白质消化和分离的等级随后收集T5、T7和T14肽从每个特定位点获得碳水化合物。目的胰蛋白酶肽峰用PNGase F进行处理且加工用于通过LC/MS在Hypercarb柱上分析。结果显示在每个位点上复合的双、三和四触角结构的异质群体。这些可以在图16中看出，其中层析使糖分成4种结构域：脱唾液酸、单唾液酸、双唾液酸和三唾液酸结构(分别称为结构域I、II、III和IV)。可以在糖基化分子、或包含糖基化分子的群体或组合物之间进行分析和比较的碳水化合物概况的特征包括峰面积百分比、结构域面积百分比、波谷间距离、或峰间距离。
CTLA4-Ig N联寡糖的LC/MS表征
LC/MS多孔石墨化碳(PGC)层析是用于给N联寡糖进行概况分析的方法，可以提供超过高pH阴离子交换层析(HPAEC)的几个优点。这些优点中的一些包括：由消化混合物直接概况分析，这使样品丧失和降解降到最低；直接MS界面提供了用于寡糖的快速表征和分析的方法；通过PGC层析增加的分辨率允许结构域间比较以及更精细的结构域内分析。
LC/MS PGC法允许就聚糖类型而言的寡糖的快速概况分析和表征，并且测定在碳水化合物的非还原端上的唾液酸化和分支的程度。随后负离子模式MS谱产生易于解释的数据，具有最低限度的寡糖断裂，而正模式电离允许结构种类验证。本文描述的方法可以应用于糖蛋白的完整消化混合物，以及先前分离的寡糖样品而无需衍生化。使用的层析流动相允许收集来自概况的峰和浓缩至干燥，无需进一步处理即可用于更详细的表征。在一个实施方案中，该方法用于表征CTLA4-Ig N联寡糖。使用LC/MS PGC法，31个不同种类的寡糖可以在CTLA4-Ig分子上鉴定，所述CTLA4-Ig分子包含具有来自SEQ ID NO：2的序列，例如SEQID NO：5、6、7、8、9或10的单体。
高pH阴离子交换层析(HPAEC)已广泛用于给从糖蛋白中释放的寡糖进行概况分析，而无需衍生化。HPAEC的高分辨率以及分离受存在的糖残基类型、键的类型和聚糖的大小影响的事实是该技术广泛使用的原因。分离中的主要因素是电荷，高度带电的寡糖比更少带电的聚糖更迟洗脱。层析概况通常分成由聚糖上的带电种类数目限定的结构域，所述带电种类一般是唾液酸残基(图17)。
为了获得关于未知寡糖结构更多的信息，可以收集HPAEC峰、脱盐且通过MS和/或NMR进行表征。寡糖分布的HPAEC-PAD概况分析的一种考虑因素是检测模式固有的变异性。电化学电池老化和电极表面结垢导致概况变异性。同样已报道当使用具有脉冲电流检测的HPAEC(HPAEC-PAD)时，寡糖结构和唾液酸化的程度可以引起检测细胞中的变异性。这种变异性可以影响用于评估过程改变的作用或测定批间一致性的定量和相对定量结果。因为其速度和特异性，质谱法(MS)作为用于评估糖蛋白的寡糖概况分析的技术已获得普及。尽管MS概况无法用于直接测定异头构型或分支模式，但MS数据可以用于鉴定结构种类且检测糖形分布中的定性变化。
用于酶促释放的N联寡糖的多孔石墨化碳(PGC)层析概况分析法使用紫外线(UV)和质谱(MS)检测，以对直接来自酶促消化混合物或来自分离的寡糖的N联寡糖进行概况分析和表征。这种方法可以用于对从CTLA4-Ig糖蛋白释放的寡糖进行概况分析和表征。LC/MSPGC法可以评估由生产过程引起的寡糖分布的一致性，以及由过程修饰引起的寡糖分布中的任何变化。在CTLA4-Ig分子的N联寡糖的层析微量分析中，酶促释放的N联寡糖可以通过PGC柱容易地分离，以渐增唾液酸化和渐增大小的顺序。存在的结构范围和每类结构的相对量通过MS和UV分析的组合进行测定(实施例3)。
为了使LC/MS PGC法最优化，质谱条件的最优化可以是有用的。最优化可以包括一组表面作图实验，以评估溶剂组成和MS电离参数对寡糖检测的作用。用于评估的溶剂组成参数包含百分比乙腈(体积)和洗脱液添加剂(三氟乙酸和氢氧化铵)。用于评估的评价的MS电离参数包括关于电喷射源的去溶剂化温度、毛细管电压和锥电压(cone voltage)设定。
电离参数可以在信号应答中起重要作用。由表面作图测定产生的模型用于设定层析测定过程中的电离参数。关于去溶剂化温度和锥电压的更高值导致更大的应答。毛细管电压最适值依赖于洗脱液添加剂、具有略微更高的最优化毛细管电压的包含TFA的溶剂系统而变。具有最大作用的因素是乙腈的体积百分比，更高的乙腈含量导致更高的应答。
多孔石墨化碳层析
多孔石墨化碳(PGC)已用于寡糖的固相萃取脱盐。PGC也已知为在酸性和碱性洗脱条件下用于寡糖分离的有效层析介质。关于从CTLA4-Ig分子中酶促释放的寡糖的酸性和碱性概况分析的层析条件得到开发，所述CTLA4-Ig分子具有来自SEQ ID NO：2的单体序列。每种条件与UV和MS检测相容。如在灌注实验中观察到的，酸性洗脱条件导致比碱性条件更高的MS灵敏度。关于在酸性条件下洗脱的作为TFA加合物检测的中性寡糖的MS应答，是在碱性条件下洗脱的相应峰强度的5－9倍。信号应答中的差异对于酸性寡糖较不显著，平均为关于单唾液酸化聚糖的信号应答的3倍和与双唾液酸化聚糖相等的信号应答。与NH4OH洗脱的层析谱(图15A－B)相比较，TFA洗脱的层析谱(图14A－B)中增加的峰数目是寡糖的异头形式分离的结果。从TFA梯度洗脱的个别峰的收集和浓缩导致单峰在再注射入后分成相同质量的2个峰。来自PGC柱的寡糖的碱性洗脱导致更简单的概况(图15A－B)。碱性洗脱条件不导致完全的异头分离，然而，观察到显著的峰加宽。峰分辨率可以通过增加柱温度得到增加，所述柱温度增加将加速异头形式的交换(Itoh S.等人，J.Chromatogr.A.2002968(1-2)，89-100)。然而，与酸性洗脱条件相比较，关于检测的寡糖的灵敏度(离子计数)仍是减少的。已报道盐例如乙酸铵的添加可以增加灵敏度。(Churms SC，J.Chromatogr.A.500(1990)555-583.)
乙酸铵、三氟乙酸铵或甲酸铵的添加导致增加的应答，但也导致不对称的峰加宽。所产生的峰加宽和添加的盐对UV检测的潜在干扰使得盐添加成为无吸引力的选择。消除异头分离的可替代地方法是使寡糖还原成相应的糖醇。
较高的灵敏度和层析分辨率使得酸性洗脱条件对于寡糖概况分析有用。特定的概况分析系统由通过2个双位置6孔阀与Hypercarb 5 μM柱(100x4.6mm)偶联的Luna C18柱组成。Hypercarb柱与UV检测器(Waters 2996 PDA)偶联，所述UV检测器与具有标准ESI探针的Q-ToF Micro(Micromass)串联。通过合适的开关控制，预纯化的CTLA4-Ig样品可以单独使用Hypercarb柱进行概况分析，或消化混合物可以通过将消化混合物直接注射入与Hypercarb柱串联的Luna C18内进行概况分析。一般地概况得自从10－20纳摩尔蛋白质中释放的N联寡糖。
在某些实施方案中，根据具有代表性峰的任何一个或多个层析谱，本发明提供了具有层析谱的CTLA4-Ig分子的群体。关于CTLA4-Ig分子的代表性寡糖概况层析谱显示于图13、图14A－B、图15A－B(PGC)、图17(HPAEC/PAD)和图18A－B中，所述CTLA4-Ig分子具有来自SEQ ID NO：2的序列的单体。这些层析谱都可以分解成包含寡糖结构的4个不同结构域，其中在稍后洗脱的结构域中唾液酸化的程度渐增。PGC层析系统允许与质量检测器的直接界面。即使对于以低百分比存在的寡糖，质量分辨和信噪比也是可接受的。与HPAEC相比较，个别寡糖结构的层析分辨率在PGC层析分离中看起来更大。
从HPAEC法中收集峰需要脱盐，并且使用的高pH引入剥离反应的可能性，所述剥离反应可能干扰峰的精确结构鉴定。因为与PGC层析一起使用的层析条件不含盐，所以洗脱的寡糖峰可以用最低限度的操作进行收集和浓缩。这允许洗脱的峰的收集和浓缩，随后将收集的寡糖注射入HPAEC系统上。将收集的寡糖再注射入HPAEC-PAD系统上允许存在于HPAEC概况中的一些峰的结构指定(图17)。由于在阴离子交换柱上不完全的峰分辨率，并非所有分离的峰都可以对HPAEC概况作图。
由消化混合物的直接注射产生的概况和关于来自相同蛋白质样品的分离的寡糖的那些并不相同。由直接注射产生的概况(图18A-B)具有不同的异头物比，从而暗示收集的寡糖的浓缩导致增加的异头化。更重要的是，由直接注射产生的概况包含峰，这对应于四唾液酸化的结构。这种结构在收集和分离的寡糖的概况中未得到鉴定。除缩短的测定时间外，通过避免收集和浓缩过程中的聚糖降解，直接来自消化混合物的概况分析可以导致更精确的寡糖分布表示。
相对定量
对灌注样品进行的表面作图指出乙腈的体积百分比对洗脱寡糖的电离效率具有显著作用。信号强度对流动相中的乙腈含量的依赖使得通过MS依赖于洗脱峰的保留时间相对定量寡糖。柱条件中的变异可以影响在PGC柱上的洗脱时间。为此，将难以获得来自离子层析谱洗脱概况的一致相对定量。在206nm处的UV脉迹应不受溶剂组成的影响至与离子脉迹相同的程度。相对定量使用UV脉迹来进行，离子脉迹仅用于表征和定性比较。对于定量的4种寡糖结构域中的每一种，从单个糖蛋白批中分离的寡糖的重复注射导致小于4％的百分比相对标准差(％RSD)。
包含SEQ ID NO：2的单体的CTLA4-Ig分子中的O联结构
除N联碳水化合物外，CTLA4-Ig分子可以包含O联碳水化合物。O联寡糖结构可以使用一系列正交质谱法技术进行分析。这些技术包括几种内肽酶切割随后为LC/MS/MS分析。
关于由具有来自SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10的序列的单体形成的CTLA4-Ig分子，使用准确质量电喷射离子化表征O联糖基化的2个主要位点，并且测定在每个O联位点上的主要结构。这些数据概括于图9中。数据与存在3种主要O联结构一致：(GalNAc)1(Gal) 1(NeuAc)1；(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2；(GalNAc)1(GlcNac) 1(Gal)2(NeuAc)2。每种结构在每个位点上以不同量观察到。这些量是相对定量的且表示得自多次分析的数据。O联寡糖为CTLA4-Ig贡献出相当大量唾液酸。存在2个主要O联寡糖附着点/链。关于O联寡糖发生的主要位点是Ser165，这占据约95％的时间。关于O联寡糖发生的次要位点是Ser155/156，这占据25％的时间。本文呈现的正交数据提供了存在于此种CTLA4-Ig分子上的占优势的碳水化合物结构的概述，且概括于图9中。
一般而言，O联碳水化合物具有远远大于N联碳水化合物中存在的结构异质性。此外，关于O联附着不存在共有序列。因此，开发了一系列正交技术用于O联寡糖的结构表征：LC/MS完整分析和LC/MS糖肽分析。
基于Edman降解和MALDI，O联位点报道是Ser165(就SEQ ID NO：2而言)。为了获得关于Ser165糖基化存在的直接数据，MS/MS测序使用T9肽上的b'和y"离子系列(参见表4和表5)来进行。表4列出了关于在4种不同状态的糖基化中的T9肽的离子系列。在所有4种状态中，b'离子系列，b1...b6离子一致。然而，b'离子系列，b7...bmax通过在b7(Ser165)上的不同糖基化状态改变。作为证实，报道了相应的y"离子系列。在所有4种y"离子系列中，y1….y19离子完全一致。然而，y"离子系列，y20...ymax通过在y20(Ser139)上的不同糖基化状态改变。b'和y"离子系列一起支持下述Edman测序暗示：Ser139是T9肽上的O联糖基化的主要位点。T9是包含几个丝氨酸和苏氨酸残基的肽。
表4呈现关于含或不含(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1的O联梯的T9肽的LC/MS/MS b’和y”离子。b'离子系列对于所有谱是相同的，直至b7，其中谱随后通过上文每个系列列出的O联碳水化合物结构而不同。y'离子系列对于所有谱是相同的，直至y19，其中谱随后通过上文每个系列列出的O联碳水化合物结构而不同。
表4：关于T9肽的LC/MS/MSb’和y”离子。
表5：具有相应的序列号、氨基酸序列和理论质量的O联糖肽片段
在Ser165上的O联碳水化合物结构表示3个主要种类的异质群体。在图19中，T9糖肽在去褶合谱中观察到。存在在2689.2amu处的基峰，这与这种肽2689.11amu的理论质量一致。该谱举例说明了3种主要O联结构。该谱举例说明了具有与O联结构(GalNAc)1(Gal) 1(NeuAc)1一致的糖梯的基本肽。该谱放大的粗体部分已增强10倍，且鉴定与(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2和(GalNAc)1(GlcNAc) 1(Gal)2(NeuAc)2一致的2种另外的O联结构。
质谱法用于评估每个O联种类的相对丰度。在图19中，(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1聚糖与(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc) 2聚糖以10：1比率，和与(GalNAc)1(GlcNAc)1(Gal)2(NeuAc)2聚糖以30：1比率观察到。因此在一个实施方案中，本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的群体，所述CTLA4-Ig分子具有(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1聚糖与(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2聚糖的10：1比率。在另一个实施方案中，本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的群体，所述CTLA4-Ig分子具有(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc) 1聚糖与(GalNAc)1(GlcNAc)1(Gal)2(NeuAc)2聚糖的30：1比率。(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2聚糖与(HexNAc)2(Gal) 2(NeuAc)2聚糖以20：1的比率观察到。在另一个实施方案中，本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的群体，所述CTLA4-Ig分子具有(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2聚糖与(HexNAc)2(Gal)2(NeuAc) 2聚糖的20：1比率。在另一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，所述CTLA4-Ig分子包含在这个段落中的所有所述比率。此外，负离子电喷射谱证实这3种占优势的结构；各自的相对丰度显示于图9中。
关于包含SEQ ID NO：2的单体的CTLA4-Ig分子，除Ser165位点外，在Ser155或Ser156上观察到第二个O联位点。这个位点称为Ser155/156。包含Ser155/156的D8肽由AspN消化产生，并且对应于SEQ ID NO：2的氨基酸150－156。该肽通过LC/MS进行分离和检测。关于D8O联糖肽的谱(本文未显示)显示790.2amu的基峰，这与790.8amu的理论质量一致。该谱举例说明了与结构(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1一致的肽离子和一系列离子。该肽占优势地是未糖基化的；糖基化于的(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1种类构成约22％的峰面积。
CTLA4-Ig单链的O联寡糖结构使用一系列正交质谱法技术进行表征。这些技术包括O联糖基化的2个占优势的位点的内肽酶切割与LC/MS分析，且利用电喷射离子化以测定每个O联位点上占优势的结构。这些数据概括于图20中。可以存在4种占优势的O联结构：(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1；(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2；(HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)2；(HexNAc)2(Gal)2(NeuAc) 3。这些结构在每个位点上以不同量检测到。超过95％的CTLA4-Ig单链具有至少(HexNAc)2(Gal)2(NeuAc)2。
开发了另一种测定以证实O联碳水化合物且寻找较不普遍的结构。这种技术利用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶共消化，以产生由MS/MS证实为THTSPPSPAPELL(SEQ ID NO：2的氨基酸159－171)的肽。这种肽允许鉴定1个单唾液酸化、2个双唾液酸化和1个三唾液酸化的O联种类。关于三唾液酸化种类的确定结构仍未阐明，然而，提出了2种可能性：包含具有3个唾液酸的核心2结构或存在于2个不同的氨基酸残基上的2个核心1结构的肽。
互补技术，通过MS的完整分析，用于证实CTLA4-Ig分子的异质O联糖基化的存在。CTLA4-Ig二聚体和CTLA4-Ig单链用PNGase F进行处理，以去除N联寡糖。分子随后通过质谱仪进行检测并且相应的离子去褶合成谱。在单链材料中，占优势的聚糖组合物是(HexNAc)2(Hex)2(NeuAc)2，而参考占优势地是(HexNAc)1(Hex)1(NeuAc)1。糖基化组合物与在LC/MS肽分析期间观察到的那些一致。除O联糖基化模式中的改变外，观察到第二种主要修饰。在单链非还原种类和还原CTLA4Ig标准之间观察到113±4u的质量移动。113±4u的质量移动在用DTT还原后消失。在二聚体材料中，所产生的离子包封去褶合成具有在79944amu处的主要峰的谱(本文未显示)，所述主要峰对应于2种(GalNAc)1(Gal)1(NeuAc) 1结构的存在。在80600amu处的下一个最大峰对应于3种O联结构或最多1种分支O联结构的组合。第三个最大峰对应于4种O联结构或包含最多2种分支O联结构的组合。
唾液酸含量的测定
糖蛋白表征的另一个方面是唾液酸的测定。唾液酸含量可以是糖蛋白的标记特性。本发明的糖蛋白的唾液酸含量可以通过常规方法进行评估。例如，唾液酸可以通过直接比色法(Yao等人，1989，Anal.Biochem.，179：332-335)分别地测定，使用至少一式三份的样品。唾液酸测定的另一种方法涉及硫代巴比妥酸(thiobarbaturic acid)(TBA)的使用，如由Warren等人，1959，J.Biol.Chem.，234：1971-1975描述的。另外一种方法涉及高效层析，例如由H.K.Ogawa等人，1993，J.Chromatography，612：145-149描述的。
在一个实施方案中，测定N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的量的方法是通过目的糖蛋白的酸水解处理(例如，参见实施例3)。在这种方法中，NANA和NGNA通过酸水解与蛋白质切割开。在一个实施方案中，糖蛋白基本上通过适合于其纯化的方法进行纯化。释放的NANA和NGNA通过HPLC在Rezex Monosaccharide RHM柱上分开，且通过UV吸光度(206nm)进行检测。NANA和NGNA基于同时运行的NANA和NGNA标准的响应因子进行定量。结果可以分别报道为NANA和NGNA与蛋白质的摩尔比(MR)。
测量唾液酸含量的酸水解法的目的是测量CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig样品中总唾液酸(NANA和NGNA)与蛋白质的量(摩尔比)。然而，重要的的是指出，这些唾液酸摩尔比包括结合的和游离的NANA和NGNA。摩尔比结果基于来自水解的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig样品的NANA和NGNA对非水解的NANA和NGNA标准的峰面积比较而获得。还可以使用NANA和NGNA的水解标准。
例如，对于具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CTLA4-Ig分子获得摩尔比。没有水解时，在NANA和NGNA标准的层析谱中的目的峰作为单峰出现。当NANA标准和CTLA4-Ig样品水解时，所产生的层析谱显示NANA为主要峰随后紧接着小肩峰(<10％的主要峰面积；称为“降解的NANA”)；有和没有水解的相同浓度的NANA标准导致非常接近的峰面积，包括降解物(degradant)。在降解的NGNA种类的层析谱中未明显地看出峰，尽管水解的NGNA标准中的NGNA峰的面积计数可见减少约8－9％。质谱法(MS)实验证实水解的NANA标准和水解的CTLA4-Ig样品中的“NGNA降解物”由来自NANA的18道尔顿(水)的损失产生。因此，该方法适当地包括在水解的CTLA4-Ig中NANA峰的整合中的小肩峰。通过MS实验也证实NGNA在水解后降解，其损失为18道尔顿。NGNA降解物在NANA和NANA降解物之间洗脱，从而使得UV未检测到它。在CTLA4-Ig材料中，NGNA含量为约5％的NANA含量，且因此NGNA降解物的共洗脱引起NANA峰面积小于0.5％的改变，这在NANA峰面积的变异性范围内。该方法无法包括在NGNA结果中降解的NGNA的面积；因此NGNA结果可以低<10％，同样在该方法的变异性内。
因为NGNA被认为比NANA更有免疫原性，所以对于包含低NGNA摩尔比的重组治疗剂存在临床优选。在本发明的一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的群体中的唾液酸优势是NANA而不是NGNA，其中这个群体中摩尔唾液酸/摩尔CTLA4-Ig分子或二聚体的摩尔比为约5－约18。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体中的唾液酸优势是NANA而不是NGNA，其中这个群体中摩尔唾液酸/摩尔CTLA4A29YL104E-Ig分子或二聚体的摩尔比为约5.5－约8.5。
CTLA4-Ig和CTLA4 A29YL104E -Ig表达盒
本发明提供了编码CTLA4-Ig分子的核酸，其在一个实施方案中是表达盒。本发明还提供了编码CTLA4A29YL104E-Ig分子的核酸。在一个实施方案中，编码CTLA4-Ig分子的核酸包含在表达盒内。在另一个实施方案中，编码CTLA4-Ig分子的核酸包含在衍生自具有SEQID NO：17的核苷酸序列的质粒的表达盒内。在进一步的实施方案中，编码CTLA4A29YL104E-Ig分子的核酸包含在表达盒内。在某些实施方案中，编码CTLA4A29YL104E-Ig分子的核酸包含在衍生自保藏为ATCC登记号PTA-2104的质粒的表达盒内。
本发明的核酸可以是可表达形式例如表达盒的目的cDNA、cDNA样、DNA或RNA核酸分子，其可以由天然启动子或其衍生物或完全异源的启动子进行表达。可替代地，目的核酸可以编码反义RNA。目的核酸可以编码蛋白质(例如，糖蛋白，例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白)，并且可以包括或不包括内含子。
在一个实施方案中，编码具有CTLA4活性的肽的核酸可以得自T细胞基因组DNA或存在于活化的T淋巴细胞中的mRNA。在另一个实施方案中，编码CTLA4A29YL104E-Ig的核酸也可以得自T细胞基因组DNA或存在于活化的T淋巴细胞中的mRNA。在本发明的另一个实施方案中，编码目的蛋白质，例如CTLA4或CTLA4A29YL104E-Ig的基因可以根据本领域技术人员实践的标准规程从基因组文库或cDNA中进行克隆。例如编码CTLA4或CTLA4A29YL104E-Ig的cDNA可以通过从合适的细胞系中分离总mRNA来获得。使用本领域已知的方法，双链cDNAs可以由总mRNA制备并且随后可以插入合适的噬菌体载体或质粒内。基因还可以使用本领域充分确立的PCR技术进行克隆。在一个实施方案中，编码CTLA4或CTLA4A29YL104E-Ig的基因可以经由PCR依照由本发明提供的核苷酸序列信息进行克隆。
在另一个实施方案中，包含CTLA4或CTLA4A29YL104E-Ig cDNA的DNA载体可以在PCR反应中充当模板，其中设计为扩增目的区域的寡核苷酸引物可以用于获得包含那个区域的分离的DNA片段。在本发明的具体实施方案中，CTLA4cDNA中靶向的目的区域可以是CTLA4的胞外结构域，包括人CTLA4的胞外结构域。在某些实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig cDNA中靶向的目的区域可以是在SEQ ID NO：2的氨基酸位置55和130上具有氨基酸变化的CTLA4的胞外结构域(例如，参见SEQ ID NO：18)，包括具有上文描述的氨基酸变化的人CTLA4的胞外结构域。
为了在本发明的背景中表达融合蛋白，在一个实施方案中，嵌合基因融合(例如编码CTLA4-免疫球蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白或CTLA4A29YL104E-Ig融合蛋白的基因)包括编码信号序列的核苷酸序列，由此在嵌合基因转录和翻译后指导新近合成的融合蛋白分泌。在一个实施方案中，可以使用天然的CTLA4信号序列(例如在Harper，K.，等人(1991，J.Immunol.147,1037-1044中描述的人CTLA4信号序列)。在本发明的可替代的实施方案中，可以使用异源信号序列以指导CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分泌(例如，制瘤素M信号序列(Malik N.等人，1989，Mol Cell Biol 9(7)，2847-2853)或免疫球蛋白信号序列)。本领域技术人员理解对应于信号序列的核苷酸序列可以通过标准重组DNA技术插入嵌合基因融合内，例如通过在编码CTLA4的核酸序列5'末端处进行信号序列的框内连接。
根据布达佩斯条约条款，编码对应于CTLA4-Ig融合蛋白的氨基酸序列的DNA(Escherichia coli MC1061/P3 with plasmid，CTLA4Ig)已于1991年5月31日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国马里兰州罗克维尔(Rockville，Md.20852USA)。它已指定ATCC登记号68629。此外，包含编码对应于CTLA4A29YL104E-Ig的氨基酸序列的核酸序列的表达质粒根据布达佩斯条约条款于2000年6月20日保藏于ATCC。保藏的质粒已指定ATCC登记号PTA-2104。保藏质粒也称为pD16 LEA29Y和pD16 L104EA29Y。CTLA4A29YL104E-Ig在美国专利号7,094,874以及共同未决的美国专利申请号09/579,927、60/287,576和60/214,065，以及国际专利公开号WO 01/923337 A2中得到进一步描述，所述所有专利文件整体引入本申请作为参考。
本发明的表达载体可以用于转染细胞，真核(例如，酵母、哺乳动物或昆虫细胞)或原核的，以产生由载体的核苷酸序列编码的蛋白质(例如，融合蛋白例如CTLA4-Ig、CTLA4A29YL104E-Ig分子等)。本领域技术人员理解所需蛋白质产物在原核生物中的表达最常在大肠杆菌中进行，其中使用包含组成型或诱导型启动子的载体。一些大肠杆菌表达载体(在本领域中也称为融合载体)被设计为添加许多氨基酸残基，通常是给表达的重组蛋白质的N末端。所述融合载体可以发挥3种功能：1)增加所需重组蛋白质的可溶性；2)增加目的重组蛋白质的表达；和3)通过充当亲和纯化中的配体帮助重组蛋白质纯化。融合表达载体的一些例子包括但不限于：a)使谷胱甘肽S转移酶与所需蛋白质融合的pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，澳大利亚)；b)使6x-His与目的重组蛋白质融合的pcDNATM3.1/V5-His A B&C(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)；和c)使麦芽糖E结合蛋白与靶重组蛋白质融合的pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)。
适合于根据本发明的过程和方法培养的细胞可以具有引入的表达载体(构建体)，例如质粒等。表达载体构建体可以经由转染、脂转染、转化、注射、电穿孔或感染等引入。表达载体可以包含编码用于在培养方法中表达和生产的蛋白质的编码序列或其部分。此种表达载体可以包括对于插入的编码序列转录和翻译所需的组分。包含编码生产的蛋白质和多肽的序列，以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体，可以使用本领域技术人员众所周知和实践的方法来产生。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内基因重组，其在J.Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.和F.M.Ausubel等人，1989，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York，N.Y中得到描述。
选择标记可以在重组表达载体(例如，质粒)中使用，其中载体稳定整合到细胞的基因组内，以对具有载体的细胞赋予抗性。这允许其在合适的选择性培养基中选择。可以使用许多选择系统，包括但不限于，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)、(Wigler等人，1977，Cell，11：223)、(Szybalska和Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：202)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)、(Lowy等人，1980，Cell，22：817)基因，这可以分别在hgprt-、tk-或aprt-细胞中使用。
可以包含在表达载体内的标记基因的下述非限制性例子也可以用作抗代谢物抗性选择的基础：gpt，其赋予针对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072)；dhfr，其赋予针对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：357；和O'Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527)；hygro，其赋予针对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，Gene，30：147)；和neo，其赋予针对氨基糖苷G418的抗性(Clinical Pharmacy，12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy，3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：573-596；Mulligan，1993，Science，260：926-932；Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.，62：191-21；May，1993，TIB Tech，11(5)：155-215)。本领域通常已知的重组DNA技术可以常规应用以选择所需重组细胞克隆。此种技术例如在Ausubel等人(编辑)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，1990，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；第12和13章中，Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，1981.J.Mol.Biol.，150：1中得到描述，所述参考文献整体引入本文作为参考。
表达的蛋白质分子的表达水平可以经由表达载体的扩增得到增加(关于综述，参见Bebbington和Hentschel，"The use of vectors based on gene amplification forthe expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning"，第3卷，Academic Press，New York，1987)。当表达目的蛋白质的表达载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞的培养基中存在的抑制剂水平中的增加将增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与蛋白质编码基因结合，所以蛋白质生产将伴随地增加(Crouse等人，1983，Mol.Cell.Biol.，3：257)。具有编码选择标记谷氨酰胺合酶(GS)或二氢叶酸还原酶(DHFR)的核酸序列的载体可以分别在药物甲硫氨酸磺酰亚胺(methionine sulphoximine)或氨甲蝶呤的存在下进行扩增。此种载体的优点是细胞系的可用性，例如鼠骨髓瘤细胞系NSO和中国仓鼠卵巢CHO细胞系DG44，其分别是谷氨酰胺合酶阴性和二氢叶酸还原酶阴性的。
在本发明的一个实施方案中，编码可溶性CTLA4或CTLA4A29YL104E-Ig融合蛋白分子的核酸序列可以插入设计用于在真核宿主中表达外来序列的表达载体内。载体的调节组分可以根据选择用于使用的真核宿主而变。用于在真核宿主细胞中表达可溶性CTLA4或CTLA4A29YL104E-Ig的载体可以包括用于最优化蛋白质表达的增强子序列。
哺乳动物细胞(例如BHK细胞、VERO细胞、CHO细胞等)经由将表达载体引入合适的宿主细胞内可以具有表达载体(例如，包含编码CTLA4-Ig融合蛋白或CTLA4A29YL104E-Ig融合蛋白的基因的表达载体)。因此，本发明包含含有编码CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig融合蛋白的核酸序列的表达载体，并且包含可以经由本领域已知的方法将此种表达载体引入其中的宿主细胞。如本文描述的，本发明的表达载体可以包括与至少一种调节序列连接的编码CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig融合蛋白的核苷酸序列，其方式允许核苷酸序列在宿主细胞中表达。对于本领域技术人员，调节序列是众所周知的，并且可以进行选择以指导目的蛋白质在合适的宿主细胞中表达，如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中描述的。调节序列可以包含下述：增强子、启动子、聚腺苷酸化信号、和其他表达控制元件。本领域从业者理解设计表达载体可以取决于下述因素，例如待转染的宿主细胞的选择和/或待表达的所需蛋白质的类型和/或量。
克隆和表达质粒(例如，pcSD和piLN)可以如实施例11中所述进行构建。在本发明的一个实施方案中，将来自质粒pSV2dhfr-的分离的DNA片段连接到pcDNA3载体主链内，从而产生表达载体pcSD。载体pcSD包含下述特征：巨细胞病毒(CMV)启动子随后为多克隆位点(MCS)；牛生长激素(BGH)聚多腺苷酸化信号和转录终止序列；小鼠dhfr cDNA序列用于选择和扩增；氨苄青霉素抗性基因；和pUC复制起点用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中选择和维持。构建包含编码氨基酸序列的部分的cDNAs的载体piLN，所述氨基酸序列对应于人CTLA4受体实施例11的胞外结构域的片段，其中编码第一种氨基酸序列的cDNA与编码第二种氨基酸序列的DNA连接，所述DNA对应于通过改变表达的CTLA4蛋白质(关于对应于CTLA4胞外部分和IgG1恒定区的残基参见图1和关于图1的简述)的可溶性允许CTLA4受体基因表达的IgC区。在一个实施方案中，制瘤素M信号肽序列可以与对应于CTLA4胞外结构域的氨基酸序列融合，其随后与对应于Ig结构域(例如，人IgCγ1结构域)的第二种氨基酸序列融合，如先前在图1中所述。制瘤素M信号序列允许产生可溶形式的CTLA4基因(例如，CTLA4-Ig)蛋白质产物。
为了构建包含编码CTLA4-免疫球蛋白融合蛋白的基因的pcSD表达载体，可以使用本领域已知的方法(例如，限制位点亚克隆)。对于本发明的一个实施方案，原材料可以是由实施例11中描述的克隆载体piLN消化和切割的DNA片段。在另一个实施方案中，由所述载体切割的DNA片段包含制瘤素M信号序列和CTLA4Ig融合蛋白的氨基酸序列，其中所述DNA片段与消化的pcSD载体连接。制瘤素M-CTLA4-Ig DNA片段可以插入CMV启动子与包含BGH聚腺苷酸化信号和转录终止序列的盒之间。这使CTLA4-Ig基因产物在命名为pcSDhuCTLA4-Ig的质粒中置于CMV启动子的控制下(图21；SEQ ID NO：17)。
此外，克隆和表达质粒(例如，pD16LEA29Y)可以衍生自Invitrogen质粒pcDNA3。载体pD16LEA29Y(图22)包含下述特征：来自pcDNA3的新霉素抗性基因用鼠二氢叶酸还原酶基因替换，在无增强子(enhancerless)(减弱的)SV40启动子控制下；编码CTLA4A29YL104E-Ig的基因由CMV启动子表达，和聚腺苷酸化信号来自牛生长激素基因；关于目的基因的表达盒侧面为转录终止序列，即在启动子的5'和在聚腺苷酸化位点的3'；该载体包含2种不同的限制位点多接头，1个在启动子的3'用于克隆目的基因，和1个在启动子的5'用于在转染前的载体线性化；该载体包含氨苄青霉素抗性基因和ColE1复制起点用于在大肠杆菌中的质粒增殖；CTLA4A29YL104E-Ig序列(SEQ ID NO：3)在制瘤素M信号肽之后且在称为载体pD16LEA29Y的表达载体中进行装配。
构建包含编码氨基酸序列的部分的cDNAs的载体，所述氨基酸序列对应于人CTLA4受体(SEQ ID NO：2)的胞外结构域的片段，其中第55位处的氨基酸Ala被氨基酸Tyr替换，且第130位处的氨基酸Leu被氨基酸Glu替换(图3)。这些氨基酸变化在具有SEQ ID NO：4的CTLA4A29YL104E-Ig氨基酸序列中得到描述。编码第一种氨基酸序列的cDNA(例如，编码CTLA4A29YL104E-Ig的序列)与编码第二种氨基酸序列的DNA连接，所述DNA对应于通过改变具有SEQ ID NO：3的表达的CTLA4A29YL104-Ig蛋白质(关于对应于经修饰的CTLA4胞外部分和IgG1恒定区的残基参见图3和关于图3的简述)的可溶性允许CTLA4A29YL104-Ig受体基因表达的IgC区。
在一个实施方案中，制瘤素M信号肽序列可以与对应于CTLA4胞外结构域的氨基酸序列融合，其随后与对应于Ig结构域(例如，人IgCγ1结构域)的第二种氨基酸序列融合，如先前在图3中所述。制瘤素M信号序列允许产生可溶形式的CTLA4基因(例如，CTLA4A29YL104E-Ig)蛋白质产物。
产生细胞系的稳定转染
包含编码目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等)的DNA的载体可以转化到合适的宿主细胞(例如，细菌细胞)内，以产生大量克隆的DNA。用于转化的细菌细胞的一些非限制性例子包括细菌细胞系大肠杆菌菌株DH5α或MC1061/p3(Invitrogen Corp.，San Diego，Calif.)，这可以使用本领域实践的标准程序进行转化，且菌落随后可以就合适的质粒表达进行筛选。
关于真核细胞例如哺乳动物细胞的表达载体可以包括与哺乳动物细胞相容的启动子和控制序列。在本发明的一个实施方案中，这些调节元件可以是例如在pcSD或pD16LEA29Y载体中发现的CMV启动子，或位于piLN载体中的禽肉瘤病毒(ASV)。其他常用的早期和晚期启动子包括但不限于，来自猿猴病毒40(SV 40)(Fiers等人，1973，Nature 273：113)的那些，或其他病毒启动子例如衍生自牛乳头瘤、多瘤和腺病毒2病毒的那些。除本领域已知的其他的外，也可以使用可调节的启动子hMTII(Karin等人，1982，Nature 299：797-802)。关于在培养的昆虫细胞(例如，SF 9细胞)中的重组蛋白质表达，可用的一些杆状病毒载体包括pVL系列(Lucklow，V.A.,和Summers，M.D.，1989，Virology 170：31-39)和pAc系列(Smith等人，1983，Mol.Cell Biol.3：2156-2165)。本领域技术人员还理解增强子区(在非编码DNA区中的启动子区上游或下游发现的那些序列)在最优化表达中也是重要的。必要时可以应用来自病毒来源的复制起点，例如如果使用原核宿主用于引入质粒DNA。然而，染色体整合是关于真核生物中的DNA复制的通常机制。
尽管在本发明的实施方案中，应用哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞)用于表达所需蛋白质(例如，融合蛋白、糖蛋白等)，但其他真核生物也可以用作宿主。可以使用芽殖酵母啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(也称为面包酵母或啤酒酵母)的实验室品系，以及其他酵母品系例如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。具有编码目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等，例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的DNA的酵母载体可以利用Broach，Meth.Enz.101：307(1983)的2μ复制起点，或与酵母相容的其他复制起点(例如，Stinchcomb等人，1979，Nature 282：39；Tschempe等人，1980，Gene 10：157；和Clarke等人，1983，Meth.Enz.101：300)。酵母载体内包含的调节元件可以是用于合成糖酵解酶的启动子(Hess等人，1968，J.Adv.Enzyme Reg.7：149；Holland等人，1978，Biochemistry 17：4900)。
本领域技术人员还可以利用其中生长条件可以调节所述可调节基因的转录的其他启动子，并且可以包括下述非限制性例子：异细胞色素C(isocytochrome C)、醇脱氢酶2、负责麦芽糖和半乳糖利用的酶、酸性磷酸酶、和与氮代谢相关的降解酶。与哺乳动物表达系统类似，酵母表达载体中的终止子序列在编码序列的3'末端上也是所需的，并且在酵母衍生的基因中的可读框后的3'非翻译区中发现。适合于酵母中(例如，在啤酒糖酵母中)的重组蛋白质表达的酵母载体的一些非限制性例子包括，pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987，Gene 54：113-123)、pYepSec1(Baldari等人，1987，Embo J.6：229-234)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)，以及属于酵母载体的pRS家族的那些。
如上所述获得的包含编码目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等)的DNA的克隆例如细菌克隆，随后可以转染到合适的宿主细胞例如哺乳动物细胞内，用于表达所需产物。转染技术使用本领域确立的适合于所述宿主细胞的标准技术来进行，其中转染技术依赖于使用的宿主细胞。例如，哺乳动物细胞转染可以使用脂转染、原生质体融合、DEAE-葡聚糖介导的转染、CaPO4共沉淀、电穿孔、直接显微注射、以及本领域已知的其他方法来完成，所述其他方法可以包括：刮擦、直接摄取、渗透压或蔗糖休克、溶菌酶融合或红细胞融合、间接显微注射例如经由红细胞介导的技术、和/或通过对宿主细胞实施电流。因为用于将遗传信息引入宿主细胞内的其他技术将得到开发，所以转染方法的上述列表并不视为无遗漏的。
在本发明的背景中特别利用编码目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等)的DNA在衍生自多细胞生物(例如，哺乳动物起源)的真核宿主细胞中的表达(Tissue Cultures，Academic Press，Cruz和Patterson，编辑(1973))。衍生自多细胞生物的宿主细胞具有剪接掉内含子的能力，且因此可以直接用于表达基因组DNA片段。如前文所述，有用的宿主细胞系包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)、BHK细胞、猴肾(COS)、VERO和HeLa细胞。在本发明中，使用稳定表达目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等)的细胞系。在一个实施方案中，哺乳动物细胞系(例如CHO细胞系)用包含编码目的糖蛋白的DNA序列的表达载体(例如pcSDhuCTLA4-Ig、pD16LEA29Y等)进行转染(例如通过电穿孔)。在一个实施方案中，目的糖蛋白可以是CTLA4-Ig蛋白质，包括具有SEQ ID NO：2中包含的氨基酸序列的一种或多种CTLA4-Ig蛋白质，由SEQ ID NO：1中的核苷酸序列的部分编码。在另一个实施方案中，目的糖蛋白可以是CTLA4A29YL104E-Ig，包括具有SEQ ID NO：4中包含的氨基酸序列的CTLA4A29YL104-Ig蛋白质，由SEQ ID NO：23中的核苷酸序列的部分编码。
重组蛋白质例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig，可以在真核宿主细胞例如哺乳动物细胞(例如CHO、BHK、VERO或NS0细胞)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒载体)、或酵母细胞中进行表达。本领域技术人员可以使用其他合适的宿主细胞，例如在本发明的背景中前文描述的那些。在一个实施方案中，应用重组融合蛋白(例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的真核而不是原核表达。真核重组蛋白质例如人CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig在真核细胞例如CHO细胞中的表达可以导致部分和/或完全糖基化，以及链内或链间二硫键的形成。对于所需蛋白质的瞬时扩增和表达，具有编码目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的DNA的载体通过本领域已知的转染方法递送到真核细胞内，但不整合到细胞的基因组内。转染的基因的表达可以在16－96小时内进行测量。哺乳动物细胞(例如COS细胞)可以与载体例如pCDM8结合用于瞬时表达所需蛋白质(Gluzman，Y.，1981，Cell 23：175-182；Seed，B.，1987，Nature 329：840)。
本领域理解对于哺乳动物细胞的稳定转染，小部分的细胞可以将DNA整合到其基因组内，并且成功的整合可以依赖于利用的表达载体和转染方法。对于所需蛋白质的稳定扩增和表达，具有编码目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的DNA的载体稳定整合到真核细胞(例如哺乳动物细胞)的基因组内，从而导致转染的基因的稳定表达。为了鉴定和选择稳定表达编码目的蛋白质的基因的克隆，编码选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因可以连同目的基因一起引入宿主细胞内。由本领域技术人员使用的选择标记可以是赋予针对药物例如G418和潮霉素的抗性的那些。编码选择标记的基因可以在分开的质粒上引入宿主细胞内，或可以在与目的基因相同的质粒上引入。包含目的基因的细胞可以通过药物选择进行鉴定，其中已掺入选择标记基因的细胞将在所述药物的存在下存活，而未掺入选择标记基因的细胞死亡。存活细胞随后可以就所需蛋白质(例如，CTLA4-Ig蛋白质或CTLA4A29YL104E-Ig)的生产进行筛选。
如前文所述，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因表达缺陷的CHO细胞仅可以通过添加核苷而存活。当所述细胞用具有dhfr基因的DNA载体稳定转染时，细胞随后能够生产必需核苷。通过使用dhfr作为选择标记，本领域技术人员理解在抗代谢物氨甲蝶呤的存在下，dhfr以及转染的目的基因(例如，CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的基因扩增容易地发生。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物细胞例如CHO dhfr-细胞用表达载体例如pcSDhuCTLA4-Ig(实施例11－13)或pD16LEA29Y进行转染，以产生可以稳定扩增和可以稳定表达所需蛋白质产物(例如，分别地，CTLA4-Ig或βpCTLA4A29YL104E-Ig多肽)的细胞群体。在另一个实施方案中，dhfr-阴性细胞系DG44(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA)可以应用于稳定转染。在本发明的另一个实施方案中，转染可以经由电穿孔而发生。
如本领域容易地实践的，转染后1－2天将转染的哺乳动物细胞(例如dhfr阴性CHO细胞)维持在包含血清的非选择性培养基中。细胞随后用胰蛋白酶进行处理，并且在包含血清的培养基中，在选择压力(例如，药物如氨甲蝶呤)的存在下进行重新铺平板。细胞在包含血清的选择性培养基中培养2－3周，频繁更换选择性培养基以消除碎片和死细胞，直至可见清楚的菌落。个别菌落随后可以进行胰蛋白酶消化，且置于多孔板内用于在选择性培养基的存在下进一步增殖和扩增，以经由本领域确立的方法例如ELISAs或免疫沉淀鉴定表达高水平的所需蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等)的生产者。在本发明的一个实施方案中，可以进行上述方法用于转染dhfr-阴性CHO细胞(例如DG44细胞)，以确立表达目的重组蛋白质(例如，CTLA4-Ig蛋白质)的稳定细胞系(参见例如，实施例12－13)。在另一个实施方案中，确立表达CTLA4A29YL104E-Ig的稳定细胞系(参见实施例23)。
本发明的稳定CHO系稳定表达CTLA4-Ig蛋白质分子，作为具有下述序列的CTLA4-Ig单体：(i)SEQ ID NO：2的26－383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、和(vi)SEQ ID NO：2的25－383。这种细胞系可以分泌可以作为多聚体形式(例如二聚体、四聚体等)存在的CTLA4-Ig分子的群体，其中多聚体形式可以具有SEQ ID NO：2的不同单体序列。整合到这种细胞系内的表达盒包含SEQ ID NO：1，并且包含在pcSDhuCTLA4-Ig内。
本发明还提供了稳定表达CTLA4A29YL104E-Ig的稳定CHO系。在一个实施方案中，细胞系表达具有下述序列的CTLA4A29YL104-Ig单体：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382、和(vi)SEQ ID NO：4的25－383。在另一个实施方案中，细胞系可以分泌可以作为多聚体形式(例如二聚体、四聚体等)存在的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体，其中多聚体形式可以具有SEQ ID NO：4的不同单体序列。整合到这种细胞系内的表达盒包含SEQ ID NO：3，并且包含在pD16LEA29Y内。
产生细胞的克隆群体的亚克隆
鉴定为所需蛋白质(例如融合构建体、糖蛋白等)的生产者的细胞从细胞培养中进行分离，且随后在其中培养基可以包含血清的生产等价条件下进行扩增。可以应用本领域已知的亚克隆方法例如但不限于，软琼脂克隆。获得的稳定的重组细胞克隆随后可以在无血清和动物产品的条件下进行进一步增殖。根据本发明，表达所需蛋白质产物(例如，CTLA4-Ig、CTLA4A29YL104E-Ig等)的稳定细胞克隆经由从细胞培养物中获得重组细胞克隆来达到，所述细胞培养物在包含血清的培养基中培养重组最初细胞克隆且使细胞重新适应无血清和动物产品的培养基后获得。在一个实施方案中，表达CTLA4-Ig的细胞克隆可以在无血清和动物产品的培养基中继续培养经过至少50代。在本发明的另一个实施方案中，细胞克隆可以如上所述继续培养经过至少75代。根据本发明，细胞克隆还可以在无血清和动物产品的培养基中继续培养经过至少100代。
在进一步的实施方案中，表达CTLA4A29YL104E-Ig的细胞克隆可以在无血清和动物产品的培养基中继续培养经过至少27代。在另一个实施方案中，细胞克隆可以如上所述继续培养经过至少75代。另外，细胞克隆还可以在无血清和动物产品的培养基中继续培养经过至少100代。
在一个实施方案中，本发明提供了产生包含SEQ ID NO：2单体的CTLA4-Ig分子的细胞系，其中细胞系在超过100代中是稳定的，且其中细胞系稳定性包含：(1)在第100代时的倍增时间小于约24.5±2.6小时；(2)在第100代时的细胞生存力超过95％，(3)在第100代时在5-L生物反应器中关于CTLA4-Ig的生产滴度超过1.69mg/mL；(4)在第105代时唾液酸与蛋白质的摩尔比为约9.3－约11.0。
本发明的稳定的重组细胞克隆以分离形式存在，其中分离可以根据本领域实践的方法(例如，软琼脂克隆或有限稀释克隆等)来发生。在本发明中，稳定的重组细胞克隆衍生自可以悬浮或贴壁生长的重组哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)，其包含编码目的重组蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等，例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的DNA序列。由本发明的细胞系表达的重组蛋白质可以是治疗糖蛋白，例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig。根据本发明，衍生自真核细胞(例如哺乳动物CHO细胞、DG44细胞、或dhfr-阴性CHO细胞)的稳定的重组细胞克隆是有用的，所述重组细胞克隆包含编码重组糖蛋白例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig的DNA序列，并且在几代中能够稳定表达重组糖蛋白。
在本发明的一个实施方案中，稳定表达目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等，例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的哺乳动物宿主细胞的群体在无血清和动物产品的条件下经由扩增稳定转染的细胞来获得。根据本发明，重组细胞克隆随后可以进行表征，其中例如它在无血清和无动物产品的培养基中经过至少105代是稳定的。
在本发明的一个实施方案中，细胞的克隆群体产生CTLA4-Ig分子。CTLA4-Ig分子的这种群体的一些特定特征在下表6中列出。CTLA4-Ig分子的群体可以至少包括CTLA4-Ig二聚体分子，其包含各自可以具有下述序列之一的2个单体分子：(i)SEQ ID NO：2的26 －383、(ii)SEQ ID NO：2的26－382、(iii)SEQ ID NO：2的27－383、(iv)SEQ ID NO：2的27－382、(v)SEQ ID NO：2的25－382、和(vi)SEQ ID NO：2的25－383。因此，CTLA4-Ig分子的群体可以包括占优势地同二聚体或异二聚体。群体可以包括同二聚体和异二聚体。在一个实施方案中，本发明提供了具有表6中所示的特征的CTLA4-Ig分子的群体或其药学等价物。如本文所使用的，药学等价物是其中分子群体具有与用于治疗患者的原始群体(标准群体)等价的安全性和功效概况，如政府机构例如FDA将理解的。例如，本发明的CTLA4-Ig群体可以具有表6中所示的特征。在另一个实施方案中，本发明的CTLA4-Ig分子群体可以单独地或以其任何组合和排列具有表6中所示的特征或其等价物。
在另一个实施方案中，目的克隆还可以根据表达的重组产物及其生物化学特征(例如，具有特定消光系数值的CTLA4-Ig)进行表征。消光系数值(也称为吸收系数值(as))可以理论上或实验上衍生。在280nm处，CTLA4-Ig的吸收系数值(as)使用如下详述的Mach等人(Analytical Biochemistry，第200卷，第74-80页，1992)的方法测定为1.01mL mg-1 cm-1。
等式1用于测定摩尔吸收系数(ε)。
等式1：ε＝[(二硫键数目x134)+(色氨酸残基数目x5,540)+(酪氨酸残基数目x1,480)]
CTLA4-Ig具有9个二硫键，8个色氨酸残基和32个酪氨酸残基，以给出如等式2中所示的92,886M-1cm-1的摩尔吸收系数(ε)。
等式2：ε＝(9x134)+(8x5,540)+(32x1,480)]＝92,886M-1cm-1
吸收系数常数(as)通过将摩尔吸收系数(ε)除以分子量进行计算，其中分子量如等式3中所示通过MALDI-TOF进行测定：
等式3：as＝ε/分子量＝92,886M-1cm-1/92,278Da＝1.01mL mg-1cm-1
使用氨基酸分析对2批CTLA4-Ig(包含SEQ ID NO：2)材料进行理论上衍生的吸收系数值与实验上测定的吸收系数值的比较。实验上测定的平均吸收系数常数为1.00±0.05mL mg-1cm-1。实验值证实在实验测定误差内1.01mL mg-1 cm-1的理论值。因此，在一个实施方案中，本发明提供了产生CTLA4-Ig分子的细胞系，所述CTLA4-Ig分子具有约1.00±0.05mL mg-1 cm-1的吸收系数值或消光系数。
根据本发明，目的重组克隆也可以根据整合到宿主细胞基因组内的DNA序列的位点数目进行表征，所述DNA序列编码目的蛋白质(例如，融合构建体、糖蛋白等例如CTLA4-Ig)。本领域技术人员理解标准DNA杂交技术将允许此种分析。在本发明的一个实施方案中，约1.2kb的单个杂交片段在由本发明的重组细胞克隆制备的基因组DNA的EcoRI和XbaI限制消化中各自检测到，与CTLA4-Ig基因的预期大小一致(DNA杂交物；图23)。该图描述与质粒的单个整合位点一致，以及在CTLA4-Ig基因中无通过DNA杂交分析可检测的插入或缺失。
在一个实施方案中，本发明提供了能够生产CTLA4-Ig分子的CHO细胞群体，其中群体的每个细胞包含编码CTLA4-Ig蛋白质的核酸的至少30个拷贝，其中30个或更多拷贝串联整合在细胞的基因组中的单个位点上，且其中细胞群体是克隆的。在其他实施方案中，能够生产CTLA4-Ig分子的CHO细胞群体包含其中群体中至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的细胞包含编码CTLA4-Ig蛋白质的核酸的至少30个拷贝的群体。
在另一个实施方案中，本发明提供了当在根据图10或实施例14的条件中进行培养时，产生包含SEQ ID NO：2的CTLA4-Ig分子的细胞系，在生产阶段时所述CTLA4-Ig分子的量为至少1.0、1.3、1.6、1.8、2.0或2.5克CTLA4-Ig分子/L细胞培养物。
根据本发明，产生了表达所需蛋白质(例如CTLA4-Ig蛋白质)的哺乳动物细胞系(例如dhfr阴性CHO细胞系)，当在悬浮培养中生长时，所述哺乳动物细胞系可以产生分泌到培养物上清液内的分子群体。这种分子群体可以具有例如表6中列出的下述特征中的一种或多种或全部。
表6.举例说明性的CTLA4-Ig特征
根据表6，CTLA4-Ig二聚体的百分比、HMW种类(例如，CTLA4-Ig多聚体例如四聚体)的百分比、和LMW种类(例如，CTLA4-Ig单体)的百分比是就CTLA4-Ig分子的群体而言的。表6中描述的糖摩尔和唾液酸摩尔是就CTLA4-Ig分子或二聚体摩尔而言的。表6中发现的B7结合的百分比是关于通过前文期描述的表面等离子体共振(SPR)在BIAcore仪器上进行的CTLA4-Ig结合实验的，其中百分比是与CTLA4-Ig对照结合的B7的比较。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞系(例如dhfr阴性CHO细胞系)产生显示来自表6的编号1－5的特征属性的CTLA4-Ig分子群体。在本发明的另一个实施方案中，哺乳动物细胞系产生具有来自表6的编号1－10的特征属性的CTLA4-Ig分子群体。在其他实施方案中，哺乳动物细胞系产生具有来自表6的编号1－15的特征属性的CTLA4-Ig分子群体。在进一步的实施方案中，在CTLA4-Ig上的游离巯基的量为约≤0.20游离硫醇/分子。
在包含通过转染的哺乳动物细胞(例如dhfr阴性CHO细胞)群体分泌的所需蛋白质(例如CTLA4-Ig蛋白质)的细胞培养物上清液纯化后，分子群体可以具有进一步的特征。除表6中列出的那些特征外，这种分子群体可以具有例如下述特征中的一种或多种或全部：约7.0－8.0的pH范围；使人细胞IL-2活性抑制50－150％的能力；在≤5ng/mg CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子的存在于最终纯化产物中的单核细胞趋化蛋白(MCP-1)；在≤2.5pg/mgCTLA4-Ig二聚体的存在于最终纯化产物中的DNA浓度；在≤50ng/mg CTLA4-Ig二聚体的存在于最终纯化产物中的CHO宿主细胞蛋白质；在≤1.0ppm的在最终纯化产物中的Triton X-100浓度；在≤5ng/mg CTLA4-Ig二聚体的A蛋白的量；在≤0.3EU/mg CTLA4-Ig二聚体时在最终纯化产物中的细菌内毒素的量；在≤3.0CFU/10ml的在最终纯化产物中的生物负荷的量。
在一个实施方案中，单核细胞趋化蛋白(MCP-1)在≤3ng/mg CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子存在于最终纯化产物中；在≤1.0pg/mg CTLA4-Ig二聚体存在于最终纯化产物中的DNA浓度；在≤10ng/mg CTLA4-Ig二聚体存在于最终纯化产物中的CHO宿主细胞蛋白质；在≤1ng/mg CTLA4-Ig二聚体A蛋白的量；在≤0.15EU/mg CTLA4-Ig二聚体在最终纯化产物中的细菌内毒素的量；在≤1.0CFU/10ml在最终纯化产物中的生物负荷的量；约7.2－7.8的pH范围。在具体实施方案中，单核细胞趋化蛋白(MCP-1)在≤1ng/mg CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子存在于最终纯化产物中。在进一步的实施方案中，CTLA4-Ig分子使人细胞IL-2活性抑制60－140％。
在本发明的另一个实施方案中，细胞的克隆群体产生CTLA4A29YL104E-Ig分子。CTLA4A29YL104E-Ig分子的这种群体的一些特定特征在表7中列出。CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体可以至少包括CTLA4A29YL104E-Ig二聚体分子，其包含各自可以具有下述序列之一的2个单体分子：(i)SEQ ID NO：4的26－383、(ii)SEQ ID NO：4的26－382、(iii)SEQ ID NO：4的27－383、(iv)SEQ ID NO：4的27－382、(v)SEQ ID NO：4的25－382、和(vi)SEQ ID NO：4的25－383。因此，CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体可以包括占优势地同二聚体或异二聚体，或其任何混合物。在一个实施方案中，本发明提供了具有表7中所示的特征的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体或其药学等价物。如本文所使用的，药学等价物是其中分子群体具有与用于治疗患者的原始群体(标准群体)等价的安全性和功效概况，如政府机构例如FDA将理解的。例如，本发明的CTLA4A29YL104E-Ig群体可以具有表7中所示的特征。在另一个实施方案中，本发明的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体可以单独地或以其任何组合和排列具有表7中所示的特征或其等价物。
在一个实施方案中，本发明提供了能够生产CTLA4A29YL104E-Ig分子的CHO细胞群体，其中群体的每个细胞包含编码CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质的核酸的至少30个拷贝，其中30个或更多拷贝串联整合在细胞的基因组中的单个位点上，且其中细胞群体是克隆的。在其他实施方案中，能够生产CTLA4A29YL104E-Ig分子的CHO细胞群体包含其中群体中至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的细胞包含编码CTLA4A29YL104E-Ig的核酸的至少30个拷贝的群体。
在另一个实施方案中，本发明提供了当在根据图24或实施例19－20的条件中进行培养时，产生包含SEQ ID NO：4的CTLA4A29YL104E-Ig分子的细胞系，在生产阶段时所述CTLA4A29YL104E-Ig分子的量为至少22、22.5、23、27.5或28克CTLA4A29YL104E-Ig分子/L细胞培养物。
根据本发明，产生了表达所需蛋白质(例如CTLA4A29YL104E-Ig)的哺乳动物细胞系(例如dhfr阴性CHO细胞系)，当在悬浮培养中生长时，所述哺乳动物细胞系可以产生分泌到培养物上清液内的分子群体。这种分子群体可以具有例如表7中列出的下述特征中的一种或多种或全部。
表7.举例说明性的CTLA4A29YL104E-Ig特征
根据表7，CTLA4A29YL104E-Ig二聚体的百分比、HMW种类(例如，CTLA4A29YL104E-Ig多聚体例如四聚体)的百分比、和LMW种类(例如，CTLA4A29YL104E-Ig单体)的百分比是就CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体而言的。表7中描述的糖摩尔和唾液酸摩尔是就CTLA4A29YL104E-Ig分子或二聚体摩尔而言的。表7中发现的B7结合的百分比是关于通过前文描述的表面等离子体共振(SPR)在BIAcore仪器上进行的CTLA4A29YL104E-Ig结合实验，其中百分比是与CTLA4A29YL104E-Ig对照结合的B7的比较。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞系(例如dhfr阴性CHO细胞系)产生显示来自表7的编号1－5的特征属性的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在本发明的另一个实施方案中，哺乳动物细胞系产生具有来自表7的编号1－10的特征属性的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。在其他实施方案中，哺乳动物细胞系产生具有来自表7的编号1－13的特征属性的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体。
在包含通过转染的哺乳动物细胞(例如dhfr阴性CHO细胞)群体分泌的所需蛋白质(例如CTLA4A29YL104E-Ig)的细胞培养物上清液纯化后，分子群体可以具有进一步的特征。除表7中列出的那些特征外，这种分子群体可以具有例如下述特征中的一种或多种或全部：在≤5ng/mg CTLA4A29YL104E-Ig二聚体存在于最终纯化产物中的单核细胞趋化蛋白(MCP-1)；在≤2.5pg/mg CTLA4A29YL104E-Ig二聚体存在于最终纯化产物中的DNA浓度；和在≤50ng/mgCTLA4A29YL104E-Ig二聚体存在于最终纯化产物中的CHO宿主细胞蛋白质。
细胞系的一般培养
根据本发明，如本领域技术人员常规已知的培养哺乳动物细胞以产生所需蛋白质，包括糖蛋白。表达目的糖蛋白的哺乳动物细胞应表达或进行处理以表达合适的酶，从而使得在满意的条件下，对糖基化最相关的翻译后修饰在体内发生。酶包括N和O联碳水化合物的添加和完成所需的那些，例如关于N联寡糖在Hubbard和Ivatt，Ann.Rev.Biochem.，50：555-583(1981)中描述的那些。酶任选包括寡糖基转移酶、α-葡糖苷酶I、α-葡糖苷酶II、ERα(1,2)甘露糖苷酶、高尔基体α-甘露糖酶(mannodase)I、N-乙酰葡糖胺转移酶)I、高尔基体α-甘露糖酶II、N-乙酰葡糖胺转移酶)II、α(1,6)岩藻糖基转移酶、β(1,4)半乳糖基转移酶、和合适的唾液酸转移酶。
细胞凋亡(程序性细胞死亡)中的延迟在细胞培养过程期间可以具有增加细胞生存力的作用。细胞凋亡中的减少和依次特定细胞的寿命中的增加可以增加来自细胞培养物的蛋白质生产。细胞凋亡事件可以通过将一种或多种抗细胞凋亡蛋白质引入细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞)内在细胞中被抑制，所述抗细胞凋亡蛋白质在沿着细胞凋亡途径的精确点上抑制细胞中的细胞凋亡。抑制细胞凋亡的另一种方法是抑制细胞中来自线粒体的促细胞凋亡分子的释放。本领域已知的促细胞凋亡蛋白质的变体，例如胱天蛋白酶-9的显性失活形式，可以在细胞中用作细胞凋亡抑制剂。此种变体蛋白质可以引入细胞内，以延迟程序性细胞死亡。细胞凋亡的抑制依次延长特定细胞生产蛋白质的时间，从而导致所需蛋白质经由特定细胞的生产中的总体增加。编码胱天蛋白酶抑制剂的几种基因(例如，细胞凋亡X连锁抑制剂(XIAP)或其变体)或抗细胞凋亡基因(例如，Bcl-2和Bcl-xL或其变体)，可以转染到基因工程改造的哺乳动物细胞(例如CHO细胞、VERO细胞、BHK细胞等)内(Sauerwald，T.等人，2003，Biotechnol Bioeng.81：329-340；Sauerwald，T.等人，2002，Biotechnol Bioeng.77：704-716；Mastrangelo，A.等人，2000，Biotechnol Bioeng.67：544-564；Kim，N.等人，2002，J Biotechnol.95：237-248；Figueroa，B.等人，2001，Biotechnol Bioeng.73：211-222)。
在一个实施方案中，生产重组蛋白质的哺乳动物细胞可以用包含抗细胞凋亡基因(例如bcl-2)的载体进行转染。在另一个实施方案中，重组哺乳动物细胞可以用质粒进行转染，所述质粒包含编码胱天蛋白酶抑制剂的基因、或编码如上所述的促细胞凋亡分子的变体的基因、编码本领域技术人员已知具有抗细胞凋亡活性的蛋白质的基因、或其任何组合。
在另一个实施方案中，所需重组蛋白质(例如治疗蛋白质)的总体产物质量(例如增强的糖基化)可以得到增强。为了增加重组蛋白质的糖基化，哺乳动物细胞(例如CHO细胞、VERO细胞、BHK细胞等)可以用编码一种或多种酶的核酸进行转染，所述酶涉及蛋白质的糖基化(例如，α2,3-唾液酸转移酶、β1,4-半乳糖基转移酶等)(Weikert等人，1999，Nature Biotechnol 17：1116-21)。在一个实施方案中，编码β1,4-半乳糖基转移酶的质粒可以引入表达目的蛋白质的哺乳动物细胞内。在另一个实施方案中，编码α2,3-唾液酸转移酶的质粒可以引入表达目的蛋白质的哺乳动物细胞内。
各种培养参数可以就培养的宿主细胞而言进行使用。关于哺乳动物细胞的合适的培养条件是本领域众所周知的(Cleveland等人，J.Immunol.Methods，56：221-234(1983))或可以由技术人员进行确定(参见，例如，Animal Cell Culture：A Practical Approach第2版，Rickwood，D.和Hames，B.D.编辑(Oxford University Press：New York，1992))，并且根据选择的具体宿主细胞而变。
不加限制地，细胞培养基(例如接种物培养基、进料培养基、基础培养基等)可以指用于培养和或维持细胞，特别是哺乳动物细胞的营养物溶液。这些溶液通常提供来自一种或多种下述种类的至少一种组分：(1)能源，通常为碳水化合物例如葡萄糖的形式；(2)所有必需氨基酸，且通常为20种氨基酸加半胱氨酸的基本组；(3)以低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；(4)游离脂肪酸或脂质，例如亚油酸；和(5)痕量元素，其中痕量元素定义为一般以极低浓度，通常为微摩尔范围需要的无机化合物或天然存在的元素。营养物溶液可以选择性补加有来自任何下述种类的一种或多种组分：(1)激素和其他生长因子例如血清、胰岛素、运铁蛋白和表皮生长因子；(2)盐，例如镁、钙和磷酸盐；(3)缓冲液，例如HEPES；(4) 核苷和碱基例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；(5)蛋白质和组织水解产物，例如可以得自纯化的明胶、植物材料或动物副产品的蛋白胨或蛋白胨混合物；(6)抗生素，例如庆大霉素；(7)细胞保护剂，例如多聚醇；和(8)半乳糖。基础培养基的例子可以是细胞生长基础培养基(Cell Growth Basal Medium)。接种物培养基的例子可以是接种物细胞生长基础培养基(Inoculum Cell Growth Basal Medium)。进料培养基的例子可以是生产生物反应器进料培养基(Production Bioreactor Feed Medium)。
商购可得的培养基可以利用并且包括例如，极限必需培养基(Minimal EssentialMedium)(MEM，Sigma，St.Louis，Mo.)；Dulbecco氏修饰的Eagles培养基(Dulbecco'sModified Eagles Medium)(DMEM，Sigma)；Ham's F10培养基(Sigma)；HyClone细胞培养基(HyClone，Logan，Utah)；RPMI-1640培养基(Sigma)；和化学成分确知(CD)培养基，其对于具体细胞类型进行配制，例如，CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。这些培养基中的任何一种可以根据需要补加有先前限定的补加组分或成分，必要或需要时包括以合适的浓度或量的任选组分。可以与本发明一起使用的哺乳动物细胞培养物在适合于培养的具体细胞的培养基中进行制备。在一个实施方案中，细胞培养基可以是一般不含来自任何哺乳动物来源的血清(例如，胎牛血清(FBS))的前述之一。在本发明的另一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物可以在补加有表15中指定的另外组分，商购可得的化学成分确知(CD)-CHO培养基中进行生长。在进一步的实施方案中，哺乳动物细胞培养物可以在补加有表20或21中指定的另外组分的CD-CHO培养基中进行生长。
本发明的方法包括众多细胞类型的培养。在本发明的一个实施方案中，细胞是动物或哺乳动物的。在另一个实施方案中，细胞可以表达且分泌大量所需蛋白质。在本发明的另一个实施方案中，细胞可以表达且将大量目的糖蛋白分泌到培养基内。动物或哺乳动物细胞也可以进行分子修饰以表达且分泌目的蛋白质。由宿主细胞生产的蛋白质对于宿主细胞可以是内源或同源的。蛋白质对于宿主细胞也可以是异源的(例如外来的)，由此编码目的蛋白质的遗传信息经由本领域的标准方法(例如，通过电穿孔、转染等)引入宿主细胞内。在一个实施方案中，哺乳动物糖蛋白可以经由中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞生产且分泌到培养基内。
在一些实施方案中，本发明提供了经由本文讨论的生产方法，包括在实施例14中描述和在图10中显示的大量生产方法生产的CTLA4-Ig分子的群体。该方法可以导致高分子量(HMW)的CTLA4-Ig分子的生产(例如，参见实施例14和15)。在另一个实施方案中，提供了经由本文讨论的生产方法，例如在实施例19和20中描述以及在图24中显示的大量生产方法生产的CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体。该方法可以导致高分子量(HMW)的CTLA4A29YL104-Ig分子的生产(例如，参见实施例19和20)。在一些实施方案中，HMW种类可以是由生产方法，包括化学成分确知(CD)-CHO1发酵方法生产的分子或二聚体的约15－25％。在其他实施方案中，本发明提供了用于分离、纯化和表征通过CD-CHO1发酵方法生产的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig HMW组分的方法。CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig HMW组分是具有比CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig二聚体更高的分子量的多聚体(例如，四聚体、六聚体等)。
能够包含、表达且将大量目的糖蛋白分泌到培养基内用于后续分离和/或纯化的动物或哺乳动物宿主细胞包括但不限于，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，例如CHO-K1(ATCC CCL-61)，DG44(Chasin等人，1986，Som.Cell Molec.Genet，12：555-556；Kolkekar等人，1997，Biochemistry，36：10901-10909；和WO 01/92337A2)，二氢叶酸还原酶阴性CHO细胞(CHO/dhfr-，Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216)和dp12.CHO细胞(美国专利号5,721,121)；由SV40转化的猴肾CV1细胞(COS细胞，COS-7，ATCC CRL-1651)；人胚肾细胞(例如，293细胞，或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人，1977，J.Gen.Virol.，36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL-10)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL-70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587；VERO，ATCC CCL-81)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.，23：243-251)；人子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL-2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL-34)；人肺细胞(W138，ATCC CCL-75)；人肝癌细胞(HEP-G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562，ATCC CCL-51)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL-1442)；TRI细胞(Mather，1982，Annals NY Acad.Sci.，383：44-68)；MCR 5细胞；FS4细胞。在本发明的一个方面，利用CHO细胞，特别是CHO/dhfr-和CHO DG44细胞。
可以通过本发明的方法生产的哺乳动物糖蛋白的例子包括但不限于，细胞因子、细胞因子受体、生长因子(例如，EGF、HER-2、FGF-α、FGF-β、TGF-α、TGF-β、PDGF、IGF-1、IGF-2、NGF、NGF-β)；生长因子受体，包括融合或嵌合蛋白质。其他例子包括但不限于，生长激素(例如，人生长激素、牛生长激素)；胰岛素(例如，胰岛素A链和胰岛素B链)，胰岛素原；促红细胞生成素(EPO)；集落刺激因子(例如，G-CSF、GM-CSF、M-CSF)；白细胞介素(例如，IL-1至IL-12)；血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGF-R)；干扰素(例如，IFN-α、β或γ)；肿瘤坏死因子(例如，TNF-α和TNF-β)及其受体，TNFR-1和TNFR-2；血小板生成素(TPO)；凝血酶；脑钠肽(BNP)；凝血因子(例如，因子VIII、因子IX、von Willebrands因子等)；抗凝血因子；组织纤溶酶原激活物(TPA)，例如尿激酶或人尿或组织型TPA；卵泡生成素(FSH)；黄体生成素(LH)；降钙素；CD蛋白质(例如，CD3、CD4、CD8、CD28、CD19等)；CTLA蛋白质(例如，CTLA4)；T细胞和B细胞受体蛋白质；骨形态发生蛋白(BNPs，例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3等)；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白，例如3－6；肾素；类风湿因子；RANTES；清蛋白；松弛素；巨噬细胞抑制蛋白(例如，MIP-1、MIP-2)；病毒蛋白质或抗原；表面膜蛋白质；离子通道蛋白；酶；调节蛋白质；抗体；免疫调谐蛋白(例如，HLA、MHC、B7家族)；归巢受体；转运蛋白质；超氧化物歧化酶(SOD)；G蛋白偶联受体蛋白质(GPCRs)；神经调制蛋白质；阿尔茨海默氏病相关蛋白质和肽(例如，A-β)，以及本领域已知的其他的。可以通过本发明的方法生产的合适的蛋白质、多肽和肽包括但不限于，融合蛋白、多肽、嵌合蛋白质、以及上述蛋白质和多肽中的任何一种的片段或部分、或突变体、变体或类似物。
本发明的方法还可以用于生产作为SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10的变体的CTLA4-Ig分子。在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子可以包含在残基55(A55Y)和130(L130E)(提及的残基来自SEQ ID NO：2)中具有一种或多种变化的单体。参见美国公开号US 2002/0182211 A1中描述的CTLA4-Ig的变体和突变体的描述，所述专利文件在此整体引入作为参考。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig变体可以包含具有在CTLA-4区域内的突变、或在Ig区域中的突变、或其任何组合的CTLA4-Ig分子。在一个实施方案中，CTLA4-Ig变体分子包含具有氨基酸序列的CTLA4-Ig分子，所述氨基酸序列与SEQ ID NOS：5、6、7、8、9或10至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％等同。在一个实施方案中，CTLA4-Ig变体分子能够与CD80或CD86结合。在另一个实施方案中，变体能够形成二聚体。在进一步的实施方案中，变体显示类似于由非突变的CTLA4-Ig分子群体显示的那种的碳水化合物概况。在一个实施方案中，CTLA4-Ig变体分子具有存在于SEQ ID NO：2中的相同潜在N联和O联糖基化位点。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig变体分子具有存在于SEQ ID NO：2中的相同N联和O联糖基化位点，且具有另外的糖基化位点。突变可以包括但不限于，核苷酸缺失、插入、添加；氨基酸缺失、置换、添加；核酸移码；置换可以是非保守(例如，用色氨酸置换甘氨酸)或保守置换(例如，亮氨酸置换异亮氨酸)。
CTLA4-Ig变体分子包括但不限于，CTLA4-L104EA29YIg(使用根据SEQ ID NO：2的残基编号系统，CTLA4-L104EA29YIg在本文中称为CTLA4-L130EA55YIg)，以及下述参考文献中描述的那些CTLA4-Ig变体分子：美国专利申请系列号09/865,321(美国公开号US2002/0182211)、60/214,065和60/287,576；WO 01/92337 A2；美国专利号6,090,914，5,844,095和5,773,253；和如R.J.Peach等人，1994，J Exp Med，180：2049-2058中描述的。在一个实施方案中，在本方法中生产的CTLA4-Ig变体分子可以由细胞分泌，所述细胞包含编码CTLA4-Ig变体蛋白质的表达载体。
CTLA4-Ig变体L130EA55Yig是在结构中类似于CTLA4-Ig分子的基因工程改造的融合蛋白。L130EA55Y-Ig具有经修饰的人CTLA-4的功能性细胞外结合结构域和IgG1类的人免疫球蛋白的Fc结构域。在CTLA4-Ig结构域的B7结合区域中进行2种氨基酸修饰，L104EA29Y变体的第104位处的亮氨酸至谷氨酸(L104E)，这对应于SEQ ID NO：2的第130位，和L104EA29Y变体的第29位处的丙氨酸至酪氨酸(A29Y)，这对应于SEQ ID NO：2的第55位，以产生L130EA55Y。L130EA55Y-Ig可以包含各自约45,700道尔顿的2条同源糖基化多肽链，所述多肽链通过1个链间二硫键和非共价相互作用结合在一起。根据布达佩斯条约条款，编码L130EA55Y-Ig的DNA于2000年6月20日作为编码L104EA29Y-Ig的DNA保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。它已给予ATCC登记号PTA-2104。L104EA29Y-Ig(对应于本申请中的L130EA55Y-Ig)在共同未决的美国专利申请系列号09/579,927、60/287,576和60/214,065和09/865,321及WO/01/923337A2中得到进一步描述，所述所有专利文件整体引入本申请作为参考。
因为与在SEQ ID NO：2的氨基酸位置55处具有Ala和在氨基酸位置130处具有Leu的CTLA4-Ig单体相比较，重组蛋白质L130EA55Y-Ig仅在2个氨基酸(氨基酸位置55处的Tyr和氨基酸位置130处的Glu)处不同，并且因为这2个突变不影响N或O联糖基化，所以包含L130EA55Y-Ig的CTLA4-Ig变体分子群体可以具有与包含野生型CTLA4-Ig的群体相同的概况或非常相似的糖基化概况。此外，因为与在SEQ ID NO：2的氨基酸位置55处具有Ala和在氨基酸位置130处具有Leu的CTLA4-Ig单体相比较，重组蛋白质L130EA55Y-Ig仅在2个氨基酸(氨基酸位置55处的Tyr和氨基酸位置130处的Glu)处不同，所以本发明的方法应能够生产具有与表6中描述的相似的特性属性的L130EA55Y-Ig。
本发明的方法还可以用于生产CTLA4A29YL104E-Ig分子，其是SEQ ID NOS：11、12、13、14、15或16的变体。在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig可以包含在SEQ ID NO：3中具有一种或多种变化的单体。例如，其他CTLA4A29YL104E-Ig分子的描述在美国专利申请公开号U.S.2002/0039577、U.S.2003/0007968、U.S.2004/0022787、U.S.2005/0019859和U.S.2005/0084933，以及美国专利号7,094,8874中得到描述，所述专利文件在此整体引入作为参考。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig包含在CTLA-4区域(SEQ ID NO：18)内的一种或多种突变、或在Ig区域中的突变、或其任何组合。在其他实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子包含具有氨基酸序列的CTLA4A29YL104E-Ig，所述氨基酸序列与SEQ ID NOS：11、12、13、14、15或16至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％等同。在进一步的实施方案中，如上所述的CTLA4A29YL104E-Ig分子能够与CD80或CD86结合。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig能够形成二聚体。在进一步的实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig显示类似于由非突变的CTLA4A29YL104E-Ig分子群体显示的那种的碳水化合物概况。在其他实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子具有存在于SEQ ID NO：4中的相同潜在N联和O联糖基化位点。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig具有存在于SEQ ID NO：4中的相同N联和O联糖基化位点，且具有另外的糖基化位点。突变可以包括但不限于，核苷酸缺失、插入、添加；氨基酸缺失、置换、添加；核酸移码；置换可以是非保守(例如，用色氨酸置换甘氨酸)或保守置换(例如，亮氨酸置换异亮氨酸)。
在本发明的一个实施方案中，CTLA4-Ig变体分子的群体可以通过根据本发明的大量生产法悬浮生长的哺乳动物细胞(例如dhfr阴性CHO细胞)生产，所述哺乳动物细胞表达编码所需蛋白质(例如，L130EA55Y-Ig蛋白质等)的基因。根据本发明，由哺乳动物细胞生产的重组CTLA4-Ig变体蛋白质可以根据本文描述的收获参数进行回收。在其他实施方案中，由哺乳动物细胞生产的重组CTLA4-Ig变体蛋白质可以根据本发明中描述的纯化方案进行纯化(实施例15)。
在本发明的一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig分子的群体可以通过根据本发明的大量生产法悬浮生长的哺乳动物细胞(例如dhfr阴性CHO细胞)生产，所述哺乳动物细胞表达编码所需蛋白质(例如，CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质等)的基因。根据本发明，由哺乳动物细胞生产的重组CTLA4A29YL104E-Ig可以根据本文描述的收获参数进行回收。在其他实施方案中，由哺乳动物细胞生产的重组CTLA4A29YL104E-Ig可以根据本发明中描述的纯化方案进行纯化(实施例19－20)。
细胞培养物类型和一般培养方法
目的蛋白质例如糖蛋白、融合蛋白等可以通过在多种细胞培养条件下培养表达所需蛋白质产物的细胞进行生产。本领域技术人员理解用于蛋白质生产的细胞培养物和培养运行可以包括但不限于，3种一般类型：连续培养、分批培养和补料分批培养。在连续培养方法中，新鲜的培养基补充物(例如，进料培养基)在培养时间段期间供应给细胞，同时去除旧培养基。在连续培养期间生产的产物也可以例如在每日基础上或连续地进行收获。只要细胞仍是活的，并且维持环境和培养条件，细胞就可以在培养中保持与连续培养方法中所需要的一样久。
在分批培养方法中，细胞最初在培养基中进行培养，并且这种培养基既不替换、也不去除、也不补充。细胞在培养运行期间或结束前不用新培养基进行“进料”，因此培养持续直至营养物耗尽。蛋白质产物在培养运行结束时进行收获。
对于补料分批培养方法，培养运行时间可以通过在运行期间用新鲜培养基每天一次或多次(或连续地)补充培养基得到增加。在这个方法中，在培养时间段期间给细胞供应新鲜培养基，“进料培养基”。补料分批培养可以包括先前描述的各种进料时间表，例如每天、每2天、每隔一天等；超过1次/天、或小于1次/天，等等。补料分批培养还可以用进料培养基进行连续进料。在培养/生产运行结束时，随后收获目的蛋白质产物。
用于由哺乳动物宿主细胞生产的蛋白质包括糖蛋白的小或大规模生产的细胞培养系统在本发明的背景中有用。本领域技术人员理解组织培养皿、旋转瓶(spinner-flask)和T瓶一般用于实验室规模上的培养方法。可以用于在更大规模(例如，500L、5000L、10,000L、20,000L等)上培养的方法包括但不限于，中空纤维生物反应器、流化床生物反应器、搅拌槽生物反应器系统、或滚瓶培养。后面2种方法可以连同或不连同微载体一起使用。
该系统可以以分批、补料分批或连续方式进行操作。对于生产规模的培养，由于其灵活性，搅拌槽生物反应器是选择的系统。这些反应器可以通过用气泡喷射或叶轮机械搅拌经由搅拌使细胞维持悬浮。搅拌槽生物反应器可以按比例增加至大生产规模体积(例如，20,000L)，并且可以以不同进料模式进行操作。这些系统提供了用于细胞生长以及代谢废物、氧和营养物的有效转移的大表面积，以及经由连续搅拌或混合反应器内的组分通过防止细胞沉降至底部维持遍及反应器的同质环境。对于所需糖蛋白的生产，本发明包含维持在搅拌槽生物反应器中，用包含D-半乳糖的进料培养基每天进料的大规模、补料分批细胞培养。在另一个实施方案中，补料分批细胞培养也可以维持在搅拌槽生物反应器中，用进料培养基每天进行进料，所述进料培养基包含合适浓度的对蛋白质糖基化重要的限制细胞培养营养物，所述营养物例如葡萄糖和谷氨酰胺(Chee等人，2005，Biotechnol.Bioeng.89：164-177)。
生产目的蛋白质的培养物的细胞可以根据任何方案或例行程序进行繁殖，所述方案或例行程序最适合于预期的具体哺乳动物宿主细胞和具体生产计划。可以发展细胞培养条件，以增强哺乳动物宿主细胞群体在细胞培养的生长期中扩增或生长对于此种扩增和生长达到最大的时间段。细胞培养的生长期包含其中细胞主要快速分裂的指数细胞生长期(例如，对数期)。在这个期过程中，活细胞的密度中的增加率高于任何其他时间点。
同样，可以发展细胞培养条件，以增强在细胞培养的生产期期间蛋白质生产一定时间段。细胞培养的生产期包含细胞生长稳定或维持在接近恒定水平的时间段。活细胞的密度在给定时间段内保持大约恒定。对数细胞生长已终止并且蛋白质生产是生产期过程中的主要活性。在这时一般补充培养基以支持连续的蛋白质生产且达到所需糖蛋白产物。
培养条件例如温度、pH、溶解氧(DO2)等是由本领域技术人员理解的在培养哺乳动物宿主细胞中使用的那些。用于培养哺乳动物宿主细胞例如CHO细胞的合适的温度范围为30－40℃，并且在一个实施方案中约37℃。pH一般使用酸或碱调整至约6.5－7.5的水平。合适的DO2为5－90％的空气饱和。这些培养条件可以用于促进产生所需蛋白质或糖蛋白产物的哺乳动物细胞的培养。
哺乳动物宿主细胞群体可以在生长期培养中进行扩增和生长，其中可能从贮藏中取出的细胞接种到对于促进生长和高生存力可接受的培养基内。细胞随后可以通过向宿主细胞培养物中添加新鲜的培养基在生产期中维持合适的时间段。在生产期过程中，可以对细胞实施各种温度变动以增强蛋白质生产。多重温度变动培养方法中在于2003年12月18日提交的专利申请美国系列号10/742,564，和于2003年12月18日提交的美国系列号10/740,645中得到描述。这些申请的内容整体引入本文作为参考。在本发明中，包含2次或更多温度变动的细胞培养方法可以导致增加数目的活细胞，所述活细胞在培养中存活直至方法或生产运行结束。在培养的生产期过程中，存活的细胞数目越多可以导致生产的蛋白质或糖蛋白产物的量越多，从而增加在方法结束时蛋白质产物的量。
本发明的具体方面包含补料分批、大规模(例如，500L、5000L、10000L等)哺乳动物细胞培养，其每天或用表14、15中描述的包含D-半乳糖的进料培养基进行进料，以使细胞生产目的糖蛋白。为了增加在这个实施方案中生产的蛋白质的量，在培养时间段期间可以采用2次或更多温度变动，以使蛋白质生产期延长超过在不使用温度变动时，或只使用1次温度变动时发生的那种。在另一个实施方案中，本发明需要补料分批、大规模(例如，500L、5000L、10000L等)哺乳动物细胞培养，其用表22中描述的包含D-半乳糖的进料培养基每天进料一次或多次，以使细胞生产目的糖蛋白(例如，CTLA4A29YL104E-Ig)。在培养时间段期间也可以采用一次或更多温度变动，以使蛋白质生产期延长超过在不使用温度变动时发生的那种，以增加糖蛋白的量。可替代地，伴随温度变动可以向培养物中添加硫酸葡聚糖。
重组蛋白质在生物反应器中的大量生产
本发明提供了用于真核细胞的常规搅拌槽生物反应器培养(例如，20000L细胞培养体积)的方法，特别用于生产大规模或工业量的由此种细胞表达的所需蛋白质产物。培养方法是悬浮生长的真核细胞的补料分批培养方法，伴随培养物上清液的收获，其中表达目的蛋白质的真核细胞例如哺乳动物细胞将所需蛋白质产物分泌到培养基内。
本发明包含了用于大规模培养哺乳动物细胞的方法，特别用于生产大量的由此种细胞表达的所需蛋白质产物。该方法可以通过包括下述的步骤来进行：
(i)将细胞接种到包含无血清培养基的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且繁殖种子培养物(例如，用于接种更大体积的起子培养物)至少直至细胞达到最低限度的交叉接种密度，由此密度是细胞在后续培养体积中的足够繁殖所需的预定值；
(ii)将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的更大培养容器(例如，滚瓶或细胞袋)，以扩增培养物；
(iii)将扩增的种子培养物转移至包含无血清培养基的大规模培养容器，以进一步繁殖细胞培养物；和
(iv)使大规模培养物维持在缺乏动物衍生组分的培养基中，至少直至所述细胞达到靶密度或显示特定生物化学特征。
在一些实施方案中，该方法可以包括(iv)收获培养基且用新鲜培养基替换那种培养基的步骤。
在其他实施方案中，用于哺乳动物细胞的大规模培养的方法可以通过包括下述的步骤来进行：
(i)将细胞接种到包含无血清培养基(例如，接种物培养基)的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且繁殖种子培养物(例如，用于接种更大体积的起子培养物)至少直至细胞达到最低限度的交叉接种密度，由此密度是细胞在后续培养体积中的足够繁殖所需的预定值；
(ii)将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基(例如，接种物培养基)的更大培养容器(例如，滚瓶或细胞袋)，以扩增培养物；
(iii)将扩增的种子培养物转移至包含无血清培养基(例如，基础培养基)的大规模培养容器(例如，1000-L生物反应器)，以进一步繁殖细胞培养物；和
(iv)使大规模培养物维持在缺乏动物衍生组分的培养基(例如，进料培养基)中，至少直至所述细胞达到靶密度或显示特定生物化学特征。
在本发明的一些实施方案中，该方法可以包括下述步骤：
(v)收获培养基且用新鲜培养基替换失去效能的培养基。
本发明可应用于在缺乏动物衍生组分的任何培养基制剂中的任何细胞类型，以生产大规模量的所需蛋白质产物，且可以利用下述2种方法中的任何一种，或其变化：a)微载体方法，或b)悬浮细胞方法。细胞例如哺乳动物细胞的培养可以利用在2个不同时期——生长期和生产期中操作的任一方法。在本发明的另一个实施方案中，包含动物衍生组分(某些非限制性例子是牛血清清蛋白(BSA)或FBS)的任何培养基制剂也可以用于如上所述的大规模蛋白质量的生产。
本领域技术人员理解微载体方法不限于标准微载体方法或灌注微载体方法，可以用于其中细胞与大孔载体附着和/或固定在大孔载体中的细胞培养。在标准微载体方法中，将细胞接种到包含无血清培养基的种子培养容器内，且进行繁殖直至细胞达到最低限度的接种密度。随后，将繁殖的种子培养物转移至包含无血清培养基和微载体的大规模培养容器。在这个生长期中，细胞在微载体上进行生长直至载体被完全建群，例如在使用大孔载体的方法的情况下通过细胞迁移到载体内。
培养基交换可以在微载体沉降至培养容器底部时发生，这之后取出预定百分比的槽体积且向容器中添加相应百分比槽体积的新鲜培养基。随后使微载体重悬浮于培养基中。技术人员理解培养基取出和替换的过程可以以预定时间间隔例如每24小时进行重复，由此替换的培养基的量依赖于细胞密度且可以一般为25％－80％的槽体积。当细胞密度达到适合于蛋白质表达的预定值时，槽中60－95％的槽培养基可以每24小时进行更换。本领域技术人员通常在生产期自始至终也使用上述培养基交换％值。
在生产期过程中，培养基可以通过允许微载体沉降至槽底部进行交换，这之后取出所选％的槽体积且向容器中添加相应％槽体积，例如如上所述的60－95％的新鲜培养基。随后使微载体重悬浮于培养基中，并且培养基取出和替换的过程可以每天进行重复。
微载体灌注方法类似标准微载体方法并且也在生长/扩增和生产期中进行操作。2种方法之间的主要差异是用于更换培养基的方法。限定量的槽体积，例如60－95％的总槽体积在标准微载体方法中突然进行更换，而在灌注方法中培养基进行连续添加。基本上，％槽体积培养基经过预定时间长度进行逐步更换，同时微载体通过使用分离装置(或灌注装置)维持在容器中，所述分离装置允许培养基离开容器但使微载体保留在槽内。这种方法中的生长期如对于标准微载体方法描述的，除了逐步的培养基交换。
悬浮细胞方法的2种非限制性选项包括悬浮细胞灌注方法和悬浮细胞分批方法。在灌注方法中，培养基中的细胞自由地悬浮而不固定化在载体中，并且如同微载体方法，可以在2个不同期(例如，生长期和生产期)中进行操作。在悬浮细胞灌注方法的生长期过程中，将细胞接种到包含无血清培养基的种子培养容器内，且进行繁殖直至细胞达到靶交叉接种密度。随后可以将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的大规模培养容器，并且进行繁殖直至达到适合于蛋白质表达的预定细胞密度值。进行培养容器用新鲜培养基的连续灌注以执行培养基交换方法。
在悬浮细胞分批方法中，细胞培养可以经由下述非限制性方式来进行：a)简单分批方法或b)补料分批方法。在简单分批方法中，将细胞接种到包含缺乏动物衍生组分的培养基的种子培养容器内，且进行繁殖直至细胞达到预定交叉接种密度。随后，将繁殖的种子培养物转移至包含无血清培养基的大规模培养容器，并且培养容器进行操作直至培养基中的营养物已耗尽。在补料分批方法中，向槽中进料营养物的浓缩溶液(例如，进料培养基)可以延长这种培养方法的培养基中的营养物供应，从而延长处理时间且最终导致在培养容器内的所需蛋白质的生产中的增加。添加进料培养基的方法可以改变。它可以作为单脉冲大丸剂(每天1次、2次、3次等)进行添加或可以在24小时时间段自始至终进行逐步进料。这种进料允许细胞在大规模培养容器中进行繁殖，并且包含分泌的目的蛋白质产物的培养基可以在运行结束时在任何营养物变得耗尽之前进行收获。代替从容器中取出所有内容物，本领域技术人员将仅取出部分槽体积(可以为约80％)。
补料分批方法的任选方面是温度变动的使用。在这种方法中，在生产期过程中用作操作温度的温度低于在生长期过程中使用的温度。关于补料分批方法例如在本发明中使用的方法的所述温度范围，可以由在适合于特定使用中细胞系生长的温度下的最初生长期，随后为在预定细胞密度时操作温度中的降低组成。
在一个实施方案中，用于大规模补料分批培养方法的方法包括下述：(i)将细胞接种到包含无血清培养基的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且在适合于生长的温度下繁殖种子培养物至少直至细胞达到预定交叉接种密度；(ii)将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的更大培养容器(例如，滚瓶或细胞袋)，以在合适的温度下扩增培养物；(iii)将扩增的种子培养物转移至包含无血清培养基的大规模培养容器，以在合适的温度下进一步繁殖细胞培养物；和(iv)在适合于蛋白质表达的降低的温度下，使大规模培养物维持在缺乏动物衍生组分的培养基中，伴随新鲜进料培养基的每天替换，至少直至所述细胞达到靶密度或临界时间长度。
在(iv)中用新鲜料培养基替换的步骤可以需要取出预定体积例如80％的槽体积，且用相同体积的新鲜进料培养基替换它。
在进一步的实施方案中，用于大规模补料分批培养方法的方法包括下述：(i)将细胞接种到包含无血清培养基的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且在适合于生长的温度下繁殖种子培养物至少直至细胞达到预定交叉接种密度；(ii)将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的更大培养容器(例如，滚瓶或细胞袋)，以在合适的温度下扩增培养物；(iii)将扩增的种子培养物转移至包含无血清培养基的大规模培养容器(例如，1000-L生物反应器)，以在合适的温度下进一步繁殖细胞培养物；和(iv)在适合于蛋白质表达的降低的温度下，使大规模培养物维持在缺乏动物衍生组分的培养基中，伴随新鲜进料培养基的每天替换，至少直至所述细胞达到靶密度或临界时间长度。
在(iv)中用新鲜进料培养基替换的步骤可以需要取出预定体积例如约80％的槽体积，且用相同体积的新鲜进料培养基替换它。
在本发明的一个实施方案中，在补料分批方法中培养的细胞是表达所需蛋白质产物的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。将哺乳动物细胞接种到包含无血清培养基例如CD-CHO培养基(实施例13)的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且在适合于生长的温度下例如于约35－39℃繁殖3－4天，直至细胞达到预定交叉接种密度(例如，具有≥6.0x106活细胞，或其中最终培养物生存力≥80％)。随后将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的大培养容器(例如，滚瓶)，用于在合适的温度下(例如，于约35－39℃)扩增约3－4天。使细胞培养物在包含无血清培养基例如CD-CHO培养基的更大培养容器(例如，20L细胞袋、100L细胞袋等)中，在适合于生长的温度下例如于约35－39℃进一步扩增3－4天，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有≥1－2x106活细胞/ml，或其中最终培养物生存力≥80％)。在一个实施方案中，接种物扩增包括最少4代。在本发明的另一个实施方案中，接种物扩增需要不超过20代。
扩增的种子培养物随后可以用于接种包含无血清培养基(例如CD-CHO培养基)的大规模培养槽(例如，1000L、4000L生物反应器等)，以在合适的温度下例如于约35－39℃进一步繁殖细胞培养物约3－6天，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有≥1－2x106活细胞/ml，或其中最终细胞培养物生存力≥80％)。大规模培养物(例如在生物反应器等中的10,000L、15,000L、20,000L培养物)随后维持在无血清培养基中，其中培养基是进料培养基(例如eRDF培养基，实施例14)，在适合于分泌的蛋白质产物的蛋白质表达和生产、低于生长温度的温度下(例如，于或约33－35℃3－4天，和于或约31－33℃6－8天)。进料培养基每天用新鲜进料培养基进行替换，由此槽的新鲜进料培养基替换需要取出预定体积例如80％的槽体积，且用相同体积的新鲜进料培养基替换槽。商业规模培养物维持直至所述细胞达到生产参数的靶值，所述生产参数可以是但不限于，时间长度、靶细胞密度、或生物化学蛋白质特征(例如，如上所述的NANA摩尔比)，其中活细胞密度可以为3.0－8.0x106细胞/ml；NANA摩尔比可以为≥6.0；最终细胞培养物生存力可以为≥30％；和最终蛋白质产物滴度可以为≥0.5g/L)。
在本发明的具体实施方案中，在补料分批方法中培养的细胞是表达所需蛋白质产物(例如，CTLA4-Ig分子)的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。将CHO细胞接种到包含无血清培养基例如CD-CHO培养基的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且在适合于生长的温度下例如于约37℃繁殖3－4天，直至细胞达到预定交叉接种密度(例如，具有≥10.0x106活细胞，或其中最终培养物生存力≥84％)。随后将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的大培养容器(例如，滚瓶)，用于在合适的温度下(约37℃)扩增约4天。使细胞培养物在包含无血清培养基例如CD-CHO培养基的更大培养容器(例如，20L细胞袋、100L细胞袋等)中，在适合于生长的温度下(例如于约37℃)进一步扩增4天，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有≥1－2x106活细胞/ml，或其中最终培养物生存力≥91％)。接种物扩增可以包括最少7代。
扩增的种子培养物随后用于接种包含无血清培养基(例如CD-CHO培养基)的大规模培养槽(例如，4000L生物反应器等)，以在合适的温度下例如于约37℃进一步繁殖细胞培养物约5－6天，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有≥1－2x106活细胞/ml，或其中最终细胞培养物生存力≥86％)。商业规模培养物(例如在生物反应器中的20,000L培养物)随后维持在无血清培养基中，其中培养基是进料培养基(例如eRDF培养基)，在适合于分泌的蛋白质产物(例如，CTLA4-Ig)的蛋白质表达和生产、低于生长温度的温度下。商业规模培养物首先从约37℃降至约34℃4天，且随后通过使温度从约34℃降至约32℃8天实施第二次温度变动。进料培养基每天用新鲜补料培养基进行替换，由此生物反应器槽中的进料培养基替换需要取出预定体积例如80％的槽体积，且用相同体积的新鲜进料培养基替换它。商业规模维持直至所述CHO细胞和/或分泌的蛋白质产物达到下述非限制性生产参数的靶值：活细胞密度4.0－7.0x106细胞/ml；NANA摩尔比≥8.0；最终细胞培养物生存力≥38％；和最终蛋白质产物滴度≥0.6g/L。
在本发明的另一个实施方案中，在补料分批方法中培养的细胞是表达所需蛋白质产物的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。将哺乳动物细胞接种到包含无血清培养基例如CD-CHO培养基(实施例19)的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且在适合于生长的温度下例如约35－约39℃繁殖约3－4天；或约36℃－约38℃繁殖约最高达约4天，直至细胞达到预定交叉接种密度(例如，具有大于或等于1.5x106的细胞密度，或其中最终培养物生存力大于或等于约80％)。随后将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的大培养容器(例如，滚瓶)，用于在合适的温度下(例如，约35－约39℃，或约36℃－约38℃)扩增约3－4天或最高达约4天。使细胞培养物在包含无血清培养基例如CD-CHO培养基的更大培养容器(例如，20L细胞袋、100L细胞袋等)中，在适合于生长的温度下例如约35－约39℃，或约36℃－约38℃进一步扩增约3－4天或最高达约4天，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有至少约1.5x106活细胞/ml，或其中最终培养物生存力大于或等于80％)。在一个实施方案中，接种物扩增包括最少4代。在本发明的另一个实施方案中，接种物扩增需要不超过20代。在一些实施方案中，CD-CHO培养基是CD-CHO接种物培养基。
扩增的种子培养物随后可以用于接种包含无血清培养基(例如CD-CHO培养基，例如CD-CHO接种物培养基和/或CD-CHO基础培养基)的大规模培养槽(例如，1000L、4000L生物反应器等)，以在合适的温度下例如约35℃－约39℃，或约36℃－约38℃进一步繁殖细胞培养物约3－约6天、或约4天－约5天、或约4.7天、或小于或等于约113小时，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有约2.3x106活细胞/ml，或其中最终细胞培养物生存力至少约88％)。
商业规模培养物(例如在生物反应器等中的10,000L、15,000L、20,000L、30,000L培养物)随后在无血清培养基中维持，其中培养基是进料培养基(例如eRDF培养基，实施例19)，在适合于分泌的蛋白质产物的蛋白质表达和生产、约35℃－约39℃的温度下维持约3－约6天、或约4天－约5天。可替代地，可以将聚阴离子化合物(例如，硫酸葡聚糖)加入维持在无血清培养基中的培养物中，其中培养基是如下文和美国专利申请公开号2005/0019859中描述的进料培养基(例如eRDF培养基，实施例19)，所述专利文件在此整体引入作为参考。可以伴随对培养物实施单步温度降低(例如，于或约32℃至于或约36℃约3－约14天、或约10－约13天、或约234－约304小时。
在本发明的一个实施方案中，还可以伴随对培养物实施多步温度降低(例如，于或约33℃至于或约35℃约3－6天、和于或约31℃至于或约33℃约6－8天)。上述处理适合于分泌蛋白质产物的蛋白质表达和生产。
在上文描述的情况下的进料培养基可以每天(每天1、2、3等次)或每数天用新鲜进料培养基进行替换。槽用新鲜进料培养基替换需要取出预定体积例如80％的槽体积，且用相同体积的新鲜进料培养基替换槽。商业规模培养物维持直至所述细胞达到生产参数的靶值，所述生产参数可以是但不限于，时间长度、靶细胞密度、或生物化学蛋白质特征(例如，如上所述的NANA摩尔比)，其中活细胞密度可以为3.0－8.0x106细胞/ml；NANA摩尔比可以为≥5.0，或约6，或约5.2－约7.6；最终细胞培养物生存力可以为大于或等于约30％，或大于或等于约37％；和最终蛋白质产物滴度可以为约0.46－约0.71g/L，大于或等于0.5g/L，或大于或等于20g/L。
依照本发明，提供了包括聚阴离子化合物的延迟添加的细胞培养方法。该方法包括在接种后某时(例如，在培养方法的生长期过程中或生产期过程中)向细胞培养物中添加聚阴离子化合物。聚阴离子化合物的延迟添加达到增加的细胞生存力。在一个实施方案中，本发明涉及细胞培养方法，其包括培养表达目的蛋白质的宿主细胞，和在接种后某时向细胞培养物中添加聚阴离子化合物。
聚阴离子化合物包括但不限于，硫酸葡聚糖(可从Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.获得)、肝素(可从Sigma-Aldrich获得)、硫酸乙酰肝素(可从Sigma-Aldrich获得)、硫酸甘露聚糖、硫酸软骨素(可从Sigma-Aldrich获得)、硫酸皮肤素(可从Sigma-Aldrich获得)、硫酸角质素(可从Sigma-Aldrich获得)、透明质酸盐(可从Sigma-Aldrich获得)、聚硫酸乙烯酯(可从Sigma-Aldrich获得)、κ-角叉菜聚糖(可从Sigma-Aldrich获得)、和苏拉明(可从Sigma-Aldrich获得)。化合物可从列出的来源容易地获得，或通过本领域技术人员已知的方法容易地获得。这些化合物通常可以以盐的形式获得，包括但不限于钠盐，但也可以以非盐的形式使用。聚阴离子化合物包括其所有形式，包括但不限于盐形式，例如钠盐。
本发明的聚阴离子化合物的特别有用的、非限制性例子包括聚硫酸化(poysulfated)化合物：硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸甘露聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、聚硫酸乙烯酯、κ-角叉菜聚糖、和苏拉明。在一个实施方案中，聚阴离子化合物是硫酸葡聚糖。硫酸葡聚糖可以具有5,000－500,000Da的平均分子量。在本发明的另一个实施方案中，使用具有5,000Da的分子量的硫酸葡聚糖。
根据本发明的方法，聚阴离子化合物可以在指定细胞培养时间段期间(例如，在接种后某时，例如在生长期或生产期过程中)向细胞培养物中添加1次、2次、3次、或任何次数。一种或多种聚阴离子化合物可以结合使用。例如，聚阴离子化合物的任何给定单次添加可以包括一种或多种其他聚阴离子化合物的添加。类似地，如果存在聚阴离子化合物的超过一次添加，那么不同的聚阴离子化合物可以在不同添加时进行添加。另外的化合物和物质包括聚阴离子化合物，可以在聚阴离子化合物的添加之前、同时或之后，在指定时间段期间或不在指定时间段期间加入培养物中。在具体实施方案中，存在聚阴离子化合物的单次例如1次添加。在另一个实施方案中，添加一种聚阴离子化合物。
聚阴离子化合物可以以任何手段加入细胞培养物中。添加聚阴离子化合物的手段包括但不限于，溶解于水中、溶解于培养基中、溶解于进料培养基中、溶解于合适的培养基中、和以其被获得的形式。特别地，聚阴离子化合物溶解于水中进行添加。依照本发明，添加聚阴离子化合物以使培养物中的浓度达到合适的水平。作为非限制性例子，添加聚阴离子化合物至1－1000mg/L、1－200mg/L、1－100mg/L或25－75mg/L的浓度。加入细胞培养物中的特别有用的聚阴离子化合物浓度包括但不限于，约25－200mg/L；约25－100mg/L；和约50－100mg/L。在本发明的一个实施方案中，加入培养物中的聚阴离子化合物浓度为约50mg/L。在另一个实施方案中，加入培养物中的聚阴离子化合物浓度为约100mg/L。
本发明的方法提供培养可以在聚阴离子化合物的添加后运行任何时间长度。培养运行时间可以由本领域技术人员进行确定，基于相关因素例如可回收的蛋白质的量和质量、以及由细胞裂解产生的上清液中的污染性细胞种类(例如蛋白质和DNA)的水平，所述污染性细胞种类将使目的蛋白质的回收变复杂。在细胞培养方法的一些实施方案中，聚阴离子化合物在接种后某时(例如，在细胞培养方法的生长期过程中或细胞培养方法的生产期过程中)添加。聚阴离子化合物在生长期时或约结束时过程中的接种后某时添加。特别地，聚阴离子化合物在生产期过程中，例如生产期开始时的接种后某时添加。
在本发明的具体实施方案中，在补料分批方法中培养的细胞是表达所需蛋白质产物(例如，CTLA4A29YL104E-Ig分子)的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。将CHO细胞接种到包含无血清培养基例如CD-CHO培养基(例如CD-CHO接种物培养基)的种子培养容器(例如，T-175瓶)内，并且在适合于生长的温度下例如于约37℃繁殖约3－4天，直至细胞达到预定交叉接种密度(例如，具有≥1.5x106活细胞，或其中最终培养物生存力≥80％)。随后将繁殖的种子培养物转移至包含缺乏动物衍生组分的培养基的大培养容器(例如，滚瓶)，用于在合适的温度下(于约37℃)扩增约4天。使细胞培养物在包含无血清培养基例如CD-CHO培养基(例如CD-CHO接种物培养基)的更大培养容器(例如，20L细胞袋、100L细胞袋等)中，在适合于生长的温度下(例如于约37℃)进一步扩增约4天，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有≥1.5x106活细胞/ml，或其中最终培养物生存力≥80％)。接种物扩增可以包括最少7代。
扩增的种子培养物随后用于接种包含无血清培养基(例如CD-CHO培养基，例如CD-CHO基础培养基)的大规模培养槽(例如，1000-L、4000-L生物反应器等)，以在合适的温度下例如于约37℃进一步繁殖细胞培养物约5－6天，直至细胞达到靶接种密度(例如，具有约2.3x106活细胞/ml，或其中最终细胞培养物生存力≥88％)。商业规模培养物(例如在生物反应器中的10,000L、15,0000L、20,000L培养物等)随后维持在无血清培养基中，其中培养基是进料培养基(例如eRDF培养基)，在适合于分泌的蛋白质产物(例如，CTLA4A29YL104E-Ig)的蛋白质表达和生产、低于生长温度的温度下。
商业规模培养物例如从约37℃降至约34℃约4天。聚阴离子化合物可以在温度降低时伴随加入培养物中。可替代地，商业规模培养物从约35℃－37℃降至约32℃－约36℃约12天，且聚阴离子化合物可以在温度降低时伴随加入培养物中。
在上文描述的情况下的进料培养基可以每天(每天1、2、3等次)或每数天用新鲜进料培养基进行替换。槽用新鲜进料培养基替换需要取出预定体积例如80％的槽体积，且用相同体积的新鲜进料培养基替换槽。在一个实施方案中，进料培养基每天进行添加，共约2－3天，直至例如葡萄糖浓度降至1g/L。在另一个实施方案中，例如，一旦葡萄糖浓度已达到1g/L，进料培养基就每8小时进行添加。商业规模维持直至所述CHO细胞和/或分泌的蛋白质产物达到下述非限制性生产参数的靶值：NANA摩尔比约6.0，或约5.2－约7.6；最终细胞培养物生存力≥37％；和最终蛋白质产物滴度约0.46－约0.71g/L。
在本发明的一个实施方案中，培养的细胞可以是哺乳动物细胞，或确立的哺乳动物细胞系，包括但不限于，CHO(例如，ATCC CCL 61)、HEK293(例如，ATCC CRL 1573；Graham等人，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)、COS-1(例如，ATCC CRL 1650)、DG44(CHO 细胞系)(Cell，33：405，1983和Somatic Cell and Molecular Genetics 12：555，1986)、和幼仓鼠肾(BHK)细胞系。其他有用的非限制性例子是骨髓瘤、3T3细胞、Namalwa细胞、和骨髓瘤与其他细胞的融合。在一些实施方案中，细胞可以是突变或重组细胞，例如表达与其衍生的细胞类型不同范围的酶的细胞，所述酶催化蛋白质的翻译后修饰(例如，加工酶例如前肽或糖基化酶，例如糖基转移酶和/或糖苷酶)。在本发明的一个具体方面，特别使用CHO/dhfr-细胞。
用于扩增细胞培养物的培养容器可以是但不限于，锥形瓶、T-175瓶、滚瓶和细胞袋。大规模培养容器可以是，例如其中搅拌借助于从容器底部引入空气来获得的气升式反应器，或其中搅拌借助于常规叶轮类型来获得的常规搅拌槽反应器(CSTR)。在控制在指定限度内的参数中有温度、pH、和溶解氧张力(DOT)。在这种系统中的温度控制介质是水，并且根据需要可以进行加热或冷却。水可以经过浸入细胞培养基中的盘管(piping coil)或容器周围的夹套。pH例如可以通过在需要时向细胞培养基中添加碱或通过改变顶空气体中的CO2浓度进行调节。DOT可以通过喷射纯氧或空气或其混合物得到维持。
本发明因此提供了用于生产重组蛋白质的方法，该方法包括至少2个步骤：(a)使分泌重组蛋白质(即，哺乳动物细胞通常不表达或超表达的蛋白质，其中重组蛋白质经由已转染到细胞或细胞亲代内的表达载体或构建体在细胞中进行表达)的哺乳动物细胞从种子培养物扩增至至少10,000L的液体培养物，和(b)从至少10,000L液体培养物中分离重组蛋白质。在一个实施方案中，该方法可以这样使用，从而使得重组蛋白质在从液体培养物中纯化蛋白质前以至少0.5克/L液体培养物的浓度生产。在另一个实施方案中，根据本发明的方法可以用于生产在从液体培养物中纯化蛋白质前浓度为至少约0.46－约0.71克/L液体培养物的重组蛋白质。
在一个实施方案中，扩增步骤可以包括(i)使细胞在无血清培养基中培养至少4代，以便获得至少约1.0x105活细胞/mL的细胞密度，和(ii)使细胞在培养中维持足以生产至少约0.5重组蛋白质的时间。在一个实施方案中，传代数目不超过36代。在另一个实施方案中，传代数目可以超过36代，其中细胞就编码重组蛋白质的核酸的拷贝数、细胞生存力和倍增时间而言在数代中是稳定的。
足以生产至少约0.5－约1.3g/L重组蛋白质的时间可以是任何时间量，只要细胞生存力不降到5％、10％、25％、30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％以下，和/或只要细胞代数不超过50、75、100、105或125代。维持步骤还可以包括温度变动步骤，例如使培养物的温度首先从37±2℃降至34±2℃，和在随后时间从34±2℃降至32±2℃。32±2℃的温度可以维持至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、50或100天。32±2℃的温度可以维持至少20、50、75或100细胞代。32±2℃的温度可以维持直至培养物的细胞密度为约30－约100x105细胞/mL液体培养物。
在其他实施方案中，本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，该方法包括至少下述步骤：(a)使分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞从种子培养物扩增至至少10,000L的液体培养物，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)当液体培养物发生下述情况时，从至少10,000L液体培养物中分离重组蛋白质：(i)包含大于或等于约6.0摩尔NANA/摩尔蛋白质(在这种情况下糖蛋白)；(ii)具有约33－约79x105细胞/mL的细胞密度；(iii)液体培养物中的细胞生存力不小于约38％，或大于或等于约38％；(iv)内毒素小于或等于约76.8EU/mL液体培养物；和/或(v)生物负荷小于1集落形成单位/mL液体培养物。
在进一步的实施方案中，扩增步骤可以包括(i)使细胞在无血清培养基中培养至少4代，以便获得至少约1.0x106活细胞/mL的细胞密度，和(ii)使细胞在培养中维持足以生产至少约0.46－约0.71克重组蛋白质/L液体培养物的时间。在一个实施方案中，传代数目不超过36代。在另一个实施方案中，传代数目可以超过36代，其中细胞就编码重组蛋白质的核酸的拷贝数、细胞生存力和倍增时间而言在数代中是稳定的。
足以生产约0.46－约0.71g/L重组蛋白质的时间可以是任何时间量，只要细胞生存力不降到5％、10％、25％、30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％以下，和/或只要细胞代数不超过27、50、75、100、105或125代。维持步骤还可以包括温度变动步骤，例如使培养物的温度首先从37±2℃降至34±2℃。34±2℃的温度可以维持至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、50或100天。可替代地，维持步骤可以为温度变动步骤，例如使培养物的温度从37±2℃降至34±2℃。
聚阴离子化合物可以在温度降低开始时进行添加。加入培养物中的聚阴离子化合物的浓度可以为约1mg/L、5mg/L、10mg/L、12.5mg/L、15mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、200mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L或1000mg/L。32±2℃的温度可以维持至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、50或100天。34±2℃的温度可以维持至少20、27、50、75或100细胞代。
在进一步的实施方案中，本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，该方法包括至少下述步骤：(a)使分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞从种子培养物扩增至至少10,000L的液体培养物，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.46－约0.71克/L液体培养物；和(b)当液体培养物发生下述情况时，从至少10,000L液体培养的培养物中分离重组蛋白质：(i)包含约6摩尔NANA/摩尔蛋白质(在这种情况下糖蛋白)；(ii)液体培养物中的细胞生存力不小于约37％；(iii)内毒素小于或等于约4.8EU/mL液体培养物；和/或(iv)生物负荷小于1集落形成单位/mL液体培养物。
通过本发明的这些方法生产的重组蛋白质可以是分泌的蛋白质、糖蛋白、细胞因子、激素、CTLA4-Ig蛋白质、或CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是由本发明提供的细胞的后代或亚克隆。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞是衍生自本发明细胞系的细胞的后代或亚克隆。在进一步的实施方案中，哺乳动物细胞是来自用包含SEQID NO：1的表达盒转染的细胞的克隆群体。在具体实施方案中，哺乳动物细胞是来自用包含SEQ ID NO：3的表达盒转染的细胞的克隆群体。
用于纯化来自培养物的重组蛋白质的一般技术
在细胞培养方法的蛋白质生产期后，目的蛋白质例如糖蛋白使用本领域技术人员理解的技术从细胞培养基中进行回收。特别地，目的蛋白质作为分泌的多肽从培养基中进行回收，尽管它也可以从宿主细胞裂解物中进行回收。培养基或裂解物最初进行离心以去除细胞碎片和颗粒。所需蛋白质随后使用本领域充分确立的下述非限制性纯化程序从污染物DNA、可溶蛋白和多肽中进行纯化：SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；乙醇沉淀；在免疫亲和或离子交换柱上分级分离；反相HPLC；在二氧化硅或阴离子交换树脂例如QAE或DEAE上的层析；层析聚焦；使用例如Sephadex G-75TM柱的凝胶过滤；和A蛋白SepharoseTM柱以去除污染物例如IgG。蛋白酶抑制剂例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)或蛋白酶抑制剂混合物的添加也可以用于抑制在纯化期间的蛋白酶解降解。本领域技术人员将认识到适合于目的蛋白质例如糖蛋白的纯化方法可能需要改变，以解决在重组细胞培养中表达后蛋白质的特征中的变化。
针对糖蛋白的碳水化合物基团选择的纯化技术和方法在本发明的背景中也具有效用。例如，此种技术包括HPLC或使用阳离子或阴离子交换树脂的离子交换层析，其中依赖于选择的碳水化合物，收集更为碱性或更为酸性的级分。此种技术的使用也可以导致污染物的伴随去除。
在本发明中，能够生产CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig融合蛋白的CHO细胞在CHO特异性培养基中作为悬浮液生长至预定细胞密度。在无血清表达培养基中悬浮生长的CHO细胞随后生产CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子，其由CHO细胞分泌到培养基内。细胞悬浮液可以经由离心变得澄清，并且CTLA4-Ig分子随后可以通过标准纯化技术与澄清的培养物上清液分离。用于单独或组合获得CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig的更大纯度和同质性的合适纯化程序的非限制性例子是：在琼脂糖上的亲和层析；在阴离子交换柱(AEC)上的分级分离；和疏水作用层析(HIC)。
在一些实施方案中，分离来自本文描述的生产方法的CTLA4-Ig分子或其他蛋白质(包括糖蛋白)可以至少包括下述步骤：(i)获得细胞培养物上清液；(ii)对上清液实施阴离子交换层析以获得洗脱的蛋白质产物；(iii)对步骤(ii)的洗脱的蛋白质产物实施疏水作用层析，以便获得富集的蛋白质产物；(iv)对富集的蛋白质产物实施亲和层析，以获得洗脱且富集的蛋白质产物；和(v)对(iv)的洗脱且富集的蛋白质产物实施阴离子交换层析。步骤(iii)中获得的富集的蛋白质产物的特征可以在于例如它的任何HMW蛋白质或污染物百分比小于5、10、15或25％。步骤(ii)的阴离子交换层析可以例如通过使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25－100mM HEPES和约300－900mM NaCl，且具有约7.0－8.0的pH。步骤(iii)的疏水作用层析可以例如通过使用具有约7.0的pH且包含约25mM HEPES和约850mM NaCl的单一洗涤缓冲液；或具有约8.0的pH且包含约25mM Tris和约250mM NaCl的洗涤缓冲液来进行。步骤(iv)的亲和层析可以例如通过使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液具有约3.5的pH，且包含约100mM甘氨酸。步骤(v)的亲和层析可以例如通过使用具有约8.0的pH且包含约25mM HEPES和约120mM NaCl－约130mM NaCl的洗涤缓冲液，或具有约8.0的pH且包含约25mM HEPES和约200mM NaCl的洗涤缓冲液来进行。步骤(ii)的阴离子交换层析可以使用具有阴离子交换树脂的柱来进行，所述阴离子交换树脂具有伯、仲、叔或季胺官能团。步骤(iii)的疏水作用柱可以使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。
在其他实施方案中，分离来自本文描述的生产方法的CTLA4A29YL104E-Ig分子或其他蛋白质(包括糖蛋白)可以至少包括下述步骤：(i)获得细胞培养物上清液；(ii)对上清液实施亲和层析以获得洗脱的蛋白质产物；(iii)对步骤(ii)的洗脱的蛋白质产物实施阴离子交换层析，以便获得富集的蛋白质产物；和(iv)对富集的蛋白质产物实施疏水作用层析，以获得具有减少的高分子量(HMW)蛋白质复合物的洗脱且富集的蛋白质产物。步骤(iv)中获得的富集的蛋白质产物的特征可以在于例如它的任何HMW蛋白质或污染物百分比小于5、10、15或25％。步骤(ii)的亲和层析可以例如通过使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液具有约3.0的pH，且包含约250mM甘氨酸。步骤(ii)的亲和层析可以例如通过使用洗涤缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液具有约7.5的pH，且包含约25mM NaH2PO4和约150mM NaCl。步骤(iii)的阴离子交换层析可以例如通过使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约50mM HEPES和约135mM NaCl，且具有约7.0的pH。步骤(iii)的阴离子交换层析可以例如通过使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约50mM HEPES和约200mM NaCl，且具有约7.0的pH。步骤(iv)的疏水作用层析可以例如通过使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液具有约7.0的pH，且包含约50mM HEPES和约1.2M(NH4)2SO4。步骤(iii)的阴离子交换层析可以使用具有阴离子交换树脂的柱来进行，所述阴离子交换树脂具有伯、仲、叔或季胺官能团。步骤(iv)的疏水作用柱可以使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。
在一个实施方案中，本发明提供了用于从液体细胞培养物中纯化CTLA4-Ig分子的方法，从而使得纯化的CTLA4-Ig基本上不含单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig分子的药学上可接受的组合物，其中组合物包含不超过0.5ppmMCP-1、1ppm MCP-1、2ppm MCP-1、3ppm MCP-1、4ppm MCP-1、5ppm MCP-1、6ppm MCP-1、7ppmMCP-1、8ppm MCP-1、9ppm MCP-1或10ppm MCP-1。在另一个实施方案中，在组合物中，MCP-1的量不可以超过1％、0.5％或0.1％纯化的CTLA4-Ig的重量。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子的组合物基本上不含MCP-1，其中在QFF洗脱物液体中存在小于50、45、40、38、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ng/mL MCP-1。在另一个实施方案中，本发明提供了用于从液体细胞培养物中纯化CTLA4-Ig分子的方法，从而使得纯化的CTLA4-Ig基本上不含MCP-1且包含小于2.5％CTLA4-Ig四聚体。
组合物中的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的量可以使用ELISA法进行定量。包被抗体是山羊抗小鼠MCP-1IgG抗体。第二抗体是兔抗大鼠MCP-1IgG抗体。检测使用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG抗体和底物TMB来完成。辣根过氧化物酶试剂产生与捕获的蛋白质量成比例显色的比色反应。ELISA相对于材料标准曲线定量MCP-1水平。在一个实施方案中，MCP-1在组合物中进行定量，且MCP-1水平为0－0.097ng/mg至0.014 0.154ng/mg。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于从液体细胞培养物中纯化CTLA4A29YL104E-Ig分子的方法，从而使得纯化的CTLA4A29YL104E-Ig基本上不含单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。在一个实施方案中，MCP-1的量不可以超过1％、0.5％或0.1％纯化的CTLA4-Ig的重量。在另一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig基本上不含MCP-1，其中在HIC洗脱物液体中存在小于50、45、40、38、35或30ng/mL MCP-1。在进一步的实施方案中，本发明提供了用于从液体细胞培养物中纯化CTLA4A29YL104E-Ig分子的方法，从而使得纯化的CTLA4A29YL104-Ig基本上不含MCP-1且包含小于2.5％CTLA4A29YL104-Ig四聚体。
从细胞培养物中回收糖蛋白和纯化
本发明描述了用于从包含目的糖蛋白(例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)和不希望有的污染物的不纯的、细胞培养物上清液、蛋白质库中分离糖蛋白(例如CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig)的一系列步骤。不纯的、细胞培养物上清液可以用作原材料用于纯化CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白。
在本发明的一个实施方案中，将包含CTLA4-Ig糖蛋白和不希望有的污染物的不纯的、细胞培养物上清液应用于阴离子交换介质。存在于不纯的、细胞培养物上清液中的CTLA4-Ig糖蛋白与阴离子交换介质结合。阴离子交换介质随后进行洗涤，以从阴离子交换介质中去除任何未结合的材料。CTLA4-Ig糖蛋白在去除未结合的材料后进行洗脱，且收集洗脱物。
在本发明的一个实施方案中，将包含CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白和不希望有的污染物的不纯的、细胞培养物上清液应用于亲和层析介质。存在于不纯的、细胞培养物上清液中的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白与亲和层析介质结合。亲和层析介质随后进行洗涤，以从阴离子交换介质中去除任何未结合的材料。CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白在去除未结合的材料后进行洗脱，且收集洗脱物。
在本发明的具体实施方案中，例如使用Q-Sepharose XL柱(GE Healthcare)的Q-Sepharose阴离子交换层析(AEC)，应用于使CTLA4-Ig糖蛋白与收获材料分离，以及用于减少大量污染物。这种柱可以用作来自哺乳动物细胞培养物的CTLA4-Ig糖蛋白纯化中的早期步骤，用于分级分离收获的细胞培养基。在另一个实施方案中，Q-Sepharose阴离子交换层析例如Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)，可以在亲和层析纯化步骤后使用。阴离子交换柱的非常高流动的性质允许在后续层析步骤例如SP-Sepharose或HIC前，通过调整条件容易地浓缩大量CTLA4-Ig糖蛋白或收获的细胞培养基，从而使得CTLA4-Ig糖蛋白与柱结合。对于约pH 5－9，特别地约8的pH的洗涤缓冲液，75mM HEPES和360mM NaCl浓度是有用的。一般地，对于约pH 5－8，特别地约7的pH的洗脱缓冲液，25mM HEPES和325mM NaCl浓度是有用的。
用于使CTLA4-Ig糖蛋白与收获的培养基分离的合适的树脂是具有固定化的胺官能团的那些。最有用的是季胺官能团树脂，例如来自GE Healthcare的Q-Sepharose FastFlow树脂上的那些，其中季铵配体与高孔隙率、交联琼脂糖结合。同样有用的是伯、仲和叔胺官能团树脂，例如来自GE Healthcare的DEAE Sepharose Fast Flow树脂上的那些，其中叔二乙氨基乙基配体与高孔隙率、交联琼脂糖结合。
在本发明的另一个实施方案中，收集来自阴离子交换介质的包含CTLA4-Ig糖蛋白的洗脱物，且与疏水作用树脂接触。如下所述，包含CTLA4-Ig糖蛋白的体积经过HIC柱，并且可以进一步纯化的收集的库随后与阴离子交换树脂结合。
HIC用于使所需的CTLA4-Ig糖蛋白二聚体与高分子量材料和来自哺乳动物细胞培养物的其他蛋白质杂质分离。例如，表达CTLA4-Ig的CHO细胞培养物包含CTLA4-Ig糖蛋白的高分子量聚集物。在哺乳动物细胞培养基中还发现的是CHO细胞蛋白质杂质。这些不希望有的产物可以在患者中产生不需要的抗原应答且促成弱产物质量或活性。HIC使疏水变体CTLA4-Ig糖蛋白二聚体与CTLA4-Ig糖蛋白HMW复合物和CHO蛋白质杂质有效分离，其经由后面的产物与HIC树脂结合和CTLA4-Ig糖蛋白二聚体经过柱实现。因此，可以获得基本上不含这些种类，和特别适合于另一个层析步骤例如阴离子交换层析的CTLA4-Ig糖蛋白库。用于与HIC一起使用的CTLA4-Ig糖蛋白混合物的来源是哺乳动物细胞培养物，例如CHO细胞培养物。特别地，可以对培养物实施如前所述的至少一个先前纯化步骤。
在本发明的另一个实施方案中，HIC法可以进行修改，以收集其他糖蛋白(例如，CTLA4-Ig HMW复合物)的库。HMW聚集物可以与HIC树脂结合(例如，包含CTLA4-Ig四聚体等)。这些HMW复合物具有更高的抗体亲抗原性且在体内比单独的CTLA4-Ig二聚体更有效地结合。因此，本领域技术人员通过从HIC中洗脱CTLA4-Ig库可以获得CTLA4-Ig HMW聚集物的库。
用于分离CTLA4-Ig糖蛋白形式的最有用的HIC树脂是具有固定化的苯基官能团的那些。在苯基-HIC树脂中，GE Healthcare的Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub(高置换)是最有用的。TosoHaas的Phenyl Toyopearl介质和TSK Phenyl 5PW是可以使用的其他苯基-HIC树脂的非限制性例子。其他HIC官能团包括但不限于，丙基、辛基、烷氧基、丁基和异戊基部分。
例如Phenyl Sepharose 4 Fast Flow柱层析，疏水作用层析(HIC)方法可以用于减少在HIC纯化步骤中洗脱的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig高分子量种类的量(参见实施例15和实施例20)。因此，来自HIC柱的清除峰富含CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig HMW种类。
可以对来自HIC纯化步骤的包含CTLA4-Ig糖蛋白的未结合级分实施另外的纯化方法，例如亲和层析，并且所得到的洗脱物随后可以应用于阴离子交换介质。CTLA4-Ig糖蛋白与阴离子交换树脂结合，所述阴离子交换树脂随后可以进行洗涤以去除未结合的蛋白质。去除未结合的蛋白质后，CTLA4-Ig糖蛋白从第二种阴离子交换树脂中进行洗脱。洗脱物进行收集且可以进行进一步浓缩。
在本发明的另一个实施方案中，亲和层析例如rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)，应用于使CTLA4-Ig糖蛋白进一步富集，这随后可以进一步为阴离子交换层析步骤，例如Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)。亲和层析步骤还可以减少CHO蛋白质和单核细胞趋化蛋白(MCP-1，趋化因子)杂质的水平。亲和层析包括吸附分离，其中待纯化的目的分子例如CTLA4-Ig糖蛋白，与固定化在一些基质或树脂上的配体特异性且可逆地结合。亲和纯化柱的一些非限制性例子包括凝集素；亲和标记物(例如，GST柱或6X-His柱)；链霉抗生物素蛋白；肝素；或抗体(例如，A蛋白柱或G蛋白柱)。特别地，本发明利用A蛋白树脂用于结合CTLA4-Ig糖蛋白。对于pH约5－9，更有效的在pH约8下的洗涤缓冲液，25mMTris和250mM NaCl浓度是有用的。对于pH约2－5，更有效的在pH约3.5下的洗脱缓冲液，100mM甘氨酸浓度是有用的。亲和层析洗脱物随后可以进行中和且装载到阴离子交换层析柱上，Q-Sepharose Fast Flow是最有用的。
为了进一步减少在前述回收/最初纯化步骤后的产物中A蛋白、DNA和不需要的CTLA4-Ig糖蛋白种类的水平，可以将另一个离子交换步骤掺入纯化程序内。本发明可以使用商购可得的离子交换柱，例如来自GE Healthcare的Q-Sepharose Fast Flow柱、或同样来自GE Healthcare的DEAE Sepharose Fast Flow柱。如本文确定的，用于使CTLA4-Ig糖蛋白与收获的培养基分离的最合适的树脂是具有固定化的胺官能团的那些。其他有用的基团是季胺官能团树脂，例如来自GE Healthcare的Q-Sepharose Fast Flow柱中的那些，其中季铵配体与高孔隙率、交联琼脂糖结合。同样有用的是伯、仲和叔胺官能团树脂，例如来自GE Healthcare的DEAE Sepharose Fast Flow柱中的那些，其中叔二乙氨基乙基配体与高孔隙率、交联琼脂糖结合。在本发明的具体实施方案中，利用使用强阴离子交换剂的柱，例如Q-Sepharose Fast Flow column柱。
在本发明的一个实施方案中，将CTLA4-Ig糖蛋白洗脱物装载到阴离子交换柱上，例如Q-Sepharose Fast Flow。该柱进行洗涤并且CTLA4-Ig糖蛋白随后从阴离子交换柱中洗脱。对于pH约5－9，在一个实施方案中，pH 8的洗涤缓冲液，25mM HEPES和100－140mMNaCl浓度是有用的。对于pH约5－9，或在另一个实施方案中，pH 8的洗脱缓冲液，25mMHEPES和200mM NaCl浓度是有用的。从阴离子交换介质中洗脱的CTLA4-Ig糖蛋白进行回收、浓缩和洗涤，其通过渗滤或本领域技术人员已知的其他合适方法实现，以提供最终纯化的CTLA4-Ig糖蛋白产物。依照本发明的方法制备的CTLA4-Ig糖蛋白产物具有高纯度，例如包含≥95％的CTLA4-Ig二聚体，包含≤5％的CTLA4-Ig HMW产物，和包含≤1％的CTLA4-Ig单体。
纯化方法可以进一步包括灭活和/或去除病毒和/或逆转录病毒的另外步骤，所述病毒和/或逆转录病毒可能潜在地存在于哺乳动物细胞系的细胞培养基中。大量病毒清除步骤是可用的，包括但不限于，用离液剂处理，例如尿素或胍，去污剂，另外的超滤/渗滤步骤，常规分离，例如离子交换或尺寸排阻层析，pH极端，热，蛋白酶，有机溶剂或其任何组合。
在本发明的另一个实施方案中，亲和层析例如MabSelect Protein A Sepharose树脂(GE Healthcare)应用于捕获CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白，这随后可以进一步为阴离子交换层析步骤，例如Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)。亲和层析步骤还可以减少CHO蛋白质和单核细胞趋化蛋白(MCP-1，趋化因子)杂质的水平。亲和层析包括吸附分离，其中待纯化的目的分子例如CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白，与固定化在一些基质或树脂上的配体特异性且可逆地结合。亲和纯化柱的一些非限制性例子包括凝集素；亲和标记(例如，GST柱或6X-His柱)；链霉抗生物素蛋白；肝素；或抗体(例如，A蛋白柱或G蛋白柱)。特别地，本发明利用A蛋白树脂用于结合CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白。对于pH约5－9，更有效的在pH约7.5下的洗涤缓冲液，25mM Tris、25mM NaH2PO4和250mM NaCl浓度是有用的。对于pH约2－5，更有效的在pH约3.5下的洗脱缓冲液，100－300mM甘氨酸浓度是有用的。亲和层析洗脱物随后可以进行中和且装载到阴离子交换层析柱上，Q-Sepharose Fast Flow是最有用的。
为了进一步减少在前述回收/最初纯化步骤后的产物中A蛋白、DNA和不需要的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白种类的水平，可以将另一个离子交换步骤掺入纯化程序内。本发明可以使用商购可得的离子交换柱，例如来自GE Healthcare的Q-Sepharose Fast Flow柱、Q-Sepharose XL柱(GE Healthcare)、或同样来自GE Healthcare的DEAE Sepharose FastFlow柱。用于分离CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白的最合适的树脂是具有固定化的胺官能团的那些。其他有用的基团是季胺官能团树脂，例如来自GE Healthcare的Q-Sepharose FastFlow柱中的那些，其中季铵配体与高孔隙率、交联琼脂糖结合。同样有用的是伯、仲和叔胺官能团树脂，例如来自GE Healthcare的DEAE Sepharose Fast Flow柱中的那些，其中叔二乙氨基乙基配体与高孔隙率、交联琼脂糖结合。在本发明的具体实施方案中，利用使用强阴离子交换剂的柱，例如Q-Sepharose Fast Flow column柱。
在本发明的一个实施方案中，将CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白洗脱物装载到阴离子交换柱上，例如Q-Sepharose Fast Flow。该柱进行洗涤并且CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白随后从阴离子交换柱中洗脱。对于pH约5－9，在一个实施方案中，pH 7的洗涤缓冲液，25－55mM HEPES和100－140mM NaCl浓度是有用的。对于pH约5－9，或在另一个实施方案中，pH 7的洗脱缓冲液，25－50mM HEPES和200mM NaCl 浓度是有用的。
在本发明的另一个实施方案中，收集来自阴离子交换介质的包含CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白的洗脱物，且随后与疏水作用树脂接触。HIC用于使所需的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白二聚体与高分子量材料和来自哺乳动物细胞培养物的其他蛋白质杂质分离。例如，表达CTLA4A29YL104E-Ig的CHO细胞培养物包含CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白的高分子量聚集物。在哺乳动物细胞培养基中还发现的是CHO细胞蛋白质杂质。这些不希望有的产物可以在患者中产生不需要的抗原应答且促成弱产物质量或活性。
HIC使疏水变体CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白二聚体与CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白HMW复合物和CHO蛋白质杂质有效分离，其经由后面的产物与HIC树脂结合和CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白二聚体经过柱实现。因此，可以获得基本上不含这些种类的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白库。用于与HIC一起使用的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白混合物的来源是哺乳动物细胞培养物，例如CHO细胞培养物。特别地，可以对培养物实施如前所述的至少一个先前纯化步骤。
在本发明的另一个实施方案中，HIC法可以进行修改，以收集其他糖蛋白(例如，CTLA4A29YL104E-Ig HMW复合物)的库。HMW聚集物可以与HIC树脂结合(例如，包含CTLA4A29YL104E-Ig四聚体等)。这些HMW复合物具有更高的抗体亲抗原性且在体内比单独的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体更有效地结合。因此，本领域技术人员通过从HIC中洗脱CTLA4A29YL104E-Ig库可以获得CTLA4A29YL104E-Ig HMW聚集物的库。
从HIC介质中洗脱的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白进行回收、浓缩和洗涤，其通过渗滤或本领域技术人员已知的其他合适方法实现，以提供最终纯化的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白产物。依照本发明的方法制备的CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白产物具有高纯度，例如包含≥95％的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体，包含≤5％的CTLA4A29YL104E-Ig HMW产物，和包含≤1％的CTLA4A29YL104E-Ig单体。
用于分离CTLA4A29YL104E-Ig糖蛋白形式的最有用的HIC树脂是具有固定化的苯基官能团的那些。在苯基-HIC树脂中，GE Healthcare的Phenyl Sepharose Fast Flow HighSub(高置换)是最有用的。TosoHaas的Phenyl Toyopearl介质和TSK Phenyl 5PW是可以使用的其他苯基-HIC的非限制性例子。其他HIC官能团包括但不限于，丙基、辛基、烷氧基、丁基和异戊基部分。
纯化方法可以进一步包括灭活和/或去除病毒和/或逆转录病毒的另外步骤，所述病毒和/或逆转录病毒可能潜在地存在于哺乳动物细胞系的细胞培养基中。大量病毒清除步骤是可用的，包括但不限于，用离液剂处理，例如尿素或胍，去污剂，另外的超滤/渗滤步骤，常规分离，例如离子交换或尺寸排阻层析，pH极端，热，蛋白酶，有机溶剂或其任何组合。
在一个方面，已浓缩且实施渗滤步骤的纯化的CTLA4-Ig分子可以填充到2-L瓶、50-L生物加工袋或任何其他合适的容器内。此种容器中的CTLA4-Ig分子可以在冷冻前于2℃－8℃贮藏约60天。纯化的CTLA4-Ig于2℃－8℃的延长贮藏可以导致CTLA4-Ig四聚体的比例增加。因此，对于长期贮藏，CTLA4-Ig分子可以在贮藏之前冷冻于约-70℃且贮藏于约-40℃。冷冻温度可以从约-50℃－约-90℃变化。冷冻时间可以改变，并且很大程度上依赖于包含CTLA4-Ig分子的容器的体积和冷冻机中装载的容器的数目。例如，在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子在2-L瓶中。在冷冻机中装载小于4个2-L瓶可能需要约14－至少18小时的冷冻时间。至少4个瓶的装载可能需要约18－至少24小时的冷冻时间。具有冷冻的CTLA4-Ig分子的容器贮藏于约-35℃－约-55℃的温度。
于约-35℃－约-55℃的温度的贮藏时间可以改变并且可以短至18小时。冷冻的CTLA4-Ig分子可以以控制方式进行解冻。冷冻的CTLA4-Ig分子的解冻受到控制，且可以在培养箱中于约20℃－约24℃的温度来完成。解冻步骤的持续时间取决于培养箱的装载，其中小于4个2-L瓶的装载可能需要小于约24小时的解冻时间。4个2-L瓶的装载可能需要约18小时。包含CTLA4-Ig分子的解冻溶液可以进行混合，以避免可能的浓度梯度。因此，解冻可以在受控温度培养箱中来完成，所述受控温度培养箱还允许包含CTLA4-Ig的容器的振荡。振荡速度可以为约40－约80rpm。解冻的CTLA4-Ig分子可以以约3rpm的旋转速率进一步混合另外5－10分钟。解冻的CTLA4-Ig分子可以贮藏于2℃－8℃，在包含CTLA4-Ig 的药物组合物的生产期间进行层化(alequated)和冻干。
本发明可以进一步应用于以大规模生产的治疗糖蛋白的其他、非限制性例子的纯化。本发明的方法可以应用于在哺乳动物细胞培养物中具有超过一种糖基化变体的其他糖蛋白的生产。本领域技术人员将理解修饰在例示方法适应不同糖蛋白的生产的过程中可能变得必要。
制剂和试剂盒
本发明还提供了作为冻干混合物的任何所述CTLA4-Ig分子。包含待冻干的CTLA4-Ig的制剂可以进一步包含3种基本组分：(1)另外的一种或多种活性成分，包括其他重组蛋白质或小分子(例如免疫抑制剂)，(2)一种或多种赋形剂和(3)一种或多种溶剂。赋形剂包括药学上可接受的试剂，以提供良好的冻干饼性质(填充剂)以及提供在贮藏期间蛋白质的冷冻保护(lyoprotection)和/或超低温保护(“稳定剂”)、pH的维持(缓冲剂)、和蛋白质的正确构象，从而使得生物活性(包括活性成分稳定性，例如蛋白质稳定性)的基本保留得到维持。关于赋形剂，制剂的例子可以包括一种或多种缓冲剂、一种或多种填充剂、一种或多种蛋白质稳定剂和一种或多种抗微生物剂中的一种或多种。糖或多元醇可以用作在溶液中以及在冻融和冷冻干燥期间的非特异性蛋白质稳定剂。聚合物可以用于稳定在溶液中以及在冻融和冷冻干燥期间的蛋白质。一种普遍的聚合物是血清清蛋白，这已用作超低温保护剂和冷冻保护剂。在一个实施方案中，本发明提供了不含清蛋白的制剂。各种盐可以用作填充剂。举例说明性盐填充剂包括例如NaCl、MgCl2和CaCl2。某些氨基酸可以用作超低温保护剂和/或冷冻保护剂和/或填充剂。可以使用的氨基酸包括但不限于，甘氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、精氨酸和赖氨酸盐酸盐。包含广泛pH范围的许多缓冲剂在制剂中可用于选择。缓冲剂包括例如，乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸、磷酸盐(钠或钾)、二乙醇胺和Tris。缓冲剂包含在冻干前使溶液pH维持在可接受范围中的那些试剂。制剂先前已在于2005年12月20日提交的美国专利申请号60/752,150中得到描述，所述专利文件在此整体引入作为参考。
在一个实施方案中，本发明提供了包含至少90％、95％、99％或99.5％的CTLA4-Ig二聚体的冻干的CTLA4-Ig混合物。在一个实施方案中，本发明提供了冻干的CTLA4-Ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的CTLA4-Ig二聚体和不超过5％、4％、3％、2％或1％的CTLA4-Ig四聚体。在另一个实施方案中，本发明提供了冻干的CTLA4-Ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的CTLA4-Ig二聚体，和不超过5％、4％、3％、2％或1％的CTLA4-Ig四聚体，和不超过2％、1.5％、1.0％、0.8％、0.5％或0.3％的CTLA4-Ig单体。在进一步的实施方案中，本发明提供了冻干的CTLA4-Ig混合物，其包含至少8.0摩尔唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子。在另一个实施方案中，本发明提供了冻干的CTLA4-Ig混合物，其包含：约15－约35摩尔GlcNac/摩尔CTLA4-Ig分子或二聚体；约1－约5摩尔GalNac/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子；约5摩尔－约20摩尔半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子；约2－约10摩尔岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子；和/或约5－15摩尔甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或对CTLA4-Ig分子。
CTLA4A29YL104E-Ig药品可作为以约25mg/mL(22.5－27.5mg/mL)的浓度溶于在pH～7.5下的25mM磷酸钠和10mM氯化钠缓冲液中的水溶液利用。CTLA4A29YL104E-Ig在水溶液中具有形成高分子量种类的趋势。因此，开发了冷冻干燥产品，以使药物产品中可能形成的高分子量种类的水平降到最低。各种赋形剂例如麦芽糖、蔗糖和氨基酸例如L-精氨酸盐酸盐作为CTLA4A29YL104E-Ig的冷冻干燥期间可能的冷冻保护剂进行筛选。发现蔗糖是最有效的冷冻保护剂。进一步观察到增加蔗糖与蛋白质比改善蛋白质稳定性。选择2：1(wt.：wt.)的蔗糖：蛋白质比用于待冷冻干燥的蛋白质溶液。冷冻干燥的药物产品具有足够的稳定性和满意的构造行为。
治疗方法
根据本发明，由T细胞与B7阳性细胞的相互作用介导的疾病可以通过接受CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig的药学上可接受的制剂进行治疗。由工程改造的哺乳动物细胞系(例如，具有编码CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig的DNA的dhfr-阴性中国仓鼠卵巢细胞系)分泌的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子可以是具有特定糖基化概况的分子群体。如本文描述的，特定糖基化概况可以影响CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig与CD80和/或CD86的结合，从而使得CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子可以提供对T细胞活化和/或增殖更大的抑制。如本文描述的，特定糖基化概况可以受细胞系和生产方法的影响。因此，在本发明的某些实施方案中，本发明提供了在本文描述的生产方法中由细胞系生产的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子，以治疗T细胞介导的疾病或病症，其包括但不限于，一般地任何T细胞依赖性淋巴增生疾病或病症以及任何T细胞依赖性自身免疫疾病或病症，且更具体而言：T细胞淋巴瘤、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、睾丸血管中心性T细胞淋巴瘤、良性淋巴细胞性血管炎、移植物抗宿主病(GVHD)、与移植物移植排斥相关的免疫病症、牛皮癣、炎症、变态反应、卵巢炎、炎性肠病、肾小球肾炎、脑脊髓炎、Hashimoto氏甲状腺炎、Graves氏病、Addison氏病、Crohn氏病、Sjogren氏综合征、红斑狼疮、原发性粘液水肿、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、good pasture氏综合征、重症肌无力、天疱疮、多发性硬化、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、硬皮病、多肌炎和混合型结缔组织病。
本发明提供了所公开的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子中的任何一种在下述方法中的用途：用于抑制T细胞增殖或活化、在受试者中或在体外抑制免疫应答、和用于治疗受试者中的免疫病症或在受试者中诱导针对抗原的免疫耐受。免疫耐受是其中发展淋巴组织针对特定抗原的特异非反应性的免疫应答的类型，其中在不存在耐受的情况下，抗原能够诱导免疫应答。在一个实施方案中，本发明的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子和组合物可以用于治疗已接受移植的受试者，以诱导耐受，和减少排斥的可能性。在另一个实施方案中，移植是器官移植、组织移植或细胞移植。在另一个实施方案中，细胞移植包含骨髓细胞或胰岛细胞。
本发明提供了所公开的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子中的任何一种在制备用于治疗任何上述疾病或病症的药物中的用途。本发明还提供了所公开的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子中的任何一种与另一种试剂共施用用于治疗上述疾病或病症的用途。本发明的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子可以例如静脉内、皮下和/或通过吸入施用于受试者。可应用于静脉内或皮下施用的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig制剂在于2005年12月20日提交的美国系列号60/752,150中得到描述，所述专利文件在此整体引入作为参考。CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig制剂还可以包括基于脂质体的制剂，其中脂质体可以将CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子递送给靶细胞或组织。CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子还可以通过施用病毒载体递送给靶细胞或组织，所述病毒载体包含CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig基因表达盒。CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子群体的施用和剂量在公开为US20030083246和US20040022787的美国专利申请，以及于2005年4月6日提交的悬而未决的美国专利申请系列号60/668,774中得到描述，所述所有专利文件在此整体引入作为参考。
本文描述的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子可以为多种剂型，所述剂型包括但不限于，液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、栓剂、聚合微胶囊或微泡、脂质体和可注射或可输注的溶液。形式取决于施用模式和治疗应用。关于本发明的分子的有效施用模式和剂量方案取决于疾病的严重性和病程、受试者的健康和对治疗的应答以及治疗医生的判断。因此，分子的剂量应对个别受试者进行滴定。基于mg/m2表面积的关于各种大小和物种的动物与人的剂量相互关系由Freireich，E.J.等人(Quantitative Comparison of Toxicity ofAnticancer Agents in Mouse，Rat，Hamster，Dog，Monkey and Man.Cancer Chemother， Rep.，50，No.4，219-244，May 1966)进行描述。可以进行剂量方案中的调整，以最优化生长抑制应答。
剂量可以以每天的基础分开且进行施用，或剂量可以依赖于情况按比例减少。例如，几次分份剂量可以每天或每月进行施用，或剂量可以如由具体治疗情况指示的按比例减少。在一个实施方案中，施用是每月、每季、每天、1天2次、约每10小时、约每6小时、约每4小时、约每2小时、约1小时1次。依照本发明的实践，用于治疗受试者的有效量可以为约0.1－约10mg/kg受试者体重。同样，有效量可以是约1－约10mg/kg受试者体重的量。本发明的CTLA4-Ig或CTLA4A29YL104E-Ig分子还具有体内临床应用。它们可以用于在一些免疫缺陷状况的诊断或预后中B7阳性细胞的计数、白血病和淋巴瘤的表型分析、以及器官移植后免疫学改变的监控。
本文描述的组合物的递送可以经由注射、径口递送、喷雾剂或其他特定分散体的吸入、皮下注射、静脉内递送、局部递送、栓剂、眼递送、鼻或口递送来达到。组合物可以经由被囊化在脂质体或其他膜样递送媒介物中进行递送。组合物可以经由血液或其他流体进行递送，所述血液或其他流体先前用组合物进行处理且随后输液到受试者内。
序列表
SEQ ID NO：17是编码pcSDhuCTLA4Ig的核苷酸序列：
SEQ ID NO：18是人CTLA4的胞外结构域的氨基酸序列。
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
进一步的非限制性实施方案：
本发明提供了能够生产CTLA4-Ig的克隆中国仓鼠卵巢细胞群体。在一个实施方案中，细胞群体能够生产超过0.5或更多克CTLA4-Ig蛋白质/L液体培养物，且其中CTLA4-Ig在1,000L或更大的培养规模时显示约6－约14的唾液酸与CTLA4-Ig二聚体的摩尔比。在一个实施方案中，细胞群体已适应无血清、化学成分确知培养基。在另一个实施方案中，由细胞群体培养生产的CTLA4-Ig具有1.00±0.05AU mL cm-1 mg-1的消光系数。在进一步的实施方案中，当在培养物中生长时，细胞群体能够生产CTLA4-Ig多肽，其中：(a)约90％的CTLA4-Ig多肽包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(b)约10％的CTLA4-Ig多肽包含从残基26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(c)约4％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(d)约96％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和任选地，(e)约小于1％的CTLA4-Ig多肽包含从残基编号25处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
本发明提供了上文描述的细胞的后代细胞，其中所述后代细胞生产CTLA4-Ig。在一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少5代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少10代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少20代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少40代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少50代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少75 代而获得。在另一个实施方案中，后代细胞由培养细胞经过至少100代而获得。
本发明提供了由上文描述的细胞中的任何一种生产的细胞系。在一个实施方案中，细胞系是克隆的。在另一个实施方案中，细胞系能够生产：(a)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(b)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(c)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(d)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(e)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；或(f)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白。
在另一个实施方案中，细胞系能够生产CTLA4-Ig融合蛋白，其中：(a)约90％的CTLA4-Ig多肽包含从残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(b)约10％的CTLA4-Ig多肽包含从残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(c)约4％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，(d)约96％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；和任选地，(e)约小于1％的CTLA4-Ig多肽包含从残基编号25处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，由培养细胞系生产的CTLA4-Ig融合蛋白具有1.00±0.05AUmL cm-1 mg-1的消光系数。在一个实施方案中，本发明提供了衍生自本发明的细胞的细胞群体。在一个实施方案中，与最初转染的细胞相比较，细胞群体由至少一种另外的遗传改变组成，且其中衍生的细胞群体能够生产CTLA4-Ig。在其他实施方案中，与最初转染的细胞相比较，细胞群体由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26种另外的遗传改变组成，且其中衍生的细胞群体能够生产CTLA4-Ig。在一个实施方案中，遗传改变包含在细胞基因组或编码CTLA4-Ig的重组表达盒中的至少一种非保守突变。
在一个实施方案中，遗传改变包含细胞内的至少一种另外的重组核酸。在一个实施方案中，改变包含细胞基因组的突变。在一个实施方案中，改变包含给细胞基因组添加核酸或作为反式核酸，所述核酸编码抗细胞凋亡多肽。在一个实施方案中，抗细胞凋亡多肽涉及糖基化。
在一个实施方案中，遗传改变包含细胞基因组或编码CTLA4-Ig的重组表达盒的至少一种突变。在一个实施方案中，当在培养物中生长时，细胞群体能够生产：(a)具有SEQ IDNO：8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(b)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(c)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(d)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(e)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；或(f)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白。
本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约8－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约11－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约12－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约13－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约14－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约15－约17的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约16的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体。
本发明提供了其中超过95％的分子是CTLA4-Ig二聚体的CTLA4-Ig分子群体。在一个实施方案中，超过98％的分子是CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，超过99％的分子是CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，超过99.5％的分子是CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，约95％－约99.5％的分子是CTLA4-Ig二聚体，且约0.5％－约5％的分子是CTLA4-Ig四聚体。在一个实施方案中，约98.6％的分子是CTLA4-Ig二聚体，且约1.2％的分子是CTLA4-Ig四聚体，且约小于0.7％的分子是CTLA4-Ig单体。本发明提供了由CTLA4-Ig二聚体组成的群体。本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4-Ig单体的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了其中群体基本上不含CTLA4-Ig四聚体的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了基本上不含CTLA4-Ig二聚体和四聚体的CTLA4-Ig单体分子群体。在一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少3个唾液酸基团。
在一个实施方案中，每种CTLA4-Ig二聚体的每个单体具有至少3个唾液酸基团－至少8个唾液酸基团。本发明提供了CTLA4-Ig四聚体分子的纯化群体，所述群体基本上不含CTLA4-Ig二聚体，且任选地，其中所述群体包含超过约100克的量。本发明提供了CTLA4-Ig四聚体分子的纯化群体，所述群体基本上不含CTLA4-Ig单体，且任选地，其中所述群体包含超过约100克的量。在一个实施方案中，每个四聚体分子包含2对CTLA4-Ig多肽，其中每个多肽具有选自SEQ ID NOS：3－8的氨基酸序列，且其中多肽对的每个成员与另一个成员共价连接，且其中2对多肽彼此非共价结合。在一个实施方案中，每个四聚体分子能够与CD80或CD86结合。在一个实施方案中，与CTLA4-Ig二聚体分子相比较，每个四聚体分子具有对于CD80或CD86的至少2倍的较大抗体亲抗原性。在一个实施方案中，与CTLA4-Ig二聚体分子相比较，每个四聚体分子具有至少2倍的较大T细胞增殖或活化抑制。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述组合物包含在CTLA4-Ig的等电聚焦凝胶上可视的优势同工型，如通过等电聚焦测定的，所述同工型具有小于或等于5.1的等电点，pI。在一个实施方案中，pI在神经氨酸酶处理后增加。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少40％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.1的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少70％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.1的等电点。在一个实施方案中，如通过等电聚焦测定的，至少90％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约2.5的等电点。本发明提供了具有约2.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约4.3±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了具有约3.3±0.2－约4.7±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体。本发明提供了用于制备组合物的方法，所述组合物包含具有约2.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子，所述方法包括：(a)对CTLA4-Ig分子的混合物实施等电聚焦凝胶电泳，其中在凝胶上的单个条带表示具有特定pI的CTLA4-Ig分子群体，和(b)分离具有约2.0±0.2－约5.0±0.2的pI的CTLA4-Ig分子群体，以便制备组合物。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约17－约25的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约7.2－约22的甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子的特征在于约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a) 约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；和(b)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；和(c)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；和(d)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；和(e)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；和(f)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比。
本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述组合物显示约9.589+/-0.3的NGNA层析谱峰，和约10.543+/-0.3的NANA层析谱峰。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子显示如图7中所示的碳水化合物概况。本发明提供了包含CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述CTLA4-Ig分子显示结构域I－IV的碳水化合物概况，其中结构域I包含代表无唾液酸化的寡糖的峰，结构域II包含代表单唾液酸化的寡糖的峰，结构域III包含代表双唾液酸化的寡糖的峰，且结构域IV包含代表三唾液酸化的寡糖的峰。在一个实施方案中，结构域I中的第一个峰和结构域II中的主峰之间N联寡糖的保留时间中的差异为约22－约28分钟。本发明提供了包含CTLA4-Ig二聚体分子的组合物，其中至少0.5％的CTLA4-Ig二聚体分子是半胱氨酰化的。在另一个实施方案中，至少1.0％的CTLA4-Ig二聚体分子是半胱氨酰化的。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中所述群体显示如图8和10中所示的质谱法概况。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中所述群体显示如图20和21中所示的毛细管电泳概况。本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子的组合物，其中CTLA4-Ig二聚体由商业细胞系的细胞生产。本发明提供了通过本发明的任何方法获得的CTLA4-Ig组合物。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中所述分子在下述残基上是糖基化的：SEQ ID NO：2的第102位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：2的第134位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：2的第233位处的天冬酰胺氨基酸残基，SEQ ID NO：2的第155位处的丝氨酸氨基酸残基，或SEQ ID NO：2的第165位处的丝氨酸氨基酸残基。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中所述分子群体的特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(f)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(g)如由等电聚焦凝胶上可视化测定的，约2.4±0.2－约5.0±0.2的pI；(h)小于或等于5ppm的MCP-1；(i)小于2.5％的四聚体；(j)小于0.5％的单体；(k)具有与SEQ ID NOS：2－8中的任何一个至少95％等同的氨基酸的群体的CTLA4-Ig多肽；(l)其中群体内的CTLA4-Ig分子能够与CD80和CD86结合。本发明提供了CTLA4-Ig分子的群体，其中所述分子群体的特征在于：(a)约15－约35的GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(b)约1.7－约3.6的GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(c)约8－约17的半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(d)约3.5－约8.3的岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(e)约7.2－约22的甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(f)约6－约12的唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比；(g)如由等电聚焦凝胶上可视化测定的，约2.4±0.2－约5.0±0.2的pI；(h)小于或等于5ppm的MCP-1；(i)小于2.5％的四聚体；(j)小于0.5％的单体；(k)具有与SEQ ID NOS：2－8中的任何一个至少95％等同的氨基酸的群体的CTLA4-Ig多肽；(l)其中群体内的CTLA4-Ig分子能够与CD80和CD86结合；或其药学等价物。本发明提供了包含有效量的CTLA4-Ig分子和药学上可接受的载体的组合物。本发明提供了包含有效量的CTLA4-Ig分子的组合物，其中所述组合物进一步包含一定量的麦芽糖一水合物。在一个实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。在一个实施方案中，组合物进一步包含麦芽糖、一代磷酸钠一水合物、氯化钠、氢氧化钠和无菌水。在一个实施方案中，组合物进一步包含蔗糖、泊洛沙姆、一代磷酸钠一水合物、无水二代磷酸钠、氯化钠、氢氧化钠和无菌水。
本发明提供了冻干的CTLA4-Ig混合物，其包含至少95％的CTLA4-Ig二聚体和不超过5％的CTLA4-Ig四聚体。在一个实施方案中，混合物包含至少98％的CTLA4-Ig二聚体和不超过2％的CTLA4-Ig四聚体。在一个实施方案中，混合物包含至少99％的CTLA4-Ig二聚体和不超过1％的CTLA4-Ig四聚体。在一个实施方案中，混合物包含至少8.0摩尔唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，混合物包含约15.7－约31摩尔GlcNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，混合物包含约1.6－约3.2摩尔GalNAc/摩尔CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，混合物包含约9.3－约15.5摩尔半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，混合物包含约3.6－约7.9摩尔岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体。在一个实施方案中，混合物包含约9.7摩尔甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体。本发明还提供了药物试剂盒，其包含：(a)包含权利要求1的冻干的CTLA4-Ig混合物的容器；和(b)用于将冻干的CTLA4-Ig混合物重构成用于注射的溶液的说明书。
本发明提供了用于抑制T细胞增殖(或活化)的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的CTLA4-Ig组合物接触。本发明提供了用于抑制受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的组合物。本发明提供了通过给受试者施用治疗疾病或病症的量的本发明组合物，用于诱导受试者中针对抗原的免疫耐受、治疗受试者中的炎症、治疗类风湿性关节炎、治疗受试者中的牛皮癣、治疗受试者中的狼疮、治疗或预防受试者中的变态反应、治疗或预防受试者中的移植物抗宿主病、治疗或预防受试者中的移植器官排斥、治疗受试者中的多发性硬化、治疗受试者中的I型糖尿病、治疗受试者中的炎性肠病、治疗受试者中的卵巢炎、治疗受试者中的肾小球肾炎、治疗受试者中的变应性脑脊髓炎、或治疗受试者中的重症肌无力的方法。组合物可以与药学上可接受的载体组合。本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体在制备用于免疫病症的治疗和/或预防性处理的药物中的用途。本发明提供了具有约6－约18的唾液酸基团与CTLA4-Ig二聚体的平均摩尔比的CTLA4-Ig分子群体在制备抗类风湿性关节炎剂中的用途，所述抗类风湿性关节炎剂连同关于其在类风湿性关节炎治疗中的用途的说明书一起在包装中。本发明提供了用于抑制T细胞增殖(或活化)的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的本发明的组合物接触，所述组合物与氨甲蝶呤组合。本发明提供了用于抑制受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的组合物，所述组合物与氨甲蝶呤组合。本发明提供了用于诱导受试者中针对抗原的免疫耐受的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的权利要求1－64中任一项的组合物，所述组合物与氨甲蝶呤组合。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物，其中重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质。在一个实施方案中，步骤(a)的扩增包含：(i)在无血清、化学成分确知培养基中将细胞培养至少4代，以便获得至少约1.0x105活细胞/mL的细胞密度，其中每个种子阶段以约2x105/ml开始且进行至1－2百万细胞/ml；(ii)使细胞在培养物中维持足以由培养物生产至少约0.5g/L的时间。在一个实施方案中，蛋白质是糖蛋白。在一个实施方案中，蛋白质是CTLA4-Ig蛋白质。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是后代细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是能够生产CTLA4-Ig融合蛋白的CHO克隆细胞系的后代，其中CHO细胞具有稳定整合在其基因组中的CTLA4-Ig表达盒的至少30个拷贝。在一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到30％以下的时间。在一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到40％以下的时间。在一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到50％以下的时间。在一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到60％以下的时间。在一个实施方案中，足够的时间是细胞的生存力不降到70％、或80％或90％或95％以下的时间。在一个实施方案中，至少4次传代包含：(i)在至少50mL的培养体积中培养细胞，直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度，(ii)在至少10L的培养体积中培养细胞，直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度；(iii)在至少100L的培养体积中培养细胞，直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度；和(iv)在200L的培养体积中培养细胞，直至达到约1百万－约2.5百万细胞/ml的细胞密度。在一个实施方案中，将半乳糖加入无血清、化学成分确知培养基中。在一个实施方案中，维持包含(i)使培养物的温度从37±2℃降至34±2℃；和(ii)使培养物的温度从34±2℃降至32±2℃。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少5天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少6天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少7天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少8天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少9天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少10天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少11天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少12天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少13天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少14天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少15天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少16天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少17天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内至少18天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内最高达18天。在一个实施方案中，温度维持在32±2℃的范围内，直至培养物的细胞密度为约30x105－约79x105细胞/mL液体培养物。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在液体培养物包含大于或等于约6.0摩尔NANA/摩尔蛋白质时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在液体培养物具有约33x105－约79x105细胞/mL的细胞密度时发生。
本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离在液体培养物中的细胞生存力不降到约20％、或约30％、或约38％以下时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在内毒素小于或等于约76.8EU/mL液体培养物时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在生物负荷小于1集落形成单位/mL液体培养物时发生。本发明提供了用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：(a)从种子培养物到至少10,000L的液体培养物扩增分泌重组蛋白质的哺乳动物细胞，从而使得重组蛋白质浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离重组蛋白质，其中所述分离仅在满足下述条件中的至少2个时发生：(i)液体培养物包含大于或等于约6.0摩尔NANA/摩尔蛋白质，(ii)液体培养物具有约33x105－约79x105细胞/mL的细胞密度，(iii)液体培养物中的细胞生存力不降到约20％、或约38％以下，或(iv)培养物中的CTLA4-Ig的量大于0.5g/L。在一个实施方案中，分离包含：(i)获得细胞培养物上清液；(ii)对上清液实施阴离子交换层析，以获得洗脱的蛋白质产物；(iii)对步骤(ii)的洗脱的蛋白质产物实施疏水作用层析，以便获得富集的蛋白质产物；(iv)对富集的蛋白质产物实施亲和层析，以获得洗脱且富集的蛋白质产物；和(v)对(iv)的洗脱且富集的蛋白质产物实施阴离子交换层析。在一个实施方案中，步骤(iii)中获得的富集的蛋白质产物的特征在于任何高分子量多聚体的百分比小于25重量％。在一个实施方案中，步骤(ii)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约75mM HEPES和约360mM NaCl，且具有约8.0的pH。在一个实施方案中，步骤(ii)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约25mM HEPES和约325mM NaCl，且具有约7.0的pH。在一个实施方案中，步骤(iii)的疏水作用层析使用单一洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约850mMNaCl，且具有约7.0的pH。在一个实施方案中，步骤(iv)的亲和层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM Tris和约250mM NaCl，且具有约8.0的pH。在一个实施方案中，步骤(iv)的亲和层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约100mM甘氨酸，且具有约3.5的pH。在一个实施方案中，步骤(v)的阴离子交换层析使用洗涤缓冲液来进行，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约120mM NaCl－约130mM NaCl，且具有约8.0的pH。在一个实施方案中，步骤(v)的阴离子交换层析使用洗脱缓冲液来进行，所述洗脱缓冲液包含约25mMHEPES和约200mM NaCl，且具有约8.0的pH。在一个实施方案中，步骤(ii)的阴离子交换层析使用具有阴离子交换树脂的柱来进行，所述阴离子交换树脂具有伯、仲、叔或季胺官能团。在一个实施方案中，树脂具有季胺官能团。在一个实施方案中，步骤(iii)的疏水作用层析使用疏水作用树脂来进行，所述疏水作用树脂具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或异戊基官能团。在一个实施方案中，官能团是苯基官能团。在一个实施方案中，步骤(iv)的亲和层析使用包含A蛋白的柱来进行。在一个实施方案中为用于制备CTLA4-Ig的方法，所述方法包括从液体细胞培养物纯化CTLA4-Ig，从而使得纯化的CTLA4-Ig(a)具有约38ng MCP-1/mgCTLA4-Ig二聚体，和(b)包含少于2.5重量％CTLA4-Ig四聚体。
在一个实施方案中，液体细胞培养物包含本发明的细胞或后代细胞。本发明提供了用于生产CTLA4-Ig的方法，所述方法包括：(a)扩增能够生产CTLA4-Ig的任何商业细胞系或CHO细胞的后代细胞，其中所述扩增是从种子培养物到至少10,000L的液体培养物，其中CTLA4-Ig浓度为至少0.5克/L液体培养物；和(b)从至少10,000L的液体培养物中分离CTLA4-Ig，其中层析在具有疏水作用树脂的柱上，所述疏水作用树脂具有至少一种苯基官能团，其中所述分离包含使用单一洗涤缓冲液来进行疏水作用层析的步骤，所述洗涤缓冲液包含约25mM HEPES和约850mM NaCl，且具有约7.0的pH。
本发明的实施例
下文提供了许多实施例以促进本发明的更完全理解。下述实施例举例说明了制备和实践本发明的示例性方式。然而，本发明的范围不限于这些实施例中公开的具体实施方案，其仅用于举例说明性目的，因为可替代的方法可以用于获得类似结果。
下述实施例涉及包含SEQ ID NOS：2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中的一种或多种的序列的CTLA4-Ig分子。这些实施例不意欲是限制性的，并且本领域技术人员理解实施例可以扩展且适合例如其他CTLA4-Ig分子、其他糖蛋白、和涉及或包含Ig超家族蛋白质的部分的其他蛋白质。
下表阐述了涉及CTLA4-Ig和CTLA4A29YL104E-Ig的实施例。
缩写：
15N 15纳米
A280 在280nm处的吸光度
CTLA4-Ig 细胞毒性T淋巴细胞抗原-4免疫球蛋白；CTLA-4Ig
API 活性药物成分
AU 吸光度单位
B7 CTLA-4受体配体
cfu 集落形成单位
CHO 中国仓鼠卵巢
CHOP 中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白质
CV 柱体积
药品充填 药品浓度/渗滤和充填步骤
ELISA 酶联免疫吸附测定
EU 内毒素单位
Fc 抗体恒定区
GalNAc N-乙酰半乳糖胺
GlcNAc N-乙酰葡糖胺
HEPES 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸
HIC 疏水作用层析；Phenyl SepharoseTM Fast Flow
HMW 高分子量
HPLC 高效液相层析
IgG1 G1 类免疫球蛋白
IPC 过程中控制
LAL 鲎变形细胞溶解物
MBR(s) 主批记录(s)
MCP-1 单核细胞趋化蛋白1
MTX 氨甲蝶呤
MW 分子量
N/A 不可用
NANA N-乙酰神经氨酸；唾液酸；SA
NMWC 标称分子量截断
OD 光密度
PAR 证明可接受的范围
Planova 病毒去除过滤器，孔径15nm
PP (s)加工参数
PQ 性能评定
psi 磅/平方英寸
psid 压差(磅/平方英寸)
psig 表压(磅/平方英寸)
QFF Q SepharoseTM Fast Flow
QXL Q Sepharose Extreme Load
rPA 重组A蛋白琼脂糖快速流动(Recombinant Protein A Sepharose FastFlow)
SA 唾液酸；N-乙酰神经氨酸；NANA
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
SOP 标准操作程序
Tris 三(羟甲基)氨基甲烷
Triton X-100 叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；聚乙二醇叔辛基苯基醚
UF 超滤
UV 紫外线
v/v 容积比
VF 病毒过滤；纳米过滤
VI 病毒灭活
实施例1：质粒pcSDhuCTLA4-Ig中的CTLA4-Ig编码序列的证实
pcSDhuCTLA4-Ig中存在的CTLA4-Ig基因的注解核酸序列和相应推导的CTLA4-Ig氨基酸序列显示于图1中。将pcSDhuCTLA4-Ig核酸转染到CHO细胞内，以产生可以表达CTLA4-Ig分子的稳定转染子(参见实施例12)。转染子进行筛选，并且某些转染子进行亚克隆或扩增以产生克隆细胞系。
DNA序列数据分析证实在质粒构建期间产生的连接为如设计的，并且聚合酶链反应中使用的合成寡核苷酸引物产生CTLA4-Ig序列上游的正确的制瘤素M信号序列。融合蛋白的铰链区中的所需半胱氨酸至丝氨酸变化(在SEQ ID NO：2的第156、162和165处)得到证实。这些氨基酸残基在图1中以粗体与星号指明。还检测到在SEQ ID NO：2的第174位处的脯氨酸至丝氨酸的另外氨基酸变化。这种变化在IgG1 cDNA合成期间由聚合酶链反应引入。这个氨基酸残基也在图1中以粗体与星号指明。
当与人CTLA4和人IgG1恒定区的公开的核苷酸序列比较时，DNA序列数据分析鉴定1种另外的差异。在CTLA4编码区的氨基酸110处的密码子鉴定为ACC(苏氨酸)而不是GCC(丙氨酸)。
实施例2：CTLA4-Ig制剂
用于注射、250mg/小瓶的CTLA4-Ig组合物是用于静脉内(IV)施用的无菌、无致热原亲液物。CTLA4-Ig分子的群体包装在15-cc I型火石制管玻璃小瓶中。每个小瓶用20-mmDaikyo灰色丁基D-21-7-S/B2-TR氟树脂包被的塞子塞住，并且用20-mm铝、白色、翻开式(flip-off)封口进行密封。
每个单次使用的小瓶包含250mg CTLA4-Ig组合物，其由无菌注射用水，USP构成，并且在使用时用0.9％氯化钠注射液，USP进一步稀释。用于注射、250mg/小瓶的CTLA4-Ig组合物，以及每种组分的功能在下表中列出。
表8：CTLA4-Ig组合物
表8：CTLA4-Ig组合物
b这些组分存在于CTLA4-Ig组合物溶液中
CTLA4-Ig组合物包含溶于在pH 7.5下的25mM磷酸钠缓冲剂和50mM氯化钠的约50mg/mL CTLA4-Ig。在早期开发期间，基于根据pH、缓冲剂类型、缓冲剂浓度和氯化钠浓度而变的CTLA4-Ig的物理和化学稳定性的评估，选择这种缓冲系统。CTLA4-Ig溶液的稳定性在pH范围5－9中进行研究。结果指出高分子量种类的形成是pH依赖性的，并且最大稳定性的pH范围为7－8。在分开的测定中，评估缓冲剂类型和浓度的作用，其中发现CTLA4-Ig组合物在pH 8的磷酸钠或tris缓冲剂中同样稳定。此外，10－100mM浓度的缓冲剂浓度对在2℃－8℃下的CTLA4-Ig组合物的稳定性没有任何影响。类似地，30－500mM浓度的氯化钠的存在对贮藏于2℃－8℃的CTLA4-Ig组合物的溶液状态稳定性没有影响。
基于这些结果，选择以10mg/mL溶于在pH 7.5下的25mM磷酸钠缓冲剂和50mM氯化钠的CTLA4-Ig组合物，用于以50mg/小瓶强度的制剂。CTLA4-Ig浓度随后在相同缓冲剂组合物中变成50mg/mL，以允许开发具有200-和250mg/小瓶强度的CTLA4-Ig组合物。
用于注射的CTLA4-Ig用麦芽糖加上磷酸钠缓冲液和氯化钠进行配制。在这种产品中使用的赋形剂的功能在上表中列出。
无机盐例如氯化钠和磷酸钠缓冲液组分的存在降低冷冻系统的玻璃化转变温度(Tg’)。此外，在pH 7.5下原位形成的二代磷酸钠在冷冻期间经历优先结晶，这降低冷冻溶液的微环境pH。基于这些原因，选择最小量的氯化钠和磷酸钠缓冲液，以使其对冻干过程的影响降到最低。麦芽糖作为稳定剂进行添加，它在药物产品的冻干期间和后续贮藏时分别充当超低温和冷冻保护剂。用于注射、250mg/小瓶的CTLA4-Ig组合物是不含抗微生物防腐剂的无菌、单次使用小瓶。
实施例3：CTLA4-Ig组合物的碳水化合物含量分析
该方法的目的是提供CTLA4-Ig N联寡糖的层析概况。这种程序可以用于获得CTLA4-Ig样品中N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)与蛋白质的摩尔比(总体结合的加游离的)。NANA和NGNA是唾液酸的2种形式。CTLA4-Ig蛋白质上的糖基化包含N联寡糖。例如，这些寡糖可以通过用PNGase F酶促水解经过22小时的过程得到释放。游离寡糖使用高pH阴离子交换层析利用电化学检测进行概况分析。关于N联寡糖的碳水化合物概况使用具有脉冲电流检测的高pH阴离子交换层析(HPAEC-PAD)进行评估。这些概况得到证实，且结构信息使用与MS偶联的多孔石墨化碳(PGC)层析来获得。技术和结果在这个部分中得到描述。这种程序对于SEQ ID NO：的CTLA4-Ig为例示的。
N联寡糖分离：天冬酰胺连接的(N联)寡糖与CTLA4-Ig的切割通过酶促水解使用PNGase F来进行。为了执行去糖基化，CTLA4-Ig首先进行还原和变性：溶于包含0.5％SDS和1％β-巯基乙醇的176μL 5mM磷酸钠缓冲液的1－2mg CTLA4-Ig于100℃加热2分钟，随后允许冷却至环境温度。向冷却的混合物中添加16μL10％NP-40。使样品充分混合，并且添加40μL PNGase F(50,000U/mL，溶于50mM磷酸钠缓冲液)。使样品充分混合，并且于38℃温育24小时。酶促释放的寡糖(聚糖)通过反相高效液相层析(HPLC)进行纯化，其中使用与ThermoHyperCarb柱(4.6x100mm；5μL)偶联的Phenomenex Luna C18柱(4.6x150mm；5μL)以1.0mL/分钟的流速；用于分离的层析仪是配备Waters 2996检测器的Waters Alliance 2695。柱首先用0.05％三氟乙酸(TFA)进行平衡。注射样品后，起始乙腈梯度，在15分钟时用溶于12％乙腈的0.05％TFA的溶剂组合物终止。聚糖随后用至溶于60％乙腈的0.05％TFA的分级梯度从HyperCarb柱中洗脱。在通过在206nm处的UV吸光度监控时收集聚糖，且在真空中浓缩至干燥。在后续注射前，Luna C18柱用溶于40％乙腈、40％异丙醇、20％水的0.05％TFA进行清洁。
NANA贮存液(N-乙酰神经氨酸)(1mg/mL)的制备。重要事项：在称量前，允许NANA标准加温至室温。不这么做将导致标准中的水冷凝。仅打开足以获得所需量的时间，随后使瓶再次紧紧密封且送回冷冻机，与干燥剂一起贮藏。精确地称量3－10mg N-乙酰神经氨酸。记录至最接近0.1mg。如果称量使用称量纸/碟来完成，那么转移至合适大小的容器。添加足够量的HPLC等级水以产生浓度1mg/mL的溶液。用搅棒或通过涡旋混合直至溶解。在聚丙烯管中贮藏于2－8℃最多3个月。
NAGA贮存液(N-羟乙酰神经氨酸)(1mg/mL)的制备。重要事项：在称量前，允许NAGA标准加温至室温。不这么做将导致原液中的水冷凝。仅打开足以获得所需量的时间，随后使瓶再次紧紧密封且送回冷冻机，与干燥剂一起贮藏。精确地称量3－10mg(记录至最接近0.1mg N-羟乙酰神经氨酸。记录至最接近0.1mg。如果称量使用称量纸/碟来完成，那么转移至合适大小的容器。添加足够量的HPLC等级水以产生靶浓度1mg/mL的溶液。用搅棒或通过涡旋混合直至溶解。在聚丙烯管中贮藏于2－8℃最多3个月。
系统适合性溶液。在合适的容器中将0.050mL 1mg/mL NANA和NGNA贮存液各自加入0.900mL HPLC等级水中。通过涡旋混合。贮藏于2－8℃最多3个月。N-乙酰神经氨酸工作溶液(0.050mg/mL)。精确地测量0.050mL 1mg/mL NANA贮存液且加入0.950mL HPLC等级水中。通过涡旋混合。在使用时一式两份地制备。N-羟乙酰神经氨酸工作溶液(0.050mg/mL)。精确地测量0.050mL 1mg/mL NGNA贮存液且加入0.950mL HPLC等级水中。通过涡旋混合。在使用时一式两份地制备。
样品和水解空白的制备。根据分析证明书(COA)获得关于CTLA4-Ig材料的蛋白质浓度。通过将0.190mL HPLC等级水加入1.5mL微量离心管中制备水解空白的单个样品。使用HPLC等级水制备样品和CTLA4-Ig参考材料的2种1mg/mL溶液。通过涡旋混合。
样品、CTLA4-Ig参考材料和水解空白的水解。对在1.5mL微量离心管中的一式两份参考材料和样品制剂进行水解。注：使用完全适合加热块的微量离心管很重要。将0.010mL1M H2SO4加入0.190mL样品和CTLA4-Ig参考材料的1mg/mL稀释物以及水解空白对照中。通过涡旋混合并且通过盖锁(lid-lock)或胶带紧固盖子。将微量离心管置于80℃±2℃加热块中1小时±2分钟。温育后，从加热块中取出管，将管置于微型离心机中且旋转以促使样品至管的底部。将水解溶液等分试样到自动进样小瓶内，且置于自动进样器中用于注射。
仪器条件。准备高效液相层析(HPLC)系统。设置下述条件。在0.6mL/分钟的流速和40℃的温度下使柱平衡至少1小时。
系统适合性。用流动相的注射作为仪器空白对照开始分析以评估系统基线，所述基线应是平坦和稳定的。如果基线并不平坦和稳定，那么应制备另外的空白注射。注：基线移动不应超过0.25AU。执行系统适合性溶液的6次重复注射。计算分辨率(R)和理论塔板(N)。
使用第一次系统适合性注射，使用下面方程式计算理论塔板数(N)：
理论塔板数→
其中
N＝理论塔板计数
t＝NANA峰的保留时间，以分钟表示
W＝基线处的NANA峰宽，以分钟表示
计算CTLA4-Ig参考材料和样品中的NANA和NGNA摩尔。NANA和NGNA标准在每次运行开始和结束时注射。对NANA和NGNA的重复注射的面积计数求平均值。在下面方程式中使用这种面积：
阿巴西普参考材料或样品中的NANA或
X＝在部分7.3.1中计算的工作溶液中的NANA或NGNA摩尔
Y＝关于每种制剂在阿巴西普参考材料或样品中的NANA或NGNA面积计数(注：关于NANA整合的峰参见部分7.2和图3)
Z＝在工作溶液中重复的NANA或NGNA的平均面积
在一个实施方案中，NGNA和NANA峰之间的分辨率必须>1.3。理论塔板计数必须>或＝4000。评估为NANA峰的面积计数％RSD的系统适合性注射重现性必须≤3％。理论塔板计数必须≥4000。评估为NANA峰的面积计数％RSD的系统适合性注射重现性必须≤3％。
通过具有脉冲电流检测的高pH阴离子交换层析(HPAEC-PAD)的N联寡糖概况分析：分离的寡糖的HPAEC在由配备Waters 464电化学检测器的Waters Alliance组成的层析系统上进行，其利用Dionex CarboPack PA1(4x250mm)阴离子交换柱和Dionex CarboPack保护柱。寡糖样品使用溶于200mM氢氧化钠的乙酸钠梯度进行洗脱(乙酸钠浓度从注射时的0mM增至在60分钟时的225mM)。电化学检测器在脉冲模式下运行，使用脉冲电压E1＝0.05V(t1＝0.4秒)，S＝0.75V(t2＝0.2秒)，E3＝-0.15V(t3＝0.4秒)。检测盒(cell)由金工作电极、不锈钢对电极和银/氯化银参比电极组成。
这种方法描述了测定从CTLA4-Ig样品中的蛋白质释放的N联寡糖的HPAEC(高pH阴离子交换层析)寡糖概况的程序。该方法的目的是提供CTLA4-Ig的层析概况，例如可以用于CTLA4-Ig分子的不同组合物之间的比较分析的CTLA4-Ig药品N联寡糖。CTLA4-Ig蛋白质上的糖基化包含N联寡糖。这些寡糖通过用PNGase F(肽：N-糖苷酶F)酶促水解经过22小时的过程得到释放。游离寡糖使用高pH阴离子交换层析利用电化学检测进行概况分析。
药品的寡糖概况针对同时运行的参考材料的样品进行评估。结果报告为选择的结构域和峰与参考标准中的相同峰的百分比偏差。
通过阴离子交换层析的寡糖概况的层析条件
Waters 2465设置
注：在进行注射前用最初流动相以分析流速使柱和检测器平衡约2小时，或直至基线稳定。
自动进样器温度设为：
4℃
注射体积 60μL
运行时间 100分钟
每个结构域中的占优势峰的
大约保留时间(RT；分钟)
(参见图1)；值可以依赖于系统
适合性(SS)标准的RT而变
用于HPAEC寡糖碳水化合物概况分析的流动相的制备
HPAEC洗脱剂1：500mM乙酸钠(NaOAc)。称量20.51±0.05g乙酸钠(无水)，置于包含400mL HPLC等级水的500mL量筒内。用HPLC等级水使体积达到500mL，并且使用塑料血清学移液管搅拌5分钟直至完全混合。通过0.2μm尼龙滤器过滤溶液。转移至1L洗脱剂瓶。将瓶松散地盖上盖子并且用氦喷射20分钟。盖紧盖子并且用氦使瓶加压。将溶液在氦下贮藏于室温最多3周。
HPAEC洗脱剂2：400mM氢氧化钠(NaOH)。使用1L量筒，测量960mL HPLC等级水且转移至干净的1L洗脱剂瓶。使用血清学塑料移液管，将40.0mL 10N NaOH直接加入洗脱剂瓶内，且通过回荡混合洗脱剂。将瓶松散地盖上盖子并且用氦喷射20分钟。盖紧盖子并且用氦使瓶加压。将溶液在氦下贮藏于室温最多3周。
HPAEC洗脱剂3：HPLC等级水。用约1L HPLC等级水装满1L洗脱剂瓶。将洗脱剂瓶置于系统上，松散地盖上盖子并且喷射约20分钟。盖紧盖子并且用氦使瓶加压。将溶液在氦下贮藏于室温最多3周。
50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5。
NaH2PO4·H2O 6.9g
Na N3 0.2g
H2O 1.0L最终体积
称出6.9g±0.1g NaH2PO4·H2O和0.2g NaN3，且溶解于在1L试剂瓶中的800mLHPLC等级H2O中，其中使用磁性搅拌棒的连续混合。使用pH计，使用10M NaOH将溶液的pH调整至7.5。使用1L量筒使最终体积达到1.0L。溶液贮藏于室温最多6个月。
溶于50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5的PNGase F酶工作溶液。
50mM磷酸钠缓冲液
0.02％叠氮化钠，pH＝7.5. 1.8mL
来自试剂盒，目录号P0704L的PNGase F 0.2mL
将1.8mL 50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5移液到1.8mL深低温小瓶内。添加来自试剂盒的0.2mL PNGase F且充分混合。溶液贮藏于-20℃或更低最多6个月。溶液可以在冷冻前进行等分试样。
外部系统适合性标准。水苏糖贮存液(1.25mg/mL)。在称量纸上称量0.125g水苏糖。使用分析天枰且转移至100mL容量瓶。用HPLC等级水充填至标记且充分混合。以2mL部分等分试样到Nalgene冷冻小瓶内。溶液贮藏于-20℃或更低最多6个月。
水苏糖系统适合性标准(12.5μg/mL)。将1mL 1.25mg/mL原液移液到100mL容量瓶内。用HPLC等级水充填至标记且充分混合。以200μL部分等分试样到0.65mL微量离心管内。将管置于适当标记的贮藏箱中。系统适合性溶液贮藏于-20℃或更低最多6个月。
标准和样品制备
参考材料制备。向包含1mg冻干的RapiGest SF的小瓶中加入包含0.02％叠氮化钠，pH7.5的625μL 50mM磷酸钠缓冲液。向0.65mL Eppendorf管中加入120μL包含缓冲液的RapiGest SF。添加40μL参考材料(～50mg/mL)。RapiGest SF终浓度应为0.12％w/v。添加40μL PNGase F工作原液，充分混合，使样品向下旋转，且置于38±2℃22±2小时(水浴或Alliance自动进样器区室)。将样品移液到microcon YM-10离心滤器内，且在13,000g下离心30分钟。将200μL HPLC水置于滤器中，且通过在13,000g下离心另外30分钟漂洗到滤液内。使组合的滤液涡旋15秒，且使样品离心10秒。使用移液管将所得到的溶液(～380μL)转移至HPLC总回收自动进样器小瓶(条目1.15)。
样品制备。向0.65mL Eppendorf管中加入120μL包含缓冲液的RapiGest SF。添加40μL蛋白质样品(这个体积应等于1－2mg CTLA4-Ig)。RapiGest SF终浓度应为0.12％w/v。添加40μL PNGase F工作原液，通过涡旋10秒充分混合。使样品向下旋转，且置于38±2℃22±2小时(水浴或Alliance自动进样器区室)。将样品移液到microcon YM-10离心滤器内，且在13,000g下离心30分钟。将200μL HPLC水置于滤器中，且通过在13,000g下离心另外30分钟漂洗到滤液内。使组合的滤液涡旋15秒，且使样品离心10秒。使用移液管将所得到的溶液(～380μL)转移至总回收HPLC自动进样器小瓶(条目1.15)。
系统适合性
电化学检测器盒稳定化。注射30μL外部水苏糖系统适合性标准(12.5μg/mL)。确保关于水苏糖的峰高≥800nA。确保不存在来自盒的过量电噪声且基线平坦。代表性系统适合性层析谱显示于图2中。如果水苏糖灵敏度或基线不可接受，那么检查缓冲液组成，清洁电极或替换电极。如果存在过量噪声，那么检查盒以确保去除所有气泡。使盒再稳定化且再次注射水苏糖标准。
理论塔板(N)。使用下式基于水苏糖峰测定理论塔板数(N)。这通过Empower数据分析系统来完成或还可以手工完成。N＝16(t/W)2，其中
T：在最大高度时从注射时间到峰洗脱时间测量的保留时间
W：通过侧面至基线外推的峰宽。
N必须≥6000。如果板计数小于6000，那么调整运行梯度或替换柱。
拖尾因子(T)。使用下式基于水苏糖峰测定柱拖尾因子(T)。这通过Empower数据分析系统来完成或还可以手工完成。T＝(W0.05/2f)，其中：
W0.05：高度5％(0.05h)时的峰宽。
f：从W0.05时的峰前面边缘到峰顶点的测量(宽度)。
T必须≤1.2。如果拖尾因子大于1.2，那么检查缓冲液组成，替换柱或按指示清洁柱，并且再次注射系统适合性标准。
水苏糖系统适合性标准保留时间验证。保留时间是系统依赖性的。水苏糖系统适合性标准应显示出18.5±2.0分钟的保留时间。CTLA4-Ig标准材料。观察来自在注射样品前注射的第一种一起进行的(bracketing)参考材料的碳水化合物概况。碳水化合物概况应类似于图1中所示的那种。绝对保留时间是系统依赖性的。确定结构域I中的第一个峰(峰1A)和结构域III中的主峰(峰3)之间的保留时间中的差异为22分钟至28分钟。如果峰的轮廓不象图1中获得的那种，那么采取合适的动作(例如，检查仪器功能、清洁柱、检查/替换缓冲液、替换柱)且再次评估。下述程序可以用于清洁柱：关闭盒且用80％洗脱剂1、20％洗脱剂2将柱清洁5分钟，随后为50％洗脱剂1、50％洗脱剂2清洁10分钟。在初始条件下使柱和盒(盒打开)再次平衡，且再次评估。
注射顺序
如下设置分离的寡糖的注射顺序：
水苏糖标准(30μL)
参考材料(60μL)
一种或多种样品(60μL)
参考材料(60μL)
推荐≤5种样品在一起进行的参考材料注射之间运行。
数据分析
处理层析谱。在Empower中处理关于参考材料和样品的层析谱。设定整合参数，从而使得峰轮廓和基线类似于图76中所示的那种，整合线可能需要手工安放。执行关于显示的相对结构域面积和相对峰面积的计算。如果进行重复注射，那么测定关于CTLA4-Ig材料和每种样品的这些参数的平均值。对于参考材料，测定关于每次重复的结构域I、II、III、峰1A和1B就所有重复的平均值而言的相对偏差。
样品概况与参考材料概况的比较。目测比较。测定样品和参考材料是否具有相同数目的结构域和主要峰。主要峰是图76中标记的那些峰(峰1A、1B、1C、1D、2、3和4)。相对定量比较。比较样品的相对面积(结构域I、II和III以及峰1A和1B；如果进行样品的重复注射，那么使用其平均值)与来自一起进行的CTLA4-Ig注射的平均相对面积。测定来自平均CTLA4-Ig材料值的这些面积的相对差异。计算－％结构域面积(相对结构域面积)。计算关于参考材料和样品的概况的结构域的％结构域面积。关于结构域面积的模式参考图76。根据图76中的例子，通过使用下述信息和式计算结构域百分比比例(保留时间是系统依赖性的且反映图76中的结果)：
结构域I：在大约保留时间18－24分钟时的峰面积的总和(峰1A－1E)
结构域II：来自26－38分钟的峰的总和
结构域III：来自39－50分钟的峰的总和
结构域IV：来自51－64分钟的峰的总和
结构域V：来自65－75分钟的峰的总和
注：关于结构域的保留时间窗将根据每日层析性能中的变化而变动。相应地调整时间。
对于结构域I－III，如果进行重复注射，那么同样计算一起进行的参考材料注射以及样品中的平均值。
％峰面积(相对峰面积)。计算关于参考材料和样品的概况的峰1A、1B、1C和3的％峰面积。关于峰面积的模式参考图1；保留时间是系统依赖性的。通过使用下述信息和式计算峰百分比比例：
对于峰1A和1B中的每一个，如果进行重复注射，那么同样计算一起进行的参考材料注射以及样品中的平均值。根据参考材料平均值计算百分比差异。使用下式以计算与参考材料相比较，样品的结构域I－III、峰1A和1B的平均相对面积中的百分比差异：
％Diff＝|RM-S|/RM x 100
其中：
RM＝关于参考材料的目的相对面积平均值
S＝关于样品的目的相对面积平均值
| |＝绝对值
示例值。对于可接受的运行，必须符合示例值，并且与样品相关的所有注射必须已成功地发生。此外，对于每次一起进行的参考材料注射，关于结构域I、II和III的％结构域面积以及关于峰1A和1B的％峰面积必须在其平均值的15％内。
通过HPAEC-PAD分析：N联寡糖与CTLA4-Ig分子切割且通过HPAEC-PAD进行分析。基于存在的唾液酸的量寡糖洗脱成4种结构域。结构域基于寡糖标准的迁移进行确定并且通过MS加以证实。结构域I代表无唾液酸化的种类。结构域II、III和IV分别代表单、双和三唾液酸化的种类。为了表征在3个N联位点上的寡糖结构，个别地分离肽T5、T7和T14(关于这些肽的特性参考表59)。这使用CTLA4-Ig的胰蛋白酶消化，并且手工收集对应于这3种肽的峰来进行。
分离的肽用PNGase F进行处理以释放寡糖，所述寡糖随后进行纯化且通过HPAEC-PAD进行分析。因为由于其极端疏水性而难以纯化，所以肽T5无法产生良好的概况。由于在胰蛋白酶消化后这种肽从反相层析步骤中的低回收，所以切割的寡糖的量低。
表59.理论上预期和观察到的CTLA4-Ig的质量
表59(续).理论上预期和观察到的CTLA4-Ig的质量
NO未检测到
NE根据胰蛋白酶消化未预料到(这些质量根据消化、非特异性切割未预料到)。
a胰蛋白酶肽T5、T7和T14具有N联糖基化。列出的质量是无糖基化的肽的那种。
b胰蛋白酶肽T8和9具有O联糖基化。列出的质量是无糖基化的肽的那种。
c观察到对应于糖基化肽的不同糖形的几种不同质量。
关于来自CTLA4-Ig和3种肽的所有N联碳水化合物的HPAEC-PAD概况显示于图55A－D中。小图A显示CTLA4-Ig分子的N联寡糖概况，而小图B、C和D分别显示关于T5、T7和T14的概况。关于每种肽注射的寡糖的量由于制备方法而不同。在肽T5上检测到的大多数寡糖由单和双唾液酸化的寡糖组成。T7的概况主要包含单、双以及一些无和三唾液酸化的聚糖种类。在T5上仅能检测到少量三唾液酸化的结构。肽14由占优势地无唾液酸化的寡糖以及少量单和双唾液酸化的寡糖组成。
通过HPAEC-PAD获得的结果提供了关于位点特异性N联糖基化的信息。来自CTLA4-Ig的CTLA4区的N联寡糖包含比来自CTLA4-Ig的Fc区的那些更大比例的唾液酸化种类。
CTLA4-Ig的胰蛋白酶、Asp-N和胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶肽作图：CTLA4-Ig在包含6M胍和5mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM Tris缓冲液(pH 8.0)中进行变性和还原。于50℃温育20分钟后，加入碘乙酰胺(IAA)至10mM的终浓度以使游离硫醇烷基化，并且于50℃在黑暗中继续温育另外20分钟。将还原和烷基化的混合物加载到脱盐柱(Amersham NAP-5)上，随后用50mM Tris，10mM CaCl2，pH 8.0或50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5洗脱至空体积。脱盐后，还原/烷基化的CTLA4-Ig使用2种不同的蛋白酶进行消化：胰蛋白酶或Asp-N。对于胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶消化，CTLA4-Ig既不还原也不烷基化。
对于胰蛋白酶消化，添加序列等级胰蛋白酶(Roche，2％，w/w，酶/蛋白质)且于37℃温育4小时。对于Asp-N消化，添加序列等级Asp-N(Roche，4％，w/w，酶/蛋白质)且于37℃温育16小时。对于胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化，添加序列等级胰蛋白酶(Promega，4％，w/w，酶/蛋白质)且于37℃温育4小时，随后添加a-胰凝乳蛋白酶(Sigma，4％，w/w，酶/蛋白质)且于37℃温育16小时。所有样品在消化后置于冷冻机中。
所得到的肽混合物在Waters Alliance HPLC Workstation上以0.120mL/分钟通过从Waters AtlantisTM dC18柱(2.1x250mm)中梯度洗脱进行分离。柱与配备离子喷射源的Waters Micromass Q-Tof microTM质谱仪直接连接用于收集质谱。肽混合物同样在Varian Polaris C18柱(4.6x250mm)上以0.7mL/分钟使用相同的HPLC工作站进行分离。柱用溶剂A(溶于水的0.02％TFA)进行平衡，并且肽通过溶剂B(95％乙腈/0.02％TFA，溶于水)的渐增浓度进行洗脱。后柱分流器阀用于将15％的流量导向以正TOF模式(m/z 100-2000)运行的Q-Tof工作站。使用的一般离子喷射电压为3000V。
通过MS的CTLA4-Ig分析：CTLA4-Ig用100mM Tris，25mM NaCl，pH 8稀释至0.7mg/mL的终浓度。PNGase F(New England Biolabs)用100mM Tris，25mM NaCl，pH 8稀释30倍至17U/μL的终浓度。将等体积(各60μL)的稀释的纯化发酵样品和稀释的糖苷酶溶液混合且于37℃温育4小时。
将所得到的去糖基化的CTLA4-Ig(2μg)加载到基于聚合物(聚苯乙烯和聚N-乙烯基-2-吡咯烷酮的共聚物)的Waters反相萃取柱体柱(2.1x20mm)上。加载的柱用5％溶剂B(溶剂A：溶于水的1％甲酸，溶剂B：溶于乙腈的1％甲酸)以0.2mL/分钟的流速洗涤5分钟以脱盐，其中使洗脱剂转向废物。在5分钟结束时，快速梯度(在10分钟内5％溶剂B至95％溶剂B)开始从柱中洗脱CTLA4-Ig；此处在流动分流(使用的层析系统是配备Waters2996检测器的Waters Alliance 2695)后以45μL/分钟将洗脱剂导入质谱仪(WatersMicromass Q-Tof microTM)内。
关于Q-Tof microTM的毛细管电压设为3kV，并且样品锥电压为40V。在每0.9秒中的扫描平均成1次扫描；扫描间时间为0.1秒。Q-Tof分析仪从m/z 800扫描至2500。对应于高于半最大峰高(在TIC层析谱中)的部分的谱使用Waters MassLynxTM软件进行组合。对组合的谱实施Waters MaxEnt1去褶合。分辨率设为1Da/通道，且选择一致的高斯(Gaussian)损害模型，其中半高度处的宽度设为0.5－1Da。关于左峰和右峰的最小强度比都设为50％。
使用多孔石墨化碳(PGC)通过液相层析/质谱法(LC/MS)的N联寡糖分析：分离的寡糖在多孔石墨化柱(Thermo Hypercarb；4.6x100mm)上进行分离，其中使用配备Waters2996光电二极管阵列检测器的Waters Alliance 2695 HPLC系统。寡糖分离使用渐增的溶于0.05％TFA的乙腈比例的2阶段梯度来达到。在梯度的第一个阶段中，乙腈百分比从注射时的9.6％到80分钟时的24％。在梯度的第二个阶段中，乙腈百分比从80分钟时的24％到110分钟时的60％。自始至终使用0.2mL/分钟的流速。洗脱流通过在206nm处的UV检测进行监控且通过质谱法进行分析，其中使用Waters MicroMass Q-Tof microTM用于质量鉴定。
通过LC/MS PGC法的碳水化合物分析：通过蛋白质的去糖基化的寡糖分离通过酶促水解使用PNGase F(New England Biolabs，Beverly，MA)来进行。对于去糖基化，溶于包含0.15％(w/v)Rapigest SF(Waters Corporation)的160μL 50mM磷酸钠缓冲液的1－2mg糖蛋白通过于100℃加热2分钟进行变性。使冷却的溶液混合，且添加40μL PNGase F(50,000U/mL，溶于50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5)。样品进行涡旋随后于38℃温育24小时。酶促释放的寡糖通过高效液相层析进行纯化。反相液相层析在与Thermo HyperCarb 5μL(4.6x100mm，Phenomenex，Torrance，CA)偶联的Phenomenex LunaC18柱(4.6x150mm，Phenomenex，Torrance，CA)上以1.0mL/分钟的流速来进行。柱在注射前用0.05％三氟乙酸(TFA)进行平衡。样品注射(150μL消化混合物)后，起始乙腈梯度，在15分钟时和溶于12％乙腈的0.05％TFA溶剂组成下终止。聚糖随后通过用溶于60％乙腈的0.05％TFA洗涤从HyperCarb柱中洗脱。聚糖通过在206nm处的UV吸光度进行检测。收集从Hypercarb洗涤中洗脱的峰且在真空中浓缩至干燥。在后续注射前，Luna C18柱用溶于40％乙腈、40％异丙醇、20％水的0.05％TFA进行清洁。
分离的寡糖用PGC的概况分析
用于分离的寡糖的PGC层析的系统由配备Waters 2996光电二极管阵列检测器的Waters Alliance组成，其中使用Hypercarb柱(2.1x100mm)。寡糖样品使用乙腈梯度进行洗脱。
酸性流动相洗脱：溶于0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈梯度。渐增乙腈的2阶段梯度用于寡糖的层析分离。从注射时的9.6％到80分钟时的24％增加乙腈体积百分比的起始线性梯度随后为从80分钟时的24％到110分钟时的60％乙腈增加乙腈体积百分比的第二个梯度。梯度自始至终使用0.15ml/分钟的流速。洗脱流在206nm处用Waters UV检测器进行监控，随后为Micromass Q-Tof Micro用于质量鉴定。关于EST探针的离子化参数如下设定：毛细管电压＝3kV，锥电压＝45V，源温度80℃，和175℃的去溶剂化温度。
碱性流动相洗脱：溶于0.4％氢氧化铵(NH4OH)的乙腈梯度用于寡糖的层析分离。以0.15mL/分钟的流速从注射时的10.4％到150分钟时的28％增加乙腈体积百分比的线性梯度用于产生概况。洗脱流在206nm处用Waters UV检测器进行监控，随后为Micromass Q-Tof Micro用于质量鉴定。关于EST探针的离子化参数如下设定：毛细管电压＝3kV，锥电压＝45V，源温度80℃，和175℃的去溶剂化温度。
寡糖消化混合物用PGC的直接概况分析：用于寡糖消化混合物的PGC层析的系统由装配Luna C18和Hypercarb多孔石墨柱(4.6x100mm，Thermo)的Waters Alliance组成。该系统与Waters 2996光电二极管阵列检测器和Q-ToF Micro(Micromass)接合。蛋白质的去糖基化通过酶促水解使用PNGase F来进行。对于去糖基化，溶于包含0.15重量％Rapigest SF(Waters Corporation)的160μL 50mM磷酸钠缓冲液的1－2mg糖蛋白通过于100℃加热2分钟进行变性。使冷却的溶液充分混合，且添加40μL PNGase F(50,000U/mL，溶于50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5)。样品进行混合且随后于38℃温育24小时。酶促释放的寡糖通过高效液相层析进行概况分析。反相液相层析在与Thermo HyperCarb柱5μL(4.6x100mm)偶联的Phenomenex Luna 5|uC18柱(4.6x150mm)上以1.0mL/分钟的流速来进行。柱用0.05％三氟乙酸(TFA)进行平衡。样品注射(150|i消化混合物)后，起始乙腈梯度，在11分钟时和溶于9％乙腈的0.05％TFA溶剂组成下终止。柱切换用于分离hypercarb柱，并且聚糖随后用渐增乙腈百分比的线性梯度从Hypercarb柱中洗脱。使用从注射时的9％到160分钟时的36％增加乙腈百分比的线性梯度。第二个梯度涉及从160分钟时的36％到170分钟时的60％乙腈增加乙腈体积百分比。洗脱梯度自始至终使用0.15mL/分钟的流速。聚糖通过在206nm处的UV吸光度进行检测，且通过MS扫描400－3000m/z的质量范围。MS参数设为下述值：毛细管3kV，锥45V。在后续注射前，Luna C18柱用溶于40％乙腈、40％异丙醇、20％水的0.05％TFA进行清洁。
通过多孔石墨化碳层析的分析：来自结构域I－IV的寡糖的结构使用与MS偶联的多孔石墨化碳层析(PGC)进行研究。N联寡糖如在先前HPAEC-PAD部分中所述的从CTLA4-Ig中进行分离且纯化。寡糖使用具有UV检测器的Hypercarb(PGC)柱，随后为Q-TOF ESI/MS进行分析。关于通过PNGase F消化从CTLA4-Ig中释放的N联寡糖的PGC概况显示于图56中，其中结构域被注明。洗脱顺序与在HPAEC-PAD中观察到的那种相同。获得的结构显示于表60中。
表60. CTLA4-Ig中检测到的N联寡糖结构和质量
表60(续).CTLA4-Ig中检测到的N联寡糖结构和质量
在结构域I中，鉴定了6个峰，对应于3种无唾液酸化的寡糖(结构P2100、P2110、P2120)。预测结构和观察到的质量之间113道尔顿的质量差异是由于三氟乙酸(TFA)加合物的检测。对应于P2100的具有1,463相同质量的不同峰指出它们可能是不同的异头物。
在结构域II中，鉴定了6个峰，对应于3种双触角和三触角的寡糖(分别为结构P2111、P2121和P3131)，各自包含1个唾液酸残基(N-乙酰神经氨酸，NANA)。
在结构域III中，鉴定了6个峰，对应于3种双触角、三触角和四触角的寡糖(分别为结构P2122、P3132和P4142)，各自包含2个唾液酸残基(NANA)。
在结构域IV中，鉴定了2个峰，对应于3种三触角和四触角的寡糖(结构P3133和P4133)，各自包含3个唾液酸残基(NANA)。
通过CTLA4-Ig分子的酸水解处理的摩尔唾液酸与摩尔CTLA4-Ig分子或二聚体的 摩尔比测量(参见图25和26)：在这种方法中，NANA和NGNA通过酸水解与蛋白质切开。释放的NANA和NGNA通过HPLC在Rezex Monosaccharide RHM柱上进行分离，且通过UV吸光度(206nm)进行检测。NANA和NGNA基于同时运行的NANA和NGNA标准的响应因子进行定量。测试结果分别报告为NANA和NGNA与蛋白质的摩尔比(MR)。这种测定确定结合和未结合的唾液酸的摩尔总数。
在测定中使用的试剂、仪器配置和层析条件：1M硫酸H2SO4(原液)和5mM H2SO4流动相运行缓冲液；1mg/ml NANA标准溶液；1mg/ml NGNA标准溶液。Alliance层析系统－具有整合的自动进样器的Waters Corporation 2695Separations Module；Rezex单糖RHM柱－8微米，7.8x300mm，Phenomenex，配备7.8x50mm保护柱，Phenomenex；检测器——WatersCorporation 996光电二极管阵列检测器或Waters Corporation 2487双波长吸光度检测器。层析参数：流量——0.600mL/分钟；流动相——5mM H2SO4；注射体积——5μL；靶浓度——1mg/ml；运行时间——25分钟；柱温——40℃；自动进样器温度——4℃；波长－206nm；保留时间NANA(系统依赖性的)－10.8分钟(+或–1分钟)，保留时间NGNA(系统依赖性的)－9.8分钟(+或–1分钟)。
系统适合性标准：将50μL各1mg/mL NANA和NGNA加入合适的容器中的900μL H2O。贮藏于4℃最多3个月；N-乙酰神经氨酸工作标准(0.05mg/mL)；N-羟乙酰神经氨酸工作标准(0.05mg/mL)。
样品和CTLA4-Ig标准材料的水解：样品和CTLA4-Ig标准材料在H2O中稀释至1mg/mL用于水解。CTLA4-Ig样品和CTLA4-Ig标准材料通过将10μL 1M H2SO4加入190μL 1mg/mL稀释的样品和CTLA4-Ig中进行水解。水解在1.5mL微量离心管中一式两份地进行。盖子通过盖锁或胶带得到紧固。管通过涡旋进行混合且置于80℃加热块中1小时。温育后，从加热块中取出管，于室温冷却3分钟，且置于离心机中用于快速旋转，以使样品收集至管的底部。从管中将50μL水解溶液等分试样到样品小瓶内，所述样品小瓶置于冷却的自动进样器中用于注射。通过向1.5mL微量离心管中的190μL水加入10μL 1M H2SO4将水解空白制备为单个制剂。空白与样品一样进行加工。
系统适合性：为了检查系统适合性，注射系统适合性标准的6次重复注射(各5μL)随后为水解空白(5μL)的1次注射。使用最后1次系统适合性标准注射，分别计算分辨率(R)，可接受的值高于1.3，和理论塔板(N)，可接受的理论塔板计数必须为至少4000。使用最后5次系统适合性重复，计算NANA计数的重现性，并且评估水解空白。
分辨率：使用最后1次系统适合性标准注射，使用下面方程式计算峰分辨率：R＝2(T2-T1)/(W2+W1)，其中R是分辨率，T2是NANA峰(峰2)的保留时间，T1是NGNA峰(峰1)的保留时间，W2是描绘的与峰2侧面相切的线的基线处的宽度，W1是描绘的与峰1侧面相切的线的基线处的宽度。图25描绘一般的系统适合性注射。
理论塔板(N)：使用最后1次系统适合性标准注射，使用下面方程式计算理论塔板计数(N)：N＝16(RT2/W)，其中N是理论塔板计数，RT是以分钟表示的NANA峰的保留时间，W是描绘的与NANA峰侧面相切的线的基线处的宽度。
系统适合性标准的最后5次注射用于计算关于NANA的平均面积计数及其标准差。相对标准差等于或小于3％。水解空白不含具有NANA和NGNA的保留时间的任何显著峰。
注射顺序：注射NANA和NGNA工作标准的各1次注射，随后为水解的CTLA4-Ig样品材料(一式两份的样品)，随后为水解的CTLA4-Ig材料。CTLA4-Ig运行完全后，注射NANA和NGNA工作标准的各1次注射。
为了测定工作标准中注射的NANA或NGNA摩尔，使用下面方程式：摩尔NANA或NGNA＝(C)(P)(I)/MW，其中C是工作标准中的NANA和NGNA浓度，P是标准的纯度，I是注射体积，MW是分子量(关于NANA为309.2g/摩尔，和关于NGNA为325.3g/摩尔)。
为了测定CTLA4-Ig样品中的NANA和NGNA摩尔，使用下面方程式：样品中的摩尔NANA或NGNA＝(X)(Y)/Z，其中X是NANA和NGNA的工作标准中的摩尔数，Y是CTLA4-Ig样品中的NANA和NGNA的平均计数，Z是工作标准中一式两份的NANA和NGNA的平均面积。根据一式两份注射的标准，NANA和NGNA标准的面积计数必须具有小于10％RSD。
为了测定每种样品中注射的量，使用下面方程式：摩尔蛋白质＝(C)(D)(I)/MW，其中C是以g/ml表示的CTLA4-Ig二聚体浓度(得自UV分析)，D是关于水解的稀度(0.95)，I是注射体积(0.005ml)，和MW是如根据质谱法测定的CTLA4-Ig二聚体的分子量(92,439g/mol)。
NANA或NGNA与CTLA4-Ig蛋白质的摩尔比(MR)通过下面方程式进行计算：MR＝A/B，其中A是NANA或NGNA的摩尔数，和B是CTLA4-Ig分子或二聚体的摩尔数。
唾液酸、NANA和NGNA与CTLA4-Ig蛋白质的摩尔比(MR)通过下面方程式进行计算：MR＝(A+B)/C，其中A是NANA的摩尔数，B是NGNA的摩尔数，和C是CTLA4-Ig分子或二聚体的摩尔数。一式两份的CTLA4-Ig样品和CTLA4-Ig标准材料在关于NANA的摩尔比中必须具有小于10％RSD。
通过测量唾液酸含量的水解法测定的应答的线性：就0.5μg/mL(～0.1％标称NANA标准＝NANA～QL)－98.7μg/mL(-200％标称NANA标准)的NANA标准浓度而言，NANA应答证实为线性。对于5.0μg/mL(-10％标称NGNA标准)－82.0μg/mL(-160％标称NGNA标准)的NGNA标准浓度，NGNA应答证实为线性。
就0.25mg/mL(25％标称CTLA4-Ig负荷)－2.0mg/mL CTLA4-Ig(200％标称CTLA4-Ig负荷)的蛋白质浓度而言，来自水解的CTLA4-Ig材料的NANA应答证实为线性。对于0.25mg/mL(25％标称CTLA4-Ig负荷)－2.0mg/Mlctla4-Ig 200％标称CTLA4-Ig负荷)的蛋白质浓度，来自水解的CTLA4-Ig材料的NGNA应答证实为线性。
测量唾液酸含量的水解法的精确性：精确性对于掺和NANA或NGNA标准的CTLA4-Ig材料(1mg/mL)进行证实。
测量唾液酸含量的水解法的精度：验证实验证实跨越不同样品制剂、不同天数、不同仪器和不同分析员(关于NANA的％RSD<6％，关于NGNA的％RSD<12％)的仪器精度(％RSD<3％)、关于样品制剂的可重复性(％RSD<4％)和重现性。NANA和NGNA摩尔比分别在报告结果的10％和20％范围内视为精确的。
测量唾液酸含量的水解法的范围：关于这种测定的工作范围显示为0.49mg/mL－3.87mg/mL CTLA4-Ig材料。
测量唾液酸含量的水解法的检测极限(DL)：使用光电二极管阵列检测器(PDA；HPLC系统1)对于NANA和NGNA标准的个别DL值分别为0.464μg/mL和0.402μg/mL；使用双波长检测器(HPLC系统2)对于NANA和NGNA的个别DL值分别为0.131μg/mL和0.111μg/mL。对于2种唾液酸种类和基于最不灵敏的检测器的使用，该方法DL对于NANA和NGNA为0.5μg/mL。
测量唾液酸含量的水解法的定量极限(QL)：使用光电二极管阵列检测器(PDA；HPLC系统1)对于NANA和NGNA标准的个别QL值分别为1.68μg/mL和1.52μg/mL；使用双波长检测器(HPLC系统2)对于NANA和NGNA的QL值分别为0.48μg/mL和0.41μg/mL。对于2种唾液酸种类和基于最不灵敏的检测器的使用，该方法QL对于NANA和NGNA为1.7μg/mL。
耐久性/坚固性：关于样品48小时冷冻的溶液稳定性、不同柱的使用、不同NANA和NGNA批次的使用、以及具有±5％浓度改变的流动相的使用，该方法证实为坚固的。
IEF凝胶电泳：糖蛋白的pI也可以在用神经氨酸酶处理以去除唾液酸之前和之后进行测量。神经氨酸酶处理后pI中的增加指出糖蛋白上唾液酸的存在。IEF凝胶可以用于测定等电点、CTLA4-Ig同工型的数目。用于运行IEF凝胶的合适系统是Multiphore IIElectrophoresis System，和pH 4.0－6.5的IEF凝胶(Amersham Biosciences)。阳极缓冲液具有下述组成：溶于0.5M磷酸的0.1M谷氨酸。阴极缓冲液具有下述组成：0.1Mβ-丙氨酸。IEF凝胶在恒定功率(25瓦)和电流(25mAmps)下进行预聚焦直至电压达到≥300V。装载IEF校正标准和合适浓度的样品，并且凝胶在恒定功率(25瓦)和电流(25mAmps)下运行，使用最大值2000V，运行2.5小时。IEF凝胶固定和考马斯蓝染色后，蛋白质条带通过光密度计显现。CTLA4-Ig二聚体制剂的一般IEF凝胶显示于图11中。
实施例4：CTLA4-Ig的单链(单体)的分离和表征
天然单链CTLA4-Ig的制备：通过本发明的方法制备的CTLA4-Ig 重组蛋白质的样品通过非变性SEC使用2695 Alliance HPLC(Waters，Milford，MA)，在串联的2个21.5x300mm TSK G3000SWXL制备型柱(Tosoh Bioscience，Montgomery，PA)上进行分离。样品以～50mg/mL的30次注射(各1.0mL)在等度条件下进行分离，其中使用由0.2MNaH2PO4，0.9％NaCl，pH 7.0组成的流动相，以1.0mL/分钟的流速。样品在280nm的吸光度下使用Water's 2996 PDA检测器进行监控。分析使用Waters Millennium 4.0TM和EmpowerSoftware来进行。在Foxy 200自动化级分收集器上从90到150分钟收集级分(各1.0mL)。合并级分16－39(以105mL开始和以129mL结束)并且使用具有3500MW的截止的centricon浓缩器进行浓缩。
样品(以～4mg/mL的2.0mL)在变性条件下使用HiLoad 26/60 Superdex 200制备级柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)以2.0mL/分钟的等度流速进行进一步层析，其中使用在pH 6.0下的200mM NaH2PO4，6.0M盐酸胍作为在(AmershamBiosciences)上的流动相。收集级分12－16，合并，使用HiPrep 26/10脱盐柱(AmershamBiosciences)缓冲液更换为200mM NaH2PO4，pH 6.0，并且最终浓缩。
诱导的单链CTLA4-Ig的制备：诱导的单链CTLA4-Ig通过CTLA4-Ig重组蛋白质的变性、还原和烷基化进行制备，所述CTLA4-Ig重组蛋白质通过本发明的方法进行制备。将盐酸胍(0.684g)称量到1.5mL Eppendorf离心管内，并且添加512μL 200mM NaH2PO4，pH 6.0且进行涡旋，直至盐酸胍完全溶解。CTLA4-Ig重组蛋白质通过将238μL CTLA4-Ig材料(浓度：50mg/mL)加入上述管内进行变性且进行涡旋，从而导致溶于6.0M盐酸胍的～10.0mg/mL的CTLA4-Ig终浓度。变性的蛋白质通过添加2.6μL 1.0M DTT和于37℃温育90分钟进行还原。还原的蛋白质随后通过下述进行烷基化：将0.047g碘乙酰胺固体加入样品混合物内，随后涡旋，且于37℃在黑暗中温育60分钟。样品(对于每次注射以～4.0mg/mL的2.0mL)在变性条件下使用HiLoad 26/60 Superdex 200制备级柱以2.0mL/分钟的等度流速进行层析，其中使用在上在pH 6.0下的200mM NaH2PO4，6.0M盐酸胍。收集所得到的单链级分(9－12)，合并，在HiPrep 26/10脱盐柱上缓冲液更换为200mM NaH2PO4，pH 6.0，并且浓缩。
天然和诱导的单链CTLA4-Ig的MALDI-TOF质谱法分析：单链样品(20μL)进行脱盐且用C4ZipTips(Millipore，Billerica，MA)进行浓缩，随后用具有由芥子酸饱和的0.1％TFA的20μL80％乙腈进行洗脱。将混合物(1.0μL)点在MALDI样品板的孔上，且在置于质谱仪中之前允许其风干。MALDI-MS谱在OmniFlex质谱仪(Bruker Daltonics，MA)上使用氮激光器(337nm)来获得。样品以反射、正离子模式通过延迟的萃取进行分析，其中使用20kV的加速电压和200ns的延迟时间。对于每种样品加总总共250个单射谱(single-shot spectia)。使用胰蛋白酶原(23982m/z)、A蛋白(44613m/z)和牛清蛋白(66431m/z)的混合物达到外部校准。
使用变性(胍HCl)尺寸排阻层析的单链分析：来自在时程过程中不同点上收集的细胞培养物生长的CTLA4-Ig上清液制备用于HPLC分析。样品通过下述进行制备：在0.65mLEppendorf微量离心管中称量0.114g盐酸胍(Mallinckrodt Baker Inc.)；添加125uL时程CTLA4-Ig样品，且涡旋以使胍HCl完全溶解。随后立即加入1.8uL 250mM碘乙酰胺且混合，并且于37℃温育30分钟。
具有TSK柱保护(SWXL，6.0mm ID x 4.0cm)的串联G3000SWXL尺寸排阻柱(7.8mm ID x 30cm)用于在具有2996光电二极管阵列检测器的Waters 2695分离模块上进行的单链SEC分析。将25μL每种样品注射到用200mM磷酸钠、6.0M盐酸胍pH 6.0作为流动相平衡的柱上。蛋白质在柱上以0.5mL/分钟的流速进行分离，并且所得到的层析谱经过60分钟窗进行收集。个别峰(单体，单链，等)的整合和定量使用Empower Pro软件来进行。为了确保HPLC系统正确工作，注射还对流动相、蛋白质样品缓冲液、系统适合性标准、以及样品注射之前和之后的目前CTLA4-Ig材料进行。计算关于系统适合性标准层析谱的峰分辨率和板计数。
CTLA4-Ig单链通过LC/MS肽分析的半胱氨酰化分析：CTLA4-Ig在包含6M胍和5mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中进行变性和还原。于50℃温育20分钟后，加入碘乙酰胺(IAM)至10mM的终浓度以使游离硫醇烷基化，并且于50℃在黑暗中继续温育另外20分钟。将还原和烷基化的混合物装载到脱盐柱(Amersham，NAP-5)上，随后用50mM Tris，10mM CaCl2，pH 8.0或50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5洗脱至空体积。脱盐后，还原/烷基化的CTLA4-Ig使用2种不同的蛋白酶进行消化：胰蛋白酶或Asp-N。还对无还原和烷基化的CTLA4-Ig材料实施胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化。
对于胰蛋白酶消化，添加序列等级胰蛋白酶(Roche，2％，w/w，酶/蛋白质)且混合物于37℃温育4小时。对于Asp-N消化，添加序列等级Asp-N(Roche，2％，w/w，酶/蛋白质)，并且混合物于37℃温育16小时。对于胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化，添加序列等级胰蛋白酶(Promega，4％，w/w，酶/蛋白质)，并且混合物于37℃温育4小时，随后添加a-胰凝乳蛋白酶(Sigma，4％，w/w，酶/蛋白质)，并且混合物于37℃温育16小时。所有样品在消化后进行冷冻(-20℃)。
所得到的肽混合物在Waters Alliance HPLC Workstation上以0.12mL/分钟通过从Waters AtlantisTM dC18柱(2.1x250mm)中梯度洗脱进行分离。柱与配备离子喷射源的Waters Micromass Q-Tof microTM质谱仪直接连接用于收集质谱。肽混合物同样在VarianPolaris C18柱(4.6x250mm)上以0.70mL/分钟使用相同的HPLC工作站进行分离。柱用溶剂A(溶于水的0.02％TFA)进行平衡，并且肽通过溶剂B(95％乙腈/0.02％TFA，溶于水)的渐增浓度进行洗脱。后柱分流器阀用于将15％的流量导向以正TOF(飞行时间)模式(m/z 100-2000)运行的Q-Tof工作站。使用的一般离子喷射电压为3000V。
在还原后113±4u的损失暗示存在对蛋白质的共价二硫键修饰。关于半胱氨酰化预测的变动是119.14u。然而，在单链种类还原后预期111.14u的实际质量损失。119.14u的损失起因于半胱氨酸的去除，且8u的获得起因于8个链内半胱氨酸(SEQ ID NO：2的Cys47 、74、92、118、197、157、303、361)还原后8个质子的添加。因此，在完整质量上的另外113±4u对应于用半胱氨酸氨基酸的半胱氨酰化。最可能进行修饰的半胱氨酸是Cys146，因为基于完整的MALDI数据，链间二硫键在单链种类中不存在。使用LC/MS肽分析以检查包含Cys146的肽，发现还原和非还原材料显示与单链材料不同的保留时间和质量。为了证实半胱氨酰化，收集包含Cys146的单链肽并且用MALDI进行分析。
收集的包含Cys146的峰具有1787.48u的质量，与对于具有Cys146的半胱氨酰化的肽预测的1787.51u质量一致(图27，小图A)。这种肽在实施还原后损失119.11u，与119.14u的预测损失一致；半胱氨酸的丢失(图27，小图B)。该材料随后用碘乙酰胺进行进一步处理，产生56.99u的变动，与预测的57.03u质量获得一致(图27，小图C)。
实施例5：处理单体或多聚体CTLA4-Ig制剂
培养基和培养基组分对单链制剂的激动作用：不同培养基和培养基组分的激动作用就单链形成进行测定。CTLA4-Ig分子可以在37℃下与各种培养基和个别培养基组成成分一起温育经过60小时的时间段，并且通过串联柱变性SEC就单链形成进行分析。向制剂缓冲液中添加10mM半胱氨酸后发现关于单链形成的压倒性激动剂应答。存在单链形成的快速上升，这在半胱氨酸添加后约6小时达到峰。这种应答在剩余56小时中逐步减少。此外，+30％gal进料影响单链形成中更逐步但仍相对快速的增加。+30％gal进料是半乳糖和117E的组合物。每天添加这种混合物以饲喂细胞。尽管在这个实验中，半胱氨酸不依赖117E人工大量引入，但需要确定哪种117E组分可以涉及单链形成。
117E和其他培养基的特定组分与CTLA4Ig一起温育经过60小时的时间段，并且通过串联柱变性SEC就单链形成进行分析。这种培养基的研究集中于可能的二硫键还原组分和/或抑制剂，基于先前实验这将实现单链形成，显示链间二硫键不存在。测试已知对二硫键具有一些还原影响的117E的组成成分；硫辛酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和谷胱甘肽。再次，向制剂缓冲液中添加半胱氨酸后发现关于单链形成的压倒性激动剂应答。存在单链形成中的快速应答，这在半胱氨酸添加后约6小时达到峰。这种应答在剩余56小时中逐步减少。主要单链形成用包含半胱氨酸的培养基发生：半胱氨酸、酵母自溶液和发酵培养基。其他含硫组分例如甲硫氨酸和谷胱甘肽对单链形成无至非常小的影响。没有观察到氯化铵的影响。
本发明因此包含用于提供蛋白质的单链：二聚体形式比的方法，此类蛋白质能够以二聚体以及单链形式存在，包括步骤(1)提供和/ 或维持(例如在步骤(2)期间)液体细胞培养基用于培养表达所述蛋白质的细胞，其中选择能够还原或抑制二聚体形成的试剂(例如半胱氨酸)的浓度以提供所述比，和(2)培养所述细胞以表达所述蛋白质。添加和/或增加液体细胞培养基中此种试剂(例如，半胱氨酸)的浓度提供此种蛋白质较高的单链：二聚体形式比，而去除、减少或消除液体细胞培养基中此种试剂(例如，半胱氨酸)的浓度减少所述蛋白质的单链：二聚体形式比。
这种方法的一个具体实施方案是其中所述蛋白质是能够通过形成链间二硫键而形成二聚体的糖蛋白，例如本发明的CTLA4-Ig分子。
高盐对高分子量形成的激动作用：在纯化过程期间，使CTLA4-Ig暴露于高盐浓度各种时间量。高盐浓度的影响就高分子量形成进行测定。CTLA4-Ig(以～50mg/mL)在500mM磷酸钠，pH＝6.0，37℃的存在下进行温育。在高浓度的磷酸钠时存在激动影响；在100小时的时间段内观察到高分子量形式主要是四聚体中持久的、快速的增加。
本发明因此包含用于减少蛋白质的聚集物：二聚体形式比的方法，在此种蛋白质的处理期间(例如纯化期间)，此种蛋白质能够以聚集物以及二聚体形式存在，包括作为非聚集物盐溶液的一种或多种液体的使用。“非聚集物盐溶液”指在其中包含溶解的盐浓度的液体，相对于包含更高浓度的此种盐的相同液体，其在聚集物形成中激动性较小。
这种方法的一个具体实施方案是其中所述蛋白质是能够通过形成链间二硫键而形成二聚体的糖蛋白，例如本发明的CTLA4-Ig分子。
对单链形成的拮抗作用：先前的建模实验证实通过添加包含半胱氨酸的组分对单链形成重大和快速的影响。半胱氨酸是包含游离巯基的氨基酸。如果巯基涉及单链的形成，那么它应通过使用拮抗化合物进行阻断。一种此种化合物是碘乙酰胺。碘乙酰胺是以快速方式与任何游离巯基反应以形成不可逆的硫醚键的水溶性化合物。CTLA4-Ig与各种培养基、半胱氨酸和碘乙酰胺一起温育经过60小时的时间段，并且通过串联柱变性SEC就单链形成进行分析，和通过串联柱非变性SEC就HMW进行分析。在CTLA4-Ig组合物和高盐中碘乙酰亚胺不仅阻断单链形成还阻断聚集物形成。在低唾液酸单体中碘乙酰胺不阻断聚集物形成。然而，在低唾液酸材料中形成的聚集物的量比得上在CTLA4-Ig组合物中形成的量。
该模型提供对先前尚未充分理解的机制的了解。看起来在已鉴定的CTLA4-Ig方法中存在至少2种聚集物形成的主要途径。第一种途径产生大量聚集物，游离羟基半胱氨酸充当激动剂用于形成单链种类。半胱氨酸的激动影响可以通过添加碘乙酰胺进行阻断。令人惊讶的是，碘乙酰胺不仅是单链形成还是高分子量形成的拮抗剂。应当指出该方法设计为生产与在下游纯化期间的发酵比较，包含增加量的唾液酸的组合物。在产生少得多的聚集物的第二种途径中，就单链或聚集物的形成而言包含少量唾液酸的亚种不受碘乙酰胺的影响。
本发明因此包含用于减少蛋白质的单链：二聚体形式比的方法，此种蛋白质能够以二聚体以及单链形式存在，包括步骤(1)提供和/或维持(例如在步骤(2)期间)液体细胞培养基用于培养表达所述蛋白质的细胞，此种培养基包含对单链形成拮抗的试剂(例如碘乙酰胺)，和(2)培养所述细胞以表达所述蛋白质。
本发明因此包含用于减少蛋白质的聚集物：二聚体形式比的方法，此种蛋白质能够以聚集物以及二聚体形式存在，包括步骤(1)提供和/或维持(例如在步骤(2)期间)液体细胞培养基用于培养表达所述蛋白质的细胞，此种培养基包含对聚集物链形成拮抗和/或对单链形成拮抗的试剂(例如碘乙酰胺)，和(2)培养所述细胞以表达所述蛋白质。
这种方法的一个具体实施方案是其中所述蛋白质是能够通过形成链间二硫键而形成二聚体的糖蛋白，例如本发明的CTLA4-Ig分子。
基于这些数据，不难想象关于聚集物形成的至少2种途径在CTLA4-Ig中得到诱导。在主要途径中，单链通过仍未完全明了的机制涉及聚集物的形成。不依赖于单链形成的第二种次要途径涉及聚集物的形成。这些途径可以帮助解释为何存在可以层析分离的至少3种形式的高分子量种类。这些是模型并且必须在实际发酵方法中进行测试，以确定实际影响(如果存在的话)和影响的量级。基于这种数据应考虑不仅测试目前的发酵方法而且测试缺乏半胱氨酸的发酵。
实施例6：CTLA4-Ig二聚体和四聚体
结合至B7-1 Ig的CTLA4-Ig二聚体和四聚体
本发明提供了用于评估与B7-1Ig结合的CTLA4-Ig二聚体和四聚体的方法。物理特征(例如，扩散系数、分子量、结合效价)和仪器操作参数(例如流速、芯片密度)可以影响Biacore测定结果。在质量转移限制下；对于相同摩尔浓度，四聚体的结合速率比二聚体慢约20％。在指定流速下，与二聚体相比较，四聚体分子可能较不有效地穿透基质。在高密度B7-1Ig固定化芯片中，四聚体和二聚体的竞争性结合显示可比较的抑制曲线。这指出四聚体(4)对二聚体(2)的理论效价对与B7-1Ig的结合没有影响。四聚体的摩尔浓度可以基于二聚体标准曲线进行计算。使用这种方法，发现与二聚体相比较，四聚体与B7-1Ig的结合具有相等的剂量依赖性应答。
四聚体和二聚体的结合效力的比较受用于制备标准和样品的测量单位的影响。四聚体和二聚体样品可以在2000ng/mL的浓度时进行比较，在质量(ng/mL)基础上，使用相同种类的标准曲线每个种类显示约100％的结合效力。然而，当在二聚体标准曲线上测定时四聚体的结合效力减半，并且当在四聚体标准曲线上测定时二聚体的结合效价超过两倍。因为Biacore仪器基于质量检测分子相互作用，所以来自相同浓度(ng/mL)的四聚体和二聚体的信号共振单位(RU)应相同。尽管检测系统是质量的函数，但分子之间的相互作用在摩尔基础上发生。因此，在2000ng/mL时CTLA4-Ig二聚体和CTLA4-Ig四聚体的摩尔浓度分别为21.6nM和10.8nM。使用摩尔浓度，CTLA4-Ig二聚体和CTLA4-Ig四聚体样品在二聚体标准曲线上显示可比较的结合效力。使用在CTLA4-Ig四聚体标准曲线上的相同摩尔浓度方法，与四聚体样品相比较，CTLA4-Ig二聚体样品显示在结合效力中另外30％的增加。这个观察是由于在高浓度时四聚体标准曲线的斜率中的减少，从而导致对于给定起始结合速率更高计算的浓度。关于这个观察的一种解释是质量转移的作用。
质量转移限制实验指出对于相同数目分子，CTLA4-Ig四聚体的起始结合速率比CTLA4-Ig二聚体慢约20％(即四聚体的结合速率与二聚体相差因子0.8)。这种观察到的差异是由于2个种类的分子量及其对分子扩散至芯片表面的作用。分子的扩散系数与分子量的立方根成反比。较低的扩散系数将指示分子的较慢移动。基于分别的分子量，CTLA4-Ig四聚体计算的扩散系数是CTLA4-Ig二聚体那种的0.8倍，或相反地二聚体是四聚体那种的1.25倍。实验数据与其中CTLA4-Ig二聚体显示133％的效力的这种观察一致，如由CTLA4-Ig四聚体标准曲线使用摩尔浓度计算的。在高密度芯片上的质量转移限制在较低流速和较低分析物浓度时更显著。随着流速增加，与四聚体相比较，二聚体显示更快的起始结合速率。因此，四聚体增加的分子量和较低的扩散系数促成与二聚体相比较的起始结合速率差异。
CTLA4-Ig四聚体和二聚体与B71Ig的竞争性结合指出四聚体和二聚体在质量转移限制条件下显示相似的结合效价。另外的四聚体对最初与二聚体或四聚体结合的B7-1Ig芯片的作用指出低结合潜力。这个观察并非由于限制的结合位点可用性，因为另外的二聚体可以与最初结合CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig四聚体的B7-1Ig芯片结合。受限的穿透至基质内可以解释四聚体结合中观察到的减少。
其中在Biacore上结合分子的性质影响结果的解释。在质量转移限制条件下由于其分子大小中的差异，四聚体和二聚体分子以不同速率扩散。此外，在高密度芯片表面上的空间位阻影响后续分子穿透至基质。
当在Biacore上进行浓度分析时，必须考虑物理特征例如分子量、扩散系数和每个种类的结合。用于比较目的分析物的标准应为相同材料。然而，当考虑到分子大小时，如果标准和样品在摩尔基础上进行表示，那么四聚体仍可以针对二聚体标准进行分析。呈现的数据指出CTLA4-Ig二聚体和CTLA4-Ig四聚体与B7-1Ig的结合是可比较的。
CTLA4-Ig二聚体和四聚体显示出相似的结合速率(kon)。然而，四聚体显示出较慢的解离速率(koff)，这归因于由于结合位点数目中的增加的抗体亲抗原性。
2种蛋白质例如配体和受体之间的结合动力学分析可以在Biacore上来进行，其中使用固定有约600－800RUs的低密度配体的芯片，从而使得最大结合能力(Rmax)为50－150RU。低密度芯片的目的是使抗体亲抗原性和质量运输的作用降到最低。由于当个别结合位点的解离发生时，可利用的配体的紧密接近，当多价分析物保持与芯片表面结合时，观察到抗体亲抗原性。当在芯片的表面和本体溶液之间的分析物浓度中存在显著差异时，观察到质量运输。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子是由通过单个链间二硫键连接的2个单链分子组成的二聚体，并且包含关于B7分子的2个结合位点。在另一个实施方案中，如由光散射、SEC和SDS-PAGE证实的，CTLA4-Ig四聚体的形成导致具有潜在地4个结合位点的分子。纯化的单体和二聚体的结合动力学与CTLA4-Ig二聚体材料进行统计学比较。在kon速率中不存在显著差异(p值>0.05)。四聚体的koff速率与二聚体的koff速率显著不同。由HIC清除峰纯化的二聚体的koff速率与CTLA4-Ig二聚体材料的koff速率无显著不同。因此，四聚体比二聚体更慢解离，从而指出由于增加的结合位点数目/分子的抗体亲抗原性作用。
四聚体可以通过胍处理解折叠且解离成二聚体。分析这种胍处理的CTLA4-Ig二聚体，且结果指出它的结合动力学特征类似于在生理条件下形成的CTLA4-Ig二聚体的那些。这个观察支持下述假设：在抗体亲抗原性在结合动力学中起作用的的情形中，二聚体和四聚体之间的koff速率中观察到的差异与分子的结合效价以及特定Biacore法的固有性质相关。
来自HIC清除峰的CTLA4-Ig材料的亲和纯化：
A蛋白-琼脂糖亲和层析：500mL HIC清除峰通过0.22微米1L过滤器系统(Corning，Corning，NY，部分编号430517)进行过滤且装载到rProtein A-Sepharose柱(5cm x 15cm)上，所述柱用在pH 7.4下的磷酸缓冲盐水(Sigma，St.Louis，MO，P-4417)进行预平衡。该柱用700mL PBS，pH 7.4进行洗涤，且用100mM甘氨酸，pH 3.5进行洗脱。各50mL的级分在收集过程中通过向收集管中添加0.5mL 2.0M tris，pH 10得到中和。级分在280nm吸光度处进行测定、合并且使用centriprep YM-3柱体(Millipore Corporation，Bedford，MA，部分编号4203)进行浓缩。纯化的蛋白质溶液贮藏于-70℃。
PROSEP-rA(重组A蛋白质)亲和层析：500mL HIC清除峰通过0.22微米1L过滤器系统(Corning，Corning，NY，部分编号430517)进行过滤，且以25mL/分钟的流速装载到PROSEP-rA High Capacity(Millipore Corporation，Bedford，MA)柱(25cm x 28cm)上，所述柱用包含250mM氯化钠的25mM Tris，pH 8.0进行预平衡。配备Waters 2767 SampleManager和Waters 2996光电二极管阵列检测器(Photodiode Array Detector)的WatersPrepLC系统用于这种层析法。该柱用25平衡缓冲液以25mL/分钟的流速洗涤30分钟，且用100mM乙酸盐，pH 3.0以25mL/分钟的流速洗脱30分钟。各10mL的级分在洗脱过程中通过收集先前已加入管中的超过50ul 2.0M tris，pH 10得到中和。具有在280nm处的高吸光度的级分进行合并且使用centriprep YM-3柱体(Millipore Corporation，Bedford，MA，部分编号4203)进行浓缩。纯化的蛋白质溶液贮藏于-70℃。
尺寸排阻层析：尺寸排阻层析在Waters Alliance 2695分离模块上进行，所述模块配备Waters 2996光电二极管阵列检测器(Milford，MA)和由Millennium32版本3.20或Empower软件控制的Foxy 200级分收集器。串联TOSOH BIOSCIENCE(Montgomery，PA)TSKG3000SW(21.5mm x 300mm)和串联TSK G3000 SWxL(7.8mm x 300mm)柱分别用于制备型和分析型SEC。洗脱的蛋白质通过在280nm处的UV吸光度进行监控。
二聚体、四聚体和多聚体的制备型分离通过A蛋白纯化的HIC清除峰材料的SEC来达到。将A蛋白洗脱物的13种样品(各～10mg)注射到制备型串联SEC柱内，其中使用以1mL/分钟的流速包含0.9％氯化钠的100mM一代磷酸钠缓冲液pH 7.0的流动相。对于13种注射的每一种，90－160分钟每分钟收集级分。关于单一注射的运行时间为180分钟。
每种级分通过串联柱分析型尺寸排阻HPLC进行检查。合并级分13－15(包含多聚体)、级分22和23(包含四聚体)和级分43－39(包含二聚体)。纯化的多聚体、四聚体和二聚体级分在分析型2柱SEC上用动态光散射检测(DSL)进行检查。
HIC清除峰的CTLA4-Ig组分和纯化的组分与固定化的B7-1Ig的生物特异性结合分 析：CTLA4-Ig与固定化的B7-1Ig(在CM5芯片上)的生物特异性结合使用基于SPR的BIAcoreC生物传感器(BIAcore，AB，Piscataway NJ)进行测量。CTLA4-Ig材料用于产生标准曲线。B7-1Ig以5000－10,000共振单位(RU's)的密度固定化在活化的CM5传感器芯片上。CTLA4-Ig参考标准、质量对照和样品以20μL/分钟的流速注射到B7-1Ig传感器芯片表面上以产生传感图。CTLA4-Ig在固定化的B7-1Ig上的起始结合速率(RU/s)在扩散限制条件下在高密度B7-1Ig表面上进行测量，并且这与样品中的CTLA4-Ig的活性浓度直接相关。标准、质量对照样品和未知样品浓度由标准曲线进行内推，所述标准曲线通过将RU's对125－8000ng/mL标称范围中的CTLA4-Ig浓度绘图来产生。最终结果表示为百分比结合(未知/样品的平均浓度/2000)x100。
摩尔质量和流体动力学半径的测定：SEC分离用TSK3000 SWXL柱和相应的保护柱来进行。流动相由25mM HEPES，850mM NaCl，pH 7.0组成，对于在0.8mL/分钟下的洗脱使用等度条件。HPLC分析在环境温度下进行，并且样品在分析期间维持于4℃。摩尔质量测定掺入Wyatt Dawn EOS，利用15个不同的散射角以测量关于每个种类的光散射的角度变化。Zimm绘图形式用于摩尔质量测定，其中关于每个种类的切片对于摩尔质量求平均值。用于计算绝对摩尔质量的具体折射率增量(dn/dc)值为0.189，其使用a)和Optilab DSP干涉仪(RI获得。流体动力学半径(Rh)测定用Photon Correlator QELS检测器轴向(in-line)进行，所述检测器以针对流动池约90℃的角度放置。平移扩散常数根据这种信号进行测量，且Rh使用爱因斯坦-斯托克斯(Einstein-Stokes)关系进行计算。数据分析使用来自WyattTechnology的Astra软件版本4.90来完成。
发现关于二聚体和四聚体种类的分子量和流体动力学半径值分别为86－91kDa和172－199kDa。通过分子量观察到清除峰样品包含对应于六聚体和十聚体的另外HMW种类。关于二聚体种类的流体动力学半径范围为3.8－4.7nm。异质四聚体种类的流体动力学半径范围为5.7至6.2－6.3nm。
使用表面等离子体共振的CTLA4-Ig二聚体和四聚体与B7-1Ig的结合：浓度分析：各种CTLA4-Ig种类与B7-1Ig的浓度分析在Biacore3000仪器(Biacore，Piscataway，NJ)上进行，根据Method 7441-42伴随少量修改。修改包括下述：使用Biacore 3000而不是Biacore C。流速为10μL/分钟而不是20μL/分钟。与15秒相反，样品注射60秒。传感器芯片表面以30μL/分钟通过下述进行再生：包含100mM NaCl的10mM柠檬酸钠，pH 4.0(再生缓冲液)的3次短30-秒(15μL)脉冲，随后为水的1次30-秒脉冲。
CM5传感器芯片用以20μg/mL的浓度溶于乙酸盐缓冲液，pH 5.0的B7-1Ig进行固定，针对6000－12000共振单位(RU)的靶密度。标准通过在HBS-EP缓冲液中将CTLA4-Ig材料系列稀释至62.5－8000ng/mL(0.675－86.3nM)的浓度和二聚体至125－16000ng/mL(0.675－86.3nM)的浓度进行制备。将由单体或二聚体组成的测试样品稀释至～2000ng/mL的靶浓度且在Biacore上进行分析。浓度通过BIAevaluation软件(版本4.0.1)使用CTLA4-Ig材料(>98％单体)或纯化的二聚体的标准曲线进行测定。结合效力计算为在Biacore上测定的浓度除以通过A280nm测定的浓度的百分比。
分子与给定表面的结合速率是浓度的函数，这允许测定未知浓度。与CTLA4-Ig四聚体相比较，CTLA4-Ig二聚体显示作为浓度(ng/mL)函数的更高的结合速率。
CTLA4-Ig二聚体和四聚体的结合效力概括于表7中。基于ng/mL，二聚体样品的结合效力由二聚体标准曲线进行计算，且发现为99.5％；而四聚体样品的等价浓度为47.2％。相反，二聚体样品的结合效力由四聚体标准曲线进行计算，且发现为266％；而四聚体样品的等价浓度为103％。然而，当二聚体和四聚体表示为摩尔浓度(nM)时，2个种类的结合效力是可比较的。由二聚体标准曲线计算的二聚体和四聚体样品的结合效力分别为99.4％和94.3％。在四聚体标准曲线上，它分别为133％和103％。基于摩尔浓度，二聚体和四聚体的标准曲线是可比较的。
表9：CTLA4-Ig二聚体和四聚体的结合效力。
结合效价：在30(μL混合物以10μL/分钟的流速注射到以9392RU的密度固定化的B7-1Ig芯片上之前，使CTLA4-Ig二聚体(25－1600 nM)或四聚体(25－400nM)与B7-1Ig以各种摩尔比预混合3分钟。芯片在每次注射后通过再生缓冲液的3次30-秒脉冲，随后为水的1次30-秒脉冲进行再生。将在每次注射结束时获得的RU's进行比较。
理论上，二聚体分子的结合效价是2；每条单链由1个结合位点组成。四聚体分子由2个二聚体分子组成，且因此具有结合效价4。为了测定二聚体和四聚体的表观结合效价，设计竞争性测定且在Biacore 3000上进行。在实验中，在混合物以10μL/分钟的流速注射入B7-1Ig芯片(9392RU)上1分钟前，使分析物与B7-1Ig以各种摩尔比预混合3分钟。表10显示用渐增摩尔量的B7-1Ig竞争性抑制的二聚体或四聚体百分比。在1.25(B7-1Ig)与1(二聚体或四聚体)的摩尔比时，在竞争性抑制中观察到显著差异，其中单体为96.1％，且二聚体为84.9％。然而，二聚体和四聚体显示类似的抑制曲线，这暗示效价大约相等。此外，使用较低密度的芯片，二聚体和四聚体同样显示类似的抑制概况。
表10：用B7-1Ig抑制二聚体和四聚体。
B7-1Ig芯片的饱和：CTLA4-Ig二聚体或四聚体(200、1000或8000ng/mL)以10μL/分钟最初注射到高密度B7-1Ig芯片(6738RU)上1分钟，随后为用单体或二聚体(200、1000或8000ng/mL)的一系列7次1分钟注射。芯片在每个条件后通过4次25μL再生缓冲液的注射随后为25μL水的注射进行再生。将在每次注射结束时获得的RU's进行比较。
将二聚体或四聚体重复注射到用二聚体或四聚体预包被的B7-1Ig表面上，而无表面再生。与四聚体的最初结合不阻碍二聚体的随后注射的结合，然而，与二聚体注射相比较，另外的四聚体注射导致明显减少的结合速率。与二聚体最初结合随后为二聚体的后续注射导致朝向饱和增加的结合。对于二聚体预包被芯片的四聚体后续注射显示结合中的逐步减少，暗示分子与芯片的解离和缺乏四聚体穿透至基质内。用200ng/mL或8000ng/mLCTLA4-Ig分子的最初注射观察到类似结果。
CTLA4-Ig四聚体具有对于B7-1Ig受体更高的抗体亲抗原性：CTLA4-Ig种类包括纯化柱的弃去部分例如HIC和QFF柱的清除峰进行纯化，并且其结合动力学在Biacore上进行分析。
来自HIC清除峰的CTLA4-Ig种类：HIC柱在CTLA4-Ig方法中用于去除高分子量种类例如DNA。来自HIC柱的清除峰的CTLA4-Ig种类可以用于后续纯化和动力学分析。使HIC清除峰经过A蛋白柱，以捕获所有CTLA4-Ig种类且去除可能存在的其他杂质。由所有CTLA4-Ig种类(即，二聚体、四聚体、六聚体多聚体)的混合物组成的来自A蛋白柱的洗脱物显示比得上CTLA4-Ig二聚体标准的表观kon和koff速率。A蛋白洗脱物通过2柱SEC的分离导致3种CTLA4-Ig种类：二聚体、四聚体和六聚体/多聚体，其中kon和koff速率概括于表11中。与CTLA4-Ig二聚体相比较，来自HIC清除峰的纯化二聚体的唾液酸含量低。
在表11中，75－200nM的样品浓度在B7-1Ig芯片(694RU)上进行测试。与CTLA4-Ig参考相比较，由HIC清除峰纯化的CTLA4-Ig种类显示更低的结合。解聚的四聚体给出与CTLA4-Ig参考可比较的kon和koff速率。
表11：来自HIC清除峰的CTLA4-Ig种类的动力学分析
数据的统计学分析使用斯氏T检验来进行，基于CTLA4-Ig二聚体标准的7次观察和纯化的二聚体和四聚体的14次观察。比较CTLA4-Ig二聚体标准与纯化的二聚体或四聚体，在kon速率中不存在差异。然而，当参考与纯化的四聚体比较时，koff速率和KD统计学上显著(表12)。比较纯化的四聚体与纯化的二聚体，kon和koff速率以及KD统计学上不同。应当指出尽管数据分组为二聚体和四聚体，但样品的个别分类(例如，前面、后部等)可以具有略微不同的特征，所述特征可以影响其结合动力学。对于二聚体，kon和koff速率分别平均为3.3±1.0x105M-1s-1和8.8±3.5x10-3s-1。四聚体的kon和koff速率分别为2.6±0.8x105M-1s-1和3.1±1.4x10-3s-1。
在表12中，分析了二聚体(n＝14)和四聚体(n＝14)以及CTLA4-Ig二聚体标准(n＝7)。
表12：CTLA4-Ig种类的统计学分析。
来自QFF清除峰的CTLA4-Ig种类：QFF柱是用于清除来自产品的残留杂质的最后纯化柱。CTLA4-Ig种类使用2柱SEC法从QFF柱的清除峰中进行分离，并且在Biacore 3000上进行分析。数据显示这种“QFF清除峰”样品的结合动力学类似于CTLA4-Ig二聚体标准。此外，与由组合物纯化的那些相比较，由QFF清除峰纯化的二聚体和四聚体给出类似的结合动力学。此外，纯化的单体级分的唾液酸含量大于CTLA4-Ig二聚体标准的那种。
胍处理(四聚体的二聚化)：四聚体可以通过用胍处理随后透析到磷酸盐缓冲液内转变成二聚体，且通过分析型SEC证实作为二聚体存在。来自HIC清除峰的“二聚化的”四聚体的动力学分析显示它的kon和koff速率类似于CTLA4-Ig二聚体的那些。
实施例7：通过MS电喷射离子化(ESI)的完整分析
CTLA4-Ig用100mM Tris，25mM NaCl，pH 8稀释至0.7mg/mL的终浓度。PNGase F(New England Biolabs)用100mM Tris，25mM NaCl，pH 8稀释30倍至17单位/μL的终浓度。将等体积(各60μL)的稀释的样品和稀释的糖苷酶溶液混合且于37℃温育4小时。
将所得到的去糖基化的CTLA4-Ig(2μL)装载到Waters 反相萃取柱体柱(2.1x20mm)上。装载的柱用5％溶剂B(溶剂A：溶于水的1％甲酸，溶剂B：溶于乙腈的1％甲酸)以0.2mL/分钟的流速洗涤5分钟以脱盐，其中使洗脱剂转向废物。在5分钟结束时，快速梯度(在10分钟内5％溶剂B至95％溶剂B)开始从柱中洗脱CTLA4-Ig；此处在流动分流(使用的层析系统是配备Waters 2996检测器的Waters Alliance 2695)后以45μL/分钟将洗脱剂导入质谱仪(Waters Micromass Q-Tof microTM)内。
关于Q-Tof microTM的毛细管电压设为3kV，并且样品锥电压为40V。扫描(每0.9秒)平均成1次扫描；扫描间时间为0.1秒。Q-Tof分析仪从m/z 800扫描至2500。对应于高于半最大峰高(在TIC层析谱中)的部分的谱使用Waters MassLynxTM软件进行组合。对组合的谱实施Waters MaxEnt1去褶合。分辨率设为1Da/通道，且选择一致的高斯损害模型，其中半高度处的宽度设为0.5－1Da。关于左峰和右峰的最小强度比都设为50％。
实施例8：基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)
MALDI-MS谱使用氮激光器(337nm)在OmniFlexTM(Bruker Daltonics，MA)上获得。使用无需脱盐或脱盐的蛋白质样品，使用以C4移液管端(Millipore，BedfordMA)形式的固相萃取。在使用前移液管端用乙腈-水(1：1v/v)润湿，并且用0.1％三氟乙酸(TFA)进行平衡。移液管端随后通过从移液管中3次抽取和排出10μL样品进行装载。装载的样品用10μL0.1％TFA洗涤3次。脱盐的蛋白质样品用10μL乙腈与水(1:1 v/v)从移液管中洗脱。通过使1μL样品(脱盐或包含缓冲液的)与1μL基质溶液混合且将1μL混合物置于不锈钢靶上进行点样。基质溶液是溶于包含0.1％TFA的1：1水与乙腈(v/v)的芥子酸饱和溶液。将混合物点在MALDI样品板上，且在置于质谱仪中之前允许其风干。所有蛋白质样品以线性、正离子模式通过延迟的萃取进行分析，其中使用20kV的加速电压和200纳秒的延迟时间。对于每种样品积累总共400个单射谱。使用包含胰蛋白酶原(23982m/z)、A蛋白(44613m/z)和牛清蛋白(66431m/z)的标准蛋白质混合物达到外部校准。
肽的MALDI-TOF MS分析
肽混合物通过反相层析进行分离，并且收集来自层析峰的级分且蒸发至干燥。样品在50μL 25mM磷酸盐缓冲液pH 7.5中进行重构。加入DTT至5mM的终浓度，并且级分于50℃温育20分钟。还原后，加入IAM至10mM的终浓度并且在黑暗中于50℃温育另外20分钟。
MALDI-MS谱使用氮激光器(337nm)在OmniFlex(Bruker Daltonics，MA)上获得。通过使1μL样品与1μL基质溶液混合来制备样品。基质溶液是溶于具有0.1％TFA的1对1水：乙腈的a-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液。将混合物点在MALDI样品板的孔上，且在置于质谱仪中之前允许其风干。所有肽以反射、正离子模式通过延迟的萃取进行分析，其中使用20kV的加速电压和200纳秒的延迟时间。对于每种样品积累总共100个单射谱。使用标准肽混合物达到外部校准，所述标准肽混合物包含血管紧张素II(1046.54m/z)、血管紧张素I(1296.68m/z)、P物质(1347.74m/z)、铃蟾肽(1619.82m/z)、ACTH clip 1－17(2093.09m/z)、ACTH clip 18－39(2465.20m/z)和生长抑素(3147.47m/z)。
实施例9：培养基和培养基组成成分对CTLA4-Ig单链和多聚体种类的作用的分析
制备CTLA4-Ig二聚体、低唾液酸亚级分、高唾液酸亚级分、单体前面、和CTLA4-Ig的单体种类且纯化。这些样品用于一系列建模实验中，所述建模实验设计为测定培养基和培养基组成成分经过0－至少60小时的时间对单链和高分子量形成的影响。制剂缓冲液、碘乙酰胺、磷酸钠、氯化铵、基础培养基、发酵液、培养基177e、培养基浓缩的酸溶液I、培养基浓缩的酸溶液II、胰岛素、EDTA、半胱氨酸、硫辛酸、谷胱甘肽、甲硫氨酸和酵母自溶液单独和组合的影响进行测试。
实施例10：通过尺寸分析CTLA4-Ig分子
使用变性条件的尺寸排阻层析(SEC)法可以用于定量不同大小的蛋白质种类。在一个实施方案中，使用变性条件的串联SEC法可以应用于定量CTLA4-Ig单链种类。单链CTLA4-Ig可以是缺乏链间二硫键的种类。在纯化过程期间分离的单链CTLA4-Ig种类称为天然单链CTLA4-Ig。通过CTLA4-Ig二聚体的还原和烷基化产生的纯化的单链称为诱导的单链。天然和诱导的单链CTLA4-Ig具有相同特征。
材料：
一代磷酸钾(KH2PO4)ACS等级
氢氧化钾(KOH)45％w/w溶液ACS等级
氯化钠(NaCl)ACS等级
校准的可调的单一移液器，100_L
Rainin,(目录号P-100)
水(H2O)HPLC等级
2.0mL深低温小瓶Nalgene,(目录号5000-0020)
浓盐酸(HCl)Fisher(目录号A144-212)
氢氧化钠(NaOH)10N溶液
J.T.Baker,(目录号5674-02)
1000mL过滤器单元0.22mm Corning,(目录号430517)
聚丙烯15mL试管Falcon,(目录号352097)
叠氮化钠(NaN3)ACS等级
一代磷酸钠，一水合物(NaH2PO4·H2O)
氢氧化钾(KOH)丸(Pellets)
仪器配置和条件
HPLC系统Waters 2695分离模块
柱Toso Haas 5μTSK 3000 SWXL，300mm x 7.8mm I.D.(部分编号08541)
保护柱Toso Haas 5μTSK 3000 SWXL，40mm x 6.0mm I.D.(部分编号08543)
检测器Waters 2487双波长检测器波长280nm流速1mL/分钟
整合系统Empower
注射体积20μL
测定靶浓度10mg/mL
流动相0.2M KH2PO4，0.9％NaCl，pH 6.8含KOH
测定运行时间20分钟
柱温环境
样品温度4℃
保留时间单体8.7分钟±1.0分钟，HMW种类于7.5分钟±1.0分钟，如果存在，MW种类将在单体峰后洗脱。
试剂
4N氢氧化钾(4N KOH)(100mL)
如所述的使用下述制剂之一：
将40mL HPLC等级水和11.6mL 45％w/w KOH溶液加入100mL容量瓶中。用HPLC等级水使体积达到100mL。
在100mL容量瓶中加入80mLHPLC等级水，称量22.4克KOH丸，并且磁性搅拌直至完全溶解。用HPLC等级水使体积达到100mL。
将溶液转移到250mL玻璃试剂瓶内。通过倒转充分混合。贮藏于室温最多1年。
流动相(0.2M KH2PO4，0.9％NaCl，pH 6.8)
称出27.2克KH2PO4和9.0克NaCl，加入1000mL烧杯内。使用由磁性搅拌棒的连续混合在800mL HPLC等级水中溶解固体。
使用pH计，使用4N KOH溶液将溶液的pH调整至6.8。如果pH超过6.8，那么用浓HCl调整它。
使用1000mL量筒使最终体积达到1L。通过0.22μm过滤器单元过滤溶液。
转移到1000mL玻璃试剂瓶内且超声处理同时真空脱气5+/-1分钟。在每次使用前进行脱气。
贮藏于室温最多1个月。
2N氢氧化钠(2N NaOH)
将20mL 10N NaOH转移到100mL玻璃量筒内。
用HPLC水使体积达到100mL。
将溶液转移到250mL玻璃试剂瓶内。通过倒转充分混合。贮藏于室温最多1年。
称出3.45克NaH2PO4·H2O和2.92克NaCl，并且在900mL HPLC等级水中用搅拌棒通过混合进行溶解。使用pH计，使用2N NaOH将溶液的pH调整至7.4。如果pH超过7.4，那么用浓HCl调整它。
使用1000mL量筒使最终体积达到1L。通过0.22μm过滤器单元过滤溶液。
贮藏于2－8℃最多6个月。
柱贮藏缓冲液(溶于水的0.05％w/v NaN3)
称量50±5mg叠氮化钠，且用磁性搅拌棒将其加入1000mL烧杯中。
向烧杯中加入500mL HPLC等级水，并且搅拌直至完全溶解。
用水使体积达到1L。通过0.22μm过滤器单元过滤溶液且倾入1000mL HPLC试剂瓶内。
贮藏于室温最多6个月。
高分子量种类和系统适合性标准的制备
这将提供加热至未加热的CTLA4-Ig参考材料的3倍稀释物和15％－30％高分子量种类面积百分比量。在15mL Falcon试管中，使用CTLA4-Ig稀释缓冲液制备10.0±1.0mg/mL的约3mL参考材料。CTLA4-Ig的初浓度来自COA。由那个值制备10.0±1.0mg/mL稀释物。转移1.0mL稀释的参考材料，使用1mL移液器将其加入2.0mL冷冻小瓶内，并且使其在水浴中于67±2℃加热45±2分钟。使用1mL移液器将制备的加热参考材料转移回15mL试管内。轻轻上下移液1mL体积的试管内容物，总共10次。这是系统适合性标准。贮藏条件：在2.0mL冷冻小瓶中制备系统适合性标准的150μL等分试样，用于在-80±5℃下贮藏最高达1年。获得参考材料的初浓度，并且由那个值制备10.0±1.0mg/mL稀释物。使用最低限度100μl参考材料和合适量的稀释缓冲液以达到10.0±1.0mg/mL的终浓度。关于稀释参考下面等式
对于CTLA4-Ig药品，由蛋白质浓度制备10.0±1.0mg/mL稀释物，其中使用最低限度100μl等分试样的样品和合适量的稀释缓冲液以达到10.0±1.0mg/mL的终浓度。关于稀释参考下面等式：
一旦稀释至10.0±1.0mg/mL，样品就可以于2－8℃贮藏最多24小时。对于CTLA4-Ig药品，由蛋白质浓度制备10.0±1.0mg/mL稀释物，其中使用最低限度200μl等分试样的样品和合适量的稀释缓冲液以达到10.0±1.0mg/mL的终浓度。关于稀释参考下面等式：
将流动相置于1个溶剂储存器中，和HPLC等级水置于另一个中。在运行前超声处理且真空脱气。打开检测器且允许在运行前加温15分钟。新的或目前的柱用于分析前，用HPLC等级水冲洗柱至少20分钟，随后为流动相缓冲液平衡至少20分钟。使用1.0mL/分钟的流速。解冻150μL等分试样的系统适合性标准，将其加入自动进样器小瓶内且将小瓶置于自动进样器中。在条件下注射20μL标准。
根据下式测定约7.5分钟时洗脱的高分子量种类的百分比：(在下式中，单体实际上指的是二聚体。)
其中：
A＝高分子量种类的峰面积
B＝单体峰面积
面积百分比高分子量种类不应小于15％。如果它小于15％，那么将另外浓缩的高分子量种类加入上述系统适合性标准中。分辨率(R)测定和保留时间评估。注射20μL系统适合性标准。使用下面等式计算高分子量种类(保留时间约7.5分钟)和单体峰(保留时间约8.7分钟)之间的分辨率：(在下式中，“单体”实际上指的是二聚体。)
其中：
t1＝高分子量种类的保留时间
t2＝单体的保留时间
W1＝高分子量种类的峰宽
W2＝单体的峰宽
峰宽在峰相对直的侧面外推至基线后在峰的底部处以分钟进行测量。保留时间和峰宽以相同单位进行测量。在一个实施方案中，(R)必须≥1.2和关于峰的保留时间应为8.7±1.0分钟。
理论塔板数测定(N)
根据系统适合性标准层析谱，根据下面等式通过计算理论塔板数(N)来测定柱的效率：
其中
t＝单体的保留时间(分钟)
w＝通过峰侧面外推至基线获得的在单体的基线处的宽度(分钟)
将进行CTLA4-Ig材料的总共六(6)次注射。将200μL的10mg/mL参考材料等分试样到自动进样器小瓶内，且将小瓶置于自动进样器中且注射6次。处理层析谱，且计算关于每个层析仪的二聚体峰面积。加总来自6个层析仪的二聚体峰面积且根据下面等式计算平均值、标准差和％RSD：
其中：
X1,2,3……＝数据集中的指定值
nx＝一组值(x)
5.4.4.2如下计算标准差：
其中：
n＝数据集中的值(x)数目
x＝数据集中的1个值
5.4.4.3如下计算％相对标准差(RSD)：
注射顺序的例子：
样品 注射
稀释缓冲液空白 1次注射
系统适合性 1次注射
参考材料 6次注射
样品#1 2次注射
样品#2 2次注射
样品#3 2次注射
参考材料 1次注射
稀释缓冲液空白 1次注射
峰的积分
积分层析谱中5.5－11.8分钟的所有峰面积。放大层析谱的基线以确保所有LMW和HMW种类的总面积包括在积分中。忽视对应于对照中的峰的样品中的峰。内含体积(inclusion volume)峰(11.8－13.5分钟)和之后的峰在这个计算中不加以考虑。然而，如果在内含体积时面积为总面积的0.1％或更大，那么它应被指出。二聚体峰在8.7±1.0分钟时洗脱，高分子量种类峰在7.5±1.0分钟时洗脱，且低分子量种类(例如，单体，如果存在的话)将在二聚体峰后洗脱。具有总峰面积的超过0.1面积％的280nm吸光度，除高分子量种类、二聚体或低分子量种类外的任何峰应当被指出。如下计算面积百分比：(在这个例子中提及“阿巴西普单体”指CTLA4-Ig二聚体。)
面积％单体＝100-(面积％HMW+面积％LMW)
其中：
A＝阿巴西普单体峰面积。
B＝保留时间小于阿巴西普单体的所有峰的总面积。
C＝保留时间大于阿巴西普单体峰的所有峰的总面积(排除内含体积)。
样品通过尺寸排阻层析进行分离，其中使用在串联放置的2个7.8x300mm TSK GelG3000SWXLTM柱(Tosoh Biosep，Montgomery，PA)上的Water's 2695(Milford，MA)，其采用6.0x40mm保护柱。注射25微升每种纯化的样品且在等度条件下进行分离，其中使用0.1M Na2HPO4，0.1M Na2SO4，pH 6.8以1.0mL/分钟。样品在280nm处使用996PDA(光电二极管阵列)检测器(Waters，Milford，MA)进行检测，并且使用Millennium 4.0TM层析软件(Waters，Milford，MA)进行分析。
来自变性分析型串联尺寸排阻层析的天然和诱导的单链材料的覆盖层析谱显示分别为27.96±0.02和27.99±0.02的平均保留时间(6次重复)。发现关于天然单链的平均峰面积为495525.0±9589.6，且关于诱导的单链为463311.8±7997.2(表13)。天然和诱导的单链材料的覆盖MALDI-TOF谱具有相当宽的峰，其基线宽度为约15000质量单位。由于2种样品中糖基化的异质性，这是预期的。每种质谱中单链峰的顶点用于计算平均质量。基于6次重复的分析，天然和诱导的CTLA4-Ig单链的平均质量分别为45694.426±297.735和45333.086±264.778质量单位(表14)。天然单链质量预期高于诱导的单链的那种，因为天然单链上存在SEQ ID NO：2的Cys146上的额外半胱氨酸(残基质量103道尔顿)，而诱导的单链是选择性还原单个链间二硫键随后为添加乙酰基(质量58道尔顿)的烷基化的结果。
这些数据显示天然和诱导的材料经由串联变性SEC层析和MALDI-TOF分析产生等价结果。这些结果证实天然和诱导的CTLA4-Ig单链材料之间的可比性。
表13：天然和诱导的单链的HPLC SEC数据
表14：天然和诱导的单链的MALDI-TOF质谱法数据
重复 诱导的SC 天然的SC质量
1 45397.896 45597.475
2 45432.199 45621.300
3 45256.929 45543.839
4 45433.849 45555.893
5 45381.812 45634.620
6 45348.376 45340.712
平均值 45375.177 45548.973
Stdev 66.265 108.043
％RSD 0.15 0.24
多肽链内半胱氨酸的存在允许二硫键的形成，所述二硫键可以是分子内或分子间的，从而导致二聚体或多聚体蛋白质复合物的形成。CTLA4-Ig作为通过每条链上的C146之间的1个二硫键结合在一起的二聚体存在(其中二聚体由具有下述序列中的任何一个的2个单体构成：(i)SEQ ID NO：2的26-383、(ii)SEQ ID NO：2的26-382、(iii)SEQ ID NO：2的27-383、(iv)SEQ ID NO：2的27-382)、(v)SEQ ID NO：2的25-382、和(vi)SEQ ID NO：2的25-383。这个二硫键的还原可以导致通过非共价静电力结合在一起的2条等价蛋白质链的形成。当实施压倒或超过吸引静电力的变性条件时，此种CTLA4-Ig可以完全解离，从而导致约46kDa的2个相同的蛋白质结构。所得到的结构称为单链或单体。单链的存在可以通过在变性条件下运行的串联柱尺寸排阻层析进行监控。
CTLA4-Ig分子的亚群包含在Cys146上的修饰：存在于大多数群体中的二硫键变成游离半胱氨酸氨基酸(称为半胱氨酰化)。CTLA4-Ig二聚体主要是具有约92,000的分子量的蛋白质。它包含通过在Cys146上的1个链间二硫键和非共价相互作用结合在一起的2条糖基化多肽链(也称为CTLA4-Ig“二聚体”)。纯化的蛋白质作为异质群体存在且包含修饰例如在N和C末端上的糖基化和变化。
存在缺乏链间二硫键的CTLA4-Ig分子的不同群体。这种非共价连接的群体存在于通过尺寸排阻层析产生的前面二聚体峰内。发现前面二聚体缺乏链间二硫键。缺乏链间二硫键的CTLA4-Ig种类通过在Cys146上的半胱氨酰化进行修饰，基于ESI-MS完整数据，这种修饰发生于>99％的单链种类上。O联碳水化合物的Cys146半胱氨酰化和富集是在CTLA4-Ig单链种类上的2种主要修饰。对前面二聚体实施变性尺寸排阻层析，从而导致CTLA4-Ig单链峰的分离。纯化的前面单体材料与使用和不使用固相萃取(SPE)的CTLA4-Ig进行比较，并且在MALDI上进行分析。纯化的前面单体包含2个优势种类：关于SPE处理的在47005u处或关于未处理的在46897u处的主要种类；关于SPE处理的在95070u处或关于未处理的在96172u处的次要种类。CTLA4-Ig材料还包含2个优势种类：关于SPE处理的在91518u处或关于未处理的在91143u处的主要种类；关于SPE处理的在45660u处或关于未处理的在46014u处的次要种类。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig组合物关于二聚体、高MW种类及低MW种类(单体，单链)的尺寸同质性(HPLC)分析具有下述特征：
·≥97.0％二聚体
·≤2.0％HMW种类
·≤0.5％LMW种类(例如，单体，单链)
在另一个实施方案中，CTLA4-Ig组合物具有每个种类的下述特征量：
·≥95.5％二聚体
·≤3.0％HMW种类
·≤0.5％LMW种类(例如，单体，单链)
方法CD-CHO1批的SE-HPLC分析的概括
对于使用方法CD-CHO1制备的药品，百分比单体为98.4－99.8％，其平均值为99.4％。百分比HMW种类为0.2－1.6％。平均值为0.6％，而CV为45.7％。95％容许区间对于二聚体为≥98.7％，且对于HMW种类为≤1.3％。批的百分比HMW种类从最小值0.4％到最大值2.1％变化。平均百分比HMW种类为0.8％，而％CV为40％。在所有情况下，LMW或单体种类低于检测极限(DL＝0.1％)。对于经由方法CD-CHO1制备的CTLA4-Ig，关于HMW种类的95％容许区间(以提供关于群体的99面积％的覆盖)分别为≤1.3和≤1.8％。对于来自方法CD-CHO1的药品中的二聚体，95％容许区间分别为98.7％和96.5％。
关于CTLA4-Ig的组合数据的概括
上表显示百分比HMW种类为0.2－2.1％，其平均值为0.6％。二聚体为94.8％－99.8％，其平均值为99.3％和精度为0.3％。对于二聚体的位点间、位点内和总位点变化为0.3－0.5％。对于HMW的位点间变化为26.4％。对于百分比HMW种类的位点内和总位点变化分别为44.2和51.4％。对于二聚体(97.3％)和HMW种类(1.8％)的95％容许区间在说明书内。
实施例11：载体构建
pcSD表达载体的构建：如图28中所示，表达载体pcSD由商购可得的pcDNA3载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行构建。新霉素抗性基因盒通过用限制性内切核酸酶Nae I消化从质粒pcDNA3中取出。限制性内切核酸酶Nae I产生平端。DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，且3.821kb pcDNA3载体主链从凝胶中进行纯化。包含编码小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)的基因和SV40启动子的DNA片段通过用限制性内切核酸酶Pvu II和BamH I消化质粒从质粒pSV2-dhfr中进行分离。对应于dhfr基因盒的1.93kb片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和纯化。通过BamH I消化产生的3-’凹缺末端使用DNA聚合酶I的克列诺片段进行填补，以产生平端。这种分离的片段与平端的3.8kb pcDNA3载体主链进行连接，以产生表达载体pcSD。这种表达载体具有下述特征：巨细胞病毒(CMV)启动子随后为多克隆位点、牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号和转录终止序列、用于选择和扩增的小鼠dhfr cDNA序列、用于在大肠杆菌中选择和维持的氨苄青霉素抗性基因和pUC复制起点。
pcSDhuCTLA4-Ig表达载体的构建：包含编码CTLA4-Ig蛋白质的序列的1.2千碱基(kb)DNA片段通过用限制酶Hind III和Xba I消化从质粒pCDM8-CTLA4-Ig中进行分离。将1.2-kb Hind III/Xba I片段连接到先前用限制酶Hind III和Xba I消化的载体piLN内。所得到的质粒构建体命名为piLN-huCTLA4-Ig，显示于图21中。piLN-huCTLA4-Ig质粒用作CTLA4-Ig编码序列的来源用于构建最终表达载体pcSDhuCTLA4-Ig。
用于表达CTLA4-Ig基因的最终载体如图29中所示进行构建。包含CTLA4-Ig基因的1.2kb DNA片段通过2步限制酶切消化程序从质粒piLN-huCTLA4-Ig中进行分离。质粒piLN-huCTLA4-Ig首先用限制酶Hind III进行消化。所得到的3-’凹缺末端通过用DNA聚合酶I的克列诺片段处理进行填补。质粒随后用限制酶Xba I进行消化，以释放包含CTLA4-Ig基因的1.2kb片段。这种片段进行纯化且与从pcSD的限制酶切消化中分离的EcoR V和Xba I片段进行连接。EcoR V和Xba I限制位点位于CMV启动子和盒之间的pcSD的多克隆位点中，所述盒包含牛生长激素多腺苷酸化信号和转录终止序列。这使CTLA4-Ig基因片段置于CMV启动子的控制下。这种质粒命名为pcSDhuCTLA4-Ig，且包含SEQ ID NO：1。
实施例12：CTLA4-Ig表达载体的转染以获得稳定的细胞系
这个实施例和实施例13描述了由其选择和扩增个别克隆的新近转染的细胞群体，且因此扩增的克隆不同于作为登记号CRL-10762保藏于ATCC的细胞。先前的CHO细胞系具有包含编码对应于CTLA4-Ig的氨基酸序列的DNA(具有ATCC登记号68629的DNA)的表达载体，描述于美国专利号5,434,131中。简言之，在ATCC登记号68629下保藏的包含cDNA的表达质粒(例如，pCDM8)，使用标准程序通过脂转染而转染到dhfr阴性CHO细胞内，以获得稳定表达CTLA4-Ig的细胞系。使用免疫染色在培养基中就B7结合活性筛选B7阳性CHO细胞系导致表达CTLA4-Ig的稳定转染子。转染的细胞的这种异质群体命名为中国仓鼠卵巢细胞系，CTLA4-Ig-24，且根据布达佩斯条约于1991年5月31日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国马里兰州罗克维尔(Rockville，Md.20852USA)，具有ATCC登记号CRL-10762。
中国仓鼠卵巢细胞系DG44包含编码二氢叶酸还原酶的基因的缺失。表达质粒pcSDhuCTLA4-Ig包含二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的拷贝。将质粒pcSDhuCTLA4-Ig插入DG44基因组内导致dhfr缺失的功能互补。这种功能互补可以用于在氨甲蝶呤(MTX)的存在下选择转染子和扩增dhfr及邻近基因。
如图29中所示，人CTLA4-Ig分泌细胞系1D5通过用pcSDhuCTLA4-Ig表达质粒转染细胞系DG44进行构建。质粒DNA使用本领域已知的标准程序通过电穿孔引入DG44细胞内。转染子使用补加有5％(v/v)透析的胎牛血清的极限必需培养基(MEM；JRH Biosciences，Inc.，Kansas)进行选择。来自转染子的培养物上清液使用夹心ELISA法就人IgG生产进行筛选。Fc特异性山羊抗人IgG用作捕获抗体。与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体用于检测人IgG。选择表达更高水平的人CTLA4-Ig基因的转染子用于进一步扩增。
所选择的转染子的基因扩增通过将MTX以100nM的终浓度加入培养基中来完成。MTX是充当二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂的叶酸类似物。将MTX加入培养基中允许选择包含dhfr基因的多拷贝和升高水平的二氢叶酸还原酶的转染子。使用人IgG特异性ELISA法鉴定还包含邻近的CTLA4-Ig基因的多拷贝的转染子。选择命名为1D5的CTLA4-Ig生产克隆用于在实施例13中描述的部分中的进一步发展。
实施例13：稳定转染的细胞的亚克隆
对细胞系1D5实施软琼脂克隆。衍生自软琼脂克隆的亚克隆使用ELISA法就人IgG生产进行分析。所选择的亚克隆就CTLA4-Ig生产和生长性质进行评估。选择命名为1D5-100A1的前导亚克隆(lead subclone)。
1D5-100A1细胞系从包含动物来源的原材料的DE培养基(JRH Biosciences，Inc.，Kansas适应到称为CD-CHO的化学成分确知培养基(表15)。CD-CHO培养基是由InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA制造的有专利权的、无动物组分的培养基。
表15：方法Y培养基的组成
细胞系1D5-100A1根据标准组织培养规程在DE培养基中进行培养和传代。随后将细胞转移至由50％DE培养基和50％CD-CHO培养基组成的培养基。在这种培养基几次传代后，将细胞转移至包含100％CD-CHO培养基的T瓶。细胞在100％CD-CHO培养基中生长几代。随后通过有限稀释对适应的细胞实施克隆。
来自CD-CHO适应的1D5-100A1细胞系的细胞通过有限稀释使用无血清培养基进行克隆。1D5-100A1细胞以1细胞/孔的靶接种到包含补加的MCDB培养基的96孔微量滴定板内。MCDB是由Sigma-Aldrich，St.Louis，MO配销的化学成分确知培养基制剂。MCDB培养基补加有4mM谷氨酰胺、500μg/mL重组人胰岛素、100nM MTX和10％条件培养基。条件培养基是来自CD-CHO适应的1D5-100A1细胞系的培养物的过滤灭菌的上清液，所述1D5-100A1细胞系在MCDB培养基中生长。
鉴定包含单个集落的孔，并且使用ELISA法就CTLA4-Ig生产评估克隆。所选择的克隆从96孔微量滴定板中扩增到6孔细胞培养板。培养物进一步扩增到25cm2T瓶和随后滚瓶内。
就CTLA4-Ig滴度、CTLA4-Ig唾液酸含量和生长评估滚瓶培养物。选择3个克隆用于在生物反应器中进一步评估和进一步表征。贮藏于-80℃的克隆细胞系1D5-100A1.17的冷冻小瓶研究原种用于产生细胞库。
实施例14：经由补料分批方法在生物反应器中生产CTLA4-Ig
表达CTLA4-Ig的悬浮哺乳动物细胞的商业规模培养：这个实施例描述了由悬浮培养的dhfr阴性CHO细胞生产包含SEQ ID NO：2单体的CTLA4-Ig分子。这个实施例中描述的方法可以适合且扩展用于生产其他重组蛋白质，包括但不限于，分泌的蛋白例如细胞因子和其他激素、作为Ig超家族成员或包含Ig超家族蛋白质的部分的分泌的蛋白、和一般地在CHO细胞中表达的任何蛋白质。关于CTLA4-Ig培养步骤的工艺流程图显示于图10中。
培养瓶(例如，T-175和锥形瓶)、滚瓶和细胞袋用于CTLA4-Ig培养方法的接种物扩增步骤，以从冷冻小瓶连续繁殖细胞以提供足够数目的活细胞以接种20,000-L生物反应器。
单个小瓶的细胞从液氮贮藏冷冻机的汽相中取出且在水浴中于37℃解冻。将小瓶的整个内容物无菌转移到无菌的15-mL圆锥形离心管内。添加CD-CHO培养基以使最终体积达到10mL。将细胞悬浮液离心，弃去上清液且使细胞沉淀重悬浮于10mL CD-CHO细胞培养基中。将重悬浮的细胞转移至包含10mL CD-CHO培养基的T-175瓶。测定T-175瓶中的培养物的活细胞密度和百分比生存力。确立在这个步骤时≥84％的百分比生存力标准。向T-175瓶中加入CD-CHO培养基以达到1.7-2.6x105细胞/mL的靶活细胞密度。
使T-175瓶于37℃在6％二氧化碳的气氛中温育最多4天，以达到≥6x106活细胞的最终靶细胞数目。如图10中所示，T-175瓶步骤后，使用一系列摇瓶、1-L和2-L滚瓶扩增培养物。在每次传代时，使细胞以2.0x105活细胞/mL的靶密度接种，其中培养物靶向具有≥80％的最终培养物细胞生存力。培养物在CD-CHO培养基中于37℃在6％二氧化碳的气氛中温育最多4天。
培养物的扩增在一系列细胞袋(20-L、100-L和200-L)中发生，以进一步接种1000-L生物反应器。合并来自2-L滚瓶接种物扩增步骤的细胞培养材料，以按2.0x105活细胞/mL的靶接种密度接种20-L细胞袋。确立关于在2-L滚瓶接种物扩增步骤时1.0－2.0x106细胞/mL的最终活细胞密度和≥80％的最低百分比细胞生存力的条件。接种后，使20-L细胞袋培养物在CD-CHO培养基中于37℃在6％二氧化碳的气氛中温育最多4天。对于每次后续传代(100-L和200-L细胞袋)，细胞以2.0x105活细胞/mL的靶密度接种，其中培养物靶向具有≥80％的最终培养物细胞生存力。使培养物在CD-CHO培养基中于37℃在6％二氧化碳的气氛中温育最多4天。确立关于在20-L、100-L和200-L细胞袋接种物扩增步骤时1.0－2.0x106细胞/mL的最终活细胞密度和≥80％的最低百分比细胞生存力的条件。这些示例性值确保足够数目的活细胞用于接种1000-L生物反应器。
CTLA4-Ig方法的1000-L和4000-L种子生物反应器接种物扩增步骤的目的是提供足够数目的活细胞，以接种20,000-L生产生物反应器。
种子生物反应器使用CD-CHO细胞培养基以分批模式进行操作。温度、pH、溶解氧、压力、搅拌以及关于空气、氧和二氧化碳的气流速率受分布控制系统(DCS)的控制，且提供关于培养物在种子生物反应器中最佳生长的条件。种子生物反应器于37℃操作。从种子生物反应器中取出培养物样品，用于确定活细胞密度、百分比生存力和代谢物浓度。
用来自200-L细胞袋扩增步骤的接种物接种1000-L种子生物反应器至1.0－3.0x105活细胞/mL的靶起始活细胞密度。培养物在CD-CHO培养基中于37℃温育最多5天。关于在1000-L种子生物反应器接种物扩增步骤时的最终活细胞密度的示例性值为1.0－2.0x106细胞/mL，和最低百分比细胞生存力为≥80％。
用来自1000-L种子生物反应器扩增步骤的接种物接种4000-L种子生物反应器至1.0－3.0x105活细胞/mL的起始靶活细胞密度。培养物在CD-CHO培养基中于37℃温育最多6天。关于在4000-L种子生物反应器接种物扩增步骤时的最终活细胞密度的示例性值为1.0－2.0x106细胞/mL，和最低百分比细胞生存力为≥80％。这些示例性值确保足够数目的活细胞用于接种20,000-L生产生物反应器。
用来自4000-L种子生物反应器扩增步骤的接种物接种20,000-L种子生物反应器至1.0－1.8x105活细胞/mL的起始靶活细胞密度。培养物在CD-CHO培养基中于37℃温育最多6天。关于在20,000-L种子生物反应器接种物扩增步骤时的最终活细胞密度的示例性值为1.0－2.0x106细胞/mL，和最低百分比细胞生存力为≥80％。这些示例性值确保在起始20,000-L生产生物反应器中的生产期之前使用足够数目的活细胞。
CTLA4-Ig的商业规模生产：在20,000-L生产生物反应器中发生的本发明的生产期产生高量和高品质的CTLA4-Ig蛋白质，其涉及具有2步温度变动的培养运行。在第6天(对数生长期结束时)对在CD-CHO培养基中于37℃温育最多6天(如上所述)的20,000L培养物实施从37℃到34℃的温度变动(T变动)。37℃至34℃的温度变动后12小时，CD-CHO培养基用改良的eRDF进料培养基(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA；表16，17)进行补加，并且这种进料作为大丸剂(1％w/w)每天供应给生产反应器。
表16：eRDF进料培养基的组成
表17：eRDF-1培养基的组成
表17：eRDF-1培养基的组成
20,000L培养物在每天补加eRDF进料培养基的CD-CHO培养基中于34℃温育最多4天。在第10天时，对20,000L培养物实施从34℃到32℃的第二次T变动。在生产生物反应器中的20,000L生产培养物维持于32℃最多8天。在第18天，培养物样品就下述示例性值进行分析：在20,000-L种子生物反应器生产步骤时的活细胞密度为3.0－8.0x106细胞/mL；最低百分比细胞生存力为≥38％；最终唾液酸摩尔比(其他地方描述)为≥6；和最终CTLA4-Ig蛋白质产物滴度为0.5－1.3g/L。这些示例性值确保足够品质和量的蛋白质产物经由重组CHO细胞系生产，并且20,000-L哺乳动物细胞培养物即将被收获。
在生产期过程中的生物反应器中的培养物如下使用改良的eRDF培养基(表16，17)每天给予大丸剂进料：起始温度变动(37℃－34℃)后12小时开始，最低限度1％培养体积作为进料培养基进行添加；如果葡萄糖水平降到3g/L以下，那么添加计算体积以使葡萄糖水平恢复至3g/L。
生产期在20,000L规模时具有18天的持续时间。每天从生产生物反应器中获取样品用于分析。例如，用于细胞计数的样品用锥虫蓝(Sigma，St.Louis，Mo.)进行染色。细胞计数和细胞生存力测定使用血细胞计数器来进行，以在显微镜下计数染色活细胞。对于代谢物的分析，另外的样品等分试样在2000rpm下(4℃)离心20分钟以沉淀细胞。上清液使用本领域照惯例实践的技术和规程就蛋白质滴度、唾液酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、pO2、pCO2、氨和LDH进行分析。
实施例15：重组CTLA4-Ig的纯化
用于CTLA4-Ig纯化的QXL阴离子交换层析：CTLA4-Ig方法中的阴离子交换层析步骤使用Q Sepharose Extreme Load(QXL)阴离子交换层析树脂。这种树脂由GEHealthcare，Waukesha，WI(以前的Amersham Biosciences)提供。QXL层析步骤从来自收获操作步骤的进行中(in-process)材料捕获和浓缩CTLA4-Ig二聚体用于进一步的下游加工。
1.0－2.0m内径柱用QXL树脂填充至17－30cm的高度，表示约643L－1018L的体积。通过测定填充柱的理论塔板高(HETP)和不对称性(As)使柱有资格用于使用。0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的As用于QXL柱的资格评定。
QXL柱操作在环境温度下进行。将澄清的细胞培养物液体培养基装载到平衡的QXL柱上。QXL层析步骤使用99.4L/分钟的最大流速来进行。柱入口压力维持在35psig下。关于QXL柱的最大CTLA4-Ig蛋白质负荷为28克CTLA4-Ig/L树脂。
QXL层析柱首先用1N氢氧化钠溶液进行卫生处理。卫生处理使用2－4柱体积(CV)的1N氢氧化钠溶液来进行。当柱流出物的导电性等于169±33mS/cm和柱保持60－120分钟时，卫生处理完成。
卫生处理步骤后，柱用75mM HEPES，360mM氯化钠，pH 8.0缓冲液进行平衡。当最低限度3CV平衡缓冲液已经过柱和流出物的pH为8.0±0.2和流出物的导电性为13.4±1.0mS/cm时，平衡完成。
将来自收获操作步骤的进行中材料装载到QXL柱上。柱用最低限度10CV洗涤缓冲液(75mM HEPES，360mM NaCl，pH 8.0)进行洗涤，且柱流出物在280nm(A280)处的吸光度在洗涤步骤结束时进行测量。CTLA4-Ig随后使用25mM HEPES，325mM NaCl或850mM NaCl，pH 7.0缓冲液从柱中洗脱。当A280增至超过在洗涤步骤结束时的AU值≥0.02吸光度单位(AU)时，使洗脱物转向收集容器。收集洗脱物直至洗脱峰的尾随边缘的A280降至≤1.0AU的值。
收集摩尔唾液酸与摩尔CTLA4-Ig蛋白质的摩尔比≥8的CTLA4-Ig二聚体产物，并且CTLA4-Ig高分子量材料库以≤25.7％存在。包括四聚体的CTLA4-Ig高分子量材料可以进一步纯化用于作为分离物质用于本文描述的处理法。
用于CTLA4-Ig纯化的苯基琼脂糖FF HIC：疏水作用层析(HIC)步骤使用苯基琼脂糖快速流动(Phenyl Sepharose Fast Flow)树脂(GE Healthcare，Waukesha，WI(以前的Amersham Biosciences))。HIC步骤减少QXL产物库中存在的CTLA4-Ig高分子量材料的水平。CTLA4-Ig二聚体在用于HIC步骤的装载条件下不与HIC树脂结合。
1.0－2.0m内径柱用苯基琼脂糖快速流动树脂填充至18－22cm的高度，表示约680L－852L的体积。通过测定填充柱的HETP和As使柱有资格用于使用。0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的As用于HIC柱的资格评定。
HIC柱操作在环境温度下进行。无需进一步处理将来自QXL柱步骤的洗脱物库装载到平衡的HIC柱上。HIC步骤以65.4L/分钟的最大流速和≤13psig的操作压力来操作。应用于HIC柱的最大CTLA4-Ig蛋白质负荷为10.0g CTLA4-Ig蛋白质/升树脂。基于存在于QXL洗脱物库中的CTLA4-Ig蛋白质的量，可以使用HIC步骤的多重循环。
HIC柱首先用1N氢氧化钠溶液进行卫生处理。当2－4CV的1N氢氧化钠溶液已经过柱时，卫生处理完成。柱随后保持60－120分钟以确保卫生处理。
卫生处理步骤后，柱用75mM HEPES，2.55mM氯化钠，pH 7.0缓冲液进行平衡。当最低限度3CV平衡缓冲液已经过柱和流出物的pH为7.0±0.3和导电性为71.5－75.5mS/cm时，平衡完成。
将来自QXL步骤的洗脱物应用于平衡的HIC柱。柱随后用追踪平衡缓冲液进行洗涤，直至流出物的A280降至0.8－1.0AU。来自HIC步骤的每个循环的包含CTLA4-Ig蛋白质的流出物通过0.2μm乙酸纤维素过滤器过滤到通常的不锈钢收集容器内。这种HIC产物库在收集容器中保持于2－8℃。在收集容器中的最大保持时间为3天。
收集摩尔唾液酸与摩尔CTLA4-Ig蛋白质的摩尔比≥8的CTLA4-Ig二聚体产物，并且CTLA4-Ig高分子量材料库以≤2.5％存在。
用于CTLA4-Ig纯化的重组A蛋白亲和层析：在下游CTLA4-Ig生产方法中使用的重组A蛋白琼脂糖快速流动(Protein A Sepharose Fast Flow)亲和树脂(rPA)得自GEHealthcare(Waukesha，WI(以前的Amersham Biosciences))。rPA柱层析步骤进一步纯化CTLA4-Ig蛋白质。这个步骤去除DNA和宿主细胞蛋白质，包括单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。
80－140m内径柱用rPA树脂填充至18－25cm的高度，表示约339L－372L的体积。通过测定填充柱的HETP和As使柱有资格用于使用。0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的As用于柱的资格评定。在树脂寿命研究中确立的用于rPA树脂的最大使用次数为60。
rPA柱操作在环境温度下进行。将病毒灭活产物库装载到平衡的rPA柱上。rPA步骤以26.7L/分钟的最大流速和≤13psig的操作压力来操作。应用于rPA柱的最大CTLA4-Ig蛋白质负荷为25g CTLA4-Ig蛋白质/升树脂。
rPA柱用25mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0缓冲液进行平衡。当最低限度3CV平衡缓冲液已经过柱以及流出物的pH和导电性值分别为7.8－8.2和23.0－27.0mS/cm时，平衡完成。
将病毒灭活步骤产物库应用于平衡的rPA柱。rPA层析步骤包括2个洗涤步骤。第一个洗涤步骤使用最低限度5CV 25mM Tris，250mM NaCl，0.5％Triton X-100，pH 8.0缓冲液来进行，以从rPA柱中去除弱结合的材料。第二个洗涤步骤使用25mM Tris，250mM NaCl，pH8.0缓冲液来进行。第二个洗涤步骤使用最低限度5CV以从rPA柱中去除残留的Triton X-100。
CTLA4-Ig蛋白质使用100mM甘氨酸，pH 3.5缓冲液从rPA层析柱中洗脱。当A280增至超过基线≥0.2AU时，将洗脱物转向收集容器。柱流出物通过0.2μm乙酸纤维素过滤器过滤到配备搅拌器的收集容器内。收集洗脱物直至洗脱峰的尾随边缘的A280降至≤0.2AU的值。洗脱物库的pH使用2M HEPES，pH 8.0缓冲液调整至pH 7.5±0.2。rPA层析步骤产物库保持于2－8℃最多3天。
收集摩尔唾液酸与摩尔CTLA4-Ig蛋白质的摩尔比≥8的CTLA4-Ig二聚体产物；CTLA4-Ig高分子量材料库以≤2.5％存在；和存在≤38ng/mL的MCP-1库。
用于CTLA4-Ig纯化的QFF阴离子交换层析：下游CTLA4-Ig生产方法中的阴离子交换层析步骤使用Q琼脂糖快速流动(QFF)阴离子交换层析树脂(GE Healthcare(Waukesha，WI(以前的Amersham Biosciences)。QFF层析步骤的目的是减少残留的A蛋白水平，且提供来自病毒过滤步骤产物库的宿主细胞DNA的另外减少。QFF柱步骤也用于控制QFF层析步骤产物库的唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质摩尔比，且提供进行中CTLA4-Ig HMW材料水平的另外控制。用于减少CTLA4-Ig HMW材料的主要进行中控制点是HIC步骤。
60－140m内径柱用QFF树脂填充至28－35cm的高度，表示约536L－667L的体积。通过测定填充柱的HETP和As使柱有资格用于使用。0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的As用于柱的资格评定。
QFF柱操作在环境温度下进行。将病毒过滤步骤产物库装载到平衡的QFF柱上。QFF步骤以38.7L/分钟的最大流速和≤35psig的操作压力来操作。应用于QFF柱的最大CTLA4-Ig蛋白质负荷为25g CTLA4-Ig蛋白质/升树脂。
QFF层析柱首先用1N氢氧化钠溶液进行卫生处理。卫生处理使用2－4CV的1N氢氧化钠溶液来进行。当柱流出物的导电性等于136－202mS/cm和柱保持60－120分钟时，卫生处理完成。
卫生处理步骤后，柱用25mM HEPES，100mM氯化钠，pH 8.0缓冲液进行平衡。当最低限度4CV平衡缓冲液已经过柱和流出物的pH为7.7－8.3和导电性为10.5－12.9mS/cm时，平衡完成。
将生物加工袋中包含的病毒过滤步骤产物库转移到无菌的不锈钢收集容器内。
将病毒过滤步骤产物库应用于平衡的QFF柱。QFF层析步骤包括2个洗涤步骤。第一个洗涤步骤使用最低限度5.0CV 25mM HEPES，120mM NaCl，pH 8.0缓冲液来进行。第二个洗涤步骤使用最低限度5.0CV 25mM HEPES，130mM NaCl，pH 8.0缓冲液来进行。
CTLA4-Ig二聚体使用25mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0缓冲液从QFF层析柱中洗脱。当流出物的A280开始增加时，起始洗脱物收集。在洗脱期间，柱流出物通过0.2μm乙酸纤维素过滤器过滤到不锈钢收集容器内。收集洗脱物直至洗脱峰的尾随边缘的吸光度降至超过基线≤0.2AU。随后使收集容器冷却至2－8℃。关于QFF层析步骤产物库于2－8℃的最大保持时间为3天。
收集摩尔唾液酸与摩尔CTLA4-Ig蛋白质的摩尔比≥8的CTLA4-Ig二聚体产物；CTLA4-Ig高分子量材料库以≤2.5％存在；CTLA4-Ig低分子量材料(例如CTLA4-Ig单体)库以≤0.5％存在；和存在≤9.5ng/mL的MCP-1库。
Pall Filtron TFF系统用于下游CTLA4-Ig生产方法的浓缩和渗滤步骤。这个步骤的目的是使QFF层析步骤产物库浓缩至45－55g/L，和由用于CTLA4-Ig组合物的最终缓冲液交换QFF层析步骤中使用的洗脱缓冲液。浓缩的CTLA4-Ig蛋白质产物库通过0.2μm聚偏1,1-二氟乙烯过滤器转移并进入50-L生物加工袋内。
实施例16：氨基单糖的CTLA4-Ig-摩尔比测定
这个实施例提供了获得CTLA4-Ig样品中氨基单糖(N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺)与蛋白质的摩尔比的方法。
仪器配置：毛细管电泳系统Beckman P/ACE MDQ CE系统；检测器Beckman激光诱导的荧光(Laser-Induced-Fluorescence)(LIF)检测系统(与P/ACE MDQ偶联)；末涂覆的毛细管(i.d.25μm；o.d.360μm)，27－31cm总长以容纳P/ACE MDQ或5510PolyMicroTechnologies，目录号TSP025375；Maxi-Mix混合器Thermolyne,(VWR目录号58810-185)。
试剂：
水解溶液(4N HCl水溶液
将160mL 6N HCl和80mL HPLC等级水加入250mL玻璃瓶中。
搅拌以充分混合。
贮藏于2－8℃最多6个月。
衍生化溶液I(0.1M APTS水溶液)
将192μL HPLC等级水加入在玻璃小瓶中的10mg APTS粉末中。
使小瓶涡旋5－10秒以完全溶解APTS。
贮藏于2－8℃最多1年。
衍生化溶液II(1M乙酸和0.25M NaBH 3 CN)
在0.4mL离心管中用320μL HPLC等级水稀释20μL乙酸(17倍稀释)，以制备1M乙酸溶液。
将2.0±0.5mg NaBH3CN称量到深低温小瓶内。
使用下式，添加合适体积的1M乙酸溶液以制备0.25M NaBH3CN。体积(μL)＝103×(以mg表示的NaBH3CN重量)/(62.84g/mol×0.25mol/L)
·氰基硼氢钠(NaBH3CN)应在黑暗中贮藏于干燥器中。·推荐如下将试剂再分到一系列2.0mL冷冻小瓶内用于贮藏，以避免反复打开最初的试剂瓶：·将1.0g±0.2mg氰基硼氢钠称量到2.0mL冷冻小瓶内。以这种方式将来自最初瓶中的氰基硼氢钠的全部内容物等分试样。·紧紧地盖上盖子且连同试剂名称、批号和6个月有效期一起顺序(1、2、3等)标记冷冻小瓶。·小瓶应用石蜡膜密封以避免湿气。·从相同冷冻小瓶中称出氰基硼氢钠用于衍生化溶液II不超过3次。在实验室工作表上注明这点和冷冻小瓶顺序号。·在CE概况中观察到的试剂峰或弱标记可能在冷冻小瓶反复打开后或用那种特定批次的氰基硼氢钠发生。如果这影响结果，那么弃去使用的冷冻小瓶并且从具有下一个顺序号的冷冻小瓶中或从新批次氰基硼氢钠中称出试剂。
再乙酰化缓冲液(25mM碳酸氢钠，pH9.5)
将0.210±0.02g碳酸氢钠称量到干净的100mL干净的玻璃烧杯内。
添加90mL HPLC等级水，且在搅拌板上混合直至盐完全溶解。
用10N NaOH将pH调整至9.5±0.1。
添加HPLC等级水以获得100mL的最终体积。过滤(步骤1.26)溶液且贮藏于室温最多3个月。
运行缓冲液(60±5mM四硼酸钠，pH9.25)
将1.21±0.02g四硼酸钠称量到100mL干净的玻璃烧杯内。
添加90mL HPLC等级水，且在搅拌板上混合直至盐完全溶解。
用10N NaOH将pH调整至9.25±0.10。
对于60±5mM的终浓度，添加HPLC等级水以获得100mL的最终体积。
对于55mM溶液，称量1.11g(±0.02)四硼酸钠且根据上述说明用于溶解和滴定。
对于65mM溶液，称量1.31g(±0.02)四硼酸钠且根据上述说明用于溶解和滴定。
贮藏于室温最多3个月。如果峰分辨率受影响(R值<1.0)，那么制备新鲜的缓冲液。
任选的：对于60mM(±5mM)的终浓度，通过将120mL超纯水加入80mL 150mM四硼酸钠缓冲液中稀释四硼酸盐缓冲溶液(MicroSolv)。用10N NaOH滴定以使溶液pH达到9.25(±0.1)。
对于55mM四硼酸盐溶液，将66mL 150mM四硼酸盐缓冲液稀释到114mL超纯水内。如上滴定。
对于65mM四硼酸盐溶液，将78mL 150mM四硼酸盐缓冲液稀释到102mL超纯水内。如上滴定。
溶液贮藏于室温最多3个月。
如果峰分辨率受影响(R值<1.0)，那么制备新鲜的缓冲液。
毛细管冲洗溶液
N NaOH溶液
将1mL 10N NaOH溶液加入包含9mL HPLC等级水的15mL刻度塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。
溶液贮藏于室温最多6个月。
N HCl溶液：
将1mL 6N HCl溶液加入包含5mL HPLC等级水的15mL刻度塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。
溶液贮藏于室温最多6个月。
3.6.3 80％甲醇溶液
将8mL HPLC等级甲醇加入包含2mL HPLC等级水的15mL刻度塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。
溶液贮藏于室温最多6个月。
单糖标准贮存液
N-乙酰葡糖胺(GalNAc)
将5±1mg Ga1NAc精确称量到2.0mL深低温小瓶内。
添加1mL HPLC等级水且通过涡旋充分混合直至溶解。
记录溶液的准确浓度(mg/mL)。
N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc)
将5±1mg GlcNAc精确称量到2.0mL深低温小瓶内。
添加1mL HPLC等级水且通过涡旋充分混合直至溶解。
记录溶液的准确浓度(mg/mL)。
N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)
将5±1mg ManNAc精确称量到2.0mL深低温小瓶内。
添加1mL HPLC等级水且通过涡旋充分混合直至溶解。
记录溶液的准确浓度(mg/mL)。
将单糖标准贮存液贮藏于-20℃最多1年。
单糖工作溶液I：内部标准工作溶液
通过将20μL ManNAc贮存液加入2mL深低温小瓶内用HPLC等级水将ManNAc的贮存液稀释100倍，所述深低温小瓶已包含1980μL HPLC等级水。涡旋约5－10秒。
将内部标准工作溶液贮藏于2－8℃最多6个月。
单糖工作溶液II：氨基混合标准工作溶液
在包含1960μL HPLC等级水的2.0mL深低温小瓶中，分别加入20μLGalNAc和GlcNAc的贮存液。涡旋约5－10秒。
将氨基混合标准工作溶液贮藏于2－8℃最多6个月。
样品和参考材料溶液。
于2－8℃解冻冷冻的蛋白质样品，且通过倒置轻轻混合。
用HPLC等级水将样品和参考材料稀释至约1.0mg/mL。注明浓度至3个有效数字。
CE运行条件
运行缓冲液(步骤2.5)60mM四硼酸钠，pH 9.25
毛细管柱体温度25℃
电压25－30kV，正模式
检测器条件LIF检测器，激发：488nm，发射：520nm.
样品注射压力注射模式，在0.5PSI时20s
运行时间10分钟
样品贮藏10℃
程序
注：使用10μL移液器和微尖端(micro tips)以转移10μL样品体积和适当大小的移液器以转移其他试剂(参见步骤2.10至2.14中的范围)。
水解
在0.65mL离心管中，加入10μL ManNAc工作溶液和200μL 4N水解溶液(步骤3.1)。这充当系统空白。
在0.65mL离心管中，加入10μL ManNAc工作溶液和10μL氨基混合标准溶液(步骤3.9)。进一步加入200μL 4N水解溶液。这充当用于定量和系统适合性的单糖标准。一式两份地制备。
在0.65mL离心管中，加入10μL ManNAc工作溶液和10μL CTLA4-Ig参考材料溶液(约1mg/mL)。
进一步加入200μL 4N HCl溶液。一式两份地制备。
在0.65mL离心管中，加入10μL ManNAc工作溶液和10μL样品溶液(约1mg/mL)。进一步加入200μL 4N HCl溶液。一式两份地制备。
使样品涡旋约10秒且离心约5－10秒。将样品置于96位置小瓶架中且在烤箱中于95℃温育6小时。
水解后，将水解的样品置于-20℃10分钟以冷却。
使水解的样品短暂离心直至任何冷凝物被迫至管的底部(在高速时5－10秒)。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。
注：关闭SpeedVac加热，且将蒸发速率设为“低”。
用100μL HPLC等级水重构每种样品且涡旋10－15秒。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。
注：关闭SpeedVac加热，且将蒸发速率设为“低”。
再乙酰化
用10μL M6再乙酰化缓冲液重构每种样品且涡旋10－15秒以充分混合。将4μL M3再乙酰化试剂加入每个管内。涡旋约5－10秒。在冰上温育30分钟。
注：再乙酰化缓冲液(M6)和试剂(M3)可以分别用内部(in house)制备的25mMNaHCO3(添加20μL)和乙酸酐(添加4μL)替换。
在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。
注：关闭SpeedVac加热，且将蒸发速率设为“低”。
用100μL HPLC等级水重构每种样品且涡旋10－15秒。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。
注：关闭SpeedVac加热，且将蒸发速率设为“低”。
衍生化
将微量离心机置于烤箱中以平衡至55℃的烤箱温度。
用10μL衍生化溶液I(0.1M APTS溶液，步骤3.2)重构每种样品。涡旋约5－10秒。
添加5μL衍生化溶液II(1M HAc和0.25M NaBH3CN，步骤3.3)。涡旋约5－10秒且离心。
将样品小瓶快速装载到预加温的离心机内，且将离心机放回到55℃烤箱中。温育3小时同时在2000rpm下离心。这防止溶剂在小瓶表面上冷凝。
仪器配置制备
安装新毛细管，使用下述步骤以高压模式(80PSI)冲洗：
1N NaOH 20分钟。
HPLC等级水10分钟。
60mM四硼酸钠缓冲液10分钟。
操作
每次操作前，运行洗涤/冲洗顺序以冲洗毛细管。
随后运行系统适合性标准(单糖标准)以确保系统是适合的。
使用1N NaOH可能蚀刻来自不同厂商的毛细管的内部，且引起运行自始至终迁移时间中的变动。如果这引起最后峰(G1cNAc)的迁移时间超过10.0分钟，那么对于步骤2冲洗，可能必须用0.1N NaOH或HPLC等级水替换1N NaOH。
当使用等价毛细管和上述洗涤操作不足够时，可能必须使用80％甲醇和/或1NHCl以使最后峰(G1cNAc)在10.0分钟的示例性值内。
用于注射的制剂
衍生化后，使样品冷却至室温。在室温下离心约10秒，直至冷凝物被迫至管的底部。
向每个管中加入85μL HPLC等级水以使每种样品的最终体积达到100μL。涡旋5－10秒。
从每个管中转移10μL样品到CE微量小瓶(micro vial)中，且向每个管中加入190μL HPLC等级水。涡旋5－10秒。
冲洗步骤和注射顺序：
注：对于每4次注射，用新鲜制备的CE运行缓冲液更换CE运行缓冲液(由于离子耗尽作用)。以40psi执行毛细管冲洗。
系统适合性
注：除非另有说明，系统适合性值使用系统适合性标准的第一次注射进行测定。
第一种系统适合性的电泳图应类似于图81中所示的那种，其中峰1是GalNAc；峰2是ManNAc；峰3是GlcNAc。
注：当使用除Beckman PACE MDO外的CE仪器时，由于保持分开的毛细管的柱体的各种构型，毛细管的长度可以不同于这种方法中指定的那种。这将导致分析物迁移时间以及峰强度中的变化。
根据下面等式通过仪器计算关于第一种系统适合性标准的2个邻近峰之间的分辨率：
其中：
R－分辨率
t2，t1－2个邻近峰分别的迁移时间
W1，W2－2个邻近峰分别在基线处的峰宽
R值必须≥1.0。如果R<1.0，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。对于最后系统适合性注射，使用下式最后峰(GlcNAc)必须具有<1.4的拖尾因子：
T＝W0.05/2f
其中：
T－拖尾因子
W0.05－在5％高度时的峰宽
f－在峰最大值时峰前面的宽度
如果T≥1.4，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。
重复注射显示下述示例性值：
■GlcNAc对MaNAc的峰面积比：RSD≤10％(在步骤7.1中计算)
■GlcNAc的迁移时间应≤10.0分钟
■概况应等价于图81，其中观察到3个峰且内部标准(ManNAc)是第2个峰。
如果在测试样品前未达到上述示例性值中的任何一个，那么如果GlcNAc的迁移时间大于10.0分钟，首先增加电压。其次，如果峰面积比>10％，那么制备新鲜的CE缓冲液从而确定其pH或替换毛细管。调整仪器后，重复系统适合性注射。当分析峰概况时，如果发生ManNac的峰高中的显著降低，那么检查以确保进入LIF模块内的纤维光学电缆并未不对准。
通过比较内部标准和单糖标准组分的峰面积比来测定单糖标准百分比RSD。将关于每个单糖组分的峰面积除以关于每次单糖标准注射的内部标准的峰面积。计算关于2种一起进行的标准的GalNAc和GlcNAc的百分比RSD。RSD应≤10％。如果不符合这个示例性平均值，那么毛细管应如上进行冲洗或替换。
计算
计算GalNAc和GlcNAc相对于内部标准(ManNAc)的峰面积比。使用最初四种系统适合性标准的重复注射以便符合上述示例性值，且对样品前和后注射的所有一起进行的、系统适合性标准进行相同计算。
峰面积比＝将关于每种单糖组分(GlcNAc，GalNAc)的峰面积除以关于每次系统适合性标准注射的内部标准(ManNAc)的峰面积。
计算在系统适合性标准中关于GlcNAc和GalNAc的峰面积比的平均值。还计算标准差(S.D.)和百分比相对标准差(％RSD)
示例性值：关于GlcNAc的峰面积比的RSD≤10％。
样品前和后注射的2种、一起进行的、系统适合性标准：关于GlcNAc和GalNAc的峰面积比的百分比RSD≤10％。
如果不符合这个示例性平均值(RSD>10％)，那么毛细管必须用冲洗程序再次冲洗，并且那些样品和一起进行的单糖标准需要再次运行。如果仍不符合示例性平均值，那么替换毛细管且冲洗。再次运行样品和一起进行单糖标准。
其中：
n－样品中的测量数目
x－个别测量
计算GalNAc/蛋白质的摩尔比：
其中：
RGalNAc＝GalNAc对蛋白质的摩尔比
AGalNAc＝样品中GalNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc＝样品中ManNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAcO＝单糖标准中ManNAc的峰面积(μV·秒)平均值
AGalNAcO＝单糖标准中GalNAc的峰面积(μV·秒)平均值
VGalNAcO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc体积(以μL表示)
CGalNAcO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MW阿巴西普＝根据分析证明书(COA)的阿巴西普参考材料的分子量
MWGlcNAc＝GalNAc的分子量(221.2道尔顿)
标准一起进行
当计算CTLA4-Ig材料和样品的摩尔比时，使用所有8种一起进行的系统适合性标准。求峰面积的平均值以包括在这个等式中。这将用于前3种样品。对于所有其他样品，一直使用接下来的4种一起进行的单糖标准和前4种一起进行的单糖标准的平均峰面积用于摩尔比计算。
计算GIcNAc/蛋白质的摩尔比
其中：
RGlcNAc＝GlcNAc对蛋白质的摩尔比
AGlcNAc＝样品中GlcNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc＝样品中ManNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAcO＝单糖标准中ManNAc的峰面积(μV·秒)平均值
AGlcNAcO＝单糖标准中GlcNAc的峰面积(μV·秒)平均值
VGlcNAcO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GlcNAc体积(以μL表示)
CGlcNAcO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GlcNAc浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWCTLA4-Ig＝CTLA4-Ig参考材料的分子量
MWGlcNAc＝GlcNAc的分子量(221.2道尔顿)
示例性值。关于2种、一起进行的、氨基系统适合性标准峰面积比的百分比RSD不应超过10％。关于参考材料中的氨基单糖的平均摩尔比应在正下方表中指定的范围内。对于每种组分，关于4种结果(一式两份制剂的一式两份注射)的％RSD必须</＝25％。
表－CTLA4-Ig参考材料的摩尔比范围
单糖 范围
GalNAc 2.0－3.2
GlcNAc 18－32
实施例17：通过毛细管电泳(CE)测定氨基单糖(GalNAc和GlcNAc)的摩尔比
在一个实施方案中，CTLA4-Ig组合物具有约15－35摩尔GlcNAc/摩尔蛋白质和约1.7－3.6摩尔GalNAc/摩尔蛋白质的特征。下述例子描述了测定这些摩尔比的方法。
试剂：水解溶液(4N HCl)；衍生化溶液I(0.1M 8-氨基1,3,6-三磺酸，三钠盐(APTS)水溶液)；衍生化溶液II(溶于1M乙酸的0.25M NaBH3CN)；再乙酰化缓冲液(25mM碳酸氢钠，pH9.5)；运行缓冲液(60±5mM四硼酸钠，pH9.25)；毛细管冲洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80％甲醇)；浓度为5mg/ml的GalNAc、GlcNAc和ManNAc的单糖标准贮存液；单糖工作溶液I：内部标准工作溶液是ManNAc贮存液的100倍稀释物；单糖工作溶液II：氨基混合标准工作溶液，GalNAc和GlcNAc贮存液的100倍稀释物。
仪器配置：CE系统是Beckman P/ACE MDQ CE系统；检测器：与P/ACE MDQ)偶联的Beckman激光诱导的(LIF)检测系统；未涂覆的毛细管(i.d.25μm，o.d.360μm)27－31cm总长以容纳P/ACE MDQ。
毛细管电泳运行条件：运行缓冲液(60mM四硼酸钠，pH 9.25)；毛细管柱体温度：25℃；电压：25－30kV，正模式；检测器条件：LIF检测器，在488nm处激发，在520m处发射；样品注射：压力注射模式，在0.5PSI时20s；运行时间：10分钟；样品贮藏：10℃。
水解：使10μL ManNAc工作溶液和200μL 4N HCl混合，以制备系统空白。使10μLManNAc工作溶液和10μL氨基混合标准溶液与200μL 4N HCl混合，以制备单糖标准。使10μLManNAc工作溶液和10μL CTLA4-Ig二聚体(约1mg/ml)与200μL 4N HCl混合，以制备测试样品。将所有管涡旋10秒，且离心10秒，随后于95℃温育6小时。水解步骤后，将样品置于-20℃10分钟以冷却。使样品向下旋转10秒且在SpeedVac中蒸发至干燥。
再乙酰化：用100μL HPLC等级水重构水解和干燥的样品。重构的样品通过下述进行再乙酰化：添加10μL M6再N-乙酰化缓冲液(Glyko)和4μL M3再乙酰化试剂(Glyko)，随后混合和在冰上温育(30分钟)。使样品向下旋转10秒且在SpeedVac中蒸发至干燥。
衍生化：重构的样品(100μL HPLC等级水)55℃平衡，随后添加10μL衍生化溶液I，短暂混合，且添加5μL衍生化溶液II。将样品装载到预加温的离心机中且于55℃温育3小时同时在2000rpm下离心。
CE注射：通过添加HPLC等级水使衍生化后样品的最终体积达到100μL，且将10μL样品转移至具有190μL HPLC等级水的CE微量小瓶。样品注射前，CE柱体用HPLC等级水广泛地冲洗(1－3分钟运行时间)，随后用运行缓冲液平衡冲洗(5分钟运行时间)。最初冲洗后，将用于分析的单糖标准和样品注射到CE柱体中(10分钟运行时间)。每种标准或测试样品的注射运行后，CE柱体用HPLC等级水和运行缓冲液进行冲洗和平衡。系统适合性的电泳图应类似于图30。
计算：计算GalNAc和GLCNAc相对于内部标准ManNAc的峰面积比。
峰面积比＝单糖峰面积(GalNAc或GlcNAc)/ManNAc峰面积，
其中关于峰面积比的相对标准差(RSD)等于或小于10％。
计算单糖(例如GalNAc)与CTLA4-Ig蛋白质的比：
比率GalNAc＝(AGalNAc x AManNAcO x VGalNAcO x CGalNAcO x MW CTLA4-Ig二聚体)/(AManNAc xAGalNAcO x Vp x Cp x MWGalNAc)
比率GalNAc＝GalNAc对蛋白质的摩尔比
AGalNAc＝GalNAc样品中的峰面积(μV·秒)
AManNAc＝ManNAc样品中的峰面积(μV·秒)
AManNAcO＝单糖标准中ManNAc的峰面积(μV·秒)平均值
AGalNAcO＝单糖标准中GalNAc的峰面积(μV·秒)平均值
VGalNAcO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc体积(以μL表示)
CGalNAcO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWCTLA4-Ig＝CTLA4-Ig二聚体的分子量
MWGalNAc＝221.2道尔顿
表18：单糖与CTLA4-Ig分子或二聚体的平均摩尔比
单糖 范围
GalNAc 2.0－3.2
GlcNAc 18－32
实施例18：通过毛细管电泳(CE)测定中性单糖(甘露糖、岩藻糖和半乳糖)的摩尔 比
试剂：水解溶液(2M三氟乙酸(TFA))；衍生化溶液I(0.1M8-氨基1,3,6-三磺酸，三钠盐(APTS)水溶液)；衍生化溶液II(溶于1M乙酸的0.25M NaBH3CN)；运行缓冲液(60±5mM四硼酸钠，pH9.25)；毛细管冲洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80％甲醇)；浓度为5mg/ml的甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和木糖(Xyl)的单糖标准贮存液；单糖工作溶液I：内部标准工作溶液是Xyl贮存液的100倍稀释物；单糖工作溶液II：中性混合标准工作溶液，Man、Fuc和Gal贮存液的100倍稀释物。
仪器配置：CE系统是Beckman P/ACE MDQ CE系统；检测器：与P/ACE MDQ)偶联的Beckman激光诱导的(LIF)检测系统；未涂覆的毛细管(i.d.25μm，o.d.360μm)27－31cm总长以容纳P/ACE MDQ。
毛细管电泳运行条件：运行缓冲液(60mM四硼酸钠，pH 9.25)；毛细管柱体温度：25℃；电压：25－30kV，正模式；检测器条件：LIF检测器，在488nm处激发，在520m处发射；样品注射：压力注射模式，在0.5PSI时20s；运行时间：10分钟；样品贮藏：10℃。
水解：使10μL木糖工作溶液和200μL 2M TFA混合，以制备系统空白。使10μL木糖工作溶液和10μL中性混合标准溶液与200μL 2M TFA混合，以制备单糖标准。使10μL木糖工作溶液和10μL CTLA4-Ig二聚体(约1mg/ml)与200μL 2M TFA混合，以制备测试样品。将所有管涡旋10秒，且离心10秒，随后于95℃温育6小时。水解步骤后，将样品置于-20℃10分钟以冷却。使样品向下旋转10秒且在SpeedVac中蒸发至干燥。
衍生化：用100μL HPLC等级水重构样品且55℃平衡，随后添加10μL衍生化溶液I，短暂混合，且添加5μL衍生化溶液II。将样品装载到预加温的离心机中且于55℃温育3小时同时在2000rpm下离心。
CE注射：通过添加HPLC等级水使衍生化后样品的最终体积达到100μL，且将10μL样品转移至具有190μL HPLC等级水的CE微量小瓶。样品注射前，CE柱体用HPLC等级水广泛地冲洗(1－3分钟运行时间)，随后用运行缓冲液平衡冲洗(5分钟运行时间)。最初冲洗后，将用于分析的单糖标准和样品注射到CE柱体中(10分钟运行时间)。每种标准或测试样品的注射运行后，CE柱体用HPLC等级水和运行缓冲液进行冲洗和平衡。系统适合性的电泳图应类似于图31。
计算：计算Man、Gal和Fuc相对于内部标准木糖的峰面积比。
峰面积比＝单糖峰面积(Gal、Fuc或Man)/木糖峰面积，
其中关于峰面积比的相对标准差(RSD)等于或小于10％。
计算单糖(例如Man)与CTLA4-Ig蛋白质的比：
比率Man＝(AMan x AXylO x VManO x CManO x MW CTLA4-Ig二聚体)/(AXyl x AManO x Vp x Cpx MWMan)
比率Man＝Man对蛋白质的摩尔比
AMan＝样品中Man的峰面积(μV·秒)
AXyl＝样品中Xyl的峰面积(μV·秒)
AXylO＝单糖标准中Xyl的峰面积(μV·秒)平均值
AManO＝单糖标准中Man的峰面积(μV·秒)平均值
VManO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的甘露糖体积(以μL表示)
CManO＝用于水解的单糖工作溶液中包含的甘露糖浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MW CTLA4-Ig＝CTLA4-Ig二聚体的分子量
MWMan＝180.2道尔顿。
表19：单糖与CTLA4-Ig分子或二聚体的平均摩尔比
单糖 范围
甘露糖 10－20
岩藻糖 4.2－7.0
半乳糖 9.2－17
实施例19：CTLA4 A29YL104E -Ig的生产
CTLA4A29YL104E-Ig是基因工程改造的融合蛋白，其由经修饰的人CTLA-4的功能结合结构域和IgG1类的人免疫球蛋白的Fc结构域组成。在CTLA-4结构域的B7结合区域中进行2个氨基酸置换(L104E和A29Y)，以产生这种分子。它包含各357个氨基酸的2条糖基化多肽链。它作为通过链间二硫键连接的共价二聚体存在。如通过基质辅助激光解吸-电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法测定的，CTLA4A29YL104E-Ig具有约91,800Da的平均质量。
CTLA4A29YL104E-Ig是CTLA4-Ig的修饰形式。修饰由导致2个氨基酸置换(L104E和A29Y)的点突变组成。相对于CTLA4-Ig，CTLA4A29YL104E-Ig以～2倍增加的抗体亲抗原性结合CD80(B7-1)，和以～4倍增加的抗体亲抗原性结合CD86(B7-2)。CTLA4A29YL104E-Ig在抑制T细胞增殖、细胞因子生产和经由天然杀伤细胞的CD28依赖性靶细胞杀伤方面为阿巴西普效力的约10倍。CTLA4A29YL104E-Ig引起B7-1介导的T细胞增殖的适度抑制，但在阻断B7-2介导的T细胞增殖方面明显更有效。这个实施例描述了包含SEQ ID NO：4的CTLA4A29YL104E-Ig分子的生产。这个实施例中描述的方法可以适合且扩展用于生产其他重组蛋白质，包括但不限于，分泌的蛋白例如细胞因子和其他激素、作为Ig超家族成员或包含Ig超家族蛋白质的部分的分泌的蛋白、和一般地在CHO细胞中表达的任何蛋白质。
关于CTLA4A29YL104E-Ig培养步骤的工艺流程图显示于图24中。CTLA4A29YL104E-Ig在具有约4000L工作体积的5000-L生产生物反应器中进行生产。1批药品由衍生自细胞库的单个小瓶的单个生产生物反应器进行生产。生产方法包括由接种物扩增、生产细胞培养物和下游纯化组成的3个阶段。接种物扩增阶段使用无动物组分的培养基来进行。生产细胞培养物阶段也在无动物组分的培养基中进行，除了使用D-半乳糖外。
细胞培养基。所有培养基在合适大小的干净培养基容器中进行制备且经由过滤进行灭菌。用于接种物扩增的培养基的组成呈现于下表中。
接种物细胞生长基础培养基
种子和生产生物反应器细胞生长基础培养基
生产生物反应器进料培养基
接种物扩增
来自细胞库的冷冻小瓶在受控温度下进行解冻且离心以去除超低温保护剂介质。将细胞重悬浮于接种物培养基中且在T瓶中进行回收。解冻后80％的最低细胞生存力是示例性值。温度和二氧化碳在T瓶温育步骤期间进行控制。T瓶温育直至获得1.0x107细胞的活细胞数目，且将内容物转移到摇瓶内。培养物通过一系列摇瓶进行扩增以达到所需接种物体积。关于摇瓶传代的接种密度范围为1.0－3.0x105活细胞/mL。温度、二氧化碳和摇床速度在摇瓶温育步骤期间进行控制。在达到1.5－3.0x106细胞/mL的活细胞密度范围后，将摇瓶培养物合并到无菌的接种物转移容器内。将来自最后摇瓶接种物扩增步骤的约20L转移到140-L种子生物反应器，以达到0.2－1.0x106活细胞/mL的初始细胞密度范围。
种子生物反应器操作
具有约90L工作体积的140-L种子生物反应器以分批模式进行操作。140-L种子生物反应器中的温度、pH、压力和溶解氧浓度使用分布控制系统(DCS)进行监控和控制。每天从140-L种子生物反应器中获得样品以监控细胞生长。140-L种子生物反应器的接种密度范围为0.2－1.0x106活细胞/mL。当达到≥1.5x106细胞/mL的活细胞密度时，140-L种子生物反应器培养物用于接种1100-L种子生物反应器。140-L种子生物反应器步骤的持续时间为约3天。1100-L种子生物反应器中的初始靶活细胞密度为0.4－1.5x106活细胞/mL。
1100-L种子生物反应器包含260L的起始培养物体积。1100-L种子生物反应器以分批模式进行操作。1100-L种子生物反应器中的温度、pH、压力和溶解氧浓度使用DCS进行监控和控制。当活细胞密度已达到≥1.5x106细胞/mL时，培养物的体积使用基础培养基增至900L。每天从1100-L种子生物反应器中获得样品以监控细胞生长。当达到≥2.0x106细胞/mL的活细胞密度时，1100-L种子生物反应器培养物用于接种5000-L生产生物反应器。1100-L种子生物反应器步骤的持续时间为约4天。5000-L生产生物反应器中的初始靶活细胞密度为0.4－1.5x106活细胞/mL。
生产生物反应器操作
5000-L生产生物反应器包含3000L的起始培养物体积。5000-L生产生物反应器以补料分批模式进行操作，其中温度、pH、压力和溶解氧浓度使用DCS进行监控和控制。在约72小时时，向培养物中加入硫酸葡聚糖大丸剂。在生产生物反应器的操作期间，在144±8小时时，培养温度设定点从37℃变动至34℃。进行温度变动和硫酸葡聚糖添加，以延长5000-L生产生物反应器步骤中高细胞生存力的持续时间。从生物反应器中获得样品，以监控细胞生长和生存力、葡萄糖、乳酸和氨浓度。样品还就CTLA4A29YL104E-Ig浓度和唾液酸与CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质摩尔比进行测试。将进料培养基加入生物反应器中以维持所需葡萄糖浓度。关于生产生物反应器的主要收获标准是唾液酸与CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质摩尔比。生产生物反应器在≥6的靶唾液酸与CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质摩尔比时进行收获。5000-L生产生物反应器步骤的持续时间为约14天。5000-L生产生物反应器的收获体积为约4000L。
细胞取出和产物浓缩
细胞通过切向流微量过滤使用0.65μm膜从培养物液体培养基中取出。微量过滤渗透物通过切向流超滤使用30kDa标称分子量截止(NMWCO)膜进行浓缩。跨膜压和流速在微量过滤和超滤步骤期间进行控制。随后使浓缩物经过一系列膜滤器，其中最终过滤通过0.2μm单次使用的滤器。浓缩物的pH通过添加0.5M Tris溶液调整至8.0。微量过滤和超滤过滤器是多次使用的。微量过滤过滤器用次氯酸钠和Triton X-100进行净化且贮藏于磷酸中。超滤过滤器用次氯酸钠和氢氧化钠进行净化且随后贮藏于氢氧化钠中。
实施例20：重组CTLA4 A29YL104E -Ig的纯化
实施例20-A：CTLA4A29YL104E-Ig纯化方法的例子显示于图88的流程图中，且纯化方法的描述由这个实施例提供。
病毒灭活
澄清的浓缩收获材料的pH通过添加0.5M Tris溶液调整至8.0。潜在的外来的病毒剂通过添加20％Triton X-100至0.5％(v/v)的终浓度进行灭活。Triton X-100处理的蛋白质溶液混合≥2小时。
亲和层析
使用MabSelect A蛋白树脂(GE Healthcare，以前称为Amersham Biosciences)柱的亲和层析用于从来自病毒灭活步骤的进行中材料捕获CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质，且使贝拉塔赛蛋白质与大多数杂质分离。
MabSelect A蛋白柱用25mM NaH2PO4，150mM NaCl，pH 7.5缓冲液进行平衡。在350cm/小时的线速度时，亲和树脂的动态结合容量为25g CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质/升树脂。157-L柱床能够结合约3.9kg CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质。
将Triton X-100处理的进行中材料应用于MabSelect A蛋白柱，且柱用最低限度3柱体积(CV)的平衡缓冲液进行洗涤，以去除弱保留的杂质。这些杂质包括细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和Triton X-100。CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质随后用250mM甘氨酸，pH3.0缓冲液从柱中洗脱。CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质作为窄峰在约2－3CV洗脱缓冲液中洗脱且收集到包含2M HEPES，pH 7.5缓冲液的槽内，以快速增加pH且因此使贝拉塔赛高分子量(HMW)种类的形成降到最低。
阴离子交换层析
使用Q-琼脂糖快速流动(QFF)树脂(GE Healthcare)的阴离子交换层析主要用于富集CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质的更高唾液酸化的种类的量。来自MabSelect A蛋白柱的pH调整的贝拉塔赛产物库在应用于QFF柱前用注射用水(WFI)稀释约2倍。
QFF柱用50mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.0缓冲液进行平衡。将pH和导电性调整的MabSelect A蛋白步骤产物库应用于QFF柱，且柱用最低限度3CV的平衡缓冲液进行洗涤，以去除弱结合的杂质。柱随后用50mM HEPES，140mM NaCl，pH 7.0缓冲液进行洗涤，以去除具有低唾液酸含量的CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质种类。CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质更高唾液酸化的种类随后使用≤5CV的50mM HEPES，200mM NaCl，pH 7.0缓冲液从柱中洗脱。
疏水作用层析
使用Toyopearl Phenyl 650M树脂(Tosoh Biosciences)的疏水作用层析(HIC)主要用于减少来自QFF层析步骤的产物库中的CTLA4A29YL104E-Ig HMW种类的量。在应用于HIC柱之前，QFF层析步骤产物库用50mM HEPES，pH 7.0缓冲液和50mM HEPES，3.6M硫酸铵，pH 7.0缓冲液进行稀释，以达到QFF产物库中约135mS/cm的导电性和≤1g/L的CTLA4A29YL104E-Ig浓度。
HIC柱用50mM HEPES，1.2M硫酸铵，pH 7.0缓冲液进行平衡。将浓度和导电性调整的CTLA4A29YL104E-Ig QFF层析步骤产物库应用于柱。柱随后用50mM HEPES，1.2M硫酸铵，pH7.0缓冲液进行洗涤，以去除弱结合的杂质。CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质使用50mM HEPES，0.55M硫酸铵，pH 7.0缓冲液从HIC柱中洗脱。
病毒过滤
来自HIC步骤的CTLA4A29YL104E-Ig产物库的浓缩和渗滤通过超滤(UF)来达到。UF步骤利用30-kDa NMWCO膜和25mM NaH2PO4，10mM NaCl，pH 7.5缓冲液。UF步骤随后为使用15-nm Planova膜(Asahi Kasei)的病毒过滤步骤。CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质产物库随后通过UF使用30-kDa NMWCO膜调整至25g/L的蛋白质浓度。
柱卫生处理和贮藏
MabSelect A蛋白层析柱使用0.1N NaOH溶液进行卫生处理，用25mM NaH2PO4，150mM NaCl，pH 7.5缓冲液进行洗涤以降低pH，且随后于2－8℃贮藏于20％乙醇中。QFF层析柱用1N NaOH溶液进行卫生处理，且在室温下贮藏于0.1N NaOH溶液中。HIC柱用0.1NNaOH溶液进行卫生处理，用20％乙醇进行洗涤，且在室温下贮藏于20％乙醇中。
实施例20-B：此种纯化方法的进一步例子如下：
病毒灭活
澄清的浓缩收获材料的pH通过添加0.5M Tris溶液调整至8.0。潜在的外来的病毒剂通过添加20％Triton X-100至0.5％(v/v)的终浓度进行灭活。Triton X-100处理的蛋白质溶液混合≥2小时。
用于CTLA4A29YL104E-Ig纯化的A蛋白亲和层析：使用MabSelect A蛋白树脂(GEHealthcare，以前称为Amersham Biosciences)柱的亲和层析用于从来自病毒灭活步骤的进行中材料捕获CTLA4A29YL104E-Ig，且使CTLA4A29YL104E-Ig与大多数杂质分离。
140cm内径柱用MabSelect PrA树脂填充至18－25cm的高度，表示约339L－372L的体积。通过测定填充柱的HETP和As使柱有资格用于使用。0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的As用于HIC柱的资格评定。
MabSelect PrA柱操作在环境温度下进行。将病毒灭活产物库装载到平衡的MabSelect PrA柱上。MabSelect PrA步骤在26.7L/分钟的最大流速和≤13psip的操作压力下进行操作。在350cm/小时的线速度时，应用于MabSelect PrA柱的最大CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质负荷为25克CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质/升树脂。柱床能够结合约3.9kg CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质。
MabSelect PrA柱用25mM NaH2PO4，150mM NaCl，pH 7.5缓冲液进行平衡。当最低限度3CV平衡缓冲液已经过柱以及流出物的pH和导电性值分别为7.3－7.7和14.5－17.5mS/cm时，平衡完成。
将Triton X-100处理的进行中材料应用于平衡的MabSelect PrA柱。柱用最低限度3CV 25mM NaH2PO4，150mM NaCl，0.5％Triton X-100，pH 7.5缓冲液进行洗涤，以从MabSelect PrA柱中去除弱保留的杂质。这些杂质包括细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和Triton X-100。后续洗涤步骤使用25mM NaH2PO4，150mM NaCl，pH 7.5缓冲液来进行，以从MabSelect PrA柱中去除残留的Triton X-100。
CTLA4A29YL104E-Ig使用250mM甘氨酸，pH 3.0缓冲液从MabSelect PrA层析柱中洗脱。当A280增至超过基线≥0.2AU时，使洗脱物转向收集容器。柱流出物通过0.2μm乙酸纤维素过滤器过滤到配备搅拌器的收集容器内。收集洗脱物直至洗脱峰的尾随边缘的A280降至≤0.2AU的值。CTLA4A29YL104E-Ig洗脱物作为窄峰在约2－3CV洗脱缓冲液中洗脱。用2MHEPES，pH 7.5缓冲液将洗脱物库的pH调整至pH 7.5±0.2，以快速增加pH且因此使CTLA4A29YL104E-Ig高分子量(HMW)种类的形成降到最低。MabSelect PrA层析步骤产物库在环境温度下保持最多5天。产物库可以进行冷却用于贮藏；CTLA4A29YL104E-Ig的稳定性概况在5℃和22℃下相同。产物可以贮藏最多5天。
收集约6或约5.2－约7.6的摩尔唾液酸与摩尔CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质摩尔比的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体产物。
用于CTLA4A29YL104E-Ig纯化的QFF阴离子交换层析：使用Q-琼脂糖快速流动(QFF)树脂(GE Healthcare)的阴离子交换层析主要用于富集CTLA4A29YL104E-Ig的更高唾液酸化的种类的量以及减少残留的A蛋白水平。来自MabSelect A蛋白柱的pH调整的CTLA4A29YL104E-Ig产物库在应用于QFF柱前用注射用水(WFI)稀释约2倍。
80cm内径柱用QFF树脂填充至27－35cm的高度，表示约136L－176L的体积。通过测定填充柱的HETP和As使柱有资格用于使用。0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的不对称性(As)用于柱的资格评定。
QFF柱操作在环境温度下进行。QFF柱用50mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.0缓冲液进行平衡。将pH和导电性调整的MabSelect A蛋白步骤产物库应用于QFF柱。QFF步骤在16.4L/分钟(196cm/h)的最大流速和35psig的最大操作压力下进行操作。
柱在使用前和后用1N NaOH溶液进行卫生处理。使最低限度2柱体积的氢氧化钠溶液经过柱。柱随后保持静态60－120分钟。关于溶液和柱流出物的可接受的导电性范围为136－202mS/cm。
柱用最低限度5柱体积的50mM HEPES，50mM氯化钠，pH 7.0缓冲液进行平衡。关于这种缓冲液的pH和导电性范围分别为6.8－7.2和5.0－7.0mS/cm。这些范围也用于确定柱是否平衡。
将pH和导电性调整的MabSelect A蛋白步骤产物库应用于QFF柱，且柱用最低限度3CV的平衡缓冲液进行洗涤，以去除弱结合的杂质。柱随后用50mM HEPES，135mM NaCl，pH7.0缓冲液进行洗涤，以去除具有低唾液酸含量的CTLA4A29YL104E-Ig种类。
CTLA4A29YL104E-Ig更高唾液酸化的种类使用50mM HEPES，200mM NaCl，pH 7.0缓冲液从QFF层析柱中洗脱。当洗脱缓冲液首先应用于柱时，起始洗脱物收集。在洗脱期间，柱流出物通过0.2μm滤器过滤到收集容器内。收集洗脱物直至洗脱峰的尾随边缘的吸光度降至超过基线≤0.2AU。使用≤5CV的50mM HEPES，200mM NaCl，pH 7.0缓冲液从柱中洗脱CTLA4A29YL104E-Ig。随后使收集容器冷却至2－8℃。关于QFF层析步骤产物库于2－8℃的最大保持时间为3天。
收集约6或约5.2－约7.6的摩尔唾液酸与摩尔CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质摩尔比的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体产物。
用于CTLA4A29YL104E-Ig纯化的苯基琼脂糖FF HIC：使用Toyopearl Phenyl 650M树脂(Tosoh Biosciences)的疏水作用层析(HIC)主要用于减少来自QFF层析步骤的产物库中的CTLA4A29YL104E-Ig HMW种类的量。
100cm内径柱用苯基琼脂糖Phenyl 650M树脂填充至18－22cm的高度，表示约141－173L的体积。通过测定填充柱的HETP和As使柱有资格用于使用。0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的As用于HIC柱的资格评定。
HIC柱操作在环境温度下进行。在应用于HIC柱之前，QFF层析步骤产物库用50mMHEPES，pH 7.0缓冲液和50mM HEPES，3.6M硫酸铵，pH 7.0缓冲液进行稀释，以达到QFF产物库中约135mS/cm的导电性和≤1g/L的CTLA4A29YL104E-Ig浓度。HIC步骤在22.7L/分钟(173cm/h)的最大流速和45psi的最大操作压力下进行操作。基于存在于QXL洗脱物库中的CTLA4A29YL104E-Ig的量，可以采用HIC步骤的多重循环。
HIC柱首先用1N氢氧化钠溶液进行卫生处理。当2－4CV的1N氢氧化钠溶液已经过柱时，卫生处理完成。柱随后保持60－120分钟以确保卫生处理。
卫生处理步骤后，HIC柱用50mM HEPES，1.2M硫酸铵，pH 7.0缓冲液进行平衡。当最低限度3CV平衡缓冲液已经过柱且流出物的pH为7.0±0.3和导电性为约135mS/cm时，平衡完成。
将浓度和导电性调整的CTLA4A29YL104E-Ig QFF层析步骤产物库应用于柱。柱随后用50mM HEPES，1.2M硫酸铵，pH 7.0缓冲液进行洗涤，以去除弱结合的杂质。CTLA4A29YL104E-Ig使用50mM HEPES，0.55M硫酸铵，pH 7.0缓冲液从HIC柱中洗脱。这种HIC产物库在收集容器中保持于2－8℃。在收集容器中的最大保持时间为3天。
约6或约5.2－约7.6的摩尔唾液酸与摩尔CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质摩尔比的CTLA4A29YL104E-Ig二聚体产物；CTLA4A29YL104E-Ig高分子量材料库以≤2.5％存在；CTLA4A29YL104E-Ig低分子量材料(例如，CTLA4A29YL104E-Ig单体)库以≤0.5％存在；且存在≤9.5ng/mL的MCP-1库。
病毒过滤。来自HIC步骤的CTLA4A29YL104E-Ig产物库的浓缩和渗滤通过超滤(UF)来达到。UF步骤利用30-kDa NMWCO膜和25mM NaH2PO4，10mM NaCl，pH 7.5缓冲液。UF步骤随后为使用15-nm Planova膜(Asahi Kasei)的病毒过滤步骤。CTLA4A29YL104E-Ig产物库随后通过UF使用30-kDa NMWCO膜调整至25g/L的蛋白质浓度。
Pall Filtron TFF系统用于下游CTLA4A29YL104E-Ig生产方法的浓缩和渗滤步骤。这个步骤的目的是使HIC层析步骤产物库浓缩至45－55g/L，和由用于CTLA4A29YL104E-Ig组合物的最终缓冲液交换HIC层析步骤中使用的洗脱缓冲液。浓缩的CTLA4A29YL104E-Ig产物库通过0.2μm聚偏1,1-二氟乙烯过滤器转移到50-L生物加工袋内。
实施例21：生物活性-通过表面等离子体共振测定CTLA4 A29YL104E -Ig与B-7IG共同受 体的生物特异性结合
表面等离子体共振(B7结合)
这种方法通过表面等离子体共振测量CTLA4A29YL104E-Ig与代表性B7共同受体的结合。B7Ig以高密度经由伯氨基固定化至活化的CM5传感器芯片表面。CTLA4A29YL104E-Ig材料、质量对照和样品稀释至0.125－8ng/mL的浓度且注射到B7Ig表面上，以产生结合传感图。CTLA4A29YL104E-Ig与固定化的B7Ig结合的初速度(斜率)在这种B7Ig表面上在质量转移(扩散)限制条件下进行测量。以共振单位/秒(RU/s)表示的最初结合速率与活性浓度直接相关。样品的结合速率使用参考标准曲线转变成活性浓度，其中CTLA4A29YL104E-Ig材料的结合速率针对浓度进行绘图。最终结果表示为样品相对于CTLA4A29YL104E-Ig材料的百分比结合。
CTLA4A29YL104E-Ig中人IgG1 Fc区的存在使用表面等离子体共振(SPR)进行检测。SPR使得能够实时测量生物特异性相互作用。对人IgG的Fc区特异的抗体片段(山羊F(ab’)2抗人IgG Fc)共价固定化在传感器芯片的表面上。CTLA4A29YL104E-Ig样品的结合通过测量与未修饰的传感器芯片表面相比较，在这种表面上获得的应答进行检测。如图6和表23中所示，关于方法B、方法C和共混合物结合的共振单位的结果是可比较的。
表23.使用SPR在CTLA4A29YL104E-Ig药品批次中人IgG Fc的检测
人细胞IL2抑制测定
该方法基于当用抗CD3和B细胞刺激时，经由CTLA4A29YL104E-Ig抑制来自T细胞的IL-2生产。用在IL-2启动子控制下的萤光素酶基因转染的Jurkat T细胞在各种浓度CTLA4A29YL104E-Ig的存在下用Daudi B细胞和抗CD3共刺激。共刺激激活IL-2启动子，其依次产生萤光素酶蛋白质。所得到的发光信号使用萤光素酶测定系统进行测量。在这种系统中，CTLA4A29YL104E-Ig产生萤光素酶活性中剂量依赖性的减少。
如表24中所示，关于方法B批次000929-278、方法C批次224818-2004-007和共混合物批次55128-162的结果是可比较的。EC50值、斜率因子以及上和下渐近线对于所有3种样品是相似的，在1个标准差内。这指出来自方法C和来自方法B的CTLA4A29YL104E-Ig在体外效价测定中可比较地表现。
表24.在体外效价生物测定中人IL-2启动子介导的萤光素酶活性的比较。关于本发明的方法的剂量应答曲线参数
表24.在体外效价生物测定中人IL-2启动子介导的萤光素酶活性的比较。关于本发明的方法的剂量应答曲线参数
材料：
-传感器芯片CM5，合格级Biacore(目录号BR-1000-13)
-HBS-EP缓冲液BIA Certified 10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3.4mM EDTA，.005％v/v
-表面活性剂P20 Biacore(目录号BR-1001-88)
-胺偶联试剂盒(Amine Coupling Kit)BIA Certified 115mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，750mg 1-乙基-3-(3二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，10.5mL乙醇胺HClBiacore(目录号BR-1000-50)
-具有PC兼容计算机Biacore的Biacore C仪器，(目录号BR-1100-51)
-与Biacore C仪器一起提供的Biacore C控制软件Biacore，版本1.0.1
胺偶联试剂盒BIA Certified：该试剂盒各包含1个小瓶115mg NHS、750mg EDC和10.5mL乙醇胺。根据制造商说明书制备每个小瓶。将200μL体积的NHS和EDC溶液等分试样到具有合适大小和盖的个别塑料/玻璃小瓶内。当贮藏于-20℃时，这些溶液对于2个月是稳定的。将200μL乙醇胺等分试样到具有合适大小和盖的个别塑料/玻璃小瓶内。根据制造商的说明书将这种溶液贮藏于2－8℃并且是稳定的。
为了确保与流动池良好结合，流动池将使用1周或286次注射，无论哪一个首先发生。新流动池将在每周开始时进行固定化。在用于样品测试的制备中固定化B7.1 Ig。注：将200μL的所有溶液等分试样到7mm Biacore管内用于分析。在环境温度下使包含B7.1 Ig的1个小瓶解冻。使用10mM乙酸盐pH 5.0缓冲液(1.7)稀释B7.1 Ig，以达到3000－9000共振单位(RU)的表面质量。使EDC和NHS的各1个小瓶(200μL)解冻至环境温度。从冰箱中取出乙醇胺HCl且允许升温至室温。根据Biacore软件：打开选自“Immobilization Wizard”的公开项目“B7 Ig Immobilization”。打开公开文件“B7 Immob.blw”。通过向导逐步进行且通过点击“Next”确认或改变选择。在“User Information”下选择流动池且在“Notebook”标签中提供实验信息。如所述的将试剂和配体小瓶置于样品架中。检查指令。将临时文件保存为：B7Immob BIOQC#Date Initials Chip#Flow cell#.blw。通过点击“Start”开始固定化。将结果文件保存为：B7 Immob BIOQC#Date Initial chip#flow cell#.blr。当测定完成时，打印Wizard结果和传感图。
实施例22：CTLA4 A29YL104E -Ig组合物、胰蛋白酶肽作图和IEF的碳水化合物含量分析
胰蛋白酶消化肽作图
在这种胰蛋白酶消化法中，CTLA4A29YL104E-Ig样品使用胍-HCl进行变性，且使用DTT和IAA进行还原和烷基化。样品使用NAP-5柱进行脱盐和用胰蛋白酶进行消化。消化混合物通过反相(C18)层析进行分离且峰通过在215nm处的UV吸光度进行检测。
试剂：流动相A溶液(溶于水的0.02％三氟乙酸(TFA)(v/v))；流动相B溶液(溶于95％ACN(乙腈)和5％水的0.02％TFA(v/v))；烷化剂(200mM碘乙酰胺(IAA))；稀释缓冲液(100mM Tris，25mM NaCl，pH 8.0)；变性缓冲液(8M胍，50mM TRIS，pH 8.0)；消化缓冲液(50mM TRIS，10mM CaCl2，pH 8.0)；还原剂(100mM DTT)。
仪器配置：(可以使用仪器配置)NAP-5柱(Amersham，目录号17-0853-02)；HPLC柱加热器；具有柱加热器和UV检测器的Water’s Alliance HPLC系统。
程序概括见图89。
还原和烷化：样品(例如，CTLA4A29YL104E-Ig等)通过添加水至100μL的最终体积稀释至10mg/ml(1mg)。将560μL变性缓冲液和35μL还原剂(100mM DTT)加入100μL样品中，混合，且在微量离心机中向下旋转3秒。样品随后于50℃温育20分钟±2分钟。随后将35μL烷化剂(200mM IAA)加入每种样品中，且再次混合，且在微量离心机中向下旋转3秒。样品随后用铝箔覆盖且于50℃温育20分钟±2分钟。NAP-5柱通过倾注3柱体积(约7－8mL)消化缓冲液进行平衡后，将500μL还原和烷化的混合物倾注于NAP-5柱上，从而允许液体通过柱排出。随后经由用1mL消化缓冲液从柱中洗脱样品从NAP-5柱中收集样品。
消化：样品用20μL胰蛋白酶(0.5μg/μL)在38℃水浴中消化4小时(±0.5小时)。消化完成后，样品用2.5μL TFA进行酸化。随后将样品置于自动进样器小瓶内用于后续分析。
仪器方法：仪器方法显示于下文：
在第一次注射前，柱用100％流动相A缓冲液平衡25分钟。UV吸光度在215nm处进行监控，同时使柱温维持于37℃和使自动进样器温度维持于4℃。流动相A缓冲液空白在第一种系统适合性标准前运行，其后为每种样品的单次50μL注射。参考材料注射应每6次样品注射一起进行。
理论塔板数：作为理论塔板数评估的柱效率可以根据等式使用保留时间和峰宽进行定量测量：
其中：
“w”是通过将相对直的侧面外推至基线测量的在基线处的峰宽，“t”是从注射时间到峰最大值的洗脱时间测量的峰的保留时间。
如果N<50000，那么使柱重新平衡。
分辨率：2个峰例如如图32中所示的峰T2和峰T12之间的分辨率(R)的测定可以使用下面等式进行测定：
其中：
t1，t2＝分别为片段峰T2和峰T12的保留时间
w1，w2＝分别具有保留时间t1和t2的峰基线处的切线限定的峰宽。
如果R<1.5，那么柱应重新平衡，并且如果问题继续存在，那么柱应进行替换。
图32和表25显示得自CTLA4A29YL104E-Ig的胰蛋白酶消化的肽片段。在～50分钟时显示肽T7和T9的区域有时反映不完全的样品消化，并且峰可以显示每天都不同的性质；然而，在运行内所有样品显示出可比性。
表25：CTLA4A29YL104E-Ig的胰蛋白酶肽片段
a具有N联碳水化合物的肽
b具有O联碳水化合物的肽
c关于T5、T7、T9和T14的质量是不含碳水化合物部分的质量。
d观察到对应于糖基化肽的许多质量
等电聚焦
等电聚焦(IEF)用于评估药品和药物产品中CTLA4A29YL104E-Ig的各种同工型的等电点(pI)。这种方法使用在4.0-6.5的pH梯度时的Pharmacia Biotech PAGplates和Multiphore II Flatbed Electrophoresis System。样品(例如，CTLA4A29YL104E-Ig等)在Milli-Q水中进行稀释且使用样品应用条直接装载到凝胶上。凝胶在渐增的电压下聚焦2.5小时，其中使用100mMβ-丙氨酸浸泡的阴极条和100mM谷氨酸/500mM磷酸浸泡的阳极条。聚焦后，凝胶使用磺基水杨酸/三氯乙酸进行固定，且随后使用考马斯蓝染色系统进行染色。染色后，使用基于激光的光密度计以50或100μm空间分辨率与最高达4096水平的光密度分辨率将湿凝胶扫描到数字图像文件内。CTLA4A29YL104E-Ig聚焦到pI4.5－5.5内的10－15个条带内。
如图12中所示，对于方法C批次224818-2004-007、方法B批次000929-287和共混合物批次55128-162，天然CTLA4A29YL104E-Ig在凝胶(pH 4.0－6.5)上的等电聚焦产生pI范围4.6－5.5内的相似条带模式。这个程序显示当在相同IEF凝胶上分析时，方法B和C材料是可比较的。
等电聚焦标准应与背景容易地区分开(参见图12)。
CTLA4A29YL104E-Ig鉴定为具有约4.5－约5.5的pI范围的多个条带(>10)(图32)。
CTLA4A29YL104E-Ig是由细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)的经修饰的配体结合结构域和人IgG1重链的恒定区组成的第二代CTLA4-Ig融合糖蛋白。这种新型分子具有作为免疫抑制剂的治疗应用。CTLA4A29YL104E-Ig包含可以通过等电聚焦(IEF)分开的多重电荷同工型。用于分析CTLA4A29YL104E-Ig药品和药物产品的IEF法已得到开发。这种方法用于在PAG板pH 4.0－6.5Multiphore II flatbed电泳系统中检查CTLA4A29YL104E-Ig。CTLA4A29YL104E-Ig药品、药物产品和参考材料在Milli-Q水中进行稀释且直接装载到凝胶上。凝胶在渐增的电压下聚焦2.5小时，其中使用100mMβ-丙氨酸浸泡的阴极条和100mM谷氨酸/500mM磷酸浸泡的阳极条。聚焦后，凝胶进行固定和使用考马斯蓝染色。染色的凝胶通过激光光密度测定法进行扫描且凝胶条带的半定量分析在数字图像文件上进行。
材料：
设备：
试剂制备：
阳极缓冲溶液(100mL)：溶于0.5M磷酸的0.1M谷氨酸；3.4mL 85％磷酸；1.47±0.02g谷氨酸；Milli-Q水。将谷氨酸加入50mL Milli-Q水中。添加85％磷酸和Q.S.至100mL，搅拌以混合。指定6个月的有效期且贮藏于4℃。
阴极缓冲溶液(100mL)：0.1Mβ-丙氨酸，0.9±0.02gβ-丙氨酸，Milli-Q水。用Milli-Q水Q.S.试剂至100mL，搅拌以混合。指定6个月的有效期且贮藏于4℃。
固定溶液(2000mL)：溶于12％三氯乙酸的3.5％5-磺基水杨酸，240±5.0g三氯乙酸，70±2.0g 5-磺基水杨酸，Milli-Q水。组合试剂并用Milli-Q水Q.S.至2000mL。指定3个月的有效期且贮藏于室温。
装置和凝胶制备。使Multiphore II电泳单元的冷却平台与Multi-Temp恒温循环机连接且将温度设为10℃。允许循环机达到10±2℃。从冰箱中取出凝胶。使用剪刀，小心地沿着封套的所有4个侧面切割，确保不切割到凝胶/凝胶支持物内。将约1.0mL Milli-Q水加到冷却平台的1个边缘。将凝胶/凝胶支持物的1个边缘置于水内，从而使得水移动横过凝胶的整个边缘。小心地将凝胶横过冷却平台应用，避免形成气泡。从凝胶的表面去除透明薄膜。用约3.0mL合适的电极溶液(下表)浸泡每个电极条。从凝胶的顶部和底部边缘约10mm应用电极条。将阴极条最接近冷却平台上的(-)标记放置，和阳极条最接近(+)标记放置。电极条已应用后，切割条以适合凝胶，从而避免与凝胶支持物接触。
电极溶液和电泳参数设定
将样品应用片应用于阴极条上方约10mm。使用正上方表中限定的电泳参数，使凝胶预聚焦直至电压达到300V。
IEF pI标记和染色对照制备。用100μL Milli-Q水重构IEF pI标记。用1000μLMilli-Q水重构碳酸酐酶II染色对照，以制备1.0mg/mL贮存液。将10μL贮存液(1.0mg/mL)加入90μL Milli-Q水中用于0.10mg/mL的最终装载浓度。
样品制备。将CTLA4A29YL104E-Ig参考材料和样品稀释至2mg/mL的浓度。例子：如果CTLA4A29YL104E-Ig样品具有25mg/mL的浓度，那么使用下述稀释以制备2mg/mL的最终装载浓度：
10μL(25mg/mL)+115μL Milli-Q水＝2mg/mL
注：如果样品浓度≤2.0mg/mL，那么无需稀释而装载样品。
凝胶装载。基于运行模式装载凝胶以促进样品鉴定。不要对称地装载凝胶。如正下方表中所述装载IEF pI标记、染色对照、CTLA4A29YL104E-Ig参考材料和CTLA4A29YL104E-Ig样品。在样品应用片上装载所有样品。
凝胶装载模式
*泳道1中的IEF pI标记装载是限定凝胶方向所必需的。在泳道2内开始装载模式且对于另外的样品重复装载模式。IEF pI标记必须装载至少每第10个泳道(例子：MRS1S2S3S4S5S6RM；M－标记；R－参考材料，Sx－样品)。
凝胶加工。将电极固定器置于Multiphor II单元上且使电极与凝胶上的电极条中心对齐。使来自电极固定器的2个电极与基底单元连接且将安全盖放置于适当位置。使用粘合带覆盖安全盖中的孔以防止凝胶干燥。使电极与电源连接。在合适的电压、电流和功率下运行电泳。当电泳完成时，关掉电源且去除安全盖和电极固定器。从凝胶中小心地取出电极条和样品应用片。从冷却板中取出整个凝胶和凝胶支持物，且置于包含200mL固定溶液的280x180x40mm PyrexTM皿中。用塑料包裹物覆盖皿且置于定轨振荡器上于室温最少20分钟。注：凝胶应固定最多1小时。当固定完成时，用约200mL Milli-Q水将凝胶洗涤3次，各5分钟。通过将瓶颠倒几次使GelCode Blue染色试剂溶液混合。在分配前混合染色试剂是重要的，以确保使用试剂的均匀样品。将约200mL染色试剂加入皿中。用塑料包裹物覆盖皿且置于定轨振荡器上于室温18－20小时，以达到最佳条带显色。当染色完成时，通过用约200mLMilli-Q水替换染色试剂来洗涤凝胶。对于最佳结果，在1－2小时的时间段内进行最少3次水更换。
凝胶扫描和分析。使用正上方表中限定的扫描参数来扫描凝胶。凝胶的分析在扫描的图像文件上进行。
凝胶扫描和分析参数
扫描参数 设置
扫描像素大小 100
扫描数字分辨率 12比特
条带检测参数
最小斜率 最初100
噪声减少 最初10
％最大峰 最初0
泳道％宽度 设为90％
注：表3概括了用于凝胶图像分析的一般指导。关于每种条带检测参数的合适调整的详细信息，参考ImageQuant TL(v2003.03)手册和屏幕上(on-screen)指令。
打开ImageQuantTL中来自<1D Gel Analysis>的凝胶图像文件(扫描的原始数据)。转到工具栏上的<Contrast>，且降低<Image Histogram>参数直至所有条带清晰可见。选择<Lane Creation>且选定<Manual>，以设定待分析的<泳道数>。调整<泳道％宽茺>直至最高100％覆盖凝胶泳道。必要时正确地对齐单个泳道。使用<Rolling Ball>法以扣除背景。这对于IEF凝胶图像分析不是关键的。使用表3中列出的最初的<最小斜率>、<噪声减少>和<％最大峰>设置检测条带。这些值的调整是精确鉴定条带所必需的。手工校正任何遗漏的条带和错误鉴定的条带。对于pH/pI 4.0－6.5凝胶，通过使用来自系统适合性部分中列出的经标记的标记的标准pI标记来计算条带pI值。不执行校准和标准化步骤。将测量窗内包含的数据输出到Excel表内，用于进一步计算和报告。将Excel数据输入到验证的电子制表软件内，以进行用于报告结果的定量分析。
系统适合性。等电聚焦标准(pI标记)必须与背景容易地区分开，且通过扫描的凝胶图像的目测显示有限的失真(关于列出的pI标记参见正下方表)。
等电聚焦标准
蛋白质 pI值
胰蛋白酶原 9.30
小扁豆凝集素，碱性 8.65
小扁豆凝集素，中间 8.45
小扁豆凝集素，酸性 8.15
肌红蛋白，碱性 7.35
肌红蛋白，酸性 6.85
碳酸酐酶B(人) 6.55
碳酸酐酶B(牛) 5.85
Β-乳球蛋白A 5.20
大豆胰蛋白酶抑制剂 4.55
甲基红(染料) 3.75
淀粉葡糖苷酶 3.50
注：并非所有等电聚焦标准都将在凝胶上显现，因为凝胶的pH/pI范围为4.0－6.5。在3.50、4.55、5.20和5.85处的pI标记将在凝胶上得到鉴定和标记。
CTLA4A29YL104E-Ig参考材料和测试物品的条带模式通过扫描的凝胶图像的目测应显示有限的失真。低水平的蛋白质负荷(1.0μg)的碳酸酐酶II(pI 5.4)的染色对照用于证实一致的凝胶染色。条带通过扫描的凝胶图像的目测必须与背景容易地区分开。CTLA4A29YL104E-Ig参考材料必须包含在4.5－5.6的pI范围内具有条带强度≥1.0％的8－15个条带。在4.5－5.6的pI范围内的CTLA4A29YL104E-Ig参考材料条带必须具有≥95％的累积百分比强度。
数据计算。下面等式用于计算CTLA4A29YL104E-Ig样品相对于参考材料的累积百分比强度：
例子：如果样品具有95％的％条带强度(pI 4.5－5.6)且参考材料具有100％的％条带强度(pI 4.5－5.6)，那么累积％强度将为95％。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig材料将具有在4.5－5.6的pI范围内相对条带强度≥1.0％的条带。CTLA4A29YL104E-Ig材料在4.5－5.6的pI范围内具有相对于CTLA4A29YL104E-Ig参考材料的那种的累积百分比强度。
实施例23：细胞系的转染和产生
电穿孔前，表达载体pD16LEA29Y用BstBI酶进行线性化，以产生相容的4bp突出端。线性化的载体和剪切的鲱精载体DNA(作为载体)与乙醇共沉淀，且无菌重悬浮于PF CHO培养基(JRH Biosciences)中用于电穿孔到DG44细胞内。
电穿孔后，允许细胞在非选择性培养基中回收。细胞随后接种到PF CHO选择性培养基中的96孔板内，所述PF CHO选择性培养基包含500ng/mL重组胰岛素(Gibco)、4mM L-谷氨酰胺(Gibco)和氨甲蝶呤(ICN)。
使用加入培养基中的氨甲蝶呤(MTX)浓度的下述进展选择来自这种铺平板的CTLA4A29YL104E-Ig生产细胞系用于表达扩增：
将完整的CTLA4A29YL104E-Ig表达质粒整合到细胞细胞基因组内。
生产细胞系选择
最佳表现、扩增的主孔细胞系的2轮有限稀释克隆后分离最终的生产细胞系GF1.1.9。细胞系GF1.1.9的选择基于生长模式、滴度、以及相对于由其他克隆生产的材料包含减少量的高分子量组分和更高唾液酸含量的产物。
实施例24：CTLA4 A29YL104E -Ig的遗传表征
基因组稳定性研究
从衍生细胞库的细胞中分离的DNA和RNA用于DNA和RNA杂交分析，以及用于CTLA4A29YL104E-Ig编码序列的cDNA测序。结果与得自CTLA4A29YL104E-Ig的结果进行比较。
关于RNA杂交分析和cDNA测序估计的结果呈现于下文。
RNA杂交分析
用来自细胞库的细胞接种的培养物进行扩增且用于分离RNA用于RNA杂交分析。制备的培养物代表超过CTLA4A29YL104E-Ig生产方法中使用的体外细胞年龄约27代的细胞。从衍生自CTLA4A29YL104E-Ig细胞库的细胞和扩增的CTLA4A29YL104E-Ig细胞的细胞中提取总RNA。利用来自亲代CHO细胞系的总RNA的对照也在这些实验中使用。在变性条件下对约5μg总RNA实施琼脂糖凝胶电泳。将凝胶中的RNA印迹到尼龙膜上，且与包含CTLA4A29YL104E-Ig基因的32P标记的1.2kb HindIII/XbaI DNA片段杂交。用于探针的1.2kb HindIII/XbaI DNA片段从质粒pD16LEA29Y中进行分离。
如图33中所示，在来自细胞库的总RNA样品中检测到与CTLA4A29YL104E-Ig基因探针杂交的约1.7千碱基的mRNA种类。图33中显示的小图A和小图B分别表示溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶和相应的放射自显影图。
这些结果指出在衍生自CTLA4A29YL104E-Ig扩增的细胞库的培养物中表达编码CTLA4A29YL104E-Ig的唯一一种转录物。此外，与使用细胞库获得的结果相比较，在这些样品中未观察到CTLA4A29YL104E-Ig mRNA转录物中可检测的变化。
实施例25：尺寸排阻层析
尺寸排阻法已开发用于分析CTLA4A29YL104E-Ig组合物，其中使用配备保护柱的7.8mm x 300mm TosoHaas TSK-3000SWXL柱，在280nm处检测。CTLA4A29YL104E-Ig就产物同质性进行评估，包括单体(单链)、二聚体或高分子量种类(例如，四聚体)。该方法显示在～10mg/mL的标称浓度时良好的精度(<2％)，且从～0.5－15mg/mL是线性的(r2＝0.999)。DL(检测极限)为～2.26Φg/mL和QL(定量极限)为～7.53Φg/mL。这些可溶性CTLA4-Ig分子是由细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)的配体结合结构域和人IgG1重链的恒定区组成、具有作为免疫抑制剂的潜在治疗应用的融合蛋白。这些化合物通过与各种抗原呈递细胞(APC)表面上的B7抗原(CD80和CD86)结合而发挥其生理作用，从而阻断B7.1和B7.2与T细胞表面上的CD28的功能相互作用。这种阻断导致T细胞活化的抑制，因而免疫应答的抑制。尽管LEA29Y仅在2个氨基酸残基Leu104－glu和Ala29－Try上不同于CTLA4Ig，但该分子具有针对B7.1和B7.2抗原显著不同的抗体亲抗原性。与亲本CTLA4Ig比较，LEA29Y显示对于B7.2(CD86)的人形式5－10倍的较大抗体亲抗原性，和对于人B7.1(CD80)相似的抗体亲抗原性。
使用配备保护柱的TSK-3000 SWXL柱(7.8mm x 300mm)且在280nm处检测的尺寸排阻层析用于就同质性分析CTLA4A29YL104E-Ig药品。区分CTLA4A29YL104E-Ig二聚体、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)种类。
尺寸排阻层析(SEC)用于就产物同质性评估CTLA4A29YL104E-Ig。图34A－C显示关于方法B、方法C和共混合物批次的CTLA4A29YL104E-Ig的SEC层析谱。CTLA4A29YL104E-Ig的SEC指出方法C材料为99.8面积百分比二聚体、0.2面积百分比HMW种类和无可检测的LMW种类。这些结果与方法B材料(二聚体97.4面积百分比、HMW 2.6面积百分比和LMW<DL)可比较。
试剂：4N KOH(100mL)；系统适合性标准(溶解于HPLC等级水中的分子量标记)；流动相运行缓冲液(0.2M KH2PO4，0.9％NaCl，pH 6.8)；4N NaOH；稀释缓冲液(25mM NaH2PO4-H2O，10mM NaCl，pH 7.5)
仪器配置和条件－等价仪器配置可以代替：
标准和样品(10mg/ml)在标记的自动进样器小瓶中制备为50ml体积。样品一式两份地进行制备。
计算
分辨率(R)测定和保留时间评估：注射20mL系统适合性标准，以使用下面等式计算来自使用此种标准产生的层析谱的2个峰(例如，1个峰，具有～8.5分钟的保留时间的峰1，和第二个峰，具有～10分钟的保留时间的峰2)之间的分辨率：
其中：
t1＝峰1的保留时间
t2＝峰2的保留时间
W1＝峰1的峰宽
W2＝峰2的峰宽
峰宽等于峰相对直的侧面外推至基线后峰底部处的宽度(以分钟表示)。保留时间和峰宽以相同单位进行测量。
R必须且关于峰的保留时间应为～8.50.5分钟。
理论塔板数测定：根据系统适合性标准层析谱，根据下面等式通过计算理论塔板数可以测定柱的效率：
其中：
(t)＝峰2的保留时间(以分钟表示)
(w)＝如图1中可见的，通过峰侧面外推至基线获得的在峰2的基线处的宽度(以分钟表示)。
N应
峰的积分：积分层析谱中的峰面积(例如，图34A－C)。CTLA4A29YL104E-Ig二聚体峰在约～8.5分钟时且高分子量种类峰在～7.4分钟时。
面积百分比可以根据下式进行计算：
面积％二聚体＝100-(面积％高分子量种类+面积％低分子量种类)
其中：
A＝CTLA4A29YL104E-Ig二聚体峰面积
B＝具有小于CTLA4A29YL104E-Ig二聚体的保留时间的所有峰的总面积
C＝具有大于CTLA4A29YL104E-Ig二聚体峰的保留时间的所有峰的总面积(排除内含体积)。
测定总面积计数(排除内含体积)的％RSD。总面积计数的％RSD必须为2％或更小。如果面积<2707面积计数，那么结果报告为#DL，(检测极限)(～2.26μg/mL)。如果面积计数为2707－9014，那么结果报告为#QL，(定量极限)(～7.53μg/mL)。如果面积计数为 那么结果报告至百分比的最近十分之一。
实施例26：SDS-PAGE和二硫键
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
用于分析CTLA4A29YL104E-Ig的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)程序用作纯度测试。在二硫苏糖醇(DTT)的存在(还原)或不存在(非还原)下，样品在Tris-HCl(pH 6.8)、SDS、蔗糖和溴酚蓝样品缓冲液中进行制备。将样品置于80℃水浴中2分钟且在预制的、梯度(4－20％)聚丙烯酰胺SDS凝胶中进行电泳，其中使用Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液。电泳后，将凝胶进行固定和使用考马斯蓝或银染色系统染色。非还原的CTLA4A29YL104E-Ig作为具有～104kD的表观近似分子量的1个大条带观察到。CTLA4A29YL104E-Ig作为具有～53kD的表观近似分子量的1个主要条带观察到。
方法B批次000929-278、方法C批次224818-2004-007和共混合物批次551218-162的样品在还原和非还原条件下，使用4－20％梯度SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。如图35和图36中所示，凝胶用考马斯或银染色进行分开染色。非还原的CTLA4A29YL104E-Ig的SDS-PAGE显示在约104kDa处的主要条带，表示完整单体。在电子再现上不容易看见的3个次要条带也在～200、65和53kDa处观察到。CTLA4A29YL104E-Ig的还原样品显示在约53kDa处的主要条带，表示单链形式，和在～150kDa处的次要条带。这种比较显示当在相同凝胶上进行分析时，3种测试的材料是可比较的。
二硫键
二硫键关于方法C药品使用批次224818-2004-007进行表征。CTLA4A29YL104E-Ig的每条链包含9个半胱氨酸。这些是Cys21、Cys48、Cys66、Cys92、Cys120、Cys171、Cys231、Cys277和Cys335。具有还原和非还原的CTLA4A29YL104E-Ig的在线(on-line)LC/MS/MS的肽作图用于鉴定CTLA4A29YL104E-Ig中的分子内和分子间二硫键的位点。得自非还原的CTLA4A29YL104E-Ig的肽作图的肽列表连同预期和观察到的MW一起显示于表27中。
非还原的肽图中某些峰的消失和还原的肽图中新峰的出现提供3种二硫键连接的肽的证据：T2-T6、T11-T17和T25-T30，其对应于二硫键Cys21-Cys92、Cys171-Cys231和Cys277-Cys335。肽T5和T7具有相对高的分子量且包含N联碳水化合物，这使得难以定位二硫键。为了产生更短和无碳水化合物的肽，CTLA4A29YL104E-Ig用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物进行消化。作为另外的胰凝乳蛋白酶切割的结果，T7从35氨基酸肽缩短至15氨基酸肽，命名为T7’-T7’，其中N联碳水化合物被去除。二硫键连接的肽T7’-T7’在非还原的图中出现(参见图37)。关于T7’-T7’的MS/MS证实其序列和在Cys120-Cys120处的链间二硫键。
表27.来自在非还原条件下CTLA4A29YL104E-Ig的胰蛋白酶消化的二硫键连接的肽的肽序列和MW
a由于N联糖基化的异质性，肽T5和T7-T7产生几种质量，从而使得难以定位二硫键。
用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物处理还导致形成片段，所述片段对应于更短形式的其他二硫键连接的肽，这通过单独的胰蛋白酶水解CTLA4A29YL104E-Ig观察到。这些显示于表28中。
表28.用(胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)消化CTLA4A29YL104E-Ig的二硫键连接的肽的肽序列和MW
用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物消化CTLA4A29YL104E-Ig确立了T7-T7中的二硫化物配对，且证实通过单独的胰蛋白酶消化可见的二硫键。然而，这种酶混合物对同样为糖肽的肽T5没有任何作用。为了从T5中去除N联碳水化合物，如图38中所示，CTLA4A29YL104E-Ig用胰蛋白酶和弹性蛋白酶的混合物进行消化。如表29中所示，这种酶混合物使T5在4个不同位点上水解，产生命名为(T5’-T5”)的更短的肽。这种产生的肽具有1259Da的预期质量且包含对应于Cys46-Cys66的二硫键。得自通过胰蛋白酶和弹性蛋白酶的混合物水解非还原CTLA4A29YL104E-Ig的肽图概况显示于图38中，并且肽T5’-T5”的序列在表29中。
表29：用胰蛋白酶和弹性蛋白酶的混合物消化CTLA4A29YL104E-Ig获得的肽T5’-T5”的肽序列和MW
结果指出CTLA4A29YL104E-Ig具有在位置Cys21-Cys92(T2-T6)、Cys48-Cys66(对应于1种单肽T5)、Cys171-Cys231(T11-T17)和Cys277-Cys335(T25-T30)处的4个分子内二硫键和在位置Cys120-Cys120(T7-T7)处的1个链间二硫键。数据解释了所有18个半胱氨酸残基。没有观察到错误配对。
实施例27：CTLA4 A29YL104E -Ig制剂
用于注射、100mg/小瓶的CTLA4A29YL104E-Ig是无菌无致热原亲液物。药物产品的组成在表30中给出。它是在用灰色丁基塞子塞住且用铝密封物密封的I型玻璃小瓶中提供的白色至灰白色、整体或断裂的饼状物。这种产品包括10％过量填注以解决小瓶、针和注射器滞留量。
在施用前，用于注射、100mg/小瓶的CTLA4A29YL104E-Ig用4.2mL无菌注射用水，USP进行构建，以产生25mg/mL的浓度。它可以用5％葡萄糖注射液，USP或0.9％氯化钠注射液，USP进一步稀释成低至1mg/mL的浓度。构建和稀释的溶液在目测时是澄清、无色的且基本上不含颗粒物。
表30.用于注射、100mg/小瓶的CTLA4A29YL104E-Ig的组合物
a每个小瓶包含10％过量填注用于重构的溶液的小瓶、针和注射器滞留量。
b在冻干期间去除
待冷冻干燥的冷冻溶液的玻璃化转变温度测定为-28.9℃。冷冻干燥研究在各种保存温度下进行，以测定初步干燥期间可容许的最高可能的保存温度，而不损害产品品质。基于这些研究，选择-20℃的保存温度用于CTLA4A29YL104E-Ig冷冻干燥期间的初步干燥步骤。在冷冻干燥循环结束时，小瓶在减压下塞住。
生产方法涉及在冷冻干燥器室中冷冻包含待冻干(具有合适的赋形剂)的本体溶液的小瓶，随后在受控温度和压力下升华冷冻水。室中的温度和压力条件进行最优化，以具有有效升华而不损害产品品质。
研究溶液与各种产品接触表面和包装组分的相容性。发现溶液与不锈钢316L、硅氧烷管形材料、AcrodiscTM、HT Tuffryn(聚砜)、Millipore PVDF(聚1,2-二氟亚乙烯氟化物)滤膜和所选择的容器封闭系统相容。
用于注射、100mg/小瓶的CTLA4A29YL104E-Ig包装在15cc I型火石制管玻璃小瓶中，且用20mm Daikyo灰色丁基D-21-7-S/B2-TR氟树脂包被的塞子塞住，并且用20mm铝翻开式封口进行密封。
用于注射的CTLA4A29YL104E-Ig的小瓶选择基于5.5mL的填充体积以确保有效的冷冻干燥，且20mm Daikyo灰色丁基D-21-7-S/B2-TR氟树脂包被的塞子选择基于相容性数据。
已进行广泛的使用时间相容性研究。当用无菌注射用水构建为25mg/mL时，用于注射的CTLA4A29YL104E-Ig 100mg/mL可以贮藏于15－25℃(59°-77°F)的环境室温和室内光下24小时。当用0.9％氯化钠注射液(生理盐水/NS)或用5％葡萄糖注射液(D5W)进一步稀释至1mg/mL或10mg/mL，且在15－25℃(59°-77°F)的环境室温和室内光下贮藏于PVC或IntraVia non-PVC袋中时，构建的溶液经过24小时的时间段显示效力中没有损失或高分子量种类中没有增加。在施用前稀释的溶液必须通过0.2μm或1.2μm混合的纤维素/乙酸盐滤器进行过滤。稀释的溶液与0.2μm或1.2μm混合的纤维素/乙酸盐滤器相容。
产品与硅氧烷不相容。它与硅氧烷相互作用以形成可见颗粒。因此，应避免与硅氧烷处理的表面例如硅氧烷化的注射器接触。
实施例28：CTLA4-Ig生产方法
CTLA4-Ig作为分泌的蛋白使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在大规模细胞培养中进行生产。CTLA4-Ig生产方法使用一系列瓶和种子生物反应器接种物扩增步骤来起始。最后种子生物反应器的内容物用于接种5000-L生产生物反应器。从5000-L生产生物反应器中收获的细胞培养物通过微量过滤和超滤进行净化和浓缩。无细胞收获材料在制剂中就pH和导电性进行调整用于下游加工。CTLA4-Ig使用一系列层析和过滤步骤进行纯化。下游CTLA4-Ig生产方法包括2个阴离子交换层析步骤、1个疏水作用层析步骤和1个亲和层析步骤。这些步骤的目的是纯化CTLA4-Ig蛋白质，去除高分子量CTLA4-Ig材料和控制CTLA4-Ig药品的唾液酸含量。下游加工步骤还包括病毒灭活步骤和病毒过滤步骤，以清除潜在的外来的病毒剂。将纯化的CTLA4-Ig药品填充到2-L聚碳酸酯瓶内，且在贮藏于-40℃的靶温度前于-70℃的靶温度进行冷冻。将冷冻的药品解冻。
N-乙酰神经氨酸(NANA)是存在于CTLA4-Ig药品中的主要唾液酸种类。这个部分自始至终提及唾液酸具体指这个种类。较少水平的N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)也存在于CTLA4-Ig药品中。对于最终的CTLA4-Ig药品测定NANA和NGNA的水平。关于CTLA4-Ig生产方法的工艺流程图显示于图90。
CTLA4-Ig在具有约4300L工作体积的5000-L生产生物反应器中进行生产。1批CTLA4-Ig药品由衍生自细胞库的单个小瓶的单个生产生物反应器进行制备。上游细胞培养物生产方法使用来自细胞库的单个小瓶的细胞起始。小瓶进行解冻且整个内容物用于接种包含细胞培养生长培养基的T瓶。细胞随后在一系列旋转瓶中进行扩增。来自最后旋转瓶接种物扩增步骤的瓶用于接种140-L种子生物反应器。140-L种子生物反应器具有约100L的工作体积。140-L种子生物反应器的内容物用于接种1100-L种子生物反应器。1100-L种子生物反应器具有约600L的工作体积。1100-L种子生物反应器的内容物用于接种5000-L生产生物反应器。细胞在5000-L生产生物反应器中培养约14天。生产生物反应器步骤后，将来自单个生物反应器的细胞培养液体培养基转移至收获容器用于进一步加工。切向流微量过滤(MF)单元用于使分泌的CTLA4-Ig蛋白质与宿主细胞和细胞碎片分离。包含CTLA4-Ig蛋白质的MF渗透物随后通过超滤(UF)进行浓缩，且在制剂中就pH和导电性进行调整用于第一个层析步骤。
关于CTLA4-Ig药品的纯化和下游加工步骤由阴离子交换层析、疏水作用层析(HIC)、病毒灭活、亲和层析、切向流UF浓缩和渗滤、病毒过滤、第二次阴离子交换层析以及UF浓缩和渗滤组成。取决于待加工的CTLA4-Ig的量，HIC步骤利用多重循环/CTLA4-Ig批。将来自多重HIC步骤循环的进行中材料合并用于随后的病毒灭活步骤。不合并来自不同批的进行中材料。多个病毒滤器可以平行使用以加工单批CTLA4-Ig。病毒过滤后，将滤液合并用于进一步加工。
每批CTLA4-Ig通过0.2μm滤器过滤到2-L聚碳酸酯(PC)瓶内且暂时贮藏于2－8℃。CTLA4-Ig的2-L PC瓶于-70℃的靶温度进行冷冻且随后贮藏于-40℃的靶温度。药品的瓶在培养箱中于22－24℃进行解冻且在装运前冷却至2－8℃。
生产
CTLA4-Ig使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在大规模细胞培养中进行生产。CTLA4-Ig上游生产方法由来自细胞库的冷冻小瓶的解冻起始。培养物在T瓶中随后在一系列旋转瓶培养中进行繁殖。将这些培养物转移至140-L种子生物反应器。将来自140-L种子生物反应器的培养物转移至1100-L种子生物反应器。来自1100-L种子生物反应器的培养物用于接种5000-L生产生物反应器。生产生物反应器主要基于靶唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质摩尔比进行收获。细胞培养物收获使用微量过滤(MF)和超滤(UF)的组合进行净化和浓缩。最后，浓缩的无细胞收获材料进行调整，以达到制剂中指定的导电性和pH用于下游加工。
细胞培养和进料培养基制备
固体和液体培养基组分进行称量和测量。在方法中使用2种细胞培养基。培养基127-G用于T瓶、旋转瓶、种子生物反应器和生产生物反应器步骤。培养基117-E在生产生物反应器步骤中用作进料培养基。培养基127-G的组成显示于正下方表中。
培养基117-E的组成显示于下文。
e-RDF-1培养基的组成如下：
在方法中用于T瓶和旋转瓶的127-G细胞培养基在配备搅拌器用于混合和刻度视镜用于体积测定的培养基容器中进行制备。在T瓶和旋转瓶接种物扩增步骤中使用的培养基127-G的分批大小为75L。培养基127-G使用注射用水(WFI)进行制备。将固体和液体培养基组分加入WFI中。在添加每种组分后使培养基混合所需时间段。加入WFI以使培养基达到75L的最终分批体积。从最终培养基制剂中取出样品，且测量样品的葡萄糖浓度、pH和重量摩尔渗透压浓度，以确保培养基符合限定的接受标准。培养基通过0.2μm滤器进行过滤且分配到无菌的二元醇改性聚对苯二甲酸乙二酯(PETG)瓶内。制备用于T瓶和旋转瓶接种物扩增步骤的培养基127-G贮藏于2－8℃最多42天。用于140-L和1100-L种子生物反应器步骤的培养基127-G在配备搅拌器用于混合的容器中进行制备。用于140-L种子生物反应器步骤的培养基127-G的分批大小为120L。用于制备用于140-L种子生物反应器的培养基的容器配备刻度视镜用于体积测定。用于1100-L种子生物反应器步骤的培养基127-G的分批大小为600kg。用于制备用于1100-L种子生物反应器的培养基的容器配备分压变送器用于重量测定。
通过连续的0.2∝m和0.1μm滤器将所需体积的培养基127-G转移至140-L和1100-L种子生物反应器。制备用于140-L和1100-L种子生物反应器步骤的培养基127-G可以在37℃保持最多48小时。培养基可以在4℃保持另外84小时。
用于5000-L生产生物反应器步骤的127-G和117-E细胞培养基的制备。
用于5000-L生产生物反应器步骤的培养基127-G在配备搅拌器和分压变送器用于重量测定的培养基制备容器中进行制备。用于5000-L生产生物反应器步骤的培养基127-G的分批大小为2900kg。通过连续的0.2μm和0.1μm滤器将所需体积的培养基127-G转移至5000-L生产生物反应器。制备用于5000-L生产生物反应器步骤的培养基127-G可以在37℃保持最多48小时。培养基可以在4℃保持另外84小时。
进料培养基117-E在配备搅拌器用于混合和分压变送器用于重量测定的培养基制备容器中进行制备。用于5000-L生产生物反应器步骤的培养基117-E的分批大小为1800kg。将培养基117-E组分加入培养基制备容器中指定重量的WFI中。在添加每种组分后使培养基混合所需时间段。加入WFI以使培养基达到指定最终重量。从最终培养基制剂中取出样品，且测量样品的葡萄糖浓度、pH和重量摩尔渗透压浓度，以确保培养基符合限定的接受标准。通过连续的0.2μm和0.1∝m滤器将所需体积的培养基117-E转移至进料培养基收集槽。制备用于5000-L生产生物反应器步骤的培养基117-E可以在37℃保持最多2天。培养基可以在4℃保持另外4天。
T瓶和旋转瓶接种物扩增步骤中的接种物扩增步骤
CTLA4-Ig生产方法的T瓶和旋转瓶接种物扩增步骤的目的是从细胞库小瓶连续繁殖细胞，以提供足够数目的活细胞以接种140-L种子生物反应器。来自细胞库的单个小瓶从液氮贮藏冷冻机的汽相中取出且在水浴中于37℃解冻。将小瓶的整个内容物无菌转移到无菌的15-mL圆锥形离心管内。添加培养基127-G以使最终体积达到10mL。将细胞悬浮液离心，弃去上清液且使细胞沉淀重悬浮于10mL 127-G细胞培养基中。将重悬浮的细胞转移至包含10mL培养基127-G的T-175瓶。测定T-175瓶中的培养物的活细胞密度和百分比生存力。确定在这个步骤时≥84％的百分比生存力。向T-175瓶中加入培养基127-G以达到2.1x105细胞/mL的靶活细胞密度。
使T-175瓶于37℃在6％二氧化碳的气氛中温育最多4天，以达到1.80x107活细胞的最终靶细胞数目。T-175瓶步骤后，培养物使用一系列0.25-L、1-L和3-L旋转瓶步骤进行扩增。在每次传代时，细胞以2.0x105活细胞/mL的靶密度接种。旋转瓶培养物于37℃在6％二氧化碳的气氛中进行温育。
将来自最终3-L旋转瓶接种物扩增步骤的细胞培养材料合并在无菌的20-L接种物转移容器中。确定在3-L旋转瓶接种物扩增步骤时1.0－2.0x106细胞/mL的最终活细胞密度和≥80％的最低百分比细胞生存力。这些示例性值确保足够数目的活细胞用于接种140-L种子生物反应器。来自最终3-L旋转瓶接种物扩增步骤的总体积12L－18L合并的细胞培养物用于接种140-L种子生物反应器。
140-L和1100-L种子生物反应器接种物扩增步骤
CTLA4-Ig生产方法的140-L和1100-L种子生物反应器接种物扩增步骤的目的是提供足够数目的活细胞以接种5000-L生产生物反应器。种子生物反应器使用细胞培养基127-G以分批模式进行操作。温度、pH、溶解氧、压力、搅拌以及关于空气、氧和二氧化碳的气流速率受分布控制系统(DCS)的控制，且提供关于培养物在种子生物反应器中最佳生长的条件。种子生物反应器于37℃操作。从种子生物反应器中取出培养物样品，用于确定活细胞密度、百分比生存力和代谢物浓度。
140-L种子生物反应器用来自3-L旋转瓶接种物扩增步骤的合并接种物接种至2.0x105细胞/mL的靶起始活细胞密度。确定在1100-L种子生物反应器接种物扩增步骤时1.0－2.5x106细胞/mL的最终活细胞密度和≥80％的最低细胞百分比生存力。这些接受标准确保足够数目的活细胞用于接种5000-L生产生物反应器。将来自1100-L种子生物反应器的细胞培养物转移至5000-L生产生物反应器，以达到1.5x105细胞/mL的靶起始活细胞密度。
生产生物反应器步骤
5000-L生产生物反应器步骤的目的是扩增活细胞的数目且生产CTLA4-Ig蛋白质。生产生物反应器步骤的持续时间为约14天。将来自1100-L种子生物反应器的接种物接种到包含细胞培养基127-G的5000-L生产生物反应器内。生产生物反应器以分批模式进行操作。温度、pH、溶解氧、压力、搅拌以及关于空气、氧和二氧化碳的气流速率受DCS的控制，且提供关于在生产生物反应器中培养物的最佳生长和CTLA4-Ig蛋白质生产的条件。
在5000-L生产生物反应器步骤期间使用三阶段温度控制策略以最优化细胞生长和CTLA4-Ig生产。生产生物反应器的起始温育温度控制在37℃以达到最佳细胞生长。当在生产生物反应器中达到4.0x106细胞/mL的活细胞密度或在距离接种时144小时时，无论哪一个先发生，将温度降至34℃。在240小时时温度降至32℃且维持在32℃直至收获。从5000-L生产生物反应器中每天获得样品，以监控细胞生长、细胞生存力、代谢物浓度、CTLA4-Ig滴度和唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质摩尔比。
培养基117-E给生产生物反应器的进料在距离接种时12－24小时之间起始。每天添加培养基117-E以达到进料培养基与培养物体积1％(v/v)的靶，或足够体积的进料培养基117-E以使葡萄糖浓度达到3g/L。这种进料策略给培养物提供足够水平的葡萄糖和其他营养物，以支持生产生物反应器步骤期间CTLA4-Ig蛋白质的生产。
培养基117-E补加有D-半乳糖以促进CTLA4-Ig蛋白质增加的糖基化。半乳糖补加导致CTLA4-Ig蛋白质的终末唾液酸含量中的增加。唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质摩尔比是CTLA4-Ig生产方法中的重要收获标准。
三阶段策略还用于控制生产生物反应器中的溶解氧和搅拌速率。30rpm的起始搅拌速率确保物理条件的均匀度且防止细胞在5000-L生产生物反应器内沉降。40％的起始溶解氧设定点确保足够水平的溶解氧的可用性，以支持培养物在生产生物反应器中的生长。在距离接种时96小时时，关于溶解氧和搅拌速率的设定点分别增至50％和40rpm。在距离接种时120小时时，关于溶解氧和搅拌速率的设定点分别进一步增至60％和50rpm。这种策略确保足够水平的溶解氧，以维持在生产生物反应器步骤期间的细胞培养。CTLA4-Ig蛋白质的滴度在生产生物反应器步骤过程中增加。这个步骤过程自始至终监控培养物生存力。从距离接种时6天直到收获时，每天监控2次唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质摩尔比。唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质摩尔比在距离接种时约8天时达到约10的最高点，且经过生产生物反应器步骤的其余部分逐步减少。关于生产生物反应器的主要收获标准是唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质摩尔比。生产生物反应器在8.0的唾液酸与CTLA4-Ig蛋白质靶摩尔比时进行收获。
对于培养物的收获还确定了38％的最低细胞生存力值。这些收获标准确保进行中收获材料的一致性用于下游加工为CTLA4-Ig药品。CTLA4-Ig上游生产方法中从接种物扩增的起始直至生产生物反应器的收获的细胞总代数为约38代。在方法中使用的细胞系在细胞系稳定性研究中证实对于105代是稳定的。
收获操作步骤
收获操作步骤的目的是从收获材料中去除细胞和细胞碎片，且使包含CTLA4-Ig蛋白质的进行中流浓缩用于进一步的下游加工。MF和UF系统在加工收获材料前进行卫生处理。MF和UF系统用过乙酸溶液进行冲洗。MF和UF随后分别用漂白溶液和氢氧化钠溶液进行处理。最后，MF和UF系统用WFI进行冲洗直至达到保留物(retentate)和渗透物中≤3μS/cm的导电性。将来自5000-L生产生物反应器的细胞培养物液体培养基转移至收获容器。具有0.65μm聚偏1,1-二氟乙烯膜的切向流MF用于从包含CTLA4-Ig蛋白质的进行中收获材料中去除细胞和细胞碎片。将无细胞MF渗透物收集在渗透物容器中。无细胞MF渗透物同时通过切向流UF使用30千道尔顿(kDa)标称分子量截止的聚醚砜膜进行浓缩。UF渗透物用作渗滤介质用于MF方法步骤。0.1N磷酸溶液用于贮藏MF系统。0.1N氢氧化钠溶液用于贮藏UF系统。在MF和UF操作期间监控和控制温度、渗透物和保留物流速以及跨膜压。流速通过存在于过滤导轨上的轴向流速计进行测量。传感器用于测量压力和温度。确定163－235L/分钟的MF保留物流速和≤3.8psig的MF跨膜压。这些值确保收获操作步骤性能中的一致性。
收获操作中的最后步骤是澄清和浓缩的进行中收获材料的pH和导电性调整。浓缩的进行中收获材料的pH和导电性进行调整用于在第一个下游层析加工步骤期间捕获CTLA4-Ig蛋白质。pH通过添加2 M Tris溶液调整至8.0，且浓缩渗透物的导电性通过添加WFI减少至10mS/cm。浓缩和调整的进行中收获材料随后通过包含0.2μm一次性滤器的3个平行和1个连续的滤器套进行过滤，且转移至下游纯化区域中的缓冲槽(surge tank)。
表31：CD-CHO培养基的组成
表32：eRDF进料培养基的组成
表33：经修饰的50％CD-CHO培养基的组成
实施例29-CTLA4-Ig纯化方法
来自实施例28中描述的收获操作步骤的最终pH和导电性调整的材料首先使用阴离子交换层析步骤进行加工。来自这种第一个阴离子交换层析步骤的产物库随后使用疏水作用层析步骤进行加工。包含CTLA4-Ig的材料随后用Triton X-100进行处理以灭活潜在的外来的病毒剂。Triton X-100处理的材料使用重组A蛋白亲和层析步骤进行加工。来自重组A蛋白层析步骤的产物库进行浓缩和渗滤。随后进行病毒过滤步骤用于去除潜在的外来的病毒剂。滤液使用第二个阴离子交换层析步骤进行进一步纯化。最后，纯化的CTLA4-Ig蛋白质进行浓缩且渗滤到最终药品缓冲液内。
CTLA4-Ig是基因工程改造的融合蛋白，其由人细胞毒性T淋巴细胞抗原4的功能结合结构域和IgG1类的人单克隆免疫球蛋白的Fc结构域组成。CTLA4-Ig二聚体包含通过单个二硫键共价连接的各自约46kDa的2条同源糖基化的多肽链。显示了用于CTLA4-Ig生产方法的下游步骤的工艺流程图(图91)。CTLA4-Ig使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在5000-L生产生物反应器进行生产。下游CTLA4-Ig生产方法中的层析和过滤步骤在环境温度下进行。进行中材料在加工步骤之间贮藏于2－8℃。下游方法由接受来自收获操作步骤的进行中收获材料起始。这种材料首先通过阴离子交换层析柱使用Q SepharoseTM Extreme Load(QXL)树脂进行加工。QXL柱用于捕获来自收获材料的CTLA4-Ig蛋白质。QXL柱捕获步骤还实现体积减少用于进一步的下游加工。
使QXL产物库经过利用苯基琼脂糖快速流动树脂的疏水作用层析(HIC)柱。在这个步骤期间，CTLA4-Ig高分子量(HMW)材料和中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白质(CHOP)与柱结合。CTLA4-Ig二聚体蛋白质不与HIC树脂结合且经过柱。HIC步骤后，进行使用X-100去污剂的病毒灭活(VI)，以灭活潜在的外来的病毒剂。下一个步骤利用重组A蛋白琼脂糖快速流动(rPA)树脂亲和柱。在这个层析步骤中，减少CHOP和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的水平。rPA步骤定义为病毒清除步骤。亲和层析步骤后，CTLA4-Ig蛋白质使用30kDa超滤(UF)膜进行浓缩和透析，且经过PlanovaTM 15nm滤器加工以去除潜在的外来的试剂。病毒过滤(VF)步骤完成后，CTLA4-Ig蛋白质在第二个阴离子交换柱上使用Q琼脂糖快速流动QFF)树脂进行加工。QFF层析步骤减少残留的重组A蛋白和DNA水平。QFF步骤定义为病毒清除步骤。最后，CTLA4-Ig蛋白质使用30kDa UF膜针对25mM磷酸钠，50mM NaCl，pH 7.5的溶液进行浓缩和渗滤。在最终填充步骤前，CTLA4-Ig药品随后通过0.2μm滤器进行过滤。
方法相关杂质CHOP、MCP-1、残留的重组A蛋白、DNA和Triton X-100在CTLA4-Ig生产方法的特定下游加工步骤时减少。关于每种杂质在主要进行中控制点时确定具有作用界限的PPs。3产物库CHOP和MCP-1鉴定为关于rPA层析步骤的PPs。产物库残留重组A蛋白配体、DNA和Triton X-100鉴定为关于QFF层析步骤的PPs。基于胰岛素的已知结构和层析保留，基于相互作用的正交模式，HIC、rPA和QFF步骤应提供胰岛素的显著清除。此外，具有5.8kDa的分子量的胰岛素应通过在收获和下游方法中的3个30kDa浓缩/渗滤步骤得到清除。rPA步骤提供氨甲蝶呤(MTX)>3.0log10的清除。此外，具有0.455kDa的分子量的MTX应通过在收获和下游方法中的3个30kDa浓缩/渗滤步骤得到清除。胰岛素和MTX以固定量加入发酵培养基中，且在下游加工前在5000-L发酵方法期间作为细胞代谢的函数进行消耗。胰岛素和MTX在下游方法中的多个点上进行测量。这些点的每一个上的胰岛素和MTX水平低于完成的过去运行的定量水平。
缓冲液：缓冲液制备的目的是产生符合示例性值、作用界限和警报界限的下游加工缓冲液。一致的缓冲液品质是确保可再现的层析性能所必需的。CTLA4-Ig方法CD-CHO1的下游步骤需要17种缓冲液和溶液。缓冲液和溶液进行制备且用于批次内的特定加工步骤。与CTLA4-Ig进行中材料接触的缓冲液视为重要的方法缓冲液。产物接触缓冲液包括平衡、洗涤、洗脱和产物库调整缓冲液。用于清除和卫生处理步骤以及层析导轨中的紫外线(UV)检测器的功能测试的缓冲液和溶液具有广泛的指定范围。由于这些缓冲液和溶液的广泛指定范围以及不存在产物接触，对这些缓冲液和溶液不指定PPs。概括了对10种产物接触缓冲液限定的PPs和相应的示例性值。关于这些缓冲液的最大保持时间界限为3天，且衍生自缓冲液容器保持研究9，且得到缓冲液稳定性研究的支持。产物接触缓冲液还具有指定的PPs与相应的警报界限。呈现了关于这些缓冲液的PPs和相应的警报界限。不与CTLA4-Ig进行中材料接触的缓冲液和溶液具有带有警报或作用界限的指定的PPs且得到呈现。非产物接触缓冲液和溶液不测试内毒素，因为它们是卫生处理溶液或者在柱卫生处理步骤之前的层析树脂清洁缓冲液或溶液。
Q Sepharose Extreme Load阴离子交换层析步骤。
阴离子交换层析使用来自GE Healthcare(以前的Amersham Biosciences)的QXL树脂来进行。1.0m内径柱用QXL树脂填充至17－24cm的高度，表示133－188L的体积。通过测定填充柱的理论塔板高(HETP)和不对称性(As)使柱有资格用于使用。需要0.02－0.08cm的HETP和0.8－1.2的As用于QXL柱的资格评定。QXL柱用于捕获来自进行中收获材料的CTLA4-Ig蛋白质。QXL捕获步骤还实现体积减少用于进一步的下游加工。QXL柱操作在环境温度下进行。将澄清的细胞培养物液体培养基装载到平衡的QXL柱上。QXL层析步骤使用28L/分钟的最大流速来进行。柱入口压维持在35psig下。关于QXL柱的最大阿巴西普蛋白质负荷为28克阿巴西普/L树脂。柱通过用25mM HEPES，100mM NaCl，pH 8.0缓冲液平衡进行制备。柱平衡后，将收获材料装载到柱上，伴随连续监控流出物在280nm处的UV吸收。装载应用后，柱用25mM HEPES，120mM NaCl，pH 8.0缓冲液进行洗涤。CTLA4-Ig蛋白质用25mM HEPES，850mMNaCl，pH 7.0缓冲液从柱中洗脱。正下方表显示关于Q Sepharose Extreme Load层析步骤的过程参数。
收获保持时间确保与确定的警报界限的过程一致性。对预过滤产物库生物负荷参数分别指定<10cfu/mL和<100cfu/mL的中间警报和作用界限。由作用界限限定的6种QXLPPs为柱高度、流速、洗涤缓冲液导电性、洗脱峰终点光密度(OD)、步骤得率和装载生物负荷。确定柱高度范围以提供足够体积的树脂以捕获来自收获材料的产物。关于这种参数的作用界限由数据确定。流速是确保层析步骤的一致性和性能的重要因子。它对于QXL步骤定义为具有最大作用界限的PP。确定洗涤缓冲液导电性以从QXL树脂中去除弱结合的杂质。按比例降低范围研究测定这种参数是维持QXL步骤的一致性的重要因子。限定洗脱峰终点OD以使产物库中CTLA4-Ig HMW材料的水平降到最低。CTLA4-Ig HMW材料在洗脱峰结束时洗脱。步骤得率作用界限确保关于QXL步骤的过程一致性。确定关于流速、洗脱峰终点OD和步骤得率PPs的作用界限。对装载生物负荷指定<1cfu/mL的作用界限。如呈现的，12种QXL PP由警报界限限定。
监控界限中的缓冲液pH和导电性值。在制备时不符合pH和导电性示例性值的缓冲液被排除且缓冲液批次被弃去。对于QXL步骤，限定平衡缓冲液导电性和pH、洗涤缓冲液pH、以及洗脱缓冲液导电性和pH。柱入口压确保在结合和洗脱层析步骤期间的一致性。QXL步骤以35psig的最大压力界限来进行。依照制造商的说明书，使用35psig的压力界限以防止QXL树脂的压缩。产物库导电性是具有警报界限的PP。对产物库导电性指定警报界限，以确保QXL产物库中的CTLA4-Ig HMW材料和CHOP与随后的HIC柱有效结合。确定58.5 －69.1mS/cm的警报界限。对产物库滴度、唾液酸(SA)N-乙酰神经氨酸(NANA)摩尔比、CTLA4-Ig HMW材料和CHOP指定警报界限，以确保过程一致性。确定产物库滴度和SA警报界限。
将来自收获操作步骤的进行中材料装载到QXL柱上。该柱用最低限度10CV洗涤缓冲液(25mM HEPES，120mM NaCl，pH 8.0)进行洗涤，且在洗涤步骤结束时测量在柱流出物的280nm(A280)处的吸光度。阿巴西普随后用25mM HEPES，850mM NaCl，pH 7.0缓冲液从柱中进行洗脱。当A280增至超过在洗涤步骤结束时的AU值≥0.02吸光度单位(AU)时，使洗脱物转向收集容器。收集洗脱物直至洗脱峰的尾随边缘的A280降至≤1.0AU的值。将洗脱缓冲液直接加入洗脱物收集容器中以达到600±10kg的洗脱物靶重量。洗脱物收集容器中30±5rpm的搅拌速率用于确保内容物得到充分混合。≥5分钟的混合时间段后，收集容器的内容物通过0.2μm乙酸纤维素滤器直接过滤到保持容器内。将另外ε50kg洗脱缓冲液加入收集容器中，且随后通过0.2μm乙酸纤维素滤器直接过滤到相同保持容器内。保持容器的内容物贮藏于2－8℃最多72小时。
表5.关于Q Sepharose Extreme Load层析步骤的过程参数
苯基琼脂糖快速流动疏水作用层析步骤
HIC步骤的主要目的是减少QXL产物库中存在的CTLA4-Ig高分子量种类(例如，四聚体)的水平。CTLA4-Ig四聚体在用于HIC步骤的装载条件下不与HIC树脂结合。
HIC步骤使用来自GE Healthcare的苯基琼脂糖快速流动树脂来进行。HIC柱结合CTLA4-Ig HMW材料和CHOP，从而减少其在CTLA4-Ig蛋白质流中的浓度。HIC柱通过用25mMHEPES，850mM NaCl，pH 7.0缓冲液平衡进行制备。将来自QXL步骤的CTLA4-Ig产物库应用于平衡的柱。装载应用后，将25mM HEPES，850mM NaCl，pH 7.0缓冲液应用于柱。CTLA4-Ig在流通和柱追踪级分中由柱进行收集。取决于QXL产物库中CTLA4-Ig的总质量，HIC柱以多重循环进行操作以加工单批CTLA4-Ig。柱在循环和批之间进行清洁和卫生处理。
HIC装载生物负荷PP由警报和作用界限进行限定。对HIC装载生物负荷PP分别指定<10cfu/mL和<100cfu/mL的中间警报和作用界限。对于柱限定的5种HIC值为柱高度、流速、追踪终点OD、步骤得率和装载保持时间。测定柱高度以提供足够的树脂体积，以在1、2或3个循环/批中加工来自QXL柱的洗脱库。关于这种参数的作用界限由数据确定。流速是确保层析步骤的一致性和性能的重要因子。它对于HIC步骤定义为具有最大作用界限的过程参数。限定追踪终点OD以使产物库中CTLA4-Ig HMW材料的水平降到最低。CTLA4-Ig HMW材料在洗脱峰结束时洗脱。方法步骤得率确保关于HIC步骤的过程一致性。确定关于流速、追踪终点OD和步骤得率PPs的作用界限。关于装载保持时间的作用界限确保过程一致性。≤5天的装载保持时间PP的作用界限得到产物容器保持时间研究和生物化学稳定性研究的支持。如呈现的，9种HIC PPs由警报界限限定。下游方法中的缓冲液pH和导电性参数鉴定为具有警报界限的PPs。在制备时不符合pH和导电性示例性值的缓冲液被排除且缓冲液批次被弃去。对于HIC步骤，平衡/追踪缓冲液的导电性和pH定义为具有警报界限的PPs。
柱入口压确保在层析步骤期间的一致性。HIC步骤以13psig的最大压力界限来进行。依照制造商的说明书，使用13psig的压力界限以防止HIC树脂的压缩。产物库滴度和SA警报界限确保过程一致性且在PAR报告12中确定。对产物库DNA、CHOP和MCP-1在这个步骤时指定警报界限，以促进其在随后的rPA步骤中去除的定量。
表7.关于苯基琼脂糖快速流动疏水作用层析步骤的过程参数
a信息得自PAR最终报告：纯化12中的表2。
病毒灭活步骤：来自HIC步骤的产物库中潜在的外来的病毒剂的灭活通过添加20％Triton X-100至0.5％(v/v)的终浓度来达到。在进展至下一个步骤前，去污剂处理的溶液混合且保持于22±3℃1－4小时。呈现了对VI步骤限定的5种PPs。20％Triton X-100添加参数的上限为3.8％。参见正下方表，其显示关于病毒灭活步骤的过程参数。
a信息得自病毒清除研究，PQ-58-病毒清除-BMS 188667-00123
表9.关于病毒灭活步骤的过程参数
a信息得自PAR最终报告：纯化12中的表3。
重组A蛋白琼脂快速流动亲和步骤。
亲和层析使用来自GE Healthcare固定的rPA树脂来进行。rPA层析步骤通过减少CHOP、MCP-1和潜在的外来的病毒剂的水平使CTLA4-Ig蛋白质进一步纯化。亲和层析柱用25mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0缓冲液进行平衡。柱平衡后，将来自VI步骤的Triton X-100处理的材料应用于亲和层析柱。该柱首先用25mM Tris，250mM NaCl，0.5％Triton X-100，pH 8.0缓冲液进行洗涤，随后为用25mM Tris，250mM NaCl，pH 8.0缓冲液的第二次洗涤。CTLA4-Ig蛋白质用100mM甘氨酸，pH 3.5缓冲液从柱中进行洗脱。来自亲和柱的产物库的pH用2M HEPES，pH 8.0缓冲液调整至7.5±0.2。对rPA步骤限定的4种PPs呈现于表10中。rPA层析步骤鉴定为病毒清除步骤，从而柱床高度确定为新PP，其示例性值为21－25cm。产物库CHOP和产物库MCP-1先前鉴定为关于rPA步骤的PPs。这些杂质重新定义为具有作用界限的PPs。参见正下方表，其显示关于重组A蛋白琼脂糖快速流动层析步骤的过程参数。
参数a 设定点/靶值 作用界限 接受标准
柱高度b N/Ac N/A 21－25cm
蛋白质负荷 N/A N/A ≤25g/L树脂
产物库生物负荷 N/A N/A <1cfu/mL
内毒素d
信息得自PAR最后报告：纯化的表4。
如呈现的，关于rPA步骤的3种PPs由警报和作用界限进行限定。装载保持时间确保与PAR报告中确定的警报界限的过程一致性。关于装载保持时间的作用界限确保过程一致性。≤48小时的装载保持时间PP的作用界限得到产物容器保持时间研究和生物化学稳定性研究的支持。范围研究鉴定洗脱缓冲液pH为影响rPA产物库中CTLA4-Ig HMW材料的水平的重要因子。确定关于洗脱缓冲液pH的警报界限。关于洗脱缓冲液pH的作用界限由按比例降低的范围研究确定。对rPA装载生物负荷PP分别指定<10cfu/mL和<100cfu/mL的中间警报和作用界限。
由作用界限限定的7种rPA PPs为柱入口压、流速、步骤得率、产物库起始pH、产物库HMW、产物库CHOP和产物库MCP-1。依照制造商的说明书，采用≤13psig的压力界限以防止rPA树脂的压缩。流速是确保层析步骤的一致性和性能的重要因子。它对于rPA步骤定义为具有最大作用界限的PP。关于步骤得率和产物库起始pH的作用界限确保关于rPA步骤的过程一致性。确定关于流速和产物库起始pH的作用界限。在峰洗脱期间CTLA4-Ig HMW材料的潜在形成使关于这种参数≤2.5％的作用界限的限定成为必要。使用来自单批rPA树脂的平均值±3标准差数据确定66－108％的作用界限范围。这个范围与树脂寿命研究中观察到的步骤得率一致。过程相关杂质CHOP和MCP-1先前鉴定为关于rPA步骤的PPs。在这个报告中，这些杂质重新定义为具有作用界限的PPs。产物库CHOP和MCP-1定义为具有示例性值的CQAs，以确保这些过程相关杂质的控制。如呈现的，12种rPA PPs由警报界限限定。下游方法中的缓冲液pH和导电性参数鉴定为具有警报界限的PPs。在制备时不符合pH和导电性示例性值的缓冲液被排除且缓冲液批次被弃去。对于rPA步骤，平衡/洗涤2缓冲液导电性和pH、洗涤1缓冲液导电性和pH、和洗脱缓冲液导电性定义为具有警报界限的PPs。
表11.关于重组A蛋白快速流动层析步骤的过程参数
a信息得自PAR最终报告：纯化12中的表4。
浓缩/渗滤和病毒过滤步骤。从rPA柱中洗脱后，产物库进行浓缩以达到CTLA4-Ig浓度界限内的靶体积。随后对浓缩物实施用25mM HEPES，100mM NaCl，pH 8.0缓冲液的渗滤，其中使用具有30kDa标称分子量截止(NMWCO)膜的UF系统。渗滤后，使用滤器串以去除潜在的外来的病毒颗粒。滤器串由0.2μm滤器、0.1μm滤器和15nm膜滤器(Planova 15N滤器)组成。VF步骤中使用的滤器(0.2μm、0.1μm和15nm)是单次使用的滤器。基于使用这些条件证实的病毒清除增加关于UF后的CTLA4-Ig浓度和Planova分压范围的上限。参见下表，其显示关于病毒过滤步骤的过程参数。
a信息得自病毒清除研究，PQ-58病毒清除-BMS188667-00123，BD-2004-001.031和BD-2005-832.036
表13.关于病毒过滤步骤的过程参数
a信息得自PAR最终报告：纯化12中的表5。
b信息得自BD-2005-706.015。
Q琼脂糖快速流动阴离子交换层析步骤。
QFF层析步骤的目的是减少残留的A蛋白水平，且提供来自病毒过滤步骤产物库的宿主细胞DNA的另外减少。QFF柱步骤还用于控制QFF层析步骤产物库的唾液酸与CTLA4-Ig分子或蛋白质摩尔比，且提供HMW材料水平的另外控制。QFF阴离子交换层析步骤还可以去除残留的重组A蛋白、宿主细胞DNA、Triton X-100和潜在的外来的病毒剂。
阴离子交换层析使用来自GE Healthcare的QFF树脂来进行。QFF柱用25mM HEPES，100mM NaCl，pH 8.0缓冲液进行平衡。柱平衡后，将Planova滤液应用于QFF柱。该柱首先用25mM HEPES，120mM NaCl，pH 8.0缓冲液进行洗涤，随后为用25mM HEPES，130mM NaCl，pH8.0缓冲液的第二次洗涤。CTLA4-Ig蛋白质用25mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0缓冲液从柱中进行洗脱。
参数 设定点/靶值 作用界限 接受标准
柱高度a,b N/Ac N/A 28－35cm
蛋白质负荷a N/A N/A ≤25g/L树脂
产物库生物负荷a N/A N/A <1cfu/mL
内毒素a,d
a信息来自PAR最后报告：纯化12的表6
QFF装载生物负荷值分别为<10cfu/mL或<100cfu/mL。由作用界限限定的12种QFFPPs为流速、洗涤2缓冲液导电性、洗脱缓冲液导电性、装载保持时间、步骤得率、以及QFF产物库中残留的A蛋白、DNA、Triton X-100、SA、HMW、CHOP和MCP-1的水平。流速是确保层析步骤的一致性和性能中考虑的因子。它对于QFF步骤定义为在PAR报告中确定的具有最大作用界限的过程参数。洗涤2和洗脱缓冲液的导电性值是具有作用界限的PPs，因为它们在测定步骤得率和产物品质中是重要的。关于这些参数的作用界限在按比例降低的QFF范围研究期间进行测定。关于装载保持时间的作用界限确保过程一致性。≤5天的装载保持时间PP的作用界限得到产物容器保持时间研究和生物化学稳定性研究的支持。步骤得率确保关于QFF步骤的过程一致性。品质参数、产物库SA、HMW、CHOP和MCP-1必须在最终的层析步骤中得到紧密控制。确定关于步骤得率、以及QFF产物库中的SA、CHOP和MCP-1的水平的作用界限。过程相关杂质残留的A蛋白、DNA和Triton X-100先前鉴定为关于QFF步骤的PPs。这些杂质重新定义为具有作用界限的PPs。残留的A蛋白、DNA和Triton X-100定义为具有示例性值的CQAs，以确保这些过程相关杂质的控制。在这个例子中，关于产物库HMW的作用界限从≤2.5修改为≤2.0％。
下游方法中的缓冲液pH和导电性参数鉴定为具有警报界限的PPs。在制备时不符合pH和导电性示例性值的缓冲液被排除且缓冲液批次被弃去。对于QFF步骤，平衡缓冲液的导电性和pH、洗涤1缓冲液导电性和pH、洗涤2缓冲液pH以及洗脱缓冲液pH定义为具有警报界限的PPs。确定这些界限。柱入口压确保在结合和洗脱层析步骤期间的一致性。依照制造商的说明书，QFF步骤以35psig的最大压力界限来进行。对参数洗涤1缓冲液体积、洗涤2缓冲液体积、产物库滴度和产物库体积指定警报界限12以确保过程一致性。
表15.关于Q琼脂糖快速流动层析步骤的过程参数
a信息得自PAR最终报告：纯化12中的表6。
浓缩/渗滤和填充步骤。来自QFF阴离子交换层析步骤的产物库进行浓缩，且实施用25mM磷酸钠，50mM NaCl，pH 7.5缓冲液的渗滤，其中使用具有30kDa NMWC膜的UF系统。渗滤的浓缩物通过0.2μm滤器过滤到无菌容器内且贮藏于2－8℃。若需要则药品可以在-70℃进行冷冻且贮藏于-40℃。呈现了对于浓缩/渗滤和填充步骤限定的单个PP。参见正下方表，其显示关于药品浓缩/渗滤和填充步骤的过程参数。
参数 设定点/靶值 作用界限 接受标准
终浓度a,b 50g/L 48－52g/L 45－55g/L
对UF II产物库生物负荷PP分别指定<10cfu/mL和<50cfu/mL的中间警报和作用界限。如呈现的，关于浓缩/渗滤和填充步骤由作用界限限定的6种PPs为渗滤体积、滤液导电性和pH、步骤得率、装载保持时间和方法得率。确定渗滤体积的下限，以确保在填充步骤前CTLA4-Ig蛋白质的完全缓冲液更换成最终药品缓冲液。滤液导电性和滤液pH进一步确保一致的药品制剂。步骤得率确保关于浓缩/渗滤和填充步骤的过程一致性。确定关于渗滤体积、滤液导电性和pH以及步骤得率的作用界限。关于装载保持时间的作用界限确保过程一致性。≤5天的UF II装载保持时间得到产物容器保持时间研究和生物化学稳定性研究的支持。推荐20－62％的方法得率作用界限。如呈现的，2种PPs由警报界限进行限定以确保关于步骤的过程一致性。
表17.关于药品浓缩/渗滤和填充步骤的过程参数
a信息得自PAR最终报告：纯化12中的表7。
实施例30：药品最终填充步骤
CTLA4-Ig的浓缩和渗滤II步骤完成后，在Class 100环境中CTLA4-Ig药品从300-L生物加工袋内填充到预灭菌的2-L和10-L Biotainer PC瓶内。
每个瓶的外部用70％异丙醇溶液进行消毒。来自每个瓶盖周围的密封物被去除且瓶在填充前称皮重。在批记录中记录计算以确保填充重量对于2-L瓶为500克－1950克，且对于10-L瓶为7500克－10200克。药品使用蠕动泵通过单次使用的0.45/0.2μm滤器和填充圆锥体分配到Biotainer瓶内。将瓶盖上盖子且将盖子盖紧至指定转矩设置。每个填充瓶的盖用带进行密封，并且带进行缩写签名和注明日期。每个瓶标记有鉴定信息以及填充日期、填充瓶在批次内的顺序号和操作者的缩写签名。
在填充过程期间，进行空气和表面微生物监控以及颗粒计数。药品样品在填充操作期间获得。在第一个瓶填充前获得1个样品用于内毒素测试。用于内毒素测试的另外样品在填充过程中间和结束时获得。在填充过程期间，获得样品用于药品释放测试。
实施例31：免疫原性研究
CTLA4-Ig是可溶性融合蛋白，其由与人免疫球蛋白(Ig)G1经修饰的Fc(铰链、CH2和CH3结构域)部分连接的人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的胞外结构域组成。它是新种类试剂中第一个批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)的，其选择性调节用于完全T细胞活化的CD80/CD86：CD28共刺激信号。在RA中，假定未知抗原经由主要组织相容性复合物呈递且在共刺激信号的存在下激活自身反应性T细胞。随后，活化的T细胞召募且激活下游免疫细胞，配合且使导致炎症和关节破坏的细胞过程保持(Choy和Panayi(2001)NEngl JMed，344(12)：907-916)。
治疗重组生物学剂例如CTLA4-Ig可以是免疫原性的且因此具有引发抗体应答的可能性。针对生物学剂的免疫原性在理论上可以影响安全性、功效和药物代谢动力学。生物学疗法的抗体介导的清除可以导致药物水平中的减少，从而导致减少的功效。抗体应答还可以防止药物与其药理学靶结合，这也将减少功效。这可以导致随着时间过去剂量扩大的需要－所谓的‘剂量蠕变’。对于抗TNF抗体，英夫单抗在RA治疗中的延长使用已报告剂量蠕变(Anderson(2005)Semin Arthritis Rheum，34(5Suppl1)：19-22)，并且近来已指出这是抗英夫单抗抗体的结果，其导致一些患者中临床功效中的减少(Haraoui等人，(2006)JRheumatol，33(1)：31-36)。
此处，检查了抗CTLA4-Ig和抗CTLA-4抗体的形成及其对CTLA4-Ig治疗功效和安全性的潜在作用。因为基于其作为选择性共刺激调节剂的活性和在非临床模型中观察到的应答，CTLA4-Ig可能抑制针对其自身的免疫应答，所以还检查了缺少1－2剂或中断治疗对免疫原性水平的作用。最后，就中和抗体活性测试血清反应阳性样品。
材料与方法
评估的研究
为了测定CTLA4-Ig是否在患有RA的患者中诱导免疫原性应答，经过多重II和III期临床试验评估抗体应答，包含在2,237个RA患者中的6个DB和4个OL研究时间段，所述患者包括对氨甲蝶呤(MTX)或抗TNF疗法具有不足的应答的患者。一项研究(IIa期)还评估CTLA4-Ig作为单一疗法用于RA的治疗(表40)。样品一般在研究前、治疗自始至终、以及最后剂次后56和/或85天以允许CTLA4-Ig清除的时间进行评估。
表40.包括在这种评估中的研究的概括。
RA＝类风湿性关节炎；MTX＝氨甲蝶呤；DB＝双盲；TNF＝肿瘤坏死因子；DMARD＝缓解疾病的抗风湿性药物；ETAN＝依那西普(etanercept)；OL＝开放标签；PK＝药物代谢动力学
*OL、无对照时间段中的受试者是完成DB、安慰剂对照研究时间段的那些的亚组
在发展针对CTLA4-Ig或CTLA-4的阳性抗体应答的患者中检查预先指定的输注周围(peri-infusional)不利事件(AEs)、总体AEs和严重AEs(SAEs)以及中断的发生率和类型。还在具有阳性抗体应答的患者中通过评估American College of Rheumatology(ACR)20和健康评定问卷(Health Assessment Questionnaire)应答检查免疫原性对功效的作用。
免疫原性测定
基本测定形式：由于针对人血清，特别是RA群体中CTLA4-Ig的Fc部分的高、预先存在的交叉反应性，2种直接形式的酶联免疫吸附测定法(ELISAs)用于评估抗体应答。抗CTLA4-Ig测定测量针对分子的所有部分的抗体应答，但具有较低的灵敏性。抗CTLA-4测定测量仅针对CTLA-4部分的抗体应答，去除了Ig区域且因此给定较大的灵敏性。2种测定以终点滴度(EPT)形式(测定A)或筛选形式(测定B)使用。
测定A形式：II期双盲临床免疫原性测定法
在II期RA试验期间使用的抗CTLA4-Ig测定和抗CTLA-4测定统称为测定A。在测定A中，将CTLA4-Ig或CTLA-4吸附在96孔微量滴定板上，所述96孔微量滴定板随后与测试血清(以1：10开始的3倍连续稀释)一起温育。结合的抗体使用碱性磷酸酶缀合的抗人抗体混合物(Southern Biotech，Birmingham，US)进行检测，且使用磷酸对硝基苯酯(PNPP)底物进行显现。因为无可用的人抗CTLA4-Ig抗体或阳性对照血清，所以这些测定使用在猕猴中产生的CTLA4-Ig特异性抗血清进行验证。来自每种测定的结果表示为EPT值。当相对于那个个体的给药前(第1天)EPT他的/她的EPT增加2个或更多连续稀释(≥9倍)时，患者视为已血清转变。
测定B形式：III期和II期开放标签的临床免疫原性测定法
对于III期试验和2年II期OL时间段，抗CTLA4-Ig和抗CTLA-4测定进行修改以减少非特异性背景、改善灵敏性，并且测定阳性的方法进行改变且统称为测定B。这些测定也使用由猕猴抗血清纯化的CTLA4-Ig特异性抗体进行验证。对于每种ELISA，用CTLA4-Ig(0.25μg/mL)或CTLA-4(0.5μg/mL)包被的96孔微量滴定板与1：400稀释的测试血清于22±5℃(抗CTLA4-Ig)一起温育2小时，或与1：25稀释的测试血清于32–40℃(抗CTLA-4)一起温育2小时。初步温育后，结合的抗体使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人抗体混合物，随后为四甲基联苯胺底物进行检测。
关于抗CTLA4-Ig测定的结果表示为后/前比，其通过将在相同板上分析的给药后样品OD值除以相应的给药前样品OD值进行计算。阳性基于使用安慰剂治疗的RA患者样品确定的截止值。如果比值小于截止，那么样品视为阴性且报告为<400的滴度值。超过这种截止的任何值视为条件阳性的。
关于抗CTLA-4测定的结果表示为‘比1’值，其通过将在相同板上的平均患者血清样品OD除以阴性对照的平均OD进行计算。阳性基于使用来自作为阴性对照的安慰剂治疗的RA患者的混合血清确定的值。如果该值小于指定截止，那么样品视为阴性且报告为<25的滴度值。超过这种截止的任何值视为条件阳性的。
证实分析
在每种测定(抗CTLA4-Ig和抗CTLA-4)和每种测定形式(测定A和B)中鉴定的条件阳性样品在免疫耗竭测定中进行评估，以测定应答的特异性。抗CTLA4-Ig阳性样品与约40μg/mL CTLA4-Ig(分子的CTLA-4部分)、另一种无关的Ig融合蛋白(CD40Ig)或无关蛋白质(卵清蛋白)预温育，以鉴定抗CTLA4-Ig反应性可能针对的分子部分(CTLA-4、Ig或连接区域)。抗CTLA-4阳性样品与CTLA4-Ig、CTLA-4部分或卵清蛋白类似地预温育，以证实抗CTLA-4反应性的特异性。预温育后，所有样品在如上所述相同的原始测定法形式中进行再次分析。其中与未处理的样品相比较，预温育导致预温育样品的OD中≥30％减少的样品视为证实阳性的。如果得到证实，那么滴定样品以鉴定导致等于具体测定的截止的比值的血清稀度，且这个值报告为EPT。
中和抗体活性评估
进行生物测定以评估具有针对CTLA-4的药物特异性抗体的患者样品抑制或中和CTLA4-Ig活性的能力(抑制与CD80/86的结合)，其通过阻止其与T细胞表面上的CD80/86结合实现。表达在白细胞介素(IL)-2启动子控制下的萤光素酶基因的稳定的Jurkat T细胞转染子，在抗CD3抗体的存在下与Daudi B细胞进行共刺激。通过Jurkat T细胞上的CD28和Daudi B细胞上的CD80/86之间的相互作用介导的这种共刺激与抗CD3抗体组合，激活IL-2启动子，从而导致增加的萤光素酶基因转录，且因此增加的萤光素酶蛋白质表达。发光信号使用萤光素酶测定系统进行测量。因为CTLA4-Ig阻断CD80/86：CD28相互作用，所以将CTLA4-Ig加入细胞混合物中阻断这种IL-2启动子活化且减少发光，而与中和抗体预温育将恢复共刺激相互作用且导致发光中的增加。
CTLA4-Ig中和抗体活性通过下述进行评估：在1：25给药后血清反应阳性血清的存在下在生物测定中测定浓度0.1、0.25或0.5μg/mL时的CTLA4-Ig应答，且在统计学上将其与在其相应的第1天样品的存在下的应答比较。在生物测定中具有CTLA4-Ig中和活性的抗人CTLA-4鼠单克隆抗体(11D4)在每次分析运行中用作阳性对照。由于在生物测定测试法中固有的局限性，只能评估CTLA4-Ig的现有水平≤1μg/mL的给药后样品，因为更高的药物水平干扰中和应答，且进一步的样品稀释将降低测定灵敏性。
药物代谢动力学评估
对来自II/III期试验的DB时间段其中证实阳性免疫应答的患者的血清样品数据进行群体药物代谢动力学(POPPK)分析。将验证的POPPK模型应用于个别患者血清浓度数据，且获得个别PK参数值的最大后验贝叶斯(Bayesian)估计。关于这些患者的清除率、体积估计、稳态曲线下面积(AUC)值、和给药后体内的药物最低浓度(Cmin)值的分布，与来自相同试验不发展免疫应答的患者的更大数据集中的这些值的分布进行比较。
结果
抗CTLA4-Ig和抗CTLA-4应答的发生率
总共2,237个患者具有基线前和后血清样品，且对于评估是合格的。如使用测定A或B测定的，在这些中，62(2.8％)个患者具有抗CTLA4-Ig或抗CTLA-4应答的证据(图39)。没有患者证实针对CTLA4-Ig的Fc和CTLA-4结构域的免疫应答。3个患者具有针对连接区域的应答。当使用更灵敏的测定B时，在1,990个患者中的60 个(3.0％)中检测到针对CTLA4-Ig的抗体应答(图39)。
在III期研究中评估的患者中(n＝1,764)，203个在DB或OL时间段过程中中断CTLA4-Ig治疗，或未进入随后的OL研究时间段，且在治疗中断后56和/或85天收集血清。在203个患者中，15个(7.4％)具有针对CTLA4-Ig(整个分子；n＝5，2.5％)或CTLA-4(n＝10，4.9％；表42)的免疫阳性应答。在完成III期DB时间段且继续进入OL治疗的其余1,561个RA患者中，40个(2.6％)在DB或OL时间段过程中具有阳性抗体应答：33个(2.1％)针对CTLA4-Ig和7个(0.4％)针对CTLA-4。有趣的是，在CTLA4-Ig作为单一疗法的IIa期研究中，没有患者对于CTLA4-Ig或该分子的CTLA-4部分血清转变；然而，使用的是较不灵敏的测定A形式。
总共191个患者在其参与DB和OL时间段之间具有超过30天的无CTLA4-Ig时间段。在这些中，在OL时间段过程中3个(1.6％)患者具有针对CTLA4-Ig的阳性抗体应答，和1个(0.5％)患者具有针对CTLA-4的阳性抗体应答(表41)。还分析了来自587个RA患者的血清，所述RA患者错过研究药疗法的1－2剂且在研究期间的任何点上重新开始。在这些患者中，15个(2.6％)证实针对CTLA4-Ig的阳性抗体应答，和7个(1.2％)具有针对CTLA-4的阳性抗体应答(表41)。
表41.具有CTLA4-Ig的中断使用的血清反应阳性患者数目(％)
CTLA-4＝细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4；DB＝双盲；OL＝开放标签
伴随的氨甲蝶呤对免疫原性的作用
总共2451个患者接受伴随的MTX和493个患者未接受。总之，具有针对CTLA4-Ig的阳性抗体应答的患者百分比一般是类似的，无论他们是否接受伴随的MTX(2.3％对1.4％)(表42)。
表42.接受或不接受伴随的氨甲蝶呤具有抗CTLA4-Ig或抗CTLA-4应答的患者数目(％)。
CTLA-4＝细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4
免疫原性对CTLA4-Ig的安全性和功效的影响
评估关于所有阳性患者的AEs、SAEs、输注周围AEs的比率，且没有观察到免疫原性和安全性之间的关联。类似地，没有注意到免疫原性和功效之间的关联；然而，由于血清转变的患者数目有限，所以这些数据的解释是受限制的。
抗CTLA-4抗体的中和活性
来自20个患者的24份血清样品在抗CTLA-4抗体筛选测定中证实对于抗CTLA-4反应性是阳性的。在这些中，14份样品(从13个患者中收集)符合在中和生物测定中用于评估的示例性值(≤1μg/mL CTLA4-Ig)。在这13份样品中，1份在给药后第56天时是阳性的，和10份在给药后第85天时是阳性的。14份样品(得自8个患者)中的9份显示中和抗体活性。除1个患者中的败血病外，在这些患者中血清转变时或接近血清转变时没有报告医学上显著的AEs，其视为与这8个患者中的治疗相关或可能相关。功效数据在研究中断后的时间段期间(中断后56和85天)未收集，这是占优势的样品数目适合于评估中和抗体的时间段。同样，不可能评估中和抗体对功效的影响。
药物代谢动力学评估
药物代谢动力学参数对于32个患者中的31个进行评估，所述32个患者在II/III期试验的DB时间段过程中具有阳性抗体应答。用于PK分析的血清样品不一定在阳性免疫应答得到证明的当天进行收集。来自DB研究时间段的患者数据的群体PK建模暗示，在31个免疫阳性患者中预测的PK参数比得上在无阳性免疫应答的更大患者群体(n＝386)中的那些。在DB时间段过程中血清转变得到证明时的研究当天的谷血清浓度为1.16－24.21μg/mL，其中大多数血清浓度为5－20μg/mL。血清转变看起来不影响血清谷水平。清除率和中央区室的体积经由免疫原性状态的分布显示于图40中。
MSD电化学发光测定。在药物的存在下(药物耐受性)改善结合免疫原性测定的灵敏性和检测抗体的能力的努力中，通过利用Meso-Scale Discovery(MSD)技术开发了新一代免疫原性测定，以监控针对CTLA4-Ig的抗药物抗体。这种新技术使用在微量培养板的电极表面上起始的电化学刺激后发光的标记。与ELISA形式相比较，MSD形式已显示在药物的存在下具有改善的灵敏性和检测抗体的更佳能力。这种溶液相技术允许标记的药物与血清中的药物更有效地竞争，并且具有超过ELISA形式更大的动态范围、信噪比、和增加的表面容量。与使用分子的CTLA4部分或整个分子作为捕获试剂的目前ELISAs不同，新测定是利用生物素化且钌标记的CTLA4-Ig分子的桥连测定，所述CTLA4-Ig分子在加入抗生物素蛋白包被的MSD板前与患者样品温育。由钌标记发出的电化学发光信号使用MSD仪器进行测量。基于验证的测定切割点的阳性样品将通过免疫耗竭以CTLA4-Ig、CTLA4-T或CD40Ig在MSD测定中进行进一步评估，以证实阳性且显示免疫原性应答针对CTLA4-Ig分子的哪个部分，且限定终点滴度。
实施例32：猴中的药物代谢动力学参数
对6只雌性猕猴/组施用由CD-CHO1方法生产的CTLA4-Ig的单次静脉内10-mg/kg剂量。6只雌性猴的对照组接受盐水(1ml/kg)。为了评估CTLA4-Ig的生物活性，所有猴在给药前30分钟内用10mg/动物的T细胞依赖性抗原匙孔血蓝蛋白(KLH)进行肌内免疫。
动物在治疗后观察6周。血液样品在给药前；给药后3和30分钟时；1、2、4、8、24和48小时时；和第4、8、11、15、22、29、36和43天时获得，以测定且比较药物代谢动力学概况。在药物代谢动力学报告中，这些研究天数分别对应于第0、1、2、3、7、10、14、21、28、35和42天。血清样品通过ELISA法就CTLA4-Ig进行分析。可比较的血液样品在相同天数时从对照动物中收集，并且适当时用于评估抗KLH抗体应答。对从CTLA4-Ig治疗动物研究前和其后每周获得的血清进行CTLA4-Ig特异性抗体的形成的评估。对免疫前和免疫后约每周得自所有动物的血清样品测定KLH特异性抗体形成，经历4周。用于评估的另外示例性值包括存活、临床病征、身体检查(包括神经学、呼吸率和听诊评估)、体重、体温和食物消耗。
临床病理学评估在研究前和第45天时进行。所有动物在研究完成后送回贮存。
表43.由本发明的方法生产的CTLA4-Ig的药物代谢动力学参数。
在用CD-CHO1方法材料治疗的6只猴中的3只中在第29天时或其后发生药物特异性抗体应答(表43；图41)。在用CD-CHO1方法材料治疗的猴中血尿素氮(BUN)中最低限度的增加(20％)和血清钾中的减少(14％)在生理学上或毒理学上没有意义，因为值仅略在历史对照范围外，并且对于BUN，不存在血清肌酸酐中的伴随增加。没有注意到临床病理学参数中的其他变化。在施用CD-CHO1方法材料的猴中观察到KLH抗体应答的显著抑制(≥94％的峰对照应答)。免疫原性明显延迟，直至在第29天时或其后CTLA4-Ig血清水平降到约1μg/mL的免疫抑制水平之下。
临床病理学。在给药前(第-13天)和最后药物代谢动力学放血后(第45天)，从禁食动物的股静脉中收集血液样品。对研究前(第-13天)和最后药物代谢动力学取样后(第45天)经过18小时时间段收集的尿进行尿分析。测定下述分析参数：血液学：测定血红蛋白、血细胞比容、红细胞计数、平均小体体积、平均小体血红蛋白、平均小体血红蛋白浓度、网织红细胞计数、总和差别白细胞计数、血小板计数，和外周血涂片中细胞形态学的评估。凝固：测定凝血酶原时间、活化部分凝血激酶时间、和血浆纤维蛋白原。血清化学：测定尿素氮、肌酸酐、葡萄糖、总胆固醇、总蛋白质、清蛋白、球蛋白、清蛋白/球蛋白比、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、甘油三酯、γ谷氨酰转移酶、钠、钾、钙、氯化物和磷。尿分析：测定输出、比重、pH、颜色和外观、以及葡萄糖、蛋白质、酮、胆红素、潜血和尿胆素原的定性测定。尿沉积物用显微镜进行检查。
特异性抗体应答。在第29天时或其后，在用CD-CHO1方法材料治疗的6只猴中的3只中发生可比较量级的药物特异性抗体应答。如预期的，在第29天时或其后，关于方法的免疫原性明显延迟，直至CTLA4-Ig血清水平降到约1μg/mL的免疫抑制水平之下。关于被给予CD-CHO1方法材料的猴的平均CTLA4-Ig特异性抗体应答在第36天时变成阳性，且在第43天时(评估的最后时间点)达到最高点。被给予CD-CHO1方法材料的个别猴中的峰抗体滴度为23－10,448。
实施例33：柱上解聚
经过亲和层析树脂的解聚过程是有用的，且具有对于在哺乳动物细胞中生产的所有基于IgG-Fc的重组分子的应用性。离液剂可以用于破坏高分子量蛋白质或材料。对于任何此种蛋白质这种解聚可以在柱上完成。这个实施例提供了用于对示例性材料：即CTLA4-Ig执行解聚过程的方法。
通过在溶液中(分批模式)或与亲和层析步骤结合(柱上模式)使用离液剂，生产生物反应器中生产的CTLA4-Ig高分子量(HMW) 材料可以部分转变成功能CTLA4-Ig二聚体。这个过程称为“解聚”。基于解聚的CTLA4-Ig材料的分析表征研究，解聚的材料看起来在生物化学上比得上不实施解聚过程的对照材料。
在生产本发明的CTLA4-Ig分子的发酵方法中，约20－25％所得到的CTLA4-Ig蛋白质可以为HMW材料(即，聚集物)的形式。这种材料的部分作为功能二聚体回收因此具有>10％的总体过程得率增强的可能性。
分批模式解聚过程
解聚已在分批模式中(在溶液中)通过下述得到证实，用中等浓度的离液剂例如盐酸胍或尿素处理，随后快速稀释到低盐重折叠缓冲液中以帮助分子获得其天然构象。
使用A蛋白(树脂使用MAbSelect)纯化的CTLA4-Ig调整至～4－5mg/ml的终浓度以用作用于这些分批实验的原材料。这随后以1：1的体积比与2x浓缩的离液缓冲液接触，以达到1－3M(对于盐酸胍)和2－7M(对于尿素)的最终离液剂浓度。>2M的盐酸胍浓度和>＝4M的尿素浓度在引起CTLA4-Ig HMW材料解聚方面是有效的。用于这些实验的流动相是在6.5－7.0的pH范围的磷酸盐缓冲系统。解聚反应通过快速稀释(以1：5的体积比)到由50mM Tris，25mM NaCl，pH 8.5组成的重折叠缓冲液中进行猝灭。在分批解聚实验中，50－60％的HMW材料以>95％的步骤得率转变成CTLA4-Ig二聚体。解聚步骤后观察到的HMW材料水平中的减少显示于图42中。
柱上解聚过程
为了克服在分批解聚过程按比例扩大期间潜在的槽和混合局限性，评估使A蛋白捕获步骤和解聚步骤组合的方法。这个方法涉及使用离液溶液作为用于A蛋白步骤的洗脱缓冲液，随后将洗脱库收集到重折叠/稀释缓冲液内。
使用分批和柱上过程观察到解聚效率中的类似性能。柱上解聚过程将具有减少加工步骤数目的独特优点。关于使用柱上解聚步骤的A蛋白步骤的实验细节概括于下表中。使用的树脂：MAbSelect(来自GE Healthcare)；柱床高度：20－25cm
掺入下游方法内的可行性
执行样品3柱纯化串以产生使用和不使用柱上A蛋白解聚步骤的最终方法材料。得自2个纯化串的层析步骤得率在表44中提供。
表44.关于含和不含解聚的3柱方法的层析得率
样品3柱方法中掺入解聚步骤导致方法得率中约10％的改善。分析来自2种方法顺序的产物库，以评估所得到的CTLA4-Ig材料的生物化学可比性。
2种产物库经由MALDI-TOF的N聚糖分析显示于图43中。基于这种分析，材料看起来是可比较的。这种MALDI-TOF结果使用基于HPLC的N聚糖测定法进行证实。HPLC分析显示在对照和解聚的最终方法材料之间双触角唾液酸峰中<1.7％的差异。
还对2种产物库进行胰蛋白酶肽作图以定量纯化的材料中存在的脱酰胺和氧化肽的百分比。结果(概括于表45中)证实关于2种样品可比较的脱酰胺和氧化水平。
表45.肽图结果
此外，B7结合测定结果对于对照和柱上解聚材料分别为101％和98％。
用于使基于IgG-Fc的重组分子，例如由哺乳动物细胞生产的那些解聚的方法，包括使包含聚集形式的此种分子的组合物与离液剂(例如盐酸胍或尿素)接触的步骤，其量和时间足以使此种聚集分子的至少部分解聚，任选随后为使所述分子解聚的部分与重折叠和/或猝灭剂接触(例如，通过快速稀释到低盐重折叠缓冲液中以帮助此种分子获得天然构象)。与离液剂接触可以例如以分批、半分批和连续模式进行，以及例如在溶液中(例如在分批模式中)、或与层析步骤结合例如在亲和层析步骤期间(柱上模式)进行。
使柱上纯化例如A蛋白捕获步骤与上述解聚法组合的方法可以增强总体方法效率，且是本发明的另一个实施方案。因此，本发明预期了用于使基于IgG-Fc的重组分子，例如由哺乳动物细胞生产的那些解聚的方法，包括使包含聚集形式的此种分子的组合物与离液剂(例如盐酸胍或尿素)接触的步骤，其量和时间足以使所述聚集分子的至少部分解聚，其中所述接触在层析柱上发生，例如其中所述离液剂在用于洗脱所述柱的溶液(例如用于A蛋白柱的洗脱缓冲液)中使用，任选随后为使所述分子解聚的部分与重折叠和/或猝灭剂接触(例如，通过快速稀释到低盐重折叠缓冲液中以帮助分子获得天然构象)。
待与此种离液剂接触的组合物可以包含除聚集形式外的形式(例如单链形式或二聚体)的基于IgG-Fc的重组分子，加上包含聚集形式的所述分子。
示例性基于IgG-Fc的分子可以包括糖蛋白例如本发明的CTLA4-Ig分子。
实施例34：药物代谢动力学
2B期、多中心、随机化、双盲、安慰剂对照研究用于评估静脉内施用于受试者的2种不同剂量的CTLA4-Ig的安全性和临床功效，所述受试者具患有活性类风湿性关节炎同时接受氨甲蝶呤)：在这个研究中，受试者接受与MTX组合的2种不同剂量(2和10mg/kg)的CTLA4-Ig或安慰剂。CTLA4-Ig根据本发明的方法进行生产，并且在包含200mg CTLA4-Ig的个别小瓶中供应。CTLA4-Ig在第1、15和30天时和其后每30天IV施用于受试者，经历1年。多剂PK衍生自在第60和90天之间的给药时间间隔期间从参与位点特异性PK子研究的受试者中获得的血清浓度对时间数据。对于PK子研究中的受试者，血液样品在下述时间点进行收集：第60天给药前、和对于第60天时开始的PK概况在30分钟时(对应于CTLA4-Ig输注结束)、在输注开始后4小时时、和其后每周一次直至第90天。总共90个受试者登记参与PK子研究。然而，从第60到90天的给药时间间隔之间的完全PK概况得自29个受试者(15个受试者以2mg/kg给药；14个受试者以10mg/kg给药)。
PK参数的概括呈现于表46中。来自该研究的结果显示Cmax和AUC(TAU)以和剂量成比例方式增加，其中TAU＝30天。对于以1：5的比增加的标称剂量，Cmax的几何平均值以1：5.2的比增加，而对于AUC(TAU)的几何平均值以1：5.0的比增加。此外，T-HALF、CLT和Vss值看起来不依赖于剂量。在这些RA受试者中，平均T-HALF、CLT和Vss值分别为约13天、～0.2mL/h/kg和～0.07L/kg。小的Vss指出CTLA4-Ig主要限制于细胞外液体积。基于在第一次输注后2和4周时，随后其后每月1次给药的给药方案，关于CTLA4-Ig的稳态条件在第3次每月一次给药时达到。同样，作为给药方案的结果，血清浓度在治疗的前2个月期间超过稳态谷浓度。谷(Cmin)值在第60、90和180天时的比较指出CTLA4-Ig看起来在每月一次给药后不累积。关于接受每月IV剂量的2和10mg/kg CTLA4-Ig的所有受试者的平均Cmin稳态值分别为4.4－6.7μg/mL和22.0－28.7μg/mL。
表46.在类风湿性关节炎受试者中多重PK研究的概括
在RA患者中，多次静脉内输注后，CTLA4-Ig的药物代谢动力学显示Cmax和AUC在2mg/kg至10mg/kg的剂量范围中的成比例增加。在10mg/kg时，血清浓度看起来到第60天时达到稳态，其平均(范围)谷浓度为24(1－66)mcg/mL。在RA患者中以每月的时间间隔用10mg/kg连续反复治疗后没有发生CTLA4-Ig的全身性累积。
RA患者中的群体药物代谢动力学分析揭示存在伴随渐增的体重朝向CTLA4-Ig的更高清除率的趋势。年龄和性别(当对于体重进行校正时)不影响清除率。伴随的氨甲蝶呤(MTX)、非类固醇消炎药(NSAIDs)、皮质类固醇和TNF阻断剂不影响CTLA4-Ig清除率。
实施例35：经由CE测定甘露糖、岩藻糖和半乳糖的摩尔比
毛细管电泳法已开发用于LEA2CTLA4A29YL104E-Ig中的中性单糖含量的定量分析。中性单糖包括甘露糖、岩藻糖和半乳糖通过在高温条件下的酸性水解(2M三氟乙酸，于95℃6小时)从CTLA4A29YL104E-Ig样品中得到释放。释放的中性单糖随后在作为催化剂的乙酸、和作为还原剂的NaBH3CN的存在下用氨基芘三磺酸(APTS)进行荧光标记(67mM APTS，330mMHAc，83mM NaBH3CN，于55℃3小时)。将木糖加入每种样品中且充当内部标准。每种中性单糖的峰面积针对内部标准的那种的比用于定量。
试剂：水解溶液(2M三氟乙酸(TFA))；衍生化溶液I(0.1M 8-氨基-1,3,6三磺酸，三钠盐(APTS)水溶液)；衍生化溶液II(溶于1M乙酸的0.25M NaBH3CN)；运行缓冲液(60±5mM四硼酸钠，pH9.25)；毛细管冲洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80％甲醇)；浓度为10mg/ml的甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和木糖(Xyl)的单糖标准贮存液；单糖工作溶液I：内部标准工作溶液是Xyl贮存液的100倍稀释物；单糖工作溶液II：中性混合标准工作溶液，Man、Fuc和Gal贮存液的100倍稀释物。
仪器配置：CE系统是Beckman P/ACE MDQ CE系统；检测器：与P/ACE MDQ)偶联的Beckman激光诱导的(LIF)检测系统；未涂覆的毛细管(i.d.25μm，o.d.360μm)27－31cm总长以容纳P/ACE MDQ。
毛细管电泳运行条件：运行缓冲液(60mM四硼酸钠，pH 9.25)；毛细管柱体温度：25℃；电压：25－30kV，正模式；检测条件：LIF检测器，在488nm处激发，在520m处发射；样品注射：压力注射模式，在0.5PSI时20s；运行时间：10分钟；样品贮藏：10℃。
水解：使10μL木糖工作溶液和200μL 2M TFA混合，以制备系统空白。使10μL木糖工作溶液和10μL中性混合标准溶液与200μL 2M TFA混合，以制备单糖标准。使10μL木糖工作溶液和10μL样品(例如，CTLA4A29YL104E-Ig，约1mg/ml)与200μL 2M TFA混合，以制备测试样品。将所有管涡旋10秒，且离心10秒，随后于95℃温育6小时。水解步骤后，将样品置于-20℃10分钟以冷却。使样品向下旋转10秒且在SpeedVac中蒸发至干燥。
衍生化：用10μL衍生化溶液I重构样品。使样品短暂混合，且添加5μL衍生化溶液II。将样品装载到预加温的离心机中且于55℃温育3小时同时在2000rpm下离心。
CE注射：通过添加HPLC等级水使衍生化后样品的最终体积达到100μL，且将10μL样品转移至具有190μL HPLC等级水的CE微量小瓶。样品注射前，CE柱体用HPLC等级水广泛地冲洗(1－3分钟运行时间)，随后用运行缓冲液平衡冲洗(5分钟运行时间)。最初冲洗后，将用于分析的单糖标准和样品注射到CE柱体中(15分钟运行时间)。每种标准或测试样品的注射运行后，CE柱体用HPLC等级水和运行缓冲液进行冲洗和平衡(表51)。系统适合性的电泳图应类似于图45，其中峰1是甘露糖；峰2是木糖；峰3是岩藻糖；且峰4是半乳糖。
表51.仪器方法
系统适合性：
系统适合性的电泳图应类似于图45中显示的那种，其中峰1是甘露糖；峰2是木糖；峰3是岩藻糖；且峰4是半乳糖。
当使用除Beckman MDQ系统外的CE仪器时，毛细管的长度可以不同于这种方法中指定的那种。这可以导致分析物迁移时间以及峰强度中的变化。但单糖分析物的峰模式应保持相同。
根据下面等式可以计算关于第一种系统适合性标准的2个邻近峰之间的分辨率：
R＝2(t2-t1)/(W1+W2)
其中，
R：分辨率
t2，t1：2个邻近峰分别的迁移时间
W1，W2：2个邻近峰分别在基线处的峰宽
R值必须≥1.0。如果R<1.0，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管。如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。
对于最后的系统适合性注射，使用下式最后的峰(半乳糖)必须具有<1.4的拖尾因子：
T＝W0.05/2f
其中：T：拖尾因子
W0.05：在5％高度时的峰宽
f：在峰最大值时峰前面的宽度
如果T≥1.4，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。半乳糖和木糖的峰面积比必须具有≤10％的RSD。半乳糖的迁移时间需≤15.0分钟。电泳图概况应等价于图45。
通过比较内部标准和单糖标准组分的峰面积比可以测定单糖标准百分比RSD，其经由将关于每个单糖组分的峰面积除以关于每次单糖标准注射的内部标准的峰面积实现。百分比RSD可以对于甘露糖、岩藻糖和半乳糖进行计算。RSD应≤10％。
中性单糖与蛋白质的摩尔比的测定
中性单糖(例如，Man、Gal和Fuc)相对于内部标准木糖的峰面积比可以根据下文提供的式进行计算，以测定每种中性单糖与蛋白质的摩尔比。例如，峰面积比等于单糖峰面积(Gal、Fuc或Man)除以木糖峰面积，其中关于峰面积比的相对标准差(RSD)等于或小于10％。下面等式可以用于计算下述：
对于甘露糖/蛋白质的摩尔比：
其中，
Rman：甘露糖对蛋白质的摩尔比
Aman：样品中甘露糖的峰面积(μV·秒)
Axyl：样品中木糖的峰面积(μV·秒)
Axyl0：单糖标准中木糖的峰面积(μV·秒)平均值
Aman0：单糖标准中甘露糖的峰面积(μV·秒)平均值
Vman0：用于水解的单糖工作溶液中包含的甘露糖体积(以μL表示)
Cman0：用于水解的单糖工作溶液中包含的甘露糖浓度(以mg/mL表示)
Vp：用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp：用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWLEA29Y：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E-Ig)的分子量(91,232Da)
甘露糖的MW：180.2道尔顿
对于岩藻糖/蛋白质的摩尔比：
其中，
Rfc：岩藻糖对蛋白质的摩尔比
Afuc：样品中岩藻糖的峰面积(μV·秒)
Axyl：样品中木糖的峰面积(μV·秒)
Axyl0：单糖标准中木糖的峰面积(μV·秒)平均值
Afuc0：单糖标准中岩藻糖的峰面积平均值(μV·秒)
Vfuc0：用于水解的单糖工作溶液中包含的岩藻糖体积(以μL表示)
Cfuc0：用于水解的单糖工作溶液中包含的岩藻糖浓度(以mg/mL表示)
Vp：用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp：用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWLEA29Y：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E-Ig)的分子量(91,232Da)
岩藻糖的MW：164.2道尔顿
对于半乳糖/蛋白质的摩尔比：
其中，
Rgal：半乳糖对蛋白质的摩尔比
Agal：样品中半乳糖的峰面积(μV·秒)
Axyl：样品中木糖的峰面积(μV·秒)
Axyl0：单糖标准中木糖的峰面积(μV·秒)平均值
Agal0：单糖标准中半乳糖的峰面积(μV·秒)平均值
Vgal0：用于水解的单糖工作溶液中包含的半乳糖体积(以μL表示)
Cgal0：用于水解的单糖工作溶液中包含的半乳糖浓度(以mg/mL表示)
Vp：用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp：用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWLEA29Y：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E-Ig)的分子量(91,232Da)
MW半乳糖：180.2道尔顿
表52：单糖与CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质的平均摩尔比
实施例36：经由CE测定GalNAc和GlcNAc的摩尔比
毛细管电泳法已开发用于CTLA4A29YL104E-Ig中的氨基单糖含量的定量分析，所述CTLA4A29YL104E-Ig是具有6个N联糖基化位点和至少1个O联糖基化位点的糖蛋白。氨基单糖包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)通过在高温条件下的酸性水解(4NHCl，于95℃6小时)从CTLA4A29YL104E-Ig样品中得到释放。释放的氨基单糖通过与乙酸酐在冰上温育半小时经历再乙酰化步骤。它们随后在作为催化剂的乙酸、和作为还原剂的NaBH3CN的存在下用氨基芘三磺酸(APTS)进行荧光标记(67mM APTS，330mM HAc，83mM NaBH3CN，于55℃3小时)。将N-乙酰甘露糖胺加入每种样品中且充当内部标准。每种氨基单糖的峰面积针对内部标准的那种的比用于定量。
试剂：水解溶液(4N HCl)；衍生化溶液I(0.1M 8-氨基1,3,6三磺酸，三钠盐(APTS)水溶液)；衍生化溶液II(溶于1M乙酸的0.25M NaBH3CN)；再乙酰化缓冲液(25mM碳酸氢钠，pH9.5)；运行缓冲液(60±5mM四硼酸钠，pH9.25)；毛细管冲洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80％甲醇)；浓度为10mg/ml的GalNAc、GlcNAc和ManNAc的单糖标准贮存液；单糖工作溶液I：内部标准工作溶液是ManNAc贮存液的100倍稀释物；单糖工作溶液II：氨基混合标准工作溶液，GalNAc和GlcNAc贮存液的100倍稀释物。
仪器配置：CE系统是Beckman P/ACE MDQ CE系统；检测器：与P/ACE MDQ)偶联的Beckman激光诱导的(LIF)检测系统。
毛细管电泳运行条件：运行缓冲液(60mM四硼酸钠，pH 9.25)；毛细管柱体温度：25℃；电压：25－30kV，正模式；检测条件：LIF检测器，在488nm处激发，在520m处发射；样品注射：压力注射模式，在0.5PSI时20s；运行时间：10分钟；样品贮藏：10℃。
水解：使10μL ManNAc工作溶液和200μL 4N HCl混合，以制备系统空白。使10μLManNAc工作溶液和10μL氨基混合标准溶液与200μL 4N HCl混合，以制备单糖标准。使10μLManNAc工作溶液和10μL样品(例如，CTLA4A29YL104E-Ig样品等；约1mg/ml)与200μL 4N HCl混合，以制备测试样品。将所有管涡旋10秒，且离心10秒，随后于95℃温育6小时。水解步骤后，将样品置于-20℃10分钟以冷却。使样品向下旋转10秒且在SpeedVac中蒸发至干燥。
再乙酰化：用20μL再乙酰化缓冲液和4μL乙酸酐重构水解和干燥的样品，随后混合和在冰上温育(30分钟)。使样品向下旋转10秒且在SpeedVac中蒸发至干燥。样品各自用100μL HPLC等级水重构且在SpeedVac中蒸发至干燥。
衍生化：向重构的样品(10μL衍生化溶液I HPLC)提供5μL衍生化溶液II。混合后，将样品装载到预加温的离心机中且于55℃温育3小时，同时在2000rpm下离心。
CE注射：通过添加HPLC等级水使衍生化后样品的最终体积达到100μL，且将10μL样品转移至具有190μL HPLC等级水的CE微量小瓶。样品注射前，CE柱体用HPLC等级水广泛地冲洗(1－3分钟运行时间)，随后用运行缓冲液平衡冲洗(5分钟运行时间)。最初冲洗后，将用于分析的单糖标准和样品注射到CE柱体中(10分钟运行时间)。每种标准或测试样品的注射运行后，CE柱体用HPLC等级水和运行缓冲液进行冲洗和平衡。系统适合性的电泳图应类似于图46，其中峰1是GalNAc；峰2是ManNAc；且峰3是GlcNAc。
表53.仪器方法
系统适合性：
系统适合性的电泳图应类似于图46中显示的那种，其中峰1是GalNAc；峰2是ManNAc；且峰3是GlcNAc。
当使用除Beckman MDQ系统外的CE仪器时，毛细管的长度可以不同于这种方法中指定的那种。这可以导致分析物迁移时间以及峰强度中的变化。但单糖分析物的峰模式应保持相同。
根据下面等式可以计算关于第一种系统适合性标准的2个邻近峰之间的分辨率：
R＝2(t2-t1)/(W1+W2)
其中，
R：分辨率
t2，t1：2个邻近峰分别的迁移时间
W1，W2：2个邻近峰分别在基线处的峰宽
R值必须≥1.0。如果R<1.0，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管。如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。
对于最后的系统适合性注射，使用下式最后的峰(GlcNAc)必须具有<1.4的拖尾因子：
T＝W0.05/2f
其中：T：拖尾因子
W0.05：在5％高度时的峰宽
f：在峰最大值时峰前面的宽度
如果T≥1.4，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。GlcNAc和ManNAc的峰面积比必须具有≤10％的RSD。GlcNAc的迁移时间必须≤10.0分钟。电泳图概况应等价于图46。
通过比较内部标准和单糖标准组分的峰面积比可以测定单糖标准百分比RSD，经由将关于每个单糖组分的峰面积除以关于每次单糖标准注射的内部标准的峰面积实现。百分比RSD可以对于GalNAc和GlcNAc进行计算。RSD应≤10％。
氨基单糖与蛋白质的摩尔比的测定
氨基单糖(例如，GalNAc和GlcNAc)相对于内部标准ManNAc的峰面积比可以根据下文提供的式进行计算，以测定每种氨基单糖与蛋白质的摩尔比。例如，峰面积比等于单糖峰面积(GalNAc和GlcNAc)除以ManNAc峰面积，其中关于峰面积比的相对标准差(RSD)等于或小于10％。下面等式可以用于计算下述：
对于GalNAc/蛋白质的摩尔比：
其中，
RGalNAc：GalNAc对蛋白质的摩尔比
AGalNAc：样品中GalNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc：样品中ManNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc0：单糖标准中ManNAc的峰面积(μV·秒)平均值
AGalNAc0：单糖标准中GalNAc的峰面积(μV·秒)平均值
VGalNAc0：用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc体积(以μL表示)
CGalNAc0：用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc浓度(以mg/mL表示)
Vp：用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp：用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWLEA29Y：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E-Ig)的分子量(91,232Da)
MW GalNAc：221.2道尔顿
对于GlcNAc/蛋白质的摩尔比：
其中，
RGlcNAc：GlcNAc对蛋白质的摩尔比
AGlcNAc：样品中GlcNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc：样品中ManNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc0：单糖标准中ManNAc的峰面积(μV·秒)平均值
AGlcNAc0：单糖标准中GlcNAc的峰面积(μV·秒)平均值
VGlcNAc0：用于水解的单糖工作溶液中包含的GlcNAc体积(以μL表示)
CGlcNAc0：用于水解的单糖工作溶液中包含的GlcNAc浓度(以mg/mL表示)
Vp：用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp：用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWLEA29Y：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E-Ig)的分子量(91,232Da)
MW GlcNAc：221.2道尔顿
表54：摩尔单糖与摩尔CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质的平均摩尔比。
单糖 范围
GalNAc 2.0－3.2
GlcNAc 18－32
实施例37：CTLA4 A29YL104E -Ig经由高效阴离子交换层析的N联寡糖碳水化合物概况 分析
糖蛋白上存在的碳水化合物结构可以影响其功能和体内清除率。因此监控糖蛋白的重组生产批次的碳水化合物的结构一致性是重要的。此处，监控CTLA4A29YL104E-Ig上存在的N联(天冬酰胺连接的)碳水化合物。在这种方法中，寡糖通过用PNGase F(肽：N-糖苷酶F)酶促消化进行切割，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)进行分离，且通过电化学检测(整合的电流分析法)进行监控。产生的层析谱是N联碳水化合物概况，其中CTLA4A29YL104E-Ig样品的概况应类似于此种。
通过反相和石墨碳HPLC用于分离寡糖的流动相的试剂：洗脱剂1(溶于HPLC等级水的0.05％三氟乙酸(TFA))；洗脱剂2(溶于60％乙腈(ACN)、40％HPLC等级水(60：40，ACN：H2O)的0.05％TFA；洗脱剂3：溶于40％乙腈、40％异丙醇(IPA)、20％HPLC等级水(40：40：20，ACN：IPA：H2O)的0.05％TFA)。
用于制备用于HPAEC寡糖碳水化合物概况分析的流动相的试剂：洗脱剂1：500mM乙酸钠(NaOAc)；洗脱剂2：400mM氢氧化钠(NaOH)；Milli-Q水；4M氢氧化钠(约4M NaOH)；50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5；溶于50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5的PNGase F酶工作溶液；水苏糖贮存液(1.25mg/mL)；水苏糖系统适合性标准(12.5μg/mL)。
仪器配置和条件－(等价仪器配置可以代替。)
仪器配置：
样品制备：向1.7mL Eppendorf管中加入包含0.02％叠氮化钠(NaAzide)，pH 7的80μL 50mM磷酸钠缓冲液和80μL样品(对于总共2mg CTLA4A29YL104E-Ig等～25μg/μL)，随后为16μL 10X变性缓冲液(5％SDS，10％β-巯基乙醇)。使样品充分混合且随后煮沸2分钟以使蛋白质变性。使小瓶冷却至室温，随后加入16μL NP40(10％)和40μL PNGase F工作溶液且随后混合。样品于37℃温育24±2小时后，将它们转移到HPLC自动进样器小瓶内，在HPLC仪器上准备注射。
用于寡糖分离的层析条件：
经由阴离子交换层析用于寡聚物(Oligo)概况的层析条件
ED40检测器设置
根据系统适合性(SS)标准
的RT的近似保留时间
CTLA4A29YL104E-Ig样品可以具有图47的层析谱中描述的碳水化合物概况。如图47中鉴定的，每个结构域的保留时间应近似：
保留时间是系统依赖性的且应与水苏糖类似地移动。
计算
理论塔板(N)：理论塔板数(N)可以使用下式基于水苏糖峰进行测定。这通过Millennium数据分析系统来完成或还可以手工完成。
N＝16(t/W)2
其中：
t：在最大高度时从注射时到峰洗脱时间测量的保留时间
w：通过侧面外推至基线的峰宽。
N必须≥6000。如果板计数小于6000，那么应替换柱。
拖尾因子(T)：柱拖尾因子(T)可以使用下式基于水苏糖峰进行计算。这通过Millennium数据分析系统来完成或还可以手工完成。
T＝(W0.05/2f)
其中：
W0.05：5％高度(0.05h)时的峰宽。
f：最大高度时从W0.05时的峰前面边缘到峰中间的测量(宽度)。
T必须≤1.2。如果拖尾因子大于1.2，那么应评估缓冲液组成，应替换或清洁柱。
％结构域面积：
结构域I：在大约保留时间10－15分钟时的峰面积的总和(峰1A－1E；例如，图47)
结构域II：来自21－27分钟的峰的总和
结构域III：来自34－40分钟的峰的总和
结构域IV：对于在45－56分钟时的峰的峰面积
百分比主峰面积：关于5个主峰各自的％峰面积可以使用下面等式对于下述进行计算：峰1A、1B、1C、2(2个未分开的种类)、3(2个未分开的种类)和4。
实施例38：药品和药物产品中CTLA4 A29YL104E -Ig的毛细管电泳鉴定
CTLA4A29YL104E-Ig是具有免疫抑制剂活性的水溶性糖蛋白。使用无涂层的熔融硅石毛细管的毛细管电泳法用于鉴定CTLA4A29YL104E-Ig。样品(例如，CTLA4A29YL104E-Ig等)于70℃加热5分钟，且随后通过设定在241nm处的UV检测立即进行分析以证实鉴定。
此外，将CTLA4A29YL104E-Ig和CTLA4-Ig材料的1：1混合物进行混合且注射，以证实2种蛋白质可以进行分离且加以区别。这种方法通过比较CTLA4A29YL104E-Ig材料与样品的迁移时间可以区别CTLA4A29YL104E-Ig与CTLA4-Ig。
设备(等价设备可以代替)：
试剂和溶液：运行缓冲液(14.4mM硼酸钠；17.3mM十二烷基硫酸钠；2.0％乙腈)；磷酸盐稀释缓冲液(22.3mM二代磷酸钠；4.2mM一代磷酸钠；53.4mM氯化钠)；硼酸盐稀释缓冲液(83.5mM NaBO2，pH 9.6)；参考或样品工作溶液(溶于磷酸盐稀释缓冲液的10±1mg/mL样品)；参考或样品注射溶液(10.0μL样品+50μL硼酸盐稀释缓冲液)；样品1：1CTLA4-Ig-CTLA4A29YL104E-Ig混合溶液(10.0μL CTLA4-Ig样品+10.0μL CTLA4A29YL104E-Ig样品+50μL硼酸盐稀释缓冲液)；注射溶液。
运行条件：
*总长：从毛细管入口到出口
**有效长度：从毛细管入口到检测窗
主峰的CTLA4-Ig样品迁移时间为约11.0±0.4分钟。主峰的CTLA4A29YL104E-Ig样品迁移时间为约12.0±0.4分钟。每种样品之间的主峰迁移时间应相隔至少0.6分钟(图48)。
实施例39：关于CTLA4 A29YL104E -Ig的N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸含量测定 的水解和HPLC分析
重组蛋白质中唾液酸化的程度可以影响药物代谢动力学和清除率。CTLA4A29YL104E-Ig是具有N和O联碳水化合物位点的重组蛋白质。占据这些位点的聚糖具有可变程度的唾液酸化。除了其唾液酸化的结构异质性外，个别唾液酸的含量可以从批到批变化。因此获得唾液酸与蛋白质的比的总体测量。
检查CTLA4A29YL104E-Ig呈现的N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)含量。唾液酸通过酸水解从蛋白质中得到释放且随后用DMB进行荧光标记。标记的唾液酸在RP-HPLC C-18柱上进行分离，且由同时运行的唾液酸标准的响应因子进行定量。在这种示例性方法内指定数据分析和报告值(作为NANA或NGNA与蛋白质的摩尔比)。这个实施例描述了用于测定CTLA4A29YL104E-Ig中存在的N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的量的方法。唾液酸通过酸水解从蛋白质中得到释放。释放的NANA和NGNA随后用1,2,-二氨基-4,5-甲氧基苯(DMB)进行荧光标记。标记的唾液酸在RP-HPLC C-18柱上进行分离，且通过荧光检测(Ex＝373nm，Em＝448nm)进行检测。NANA和NGNA基于同时运行的NANA和NGNA标准的响应因子进行定量。测试结果分别报告为NANA和NGNA与蛋白质的摩尔比(MR)。
试剂和溶液：1.0M H2SO4；50mM H2SO4；荧光标记试剂(18mM连二亚硫酸钠(Na2S2O4)，7％2-巯基乙醇，7mM 1,2,-二氨基-4,5-亚甲基-二氧苯二盐酸盐(DMB))；流动相运行缓冲液A(20％甲醇)；流动相运行缓冲液B(70％甲醇)；N-乙酰神经氨酸标准溶液(1mg/mL)；N-羟乙酰神经氨酸标准溶液(1mg/mL)；系统适合性标准(溶于900μL水中的50μL NANA或NGNA溶液)；样品溶液(例如，2mg/ml CTLA4A29YL104E-Ig等)；NANA工作原液标准溶液(使原液稀释至50μg/mL)；NGNA工作原液标准溶液(使原液稀释至50μg/mL)。
水解：将各20μL NANA标准、NGNA标准、CTLA4A29YL104E-Ig和系统适合性标准溶液等分试样到分别的1.5mL离心管内，且向每个小瓶中加入200μL 50mM硫酸溶液。将内容物轻轻混合且于80EC温育1小时5分钟。当水解完成时，使样品快速离心。
荧光标记：将荧光标记试剂(200μL)加入每种样品中且充分混合。样品随后在黑暗中于80EC温育455且随后冷却。
仪器配置和层析条件(等价仪器配置可以代替)：
HPLC系统：Waters 2690/2695分离模块或等价物。
荧光检测器：Waters 2475多波长荧光检测器或等价物。
数据获取：Waters Millennium 32或Empower。
柱：Luna 5μ，C18，100A，150x4.6mm，Phenomenex,(目录号00F-4252-E0)
唾液酸标准制剂(～5mM)。N-乙酰神经氨酸(NANA，MW＝309.3)标准(～5mM)。精确称量154.5±1.0mg N-乙酰神经氨酸加入100mL容量瓶内。用DI水溶解且Q.S.至体积，充分混合。将溶液等分试样到2mL深低温小瓶内。
P＝NANA的纯度－来自厂商COA(即，99％＝0.99)。
N-羟乙酰神经氨酸(NGNA，MW＝325.7)标准(～0.25mM)。精确称量8.0±1.0mg N-羟乙酰神经氨酸加入100mL容量瓶内。用DI水溶解且Q.S.至体积，充分混合。将溶液等分试样到2mL深低温小瓶内。
P＝NGNA的纯度－来自厂商COA(即，99％＝0.99)。等分试样的唾液酸标准可以贮藏于-20℃最多6个月。
唾液酸标准混合物制备。用于系统适合性和定量的唾液酸标准混合物(50μMNANA，1μM NGNA)。将1mL 5mM NANA，400μl 0.25mM NGNA加入100mL容量瓶内。用DI水Q.S.至体积且充分混合。将唾液酸标准混合物等分试样到2mL深低温小瓶内。等分试样的唾液酸标准混合物可以贮藏于-20℃最多6个月。
样品和参考材料制备。于2－8℃解冻冷冻的蛋白质样品，充分混合。将样品和参考材料稀释至约0.5mg/mL CTLA4A29YL104E-Ig(例如蛋白质浓度＝25.0mg/mL，将50.0μL蛋白质加入2450μL水中)。将稀释的测试样品和参考材料在10,000rpm下离心5分钟以去除颗粒。
水解。空白：向2.0mL离心管中加入50μL DI水和200μL 50mM硫酸。这充当空白。用于系统适合性和定量的唾液酸标准。向2.0mL离心管中加入50μL唾液酸标准混合物和200μL50mM硫酸。一式两份地制备。注明为Std1和Std2。参考材料：向2.0mL离心管中加入50μL稀释的CTLA4A29YL104E-Ig参考材料(～0.5mg/mL)和200μL 50mM硫酸。一式两份地制备，注明为RM1和RM2。测试样品：向2.0mL离心管中加入50μL稀释的CTLA4A29YL104E-Ig药品(～0.5mg/mL)和200μL 50mM硫酸。一式两份地制备。注明为S1-1，S1-2；S2-1，S2-2；S3-1，S3-2；等。使样品涡旋约5秒且离心约5－10秒。将样品置于加热块中且于80℃±5℃温育1小时±5分钟。允许水解的样品冷却至室温。使水解的样品短暂离心以迫使冷凝物进入管内(以高速～10秒)。
衍生化。使加热块预热至80℃±5℃。将200μL荧光标记试剂加入每种水解的样品中。涡旋约5秒且离心～10秒。将样品置于80℃±5℃加热块中40±5分钟。用铝箔覆盖加热块，因为标记溶液是光敏感的。使衍生化的样品冷却至室温。使样品涡旋且离心约10秒以迫使冷凝物进入管内。
注射用制剂。确保柱在分析前用流动相进行平衡。将足够的样品(100－200μL)从每个离心管转移到具有有限插入物的自动进样器小瓶内。用于10次样品注射的一般自动进样器装载如下：
样品# 描述 注射#
1 空白 1
2 Std1 2
3 Std1 2
4 Std2 2
5 RM1 1
6 RM2 1
7 S1-1 1
8 S1-2 1
9 S2-1 1
10 S2-2 1
11 S3-1 1
12 S3-2 1
13 S4-1 1
14 S4-2 1
15 Std1 1
16 Std2 1
其中Std1和Std 2是唾液酸标准混合物溶液的制剂；RM1和RM2是关于对照样品的制剂；且S是样品注射。前4次(样品#2和3)唾液酸标准(Std1)注射将用于系统适合性用途。样品#3(Std1)和样品#4(Std2)的4次注射将用于计算。对于另外的样品注射，重复自动进样器装载5－16。
系统适合性。系统适合性样品的层析图概况应类似于图49中所示的层析谱。对于系统适合性标准(Std1)的第一次注射，关于NGNA和NANA的USP分辨率(R)必须≥1.5。系统适合性标准(Std1)的4次注射必须符合下述示例性值：关于NANA的峰面积的RSD必须≤5％。关于NGNA的峰面积的RSD必须≤10％。NGNA峰的迁移时间必须在11.3±2.0分钟时进行洗脱。NANA峰的迁移时间必须在16.0±2.5分钟时进行洗脱。4次标准注射(Std1，样品#3)和(Std2，样品#4)的峰面积的RSD必须≤10％。来自顺序的所有一起进行的标准注射的峰面积的RSD必须≤15％。
HPLC系统的制备：柱用98％缓冲液A和2％缓冲液B以1mL/分钟平衡15分钟。将10μL荧光标记的系统适合性溶液注射进系统内。峰分辨率和理论塔板数随后可以使用下面等式进行计算：
其中：R＝分辨率
T1＝N-羟乙酰神经氨酸的保留时间(分钟)
T2＝N-乙酰神经氨酸的保留时间(分钟)
W1＝在N-羟乙酰神经氨酸的基线处的峰宽(分钟)
W2＝在NANA的基线处的峰宽(分钟)
分辨率值必须
理论塔板数可以使用下面等式进行计算：
N＝16(T2/W2)2
其中：
N＝理论塔板数
T2＝N-乙酰神经氨酸的保留时间(分钟)
W2＝N-乙酰神经氨酸的在基线线处的峰宽(分钟)
理论塔板数必须为2000。CTLA4A29YL104E-Ig水解概况层析谱应类似于图49。
样品通过反相HPLC(RP-HPLC)以下述顺序进行分析：首先注射NANA和NGNA标准，随后注射样品，需要时一式两份(例如，CTLA4A29YL104E-Ig等)。样品分析后，柱用流动相B以0.5mL/分钟洗涤20分钟。需要时，柱可以进行反转。
唾液酸(NANA或NGNA)与蛋白质的摩尔比(MR)的测定
唾液酸与蛋白质的摩尔比可以通过Millennium或Empower软件进行计算。
稀释因子：
其中，
V蛋白质＝添加的蛋白质贮存液的体积(μl)，
V水＝添加的水的体积(μl)
蛋白质工作溶液(用于水解的蛋白质)浓度(μM)：
其中，
C蛋白质＝蛋白质工作溶液的浓度(μM)，
CA280＝蛋白质贮存液的A280浓度(mg/ml)，
MWCTLA4A29YL104E-Ig＝CTLA4A29YL104E-Ig的分子量，91232Da。
蛋白质工作溶液中的唾液酸浓度(μM)：
其中，
C未知＝未知样品中的唾液酸(NANA或NGNA)浓度
Cstd＝标准中的唾液酸(NANA或NGNA)浓度(μM)
Au＝未知样品中的唾液酸(NANA或NGNA)峰面积
Astd＝标准中的唾液酸(NANA或NGNA)峰面积
唾液酸(NANA或NGNA)与蛋白质的摩尔比(M.R.)：
唾液酸与蛋白质的总摩尔比(TSA)的计算：
TSA＝NANA摩尔比+NGNA摩尔比
关于2个一起进行的NANA标准的面积计数的相对标准差应<10％。关于2个一起进行的NGNA标准的面积计数的相对标准差应<10％。关于2个独立水解产物的面积计数的相对标准差应<10％。
在一个实施方案中，CTLA4A29YL104E-Ig中唾液酸的平均摩尔比必须在正下方表中指定的范围内。
CTLA4A29YL104E-Ig材料的摩尔比范围
单糖 范围
NANA 5.0－10.0
NGNA <1.5
关于2种样品制剂的参考材料和样品中唾液酸的摩尔比的％偏差必须≤15％、≤20％、≤25％、≤30％或≤35％。
实施例40：关于CTLA4 A29YL104E -Ig的体外基于细胞的生物测定
T细胞需要2种信号用于活化和后续增殖。第一种信号由抗原肽与TCR-CD3复合物的相互作用提供。第二种共刺激信号伴随T细胞上的CD28和抗原呈递细胞上的B7蛋白质之间的相互作用而发生。这2种信号接受后，T细胞分泌细胞因子白细胞介素2(IL-2)。IL-2的释放导致细胞活化和增殖。可溶性、免疫抑制化合物CTLA4A29YL104E-Ig也与抗原呈递细胞上的B7蛋白质结合，从而阻断与CD28的功能相互作用且阻止IL-2产生所需的共刺激信号。
在这种方法中，用在IL-2启动子控制下的萤光素酶基因转染的Jurkat T细胞在抗CD3的存在下以Daudi B细胞共刺激。共刺激活化IL-2启动子，这依次产生萤光素酶蛋白质。所得到的发光信号使用萤光素酶测定系统进行测量。在这种系统中，CTLA4A29YL104E-Ig产生萤光素酶活性中剂量依赖性的减少。
这种方法检查CTLA4A29YL104E-Ig对IL-2产生所需的共刺激信号的作用。可溶性CTLA4A29YL104E-Ig的存在阻止T细胞和抗原呈递细胞之间的信号传导。如果没有这种信号，那么不产生IL-2，从而阻止T细胞的克隆扩增。具有萤光素酶基因的载体使用IL-2启动子产生。Jurkat T细胞随后用这种报道载体进行转染。选择阳性克隆Jurkat.CA且用于该方法中。
这种生物测定涉及用抗CD3和B细胞(Daudi)刺激转染的T细胞(Jurkat.CA)。由B细胞提供的共刺激受CTLA4A29YL104E-Ig添加的抑制。将Jurkat.CA和Daudi细胞接种到96孔、白色、不透明、平底板的孔内，且在不同浓度的CTLA4A29YL104E-Ig的存在下用抗CD3进行刺激。于37℃温育16－20小时后，孔就萤光素酶活性进行测定。共刺激经由CTLA4A29YL104E-Ig的抑制作为萤光素酶活性中剂量依赖性减少可见。
试剂：Daudi细胞培养基(溶于RPMI 1640的10％胎牛血清，1％MEM丙酮酸钠)；Jurkat.CA细胞培养基(溶于RPMI 1640的10％小牛血清，1％MEM丙酮酸钠，400μg/mL遗传霉素)；生物测定培养基(溶于Daudi细胞培养基的0.2μg/mL抗CD3抗体和1％青霉素-链霉素溶液)；来自测定系统的Bright-Glo萤光素酶溶液(Promega，目录号E2620)。
仪器配置：Nikon，Diaphot 200倒置显微镜；Packard TopCount NXT发光计；TecanGenesis液体处理器；Coulter Vi-Cell细胞计数器；Zymark RapidPlate-96。
程序见图92。
工作溶液的制备：溶于生物测定培养基中的3mL CTLA4A29YL104E-Ig溶液(5000ng/mL)
Daudi细胞培养基。将300mL RPMI 1640加入1L Corning过滤器单元中。随后添加100mL胎牛血清和10mL MEM丙酮酸钠。添加足够的RPMI 1640以获得1L。过滤且贮藏于4℃最多1个月。
Jurkat.CA细胞培养基。将300mL RPMI 1640加入1L Corning过滤器单元中。随后添加100mL小牛血清、10mL MEM丙酮酸钠和50mg/mL的8mL遗传霉素(终浓度为400μg/mL)。添加足够的RPMI 1640以获得1L。过滤且贮藏于4℃最多1个月。
生物测定培养基。将100mL Daudi细胞培养基(2.1)加入100mL培养基瓶中。随后加入抗CD3抗体至0.2μg/mL的浓度和1mL青霉素-链霉素溶液(1.11)。通过倒转轻轻混合且贮藏于室温不超过8小时。
Bright-Glo萤光素酶溶液。如系统(1.21)中所述制备溶液，通过将测定缓冲液加入萤光素酶底物中且通过倒转混合。该试剂应在2小时内使用或贮藏于-20℃且避光保护最多4周。
细胞系维持。对于Jurkat.CA和Daudi细胞系通过用细胞计数器计数来测定细胞数目/mL。细胞应为1x105－1.5x106细胞/mL。将12x106Jurkat.CA细胞和12x106Daudi细胞组合在无菌离心管中。使细胞在～125xg下于室温离心10分钟。通过用血清学移液管轻轻反复移液使细胞充分重悬浮于9mL Daudi细胞培养基(2.1)中，直至看不到细胞团块，以产生2.7x106细胞/mL的浓度。通过在细胞计数器上计数细胞验证细胞浓度。将重悬浮的细胞以75mL/孔(200,000细胞/孔)接种到96孔板的孔内(1.3)。在37℃、5％CO2和85％湿度的培养箱设定点时温育板，同时制备标准、质量对照样品。制备标称浓度的CTLA4A29YL104E-Ig用于标准、质量对照以及样品1和2。在生物测定培养基(2.3)中以5000ng/mL制备3mLCTLA4A29YL104E-Ig材料工作溶液用于在标准曲线中使用。在生物测定培养基(2.3)中以5000ng/mL制备3mLCTLA4A29YL104E-Ig材料工作溶液用于在质量对照曲线中使用。在生物测定培养基(2.3)中以5000ng/mL制备各3mL的2种CTLA4A29YL104E-Ig样品工作溶液用于在样品曲线中使用。(关于CTLA4A29YL104E-Ig样品的近似浓度可以用于制备8点曲线，且当测定的浓度可用时，相对功效值可以如5.5中所述进行校正)
如下表55中所示，在5000、200、100、50、25、10、5和0.1ng/mL CTLA4A29YL104E-Ig的浓度时制备关于标准、质量对照和样品的8点曲线，在2倍稀释到板内后在测定中的终浓度为2500、100、50、25、12.5、5、2.5和0.05ng/mL。
表55.用于产生标准曲线的稀度。
可以使用2种板图。随机板图需要使用液体处理器用于设置。有序板图具有邻近的一式三份，且关于检测物品的每个曲线点以顺次有序的设计添加。对于随机板图，如下文的板图中所示，将75μL每种溶液(4.8)加入包含细胞(4.5)的板的合适孔内。对于有序板图，如下文的板图中所示，将75μL每种溶液(4.8)加入包含细胞(4.5)的2块板的合适孔内。
用TopSeal-A(1.22)密封板。确保密封物紧紧在适当位置上。不应有空气间隙。在37℃、5％CO2和85％湿度的培养箱设定点时使板温育16－20小时。使板和Bright-Glo萤光素酶溶液(2.4)平衡至仪器温度。向每个孔中同时添加150μL Bright-Glo萤光素酶溶液且混合。板紧在混合后置于TopCount NXT中以在黑暗中平衡10分钟。在TopCount NXT中使用1秒整合/孔或对使用的具体类型的发光计适当地测量发光信号。记录来自TopCount NXT的输出信号。当使用有序板图时，将记录2块板。第1块板(直立的)将以在上方左手角落中的孔A1记录。第二块平板(倒置的)将以在下方右手角落中的孔A1记录。
生物测定随机板图设置：
Stnd：在孔中2500－0.05ng/mL终浓度的标准
QC：在孔中2500－0.05ng/mL终浓度的质量对照
Smp1，Smp2：在孔中2500－0.05ng/mL终浓度的样品1－2
生物测定有序板图设置：
Stnd：在孔中2500－0.05ng/mL终浓度的标准
QC：在孔中2500－0.05ng/mL终浓度的质量对照
Smp1，Smp2：在孔中2500－0.05ng/mL终浓度的样品1－2。
96孔板的每个孔加入200,000细胞且在37℃、5％CO2和85％湿度时进行温育。将12x106Jurkat.CA细胞和12x106Daudi细胞组合在无菌离心管中。使细胞在～125xg下于室温离心10分钟，且通过用血清学移液管轻轻反复移液使细胞充分重悬浮于9mL Daudi细胞培养基中，直至看不到细胞团块，以产生2.7x106细胞/mL的浓度。将来自表55的75μL每种溶液加入包含细胞的板的合适孔中。板随后用TopSeal-A进行密封，且在37℃、5％CO2和85％湿度时温育16－20小时。板和Bright-Glo萤光素酶溶液平衡至仪器温度后，向每个孔中同时添加150μL Bright-Glo萤光素酶溶液且混合。随后板紧在混合后置于TopCount NXT中用于在黑暗中平衡10分钟。随后在TopCount NXT中使用1秒整合/孔或对使用的具体类型的发光计适当地测量发光信号。
记录来自TopCount NXT的输出，读取到标准分析程序内，且数据通过取其对数(底10)进行转化。如下面等式中所示，来自每个物品的转化数据对4参数对数模型进行拟合：
等式1：
其中：
A是曲线的顶部坪(pleteau)，D是曲线的底部坪，B是斜率因子，且C是产生等于A和D的平均值的作用的浓度。
可以对于每个物品计算R2统计量和缺乏拟合F检验。还可以计算测试物品相对于标准材料的最小值、最大值和斜率的比率。此外，还可以计算关于比率的置信区间。
每个物品的相对效价通过使单一等式对与来自参考物品的数据组合的来自目的物品的数据拟合进行测定。
其中
A、B和D参数是参考和测试物品共有的，且CR是参考参数，CA是测试物品参数，且比CR/CA是相对效价。上标I是指示变量。如果数据来自目的物品，那么它设为等于1，且如果数据来自标准材料，那么它为0。
将每个测试物品的相对效价转变为百分比等级，且相对效价作为来自程序的输出而给出。
用近似浓度获得的相对效价值的调整：由于样品接受和获得精确的蛋白质浓度之间的时间延迟，样品可以在测定中以近似浓度进行测试，并且当精确浓度被测定时调整结果。这种调整使用下面等式2来进行，其中在测定中测定的相对效价乘以用于设置测定的CTLA4A29YL104E-Ig浓度与测定的CTLA4A29YL104E-Ig样品浓度的比。
等式2：
例子：
样品在测定中以25mg/mL的蛋白质浓度进行测试。
测定的相对效价是105％。
测定的CTLA4A29YL104E-Ig浓度测定为25.5mg/mL
可报告的相对效价＝(105*25)/25.5＝103％。
标准材料：关于输出的标准的EC50值应为5－35ng/mL。2500ng/mL和0.05ng/mL浓度标准(范围)之间的差异应为≥40,000计数/秒(CPS)。关于参考的R平方值应大于0.95。
表9中的测试物品相对效价值必须为参考标准的25－175％，这是测定的范围。如果相对效价值在这个范围外，那么样品必须进行稀释或浓缩以落在这个范围内，且样品进行再次分析。
Daudi B细胞系：
来源：Daudi细胞得自ATCC。产生包含64小瓶的主库。工作库由主库小瓶4次传代后产生。(注：第0代视为解冻，且随后在工作库产生前进行另外3次传代)。
培养基：Daudi细胞在补加有10％胎牛血清和1％丙酮酸钠的RPMI 1640培养基(包含HEPES和L-谷氨酰胺)中生长。
培养箱条件：细胞在37℃、5％CO2和70－90％湿度时维持在通风的T瓶中。
解冻规程：小瓶细胞从液氮冷冻机中取出且在37℃水浴中进行解冻。使内容物与10mL培养基混合。细胞进行计数且随后通过在125xg下离心10分钟进行收集。离心后。去除上清液且使细胞以3x105活细胞/mL悬浮于新鲜培养基中。细胞在这个点时定义为第0代。
生长性质：该细胞系悬浮生长。
传代培养：培养物通过每周传代2次进行维持，其中在传代之间不超过5天。细胞在0.5x105－2x105活细胞/mL在具有新鲜培养基的通风的T瓶中进行传代。细胞不应达到超过1.5x106细胞/mL的密度。如通过锥虫蓝染色评估的，细胞应超过80％存活。日期和传代数应在传代后在T瓶上进行标记。
倍增时间：倍增时间为18－26小时。
传代限制：来自工作库的细胞在用于生物测定前应传代3次，即它们应在第3代或更高。细胞应仅在培养中维持20代。新工作小瓶应在那时进行解冻。
冷冻规程：细胞以5－10x106细胞/mL冷冻于冷冻小瓶中。深低温保护剂培养基通过用5％(v/v)DMSO补加完全细胞培养基进行制备。细胞以1℃/分钟的速率进行冷冻直至它们达到液氮温度(～190℃)。
Jurkat.CA T细胞系：
来源：Jurkat T细胞用编码CTLA4-Ig分子的质粒进行转染。工作库由主库小瓶3次传代后产生。(注：第0代视为解冻，且随后在工作库产生前进行另外2次传代)。
培养基：Jurkat.CA细胞在补加有10％小牛血清和1％丙酮酸钠、补加有终浓度400μg/mL的遗传霉素(G418硫酸盐)的RPMI 1640培养基(包含HEPES和L-谷氨酰胺)中生长。
培养箱条件：细胞在37℃、5％CO2和70－90％湿度时维持在通风的T瓶中。
解冻规程：小瓶细胞从液氮冷冻机中取出且在37℃水浴中进行解冻。使内容物与10mL培养基混合。细胞进行计数且随后通过在125xg下离心10分钟进行收集。离心后。去除上清液且使细胞以3x105活细胞/mL悬浮于新鲜培养基中。细胞在这个点时定义为第0代。
生长性质：该细胞系悬浮生长。
传代培养：培养物通过每周传代2次进行维持，其中在传代之间不超过5天。细胞在0.5x105－2x105活细胞/mL在具有新鲜培养基的通风的T瓶中进行传代。细胞不应达到超过1.5x106细胞/mL的密度。如通过锥虫蓝染色评估的，细胞应超过80％存活。日期和传代数应在传代后在T瓶上进行标记。
倍增时间：倍增时间为18－26小时。
传代限制：来自工作库的细胞在用于生物测定前应传代3次，即它们应在第3代或更高。细胞应仅在培养中维持20代。新工作小瓶应在那时进行解冻。
冷冻规程：细胞以5－10x106细胞/mL冷冻于冷冻小瓶中。深低温保护剂培养基通过用5％(v/v)DMSO补加完全细胞培养基进行制备。细胞以1℃/分钟的速率进行冷冻直至它们达到液氮温度(～190℃)。
实施例41：经由表面等离子体共振(BIAcore)测定CTLA4 A29YL104E -Ig与B7.1-Ig受体 的生物特异性结合
CTLA4A29YL104E-Ig样品与B7.1Ig受体的相对结合通过表面等离子体共振使用BIAcore仪器进行测量。在这种测定中，CTLA4A29YL104E-Ig与衍生自APC细胞膜蛋白质B7.1的B7.1Ig免疫球蛋白融合蛋白结合。B7.1Ig受体以高密度固定化在活化的传感器芯片表面上后，CTLA4A29YL104E-Ig材料、质量对照和样品进行稀释以产生结合传感图。CTLA4A29YL104E-Ig与固定化的B7.1Ig表面的起始结合速率(斜率)/结合的共振单位(RU)在质量转移(扩散)限制条件下在这种高密度B7.1Ig表面上进行测量。以共振单位/秒(RU's)表示的起始结合速率与生物活性浓度直接相关。样品的结合速率使用参考标准曲线计算成活性浓度，在所述参考标准曲线中CTLA4A29YL104E-Ig材料的结合速率针对浓度进行绘图。最终结果由样品相对于CTLA4A29YL104E-Ig材料的百分比结合表示或表示为浓度。
试剂：经鉴定的胺偶联试剂盒BIA(Amine Coupling Kit BIA Certified)(试剂盒包含各115mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、750mg N-乙基-N'-(3-二甲基)(EDC)和乙醇胺的1个小瓶)；再生缓冲液(10mM柠檬酸钠，100mM NaCl，pH 4.0)；
仪器配置：具有PC兼容计算机的BIAcore C仪器(BIAcore(目录号BR-1100-51))；BIAcore C控制软件版本1.0.2；BIAcore评估软件1.0；BIAcore 96孔微量滴定板U型BIAcore(目录号BR-1005-03)；BIAcore 96孔微量培养板箔板密封器(目录号BR-1005-78)。
方法概述见图93。
材料
试剂
经鉴定的胺偶联试剂盒BIA。该试剂盒包含各115mg N-羟基琥珀酰亚胺、750mg N-乙基-N'-(3-二甲基)和乙醇胺的1个小瓶。根据制造商说明书等分试样每种溶液且如下所述进行贮藏：
11.5mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的等分试样贮藏于-20℃。这种冷冻的等分试样自制备日期2个月失效。75mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的等分试样贮藏于-20℃。这种冷冻的等分试样自制备日期2个月失效。1.0M乙醇胺-HCl pH8.5的等分试样贮藏于-20℃。这种冷冻的等分试样自制备日期2个月失效。再生缓冲液(10mM柠檬酸钠，100mM NaCl，pH 4.0)。经分析称出1.5±0.1g柠檬酸钠和2.9±0.1g NaCl。加入500mL Milli-Q水中且用1N HCl将pH调整至4.0。用0.22μm滤器过滤溶液，随后以500mL等分试样到45mL/50mL圆锥形管内。当贮藏于2－8℃时，溶液自制备日期6个月失效。
仪器配置
传感器芯片的制备。将新传感器芯片CM5插入仪器的检测器单元上的盒口内。使用HBS-EP缓冲液如BIAcore C手册中所述起动系统。
用于方法功能的BIAcore C仪器的操作。BIAcore C仪器从兼容的PC计算机在Microsoft Windows环境下由BIAcore C控制软件进行控制。关于BIAcore C仪器的使用和维持，参考工作说明书，“Operation of BIAcore C Instrument”和“Calibration andMaintenance of BIAcore C Instrument”。
B7.1Ig的固定化方法
B7.1Ig的制备：包含B7.1Ig的小瓶于22.5±5℃进行解冻且稀释至固定化3000－9000RU的浓度，其中使用10mM乙酸盐pH 5.0缓冲液作为稀释剂。EDC、NHS和乙醇胺的小瓶各自如所述的由胺偶联试剂盒进行解冻。试剂和配体小瓶随后如由BIAcore程序指示的置于样品架中，并且根据BIAcore仪器说明书起始固定化。
CTLA4 A29YL104E -Ig标准曲线的制备
标准和样品(例如，CTLA4A29YL104E-Ig等)在室温下进行解冻。将用于产生标准曲线的标准稀释至标准曲线的靶浓度(250、500、1000、2000、4000和8000ng/mL)。
对于标准样品(例如CTLA4A29YL104E-Ig材料原液)的稀释及浓度为25mg/mL，人们可以进行下述稀释：
i.通过将20μL加入980μL HBS-EP中1/50稀释(500μg/mL)
ii.通过将30μL 500μg/mL加入908μL HBS-EP中稀释至16μg/mL
iii.以1/2步骤(500μL先前稀释物+500μL HBS-EP)向下连续稀释至250ng/mL
每个标准可以以一式两份的注射进行分析，这将导致2个斜率值。
质量对照样品。CTLA4A29YL104E-Ig的质量对照(QC)样品在HBS-EP缓冲液中以750、2500和5000ng/mL的3个靶浓度水平进行制备，且作为200μL等分试样在-80℃下冷冻于7mm塑料小瓶中。QC样品中的CTLA4A29YL104E-Ig浓度使用这种方法在3次独立的浓度分析实验中进行测定。在每次实验中，所有QC样品注射必须是可接受的，在±20％的标称浓度内检测。合格和冷冻的QC样品在制备后6个月失效。在实验当天，在室温下解冻3种QC样品的各1个小瓶。如方法向导中所述将QC样品置于相样品架位置中，并且用一式三份的注射分析每种QC。可替代地，QCs可以在分析当天新鲜制备。
CTLA4A29YL104E-Ig测试样品。CTLA4A29YL104E-Ig样品必须稀释至测定范围内的浓度(750－5000ng/mL)。具有已知近似CTLA4A29YL104E-Ig浓度的样品应稀释至2000ng/mL的靶浓度。样品在室温下解冻后，使用HBS-EP缓冲液将它们稀释至2000ng/mL的靶浓度。可以制备样品稀释物用于在BIAcore经鉴定的聚丙烯试管或96孔微量滴定板中分析。下述是关于CTLA4A29YL104E-Ig测试样品稀释的一个例子：
样品在室温下解冻后，CTLA4A29YL104E-Ig样品稀释至测定范围内的浓度(例如，750－5000ng/mL)。具有已知近似CTLA4A29YL104E-Ig浓度的样品应使用HBS-EP缓冲液在BIAcore经鉴定的聚丙烯试管或96孔微量滴定板中稀释至2000ng/mL的靶浓度。
下述是关于CTLA4A29YL104E-Ig样品(浓度＝25.0mg/mL)稀释的一个例子：
i.通过将20μL加入980μL HBS-EP中1/50稀释(500μg/mL)
ii.通过将30μL 500μg/mL加入720μL HBS-EP中1/25稀释(20μg/mL)
iii.通过将100μL 20μg/mL加入900μL HBS-EP中1/10稀释(2μg/mL)
使每种稀释物以中等速度涡旋2－4秒。样品一式三份地进行制备(来自样品贮存液的3种独立稀释物)，且每种稀释物用1次注射进行分析。样品一式三份地进行制备(来自样品贮存液的3种独立稀释物)，且每种稀释物用1次注射进行分析。
使用BIAcore C软件开始分析：打开BIAcore C控制软件且选择File->Project->Published->8164-2->Concentration Analysis Wizard，点击“Next”且选择适合于待执行的分析的公开模板，例如“CTLA4A29YL104E-Ig Sample Concentration Analysis.blw”。输入关于计划的分析的最大样品数目。这个样品数目包括重复，因此例如为了分析一式三份的8份样品，应输入数目24。选择在其上B7.1Ig配体固定化的流动池(1－4)。点击“Next”且输入样品的ID's、稀释因子和重复数目。点击“Next”且检查小瓶位置。在这个点上小瓶的位置可以移至所需定位。点击“Next”且在“Preparation for Analysis”屏幕上确认关于测定的设置和选择。点击“Next”以向下滚动。将标准、QC's、再生溶液和测试样品置于合适的位置中。点击“Start”以开始分析。
数据评估。开始BIAcore C软件且打开产生的BIAcore文件***.blr。随后从“View”菜单中选择“Wizard Results”以评估数据。
关于B7.1Ig表面的示例性值
固定化在活化流动池上的B7.1Ig的质量表示为RU’s(共振单位)。对于最佳的测定性能，表面质量应为3000－9000RU’s。如果表面质量不符合这个示例性值，那么可以进行活化时间(EDC/NHS注射)或B7.1Ig浓度的调整且可以固定化另一个流动池。
关于基线漂移的示例性值
每次运行的基线漂移计算为每个循环之间的基线(“绝对应答值”) 相对于配体的固定化表面质量的百分比变化。运行的任何2个循环之间的最大百分比变化必须≤5.0％。例如：如果在循环20时的基线＝13500RU，在循环23时的基线＝13650RU，且B7.1Ig表面密度＝6000RU，那么基线漂移＝(13650-13500)/6000x100＝2.5％。
关于标准的示例性值
示例性值应用于在500ng/mL时或超过500ng/mL的标准曲线浓度。用于测定标准曲线的每个标准浓度时的每个斜率值上的值的变异系数(％CV)必须在±10％内。在每个标准浓度时计算的平均浓度值(ng/mL)必须在靶(标称)值的15％内。计算的浓度和靶(标称浓度)之间的差异可以除以靶(标称)浓度且乘以100。例如，在标准500ng/mL时，BIAcore C计算的浓度为510ng/mL。％偏差将如下计算：(510ng/mL–500ng/mL)/500ng/mL x 100％＝2.0％。
关于QC样品的示例性值：关于每个QC样品靶浓度的一式三份计算的浓度值的％CV必须在±10％内。对于9次QC测定中的至少7次，QC样品结果必须在其分别靶值的±15％内。在2500ng/mL水平时第一次和最后一次QC注射之间的斜率值中的差异必须在±5.0％内。例如，第一个斜率值为10.366RU/s，且最后一个斜率值为10.230RU/s，百分比差异将如下：
(10.366-10.230)/10.366x100％＝1.3％
关于测试样品的示例性值
对于每个测试样品靶浓度获得的一式三份观察的％CV必须在±20％内。关于样品的斜率值必须在该方法的范围内：在质量对照样品1时的平均斜率≤样品的平均斜率≤质量对照样品3的平均斜率。
样品结果计算
为了测定测试样品相对于CTLA4A29YL104E-Ig材料的百分比结合，关于每个测试样品的浓度值以ng/mL由标准曲线进行计算。BIAcore仪器配置的结果向导基于对于每种样品输入的稀释因子以mg/mL计算未稀释样品中的CTLA4A29YL104E-Ig浓度。
测定百分比结合：对于测试的每个样品计算的平均浓度值可以乘以100，且除以如通过在280nm处测量的吸光度(A280)测定的样品报告的蛋白质浓度。值随后可以作为相对于标准样品的百分比结合报告至最接近的整数。例如，样品通过12,500的稀释因子进行稀释(约25mg/mL的样品蛋白质浓度)。由样品一式三份的注射计算的平均CTLA4A29YL104E-Ig浓度为25.3mg/mL。关于样品的A280为24.2mg/mL。相对于标准样品计算的百分比结合可以如下：25.3mg/mL/24.2mg/mL x 100％＝104.545％。
CTLA4A29YL104E-Ig固定化向导模板
固定化注射参数
固定化报告点
实施例42：CTLA4-Ig的碳水化合物分析数据和药物代谢动力学数据之间的关联
CTLA4-Ig上的碳水化合物结构在CTLA4-Ig治疗组合物的药物代谢动力学(PK)中起重要作用。几种分析法已开发用于表征这些碳水化合物结构。2种分析参数与清除率良好关联：唾液酸(NANA)与CTLA4-Ig蛋白质比以及来自碳水化合物概况的百分比结构域III和IV。第三种参数(来自单糖分析的半乳糖与甘露糖比)看起来也良好关联。例如，关于这些参数的详细说明可以是：
NANA：CTLA4-Ig蛋白质比≥8.0
碳水化合物概况结构域III和IV≥25％(方法1)
半乳糖：甘露糖比≥0.65
CTLA4-Ig发酵方法中的重要步骤可以是收获参数的选择，所述收获参数将使包含本文指定特征的最终产物的得率(滴度)达到最大(参见表6)。一个参数(NANA：蛋白质比)足够快速和精确以用作收获参数之一。约8.0的NANA与CTLA4-Ig蛋白质的靶摩尔比可以确保大多数收获物将具有>7.0的NANA比。在纯化期间的增强可以随后产生具有NANA比>9.0的CTLA4-Ig分子。
CTLA4-Ig是具有几个N联和O联糖基化位点的糖蛋白。N联碳水化合物结构一般是双或三触角的，且如果充分唾液酸化，那么以碳水化合物NANA-Gal-GlcNAc结束。大多数分子是仅部分唾液酸化的，且包含以Gal或GlcNAc结束的一些碳水化合物链。末端唾液酸(NANA)残基的不存在是导致来自血流增加的暴露率的因子。在这个例子中，呈现的数据指出末端半乳糖还提供不受快速清除的一些保护。
用于评估糖基化的主要参数是NANA：CTLA4-Ig蛋白质摩尔比。猴PK研究已显示可接受的清除可以使用具有6.9的NANA比的CTLA4-Ig分子达到。在猴中测试的第一批方法YCTLA4-Ig材料(得自Y方法的CTLA4-Ig组合物)具有7.1的NANA比。令人惊讶的是，发现它以具有6.9的NANA比的CTLA4-Ig分子的2倍速度清除。2种样品的单糖分析的综述指出X方法材料具有比CD-CHO方法材料明显更多的半乳糖。开发了在进料中包括半乳糖的方法(CD-CHO1)。由这种方法产生的CTLA4-Ig具有比Y方法材料更高水平的半乳糖和唾液酸。对于来自CD-CHO1方法的材料的分析和PK数据在下文进行讨论且与方法Y和方法X材料进行比较。
分析法
碳水化合物概况分析由完整碳水化合物结构的酶促去除及其通过阴离子交换层析分离组成。碳水化合物峰在很大程度上基于每种结构中的唾液酸残基数目分成4个或5个簇(“结构域”)。结构域I主要是无唾液酸化的，结构域II是单唾液酸化的，结构域III是双唾液酸化的，结构域IV是三唾液酸化的，且结构域V是四唾液酸化的。每个峰或结构域下的面积可以进行测定且报告为所有峰下的总面积百分比。
清除率通过下述进行测定：用10mg/kg CTLA4-Ig一式三份地注射猴，随后跟踪经过28天时间段血清浓度中的减少。清除率与测量的“曲线下面积”或AUC有关。AUC与清除有关，更高的清除率与更小的AUC有关，而更低的清除率与更大的AUC值有关。更高的值表示CTLA4-Ig更慢的清除。
图50描绘了在哺乳动物蛋白质中发现的许多N联碳水化合物结构中的几种。所有链共享包含2个GlcNAc和3个甘露糖残基的共同核心结构。从这个核心中伸展出由下述3种结构之一组成的2－4条链：-GlcNAc-Gal-NANA、-GlcNAc-Gal或–GlcNAc(图50，结构(1)、(2)和(3))。假定末端唾液酸(NANA)负责减少蛋白质从血流中的清除。尽管NANA比保持相同，但CTLA4-Ig的清除率在猴PK研究(表56)中加倍，这是令人惊讶的(表56－在图51－52中分别地样品CTLA4-Ig S1和CTLA4-Ig(-)Gal)。在不同培养基中制备的样品之间观察到的1种差异是半乳糖与蛋白质摩尔比，这在由方法X制备的样品中明显高于方法Y(CTLA4-Ig)。这暗示清除率主要由末端GlcNAc残基决定，并且末端半乳糖可能提供一些保护。为了增加CTLA4-Ig的半乳糖基化，将半乳糖加入用于Y方法的进料中。新方法(CD-CHO1；图51－52中的CTLA4-Ig S2)显著增加生物反应器中的CTLA4-Ig的半乳糖和NANA摩尔比。
进一步的猴PK研究已得到进行。这些已包括由3种不同方法生产的CTLA4-Ig产物(方法X、方法Y和CD-CHO1方法；在图51－52中分别地CTLA4-Ig S1、CTLA4-Ig(-)Gal和CTLA4-Ig S2)。此外，具有非常低的NANA比的CTLA4-Ig(从纯化程序的洗涤步骤中回收；参见图62)已进行测试。来自迄今为止测试的所有样品的分析和PK数据汇编在表56中。在最近的PK研究中(表56)，评估了由延长的方法Y发酵运行产生的CTLA4-Ig(CTLA4-Ig S3)。
表51显示关于4种研究中的所有样品的NANA比和猴PK AUC值之间的关联。由Y方法(参见图51中的CTLA4-Ig(-)Gal)和CD-CHO1方法(图51中的CTLA4-Ig S2)制备的样品显示这些参数之间的强关联，从而指出NANA比对CTLA4Ig清除率具有显著影响。关于这些点的趋势线的分析指出在NANA＝9时，由Y(CTLA4-Ig(-)Gal)或CD-CHO1(CTLA4-Ig S2)方法制备的CTLA4-Ig将以与方法X材料CTLA4-Ig S1)大约相同的速率清除。使NANA比减少至8使猴PK中的AUC减少约25％，而使该比率增加至10使AUC增加约25％。尽管在Y(CTLA4-Ig(-)Gal)和CD-CHO1(CTLA4-Ig S2)方法背景下在NANA和AUC之间存在强关联，但记住关于X材料(CTLA4-Ig S1)的NANA＝7具有与NANA比为9的CD-CHO1材料(CTLA4-Ig S2)相同的清除率是重要的。因此，NANA比并非单独负责决定CTLA4-Ig的清除率。
表56.CTLA4-Ig的碳水化合物评估。M-1指出CTLA4-Ig材料使用方法1进行分析，M-2指出CTLA4-Ig材料使用略微不同的方法2进行分析。“PA”指出材料是来自发酵液的A蛋白纯化的样品
进行另一项猴PK研究(表56)以比较由3种不同方法(方法X、方法Y和CD-CHO1方法)产生的CTLA4Ig的清除率。此外，具有非常低的NANA比的CTLA4-Ig(从纯化程序(PA)的洗涤步骤中回收)包括在该研究中。在50L或5000L生物反应器中由CD-CHO方法制备的CTLA4Ig具有接近X方法材料的NANA摩尔比，并且在PK研究中，两者都具有方法X值约一半的AUC值。由CD-CHO1方法产生的CTLA4Ig具有比方法X材料更高的NANA比(9.9对6.9)和高约30％的AUC值，从而指出较慢的清除率。弱唾液酸化和半乳糖基化的洗涤材料(NANA＝2.3)被极快地清除(AUC＝2337hr-μg/ml对方法X材料的15753)。
另一项猴PK研究(表56)比较在5,000L生物反应器中由CD-CHO1方法制备且在不同天数时收获的CTLA4Ig。在发酵运行过程中，NANA比一般在约第8天时达到最高点，随后逐步下降。来自2次运行，等分试样在第12、14和16天时取出，随后进行纯化。纯化后，NANA比为8.8－10.0。第12和14天样品(分别为NANA＝9.8和10.0)具有比方法X材料高20－30％的AUC值。第16天样品(NANA＝8.8)具有与方法X材料几乎相同的AUC值。
评估CTLA4-Ig的糖基化的另一个分析工具是碳水化合物概况。完整N联碳水化合物结构被酶促去除且通过阴离子交换HPLC进行分离。产生了分成4个或5个结构域的大量峰(参见图58－62)。结构域I和II主要是无唾液酸化和单唾液酸化的结构，而结构域III和IV和V主要是双和三和四唾液酸化的结构。
凭经验观察到对于所有样品包括方法X材料，结构域III和IV中的总体概况百分比与AUC良好关联(图52)。这些结构域中的大多数结构预期是充分唾液酸化和半乳糖基化的。使用来自M-1组的数据，约29％的结构域III和IV百分比应具有与方法X材料相同的清除率。来自方法2的结构域III和IV数据一般比由方法1产生的数据低约4％(21％对25％)。
此外，对于所有样品，还观察到结构域I和II中的总体概况百分比与AUC良好关联(图57)。这些结构域中的大多数结构预期主要是无唾液酸化和单唾液酸化的结构。图57显示与具有更高百分比的结构域I和II的那些样品相比较，清除率在具有更低百分比的结构域I和II的样品中更高。结构域I和II减少的半乳糖基化与结构域III 和IV中糖基化肽推测增加的存在关联。
尽管唾液酸与蛋白质摩尔比一般已用于预测CTLA4Ig的清除率，但不同发酵培养基已产生在猴PK研究中具有相同NANA比但不同清除率的分子。为了开发预测清除率的更佳方法，评估2组其他的分析数据(单糖分析和碳水化合物概况)且与猴PK数据进行比较。最有预测性的分析参数是CTLA4Ig的半乳糖基化程度。为了减少这种测定的分析变异性，半乳糖摩尔比对甘露糖摩尔比进行标准化。对于所有样品包括方法X材料，所得到的Gal：Man比与来自猴PK研究的AUC结果良好关联。这个结果与CTLA4Ig的清除率主要由分子上暴露的末端GlcNAc残基数目决定的模型一致。如果这种模型是正确的，那么半乳糖基化的程度应比唾液酸化更好地预测清除率。为了确保药物代谢动力学可比性(来自X方法的材料的AUC>75％)，对于纯化的大量CTLA4-Ig药品(BDS)推荐Gal：Man>0.65的半乳糖与甘露糖比的具体要求。
当仅分析由Y方法或CD-CHO1方法制备的材料时，NANA与蛋白质摩尔比可以精确地预测清除率。然而，这个关联不适用于由X方法制备的材料。为了与X方法材料可比较，由Y方法或CD-CHO1方法制备的CTLA4-Ig必须具有高2个单位的NANA比(关于CD-CHO1的NANA＝9与关于X方法材料的NANA＝7可比较)。因为唾液酸测定是精确的并且具有快速的周转时间，所以它作为进行中分析工具以监控发酵运行期间CTLA4Ig的品质是有用的。
为了维持可比较的药物代谢动力学(参考的AUC>75％)，对于纯化的BDS推荐NANA>8的具体要求。这个值还表示用于收获发酵运行的合理靶。因为纯化方法可以使唾液酸比增加至少2个单位，所以将收获靶设为NANA＝8将确保至少NANA＝7的实际收获值。纯化方法可以使这个值增加到至少NANA＝9，这与方法X材料可比较且远超过上文推荐的BDS最低具体要求。
当结构域III和IV下的百分比面积与AUC进行比较时，对于方法X材料和方法Y材料，碳水化合物概况同样良好地预测猴PK结果。结构域III和IV主要由充分唾液酸化和半乳糖基化的碳水化合物结构组成。
可以进一步呈现表56中的数据，以便显示AUC值、NANA值、Gal值以及结构域II和IV的AUC总和的总百分比之间的关联。参见下文：
上表显示在结构域III(和IV)的总和与组合物的PK结果之间存在关联。结构域III和IV和V的AUC直接涉及NANA和Gal与CTLA4-Ig蛋白质摩尔的摩尔比。因此，本发明提供了组合物，其特征在于其碳水化合物概况包含18－约37AUC％的结构域III和IV的总和、或结构域III、IV和V的总和。在一个实施方案中，结构域II、IV和V的总和为约19－约36、约20－约35、约21－约34、约22－约33、约23－约32、约24－约31、约25－约30、约26－约29、约27－约28AUC％。在一个实施方案中，本发明提供了CTLA4-Ig组合物，其特征在于结构域III具有总共19±4的AUC％；且结构域IV具有总共7±4的AUC％。
实施例43：CTLA4-Ig的胰蛋白酶肽作图
衍生自转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的CTLA4-Ig是具有约92500道尔顿的分子量的糖蛋白。肽作图是用于测定蛋白质的一级结构特性的高度灵敏的方法且在检测翻译后修饰中有用。该蛋白质使用胍-HCl进行变性、使用DTT和IAA进行还原和烷基化。该蛋白质使用NAP-5柱进行脱盐且消化混合物通过反相(C18)层析进行分析。峰检测通过在215nm处的UV吸光度来完成。
试剂：流动相A溶液(溶于水的0.02％三氟乙酸(TFA)(v/v))；流动相B溶液(溶于95％ACN(乙腈)和5％水的0.02％TFA(v/v))；烷化剂(200mM碘乙酰胺(IAA))；稀释缓冲液(100mM Tris，25mM NaCl，pH 8.0)；变性缓冲液(8M胍，50mM TRIS，pH 8.0)；消化缓冲液(50mM TRIS，10mM CaCl2，pH 8.0)；还原剂(100mM DTT)。
仪器配置：(可以使用等价仪器配置)NAP-5柱(Amersham，目录#17-0853-02)；HPLC柱加热器；具有柱加热器和UV检测器的Water’s Alliance HPLC系统。
还原和烷化：样品(例如，CTLA4A29YL104E-Ig、标准等)通过添加水至100μL的最终体积(1mg)稀释至10mg/ml。将560μl变性缓冲液和35μL还原剂(100mM DTT)加入100μl样品中，混合，且在微量离心机中向下旋转3秒。样品随后于50℃温育20分钟±2分钟。随后将35μL烷化剂(200mM IAA)加入每种样品中，且再次使样品混合，且在微量离心机中向下旋转3秒。样品随后于50℃在黑暗中温育20分钟±2分钟。NAP-5柱通过倾注3柱体积(约7－8mL)消化缓冲液进行平衡后，将500μl还原且烷化的混合物倾注到NAP-5柱上，从而允许液体经过柱排出。随后经由用1mL消化缓冲液从柱中洗脱样品从NAP-5柱收集样品。
消化：样品用20μL胰蛋白酶(0.5μg/μL)在38℃水浴中消化4小时(±0.5小时)。消化完成后。样品用2.5μL TFA进行酸化。随后将样品置于自动进样器小瓶内用于后续分析。
仪器方法：仪器方法显示于下文：
在第一次注射前，柱用100％流动相A缓冲液平衡25分钟。UV吸光度在215nm处进行监控，同时柱温维持在37℃和自动进样器温度维持在4℃。流动相A缓冲液空白在第一个系统适合性标准前运行，其后随后为每种样品的单次50μL注射。参考材料注射应每6次样品注射一起进行。对于CTLA4-Ig样品产生的肽图层析谱由图53描绘。起始和一起进行的参考材料层析谱之间关于峰T2、T3、T15和T19(图53和表57)的保留时间差异必须为±0.5分钟。
表57.用胰蛋白酶消化的CTLA4-Ig的理论预期片段
*包含N联碳水化合物**包含O联碳水化合物
理论塔板数：作为理论塔板数评估的柱功效可以根据下面等式使用保留时间和峰宽进行定量测量：
其中：
“w”是通过将相对直的侧面外推至基线测量的在基线处的峰宽，“t”是从注射时间到峰最大值的洗脱时间测量的峰的保留时间。
如果N<50000，那么使柱重新平衡。
分辨率：2个峰例如如图53中所示的峰T30和峰T12之间的分辨率(R)可以使用下面等式进行测定：
其中：
t1，t2＝分别为片段峰T30和峰T12的保留时间
w1，w2＝分别具有保留时间t1和t2的峰基线处的切线限定的峰宽。
如果R<1.5，那么柱应重新平衡，并且如果问题继续存在，那么柱应进行替换。
示例性值：关于测试物品和参考材料中的峰T3、T15和T19的相对峰面积之间的差异必须≤10.0％。峰的相对峰面积定义为作为峰T2的峰面积百分比表示的峰面积。测试物品和起始系统适合性参考的相对峰面积之间的差异如下文所示获得。相对峰面积(RSX)可以通过使用下式对于测试物品的层析谱中的峰T3、T15和T19各自进行计算：
RSX＝(AsX/AS2)*100
其中
RSX＝层析谱中峰X的相对峰面积
ASX＝样品中峰X的面积和
AS2＝样品中峰T2的面积。
类似地，相对峰面积(RRX)可以对于标准的层析谱中的峰T3、T15和T19各自进行计算。样品和标准(DX)中的相对峰面积之间的差异随后可以通过使用下式进行计算：
DX＝[(RSX-RRX)/(RRX)]*100。
如果样品中存在单个另外的峰，那么与峰T11相比较，关于那种峰的相对峰高可以通过使用下式进行测定：
相对峰高RT＝(HT/H11)*100其中
HT＝具有保留时间t分钟的峰高
H11＝峰T11的高度，层析谱中的最高峰。
在一个实施方案中，如果新峰的相对峰高≤5.0％，那么该概况视为与CTLA4-Ig标准的概况一致。如果新峰的相对峰高>5.0％，那么该概况视为与CTLA4-Ig标准材料的概况不一致。
百分比氧化数据通过使用RP-HPLC胰蛋白酶作图测定来获得，所述测定定量蛋白质中Met85至甲硫氨酸亚砜的面积百分比氧化。该方法中的百分比氧化通过测量RP-HPLC胰蛋白酶图中关于包含含有Met85的残基84－93的T6胰蛋白酶肽，和包含Met(O)85的相应氧化的胰蛋白酶肽T6ox的UV峰面积来获得。Met85至Met(O)85的面积百分比氧化与T6ox峰的面积百分比成比例：
百分比氧化＝100*AT6ox/(AT6ox+AT6)
其中，
AT6＝关于T6胰蛋白酶肽，(84－93)的峰面积。
AT6ox＝关于T6ox胰蛋白酶肽，Met(O)85(84－93)的峰面积。
百分比脱酰胺数据通过使用RP-HPLC胰蛋白酶作图测定来获得，所述测定定量测定中脱酰胺的面积百分比氧化，其通过测量RP-HPLC胰蛋白酶图中关于包含含有Asn294的残基281－302的T26胰蛋白酶肽，和包含isoAsp294的相应脱酰胺胰蛋白酶肽T26deam1的UV峰面积来获得。随后，Asn294至isoAsp294的面积百分比脱酰胺与T26deam1峰的面积百分比成比例：
其中，
AT26＝关于T26,(281－302)的峰面积
AT26deam1＝关于T26deam1，isoAsp294(281－302)的峰面积。
AT26deam2＝关于T26deam2，Asp299(281－302)的峰面积。
AT26deam3＝关于T26deam3，Asp294(281－302)的峰面积。
AT26deam4＝关于T26deam4，Asu294(281－302)的峰面积。
实施例44：通过具有电化学检测的高效阴离子交换层析的CTLA4-IgN联寡糖碳水 化合物概况分析
糖蛋白上存在的碳水化合物结构可以影响其功能和体内清除。因此监控糖蛋白的重组生产批次的碳水化合物的结构一致性是重要的。CTLA4-Ig是包含N联和O联(丝氨酸连接的)糖基化位点的重组蛋白。此处，监控CTLA4-Ig上存在的N联(天冬酰胺连接的)碳水化合物。在这种方法中，寡糖通过用PNGase F(肽：N-糖苷酶F)酶促消化进行切割，随后通过反相HPLC在2柱系统中进行分离，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分离，且通过电化学检测(整合的电流分析法)进行监控。产生的层析谱是N联碳水化合物概况，其中CTLA4-Ig样品的概况应类似于此种。
这种方法描述了测定从CTLA4-Ig样品中释放的N联寡糖的HPAEC寡糖概况的程序。该方法的目的是提供CTLA4-Ig药品N联寡糖的层析概况，这可以用于之间的比较分析。CTLA4-Ig上的糖基化包含N联寡糖。这些寡糖通过用PNGase F酶促水解经过22小时的过程得到释放。游离的寡糖使用利用电化学检测的高pH阴离子交换层析进行概况分析。药品的寡糖概况针对同时运行的参考材料的样品进行评估。结果报告为选择的结构域和峰与参考标准中的相同峰的百分比偏差。
％Diff 百分比差异
％RSD 百分比相对偏差
HPAEC 高pH阴离子交换层析
HPLC 高效液相层析
NaOAc 乙酸钠
NaOH 氢氧化钠
PNGaseF 肽：N-糖苷酶F
材料。除非另有说明，等价材料可以替代。
仪器配置和条件。除非另有说明，可以使用等价仪器配置。
仪器配置。
通过阴离子交换层析的寡糖概况的层析条件
Waters 2465设置
注：在进行注射前用最初流动相以分析流速使柱和检测器平衡约2小时，或直至基线稳定。
自动进样器温度设为：
4℃
注射体积 60μL
运行时间 100分钟
每个结构域中的占优势峰
的大约保留时间(RT；分
钟)(参见图1)；值可以
依赖于系统适合性(SS)标
准的RT而变
电极清洁(Waters 2465)。遵照检测器手册中的清洁说明。使用流动池试剂盒中提供的金刚石浆以磨光电极的表面。如果磨光不产生可接受的结果，那么以新流动池试剂盒替换电极。使用新隔离物(50μm)重新构建流动池。
试剂。注：根据部门程序标记且记录所有试剂制备。
用于HPAEC寡糖碳水化合物概况分析的流动相的制备
HPAEC洗脱剂1：500mM乙酸钠(NaOAc)。称量20.51±0.05g乙酸钠(无水)，加入包含400mL HPLC等级水的500mL量筒内。用HPLC等级水使体积达到500mL，并且使用塑料血清学移液管搅拌5分钟直至完全混合。通过0.2μm尼龙滤器过滤溶液。转移至1L洗脱剂瓶。将瓶松散地盖上盖子并且用氦喷射20分钟。盖紧盖子并且用氦使瓶加压。将溶液在氦下贮藏于室温最多3周。
HPAEC洗脱剂2：400mM氢氧化钠(NaOH)。使用1L量筒，测量960mL HPLC等级水且转移至干净的1L洗脱剂瓶。使用血清学塑料移液管，将40.0mL 10N NaOH直接加入洗脱剂瓶内，且通过回荡混合洗脱剂。将瓶松散地盖上盖子并且用氦喷射20分钟。盖紧盖子并且用氦使瓶加压。将溶液在氦下贮藏于室温最多3周。
HPAEC洗脱剂3：HPLC等级水。用约1LHPLC等级水装满1L洗脱剂瓶。将洗脱剂瓶置于系统上，松散地盖上盖子并且喷射约20分钟。盖紧盖子并且用氦使瓶加压。将溶液在氦下贮藏于室温最多3周。
50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5。叠氮化钠(NaN3)应小心进行处理以避免吸入(有毒)和与皮肤接触(刺激)。关于另外的要求咨询MSDS表。NaN3称量后，天平区应进行彻底清洁。
NaH2PO4·H2O 6.9g
NaN3 0.2g
H2O 1.0L最终体积
称出6.9g±0.1g NaH2PO4·H2O和0.2g NaN3，且溶解于在1L试剂瓶中的800mLHPLC等级H2O中，其中使用磁性搅拌棒连续混合。使用pH计，使用10M NaOH将溶液的pH调整至7.5。使用1L量筒使最终体积达到1.0L。溶液贮藏于室温最多6个月。溶于50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5的PNGase F酶工作溶液。
50mM磷酸钠缓冲液
0.02％叠氮化钠，pH＝7.5. 1.8mL
来自试剂盒的PNGase F，目录号P0704L 0.2mL
将1.8mL 50mM磷酸钠缓冲液，0.02％叠氮化钠，pH＝7.5移液到1.8mL深低温小瓶内。添加来自试剂盒的0.2mL PNGase F且充分混合。溶液贮藏于-20℃或更低最多6个月。溶液可以在冷冻前进行等分试样。
外部系统适合性标准。水苏糖贮存液(1.25mg/mL)。在称量纸上称量0.125g水苏糖。使用分析天枰且转移至100mL容量瓶。用HPLC等级水装满至标记且充分混合。以2mL部分等分试样到Nalgene冷冻小瓶内。溶液贮藏于-20℃或更低最多6个月。
水苏糖系统适合性标准(12.5μg/mL)。将1mL 1.25mg/mL原液移液到100mL容量瓶内。用HPLC等级水装满至标记且充分混合。以200μL部分等分试样到0.65mL微量离心管内。将管置于适当标记的贮藏盒中。系统适合性溶液贮藏于-20℃或更低最多6个月。
标准和样品制备
参考材料制备。向包含1mg冻干的RapiGest SF的小瓶中加入包含0.02％叠氮化钠，pH7.5的625μL 50mM磷酸钠缓冲液。注：对于样品组内的所有样品应使用包含RapiGestSF的缓冲液的单个库。几小瓶RapiGest SF可以进行重构且组合以提供足够体积。向0.65mLEppendorf管中加入120μL包含RapiGest SF的缓冲液。添加40μL参考材料(～50mg/mL)。RapiGest SF终浓度应为0.12％w/v。添加40μL PNGase F工作原液，充分混合，使样品向下旋转，且置于38±2℃22±2小时(水浴或Alliance自动进样器区室)。将样品移液到microcon YM-10离心滤器内，且在13,000g下离心30分钟。将200μL HPLC水置于滤器中，且通过在13,000g下离心另外30分钟冲洗到滤液内。使组合的滤液涡旋15秒，且使样品离心10秒。使用移液管将所得到的溶液(～380μL)转移至HPLC总回收自动进样器小瓶。
样品制备。向0.65mL Eppendorf管中加入120μL包含RapiGest SF的缓冲液。添加40μL蛋白质样品(这个体积应等于1－2mg CTLA4-Ig)。RapiGest SF终浓度应为0.12％w/v。添加40μL PNGase F工作原液，通过涡旋10秒充分混合。使样品向下旋转，且置于38±2℃22±2小时(水浴或Alliance自动进样器区室)。将样品移液到microcon YM-10离心滤器内，且在13,000g下离心30分钟。将200μL HPLC水置于滤器中，且通过在13,000g下离心另外30分钟冲洗到滤液内。使组合的滤液涡旋15秒，且使样品离心10秒。使用移液管将所得到的溶液(～380μL)转移至总回收HPLC自动进样器小瓶。
电化学检测器池稳定性：注射30μL外部水苏糖系统适合性标准(12.5μg/mL)。确保关于水苏糖的峰高≥800nA。确保不存在来自池的过量电噪声和基线平坦。如果水苏糖灵敏度或基线不可接受，那么检查缓冲液组成，清洁电极或替换电极。如果存在过量噪声，那么检查池以确保去除所有气泡。使池再次稳定化且再次注射水苏糖标准。如果问题继续存在，那么采取其他合适的动作或联系管理者。
理论塔板(N)。使用下式基于水苏糖峰测定理论塔板数(N)。这通过Empower数据分析系统来完成或还可以手工完成。
N＝16(t/W)2，
其中
t：在最大高度时从注射时间到峰洗脱时间测量的保留时间
w：通过侧面外推至基线的峰宽。
N必须≥6000。如果板计数小于6000，那么调整运行梯度或替换柱。
拖尾因子(T)。使用下式基于水苏糖峰测定柱拖尾因子(T)。这通过Empower数据分析系统来完成或还可以手工完成。
T＝(W0.05/2f)，
其中：
W0.05：5％高度(0.05h)时的峰宽。
f：从W0.05时的峰前面边缘到峰顶点的测量(宽度)。
T必须≤1.2。如果拖尾因子大于1.2，那么检查缓冲液组成，替换柱或清洁柱，并且再次注射系统适合性标准。
水苏糖系统适合性标准保留时间验证：保留时间是系统依赖性的。水苏糖系统适合性标准应显示出18.5±2.0分钟的保留时间。
CTLA4-Ig参考材料－观察来自在样品注射前注射的第一种一起进行的参考材料的碳水化合物概况。碳水化合物概况应类似于图68中所示的那种。绝对保留时间是系统依赖性的。确保结构域I中的第一个峰(峰1A)和结构域III中的主峰(峰3)之间的保留时间中的差异为22分钟至28分钟。如果峰的轮廓不象图68中获得的那种，那么采取合适的动作(例如，检查仪器功能、清洁柱、检查/替换缓冲液、替换柱)且再次评估。下述程序可以用于清洁柱：关掉池且用80％洗脱剂1、20％洗脱剂2将柱清洁5分钟，随后为50％洗脱剂1、50％洗脱剂2清洁10分钟。在初始条件下使柱和池(池打开)再次平衡，且再次评估。
注射顺序：
如下设置分离的寡糖的注射顺序：
水苏糖标准(30μL)
参考材料(60μL)
一种或多种样品(60μL)
参考材料(60μL)
推荐≤5种样品在一起进行的参考材料注射之间运行。
数据分析：处理层析谱。在Empower中处理关于参考材料和样品的层析谱。设定整合参数，从而使得峰轮廓和基线类似于图68中所示的那种，整合线可能需要手工安放。执行关于相对结构域面积和相对峰面积的计算(参见图68的简述和这个实施例结束时包括的表)。如果进行重复注射，那么测定关于参考材料和每种样品的这些参数的平均值。
对于参考材料，测定关于每次重复的结构域I、II、III、峰1A和1B就所有重复的平均值而言的相对偏差。
样品概况与参考材料概况的比较。
目测比较。测定样品和参考材料是否具有相同数目的结构域和主要峰。主要峰是图68描述中标记的那些峰(峰1A、1B、1C、1D、2、3和4)。相对定量比较。比较样品的相对面积(结构域I、II和III以及峰1A和1B；如果进行样品的重复注射，那么使用其平均值)与来自一起进行的参考材料注射的平均相对面积。测定来自平均参考材料值的这些面积的相对差异。
计算。％结构域面积(相对结构域面积)：计算关于参考材料和样品的概况的结构域的％结构域面积。关于结构域面积的模式参考图68。根据图68中的例子，通过使用下述信息和式计算结构域百分比比率(保留时间是系统依赖性的且反映图68中的结果：
结构域I：在大约保留时间18－24分钟(峰1A－1E)时的峰面积的总和
结构域II：来自26－38分钟的峰的总和
结构域III：来自39－50分钟的峰的总和
结构域IV：来自51－64分钟的峰的总和
结构域V：来自65－75分钟的峰的总和
注：关于结构域的保留时间窗将根据每日层析性能中的变化而变动。相应地调整时间。
对于结构域I－III，如果进行重复注射，那么也计算一起进行的参考材料注射以及样品中的平均值。
％峰面积(相对峰面积)。计算关于参考材料和样品的概况的峰1A、1B、1C和3的％峰面积。关于峰面积的模式参考图68；保留时间是系统依赖性的。通过使用下述信息和式计算峰百分比比率：
对于峰1A和1B中的每一个，如果进行重复注射，那么也计算一起进行的参考材料注射以及样品中的平均值。
来自参考材料平均值的百分比差异计算。使用下式以计算与参考材料相比较，样品的结构域I－III、峰1A和1B的平均相对面积中的百分比差异：
％Diff＝|RM-S|/RM x 100
其中：
RM＝关于参考材料的目的相对面积平均值
S＝关于样品的目的相对面积平均值
| |＝绝对值
结果：待报告的结果是关于结构域I、结构域II、结构域II、峰1A和峰1B计算的与参考材料的百分比差异。包括关于参考材料和样品整合的代表性层析谱。包括样品和参考材料的结构域I－III以及峰1A和峰1B的相对面积百分比(一起进行的注射的平均值)，至百分比的十分之一。此外，对于每次一起进行的参考材料注射，关于结构域I、II和III的％结构域面积以及关于峰1A和1B的％峰面积应在其平均值的15％内。
图57－62、68、76和82－84显示如本文描述的由N联寡糖概况所得到的数据。图68描述了一般的N联寡糖概况(结构域I、II、III、IV和V以及峰1A和峰1B在批次平均值的5％内)。峰1A、1B和1C表示G0、G1和G2的脱唾液酸N联寡糖结构。
图68显示关于CTLA4-Ig组合物的一般N联碳水化合物概况。
正上方表显示关于CTLA4-Ig的N联寡糖概况的列表的数据。
正下方表显示观察到的CTLA4-Ig范围。
结构域/峰 最小面积％ 最大面积％
结构域I 24.5 35.2
结构域II 26.3 34.1
结构域III 21.9 31.5
结构域IV+V 7.9 18.6
峰1A 4.5 11.2
峰1B 8.7 11.8
实施例45：关于CTLA4-Ig的体外基于细胞的生物测定
T细胞需要2种信号用于活化和后续增殖。第一种信号由抗原肽与TCR-CD3复合物的相互作用提供。第二种共刺激信号伴随T细胞上的CD28和抗原呈递细胞上的B7蛋白质之间的相互作用而发生。这2种信号接受后，T细胞分泌细胞因子白细胞介素2(IL-2)。IL-2的释放导致细胞活化和增殖。可溶性、免疫抑制化合物CTLA4-Ig也与抗原呈递细胞上的B7蛋白质结合，从而阻断与CD28的功能相互作用且阻止IL-2产生所需的共刺激信号。
在这种方法中，用在IL-2启动子控制下的萤光素酶基因转染的Jurkat T细胞在抗CD3的存在下以Daudi B细胞共刺激。共刺激活化IL-2启动子，这依次产生萤光素酶蛋白质。所得到的发光信号使用萤光素酶测定系统进行测量。在这种系统中，CTLA4-Ig产生萤光素酶活性中剂量依赖性的减少。
这种方法检查CTLA4-Ig对IL-2产生所需的共刺激信号的作用。可溶性CTLA4-Ig的存在阻止T细胞和抗原呈递细胞之间的信号传导。如果没有这种信号，那么不产生IL-2，从而阻止T细胞的克隆扩增。具有萤光素酶基因的载体使用IL-2启动子产生。Jurkat T细胞随后用这种报道载体进行转染。选择阳性克隆Jurkat.CA且用于该方法中。
这种生物测定涉及用抗CD3和B细胞(Daudi)刺激转染的T细胞(Jurkat.CA)。由B细胞提供的共刺激受CTLA4-Ig添加的抑制。将Jurkat.CA和Daudi细胞接种到96孔、白色、不透明、平底板的孔内，且在不同浓度的CTLA4-Ig的存在下用抗CD3进行刺激。于37℃温育16－20小时后，孔就萤光素酶活性进行测定。共刺激经由CTLA4-Ig的抑制作为萤光素酶活性中剂量依赖性减少可见。
试剂：Daudi细胞培养基(溶于RPMI 1640的10％胎牛血清，1％MEM丙酮酸钠)；Jurkat.CA细胞培养基(溶于RPMI 1640的10％小牛血清，1％MEM丙酮酸钠，400μg/mL遗传霉素)；生物测定培养基(溶于Daudi细胞培养基的0.2μg/mL抗CD3抗体和1％青霉素-链霉素溶液)；来自测定系统的Bright-Glo萤光素酶溶液(Promega，目录号E2620)。
仪器配置：Nikon，Diaphot 200倒置显微镜；Packard TopCount NXT发光计；TecanGenesis液体处理器；Coulter Vi-Cell细胞计数器；Zymark RapidPlate-96。
程序流程图见图94。
工作溶液的制备：溶于生物测定培养基中的3mL CTLA4-Ig溶液(5000ng/mL)
如下表58中所示，在100、4、2、1、0.5、0.2、0.1和0.002μg/mL CTLA4-Ig的浓度时制备关于标准、质量对照和样品的8点曲线，在2倍稀释到板内后在测定中的终浓度为50、2、1、0.5、0.25、0.1、0.05和0.001μg/mL。
表58.用于产生标准曲线的稀度。
96孔板的每个孔加入200,000细胞且在37℃、5％CO2和85％湿度时进行温育。将12x106Jurkat.CA细胞和12x106Daudi细胞组合在无菌离心管中。使细胞在～125xg下于室温离心10分钟，且通过用血清学移液管轻轻反复移液使细胞充分重悬浮于9mL Daudi细胞培养基中，直至看不到细胞团块，以产生2.7x106细胞/mL的浓度。将来自表58的75μL每种溶液加入包含细胞的板的合适孔中。板随后用TopSeal-A进行密封，且在37℃、5％CO2和85％湿度时温育16－20小时。板和Bright-Glo萤光素酶溶液平衡至仪器温度后，向每个孔中同时添加150μL Bright-Glo萤光素酶溶液且混合。板紧在混合后置于TopCount NXT中用于在黑暗中平衡10分钟。随后在TopCount NXT中使用1秒整合/孔或对使用的具体类型的发光计适当地测量发光信号。
记录来自TopCount NXT的输出，读取到标准分析程序内，且数据通过取其对数(底10)进行转化。如下面等式中所示，来自每个物品的转化数据对4参数对数模型进行拟合：
等式1：
其中：
A是曲线的顶部坪，D是曲线的底部坪，B是斜率因子，且C是产生等于A和D的平均值的作用的浓度。
可以对于每个物品计算R2统计量和缺乏拟合F检验。还可以计算测试物品相对于标准材料的最小值、最大值和斜率的比率。此外，还可以计算关于比率的置信区间。
每个物品的相对效价通过使单一等式对与来自参考物品的数据组合的来自目的物品的数据拟合进行测定。
等式2：
其中
A、B和D参数是参考和测试物品共有的，且CR是参考参数，CA是测试物品参数，且比CR/CA是相对效价。上标I是指示变量。如果数据来自目的物品，那么它设为等于1，且如果数据来自CTLA4-Ig材料，那么它为0。
将每个测试物品的相对效价转变为百分比等级，且相对效价作为来自程序的输出而给出。
来自分析的每个8数据集的输出的8个相对效价结果可以求平均值，且标准差可以分别使用等式3和4进行计算。平均结果报告为四舍五入至最近的整数的“百分比相对效价”。
等式3：
等式4：
其中：
8是效价测量的数目
x＝个别测量
用近似浓度获得的相对效价值的调整：由于样品接受和获得精确的蛋白质浓度之间的时间延迟，样品可以在测定中以近似浓度进行测试，并且当精确浓度被测定时调整结果。这种调整使用下文的等式5来进行，其中在测定中测定的相对效价乘以用于设置测定的CTLA4-Ig浓度与测定的CTLA4-Ig样品浓度的比。
等式5：
例子：
样品在测定中以25mg/mL的蛋白质浓度进行测试。
测定的相对效价是105％。
测定的CTLA4-Ig浓度测定为25.5mg/mL
可报告的相对效价＝(105*25)/25.5＝103％。
测试物品相对效价值必须为参考标准的25－175％，这是测定的范围。如果相对效价值在这个范围外，那么样品必须进行稀释或浓缩以落在这个范围内，且样品进行再次分析。
实施例46：O联寡糖的结构表征
CTLA4-Ig的O联糖基化通过肽作图随后为ESI-MS/MS和MALDI-TOF进行表征。
通过肽作图与ESI-MS/MS分析T8和T9
进行胰蛋白酶消化法经修饰的手工形式，其具有使用Finnigan离子阱(Ion Trap)质谱仪的轴向ESI-MS/MS，以表征O联糖肽T8和T9(关于肽特征参考表59)。
图63显示CTLA4-Ig的胰蛋白酶肽图，其指出T8在溶剂前面结束时洗脱，且T9在T27的肩部洗脱。
肽T8的全质谱显示于图64中，其中峰436.2对应于单荷电的未修饰的肽T8的预期MW，且峰1092.2对应于单荷电的糖基化的T8的MW。对应于主峰的质量及其结构(T8-HexNAc-Hex-NeuAc)显示于表61中。
表61
表3.2.S.3.1.4.1.T03：肽T8的寡糖结构
肽T9的全质谱显示于图65中，其中出现糖肽的双和三荷电离子，对应于一系列异质糖形。主峰1115.9对应于用HexNAc-Hex-NeuAc糖基化的三荷电的T9的MW。峰1213.0和1334.8分别对应于用HexNAc(NeuAc)-Hex-NeuAc和(HexNAc-Hex-NeuAc)2糖基化的三荷电T9的分子量(表62)。占优势的糖形是单唾液酸化的T9-HexNAc-Hex-NeuAc，而其他糖形以低得多的丰度存在。
表62
表3.2.S.3.1.4.1.T04：肽T9的寡糖结构
为了测定O联位点，如先前实施例4中所述进行CTLA4-Ig的肽作图，并且收集级分T8-9(由于通过胰蛋白酶的不完全消化)且实施Edman测序。测序数据显示在第一个循环中，出现除Ser外的额外峰。额外峰的保留时间与任何标准氨基酸的那种都不一致，从而暗示在T8中的第1位处的Ser(Ser 129)被修饰且包含O联聚糖。Ser和额外峰的出现指出Ser是部分修饰的。这与关于T8的MS数据一致。测序实验还揭示T9中的O联位点为Ser 139。总之，在氨基酸残基丝氨酸129和丝氨酸139处鉴定了2个O联糖基化位点。与2个位点附着的占优势的聚糖是HexNAc-Hex-NeuAc。
T9肽的MALDI-TOF分析
T9肽的MALDI-TOF分析证实几种糖形的存在(图66)。具有2690.8的MW的峰与T9片段一致。具有2893.7的MW的峰与T9加HexNAc相关。具有3055.7的MW的峰与T9加HexNAc–Hex相关。具有3345.8的MW的峰指示T9加HexNAc-Hex-NANA。基于单糖分析在T9中检测到半乳糖和N-乙酰半乳糖胺，因此T9中的主要O联种类假定为GalNAc-Gal-NANA。由于低回收得率，未进行肽T8的MALDI-TOF分析。
实施例47：CTLA4-Ig中的氧化和脱酰胺变体
氧化和脱酰胺是肽和蛋白质常见的产物变体。它们可以在发酵、收获/细胞澄清、纯化、样品/药物产品贮藏期间、以及样品分析期间发生。
蛋白质氧化一般特征在于一个或多个氧原子对蛋白质的化学添加。与其他天然氨基酸相比较，几种氨基酸Met、Cys、Tyr、His和Trp更易于氧化。具有针对氧化的最高程度的易感性的氨基酸是甲硫氨酸。迄今为止鉴定的大多数蛋白质氧化是甲硫氨酸氧化至亚砜的变体。蛋白质中的氧化可以由几种不同机制引起。氧化的常见机制由光暴露或过渡金属催化而发生。
脱酰胺是NH3从蛋白质中失去，从而形成可以经历水解的琥珀酰亚胺中间物。琥珀酰亚胺中间物导致亲本肽17u的质量减少。随后的水解导致18u的质量增加。由于在水性条件下的不稳定性，琥珀酰亚胺中间物的分离是困难的。同样，脱酰胺一般可作为1u的质量增加检测到。天冬酰胺的脱酰胺导致天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。肽链中与Asn邻近的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn后的Gly和Ser导致对脱酰胺更高的易感性。
材料与方法
样品：CTLA4-Ig标准
CTLA4-Ig的胰蛋白酶/Asp-N/胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶肽作图：蛋白质在包含6M胍和5mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM Tris缓冲液(pH 8.0)中进行变性和还原。于50℃温育20分钟后，加入碘乙酰胺(IAM)至10mM的终浓度，且使样品在黑暗中于50℃温育另外20分钟。将还原和烷化的混合物装载到NAP-5柱上，且随后用50mM Tris，10mM CaCl2，pH 8.0洗脱出。添加序列等级胰蛋白酶(2％，w/w，酶：蛋白质)且于37℃温育4小时。在Asp-N消化的情况下，添加序列等级Asp-N(4％，w/w，酶：蛋白质)且使样品于37℃温育16小时。
在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的情况下，蛋白质在50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5中。添加序列等级胰蛋白酶(4％，w/w，酶：蛋白质)且使样品于37℃温育4小时。添加胰凝乳蛋白酶(4％，w/w，酶：蛋白质)且使样品于37℃温育16小时。所有样品在消化后贮藏于-20℃。
肽混合物在Waters Alliance HPLC Workstation(Waters，Milford，MA)上以0.120mL/分钟通过从Atlantis C18柱(2.1x250mm)中梯度洗脱进行分离。柱与配备电喷射离子化喷射源的Q-Tof micro(Waters，Milford，MA)直接连接且收集质谱。在Asp-N肽作图的情况下，肽混合物使用相同的HPLC工作站在Varian C18柱(4.6x250mm)上以0.7mL/分钟进行分离。柱用溶剂A(溶于水的0.02％TFA)进行平衡，并且肽通过溶剂B(95％乙腈/0.02％TFA，溶于水)的渐增浓度进行洗脱。柱后分流器阀用于将15％的流量导向Q-Tofmicro。仪器以正模式(m/z 100-2000)运行。毛细管电压设为3000V。
肽的MS/MS分析：收集来自反相层析的级分且以20μL/分钟的流速灌注到Q-Tofmicro内。MS/MS谱使用对于个别肽最优化的碰撞能量(25－42eV)来获得。
结果
CTLA4-Ig的氧化：CTLA4-Ig具有7个甲硫氨酸/单链：Met1、Met53、Met54、Met85、Met97、Met162和Met338。肽作图用于鉴定这些位点中每一个上的氧化产物变体。Met1、Met85和Met162的氧化使用胰蛋白酶肽作图技术进行鉴定(图67A－B)。没有检测到的Met338的氧化。包含Met53、Met54或Met97的胰蛋白酶片段是包含异质N联碳水化合物的大的肽。这些肽不易接受氧化的鉴定和相对定量。因此，执行使用多种酶的蛋白水解，所述酶产生更短的、非糖基化的肽。Asp-N肽EVCAATYMMGN(46－56)和胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶肽MYPPPY(97－102)用于测定Met53、Met54和Met97的氧化。甲硫氨酸氧化的相对定量根据提取的离子层析谱的峰面积百分比进行计算。氧化肽的相对量在表63中列出。检测到每条单链的7个CTLA4-Ig甲硫氨酸中的6个上的氧化。峰A和B是肽EVCAATYMMGN(46－56)(峰3)的单氧化形式。来自峰2A和2B的肽是同量异序的，并且与未修饰的肽质量相比较，具有16u的质量增加。每个峰表示在不同Met上的氧化。氧化的程度在2个位点上不同。
表63.CTLA4-Ig中Met的氧化
*由于AT1氧化的较少贡献，AT1氧化的百分比未包括在CTLA4-Ig氧化的估计量的计算中。
CTLA4-Ig甲硫氨酸氧化的总体估计量对于CTLA4-Ig计算为2.0％。这通过将每个位点上的总氧化百分比相加且除以甲硫氨酸总数目(其为7)进行计算。对表63中列出的氧化和天然肽进行MS/MS分析。
除D5外的所有肽使用MS/MS进行测序。氧化的氨基酸通过b和y离子系列内的质量差异进行测定。氧化和天然T1肽的MS/MS谱使得需要m/z 741.4和733.4处双荷电的前体离子。质量差异是8u(对于双电荷状态)，当对于电荷状态进行校正时是16u。胰蛋白酶肽T1(1－14)包含Met1残基。天然肽及其氧化衍生物是通过反相层析进行分离的基线。关于T1及其衍生物的双荷电离子的离子层析谱显示于图67A－B中。b和y离子系列是在碰撞诱导的解离中产生的占优势的离子。y6－y13离子具有相同的经修饰的和未修饰的离子质量。氧化肽的b2离子比天然肽的相应b2离子高16u。b和y离子系列连同肽质量一起鉴定甲硫氨酸1为T1肽中经修饰的氨基酸。以相同方式，鉴定了AT1、T6、T10和MYPPPY(97–102)肽中的Met氧化。
CTLA4-Ig的脱酰胺：CTLA4-Ig具有15个天冬酰胺/单链。3个天冬酰胺已知与N联碳水化合物结构附着。肽作图用于鉴定和相对定量在另外12个Asn残基上发生的脱酰胺。Asn186、Asn225、Asn271、Asn294和Asn344的脱酰胺通过LC/MS胰蛋白酶肽图进行鉴定(表64)。天冬酰胺脱酰胺的相对定量根据提取的离子层析谱的峰面积百分比进行计算。脱酰胺肽的相对量在表64中列出。CTLA4-Ig天冬酰胺脱酰胺的总体估计量对于CTLA4-Ig计算为0.3％。这通过将每个位点上的总脱酰胺百分比相加且除以15进行计算。对表64中列出的脱酰胺和天然肽进行MS/MS分析。
表64.CTLA4-Ig中Asn的脱酰胺
脱酰胺的氨基酸通过b和y离子系列内的质量差异进行测定。例如，如果对于肽15存在2个脱酰胺峰则质量为905.0u。峰1在天然峰之前洗脱；峰3在天然峰后洗脱。胰蛋白酶肽及其脱酰胺形式是在反相柱上进行分离的基线。对胰蛋白酶肽进行MS/MS分析且脱酰胺肽在表64中列出。峰1－3包含相同的y1和y2离子，从而指出C末端氨基酸对于所有3个峰都相同；然而，来自峰1和3的y3－y14离子比来自峰2的相应离子高1u。y2和y3之间的质量差异对于峰2为114u；这对应于Asn残基。与Asn残基质量相比较，关于峰1和3的115u是1u的质量增加；这对应于天冬氨酸或异天冬氨酸。以相同方式，鉴定了T12、T25、T26和T30中的脱酰胺，且片段离子鉴定修饰位点。
天冬酰胺脱酰胺和甲硫氨酸氧化由CTLA4-Ig的内肽酶切割的LC/MS和LC/MS/MS分析进行测定。修饰通过经修饰的和未修饰的肽之间的质量变动进行鉴定。经修饰的氨基酸通过MS/MS测序进行鉴定。6个甲硫氨酸氧化和5个天冬酰胺脱酰胺/单链以小百分比存在于CTLA4-Ig材料中。发现CTLA4-Ig Met1、Met53、Met54、Met85、Met97和Met162都是氧化的。发现由CTLA4-Ig测定的这些氧化小于所有CTLA4-Ig甲硫氨酸的2.5％。发现CTLA4-Ig Asn186、Asn225、Asn271、Asn294和Asn344都以少量进行脱酰胺。发现由CTLA4-Ig测定的这些脱酰胺小于所有CTLA4-Ig天冬酰胺的0.5％。
实施例48－关于CTLA4-Ig和CTLA 4A29YL104E -Ig的细菌内毒素测定
在一个实施方案中，CTLA4-Ig组合物药品具有小于或等于0.15EU/mg的细菌内毒素。CTLA4-Ig基于USP<85>使用鲎变形细胞溶解物(LAL)凝胶凝块技术就细菌内毒素的存在进行测定。在测定的制备和应用中，遵守样品处理中的注意事项，以避免总的微生物污染；处理应用的所有容器或器具以破坏可能存在于其表面上的外来内毒素，例如在干热烤箱中使用验证的循环加热。
LAL试剂：(Associates of Cape Cod，Inc.－或等价物)冻干的鲎(Limulus)
变形细胞溶解物(LAL)试剂例如Pyrotell应根据制造商的说明书进行贮藏。重构的LAL试剂可保持冷冻不超过1个月，且不应解冻或冷冻超过1次。
内毒素标准：(Associates of Cape Cod，Inc.－或等价物)该测试中使用的对照标准内毒素(CSE)必须是可追踪的，且针对参考标准内毒素(RSE)进行标准化。未重构的内毒素容器贮藏于冰箱中；一旦重构，它们就可以保持于2－8℃不超过14天，除非关于更长时间段的验证显示合适的反应性。
生产批次的测试
LAL程序的产物抑制或增强的缺乏应对于每种药物制剂进行验证。产物批次的测试使用代表生产开始、中间和结束的3种个别单元组来进行。这些单元可以单独或合并运行。对于有效测试必须包括用溶解物标记灵敏度2倍量的CSE(或RSE)进行接种的、测试浓度的样品的代表性阳性产物对照。使用无菌无内毒素的HCl、NaOH或合适的缓冲液调整pH，从而使得最终产物/溶解物溶液为6.0－8.0。在一些情况下，使用缓冲剂例如Pyrosol作为pH调整的替代方案可能是有用的。关于具体使用参考制造商的说明。
用于溶解物重构的缓冲剂的使用
缓冲剂例如Pyrosol(Associates of Cape Cod，Inc.)用于重构用于测试的溶解物，且设计为扩大溶解物的缓冲能力。Pyrosol重构的溶解物可以用于测试可能在其他情况下需要用酸或碱调整pH，或在pH调整时发生沉淀的样品或样品稀释物。当与测试样品组合时，Pyrosol重构的溶解物产生粉红色，以指示pH在用于有效测试的范围内。如果在范围外，那么颜色将是黄色或紫色的；在这种情况下，测试样品将需要另外的pH调整。具体方法将指示Pyrosol用于溶解物重构的用途。
用于溶解物重构的葡聚糖抑制缓冲液的使用
聚糖抑制缓冲液例如Glucashield(Associates of Cape Cod，Inc.)用于重构用于测试的溶解物，且设计为阻断潜在的葡聚糖干扰。Glucashield重构的溶解物可以用于测试可能包含葡聚糖污染物的样品或样品稀释物。来自葡聚糖污染物的干扰可以在某些测试材料中产生假阳性，因此使用Glucashield重构的溶解物可以阻断或减少干扰，从而允许减少假阳性的数目。具体方法将指示Glucashield用于溶解物重构的用途。
样品稀释
如果必须接近样品中的内毒素浓度水平，那么在无菌无内毒素水中制备样品合适的系列稀释。涡旋且向2个无菌无内毒素10x75mm玻璃试管的每一个中添加0.1mL待测试的每种制剂。
用于标准曲线的内毒素标准溶液的制备
根据制造商的说明书用无内毒素水重构内毒素的小瓶。在涡旋混合器上使小瓶间歇地剧烈混合30分钟。将浓缩物在2－8℃下保存于冰箱不超过4周。在使用前使用涡旋混合器剧烈混合不少于3分钟。参考制造商的分析证明书以验证内毒素原液的浓度，且制备设计为囊括终点的标准内毒素稀释系列，例如在下述例子中：
0.5mL(1000EU/mL)+9.5mL无内毒素水＝50EU/mL
5.0mL(50EU/mL)+5.0mL无内毒素水＝25EU/mL
1.0mL(25EU/mL)+9.0mL无内毒素水＝2.5EU/mL
1.0mL(2.5EU/mL)+9.0mL无内毒素水＝0.25EU/mL
5.0mL(0.25EU/mL)+5.0mL无内毒素水＝0.125EU/mL
5.0mL(0.125EU/mL)+5.0mL无内毒素水＝0.06EU/mL
5.0mL(0.06EU/mL)+5.0mL无内毒素水＝0.03EU/mL
5.0mL(0.03EU/mL)+5.0mL无内毒素水＝0.015EU/mL
在进展至下一次稀释前确保使每种稀释物剧烈涡旋至少30秒。包括使用的稀释剂的阴性水对照。涡旋且向2个无菌无内毒素10x75mm玻璃试管的每一个中添加各0.1mL的0.125EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL、0.015EU/mL浓度(或可替代曲线)和阴性水对照，以提供2条重复曲线。
LAL试剂溶液的制备
从冷冻机中取出冻干的LAL试剂。向小瓶中无菌添加5.0mL无内毒素水(除非使用重构缓冲液的具体方法另有说明)。使小瓶回荡或滚动以溶解试剂。
阳性产物对照的制备
所有产物必须与阳性产物对照一起进行测试。关于制备阳性对照的说明，参考可用的具体方法。如果未提供说明，那么制备阳性产物对照，以包含在溶解物灵敏度2X水平上的内毒素掺料(spike)，与在其测试水平上的产物组合。当测试注射用水或高品质加工水时，使用重构的内毒素标准的稀释物，从而使得当加入样品中时，内毒素浓度将是2X LAL溶液灵敏度。例如，如果溶解物灵敏度＝0.06EU/mL，那么向1.9mL测试样品中加入0.1mL2.5EU/mL内毒素溶液(以与加入LAL溶液相同的形式)＝0.125EU/mL。内毒素溶液的体积不超过0.1mL，且总体稀度不小于1：20。
测试程序
1.将0.1mL LAL试剂溶液无菌分配到每个测试样品管和内毒素标准管内，小心不要在管之间交叉污染。注：将任何剩余试剂在约-10℃－-25℃置于冷冻机中。
2.关于产物-溶解物混合物的混合说明，参考具体的溶解物插页。
3.将每个管置于维持在37±1℃的温育装置例如水浴或加热块中。记录温育开始时间和水浴或加热块的温度。
4.使每个管不受打扰地温育60±2分钟。
5.温育后，记录温育结束时间且通过使管轻轻倒转180°观察每个管。阳性结果由小心倒转时保持牢固的牢固凝胶指示，阴性结果的特征在于不存在此种凝胶，或无法保持其完整性的粘性凝胶的形成。小心地处理管且避免对其实施可能引起假阴性观察的振动。
评估
每个重复系列中产生阳性结果的最低浓度称为终点。通过下述程序计算关于测试的几何平均值终点：几何平均值＝胶凝终点的对数总和的反对数除以重复终点测定数目。测试是有效的，前提是几何平均值终点在标记的溶解物灵敏度的2倍稀释内，阳性产物对照是阳性的，且阴性水对照是阴性的。通过比较标记的溶解物灵敏度与阳性或阴性结果来测定测试项目中或其上的近似细菌内毒素水平，所述阳性或阴性结果与测试的项目的稀释因子偶联。如果在个别专题文章或说明书中指定的内毒素水平上未形成牢固凝胶，那么物品符合测试的要求。
关于CTLA4 A29YL104E -Ig的方法
这种方法用于使用动态比浊LAL法定量CTLA4A29YL104E-Ig药品和药物产品的样品中的细菌内毒素。结果报告为EU/mL和EU/mg药物产品等价物。
术语：
LAL－鲎变形细胞溶解物
CSE－对照标准内毒素
EU－美国药典内毒素单位
EU/mg－美国药典内毒素单位/毫克
EU/mL－美国药典内毒素单位/毫升
LRW–LAL试剂水
鲎变形细胞溶解物比浊溶液。允许和的小瓶在打开前加温至室温30分钟。去除来自的金属密封物且无菌去除塞子。用5.0mL重构缓冲液重构使瓶轻轻回荡以混合直至完全溶解。紧在使用前重构缓冲液。重构的可以维持于2－8℃不超过24小时。用层覆盖容器的顶部。
对照标准内毒素溶液。允许CSE(1.2)的小瓶在打开前加温至室温30分钟。去除来自小瓶的金属密封物且无菌去除塞子。小心地提起塞子仅足以允许空气进入，从而破坏真空。用5.0mL LRW(1.4)重构对照标准内毒素(CSE)。用密封。在室温下以5－10分钟的时间间隔剧烈涡旋1分钟，经历30－60分钟时间间隔。CSE随后现成可用。为了获得以USP-EU/小瓶表示的针对具体批次的对照标准内毒素(CSE)效价，参考制造商的分析证明书。计算小瓶中的CSE的USP-EU/mL。重构的CSE可以维持于2－8℃30天。每次使用后，用新密封容器。
例子：
对于用5.0mL LRW重构的具有6,000USP-EU/小瓶的效价的小瓶，效价可为1,200USP-EU/mL。
设置软件中的测定参数。一般参数。如下表中所示设置一般测试信息中的参数。
一般测试信息
选项
参数 值
标记相关系数 检查的
显示相关系数 未检查的
标记变异系数 未检查的
外推超出 未检查的
自动测试ID 未检查的
显示通过未通过结果 检查的
自动打印 未检查的
管指定－例子
制备标准曲线浓度。制备4USP-EU/mL的对照标准内毒素(CSE，2.2)工作贮存液。制备4EU/mL的效价的CSE工作溶液。使用等式1计算稀释所需的LRW体积。向聚苯乙烯管(1.9)中合适量(等式1)的LRW(1.4)中添加20μL CSE溶液(2.2)。使稀释物涡旋30秒。
例子：
对于1,200EU/mL的效价的CSE溶液，向5,980μL LRW中添加20μL CSE溶液。
制备0.64EU/mL的CSE工作贮存液。通过向聚苯乙烯管中的8.4mL LRW中添加4USP-EU/mL的1.6mL CSE贮存液来制备0.64USP-EU/mL的效价的CSE工作溶液。涡旋30秒。
制备标准贮存液。标准贮存液由聚苯乙烯管中的CSE工作溶液以0.128、0.064、0.032、0.016、0.008和0.004EU/mL进行制备。在稀释后使每个管涡旋30秒。稀释方案显示于下表中。
关于标准贮存液的稀释方案
*最终的2倍稀释在反应管中发生。
样品制备。药品样品制备。制备至0.25mg/mL的样品稀释物。使用下面等式计算稀释所需的LRW体积。小心地取出样品容器的顶部且将50μL样品加入聚苯乙烯管中的合适量(下面等式)的LRW，以制备0.25mg/mL溶液。使样品涡旋30秒。用层覆盖样品容器的顶部。
例子：
对于具有24.7mg/mL浓度的样品，向4.89mL水中添加50μL(0.05mL)样品
等式2：
药物产品亲液物样品制备。注：单个药物产品批次由3种分开的样品－“开始”、“中间”和“结束”组成。根据产品鉴定(PI)具体要求用LAL试剂水重构药物产品的小瓶。使重构的样品稀释至0.25mg/mL。使用等式2计算稀释所需的LRW体积。小心地取出样品容器的顶部且将50μL样品加入聚苯乙烯管中的合适量(等式2)的LRW，以制备0.25mg/mL溶液。使样品涡旋30秒。用覆盖样品容器的顶部。
药物产品即用的样品制备。使样品稀释至0.25mg/mL。使用等式3计算稀释所需的LRW体积。小心地取出样品容器的顶部且将10μL样品加入聚苯乙烯管中的合适量(等式3)的LRW，以制备0.25mg/mL溶液。使样品涡旋30秒。用覆盖样品容器的顶部。
例子：
对于具有125.0mg/mL浓度的样品，向4.99mL水中添加10μL(0.01mL)样品
等式3：
药物产品即用的安慰剂。使安慰剂(犹如它在125mg/mL的标称药物产品蛋白质浓度)稀释至0.25mg/mL。这等价于1：500的稀度。使用等式3计算稀释所需的LRW体积。小心地取出样品容器的顶部且将10μL样品加入聚苯乙烯管中的合适量(等式3)的LRW，以制备0.25mg/mL等价溶液。
阳性水对照。阳性对照通过将100μL 0.032EU/mL标准加入反应管中的100μL LRW中的标准曲线进行制备。
反应管设置－例子
添加试剂。用重复移液器向每个反应管中添加50μL 溶液(阴性对照、标准、样品、掺料样品、和阳性水对照)。使每个管涡旋1－2秒，且将其插入Pyros Kinetix仪器中的指定孔中(表1)。
数据分析。
分析。软件将执行所有标准、对照和样品的自动分析，且在运行完成时报告以EU/mL表示的样品结果。每种一式两份的样品报告为2个的平均值。如果一式两份的配对值的管之一经由软件未检测到，那么可以排除那个管作进一步的数据分析，且重新计算结果。掺料回收(阳性样品对照)将基于样品中的内毒素量加掺入样品内的内毒素量(0.016EU/mL)进行计算。
将稀释的药品或药物产品样品的EU/mL值转变成EU/mg值
原始数据作为EU/mL产生，且作为蛋白质的EU/mg报告。为了将EU/mL转变成EU/mg，将内毒素值(EU/mL)除以蛋白质浓度(0.125mg/mL)。结果报告至1个有效数字。
例子：
对于在测定中具有0.23EU/mL的样品，可报告的EU/mg值将是2EU/mg(1.8四舍五入至1个有效数字)。
关于药品样品的结果。该结果测定为1个有效数字。测定的QL是0.02EU/mg。如果样品≤0.02EU/mg，那么可报告的结果是[<QL,(QL＝0.02EU/mg)]。关于药物产品样品的结果。以EU/mg表示的每批药物产品的3个样品(“开始”、“中间”和“结束”)的平均值是以1个有效数字对于药物产品样品可报告的结果。对于其中批次的一个或多个样品<QL(0.02EU/mg)的情况，0.02EU/mg的值将用于计算平均值。如果平均可报告的结果为≤0.02EU/mg，那么可报告的结果为[<QL,(QL＝0.02EU/mg)]。
例子：
来自药物产品批次的样品 值EU/mg
开始 <QL＝0.02EU/mg
中间 0.023
结束 0.031
可报告的值(平均值) 0.02EU/mg
对于这个例子，药物产品安慰剂将报告为：3EU/mL，等价于在125mg/mL的标称药物产品浓度时的0.02EU/mg。
系统适合性。药物产品样品应于2－8℃容纳于聚苯乙烯容器中。如果样品容纳于不同温度下的不同容器中，那么它们不能在测定中使用。关于标准曲线的决定系数(r2)必须≥0.99。如果r2值<0.99，那么该测定是无效的且必须进行重复。关于阴性对照的测量的平均内毒素浓度必须<0.002EU/mL。如果阴性对照≥0.002EU/mL，那么该测定是无效的且必须进行重复。掺料的样品值必须落在预期值的50－200％范围内。如果掺料的样品值是预期值的≤49％或≥201％，那么该测定是无效的且必须进行重复。关于阳性水对照的测量的平均内毒素浓度必须落在标准曲线中的相同浓度的50－200％范围内。如果阳性水对照值是预期值的≤49％或≥201％，那么该测定是无效的且必须进行重复。关于样品的内毒素值必须落在内毒素标准曲线范围内(0.002－0.064USP-EU/mL)。如果样品<0.002EU/mL，那么它们低于测定的QL且根据部分5.4进行报告。如果样品>0.064USP-EU/mL，那么样品必须进一步稀释到测定的范围内。
实施例49－关于CTLA4-Ig的微生物限度测试(生物负荷)
这种方法提供了用于评估存在的存活需氧微生物数目和用于免除指定微生物物种的测试程序。在一个实施方案中，CTLA4-Ig组合物应具有≤1CFU/10mL水平的生物负荷。在测试的制备和应用中，在处理样品时注意无菌遵守事项。术语“生长”定义为活微生物的存在和假定的增殖。测试结果的验证很大程度上依靠它们应用于其的测试样品自身在测试条件下不抑制可能存在的微生物生长的证实。这种证实应包括用合适的攻击生物分开的存活培养物攻击待测试材料适当制备的样品，以确保测试将不抑制这些微生物种类的生长，如果它们存在于测试的材料中的话。用于测试的任何β-内酰胺产物的那个部分必须依照验证的程序用合适量的青霉素酶进行处理。
稀释流体和培养基
1.培养基和稀释流体的制备。可以制备培养基和稀释流体，或可以使用脱水的培养基，前提是当如由制造商或经销商指导的重构时，它们具有类似的成分和/或产生与得自本文给出的配方的那些可比较的培养基。在通过配方制备培养基中，将可溶性固体溶解于水中，必要时使用加热，以实现完全溶解，且添加足够量的盐酸或氢氧化钠溶液，以产生在即用时培养基中的所需pH。培养基使用验证的灭菌程序在高压灭菌器中进行灭菌。灭菌后于25±2℃时测定pH。
生长促进
a)根据下文详细说明的条件通过用小于100种微生物接种每种培养基的一式两份的测试容器和温育，就其生长促进能力测试每批高压灭菌的培养基。生物距离由ATCC最初接受到的培养基不能超过5代。
b)如果对于细菌在48－72小时内和对于真菌在5天内出现生长证据，那么测试培养基是令人满意的。生长促进测试可以与测试培养基用于材料测试的用途同时进行。然而，如果这种生长促进测试不成功，那么材料测试视为无效的。
用于在培养基的生长促进测试中使用的测试微生物
*其他非致病沙门氏菌属物种也可是合适的。
关于总需氧微生物计数或总组合的霉菌和酵母计数的程序
a)样品制备。除非具体方法另有说明，如下制备样品用于测试。取决于进行何种测试，关于涉及培养基和温育程序的另外信息，参考下文合适的部分。
i)疏松粉末和原材料－将10克或10mL样品溶解或悬浮于90mL无菌磷酸盐缓冲液pH 7.2中。充分混合且将1.0mL转移到2个无菌培养皿中的每一个。
ii)胶囊－将2个胶囊壳及其内容物无菌转移到20mL无菌的磷酸盐缓冲液pH 7.2中。在水浴(约45℃)中加温约10分钟。剧烈振荡直至悬浮液变得均匀，且将1.0mL转移到2个无菌培养皿中的每一个。
iii)用于悬浮的粉末－根据标签说明使用无菌的磷酸盐缓冲液pH7.2作为稀释剂重构样品。充分振荡且将1.0mL转移到2个无菌培养皿中的每一个。
iv)溶液/悬浮液－将1.0mL转移到2个无菌培养皿中的每一个。
v)片剂－将4个片剂(硬片剂应首先用无菌的研钵和研杵粉碎)转移至20mL无菌的磷酸盐缓冲液pH 7.2。充分振荡直至片剂完全分解或溶解，且将1.0mL转移到2个无菌培养皿中的每一个。
vi)胶囊壳－将25个胶囊壳转移至100mL无菌的磷酸盐缓冲液pH 7.2，且在水浴(约45℃)中加温约15分钟，间歇地振荡至溶解。充分振荡且将1.0mL转移到2个无菌培养皿中的每一个。
vii)软膏－在无菌容器内合并横越批次获取的3个样品中每一个的约5mL且混合。将0.1mL这种合并的样品转移至10个培养皿的每一个中。借助于无菌的弯曲玻璃棒(曲棍球棒状物)将样品涂布在培养基表面上。对于每块板使用分开的无菌棒，如“总需氧计数”中所述温育。
b)膜过滤。作为倾注铺平板程序的可替代方案，可以使用合适的、验证的膜过滤测试程序。这对于包含抑制物质的产品可能特别有用。
c)再测试。为了通过任何下述程序证实可疑结果，再测试可以使用二又二分之一倍(最低限度)的最初样品大小来进行，伴随合适的稀释调整。
关于总需氧微生物计数的测试
1.如所述的制备待测试的样品。向每块板中加入15－20mL无菌的TSA，所述TSA已熔化且冷却至约45℃。覆盖每个皿，且使皿轻轻倾斜或回荡以混合样品与琼脂，且允许内容物在室温下固化。倒置板且于30－35℃温育48－72小时。
2.温育后，使用放大装置例如Quebec菌落计数器检查板的生长，计数菌落数目，且如材料说明中指定的以单位为基础(每片剂、胶囊、mL、克等)计算结果，且针对材料说明评估可接受性。
3.通过革兰氏染色和微观形态学进一步表征细菌污染。对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性球菌实施生物化学测试(或可替代的合适鉴定方法)。
注：当计数菌落时，为了促进来自待测试材料的菌落生长的区分，使用氯化2,3,5-三苯基四唑(TTC)的2％溶液作为用于观察微生物生长的增强剂有时是可取的。TTC是无色氧化还原指示剂，当通过活细胞中发现的还原糖氢化时变红，从而使菌落变成深红色。对于使用TTC，用约1mL的2％溶液覆满Petri板，且使板于30－35℃温育约2小时。微生物菌落将明显突出于板上存在的其他材料且可以更容易地进行计数。
C.关于总组合的霉菌和酵母计数的测试。1.如所述的制备待测试的样品。向每块板中加入15－20mL无菌的SDA，所述SDA已熔化且冷却至约45℃。覆盖每个皿，且使皿轻轻倾斜或回荡以混合样品与琼脂，且允许内容物在室温下固化。倒置板且于20－25℃温育5－7天。[注：在温育期间不要干扰板，因为霉菌在板内扩散可以产生比实际存在更高的计数]。
2.温育后，使用放大装置例如Quebec菌落计数器检查板的生长，计数菌落数目，且如材料说明中指定的以单位为基础(每片剂、胶囊、mL、克等)计算结果，且针对材料说明评估可接受性。
3.通过宏观和微观形态学进一步表征真菌污染。适当时，对酵母实施生物化学测试(或可替代的合适鉴定方法)。
关于测试讨厌的生物不存在的程序
a)样品制备－除非具体方法另有说明，如上文关于总需氧和总组合的霉菌和酵母的样品制备部分中所述制备样品用于测试。取决于进行何种测试，关于另外的信息，参考下文合适的部分。
b)膜过滤。作为预富集程序的可替代方案，可以使用合适的、验证的膜过滤测试程序。这对于包含抑制物质的产品可能特别有用。
c)再测试。为了通过任何下述程序证实可疑结果，再测试可以使用二又二分之一倍(最低限度)的最初样品大小来进行，伴随合适的稀释调整。
B.关于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌不存在的测试。向样品中加入TSB以获得100mL，混合且于30－35℃温育24－48小时。检查培养基的生长，并且如果存在的话使用接种环将部分划线到选择性培养基，温育且检查下文列出的特征(商购可得的鉴定试剂盒可以代替个别反应测试)：
金黄色葡萄球菌的特征：
*将得自选择性琼脂的代表性可疑菌落转移至含有0.5mL哺乳动物(优选兔或马)血浆的个别管，于37℃温育，于3-4小时及随后在合适的时间间隔最高达24小时检查凝固。
铜绿假单胞菌的特征：
*对于色素测试，将代表性可疑菌落从Centrimide琼脂划线到PSF和PSP皿。覆盖且于35±2℃温育最少3天。在UV光下检查板。
**对于氧化酶测试，通过转移至用N,N-二甲基对苯二胺二盐酸盐浸渍的条或皿来证实任何可疑菌落；如果没有粉色变成紫色的发展，那么样品符合关于铜绿假单胞菌不存在的要求。应当指出还可以使用已证实以可接受形式执行的商购可得的测试试剂盒。
如果未观察到生长，或如果发现的菌落无一符合上表中列出的特征组，那么样品符合关于那种生物不存在的测试要求。
关于沙门氏菌属物种和大肠杆菌不存在的测试
将样品转移至包含总共100mL流体乳糖培养基的无菌容器，且于30－35℃温育24－48小时。轻轻振荡且检查生长。(商购可得的鉴定试剂盒可以代替个别反应测试。)a)沙门氏菌属－如果生长存在于流体乳糖培养基中：
1.将1.0mL部分转移至流体亚硒酸盐胱氨酸培养基和流体连四硫酸盐培养基的10mL管，混合且于30－35℃温育24－48小时。
2.借助于接种环，将部分从2种培养基划线到亮绿琼脂培养基、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐琼脂培养基、和亚硫酸铋琼脂培养基上。覆盖、倒置且于30－35℃温育24－48小时，并且检查下文列出的形态学特征：
沙门氏菌属的特征：
3.进一步的鉴定可以通过将可疑菌落转移至三重-糖-铁-琼脂培养基的斜面底斜面(buttslant)管来进行，其通过首先划线斜面培养的表面，且随后将金属丝充分刺穿到表面下。于30－35℃温育24－48小时且检查。如果管没有显示碱性(红色)斜面和酸性(黄色)斜面底(含或不含伴随的斜面底变黑)的证据，那么样品符合关于沙门菌属不存在的测试要求。
b)大肠杆菌－如果生长存在于流体乳糖培养基中：1.借助于接种环，将部分划线至MacConkey琼脂培养基。覆盖、倒置且于30－35℃温育24－48小时。
2.如果所产生的菌落无一显示硅红色外观(具有沉淀出的胆汁的可能围绕区带)且是革兰氏阴性杆菌(球杆菌)，那么样品符合关于大肠杆菌不存在的测试要求。
3.如果菌落符合这种描述，那么将它们转移至Levine伊红美蓝琼脂培养基。覆盖皿，倒置且于30－35℃温育24－48小时。如果菌落无一显示出在反射光下的特有金属光泽和在透射光下的蓝黑色外观，那么样品符合关于大肠杆菌不存在的测试要求。
培养基配方
1.磷酸盐缓冲液pH 7.2
a)贮存液：一代磷酸钾34.0g；水(蒸馏或去离子的)1000mL；氢氧化钠TS 175mL。将34克一代磷酸钾溶解于包含在1000-mL容量瓶中的约500mL水中。通过添加氢氧化钠TS(约175mL)调整至pH 7.1－7.3，添加水至体积且混合。灭菌且在致冷(2－8℃)下贮藏直至使用。
b)工作溶液。对于使用，用水以1至800的比稀释贮存液且灭菌。
2.TSA(胰胨豆胨琼脂/大豆-酪蛋白消化琼脂)。酪蛋白的胰消化物15.0g；大豆粉木瓜蛋白酶(papaic)消化物5.0g；氯化钠5.0g；琼脂15.0g；水1000mL；灭菌后的pH：7.3±0.2。
3.TSB(胰胨豆胨培养液/大豆-酪蛋白消化物液体培养液)。酪蛋白的胰消化物17.0g；大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g；氯化钠5.0g；二代磷酸钾2.5g；葡萄糖2.5g；水1000mL；灭菌后的pH：7.3±0.2；4.SDA(Sabouraud葡萄糖琼脂)；葡萄糖40g；等份的动物组织胃酶消化物和酪蛋白的胰消化物混合物10.0g；琼脂15.0g；水1000mL；混合且煮沸以实现溶解；灭菌后的pH：5.6±0.2。
5.FLM(流体乳糖培养基)。牛肉提取物3.0g；明胶的胰消化物5.0g；乳糖5.0g；水1000mL；灭菌后尽可能快地冷却。灭菌后的pH：7.1±0.2。
实施例50－CTLA4-Ig的等电聚焦凝胶分析
这个实施例的目的是测定CTLA4-Ig的等电点、同工型数目、和微不均一性。
材料
IEF校准试剂盒(pH 3－10),(Amersham Pharmacia，目录号17-0471-01)或(pH2.5－6.5),(Amersham Pharmacia，目录号17-0472-01)。
Ampholine PAGplate凝胶：pH 4.0－6.5,(Amersham Pharmacia，目录号80-1124-81)。
IEF样品施用器,(Amersham Pharmacia，目录号80-1129-46)。
IEF电极条,(Amersham Pharmacia，目录号80-1104-40)。
磷酸(85％),(EMD，目录号PX0995-6)。
设备
Multiphor II电泳系统,(GE Healthcare，目录号18-1018-06)。
试剂的制备
阳极缓冲溶液(溶于0.5M磷酸中的0.1M谷氨酸)(用这浸透的芯置于平板的(+)侧)。
例子：
3.4mL 85％磷酸。
1.47g±0.02g谷氨酸。
HPLC等级水。
将上述试剂组合在100mL量筒中，用HPLC等级水达到100mL，盖上盖子且倒置几次以混合。
溶液贮藏于2－8℃至多6最月。
阴极缓冲溶液(0.1Mβ-丙氨酸)(用这浸透的芯置于平板的(－)侧)。
例子：
0.9g±0.02gβ-丙氨酸。
HPLC等级水。
将上述试剂组合在100mL量筒中，用HPLC等级水达到100mL，盖上盖子且倒置几次以混合。
溶液贮藏于2－8℃最多6个月。
固定溶液(溶于12％三氯乙酸中的3.5％5-磺基水杨酸)。
例子：
240g±5.0g三氯乙酸。
70g±2.0g 5-磺基水杨酸。
2000mL HPLC水。
将上述试剂组合以补足2000mL体积。
溶液贮藏于室温最多3个月。
染色溶液：
通过使瓶轻轻倒转和回荡几次，紧在使用前混合GelCode Blue试剂溶液。
注：重要的是在倾注或分配前混合染色试剂，以确保使用均匀的试剂样品。
染色对照制备：
用HPLC等级水重构碳酸酐酶II以制备1.0mg/mL贮存液。
使10μL贮存液与90μLHPLC等级水混合以获得0.10μg/μL工作溶液。
将10μL 0.10μg/μL溶液装载到凝胶上(1.0μg装载)。
程序
样品稀释
在HPLC水中制备样品和参考材料的20μg/10μL溶液。
例子：
装置和凝胶制备
使Multiphore II电泳单元的冷却板与恒温循环器连接且将温度设为10±2℃。
注：允许循环器达到上述温度至少20分钟。
从冰箱中取出凝胶。小心地沿着封套的侧面切割，确保不切割到凝胶/凝胶支持物。
将约1.0mL：HPLC水加到冷却平台的1个边缘。
将凝胶/凝胶支持物的1个边缘置于水内，从而使得毛细管作用携带水跨过凝胶的整个边缘。缓慢地将凝胶跨过冷却平台应用，确保未捕获气泡。如需要可以应用另外的HPLC等级水。
从凝胶的表面去除透明薄膜。
用阳极缓冲溶液浸泡1个电极，且置于最接近冷却平台(+)标记的凝胶边缘上。
在阴极缓冲溶液中浸泡1个电极，且置于最接近冷却平台上的(-)标记的凝胶另一侧上。
电极条已应用后，使用新剃刀片小心地切割多余量，从而使得条在凝胶而不是凝胶支持物的边缘处结束。
将样品应用片应用于最接近冷却平台上的(-)标记的侧上，确保样品应用片和凝胶之间良好接触。注：确保IEF样品施用器不接触阴极缓冲液浸湿的条，不吸上阴极缓冲液，并且充分分离以保证每个样品分开地运行。样品施用器应稳固地放置在平板凝胶上。
放置Multiphor II单元的电极固定器，且沿着凝胶上的电极条中心对准电极。使来自电极固定器的2个电极与基底单元连接且将安全盖放置在适当位置。使用粘合带覆盖安全盖中的孔以防止凝胶干燥。使电极与电源连接。
用设定为下述设置的电源使凝胶预聚焦，直至电压达到≥300V。
表1：使IEF凝胶预聚焦的电源设置。
运行参数 设置
电压(可变参数) 最大2000伏特
电流(恒定参数) 25mAmps
功率(恒定参数) 25瓦特
凝胶装载
凝胶已预聚焦后，关闭电源、去除安全盖、使电极分开且从Multiphor II元件取出电极固定器。
将样品以特定顺序装载到样品施用器上。对于这个程序，确保(-)阴极缓冲液条侧最接近于分析物。
样品从右向左进行装载。首先进行IEF校正标准(泳道1和2)、1个参考材料(泳道3)、1个测试样品#1(泳道4)、1个染色对照制剂(泳道5)、1个测试样品#2(泳道6)、1个参考材料(泳道7)和1个IEF校正标准(泳道8)的2个或更多应用。
通过下述添加第3和4种样品，应用参考材料的1个应用(泳道9)、测试样品#3的1个应用(泳道10)、染色对照制剂的1个应用(泳道11)、测试样品#4的1个应用(泳道12)、参考材料的1个应用(泳道13)和IEF校正标准的1个应用(泳道14)。第5和6种样品通过重复与样品3和4相同的模式来应用，使用泳道15－20。样品装载模式显示于表2中。
表2－样品稀释和凝胶装载模式
电泳。当凝胶装载时，放置Multiphor II单元的电极固定器，且沿着凝胶上的电极条中心对准电极。使来自电极固定器的2个电极与基底单元连接且将安全盖放置在适当位置。使用粘合带覆盖安全盖中的孔以防止凝胶干燥。使电极与电源连接。设定合适的电压、电流和功率设置且开始运行。
表3：运行IEF凝胶的电源设置。
运行参数 设置
电压(可变参数) 最大2000伏特
电流(恒定参数) 25mAmps
功率(恒定参数) 25瓦特
时间(恒定参数) 2.5小时
凝胶已运行后，关闭电源、去除安全盖、使电极分开且从Multiphor II单元取出电极固定器。
小心地从凝胶取出电极条和样品施用器。
注：可以将平板凝胶直接放置在固定溶液中且使电极条和应用片从凝胶浮起。
从冷却板处取出凝胶/凝胶支持物，且置于包含足够体积的固定溶液的平皿中(步骤3.3)以使凝胶保持湿润。用塑料包裹物覆盖且置于轨道平台上且温育20－60分钟。在IEF工作表上记录开始和停止时间。
注：将IEF凝胶置于固定剂中太长时间有时脱层。这通过使固定时间限制于约1小时得到避免。
4.5染色凝胶。
固定后，用足够体积的HPLC等级水冲洗凝胶3x5分钟以使凝胶保持湿润。在IEF工作表上记录开始和停止时间。
使用前使GelCode Blue染色试剂溶液混合后(步骤3.4)，将凝胶置于足够体积的染色剂中以保持凝胶湿润。在紧密地密封的容器中温育15－24小时，以防止试剂蒸发。在IEF工作表上记录开始和停止时间。
染色的凝胶通过用HPLC等级水替换染色液进行脱色。经过1－2小时的时间段至少换水3次冲洗凝胶。在IEF工作表上记录开始和停止时间。脱色后，凝胶即用于扫描。
注：可能需要另外的洗涤以减少IEF凝胶上的背景染色。
系统适合性
等电聚焦标准应与背景容易地区分开。迁移至4.0－6.5之间的pI值的蛋白质标准在凝胶上可见。具有这个范围外的pIs的蛋白质标准在凝胶上看不到。在3.50、4.55、5.20和5.85处的pI标记得到鉴定且在凝胶图像上得到标记。
表4：IEF校正标准的组分。
蛋白质标准 pI
胰蛋白酶原 9.30
小扁豆凝集素碱性条带 8.65
小扁豆凝集素中间条带 8.45
小扁豆凝集素酸性条带 8.15
肌红蛋白碱性条带 7.35
肌红蛋白酸性条带 6.85
人碳酸酐酶B 6.55
牛碳酸酐酶B 5.85
β-乳球蛋白A 5.20
大豆胰蛋白酶抑制剂 4.55
淀粉葡糖苷酶 3.50
低水平的蛋白质装载(1.0μg)的碳酸酐酶II标准(pI 5.4)的染色对照用于显现凝胶染色一致性。这个条带必须通过扫描的凝胶图像的目测检查与背景容易地区分开。
CTLA4-Ig参考材料应在4.3－5.6的pI范围内以10－22个条带列举。
CTLA4-Ig参考材料的最显著条带的累积百分比强度应在4.3－5.3的pI范围内≥90％。
对于参考材料，通过目测检查证实在pI标记4.5－5.2之间存在3个聚焦的主要条带(关于主要条带模式参见图)。
凝胶扫描和分析
电泳和染色后，所有凝胶使用光密度计进行扫描。图像文件存储于计算机当地硬盘驱动器/网络上且经由局域网进行存档。扫描的凝胶图像的分析使用ImageQuant TL软件(v2003.03)来进行。扫描和分析参数在表5中列出。扫描使用部门程序来产生和定量。
表5－凝胶扫描和分析参数
扫描参数 设置
扫描像素大小 100
扫描数字分辨率 12比特
条带检测参数
最小斜率 最初100
噪声减少 最初10
％最大峰 最初0
泳道％宽度 设定为90％
注：上述程序提供用于分析凝胶图像的基本步骤。表中的扫描参数得到限定。表中的条带检测参数暗示是最初设置。由于凝胶的物理性质变化(例如，染色/脱色后凝胶收缩)以及凝胶条带形状和移动的改变，条带检测参数的调整可能是精确鉴定条带所必需的。手工校正任何遗漏或错误鉴定的条带。
使用表中限定的扫描参数来扫描凝胶。凝胶的所有分析和评估由扫描的图像进行。打开ImageQuantTL中来自<1D Gel Analysis>的凝胶图像文件(扫描的原始数据)。转到工具栏上的<Contrast>，且降低<Image Histogram>参数直至所有条带清晰可见。选择<Lane Creation>且选定<Manual>，以设定待分析的<泳道数>。调整<泳道％宽度>直至最高100％覆盖凝胶泳道。必要时正确地对齐单个泳道。使用<Rolling Ball>法以扣除背景。使用表3中列出的最初的<最小斜率>、<噪声减少>、<％最大峰>设置检测条带。这些值的调整是精确鉴定条带必需的。对于pH/pI 4.0－6.5凝胶，通过使用来自系统适合性部分中列出的经标记的标记的标准pI标记来计算条带pI值。跳过校正和标准化步骤。列举在4.3－5.6pI范围内的条带数目。将结果输出到Excel表内，用于进一步的文件编制和报告。样品相对于参考材料的累积百分比强度的计算。注：关于样品的累积百分比强度是与泳道中存在的所有条带的100％相比较，在4.3－5.3的pI范围内迁移的条带百分比。下面等式应当用于计算样品相对于参考材料的累积百分比强度：
注：参考凝胶装载模式，紧靠样品的参考材料应当用于计算。如果参考材料具有100％的累积值，且样品具有95％的值，那么样品相对百分比为95/100*100＝95％。如果参考具有95％的累积值，且样品具有100％的值，那么样品相对百分比为100/95*100＝105％。
报告结果
报告在范围4.3－5.6的pI内列举的条带数目。报告相对于CTLA4-Ig参考材料在4.3－5.3的pI范围内的那种的累积百分比强度(关于这种方法中限定的定量IEF凝胶分析的报告的例子参见图)。通过目测检查证实相对于参考材料在pI标记4.5－5.2之间存在3个聚焦的主要条带(关于主要条带模式参见图1)，且报告在pI标记4.5－5.2内观察到的主要条带数目。通过目测检查证实相对于参考材料在pI标记4.5－5.2之间没有新的显著条带。
在某些实施方案中，这种方法的结果将显示在4.3－5.6、或4.3－5.3的pI范围内的条带，其中鉴定10－22个条带，而累积条带强度为90－110％。在另一个实施方案中，pI范围为4.5–5.2，具有3个主要条带。在另一个实施方案中，pI范围为4.3–5.6，具有10－22个主要条带。在另一个实施方案中，pI范围为4.3–5.3，累积条带强度为95－105％。在另一个实施方案中，pI范围为4.5–5.2，具有2个显著条带。
实施例51：CTLA4-Ig的SDS-PAGE
该实施例显示了经由SDS-PAGE在还原和非还原条件下检查CTLA4-Ig。
材料
Tris-甘氨酸(Tris-Gly)SDS样品缓冲液2X(Invitrogen，目录号LC2676)。
NuPAGE“样品还原剂10X(Invitrogen，目录号NP0004)。
4－20％Tris-甘氨酸凝胶－1.0mm x 12孔(Invitrogen，目录号EC60252BOX)。
Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液10X(Invitrogen，目录号LC2675)。
Mark12TM广泛范围未染色的标准(Invitrogen，目录号LC5677)。
GelCode Blue染色涉及(考马斯蓝),(Pierce，目录号24590：500mL目录号24592：3.5L)。
染色试剂盒II(银染色)(Pierce，目录号24612)。
仪器配置：
Xcell SureLock Mini Cell(Invitrogen，目录号EI0001)。
关于电泳的电源(OWL Separation Systems，目录号OSP-300)。
试剂：
用于考马斯蓝染色的固定溶液(溶于HPLC等级水中的50％甲醇和7％乙酸)。
例子：
向包含搅拌棒的合适大小的、有刻度的容器中：
加入500mL甲醇。
加入70mL乙酸。
用HPLC等级水将体积调整至1000mL。
贮藏于室温最多6个月。
考马斯蓝染色剂(GelCode Blue)。
直接从容器中使用。添加足够量以覆盖凝胶，对于在小托盘中的1个微型凝胶(10x10cm)约50mL。
贮藏于2－8℃最多1年。
银染色固定溶液(溶于HPLC等级水中的30％乙醇和10％乙酸)。
向包含搅拌棒的合适大小的、有刻度的容器中：加入300mL乙醇。加入100mL乙酸。用HPLC等级水将体积调整至1000mL。使溶液混合且将溶液贮藏于室温最多6个月。凝胶洗涤溶液(10％乙醇)。
向50mL离心管中：加入1.0mL增强剂(银染色试剂盒)。加入50mL银染色剂(银染色试剂盒)。将管盖上盖子且通过轻轻涡旋3－5秒混合。显影剂工作溶液。紧在使用前制备。
向50mL离心管中：加入1mL增强剂(银染色试剂盒)。加入50mL显影剂(银染色试剂盒)。将管盖上盖子且通过轻轻涡旋3－5秒混合。1X Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液。在使用当天时制备。向量筒中：加入900mL HPLC等级水。加入100mL Tris-甘氨酸-SDS 10X运行缓冲液。将上述试剂组合，用石蜡膜覆盖且倒转几次以混合。
染色对照。向包含2mg胰蛋白酶抑制剂(染色对照)的小瓶中加入1mL HPLC等级水。这将产生对于在-200℃下6个月稳定的2μg/μL贮存液。为了防止由于多次冻融循环的降解，将50μL等分试样转移到小管中且贮藏于-200℃。将25μL贮存液加入75μL HPLC等级水中以得到0.5μg/μL溶液。将40μL 0.5μg/μL溶液加入160μL HPLC等级水中以得到0.1μg/μL的浓度。向微量离心管中加入10μL的0.1μg/μL溶液、50μL 2X TrisGly样品缓冲液和40μL HPLC等级水。胰蛋白酶抑制剂染色对照的终浓度为0.01μg/μL。就释放进行分析且用考马斯蓝染色的样品以10mg/10μL的浓度装载。
对于考马斯蓝凝胶，在HPLC等级水中将参考材料和样品稀释至10μg/μL的浓度。例子：添加80μL 50μg/μL参考材料样品溶液+320μL HPLC等级水。对于非还原样品，将10μL 10μg/μL溶液浓度加入50μL 2X Tris-Gly样品缓冲液中，和将40μL HPLC等级水加入微量离心管内。对于还原的样品，将10μL 10μg/μL溶液加入50μL 2X Tris-Gly样品缓冲液、30μLHPLC等级水和10μL 10X还原剂中。对于银染色的凝胶，在HPLC等级水中将10μg/μL溶液进一步稀释至1μg/μL。例子：添加40μL 10μg/μL溶液+360μL HPLC等级水。对于非还原样品，将10μL 1μg/μL溶液加入在微量离心管中的50μL 2X TrisGly样品缓冲液和40μL HPLC等级水中。对于还原的样品，将10μL 1μg/μL溶液、50μL 2X TrisGly样品、30μL HPLC等级水和10μL10X还原剂加入中微量离心管中。对于空白，将50μL 2X TrisGly样品缓冲液和50μL HPLC等级水组合在微量离心管中。
表6：关于可能存在于还原和非还原阿巴西普样品中的预期较少蛋白质条带的分子量(kDa)范围
将凝胶从其包裹物取出，且用HPLC等级水冲洗外部以去除聚丙烯酰胺片。小心地取出孔梳，确保必要时用凝胶装载尖端使孔变直。用HPLC等级水填充孔且轻弹，从而使得水从孔中被去除。将孔冲洗再重复2次。5.2将凝胶插入XCell装置内，从而使得短板面朝向内室。如果仅使用1块凝胶，那么将聚异丁烯酸树脂板插入对侧上。使凝胶紧紧楔入，从而形成内和外室。用1X Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液填充内室。检查渗漏，随后用1X Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液填充外室。所有凝胶必须包含至少1个空白泳道和1个分子量标记泳道。仅对于考马斯蓝染色的凝胶添加染色对照。使用凝胶装载尖端。在还原和非还原样品之间装载至少一个“空白”。与还原样品一样处理分子量标记。这将帮助防止非还原的样品由于还原剂的沥滤而还原。使Xcell装置的顶端附着且使电极与电源连接。将电流调整至25mAmps/凝胶，且使电压(v)和功率(w)设为最大值。如果运行2块凝胶，则将电流设为50mAmps。当在一个装置上运行2块凝胶、或在相同电源上运行多个Xcell装置时，调整电流。电泳60±5分钟或直至缓冲液前面移动可用迁移距离的至少80％。在工作表上记录开始时间和停止时间。通过用凝胶刀撬开小心地使容纳凝胶的2块塑料板分开。凝胶分开后，遵循关于染色的程序。
考马斯蓝染色－将凝胶置于50mL考马斯蓝固定溶液(50％甲醇和7％乙酸)中15分钟。用～100mL HPLC等级水将凝胶冲洗3次5分钟，共15分钟。将考马斯蓝染色剂直接加入凝胶中且温育15－24小时。染色的凝胶通过用100mL HPLC等级水替换考马斯蓝染色试剂进行脱色。脱色1小时后，凝胶即用于扫描。
凝胶扫描和分析。电泳和染色后，凝胶使用光密度计进行扫描。图像文件存储于计算机当地硬盘驱动器和/或网络上且经由局域网进行存档。扫描的凝胶图像的分析使用ImageQuant TL软件(v2003.03)来进行。扫描使用部门程序来产生和定量。
表4：凝胶扫描和分析参数
扫描参数 设置
扫描像素大小 100
扫描数字分辨率 12比特
条带检测参数
最小斜率 最初100
噪声减少 最初10
％最大峰 最初0
泳道％宽度 设定为90％
通过目测检查，还原的CTLA4-Ig的主要条带必须作为迁移至接近55,400Da分子量标记(谷氨酸脱氢酶)的位置的宽条带出现。
实施例52－通过ELISA测定CTLA4 A29YL104E -Ig药品中的中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细 胞蛋白质杂质
这个实施例描述了定量测试样品中CD-CHO1残留的宿主细胞蛋白质(HCP)的污染水平的酶联免疫吸附测定(ELISA)。首先将兔多克隆抗CD CHO1 HCP IgG包被在微量滴定板上。HCP参考标准、质量对照和CTLA4A29YL104E-Ig药品样品与结合的兔抗CD CHO1 HCP IgG温育。洗涤微量滴定板后，加入多克隆兔抗CD CHO1 HCP生物素IgG抗体，其与最初步骤期间捕获的HCP结合。洗涤微量滴定板以去除任何未结合的多克隆抗体。添加链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶且再次洗涤微量滴定板，以去除任何未结合的缀合抗体。随后加入TMB色原以产生比色反应。该反应用硫酸终止且在96孔微量培养阅读器中在450nm处测量吸光度。颜色与捕获的HCP量成比例显现。样品浓度基于标准曲线进行测定，所述标准曲线通过标绘吸光度对4.11ng/mL－3000ng/mL范围中的HCP浓度而产生。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(DG44)用于CTLA4A29YL104E-Ig的生产。对于CD-CHO1蛋白质(HCP)的生产，DG44细胞用重组载体pD16进行稳定转染，且在补加有半乳糖和重组胰岛素的CD-CHO1培养基中生长。用于这种形式的ELISA的多克隆抗体在用CD-CHO1 HCP材料浓缩物免疫的新西兰白兔中产生。兔抗体进行亲和纯化(A蛋白)，随后透析到磷酸缓冲盐水内且进行浓缩。约50mg兔抗CD-CHO1抗体的IgG级分使用N-羟磺基琥珀酰亚胺酯化学进行生物素化。未修饰的兔抗CHO1抗体用于包被96孔微量滴定板。它捕获CD-CHO1 HCP，其通过生物素化的兔抗CD-CHO1抗体进行检测。链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物酶缀合物与生物素结合，并且与TMB色原的比色反应用于定量CD-CHO1 HCP。
这种方法设计为通过ELISA定量测定CD-CHO1宿主细胞蛋白质的残留水平以用于CTLA4A29YL104E-Ig药品材料的释放测试。
方法概述见图95。
兔抗CD-CHO1抗体使用生物素化试剂盒进行生物素化，用磺基琥珀酰亚胺基-6(生物素酰胺基)己酸酯作为生物素化试剂。可以使用来自PIERCE(产品#21335)的具有磺基-NHS-LC-生物素的生物素化试剂。抗体根据制造商在手册中提供的建议用生物素化试剂进行标记。标记和在提供的尺寸排阻柱上分离后，测定生物素掺入且使样品以50μL或更小的等分试样冷冻于-70℃或更低。最终产物的生物素/IgG比应为2－4。贮藏于-70℃或更低。
板包被。在碳酸盐缓冲液中制备用于包被微量滴定板(每块微量滴定板需要12mL溶液)的纯化的兔抗CD-CHO1 HCP IgG的8μg/mL溶液。使用校准的多道移液器将100μL这种溶液加入Immulon 4微量滴定板的每个孔中。用石蜡膜覆盖微量滴定板且于4℃温育18±2小时。
板洗涤和封闭。使用板洗涤器仪器用洗涤缓冲液将板洗涤3次。使用校准的多道移液器将300μL SeaBlock加入每个孔中。使平板于22.5±5℃温育1小时。在15mL有刻度的无菌聚丙烯管中制备CD-CHO1蛋白质参考标准和质量对照样品的浓度。使用Teknova稀释剂(1.21)稀释参考材料和质量对照样品。标准浓度在试验当天时以下文实例中列出的浓度进行制备：
关于标准曲线样品的稀释(用于每日制剂的例子)
CD-CHO1蛋白质的原液浓度为5.7mg/mL
稀释剂A：26.3μL(5.7mg/mL)+4.973mL PTB稀释剂＝30μg/ml
稀释剂B：0.6mL(30μg/mL)+5.4mL稀释剂3000ng/mL
2mL(3000ng/mL)+4mL稀释剂1000ng/mL
2mL(1000ng/mL)+4mL稀释剂333.3ng/mL
2mL(333.3ng/mL)+4mL稀释剂111.1ng/mL
2mL(111.1ng/mL)+4mL稀释剂37.0ng/mL
2mL(37.0ng/mL)+4mL稀释剂12.3ng/mL
2mL(12.3ng/mL)+4mL稀释剂4.11ng/mL
0+4mL稀释剂0ng/mL
QC浓度分析、贮藏和到期
在分析当天时新鲜制备且使用3种不同靶浓度(25、100和700ng/mL)的质量对照(QC)样品，或以较大的量制备且以等分试样贮藏于-70℃或更低。冷冻的等分试样在3次独立实验中进行分析。来自3次实验的平均结果在分析证明书(COA)中对于3种QC样品中的每一种进行报告。在实验当天时，使冷冻的QC样品解冻且如下所述进行分析。解冻后，每种QC样品以中等速度涡旋2－4秒。冷冻的QC样品在制备日期后6个月到期。它们以其在COA上报告的标称浓度使用。新鲜制备的QC在制备后24小时到期。
关于质量对照(QC)样品的稀释(例子)
稀释A：26.3μL(5.7mg/mL)+4.973mL稀释剂＝30μg/mL
233μL(30μg/mL)+9.767mL稀释剂＝700ng/mL(QC 1)
1.43mL(700ng/mL)+8.57mL稀释剂＝100ng/mL(QC 2)
2.5mL(100ng/mL)+7.5mL稀释剂＝25ng/mL(QC 3)
样品制备。将药品样品稀释至约12.5、6.25和3.125mg/mL。
稀释A：400μL样品(～25mg/mL)+400μL稀释剂＝12.5mg/mL
稀释B：400μL(～12.5mg/mL)+400μL稀释剂＝6.25mg/mL
稀释C：400μL(～6.25mg/mL)+400μL稀释剂＝3.125mg/mL
板洗涤。使用板洗涤器用洗涤缓冲液将板洗涤3次。向封闭且洗涤的板中一式三份地添加100μL/孔每种标准浓度、样品和QC样品。每种QC浓度添加2次至总共6个孔/板。关于建议的放置，参见方法附件中的板图。于22.5±5℃温育1小时。将洗涤步骤重复5次。在Teknova缓冲液中将兔抗CD-CHO1 HCP生物素稀释至2μg/mL。使溶液以中等速度涡旋约2－4秒。添加100μL/孔。于22.5±5℃温育1小时。将洗涤步骤重复5次。在Teknova缓冲液中适当地稀释链霉抗生物素蛋白-HRP(SA-HRP)(例子：1/20,000的稀度通常导致可接受的吸光度读数)。向每个孔中加入100μL SA-HRP稀释物且于22.5±5℃温育1小时。从冰箱中取出TMB色原且以最低限度10mL/板倾析入合适的容器内。置于黑暗场所中且允许达到室温。将洗涤步骤重复5次。向每个孔中加入100μL TMB色原且于22.5±5℃温育约2分钟。通过向每个孔中加入100μL 1N H2SO4来停止色原反应。以与色原添加的相同顺序向板和孔中加入终止溶液，以确保每个孔中色原与酶相同的反应时间。在合适的96孔板阅读器上用630nm的参考波长测量在450nm处的吸光度。
数据分析。设立Softmax程序模板“CHO1 Elisa template.ppr”以产生平均值、标准差、％CVs、计算的浓度、曲线拟合参数等。标准曲线。参考标准数据使用4参数曲线拟合函数对标准曲线进行拟合：
Y＝((A-D)/(1+(X/C^B))+D
其中：
Y＝吸光度值(A450－A630)
A＝对应于最小渐近线的吸光度值
D＝对应于最大渐近线的吸光度值
C＝对应于最大和最小渐近线值之间的一半绝对差异的吸光度(拐点)。
B＝在曲线的拐点处的斜率
X＝CD-CHO1HCP的浓度
Softmax程序模板“CHO1 Elisa template.ppr”使用计算的平均值测定关于标准的回归线的相关系数(R2)。
示例性值。测定关于标准、QC和样品的结果是否符合下文列出的示例性值。关于标准的示例性值。关于标准曲线的相关系数(R2)必须≥0.99。关于0ng/mL标准浓度的平均背景必须≤0.2吸光度单位。如果标准曲线的7个标称浓度中的2个或更多，排除0和低于QL的浓度(12.3ng/mL)，不符合条件6.1.4和6.1.5，那么该测定视为无效的且必须进行重复。在用于测定标准曲线的每个标准浓度时计算的值(ng/mL)的平均值，排除0和低于QL的浓度(12.3ng/mL)，必须在靶(标称)值的20％内。在每个标准浓度时一式三份的吸光度值的变异系数(％CV)，排除0和低于QL的浓度(12.3ng/mL)，必须小于20％。为了确保至少2个适合数据点可用于计算；将标准、质量对照和样品装载在一式三份的孔中。分开分析每个一式三份的值。放弃位于离靶最远的值。重新计算曲线且再次分析示例性值。
例子：
离25ng/mL的靶值最远的单个值为12ng/mL。通过从一式三份中排除12ng/mL值，剩余值的平均值符合所有示例性值。如果显示剩余2个值的平均值仍不符合示例性值，那么排除单个点且重新计算曲线。
例子：
平均值距离靶>20％，不管哪个值被消除，因此，单个点从曲线中被放弃且曲线将进行重新计算。
关于QC样品的示例性值。QC样品是在指定浓度时的一组6个孔。关于QC样品的6个孔中的至少4个必须在关于可接受的QC样品的标称的20％内。所有3个QC样品都必须是可接受的。如果这些示例性值不符合，那么该测定必须进行重复。
关于测试样品的示例性值。关于测定的测试样品的吸光度值必须小于最高QC。如果值超过最高QC的那种，那么测试样品必须充分稀释以便获得700－12.3ng/mL之间的平均值。对于可报告的结果，3种样品稀释物(12.5、6.25和3.125mg/mL)中的至少一种必须落在标准曲线的范围内，除非关于所有稀释物的吸光度低于测定的QL。在那种情况下，测试样品报告为<QL。大于QL且落在测定范围内的样品稀释物的一式三份吸光度值的平均值应显示小于20％的CV。
样品中CD-CHO1 HCP浓度的计算和报告结果。样品中CD-CHO1 HCP浓度的计算。对于每种稀释物，将平均样品结果乘以合适的稀释因子(即2、4和8)，以获得以ng/mL表示的未稀释样品中的CD CHO1 HCP浓度。测定关于落在测定范围内的那些稀释物的结果的平均值。将结果除以报告的CTLA4A29YL104E-Ig蛋白质浓度(mg/mL)，以获得以ng/mg表示的CTLA4A29YL104E-Ig的CD CHO1 HCP浓度。
例子计算：
平均样品结果：235ng CD-CHO1 HCP/mL＝9.4ng/mg
蛋白质浓度：25.0mg/mL
注：ng CD-CHO1 HCP/mg产物(ng/mg)等价于百万分之(ppm)。
实施例53：通过ELISA测定CTLA4 A29YL104E -Ig的A蛋白水平
酶联免疫吸附测定(ELISA)定量CTLA4A29YL104E-Ig测试样品中的A蛋白的污染水平。首先将兔抗A蛋白包被在微量滴定板上。A蛋白参考标准、质量对照、回收对照和CTLA4A29YL104E-Ig样品与结合的兔抗A蛋白IgG温育。洗涤微量滴定板后，加入生物素化的单克隆抗兔A蛋白IgG抗体，其与最初步骤期间捕获的A蛋白结合。洗涤微量滴定板以去除任何未结合的单克隆抗体。在温育1小时后随后添加链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶；再次洗涤微量滴定板，以去除任何未结合的缀合抗体。随后加入TMB色原以产生比色反应。该反应用硫酸终止且在96孔微量培养板阅读器中在450nm处测量光密度。颜色与捕获的A蛋白量成比例显现。样品浓度基于标准曲线进行测定，所述标准曲线通过标绘光密度对0.188ng/mL－12ng/mL范围中的A蛋白浓度而产生。
方法概述见图96。
用捕获抗体进行板涂覆。在包被缓冲液中制备兔抗A蛋白抗体的1μg/mL溶液，且将100μL溶液加入Costar微量滴定板的每个孔中。于4℃温育18±2小时。
板洗涤和封闭。使用板洗涤器用洗涤缓冲液将板洗涤3次。将200μL SeaBlockTM加入每个孔中。使微量滴定板在环境温度下温育60分钟。参考标准的制备通过将合适量的A蛋白参考材料混合到合适体积的乙酸盐缓冲液内制备参考标准。使溶液以中等速度涡旋2－4秒。在加入微量滴定板前使参考标准、质量对照和回收对照样品在环境温度下温育10分钟。
例子：参考材料A蛋白、贮存浓度2.3mg/mL
1：200 10μL(2.3mg/mL)+1990μL(乙酸盐缓冲液)＝11500ng/mL
1：479 10μL(11500ng/mL)+4780μL(乙酸盐缓冲液)＝24 ng/mL
2mL(24ng/mL)+2mL(乙酸盐缓冲液)＝12ng/mL
2mL(12ng/mL)+2mL(乙酸盐缓冲液)＝6ng/mL
2mL(6ng/mL)+2mL(乙酸盐缓冲液)＝3ng/mL
2mL(3ng/mL)+2mL(乙酸盐缓冲液)＝1.5ng/mL
2mL(1.5ng/mL)+2mL(乙酸盐缓冲液)＝0.75ng/mL
2mL(0.75ng/mL)+2mL(乙酸盐缓冲液)＝0.375ng/mL
2mL(0.375ng/mL)+2mL(乙酸盐缓冲液)＝0.188ng/mL
0mL+2mL(乙酸盐缓冲液)＝0ng/mL
每个标准浓度一式三份地进行分析。如方法附件中所述将样品置于微量滴定板上。质量对照样品的制备。A蛋白的质量对照(QC)样品在乙酸盐缓冲液中以0.5、2和5ng/mL的3个靶浓度水平进行制备。它们在实验当天时新鲜制备，或以较大的量制备且以750μL等分试样贮藏于≤-70℃。冷冻QC样品中的A蛋白浓度使用这种方法在3次独立的A蛋白ELISA实验中进行预测定，且平均浓度结果报告为关于每种QC样品的分析证明书中的“标称”QC浓度。
在实验当天时，使3种QC样品的各1个小瓶在室温下进行解冻。每种QC浓度分析2次(以2次一式三份的分析/浓度)。如方法附件中所述将QC样品置于微量滴定板上。
参考材料A蛋白，2.3mg/mL
1：200 10μL(2.3mg/mL)+1990μL(乙酸盐缓冲液)＝11500ng/mL
1：479 10μL(11500ng/mL)+4780μL(乙酸盐缓冲液)＝24ng/mL
833.3μL(24ng/mL)+3.166mL(乙酸盐缓冲液)＝5ng/mL(QC1)
1.600mL(5ng/mL)+2.4mL(乙酸盐缓冲液)＝2ng/mL(QC2)
1mL(2ng/mL)+3mL(乙酸盐缓冲液)＝0.5ng/mL(QC3)
测试样品的制备。使用乙酸盐缓冲液(pH 3.5)在聚丙烯管中制备浓度为2.5mg/mL、1.25mg/mL和0.625mg/mL的CTLA4A29YL104E-Ig测试样品。在加入微量滴定板前使测试样品在环境温度下温育约10分钟。
板洗涤。使用板洗涤器用洗涤溶液将板洗涤3次。板洗涤器应设为用300μL洗涤缓冲液填充孔，零浸泡时间。将各100μL参考标准、质量对照、回收对照和测试样品加入每个孔中，且在环境温度下温育1小时。重复步骤。用Teknova稀释剂将生物素化的抗A蛋白抗体稀释至如通过对每个新批次最优化指示的所需浓度。例如，对于单克隆抗A蛋白生物素缀合物制备1：64,000稀释物，以中等速度涡旋且使用多道移液器将100μL加入每个孔中。在环境温度下温育1小时。
用Teknova稀释剂将链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶稀释至如通过对每个新批次最优化指示的所需浓度。例如，对于链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶制备1：80,000稀释物。以中等速度涡旋且将100μL加入每个孔中，并且在环境温度下温育30分钟。重复步骤但洗涤5次。将100μL TMB色原加入每个孔中。在室温下温育约2分钟。关于标准曲线的最高浓度的光密度应为0.980－1.400。通过添加100μL/孔1N H2SO4来终止色原反应。以与色原添加相同的顺序向板和孔中加入终止溶液，以确保每个孔中色原与酶相同的反应时间。在合适的96孔板阅读器上用630nm的参考波长测量在450nm处的吸光度。
数据分析。关于A蛋白ELISA参考Softmax程序模板，因为它产生平均值、标准差和％CVs等。在数据分析部分中进行的所有计算将使用SoftMax Pro中的A蛋白ELISAtemplate.ppr来进行。
求对于测定的每个参考和样品浓度获得的一式三份的吸光度值(Abs)的平均值。使用未加权4参数回归对关于A蛋白标准的数据进行建模：
其中：
Abs＝吸光度
min＝对应于最小渐近线的吸光度值
max＝对应于最大渐近线的吸光度值
ED50＝对应于最大和最小渐近线值之间的一半绝对差异的吸光度
B＝在曲线拟合的拐点处的斜率
C＝A蛋白的浓度
示例性值。关于标准的示例性值。关于标准的示例性值应用于在定量界限(QL)处或其上的那些值，因为低于QL的值仅用于帮助确定曲线的极限值。关于标准曲线的相关系数(R2)应≥0.99。关于0ng/mL标准的平均背景应≤0.08吸收单位。在用于测定除0和QL外的标准曲线的每个标准浓度时计算的值(ng/mL)的平均值必须在靶(标称)值的15％内。标准曲线的QL的一式三份吸光度值的平均值必须显示小于20％的％CV且在靶的20％内。
实施例54－用于测定CTLA4 A29YL104E -Ig中的MCP-1样蛋白质的ELISA
进行这种ELISA以测定CTLA4A29YL104E-Ig中的MCP-1样蛋白质浓度。将标准曲线(0.4－25.6ng/mL)、质量对照和测试样品的浓度应用于山羊抗小鼠MCP-1吸收的微量滴定板，且在环境温度(22.5±5℃)下温育60分钟。洗涤板，加入第二抗体(兔抗大鼠MCP-1IgG)，且在22.5±5℃下温育60分钟。洗涤板，将山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶加入每个孔中，且在22.5±5℃下温育30分钟。洗涤板且加入TMB色原以产生比色反应。用1N H2SO4来终止反应后，在96孔微量培养板阅读器中在450nm处测量光密度，且数据使用4参数回归曲线进行建模。MCP-1样蛋白质的浓度随后相对于MCP-1参考材料对于每个测试样品进行计算。浓度以ng MCP-1样蛋白质/mg(百万分之，ppm)的样品报告，其通过将相对于标准曲线获得的结果和未稀释的样品浓度相除实现。这种方法允许在细胞培养衍生的生物样品中测定MCP-1样杂质，所述生物样品包括进行中、纯化的药品和药物产品。MCP-1样蛋白质可以存在于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养中产生的生物样品中。鉴定了与由CHO细胞纯化的MCP-1样杂质结合的2种多克隆抗体。抗体针对鼠和大鼠MCP-1(完整的)，且两者都的确与来自CHO细胞的MCP-1样蛋白质交叉反应，这在这个报告中得到证实。
板包被。对于包被，用包被缓冲液使山羊抗小鼠MCP-1抗体稀释至5μg/mL。用100μL/孔包被板。用板封闭器包被板且在22.5±5℃温育12－18小时。板洗涤。使用板洗涤器用洗涤溶液将板洗涤3次。洗涤器应设为3次洗涤、300μL/孔与零浸泡时间。可替代地，板可以进行手工洗涤。使用校准的多道移液器将300μL溶液加入每块板的每个孔中。通过轻打到槽内来倒空孔，并且在纸巾上轻轻吸干。重复3次。
板封闭。使用校准的多道移液器将300μL包被稳定剂和封闭缓冲液加入每个孔中。使板在22.5±5℃下温育1－2小时。板洗涤和贮藏。如4.2下所述用洗涤溶液将板洗涤3次。用300μL包被缓冲液/孔填充板，用板封闭器覆盖且在2－8℃下贮藏于黑暗中最高达1周。
标准的制备。由MCP-1样蛋白质原液在PTB中制备25.6ng/mL溶液，且使用PTB作为稀释剂由此以连续稀释步骤(1：2)稀释至12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4和0ng/mL。可替代地，冷冻的标准可以通过制备大量标准来使用。等分试样且贮藏于-70℃－-80℃。避免反复冷冻/融解。冷冻的标准在3次独立的ELISA运行中需针对质量对照进行定量。冷冻的标准和QC在每次运行中必须是可接受的。3次可接受的运行完成后，发布分析证明书。冷冻的标准将以其标称浓度使用。它们从制备日期起3个月到期。
关于原液浓度为0.97mg/mL的MCP-1参考的例子：
在PTB中制备2.5mL的5200ng/mL：
13.4mL原液+2.487mL稀释剂
b)在PTB中制备160mL的25.6ng/mL：
788mL原液a+160mL稀释剂
通过将管涡旋约2－3秒随后轻轻倒转2－3次来混合每种溶液。
质量对照。质量对照(QCs)是在PTB中以17.7ng/mL、5.3ng/mL和1.2ng/mL的标称浓度制备的MCP-1样蛋白质。制备大量QCs、等分试样且贮藏于-70℃－-80℃最多3个月。避免反复冷冻/融解。质量对照在3次独立ELISA运行中针对标准曲线进行定量。QC在每次运行中必须是可接受的。3次可接受的运行完成后，报告关于每个可接受的QC的平均结果且发出分析证明书。QC将以其计算浓度进行使用。它们从制备日期起3个月到期。关于由原液浓度为0.97mg/mL的MCP-1参考制备冷冻的QC稀释物的例子：
a)在PTB中制备2.5mL的5200ng/mL：
13.4mL原液+2.487mL稀释剂
b)如下制备MCP-1样蛋白质质量对照样品的最终稀释物：
通过涡旋2－3秒随后轻轻倒转2－3次来混合每种溶液。可替代地，QC可以在分析当天时新鲜制备。
测试样品。测试样品通过将200μL测试样品加入200μL PTB中进行制备且涡旋2－4秒。将参考标准、质量对照(x2)和测试样品一式三份、100μL/孔地加入板中，且在22.5±5℃下温育1小时(不使用外部孔)。在PTB缓冲液中以2μg/mL的浓度制备兔抗大鼠MCP-1第二抗体，其体积足够用于在测定中使用的板。使溶液涡旋约2－4秒。重复洗涤，但洗涤5次。向每个孔中加入100μL第二抗体溶液且在22.5±5℃下温育60分钟。使用PTB作为稀释剂制备三级山羊抗兔HRP缀合物溶液(例如1：20,000稀度或合适的稀度)。使溶液涡旋约2－4秒。重复洗涤。向每个孔中加入100μL HRP缀合物且在22.5±5℃下在黑暗中温育30分钟。重复洗涤。向每个孔中加入100μL TMB，且在22.5±5℃下在黑暗中温育3－6分钟或直至合适的颜色已显现。通过以与色原添加进行的相同顺序加入100μL 1N H2SO4来终止色原反应。在合适的96孔板阅读器上用630nm的参考波长读取在450nm处的光密度。
数据简化
使用SoftmaxTM软件用规程文件MCP-1.ppr以使用下式的未加权4参数回归来构建标准曲线。
其中：
A＝对应于最小渐近线的吸光率450值。
D＝对应于最大渐近线的吸光率450值。
C＝对应于最大和最小渐近线值之间的一半绝对差异的浓度。
B＝曲线的线性部分的近似斜率。
X＝参考标准的浓度。
对于标准曲线、质量对照和测试样品仅报告关于具有可接受数据的样品的结果。
关于标准的示例性值。关于标准的示例性值应用于在QL(0.8ng/mL)处或其上的那些值，因为低于QL的值仅用于帮助确定曲线的极限值。平均背景(0ng/mL标准)必须≤0.1吸收单位。在用于测定标准曲线的每个标准浓度时平均反计算(back-calculated)的MCP-1浓度(ng/mL)必须在靶(标称)值的15％内。用于测定标准曲线的每个标准浓度时一式三份A450值的变异系数(％CV)必须≤15％。在标准曲线的QL时一式三份A450值的平均值必须显示≤20％的％CV和反计算在20％的靶(标称浓度，0.8ng/mL)内。用于计算平均值的一式三份的每个值将分开进行分析。位于离平均值最远的值将被放弃，重新计算曲线且再次分析示例性值。如果显示剩余2个值的平均值仍不符合示例性值，那么消除单个点且重新计算曲线。
关于QC样品的示例性值。QC样品在指定浓度时定义为一组3个孔，因此对于在这种方法中指定的3种标称浓度存在总共6个QC样品。为了QC样品可接受，关于QC样品的3个孔中的至少2个的反计算浓度必须在先前测定的靶浓度(参见COA)的20％内。6个QC样品中的至少4个必须是可接受的；6个QC样品中的2个(不是相同浓度时的2个)可以是不可接受的，并且18个QC样品孔中不超过6个可以偏离各自的靶浓度超过20％。如果这些示例性值不符合，那么该测定必须进行重复。
关于测试样品的示例性值。平均计算的MCP-1浓度必须小于最高QC的浓度。如果平均计算的MCP-1浓度≥0.8ng/mL(QL)，那么一式三份测定的％CV必须≤20％。如果这种条件不符合，那么样品结果将是无效的且必须进行重复。如果这种标准符合，那么平均的MCP-1浓度用于计算最终结果。如果计算的MCP-1浓度<0.8ng/mL(QL)，那么样品报告为<QL且值“<0.8ng/mL”用于计算最终结果。
实施例55－通过定量聚合酶链反应检测CTLA4 A29YL104E -Ig和CTLA4-Ig中的CHO DNA
开发这种程序以使用实时定量聚合酶链反应(qPCR)测定来检测药品样品中残留的CHO DNA。PCR是DNA混合物的复制。这种测定使用荧光探针以检测特异性CHO PCR产物，因为它在测定期间积聚。PCR产物的扩增率与样品中存在的起始DNA的量成正比。
将DNA值转变成皮克/毫克。将pg/mL值除以通过在280nm处的吸光度测定的样品浓度。关于具有50mg/mL的蛋白质浓度和由Bioreliance报告的值＝0.67fg/μL的样品的例子计算。步骤1：转变成pg/mL＝0.67pg/mL。步骤2：转变成pg/mg＝(0.67pg/mL/50.0mg/mL)＝0.013pg/mg。
实施例56：通过SDS-PAGE分析CTLA4 A29YL104E -Ig
这个实施例描述了用于评估CTLA4A29YL104E-Ig药品和药物产品的纯度的CTLA4A29YL104E-Ig分析。CTLA4A29YL104E-Ig是工程改造的融合蛋白，其由细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)经修饰的配体结合结构域和人IgG的Fcγ1区组成。CTLA4A29YL104E-Ig具有～92千道尔顿的分子量和97千道尔顿(非还原的)或55千道尔顿(还原的)的表观分子量。CTLA4A29YL104E-Ig在4－20％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳使主要单体种类与更高分子量的种类(聚集物、二聚体和更高级别的多聚体)以及任何低分子量种类(降解片段)分开。考马斯蓝染色的凝胶的光密度扫描和ImageQuantTLTM定量产生蛋白质纯度的测量。结果报告为CTLA4A29YL104E-Ig在还原和非还原条件下的百分比纯度。
试剂
注：所有试剂可以用等价替代物进行替换。1X Tris-甘氨酸-SDS运行缓冲液。将100mL Tris-甘氨酸-SDS 10X运行缓冲液加入1L量筒中。用Milli-Q或HPLC等级水Q.S.至1L。覆盖、倒转几次以混合。这种试剂应在测定当天时进行制备。注：如需要则制备另外的体积。
考马斯蓝染色试剂。通过使瓶轻轻倒转或倾斜和回荡几次，紧在使用前混合GelCode Blue染色试剂溶液。当使用具有手工泵的3.5L GelCode容器(目录号24592)时，此种混合尤其重要。不要摇动瓶以混合溶液。注：重要的是在分配前混合染色试剂，以确保溶液是均匀的。
固定溶液：溶于水的50％甲醇/7％乙酸。将500mL甲醇和70mL乙酸组合在1L量筒中。用Milli-Q水Q.S.至1L且混合。固定溶液在室温下稳定最多6个月。注：固定溶液应在化学烟雾通风橱中进行制备。
染色对照制备。使用Milli-Q水重构胰蛋白酶抑制剂以制备2mg/mL贮存液。制备50μL等分试样且在-30±10℃下冷冻最多6个月。使用下述稀释计划以将蛋白质贮存液稀释至工作浓度：
25μL贮存液+75μL Milli-Q水＝0.5μg/μL
40μL 0.5μg/μL+160μL Milli-Q水＝100ng/μL
使用正下方表以制备染色对照装载溶液。
关于染色对照的样品制备
装载10μL染色对照制剂将产生100ng的蛋白质负荷。
标准和样品制备
关于固定方法、GLP/GMP药品、药物产品或稳定性样品的装载模式。关于考马斯蓝染色凝胶的稀释。将测试物品和参考材料稀释至1.0μg/μL的工作浓度，且如正下方表中所述装载具有分子量标记的还原和非还原的。
关于考马斯蓝染色凝胶的样品稀释和凝胶装载
1空白＝装载10μL 1X NR样品缓冲液
注：染色对照条带包括在用于目测检查的扫描凝胶图像中以评估系统适合性。染色对照条带在修剪的凝胶图像中不存在，以维持凝胶报告的一致性。
样品制备和电泳。关于10μg/泳道蛋白质负荷的样品稀释。根据下文的方法制备用于10μg/10μL装载的样品。使用Milli-Q水作为稀释剂，使测试样品和参考材料稀释至10mg/mL CTLA4A29YL104E-Ig。近似浓度可以用于计算。例如，如果CTLA4A29YL104E-Ig药品的样品具有25mg/mL的浓度，那么制备1：2.5稀度(将40μL样品加入60μL Milli-Q水中)。根据正下方表制备用于电泳的最终样品。对于这些稀释使用微量离心管。
测试样品的稀释
注：必要时调整蛋白质溶液和Milli-Q水的体积以达到100μL的最终体积。注：如果样品浓度<10mg/mL，那么根据上表制备最终样品。调整蛋白质溶液和水的体积以使凝胶上的蛋白质负荷得达到最大。
样品加热。制备样品稀释物后，关上微量离心管且使管涡旋以混合溶液。在80±5℃水浴中使样品加热2.0±0.5分钟(使用校准的计时器)。从加热中取出样品且允许其冷却至室温。使管倒转几次以去除来自管顶部和侧面的冷凝。
装置和凝胶制备。从其包装中取出凝胶且小心地取出梳，从而确保孔壁是直的。若需要则可以用凝胶装载尖端使孔变直。将凝胶插入电泳单元内，从而使得短玻璃板朝向内室。如果仅运行单块凝胶，那么将聚异丁烯酸树脂隔离物插入对侧上。使凝胶紧紧楔入，以使内室与外室密封。用1X Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液完全填充内室。检查渗漏，随后用1XTris-甘氨酸SDS运行缓冲液填充外室至孔的底部。使用移液管用1X Tris-甘氨酸-SDS运行缓冲液轻轻冲洗孔以去除任何残留的丙烯酰胺。重复孔冲洗直至孔完全清晰和确定。
样品装载。使用凝胶装载尖端，用10μL样品装载每个孔。用10μL 1X非还原样品缓冲液填充所有空白泳道。这将帮助防止非还原样品由于还原剂的沥滤而还原，并且将维持跨过整个凝胶相似的盐浓度。
电泳。附着凝胶盒盖，且使电极与电源连接。将电流调整至25mAmps/凝胶(mA)，且使电压(v)和功率(w)设为最大值。注：电源设置可以从厂商到厂商不等。调整设置以达到25mA/凝胶。使凝胶电泳60分钟或直至样品缓冲液染料前面正好达到凝胶的底部。关闭电源、使导线分开且从装置中取出凝胶。小心地撬开塑料板。使塑料板与附着的凝胶放在用于染色技术的合适固定溶液上。将凝胶浸没到溶液内直至凝胶离开塑料板。
凝胶固定。注：所有步骤在室温下进行伴随在定轨振荡器上的轻轻摇动。注：在紧密密封的容器中进行染色以防止试剂蒸发。注：尽管可以使用引用的体积，但必要的是凝胶在所有步骤中都完全覆盖。在测定需要的体积中必须考虑凝胶和染色托盘的大小。电泳后，加入50mL固定溶液(50％甲醇/7％乙酸溶液)15分钟。用～100mL Milli-Q水将凝胶冲洗3次，各5分钟。在使用前混合考马斯染色试剂溶液，且对于8x10cm微型凝胶加入50mL。如果使用更大的托盘，那么可能需要另外的试剂。使用定轨振荡器使托盘轻轻振荡20±1小时。为了一致性，在相同运行中使所有凝胶染色相同的持续时间。通过用100mL Milli-Q水替换考马斯染色试剂来脱色。脱色1小时后，凝胶即用于扫描。
凝胶扫描和分析
电泳和染色后，所有凝胶使用光密度计进行扫描且使用ImageQuantTLTM软件进行分析。图像文件存储于计算机当地硬盘驱动器上且经由局域网进行存档。扫描和分析参数在正下方表中列出。
凝胶扫描和分析参数
注：这个表中的扫描参数在扫描期间必须不改变。对于所有扫描的凝胶图像分析推荐条带检测参数、泳道％宽度(设定为75％)和背景校正(设定为200的半径)(任何改变都将需进行记录)。由于凝胶的物理性质中的变化(例如，染色/脱色后的凝胶收缩)或凝胶条带形状的形状中的差异，最小斜率、噪声减少和％最大峰参数的调整可能是精确鉴定条带所必需的。手工校正任何遗漏或错误鉴定的条带。关于条带检测参数的另外信息，参考ImageQuantTL(v2003.03)手册和屏幕上指令。
使用上表中列出的扫描参数来扫描凝胶。凝胶的所有分析和评估应由扫描的图像进行。打开ImageQuantTL软件中来自<1D Gel Analysis>的凝胶图像文件(扫描的图像)。转到工具栏上的<Contrast>，且将<Image Histogram-High>参数设为0.3，以增强凝胶图像用于清晰显现所有条带。注：这个步骤是为了容易显现凝胶图像用于下述分析且对定量结果没有影响。为了凝胶条带或凝胶报告的视觉评估的目的，不使用增强的凝胶图像。选择<Lane Creation>且选定<Manual>，以设定待分析的<泳道数>。将<泳道％宽度>设为75％。必要时正确地对齐单个泳道。使用<Rolling Ball>法以扣除背景。为了精确解释背景，将<Radius>设为200。使用表4中列出的最初的<最小斜率>、<噪声减少>、<％最大峰>设置检测条带。这些值的调整可能是精确鉴定条带所必需的。手工评估任何遗漏或错误鉴定的条带。通过使用下文列出的分子量标记来测定条带分子量。跳过校正和标准化步骤。将结果包括分子量、条带体积、和条带％输出到Excel工作表内，用于进一步的文件编制和报告。表5中列出的12种分子量标准中的11种应与背景容易地区分开(图79)。注：胰岛素B链(3,500Da)和胰岛素A链(2,500Da)可以作为单个宽条带出现或胰岛素A链可以在凝胶上未视觉鉴定。
标记12种分子量标准
在这个例子中，对于非还原(单体)和还原(单链)的测试物品的主要条带将在凝胶上与CTLA4A29YL104E-Ig参考材料相同的相对位置中。参见图79。以100ng/装载的大豆胰蛋白酶抑制剂(21,500Da)标准的染色对照必须在扫描的凝胶图像上可见(图79，泳道12)。除了在非还原条件下的次要条带外，所述次要条带通常接近于55,400Da分子量标记观察到(单链)，考马斯蓝染色的凝胶中的任何另外条带的相对百分比强度对于参考材料应≤2％。注：由于其的非高斯分布，主要条带的分子量估计无法精确测定。还原的参考材料的目测检查产生迁移至接近55,400Da分子量标记的位置的单个宽条带(参见图79)。关于还原的主要条带的百分比纯度必须≥97％。非还原的参考材料主要条带的目测检查必须产生迁移至接近97,400Da和116,300Da分子量标记的位置的单个宽条带(参见图79，泳道2)。参考材料主要条带的百分比纯度必须≥97％。非还原的参考材料主要条带的目测检查必须产生迁移至接近97,400Da和116,300Da分子量标记的位置的单个宽条带(参见图79，泳道2)。参考材料主要条带的百分比纯度必须≥97％。
实施例57－用于定量检测CTLA4 A29YL104E -Ig中的TRITONX-100的HPLC法
Triton X-100通过HPLC在CTLA4A29YL104E-Ig的蛋白质样品中以低百万分之(ppm)水平(<10ppm)检测到。该方法涉及在固相萃取介质上萃取Triton X-100，随后用水洗涤以去除残留蛋白质和用乙腈洗脱Triton X-100。乙腈洗脱物使用Phenomenex Hypersil C1柱和由乙腈：水(80：20)组成的流动相进行层析。检测经过UV在225nm处。该方法在1－22ppm之间是线性的，其中检测极限为0.25ppm。潜在的免疫抑制剂CTLA4A29YL104E-Ig是第二代融合蛋白，由细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)的配体结合结构域和人IgG1重链的恒定区组成。非离子型表面活性剂Triton X-100在CTLA4A29YL104E-Ig的纯化中用于病毒灭活。尽管TritonX-100被去除，但为了产物品质和调节目的，需要确定来自蛋白质的表面活性剂的残留水平或不存在。为此，开发了能够检测和定量痕量水平的Triton X-100的方法。对于经由HPLC的分析，Triton X-100在SPE介质上从蛋白质中进行萃取且用乙腈进行洗脱。
标准制备
空白。先前通过这种方法进行分析且未发现包含可检测水平的Triton X-100的任何样品或参考标准可以用作空白。空白和样品中的蛋白质浓度应是相似的。空白应连同样品一起运行。
标准贮存液。精确称量10.01.0mg Triton X-100，加入100mL体积中，且用水稀释至体积且混合。注：Triton X-100在水中缓慢溶解。在使用前检查溶液的完全溶解(一般在15分钟后)。Triton X-100比水更粘稠，因此未溶解的量在水的存在下可见。
标准工作溶液。将25μL Triton X-100标准贮存液掺入0.5mL CTLA4A29YL104E-Ig空白内。通过涡旋或其他合适的方式充分混合。这种标准工作溶液包含约5ppm(或5μg/mLwt.vol.)Triton X-100。注：标准溶液应每天新鲜制备。
样品制备。样品按现在样子使用。空白应连同样品一起运行。从标准和样品溶液中萃取Triton X-100。下述萃取步骤在3－5英寸Hg的真空下进行。
固相萃取(SPE)介质的激活。将真空多支管的盖提起，且将架中的试管置于多支管内。这些是“废物”试管。将盖复位且将SPE管置于真空多支管上，从而确保在每个SPE管下存在“废物”试管。向每个管中加入1mL乙腈，且对管应用真空直至所有乙腈已通过介质床。重复步骤。得自标准/样品基质的SPE介质上Triton X-100浓度。向分开活化的SPE管内移液各0.5mL的标准工作溶液、样品和空白。对SPE管应用真空直至溶液已完全通过介质床。从SPE床中去除残留蛋白质。向每个SPE管中加入1mL水，且对管应用真空直至水已通过介质床。重复步骤。从SPE床中洗脱Triton X-100。关闭对多支管的真空以使单元达到常压。使多支管的盖轻轻提起，使标准和样品SPE管仍附着。用一组预标记的试管(对于标准、空白和样品)替换“废物”试管，以收集在下述步骤中可能从SPE床中洗脱的任何Triton X-100。这些是洗脱物试管。使多支管的盖复位，从而确保每种样品、空白和标准SPE床在其下具有分别的洗脱物试管。向每个SPE管中加入0.50mL乙腈，且对管应用真空直至所有乙腈已通过介质床。关闭对多支管的真空，并且提起盖子以回收洗脱物试管。将标准、样品和空白的乙腈洗脱物置于自动进样器小瓶内用于注射入层析系统内。
系统适合性
在开始注射前用流动相使柱/系统平衡约1小时。获得标准溶液的层析谱。关于Triton X-100的保留时间应为51分钟。当根据下面等式计算时，作为理论塔板数N评估的关于Triton X-100的柱功效必须>2000板/柱：
其中：
t是Triton X-100峰的保留时间，且w是通过将峰侧外推至基线获得的在TritonX-100峰基线处的宽度。进行标准溶液的至少3次注射。最后3次注射的面积计数的百分比RSD不应超过3.0％。
用下述计算从标准和样品层析谱中扣除空白层析谱且进行：Triton X-100的浓度(ppm)＝
其中：
实施例58－用于测定CTLA4-Ig组合物CHO细胞DNA含量的测定
开发这种程序以使用实时定量聚合酶链反应(qPCR)测定来检测CTLA4-Ig药品样品中残留的CHO DNA。PCR是DNA混合物的复制。这种测定使用荧光探针以检测特异性CHOPCR产物，因为它在测定期间积聚。PCR产物的扩增率与样品中存在的起始DNA的量成正比。目的是检测CTLA4-Ig组合物的样品中的CHO基因组DNA量。
样品通过定量聚合酶链反应分析经由检测生物样品中的CHO DNA进行分析。进行计算且结果报告至以pg/mg为单位的2个有效数字。如果结果小于测定的定量极限，那么结果报告为<Q.L.，且记录测定的Q.L.。将DNA值转变成皮克/毫克。将pg/mL值除以通过在280nm处的吸光度测定的样品浓度。关于具有50mg/mL的蛋白质浓度和由Bioreliance报告的值＝0.67fg/μL的样品的例子计算。步骤1：转变成pg/mL＝0.67pg/mL。步骤2：转变成pg/mg＝(0.67pg/mL/50.0mg/mL)＝0.013pg/mg。
实施例59－测定生物样品和CTLA4-Ig组合物中的MCP-1蛋白质
该实施例阐述用于定量生物样品和CTLA4-Ig样品中残留的MCP-1样蛋白质的方法。
材料：
试剂
磷酸缓冲盐水(PBS，10mM磷酸盐缓冲液，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.3－7.5)。根据瓶上的制造商的指导制备。向足够大小的容器中加入HPLC等级水、PBS团块和搅拌棒。在搅拌板上混合直至团块和盐溶解。必要时用氢氧化钠或盐酸调整pH 7.3－7.5。搅拌直至充分混合。通过一次性的0.22μm过滤器单元过滤。溶液从制备日期起在2－8℃下贮藏最多30天。
MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)是在单核细胞召募至损伤和感染位点中起作用的人蛋白质。基于与针对MCP-1的抗体的同源性和交叉反应性，蛋白质可以视为MCP-1样。因为在ELISA中使用的抗体仅识别靶蛋白的部分，所以截短形式的MCP-1可以在测定法中反应，尽管它们不是技术上活性的。因此将定量在测定中反应的仓鼠MCP-1的任何变体，从而使得该测定检测全长MCP-1和包含正确表位的MCP-1的任何变体。应当指出通过使用多克隆抗体混合物，更可能将提出许多表位。
洗涤溶液(包含0.01％v/v Tween 20的1.0mM磷酸盐缓冲液，137mM NaCl，0.27mMKC1，pH 7.3－7.5)。向4.0L蒸馏或HPLC等级水中加入搅拌棒、2个PBS片剂、28.8g NaCl和0.4mL Tween 20。轻轻混合直至所有内容物溶解。必要时用氢氧化钠或盐酸调整pH 7.3－7.5。从制备日期起在2－8℃下贮藏最多30天。
稀释剂(包含1％w/v BSA和0.05％v/v Tween 20的PBS，pH 7.3至7.5)(应指出这是使用商购可得的稀释剂的替代方案)。向4L磷酸缓冲盐水中加入搅拌棒、40g BSA和2mLTween 20。轻轻混合直至所有内容物溶解。通过0.22μm滤器过滤。当未启封贮藏时从制备日期起在2－8℃下贮藏最多30天，或打开后7天。
板包被试剂。根据制造商的说明书重构几小瓶山羊抗小鼠MCP-1抗体，通过轻轻倒转几次混合且组合。制备等分试样且贮藏于-20℃最多1年(不超过制造商的失效期)。避免反复冷冻融解。可替代地，冻干的样品小瓶可以贮藏于-20℃超过6个月。重构后，抗体可以贮藏于2－4℃1个月。
次级试剂。根据制造商的说明书重构1小瓶兔抗大鼠MCP-1抗体，通过轻轻倒转几次混合。该溶液贮藏于2－8℃最多4周。可替代地，冻干的样品小瓶可以在-20℃下稳定超过1年。
三级试剂。合并几小瓶山羊抗兔IgG(H+L)HRP且通过轻轻倒转几次混合。制备等分试样且贮藏于-20℃最多2年(不超过制造商的失效期)。避免反复冷冻融解。一旦解冻，小瓶就可以在2－8℃下贮藏最多30天。
标准的制备。由MCP-1样蛋白质原液在稀释剂中制备25.6ng/mL溶液，且由此以连续稀释(2倍)步骤稀释至12.8、6.4、3.2、1.6、0.8和0.4。0ng/mL标准是未稀释的稀释剂。
关于使用原液浓度为0.97mg/mL的MCP-1参考材料制备标准的例子：
a)(溶液A)在稀释剂中制备2.5mL的5200ng/mL：
13.4uL原液+2.487mL稀释剂
b)(溶液B)在稀释剂中制备3.9mL的25.6ng/mL：
19.2uL原液a+3.881mL稀释剂
使用下文限定的体积制备剩余的标准：
终浓度
通过在中等设置下涡旋约2－3秒且随后轻轻倒转2－3次混合每种溶液。
质量对照样品的制备。在稀释剂中由MCP-1样蛋白质小瓶制备质量对照(QC)样品。制备520ng/mL贮存液浓度，由其制备下述质量对照样品用于冷冻：11.0ng/mL、5.3ng/mL和1.2ng/mL。如下表中所述稀释。
关于使用原液浓度为0.97mg/mL的MCP-1参考材料制备QCs的例子：
a)(溶液A)在稀释剂中制备2.5mL的5200ng/mL：
13.4uL原液+2.487mL稀释剂
b)(溶液B)在稀释剂中制备5.0mL的520ng/mL：
500uL原液a+4.500mL稀释剂
c)如下制备MCP-1样蛋白质QC样品的最终稀释物：
通过在中等设置下涡旋约2－3秒且随后轻轻倒转2－3次混合每种溶液。
测试样品的制备。每种测试样品由稀释的测试物品组成。测试样品通过将200μL测试样品加入200μL稀释剂中进行制备。通过以中等速度涡旋约2－3秒且随后轻轻倒转2－3次混合每种溶液。
程序。板包被。用PBS将山羊抗小鼠MCP-1抗体稀释至5μg/mL。通过在中等设置下涡旋约2－3秒且随后轻轻倒转2－3次混合抗体和PBS溶液。使用多道移液器，向每个孔中加入100μL这种溶液。用板封闭器覆盖板且在室温下温育12－18小时。板洗涤。使用板洗涤器用洗涤溶液将板洗涤3次。洗涤器设定为3次洗涤、300μL/孔与零浸泡时间。可替代地，板可以进行手工洗涤。使用多道移液器将300μL洗涤溶液加入每块板的每个孔中。通过轻打到槽内来倒空孔，并且在纸巾上轻轻吸干。重复3次。板封闭。使用多道移液器将300μL CSBB加入每个孔中。使板在室温下温育约60±10分钟。样品添加。向板中一式三份、100μL/孔地添加参考标准、质量对照(每种浓度2组)和测试样品，且在室温下温育约60±10分钟。不使用外部孔。制备兔抗大鼠MCP-1第二抗体。在稀释剂中将兔抗大鼠MCP-1抗体原液稀释至2μg/mL或合适的稀度(根据批次等价测试或COA)，其体积足够用于在测定中使用的板。使溶液以中等速度涡旋约2－4秒。重复板洗涤，但洗涤5次。使用多道移液器将100μL第二抗体溶液加入每个孔中，并且在室温下温育60±10分钟。使用稀释剂制备三级山羊抗兔HRP缀合物溶液(0.5μg/mL或合适的稀度)。通过在中等设置下涡旋约2－3秒且随后轻轻倒转2－3次混合HRP缀合物。稀释至根据部门SOP确定的浓度用于试剂限定。使板洗涤重复5次。使用多道移液器，向每个孔中加入100μL HRP缀合物且在室温下在黑暗中温育约30±5分钟。使板洗涤重复5次。使用多道移液器，向每个孔中加入100μL TMB且在环境温度下在黑暗中温育约2.5－4分钟。使用多道移液器，通过以与TMB添加进行的相同顺序加入100μL 1.0N H2SO4来终止TMB反应。在96孔板阅读器上用630nm的参考波长读取在450nm处的光密度。
示例性值。关于标准的示例性值应用于在定量界限(QL)(0.8ng/mL)处或其上的那些值，因为低于QL的值仅用于帮助确定曲线的极限值。使用下述计算的平均背景(0ng/mL标准)必须≤0.1吸收单位。
其中：X1,2,3＝一组数据中的特定值
N＝一组数据中的值的数目
用于测定标准曲线的每个标准浓度，排除0、0.4和QL(0.8ng/mL)，必须在靶(标称)值的15％内。用于测定标准曲线的每个标准浓度时一式三份AB450值的变异系数(％CV)，排除0、0.4和QL(0.8ng/mL)，必须≤15％。对于CTLA4-Ig组合物的测试样品计算的平均MCP-1浓度应≤11.0ng/mL。如果计算的平均MCP-1浓度≥0.8ng/mL(测定QL)，那么计算一式三份测定的％CV且示例性值必须≤20％。如果示例性值符合，那么平均MCP-1浓度用于计算ppm。如果计算的MCP-1浓度≤0.8ng/mL(测定QL)，那么样品报告为<QL且值“<0.8ng/mL”用于计算ppm。一式三份测定的％CV不予以考虑。
QC样品在指定浓度时定义为一组3个孔，因此对于在这种方法中指定的3种标称浓度存在总共6个QC样品。为了QC样品可接受，关于QC样品的3个孔中的至少2个的浓度必须在指定的标称浓度的20％内。18个QC样品测定中的至少12个必须在其各自靶值的20％内。18个QC样品中的6个(不是相同浓度时的3个)可以偏离各自的标称值超过20％。6个QC样品中的至少4个必须是可接受的。2个允许是不可接受的，前提是它们不是在相同浓度时的2个。
数据评估。使用SoftmaxTM软件与规程文件MCP-1.ppr以使用下式的未加权4参数回归来构建标准曲线。
其中：
A＝对应于最小渐近线的吸光率450值。
D＝对应于最大渐近线的吸光率450值。
c＝对应于最大和最小渐近线值之间的一半绝对差异的浓度。
b＝曲线的线性部分的近似斜率。
x＝参考标准的浓度。
关于MCP-1样蛋白质浓度的计算。测试样品中的MCP-1样蛋白质的量可以使用Softmax板阅读器软件进行计算。下文的例子举例说明可以如何报告最终结果。测定每种样品的2倍稀释。将计算的浓度乘以合适的稀释因子(2)以产生在未稀释的测试物品中的浓度。
例子：
1)稀释的测试样品为10.0ng/mL。
未稀释的测试物品中的MCP-1样蛋白质浓度为：
10ng/mL x 2＝20ng/mL MCP-1
2)稀释的样品结果为“<0.8ng/mL”。
未稀释的测试物品中的MCP-1样蛋白质浓度为：
“<0.8ng/mL”x2＝“<1.6ng/mL”MCP-1
为了以ng MCP-1样蛋白质/mg样品(ppm)报告最终结果，将上文获得的结果除以未稀释的样品浓度。
例子：
1)测试样品蛋白质浓度＝50mg/mL
MCP-1样蛋白质浓度＝200ng/mL：
200ng/mL MCP-1/50mg/mL＝4ng/mg
样品报告为4ppm(百万分之)
2)测试样品蛋白质浓度＝50mg/mL
MCP-1样蛋白质浓度＝“<1.6ng/mL”：
“<1.6ng/mL”MCP-1/50mg/mL＝“<0.032ng/mg”
样品报告为“<QL,(<0.032ppm)”
实施例60：对于CTLA4-Ig药品材料的释放测试通过ELISA用于测定CD-CHO1蛋白质 的残留水平的测定
碳酸盐缓冲液。向包含搅拌棒的合适容器中加入200mL HPLC等级水，2个碳酸盐缓冲液胶囊的内容物。使用搅拌板混合直至材料在溶液中。必要时使用1N NaOH或H2SO4用pH计将pH调整至9.6。使用搅拌板使溶液混合最少5分钟。通过0.22μm滤器过滤溶液。溶液在2－8℃下贮藏最多30天且根据部门程序标记。
洗涤缓冲液(包含0.05％v/v Tween 20的PBS，pH 7.4)。向4L HPLC等级水瓶中加入搅拌棒、20个PBS片剂，加入2mL Tween 20。使用搅拌板混合直至材料在溶液中。必要时使用1N NaOH或1N HCl用pH计将pH调整至7.4。使用搅拌板使溶液混合最少5分钟。溶液在2－8℃下贮藏最多30天且根据部门程序标记。
链霉抗生物素蛋白-HRP。向链霉抗生物素蛋白-HRP的小瓶中加入0.5mL HPLC等级水。为了混合，给小瓶盖上盖子且轻轻涡旋约10秒。将0.5mL甘油加入链霉抗生物素蛋白-HRP的小瓶中。混合。通过将溶液抽取到干净的巴斯德吸管内来检查溶液的澄清度。如果溶液不澄清，那么根据3.3.2混合且重复3.3.5直至溶液澄清。根据部门程序确定用于链霉抗生物素蛋白HRP批次的合适的稀释方案。将20μL体积等分试样到0.5mL螺口管中。盖上盖子且置于细胞贮藏盒中。溶液在-20℃下贮藏最多365天且根据部门程序标记。
终止溶液(1N H2SO4)。在烟雾通风橱中将合适的容器放置在搅拌板上。加入搅拌棒。加入485.6mL HPLC等级水。打开搅拌板以开始水的搅拌。缓慢加入14.4mL浓H2SO4。当在室温下贮藏时，溶液对于90天是稳定的。根据部门程序标记溶液。
程序。板包被。在用于包被微量滴定板的碳酸盐缓冲液中制备纯化的兔抗CD CDCHO1抗体的8μg/mL溶液(每块微量滴定板需要10mL溶液)。使用多道移液器将100μL这种溶液加入Immulon 4微量滴定板的每个孔中。用石蜡膜覆盖微量滴定板且于2－8℃温育18±2小时。
板洗涤和封闭。使用板洗涤器仪器用300μL洗涤缓冲液将板洗涤3次。(可替代地，板可以使用多道移液器进行手工洗涤。)最后一次洗涤后。板应颠倒且针对放在硬表面上的纸巾轻拍。
板封闭。使用多道移液器将300μL SeaBlock加入每个孔中。使板在室温下在黑暗中温育1小时(±6分钟)。板可以用铝箔进行包裹或置于橱柜或抽屉中。根据下文的稀释方案，使用Teknova稀释剂在15mL有刻度的无菌聚丙烯管中制备标准曲线样品。注：下文的稀释方案用于5块板。必要时对于测定中的板数目调整体积。由分析证明书(COA)获得CD-CHO1蛋白质参考标准(Ref Std)的蛋白质浓度。制备CD-CHO1蛋白质Ref Std的30μg/mL溶液。计算获得30μg/mL溶液所需的CD-CHO1蛋白质Ref Std体积。关于CD-CHO1蛋白质Ref Std的最小转移体积应为10μL。
公式：
注：确保单位是相容的。
例子：
通过从所需体积中减去CD-CHO1蛋白质Ref Std的需要体积来计算稀释剂的体积。
公式：(所需体积)-(Ref Std体积)＝(稀释剂体积)
例子：10.0mL–0.012mL＝9.988mL稀释剂
将计算的CD-CHO1蛋白质Ref Std体积加入包含计算的稀释剂体积的15mL无菌管中。给管盖上盖子且在设置下涡旋2－4秒。制备剩余的标准。下表作为例子显示：
每个稀释步骤后给管盖上盖子，并且在进展至下一个稀释步骤前轻轻涡旋2－4秒。
根据下文的稀释方案，使用Teknova稀释剂在15mL有刻度的无菌聚丙烯管中制备质量对照(QC)溶液。由分析证明书(COA)获得CD-CHO1蛋白质参考材料(RefMat)的蛋白质浓度。制备CD-CHO1蛋白质参考标准(Ref Mat)的30μg/mL溶液。给管盖上盖子且在之间的设置下涡旋2－4秒。制备浓度为700、100和25ng/mL的QC溶液。实例稀释方案显示于下文：
给关于每种QC溶液的管盖上盖子且轻轻涡旋2－4秒。质量对照溶液可以在测定当天时新鲜制备或它们可以进行等分且冷冻。在3次独立实验中测定3种QC溶液的实际浓度。求关于每种QC溶液来自3次实验的结果的平均值且发出关于3种QC溶液中每一种的COA。当对CTLA4-Ig样品执行分析时，这些实验上测定的QC浓度将用作靶值。将QC溶液以即用的等分试样贮藏于-70℃。QC溶液在制备后6个月到期。在测定当天时从贮藏中取出QC溶液且在室温下解冻。在使用前使解冻的QC溶液以中等速度涡旋2－4秒。
样品制备。通过将250μL药品样品加入750μL稀释剂中，在稀释剂中制备关于每种待分析的CTLA4-Ig样品的约12.5mg/mL溶液。给管盖上盖子且轻轻涡旋2－4秒。通过将40012.5mg/mL溶液加入包含400μL稀释剂的管中，制备关于每种待分析的CTLA4-Ig样品的6.25mg/mL溶液。给管盖上盖子且轻轻涡旋2－4秒。通过将4006.25mg/mL溶液加入包含400μL稀释剂的管中，制备关于每种待分析的CTLA4-Ig样品的3.125mg/mL溶液。给管盖上盖子且轻轻涡旋2－4秒。通过重复洗涤步骤来洗涤板。向封闭且洗涤的板中一式三份地添加100μL/孔的每种标准浓度、样品和QC溶液。每种QC溶液添加2次至总共6个孔/板。在黑暗中在室温下温育1小时(±6分钟)。重复洗涤5次。从冷冻机中取出链霉抗生物素蛋白-HRP且允许达到室温。在Teknova缓冲液将兔抗CD CHO1-生物素抗体稀释至2μg/mL。使溶液以中等速度涡旋约2－4秒。使用多道移液器添加100μL/孔。在黑暗中在室温下温育1小时(±6分钟)。根据部门程序，基于试剂批次的限定将链霉抗生物素蛋白-HRP稀释至确定用于在测定中使用的浓度。盖上盖子且使溶液以中等速度涡旋约2－4秒。使用多道移液器向每个孔中添加100μL链霉抗生物素蛋白-HRP稀释物。在黑暗中在室温下温育1小时(±6分钟)。重复。使用多道移液器向每个孔中添加100μLTMB色原。在环境温度下温育2分钟(±12秒)。使用多道移液器添加100μL/孔终止溶液(1N H2SO4)。以与色原添加的相同顺序向板和孔中加入终止溶液，以确保每个孔中色原与酶相同的反应时间。使用SpectraMax Plus板阅读器，在合适的96孔板阅读器上用630nm的参考波长测量在450nm处的吸光度。
数据评估。参考Softmax程序模板，因为它产生平均值、标准差和％CVs等。使用对于测定的每种参考、QC和样品稀释物获得的一式三份的吸光度值测定每个示例性值。产生标准曲线。使用下式的4参数回归对参考标准数据建模。
其中：
AB＝在450纳米处的吸光率
A＝对应于最小渐近线的吸光率值
D＝对应于最大渐近线的吸光率值
c＝对应于最大和最小渐近线值之间的一半绝对差异的浓度
B＝曲线的线性部分的近似斜率
C＝CD-CHO1参考材料的浓度
使用上式使用计算的平均值测定关于标准的回归线的决定系数(R2)。计算样品中的CD-CHO1浓度。将平均样品结果乘以合适的稀释因子(即4、8和16)，以获得以ng/ml表示的原始样品中的CD-CHO1浓度。将结果除以报告的CTLA4-Ig蛋白质浓度(mg/ml)，以获得以ng/mg表示的CTLA4-Ig的CD-CHO1浓度。测定所有结果的平均值，这落在标准曲线的范围内。通过应用稀释因子计算未稀释样品中的CD-CHO1蛋白质浓度。为了测定相对于CTLA4-Ig样品浓度的CD-CHO1蛋白质浓度，除以未稀释的浓度。
例子计算：
注：ng CD CHO1mg产物(ng/mg)等价于百万分之(ppm)。
示例性值。关于标准的示例性值。关于标准曲线的决定系数(R2)应≥0.99。关于0ng/mL标准的平均背景应≤0.10吸收单位。如通过软件测定的，在用于测定标准曲线的每个标准浓度时计算的值(ng/mL)的平均值，排除0和低于QL的浓度(12.3ng/mL)，必须在靶(标称)值的20％内。如通过软件测定的，在用于测定标准曲线的每个标准浓度时一式三份的吸光度值的变异系数(％CV)，排除0和低于QL的浓度(12.3ng/mL)，必须小于20％。为了确保至少2个适合的数据点可用于计算，将标准、质量对照和样品装载在一式三份的孔中。分开分析每个一式三份的值。放弃位于离靶最远的值。
例子：
位于离50ng/mL的靶值最远的单个值为25ng/mL。通过从一式三份中排除25ng/mL值，剩余值的平均值符合所有示例性值。
如果显示剩余2个值的平均值仍不符合示例性值，那么排除单个点且重新计算曲线。
例子：
平均值距离靶>20％，不管哪个值被排除，因此，单个点从曲线中被放弃且曲线将进行重新计算。在标准曲线上仅可以排除2个点。
关于QC样品的示例性值。QC样品在指定浓度时定义为一组3个孔，因此对于在这种方法中指定的3种标称浓度存在总共6个QC样品。为了QC样品可接受，关于QC样品的3个孔中的至少2个必须在QC样品的标称的20％内。如通过软件计算的，6个QC样品中的至少4个必须在其各自靶浓度的20％内；6个QC样品中的2个(不是相同浓度时的2个)可以超过20％偏离标称。18个QC样品孔中不超过6个可以偏离各自的靶浓度超过20％。
关于测试样品的示例性值。关于测定的测试样品的平均吸光度必须小于标准曲线上的最高点。如果样品的平均吸光度超过平均吸光度3000ng/mL标准，那么测试样品必须充分稀释，以便获得3000至12.3ng/mL的平均吸光度。对于可报告的结果，3种样品稀释物(12.5、6.25和3.125mg/mL)中的至少一种的平均吸光度必须落在标准曲线的范围内，除非关于所有稀释物的平均吸光度都低于QL(12.3ng/mL标准)的平均吸光度。在那种情况下，测试样品报告为<QL。如通过软件测定的，大于QL且落在标准曲线的范围内的样品稀释物的一式三份吸光度值的平均值必须显示小于20％的CV。如果一式三份吸光度之一消除且重新计算后CV仍>20％，或如果2个样品稀释度具有吸光度大于20％的CV's且落在标准曲线的范围内，那么这种样品的分析必须进行重复。
实施例61－关于CTLA4-Ig组合物中残留的Triton X-100量的测定
材料
试剂制备
流动相制备。：乙腈：水(80：20)。对于1L，用搅拌棒充分混合800mL乙腈和200mL纯化或HPLC等级水。通过0.2μm尼龙滤器过滤。使用轴向脱气装置例如Alliance系统或使用氦喷射使流动相脱气。每天新鲜制备。
2N NaOH。称量且定量转移80±1g固体NaOH至1L瓶。用纯化或HPLC等级水达到体积。用搅拌棒充分混合且通过0.2μm过滤器装置过滤。可替代地，连续稀释10N NaOH溶液。在室温下贮藏最多6个月。
药品缓冲液。称量且定量转移3.45g NaH2PO4·H20和2.92g NaCl至1L瓶。加入约800mL纯化或HPLC等级水。用搅拌棒充分混合且用纯化或HPLC等级水达到体积。用2N NaOH使pH调整至7.5。通过0.2μm过滤器装置过滤。在4℃下贮藏最多4个月。
标准样品空白的制备。先前进行分析且未发现包含可检测水平的Triton X-100的任何CTLA4-Ig样品或参考材料都可以用作样品空白。样品空白蛋白质应连同样品一起运行。Triton X-100在水中缓慢溶解。在使用前检查溶液的完全溶解(一般在15分钟后)。Triton X-100比水更粘稠，因此未溶解的量在水的存在下可见。
制备10.0μg/mL Triton X-100原液标准#1。将10.0±1.0mg Triton X-100准确称量到100mL容量瓶内且用水稀释至体积；并且用搅拌棒轻轻混合。标记为TX100原液标准A。将10mL TX100原液标准A放入100mL容量瓶内。用水稀释至体积。标记为TX100原液标准#1。每天新鲜制备。
制备10.0μg/mL Triton X-100原液标准#2。将10.0±1.0mg Triton X-100准确称量到100mL容量瓶内且用水稀释至体积；并且用搅拌棒轻轻混合。标记为TX100原液标准B。将10mL TX100原液标准B放入100mL容量瓶内。用水稀释至体积。标记为TX100原液标准#2。每天新鲜制备。
TX100系统适合性评估溶液#1(SS#1)的制备。通过用300μL乙腈稀释300μL TX100原液标准#1，由TX-100原液标准#1制备5.0μg/mL TX100系统适合性评估溶液。通过上下移液充分混合。
TX100系统适合性评估溶液#2(SS#2)的制备。通过用300μL乙腈稀释300μL TX100原液标准#1，由TX-100原液标准#2制备5.0μg/mL TX100系统适合性评估溶液。通过上下移液充分混合。
TX100经过对照、限制标准、失败对照的制备。由TX原液标准#1制备下表中鉴定的溶液。
样品的制备。使用没有浓缩或稀释的样品。程序：从标准和样品溶液中萃取TritonX-100。注意：下述萃取步骤在3－3.5英寸Hg的真空下进行。
固相萃取(SPE)介质的激活。将真空多支管的盖提起，且将架中的空12x75mm试管置于多支管内。这些是“废物”试管。将盖复位且将SPE柱体置于真空多支管上，从而确保在每个SPE管下存在“废物”试管。向每个SPE柱体中加入1000μL乙腈，且应用真空直至所有乙腈已通过介质床。用另外1000μL乙腈重复。向每个SPE柱体中加入500μL纯化或HPLC等级水，并且应用真空直至所有水已通过介质床。用另外500μL纯化或HPLC等级水重复。
关于限制标准和对照的SPE介质上的Triton X-100浓缩。将各500μL的限制标准、经过对照、失败对照空白和样品移液到分开活化的SPE柱体内。对SPE管应用真空直至每种溶液已完全通过介质床。
从SPE床中去除残留蛋白质。向每个SPE柱体中加入1000μL水，且对管应用真空直至水已通过介质床。用另外1000μL水重复步骤。
从SPE床中洗脱Triton X-100。关闭对多支管的真空以释放单元压力至零。使多支管的盖轻轻提起，使SPE柱体仍附着。用一组预标记的“洗脱物”试管或自动进样器小瓶(预标记的限制标准、经过对照、失败对照、空白和样品)替换“废物”试管，以收集从SPE床中洗脱的任何Triton X-100。使多支管的盖复位，从而确保每种限制标准、经过对照、失败对照、空白和样品SPE柱体在其下具有各自的洗脱物试管或自动进样器小瓶。向每个SPE柱体中加入500μL乙腈，且对管应用真空直至所有乙腈已通过介质床。关闭对多支管的真空，并且提起盖子以回收洗脱物试管或自动进样器小瓶。如果使用洗脱物试管，则将限制标准、经过对照、失败对照、空白和样品的乙腈洗脱物置于自动进样器小瓶内用于注射到层析系统内。如果使用自动进样器小瓶收集洗脱物，那么将小瓶直接置于层析系统内。
运行条件
系统适合性。设立层析系统；在分析前允许灯加温和系统用流动相平衡至少1小时。SS#1注射最少4次。除非另有说明，对于所有系统适合性分析使用第二次SS#1注射。关于Triton X-100的保留时间应为5.0±1分钟。当根据下面等式计算时，作为理论塔板数(N)评估的关于Triton X-100的柱功效必须≥2000板/柱：
其中：
t＝从注射时间到峰最大值的洗脱时间测量的Triton X-100峰的保留时间。
w＝是通过将峰侧面外推至基线测得的Triton X-100峰的宽度。
Triton X-100峰和最邻近的峰(如果存在的话)之间的分辨率必须≥1。
其中：
t＝标准中的Triton X-100峰和邻近峰的保留时间。
W＝通过将峰侧面外推至基线获得的峰基线的相应宽度。
使用下面等式计算最后3次SS#1的注射的响应因子：
其中：
A＝Triton X-100峰的面积
W＝在相应的TX100原液标准溶液的制备中使用的Triton X-100重量(mg)
SS#1的最后3次注射的响应因子必须具有≤10％的相对标准差(RSD)。使用下面等式计算％RSD：
％RSD＝标准差/平均值×100
其中：
n＝样品中的测量数目
x＝个别测量
比较SS#2的单次注射的响应因子与SS#1的最后3次注射的平均响应因子。SS#2响应因子和3次SS#1注射的平均响应因子之间的百分比差异必须≤10％。使用下面等式计算百分比差异。
其中：
RF1＝关于3次SS#1注射的平均响应因子
RF2＝SS#2的响应因子
进行SPE后样品空白的单次注射。如果发现Triton X-100水平，那么再施行样品空白的2次注射。如果存在Triton X-100，那么弃去CTLA4-Ig药品，并且用先前进行分析且发现未包含可检测水平的Triton X-100的CTLA4-Ig药品的新批次制备新限制标准和对照。如果上述示例性值不符合，那么使柱的平衡延长另一小时且再次注射标准溶液。如果示例性值仍不符合，那么执行下述步骤。检查渗漏，从而确保所有管道连接是牢固的。如果延长的平衡不起作用，那么调整流动相的有机内容物和/或制备流动相的新批次，且重新制备SS#1和SS#2。如果延长的平衡和/或流动相调整没有导致示例性值符合，那么更换柱。重复前平衡至少1小时。
注射顺序。HPLC系统的初步平衡和上述的成功运行。进行SPE后药品缓冲液的单次注射，参考上文部分作为校正空白。观察到不存在Triton X-100应答。如果在Triton X-100峰的保留时间时存在峰，那么继续注射空白直至未记录到应答。进行SPE后CTLA4-Ig药品的单次注射，参考上文部分作为样品空白。观察到不存在Triton X-100应答。在进行数据处理前，这个层析谱将从标准、对照和样品层析谱中被扣除。进行经过对照、限制标准和失败对照的一式两份注射。进行药品缓冲液的单次注射，且必须未记录到triton X-100应答。进行样品的一式两份注射。样品注射与限制标准的一式两份注射和药品缓冲液的1次注射一起进行，从而使得在一起进行的限制标准和药品注射之间存在不超过10次样品注射。运行的结束必须以限制标准的一式两份注射和药品缓冲液空白的1次注射来完成。
数据处理。在进行数据处理前，从所有标准、对照和样品层析谱中扣除样品空白注射的层析谱。确保在限制标准、对照和样品层析谱中Triton X-100峰适当地积分。样品中的Triton X-100峰如果存在，则必须在与限制标准相同的保留时间窗内。求每组一式两份注射的峰面积的平均值。一式两份注射必须具有峰面积中≤10％的％差异。如果限制标准、经过对照或失败对照的一式两份注射不符合这个标准，那么整个运行视为无效的且将需进行重复。如果样品的一式两份注射不符合这个标准，那么样品视为无效的且将需进行重复。所有其他样品、对照和标准视为有效的，只要它们符合≤10％标准。关于所有一起进行的限制标准中的Triton X-100峰的平均峰面积，包括最后一次注射，必须在限制标准的最初平均峰面积的10％内。如果任何中间物限制标准未能符合10％的比较要求，那么在最后通过限制标准后分析的所有样品视为无效的且将必须进行重新分析。
限制标准、经过对照、失败对照样品的评估。比较关于限制标准、经过对照和失败对照的平均Triton X-100峰面积。失败对照样品的峰面积必须大于限制标准的那种。经过对照样品的峰面积必须小于限制标准的那种。如果2个条件都符合，那么继续样品的评估。
样品的评估。限制标准的平均Triton X-100峰面积必须进行如下校正，以解释Triton X-100原液标准#1的制备中称量的材料量：
AL＝ALS X(10.00mg/Wt.)
其中：
AL＝校正至0.5μg/mL限制的峰面积
ALS＝一起进行的限制标准的平均Triton X-100峰面积
注：AL是在0.5μg/mL限制时校正的面积且将用于与样品的比较。
比较来自样品的平均Triton X-100峰面积与AL。如果峰面积≤AL，那么样品通过具体要求。如果峰面积>AL，那么样品未通过具体要求。将通过具体要求的结果报告为“<0.50ppm”，或未通过具体要求的报告为“>0.50ppm”，或如由报告惯例所需的其他方式。
实施例62－定量CTLA4-Ig药品材料中的残留A蛋白量的测定。
材料
兔抗A蛋白抗体 Sigma,(目录号P3775)
生物素化的抗A蛋白单克隆抗体 Sigma,(目录号B3150)
试剂
碳酸盐包被缓冲液。向合适的容器中添加；加入搅拌棒。加入500mLHPLC等级或Millipore水。加入5个碳酸盐胶囊的内容物。搅拌直至充分混合。检查且使用NaOH(1.16)或HCl(1.23)使pH调整至9.6±0.1。将溶液倾入500mL过滤灭菌系统内。应用真空以使溶液过滤灭菌。在无菌条件下取出过滤器单元且给瓶盖上盖子。当在2－8℃下贮藏时，溶液对于30天是稳定的。将溶液标记为“碳酸盐包被缓冲液”。洗涤缓冲液：(PBS+0.05％Tween 20)：向4L HPLC等级或Millipore水瓶中添加；加入搅拌棒。加入20个PBS片剂。加入2.0mL Tween20。检查且使用NaOH或HCl使pH调整至7.4±0.1。使用搅拌板搅拌直至充分混合。当在2－8℃下贮藏时，溶液对于30天是稳定的。将溶液标记为“洗涤缓冲液”。终止缓冲液(1N H2SO4)或使用来自VWR的1.000当量硫酸，无需稀释。在烟雾通风橱中将合适的容器放置在搅拌板上：加入搅拌棒。加入485.6mL HPLC等级或Millipore水。打开搅拌板以开始水的搅拌。缓慢加入14.4mL浓H2SO4。当在室温下贮藏时，溶液对于30天是稳定的。将容器标记为“终止溶液”。
乙酸盐缓冲液(0.5M乙酸，0.1M氯化钠，0.1％Tween 20，pH 3.5)。在烟雾通风橱中将合适的容器放置在搅拌板上：加入搅拌棒。加入400mL HPLC等级或Millipore水。打开搅拌板以开始水的搅拌。缓慢加入14.8mL浓冰醋酸。搅拌直至充分混合。加入2.9克氯化钠。搅拌直至充分混合。检查且使用NaOH或HCl使pH调整至3.5±0.1。加入0.5mL Tween 20。搅拌直至充分混合。用HPLC等级或Millipore水调整至500mL的最终体积。搅拌直至充分混合。当在2－8℃下贮藏时，溶液对于30天是稳定的。将容器标记为“乙酸盐缓冲液”。
兔抗A蛋白抗体。从冰箱中取出小瓶且允许达到室温。加入2.0mL HPLC等级或Millipore水。将20μL体积等分试样到0.5mL螺口管中。盖上盖子且置于细胞贮藏盒中。溶液在-20℃下贮藏时对于365天是稳定的。生物素化的抗A蛋白抗体从冰箱中取出小瓶且允许达到室温。加入1.0mL HPLC等级或Millipore水。将60μL体积等分试样到2.0mL螺口管中。盖上盖子且置于细胞贮藏盒中。溶液在-20℃下贮藏时对于365天是稳定的。
链霉抗生物素蛋白-HRP。向链霉抗生物素蛋白-HRP的小瓶中加入0.5mL HPLC等级或Millipore水。为了混合，给小瓶盖上盖子且轻轻涡旋约10秒。将0.5mL甘油加入链霉抗生物素蛋白-HRP的小瓶中。给小瓶盖上盖子且使小瓶轻轻倒转几次。通过将溶液抽取到干净的巴斯德吸管内来检查溶液的澄清度。将20μL体积等分试样到0.5mL螺口管中。盖上盖子且置于细胞贮藏盒中。当在-20℃下贮藏时，溶液对于365天是稳定的。
标准的制备。由分析证明书(COA)获得A蛋白参考材料(ref mat)的蛋白质浓度。通过在室温下解冻A蛋白贮存液来制备A蛋白ref mat的11,500ng/mL溶液。计算获得11,500ng/mL溶液所需的A蛋白ref mat体积。最小转移体积应为10μL。
式：
注：确保单位是相容的。
例子：
通过从所需体积中减去A蛋白ref mat的需要体积来计算乙酸盐缓冲液(3.4)的体积。
式：(所需体积)-(Ref Std体积)＝(稀释剂体积)
例子：10.0mL–0.920mL＝9.180mL稀释剂
将计算的A蛋白ref mat体积加入包含计算的乙酸盐缓冲液体积的15mL无菌管中。给管盖上盖子。轻轻涡旋(在Vortex Genie 2上的设置4)2－4秒。使用下文限定的体积制备剩余的标准：
每个稀释步骤后给管盖上盖子，并且在进展至下一个稀释步骤前轻轻涡旋2－4秒。在加入微量滴定板前在室温下使参考标准和质量对照样品温育10分钟。每个标准浓度在一式三份的孔中进行分析。
测试样品的制备。使用乙酸盐缓冲液在聚丙烯管中制备CTLA4-Ig测试样品的5mg/mL、2.5mg/mL和1.25mg/mL浓度。在用于制备稀释物前在室温下解冻CTLA4-Ig样品。计算获得5.0mg/mL溶液所需的测试样品体积。最小转移体积应为10μL。
式：
例子：
5.1.3通过从所需体积中减去测试样品的需要体积来计算乙酸盐缓冲液的体积。
式：(所需体积)-(测试样品体积)＝(稀释剂体积)
例子：10.0mL–0.200mL＝0.800mL稀释剂
将计算的测试样品体积加入包含计算的乙酸盐缓冲液体积的15mL无菌管中。给管盖上盖子且轻轻涡旋(在Vortex Genie 2上的设置4)2－4秒。测试样品在加入微量滴定板前在室温下温育10分钟。
质量对照样品的制备。由COA获得A蛋白参考材料的蛋白质浓度。制备A蛋白refmat的11,500ng/mL溶液。如下表中所述制备质量对照(QC)样品。
将700μL体积等分试样到2.0mL螺口管中。盖上盖子且置于细胞贮藏盒中。当在-70℃或以下贮藏时，溶液对于180天是稳定的。QC样品中的A蛋白浓度由下述预先测定：使用这种方法进行3次独立的A蛋白ELISA测定。18个结果(3次独立测定乘6孔/测定)将进行平均。对每种制剂指定关于每个QC样品的A蛋白浓度。在实验当天时，在室温下解冻各1小瓶QC样品，或由A蛋白的原液小瓶新鲜制备QC样品。轻轻涡旋(在Vortex Genie 2上的设置4)2－4秒。
程序。用捕获抗体包被板。由制造商COA获得兔抗A蛋白抗体的蛋白质浓度。计算获得10mL 100μg/mL溶液所需的兔抗A蛋白抗体体积。最小转移体积应为10μL。
式：
注：确保单位是相容的。
例子：
通过从所需体积中减去兔抗A蛋白抗体的需要体积来计算稀释剂的体积。
式：(所需体积)-(抗体体积)＝(稀释剂体积)
例子：3.0mL–0.012mL＝2.988mL稀释剂
将计算的兔抗A蛋白抗体体积加入包含计算的稀释剂体积的15mL无菌管中。给管盖上盖子且轻轻涡旋2－4秒。使用式在包被缓冲液中制备兔抗A蛋白抗体的1μg/mL溶液。将100μL溶液加入Immulon IV微量滴定板的每个孔中。在2－8℃下温育18±2小时。使用板洗涤器用300μL洗涤缓冲液与零浸泡时间将板用洗涤溶液洗涤3次。可替代地，板可以使用多道移液器进行洗涤。使用多道移液器将200μL SuperBlockTM加入每个孔中。微量滴定板在室温下在黑暗中温育60分钟。重复洗涤。向测定板中加入各100μL参考标准、质量对照和测试样品。微量滴定板在室温下在黑暗中温育60分钟±10分钟。重复洗涤。由制造商COA获得生物素抗A蛋白抗体的蛋白质浓度。在稀释剂中制备1.0mL 1.0mg/mL生物素抗A蛋白抗体溶液。以中等速度涡旋。将50μL 1mg/mL溶液(7.9.1)加入0.950mL稀释剂中。以中等速度涡旋。将150μL 50μg/mL溶液(7.9.3)加入14.850mL稀释剂中。使用多道移液器向每个孔中加入100μL。在室温下温育60分钟±10分钟。重复洗涤。如下稀释链霉抗生物素蛋白-HRP：将10μL链霉抗生物素蛋白-HRP加入0.990μL稀释剂中，以产生0.01mg/mL链霉抗生物素蛋白-HRP。以中等速度涡旋。将80μL 0.01mg/mL链霉抗生物素蛋白-HRP加入39.920mL稀释剂中。以中等速度涡旋。使用多道移液器向每个孔中加入100μL。在室温下温育30分钟±5分钟。从冰箱中取出TMB且将最低限度10mL/板TMB倾析入合适的容器内。置于黑暗场所中且允许达到室温。重复洗涤，但洗涤5次。向每个孔中加入100μL TMB色原。在室温下温育约2分钟±1分钟。通过加入100μL/孔终止溶液来终止色原反应。以与色原添加的相同顺序向板和孔中加入终止溶液，以确保每个孔中色原与酶相同的反应时间。用630nm的参考波长测量在450nm处的吸光度(AB)。
示例性值。关于标准曲线的示例性值。关于标准的示例性值应用于在定量界限(QL)处或其上的那些值，因为低于QL的值仅用于帮助确定曲线的极限值。如通过SoftMaxPRO软件测定的，关于标准曲线的决定系数(R2)应≥0.99。关于0ng/mL标准的平均背景应≤0.08吸收单位。如通过软件测定的，在用于测定标准曲线的每个标准浓度(除0和QL外)时计算的值(ng/mL)的平均值必须在靶(标称)值的15％内。如通过软件测定的，在用于测定标准曲线的每个标准浓度(排除0和QL)时一式三份AB450值的变异系数(％CV)必须≤15％。如通过软件测定的，标准曲线的QL的一式三份吸光度值的平均值必须显示小于20％的％CV且在20％的靶内。为了确保至少2个适合的数据点可用于计算，将标准、质量对照和样品装载在一式三份的孔中。用于计算平均值的一式三份的每个值将分开进行分析。
例如：
位于离2.5ng/mL的靶值最远的单个值为1.2ng/mL。通过从一式三份中排除1.2ng/mL值，剩余值的平均值符合所有示例性值。如果，在重新计算后，另一个点不符合示例性值，那么该测定将是无效的且必须重新进行。如果显示剩余2个值的平均值仍不符合示例性值，那么排除单个点(所有3个孔)且重新计算曲线。
关于QC样品的示例性值。QC样品在指定浓度时定义为一组3个孔，因此对于在这种方法中指定的3种标称浓度存在总共6个QC 样品(总共18个孔)。为了QC样品可接受，关于QC样品的3个孔中的至少2个必须在标称的20％内。6个QC样品中的至少4个必须是可接受的；6个QC样品中的2个(不是相同浓度时的2个)以及18个QC样品孔中不超过6个可以偏离各自的靶浓度超过20％。
关于测试样品的示例性值。如通过软件测定的，测定的测试样品的一式三份的每个值必须在那个浓度时的平均值的20％内。如果2个或更多AB450平均值无法计算，因为其超过标准曲线上的最高点，那么样品必须以更高稀度进行重新测定，直至3个值中的至少2个落在标准曲线上。如通过软件测定的，对于每种测试样品靶浓度获得的一式三份观察的％CV必须≤20％。
计算。关于A蛋白ELISA，参考Softmax程序模板，因为它产生平均值、标准差和％CVs。求对于测定的每个参考和样品浓度获得的一式三份的吸光度(AB)值的平均值。使用下式的未加权4参数回归对关于A蛋白标准的数据建模。
其中：
min＝对应于最小渐近线的AB值
max＝对应于最大渐近线的AB值
ED50＝对应于最大和最小渐近线值之间的一半绝对差异的AB
B＝曲线的线性部分的近似斜率
C＝A蛋白的浓度
样品中的A蛋白浓度的计算。将平均样品结果乘以合适的稀释因子(即2、4和8)，以获得以ng/mL表示的原始样品中的A蛋白浓度。将结果除以报告的CTLA4-Ig蛋白质浓度(mg/mL)，以获得以ng/mg表示的CTLA4-Ig中的A蛋白浓度。
例子计算：
注：ngA蛋白/mg CTLA4-Ig(ng/mg)等价于百万分之(ppm)。
关于Ng/mL样品中的A蛋白浓度的计算。测试样品中的A蛋白量使用目前的SoftMax软件使用回归方程进行计算。测定每个样品的3个稀度。计算的浓度乘以合适的稀释因子以产生最初测试样品中的浓度。
例子：
测试样品中的浓度为50mg/mL。
5mg/mL样品－ELISA数据测定A蛋白浓度为10ng/mL
10ng/mL x 10(稀释因子)＝测试样品中的100ng/mL A蛋白
2.5mg/mL样品－ELISA数据测定A蛋白浓度为5.0ng/mL
5ng/mL x 20(稀释因子)＝测试样品中的100ng/mL A蛋白
1.25mg/mL样品－ELISA数据测定A蛋白浓度为2.5ng/mL
2.5ng/mL x 40(稀释因子)＝测试样品中的100ng/mL A蛋白
计算来自3个值的平均浓度。
结果的报告。结果可以以“％w/w总蛋白、ng A蛋白/mg总蛋白”的形式报告，或称为“ppm”(w/w)。
例子：
0.0001％w/w＝1ng/mg＝1ppm(w/w)
例子计算：
导致比QL(0.188ng/mL)的AB450小的AB450值的样品应报告为“小于QL”。导致比QL(0.188ng/mL)的AB450大的AB450值的样品应作为百万分之(ppm)报告至最近的整数。
例子：
样品浓度为50mg/mL。分析的最高样品浓度为5mg/mL(1/10 稀度)。样品的AB450小于QL。
QL＝0.188ng/mL
≤0.188ng/5mg
≤0.04ng/mg
报告为“≤，QL＝0.04ppm”
实施例63：获得CTLA4-Ig药品样品中的氨基单糖(N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖 胺)与蛋白质的摩尔比的方法
试剂：
水解溶液(4N HCl水溶液)。将160mL 6N HCl和80mL HPLC等级水加入250mL玻璃瓶中。搅拌以充分混合。贮藏于2－8℃最多6个月。衍生化溶液I(0.1M APTS水溶液)。将192μLHPLC等级水加入在玻璃小瓶中的10mg APTS粉末中。使小瓶涡旋5－10秒以完全溶解APTS。贮藏于-20℃最多1年。
衍生化溶液II(1M乙酸和0.25M NaBH3CN)。在0.4mL离心管中用320μL HPLC等级水稀释20μL乙酸(17倍稀释)，以制备1M乙酸溶液。将2.0±0.5mg NaBH3CN称量到深低温小瓶内。使用下式，添加合适体积的1M乙酸溶液以制备0.25M NaBH3CN。体积(μL)＝103×(以mg表示的NaBH3CN的重量)/(62.84g/mol×0.25mol/L)。注：紧在使用前制备。氰基硼氢钠(NaBH3CN)应在黑暗中贮藏于干燥器中。推荐如下将试剂再分到一系列2.0mL冷冻小瓶内用于贮藏，以避免反复打开原始试剂瓶：将1.0g±0.2mg氰基硼氢钠称量到2.0mL冷冻小瓶内。以这种方式将来自原始瓶中的氰基硼氢钠的全部内容物等分试样。紧紧地盖上盖子且连同试剂名称、批号和6个月有效期一起顺次(1、2、3等)标记冷冻小瓶。小瓶应用石蜡膜密封以避免湿气。从相同冷冻小瓶中称出氰基硼氢钠用于衍生化溶液II不超过3次。在实验室工作表上注明这点和冷冻小瓶顺序号。在CE概况中观察到的试剂峰或弱标记可能在冷冻小瓶反复打开后或用那种特定批次的氰基硼氢钠后发生。如果这影响结果，那么弃去使用的冷冻小瓶并且从具有下一个顺序号的冷冻小瓶中或从新批次氰基硼氢钠中称出试剂。
再乙酰化缓冲液(25mM碳酸氢钠，pH 9.5)。将0.210±0.02g碳酸氢钠称量到干净的100mL干净的玻璃烧杯内。添加90mL HPLC等级水，且在搅拌板上混合直至盐完全溶解。用10N NaOH将pH调整至9.5±0.1。添加HPLC等级水以得到100mL的最终体积。过滤溶液且贮藏于室温最多3个月。运行缓冲液(60±5mM四硼酸钠，pH 9.25)。将1.21±0.02g四硼酸钠称量到100mL干净的玻璃烧杯内。添加90mL HPLC等级水，且在搅拌板上混合直至盐完全溶解。用10N NaOH将pH调整至9.25±0.10。对于60±5mM的终浓度，添加HPLC等级水以得到100mL的最终体积。对于55mM溶液，称量1.11g(±0.02)四硼酸钠且根据上述说明用于溶解和滴定。对于65mM溶液，称量1.31g(±0.02)四硼酸钠且根据上述说明用于溶解和滴定。贮藏于室温最多3个月。如果峰分辨率(如系统适合性部分中定义的)受影响(R值<1.0)，那么制备新鲜的缓冲液。任选的：对于60mM(±5mM)的终浓度，通过将120mL超纯水加入80mL 150mM四硼酸钠缓冲液中稀释四硼酸盐缓冲溶液(MicroSolv)。用10N NaOH滴定以使溶液pH达到9.25(±0.1)。对于55mM四硼酸盐溶液，将66mL 150mM四硼酸钠缓冲液稀释到114mL超纯水内。如上滴定。对于65mM四硼酸盐溶液，将78mL 150mM四硼酸钠盐缓冲液稀释到102mL超纯水内。如上滴定。溶液贮藏于室温最多3个月。如果峰分辨率(如系统适合性部分中定义的)受影响(R值<1.0)，那么制备新鲜的缓冲液。
毛细管冲洗溶液。
1N NaOH溶液：将1mL 10N NaOH溶液加入包含9mL HPLC等级水的15mL有刻度的塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。溶液贮藏于室温最多6个月。
1N HCl溶液：将1mL 6N HCl溶液加入包含5mL HPLC等级水的15mL有刻度的塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。溶液贮藏于室温最多6个月。80％甲醇溶液：将8mL HPLC等级甲醇加入包含2mL HPLC等级水的15mL有刻度的塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。溶液贮藏于室温最多6个月。
单糖标准贮存液：
N-乙酰葡糖胺(GalNAc)。将5±1mg Ga1NAc精确称量到2.0mL深低温小瓶内。添加1mL HPLC等级水且通过涡旋充分混合直至溶解。记录溶液的精确浓度(mg/mL)。
N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc)：将5±1mg GlcNAc精确称量到2.0mL 深低温小瓶内。添加1mL HPLC等级水且通过涡旋充分混合直至溶解。记录溶液的精确浓度(mg/mL)。
N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)：将5±1mg ManNAc精确称量到2.0mL深低温小瓶内。添加1mL HPLC等级水且通过涡旋充分混合直至溶解。记录溶液的精确浓度(mg/mL)。
单糖标准贮存液贮藏于-20℃最多1年：
单糖工作溶液I：内部标准工作溶液。通过将20μL ManNAc贮存液加入2mL深低温小瓶内，用HPLC等级水将ManNAc的贮存液稀释100倍，所述深低温小瓶已包含1980μL HPLC等级水。涡旋约5－10秒。内部标准工作溶液贮藏于2－8℃最多6个月。
单糖工作溶液II：氨基混合标准工作溶液。在包含1960μL HPLC等级水的2.0mL深低温小瓶中，分别加入20μL GalNAc和GlcNAc的贮存液。涡旋约5－10秒。氨基混合标准工作溶液贮藏于2－8℃最多6个月。
样品和参考材料溶液。于2－8℃解冻冷冻的蛋白质样品，且通过倒置轻轻混合。用HPLC等级水将样品和参考材料稀释至约1.0mg/mL。注明浓度至3个有效数字。
CE运行条件
程序
水解。在0.65mL离心管中，加入10μL ManNAc工作溶液和200μL 4N水解溶液。这充当系统空白。在0.65mL离心管中，加入10μL ManNAc工作溶液和10μL氨基混合标准溶液。进一步加入200μL 4N水解溶液。这充当用于定量和系统适合性的单糖标准。一式两份地制备。在0.65mL离心管中，加入10μL ManNAc工作溶液和10μL CTLA4-Ig参考材料溶液(约1mg/mL)。进一步加入200μL 4N HCl溶液。一式两份地制备。在0.65mL离心管中，加入10μLManNAc工作溶液和10μL样品溶液(约1mg/mL)。进一步加入200μL 4N HCl溶液。一式两份地制备。使样品涡旋约10秒且离心约5－10秒。将样品置于96位置小瓶架中且在烤箱中于95℃温育6小时。水解后，将水解的样品置于-20℃10分钟以冷却。使水解的样品短暂离心直至所有冷凝物被迫至管的底部(在高速时5－10秒)。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。用100μLHPLC等级水重构每种样品且涡旋10－15秒。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。
再乙酰化。用10μL M6再乙酰化缓冲液重构每种样品且涡旋5－10秒以充分混合。将4μL M3再乙酰化试剂加入每个管内。涡旋约5－10秒。在冰上温育30分钟。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。用100μL HPLC等级水重构每种样品且涡旋10－15秒。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。
衍生化。将微量离心机置于烤箱中以平衡至55℃的烤箱温度。用10μL衍生化溶液I(0.1M APTS溶液)重构每种样品。涡旋约5－10秒。添加5μL衍生化溶液II(1M HAc和0.25MNaBH3CN)。涡旋约5－10秒且离心。将样品小瓶快速装载到预加温的离心机内，且将离心机放回到55℃烤箱中。温育3小时同时在2000rpm下离心。这防止溶剂在小瓶表面上冷凝。
仪器配置制备。
5.4.1安装新毛细管，使用下述步骤以高压模式(80PSI)冲洗：1N NaOH 20分钟。；HPLC等级水10分钟。60mM四硼酸钠缓冲液10分钟。
每日操作
每天操作前，运行洗涤/冲洗顺序以冲洗毛细管。
随后运行系统适合性标准(单糖标准)以确保系统是适合的。
使用1N NaOH可蚀刻来自不同厂商的毛细管的内部，且引起运行自始至终迁移时间中的变动。如果这引起最后峰(G1cNAc)的迁移时间超过10.0分钟，那么对于步骤2冲洗，可能必须用0.1N NaOH或HPLC等级水替换1N NaOH。
当使用等价毛细管和上述洗涤程序不足够时，可能必须使用80％甲醇和/或1NHCl以使最后峰(G1cNAc)在10.0分钟的示例性值内。
用于注射的制剂
衍生化后，使样品冷却至室温。在室温下离心约10秒，直至冷凝物被迫至管的底部。
向每个管中加入85μL HPLC等级水以使每种样品的最终体积达到100μL。涡旋5－10秒。
从每个管中转移10μL样品到CE微量小瓶中，且向每个管中加入190μL HPLC等级水。涡旋5－10秒。
冲洗步骤和注射顺序：
注：对于每4次注射，用新鲜制备的CE运行缓冲液更换CE运行缓冲液(由于离子耗尽作用)。以40psi执行毛细管冲洗。
*注：一式两份地对于最多3种样品重复顺序且与单糖标准的每种制剂的2次注射一起进行。对于置于3个的组中的样品使用所有8种系统适合性标准注射。如果运行超过3种样品，那么如上文顺序中所示从第19行开始运行另外的样品。通过如表中第47至53行中所示运行系统适合性(Mono Std)完成顺序。
**将样品与CTLA4-Ig参考材料的每种制剂的2次注射一起进行。
系统适合性注：除非另有说明，系统适合性值使用第一次注射的系统适合性标准进行测定。第一种系统适合性的电泳图应类似于图1中所示的那种，其中峰1是GalNAc；峰2是ManNAc；峰3是GlcNAc。注：当使用除Beckman PACE MDO外的CE仪器时，由于保持分开的毛细管的柱体的各种构型，毛细管的长度可以不同于这种方法中指定的那种。这将导致分析物迁移时间以及峰强度中的变化。
根据下面等式通过仪器计算关于第一种系统适合性标准的2个相邻峰之间的分辨率：
其中：
R＝分辨率
t2，t1＝2个相邻峰各自的迁移时间
W1，W2＝2个相邻峰各自在基线处的峰宽
R值必须≥1.0。如果R<1.0，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。
对于最后的系统适合性注射，使用下式最后的峰(GlcNAc)必须具有<1.4的拖尾因子：
T＝W0.05/2f
其中：
T＝拖尾因子
W0.05＝在5％高度时的峰宽
f＝在峰最大值时峰前面的宽度
如果T≥1.4，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。
6.1系统适合性标准的重复注射必须符合下述示例性值：
■GalNAc对MaNAc的峰面积比：RSD≤10％(在步骤7.1中计算)
■GalNAc的迁移时间应≤10.0分钟
■概况应等价于图1，其中观察到3个峰且内部标准(ManNAc)是第2个峰。
如果在测试样品前上述示例性值中的任何一个未符合，那么若GlcNAc的迁移时间大于10.0分钟，则首先增加电压。其次，如果峰面积比>10％，那么制备新鲜的CE缓冲液从而确定其pH或替换毛细管。调整仪器后，重复系统适合性注射。当分析峰概况时，如果发生ManNac的峰高中的显著降低，那么检查以确定进入LIF模块内的纤维光学电缆并非不对准。
通过比较内部标准和单糖标准组分的峰面积比来测定单糖标准百分比RSD。将关于每个单糖组分的峰面积除以关于每次单糖标准注射的内部标准的峰面积。计算关于2种一起进行的标准的GalNAc和GlcNAc的百分比RSD。RSD应≤10％。如果这个示例性平均值不符合，那么毛细管应如上进行冲洗或替换。
计算
计算GalNAc和GlcNAc相对于内部标准(ManNAc)的峰面积比。使用于最初四种系统适合性标准的重复注射上以便符合示例性值，且对样品前和后注射的所有一起进行的、系统适合性标准进行相同计算。
峰面积比＝将关于每种单糖组分(GlcNAc，GalNAc)的峰面积除以关于每次系统适合性标准注射的内部标准(ManNAc)的峰面积。
计算在系统适合性标准中关于GlcNAc和GalNAc的峰面积比的平均值。还计算标准差(S.D.)和百分比相对标准差(％RSD)
示例性值：关于GlcNAc的峰面积比的RSD≤10％。
样品前和后注射的2种、一起进行的、系统适合性标准：关于GlcNAc和GalNAc的峰面积比的百分比RSD≤10％。
如果这个示例性平均值不符合(RSD>10％)，那么毛细管需用冲洗程序再次冲洗，并且那些样品和一起进行的单糖标准需再次运行。如果示例性平均值仍不符合，那么如所述的替换毛细管且冲洗。再次运行样品和一起进行的单糖标准。
其中：
n＝样品中的测量数目
x＝个别测量
计算GalNAc/蛋白质的摩尔比：
其中：
RGalNAc＝GalNAc对蛋白质的摩尔比
AGalNAc＝样品中GalNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc＝样品中ManNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc0＝单糖标准中ManNAc的峰面积(μV·秒)平均值
AGalNAc0＝单糖标准中GalNAc的峰面积(μV·秒)平均值
VGalNAc0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc体积(以μL表示)
CGalNAc0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GalNAc浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWCTLA4-Ig＝CTLA4-Ig参考材料的分子量
MWGlcNAc＝GalNAc的分子量(221.2道尔顿)
标准一起进行。当计算CTLA4-Ig参考材料和样品的摩尔比时，使用所有8种一起进行的系统适合性标准。求包括在这个等式中的峰面积的平均值。这将用于前3种样品。对于所有其他样品，一直使用接下来的4种一起进行的单糖标准和前4种一起进行的单糖标准的平均峰面积用于摩尔比计算。
计算GIcNAc/蛋白质的摩尔比
其中：
RGlcNAc＝GlcNAc对蛋白质的摩尔比
AGlcNAc＝样品中GlcNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc＝样品中ManNAc的峰面积(μV·秒)
AManNAc0＝单糖标准中ManNAc的峰面积(μV·秒)平均值
AGlcNAc0＝单糖标准中GlcNAc的峰面积(μV·秒)平均值
VGlcNAc0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GlcNAc体积(以μL表示)
CGlcNAc0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的GlcNAc浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWCTLA4-Ig＝根据COA的CTLA4-Ig参考材料的分子量
MWGlcNAc＝GlcNAc的分子量(221.2道尔顿)
示例性值。关于2种、一起进行的、氨基系统适合性标准峰面积比的百分比RSD不应超过10％。关于参考材料中的氨基单糖的平均摩尔比必须在指定的范围内。对于每种组分，关于4种结果(一式两份制剂的一式两份注射)的％RSD必须</＝25％。
CTLA4-Ig参考材料的摩尔比范围
单糖 范围
GalNAc 2.0－3.2
GlcNAc 18－32
报告结果。平均结果报告为GalNAc分子数目/CTLA4-Ig分子和GlcNAc分子数目/CTLA4-Ig分子。摩尔比结果报告至2个有效数字。对于每种组分，关于4种结果(一式两份制剂的一式两份注射)的％RSD必须</＝25％。
实施例64：获得CTLA4-Ig药品样品中的中性单糖(甘露糖、岩藻糖、半乳糖)与蛋白 质的摩尔比的方法
试剂
水解溶液(2M TFA水溶液)将148μL TFA和852μL HPLC等级水加入1.7微量离心管中。涡旋5－10秒。必要时按比例扩大。紧在使用前制备溶液。
衍生化溶液I(0.1M APTS水溶液)。将192μL HPLC等级水加入在玻璃小瓶中的10mgAPTS粉末中。使瓶涡旋5－10秒以完全溶解APTS。贮藏于-20℃最多1年。
衍生化溶液II(1M乙酸和0.25M NaBH3CN)。在0.4mL离心管中用320μL HPLC等级水稀释20μL乙酸(17倍稀释)，以制备1M乙酸溶液。将2.0±0.5mg NaBH3CN称量到深低温小瓶内。使用下式，添加合适体积的1M乙酸溶液以制备0.25M NaBH3CN。
体积(μL)＝103×(以mg表示的NaBH3CN重量)/62.84g/mol×0.25mol/L)
·氰基硼氢钠(NaBH3CN)应在黑暗中贮藏于干燥器中。
·推荐如下将试剂再分到一系列2.0mL冷冻小瓶内用于贮藏，以避免反复打开最初的试剂瓶：
·将1g±0.2mg氰基硼氢钠称量到2.0mL冷冻小瓶内。以这种方式将来自最初瓶中的氰基硼氢钠的全部内容物等分试样。
·紧紧地盖上盖子且连同试剂名称、批号和6个月有效期一起顺次(1、2、3等)标记冷冻小瓶。
·小瓶应用石蜡膜密封以避免湿气。
·从相同冷冻小瓶中称出氰基硼氢钠用于衍生化溶液II不超过3次。在实验室工作表上注明这点和冷冻小瓶顺序号。
·在CE概况中观察到的试剂峰或弱标记可能在冷冻小瓶反复打开后或用那种特定批次的氰基硼氢钠后发生。如果这影响结果，那么弃去使用的冷冻小瓶并且从具有下一个顺序号的冷冻小瓶中或从新批次氰基硼氢钠中称出试剂。
运行缓冲液(60±5mM四硼酸钠，pH 9.25)
将1.21±0.02g四硼酸钠称量到100mL干净的玻璃瓶内。
添加90mL HPLC等级水，且在搅拌板上混合直至盐完全溶解。
用10N NaOH将pH调整至9.25±0.10。
对于60mM(±5mM)的终浓度，添加HPLC等级水以得到100mL的最终体积。
对于55mM溶液，称量1.11g(±0.02)四硼酸钠且根据上述说明用于溶解和滴定。
对于65mM溶液，称量1.31g(±0.02)四硼酸钠且根据上述说明用于溶解和滴定。
贮藏于室温最多3个月。如果峰分辨率(如系统适合性部分中定义的)受影响(R值<1.0)，那么制备新鲜的缓冲液。
任选的：对于60mM(±5mM)的终浓度，通过将120mL超纯水加入80mL 150mM四硼酸钠缓冲液中稀释四硼酸盐缓冲溶液(MicroSolv)。用10N NaOH滴定以使溶液pH达到9.25(±0.1)。
对于55mM四硼酸盐溶液，将66mL 150mM四硼酸钠缓冲液稀释到114mL超纯水内。如上滴定。
对于65mM四硼酸盐溶液，将78mL 150mM四硼酸钠缓冲液稀释到102mL超纯水内。如上滴定。
溶液贮藏于室温最多3个月。如果峰分辨率(如系统适合性部分中定义的)受影响(R值<1.0)，那么制备新鲜的缓冲液。
毛细管冲洗溶液
1N NaOH溶液
将1mL 10N NaOH溶液加入包含9mL HPLC等级水的14mL有刻度的塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。
溶液贮藏于室温最多6个月。
1N HCl溶液：
将1mL 6N HCl溶液加入包含5mL HPLC等级水的15mL有刻度的塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。
溶液贮藏于室温最多6个月。
80％甲醇溶液：
将8mL HPLC等级甲醇加入包含2mL HPLC等级水的15mL有刻度的塑料管内。通过涡旋5－10秒充分混合。
溶液贮藏于室温最多6个月。
单糖标准贮存液
甘露糖(Man)
将5±1mg甘露糖精确称量到2.0mL深低温小瓶内。
添加1mL HPLC等级水且通过涡旋5－10秒充分混合。
记录溶液的精确浓度(mg/mL)。
岩藻糖(Fuc)
将5±1mg岩藻糖精确称量到2.0mL深低温小瓶内。
添加1mL HPLC等级水且通过涡旋5－10秒充分混合。
记录溶液的精确浓度(mg/mL)。
半乳糖(Gal)
将5±1mg半乳糖精确称量到2.0mL深低温小瓶内。
添加1mL HPLC等级水且通过涡旋5－10秒充分混合。
记录溶液的精确浓度(mg/mL)。
木糖(Xyl)
将5±1mg木糖精确称量到2.0mL内。
添加1mL HPLC等级水且通过涡旋5－10秒充分混合。
记录溶液的精确浓度(mg/mL)。
单糖标准贮存液贮藏于-20℃最多1年。
单糖工作溶液I：内部标准工作溶液。为制备内部标准工作溶液，通过将20μL木糖贮存液(3.6.4)加入2mL深低温小瓶内，用HPLC 等级水将木糖的贮存液稀释100倍，所述深低温小瓶已包含1980μL HPLC等级水。涡旋约5－10秒。这种内部标准工作溶液贮藏于2－8℃最多6个月。
单糖工作溶液II：中性混合标准工作溶液。在包含1940μL HPLC等级水的2.0mL深低温小瓶中，分别加入20μL甘露糖、岩藻糖和半乳糖的贮存液。涡旋约5－10秒。这种内部标准工作溶液贮藏于2－8℃最多6个月。
样品和参考材料溶液。于2－8℃解冻冷冻的蛋白质样品，且通过倒置轻轻混合。用HPLC等级将样品和参考材料稀释至约1.0mg/mL。
CE运行条件
程序
水解：在0.65mL离心管中，加入10μL木糖工作溶液和200μL 2M TFA溶液。这充当系统空白。在0.65mL离心管中，加入10μL木糖工作溶液和10μL中性混合标准工作溶液。进一步加入200μL 2M TFA溶液且涡旋3-4秒。这充当用于定量和系统适合性的单糖标准。一式两份地制备。在0.65mL离心管中，加入10μL木糖工作溶液和10μL CTLA4-Ig参考材料溶液(约1mg/mL)。进一步加入200μL 2M TFA溶液且涡旋3－4秒。一式两份地制备。在0.65mL离心管中，加入10μL木糖工作溶液和10μL样品溶液(约1mg/mL)。进一步加入200μL 2M TFA溶液且涡旋3－4秒。一式两份地制备。使样品涡旋约20秒且离心约5－10秒。将样品置于96位置小瓶架中且在烤箱中于95℃温育6小时。水解后，将样品置于-20℃10分钟以冷却。使水解的样品短暂离心直至所有冷凝物被迫至管的底部(在高速时5－10秒)。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。用100μL HPLC等级水重构每种样品且涡旋10－15秒。在SpeedVac中使样品蒸发至干燥。
衍生化：将微量离心机置于烤箱中以平衡至55℃的烤箱温度。用10μL衍生化溶液I(0.1M APTS溶液)重构每种样品。涡旋约5－10秒。添加5μL衍生化溶液II(1M HAc和0.25MNaBH3CN)。涡旋约5－10秒且离心。将样品小瓶快速装载到预加温的离心机内，且将离心机放回到55℃烤箱中。温育3小时同时在2000rpm下离心。这防止溶剂在小瓶表面上冷凝。
仪器配置制备：安装新毛细管，使用下述步骤以高压模式(80PSI)冲洗：
1N NaOH 20分钟。
HPLC等级水10分钟。
60mM四硼酸钠缓冲液10分钟。
运行洗涤/冲洗顺序以冲洗毛细管。随后运行系统适合性标准(单糖标准)以确保系统是适合的。使用1N NaOH可蚀刻来自不同厂商的毛细管的内部，且引起运行自始至终迁移时间中的变动。如果这引起最后峰(半乳糖)的迁移时间超过15.0分钟，那么对于步骤2冲洗，可能必须用0.1N NaOH或HPLC等级水替换1N NaOH。当使用等价毛细管和上述洗涤程序不足够时，可能必须使用80％甲醇和/或1N HCl以使最后峰(半乳糖)在15.0分钟的示例性值内。
用于注射的制剂：衍生化后，使样品冷却至室温。在室温下离心约10秒，直至冷凝物被迫至管的底部。向每个管中加入85μL HPLC等级水以使每种样品的最终体积达到100μL。涡旋5－10秒。从每个管中转移10μL样品到CE微量小瓶中，且向每个管中加入190μL HPLC等级水。涡旋5－10秒。
冲洗步骤和注射顺序：
*一式两份地对于最多3种样品重复顺序与用单糖标准的每种制剂的2次注射一起进行。对于置于3个的组中的样品使用所有8种系统适合性标准注射。如果运行超过3种样品，那么如上文顺序中所示从第19行开始运行另外的样品。
**将样品与CTLA4-Ig参考材料的每种制剂的2次注射一起进行。
系统适合性。第一种系统适合性的电泳图应类似于其中峰1是甘露糖；峰2是木糖；峰3是岩藻糖；和峰4是半乳糖。注：当使用除Beckman PACE MDQ外的CE仪器时，由于保持分开的毛细管的柱体的各种构型，毛细管的长度可以不同于这种方法中指定的那种。这将导致分析物迁移时间以及峰强度中的变化。
根据下面等式通过仪器计算关于第一种系统适合性标准的2个相邻峰之间的分辨率：
其中：
R＝分辨率
t2，t1＝2个相邻峰各自的迁移时间
W1，W2＝2个相邻峰各自在基线处的峰宽
R值必须≥1.0。如果R<1.0，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。
对于最后的系统适合性注射，使用下式最后的峰(半乳糖)必须具有<1.4的拖尾因子：
T＝W0.05/2f
其中：
T＝拖尾因子
W0.05＝在5％高度时的峰宽
f＝在峰最大值时峰前面的宽度
如果T≥1.4，那么用洗涤/冲洗顺序冲洗毛细管；如果问题继续存在，那么用新鲜制备的运行缓冲液替换旧缓冲液或替换毛细管。
最初四种系统适合性标准的重复注射必须符合下述示例性值：
·半乳糖对木糖的峰面积比：RSD≤10％。
·半乳糖的迁移时间需≤15.0分钟
·概况应等价于图1，其中观察到4个峰且内部标准(木糖)是第2个峰。
如果上述示例性值中的任何一个未符合，那么若半乳糖的迁移时间大于15.0分钟，则首先增加电压。其次，如果峰面积比>10％，那么制备新鲜的CE缓冲液从而确定其pH或替换毛细管。
调整仪器后，重复系统适合性注射。当分析峰概况时，如果发生木糖的峰高中的显著降低，那么检查以确定进入LIF模块内的纤维光学电缆并非不对准。通过比较内部标准和单糖标准组分的峰面积比来测定单糖标准百分比RSD。将关于每个单糖组分的峰面积除以关于每次单糖标准注射的内部标准的峰面积。计算关于2种一起进行的标准的甘露糖、岩藻糖和半乳糖的百分比RSD。RSD应≤10％。如果这个示例性平均值不符合，那么毛细管应如上进行冲洗或替换。样品和一起进行的单糖标准需进行重复。
计算。计算Man、Fuc和Gal相对于内部标准(木糖)的峰面积比。使用于最初四种系统适合性标准的重复注射以便符合示例性值，且对样品前和后注射的所有一起进行的、系统适合性标准进行相同计算。峰面积比＝将关于每种单糖组分(Man、Fuc和Gal)的峰面积除以关于每次系统适合性标准注射的内部标准(木糖)的峰面积。
计算在系统适合性标准中关于Man、Fuc和Gal的峰面积比的平均值。还计算标准差(S.D.)和百分比相对标准差(％RSD)。示例性值：关于半乳糖的峰面积比的RSD≤10％。样品前和后注射的2种、一起进行的、系统适合性标准：
关于Man、Fuc和Gal的峰面积比的百分比RSD≤10％。
如果这个示例性平均值不符合(RSD>10％)，那么毛细管需用冲洗程序再次冲洗，并且那些样品和一起进行的单糖标准需再次运行。如果示例性平均值仍不符合，那么替换毛细管且冲洗。再次运行样品和一起进行的单糖标准。
其中：
n＝样品中的测量数目
x＝个别测量
计算甘露糖/蛋白质的摩尔比：
其中：
RMan＝甘露糖(Man)对蛋白质的摩尔比
AMan＝样品中Man的峰面积(μV·秒)
AXyl＝样品中木糖(Xyl)的峰面积(μV·秒)
AXyl0＝单糖标准中Xyl的峰面积(μV·秒)平均值
AMan0＝单糖标准中Man的峰面积(μV·秒)平均值
VMan0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的Man体积(以μL表示)
CMan0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的Man浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWCTLA4-Ig＝根据分析证明书(COA)的CTLA4-Ig参考材料的分子量
MWMan＝甘露糖的分子量(180.2道尔顿)。
标准一起进行。当计算CTLA4-Ig参考材料和样品的摩尔比时，使用所有8种一起进行的系统适合性标准。求包括在这个等式中的峰面积的平均值。这将用于前3种样品。对于所有其他样品，一直使用接下来的4种一起进行的单糖标准和前4种一起进行的单糖标准的平均峰面积用于摩尔比计算。
计算岩藻糖/蛋白质的摩尔比：
其中：
RFuc＝岩藻糖(Fuc)对蛋白质的摩尔比
AFuc＝样品中Fuc的峰面积(μV·秒)
AXyl＝样品中木糖(Xyl)的峰面积(μV·秒)
AXyl0＝单糖标准中Xyl的峰面积(μV·秒)平均值
AFuc0＝单糖标准中Fuc的峰面积(μV·秒)平均值
VFuc0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的Fuc体积(以μL表示)
CFuc0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的Fuc浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWCTLA4-Ig＝根据分析证明书(COA)的CTLA4-Ig参考材料的分子量
MWFuc＝岩藻糖的分子量(164.2道尔顿)
计算半乳糖/蛋白质的摩尔比：
其中：
RGal＝半乳糖(Gal)对蛋白质的摩尔比
AGal＝样品中Gal的峰面积(μV·秒)
AXyl＝样品中木糖(Xyl)的峰面积(μV·秒)
AXyl0＝单糖标准中Xyl的峰面积(μV·秒)平均值AGal0
VGal0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的Gal体积(以μL表示)
CGal0＝用于水解的单糖工作溶液中包含的Gal浓度(以mg/mL表示)
Vp＝用于水解的蛋白质样品的体积(以μL表示)
Cp＝用于水解的蛋白质样品的浓度(以mg/mL表示)
MWCTLA4-Ig＝根据分析证明书(COA)的CTLA4-Ig参考材料的分子量
MWGal＝Gal的分子量(180.2道尔顿)
注：当计算CTLA4-Ig参考材料和样品的摩尔比时，使用最后的系统适合性标准和下一种一起进行的系统适合性标准制剂。求包括在这个等式中的峰面积的平均值。这将用于前6种样品。对于所有其他样品，一直使用2种一起进行的单糖标准的平均峰面积用于摩尔比计算。
示例性值。关于2种、一起进行的、中性系统适合性标准峰面积比的百分比RSD不应超过10％。关于参考材料中的中性单糖的平均摩尔比可在下表指定的范围内。对于每种组分，关于4种结果(一式两份制剂的一式两份注射)的％RSD必须</＝25％。
CTLA4-Ig参考材料的摩尔比范围
单糖 范围
甘露糖 11－18
岩藻糖 4.2－7.5
半乳糖 9.2－18
报告结果。平均结果报告为甘露糖分子数目/CTLA4-Ig分子、岩藻糖分子数目/CTLA4-Ig分子、和半乳糖分子数目/CTLA4-Ig分子。摩尔比结果报告至2个有效数字。对于每种组分，关于4种结果(一式两份制剂的一式两份注射)的％RSD必须</＝25％。
实施例65－CTLA4-Ig氧化和脱酰胺的胰蛋白酶作图定量
该方法的目的是使用手工胰蛋白酶肽作图程序以甲硫氨酸氧化和天冬酰胺脱酰胺的特异性检测和定量来监控CTLA4-Ig批次之间的一致性。肽作图涉及蛋白质的蛋白酶解或其他断裂以产生界限分明的肽片段组，其随后通常经由HPLC进行分析。层析谱或肽图对蛋白质的化学结构中甚至最小的变化都非常敏感，且因此对于检测和表征翻译后修饰有用。在用蛋白水解酶胰蛋白酶消化前，CTLA4-Ig蛋白质样品在8M胍-HCl缓冲液中进行变性，且半胱氨酸二硫键用二硫苏糖醇进行还原和用碘乙酰胺进行S-烷化。所得到的的胰蛋白酶肽混合物随后通过反相高效液相层析(RP-HPLC)以在215和280nm处的UV检测进行分析。一些缩写在下文列出：
化学药品和试剂
流动相A－溶于HPLC等级水的0.1％TFA
将1mL安瓿TFA的整个内容物转移至1000mL HPLC等级水，且充分混合以制备0.1％TFA(流动相A)。0.1％TFA可以贮藏于室温最多2个月。
流动相B－溶于80％ACN和20％HPLC等级水的0.1％TFA
将1mL安瓿TFA的整个内容物转移至800mL乙腈和200mL HPLC等级水，且充分混合以制备溶于80％ACN的0.1％TFA(流动相B)，其可以贮藏于室温最多2个月。
稀释缓冲液－100mM TRIS，25mM NaCl，pH 7.6
通过在磁性搅拌板上搅拌溶液，将14.0g Trizma Pre-Set Crystal pH 7.6和1.46g NaCl溶解于1000mL HPLC等级水中。通过0.2μm过滤器单元过滤溶液。溶液贮藏于2－8℃最多2个月。
变性缓冲液－8M胍，50mM TRIS，pH 8.0
通过在磁性搅拌板上搅拌溶液，将152.8g盐酸胍和1.4g Trizma Pre-SetCrystal pH 8溶解于90mL HPLC等级水中。用HCl或NaOH将pH调整至8.0，且用HPLC等级水达到最终体积200mL。通过0.2μm滤器过滤溶液。溶液贮藏于室温最多6个月。
消化缓冲液－50mM TRIS，10mM CaCl2，pH 7.6
通过在磁性搅拌板上搅拌溶液，将7.0g Trizma Pre-Set Crystal pH 7.6和1.47g CaCl2溶解于1000mL HPLC等级水中。通过0.2μm过滤器过滤溶液。溶液贮藏于2－8℃最多2个月。
还原剂－200mM二硫苏糖醇(DTT)
紧在使用前向30.8±0.2mg DTT中加入1000μL水且涡旋直至溶解。溶液从制备时起24小时到期。
烷化剂－400mM碘乙酰胺(IAM)
紧在使用前向74.0±0.5mg碘乙酰胺中加入1000μL水且涡旋直至溶解。溶液从制备时起24小时到期。
1.0M HCl
用HPLC等级水将8.7mL浓盐酸稀释至100mL。溶液贮藏于室温最多2个月。
标准和对照
T6ox肽标准，30μM
T6ox胰蛋白酶肽合成标准是Ala-Met(O)-Asp-Thr-Gly-Leu-Tyr-Ile-Cys-Lys·2TFA，FW 1358.4，～95重量％纯度。将固体紧密密封贮藏于-20℃，并且总是在干燥器加温至室温以防止吸湿。称出1.0±0.1mg T6ox，记录确切重量，且溶解于1.50mL消化缓冲液中。加入40uL 200mM DTT且置于37℃20分钟。冷却至室温，加入48μL 400mM碘乙酰胺，并且在室温下在黑暗中烷化30分钟。用消化缓冲液稀释至24.5mL的最终体积以产生30±3μM标准溶液。将30μM T6ox标准的1mL等分试样贮藏于-70℃最多24个月。
T26deam1肽标准，30μM
T26deam1胰蛋白酶肽合成标准是Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-isoAsp-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys·2TFA，FW 2773.7，～85重量％纯度。将固体紧密密封贮藏于-20℃，并且总是在干燥器加温至室温以防止吸湿。称出1.0±0.1mg T26deam1，记录确切重量，且溶解于1mL溶于消化缓冲液中的30％v：v乙腈。稀释至10.7mL的最终体积以产生30±3μM标准溶液。将30μM T26deam1标准的1mL等分试样贮藏于-70℃最多24个月。
标准和样品的制备
还原和烷化
关于肽作图的蛋白质浓度范围为约20mg/mL。如果蛋白质浓度>20mg/mL，那么用稀释缓冲液将样品稀释至约20mg/mL的终浓度。制备至少100μL稀释的溶液。在1.7mL离心管中，将100μL 20mg/mL(2mg)CTLA4-Ig溶液(样品或参考材料)加入500μL变性缓冲液中。加入35μL 200mM还原剂，使管涡旋3－5秒，随后离心约3秒。使管于37℃温育20±2分钟。向每个管中加入38.5μL 400mM烷化剂，涡旋3－5秒，随后离心约3秒。使样品在室温下在黑暗中温育20±2分钟。将NAP-5柱置于架子中。使用1个柱/样品。当样品在IAM中温育时，用7.5mL消化缓冲液平衡NAP-5柱。根据位点程序弃去流出物。将500μL还原且烷化的混合物加在NAP-5柱上，从而允许液体通过柱排出。根据位点程序弃去流出物。将1.0mL消化缓冲液加入NAP-5柱内，并且将流出物收集到1.7mL离心管内且轻轻混合收集的流出物。
消化。对于待消化的每mL样品和参考材料，用86μL每种胰蛋白酶缓冲液(与酶一起供应)重构1个胰蛋白酶小瓶(20μg)，加另外1个胰蛋白酶小瓶，以产生0.25μg/μL。将胰蛋白酶小瓶的内容物一起合并到1个小瓶内。用80μL上述合并的胰蛋白酶溶液/mL样品在37℃下将每种样品消化120±12分钟。消化完成后，用40μL 1.0M HCl/mL样品来酸化样品，且涡旋3－5秒。将各100μL样品和参考材料的消化物移液到自动进样器小瓶内。制备包含与5μL 30μM T6ox肽标准和5μL 30μM T26deam1肽标准混合的95μL参考材料消化物的另外系统适合性对照，以产生用5％T6ox和5％T26deam1掺料的消化物。将所有小瓶在5±5℃下置于自动进样器小器中用于HPLC分析。将所有剩余消化样品贮藏于-70℃。
层析条件
下表显示流速和层析梯度。
在第一次注射前，在55℃下用100％流动相A将柱平衡至少25分钟。监控215nm和280nm处的UV吸光度。从柱到检测器的管道应具有≤0.01”的内径，以使扩散条带加宽降到最低。使柱温维持于55±2℃。使自动进样器温度维持于5±5℃。进动相A用作空白注射。使样品(每次不超过10个)与参考材料注射一起进行。下表显示用于层析分析的注射顺序。应当指出所有注射体积为25μL，除了由用5％T6ox和5％T26deam1肽标准掺料的参考材料组成的对照样品，其注射28μL：
示例性值。
示例性值。就关于215nm和280nm痕量的显著峰数目、相对大小和洗脱顺序而言，关于参考材料的肽图概况必须在视觉上可与图1中呈现的层析谱比较。在起始和一起进行的参考材料中关于峰T4、T25和T27的保留时间差异应不超过±0.5分钟。理论塔板数必须≥100,000。如果N<100,000，那么使柱重新平衡。如果问题继续存在，那么替换柱。对于T2和T12峰，分辨率(R)必须≥1.5。如果R<1.5，那么那么使柱重新平衡。如果问题继续存在，那么替换柱。如图85中所示，用5％T6ox和T26deam1掺料的参考材料的280nm层析谱必须显示关于在～33.0分钟时洗脱的T6ox峰的增加。如图87中所示，用5％T6ox和T26deam1掺料的参考材料的215nm层析谱必须显示关于在～66.5分钟时洗脱的T26deam1峰的增加。
样品示例性值。如图85中关于标记峰指出的，就215nm和280nm 痕量的显著峰数目、相对大小和洗脱顺序而言，第一次参考材料注射和样品的层析谱必须在视觉上等价，除了分开报告的关于T6ox和T26deam的氧化和/或脱酰胺峰外。样品中关于峰T4、T25和T27的保留时间必须在第一次参考材料注射的相应峰的保留时间±0.5分钟内。
计算。注：除非另有说明，对于这些计算使用215nm数据。一起进行的参考材料运行中的峰T4、T25和T27的保留时间(图85)不应相差超过0.5分钟(图85)。
理论塔板数。作为理论塔板数(N)评估的柱功效根据下面等式使用来自参考材料运行的峰T27的保留时间和宽度(图85)进行计算：
其中：
w＝通过将相对直的侧面外推至基线测量的在基线处的峰宽
t＝从注射时间到峰最大值的洗脱时间测量的峰T27的保留时间
分辨率。峰T12和峰T2(图85)之间的分辨率(R)使用下面等式进行计算：
其中：
t1，t2＝分别为峰T12和峰T2的保留时间
w1，w2＝分别具有保留时间t1和t2的峰基线处的切线限定的峰宽。
对于所有样品和标准，如下由280nm峰面积数据计算Met85的百分比氧化：
氧化百分比＝100*AT6ox/(AT6ox+AT6)
其中：
AT6＝在280nm痕量中关于T6,(84－93)的峰面积
AT6ox＝在280nm痕量中关于T6ox，Met(O)85(84－93)的峰面积
对于所有样品和标准，按照图87中所示数据计算215nm峰面积的Asn294的百分比脱酰胺：
其中：
AT26＝在215nm痕量中，关于T26,(281－302)的峰面积
AT26deam1＝在215nm痕量中，关于T26deam1，isoAsp294(281－302)的峰面积。
AT26deam2＝在215nm痕量中，关于T26deam2，Asp299(281－302)的峰面积。
AT26deam3＝在215nm痕量中，关于T26deam3，Asp294(281－302)的峰面积。
AT26deam4＝在215nm痕量中，关于T26deam4，Asu294(281－302)的峰面积。
CTLA4-Ig胰蛋白酶消化物的理论预期片段(参考图85)
*包含N联碳水化合物。
**包含O联碳水化合物。
实施例66－健康的单剂人研究
单位点、随机化、单剂研究用于评估CTLA4-Ig(由CD-CHO1产生)方法在健康受试者中的药物代谢动力学。达到包含和排除示例性值的十三(13)个受试者进入临床研究单位，并且接受作为10mg/kg经过30分钟单次静脉内输注的由方法CD-CHO1产生的CTLA4-Ig。输注后每个受试者在临床研究单位中观察24小时。在给药后至最高71天在指定时间点上收集血液样品用于CTLA4-Ig的定量。受试者就药物代谢动力学进行评估：关于每个受试者的Cmax、Tmax、AUC (INF)、T-HALF、CLT和Vss衍生自血清浓度对时间数据。CTLA4-Ig作为200mg/小瓶制剂供应。向健康受试者施用30分钟IV输注的10mg/kg CTLA4-Ig。PK测定、安全性和免疫原性测定在给药后直到第71天的指定时间点上进行评估。
统计学方法：
样本大小：13个受试者的样本大小提供90％置信度，其中对于CTLA4-Ig，几何平均值比的评估将在关于Cmax的真值的15％内，和关于AUC(INF)的真值的10％内。统计学分析：概括了受试者人口统计数据、身体检查、实验室数据、和生命体征。不利事件的发生率通过身体系统和严重度而列表。对于CTLA4-Ig的Cmax和AUC(INF)，由关于log(Cmax)和log(AUC)的方差分析结果计算关于方法CD-CHO1的群体几何平均值比的90％置信区间。
药物代谢动力学结果：药物代谢动力学结果使用验证的非区室分析程序进行测定。药物代谢动力学参数得自用方法CD-CHO1CTLA4-Ig给药的13个受试者。下表列出了在健康受试者中关于CTLA4-Ig的药物代谢动力学参数。下表显示了关于CTLA4-Ig药物代谢动力学参数的概括统计表。
CTLA4-Ig在健康受试者中具有约17天的平均T-HALF值，与在牛皮癣受试者(10－18天)和类风湿性关节炎患者(约13天)中获得的半衰期一致。观察到的0.09－0.10L/kg的平均Vss值指出CTLA4-Ig主要限制于血管系统且并不显著地分布到血管外空间内。
下表显示了血清浓度(ng/ml)/受试者。
关于CTLA4-Ig的血清测定
在总共25次分析运行中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)就CTLA4-Ig分析血清样品。所有分析结果符合样品分析前确定的示例性值，从而指出ELISA法对于研究样品中的CTLA4-Ig定量是精确和准确的。关于血清中的CTLA4-Ig的标准曲线参数和平均QC数据概括呈现于表48中。关于CTLA4-Ig的分析QCs的运行间和运行内变异性分别为4.5％和3.5％CV。分析QC样品观察到的平均浓度偏离标称值小于±8.9％(表48)。
表48：关于人血清中CTLA4-Ig的测定的质量对照数据概括
CTLA4-Ig的药物代谢动力学
经由方法对于所有受试者的CTLA4-Ig血清浓度的平均值和标准差呈现于下表中。经过71天的平均CTLA4-Ig血清浓度对时间概况呈现于图44中。
关于CTLA4-Ig(ng/ml)的平均血清浓度对时间数据
天 小时 分钟 N 平均值 SD ％CV
. . 0 15 0.42 0.87 207.21
. . 15 15 135475.0 28811.82 21.27
. . 30 15 273867.9 71406.26 26.07
. 1 0 15 253311.5 43221.58 17.06
. 2 0 15 254479.4 39611.12 15.57
. 6 0 15 219082.5 44894.29 20.49
. 12 0 15 191885.0 45180.00 23.55
1 0 0 15 161732.2 28740.25 17.77
3 0 0 15 101411.4 18615.59 18.36
7 0 0 15 59375.96 13598.10 22.90
14 0 0 15 33676.97 8148.64 24.20
21 0 0 15 21909.72 5226.77 23.86
28 0 0 15 17193.52 5145.61 29.93
42 0 0 15 8828.95 3246.22 36.77
56 0 0 15 5244.51 2621.36 49.98
70 0 0 15 2970.32 1811.64 60.99
关于药物代谢动力学参数(Cmax、AUC(INF)、CLT、Vss、Tmax和T-HALF)的概括统计学呈现于表50中。结果指出由本发明的方法产生的CTLA4-Ig具有约17天(范围7-25天)的平均T-HALF值。观察到的0.09-0.10L/kg的Vss值指出CTLA4-Ig主要限制于细胞外液体积。
表50：关于由本发明的方法产生的CTLA4-Ig的药物代谢动力学参数的概括统计表
结果指出关于由本发明的方法产生的CTLA4-Ig的平均T-HALF为约17天。清除率和分布体积值也呈现于表50中。
单次10mg/kg静脉内输注后健康成年人受试者和多次10mg/kg静脉内输注后RA患者中的CTLA4-Ig药物代谢动力学在表47中列出。
表47.在10mg/kg静脉内输注后健康受试者和RA患者中的药物代谢动力学参数(平均值，范围)
a多次静脉内输注在第1、15、30天及其后每月施用。
实施例67－质粒pcSDhuCTLA4Ig的DNA序列
质粒pcSDhuCTLA4Ig的DNA序列示于图97。
上文的实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、21、28、29、30、31、32、33、34、42、44、45、46、47、48、49、50、51、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67特别涉及具有SEQ ID NO：1、2、5、6、7、8、9、10或18的CTLA4-Ig蛋白质，且上文的实施例19、20、22、23、24、25、26、27、35、36、37、38、39、40、41、52、53、54、55、56、57特别涉及具有SEQ ID NO：4、11、12、13、14、15或16的CTLA4-Ig蛋白质。如本说明书中所述，涉及实施例中的这些蛋白质的方法及其用途对于涉及本发明的其他CTLA4-Ig蛋白质的方法及其用途是举例说明性的。
包含本发明的CTLA4-Ig分子的示例性和非限制性组合物包括此种组合物，其中：
(1)CTLA4-Ig分子包含SEQ ID NO：2、5、6、7、8、9、10或18中的一种或多种，且如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测(关于其的测量方法在实施例10中阐述)所测定的，CTLA4-Ig分子小于或等于约5.0面积百分比的CTLA4-Ig高分子量种类(或CTLA4-Ig四聚体)。更具体而言，本发明提供了进一步具有一种或多种下述特征的此种组合物：
不超过0.35EU/mg CTLA4-Ig分子或76.8EU/mL的细菌内毒素最大量(其可以是细菌内毒素的不存在)；用于测量这种特征的方法在实施例48中阐述；
不超过1CFU/10mL或1CFU/mL的最大生物负荷(其可以是生物负荷的不存在)；用于测量这种特征的方法在实施例49中阐述；
提供(作为CTLA4-Ig分子或作为所述组合物)(a)具有约4.3－约5.6的pI范围的约10－22个条带，在约4.3－约5.3的pI范围时90％－110％的累积条带强度，和在约4.5－约5.2的pI范围时的约3个主要条带，或(b)具有小于或等于5.1的pI的占优势CTLA4-Ig同工型，且至少90％的CTLA4-Ig分子显示小于或等于约5.3的pI；用于测量这种特征的方法在实施例50中阐述；
小于或等于3.5面积百分比的CTLA4-Ig分子是其氧化种类，且小于或等于2.5面积百分比的CTLA4-Ig分子是其脱酰胺种类；用于测量这些特征的方法在实施例47中阐述；
如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是大于或等于95.0面积百分比的CTLA4-Ig二聚体；用于测量这种特征的方法在实施例10中阐述；
如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是小于5.0面积百分比的CTLA4-Ig高分子量种类(或CTLA4-Ig四聚体)；用于测量这种特征的方法在实施例10中阐述；
如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是小于或等于0.5面积百分比的低分子量种类(或CTLA4-Ig单体)，或如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，小于0.5面积百分比的低分子量种类(或CTLA4-Ig单体)；用于测量这种特征的方法在实施例10中阐述；
不超过2.5皮克/mg CTLA4-Ig分子或2.5皮克/mg CTLA4-Ig二聚体的DNA最大量(其可以是DNA的不存在)；用于测量这种特征的方法在实施例58中阐述；
不超过3.0ng/mg总CTLA4-Ig分子、5ppm或5ng/mg CTLA4-Ig二聚体的MCP-1最大量(其可以是MCP-1的不存在)；用于测量这种特征的方法在实施例59中阐述；
不超过25ng/mg CTLA4-Ig分子或50ng/mg CTLA4-Ig二聚体的宿主细胞蛋白质(也称为细胞蛋白质)最大量(其可以是宿主细胞蛋白质或细胞蛋白质的不存在)；用于测量这种特征的方法在实施例60中阐述；
不超过1.0ng/mg CTLA4-Ig分子的Triton X-100最大量(其可以是Triton X的不存在)；用于测量这种特征的方法在实施例61中阐述；
不超过5.0ng/mg CTLA4-Ig分子的A蛋白最大量(其可以是A蛋白的不存在)；用于测量这种特征的方法在实施例62中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约15－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例63中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约1.7－约3.6的GalNAc与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例63中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约8.0－约17的半乳糖与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例64中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约3.5－约8.3的岩藻糖与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例64中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约7.7－约22的甘露糖与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例64中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，大于或等于8.0，例如约8.0－约12.0的唾液酸与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例16中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，大于或等于8.0，例如约8.0－约12.0的NANA与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例16中阐述；
CTLA4-Ig分子具有N联糖基化，从而使得结构域I显示约24.5％－约35.2％的面积百分比，或结构域II显示约26.3％－约34.1％的面积百分比，或结构域III显示约21.9％－约31.5％的面积百分比，或结构域IV和结构域V显示约7.9％－约18.6％的面积百分比；用于测量这种特征的方法在实施例44中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，小于或等于1.5的NGNA与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例16中阐述。
本发明提供了作为分离或基本上纯化的此种组合物。本发明提供了作为药物组合物或药学上可接受的组合物的此种组合物。本发明提供了具有这些特征的任何排列或组合的组合物。
本发明提供了作为分离或基本上纯化的此种组合物。本发明提供了作为药物组合物或药学上可接受的组合物的此种组合物。本发明提供了具有这些特征的任何排列或组合的组合物：
(2)CTLA4-Ig分子包含SEQ ID NO：4、11、12、13、14、15、16或24中的一种或多种(例如CTLA4A29YL104E-Ig)，且如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测(关于其的测量方法在实施例25中阐述)所测定的，CTLA4-Ig分子小于或等于约5.0面积百分比的CTLA4-Ig高分子量种类(或CTLA4-Ig四聚体)。更具体而言，本发明提供了进一步具有一种或多种下述特征的此种组合物：
如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是大于或等于95.0面积百分比的CTLA4-Ig二聚体；用于测量这种特征的方法在实施例25中阐述；
如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的，CTLA4-Ig分子是小于或等于1.0面积百分比的CTLA4-Ig低分子量种类(或CTLA4-Ig单体)；用于测量这种特征的方法在实施例25中阐述；
提供(作为CTLA4-Ig分子或作为所述组合物)具有约4.5－约5.6的pI范围的约8－15个条带，和在约4.5－约5.6的pI范围时95％－105％的累积条带强度；用于测量这种特征的方法在实施例22中阐述；
不超过约2.5pg/mg CTLA4-Ig分子的DNA最大量；用于测量这种特征的方法在实施例55中阐述；
不超过5ng/mg CTLA4-Ig分子的A蛋白最大量；用于测量这种特征的方法在实施例53中阐述；
不超过5ng/mg CTLA4-Ig分子的MCP-1最大量；用于测量这种特征的方法在实施例54中阐述；
不超过50ng/mg CTLA4-Ig分子的宿主细胞蛋白质(也称为细胞蛋白质)最大量；用于测量这种特征的方法在实施例52中阐述；
不超过0.42EU/mg CTLA4-Ig分子的细菌内毒素最大量；用于测量这种特征的方法在实施例48中阐述；
不超过1CFU/mL的最大生物负荷；用于测量这种特征的方法在实施例49中阐述；
不超过2ppm的Triton X-100最大量；用于测量这种特征的方法在实施例57中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，大于或等于5.0，例如约5.0－约9.0、或约5.0－约10.0的唾液酸与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例39中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，大于或等于5.0，例如约5.0－约9.0、或约5.0－约10.0的NANA与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例39中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约0.8－约4.0的GalNAc与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例36中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约14－约35的GlcNAc与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例36中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约8.0－约14的半乳糖与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例35中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约1.7－约9.3的岩藻糖与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例35中阐述；
CTLA4-Ig分子具有表示为摩尔/摩尔蛋白质，约9－约18的甘露糖与CTLA4-Ig分子(或与CTLA4-Ig二聚体)的平均摩尔比；用于测量这种特征的方法在实施例35中阐述；
本发明提供了分离或基本上纯化的此种组合物。本发明提供了具有这些特征的任何排列或组合的组合物。
上文的实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、21、28、29、30、31、32、33、34、42、44、45、46、47、48、49、50、51、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67特别涉及上文(1)的CTLA4-Ig蛋白质，尽管，如本说明书中所述，涉及这些实施例中的此种蛋白质的方法及其用途对于涉及本发明的其他CTLA4-Ig蛋白质的方法及其用途是举例说明性的。
上文的实施例19、20、22、23、24、25、26、27、35、36、37、38、39、40、41、52、53、54、55、56、57特别涉及上文(2)的CTLA4-Ig蛋白质，尽管，如本说明书中所述，涉及这些实施例中的此种蛋白质的方法及其用途对于涉及本发明的其他CTLA4-Ig蛋白质的方法及其用途是举例说明性的。

Claims (7)

1.用于获得包含来自液体培养基的分离的CTLA4-Ig分子群体的组合物的方法，所述培养基包含CTLA4-Ig分子的原始群体，其中(1)所述原始群体的CTLA4-Ig分子具有一个或多个唾液酸残基，(2)所述唾液酸残基的数目/CTLA4-Ig分子在所述原始群体内有变化，(3)所述原始群体包含CTLA4-Ig二聚体和高分子量聚集物，和(4)所述液体培养基含有MCP-1，所述方法包括：
(i)收获来自表达CTLA4-Ig分子的哺乳动物细胞培养物的所述液体培养基；
(ii)使所述CTLA4-Ig分子与细胞组分分离；
(iii)使用柱层析以减少组合物中的MCP-1含量；
(iv)使用柱层析以使CTLA4-Ig二聚体和CTLA4-Ig高分子量聚集物分离；和
(v)使用柱层析以将所述CTLA4-Ig分子分成2个或更多级分，其中与至少一个另外级分相比较，至少一个级分具有更大的唾液酸与CTLA4-Ig分子的摩尔比；
(vi)其中步骤(ii)、(iii)、(iv)和(v)同时或以任何顺序进行，以便获得所述组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述组合物的CTLA4-Ig分子特征在于大于或等于8.0的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
3.权利要求1的方法，其中所述组合物的CTLA4-Ig分子特征在于小于或等于2.5面积％的CTLA4-Ig高分子量种类，如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的。
4.权利要求1的方法，其中所述组合物包含小于或等于3ng/mgCTLA4-Ig分子的量的MCP-1。
5.权利要求1的方法，其中所述组合物的CTLA4-Ig分子特征在于大于或等于5.0的NANA与CTLA4-Ig分子的平均摩尔比。
6.权利要求1的方法，其中所述组合物的CTLA4-Ig分子特征在于小于或等于4.0面积％的CTLA4-Ig高分子量种类，如通过尺寸排阻层析和分光光度法检测所测定的。
7.权利要求1的方法，其中所述组合物包含不超过5ppm MCP-1。
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