CN112638419A - 修饰的ctla4及其使用方法 - Google Patents

Abstract

在一些方面，本公开提供了对配体具有高结合亲和力的多肽，以及包含该多肽的组合物，和使用该多肽的方法。在一些实施方案中，提供了对CD80、CD86或两者具有高结合亲和力的多肽。

Description

修饰的CTLA4及其使用方法

交叉引用

本申请要求2018年11月2日提交的PCT申请PCT/CN2018/113643的优先权，该申请为了所有目的在此通过引用整体并入本文。

背景技术

免疫系统是保护生物体抵御疾病的宿主防御系统。免疫系统的功能障碍可导致多种疾病，如自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症。仍然非常需要改进的治疗组合物和方法，其可帮助调节免疫系统的正常功能，从而保护人体抵御各种疾病和状况。

发明内容

在某些实施方案中，本文描述了一种多肽，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1-124具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的第一氨基酸序列，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2在选自位置18、40、68、77、86、92、107、117、118和122的一个或多个位置处包含突变。

在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，与阿巴西普(SEQ ID NO:2)相比，所述多肽表现出增强的对CD80和/或CD86的结合亲和力。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2在位置68处包含突变。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2在位置40处包含突变。在一些实施方案中，所述多肽进一步相对于SEQID NO:2在选自位置16、24、25、27、28、29、33、41、42、48、49、50、51、52、53、54、58、59、60、61、63、64、65、69、70、80、85、93、94、96和105的一个或多个位置处包含突变。在一些实施方案中，所述突变包括氨基酸置换或缺失。

在某些实施方案中，本文描述了一种多肽，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1-124具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含选自下组的氨基酸置换：S18R、S18N、A24S、G27DKA、G27DK、G27K、G27R、G27W、G27Y、G27E、G27KK、A29T、A40T、A49P、A50T、G68F、G68K、G68W、G68Y、G68H、G68D、G68E、L77V、D86N、C92S、C92Y、K93V、K93W、K93P、K93C、K93F、K93R、V94L、G105S、G107D、P117S、E118K、D122H及其任意组合。

在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，与阿巴西普(SEQ ID NO:2)相比，所述多肽表现出增强的对CD80和/或CD86的结合亲和力。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G27DKA。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G68F。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ IDNO:2包含氨基酸置换A40T。在一些实施方案中，所述多肽进一步相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换K93M。在一些实施方案中，所述多肽进一步相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G27DK。在一些实施方案中，所述多肽进一步相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G27H。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换P117S。在一些实施方案中，所述多肽进一步相对于SEQ ID NO:2包含至少一个选自下组的氨基酸置换：A24E、G27H、G27D、A29S、R33W、D41G、T51N、K93M、K93N和G105D。

在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含选自下组的氨基酸置换组合：G27DKA/R33W、G27DKA/G68F、R33W/G68F、G27R/G68Y、G27H/G68F、G27DK/G68F、G27DK/G68D、G27DK/G68E、G27D/G68F、G27E/G68F、G27H/G68D、G27H/G68E、G27DKA/G68F、G27H/G68F、G27DK/G68F、G27DKA/G68F/D122H、G27DKA/G68F/A40T/D122H、G27DKA/G68F/A40T/P117S、G27DKA/G68F/L77V、G27DKA/G68F/C92S/K93M、G27DK/G68F/A49P/A50T、G27DK/G68F/A40T/D86N/G105S、G27KK/G68F、G27DKA/G68F/P117S、G27DKA/G68F/A49P/A50T、G27DK/G68F/A40T、G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S、G27DK/G68F/L77V、G27DK/G68F/C92S/K93M、G27DK/G68F/P117S、G27DKA/G68F/G105S、G27DKA/G68F/D86N、G27DK/G68F/D122H、G27DK/G68F/A40T/G105S、G27DK/G68F/G105S、G27DK/G68F/D86N、G27DKA/G68F/A40T、G27DKA/G68F/K93M、G27DK/G68F/K93M和G27DKA/A40T/G68F/K93M。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/A40T/G68F/K93M。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/A40T。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/K93M。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/A40T/P117S。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/P117S。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27H/G68F。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/K93M。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/A40T。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/L77V。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/P117S。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/D122H。

在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124包含至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个氨基酸置换。

在某些实施方案中，本文描述了一种多肽，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1-124具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124的氨基酸置换选自本文所述的氨基酸置换。

在一些实施方案中，所述多肽进一步包含与所述第一氨基酸序列融合的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第二氨基酸序列编码IgG Fc区。在一些实施方案中，所述IgG Fc区来自人IgG分子。

在一些实施方案中，所述第二氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸125-357具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO:6的氨基酸1-359具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述第一和第二氨基酸序列通过连接体融合在一起。在一些实施方案中，所述连接体包含1至10个氨基酸。在一些实施方案中，所述连接体包含选自表7的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接体包含氨基酸序列Q(SEQ ID NO:82)或GGGGS(SEQ ID NO:54)。

在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是阿巴西普(SEQ ID NO:2)对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250或至少300倍。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是阿巴西普(SEQ ID NO:2)对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250或至少300倍。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力大于贝拉西普(SEQ ID NO:3)对CD80的亲和力。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力大于贝拉西普(SEQ ID NO:3)对CD86的亲和力。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是贝拉西普(SEQ ID NO:3)对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是贝拉西普(SEQ IDNO:3)对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力大于SEQ ID NO:4对CD80的亲和力。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力大于SEQ IDNO:4对CD86的亲和力。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力大于SEQ ID NO:5对CD80的亲和力。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力大于SEQ ID NO:5对CD86的亲和力。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。

在某些实施方案中，本文描述了一种多肽-药物缀合物，其包含本文公开的多肽。

在某些实施方案中，本文描述了一种治疗疾病或状况的方法，其包括向有需要的受试者施用本文公开的多肽或本文公开的多肽-药物缀合物。

在一些实施方案中，所述疾病或状况包括感染、与感染相关的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身发作型青少年特发性关节炎(JIA)、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、多发性硬化、强直性脊柱炎、皮肌炎、葡萄膜炎、Peyronie病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛症、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜脑炎、免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性病症、自身免疫性病症、胰腺炎、手术引起的创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病、骨吸收、烧伤患者、心肌梗死、Paget病、骨质疏松症、脓毒症、肝/肺纤维化、牙周炎、低胃酸、实体瘤(肾细胞癌)、肝癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症和B细胞恶性肿瘤(例如，Casteleman病、某些淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤)。

在某些实施方案中，本文描述了一种用于治疗受试者的状况的多肽。

在一些实施方案中，所述状况包括移植排斥、感染、与感染相关的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身发作型青少年特发性关节炎(JIA)、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、多发性硬化、强直性脊柱炎、皮肌炎、葡萄膜炎、Peyronie病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛症、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜脑炎、免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性病症、自身免疫性病症、胰腺炎、手术引起的创伤、移植物抗宿主病、心脏病、骨吸收、烧伤患者、心肌梗死、Paget病、骨质疏松症、脓毒症、肝/肺纤维化、牙周炎、低胃酸、实体瘤(肾细胞癌)、肝癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症和B细胞恶性肿瘤(例如，Casteleman病、某些淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤)。

在某些实施方案中，本文描述了一种药物组合物，其包含本文公开的多肽或本文公开的多肽-药物缀合物以及药学上可接受的赋形剂。

在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其在容器中包含本文公开的多肽或本文公开的多肽-药物缀合物。

在某些实施方案中，本文描述了本文提供的多肽或本文提供的多肽-药物缀合物在制备用于治疗受试者的状况的药物中的用途。

在某些实施方案中，本文描述了一种分离的多核苷酸，其编码本文公开的多肽。

在某些实施方案中，本文描述了一种载体，其包含本文公开的分离的多核苷酸。

在某些实施方案中，本文描述了一种细胞，其包含本文公开的载体。

在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞或昆虫细胞。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：

图1是示例性多肽(CTLA4-Fc突变体)的竞争性结合测定的图示。

图2A和图2B显示了示例性多肽的竞争性结合测定的代表性结果，分别表明了其对CD80和CD86的相对结合亲和力。

图3A和图3B显示了示例性多肽的另一个竞争性结合测定的代表性结果，分别表明了其对CD80和CD86的相对结合亲和力。

图4显示了示例性多肽的T细胞增殖试验的代表性结果，证明了其对T细胞增殖的抑制作用。

图5示出了检查示例性多肽对T细胞在免疫刺激后的IL-2分泌的抑制作用的试验原理。

图6A-6C显示了示例性多肽的IL-2分泌测定的代表性结果，证明了其对T细胞在免疫刺激后的IL-2分泌的抑制作用。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文所述的本公开的系统和方法可使用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、微阵列和测序技术的常规技术和描述，这些技术和描述都在本领域技术人员的技能范围内。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、寡核苷酸的杂交和连接、寡核苷酸的测序以及使用标记物检测杂交。可以参考本文的实例对合适的技术加以具体说明。然而，当然也可以使用等效的常规程序。这类常规技术和描述可见于标准实验室手册，如Green等人编,Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)(1999)；Weiner等人编,Genetic Variation:A Laboratory Manual(2007)；Dieffenbach,Dveksler编,PCR Primer:A Laboratory Manual(2003)；Bowtell和Sambrook,DNAMicroarrays:A Molecular Cloning Manual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequenceand Genome Analysis(2004)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols fromMolecular Cloning:A Laboratory Manual(2006)；以及Sambrook和Green,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)(均来自Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Stryer,L.,Biochemistry(第4版)W.H.Freeman,N.Y.(1995)；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”IRL Press,London(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry,第6版,W.H.Freeman Pub.,New York(2012)；R.I.Freshney,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique andSpecialized Applications,第6版,Wiley-Blackwell(2010)；以及Berg等人,Biochemistry,第5版,W.H.Freeman Pub.,New York(2002)，以上全部为了所有目的通过引用整体并入本文。在描述本发明的组合物、研究工具和系统及方法之前，应当理解，本公开内容不限于所描述的具体系统和方法、组合物、目标及用途，因为这些当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并非旨在限制本公开的范围，本公开的范围将仅由所附权利要求书来限制。

除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分取决于该值如何测量或测定，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域中的实践，“约”可指在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可指给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可表示在某个值的一个数量级内，优选5倍以内，更优选2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应推定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。这些术语还包括自然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或其他任何操作或修饰，如与标记组分缀合。该定义内还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。应当理解，由于本文所述的多肽基于抗体，因此所述多肽可以作为单链或缔合链出现。

术语“氨基酸”是指天然的、非天然的和合成的氨基酸，包括但不限于D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。使用标准的单字母或三字母代码指代氨基酸。

术语“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光异构体形式：甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。

应用于序列并在本文中使用的术语“非天然存在的”意指与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列没有对应物、不互补或不具有高度同源性，或者包含非天然存在的残基(例如核苷酸类似物)的多肽或多核苷酸序列。例如，当适当比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共有不超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更低的氨基酸序列同一性。

术语“亲水性”和“疏水性”是指物质与水的亲和力程度。亲水性物质对水具有强亲和性，倾向于在水中溶解、与水混合或被水润湿，而疏水性物质基本上缺乏对水的亲和性，倾向于排斥及不吸收水并倾向于不在水中溶解或不与水混合或不被水润湿。氨基酸可以根据它们的疏水性来表征。已经开发了许多量表(scale)。一个实例是由Levitt，M等人,J MolBiol(1976)104:59开发的量表，其在Hopp,TP等人,Proc Natl Acad Sci USA(1981)78:3824中列出。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别感兴趣的是亲水性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸以及甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

当用于蛋白质时，“片段”为天然生物活性蛋白质的截短形式，其可以保留或可能不保留至少一部分治疗活性和/或生物活性。当用于蛋白质时，“变体”是与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质，其保留了该生物活性蛋白质的至少一部分治疗活性和/或生物活性。例如，与参考生物活性蛋白质相比，变体蛋白质可以共有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。如本文所用的，术语“生物活性蛋白质部分”包括例如通过定点诱变、编码基因的合成、插入而有意修饰或通过突变而意外修饰的蛋白质。

在多肽的语境中，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基端至羧基端方向的氨基酸顺序，其中在序列中彼此邻接的残基在多肽一级结构中是连续的。“部分序列”是已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。

在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括，例如，一个或多个天然存在的核苷酸被类似物的“帽”置换，核苷酸间修饰，例如，带有不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的那些，以及带有带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂部分例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些，带有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些，含有烷化剂的那些，带有修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，糖中通常存在的任何羟基都可以被替换，例如替换为膦酸酯基团、磷酸酯基团，被标准保护基保护，或被活化以形成与额外的核苷酸的额外的连接，或者可以缀合至固体支持物。可以用1或20个碳原子的胺或有机加帽基团对5’和3’末端OH进行磷酸化或取代。其他羟基也可以衍生为标准保护基。多核苷酸还可以包含在本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键可被替换为备选的连接基团。这些备选的连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸脂被替换为P(O)S(“硫代磷酸酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代磷酸酯(dithioate)”)、(O)NR₂(“氨基磷酸酯(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH₂(“formacetal”)，其中每个R或R'独立地为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都需要是相同的。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“融合配偶体”是指与本文所述的CTLA4变体序列融合的肽或多肽。可以将融合配偶体与N和/或C末端的CTLA4变体序列融合。示例性的融合配偶体包括但不限于白蛋白、转铁蛋白、adnectins(例如，白蛋白结合的或药代动力学延伸的(PKE)adnectins)、Fc结构域和非结构化多肽如XTEN和PAS多肽(例如，由氨基酸Pro、Ala和/或Ser组成的构象杂乱的多肽序列)或上述任一种的片段。融合配偶体可以与修饰的CTLA4变体序列融合，以用于任何目的，包括但不限于纯化、可制备性、半衰期延长、增强的生物物理性质(例如，溶解性或稳定性)、降低的免疫原性或毒性等。

抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，它们是单独的或组合的。重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR近距离地靠在一起，并与另一条链的CDR一起促使形成抗体的抗原结合位点。至少有两种确定CDR的技术：(1)一种基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等人.Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD)；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948)。如本文所用的，CDR可指通过任何一方法或通过两种方法的组合定义的CDR。

抗体的“恒定区”是指抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，它们是单独的或组合的。

“连接体序列”是指其N末端和C末端均与其他肽或多肽融合的氨基酸序列。连接体序列可存在于融合蛋白中，例如，其末端(以任一顺序)与CTLA4变体序列和融合配偶体序列融合。示例性的连接体序列可包含0个氨基酸(即不存在连接体序列)至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60或100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，连接体序列可包含1至40个、1至30个、1至20个、1至10个、1至5个、2至40个、2至30个、2至20个、2至10个、5至40个、5至30个、5至20个或5至10个氨基酸。在一些实施方案中，连接体序列可包含5至20个氨基酸。在一些实施方案中，连接体序列可包含10至20个氨基酸。本文所述的某些示例性连接体序列可以富含丝氨酸和甘氨酸残基，然而，应当理解，连接体序列并不限于这些序列。

“宿主细胞”包括可以是或已经是包含外源多核苷酸的载体的接受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且该后代因天然的、偶然的或有意的突变而可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补体上)。宿主细胞包括在体内用本公开的多核苷酸转染的细胞。

术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C末端区域，该区域可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来生成。如本文所述的Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。在某一情况下，如本文所述的Fc区包含两个恒定域，即一个CH2域和一个CH3域。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至其羧基末端。Fc区中的残基的编号是按Kabat中的EU索引进行的编号。Kabat等人,Sequences of Proteins of Imunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定域，即CH2和CH3。

“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变异Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些情况下，可变Fc区仍保留天然序列Fc区的至少一种效应功能。在其他情况下，可变Fc区可能没有天然序列Fc区的效应功能。与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变异Fc区可具有至少一个氨基酸置换，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的约一个至约十个氨基酸置换，或约一个至约五个氨基酸置换。本文的变异Fc区与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区可具有至少约80％的序列同一性，或至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。

“个体”或“受试者”是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞技动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。

如本文所用的，“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送并优选表达一种或多种目的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，如生产细胞。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或所需结果的药剂的量。治疗有效量可根据以下一个或多个因素而不同：所治疗的受试者和疾病状况，受试者的体重和年龄，疾病状况的严重程度，给药方式等，这些可以容易地由本领域普通技术人员确定。可以以单一剂量或多个剂量施用有效量的活性剂。组分在本文中可被描述为至少具有有效量，或至少具有有效产生所需结果的量，例如与特定目标或目的如本文所述的任何目标或目的相关的有效量。

术语“有效量”还适用于将通过适当成像方法提供图像以供检测的剂量。具体剂量可根据以下一个或多个因素而不同：所选择的特定药剂、所遵循的给药方案、是否与其他化合物联合施用、给药时机、待成像的组织以及携带该药剂的物理递送系统。

如本文所用的，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时使该成分保留生物活性，并且对受试者的免疫系统没有反应性的任何物质。实例包括但不限于任何标准的药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，如油/水或水/油乳液，以及多种类型的润湿剂。用于气雾剂或肠胃外给药的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过公知的常规方法配制(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；以及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版.MackPublishing,2000)。

概述

在一个方面，本公开提供了一种包含CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)变体序列、具有改进的靶标结合亲和力的多肽，例如，修饰的CTLA4融合蛋白，包含它的组合物和试剂盒，及其使用方法。

T细胞淋巴细胞通过提供对特定病原体的适应性应答而在细胞介导的免疫中起关键作用。在一些情况下，T辅助细胞抗原应答需要通过将T细胞受体结合至与抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC(主要组织相容性复合物)结合的抗原来激活第一信号传导途径，并且同时，还需要激活第二信号传导途径，该途径可以通过将T细胞表面上的CD28蛋白结合至APC表面上的CD80(B7-1)和CD86(B7-2)而产生共刺激信号。由CD28与APC表面上的CD80和CD86的结合所介导的共刺激途径可以在T细胞活化和分化中发挥作用，其对组织迁移和外周耐受诱导也至关重要。活化的T细胞也可以在其细胞表面上表达CTLA4，这是可以以较高亲和力与CD80和CD86结合的CD28的同系物。在一些情况下，CTLA4表达导致与CD80和CD86的竞争性结合，从而阻断CD80/86-CD28相互作用并终止T细胞活化。在一些情况下，这些信号传导途径决定了T细胞对抗原的应答的量级，以及对抗原的下游应答，例如通过阻断CD80/CD86与CD28和/或CTLA4之间相互作用中的一个或多个而调节一种或多种共刺激信号的药剂可以有效治疗由免疫应答失调导致的病症。

在一些实施方案中，本文提供了包含CTLA4变体序列的多肽，其具有改善的对CD80或CD86的结合亲和力。在一些实施方案中，本文提供的包含CTLA4变体序列的多肽具有改善的免疫抑制活性，例如，增强的对T细胞活化的抑制作用。不希望束缚于某些理论，在一些实施方案中，对CD80或CD86的结合亲和力的改善至少部分是与具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的天然人CTLA4蛋白相比在一个或多个位置处的突变的结果。在一些实施方案中，与天然CTLA4蛋白(SEQ ID NO:1)相比，主题多肽序列在针对CD80或CD86的结合域中的一个或多个位置处包含突变，从而潜在地诱导影响对其配体CD80或CD86的结合亲和力的构型变化。

在一些实施方案中，本文提供了一种多肽，该多肽是包含与融合配偶体序列融合的CTLA4变体序列的融合蛋白。在一些实施方案中，不希望束缚于某些理论，本文所述的融合配偶体序列的选择导致主题多肽与天然CTLA4蛋白(SEQ ID NO:1)或其他一些CTLA4融合蛋白，如具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的阿巴西普或具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的贝拉西普相比的各种优点(例如，稳定性、溶解度、可递送性、生物利用度或生产率)。

序列同一性

如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列在进行如下所述的最大对应关系比对时是相同的，则这两个多核苷酸或多肽序列被称为“相同的”。通常通过比较对比窗口上的序列以鉴定并比较具有序列相似性的局部区域来进行两个序列之间的比较。

可使用采用默认参数的生物信息学软件Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)来进行用于比较的序列的最佳比对。该程序体现了在以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary changein proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。可以使用备选的比对程序，包括但不限于BLAST算法，其还可以用来评价序列同一性，例如通过使用默认参数。

优选地，通过在(例如，至少20个位置)的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即空位)，如20％或更少(例如5％至15％或10％至12％)的空位。一般通过以下方法来计算百分比：确定在两个序列中均出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以参考列中的位置总数(即窗口大小)，并将所得结果乘以100以得到序列同一性百分比。

关于本文确定的氨基酸序列的序列同一性被定义为在将序列进行比对并在必要时引入空位以达到最大序列同一性百分比之后，并且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分，查询序列中与第二、参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。旨在确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以本领域技术中的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个定义的多核苷酸序列的长度上进行测量，或者可以在较短的长度上，例如，在从较大的、定义的多核苷酸序列取得的片段的长度上进行测量，该片段例如是至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且应当理解，本文在表格、附图或序列表中示出的序列所支持的任何片段长度可以用来描述可测量百分同一性的长度。在一些实施方案中，相对于所述参考序列如本文提供的序列的全长来确定同一性百分比。例如，可以通过国家生物技术信息中心(Nation Center for Biotechnology Information)(NCBI)在线提供的计算机程序Blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)进行本公开的两个氨基酸序列(或其较短长度)之间的序列比较。给定的氨基酸序列A相对于给定的氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(其也可以表述为与给定的氨基酸序列B具有一定氨基酸序列同一性百分比的给定的氨基酸序列A)根据以下公式计算：

其中X是通过序列比对程序BLAST在A与B的程序比对中被评分为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中Y是A或B中的氨基酸残基总数，以较短者为准。

CTLA4变体

本公开提供了包含能够与CD80或CD86结合的多肽的组合物，其用途，及其制备方法。在一个方面，本公开提供了一种多肽，其包含作为CTLA4变体的氨基酸序列(CTLA4变体序列)。本文提供的CTLA4变体可以是包含与天然CTLA4序列相关的序列的多肽。CTLA4的变体是包含以下序列的多肽，该序列与天然CTLA4序列(SEQ ID NO:1)的至少一部分具有大约或大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。

天然CTLA4蛋白可以通过其胞外域，或者更具体地通过其结合域与CD80和CD86结合，该结合域可以形成接纳并结合CD80或CD86的三维构型。本文提供的CTLA4变体可具有通过其氨基酸序列的至少一部分与CD80、CD86或两者结合的能力，该至少一部分与天然CTLA4蛋白的胞外域或结合域相关。在一些情况下，CTLA4的变体是包含以下序列的多肽，该序列与天然CTLA4序列的胞外域的部分或整体，例如SEQ ID NO:1的氨基酸36-161，或阿巴西普(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-124，具有大约或大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。在一些情况下，CTLA4的变体是包含以下序列的多肽，该序列与天然CTLA4序列的结合域，例如SEQ ID NO:1的氨基酸58-149，或SEQ ID NO:2的氨基酸21-112，具有大约或大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。

天然CTLA4蛋白的胞外域可包含作为SEQ ID NO:1的氨基酸36-161或SEQ ID NO:2的氨基酸1-124的序列，并且天然CTLA4蛋白的结合域可包含开始于氨基酸1至21之间的任何位置并结束于氨基酸112至124之间的任何位置的氨基酸序列。在一些情况下，本文提供的CTLA4的变体可包含以下氨基酸序列，该序列与开始于SEQ ID NO:2的氨基酸1至8、8至16或16至21之间的任何位置并结束于氨基酸112至124之间的任何位置的氨基酸序列具有大约或大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。在一些情况下，本文提供的CTLA4的变体可包含以下氨基酸序列，该序列与开始于SEQ ID NO:2的氨基酸1至21之间的任何位置并结束于氨基酸112至115、115至118、118至121或121至124之间的任何位置的氨基酸序列具有大约或大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。在一些情况下，本文提供的CTLA4的变体可包含以下氨基酸序列，该序列与开始于SEQID NO:2的氨基酸1至8、8至16或16至21之间的任何位置并结束于氨基酸112至115、115至118、118至121或121至124之间的任何位置的氨基酸序列具有大约或大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。

如本文所提供的，CTLA4的变体可包含与天然CTLA4序列(例如，SEQ ID NO:1)的至少一部分相比，例如与天然CTLA4序列的胞外域或结合域，例如SEQ ID NO:1的氨基酸36-161或SEQ ID NO:2的氨基酸1-124，或SEQ ID NO:1的氨基酸56-147或SEQ ID NO:2的氨基酸21-112相比，具有一个或多个突变的氨基酸序列。在一些情况下，与天然CTLA4序列的至少一部分相比，例如与SEQ ID NO:1的氨基酸36-161或SEQ ID NO:2的氨基酸1-124，或SEQID NO:1的氨基酸56-147或SEQ ID NO:2的氨基酸21-112相比，CTLA4的变体具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或50个突变。在一些情况下，与天然CTLA4序列的至少一部分相比，例如与SEQ ID NO:1的氨基酸36-161或SEQ ID NO:2的氨基酸1-124，或SEQID NO:1的氨基酸56-147或SEQ ID NO:2的氨基酸21-112相比，CTLA4的变体具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或50个突变。

突变

在本文提供的一些实施方案中，相对于参考序列，例如，CTLA4蛋白的至少一部分，本文所述的主题多肽可具有一个或多个突变。突变可以是缺失、插入或添加，或替换或置换为氨基酸残基。“缺失”是指由于缺乏一个或多个氨基酸残基而导致的氨基酸序列的变化。“插入”或“添加”是指导致与参考序列相比增加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的变化。“替代”或“置换”是指用不同的氨基酸替换一个或多个氨基酸。在本公开的上下文中，主题多肽相对于参考序列，例如相对于天然CTLA4蛋白的至少一部分的突变，可以通过将主题多肽或其部分与参考序列进行比较来确定。可以根据本领域中任何已知的方法对序列进行最佳比对以供比较。

突变可以通过突变位点来标识。突变位点是参考序列上发生缺失、添加或置换的位置。参考序列上的氨基酸残基从N末端向C末端编号，并且突变位点是发生缺失、添加或置换的氨基酸残基的编号。例如，参考序列上的位置26是从N末端开始第26个氨基酸残基所处的位置。

在本公开的上下文中，在参考序列上的特定位置与紧接在特定位置之后的位置之间(或者在特定位置的氨基酸残基是最后一个氨基酸残基时，在特定位置之后)添加一个或多个氨基酸残基的情况被认为是特定位置的氨基酸残基被置换为超过一个氨基酸残基。例如，与参考氨基酸序列XYZ相比，突变氨基酸序列XYYZ被认为在第二个位置的Y被置换为YY，其中X、Y和Z分别代表单个氨基酸残基。因此，在本公开的上下文中，在特定位置的一个突变旨在表示在特定位置缺失一个氨基酸残基，或特定位置的氨基酸残基被置换为另一个氨基酸残基或超过一个氨基酸残基。

为了相对于参考序列描述突变，可以使用单字母氨基酸代码。就此而言，例如，当主题多肽被称为相对于参考序列在位置26处包含从G到I的突变时，其可以被描述为“G26I”，旨在表示第26个氨基酸残基(根据参考序列为甘氨酸(G)残基)在主题多肽或其部分中被置换为丙氨酸残基。在本公开的上下文中，例如，当主题多肽被称为相对于参考序列在位置26处包含甘氨酸(G)残基的缺失时，其可以被描述为“G26del”，旨在表示第26个氨基酸残基(根据参考序列为甘氨酸(G)残基)在主题多肽或其部分中不存在。在本公开的上下文中，例如，当主题多肽被称为在位置26处的甘氨酸(G)残基之后包含一个或多个氨基酸残基的添加时，其可以被描述为“G26_ins”，后跟添加的氨基酸残基的列表，旨在表示在第26个氨基酸残基(其为甘氨酸(G))与第27个氨基酸之间或者(根据参考序列，在第26个氨基酸残基是最后一个氨基酸残基的情况下)在第26个氨基酸残基(其为甘氨酸(G))之后添加所列出的一个或多个氨基酸残基。

在一些实施方案中，主题多肽包含CTLA4变体序列，该序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124具有一个或多个突变。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含突变。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含突变，如位置16、18、24、25、27、28、29、30、32、33、40、41、42、48、49、50、51、52、53、54、56、58、59、60、61、63、64、65、68、69、70、77、80、85、86、92、93、94、96、105、106、107、122、117、118或其任意组合。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含突变，如位置18、24、27、29、33、40、41、49、50、51、68、77、86、92、93、94、105、107、122、117、118或其任意组合。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含突变，如位置18、40、68、77、86、92、107、117、118和122。

在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含任何类型的突变。例如，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124可在任何一个或多个位置处具有缺失。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含缺失，如位置16、18、24、25、27、28、29、30、32、33、40、41、42、48、49、50、51、52、53、54、56、58、59、60、61、63、64、65、68、69、70、77、80、85、86、92、93、94、96、105、106、107、122、117、118或其任意组合。主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含任何类型的置换。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含任何类型的置换，如位置16、18、24、25、27、28、29、30、32、33、40、41、42、48、49、50、51、52、53、54、56、58、59、60、61、63、64、65、68、69、70、77、80、85、86、92、93、94、96、105、106、107、122、117、118或其任意组合。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含任何类型的置换，如位置18、24、27、29、33、40、41、49、50、51、68、77、86、92、93、94、105、107、122、117、118或其任意组合。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在任何一个或多个位置处包含任何类型的置换，如位置18、40、68、77、86、92、107、117、118和122。

在一些实施方案中，相对于SEQ ID ID NO:2的氨基酸1-124，主题多肽中的CTLA4变体序列包含一个或多个氨基酸置换，如S18R、S18N、A24S、A24E、G27D、G27DK、G27DKA、G27E、G27H、G27K、G27KK、G27R、G27W、G27Y、A29S、A29T、A29H、A29Y、T30N、V32I、R33W、A40T、D41G、D41N、A49P、A50T、A50M、T51N、M53Y、M54K、N56D、L61E、S64P、I65S、G68D、G68E、G68F、G68H、G68K、G68W、G68Y、S70F、L77V、M85A、D86N、C92S、C92Y、K93C、K93N、K93F、K93M、K93P、K93R、K93V、K93W、K93Q、V94L、G105S、G105D、I106F、G107D、P117S、E118K、D122H，或其任何适当的组合。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124，主题多肽中的CTLA4变体序列包含一个或多个氨基酸置换，如S18R、S18N、A24S、G27DKA、G27DK、G27K、G27R、G27W、G27Y、G27E、G27KK、A29T、A40T、A49P、A50T、G68F、G68K、G68W、G68Y、G68H、G68D、G68E、L77V、D86N、C92S、C92Y、K93V、K93W、K93P、K93C、K93F、K93R、V94L、G105S、G107D、P117S、E118K、D122H，或其任何适当的组合。如上所述，主题多肽中的CTLA4变体序列可在任何一个或多个位置处具有任何类型的突变，例如，相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在位置27处的氨基酸G可以置换任何类型的氨基酸或一组氨基酸残基，例如D、DK、DKA、E、H、K、KK、R、W或Y，或者相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124在位置93处的氨基酸K也可以置换任何类型的氨基酸或一组氨基酸残基，例如N、F、M、V、W、P、C、F或R。

在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列可具有相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124的任何突变组合。例如，主题多肽中的CTLA4变体序列可具有相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124的任何突变组合，如表5中的任一个，例如G27DKA/R33W、G27DKA/G68F、R33W/G68F、G27R/G68Y、G27H/G68F、G27DK/G68F、G27DK/G68D、G27DK/G68E、G27D/G68F、G27E/G68F、G27H/G68D、G27H/G68E、G27DKA/G68F、G27H/G68F、G27DK/G68F、G27DKA/G68F/D122H、G27DKA/G68F/A40T/D122H、G27DKA/G68F/A40T/P117S、G27DKA/G68F/L77V、G27DKA/G68F/C92S/K93M、G27DK/G68F/A49P/A50T、G27DK/G68F/A40T/D86N/G105S、G27KK/G68F、G27DKA/G68F/P117S、G27DKA/G68F/A49P/A50T、G27DK/G68F/A40T、G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S、G27DK/G68F/L77V、G27DK/G68F/C92S/K93M、G27DK/G68F/P117S、G27DKA/G68F/G105S、G27DKA/G68F/D86N、G27DK/G68F/D122H、G27DK/G68F/A40T/G105S、G27DK/G68F/G105S、G27DK/G68F/D86N、G27DKA/G68F/A40T、G27DKA/G68F/K93M、G27DK/G68F/K93M或G27DKA/A40T/G68F/K93M。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/A40T/G68F/K93M。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/A40T。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/K93M。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/A40T/P117S。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ IDNO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/P117S。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27H/G68F。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/K93M。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/A40T。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ IDNO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/L77V。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/P117S。在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/D122H。

在一些实施方案中，主题多肽中的CTLA4变体序列包含与SEQ ID NO:6的氨基酸1-126具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。

结合亲和力

如上所述，本文提供的主题多肽包含CTLA4结合域，并且能够与CD80、CD86或两者结合。主题多肽通常可表现出对CD80、Cd86或两者的高结合亲和力。在一些实施方案中，该CD80是人CD80。在一些实施方案中，该CD86是人CD86。

可使用本领域已知的检测技术来检测分子对溶液中或固定在阵列上的CD80或CD86的结合亲和力。这类技术的实例包括免疫技术，如竞争性结合试验和夹心试验；使用诸如共焦扫描仪、共焦显微镜或基于CCD的系统等装置以及诸如荧光、荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移(FRET)、全内反射荧光(TIRF)、荧光相关谱(FCS)等技术进行的荧光检测；比色/光谱技术；表面等离子体共振(SPR)(通过该技术测量在表面吸附的物质的质量变化)；使用放射性同位素的技术，包括常规同位素结合以及闪烁迫近分析(SPA)；质谱法，如基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI)和MALDI飞行时间(TOF)质谱法；椭圆光度法，其为测量蛋白质膜厚度的光学方法；石英晶体微天平(QCM)，其为测量吸附在表面上的材料质量的极灵敏的方法；扫描探针显微术，如原子力显微术(AFM)、扫描力显微术(SFM)或扫描电子显微术(SEM)；以及诸如电化学、阻抗、声学、微波和IR/Raman检测等技术。参见，例如，Mere L等人,"Miniaturized FRET assays and microfluidics:key components for ultra-high-throughput screening,"Drug Discovery Today 4(8):363-369(1999)及其中引用的文献；Lakowicz J R,Principles of Fluorescence Spectroscopy,第2版,Plenum Press(1999)，或Jain KK:Integrative Omics,Pharmacoproteomics,and Human BodyFluids.In:Thongboonkerd V编.Proteomics of Human Body Fluids:Principles,Methods and Applications.Volume 1:Totowa,N.J.:Humana Press,2007，以上文献均通过引用整体并入本文。

在本文提供的一些实施方案中，通过表面等离子体共振来测量主题多肽对CD80或CD86的结合亲和力。

表面等离子体共振(SPR)系统(GE Healthcare，ChicagoIl)可用来测量主题多肽的结合亲和力。示例性SPR分析系统包括但不限于Biacore X100、Biacore T200、Biacore3000或Biacore 4000仪器以及商业传感器芯片系列。在Biacore系统的典型应用中，通过在一定范围的分析物浓度内随时间监测相互作用，然后将整个数据集拟合至描述该相互作用的数学模型，来分析相互作用动力学。缔合阶段(在样品注入期间)包含关于缔合和解离过程的信息，而解离阶段(在样品注入后，当缓冲液流除去解离的分析物分子时)只发生解离。本领域技术人员可根据制造商的手册选择或确定适当的参数和/或条件来进行结合亲和力测定。在一些实施方案中，在37℃下通过表面等离子体共振确定主题多肽的结合亲和力。在一些实施方案中，在室温，例如约22-25℃下，通过表面等离子体共振确定主题多肽的结合亲和力。在一些实施方案中，在不高于37℃的温度下，通过表面等离子体共振确定主题多肽的结合亲和力。

在一个方面，本公开提供了对CD80、CD86或两者具有高结合亲和力的多肽。在一些实施方案中，该多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力大于阿巴西普例如SEQ ID NO:2的结合亲和力。例如，本文提供的多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力是阿巴西普(SEQ IDNO:2)的结合亲和力的至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少2.2、至少2.4、至少2.6、至少2.8、至少3、至少3.5、至少4、至少4.5、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250或至少300倍。在本公开的上下文中，比较两个不同分子之间对CD80、CD86或两者的结合亲和力，该结合亲和力是通过相同的结合测定在相同的实验条件下测定的，例如，在37℃下通过表面等离子体共振测定的。

在一些实施方案中，本文提供的多肽对CD80的结合亲和力与SEQ ID NO:2相比得到改善，但对CD86的结合亲和力相对类似于或低于SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，本文提供的多肽对CD86的结合亲和力与SEQ ID NO:2相比得到改善，但对CD80的结合亲和力相对类似于或低于SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，本文提供的多肽对CD80和CD86的结合亲和力与SEQ ID NO:2相比均得到改善。

在一些实施方案中，所述多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力大于贝拉西普例如SEQ ID NO:3的结合亲和力。例如，本文提供的多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力是贝拉西普(SEQ ID NO:3)的结合亲和力的至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少2.2、至少2.4、至少2.6、至少2.8、至少3、至少3.5、至少4、至少4.5、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50或至少100倍。

在一些实施方案中，所述多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力大于SEQ ID NO:4、5或两者的结合亲和力。例如，该多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力是SEQ ID NO:4、5或两者的结合亲和力的至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少2.2、至少2.4、至少2.6、至少2.8、至少5、至少3.5、至少4、至少4.5、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50或至少100倍。

在另一方面，本公开提供了对CD80、CD86或两者具有低结合亲和力的多肽。在一些实施方案中，多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力低于SEQ ID NO:2的结合亲和力。例如，本文提供的多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力是SEQ ID NO:2的结合亲和力的至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少2.2、至少2.4、至少2.6、至少2.8、至少3、至少3.5、至少4、至少4.5、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50或至少100倍。

主题多肽对CD80或CD86的结合亲和力可以用k_a、k_d或K_D来表征。如本文所用的术语“k_a”可指多肽与抗原缔合的速率常数。如本文所用的术语“k_d”可指多肽从蛋白质-蛋白质复合物上解离的速率常数。如本文所用的术语“K_D”可指蛋白质-蛋白质相互作用的平衡解离常数。对于本公开而言，K_D被定义为两个动力学速率常数之比k_d/k_a。平衡解离常数越小，主题多肽与CD80或CD86彼此之间的结合越紧密。

在一些实施方案中，本文公开的多肽以至少10²M^-1s^-1、至少5×10²M^-1s^-1、至少10³M^-1s^-1、至少5×10³M^-1s^-1、至少10⁴M^-1s^-1、至少5×10⁴M^-1s^-1、至少10⁵M^-1s^-1、至少5×10⁵M^-1s^-1、至少10⁶M^-1s^-1、至少5×10⁶M^-1s^-1、至少10⁷M^-1s^-1、至少5×10⁷M^-1s^-1、至少10⁸M^-1s^-1、至少5×10⁸M^-1s^-1、至少10⁹M^-1s^-1、至少5×10⁹M^-1s^-1的k_a或以这些值中的任意两个之间的任何范围的k_a与CD80结合。在一些实施方案中，本文公开的多肽以10⁵M^-1s^-1至10⁵M^-1s^-1、5×10⁵M^-1s^-1至1×10⁶M^-1s^-1、7.5×10⁵M^-1s^-1至2.5×10⁶M^-1s^-1或1×10⁵M^-1s^-1至5×10⁶M^-1s^-1的k_a与CD80结合。

在一些实施方案中，本文公开的多肽以至少10²M^-1s^-1、至少5×10²M^-1s^-1、至少10³M^-1s^-1、至少5×10³M^-1s^-1、至少10⁴M^-1s^-1、至少5×10⁴M^-1s^-1、至少10⁵M^-1s^-1、至少5×10⁵M^-1s^-1、至少10⁶M^-1s^-1、至少5×10⁶M^-1s^-1、至少10⁷M^-1s^-1、至少5×10⁷M^-1s^-1、至少10⁸M^-1s^-1、至少5×10⁸M^-1s^-1、至少10⁹M^-1s^-1、至少5×10⁹M^-1s^-1的k_a或以这些值中的任意两个之间的任何范围的k_a与CD86结合。在一些实施方案中，本文公开的多肽以10⁵M^-1s^-1至10⁵M^-1s^-1、5×10⁵M^-1s^-1至1×10⁶M^-1s^-1、7.5×10⁵M^-1s^-1至2.5×10⁶M^-1s^-1或1×10⁵M^-1s^-1至5×10⁶M^-1s^-1的k_a与CD86结合。

在某些实施方案中，本文公开的多肽以2s^-1或更低、1.5s^-1或更低、1s^-1或更低、0.5s^-1或更低、0.1s^-1或更低、5×10^-2s^-1或更低、10^-2s^-1或更低、5×10^-3s^-1或更低、10^-3s^-1或更低、5×10^-4s^-1或更低、10^-4s^-1或更低、5×10^-5s^-1或更低、10^-5s^-1或更低、5×10^-6s^-1或更低、10^-6s^-1或更低、5×10^-7s^-1或更低、10^-7s^-1或更低、5×10^-8s^-1或更低、10^-8s^-1或更低的k_d或以这些值中的任意两个之间的任何范围的k_d速率与CD80结合。在某些实施方案中，本文公开的多肽以2s^-1或更低、1.5s^-1或更低、1s^-1或更低、0.5s^-1或更低、0.1s^-1或更低、5×10^-2s^-1或更低、10^-2s^-1或更低、5×10^-3s^-1或更低、10^-3s^-1或更低、5×10^-4s^-1或更低、10^-4s^-1或更低、5×10^-5s^-1或更低、10^-5s^-1或更低、5×10^-6s^-1或更低、10^-6s^-1或更低、5×10^-7s^-1或更低、10^-7s^-1或更低、5×10^-8s^-1或更低、10^-8s^-1或更低的k_d或以这些值中的任意两个之间的任何范围的k_d速率与CD86结合。

在一些实施方案中，本文公开的多肽以5×10^-6M或更低、10^-6M或更低、5×10^-7M或更低、10^-7M或更低、5×10^-8M或更低、10^-8M或更低、5×10^-9M或更低、10^-9M或更低、5×10^-10M或更低、10¹⁰M或更低、5×10^-11M或更低、10^-11M或更低、5×10^-12M或更低、10^-12M或更低、5×10^-13M或更低、10^-13M或更低、5×10⁴⁴M或更低、10^-14M或更低、5×10^-15M或更低、10^-15M或更低的K_D或以这些值中的任意两个之间的任何范围的K_D与CD80结合。

在一些实施方案中，本文公开的多肽以5×10^-6M或更低、10^-6M或更低、5×10^-7M或更低、10^-7M或更低、5×10^-8M或更低、10^-8M或更低、5×10^-9M或更低、10^-9M或更低、5×10^-10M或更低、10¹⁰M或更低、5×10^-11M或更低、10^-11M或更低、5×10^-12M或更低、10^-12M或更低、5×10^-13M或更低、10^-13M或更低、5×10⁴⁴M或更低、10^-14M或更低、5×10^-15M或更低、10^-15M或更低的K_D或以这些值中的任意两个之间的任何范围的K_D与CD86结合。

在某些实施方案中，在可比的测定中，与阿巴西普(SEQ ID NO:2)相比，本文公开的多肽的动力学性质得到改善。例如，在某些实施方案中，本公开的多肽与CD80、CD86或两者结合的k_a速率在阿巴西普的相应k_a的大约1.1至1000倍的范围内。在一些实施方案中，本公开的多肽与CD80、CD86或两者结合的k_a速率是阿巴西普的相应k_a的约1.1、约1.2、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约5、约7.5、约10、约20、约50、约100、约200、约500、约750或约1000倍，或者这些值中的任意两个之间的任何范围内的k_a速率。在一些实施方案中，本公开的多肽与CD80、CD86或两者结合的k_d速率在阿巴西普的相应k_d的大约0.0001至0.99倍的范围内。在一些实施方案中，本公开的多肽与CD80、CD86或两者结合的k_d速率是阿巴西普的相应k_a的约0.0001、约0.0002、约0.001、约0.002、约0.005、约0.01、约0.02、约0.05、约0.075、约0.1、约0.2、约0.25、约0.3、约0.4、约0.5、约0.075、约0.75、约0.8、约0.9、约0.92、约0.94、约0.96、约0.98或约0.99倍，或者这些值中的任意两个之间的任何范围内的k_d速率。例如，在某些实施方案中，本公开的多肽与CD80、CD86或两者结合的K_D速率在阿巴西普的相应K_D的大约0.0001至0.99倍的范围内。在一些实施方案中，本公开的多肽与CD80、CD86或两者结合的k_d速率是阿巴西普的相应K_D的约0.0001、约0.0002、约0.001、约0.002、约0.005、约0.01、约0.02、约0.05、约0.075、约0.1、约0.2、约0.25、约0.3、约0.4、约0.5、约0.075、约0.75、约0.8、约0.9、约0.92、约0.94、约0.96、约0.98或约0.99倍，或者这些值中的任意两个之间的任何范围内的K_D速率。

在一些实施方案中，主题多肽的结合具有pH依赖性。在一些实施方案中，pH依赖性被定义为在pH7.4和pH6.0时对CD80、CD86或两者的结合亲和力之比。pH依赖性可以是从pH7.4到pH6.0的结合亲和力降低倍数的形式，或者是从pH7.4到pH6.0的结合亲和力增加倍数的形式。在一些实施方案中，根据pH 6.0时的K_D值与pH 7.4时的K_D值之间的比例计算pH依赖性，而pH依赖性，即该比例，表示从pH 7.4到pH 6.0的亲和力降低倍数。如果本文描述的主题多肽的pH依赖性大于1，则表示该多肽以pH依赖性方式与CD80、CD86或两者结合，该pH依赖性方式使得在pH7.4时与CD80、CD86或两者的结合高于在pH6.0时。如果本文描述的主题多肽的pH依赖性低于1，则表示该多肽以pH依赖性方式与CD80、CD86或两者结合，该pH依赖性方式使得在pH6.0时与CD80、CD86或两者的结合高于在pH7.4时。在中性条件(例如，pH约为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)下保持结合，但在酸性条件下显著降低的能力使得主题多肽与其结合配偶体(例如CD80或CD86)在酸性条件(例如，在溶酶体内部，例如pH小于7.0，或约为6.5、6.0、5.5或5.0)下解离。在一些实施方案中，在中性条件下保持结合，但在酸性条件下显著降低的能力使主题多肽避免在酸性条件下被溶酶体降解并返回血浆，在血浆中它能够再次在中性条件下与结合配偶体(例如CD80或CD86)结合。不希望受到任何理论的束缚，认为具有这种pH依赖性结合模式(例如，在中性条件下比在酸性条件下更高的结合亲和力)的主题多肽在抗原中和及清除方面的性质优于以不依赖于pH的模式结合的、在其他方面相同的多肽。

在一些实施方案中，本文提供的主题多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力的pH依赖性高于1，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100或更高。在一些实施方案中，主题多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力的pH依赖性高于SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，主题多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力的pH依赖性是SEQ ID NO:2的至少1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80倍。在一些实施方案中，主题多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力的pH依赖性高于SEQ IDNO:3。在一些实施方案中，主题多肽对CD80、CD86或两者的结合亲和力的pH依赖性是SEQ IDNO:3的至少1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。

在一些实施方案中，针对与CD80或CD86的结合，主题多肽表现出对其他蛋白质的竞争性抑制作用。可以通过测量对CD80或CD86具有结合亲和力的其他蛋白质的竞争性抑制来评价主题多肽对CD80或CD86的结合亲和力。例如，可以进行竞争性抑制试验，其中参考多肽，例如天然CTLA4蛋白(SEQ ID NO:1)、阿巴西普(SEQ ID NO:2)、贝拉西普(SEQ ID NO:3)、SEQ ID NO:4或5、CD28或其功能等效物，或本文提供的不同主题多肽，在宿主细胞，例如免疫细胞，例如Ramos细胞(人类伯基特淋巴瘤细胞)中表达。在一些情况下，将参考多肽纯化并附接至固体支持物如微珠上。然后将用可检测标记物标记(例如与生物素或荧光标签缀合)的CD80或CD86分子与宿主细胞表达的或附接在固体支持物上的参考多肽一起孵育。在一些实例中，将主题多肽添加到孵育物中，在其中主题多肽可与参考多肽竞争结合可检测地标记的CD80或CD86分子。可以通过检查保留在宿主细胞表面上或附接至固体支持物上的可检测地标记的CD80或CD86分子来测量这种竞争。可以通过本领域技术人员可用的任何技术来进行该测量，这取决于用来标记CD80或CD86分子的可检测标记，例如，当使用荧光标记时，可以使用流式细胞术、荧光成像或荧光光谱法，而当使用磁性或导电标记时，分别可以使用测量磁力或电阻抗的其他方法。在这些情况下，主题多肽与参考多肽相比对CD80或CD86的相对结合亲和力与保留在细胞表面上或附接至固体支持物上的CD80或CD86分子成反比。在其他情况下，主题多肽与参考多肽相比对CD80或CD86的相对结合亲和力与保留在细胞表面上或附接至固体支持物上的CD80或CD86分子成比例，其中待测主题多肽由宿主细胞表达或附接至固体支持物上，并使用参考多肽竞争结合CD80或CD86分子。还可以使用本领域技术人员可用的其他形式的竞争抑制试验来主题多肽的结合亲和力。例如，发光氧通道(LOCI)竞争试验，如美国专利6,251,581所述，或其变化形式，例如

竞争试验，可用来测量主题多肽的结合亲和力。

在一些实施方案中，主题多肽表现出免疫抑制活性。例如，主题多肽可以抑制免疫细胞的活化，例如免疫细胞增殖或细胞因子例如IL2的分泌。

可以使用不同类型的试验来评价细胞的增殖，包括但不限于DNA合成细胞增殖试验、代谢细胞增殖试验、检测增殖标志物的试验和测定ATP浓度的试验。在DNA合成细胞增殖试验中，将增殖细胞的DNA标记为放射性的，并且可以洗涤该标记物，使其粘附在过滤器上，然后使用闪烁计数器进行测量。在代谢细胞增殖试验中，可以使用四唑盐，如MTT、XTT、MTS和WST，其在代谢活跃的细胞中还原，从而形成甲替染料，该染料随后改变培养基的颜色。在检测增殖标志物的试验中，可以使用单克隆抗体来靶向细胞增殖和/或细胞周期调节的共同标志物，如Ki-67、PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸组蛋白H3。为了测定ATP浓度，可以使用萤光素酶及其底物萤光素进行基于生物发光的ATP检测。

CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)细胞增殖试验可用来测量淋巴细胞的增殖以及主题多肽对T细胞增殖的影响。CFSE是一种有效且普遍的用来监测淋巴细胞分裂的手段。CFSE可以用荧光染料羧基荧光素共价标记长寿命的细胞内分子。因此，当CFSE标记的细胞分裂时，其后代被赋予一半数量的羧基荧光素标记的分子，因此每个细胞分裂都可以通过测量细胞荧光的相应降低来评估，例如通过流式细胞术或荧光成像来评估。在一些情况下，原代T细胞或无限增殖化细胞系，如Jurkat细胞，可以在激活后用于该试验。本领域技术人员可用的其他细胞增殖标记物，如MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)或BrdU，或测量技术，如无标记物的细胞增殖计数，也可用于检查主题多肽对T细胞增殖的抑制作用，指示其免疫抑制活性。

在一些实施方案中，主题多肽至少与天然CTLA4蛋白(SEQ ID NO:1)、阿巴西普(SEQ ID NO:2)、贝拉西普(SEQ ID NO:3)或SEQ ID NO:4或5一样有效地抑制T细胞的增殖。在进一步的实施方案中，主题多肽至少与阿巴西普(SEQ ID NO:2)或贝拉西普(SEQ ID NO:3)一样有效地抑制T细胞的增殖。在一些实施方案中，本文所述的主题多肽在0.001-100ug/mL、0.01-100ug/mL、0.1-100ug/mL、1-100ug/mL、10-100ug/mL、0.01-1ug/mL、0.01-10ug/mL或0.1-10ug/mL的浓度下将T细胞的增殖抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

T细胞的另一方面包括细胞因子如IL2的产生和释放。主题多肽的免疫抑制活性可以通过这样的测定来测量，在该测定中，在主题多肽的存在下测量活化的T细胞的IL2分泌。IL2分泌可通过本领域中任何可用的技术来测量，例如通过ELISA(酶联免疫吸附测定)来测量。

在一些实施方案中，在细胞增殖试验或细胞因子产生测定中，可以通过测试一系列不同浓度的主题多肽的抑制作用来检查主题多肽的抑制作用。在一些实施方案中，可以在此类测定中计算主题多肽的IC₅₀。在某些实施方案中，主题多肽结合CD80和/或CD86并抑制细胞生长，如T细胞增殖，或细胞因子产生，如IL2产生，其IC₅₀值在天然CTLA4蛋白(SEQ IDNO:1)、阿巴西普(SEQ ID NO:2)、贝拉西普(SEQ ID NO:3)或SEQ ID NO:4或5的IC₅₀的约0.0001至10倍范围内。在某些实施方案中，主题多肽结合CD80和/或CD86并抑制细胞生长，如T细胞增殖，或细胞因子产生，如IL2产生，其IC₅₀值在天然CTLA4蛋白(SEQ ID NO:1)、阿巴西普(SEQ ID NO:2)、贝拉西普(SEQ ID NO:3)或SEQ ID NO:4或5的IC₅₀的约0.0001至0.0005倍、约0.0005至0.001倍、约0.001至0.002倍、约0.002至0.005倍、约0.005至0.0075倍、约0.0075至0.01倍、约0.01至0.02倍、约0.02至0.05倍、约0.05至0.075倍、约0.075至0.1倍、约0.1至0.2倍、约0.2至0.5倍、约0.5至0.75倍、约0.75倍至1倍、约1至5倍或约5至10倍范围内，或者上述值中的任意两个的范围内的IC₅₀值。

在一些实施方案中，主题多肽以阿巴西普(SEQ ID NO:2)的IC₅₀的约0.001至0.01倍、约0.002至0.0075倍、约0.0025至约0.005倍或约0.003至0.004倍范围内的IC₅₀值抑制T细胞增殖。在一些实施方案中，主题多肽以贝拉西普(SEQ ID NO:3)的IC₅₀的约0.075至0.75倍、约0.1至0.5倍或约0.2至约0.3倍范围内的IC₅₀值抑制T细胞增殖。

在一些实施方案中，主题多肽以阿巴西普(SEQ ID NO:2)的IC₅₀的约0.005至0.05倍、约0.0075至0.025倍或约0.01至约0.015倍范围内的IC₅₀值抑制IL2分泌。在一些实施方案中，主题多肽以贝拉西普(SEQ ID NO:3)的IC₅₀的约0.075至0.75倍、约0.1至0.5倍或约0.2至约0.3倍范围内的IC₅₀值抑制IL2分泌。

融合蛋白和其他修饰

在一些方面，本公开提供了一种多肽，该多肽是包含本文所述的CTLA4变体序列和融合配偶体序列的融合蛋白。

本文提供的融合配偶体序列可赋予功能性质，包括但不限于半衰期延长，促进蛋白质纯化和/或制备，增强的生物物理性质，如增加溶解度或稳定性，以及降低免疫原性或毒性，或其他任何目的。例如，主题融合蛋白可表现出延长的体内半衰期，从而促进在治疗方案中较低频率的给药(如每周两次、每周一次或每隔一周一次给药等)。示例性主题多肽包含与融合配偶体序列融合的本文所述的CTLA4变体序列，该融合配偶体序列例如是白蛋白(例如人血清白蛋白)、PK延伸(PKE)adnectin、XTEN、Fc结构域，或任何前述的片段，或上述任何一种的组合。可以通过在同一阅读框中表达编码CTLA4变体序列和融合配偶体序列的核酸来产生融合蛋白，以上两个序列任选地被编码连接体序列的序列隔开。融合蛋白可以以任何顺序包含CTLA4变体序列和融合配偶体序列，例如，一个或多个融合配偶体连接至CTLA4变体序列的N末端和/或C末端，或者一个或多个融合配偶体连接至CTLA4变体序列的N末端和/或C末端两者。该融合可以通过将融合配偶体附接至CTLA4变体序列的任一端(即，N或C末端)而形成，即融合配偶体-CTLA4变体或CTLA4变体-融合配偶体排列。另外，CTLA4变体序列可以在两端与一个或多个融合配偶体融合，任选地在任一端或两端具有连接体序列。

在一些实施方案中，CTLA4变体序列可以与免疫球蛋白Fc结构域(“Fc结构域”)或其片段或变体如功能性Fc区融合。功能性Fc区可以与FcRn结合，但不具有效应功能。Fc区或其片段与FcRn结合的能力可以通过本领域已知的标准结合测定来确定。示例性的“效应功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。可以使用本领域已知的用于评价此类抗体效应功能的各种试验来评估此类效应功能。

在示例性实施方案中，Fc结构域衍生自IgG1亚类，然而，也可以使用其他亚类(例如，IgG2、IgG3和IgG4)。在一些实施方案中，可以在主题多肽中使用的人IgG1免疫球蛋白Fc结构域的示例性序列包括表6中的SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:2的氨基酸131-357。

在一些实施方案中，在融合蛋白中使用的Fc区可包含Fc分子的铰链区。示例性的铰链区包含跨越位置1-16的核心铰链残基(即，上文提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的DKTHTCPPCPAPELLG)。在某些实施方案中，所述融合蛋白可采用多聚体结构(例如，二聚体)，这部分地是由于上文提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的铰链区内的位置6和9处的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的铰链区内的位置6和9处的半胱氨酸残基可以被丝氨酸替换，例如SEQ ID NO:2的氨基酸131-257。在其他实施方案中，如本文所用的铰链区可进一步包括源自CH1和CH2区的残基，其位于以上提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的核心铰链序列的侧翼。在另外其他的实施方案中，铰链序列可包含或由GSTHTCPPCPAPELLG组成。

在一些实施方案中，铰链序列可包括一个或多个赋予所需药代动力学、生物物理学和/或生物学性质的置换。一些示例性铰链序列包括EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS、DKTHTCPPCPAPELLGGPS和DKTHTCPPCPAPELLGGSS。在一个实施方案中，可以将上文提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的位置18处的残基P替换为S，以消除Fc效应功能；这种替换在具有序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS和DKTHTCPPCPAPELLGGSS的铰链中例示。在另一个实施方案中，可以将上文提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的位置1-2处的残基DK替换为GS，以去除潜在的卡夹位点(clip site)；这种替换在序列EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS中例示。在另一个实施方案中，人IgG1的重链恒定区(即结构域CH₁—CH₃)的位置103处的C可以被S替换，以防止在不存在轻链的情况下不适当的半胱氨酸键形成；这种替换在序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS和EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS中例示。

在一些实施方案中，Fc结构域包含选自表6的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸125-357具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的氨基酸序列。应当理解，Fc结构域的C末端赖氨酸是包含Fc结构域的融合蛋白的可选组分。在一些实施方案中，Fc结构域包含选自表6的氨基酸序列，不同之处是其C末端赖氨酸被省略。

在一些实施方案中，本文提供的主题多肽包含与SEQ ID NO:6的氨基酸1-359具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供了主题多肽，其包含与白蛋白结合序列融合的CTLA4变体序列。在一些实施方案中，与血清白蛋白的融合可以延长主题多肽或其片段的半衰期。示例性白蛋白结合序列包括但不限于来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(参见，例如，Makrides等人,J Pharmacol.Exp.Ther.277:534-542(1996)和Sjolander等人,J,Immunol.Methods201:115-123(1997))，或白蛋白结合肽，如例如Dennis等人,J Biol.Chem.277:35035-35043(2002)描述的那些。

在一些实施方案中，本公开的CTLA4变体序列直接与血清白蛋白(包括但不限于人血清白蛋白)融合。在一些实施方案中，本公开的CTLA4变体序列被脂肪酸酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。参见，例如，Kurtzhals等人,Biochem.J312:725-731(1995)。CTLA4变体序列可以作为包含人血清白蛋白(HSA)或其部分的融合蛋白产生。这样的融合构建体可能适合于增强CTLA4变体或其片段在真核宿主细胞如CHO中，或在细菌如大肠杆菌中的表达。示例性的HSA部分包括N末端多肽(氨基酸1-369、1-419，以及从氨基酸1开始的中间长度)，如美国专利5,766,883和PCT公开WO 97/24445所披露的，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述融合蛋白可包含具有CTLA4变体或其片段的HSA蛋白，后者附接至HSA的C末端和N末端中的每一个。示例性的HSA构建体在美国专利5,876,969中公开，其通过引用并入本文。

CTLA4变体序列可以与XTEN分子融合。XTEN分子也被称为非结构化重组聚合物、非结构化重组多肽(URP)，并且总体上描述于Schellenberger等人,Nat Biotechnol.,2009年12月；27(12):1186-90、美国公开2012/0220011、美国专利7,846,445和WO/2012/162542，每一篇均通过引用整体并入本文。可以通过改变XTEN分子的组成，例如通过改变其大小，来改变CTLA4变体序列的半衰期。例如，可以选择XTEN分子以达到所需的半衰期，例如在1至50小时的范围内，如至少1、2、5、10、12、15、20或25小时，或更长时间。

在一些实施方案中，主题多肽包含与adnectin，例如白蛋白结合adnectin或PKEadnectin融合的CTLA4变体序列。示例性的adnectin在美国公开2011/0305663中披露，其通过引用整体并入本文。adnectin可以基于第十个III型纤连蛋白结构域，并且可与血清白蛋白结合。adnectin可包含以下一个或多个：BC环，其包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；DE环，其包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；以及FG环，其包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，或者包含选自SEQ ID NO:48、49、50、51和52-72的多肽，或者包含与SEQ ID NO:48、49、50、51或52-72(分别对应于美国公开2011/0305663的SEQ ID NO:5、6、7、8、12、16、20和24-44)至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的多肽。

在某些实施方案中，融合配偶体和CTLA4变体通过连接体序列融合。示例性连接体序列可包含选自表7的序列或其组合，或由其组成。示例性连接体序列的长度可以是0(即，不存在连接体序列)至100个或更多个氨基酸，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个至最多60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或11个氨基酸。连接体序列的示例性非限制性长度包括1至100个氨基酸、1至40个氨基酸、1至20个氨基酸、1至10个氨基酸或3至5个氨基酸的长度。

在一些实施方案中，本文所述的主题多肽融合至聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。多肽或其片段可被聚乙二醇化，以便例如延长该多肽的生物学(例如血清)半衰期。为了对多肽进行聚乙二醇化，通常使多肽与聚乙二醇(PEG)，如PEG的反应性酯或醛衍生物在一定条件下反应，在该条件下一个或多个PEG基团变为附接至该多肽。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文所用的，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。可以使用蛋白质的聚乙二醇化方法，例如Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384中所公开的那些。在一些实施方案中，可使用常规化学方法，例如化学缀合，在N或C末端或内部位置，将聚合物例如PEG共价连接至本文所述的主题多肽。不受理论的束缚，一旦与本文所述的多肽连接，PEG部分就可有助于水溶性，在溶液中的高迁移率，缺乏毒性和低免疫原性，延长的循环寿命，增加的稳定性，易于从体内清除，以及改变的体内分布。

其他半衰期延长技术可用来延长主题多肽的血清半衰期，但不限于XTEN(Schellenberger等人,Nat.Biotechnol.27:1186-1192,2009)和Albu标签(Trussel等人,Bioconjug Chem.20:2286-2292,2009)。

在一些方面，本公开提供了包含具有化学修饰的CTLA4变体序列的多肽，所述化学修饰例如是但不限于出于各种功能目的的缀合、融合和附接化学。

改变主题多肽的免疫反应性的药剂可用来修饰本文提供的主题多肽。

在一些实施方案中，主题多肽优选具有低免疫原性。在一些实施方案中，降低主题多肽的免疫原性的药剂用于这种修饰。降低免疫反应性的药剂包括但不限于抗炎剂和免疫抑制剂。抗炎剂包括非甾体抗炎药(NSAID)和皮质类固醇。NSAID包括但不限于水杨酸酯，如乙酰水杨酸；二氟尼柳、水杨酸和双水杨酯；丙酸衍生物，如布洛芬；萘普生；右布洛芬、右酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪、非诺洛芬、洛索洛芬和酮洛芬；乙酸衍生物，如吲哚美辛、双氯芬酸、托美汀、醋氯芬酸、舒林酸、萘丁美酮、依托度酸和酮咯酸；烯醇酸衍生物，如吡罗昔康、氯诺昔康、美洛昔康、伊索昔康、替诺昔康、保泰松和屈噁昔康；邻氨基苯甲酸衍生物，如甲芬那酸、氟芬那酸、甲氯芬那酸和托芬那酸；选择性COX-2抑制剂，如塞来考昔、鲁米考昔、罗非考昔、依托考昔、伐地考昔、非罗考昔和帕瑞考昔；磺苯胺类，如尼美舒利；以及其他，如氯尼辛和利考非隆。皮质类固醇包括但不限于可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松和泼尼松龙。免疫抑制剂包括但不限于羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、D-青霉胺、口服金化合物、可注射的金化合物(肌肉内注射)、米诺环素、硫代苹果酸金钠、金诺芬、D-青霉胺、氯苯扎利、布西拉明、阿克他利、环磷酰胺、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、咪唑立宾、环孢菌素和他克莫司。

在一些实施方案中，主题多肽优选具有高免疫原性。在一些实施方案中，提高主题多肽的免疫原性的药剂用于这种修饰。增强免疫反应性的药剂包括但不限于细菌超抗原。促进与固体支持物偶联的药剂包括但不限于生物素或抗生物素蛋白。免疫原载体包括但不限于任何生理学上可接受的缓冲液。生物反应调节剂包括细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2、白介素-4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和γ-干扰素。

其他功能部分包括信号肽、增强或降低免疫反应性的药剂、促进与固体支持物偶联的药剂、疫苗载体、生物反应调节剂、顺磁性标记和药物。信号肽是短氨基酸序列，其指导新合成的蛋白质通过细胞膜，通常是真核细胞的内质网，以及细菌的内膜或内外膜。信号肽通常在多肽的N末端部分，并且通常在生物合成与多肽从细胞分泌之间被酶促去除。可以将这样的肽并入主题抗体或其片段中，以允许合成分子的分泌。

在一些实施方案中，主题多肽缀合至化学功能部分。通常，该部分是能够产生可检测信号的标记物。这些缀合的多肽可用于例如检测系统，例如肿瘤负荷的定量，以及转移灶的成像和肿瘤成像。这类标记物是本领域中已知的，并且包括但不限于放射性同位素、酶、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物底物辅因子和抑制剂。参见，例如，描述这类标记物的应用的专利，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。所述部分可以共价连接至本文所述的主题多肽，重组连接，或通过二级试剂如抗体、蛋白A或生物素-抗生物素蛋白复合物缀合至主题多肽。

在一些实施方案中，主题多肽缀合至一个或多个药物部分。合适的药物部分包括免疫抑制剂。可以缀合至主题多肽的免疫抑制剂的非限制性实例包括糖皮质激素、细胞生长抑制剂、抗体、作用于抑免蛋白的药物、他汀类药物和其他药剂，如干扰素(例如INF-β和INF-γ)、阿片类药物、TNF结合剂(例如英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、姜黄素和儿茶素)、霉酚酸酯、IL-1受体拮抗剂和其他小分子药物(例如芬戈莫德、多球壳菌素)。示例性的糖皮质激素包括但不限于氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼松、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮和醛固酮。示例性的细胞生长抑制剂包括但不限于环磷酰胺、亚硝基脲、铂类化合物、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、嘧啶类似物、蛋白质合成抑制剂和抗生素，如更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光辉霉素。示例性的免疫抑制抗体包括但不限于抗CD20抗体、抗IL2受体抗体(达克珠单抗、巴利昔单抗)、Campath-1H、抗α₄β₁整联蛋白抗体、抗IL-15抗体、抗IL-6受体抗体和抗CD3抗体(莫罗单抗)。作用于抑免蛋白的示例性药剂包括但不限于环孢菌素、他克莫司和西罗莫司。

在一些实施方案中，主题多肽与抗炎剂缀合。抗炎剂的非限制性实例包括非甾体抗炎药，如布洛芬、阿司匹林、萘普生、二氟尼柳、酮洛芬、萘丁美酮、吡罗昔康、双氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸、托美汀、依托度酸、酮咯酸、奥沙普嗪和塞来考昔，以及糖皮质激素，其也具有免疫抑制活性。

在一些实施方案中，主题多肽与抗肿瘤剂缀合。非限制性实例是放射性同位素、长春花生物碱，如长春碱、长春新碱和硫酸长春地辛、阿霉素、硫酸博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托坦、喷司他丁、哌泊溴烷、盐酸丙卡巴肼、链脲菌素、紫杉醇、硫代鸟嘌呤和尿嘧啶氮芥。

在一些实施方案中，主题多肽缀合至毒素，例如免疫毒素。有多种免疫毒素可以在本发明的组合物中使用。合适的免疫毒素可见于，例如，Monoclonal Antibody-toxinConjugates:Aiming the Magic Bullet,Thorpe等人(1982)Monoclonal Antibodies inClinical Medicine,Academic Press,pp.168-190；Vitatta(1987)Science 238:1098-1104；以及Winter and Milstein(1991)Nature 349:293-299。合适的毒素包括但不限于蓖麻毒蛋白、放射性核素、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A链、真菌毒素，如局限曲菌素和磷脂酶。总体上参见"Chimeric Toxins,"Olsnes and Pihl,Pharmac.Ther.15:355-381(1981)；和"Monoclonal Antibodies for Cancer Detectionand Therapy,"eds.Baldwin and Byers,pp.159-179,224-266,Academic Press(1985)。

化学功能性部分可以例如通过创建编码主题多肽和功能性部分的融合基因而重组地制备。或者，可以通过多种建立的化学方法中的任一种将主题多肽与该部分化学键合。例如，当该部分是蛋白质时，可以使用多种偶联剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性含氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。连接体可以是促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接体”。例如，可以使用酸不稳定的连接体、肽酶敏感的连接体、二甲基连接体或含二硫键的连接体(Chari等人，Cancer Research,52:127-131(1992))。所述部分可以通过二级试剂如抗体、蛋白A或生物素-抗生物素蛋白复合物共价连接或缀合。

在一些实施方案中，本文提供的主题多肽是双特异性的，因为其可以具有两个不同的结合域，一个是能够特异性结合CD80或CD86的结构域，另一个是能够结合不同分子的结构域。在其他实施方案中，除CD80和CD86外，主题多肽还对超过两种不同分子是特异性的。

多肽的产生

在一个方面，本文提供了编码本公开的多肽的多核苷酸。本公开的其他方面还提供了一种载体，其包含编码本文所述的多肽的多核苷酸序列。在一些方面，还提供了表达本文所述的多肽的宿主细胞。

通过克隆编码主题多肽的DNA，将该克隆整合到合适的载体中，并将该载体转导到宿主细胞中，可以产生作为重组多肽的主题多肽。或者，可以部分或完整地合成编码本公开的多肽的多核苷酸。在一些情况下，主题多肽是一种融合蛋白，可以通过例如使用聚合酶链反应(PCR)对种系DNA或编码所需融合蛋白的cDNA进行扩增和修饰，来获得编码融合配偶体序列的核酸，例如免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，可以合成编码野生型阿巴西普的核酸，并将其用作诱变的模板，以使用常规诱变技术生成本文所述的主题多肽；或者，可以直接合成编码该变体的核酸。

在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码CTLA4变体的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至编码另一种蛋白质(例如融合配偶体，如抗体恒定区和/或柔性连接体序列)的另一核酸序列。在该背景中使用的术语“可操作地连接”旨在表示将两个核酸连接在一起，使得由这两个核酸编码的氨基酸序列保持符合读框。

还可以修饰编码本公开的多肽的核苷酸序列，例如，可以对编码主题多肽的多核苷酸进行密码子优化，以实现主题多肽在所需宿主细胞中的优化表达。例如，在密码子优化的一种方法中，将天然密码子置换为来自一组参考基因的频率最高的密码子，其中每个氨基酸的密码子翻译速率被设计为很高。Kanaya等人,Gene,238:143-155(1999)，Wang等人,Mol.Biol.Evol.,18(5):792-800(2001)，美国专利5,795,737，美国公开2008/0076161和WO2008/000632中描述了用于生成密码子优化的多核苷酸以供表达所需蛋白质的其他示例性方法，所述方法可应用于本公开的多肽的CTLA4变体序列和/或融合配偶体序列。

本公开的多核苷酸包括编码示例性多肽的功能等同物及其片段的那些多核苷酸。功能等同物可以是具有保守氨基酸置换的多肽，包括融合体的类似物，以及突变体。

需要时，重组多核苷酸可包含有助于检测基因产物的表达和纯化的异源序列。这类序列的实例包括编码报告蛋白如β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物的序列。其他有助于纯化的异源序列可编码表位，如Myc、HA(衍生自流感病毒血凝素)、His-6、FLAG或免疫球蛋白的Fc部分、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和麦芽糖结合蛋白(MBP)。

可将多核苷酸缀合至如上所述的多种化学功能部分。常用的部分包括能够产生可检测信号的标记物、信号肽、增强或降低免疫反应性的药剂、促进与固体支持物偶联的药剂、疫苗载体、生物反应调节剂、顺磁性标记和药物。所述部分可以重组地或通过本领域已知的其他手段与多核苷酸共价连接。

多核苷酸可包含另外的序列，如同一转录单元内的其他编码序列，控制元件，如启动子、核糖体结合位点和聚腺苷酸化位点，在相同或不同启动子控制下的其他转录单元，允许宿主细胞的克隆、表达和转化的序列，以及根据本文所述的各个实施方案中的任何一个可能需要的任何这类构建体。

可以使用化学合成、重组克隆方法、PCR或其任何组合来获得多核苷酸。本领域技术人员可以使用本文提供的序列数据，通过采用DNA合成仪或从商业服务处订购来获得所需的多核苷酸。

可将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中，继而可将该载体引入合适的宿主细胞中以供复制、扩增和表达。因此，在一个方面，本文提供了多种包含一种或多种本公开的多核苷酸的载体。还提供了表达载体的可选择文库，其包含至少一种编码主题多肽的载体。

本公开的载体通常被分类为克隆和表达载体。克隆载体可用于获得它们所包含的多核苷酸的复制拷贝，或用作将多核苷酸储存在保藏库中以备将来恢复的工具。表达载体(和包含这些表达载体的宿主细胞)可用来获得由它们所包含的多核苷酸产生的多肽。在一些实施方案中，主题多肽是融合蛋白，表达载体可能已经携带融合配偶体序列，例如抗体恒定区序列。例如，一种将仅包含CTLA4变体序列的本公开的蛋白质转化为主题融合蛋白的方法是将编码CTLA4变体序列的核酸插入已经编码免疫球蛋白Fc的表达载体中，使得编码CTLA4变体的序列与载体中的Fc编码序列可操作地连接。另外地或备选地，重组表达载体可以编码促进从宿主细胞分泌CTLA4蛋白的信号肽。可将编码CTLA4蛋白的核酸克隆到载体中，使得信号肽与编码CTLA4蛋白的核酸的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是CTLA4信号肽或异源信号肽，例如免疫球蛋白信号肽。合适的克隆和表达载体包括本领域已知的任何载体，例如用于细菌、哺乳动物、酵母、昆虫和噬菌体展示表达系统的载体。

合适的克隆载体可根据标准技术来构建，或者从本领域可用的大量克隆载体中选择。尽管所选的克隆载体可根据意欲使用的宿主细胞而不同，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有对于特定限制性内切核酸酶的单个靶标，或者可携带标志物基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、pUC18、mp18、mp19、噬菌体DNA(包括丝状和非丝状噬菌体DNA)，以及穿梭载体，如pSA3和pAT28。这些和其他克隆载体可从商业供应商如Clontech、BiORad、Stratagene和Invitrogen获得。

包含主题多核苷酸的表达载体可用于获得宿主载体系统，以产生蛋白质和多肽。通常，这些表达载体可以作为附加体或作为染色体DNA的组成部分在宿主生物体中复制。用于主题多肽的合适的表达载体包括质粒、病毒载体，包括噬菌粒、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、粘粒等。有许多适合在包括酵母、禽类和哺乳动物细胞在内的真核细胞中表达的表达载体是可用的。表达载体的一个实例是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，其中转录由巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子驱动。用于表达如本文所述的主题多肽的两种类型的特别有用的表达载体是噬菌体展示载体和细菌展示载体。

有可能在原核或真核宿主细胞中表达本公开的主题多肽。可以选择这样的宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或者以所需的特定方式修饰并加工基因产物。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于主题多肽的功能可能至关重要。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以确保对表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NSO(不内源产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。

为了长期、高产量地产生重组蛋白，优选稳定的表达。例如，可以工程改造稳定表达主题多肽的细胞系。宿主细胞不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA来转化。引入外源DNA后，可以使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换至选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将该质粒稳定整合到其染色体中并生长以形成转化灶，继而可将其克隆并扩充成细胞系。该方法可以有利地用来工程改造表达主题多肽的细胞系。

一旦通过重组表达产生了主题多肽分子，就可以通过任何合适的用于纯化免疫球蛋白分子的方法进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是根据蛋白A后对特定抗原的亲和力，和大小分级柱色谱法)、离心、差异溶解度，或通过其他任何标准蛋白质纯化技术。此外，主题多肽可与本文提供的或本领域已知的异源多肽序列融合，以利于纯化。例如，主题多肽可通过重组添加可商购获得的聚组氨酸标签(His标签)、FLAG标签、血凝素标签(HA标签)或myc标签，并利用合适的纯化方法来纯化。

治疗方法

在另一方面，本文提供了使用主题多肽治疗状况、疾病或病症，例如炎性病症、自身免疫性疾病、癌症或移植排斥的方法。

在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的哺乳动物中的炎性病症的方法，其包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本公开的主题多肽。在一些情况下，该炎性病症是多发性硬化。在其他情况下，该炎性病症是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、Addison病、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻、克罗恩病、糖尿病(1型)、Goodpasture综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本病、多发性硬化、重症肌无力、视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、Ord甲状腺炎、天疱疮(oemphigus)、多关节炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD)、青少年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、Reiter综合征、Takayasu动脉炎、颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎”)、温型自身免疫性溶血性贫血(warm autoimmune hemolytic anemia)、韦格纳肉芽肿病、普秃、Chagas病、慢性疲劳综合征、自主神经功能异常、子宫内膜异位症、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、神经性肌强直、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎、白癜风和外阴痛。其他病症包括骨吸收失调和血栓。

在进一步的实施方案中，本公开的主题多肽用于治疗滑囊炎、狼疮、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、addison病、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻、克罗恩病、糖尿病(1型)、Goodpasture综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本病、炎性肠病、红斑狼疮、重症肌无力、视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、ord甲状腺炎、骨关节炎、葡萄膜视网膜炎、天疱疮、多关节炎、原发性胆汁性肝硬化、Reiter综合征、Takayasu动脉炎、颞动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病、普秃、Chagas病、慢性疲劳综合征、自主神经功能异常、子宫内膜异位症、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、神经性肌强直、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎、白癜风、外阴痛、阑尾炎、动脉炎、关节炎、眼睑炎、细支气管炎、支气管炎、宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、绒毛膜羊膜炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、泪腺炎、皮肌炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维织炎、胃炎、胃肠炎、牙龈炎、肝炎、汗腺炎、回肠炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎、心肌炎、肌炎、肾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、肺炎、直肠炎、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口炎、滑膜炎、肌腱炎、扁桃体炎、葡萄膜炎、阴道炎、血管炎或外阴炎。

在更进一步的实施方案中，本公开提供了治疗有需要的哺乳动物中的癌症的方法，其包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本公开的主题多肽。在一些情况下，该癌症是肝细胞癌。在其他情况下，该癌症是急性髓样白血病、胸腺癌、脑癌、肺癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、眼癌、视网膜母细胞瘤、眼内黑素瘤、口腔和口咽癌、膀胱癌、胃部癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、头癌、颈癌、肾脏癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、食管癌、睾丸癌、妇科癌症、甲状腺癌、CNS癌、PNS癌、AIDS相关癌症(例如淋巴瘤和卡波西肉瘤)或病毒诱发的癌症。

在一些实施方案中，本公开的主题多肽用于治疗感染、与感染相关的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身发作型青少年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、Castleman病、强直性脊柱炎、皮肌炎、葡萄膜炎、Peyronie病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛症、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜脑炎、免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性病症、自身免疫性病症、胰腺炎、手术引起的创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病、骨吸收、烧伤患者、心肌梗死、Paget病、骨质疏松症、脓毒症、肝/肺纤维化、牙周炎、低胃酸、实体瘤(肾细胞癌)、前列腺癌和膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症和B细胞恶性肿瘤(例如，Casteleman病、某些淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤)。

在一些实施方案中，待治疗的受试者是哺乳动物，如人。在其他情况下，该哺乳动物是小鼠、大鼠、猫、狗、兔、绵羊、马、牛、山羊、沙鼠、仓鼠、豚鼠、猴或其他任何哺乳动物。许多这样的哺乳动物可以是本领域已知作为针对某些疾病或病症的临床前模型的受试者，所述疾病或病症包括炎性疾病、实体瘤和/或其他癌症(例如，Talmadge等人,2007Am.J.Pathol.170:793；Kerbel,2003Canc.Biol.Therap.2(4Suppl1):S134；Man等人,2007Canc.Met.Rev.26:737；Cespedes等人,2006Clin.TransL Oncol.8:318)。

在另一方面，本公开提供了使用本公开的主题多肽与第二药剂一起治疗哺乳动物的疾病、状况或病症的方法。第二试剂可以与主题多肽一起、在其之前或之后施用。

在一些实施方案中，第二药剂是免疫抑制剂。可以与主题多肽联合使用的免疫抑制剂包括但不限于氢化可的松，泼尼松，泼尼松龙，甲泼尼松，地塞米松，倍他米松，曲安西龙，倍氯米松，醋酸氟氢可的松，醋酸脱氧皮质酮，醛固酮，环磷酰胺，亚硝基脲，铂类化合物，氨甲蝶呤，硫唑嘌呤，巯基嘌呤，嘧啶类似物，蛋白质合成抑制剂，更生霉素，蒽环类，丝裂霉素C，博来霉素，光辉霉素，雷帕霉素，环孢菌素，他克莫司，西罗莫司，霉酚酸，咪唑立宾，15-脱氧精胍菌素，霉酚酸酯(MMF)，抗胸腺细胞球蛋白，抗CD20抗体或其衍生物、其类似物或抗原结合片段，抗IL2受体抗体(达克珠单抗、巴利昔单抗)或其衍生物、类似物或抗原结合片段，Campath-1H，抗α₄β₁整联蛋白抗体或衍生物、类似物或抗原结合片段，抗IL-15抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗IL-6受体抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD3抗体(莫罗单抗)或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗MHC抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD2抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD4抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD11a/CD18抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD7抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD27抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD80和/或抗CD86抗体(例如，ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCCHB-301、ATCC HB-11341等)或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD40抗体(例如ATCCHB-9110)或其衍生物、类似物或抗原结合片段，或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD45抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD58抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD137抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗ICOS抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗CD150抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗OX40抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，抗4-1BB抗体或其衍生物、类似物或抗原结合片段，以及低分子量粘附拮抗剂，如LFA-1拮抗剂、选择蛋白拮抗剂和VLA-4拮抗剂。

在一些实施方案中，主题多肽可以与其他免疫调节化合物联合使用，所述免疫调节化合物例如是但不限于可溶性gp39(也称为CD40配体(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80(例如ATCC 68627)、可溶性CD86、可溶性CD28(例如68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、对gp39具有反应性的抗体(例如ATCC HB-10916、ATCC HB-12055和ATCC HB-12056)、对CD28具有反应性的抗体(例如Martin等人(J.Clin.Immun.4(1):18-22,1980)所述的ATCC HB-11944或mAb9.3)、对LFA-1具有反应性的抗体(例如ATCC HB-9579和ATCC TIB-213)、对LFA-2具有反应性的抗体、对IL-12具有反应性的抗体、对IFN-γ具有反应性的抗体、对CD48具有反应性的抗体、对任何ICAM(例如ICAM-1(ATCC CRL-2252)、ICAM-2和ICAM-3)具有反应性的抗体、对CTLA4具有反应性的抗体(例如ATCC HB-304)、对Thy-1具有反应性的抗体、对CD56具有反应性的抗体、对CD29具有反应性的抗体、对TCR具有反应性的抗体、对VLA-4具有反应性的抗体、对VCAM-1具有反应性的抗体、对LECAM-1具有反应性的抗体、对ELAM-1具有反应性的抗体、对CD44具有反应性的抗体。

在一些实施方案中，第二药剂是抗病毒剂。抗病毒剂包括但不限于特拉匹韦、波普瑞韦、semiprevir、索非布韦(sofosbuvir)、daclastavir、阿那匹韦(asunaprevir)、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦、替比夫定、干扰素α和聚乙二醇化的干扰素α。在其他实施方案中，第二药剂是用来减轻本文所述的炎性状况的症状的药剂。抗炎剂包括非甾体抗炎药(NSAID)和皮质类固醇。NSAID包括但不限于水杨酸酯，如乙酰水杨酸；二氟尼柳、水杨酸和双水杨酯；丙酸衍生物，如布洛芬；萘普生；右布洛芬、右酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪、非诺洛芬、洛索洛芬和酮洛芬；乙酸衍生物，如吲哚美辛、双氯芬酸、托美汀、醋氯芬酸、舒林酸、萘丁美酮、依托度酸和酮咯酸；烯醇酸衍生物，如吡罗昔康、氯诺昔康、美洛昔康、伊索昔康、替诺昔康、保泰松和屈噁昔康；邻氨基苯甲酸衍生物，如甲芬那酸、氟芬那酸、甲氯芬那酸和托芬那酸；选择性COX-2抑制剂，如塞来考昔、鲁米考昔、罗非考昔、依托考昔、伐地考昔、非罗考昔和帕瑞考昔；磺苯胺类，如尼美舒利；以及其他，如氯尼辛和利考非隆。皮质类固醇包括但不限于可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松和泼尼松龙。

在进一步的实施方案中，第二药剂是抗癌剂(例如化疗剂)。化疗剂可选自有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素、血管生成抑制剂和抗雄激素。化疗剂、细胞毒性剂和非肽小分子的非限制性实例包括

(甲磺酸伊马替尼)、

(硼替佐米)、Casodex(比卡鲁胺)、

(吉非替尼)和阿霉素以及许多化疗剂。化疗剂的非限制性实例包括烷化剂，如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲蜜胺类，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、Casodex^TM、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷，雄激素类，如卡芦睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；贝塔布辛(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elfomithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK.R^TM.；雷佐生；西左非兰；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL^TM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton,N.J.)和多西他赛(TAXOTERE^TM，Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。合适的化疗细胞调节剂还包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(NolvadexTM)、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、雷洛昔芬、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；喜树碱-11(CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)。需要时，主题多肽可与常开出的抗癌药联合使用，该抗癌药例如是

ABVD、AVICINE、阿巴伏单抗、吖啶甲酰胺、阿德木单抗、17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、Alpharadin、阿伏西地(Alvocidib)、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲、氨萘非特、蒽二酮、抗-CD22免疫毒素、抗肿瘤药、抗肿瘤发生草药、阿帕齐醌、阿替莫德、硫唑嘌呤、贝洛替康、苯达莫司汀、BIBW 2992、比立考达、溴他利星、苔藓抑素、丁硫氨酸亚砜胺、CBV(化疗)、花萼海绵诱癌素、细胞周期非特异性抗肿瘤剂、二氯乙酸、盘皮海绵内酯、依沙芦星、依诺他滨、埃博霉素、艾日布林、依维莫司、依沙替康、依昔舒林、弥罗松酚、呋咯地辛、磷雌酚、ICE化疗方案、IT-101、伊美克、咪喹莫德、吲哚并咔唑、伊罗夫文、拉尼喹达、拉罗他赛、来那度胺、硫蒽酮、勒托替康、马磷酰胺、米托唑胺、萘福昔定、奈达铂、奥拉帕利、奥他赛、PAC-1、木瓜、匹克生琼、蛋白酶体抑制剂、蝴蝶霉素、瑞喹莫德、芦比替康、SN-38、放线菌酰胺A(Salinosporamide A)、沙帕他滨、Stanford V、苦马豆素、他拉泊芬、他立喹达、喃氟啶-尿嘧啶、替莫唑胺、替司他赛、四硝酸三铂(Triplatin tetranitrate)、三(2-氯乙基)胺、曲沙他滨、乌拉莫司汀、伐地美生、长春氟宁、ZD6126和佐舒喹达。

具体剂量将根据所选择的特定多肽、所遵循的给药方案、是否与其他药剂联合施用、给药时机、所施用的组织和携带该多肽的物理递送系统而变化。在一些实施方案中，在治疗周期过程中，主题多肽在平均每周约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70mg的范围内施用于受试者。例如，主题多肽在每周约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55mg的范围内施用于受试者。在一些实施方案中，主题多肽在每周约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55mg的范围内施用于受试者。

在一些实施方案中，在治疗周期过程中，主题多肽以平均每天超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的量施用于受试者。例如，在治疗周期过程中，主题多肽以平均每天约6至10mg、约6.5至9.5mg、约6.5至8.5mg、约6.5至8mg或约7至9mg的量施用于受试者。

在一些实施方案中，主题多肽在每天约0.01mg/kg-50mg/kg的范围内，例如每天大约、少于约或多于约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，主题多肽在每周约0.1mg/kg-400mg/kg的范围内，例如每周大约、少于约或多于约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg或400mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，主题多肽在每月约0.4mg/kg-1500mg/kg的范围内，例如每月大约、少于约或多于约0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg或1000mg/kg施用于受试者。在一些实施方案中，主题多肽在每周约0.1mg/m²-200mg/m²的范围内，例如每周大约、少于约或多于约1mg/m²、5mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²、100mg/m²、125mg/m²、150mg/m²、175mg/m²或200mg/m²施用于受试者。目标剂量可以在单一剂量中施用。或者，目标剂量可以在大约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多剂量中施用。例如，每周约1mg/kg的剂量可以以每周约1mg/kg的剂量每周递送，每两周施用约2mg/kg，或者每四周在该周的时间内施用约4mg/kg。可以按照本文所述的任何方案来重复给药时间表，包括本文所述的任何给药时间表。在一些实施方案中，主题多肽在约0.1mg/m²-500mg/m²的范围内，例如以大约、少于约或多于约1mg/m²、5mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²、100mg/m²、130mg/m²、135mg/m²、155mg/m²、175mg/m²、200mg/m²、225mg/m²、250mg/m²、300mg/m²、350mg/m²、400mg/m²、420mg/m²、450mg/m²或500mg/m²施用于受试者。

主题多肽的剂量可以是大约、至少约或最多约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000mg或mg/kg，或由此可推导出的任何范围。应当指出，mg/kg的剂量是指每千克受试者总体重的主题多肽的毫克量。应当想到，当给予患者多个剂量时，这些剂量可在量上不同，或者它们可以是相同的。

药物组合物

在另一方面，本文提供了包含主题多肽和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂的药物组合物，所述载体、赋形剂或稳定剂包括但不限于惰性固体稀释剂和填充剂、稀释剂、无菌水溶液和各种有机溶剂、渗透促进剂、增溶剂和佐剂。(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))。

例如，主题药物组合物可以是作为片剂、胶囊、丸剂、粉末、持续释放制剂、溶液、悬浮液适合于口服给药，作为无菌溶液、悬浮液或乳液适合于胃肠外注射，作为软膏或乳膏适合于局部给药，或作为栓剂适合于直肠给药的形式。持续释放制品的合适的实例包括含有主题多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质是成型物品(例如，膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。一些持续释放制剂使分子能够在数周至数月，乃至长达数年的时间内释放。在一些实施方案中，主题药物组合物释放如本文所述的主题多肽至少数周，例如至少1周、2周、3周或4周。在进一步的实施方案中，主题药物组合物释放如本文所述的主题多肽数月，例如至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。

所述药物组合物可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。该药物组合物可以进一步包含主题多肽作为活性成分，且可以包含常规药用载体或赋形剂。此外，其可以包含其他药用或药物剂、载体、助剂等。

示例性的肠胃外给药形式包括活性多肽和/或PEG修饰的多肽在无菌水溶液如丙二醇水溶液或右旋糖溶液中的溶液或悬浮液。如果需要的话，这样的剂型可以用盐如组氨酸和/或磷酸盐适当地缓冲。

在一些实施方案中，本公开提供了用于注射的药物组合物，其包含本发明的多肽和适合于注射的药物赋形剂。这类组合物中的示例组分和试剂的量如本文所述。

本公开的组合物可掺入其中以供注射给药的形式包括水性或油性悬浮液，或乳液，其具有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂、甘露醇、右旋糖，或无菌水溶液以及类似的药物媒介物。

在盐水中的水溶液可用于注射。还可以采用乙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣以在分散体的情况下维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来阻止微生物的作用。

无菌可注射溶液可通过以下方法制备：将在适当溶剂中的所需量的本公开的主题多肽或其功能片段与如上列举的各种其他成分合并，随后过滤除菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，某些理想的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其由其先前过滤除菌的溶液产生活性成分加任何额外所需成分的粉末。

在一些实施方案中，本公开提供了用于口服给药的药物组合物，其含有本公开的主题多肽或其功能片段，和适合口服给药的药物赋形剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于口服给药的固体药物组合物，其含有：(i)有效量的本公开的主题多肽或其功能片段；任选地(ii)有效量的第二药剂；和(iii)适于口服给药的药物赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含：(iv)有效量的第三药剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物是适合于口服的液体药物组合物。适合于口服给药的药物组合物可以呈现为离散的剂型，如胶囊、扁囊剂或片剂，或各自含有预定量的作为粉末或颗粒的活性成分的液体或气雾喷雾剂，溶液，或在水性或非水性液体中的悬浮液，水包油乳液，或油包水液体乳液。这样的剂型可通过任何药学方法制备，一般包括使活性成分与载体关联，从而构成一种或多种必需成分的步骤。通常，该组合物如下制备：将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀地且紧密地混合，然后，如有必要，将产物成形为所需的呈现形式。

本公开进一步包括包含活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进一些多肽的降解。例如，在药学领域中可以加入水(例如，5％)作为模拟长期贮存的手段，以确定诸如制剂的贮存期限或随时间的稳定性等特性。无水药物组合物和剂型可使用无水或低含水量成分以及低水分或低湿度条件来制备。含有乳糖的药物组合物和剂型如果预计在制备、包装和/或储存过程中与水分和/或湿气发生实质性接触，则可以制成无水的。可制备并储存无水药物组合物，以使得其无水性质得以保持。因此，无水组合物可以使用已知防止暴露于水的材料进行包装，使得它们可以容纳在合适的制剂试剂盒(formulary kit)中。合适的包装的实例包括但不限于气密的箔、塑料等，单位剂量容器、泡罩包装和条带包装。

可以按照常规药物配混技术，将本公开的多肽与药物载体在紧密掺合物中进行组合。取决于施用所需的制品形式，载体可以采取多种形式。在制备用于口服剂型的组合物时，任何常用的药物介质都可用作载体，例如在口服液体制品(如悬浮液、溶液和酏剂)或气雾剂情况下的水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或者在口服固体制品的情况下可使用诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂等载体，在一些实施方案中不使用乳糖。例如，对于固体口服制品，合适的载体包括粉末、胶囊和片剂。如果需要的话，片剂可以通过标准水性或非水性技术进行包衣。

适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉，明胶，天然和合成的树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、粉状西黄蓍胶、瓜尔胶，纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)，聚乙烯吡咯烷酮，甲基纤维素，预胶化淀粉，羟丙基甲基纤维素，微晶纤维素，及其混合物。

用于药物组合物和剂型的合适的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、葡萄糖结合剂(dextrates)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉及其混合物。

可以在组合物中使用崩解剂，以提供在暴露于水性环境时发生崩解的片剂。太多的崩解剂可能产生可在瓶中崩解的片剂。过少则可能不足以发生崩解，因此可以改变活性成分从剂型中的释放速率和程度。因此，可以使用既不过少也不过多从而不会有害地改变活性成分的释放的足量崩解剂来形成剂型。使用的崩解剂的量可以根据制剂的类型和给药方式而不同，并且本领域普通技术人员可以容易地辨别。约0.5至约15重量％的崩解剂或约1至约5重量％的崩解剂可以在药物组合物中使用。可用来形成药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、羟基乙酸淀粉钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶化淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、树胶或其混合物。

可用来形成药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂或其混合物。另外的润滑剂包括，例如，syloid硅胶、合成二氧化硅的凝固气溶胶或其混合物。润滑剂可任选地以小于药物组合物的约1重量％的量添加。

当需要水性悬浮液和/或酏剂供口服给药时，其内的活性成分可与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料以及(如果需要的话)乳化剂和/或悬浮剂，连同诸如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种组合的稀释剂一起组合。

片剂可以是未包衣的或通过已知的技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时期内提供持续的作用。例如，可采用时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。供口服使用的制剂还可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

可用来形成药物组合物和剂型的表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物。换言之，可以采用亲水性表面活性剂的混合物，可以采用亲脂性表面活性剂的混合物，或者可以采用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲脂性表面活性剂的混合物。

具有较低HLB值的表面活性剂更加亲脂或疏水，并且在油中具有较高的溶解度，而具有较高HLB值的表面活性剂更加亲水，并且在水溶液中具有较高的溶解度。亲水性表面活性剂通常被认为是HLB值大于约10的那些化合物以及HLB标度通常不适用的阴离子、阳离子或两性离子化合物。类似地，亲脂性(即疏水性)表面活性剂是HLB值等于或小于约10的化合物。然而，表面活性剂的HLB值仅仅是粗略的指导，通常用来支持工业、药物和化妆品乳液的配制。

亲水性表面活性剂可以是离子型的或非离子性的。合适的离子型表面活性剂包括但不限于烷基铵盐；梭链孢酸盐；氨基酸、寡肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基酰化物(acylactylates)；单甘油酯和二甘油酯的单乙酰化酒石酸酯和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。

在上述组中，举例而言，离子型表面活性剂包括：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸酯的盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单甘油酯和二甘油酯的单乙酰化酒石酸酯和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。

离子型表面活性剂可以是离子化形式的卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸的乳酸酯、硬脂酰-2-乳酸酯、硬脂酰乳酸酯、琥珀酰化单甘油酯、单/二甘油酯的单/二乙酰化酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、胆酰肌氨酸、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、油酸酯、蓖麻酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、硬脂酸酯、月桂基硫酸酯、十四烷基硫酸酯、多库酯、月桂酰肉碱、棕榈酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱，及其盐和混合物。

亲水性非离子型表面活性剂可以包括但不限于烷基葡糖苷；烷基麦芽糖苷；烷基硫代葡糖苷；月桂基聚乙二醇甘油酯；聚氧化烯烷基醚，如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚，如聚乙二醇烷基酚；聚氧化烯烷基酚脂肪酸酯，如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯失水山梨醇脂肪酸酯，如聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇组成的组中的至少一个成员的亲水性酯交换产物；聚氧乙烯甾醇、其衍生物和类似物；聚氧乙烯化维生素及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；和它们的混合物；聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯和多元醇与由甘油三酯、植物油和氢化植物油组成的组中的至少一个成员的亲水性酯交换产物。该多元醇可以是甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇、丙二醇、季戊四醇或糖。

其他亲水性非离子型表面活性剂包括但不限于PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-25三油酸甘油酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20月桂酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-20硬脂酸甘油酯、PEG-20油酸甘油酯、PEG-30油酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-40月桂酸甘油酯、PEG-40棕榈仁油、PEG-50氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸/辛酸甘油酯、PEG-8癸酸/辛酸甘油酯、聚甘油-10月桂酸酯、PEG-30胆固醇、PEG-25植物甾醇、PEG-30大豆甾醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40失水山梨醇油酸酯、PEG-80失水山梨醇月桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10油基醚、POE-20油基醚、POE-20硬脂基醚、生育酚PEG-100琥珀酸酯、PEG-24胆固醇、聚甘油-10油酸酯、吐温40、吐温60、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、PEG 10-100壬基酚系列、PEG 15-100辛基酚系列和泊洛沙姆。

仅举例而言，合适的亲脂性表面活性剂包括：脂肪醇；甘油脂肪酸酯；乙酰化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；失水山梨醇脂肪酸酯；聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯；甾醇和甾醇衍生物；聚氧乙烯化甾醇和甾醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；单甘油酯和二甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇组成的组中的至少一个成员的疏水性酯交换产物；油溶性维生素/维生素衍生物；及其混合物。在该组中，优选的亲脂性表面活性剂包括甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯及其混合物，或者是多元醇与由植物油、氢化植物油和甘油三酯组成的组中的至少一个成员的疏水性酯交换产物。

在一个实施方案中，所述组合物包含增溶剂以确保化合物的良好的增溶和/或溶解并最小化该化合物的沉淀。这对于非口服使用的组合物，例如注射用组合物，可能特别有利。还可添加增溶剂以提高亲水性药物和/或其他组分如表面活性剂的溶解度，或将组合物保持为稳定或均匀的溶液或分散体。

合适的增溶剂的实例包括但不限于以下物质：醇和多元醇，如乙醇、异丙醇、丁醇、苄醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山梨醇、甘露醇、还氧二元醇(transcutol)、二甲基异山梨醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素和其他纤维素衍生物、环糊精和环糊精衍生物；平均分子量为约200至约6000的聚乙二醇的醚，如四氢糠醇PEG醚(四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol))或甲氧基PEG醚；酰胺和其他含氮化合物，如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、ε-己内酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟基烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己内酰胺、二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮；酯，如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三醋精、丙二醇单乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、ε-己内酯及其异构体、δ-戊内酯及其异构体、β-丁内酯及其异构体；以及本领域已知的其他增溶剂，如二甲基乙酰胺、二甲基异山梨醇、N-甲基吡咯烷酮、单辛精、二乙二醇单乙醚和水。

还可使用增溶剂的混合物。实例包括但不限于三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、聚乙二醇200-100、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、还氧二元醇、丙二醇和二甲基异山梨醇。特别优选的增溶剂包括山梨醇、甘油、三醋精、乙醇、PEG-400、四氢呋喃聚乙二醇醚和丙二醇。

可包含的增溶剂的量没有特别限制。给定的增溶剂的量可以限制为生物可接受的量，其可以由本领域技术人员容易地确定。在一些情况下，以下可能是有利的：包含远远超过生物可接受量的增溶剂的量，例如，以最大化药物的浓度，在将该组合物提供给受试者之前使用常规技术如蒸馏或蒸发移除过多的增溶剂。因此，如果存在的话，基于药物和其他赋形剂的合并重量，增溶剂的重量比可以是10％、25％、50％、100％或高达约200％(重量)。如果需要，也可以使用极少量的增溶剂，如5％、2％、1％或甚至更少。通常，增溶剂可以以约1％至约100％，更典型地约5％至约25％(重量)的量存在。

所述组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的添加剂和赋形剂。这类添加剂和赋形剂包括但不限于防粘剂、消泡剂、缓冲剂、聚合物、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度调节剂(viscomodulators)、张力调节剂(tonicifiers)、调味剂、着色剂、添味剂、遮光剂、悬浮剂、粘合剂、填充剂、增塑剂、润滑剂及其混合物。

另外，为了方便处理、增强稳定性或出于其他原因，可以向组合物中掺入酸或碱。药学上可接受的碱的实例包括氨基酸、氨基酸酯、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁、硅酸镁铝、合成硅酸铝、合成二水方解石(hydrocalcite)、氢氧化镁铝、二异丙基乙胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、三乙胺、三异丙醇胺、三甲胺、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)等。同样合适的是作为药学上可接受酸的盐的碱，所述酸例如是乙酸、丙烯酸、己二酸、藻酸、链烷磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸、尿酸等。还可以使用多元酸的盐，如磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。当所述碱为盐时，阳离子可以是任何方便的药学上可接受的阳离子，如铵、碱金属、碱土金属等。实例可以包括但不限于钠、钾、锂、镁、钙和铵。

合适的酸是药学上可接受的有机或无机酸。合适的无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、硼酸、磷酸等。合适的有机酸的实例包括乙酸、丙烯酸、己二酸、藻酸、链烷磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸、尿酸等。

在本公开的另一方面，提供了包含单位剂量的试剂盒，该单位剂量包含本公开的主题多肽组合物和使用说明书。该试剂盒可进一步包含一个或多个单位剂量，所述单位剂量包含一种或多种附加试剂，例如上文所述的免疫抑制试剂、细胞毒性剂或放射毒性剂，或一种或多种本文所述的附加治疗性蛋白质(例如，抗体)。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期应用的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的，或以其他方式随附于试剂盒的任何书面或记录的材料。

本公开的试剂盒还可以包括诊断剂和/或其他治疗剂。在一个实施方案中，试剂盒包括本公开的主题多肽和诊断剂，该诊断剂可以在本文所述的用于诊断受试者中的疾病、状况或病症的状态或存在的诊断方法中使用。

实施例

给出以下实施例是为了说明本公开的多个实施方案的目的，而并非意图以任何方式限制本发明。这些实施例以及目前代表优选实施方案的本文所述方法是示例性的，而非旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将会想到其变化以及包含在由权利要求的范围所限定的本公开的精神之内的其他用途。

实施例1：结合亲和力测定

所有SPR测量均在BIAcore 3000仪器(GE Biosciences，Piscataway,N.J.)上进行。BIAcore软件-BIAcore 3000Control Software V3.2用于BIAcore 3000仪器的操作和控制。使用BiaEvaluation Software V4.1对来自BIAcore 3000仪器的SPR数据进行分析，并使用Graph Pad Prism Software Version 5对数据进行作图。在25℃下在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％P20)中测量CTLA4变体对CD80或CD86的结合亲和力。亲和力研究的流速为30μL/分钟。所指示的CTLA4变体作为配体用于芯片的参考通道的构建。测量与固定的配体结合的分析物(CD80/CD86)，sIL-6R的浓度为1.2至100nM(稀释3倍)。每个样品以30μL/min的流速注入3分钟，以允许与芯片结合的肽结合。接下来，使不含分析物的结合缓冲液以相同的流速流过芯片，以使结合的分析物解离。500s后，通过注入再生溶液(1M甲酸)去除残留的结合的分析物。使用均与BiaEvaluation SoftwareV4.1一同包含的Kinetics Wizard和手动拟合程序对数据进行分析。k_a是缔合速率；k_d是解离速率；K_D是平衡解离常数；相对亲和力以K_D(阿巴西普)/K_D(变体)计算。k_a、k_d、K_D和相对于阿巴西普的亲和力(样品70#或103#)在表1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7和1-8中示出。

所有SPR测量均在BIAcore 3000仪器(GE Biosciences，Piscataway,N.J.)上进行。

表1-1 CD80对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表1-2 CD86对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表1-3 CD80对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表1-4 CD86对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表1-5 CD80对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表1-6 CD86对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表1-7 CD80对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表1-8 CD86对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

实施例2：对CD80和CD86的结合亲和力的pH依赖性的确定

平行进行在pH 7.4和pH 6.0下的SPR测量，并根据实施例1中详述的方案计算K_D值。根据pH 6.0时的K_D值与pH 7.4时的K_D值之间的比例计算pH依赖性，其表示从pH 7.4到pH6.0的亲和力降低倍数。如果本文描述的主题变体的pH依赖性大于1，则表示该变体以pH依赖性方式与CD80或CD86结合，该pH依赖性方式使得在pH7.4时与CD80或CD86的结合高于在pH6.0时。如果本文描述的主题变体的pH依赖性低于1，则表示该变体以pH依赖性方式与CD80或CD86结合，该pH依赖性方式使得在pH6.0时与CD80或CD86的结合高于在pH7.4时。对示例性变体133#和142#进行SPR测量，并使用阿巴西普和贝拉西普作为参考。获得的KD值分别在以下表2-1和3-1中提供。通过比较pH7.4时和pH 6.0时的结合亲和力确定的pH依赖性分别在表2-2和3-2中提供。如表2-2和表3-2所示，示例性变体133#和142#均显示出高于阿巴西普的关于CD80和CD86亲和力结合的pH依赖性，表明从pH7.4到pH6.0，结合亲和力更显著降低；示例性变体133#显示出高于贝拉西普的关于CD80和Cd86亲和力结合的pH依赖性；而示例性变体142#显示出比阿巴西普和贝拉西普都高得多的关于CD86亲和力结合的pH依赖性。这些数据表明了这些示例性CTLA4-Ig变体在抗原中和和清除方面的优异性能。

表2-1 CD80对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表2-2 CD80对示例性CTLA4变体的结合亲和力的pH依赖性

表3-1 CD86对示例性CTLA4-Ig变体的结合亲和力

表3-2 CD86对示例性CTLA4变体的结合亲和力的pH依赖性

实施例3：相对结合亲和力的评价

通过竞争性抑制试验检查示例性CTLA4-Ig变体对CD80和CD86的结合亲和力。在该竞争性抑制试验中，将阿巴西普(WT CTLA4-Ig)构建体转染到Ramos细胞(人类伯基特淋巴瘤细胞)中，并在Ras细胞的细胞表面上表达并呈现阿巴西普。如图1所示，然后将表达阿巴西普的Ramos细胞与生物素缀合的CD80或CD86一起孵育，后者可以被细胞表面上表达的阿巴西普结合。然后将示例性CTLA4-Ig变体或参考变体(例如，阿巴西普或贝拉西普)添加到孵育的细胞中。后来添加的示例性CTLA4-Ig变体与表面呈现的阿巴西普之间竞争结合CD80-生物素或CD86-生物素将导致表面结合的CD80-生物素或CD86-生物素的一部分脱离细胞表面。从细胞表面脱落的CD80-生物素或CD86-生物素的量可与示例性变体相对于阿巴西普对CD80或CD86的结合亲和力成正比。结果，保留在细胞表面上的CD80-生物素或CD86-生物素的量与示例性变体的相对结合亲和力成反比。细胞与链霉亲和素-APC孵育后，通过流式细胞术检查细胞表面结合的CD80或CD86的量，并通过细胞表面结合的APC染料引起的荧光信号水平来指示。如图2A和图2B所示，荧光信号越低，检查到的示例性变体对CD80或CD86的结合亲和力越高。例如，示例性变体——突变体142#(分别由图2A和图2B中的曲线#1和#6所证明)和133#(曲线#2和#7)显示出对CD80和CD86的亲和力高于阿巴西普(曲线#4和#9)和贝拉西普(曲线#3和#8)。

实施例4：相对结合亲和力的评价

通过不同的竞争性抑制试验检查示例性CTLA4-Ig变体对CD80和CD86的结合亲和力。在该竞争性抑制试验中，将CD28-Ig构建体转染到Ramos细胞(人类伯基特淋巴瘤细胞)中，并在Ras细胞的细胞表面上表达并呈现CD28-Ig。由于CD28可能是T细胞活化中的关键共刺激受体，因此对CD80和CD86可具有自然的结合亲和力。然后将表达CD28-Ig的Ramos细胞与生物素缀合的CD80或CD86一起孵育，后者可以被细胞表面上表达的CD28-Ig结合。然后将示例性CTLA4-Ig变体或参考变体(例如，阿巴西普或贝拉西普)添加到孵育的细胞中。后来添加的示例性CTLA4-Ig变体与表面呈现的CD28之间竞争结合CD80-生物素或CD86-生物素将导致表面结合的CD80-生物素或CD86-生物素的一部分脱离细胞表面。从细胞表面脱落的CD80-生物素或CD86-生物素的量可与示例性变体相对于CD28对CD80或CD86的结合亲和力成正比。结果，保留在细胞表面上的CD80-生物素或CD86-生物素的量与示例性变体的相对结合亲和力成反比。细胞与链霉亲和素-APC孵育后，通过流式细胞术检查细胞表面结合的CD80或CD86的量，并通过细胞表面结合的APC染料引起的荧光信号水平来指示。如图3A和图3B所示，荧光信号越低，检查到的示例性变体对CD80或CD86的结合亲和力越高。例如，示例性变体——突变体142#(分别由图3A和图3B中的曲线#11和#16所证明)和133#(曲线#12和#17)显示出对CD80和CD86的亲和力高于阿巴西普(曲线#14和#19)和贝拉西普(曲线#13和#8)。

实施例5：对T细胞增殖的免疫抑制作用的评价

在测试示例性CTLA4-Ig对原代T细胞增殖的抑制作用的试验中检查了示例性CTLA4-Ig变体的免疫抑制作用。在该实验中，从健康的人类外周血单核细胞(PBMC)中分离T细胞，并用荧光染色染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行标记，该染料用来示踪细胞增殖。用包被在细胞培养皿表面上的抗CD3抗体OKT3和CD86-Fc刺激分离的原代T细胞。将不同浓度的阿巴西普或示例性CTLA4-Ig变体添加到T细胞培养物中，这可抑制T细胞的增殖。在37℃下培养4天后，对T细胞进行其增殖的流式细胞术分析。如图4所示，计算每种测试的示例性变体和阿巴西普的半数最大抑制浓度(IC₅₀)。

实施例6：对IL2分泌的免疫抑制作用的评价

在测试示例性CTLA4-Ig对T细胞的IL12分泌的抑制作用的试验中检查了示例性CTLA4-Ig变体的免疫抑制作用。Raji细胞(人类B淋巴细胞)可以在表面上表达CD80和CD86。当被PHA(植物凝集素P)刺激时，Jurkat细胞(人类T淋巴细胞)可以激活其表面受体CD28。因此，如图5所示，在PHA的存在下，共培养的Raji细胞和Jurkat细胞可以将它们的表面CD28和CD80/CD86结合在一起，这可以导致Jurkat细胞的活化以及活化的Jurkat细胞的IL2分泌。在该实验中，将Jurkat细胞和Raji细胞在PHA的存在下共培养，并将不同浓度的阿巴西普或示例性CTLA4-Ig变体添加到共培养物中，这可以抑制Jurkat细胞的活化，因而抑制IL2分泌，如图5所示。示例性变体的免疫抑制活性越高，检测到的IL2水平越低。在5μg/mL PHA刺激24小时后，通过ELISA检查IL2分泌。如图6A-6C所示，计算每种测试的示例性变体和阿巴西普的IC₅₀。示例性多肽的更多测试结果在表4中示出。

表4.示例性多肽对IL2分泌的IC₅₀

在实施例1-6中测试的示例性多肽是相对于SEQ ID NO:2包含表5中列出的突变的多肽。

表5.示例性多肽的突变

虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开时可以采用本文所述本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

表6. Fc序列

表7.连接体序列

表8.序列表

Claims (70)

1.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1-124具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的第一氨基酸序列，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2在选自位置18、40、68、77、86、92、107、117、118和122的一个或多个位置处包含突变。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，与阿巴西普(SEQ ID NO:2)相比，所述多肽表现出增强的对CD80和/或CD86的结合亲和力。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2在位置68处包含突变。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2在位置40处包含突变。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步相对于SEQ ID NO:2在选自位置16、24、25、27、28、29、33、41、42、48、49、50、51、52、53、54、58、59、60、61、63、64、65、69、70、80、85、93、94、96和105的一个或多个位置处包含突变。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述突变包括氨基酸置换或缺失。

7.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1-124具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2包含选自下组的氨基酸置换：S18R、S18N、A24S、G27DKA、G27DK、G27K、G27R、G27W、G27Y、G27E、G27KK、A29T、A40T、A49P、A50T、G68F、G68K、G68W、G68Y、G68H、G68D、G68E、L77V、D86N、C92S、C92Y、K93V、K93W、K93P、K93C、K93F、K93R、V94L、G105S、G107D、P117S、E118K、D122H及其任意组合。

8.根据权利要求7所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，与阿巴西普(SEQ ID NO:2)相比，所述多肽表现出增强的对CD80和/或CD86的结合亲和力。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G27DKA。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G68F。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换A40T。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽，其进一步相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换K93M。

13.根据权利要求1-7或10-12中任一项所述的多肽，其进一步相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G27DK。

14.根据权利要求1-7或10-12中任一项所述的多肽，其进一步相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换G27H。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换P117S。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的多肽，其进一步相对于SEQ ID NO:2包含至少一个选自下组的氨基酸置换：A24E、G27H、G27D、A29S、R33W、D41G、T51N、K93M、K93N和G105D。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含选自下组的氨基酸置换组合：G27DKA/R33W、G27DKA/G68F、R33W/G68F、G27R/G68Y、G27H/G68F、G27DK/G68F、G27DK/G68D、G27DK/G68E、G27D/G68F、G27E/G68F、G27H/G68D、G27H/G68E、G27DKA/G68F、G27H/G68F、G27DK/G68F、G27DKA/G68F/D122H、G27DKA/G68F/A40T/D122H、G27DKA/G68F/A40T/P117S、G27DKA/G68F/L77V、G27DKA/G68F/C92S/K93M、G27DK/G68F/A49P/A50T、G27DK/G68F/A40T/D86N/G105S、G27KK/G68F、G27DKA/G68F/P117S、G27DKA/G68F/A49P/A50T、G27DK/G68F/A40T、G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S、G27DK/G68F/L77V、G27DK/G68F/C92S/K93M、G27DK/G68F/P117S、G27DKA/G68F/G105S、G27DKA/G68F/D86N、G27DK/G68F/D122H、G27DK/G68F/A40T/G105S、G27DK/G68F/G105S、G27DK/G68F/D86N、G27DKA/G68F/A40T、G27DKA/G68F/K93M、G27DK/G68F/K93M和G27DKA/A40T/G68F/K93M。

18.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/A40T/G68F/K93M。

19.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/A40T。

20.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/K93M。

21.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/A40T/P117S。

22.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F/P117S。

23.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27H/G68F。

24.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DKA/G68F。

25.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/K93M。

26.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/A40T。

27.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/L77V/G105S/P117S。

28.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/L77V。

29.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/P117S。

30.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2包含氨基酸置换组合G27DK/G68F/D122H。

31.根据权利要求1-25中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸置换。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的多肽，其相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124包含至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个氨基酸置换。

33.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1-124具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽相对于SEQ ID NO:2的氨基酸1-124的氨基酸置换选自权利要求7-32中任一项所述的氨基酸置换。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的多肽，其进一步包含与所述第一氨基酸序列融合的第二氨基酸序列。

35.根据权利要求34所述的多肽，其中所述第二氨基酸序列编码IgG Fc区。

36.根据权利要求35所述的多肽，其中所述IgG Fc区来自人IgG分子。

37.根据权利要求35或36所述的多肽，其中所述第二氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸125-357具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。

38.根据权利要求34-37中任一项所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:6的氨基酸1-359具有大约或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。

39.根据权利要求34-38中任一项所述的多肽，其中所述第一和第二氨基酸序列通过连接体融合在一起。

40.根据权利要求39所述的多肽，其中所述连接体包含1至10个氨基酸。

41.根据权利要求39或40所述的多肽，其中所述连接体包含选自表7的氨基酸序列。

42.根据权利要求39或40所述的多肽，其中所述连接体包含氨基酸序列Q(SEQ ID NO:82)或GGGGS(SEQ ID NO:54)。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是阿巴西普(SEQ ID NO:2)对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250或至少300倍。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是阿巴西普(SEQ ID NO:2)对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250或至少300倍。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力大于贝拉西普(SEQ ID NO:3)对CD80的亲和力。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力大于贝拉西普(SEQ ID NO:3)对CD86的亲和力。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是贝拉西普(SEQ ID NO:3)对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是贝拉西普(SEQ ID NO:3)对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力大于SEQ ID NO:4对CD80的亲和力。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力大于SEQ ID NO:4对CD86的亲和力。

51.根据权利要求1-50中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。

53.根据权利要求1-52中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力大于SEQ ID NO:5对CD80的亲和力。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力大于SEQ ID NO:5对CD86的亲和力。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD80表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD80的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。

56.根据权利要求1-55中任一项所述的多肽，其中如在37℃下通过表面等离子体共振所确定的，所述多肽对CD86表现出的结合亲和力是SEQ ID NO:4对CD86的亲和力的至少1.5、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25或至少30倍。

57.一种多肽-药物缀合物，其包含权利要求1-56中任一项的多肽。

58.一种治疗疾病或状况的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求1-56中任一项的多肽或权利要求57的多肽-药物缀合物。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述疾病或状况包括感染、与感染相关的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身发作型青少年特发性关节炎(JIA)、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、多发性硬化、强直性脊柱炎、皮肌炎、葡萄膜炎、Peyronie病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛症、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜脑炎、免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性病症、自身免疫性病症、胰腺炎、手术引起的创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病、骨吸收、烧伤患者、心肌梗死、Paget病、骨质疏松症、脓毒症、肝/肺纤维化、牙周炎、低胃酸、实体瘤(肾细胞癌)、肝癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症和B细胞恶性肿瘤(例如，Casteleman病、某些淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤)。

60.根据权利要求1-56中任一项所述的多肽，其用于治疗受试者的状况。

61.根据权利要求60所述的多肽，其中所述状况包括移植排斥、感染、与感染相关的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身发作型青少年特发性关节炎(JIA)、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、多发性硬化、强直性脊柱炎、皮肌炎、葡萄膜炎、Peyronie病、乳糜泻、胆囊疾病、藏毛症、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜脑炎、免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性病症、自身免疫性病症、胰腺炎、手术引起的创伤、移植物抗宿主病、心脏病、骨吸收、烧伤患者、心肌梗死、Paget病、骨质疏松症、脓毒症、肝/肺纤维化、牙周炎、低胃酸、实体瘤(肾细胞癌)、肝癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症和B细胞恶性肿瘤(例如，Casteleman病、某些淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤)。

62.一种药物组合物，其包含权利要求1-56中任一项的多肽或权利要求57的多肽-药物缀合物以及药学上可接受的赋形剂。

63.一种试剂盒，其在容器中包含权利要求1-56中任一项的多肽或权利要求57的多肽-药物缀合物。

64.权利要求1-56中任一项的多肽或权利要求57的多肽-药物缀合物在制备用于治疗受试者的状况的药物中的用途。

65.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-56中任一项的多肽。

66.一种载体，其包含权利要求65的分离的多核苷酸。

67.一种细胞，其包含权利要求66的载体。

68.根据权利要求67所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。

69.根据权利要求67所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。

70.根据权利要求67所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞或昆虫细胞。

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