Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Zpusob izolace rekombinantního lidského neurotrofinu, neurotrofinový prostredek a zpusob cištení neurotrofinu
CZ300296B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
E. Burton@Louis H. Schmelzer@Charles T. Beck@Joanne
Description
translated from
Způsob izolace rckonibinantního lidského neurotrofinu, neurotrofinový prostředek a způsob čištění neurotrofinu
Oblast techniky
Předmětný vynález se týká zlepšené metody purifikace neurotrofinu, konkrétné těch, které patří do NGF rodiny, konkrétněji pak nervového růstového faktoru (NGF) a neurotrofinů 4/5 (NT4/5), a neurotrofinů 3 (NT—3) od variant, nečistot a kontaminantů s nimi spojených, zejména, io jsou-li produkovány fermentací bakteriálních a savčích buněk.
Dosavadní stav technik v
Produkce velkého množství relativně čistých, biologicky aktivních polypeptidů a proteinů je důležitá z ekonomického hlediska pro výrobu lidských a živočišných farmaceutických formulací, enzymů a jiných speciálních chemikálií. Pro produkci mnoha proteinů se metodou výběru stávají techniky rekombinantní DNA, protože velká množství exogenních proteinů mohou být exprimována v savčích, bakteriálních a jiných hostitelských buňkách.
2(1
Primární strukturu savčího NGF (myší NGF) poprvé objasnili Angeletti a Bradshaw, Proč·. Nati. Acad. Aci. USA 68:2417 (1971), Primární struktura jeho prekurzorů. pre-pro -NGF, byla odvozena od nukleotidové sekvence cDNA myšího NGF (Scott a spol. Nátuře 302:538 (1983);Ullrich a spol. Nátuře 303:821 (1983)),
Identifikován byl rovněž gen pro homologní lidský NGF (hNGF) (Ullrich. Svtnp. on Qiiíiii,Biol. Cold Spring Harbor 48:435 (1983); patent US 5 288 622 vydaný 22. února 1994. jak je uvedeno v referencích). Jeho homologie s myším NGF je asi 90 % v případě aminokyselinového složeni a 87 % u nukleotidové sekvence. Vzhledem k nedostatku přirozené se vyskytujícího lidského NGF nebyl připraven z přírodních zdrojů v takových množstvích, která by byla dostatečná pro podrobnou biochemickou charakterizaci.
Od té doby byly identifikovány další neurotrofní faktory vztahující se k NGF. Patří sem mozkový ncurolrolhí faktor (BDNF) (l.eibrock, a spol.. Nátuře, 341:149 až 152 (1989)), neurotrofin-3 (NT-3) (Kaisho, a spol., FEBS Lett.. 266:187 (1990); Maisonpierre, a spol.. Science, 247:1446 (1990); Rosenthal. a spol,. Neuron. 4:767 (1990)) a neurotrofiu 4/5 (NT—4/5) (Berkmeier, a spol.. Neuron. 7:857 až 866 (1991)). GDNF. vzdálený člen TGF-B nadrodiny a neurturin („NTN“) jsou dva nedávno identifikované strukturálně podobné účinné faktory pro neurony sympatických senzorů centrálního nervového systému (Fin a spol. Science 260:1 130 až 1132 (1993); llenderson a spol. Science 266:1062 až 1064 (1994); Buj-Bello a spol.. Neuron 15:821 až 828 (1995): Kotzbauer a spol. Nátuře 384. 467 až 470 (1996)).
Produkce rekombinantních proteinů zahrnuje transfekci hostitelských buněk DNA, která kóduje protein, a růst buněk za podmínek, které jsou příznivé pro expresi rekombinantniho proteinu.
Prokaryotní E. coii je vhodná hostitelská buňka, protože umožňuje levnou produkci rekombinantního proteinu ve vysokých výtěžcích. Existuje řada US patentů na obecnou bakteriální expresi DNA. která kóduje proteiny. Patří sem patent US 4 565 785 na molekulu rekombinantní DNA obsahující bakteriální gen pro extracelulární nebo periplazmatický nosičový protein a nebakteriální gen: patent US 4 673 641 na současnou produkci cizího polypeptidů s polypeptidem, který
3i) tvoří agregáty; patent US 4 738 921 na expresní vektor s trp promotor/operátorem a na trp LE fúzi s polypeptidem. jako je IGF—J; patent US 4 795 706 na začlenění expresních kontrolních sekvencí do cizího proteinu; a patent US 4 710 473 na specifické cirkulární DNA plazmidy jako jsou ty, které kódují IGF-l.
C7. 300296 B6
Geneticky modifikované biofarmaceutické látky jsou většinou purifikované ze supernatantu. který' obsahuje řadu různorodých kontaminantů hostitelské buňky. V konkrétním případě NGF byl podle dostupných informací purifikován s použitím řady různých metod do různého stupně čistoty, s různým stupněm úsilí a úspěchu. Viz např. Longo a spoL, IBRO Handbook, vol. 12. pp
3 až 30 (1989); patent US 5 082 774, který' odhaluje CHO buněčnou produkci NGF; Bruče a
Heinrich (Neurobit). Aging 10:89 až 94 (1989); Schmelzer a spol.,/. Neurochem. 59; 1675 až 1683 (1992); Burton a spoí, .7. Nerochem. 59:1937 1945 (1992). Toto vše bylo prováděno původně v laboratorním měřítku.
io Avšak nepodařilo se docílit preparativnť izolace farmaceuticky čistého rekombinantního lidského NGF bez příměsí variant a s vysokým výtěžkem.
Proto je tedy třeba vyvinout účinný protokol pro selektivní separaci neurotrofinů. konkrétně NGF a neurotrofinů z NGF rodiny od jejich variant a jiných molekul a od ostatních polypeptidú s i? vysokým pl. Proces purifíkace neurotrofinů ve velkém měřítku by měl být aplikovatelný na výchozí materiál z různých zdrojů včetně fermentačního bujónu a lyžovaných bakteriálních nebo savčích buněk s cílem pokrýt klinické potřeby. Kromě toho. protože autoři předmětného vynálezu objevili dosud neznámé, obtížné separovatelné neurotrofinové varianty, např. NGF varianty, prezentované metody jsou konkrétně užitečné pro získání komerčně využitelného množství rekom?o binantnieh neurotrofinů. včetně lidského NGF (rhNGF), rhNT-3 a rhNT-4/5 a jejich žádoucích geneticky modifikovaných mutantů. které neobsahují žádné nežádoucí varianty. Tyto a další předměty vynálezu budou nyní zřejmé pro každého odborníka v dané oblasti.
Podstata vynálezu
Vynález se týká způsob izolace rekombinantního lidského neurotrofinů ze směsi, obsahující jiné proteiny a variantu rekombinantního lidského neurotrofinů. a kde varianta je vybraná ze skupiny skládající se z chybně svinuté varianty, proteolytícky zpracované varianty a glykosy lační varianty io tohoto rekombinantního lidského neurotrofinů, vyznačující se tím, že se roztok směsi obsahující rekombinantní lidský neurotrofin mající pil 5 až 8 a/nebo koncentraci soli 0,5 až 3M nanese na pryskyřici pro chromatografií s hydrofobní interakcí mající funkční skupinu vybranou ze skupiny obsahující fenyl. alkoxy, propyI butyl. oktyl a isoamyl. následně se pryskyřice promyje pufretn při pH 5 až 8 a eluuje se rekombinantní lidský neurotrofin z pry sky řice pomocí elučního pufru obsahujícího alkoholické nebo polární aprotické roz.pouštědlo o koncentraci 5 až 25 % objemových.
V jednom provedení předmětného vy nálezu je uváděn proces purifíkace neurotrofinů, konkrétně toho. který patří do NGF rodiny, včetně NGF, NT-3, NT-A/5 a BDNF, které jsou rozpoznávány
-to vysoce homologní rodinou receptorů (trks). výhodněji rhNGF, rNT-3, rnNT 4/5, rhBDNF nebo jejich žádoucích geneticky manipulovaných forem užitím chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC)· Vzhledem k tomu, že autoři předmětného vynálezu objevili existenci určitých nežádoucích neurotrofinovýeli variant, vznikajících z rekombinantní produkce neurotrofinů, jak je zde uváděno, použití i 1IC umožňuje separaci chemicky odlišných nebo dokonce chybně svinutých forem neurotrofinů od požadovaného, správně svinutého, neporušeného neurotrofinů. Varianty, které mohou být odstraněny, jsou takové, které se liší v hydrofohicitě od zralých, správně svinutých neurotrofinů. Jsou to částečně zpracované prekurzorové sekvence, glykosylované zralé formy a formy obsahující prekurzor (pochází—li z eukaryotické buněčné kultury), a chybně svinuté nebo částečně svinuté varianty (obecně z bakteriální buněčné kultury', probíhají—li kroky,
5(i vedoucí ke svinutí in vitro). Např. IIIC je konkrétně užitečná při odstranění částečně zpracovaných prekurzorových sekvencí NGF, glykosylovaných druhů NGF a prekurzorů (pochází—li z eukaryotické buněčné kultury') a chybně nebo částečně svinutých variant (obecně z bakteriální buněčné kultury a in vitro probíhajících kroků, vedoucích ke svinutí) ze směsí zralého NGF. NGF má jedno N-vazebné glykosylační místo na Asn45. V případě znovu svinutého rhNT-4/5. který
5? je exprimován bakterií, separuje HIC správně svinuté formy NT -4/5 od nesprávně svinutých
->
forem. Výsledkem tohoto postupu je neurotrofin, který' neobsahuje téměř žádné tyto varianty. Pro purifíkaci neurotrofinu jsou upřednostňovány fenylové funkční skupiny vázané na pryskyřicovém nosiči, zatímco oktylové a butylove skupiny mohou být použity. Konkrétně upřednostňovaná provedení zahrnují HIC pryskyřicové náplně Phenyl Toyopearl. Phenyl Sepharose Past Flow
Low Substitution, Ί SK- Phenyl 5PW a podobné.
V jiném provedení je uváděn proces purifikace neurotrofinu, konkrétně jednoho z NGF rodiny, výhodněji rhNGF. rNT-3, rhNT-4/5 nebo jejich žádoucích geneticky modifikovaných forem pomocí preparativní ionexové chromatografie na katexu. Tato chromatografie separuje nábojové ío modifikované varianty , jako jsou oxidované a deamidované nebo isoasp formy od zralého neurolrofínu. Konkrétně upřednostňovaná provedení používají SP-Sepharose High Performance, Fractogel FMD SO3 nebo pryskyřice obsahující polyasparagovou kyselinu, z nichž je konkrétně upřednostňovaná PolyCAT A. Ve velkém měřítku jsou nejvíce upřednostňovány pryskyřice SP Sepharose High Performance nebo Fractogel FMD SO3.
i?
V ještě dalším provedení předmětného vynálezu je použita jak HIC. tak ionexová chromatografie na katexu pro přípravu kompozice žádoucího neurotrofinu např. rekoinbinanlního zralého NGF, výhodněji lidského NGF. který je převážně homogenní, tzn. převážně neobsahuje žádné procesní a nábojové varianty, např. chybně svinuté a chemické varianty, a je také převážně čistý z hlediska obsahu proteinů.
V jednom provedení předmětného vynálezu je poskytován zdokonalený postup separace neurotrofinu. konkrétně těch, které patří do NGF rodiny, výhodněji rckombinantiíího lidského NGF, NT-3, NT-4/5 a jejich žádoucích geneticky modifikovaných forem, od příbuzných nežádoucích variant, např. fcnncntaěních, proteázami štěpených, gly kosy lovaných variant a chybně svinutých variant kapalinovou chromatografií s reverzní fází. Výhodněji je NGF 120/120 nebo 118/118 honiodimer. Výsledkem zde popisovaného postupu je neurotrofin. který nejvýhodnčji neobsahuje téměř žádné varianty.
V jiném provedení je poskytován postup purifikace ncurolrofinů. konkrétně těch z. NGF rodiny, od příbuzných variant použitím eluěníeh podmínek, zahrnujících fyziologické pH.
V ještě jiném provedení je poskytován postup purifikace neurotrofinu se značně zlepšenou homogenitou.
V jiném provedení poskytuje předmětný vy nález postup pro separaci neurotrofinu z NGF rodiny od jejich variant a skládá se z:
a) nanesení pufru, obsahujícího neurotrofin a jeho varianty při pH asi 5 až 8 na kolonu pro chromatografií s hydrofobní interakcí ta b) promytí kolony
e) eluee neurotrofinu pufrem o pH 5 až 8
d) nanesení eluentu, obsahujícího neurotrofin, na kolonu pro ionexovou chromatografii na katexu při pl 1 asi 5 až 8, a
e) eluee neurotrofinu z kolony pomocí pufru s gradientem soli při pi l asi 5 až 8. výhodněji pH
4? 6. Neurotrofin je nejvýhodněji rhNGF.
V jednom provedení předmětného vynálezu je poskytován krok chromatografie na sloupci silikagelu, který· účinně odstraňuje proteiny hostitelské buňky z neurotrofinové frakce, která je výhodněji NGF frakcí.
V jednom provedení předmětného vynálezu je poskytován krok postupu, ve kterém je NGF o 120 aminokyselinách vystaven působeni proteázy na bázi trypsinu. Dojde k selektivnímu odstranění koncového RA dipeptidu z VRRA C-konee a ke vzniku 118 aminokyselinového zbytku. Jc upřednostňována kolona s imobilizovaným trypsinem.
- _> CZ 300296 B6
Předmětný vynález se také vztahuje k neurotrofinové kompozici a formulaci, připravené pomocí postupů předmětného vynálezu, a k použití kompozice a formulace.
s Je poskytována kompozice neurotrofuiu, který jc převážné homogenní, tzn. neobsahuje ani procesní ani nábojové varianty, např. chybně svinuté varianty a chemické varianty a také je převážně čistý z hlediska obsahu proteinů. V této formě jsou výhodněji poskytovány zralý lidský NGF, zralý lidský nebo potkaní NT-3 a zralý lidský NT 4/5. V upřednostňovaném provedeni obsahuje NGF 120 aminokyselin a výhodněji 118, nejvýhodněji jako homodimer, např. 118/118.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek I zobrazuje chromatogram na SP-Sepharose HP. Po fěrmentaei 12 kd byla směs, obsaií hujíeí NGF po HIC, nanesena na kolonu s pryskyřici SP-Sepharose High Performance (rozměry kolony 1.0 x 35 cm; 27,5 ml mrtvý objem) z pryskyřice 25 omnifit SOS I IP.
Pufr A obsahoval 0.2 M NaCl, 20 mM sukeinát. pH 6,0 (23 nis). Pufr B obsahoval 0,7 M NaCl. 20 mM sukeinát, pH 6,0 (63 ms). Kolona byla nejdříve ekv i I ibrována pufrem A. Frakce po HIC o
2i) objemu 345 ml a koneenlraei 0,24 mg/ml byly převedeny do roztoku 25 mM sukeinátu. pil 6 (I 7 ms). z čehož 362 ml bylo naneseno a to dává 3 mg/ml pryskyřice; 82.5 mg NGF bylo naneseno. Rychlost nanášení byla 40cm/h. NGF byl eluován gradientem 30 až 80 % pufru B (od 0,35 do 0.60 M NaCl; 37 až 57 ms), objemem odpovídajícím 22 násobku objemu kolony. Rychlost eluce byla 60 cm/li. Absorbance (280 nm) a mS/cm byly vyneseny proti číslu frakce a clučnimu objemu v ml. Frakce, obsahující NGF. byly stanoveny a spojeny dohromady. V tomto případě byly spojeny frakce 43 až 60 a bylo získáno 99 ml vzorku o koncentraci NGF 0,38 mg/ml. návratnost kroku byla asi 46 %.
Obrázek 2 zobrazuje analýzu frakcí po ehromatografíi na koloně Phenyl Sepharose Fast Flow a
SP-Sepharose HP ionexovou ehromatografíi na katexu SP-NPR HPFC (HPIFX). Jednotlivé chromatogramy jsou označeny.
Obrázek 3 zobrazuje C4 RP-HPLC analýzu vybraných frakcí (hlavní frakce, koncové a počáteční frakce hlavního píku) po ehromatografíi na SP-Sepharose HP. Iři signály byly překryty a ozna55 čeny. Jak je vidět, hlavní pík (obsahující zralý NGF) je separován od ostatních nižších píku. které obsahují varianty NGF.
Obrázek 4 zobrazuje sekvenci lidského prepro-NGF (SFQ ID NO; 1). Podle obrázku je první aminokyselina zralého NGF (pozice 1) a poslední aminokyselina 120 aminokyselinové formy
4o NGF (pozice 120). Upřednostňovaná aminokyselinová sekvence NGF je sekvence zralé 118 aminokyselinové formy (od pozice 1 do pozice 118). Také jsou ukázány variantní formy: zralá 120 (pozice 1 až pozice 120); zralá I 17 ( pozice I až 117); R120 (pozice - 1 až 120); a místa pro další chybné zpracování formy, které se vyskytuje na N- a C-konci, včetně zralých variant 114 (aminokyseliny 1 až I 14). I 15 ( aminokyseliny I až 115) a 117 ( aminokyseliny 1 až I 17). Hlavní •t5 chybně zpracovaná varianta, proteolyticky chybně zpracovaná, jc v sekvenci NGF štěpena na Nkonci mezi aminokyselinami R(-39) a S(-38). Pravděpodobné iniciační Met jsou podtrženy. Další varianty, štěpené na N-konci, zahrnují zkrácené formy NGF s nejběžnějším štěpením mezi aminokyselinami H8 a R9 a mezi aminokyselinami R9 a GI0.
Obrázek 5 zobrazuje aminokyselinové sekvence lidského NGF (SE5Q ID NO:2), myšího NGF (SFQ ID NO;3), BDNF (SEQ ID NO:4), NT 3 (SEQ ID NO:5) a NT--4/5 (SFQ ID NO:6>. Orámované oblasti označují homologní oblasti obsahující cystein, které jsou zahrnuty v uzlíkovém motivu cysteinu ( De Young5(8): 1554 až 66 (1996)).
-4 C7. 300296 Bó
Obrázek 6 zobrazuje chromatograflcký záznam purifikaee preparátu rhNT-4/5 na koloně s pryskyřicovou náplní DEAF-Sepharose Fast Flow (DEFF). Chromatogram. označený jako „NT45DF1:1- UV. udává průběh UV absorbance měřené při 280 nm. Chromatogram, označený jako „NT45DF1: ]_Cond1, znázorňuje vodivost eluovanýeh frakci. Frakce, obsahující neurotio5 fin, které byly spojeny, jsou označeny vodorovnou šipkou „Pool.
Obrázek 7 zobrazuje záznam chromatografie rhNTM/5 na koloně s pryskyřicí SP-Sepharose Fast Flow. Chromatogram. označený jako ,.N 145SFF1; 1_UV“, je UV absorbance při 280 nm, Chromatogram, označený jako „NT45SFFI: l_C'ond 1”, znázorňuje vodivost eluovanýeh frakcí. Frakce io obsahující neurotrofin. které byly spojeny, jsou naznačeny vodorovnou šipkou „Pool.
Obrázek 8 zobrazuje typický chromatograflcký záznam preparativní C4-RP-IIPLC chromatografie preparátu rhNT—4/5 za podmínek popsaných v textu. Byla sledována absorbance při 280 nm. Frakce obsahující neurotrofin, které byly spojeny, jsou označeny vodorovnou šipkou „Pool.
Obrázek 9 poskytuje záznam analytické HPLC chromatografie vzorků NT4/5. analyzovaných v naznačených časech během procesu, kdy docházelo ke znovusvinutí. Chromatografieké podmínky jsou popsány v textu. „NT 4/5 Std. naznačuje záznam eluce správně svinutého, neporušeného NT-4/5, který byl použit jako standard. Křivka označená jako „SSFF (0,5 in)” zobrazuje analýzu preparátu NT-4/5. ehiovaného před znovusvinutím z kolony S-Sepharose Fast Flow roztokem 0,5 M NaCI. Jak dochází k opětovnému svinování NT-4/5, křivka, naznačující průběh eluce, se blíží křivce standardu.
Obrázek 10 zobrazuje chromatogram zobrazující separaci neporušeného, správně svinutého NT25 4/5 od chybně svinutých variant chromatografií s hydrofobní interakcí na koloně Phenyl
Toyopearl 650M. Chybné svinuté varianty, které jsou rnénč hydrofobní než správně svinutý NT-4/5, jsou cínovány bez zadržení na koloně, zatímco chybně svinuté varianty (pík B), které jsou hydrofobnější, se cluují vyššími koncentracemi organických rozpouštědel, než je třeba pro eluei správně svinutého NT—4/5 (pík A).
5(1
Obrázek I 1 zobrazuje průběh eluce NT-4/5 a jeho variant z. katexové kolony s pryskyřicí SPSepharose. Byla sledována absorbance při 280 nm. Pík A obsahuje karbamylované a zkrácené varianty, zatímco pík B obsahuje neporušený, správně svinulý N I-4/5, Frakce, obsahující NT4/5. které byly spojeny, jsou označeny vodorovnou šipkou „Pool.
Obrázek 12 zobrazuje typický ehroniatografický záznam preparativní chromatografie preparátu rhNT-4/5 na pryskyřici póly CAT A za podmínek, které jsou popsány v textu.
Obrázek 13 zobrazuje SDS elektroforézu v 16 % PAA gelu (komerčně připravený 1 ris— glycino4(i vý systém od firmy Novcx, lne.. San Diego, CA) za redukčních podmínek, která byla použita pro určení čistoty a homogenity vzorků po naznačených krocích purifíkačního postupu, popsaného v textu. Proteiny byly detekovány roztokem Coomassie-R250 (Andrews, Flectrophoresis, Oxford University Press; New York, 1986), Dráha označená jako „DF nástřik obsahuje vzorek PEI směsi, která byla nanesena na kolonu DE-Sepharose Fast Flow; dráha označená jako „DE Uf obsahuje vzorek, který1 protek! kolonou DE Sepharose Fast Flow bez zadržení; dráha „S frakce obsahuje vzorek spojených frakcí, obsahujících NT-4/5, které byly cluovánv z kolony SSepharose Fast Flow před tím. než došlo ke znovusvinutí; dráha „frakce znovusvinutého NT4/5” obsahuje vzorek spojených frakcí po ukončení znovusvinování; dráha „C4 frakce obsahuje vzorek spojených frakcí po preparativní chromatografií na koloně C4 RP- UPEC; a dráha „PolyCAT A frakce obsahuje vzorek ze spojených frakcí, obsahujících ΝΊΜ/5. po HPLC na koloně PolyCAT A.
Obrázek 14 zobrazuje průběh UV absorbance frakcí po chromatografií směsi, obsahující bakteriálně produkovaný sulfonylovaný rhNT-3, na koloně S-Sepharose Fast Flow.
- S CZ 300296 136
Obrázek 15 zobrazuje ionexovou chroniatografii směsi obsahující in vitro znovusvinuté formy rhNT 3 na katcxové koloně Macroprep High S. Pryskyřice byla dodána firmou Biorad. Rozměry kolony byly 9 x 9 cm. 700 ml vzorku spojených frakcí po SSPP chroniatografii, obsahujících znovusvinuté formy (po 36 hodinách znovusvínování), pH 6,8, byl nanesen na kolonu Macroprep při průtoku asi 310 ml/min. Podmínky jsou udány v textu.
Obrázek 16 zobrazuje chroniatografii na koloně Phenyl Sepharose Past Plow High Substitution (chromatografie s hydrofobní interakcí) preparátu znovusvinutého rhNT-3, purifikovaného ionexovou chromatografií na katexu. Tato chromatografie byla použita pro odstranění chybně svinulo tých variant.
Obrázek 17 zobrazuje SP- Sepharose High Performance chromatografií frakcí rhNT-3, spojených po HIC.
Definice
Zde použitý pojem „neurotrofin“ označuje neurotrofin. výhodněji lem klerý patří do NGF rodiny, včetně NGP. NT-3, NT-4/5 a BDNP z mnoha druhů, včetně myšího, hovězího, ovčího, prasečího. koňského, ptačího a výhodněji pak lidského, v nativní sekvenci nebo geneticky modifikované
2« formě a z jakýchkoliv zdrojů, ať již přirozených, syntetických nebo rekombinantně vyráběných. Např., ..NGP znamená nervový růstový faktor z různých druhů, včetně myšího, hovězího, ovčího. prasečího, koňského, ptačího a výhodněji lidského, v nativní sekvenci nebo v geneticky modifikované formě a z jakéhokoliv zdroje ať již přirozeného, syntetického nebo rekombinantně vyráběného. Výhodněji jc neurotrofin vyráběn rekombinantně. V metodě, která je upřednostňo2? vána, je neurotrofin klonován a jeho DNA exprimována např. v savčích a bakteriálních buňkách. Zde zmíněné postupy a metody mohou být rovněž použity pro neurotroflny GDNP a neurturin.
Pro použití v humánní medicíně je upřednostňován zralý NGP s nativní sekvenci, výhodněji 120 aminokyselinovou sekvencí a nejvýhodněji 118 aminokyselinovou sekvencí. Výhodněji je tento jo NGF s nativní sekvencí produkován rekombinantně. Upřednostňovaná sekvence aminokyselin pro lidské pre-pro-NGP a zralý NGF je poskytována v patentu US 5 288 622, který je zde specificky uveden jako odkaz. Upřednostňovaná forma se 120 aminokyselinovou sekvenci bez. dalších posttranslačních modifikací, je homodimerová forma (tzn., 120/120). Ještě více upřednostňovaná je forma se 118 aminokyselinami, bez dalších posttranslačních modifikací, konkrétně homodimer b (tzn.. I 18/1 18).
Pod pojmem ..převážně čistý je míněn stupeň čistoty preparátu celkového neurotrofinu, např. NGP, vzhledem k celkovému obsahu proteinů, kde je alespoň 70 % neurotroflnu, výhodněji alespoň 80 % a ještě výhodněji rostoucí obsah do alespoň 90, 95 nebo 99 %. Konkrétně upřednostňoi(i váná čistota je alespoň 95 %. Pod pojmem „téměř čistý“ je míněno, že čistota kompozice žádoucího neurotroflnu je alespoň 90 % nebo vyšší.
Pod pojmem „převážně bez obsahu neurotrofinových variant je míněna kompozice, která obsahuje alespoň 70 % žádoucích druhů neurotrofinu vzhledem k celkovému neurotrofinu (včetně méně žádoucích typů neurotrofinu), výhodněji alespoň 80 % a ještě výhodněji procento rostoucí do alespoň 90. 93, 95 nebo 99 %. Pod pojmem „téměř čistý je míněna kompozice, která obsahuje minimálně 90 % nebo více žádoucího neurotrofinu. Konkrétně upřednostňovaná hladina je alespoň 95 % žádoucího neurotrofinu, např. správně svinutého, neporušeného 118/118 druhu rhNGP. Další nežádoucí druhy nebo formy mohou být chy bně zpracované formy nebo chemické
5o varianty, např. nábojově změněné varianty, vznikající při fermentaci nebo během purifikačního procesu, nebo výhodněji všechny dříve uvedené. Např., je-li NGP po syntéze v bakteriích svinut in vitro, „druhy nebo „varianty“ mohou obsahovat nesprávně nebo Částečně svinuté formy.
Pod pojmem „nesprávně svinutá varianta neurotroflnu je míněna varianta, která se liší od neu55 rotrofinu párováním cysteinových zbytků nebo konkrétně cysteinových zbytků, které jsou volné
- 6 CZ 300296 B6 nebo blokované. Nesprávné svinuté varianty také mohou mít stejné cysteinové párování jako neurotrofin, ale mají rozdílnou prostorovou trojrozměrnou konforniaci, která vzniká v důsledku nesprávného svinutí.
Pod pojmem „chemická varianta je míněna varianta, která se chemicky liší od neurotrofinu, např. tím. že má změněný náboj, je karbamylována. deamidována, oxidována, glykosylována nebo proteolyticky štěpena.
V předmětném vynálezu mají pufry používané při chromatografiícb obvykle pH v rozsahu asi
5 až 8. Pufry, které budou kontrolovat pl I v tomto rozsahu, zahrnují např. citrátový, sukcinátový, fosfátový, MES, ADA, BIS-TR1S propanový, PIPES, ACES. imidazolový. pufr s kyselinou dietylnialonovou, MOPS, MOPSO. I ES, TR1S pufry jako jsou TRIS-HC1, HEPES, HEPPS, TRIC1NE, glycin-amidový. B1C1NE. glycylglycinový a borátové pufry. Upřednostňovaný pufr je MOPSO.
i?
Pojmy ..alkoholy a „alkoholická rozpouštědla jsou zde používány ve smyslu běžně používané terminologie pro alkoholy, výhodněji alkoholy s 1 až 10 atomy uhlíku, ještě výhodněji metanol, etanol, isopropanol, n propanol nebo t-butanol. stejně tak jako glycerol. propylenglykol. etylenglykol. hexylenglykol. polvpropylenglykol a polyetylenglykol a nejvýliodněji etanol nebo iso20 propanol. Protože alkoholy jsou rozpouštědla, jsou-li přidány do vodných roztoků, zvýší se hydrofobicita roztoku snížením jeho polarity,
MOPSO je 3 (N -Morfolino)-2-hydroxypropansulfbnová kyselina. HEPES je N-2- Hydroxyetylpiperazin-N'-2-clansul fonová kyselina. Alkohol obsahuje 95 objemových dílů Speciálně
Denaturovaného Alkoholu formule 3A a 5 objemových dílů isopropylalkoholu. MES je 2-(NMorfolino)elansulfonová kyselina. UE/DE znamená ultraťiltrace/d infiltrace. EMAC je chlorid tetrametylamonný. EEAC je chlorid tctractylamonný. NGF 120 označuje celou délku 120/120 formy nervového růstového faktoru. NGE-118 označuje molekulu hotnodimeru zralého NGF se 118 aminokyselinami. Oxidovaný NGF označuje molekulu varianty NGE. Metsulfoxíds,7. která so jc zde uváděna jako asi z 80 % biologicky aktivní oproti zralému nativnímu NGE. Isoasp NGE označuje molekulu isomerizované varianty NGF. Asp93. Deamidovaný NGF označuje NGF, který má Asn45 přeměněn na Asp45. RNGF označuje molekulu NGF s extra argininovým zbytkem na N-konci. CHO označuje ovariáluí buňky čínského křečka.
Zde popisované pryskyřice zahrnuji MACROPREP IIIGH S Cation-exchange (BIO RAD Laboratories; silná kationtová výměna; SO, funkční skupiny; nominální velikost částic 50 m; přibližná velikost pórů 1000 A); Silikagel (nederivatizovaný): Phenyl Sepharose Past Elow Substitution (Pharmacia; vysoce překřížená 6% agarosa; velikost částic 45 až 165 mikronů); SP-Sepharose IIP (Pharmacia; vysoce překřížená 6% agarosa; velikost částic 34 mikronů): Phenyl Eoyopearl
650 M (EosoHaas; velikost částic 40 až 90 mikronů); a Eractogcl EMD SO, 650 S (EM Separations, reprezentant firmy Merck (Německo) pro USA; velikost částic 25 až 40 tn).
Způsob provedení vynálezu
Neurotrofiny patří do rodiny malých základních proteinů, které hrají podstatnou roli ve vývoji a zachování nervového systému. Prvním identifikovaným a pravděpodobně nejlépe pochopeným členem této rodiny je nervový růstový faktor (NGE). Viz patent US 5 169 762, vydaný 8. prosince 1992. V poslední době byly identifikovány sekvenčně podobné, ale vzdálené polypeptidy s
5d podobnými funkcemi jako NGF. Např. mozkový neurotrofin' faktor (BDNF), také označován jako neurotrofin-2 (NI 2) byl klonován a sekvenován Leibrockem a spol. (Nalure, 341: 49 až 152 [1989J). Několik skupin identifikovalo neurotrofní faktor, původně zvaný neuronální faktor (NE), a nyní uváděný jako neurotrofin 3 (NE3). (Ernfors a spol., Proč. Nud.Acud.Sci. USA, 87: 5454 až 5458 [I990J: Ilohn a spol.. Ncili/re, 344:339 |I99O|; Maisonpierrc a spol.. Science.
2 4 7:144 6 11990]; Rosenthal a spoí. Neuron. 4:767 [1990]: Jones a Reichardt, Proč. Nutí. Aead.
-7 CZ 31)0296 B6
Sci. USA, 87:8060 až 8064 [1990]; Kaislio a spol., FFBS Lett., 226:187 [1990]). Byl identifikován neurotrotln-4/5 (uváděný buď jako N'í'4 nebo NT5) (Hallbook a spol. Neuron, 6:845 až 858 [1990]; Berkmeier a spol, Neuron. 7:857 až 866 [1991]; Ip a spol. Proč. NatlAcad. Sci. USA. 89:3060 až 3064 [1992]). Patent US 5 364 769, vydaný 15. listopadu 1994, odhaluje lidský NT5 4/5 a postupy pro jeho rekombinantní expresi aje zde začleněn jako odkaz. 1'aké jsou uvedeny chimérické a pantropieké neurotrofíny, jako ty, uvedené v patentu US 5 488 099. vydaném 30. ledna 1996. v publikaci Urfer a spol, FMBO J. 13(24):5896 až 5909 (1994) a v WO 95/33 829. publikovaném 14. prosince 1995 (začleněn zde jako odkaz), ve kterých byl neurotrofln buď modifikován tak. aby se vázal na více než jeden receptor. nebo obsahoval reeeptorovou vazebnou io aktivitu, která běžně není přítomna v nativním neurotrofinu ve významném stupni. Zvláštnímu zájmu se těší neurotrofíny označované MNTS-1 a D15A NT3. Zvláštnímu zájmu se také těší ncurotrofiny, které mají aminokyselinovou páteř jako NGF, ale které jsou modifikovány tak, aby vázaly receptory jiné než trkA, jako jsou trkB nebo trkC. Upřednostňovány jsou NGF, ve kterých byly provedeny aminokyselinové substituce s aminokyselinou z odpovídající pozice v NT 3. ís která jc odpovědná za vazbu trk receptem na NT-3. Tyto mutanty mají reeeptorovou vazebnou aktivitu stejnou jako NT-3, zatímco farmakokinetiky a chování během purifikaee si zachovávají stejné jako NGF (Urfer a spol, Bioehemistry 36(16):4775 až 4781 (1997)). Tyto NGF mutanty mohou také postrádat trkA vazebnou aktivitu (Shih a spol. J. Biol. Chem. 269 (44):27679 až 27686 (1994). Tyto mutanty NGF jsou konkrétně upřednostňované neurotrofíny to pro použití vc zde popisovaném předmětném vynálezu.
Izolace rekombinantního lidského neurotrofinu. např. rhNGF, zahrnuje separaci proteinu od řady různorodých kontaminantů hostitelské buňky. Každý krok zahrnuje speciální pufry. které umožňují dostatečnou separaci. Poslední nebo předposlední krok postupu je komplikován přítomností několika neurotrofi nových variant, které se v důsledku použití běžných chromatografických médií spohipurifikují s neurotrofinem. Je li do purifikačního procesu zařazen krok. vedoucí ke znovusvinutí, varianty obsahují nesprávně svinuté formy neurotrofinu. Varianty mohou rovněž obsahovat ty, které se od neurotrofinu liší chemicky, jako jsou karbamylované, deamidované, deamidované nebo proteolyticky štěpené formy. V případě NGF, je íi žádoucí forma I 18/118, se io tyto druhy skládají zejména z dimerických forem - homodimerň např. 120/120 nebo 117/117, nebo heterodimerů např. 120/118, 117/118, chemicky modifikovaných variant-isoasp, inonooxidovaných glykosylovanýeh variant, N·-koncově a C-koncove zkrácených forem a jejich dimerů.
Předmětný vynález umožňuje produkci neurotrofinu ve velkém měřítku, konkrétně rhNGF v íš množstvích dostatečných pro terapeutické použiti, jako je např. léčba Alzlieirnerovy choroby, periferní neuropatie včetně diabetické neuropatie a ncuropatie spojené s AIDS apod..
Z pohledu podobnosti sekvence a konforniaee NGF a jiných neuiOtrofiníi, konkrétně těch z NGF rodiny·, mohou být aplikovány metody předmětného vynálezu na přípravu neurotrofmů. které převážně neobsahují špatné zpracované, chybně nebo částečně svinuté, glykosylovanc a/nebo nábojové varianty, V předmětném vynálezu jsou identifikovány ehromatografické pryskyřice a podmínky, které jsou příznivé pro selektivní separaci neurotrofinu od těchto a dalších hodně podobných variant, Neurotrofíny zahrnují NT-3, NTM/5, NT--6, BDNF a vyrobené formy včetně jejich heterodimerovýeh, chimérických a pantropických forem. Výhodněji jsou neurotrofíny lids45 ké nebo takové, které vykazují vysokou hoinologii s aminokyselinovou sekvencí lidského neurotrofinii, výhodněji více než 80 %, výhodněji více než. 90 % a nejvýhodněji více než 95 % homologii se sekvencí lidského neurotrofinu. Vyrobený neurotrofln si bude zachovávat alespoň z 50 % vazebnou funkci trk receptem jako nativní neurotrolln, kterému je podobný, výhodněji alespoň ze 75 % a ještě výhodněji alespoň z 80 %. Tyto vyrobené formy jsou takové, které udržují dosta5d tečně vysoké pí nebo hydrofobní charakter nativního neurotrofinu, aby udržely podobný výkon v procesech, které jsou zde popisovány.
Jak je popisováno níže, zde popsané procesy by ly úspěšně aplikovány na rhNGF, rhNT-3 a rhNTM/5. Např. rliNT-4/5, který byl vyroben v E.coli, byl izolován v inkltizníeli tělískách, redu55 kován a rozpuštěn z inkluzních tělísek, Redukovaný NT-4/5 byl částečně puntíkován ehromato- 8 CZ 300296 B6 grafienii na DE Sepharose Fast Flow a S-Scpharose Fast Elow. Frakce po ehromatografii na SSepharosc Fast Flow byly podrobeny procesu, během kterého došlo ke znovusvinutí proteinu. Proces probíhal po dobu 24 h, v pufru obsahujícím guanidin. Chybné svinuté formy ΝΊΜ/5 byly odstraněny chromatografií ve velkém měřítku. Karbamylované a zkrácené formy NT—4/5 (špatně zpracované formy) byly odstraněny HPLC íonexovou chromatografií na katexové pryskyřici PolyCat A nebo na SP-Sepharose HP, v kolonovém uspořádání, ve velkém měřítku. Pro formulaci by! purifikovaný rhNT-4/5 ultrafiItrován a diafiltrován do kyselého pufru.
Jedno provedení předmětného vynálezu zahrnuje purifikaci neurotrofinu od jeho příbuzných variant, jejímž výsledkem bylo odstranění většiny nečistot z preparátu neurotrofinu. K odstranění nežádoucích látek docházelo většinou v posledním nebo v jednom z posledních kroků před odsolením nebo diafiltrací, které předcházely formulaci. Příbuzné varianty mohou být nejenom varianty , vznikající při fermentaci, ale také varianty, produkované v případě, je-li neurotrofin degradován skladováním nebo během výroby.
Neurotrofiny, vhodné pro použití v provedeních předmětného vynálezu, mohou být připraveny jakýmikoliv způsoby, ale výhodněji jsou připravovány rekombinantně. Zde diskutovaná molekula nukleové kyseliny, která kóduje neurotrofin, jc dostupná z několika zdrojů, např. pomocí chemické syntézy použitím známé sekvence DNA nebo použitím standardních klonovacích technik, které jsou známé odborníkům v dané oblasti. cDNA klony, nesoucí neurotrofin, např. sekvence kódující liNCiE, mohou být identifikovány použitím oligoiiukleotidovýeh hy bridizaěníeh prób, spéci fleky navržených na základě známé sekvence neurotrofinu.
Aby by la získána molekula, která má sekvenci kódující neurotrofin, je molekula vložena do klonovacího vektoru, vhodného pro expresi ve vyhrané hostitelské buňce. Klonovací vektor je konstruován tak, aby poskytoval vhodné regulační funkce, požadované pro účinnou transkripci, translaci a výrobu kódující sekvence.
Je-li neurotrofin připravován rekombinantně. hostitelské buňky, vhodné pro expresi DNA se zakódovaným neurotrofinem, jsou prokaryota. kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky. Mezi prokaryota, vhodná pro tyto účely, patří bakterie, jako jsou arehaebakterie nebo eubakterie. Upřednostňované bakterie jsou eubakterie. jako jsou gram-negativní nebo gram-pozitivní organismy, např. Lnterobacteriaeeae jako je Escherichia. např, E. coli, Enterobaeler. Erwinia, Klebsiella. Próteus, Salmonella, např. Salmonella typhiímiiiuni. Serratia, např. Serralia marcescans a Shigella; Bači I li jako jsou B. subtilis a B. lichenifonnis (např. B. licheniformis 4 IP odhalený v DD 266.710, publikovaném 12. dubna 1989); Pseudomonas jako jsou P. aeruginosa; Streptomyces; Azotobacter; Rhizobia; Vitreoscilla; a Paracoceus. Vhodná hostitelská E. coli zahrnuje k coli W3 I 10 ( ATCC 27,325). E. coli 94 (ATCC 31,446), £. coli B, a E. coli XI 776 (A ICC 31,537), lyto příklady jsou spíše ilustrační než limitující.
Jako celek je zde začleněna PCT publikace WO 95/30 686, publikovaná 16. listopadu 1995. Tato publikace je konkrétně významná pro svůj popis bakteriální sy ntézy NOE a jeho in vitro svinutí. Produkty tohoto procesu mohou být podrobeny purifikačním metodám předmětného vynálezu.
Mohou být také použity mutantní buňky jakýchkoliv výše zmíněných bakterií. Samozřejmě je nezby tné vybrat vhodné bakterie s ohledem na replikabilitu replikonu v buňkách bakterie. Poskytují-li replikou dobře známé plazmidy , jako jsou pBR322, pACYA177 nebo pKN410, mohou být jako hostitelské buňky vhodně použity např. E. coli. nebo druhy bakterií Serratia nebo Salmonella. Kmen E. coli W3110 je upřednostňovaný hostitel nebo rodičovský hostitel, protože je lo běžný hostitelský kmen pro rckombinantní DNA produkt fermentaci. Výhodněji, hostitelské buňky uvolňují minimální množství proteolytických enzymů. Např., kmen W3I10 může být modifikován lak, aby došlo ke genetické mutaci v genech, které kódují proteiny endogenní pro hostitele, s příklady těchto hostitelů včetně E. coli W3110 kmen 1A2, který má kompletní genotyp tonAA; E. coli W3110 kmen 9E4, který'· má kompletní genotyp lonA Λ ptr3; E. coli W3110 kmen 27C7 (A TCC 55.244), který má kompletní genotyp tonA ptr3 phoA Λ ΕΙ5Δ (argF-lac)169
-9CZ 300296 B6
Δ deg P A ompT kan <r>; E. coli W3110 kmen 37D6, který má kompletní genotyp tonA ptr3 phoA Δ El 5 Λ (argF-lac)169 Λ degP Δ ompTA rbs7 ilvG kan r; E. coli W3110 kmen 40B4, což je kmen 37D6 s degP deleční mutací, rezistentní ke kanamycinu; a E. coli kmen. který' má mutantní periplazmatickou proteázu. odhalenou v patentu US 4 946 783, vydaném 7. srpna 1990.
Lidský NGE byl exprimován v E. coli. Izolace a sekvence genu. kódujícího β podjednotku hNGE a jeho exprese jako heterologního proteinu v E. coli. byly popsány v patentu US 5 288 622. Návody uvedené v tomto patentu jsou také vhodné pro poskytování zralého lidského NGE, produkovaného savčími buňkami. Použitím rekombinantních technik byl exprimován lidský βNGF bez přítomnosti dalších savčích proteinu. Výsledkem exprese HNGE v E. coli s použitím dvou genii, které obsahují změněné amino konce, byla exprese fúzovaného proteinu, který popsal lwai aspol.. Chem. Pharm. Bull 34:4724 (1986).
Vhodní expresní hostitelé pro vektory, které kódují neurotrotin, jsou kromě prokarvot i eukaryotické mikroorganismy, jako jsou plísně nebo kvasinky. Nejběžněji používané nižší eukaryetní hostitelské mikroorganismy jsou Saccharomyces cercvisiae nebo běžné pekařské kvasinky. Je však možno použít i mikroorganismy z řady ostatních tříd. druhu a kmenu, které jsou běžně dostupné, jako je Schizosaccharomyces pombe [Beach a Nurse, Nátuře, 290:140(1981); EP 139 383 publikovaný 2. května 1985); hostitelé třídy Kluyveromyces patent US 4 943 529; Fleer a spol., Bio/Technology. 9:968 až 975 (1991)] jako jsou např, K? lactis [MW98 8C. CBS683. CBS4574. Louvencourt a spol.. J. bacteriol., 737 (1983)). K. fragilis (ATCC 12.424). K. bulgarieus (ATCC 16.045). K. vvickcramii (ATCC 24.178), K. waltii (A I CC 56,500). K. drosophilarum [ A I CC 36.906; Van den Berg a spol.. Bio/Tcchnology, 8:135 (1990)). K. thermotolerans a K. marxianus; yarrowia [EP 402 226); Picliia pastoris [EP 183,070; Sreekrishna a spol.. J. Basic Microbiol.. 28: 265 až 278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia [EP 244 234); Neurospora erassa [Čase aspol.. Proč. Nati. Acad. Scí. USA, 76: 5259 až 5263 (1979)]; Schwanniomyces jako jsou Schwanniomyces occidentalis [EP 394 538. publikovaný 31. října 1990); a plísně, jako jsou např. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium [WO9I/0O 357, publikovaný 10. ledna 1991] a hostitelé třídy Aspergillus. jako jsou A. nidulans |Ballance a spol.. Bíochem. Biophys. Res. Commun., 112:284 až 289 (1983); Tilburn a spol., Gene. 26:205 až 221 (1983); Yelton a spol.. Proč. Nati. Acad. Sci.USA, 81:1470 až 1474 (1984)) a A. niger [Kelly a Hvnes, EMBO J„ 4:475 až 479 (1985)).
Hostitelské buňky, vhodné pro expresi DNA. která kóduje neurotrofln, mohou být také odvozeny od multicelulárních organismu, takovéto hostitelské buňky mají řadu výrobních a glykosylačních aktivit. Zpravidla jakákoliv vyšší eukaryotická buněčná kultura jc vhodná, ať z kultury obratlovců nebo bezobratlích. Příklady buněk bezobratlích zahrnují rostliny a buňky hmyzu. Byla identifikována řada bakulovirálnich kmenů a variant a odpovídajících povolených hmyzích hostitelských buněk hostitelů, jako jsou Spodoptera frugiperda (housenka), Aedes aegypti (komár), Aedes albopictus (komár). Drosophila Melanogaster (muška) a Bombyx moři. Viz např. Luckou a spol.. Bio/Technology, 6:47 až 55 (1988); Miller a spol., v Gcnctic Enginccring, Sctlow. J.K. a spol.. eds.. Vol. 8 (plenární přednáška, 1986). pp.277 až 279 a Maeda a spol.. Nátuře, 315: 592 až 594 (1985). Veřejně dostupné jsou různé kmeny virů pro transfekci, např. L-l varianta viru Autographa californica NPV a Bm-5k kmen viru Bombyx moři NPV a tyto viry mohou být použity konkrétně pro transfekci buněk Spodoptera frugiperda. Lidský NGF byl produkován v buňkách hmyzu, uvedeno v patentu US 5 272 063, vydaném 21. prosince 1993.
Jako hostitelé mohou být využity rostlinné buněčné kultury bavlny, kukuřice, brambory, sojového bobu. petúnie, rajského jablka a tabáku. Rostlinné buňky jsou většinou transferovány inkubací se spolehlivými kmeny bakterie Agrobacterium tumefaciens, které byly nejdříve manipulovány tak, aby obsahovaly DNA, kódující neurotrofln. Během inkubace rostlinné buněčné kultury' s A. tumefaciens je DNA. která kóduje neurotrofln. transferována do rostlinného buněčného hostitele tak, že je transferován a bude za vhodných podmínek exprimovat DNA. kódující neurotrofln. Dále jsou dostupné regulátorové a signální sekvence, slučitelné s rostlinnými buňkami, jako jsou nopalin syntázový promotora polyadenylační signální sekvence (Depicker a spol.. .1. Mol. Appl.
-10CZ 300296 B6
Gen., 1:561 (1982)). Dále, DNA segmenty, izolované z oblasti před 780 genem T DNA, jsou schopné aktivovat nebo zvyšovat hladiny transkripce rostlinami exprimovaných genů v rostlinné tkáni, které obsahuji rckombinantní DNA (EP 321,196 publikovaný 21 .června 1989).
Příklady užitečných linií savčích hostitelských buněk jsou CV1 linie opičích ledvin, transformované pomocí SV40 (COS-7. ATCC CRL 1651); linie lidských zárodečných ledvin [293 nebo 293 buněk subklonovaných pro růst v suspenzní kultuře, Graham a spoL. J. Gen Virol, 36:59 (1977)]; renální buňky mláděte křečka (BHK. ATCC' CCL 10); ovariální buňky čínského křečka DHFR [CHO. IJrlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. IJSA, 77:4216 (1980)]; myší Sertoliho buňky ιο [TM4, Mather. Biol. Reprod.. 23: 243-251 (1980)]; renální buňky opice (CV1 ARCC CCL 70); renální buňky africké zelené opice (VERO-76), ATCC CRL-1587), buňky lidského cervikálního karcinomu (HELA, ATCC CCL 2); psí renální buňky (MDCK, ATCC CCL 34); buňky jater potkana buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); buňky lidského plieního laloku ( W138. A I CC CCL 75); buňky lidských jater (Hep G2, HB 8065 ); myší mama karcinom (MMT 060562, ATCC
CCL51): 1 Rl buňky [Mather a spoi.. Annals N.Y.Acad.Sci., 383: 44-68 (1982)1; MRC 5 buňky;
ES4 buňky a linie (Hep G2). Upřednostňovaná metoda je exprese v CHO buňkách. Aby bylo dosaženo exprese vylučovaného zralého NGL (včetně 118 a 120 aminokyselinové formy) použitím vhodných promotorů a vektorů (patentu US 5 288 622). muže být použit exon lidského NGf, obsahující prepro-NGE. Kultury stabilních, stabilně transfektovanýeh CHO buněk, a sek2i) řece zralých forem NGL jsou užitečné v předmětném vynálezu, jak je diskutováno v Příkladech.
Hostitelské buňky jsou transfektovány a výhodněji transformovány s výše uvedenými expresními nebo klonovacínii vektory a kultivovány ve vhodných nutričních médiích, modifikovaných pro indukci promotorů, selekci translbrmantů nebo amplifikaci genů. kódujících požadované sekven25 ce. Transfekci se rozumí přijetí expresního vektoru hostitelskou buňkou, ať jsou nebo nejsou jakékoliv kódující sekvence ve skutečnosti exprimovány. Odborníkům v dané oblasti je známa řada metod transfekce např. CaPO4 a elektroporace. Úspěšná transfekec je obecně rozpoznána, proběhne—li uvnitř hostitelské buňky jakákoliv indikace činnosti vektoru.
Transformace znamená začlenění DNA do organismu tak, že DNA je replikabilní, bud' jako extrachromozomální element, nebo pomocí ehromozomálního integrantu. V závislosti na použité hostitelské buňce je transformace prováděna pomocí standardních technik, vhodných pro tyto buňky. Pro prokaryota nebo jiné buňky, které obsahují pevnou bariéru buněčné stěny , jsou běžně používány působení vápníku prostřednictvím chloridu vápenatého, jak je popsáno v sekci 1.82
Sambrook a spoi.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989] nebo elektroporace. Infekce s Agrobacterium tumefaciens je používána pro transformaci spolehlivých rostlinných buněk, jak popisuje Shaw a spoi.. Gene, 23:315 (1983) a WO 89/05 859, publikovaný 29. června 1989. Dále mohou být rostliny transformovány působením ultrazvuku, jak je popsáno v WO 91/00 358, publikovaném 10. června 1991,
41)
Pro savčí buňky bez těchto buněčných stěn jc upřednostňována metoda precipitace fosforečnanem vápenatým podle autorů Graham a van der Lb, Virology, 52:456 až 457 (1978). Obecné aspekty transformace systémů savčích hostitelských buněk popsali Axel v patentu US 4 399 216, vydaném 16. srpna 1983. Transformace v kvasinkách je typicky prováděna podle metody autorů
Van Soligen a spoi., .1. Bact., 130:946 (177) a Hsiao a spoi., Proč. Nati.Acad. Sci.(USA), 76: 3829 (1979). Pro začlenění DNA do buněk však mohou být použity také další metody, jako jsou nukleární mikroinjekce, elektroporace, fúze bakteriálního proloplastu s neporušenými buňkami nebo polykationty např, polybren, polyornitin atd. Různé techniky transformace savčích buněk viz Keown a spoi., Methods in Enzymology (1990) Vol. 185, PP. 527 až 537 a Mansour a spoi.,
Nátuře, 336: 348 až 352 (1988).
Výhodněji, gen pro hNGF je vložen do vektoru tak, aby měl dostupný methioninový iniciační kodón, výhodněji jeden ze dvou methioninových iniciačních kodónů,jak identifikoval Ullrich a spoi. Nátuře, 303:821 až 825 (1983)). hNGF gen (Ullrich a spoi., Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, p. 435 (1983); patent US 5 288 622) má dva blízko sousední methioni-IICZ 300296 B6 ny, které jsou pravděpodobné využity jako translační iniciační kodóny (pozice 1 sc vztahuje k Nkoncovérnu serinovému zbytku zralého NGL). Naopak eDNA pro NGL. izolovaný z myší submaxilární žlázy, nejprostudovančjší z nervových růstových faktorů, má methionin v pozici -187 kromě těch v pozicích -121 a -1 19. V upřednostňovaném provedení pro expresi v savčích buňkách je přítomna prepro-NGF sekvence.
Jsou li pro produkci neurotrofinu použity prokaryotní buňky, jsou kultivovány ve vhodných médiích, ve kterých může být promotor indukován přirozeně nebo uměle, jak obecně popsali např. Sambrook a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989). Vedle uhlíku, dusíku a zdrojů anorganického fosfátu mohou být také dodány jakékoliv nezbytné doplňky v odpovídajících koncentracích, samostatně nebo ve směsi s jiným doplňkem nebo jako medium, jako je komplexní zdroj dusíku.
Jestliže jsou pro produkci neurotrofinu použity savčí hostitelské buňky, mohou být kultivovány v různých médiích. Komerčně dostupná média, jako jsou llam s L10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEMJ, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) a Dulbcccos Modified Eaglc s Medium ([DMEMj, Sigma), jsou vhodná pro kultivování hostitelských buněk. Dále. jakékoliv médium popsané v Ham a Wallace. Mcth Enz., 58:44(1979); Barncs a Sáto, Anal. Biochcm., 102:255 (1980); patent US 4 767 704; US 4 657 866; US 4 927 762; US 5 122 469 nebo US 4 560 655; WO 90/03 430 nebo patent US Re. 30 985 (všechny jsou začleněny zde jako odkaz), může být použilo jako kultivační médium pro hostitelské buňky. Jakékoliv z těchto médií může být doplněno, je-li to nezbytné, hormony a/nebo dalšími růstovými faktory (jako je insulin, transferrin nebo epidermální růstový faktor), solemi (jako je chlorid sodný, vápník, hořčík a fosfát), pufry (jako LIEPES), nukleosidy (jako jsou adenosin a thymidin), antibiotiky (jako je lék Gcntamycin TM), stopovými prvky (definované jako anorganické sloučeniny, obvykle přítomné v mikromolárních konečných koncentracích) a glukózou nebo ekvivalentními zdroji energie. V odpovídajících koncentracích, které by měly být známy odborníkům v dané oblasti, mohou být přidány jakékoliv další nezbytné doplňky. Kultivace probíhá za stejných podmínek (teplota. pH a podobné), jaké byly předem použity pro hostitelské buňky, vybrané pro expresi a budou zjevné pro odborníky.
Principy, protokoly a praktické techniky pro maximalizaci produktivity in vitro kultivovaných savčích buněčných kultur mohou být nalezeny v Mammalian Cell Bioteelmology: A Praetical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press al Oxford University Press, Oxford, 1991). Výše uvedené postupy mohou být uplatněny v případech, kdy je neurotrofin produkován intracelulárně, v periplazmatickém prostoru nebo je-li přímo vylučován do média.
Kultivační tekutina je sklizena po vhodné době a jsou provedena standardní identifikační měření, např. imunometody jako je LUISA a Western blot nebo biologická měření jako je PC 12 buněčná diferenciace (Green, L.A., Trends Neurosei. 7:91 (1986)). Měření pro stanovení typu a rozsahu zde odhalených variant jsou známá v dané oblasti nebojsou poskytnuty nebo citovány v Příkladech (viz např. Schmelzer a spol., .1. Neurochem. 59 (5):1675 až 83 (1992) a Burton a spol.. .1. Neurochem. 59(5): 1937 až, 45 (1992), které jsou zde uvedeny jako odkaz.
Kompozice neurotrofinu, připraveného z buněk, je výhodněji podrobena před použitím HIC alespoň jednomu purifikačnímu kroku. Příklady vhodných purifikačních kroků jsou zde popsány, včetně afinitní ehrornatografie, dalších technik pro purifikaci proteinů, jako jsou ehromatografie na silikagelu, ehromatografie na heparinové Sepharose, íonexová ehromatografie na katexové nebo anexové pryskyřici (jako je kolona s polyasparagovou kyselinou), ehromatofokuzace a preparativní SDS elektorforéza v PAA gelu. Použitý postup závisí na neurotrofinu, který má být získán a na použité počáteční kultuře.
V jednom provedení, kde je neurotrofin přímo vylučován do média, je médium separováno od zbytků buněk odstředěním a vyčištěný fermentační bujón nebo médium je pak použito pro purifíkaci na silikagelu. Při chromatografii na silikagelu prochází většinou bujón nederivatizovaiiýnii
silikagelovými částicemi tak, že neurotrofinový polypeptid se pevné váže na silikagelové částice; promytím silikagelových částic dochází k odstranění kontaminantů: a polypeptid je eluován ze silikagelových částic pufretn, obsahujícím alkoholické nebo polární aprotické rozpouštědlo a kovy alkalických zemin, alkalický kov nebo anorganickou amonnou sůl.
V upřednostňovaném provedení předmětného vynálezu je použita ionexová chromatografie na katexu Macroprep High S jak pro separaci neurotrofinu od jeho variant, tak pro snížení celkového obsahu kontaminantů. Pryskyřice může být použita jako počáteční krok purifikace neuiOtrofinu z kultury savčích buněk, výhodněji pro frakcionaci sklizeného média. V jiném provedení je in nejvýhodněji používána ionexová chromatografie na katexu Macroprep High S ihned po kroku, vedoucího ke znovusvinutí proteinu. Velmi vysoké průtokové vlastnosti této katexové kolony umožňují koncentrací velkých objemů rozpuštěného, znovu svinutého proteinu nebo sklizeného buněčného média s neurotrofinem před následujícími chromatografickými kroky, jako jsou HIC nebo chromatografie na SP-Sepharose, upravením podmínek lak. že se neurotrofiny váží na i? kolonu. Katexový charakter pryskyřice dále umožňuje odstranění nenavázaných proteinů a některých špatně zpracovaných a chemicky modifikovaných variant (např. změněný náboj. ΜΓ.Τ 37oxidované varianty). Nejdůležitčjší je, že jsou—li přítomny chybně svinuté nebo chemicky modifikované varianty (např. špatně zpracované varianty nebo glykosylované varianty (jako z produkce kultury savčích buněk)), které se od nativního neurotrofinu liší v hydrofobicitč, pryskyřice
Macroprep dovoluje alespoň částečné odstranění těchto hydrofobníeh variant. Aniž by to bylo limitujícím faktorem, doufá se. že páteř pryskyřicového nosiče obsahuje hydrofobní obsah, který podporuje nespecifické interakce mezi neurotrofiny a pryskyřicí, čehož bylo zde s výhodou využito. Užitečná koncentrace TMAC v elučním pufru o pil přibližně mezi 5 až 8, výhodněji 6 až 8. je od 0 do 3M. Je-li přítomen octan sodný, který zvyšuje iontovou sílu roztoku, lze použít nižší koncentrace TMAC. Chlorid je upřednostňovaná náhrada pro oetanový ion.
V jednom příkladu provedení, kde je neurotrofin produkován v periplazmatickém prostoru, jsou kultivační médium nebo lyzát odstředěny, ahv byly odstraněny částečné buněčné zbytky. Je-li to nezbytné, mohou být potom separovány membrána a frakce rozpuštěného proteinu. Neurotrofin iu pak může být puntíkován od frakce rozpuštěného proteinu a od membránové frakce lyzátů kultury v závislosti na tom, je-li membránově vázaný, je-li rozpustný nebo je-li přítomen ve formč agregátu. Neurotrofin je potom rozpuštěn a následně znovusvinut použitím odpovídajícího pufru. Detaily pro tuto metodu izolace z periplazmy s cílem získat znovusvinutý protein jsou popsány níže.
Nerozpustný, ne nativ ní neurotrofin je izolován z prokaryotních hostitelských buněk ve vhodném izolačním pufru jakoukoliv odpovídající technikou, např. jedna technika zahrnuje vystavení buněk do pufru o vhodné iontové síle (s cílem rozpustit většinu hostitelských proteinů), ve kterém je však agregovaný neurotrofin převážně nerozpustný a rozrušení buněk tak, že jsou uvolně40 na inkluzní tělíska a stávají se tak dostupnými pro opětovné získání např. odstředěním, lato technika je dobře známa a je popsána např. v patentu US 4 511 503.
Stručně řečeno, buňky jsou rozpuštěny v pufru (většinou v pil 5 až. 9, výhodněji okolo pH 6 až 8, použitím iontové síly asi 0,01 až 2 M, výhodněji 0.1 až 0,2 M). Pro udrženi dostatečné iontové síly je užitečná jakákoliv vhodná sůl včetně chloridu sodného. Po rozpuštění v tomto pufru, jsou pak buňky rozrušeny lýzí pomocí běžně používaných technik, jako jsou např. mechanické metody, např. Mamon-Gaulin press mikrofluidizer, Prcnch press nebo sonikátor nebo pomocí chemických nebo enzymových metod.
5o Příklady chemických nebo enzymových metod rozrušení buněk zahrnují tvorbu sféroplastů, což vyžaduje použití lysozymu pro lýzi stěny bakteriální buňky (Neu a .s/w/., Biochcm. Biophys. Res. Cornin.. 17:215 (1964)) a osmotický šok, což je působení roztoku s vysokou tonicitou na živé buňky a promytí studenou vodou o nízké tonicitě, aby došlo k uvolněni polypeptidů (Neu a spoí,
J. Biol. Chem,, 240:3685 až. 3692 (1965)). Třetí metoda, popsaná v patentu US 4 680 262, je založena na kontaktu transformovaných bakteriálních buněk a dostatečného množství nižšího
- 13 C7. 300296 B6 alkanolu se 2 až 4 uhlíkovými atomy dostatečné dlouho a při teplotě dostatečné pro usmrcení a lýzi buněk.
Poté. co jsou buňky rozrušeny, je suspenze většinou odstředěna a vytváří peletu inkluzních tělí5 sek. V jednom provedení tento krok probíhá ve standardní odstředivce asi při 500 až 15 000 x g, výhodněji okolo 12 000 x g, dostatečně dlouho. Doba závisí na objemu a typu odstředivky, většinou je však okolo 10 minut až 0,5 hodiny. Vznikající pelety převážně obsahují všechny nerozpustné polypeptidové frakce, ale není-li proces rozrušováni buněk ukončen, mohou rovněž obsahovat neporušené buňky nebo zlomené buněčné fragmenty. Ukončení rozrušování buněk může io být zjištěno tím, že jsou pelety resuspendovány v malém množství stejného pufru a suspenze je sledována fázovým kontrastním mikroskopem. Přítomnost zlomených buněčných fragmentů nebo celých buněk naznačuje, že je nezbytné další rozrušování, aby byly odstraněny fragmenty nebo buňky a s nimi spojené nezlámáno polypeptidy. Po tomto dalším rozrušení, je-li to nutné, je suspenze opět odstředěna a získané pelety resuspendovány a analyzovány. Proces je opakován tak dlouho, než vizuální sledování ukáže nepřítomnost zlomených buněčných fragmentů v peletovaném materiálu nebo až do doby. kdy další působení nevede ke zmenšení velikosti vznikajících pelet.
V příležitostném provedení je neurolrofin izolován z periplazmatického prostoru sol ubil izací ve vhodném pufru. l ato procedura může být solubilizaee in silu, která zahrnuje přímé přidání reagencií do fermentační nádoby poté, eo byl neurolrofin produkován rekombinantně. Tímto se lze vyhnout jednotlivým krokům sklízení, homogenizace a odstředění. Zůstávající zbytky mohou být odstraněny odstředěním nebo filtrací nebo jejich kombinací.
2? Jestliže je neurolrofin nesvinutý, stupeň nesvinutí je vhodné stanovit ehromatografií ne nativního neurotrofinu, včetně RP-HPLC. Vzrůstající plocha píku pro ne nativní materiál naznačuje, jak mnoho ne nativního neurotrofinu jc přítomno,
Jakmile je neurolrofin získán z rozpuštěných inkluzních tělísek nebo v pozdější fázi purillkace, je vhodně znovu svinut do aktivní konformacc, což je popsáno níže.
Jestliže již neurotrofin není v rozpustné formě před tím než. je znovu svinut, může být solubiIizován inkubací v alkalickém pufru, který obsahuje chaotropní a redukční činidlo, v množstvích nezbytných pro převážné rozpuštění neurotrofinu. l ato inkubace probíhá za takových podmínek (koncentrace neurotrofinu. doba inkubace a teplota inkubace), které umožní rozpuštění tieurotrofinu v alkalickém pufru.
Stanovení stupně rozpuštěnosti neurotrofinu v pufru je vhodné provést měřením zákalu, analyzováním neurotiofinové frakcionace mezi supernatant a peletu po odstředění na redukovaném SDS gelu. měřením proteinů (např. pomocí setu pro stanovení proteinů od firmy Bio-Rad) nebo HPLC.
pl í alkalického pufru pro rozpouštění je většinou alespoň 7,5, výhodněji v rozsahu asi 8 až 11. Příklady vhodných pufrů, které poskytují pH v této oblasti, jsou glycinový, CAPSO (3-jCyclo45 hexylaminoj-2-hydroxy-l propansulťonová kyselina), AMP (2 Ainino-2-methyl-l-propanol), CAPS (3-[Cyclohexylamino]-l-propansulfonová kyselina), CHES (2-fN—Cyclohexylaminojcthansulfonová kyselina) a IRIS HCI (Tris[hydroxymethyljaminometlian hydrochlorid). Upřednostňované pufry jsou glycinový a CAPSO. výhodněji v koncentracích okolo 20 mM a v rozsahu pH asi 8,5 až 11, výhodněji 10 až 11.
Koncentrace neurotrofinu v pufrovaném roztoku pro solubilizaci musí být taková, že neurotrofin bude převážně rozpuštěný a částečně nebo zcela redukovaný a denaturovaný. Neurotrofin může být příležitostně zpočátku nerozpustný. Přesné použité množství bude záležet např. na koncentracích a typech dalších přísad v pufrovaném roztoku, konkrétně na typu a množství redukčního činidla, typu a množství chaotropního činidla a pH pufru. Např. koncentrace neurotrofinu může
- 14 CZ 300296 B6 být zvýšena alespoň třikrát, je-li koncentrace redukčního činidla, např, DTT, současně zvyšována tak, aby byl zachován poměr DTT: neurotrofin od asi 3:1 do 10:1. Je více žádoucí produkovat koncentrovanější roztok s rozpuštěným proteinem. Upřednostňovaná koncentrace neurotrofinů je alespoň okolo 30 mg/ml s upřednostňovanějším rozsahem 30 až 50 mg/ml. Neurotrofin může být např. rozpuštěn do koncentrace asi 30 až 50 ing/ml v 5M močovině, lOmM D I I' a zředěn např. pro svinutí na koncentraci 1 mg/ml.
Poté co je neurotrofin rozpuštěn, je převeden nebo zředěn do pufru, kde dochází ke svinutí. Pufr obsahuje 5 až 40 % (v/v) alkoholického nebo aprotického rozpouštědla, chaotropni činidlo a alkalický kov. kovy alkalických zemin nebo amonnou sůl. Pufr může být jakýkoliv pufr pro první pufrované roztoky; upřednostňované v rozsahu pH 8,5 až 11 jsou CAPSO, glycinový a CAPS, konkrétně v koncentracích okolo 20mM a nejupřednostňovaiiéjší jsou CAPSO a glycinový pufr. Neurotrofin může být naředěn pufrem pro znovusvinulí. výhodněji alespoň 5 krát, ještě výhodněji alespoň přibližně 10 krát. Příležitostně může být neurotrofin dialyzován proti pufru, ve kterém probíhá znovusvinutí. Proces, během kterého dochází ke znovusvinování proteinu, muže probíhat při teplotě 2 až 45 °C, přednostněji okolo 2 až 8 °C po dobu alespoň jedné hodiny. Roztok také může obsahovat redukční činidlo a osmolyt.
Redukční činidlo v dané koncentraci je vhodně vybrané z těch, které byly výše popsány pro krok. vedoucí k rozpuštění. Jeho koncentrace bude záviset zejména na koncentracích kovů alkalických zemin, alkalického kovu nebo amonné soli, neurotrofinů a rozpouštědla. Koncentrace redukčního činidla jc výhodněji asi 0,5 až 8mM, ještě výhodněji asi 0,5 až 5mM a nejvýhodněji asi 0,5 až 2mM. Upřednostňovaná redukční činidla jsou D IT a cystein.
7. roztoku, kde dochází ke znovusvinování. může být vyčerpán kyslík přídavkem inertního plynu, např. helia nebo argonu.
Jako osmolyt může být výhodněji použita sacharóza (v koncentracích asi 0,25 až 1M) nebo glycerol (v koncentracích asi 1 až4M). Koncentrace sacharosy je ještě výhodněji přibližně 1M a koncentrace glycerolu je přibližně 4M.
Jak bylo stanoveno HPLC. RIA nebo bio stanovením, počáteční koncentrace neurotrofinů v pufru pro svinování je taková, že poměr správně svinutého ku chybně svinutému získanému konformeru bude maximální. Upřednostňovaná koncentrace neurotrofinů (vznikajícího v maximálním výtěžku správně svinutého konformeru) je v rozsahu přibližně OJ až 15 mg/ml, výhodněji asi OJ až 6 mg/ml a nejvýhodněji asi 0,2 až. 5 mg/ml.
Stupeň znovusvinutí, které probíhá během této inkubace, je vhodně stanoven pomocí RIA titru ne li rot rotí nu nebo HPLC analýzou. Rostoucím RIA titr nebo velikost píku správně svinutého neurotrofinů přímo odpovídá rostoucímu množství správně svinutého, biologicky aktivního neurotrofinového konformeru, přítomného v pufru. Inkubace je prováděna proto, aby byl maximalizován výtěžek konformeru správně svinutého neurotrofinů a poměru správně svinutého ncurotrofinovcho konformeru ku získanému chybné svinutému ncurotrofinovému konformeru, jak bylo stanoveno metodami RIA nebo HPLC, a zároveň proto, aby byl minimalizován výtěžek multimerního, spojeného neurotrofinů, jak bylo stanoveno vážkově. Druhy mohou být příležitostně stanoveny metodami uvedenými níže a v Příkladech. Upřednostňované denaturační činidlo pro znovusvinování je guanidin.
Poté, eo je neurotrofin znovu svinut, aby bylo dosaženo větší čistoty a homogenity preparátu, jsou použity jednotlivě nebo v kombinaci následující, příkladné vhodné purifíkační postupy: frakcionace ionexovou chromatografií na koloně katexu; chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC): chromatografie na silikagelu.
Ať je krok, vedoucí kc znovusvinutí proteinu, součástí procesu nebo ne, upřednostňovaný krok pro separaci neurotrofinů od jeho variant je chromatografie s hydrofobní interakcí. Během fer- 15 CZ 300296 B6 mentace. purifikace nebo in vilro znovusvinování proteinu mohou byt některé proteiny chemicky modifikovány, chybně zpracovány nebo se nemusí svinout do své nativní trojrozměrné struktury, ale spíše do jiných struktur, kterč se liší s ohledem na jejich stabilitu, rozpustnost, imunogcnicitu nebo bioaktivitu. Tyto varianty musí být odstraněny v průběhu purifikace, protože je třeba se vyhnout nežádoucím vedlejším efektům, jako je antigenicita nebo ztráta účinnosti. Je li varianta nerozpustná, je možno ji snadno odstranit separaěními dvoufázovými technikami (pevná/kapalná), jako je odstředění nebo filtrace. Je-li však varianta rozpustná, je třeba pro její odstranění použit adsorpční techniky s vyšší rozlišovací schopností, jako je ehromatografie. Jsou—li neurotrofiny produkovány v prokaryotních buňkách nebo jsou—li znovusvinuty in vitro. tvoří rozpustné κι stabilní chybně svinuté varianty. Chybně svinutý neurotrofin má změněný profil disulfidového párování a trojrozměrnou strukturu, vztahující se k nativnímu proteinu a postrádá přirozenou farmakologickou aktivitu. Jsou—li varianty produkovány v eukaryotických buňkách, např. v savčí buněčné kultuře, většinou vznikají jako chybně zpracované varianty. Tyto varianty také většinou postrádají přirozenou farmakologickou aktivitu a měly by být odstraněny. Jako vhodná metoda separace těchto variant od nativního neurolrollnu zde byla zjištěna IIIC.
HIC' zahrnuje postupnou adsorpci a desorpci proteinu, vázaného na pevnou matrici nekovalentními hydrofobními vazbami. Obecně, na HIC kolonu jsou naneseny molekuly vzorku v pufru s vysokou koncentrací soli. Sůl z. pufru interaguje s molekulami vody. čímž snižuje solvataci to molekul v roztoku, a lim odhaluje hydrofobní oblasti v molekulách vzorku, které jsou následně adsorbovány na HIC koloně. Čím jc molekula hydrofobnější. tím nižší koncentrace soli jsou (řeba pro vazbu. Pro eluei vzorku z kolony je obvykle používán klesající gradient soli. Jak klesá iontová síla, roste odhalení hydrofilníeh oblastí molekuly a molekuly se eluují z kolony v závislosti na rostoucí hydrofobicitě. Eluce vzorku muže být také dosaženo přidáním slabého organického modifikátoru nebo detergentu do elučního pufru. HIC je shrnula v knize Protein Purification, 2nd Ed., Springer - Verlag, New' York, pgs 176- 179 (1988).
Síla vazby mezi proteinem a nosičem závisí na několika faktorech, včetně velikosti a hydrofobnibo charakteru imobilizovaných funkčních skupin, polaritě a povrchovém napětí okolního rozpouštědla a na hydrofobicitě proteinu. Vazebná kapacita nosičů pro HIC má tendenci být nižší vzhledem k tomu, že imobilizovaný hydrofobní ligand musí být dostatečně oddálen. Kapacita média pro daný protein se dále liší inverzně k hladině hydrofobních nečistot v preparátu vzorku. Aby byl oddělen žádoucí protein od variant a dalších nečistot, zatímco současně bude maximalizována kapacita, jc nezbytné najít vhodnou HIC stacionární fázi i mobilní fázi pro nanesení, promytí a eluei.
Jak je zde stanoveno. nej vhodnější média pro separaci správně svinutých a chybně svinutých neurotrofínů nebo špatné zpracovaných forem od neporušených, správně zpracovaných forem, jsou ty. které mají mobilizované fenylovc funkční skupiny. Stacionární fáze s fenylovými skupi40 námi od různých dodavatelů vykazují odlišnou schopnost rozpouštět tyto neurotrofinové formy. Nejlepší výsledky byly dosaženy na médiích Phenyl Toyopearl od losollaas a Phenyl Sepharose East Flow I.ow Sub (low substitutům). Vhodný byl rovněž TSK Phenyl 5PW. K separaci těchto forem mohou sloužit i náplně pro HIC s jinými imobilizovanými funkčními skupinami. Příklady jsou oktylové skupiny, jako jsou na náplních Octyl Sepharose CL4B od Pharmacie a propylové skupiny jako na náplních High Propyl od llrmy Baker. Méně upřednostňované jsou pryskyřice s alkoxy, butylovými a isoamylovými funkčními skupinami.
V savčích buněčných kulturách je HIC užitečná pro separaci neurotrofinu od jejich variant. Např. jak zde bylo stanoveno. rhNGF, exprimovaný v Cl 10 buněčné kultuře, obsahuje nesprávně proso teolytieky zpracované varianty, jako jsou ty. ve kterých je přítomna částečná prekurzorová sekvence, např, prekurzor NGE, hybridní prekurzor NGF a sekvence zkráceného prekurzoru
NGF. V kultuře savčích buněk byly rovněž nalezeny glykosylovaný NGF a glykosylované formy nesprávně proteolyticky zpracovaných variant. Nežádoucí glykosylované formy, které mohou být v případě NGF pozorovány jako druhy s vyšší molekulovou hmotností (t 2000 kD), mohou vyt55 vářet nechtěnou antigenní odezvu u pacientů a být příčinou nízké kvality nebo aktivity produktu.
- 16CZ 300296 B6
HIC účinně separovala hydrofobní varianty, v první řadě varianty rhNGF, proteolyticky špatně zpracované 11a N-konci, včetně glykosylovaných forem. Jak je ukázáno v Příkladech. NGF, obsahující prekurzorovou sekvenci, zkrácenou sekvenci prekurzorů NGF a glykosylované formy jak NGF tak i NGF, obsahujícího prekurzorovou sekvenci, se cluovaly v počátečních fázích píku
NGF při HIC s fenylovými funkčními skupinami. Tak může být získaná kompozice rhNGF převážně bez obsahu těchto druhů a konkrétně vhodná pro následný krok, jako je IIPLC na katexu. HIC lze aplikovat bez ohledu na zdroj i na další neurotrofiny i NGF. Např. HIC je užitečná pro separací NGF monomerů od dimerů, bud’ homo-. nebo hetero-dimerů, v závislosti na přítomné monorncrní formě, stejně tak jako pro rozlišení dimcrových forem, lišících sc v hydrofobicilě, a id které jsou získány po in vitro znovusvinutí nebo, které jsou produkovány a vylučovány savčími buňkami. Pro HIC jc upřednostňovaný zdroj směsi neurotrofinu kultura savčích buněk, více upřednostňovaná je CHO buněčná kultura. Jak je zde diskutováno, kultura jc výhodněji podrobena alespoň jednomu předcházejícímu purifikačnimu kroku. HIC je konkrétně účinná při separaci chybně zpracovaných glykosylovaných variant (varianty) od nativního rekombinantniho neuro13 trofinu. V případě rhNGF jsou glykosylované a prepro-NGF formy méně hydrofobní než nativní NGF, a proto jsou cluovány dříve než nativní NGF, Chybně svinuté formy neurotrofinu (jsou-li produkovány bakteriemi) jsou také hydrofobnějši, a tudíž cínované dříve než nativní neurotrofiu.
Nejupřednostňovanější HIC pryskyřice pro separaci neurotrofinových forem jsou ty. které mají ?d imobilizované fenylové funkční skupiny. HIC' náplně s fenylovými skupinami od různých dodavatelů vykazují odlišnou účinnost pro rozpouštění těchto NGF forem. Z pryskyřicí s fenylovými skupinami je nejupřednostňovanější pro HIC' náplň Phenyl Tovoperal od TosoHass a Phenyl Sepharose Fast Flow Low Sub (low substitution). upřednostňována je TSK Phenyl 5PW. Upřednostňované HIC funkční skupiny pro HIC zahrnují alkoxy, butylové a isoamylové skupiny.
Při HIC mohou být použity pro promytí a rozlišenou eluci neurotrofinových forem různé mobilní fáze. lyto mobilní fáze mohou obsahovat několik různých chemických druhů, které v různých směrech ovlivňují vazbu mezi neurotroťinem a stacionární fází. Správně svinutý a chybně svinutý neurotrofin, např. NT-4/5 může být rozpuštěn na koloně pro HIC klesajícími gradienty koncent50 raci solí nebo nespojitým poklesem např. koncentrace soli v mobilní fázi. např. síranu amonného. Nad. acetátu. Soli mohou ovlivňovat vazbu neurotrofinu 11a pryskyřici tím. že snižují povrchové napětí mobilní fáze. Další činidla, která snižují povrchové napětí, jsou citrát sodný, chlorid tetramethy lamonný, jak je diskutováno v příkladech. Varianty mohou být také rozpouštěny na koloně během chromatografie eluováníni vázaného proteinu rostoucím gradientem nebo nespojitou ros33 toucí změnou koncentrace relativně polárních organických rozpouštědel. Příklady vhodných rozpouštědel jsou etanol, acetonitril a propanoi. Síla vazby mezi neurotrofinovýnii formami a pryskyřicí pro HIC také závisela na pil mobilní fáze, s upřednostňovanými neutrálními podmínkami. Na pil roztoku také závisela relativní hydrofobicita správně svinutého a chybně svinutého neurotrofinu. Separace variant od nativního neurotrofinu může být také dosaženo současně probíhající κι změnou několika vlastností mobilní fáze během gradientově nebo nespojité eluce. Např. mobilní fáze. kde se během eluce současně mění koncentrace soli a koncentrace apolárního rozpouštědla, poskytuje větší rozlišeni než když je měněna pouze koncentrace soli.
Pro HIC’ ehromatografii mohou být použity zde diskutované soli, včetně síranu amonného, citrá43 tu, octanu a chloridu draselného. Aby bylo dosaženo vazby neurotrofinu na pryskyřici, je v závislosti na použité soli koncentrace soli většinou O,5až3M, výhodněji 0,5až2.5M. Např. vazebný pufr s koncentrací soli 0,8 až 1,5M je upřednostňovaný pro NGF. zatímco vyšší koncentrace solí vedou ke srážení NGF 11a koloně a výsledkem je nižší návratnost. Pro NT-3 je upřednostňován vazebný pufr pH 7 s koncentrací soli 1,0 až 2,5M. z čehož jc více upřednostňo31) váná koncentrace 1,25 až 1.75M NaCI a nejvíce upřednostňovaná koncentrace 1,5M. Pro NT—4/5 jc upřednostňován vazebný pufr pil 7 s koncentrací soli 1 3M. z čehož, je více upřednostňovaná koncentrace 2 až 2.75M a nejvíce upřednostňovaná koncentrace 2.5M. V případě NT 4/5. byla-li upřednostňovaná koncentrace soli pro nanesení vzorku 2,5M, pro eluci byla upřednostňována 2M NaCI s přítomným organickým rozpouštědlem (např. 10% alkohol, pi l 7). Pro eluci a separaci neurotrofinu a jeho variant je výhodněji používáno snižování koncentrace soli. Aby došlo k eluci.
- 17 CZ 300296 Β6 koncentrace soli v elučním pufru jc většinou nižší než v nanášecíni pufru, ale muže být použita i stejná koncentrace v případě, je-li kompenzována organickým rozpouštědlem.
Použití organických rozpouštědel má také tu výhodu, jak zde bylo zjištěno, že přídavek organicí kého rozpouštědla zlepšuje eluční profil tím, že vzniká užší profil píku. Kromě etanolu mohou být použita další zde diskutovaná organická rozpouštědla včetně propanolu, isopropanolu a nižších alkylenových glykolů, jako jsou propylenglykol, etylenglyko! a hexylenglykol. Organická rozpouštědla v koncentracích 5 až 25 % (v/v), výhodněji 5 až 20 % (v/v), budou většinou eluovat správně svinutý neurotrofin. Eluce organickým rozpouštědlem může být jak gradientová, tak i io nespojitá. Rozsah pH je výhodněji oblast blízko neutrální až slabě zásaditá, pH 5 až 8, ještě výhodněji pH 6 až 8, pH 6,5 až 7,5 a nejvýhodněji pH 7. Všechny ostatní zde diskutované pufry včetně MOPSO, MOPS, I1EPES, fosfátového, citrátového, amonného a acetátového mohou být použity tak dlouho, dokud udrží požadované pl 1.
Určité nežádoucí varianty neurotrofínu, uvolňované během rckombiiiantní produkce neurotrofinu. které objevili autoři předmětného vynálezu, mohou být separovány I1PLC na katexu, konkrétně v preparati νπίιπ uspořádám. Pato chromatografie umožňuje separaci nábojově modifikovaných variant, jako jsou karbamylované, oxidované, isoasp. formy, deamidované a určitým způsobem zkrácené formy, (např. formy NGF, zkrácené na C konci), od nativního neurotrofínu. jo Mohou být odstraněny např. formy zkrácené na N-konci (např. delecí 2 až 4 aminokyseliny z Nkonee), vznikající jako nábojově upravené, které se mohou vyskytovat v průběhu bakteriální fermentaee jako v případě NT-4/5 a NT-3. V případě neurotrofinu, produkovaných v kultuře savčích buněk, se může zkrácení na ('-konci vyskytovat vc vysoce nabitých koncových oblastech. Např., 118 aminokyselinová forma NGF může být nesprávně zpracovaná nebo Štěpená na svém C-konci na 117, 114 a 115 aminokyselinovou formu. Ty mohou být separovány od nativního 1 18 aminokyselinového NGF pomocí HPLC na katexu. Konkrétně upřednostňované provedení používá SP-Sepharose High Performance, Fractogel LMD S03 nebo pryskyřici s polyasparagovou kyselinou, z nichž je konkrétně upřednostňovaná PolyCAl A. Ve velkém měřítku jsou nejvíce upřednostňované SP Sepharose High Performance nebo Fractogel EMD το SO3.
Kompozice, získaná zde popsaným postupem, bude převážně čistý neurotrofin, častěji a výhodněji téměř čistý, a bude převážně bez obsahu neurotrofinovych variant, výhodněji bude téměř bez obsahu neuiOtrofinových variant. Např. po purifikaci NGF z CHO buněčné kultury na koloně
SP-Sepharose obsahují typické frakce asi 92 % 118 aminokyselinové formy. 4.6 % 120 aminokyselinové formy, 1 % dcainidovaného NGF, 1 % oxidovaného NGF a I % isoasp. NGF. Běžně se množství každého druhu pohybuje od asi 85 do 93 % 118 aminokyselinové formy, od 0 do 5 % 120 aminokyselinové formy (z velké části v závislosti na přesnosti endogenní a/nebo exogenní proteolýzy. která je použita), od 0 do 5 % 117 aminokyselinové formy, od 0 do 3 % deamidované to formy. 0 až 2 % isoasp formy a 0 až 2 % oxidované formy. Čistota NGF (všech druhů) je běžně vyšší než 99,5 %.
Poté, co je neurotrofin eluován z kolony, je vhodně formulován do kompozice s nosičem, výhodněji farmaceutické kompozice s fyziologicky přijatelným nosičem. Neurotrofinové kompozice jsou výhodněji sterilní. Neurotrofinové kompozice tohoto předmětného vynálezu také nacházejí in vilro použití, např. pro zajištění růstu a přežiti neuronů v kultuře.
Chemická a fyzikální stabilita rekombinantního lidského nervového růstového faktoru (NGF) ve vodných roztocích byla stanovena mezi 5a37°C, v rozsahu pil 4.2 až 5.8. Chemická stabilita
5i> NGF rostla s rostoucím pH. V sukcinátovém pufru pH 5,8 fyzikální stabilita NGF v důsledku agregace proteinů klesala. Na základě dat jak pro stabilitu při 5 °C tak i intenzivních degradačních studií při 37 °C, byla nalezena optimální formulace - acetátový pufr v pi l 5,5 (viz WO 97/17087, který je zde začleněn jako odkaz), HPLC na reverzní táži byla metoda, která jako první naznačila stabilitu a která ukazuje, že konverze Asn-93 na iso-Asp je primární degradační cesta při 5 °C. Kvantifikace degradace NGF pomocí ionexové chromatografie na katexu byla
- 18CZ 300296 B6 komplikována přesmykem monomerových variant NGF na různé směsné dimery (dimerová výměna). Působením zředěných kyselin na vzorky a kontrolní vzorky se rychle ustálila distribuce monomeru v dimerech a tím bylo možno kvantifikovat degradaci NGF bez dimerové výměny. Benzylalkohol a fenol byly oceněny pro jejich stabilitu a slučitelnost s rhNGF ve dvou kapalných formulacích pro účely vícenásobného použití. Tyto dvě formulace se skládají z roztoku proteinu o koncentrací 0.1 mg/ml. 20mM octanu sodného pH 5,5 a 136mM chloridu sodného s a bez 0,01 % pluronové kyseliny (F68)jako surfaktantu. Konečné koncentrace benzylalkoholu a fenolu v každé z. těchto dvou formulací byly 0,9 a 0,25 %. Na základě sledování 12 měsíční stability lze říci, že rhNGF je více stabilní v přítomnosti benzy lalkoholu než fenolu v těchto formulacích, io Bcnzylalkoholem chráněná formulace rhNGF je v přítomnosti surfaktantu stejně stabilní jako formulace, kam surfaktant nebyl přidán, což naznačuje, že přídavek F68 k niulti-dávkovaeí formulaci rhNGF není pro účely stability požadován. Formulace skládající se z 0,1 mg/ml proteinu v 20mM aeetátu, l36mM NaCI, 0,9% benzylalkoholu pil 5,5 je proto doporučovaná pro rhNGF. které jsou používány pro vícenásobné dávkování ve Fázi lil klinických studií. '1 ato multi dávko15 vací formulace rhNGF vyhověla USP a EP ochranným testům účinnosti po 6 měsících při 5 °C a jc stejně stabilní jako současná kapalná formulace o koncentraci 2 mg/ml. Formulace by se však neměla vystavoval působení intenzivního světla, protože přítomny benzylalkohol je citlivý na světlo.
Obecně, kompozice může obsahovat další složky, výhodněji v množstvích ne menších než preparát stabilní, kapalný nebo lyofilizovaná forma a v množstvích vhodných pro účinnou a bezpečnou farmaceutickou aplikaci.
Neurotrofin je formulován s farmaceuticky přijatelným nosičem, tzn. takovým, který není v pou25 žívaných dávkách a koncentracích toxický pro příjemce a je slučitelný s ostatními přísadami formulace. Např. formulace výhodněji neobsahuje oxidační činidla a další sloučeniny, které jsou známé jako škodlivé pro polypeptidv. Tohoto kroku formulace je dosaženo odsolením nebo diaťiltrací za použití standardní technologie.
Obecně, formulace jsou připravovány rovnoměrným a těsným spojením neurotrofinu s kapalným nosičem nebo jemně rozdělenými pevnými nosiči nebo oběma. Potom je, je-li to nezbytné, produkt tvarován do žádoucí formulace. Nosič je výhodněji parenterální nosič, ještě výhodněji roztok, který je isotonický vzhledem ke krvi příjemce. Příklady těchto nosičů zahrnují vodu, fyziologický roztok. Ringerův roztok a roztok dextrózy. Nevodná vehikula. jako jsou fixovaný olej a ctylolcát. jsou také užitečná, stejně tak jako lipozomy.
Je vhodné, aby nosič obsahoval minoritní množství aditiv jako jsou slouěeniny, které zvyšují isotonicitu a chemickou stabilitu. Takové materiály jsou v používaných dávkách a koncentracích netoxické pro příjemce a zahrnují pufry, jako je fosfátový, citrátový. sukcinátový. s kyselinou io octovou a dalšími organickými kyselinami a jejich solemi; antioxydanty jako je kyselina askorbová; nízkomolekulární polypeptidv (menší než asi 10 zbytků), např. polyarginin nebo tripeptidy; proteiny, jako jsou sérový albumin, gelatin, nebo imunoglobuliny; bydrofilní polymery, jako jsou polyvinylpyrolidon; aminokyseliny, jako jsou glyein, glutamová kyselina, asparagová kyselina nebo arginin: monosacharidy, disacharidy a další uhlovodíky, včetně celulózy nebo jejích deri45 vátů, trehalózy, glukózy, manózy nebo dextrinů; ehelatační činidla jako je FD FA; alkoholické cukry, jako je manitol nebo sorbitol; proti ionty, jako je sodík; a/ncbo neionogenní surfaklanty. jako polysorbáty, poloxamery nebo PFG. Konečný preparát může být kapalina nebo lyofilizovaná pevná látka.
?n Neurotrolm, který jc používán pro terapeutickou aplikaci, musí být sterilní. Sterilita je snadno uskutečněna filtrací přes sterilní filtrační membrány (např. membrány s velikostí pórů 0,2 mikronů). Obecně jsou terapeutické neuiOtroťinové kompozice dány do nádoby sc sterilním přístupovým otvorem, např. sáčky nebo láhve s roztokem pro intravenózní aplikaci, sc zátkou propíehnutelnou hypodermíckou injekční jehlou. Výše uvedené formulace jsou rovněž vhodné pro pou55 žití in vitro.
- 19 CZ 300296 B6
Neurotrofin je běžně skladován jako vodný roztok nebo jako lyoíllizovaná formulace pro další použití v jednotkách nebo multídávkovacích nádobách, např. zatavené ampule nebo lahvičky. Příklad lyofilizované formulace: nádobky o objemu 10 ml jsou naplněny 5 ml sterilně přefiltrovaného 1% (w/v) vodného roztoku neurotrofinu a vzniklá směs je lyoťilizovaná. lnfúzní roztok je přípraven rozpuštěním lyofilizovaného neurotrofinu použitím bakteriostaliekého zařízení Waterfor-lnjection.
Pacientům je podávána terapeuticky účinná dávka neurotrofinové formulace. Pod pojmem „terapeuticky účinná dávka je zde míněna taková dávka, která má takový efekt, pro který je podávána. Přesná dávka bude záviset na onemocnění, které má být léčeno, a známými technikami ji určí odborník v dané oblasti. Obecně, neurotrofinové formulace předmětného vynálezu jsou podávány v množstvích přibližně 0.01 pg/kg až 100 mg/kg na den. Výhodněji v dávkách od 0,1 do 0,3 pg/kg. Dále. jak je v dané oblasti známo, muže být nezbytná úprava dávek podle věku, tělesně hmotnosti, celkového zdraví, pohlaví, diety, délky podávání, lékové interakce a závažnosti onemocnění a bude zjistitelná rutinními experimenty. Většinou budou kliničtí lékaři podávat neuiOtiofinové formulace předmětného vynálezu až do takových dávek, které jsou dostatečné pro opravu, zachování a optimálně také opětovné ustanovení funkce neuronů. Vývoj této terapie jc snadno monitorován vhodnými stanoveními.
Neurotrofin může být kombinován nebo podáván spolu s dalšími neurotrofními faktory; včetně NGF. NT—4/5, N I -3 a/nebo BDNF a může být použit s ostatními vhodnými terapiemi nervových onemocnění.
V případě NGF, kompozice výhodněji obsahuje farmaceuticky účinné množství nervového růstového faktoru a farmaceuticky přijatelný acetátový pufr. Kompozice muže mít pil v rozmezí od 5 do 6. Pufr je výhodněji pufr s octanein sodným. Koncentrace octanu je výhodněji 0,1 až 200mM. Kompozice má výhodněji koncentraci NGF 0,07 až 20 mg/ml. Kompozice může dále obsahovat farmaceuticky přijatelné ochranné látky, jako jsou benzy lalkohol, fenol, m-kresol, melylparaben nebo propylparaben. Výhodněji je jako ochranná látka uváděn benzy lalkohol. Koncentrace benzylalkoholu je výhodněji v rozmezí od 0,1 do 2,0 %. Kompozice může obsahovat farmaceuticky přijatelné surfaktanty a výhodněji fyziologicky přijatelné koncentrace chloridu sodného. Upřednostňovanější kompozice obsahuje nervový růstový faktor v koncentraci alespoň asi 0,1 mg/ml a s koncentrací oetanového iontu 10 až 50mM. Ještě výhodněji, obsahuje kompozice růstový nervový faktor v koncentraci asi 0,1 až 2,0 mg/ml a octanový iont v koncentracích 10až50mM. Nejupřednostňovanější kompozice obsahuje NGF v koncentraci 0,1 mg/ml s koncentrací octanu sodného 20mM, pil 5.5, koncentrací chloridu sodného l36mM a koncentrací benzylalkoholu 0,9% (v/v).
Jiné provedení obsahuje koncentraci NGF 2,0 mg/ml, koncentraci octanu sodného lOtnM, pil 5,5 a koncentraci chloridu sodného l4mM. Výhodněji je formulován NGF o koncentraci 0.1 mg/ml v roztoku 20mM octanu sodného. 136mM chloridu sodného a 0,9% (v/v) benzylalkoholu pil 5,5. Jak je výše diskutováno, upřednostňovaná forma NGF je homodimer 118/118. NGF je puntíkován při pH přibližně 6 až 8 proto, aby byla zachována normální homodimerová forma. Avšak určité procento (proteolytieky) zkrácených forem reprezentuje takové monomerni formy, které se stávají zřetelnými a mohou být stanoveny HPLC s reverzní fází. Kyselé podmínky analytické HPLC disoeiiijí dimery; Byla publikována existence odlišných dimeiových forem NGF 120/120, 120/118, 118/118 atd. - (Sehmelzer a spol., J. Neurochem, 59:1675 až 1683 (1992). který je specificky začleněn jako celek, hlavně pro jeho analytiku a biostanovení, které byly použity v současných studiích a pro jeho obecně naučný charakter). V této publikaci bylo uvedeno, žc in vitro aktivity byly stejné u každé dimerové formy. Avšak v kontrastu s tím, zde prezentované studie poprvé ukazují, že dimer 120/120 je méně aktivní, má asi 80 až 90 % aktivity než 118/118 druhy, což bylo zjištěno stanovením na bázi radioreccptoru. V jedné formě stanovení byly izolovány membrány PC—12 buněk potkanů, které byly použity pro kompetitivní vazbu mezi standardem NGF a různými testovanými druhy. KRA má jak P75 lak trkA reeeptory; Rov- 20 C7. 300296 B6 něž zde byio zjištěno, že 117/117 druhy jsou stejně aktivní jako 118/! 18 druhy. Zde použité stanovení. založené na PC—12, dále potvrdilo, že byio nalezeno stanovení na základě receptem, které ukázalo, že forma 120/120 je asi z 60 % aktivní než 118/118 forma. Publikace Burton a spoi.. J. Neurochem. 59:1937 až 1945 (1992) je také specificky začleněna jako celek, zejména pro analytická stanovení a biostanovení, která byla použita v běžných studiích a pro svůj obecně naučný charakter.
Předpokládá se, že u lidských pacientů bude forma 118/118 lépe dostupná než forma 120/120. Biodostupnost je zvýšena alespoň 4 až 5 krát. Tento rozdíl je významný, překvapující a v dané oblasti neočekávaný.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci nikoliv jako omezující. Jako odkazy ve specifikaci jsou zde úmyslné zahrnuta odhalení všech citací.
Příklady provedení vynálezu
Příklad I. Purifikace homodinieru NCil·' 118/118
Tento příklad ukazuje purifikaei NGl·' a princip každého kroku. Jako v každém z. Příkladů provedení vy nálezu, může odborník v dané oblasti snadno stanovit a upravit rozměry kolony a rychlost průtoku, aby byl kompenzován původní objem kultury a koncentrace proteinů.
Tekutina sklizené buněčné kultury
Rckombinantní CHO buňka byla podrobena transfekci s expresním vektorem, obsahujícím DNA sekvenci, která kóduje 120 aminokyselinový lidský NGf. Pro zajištění sekrece a výroby NGf byla také přítomna prepro sekvence. Po kultivaci rekombinantních CHO buněk bylo médium buněčné kultury sklizeno. Sklizená tekutá buněčná kultura (HCCF) obsahovala 120, 118 a 117 aminokyselinové druhy NGF. Asi 40 až 70 % NGF byl většinou homodimer 11 8/í 18 a zbývající formy byly heterodimery 120/118. 120/120 a malé množství 118/117. lyto druhy mohou být separovány chromatografií na koloně SP-Sepharose HP (viz výše).
Sklizená tekutina buněčné kultury byla přibližně 20 x zahuštěna na zařízení Míllipore s filtry s vylučovací mezí 10 kD (použity byly buď eelulózové, smíšené, nebo polysiilfonové filtry a bylo jc možno zaměnit). Do koncentrátu bylo přidáno 0.1 objemu l,0M Tris, pil 8,2. Zředěny materiál byl inikrofiltrován přes filtr s velikostí pórů 0.22 pm a převeden do zásobního tanku o teplotě 37 °C na dobu 2 až 18 hodin. Konverze formy 120/120 na 118/118, ke které dochází během procesu. je katalyzována endogenní proteázou.
Chromatografie na silikagelu
Mikrotiltrát byl převeden do roztoku IM NaCI a aplikován na kolonu Silica (iel Column, ekvilibrovanou roztokem ÍM NaCI, 25inM MOPSO, pH 7. Kolona byla proinyta IM NaCI v 25niM MOPSO. pil 7. Vhodný rozsah pfl je asi 6 až 8. s upřednostňovaným pil 7. Kolona byla dále proinyta 25mM MOPSO, pil 7. Nízká vodivost promývaeího roztoku odstraňuje proteiny hostitelské buňky. Vázaný NGF byl eluován roztokem, obsahujícím 50mM MOPSO. 0.5M TMAC a 20% bezvodý alkohol (94 až 96% Speciálně Denaturovaný Alkohol formule 3 A (5 objemových dílů metanolu a 100 objemových dílů etanolu (200 proof)) a 4 až 6 % isopropaiiolu). Další alkoholy, které mohou být použity, jsou 20% propanol, 20% isopropanol a 20% metanol. Zde použité pojmy ..alkoholy” a „alkoholická rozpouštědla” jsou míněny ve smyslu běžně používané terminologie pro alkoholy, výhodněji alkoholy s I až 10 uhlíkovými atomy, ještě výhodněji metanol, etanol, isopropanol, n propanol nebo t—butanol a nejvýhodnčji ctanol nebo isopropanol. Protože alkoholy jsou rozpouštědla, jsou li přidány do vodného roztoku, klesá polarita rozpouštědla a tím
CZ 300296 Bó zvyšují hydrofobicitu roztoku. Nejuprednostnovanější je etanol. Spodní limit koncentrace alkoholu je jakékoliv procento, které eluuje, a horní limit je dán potřebou vyvarovat se denaturace proteinu. Rozpouštědlo je výhodněji 5 až. 25%, ještě výhodněji 5 až 20%. a nejvýhodněji 5 až 15%. TMAC je chlorid tetrametylamonný, který je přítomen pro eluei NGF. TMAC může být v rozsahu koncentrací 0,1 až IM. Upřednostňované jsou koncentrace v rozsahu 0,3 až 0,7M. Množství TMAC', použité pro eluei NGF, je funkcí pH a koncentrace alkoholu. Činí je pH nižší, tím menší množství alkoholu a TMAC je požadováno, pil může být v rozsahu asi 4 až 8. V tomto příkladu je upřednostňováno pH 7. které umožňuje velmi malé úpravy spojených frakcí před tím. než jsou naneseny na kolonu. Horní limit pH jc dán hodnotou pH, které je nezbytné pro nanesení vzorku na další kolonu, a spodní limit je dán jako užitečný pro úspěšnou eluei NGF.
Chromatografie na koloně S-Sepharose Fast Flow
Eluent, obsahující NGE, byl spojen dohromady, zředěn purifíkovanou vodou na vodivost menší než 15.5 nis/cni a pl 1 roztoku bylo upraveno na hodnotu 7. Materiál nebyl skladován déle než 8 hodin, protože byly slále přítomny některé proteázy, Nebyla však zjištěna žádná aktivita endogenní proteázy. která přeměňuje 120 aminokyselinový NGF na 118 aminokyselinovou formu. Materiál byl aplikován na kolonu S-Sepharose Fast Flow (Latexová ionexová pryskyřice SSEPHAROSE TM agarose Fast Flow TM (Pharmacia)), ekvilibrovanou 25mM MOPSO, pH 7. Kolona je promytá 25mM MOPSO, pH 7. Vhodný rozsah pH je přibližně od 6 do 8, s upřednostňovaným pil 7. Kolona byla poté promytá 0.16M NaCI, pH 7. Vázaný NGF byl eluován 0,5M NaCI, pH 7. Molární koncentrace soli v roztoku, který je používán pro eluei, se může pohybovat z rozmezí 0,3 až Ε0Μ, ještě 0,4 ažO.óM, Spodní limit jc dán užitečností cínovat všechen NGF a horní limit jc dán potřebou vyvarovat se odstranění kontaminant a vzniku hydrofobních interakcí na koloně, které by mohly rušit eluei NGE. Mohou být použity i další sole, z nichž je upřednostňovaná alternativa KG. Aby byly získány frakce o malém objemu, je upřednostňována eluce 0.5M NaCI. pil 7. Ve vyšších koncentracích soli, např. více než IM, mohou byt eluovány slabě vázané kontaminanty.
Chromatografie na koloně Phenyl Toyopearl 650 M
Frakce po SSEE ehromatografii, obsahující NGF. byly spojeny dohromady, převedeny do IM NaCI a aplikovány na kolonu Phenyl Toyopearl 650M. Kolona byla promvta 25mM MOPSO, pH 7. Vhodný rozsah pH jc přibližně od pH 5 do pi l 8. Vázaný NGE byl eluován 10 CV (objem kolony) lineárního gradientu, který začíná gradientovým pufrem A (25mM MOPSO, pi l 7, 1.0M NaCI) a konči gradientovým pufrem B (20% alkohol v 80% 25mM MOPSO. pil 7). Frakce, obsahující NGF, byly analyzovány SDS elektrolorczou v polyakrylamidovém gelu. aby bylo stanoveno, které frakce obsahují druhy s prekurzorem NGE. Aby byla získána kompozice NGE. převážně bez obsahu jakýchkoliv sekvencí prckurzoru NGF. byly vybrány a spojeny frakce, obsahující NGF, zc kterých je třeba odstranit špatně zpracované varianty, jako jsou ty, ve kterých je přítomna částečná prekurzorová sekvence, např. prekurzor NGE. hybridní prekurzor NGE a zkrácená sekvence prckurzoru NGE. Fenylová kolona také odstraňovala malé množství glykosylovaného NGF a sekvence prckurzoru glykosylovaného NGF. Prekurzor a zkrácené sekvence prckurzoru NGF spolu s glykosylovanými formami jak NGF tak prekurzorů NGE se eluovaly na začátku NGE píku. Tato kolona snadno separovala NGE od různých druhů NGF, aby byla získána kompozice NGF převážně bez obsahu těchto druhů. V tomto kroku byly separovány použitím 1 IIC různé hydrofobní varianty NGF, hlavně chybně zpracované varianty', včetně proteolytických a glykosylovaných variant.
Pro separaci forem NGF byla nejvhodnější média s mobilizovanými fenylovými skupinami. Tato média od různých dodavatelů vykazují odlišnou účinnost při rozpouštění těchto forem NGF. Nejlepších výsledků bylo dosaženo na médiu Phenyl Toyopearl od IosoHaas. HIC pryskyřice Phenyl Sepharose Fast Flow Eow Sub (low substitution) a TSK Phenyl 5PW pracovaly dobře. Ostatní nosiče pro HIC s jinými funkčními skupinami byly za stejných podmínek méně vhodné a méně účinné včetně alkoxy, butylových a isoamylových skupin.
- 2T _
CZ 311(1296 B6
Frakce spojené po chromatografii na koloně Phenvl Toyopearl obsahovaly 75 % 1 18 aminokyselinové formy. 10 % 120 aminokyselinové formy, 7 % 117 aminokyselinové formy, 1,8 % deamidovanélio NGF, 1,4 % oxidovaného NGF a 2 % isoasp NGF. 2,8 % připadají na zbývající neidentifikované druhy NGF.
Aby bylo dosaženo virální inaktivace, mohly být spojené frakce podrobeny účinku kyseliny v pH nižším než 3,95 po dobu minimálně 15 minut, io ehromatografie na SP-Sepharose HP
Frakce spojené po HIC chromatografii byly zředěny 0,5 až 1 objemem vody a zředěný vzorek byl upraven na pil 6. Vzorek byl nanesen na kolonu SP-Sepharose IIP, ekvilibrovanou 0.2M NaCI v 20mM sukeinátu pH 6, obsahujícím 5 % alkoholu (jako v kroku na koloně silikagelu). Kolona byla promyta 0.2M NaC'1 v 20mM sukeinátu pH 6, obsahujícím 5% alkohol (formule SDA-3A aleohoh alkohol nemusí být přítomen). Alkohol pomáhá redukovat nespecifické (většinou hydrofobní) interakce NGF s páteři pryskyřice. Vhodný rozsah koncentrace alkoholu je přibližně 0 až 10 %, pH nanášení je v rozmezí asi 5 až 8. Toto rozmezí bylo vybráno proto, aby bylo dosaženo separace variant NGF a zachována maximální stabilita NGF. Kolona byla promyta dvěma ?(i objemy kolony ekvilibračního pufru. Vázaný NCiF byl eluován a separován od variant pomocí lineárního gradientu o objemu odpovídajícímu 22 násobku objemu kolony. Gradient byl vytvořen smícháním 11 objemů kolony gradientového pufru A (0.25M NaCI v 0.02M sukeinátu pH 6, obsahující 5% alkohol) a 1 I objemů kolony gradientového pufru B (0,5M NaCI, pil 6). Alkohol nemusí být přidán. 118/118 forma NGF je většinou eluována koncentrací NaCI 0,35 až 0,40M.
2?
Frakce, vycházející z kolony, byly analyzovány z hlediska obsahu NGF a NGF variant. Frakce byly ještě analyzovány chromatografii C4 RP-HPLC, jak popisuje Schmelzer a spol. (1992), supra., a Burton a spo!. (1992)., supra. Aby byla získána kompozice NGF. která převážně neobsahuje modifikované varianty, např. nabité druhy NGF jako jsou oxidované, dcamidované a w isoasp. druhy, byly vybrány a spojeny příslušné frakce. HIC kolona z předcházejícího příkladu nemůže účinně odstranit další různé formy NGF. jako je oxidovaná a isoasp. forma NGF. HIC kolona účinně ncodslraňuje chybně svinuté proteiny a glykosylované formy, které, protože mají tendenci být hydrofobnější, se vážou na pryskyřici slaběji než správně svinutý NGF. Proto byla tedy použita pro odstranění nábojově změněných variant neodstraněných na HIC pryskyřici, pryskyřice pro ionexovou chromatografii na katexu, např. SP-Sepharose IIP.
Frakce spojené po chroniatografii na SP-Sepharose většinou obsahovaly asi 92% 118 aminokyselinové formy, 4,6 % 120 aminokyselinové formy. 1 % deamidovaného NGF, i % oxidovaného NGF a I % isoasp formy NGF. Množství každého druhu se běžně pohybuje v rozmezí při4o bližně 85 až 93 % 118 aminokyselinové formy, od 0 do 5 % 120 aminokyselinové formy, od 0 do 5 % 117 aminokyselinové formy, od 0 do 3 % deamidované formy. 0 až 2 % isoasp. formy a 0 až. 2 % oxidované formy. Čistota NGF (všech druhů) je běžně vyšší než 99,5 %.
Formulace
Frakce spojené po chromatografii na SP-Sepharose IIP byly pro formulaci připraveny ullrafillrací/diafihrací do formulačního pufru. Výhodněji je používán kyselý pufr, výhodněji acetátový pi l 5, jak je diskutováno výše. Kompozice 11 8/1 18 formy NGF je převážně bez obsahu NGF variant a jedná sc o převážně čistý NGF. Formulovaný materiál je vhodný pro léčbu neuronáhiích one5(i mocnění, konkrétně periferní ncuropatie spojené s diabetem a periferní senzorické ncuropatie spojené s AIDS.
Příklad II. Purifikaee homodimeru NGF 120/120 ve velkém měřítku
SS
-23 CZ 300296 B6
Tekutina sklizené buněčné kultury (HCCF)
HCCF byla získána z kultivace 12 000 litrů CHO buněčné kultury, jak je obecně popsáno v Příkladu I. Distribuce jednotlivých druhů NGF v HCCF byla asi 40 až 65 % homodimeru 120/120 s heterodimerem 120/118 a zbývající množství byl homodimer 118/1 18. Aby byla minimalizována proteolytická konverze 120 na 118. bylo médium rychle zpracováno.
lonexová chromatografie na katexu Macroprep High S
HCCF byla nanesena na kolonu Macroprep High S, promytou 1.5M octanem sodným v 50mMHFPES. pH 7. Vázaný NGF bvi cluován 1.5M NaCI, 0,2M TMAC, 0,2% thiodiglykolem pH 7. Chromatografie na koloně Macroprep může probíhat při pi l 5 až 8 s úpravou koncentrace oetanu. Chlorid je upřednostňovaná náhrada oetanového iontu, NGF byl cluován gradientem TMAC. TMAC je sůl. která maják iontový tak i hydrofobní charakter, což. je užitečná vlastnost, protože páteř některých pryskyřic obsahuje hydrofobní oblasti, které podporuji nespecifické interakce mezi NGf a pryskyřicí. Pro eluění pufr o pH asi 6 až 8, jsou užitečné koncentrace TMAC 0 až 3M. frakce, které obsahují NGf, byly spojeny dohromady.
Chromatografie na silikagelu
Spojené frakce byly přímo aplikovány na kolonu silikagelu. Silikagel představuje směsný typ ehromatografické pryskyřice. která je iontová, polární a vykazuje hydrofobní interakce, které hraji roli ve vazebných charakteristikách proteinu. Kolona byla ekvilibrována roztokem I M NaCI v 25mM MOPSO pH 7. Kolona byla promyta 1M NaCI v 25mM MOPSO pH 7 (výhodněji pH asi 5 až 8,5. ještě výhodněji pil 6 až 8, a nej výhodně] i pil 7). Vázaný NGf byl eluován 25mM sukcinátem pH 3.9, 50mM TEAC (chlorid tetraetylamonný). TEAC je silnější eluent než TMAC. pH se výhodněji pohybuje přibližně v rozmezí od pl I 3,5 do 8. Je však třeba se vyvarovat delšího působení pH vyššího než 7,5. aby se předešlo nebo aby byla snížena tvorba deamidovanýcli druhů NGF. Obecné, čím nižší je pH pufru, tím menší koncentrace soli sc směsnými vlastnostmi, např, TMAC nebo TEAC, je požadována pro eluci NGF z. kolony silikagelu. Pro použití jsou vhodné pufry, které mají dobrou pufrovaeí kapacitu v oblasti blízko pH 4 až 5. Přítomnost soli v elučním pufru není nezbytná, takže před aplikací elučního pufru může být kolona promyta MOPSO pufrem bez soli,
Chromatografie na koloně Phenyl Sepharose Fast Flow
Frakce, obsahující NGF, byly identifikovány a spojeny dohromady. Spojené frakce byly převedeny do roztoku 0.7M oetanu pH 7, 25mM MOPSO. Upravené frakce byly naneseny na ehromatografickou kolonu Phenyl Sepharose Fast Flow, ekvilibrovanou gradientovým pufrem A (0.7M octan, 25mM MOPSO, pH 7). Kolona byla promyta klesajícím gradientem od 90 % gradientového pufru A (0.7M octan. 25mM MOPSO, pil 7) do 10 % grád iontového pufru B (25mM MOPSO. pH 7.20% propylenglykol). Jako náhrada mohou být použity ostatní glykoly, jako je hexylenglvkol. Promývání je většinou prováděno asi 2 až 3 objemy kolony nebo tak dlouho, než. je základní čára absorbanee stabilní. Promytím se odstranily některé proteiny hostitelské buňky. Vázaný NGF byl eluován 10 objemy kolony lineárního gradientu od směsi 90 % gradientového pufru A a 10 % gradientového pufru B do směsi 10 % gradientového pufru Λ a 90 % gradientového pufru Β. V pufreeh pro HIC mohou octan nahradit Nad nebo síran sodný. pH je výhodněji v rozmezí od asi 5 do 8, ještě výhodněji od 5,5 do 7.5, s akceptovaným pi l 6 až 8 a nejvýhodněji okolo 7. Kolona separovala jakékoliv zbývající prekurzorové sekvence, částečné sekvence prekurzoru nebo glykosylované formy, přítomné jako homodimer nebo heterodimer monomeru zralého NGF. a monomer NGF, který' má stále přítomnou část sekvence prekurzoru. Prekurzor a glykosylované formy NGF jsou přítomny ve frakcích na počátku elučního píku, takže, aby byly převážně tyto druhy vyloučeny, byly frakce obsahující NGF spojeny.
-24CZ 300296 B6
Frakce spojené po HIC obsahovaly asi 72 % 120 aminokyselinového monomeru, 17 % 118 aminokyselinového monomeru, 2.8 % 117 aminokyselinového monomeru, 3,6 % R120 monomeru, 0,8 % isoasp. forem, 1,3 % oxidovaných forem a 1 % deamidovaných forem, které byly separovány a detekovány na analytickém HPLC systému.
Chromatografic na koloně SP-Sepharose HP
Frakce, obsahující NGF, z kroku HIC, byly spojeny dohromady. Vc velkém měřítku toho bylo dosaženo tak. že efluent byl v odpovídajícím čase odváděn z kolony do zásobního tanku, pi l io spojených frakcí bylo upraveno na pH 6 a frakce byly aplikovány na chromatografíckou kolonu
SP-Sepharose HP. Kolona byla promyta roztokem 20mM sukcinátu, 0,2M NaCI pH 6 (gradientovy pufr A). Vázaný NGF byl eluován 22 objemy kolony gradientu, začínajícího směsí 70 % gradientového pufru A a 30 % gradientového pufru B a končícího směsí 80 % gradientového pufru B (0,7M NaCI pH 6) a 20 % gradientového pufru A. pH jc výhodněji v rozmezí od pH
5 do 8, ještě výhodněji pil 5,7 až 6,5 a nejvýhodněji pfl 6. Reprezentativní chromatogram je ukázán na Obrázku 1,
Spojené frakce po chromatografií na SP-Sepharose IIP běžně obsahovaly asi 95 % 120 aminokyselinové formy, 3 % R120 formy, 0,65 % isoasp formy, 0,6 % oxidované formy, 0,6 % deami20 dováné formy. Ostatní neidentifikované formy NGF byly přítomny v množství asi 0,6 % a obsahovaly dioxidovaný NGF (Met 37 a Met 92) s deamidovaným Asn45. HPILX analýza, která porovnává reprezentativní spojené frakce po HIC (nanesené na pryskyřici SP-Sepharose) a spojené frakce, získané po chromatografií na SP-Sepharose je ukázána na Obrázku 2. Každá z těchto tři zkrácených hlavních forem NGF, 120, 1 18 a I 17, může mít varianty. Varianty převládající zkrácené formy (v tomto příkladu 120 formy), jako jsou oxidované a isoasp. formy, mohou během purifikacc rušit analýzu variant z méně převládajících forem (v tomto příkladu 118 a 117 formy). HPLC analýza frakcí z reprezentativního chromatografického běhu je ukázána na Obrázku 3.
.ni SP Sepharosa HP účinně odstraňovala varianty, přítomné ve frakcích spojených po HIC. R120 forma NGF má doplňkový argininový zbytek na N konci; obvykle je N- koncová aminokyselinová sekvence rliNGF SSSHP. ale R120 má N-koncovou sekvenci RSSSHP. Proto jc forma R120 zásaditější než zralý NGF a byla separována SP—S! IP chromatografií. Má také nižší bioaktivitu, což pravděpodobně souvisí s faktem, že N-konec NGF je nezbytný pro vazbu receptem (trkA). Oxidovaná forma NGF je monooxidovaná. a má methionin v pozici 37 oxidovaný, a vzniká v kyselejší formě než ta, která se eluuje na počátku píku NGF. Isoasp. forma obsahuje modifikaci kyseliny asparagové na 93 aminokyselině. Isoasp forma je nepatrně zásaditější, a proto se váže nepatrně slaběji na pryskyřici SP-Sepharose HP. NGF druhy, obsahující isoAsp93. se eluovalv v závěrečné Páži eluěniho piku. Deamidace probíhá na asparaginových zbytcích, vět4d šinou na asparagínu v pozici 45. NGF, obsahující deamidovaný Asn, který poskytuje Asp v pozici 45. jc nepatrně kyselejší a objevuje sc na počátku eluěniho píku.
Pro separaci nabitých variant NGF druhu je méně upřednostňovaná alternativní pryskyřice k SPSepharose HP pryskyřice Fraclogcl EMD SO3. Je-li použita méně upřednostňovaná pryskyřice, jsou třeba pro eluci NGF vyšší koncentrace NaCI.
Formulace
Celý materiál byl formulován pomocí UL/DL do formulačního pufru. stejně jako v předchozím
5(i Příkladu, V konečném produktu se obsah formy 120 pohyboval v rozmezí od asi 92 do 97 %, formy R120 od asi 1 do 4 %, isoasp. formy od asi 0,2 do 1,5 %, oxidované formy od asi 0,2 do 2 % a deainidované formy od asi 0.2 do 2 %. Obsah I 17 a 118 aminokyselinových forem byl běžně nižší než asi 2 %. Čistota konečného produktu NGF byla běžně alespoň 99,5 % (včetně všech druhů).
- 5>5 CZ 300296 B6
Příklad lil. Izolace 118/118
Aby byla získána převážně čistá kompozice NGF 118/118. která je převážně bez obsahu NGF variant, byla v jednom upřednostňovaném provedení použita metoda z Příkladu 11 s následujícími modifikacemi. Kolona s imobilizovaným trypsinem je použitá mezi ehromatografií na koloně Macroprep High S a ehromatografií na koloně sílikagelu. Spojené frakce po ehromatografií na koloně Macroprep jsou přímo naneseny na kolonu s imobilizovaným trypsinem, po úpravě pil na hodnoty asi 5 až 8.5. typičtěji pil 6,5 až 7.5, je-li to nezbytné. Spojené frakce procházely kolonou a většina NGF byla v průběhu konvertována na 118 aminokyselinovou formu. Proteáz.ové štěpení přeměňuje štěpením na C-konci VRRA na VR 120 aminokyselinovou formu na 118 aminokyselinovou formu. Pro dosažení limitovaného a selektivního štěpení byly použity trypsin nebo trypsinu podobná proteáza, výhodněji trypsin, ještě výhodněji snadno dostupný prasečí trypsin nebo alternativně hovězí nebo rekombinantní trypsin. Může být použita jakákoliv proteolytieká metoda, která poskytuje převážně limitované a selektivní štěpení, ale upřednostňovaná jc kolona s imobilizovaným trypsinem, aby byla minimalizována kontaminace preparátu NGF. Chromatografie byla prováděna při pH napomáhajícím proteázové aktivitě, výhodněji pH 5,5 až 8,5, ještě výhodněji 6.0 až 8.0 a nejvýhodněji 6.5 až 7,5.
V tomto příkladu by! odstraněn glykosylovaný NGF' HIC. jak je zde diskutováno. Následovala chromatografíe na koloně SP-Sepharose HP, jak je diskutováno v Příkladu 11, ale kompozice NGI·’, upřednostňovaná pro klinické použití, byla získána výhodněji použitím 22 objemů kolony 0,3M až 0.55M gradientu soli. Může být získána kompozice s obsahem více než 70 % 118 aminokyselinového monomeru, méně než 10 % 120 aminokyselinového monomeru a méně než 15 % 117 aminokyselinového monomeru, jak bylo stanoveno HPLC. Většinou jsou získány kompozice s obsahem 90 % nebo více 118/1 18 rliNGF obvykleji 93 % nebo víee 118/118 rhNGF s obsahem stejným nebo menším než 70 % deamidovaných, isoasp a oxidovaných variant. To znamená, že pro dosažení vyšší čistoty je třeba se vyvarovat selekce frakcí s významným množstvím variant jako jsou ty, které mohou být nalezeny v počátečních nebo konečných frakcích hlavního neurotrofinového píku, např. píku pro 118/1 18 formu rhNGF.
Příklad IV. Částečná purifikace rhNT-4/5 z bakteriálních inkluzních tělísek a jeho znovusvinutí
V tomto příkladu byl puntíkován rhNT-4/5, který byl produkován během fermentace 10 nebo 60 litrů. Hostitel, ve kterém byl během fermentace produkován rekombinantní lidský NT-4/5. byl kmen E.coli, označený 27C7/pmNT5DT; přesto je ΝΊΜ/5. produkovaný ostatními kmeny a organismy, vhodný pro zde popsaný purifikaění proces. Expresní plazmid, použitý v tomto příkladu obsahoval sekvenci, která kóduje zralý NT-4/5 pod kontrolou transkripěníeh a translačníeh sekvencí, požadovaných pro expresi genu pro NT 4/5 v E.coli. V plazmidu, ve kterém je exprimován NT-4/5. byly poskytovány transkripční sekvence, použité pro expresi genu v E.coli, sekvenci promotoru alkalické fosfatázv. Lambda transkripční terminátor byl situován vedle terminačního kodónu NT-4/5. Sekrece proteinu z cytoplasmy byla řízena S TU signální sekvenci. Většina rbNT 4/5 byla nalezena v buněčném periplazmatickém prostoru v podobě nezlámaných tělísek. Plazmid propůjčil transformovanému hostiteli rezistenci k tetraeyklinu. Fermentacní proces probíhal při 35 až 39 °C a pi l 7,0 až 7,8. Fermentace probíhala 25 až 40 hodin, a kultura byla před sklizením vychlazena, Kultura byla tepelné Zaktivována pří 60 °C použitím kontinuálnčprůtoěné aparatury nebo uvnitř tanku po dobu 5 až 15 minut. Tepelně inaktivovaná kultura byla odstředěna v odstředivce AX Alpha-laval nebo podobné. Buňky E.coli byly získány v peletě.
Buňky E.coli, exprimující rekombinantní lidský ΝΊΜ/5 v inkluzních tělískách, byly lyžovány standardními postupy a byla získána pasta, obsahující NT-4/5 v inkluzních tělískách. V pufru nebyly obsaženy žádné inhibitory- proteáz.
Při izolaci inkluzních tělísek ze zbytků buněk byla pasta E.coli s NT-5 použitím rotačního mechanicky disperguj íeího zařízení např. Turrax, restispendována v roztoku 0.02M Tris, pH 8,
-26CZ 300296 B6
5mM EDTA (10 ml pufru/gram pasty). Suspenze buněk byla 3x protlačena mikrofluidizerem při tlaku 6000 psi. Vzniklý homogenát byl odstředěn na centrifuze Servali RC-3B při 5000 rpm po dobu asi 45 min. Supernatant dále nebyl používán a peleta byla 2 až 3 min resuspendována v roztoku 20mM Iris, pil 8, 5mM EDTA (extrakční pufr) použitím zařízení turrax při střední rychlosti. Homogenát byl odstředěn výše popsaným způsobeni. Peleta byla resuspendována v extrakčním pufru a odstředěna výše popsaným způsobem. Vznikající peleta (pelety) (označované jako NT-4/5 inkluzní tělíska nebo nezlámána tělíska) byla skladovány při -70 °C.
NT-E5 byl izolován z inkluzních tělísek následujícím postupem. Pelety ínkluzního tělíska byly io resuspendovány v roztoku 20mM Tris, pH 8, 6M močoviny, 25mM DTT (10 ml pufru/gram
Ínkluzního tělíska) v zařízení turrax při střední rychlosti po dobu asi 10 min. Suspenze byla míchána 40 min při 2 až 8 °C a odstředěna v odstředivce Servali RC3B při 5000 rpm asi 45 min. Do supernatantu byl přidán PE1 (polyetylenimm) do koncentrace 0,1% a roztok byl míchán při 2 až 8 °C 30 minut. PEI sráží nukleové kyseliny a ostatní kyselé nabité molekuly . Směs byla iš odstředěna v odstředivce Servali RC3B při 5000 rpm po dobu asi 45 minut. PE] supernatant byl nanesen na kolonu DEFF Sepharose Kast Elow (10 cm x 14 cm; DEEE je dietyl aminoctyl pryskyřice) ekvilibrovanu v0.02M Tris. 6M močovině, lOmM DTT, pH 8. Ekvivalent k 1 kg rozpuštěných nezlámaných tělísek byl nanesen na kolonu DEEP. Protože se redukovaný a denaturovaný NT-4/5 neváže na kolonu DEFE, vzorek, který prošel kolonou bez zadržení a obsahoval
NT4/5 a 6M močovinu, byl spojen dohromady (Obrázek 6) a pH bylo upraveno kyselinou octovou na pil 5. Frakce s upraveným pil byly po ehromatografií na koloně DEFF za podmínek, za kterých se NT-4/5 váže na pryskyřici, naneseny na kolonu S-Sepharosc East Elow (S značí SO3 funkční skupiny na pryskyřici), ekvilibrovanou v 20mM octanu pH 5, obsahujícím 6M močovinu. Po nanesení byla kolona S-Sepharose East Elow promyta několika objemy ekvilibračního pufru. Vázaný ΝΊΜ/5 byl eluován roztokem 0.5M NaCI, 20mM octanu sodného, 6M močoviny pH 5 (Obrázek 7). Frakce spojené po ehromatografií, eluované 0.5M NaCI, byly dialyzovány přes noc proti roztoku 20mM Tris, 0.14M NaCI, pli 8, za podmínek, které umožňují NT-4/5 znovu se svinout, i když třeba chybně. Chybně svinuté molekuly rhNT-4/5 agregovaly za tvorby precipitátu.
5(1
Aby byl získán správně svinutý NT-4/5, byl agregovaný, chybně svinutý rhNT 4/5 dále zpracováván. Agregovaný, chybně svinutý rhNT—4/5 byl odstředěním shromážděn ve formě pelety. Peleta by la resuspendována v roztoku 0.2M I ris, pH 8. 4M močoviny, 5mM DII a míchána při 2 až 8 °C po dobu asi I až 2 hodiny nebo tak dlouho, dokud nebyla peleta rozpuštěna. Na základě hodnoty extinkčního koeficientu při 280 nm 1,8 byla konečná koncentrace proteinu upravena přibližně na 10 mg/ml. Do roztoku rozpuštěné pelety byl přidán oxidovaný glutation do konečné koncentrace 20mM a následovalo jemné míchání po dobu 15 až 30 minut při teplotě 2 až 8 °C. Oxidovaný glutathion reaguje se sulfhydrylovými skupinami NT—4/5 a vzniká směsný disulťid NT-4/5-S glutathion. Směsný disulfid N IM/5-SG byl zředěn na konečnou koncentraci proteinu
4(i 0.1 až 0.5 mg/ml roztokem lOOniM Tris, 20mM glycin 15% PEG-300. IM guanidin IICE, pH
8.3. Pro zahájení vlastního procesu znovusvinování NT-4/5. byl do směsi přidán cystein v koncentraci 2 až 4mM, následovalo provzdušfiování (probubláváním) roztoku dusíkem nebo heliem po dobu 5 až 60 minut před tím, než byla nádoba uzavřena, aby byl vyloučen přístup kyslíku. Znovusvinování NT 4/5 probíhalo 18 až 24 hodin při 2 až 8 °C.
Příležitostně byl rhNT—4/5 znovu svinován použitím sulfitolýzy. a to následovně: Pelety inkluzního tělíska (I 10 g) byly resuspendovány v 1.1 litru roztoku 20rnM I ris, 7M močovina, lOmM glycin). ΙΟΟιηΜ siřičitan sodný, lOmM tetrathionát sodný a solubilizovány v zařízení turrax 10 min při střední rychlosti. Směs (1260 ml) byla míchána při 2 až 8 °C po dobu 45 min. Byl přidán
PEI do konečné koncentrace 0,1%. Směs byla míchána dalších 30 minut při 4 °C’ a odstředěna 45 minut při 5500 rpm v odstředivce RC3B. Supernatant byl nanesen na kolonu DEFF (4,4 cm x 25 cm), ekvilibrovanou roztokem 20mM iris, 6M močovina, pil 8. pil vzorku, který' protekl kolonou bez zadržení, bylo upraveno kyselinou octovou na pH 5 a vzorek by l nanesen na kolonu
S-Scpharose East Elow (4,4 cm x 25 cm), ekvilibrovanou roztokem 20mM octanu. 6M močovi55 na, pH 5. NT 4/5 byl eluován roztokem 25mM MOPSO. 0.5M NaCI, pH 7.
-27CZ 300296 B6
Frakce, spojené po chromatografií na koloně SSFF. obsahující 0,5M NaCl a sulfonylovaný rhNT-4/5, byly zředěny na koncentraci proteinů asi 0,1 mg/ml a převedeny do roztoku IM guanidin hvdrocblorid, lOOmM I ris. 20mM glycin, 15% PFG-300. pH 8,3. Znovusvinování NTs 4/5 bylo odstartováno přídavkem 2 až4mM cysteinu. Proces znovusvinování byl téměř úplný po hodinách. Aby hyl odstraněn kyslík z roztoku, může být provedeno vzdušnění inertním plynem. např. heliem nebo dusíkem.
io Příklad V. Izolace správně svinutého rliN'IM/5 od konfrontačních (chybně svinutých) variant
Směs znovusvinutých rhNT-4/5 z Příkladu IV byla přes noc dialyzována proti roztoku o pH až 5 proto, aby byl odstraněn guanidin a ostatní činidla. Pro vyčerení roztoku byl roztok buď odstředěn 45 minut při 5000 rpm, nebo přefiltrován přes filtr s velikostí pórů 0.2 pni.
pH vyčeřeného supernatantu. obsahujícího 0.5 až 5 gramů proteinů, bylo upraveno přídavkem gJaeiúlní kyseliny octové na pi l 3 až 5 a vzorek byl buď nanesen na kolonu (1 RP-HPLC. nebo skladován zmražený při -20 C. V tomto příkladě byl okyselený a vyčeřený roztok nanesen na kolonu ('4 RP-HPI.C (3 cm x 50 cm), na jejíž pryskyřici se váže svinutý rliNT 4/5. Správně svinutý NT-4/5 byl eluován použitím rozpoušlědlového systému s acetonitrilovým gradientem v
0.05% Irifluoroelové kyselině ( FFA): 26 až 40% aeetonotrilový gradient (během 95 min) v
0,05% FFA při průtoku 25 ml/min. frakce byly sbírány v I až 1.5 minutových intervalech.
(Obrázek 8). Frakce byly analyzovány z hlediska správně svinutého NT-4/5 srovnáním elučních časů na analytické koloně C4 HPLC Vvdac (0,21 x 15 cm) s eluěním časem standardu správně svinutého NT-4/5 (Obrázek 9). Standard správně svinutého neporušeného NT 4/5 je většinou eluován v 19. minutě, při průtoku 2,5 ml/min. pufrovacim systémem 0.5% TFA/acctonílril. Frakce, obsahující správně svinutý rhNT—4/5. byly spojeny a pfl bylo upraveno na 5 až 7. Tento vzorek správně svinutého rhNT—4/5 také obsahoval karbamylované a na N-konci zkrácené formy N ΊΜ/5.
Pryskyřice pro preparativní chromatografií na reverzní fázi je výhodněji médium, mající průměr částic přibližně 10 až 40 mikronů, velikost pórů asi okolo 200 až 400 Angstromú a C4, C8 nebo C 18 alkylové skupiny. Ještě výhodněji má pryskyřice průměr částice přibližně I 5 až. 40 mikronů a velikost pórů asi okolo 300 Angstromú a je to C4 silikagelové médium
Příklad VI. Alternativní izolace správně svinutého rhNT-4/5 od konformaěních (chybně svinutých) variant
Směs znovu svinutých rhNT—4/5 z Příkladu IV byla zahuštěna přibližně lOx v ultraílItraěním zařízení MiIIipore-PelIicon s cclulózovou (nebo polysulfónovou nebo ekvivalentní) membránou (20 ft ) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 kDa. Před tím. než byla zahuštěná směs přefiltrována přes membránu s velikostí pórů 0,2 mikronů, byla buď přes noc dialyzována proti 50 I roztoku 50mM octanu. pil 5,5, 50mM NaCl nebo diafiltrovánado roztoku 50mM oetanu. 50mM
NaCl, pl 15,5.
Přefiltrovaná, znovusvinutá směs byla převedena do roztoku 2,5M NaCl. 20mM MGPSO, pH 7 a nanesena na kolonu pro IIIC Phcnyl Toyopearl 650M (10 cm x 19 em). předem ekvilibrovanou roztokem 2.5M NaCl, 20mM MOPSO. pH 7. Kolona byla dále promyta ekvilibračníin pufrem.
Některé nesprávně svinuté formy molekuly rhNT-4/5 byly eluovánv ve trakcích, které prošly kolonou bez zadržení, zatímco ostatní chybně svinuté formy byly eluovánv vysokými koncentracemi organických rozpouštědel, jako je 20 až 40% alkohol. Správné svinuty rhNT -4/5 byl z fenylové kolony eluován roztokem 2M NaCl, 10 % alkoholu, pH 7 (Obrázek 10). Místo nosiče loyopearl mohou být použity jiné pryskyřice s imobilizovanými fenylovými skupinami, jako je
Phenyl Sepharose. Mohou být použity výše diskutované soli, včetně síranu amonného, citrátu.
-28 CZ 300296 R6 octanu a chloridu draselného. V závislosti na typu použité soli je koncentrace soli většinou 1 až 3M s koncentrací NaCI 2,5M, upřednostňovanou pro nanesení a 2M NaC'1, upřednostňovanou pro eluci, je li přítomno organické rozpouštědlo, Pro eluci a separaci neurotrofinu a jeho variant je výhodněji používána klesající koncentrace soli. Aby bylo dosaženo eluee, je koncentra5 ce soli v elučním pufru většinou nižší než v nanášecím pufru, ale je-li vykompenzována organickým rozpouštědlem, muže být i stejná. Jak bylo zjištěno, použití organického rozpouštědla má ještě další výhodu. Přídavek organického rozpouštědla totiž zlepšuje eluční záznam tím, že poskytuje užší profil píku. Kromě ctanolu mohou být použita výše diskutovaná ostatní organická rozpouštědla včetně propanolu. isopropanolu a nižších alkylenových glvkolů. jako je propylcniu glykol, etylenglykol a hexylenglykol. Správně svinutý neurotrofin budou většinou eluovat organická rozpouštědla v koncentracích 5 až 25 % (v/v), výhodněji 5 až 20 % (v/v) a ještě výhodněji 5 až 1 5 %. Eluee organickým rozpouštědlem může být bud’ gradientova, nebo nespojitá. Rozsah pil je výhodněji v oblasti blízko neutrální až slabě kyselé, od pil 5 do 8. ještě výhodněji pH
5,5 až 7.5 a nejvýhodněji pil 7. Dokud pufrujc požadované pH, může být použit jakýkoliv i výše diskutovaných pufru včetně MOPSO. MOPS, HEPES. fosfátového, citrátového a acetátového.
Příklad VII. Purifikace správně svinutého rhNT 4/5 od chemických variant
2ii Separace správně svinutého neporušeného rhNT—4/5 od jeho chemických variant včetně karbamylovaných a na N-konci zkrácených forem rhNT 4/5 bylo dosaženo vysokoúčinnou ionexovou chromatografií na katexové pryskyřici SP-Sepharose IIP nebo PolyCat.
Je li pro odstranění chybně svinulých variant použita kolona C4 RP-IIPLC. jsou frakce po této ?5 chromatografii spojeny dohromady a pil upraveno na pil 5 až 7. Vzorek byl nanesen na kolonu SP Sepharose o rozměrech 7 em x 19 cm, ekvilibrovanou roztokem 20mM sukcinátu, pil 6,5 % alkoholu a 0.2M NaCI. Pryskyřice s navázaným NT—1/5 byla promyta ekvilibračním pufrem. Vázaný rhNT-4/5 byl eluován a separován od karbamylovanýeh a na N-konci zkrácených forem použitím 22 objemů kolony (CV) gradientu od 0,2M NaCI do 0,4M NaCI při pil 6 (tzn. gradient w soli v ekvilibračním pufru) (Obrázek 1 I), frakce, obsahující NT 4/5. byly spojeny dohromady a formulovány do 0,05M octanu, pH 4 až 5. Neporušený rhNT-4/5 byl ve frakcích identifikován a rozlišen od variant výhodněji analytickou RP-IIPLC nebo SDS elektroforézou porovnáním se standardem.
Variantní formy NT-4/5 byly příležitostně odstraněny vysokoúčinnou ionexovou chromatografií na katexu, na koloně s polyasparagovou kyselinou (Póly CAT a PolxLC. Coumbia, Md.) (9,4 x 200 mm) (Obrázek 12). pil frakcí po C'4 UPEC bylo upraveno na pil 5 až 6 a vzorek byl poté nanesen na kolonu Polyeat. Chromatografieké podmínky byly; Pufr A byl 20mM fosfát, 5% acetonitril. pil 6; Pufr B byl 20mM fosfát. 5% acetonitril, 0.8M KCI. pil 6. rhNT—1/5 byl eluo40 ván použitím gradientu 25 až 60 % pufru B po dobu 60 min (Obrázek 12). Frakce byly sbírány v I minutových intervalech a analyzovány analytickou chromatografií na koloně C4. jak je popsáno výše.
Byla—li použita pro odstraněni chybně svinulých variant HIC (Příklad VI). frakce, obsahující správné svinutý NT-4/5, byly dialyzovány přes noc proti roztoku 20inM sukcinátu, 0,1 M NaCI, 5 % alkoholu, pH 6 nebo ultrafíltrovány/diafiltiOvánv do 20mM sukcinátového pufru. Dialyzovanc nebo UF/DF frakce byly poté naneseny na kolonu SP-Sepharose nebo PolyCAT, jak jc popsáno výše.
Formulace.
Frakce, obsahující správně svinutý, neporušený NT—4/5 (z HPLC kroku na SP Sepharose HP nebo PolyCAT), byly spojeny a zahuštěny ve 20mM aeetálovém formulačním pufru, pH 4 až 5 na koncentraci I až 5 mg/ml. Příležitostně byl NT-4/5 formulován použitím ultrafiltra55 ce/d i a filtrace.
- 29 CZ 300296 B6
Cely konečný roztok byl analyzován aminokyselinovou analýzou. N-koncovou sekvenční analýzou, hmotnostní spektrometrií, SDS elektroforézou (Obrázek 13) a biologickými stanoveními. Pro charakterizaci puntíkovaného rhNT-4/5 bylo použito stanovení aktivace kinázového reccp5 tem (KIRA), který detekuje aktivaci autofosfbrylace tyrosin kinázových receptem (trkB) ΝΊΜ/5, lokalizovaných v buněčné membráně. Byly použity CHO buňky, které exprimují trkB s gD tag. WO 95/14930. publikovaný 1. června 1995, popisuje KIRA stanovení a jc zde začleněn jako odkaz. rhNT-4/5 měl v tomto stanovení hodnotu EC50 12,6 ng/ml. Typická hodnota EC'50 správně svinutého neporušeného NT—4/5. puntíkovaného stejným způsobem jaký je zde popsaný, je io 5 až 30. ještě výhodněji 10 až 20.
Čistota rhNT 4/5 s ohledem na jiné proteiny než NT-4/5 byla včlšinou 90 až 99 %. Homogenita NT-4/5 s ohledem na karbamy lované a na N-konci zkrácené varianty byla od 90 do 99 %. Nejtypičtěji a výhodněji jsou čistota a homogenita 99 % a vyšší.
Příklad Vlil. Úvodní purifikace. znovusvinutí a konečná purifikace rhNT 4/5 z bakteriálních inklu/níeh tělísek /o Aby byla izolována inkluzní tělíska z buněčných zbytků, byla pasta (1 kg) NT-3 z E. eoli resuspendována v 10 1 lOOmM octanu sodného, pH 5 v rotačním mechanickém disperzním zařízení např. turrax. Buněčná suspenze by la 3x protlačena mikrofluidizerem při tlaku 6000 psi. Vzniklý homogenát by l odstředěn v odstředivce Servali RC' 3B při 5000 rpm 30 minut.
NT-3 byl izolován z inkluzních tělísek následovně. Pelety inkluznich tělísek by ly suspendovány do roztoku lOOmM Tris, lOOmM NaCI, 5mM EDTA, lOOmM siričitan sodný 7,5M močovina, pH 8,3 (10 ml/grain inkluzních tělísek) v zařízení turrax při střední rychlosti po dobu asi 10 minut. Suspenze by la míchána asi I hodinu při 2 až 8 °C. PEI (polyetyIcniinin) by l přidán do přibližně 0,15% (konečná koncentrace) a míchán při 2 až 8 °C 30 minut. Směs byla odstředěna na .tu odstředivce Servali RC3B při 5000 rpm po dobu asi 30 minut. Supernatant byl přefiltrován přes kolonu Gelman Preflow. Přefiltrovaný supernatant byl naředěn 3 objemy ekvilibračního pufru pro chromalografii na koloně S-Sepharose Past Flow (5mM oclan sodný, 5M močovina, pH 5). Naředěný přefiltrovaný supernatant (vodivost menší než 7 mS) je nanesen na kolonu S-Sepharose FF, ekvilibrovanou roztokem 50mM octan sodný, 5M močovina, pi l 5. Kolona byla nejdříve t? promyta roztokem 50mM octan sodný, 5M močoviny, pil 5, následovalo promytí roztokem 50mM MOPS, 5M močoviny. lOmM glycinu, pil 7. Sulfitolyžovaný NT-3 byl eluován z kolony použitím 10 objemů kolony gradientu 0 až 0,6M NaCI v roztoku 50mM MOPS. 5M močoviny,
OmM glycinu, pi l 7.
m Částečně purifikovány NT-3 byl znovusvinut zředěním spojených frakcí po chromalografii na koloně S-Sepharose FF na koncentraci proteinu přibližně 0.1 mg/ml v pufru pro znovusvinování, obsahujícím 0,1M Tris, 2M močovinu, 0.1M NaC'1, 15% PEG 300, lOmM glycin. 25mM etanolamin, pil 9,1. Znovusvinování bylo iniciováno přídavkem cysteinu do koncentrace přibližně 5mM a mícháno při 2 až 8 °C podobu 2 až 5 dní. Aby byla snížena koncentrace kyslíku v rozto45 ku, kde dochází ke znovusvinování, může být pufr. ve kterém proces znovusvinování probíhá, probubláván heliem nebo argonem.
pil preparátu po svinutí bylo upraveno na hodnotu pil 7, vzorek byl přefiltrován a nanesen na kolonu pro ionexovou chromatograIIi na katexu Macroprep High S, ekvilibrovanou v 50mM
11EPES, pH 7. Po nanesení preparátu s upraveným pH na kolonu Macroprep by la kolona nejdříve promyta 50mM MOPS, pH 7, následovaly 5()mM MOPS. 0,1M TMAC. 0.3M NaCI. pil 7. NT-3 byl eluován roztokem 50mM MOPS, 0.25M TMAC, 1,5M NaCI. pH 7.
Frakce spojené po chromatografií na koloně Macroprep byly dále purifikovaný na koloně Phenyl
Sepharose Past Flow High Substitution. Kolona byla ekvilibrována roztokem 50mM HEPES,
- 3« CZ 30(1296 B6 ] ,5M NaCI. pH 7 a frakce po této ehromatografii byly přímo naneseny na kolonu Phenyl-Scpharose. Kolona byla promyta ekvilibračním pufrem a potom byl správně znovusvinutý NT-3 eluován použitím 15 objemů kolony gradientu od 50mM HEPES, I.5M NaCI. pH 7 do 50mM HEPES, 10 % alkoholu. pH 7, frakce byly analyzovány bud’ C4 HPLC nebo SDS elektroforézou a frakce, obsahující správně svinutý NT-3, byly spojeny dohromady.
Frakce, spojené po ehromatografii na koloně Phenyl-Sepharosc, byly naředěný tak, aby vodivost byla menší než. 25 mS (většinou asi 2 objemy vody) a vzorek byl nanesen na kolonu SP- Sepharose HP, předem ekvilibrovanou 25mM MOPSO, pH 7. Kolona byla nejdříve promyta ekvilibio račním pufrem a NT-3 byl eluován použitím 20 objemů kolony gradientu od 0.35M I MAC do
0.65M TMAC v 25mM MOPSO. pil 7. Frakce, obsahující rhNT 3 (usuzováno podle výsledků
C4 HPLC), byly spojeny.
Frakce po chromatografií na koloně na SP-Sepharose HP byly zahuštěny na koncentraci asi 13 I mg/ml na membráně s vylučovacím limitem molekulové hmotnosti 10 000 a potom bylv diafiltrovány 6 objemy roztoku lOmM octanu. 140mM NaCI, pil 5,0.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Geneteeh, lne.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Purifikace neuiOtrofinů (iii) POČET SEKVENCÍ: 6 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Geneteeh, lne.
(B) ULICE; I DNAWay (C) MĚSTO: Jižní San Francisco (D) STÁT: Kalifornie
V) (F) ZEMĚ: USA (F) SMĚROVACÍ ČÍSLO: 94080 (v) POČÍTAČOVÉ ÚDAJE:
(A) TYP MEDIA: disketa 3.5 palce. 1.44 Mb floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Geneteeh) (ví) SOUČASNÁ APLIKAČNÍ DATA:
(A) ČÍSIT) APLIKACE:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) KLASIFIKACE:
(vii) PŘEDCHOZÍ APLIKAČNÍ DATA:
(A) ČÍSLO APLIKACE: 60/030838 (B) DATUM PODÁNÍ: 15. listopad 1996 (vii) PŘEDCHOZÍ APLIKAČNÍ DA1A:
(A) ČÍSLO APLIKACE: 60/047855 (B) DATUM PODÁNÍ: 29. květen 1997 (viii) ÚDAJE O PRÁVNÍM PORADCI:
(A) JMÉNO: Timothy E. Torchia, PhD.
- 31 C.7. 300296 B6 (B) ČÍSLO REGISTRACE: 36 700 (C) POŘADOVÉ/JEDNACÍ ČÍSLO: PIO63R2PCT (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ ÚDAJE:
(A) TELEFON: 650/225-8674 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMACE PRO SFO ID NO: 1:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 241 aminokyselin o (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: I:
| Met 1 | Ser | Met | Leu | Phe 5 | Tyr | Thr | Leu | Ile | Thr 10 | Ala | Phe | Leu | Ile | Gly 15 |
| Ile | Gyn | Ala | Glu | Pro | His | Ser | Glu | Ser | Asn | Val | Pro | Ala | Gly | His |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Thr | Ile | Pro | Gin | Val | His | Trp | Thr | Lys | Leu | Gin | His | Ser | Leu | Asp |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Thr | Ala | Leu | Arg | Arg | Ala | Arg | Ser | Ala | Pro | Ala | Ala | Ala | Ile | Ala |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Ala | Arg | Val | Ala | Gly | Gin | Thr | Arg | Asn | Ile | Thr | Val | Asp | Pro | Arg |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Leu | Phe | Lys | Lys | Arg | Arg | Leu | Arg | Ser | Pro | Arg | Val | Leu | Phw | Ser |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Thr | Gin | pro | Pro | Arg | Glu | Ala | Ala | Asp | Thr | Gin | Asp | Leu | Asp | Phe |
| 95 | 100 | 105 |
Ή
| Glu | Val | Gly | Gly | Ala 110 | Ala | Pro | Phe | Asn | Arg 115 | Thr | His | Arg | Ser | Lys 120 |
| Arg | Ser | Ser | Ser | His | Pro | lle | Phe | His | Arg | Gly | Glu | Phe | Ser | Val |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Cys | Asp | Ser | Val | Ser | Val | Trp | Val | Gly | Asp | Lys | Thr | Thr | Ala | Thr |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Asp | lle | Lys | Gly | Lys | Glu | Val | Met | Val | Leu | Gly | Glu | Val | Asn | lle |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| Asn | Asn | Ser | Val | Phe | Lys | Gin | Tyr | Phe | Phe | Glu | Thr | Lys | Cys | Arg |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Asp | Pro | Asn | Pro | Val | Asp | Ser | Gly | Cys | Arg | Gly | lle | Asp | Ser | Lys |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| His | Τφ | Asn | Ser | Tyr | Cys | Thr | Thr | Thr | His | Thr | Phe | Val | Lys | Ala |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Leu | Thr | Met | Asp | Gly | Lys | Gin | Ala | Ala | Trp | Arg | Phe | lle | Arg | lle |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| Asp | Thr | Ala | Cys | Val | Cys | Val | Leu | Ser | Arg | Lys | Ala | Val | Arg | Arg |
230 235 240
Ala
241 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:
(i) SEKVENČNÍ CIIARAK I ERISTiKY:
(A) DÉLKA; 120 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Eineanií (xi) POPIS SEKVENCE: SFQ IDNO:2:
Ser Ser Ser His Pro lle Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 1 5 10 15
C'Z 300296 B6
| Asp | Ser | Val | Ser | Val 20 | Trp | Val | Gly | Asp | Lys 25 | Thr | Thr | Ala | Thr | Asp 30 |
| Ue | Lys | Gly | Lys | Glu | Val | Met | Val | Leu | Gly | Glu | Val | Asn | Ile | Asn |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Asn | Ser | Val | Phe | Arg | Glu | Tyr | Phe | Phe | Glu | Thr | Lys | Cys | Arg | Asp |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Pro | Asn | Pro | Val | Asp | Ser | Gly | Cys | Arg | Gly | Ile | Asp | Ser | Lys | His |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Trp | Asn | Ser | Tyr | Cys | Thr | Thr | Thr | His | Thr | Phe | Val | Lys | Ala | Leu |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Thr | Met | Asp | Gly | Lys | Gin | Ala | Ala | Trp | Arg | Phe | Ile | Arg | Ile | Asp |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| Thr | Ala | Cys | Val | Cys | Val | Leu | Ser | Arg | Lys | Ala | Val | Arg | Arg | Ala |
| 110 | 115 | 120 |
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO; 3:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: l.ineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
| Ser 1 | Ser | Thr | His | Pro 5 | Val | Phe | His | Met | Gly 10 | Glu | Phe | Ser | Val | Cys 15 |
| Asp | Ser | Val | Ser | Val | Trp | Val | Gly | Asp | Lys | Thr | Thr | Ala | Thr | Asp |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| ile | Lys | Gly | Lys | Glu | Val | Thr | Val | Leu | Ala | Glu | Val | Asn | Ile | Asn |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Asn | Ser | Val | Phe | Arg | Gin | Tyr | Phe | Phe | Glu | Thr | Lys | Cys | Arg | Ala |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Ser | Asn | Pro | Val | Glu | Ser | Gly | Cys | Arg | Gly | Ile | Asp | Ser | Lys | His |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Trp | Asn | Ser | Tyr | Cys | Thr | Thr | Thr | His | Thr | Phe | Val | Lys | Ala | Leu |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Thr | Thr | Asp | Glu | Lys | Gin | Ala | Ala | Trp | Arg | Phe | Ile | Arg | Ile | Asp |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| Thr | Ala | Cys | Val | Cys | Val | Leu | Ser | Arg | Lys | Ala | Thr | Arg | Arg | Gly |
| 110 | 115 | 120 |
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 118 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární o (xí) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:
- 35 C7. 300296 B6
| His 1 | Ser | Asp | Pro | Ala 5 | Arg | Arg | Gly | Glu | Leu 10 | Ser | Val | Cys | Asp | Ser 15 |
| lle | Ser | Glu | Trp | Val | Thr | Ala | Ala | Asp | Lys | Lys | Thr | Ala | Val | Asp |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Met | Ser | Gly | Gly | Thr | Val | Thr | Val | Leu | Glu | Lys | Val | Pro | Val | Ser |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Lys | Gly | Gin | Leu | Lys | Gin | Tyr | Phe | Tyr | Glu | Thr | Lys | Cys | Asn | Pro |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Met | Gly | Tyr | Thr | Lys | Glu | Gly | Cys | Arg | Gly | Ile | Asp | Lys | Arg | His |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Tip | Asn | Ser | Gin | Cys | Arg | Thr | Thr | Gin | Ser | Tyr | Val | Arg | Ala | Leu |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Thr | Met | Asp | Ser | Lys | Lys | Arg | lle | Gly | Trp | Arg | Phe | Ile | Arg | Ile |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| Asp | Thr | Ser | Cys | Val | Thr | Leu | Thr | De | Lys | Arg | Gly | Arg | ||
| 110 | 115 | 118 |
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DEEKA: I 19 aminokyselin (Β) ΊΎΡ: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární η (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:
Cl 300296 136
| Tyr 1 | Ala Glu | His | Lys 5 | Ser | His | Arg | Gly | Glu 10 | Tyr | Ser | Val | Cys | Asp 15 | |
| Ser | Glu | Ser | Leu | Trp | Val | Thr | Asp | Lys | Ser | Ser | Ala | Ile | Asp | Ile |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Arg | Gly | His | Gin | Val | Thr | Val | Leu | Gly | Glu | Ue | Lys | Thr | Gly | Asn |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ser | Pro | Val | Lys | Gin | Tyr | Phe | Tyr | Glu | Thr | Arg | Cys | Lys | Glu | Ala |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Arg | Pro | Val | Lys | Asn | Gly | Cys | Arg | Gly | Ue | Asp | Asp | Lys | His | Trp |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Asn | Ser | Gin | Cys | Lys | Thr | Ser | Gin | Thr | Tyr | Val | Arg | Ala | Leu | Thr |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Ser | Glu | Asn | Asn | Lys | Leu | Val | Gly | Trp | Arg | Trp | Ile | Arg | Ue | Asp |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| Thr | Ser | Cys | Val | Ser | Ala | Leu | Ser | Arg | Lys | Ile | Gly | Arg | Thr | |
| 110 | 115 | 119 |
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:6:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 130 aminokyselin (R) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:
-37CZ 300296 B6
| Gly 1 | Val | Ser | Glu | Thr 5 | Ala | Pro | Ala | Ser | Arg 10 | Arg | Gly | Glu | Leu | Ala 15 |
| Val | Cys | Asp | Ala | Val | Ser | Gly | Trp | Val | Thr | Asp | Arg | Arg | Thr | Ala |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Val | Asp | Leu | Arg | Gly | Arg | Glu | Val | Glu | Val | Leu | Gly | Glu | Val | Pro |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ala | Ala | Gly | Gly | Ser | Pro | Leu | Arg | Gin | Tyr | Phe | Phe | Glu | Thr | Arg |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Cys | Lys | Ala | Asp | Asn | Ala | Glu | Glu | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Gly |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Gly | Gly | Cys | Arg | Gly | Val | Asp | Arg | Arg | His | Trp | Val | Ser | Glu | Cys |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Lys | Ala | Lys | Gin | Ser | Tyr | Val | Arg | Ala | Leu | Thr | Ala | His | Ala | Gin |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| Gly | Arg | Val | Gly | Trp | Arg | Trp | Ile | Arg | Ile | Asp | Thr | Ala | Cys | Val |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Cys | Thr | Leu | Leu | Ser | Arg | Thr | Gly | Arg | Ala | |||||
| 125 | 130 |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (2)
Hide Dependent
translated from
Claims (2)
Hide Dependent
translated from
1. /.působ izolace rekombinantního lidského neurotronu ze směsi, obsahující jiné proteiny a
10 variantu rekombinantního lidského neurotrofinu, a kde varianta je vybraná ze skupiny skládající sc z chybně svinuté varianty, proteolyticky zpracované varianty a glykosylačni varianty tohoto rekombinantního lidského neurotrofinu., vyznačující se t í m , že se roztok směsi obsahující rekombinantní lidský neurotrofin mající pil 5 až 8 a/nebo koncentraci soli 0.5až3M nanese na pryskyřici pro chromatografii s liydrofobní interakcí mající funkční skupinu vybranou
15 ze skupinv obsahující fenyl, alkoxy. propyl. butyl, oklyl a isoamyl. následně se pryskyřice promyje pufrem při pil 5 až. 8 a eluuje se rekombinantní lidský neurotrofin z pryskyřice pomocí elučního pufru obsahujícího alkoholické nebo polární aprotické rozpouštědlo o koncentraci 5 až 25 % objemových.
20 2. Zpu sob podle nároku 1. v y z n a č u j i c í se tím. že pryskyřice obsahuje fenylovou funkční skupinu.
3. /působ podle nároku I,vyznačující se t í m . že směs nanesená na pryskyřici má koncentraci soli 0,5 do 2.5M.
-38CZ 300296 B6
4. Způsob podle nároku 3, v y z n a č u j í c í s c t í m , že směs nanesená na pryskyřici má koncentraci soli 0.7M octanu nebo 1.0 až 2.5M NaCI.
5. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj í c í sc t í m , že alkoholické nebo polární aprotické rozpouštědlo je v množství 5 až 20 %, vyjádřeno v % objemových.
je v NGF nadrodině.
|5 9. Způsob podle nároku 8. v y z n a č u j í c í se t í m , že rekombinantní lidský neurotrofin je NGF. NT-4/5 nebo NT-3.
10. Způsob podle nároku 1. v y z n a č u j í c í se t í m , že rekombinantní lidský neurotrofin je připraven z bakteriální kultury a je znovusvinut in vitro před použitím pryskyřice pro chroma2ϋ togralii s hydrofobní interakcí.
11. Způsob podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m , že rekombinantní lidský neurotrofin je izolován z kultury savčích buněk.
25 12. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í ni, že dále obsahuje separaci ncurotrofinu od chemické varianty použitím vysokoúčinnč ioncxové chromatografie na katexové pryskyřici, kde chemická varianta se odlišuje od rekombinantniho lidského neurotrofinu nábojem, karbamylaeí, deaminaeí. oxidací, glykosylací, a proteolytickým štěpením.
so 13. Způsob podle nároku 12. vyznačuj ící se t í m , že separačni krok, zahrnující vvsokoůčimioLi ionexovou chromatografii na katexu. se skládá z nanesení směsi, obsahující rekombinantní lidsky neurotrofin a chemickou variantu tohoto rekombinantniho lidského neurotrofinu, na Latexovou pryskyřici pro vysokoúčinnou ionexovou chromatografií a z eluce rekombinantniho lidského neurotrofinu z pryskyřice, přičemž se rekombinantní lidský neurotrofin separuje od
55 chemické varianty, přičemž rekombinantní lidský neurotrofin má vysoké pí.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t í m . že pryskyřice pro vysokoúčinnou Latexovou chromatografii je SP Sepharose HP. pryskyřice s polyasparagovou kyselinou. Latexová pryskyřice polysulfoethyl nebo Fractogel EMD SO3 prysky řice.
15. Způsob podle nároku 13, vy zn ač u j í cí sc t í m , že eluát z vysokoúčinné ionexové chromatografie na katexové pryskyřici, obsahující rekombinantní lidský neurotrofin, je odsolen nebo podroben diafiItraci a následně formulován s nosičem.
45 16. Způsob podle nároku I. vyznačující se tím, že dále zahrnuje separaci rekombinantního lidského neurotrofinu od jiných proteinů za použití silikagelové pryskyřice před nanesením na pryskyřici pro chromatografii s hydrofobní interakcí.
17. Způsob izolace rekombinantniho lidského neurotrofinu podle nároku 1, vyznačující
5o se t i m . že zahrnuje první separaci neurotrofinu od jiných proteinů použitím silikagelové pryskyřice bez přítomnosti alkoholického nebo polárního aprotíckého rozpouštědla před použitím chromatografie s hydrofobní interakcí na pryskyřici.
18. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t í m , že neurotrofin a jeho varianta jsou
55 před separací téměř čisté.
-39CZ 300296 B6
19. Způsob podle nároku I, v y z. n a č u j í c í se t í m . že dále případně zahrnuje krok, ve kterém je separován neurotrofin od chybně svinutých variant tohoto neurotrofinu za použití preparativní kapalinové chromatografie na pryskyřici s reverzní fází.
20. Způsob podle nároku 19. v y z n a č u j í c í se t í ni. že pryskyřice obsahuje funkční skupinu C4.
21. Způsob čištění rekombinantního lidského neurotrofinu podle nároku 1, vyznačující io se t í m , žc zahrnuje:
(a) nanesení směsi, obsahující rekombinantní lidský neurotrofin a jeho varianty, na pryskyřici pro chromatografii s hydrofobní interakcí při pH 5 až 8:
(b) promylí pryskyřice pufrem při pH 5 až 8;
(c) eluci rekombinantního lidského neurotrofinu pufrem při p!4 5 až 8, obsahujícím alkoholické
15 nebo polární aprotieké rozpouštědlo o koncentraci 5 až 25 % objemových;
(d) nanesení eluentu, obsahujícího rckombinantní lidský neurotrofin, na pryskyřici pro vysokoúěinnou ionexovou chromatografii na katexu při pH 5 až 6; a (e) eluci rekombinantního lidského neurotrofinu z pryskyřice pro vysokoúčinnou ionexovou chromatografii na katexu pufrem při pil 5 až 6, obsahujícím kation o koncentraci 0,2 až
2(i 0,5 M.