EA017765B1 - КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СИАЛИРОВАННЫЕ МОЛЕКУЛЫ CTLA4-Ig, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

Abstract

Изобретение раскрывает композиции, содержащие сиалированные молекулы CTLA4-Ig, и их применение.

Description

Антиген 4 цититотоксических Т-лимфоцитов (СТЬА4) - член суперсемейства иммуноглобулинов является молекулой, экспрессируемой на активированных Т-лимфоцитах. СТЬА4 схож с молекулой костимулятора Т-лимфоцитов СЭ28. при этом обе молекулы связываются с В7-1 (СЭ80) и В7-2 (СЭ86) на антигенпредставляющих клетках (АПК). Однако СТЬА4 передает Т-лимфоцитам ингибиторный сигнал, а СЭ28 передает стимуляторный сигнал.

Молекулы СТЬА4-1д являются составными белками, которые включают домен антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬА4), связывающего лиганды, и постоянного участка тяжелой цепи иммуноглобулинов. Эта растворимая молекула оказывает физиологическое действие, связываясь с антигенами В7 (СЭ80 и СЭ86) на поверхности различных антигенпредставляющих клеток (АПК), таким образом, блокируя функциональное взаимодействие В7-1 и В7-2 с СЭ28 на поверхности Т-лимфоцитов. Такая блокада приводит к подавлению активации Т-лимфоцитов и, следовательно, подавлению иммунного ответа. Таким образом, молекулы СТЬА4-1д могут стать основой способа торможения реакций отторжения трансплантированных тканей и (или) органов, а также использоваться для лечения заболеваний или состояний, обусловленных нарушением регуляции иммунного ответа в целом, включая аутоиммунные заболевания, например, молекулы СТЬА4-1д могут подавлять выработку антител к двуспиральной ДНК и уменьшать выраженность нефрита у мышей, предрасположенных к красной волчанке; также они могут уменьшать протеинурию и увеличивать выживаемость у мышей с выраженным нефритом и улучшать исход лечения псориаза и ревматоидного артрита.

Чтобы повысить терапевтическую полезность молекул СТЬА4-1д, важно определить, какие изменения можно внести в молекулы для увеличения эффективности этой молекулы в качестве ингибитора стимуляции Т-лимфоцитов, например, за счет увеличения авидности и эффективности этих молекул в отношении антигенов В7. Увеличение авидности и эффективности молекул СТЬА4-1д, возможно, поможет вводить меньшее количество молекул СТЬА4-1д пациенту для достижения желаемого терапевтического эффекта (т.е. введение менее высокой дозы). Увеличение авидности и эффективности молекул СТЬА4-1д, возможно, также поможет уменьшить число введений или частоту применения, необходимые для достижения желаемого терапевтического результата у пациента.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение относится к улучшенным композициям и способам получения композиций, содержащих СТЬА4-1д. Данное изобретение относится к молекулам СТЬА4-1д, улучшенным композициям, содержащим молекулы СТЬА4-1д, и улучшенным способам получения (включая массовое производство) молекул СТЬА4-1д и других рекомбинантных белков.

Данное изобретение включает любые перестановки и (или) комбинации любого из элементов и характеристик, описанных в данном документе, либо описанных по отдельности, либо в определенных комбинациях или перестановках.

Клетки: данное изобретение позволяет получать клональную популяцию клеток яичника китайского хомяка, способную вырабатывать СТЬА4-1д. Данное изобретение позволяет получать клональную популяцию клеток яичника китайского хомяка, способную вырабатывать СТЬА4-1д, при этом каждая клетка содержит 30 или больше копий кассет экспрессии СТЬА4-1д. Данное изобретение также относится к клональной популяции клеток яичника китайского хомяка, способных вырабатывать СТЬА4-1д, при этом каждая клетка содержит 30 или больше копий кассет экспрессии СТЬА4-1д, где эти 30 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки. Данное изобретение также относится к клональной популяции клеток яичника китайского хомяка, способных вырабатывать СТЬА4-1д, при этом кассета экспрессии СТЬА4-1д стабильна на протяжении примерно 105 пассажей.

В одном варианте СТЬА4-1д кодируется кассетой экспрессии, включающей последовательность нуклеиновых кислот, описанную Кобил В. с соавт. (Сепе, 2001, 280:87-95) в патентах США 6800457 и 6521419, которые включены в данный документ в виде ссылок во всей полноте. В другом варианте СТЬА4-1д кодируется кассетой экспрессии, встроенной в клеточный геном из клеточной популяции в определенном локусе, описанном Кобшт В. с соавт. (Сепе, 2001, 280:87-95) в патентах США 6800457 и 6521419, которые включены в данный документ в виде ссылок во всей полноте. В одном варианте популяция включает субпопуляцию клеток, содержащих 33 или больше копий кассет экспрессии СТЬА4-1д, где 33 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки субпопуляции.

Данное изобретение позволяет получать клональную популяцию клеток яичника китайского хомяка, способную вырабатывать СТЬА4-1д, где по крайней мере 75% клеточной популяции содержат 30 или больше копий кассет экспрессии СТЬА4-1д, где 30 или больше копий интегрированы в единственном сайте в геноме каждой клетки 75% популяции. Данное изобретение позволяет получать клональную популяцию клеток яичника китайского хомяка, способную вырабатывать СТЬА4-1д, где по крайней мере 85% клеточной популяции содержат 30 или больше копий кассет экспрессии СТЬА4-1д, где 30 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки 85% популяции. Данное изобретение позволяет получать клональную популяцию клеток яичника китайского хомяка, способную вырабатывать СТЬА4-1д, где по крайней мере 95% клеточной популяции содержат 30 или больше копий кассет экспрессии СТЬА4-1д, где 30 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки

- 1 017765

95% популяции. В одном варианте клеточная популяция способа вырабатывать больше 0.5 г белка СТЬА4-1д на 1 л жидкой культуры, где СТБА4-[д проявляет приемлемые углеводные характеристики, где молярное отношение сиаловой кислоты к СТЬА4-1д составляет от 6 до примерно 14, когда объем культуры составляет 1000 л или больше. В другом варианте клеточная популяция адаптирована к бессывороточной среде с определенным химическим составом. В другом варианте СТЬЛ4-1д, полученный из культуры клеточной популяции, имеет коэффициент поглощения 1.00±0.05 ЛИ мл-см’¹-мг’¹. В другом варианте клеточная популяция, выращенная в культуре, способна вырабатывать полипептиды СТЬЛ4-1д, где: а) около 90% полипептидов СТЬЛ4-1д содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, начинающуюся с метионина в положении остатка 27; б) около 10% полипептидов СТЬЛ4-1д включают аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, начинающуюся с аланина в положении остатка 26; в) около 4% полипептидов СТЬЛ4-1д включают аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, заканчивающуюся лизином в положении остатка 383; г) около 96% полипептидов СТЬЛ4-1д включают аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, заканчивающуюся глицином в положении остатка 382; и, на выбор, д) примерно меньше 1% полипептидов СТЬЛ4-1д включают аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, начинающуюся с метионина в положении остатка 25.

Данное изобретение относится к клеточному потомству клональной клетки, где клеточное потомство вырабатывает СТЬЛ4-1д. В одном варианте клеточное потомство получают путем культивирования клональной родительской клетки на протяжении минимум 5 поколений. В другом варианте клеточное потомство получают путем культивирования клональной родительской клетки на протяжении минимум 10 поколений, на протяжении минимум 20 поколений, на протяжении минимум 40 поколений, на протяжении минимум 50 поколений, на протяжении минимум 75 поколений или на протяжении минимум 100 поколений. Данное изобретение относится к клеточной линии, получаемой из клональной клетки. В одном варианте клеточная линия является клональной. Данное изобретение относится к клеточной линии, способной вырабатывать: а) составной белок СТЬЛ4-1д, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:10 (метионин в аминокислотной позиции 27 и глицин в аминокислотной позиции 382; фиг. 1А и 1Б); б) составной белок СТЬА4-1д, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:7 (метионин в аминокислотной позиции 27 и лизин в аминокислотной позиции 383; фиг. 1А и 1Б); в) составной белок СТЬА4-1д, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:9 (аланин в аминокислотной позиции 26 и глицин в аминокислотной позиции 382; фиг. 1А и 1Б); г) составной белок СТЬА4-1д, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:6 (метионин в аминокислотной позиции 26 и лизин в аминокислотной позиции 383; фиг. 1А и 1Б); д) составной белок СТЬА4-1д, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:8 (метионин в аминокислотной позиции 25 и глицин в аминокислотной позиции 382; фиг. 1А и 1Б); или е) составной белок СТЬА4-1д, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:5 (метионин в аминокислотной позиции 25 и лизин в аминокислотной позиции 382; фиг. 1А и 1Б). В другом варианте клеточная линия способна вырабатывать составные белки СТЬА4-1д, где: а) около 90% полипептидов СТЬА4-1д содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, начинающуюся с метионина в остатке под номером 27; б) около 10% полипептидов СТЬА4-1д содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, начинающуюся с аланина в остатке под номером 26; в) около 4% полипептидов СТЬА4-1д содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, заканчивающуюся лизином в остатке под номером 383; г) около 96% полипептидов СТЬА4-1д содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, заканчивающуюся глицином в остатке под номером 383; и, на выбор, д) примерно меньше 1% полипептидов СТЬА4-1д содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2, начинающуюся с метионина в остатке под номером 25.

В другом варианте составные белки СТЬА4-1д, получающиеся из культуры клеточной популяции, характеризуются коэффициентом поглощения 1.00±0.05 Аи мл-см’¹-мг’¹. Данное изобретение относится к клеточной популяции - производному клональной клеточной линии. В одном варианте клеточная популяция содержит минимум одно генетическое изменение по сравнению с первоначальной клональной клеточной линией и где производная клеточная популяция способна вырабатывать СТЬА4-1д.

В другом варианте клеточная популяция содержит минимум 2, минимум 3, минимум 4, минимум 5, минимум 6, минимум 7, минимум 8, минимум 10, минимум 15 или минимум 20 дополнительных генетических изменений по сравнению с родительской клеткой, где производная клеточная популяция способна вырабатывать СТЬА4-1д. В одном варианте генетическое изменение включает как минимум одну неконсервативную мутацию в клеточном геноме или рекомбинантной кассете экспрессии, кодирующей СТЬА4-1д. В другом варианте генетическое изменение включает минимум одну дополнительную рекомбинантную нуклеиновую кислоту внутри клетки. Еще в одном варианте изменение включает мутацию клеточного генома. В другом варианте изменение заключается в добавлении нуклеиновой кислоты либо в клеточный геном, либо в виде транс-нуклеиновой кислоты, которая кодирует антиапоптозный полипептид. Еще в одном варианте антиапоптозный полипептид связан с гликозилированием. В другом варианте генетическое изменение заключается минимум в одной мутации клеточного генома или рекомбинантной кассеты экспрессии, кодирующей СТЬА4-!д.

- 2 017765

Композиции: данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет от примерно 6 до примерно 18. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ41д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет от примерно 8 до примерно 18. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет примерно от 11 до примерно 18. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет примерно от 12 до примерно 18. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет от примерно 13 до примерно 18. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ41д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет примерно от 14 до примерно 18. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет примерно от 15 до примерно 17. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТЬЛ4-1д или его молекуле, которое составляет примерно 16. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, где больше 95% молекул являются димерами СТЬЛ4-1д. В одном варианте больше 98% молекул СТЬЛ4-1д являются димерами. В другом варианте больше 99% молекул СТЬЛ4-1д являются димерами.

В другом варианте больше 99.5% молекул СТЬЛ4-1д являются димерами. В другом варианте от 95 до примерно 99.5% молекул СТЬЛ4-1д являются димерами, и примерно 0.5 до примерно 5% молекул СТЬЛ4-1д являются тетрамерами или другими высокомолекулярными формами. В другом варианте примерно 98.6% молекул СТЬЛ4-1д являются димерами, и примерно 1.2% молекул СТЬЛ4-1д являются тетрамерами или высокомолекулярными формами, и примерно меньше 0.7% молекул СТЬЛ4-1д являются мономерами. Данное изобретение относится к популяции, состоящей из димеров СТЬЛ4-1д. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, где эта популяция преимущественно не содержит мономеры. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, где эта популяция преимущественно не содержит тетрамеры СТЬЛ4-1д. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬЛ4-1д, где эта популяция преимущественно не содержит димеры и тетрамеры СТЬЛ4-1д. В одном варианте каждый мономер каждого димера СТЬЛ4-1д содержит минимум три группы сиаловой кислоты. В другом варианте каждый мономер каждого димера СТЬЛ4-1д содержит минимум от 3 групп сиаловой кислоты до 8 групп сиаловой кислоты. Данное изобретение относится к очищенной популяции тетрамеров молекул СТЬЛ4-1д, где эта популяция преимущественно не содержит димеры СТЬЛ4-1д и, на выбор, где популяция включает количество, превышающее примерно 100 г. Данное изобретение относится к очищенной популяции молекул-тетрамеров СТЬЛ4-1д, где эта популяция преимущественно не содержит мономеры СТЬЛ4-1д и где, на выбор, популяция включает количество, превышающее примерно 100 г. В одном варианте каждая молекула тетрамер включает две пары полипептидов СТЬЛ4-1д, где каждый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную только из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:5-10, каждый член пары полипептидов ковалентно связан с другим членом и где две пары полипептидов нековалентно связаны друг с другом. В другом варианте каждая молекула тетрамер способна связываться с СГО80 или СБ86. Еще в одном варианте каждая молекула тетрамер обладает минимум двукратной авидностью к СБ80 или СБ86 по сравнению с молекулой димером СТЬЛ4-1д. Еще в одном варианте каждая молекула тетрамер обладает минимум двукратной способностью тормозить пролиферацию или активацию Т-лимфоцитов по сравнению с молекулой димером СТЬЛ4-1д. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬЛ4-1д, где композиция содержит доминантные изоформы, визуализируемые на изоэлектрофокусировочном геле с СТЬЛ4-1д, который характеризуется изоэлектрической точкой пи, составляющей максимум 5.1, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬЛ4-1д, где композиция содержит доминантные изоформы, визуализируемые на изоэлектрофокусировочном геле с СТЬЛ4-1д, который характеризуется изоэлектрической точкой пи, составляющей максимум 5.8, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте пи увеличивается после обработки нейраминидазой. В одном варианте композиция включает доминантные изоформы, визуализируемые на изоэлектрофокусировочном геле с СТЬЛ4-1д, который характеризуется изоэлектрической точкой пи, составляющей максимум 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6 или 4.5, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В другом варианте минимум 40% молекул СТЬЛ4-1д имеет изоэлектрическую точку, которая меньше или равна примерно 5.1, как определяется с помощью изоэлектрофокусировки. Еще в одном варианте минимум 70% молекул СТЬЛ4-1д имеет изоэлектрическую точку максимум примерно 5.1 как определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В другом варианте минимум 90% молекул СТЬЛ4-1д имеют изоэлектрическую точку, составляющую максимум примерно 2.5, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. Данное изобретение относится к попу

- 3 017765 ляции молекул СТЬА4-1д, пи которой составляет от примерно 2.0±0.2 до примерно 5.0±0.2. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЕА4-[д. пи которой составляет от примерно 4.0±0.2 до примерно 5.0±0.2. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬА4-1д, пи которой составляет от примерно 4.3±0.2 до примерно 5.0±0.2. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬА4-1д, пи которой составляет от примерно 3.3±0.2 до примерно 4.7±0.2. Данное изобретение относится к способу получения композиции, где композиция включает молекулы СТЬА4-1д, пи которых составляет от примерно 2.0±0.2 до примерно 5.0±0.2, при этом способ включает: а) проведение электрофореза смеси молекул СТЬА4-1д в изоэлектрофокусировочном геле, где единственная полоса на геле соответствует популяции молекул СТЬА4-1д, имеющих определенное пи, и б) выделение популяции молекул СТЬА4[д, характеризующихся пи в диапазоне от примерно 2.0±0.2 до примерно 5.0±0.2 с тем, чтобы получить композицию.

Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением ΟΙοΝΛο на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 15 до примерно 35. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением Са1NΛс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 1.7 до примерно 3.6. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением галактозы на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 8 до примерно 17. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением фукозы на 1 моль димеров СТЬА41д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 3.5 до примерно 8.3. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением маннозы на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 7.2 до примерно 22.

Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 6 до примерно 12.

Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, характеризующейся: а) средним молярным отношением Са1NΛс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 15 до примерно 35, и б) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, характеризующейся: а) средним молярным отношением С[сNΛс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 15 до примерно 35, б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 1.7 до примерно 3.6, и в) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, характеризующейся: а) средним молярным отношением С!^Ас на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 15 до примерно 35, б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 1.6 до примерно 3.6, в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 8 до примерно 17, и г) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, характеризующейся: а) средним молярным отношением С[сNΛс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 15 до примерно 35, б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 1.6 до примерно 3.6, в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димеров СТЬА41д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 8 до примерно 17, г) средним молярным отношением фукозы на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 3.5 до примерно 8.3, и д) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции молекул СТЬА4-1д, характеризующейся: а) средним молярным отношением С!^Ас на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 15 до примерно 35, б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 1.6 до примерно 3.6, в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димеров СТЬА41д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 8 до примерно 17, г) средним молярным отношением фукозы на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 3.5 до примерно 8.3, д) средним молярным отношением маннозы на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 7.2 до примерно 22, и е) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димеров СТЬА4-1д или молекул СТЬА4-1д, составляющим от примерно 6 до примерно 12.

- 4 017765

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬЛ4-1д, где композиция характеризуется пиком ΝΟΝΆ на хроматограмме, составляющим примерно 9.589±0.3, и пиком ΝΑΝΑ на хроматограмме, составляющим примерно 10.543±0.3. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются профилем углеводов, как показано на фиг. 67. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются профилем углеводов доменов Ι-У (например, Ι-ГУ), где домен I включает пики, соответствующие α-сиалированным олигосахаридам, домен II включает пики, соответствующие моносиалированным олигосахаридам, домен III включает пики, соответствующие дисиалированным олигосахаридам, и домен IV включает пики, соответствующие трисиалированным олигосахаридам. Домен У включает пики, соответствующие тетрасиалированным олигосахаридам. В одном варианте разность времени удержания Ν-связанных олигосахаридов между первым пиком в домене I и главным пиком в домене II составляет от примерно 22 до примерно 28 мин. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы димеры СТБА4-[д. где минимум 0.5% молекул димеров СТБА4-!д находятся в цистеинилированном состоянии. В одном варианте минимум 1.0% молекул димеров СТ^Α4-Iд находятся в цистеинилированном состоянии. Данное изобретение относится к популяции молекул СТ^Α4-[д. где популяция характеризуется масс-спектрометрическим профилем, как показано на фиг. 8. Данное изобретение относится к популяции молекул СТ^Α4-[д. где популяция характеризуется профилем капиллярного электрофореза, как показано на фиг. 19 и 20. Данное изобретение относится к композиции молекул СТ^Α4-[д. где популяция характеризуется средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру СТ^Α4-[д. составляющим от примерно 6 до примерно 18. Данное изобретение относится к композиции СТ^Α4-[д. полученной каким-либо из способов, описанных в данном документе. Данное изобретение относится к популяции молекул СТ^Α4-[д. где молекулы гликозилированы по аминокислотному остатку аспарагина в положении 102 последовательности 8ЕО ГО ΝΟ:2, по аминокислотному остатку аспарагина в положении 134 последовательности 8ЕО ГО ΝΟ:2, по аминокислотному остатку аспарагина в положении 233 последовательности 8ЕО ГО ΝΟ:2, по аминокислотному остатку серина в положении 155 последовательности 8ЕО ГО ΝΟ:2 или по аминокислотному остатку серина в положении 165 последовательности 8ЕО ГО ΝΟ:2.

Данное изобретение относится к популяции молекул СТ^Α4-[д. где популяция молекул характеризуется: а) средним молярным отношением ШсНАс на 1 моль димера СТ^Α4-Iд или молекулы СТ^Α4-[д. составляющим от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димера или молекулы СТ^Α4-[д. составляющим от примерно 1.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера или молекулы СТ^Α4-[д. составляющим от примерно 8 до примерно 17; г) средним молярным отношением фукозы на 1 моль димера или молекулы СТ^Α4-[д. составляющим от примерно 3.5 до примерно 8.3; д) средним молярным отношением маннозы на 1 моль димера или молекулы СТ^Α4-[д. составляющим от примерно 7.2 до примерно 22; е) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера или молекулы СТ^Α4-[д. составляющим от примерно 6 до примерно 12; ж) пи, как определяется визуализацией на изоэлектрофокусировочного геле, в диапазоне от примерно от 2.4±0.2 до примерно 5.0±0.2; з) содержанием МСР4 максимум 5 млн^-1; и) содержанием менее 3.0% тетрамера (например, 2.5% высокомолекулярных форм или тетрамера, 2.0% высокомолекулярных форм или тетрамера; к) содержанием меньше 0.5% мономера; л) тем, что полипептиды СТ^Α4-Iд популяции содержат аминокислотную последовательность, минимум на 95% идентичную 8ЕО ГО ΝΟ:28; м) где молекулы СТЬА44д в популяции способны связываться с СГО80 или СГО86.

Композиции: данное изобретение относится к композиции, включающей эффективное количество молекулы С'ТЕА44д, являющейся предметом данного изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Данное изобретение относится к композиции, включающей наполнители, как описано в заявке на патент США № 60/752150, зарегистрированной 20 декабря 2005 г. В одном варианте композиция включает СТ^Α4-Iд. В другом варианте композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый растворитель, адъювант или носитель. В другом варианте композиция дополнительно включает мальтозу, моноосновный натрия дигидрофосфат моногидрат, хлорид натрия, гидроксид натрия и стерильную воду. В другом варианте композиция включает сахарозу, полоксамер, моноосновный натрия дигидрофосфат моногидрат, натрия двуосновный фосфат безводный, хлорид натрия, гидроксид натрия и стерильную воду.

Составы и наборы: данное изобретение относится к лиофилизированной смеси СТЬА44д, включающей минимум 95% димера СТ^Α4-Iд и максимум 5% тетрамера СТЬА44д. В одном варианте эта смесь включает минимум 98% димера СТ^Α4-Iд и максимум 2% высокомолекулярных форм или тетрамера СТ^Α4-Iд. В другом варианте смесь включает минимум 99% димера СТЬА44д и максимум 1% высокомолекулярных форм или тетрамера СТ^Α4-Iд. В другом варианте смесь включает минимум 8.0 моль сиаловой кислоты на 1 моль димера или молекулы СТ^Α4-Iд. В другом варианте смесь включает от примерно 15.7 до примерно 31 моль СIсNΑс на 1 моль димера или молекулы СТЬА44д. В другом варианте смесь включает от примерно 1.6 до примерно 3.2 моль СаШАс на 1 моль димера или молекулы СТЬА4Ц. В другом варианте смесь включает от примерно 9.3 до примерно 15.5 моль галактозы на 1 моль диме

- 5 017765 ра или молекулы СТЬЛ4-1д. В одном варианте смесь включает от примерно 3.6 до примерно 7.9 моль фукозы на 1 моль димера или молекулы СТЬ-Л4-[д. В одном варианте смесь включает от примерно 9.6 моль маннозы на 1 моль димера или молекулы СТЬЛ4-1д. Данное изобретение также относится к фармацевтическому набору, включающему: а) емкость, содержащую лиофилизированную смесь СТЬЛ4-1д, являющуюся предметом изобретения, и б) инструкции по разведению лиофилизированной смеси СТЬЛ4-1д с получением раствора для инъекции.

Иллюстративные способы лечения: данное изобретение относится к способу торможения пролиферации (или активации) Т-лимфоцитов, при этом способ заключается в обеспечении контакта Тлимфоцита с эффективным количеством композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу подавления иммунного ответа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу индукции иммунологической толерантности к антигену у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения воспаления у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения псориаза, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения красной волчанки у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики аллергии у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики реакции трансплантат против хозяина, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики отторжения трансплантированного органа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения рассеянного склероза у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения болезни Крона у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения сахарного диабета [ типа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения воспалительных заболеваний кишечника у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения оофорита у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения гломерулонефрита у пациента, при этом способ заключается во введении человеку, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения аллергического энцефаломиелита у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения миастении у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения.

Данное изобретение относится к применению популяции молекул СТЬЛ4-1д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димерам или молекулам СТЬЛ4-1д, которое составляет от примерно 6 до примерно 18, в производстве лекарственных средств для лечения и (или) профилактики заболеваний, обусловленных иммунологическими механизмами. Данное изобретение относится к применению популяции молекул СТЬЛ4-1д, характеризующейся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димерам или молекулам СТЬЛ4-1д, которое составляет от примерно 6 до примерно 18, в производстве лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита в упаковке вместе с вкладышем-инструкцией по применению данного средства для лечения ревматоидного артрита.

Иллюстративные способы комбинированного лечения: данное изобретение относится к способу торможения пролиферации (или активации) Т-лимфоцитов, при этом способ заключается в обеспечении

- 6 017765 контакта Т-лимфоцита с эффективным количеством композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения, в комбинации с метотрексатом. Данное изобретение относится к способу подавления иммунного ответа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения, в комбинации с метотрексатом.

Данное изобретение относится к способу индукции иммунологической толерантности к антигену у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с СТЬЛ4-1д, являющейся предметом изобретения, в комбинации с метотрекса том.

Способы получения СТЬЛ4-1д: данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный белок, где выращивание происходит путем переноса из культуры для посева в жидкую культуру, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г на 1 л жидкой культуры; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры. Жидкая культура может составлять минимум 1000 л, минимум 5000 л, минимум 10000 л, минимум 15000 л, минимум 20000 л, минимум 25000 л, минимум 30000 л, минимум 40000 л. В одном варианте стадия выращивания а) включает: ί) культивирование клеток в бессывороточной среде с определенным химическим составом с минимум четырьмя пассажами с тем, чтобы получить плотность клеток минимум примерно 1.0х10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл, где каждый этап посева начинается с концентрации примерно 2х10⁵ на 1 мл и достигает 1-2 млн клеток на 1 мл; ίί) поддержание клеток в культуре на протяжении времени, достаточного для получения из культуры рекомбинантного белка в минимальной концентрации примерно 0.5 г/л. В одном варианте белок является гликопротеином. В одном варианте белок является белком СТЬЛ4-1д. В одном варианте потомство клеток млекопитающего является потомством клеток клональной линии СНО, способной вырабатывать составной белок СТЬЛ4-1д, где клетки СНО имеют стабильно встроенные в их геном минимум 30 копий кассет экспрессии СТЬЛ4-1д. В одном варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 30%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 40%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 50%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 60%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 70, или 80, или 90, или 95%.

Еще в одном варианте минимум четыре пассажа включают: ί) выращивание клеток в культуре объемом минимум 50 мл до тех пор, пока плотность клеток не составит от примерно 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл; ίί) выращивание клеток в культуре объемом минимум 10 л до тех пор, пока плотность клеток не составит от примерно 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл; ίίί) выращивание клеток в культуре объемом минимум 100 л до тех пор, пока плотность клеток не составит от примерно 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл; и (ίν) выращивание клеток в культуре объемом минимум 200 л до тех пор, пока плотность клеток не составит от примерно 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл.

В одном варианте в бессывороточную среду с определенным химическим составом добавляют галактозу. В одном варианте поддержание включает: ί) снижение температуры культуры с 37±2 до 34±2°С; ίί) снижение температуры культуры с 34±2 до 32±2°С. В другом варианте температуру поддерживают в

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С

32±2°С на

В

В

В

В

В протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум протяжении минимум поддерживают поддерживают поддерживают поддерживают поддерживают диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне диапазоне 32±2°С до тех пор, пока плотность клеток не составит от примерно 30х 10⁵ до примерно 79х 10 клеток на 1 мл жидкой культуры.

Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, при этом способ включает: а) перенос клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный белок, из культуры для посева в жидкую культуру, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г на на на на на на на на на на на на на температуру температуру температуру суток. суток. суток. суток. суток.

суток. В суток. В суток. В суток. В суток. В суток. В суток. В суток. В суток. В другом варианте другом варианте другом варианте другом варианте температуру другом варианте температуру другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают другом варианте температуру поддерживают в

,5

- 7 017765 на 1 л жидкой культуры; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры, где выделение происходит, только когда жидкая культура содержит не меньше примерно 6.0 моль ΝΑΝΑ на 1 моль белка или димера СТЬЛ4-1д. Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, при этом способ включает: а) перенос клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный белок, из культуры для посева в жидкую культуру, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г на 1 л жидкой культуры; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры, где выделение происходит, только когда в жидкой культуре достигается плотность клеток от примерно 33х10⁵ до примерно 79х10⁵ клеток на 1 мл. Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, при этом способ включает: а) перенос клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный белок, из культуры для посева в жидкую культуру, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г на 1 л жидкой культуры; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры, где выделение происходит, только когда жизнеспособность клеток составляет не ниже значения от примерно 20 до примерно 30% или примерно 38%. Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, при этом способ включает: а) перенос клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный белок, из культуры для посева в жидкую культуру минимальным объемом примерно 10000 л, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г на 1 л жидкой культуры; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры, где выделение происходит, только когда концентрация эндотоксина составляет не больше 76.8 единиц эндотоксина на 1 мл жидкой культуры. Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, при этом способ включает: а) перенос клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный белок, из культуры для посева в жидкую культуру минимальным объемом примерно 10000 л, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г на 1 л жидкой культуры; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры минимальным объемом примерно 10000 л, где выделение происходит, только когда бионагрузка составляет меньше 1 колониеобразующей единицы на 1 мл жидкой культуры. Жидкая культура в данном изобретении может быть минимальным объемом примерно 5000 л, минимум 10000 л, минимум 15000 л, минимум 20000 л, минимум 25000 л, минимум 30000 л, минимум 40000 л, минимум 50000 л, минимум 60000 л.

Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, при этом способ включает: а) перенос клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный белок, из культуры для посева в жидкую культуру, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г на 1 л жидкой культуры; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры, где выделение происходит только при соблюдении минимум двух из следующих условий: 1) только когда жидкая культура содержит не меньше примерно 6.0 моль ΝΑΝΑ на 1 моль белка, и) плотность клеток в культуре составляет от примерно 33х10⁵ до примерно 79х10⁵ клеток на 1 мл, ίίί) жизнеспособность клеток составляет не меньше примерно 20% или примерно 38% или ίν) содержание СТЬА4-1д в культуре выше 0.5 г/л. В одном варианте выделение включает: 1) сбор надосадочной жидкости из культуры; и) анионообменную хроматографию надосадочной жидкости для получения элюированного белкового продукта; ίίί) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием белкового продукта, полученного на стадии (ίί) с тем, чтобы получить обогащенный белковый продукт; ίν) проведение аффинной хроматографии для получения элюированного и обогащенного белкового продукта; ν) проведение анионообменной хроматографии обогащенного продукта, полученного на стадии (ίν).

В другом варианте обогащенный белковый продукт, полученный на стадии (ίίί), характеризуется тем, что процентное содержание любой высокомолекулярной примеси составляет меньше 25 мас.%. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием отмывочного буфера, содержащего примерно 75 ммоль НЕРЕ8 и примерно 360 ммоль Νηί'Ί и имеющего рН примерно 8.0. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием отмывочного буфера, содержащего примерно 25 ммоль раствора НЕРЕ8 и примерно 325 ммоль Νηί'Ί и имеющего рН примерно 7.0. В другом варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίίί) проводят с использованием единственного отмывочного буфера, содержащего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и примерно 850 ммоль Νηί'Ί и имеющего рН примерно 7.0. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίν) проводят с использованием отмывочного буфера, содержащего примерно 25 ммоль Тп8 и примерно 250 ммоль Νηί'Ί и имеющего рН примерно 8.0. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίν) проводят с использованием буфера-элюента, содержащего примерно 100 ммоль глицина и имеющего рН примерно 3.5. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ν) проводят с использованием отмывочного буфера, содержащего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и от примерно 120 ммоль №С1 до примерно 130 ммоль Νηί'Ί и имеющего рН примерно 8.0. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ν) проводят с использованием буфера-элюента, содержащего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и примерно 200 ммоль Νηί'Ί и имеющего рН примерно 8.0. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием колонки, заполненной анионообменной смолой, которая содержит первичные, вторичные, третичные или четвертичные функциональные аминогруппы. В другом варианте смола содержит четвертичную функциональную аминогруппу. В дру

- 8 017765 гом варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ш) проводят с использованием смолы для гидрофобного взаимодействия, содержащей фенил, октил, пропил, алкоксил, бутил или изоамильную функциональную группу. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίν) проводят с использованием колонки, содержащей белок А.

Данное изобретение относится к способу получения СТЬА4-1д, при этом способ включает очистку СТЬА4-1д из жидкой клеточной культуры так, чтобы очищенный СТЬА4-1д а) содержался в соотношении примерно 38 нг МСР-Ι на 1 г димера СТЬА4-1д, и б) включал меньше 2.5% высокомолекулярных форм СТЬА4-1д (например, тетрамер) по массе. Данное изобретение относится к способу получения СТЬА4-1д, при этом способ включает: а) выращивание клеточного потомства или клеток СНО, способных вырабатывать СТЬА4-1д, где выращивание происходит из культуры для посева в жидкой культуре минимальным объемом примерно 10000 л, где концентрация СТЬА4-1д составляет минимум 0, 5 г на 1 л жидкой культуры; б) выделение СТЬА4-1д из жидкой культуры минимальным объемом примерно 10000 л, где хроматографию проводят на колонке со смолой для гидрофобного взаимодействия, содержащей как минимум фенильную функциональную группу, где выделение включает стадию хроматографии с гидрофобным взаимодействием, которую проводят с использованием единственного отмывочного буфера, содержащего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и примерно 850 ммоль ЫаС1 и имеющего рН примерно 7.0.

Молекулы СТЬА4-1д включают молекулы бета-полипептида. СТЬА4^{А29¥Ъ104Е}-1д - это молекула бетаполипептида. Настоящее изобретение относится к способам получения (включая массовое производство) композиций бета-полипептида или композиций молекул бета-полипептида и улучшенные композиции. Данное изобретение относится к молекулам бета-полипептида, улучшенным композициям, включающим молекулы бета-полипептида, и усовершенствованные способы получения (включая массовое производство) молекул бета-полипептида и других рекомбинантных гликопротеинов.

Способы получения бета-полипептидов и других гликопротеинов: данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного гликопротеина, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный гликопротеин, где выращивание происходит из культуры для посева в жидкой культуре минимальным объемом примерно 10000 л, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г/лимфоцит жидкой культуры, где выращивание включает: ί) культивирование клеток в бессывороточной среде с определенным химическим составом с минимум четырьмя пассажами с тем, чтобы получить плотность клеток минимум примерно 1.0х10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл, где каждый этап посева начинается с концентрации примерно 2х10⁵ на 1 мл и достигает до 1-2 млн клеток на 1 мл; где культивирование включает: 1) культивирование клеток в бессывороточной среде-инокулюме с определенным химическим составом на протяжении от примерно 15 суток до примерно 25 суток; затем 2) культивирование клеток в бессывороточной базальной среде с определенным химическим составом до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 4 млн на 1 мл; и п) поддержание клеток в культуре на протяжении времени, достаточного для получения рекомбинантного белка из культуры в концентрации минимум примерно 0.5 г/л; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры минимальным объемом примерно 10000 л.

Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного гликопротеина, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный гликопротеин, где выращивание происходит из культуры для посева в жидкой культуре минимальным объемом примерно 10000 л, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г/л жидкой культуры, где выращивание включает: ί) культивирование клеток в бессывороточной среде с определенным химическим составом с минимум четырьмя пассажами с тем, чтобы получить плотность клеток минимум примерно 1.0х10⁵ жизнеспособных клеток на мл, где каждый этап посева начинается с концентрации примерно 2х 10⁵ на 1 мл и достигает до 1-2 млн клеток на 1 мл; й) поддержание клеток в культуре на протяжении времени, достаточного для получения рекомбинантного белка из культуры в концентрации минимум примерно 0.5 г/л; где поддержание включает: 1) снижение температуры культуры с 37±2°С до 34±2°С и 2) добавление полианионного соединения в культуру; б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры минимальным объемом примерно 10000 л.

Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного гликопротеина, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые секретируют рекомбинантный гликопротеин, где выращивание происходит из культуры для посева в жидкой культуре минимальным объемом примерно 10000 л, где концентрация рекомбинантного белка составляет минимум 0.5 г/л жидкой культуры, и б) выделение рекомбинантного белка из жидкой культуры минимальным объемом примерно 10000 л, где выделение включает: ί) получение растворимой фракции культуры стадии (а); п) проведение аффинной хроматографии растворимой фракции, чтобы получить элюированный белковый продукт; ш) проведение анионообменной хроматографии элюированного белкового продукта стадии (п) с тем, чтобы получить элюированный и обогащенный белковый продукт; и ίν) проведение с этим белковым продуктом хроматографии с гидрофобным взаимодействием для получения обогащенного белкового продукта.

В одном варианте осуществления изобретения белок включает СТЬА4-1д. В другом варианте белок включает бета-полипептид или молекулы бета-полипептида. В другом варианте белок включает бета

- 9 017765 полипептиды, содержащие 8ЕО ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16.

В одном варианте осуществления изобретения минимум четыре пассажа включают: ί) выращивание клеток в культуре минимальным объемом 50 мл до тех пор, пока плотность клеток не достигнет значения от примерно 1 до примерно 2.5 млн на 1 мл; ΐΐ) выращивание клеток в культуре минимальным объемом 10 л до тех пор, пока плотность клеток не достигнет значения от примерно 1 до примерно 2.5 млн на 1 мл; ίίί) выращивание клеток в культуре минимальным объемом 100 л до тех пор, пока плотность клеток не достигнет значения от примерно 1 до примерно 2.5 млн на 1 мл; и ίν) выращивание клеток в культуре минимальным объемом 200 л до тех пор, пока плотность клеток не достигнет значения от примерно 1 до примерно 2.5 млн на 1 мл.

В одном варианте осуществления изобретения выделение включает: ί) получение растворимой фракции культуры стадии а); ίί) проведение аффинной хроматографии растворимой фракции с получением элюированного белкового продукта; ίίί) проведение с элюированным белковым продуктом стадии (ίί) анионообменной хроматографии с тем, чтобы получить элюированный и обогащенный белковый продукт; и ίν) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием обогащенного белкового продукта для получения обогащенного белкового продукта.

В одном варианте обогащенный белковый продукт, полученный на стадии (ίν), характеризуется тем, что процентное содержание любого высокомолекулярного мультимера не превышает 25 мас.%. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίίί) проводят с использованием отмывочного буфера, содержащего примерно 50 ммоль НЕРЕ8 и примерно 135 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 7.0. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίίί) проводят с использованием буфераэлюента, содержащего примерно 50 ммоль НЕРЕ8 и примерно 200 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 7. В другом варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίν) проводят с использованием отмывочного буфера, содержащего примерно 50 ммоль НЕРЕ8 и примерно 1.2 моль (ΝΗ₄)8Ο₄, имеющего рН примерно 7.0. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием отмывочного буфера, содержащего примерно 25 ммоль №1Н₂Р0₄ и примерно 150 ммоль №С1, имеющего рН примерно 7.5. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием буфера-элюента, содержащего примерно 250 ммоль глицина и имеющего рН примерно 3. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίίί) проводят с использованием колонки, заполненной анионообменной смолой, содержащей первичную, вторичную, третичную или четвертичную функциональную аминогруппу. В другом варианте смола содержит четвертичную функциональную аминогруппу. В другом варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίίί) проводят с использованием смолы для гидрофобного взаимодействия, содержащей фенил, октил, пропил, алкокси, бутил или изоамильную функциональную группу. В другом варианте функциональной группой является фенильная функциональная группа. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием колонки, содержащей белок А.

В другом варианте выращивание включает: ί) культивирование клеток в бессывороточной среде с определенным химическим составом с минимум четырьмя пассажами с тем, чтобы получить плотность клеток минимум примерно 1.0х 10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл, где каждый этап посева начинается с концентрации примерно 2х10⁵ на 1 мл и достигает примерно 1-2 млн клеток на 1 мл; и ίί) поддержание клеток в культуре на протяжении времени, достаточного для получения из культуры рекомбинантного белка в минимальной концентрации примерно 0.5 г/л. В другом варианте культивирование включает: ί) культивирование клеток в бессывороточной среде-инокулюме с определенным химическим составом на протяжении периода от примерно 15 суток до примерно 25 суток; затем ίί) культивирование клеток в бессывороточной базальной среде с определенным химическим составом до тех пор, пока плотность клеток не достигнет примерно минимум 4 млн клеток на 1 мл.

В другом варианте поддержание включает ί) снижение температуры культуры с 37±2 до 34±2°С и ίί) добавление в культуру полианионного соединения. В одном варианте полианионным соединением является декстрана сульфат, где декстрана сульфат добавляют в культуру в конечной концентрации примерно 50 мг/мл. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 5 суток. В нимум 6 суток. В нимум 7 суток. В нимум 8 суток. В нимум 9 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне другом варианте температуру поддерживают в диапазоне другом варианте температуру поддерживают в диапазоне другом варианте температуру поддерживают в диапазоне другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 10 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 11 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 12 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 13 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 14 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 15 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне нимум 16 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне

34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на 34±2°С на протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении протяжении ми ми ми ми ми ми ми ми ми ми ми ми ми

- 10 017765 нимум 17 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 18 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 19 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 20 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 21 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 22 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 23 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 24 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 25 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 26 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 27 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении минимум 28 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С на протяжении до 28 суток. В другом варианте температуру поддерживают в диапазоне 34±2°С до тех пор, плотность клеток не достигнет значения от примерно 30х 10⁵ до примерно 79х 10⁵ клеток на 1 мл жидкой культуры.

В одном варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 30%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 40%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 50%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 60%. В другом варианте достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не снижается ниже 70, или 80, или 90, или 95%.

В одном варианте в бессывороточную среду с определенным химическим составом добавляют галактозу. В другом варианте выделение проводится, когда жидкая культура содержит не меньше примерно 6 моль сиаловой кислоты на 1 моль белка. В другом варианте выделение проводится, когда жидкая культура содержит от примерно 5.2 до примерно 7.6 моль сиаловой кислоты на 1 моль белка. В другом варианте выделение проводится, когда жидкая культура имеет плотность клеток от примерно 33х10⁵ до примерно 79х10⁵ клеток на 1 мл. В другом варианте выделение проводится, когда жизнеспособность клеток в жидкой культуре не снижается ниже примерно 37%. В другом варианте выделение проводится, когда концентрация эндотоксина не превышает примерно 4.8 единиц эндотоксина 1 мл жидкой культуры. В другом варианте выделение проводится, когда бионагрузка меньше примерно 1 колониеобразующая единица на 1 мл (КОЕ/мл) жидкой культуры. В другом варианте выделение проводится, если соблюдается минимум два из следующих условий: ί) жидкая культура содержит не меньше примерно 6 моль сиаловой кислоты на 1 моль белка, ίί) жидкая культура имеет плотность клеток от примерно 33х10⁵ до примерно 79х10⁵ клеток на 1 мл, ш) жизнеспособность клеток в жидкой культуре не снизилась ниже примерно 37%, или ίν) содержание гликопротеина в культуре составляет от примерно 0.46 до примерно 0.61 г/л.

В одном варианте клетки млекопитающего - это потомство клональной клеточной линии яичника китайского хомяка, которое вырабатывает какую-либо комбинацию бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8ЕО Ш N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, где каждая из клеток яичника китайского хомяка содержит стабильно встроенные в их геном минимум 30 копий кассеты экспрессии, включающей 8ЕО Ш N0:3. В одном варианте жидкая культура включает клетку или клеточное потомство клеточной линии-продуцента, являющейся предметом изобретения.

Данное изобретение относится к бета-полипептиду, содержащему 8Е0 Ш N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, который получают способом, предусмотренным изобретением. Данное изобретение относится к композиции, включающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 Ш N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и получается способом, предусмотренным изобретением. Данное изобретение относится к бета-полипептиду, который получают способом, предусмотренным изобретением.

Клетки: данное изобретение относится к клональной клетке яичника китайского хомяка, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую бета-полипептид или молекулу бета-полипептида. Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бетаполипептиды или молекулы бета-полипептидов. В одном варианте бета-полипептид содержит последовательность 8Е0 Ш N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16. Данное изобретение относится к клональной клетке яичника китайского хомяка, включающей нуклеиновую кислоту, содержащую кассету экспрессии, которая кодирует аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16. В одном варианте кассета экспрессии содержит последовательность 8Е0 Ш N0:3. Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где бета-полипептид экспрессируется согласно нуклеотидной последовательности плазмидного происхождения, имеющей инвентарный номер АТСС РТА-2104, и согласно положениям Будапештского договора, подписанного 19 июня 2000 г., хранящейся в Американском банке типов

- 11 017765 культур (АТСС), 20110, штат Виргиния, Манассас, Университетский бульвар, 10801.

Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, при этом каждая клетка содержит 30 или больше копий кассеты экспрессии бета-полипептида. Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бета-полипептиды или молекулы бетаполипептидов, при этом каждая клетка включает 30 или больше копий кассеты экспрессии бетаполипептида, где 30 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки. Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где кассета экспрессии бета-полипептида остается стабильной на протяжении примерно 105 пассажей. В одном варианте бета-полипептид кодируется кассетой экспрессии, встроенной в клеточный геном.

Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бета-полипептид, где минимум 75% клеточной популяции содержат 30 или больше копий кассеты экспрессии бета-полипептида на клетку, где 30 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки 75% клеточной популяции.

Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бета-полипептид, где минимум 85% клеточной популяции содержат 30 или больше копий кассеты экспрессии бета-полипептида на клетку, где 30 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки 85% клеточной популяции. Данное изобретение относится к популяции клональных клеток яичника китайского хомяка, вырабатывающей бета-полипептид, где минимум 95% клеточной популяции содержат 30 или больше копий кассеты экспрессии бета-полипептида на клетку, где 30 или больше копий встроены в единственный сайт генома каждой клетки 95% клеточной популяции. В одном варианте кассета экспрессии имеет плазмидное происхождение и хранится в банке АТСС под инвентарным номером РТА-2104. В другом варианте кассета экспрессии включает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 8ЕО ГО N0:3. В одном варианте клеточная популяция вырабатывает минимум примерно 0.5 г бета-полипептида на 1 л жидкой культуры, и где бета-полипептид имеет молярное отношение сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекуле бета-полипептида, которое составляет от примерно 5.5 до примерно 8.5 при объеме культуры 1000 л или больше. В другом варианте клеточная популяция вырабатывает минимум 5, минимум 10 или минимум 20 г бета-полипептида на 1 л жидкой культуры. В другом варианте бета-полипептид имеет молярное отношение сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекуле бета-полипептида, которое составляет от примерно 5 до примерно 10 при объеме культуры 1000 л или больше. В другом варианте клеточная популяция адаптирована к бессывороточной среде с определенным химическим составом. В другом варианте бета-полипептид, вырабатываемый в культуре клеточной популяции, имеет коэффициент поглощения от 1.0±0.05 Аи мл-см^-1-мг^-1. В другом варианте клеточная популяция, выращиваемая в культуре, вырабатывает бетаполипептиды, где: а) примерно 90% или примерно 80% бета-полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:4, начинающуюся с метионина в положении остатка 27; б) примерно 10% или примерно 20% бета-полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:4, начинающуюся с аланина в положении остатка 26; в) от примерно 4 до примерно 8% бетаполипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:4, заканчивающуюся лизином в положении остатка 383; г) от примерно 92 до примерно 96% бета-полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:4, заканчивающуюся глицином в положении остатка 382; и, на выбор, д) примерно меньше 1% бета-полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:4, начинающуюся с метионина в положении остатка 25.

Данное изобретение относится к клеточному потомству клеточной популяции, являющейся предметом изобретения, где клеточное потомство вырабатывает бета-полипептид. В одном варианте клеточное потомство получают путем культивирования клетки на протяжении минимум 5, минимум 10, минимум 20, минимум 40, минимум 50, минимум 75 поколений. В другом варианте клеточное потомство получают путем культивирования клетки на протяжении 27 поколений.

Данное изобретение относится к клеточной линии, полученной из любой клетки, являющейся предметом изобретения. В одном варианте клеточная линия является клональной. В одном варианте клеточная линия вырабатывает: а) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:16 (метионин в положении аминокислоты 27 и глицин в положении аминокислоты 382 8Е0 ГО N0:4); б) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:13 (метионин в положении аминокислоты 27 и лизин в положении аминокислоты 383 из 8Е0 ГО N0:4); в) бетаполипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:15 (аланин в положении аминокислоты 26 и глицин в положении аминокислоты 382 из 8Е0 ГО N0:4); г) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:12 (аланин в положении аминокислоты 26 и лизин в положении аминокислоты 383 8Е0 ГО N0:4); д) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:11 (метионин в положении аминокислоты 25 и лизин в положении аминокислоты 383 8Е0 ГО N0:4); е) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность

- 12 017765

5>ЕО ГО N0:14 (метионин в положений аминокислоты 25 и глицин в положении аминокислоты 382 8Е0 ГО N0:4); или ж) любую комбинацию из вышеописанных. В одном варианте клеточная линия вырабатывает бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где: а) примерно 90 или примерно 80% бетаполипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:4, начинающуюся с метионина в положении остатка 27; б) примерно 10% или примерно 20% бета-полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:4, начинающуюся с аланина в положении остатка 26; в) от примерно 4 до примерно 8% бета-полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:4, заканчивающуюся лизином в положении остатка 383; г) от примерно 92 до примерно 96% бетаполипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:4, заканчивающуюся глицином в положении остатка 382; и, на выбор, д) примерно меньше 1% бета-полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:2, начинающуюся с метионина в положении остатка 25. В одном варианте бета-полипептиды, полученные путем культивирования этой клеточной линии, характеризуются коэффициентом поглощения 1.0±0.05 ЛИ мл-см’¹-мг’¹.

Данное изобретение относится к клеточной популяции - производному клетки, являющейся предметом изобретения. В одном варианте клетки этой популяции содержат минимум одно добавочное генетическое изменение по сравнению с клеткой, являющейся предметом изобретения, из которой получена популяция и где клетки вырабатывают бета-полипептид. В другом варианте клетки этой популяции содержат минимум 2, минимум 3, минимум 4, минимум 5, минимум 6, минимум 7, минимум 8, минимум 9, минимум 10 или минимум 20 дополнительных генетических изменений по сравнению с клеткой, являющейся предметом изобретения, из которой получена популяция, где клетки вырабатывают бетаполипептид. В одном варианте генетическое изменение включает минимум одну неконсервативную мутацию в клеточном геноме и кассете экспрессии, кодирующей бета-полипептид. В другом варианте генетическое изменение включает минимум одну добавочную рекомбинантную нуклеиновую кислоту в клетке. В другом варианте генетическое изменение включает мутацию в клеточном геноме. В другом варианте генетическое изменение включает добавление нуклеиновой кислоты в клеточный геном или в виде транс-нуклеиновой кислоты, и где нуклеиновая кислота кодирует антиапоптозный полипептид. В другом варианте антиапоптозный полипептид связан с гликозилированием. В другом варианте генетическое изменение включает минимум одну мутацию клеточного генома или кассеты экспрессии, кодирующей бета-полипептид. В другом варианте клеточная популяция при выращивании в культуре вырабатывает: а) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:16 (метионин в положении аминокислоты 27 и глицин в положении аминокислоты 382 из 8Е0 ГО N0:4); б) бетаполипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:7 (метионин в положении аминокислоты 27 и лизин в положении аминокислоты 383 8Е0 ГО N0:4); в) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:15 (аланин в положении аминокислоты 26 и глицин в положении аминокислоты 382 8Е0 ГО N0:4); г) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:12 (аланин в положении аминокислоты 26 и лизин в положении аминокислоты 383 из 8Е0 ГО N0:4); д) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 5>Е0 ГО N0:11 (метионин в положении аминокислоты 25 и лизин в положении аминокислоты 383 8Е0 ГО N0:4); е) бета-полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:14 (метионин в положении аминокислоты 25 и глицин в положении аминокислоты 382 из 8Е0 ГО N0:4); или ж) любую комбинацию вышеописанных вариантов.

Композиции: данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов или молекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, со средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекуле бета-полипептида от примерно 5 до примерно 10. В одном варианте среднее молярное отношение групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекуле бета-полипептида составляет от примерно 5.5 до примерно 8.5. В одном варианте среднее молярное отношение групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекуле бета-полипептида составляет от примерно 5.2 до примерно 7.6. Данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, имея среднее молярное отношение групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекуле бета-полипептида примерно 6. Данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где больше 95% полипептидов представлены димерами. В одном варианте больше 98, больше 99 или больше 99.5% полипептидов представлены димерами. В другом варианте от примерно 95 до примерно 99.5% полипептидов представлены димерами, и от примерно 0.5 до примерно 5% полипептидов представлены тетрамерами или высокомолекулярными формами. В другом варианте примерно 98.6% полипептидов представлены димерами, и примерно 1.2% полипептидов представлены тетрамерами или высокомолекулярными формами и примерно меньше 0.6% полипептидов являются мономерами. В другом варианте примерно 95% полипептидов представлены димерами, и примерно 4% полипептидов представлены тетрамерами или высокомолекулярными формами и примерно 1% полипептидов являются выделенной популяцией димеров бетаполипептида, где каждый мономер полипептида содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14,

- 13 017765 или 16. В одном варианте популяция преимущественно не содержит мономер бета-полипептида. В другом варианте популяция преимущественно не содержит тетрамер бета-полипептида. Данное изобретение относится к выделенной популяции мономера бета-полипептида, преимущественно не содержащей димер и тетрамер бета-полипептида. В одном варианте каждый мономер каждого димера бетаполипептида содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и содержит минимум 2.5 группы сиаловой кислоты.

Данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, обладающей активностью от примерно 70 до примерно 130% в анализе связывания В7 по сравнению со стандартным СТЬЛ4-1д, где это анализ включает измерение поверхностного плазменного резонанса. Данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, обладающей активностью от примерно 50 до примерно 150% в анализе торможения ИЛ-2 в клетке человека по сравнению со стандартом. Данное изобретение относится к очищенной популяции тетрамеров или высокомолекулярных форм бета-полипептида, где каждый мономер полипептида содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, при этом популяция преимущественно не содержит димер бета-полипептида, и, на выбор, популяция содержит количество, превышающее примерно 100.

Данное изобретение относится к очищенной популяции тетрамеров или высокомолекулярных форм бета-полипептида, где каждый мономер содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, при этом популяция преимущественно не содержит мономер бета-полипептида, и, на выбор, популяция содержит количество, превышающее примерно 100 г. В одном варианте каждая молекула тетрамера включает две пары бета-полипептидов, где каждый мономер полипептида содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, и где каждый член пары полипептидов ковалентно связан с другим членом, и где две пары полипептидов нековалентно связаны друг с другом. В одном варианте каждая молекула тетрамера способна связываться с 0Ω80 или СЭ86. В одном варианте каждая молекула тетрамера обладает минимум двукратной авидностью к СЭ80 или СЭ86 по сравнению с димером бетаполипептида, где каждый мономер димера полипептида содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12,

13, 14, 15 или 16. В другом варианте каждая молекула тетрамера обладает минимум двукратной авидностью к СЭ80 или СЭ86 по сравнению с молекулой тетрамера 0Т^Α4-Iд. содержащей последовательность БЕЦ ΙΌ N0:2. В другом варианте каждая молекула тетрамера обладает минимум двукратной способностью тормозить активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов по сравнению с димером бета-полипептида, где каждый мономер димера полипептида содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16. В другом варианте каждая молекула тетрамера обладает минимум двукратной способностью тормозить активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов по сравнению с молекулой тетрамера СТЕЛ4-[д, содержащей последовательность БЕЦ ΙΌ N0:2.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13,

14, 15 или 16, и где композиция включает доминантные изоформы, визуализируемые на изоэлектрофокусировочном геле, который имеет изоэлектрическую точку пи, не превышающую примерно 5.5, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте пи увеличивается после обработки нейраминидазой. В одном варианте минимум 40% бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов имеет изоэлектрическую точку, не превышающую примерно 5.3, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте минимум 70% бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов имеет изоэлектрическую точку, не превышающую примерно 5.3, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте минимум 90% бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов имеет изоэлектрическую точку, не превышающую примерно 5.3, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. Данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов или молекул бетаполипептидов, имеющих пи в диапазоне от примерно 2.0±0.2 до примерно 5.2±0.2.

Данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов или молекул бетаполипептидов, имеющих пи в диапазоне от примерно 4.5±0.2 до примерно 5.2±0.2. Данное изобретение относится к выделенной популяции бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов, имеющих пи в диапазоне от примерно 4.7±0.2 до примерно 5.1±0.2. Данное изобретение относится к способу получения композиции, при этом композиция включает бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов с пи, находящейся в диапазоне от примерно 2.0±0.2 до примерно 5.2±0.2, где каждый полипептид содержит последовательность БЕЦ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, при этом способ включает: а) проведение электрофореза смеси бета-полипептидов в изоэлектрофокусировочном геле, где единственная полоса на геле соответствует популяции бета-полипептидов или молекулам бета-полипептидов с определенной пи, и б) выделение популяции бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов, которые характеризуются пи, находящимся в диапазоне от примерно 2.0±0.2 до примерно 5.2±0.2 согласно условиям получения этой композиции.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды или мо

- 14 017765 лекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, и где полипептиды характеризуются средним молярным отношением ΟΙοΝΆο на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся от примерно 2.6 до примерно 3.6. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются средним молярным отношением фукозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 6.4 до примерно 7.0. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются средним молярным отношением маннозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 14 до примерно 16. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно

8.5. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5 до примерно 10. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением СIсNАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бетаполипептида, находящимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы характеризуются: а) средним молярным отношением СIсNАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 2.6 до примерно 3.6; и в) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы характеризуются: а) средним молярным отношением СIсNАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бетаполипептида, находящимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 2.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; и г) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением СIсNАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 2.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; г) средним молярным отношением фукозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 6.4 до примерно 7.0; и д) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бетаполипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением СIсNАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находя

- 15 017765 щимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением ОаШЛс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 2.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; г) средним молярным отношением фукозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 6.4 до примерно 7.0; д) средним молярным отношением маннозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 14 до примерно 16; и е) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно

8.5. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 8 до примерно 17; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бетаполипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5; и в) профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что представлен на фиг. 8. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 8 до примерно 17; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5; в) профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что представлен на фиг. 8; и г) содержанием тетрамера бета-полипептида ниже примерно 5%. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно

8.5. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бетаполипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5; и в) содержанием тетрамера бета-полипептида ниже примерно 5%. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5; б) профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что представлен на фиг. 8. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бетаполипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; б) профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что представлен на фиг. 8. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5; б) содержанием тетрамера или высокомолекулярных форм бета-полипептида ниже примерно 5%. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются: а) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; б) содержанием тетрамера или высокомолекулярных форм бета-полипептида ниже примерно 5%.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что представлен на фиг. 8. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где полипептиды характеризуются профилем углеводов с доменами Ι-ΐν, где домен I включает пики, соответствующие α-сиалированным олигосахаридам, домен II включает пики, соответствующие

- 16 017765 моносиалированным олигосахаридам, домен [[[ включает пики, соответствующие дисиалированным олигосахаридам, и домен IV включает пики, соответствующие трисиалированным олигосахаридам. В одном варианте разность времени удержания Ν-связанных олигосахаридов между первым пиком в домене I и главным пиком в домене II составляет от примерно 11 до примерно 13 мин. В одном варианте на сумму доменов III и IV приходится от примерно 25 до примерно 36% всего профиля углеводов.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов, где каждый мономер полипептида содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где минимум примерно 0.5% молекул находятся в цистеинилированном состоянии. Данное изобретение относится к отдельной популяции бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где при масс-спектрометрии популяция дает профиль, как представлено на фиг. 10. Данное изобретение относится к отдельной популяции бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, характеризующуюся средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекуле бета-полипептида, которое находится в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5, где димер бета-полипептида или молекулы бетаполипептидов получают из клеток клеточной линии-продуцента. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, где полипептиды гликозилированы в аспарагине, находящемся в положении аминокислотного остатка 102 последовательности 8Е0 ГО N0:4, в аспарагине, находящемся в положении аминокислотного остатка 134 из 8Е0 ГО N0:4, в аспарагине, находящемся в положении аминокислотного остатка 233 из 8Е0 ГО N0:4. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей бета-полипептиды, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы характеризуются: а) средним молярным отношением СIсNАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаТОАс на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 2.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; г) средним молярным отношением фукозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 6.4 до примерно 7.0; д) средним молярным отношением маннозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 14 до примерно 16; е) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера полипептида или молекулы бета-полипептид, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5; ж) пи, как определяется визуализацией на изоэлектрофокусировочном геле, в диапазоне от примерно 2.4±0.2 до примерно 5.2±0.2; з) содержанием МСР4 меньше или равного 5 млн^-1; и) содержанием тетрамера или высокомолекулярных форм меньше 5%; к) на мономер приходится меньше 1% полипептида и л) бета-полипептиды или молекулы бета-полипептидов этой популяции, где аминокислотная последовательность минимум на 95% идентична любой из последовательностей 8Е0 ГО N0:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, где бетаполипептиды в составе этой популяции способны связываться с ί.Ό80 и СЭ86. Данное изобретение относится к отдельной популяции бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где популяция молекул характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаШАс на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 2.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 11 до примерно 13; г) средним молярным отношением фукозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 6.4 до примерно 7.0; д) средним молярным отношением маннозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 14 до примерно 16; е) средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5; ж) пи, как определяется визуализацией на изоэлектрофокусировочном геле, в диапазоне от примерно 2.4±0.2 до примерно 5.2±0.2; з) содержанием МСР4 меньше или равным 5 млн^-1; и) содержанием в бетаполипептиде тетрамера или высокомолекулярных форм меньше 5%; к) содержанием мономера меньше 1% и л) бета-полипептидами в этой популяции, где аминокислотная последовательность минимум на 95% совпадает с любой из последовательностей 8Е0 ГО N0:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, где молекулы бета-полипептиды в рамках этой популяции способны связываться с ί.Ό80 и СЭ86; или их фармацевтическими эквивалентами.

Данное изобретение относится к композиции, включающей эффективное количество бетаполипептида, являющегося предметом изобретения, и фармацевтически приемлемого носителя. Данное изобретение относится к композиции, включающей наполнители, согласно описанию в заявке на патент

- 17 017765

США № 60/752150; зарегистрированной 20 декабря 2005 г. В одном варианте композиция включает молекулы бета-полипептидов. В одном варианте композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый растворитель, адъювант или носитель. В одном варианте композиция дополнительно включает сахарозу, моноосновный натрия дигидрофосфат моногидрат, хлорид натрия, гидроксид натрия, соляную кислоту и стерильную воду. В другом варианте композиция включает сахарозу, полоксамер, моноосновный натрия дигидрофосфат моногидрат, натрия двухосновный фосфат безводный, хлорид натрия, гидроксид натрия и стерильную воду. В одном варианте композиция лиофилизирована. Данное изобретение относится к лиофилизированной композиции, включающей эффективное количество бетаполипептидов, являющихся предметом изобретения, сахарозу, моноосновный натрия дигидрофосфат моногидрат, хлорид натрия, гидроксид натрия и соляную кислоту.

Составы и наборы: данное изобретение относится к лиофилизированной смеси бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательности 8ЕС Ш N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16, включающей минимум 95% димера бета-полипептида и максимум 5% тетрамера бета-полипептида (высокомолекулярные формы). В одном варианте смесь включает минимум 98% димера бета-полипептида и не больше 2% тетрамера бета-полипептида (высокомолекулярные формы). В одном варианте смесь включает минимум 99% димера бета-полипептида и не больше 1% тетрамера бета-полипептида (высокомолекулярные формы). В одном варианте смесь включает минимум 5 моль сиаловой кислоты на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида. В одном варианте смесь включает от примерно 24 до примерно 28 моль СIсNАс на 1 моль из димера бета-полипептида (высокомолекулярные формы). В одном варианте смесь включает от примерно 2.6 до примерно 3.6 моль СаШАс на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида. В одном варианте смесь включает от примерно 11 до примерно 13 моль галактозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида. В одном варианте смесь включает от примерно 6.4 до примерно 7.0 моль фукозы на 1 моль димера бетаполипептида или молекулы бета-полипептида. В одном варианте смесь включает от примерно 14 до примерно 16 моль маннозы на 1 моль димера бета-полипептида или молекулы бета-полипептида. Данное изобретение также относится к фармацевтическому набору, включающему: а) емкость, которая содержит лиофилизированную бета-полипептидную смесь, являющуюся предметом изобретения, и б) инструкции по разведению лиофилизированной бета-полипептидной смеси для получения раствора для инъекции.

Иллюстративные способы лечения: способ торможения пролиферации или активации Тлимфоцитов или обоих процессов, при этом способ заключается в обеспечении контакта Т-лимфоцита с эффективным количеством композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу торможения иммунного ответа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бетаполипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения заболеваний у пациента заболеваний, обусловленных иммунологическими механизмами, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу индукции иммунологической толерантности к антигену у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Этот способ относится к способу лечения воспаления у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Этот способ относится к способу лечения ревматоидного артрита, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения псориаза у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения красной волчанки у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики аллергии у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики реакции трансплантат против хозяина у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики отторжения трансплантированного органа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бетаполипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики отторжения трансплантированной ткани у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бетаполипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения или профилактики отторжения трансплантированной клетки у пациента, при этом способ заключается во

- 18 017765 введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бетаполипептидом, являющейся предметом изобретения. В одном варианте трансплантированной клеткой является клетка костного мозга. В другом варианте трансплантированной клеткой является островковая клетка поджелудочной железы. В другом варианте трансплантированной клеткой является клетка, продуцирующая инсулин, - островковая клетка поджелудочной железы. Данное изобретение относится к способу лечения рассеянного склероза у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения болезни Крона у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения сахарного диабета I типа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения воспалительных заболеваний кишечника у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения оофорита у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бетаполипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения гломерулонефрита у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения аллергического энцефаломиелита у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения. Данное изобретение относится к способу лечения миастении у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения.

Данное изобретение относится к использованию популяции бета-полипептидов или молекул бетаполипептидов, где каждый полипептид содержит последовательности 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где популяция характеризуется средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекулам бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5 до примерно 10, в производстве лекарственного средства, предназначенного для лечения и (или) профилактики заболеваний, обусловленных иммунологическими нарушениями. Данное изобретение относится к использованию популяции бета-полипептидов или молекул бета-полипептидов, где каждый полипептид содержит последовательности 8Е0 ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где популяция характеризуется средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекулам бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5 до примерно 10, в производстве лекарственного средства, предназначенного для лечения ревматоидного артрита, в упаковке вместе с инструкциейвкладышем по применению при лечении ревматоидного артрита. В одном варианте популяция характеризуется средним молярным отношением групп сиаловой кислоты к димеру бета-полипептида или молекулам бета-полипептида, находящимся в диапазоне от примерно 5.5 до примерно 8.5.

Иллюстративные комбинированные способы лечения: данное изобретение относится к способу торможения пролиферации или активации Т-лимфоцитов или обоих процессов, при этом способ заключается в обеспечении контакта Т-лимфоцита с эффективным количеством композиции с бетаполипептидом, являющейся предметом изобретения, в комбинации с метотрексатом. Данное изобретение относится к способу торможения иммунного ответа у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бета-полипептидом, являющейся предметом изобретения, в комбинации с метотрексатом. Данное изобретение относится к способу индукции иммунологической толерантности к антигену у пациента, при этом способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции с бетаполипептидом, являющейся предметом изобретения, в комбинации с метотрексатом.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А, 1Б представляют нуклеотидную последовательность (8Е0 ΙΌ N0:1) части кассеты экспрессии молекулы СТЬА4-1д. Также показана аминокислотная последовательность (ИД ПСЛ:2), кодируемая этой нуклеиновой кислотой. Молекулы СТЬА4-1д, которые можно получить с помощью этой кассеты экспрессии, включают те, что имеют аминокислотную последовательность из остатков: ί) 26-383 из 8ЕО ΙΌ N0:2, ίί) 26-382 из 8ЕО ΙΌ N0:2, ίίί) 27-383 из 8ЕО ΙΌ N0:2, ίν) 26-382 из 8ЕО ΙΌ N0:2, (ν) 25382 из 8Е0 ΙΌ N0:2 и (νί) 25-383 из 8Е0 ΙΌ N0:2. Кассета экспрессии включает следующие районы: а) сигнальная последовательность онкостатина М (нуклеотиды 11-88 из 8Е0 ΙΌ N0:1; аминокислоты 126 из 8Е0 ΙΌ N0:2); б) внеклеточный домен человеческого СТБА4 (нуклеотиды 89-463 из 8Е0 ΙΌ N0:1; аминокислоты 27-151 из 8Е0 ΙΌ N0:2); в) модифицированный участок постоянного района человеческого Ι§61 (нуклеотиды 464-1159 из 8Е0 ΙΌ N0:1; аминокислоты 152-383 из 8Е0 ΙΌ N0:2), включая модифицированный шарнирный участок (нуклеотиды 464-508 из 8Е0 ΙΌ N0:1; аминокислоты 152-166 из 8Е0

- 19 017765

ГО ΝΟ:2), модифицированный домен С_н2 человеческого (нуклеотиды 509-838 из 8ЕО ГО ΝΟ:1; аминокислоты 167-276 из 8ЕО ГО ΝΟ:2) и домен С_Н3 человеческого (нуклеотиды 839-1159 из 8ЕО

ГО ΝΟ:1; аминокислоты 277-383 из 8ЕО ГО ΝΟ:2).

Фиг. 2 представляет нуклеиновую кислоту (верхний ряд) и аминокислотные (нижний ряд) последовательности, соответствующие СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. Эта аминокислотная последовательность содержит отличия от аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1, где эти изменения затрагивают положение 29 (от А до Υ) и положение 104 (от Ь до Е) при сравнении с 8ЕО ГО ΝΟ:2, где нумерация аминокислотных остатков начинается с метионина (М), помеченного как +1. Нуклеотидная последовательность СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд показана на этой фигуре, начиная с А в положении 79 (т.е. положении, помеченном как +1 ниже М) до А в положении нуклеотида 1149 (8ЕО ГО ΝΟ:3). В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, соответствует последовательности от нуклеотида в положении 79 до нуклеотида в положении 1149, обозначенной как 8ЕО ГО ΝΟ:3. Полная нуклеотидная последовательность, показанная на фиг. 2, обозначена как 8ЕО ГО ΝΟ:23 и содержит последовательность нуклеиновых кислот, кодирующий сигнальный пептид онкостатина М.

Фиг. 3 представляет аминокислотную последовательность (8ЕО ГО ΝΟ:4) молекулы СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, включающей предпоследовательность онкостатина М (см. текст, выделенный курсивом и жирным шрифтом). Полипептиды, которые можно получать, - это молекулы, которые являются молекулами СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность из остатков: ί) 26-383 из 8ЕС) ГО ΝΟ:4, ίί) 26-382 из 8ЕС) ГО ΝΟ:4, ίίί) 27-383 из 8ЕС) ГО ΝΟ:4, ίν) 26-382 из 8ЕС) ГО ΝΟ:4, (ν) 25-382 из 8ЕС) ГО ΝΟ:4, (νί) 25-383 из 8ЕС) ГО ΝΟ:4.

Фиг. 4 - модель СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, показанная с Ν-связанными сайтами гликозилирования (Ν76, Ν108 и Ν207), дисульфидная связь С120-С120 и две аминокислотные замены, внесенные в домен СТЬА4 (1.104Е и Α29Υ).

Фиг. 5 представляют теоретическую аминокислотную последовательность из СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд (8ЕО ГО ΝΟ:4), определенную кДНК. Две аминокислотные замены внесены во внеклеточный домен СТЬА-4 (Б104Е и Α29Υ) с тем, чтобы получить СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. Эта последовательность идентифицирует сигнальный пептид (предпоследовательность) онкостатина М вместе с Ν-связанными сайтами гликозилирования.

Фиг. 6 - диаграмма, на которой отображено связывание образцов СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд с козьими Есантителами к человеческому ^0. Связывание образцов СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд выявлено путем измерения реакции, полученной на поверхности, при сравнении с немодифицированной поверхностью сенсорного чипа. Различные партии отображают три разных образца СТЕА4^А29™^04Е4д.

Фиг. 7 - диаграмма, на которой представлены кажущиеся молекулярные массы, которые соответствуют мультимерной, тетрамерной и димерной фракциям СТБА44д на пике очистки хроматограммы с гидрофобным взаимодействием, что определено наложением двухколоночной гельпроникающей хроматографии с динамической детекцией рассеяния света и временем удержания на хроматограмме, полученной с помощью гельпроникающей хроматографии.

Фиг. 8А и 8Б отображают репрезентативные изоэлектрофокусировочные гели с фракциями гликозилированных молекул СТЬА44д (включающих мономеры 8Е0 ГО ΝΟ:2), выделенных и очищенных из пиков очистки, которые получены с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием. Порядок загрузки для верхнего геля таков: дорожка 1, пи-маркёры (Атегкйат); дорожка 2, стандартный димер СЬТА44д; дорожка 3, элюат белка А; дорожка 4, мультимер; дорожка 5, тетрамер, дорожка 6, димер. Порядок загрузки для нижнего геля таков: дорожка 1, пи-маркёр (Атегкйат); дорожка 2, дорожка 2, стандартный димер СЬТА44д; дорожка 3, тетрамер; дорожка 4, диссоциированный тетрамер. По полосам видно, что тетрамер сиалилирован меньше, чем димер.

Фиг. 9 демонстрирует преобладающие углеводные структуры и относительное содержание углеводов, наблюдаемое в димере СТЬА44д, включающем мономеры с последовательностью 8Е0 ГО ΝΟ:2. Нумерация аминокислотных остатков на фигуре не соответствует 8Е0 ГО ΝΟ:2. Чтобы нумерация аминокислотных остатков на фигуре соответствовала 8Е0 ГО ΝΟ:2, нумерацию нужно увеличить на 26, т.е. № 76 превратить в № 102.

Фиг. 10 демонстрирует репрезентативный изоэлектрофокусировочный гель (рН от 4.0 до 6.5) димера СТЕА44д, содержащего мономеры с последовательностью 8Е0 ГО ΝΟ:2. Дорожки 1 и 5 соответствуют калибровочному стандарту, каждая из дорожек 2, 3, 4 соответствует содержанию димера СБТА44д 20 мкг/мкл.

Фиг. 11 демонстрирует репрезентативный изоэлектрофокусировочный гель (рН от 4.0 до 6.5) димера СТЕА4^А29™^04Е4д, содержащего мономеры с последовательностью 8ЕО ГО ΝΟ:4. Дорожки 1 и 8 соответствуют калибровочному стандарту, каждая из дорожек 2-7 соответствует содержанию димера СТЕА4^А29™^04Е4д 10 мкг/мкл.

Фиг. 12 демонстрирует профиль Ν-связанных углеводов в популяции молекул СТЕА44д, включающей мономеры с последовательностью 8ЕО ГО ΝΟ:2. Эти углеводы выделены из гликопептидов и разделены с помощью жидкостной хроматографии с пористым графитообразным углеродом и массспектрометрии Ν-связанных олигосахаридов. Хроматограммы отображают профиль популяции для каж

- 20 017765 дого сайта присоединения Ν-связи. А) Аспарагин 76 (аспарагин 102 в 8Еф ГО N0:2) углеводы из Т5пептида и Б) аспарагин 108 (аспарагин 134 в 8Е0 ГО N0:2) углеводы из Т7-пептида проявляют распределение среди моно- и мультисиалированных форм. В) Аспарагин 207 (аспарагин 233 в 8Еф ГО N0:2) углеводы из Т14-пептида состоят преимущественно из несиалированных форм. Г) Представлено распределение Ν-связанных углеводов в отношении молекул СТЬА4-1д. Д) Отдельный необработанный спектр Т5-пептида демонстрирует главный пик, соответствующий двухантенной моносиалированной структуре. Е) Отдельный необработанный спектр Т14 демонстрирует главный пик, соответствующий двухантенной несиалированной структуре. Ж) Отдельный необработанный спектр состоит из немногочисленных форм, которые элюируются вместе с пиком на 64.23 минутах, который соответствует трехантенной дисиалированной структуре. З) Отдельный необработанный спектр выявляет главные формы в пике на 64.23 минутах, который соответствует двухантенной дисиалированной структуре.

Фиг. 13А, 13Б демонстрируют УФ- и суммарную ионную хроматограмму (профиль) Ν-связанных олигосахаридов мономера СТЬА4-1д с 8Еф ГО Ν0:2 согласно хроматографии с пористым графитообразным углеродом в условиях кислотной элюции (0.05% ΊΕΑ). Кривая на фиг. 13А демонстрирует отрицательную сумму ионов в отношении хроматограммы, полученной с пористым графитообразным углеродом в условиях кислотной элюции (0.05% ТЕА). Кривая на фиг. 13Б демонстрирует УФ-спектр при 206 нм в отношении хроматограммы, полученной с пористым графитообразным углеродом в условиях кислотной элюции (0.05% ТЕА).

Фиг. 14А, 14Б демонстрируют УФ- и суммарную ионную хроматограмму (профиль) Ν-связанных олигосахаридов мономера СТЬА4-1д с 8Еф ГО Ν0:2 согласно хроматографии с пористым графитообразным углеродом в условиях основной элюции (0.4% ΝΠ^^. Кривая на фиг. 14А демонстрирует отрицательную сумму ионов в отношении хроматограммы, полученной с пористым графитообразным углеродом в условиях основной элюции (0.4% NΠ₄0Н). Кривая на фиг. 14Б демонстрирует УФ-спектр при 206 нм в отношении хроматограммы, полученной с пористым графитообразным углеродом в условиях основной элюции (0.4% NΠ40Н).

Фиг. 15 демонстрирует сравнительные углеводные профили Ν-связанных олигосахаридов в отношении молекул СТЬА4^{А29¥Ъ104Е}-1д, содержащих 8Е0 ГО Ν0:4. В отношении олигосахаридных доменов выявлено: домен I содержит несиалированные формы, в то время как домены II, III и IV содержат моно-, ди- и трисиалированные формы соответственно. Домены определены с помощью хроматографического выделения олигосахаридов и их анализа с помощью масс-спектрометрии.

Фиг. 16 демонстрирует профиль Ν-связанных олигосахаридов в молекулах мономеров СТЕА4-[д. содержащих 8Е0 ГО Ν0:2 и полученных с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН и импульсного амперометрического детектора. Домены показаны в порядке возрастания содержания сиаловой кислоты в олигосахаридах. Домены I, II, III и IV содержат олигосахаридные структуры, содержащие соответственно 0, 1, 2 и 3 сиаловые кислоты. Метки пиков указывают олигосахаридные структуры, присвоенные при исследовании профилей пиков, собранных в результате профилирования с использованием пористого графитообразного углерода, при помощи анионообменной хроматографии с высоким рН и импульсного амперометрического детектора. Структурная идентификация углеводной структуры соответствует предыдущим находкам.

Фиг. 17А, 17Б демонстрирует профиль молекулы мономера СТ^Α4-Iд, содержащего 8Е0 ГО Ν0:2, который получен с использованием пористого графитообразного углерода. Это профиль получен путем прямого впрыска смеси переваренных углеводов, как описано в примере 3. Благодаря прямому впрыску возможна детекция структуры Р4144, элюирующейся на 130 мин. Тетрасиалированная структура Р4144 в профилях олигосахаридов, выделенных до впрыска, не выявлена.

Фиг. 18 демонстрирует спектр с обратной сверткой и положительным электрораспылением (полученной с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии) для Т9-фрагмента мономера с последовательностью 8Е0 ГО Ν0:2. Спектр демонстрирует три главных О-связанных структуры. Спектр демонстрирует пептид из оснований с лестницей из сахаров, соответствующий О-связанной структуре (ОаШАсАОаБ^еиАс)!. Часть спектра, выделенная жирным шрифтом, имеет 10-кратное усиление относительно части, не выделенной жирным шрифтом, и демонстрирует две дополнительные О-связанные структуры с (баШАсфШаВ^еиАсД и (СаГОАсАС^АсПСаААеиАсЕ.

Фиг. 19 демонстрирует точки присоединения и относительные популяции О-связанных углеводных структур в одной цепи мономера СТ^Α4-Iд, содержащего последовательность 8Е0 ГО Ν0:2. Относительное содержание в каждом сайте демонстрирует данные, полученные с помощью двух или нескольких ортогональных методик, при этом они подвержены колебаниям. Также указана локализация ковалентного цистеинилирования.

Фиг. 20 демонстрирует карту промежуточной плазмиды ρ^^N^1шС'Т^Α4-[д. Эта плазмида содержит последовательность, которая кодирует молекулу СТ^Α4-Iд у человека (йиСТ^Α4-Iд) (т.е. 8Е0 ГО Ν0:1), где по бокам находятся сайты для энзиматического расщепления НгибШ и ХЬаЕ

Фиг. 21 демонстрирует карту плазмиды ρΌΙ 6БЕА29У. Эта плазмида содержит последовательность, которая кодирует молекулу СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд у человека (т.е. 8Е0 ГО Ν0:4).

Фиг. 22 - это фотография блоттинга по Саузерну ДНК, экстрагированной из клеток СНО, экспрес

- 21 017765 сирующих кассеты экспрессии СТЬЛ4-1д, производные 1Ό5-100Ά1 (например, клон 17). Дорожки на геле слева направо соответствуют: дорожка М, маркёр молекулярной массы ДНК; дорожка Ν, обработанная ЕсоШ/ХЬа! нетрансфицированная ДНК СНО (5 мг); дорожка 1, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 нетрансфицированная ДНК СНО (2.5 мкг) + 1 нг рс8ПйиСТЬЛ4-1д; дорожка 2, обработанная ЕсоШ/ХЬа! нетрансфицированная ДНК СНО (2.5 мкг) + 0.5 нг рс8ПйиСТЬЛ4-1д; дорожка 3, обработанная ЕсоШ/ХЬа! нетрансфицированная ДНК СНО (2.5 мкг) + 0.25 нг рс8ПйиСТЬЛ4-1д; дорожка 4, обработанная ЕсоШ/ХЬа! нетрансфицированная ДНК СНО (2.5 мкг) + 0.125 нг рс8ПйиСТЬЛ4-1д; дорожка 5, обработанная ЕсоШ/ХЬа! нетрансфицированная ДНК СНО (2.5 мкг) + 0.0625 нг рс8ПйиСТЬЛ4-1д; дорожка 6, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 нетрансфицированная ДНК СНО (2.5 мкг) + 0.03125 нг рс8ПйиСТЬЛ4-1д; дорожка 7, обработанная ЕсоШ/ХЬа! ДНК: МСВ (5.0 мкг); дорожка 8, обработанная ЕсоШ/ХЬа! ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030618А-01 (5.0 мкг); дорожка 9, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030712А-01 (5.0 мкг); дорожка 10, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030801А01 (5.0 мкг); дорожка 11, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 ДНК: МСВ (2.5 мкг); дорожка 12, обработанная ЕсоШ/ХЬа! ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030618А-01 (2.5 мкг); дорожка 13, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030712А-01 (2.5 мкг); дорожка 14, обработанная ЕсоШ/ХЬа! ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030801А-01 (2.5 мкг); дорожка 15, обработанная ЕсоШ/ХЬа! ДНК: МСВ (1.25 мкг); дорожка 16, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030618А-01 (1.25 мкг); дорожка 17, обработанная ЕсоК1/ХЬа1 ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030712А-01 (1.25 мкг); дорожка 18, обработанная ЕсоШ/ХЬа! ДНК: ЕРСВ Номер партии С20030801А-01 (1.25 мкг).

Фиг. 23 демонстрирует технологическую схему процесса культивирования в промышленном масштабе. Это процесс обеспечивает массовое производство рекомбинантных белков в 25000-л производственном реакторе.

Фиг. 24 демонстрирует репрезентативную хроматограмму системы соответствия стандартам ΝΟΝΆ и ΝΑΝΑ. Пик на -9.6 мин соответствует ΝΟΝΑ, пик на -10.6 мин - ΝΑΝΑ.

Фиг. 25 демонстрирует репрезентативную хроматограмму гидролизованных молекул ΟΓΕΑ4-Ι§, содержащих мономеры с последовательностью 8ЕО ГО ΝΟ:2. Пик на -8.4 мин соответствует пику растворителя. Пик на -9.6 мин соответствует ΝΟΝΑ. Пик на ~10.5 мин соответствует ΝΑΝΑ. Пик на -11.3 мин соответствует расщепленному ΝΑΝΑ, получающемуся в условиях гидролиза. Доли площади, соответствующие ΝΑΝΑ и расщепленной ΝΑΝΑ, объединены для расчета молярного отношения ΝΑΝΑ.

Фиг. 26А-26В демонстрируют спектры цистеинилированного пептида С.'ТЕЛ4-1д. полученные с помощью лазерной десорбции-ионизации в присутствии матрицы. Эти спектры получены для фрагмента ΟΓΕΑ4-Ι§, выделенного после обработки трипсином/химотрипсином и содержащего цистеин 146 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2. Фиг. 26А демонстрирует спектр одноцепочечного пептида, иллюстрируя модификацию цистеинилированием. Фиг. 26Б демонстрирует спектр одноцепочечного пептида после восстановления и демонстрирует, что модификация происходит по цистеину 146. Фиг. 26В демонстрирует алкилирование восстановленного одноцепочечного пептида, что демонстрирует цистеинилирование в положении цистеина 146.

Фиг. 27 демонстрирует схему клонирования, применяемую для получения вектора рс8Э. рс^NΑ3 обработан рестрикционным ферментом №е1, чтобы выделить фрагмент массой 3.821 КЬ, который содержит промоутер СМУ, ген устойчивости к ампициллину и начало репликации Е.соЬ. р8У2-бЫт обработан рестрикционными ферментами ΡνυΙΙ и ВатШха, чтобы выделить фрагмент массой 1.93 КЬ, который содержит промоутер 8У40 и ген бЫг, а затем конец ДНК обрублен. Для получения рс8Э оба фрагмента связаны вместе. Карта плазмиды рс8Э показана в нижней части фигуры.

Фиг. 28 демонстрирует схему клонирования, применяемую для получения вектора экспрессии рс8^ЬиСТ^Α4-Iд. рс8Э обработан рестрикционными ферментами ЕсоКУ и ХЬаЕ р^^N-ЬиСТ^Α4-Iд обработан рестрикционным ферментом ΗίηάΙΙΙ, конец ДНК обрублен, а затем обработан рестрикционным ферментом ХЬаЕ чтобы выделить фрагмент ΗπΟΓΕΑ4-Ι§ массой 1.2 КЬ. Для получения рс8^ЬиСТ^Α4Ι& фрагмент ΟΓΕΑ4-Ι§ связан с обработанным вектором рс8Э. Карта плазмиды рс8^ЬиСТ^Α4-Iд показана в нижней части фигуры. Эта плазмида приведена в линейное состояние и трансфицирована в клетки СНО, в которых отсутствует функциональный ген бМт. Поскольку плазмида содержит функциональный ген бЫг, стабильные трансфектанты можно выбирать на основе клеточной выживаемости. рс8^1шС'Т^Л4-Iд содержит кассету экспрессии, включающую промоутер СМУ, последовательность, кодирующую молекулу СТ^Α4-Iд у человека (ЬиСТ^Α4-Iд) (т.е. 8ЕО ГО ΝΟ:1) и многохвостную последовательность ВОН.

Фиг. 29 демонстрирует электроферограмму системы пригодности аминированных моносахаридов, представленной в относительных единицах флуоресценции (КЕИ) против времени (мин).

Фиг. 30 демонстрирует электроферограмму системы пригодности нейтральных моносахаридов, представленной в относительных единицах флуоресценции (КЕИ) против времени (мин).

Фиг. 31 демонстрирует трипсиновую карту пептида СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд с мечеными пептидами. Табл. 23 соответствует меченым пептидам.

Фиг. 32 демонстрирует Нозерн-анализ гибридизации СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. Панель А демонстрирует гель с агаром, окрашенный этидия бромидом, где дорожка М - маркёр РНК; дорожка 1 - суммарная РНК

- 22 017765 в СНО; дорожка 2 - суммарная РНК в МСВ; дорожка 3 - суммарная РНК в ЕРСВ. Панель Б соответствует авторадиограмме, где дорожка М - маркёр РНК; дорожка 1 - суммарная РНК в СНО; дорожка 2 - суммарная РНК в МСВ и дорожка 3 - суммарная РНК в ЕРСВ.

Фиг. 33А-33В демонстрирует эксклюзионные хроматограммы, которые разделяют димеры СТЬЛ4^{А29¥Ъ104Е}-1д от высоко- и низкомолекулярных форм.

Фиг. 34 демонстрирует анализ 8Э8-РАСЕ (восстановленный или невосстановленный) СТЬА4^{А29¥Ъ104Е}-1д, окрашенного синим красителем Кумасси. Дорожка 1 заполнена маркёрами молекулярной массы; дорожки 2, 7 и 12 пусты; дорожки 3-6 - образцы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д (восстановленные); дорожки 8-11 - образцы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д (невосстановленные).

Фиг. 35 демонстрирует анализ 8Э8-РАСЕ (восстановленный или невосстановленный) СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, окрашенного серебряным красителем. Дорожка 1 заполнена маркёрами молекулярной массы; дорожки 2, 7 и 12 пусты; дорожки 3-6 - образцы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д (восстановленные); дорожки 811 - образцы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д (невосстановленные).

Фиг. 36 демонстрирует пептидную карту невосстановленного СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, полученную обработкой трипсином и химотрипсином.

Фиг. 37 демонстрирует пептидную карту невосстановленного СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, полученную обработкой трипсином и эластазой.

Фиг. 38 - диаграмма, отображающая пациентов с антителами к СТЬА4-1д или СТЬА-4. Выработка антител ко всей молекуле СТЬА4-1д (части СТЬА-4 и 1д) и только части СТЬА-4 проанализирована с помощью анализов А и Б, как показано в примере 32.

Фиг. 39 - схематическое изображение распределения клиренса и объема центрального компартмента в зависимости от статуса иммуногенности.

Фиг. 40 - диаграмма, демонстрирующая профиль средних (8Ό) концентраций СТЬА4-1д в сыворотке в зависимости от времени у обезьян, которым ввели 10 мг/кг лекарственного вещества, полученного с помощью способа, являющегося предметом изобретения.

Фиг. 41 - диаграмма эксклюзионной хроматограммы белка А (МАЬ8с1сс1). очищенного из контроля и дезагрегированного материала СТЬА4-1д.

Фиг. 42 - диаграмма анализа №гликана, сравнивающего дезагрегированный материал (и) с контролем (1).

Фиг. 43 - диаграмма, демонстрирующая средние сывороточные концентрации СТЬА4-1д [мкг/мл] против времени (за 71 сутки).

Фиг. 44 демонстрирует электроферограмму нейтральных моносахаридов, представленную в относительных единицах флуоресценции (КРИ) против времени (мин).

Фиг. 45 электроферограмму нейтральных аминомоносахаридов, представленную в относительных единицах флуоресценции (КРИ) против времени (мин).

Фиг. 46 демонстрирует сравнительные углеводные профили ίν-связанных олигосахаридов для молекул СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, содержащей 8ЕО ГО N0:4. Выявлено четыре олигосахаридных домена, где домен I содержит несиалированные формы, а домены II, III и IV содержат моно-, ди- и трисиалированные формы соответственно.

Фиг. 47 - диаграмма разделения СТ^Α4-Iд, смешанного в соотношении 1:1 с СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, с помощью капиллярного электрофореза. Время миграции главных пиков составляет примерно 0.8 мин.

Фиг. 48 - хроматограмма гидролизованного материала СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, где пик NΑNΑ выявляется на 3.4 мин.

Фиг. 49 демонстрирует несколько различных ^связанных углеводных структур, обнаруженных в белках млекопитающих. Во всех цепях имеются одинаковые сердцевинные структуры, содержащие СЬНАс и три остатка маннозы.

Фиг. 50 - диаграмма, демонстрирующая воздействие СТЬА4-[д (АИС) как функцию сиалирования гликопротеина (отношение NΑNΑ).

Фиг. 51 - диаграмма, демонстрирующая воздействие СТ^Α4-[д (АИС) как функцию углеводного профиля. При высокоэффективной анионообменной хроматографии получено большое число пиков, которые разрешены на четыре или пять доменов. Домены 1 и 2 - в основном несиалированные и моносиалированные структуры, домены 3 и 4 - в основном ди- и трисиалированные структуры.

Фиг. 52 демонстрирует трипсиновую карту пептида СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд с мечеными пептидами. Табл. 56 соответствует меченым пептидам.

Фиг. 53 демонстрирует сравнительные углеводные профили ^связанных олигосахаридов для молекул СТ^Α4-[д. содержащих 8Е0 ГО N0:2. Выявлены четыре олигосахаридных домена, где домен I содержит несиалированные формы, а домены II, III и IV содержат моно-, ди- и трисиалированные формы соответственно.

Фиг. 54А-54Г - диаграмма, которая демонстрирует профили олигосахаридов СТ^Α4-[д и пептидов Т5, Т7 и Т14, полученные с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН и импульсного амперометрического детектора.

Фиг. 55 - диаграмма, которая демонстрирует профили олигосахаридов СТ^Α4-[д. полученная с ис

- 23 017765 пользованием колонки, заполненной пористым графитообразным углеродом (НурегсагЬ).

Фиг. 56 демонстрирует диаграмму фармакокинетических данных, полученных у обезьян, АИС на оси Υ и проценту Ν-связанного гликозилирования, как показано в доменах I и II углеводного профиля на оси X. См. методики определения профиля Ν-связанных углеводов, например, в примерах 3, 44, 22 и 37. По мере увеличения процентной доли доменов I и II (и снижения процентной доли доменов III, IV и V), клиренс возрастает. Обратите внимание, что отрицательный контроль, СТ^А4-Iд с низким содержанием сиаловой кислоты, выводится очень быстро. Обратите внимание, что в эту диаграмму включен вариант СТЬА44д, БЕА (СТ1.А4-1д'’' -1д).

Фиг. 57А и 57Б демонстрирует хроматограмму Ν-связанных углеводов, высвобожденных из СТА4Ц (что получается с помощью методик, описанных в примерах 3, 44, 22 и 37). Изображение на фиг. 57А результат анализа СТ^А4-Iд. выработанного с помощью культивирования, без добавления галактозы в культуру. Изображение на фиг. 57Б отображает добавление галактозы в культуру. Процентные доли Νсвязанных углеводов в каждом домене показаны в таблице-вставке.

Фиг. 58 демонстрирует изображение хроматограммы Ν-связанных углеводов, высвобожденных из СТА44д (что получается с помощью методик, описанных в примерах 3, 44, 22 и 37). Это результат анализа СТЬА44д, выработанного с помощью культивирования, с добавлением галактозы в культуру на 8-е сутки. Изображение - результат анализа СТЬА44д, выработанного с помощью культивирования, без добавления галактозы в культуру. Процентные доли Ν-связанных углеводов в каждом домене показаны в таблице-вставке.

Фиг. 59 демонстрирует изображение хроматограммы Ν-связанных углеводов, высвобожденных из СТА44д (что получается с помощью методик, описанных в примерах 3, 44, 22 и 37). Это результат анализа СТЬА44д, выработанного с помощью культивирования, с добавлением галактозы в культуру на 14-е сутки. Изображение - результат анализа СТЬА44д, выработанного с помощью культивирования, без добавления галактозы в культуру. Процентные доли Ν-связанных углеводов в каждом домене показаны в таблице-вставке.

Фиг. 60А и 60Б демонстрирует изображения хроматограмм Ν-связанных углеводов, высвобожденных из СТА44д (что получается с помощью методик, описанных в примерах 3, 44, 22 и 37). Фиг. 60А результат анализа СТЬА44д, выработанного с помощью культивирования, без добавления галактозы, Фиг. 60Б - результат анализа с добавлением галактозы в культуру на 14-е сутки. Это изображение - результат анализа СТЬА44д, выработанного с помощью культивирования, без добавления галактозы в культуру. Процентные доли Ν-связанных углеводов в каждом домене показаны в таблице-вставке.

Фиг. 61 демонстрирует изображение хроматограммы Ν-связанных углеводов, высвобожденных из СТА44д (что получается с помощью методик, описанных в примерах 3, 44, 22 и 37). Это изображение получено в отношении материала СТЬА44д, который был выделен на стадии промывания колонки ЦБР, с выходом материала СТЬА44д с низким содержанием сиаловой кислоты. Относительные доли доменов I и II увеличились, а доменов III и IV уменьшились по сравнению с изображениями на фиг. 60, 59 и 58. Процентные доли Ν-связанных углеводов в каждом домене показаны в таблице-вставке.

Фиг. 62 демонстрирует трипсиновую карту пептида СТЬА44д, указывающую, что Т8 элюируется к концу фронта растворителя, а Т9 элюируется на плече Т27.

Фиг. 63 - диаграмма, которая демонстрирует полный масс-спектр, соответствующий гликопептиду Т8 из СТЬА44д.

Фиг. 64 - диаграмма, которая демонстрирует полный масс-спектр, соответствующий гликопептиду Т9 из СТЬА44д.

Фиг. 65 - диаграмма, которая демонстрирует данные лазерной десорбции-ионизации в присутствии матрицы-ТОР для фрагмента пептида Т9 из СТЬА44д.

Фиг. 66А, 66Б демонстрируют ионные хроматограммы и масс-спектры окисленных и нативных трипсиновых пептидов из СТЬА44д.

Фиг. 67 демонстрирует типичный профиль Ν-связанных олигосахаридов (домены I, II, III, IV и V, и пики и ГВ в пределах в среднем 5% для партии). Пики 1А, 1В и 1С соответствуют несиалированным Ν-связанным олигосахаридным структурам 00, 01 и 02. Данные профиля приведены в таблице, расположенной чуть ниже. См. пример 44.

- 24 017765

Название

Площадь

19,413

2567838

27989176

47807873

50746179

22,685

29,076

30,763

3421324

14331509

11115168

633176

13507144

Домен I

Домен II

Домен 111

Домен V

Домен Γν

Фиг. 68 демонстрирует изоэлектрофокусировочный гель с СТЬА4-1§. Полосы характеризуются:

Дорожка	Описание	Содержание белка (микрограммы)	Полоса №	Суммарная % интенсивность полосы	Относительная процентная доля полосы (%)
1	Маркеры ΙΒΡ	Неприменимо	Неприменимо	Неприменимо	Неприменимо
2	СТЬА4-1§ та1епа!	20	16	100	Неприменимо
3	Лекарственное вещество с СТЬА4-1§	20	16	100	100
4	Окрашенный контроль	1	Неприменимо	Неприменимо	Неприменимо

Фиг. 69 демонстрирует репрезентативный протокол количественного анализа СТЬА4-1§ с использованием изоэлектрофокусировочного геля. Проведен количественный анализ геля и получены следующие данные:

----ШГМаркер-----		ВОС060082 (05 АВС04014)	Окрашенный контроль
Дорожка. 1.	Дорожка 2	Дорожка 1	Цорожка2	. Дорожка 2	Дорожка 2	Дорожка 3	Дорожка 3	Дорожка 3 :	Дорожка 4	Дорожка 4	Дорожка 4
Полоса .	Полоса. %	р!	Полоса	Полоса %	ΡΙ	Полоса	Полоса %	Р1	Полоса	Полоса %	Р1
I	20.95	5.83	1	0.51	52«	I	1.34	5.26	1	100	3.68
2	2239	. .5,2 .	2	0.17	5.25	2	234	5.19
. 3. .	9.62	455	' 3 ;	0.71	5.23	' 3	0.99	5.17
. 4 ,	47.04	3.5	4	161	5.2	4	3.2	5.14
			5	1.15	3.18	5	3.23	5.11
			6	7.44	5.15	6	з:41	5.08
			7'	10.96.	.5.09	7	10.29.	5.03
			8	9.32	5.02	8	5.95	5.01
			9	18.22	4.94	9	5.66	4.97
			10	5.52	4491	10	13.4	. 4.91
			II	4.19	4.8«	Η ί	17Л1	4.85
			12	22.58	4.82	12	7.39	4.8
			13	3.8 . ;	. 4,67	13	.1603	4.72
			14	10.02	4.63	14	3.88	4.56
			15	3.44	4.55	‘15	' 4.97	4,52 *
			16	0.35	4.48 .	16	0.8	4.45
		Полосы (4.5-5.6)		Полосы (4Л-5.6)	16
		.% полос (43-5.3)	.100	% полос	(4.3-5.3)	100
	Относительный процент образцэ£%)	100 1	1

Относительный процент образца!9л)-³ (Образец %Интенсивность полосы/отн. %-ая интенсивность полосы)х 100 Примечание; Для р! области от.4,3 до 53

Фиг. 70А демонстрирует типичный стандарт пригодности системы с впрыском 20 мкл в колонку Т080 НАА8 3000 8ШХС. оснащенной предохрантительной колонкой. Фиг. 70Б демонстрирует эталонный материал с 20 мкл СТЬА4-1§ для впрыска в колонку Т080 НАА8 3000 8ШХС. оснащенную предохрантительной колонкой.

Фиг. 71. Пример цифрового изображения анализа 8О8-РАОЕ СТЬА4-1§ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (4-20), окрашенном синим красителем Кумасси.

- 25 017765

Дорожка	Описание	Содержание белка (микрограммы)	Невосстановленный (НВУВосстановленный (В) Условия	Процентная интенсивность (%) полосы
1	Лекарственное вещество СТЪА4-1ё	10	НВ	100
2	Материал с СТЬА4-1§	10	НВ	99
3	Пустой	Неприменимо	НВ	Неприменимо
4	Лекарственное вещество СТЬА4-1§ се	10	в	100
5	Материал с СТЬА4-1§	10	в	100
6	Маркер молекулярной массы	Неприменимо	Неприменимо	Неприменимо
7	Лекарственный продукт СТЬА4-1§	10	НВ	99
8	Материал с СТЬА4-1§	10	НВ	100
9	Пустой	Неприменимо	НВ	Неприменимо
10	Лекарственный продукт СТЬА4-1§	10	В	99
11	Материал с СТЬА4-1§ та1епа1	10	В	99
12	Окрашенный контроль с ингибитором трипсина	Неприменимо	Неприменимо	Неприменимо

Фиг. 72 демонстрирует пример протокола количественного анализа с использованием δϋδ-ΡΑΘΕ, окрашенного синим красителем Кумасси.

Фиг. 73 демонстрирует таблицу с данными количественного анализа с использованием δϋδ-ΡΑΘΕ, окрашенного синим красителем Кумасси, из фиг. 72.

Фиг. 74 демонстрирует пример усиленного изображения анализа СТЬА4-1§ δϋδ-ΡΆΘΕ с использованием геля, окрашенного синим красителем Кумасси, иллюстрирующий положения миграции главных и ожидаемых малых полос относительно маркёров молекулярной массы.

Фиг. 75 - отображение репрезентативного профиля Ν-связанных углеводов в эталонном и стандартном материале СТЬЛ4-1д. Это репрезентативный углеводный профиль, полученный после цикла на системе Ша1ег8. Время удержания определяется системой.

Фиг. 76 - отображение репрезентативной хроматограммы стахиозной системы пригодности.

Фиг. 77 - изображение репрезентативной хроматограммы материала гидролизованного СТЬА4-1§.

Фиг. 78 демонстрирует сканированное изображение полиакриламидного (4-20%) геля, окрашенного синим красителем Кумасси, после анализа δϋδ-ΡΆΘΕ СТЕА4^А29¥Ы04Е-1§ с помощью электрофореза.

Дорож ка №	Описание	Содержание белка (рис)	Условия В/НВ	% Чистота (%)
1	Лекарственное вещество	10	НВ	99
2	Эталонный материал Α29ΥΕ104Ε_ΐ£	10	НВ	99
3	Пустой	Непримен ИМО	НВ	Неприменимо
4	Лекарственное вещество СТЬА4 Λ29ΥΠ04Ε	10	В	100
5	Эталонный материал с США Α29ΥΠ04Ε	10	В	100
б	Маркер молекулярной массы	Неприменимо	В	Неприменимо
7	Эталонный материал с СТЬА А29УЫ04Е_^	10	В	99
.8	Продукт СТЬАа29Ш04Е-1§	10	в	99
9	Пустой	0	НВ	0
10	Эталонный материал с СТЕА А29Ш04Е_|&	10	НВ	100
11	Продукт СШАА29¥Ш4ЕЛ§	10	НВ	100
12	Окрашенный контроль	од	НВ	100

Фиг. 79 демонстрирует технологическую схему стадий сбора, см. пример 28.

Фиг. 80 демонстрирует электроферограмму системы пригодности аминомоносахаридов, см. пример 16.

- 26 017765

Фиг. 81 демонстрирует диаграмму фармакокинетических данных, полученных у обезьян, ЛИС на оси Υ и проценту ^связанного гликозилирования, как показано в доменах Ι и ΙΙ углеводного профиля на оси X. См. методики определения профиля ^связанных углеводов, например, в примерах 3, 44, 22 и 37. По мере увеличения процентной доли доменов Ι и ΙΙ (и снижения процентной доли доменов ΙΙΙ, Ιν и V) ЛИС возрастает. Обратите внимание, что отрицательный контроль, СТЕЛ4-[д с низким содержанием сиаловой кислоты, выводится очень быстро. Обратите внимание, что в эту диаграмму включена мутантная молекула СТЕЛ4-[д - СТ^А4-Iд^{Λ29Υ^104Е}-Iд (обозначенная как ЬЕА).

Фиг. 82 демонстрирует диаграмму фармакокинетических данных с АИС на оси Υ и процентной долей ^связанного гликозилирования, как показано в доменах ΙΙΙ и Ιν (что определяется по профилю N связанных углеводов) на оси X. По мере увеличения процентной доли доменов Ι и ΙΙ АИС возрастает. Обратите внимание, что отрицательный контроль, С.'ТЕА4-[д с низким содержанием сиаловой кислоты, выводится очень быстро. См. методики определения профиля ^связанных углеводов, например, в примерах 3, 44, 22 и 37. Обратите внимание, что в эту диаграмму включена мутантная молекула СТ^А4-[д СТ^А4-Iд^{Λ29Υ^104Е}-Iд (обозначенная как ЬЕА).

Фиг. 83 демонстрирует диаграмму фармакокинетических данных с АИС на оси Υ и процентной долей ^связанного гликозилирования, как показано в доменах ΙΙΙ и Ιν (что определяется по профилю N связанных углеводов) на оси X. По мере увеличения процентной доли доменов Ι и ΙΙ АИС возрастает. Обратите внимание, что отрицательный контроль, СТ^А4-[д с низким содержанием сиаловой кислоты, выводится очень быстро. См. методики определения профиля ^связанных углеводов, например, в примерах 3, 44, 22 и 37. Обратите внимание, что в эту диаграмму включена мутантная молекула СТ^А4-[д СТ^А4-Iд^{Λ29Υ^104Е}-Iд (обозначенная как ЬЕА).

Фиг. 84 демонстрирует трипсиновую карту стандарта СТ^А4-[д. См. таблицу в конце примера 65 в отношении меток пиков. Малый пик, меченный как Т1+А, - это трипсиновый пептид Т1, удлиненный по №концу остатком аланина. Малый пик, меченный как Т31+К, - это трипсиновый пептид Т31, удлиненный по С-концу остатком лизина.

Фиг. 85 демонстрирует наложение данных для трипсиновой карты стандарта СТ^А4-[д плюс вместе с пиками 5 мол.% индикаторного пептида Т6ох, Ме1(0) 85 (84-93). См. пример 65.

Фиг. 86 демонстрирует расширенный вид данных при 215 нм для трипсиновой карты стандарта СТ^А4-Iд плюс вместе с пиками 5 мол.% индикаторного пептида Т26беат1 ΙηΠίοαΓ Рерйбе, 18оАзр294(281-302). См. пример 65.

Подробное описание изобретения

Молекулы 0Т^А4-[д можно использовать для лечения различных заболеваний, включая заболевания, обусловленные патологическими иммунопролиферативными и иимунореактивными явлениями, такими как аутоиммунные реакции и аллергия. Изобретение относится к композициям 0Т^А4-[д. которые, например, включают популяции молекул СТ^А4-[д. имеющих определенные модификации гликозилирования, имеющих определенные углеводные профили или характеристики, имеющих определенные мультимерные структуры и (или) имеющих определенные показатели авидности. Документы, включенные в данное описанное во всей их полноте, которые также описывают молекулы 0Т^А4-[д. их применение и соответствующие методики, включают патенты США 5434131; 5851795; 5885796; 5885579 и 7094874.

Данное изобретение также относится к клеточным линиям, способным вырабатывать большие количества молекул 0Т^А4-[д посредством способов массового производства и культивирования, описанных в данном документе. Одна конкретная клеточная линия, являющаяся предметом изобретения, является клональной клеточной линией, которую можно использовать для массового производства молекул СТ^А4-[д. таких, которые имеют определенный профиль гликозилирования и углеводный профиль. По сравнению с гетерогенной и неклональной клеточной популяцией, имеющей инвентарный номер АТСС 68629 (см. патент США 5434131, который включен в данный документ во всей его полноте в виде ссылки), клональные клеточные линии, являющиеся предметом изобретения, могут секретировать популяцию молекул СТ^А4-[д. имеющую более воспроизводимый или более постоянный профиль гликозилирования или углеводный профиль. Кроме того, по сравнению с гетерогенной и неклональной клеточной популяцией под инвентарным номером АТСС 68629, клональные клеточные линии, являющиеся предметом изобретения, могут секретировать большие количества молекул СТ^А4-[д. отчасти за счет того, что настоящие клональные клеточные линии выбраны из-за того, что они содержат большое количество копий кассет экспрессии СТ^А4-[д. встроенных в единственный сайт клеточного генома.

Данное изобретение относится к открытию того, что авидность и активность 0Т^А4-[д (БЕЦ ΙΌ N0:2) можно увеличить за счет внесения замен двух аминокислот в В7-связывающем регионе связывающего домена СТЬА4: ί) аланин в положении 29 из БЕЦ ΙΌ N0:2 заменен тирозином (Λ29Υ), а и) лизин в положении 104 из БЕЦ ΙΌ N0:2 заменен глутаматом (Ь104Е). Данное изобретение относится к подроду молекул СТ^Λ4-[д. называемых молекулами бета-полипептидов, включающими бетаполипептиды, которые обладают В7-связывающей активностью и могут включать аминокислотную последовательность в БЕЦ ΙΌ N0:24 (внеклеточный домен СТЬА4 с мутациями Λ29Υ и Ь104Е), связанную с постоянным участком иммуноглобулина его частью.

- 27 017765 [8ЕО Ю N0: 24]

МНУ А(^Р АУУЬА88КСг1А8РУСЕУА8РСгКУТЕУВ.УТУЕШЗАО80УТЕУСААТУММС ΝΕΕΤΡΕΟϋδΙΟΤΟΤδδΟΝρνΝΕΤ^ΟΕΚΑΜΟΤΟΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤΟΙ ΥνίϋΡΕΡΟΡϋδϋ [8Εζ) ГО ΝΟ: 18]- Внеклеточный домен СТЬА4

МНУΑΟΡ А У/ЬА88КСг1А8ЕУСЕУА8РСгКАТЕУКУТУЕК.0АО80УТЕУСААТУММО ΝΕΕΤΡΕΟΟδΙΟΤσΤδδΟ^νΝΕΤΙΟσΕΚΑΜΟΤ.σΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσίσΝΟΤςί ΥνίϋΡΕΡΟΡϋδϋ

Термины.

Согласно тому, как используется в данном описании, термин клональный означает клеточную популяцию, которая выращивается из одной-единственной клетки. В отношении клональной клеточной линии или клональной клеточной популяции, способной вырабатывать молекулу СТЬЛ4-1§, клональная клеточная линия или популяция выращивается из одной-единственной клетки, выделенной из популяции клеток, которые были трансфицированы вектором экспрессии, кодирующим молекулу СТЬА4-1§. Трансфецированная популяция клеток может быть гетерогенной популяцией. Клональную клеточную линию или популяцию можно считать гомогенной в том смысле, что все клетки в популяции получают с использованием одного-единственного трансфектанта.

Согласно тому, как используется в данном описании, термин В7-1 означает СЭ80; термин В7-2 означает СЭ86; термин В7 означает либо В7-1, либо В7-2, либо оба из них (СЭ80 и СЭ86). Термин В7-1-1д или В7-11д означает СО80-1§; термин В7-2-1§или В7-21§ означает СО86-1§.

Согласно тому, как используется в данном описании, термины СТЬЛ4-1§, или молекула СТЬА41д, или молекула СТЬЛ41§, или белок СТЬЛ4-1§, или белок СТЬА41§ используются взаимозаменяемо и означают молекулу белка, которая включает, по меньшей мере, полипептид СТЬЛ4-1§, имеющий внеклеточный домен СТЬЛ4, и постоянный участок иммуноглобулина или его часть. В некоторых вариантах, например, полипептид СТЬА4-1§ включает минимум аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:18. В некоторых вариантах СТЬА4 внеклеточный домен и постоянный участок иммуноглобулина или его часть могут относиться к дикому типу, или мутантному, или модифицированному. Мутантный полипептид СТЬА4-1§ - это полипептид СТЬЛ4-1§, включающий мутантный внеклеточный домен СТЬА4. Мутантная молекула СТЬА41§ включает минимум мутантный полипептид СТЬА4-1§. В некоторых вариантах внеклеточный домен СТЬА4 и постоянный участок иммуноглобулина или его часть могут иметь источником организм млекопитающего, включая человека или мышь. В некоторых вариантах мутантный внеклеточный домен СТЬА4 может иметь аминокислотную последовательность, которая минимум на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична внеклеточному домену СТЬЛ4, представленному на фиг. 1 или последовательности 8ЕО ГО N0:18. В некоторых вариантах мутантный постоянный участок иммуноглобулина или его части может иметь аминокислотную последовательность, которая минимум на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична постоянному участку иммуноглобулина (ΐ), как показано на фиг. 1. Полипептид может также включать дополнительные белковые домены. Молекула СТЬА4-1§ может означать мономер полипептида СТЬА4-1§ и также может означать мультимерные формы полипептида, такие как димеры, тетрамеры и гексамеры и т.д. (или другие высокомолекулярные формы). Молекулы СТЬА4-1§ также способны связываться с СЭ80 и (или) СЭ86. Молекулы СТЬА4-1§ включают мутантные молекулы СТЬЛ41§, такие как молекулы бета-полипептидов например, СТЬЛ4^А29¥Ы04Е-1§. Например, СТЬА4-1§ включает молекулы СТЬА4-1§, а СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1§ включает молекулы бета-полипептидов (пример мутантных молекул СТЬА4-1§).

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин внеклеточный домен СТЬА4 означает белковый домен, включающий всю или часть аминокислотной последовательности, показанной в 81%) ГО N0:18, которая связывается с В7-1 (СО80) и (или) В7-2 (СО86). В некоторых вариантах внеклеточный домен СТЬА4 может включать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая минимум на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотам 27-150 из 81%) ГО N0:2, которые соответствуют тем же самым аминокислотам, что показаны в 81%) ГО N0:18. Аминокислота 151 из 81%) ГО N0:2 является соединительной аминокислотой.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин бета-полипептид означает мутантный полипептид СТЬА4-1§, который 1) включает аминокислотную последовательность 81%) ГО N0:18, где аминокислота в положении 29 заменена на тирозин, а аминокислота в положении 104 заменена на глутаминовую кислоту, на выбор, с другими добавочными мутациями, и постоянный участок иммуноглобулина или его часть; и 2) способен связываться с СО80 и (или) СО86. В некоторых вариантах, например, бета-полипептид включает минимум аминокислотную последовательность внеклеточного домена СТЕА4^{А29¥Е104Е}-1§ (как показано в 81%) ГО N0:24). Примеры бета-полипептидов, не налагающие ограничений, включают белатацепт и 81%) ГО N0:4 и 11-16. В некоторых вариантах постоянный участок иммуноглобулина или его часть могут относиться к дикому типу, или мутантному или модифицированному. В некоторых вариантах постоянный участок иммуноглобулина или его часть могут иметь источ

- 28 017765 ником организм млекопитающего, включая человека или мышь. Дополнительные примеры бетаполипептидов, не налагающие ограничений, включают бета-полипептид, содержащий одну или больше аминокислотных мутаций, в постоянном участке иммуноглобулина или его части (например, замену цистеина 120 в 8ЕО Ш N0:4), и бета-полипептид, включающей дополнительные мутации в одной или нескольких аминокислотах в положениях 25, 30, 93, 96, 103 или 105 8Е0 Ш N0:18. Молекулы бетаполипептида включает бета-полипептид. Молекулы бета-полипептида могут означать мономер бетаполипептида и мультимерные формы бета-полипептида, такие как димеры, тетрамеры, гексамеры и т.д. Например, белатацепт включает молекулы бета-полипептидов. Молекулы бета-полипептидов подробнее описаны в предварительной заявке на патент США № 60/849543, зарегистрированной 5 октября 2006 г., которая во всей полноте включена в данный документ в виде ссылки.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термины глутамат и глутаминовая кислота взаимозаменяемы.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин димер означает белок СТЬА4-1д или молекулу СТЬА4-1д, состоящую из двух полипептидов СТЬА4-1д или мономеров, связанных или соединенных вместе. Связь между мономерами в димере может быть нековалентной или нековалентным взаимодействием, ковалентной связью или ковалентным взаимодействием или обоими сразу. Пример димера СТЬА4-1д показан на фиг. 4. Белок СТЬА4-1д или молекула СТЬА4-1д, состоящая из двух одинаковых мономеров, является гомодимером. Гомодимер СТЬА4-1д также включает молекулу, включающую два мономера, которые могут слегка отличаться в последовательностях. Гомодимер включает димер, где мономеры, соединенные вместе, имеют, по существу, одинаковые последовательности. Мономеры в гомодимере обладают значимой структурной гомологией. Например, различия в последовательностях могут быть обусловлены модификациями Ν-конца мономера.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин консервативная мутация означает изменение в последовательности нуклеиновых кислот, где одна аминокислота заменены на другую того же самого класса (например, замена одной неполярной аминокислоты на другую, такую как изолейцин, валин, лейцин или метионин, или замена одной поляной аминокислоты на другую, такую как замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамата на аспарагин).

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин неконсервативная мутация означает изменение в последовательности нуклеиновых кислот, где одна аминокислота заменена на другую другого класса (например, замена одноосновной аминокислоты, такой как лизин, аргинин или гистидин, на кислую аминокислоту, такую как аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). Например, аминокислота может по биохимическому составу отличаться от другой аминокислоты по размеру, заряду, полярности, реакционной способности и другим характеристикам аминокислоты.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин выделенный означает молекулу, извлеченную из ее естественной среды и находящуюся в среде, отличающейся от той, в которой находится молекула в естественных условиях, или вещество (например, белок), который частично или полностью извлечен или отделен от других компонентов его среды таким образом, что это вещество (например, белок) становится преобладающей формой (например, белковой формой), присутствующей в получающейся композиции, смеси или совокупности компонентов (например, на молярной основе эта форма содержится в намного больших количествах, чем любая другая индивидуальная форма в композиции). Например, смесь может состоять из больше чем примерно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95% выделенного СТЬА4-1д. Выделенный не исключает смеси молекул СТЬА4-1д с другими молекулами СТЬА4-1д из среды, в которой находится эта молекула в естественных условиях. Выделенный не исключает фармацевтически приемлемый наполнители, комбинированные с СТЬА4-1д, где СТЬА4-1д выделен из соответствующей среды, такой как клеточная культура, культура одного производственного цикла или биореактор и т.д. Согласно смыслу, использующемуся в данном документе, термин выделение означает осуществление процесса или методики, предназначенного для получения выделенной молекулы СТЬА4-1д.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин растворимый СТБА4 означает молекулу, которая может циркулировать ίη νίνο или СТБА4, который не связан с клеточной мембраной. Например, растворимый СТБА4 может включать СТЬА4-1д, который содержит внеклеточный район СТБА4, связанный с 1д.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин растворимая фракция клеточной культуры означает жидкую часть клеточной культуры, отличающуюся от или преимущественно не содержащую нерастворимые, мелкодисперсные или твердые компоненты клеточной культуры, такие как клетки, клеточные мембраны и ядра. Растворимая фракция может быть, например, надосадочной жидкостью, получающейся после центрифугирования клеточной культуры, или фильтратом, получающимся после фильтрования клеточной культуры.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин кассета экспрессии означает нуклеиновую кислоту, содержащую минимум 5'-регуляторный район (например, промоутер), функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, и, на выбор, нетранслированный 3'-концевой район (например, стоп-кодон или последовательность полиаденилирования).

- 29 017765

При соответствующих условиях полипептид, кодируемый кассетой экспрессии, получается с помощью этой кассеты экспрессии. Кассета экспрессии может также содержать одну или несколько нуклеотидных последовательностей, которые направляют встраивание кассеты экспрессии в определенный сайт генома клетки хозяина (например, см. Койип с соавт. (2001), Сепе 280:87-95). Например, кассета экспрессии полипептида СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д плазмидного происхождения, хранящаяся в банке АТСС под инвентарным номером РТА-2104, является примером кассеты экспрессии, кодирующей СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин преимущественно очищенная означает композицию, включающую молекулу СТЬА4-1д или отдельную популяцию молекул СТЬА4-1д, которая извлечена из ее естественной среды (например, выделен) и минимум на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 или 99.9% не содержит другие компоненты, такие как клеточный материал или питательная среда, с которой она связаны в естественных условиях. Например, в отношении молекулы белка СТЬА4-1д, получающейся путем рекомбинации, термин преимущественно очищенная также может означать композицию, содержащую молекулу белка СТЬА4-1д, которая извлечена из среды, где происходит ее выработка, так, что молекула белка минимум на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 или 99.9% не содержит молекулы белка, которые не являются полипептидами, соответствующими последовательности 8ЕС Ш N0:2, или мутантными полипептидами с 8ЕЦ Ш N0:2, являющимися предметом изобретения. Преимущественно очищенная не исключает смеси молекул СТЬА4-1д (такие, как димеры) с другими молекулами СТЬА4-1д (такими, как тетрамер). Преимущественно очищенный не исключает фармацевтически приемлемый наполнители или носители, комбинированные с молекулами СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д извлечены из их естественной среды.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин крупномасштабный процесс используется взаимозаменяемо с термином процесс в промышленном масштабе. Термин емкость для культивирования используется взаимозаменяемо с терминами биореактор, реактор и резервуар.

Жидкая культура означает клетки (например, бактериальные, растительные, насекомых, дрожжевые или животного происхождения), выращенные на подложках или выращиваемые в виде взвеси в жидкой питательной среде.

Культура для посева означает клеточную культуру, выращиваемую для инокуляции более крупных объемов питательной среды. Культуру для посева можно использовать для инокуляции более крупных объемов среды для выращивания клеток, способных расти в культуре (например, клеток, выращиваемых в виде взвеси).

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин культивирование означает выращивание одной или нескольких клеток ίη νίίτο в определенных или управляемых условиях. Примеры условий культивирования, которые можно определить, включают температуру, состав газовой смеси, время и состав среды.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин выращивание означает культивирование одной или нескольких клеток ίη νίίτο для получения большего числа клеток в культуре.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, популяция означает группу из двух или нескольких молекул (популяция молекул) или клеток (популяция клеток), которая характеризуется присутствием или отсутствием одного или нескольких измеряемых или выявляемых свойств. В однородной популяции молекулы или клетки в популяции характеризуются одинаковыми или преимущественно одинаковыми свойствами (например, клетки клональной клеточной линии). В неоднородной популяции молекулу или клетки в популяции характеризуются минимум одним свойством, которое одинаково или преимущественно одинаково, где клетки или молекулы также проявляют свойства, которые отличаются друг от друга (например, популяция молекул СТЬА4-1д, имеющих преимущественно одинаковое среднее содержание сиаловой кислоты, но имеющая различное содержание маннозы).

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, высокомолекулярный агрегат используется взаимозаменяемо с высокомолекулярной формой и означает молекулу СТЬА4-1д, включающую минимум три мономера СТЬА4-1д. Например, высокомолекулярным агрегатом может быть тетрамер, пентамер или гексамер.

Процентный (%) выход означает фактический выход, деленный на теоретический выход, а затем умноженный на 100. Фактический выход может быть представлен в граммах или молях (например, молярный выход). Теоретический выход может быть представлен как идеальный выход или выход, рассчитанный математически.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, содержание МСР-1 означает 1) содержание МСР-1 (белка хемотаксиса моноцитов 1, особенно МСР-1 хомяка) или 2) содержание МСР-1подобного белка, где МСР-1-подобный белок включает МСР-1 вместе с белками, гомологичными МСР-1, фрагментам МСР-1 и (или) фрагментам белков, гомологичных МСР-1 (например, в каждом из вышеупомянутых примеров, возможна перекрестная реакция с антителом (например, поликлональная методика ЕЬ18А) в анализе при выявлении МСР-1). Отсутствие МСР-1 (и (или) белков, гомологичным МСР-[, фрагментов МСР-[, и (или) фрагментов белков, гомологичных МСР-[) ожидается, когда в отношении диапазона количества МСР-[ не указана нижняя граница нормы.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, содержание гликозилированных групп

- 30 017765 означает содержание ^связанных или О-связанных остатков сахаров, ковалентно связанных с молекулой белка, такой как гликопротеин-подобная молекула СТЬЛ4-1д.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин молярное отношение сиаловых кислот к белку рассчитывается и представляется в виде числа молей молекул сиаловой кислоты на 1 моль белка (молекулы СТЬЛ4-1д) или димера.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин гликопротеин означает белок, модифицированный путем добавления одного или нескольких углеводов, включая добавление одного или нескольких остатков сахаров.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин сиалирование означает добавление остатка сиаловой кислоты к белку, включая гликопротеин.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин изоформа гликопротеина означает молекулу, характеризующуюся содержанием в ней углеводов и сиаловой кислоты, что определяется с помощью электрофореза в изоэлектрофокусировочном геле или другими соответствующими методами для дифференцировки разных белков в смеси по молекулярной массе, заряду и (или) другим характеристикам. Например, каждая отдельная полоса, видимая на изоэлектрофокусировочном геле, представляет собой молекулы, обладающие определенной изоэлектрической точкой (пи) и, следовательно, одинаковым общим результирующим зарядом. Изоформа гликопротеина может соответствовать отдельной полосе, видимой на изоэлектрофокусировочном геле, где каждая полоса может представлять собой популяцию молекул, обладающим определенным пи.

Иммунологическая толерантность означает состояние нечувствительности к определенному антигену или группе антигенов, на которые человек обычно реагирует (например, состояние, при котором Тлимфоцит больше не способен реагировать на антиген).

Активность означает меру реагирования, как функции концентрации лиганда. Например, агонистическая активность измеряется как концентрация лиганда, которая обусловливает половину максимального эффекта. Не налагающее ограничений фармакологическое определение активности включает компоненты, соответствующие аффинности и эффективности, где эффективность - это способность лекарственного средства вызывать эффект после того, как оно связывается с мишенью. Активность соотносится с аффинностью, но активность и аффинность являются разными мерами действия лекарственного средства.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, фармацевтически приемлемый носитель означает носитель фармакологически активного вещества. Носитель облегчает доставки активного вещества к мишени, не прекращая действие этого вещества. Не налагающие ограничений примеры пригодных форм носителей включают растворы, кремы, гели, эмульсии, желе, пасты, лосьоны, притирания, спреи, мази, порошки, твердые смеси, аэрозоли, эмульсии (например, воды в масле или масла в воде), гелеобразные водные растворы, водные растворы, суспензии, линименты, настойки и пластыри для местного применения.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, фраза фармацевтически приемлемая композиция (или фармацевтическая композиция) означает композицию, приемлемую для применения в качестве лекарственного средства, как, например, у человека. Такая композиция может включать вещества, которые являются примесями на уровне, не превышающем допустимый уровень для применения в качестве лекарственного средства (такой уровень включает и отсутствие таких примесей), и может включать фармацевтически приемлемые наполнители, наполнители, носители и другие неактивные ингредиенты, например, для составления композиции, более простой в применении, вдобавок к одному или нескольких активным веществам. Например, фармацевтически приемлемая композиция СТЬА4-1д может включать МСР-1 или ДНК поскольку, поскольку их содержание находится на уровне, допустимом для применения у человека.

Лекарственное вещество - это активное лекарственное вещество, содержащееся в фармацевтической композиции. Термин лекарственное вещество включает активное лекарственное вещество в растворе и (или) в виде буфера. Лекарственное средство - это фармацевтическая композиция, содержащая лекарственное вещество, включенное в форму выпуска для фармацевтического применения. В рамках анализов, содержащихся в примерах и других разделах данного документа, которые могут ссылаться на лекарственное вещество и (или) лекарственный продукт, примеры типичных лекарственных веществ и лекарственных продуктов можно анализировать следующим образом.

Типичное лекарственное вещество в отношении молекул СТЬА4-1д, содержащих последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 18, - это белок СЬТА4-1д в концентрации 50 мг/мл, в буферном водном растворе (25 ммоль фосфата натрия, 50 ммоль хлорида натрия, рН 7.5).

Типичное лекарственное вещество в отношении молекул СТЬА4-1д, содержащих последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 18, - это 250 мг лиофилизированного белка СТЬА4-1д, 500 мг мальтозы, 17.2 мг моноосновного натрия гидрофосфата и 14.6 мг хлорида натрия, рН 7.0-8.0; или композиция лекарственного продукта лиофилизированного белка СТЬА4-1д (250 мг/флакон) в буферном водном растворе (25 ммоль фосфата натрия, 10 ммоль хлорида натрия, рН 7.5).

Композиция лекарственного продукта с лиофилизированным белком СТЬА4-1д (250 мг/флакон).

- 31 017765

Типичный лекарственный продукт в отношении молекул СТ^А4-Iβ, содержащих последовательность 8ЕО ΙΌ N0:4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 24.

Композиция лекарственного продукта из лиофилизированного белка СЬТАД^⁹^¹⁰⁴^^ (100 мг/флакон). ____________________________________________________

Компонент	Количество/флако н (мг)
СТЬАА2У¥и1,4Ь-1ё	110
Сахароза	220
Моноосновный натрия дигидрофосфат моногидрат	15,18
Хлорид натрия	2,55
Гидроксид натрия	Довести до рН 7,5
1 N соляная кислота	Довести до рН 7,5

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термины питательная среда и среда для клеточной культуры , питательная среда и ферментативная среда означают питательный раствор, использующийся для выращивания или поддержания клеток, особенно клеток млекопитающего. Без каких-либо ограничений эти растворы обычно содержат как минимум один компонент из одной или нескольких из следующих категорий: 1) источник энергии, обычно в виде углевода, такого как глюкоза;

2) все необходимые аминокислоты и обычно основной набор из двадцати аминокислот плюс цистеин;

3) витамины и (или) другие органические соединения, требуемые в низких концентрациях; 4) свободные жирные кислоты или жиры, например линолевая кислота; и 5) микроэлементы, когда микроэлементы определяются как неорганические соединения или элементы, встречающиеся в естественных условиях, которые, как правило, требуются при очень низких концентрациях, обычно в микромолярном диапазоне. Питательный раствор может быть дополнен одним или несколькими компонентами из любой из следующих категорий: 1) гормоны и другие факторы роста, такие как сыворотка, инсулин, трансферрин и эпидермальный фактор роста; 2) соли, например, магния, кальция и фосфаты; 3) буферные растворы, такие как НЕРЕ8; 4) нуклеозиды и основания, такие как аденозин, тимидин и гипоксантин; 5) белковые и тканевые гидролизаты, например пептон или смеси пептонов, которые можно получить из очищенного желатина, растительного материала и побочных продуктов животного происхождения; 6) антибиотики, такие как гентамицин; 7) цитопротекторы, например плюронилполиол; и 8) галактоза.

Термин инокуляция согласно смыслу, использующемуся в данном описании, означает добавление клеток в питательную среду для запуска выращивания культуры.

Т ермин фаза роста клеточной культуры согласно смыслу, использующемуся в данном документе, означает период экспоненциального клеточного роста (например, 1од-фазу), когда клетки преимущественно быстро делятся. В этой фазе скорость увеличения плотности жизнеспособных клеток выше, чем в любой другой фазе.

Согласно смыслу, использующемуся в данном документе, термин фаза продукции клеточной культуры означает период времени, в течение которого клеточный рост является постоянным или поддерживается на почти постоянном уровне. Плотность жизнеспособных клеток остается примерно постоянной на протяжении определенного периода времени. Логарифмический клеточный рост завершен, и главная активность в фазе продукции проявляется выработкой белка. В это время в среду, как правило, добавляют различные вещества, чтобы поддержать постоянную продукцию белка и достичь выработки желаемого продукта гликопротеина.

Согласно смыслу, использующемуся в данном документе, термины экспрессия или экспрессировать означают транскрипцию и трансляцию, происходящие в клетке. Уровень экспрессии гена продукта в клетке хозяина можно определить либо по содержанию соответствующей мРНК, присутствующей в клетке, либо по содержанию белка, кодируемого геном продукта, который вырабатывается клеткой, либо и тем, и другим.

Согласно смыслу, использующемуся в данном документе, гликозилирование означает добавление сложных олигосахаридных структур к белку в определенных сайтах в пределах полипептидной цепи. Г ликозилированные белки и последующий процессинг добавленных углеводов может влиять на скручивание и структуру белка, стабильность белка, включая период полужизни белка, и функциональные свойства белка. Гликозилирование белка можно разделить на два класса согласно контексту последовательности, где происходит модификация, О-связанное гликозилирование и ^связанное гликозилирование. О-связанные полисахариды связаны с гидроксильной группой, обычно гидроксильной группой ос

- 32 017765 татка серина или треонина. О-гликаны не добавляются к каждому остатку серина и треонина. Освязанные олигосахариды обычно являются одно- или двухантенными, т.е. они включают одну или максимум две боковые цепи (антенны) и состоят из одного до четырех различных остатков сахаров, которые добавляются поочередно один за другим. Ν-связанные полисахариды присоединяют к амидному азоту аспарагина. Только остатки аспарагина, которые являются частью одной из двух трипептидных последовательностей, либо аспарагин-Х-серин, либо аспарагин-Х-треонин (где X - любая аминокислота, кроме пролина), служат мишенями для гликозилирования. Ν-связанные олигосахариды могут иметь от одной до четырех боковых цепей и называются одно-, двух-, трех- или четырехантенными. Структуры остатков сахаров, обнаруженных в Ν- и О-связанных олигосахаридах, различны. Несмотря на различия, концевой остаток на каждой цепи и Ν- и О-связанных полисахаридов можно модифицировать с использованием молекулы сиаловой кислоты, что называют кэппингом сиаловой кислотой: сиаловая кислота - известное название семейства уникальных девятикарбоновых моносахаридов, которые можно связывать с другими олигосахаридами. Два члена этого семейства - Ν-ацетилнейраминовая кислота (в сокращении №и5 Ас или ΝΛΝΆ) и Ν-гликолилнейраминовая кислота (в сокращении №и5Сс или Ν0ΝΛ). Самая частая форма сиаловой кислоты в человека - NΆNА. Ν-ацетилнейраминовая кислота (КАИА) - форма первичной сиаловой кислоты, имеющейся в молекуле €.4^44^. Однако следует отметить, что небольшие, но выявляемые уровни Ν-гликолилнейраминовой кислоты (NСNΛ) тоже присутствуют среди молекул СТ^Λ4-Iд. Кроме того, способ, описанный в данном документе, можно использовать для определения числа молей сиаловых кислот в NАNА и N6NА, и, таким образом, определены и приведены уровни NАNА и N6NА в отношении молекулы €.4^44^. Ν- и О-связанные олигосахариды имеют разное число боковых цепей, за счет чего обеспечивается различное число положений, к которым можно присоединить молекулы сиаловой кислоты. Ν-связанные олигосахариды могут обеспечить до четырех положений связывания сиаловых кислот, в то время как О-связанные олигосахариды могут обеспечить два места связывания сиаловой кислоты.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, термин крупномасштабный процесс можно использовать взаимозаменяемо с термином процесс в промышленном масштабе. Кроме того, термин емкость для культивирования может быть использован взаимозаменяемо с терминами биореактор, реактор и резервуар.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, фраза рабочий(е) раствор(ы) означает растворы, которые используются в способе. Не налагающие ограничений примеры рабочих растворов включают буферные растворы.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, эталонный материал означает материал, который используется в качестве стандарта в способе. Например, эталонный материал может быть использован в качестве стандарта, с которым будут сравниваться экспериментальные образцы.

Отсутствие вещества ожидается, когда в отношении содержания такого вещества не указана нижняя граница нормы.

Согласно смыслу, использующемуся в данном описании, указанные температуры в отношении клеточной культуры означают температуры, установленные на инструменте, который регулирует температуру биореактора. Конечно, температура жидкой культуры сама по себе дойдет до температуры, установленной на инструменте, который регулирует температуру биореактора. Там, где температура относится к клеточной культуре, которая поддерживается на полке инкубатора, эта температура означает температуру полки инкубатора.

Варианты осуществления изобретения.

Данное изобретение относится к композиции молекул €.4^44^ и композиции мутантных молекул СТ^А4-Iд, таких как СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Данное изобретение относится к композиции с некоторыми характеристиками, такими как определенное содержание бактериального эндотоксина, бионагрузка, пи в пределах определенного диапазона (или определенных изоэлектрофокусировочных полос в пределах пи определенного диапазона), определенное содержание мономера (одноцепочечного), димера или высокомолекулярных форм (таких как тетрамер), определенный профиль трипептидов, определенный набор главных полос δΌδ-РАбЕ, определенное содержание ДНК, содержание МСР4, не превышающее определенный максимум, содержание клеточного белка, не превышающего определенный максимум, содержание Тритона Х-100, не превышающее определенный максимум, содержание белка А, не превышающее определенный максимум, определенный профиль Ν-связанных углеводов, определенная композиция аминомоносахаридов (СкМас, СаШАс), определенная композиция нейтральных моносахаридов (галактозы, фукозы, маннозы), определенное содержание В7-связывания, определенное содержание активности в анализе торможения клеток, обусловленного ИЛ-2, и (или) определенная композиция сиаловых кислот (NАNА, NСNΛ). в каждом случае, где формулировка определенное содержание может означать диапазон или диапазоны. Данное изобретение относится к композиции с любой одной из вышеуказанных характеристик или с несколькими из вышеуказанных характеристик вплоть до включения всех вышеуказанных характеристик в любой или всех возможных перестановках и комбинациях. Данное изобретение включает все композиции, являющиеся предметом изобретения, в выделенной или преимущественно очищенной форме, или не выделенной или преимущественно не очищенной форме. Данное изобретение

- 33 017765 относится к композициям, которые являются фармацевтическими композициями.

В одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции, включающей выделенную популяцию молекулы СТ^А4-Iд из жидкой питательной среды, при этом эта среда содержит начальную популяцию молекул СТ^А4-Iд, где 1) молекулы СТ^А4-Iд начальной популяции имеют один или несколько остатков сиаловой кислоты, 2) число остатков сиаловой кислоты на молекулу СТ^А4-Iд колеблется в пределах начальной популяции, и 3) начальная популяция включает димер €^^4-^ и высокомолекулярный агрегат, и способ включает а) отделение жидкой питательной среды от культуры клеток млекопитающего, вырабатывающих молекулы СТ^А4-Iд; б) отделение молекул СТ^А4-Iд от клеточных компонентов; в) отделение димеров СТ^А4-Iд от высокомолекулярных агрегатов СТ^А4-Iд и г) разделение молекул 0^^448 на две или больше фракций, где минимум одна фракция характеризуется большим молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА44д по сравнению с одной из других фракций и где стадии б), в) и г) проводятся одновременно или в другом порядке с тем, чтобы получить указанную композицию.

В одном варианте осуществления способа, являющегося предметом изобретения, отделение на стадии а) включает получение растворимой фракции жидкой культуры. В другом варианте стадии в) и г) способа включают использование колоночной хроматография для получения фракций молекул СТЬА4Ц, имеющих другое содержание сиаловых кислот. В другом варианте способ дополнительно включает использование колоночной хроматографии для уменьшения содержания МСР4 в композиции.

В некоторых вариантах осуществления способа, являющегося предметом изобретения, молекулы СТЬА44д включают один или несколько полипептидов, содержащих последовательность 8Е0 ГО N0:2, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В других вариантах молекулы СТЬА44д включают один или несколько полипептидов, содержащих последовательность 8Е0 ГО N0:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

В некоторых вариантах осуществления способа, являющегося предметом изобретения, фракция в г), характеризующаяся большим молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА44д, проявляет среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТЬА44д от примерно 8 до примерно 14. В определенных вариантах это среднее молярное отношение составляет от примерно 8 до примерно 11, от примерно 8 до примерно 10 или от примерно 8 до примерно 9.

Данное изобретение относится к способу выделения молекул СТЬА44д, при этом способ включает: ί) получение растворимой фракции жидкой культуры, включающей клетки млекопитающего, которые вырабатывают композицию, включающую молекулы СТЬА44д; ίί) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; ίίί) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием с композицией стадии (ίί) для получения обогащенной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; ίν) проведение аффинной хроматографии с композицией стадии (ίίί) для получения обогащенной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; и ν) проведение анионообменной хроматографии с композицией стадии (ίν). В одном варианте композиция, полученная на стадии (ίί), характеризуется: а) средним отношением 6.0-10.1 моль NАNА на 1 моль молекулы СТЬА44д; б) максимум 25.6% площади высокомолекулярных форм СТЬА4Ц, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В другом варианте композиция, полученная на стадии (ίίί), характеризуется: а) средним отношением 6.811.4 моль NАNА на 1 моль молекулы СТЬА44д; б) максимум 2.5% площади высокомолекулярных форм, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В другом варианте композиция, полученная на стадии (ίν), характеризуется: а) средним отношением 8.011.0 моль NΛNА на 1 моль молекулы СТЬА44д; б) максимум 2.5% площади высокомолекулярных форм СТЬА44д. В другом варианте композиция, полученная на стадии (ν), характеризуется: а) средним отношением 8.0-11.9 моль NΛNА на 1 моль молекулы СТЬА44д; б) максимум 2.0% площади высокомолекулярных форм СТЬА44д, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В одном варианте пример спектрофотометрической детекции может быть при А 280 нм.

Данное изобретение также относится к способу выделения композиции молекулы СТЬА44д, включающей: ί) получение растворимой фракции жидкой культуры, включающей клетки млекопитающего, которые вырабатывают молекулу СТЬА44д, и, в любом порядке, ίί) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; ίίί) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; ίν) проведение аффинной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; и (ν) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д. В другом аспекте данное изобретение относится к способу выделения композиции, включающей молекулы СТЬА44д, при этом способ включает: ί) получение растворимой фракции жидкой культуры, включающей клетки млекопитающего, которые вырабатывают молекулу СТЬА44д; ίί) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; ίίί) проведение хроматографии с гидро

- 34 017765 фобным взаимодействием с белковым продуктом стадии (ίί) для получения обогащенной композиции, включающей молекулы СТЕА4-[д; ίν) проведение аффинной хроматографии с белковым продуктом стадии (ίίί) для получения дополнительно обогащенной композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д; и ν) проведение анионообменной хроматографии с белковым продуктом стадии (ίν) с тем, чтобы выделить композицию, включающую молекулы СТ^А4-[д.

В одном варианте композиция, включающая молекулы СТ^А4-[д и полученная на стадии (ίί) способа, характеризуется: а) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-[д от 6.0 до 10.1, и б) максимум 2.5% площади высокомолекулярных форм СТ^А4-[д. что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В другом варианте композиция, включающая молекулы СТ^А4-[д и полученная на стадии (ίίί) способа, характеризуется тем, что: а) высокомолекулярные формы СТ^А4-[д составляют меньше примерно 2.5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции, б) содержание клеточного белка составляет меньше примерно 95 нг/мл; и в) содержание МСР-Ι меньше примерно 5 млн^-1. В дополнительном варианте композиция, включающая молекулы СТ^А4-[д и полученная на стадии (ίίί) способа, характеризуется: а) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-[д от 6.8 до 11.4, и б) максимум 2.5% площади высокомолекулярных форм СТ^А4-[д. что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В другом варианте композиция, включающая молекулы СТ^А4-[д и получающаяся на стадии (ίν) способа, характеризуется: а) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-[д от 8.0 до 11.0, и б) максимум 2.5% площади высокомолекулярных форм СТ^А4-[д. что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В другом варианте композиция, получающаяся на стадии (ίίί) согласно данному изобретению, характеризуется тем, что на высокомолекулярные формы СТ^А4-[д приходится меньше 2.5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В другом варианте белковая композиция, включающая молекулы СТ^А4-[д и полученная на стадии (ν) способа, характеризуется: а) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-[д от 8.0 до 11.9, и б) максимум 2.0% площади высокомолекулярных форм СТ^А4-[д. что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции.

Также данное изобретение относится, в другом аспекте, к способу выделения композиции молекулы СТ^А4-[д. включающему: ί) получение растворимой фракции жидкой культуры, включающей клетки млекопитающего, которые вырабатывают молекулу СТ^А4-[д. и, в любом порядке, ίί) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д; ίίί) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-Iд; ίν) проведение аффинной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д; и ν) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д.

Композиция, полученная на стадии (ίίί), характеризуется тем, что на высокомолекулярные формы СТ^А4-[д приходится меньше 2.5% площади, содержание клеточного белка составляет меньше 95 нг/мл и содержание МСР-Ι составляет меньше примерно 5 млн^-1.

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу выделения композиции молекулы СТ^А4-[д. при этом способ включает: ί) получение растворимой фракции жидкой культуры, включающей клетки млекопитающего, которые вырабатывают молекулу СТ^А4-[д. и, в любом порядке, ίί) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д; ίίί) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-Iд; ίν) проведение аффинной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д; и ν) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. где композиция стадии (ίίί) характеризуется тем, что на высокомолекулярные формы СТ^А4-[д приходится меньше 2.5% площади, содержание клеточного белка составляет меньше 95 нг/мл и содержание МСР-Ι составляет меньше примерно 5 млн^-1, среднее молярное отношение NАNА к молекулам СТ^А4-[д находится в диапазоне от примерно 8.0 до примерно 12.

В одном варианте анионообменную хроматографию стадии (ίί) способа проводят с использованием отмывочного буфера, включающего примерно 75 ммоль НЕРЕ8 и примерно 360 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 8.0. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίί) изобретения проводят с использованием буфера-элюента, включающего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и примерно 850 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 7.0. В одном дополнительном варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίίί) способа проводят с использованием единственного отмывочного буфера, включающего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и примерно 850 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 7.0. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίν) способа проводят с использованием отмывочно

- 35 017765 го буфера, включающего примерно 25 ммоль Тп5 и примерно 250 ммоль №С1 и имеющего рН примерно 8.0. Еще в одном варианте аффинную хроматографию стадии (ίν) способа проводят с использованием буфера-элюента, включающего примерно 100 ммоль глицина и имеющего рН примерно 3.5. Еще в одном варианте анионообменную хроматографию стадии (ν) способа проводят с использованием отмывочного буфера, включающего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и от примерно 120 ммоль №С1 до примерно 130 ммоль №С1 и имеющего рН примерно 8.0. Еще в одном варианте анионообменную хроматографию стадии (ν) способа проводят с использованием буфера-элюента, включающего примерно 25 ммоль НЕРЕ8 и примерно 200 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 8.0. Еще в одном варианте анионообменную хроматографию стадии (ίί) способа проводят с использованием колонки, заполненной анионообменной смолой, включающей первичную, вторичную, третичную или четвертичную функциональную аминогруппу. В определенном варианте эта смола включает четвертичную функциональную аминогруппу. Еще в одном варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίίί) способа проводят с использованием смолы для гидрофобного взаимодействия, включающей фенил, октил, пропил, алкокси, бутил или изоамильную функциональную группу. В определенном варианте функциональная группа включает фенильную функциональную группу. Еще в одном варианте аффинную хроматографию стадии (ίν) способа проводят с использованием смолы для аффинной хроматографии, включающей белок А.

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции, включающей молекулы СТ^Α4-Iд, в том числе очищенные молекулы СТ^Α4-Iд из жидкой клеточной культуры, где очищенная композиция СТЬА44д включает а) фармацевтически приемлемое содержание МСР4 на 1 мг молекул СТЬА44д, и б) на высокомолекулярные формы СТЬА44д приходится меньше 2.5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В одном варианте фармацевтически приемлемое содержание МСР4 включает от примерно 40 до примерно 0.5 нг/мг молекул СТЬА44д. В другом варианте фармацевтически приемлемое содержание МСР4 включает от примерно 35 до примерно 0.5 нг/мл молекул СТЬА44д. В дополнительном варианте фармацевтически приемлемое содержание МСР4 включает от примерно 10 до примерно 0.5 нг/мл молекул СТЬА4^. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίν) способа проводят с использованием колонки, заполненной смолой, способной снижать содержание включающей МСР4 в элюированном белковом продукте. Еще в одном варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίίί) способа проводят с использованием смолы для гидрофобного взаимодействия, где эта смола способна а) отделять димеры СТЬА44д от высокомолекулярных форм СТЬА44д; б) увеличивать содержание сиаловой кислоты в элюированных молекулах СТЬА44д; или в) как а), так и б). Еще в одном варианте анионообменную хроматографию стадии (ίί) или стадии (ίν), или обеих стадий, проводят с использованием анионообменной смолы, где эта смола способна а) уменьшать содержание высокомолекулярных агрегатов СТЬА44д в элюированной композиции; б) увеличивать содержание сиаловой кислоты в элюированной композиции; или в) как а), так и б).

В другом аспекте данное изобретение относится к способу выделения композиции, включающей молекулы СТЬА44д, при этом способ включает: ί) получение растворимой фракции жидкой культуры, включающей клетки млекопитающего, которые вырабатывают молекулу СТЬА44д, и, в любом порядке, ίί) проведение аффинной хроматографии с растворимой фракцией для получения элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; ίίί) проведение анионообменной хроматографии с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; и ίν) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием с растворимой фракцией для получения обогащенной и элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д. В одном варианте стадию аффинной хроматографии проводят в первую очередь. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) способа проводят с использованием смолы, включающей белок А. В дополнительном варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием буфера-элюента, включающего гуанидин. В другом варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием буфера-элюента, включающего мочевину. Еще в одном варианте аффинная хроматография стадии (ίί) приводит к увеличению содержания димеров СТЬА44д в элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д.

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу выделения композиции, включающей молекулы СТЬА44д, из собранной жидкой части культуры клеток млекопитающего, где клетки вырабатывают молекулы СТЬА44д, при этом способ включает: ί) получение растворимой фракции собранной жидкости; ίί) проведение аффинной хроматографии с растворимой фракцией для получения элюированной композиции, включающей молекулы СТЬА44д; ίίί) проведение анионообменной хроматографии с композицией стадии (ίί) с тем, чтобы получить элюированную и обогащенную композицию, включающую молекулы СТЬА44д; и ίν) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием с композицией стадии (ίίί) для получения обогащенной композиции, включающей молекулы СТЬА44д. В одном варианте композиция, полученная на стадии (ίν) способа, характеризуется тем, что на высокомолекулярные формы СТЬА44д приходится меньше примерно 2.5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции, содержание клеточного белка составляет меньше примерно 95 нг/мл и содержание МСР4 меньше примерно 5 млн^-1. В другом варианте анио

- 36 017765 нообменную хроматографию стадии (ίίί) проводят с использованием отмывочного буфера, включающего примерно 50 ммоль НЕРЕ8 и примерно 135 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 7. В дополнительном варианте анионообменную хроматографию стадии (ίίί) проводят с использованием буфера-элюента, включающего примерно 50 ммоль НЕРЕ8 и примерно 200 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 7. В определенном варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίίί) проводят с использованием смолы для гидрофобного взаимодействия, включающей фенил, октил, пропил, алкокси, бутил или изоамильную функциональную группу. В другом варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίν) проводят с использованием отмывочного буфера, включающего примерно 50 ммоль НЕРЕ8 и примерно 1.2 моль (ИЕЬ))₂§0₄ и имеющего рН примерно 7. Еще в одном варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием отмывочного буфера, включающего примерно 25 ммоль NаНаΡ0₄ и примерно 150 ммоль №1С1 и имеющего рН примерно 7.5. Еще в одном варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием буфера-элюента, включающего примерно 250 ммоль глицина и имеющего рН примерно 3. В другом варианте анионообменную хроматографию стадии (ίίί) проводят с использованием колонки, заполненной анионообменной смолой, включающей первичную, вторичную, третичную или четвертичную функциональную аминогруппу. В определенном варианте эта смола включает четвертичную функциональную аминогруппу.

В одном варианте хроматографию с гидрофобным взаимодействием стадии (ίίί) проводят с использованием смолы для гидрофобного взаимодействия, включающей фенил, октил, пропил, алкокси, бутил или изоамильную функциональную группу. В одном варианте функциональная группа включает фенильную функциональную группу. В одном варианте аффинную хроматографию стадии (ίί) проводят с использованием смолы, включающей белок А. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. полученные любым из способов изобретения. В одном варианте композиция включает один или несколько полипептидов, содержащих последовательность 8ЕО ГО N0:2, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном варианте композиция включает один или несколько полипептидов, содержащих 8ЕО ГО N0:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. Данное изобретение относится к плазмиде экспрессии СТ^Α4-Iд, содержащей нуклеиновую кислоту с последовательностью 8ЕО ГО N0:17. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к белку СТ^Α4-[д от примерно 5.5 до примерно 18. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 5.5 до примерно 9.5.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 5 до примерно 10. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 6 до примерно 18. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 8 до примерно 18.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 8 до примерно 12. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 8 до примерно 11. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 7 до примерно 12.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 7 до примерно 11. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 11 до примерно 18. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 12 до примерно 18.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 13 до примерно 18. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д; где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 14 до примерно 18. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиало

- 37 017765 вой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 15 до примерно 17.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-Iд характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-Iд из примерно 16. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-Iд примерно 10. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-Iд; где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Α4-[д примерно 6. В одном варианте сиаловая кислота - Ν-ацетилнейраминовая кислота (ХАКА). Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением NΑNΑ к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 8 до примерно 12. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением Ν-гликолилнейраминовой кислоты (АСНА) к молекулам СТ^Α4-[д не больше примерно 1.5.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением NСNΑ к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 0.5 до примерно 1.5. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-Iд характеризуются средним молярным отношением NСNΑ к молекулам СТ^Α4-[д от примерно 1.0 до примерно 1.5. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-Iд характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТБА448 от примерно 6 до примерно 18.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где молекулы СТ^Α4-Iд характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль молекул СТ^Α4-Iд от примерно 6 до примерно 12.

Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где каждый полипептид молекулы содержит последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы СТ^Α4-[д характеризуются средним молярным отношением сиаловой кислоты на 1 моль молекул СТ^Α4-Iд от примерно 5.5 до примерно 9.5. В одном варианте молярное отношение сиаловой кислоты на 1 моль молекул СТ^Α4-[д определяется с помощью кислого гидролиза и ВЭЖХ. В одном варианте молекулы СТ^Α4-Iд включают один или несколько полипептидов, содержащих последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:2, 5, 6, 7, 8, 9 или 10,

В одном варианте молекулы СТ^Α4-[д включают один или несколько полипептидов, содержащих последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. Данное изобретение относится к преимущественно очищенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-[д. где больше или 95% молекул СТЕА448 являются димерами СТ^Α4-Iд. В одном варианте больше или 98% молекул СТ^Α4-Iд являются димерами СТ^Α4-Iд. В одном варианте больше или 99% молекул СТ^Α4-Iд являются димерами СТ^Α4-Iд.

В одном варианте больше или 99.5% молекул СТ^Α4-[д являются димерами СТ^Α4-Iд. В одном варианте от примерно 95 до примерно 99.5% молекул СТЕА448 являются димерами СТ^Α4-Iд, и от примерно 0.5% площади до примерно 5% площади приходится на высокомолекулярные формы СТ^Α4-[д. что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В одном варианте примерно 98.6% молекул СТ^Α4-Iд являются димерами СТ^Α4-Iд и примерно 1.2% площади приходится на высокомолекулярные формы СТ^Α4-Iд и примерно меньше 0.6% площади молекул приходится на мономеры СТ^Α4-[д. что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В одном варианте меньше примерно 0.3% молекул приходится на мультимеры, включающие пять или больше мономеров СТ^Α4-[д. Данное изобретение относится к композиции, состоящей преимущественно из димеров СТ^Α4-[д. Данное изобретение относится к композиции, состоящей преимущественно из молекул СТ^Α4-[д. где популяция преимущественно не содержит СТ^Α4-[д мономеры. Данное изобретение относится к композиции, состоящей преимущественно из молекул СТ^Α4-[д. где популяция преимущественно не содержит высокомолекулярные формы СТ^Α4-[д. Данное изобретение относится к композиции, состоящей преимущественно из мономеров СТ^Α4-[д. преимущественно не содержащих димеры и высокомолекулярные формы СТ^Α4-Iд. В одном варианте каждый мономер каждого димера СТ^Α4-[д имеет минимум 3 группы сиаловой кислоты. В одном варианте каждый мономер каждого димера СТ^Α4-[д имеет минимум 2.5 группы сиаловой кислоты. В одном варианте каждый мономер каждого димера СТ^Α4-Iд имеет от минимум 3 групп сиаловой кислоты до минимум 8 групп сиаловой кислоты.

В одном варианте каждый мономер каждого димера СТ^Α4-[д имеет от минимум 2.5 групп сиаловой кислоты до минимум 5 групп сиаловой кислоты. В одном варианте каждый димер включает два полипептида СТ^Α4-[д. где каждый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную только из группы, состоящей из 8ЕО ГО ΝΟ:5-16. В одном варианте композиция включает один или несколько полипептидов, содержащих последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:2, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном

- 38 017765 варианте композиция включает один или несколько полипептидов, содержащих последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей тетрамеры ΟΓΕΑ4-Ι§, которая преимущественно не содержит димеры СТ^Л4-Iд. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей тетрамеры ΟΓΕΑ4-Ι§, которая преимущественно не содержит мономеры СТ^Л4-Iд. В одном варианте композиция существует в количестве больше примерно 100 г. В одном варианте каждый тетрамер включает две пары полипептидов ΟΓΕΑ4-Ι§, где каждый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную только из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:5-10. В одном варианте каждый тетрамер включает две пары полипептидов ΟΓΕΑ4Ι§, где каждый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную только из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:11-16. В одном варианте каждый тетрамер способен связываться с СЭ80 или СО86. Данное изобретение относится к фармацевтически приемлемой композиции, включающей молекулы ΟΓΕΑ4-Ι§, где композиция преимущественно не содержит МСР-Ι. Данное изобретение относится к фармацевтически приемлемой композиции, включающей молекулы ΟΓΕΑ4-Ι§, где композиция включает максимум примерно 25 млн^-1 МСР-Ι. В одном варианте композиция включает максимум 10 млн^-1 МСР-Ι. В одном варианте композиция включает от примерно 0.2 нг/мл МСР-Ι до примерно 10 нг/мл МСР-Ι. В одном варианте данное изобретение относится к фармацевтически приемлемой композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. где композиция включает а) от примерно 0.2 нг/мл МСР-Ι до примерно 10 нг/мл МСР-Ι и б) максимум 25 нг/мл белка СНО или максимум 10 нг/мл белка СНО. В одном варианте композиция включает максимум примерно 20 пг/мл ДНК.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы ΟΓΕΑ4-Ι§, где при внутривенном введении человеку дозы примерно 10 мг/кг молекулы СТ^Л4-Iд способны проявлять: площадь под кривой (ΑϋΠ) примерно 44400 мкг-ч/мл; объем распределения примерно 0.09 л/кг; максимальную концентрацию (С_тах) примерно 292 мкг/мл; скорость выведения примерно 0.23 мл/ч/кг. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. где композиция включает доминантные изоформы молекул СТ^Л4-Iд. визуализируемые на изоэлектрофокусировочном геле, которые имеют изоэлектрическую точку пи максимум до примерно 5.1±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте среднее пи композиции увеличивается после обработки нейраминидазой. В одном варианте минимум 40% молекул СТ^Л4-Iд характеризуются изоэлектрической точкой максимум до примерно 5.1±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте минимум 70% молекул СТ^Л4-Iд характеризуются изоэлектрической точкой максимум до примерно 5.1±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте минимум 90% молекул СТ^Л4-Iд характеризуются изоэлектрической точкой максимум до примерно 5.1±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. характеризующейся пи от примерно 3.0±0.2 до примерно 5.0±0.2. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Α4-Iд, характеризующейся пи от примерно 4.3±0.2 до примерно 5.0±0.2.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. характеризующейся пи от примерно 3.3±0.2 до примерно 4.7±0.2. В одном варианте композиция является преимущественно очищенной. Данное изобретение относится к способу получения композиции, при этом композиция включает молекулу ΟΓΕΑ4-Ι§ с пи от примерно 3.0±0.2 до примерно 5.0±0.2, при этом способ включает: а) проведение электрофореза смеси молекул ΟΓΕΑ4-Ι§ на изоэлектрофокусировочном геле, где единственная полоса на геле соответствует популяции молекул ΟΓΕΑ4-Ι§ с определенным пи, и

б) выделение популяции молекул СТ^Л4-Iд. характеризующейся пи от примерно 3.0±0.2 до примерно 5.0±0.2, с тем, чтобы получить композицию. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. где композиция включает доминантные изоформы молекул ΟΓΕΑ4Ι§, визуализируемые на изоэлектрофокусировочном геле, которые имеют изоэлектрическую точку пи максимум до примерно 5.5±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте среднее пи композиции увеличивается после обработки нейраминидазой. В одном варианте минимум 40% молекул СТ^Л4-Iд характеризуются изоэлектрической точкой максимум до примерно 5.3±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте минимум 70% молекул СТ^Л4-Iд характеризуются изоэлектрической точкой максимум до примерно 5.3±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. В одном варианте минимум 90% молекул СТ^Л4-Iд характеризуются изоэлектрической точкой максимум до примерно 5.3±0.2, что определяется с помощью изоэлектрофокусировки. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. характеризующейся пи от примерно 3.0±0.2 до примерно 5.2±0.2.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. характеризующейся пи от примерно 4.5±0.2 до примерно 5.2±0.2. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТ^Л4-Iд. характеризующейся пи примерно 4.7±0.2 до примерно 5.1±0.2. В одном варианте композиция является преимущественно очищенной.

Данное изобретение относится к способу получения композиции, при этом композиция включает

- 39 017765 молекулы СТЬА4-1д с пи от примерно 2.0±0.2 до примерно 5.2±0.2, при этом способ включает: а) электрофорез смеси молекул СТЬА4-1д в изоэлектрофокусировочном геле, где единственная полоса в геле соответствует популяции молекул СТЬА4-1д с определенным пи, и б) выделение популяции молекул СТЬА4-1д, характеризующихся пи от примерно 3.0±0.2 до примерно 5.2±0.2, для того, чтобы получить композицию. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 17 до примерно 28. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 17 до примерно 25. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуется средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 15 до примерно 35.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где каждый полипептид молекулы содержит последовательность δΕΟ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением ΟΙοΝΛο к молекулам СТЬА4-1д от примерно 24 до примерно 28. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 1.6 до примерно 3.6. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где каждый полипептид молекулы содержит последовательность δΕΟ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 2.6 до примерно 3.6.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением галактозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 8 до примерно 17. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТБА41д, где каждый полипептид молекулы содержит последовательность δΕΟ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением галактозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 11 до примерно 13. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением фукозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 3.5 до примерно 8.3.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где каждый полипептид молекулы содержит последовательность δΕΟ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением фукозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 6.4 до примерно 7.0. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением маннозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 7.6 до примерно 22. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где каждый полипептид молекулы содержит последовательность δΕΟ ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16 и где молекулы СТЬА4-1д характеризуются средним молярным отношением маннозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 14 до примерно 16.

В одном варианте молярное отношение молекул СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д определяется с помощью капиллярного электрофореза. В одном варианте молярное отношение молекул СаШАс к молекулам СТЬА4-1д определяется с помощью капиллярного электрофореза. В одном варианте молярное отношение галактозы к молекулам СТЬА4-1д определяется с помощью капиллярного электрофореза.

В одном варианте молярное отношение фукозы к молекулам СТЬА4-1д определяется с помощью капиллярного электрофореза. В одном варианте молярное отношение маннозы к молекулам СТЬА4-1д определяется с помощью капиллярного электрофореза. В одном варианте молекулы СТЬА4-1д получают путем энзиматического присоединения к молекуле одного или нескольких углеводов. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где молекулы содержат остатки углеводов, присоединенные к молекулам ίη νίίτο энзиматическим путем. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 1.6 до примерно 3.6; и в) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 1.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 8 до примерно 17; и г) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отноше

- 40 017765 нием СаШАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 1.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 8 до примерно 17; г) средним молярным отношением фукозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 3.5 до примерно 8.3; и д) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-[д от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 1.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 8 до примерно 17; г) средним молярным отношением фукозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 3.5 до примерно 8.3; д) средним молярным отношением маннозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 7.2 до примерно 22; и е) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-[д от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 24 до примерно 28 и б) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-[д от примерно 5.5 до примерно 9.5. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется:

а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 24 до примерно 28;

б) средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 2.6 до примерно 3.6; и в) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-[д от примерно 5.5 до примерно

9.5. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаГОАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 2.6 до примерно 3.6;

в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 11 до примерно 13; и

г) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-[д от примерно 5.5 до примерно 9.5. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы 0^^4-^. которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаГОАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 2.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 11 до примерно 13; г) средним молярным отношением фукозы к молекулам €:^^4-^ от примерно 6.4 до примерно 7.0 и д) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-[д от примерно 5.5 до примерно 9.5. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 24 до примерно 28; б) средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТ^А4-[д от примерно 2.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 11 до примерно 13; г) средним молярным отношением фукозы к молекулам СТ^А4-[д от примерно 6.4 до примерно 7.0; д) средним молярным отношением маннозы к белку СТ^А4-[д от примерно 14 до примерно 16 и е) средним молярным отношением сиаловой кислоты к белку СТ^А4-[д от примерно 5.5 до примерно

9.5.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. где молекулы СТ^А4-[д гликозилированы по аминокислотному остатку аспарагина в положении 102 последовательности ЗЕО ГО N0:2 или 4, по аминокислотному остатку аспарагина в положении 134 последовательности ЗЕО ГО N0:2 или 4, по аминокислотному остатку аспарагина в положении 233 последовательности ЗЕО ГО N0:2 или 4, по аминокислотному остатку серина в положении 155 последовательности ЗЕО ГО N0:2 или 4, или по аминокислотному остатку серина в положении 165 последовательности ЗЕО ГО N0:2 или 4. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. где молекулы СТ^А4-[д гликозилированы и где минимум примерно 2% общей массы гликозилирования приходится на О-связанное гликозилирование.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. где композиция характеризуется хроматографическим пиком NСNА примерно 9.6±0.3 и хроматографическим пиком NАNА примерно 10.5±0.3. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4Ι§, где молекулы СТ^А4-[д характеризуются профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что представлен на фиг. 68. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. где молекулы СТ^А4-[д характеризуются профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что представлен на фиг. 67. Данное изобретение относится к композиции, состоящей преимущественно из молекул СТ^А4-[д. где молекулы СТ^А4-[д характеризуются профилем углеводов доменов Ι-Ιν, где домен Ι включает пики, соответствующие α-сиалированным олигосахаридам, домен ΙΙ включает пики, соответствующие моносиалированным олигосахаридам, домен ΙΙΙ включает пики, соответствующие дисиалированным олигосахаридам, домен Ιν включает пики, соответствующие трисиалированным олигосахаридам, и домен ν включает пики, соответствующие тетрасиалированным олигосахаридам, и где профиль является хроматограммой олигосахаридов, высвобожденных из СТ^А4-[д. В одном варианте разность времени удержания ^связанных олигосахаридов между первым пиком в домене Ι и главным пиком в домене ΙΙ составляет от примерно 10 до примерно 12 мин. В одном варианте разность

- 41 017765 времени удержания ^связанных олигосахаридов между первым пиком в домене I и главным пиком в домене II составляет от примерно 11 до примерно 13 мин.

В одном варианте гликозилирование доменов III и IV включает примерно от 25 до примерно 36% ^связанного гликозилирования, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. В одном варианте гликозилирование домена I включает от примерно 24.5 до примерно 35.2% N связанного гликозилирования, что измеряется с помощью ВЭАОХ. В одном варианте гликозилирование домена II включает от примерно 26.3 до примерно 34.1% ^связанного гликозилирования, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. В одном варианте гликозилирование домена III включает от примерно 21.9 до примерно 31.5% ^связанного гликозилирования, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. В одном варианте гликозилирование домена IV и домена V включает от примерно 7.9 до примерно 18.6% ^связанного гликозилирования, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН.

В одном варианте: а) домен I характеризуется процентом площади, составляющей не меньше примерно 31; б) домен II характеризуется процентом площади, составляющей не меньше примерно 33; в) домен III характеризуется процентом площади, составляющей не меньше примерно 24; IV) домен IV характеризуется процентом площади, составляющей не меньше примерно 9.4, V) домен V характеризуется процентом площади, составляющей не меньше примерно 67; или где площадь измеряется по хроматограмме олигосахаридов, высвобожденных из СТЕ-А4-[д.

В одном варианте: а) домен I характеризуется не меньше чем примерно 5 пиками; б) домен II характеризуется не меньше чем примерно 5 пиками; в) домен III характеризуется не меньше чем примерно 5 пиками; г) домен IV характеризуется минимум примерно 6 пиками, или д) домен V характеризуется минимум примерно 6 пиками и где эти пики проявляются на хроматограмме. Композиция, где домен I характеризуется не меньше чем двумя пиками, где первый пик имеет минимальную площадь, составляющую примерно 4.5%, и максимальную площадь, составляющую примерно 11.2%, и где второй пик имеет минимальную площадь, составляющую примерно 8.6% и максимальную площадь, составляющую примерно 11.8%.

В одном варианте домены III и IV характеризуются процентом площади примерно от 25% до примерно 36%, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. В одном варианте домен I характеризуется процентом площади от примерно 24.5 до примерно 35.2%, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. В одном варианте домен II характеризуется процентом площади от примерно 26.3 до примерно 34.1%, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. В одном варианте домен III характеризуется процентом площади от примерно 21.9 до примерно 31.5%, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. В одном варианте домен IV характеризуется процентом площади от примерно 7.9 до примерно 18.6%, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН.

Данное изобретение относится к композиции, включающей полипептиды 0^^4-^. где: а) примерно 80% полипептидов характеризуются двухантенным ^связанным гликозилированием; б) примерно 14% полипептидов характеризуются трехантенным ^связанным гликозилированием; и в) примерно 6% полипептидов характеризуются четырехантенным ^связанным гликозилированием. В одном варианте ^связанное гликозилирование определяется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН с импульсным амперометрическим детектором. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-Iд, которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 8 до примерно 17 и б) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 6 до примерно 12. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-Iд, которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 8 до примерно 17; б) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 6 до примерно 12; в) процентом площади высокомолекулярных форм СТ^А4-Iд меньше примерно 3%, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТЬА4Ц от примерно 8 до примерно 17; б) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 6 до примерно 12; в) средним молярным отношением ХСХА к молекулам СТ^А4-Iд от максимума до примерно 1.5.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 8 до примерно 17; б) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 6 до примерно 12; в) содержанием высокомолекулярных агрегатов СТ^А4-Iд меньше примерно 3% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; г) профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что изображен на фиг. 67. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^А4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 8 до примерно 17; б) средним молярным отношением NАNА к молекулам СТ^А4-Iд от примерно 6 до примерно 12; в) содержанием высокомолеку

- 42 017765 лярных агрегатов 0Т^Λ4-[д меньше примерно 3% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; г) содержанием гликозилирования в доменах ΙΙΙ, Ιν и V не меньше от примерно 29.8 до примерно 50.1% ^связанного гликозилирования, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^Λ4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 8 до примерно 17; б) средним молярным отношением NАNА к молекулам 0Т^Λ4-[д от примерно 6 до примерно 12; в) содержанием высокомолекулярных агрегатов СТ^Λ4-[д меньше примерно 3% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В одном варианте молекулы дополнительно характеризуются средним молярным отношением NΛNА к молекулам 0Т^Λ4-[д от примерно 8 до примерно 12.

В одном варианте молекулы дополнительно характеризуются: а) примерно 80% двухантенного N связанного гликозилирования; б) примерно 14% трехантенного ^связанного гликозилирования; в) примерно 6% четырехантенного ^связанного гликозилирования. В одном варианте молекулы дополнительно включают любую комбинацию одной или нескольких: а) аминокислотных последовательностей БЕЦ ΙΌ N0:10 (метионин в положении аминокислоты 27 и глицин в положении аминокислоты 382 БЕЦ ΙΌ N0:2); б) аминокислотных последовательностей БЕЦ ΙΌ N0:7 (метионин в положении аминокислоты 27 и лизин в положении аминокислоты 383 БЕО ΙΌ N0:2); в) аминокислотных последовательностей БЕО ΙΌ N0:9 (аланин в положении аминокислоты 26 и глицин в положении аминокислоты 382 БЕО ΙΌ N0:2); г) аминокислотных последовательностей БЕО ΙΌ N0:6 (аланин в положении аминокислоты 26 и лизин в положении аминокислоты 383 БЕО ΙΌ N0:2). В одном варианте а) примерно 90% молекул включают аминокислотную последовательность БЕО ΙΌ N0:2, начинающуюся с метионина в положении остатка 27; б) примерно 10% молекул включают аминокислотную последовательность БЕО ΙΌ N0:2, начинающуюся с аланина в положении остатка 26; в) примерно 4% молекул включают аминокислотную последовательность БЕО ΙΌ N0:2, заканчивающуюся лизином в положении остатка 383; г) примерно 96% молекул включают аминокислотную последовательность БЕО ΙΌ N0:2, заканчивающуюся глицином в положении остатка 382. Данное изобретение относится к композиции, включающей полипептиды СТ^Λ4-[д. где: а) примерно 80% полипептидов содержат двухантенное ^связанное гликозилирование; б) примерно 14% полипептидов содержат трехантенное ^связанное гликозилирование; в) примерно 6% полипептидов содержат четырехантенное ^связанное гликозилирование; г) среднее молярное отношение NСNА к молекулам СТ^Λ4-[д составляет максимум 1.5. Данное изобретение относится к композиции, включающей полипептиды СТ^Λ4-[д. где: а) примерно 80% полипептидов содержат двухантенное ^связанное гликозилирование; б) примерно 14% полипептидов содержат трехантенное ^связанное гликозилирование; в) примерно 6% полипептидов содержат четырехантенное ^связанное гликозилирование; г) среднее молярное отношение СIсNАс к молекулам 0Т^Λ4-[д составляет от примерно 15 до примерно 35. Данное изобретение относится к композиции, включающей полипептиды СТ^Λ4-[д. где: а) примерно 80% полипептидов содержат двухантенное ^связанное гликозилирование; б) примерно 14% полипептидов содержат трехантенное ^связанное гликозилирование; в) примерно 6% полипептидов содержат четырехантенное ^связанное гликозилирование и г) среднее молярное отношение СаШАс к молекулам СТ^Λ4-[д составляет от примерно 1.6 до примерно 3.6. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы 0Т^Λ4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 11 до примерно 13; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 5.5 до примерно 9.5.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы 0Т^Λ4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 11 до примерно 13; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 5.5 до примерно 9.5; в) содержанием высокомолекулярных форм СТ^Λ4-[д меньше примерно 5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^Λ4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 11 до примерно 13; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 5.5 до примерно 9.5; в) содержанием высокомолекулярных форм СТ^Λ4-[д меньше примерно 5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; г) профилем углеводов, преимущественно совпадающим с тем, что изображен на фиг. 67. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТ^Λ4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 11 до примерно 13; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТ^Λ4-[д от 5.5 до примерно 9.5; в) содержанием высокомолекулярных форм СТ^Λ4-[д меньше примерно 5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; г) содержанием гликозилирования в доменах ΙΙΙ, Ιν и ν минимум от примерно 29.8 до примерно 50.1% ^связанного гликозилирования, что измеряется с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы 0Т^Λ4-[д. которая характеризуется: а) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д от примерно 11 до при

- 43 017765 мерно 13; б) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д от примерно 5.5 до примерно 9.5; в) содержанием высокомолекулярных форм СТЬА4-1д меньше примерно 5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции. В одном варианте молекулы дополнительно характеризуются: а) примерно 80% двухантенным Νсвязанным гликозилированием; б) примерно 14% трехантенным Ν-связанным гликозилированием; в) примерно 6% четырехантенным Ν-связанным гликозилированием. В другом варианте молекулы дополнительно включают любую комбинацию одной или нескольких: а) аминокислотных последовательностей 8ЕО ΙΌ N0:16 (метионин в положении аминокислоты 27 и глицин в положении аминокислоты 382 8Е0 ΙΌ N0:4); б) аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:13 (метионин в положении аминокислоты 27 и лизин в положении аминокислоты 383 8Е0 ΙΌ N0:4); в) аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:15 (аланин в положении аминокислоты 26 и глицин в положении аминокислоты 382 8Е0 ΙΌ N0:4); г) аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:12 (аланин в положении аминокислоты 26 и лизин в положении аминокислоты 383 8Е0 ΙΌ N0:4). В другом варианте а) примерно 90% молекул включают аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:4, начинающуюся с метионина в положении остатка 27; б) примерно 10% молекул включают аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:4, начинающуюся с аланина в положении остатка 26; в) примерно 4% молекул включают аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:4, заканчивающуюся лизином в положении остатка 383; г) примерно 96% молекул включают аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:4, заканчивающуюся глицином в положении остатка 382. Данное изобретение относится к композиции, включающей полипептиды СТЬА4-1д, где: а) примерно 80% полипептидов содержат двухантенное ^связанное гликозилирование; б) примерно 14% полипептидов содержат трехантенное ^связанное гликозилирование; в) примерно 6% полипептидов содержат четырехантенное ^связанное гликозилирование; г) среднее молярное отношение 6IсNАс на 1 моль белка СТЬА4-1д составляет от примерно 24 до примерно 28. Данное изобретение относится к композиции, включающей полипептиды СТЬА4-1д, где: а) примерно 80% полипептидов содержат двухантенное ^связанное гликозилирование; б) примерно 14% полипептидов содержат трехантенное ^связанное гликозилирование; в) примерно 6% полипептидов содержат четырехантенное ^связанное гликозилирование; г) среднее молярное отношение СаШАс к молекулам СТЬА4-1д составляет от примерно 2.6 до примерно 3.6. В другом варианте композиция является преимущественно очищенной композицией. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА41д, где максимум до примерно 2.5% молекул СТЬА4-1д находится в окисленном виде. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где максимум до примерно 2.0% молекул СТЬА4-1д находится в деаминированном виде. Данное изобретение относится к композиции, включающей димеры молекул СТЬА4-1д, где минимум 0.5% димеров молекул СТЬА4-1д находятся в цистеинилированном виде. В одном варианте минимум 1% димеров молекул СТЬА4-1д находятся в цистеинилированном виде. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬА4-1д, где популяция характеризуется масс-спектрофотометрическим профилем, преимущественно совпадающим с тем, что изображен на фиг. 63, 64 или 66. Данное изобретение относится к популяции молекул СТЬА4-1д, где популяция характеризуется профилем капиллярного электрофореза, преимущественно совпадающим с тем, что изображен на фиг. 47.

Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где композиция характеризуется: а) средним молярным отношением С1<^Ле к молекулам СТЬА4-1д от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 1.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 8 до примерно 17; г) средним молярным отношением фукозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 3.5 до примерно 8.3; д) средним молярным отношением маннозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 7.2 до примерно 22; е) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д от примерно 6 до примерно 12; ж) пи, как определено визуализацией на изоэлектрофокусировочном геле, в диапазоне от примерно 2.4±0.2 до примерно 5.0±0.2; з) содержанием МСР-Ι максимум 3 млн^-1; и) содержанием высокомолекулярных форм СТЬА4-1д меньше примерно 2.5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; к) содержанием мономера меньше 0.5% площади, что определяется с помощью площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; л) полипептидами СТЬА4-1д, по аминокислотной последовательности, минимум на 95% идентичной любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:5-10; м) молекулами СТЬА4-1д, способными связываться с СБ80 и СБ86. Данное изобретение относится к композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где популяция молекул характеризуется: а) средним молярным отношением СIсNЛс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 15 до примерно 35; б) средним молярным отношением СаШАс к молекулам СТЬА4-1д от примерно 1.6 до примерно 3.6; в) средним молярным отношением галактозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 8 до примерно 17; г) средним молярным отношением фукозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 3.5 до примерно 8.3; д) средним молярным отношением маннозы к молекулам СТЬА4-1д от примерно 7.2 до примерно 22; е) средним молярным отношением сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д от примерно 6 до примерно 12; ж) пи, как определено визуали

- 44 017765 зацией на изоэлектрофокусировочном геле, в диапазоне от примерно 3.4±0.2 до примерно 5.0±0.2; з) содержанием МСР-1 максимум 5 млн^-1; и) содержанием высокомолекулярных форм СТЬА4-1д меньше примерно 2.5% площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; к) содержанием мономера меньше 0.5% площади, что определяется с помощью площади, что определяется с помощью эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрической детекции; л) полипептидами СТЬА4-1д, по аминокислотной последовательности, минимум на 95% идентичной любой из последовательностей 8ЕЦ Ш N0:5-10; м) молекулами СТЬА4-1д, способными связываться с ί.Ό80 и СЭ86. или фармацевтическими эквивалентами.

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, характеризующейся частотой иммуногенности максимум 7.4%. В одном варианте частота иммуногенности составляет от примерно 2.1 до примерно 7.4%. В одном варианте частота иммуногенности составляет максимум 3.6%.

В одном варианте частота иммуногенности составляет максимум 3.0%. В одном варианте частота иммуногенности составляет от примерно 2.8 до примерно 3.0%. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где после введения этой композиции человеку выработка антител, которые связываются к молекулами СТЬА4-1д, происходит у человека с частотой максимум 7.4%. В одном варианте эта частота составляет от примерно 2.1 до примерно 7.4%. В одном варианте эта частота составляет максимум 3.6%. В одном варианте эта частота составляет максимум 3.0%. В одном варианте эта частота составляет от примерно 2.8 до примерно 3.0%. Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где после введения этой композиции человеку выработка антител, которые связываются с частью СТЬА4 молекулы СТЬА4-1д, происходит у человека с частотой максимум 4.9%. В одном варианте эта частота составляет от примерно 0.5 до примерно 4.9%. В одном варианте эта частота составляет максимум 1.2%. В одном варианте эта частота составляет максимум 1.0%. В одном варианте эта частота составляет от примерно 0.9 до примерно 1.0%. В одном варианте эта частота измеряется с помощью твердофазного иммуносорбентного анализа (ЕЬ18А). В одном варианте эта частота измеряется с помощью электрохемолюминесцентного анализа (ЭЛА).

Данное изобретение относится к выделенной композиции, включающей молекулы СТЬА4-1д, где после введения этой композиции человеку выработка антител, которые нейтрализуют молекулы СТЬА4[д, происходит у человека с частотой максимум 75% людей, имеющих антитела, которые связываются с частью СТЬА4 молекулы СТЬА4-1д. В одном варианте эта частота составляет 40-75%. В одном варианте эта частота составляет максимум 40%. В одном варианте эта частота измеряется с помощью анализа репортерного гена люциферазы.

Данное изобретение относится к способу получения белка СТЬА4-1д, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТЬА4-1д, где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТЬА4-1д не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТЬА4-1д на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТЬА4-1д из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда жидкая культура характеризуется минимальным отношением примерно 6.0 моль NАNА на 1 моль димера СТЬА4-1д или молекулы СТЬА4-1д, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры. Этот способ также предусматривает способ получения белка СТЬА4-1д, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТЬА4-1д, где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТЬА4-1д не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТЬА4-1д на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТЬА4-1д из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда жидкая культура характеризуется отношением от примерно 5.2 до примерно 7.6 моль сиаловой кислоты на 1 моль димера СТЬА4-1д или молекулы СТЬА4-1д, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры. Этот способ также предусматривает способ получения белка СТЬА4-1д, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТЬА4-1д, где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТЬА4-1д не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТЬА4-1д на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТЬА4-1д из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда жидкая культура характеризуется плотностью клеток от примерно 33х10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл жидкой культуры до примерно 79х10⁵ клеток на 1 мл жидкой культуры. Данное изобретение также относится к способу получения белка СТЬА4-1д, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТЬА4-1д, где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТЬА4-1д не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТЬА4-!д на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жид

- 45 017765 кой культуры; б) выделение белка СТ^Λ4-Iд из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда жидкая культура характеризуется жизнеспособностью клеток минимум примерно 38%. Данное изобретение также относится к способу получения белка СТ^Λ4-Iд. при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТ^Λ4-Iд. где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТ^Λ4-Iд не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТ^Λ4-Iд на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТ^Λ4-Iд из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда жидкая культура характеризуется жизнеспособностью клеток минимум примерно 37%. Способ также предусматривает способ получения белка СТ^Λ4-Iд. при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТ^Λ4-Iд. где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТ^Λ4-Iд не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТ^Λ4-Iд на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТ^Λ4-Iд из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда жидкая культура характеризуется концентрацией эндотоксина максимум до примерно 76.8 единиц эндотоксина на 1 мл жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры. Способ также предусматривает способ получения белка СТ^Λ4-Iд. при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТ^Λ4-Iд. где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТ^Λ4-Iд не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТ^Λ4-Iд на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТ^Λ4-Iд из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда жидкая культура характеризуется концентрацией эндотоксина максимум до примерно 4.8 единиц эндотоксина на 1 мл жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры. Данное изобретение также относится к способу получения белка СТ^Λ4-Iд. при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТ^Λ4-Iд. где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТ^Λ4-Iд не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТ^Λ4-Iд на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТ^Λ4-Iд из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда бионагрузка составляет меньше 1 колониеобразующей единицы на 1 мл жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры. Данное изобретение также относится к способу получения белка СТ^Λ4-Iд. при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТ^Λ4-Iд. где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТ^Λ4-Iд не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТ^Λ4-Iд на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТ^Λ4-Iд из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда соблюдается минимум два из следующих условий: ί) жидкая культура содержит минимум примерно 6.0 моль NАNА на 1 моль димера СТ^Λ4-Iд или молекулу €.4^44^ ίί) жидкая культура характеризуется плотностью клеток от примерно 33х10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл жидкой культуры до примерно 79х10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл жидкой культуры; ίίί) жизнеспособность клеток жидкой культуре составляет минимум примерно 38%; или ίν) выход белка СТЬА44д больше примерно 0.5 г белка СТЬА44д на 1 л жидкой культуры, где концентрация NАNА в (ί) и выход в (ίν) определяются с помощью анализа порции жидкой культуры.

Данное изобретение также относится к способу получения белка СТЬА44д, при этом способ включает: а) выращивание клеток млекопитающего, которые вырабатывают белок СТЬА44д, где выращивание происходит посевом из культуры для посева в жидкую культуру объемом минимум 10000 л до тех пор, пока белок СТЬА44д не вырабатывается с выходом минимум примерно 0.5 г белка СТ^Λ4-Iд на 1 л жидкой культуры, что определяется с помощью анализа порции жидкой культуры; б) выделение белка СТЬА44д из жидкой культуры объемом минимум 10000 л, где выделение проводится, когда соблюдается минимум два из следующих условий: ί) жидкая культура содержит от примерно 5.2 до примерно 7.6 моль сиаловой кислоты на 1 моль димера СТЬА44д или молекулы СТ^Λ4-Iд; ίί) жизнеспособность клеток в жидкой культуре составляет минимум примерно 37%; или ίίί) выход белка СТЬА44д больше примерно 0.5 г белка СТ^Λ4-Iд на 1 л жидкой культуры, где содержание сиаловой кислоты в (ί) и выход в (ίίί) определяются с помощью анализа порции жидкой культуры.

- 46 017765

Последовательности:

δΕΟ ГО N0:1 [нуклеотидная последовательность СТЬА4-1§, см. Фиг. 1] δΕζ) ГО N0:2 [аминокислотная последовательность СТЬА4-1§, см. Фиг. 1]

8Е0 ГО N0:3 [нуклеотидная последовательность СТЬА4А29¥Ы04Е-1§ включает нуклеотиды от 79 до 1149 в последовательности нуклеиновых кислот, представленной на ФИГ. 2] δΕζ) ГО N0: 23 — полная нуклеотидная последовательность, представленная на Фиг. 2.

Эта нуклеотидная последовательность включает кодирующую последовательность для предпосл едовательности.

8Εζ) ГО N0:4 [аминокислотная последовательность СТЬА4А29УЫ04Е-1§, Фиг. 3, без предпоследовательности] 8ЕЦ ГО N0:5 [аминокислоты 25-383 в 8ЕЦ ГО N0:2]

ΜΑΜΗνΑζ)ΡΑν/ΕΑδδΚΟΙΑδΡνθΕΥΑ8ΡΟΚΑΤΕνκντνΕΚζ)ΑΟδζ)νΤΕνθΑΑΤΥΜΜ ζ}ΝΕΕΤΡΕϋΟδΙΟΡ6ΤδδΟΝζ)νΝΕΤΙζ)ΟΕΚΑΜΟΤζ3ΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕ(3ΙΟΝΟΤΟΙΥ

УГОРЕРСРО8О0ЕРК88ВКТНТ8РР8РАРЕЕЬС1О88УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУУУ

0ν8ΗΕ0ΡΕνΚΕΝ\νγν0σνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ(2ΥΝ8ΤΥΚνν8νΕΤνΕΗ(20\νΕΝ6ΚΕΥ

ΚΟΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝΟνδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδϋΙΑ νΕ\νΕ8Ν60ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ8Ο68ΡΡΕΥ8ΚΕΤνθΚ8Κλν00ΟΝνΡ808νΜ ΗΕΑΕΗΝΗΥΤ0Κ8Ε8Ε8ΡΟΚ

8Е0 ГО N0:6 [аминокислоты 26-383 в δΕζ) ГО N0:2]

- 47 017765

АМНУА0РА\¥ЬА88КС1А8РУСЕ¥А8РОКАТЕУКУТУЕК0АО8рУТЕУСААТ¥ММОМ

ΕΕΤΡΕΟΟ8ΙϋΤΟΤ88σ^νΝΕΤΐρσΕΚΑΜΟΤσΕΥΙΕΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσΐσΝσΤζ)ΙΥνΐ ОРЕРСРО8О(^ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОа88УРЕРРРКРКОТЕМ18БП'РЕУТСУ\УЕ)У 8НЕОРЕУКРМАУУУООУЕУНМАКТКРКЕЕрУМ8ТУКУУ8УЕТУЕНОО\УЕМОКЕУКС ΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚσΟΡΕΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚϋΕΕΤΚΝί^νδΕΊΌΕνκσΡΥΡδΟΙΑνΕ νΕδΝΟρΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδϋΟδΡΡΕΥδΚΕΤνΟΚδΚ^ΟΟΝνΡδΟδνΜΗΕ ΑΕΗΝΗΥΤΡΚ8Ε8Ε8ΡΟΚ

8Εζ) ГО N0:7 [аминокислоты 27-383 в 8Ε0 ГО N0:2]

МНУАЭРА\УЕА88КО1А8РУСЕУА8РС}КАТЕУНУТУЕК(2АО8(2УТЕУСААТУММ(ЖЕ ΕΤΡΕΟΟδΙΟΤ(3Τ880ΝθνΝΕΤΙζ)ΟΕΚΑΜΟΤί}ΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕ(3Ι(3ΝΟΤζ)ΙΥνΐΌ ΡΕΡ0ΡΟ8Ρ0ΕΡΚ88ΟΚΤΗΤ8ΡΡ8ΡΑΡΕΕΕΟΟ88νΡΕΕΡΡΚΡΚϋΤΕΜΙ8ΚΤΡΕνΤ0νννθν8

ΗΕΟΡΕνΚΡΝν/ΥνϋσνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ(2ΥΝ8ΤΥΙθν8νΕΤνΕΗ9ΟλνΕΝσΚΕΥΚ0Κν 8ΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚΟ(}ΡΚΕΡ(2νΥΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ0ν8ΕΤ0ΕνΚσΡΥΡ8ΟΙΑνΕλνΕ 8Ν6(2ΡΕΝΝΥΚΊΤΡΡνΕ08θσ8ΕΡΕΥ8ΚΕΤνθΚ8Κ\ν(2Ρ6ΝνΡ808νΜΗΕΑ

ΕΗΝΗΥΤζ)Κ8Ε8Ε8ΡΟΚ

8Εζ) ГО N0:8 [аминокислоты 25-382 в 8Ε(^ ГО N0:2]

МАМНУАрРА\УЕА88КО1А8РУСЕУА8РОКАТЕУКУТУЕК(2АО80УТЕУСААТУММ ΟΝΕΕΤΡΕϋΟδΙΟΤσΤδδΟΝί^νΝΕΤΚ^σΕΚΑΜΟΤΟΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσίΟΝΟΤΟΙΥ УГОРЕРСРО8О(}ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕ6О88УРЕГРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУ\У 0νδΗΕ0ΡΕνΚΡΝλνΥνϋ0νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ(2ΥΝ8ΤΥΚνν8νΕΤνΕΗρ0\νΕΝσΚΕΥ ΚΟΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚϋΕΕΤΚΝΟνδΕΤΟΕνΚΟΕΥΡδΟΙΑ VΕ^VΕ8NΟ^ΡΕNNΥΚΤΤΡΡV^^8^σ8ΕΡ^Υ8Κ^ΤV^Κ8Κ^V^^ΟNVΡ8С8VΜ

ΗΕΑΕΗΝΗΥΤ0Κ8Ε8Ε8ΡΟ

8Εζ) ГО N0:9 [аминокислоты 26-382 в 8ЕЭ ГО N0:2]

АМНУА(2РАУУЕА88К61А8РУСЕУА8РОКАТЕУКУТУЕК(2АО8РУТЕУСААТУММ6

ΝΕΕΤΡΕΟϋ8ΙΟΤ(}Τ880Ν(3νΝΕΤΙΟΟΕΚΑΜΟΤ(3ΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤζ)ΙΥν ГОРЕРСРО8ОРЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОС88УРЕЕРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУУУО νδΗΕΟΡΕνΚΡΝλνΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗί^ΟλνΕΝσΚΕΥΚ ΟΚνδΝΚΑΕΡΑΡΕΚΤΙδΚΑΚΟςΡΚΕΡρνΥΤΕΡΡδΚϋΕΕΤΚΝί^νδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδΟΙΑν ΕλνΕ8ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ8Ο68ΡΡΕΥ8ΚΕΤνθΚ8ΚΛ¥(206ΝνΡ8Ο8νΜΡΙΕ ΑΕΗΝΗΥΤΟΚδΕδΕδΡΟ

8Εζ) ГО N0: 10 [аминокислоты 27-382 в 8Е(2 ГО N0:2]

МНУА0РА\УЕА88КО1А8ЕУСЕУА8РОКАТЕУ1<УТУЫ<(2АО89УТЕУСААТУММО№ ΕΤΓΕΟΟδΙΟΤΟΤδδΟΝρνΝΕΤ^ΟΕΚΑΜΟΤσΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤρίΥνίΟ РЕРСРО8О(2ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОО88УГЕРРРКРКГ>ТЕМ18КТРЕУТС\¥УОУ8 ΗΕΟΡΕνΚΡΝλνΥνοσνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗ(2ϋ\νΕΝ6ΚΕΥΚΟΚ νδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚΟ(2ΡΚΕΡ(2νΥΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ(2ν8ΕΤ0ΕνκσΡΥΡ8ΟΙΑνΕ\ν ΕδΝί^ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδΟΟδΡΡΕΥδΚΕΤνΟΚδΚν^ΟΝνΡδΟδνΜΗΕΑ

ΕΗΝΗΥΤ0Κ8Ε8Ε8Ρ6

8Е<2 ГО N0: 11 [аминокислоты 25-383 в 8Εζ) ГО N0:4]

- 48 017765

МАМНУА(2РА\УЕА88КС1А8Р.У.СЕУА8Р.СКУТЕУКУТУЕК(2АО8РУТЕУСААТУМ

Μ6NΕ^ΤΡ^^^8IСΤ^Τ886N^VN^ΤI^С^ΕΑΜ^ΤС^ΥIСΚVΕ^ΜΥΡΡΡΥΥΕСI^NСΤ^I

УУГОРЕРСРО8О0ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОО88УРЕРРРКРКОТЕМ18НТРЕУТСУУ νονδΗΕΟΡΕνΚΡΝν/ΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕί^ΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗί^ΟλνΕΝΟΚΕ ΥΚ0Κν8ΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚΟ0ΡΚΕΡζ)νΥΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ0ν8ΕΤ0ΕΥΚΟΡΎΡ8ΟΙ ΑνΕλνΕδΝσΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕϋδΟσδΡΡΕΥδΚΕΤνΟΚδΚλνρρσΝνΡδΕδνΜ ΗΕΑΕΗΝΗΥΤ0Κ8Ε8Ε8ΡΟΚ

8Εζ) Ю ΝΟ: 12 [аминокислоты 26-383 в 8Εζ) Ю N0:4]

АМНУА(2РАУУЕА88КО1А8РУСЕУА8РОКУТЕУКУТУЕК0АО8рУТЕУСААТУММО ΝΕΕΤΡΕϋϋδΙΟΤΟΤδδΟΝΟνΝΕΊΤΟΟΕΚΑΜΟΤΟΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤζΠΥν ЮРЕРСРО8ОрЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОО88УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУТО νδΗΕΟΡΕνΚΡΝλνΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚλνδνΕΤνΕΗΟΟΧνΕΝΟΚΕΥΚΟ ΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝί^νδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕ \VΕ8NС^ΡΕNNΥΚΊΤΡΡV^^8^68ΡΡ^Υ8Κ^ΤV^Κ8Κ.^V^^СNVΡ8С8VΜΗΕ ΑΕΗΝΗΥΤζ)Κ8Ε8Ε8ΡΟΚ

8Εζ) ΙΟ N0:13 [аминокислоты 27-383 в 8Ε0 Ю N0:4]

ΜΗνΑ(2ΡΑννΕΑ88Κ0ΙΑ8Ρν0ΕΥΑ8Ρ6ΚΥΤΕνκντνΕΡ(2ΑΟ8(2νΤΕν0ΑΑΤΥΜΜσΝ Ε^ΤΡ^^^8IСТСΤ880N^VN^ΤI^6^ΚΑΜ^Τ0^ΥIСΚVΕ^ΜΥΡΡΡΥΥΕ0I0NσΤ^IΥVI

ОРЕРСРО8О(2ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕС688УРЕРРРКРКГ)ТЕМ181<ТРЕУТС\УУОУ δΗΕΟΡΕνΚΡΝν/ΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗ^ΟλνΕΝΟΚΕΥΚΟ Κν8ΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚθρΡΚΕΡ(2νΥΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ(2ν8ΕΤΟΕνΚΟΡΥΡ8ϋΙΑνΕ \νΕ8Ν0(2ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ8Ο68ΓΕΕΥ8ΚΕΤνθΚ8Κν^(20ΝνΡ808νΜΗΕΑ ΕΗΝΗΥΤζ)Κ8Ε8Ε8Ρ0Κ

8Εζ) Π) N0:14 [аминокислоты 25-382 в δΕΟ Ю N0:4]

МАМНУА(2РАДУЕА88КС}1А8РУСЕУА8РООТТЕУКУТУЬК0АО8рУТЕУСААТУММ ΟΝΕΕΤΡΕΟΟδΙΟΤσΤδδΟΝρνΝΕΤ^ΟΕΚΑΜϋΤΟΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤΟΙΥ УГОРЕРСРО8О(2ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕО(388УЕЕЕРРКРКЕ)ТЕМ18КТРЕУТСУАУ θν8ΗΕΏΡΕνΚΡΝλνΥνθ6νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ0ΥΝ8ΤΥΚν/8νΕΤνΕΗ0Ώλ¥Ε

ΝΟΙΟΕΥΚΟΚνδΝΚ/ΔΕΡ ΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚαΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΌΕΕΤΚΝΟνδΕΤΟΕνκαΡ

ΥΡ8^IΑVΕ^VΕ8NΟ^ΡΕNNΥΚΤΤΡΡV^^8^68ΡΡ^Υ8Κ^ΤV^Κ8Κ^V^^6NVΡ8С8VΜ ΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚ8Ε8Ε8ΡΟ

8Ε0 ΙΕ> N0: 15 [аминокислоты 26-382 в 8Εζ) Ιϋ N0:4]

АМНУА(2РАУУЬА88КО1А8РУСЕУА8РОКУТЕУКУТУЬК(2АО80УТЕУСААТУММО

ΝΕΕΤΡΕΟΟ8ΙΟΤσΤ88ΟΝ(2νΝΕΤΙ0ΟΕΚΑΜΙ)Τ6ΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσΐ6ΝΟΤ(2ΙΥν ГОРЕРСРО8О(2ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕШ3688УРЬРРРКРКОТЬМ18КТРЕУТСУУУО νδΗΕΟΡΕνΚΕΝΧνΥνΟΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕί^ΥΝδΤΥΚλνδνΕΤΥΕΗί^ϋλνΕΝΟΚΕΥΚΟ ΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝΟνδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδϋΙΑνΕ ^VΕ8NС^ΡΕNNΥΚΊΤΡΡV^^8^С8ΡΡ^Υ8Κ^ΤV^Κ8Κ^¥^^СNVΡ8СδVΜΗΕΑ^ΗNΗΥ ТОКЗЬЗЬЗРб

8Εζ) Ю N0:16 [аминокислоты 27-382 в 8Εζ) Ю N0:4]

- 49 017765

ΜΗνΑζΧΡΑννΕΑδδΚΟΙΑδΕνΟΕΥΑδΡΟΚΥΤΕνκντνΕΚΟΑϋδί^νΤΕνΟΑΑΤΥΜΜΟΝ ΕΕΤΕΕΟϋδΙΟΤΟΤδδΟΝΟνΝΕΤΙΟΟΕΚΑΜϋΤΟΕΥΙΟΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤΟΙΥνί ОРЕРСРО8ОрЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЬЕОСг88УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУУУО νδΗΕΟΡΕνΚΕΝν^ΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕρΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗί^ΟλνΕΝΟΚΕΥΚ СКУЗККАЬР

ΑΡΕΚΤΙ8ΚΑΚ60ΡΚΕΡ0νΥΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ0νδΕΤ0ΕνΚΟΕΥΡ8ΟΙΑνΕν/Έ8ΝΟ0ΡΕ ΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδΟΟδΕΡΕΥδΚΕΤνΟΚδΚ^ΟΟΝνΡδΟδνΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚδΕδΕδΡ С

8ΕΟ ГО N0: 17

8Ε<2 ГО N0: 18 [последовательность внеклеточного домена СТЬА4]

ΜΗνΑςΡΑ\νΕΑ88Κ.σΐΑ8ΕνσΕΥΑ8ΡΟΚΥΤΕνκντνΕΚ.ςΑΟδςνΤΕνσΑΑΤΥΜΜΟΝΕ ΕΤΕΕΟΟδΙΟΤΟΤδδΟΝΟνΝΕΤΙΟΟΕΚΑΜΟΤΟΕΥΙΟΚνΕΕΜΎΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤΟΙ уугорерсрозо

8Εζ) ГО N0: 19

57А6ААААООООСТО6АОАОАТООСТСАОТ6ОТТААСАОСА-8'

8Е9 ГО N08: 20-22

8Εζ) ГО N0: 20 - 5'-ОТАСТСАОО

8Е0 ГО N0:21 ~ АОТСАОАОАС

8Е0 ГО N0: 22 ~ СООСАОАТСТСТОТОАОТТТОАООССАОССТОО ТСТАСАА АОС

ААСТТ-3 ’

Мономеры и мультимеры СТЬА4-1§.

В некоторых вариантах данное изобретение относится к клеточным линиям, содержащим кассету экспрессии, которая содержит последовательность 8Е^ ГО N0:1 (фиг. 1А). Такая кассета экспрессии при экспрессии в клетках млекопитающего, включая клетки СНО, может обусловливать продукцию N и Сконцевых вариантов, при этом белки, выработанные за счет кассеты экспрессии, могут иметь аминокислотные остатки последовательностей: 1) 26-383 из 8Е^ ГО N0:2, ίί) 26-382 из 8Е^ ГО N0:2; ίίί) 27-383 из 8ЕО ГО N0:2, или ίν) 27-382 из 8Е^ ГО N0:2, или, на выбор, ν) 25-382 из 8Е^ ГО N0:2, или (νί) 25-383 из 8Е^ ГО N0:2 (фиг. 1А). Такие белки можно обозначить в данном документе как мономеры 8Е^ ГО N0:2, или мономеры, содержащие последовательность 8Е^ ГО N0:2. Эти мономеры 8Е^ ГО N0:2 могут димеризоваться, при этом комбинации димеров могут включать, например: (ί) и (ί); (ί) и (ίί); (ί) и (ίίί); (ι) и (ίν); (ι) и (ν); (ί) и (νί); (ίί) и (ίί); (ίί) и (ίίί); (ίί) и (ίν); (ίί) и (ν); (ίί) и (νί); (ίίί) и (ίίί); (ίίί) и (ίν); (ίίί) и (ν); (ίίί) и (νί); (ίν) и (ίν); (ίν) и (ν); (ίν) и (νί); (ν) и (ν); (ν) и (νί); (νί) и (νί). Эти различные комбинации димеров могут также связываться друг с другом с образованием тетрамера молекулы СТЬА4-1§. Эти мономеры, димеры, тетрамеры и прочие мультимеры можно обозначить в данном документе как белки 8Е^ ГО N0:2 или белки, содержащие последовательность 8Е^ ГО N0:2. В то время как клеточные линии могут вырабатывать эти варианты сразу после трансляции, варианты могут представлять собой продукт посттрансляционных событий в клетке. Эта клеточная линия также секретирует молекулы СТЬА4-1§. Абатацепт означает белки 8Е^ ГО N0:2. Молекулы СТЬА4-1§ могут, например, включать белки СТЬА4-1§ в мономерной, димерной, тримерной, тетрамерной, пентамерной, гексамерной или других мультимерных формах. Молекулы СТЬА4-1§ могут включать гибридный белок, как минимум, с внеклеточным доменом СТЬА4 и постоянным участком иммуноглобулина. Молекулы СТЬА4-1§ могут иметь последовательности дикого типа или мутантные последовательности, например, в последовательностях внеклеточного домена СТЕА4 и постоянного участка иммуноглобулина.

Мономеры СТЬА4-1§, поодиночке или в димере, тетрамере или другой мультимерной форме, могут быть гликозилированы.

В некоторых вариантах данное изобретение относится к популяциям молекул СТЬА4-1§, которые содержат определенную долю димеров или других мультимерных молекул. Например, данное изобретение относится к популяциям молекул СТЬА4-1§, которые больше чем на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99.5% состоят из димеров СТЬА4-1§. В одном варианте данное изобретение относится к популяциям молекул СТЬА4-1§, которые включают от примерно 95 до примерно 99.5% димера СТЬА4-1§ и от примерно 0.5 до примерно 5% тетрамера СТЬА4-1§. В другом варианте популяция молекул СТЬА4-1§ включает примерно 98% димера СТЬА4-1§, примерно 1.5% тетрамера СТЬА4-1§ и примерно 0.5% мономера СТЬА4-1§.

В одном варианте данное изобретение относится к популяциям молекул СТЬА4-1§, где популяция преимущественно не содержит мономерные молекулы СТЬА4-1§. Преимущественно не содержит мономерные молекулы СТЬА4-1§ может означать популяцию молекул СТЬА4-1§, которая содержит меньше 1, 0.5 или 0.1% мономеров.

В одном варианте данное изобретение относится к популяциям молекул СТЬА4-1§, где популяция преимущественно не содержит мультимеры СТЬА4-1§ крупнее димеров, такие как тетрамеры, гексамеры и т.д. (например, высокомолекулярные формы). Преимущественно не содержит мультимерные молекулы СТЬА4-1§ крупнее димеров может означать популяцию молекул СТЬА4-1§, которая содержит меньше 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 или 0.1% мультимеров СТЬА4-1§ (например, высокомолекулярные формы) крупнее

- 50 017765 димеров.

Молекула мономера СТЬА4-1§ может содержать, например, аминокислотные последовательности: 1) 26-383 из 81%) ΙΌ N0:2, ίί) 26-382 из 8Е^ ΙΌ N0:2, ίίί) 27-383 из 81%) ΙΌ N0:2, или ιν) 27-382 из 8Е^ ΙΌ N0:2, или, на выбор, ν) 25-382 из 8Е^ ΙΌ N0:2, или νΐ) 25-383 из 8Е^ ΙΌ N0:2. Когда кассета экспрессии, содержащая последовательность нуклеиновых кислот 8Е^ ΙΌ N0:1, экспрессируется в клетках СНО, преобладающая экспрессированная мономерная форма имеет на Оконце аминокислотный остаток метионина (остаток 27 из 8Е^ ΙΌ N0:2), который соответствует ^концевому аминокислотному остатку в человеческом СТЬА4 дикого типа. Однако поскольку 81%) ΙΌ N0:1 также включает последовательность, кодирующую сигнальную последовательность онкостатина М (нуклеотиды 11-88 в 81%) ΙΌ N0:1), экспрессированный белок из 81 %) ΙΌ N0:1 содержит сигнальную последовательность онкостатина М.

Эта сигнальная последовательность отщепляется от экспрессированного белка в процессе экспорта белка из цитоплазмы или секреции за пределы клетки. Но расщепление может обусловливать варианты Оконца, такие как расщепление между аминокислотными остатками 25 и 26 в 81%) ΙΌ N0:2 (в результате на Оконце остается остаток 26, т.е. вариант А1а), или между аминокислотными остатками 24 и 25 в 81%) ΙΌ N0:2 (в результате на Оконце остается остаток 26, т.е. вариант Ме1-А1а), в отличие от расщепления между аминокислотными остатками 26 и 27 в 8Е^ ΙΌ N0:2 (в результате на Оконце остается остаток 27). Например, вариант Ме1-А1а может присутствовать в смеси молекул СТ^Л4-Iд примерно на уровне 1%, и вариант А1а может присутствовать в смеси молекул СТ^Л4-Iд примерно на уровне 8-10%. Кроме того, экспрессированный белок из 8Е^ ΙΌ N0:1 может иметь варианты С-конца из-за неполного процессинга. Преобладающим С-концом является глицин в положении 382 в 8Е^ ΙΌ N0:2. В смеси молекул СТ^Л4-Iд мономеры, содержащие лизин на С-конце (остаток 383 в 8Е^ ΙΌ N0:2), могут присутствовать, например, на уровне примерно 4-5%.

В одном варианте молекулы СТ^Л4-Iд содержат аминокислотные последовательности 8Е^ ΙΌ N0:5, как описано ниже (что соответствует аминокислотам 25-383 в 81%) ΙΌ N0:2):

[8Е0 ГО N0: 5]

МАМНУА0РАУ/ЕА88КС1А8ЕУСЕУА8РСгКАТЕУКУТУЕКДАО80УТЕУСААТУММ ΟΝΕΕΤΕΕΟΟδΚΤΟΤδδΟΝΟνΝΕΤ^ΟΕΚΑΜΟΤσΕΥίσκνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσίΟΝΟΤΟΙΥ УШРЕРСРО8О0ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОО88УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУУУ ΟνδΗΕΟΡΕνΚΡΝίνΥνοσνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚΧνδνΕΤνΕΗΟΟίνΕΝσΚΕΥΚ ΟΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟρΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝρνδΕΤΕΕνΚΟΡΥΡδΟΙΆν

ΕλνΕδΝ^ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδΟσδΡΡΕΥδΚΕΤνϋΚδΚλνρΟσΝνΡδΟδνΜΗΕΑΕΗΝΗ утсзкзьзьзрак;

В другом варианте молекулы СТ^Л4-Iд содержат аминокислотные последовательности 81%) ΙΌ N0:6, как описано ниже (что соответствует аминокислотам 26-383 в 81%) ΙΌ N0:2):

[8Е<2 ГО ΝΟ: 6] АМНУАрРУПЬАЗЗКСИАЗГУСЕУАЗРСКАТЕУКУТУЕК^АОЗС^УТЕУСААТУММСгМЕ ЕТРЕОО81СТСТ88СМ0УЖТ1рСЕКАМОТСЕУ1СКУЕЬМУРРРУУЕС16М6Т(21УУ1Е) ΡΕΡСΡ^8^^ΕΡΚ88^ΚΤΗΤ8ΡΡ8ΡΑΡΕ^^ΟΟ88VΡ^ΡΡΡΚΡΚ^Τ^ΜI8ΚΤΡΕVΤСVVV^V δΗΕΟΡΕνΚΡΝλνγνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗΟΟλνΕΝΟΚΕΥΚΟ ΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝΟνδΕΤσΕνΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕ λνΕ8Νσ(}ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ8θσ8ΡΡΕΥ8ΚΕΤνθΚ8Κλν(20σΝνΡ8σ8νΜΗΕ ΑΕΗΝΗΥΤΟΚδΕδΕδΡΟΚ;

В другом варианте молекулы СТ^Л4-Iд содержат аминокислотные последовательности 81%) ΙΌ N0:7, как описано ниже (что соответствует аминокислотам 27-383 в 81%) ΙΌ N0:2):

[8Е0 ГО ΝΟ: 7] МНУА0РА\УЕА88КО1А8РУСЕУА8РСКАТЕУКУТУЬК0АО8(2УТЕУСААТУММОМЕ ΕΤΡΕΟΟ8Ι€ΤσΤ886Ν0νΝΕΤ^σΕΚΑΜΟΤ6ΕΥΙ(2ΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσΐ6Ν6Τ(2ΙΥνΐΟ РЕРСРО8О0ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕСС88УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТС\УУОУ8 ΗΕΟΡΕνΚΡΝλνΥνϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚλνδνΕνΕΗΟΟλνΕΝΟΚΕΥΚσκνδ NΚΑ^ΡΑΡIΕΚΤIδΚΑΚΘ^ΡΚΕΡ^VΥΤ^ΡΡ8Κ^Ε^ΤΚN^V8^ΤС^VΚσрΥΡ8^IΑVΕλVΕ8 ΝΟρΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδΟΟδΕΕΕΥδΚΕΤνϋΚδΚν/ί^ΟΝνΡδαδνΜΗΕΑ

ЬН\НУТ0К8Ь8Ь8РСК;

В другом варианте молекулы СТ^Л4-Iд содержат аминокислотные последовательности 81%) ΙΌ N0:8, как описано ниже (что соответствует аминокислотам 25-382 в 81%) ΙΌ N0:2):

[8Е(} ГО ΝΟ: 8] ΜΑΜΗVΑ^ΡΑ^V^Α88ΚΟIΑ8ΡVСΕΥΑ8ΡΟΚΑΤΕVΚVΤV^Κ^Α^8^VΤΕVСΑΑΤΥΜΜ ΟΝΕΕΤΗΕΟΟδίστσΤδδσΝΟνΝΕΤΙΟΟΕΚΑΜΟΤσΕΥΙΕΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟίσΝΟΤΟΙΥ УГОРЕРСРО8О0ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕСО88УРЕРРРКРК0ТЕМ18КТРЕУТСУУУ ΟνδΗΕΟΡΕνΚΡΝλνΥνΟΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗΟΟλνΕΝΟΚΕΥ Κεκν8ΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΊΊ8ΚΑΚ6ρΡΚΕΡ0νΥΤΕΡΡ8ΕΟΕΕΤΚΝ(2ν8ΕΊΌΕνΚ6ΡΥΡ8ΟΙΑ νΕλ¥Ε8Ν60ΡΕΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ8ΟΟ8ΕΡΕΥ8ΚΕΤνθΚ8Κλ¥00σΝνΕ808νΜΗΕΑΕΗΝΗ УТ0К8Е8Ь8РС;

В одном варианте молекулы СТ^Л4-Iд содержат аминокислотные последовательности 8Е^ ΙΌ N0:9, как описано ниже (что соответствует аминокислотам 26-382 из 8Е^ ΙΌ N0:2):

- 51 017765 [8ЕО Ιϋ ΝΟ: 9]

АМН¥АрРА\УЬА88КО1А8Р¥СЕ¥А8РСКАТЕУКУТУЕК0АО80УТЕУСААТ¥ММ6М ΕΕΤΓΕΟΟδΙΟΤσΤδδΟΝΟνΝΕΤΙΟσΕΚΑΜϋΤΟΕΥΙΕΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤΟΙΥνί ОРЕРСРО8ОрЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕСС88УРЕРРРКРК0ТЕМ18КТРЕУТСУУУО νδΗΕϋΡΕνΚΡΝλνΥγϋΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕί^ΥΝδΤΥΚλνδνΕΤνΕΗΟΟλνΕΝσΚΕΥΚα ΚνδΝΚΑΕΡΑΡΕΚΤΙ8ΚΑΚσ(2ΡΚΕΡ0νΎΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ0ν8ΕΤΕΕνΚ6ΡΥΡ8ΟΙΑνΕ λνΕδΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδϋΟδΡΡΕΥδΚΕΤνΟΚδΚλνΟΟΟΝνΡδαδνΜΗΕ

ΑΕΗΝΗΥΤ0Κ8Ε8Ε8ΡΟ;

В одном варианте молекулы СТ^Α4-Iд содержат аминокислотные последовательности 8Е^ ГО N0:10, как описано ниже (что соответствует аминокислотам 27-382 в 8Е^ ГО N0:2):

[8Е0 Ιϋ ΝΟ: 10]

ΜΗνΑ(2ΡννΕΑ88ΚσΐΑ8Ρν0ΕΥΑ8Ρ0ΚΑΊΈνκντνΕΚ(2ΑΟ8(2νΤΕν0ΑΑΤΥΜΜΟΝΕ ΕΤΡΕΟΟδΙϋΤσΤδδΟΝςνΝΕΤΙΟσΕΕΑΜΟΤσΕΥίεκνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσίΟΝσΤί^ΙΥνίΟ РЕРСРО8О0ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОО88УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУУУОУ 8ΗΕΟΡΕνΜΗΝ\νΥνθσνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ(2ΥΝ8ΤΥΚνν8νΕΤνΕΗ(2ΟλνΕΝΟΚΕΥΚα Κν8ΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚθρΡΕΕΡ(2νΥΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ(2ν8ΕΤΕΕνκσΡΥΡ8ΟΙΑνΕ λνΕδΝΟί^ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕϋδϋσδΡΡΕΥδΚΕΤνΟΚδΚλνί^σΝνΡδΟδνΜΡΕΑ ΕΗΝΗΥΤ(^Κ8Ε5Ε8Ρ6.

Молекула мономера СТ^Α4-Iд может содержать внеклеточный домен человеческого СТЬА4. В одном варианте внеклеточный домен может включать нуклеотидную последовательность 89-463 в 8Е^ ГО N0:1, которая кодирует аминокислоты 27-151 в 8Е^ ГО N0:2. В другом варианте внеклеточный домен может включать мутантную последовательность человеческого СТЬА4. В другом варианте внеклеточный домен может включать изменения нуклеотидов 89-463 в 8Е^ ГО N0:1, в итоге возможны консервативные замены аминокислот. В другом варианте внеклеточный домен может включать нуклеотидную последовательность, которая минимум на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидам 89-463 в 8Ш ГО N0:1.

Молекула мономера СТ^Α4-Iд может содержать постоянный участок человеческого иммуноглобулина. Это постоянный участок может быть частью постоянного района; этот постоянный район может относиться к дикому типу или содержать мутантную последовательность. Постоянный район может быть частью человеческого ^01, ^02, ^03, ^04, ^М, ^А^ IдΑ2, или ^Е. Постоянный район может быть частью легкой цепи или тяжелой цепи иммуноглобулина. Когда постоянный район является частью молекулы ^0, или ^А, постоянный район может содержать один из следующих доменов постоянного района: С_ь, С_Н1, соединительный, С_Н2 или С_Н3. Когда постоянный район являются частью ^М или ^Е, постоянный район может включать один или несколько следующих доменов постоянного района: С_ь, С_Н1, С_Н2, С_Н3 или С_Н4. В одном варианте постоянный район может включать один или несколько доменов постоянного района из ^О, ^А, или ^Е.

В одном варианте димеры СТ^Α4-Iд состоят из двух мономеров, где каждый мономер может содержать одинаковые или различные аминокислотные последовательности и где последовательность может быть аминокислотной последовательностью: 1) 26-383 из 8Е^ ГО N0:2, ίί) 26-382 из 8Е^ ГО N0:2, ίίί) 27-383 из 8Ш ГО N0:2, ίν) 27-382 из 8Е^ ГО N0:2, ν) 25-382 из 8Е^ ГО N0:2 и νΐ) 25-383 из 8Е^ ГО N0:2. Такие мономеры СТ^Α4-Iд могут димеризоваться с участием внеклеточного домена последовательности человеческого СТЬА4 через аминокислотный остаток цистеина в положении 146 в 8Е^ ГО N0:2.

Молекулы СТ^Α4-Iд могут мультимеризоваться путем взаимодействия доменов постоянных районов или ^А Ι-цепочечным белком. и ^А обычно вырабатываются как мультимеры вместе с дополнительной полипептидной цепью - 1-цепью. В пентамерном мономеры перекрестно связаны друг с другом дисульфидными мостиками в домене С_Н3 и с 1-цепью с участием домена С_Н4. также может образовывать гексамеры, в которых отсутствует 1-цепь, где мультимеризация происходит за счет дисульфидных связей. В димерном ^А мономеры связаны дисульфидными связями с 1-цепью через домен С_Н3, но не друг с другом. Таким образом, в одном варианте изобретение относится к мультимерам СТ^Α4-Iд, включая димеры, пентамеры и гексамеры, где часть включает постоянный район или его часть или постоянный район ^А или его часть. Такие мультимеры СТ^Α4-Iд, основанные на ^М или ^А, могут включать 1-цепь.

В одном варианте молекула мономера СТ^Α4-Iд (СТЬА4 с инвентарным номером 113253 в Генетическом банке) включает модифицированный человеческий шарнирный район ^О1 (нуклеотиды 464-508 в 8Е^ ГО N0:1; аминокислоты 152-166 в 8Е^ ГО N0:2), где серины в аминокислотных остатках 156, 162, и 165 в 8Е^ ГО N0:2 созданы из цистеинов, присутствующих в последовательности дикого типа.

В одном варианте молекула мономера СТ^Α4-Iд содержит модифицированный район С_Н2 человеческого ^01 и район С_Н3 дикого типа (при этом модифицированный домен С_Н2 человеческого ^01 содержит нуклеотиды 509-838 из 8Е^ ГО N0:1 и аминокислоты 167-276 из 8Е^ ГО N0:2; домен С_Н3 человеческого ^01 содержит нуклеотиды 839-1159 из 8Е^ ГО N0:1 и аминокислоты 277-383 из 8Е^ ГО N0:2).

В одном варианте популяция молекул СТ^Α4-Iд включает мономеры, содержащие последовательность, которая показана на одном или нескольких из фиг. 7, 8 или 9 из заявки на патент США, опублико

- 52 017765 ванной под номером 2002/0182211 А1, и в заявках на патент США, опубликованных под номерами И8 20030083246 и И820040022787, каждая из которых включена во всей полноте в данный документ в виде ссылки.

В одном варианте тетрамерная молекула СТ^Л4-Iд включает две пары или два димера полипептидов СТ^Л4-Iд. где каждый полипептид содержит одну из следующих аминокислотных последовательностей: ί) 26-383 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2, ίί) 26-382 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2, ίίί) 27-383 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2, ίν) 27-382 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2, ν) 25-382 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и νί) 25-383 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2. Каждый член пары полипептидов или димера ковалентно связан с другим членом, и эти две пары полипептидов нековалентно связаны друг с другом, образуя, таким образом, тетрамер. Такие тетрамерные молекулы способны связываться с СО80 или СО86. В другом варианте такие тетрамерные молекулы могут связываться с СО80 или СО86 с авидностью, минимум вдвое превышающей авидность связывания димера СТ^Л4-Iд (чьи мономеры содержат одну из вышеуказанных аминокислотных последовательностей) с СО80 или СО86. В другом варианте такие тетрамерные молекулы могут связываться с СО80 или СО86 с авидностью, минимум вдвое превышающей аффинность или авидность связывания ΟΓΕΑ4 дикого типа с СО80 или СО86. Такая повышенная авидность может обеспечить более высокую эффективность при лечении заболеваний, обусловленных иммунологическими нарушениями, и других заболеваний, как описано выше, а также в торможении отторжения трансплантированной ткани и (или) паренхиматозного органа. Кроме того, повышенная или улучшенная авидность может обеспечивать более высокую активность лекарственного средства. Например, терапевтическая композиция, включающая тетрамер ΟΓΕΑ4-Ι§, имела бы большую авидность и, следовательно, более высокую активность, чем то же самое количество терапевтической композиции СТ^Л4-Iд. содержащей мономер. В другом варианте такие тетрамерные молекулы могут обеспечивать минимум вдвое большее торможение пролиферации Т-лимфоцитов по сравнению с димером ΟΓΕΑ4-Ι§ (чьи мономеры содержат одну из вышеуказанных аминокислотных последовательностей). В другом варианте такие тетрамерные молекулы могут обеспечивать минимум вдвое большее торможение пролиферации Т-лимфоцитов по сравнению с молекулой СТ^Л4-Iд дикого типа.

Мономеры, димеры и мультимеры СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд.

СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд - это модифицированные формы ΟΓΕΑ4-Ι§ (фиг. 1Α; 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1-2). Модификация включает точковые мутации, которые обусловливают две аминокислотные замены (Ь104Е и Α29Υ), как показана на фиг. 2 (соответствует положениям аминокислот 55 и 130 на фиг. 3; 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4). По сравнению с ΟΓΕΑ4-Ι§, СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:5-10) связывается с СО80 (В7-1) примерно с вдвое большей авидностью и связывается с СО86 (В7-2) с вчетверо большей авидностью. СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд примерно в 10 раз эффективнее ΟΓΕΑ4-Ι§ в торможении пролиферации Тлимфоцитов, продукции цитокинов и СО28-зависимом уничтожении клеток-мишеней естественными киллерами. СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд вызывает умеренное торможение опосредованной В7-1 пролиферации Тлимфоцитов, но он намного активнее СТ^Л4-Iд в блокировании пролиферации Т-лимфоцитов, опосредованной В7-2. Эта повышенная активность СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд - это гибридный (химерный) белок, созданный методами генетической инженерии, который состоит из домена функциональной связи модифицированного человеческого ΟΓΕΑ-4 и домена Ес человеческого иммуноглобулина класса ΙβΟ1 (фиг. 3АВ). Две замены аминокислот были произведены в области связывания В7 домена СТ^Α-4 (Б104Е и Α29Υ), в результате была сгенерирована молекула СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд. Димер СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд состоит из двух гликозилированных СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд цепей. Он существует как ковалентный димер, соединенный посредством межцепного дисульфидного мостика. Молекулярная модель молекулы ΟΓΕΑ4^Α29ΥΕ104-Ι§ показана на фиг. 4. Молекула СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд имеет среднюю массу приблизительно 91.800 Да, что было определено времяпролетной масс-спектрометрией с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы (МЛ^^I-ТΟЕ).

В определенных вариантах осуществления изобретения предусмотрены линии клеток, обладающие полигенным экспрессирующим кластером, который включает 8ЕО ΙΌ ΝΟ:3 (номер идентификации последовательности). Подобный полигенный экспрессирующий кластер, если он представлен в клетках млекопитающих, например клетках яичников китайского хомячка, может привести к продуцированию Νи С-терминальных вариантов, так что полипептиды, полученные из полигенного экспрессирующего кластера, могут иметь аминокислотную последовательность остатков: (ί) 26-383, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4, (ίί) 26-382, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4; (ίίί) 27-383, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4, или (ίν) 27-382, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4, или опционально (ν) 25-382, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4, или (νί) 25-383, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4. В данном документе полипептиды могут называться как 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4 мономеры или мономеры, имеющие последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4.

Данные мономеры 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4 могут димеризоваться (разделиться на два члена), таким образом, что данная комбинации димеров может включать, например, (ί) и (ί); (ί) и (ίί); (ί) и (ίίί); (ί) и (ίν); (ί) и (ν); (ί) и (νί); (ίί) и (ίί); (ίί) и (ίίί); (ίί) и (ίν); (ίί) и (ν); (ίί) и (νί); (ίίί) и (ίίί); (ίίί) и (ίν); (ίίί) и (ν); (ίίί) и (νί); (ίν) и (ίν); (ίν) и (ν); (ίν) и (νί); (ν) и (ν); (ν) и (νί); (νί) и (νί). Эти различные комбинации димеров могут также соединяться друг с другом, образуя тетрамерные молекулы СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд. Эти мономеры, димеры, тетрамеры и другие мультимеры могут рассматриваться здесь как полипептиды 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4 или полипептиды, имеющие последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4. В то время как клеточные линии могут продуцировать эти варианты сразу после трансляции, варианты могут быть, более типично, продуктом по

- 53 017765 сттрансляционных действий в клетках. Димеры могут соединяться вместе ковалентно, соединяться вместе нековалентно или сочетая то и другое. Данное изобретение относится к составам, которые, в основном, состоят из димеров, которые соединены вместе ковалентно. Например, изобретение относится к составам, где по меньшей мере 50% димеров СТ^Α4-Iд состоят из мономеров, соединенных ковалентно. Изобретение также относится к составам, где по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 90, 95; 96, 97, 98, 99 или 100% димеров СТ^Α4-Iд состоят из мономеров, соединенных ковалентно. Изобретение также относится к составам молекул СТ^Α4-[д. где молекулы представлены преимущественно в форме димера, а димеры преимущественно сформированы посредством ковалентных связей. Например, изобретение относится к составу, где большая часть димеров СТΑ^4-[д соединена ковалентно. Возможно, что часть димеров СТ^Α4-[д в составе соединена нековалентно.

Молекулы СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд могут включать, например, СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд в мономерных, димерных, тримерных, тетрамерных, пентамерных, гексамерных и других мультимерных формах. Молекулы СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд могут включать белковое слияние (фузию), по меньшей мере, с внеклеточным доменом модифицированного СТЬА4 (8ЕО ГО ΝΟ:18) и иммуноглобулиновой константной областью (Собластью, сегментом). Молекулы СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд могут иметь мутантные последовательности, например, что касается последовательностей модифицированного внеклеточного домена СТЬА4 и иммуноглобулинового константного региона. Мономеры СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд одиночно или в димерной, тетрамерной или другой мультимерной форме могут быть гликозилированы.

В определенных примерах (случаях) изобретение предусматривает совокупности молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, которые имеют, по меньшей мере, определенное процентное содержание димерных или других мультимерных молекул. Например, изобретение обеспечивает совокупности молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, которые больше чем 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99.5% димеров СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд. В одном примере изобретение предусматривает совокупность молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, которая состоит из от 95% до приблизительно 99.5% димера СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд и от приблизительно 0.5% до приблизительно 5% тетрамера СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд. Еще в одном случае изобретение предусматривает совокупность молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, которая состоит приблизительно от 95 до 5% димера СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, от приблизительно 0.5% до приблизительно 2.5% мономера СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд и от приблизительно 0.5% до приблизительно 5% тетрамера СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. В другом случае совокупность молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд включает приблизительно 96% димера СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, приблизительно 2.5% тетрамера СТ^Α4^{Α29Υ^04Е}-Iд и приблизительно 0.5% мономера СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд.

В одном случае изобретение обеспечивает совокупность молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, где совокупность большей частью свободна от мономеров СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд. Преимущественно свободные от СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд мономеры могут относиться к популяции молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, которые имеют менее 1, 0.5 или 0.1% мономеров.

В другом случае осуществления изобретения предусмотрены молекулы СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, где популяция большей частью свободна от мультимеров СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд, которые больше, чем димеры, например, такие как тетрамеры, гексамеры и т.д. Преимущественно свободные от мультимеров (больших, чем димеры) СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд могут относиться к популяции молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, которые имеют менее 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 или 0.1% мультимеров (больших, чем димеры) СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд.

Мономер СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд может иметь, например, аминокислотную последовательность: (ί) 26383, 8ЕО ГО ΝΟ:4, (ίί) 26-382, ЧА) I^NΟ:4 (ίίί) 27-38, ЧТ) ГО ΝΟ:4, (ίν) 27-382, ЧТ) ГО ΝΟ:4, или опционально (ν) 25-382, 8ЕО ГО ΝΟ:4, или (νί) 25-383, 8ЕО ГО ΝΟ:4. Когда полигенный экспрессирующий кластер, включающий последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕО ГО ΝΟ:3 или 23, представлен в клетках яичников китайского хомячка, преимущественно выраженная мономерная форма имеет остаток аминокислоты Ν-конца метионина (остаток 27 из 8ЕО ГО ΝΟ:4), который соответствует остатку аминокислоты Ν-конца человеческого СТЬА4. Тем не менее, так как 8ЕО ГО ΝΟ:23 также включает кодирующую последовательность для сигнальной последовательности онкостатина М (нуклеотиды 11-88 из 8ЕО ГО ΝΟ:23), экспрессируемый белок от 8ЕО ГО ΝΟ:23 содержит в себе сигнальную последовательность онкостатина М.

Сигнальная последовательность расщепляется от экспрессируемого белка во время процесса вывода (выведения) белка из цитоплазмы или секреции из клетки. Но расщепление может привести к вариантам Ν-конца, таким как расщепление между аминокислотными остатками 25 и 26 из 8ЕО ГО ΝΟ:4 (приводящее к Ν-концу остатка-26', т.е. А1а (аланин) вариант), или между аминокислотными остатками 24 и 25 8ЕО ГО ΝΟ:4 (приводящее к Ν-концу остатка 25, т.е. Ме1-А1а (метионин-аланин) вариант), в отличие от расщепления между аминокислотными остатками 26 и 27 8ЕО ГО ΝΟ:4 (приводящее к Ν-концу, начинающемуся с остатка Ме1 (метионин) в положение аминокислоты 27). Например, вариант Ме1.А1а может присутствовать в смеси молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд в количестве приблизительном, а вариант А1а может присутствовать в смеси молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд в количестве приблизительно 10-20%.

Кроме того, экспрессируемый белок из нуклеиновой кислоты, включающий 8ЕО ГО ΝΟ:3, может иметь варианты С-конца из-за неполного процессинга (обработки). Доминирующим С-концом является глицин в остатке 382 из 8ЕО ГО ΝΟ:4. В смеси молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104}-Iд могут присутствовать мономеры, имеющие лизин в С-конце (остаток 383 из 8ЕО ГО ΝΟ:4), например, в количестве приблизительно 4-8%.

- 54 017765

В одном примере молекула СТЬАА²⁹^¹⁰⁴^^ включает нижеследующую аминокислотную последовательность 8Ер ГО N0:11 (которая идентична аминокислотам 25-383, 8Ер ГО N0:4):

[8Е0 ГО ΝΟ: И]

ΜΑΜΗVΑ^ΡΑVV^Α85Κ^IΑ8ΡVСΕΥΑ8ΡСΚΥΤΕVΚVΤV^Κ^Α^5^VΤΕVСΑΑΤΥΜ

ΜΟΝΕΕΤΡΕΟϋ8^ΤΟΤ88ΟΝρνΝΕΤ^ΟΕΚΑΜΟΤΟΕΥΐεκνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσΐΟΝΟΤ ρΐΥνΐΟΡΕΡ(:ΡΟ8Ο0ΕΡΚ88ΟΚΤΙΙΤ8ΡΡ8ΡΑΡΕΕΕθσ88νΡΕΡΡΡΚΡΚΟΤΕΜΙ8ΚΤΡΕνΤ

СУУУОУ8НЕОРЕУКРЖУУУОСУЕУНУАКТКРКЕЕ(2УК8Т¥НУУ8УЕТУЕЬ1(2О\АЕ

NСτΚΕΥΚСΚV8NΚΑ^ΡΑΡIΕΚΤI8ΚΑΚΟ^ΡΚΕΡ^VΥΤ^ΡΡ8Κ^Ε^ΤΚN^V8^ΤС^VΚСΡ ΥΡδΟΙΑνΕννΕδΝΟζ)ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδΟ(38ΡΡΕΥδΚΙ/ΓνϋΚδΚ\νζ)ζ)ΟΝνΡδΕδνΜ ΗΕΑΕΗΝΗΥΤζ)Κ8ΕδΕ8ΡΟΚ.

В другом примере молекула СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд включает нижеследующую аминокислотную последовательность 8Ер ГО N0:12 (которая идентична аминокислотам 26-383, 8Ер ГО N0:4):

[8Е0 ГО ΝΟ: 12]

ΑΜΗVΑ^ΡΑVV^ΑδδΚΟIΑδΡVСΕΥΑδΡΟΚΥΤΕVI^VΤV^Κ^Α^δ^VΤΕVСΑΑΤΥΜΜ 6№ΕΤΡΕΟΟ8Ι€ΤσΤ88σ^νΝΕΤ^σΕΚΑΜΟΤσΕΥΐεκνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕ6ΐσΝσΤ(2Ι УУГОРЕРСРО8ОрЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЬЕС688УРЕРРРКРКОТЕМ18КТРЕУТСУ ννϋνδΗΕΟΡΕνΚΡΝΤλνΥνϋσνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΒΕί^ΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗρΟλνΕΝσ ΚΕΥΚΕΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚ0ζ)ΡΚΕΡζ)ΥΥΤΕΡΡδΚ0ΕΕΤΚΝζ)ν8ΕΤΕΕνΚ0ΡΥΡ δ^IΑVΕλVΕδNС^ΡΕ11^VΥΚΤΤΡΡV^^δ^^δΓΡ^Υ8Κ^ΤV^Κ8Β^V^^СNVΓδСδVΜΗΕ ΑΕΗΝΗΥΤζ)ΚδΕδΕδΡ6Κ.

В другом варианте осуществления изобретения молекула СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд включает нижеследующую аминокислотную последовательность 8Ер ГО N0:13 (которая идентична аминокислотам 27-383, 8Ш ГО N0:4):

[8Е0 ϋ3 ΝΟ: 13]

МНУА(^РАУУ1^Л88К61А8ГУСЕУА8РСЮТЕУНУТУЕК(2АО8(2УТЕУСААТ¥ММО

NΕ^ΤΡ^^^δIСΤΟΤδ8^N^VN^ΤI^Ο^ΚΑΜ^ΤΟ^ΥIСΚVΕ^ΜΥΡΡΡΥΥΕΟIΟNΟΤ^ΓΥ

УГОРЕРСРО8ОрЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕОО88УРЬРРРКРКОТЬМ18КТТЕУТСУУ

УОУ8НЕОРЕУКРНАУ¥УОСУЕУНМАКТ1СРКЕЕ(2УМ8ТУКУУ8УЬТУЕН(2О\У1УЮК

ΕΥΚСΚVδNΚΑ^ΡΑΡIΕΚΤIδΚΑΚΟ^ΡΕΕΡ^VΥΤI^ΡΡ8Κ^Ε^ΤΚN^V8^ΤС^VΚΟΡΥ'Ρ8 ^ΤΑVΕVVΕδNС^ΡΕNNΥΚΤΤΡΡV^^8^Сг8ΡΡ^Υ8Κ^ΤV^Κ8Κ^V^^СNVΡ8СδVΜΗΕΑ

ΕΗΝΗΥΤρΚδΕδΕδΡΟΚ.

В другом примере молекула СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд включает нижеследующую аминокислотную довательность 8Ер ГО N0:14 (которая идентична аминокислотам 25-382, 8Ер ГО N0:4):

[8Е0 ГО ΝΟ: 14]

ΜΑΜΗVΑ^ΡΑVV^ΑδδΚ.ΟIΑδΡVСΕΥΑδΡ(^ΚΥΤΕVΚVΤV^Κ.^Α^δ^VΤΕVСΑΑΤΥΜ

МСЬЕЬТРЬОО81СТОТ88С^УМЕТ^СЕКАМОТОЬУ1СКУЕЬМ¥РРРУ¥ЕОЮМСТ р1¥У1ОРЕРСТО81^ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЕ6С88УРЕРРРКРКОТЕМ18ЕТРЕУТ

СVVV^V8ΗΕ^ΡΕVΚΡNΑVΥV^σVΕVΗNΑΚΤΚΡΚΕΕ^ΥN8ΤΥΚVV8V^ΤV^Η^^\V^

NСΚΕΥΚСΚV8NΚΑ^ΡΑΡIΕΚΤI8ΚΑΚΟ^ΡΚΕΡ^VΥΤ^ΡΡ8Κ^Ε^ΤΚN^V8^ΤС^VΚσΡ ΥΡδΟΙΑνΕν/ΕδΝΟρΡΕΝΝΥΚΤΙΤΡνΕΟδϋΟδΡΡΕΥδΚΕΤνϋΚδΚΛνί^ζΧιΝνΡδΟδνΜ ΗΕΑΕΗΝΗΥΤζ)Κ8Ε8Ε8Ρ6.

В одном варианте молекула СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд включает нижеследующую аминокислотную довательность 8Ер ГО N0:15 (которая идентична аминокислотам 26-382, 8Ер ГО N0:4):

[8Ер ГО N0: 15]

АМНУА0РАУЪА88КС1А8РУСЕУА8РСК¥ТЕУКУТУЕК(2АО8(2УТЕУСААТ¥ММ σΝΕΕΤΡΕϋΟ8Κ:Ί'0Τ886ΝρνΝΕΤΐρ0ΕΠΑΜΌΤ0ΕΥΙΕΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕ0Ι6Ν0Τ9Ι ΥνΐΟΡΕΡσΡΟ8Ο0ΕΡΚ88ΟΚΤΗΤ8ΡΡ8ΡΑΡΕΕΕ6Ο88νΡΕΡΡΡΚΡΚΟΤΕΜΙ8ΚΤΡΕνταν ννπνδΒΕΟΡΕνΚΡΝ\\ΑΑ^ζϋθνΕνΗΝΑΚΤΡ€ΡΚΕΕζ)ΥΝδΤΥΚ.ννδνΕΤνΕΗ(5ΟλνΕΝ(} ΚΕΥΚСΚVδNΚΑ^ΡΑΡIΕΚΤIδΚΑΚΟ^ΡΡ^ΕΡ^VΥΤ^ΡΡδΚ^Ε^ΤΚN^Vδ^ΤС^VΚΟΡΥΡ 8О1АУЕУУЕ8КС0РЕММ¥КТТРРУЕО8ОС8РР1А8КЕТУОК8К\¥9(26МУР8С8УМНЕ ΑΕΗΝΗΥΤρΚδΙΑΕδΡΟ.

В следующем варианте молекула СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд имеет нижеследующую аминокислотную довательность 8Ер ГО N0:16 (которая идентична аминокислотам 27-382, 8Ер ГО N0:4):

послепослепосле- 55 017765 [8ЕО ГО ΝΟ: 16] МНУА0РАУУЕА88КС1А8ЕУСЕУА8РСКУТЕУКУТУЬК0АО80УТЕУСААТУММ6 ΝΕΕΤΡΕϋΟ8Ι€ΤΟΤ886Ν0νΝΕΤΙ0σΕΚΑΜΟΤΟΕΥΙϋΚνΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤ01Υ УГОРЕРСРО8О0ЕРК88ОКТНТ8РР8РАРЕЕЬ6О58УРЕЕРРКРКОТЕМ18К.ТРЕУТС1У νϋνδΗΕϋΡΕνΚΡΝλνΥνΏΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚνν’δνΕΤνΕΗΟΟλνΕΝΟΚ ΕΥΚσΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΟΕΕΤΚΝρνδΕΤσΕνΚΟΡΥΡδ ΟΙΑνΕλνΕδΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟδϋΟδΕΡΕΥδΚΕΤνΟΚδίΟνΟςΟΝνΕδΟδνΜΗΕΑ ЕНННУТС^КЗЬЗЬЗРС.

Мономер СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд включает внеклеточный домен человеческого СТЬА4, где в домене СТЬА-4 были произведены две замены аминокислот (Ы 04Е и А29Υ) (фиг. 5). В одном примере внеклеточный домен может включать нуклеотидную последовательность нуклеотидов 89-463, ЗЕО ГО ΝΟ:23, которые отвечают за генетический код аминокислот 27-151, ЗЕО ГО ΝΟ:4. В другом примере внеклеточный домен может включать мутантные последовательности человеческого СТЬА4 (такие как мутанты с одинарными, двойными и тройными участками в аминокислотах 27-151, ЗЕ^ ГО ΝΟ:4). В другом примере внеклеточный домен может включать нуклеотидные изменения в нуклеотидах 89-463, ЗЕ^ ГО ΝΟ:23 таким образом, что производятся консервативные изменения аминокислот. В следующем примере внеклеточный домен может включать нуклеотидные изменения в нуклеотидах 89-463 ЗЕ9 ГО ΝΟ:23 таким образом, что производятся неконсервативные изменения аминокислот. В другом примере внеклеточный домен может включать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичная нуклеотидам 89-463, ЗЕО ГО ΝΟ:23.

Мономер СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд может включать константную область человеческого иммуноглобулина. Эта константная область может быть частью константного участка. Эта константная область также может иметь последовательность дикого типа или мутантную последовательность. Константная область может происходить из человеческого IдΟ^, IдΟ2, ^Οδ, IдΟ, *, ^М, ШАг ^А^ ГО) или ^Е. Константная область может происходить из легкой цепи или тяжелой цепи иммуноглобулина. Когда константная область происходит из молекулы или ^А, то константная область может включать один или более из следующих доменов константной области: С_ь, С_Н1, шарнир, С_Н2 или С_Н3. Когда константная область происходит из ^М или ^Е, то константная область может включать один или более из следующих доменов константной области: С_ь, С_Н1, С_Н2, С_Н3 или С_Н4. В одном примере константная область может включать один или более доменов константной области из ГОА, или ^Е.

В одном варианте осуществления изобретения димеры СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд состоят из двух мономеров, где каждый мономер может иметь идентичную или отличающуюся аминокислотную последовательность и где последовательность может быть аминокислотной последовательностью: (1) 26-383, ЗЕ9 ГО ΝΟ:4, (ίί) 26-382, ЗЕ О ГО ΝΟ:4, (ίίί) 27-383, ЗЕ О ГО ΝΟ:4, (ίν) 27-382, ЗЕ9 ГО ΝΟ:4, (ν) 25-382, ЗЕ9 ГО ΝΟ:4 и (νΐ) 25-383, ЗЕХ) ГО ΝΟ:4. Такие мономеры СТ^А4^{Ά29Υ^104}-Iд могут димеризоваться (разделиться на две части) через внеклеточный домен последовательности человеческого СТЬА4 посредством цистеинового аминокислотного остатка в положении 146, ЗЕХ) ГО ΝΟ:4 (цистеинового аминокислотного остатка в положении 120, фиг. 5).

Молекула СТ^А4^{Ά29Υ^104Е}-Iд может мультимеризоваться (разделиться на несколько частей) благодаря взаимодействию доменов константной области ^М или ГОА с цепным белком I, ^М и IдА обычно производятся как мультимеры в ассоциации с дополнительной полипептидной цепью, цепью I. В пентамерном (пятичленном) ^М мономеры сшиваются при помощи дисульфидных связей друг к другу в домене С_Н3 и к цепи I через домен С_Н4. может также образовывать гексамеры, которые испытывают недостаток цепи I, где мультимеризация достигается через дисульфидные мостики к каждому. В димерных ГОА мономеры имеют дисульфидные мостики к цепи I через их домен С_Н3, а не друг друга. Таким образом, в одном варианте изобретение обеспечивает мультимеры СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд, включая димеры, пентамеры и гексамеры, где часть включает константную область или ее часть или константную область ^А, константную область или ее часть. Такие мультимеры СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, основанные на или ^А, могут включать цепь I.

В одном примере мономер СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд включает модифицированную шарнирную область человеческого ^01 (нуклеотиды 464-508, ЗЕХ) ГО ΝΟ:23; аминокислоты 152-166, ЗЕ9 ГО ΝΟ:4), где сериновые остатки в положениях 156, 162 и 165, ЗЕХ) ГО ΝΟ:4 были получены из цистеиновых остатков, при сутствующих в последовательности дикого типа.

В одном примере мономер СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд включает область С_Н2 модифицированного человеческого ТдО1 и область С_Н3 дикого типа (домен С_Н2 модифицированного человеческого имеющего нуклеотиды 509-838, ЗЕ9 ГО ΝΟ:1 и аминокислоты 167-276, ЗЕ9 ГО ΝΟ:2; домен С_Н3 человеческого ^01, имеющего нуклеотиды 839-1159, ЗЕ9 ГО ΝΟ:1 и аминокислоты 277-383, ЗЕХ) ГО ΝΟ:2).

В одном примере совокупность молекул СТ^А4^{Ά29Υ^104Е}-Iд включает мономеры, имеющие последовательность, показанную в ИЗ Ра1еп1 АррПсайоп РиЬПсайоп Νοδ. (номерах публикаций патентных заявок США) ИЗ 2002/0039577, ИЗ 2003/0007968, ИЗ 2004/0022787, ИЗ 2005/0019859, ИЗ2005/0084933 и патенте США № 7094874, каждый из которых включен в данный документ в целостности посредством ссылки.

- 56 017765

В одном варианте осуществления изобретения тетрамер СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд включает две пары или два димера молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, где каждый полипептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: (ί) 26-383, ЗЕО ΙΌ N0:4, (ίί) 26-382, ЗЕО ΙΌ N0:4, (ίίί) 27-383, ЗЕО ΙΌ N0:4, (ίν) 27-382, ЗЕО ΙΌ N0:4, (ν) 25-382, ЗЕО ΙΌ N0:4, (νί) 25-383, ЗЕО ΙΌ N0:4. Каждый член пары полипептидов или димер ковалентно присоединен к другому члену, а две пары полипептидов связаны нековалентно друг с другом, образуя, таким образом, тетрамер. Такие тетрамерные молекулы могут связываться с СЭ80 или СЭ86. В другом примере подобные тетрамерные молекулы могут связываться с СЭ80 или СЭ86 с авидностью, которая по меньшей мере в два раза больше авидности связывания димера СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд (чьи мономеры имеют одну из вышеприведенных аминокислотных последовательностей) с СЭ80 или СЭ86.

Подобная, более значительная авидность может содействовать большей эффективности в лечении иммунных нарушений и других заболеваний, как описано ниже, а также подавлению отторжения тканей и/или цельных органов при трансплантации. Кроме того, большая или улучшенная авидность может привести к лучшей эффективности лекарственных препаратов. Например, терапевтический состав, включающий тетрамер СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, будет иметь большую авидность и, следовательно, большую эффективность, чем такое же количество терапевтического состава, в который включен мономер СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд. В другом примере молекулы подобного тетрамера могут оказывать по меньшей мере в два раза большее подавление быстрого размножения Т-клеток по сравнению с димером СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд (чьи мономеры имеют одну из вышеприведенных аминокислотных последовательностей). В другом примере такие молекулы тетрамера могут оказывать по меньшей мере в два раза большее подавление быстрого размножения Т-клеток по сравнению с молекулой тетрамера СТ^А4-[д.

Характеристика молекул СТЬ^-к и СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд.

Быстрое размножение Т-клеток может быть измерено при помощи стандартных анализов, известных в данной области знаний. Например, один из наиболее распространенных способов определить величину быстрого размножения Т-клеток состоит в том, чтобы стимулировать (раздражать) Т-клетки посредством антигенных или агонистических антител по отношению к ТСР (предшественник Т-клетки) и измерить, например, включение тимидина, меченного тритием, (³Н-ТйВ) в пролиферирующие (размножающиеся) Т-клетки или количество цитокинов, выделенных пролиферирующими (размножающимися) Т-клетками в культуру.

Тормозящий эффект молекул СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд на возбуждение (активацию) или быстрое размножение Т-клеток может быть измерен таким образом.

Сродство (связь) молекулы СТ^А4-[д - это сила связывания молекулы с одиночным лигандом, включая составные (химерные) ί.Ό80, СЭ86 или С^80[д либо С^86Iд. Сродство СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд с лигандами может быть измерено, например, путем использования анализа связывающего взаимодействия (ЫА-АСВ), основанного на методе поверхностного плазмона. Помимо измерения связующей способности, он позволяет определить в режиме реального времени кинетику связывания, такую как коэффициент кинетики ассоциации и диссоциации. Сенсорный чип, состоящий из предметного стекла, покрытого тонкой металлической пленкой, к которой ковалентно присоединена поверхностная матрица, покрыт одним из взаимодействующих веществ, т.е. СТ^А4-[д. СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд, или одним из лигандов.

Раствор, содержащий другое взаимодействующее вещество, течет по его поверхности.

Световой луч непрерывно направляется на другую сторону поверхности и его угол отражения измеряется. После присоединения (связывания) СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд к лиганду угол резонанса светового луча меняется (так как он зависит от коэффициента преломления среды, находящейся рядом с реактивной (химически активной) стороной сенсора, который, в свою очередь, напрямую соотносится с концентрацией растворенного материала в среде). Впоследствии это анализируется с помощью компьютера.

В одном случае эксперименты связывания СТ^А4-[д могут быть выполнены при помощи резонанса поверхностного плазмона (ЗРК-РПП) на измерительном приборе Высоте (ЫАсоге АС, Ирр5а1а, Згейеи). СТ^А4-[д может быть ковалентно сдвоен простейшими аминогруппами к матрице с карбоксиметилированным декстраном на сенсорном чипе Высоте, фиксируя тем самым СТ^А4-[д на сенсорном датчике. В качестве альтернативы антитело антиконстантной области может использоваться для фиксирования СТ^А4-[д непосредственно к поверхности сенсора посредством фрагмента Ιβ. После этого лиганды добавляются к чипу, чтобы измерить связывание СТ^А4-[д с лигандами. Измерение сходства также может быть выполнено, например, как описано ван дер Мэрве П. и др. (Аап йег Менге, Р. е1 а1.) в журнале Экспериментальная медицина (1. Ехр. Мей.) (1997), 185 (3); 393-404, на эти данные есть в данном документе ссылка. В другом случае эксперименты связывания СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд могут быть выполнены путем использования технологии резонанса поверхностного плазмона (ЗРВ-РПП), как описано выше (фиг. 6; см. пример 21).

Авидность молекул СТ^А4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104}-Iд может быть также измерена. Авидность может быть определена как общая сумма прочности (силы) связывания двух молекул или клеток друг к другу на множественных участках. Авидность отличается от сходства, которое является прочностью (силой)

- 57 017765 связывания одного участка на молекуле к ее лиганду. Теоретически без связывания более высокая авидность молекул СТЬА4-1д или СТЬА4^А29¥Е104-1д может привести к увеличенной силе тормозящего воздействия молекул СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д на быстрое размножение и возбуждение (активацию) Тклеток. Авидность может быть измерена, например, при помощи двух категорий анализа твердой фазы: а) анализы конкурентного торможения, Ь) анализы элюирования. В обоих случаях лиганд присоединяется к твердой (сплошной) опоре. При анализе конкурентного торможения молекулы СТЬА4-1д или СТЬА4^А29¥Е104-1д затем добавляются в раствор при фиксированной концентрации вместе со свободным лигандом в различных концентрациях и определяется количество лиганда, которое замедляет связывание твердой фазы на 50%. Чем меньше нужно лиганда, тем сильнее авидность. В анализах элюирования лиганд добавляется в раствор. После достижения состояния равновесия разобщающий агент или денатурирующий агент (например, изотиоцианат, мочевина или диэтиламин) добавляется в различных концентрациях, чтобы нарушить взаимодействия СТЬА4-1д/лиганд или взаимодействия СТЬА4^{А29¥Е104Е}[д/лиганд количество СТЬА4-1д или СТЬА4^А29¥Е104-1д, противостоящего элюированию, определяется впоследствии при помощи ЕЬ18А. Чем выше авидность, тем больше разобщающего агента требуется, чтобы элюировать определенное количество СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д. Относительная авидность неоднородной смеси молекул СТЬА4-1д или СТЬА4^А29¥Е104-1д может быть выражена как коэффициент авидности (А1), равный концентрации элюирующего агента, необходимого, чтобы элюировать 50% связанных молекул СТЬА4-1д или СТЬА4^А29¥Е104-1д. Уточненный анализ данных может быть получен путем определения процентного отношения элюированного СТЬА4-1д или СТЬА4^А29¥Е104-1д при различных концентрациях элюирующего агента.

Колончатая хроматография скоростного потока фенил-сефароза (РЬепу1 фенил 8ерЬагоке сефароза 4 Рай Е1о\х колоночная хроматография), хроматография гидрофобного взаимодействия (НуйгорРоЫс [п1егасйоп СЬготаФдгарРу - Н1С-ХГВ), процесс может использоваться для уменьшения количества видов СТЬА4-1д с высокой молекулярной массой, элюированных на этапе очистки Н1С-ХГВ (см. пример 15). Следовательно, максимум очистки из колонны Н1С-ХГВ достигается в образцах СТЬА4-1д НМА. Например, подготовительная одинарная или последовательная (тандемная) колонна гель-хроматографии ВЭЖХ (8ЕС НРЬС) может использоваться для очистки димерных, тетрамерных и мультимерных субпопуляций из материала максимальной очистки Н[С-ХГВ. В одном случае, очищенными компонентами являются димер, тетрамер и гексамер СТЬА4-1д. Определение характеристик компонентов СТЬА4-1д с высокой молекулярной массой, присутствующих в пике очистки Н[С-ХГВ, может быть проведено при помощи методов статического и динамического светорассеяния. Образцы, взятые на технологическом этапе слежения за меткой (чейза) хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н[С-ХГВ), показали присутствие димера, тетрамера и мультимеров в различных измерительных (пробных) точках. Виды гексамера могли быть обнаружены только в образцах, соответствующих началу пика очистки и максимуму пика очистки 0Ό. Виды декамера (из десяти частей) были обнаружены в максимуме пика очистки 0Ό. Молярная масса и образование гидродинамического радиуса (действия) могут быть определены путем фракционирования посредством гель-хроматографии (8ЕС) с применением многоугольного светорассеяния (Мн11|Апд1е НдЫ ксайегтд-МЛЬЗ) в сочетании с обнаружением квазиупругого светорассеяния (с.|иам е1акПс КдЫ 5са11ег - 0ЕБ8).

В отношении молекул СТЬА4-1д, полученных из клеточной линии, 8ЕС показывает, что элюат протеина А является смесью мультимерных, тетрамерных и димерных компонентов. Фракционирование данной смеси в подготовительной последовательной (тандемной) колонне 8ЕС позволяет осуществить выделение некоторого количества мультимерных, тетрамерных и димерных видов. Выход процентного содержания площади для каждого компонента в анализ 8ЕС изолированных фракций приводит к 93-98% гомогенности для каждой фракции. С одной точки зрения, очистка отдельных компонентов позволяет сравнить физико-химические свойства компонентов материала СТЬА4-1д с высокой молекулярной массой со свойствами димера СТЬА4-1д. На фиг. 7 показаны видимые молекулярные массы, которые соответствуют мультимерным, тетрамерным и димерным фракциям пика очистки СТЬА4-1д при хроматографии гидрофобного воздействия (Н1С), как это определено гель-хроматографией (8ЕС) с выявлением динамического светорассеяния (О8Ь) и временем удержания в гель-хроматографии 8ЕС. В одном случае активность по биоспецифичному связыванию компонентов из пика очистки хроматографии гидрофобного воздействия (Н1С) сопоставима с активностью связывания иммобилизованных В7-11д, определенной при помощи анализа связывания на основе В1Асоге. С другой стороны, молярное отношение сиаловой кислоты для компонентов, выделенных из пика очистки хроматографии гидрофобного воздействия (Н[С), находится в диапазоне от 4.9 до 7.6, тогда как молярное отношение сиаловой кислоты молекулы СТЬА4-1д или димера (не в пике очистки Н1С) находится в диапазоне 8-10. Анализ при помощи гелья изоэлектрического фокусирования (ГЕР) обозначает уменьшенную (приведенную) мобильность изоформ СТЬА4-1д, очищенных в пике очистки Н1С по сравнению с миграцией (перемещением) димера СТЬА4[д. Это не противоречит более низким молярным соотношениям сиаловой кислоты, которые наблюдались во фракциях пика очистки хроматографии гидрофобного воздействия (Н1С) СТЬА4-1д (фиг. 8).

Выбор условий клеточной культуры может повлиять на образование одиночной цепи (т.е. мономера) и виды с высокомолекулярной массой (т.е. димеры, тетрамеры и т.д.) продукта рекомбинационного

- 58 017765 белка. Условиями роста, также включающими, но не ограничивающимися составом среды, являются факторы, которые могут повлиять на образование одиночной цепи и уровень цистеинилизации. Это, вероятно, является результатом присутствия агентов, что ведет к восстановлению (снижению) дисульфидной связи. Добавление непосредственно цистеина или среды, содержащей цистеин, в клетки, выделяющие СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, может привести к быстрому образованию видов с одиночной цепью и высокомолекулярным весом. Скорость пропорциональна количеству добавленного цистеина. В другом варианте добавление йодоацетамида, вещества, которое реагирует со свободными сульфгидрилами, блокирует образование высокомолекулярных видов СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, которые зависят от дисульфидных связей.

Например, высокомолекулярный путь, чувствительный и нечувствительный к йодоацетамиду, выдвигает на первый план два основных и очевидно различных механизма, при помощи которых виды с высокомолекулярным весом могут образовываться в СТ^А4-Iд. Добавление солей высоких концентраций (0.5 М) к растворам СТ^А4-Iд приводит к установившейся высокой скорости высокомолекулярного образования. ЕЭТА (этилендиаминтетраацетат), СопАсИ8о1 II и уса5Ю1а1с5 (дрожжевых) умеренно увеличивает образование одиночной цепи (см. пример 5).

В определенных случаях изобретение обеспечивает методы для образования высокомолекулярных популяций СТ^А4-Iд, где смеси, содержащие в основном мономеры или димеры СТ^А4-Iд, дополняются солью высокой концентрации так, что смесь имеет концентрацию соли более чем (приблизительно) 0.3, 0.4, 0.45, 0.5 или 0.6 М. В одном варианте такие методы приводят к образованию смеси, содержащей популяцию СТ^А4-Iд, которая имеет по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% тетрамерных молекул СТ^А4-Iд.

В одном варианте изобретение обеспечивает популяцию видов с одиночной цепью СТ^А4-Iд, содержащих такую модификацию на Сук¹⁴⁶, что он цистеинилизуется (см. пример 4). Цистеинилизация это посттрансляционная модификация, при которой цистеин внутри полипептидной цепи модифицируется присоединением другого цистеина посредством дисульфидной связи. Цистеинилизация белков вовлечена в изменение биоактивности белков, включая иммуногенность и антигенность эволюционно стабильных (ограниченых) вирусных детерминант Класса I МНС (главный комплекс гистосовместимости). В одном варианте изобретение обеспечивает состав, котоорый содержит по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 90 или 95% суйетуШеб цистеинилированных молекул СТ^А4-Iд с одиночной цеью. В другом варианте изобретения популяция СТ^А4-Iд имеет не более 1% мономерных молекул СТ^А4-Iд или в другом варианте менее 0.6% мономера СТ^А4-Iд.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТ^А4-Iд, молекулы СТ^А4-Iд имеют среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-Iд от (приблизительно) 5 до (приблизительно) 18. В некоторых случаях среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-Iд находится в пределах от (приблизительно) Х до (приблизительно) Υ, включая X и Υ, где X равен приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17, а Υ равен приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18. В других случаях среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-Iд находится в пределах от (приблизительно) Х до (приблизительно) Υ, включая X и Υ, где X равен приблизительно 4.0; 4.5; 5.0; 5.5 или 6.0, а Υ равен приблизительно 8.0; 8.5; 9.0; 9.5 или 10.0. В других случаях среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4Ц находится в пределах от (приблизительно) Х до (приблизительно) Υ, включая X и Υ, где X равен приблизительно 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5 или 9.0, а Υ равен приблизительно 11.0; 11.5; 12.0; 12.5 или 13.0. В других случаях среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-Iд равно от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 14, равно от (приблизительно) 7 до (приблизительно) 13, равно от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 12 или равно от (приблизительно) 9 до (приблизительно) 11. В других случаях среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТ^А4-Iд равно от (приблизительно) 5 до (приблизительно) 9, от (приблизительно) 5.5 до (приблизительно) 9.5, от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 9, от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 10 или от (приблизительно) 7 до (приблизительно) 10. В других случаях среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-Тд больше или равно 5 или больше или равно 8. В определенных вариантах сиаловая кислота №ацетил нейраминовая кислота (NАNА).

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТ^А4-Iд, в котором молекулы СТ^А4-Iд имеют среднее молярное отношение №гликолил (д1усо1у1-ацильный радикал гликолевой кислоты, замещающий ацетил в некоторых сиаловых кислотах) нейраминовой кислоты (NСN А) к молекулам СТ^А4-Iд, меньшее или равное 2.5, меньшее или равное 2.0, меньшее или равное 1.5, меньшее или равное 1.0 или меньшее или равное 0.5.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТ^А4-Iд, в котором молекул СТ^А4-Iд больше или равно 93.0%-ного содержания поверхности, больше или равно 93.5%-ного, больше или равно 94.0%-ного содержания поверхности больше или равно 94.5%-ного содержания поверхности, больше или равно 95.0%-ного содержания поверхности, больше или равно 95.5%-ного содержания поверхности, больше или равно 96.0%-ного содержания поверхности, больше или равно 96.5%ного содержания поверхности или больше или равно 97.0%-ного содержания поверхности димеров

- 59 017765

СТ^Λ4-[д. как это было определено гель-хроматографией (эксклюзионной хроматографией) и спектрофотометрией. В некоторых случаях состав включает молекулы СТ^Λ4-[д. где молекул 0Т^Λ4-[д больше или равно 95.0%-ного содержания поверхности димеров СТ^Λ4-[д и меньше или равно 4.0%-ного содержания поверхности видов с высокомолекулярным весом, что было определено гель-хроматографией (эксклюзионной хроматографией) и спектрофотометрией. В некоторых вариантах состав содержит молекулы 0Т^Λ4-[д. где молекул 0Т^Λ4-[д больше или равно 95.0%-ного содержания поверхности димеров СТ^Λ4-[д и меньше или равно 5.0%-ного содержания поверхности видов с высокомолекулярным весом, что было определено гель-хроматографией (эксклюзионной хроматографией) и спектрофотометрией.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы 0Т^Λ4-[д. где молекул СТ^Λ4-[д меньше или равно 2.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.0%-ного содержания поверхности или меньше или равно 0.5%ного содержания поверхности мономеров СТ^Λ4-[д (т.е. одиночной цепи), что было определено гельхроматографией (эксклюзионной хроматографией) и спектрофотометрией.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы 0Т^Λ4-[д. где молекул СТ^Λ4-[д меньше или равно 5.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 4.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 4.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 3.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 3.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 2.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 2.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.0%-ного содержания поверхности или меньше или равно 0.5%-ного содержания поверхности видов СТ^Λ4-[д с высоким молекулярным весом (например, тетрамера), что было определено гель-хроматографией (эксклюзионной хроматографией) и спектрофотометрией. В некоторых вариантах, особенно там, где имеются концентрированные составы, включающие молекулы СТ^Λ4-[д. (такие как, например, предназначенные для подкожного введения), молекулы СТ^Λ4-[д меньше или равны 10%-ного содержания поверхности, меньше или равны 9%-ного содержания поверхности, меньше или равны 8%-ного содержания поверхности, меньше или равны 7%ного содержания поверхности, меньше или равны 6%-ного содержания поверхности видов СТ^Λ4-[д с высоким молекулярным весом, что было определено гель-хроматографией (эксклюзионной хроматографией) и спектрофотометрией.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы СТ^Λ4-[д. где состав содержит некоторое количество материала, подобного МСР-1 или МСР-1, меньшего или равного 50 промиль, меньшего или равного 40 промиль, меньшего или равного 38 промиль, меньшего или равного 30 промиль, меньшего или равного 20 промиль, меньшего или равного 10 промиль, меньшего или равного 5 промиль, меньшего или равного 4 промиль, меньшего или равного 3 промиль, меньшего или равного 2 промиль, меньшего или равного 1 промиль. Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы СТ^Λ4-[д. где состав содержит некоторое количество материала, подобного МСР-1 или МСР-1, при меньшем или равном 50 нанограмм/миллиграмм (нг/мг) молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 40 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 38 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 30 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 20 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 10 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 5 нг/мг, при меньшем или равном 4 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д; при меньшем или равном 3 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 2 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. при меньшем или равном 1 нг/мг молекул 0Т^Λ4-[д. Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы СТ^Λ4-[д и некоторое количество МСР-1 (включая отсутствие МСР-1), где вышеуказанная композиция является фармацевтически допустимым составом.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы СТ^Λ4-[д. где молекулы СТ^Λ4-[д имеют среднее молярное отношение галактозы к молекулам 0Т^Λ4-[д от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 19. В некоторых вариантах среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам 0Т^Λ4-[д составляет от (приблизительно) X до (приблизительно) Υ, где X равен (приблизительно) 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18, а Υ равен до (приблизительно) 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19. В других вариантах среднее молярное отношение галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д находится от (приблизительно) X до Υ, включая X и Υ, где X равен (приблизительно) 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0; 9.5 или 10.0, а Υ равен (приблизительно) 12.0; 12.5; 13.0; 13.5; 14.0; 14.5; 15.0; 15.5 или 16.0. В других вариантах среднее молярное отношение галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д находится от (приблизительно) Х до (приблизительно) Υ, включая X и Υ, где X равен (приблизительно) 6.0; 6.5; 7.0; 7.5 или 8.0, а Υ равен (приблизительно) 15.0; 15.5; 16.0; 16.5; 17.0; 17.5; 18.0; 18.5 или 19.0. В других вариантах среднее молярное отношение галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д равно от (приблизительно) 7 до (приблизительно) 15, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 14, от (приблизительно) 9 до (приблизительно) 13, от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 12. В других вариантах среднее молярное отношение галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д равно от (приблизительно) 7 до (приблизительно) 18, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 17, от (приблизительно) 9 до (приблизительно) 17, от (приблизительно) 9 до (приблизительно) 16 или от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 15. В других вариантах среднее молярное отношение галактозы к молекулам СТ^Λ4-[д больше или равно 8.

- 60 017765

Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д имеют среднее молярное отношение фукозы к молекулам СТЬА4-1д от (приблизительно) 0.5 до (приблизительно) 12. В некоторых вариантах среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д находится в диапазоне между от (приблизительно) X до (приблизительно) Υ, включая X и Υ, где X равен (приблизительно) 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5 или 4.5, а Υ равен (приблизительно) 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0; 9.5; 10.0 или 10.5. В других вариантах среднее молярное отношение фукозы к молекулам СТЬА4-1д находится в диапазоне между от (приблизительно) X до Υ, включая X и Υ, где X равен (приблизительно) 2.9; 3.1; 3.3; 3.5; 3.6; 3.9 или 4.1, а Υ равен (приблизительно) 7.9; 8.1; 8.3; 8.5; 8.6; 8.9 или 9.1. В других вариантах среднее молярное отношение фукозы к молекулам СТЬА4-1д находится в диапазоне между от (приблизительно) X до Υ, включая X и Υ, где X равен (приблизительно) 1.0; 1.5; 1.6; 1.9; 2.1; 2.3 или 2.5, а Υ равен (приблизительно) 8.6; 8.9; 9.1; 9.3; 9.6; 9.9; 10.1; 10.3 или 10.5. В других вариантах среднее молярное отношение фукозы к молекулам СТЬА4-1д составляет от (приблизительно) 3.3 до (приблизительно) 8.5, от (приблизительно) 3.5 до (приблизительно) 8.3, от (приблизительно) 3.6 до (приблизительно) 8.1, от (приблизительно) 3.9 до (приблизительно) 7.9. В других вариантах среднее молярное отношение фукозы к молекулам СТЬА4-1д составляет от (приблизительно) 1.5 до (приблизительно) 9.5, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 9.3, от (приблизительно) 1.9 до (приблизительно) 9.1 или от (приблизительно) 2.1 до (приблизительно) 8.9. В других вариантах среднее молярное отношение фукозы к молекулам СТЬА4-1д больше или равно 1.6.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, включающий молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д имеют среднее молярное отношение маннозы к молекулам СТЬА4-1д от (приблизительно) 5 до (приблизительно) 25. В некоторых вариантах среднее молярное отношение сиаловой кислоты к молекулам СТЬА4-1д составляет от (приблизительно) X до (приблизительно) Υ, включая X и Υ, где X равен (приблизительно) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21, а Υ равен от (приблизительно) 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24. В других вариантах среднее молярное отношение маннозы к молекулам СТЬА4-1д находится в диапазоне между от (приблизительно) Х до (приблизительно) Υ, включая X и Υ, где X составляет (приблизительно) 6.5; 7.0; 7.5; 7.6; 7.9; 8.1; 8.3; 8.5; 9.0; 9.5; 10.0; 10.5; 11.0; 11.5 или 12.0, а Υ составляет (приблизительно) 17.0; 17.5; 18.0; 18.5; 19.0; 19.5; 20.0; 20.5; 21.0; 21.5; 22.0; 22.5; 23; 23.5 или 24.0. В других вариантах среднее молярное отношение маннозы к молекулам СТЬА4-1д находится в диапазоне между от (приблизительно) Х до Υ, включая X и Υ, где X составляет (приблизительно) 8; 8.5; 9.0; 9.5; 10.0 или 11.0, а Υ составляет (приблизительно) 17.0; 17.5; 18.0; 18.5; 19.0; 19.5 или 20.0. В других вариантах среднее молярное отношение маннозы к молекулам СТЬА4-1д равно от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 23, от (приблизительно) 7 до (приблизительно) 22, от (приблизительно) 7.6 до (приблизительно) 22, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 21, от (приблизительно) 9 до (приблизительно) 20, от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 19, от (приблизительно) 11 до (приблизительно) 19 и от (приблизительно) 11 до (приблизительно) 17. В других вариантах среднее молярное отношение маннозы к молекулам СТЬА4-1д равно от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 19, от (приблизительно) 9 до (приблизительно) 18, от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 17 или от (приблизительно) 11 до (приблизительно) 16. В других вариантах среднее молярное отношение маннозы к молекулам СТЬА4-1д больше или равно 7.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, в котором молекул СТЬА4-1д меньше или равно 5.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 4.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 4.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 3.5%ного содержания поверхности, меньше или равно 3.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 2.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 2.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.0%-ного содержания поверхности или меньше или равно 0.5%-ного содержания площади (области) окисленных видов. Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, в котором молекул СТЬА4-1д меньше или равно 5.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 4.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 4.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 3.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 3.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 2.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 2.0%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.5%-ного содержания поверхности, меньше или равно 1.0%-ного содержания поверхности, или меньше или равно 0.5%-ного содержания площади (области) дезамидированных видов. В некоторых вариантах состав содержит молекулы СТЬА4-1д, где молекул СТЬА4-1д меньше или равно 3.5%-ного содержания площади (области) окисленных видов и меньше или равно 2.5%-ного содержания площади (области) дезамидированных видов.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает бактериальные эндотоксины ^Λ^ при меньшем или равном 0.6 Ευ (эндотоксиновая единица ЭЕ)/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.6 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.5 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.42 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.4 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.35 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.3 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.25 ЭЕ/мг

- 61 017765 молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.20 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 0.15 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д или при меньшем или равном 0.05 ЭЕ/мг молекул СТЬА4-1д.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает микрофлору при меньшем или равном 2 СЕИ (колониеобразующая единица)/10 мл, при меньшем или равном 1.5 СЕИ/10 мл, при меньшем или равном 1 СЕИ/10 мл или при меньшем или равном 0.5 СЕИ/10 мл.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает ^NА (ДНК) при меньшем или равном 25 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 20 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 15 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 10 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 5.0 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 4.0 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 3.5 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 3.0 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 2.5 пг/мг молекул СТЬА41д, при меньшем или равном 1.5 пг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 1.0 пг/мг молекул СТЬА4-1д, или при меньшем или равном 0.5 пг/мг молекул СТЬА4-1д, или при меньшем или равном 0.20 пг/мл молекул СТЬА4-1д.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает клеточный белок (например, белок СНО (яичники китайского хомячка) при меньшем или равном 200 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 150 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 125 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 100 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 90 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 80 нг/мг молекул СТЬА4-1д, 70 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 60 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 50 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 40 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 30 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 25нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 20 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 15 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 10 нг/мг молекул СТЬА4-1д или при меньшем или равном 5 нг/мг молекул СТЬА4-1д. Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает клеточный белок в количестве, меньшем или равном 200 промиль, меньшем или равном 150 промиль, меньшем или равном 125 промиль, меньшем или равном 100 промиль, меньшем или равном 90 промиль, меньшем или равном 80 промиль, 70 промиль, меньшем или равном 60 промиль, меньшем или равном 50 промиль, меньшем или равном 40 промиль, меньшем или равном 30 промиль, меньшем или равном 25 промиль, меньшем или равном 20 промиль, меньшем или равном 15 промиль, меньшем или равном 10 промиль или меньшем или равном 5 промиль.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает Тритон (например, Тритон Х-100) при меньшем или равном 4.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 3.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 3.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 2.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 2.0 нг/мг молекул СТЬА41д, при меньшем или равном 1.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 1.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, или при меньшем или равном 0.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает Тритон-Х при меньшем или равном 4.0 промиль, при меньшем или равном 3.5 промиль, при меньшем или равном 3.0 промиль, при меньшем или равном 2.5 промиль, при меньшем или равном 2.0 промиль, при меньшем или равном 1.5 промиль, при меньшем или равном 1.0 промиль или при меньшем или равном 0.5 промиль.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает протеин А при меньшем или равном 8.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 7.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 7.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 6.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 6.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 5.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 5.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 4.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 4.0 нг/мг молекул СТЬА41д, при меньшем или равном 3.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 3.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 2.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 2.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 1.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, при меньшем или равном 1.0 нг/мг молекул СТЬА4-1д или при меньшем или равном 0.5 нг/мг молекул СТЬА4-1д, Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где состав включает протеин А при меньшем или равном 8.0 промиль, при меньшем или равном 7.5 промиль, при меньшем или равном 7.0 промиль, при меньшем или равном 6.5 промиль, при меньшем или равном 6.0 промиль, при меньшем или равном 5.5 промиль, при меньшем или равном 5.0 промиль, при меньшем или равном 4.5 промиль, при меньшем или равном 4.0 промиль, при меньшем или равном 3.5 промиль, при меньшем или равном 3.0 промиль, при меньшем или равном 2.5 промиль, при меньшем или равном 2.0 промиль, при меньшем или равном 1.5 промиль, при меньшем или равном 1.0 промиль или при меньшем или равном 0.5 промиль.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТЬА4-1д, где молекулы СТЬА4-1д имеют среднее молярное отношение 61сNАс к молекулам СТЬА4-1д от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 40. В некоторых вариантах среднее молярное отношение С1сNЛс к молекулам

- 62 017765

СТ^Л4-Iд находится в диапазоне между от (приблизительно) Х до (приблизительно) Υ, включая Х и Υ, где Х является любым целым числом между 10 и 39, а Υ является любым целым числом между 11 и 40. В других вариантах среднее молярное отношение С1сNЛс к молекулам СТ^Л4-Iд находится в диапазоне между от (приблизительно) Х до Υ, включая Х и Υ, где Х равно (приблизительно) 12, 13, 14, 15, 16 или 17, а Υ равно (приблизительно) 33, 34, 35, 36 или 37. В других вариантах среднее молярное отношение С1сNЛс к молекулам СТ^Л4-Iд составляет от (приблизительно) 12 до (приблизительно) 35, от (приблизительно) 13 до (приблизительно) 35, от (приблизительно) 14 до (приблизительно) 35, от (приблизительно) 15 до (приблизительно) 35.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы ΟΓΕΑ4-Ι§, где молекулы СТ^Α4-Iд имеют среднее молярное отношение 6а1NΑс к молекулам СТ^Α4-Iд от (приблизительно) 0.5 до (приблизительно) 7.0; в некоторых вариантах среднее молярное отношение Са1NЛс к молекулам СТ^Л4-Iд находится в диапазоне между от (приблизительно) Х до (приблизительно) Υ, включая Х и Υ, где Х равен 0.5; 0.6; 0.6; 0.8; 0.9; 1.0; 1.1; 1.2; 1.3; 1.4; 1.5; 1.6; 1.6; 1.8; 1.9 или 2.0, а Υ равен 3.0; 3.1; 3.2; 3.3; 3.4; 3.5; 3.6; 3.6; 3.8; 3.9; 4.0; 4.1; 4.2; 4.3; 4.4; 4.5; 4.6; 4.7; 4.8; 4.9; 5.0; 6.0; 7.0 или 8.0. В других вариантах среднее молярное отношение Са1NЛс к молекулам СТ^Л4-Iд находится в диапазоне между от (приблизительно) Х до Υ, включая Х и Υ, где Х равен 0.6; 0.6; 0.8; 0.9 или 1.0, а Υ равен (приблизительно) 3.4; 3.5; 3.6; 3.6; 3.8; 3.9; 4.0; 4.1 или 4.2. В других вариантах среднее молярное отношение 6а1NΑс к молекулам СТ^Л4-Iд составляет от (приблизительно) 0.6 до (приблизительно) 4.1, от (приблизительно) 0.8 до (приблизительно) 4.0, от (приблизительно) 0.9 до (приблизительно) 3.9, или от (приблизительно) 1.0 до (приблизительно) 3.8, или от (приблизительно) 1.1 до (приблизительно) 3.6. В других вариантах среднее молярное отношение Са1NЛс к молекулам СТ^Л4-Iд составляет от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 3.6, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 3.6, от (приблизительно) 1.8 до (приблизительно) 3.5 или от (приблизительно) 1.9 до (приблизительно) 3.4.

Настоящим изобретением предусмотрен состав, содержащий молекулы СТ^Л4-Iд. где в составе СТ^Л4-Iд обнаруживаются полосы в диапазонах рТ, что было определено на геле изоэлектрического фокусирования (ГЕЕ гель) следующим образом: от (приблизительно) 10 до 22 полос в диапазоне рI от (приблизительно) 4.3 до (приблизительно) 5.6; совокупная плотность (интенсивность) полос составляет от (приблизительно) 90% до (приблизительно) 110% в диапазоне рI от (приблизительно) 4.3 до (приблизительно) 5.3 и около 3 главных (больших) полос в диапазоне рI от (приблизительно) 4.5 до (приблизительно) 5.2. В одном варианте полосы в диапазоне от (приблизительно) 4.3 до (приблизительно) 5.6 составляют от (приблизительно) 5 до (приблизительно) 30, от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 29, от (приблизительно) 7 до (приблизительно) 28, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 27, от (приблизительно) 9 до (приблизительно) 26, от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 25, от (приблизительно) 11 до (приблизительно) 24, от (приблизительно) 12 до (приблизительно) 23, от (приблизительно) 13 до (приблизительно) 22, от (приблизительно) 14 до (приблизительно) 21, от (приблизительно) 15 до (приблизительно) 20, от (приблизительно) 16 до (приблизительно) 19, от (приблизительно) 17 до (приблизительно) 20, от (приблизительно) 18 до (приблизительно) 19.

Гликозилированные молекулы СТ^Α4-Iд и СТ^Α4^{ЛΖ5IΥ^104Е}-Iд и их популяции.

Без ограничений гликозилирование может относиться к добавлению сложных олигосахаридных структур к белку в конкретных местах внутри полипептидной цепи. Гликозилирование белка и последующий процессинг добавленных углеводородов может повлиять на укладку и структуру белков, стабильность белков, включая полупериод (распада или выведения) и функциональные свойства белка. Гликозилирование белка может быть подразделено на два класса на основании последовательного контекста, где происходит модификация, О-соединенное гликозилирование и Ν-соединенное гликозилирование. О-соединенные полисахариды соединены с гидроксильной группой, обычно с гидроксильной группой остатка серина или треонина. О-гликаны не добавляются к каждому остатку серина или треонина. О-соединенные олигосахариды обычно являются моно- или биантенными, т.е. они содержат один или, самое большее, два ответвления (антенны), содержат от одного до четырех различных видов остатков сахаров, которые добавляются один за другим.

Ν-соединенные полисахариды присоединяются к амидному азоту аспарагина. Только аспарагины, которые являются частью одной из двух трипептидных последовательностей, или аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин (где Х - это любая аминокислота, кроме пролина), являются мишенями для гликозилирования. Ν-соединенные олигосахариды могут иметь от одного до четырех ответвлений, рассматриваемых как моно-, би-, три-тетра-антенными. Структуры и остатки сахара, найденные в Ν- и Осоединенных олигосахаридах, являются разными. Несмотря на эту разницу, конечный остаток на каждом ответвлении как Ν-, так и О-соединенных полисахаридов может быть модифицирован при помощи молекулы сиаловой кислоты, модификация рассматривается как кэппинг (образование шапочки) сиаловых кислот. Сиаловая кислота - это общее название для семейства уникальных девятиуглеродных моносахаридов, которые могут быть присоединены к другим олигосахаридам. Двумя членами семейства являются Ν-ацетил нейраминовая кислота, сокращенно Nеи5Αс или ΝΑΝΑ, и Ν-гликолил (ацильный радикал гликолевой кислоты) нейраминовая кислота, сокращенно №и80с или ΝΟΝΑ.

Наиболее распространенной формой сиаловой кислоты у людей является ΝΑΝΑ. Ν

- 63 017765 ацетилнейраминовая кислота (NΛNА) - первичный вид сиаловой кислоты, представленный в молекулах СТ^А4-Iд. Тем не менее, следует отметить, что незначительные, но обнаружимые уровни N гликолнейраминовой кислоты (NСNА) также присутствуют в молекулах СТ^А4-Iд. Более того, метод, описанный в данном документе, может использоваться для определения количества грамм-молей сиаловых кислот как для NΛNА, так и NСNА, и, следовательно, уровни и NАNА, и NСNА определяются и описываются для молекул СТ^А4-Iд. N и О-соединенные олигосахариды имеют различное количество ответвлений, которые обеспечивают различное количество мест, к которым могут быть присоединены молекулы сиаловой кислоты. №соединенные олигосахариды могут обеспечить до четырех мест присоединения для сиаловых кислот, в то время как О-соединенные олигосахариды могут обеспечить два места для присоединения сиаловой кислоты.

Гликозилированные белки (гликопротеины), многие из которых были получены технологическими методами рекомбинантной ДНК, представляют большой интерес как диагностические и терапевтические средства. Многие эукариотические трансмембранные белки, предназначенные для белков клеточной поверхности и выделенных белков, посттрансляционно модифицируются, вводя №соединенные и Осоединенные углеводные группы. №соединенные олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина, когда они являются частью пептидного мотива (фрагмента) Λ5η-X-8е^/Т11^. где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина. О-соединенные олигосахариды присоединяются к остаткам серина или треонина. Структуры №соединенных и О-соединенных олигосахаридов, а также остатки сахара, найденные в каждом из них, могут отличаться. Один тип сахара, который обычно встречается в обоих из них, это №ацетил нейраминовая кислота (NΛNА; далее она будет рассматриваться как сиаловая кислота). Обычно, сиаловая кислота - это конечный остаток как №соединенных, так и О-соединенных олигосахаридов. Гликопротеин из-за своего отрицательного заряда может проявлять кислотные свойства.

Предполагается, что гликозилированные белки выполняют роли в увеличении укладки (свертывания) белков, регулировании сортировки и направленной миграции клеток, предотвращении скопления (агрегаций) белка, в выполнении промежуточного звена в межклеточной адгезии и увеличении резистентности к протеолизу. В эукариотических организмах природа и степень гликозилирования могут оказывать глубокое влияние на периодический период полураспада и биоактивности терапии гликопротеином в результате процессов, которые включают эндоцитоз, опосредуемый рецептором, и клиренс. Считается, что системы, опосредуемые рецептором, играют главную роль в очистке (просветлении) сывороточных гликопротеинов путем распознавания различных компонентов сахара олигосахарида. Гликопротеиновая конечная группа сиаловой кислоты может повлиять на поглощение (абсорбцию), период полувыведения, сывороточный клиренс. Таким образом, технологические концепции гликопротеина, которые поддерживают конечный компонент сиаловой кислоты гликозилированного белка, могут лучше увеличить биодоступность и период полувыведения сыворотки. Было исследовано несколько параметров производственного процесса в отношении рекомбинантного синтеза гликопротеина, особенно влияние состава среды и сдвигов температуры при различных технологических концепциях.

Димеры СТ^А4-Iд, состоящие из мономеров, имеющих аминокислотную последовательность остатков (ί) 26-383, 8ЕЦ ГО N0:2 (№ идентификатора последовательности), (ίί) 26-382, 8ЕЦ ГО N0:2, (ίίί) 27-383, 81Т) ГО N0:2, (ίν) 27-382,8Ер ГО N0:2, (ν) 25-382, 8Ер ГО N0:2 или (νί) 25-383, 81Т) ГО N0:2, могут иметь вычисленный теоретический молекулярный вес от (приблизительно) 78000 до (приблизительно) 79000 Да. Тем не менее, молекулярный вес для подобных димеров, полученных при помощи МΛ^^I-Т0Р (времяпролетная масс-спектрометрия ионизацией с лазерной десорбцией с использованием матрицы), равен приблизительно 91000 Да. Данная разница молекулярного веса, равная приблизительно 13000-14000 Да, вызвана, по меньшей мере частично, гликозилированием, которое в одном варианте является причиной (приблизительно) 15% веса молекулы данного конкретного мономера СТ^А4-Iд. Вышеуказанные мономеры имеют три №соединенных мест гликозилирования, которые были подтверждены тем, что пептидное картирование имело место на аспарагинах, в остатках 102, 134 и 233, 8ЕЦ ГО N0:2. Углеводные молекулы, которые присоединяются посредством аспарагина, могут быть расщеплены избирательно с использованием фермента пептид^ гликозидаза Р (РNСа8е Р). В одном примере обработка ферментом РNСа8е Р мономера, имеющего последовательность 27-383, 8ЕЦ ГО N0:2, привела к образованию вида с молекулярным весом примерно 80200 Да, а так как теоретический молекулярный вес данного мономера составляет около 80200, то обработка наводит на мысль, что необъясненные 1400 Да (80200-78800=1400) могут иметь место из-за О-соединенного гликозилирования. Хотя имеются многочисленные остатки серина и треонина, которые потенциально могут быть местами гликозилирования, только два О-соединенных места могут быть идентифицированы: 8ег155 и 8ег165, 8ЕЦ ГО N0:2. В одном примере доминирующим гликаном (полисахаридом), присоединенным к этим двум местам, является ΗеxNАс-Ηеx-NеиАс.

Например, на фиг. 9 представлен общий вид №соединенных и О-соединенных углеводных структур на молекулах СТ^А4-Iд, которые содержат мономеры, имеющие последовательность из 8ЕЦ ГО N0:2 (т.е. мономер, имеющий одну из следующих последовательностей: (ί) 26-383, 8ЕЦ ГО N0:2, (ίί) 26-382, 81Т) ГО N0:2, (ίίί) 27-383, 8ЕО ГО N0:2, (ίν) 27-382, 8ЕО ГО N0:2, (ν) 25-382, 8ЕО ГО N0:2 или (νί) 25383, 8ЕЦ ГО N0:2, где в одном примере подобные молекулы с показанными углеводными характеристи

- 64 017765 ками получают при помощи линии клеток данного изобретения или их потомства в соответствии с методом производства, описанным в примерах 14-15, а также показанным на фиг. 10. Основные структуры, перечисленные для каждого места, основаны на ортогональной методике (см. в данном документе). Для каждой структуры существует расчетное процентное отношение этой структуры, которое наблюдалось во время этих экспериментов. Эти процентные отношения представляют наилучшие оценки с точки зрения ортогональной методики.

Димеры СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, состоящие из мономеров, имеющих аминокислотную последовательность остатков (ί) 26-383, БЕО ΙΌ N0:4, (ίί) 26-382, БЕО ΙΌ N0:4, (ίίί) 27-383, БЕО ΙΌ N0:4, (ίν) 27-382, БЕО ΙΌ N0:4, (ν) 25-382, БЕО ΙΌ N0:4 или (νί) 25-383, БЕО ΙΌ N0:4, могут иметь вычисленный теоретический молекулярный вес от (приблизительно) 78000 до (приблизительно) 79000 Да. Тем не менее, молекулярный вес для подобных димеров, полученных при помощи МΛ^^I-Т0Е (времяпролетная массспектрометрия с ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы), равен приблизительно 91500 Да. Данная разница молекулярного веса, равная приблизительно 12000-13000 Да, вызвана, по меньшей мере, частично гликозилированием. Вышеуказанные мономеры имеют три №соединенных места гликозилирования, которые были подтверждены тем, что пептидное картирование имело место на аспарагинах, в остатках 102, 134 и 233, БЕО ΙΌ N0:4 (N76, N108 и N207, фиг. 4). Углеводные молекулы, которые присоединяются посредством аспарагина, могут быть расщеплены избирательно с использованием фермента пептид-Ы гликозидаза Е (РНСаю Е). Хотя имеются многочисленные остатки серина и треонина, которые потенциально могут быть местами гликозилирования, только три О-соединенных места могут быть идентифицированы: Бег149, Бег155 и Бег165, БЕО ΙΌ N0:4 (см. табл. 25 в примере 22). В одном примере доминирующим гликаном (полисахаридом), присоединенным к этим местам, является ΗеxNАс-Ηеx-NеиАс.

В определенных случаях молекулы СТ^Λ4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд являются гликопротеинами, которые могут быть получены методами культивирования данного изобретения. В одном случае гликопротеины СТ^Λ4-[д модифицируются с олигосахаридами, которые представляют примерно 15% (в весовом отношении) молекулы. Эти олигосахариды могут играть важную роль в фармакокинетических (РК) показателях гликопротеина СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Кроме того, различные профили олигосахаридов могут повлиять на стабильность и расщепление белков. Например, О-соединенные олигосахариды могут улучшить стабильность молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, предотвращая автолиз в шарнирной области константной области иммуноглобулина.

Распределение олигосахарида на популяции молекул СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд может быть неоднородным по природе из-за сложности культуры клеток и процессов. Неоднородность может иметь место из-за того, что места гликозилирования могут быть полностью заняты и не заняты, и того факта, что любое конкретное место может быть заселено многими различными структурами олигосахаридов, которые, в свою очередь, могут иметь вариации в характере модификации сиаловой кислоты.

В одном случае первичным компонентом сиаловой кислоты на молекулах СТ^Λ4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд является ^ацетил нейраминовая кислота (КеиАс, NАNА), а вторичным компонентом сиаловой кислоты является ^гликолил (ацильный радикал гликолевой кислоты) нейраминовая кислота (N0NА). Заряженная природа сиаловой кислоты и сложные структуры, содержащие силовую кислоту, могут привести к многочисленным изоформам СТ^Λ4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд соответственно, где такие изоформы могут быть выраженными в профиле изоэлектрического фокусирования (ГЕЕ). Например, см. на фиг. 11 и примере 3 профиль изоэлектрического фокусирования (ШЕ) СТ^А4-Iд. Кроме того, см. на фиг. 12 и примере 22 профиль изоэлектрического фокусирования (ШЕ) СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд.

В одном случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^Λ4-[д. которая имеет преобладающую изоформу СТ^Λ4-[д с изоэлектрической точкой (ρΙ), которая меньше или равна 5.1 или 5.0, которая может быть определена, например, при помощи изоэлектрического фокусирования (ШЕ). В другом случае предусмотрена популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, которая имеет преобладающие изоформы СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд с изоэлектрической точкой (ρΙ), которая меньше или равна 5.5, что может быть определено, например, при помощи изоэлектрического фокусирования (ШЕ) (фиг. 12).

В одном случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^Λ4-[д. которая имеет ρΙ от (приблизительно) 4.2 до (приблизительно) 5.6, от (приблизительно) 4.25 до (приблизительно) 5.5, от (приблизительно) 4.3 до (приблизительно) 5.3 или от (приблизительно) 4.5 до (приблизительно) 5.2. В другом примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^Λ4-[д. которая имеет ρΙ от (приблизительно) 4.45 до (приблизительно) 5.30. В следующем примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^Λ4-[д. где ρΙ составляет от (приблизительно) 4.3 до (приблизительно) 5.1. В конкретном примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТЕА4-1д, где ρΙ составляет от (приблизительно) 4.45 до (приблизительно) 5.0. В одном примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^Λ4-[д. где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции обнаруживают изоэлектрическую точку, которая меньше или равна 5.6; 5.6; 5.5; 5.4; 5.3; 5.2; 5.1; 5.0; 4.9; 4.8; 4.7; 4.6; 4.5; 4.4; 4.3; 4.2; 4.1; 4.0; 3.9; 3.8; 3.6; 3.6; 3.5; 3.4; 3.3; 3.2; 3.1; 3.0; 2.9; 2.8; 2.6; 2.6; 2.5; 2.4; 2.3; 2.2; 2.1 или 2.1, что было определено при помощи изоэлектрического фокусирования (ЕЕЕ) (данные значения могут иметь допустимое (стандартное) отклонение±0.2). В одном примере изобретение предоставляет

- 65 017765 метод для подготовки популяции молекул СТ^А4-[д с ρΙ от (приблизительно) 4.45 до (приблизительно) 5.30, или от (приблизительно) 4.45 до (приблизительно) 5.1 или от (приблизительно) 4.45 до (приблизительно) 5.0, где популяция молекул СТЬА44д подвергается воздействию ЬЕЕ гель-электрофорезу, где одинарная полоса на геле представляет подпопуляцию молекул СТ^А4-[д. имеющую определенную ρΙ, затем подпопуляция молекул СТЬА44д, имеющая определенную ρΙ, выделяется путем удаления полосы из геля и последующей очисткой белков из выделенной полосы геля.

В дальнейших вариантах изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд с ρΙ, которая составляет примерно от 4.5 до примерно 5.2. В других примерах изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, имеющая ρΙ от (приблизительно) 4.7 до (приблизительно) 5.1. В другом примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, которая имеет ρΙ от примерно 2.0 до примерно 5.2. В одном примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции обнаруживают изоэлектрическую точку, которая меньше или равна 5.5; 5.4; 5.3; 5.2; 5.1; 5.0; 4.9; 4.8; 4.7; 4.6; 4.5; 4.4; 4.3; 4.2; 4.1; 4.0; 3.9; 3.8; 3.6; 3.6; 3.5; 3.4; 3.3; 3.2; 3.1 или 3.0, что было определено изоэлектрическим фокусированием (ГЕЕ) (эти значения могут иметь допустимое стандартное отклонение±0.2). В одном случае изобретение обеспечивает метод для подготовки популяции молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд; имеющей ρΙ от (приблизительно) 4.5 до (приблизительно) 5.2; от (приблизительно) 4.7 до (приблизительно) 5.1; от (приблизительно) 2.0 до (приблизительно) 5.2, где метод включает в себя то, что популяция молекул СТЬА4^А29™^04Е4д подвергается воздействию гель-электрофорезу изоэлектрического фокусирования (ШЕ), где одинарная полоса на геле представляет подпопуляцию молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, имеющую определенную ρΙ, затем подпопуляция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, имеющую определенную ρΙ, выделяется путем удаления полосы из геля и последующей очисткой белков из выделенной полосы геля.

В определенных случаях изобретение обеспечивает популяции молекул СТЬА44д, имеющие среднее молярное отношение грамм-молей групп сиаловой кислоты к грамм-молям молекул СТ^А4-[д от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 32, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 32, от (приблизительно) 11 до (приблизительно) 30, от (приблизительно) 12 до (приблизительно) 20, от (приблизительно) 13 до (приблизительно) 19, от (приблизительно) 14 до (приблизительно) 18, от (приблизительно) 15 до (приблизительно) 17, от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 16, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 16, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 14, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 12.

В нескольких случаях максимально допустимый белок клетки-хозяина яичников китайского хомячка (СНО) от <25 промиль до <10 нг/мг характеризует состав молекул СТ^А4-[д. В другом случае состав молекул СТ^А4-[д характеризуется ДНК хозяина-клетки на уровне от <2.5 пг/мг до <1.0 пг/мг. В другом примере состав молекул СТ^А4-[д характеризуется Тритоном Х-100 на уровне от <1.0 нг/мг или <1.0 промиль. Концентрацию Тритона Х-100 можно определить путем выделения Тритона Х-100 с использованием выделения твердой фазы Аа1ег5 0АЗIЗ-Н^В, после которой следует промывка водой для удаления остаточного белка. Связанный Тритон Х-100 удаляется путем элюирования ацетонитрилом. Элюат ацетонитрила анализируется при помощи обращенно-фазовой хроматографии с использованием 5 мкм колонны ЗАЗ Нуρе^5^1 и подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила:воды (80:20). Выявление производится при помощи оптической УФ при 225 нм. В одном случае состав молекул СТ^А4-[д характеризуется <2.5 поверхности % окисления и <2.0 поверхности % дезамидирования. В другом случае состав молекул СТЬА44д характеризуется <3.0 поверхности % окисления и <2.5 поверхности % дезамидирования. Для количественного анализа окисления и дезамидирования использовался метод триптического пептидного картирования. Данные окисления в процентах были определены при помощи анализа триптического картирования КР-НРЬС (обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография, ОФВЭЖХ), когда проводится количественный анализ окисления в процентах поверхности Ме185 (аминокислота метионина) в белке СТЬА44д до сульфоксида метионина. Окисление в процентах в данном методе получают путем измерения площади пика УФ в триптической карте КР-НРЬС (обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография) для триптического пептида Т6, состоящего из остатковрадикалов 84-93, содержащих Ме185, и соответствующего окисленного триптического пептида, Т6ох, имеющего в своем составе Ме1(0)85. Окисление в процентах поверхности Ме185 в Ме1(0)85 пропорционально к проценту площади пика Т6ох ρеак:

Окисление в процентах=100хАТ6ох/(АТ6ох+АТ6), где АТ6 = площадь пика для триптического пептида Т6, (84-93);

АТ6ох = площадь пика для триптического пептида Т6ох, Ме1(0)85(84-93).

Данные дезамидирования в процентах, полученные с использованием анализа триптического картирования КР-НРЬС (обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография), в результате которого производится количественный анализ окисления и дезамидирования в процентах поверхности, получают путем измерения площадей пика УФ в КР-НРЬС (обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография) для триптического пептида Т26, состоящего из остатков-радикалов 281-302, содержащих А5и294, соответствующего дезамидированного триптического пептида, Т26йеат1, имеющего

- 66 017765 в своем составе 1§оА§р294. Дезамидирование в процентах площади А§п294 до 1§оА§р294 пропорционально к площади в процентах пика Т26беат1, где АТ26 = площадь пика для Т26, (281-302), АТ26беат1 = площадь пика для Т26беат1, 1§оА§р294(281-302). АТ26беат2 = площадь пика для Т26беат2, А§р299(281-302). АТ26беат3 = площадь пика для Т26беат3, А§р294(281-302). АТ26беат4 = площадь пика для Т26беат4, А§и294(281-302).

В другом варианте состав молекул СТ^Α4-Iд характеризуется Ν-ацетил глюкозамином (С1сNΑс), который имеет от 15 до 35 грамм-моль:грамм-моль СТ^Α4-Iд Белок, или Ν-ацетилгалактозамином (Са1NΑс), который имеет от 1.6 до 3.6 грамм-моль:грамм-моль СТ1.А4 Белок. Количественный анализ аминомоносахаридов производится при помощи капиллярного электрофореза (СЕ), который проводится после выделения из белка при помощи кислотного гидролиза. Выделенные аминомоносахариды ацетилируются вновь и флуоресцентно помечаются при помощи аминопириновой трисульфоновой кислоты (АРТ8), чтобы ускорить их выявление и количественный анализ. \-Асе1у1таппо<ат1пе (Ацетиманнозамин) добавляется к образцу, а стандарты аминомоносахарида служат как внутренний стандарт. Площади пика аминомоносахаридов в образцах нормализуются при помощи использования внутреннего стандарта, и определяется количество путем сравнения с площадями пиков соответствующих нормализованных аминомоносахаридов в стандарте. Затем подсчитывается молярное отношение каждого моносахарида относительно молекулы СТ^Α4-Iд.

В одном случае состав молекул СТ^Α4-Iд характеризуются следующими техническими характеристиками профиля Ν-соединенных олигосахаридов.

Характеристики профиля Ν-соединенных олигосахаридов

	% Разница Домен I ·	• % Разница % Разница
Домен II	Домен III
% Разница	19-3.1	7-19	-6 - -18
Стандартное допустим отклонение (% отличия вышеуказанных	±29	±27	±25

В одном примере состав молекул СТ^Α4-Iд характеризуется нейтральным моносахаридом, где состав имеет соотношения примерно следующее:

Галактоза от 8.0 до 17 грамм-моль:грамм-моль СТ^Α4-Iд Белок

Фукоза от 3.5 до 8.3 грамм-моль:грамм-моль СТ^Α4-Iд Белок

Манноза от 7.6 до 22 грамм-моль:грамм-моль СТ^Α4-Iд Белок или

Галактоза от 9.0 до 17 грамм-моль:грамм-моль СТ^Α4-Iд Белок

Манноза от 11 до 19 грамм-моль:грамм-моль СТ^Α4-Iд Белок.

Пояснительный состав нейтральных моносахаридов: грамм-моли: Белок в грамм-молях галактозы,

фукозы и маннозы
Нейтральный моносахарид	Процесс λν (п=34)	Процесс СО-СНО1 (п=109)
Среднее (8ϋ)	Мин,	Среднее (8ϋ)	Мин, Макс
Г алактоза	13.9(1.1)	12.0,16,0	12.6(1.0)	10.0,16.0
Фукоза	5,8 (1.0)	4.2, 7.7	5.6 (0.7)	4.5, 7.6
Манноза	15.3(1.0)	13.0,17.0	15.4(1.0)	13.0, 18.0

Пояснительный (состав) сиаловой кислоты (NΑNΑ:белок в моль-граммах)

Сиаловая кислота	Процесс (п=34)	Процесс (п=109) Ср Мин, Макс	СО-СНО1 еднее (8ϋ)
Среднее (5ϋ) Макс	Мин,
ΝΑΝΑ	10.2 (0,6)	9.3,11.6	9.7 (0.6)	8.2,11.5

В другом случае диапазон молярного соотношения моносахаридов для состава ΓΉ..-^'^²^'¹¹⁰'¹''является следующим: манноза от (приблизительно) 10-20 грамм-моль/белок в грамм-молях; фукоза от (приблизительно) 4.2-7.0 грамм-моль/белок в грамм-молях и галактоза от (приблизительно) 9.2-17 грамммоль/белок в грамм-молях. В другом случае состав СТ^Α4-Iд характеризуется молярным отношением NΑNΑ от (приблизительно) 5.0-10.0 грамм-моль NΑNΑ/белок в грамм-молях. В другом случае состав СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд характеризуется молярных отношением NСNΑ в <1.5 грамм-моль NСNΑ/белок в грамм-молях. В другом случае отклонение в % молярного отношения для сиаловых кислот составляет <15%, или <20%, или <30%.

В одном примере популяция молекул СТ^Α4-Iд может содержать мономеры СТ^Α4-Iд, каждый из которых имеет по меньшей мере три группы сиаловой кислоты.

В другом примере популяция молекул СТ^Α4-Iд включает мономеры СТ^Α4-Iд, каждый из которых имеет от 3 до 8 групп сиаловой кислоты.

В одном примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТ^Α4-Iд, где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции проявляют изоэлектрическую точку, которая меньше

- 67 017765 или равна (приблизительно) 5.6; 5.6; 5.5; 5.4; 5.3; 5.2; 5.1; 5.0; 4.9; 4.8; 4.7; 4.6; 4.5; 4.4; 4.3; 4.2; 4.1; 4.0; 3.9; 3.8; 3.6; 3.6; 3.5; 3.4; 3.3; 3.2; 3.1 или 3.0.

В некоторых примерах изобретением предусмотрены популяции молекул СТЬА4-1д, имеющие среднее мольное отношение грамм-молей NАNА к грамм-молям молекул или димера СТЬА4-1д от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 16, от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 14, от (приблизительно) 6 до (приблизительно) 12, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 12, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 14, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 16.

В других случаях изобретением предусмотрены популяции молекул СТЬА4-1д, имеющие среднее мольное отношение грамм-молей NСNА к грамм-молям молекул или димера СТЬА4-1д, меньшее или равное 2, 1.8; 1.6; 1.5; 1.4; 1.0; 0.8 или 0.5.

В конкретных случаях изобретением предусмотрены популяции молекул €^^4^^9,41,1041^^. имеющие среднее мольное отношение грамм-молей групп сиаловой кислоты к грамм-молям молекул или димера СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд от (приблизительно) 5.5 до (приблизительно) 8.5. В другом случае изобретением предусмотрены популяции молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, имеющие среднее мольное отношение грамммолей групп сиаловой кислоты к грамм-молям молекул или димера СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд от (приблизительно) 5 до (приблизительно) 10.

В одном примере популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд может включать мономеры СТ^А4^{А29Υ^104Ε}1д, каждый из которых имеет по меньшей мере 2.5 группы сиаловой кислоты. В другом примере популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд содержит мономеры СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, каждый из которых имеет от 2.5 до 5 групп сиаловых кислот.

В других примерах изобретением предусмотрены популяции молекул СТЬА4-1д, которые характеризуются средним молярным отношением популяции грамм-молей аминомоносахаридов и/или нейтральных моносахаридов и/или сиаловых кислот к грамм-молям молекул или димера СТЬА4-1д. В частных случаях изобретением предусмотрены популяции молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, характеризуются средним молярным отношением популяции грамм-молей аминомоносахаридов и/или нейтральных моносахаридов и/или сиаловых кислот к грамм-молям молекул или димера СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд. Аминомоносахариды включают Жацетил галактозамин (СаШАс) и Жацетил глюкозамин (С1сNАс). Нейтральные моносахариды включают маннозу, фукозу и галактозу. Сиаловые кислоты включают Жацетил нейраминовую кислоту (NАNА) и Жгликолил (ацильный радикал гликолевой кислоты) нейраминовую кислоту (N6^).

В одном примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, которые характеризуются средним молярным отношением грамм-молей С1сNАс на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, что составляет от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 40, от (приблизительно) 15 до (приблизительно) 35, от (приблизительно) 15 до (приблизительно) 25 или от (приблизительно) 15 до (приблизительно) 20. В другом примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции характеризуются средним молярным отношением грамм-молей С1сNАс на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, которая меньше или равна (приблизительно) 40, 38, 35, 30, 25, 20, 18 или 15.

В другом примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, которые характеризуются средним молярным отношением грамм-молей СаШАс на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, что составляет от (приблизительно) 1.5 до (приблизительно) 8.5, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 3.0, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 4.0, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 5.0, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 6.0, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 7.0, от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 8.0 или от (приблизительно) 1.6 до (приблизительно) 8.3. В другом случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции характеризуются средним молярным отношением грамм-молей СаШАс на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, которое меньше или равно (приблизительно) 8.5; 8; 7.5; 7; 6.5; 6; 5.5; 5; 4.5; 4.0; 3.8; 3.6; 3.5; 3.0; 2.5; 2.0; 1.6 или 1.5.

В другом примере изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, которые характеризуются средним молярным отношением грамм-молей галактозы на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, которое равно от (приблизительно) 7.5 до (приблизительно) 20.0, от (приблизительно) 8.0 до (приблизительно) 19.0, от (приблизительно) 8 до (приблизительно) 18.0, от (приблизительно) 8.0 до (приблизительно) 17.0, от (приблизительно) 8.5 до (приблизительно) 17.0 или от (приблизительно) 9.0 до (приблизительно) 17.0. В другом случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТБА41д, где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции характеризуются средним молярным отношением грамм-молей галактозы на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТБА41д, которое меньше или равно (приблизительно) 20.0; 19.0; 18.0; 17.0; 16.0; 15.0; 14.0; 13.0; 12.0; 11.0; 10.0; 9.0; 8.5; 8.0 или 7.5.

В следующем случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, которые характеризуются средним молярным отношением грамм-молей фукозы на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, которое равно от (приблизительно) 3 до (приблизительно) 8.5, от (приблизительно)

- 68 017765

3.5 до (приблизительно) 8.5, от (приблизительно) 3.5 до (приблизительно) 8.3, от (приблизительно) 3.5 до (приблизительно) 8.0, от (приблизительно) 3.5 до (приблизительно) 7.5 или от (приблизительно) 3.5 до (приблизительно) 7.0. В другом случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции характеризуются средним молярным отношением грамм-молей фукозы на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, которое меньше или равно (приблизительно) 8.5, 8.3, 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.2 или 3.0.

В следующем случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, которые характеризуются средним молярным отношением грамм-молей маннозы на грамм-моль димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, которое равно от (приблизительно) 7 до (приблизительно) 23, от (приблизительно)

7.5 до (приблизительно) 23, от (приблизительно) 7.6 до (приблизительно) 23, от (приблизительно) 7.6 до (приблизительно) 22.5, от (приблизительно) 7.6 до (приблизительно) 22, от (приблизительно) 7.6 до (приблизительно) 20, от (приблизительно) 7.6 до (приблизительно) 18, от (приблизительно) 7.6 до (приблизительно) 16, от (приблизительно) 8.0 до (приблизительно) 16.0, от (приблизительно) 9.0 до (приблизительно) 17.0, от (приблизительно) 10 до (приблизительно) 19.0 или от (приблизительно) 11 до (приблизительно) 19.0. В другом случае изобретением предусмотрена популяция молекул СТЬА4-1д, где по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% молекул в популяции характеризуются средним молярным отношением грамм-молей маннозы на грамм-моль молекул или димера СТЬА4-1д или к молекуле СТЬА4-1д, которое меньше или равно (приблизительно) 23, 22.5, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.6, 7.5, 7.3 или 7.

В одном случае изобретением предусмотрена гликозилированная популяция СТЬА4-1д, которая показывает увеличенные значения РК (пируваткиназа), такие как увеличенное воздействие (облучение), измеренное по площади под кривой (АИС-ППК), такие, которые получаются в результате или демонстрируются уменьшенным выведением сыворотки, сохраняя в то же время биоактивность.

В нескольких вариантах осуществления изобретения предусмотрены аналоги растворимых молекул СТЬА4-1д, которые имеют дополнительные места гликозилирования. В других вариантах осуществления изобретения предусмотрены аналоги растворимых молекул СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, которые имеют дополнительные места гликозилирования. Дополнительные места гликозилирования обеспечивают места присоединения для дополнительных углеводных структур, которые могут быть сиалированы. Увеличенное сиаловое содержание может привести к увеличенным значениям РК и/или повышенной стабильности гликопротеинов. Более высокое содержание сиаловой кислоты является благоприятным. В лабораторных условиях могут быть выполнены методы последующей очистки, где используются ферменты для дополнительного добавления сиаловых кислот с тем, чтобы получить дальнейшие варианты осуществления изобретения с использованием молекул СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

Варианты осуществления изобретения включают любой один диапазон, раскрытый в данном документе в комбинации с любым одним или более диапазонами, раскрытыми в данном документе. Варианты осуществления изобретения включают любую характеристику или свойство СТЬА4-1д, раскрытое в данном документе в комбинации с любой одной или более характеристиками или свойствами СТЬА4-1д, раскрытыми в данном документе.

Методы для анализа и получения гликопротеинов СТЬА4-1д СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

Следующие методы, описанные здесь, могут использоваться, чтобы охарактеризовать, определить или выделить популяции молекул СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д на основе различных углеводных составов (состава сахаров), включая, но, не ограничиваясь, среднее мольное отношение популяции грамммолей аминомоносахаридов и/или нейтральных моносахаридов и/или сиаловых кислот на грамм-моль молекул или димера СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

Гликопротеин, который выделяется из культивированных клеток, можно получить из культуральной среды или кондиционированной среды. Гликопротеин, производимый клетками, собирается, восстанавливается, изолируется, и/или очищается или очищается в основном, по желанию, в конце всего периода культуры клеток с использованием методов выделения и очистки, известных и используемых в отрасли, как описано в данном документе. В одном варианте осуществления изобретения гликопротеин данного изобретения, который выражен клеткой, но не секретирован клеткой, по-прежнему можно восстановить из клеток, например, посредством клеточных лизатов и выделением гликопротеина, и/или использованием методов, которые известны и практикуются в данной области, и как будет описано ниже.

Гликопротеин, полученный в результате процессов клеточной культуры в данном изобретении, содержит сложные углеводороды, которые можно проанализировать при помощи различных методов анализа углеводородов. Например, такие методы, как блоттинг лектина, хорошо известного в данной отрасли, выявляет пропорции конечной маннозы или других сахаров, таких как галактоза. Терминация (завершение) моно-, би-, три- или тетраантенного олигосахарида сиаловыми кислотами может быть подтверждена высвобождением сахаров из белка с использованием безводного гидразина или ферментативными методами и фракционированием олигосахаридов при помощи ионообменной хроматографии, гельхроматографии (эксклюзионной хроматографии) или других методов, которые известны в данной области.

Существует два основных типа гликозидных связей, которые были обнаружены в гликопротеинах,

- 69 017765

И- и О-соединенных. ^гликозилирования созданы путем ковалентной связи гликан к амидному азота остатков аспарагина, О-гликозидные связи создаются ковалентной связью гидроксильной группы серина, треонина, гидроксилизина или гидроксипролаин с гликаном. Углеводородные компоненты гликопротеинов вовлечены в многочисленные явления молекулярного распознавания, включая взаимодействия хозяин-болезнетворный организм, очистка от сыворотки и наведение на мишень различных тканей. Что касается молекул СТЬА4-1д и СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, углеводородные компоненты могут, по меньшей мере, повлиять на связь между молекулами СТЬА4-1д и СЭ80 или СЭ86. или между молекулами СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д и СО80 или СО86.

Углеводородные структуры обычно встречаются в выраженном белке как Н-соединенные или Осоединенные углеводороды. Х-соединенные и О-соединенные углеводороды отличаются первично в своих фибриллярных центрах. ^соединенное гликозилирование относится к присоединению углеводородного компонента через С1сNАс к остатку аспарагина в пептидной цепи. В одном варианте осуществления изобретения все ^соединенные углеводороды содержат общий фибриллярный центр Мап16(Маη1-3)Маηρ1-4С1с-NАсρ1-4С1сNАсρ-К, где К в этом фибриллярном центре представляет остаток аспарагина. Пептидная последовательность полученного белка будет содержать аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин, где X - любая аминокислота, кроме пролина.

По контрасту, О-соединенные углеводороды характеризуются общим фибриллярным центром, который содержит СаШАс, присоединенный к гидроксильной группе треонина или серина. Из N соединенных и О-соединенных углеводородов самыми важными являются сложные N и О-соединенные углеводороды. Подобные сложные углеводороды могут содержать несколько антенных структур. Моно-, би-, три- и тетраантенные структуры являются важными для добавления конечных сиаловых кислот. Подобные внешние цепные структуры обеспечивают дополнительные места для специфических сахаров и связей, которые включают углеводороды белковых продуктов.

Терапевтические гликопротеины часто производятся с использованием методов клеточной культуры рекомбинантной ДНК. На распределения гликозилирования белка в клеточной культуре могут повлиять изменения в рН, плотности клеток, концентраций питательного вещества и концентраций метаболита. Чувствительность распределений гликана к воздействию окружающей среды делает необходимым тщательно контролировать распределение гликана во время разработки продукта производства, чтобы обеспечить производство воспроизводимого продукта.

Разработка рекомбинантно-выведенных гликопротеинов для терапевтического использования привела к увеличению спроса на методы, чтобы охарактеризовать и профилировать (по определенному критерию осуществлять выборку из массива данных) их углеводородные структуры. Картирование олигосахарида было использовано во время начального определения параметров рекомбинантных белков для сравнения с нативным белком, чтобы идентифицировать присутствующие олигосахаридные структуры, контролировать консистенцию состава олигосахаридов, оценить изменения, которые могут произойти в результате изменения (сдвига) в клеточной культуре или процессе производства, а также определить изменения в гликозилировании, которые происходят как результат экспрессии в различных клеточных линиях.

Имеется множество методов для оценки углеводородных структурных распределений. К ним относятся методы гель-фильтрации, хроматографического и электрофоретического разделения в сочетании с широким кругом методов обнаружения. Если количество образцов ограничено, то гликопротеины часто дериватизируются при помощи флюоресцентных реактивов, таких как 2-аминобензойная кислота и 2аминопиридин, чтобы улучшить обнаружение. Тем не менее, получение производных и очистка производных может занимать много времени. Когда объем выборки не является выходом, то возможна прямая оценка углеводородных структурных распределений.

Анализ олигосахаридного содержания гликопротеина.

Конкретный гликопротеин может проявлять углеводороды. Гетерогенность может быть видна на нескольких уровнях: места гликозилирования могут варьироваться от полностью занятых до незанятых, а любое конкретное место может быть заселено множеством различных олигосахаридных структур, где каждая структура может быть модифицирована молекулами сиаловой кислоты, такими как NАNА или NСNА.

Углеводородное содержание белка в настоящем изобретении может быть проанализировано методами, хорошо известными в данной отрасли, включая методы, описанные в примерах, приведенных в данном документе. Известно несколько методов для анализа гликозилирования и они являются полезными в контексте данного изобретения. Данные методы предоставляют информацию, касающуюся идентичности и состава олигосахаридов, прикрепленных к полученному пептиду. Методы анализа углеводорода, полезные в связи с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются, лектинхроматографию; высокоэффективную анионообменную хроматографию в сочетании с импульсным амперометрическим детектированием (НРАЕС-РАЭ), где используется анионообменная хроматография с высоким рН, чтобы отделить олигосахариды, основываясь на заряде; ЯМР; масс-спектрометрию; высокоэффективную жидкостную хроматографию; хроматографию пористого графитированного углерода (СРС).

Известны методы для высвобождения олигосахаридов. Данные методы включают 1) ферментатив

- 70 017765 ные методы, которые обычно выполняются с использованием пептид-№гликозидазы Е/ендо-αгалактозидазы; 2) методы β-элиминации с использованием агрессивной щелочной окружающей среды для высвобождения, в основном, О-соединенных структур; и 3) химические методы с использованием безводного гидразина для высвобождения как №, так и О-соединенных олигосахаридов. Методы для анализа могут включать следующие этапы.

1. Диализ образца в отношении деионизированной воды для удаления всех буферных солей с последующей лиофилизацией.

2. Высвобождение неповрежденных олигосахаридных цепей с безводным гидразином.

3. Обработка неповрежденных олигосахаридных цепей безводным метанольным НС1 для высвобождения отдельных моносахаридов как О-метилпроизводных.

4. ^ацетилирование любых первичных аминогрупп.

5. Получение производных, чтобы получить пер-О-триметилсинильные метилглюкозиды.

6. Отделение этих производных путем капиллярной газожидкостной хроматографии (СЬС) в колонне СР-8ЕЬ8.

7. Определение отдельных гликозидных производных по продолжительности отстаивания по спектроскопии СЬС и масс-спектроскопии, по сравнению с известными стандартами.

8. Количественный анализ отдельных производных при помощи ЕШ (пламенно-ионизационный детектор) с внутренним стандартом (13-0-метил-Б-глюкоза).

Наличие нейтрального и аминосахара может быть определено при использовании высокоэффективной анионообменной хроматографии в сочетании с импульсным амперометрическим детектированием (НРАЕС-РАО Углевод Система Корпорации; Бюпех). Например, сахар может быть высвобожден путем гидролиза в 20% (в объемном отношении) трифторуксусной кислоте при 100°С в течение 6 ч. Гидролизаты затем высушиваются путем лиофилизации или при помощи 8реей-Уас (8ηνηηΙ 1п51гитеп15). Остатки затем растворяются в 1% растворе тригидрата уксусно-кислого натрия и анализируются в колонне НРЬС-А86 (как описано АттиИ и др., 1991, Апа1. ВюсНет. 195:269-280).

В качестве альтернативы может быть иммуноблотный углеводный анализ. В этой процедуре углеводы, связанные с белками, обнаруживаются при использовании промышленной системы обнаружения гликана (Воейппдег), которая основана на процедуре окислительного иммуноблота, описанной На§е1Ьеск и др. (1993, С1усосошида1е 1. 7:63). Выполняется протокол окрашивания, рекомендованный производителем, за исключением того, что белок перемещается на мембрану из дифторида поливинилидена вместо мембраны из нитроцеллюлозы, а блокирующие буферные растворы содержат 5% альбумина сыворотки крупного рогатого скота в 10 миллимолях Трис-буфера, рН 7.4, с 0.9% хлорида натрия. Обнаружение производится с антидигоксигенинными антителами, соединенными с щелочным фосфатным конъюгатом (Воейппдег), 1:1000 разведение в Трис-буферном растворе солей с использованием субстрата фосфатазы, 4-нитросиний тетразолий хлорида, 0.03% (отношение веса к объему) и 5-бром-4-хлор-3-индоксилфосфата 0.03% (отношение веса к объему) в 100 ммоль Трис-буфера, рН 9.5, содержащий 100 ммоль хлорид натрия и 50 ммоль хлорида магния. Белковые полосы (зоны), содержащие углевод, обычно обнаруживаются через 10-15 мин.

Углеводы, связанные с белком, также могут быть расщеплены путем расщепления пептид-№ гликозидазой Е. Согласно данной процедуре остаток откладывается в 14 мкл буферный раствор, содержащий 0.18% 8Ό8 (додецилсульфат натрия), 18 ммоль бета-меркаптоэтанола, 90 ммоль фосфата, 3.6 ммоль ЕБТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), при рН 8.6, и нагревается при 100°С в течение 3 мин. После охлаждения до комнатной температуры реакционная смесь делится на две приблизительно равные части. Одна часть, которая больше не обрабатывается, служит контрольной. Другая часть доводится до (примерно) 1% №-40 детергента с последующим добавлением 0.2 единиц пептид-№ гликозидазы Е (Воейппдег). Обе части нагреваются при 37°С в течение 2 ч, затем анализируются путем электрофореза в 8Б8-полиакриламидном геле.

Картирование гликана в гликопротеинах становится в большей степени распространенным. Методика, описанная здесь, позволяет быстро определить параметры олигосахаридов исходя из типа гликана, степени сиалирования и количества ответвлений на не восстановленном конце углеводов. Таким образом, в определенных вариантах осуществления изобретения предусмотрены популяции СТЬА4-1д, характеризуемые конкретными профилями олигосахаридов. Анализ профиля олигосахаридов обычно проводится при помощи хроматографического разделения олигосахаридов, за которой следует обнаружение и относительный количественный анализ. Альтернативой хроматографическому анализу профиля служит прямой анализ олигосахаридов путем вливания Ε8Ι после текущего обессоливания.

Анализ профиля олигосахаридов при помощи РСС может использоваться для описания характеристик №соединенных олигосахаридов из молекул СТЬА4-1д. Существует 31 структурный класс олигосахаридов, определенный из молекул СТЬА4-1д (8ЕО ΙΌ N0:2), включая сструктурный класс, содержащий группы О-ацетилированной сиаловой кислоты. Проверка структурного класса достигается благодаря использованию М8/М8 (тандемная масс-спектрометрия) и масс-спектрометрии режима определения положительных ионов. Относительный количественный анализ структурных классов возможен благодаря

- 71 017765 интеграции следа УФ при 206 нм. Известно сравнение профилей субпопуляций от отдельных мест Νсвязей, которое выявляет значительные различия популяций между местами Ν-связей. Анализ профиля олигосахарида с использованием Р0С (промышленного газового хроматографа) обеспечивает подходящую информацию, хорошую альтернативу более традиционным методам анализа профиля, таким как НРАЕС (высокоэффективная анионообменная хроматография).

Ν-соединенные структуры в молекулах СТЬА4-Ье., содержащих мономеры ЗЕЦ ГО ΝΟ:2.

Существует три основных Ν-соединенных мест гликозилирования на цепь (т.е. на мономер) на мультимере или димере СТ^Λ4-Iд. где мономер имеет последовательность от ЗЕЦ ГО ΝΟ:2. Например: (ί) 26-383, ЗЕВ) ГО ΝΟ:2, (ίί) 26-382, ЗЕВ) ГО ΝΟ:2, (ίίί) 27-383, ЗЕВ) ГО ΝΟ:2, (ίν) 27-382, ЗЕВ) ГО ΝΟ:2, (ν) 25-382, ЗЕЦ ГО ΝΟ:2 или (νί) 25-383, ЗЕЦ ГО ΝΟ:2. Изменения гликозилирования по месту анализируются путем выделения пептидных фрагментов, содержащих Ν-соединенные гликаны от триптического гидролизата белка. Ν-соединенные места гликозилирования на белке расположены на Аδη¹⁰², Аδη¹³⁴ и Аδη²³³, содержащиеся в триптических фрагментах 5, 7 и 14 соответственно. Ферментативное высвобождение Ν-соединенных олигосахаридов из выделенных пептидных фрагментов, сопровождаемое анализом профиля высвобожденных олигосахаридов на промышленном газовом хроматографе приводит к получению профилей, показанных на фиг. 13. Из профиля гликанов, высвобожденных из Аδη (триптический фрагмент 14, Т14), очевидно, что олигосахаридная популяция обогащена также в асиаловых структурах (структуры не имеют сиаловых кислот). Олигосахаридные профили от гликанов, присоединенные при Аδη¹⁰² и Аδη¹³⁴ (Т5 и Т7), содержат основную массу сиалированных структур.

Выделенные олигосахариды, освобожденные от гликопротеина, напрямую впрыскиваются в систему ВСД)Ь/\1З пористого графитированного углерода. На фиг. 14 и 15 показаны ГОС и υV хроматограммы типичных профилей Р0С (газовый промышленный хроматограф), порожденные ацетонитрильными градиентами, содержащими кислые и щелочные добавки. В большинстве случаев спектры масс от одиночного хроматографического пика содержат пики масс для одиночного олигосахарида. Тридцать структурных олигосахаридных классов идентифицированы из профиля элюции, содержащего ТРА. Только шестнадцать структурных олигосахаридных классов идентифицированы из профиля элюции, содержащего NН₄ΟН. Внутри каждого структурного класса существуют структуры вариантов, содержащие замещение Ν-гликолил (ацильный радикал гликолевой кислоты) нейраминовую кислоту (NΟNА) вместо Ν-ацетил нейраминовой кислоты (NΆNА), а также отличающиеся степени ацетилирования сиаловой кислоты. Хотя только качественная информация может быть получена сравнением подсчета ионов для олигосахаридных классов, очевидно, что структурными основными классами внутри каждого из четырех доменов являются Р2100, Р2111, Р2122 и Р3133. Это согласуется со значениями интеграции, полученными от следа ЦУ при 206 нм. Структурная дальнейшая проверка (верификация) может быть получена из масс спектрограммы определения положительных ионов. Ионизация режима определения положительных ионов способствует фрагментации источников олигосахаридов, главным образом на гликозидных связях. Так как существует хорошее отделение олигосахаридов, как определено спектрами масс положительных ионов, разбитые на куски (фрагментированные) спектры, полученные в режиме определения положительных ионов, воспроизводят спектры тандемной масс-спектрометрии положительных ионов. Домен III (дисиалированные структуры) содержит значительное количество О-ацетилированной структуры Р2122-Ас. Данные спектры масс положительных ионов поддерживают О-ацетилирование одной из сиаловых кислот на структуре. Самое распространенное место О-ацетилирования остатков сиаловой кислоты находится в положениях С-7 и С-9 (ЗЕ1 \У.Х., СНатпт К., УаГО А., 1. Вю1. СЕет. 271 (1996), 15130-15188). При физиологическом внеклеточном рН, О-ацетил сложные эфиры на С-7 самопроизвольно мигрируют к С-9. Скорее всего, местом О-ацетилирования является, следовательно, С-9.

Анализ содержания Ν-соединенных олигосахаридов: аналитические методы могут включать расщепление и выделение Ν-соединенных олигосахаридов путем колоночной хроматографии, который в неограничивающем варианте изобретения использует колонну НурегсагЬ. Гликаны, подвергнутые воздействию хроматографии НурегсагЬ, выделяются и могут быть проанализированы на НРАВС-РАО*, анализ которого определяет типы углеводов, которые модифицируют конкретный гликопротеин. Аналитическое определение параметров Ν-соединенных олигосахаридов также может быть достигнуто при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЬС/МЗ) с использованием пористого графитированного углерода (РОС). Углеводный анализ может также включать картирование трипсина, Аδр-N и Трипсин/химотрипсин пептида, чтобы определить пептиды, которые содержат углеводные структуры.

Ν-соединенные олигосахаридные структуры могут быть проанализированы с использованием серии методов ортогональной масс-спектрометрии и НРΆЕС-РΆ^* (см. примеры). Эти методы включают несколько расщеплений эндопептидаза, затем следует анализ ЬС/МЗ/МЗ. Что касается мономеров СТЬА4Ц, имеющих последовательность ЗЕЦ ГО ΝΟ:2, то три основных места Ν-соединенного гликозилирования были охарактеризованы с использованием ЬС/МЗ* и ЬС/МЗ/МЗ* электрораспылительной ионизации, и были определены основные структуры на каждом месте Ν-связи. Данные суммированы на фиг. 9. Существует по меньшей мере три главных точки присоединения для Ν-соединенных олигосахаридов в Аδη¹⁰², Аδη¹³⁴ и Аδη. Кроме того, выяснено, что Аδη содержит популяцию Ν-соединенных структур, которые не содержат групп сиаловой кислоты, которая встречается примерно в 80% времени.

- 72 017765

Примечание.

* НРАЕС (высокоэффективная анионообменная хроматография)-РАЭ (импульсное амперометрическое детектирование).

ЬС/М§ - жидкостная хроматография/масс-спектрометрия.

ЬС/М8/М§ - тандемная масс-спектрометрия.

№соединенные олигосахаридные структуры СР^Α4-Iд, определенные при помощи ЬС/М8 гликопептидов, ЬС/М8 олигосахаридов и НРАЕС-РАЭ: №соединенные углеводы связаны с мотивом консенсусной последовательности Акп - X - Зег/ТЬг. Эта последовательность появляется три раза на мономерных цепях СТ^Α4-[д. имеющих одну из следующих последовательностей: (ί) 26-383, 8ЕЦ ГО N0:2, (ίί) 26-382, ЗЕО ГО N0:2, (ίίί) 27-383, ЗЕО ГО N0:2, (ίν) 27-382, ЗЕО ГО N0:2, (ν) 25-382, ЗЕО ГО N0:2 и (νΐ) 25-383, ЗЕО ГО N0:2. Мотив консенсусной последовательности появляется в ЗЕО ГО N0:2 при Акп¹⁰² Ьеи¹⁰³ ТЬг^; Акп¹³⁴ 01у¹³⁵ ТЬг¹³⁶ и Акп²³³ Зег²³⁴ ТЬг²³⁵. Основываясь на консенсусной последовательности, существует шесть №соединенных углеводных мест на молекулу димера, которая сформирована одной или двумя из следующих мономерных последовательностей: (ί) 26-383, ЗЕО ГО N0:2, (ίί) 26-382, ЗЕО ГО N0:2, (ίίί) 27-383, ЗЕО ГО N0:2, (ίν) 27-382, ЗЕО ГО N0:2, (ν) 25-382, ЗЕО ГО N0:2 и (νΐ) 25-383, ЗЕО ГО N0:2.

№соединенные углеводы могут быть трех основных разновидностей: высокая манноза, гибрид и/или совокупность. Была разработана методика ЬС/М8 для анализа гликопептида. Трипсическое эндопротеолитическое расщепление мономеров (имеющих одну из последовательностей (ί) 26-383, ЗЕО ГО N0:2, (ίί) 26-382, ЗЕО ГО N0:2, (ίίί) 27-383, ЗЕО ГО N0:2, (ίν) 27-382, ЗЕО ГО N0:2, (ν) 25-382, ЗЕО ГО N0:2 и (νί) 25-383, ЗЕО ГО N0:2 приводит к трем пептидам, которые содержат №соединенное гликозилирование. Все три №соединенных места населены углеводными структурами. Триптический фрагмент Т5, соответствующий аминокислотам 65-109, ЗЕО ГО N0:2, содержит гликозилирование на Акп¹⁰². Триптический фрагмент Т7, соответствующий аминокислотам 120-154, ЗЕО ГО N0:2, содержит гликозилирование на Акп¹³⁴. Триптический фрагмент Т14, соответствующий аминокислотам 229-237, ЗЕО ГО N0:2, содержит гликозилирование на Акп²³³.

Чтобы определить специфические типы гликозилирования на каждом месте, углеводы были получены с каждого конкретного места путем увеличения шкалы расщепления белков и отделения, за которыми последовало коллектирование пептидов Т5, Т7 и Т14. Интересующие нас пики триптического пептида подвергались воздействию ΡNОаке Р и обрабатывались для анализа при помощи ЬС/М8 в колонне НурегсагЬ. Результаты показали, что гетерогенная популяция сложных би-, три- и тетраантенных структур на каждом месте. Это можно увидеть на фиг. 13, где хроматография разделяет сахар на пять доменов: асиало, моносиало, дисиало, трисиало и тетрасиало структуры (называются домены I, II, III, IV и V соответственно).

Хроматограмма (фиг. 13 вставка А) для углеводов Акп¹⁰² (Т5) показывает ряд моно- и дисиалоструктур на участке. Хроматограмма (фиг. 13 вставка В) для Акп¹³⁴(Т7) показывает две основных дисиалоструктуры с популяцией моносиалоструктуры. Хроматограмма (фиг. 13 вставка С) для Акп²³³ (Т14) показывает малое сиалирование. Для каждого из №соединенных углеводных участков спектр массспектрометрии и соответствующая структура показана для главного пика в каждой хроматограмме (см. фиг. 13, вставки Е, Р, Н). На фиг. 13, вставка Ό, совокупный №соединенный углеводный профиль СТ^Α4-[д показан в хроматограмме. Масса и структуры выбранных пиков приведены в табл. 1. Данные БС/МЗ олигосахаридов были подтверждены тщательным анализом картирования пептидов. Акп¹⁰² (Т5 пептид) имеет самую большую степень углеводной гетерогенности в диапазоне от биантенных, несиалированных структур до тетраантенных, тетрасиалированных структур. Акп¹³⁴ (Т7 пептид) содержит преимущественно биантенные структуры. Данный участок содержит гораздо меньше гетерогенности, чем 102 233 участок Акп . Участок Акп (Т14 пептид) содержит мало сиалирования. Третий аналитический метод, НРАЕС-РАЭ, также применялся, чтобы подтвердить два факта данных анализа ортогональных ЬС/М8.

- 73 017765

Таблица 1

Основные Ν'-соединенные структуры и отобранные незначительные сложные структуры, наблюдаемые с помощью методов ЬС/М8

Структура	Теоретическая масса	Фактическая Деконволютирова иная
(ΟΕΝΑο)4 (Рис)1 (Мап)3	1462	1575*
(ΟΙοΝΑο (Рис)! (МапЬ (Оа1)1.	1624	1737*
(ΟΙοΝΑο (Рис)1 (Мап)3 (Оа1)*	1786	1899*
(ΟΙοΝΑο)ί (Рис)1 (МапЬ (Оа1)1 (ΝευΑοΡ	1916	1916
(01οΝΑο)4 (Рис)1 (Мап>3 (Оа11е (ΝευΑοΧ	2077	2077
(01οΝΑο)5 (Рис)! (МапГс (Оа1), (№иАс),	2443	2442
(01οΝΑο)4 (Рис)1 (Мал)] (Оа1)2 (ΝευΑοΕ	2369	2368
(ΟΙοΝΑο)., (Рис)1 (Мап)3 (ОаЕс (ΝειιΑο)2	2734	2734
(ΟΙοΝΑο), (Рис)1 (Мап)3 (Оа1)3 (ИеиАсЬ	3025	3025
(01οΝΑο)5 (Рис)1 (МапЕ (Оа1Л (ΝευΑο)ί	3388	3388
(01οΝΑε)6 (Рио)1 (МапЕ (Оа1)3 (ΝευΑοΙ	3680 ·	3680

*Виды асиало (аз1а1о) детектируются как аддукты (продукты присоединения) ТЕА.

Популяция совокупных Ν-соединенных углеводов была проанализирована с использованием

НРАРС-РАО. Данные, полученные этим методом, приведены в табл. 2 и 3. В табл. 2 относительные процентные отношения поверхности асиало к доменам трисиало (з1а1о) приведены в пределах каждого уча102 233 стка (Азп , Азп и Азп 8ЕР ГО ΝΟ:2). В табл. 3 процентные отношения поверхности домена олигосахарида приведены как фракция целой популяции олигосахаридов.

Таблица 2

Процентные отношения для каждого домена, наблюдаемого в НРАЕС-РАО

N соед.	Асиало	Моно	Ди	Три
Х-Ю21	27	37	25	11
Ν135	25	38	28	8
Ν333	82	12	5	1

Таблица 3 Проценты поверхности для каждого домена, выраженного как взвешен.

Среднее в данных табл. 2 домен ехОгеззеб

N соед.	Асиало	Моно	Ди	Три
Ν'*2	9	12	8	4
Т?	8	13	9	3
	28	4	2	0
общее ,	! 45	29	19	7

Предполагается полное гликозилирование.

Ν-соединенные олигосахаридные структуры молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iβ, определенные при помощи 1.С/М8 гликопептидов, 1.С/М8 олигосахаридов и НРАЕС-РАО: Ν-соединенные углеводы связаны с мотивом консенсусной последовательности Азп - X - 8ег/ТЬг. Эта последовательность появляется три раза на мономерных цепях СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iβ, имеющих одну из следующих последовательностей: (ΐ) 26-383, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ίί) 26-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ΐΐΐ) 27-383, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ίν) 27-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ν) 25-382, 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4 и (νΐ) 25-383, 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4. Мотив консенсусной последовательности появляется в 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4 при Азп¹⁰² Ееи¹⁰³ ТЬг¹⁰⁴; Азп¹³⁴ С1у¹³⁵ ТЬг¹³⁶ и Азп²³³ 8ег²³⁴ ТЬг²³⁵. Основываясь на консенсусной последовательности, существует шесть Ν-соединенных углеводных участков на молекулу димера, которая сформирована одной или двумя из следующих мономерных последовательностей: (ΐ) 26-383, 8ЕО ГО ΝΟ:4, (ίί) 26-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ΐΐΐ) 27-383, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ίν) 27-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ν) 25-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4 и (νΐ) 25-383, 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4.

Ν-соединенные углеводы могут быть трех основных разновидностей: высокая-манноза, гибрид и/или совокупность. Была разработана методика РС/М8 для анализа гликопептида. Трипсическое эндопротеолитическое расщепление мономеров (имеющих одну из последовательностей (ΐ) 26-383, 8ЕО ГО ΝΟ:4, (ίί) 26-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ΐΐΐ) 27-383, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ίν) 27-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4, (ν) 25-382, ЕЕА ГО ΝΟ:4 и (νΐ) 25-383, 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4) приводит к трем пептидам, которые содержат Ν-соединенное гликозилирование (см. табл. 25 в примере 22). Все три Ν-соединенных места населены углеводными структурами. Триптический фрагмент Т5, соответствующий аминокислотам 65-109, 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4 содержит гликозилирование на Азп. Триптический фрагмент Т7, соответствующий аминокислотам 120-154, 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4 содержит гликозилирование на Азп¹³⁴. Триптический фрагмент Т14, соответствующий аминокислотам 229-237, 8ЕЕ) ГО ΝΟ:4 содержит гликозилирование на Азп²³³ (см. табл. 25 в примере 22).

Чтобы определить специфические типы гликозилирования на каждом участке, углеводы были по

- 74 017765 лучены с каждого конкретного места путем увеличения шкалы расщепления белков и отделения, за которыми последовало коллектирование пептидов Т5, Т7 и Т14. Интересующие триптические пики пептидов подвергались воздействию ΡNΟа8е Е и обрабатывались для анализа при помощи БС/М8 в колонке НурегсагЬ. Результаты показали, что гетерогенная популяция сложных би-, три- и тетраантенных структур на каждом участке. Это можно увидеть на фиг. 13, где хроматография разделяет сахар на четыре домена: структуры асиало, моносиало, дисиало, трисиалоструктуры (называемые домены Ι, ΙΙ, ΙΙΙ и ЕУ соответственно). Характеристики углеводных профилей, которые могут быть проанализированы между двумя гликозилированными молекулами или популяциями или составами, включающими гликозилированные молекулы, содержат процентное отношение поверхности пика, процентное отношение домена, расстояние от точки минимума до точки минимума или расстояние от пика до пика.

Определение характеристик Ν-соединенных олигосахаридов СТ^Л4-Iд при помощи БС/М8.

Хроматография пористого графитированного углерода (РОС) в БС/М8 (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия) представляет собой метод анализа профиля Ν-соединенных олигосахаридов, имеет несколько преимуществ по сравнению с высокоэффективной анионообменной хроматографией (НРАЕС). Некоторые из этих преимуществ включают в себя: прямой анализ профиля из гидролизатных смесей, что сводит к минимуму потери и ухудшение качества образцов; прямое подключение М8 предоставляет метод для быстрого определения характеристик и анализа олигосахаридов; увеличенное разрешение благодаря хроматографии РОС позволяет проводить как междоменные сравнения, так и более точный инфра (под)-доменный анализ.

Метод БС/М8 РОС позволяет провести быстрый анализ профиля и определение характеристик олигосахаридов исходя из типа гликана и определение степени сиалирования и ответвления невосстановленного конца углеводов. Спектры масс-спектрометрии режима определения отрицательного иона дают данные, которые легко интерпретировать, при минимальной фрагментации, в то время как режим положительной ионизации позволяет осуществлять проверку структурного класса. Метод, описанный здесь, может быть применен ко всем гидролизатным смесям гликопротеинов, а также к ранее выделенным олигосахаридным образцам, при этом нет необходимости получения производных. Использованные хроматографические подвижные фазы позволяют сбор материалов пиков из профилей и концентрацию на сухости (влагосодержании), не совершая дальнейших действий для более детального определения характеристик. В одном варианте осуществления изобретения используется метод для описания Ν-соединенных олигосахаридов ΟΓΕΑ4-Ι§. С использованием метода БС/М8 РОС*, 31 отличающихся классов олигосахаридов могут быть определены на молекулах СТ^Л4-Iд. состоящих из мономеров, которые имеют последовательности из 8Е0 ΙΌ ΝΟ:2, например 8Е0 ΙΌ ΝΟ:5, 6, 7, 8, 9 или 10.

Была широко использована анионообменная хроматография с высоким рН (НРАЕС), чтобы проанализировать профиль олигосахаридов, высвобожденных из гликопротеинов, при этом нет необходимости получения производных. Высокое разрешение НРАЕС и тот факт, что на разделение влияет тип остатков присутствующего сахара, тип связи, а также размер гликана, являются причинами широкого распространения данной методики. Преобладающим фактором в разделении является заряд, высоко заряженные олигосахариды элюируют позже, чем менее заряженные гликаны. Хроматографические профили часто делятся на домены, определяемые количеством заряженных образцов, обычно остатков сиаловой кислоты, на гликанах (фиг. 17).

Чтобы получить больше информации о структуре неизвестных олигосахаридов, пики НРАЕС могут быть собраны, обессолены и охарактеризованы при помощи М8 и/или ЯМР. Одним из факторов в пользу анализа профиля распределения олигосахаридов при помощи ΗΡЛЕС-ΡЛ^ является вариабельность, присущая режиму обнаружения. Электрохимическое старение клетки и загрязнение поверхности электрода приводит к вариабельности (изменчивости) профиля. Также сообщалось, что олигосахаридные структуры и степень сиалирования могут привести к изменчивости среди клеток детекции при использовании НРАЕС с импульсным амперометрическим детектированием (ΗΡЛЕС-ΡЛ^). Данная изменчивость может повлиять на количественные и относительно количественные результаты, используемые для оценки влияния изменений процесса или определения стабильности от опыта к опыту. Из-за своей скорости и специфичности масс-спектрометрия (М8) завоевала популярность как методика для оценки анализа профиля олигосахаридов гликопротеинов. Хотя М8 профили не могут использоваться непосредственно для определения аномерной конфигурации или типов ответвления, данные М8 могут использоваться для идентификации структурных классов и обнаружения качественных изменений в распределении гликоформы.

В хроматографическом методе анализа профиля с использованием пористого графитированного углерода (РОС) для ферментативно высвобожденных Ν-соединенных олигосахаридов используется как ультрафиолетовое (ИУ), так и масс-спектроскопическое (М8) обнаружение, чтобы проанализировать профиль и охарактеризовать Ν-соединенные олигосахариды, или напрямую из ферментативных гидролизатных смесей или из выделенных олигосахаридов. Этот метод может использоваться для анализа профиля и определения параметров олигосахаридов, высвобожденных из гликопротеинов СТ^Л4-Iд. Метод БС/М8 РОС может оценить консистенцию олигосахаридных распределений, которые происходят в результате процесса производства, а также любых изменений в олигосахаридных распределениях, проис

- 75 017765 ходящих в результате изменений процесса. При хроматографическом микроанализе №соединенных олигосахаридов молекул СТЬА4-1д, ферментативно высвобожденные №соединенные олигосахариды могут быть легко отделены при помощи колонны РСС в порядке увеличения сиалирования и увеличения размера. Диапазон наличествующих структур и относительные количества каждого класса структур определяются благодаря комбинации анализа М8 (масс-спектрометрия) и ИУ (ультрафиолетовый свет) (пример 3).

Чтобы оптимизировать метод ЬС/М8 РСС, может быть полезной оптимизация масс-спектральных условий. Оптимизация может включать ряд экспериментов по картированию поверхности, чтобы оценить влияния состава растворителей и параметров ионизации М8 на обнаружение олигосахаридов. Параметры состава растворителя для оценки содержат ацетонитрил в процентном отношении (по объему) и элюентные добавки (трифторуксусная кислота и гидроксид аммония). Параметры ионизации М8, определенные для оценки, включают параметры температуры десольватации, капиллярного напряжения и конического напряжения для источника электрораспыления.

Параметры ионизации могут играть значительную роль в ответном действии на сигнал. Модель, полученная в результате определения картирования поверхности, использовалась для установки параметров ионизации во время хроматографического определения. Более высокие значения как для температуры десольватации, так и конического напряжения приводят к большей величине ответного действия. Оптимум капиллярного напряжения изменяется в зависимости от элюентных добавок, система растворителя, содержащая ТРА, имеет слегка более высокое оптимальное капиллярное напряжение. Фактором, оказывающим наиболее влияние, является объемный процент ацетонитрил, более высокое содержание ацетонитрила приводит к лучшим ответным действиям.

Хроматография с пористым графитированным углеродом.

Пористый графитированный углерод (РСС) использовался для обессоливания твердофазной экстракции олигосахаридов. РСС был также известен как эффективная хроматографическая среда для олигосахаридного отделения как при кислотных условиях, так и при щелочных условиях элюирования. Разработаны условия хроматографии как для кислотного, так и для щелочного анализа профиля ферментативно высвобожденных олигосахаридов из молекул СТЬА4-1д, имеющих мономерные последовательности из 8ЕЦ Ш N0:2. Каждое условие совместимо и с обнаружением при помощи ИУ (ультрафиолетовый свет), и с обнаружением при помощи М8 (масс-спектрометрия). Как было отмечено в экспериментах по вливанию, кислотные условия элюирования приводят к более высокой чувствительности М8, чем щелочные условия. Ответное действие М8 (масс-спектрометрия) для нейтральных олигосахаридов, элюированных при кислотных условиях, выявленные как аддукты (продукты присоединения) ТРА, составляет от пяти до девяти раз от интенсивности соответствующего пика при щелочных условиях. Разница в ответе на сигнал менее существенная для кислых олигосахаридов, в среднем три раза от ответа на сигнал для моносиалированных гликанов и равна ответу на сигнал для дисиалированных гликанов. Увеличенное количество пиков в элюированной хроматограмме ТРА (фиг. 14А, 14В) по сравнению с элюированной хроматограммой ИН₄0Н (фиг. 15) является результатом разделения аномерных форм олигосахаридов. Сбор материала и концентрация отдельных пиков, элюированных из градиента ТРА, приводят к расщеплению одиночного пика на два пика с идентичной массой после повторного впрыскивания. Базовое элюирование олигосахаридов из колонны РСС приводит к более простому профилю (фиг. 15). Условия базового элюирования не приводят к полному аномерному разделению, тем не менее, наблюдается расширение статически значимого пика. Разрешение пиков может быть увеличено путем увеличения температуры колонны, что увеличивает взаимный обмен аномерных форм (НоН 8., еί а1., 1. СНготакдг. А. 2002, 968(1-2), 89-100). Тем не менее, чувствительность (подсчет ионов) для выявленных олигосахаридов остается уменьшенной по сравнению с кислотными условиями элюирования. Сообщалось, что добавление солей, таких как ацетат аммония, может увеличить чувствительность (С1шппк 8.С. 1. СНготаФдг. А. 500 (1990), 555-583).

Добавление ацетата аммония, трифторацетата аммония или разновидностей форм аммония приводит к увеличенной ответной реакции, а также приводит к ассиметричному расширению пика. Получившееся расширение пика и потенциальная интерференция (вмешательство) добавленной соли при детектировании ИУ (ультрафиолетом) сделало добавление непривлекательным вариантом. Альтернативным средством устранения аномерного разделения является восстановление олигосахаридов до соответствующих альдитов.

Более высокая чувствительность и хроматографическое разрешение делают условия кислотного элюирования полезными для анализа профиля олигосахаридов. Определенный анализ профиля системы состоит из колонны Ьипа С1 8, связанной посредством двух двухпозиционных шестипортовых клапанов с колонной НурегсагЬ 5 мкМ (100x4.6 мм). Колонна НурегсагЬ связывается с ИУ (ультрафиолет) детектором (Аа1егк 2996 РОА) последовательно с О-ТоР М1сго (Мюготакк) со стандартным датчиком Е81 (ионизации методом электрораспыления). Через подходящий орган управления переключателем предварительно очищенные образцы СТЬА4-1д могут быть профилированы с использованием только колонны НурегсагЬ, или гидролизатные смеси могут быть профилированы путем прямого впрыскивания гидролизатной смеси в Ьипа С1 8 последовательно с колонной НурегсагЬ. Обычно, профили получают из N

- 76 017765 соединенных олигосахаридов, высвобожденных из 10-20 нмоль белка.

В определенных вариантах использования изобретения предусмотрена популяция молекул СТЬА4Ц, которые имеют хроматограмму согласно любой одной или более хроматограмм, имеющих репрезентативные пики. Репрезентативные хроматограммы профиля олигосахаридов для молекул СТ^А4-Iд, имеющих мономеры с последовательностями из ЗЕЦ ГО N0:2, показаны на фиг. 13, 14А, 14Б, 15 (РСС), 17 (ΗРΛЕС/РΛ^) и 18. Оба этих хроматографических профиля могут быть разложены на четыре четких домена, содержащих олигосахаридные структуры с увеличивающейся степенью сиалирования в более поздних элюирующих доменах. Хроматографическая система РСС позволяет осуществлять более прямое подключение с детектором масс-спектрометра. Разрешающая способность масс-спектрометра соотношения сигнала к шуму являются приемлемыми даже для олигосахаридов, которые присутствуют в низком процентном содержании. Хроматографическое разрешение отдельных олигосахаридных структур кажется большим в хроматографическом разделении РСС по сравнению с НРАЕС.

Сбор материала по пикам по методу НРАЕС требует обессоливания, а из-за применения высокого рН появляется вероятность реакций отслаивания, что может помешать точной структурной идентификации пиков. Так как хроматографические условия, используемые с хроматографией РСС, не содержат солей, то пики элюированных олигосахаридов могут быть собраны и сконцентрированы при минимальной обработке. Это позволяет собрать и концентрировать элюированные пики, с дальнейшим впрыскиванием собранных олигосахаридов в систему НРАЕС. Повторная инъекция собранных олигосахаридов в систему ΗРΛЕС-РΛ^ позволяет структурное размещение некоторых пиков, присутствующих в профиле НРАЕС (фиг. 17). Из-за неполного разрешения пиков в анионообменной колонне не все из выделенных пиков могут быть картированы в профиль НРАЕС.

Профили, полученные в результате прямого впрыскивания гидролизатных смесей, и профили для выделенных олигосахаридов из того же образца белка не являются идентичными. Профили, полученные в результате прямого впрыскивания (фиг. 18), имеют различные аномерные соотношения, что ведет к предположению, что концентрация собранных олигосахаридов приводит к увеличенной аномеризации. Более важно, профиль, полученный в результате прямого впрыскивания, содержит пик, который соответствует тетра-сиалированной структуре. Данная структура не идентифицируется в профиле собранных и выделенных олигосахаридов. Кроме более короткого времени количественного анализа, анализ профиля напрямую из гидролизатных смесей может привести к более точному отображению олигосахаридного распределения, избегая ухудшения гликана во время сбора и концентрации.

Относительный количественный анализ.

Картирование поверхности, выполненное на образцах вливания, свидетельствует, что объемный процент ацетонитрила оказывает значительное влияние на эффективность ионизации элюируемых олигосахаридов. Зависимость интенсивности сигнала от содержания ацетонитрила в подвижной фазе делает относительный количественный анализ олигосахаридов при помощи масс-спектрометрии зависимым от продолжительности отстаивания элюирующегося пика. Изменения в условии колонны могут повлиять на время элюирования в колонне РСС. По этим причинам трудно получить удовлетворяющий относительный количественный анализ из профиля элюирования ионной хроматограммы. На след υν (УФ) при 206 нм не должен влиять состав растворителя в той же степени, что и ионный след. Относительный количественный анализ был выполнен с использованием следа υν (ультрафиолета), ионный след использовался только для определения параметров и сравнения качества. Дополнительное введение для олигосахаридов, выделенных из одиночной партии гликопротеина, привело к (в процентах) относительному допустимому стандартному отклонению (%Ε8Ό) менее 4% для каждого из четырех олигосахаридных доменов, чье количество было определено.

О-соединенные структуры в молекулах СТ^А4-Iд, содержащих мономеры из 8ЕЦ ГО N0:2.

Кроме №соединенных углеводов молекулы СТ^А4-Iд могут содержать О-соединенные углеводы. О-соединенные олигосахаридные структуры могут быть проанализированы с использованием серии методики ортогональной масс-спектрометрии. Эти методики включают несколько расщеплений энодпептидазы, за которыми следует анализ ЬС/М8/М§.

Что касается молекул СТ^А4-Iд, образованных из мономеров, имеющих последовательность из ЗЕЦ ГО N0:5, 6, 7, 8, 9 или 10, то два основных участка О-соединенного гликозилирования были охарактеризованы с использованием точной масс-электрораспылительной ионизации, и были определены главные структуры О-соединенного участка. Эти данные приведены на фиг. 9. Данные согласуются с тремя находящимися там главными О-соединенными структурами: (СаТОАс)1 (Са1ф (№иАс)1 (СаГОАсф (СаЦ (№иАс)₂ (СаШАс)1 (С1с№с)1 (Са1)₂ (№иАс)₂. Каждая структура регистрируется в различных количествах на каждом участке. Эти величины являются относительно количественными и представляют данные, полученные в результате многочисленных анализов. О-соединенные олигосахариды вводят значительное количество сиаловой кислоты для СТ^А4-Iд. На каждую цепь существуют две основные точки присоединения О-соединенных олигосахаридов. Первичным участком появления О-соединенных олигосахаридов является 8ег¹⁶⁵, который занят примерно 95% времени. Вторичным участком появления Осоединенных олигосахаридов является §ег^155/156, который занят = 25% времени. Ортогональные данные, имеющиеся в данном документе, предоставляют обзор преобладающих углеводных структур, присутст

- 77 017765 вующих на таких молекулах СТ^А4-Iд, и они приведены на фиг. 9.

Вообще говоря, О-соединенные углеводы обладают гораздо большей гетерогенностью структуры, чем те, которые присутствуют в Н-соединенных углеводах. Кроме того, не существует согласованной последовательности для О-соединенного присоединения. Таким образом, были разработаны серии ортогональных методик для использования в структурном определении параметров О-соединенных олигосахаридов: интактный анализ ЕС МБ и гликопептидный анализ ЕС... МБ.

Сообщалось, что основываясь на расщеплении по Эдману и МА^^I (Ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы), О-соединенный участок является Бег¹⁶⁵ (что касается БЕС ΙΌ N0:2). Чтобы получить прямые данные для присутствия гликозилирования Бег¹⁶⁵, было выполнено секвенирование МБ/МБ с использованием ионной серии Ъ¹ и у на пептиде Т9 (см. табл. 4 и 5). В табл. 4 перечислены ионные серии для пептида Т9 в четырех различных участках гликозилирования. Во всех четырех состояниях серии Ъ' ионов ионы Ъ1-Ъ6 согласуются. Однако серии ионов Ъ', Ъ7-Ътах отличаются по различным состояниям гликозилирования в Ъ7 (Бег¹⁶⁵). В качестве подтверждения сообщается о соответствующей серии ионов у. Во всех четырех сериях ионов у ионы у1-у19 полностью согласуются. Тем не менее, серии ионов у, у20-умакс отличаются по различным состояниям гликозилирования в у20 (Бег¹³⁹). Группы ионов Ъ' и у, вместе, подтверждают секвенирование по Эдману, а именно, что Бег¹³⁹ является первичным участком О-соединенного гликозилирования на пептиде Т9. Т9 является пептидом, который содержит несколько остатков серина и теронина.

В табл. 4 представлены ионы Ъ' и у ЬС/МБ/МБ для пептида Т9 с и без О-соединенной лестницы (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1. Серии ионов Ъ' идентичны для всех спектров до Ъ7, где спектр отличается по О-соединенной углеводной структуре, перечисленной над каждой серией. Серии ионов у' идентичны для всех спектров до у19, где спектр отличается по О-соединенной углеводной структуре, перечисленной над каждой серией.

Таблица 4

Ионы Ъ' и у ЬС/МБ/МБ для пептида Т9

Т9-0аШАс-0а1-	Т9-0а1Кас-С1а1	Т9-ОаШас	Т9
	Ь’	У		Ь*	У		Ь’	У		Ь’	У
1 ТЬг 26	102.1		ΓΠ1Γ 26	102.1		ГГЬг 26	102.1		ГГЬг 26	102.1	тм
2 ΗΪ8 25	239.1	3243.6	2 ΗΪ8 25	239.1	2952.5	2 Ηΐδ 25	239.1	2790.5	2 Ηίδ 25	239.1	2587.4
ЗТйг 24	340.2	3106,6	ЗТЬг 24	340.2	28152.5	ЗТйг 24	340.2	2653.4	ЗТЬг 24	340.2	2450.3
4 Зег 23	427.2	3005.5	4 Зег 23	427.2	2714.4	4 Зег 23	427.2	2552.4	4 Зег 23	427.2	2349.3
5 Рго	524.2	2918.5	5 Рго	524.2.	2627.4	5 Рго	524,2	2465-3	5 Рго	524,2	2262.3
22			22			22			22
6 Рго	621.3	2821.4	6 Рго	621.3	2530,3	6 Рго	621.3	2368.3	6 Рго	621.3	2165.2
7 01к	1364.6	2724.4	7 01п	1073.52	2433.3	7 ОН	911.4	2271.2	7 Зег	708.3	2068.1
8 Рго	1461.6	1981.1	8 Рго	1170.5	1981.1	8 Рго	1008.5	1981.1	8 Рго	605.4	1981.1
9 А1а	1532.6	1884.1	9 А1а	1241.6	1884.1	9 А1а	1079.5	1884.1	9 А1а	876.4	1884.1

- 78 017765

10 Рго 17	1629.7	1813.0	10 Рго	1338.6	1813.0	10 Рго	1176.6	1813.0	10 Рго	973.5	1813.0
11 О1и	1758.7	1716.0	11 О1и	1467.6	1716.0	11 О1и	1305.6	1716.0	11 О1и	1102.5	1716.0
12 Ьеи	1871.8	1586.9	12 Ьеи	1580.7	1586.9	12 Ьеи	1418.7	1586.9	12 Ьеи	1215.6	1586.9
13 Ьеи	1984.9	1473.8	13 Ьеи	1693.8	1473.8	13 Ьеи	1531,8	1473.8	13 Ьеи	1328.7	1473.8
14 СИу	2041.9	1360.8	14 СИу	1750.8	1360.8	14 СИу	1588.8	1360.8	14 СИу	1385.7	1360.8
15 СИу	2099.0	1303.7	15 СИу	18070.9	1303.7	15 СИу	1645.8	1303.7	15 СИу	1442.7	1303.7
16 Зег 11	2186.0	1246.7	16 Зег	1894.9	1246.7	16 Зег	1732.8	1246.7	16 Зег	1529.8	1246.7
17 Зег 10	2273.0	1159.7	17 Зег	1981.9	1159.7	17 Зег	1819.9	1159.7	17 Зег	1616.8	1159.7

Таблица 5 О-Соединенные гликопептидные фрагменты с соответствующими номерами последовательностей, последовательностями аминокислот и теоретическими массами

Фермент Фермент последовательность Аминокислот, последовательность Немодифицирован. масса

Фрагмент Фрагмент_(8ЕО ΙΡ ΝΟ;2) ______________

Трипсин Т9 159-184 ТНТ8РР8РАРЕЬЬСО88УРЬРРРКРК 2688.44 ,

Α§ρΝ____Р8____ 150-156 РОЕРК88__________________790.36______

Тгур/ нет данных 159-171

ТНТ8РР8РАРЕЬЬ 1345.7 сЬгто

О-Соединенные углеводные структуры в Зег представляют гетерогенную популяцию трех основных образцов. На фиг. 19 гликопептид Т9 наблюдается в деконволютированном спектре. Существует базовый пик при 2689.2 ати (атомная единица массы), который согласуется с теоретической массой для данного пептида, который составляет 2689.11 ати (атомная единица массы). Спектр иллюстрирует три основные О-соединенные структуры. Спектр иллюстрирует базовый пептид с лестницей сахара, согласующейся с О-соединенной структурой (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1. Увеличенная отчетливая часть спектра увеличена в 10 раз, и в ней определены две дополнительные О-соединенные структуры, согласующиеся с (Са№Ас)1 (Са1)1 ^еиЛчЬ и (Са№Ас)_ь (СШАс)1 (Са1)2 ^еиАсЬ

Была использована масс-спектрометрия для оценки относительного содержания каждого из Осоединенных видов. На фиг. 19 гликан (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1 отмечен в соотношении 10:1 с гликаном (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)₂ и в соотношении 30:1 с гликаном (СаШАс)1 (С1сNАс)1 (Са1)₂ (№иАс)₂. Далее в одном варианте осуществления изобретения предусмотрена популяция, включающая молекулы СТ^А4-Iд, в которой имеется соотношение 10:1 гликана (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1 к гликану (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)₂. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрена популяция, включающая молекулы СТ^А4-Iд, в которой имеется соотношение 30:1 гликана (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1 к гликану (СаШАс)1 (С1сNАс)1 (Са1)₂ (№иАс)₂. Гликан (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)₂ отмечен в соотношении 20:1 с гликаном (НеxNАс)₂ (Са1)₂ (№иАс)₂. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрена популяция, включающая молекулы СТ^А4-Iд, в которой имеется соотношение 20:1 гликана (СаШАс), (Са1), (№иАс)₂ к гликану (НеxNАс)₂ (Са1)₂ (№иАс)₂. В другом варианте осуществления изобретения предусмотрена популяция, включающая молекулы СТ^А4-Iд, которая включает все вышеприведенные соотношения в данном параграфе. Кроме того, масс-спектр электрораспыления отрицательного иона подтверждает эти три преобладающие структуры; относительное содержание каждой показано на фиг. 9.

Что касается молекул СТ^А4-Iд, содержащих мономеры ЗЕО ΙΌ N0:2, в добавление к участку Зег¹⁶⁵, отмечен О-соединенный участок в Зег или Зег¹⁵⁶. Этот участок именуется как Зег^155/156. Пептид Ό8, содержащий Зег^155/156, был образован из расщепления А8ρN и соответствует аминокислотам 150-156 из ЗЕО ΙΌ N0:2. Пептид отделен и обнаружен при помощи ЬС/МЗ. Спектр (не показанный здесь) для Осоединенного гликопептида Ό8 показывает базовый пик в 790.2 а.е.м. (атомная единица массы), который согласуется с теоретической массой в 790.8 а.е.м. Спектр показывает ион пептида и серию ионов, которые согласуются со структурой, (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1. Пептид является преимущественно негликозилированным; гликозилированные виды (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1 составляют примерно 22% поверхности пика.

- 79 017765

О-Соединенные олигосахаридные структуры одиночной цепи СТЬА4-[д были охарактеризованы с использованием серии методик ортогональной масс-спектрометрии. Эти методики включают расщепления эндопептидазов с анализом ЬС/М8 двух преобладающих участков О-соединенного гликозилирования с использованием электрораспылительной ионизации, чтобы определить преобладающие структуры на каждом О-соединенном участке. Эти данные приведены на фиг. 20. Могут находиться четыре преобладающие О-соединенные структуры: ЮаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1; (6аШАс)1 (Са1), (№иАс)₂; (ΗеxNЛс)₂ (Са1)₂ (№иАс)₂; (ΗеxNЛс)₂; (Са1)₂, (№иАс)₃. Эти структуры обнаружены в различных количествах на каждом участке. Более 95% одиночной цепи СТБА^Тд имеет, по меньшей мере, (НехИАс)₂ (Са1)₂ (№иАс)₂.

Был разработан еще один количественный анализ, чтобы подтвердить О-соединенные углеводы и поискать менее преобладающие структуры. В этой методике использовано совокупное расщепление трипсина и химотрипсина, чтобы получить пептид, который является ТИТБРРБРАРЕЕЕ (аминокислоты 159-171, 8Е0 ΙΌ N0:2), что подтверждается М8/М8. Данный пептид позволил идентифицировать один из моносиалированных, два дисиалированных и один из трисиалированных О-соединенных вида. Не была разъяснена определенная структура для три-сиалированных вида, тем не менее, предложены две возможности: пептид, содержащий структуру с 2 ядрами с 3 сиаловыми кислотами, или две структуры с 1 ядром, присутствующие на двух остатках различных аминокислот.

Была использована дополнительная методика, интактный анализ при помощи М8 для подтверждения присутствия гетерогенных О-соединенных гликозилирований молекул СТ^Л4-Iд. Димеры СТЕА4-[д и одиночная цепь СТ^Л4-Iд были обработаны РНСахе Р, чтобы удалить №соединенные олигосахариды. Затем при помощи масс-спектрометра была выявлена молекула, и соответствующие волны были восстановлены из свертки в спектр. В материале одиночной цепи преобладающим составом гликана является (НехИАс)₂ (Нех)₂ (№иАс)₂, в то время как эталонный образец - это преимущественно (НеxNЛс)1 (Нех)1 (№иАс)1. Составы гликозилирования согласуются с составами, наблюдаемыми во время анализа пептидов при помощи ЬС/М8. Кроме изменения характера О-соединенного гликозилирования наблюдалась вторая большая модификация. Наблюдается смещение массы 113±4 а.е.м. (ед.) между не восстановленными видами одиночной цепи и восстановленным стандартом СТ^Л4Iд. Смещение массы 113±4 а.е.м. (ед.) исчезло после восстановления (редукции) с ОТТ (дитиотреитол). В материале димера получившаяся ионная оболочка была восстановлена из свертки в спектр (здесь не показано) с главным пиком при 79944 а.е.м., что соответствует присутствию двух структур (СаШАс)1 (Са1)1 (№иАс)1. Следующий самый большой пик при 80600 а.е.м. соответствует трем О-соединенным структурам или комбинации одной наиболее разветвленной О-соединенной структуры.

Третий самый большой пик соответствует или четырем О-соединенным структурам, или комбинации, содержащей, самое большее, две разветвленные О-соединенные структуры.

Определение содержания сиаловой кислоты.

Другим аспектом определения параметров гликопротеина является определение сиаловой кислоты. Содержание сиаловой кислоты может быть характерным признаком гликопротеина. Содержание сиаловой кислоты гликопротеина по данному изобретению может быть оценено традиционными методами. Например, сиаловая кислота может быть отдельно определена прямым колориметрическим методом (Уао е1 а1., 1989, Апа1. Вюсйет. 179:332-335), с использованием, по меньшей мере, тройных образцов (в тройном повторе). Другой метод определения сиаловой кислоты включает использование тиобарбитуровой кислоты (ТВА), описано ХУаггеп и др., 1959, 1. Вю1. Сйет., 234:1971-1975. Еще один метод включает высокоэффективную хроматографию, такую, которая было описана Н.К. 0да\\а и др., 1993, 1. СйготаЮщарйу. 612:145-149.

В одном варианте осуществления изобретения метод определения количества №ацетил нейраминовой кислоты (NЛNЛ) и №гликолил (ацильный радикал гликолевой кислоты) нейраминовой кислоты (НСНА) осуществляется посредством обработки кислотным гидролизом интересующего гликопротеина (например, см. пример 3). В этом методе NЛNЛ и NСNЛ отщепляются от белка при помощи кислотного гидролиза. В одном варианте осуществления изобретения гликопротеин очищается при помощи методов, которые наиболее подходят для его очистки. Выделенные NЛNЛ и NСNЛ отделяются при помощи НРЬС в колонне Иехех Мопокассйапбе ИНМ и определяются при помощи оптического ультрафиолетового света (206 нм). NЛNЛ и NСNЛ определяются количественно, основываясь на факторах ответной реакции стандартов по NЛNЛ и NСNЛ, имеющихся в настоящее время. Результаты могут быть выражены в виде молярного отношения (МИ) NЛNЛ и NСNЛ соответственно к белку.

Целью метода кислотного гидролиза измерения содержания сиаловой кислоты является измерение общего количества сиаловой кислоты (NЛNЛ и NСNЛ) по отношению к белку в образцах СТЕА4-[д или СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд (молярные отношения). Тем не менее, важно отметить, что эти молярные отношения сиаловой кислоты включают как связанные, так и свободные NЛNЛ и NСNЛ. Результаты молярного отношения получены на основании сравнения площадей пиков NЛNЛ и NСNЛ из гидролизованных образцов СТЕА4-[д или СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд по сравнению с негидролизованными стандартами NЛNЛ и NСNЛ. Могут использоваться также гидролизованные стандарты NЛNЛ и NСNЛ.

- 80 017765

Например, были получены молярные отношения для молекул СТЬА4-1д, имеющих последовательности аминокислот 8Е0 Ш N0:2. Без гидролиза интересующий пик в хроматограммах стандартов NАNА и NСNА выглядит как одиночный пик. Когда стандарт NАNА и образцы СТЬА4-1д гидролизуются, получившиеся хроматограммы показывают NАNА как главный пик, к которому непосредственно примыкает небольшой ступенчатый (откосный) пик (<10% от поверхности главного пика; который называется как уменьшенная NАNА); та же концентрация стандартов NАNА с и без гидролиза приводит к очень плотным поверхностям пика, включая деструкционные. В хроматограмме для образцов пониженной NСNА пик не виден отчетливо, хотя подсчеты поверхности пика NСNА в гидролизованном стандарте NСNА показывают, что они уменьшаются на приблизительно 8-9%. Эксперименты с массспектрометрией (М8) показали, что деструктированная NАNА как в гидролизованном стандарте NАNА и гидролизованных образцах СТЬА4-1д получается при потере 18 Да (воды) из NАNА. Следовательно, метод соответственно включает малый ступенчатый пик в комплексе пика NАNА в гидролизованном СТЬА4-1д. Также было показано при помощи экспериментов М8, что NСNА дегидролизуется, отщепляя ион с массой 18 Да. Полученная в результате деструкции NСNА элюирует между NАNА и получающейся при деструкции NАNА, так что ИУ (ультрафиолетовый свет) не обнаружил его. В материале СТЬА4-1д содержание NСNА составляет приблизительно 5% от содержания NАNА и, в результате, со-элюирование деструкционного NСNА вызывает менее 0.5% изменения поверхности пика NАNА, что находится в пределах диапазона изменчивости поверхности пика NАNА. Метод не может включать поверхность деградированного NСNА в результатах по NСNА; следовательно, результат по NСNА может быть ниже на < 10%, также в пределах изменчивости данного метода.

Так как думали, что NСNА является более иммуногенным, чем NАNА, клиническое предпочтение отдается рекомбинантной терапии, которая включает низкое молярное отношение NСNА. В одном варианте осуществления изобретения преобладанием сиаловой кислоты в популяции молекул СТЬА4-1д является NАNА, а не NСNА, где в популяция молярное отношение грамм-молей сиаловой кислоты на грамм-моль молекул или димера СТЬА4-1д составляет от (приблизительно) 5 до (приблизительно) 18. В другом варианте осуществления изобретения преобладанием сиаловой кислоты в популяция молекул СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д является NАNА, а не NСNА, где в популяции молярное отношение грамм-молей сиаловой кислоты на грамм-моль молекул или димера СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д составляет от (приблизительно) 5.5 до (приблизительно) 8.5.

Полигенные экспрессирующие кластеры СТЬА4-1д и СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

Данным изобретением предусмотрено кодирование нуклеиновой кислоты молекулы СТЬА4-1д, которая представляет собой полигенный экспрессирующий кластер в одном варианте осуществления изобретения. Изобретением также предусмотрено кодирование нуклеиновой кислоты молекулы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д. В одном варианте осуществления изобретения кодирование нуклеиновой кислоты молекулы СТЬА4-1д содержится внутри полигенного экспрессирующего кластера. В другом варианте осуществления изобретения кодирование нуклеиновой кислоты молекулы СТЬА4-1д содержится внутри полигенного экспрессирующего кластера, полученного из плазмида, обладающего нуклеотидной последовательностью 8Е0 Ш N0:17. В других вариантах осуществления изобретения кодирование нуклеиновой кислоты молекулы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д содержится внутри полигенного экспрессирующего кластера. В определенных вариантах осуществления изобретения кодирование нуклеиновой кислоты молекулы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д содержится внутри полигенного экспрессирующего кластера, полученного из плазмиды, депонированной как АТСС Ассеззюп N0. РТА-2104.

Нуклеиновыми кислотами данного изобретения может быть кДНК, ДНК-подобные или РНК молекула (представляющих интерес) нуклеиновой кислоты в выразимом формате, таком как полигенный экспрессирующий кластер, который может быть экспрессирован при использовании природного (естественного) промотора или деривата (производного) или полностью гетерологичного промотора. В качестве альтернативы представляющая интерес нуклеиновая кислота может кодировать антисмысловую РНК. Представляющая интерес нуклеиновая кислота может кодировать белок (например, гликопротеин, такой как гликопротеин СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д) и может включать или не включать интроны.

В одном варианте осуществления изобретения кодирование нуклеиновой кислотой пептида, обладающего активностью СТЬА4, можно осуществлять при использовании геномной ДНК Т-клетки или из мРНК, присутствующей в активированных Т-лимфоцитах. В другом варианте осуществления изобретения кодирование нуклеиновой кислотой СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д также можно осуществлять при использовании геномной ДНК Т-клетки или из мРНК, присутствующей в активированных Т-лимфоцитах. В другом варианте осуществления изобретения ген, кодирующий представляющий интерес белок, например СТЬА4 или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, может быть клонирован или из геномной библиотеки, или из кДНК согласно стандартным протоколам специалистом в данной области. Например, кодирование кДНК для СТЬА4 или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д может быть получено путем выделения полной мРНК из подходящей клеточной линии. С использованием методов, известных в данной области, двойные скрученные кДНК могут быть подготовлены из цельной мРНК и впоследствии могут быть вставлены в подходящий бактериофаговый вектор или плазмиду. Гены также могут быть клонированы с использованием методики РСК (ПЦР-полимеразная цепная реакция), которая является общепринятой в данной области. В одном вари

- 81 017765 анте осуществления изобретения ген, который кодирует СТБА4 или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, может быть клонирован посредством ПЦР в соответствии с информацией о последовательности нуклеотидов, предоставленной данным изобретением.

В другом варианте осуществления изобретения вектор ДНК, содержащий кДНК СТБА4 или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, может действовать как матрица в реакциях ПЦР, где олигонуклеотид-праймеры, предназначенные для усиления участка, представляющего интерес, может использоваться для получения выделенного фрагмента ДНК, охватывающий участок (та!). В конкретном варианте осуществления изобретения представляющий интерес участок, заданный в кДНК СТБА4, может быть внеклеточным доменом СТБА4, включая внеклеточный домен человеческого СТБА4. В определенных вариантах представляющий интерес участок, заданный в кДНК СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, может быть внеклеточным доменом СТБА4 с изменениями аминокислот в положении аминокислот 55 и 130 в δΕΟ ΙΌ N0:2 (например, см. δΕΟ ΙΌ N0:18), включая внеклеточный домен человеческого СТБА4, скрывающий изменения аминокислот, описанные выше.

Чтобы представить гибридный белок в контексте данного изобретения, слияние химерного гена в одном варианте (например, генное кодирование гибридного белка СТЬА4-иммуноглобулина (СТ^Λ4-Iд) или гибридного белка СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд) включает последовательность нуклеотидов, которая кодирует сигнальную последовательность, посредством чего после транскрипции (считывание генетического кода) и трансляции химерного гена вновь синтезированный гибридный белок направляется для секреции (выделения). В одном варианте осуществления изобретения может использоваться нативная сигнальная последовательность СТБА4 (например, сигнальная последовательность человеческого СТБА4, описанная в Нагрег К. и др. (1991, 1. Iттиηο1. 147.1037-1044)). В альтернативном варианте использования изобретения может использоваться последовательность гетерологичных сигналов для направления секреции СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд (например, сигнальная последовательность онкостатина-М (Ма11к N. и др., 1989, Мо1 Се11 Βίο1 9(7), 2847-2853) или сигнальная последовательность иммуноглобулина). Специалист в данной области понимает, что последовательность нуклеотидов, соответствующая последовательности сигналов, может быть вставлена в слияние химерного гена согласно стандартной методике рекомбинантной ДНК, такой, которая осуществляется путем совершения лигирования внутри рамки (считывания) сигнальной последовательности в 5' конце последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей СТБА4.

Согласно условиям Будапештского договора ДНК, кодирующая последовательность аминокислот, соответствующая гибридному белку СТ^А4-Iд, была депонирована в Атепсап Туре Си1!иге Со11ес!юп Американская коллекция типовых культур (АТСС), 10801 иштегвПу Β1νά., Мапаззаз, УА, 20110, 31 мая, 1991. Ей был присвоен номер АТСС Ассеззюп N0. 68629. Кроме того, плазмида экспрессии, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующий последовательность аминокислот, соответствующий СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, была депонирована согласно условиям Будапештского договора 19 июня, 2000 в АТСС. Депонированная плазмида была зарегистрирована под номером АТСС Ассеззюп N0. РТА2104. Депонированная плазмида также обозначается как ρΌ16 ^ΕΛ29Υ и ρΌ16 ^104ΕА29Υ. СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд далее описывается в патенте США № 7094874 и находящейся на рассмотрении заявке на патент США номера 09/579927, 60/287576 и 60/214065, и в опубликованной Международной патентной заявке \¥0 01/923337 А2, все они включены при помощи ссылок в данное заявление во всей полноте.

Вектор экспрессии изобретения может использоваться, чтобы трансфицировать клетки, эукариотические (например, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих или насекомых) или прокариотические, чтобы получить белки (например, гибридные белки, такие как молекулы СТ^Λ4-Iд. СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд и т.п.), кодированные последовательностями нуклеотидов вектора. Специалист в данной области понимает, что представление необходимых белковых продуктов в прокариотах наиболее часто выполняется в Е.со11 с векторами, которые содержат конститутивные или индуцируемые промоторы. Некоторые векторы выражения Е.соБ (также известные в данной области как слияние векторов) предназначены для того, чтобы добавлять ряд остатков аминокислоты, обычно к Жконцу представляемого рекомбинантного белка. Упомянутые векторы слияния могут выполнять три функции: 1) увеличить растворимость желаемого рекомбинантного белка; 2) увеличить экспрессию рекомбинантного белка, представляющего интерес; и 3) способствовать очистке рекомбинантного белка, действуя как лиганд в очистке по структурной близости. Некоторые примеры векторов экспрессии экссудата включают, но не ограничиваются ими: а) рСΕX (корпорация Атгак Согр., Мельбурн, Австралия), который соединяют глутатион δ-трансферазу до необходимого белка; Ь) ркДНК ™3.1/У5-Н18 А В & С (корпорация 'ЧпуЦгодеп Согр, Карлсбад, Калифорния), который присоединяет 6х-Н18 к рекомбинантным белкам, представляющим интерес; с) рМАБ (компания №\ν Επ^Ε-ιι^ Вю1аЬ8, Беверли, Массачусетс), который соединяет мальтоза-Е-связывающий белок с целевым (представляющим мишень) рекомбинантным белком.

Клетки, подходящие для культивирования согласно процессам и методам настоящего изобретения, могут скрывать внедренные векторы экспрессии (конструкции), такие как плазмиды и т.п. Конструкции вектора экспрессии могут быть введены посредством трансфекции, липофекции, трансформации, введения, электропорации или заражения. Векторы экспрессии могут содержать последовательности кодирования или ее части, кодируя белки для экспрессии и производства в процессах культивирования. Подоб

- 82 017765 ные векторы экспрессии могут включать необходимые компоненты для транскрипции и трансляции представляющей интерес последовательности кодирования. Векторы экспрессии, содержащие последовательности кодирования полученных белков и полипептидов, а также соответствующие элементы контроля транскрипции и трансляции, могут быть получены с использованием методов, хорошо известных и практикуемых в данной области. Эти методы включают методы ш уйго (в лабораторных условиях) рекомбинантной ДНК, синтетические методы и ш νί\Ό (в организме) генетическую рекомбинацию, которые описаны 1. 8атЬгоок и др., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог Ргезз, Р1атм1еху, КУ, и в Е.М. Аи8иЬе1 и др., 1989, Сиггеп! Рго!осо1з т Мо1еси1аг Вю1оду, 1окп \Уйеу & 8опз, №\ν Уогк, КУ.

Подходящий маркёр может использоваться в рекомбинантном векторе экспрессии (например, плазмида), где вектор стабильно интегрируется в геном клетки, чтобы придать устойчивость клеткам, скрывающим вектор. Это позволяет осуществить их выбор в подходящей среде для селекции. Ряд систем может использоваться, включая, но не ограничиваясь, гены гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (НСРКТ), вируса простого герпеса тимидинкиназы (Н8У ТК) (^1д1ег и др., 1977, Се11, 11:223), (8хуЬа1зка апб 8хуЬа1зкГ 1992, Ргос. Асай. 8ск И8А. 48:202) и аденин фосфорибозилтрансферазы (АР-КТ), (Ьо\\у е! а1., 1980, Се11. 22:817), которые могут применяться в кдрй-, !к- или арП-клетках соответственно.

Следующие неограничивающие примеры маркёрные гены, которые могут содержаться внутри вектора экспрессии, также могут использоваться как основа выбора для антиметаболитной резистентности: цр1, который придает резистентность к микофеноловой кислоте (МиШдап апй Вегд, 1981, Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А. 78:2072); йЫт, который придает резистентность к метотрексату (^1§1ег е! а1., 1980, Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А. 77:357; апй 0'Наге е! а1., 1981, Ргос. Асай. 8ск И8А. 78:1527); Будто, который придает резистентность к гигромицину (8ап!егге е! а1., 1984, Сепе. 30:147); и пео, который придает резистентность к аминогликозиду С418 (С11шса1 Рйагтасу. 12:488-505; \Уи апй ^и, 1991, Вю1кегару. 3:87-95; То1зЮзкех, 1993, Апп. Кеу. Ркагтасо1. Тох1со1. 32:573-596; МиШдап, 1993. 8с1епсе. 260:926-932; Апйегзоп, 1993, Апп. Кеу. Вюскет. 62:191-21; Мау, 1993. Т1В Теск. 11 (5):155-215). Методы рекомбинантной ДНК, общеизвестные в данной области, могут регулярно применяться для выбора необходимых клонов рекомбинантных клеток. Подобные методики описаны, например, Аи8иЬе1 и др. (ейб.), Сиггеп! РгоЮсо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойп \Уйеу & 8опз, ΚΥ (1993); Кпед1ег, 1990, Сепе ТгапзГег апй Ехргеззюп (Перенос и экспрессия генов), А ЬаЬога!огу Мапиа1 (лабораторный справочник), 8!оск!оп Ргезз, ΚΥ; главы 12 и 13, Бгасорок е! а1. (ейз), Сиггеп! Рго!осо1з ш Нитап Сепексз (Текущие исследования в генетике человека), 1окп \Уйеу & 8опз, ΚΥ (1994); Со1Ьегге-Сагарш и др., 1981. 1. Мо1. Вю1. 150:1, на данные издания имеются ссылки в данном документе.

Уровни экспрессии в молекуле белка могут быть повышены путем амплификации вектора экспрессии, см. в ВеЬЬтдГоп апй Неп!зсйе1, Тке изе ок уесЮгз Ьазей оп депе атркПсакоп Гог !ке ехргеззюп ок с1опей депез т таттакап се11з ш ^NА с1ошпд (Использование векторов, основываясь на генной амплификации для экспрессии клонированных генов в клетках млекопитающих при клонировании ДНК), Уо1. 3, Асайетю Ргезз, №ν Уогк, 1987). Повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуральной среде клетки-хозяина, увеличивает количество копий маркёрного гена, когда маркёры в системе вектора экспрессии, экспрессирующей белок (представляющий интерес), амплифицируются. Так как амплифицируется участок связи с геном, кодирующим белок, выход белка увеличится (Сгоизе е! а1., 1983, Мо1. Се11. Вю1., 3:257). Векторы, которые скрывают последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют для глутамин синтазы (С8) или дигидрофолат редуктаза (БНЕК) селектируемых маркёров, могут быть усилены в присутствии медикаментов метионин сульфоксимин или метотрексат соответственно. Преимуществом таких векторов является наличие клеточные линий, например клеточной линии миеломы крыс, N80 и яичников китайского хомячка, СНО, клеточной линии БС44, которые являются глутамин синтаза отрицательной и дигидрофолатредуктаза отрицательной соответственно.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая растворимую молекулу гибридного белка СТЬА4 или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, может быть вставлена в вектор экспрессии, предназначенной для экпрессирования инородных последовательностей в эукариотическом носителе. Регуляторные компоненты вектора могут варьировать в зависимости от эукариотического носителя, выбранного для использования. Векторы, используемые для экпрессирования растворимого СТЬА4 или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д в эукариотических клетках-хозяинах, могут включать последовательности генов-усилителей для оптимизации экспрессии белка.

Клетки млекопитающих (такие как клетки ВНК, клетки УЕК0, клетки СНО (яичника китайского хомячка) и т.п.) могут скрывать вектор экспрессии (например, тот, который содержит ген, кодирующий гибридный белок СТЬА4-1д или гибридный белок СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д) посредством введения вектора экспрессии в подходящую клетку-хозяина. Соответственно изобретение охватывает векторы экспрессии, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует гибридный белок СТЬА4-1д или гибридный белок СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д и охватывает клетки-хозяина, в которые подобные векторы экспрессии могут быть введены при помощи методов, известных в данной области. Как описано в данном документе, вектор экспрессии по данному изобретению может включать последовательности нуклеотидов, которые кодируют гибридный белок СТЬА4-1д или гибридный белок СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, соединен

- 83 017765 ных по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью способом, который позволяет экспрессию последовательности нуклеотидов в клетке-хозяине. Тем, кто работает в данной области, хорошо известны регуляторные последовательности и их можно выбрать для того, чтобы направить экспрессию белка (представляющего интерес) в соответствующую клетку-хозяина, как это описано у Соеббе1, 0епе Ехргеккюп ТесЬпо1оду (технология экспрессии генов): Мебюбк ш Епхуто1оду (методы в ферментологии) 185, Асабеплс Ргекк, Сан-Диего, Калифорния (1990). Регуляторные последовательности могут включать следующее: гены-усилители, промоторы, сигналы полиаденилирования и другие элементы управления экспрессией. Специалисты-практики в данной области понимают, что разработка вектора экспрессии может зависеть от факторов, таких как выбор клетки-хозяин, которые должны быть трансфицированы, и/или тип, и/или количество необходимого белка, который нужно экспрессировать ехргеккеб.

Плазмиды клонирования и экспрессии (например, рс® и р|БН) созданы, как описано в примере 11. В одном варианте осуществления данного изобретения выделенный фрагмент ДНК из плазмиды рЗУ2б11Гг- связан с лигандами к остову вектора ркДНК 3, образуя вектор экспрессии рс®. Вектор рс® включает в себя следующие признаки: промотор цитомегаловирус (СМУ), за которым следует множественный сайт клонирования (МСЗ); последовательность сигнала полиаденилирования и транскрипционной терминации гормона роста крупного рогатого скота (В0Н); последовательность бЬГг кДНК мыши для выбора и амплификации; ген резистентности к ампициллину и репликатор рИС для выбора и сохранения в ЕксйепсЫа со11. Создан вектор р|Б№ содержащий кДНК, кодирующий части последовательности аминокислот, соответствующей фрагменту внеклеточного домена рецептора человеского СТЬА4 (пример 11), где кДНК, кодирующая первую последовательность аминокислот, присоединяется к ДНК, кодирующей вторую последовательность аминокислот, что соответствует области ^С, это позволяет экспрессию гена рецептора СТЬА4, путем изменения растворимости экспрессированного белка СТЬА4 (см. фиг. 1 и краткое описание фиг. 1, информация об остатках, соответствующих внеклеточной части СТЬА4 и константной области ^01). В одном варианте осуществления изобретения сигнальная последовательность пептида онкостатина М может быть присоединена к последовательности аминокислот, соответствующей внеклеточному домен у СТЬА4, который впоследствии присоединяется ко второй последовательности аминокислот, соответствующей домену (например, домен человеческого [дС^^). как было описано ранее на фиг. 1. Сигнальная последовательность онкостаина М позволяет образовывать растворимые формы белкового продукта гена СТЬА4 (например, СТ^Α4-Iд).

Чтобы создать вектор экспрессии рс®, содержащий ген, кодирующий гибридный белок СТЬА4иммуноглобулина, могут быть использованы методы, хорошо известные в данной области (например, субклонирование сайта рестрикции). Исходным материалом для одного варианта данного изобретения может быть сброженный (гидролизованный) и отделенный фрагмент ДНК из вектора клонирования р|Б№ описанный в примере 11. В другом варианте осуществления изобретения фрагмент ехс1кеб ДНК из упомянутого вектора содержит последовательность аминокислот сигнальной последовательности онкостатина М и гибридного белка СТЬИд, где указанный фрагмент ДНК связан лигандами с сброженным (гидролизованным) вектором рс® уес1ог. Фрагмент ДНК онкостатина М-СТ^Α4-Iд может быть вставлен между промотром СМV и кластером, содержащим последовательность сигнала полиаденилирования и транскрипционной терминации гормона роста крупного рогатого скота (В0Н). Это поставит генный продукт СТЕА44д под контроль промотора СМV в плазмиде, обозначенной рсЗО1и.1СТЕА44д (фиг. 21; ЗЕО ® N0:17).

Дополнительно, плазмиды клонирования и экспрессии (например, рО1 6ЬЕА29У) могут быть получены из плазмиды ш νίΙΐΌ (вне организма) деп ркДНК 3. Вектор рО16БЕА29У (фиг. 22) обладает следующими характерными признаками: ген устойчивости к неомицину из ркДНК 3 был заменен геном крысиной дигидрофолатредуктазы ®НЕК) под контролем неусиливающего (ослабленного) промотора ЗМ40; ген, кодирующий СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, экспрессирован из промотора СМV, а сигнал полиаденилирования - из гена гормон роста крупного рогатого скота; полигенный экспрессирующий кластер представляющего интерес гена закрыт сбоку последовательностями транскрипционной терминации, т.е. 5' к промотору и 3' к сайту полиаделиновой кислоты; векторы содержат два четко выраженных полилинкеров сайта рестрикции: один 3' к промотору для клонирования гена, представляющего интерес, а один 5' - к промотору для линеаризации вектора, предшествуя трансфекции; вектор содержит ген устойчивости к ампициллину и репликатор Со1Е1 для распространения плазмиды в Е.сок; последовательности СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд (ЗЕО ГО N0:3) предшествует сигнальный пептид онкостатина М к1дпа1, и она (последовательность) собирается в векторе экспрессии, известной как вектор рО16БЕА29У.

Создается вектор, содержащий кДНК, кодирующие части последовательности аминокислот, соответствующей фрагменту внеклеточного домена рецептора человеческого СТЬА4 (ЗЕО ГО N0:2), где аминокислота А1а в положении 55 заменяется аминокислотой Туг, а аминокислота Ьеи в положении 130 заменяется аминокислотой 01и (фиг. 3). Эти изменения аминокислот отражены в последовательности аминокислот СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, имеющих ЗЕО ГО N0:4. кДНК, кодирующая первую последовательность аминокислот (например, последовательность, которая кодирует СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд), присоединяется к ДНК, кодирующей вторую последовательность аминокислот, которая соответствует области ^С, что позволяет экспрессию гена рецептора СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд путем изменения растворимости экспрессиро

- 84 017765 ванного белка СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд (см. фиг. 3 и краткое описание фиг. 3 для получения информации об остатках, соответствующих модифицированной внеклеточной части СТЬА4 и ^01 константной области), имеющей ЗЕЦ ГО ΝΟ:3.

В одном варианте осуществления изобретения сигнальная последовательность пептида онкостатина М может быть присоединена к последовательности аминокислот, соответствующей внеклеточному домену СТЬА4, который впоследствии присоединяется ко второй последовательности аминокислот, соответствующей домену Ц (например, домен человеческого IдСη), как было описано ранее на фиг. 3. Сигнальная последовательность онкостатина М позволяет получить растворимые формы белкового продукта гена СТЬА4 депе (например, СТ^А4^{А29Υ^104е}-Iд).

Стабильная трансфекция для получения клеточной линии.

Векторы, которые содержат ДНК, кодирующий белок (представляющий интерес) (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п.), могут быть включены для преобразования в подходящие клетки-хозяева (например, бактериальные клетки, чтобы получить большие количества клонированной ДНК). Некоторые неограниченные примеры бактериальных клеток для преобразования включают линию бактериальных клеток Е.со11 штаммов ЭН5а или МСЮ61/р3 (корпорация 'Чпхйгодеп Согр., Сан-Диего, Калифорния), которые могут быть преобразованы при помощи стандартных процедур, используемых в данной области, колонии затем могут быть отсортированы для подходящей плазмиды экспрессии.

Векторы экспрессии для эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих, могут включать промоторы и контрольные последовательности, совместимые с клетками млекопитающих. В одном варианте осуществления изобретения этими регуляторными элементами могут быть, например, промотор СМХ, найденный в рсЗЭ или векторе рЭ 16^ЕΛ29Υ. или вирус саркомы птиц (АЗ^, расположенный в векторе р/ΕΝ. Другие, как правило, используемые ранние и поздние промоторы включают, но не ограничиваются ими, полученные из вируса обезьян 40 (ЗV 40) (Иега, е! аЕ, 1973, №1и.1ге (Природа) 273:113), или другие вирусные промоторы, такие как полученные из вируса папилломы крупного рогатого скота, вируса полиомы и аденовируса 2. Дополнительно к уже известным в данной области может использоваться регуляторный промотор, 11МТП (Капп, е! аЕ, 1982, №11иге (Природа) 299:797-802). Для экспрессии рекомбинантного белка в культивируемых клетках насекомых (например, клетках ЗР 9) некоторые из имеющихся векторов бакуловируса включают серию р7Е δе^^еδ (ЬисНо^, апД Зиттега,

МГО., 1989, ^гок^у (Вирусология), 170:31-39) и серию рАс (ЗтйЬ е! а1., 1983, Мо1. Се11 Вю1. (Мол. Биол. клеток) 3:2156-2165). Специалист в данной области также понимает, что энхансерные области (последовательности, обнаруженные выше или ниже области промотора в некодирующих областях ДНК) являются также важными в оптимизации экспрессии. Репликаторы из источников вирусов могут применяться в случае необходимости, например, если использовать прокариотического хозяина для введения ДНК плазмиды.

Тем не менее, интеграция хромосом представляет собой общий механизм для репликации ДНК в эукариотических организмах.

Хотя в варианте использования данного изобретения клетки-хозяева млекопитающих (такие как клетки яичников китайского хомячка) применяются для экспрессии желаемого белка (например, гибридные белки, гликопротеины и т.п.), в качестве хозяина могут использоваться другие эукариотические организмы. Лабораторные штаммы почкующихся дрожжей Зассйа^οтусеδ сеге\%1ае (также известные как хлебопекарные дрожжи или пивные дрожжи) могут использоваться так же, как другие штаммы дрожжей, такие как делящиеся дрожжи ЗсΗ^ζοδассΗа^οтусеδ ротЬе. Векторы дрожжей, скрывающие ДНК, кодирующий представляющий интерес белок (например, конструкции слияния, гликопротеины и т.п., такие как СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд), могут использовать 2 μ исходный источник репликации ВгоасЬ, Ме111. Епх. 101:307 (1983), или другие исходные источники репликации, совместимые с дрожжами (например, ЗйпсЬсотЬ е! аЕ, 1979, №11иге (Природа) 282:39; Тδсйетре и др., 1980, 0епе 10:157; апД С1агке е! а1., 1983, Ме!Ь. Епх. 101:300). Регуляторный элемент, содержащийся внутри векторов дрожжей, может быть промотором для синтеза гликолитических ферментов (^δδ е! аЕ, 1968, Е АДу. Епхуте Кед. 7:149; Но11апД е! аЕ, 1978, В^οскет^δ!^у 17:4900).

Специалист в данной области также может использовать другие промоторы, где условия роста могут регулировать транскрипцию упомянутого регуляторного гена и могут включать следующие примеры (но не ограничиваются ими): изоцитохром С, алкогольдегидрогеназа 2, ферменты, отвечающие за использование мальтозы и галактозы, кислая фосфатаза и расщепляющие ферменты, связанные с азотистым обменом. Подобно системам экспрессии млекопитающих терминаторные последовательности в дрожжевых векторах экспрессии также желательны в конце кодирующих последовательностей и выявлены в 3' нетранслируемой области, следуя за открытой рамкой считывания в генах, полученных из дрожжей. Некоторые примеры (но не ограничиваются ими) дрожжевых векторов, подходящие для экспрессии рекомбинатного белка в дрожжах (например, в З. сеге\®1ае), включают рМРа (Кнг|ан апД Негδ^ί!ζ (1982), Се11 30:933-943), рЮТ88 (ЗскиШ е! аЕ, 1987, 0епе 54:113-123), рΥерЗес1 (Ва1Дап, е! аЕ, 1987, ЕтЬо к 6:229-234), рΥЕЗ2 (корпорация Iην^ΐ^οдеη Согрога!юп, Сан-Диего, Калифорния), а также те, которые принадлежат к семейству рКЗ дрожжевых векторов.

Клоны, например бактериальные клоны, которые содержат ДНК, кодирующий белок, представ

- 85 017765 ляющий интерес (например, конструкции слияния, гликопротеины и т.п.), полученные, как описано выше, могут тогда трансфицироваться в подходящие клетки-хозяин, такие как клетки млекопитающих, для экспрессии желаемых продуктов. Методы трансфекции выполняются с использованием стандартных методик, установленных в данной области, подходящих для упомянутых клеток-хозяев, где методика трансфекции зависит от использованной клетки-хозяина. Например, трансфекция клеток млекопитающих может быть выполнена с использованием следующего: липофекция, слияние протопласта, ^ЕЛЕдекстран опосредованная трансфекция, СаРО₄ копреципитация, электропорация, прямая микроинъекция, а также другие методы, известные в данной области, которые могут включать соскоб, прямой ввод, осмотический или сахарозный шок, слияние лизоцима или слияние эритроцитов, непрямую микроинъекцию, такие как посредством эритроцит-опосредованных методик и/или путем воздействия электрическим током на клетки-хозяева. Так как разрабатываются другие методы для введения генетической информации в клетки-хозяиева, вышеперечисленный список методов трансфекции не считается исчерпывающим.

Экспрессия ДНК, кодирующей представляющий интерес белок (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п.), в эукариотических клетках-хозяевах многоклеточных организмов (например, млекопитающих) используется в высокой степени в контексте данного изобретения (Т188ие Сикигек (Культуры клеток тканей), Αсабет^с Ргекк, Сгнх апб Рабегкоп, Ебк. (1973)). Клетки-хозяева, полученные из многоклеточных организмов, обладают способностью сплайсировать интроны и таким образом могут использоваться напрямую для того, чтобы экспрессировать геномный фрагмент ДНК. Как было установлено ранее, полезные линии клеток-хозяина включают, не ограничиваются ими, яичники китайского хомячка (СНО), клетки ВНК, почечную клетку обезьяны (СΟ8), клетки ΥΚΚΟ и НеЬа. В настоящем изобретении используются клеточные линии, стабильно экспрессирующие белок, представляющий интерес (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п.). В одном варианте осуществления изобретения клеточная линия млекопитающих (такая как клеточная линия СНО) трансфецируется (например, при помощи электропорации) с помощью вектора экспрессии (например, рс8^киСТ^Α4-Iд, р^16^ЕЛ29Υ и т.п.), содержащего последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес гликопротеин. В одном варианте осуществления изобретения представляющий интерес гликопротеин может быть белком СТ^Л4-Iд. включая белок (белки) СТ^Л4-Iд. имеющую последовательность аминокислот, содержащуюся в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2, кодированную частью последовательности нуклеотид в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1. В другом варианте осуществления изобретения представляющий интерес гликопротеин может быть СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, включая СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, имеющий последовательность аминокислот, содержащуюся в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4, кодированную частью последовательности нуклеотид в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:23.

Рекомбинантный белок, такой как ΟΓΕΑ4-Ι§ или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, может быть экспрессирован в эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки млекопитающих (например, клетки СНО, ВНК, ΥΈΡΟ или Ν8Ο), клетки насекомых (например, используя вектор бакуловируса) или клетки дрожжевых. Специалисты в данной области могут использовать другие подходящие клетки-хозяин, такие как те, которые были описаны ранее, в контексте данного изобретения. В одном варианте осуществления изобретения применена скорее эукариотическая, чем прокариотическая экспрессия рекомбинантного гибридного белка (такие как ΟΓΕΑ4-Ι§ или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд).

Экспрессия эукариотических рекомбинантных белков, таких как человеческий СТ^Л4-Iд или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, в эукариотических клетках, таких как клетки СНО, может привести к частичному и/или полному гликозилированию, а также образованию внутри- или межцепных дисульфидных мостиков. Для временной амплификации и экспрессии желательного белка, вектор, включающий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок (например гибридные конструкции, гликопротеины и т.п., такие как СТ^Л4-Iд или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд), доставляется в эукариотические клетки методом трансфекции, известным в данной области техники, но не интегрируется в геном клетки. Экспрессия трансфицированных генов может быть измерена в пределах 16-96 ч. Клетки млекопитающих (такие как клетки СΟ8) могут использоваться в связке с векторами, такими как рСЭМ8, чтобы кратковременно экспрессировать желательный белок (С1нхтап, Υ., 1981, 1еЛ 23:175-182; 8ееб, В., 1987, №бие (Природа) 329:840).

В данной области предполагается, что для подходящей трансфекции клеток млекопитающих малая часть клеток может интегрировать ДНК в свои геномы и успешность интеграции может зависеть от использованного вектора экспрессии и метода трансфекции. Для стабильной амплификации и экспрессии желательного белка вектор, скрывающий ДНК, кодирующий представляющий интерес белок (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п., такие как СТ^Л4-Iд или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд) стабильно интегрируется в геном эукариотических клеток (таких как клетки млекопитающих), что приводит к стабильной экспрессии трансфицированных генов. Чтобы определить и выбрать клоны, стабильно выражающие ген, который кодирует представляющий интерес белок, ген, который кодирует селективный маркёр (например, устойчивость к антибиотикам), может быть введен в клетки-хозяин наряду с интересующим геном. Селективные маркёры, используемые специалистами в данной области, могут быть те, которые придают устойчивость к лекарствам, таким как О418 и гигромицин. Ген, кодирующий селективный маркёр, может быть введен в клетку-хозяина на отдельной плазмиде или может быть введен на ту же плазмиду, как ген, представляющий интерес. Клетки, содержащие представляющий интерес ген,

- 86 017765 могут быть идентифицированы при помощи выбора лекарств, где клетки, которые включили в свой состав ген селективного маркёра, выживут в присутствии вышеупомянутого лекарственного препарата, в то время как клетки, которые включили в свой состав ген селективного маркёра, погибнут. Выжившие клетки затем могут быть отсортированы для получения необходимого белка (например, белок СТ^Λ4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд).

Как было описано ранее, клетки СНО, несоответствующие экспрессии гена дигидрофолатредуктазы (бЫг), могут выжить только при добавлении нуклеозидов. Когда указанные клетки стабильно трансфецируются при помощи вектора ДНК, скрывающего ген йШг, клетки способны продуцировать необходимые нуклеозиды. Используя бЫг как селективный маркёр, специалист в данной области понимает, что в присутствии антиметаболита, метотрексата амплификация гена бШг, а также трансфицированного гена (например, СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд) происходит легко. В одном варианте осуществления данного изобретения клетки млекопитающих, такие как клетки СНО йШг-, трансфецируются с помощью вектора экспрессии, такого как ρсБ^ЫиСТ^А4-Iд (примеры 11-13) или ρΌ1 6^ЕΛ29Υ, чтобы генерировать популяцию клеток, которые могут быть стабильно амплифицированы и могут стабильно экспрессировать желательный белковый продукт (такие как СТ^А4-Iд или Ье1а (бета) р СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд олипептид (о1уρеρί^άе) соответственно). В другом варианте осуществления изобретения йШг-негативная клеточная линия ЭС44 (корпорация ΙηνίΐΐΌ^η Со1р., Карлзбад, Калифорния) может применяться для стабильной трансфекции. В другом варианте осуществления данного изобретения трансфекция может иметь место посредством электропорации.

Как это охотно практикуется в данной области, трансфицированные клетки млекопитающих (например, бЫг-негативные клетки СНО-яичника китайского хомячка) выдерживаются в неселективной среде, содержащей сыворотку, в течение 1-2 дней после трансфекции. Затем клетки обрабатываются трипсином и вновь помещаются в среду, содержащую сыворотку, при наличии давления отбора (например, лекарственного средства, такого как метотрексат). Клетки культивируются в селективной содержащей сыворотку среде в течение 2-3 недель с частыми изменениями селективной среды, чтобы устранить остатки и мертвые клетки, пока не будут видны четкие колонии. Отдельные колонии затем могут быть трипсинизированы и помещены в мультилуночные плашки для дальнейшего размножения и амплификации в присутствии селективной среды, чтобы идентифицировать продуценты, которые экспрессируют высокий уровень желательного белка (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п.) при помощи методов, установленных в данной области, такие как методы твердофазного иммуноферментного анализа или иммунопреципитация. В одном варианте осуществления данного изобретения описанный выше метод был использован для трансфекции бЫг-негативных клеток СНО (например, клетки ОС44), чтобы создать стабильную клеточную линию, экспрессирующую рекомбинантный представляющий интерес белок (например, белок СТ^А4-Iд) (см., например, примеры 12-13). В другом варианте осуществления изобретения была установлена стабильная клеточная линия, экспрессирующая СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд (см. пример 23).

Стабильная линия СНО изобретения экспрессирует молекулы белка 0Т^Λ4-[д. как мономеры СТ^А4-Iд, имеющие последовательность (ί) 26-383, БЕО ΙΌ N0:2, (ίί) 26-382, БЕО ΙΌ N0:2, (ίίί) 27-383, БЕО ΙΌ N0:2, (ίν) 27-382, БЕО ΙΌ N0:2, (ν) 25-382, БЕО ΙΌ N0:2 и (νί) 25-383, БЕО ΙΌ N0:2. Данная клеточная линия может секретировать популяцию молекул СТ^Λ4-[д. которые могут существовать как мультимерные формы (такие как димеры, тетрамеры и т.п.), где мультимерная форма может иметь различные последовательности мономеров БЕО ΙΌ N0:2. Полигенный экспрессирующий кластер, интегрированный в эту клетку, включает БЕО ΙΌ N0:1, и он содержится внутри ρсБ^ЫиСТ^А4-Iд.

Изобретением также предусмотрена стабильная линия СНО, которая устойчиво экспрессирует СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. В одном варианте осуществления изобретения клеточная линия экспрессирует мономеры СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, имеющие последовательность (ί) 26-383, БЕО ΙΌ N0:4, (ίί) 26-382, БЕО ΙΌ N0:4, (ίίί) 27-383, БЕО ΙΌ N0:4, (ίν) 27-382, БЕО ΙΌ N0:4, (ν) 25-382, БЕО ΙΌ N0:4 и (νί) 25-383, БЕО ΙΌ N0:4. В другом варианте осуществления изобретения клеточная линия может секретировать популяцию молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, которые могут существовать как мультимерные формы (такие как димеры, тетрамеры и т.п.), где мультимерная форма может иметь различные последовательности мономеров БЕО ΙΌ N0:4. Полигенный экспрессирующий кластер, интегрированный в эту клетку, включает БЕО ΙΌ N0:3, и он содержится внутри ρ^16^ЕΛ29Υ.

Субклонирование для генерации клоновой популяции клеток.

Клетки, идентифицированные как продуценты желательного белка (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п.), изолируются от клеточной культуры и впоследствии амплифицируются в условиях, эквивалентных производству, где культуральная среда может содержать сыворотку. Могут применяться методы субклонирования, известные в данной области, такие как (но не ограничиваясь ими) клонирование мягкого агара. Полученные стабильные рекомбинантные клоны клеток могут быть далее размножены в условиях, не содержащих сыворотку и продукты животного происхождения. Согласно данному изобретению стабильный клон клеток, экспрессирующий желательный продукт белка (например, СТ^А4-Iд, СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд и т.п.), достигается посредством получения клона рекомбинантной клетки из клеточной культуры, которая получена после культивирования рекомбинантной

- 87 017765 первоначальной клетки в среде, содержащей сыворотку, и повторной адаптации клеток к среде, не содержащей сыворотку и продукты животного происхождения. В одном варианте осуществления изобретения можно продолжить культивировать клоны клеток, экспрессирующие СТЬА4-1д, в среде, не содержащей сыворотку и продукты животного происхождения, на протяжении по меньшей мере 50 генераций (поколений). В другом варианте осуществления изобретения можно продолжить культивировать клоны клеток, как было описано выше, на протяжении по меньшей мере 75 генераций (поколений). Согласно изобретению можно продолжить культивировать клоны клеток в среде, не содержащей сыворотку и продукты животного происхождения, на протяжении по меньшей мере 100 генераций (поколений).

В еще одном варианте можно продолжить культивировать клоны клеток, экспрессирующие СТЬА4^{А29¥Ъ104Е}-1д в среде, не содержащей сыворотку и продукты животного происхождения, на протяжении по меньшей мере 27 генераций (поколений). В другом варианте осуществления изобретения можно продолжить культивировать клоны клеток, как было описано выше, на протяжении по меньшей мере 75 генераций (поколений). Дополнительно, можно продолжить культивировать клоны клеток в среде, не содержащей сыворотку и продукты животного происхождения, на протяжении по меньшей мере 100 генераций (поколений).

В одном варианте осуществления изобретения предусмотрена клеточная линия, которая производит молекулы СТЬА4-1д, включающие мономеры 8ЕЦ ΙΌ N0:2, где линия клеток стабильна на протяжении более 100 генераций (поколений) и где стабильность линии клеток включает: (1) время удвоения при генерации 100 менее (приблизительно) 24.5±2.6 ч; (2) жизнеспособность клеток при генерации 100 больше 95%, (3) титр производства для СТЬА4-1д в биореакторах 5-Ь больше чем 1.69 мг/мл при генерации 100; молярное отношение (4) сиаловой кислоты к белку составляет примерно 9.3 к примерно 11.0 при генерации 105.

Стабильный клон рекомбинантной клетки в данном изобретении присутствует в выделенной форме, где выделение может происходить согласно методам, практикуемым в данной области (например, клонирование мягкого агара или клонирование при ограниченном разведении или т.п.). В данном изобретении стабильный клон рекомбинантной клетки получают из рекомбинантной клетки млекопитающего (например, клетки СНО-яичников китайского хомячка), которая содержит последовательности ДНК, кодирующие представляющий интерес рекомбинантный белок (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п., такие как СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д), которые могут расти в суспензии или прикрепленно (соединившись). В данном изобретении рекомбинантный белок, экспрессированный линией клеток, может быть терапевтическим гликопротеином, таким как СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д. Согласно данному изобретению стабильные клоны рекомбинантных клеток, полученные из эукариотических клеток (таких как клетки млекопитающих СНО, клетки ЭС44к или Й1уг-негативные клетки СНО), которые содержат последовательность ДНК, кодирующие рекомбинантный гликопротеин, такие как СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, и которые способны стабильно экспрессировать рекомбинантный гликопротеин на протяжении нескольких поколений, очень полезны.

В одном варианте осуществления изобретения популяцию клеток-хозяин млекопитающих, устойчиво экспрессирующих белок, представляющий интерес (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п., такие как СТЬА4-1д или СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д), получают в условиях без сыворотки и продуктов животного происхождения посредством амплификации устойчиво трансфицированных клеток. Согласно изобретению тогда клон рекомбинантной клетки может быть охарактеризован, например, тем, что он стабилен в питательной среде для культивирования, не содержащей сыворотки и продуктов животного происхождения, на продолжении по меньшей мере 105 поколений.

В одном варианте осуществления изобретения клоновая популяция клеток продуцирует молекулы СТЬА4-1д. Некоторые из специальных характеристик этой популяции молекул СТЬА4-1д приведены ниже в табл. 6. Популяция молекул СТЬА4-1д может, по меньшей мере, включать димерные молекулы СТЬА4-1д, которые содержат две мономерные молекулы, каждая из которых может иметь одну из следующих последовательностей: (ί) 26-383, 8ЕЦ ΙΌ N0:2, (ίί) 26-382, 8ЕЦ ΙΌ N0:2, (ίίί) 27-383, 8ЕЦ ΙΌ N0:2, (ίν) 27-382, 8ЕО ΙΌ N0:2, (ν) 25-382, 8ЕО ΙΌ N0:2 и (νί) 25-383, 8ЕО ΙΌ N0:2. Таким образом, популяция молекул СТ^А4-Iд может включать преимущественно гомодимеры или гетеродимеры, популяция может включать гомодимеры и гетеродимеры. В одном варианте осуществления изобретения предусмотрена популяция молекул СТ^А4-Iд, имеющих характеристики, которые показаны в табл. 6, или фармацевтический эквивалент. В данном документе под фармацевтическим эквивалентом понимается следующее - это когда популяция молекул обладает безопасностью и профилем эффективности, эквивалентным первоначальной популяции (стандартная популяция), для лечения пациента, так как это предусматривается правительственным агентством, таким как РОА (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США). Например, популяция СТЕА44д в данном изобретении может иметь характеристики, показанные в табл. 6. В другом варианте осуществления изобретения популяция молекул СТ^А4-Iд может иметь характеристики, показанные в табл. 6, или их эквиваленты отдельно или в любой комбинации или в любом их порядке.

В другом варианте осуществления изобретения клон, представляющий интерес, можно охарактеризовать по экспрессированному рекомбинантному продукту и его биохимическим характеристикам (на

- 88 017765 пример, СТ^Α4-Iд, обладающий специфическим значением коэффициента экстинкции). Значение коэффициента экстинкции (часто называемое как величина поглощательной способности (¾)) может быть выведено теоретически или экспериментально. При 280 нм было определено, что значение поглощательной способности (а,) СТ^Α4-Iд равняется 1.01 мл-мг^-1-м^-1, при этом был использован метод Масб (Маха), е1 а1. (Аиа1убса1 Вюсйешкбу (Аналитическая биохимия), νοί. 200, р. 74-80, 1992), который подробно описан ниже.

Уравнение 1 было использовано для определения молярной поглощательной способности (е).

Уравнение 1:

е=(Количество дисульфидных мостиковх34)+(Количество остатков триптофанах5.540)+ (Количество остатков тирозинах 1.480)

СТ^Α4-Iд имеет 9 дисульфидных мостиков, 8 остатков триптофана и 32 остатков тирозина, что дает молярный коэффициент поглощения (е), равный 92.886 М^-1-см^-1, как показано в уравнении 2.

Уравнение 2:

е=(9х134)+(8х5.540)+(32х 1.480)=92.886 М^-1-см^-1.

Константа коэффициента поглощения (а_,) была рассчитана путем деления молярного коэффициента поглощения (е) на молекулярную массу, где молекулярная масса была определена при помощи МАРШ (Ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы)-Т0Е (Время пролетная массспектрометрия), как показано в уравнении 3:

Уравнение 3:

а₈=е/молекулярная масса=92.886 М^-1-см^-1/92.278 Да=1.01 мл-мг'-см^-1

Сравнение теоретически выведенного значения коэффициента поглощения и экспериментально определенного значения коэффициента поглощения на двух партиях материала СТ^Α4-Iд (включающий ГО Ν0:2) было проведено с использованием анализа аминокислот. Средняя экспериментально определенная константа коэффициента поглощения составляет 1.00±0.05 мл-мг^-1-см^-1. Экспериментальное значение подтверждает теоретическое значение 1.01 мл-мг^-1-см^-1 в пределах ошибки экспериментального определения. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения предусмотрена линия клеток, которая продуцирует молекулы СТ^Α4-Iд, которые обладают значением коэффициента поглощения или коэффициент экстинкции, составляющим приблизительно 1.00±0.05 мл-мг^-1-см^-1.

Согласно данному изобретению рекомбинантный клон, представляющий интерес, также может быть охарактеризован согласно количеству сайтов (участков) последовательности ДНК, которая кодирует белок, представляющий интерес (например, гибридные конструкции, гликопротеины и т.п., такие как СТ^Α4-Iд), он интегрирован в геном клетки-хозяина. Специалист в данной области понимает, что стандартный метод гибридизации по Саузерну позволят осуществить подобный анализ. В одном варианте осуществления изобретения одиночный гибридизирующий фрагмент приблизительно в 1.2 кЬ (т.н.о.) был обнаружен в каждом из рестрикционных гидролизатов ЕсоШ и ХЬаХ геномного ДНК, подготовленного из клона рекомбинантной клетки в данном изобретении, согласуется с ожидаемым размером гена СТ^Α4-Iд (гибрид Саузерну; фиг. 23). Изображение на фигуре согласуется с сайтом (участком) однократного интегрирования плазмид, а также там по методу гибридизации по Саузерну не было обнаружено включений или делеций в гене СТ^Α4-Iд.

В одном варианте осуществления изобретения предусмотрены популяции клеток СНО, способные продуцировать молекулы СТ^Α4-Iд, где каждая клетка популяции включает по меньшей мере 30 вариантов нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок СТ^Α4-Iд, где 30 или более вариантов интегрированы последовательно в одиночном сайте (участке) в геноме клетки и где популяция клеток является клоновой. В других вариантах изобретения популяции клеток СНО, способные продуцировать молекулы СТ^Α4-Iд, включают популяцию, где по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99% клеток в умирающих популяциях содержат по меньшей мере 30 вариантов нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок СТ^Α4-Iд.

В другом варианте осуществления изобретения предусмотрена линия клеток, которая при культивировании в условиях согласно фиг. 10 или примеру 14 продуцирует молекулы СТ^Α4-Iд, включающие

ГО Ν0:2 в количестве, наименьшем 1.0, 1.3, 1.6, 1.8, 2.0 или 2.5 г молекул СТ^Α4-Iд на 1 л клеточной культуры на стадии производственного процесса.

Согласно изобретению линия клеток млекопитающих (например, бЫг-негативная линия клеток СНО) генерируется, что экспрессирует желательный белок (например, белок СТ^Α4-Iд), который при выращивании в культуре, находящейся во взвешенном состоянии, может продуцировать популяцию молекул, которая секретируется (выделяется) в надосадочную жидкость (супернатант) культуры. Данная популяция молекул может иметь, например, одну или более из следующих характеристик, перечисленных в табл. 6.

- 89 017765

Таблица 6

Пояснительные характеристики СТЬА4-1§

	Характеристика
1	Ν-терминальная Последовательность	аа 26 (А1а) οί 8Е<2 ГО N0:2 аа 27 (МеО οί 5ЕО ГО N0:2
2	С-терминальная Последовательность	аа 382 (О1у) οί 8Εζ) ΕΌ N0:2 аа 383 (Ьук) οί8ΕΟΙΟΝΟ:2
3	В7 Связь	70-130%
4	Ρϊ	4.3-5.6
5	Соотношение сиаловой кислоты ΝΑΝΑ ΝΟΝΑ	>8.0 грамм-молей на грамм-моль молекул СТЬА4- Ιβ 8.0 - 12.0 грамм-молей на грамм-моль молекул
6	димер	>95%
7	Виды с ΗΜλν (высок, молекул. масса) (например, тетрамер)	>54.0%
8	Виды с низкой молекулярной масса (например, мономер)	>0.5%
9	Коэффициент поглощения	1.0±0.05мл/мг-см
10	Свободные сульфгидрильные группы	50.24 свободных тиолов на молекулу
11	Состав амино моносахаридов: ΟΙοΝΑο	15-35 грамм-молей на грамм-моль молекул СТЬА4-1§
12	Состав амино моносахаридов: СаШАс	1.7-8.3 грамм-молей на грамм-моль молекул СТЬА4-1§
13	Состав нейтральных моносахаридов: Г ЯШППТПЯ	8-17 грамм-молей на грамм-моль молекул СТЬА4-
14	Состав нейтральных моносахаридов: Фукоза	3.5- 8.3 грамм-молей на грамм-моль молекул СТЬА4-1§
15	Состав нейтральных моносахаридов: Манноза	7.7-22 грамм-молей на грамм-моль молекул СТЦА4-Ц

Согласно табл. 6 процентное отношение димера СТ1,Л4-1д, процентное отношение видов с НМ^ (например, мультимеры СТ1 ,Л4-1д, такие как тетрамер) и процентное отношение видов с ЬМ^ (например, мономер СТЬА4-1§) находятся в соответствии с популяцией молекул СТЬА4-1§. Грамм-моли сахара и грамм-моли сиаловой кислоты, описанные в табл. 6, находятся в соответствии с грамм-молем молекул или димера СТЬА4-1§. Процентное отношение связывания В7, найденное в табл. 6, находится в соответствии с экспериментами по соединению СТЬА4-1§, выполненных при помощи резонанса поверхностного плазмона (8РК) на приборе В1Асоге, описанном ранее, где процентное отношение - это сравнение связывания В7 к стандарту (контролю) СТЬА4-1§.

В одном варианте осуществления изобретения линия клеток млекопитающего (такая как ί,ΙΙιίΐнегативная лини клеток СНО) генерирует популяцию молекул СТЬА4-1§, проявляющих характеристики, описанные под номерами 1-5 в табл. 6. В другом варианте осуществления изобретения линия клеток млекопитающего генерирует популяцию молекул СТЬА4-1§, имеющих характеристики, описанные под номерами 1-10 в табл. 6. В других вариантах линия клеток млекопитающего генерирует популяцию молекул СТЬА4-1§, проявляющих характеристики, описанные под номерами 1-15 в табл. 6. В другом варианте количество свободных сульфгидрильных групп на СТЬА4-1§ составляет около <0.20 свободных тиолов на молекулу.

После очистки надосадочной жидкости клеточной культуры, в которой содержится желательный белок (например, белок СТЬА4-1§), выделенный популяцией трансфицированных клеток млекопитающих (например, бЫт-негативная клетка СНО), популяция молекул может иметь добавочные характеристики. В добавление к характеристикам, перечисленным в табл. 6, данная популяция молекул может иметь, например, одну или более из следующих характеристик: диапазон рН (приблизительно) 7.0-8.0; способность подавлять активность человеческой клетки П.-2 на 50-150%; моноцитарный хемотаксический белок (МСР-1) присутствует в конечном очищенном продукте при <5 нг/мг СТЬА4-1§, димере или

- 90 017765 молекул СТ^А4-Iд; концентрация ДНК, присутствующего в конечном очищенном продукте при <5 пг/мг димера СТ^А4-Iд; белок клетки-хозяин СНО присутствующего в конечном очищенном продукте при <50 нг/мг димера СТ^А4-Iд; концентрация Тритона Х-100 в конечном очищенном продукте при <1.0 промиль; количество белка А в конечном очищенном продукте при <5 нг/мг димера СТ^А4-[д. количество бактериальных эндотоксинов в конечном очищенном продукте при <0.3 ЕЙ (эндотоксиновая единица)/мг димера СТ^А4-Iд; количество бионагрузки (микрофлоры) в конечном очищенном продукте при <3.0 СЕИ (КОЕ-колониеобразующая единица)/10 мл.

В одном варианте осуществления изобретения моноцитарный хемотаксический белок (МСР-1) присутствует в конечном очищенном продукте при <3 нг/мг димера СТ^А4-Iд или молекул СТ^А4-Iд; концентрация ДНК присутствует в конечном очищенном продукте при <1.0 пг/мг димера СТ^А4-Iд; белок клетки-хозяин СНО присутствует в конечном очищенном продукте при <10 нг/мг димера €:^^4-^ количество Протеина А при <1 нг/мг димера СТ^А4-Iд; количество бактериальных эндотоксинов в конечном очищенном продукте при <0.15 ЕЙ (эндотоксиновая единица)/мг димера СТ^А4-Iд и количество бионагрузки (микрофлоры) в конечном очищенном продукте при <1.0 СЕИ/10 мл; диапазон рН составляет (приблизительно) 7.2-7.8. В конкретном варианте осуществления изобретения моноцитарный хемотаксический белок (МСР-1) присутствует в конечном очищенном продукте при <1 нг/мг димера СТЬА4Ц или молекулах СТ^А4-Iд. В другом варианте молекулы СТ^А4-Iд подавляют активность человеческих клеток Ш-2 на 60-140%.

В другом варианте осуществления изобретения клональная популяция клеток продуцирует молекулы СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Некоторые из особых характеристик этой популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд приведены в табл. 7. Популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд может, по меньшей мере, включать молекулы димера СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, которые включают в себя две мономерные молекулы, каждая из которых обладает одной из следующих последовательностей: (ί) 26-383, 8ЕО ГО N0:4, (ίί) 26-382, 8ЕО ГО N0:4, (ίίί) 27-383, 8ЕО ГО N0:4, (ίν) 27-382, 8ЕО ГО N0:4, (ν) 25-382, 8ЕО ГО N0:4 и (νί) 25-383, 8ЕО ГО N0:4. Таким образом, популяция молекул ^Т^А4^{А29Υ^104Β}-Iд может включать преимущественно гомодимеры, или гетеродимеры, или их любую смесь. В одном варианте осуществления изобретения предусмотрена популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, имеющих характеристики, показанные в табл. 7, или их фармацевтический эквивалент. В данном документе фармацевтический эквивалент считается таковым, когда популяция молекул обладает профилем безопасности и эффективности, эквивалентным первоначальной популяция (стандартная популяция) в отношении лечения пациента, так как это рассматривается правительственным агентством, таким как РИА (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США). Например, популяция СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд в данном изобретении может иметь характеристики, показанные в табл. 7. В другом варианте осуществления изобретения популяция молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд данного изобретения может иметь характеристики, показанные в таблице, или их эквиваленты отдельно или в любой комбинации или их перестановки.

В одном варианте осуществления изобретения предусмотрены популяции клеток СНО, способные продуцировать молекулы СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, где каждая клетка популяции содержит по меньшей мере 30 вариантов нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, где 30 или более вариантов последовательно интегрированы в одиночный сайт в геноме клетки, где популяция клеток является клоновой. В других вариантах осуществления изобретения популяции клеток СНО, способные продуцировать молекулы СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, включают популяцию, где по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99% клеток в популяциях содержит меньшей мере 30 вариантов нуклеиновой кислоты, которая кодирует для СТЕ^'''^29,21'¹⁰'''''В другом варианте осуществления изобретения предусмотрена линия клеток, когда будучи культивированной, в условиях согласно фиг. 24 или примерам 19-20, продуцирует молекулы СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, включающие 8Е0 ГО N0:4 в количестве, наименьшем числом которого является 22, 22.5, 23, 27.5 или 28 г молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд на 1 л клеточной культуры на стадии промышленного производства.

Согласно изобретению линия клеток млекопитающих (например, Й11)г негативная линия клеток СНО) образуется, что экспрессирует желательный белок (например, СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд), что при выращивании в суспендированной культуре может продуцировать популяцию молекул, которая секретируется (выделяется) в надосадочную жидкость культуры. Данная популяция молекул может иметь, например, одну, или более, или все из следующих характеристик, перечисленных в табл. 7.

- 91 017765

Таблица 7

Пояснительные характеристики СТЬАД^⁹^¹⁰⁴^^

	Характеристика
1	Ν-терминальная последовательность	аа 26 (А1а), 8Е<2 ГО N0:4 аа 27 (Ме1), 5Е0 ГО N0:4
2	С- терминальная последовательность	аа 382 (О1у), 8Е(2 ГО N0:4 аа 383 (Ьу§), 8Е<2 ГО N0:4
3	В 7 Связь	70-130%
4	р1	4.5-5.5
5	Соотношение сиаловой кислоты	>5.0 шо1е8 рег то1е То1а1 СТЬА4-1§ ρτοίεΐη
6	Димер	>95%
7	Виды с НМ\У (высок, молекул. масса) (например, тетрамер)	>4.0%
8	Виды с низкой молекулярной масса)(например, мономер)	>1%
9	Состав амино моносахаридов: ΟΙοΝΑο	24-28 грамм-молей на грамм-моль молекул совокупного белка СТЬА4-1§
10	Состав амино моносахаридов: СаШАс	2.7-3.6 грамм-молей на грамм-моль молекул совокупного белка СТЬА4-1§
11	Состав нейтральных моносахаридов: Г аляктозя	11-13 грамм-молей на грамм-моль молекул совокупного белка СТЬА4-1§
12	Состав нейтральных моносахаридов: Фукоза	6.4-7.0 грамм-молей на грамм-моль молекул совокупного белка СТЬА4-1§
13	Состав нейтральных моносахаридов: Манноза	14-16 грамм-молей на грамм-моль молекул совокупного белка СТЬА4-1§

Согласно табл. 7 процентное отношение димера ('ΊΊ.ΛΕ²'^¹'¹⁰'¹¹''-^. процентное отношение видов с НМ\ (например, мультимеры СТЬАДЛд, такие как тетрамер) и процентное отношение видов с 1.М\\' (например, мономер ('ΊΊ.ΛΕ²⁹^'¹⁰'¹¹''-^') соответствуют популяции молекул ('ΊΊ.ΛΕ²⁹²⁴'¹⁰'¹¹''-^. Грамммоли сахара и грамм-моли сиаловой кислоты, описанные в табл. 7, соответствуют грамм-молю молекул или димеру СТ1 .ЛД'²²⁹²²'¹⁰'¹¹''-^. Процентное отношение связывания В7, найденное в табл. 7, находится в соответствии с экспериментами по соединению СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iβ, выполненных при помощи резонанса поверхностного плазмона (8РК) на приборе ЫАсоге, описанном ранее, где процентное отношение - это сравнение связывания В7 к стандарту (контролю) СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iβ.

В одном варианте осуществления изобретения линия клеток млекопитающего (такая как (ΙΙιίϊнегативная лини клеток СНО) генерирует популяцию молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iβ, проявляющих характеристики, описанные под номерами 1-5 в табл. 7. В другом варианте осуществления изобретения линия клеток млекопитающего генерирует популяцию молекул СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iβ, имеющих характеристики, описанные под номерами 1-10 в табл. 7. В других вариантах линия клеток млекопитающего генерирует популяцию молекул СТ^А4-Iβ, проявляющих характеристики, описанные под номерами 1-15 в табл. 7.

После очистки надосадочной жидкости клеточной культуры, в которой содержится желательный белок (например, СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iβ), выделенный популяцией трансфицированных клеток млекопитающих (например, ДЫт-негативная клетка СНО), популяция молекул может иметь добавочные характеристики. В добавление к характеристикам, перечисленным в табл. 7, данная популяция молекул может иметь, например, одну, или больше, или все из следующих характеристик: моноцитарный хемотаксический протеин (МСР-1) присутствует в конечном очищенном продукте при <5 нг/мг димера СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iβ; концентрация ДНК, присутствующего в конечном очищенном продукте при <2.5 пг/мг димера СТЬА4^{А2 ε}-Ι§; белок клетки-хозяина СНО присутствующего в конечном очищенном продукте при <50 нг/мг димера СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iβ.

Общепринятое культивирование линии клеток.

Согласно данному изобретению клетки млекопитающих культивируются для продуцирования желательного белка, включая гликопротеин, как традиционно известно специалисту в данной области. Клетки млекопитающих, экспрессирующих гликопротеин (представляющий интерес), должны экспрессировать или регулироваться для экпрессирования соответствующих ферментов так, что при удовлетво- 92 017765 рительных условиях, пострансляционные модификации, наиболее применимые к гликозилировании, происходят ίη νίνο (в организме). Ферменты включают те необходимые для добавления и завершения Μη О-соединенные углеводы, которые описаны НиЬЬагй апй Ιναίί, Апп. Веу. ВюсЬет. 50:555-583 (1981) для Ν-соединенных олигосахаридов. Ферменты дополнительно включают олигосахарнлтрансферазу, альфа-глюкозидазу I, альфа-глюкозидазу II, ЕК альфа(1.2)-маннозндазу, Гольджи альфа-маннозндазу I, Ν-ацетилглюкозаминилтрансферазу I, Гольджи альфа-маннозндазу II, Νацетилглюкозамннилтрансферазу II, альфа(1.6)-фукозилтрансферазу, бета(1.4)-галактозилтрансферазу и соответствующую сиалилтрансферазу.

Замедление в апоптозе (запрограммированная смерть клетки) может иметь эффект увеличения жнзнеспособности клетки во время процесса культивирования клетки. Уменьшение в апоптозе, и в свою очередь, увеличение времени жизни конкретной клетки может увеличить продуцирование белка из культуры клеток. Апоптические случаи могут быть ингибированы в клетке при помощи введения в клетку (такую как клетка млекопитающего, клетка насекомого или дрожжевая клетка) одного или более антиапоптических белков, которые подавляют апоптоз в клетках в точных точках вдоль апоптического пути. Другим методом ингибирования апоптоза является ингибирование секреции проапоптических молекул из митохондрий в клетке. Варианты проапоптических белков, известных в данной области, такие как доминант-негативная форма каспазы-9, могут использоваться как ингибитор апоптоза в клетке. Подобный вариантный белок может быть введен в клетку, чтобы отложить запрограммированную смерть клетки. Ингибирование апоптоза клетки, в свою очередь, продлевает время, в течение которого конкретная клетка продуцирует белок, что приводит к общему увеличению в продуцировании желательного белка конкретной клеткой. Несколько генов, которые кодируют ингибиторы каспазы (такие как Х-1 соединенный ингибитор апоптоза (XIАР) или его варианты) или антиапоптические гены (например, Вс1-2 и Вс1или их варианты), могут быть трансфицированы в клетки млекопитающих, созданные методом генной ннженерии (такие как клетки СНО, клетки УЕК0, клетки ВНК и т.п.) (8аиегга1й, Т. и др., 2003, Вю!есЬηο1 Вюепд (Биотехн. Биоинж.), 81:329-340; 8аиег^а1й, Т. и др., 2002, Вю!есЬпо1 Вюепе. 77:704-716; Мак1гапде1о, А., и др., 2000, Вю!есЬпо1 Вюепд. 67:544-564; К1Ш, Ν., е! а1., 2002, 1. Вю!есЬпо1. 95:237-248; Рисиегоа, В., е! а1., 2001, Вю!есЬпо1 Вюепе. 73:211-2221).

В одном варианте осуществления изобретения клетки млекопитающих, которые продуцируют рекомбинантный белок, могут быть легко трансфицированы вектором, содержащим апоптический ген (такне как Ьс!-2). В другом варианте осуществления изобретения рекомбинантные клетки млекопитающих могут быть трансфицированы плазмидой, которая содержит ген, который несет информацию об ингибиторе каспазы, или ген, который несет информацию о варианте проапоптической молекулы, как описано выше, ген, который кодирует белок, как известно специалисту, работающему в данной области, обладает антиапоптической активностью или содержит комбинацию этих генов.

В другом варианте осуществления изобретения общее качество (например, улучшенное гликозилирование) желательного рекомбинантного белка (такого как терапевтический белок) может быть улучшено. Чтобы увеличить гликозилирование рекомбинантного белка, клетки млекопитающих (например, клетки СНО, клетки УЕК0, клетки ВНК и т.п.) могут быть трансфицированы с нуклеиновыми кнслотами, кодирующими один или более ферментов, вовлеченных в гликозилирование (такие как а2.3сиалилтрансфераза, р1.4-галактозилтрансфераза и т.п.) белков (\Уе1кеП е! а1., 1999, №11иге Вю!есЬпо1 17:1116-21). В одном варианте осуществления изобретения плазмида, которая кодирует ρί.4галактозилтрансферазу, может быть введена в клетки млекопитающих, экспрессирующих белок (представляющий интерес). В другом варианте осуществления изобретения плазмида, которая кодирует а2.3сиалилтрансферазу, может быть введена в клетки млекопитающих, экспрессирующих белок (представляющий интерес).

Могут использоваться различные параметры культивирования в отношении клетки-хозяина, которая культивируется. Подходящие условия выращивания для клетки млекопитающих хорошо известны в данной области (С1еуе1апй е! а1., 1. Iттиηο1. МеШойк. 56:221-234 (1983)) или могут быть определены специалистом (см., например, Ашша1 Се11 Си1!иге: А Ргас!юа1 АрргоасЕ 2пй Ей., Шск^оой, Ό. апй Натек, ВТ., ейк. (0хГогй Ишуегкйу Ргекк: Кел Уогк, 1992)) и различаются в зависимости о выбранной конкретной клетки-хозяина.

Без ограничений культуральная среда клетки (такие как среда прививочного материала, среда базальная (минимальная) и т.п.) может относиться к питательному раствору, используемому для выращивання н/или поддерживания клеток, особенно клеток млекопитающих. Данные растворы обычно обеспечивают по меньшей мере один компонент из одной или более следующих категорий (1) источника энергии, обычно в форме углевода, такого как глюкоза; (2) все основные аминокислоты и обычно основной комплект двадцати аминокислот плюс цистеин; (3) витамины н/или другие органические соединения, необходимые при низких концентрациях; (4) свободные жирные кислоты или липиды, например линолевая кислота; и (5) микроэлементы, где микроэлементы определяются как неорганические соединения или элементы, встречающиеся в природном виде элементы, которые обычно требуются при очень низких концентрациях, обычно в микромолекулярном диапазоне. Питательный раствор может быть дополнен по выбору одним или более компонентами из любого из следующих: (1) гормоны и другие факторы роста,

- 93 017765 такие как сера, инсулин, трансферин и эпидермальный фактор роста; (2) соли, например магний, кальций и фосфат; (3) буферы, такие как НЕРЕЗ (№2-гидроксиэтилпиперазин-№2-этансульфоновая кислота); (4) нуклеозиды, такие щелочи, такие как аденозин, тимидин и гипоксантин; (5) гидролизата белков продукт и гидролизата тканей, например пептона или смеси пептона, которые могут быть получены из очищенного желатина, материала растений или побочных продуктов животных; (6) антибиотики, такие как гентамицин; (7) защитные средства клетки, например плюрониловый полиол; и (8) галактоза. Примером базальной (минимальной) среды может быть Се11 Сго\\Н1 Ваза1 Мейшт (Базальная среда роста клеток). Примером среды прививочного материала может быть Iηоси1ит Се11 Сго\\111 Ваза1 Мейшт (Базальная среда роста клеток прививочного материала). Примером среды питания может быть Ргойисйоп Вюгеас1ог Ееей Мейшт.

Могут быть использованы имеющиеся промышленные среды, к ним относятся, например, М1шта1 Е88еийа1 Мейшт (МЕМ, З1дта, З1. Ьош8, Мо.); Эи1Ьессо'8 МойШей Еад1ез Мейшт (ЭМЕМ, З1дта); Нат'з Е10 Мейшт (З1дта); культуральная среда клетки НуС1опе (НуС1опе, Ьодаи, Ь1аН); КРМЫ640 Мейшт (Зщта); и химически-определенные среды (СЭ), которые составляются для конкретных типов клеток, например С0-СН0 Мейшт (корпорация ΙηνίΐΐΌ^η, Карлсбад, Калифорния). Любая из этих сред может быть дополнена в случае необходимости ранее определенными дополнительными компонентами или ингредиентами, включая опциональные компоненты, в подходящих концентрациях и количествах, как необходимо или желательно. Клеточная культура млекопитающих, которая может использоваться с данным изобретением, подготавливается в среде, подходящей для конкретной клетки, которая культивируется. В одном варианте осуществления изобретения культуральная среда клетки может быть одной из вышеупомянутых, в которой обычно отсутствует сыворотка из любого источника млекопитающих (например, эмбриональная бычья сыворотка (ЕВЗ)). В другом варианте осуществления изобретения клеточная культура млекопитающих может быть выращена в промышленной химически определенной (СЭ)СН0 среде, дополненной дополнительными компонентами, определенными в табл. 15. В следующем варианте осуществления изобретения клеточная культура млекопитающих может быть выращена в среде СЭ-СН0, дополненной дополнительными компонентами, определенными в табл. 20 или 21.

Методы данного изобретения включают культивирование многочисленных типов клеток. В одном варианте осуществления изобретения клетки являются клетками животных или млекопитающих. В другом варианте осуществления изобретения клетки могут экспрессировать и секретировать (выделять) большие количества желаемого белка. В другом варианте осуществления изобретения клетки могут экспрессировать и секретировать (выделять) большие количества гликопротеина (представляющего интерес) в культуральную среду. Клетки животных или млекопитающих могут быть также молекулярно модифицированы, чтобы экспрессировать и выделять белок, представляющий интерес. Белок, продуцированный клеткой-хозяином, может быть эндогенным или гомологичным по отношению к клетке-хозяину. Белок также может быть гетерологичным (например, инородным) по отношению к клетке-хозяину, посредством чего генетическая информация о белке (представляющему интерес) вводится в клетку-хозяина при помощи стандартных методов, известных в области (например, при помощи электропорации, трансфекции и т.п.). В одном варианте осуществления изобретения гликопротеин млекопитающих может быть продуцирован и выделен (секретирован) клеткой-хозяином яичников китайского хомячка (СНО) в культуральную среду.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предусмотрены популяции молекул СТ^Λ4-[д. произведенных методами продуцирования, описанными в данном документе, включая метод промышленного производства, который описан в примере 14 и показан на фиг. 10. Процесс приводит к продуцированию молекул СТ^Л4-[д с высокой молекулярной массой (НМА) (например, см. примеры 14 и 15). В другом варианте осуществления изобретения предусмотрены молекулы СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, которые продуцируются методами производства, обсуждаемыми в данном документе, такие как метод массового производства, который описан в примерах 19 и 20, см. фиг. 24. Процесс может привести к продуцированию молекул СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд с высокой молекулярной массой (НМА) (например, см. примеры 19 и 20). В некоторых вариантах виды НМА могут составлять 15-25% молекул или димера, продуцированного методом для производства, включая процесс химически определенной ферментации, СЭ-СН01. В других вариантах настоящего изобретения представлены методы для выделения, очистки и определения параметров высокомолекулярных компонентов СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, произведенных процессом ферментации СЭ-СН01. Высокомолекулярные компоненты СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд являются мультимерами (есть тетрамеры, гексамеры и т.д.), имеющими большую молекулярную массу по сравнению с димерами СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд.

Клетки-хозяева животных или млекопитающих, способные экспрессировать и выделять большие количества гликопротеина (представляющего интерес) в культуральную среду для последующего выделения и/или очистки, включают, но не ограничиваются ими, клетки яичников китайского хомячка (СНО), такие как СНО-К1 (АТСС ССЬ-61), 1)644 (СЬаяи е! а1., 1986, Зот. Се11 Мо1ес. СепеЕ 12:555-556; Ко1кекаг е1 а1., 1997, Вюскет18йу. 36:10901-10909; апй А0 01/92337 А2), отрицательные клетки гидрофолатредуктазы СНО (СК0ШНГГ-, ИпаиЬ апй Сйа81п, 1980, Ргос. №11. Асай. Зск ИЗА. 77:4216), и йρ12.СН0 се118 (ИЗ Рак №. 5.621.121); клетки почки ^1, преобразованных ЗV40 (С0З сеШ С0З-7,

- 94 017765

АТСС СКЕ-1651); клетки человеческой эмбриональной почки (например, 293 клетки или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензионной культурой, СгаБат е! а1., 1977, 1. Сеп. У1го1. 36:59); клетки почки детеныша хомячка (ВНК, АТСС ССЬ-10); клетки почки обезьяны (СУ1, АТСС ССЬ-70); клетки почки африканской зеленой мартышки (УЕК0-76, АТСС СКБ-1587; УЕК0, АТСС ССЬ-81); клетки Сертоли (ТМ4, Ма!йет, 1980, Вю1. Кергок:. 23:243-251); клетки рака шейки матки у человека (ЖЕА, АТСС ССЬ-2); клетки почки собаки (МОСК,-АТеС ССЬ-34); клетки легких человека (^138; АТСС ССЬ-75); клетки человеческой гепатоиы (НΕΡ-С2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы (ММТ 060562, АТСС ССЬ-51); клетки почек крысы (ВКБ 3А, АТСС СКЬ-1442); клетки ТК! (Ма!йет, 1982, Аппак NΥ Асак. δα. 383:44-68); клетки МСК5; клетки Εδ4. В одном аспекте данного изобретения использованы клетки СНО, особенно СК0/кЫг- и клетки СНО ΌΟ44.

Примеры гликопротеинов млекопитающих, которые могут быть продуцированы методами в данном изобретении, включают, без ограничений, цитокин, рецепторы цитокина, факторы роста (например, ΕСЕ, ΗΕΚ-2, ЕСЕ-а, ЕСЕ-р, ТСЕ-а, ТСЕ-р, ΡΌΟΕ ЮЕ-1, ЮЕ-2, NСΕ, NСΕ-р); рецепторы фактора роста, включая гибридные или химерные белки. Другие примеры включают, но не ограничиваются ими, гормоны роста (например, гормон роста человека, гормон роста крупного рогатого скота); инсулин (например, цепь инсулина А и цепь инсулина В), проинсулин; эритропоэтин (ЕРО); факторы, стимулирующие колонию (например, С-СδЕ, СМ-СδЕ, М-СδЕ); интерлейкины (например, с ΙΌγ1 по ΙΕ-12); фактор роста эндотелия сосудов (УЕСЕ) и его рецептор (УЕСЕ-К); интерфероны (например, ШЖа, р или у); фактор некроза опухоли (например, Т№-о и ЮТ^) и их рецепторы, Т№К-1 и ТЖ-2; тромбопоэтин (ΎΡ0); тромбин; натрийуретический пептид мозга (В№); факторы свертывания крови (например, фактор УШ, фактор К, фактор фон Виллибранда и т.п.); факторы антисвертывания крови; тканевой активатор плазминогена (ТРА), например, урокиназа или человеческая моча или тип ткани ТТА; фолликулостимулирующий гормон (ΕδΗ); лютеинизирующий гормон (ЬН); кальцитонин; белки СО (например, СЭ3, СЭ4, СЭ8, ί’Ό28, СЭ19 и т.д.); белки СТЬА (например, СТБА4); белки рецептора Т-клетки и В-клетки; морфогенетические белки кости (В№з, например, ВМР-1, ВМР-2, ВМР-3 и т.д.); нейротрофические факторы, например, нейротрофический фактор, выведенный из кости (ВО№); нейтрофины, например, 3-6; ренин; ревматоидный фактор; КАNТΕδ; альбумин; релаксин; белок торможения макрофага (например, МШ-Е МЕР-2); вирусные белки или антигены; поверхностные мембранные белки; белки ионного канала; ферменты; регуляторные белки; антитела; иммуномодулирующие белки (например, НЬА, МНС, семейство В7); хоминг-рецепторы; транспортный белки; супероксиддисмутаза (δ0Ό); С-белок сопряженный рецептор (ΟΡΟΚδ); нейромодилирующие белки; протеины и пептиды, связанные с болезнью Альцгеймера (например, А-Ье!а), а также другие, известные в данной области. Подходящие белки, полипептиды и пептиды, которые могут быть получены при помощи методов данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, гибридные белки, полипептиды, химерные белки, а также фрагмент или части, или мутанты, варианты, или аналоги любых из упомянутых ранее белков и полипептидов.

Данное изобретение также может использоваться для продуцирования молекул СТ^Λ4-Iд. которые являются вариантами δΕΟ ΙΌ N0:5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном варианте осуществления изобретения молекула СТ^Λ4-Iд может включать мономер, имеющий одну цепь или более в остатках 55 (А55У) и 130 (Ы 30Е) (остатки, о которых идет речь, из δΕΟ ΙΌ N0:2). См. описания вариантов и мутантов СТ^А4-Iд, описанных в заявке США Ж. υδ 2002/0182211 А1, на которую имеется ссылка в данном документе. В другом варианте осуществления изобретения вариант СТ^Λ4-Iд может содержать молекулу СТ^Λ4-Iд. имеющую мутацию внутри области СТЬА-4 или мутацию в области Ι§, или любую комбинацию из них. В одном варианте осуществления изобретения молекула варианта СТ^Λ4-Iд содержит молекулу СТБА4Ι§, обладающую последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере на (приблизительно) 70%, (приблизительно) 75%, (приблизительно) 80%, (приблизительно) 85%, (приблизительно) 90%, (приблизительно) 95%, или (приблизительно) 99% идентична по отношению к δΕΟ ΙΌ N0:5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном варианте осуществления изобретения молекула варианта СТЬА4-[д способна присоединяться к СО80 или к СО86. В другом варианте осуществления изобретения вариант также может образовать димеры. В другом варианте осуществления изобретения вариант показывает углеводный профиль, похожий на профиль, который проявляет немутированная популяция СТЬА4-[д. В одном варианте осуществления изобретения молекулы варианта СТ^Λ4-Iд имеют одинаковые потенциальные сайты Жсоединенного и О-соединенного гликозилирования, присутствующие в δΕΟ ΙΌ N0:2. В другом варианте осуществления изобретения молекула варианта СТЬА4-[д имеет те же самые сайты Жсоединенного и -О-соединенного гликозилирования, присутствующие в δΕΟ ΙΌ N0:2, и имеет дополнительные сайты гликозилирования. Мутации могут включать, но не ограничиваются ими, нуклеотидные делеции, включения (вставки), добавления; делеции аминокислот, подстанции, добавления; сдвиг рамки генетического кода нуклеиновой кислоты. Замены могут быть или неконсервативными (например, глицин, замененный триптофан), или консервативными (например, лейцин, замещенный изолейцином).

Молекулы варианта СТЕА4-[д могут включать, но не ограничиваются ими, СТЕА4-Б1 04ΕΛ29ΥIд (используя систему счисления остатков δΕΟ ΙΌ N0:2, СТ^Λ4-^104ΕΛ29УIд в данном документе называется как СТ^Λ4-^130ΕΛ55УIд). а также те молекулы варианта СТ^Λ4-Iд. описанные в заявке на патент США δ^'Γ. Nο8. 09/865321 (υδ ₽иЬ. № υδ2002/0182211), 60/214065 и 60/287576; в \\'0 01/92337 А2;

- 95 017765 в И8 Раб Nо8. 6090914, 5844095, 5773253; и как описано К.1. Реасй еб а1., 1994, 1. Ехр Меб. 180:2049-2058. В одном варианте осуществления изобретения полученные молекулы варианта €:7^463 могут быть выделены из клетки, которая содержит вектор экспрессии, кодирующий белок варианта СТ^Л4-Iд.

Вариант СТЬА4-[д, Ы 30ЕА55У1д, гибридный белок, полученный методом генной инженерии, похожей по структуре на молекулу СТАЕТ-Ю Ь130ЕА55У-[д обладает функциональным внеклеточном доменом связывания модифицированного человеческого СТЬА-4 и домена Рс человеческого иммуноглобулина класса Ι§01 с1а88. Две аминокислотные модификации, лейцин на глутаминовую кислоту в положении 104 (Ь104Е) варианта ^104ЕЛ29Υ, который соответствует положению 130, 8ЕО ΙΌ N0:2, и аланин к тирозину в положении 29 (А29У) варианта Ь104ЕА29У, который соответствует положению 55, 8Е0 ΙΌ N0:2, были проведены в области связывания В7 домена СТЬА-4 домен для порождения Ь130ЕА55У Ь130ЕА55¥-[д может содержать две гомологические гликозилированные полипептидные цепи, каждая из которых примерно составляет 45.600 Дальтонов (Да), которые удерживаются вместе одним межцепным дисульфидным мостиком и не ковалентными взаимодействиями. ДНК, кодирующая ^130ЕЛ55Υ-Iд, была депонирована как ДНК, кодирующая ^104ЕЛ29Υ-Iд. 20 июня 2000, в Атепсап Туре СиЙиге Со11ес11оп (АТСС) (американская коллекция типовых культур) по условиям Будапештского договора. Ему был присвоен инвентарный номер АТСС, а именно РТА-2104. Ы 04ЕЛ29Υ-Iд (соответствует ^130ЕЛ55Υ-Iд в его применении) далее описан в заявке на патент США, номер серии 09/579927, 60/287576 и 60/214065 и 09/865321 и в \У0 01/923337 А2, на все эти публикации имеется ссылка.

Так как рекомбинантный белок Ь130ЕА55¥-[д отличается только по 2 аминокислотам (Туг в положении аминокислоты 55, а С1и в положении аминокислоты 130) по сравнению с мономерами СТ^Л4-Iд. имеющими А1а в положении аминокислоты 55, а Ьеи в положении аминокислоты 130, 8ЕО ΙΌ N0:2, и так как эти 2 мутации не влияют на N или О-соединенное гликозилирование, популяции молекулы варианта СТ^Л4-Iд. включающей Ш 30ЕЛ55Υ-Iд. могут иметь тот же профиль или очень похожий профиль гликозилирования, как это делают популяции, составляющие дикий [немутантный] тип СТЬА4-[д. Далее, так как рекомбинантный белок Ш 30ЕА55¥4д отличается только по 2 аминокислотам (Туг в положении аминокислоты 55 и С1и в положении аминокислоты 130) по сравнению с мономерами СТЬА4Ι§, имеющими А1а в положении аминокислоты 55, а Ьеи в положении аминокислоты 130, 8ЕО ΙΌ N0:2, согласно существующим методам данного изобретения должен продуцироваться Ь130ЕА55¥-[д со сходными характеристиками, как описано в табл. 6.

Методы данного изобретения также могут использоваться для продуцирования молекул СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд, которые являются вариантами 8ЕО ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16. В одном варианте осуществления изобретения СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд может включать мономер, имеющий одно или более изменение в 8ЕО ΙΌ N0:3. Например, описания других молекул СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд даны в публикациях по патентам США. Ра1еп1 АррНсабоп РиЫюабоп Боз. (номера публикаций по патентным заявкам) И8 2002/0039577, И8 2003/0007968, И8 2004/0022787, И8 2005/0019859, а также И8 2005/0084933, и патент И8 70948874, на которые имеются полные ссылки в данном документе.

В одном варианте осуществления изобретения СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд включает одну или более мутаций внутри области СТЬА-4 (8ЕО ΙΌ N0:1 8), или мутацию в области Ι§. или их любую комбинацию. В других вариантах осуществления изобретения молекула СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд включает СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд, имеющую последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на (приблизительно) 70%, (приблизительно) 75%, (приблизительно) 80%, (приблизительно) 85%, (приблизительно) 90%, (приблизительно) 95% или (приблизительно) 99% идентична 8ЕО ΙΌ N0:11, 12, 13, 14, 15 или 16. В дальнейшем варианте осуществления изобретения молекула СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд, как было описано выше, способна связываться с СЬ80 или СЭ86. В другом варианте осуществления изобретения СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд может образовать димер. В дальнейшем варианте осуществления изобретения СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд проявляет углеводородный профиль, похожий на профиль, проявленный немутированной популяцией молекул СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд. Еще в других вариантах молекулы СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд имеют те же самые потенциальные сайты №соединенного и О-соединенного гликозилирования, присутствующие в 8ЕО ΙΌ N0:4. В другом варианте осуществления изобретения СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд имеет те же самые места №соединенного и О-соединенного гликозилирования, имеющихся в 8Е0 ΙΌ N0:4, и имеет дополнительные сайты гликозилирования. Мутации могут включать, но не ограничиваются ими, нуклеотидные делеции, включения (вставки), добавления; делеции аминокислот, подстанции, добавления; сдвиг рамки генетического кода нуклеиновой кислоты; замены могут быть или неконсервативными (например, глицин, замененный триптофаном), или консервативные (например, лейцин, замещенный изолейцином).

В одном варианте осуществления изобретения популяция молекул варианта СТ^Л4-Iд может быть продуцирована клетками млекопитающих (например бйТг-негативные клетки СНО), которые экспрессируют ген, кодирующий желательный белок (например, белок ^130ЕЛ55Υ-Iд или наподобие), выращенный в суспензии согласно методу массового производства данного изобретения. Согласно данному изобретению вариант рекомбинантного белка СТ^Л4-Iд. продуцированный клетками млекопитающих, может быть восстановлен согласно йщхезбюд рагате1егз, как представлено в данном документе. В одном случае вариант рекомбинантного белка СТ^Л4-Iд. продуцированный клетками млекопитающих, может быть очищен согласно схеме очистки, описанной в данном изобретении (пример 15).

- 96 017765

В одном варианте осуществления изобретения популяция молекул СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд может быть продуцирована клетками млекопитающих (например, йМг отрицательная клетка СНО), которая экспрессирует ген, кодирующий желательный белок (например, СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд), выращенной суспензии согласно методу массового производства. Согласно данному изобретению рекомбинантный СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, продуцированный клетками млекопитающих, может быть восстановлен в соответствии с параметрами получения (клеток), описанными в данном документе. В других вариантах рекомбинантный СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, продуцированный клетками млекопитающих, может быть очищен согласно схеме очистки, описанной в данном изобретении (примеры 19, 20).

Типы культур клеток и общие процессы культивирования.

Белок, представляющий интерес, например гликопротеин, гибридный белок и т.п., может быть продуцирован путем выращивания клеток, экспрессирующих желательный белковый продукт при разнообразных условиях клеточных культур. Специалист, работающий в данной области, понимает, что культуры клеток и серия опытов культивирования для получения белков могут включать, но не ограничиваться ими, три общих типа: непрерывная культура, периодическая культура и подпитываемая культура (одного производственного цикла). В процессе непрерывного культивирования обеспечивается добавление свежей культуральной среды (например, среда подпитки) к клеткам во время всего периода культивирования, в то время как старая культуральная среда удаляется. Продукт, произведенный во время непрерывной культуры, также может быть собран, например, на ежедневной основе или постоянно. Пока клетка остается живой, а условия окружающей среды и культивирования остаются постоянными, клетка может остаться, клетки могут оставаться в культуре так долго, насколько это возможно в условиях непрерывной культуры.

В процессе обработки периодической культуры процессы первоначально культивируются в среде, и эта среда для культивирования никогда не заменяется, не удаляется, не дополняется. Клетки не накормлены новой средой во время или до конца эксперимента культивирования, таким образом, это культивирование продолжается, пока не будут исчерпаны все питательные вещества. Продукт белка получается в конце эксперимента по культивированию.

Для процессов культивирования с подпиткой время эксперимента может быть увеличено путем добавления культуральной среды один или более раз в день (или постоянно) вместе со внешней средой во время эксперимента. В этом процессе клетки снабжены накормлены средой во время эксперимента. Культивирование с подпиткой может включать различные схемы питания, описанные ранее. Например, ежедневно, каждое утро, каждый второй день и т.д.; более одного раза в день или менее одного раза в день и т.д. В подпитываемые культуры также можно постоянно добавлять среду питания. В конце эксперимента культивирования/получение белковый продукт интересующий нас затем добавляется.

Системы клеточных культур для мало- или крупномасштабных производств белков, включая гликопротеины, продуцированные клетками-хозяевами млекопитающих, являются полезными в контексте данного изобретения. Обладающие квалификацией в данной области понимают, что чашки Петри, роллерные колбы и Т-колбы обычно используются для методов культивирования на лабораторном уровне. Процессы, которые могут использоваться для культивирования в более крупных масштабах (например, 500 л, 5000 л, 10000 л, 20000 л и т.п.), включают, но не ограничиваются ими, биореакторы с полыми волокнами, биореактор с псевдоожиженным слоем, систему биореактора с механическим перемешиванием или культивирование в роллерном флаконе. Последние два процесса могут использоваться с или без микроносителей.

Системы могут работать в периодическом режиме, в периодическом режиме подпитывания или непрерывном режиме работы. Для культивирования в промышленных масштабах система биореактора с механическим перемешиванием это система выбора из-за ее гибкости. Эти реакторы могут выдерживать клетки в суспензии путем размешивания благодаря механическому перемешиванию при помощи барботажа воздушных пузырьков или лопастного колеса. Биореактор с механическим перемешиванием Т8 может быть увеличен до объемов производственных масштабов (например, 20.000 л) и может работать в различных режимах работы. Эти системы обеспечивают большую площадь поверхности для роста клеток и эффективную передачу метаболических отходов, кислорода и питательных веществ, а также поддерживает однородную окружающую среду по всему реактору, предотвращая осаждение клеток на дне благодаря постоянному перемешиванию компонентов внутри реактора. Для производства необходимого гликопротеина в настоящем изобретении осуществляется крупномасштабное культивирование клеток, работающий в периодическом режиме подпитывания, процесс происходит в биореакторе с механическим перемешиванием, питательная среда, содержащая Ό-галактозу, подается ежедневно. В другом варианте осуществления изобретения культивирование клеток в периодическом режиме подпитывания также может происходить в биореакторе с механическим перемешиванием, подается ежедневно питательная среда, которая содержит подходящую концентрацию питательных веществ клеточной культуры, важных для гликозилирования белка, таких как глюкоза и глутамин (СЬее е1 а1., 2005, Вю1ес11по1. Вюепр. 89:164-177).

Клетки культуры, производящей белок (представляющий интерес), могут быть распространены согласно любой схеме или установившейся практике, которая наиболее подходит для конкретной клетки

- 97 017765 хозяина млекопитающих и предполагаемого конкретного производственного плана. Могут быть разработаны условия культивирования клеток для усиления экспансии или роста популяции клеток-хозяина млекопитающих в фазе роста клеточной культуры в течение времени, которое обеспечивает максимум для подобного расширения и роста. Фаза роста клеточной культуры содержит период экспоненциального роста клеток (например, логарифмическая фаза), где клетки, прежде всего, делятся быстро. Во время этой фазы скорость увеличения в плотности жизнеспособных клеток выше, чем в любой точке, взятой в любое время.

Также условия культивирования клеток могут быть разработаны, чтобы улучшить производство белка во время производственной фазы культивирования клеток в течение некоторого периода времени. Производственная фаза клеточной культуры заключает в себе период, в течение которого рост клеток является стабильным или поддерживается на близком константном уровне. Плотность жизнеспособных клеток остается приблизительно постоянной в течение данного периода времени. Логарифмический рост клеток завершился и получение белка является деятельность первостепенной важности во время фазы производства. Среда в это время обычно добавляется, чтобы поддерживать продолжающееся производство белка и достичь желательного продукта гликопротеина.

Условия культивирования, такие как температура, рН, растворенный кислород (Ό02) и т.п., - это те, которые используются в культивировании клеток хозяина млекопитающих, их хорошо понимает специалист в данной области. Подходящий температурный диапазон для культивирования клеток хозяина млекопитающих, таких как клетки СНО, находится между 30 и 40°С, а в одном варианте осуществления изобретения - около 37°С. рН обычно регулируется к уровню между 6.5-7.5 с использованием или кислоты, или щелочи. Подходящий Ό02 находится между 5-90% насыщения воздуха. Эти условия культивирования могут использоваться для ускорения культивирования клеток млекопитающих, что в результате дает желательный белок или продукт гликопротеина.

Популяция клеток хозяина млекопитающих может быть расширена и выращена в фазе роста, где клетки, вероятно, удаленные из хранения, добавляются в среду культивирования, подходящую для активации роста и высокой жизнеспособности. Клетки затем могут сохраняться в фазе производства в течение подходящего периода времени путем добавления свежей среды культивирования к культуре клеткихозяина. Во время фазы производства клетки могут подвергаться различным сдвигам в температуре, чтобы ускорить получение белка. Процессы культивирования со множественными температурными сдвигами описаны в заявках на патенты И8 8ег. №. 10/742564, поданной 18.12.2003, и И8 8ег. №. 10/740645, поданной 18.12.2003. На все эти документы имеются полные ссылки. В данном изобретении два или более температурных сдвига, включенных в процессы культивирования клеток, могут приводить к увеличенному количеству жизнеспособных клеток, которые выживут в культуре до конца процесса или производственного цикла. Во время производственной фазы культивирования, чем больше количество клеток, тем больше количество полученных белков и продукта гликопротеина, увеличивая количество белкового продукта в конце процесса.

Особенным аспектом данного изобретения является воплощение подпитываемого широкомасштабного (например, 500, 5000, 10000 л и т.п.) культивирования культуры клеток млекопитающих, которые подаются ежедневно или согласно механизму подачи, описанному в табл. 14, 15, содержащей Όгалактозу, чтобы клетки производили гликопротеин (представляющий интерес). Чтобы увеличить качество белка, полученного в данном варианте осуществления этого изобретения, могут быть использованы два или три температурных сдвига во время, чтобы увеличить фазу производства белка больше того, когда температурный сдвиг не используется или когда есть только один температурный сдвиг. В другом варианте изобретения применяется подпитывание, широкомасштабное (например, 500 л, 5000 л, 10000 л Ь и т.п.) культивирование клеток млекопитающих, которые получают питание один раз в день или чаще с питательной средой, описываемых в табл. 22, в которую включена Ό-галактоза, чтобы клетки производили гликопротеин (например, СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд). Во время культивирования может использоваться один или более температурный сдвиг, чтобы расширить фазу производства выше того уровня, который имеет место, когда температурные сдвиги не используются с целью увеличения количества. В качестве альтернативы сульфат декстрана может быть добавлен посредством сопутствующего температурного сдвига.

Массовое производство рекомбинантного белка в биореакторах.

Данное изобретение включает методы традиционного культивирования с помощью биореактора с механическим перемешиванием эукариотических клеток (например, объем клеточной культуры 20000 л), особенно для получения крупных или промышленных количеств желательных белковых продуктов, которые экспрессируются подобными клетками. Процесс культивирования - это процесс подпитываемой культуры эукариотических клеток, выращиваемых в суспензии, с получением надосадочной жидкости культуры, где эукариотические клетки, например клетки млекопитающих, экспрессирующих белок, представляющий интерес, выделяют желательный белковый продукт в среду культивирования.

Методы для широкомасштабного культивирования клеток млекопитающих, особенно для получения больших количеств желательных белковых продуктов, которые экспрессируются такими клетками, воплощены в настоящем изобретении. Методы могут быть выполнены путем выполнения следующих

- 98 017765 этапов:

(ί) прививание клеток в сосуде для культивирования (например, Т-175 колба), содержащем культуральную среду без сыворотки, и размножение культуры семян (например, начальной культуры, которая используется для инокулирования большего объема), по меньшей мере, пока клетки не достигнут минимальной плотности перекрестного посева, где плотность (густота) - это заранее определенное значение, необходимое для достаточного размножения клеток в последующем объеме культивирования;

(ίί) передача размноженной культуры в сосуд культивирования большего объема (например, роллерные флаконы или се11 Ьадк), содержащий культуральную среду, где не хватает элементов животного происхождения, чтобы расширить культуру;

(ίίί) передача увеличенной в объеме культуры для посева в крупный сосуд для культивирования, содержащий культуральную среду без сыворотки, чтобы далее размножаться в культуре клетки;

(ίν) поддерживание культивирования в больших размерах в среде, где не хватает компонентов животного происхождения, по меньшей мере, пока вышеуказанные клетки не достигнут целевой плотности или не проявят специфические биохимические характеристики.

В некоторых вариантах метод может включать этап (ίν) получения культуральной среды и замены этой среды свежей средой.

В других вариантах методы для культивирования в широких масштабах клеток млекопитающих могут быть выполнены следующим образом:

(ί) прививание клеток в сосуде для культивирования (например, Т-175 колба), содержащем культуральную среду без сыворотки (например, прививочная среда), и размножение культуры семени (например, начальной культуры, которая используется для инокулирования большего объема), по меньшей мере, пока клетки не достигнут минимальной перекрестной густоты посевов, где плотность (густота) - это заранее определенное значение, необходимое для достаточного размножения клеток в последующем объеме культивирования;

(ίί) передача размноженной культуры в сосуд культивирования большего объема (например, роллерные флаконы или мешочки с клетками), содержащий культуральную среду, где не хватает элементов животного происхождения, чтобы увеличить объем культуры;

(ш) передача увеличенной в объеме культуры для посева в крупный сосуд для культивирования, содержащий культуральную среду без сыворотки, чтобы далее размножаться в культуре клетки;

(ίν) поддерживание культивирования в больших размерах в среде, где не хватает компонентов животного происхождения (например, питаемой среды), по меньшей мере, пока вышеуказанные клетки не достигнут целевой плотности или не проявят специфические биохимические характеристики.

В некоторых вариантах метод может включать этап:

(ν) уборка культуральной среды и замена использованной среды новой средой.

Данное изобретение применимо к любому типу клеток в любой формулировке среды, где отсутствуют компоненты животного расхождения, чтобы получить в больших количествах желательные белковые продукты и можно использовать или один их двух следующих процессов, или из вариации: а) процессы микроносителей, Ь) процессы суспензионной клеточной культуры. При культивировании клеток, например клетки млекопитающих, можно применять любой из процессов, работая в двух отчетливых фазах, фаза роста и фаза производства. В другом варианте осуществления изобретения любая формулировка среды, которая содержит компоненты животного происхождения (в качестве некоторых примеров можно привести сыворотку альбумин для крупного рогатого скота (Β8Α) или ЕВ8), может использоваться для производства большого количества, как описывалось выше.

Профессионал в данной области понимает, что процесс микроносителя, не ограниченный стандартным микроносителем-процессом или процессом микроносителя профузии, может использоваться для культивирования клеток, где клетки присоединяются и/или фиксируются на крупнопористом носителе. В стандартном микроносителе-процессе клетки инокулируются в сосуд с культурой посева, содержащий культуральную среду без сыворотки, и размножаются, пока клетки не достигнут минимальной плотности обсеменения. Впоследствии размножившаяся культура обсеменения передается в более крупный сосуд, содержащий культуральную среду без сыворотки и микроносители. В этой фазе роста клетки выращиваются на микроносителях, пока носители полностью не колонизуются, например, клетками, мигрирующими в носители в случае, если в процессе используются пористые носители.

Обмен средой может произойти, когда микроносители оседают на дне сосуда с культурой, после чего заранее определенное процентное соотношение объема резервуара удаляется, а соответствующее процентное соотношение объема резервуара со свежей средой добавляется. Микроносители затем вновь находятся во взвешенном состоянии в среде для культивирования. Профессионал понимает, что процесс удаления замены среды может быть повторен с заранее определенным интервалом, например каждые 24 ч, в соответствии с чем количество замененной среды зависит от плотности клеток и обычно может составлять от 25 до 80% объема резервуара. 60-95% среды в резервуаре может меняться каждые 24 ч, когда плотность клеток достигает заранее определенного значения, подходящего для экспрессии белка. Профессионалы в данной области часто используют упомянутое выше значения % обмена среды также и в течение всей фазы производства.

- 99 017765

В течение фазы производства культуральная среда может быть заменена путем того, что микроносителям позволяют осесть на дно резервуара, после чего выбранный в % объем резервуара удаляется, а соответствующий % объема резервуара добавляется, например 60-95%, как было описано ранее, свежей среды для культивирования добавляется в сосуд. Микроносители затем вновь находятся во взвешенном состоянии, а процесс удаления и замены среды можно повторять ежедневно.

Процесс перфузии микроносителя напоминает стандартный процесс микроносителя и также выполняется в фазах роста/расширения и производства. Главная разница между двумя процессами состоит в методе, применяемом для изменения культуральной среды. Определенное количество объема резервуара, например 60-95% суммарного объема резервуара, заменяется все сразу в стандартном процессе с микроносителем, в то время как в процессе перфузии среда добавляется постоянно. В основном, среда объема резервуара в % меняется постепенно в течение заранее определенного промежутка времени, в то время как микроносители хранятся в сосуде путем использования устройства для разделения (или устройство для перфузии), которое позволяет убрать среду из сосуда, но сохраняет микроноситель внутри резервуара. Фаза роста в данном процессе такая же, которая была описана для стандартного процесса с микроносителем, кроме постепенного обмена среды.

Две неограничивающие опции для процесса с суспензионной клеточной культурой включают процесс перфузии суспензии клеток и периодический процесс суспензии клеток. В процессе перфузии клетки в среде для культивирования свободно находятся во взвешенном состоянии, не прикрепляясь к носителями, подобно процессу с микроносителями, могут быть управляемыми в двух четких фазах (например, фаза роста и фаза производства). Во время фазы роста процесса перфузии клеток суспензии клетки инокулируются в сосуд с культурой посева, содержащий культуральную среду без сыворотки, и размножаются, пока клетки не достигнут целевой плотности кросс-обсеменения. Размножившаяся культура обсеменения может затем передаваться в сосуд с культурой большего размера, в котором содержится среда для культивирования без компонентов животного происхождения, и размножаться, пока не будет достигнута заранее определенная плотность клеток, подходящая для экспрессии. Выполняется постоянная перфузия сосуда со свежей культуральной средой, чтобы осуществить процесс обмена среды.

В периодическом процессе культивирование клеток суспензии может быть выполнено посредством следующих неограничивающих форматов: а) простой периодический процесс или Ь) процесс с подпитываемой культурой. Клетки инокулируются в сосуд с культурой посева, содержащий культуральную среду без компонентов животного происхождения, в простом периодическом процессе и размножаются, пока клетки не достигнут заранее определенной плотности кросс-обсеменения. Соответственно, размножившаяся культура передается в сосуд с культурой большого размера, содержащий культуральную среду без сыворотки, и с сосудом для культивирования работают, пока питательные вещества в культуральной среде не будут исчерпаны. В процессе с подпитываемой культурой подача концентрированного раствора питательных веществ (например, например, среда питателя) в резервуар может увеличить подачу питательных веществ в среде процесса культивирования, таким образом, увеличение времени процесса, в конечном счете, ведет к увеличению производства желательного белка внутри сосуда с культурой. Метод добавления среды питания может изменяться. Она может быть или в виде болюса одиночных импульсов (один, два, три раза и т.д. три раза в день), или может быть подан постепенно в течение 24 ч. Данное питание (подача) позволяет клеткам размножаться в большом сосуде с культурой, а среда, в которой могут содержаться секретированные продукты белка (представляющего интерес), должна быть собрана в конце серии опытов, прежде чем не закончится какое-нибудь из питательных веществ. Вместо удаления всего содержания из сосуда специалист в данной области удаляет только часть объема резервуара (может составлять (приблизительно) 80%).

Дополнительным аспектом процесса с подпитываемой культурой является использование температурных сдвигов. В этом процессе температуры, используемые как рабочие температуры во время фазы производства, ниже, чем температуры, используемые во время фазы роста. Указанная температура колеблется в определенных пределах для процесса с подпитываемой культурой, например процесс, использованный в данном изобретении, может состоять из начальной фазы роста при температуре, подходящей для роста конкретной используемой линии клеток, затем следует понижение рабочей температуры при заранее определенной плотности клеток.

В одном варианте осуществления изобретения процесс широкомасштабного процесса с подпитываемой культурой состоит из следующего:

(ΐ) привитие клетки в сосуде для культивирования (например, Т-175 колба), содержащем культуральную среду без сыворотки, и размножение культуры семени, по меньшей мере, до тех пор, пока клетки не достигнут заранее определенной кросс-густоты (плотности) посева при температуре, подходящей для роста;

ίί) перенос размноженной культуры в сосуд для культивирования большего объема (например, роллерные флаконы или мешочки с клетками), содержащий культуральную среду, где не хватает элементов животного происхождения, чтобы увеличить культуру при подходящей температуре;

(ш) перенос увеличенной культуры для посева в крупный сосуд для культивирования, содержащей культуральную среду без сыворотки, чтобы далее размножаться в культуре клетки при подходящей тем

- 100 017765 пературе;

(ίν) поддерживание культивирования в больших размерах в среде при уменьшенной температуре, подходящей для экспрессии белка, в среде, не содержащей продукты животного происхождения, с ежедневной сменой свежим раствором питания, по меньшей мере, до тех пор, пока указанные клетки не достигнут целевой плотности или критического отрезка времени.

Ступенчатая замена свежей средой питания в (ίν) может повлечь за собой удаление заранее определенного объема, например 80%, объема резервуара и замену его тем же объемом свежей среды питания.

Еще в одном варианте воплощения изобретения процесс широкомасштабного процесса с подпитываемой культурой включает следующее:

(ί) привитие клетки в сосуде для культивирования (например, Т-175 колба), содержащем культуральную среду без сыворотки, и размножение культуры семян, по меньшей мере, до тех пор, пока клетки не достигнут заранее определенной кросс-густоты (плотности) посева при температуре, подходящей для роста;

(ίί) перенос размноженной культуры в сосуд для культивирования большего объема (например, роллерные флаконы или мешочки с клетками), содержащий культуральную среду, где не хватает элементов животного происхождения, чтобы увеличить культуру при подходящей температуре;

(ίίί) перенос увеличенной культуры для посева в крупный сосуд для культивирования (например, 1000-л биореактор), содержащий культуральную среду без сыворотки, для дальнейшего размножения в клеточной культуре при подходящей температуре;

(ίν) поддерживание культивирования в больших размерах в среде при уменьшенной температуре, подходящей для экспрессии белков, в среде, не содержащей компонентов животного происхождения, с ежедневными заменами свежей средой подачи, по меньшей мере, до тех пор, пока указанные клетки не достигнут целевой плотности или критического отрезка времени.

Этап замены свежей средой подачи в (ίν) может повлечь удаление заранее определенного объема, например около 80% объема резервуара, замену ее некоторым объемом свежей среды подачи.

В одном варианте осуществления изобретения клетки, культивированные в процессе подпитываемой культурой, являются клетками млекопитающих, например клетки СНО, которые экспрессируют желательный продукт белка. Клетки млекопитающих инокулируются в сосуд культивирования обсеменения (например, Т-175 йакк), культуральную среду без сыворотки, например среду СИ-СН0 (пример 13), и размножаются при температуре, подходящей для роста, например при (приблизительно) 35-39°С, в течение 3-4 дней, пока клетки не достигнут заранее определенной плотности кросс-обсеменения (например, имея >6.0х10⁶ жизнеспособных клеток, или где конечная жизнеспособность культуры 80%). Размноженная культура обсеменения затем передается в сосуд большого объема (например, роллерфлаконы), содержащий культуральную среду, не содержащую компонентов животного происхождения, для увеличения в объеме при подходящей температуре (например, при приблизительно 35-39°С) в течение примерно 3-4 дней. Клеточная культура далее увеличивается в большем сосуде (например, мешок для культивирования клеток на 20 л, на 100 л и т.п.), содержащем среду без сыворотки, например среду СИ-СН0 при температуре, подходящей для роста, например при приблизительно 35-39°С, в течение 3-4 дней, пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, имея >1-2х10⁶ жизнеспособных клеток/мл или конечная жизнеспособность культуры составляет >80%). В одном варианте осуществления изобретения увеличение объема посевного материала включает в себя минимум 4 пересевов. В другом варианте осуществления изобретения увеличение объема посевного материала включает не более 20 пересевов.

Увеличенная в объеме культура обсеменения затем может использоваться для инокулирования в резервуар для культивирования крупного размера (например, 1000-л биореактор, 4000-л биореактор и т.п.), содержащий культуральную среду без сыворотки (например, среда СИ-СН0), для дальнейшего размножения клеточной культуры при подходящей температуре, например при примерно 35-39°С, в течение 3-6 дней, пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, имея >1-2х10⁶ жизнеспособных клеток/мл или конечная жизнеспособность культуры составляет >80%). Культура в резервуаре большого объема (например, 10000 л, 15000 л, 20000 л культуры в биореакторе и т.п.) впоследствии хранится в культуральной среде без сыворотки, где среда является средой подачи (подпитки) (например, среда еКЭЕ, пример 14), при температуре ниже, чем температура роста (например, при (приблизительно) 33-35°С в течение 3-4 дней и при (приблизительно) 31-33°С в течение 6-8 дней), подходящей для экспрессии белка и производства выделенного продукта белка. Среда подачи заменяется ежедневно свежей средой подачи, при этом замена резервуара свежей средой подачи определяет удаление заранее определенного объема, например 80% объема резервуара, и замену резервуара тем же объемом свежей средой подачи. Культура промышленного масштаба поддерживается, пока указанные клетки не достигнут целевого значения производственных параметров, которые могут включать, но не ограничиваются ими, продолжительность, целевая плотность клеток или биохимические характеристики белка (такие как молярное отношение ΝΑΝΑ, что было описано ранее), где плотность жизнеспособных клеток может быть 3.08.0х10⁶ клеток/мл; молярное отношение ΝΑΝΑ может быть >6.0; конечная жизнеспособность клеточной

- 101 017765 культуры может быть >30%; а конечный титр продукта белка может быть >0.5 г/л.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения клетки, культивируемые в процессе с подпитываемой культурой, являются клетками млекопитающих, например клетки СНО, которые экспрессируют желательный продукт белка (например, молекула СТ^А4-Iд). Клетки СНО инокулируют в сосуд с культурой обсеменения (например, Т-175 колба), содержащий среду, в состав которого не входит сера, например среда ί.Ό-ίΉΟ, и они размножаются при температуре, подходящей для роста, например при примерно 37°С в течение 3-4 дней, пока клетки не достигнут заранее определенной кросс-плотности (например, имеющей 10.0х10⁶ жизнеспособных клеток, или где жизнеспособность конечной культуры составляет конечную жизнеспособность >84%). Размножившаяся культура обсеменения затем передается в сосуд большего размера (например, роллер-флаконы), содержащий культуральную среду без компонентов животного происхождения, при подходящей температуре (приблизительно) 37°С в течение (приблизительно) 4 дней. Клеточная культура далее увеличивается в объеме емкости с культурой большего размера (например, 20-л мешок для клеток, а 100-л мешок для клеток и т.п.), содержащем среду без сыворотки, например среда ί.Ό-ίΉΟ, в течение 4 дней при температуре, подходящей для роста (например, при (приблизительно) 37°С), пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, имеющей 1-2 х10⁶ жизнеспособные клетки/мл или конечная жизнеспособность культуры составляет >91%). Расширение посевного материала может включать как минимум 7 пересевов.

Увеличившаяся в объеме культура обсеменения затем используется для инокулирования резервуара для культивирования большого размера (например, 4000-л биореактор и т.п.), содержащего культуральную среду без сыворотки (например, среду ί.Ό-ίΉΟ), чтобы далее размножать клеточную культуру при подходящей температуре, например при (приблизительно) 37°С, в течение 5-6 дней, пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, >1-2х10⁶ жизнеспособные клетки/мл или конечная жизнеспособность клеток культуры >86%). Промышленная культура (например, 20000-л культуры в биореакторе) впоследствии выдерживается в культуральной среде, не содержащей сыворотку, где среда представляет собой среду подачи (питания) (например, среда еКЭР) при температуре ниже, чем температура роста, которая подходит для экспрессии белка и производства продукта белка (например, СТЬА4Ц). Температуру культуры промышленного масштаба сначала понижают с (приблизительно) 37 до (приблизительно) 34°С в течение 4 дней, а затем подвергают второму температурному сдвигу, понижая температуру от (приблизительно) 34 до (приблизительно) 32°С в течение 8 дней. Среда питания заменяется ежедневно свежей средой питания, замена среды питания в резервуаре биореактора определяет удаление заранее определенного объема, например 80% объема резервуара, и замену таким же объемом свежей среды питания. Промышленный масштаб поддерживается, пока указанные клетки СНО и/или выделенный продукт белка не достигнет целевого значения следующих не ограничивающих производство параметров: плотность жизнеспособных клеток составляет 4.0-7.0х10⁶ клетки/мл; молярное отношение NАNА >8.0; конечная жизнеспособность культуры клеток >38%; конечный титр продукта белка >0.6 г/л.

В другом варианте осуществления изобретения клетки, культивируемые в периодическом подпитываемом процессе, являются клетками млекопитающих, например клетки СНО, которые экспрессируют желательный продукт белка. Клетки млекопитающих инокулируются в сосуде с культурой обсеменения (например, колба Т-175), содержащем культуральную среду без сыворотки, например среда ί.Ό-ί.ΉΟ (пример 19), размноженная при температуре, подходящей для роста, например от (приблизительно) 35°С до (приблизительно) 39°С, до (приблизительно) 3-4 дней; от (приблизительно) 36°С до (приблизительно) 38°С в течение (приблизительно) 4 дней, пока клетки не достигнут заранее определенной плотности кросс-обсеменения (например, плотность клеток больше чем или равна 1.5х10⁶, или где конечная жизнеспособность культуры больше чем или равна (приблизительно) 80%). Размноженная культура обсеменения затем передается в сосуд с культурой большего размера (например, роллер-флаконы), содержащий культуральную среду при отсутствии компонентов животного происхождения, для увеличения объема при подходящей температуре (например, от (приблизительно) 35°С до (приблизительно) 39°С, или от (приблизительно) 36°С до (приблизительно) 38°С) в течение (приблизительно) 3-4 дней или до (приблизительно) 4 дней. Клеточная культура далее увеличивается в объеме в большом сосуде для культуры (например, 20-л мешок для клеток, 100-л мешок для клеток и т.п.), содержащем среду, свободную от сыворотки, например среда ί.Ό-ίΉΟ, при температуре, подходящей для роста, например от (приблизительно) 35°С до (приблизительно) 39°С или от (приблизительно) 36°С до (приблизительно) 38°С в течение примерно 3-4 дней или до (приблизительно) 4 дней, пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, по меньшей мере (приблизительно) 1.5х10⁶ жизнеспособных клеток/мл или конечная жизнеспособность культуры больше чем или равна (приблизительно) 80%). В одном варианте осуществления изобретения расширение посевного материала вовлекает как минимум 4 пересева. В другом варианте осуществления изобретения расширение посевного материала вовлекает не менее 20 пересевов. В некоторых вариантах среда ί.Ό-ί.ΉΟ является средой инокулята ί.Ό-ί.ΉΟ.

Размноженная культура обсеменения затем может использоваться для инокулирования резервуара для культивирования промышленного масштаба (например, 1000-л, 4000-л биореактор и т.д.), содержащего среду без содержания сыворотки (например, среду ί.Ό-ίΉΟ, такую как среда инокулирования СЭ

- 102 017765

СН0, и/или базальную среду СИ-СН0), чтобы далее размножить клеточную культуру при подходящей температуре, например от (приблизительно) 35°С до (приблизительно) 39°С или от (приблизительно) 36°С до (приблизительно) 38°С в течение от 3 до (приблизительно) 6 дней, или в течение от (приблизительно) 4 до (приблизительно) 5 дней, или в течение (приблизительно) 4.7 дней, или в течение > (приблизительно) 113 ч, пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, 2.3х10⁶ жизнеспособных клеток/мл или конечная жизнеспособность культуры клеток, по меньшей мере, составляет (приблизительно) 88%).

Промышленная культура (например, 10000-, 15000-, 20000-, 30000-л культуры в биореакторе и т.п.) впоследствии выдерживается в культуральной среде без сыворотки, где средой является среда питания (например, среда еВЭЕ, пример 19), при температуре от (приблизительно) 35°С до (приблизительно) 39°С в течение (приблизительно) от 3 до (приблизительно) 6 дней или от (приблизительно) 4 до (приблизительно) 5 дней, что подходит для экспрессии белка и производства выделенного продукта белка. В качестве альтернативы полианионическое соединение (например, такие как сульфат декстрана) может быть добавлено к культуре, выдержанной в культуральной среде без сыворотки, где средой является среда питания (например, среда еВЭЕ, пример 19), как описано ниже и в патентах США (И8 Ра1. Арр. РиЬНсаΐίοη N0. 2005/0019859), на которые имеются полные ссылки в данном документе. Попутно культура может быть подвержена одноэтапному понижению температуры (например, при (приблизительно) 32-36°С в течение от (приблизительно) 3 до (приблизительно) 14 дней в течение от (приблизительно) 10 до 13 дней, в течение от (приблизительно) 234 до (приблизительно) 304 ч.

В одном варианте осуществления изобретения культура также может быть подвержена воздействию многоступенчатого понижения температуры (например, при (приблизительно) 33-35°С в течение (приблизительно) 3-6 дней и при (приблизительно) 31-33°С в течение (приблизительно) 6-8 дней). Вышеописанные процессы подходят для экспрессии белка и производства выделенного продукта белка.

Среда питания в случаях, описанных выше, может заменяться свежей средой питания ежедневно (1, 2, 3 и т.д. раз в день) или каждые несколько дней. Смена содержимого резервуара свежей средой питания предполагает удаление заранее определенного объема, например 80% объема резервуара, и замену содержимого резервуара свежей средой питания того же объема. Промышленная культура выдерживается, пока указанные клетки не достигнут целевого значения производственных параметров, которыми могут быть, но ими не ограничиваются, промежуток времени, целевая плотность клеток или биохимические характеристики белка (такие как молярное отношение NАNА, как было описано ранее), где жизнеспособная плотность клеток может достигать 3.0-8.0х10⁶ клетки/мл; а молярное отношение NАNА может составлять >5.0 или (приблизительно) 6 или от (приблизительно) 5.2 до (приблизительно) 7.6; конечная жизнеспособность культуры клеток может быть больше или равна (приблизительно) 30% или больше или равна (приблизительно) 37%; а конечный титр продукта белка может быть от (приблизительно) 0.46 до (приблизительно) 0.61 г/л, больше или равен 0.5 г/л, больше или равен 20 г/л.

В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен процесс культуры клеток, включающий в себя добавление с задержкой полианионного соединения. Процесс включает в себя добавление полианионного соединения к клеточной культуре через некоторое время после инокуляции (например, во время фазы роста или в течение фазы производства процесса культивирования). Добавление с задержкой полианионного соединения помогает достичь увеличенной жизнеспособности клеток. В одном варианте осуществления изобретение направлено на процесс культивирования клетки, в который входят клеткихозяина культивирования, которые экспрессируют белок, представляющий интерес, и добавление полианионного соединения к клеточной культуре через некоторое время после инокуляции.

Полианионные соединения включают, но не ограничиваются ими, сульфат декстрана (компании 8ίβΐη;·ι-Λ1άΓΒ1ι, 8ΐ. Ьошк, Мо.), гепарин (компании 81дта-АИг1сй), гепарансульфат (компании 81дтаАНпсН), маннан сульфат, хондроитинсульфат (компании 81дта-АИг1сй), дерматансульфат (компании 81дта-А1йг1сй), кератансульфат (компании 81дта-А1йг1сй), гиалуронат (компании 81дта-А1йг1сй), поли(винил)сульфат) (компании 81дта-А1йпсй), каппа-каррагенан (компании 81дта-А1йг1сй) и сурамин (компании 81дта-А1йг1сй). Данные соединения уже имеются в указанных источниках, или их можно легко получить при помощи средств, которые хорошо известны специалистам, работающим в данной области. Эти соединения часто доступны в форме соли, включая, но не ограничиваясь, натриевую соль, но могут также использоваться в виде несолевых форм. Полианионное соединение включает, следовательно, все формы, включая, но не ограничиваясь, формы солей, такие как натриевая соль.

Особенно полезные неограничивающие примеры полианионных соединений данного изобретения включают полисульфатированные соединения: сульфат декстрана, гепарин, гепарансульфат, маннан сульфат, хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератансульфат, поли(винил)сульфат, каппа-каррагенан и сурамин. В одном варианте осуществления изобретения полианионным соединением является сульфат декстрана. Сульфат декстрана может иметь среднюю молекулярную массу от 5000 до 500000 Да. В другом варианте осуществления изобретения использовался сульфат декстрана с молекулярной массой 5000 Да.

Согласно методам данного изобретения полианионное соединение может быть добавлено к клеточ

- 103 017765 ной культуре один раз, два раза, три раза или любое количество раз, во время определенного периода культивирования клеток (например, в какой-то момент после инокуляции, такой как во время фазы роста или фазы производства). Может использоваться один или более полианионных соединений объединенно, например, любое одинарное добавление полианионного соединения может включать добавление одного или более полианионных соединений. Подобным же образом, если существует более одного добавления полианионного соединения, то полианионные соединения могут добавляться при различных добавлениях. Дополнительные соединения и вещества, включая полианионные соединения, могут добавляться к культуре до, одновременно или после добавления полианионного соединения, в течение определенного отрезка времени или не в течение или определенного отрезка времени. В конкретном варианте осуществления существует одинарное, например за один раз, добавление полианионного соединения. В другом варианте осуществления изобретения добавляется одно полианионное соединение.

Полианионное соединение может добавляться к клеточной культуре любыми способами. Средства добавления полианионного соединения включают, но ими не ограничиваются, растворенным в воде, растворенным в культуральной среде, растворенным в среде питания, растворенным в любой подходящей среде и в формах, в которых его получают. В частности, полианионное соединение добавляется растворенным в воде. В соответствии с данным изобретением полианионное соединение добавляется, чтобы увеличить концентрацию в культуре до должного уровня. В качестве неограничивающих примеров полианионное соединение добавляется к концентрации 1-1000 мг/л, 1-200 мг/л, 1-100 мг/л или 25-75 мг/л. К особенно полезным концентрациям полианионного соединения, добавленного к клеточной культуре, относится, но не ограничивается, 25-200 мг/л; около 25-100 мг/л и около 50-100 мг/л. В одном варианте осуществления изобретения концентрация полианионного соединения, добавленного к культуре, составляет около 50 мг/л. В другом варианте осуществления изобретения концентрация полианионного соединения, добавленного к культуре, составляет около 100 мг/л.

Методы изобретения обеспечивают, что культура может работать в течение периода любой длительности после добавления полианионного соединения. Время работы культуры может определяться специалистом в данной области, основываясь на относительных фактах, таких как количество и качество регенируемого белка, уровня загрязняющих клеточных видов (например, белки и ДНК) в надосадочной жидкости, получающейся в результате лизиса клетки, что затруднит восстановление белка, представляющего интерес. В некоторых вариантах процесса культивирования клетки полианионное соединение добавляется после инокуляции (например, во время фазы роста процесса культивирования клетки или во время фазы производства процесса культивирования клетки). Полианионное соединение добавляется в какой-то момент после инокуляции, т.е. в течение или ближе к концу фазы роста. В частности, полианионное соединение добавляется в какой-то момент после инокуляции, т.е. в течение фазы производства, например в начале фазы производства.

В конкретном варианте воплощения данного изобретения клетками, культивированными в периодическом процессе (с подпитыванием), являются клетки млекопитающих, например клетки СНО, которые экспрессируют желательный продукт белка (например, молекула СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд). Клетки СНО вводятся в емкость с культурой обсеменения (например, колбу Т-175), содержащую культуральную среду без сыворотки, см., например, среду С0-СН0 (такую как среда инокулята СП-СН0), и размножаются при температуре, подходящей для роста, например при (приблизительно) 37°С в течение (приблизительно) 3-4 дней, пока клетки не достигнут заранее определенной плотности кросс-обсеменения (например, имея >1.5х10⁶ жизнеспособных клеток, или где конечная жизнеспособность культуры >80%). Размножившаяся культура обсеменения затем переводится в большую емкость культивирования (например, роллер-флаконы), содержащую культуральную среду, лишенную компонентов животного происхождения, для увеличения объема при подходящей температуре (при (приблизительно) 37°С) в течение (приблизительно) 4 дней клеточная культура далее увеличивает объем в большем сосуде для культивирования (например, 20-л мешок для клеток, 100-л мешок для клеток и т.п.), содержащем среду без сыворотки, например среду СЭ-СН0 (такую как среда инокулята СП-СН0), в течение (приблизительно) 4 дней при температуре, подходящей для роста (например, при (приблизительно) 37°С), пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, имея >1.5х10⁶ жизнеспособных клеток, или конечная жизнеспособность культуры составляет >80%). Увеличение объема инокулята может занять как минимум 7 пересевов.

Увеличившая объем культура используется затем для инокулирования резервуара для культивирования большого размера (например, 1000-, 4000-л биореактор и т.п.), содержащего среду без сыворотки (например, среду СП-СН0, такую как базальная среда СП-СН0), чтобы размножать далее клеточную культуру при подходящей температуре, например при (приблизительно) 37°С, в течение (приблизительно) 5-6 дней, пока клетки не достигнут целевой плотности обсеменения (например, имея 2.3х10⁶ жизнеспособные клетки/мл, или конечная жизнеспособность клеточных культур >88%). Культура промышленного масштаба (например, 10000-, 150000- или 20000-л культуры и т.п. в биореакторе) впоследствии выдерживается в культуральной среде, средой является среда питания (например, среда еКПЕ), при температуре ниже температуры роста, которая подходит для экспрессии белка и производства выделенного

- 104 017765 продукта (например, СТЬА4^А29™^04Е-1д).

Температура культуры промышленного масштаба понижена, например, от (приблизительно) 37 до (приблизительно) 34°С в течение (приблизительно) 4 дней. Полианионное соединение может быть добавлено попутно к культуре, когда температура понижается. В качестве альтернативы температура культуры промышленного масштаба понижена от (приблизительно) 35-37°С до (приблизительно) 32-36°С в течение (приблизительно) 12 дней; полианионное соединение попутно добавляется к культуре после того, как температура понижена.

Среда питания, описанная в случаях выше, может заменяться ежедневно на свежую среду питания (1, 2, 3 и т.д. раз в день) или каждые несколько дней. Замена содержимого резервуара свежей средой питания определяет удаление заранее определенного объема, например 80% объема резервуара, и замену содержимого резервуара тем же самым объемом свежей среды питания. В одном варианте осуществления изобретения среда питания добавляется ежедневно от (приблизительно) 2 до 3 дней, пока, например, концентрация глюкозы не упадет до 1 г/л. В другом варианте осуществления изобретения среда питания добавляется каждые 8 ч, например, после того, как концентрация глюкозы достигнет 1 г/л. Промышленный масштаб поддерживается, пока вышеуказанные клетки СНО и/или выделенный продукт белка достигает целевого значения следующих неограничивающих параметров производства: молярное соотношение NАNА составляет около 6.0 или от (приблизительно) 5.2 до (приблизительно) 7.6; конечная жизнеспособность клеточной культуры составляет >37%; а конечный титр продукта белка составляет от (приблизительно) 0.46 до (приблизительно) 0.71 г/л.

В варианте настоящего изобретения клетки, являющиеся культивированными, могут быть клетками млекопитающих, или устоявшейся линией клеток млекопитающих, включая, без ограничений, СНО (например, АТСС ССЬ 61), НЕК293 (например, АТСС СКЬ 1573; Сгайат е! а1., I. Сеп. νΐΐΌ1. 36:59-72, 1977), С08-1 (например, АТСС СКЬ 1650), ЭС44 (линию клеток СНО) (Се11. 33: 405, 1983, апб 8отабс Се11 апб Мо1еси1аг Сепебск 12:555, 1986) и клеточные линии почки детеныша хомяка (ВНК). Другими полезными, неограничивающими примерами являются миеломы, 3Т3-клетки, №ιηι;ι1κι клетки и слияния миелом с другими клетками. В некоторых вариантах воплощения изобретения клетки могут быть мутантами или рекомбинантными клетками, такими как, например, клетки, которые экспрессируют различный спектр ферментов, которые катализируют посттрансляционную модификацию белков (например, процессинг ферментов, таких как пропептиды или ферменты гликозилирования, такие как гликозил трансферазы и/или глюкозидазы), чем тот тип клетки, от которой они были получены. В одном конкретном аспекте данного изобретения СН0/бЫг-клетки особенно используются.

Сосудами для культивирования, используемыми для увеличения объема клеточной культуры, могут быть, но не ограничиваются ими, колбы Эрленмейера, колбы Т-175, роллер-флаконы, мешки для клеток. Крупными сосудами для культивирования могут быть, например, аэролифтные реакторы, где перемешивание осуществляется при помощи введения воздуха с нижней части сосуда, или традиционные реакторы с механическим перемешиванием (С8ТК), где перемешивание осуществляется при помощи традиционных типов лопастей. Параметрами, регулируемыми в определенных пределах, являются температура, рН, давление растворенного кислорода (Э0Т). Регулирующей средой температуры в этой системе является вода, и система может охлаждаться и нагреваться, в случае необходимости. Вода может быть пропущена через спиральную трубку, погруженную в культуральную среду клетки, или через кожух, покрывающий сосуд. рН, например, может регулироваться добавлением основы к культуральной среде клетки по необходимости или путем изменения концентрации СО₂ концентрации в газе в свободном пространстве над продуктом. Э0Т можно поддерживать путем опрыскивания чистым кислородом или воздухом или их смесью.

Следовательно, изобретение обеспечивает метод для получения рекомбинантного белка, метод, включающий по меньшей мере два пункта: (а) увеличение клеток млекопитающих, которые выделяют рекомбинантный белок (т.е. белок, который клетки млекопитающих обычно не экспрессируют или экспрессируют, где рекомбинантный белок экспрессируется в клетке через вектор экспрессии или конструкт, который был трансфицирован в клетки или родителей клеток) из культуры обсеменения в жидкую культуру по меньшей мере 10000 л, и (Ь) выделение рекомбинантного белка по меньшей мере из 10000 л жидкой культуры. В одном варианте осуществления изобретения этот метод может использоваться таким образом, что рекомбинантный белок получают при концентрации по меньшей мере 0.5 г на 1 л жидкой культуры до очищения белка от жидкой культуры. В другом варианте осуществления изобретения метод в соответствии с изобретением может использоваться для получения рекомбинантного белка при концентрации по меньшей мере от (приблизительно) 0.46 до (приблизительно) 0.71 г на 1 л жидкой культуры до очищения белка от жидкой культуры.

В одном варианте осуществления изобретения пункт увеличения объема может включать (ί) культивирование клеток в среде, не содержащей сыворотку, по меньшей мере с четырьмя пересевами (пассажами), так чтобы получить плотность клеток, равную по меньшей мере около 1.0х10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл, и (ίί) выдерживание клеток в культуре в течение времени, достаточного для получения по меньшей мере около 0.5 рекомбинантного белка. В одном варианте осуществления изобретения количе

- 105 017765 ство пересевов не превышает 36 пересевов. В другом варианте осуществления изобретения количество пересевов может превышать 36 пересевов, где клетки являются стабильными на протяжении поколений, что касается номера копии кодирования нуклеиновой кислоты для рекомбинантного белка, жизнеспособность клетки и время удвоения.

Время, достаточное для получения по меньшей мере около 0.5 до приблизительно 1.3 г/л рекомбинантного белка, может быть любым количеством времени, пока жизнеспособность клетки не упадет ниже 5, 10, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98%, и/или пока количество генераций клеток не превысит 50, 75, 100, 105 или 125 генераций. Пункт выдерживания также может содержать пункты температурных сдвигов, таких как понижение температуры культуры сначала от 37±2 до 34±2°С, а на более позднем отрезке времени от 34±2 до 32±2°С. Температура 32±2°С может быть поддерживаться в течение по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 или 100 дней. Температура 32±2°С может поддерживаться в течение по меньшей мере 20, 50, 75 или 100 поколений клеток. Температура 32±2°С может поддерживаться до того, как плотность клеток культуры достигнет от 30 до 100х10⁵ клеток на каждый миллилитр жидкой культуры.

В других вариантах воплощения данного изобретения может использоваться в качестве метода создания рекомбинантного белка. Данный метод состоит, по крайней мере, из следующих операций: (а) выращивание клетки млекопитающих, которые выделяют рекомбинантный белок из семенной культуры в жидкую культуру, не менее 10000 л, так чтобы концентрация рекомбинантного белка была не менее 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) отделение рекомбинантного белка по меньшей мере от 10000 л жидкой культуры, когда жидкая культура: (ί) содержит 6.0 моль NАNА или более на 1 моль белка (в данном случае гликопротеина); (ίί) имеет плотность клеток от 33 до 19х10⁵ клеток на 1 мл; (ίίί) жизнеспособность клетки в жидкой культуре составляет не менее 38% или более и равна 38%; (ίν) содержание эндотоксина составляет 76.8 ЕЙ (единица эндотоксина) или более на 1 мл жидкой культуры; и/или (ν) содержание микрофлоры составляет менее 1 колониеобразующей единицы на 1 мл жидкой культуры.

В дальнейшем варианте воплощения изобретения операция выращивания клеток может включать в себя: (ί) выращивание клеток в бессывороточной среде по крайней мере с 4 переносами для того, чтобы получить плотность клеток не менее 1.0х10⁶ жизнеспособных клеток на 1 мл, и (ίί) содержание клеток в культуре в течение времени, необходимого для образования рекомбинантного белка, по меньшей мере от 0.46 до 0.61 г на 1 л жидкой культуры. В одном варианте осуществления изобретения количество переносов (пассажей) не превышает 36. В другом варианте осуществления изобретения число переносов может превышать 36, где клетки являются стабильными в течение нескольких поколений, это относится к числу копий кодирования нуклеиновой кислоты для рекомбинантного белка, жизнеспособности клеток и времени удвоения.

Время, необходимое для образования от 0.46 до 0.61 г/л рекомбинантного белка, может быть любым, и его величина зависит от того, какая необходима жизнеспособность клеток, например не ниже 5, 10, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98%, и/или количество поколений клеток не должно превышать 27, 50, 75, 100, 105 или 125 поколений. Процедура выдержки клеток в среде может также включать сдвиги температур, такие как понижение температуры культуры сначала от 37±2 до 34±2°С. Температура 34±2°С может поддерживаться по меньшей мере в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 или 100 дней. В качестве альтернативы процедура выдержки может быть процедурой изменения температуры культуры, например, понижение температуры культуры от 37±2 до 34±2°С.

С началом понижения температуры в культуру может быть добавлено полианионное соединение. Концентрация полианионного соединения, добавляемого в культуру, может составлять около 1, 5, 10, 12.5, 15, 25, 50, 75, 100, 200, 250, 500, 750 или 1000 мг/л. Температура 32±2°С может поддерживаться по меньшей мере в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 или 100 дней. Температура 34±2°С может поддерживаться по меньшей мере для 20, 27, 50, 75 или 100 поколений клеток.

В дальнейшем данное изобретение может использоваться как метод для производства рекомбинантного белка. Данный метод состоит, по меньшей мере, из следующих процедур: (а) выращивание клетки млекопитающих, которые выделяют рекомбинантный белок из семенной культуры не менее 10000 л, так, чтобы концентрация рекомбинантного белка была не менее 0.46-0.61 г на 1 л жидкой культуры; и (Ь) отделение рекомбинантного белка от 10000 л культуры, когда жидкая культура: (ί) содержит около 6 моль NЛNА на 1 моль белка (в данном случае гликопротеина); (ίί) жизнеспособность клеток в жидкой среде не менее 37%; (ίίί) содержание эндотоксина менее или равно 4.8 ЕЙ (единица эндотоксина) на 1 мл жидкой культуры; и/или (ίν) содержание микрофлоры составляет менее 1 колониеобразующей единицы на 1 мл жидкой культуры.

Рекомбинантный белок, полученный этими методами, может быть секретируемым белком, гликопротеином, цитокином, гормоном, белком СТЬА4-1д или белком СТЬА4^А29¥Ъ104-1д. В одном варианте осуществления изобретения клетки млекопитающих являются потомством или клонами клеток, выведенными данным изобретением. В другом варианте осуществления изобретения клетки млекопитающих являются потомками или клонами клеток, полученными из клеточной линии изобретения. В дальнейшем варианте осуществления изобретения клетки млекопитающих являются клональной популяцией, полу

- 106 017765 ченной из клеток, подвергшихся трансфекции с полигенным экспрессирующим кластером, содержащим 8Е0 ΙΌ N0:1. В отдельном варианте осуществления изобретения клетки млекопитающих являются клональной популяцией клеток, подвергшихся трансфекции с полигенным экспрессирующим кластером, содержащим 8ЕС ΙΌ N0:3.

Общие методы очистки рекомбинантного белка от культуры.

Следующая фаза процесса клеточной культуры для производства белка, например гликопротеина, это восстановление белка из среды клеточной культуры с помощью методов, хорошо известных в области науки предлагаемого изобретения. В данном случае интересующий нас белок восстанавливается из культуральной среды в качестве секретируемого полипептида, хотя он также может быть получен из лизатов клеток хозяина. Культуральная среда или лизат сначала центрифугируется для удаления продуктов распада клеток и твердых частиц. Затем необходимый белок очищается от загрязняющей ДНК, растворимых белков и полипептидов с помощью следующих процедур очистки, которые являются общеизвестными в области науки предлагаемого изобретения: ЗЭЗ-РАСЕ (метод электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия); преципитация (осаждение) сульфата аммония; преципитация этанола; фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колоннах; жидкая хроматография высокого разрешения (НРЬС) обратной фазы; хроматография на оксиде кремния или на анионообменных смолах, таких как РАЕ или ΌΕΆΕ; хроматофокусирование; использование гель-хроматографии, например колонны 8ерйабех С-75™; и протеин А колонны с протеин А - Зерйагоке™ для удаления загрязняющих веществ, таких как ^С. Добавление ингибитора протеазы, такого как фенилметилсульфонилфторида (РМ8Е) или смеси ингибитора протеазы, также может использоваться для замедления протеолитического расщепления во время процедуры очистки. Квалифицированный персонал сможет распознать, какой метод очистки подойдет для данного белка. Например, для гликопротеина могут потребоваться изменения, для того чтобы учесть изменения характеристик белка при экспрессии в культуре рекомбинантной клетке.

Процедуры и методы очистки, которые были выбраны для углеводородных групп гликопротеина, также являются вспомогательными методами в контексте представленного изобретения. Например, такими методами могут быть НРЬС (жидкостная хроматография высокого разрешения) или ионообменная хроматография, использующая катионообменные или анионообменные смолы, где собираются больше долей оснований или кислот, в зависимости от того, какой углеводород был выбран. Использование таких методов может привести к сопутствующему удалению загрязнителей.

В представленном изобретении клетки СНО, способные производить гибридные белки ΟΓΕΆ4-Ι§ или СТ^Ά4^{Ά29Υ^104Е}-Iд, выращиваются в качестве суспензии в специальной среде СНО для предопределения плотности клеток. Клетки СНО, врастающие в суспензию в среде бессывороточной экспрессии, впоследствии образуют молекулы СТ^Ά4-Iд или СТ^Ά4^{Ά29Υ^104Е}-Iд, которые выделяются клетками СНО в культуральную среду. Клеточная суспензия может быть очищена с помощью центрифугирования. Молекулы СТ^Ά4-[д затем могут быть отделены от кондиционированной среды очищенной культуры с помощью стандартных методов очистки. Примерами методов очистки для получения высокой чистоты и гомогенности СТ^Ά4-[д или СТ^Ά4^{Ά29Υ^104Е}-Iд отдельно или в сочетании могут служить афинная хроматография на сефарозе; фракционирование на анионообменных колоннах (АЕС) и гидрофобная хроматография (ШС).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения изолирование СТ^Ά4-[д молекул или других белков (включая гликопротеин) методами, описанными здесь, может включать следующие стадии: (ί) получение супернатанта клеточной культуры; (ίί) подвержение супернатанта анионообменной хроматографии для получения элюированного белкового продукта; (ίίί) подвержение элюированного белкового продукта, полученного на стадии (ίί) хроматографии гидрофобного взаимодействия, чтобы получить обогащенный белковый продукт; (ίν) подвержение обогащенного белкового продукта аффинной хроматографии для получения элюированного и обогащенного белкового продукта и (ν) подвержение элюированного и обогащенного белкового продукта, полученного на стадии (ίν), анионообменной хроматографии. Обогащенный белковый продукт, полученный на стадии (ίίί), может характеризоваться, например, тем, что процентное содержание любого высокомолекулярного белка или примесей в нем менее 5, 10, 15 или 25%. Анионообменная хроматография, указанная на стадии (ίί), может быть проведена, например, с использованием отмывающего буфера, содержащего около 25-100 мМ НЕРЕ8 и около 300900 мМ №1С1 и с рН около 7.0-8.0. Хроматография гидрофобного воздействия со стадии (ίίί) может быть проведена с использованием одного отмывающего буфера с рН около 7.0 и содержащего около 25 мМ НЕРЕ8 и около 850 мМ №С1; или отмывающего буфера, имеющего рН около 8.0 и содержащего примерно 25 мМ Трис и около 250 мМ №С1. Аффинная хроматография со стадии (ίν) может быть проведена, например, с использованием элюирующего буфера, имеющего рН около 3.5 и содержащего около 100 мМ глицина. Аффинная хроматография со стадии (ν) может быть проведена, например, с использованием отмывающего буфера с рН около 8.0 и содержащего около 25 мМ НЕРЕ8 и от 120 до 130 мМ №С1, или отмывающего буфера с рН около 8.0 и содержащего около 25 мМ НЕРЕ8 и около 200 мМ №С1. Анионообменная хроматография со стадии (ίί) может быть проведена на колонне с содержанием анионообменной смолы, имеющей первичную, вторичную, третичную и четвертичную аминные функ

- 107 017765 циональные группы. Гидрофобное взаимодействие на колонне стадии (ίίί) может быть проведено с использованием смолы гидрофобного взаимодействия, имеющей фенильную, октальную, пропильную, алкоксильную, бутильную или изоамильную функциональные группы.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения изолирование СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд молекул или других белков (включая гликопротеины) описанными методами может включать следующне стадии: (ί) получение супернатанта клеточной культуры; (ίί) подвержение супернатанта аффинной хроматографии для получения элюированного белкового продукта; (ίίί) подвержение элюированного белкового продукта из стадии (ίί) анионообменной хроматографии для получения обогащенного белкового продукта и (ίν) подвержение обогащенного белкового продукта хроматографии гидрофобного взаимодействия для получения элюированного и обогащенного белкового продукта с пониженным содержанием высокомолекулярных белковых комплексов (НМ^). Обогащенный белковый продукт, полученный на стадии (ίν), может характеризоваться, например, тем, что процентное содержание в нем любого высокомолекулярного белка или примесей менее 5, 10, 15 или 25%. Аффинная хроматография из стадии (ίί) может быть проведена, например, с использованием элюирующего буфера с рН около 3.0 и содержащего около 250 мМ глицина. Аффинная хроматография из стадии (ίί) может быть проведена, например, с использованием отмывающего буфера с рН около 7.5 и содержащего около 25 мМ КаН₂Р0₄ и около 150 мМ №1С1. Анионообменная хроматография из стадии (ίίί) может быть проведена, например, с использованием отмывающего буфера, содержащего около 50 мМ НЕРЕ8 и около 135 мМ ИаС1 и с рН около 7.0. Анионообменная хроматография из стадии (ίίί) может быть проведена, например, с использованием элюирующего буфера, содержащего около 50 мМ НЕРЕ8 и около 200 мМ ИаС1 с рН около 7.0. Хроматография гидрофобного взаимодействия из стадии (ίν) может быть проведена, например, с использованием отмывающего буфера с рН около 7.0 и содержанием около 50 мМ НЕРЕ8 и около 1.2 М (ΝΉ₄)₂80₄. Анионообменная хроматография из стадии (ίίί) может быть проведена с использованием анионообменной смолы, имеющей первичную, вторичную, третичную или четверичную аминные функциональные группы. Гидрофобное взаимодействие на колонне из стадии (ίν) может быть проведено с использованием смолы гидрофобного взаимодействия, имеющей фенильную, октальную, пропильную, алкоксильную, бутильную или изоамильную функциональные группы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается метод очистки СТЬА4Ц молекул от жидкой клеточной культуры таким образом, чтобы очищенная 0^^4-^ была свободна от моноцитарного хемотаксического протеина-1 (МСР-1). В одном из вариантов предлагается фармацевтическн приемлемое соединение СТ^А4-Iд молекул, в котором содержится не более 0.5 мд МСР-1, 1 мд МСР-1, 2 мд МСР-1, 3 мд МСР-1, 4 мд МСР-1, 5 мд МСР-1, 6 мд МСР-1, 7 мд МСР-1, 8 мд МСР-1, 9 мд МСР-1 или 10 мд МСР-1; в одном из вариантов количество МСР-1 в соединении не может превышать 1, 0.5 или 0.1% от веса очищенной СТ^А4-Iд. В одном из вариантов соединение СТ^А4-Iд молекул в значительной степени свободно от МСР-1 и в нем содержится менее 50, 45, 40, 38, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нг/мл МСР-1 в РЕЕ элюированной жидкости. В одном из вариантов изобретения предлагается метод очистки СТ^А4-Iд молекул от жидкой клеточной культуры для получения очищенной СТЕ^-Ц свободной от МСР-1 и с содержанием менее 2.5% СТ^А4-Iд тетрамера.

Количество моноцитарного хемотаксического протеина (МСР-1) в соединении может быть подсчитано при помощи метода ЕЫ8А. Первичное антитело - козел антимышь МСР-1 ЦС антитело. Вторичное антитело - кролик антнкрыса МОР-1 ЦС антитело. Детекция выполняется с использованием пероксидазы конъюгированного антитела козы против кроличьего ЦС и субстрата ТМВ. Пероксидаза хрена производит колориметрическую реакцию, которая развивается пропорционально количеству захваченного белка. Метод ЕЫ8А определяет уровень МСР-1 относительно калибровочной кривой. В одном из вариантов в соединении было подсчитано количество МСР-1 и уровни МСР-1 находились в диапазоне 00.097 и 0.014-0.154 нг/мг.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается метод очистки СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд молекул от жидкой клеточной культуры таким образом, чтобы очищенная СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд была в значительной степени свободна от моноцитарного хемотаксического протеина 1 (МСР-1). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество МСР-1 не может превышать 1, 0.5 или 0.1% веса очищенной СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. В одном из вариантов СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд в значительной степени свободен от МСР-1 и в элюированной жидкости, полученной хроматографией гидрофобного взаимодействия, количество МСР-1 менее 50, 45, 40, 38, 35 или 30 нг/мл. Еще в одном из вариантов предлагается метод очистки СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд молекул из жидкой клеточной культуры таким образом, чтобы очищенная СТБА4^Л29'^¥| ''‘''Мд была в значительной степени свободна от МСР-1 и содержала менее 2.5% СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд тетрамера.

Выделение гликопротеина из клеточной культуры и очистка.

Настоящее изобретение описывает серию шагов по выделению гликопротеина (например, СТЬА4Ц или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд) из неоднородного супернатанта клеточной культуры, пула протеина, который содержит интересующий нас гликопротеин (такой как СТ^А4-Iд нли СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд) и нежелательные примеси. Неоднородный супернатант клеточной культуры может использоваться в качестве начального материала для очистки СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд гликопротеина.

- 108 017765

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения неоднородный супернатант клеточной культуры, который содержит СТЬА44д гликопротеин и нежелательные примеси, распространяется на среду для ионного обмена. СТЬА44д гликопротеин, присутствующий в неоднородном супернатанте клеточной культуры, связывается со средой для ионного обмена. Среда для ионного обмена тогда промывается для удаления любого несвязанного материала. СТЬА44д гликопротеин элюируется после удаления несвязанного материала и элюат собирается.

В одном из вариантов неоднородный супернатант клеточной культуры, который содержит СТЕА4^{А29¥Е104Е}4д гликопротеин и нежелательные примеси, связывается со средой для аффинной хроматографии. СТЕА4^{А29¥Е104Е}4д гликопротеин, который присутствует в неоднородном супернатанте клеточной культуры, связывается со средой для аффинной хроматографии. Среда для аффинной хроматографии затем промывается для удаления любого несвязанного материала из среды для анионного обмена. СТЕА4^{А29¥Е104Е}4д гликопротеин элюируется после удаления несвязанного материала и затем элюат собирается.

В определенном варианте осуществления данного изобретения анионообменная хроматография (АЕС) с использованием, например, ХЬ колонны с Р-Сефарозой (СЕ НеаННсаге), применяется для отделения СТЬА44д гликопротеина из заготовленного материала, а также для уменьшения объема примесей. Данная колонка может использоваться в качестве первого шага в очистке СТЬА44д из клеточной культуры млекопитающего для фракционирования заготовленной среды клеточной культуры. В одном из вариантов анионообменная хроматография с Ο-Сефарозой, например колонна Р-Сефароза Рак! Р1оте (СЕ НеаИйсаге), может быть использована после проведения очистки путем аффинной хроматографии. Очень высокая текучесть в колоннах для анионного обмена позволяет большому количеству СТЬА44д гликопротеина или среды для заготовленной клеточной культуры сконцентрироваться до выполнения следующих хроматографических стадий, таких как хроматография на 8Р-Сефарозе или хроматография гидрофобного взаимодействия, регулируя условия таким образом, чтобы СТЬА44д связывался с насадкой в колонне. Для отмывающего буфера с рН 5-9 концентрация около 8, 75 мМ НЕРЕ8 и 360 мМ №1С1 является полезной. Обычно для элюирующего буфера с рН 5-8 концентрация около 7, 25 мМ НЕРЕ8 и 325 мМ №1С1 является полезной.

Подходящими смолами для выделения СТЬА44д гликопротеина из среды заготовленной культуры были те, в которых имеются иммобилизованные аминные функциональные группы. Наиболее полезными являются смолы четвертичной аминной функциональной группы, например на смолах колонны рСефароза Рак! Р1оте от СЕ НеаННсаге, где четвертичный аммониевый лиганд привязан к макропористой поперечно связанной агарозе. Также полезными являются первичные, вторичные и третичные смолы аминных функциональных групп, например, на смолах колонны ПЕЛЕ Сефароза Рак! Р1оте от СЕ Неа1!Нсаге, где третичный диэтиламиноэтиловый лиганд привязан к макропористой, поперечно связанной агарозе.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения СТЬА44д гликопротеиносодержащий элюат из среды для анионного обмена собирается и затем вступает в контакт со смолой гидрофобного взаимодействия. Как будет описано ниже, СТЬА44д гликопротеиносодержащее вещество проходит через колонну для гидрофобной хроматографии и сборный пул, который может быть затем очищен. И затем связывается с анионообменной смолой.

Хроматография гидрофобного взаимодействия полезна для выделения желаемых димеров СТЬА4гликопротеинов из высокомолекулярного материала и других белковых примесей из клеточной культуры млекопитающего. Например, СТЬА44д-содержащая клеточная культура яичников китайского хомячка содержит скопления с высоким молекулярным весом СТЬА44д гликопротеина. Также в клеточной культуре млекопитающего найдены белковые примеси клетки СНО. Эти нежелательные продукты могут вызвать нежелательную аллергическую реакцию у пациента и привести к плохому качеству продукта и его действию. Хроматография гидрофобного взаимодействия эффективно выделяет гидрофобные варианты, димеры СТЬА44д гликопротеина из СТЬА44д высокомолекулярных гликопротеиновых комплексов и белковых примесей СНО через последние продукты, связанные со смолой гидрофобного взаимодействия и димерами СТЬА44д гликопротеина, проходящими через колонну. Таким образом, может быть получен СТЬА44д гликопротеиновый пул, в значительной степени свободный от этих примесей и в особенности подходящий для проведения следующего шага хроматографии, например анионообменной хроматографии. Источником смесей СТЬА44д гликопротеина для использования с хроматографией гидрофобного взаимодействия является клеточная культура млекопитающего, например клеточная культура яичников китайского хомячка. В особенности культура может подвергаться по крайней мере одной предварительной процедуре очистки, описанной выше.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод хроматографии гидрофобного взаимодействия может быть модифицирован для сбора других гликопротеинов (например, высокомолекулярных агрегатов СТЬА44д). Высокомолекулярные агрегаты могут связываться со смолой гидрофобного взаимодействия (например, содержащей СТЬА44д тетрамер). Эти высокомолекулярные агрегаты обладают более высокой авидностью и связываются более эффективно 1п νί\Ό, чем один СТЬА44д димер. Таким образом, опытный специалист может получить пул высокомолекулярных агрегатов СТЬА44д

- 109 017765 посредством элюирования СТЬА4-1д пула хроматографией гидрофобного взаимодействия.

Наиболее полезными смолами гидрофобного взаимодействия для выделения форм СТЬА4-1д гликопротеина являются те смолы, которые содержат иммобилизованные фениловые функциональные группы. Из всех фениловых смол для гидрофобного взаимодействия РЬепу1 8ерИатозе Еаз1 Е1о\т НщН 8иЬ (высокое замещение) от СЕ НеаИНсаге является наиболее полезной. Средство РЬепу1 Тоуореаг1 от ТозоНааз и Т8К РНепу1 5Р\У - примеры других фенильных смол хроматографии гидрофобного взаимодействия, которые можно использовать. Другие функциональные группы хроматографии гидрофобного взаимодействия включают, но не ограничены пропиловым, октиловым, алкоксиловым, бутиловым и изоамиловым компонентами.

Например, хроматография гидрофобного взаимодействия на колонне Фенил Сефароза 4 Еаз1 Е1о\т процесс, который может применяться для сокращения количества высокомолекулярных СТЬА4-1д или СТЬА4^А29'^Е104Е-1д пород, элюированных во время очистки методом хроматографии гидрофобного взаимодействия (см. пример 15 и 20). Следовательно, пик очистки из колонны достигается в высокомолекулярных видах СТЬА4-1д или СТЬА4^А29'^Е104Е-1д.

Несвязанные фракции, содержащие СТЬА4-1д гликопротеин, полученные путем хроматографии гидрофобного взаимодействия, могут быть подвергнуты дополнительной очистке другим методом, таким как аффинная хроматография, и полученный элюат может затем быть связан со средой для анионного обмена. СТЬА4-1д гликопротеин связывается со смолой анионного взаимодействия, которая может быть затем промыта для удаления несвязанных протеинов. После удаления несвязанных белков СТЬА4-1д гликопротеин элиюруется из смолы второго анионного обмена. Элюат собирается и может дальше обрабатываться.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аффинная хроматография, например Протеин А Сефароза Еаз1 Е1о\т (СЕ НеаИНсаге), применяется для дальнейшего обогащения СТЬА4-1д гликопротеина, далее за которой может следовать анионообменная хроматография, например 0Сефароза Еаз1 Е1о\т (СЕ НеаИНсаге). Аффинная хроматография может также уменьшить уровень примесей СНО протеинов и моноцитарного хемотаксичного протеина (МСР-1, хемокин). Аффинная хроматография включает адсорбционную сепарацию, во время которой молекула, которую необходимо очистить, например СТЬА4-1д гликопротеин, связывается с лигандом, иммобилизованным на некой матрице или смоле. Некоторые неограниченные примеры колонн для аффинной очистки включают лектин; аффинную метку (например, С8Т колонна или 6Х-Н1з колонна); стрептавидин; гепарин или антитело (например, колонна с протеином А или колонна с протеином С). В особенности в данном изобретении используется смола протеина А для связывания СТЬА4-1д гликопротеина. Для отмывающего буфера с рН от 5 до 9, наиболее эффективным при примерно 8, полезными являются концентрации 25 мМ Трис и 250 мМ №€1. Для элюирующего буфера с рН от 2 до 5, наиболее эффективным при 3.5, 100 мМ глицина является полезной концентрацией. Элюат, полученный в результате аффинной хроматографии, затем может быть нейтрализован и помещен в колонну для анионообменной хроматографии, наиболее полезной в таких случаях является 0-Сефароза Еаз1 Е1о\\\

Для дальнейшего сокращения уровня протеина А, ДНК и нежелательных примесей СТЬА4-1д гликопротеина в продукте после вышеупомянутых процедур восстановления/начальной очистки в процесс очистки можно включить и ионный обмен. Данное изобретение может применять доступные в продаже колонны для ионного обмена, такие как колонна Ц-Сефароза Еаз1 Е1о\т от СЕ НеаИНсаге, или колонна ЭЕАЕ Сефароза Еаз1 Е1о\т также от СЕ НеаИНсаге. Как было уже отмечено, наиболее подходящими смолами для выделения СТЬА4-1д гликопротеина из заготовленного сорбента являются те смолы, в составе которых имеются иммобилизованные аминные функциональные группы. Другими полезными группами являются смолы с четвертичными аминными функциональными группами, например, содержащиеся в 0Сефароза Еаз1 Е1о\т колонне от СЕ НеаИНсаге, где четвертичный аммониевый лиганд связан с макропористой поперечно связанной арагозой. Также эффективными являются смолы с первичными, вторичными и третичными функциональными группами, например находящиеся в колонне ЭЕАЕ Сефароза Еаз1 Е1о\т от СЕ НеаИНсаге, где третичный диэтиламиноэтиловый лиганд связывается с макропористой, сшитой арагозой. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения используется колонна с сильной анионообменной смолой, например такая колонна, как О-сефароза Еаз1 Е1о\\з

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения элюат СТЬА4-1д гликопротеина загружается на колонну для анионного обмена, например О-сефароза Еаз1 Е1о\\\ Колонна вымывается и СТЬА4-1д гликопротеин последовательно элюируется из колонны для анионного обмена. Для отмывающего буфера с рН 5-9 в одном из вариантов с рН 8 полезной концентрацией является 25 мМ НЕРЕ8 и 100-140 мМ ИаС1. Для элюирующего буфера с 5-9, с рН 8, полезной концентрацией является 25 мМ НЕРЕ8 и 200 мМ ИаС1. СТЬА4-1д гликопротеин, элюированный из среды анионного обмена, восстанавливается, концентрируется и вымывается посредством диафильтрации или другого известного специалистам подходящего метода для получения конечного чистого гликопротеиного продукта СТЬА4-1д. Гликопротеиновый продукт СТЬА4-1д, приготовленный в соответствии с процессом, описанным в настоящем изобретении, отличается высокой чистотой и содержит, например >95% СТЬА4-1д димера, <5% вы

- 110 017765 сокомолекулярного продукта СТ^Α4-Iд и <1% ΟΓΕΑ4-Ι§ мономера.

Метод очистки может далее включать дополнительные стадии, которые инактивируют и/или удаляют вирусы и/или ретровирусы, которые могут потенциально присутствовать в млекопитающей клеточной культуре. Имеется значительное число способов устранения вирусов, среди них обработка диссациирующими средствами, такими как мочевина или гуандин, детергенты, дополнительная ультрафильтрация/диафильтрация, традиционная сепарация, такая как ионообменная или исключающая по размеру хроматография, тепло, протеазы, органические растворители и любое сочетание данных способов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аффинная хроматография, например смола МаЬ8е1ес1 Протеин А Сефароза (ОЕ НеаИНсаге), применяется для захвата СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина, за которой далее может следовать стадия анионообменной хроматографии, например на колонне 0-Сефароза Еак1 Е1о\у (ОЕ НеаИНсаге). Стадия аффинной хроматографии может также сократить уровень примесей СНО белков и моноцитарного хромотаксического протеина (МСР-1, хемокин). Аффинная хроматография включает адсорбционную сепарацию, когда молекула, которую необходимо очистить, например СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеин, связывается с лигандом, иммобилизованным на некой матрице или смоле. Среди примеров колонн для аффинной очистки можно выделить лектин; аГПп11у 1ад (например, О8Т колонку или 6Х-Н1К колонну); стрептавидин; хепадин или антитело (например, колонна протеина А или колонна протеина О). В особенности в данном изобретении используется смола протеина А для связывания СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина. Для отмывающего буфера с рН 5-9, наиболее эффективного при 7.5, полезной концентрацией является 25 мМ Трис, 25 мМ NаΗ₂ΡΟ₄ и 250 мМ №С1. Для элюирующего буфера с рН 2-5, наиболее эффективного при 3.5, полезная концентрация 100-300 мМ глицина. Элюат из аффинной хроматографии может затем быть нейтрализован и загружен в колонну для анионообменной хроматографии, наиболее эффективной здесь будет О-Сефароза Рак! Е1о\\\

Для дальнейшего сокращения уровня примесей белков А, ДНК и нежелательного СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина в продукте после описанных шагов восстановления/очистки в процесс очистки можно включить и шаг ионного обмена. В данном случае могут применяться доступные в продаже колонны для ионного обмена, такие как колонна Ο-Сефароза Еак1 Е1о\у от ОЕ НеаИНсаге, Ο-Сефароза ХБ колонна (ОЕ НеаИНсаге), или □ΒΑΒ Сефароза Еак1 Е1о\\' колонна также производства ОЕ НеаИНсаге. Наиболее подходящими смолами для выделения СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина являются те, в составе которых имеются иммобилизованные аминные функциональные группы. Также полезными являются смолы с четвертичными аминными функциональными группами, например в колонне 0-Сефароза Еак1 Е1о\у от ОЕ НеаИНсаге, где четвертичный аммониевый лиганд связан с макропористой поперечно связанной арагозой. Также эффективными являются смолы с первичной, вторичной и третичной функциональной группой, например в колонне ^ЕЛЕ Сефароза Еак1 Е1о\у от ОЕ НеаИНсаге, где третичный диэтиламиноэтиловый лиганд связывается с макропористой, поперечно связанной арагозой. В особых случаях используется колонна с сильной анионообменной смолой, такой как колонна О-Сефароза Еак1 Е1о\\\

В одном случае элюат СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина загружается в анионообменную колонну, например в колонну О-Сефароза Еак1 Е1о\\\ Колонна промывается и СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеин элюируется из колонны для анионного обмена. Для отмывающего буфера с рН 5-9, в одном случае рН 7, наиболее эффективной является концентрация 25-55 мМ НЕРЕ8 и 100-140 мМ №С1. Для элюирующего буфера с рН 5-9, наиболее эффективного при рН 7, наиболее эффективной является концентрация 25-50 мМ НЕРЕ8 и 200 мМ №С1.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения элюат из среды для анионного обмена, содержащий СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеин, собирается и затем взаимодействует со смолой гидрофобного взаимодействия. Хроматография гидрофобного взаимодействия эффективна для выделения желаемых димеров СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина из высокомолекулярного материала и других белковых примесей из клеточной культуры млекопитающего. Например, СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд содержащая СНО клеточная культура содержит высокомолекулярные агрегаты СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина. Также в клеточной культуре млекопитающего можно обнаружить белковые примеси СНО клеток. Эти нежелательные продукты могут вызвать аллергическую реакцию у пациента и привести к плохому качеству и действию продукта.

Хроматография гидрофобного взаимодействия эффективно выделяет гидрофобные варианты, димеры СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина из высокомолекулярных комплексов СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина и СНО белковых примесей через связывание последних со смолой гидрофобного взаимодействия и димеры СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина, проходящие через колонну. Таким образом, можно получить пул СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина, в значительной степени свободный от этих примесей. Источником СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина в смесях для использования с хроматографией гидрофобного взаимодействия является, например, клеточная культура СНО. Культура может быть подвергнута по крайней мере одному шагу очистки, описанному ранее.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод хроматографии гидрофобного взаимодействия может быть модифицирован для получения пула других гликопротеинов (например, СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд высокомолекулярных агрегатов). Высокомолекулярные агрегаты могут связываться со смолой гидрофобного взаимодействия (например, содержащей СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд тетрамер и подобные

- 111 017765 вещества). Эти высокомолекулярные агрегаты обладают большей авидностью и более прочно связываются 1п νί\Ό, чем один димер СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. Таким образом, опытный специалист может получить пул СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд высокомолекулярного агрегата, элюируя СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд посредством хроматографии гидрофобного взаимодействия.

СТ^Α4-Iд гликопротеин, элюированный из среды гидрофобного взаимодействия, восстанавливается и вымывается посредством диафильтрации либо другого подходящего способа, известного специалистам, для получения окончательного очищенного СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеинового продукта. СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеиновый продукт, приготовленный в соответствии с процессом, описанным в настоящем изобретении, отличается высокой чистотой, например в нем содержится >95% СТЬА4^А29™^04Е4д димера, <5% СТЬА4^А29™^04Е4д высокомолекулярного продукта и <1% СТЬА4^А29™^04ЕЦ мономера.

Наиболее эффективными смолами гидрофобного взаимодействия для выделения СТЬА4^А29™^04Е4д гликопротеиновых форм являются те, в составе которых имеются иммобилизованные функциональные фенильные группы. Из фенилосодержащих смол для хроматографии гидрофобного взаимодействия РЬепу1 Зерйагоке Рак! Е1о\г Н1дЬ ЗиЬ (высокое замещение) от 0Е Неаййсаге является наиболее эффективной. Среда РЬепу1 Тоуореаг1 от ТокоНаак и ТЗК РЬепу1 5РА - примеры других фенильных смол хроматографии гидрофобного взаимодействия, которые можно использовать. Другие функциональные группы включают пропиловые, октиловые, алкоксиловые, бутиловые и изоамиловые компоненты.

Метод очистки может дальше включать дополнительные стадии, которые инактивируют и/или удаляют вирусы и/или ретровирусы, которые могут потенциально присутствовать в среде клеточной культуры млекопитающей клетки. Имеется значительное количество способов очистки, среди которых обработка диссоциирующими веществами, такими как мочевина или гуанидин, детергентами, дополнительная ультрафильтрация/диафильтрация, традиционная сепарация, такая как исключающая по размеру хроматография, тепло, протеазы, органические растворители и любое сочетание данных способов.

Очищенные молекулы СТЬА44д, которые были собраны и подвержены стадии диафильтрации, могут быть помещены в Вю!атег® бутыли, емкостью 2 л, 50-л пакет либо другую подходящую емкость. Молекулы СТЬА44д в таких емкостях могут храниться в течение примерно 60 дней при 2-8°С до заморозки. Длительное хранение очищенного СТЬА44д при 2-8°С может привести к увеличению содержания СЬТА44д тетрамера. Следовательно, для длительного хранения молекулы СТЬА44д могут быть заморожены при температуре примерно -70°С и храниться при температуре примерно -40°С. Температура заморозки может варьироваться от -50 до -90°С. Время заморозки также может варьироваться и в значительной степени зависит от объема емкости, в которой содержатся молекулы СТЬА44д, и количества емкостей, помещенных в морозильную камеру. Например, молекулы СТЬА44д содержатся в Вю!атег® бутылях емкостью 2 л. Загрузка менее четырех бутылей в морозильную камеру может привести к 14-18 ч заморозки. При загрузке четырех бутылей время заморозки составит 18-24 ч. Емкости с замороженными молекулами СТЬА44д хранятся при температуре (-35)-(-55)°С.

Время хранения при температуре (-35)-(-55)°С может варьироваться и быть не меньше 18 ч. Замороженные молекулы СТЬА44д могут быть разморожены только под контролем. Разморозка замороженных молекул СТЬА44д контролируется и может быть проведена только в инкубаторе при температуре 20-24°С. Продолжительность процесса разморозки зависит от загрузки инкубатора и разморозка менее четырех 2-л бутылей Вю!атег® может продолжаться примерно 24 ч. При загрузке четырех 2-л бутылей Вю!атег® время разморозки составит около 18 ч. Размороженный раствор с содержанием молекул СТЬА44д может быть перемешан для того, чтобы избежать неправильной концентрации раствора. Следовательно, разморозку можно проводить в инкубаторе с контролем температуры, в котором также можно взбалтывать емкости с СТЬА44д. Скорость взбалтывания может быть 40-80 об/мин. Размороженные молекулы СТЬА44д могут перемешиваться дальше в течение дополнительных 5-10 мин со скоростью около 3 об/мин. Размороженные молекулы СТЬА44д могут храниться при температуре 2-8°С, лиофилизированные во время производства фармацевтических веществ с содержанием СТЬА44д.

Данное изобретение может применяться без ограничения для очистки других терапевтических гликопротеинов, произведенных в больших количествах. Процесс данного изобретения может применяться для производства других гликопротеинов, имеющих более одного гликозилированного варианта в клеточной культуре млекопитающего. Опытный специалист поймет, какие модификации может быть необходимо провести в процессе адаптации предложенного метода к производству других гликопротеинов.

Составы и наборы.

Изобретение также представляет любые из описанных СТЬА44д молекул в качестве лиофизированной смеси. Вещества, имеющие в своем составе СТЬА44д, который необходимо лиофизировать, могут содержать три основных компонента: (1) дополнительный активный ингредиент(ы), включающий другие рекомбинантные белки или небольшие молекулы (такие как иммунодепрессанты), (2) эксципиент(ы) и (3) растворители. Эксципиенты включают фармацевтически одобренные реагенты для обеспечения хороших лиофилизированных свойств крови (наполнители), а также для обеспечения лиопротекции и/или криопротекции белков (стабилизатор), сохранения рН (буфер) и правильной конформации

- 112 017765 белка во время хранения таким образом, чтобы наблюдалось значительное сохранение биологической активности (включая стабильность активного ингредиента, например, стабильность белка). В отношении эксципиентов, в их составе имеется одно или более буферное вещество, наполнитель(и), стабилизатор(ы) белка и антимикробный препарат(ы). Сахара или полиолы могут использоваться в качестве неспецифических стабилизаторов белка в растворах и во время заморозки-разморозки и заморозки-высушивания. Полимеры могут использоваться для стабилизации белков в растворе и во время заморозки-разморозки и заморозки-высушивания. Одним популярным полимером является сывороточный альбумин, который используется в качестве криопротектанта и лиопротектанта. В одном из вариантов настоящее изобретение предоставляет вещество без содержания альбумина. Различные соли могут использоваться в качестве наполнителей. Примеры солевых наполнителей включают, например, №С1, МдС1₂ и СаС1₂. Определенные аминокислоты могут использоваться в качестве криопротекторов и/или лиопротекторов и/или в качестве наполнителей. Это, например, глицин, пролин, 4-гидроксипролин, Ь-герин, глютамат натрия, аланин, аргинин и лизин гидрохлорид. Для использования в веществах имеется большое количество наполнителей с широким диапазоном рН. Буферные вещества включают, например, ацетат, цитрат, глицин, гистидин, фосфат (натрия или калия), диэтаноламин и Трис. Буферные вещества охватывают те вещества, которые сохраняют рН раствора в приемлемом диапазоне до проведения лиофилизации. Составы первоначально были описаны в патентах США (И8 Ра1еп1 Лрр11са11оп) под номером 60/752150, внесено в реестр 20.12.2005, на которые имеются полные ссылки в данном документе.

В одном из вариантов осуществления изобретение представляет лиофизированную смесь €.4^443, состоящую по меньшей мере на 90, 95, 99 или 99.5% из СТ^Α4-Iд димера. В одном из вариантов изобретение предоставляет лиофизированную смесь СТ^Л4-[д, состоящую по меньшей мере на 90, 95, 99 или 99.5% из СТ^Α4-Iд димера и не более чем на 5, 4, 3, 2 или 1% из СТ^Α4-Iд тетрамера. В одном из вариантов изобретение представляет лиофизированную смесь 44^443, состоящую по меньшей мере на 90, 95, 99 или 99.5% из СТ^Α4-Iд димера и не более чем на 5, 4, 3, 2 или 1% из СТ^Α4-Iд тетрамера, не более чем на 2, 1.5, 1.0, 0.8, 0.5 или 0.3% из ΟΊΈΑ44§ мономера. В одном из вариантов изобретение представляет лиофизированную смесь 44^443, содержащую по меньшей мере 8.0 моль сиаловой кислоты на 1 моль 44^44^ димера или молекулы. В одном из вариантов изобретение предоставляет лиофизированную смесь СТ^Α4-Iд, содержащую по меньшей мере от 15 до 35 моль 6а1NΑс на 1 моль СТ^Α4-Iд молекулы или димера; от 1 до 5 моль Са1NЛс на 1 моль 04^44^ димера или молекулы; от 5 до 20 моль галактозы на 1 моль 6.4^44^ димера или молекулы; от 2 до 10 моль фукозы на 1 моль 6.4^44^ димера или молекулы и/или от 5 до 15 моль маннозы на 1 моль 44^44^ димера или молекулы.

СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд лекарственное вещество имеется в виде водного раствора с концентрацией приблизительно 25 мг/мл (22.5-27.5 мг/мл) в буфере с 25 мМ фосфата натрия и 10 мМ хлорида натрия с рН ~7.5. СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд имеет тенденцию формировать высокомолекулярные примеси в водном растворе. Следовательно, замороженный-высушенный продукт был получен для того, чтобы снизить до минимума уровень высокомолекулярных примесей, которые могут сформироваться в лекарственном продукте. Разнообразные эксципиенты, такие как мальтоза, сахароза и аминокислоты, такие как Ь-аргинина гидрохлорид, были отсортированы как потенциальные лиопротектанты во время заморозки-высушивания СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. Сахароза оказалась наиболее эффективным лиопротектантом. По дальнейшим наблюдениям было установлено, что увеличение соотношения сахароза:белок улучшало стабильность белка. Соотношение сахароза:белок 2:1 (\\1:\\1) было выбрано для белкового раствора, подвергающегося заморозке-высушиванию. Замороженный-высушенный лекарственный продукт обладает адекватной стабильностью и удовлетворительным генетическим поведением.

Методы лечения.

В соответствии с данным изобретением заболевание, вызванное взаимодействием Т-клетки с положительными В7 клетками, может лечиться фармацевтически приемлемыми составами СТ^Α4-Iд или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. Молекулы СТ^Α4-Iд или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, секретируемые промышленной млекопитающей клеточной линией (например, бЫг-негативная СНО клеточная линия, которая накапливает ДНК, кодирующую 44^44^ или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд), могут являться популяцией молекул с особенным профилем гликозилирования. Как указано в данном документе, особенный профиль гликозилирования может влиять на СТ^Α4-Iд или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд связывание с СЭ80 и/или СЭ86 таким образом, что молекулы 44^44^ или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд могут обеспечить более высокое ингибирование при активации и/или пролиферации Т-клетки. Как здесь указано, на определенный профиль гликозилирования может влиять клеточная линия и метод производства. Таким образом, в определенных вариантах осуществления изобретение представляет 44^44^ или СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд молекулы, произведенные клеточной линией способом производства, описанным здесь, для того, чтобы лечить заболевания, связанные с Тклеткой, среди которых можно выделить обычно любые Т-клеточно опосредованные заболевания, связанные с распространением лимфы, и любые Т-клеточно опосредованные аутоиммунные заболевания, а именно Т-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфобластическая лейкемия, тестикулярная ангиоцентрическая Т-клеточная лимфома, доброкачественный лимфоцитный васкулит, реакция трансплантант против хозяина (РТПХ), иммунные нарушения, связанные с отторжением трансплантанта, псориаз, воспаление, аллергия, оофорит, воспалительное заболевание кишечника, гломерилонефрит, энцефаломиелит, тиреои

- 113 017765 дит Хашимото, болезнь Грейва, болезнь Эддисона, болезнь Крона, синдром З_)одгеп'5, эритематоз, первичная микседема, злокачественная анемия, аутоиммунный атрофический гастрит, ревматоидный артрит, диабетический меллит с инсулиновой зависимостью, миастения, множественный склероз, симпатическая офтальмия, аутоиммунный увеит, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, первичный билиарный цирроз, хронический гепатит, язвенный колит, склеродермия, полимиозит и смешанное заболевание соединительной ткани.

Изобретение обеспечивает использование любых обнаруженных СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд молекул в методах для ингибирования при пролификации или активации Т-клетки, ингибирование иммунного ответа у испытуемого или в лабораторных условиях, и для лечения иммунных нарушений у испытуемого или стимулирования иммунной толерантности к антигену у испытуемого. Иммунная толерантность - это тип иммунного ответа, при котором развивается специфическая нереактивность лимфоидной ткани к специфическому антигену, где при отсутствии толерантности антиген способен вызывать иммунный ответ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 64^4-^ или 64^4^^9,21,1041^^ молекулы и составы могут использоваться для лечения испытуемого, который получил трансплантант для того, чтобы вызвать толерантность и уменьшить вероятность отторжения. В одном из вариантов трансплантируется орган, ткань или клетка. В одном из вариантов клеточный трансплантат имеет в своем составе клетки костного мозга или островковые клетки.

Изобретение представляет способ использования любых обнаруженных СТ^Л4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд молекул в производстве медикамента для лечения любых из вышеназванных заболеваний или нарушений. Изобретение также представляет способ использования любых СТ^Л4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд молекул в соединении с другим веществом для лечения вышеназванных заболеваний или нарушений. Молекулы СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд могут быть введены испытуемому, например, внутривенно, подкожно и/или посредством ингаляций. Составы СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, применяемые для внутривенного или подкожного введения, описаны в патентах США под серийный номером 60/752150, внесенном в реестр 20.12.2005, на которые имеются полные ссылки в данном документе. СТ^Л4-[д или СТ^А4-Iд составы могут также включать составы на основе липосом, в которых липосомы могут доставлять молекулы СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд в целевые клетки и ткани. СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд молекулы могут также быть доставлены в целевые клетки или ткани путем введения вирусного вектора, который содержит СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд кассету экспрессии генов. Введение и дозировка СТ^Л4-[д или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд популяции молекул описаны в патенте ИЗ 20030083246 и ИЗ 20040022787 под номером 60/668774, внесенном в реестр 6 апреля 2005, на который имеются полные ссылки в данном документе.

СТ^А4-Iд или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд молекулы, описанные здесь, могут в формах с разнообразной дозировкой формировать жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, суппозитории, полимерные микрокапсулы или микропузырьки, липосомы и инъекционные растворы. Форма зависит от режима введения и терапевтического применения. Эффективный режим введения и дозировка молекул в данном изобретении зависят от сложности и течения заболевания, общего здоровья испытуемого и ответа на лечение, а также решения лечащего врача. Соответственно дозировка молекул должна быть индивидуально определена для каждого испытуемого. Взаимосвязь дозировки для животных различных размеров и пород и людей, основанная на 1 мг/м² площади поверхности, описана ЕгейекЬ, ЕЭ., в ОнапШаНге Сотρа^^8оη оГ Тох1сйу оГ Апйсапсег Адеп!к т Мойке, Ка!, Натк!ег, Под, Мопкеу апй Мап. (Количественный анализ токсичности антираковых веществ у мыши, крысы, хомячка, собаки, обезьяны и человека) Сапсег СНетоШег, издание 50, №. 4, 219-244, Май 1966. Для оптимизации ответа необходимо регулировать дозировку.

Дозы могут быть поделены и вводиться ежедневно или доза может быть уменьшена пропорционально в зависимости от ситуации. Например, несколько разделенных доз могут быть введены ежедневно или ежемесячно или доза может быть пропорционально уменьшена в зависимости от специфической терапевтической ситуации. В одном из вариантов осуществления введение производится ежемесячно, ежеквартально, ежедневно, дважды в день, через каждые 10 ч, через каждые 6 ч, через каждые 4 ч, через каждые 2 ч, через 1 ч. В соответствии с практикой применения данного изобретения эффективным будет лечение испытуемого при применении средства в количестве около 0.1 и около 10 мг/кг веса тела испытуемого. Также эффективным является количество от 1 до 10 мг/кг веса тела испытуемого. Молекулы £.4^4-^ или СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд также имеют клиническое применение 1п νίΙΐΌ. Они могут использоваться для определения количества В7 положительных клеток при диагностике или прогнозировании некоторых проявлений иммунодефицита, фенотипов лейкемии и лимфомы и определения иммунных изменений, сопровождающих трансплантацию органа.

Доставка составов, описанных здесь, может осуществляться через инъекции, перорально, путем ингаляций или другого рассеивания, подкожных инъекций, внутривенно, локально, суппозиториями, через глаза, нос или рот. Составы могут быть заключены в липосомные капсулы либо другие мембраноподобные оболочки. Состав может быть введен через кровь или через другие жидкости, которые предварительно обрабатываются данным составом и затем переливаются испытуемому.

- 114 017765

Перечень последовательностей

8Εζ) Ю ΝΟ: 17 - это нуклеотидная последовательность, кодирующая рс8ОИиСТЬА41§:

САТСТССС6А ТССССТАТСС ТССАСТСТСА СТАСААТСТО СТСТОАТОСС ОСАТАОТТАА

0ССА6ТАТСТ 6СТСССТОСТ ТСТСТОТТОС АООТСОСТОА СТАСТССОСО АОСААААТТТ

ААОСТАСААС	ААООСААООС	ТТОАССОАСА	АТТОСАТОАА	СААТСТССТТ
АОООТТАООС	СТТТТССССТ	ССТТССССАТ	ОТАСОООССА	6АТАТАС0С6
ТТОАСАТТОА ТТАТТОАСТА ОТТАТТААТА ОТААТСААТТ АСООООТСАТ ТАСТТСАТАС
СССАТАТАТО	ОАОТТССОСО	ТТАСАТААСТ	ТАСООТАААТ	ООСССОССТО
ОСТОАССОСС	СААСОАСССС	СОСССАТТОА	СОТСААТААТ	6АССТАТСТТ
СССАТАОТАА	СОССААТАОО	ОАСТТТССАТ	ТСАС6ТСААТ	ОООТООАСТА
ТТТАСССТАА	АСТОСССАСТ	ТООСАОТАСА	ТСААОТОТАТ	САТАТОССАА
ОТАСОССССС	ТАТТСАСОТС	ААТОАСООТА	ААТООСССОС	СТ06САТТАТ

ОСССАОТАСА ТСАССТТАТО ООАСТТТССТ АСТТООСАОТ АСАТСТАСОТ АТТАОТСАТС

ОСТАТТАССА ТСОТОАТОСО СТТТТ60СА0 ТАСАТСААТО ООСОТОСАТА

ССООТТТОАС ТСАСООООАТ ТТССААСТСТ ССАССССАТТ ОАСОТСААТО ООАОТТТОТТ

ТТООСАССАА

САТТСАСССА

А6А0СТСТСТ

ТААТАССАСТ

АСТАОТААСО

ААТСААСООС

ААТСООСОСТ СССТААСТАС САСТАТАООО ОССОССАОТО

АСТТТССААА АСОСОТОТАС АСААСССАСТ АОАСССААОС

ТОСТООААТТ

АТОТСОТААС оотоооаоот ОСТТАСТОСС ТТСтОТАСССА СТССАСАТАС

ААСТССОССС СТАТАТААОС ТТАТСОАААТ ОСТССтОАТСС СТТСАССААТ

СССТСТАСТС СТСАСАСА6А С6АСССТ6СТ САОТСТООТС СТТОСАСТСС ТСТТТССААО

САТООСОАОС

ОСАОССОАОС

ОССАСТ6АОО

ТОААОТСТОТ

АТОАТТССАТ

АТССААСОАС

ССТСАТОТАС

АТСОСААТСС

САТСОССАОС

ТССОООТОАС

ОСОСгСААССТ

СТОСАСОООС

ТСАСОСССАТ

ССАССОССАТ

АССТСтСтСССА тттототото АОТОСТТСОО АСАТОАТООО АССТССАСТО ООАСАСОООА АСТАССТООО

ОССТОСТОТО

АбТАТбСАТС СА0ССТ6АСА

ОААТСгАСгТТС ОАААТСААОТ СТСТАСАТСТ САТАОСгСААС

ОТАСТООССА

ТССАООСААА ОССАООТОАС

АССТТССТАО ОААССТСАСТ ОСААООТООА ООААСССАОА

ТТТАТОТААТ ТСАТССАСАА СССТССССАО АТТСТОАТСА ООАОСССААА ТСТТСТОАСА

АААСТСАСАС АТССССАССО ТССССАССАС СТОААСТССТ СООООСАТСО

ТСАОТСТТСС ТСТТСССССС ААААСССААО ОАСАСССТСА ТСАТСТСССС ОАССССТОАО

ОТСАСАТССС

СААСТООТАС ОООАООАОСА СТОСАССАОО САААСгСССТС τσοτοστσσΑ

ОТООАСООСО

СТАСААСАОС

АСТООСТОАА

ССАОСССССА

СОТОАОССАС

ТООАООТОСА

АСОТАССОТО

ТС0САА60А0

ТСОАСААААС

ОААОАСССТО

ТААТОССААО

ТООТСАОСОТ

ТАСААОТОСА

САТСТССААА

АООТСААОТТ

АСАААОССОС

ССТСАСССТС

АСгбТСТССАА

ОССАААОООС

- 115 017765

АОССССОАОА

АССАСАООТО

ТАСАСССТСС

ССССАТСССО

ССАТСАССТС

АССАА6ААСС

АООТСАОССТ

ОАССТОССТО

ОТСАААСгСгСТ

ТСТАТСССАО

ССАСАТСОСС

СТООАСгТОСО

АОАОСААТОО

ОСАОССООАО

ААСААСТАСА

АОАССАСССС ТССССТ0СТ6 ОАСТССОАСО ОСТССТТСТТ ССТСТАСАОС ААОСТСАССО

Т6ОАСААОА6

САООТООСА6

САООООААСО

ТСТТСТСАТС

СТССОТОАТО

САТСтАССгСТС

ТОСАСААССА

СТ АС АСОС АС

ААСгАСгССТСТ

СССТСТСТСС

ОСОТАААТОА

СТСтСОАСОСС

СОССААСССС

ССОСТССССО ссстстсссо

ОТСбСАСОАСт

0АТ6СТТСТА

ОАОООСССТА

ТТСТАТАОТО

ТСАССТАААТ

ОСТА6АОСТС ССТСАТСАСС СТСОАСТОТО ССТТСТАОТТ ОССАОССАТС ТОТТОТТТОС

СССТСССССО ТОССТТССТТ СтАСССТООАА ООТОССАСТС ССАСТ6ТССТ ТТССТААТАА

ААТОАООААА

ТТОСАТСОСА

1ТТ6ТСТОАСТ

АСЮТСТСАТТ

СТАТТСТООО ооотоооото

ОСОСА6ОАСА

ОСААОООООА

ООАТТОООАА

ОАСААТАОСА

ООСАТОСТОС

ООАТОССОТСт

СОСТСТАТСО

СТТСТОАООС

СгСАААСААСС

АОСТООООСТ

СТАООССгОТА

ТССССАСОСО

СССТОТАОСО

ССОСАТТААО сосоосооот отсстсстта

СОСОСАОССТ

ОАССОСТАСА

СТТОССАОСО

СССТАОСОСС СОСТССТТТС ОСТТТСТТСС СТТССТТТСТ СОССАСОТТС ОСССХОТСОА

АТ6ТОТ6ТСА сттассстст

ООАААСТССС

САССтСТСССС

АОСАООСАОА

АОТАТССААА

ОСАТОСАТСТ

СААТТАОТСА

ОСААССАООТ

ОТООАААСТС

СССА06СТСС

ССАОСАОСтСА

6АА0ТАТ0СА

ААОСАТОСАТ

СТСААТТАСТ

САОСААССАТ АОТССССССС СТААСТССОС ССАТСССОСС ССТААСТССО СССАОТТССО

СССАТТСТСС СССССАТССС ТОЛСТААТТТ ТТТТТАТТТА ТССАОАООСС САСОССОССТ

ССОССТСТОА

ООСТТТТОСА

ОСТАТТССАО ААОТАОТОАО ОАООСТТТТТ ТООАССССТА

ААААОСТТ6О АСА0СТ0А60 0СТ6С0АТТТ ССССССАААС

ТТСАССССАА ТССТАСССТС ААОССТСОТА СОАТТТТАТС СССССТСССА ТСАТООТТСО

АССАТТ6ААС

Т0САТС0ТС6

ССОТОТСССА

АСтАТАТОООС

АТТООСААОА

АСООАОАССТ

АСССТООССТ

ССОСТСАООА

АСОАОТТСАА

СТАСТТССАА

АОААТОАССА

СААССТСТТС

АОТООААООТ

АААСАОААТС

ТООТОАТТАТ

ОСОТАООААА

АССТООТТСТ

ССАТТССТОА

6АА0ААТС0А

ССТТТАААОС

АСАОААТТАА

ТАТАСтТТСТС

АОТАОАОААС

ТСАААСААСС

АССАСОАООА

ССТСАТТТТС ТТОССААААО ТТТООАТОАТ ОССТТААОАС ТТАТТОААСА АССООААТТО

ОСААОТАААО	ТАСАСАТССТ	ТТ06АТАСТС	СОАОССАОТТ	СТОТТТАССА
6ОААОССАТО	ААТСААССАО	6ССАССТСА6	АСТСТТТСТС	АСААОСтАТСА
ТССАООААТТ	ТОАААОТОАС	АСОТТТТТСС	СА6АААТТ0А	ТТТС6ССААА
ТАТАААСТТС	ТСССАОААТА	СССАОСтСОТС	СТСТСТОАОС	ТССАССАООА
ААААООСАТС	ААСТАТААСТ	ТТОААОТСТА	С6АСАА0ААА	ОАСТААСАОО

- 116 017765

ААСАТССТТТ СААОТТСТСТ ОСТССССТСС ТАААОСТАТО САТТТТТАТА АСАССАТССС АСТТТТССТС ОСТТТАСАТС ТТТСТСААСС- ААССТТАСТТ СТСТССТСТС АСАТААТТОО АСАААСТАСС ТАСАСАСАТТ ТАААОСТСТА АССТАААТАТ ААААТТТТТА АОТОТАТААТ СТОТТ АААСТ АСТСАТТСТА АТТСТТТСТС ТАТТТТАСАТ ТССААССТАТ ССААСТСАТС ААТСССАССА СТССТССААТ СССТТТААТС АССААААССТ СТТТТССТСА СААСАААТСС САТСТАСТСА ТСАТСАСССТ АСТССТСАСТ СТСААСАТТС ТАСТССТССА ААААА6АА6А САААССТАСА А6АССССАА6 6АСТТТССТТ САСААТТССТ ААСГГТТТТС АСТСАТССТС ТСТТТАСТАА ТАСААСТСТТ ССТТССТТТС СТАТТТАСАС САСАААССАА АААССТССАС ТССТАТАСАА СААААТТАТС ОАААААТАТТ СТОТААССТТ ТАТААСТАСС САТААСА6ТТ АТААТСАТАА САТАСТ6ТТТ ТТТСТТАСТС САСАСАСССА ТАСАСТСТСТ ССТАТТААТА АСТАТССТСА ААААТТСТСТ АССТТТАССТ ТТТТААТТТС ТАААССССТТ ААТААССААТ АТТТСАТСТА ТАСТСССТТС АСТАСАСАТС АТААТСАССС АТАССАСАТТ Т6ТАСА66ТТ ТТАСТТОСТТ ТААААААССТ СССАСАССТС ССССТ6ААСС ТСАААСАТАА ААТСААТССА АТТСТТСТТС ТТААСТТСТТ ТАТТССАССТ ТАТААТССТТ АСАААТАААС СААТАССАТС АСАААТТТСА САААТАААОС АТТТТТТТСА СТССАТТСТА СТТСТССТТТ СТССАААСТС АТСААТ6ТАТ СТТАТСАТСТ СТССАТСССС ТССАТСАТСС ТССАСССССС ССАТСТСАТС СТССАСТТСТ

ТСССССАССС СААСТТСТТТ АТТССАССТТ АТААТССТТА САААТАААОС ААТАССАТСА САААТТТСАС АААТААА6СА ТТТТТТТСАС ТССАТТСТАО ТТСТССТТТС ТССАААСТСА ТСААТСТАТС ТТАТСАТСТС ТОТАТАСССТ ССАССТСТАС СТАСАОСТТО ОСОТААТСАТ ООТСАТАССТ СТТТССТСТС ТСАААТТСТТ АТССССТСАС ААТТССАСАС ААСАТАССАС СССОААОСАТ АААСТСТААА СССТССССТС ССТААТСАСТ САССТААСТС АСАТТААТТС ССТТССССТС АСТССССССТ ТТССАСТССО САААССТСТС СТСССАССТС САТТААТСАА ТССОССААСС СССССССАСА СССССТТТСС СТАТТССССС СТСТТССССТ ТССТСОСТСА СТОАСТСССТ ССССТСССТС СТТССССТСС ООССАСССОТ

АТСАССТСАС

ТСАААССССО

ТААТАСССТТ

АТССАСАСАА

ТСАСОСОАТА

АСССАССААА

СААСАТСТСА

ССААААСССС

АССААААССС

САСОААСССТ

АААААССССС

ССТТССТССС

ОТТТ.ТТССАТ

АСССТССССС

ССССТСАССА

ССАТСАСААА

ААТССАСОСТ

СААСТСАСАС

ОТСССОАААС

СССАСАССАС

ТАТАААСАТА ССАССССТТТ СССССТССАА ССТСССТССТ ССССТСТССТ СТТСССАССС

ТСССССТТАС СССАТАССТО ТССОССТТТС ТСССТТСССС ААОССТСОСО СТТТСТСААТ

ССТСАСССТС ТАССТАТСТС АСТТСССТСТ АССТССТТСС СТССААССТО СССТСТСТСС

АССААССССС ССТТСАСССС САССССТССС ССТТАТССОС ТААСТАТССТ СТТСАСТССА

- 117 017765

АСССООТААС	АСАССАСТТА	ТСОССАСТОО	САОСАОССАС	ТОСТААСАСС
АТТАОСАОАО	СОАОСТАТОТ	АОСССОТОСТ	АСАСАОТТСТ	ТОААОТООТО
ОССТААСТАС	СОСТАСАСТА	ОААООАСАОТ	АТТТООТАТС	ТССССТСТСС
ТОААОССАОТ	ТАССТТСООА	ААААСАСТТ6	ОТАОСТСТТО	АТССООСААА
САААССАССО	СТООТАОСОО	ТООТТТТТТТ	ОТТТОСААОС	АОСАОАТТАС
ОСОСАОАААА	АААООАТСТС	ААСААОАТСС	ТТТОАТСТТТ	ТСТАСООООТ
СТОАСОСТСА	СТОСААСОАА	ААСТСАСОТТ	ААСОСАТТТТ	ООТСАТСАОА

ТТАТСААААА 60АТСТТСАС СТАОАТССТТ ТТАААТТААА ААТСААОТТТ ТАААТСААТС

ТАААСТАТАТ АТОАОТАААС ТТССТСТОАС АОТТАССААТ ОСТТААТСАО

ТСАСССАССТ АТСТСА6С0А ТСТОТСТАТТ ТСОТТСАТСС АТАСТТОССТ 0АСТСССС6Т

СОТОТАОАТА

АСТАСОАТАС

СОСгАОСЮСТТ

АССАТСТООС

СССАСТСгСТСг

СААТОАТАСС

ОСОАСАСССА

СОСТСАСССгС

СТССАОАТТТ

АТСАСгСААТА

ААССАОССАО

ССООААОООС

СОАОСОСАОА

АОТООТССТО

СААСТТТАТС

СОССТССАТС

САОТСТАТТА

АТТОТТОССО

ООААОСТАОА

ОТААОТАОТТ

СОССАСТТАА ТАОТТТССОС ААСОТТОТТС ССАТТОСТАС АООСАТСОТО 0Т0ТСАС6СТ

СОТССТТТСО ТАТООСТТСА ТТСАОСТССС ОТТСССААСС ТСААООСОА ОТТАСАТОАТ

СССССАТСгТТ ОТОСАААААА СССОТТАОСТ ССТТСООТСС СС6АТСОТТ ОТСАОААОТА

АОТТ6ССССС АСТОТТАТСА СТСАТСОТТА ТООСАОСАСТ САТААТТСТ СТТАСТОТСА

ТСССАТСС6Т ААОАТОСТТТ ТСТСТ0АСТ6 ОТСАСТАСТС ААССАА6ТСА ТТСТОАСААТ

АСгТОТАТОСО

ОСОАССОАОТ

ТОСТСТТОСС

СООСОТСААТ

АСОООАТААТ

АССССОССАС

АТАОСАОААС

ТТТААААОТО

СТСАТСАТТО

ОААААСОТТС

ТТСССООСОА

АААСТСТСАА

ООАТСТТАСС

ОСТОТТОАОА

ТССА6ТТССА

ТОТААСССАС ТС0Т6САССС ААСТОАТСТТ САССАТСТТТ ТАСТТТСАСС АСССТТТСТО

СОТОАСгСААА

ААСАСОААОО СААААТСССС СААААААООО

ААТААСОССО

АСАСООАААТ

СгТТСААТАСТ САТАСТСТТС СТТТТТСААТ

АТТАТТОААО

САТТТАТСАО

СОТТАТТСТС ТСАТОАССОО АТАСАТАТТТ

ОААТОТАТТТ

АОАААААТАА

АСАААТАООО

ОТТССССОСА САТТТССССО

ААААОТОССА

ССТОАСОТСО

АССОАТСОСгО А

8Εζ) Ш N0: человека СТЬА4.

- это аминокислотная последовательность внеклеточного домена

МНУА0РАУУЬА8ЖС1А8РУСЕУА8РОКАТЕУКУТУЬК0АО80УТЕУСААТ¥ММСМЕЬТРЪО

ОШСТСТЗЗОМОУЖТЮСЕКАМОТСЬУТСКУЕЬМУРРРУУЕСЮХОТОГГУЕОРЕРСРОЗО

Другие неограничивающие варианты осуществления изобретения.

Изобретение предоставляет популяцию клонированных клеток яичника китайского хомячка, способных производить СТ^Л4-Iβ. В одном случае популяция клеток способна производить более 0.5 г СТ^Л4-Iβ белка на 1 л жидкой культуры, и в этом случае СТ^Л4-Iβ демонстрирует молярное соотношение сиаловая кислота-димер СТ^Л4-Iβ от 6 до 14 по культурной шкале на 1000 л или больше. В одном из вариантов популяция клеток была адаптирована к химически определенной среде без содержания сыворотки. В одном из вариантов СТ^Л4-Iβ, произведенный из культуры популяции клеток, имеет коэффициент экстинкции 1.00±0.05 Аи мл-см^-1-мг^-1. В одном из вариантов популяция клеток, выращенная в культуре, способна производить СТ^Л4-Iβ полипептиды, где: (а) около 90% СТ^Л4-Iβ полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΏ N0:2, начинающуюся с метионина в положении 27; (Ь) около 10% СТ^Л4-Iβ полипептидов содержат аминокислотную последовательность 81%) П) N0:2, начинающуюся с аланина в положении 26; (с) около 4% СТ^Л4-Iβ полипептидов содержат аминокислотную последовательность 81%) П) N0:2, заканчивающуюся лизином в положении 383; (б) около 96% СТ^Л4-Iβ полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 П) N0:2, заканчивающуюся глицином в положении 382; и (е) менее 1% СТ^Л4-Iβ полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8Е0 П) N0:2, начинающуюся с метионина в положении 25.

Изобретение представляет потомственную клетку от клеток, описанных выше, где потомственная клетка производит СТ^Л4-Iβ. В одном из вариантов потомственная клетка добывается путем культивирования клетки в течение более 5 поколений. В одном из вариантов потомственная клетка добывается

- 118 017765 путем культивирования клетки в течение более 10 поколений. В одном из вариантов потомственная клетка добывается путем культивирования клетки в течение по крайней мере 20 поколений. В одном из вариантов потомственная клетка добывается путем культивирования клетки в течение по крайней мере 40 поколений. В одном из вариантов потомственная клетка добывается путем культивирования клетки в течение по крайней мере 50 поколений. В одном из вариантов потомственная клетка добывается путем культивирования клетки в течение по крайней мере 75 поколений. В одном из вариантов потомственная клетка добывается путем культивирования клетки в течение по крайней мере 100 поколений.

Изобретение представляет клеточную линию, произведенную из любой клетки, описанной выше. В одном из вариантов клеточная линия является клональной. В одном из вариантов клеточная линия способна производить: (а) СТЬА4-1д гибридный белок, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:8 (метионин в положении 27 и глицин в положении 382 8ЕЦ ГО N0:2); (Ь) СТЬА4-1д гибридный белок, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:5 (метионин в положении 27 и лизин в положении 383 8ЕЦ ГО N0:2); (с) СТЬА4-1д гибридный белок с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:7 (аланин в положении 26 и глицин в положении 382 8ЕЦ ГО N0:2); (б) СТЬА4-1д гибридный белок с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:4 (аланин в положении 26 и лизин в положении 383 8ЕЦ ГО N0:2); (е) СТЬА4-1д гибридный белок с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:4 (метионин в положении 25 и лизин в положении 383 8ЕЦ ГО N0:2) или (ί) СТЬА4-1д гибридный белок, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:6 (метионин в положении 25 и глицин в положении 382 8ЕЦ ГО N0:2).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клеточная линия способна производить СТЬА4-1д гибридные белки, где: (а) около 90% СТЬА4-1д полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, начинающуюся с метионина в положении 27; (Ь) около 10% СТЬА4-1д полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, начинающуюся с аланина в положении 26; (с) около 4% СТЬА4-1д полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, заканчивающуюся лизином в положении 383; (б) около 96% СТЬА4-1д полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, заканчивающуюся глицином в положении 382; и дополнительно (е) менее 1% СТЬА4-1д полипептидов содержат аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, начинающуюся с метионина в положении 25.

В одном из вариантов СТЬА4-1д гибридные белки, произведенные путем культивирования клеточной линии, имеют коэффициент экстинкции 1.00±0.05 Аи мл-см^-1-мг^-1. В одном из вариантов изобретение представляет популяцию клеток, полученную из клетки данного изобретения. В одном из вариантов популяция клеток имеет по крайней мере одно генетическое изменение по сравнению с традиционно трансфекцируемой клеткой, и полученная популяция клеток способна производить СТЬА4-1д. В одном из вариантов популяция клеток имеет по крайней мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 дополнительных генетических изменений по сравнению с традиционно трансфекцируемой клеткой и полученная популяция клеток способна производить СТЬА4-1д. В одном из вариантов генетическое изменение содержит по крайней мере одну неконсервативную мутацию клеточного генома или рекомбинантный полигенный экспрессирующий кластер, кодирующий СТЬА4-1д.

В одном из вариантов генетическое изменение заключается в содержании по крайней мере одной дополнительной рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетке. В одном из вариантов изменение заключается в мутации клеточного генома. В одном из вариантов изменение заключается в дополнении нуклеиновой кислоты либо к клеточному геному, либо транснуклеиновой кислоте, которая кодирует антиапоптический полипептид. В одном из вариантов антиапоптический полипептид определяет гликозилирование.

В одном из вариантов генетическое изменение заключается в содержании по крайней мере одной мутации клеточного генома или рекомбинантного полигенного экспрессирующего кластера, кодирующего СТЬА4-1д. В одном из вариантов популяция клеток, выросшая в культуре, способна производить: (а) СТЬА4-1д гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:8 (метионин в положении 27 и глицин в положении 382 8ЕЦ ГО N0:2); (Ь) СТЬА4-1д гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:5 (метионин в положении 27 и лизин в положении 383 8ЕЦ ГО N0:2); (с) СТЬА4-1д гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:7 (аланин в положении 26 и глицин в положении 382 8ЕЦ ГО N0:2); (б) СТЬА4-1д гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:4 (аланин в положении 26 и лизин в положении 383 8ЕЦ ГО N0:2); (е) СТЬА4-1д гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:4 (метионин в положении 25 и лизин в положении 383 8ЕЦ ГО N0:2) или (ί) СТЬА4-1д гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:6 (метионин в положении 25 и глицин в положении 382 8ЕЦ ГО N0:2).

Изобретение представляет популяцию СТЬА4-1д молекул, имеющую молярное отношение групп сиаловой кислоты к димеру СТЬА4-1д 6 к 18. Изобретение представляет популяцию СТЬА4-1д молекул, имеющую среднее молярное отношение группы сиаловой кислоты к димеру СТЬА4-1д 8 к 18. Изобретение представляет популяцию СТЬА4-1д молекул, имеющую среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к димеру СТЬА4-1д 11 к 18. Изобретение представляет популяцию молекул СТЬА4-1д,

- 119 017765 имеющую среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к димеру СТ^Λ4-Iд приблизительно 12 к 18. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул, имеющую среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к димеру СТ^Λ4-Iд приблизительно 13 к 18. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-[д молекул, имеющую среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к димеру СТ^Λ4-[д приблизительно 14 к 18. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул, имеющую среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к димеру СТ^^.Λ4-Iд приблизительно 15 к 17. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул, имеющую среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к димеру СТ^Λ4-Iд приблизительно 16.

Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул, где более 95% молекул - СТ^Λ4-Iд димеры. В одном из вариантов более 98% молекул являются СТ^Λ4-Iд димерами. В одном из вариантов более 99% молекул являются СТ^Λ4-Iд димерами. В одном из вариантов более 99.5% молекул - СТЬА4Ц димеры. В одном из вариантов от 95 до 99.5% молекул - СТ^Λ4-Iд димеры и от 0.5 до 5% молекул СТ^Λ4-Iд тетрамеры. В одном из вариантов около 98.6% молекул - СТ^Λ4-Iд димеры и около 1.2% молекул - СТ^Λ4-Iд тетрамеры и менее 0.7% молекул - СТ^Λ4-Iд мономеры. Изобретение представляет популяцию, состоящую из СТ^Λ4-[д димеров. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул, в значительной степени свободную от СТ^Λ4-Iд мономера. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-[д молекул, в значительной степени свободную от СТ^Λ4-Iд тетрамера. Изобретение представляет популяцию молекул СТ^Λ4-Iд мономера, в значительной степени свободную от СТ^Λ4-Iд димера и тетрамера. В одном из вариантов каждый мономер каждого СТ^Λ4-Iд димера имеет по крайней мере 3 группы сиаловой кислоты.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждый мономер каждого СТ^Λ4-Iд димера имеет по крайней мере от 3 до 8 групп сиаловой кислоты. Изобретение представляет очищенную популяцию молекул СТ^Λ4-Iд тетрамера, в значительной степени свободную от СТ^Λ4-Iд димера, а также дополнительно популяцию, которая содержит количество больше 100 г. Изобретение представляет очищенную популяцию молекул СТ^Λ4-Iд тетрамера, в значительной степени свободную от СТ^Λ4-Iд мономера, а также дополнительно популяцию, которая содержит количество больше 100 г. В одном из вариантов каждая молекула тетрамера содержит две пары СТ^Λ4-Iд полипептидов, и каждый полипептид содержит аминокислотную последовательность, отобранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:38, и где каждый член пары полипептидов нековалентно связан с другим членом и где две пары полипептидов нековалентно связаны друг с другом. В одном из вариантов каждая молекула тетрамера способна образовывать связь с СГО80 или СГО86. В одном из вариантов каждая молекула тетрамера имеет по крайней мере в два раза большую авидность к СЭ80 или СГО86 по сравнению с молекулой СТ^Λ4-Iд димера. В одном из вариантов каждая молекула тетрамера имеет по крайней мере в два раза большее ингибирование пролиферации или активации Т-клетки по сравнению с молекулой СТ^Λ4-Iд димера.

Изобретение представляет состав, содержащий молекулы СТ^Λ4-[д. в составе содержатся доминантные изоформы, видимые при изоэлектрическом фокусировании геля СТ^Λ4-[д. который имеет изоэлектрическую точку ρί меньше или равную 5.1, как определено изоэлектрическим фокусированием. В одном из вариантов ρί увеличивается после лечения нейраминидазой. В одном из вариантов по крайней мере 40% СТ^Λ4-Iд молекул демонстрирует изоэлектрическую точку меньше или равную 5.1, как определено изоэлектрическим фокусированием. В одном из вариантов по крайней мере 70% СТ^Λ4-Iд молекул демонстрирует изоэлектрическую точку меньше или равную 5.1, как определено изоэлектрическим фокусированием. В одном из вариантов по крайней мере 90% СТ^Λ4-Iд молекул демонстрирует изоэлектрическую точку меньше или равную 2.5, как определено изоэлектрическим фокусированием. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул, имеющую ρί от 2.0±0.2 до 5.0±0.2. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул, имеющую ρί от 4.3±0.2 до 5.0±0.2. Изобретение представляет популяцию СТ^Λ4-[д молекул, имеющую ρί от 3.3±0.2 до 4.7±0.2. Изобретение представляет метод приготовления состава, в котором содержится СТ^Λ4-Iд молекула с ρί от 2.0±0.2 до 5.0±0.2, метод заключается в следующем: (а) подвержение смеси СТ^Λ4-Iд молекул изоэлектрическому фокусированию и гель-электрофорезу, где одна полоса хромосомы на геле представляет популяцию СТ^Λ4-Iд молекул с определенной ρί, и (Ь) изолирование популяции СТ^Λ4-Iд молекул, имеющей ρί от 2.0±0.2 до 5.0±0.2, для приготовления таким образом соединения. Изобретение представляет состав, содержащий СТ^Λ4-Iд молекулы, которые характеризуются средним молярным соотношением С1сНАс на 1 моль СТ^Λ4-Iд димера от 17 до 25. Изобретение представляет состав, содержащий СТ^Λ4-Iд молекулы, которые характеризуются средним молярным соотношением С1сНАс на 1 моль СТ^Λ4-Iд димера от 15 до 35. Изобретение представляет состав, содержащий СТ^Λ4-Iд молекулы, которые характеризуются средним молярным соотношением СаШАс на 1 моль СТ^Λ4-Iд димера от 1.7 до 3.6. Изобретение представляет состав, содержащий СТ^Λ4-Iд молекулы, которые характеризуются средним молярным соотношением галактозы на 1 моль СТ^Λ4-Iд димера от 8 до 17. Изобретение представляет состав, содержащий СТ^Λ4-Iд молекулы, которые характеризуются средним молярным соотношением фукозы на 1 моль СТ^Λ4-Iд димера от 3.5 до 8.3. Изобретение представляет состав, содержащий СТ^Λ4-Iд молекулы, которые характеризуются средним молярным соотношением маннозы на 1 моль СТ^Λ4-Iд димера от 7.2 до 22. Изобретение

- 120 017765 представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые характеризуются средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТЬА4-1д димера от 6 до 12. Изобретение представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые характеризуются: (а) средним молярным соотношением С1сNАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 15 до 35; (Ь) средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТЬА4-1д димера от 6 до 12. Изобретение представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые характеризуются: (а) средним молярным соотношением С1сNАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 15 до 35; (Ь) средним молярным соотношением СаШАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 1.7 до 3.6 и (с) средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТЬА4-1д димера от 6 до 12. Изобретение представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые характеризуются: (а) средним молярным соотношением С1сNАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 15 до 35; (Ь) средним молярным соотношением СаШАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 1.7 до 3.6; (с) средним молярным соотношением галактозы на 1 моль СТЬА4-1д димера от 8 до 17 и (й) средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТЬА4-1д димера от 6 до 12. Изобретение представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые характеризуются: (а) средним молярным соотношением С1сNАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 15 до 35; (Ь) средним молярным соотношением СаШАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 1.7 до 3.6; (с) средним молярным соотношением галактозы на 1 моль СТ1А4-1д димера от 8 до 17; (й) средним молярным соотношением фукозы на 1 моль СТЬА4-1д димера от 3.5 до 8.3 и (е) средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТЬА4-1д димера от 6 до 12.

Изобретение представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые характеризуются: (а) средним молярным соотношением С1сNАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 15 до 35; (Ь) средним молярным соотношением СаШАс на 1 моль СТЬА4-1д димера от 1.7 до 3.6; (с) средним молярным соотношением галактозы на 1 моль СТЬА4-1д димера от 8 до 17; (й) средним молярным соотношением фукозы на 1 моль СТЬА4-1д димера от 3.5 до 8.3; (е) средним молярным соотношением маннозы на 1 моль СТЬА41д димера от 7.2 до 22 и (Г) средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТЬА4-1д димера от 6 до 12.

Изобретение представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы и который демонстрирует пик на NСNА хроматограмме на 9.589±0.3 и пик на NАNА хроматограмме на 10.543±0.3. Изобретение представляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые демонстрируют углеводородный профиль, как показано на фиг. 7. Изобретение предоставляет состав, содержащий СТЬА4-1д молекулы, которые демонстрируют углеводородный профиль доменов Ι-ΐν, где домен I содержит пики, которые представляют асиалированные олигосахариды, домен ΙΙ содержит пики, которые представляют моносиалированные олигосахариды, домен ΙΙΙ содержит пики, которые представляют дисиалированные олигосахариды, и домен Ιν содержит пики, которые представляют трисиалированные олигосахариды. В одном из вариантов разница во времени удержания ^связанных олигосахаридов составляет между первым пиком в домене Ι и главным пиком в домене ΙΙ 22-28 мин. Изобретение представляет состав, содержащий молекулы €.^^4-^ димера, где по крайней мере 0.5% молекул €^^4-^ димера цистенилируется. В одном из вариантов по крайней мере 1.0% молекул 6^^4-^ димера цистенилируется. Изобретение представляет популяцию СТ^А4-Iд молекул, которая демонстрирует профиль масс-спектрометрии, как показано на фиг. 8 и 10. Изобретение представляет популяцию СТ^А4-Iд молекул, которая демонстрирует профиль капиллярного электрофореза, как показано на фиг. 20 и 21. Изобретение представляет состав молекул СТ^А4-Iд, имеющий среднее молярное соотношение сиаловой кислоты к группам СТ^А4-Iд димера 6:18, и где СТ^А4-Iд димер произведен из промышленной клеточной линии. Изобретение представляет состав СТ^А4-Iд, полученный любым методом, описанным в данном изобретении. Изобретение представляет популяцию СТ^А4-Iд молекул, где молекулы гликозилируются в апарагиновый аминокислотный остаток в положении 102 последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2, апарагиновый аминокислотный остаток в положении 134 последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2, апарагиновый аминокислотный остаток в положении 233 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, сериновый аминокислотный остаток в положении 155 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, или сериновый аминокислотный остаток в положении 165 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2. Изобретение представляет популяцию СТ^А4-Iд молекул, которая характеризуется:

(a) средним молярным соотношением С1сNАс на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 15 до 35; (Ь) средним молярным соотношением СаШАс на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 1.7 до 3.6; (с) средним молярным соотношением галактозы на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 8 до 17; (й) средним молярным соотношением фукозы на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 3.5 до 8.3; (е) средним молярным соотношением маннозы на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 7.2 до 22; (Г) средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 6 до 12; (д) изоэлектрической точкой в диапазоне от 2.4±0.2 до 5.0±0.2, как определено посредством изоэлектрического фокусирования; (к) МСР-1 <5 мд; (ί) содержанием тетрамера менее 2.5%; (]) содержанием мономера менее 0.5%; (к) СТ^А4-Iд полипептидами популяции, имеющими аминокислоту, на 95% идентичную любой 8Е0 ΙΌ N0:2-8; (1) молекулы СТ^А4-Iд в популяции способны связываться с СБ80 и СБ86. Изобретение представляет популяцию СТ^А4-Iд молекул, которая характеризуется: (а) средним молярным соотношением С1сNАс на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 15 до 35;

(b) средним молярным соотношение СаШАс на 1 моль СТ^А4-Iд димера от 1.7 до 3.6; (с) средним мо

- 121 017765 лярным соотношением галактозы на 1 моль СТ^Ά4-Iд димера от 8 до 17; (б) средним молярным соотношением фукозы на 1 моль СТ^Ά4-[д димера от 3.5 до 8.3; (е) средним молярным соотношением маннозы на 1 моль СТ^Ά4-[д димера от 7.2 до 22; (ί) средним молярным соотношением сиаловой кислоты на 1 моль СТ^Ά4-[д димера от 6 до 12; (д) изоэлектрической точкой в диапазоне от 2.4±0.2 до 5.0±0.2, как определено посредством изоэлектрического фокусирования; (к) МСР-1 <5 мд; (ί) содержанием тетрамера менее 2.5%; (|) содержанием мономера менее 0.5%, (к) СТ^Ά4-Iд полипептидами популяции, имеющими аминокислоту, на 95% идентичную любой 8ЕР ΙΌ N0:2-8; (1) молекулы СТ^Ά4-Iд в популяции способны связываться с 0Ό80 и 0Ό86; или их фармацевтическими эквивалентами. Изобретение представляет состав, содержащий эффективное количество СТ^Ά4-Iд молекул и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение представляет состав, содержащий эффективное количество СТ^Ά4-Iд молекул, а также моногидрат мальтозы. В одном из вариантов состав содержит фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель. В одном из вариантов состав содержит мальтозу, натрия фосфата одноосновного моногидрат, хлорид натрия, гидроксид натрия и стерильную воду. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав содержит сахарозу, полоксамер, натрия фосфата одноосновного моногидрат, натрия фосфат двуосновной безводный, хлорид натрия, гидроксид натрия и стерильную воду.

Изобретение представляет лиофилизированную СТ^Ά4-Iд смесь, состоящую на 95% из 01^4димера и не более чем на 5% из СТ^Ά4-Iд тетрамера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смесь состоит на 98% из СТ^Ά4-Iд димера и не более чем на 2% из СТ^Ά4-Iд тетрамера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смесь состоит на 99% из СТ^Ά4-Iд димера и не более чем на 1% из СТ^Ά4-Iд тетрамера. В одном из вариантов смесь содержит 8.0 моль сиаловой кислоты на 1 моль СТ^Ά4-Iд димера. В одном из вариантов смесь содержит от 15.7 до 31 моль С1сNΆс на 1 моль СТ^Ά4-Iд димера. В одном из вариантов смесь содержит от 1.6 до 3.2 моль СаШАс на 1 моль СТ^Ά4-Iд димера. В одном из вариантов смесь содержит от 9.3 до 15.5 моль галактозы на 1 моль СТЬА4димера. В одном из вариантов смесь содержит от 3.6 до 7.9 моль фукозы на 1 моль СТ^Ά4-Iд димера. В одном из вариантов смесь содержит от 9.7 моль маннозы на 1 моль СТ^Ά4-Iд димера. Изобретение представляет фармацевтический набор, который включает: (а) контейнер с лиофилизированной смесью СТ^Ά4-Iд и (Ь) инструкцию по восстановлению лиофизированной СТ^Ά4-Iд смеси в раствор для инъекций.

Изобретение представляет метод по ингибированию пролиферации (или активации) Т-клетки, который заключается в контакте Т-клетки с эффективным количеством СТ^Ά4-Iд состава. Изобретение представляет метод по ингибированию иммунного ответа у испытуемого и заключается во введении испытуемому в случае необходимости эффективного количества соединения. Изобретение представляет методы по стимулированию иммунной толерантности к антигену у испытуемого, лечению воспаления у испытуемого, лечению ревматоидного артрита, лечению псориаза у испытуемого, лечению волчанки, лечению или предотвращению появления аллергии у испытуемого, лечению или предотвращению реакции трансплантант против хозяина у испытуемого, лечению или предотвращению отторжения трансплантированного органа у испытуемого, лечению множественного склероза лечения диабета типа Ι, лечению воспалительного заболевания кишечника, лечению оофорита у испытуемого, лечению гломерилонефрита, лечению аллергического энецефаломелита или лечению миастении у испытуемого путем введения ему состава данного изобретения в количестве, необходимом для лечения заболевания или нарушения. Состав может быть смешан с фармацевтически приемлемым носителем. Изобретение представляет использование популяции СТ^Ά4-Iд молекул, имеющей среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к СТ^Ά4-Iд димеру от 6 до 18, в производстве медикаментов для терапевтического и/или профилактического лечения иммунного нарушения. Изобретение представляет использование популяции СТ^Ά4-Iд молекул, имеющих среднее молярное соотношение групп сиаловой кислоты к СТ^Ά4-Iд димеру от 6 до 18, в производстве средства от ревматоидного артрита в упаковке вместе с инструкцией по его использованию в лечении ревматоидного артрита. Изобретение представляет метод по ингибированию пролиферации (или активации) Т-клетки, который заключается в контакте Т-клетки с эффективным количеством состава настоящего изобретения в комбинации с метотрексатом. Изобретение представляет метод ингибирования иммунного ответа у испытуемого, который заключается во введении испытуемому в случае необходимости эффективного количества изобретенного состава в комбинации с метотрексатом. Изобретение представляет метод по стимулированию иммунной толерантности к антигену у испытуемого, который заключается во введении испытуемому в случае необходимости эффективного количества любого изобретенного вещества, описанного под пунктами 1-64 в комбинации с метотрексатом. Изобретение представляет метод производства рекомбинантного белка, который заключается в следующем: (а) выращивание млекопитающих клеток, которые секретируют рекомбинантный белок, выращивание происходит от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л, где концентрация рекомбинантного белка составляет 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование рекомбинантного белка из 10000 л жидкой культуры. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стадия выращивания (а) включает: (ί) культивирование клеток в химически определенной среде без сыворотки в че- 122 017765 тыре прохода для получения культуры с плотностью клеток 1.0х10⁵ жизнеспособных клеток на 1 мл, где каждый следующий шаг пересева начинается при 2х10⁵ на 1 мл и возрастает до 1-2 тыс. клеток на 1 мл; (ίί) сохранение клеток в культуре на время, достаточное для производства из культуры по меньшей мере 0.5 г/л. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок является гликопротеином. В одном из вариантов белок является 04^44^ белком. В одном из вариантов млекопитающие клетки являются потомственными клетками. В одном из вариантов млекопитающие клетки являются потомственными клетками СНО клональной клеточной линии, способной производить СТЬА44д гибридный белок, при этом СНО клетки стабильно интегрированы в них геном у 30 копий СТЬА44д полигенного экспрессирующего кластера. В одном из вариантов достаточное время - это то время, за которое жизнеспособность клеток не опускается ниже 30%. В одном из вариантов достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не опускается ниже 40%. В одном из вариантов достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не опускается ниже 50%. В одном из вариантов достаточное время это время, за которое жизнеспособность клеток не опускается ниже 60%. В одном из вариантов достаточное время - это время, за которое жизнеспособность клеток не опускается ниже 70, или 80, или 90, или 95%. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения четыре прохода заключаются в: (ί) выращивании клеток в культуре объемом по крайней мере 50 мл до достижения плотности от 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл, (ίί) выращивании клеток в культуре объемом по крайней мере 10 л до достижения плотности от 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл; (ίίί) выращивании клеток в культуре объемом по крайней мере 100 л до достижения плотности от 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл и (ίν) выращивании клеток в культуре объемом 200 л до достижения плотности от 1 до 2.5 млн клеток на 1 мл. В одном из вариантов галактоза добавляется к химически определенной среде без сыворотки. В одном из вариантов сохранение заключается в (ί) понижении температуры культуры с 37±2 до 34±2°С и (ίί) понижении температуры культуры с 34±2 до 32±2°С. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 5 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 6 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 7 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 8 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 9 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 10 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 11 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 12 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 13 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 14 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 15 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 16 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 17 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С в течение 18 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С до 18 дней. В одном из вариантов температура поддерживается в пределах 32±2°С до тех пор, пока плотность культуры не изменится с 30х10⁵ клеток на 79х10⁶ клеток на 1 мл жидкой культуры. Изобретение представляет метод производства рекомбинантного белка, который заключается в следующем: (а) выращивание млекопитающих клеток, которые секретируют рекомбинантный белок, от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л таким образом, чтобы концентрация рекомбинантного белка была по крайней мере 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование рекомбинантного белка из 10000 л жидкой культуры, которое происходит тогда, когда жидкая культура содержит больше или равное 6.0 моль количество NАNА на 1 моль белка. Изобретение представляет метод производства рекомбинантного белка, который заключается в следующем: (а) выращивание млекопитающих клеток, которые секретируют рекомбинантный белок, от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л таким образом, чтобы концентрация рекомбинантного белка была по крайней мере 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование рекомбинантного белка из 10000 л клеточной культуры, которое происходит только тогда, когда плотность клеточной культуры составляет от 33х 10⁶ до 79х 10⁶ клеток на 1 мл.

Изобретение представляет метод производства рекомбинантного белка, который заключается в следующем: (а) выращивание млекопитающих клеток, которые секретируют рекомбинантный белок, от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л таким образом, чтобы концентрация рекомбинантного белка составила по крайней мере 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование рекомбинантного белка из 10000 л жидкой культуры, которое происходит тогда, когда жизнеспособность клеток в жидкой культуре не опускается ниже 20, или 30, или 38%. Изобретение представляет метод производства рекомбинантного белка, который заключается в следующем; (а) выращивание млекопитающих клеток, которые секретируют рекомбинантный белок, от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л таким образом, чтобы концентрация рекомбинантного белка составила по крайней мере 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование рекомбинантного белка из 10000 л жидкой культуры, которая происходит только тогда, когда содержание эндотоксинов меньше или равно 76.8 ЕЙ на 1 мл жидкой культуры. Изобретение представляет метод производства рекомбинантного белка, который заключается в

- 123 017765 следующем: (а) выращивание млекопитающих клеток, которые секретируют рекомбинантный белок, от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л таким образом, чтобы концентрация рекомбинантного белка составила по крайней мере 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование рекомбинантного белка из 10000 л жидкой культуры, которое происходит только тогда, когда бионагрузка меньше, чем 1 колониеобразующая единица на 1 мл жидкой культуры. Изобретение представляет метод производства рекомбинантного белка, который заключается в следующем: (а) выращивание млекопитающей клетки, которая секретирует рекомбинантный белок, от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л, так чтобы концентрация рекомбинантного белка составляла по крайней мере 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование рекомбинантного белка из 10000 л жидкой культуры, которое происходит, если удовлетворены хотя бы два из следующих условий: (ί) жидкая культура содержит больше или равно 6.0 моль NΑNΑ на 1 моль белка, (ίί) жидкая культура имеет плотность от 33х10⁶ до 79х10⁶ клеток на 1 мл, (ίίί) жизнеспособность жидкой культуры на опускается ниже 20 или 38% или (ίν) количество СТ^Α4-Iд в культуре больше 0.5 г/л. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения изолирование включает следующие шаги: (ί) получение супернатанта клеточной культуры; (ίί) подвержение супернатанта анионообменной хроматографии для получения элюированного белкового продукта; (ίίί) подвержение элюированного белкового продукта, полученного в шаге (ίί) хроматографии гидрофобного взаимодействия для получения обогащенного белкового продукта; (ίν) подвержение обогащенного белкового продукта аффинной хроматографии для получения элюированного и обогащенного белкового продукта и (ν) подвержение элюированного и обогащенного белкового продукта, полученного в шаге (ίν), анионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения обогащенный белковый продукт, полученный в шаге (ίίί), характеризуется тем, что процентное содержание в нем любых высокомолекулярных мультимеров меньше 25% от общего веса. В одном из вариантов шаг анионообменной хроматографии (ίί) производится с использованием отмывающего буфера, содержащего около 75 мМ НЕРЕЗ и около 360 мМ №1С1 с рН около 8.0. В одном из вариантов шаг анионообменной хроматографии (ίί) производится с использованием элюирующего буфера, содержащего около 25 мМ НЕРЕЗ и около 325 мМ №1С1 с рН около 7.0. В одном из вариантов стадия хроматографии гидрофобного взаимодействия (ίίί) производится с использованием одного промывного буфера, содержащего около 25 мМ НЕРЕЗ и около 850 мМ №1С1 с рН около 7.0. В одном из вариантов шаг аффинной хроматографии (ίν) производится с использованием промывного буфера, содержащего около 25 мМ Трис и около 250 мМ №1С1 с рН около 8.0. В одном из вариантов стадия аффинной хроматографии (ίν) производится с использованием элюирующего буфера, содержащего около 100 мМ глицина с рН около 3.5. В одном из вариантов стадия анионообменной хроматографии (ν) производится с использованием отмывающего буфера, содержащего около 25 мМ НЕРЕЗ и от 120 до 130 мМ №1С, с рН около 8.0. В одном из вариантов стадия анионообменной хроматографии (ν) производится с использованием элюирующего буфера, содержащего около 25 мМ НЕРЕЗ и около 200 мМ №1С1 с рН около 8.0. В одном из вариантов анионообменная хроматография из стадии (ίί) производится с использованием колонки с анионообменной смолой, имеющей первичную, вторичную, третичную и четвертичную функциональную аминную группу. В одном из вариантов смола имеет четвертичную функциональную аминную группу. В одном из вариантов гидрофобная хроматография из стадии (ίίί) производится с использованием смолы гидрофобного взаимодействия, имеющей фенильную, октильную, пропильную, алкоксильную, бутильную или изоамильную функциональную группу. В одном из вариантов функциональная группа - фенильная функциональная группа. В одном из вариантов аффинная хроматография из шага (ίν) выполняется с использованием колонны, содержащей протеин А. В одном из вариантов метод приготовления СТ^Α4-Iд, метод, заключающийся в очистке СТ^Α4-Iд из жидкой клеточной культуры, таким образом, чтобы очищенный СТЬА44д (а) имел около 38 нг МСР-1 на 1 мг СТЬА44д димера и (Ь) содержал менее 2.5% от общего веса СТЬА44д тетрамера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения жидкая клеточная культура содержит клетку или потомственную клетку настоящего изобретения. Изобретение представляет метод производства СТЬА44д, который заключается в следующем: (а) выращивание потомственных клеток любой промышленной клеточной линии или клеток СНО, которые способны производить СТЬА44д, выращивание происходит от семенной культуры до жидкой культуры объемом 10000 л, и концентрация СТЬА44д составляет по крайней мере 0.5 г/л жидкой культуры; и (Ь) изолирование СТЬА44д из 10000 л жидкой культуры, которое происходит посредством хроматографии и колонке со смолой гидрофобного взаимодействия с фениловой функциональной группой, изолирование посредством хроматографии гидрофобного взаимодействия осуществляется с использованием одинарного отмывающего буфера, содержащего около 25 мМ НЕРЕЗ и около 850 мМ №1С1 с рН около 7.0.

- 124 017765

Примеры изобретения

Ниже представлены примеры для более полного понимания данного изобретения. Следующие примеры показывают типичные способы создания и осуществления на практике настоящего изобретения. Однако область действия изобретения не ограничена специфическими вариантами осуществления, раскрытыми в данных примерах, которые представлены только в целях иллюстрирования, поскольку для получения подобных результатов могут быть использованы альтернативные методы.

Следующие примеры относятся к молекулам СТ1 ,Λ4-Ε, которые включают одну или более последовательностей из ряда 8ЕР ГО N0:2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. Эти примеры не являются ограничивающими, тот, кто знает технологию, может эти примеры расширить и адаптировать, например, для других молекул СТ^А4-Iд, других гликопротеинов и других белков, относящихся или составляющих части ^-надсемейство белка.

Следующая таблица представляет примеры, которые относятся к СТ1 ..-АД-Е и к СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд.

Белок СТЬА4-1§ Характеристики	Пример белка СТЬА4-1§ №1СТЬА4-1§, имеющий 8Е0 ГО N0:1, 2, 5, 6, 7,8 9 или 10	Пример белка №2 - СТЬА4а: имеющий 8Εζ) или 4 или 11-16	СТЬА4-1г 29УЫ04Е_ ГО ΝΟ: 3
Связь с В 7 - 1; скорости вкл/выкл; мощность, валентность	Пример 6
Бионагрузка	Пример 49
Капиллярный электрофорез		Пример 38
Содержание углеводов, Νсвязанный НРЕАС профиль,	Пример 3	Пример 22
интервалы	Пример 44	Пример 37
Трансфекция клеточной линии	Пример 12	Пример 23
СНО ДНК	Пример 58	Пример 55
СНО клетка -хозяин белка	Пример 60	Пример 52
Генетическое определение характеристик		Пример 24
Дезагрегация	Пример 5 Пример 33
Эндотоксин	Пример 48	Пример 48
Окончательное наполнение	Пример 30
Формулировки	Пример 2	Пример 27
Молярное отношение баШАс, СИсДАс	Пример 17 Пример 63	Пример 36
ЕР	Пример 50	Пример 22
Е-2 био проба	Пример 45	Пример 40
Имунногенность	Пример 31
Однократная здоровая доза РК	Пример 66
МА1ГО1 - ТОР	Пример 8
Манноза, фликоза, молярные соотношения галактозы	Пример 18 Пример 64	Пример 35

- 125 017765

Масс спектроскопия	Пример 7
МСР-1	Пример 59	Пример 54
Окружающая среда/выращивание	Пример 9
Шлаковый РК	Пример 32
Мономер	Пример 4
Молярное соотношение ΝΑΝΑ, ΝΟΝΑ	Пример 3 Пример 16	Пример 39
О-связанный	Пример 46
Окисление и деамидирование	Пример 47
Корелляции РК	Пример 42
Плазмида	Пример 1, Пример 11, Пример 61
Производство	Пример 14 Пример 28	Пример 19
Протеин А	Пример 62	Пример 53
Очистка	Пример 15 Пример 29	Пример 20
Многократная доза КА РК	Пример 34
δϋδ-ΡΑΟΕ	Пример 51	Пример 26 Пример 56
ЗЕС-НМУ/, димер, мономер, величина гомогенности	Пример 10	Пример 25
8РК-связь с В7.1 (ΒΙΑ ядро)	Пример 21	Пример 41
Под-клонирование клеточных линий	Пример 13	Пример 24
ТРИТОН-Х 100	Пример 61	Пример 57
Трипсиновое катрирование	Пример 3 Пример 47 Пример 65	Пример 22

Сокращения.

Ν - 15 нанометр;

А280 - оптическая плотность при 280 нм;

СТАМАц - цитотоксический Т-лимфоцит антиген-4 иммуноглобулин;

ΑΓΣ - активный фармацевтический ингредиент;

Αϋ - единицы оптической плотности;

В7 СΊ^Α-4 - лиганд рецептора;

с£а - блок образования колонии;

СНО - СЫпезе Нашз1ег 0уагу (яичник китайского хомячка);

СН0Р - протеины клетки-хозяина яичника китайского хомячка;

Όν - коэффициент изменчивости;

Эгид 8иЬз1апсе Е111 - концентрация лекарственного вещества/диафильтрация и стадия наполнения;

Е1 Ί^Α - иммуносорбентная проба, связанная с ферментом;

Еи - блоки эндотоксина;

Ес - постоянная область антител;

Οа1NΑс - Ν-ацетилгалактозамин;

Ο1сNΑс - Ν-ацетилглюкозамин;

- 126 017765

НЕРЕЗ - 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этаносульфоновая кислота;

ШЗ - хроматография гидрофобного взаимодействия; быстрое движение фениловой Сефарозы™;

НМА - высокая молекулярная масса;

НРЬС - жидкостная хроматография высокой эффективности;

ТдС - иммуноглобулин в классе С1;

ШС - контроль активный;

БАГ - Лимулус Амебоцит Лизат;

МВК(к) - регистрация маточной смеси;

МСР-1 - моноцитарный хемотаксичный протеин 1;

МТХ - метотрексат;

МА - молекулярная масса;

МА - не применяется;

NАNА - N-ацетилнейраминовая кислота; сиаловая кислота; ЗА;

НМАС - отсечка номинальной молекулярной массы;

0Ό - оптическая плотность;

РАК - доказанный допустимый диапазон;

Р1аηоνа - фильтры удаления вирусов, размер пор 15 нм;

РР(к) - параметры процесса;

РР - определение характеристик; ρκί - фунты на квадратный дюйм; ρδίό - фунты на квадратный дюйм, разность; ρκι^” - фунты на квадратный дюйм; средство измерения; РЕЕ - быстрое движение Р Сефарозы™;

РХЬ - предельная нагрузка Р Сефарозы;

гРА - быстрое движение сефарозы А протеина, связанного с рекомбинированием;

ЗА - сиаловая кислота; N-ацетилнейраминовая кислота; NАNА;

ЗОЗ-РАСЕ - гель-электрофорез натриевого додецилсульфатного полиакриламида;

З0Р - стандартная рабочая процедура;

Тпк - трис-(гидроксиметил)аминометан;

ТгПоп Х-100 - полиоксиэтилированный неионогенный детергент; (октилфеноксиполиетоксиетанол); полиэтиленгликолевый трет-октилфениловый эфир;

ИЕ - ультрафильтрация;

υν - ультрафиолет;

ν/ν - объем на объем;

V? - вирусная фильтрация; фильтрация нанометра;

νΙ - инактивация вирусов.

Пример 1. Подтверждение кодирующей последовательности СТ^А4-Iд в плазмиде ρсЗ^1шСТ^Λ41д·

Аннотированная последовательность нуклеиновой кислоты гена СТ^А4-Iд присутствует в ρсЗ^1шСТ^Л4-[д и соответствующая выведенная последовательность аминокислоты СТ^А4-Iд показана на фиг. 1. Нуклеиновая кислота ρсЗ^1шСТ^Л4-[д была трансфекцирована в клетки СНО для того, чтобы выработать стабильные трансфектанты, которые могут отображать молекулы СТ^А4-Iд (см. пример 12). Трансфектанты были отсортированы и определенные трансфектанты были субклонированы или расширены для выработки линий клоновых клеток.

Анализ данных последовательности ДНК подтвердил, что составы, созданные во время конструирования плазмиды, получились согласно проекту и что синтетические олигонуклеотидные подслои, использованные в полимеразной цепной реакции, выработали правильную верхнюю онкостатиновую М сигнальную последовательность в последовательности СТ^А4-Iд. Был подтвержден номинальный цистеин для изменений серина (на позициях 156, 162 и 165 ЗЕр ΙΌ N0:2) в шарнирной области слияния белка. Эти остатки аминокислоты выделены жирным шрифтом со звездочкой на фиг. 1. Было также обнаружено дополнительное изменение аминокислоты пролина в серине на позиции 174 ЗЕр ΙΌ N0:2. Это изменение было представлено во время синтеза с ДНК путем полимеразной цепной реакции. Остаток аминокислоты также выделен жирным шрифтом со звездочкой на фиг. 1.

Анализ данных последовательности ДНК обозначил одно дополнительное различие при сравнении опубликованной нуклеотидной последовательности человеческой СТЬА4 и человеческой ^С постоянной области. Кодон в аминокислоте 110 области кодирования СТЬА4 был определен скорее как АСС (треонин), чем как ССС (аланин).

- 127 017765

Пример 2. Формулировка СТЬА4-1д.

Состав СТЬА4-1д для впрыскивания, 250 мг/колбу, стерильный, непирогенный лиофил для внутривенного (IV) применения. Количество молекул СТЬА4-1д размещено в колбочках из бесцветного стекла 15-сс класс I. Каждая колба закупорена 20-мм серой бутиловой Ба1куо Б-21-7-8/В2-ТК пробкой, покрытой фторполимером, и запечатана 20-мм алюминиевым белым уплотнением.

Каждая колба индивидуального пользования содержит 250 мг состава СТЬА4-1д, который основывается на стерильной воде для впрыскивания, ЦБР и дальнейшем разбавлении 0.9% вводом пробы хлорида натрия, ЦБР, во время использования. Состав СТЬА4-1д для впрыскивания, 250 мг/колбу, и функция каждого компонента указаны в нижеприведенной таблице.

Таблица 8

Компонент	Состав СТЬА4-1д Функция	Мг на колбу
СТЬА4-1§	Активный ингредиент	262.5
Моногидрат мальтозы	Наполнитель/ стабилизатор	525
Фосфат натрия одноосновной	Агент буферного действия	18.1
Моногидрат (Ь)	Регулировка ионной силы	15.3
Хлорид натрия (Ь)
Соляная кислота	рН регулировка	Регулировки рН к
Гидроксид натрия	рН регулировка	~7.5

(Ь) Эти компоненты присутствуют в составе раствора СТЬА4-1д.

Состав СТЬА4-1д содержит приблизительно 50 мг/мл СТЬА4-1д в 25 мМ буферного раствора фосфата натрия и 50 мМ хлорида натрия при рН 7.5. Во время первоначальной разработки эта буферная система была отобрана на основе оценки физической и химической стабильности СТЬА4-1д как функции рН, буферного типа, буферной концентрации и концентрации хлорида натрия. Стабильность растворов СТЬА4-1д была исследована в диапазоне рН от 5 до 9. Результаты показали, что образование видов с высокой молекулярной массой было рН-зависимо, и диапазон рН максимальной стабильности был между 7 и 8. При отдельном определении был оценен эффект буферного типа и концентрация, где выяснилось, что состав СТЬА4-1д равно стабилен в фосфате натрия или буферном трисе при рН 8. Кроме того, буферные концентрации от 10 до 100 мМ не имели влияния на стабильность состава СТЬА4-1д при 2-8°С. Подобным образом, присутствие хлорида натрия в концентрации от 30 до 500 мМ не повлияло на стабильность состояния раствора состава СТЬА4-1д, храненного при 2-8°С.

Основываясь на данных результатах, был отобран состав СТЬА4-1д при 10 мг/мл в 25 мМ буфера фосфата натрия и 50 мМ хлорида натрия при рН 7.5 для разработки при концентрации 50 мг/колбу. Концентрация СТЬА4-1д была позднее изменена на 50 мг/мл в том же буферном составе для подготовки составов СТЬА4-1д с концентрациями 200-и 250 мг/колбу.

СТЬА4-1д для впрыскивания разрабатывается с мальтозой дополнительно к буферу фосфата натрия и хлориду натрия. Функция наполнителей, использованных в этом продукте, указана в вышеприведенной таблице.

Присутствие неорганических солей, таких как буферные компоненты хлорида натрия и фосфата натрия, снижают температуру стеклования (Тд¹) системы заморозки. Более того, двуосновной фосфат натрия, который формируется на месте, при рН 7.5 подвергается избирательной кристаллизации во время замерзания, что снижает рН микроокружающей среды застывшего раствора. Основываясь на этих причинах, было отобрано минимальное количество буфера хлорида натрия и фосфата натрия для снижения их влияния на процесс лиофилизации. Мальтоза добавляется как стабилизатор, который действует как крио- и лиопротектант во время лиофилизации и при последующем хранении продукта соответственно. Состав СТЬА4-1д для впрыскивания, 250 мг/колбу, стерильный, колба однократного использования без антимикробных консервантов.

Пример 3. Анализ содержания углевода в составе СТЬА4-1д.

Целью метода является обеспечение хроматографических профилей СТЬА4-1д Ν-связанных олигосахаридов. Эту процедуру можно использовать для получения молярной концентрации Ν-ацетиловой нейраминовой кислоты (МАМА) и Ν-гликолиловой нейраминовой кислоты (МСМА) для белка в образцах СТЬА4-1д (полный предел плюс свободный). NΑNΑ и NСNΑ - это две формы сиаловой кислоты. Гликозилирование на белке СТЬА4-1д содержит Ν-связанные олигосахариды. Например, эти олигосахариды

- 128 017765 могут быть выделены ферментным гидролизом с ΡNΟаке Е в течение 22 ч. Свободные олигосахариды профилируются, используя анионообменную хроматографию с высоким рН, с применением электрохимического обнаружения. Профили углевода для Ν-связанных олигосахаридов были выявлены с использованием анионообменной хроматографии с высоким рН с помощью импульсного амперометрического определения (ΗΡЛЕС-ΡЛ^). Эти профили были подтверждены и была получена структурная информация с использованием хроматографии пористого углеграфита (РОС), сдвоенного с М8. Методики и результаты описаны в данном разделе. Эта процедура является типичной для СТ^Л4-Iд 8Е0 ΙΌ ΝΟ.

Выделение Ν-связанных олигосахаридов. Расщепление аспарагиносвязанных (Ν-Нпкеб) олигосахаридов из СТ^Л4-Iд было осуществлено ферментным гидролизом с использованием ΡNΟаке Е. Для проведения дегликозилирования СТ^Л4-Iд сначала был восстановлен и денатурирован: 1-2 мг СТ^Л4-Iд в 176 мкл 5 мМ буфера фосфата натрия, содержащего 0.5% 8Ό8 и 1% бета-меркаптоэтанол, был нагрет при 100°С в течение 2 мин, затем остужен до температуры окружающей среды. К охлажденной жидкости были добавлены 16 мкл 10% №-40. Образец хорошо перемешали и добавили 40 мкл ΡNΟаке Е (50000 и/мл, в 50 мМ буферного фосфата натрия). Образец хорошо перемешали и выдержали при 38°С в течение 24 ч. Ферментативно выделенные олигосахариды (гликаны) были очищены с помощью жидкостной хроматографии высокой эффективности противофазы (НРЬС) с использованием колонны РНепотепех Ьипа С18 (4.6x150 мм; 5 мкл), сцепленной с колонной ТЬегто НурегСагЬ (4.6x100 мм; 5 мкл) при скорости потока 1.0 мл/мин; хроматограф, использованный для выделения, был \Уа1егк Αυ^аηсе 2695, оснащенный детектором \Уа1егк 2996. Колонны были сначала сбалансированы 0.05% трехфтористой уксусной кислотой (ТΕΑ). После введения образца был инициирован градиент ацетонитрила, завершающийся через 15 мин растворенным составом 0.05% ТΕΑ в 12% ацетонитрила. Гликаны были затем элюированы из колонны НурегСагЬ с помощью ступенчатого градиента до 0.05% ТΕΑ в 60% ацетонитрила. Г ликаны были собраны во время наблюдения коэффициента пропускания ИУ при 206 нм и были сгущены до сухого состояния под вакуумом. До последовательных впрыскиваний колонна Ьипа С'Ч8 была очищена 0.05% ТΕΑ в 40% ацетонитриле, 40% изопропаноле, 20% воды.

Приготовление исходного раствора ΝΑΝΑ (Ν-ацетиловая нейраминовая кислота) (1 мг/мл). Важно: до взвешивания дайте стандартному ΝΑΝΑ нагреться до комнатной температуры. Если этого не сделать, то в стандарте образуется конденсат воды. Открывайте только для получения необходимого количества, затем плотно закройте бутылку и верните в морозильную камеру, храните с влагопоглотителем. Точно взвесьте между 3 и 10 мг Ν-ацетиловой нейраминовой кислоты. Запишите с точностью до 0.1 мг. Перенесите в контейнер подходящего размера, если взвешивание производится с помощью бумаги/лодочки для взвешивания. Добавьте достаточное количество чистой воды НРЬС, чтобы получить раствор концентрации 1 мг/мл. Смешайте с помощью перемешивающего стержня или встряхивайте до растворения. Храните при 2-8°С до 3 месяцев в полипропиленовом баллоне.

Приготовление исходного раствора NΟNΑ (Ν-гликолиловая нейраминовая кислота) (1 мг/мл). Важно: до взвешивания дайте стандартному NΟNΑ нагреться до комнатной температуры. Если этого не сделать, то в исходном продукте образуется конденсат воды. Открывайте только для получения необходимого количества, затем плотно закройте бутылку и верните в морозильную камеру, храните с влагопоглотителем. Точно взвесьте между 3 и 10 мг Ν-гликолиловой нейраминовой кислоты. Запишите с точностью до 0.1 мг. Перенесите в контейнер подходящего размера, если взвешивание производится с помощью бумаги/лодочки для взвешивания. Добавьте необходимый объем воды НРЬС, чтобы получить заданную концентрацию раствора 1 мг/мл. Смешайте с помощью перемешивающего стержня или встряхивайте до растворения. Храните при 2-8°С до 3 месяцев в полипропиленовом баллоне.

Раствор, подходящий для системы. Добавьте 0.050 мл каждого из 1 мг/мл исходных растворов ΝΑΝΑ и NΟNΑ к 0.900 мл чистой воды НРЬС в подходящий контейнер. Перемешайте с помощью потряхивания. Храните при 2-8°С до 3 месяцев. Рабочий раствор Ν-ацетиловой нейраминовой кислоты (0.050 мг/мл). Точно отмерьте 0.050 мл от 1 мг/мл исходного раствора ΝΑΝΑ и добавьте к 0.950 мл чистой воды НРЬС. Перемешайте с помощью потряхивания. Приготовьте в двух экземплярах во время использования. Рабочий раствор Ν-гликолиловой нейраминовой кислоты (0.050 мг/мл). Точно отмерьте 0.050 мл от 1 мг/мл исходного раствора NΟNΑ и добавьте к 0.950 мл чистой воды НРЬС. Перемешайте с помощью потряхивания. Приготовьте в двух экземплярах во время использования.

Приготовление образцов и заготовки гидролиза. Возьмите концентрацию белка для материала СТ^Α4-Iд из Сертификата анализа (СОА). Приготовьте один образец заготовки гидролиза, добавив 0.190 мл воды НРЬС в 1.5-мл микроколбу центрифуги. Приготовьте два раствора образцов 1 мг/мл и исходное вещество СТ^Л4-Iд с использованием воды НРЬС. Перемешайте при помощи встряхивания.

Гидролиз образцов, исходное вещество ΟΓΕΑ4-Ι§ и заготовка гидролиза. Выполните гидролиз в двойном приготовлении исходного материала и образцов в 1.5-мл колбе микроцентрифуги. Примечание: важно использовать колбы микроцентрифуги, которые полностью подходят к блоку нагревания. Добавьте 0.010 мл 1 М Н₂^₄ к 0.190 мл 1 мг/мл разбавленным образцам и исходному веществу ΟΓΕΑ4-Ι§, и заготовке гидролиза. Перемешайте потряхиванием и закрепите крышку запором или лентой. Поместите колбы микроцентрифуги в нагревательный блок 80±2°С на 1 ч±2 мин. После инкубации удалите колбы

- 129 017765 из нагревательного блока, поместите их в микроцентрифугу и крутите, чтобы образец спустился на дно колбы. Разделите гидролизованные растворы по колбам автопроб и поместите в автоматический пробоотборник для впрыскивания.

Условия измерения. Подготовьте систему жидкостной хроматографии высокой эффективности (НРЬС). Создайте следующие условия. Сбалансируйте колонну на 1 ч при скорости потока 0.6 мл/мин и температуре 40°С.

Подвижная фаза(ы)

Скорость потока

А:5нм Н₂8О₄

В: очищенная вода НРЬС (промывание колонны)

0.6 мл/мин

Время выполнения минут

Определитель длины волны

206 нм

Температура колонны

40°С

Автоматический пробоотборник

Температура

Объем впрыскивания

4°С

5μί

Время удержания

ΝΟΝΑ

ΝΑΝΑ

9.8 ± 1 минут (зависит от системы.) 10:8 ± 1 минут (зависит от системы)

Градиентные условия

Изократические

Пригодность системы. Начните анализ с введения подвижной фазы как заготовки измерения для оценки базы системы, которая должна быть плоской и стабильной. Если база не ровная и стабильная, необходимо провести дополнительные фиктивные вливания. Примечание: сдвиг базы не должен превышать 0.25 Аи. Выполните шесть повторных вливаний раствора, пригодного для системы. Подсчитайте повторное растворение (К) и теоретические тарелки ^).

Используя первое системное пригодное вливание, подсчитайте количество теоретических тарелок (Ю с помощью следующего уравнения:

Количество теоретических тарелок

где N - подсчет теоретических тарелок;

- время удержания максимума NΛNΛ, в мин;

- NΛNΛ макс. ширина на базе, в мин.

Подсчитайте моли NΛNΛ и NСNΛ в исходном веществе СТЬА4-1д и образцах. Стандарты NΛNΛ и NСNΛ вводятся в начале и в конце каждого цикла. Усредните вычисления для повторных вливаний NΛNΛ и NСNΛ. Используйте эту площадь в следующем уравнении:

(Х)СП моли ΝΑΝΑ или ΝΟΝΑ в аЬа1асер1 исходном веществе или образце = 6Ό

Х - моли NΛNΛ или NСNΛ в подсчитанном рабочем растворе в разделе 7.3.1;

Υ - подсчеты области NΛNΛ или NСNΛ в аЬа!асер! исходном веществе или образце для каждого приготовления (примечание: см. раздел 7.2 и фиг. 3 для определения максимума для интеграции в NΛNΛ);

Ζ - усредненная площадь повторов NΛNΛ или NСNΛ в рабочих растворах.

При одном использовании разрешение между максимумом NСNΛ и NΛNΛ должно быть >1.3. Подсчет теоретической тарелки должен быть > или = 4000. Воспроизводимость системного пригодного вливания, оцененная в % Κ8Ό подсчетов области максимума NΛNΛ, должна быть <3%. Подсчет теоретической тарелки должен быть >4000. Воспроизводимость вливания, пригодного к системе, оцененная в % Κ8Ό подсчетов области максимума NΛNΛ, должна быть <3%.

Профилирование ^связанных олигосахаридов с помощью хроматографии анионообмена с высоким рН с импульсным амперометрическим определением (НРАЕС-РАО). НРАЕС выделенных олигосахаридов был осуществлен в системе хроматографии, состоящей из объединения воды, оснащенной электрохимическим детектором ^а1ег8 464, использующей колонну анионообмена Оюпех СагЬоРаск РА1 (4x250 мм) и защитную колонну Оюпех СагЬоРаск. Образцы олигосахарида были элюированы с помощью градиента ацетата натрия в 200 мМ гидроксида натрия (возрастающая концентрация ацетата натрия от 0 мМ во время впрыскивания до 225 мМ через 60 мин). Электрохимический детектор функционировал в режиме пульсации с импульсными потенциалами Е1=0.05V (1₁=0.4 с), 8=0.75ν (1₂=0.2 с), Е3=-0.15V (1₃=0.4 с). Ячейка обнаружения состояла из золотого рабочего электрода, противоэлектрода из нержа

- 130 017765 веющей стали и серебряного хлоридного контрольного электрода.

Этот метод описывает процедуру определения НРАЕС (анионно-обменная хроматография с высоким рН) профиля олигосахарида ^связанных олигосахаридов, выделенных из протеина в образцах СТ^А4-Iд. Целью метода является обеспечение хроматографическими профилями СТ^А4-Iд, такими как лекарственное вещество СТк.М-Ц ^связанных олигосахаридов, которые могут быть использованы для сравнительного анализа различных составов молекул СТк/АА-Ц. Гликозилирование на протеине СТЬА4содержит ^связанные олигосахариды. Эти олигосахариды выделяются ферментным гидролизом с РNΟа8е Е (пептид: ^гликозидаза Е) в течение 22 ч. Свободные олигосахариды профилируются с помощью анионообменной хроматографии с высоким рН с использованием электрохимического определения.

Масса СТЬА4-1§ лекарственного СТЬА4-1§ в 25 мМ фосфата вещества натрия, 10 мМ КаС1, рН = 7.5

Колбы с полным восстановлением \Уа1ег8 Согрогабоп, Са1а1о§ Νο.

со связующей РТРЕ/силиконовой 186000234 перегородкой

НарЮез! 8Р У/а(ег8 Согрогабоп, каталог Νο.

186001861

Объединенная система НРЬС У/а1ег$ Согрогабоп оснащенная:

автопробоотборник (охлажденный), модуль элюции дегазации

Модель 2465 электрохимического детектора

Колонна: СагЪоРас РА-1 4 х 250 мм ϋΐοηεχ Согрогабоп, Каталог

Νο. 35391

Предохранительная колонна: Эюпех Согрогабоп, Каталог

СагЬоРас РА-1 4 х 50 тт Νο. 43096

Система сбора данных.

Профили олигосахарида лекарственного вещества определяются по отношению к одновременно действующим образцам исходного материала. Результаты предоставляются как процентное отклонение выбранных доменов и амплитуд с тех же самых амплитуд в исходных стандартах.

Условия хроматографии для профилирования олигосахарида анионообменной хроматографией

Температура колонки Скорость потока

29 °С 1 мл/мин

Подвижные фазы и градиент Программа градиента условия

1: 500тМЫаОАс Время

2: 400тМИаОН	(мин)	%1	%2
3: НРЬС очищенная вода	начальный	: 0	30	70
	0.0	0	30	70
	11.0	0	30	70
	12.0	4	30	66
	20.0	10	30	60
	80.0	45	30	25
	81.0	0	30	70
	100	0	30	70
Установки воды 2465
Режим	выброс
Установки Етрошег	диапазон=5цА

Е1= +0.05У Е2= +0.75У Е3= -0.15У =400 мсек 12=200 мсек 13=400 мсек

Время выборки(18)= 100 мсек

Время постоянное(фильтр)1=0.1 сек

Смещение диапазона=5%

Полярность +

Температура= 29 °С

Примечание: уравновесьте колонку и детектор с первоначальной подвижной фазой при анализе скорости потока в течение приблизительно 2 ч или пока база не будет стабильной до начала вливаний.

- 131 017765 установлена на: 4°С цЬ

100 минут

Температура автоматического пробоотборника Объем вливания

Время функционирования

Приблизительное время удержания (КТ; минуты) основных максимумов в каждом домене (см. рис. 1); значения могут меняться в зависимости от КТ системы стандарта пригодности (88)

Приблизительное реальное время

58:

пик 1А: пикΙΒ: пик 1С: пик ГО: пик Е: пик 2 пик 3: пик 4:

(мин)

Приготовление подвижных фаз для профилирования углевода олигосахарида.

НРАЕС элюат 1: 500 мМ ацетата натрия (№0Ас). Взвесьте 20.51±0.05 г ацетата натрия (безводный) и добавьте в 500 мл градуированный цилиндр, содержащий 400 мл воды НРЬС. Доведите объем до 500 мл с помощью воды НРЬС и помешивайте 5 мин с помощью пластмассовой серологической пипетки до полного перемешивания. Профильтруйте раствор через 0.2-мкм нейлоновый фильтр. Перенесите в 1-л элюентную бутылку. Неплотно закройте бутылку и опрыскивайте гелием 20 мин. Закройте бутылку плотно и загерметизируйте бутылку гелием.

Храните раствор при комнатной температуре под гелием до трех недель.

НРАЕС элюат 2: 400 мМ гидроксида натрия (\а0Н). Используя 1-л градуированный цилиндр, отмерьте 960 мл воды НРЬС и переместите в чистую 1-л элюентную бутылку. С помощью серологической пластмассовой пипетки, добавьте 40.0 мл 10 N \а0Н прямо в элюентную бутылку и перемешайте элюат вихревым движением. Неплотно закройте бутылку и опрыскивайте гелием 20 мин. Закройте бутылку плотно и загерметизируйте бутылку гелием. Храните раствор при комнатной температуре под гелием до трех недель.

НРАЕС элюат 3: очищенная вода НРЬС. Наполните 1-л элюентную бутылку приблизительно 1 л воды НРЬС. Поместите элюентную бутылку в систему, неплотно закройте и опрыскивайте приблизительно 20 мин. Закройте плотно и герметизируйте бутылку гелием. Храните раствор при комнатной температуре под гелием до трех недель.

мМ буфера фосфата натрия, 0.02% азида натрия, рН = 7.5.

ΝηΗ₂ΡΟ4 · НгО 6.9 §

ΝηΝ₃ 0.2 _ё

Н2О 1.0 литр окончательного объема

Отвесьте 6.9±0.1 г №Н₂Р0₄-Н₂О и 0.2 г \а\₃ и растворите в 800 воды НРЬС Н₂0 в 1-л реагентную бутылку, постоянно помешивая магнитной размешивающей палочкой. Используя измеритель рН, отрегулируйте рН раствора до 7.5 с помощью 10 М \а0Н. Доведите окончательный объем до 1.0 л, используя 1-л градуированный цилиндр. Храните раствор при комнатной температуре до 6 месяцев.

РИСазе Р ферментная заготовка в 50 мМ буфера фосфата натрия, 0.02% азид натрия, рН = 7.5.

мМ буфера фосфата натрия

0.02% азид натрия, рН - 7.5. 1.8 мл

РИОазе Р из набора, каталог Νο. Р0704Ь 0.2 мл

Наберите пипеткой 1.8 мл 50 мМ буфера фосфата натрия, 0.02% азида натрия, рН 7.5 в 1.8-мл криогенную пробирку. Добавьте 0.2 мл РNСазе Е из набора и тщательно перемешайте. Храните раствор при -20°С или ниже до 6 месяцев. Раствор может быть распределен по пробиркам до замораживания.

Внешний стандарт пригодности системы. Исходный раствор стахиозы (1.25 мг/мл). Взвесьте 0.125 г

- 132 017765 стахиозы на взвешивающей бумаге. Используйте аналитические весы и перенесите в 100-мл мерную колбу. Заполните до отметки водой НРЬС и тщательно перемешайте. Разделите по 2 мл частям в криогенные колбы №1депе. Храните раствор при -20°С или ниже до 6 месяцев.

Стандарт пригодности системы стахиозы (12.5 мкг/мл). Наберите пипеткой 1 мл материала 1.25 мг/мл и влейте в 100-мл мерную колбу. Заполните до отметки водой НРЬС и тщательно перемешайте. Распределите по частям в 200 мкл в 0.65 мл баллоны микроцентрифуги. Поместите баллоны в соответственно отмеченный контейнер. Храните системный пригодный раствор при -20°С или ниже до 6 месяцев.

Приготовление нормы и образца

Приготовление исходного материала. В колбу, содержащую 1 мг лиофилизированного КарЮез! 8Е, добавьте 625 мкл 50 мМ буфера фосфата натрия, содержащего 0.02% азида натрия, рН 7.5. В 0.65-мл баллон ЕррепбогГ добавьте 120 мкл КарЮез! 8Е, содержащего буферный раствор. Добавьте 40 мкл исходного материала (~50 мг/мл). Окончательная концентрация КарЮез! 8Е должна быть 0.12% те/ν. Добавьте 40 мл рабочего материала РNСа8е Е, тщательно перемешайте до опускания образца и разместите при 38±2°С на 22±2 ч (водяной термостат или отделение автоматического пробоотборника Λ11^аηсе). Пипеткой наберите образец в фильтрующую центрифугу микроконцентрации УМ-10 и центрифугируйте при 13000 г в течение 30 мин. Поместите 200 мкл воды НРЬС в фильтр и промойте в фильтрат центрифигурированием еще в течение 30 мин при 13000 г. Встряхивайте комбинированный фильтрат 15 с и центрифугируйте образец 10 с. С помощью пипетки передайте получившийся раствор (~380 мкл) в колбу автоматического пробоотборника полного восстановления НРЬС (пункт 1.15).

Приготовление образца. В 0.65-мл баллон ЕррепбогГ добавьте 120 мкл КарЮеб 8Е, содержащего буферный раствор. Добавьте 40 мкл образца протеина (этот объем должен равняться 1-2 мг СТ^Л4-Iд). Окончательная концентрация КарЮей 8Е должна быть 0.12% те/ν. Добавьте 40 мкл рабочего материала РNСа8е Е, тщательно перемешайте встряхиванием в течение 10 с. Образец спустите вниз баллона и разместите при 38±2°С на 22±2 ч (водяной термостат или отделение автоматического пробоотборника Α11ΐапсе). Пипеткой наберите образец в фильтрующую центрифугу микроконцентрации УМ-10 и центрифугируйте при 13000 г в течение 30 мин. Поместите 200 мкл воды НРЬС в фильтр и промойте в фильтрат центрифигурированием еще в течение 30 мин при 13000 г. Встряхивайте комбинированный фильтрат 15 с и центрифугируйте образец 10 с, передайте получившийся раствор (~380 мкл) в колбу автоматического пробоотборника полного восстановления НРЬС (пункт 1.15).

Пригодность системы

Стабилизация ячейки электрохимического детектора. Влейте 30 мкл внешнего стандарта стахиозы, пригодного для системы (12.5 мкл/мл). Убедитесь, что высота максимума для стахиозы >800 пА. Убедитесь, что нет чрезмерных электрических помех от ячейки и что база плоская. Характерная хроматограмма пригодности системы показана на фиг. 2. Если чувствительность стахиозы или база непригодны, проверьте состав буфера, почистите электрод или замените его. Если присутствует чрезмерный шум, проверьте ячейку и убедитесь, что все воздушные пузырьки удалены. Заново стабилизируйте ячейку и еще раз введите стандарт стахиозы.

Теоретические тарелки (Ν). Определите количество теоретических тарелок (Ν), основанных на максимуме стахиозы, используя нижеприведенную формулу. Это осуществляется с помощью системы анализа данных Етротеег или это можно сделать вручную.

Ν=16(ί/№)², где ΐ - время удержания, отмеряемого от времени впрыскивания до максимального времени элюирования при максимальной отметке;

- ширина максимума при экстраполяции сторон к базе.

Ν должно быть >6000. Если количество тарелок меньше 6000, скорректируйте функционирующий градиент или замените колонну.

Коэффициент ассиметрии пика (Т). Определите колонку коэффициента ассиметрии пика (Т), основанную на максимуме стахиозы, используя нижеприведенную формулу. Это осуществляется с помощью системы анализа данных Етротеег или это можно сделать вручную.

Т=(^0.05/21), где ^₀.₀5 - ширина максимума при 5% от высоты (0.05 ч);

Г - измерение (ширина) от переднего края максимума при \У₀.₀₅ до самой верхней части максимума.

Т должен быть <1.2. Если коэффициент ассиметрии пика больше 1.2, проверьте состав буферной жидкости, замените колонну или почистите колонну, как указано, и заново введите стандарт, пригодный для системы.

Контроль времени удержания стандарта стахиозы, пригодного для системы.

Время удержания зависит от системы. Стандарт стахиозы, пригодный для системы, должен показывать время удержания 18.5±2.0 мин. Стандартный материал СТ^Л4-Iд. Отметьте профиль углевода от первого брикетированного исходного материала, введенного до впрыскивания образцов. Профиль углевода должен быть похожим на показанный на фиг. 1. Полное время удержания зависит от системы. Убе

- 133 017765 дитесь, что разница во времени удержания между первым максимумом в домене I (максимум 1А) и главным максимумом в домене III (максимум 3) находится между 22 и 28 мин. Если формирование максимумов не похоже на представленное на фиг. 1, предпримите необходимые действия (например, проверка функции инструмента, очистка колонны, проверка/замена буферов, замена колонки) и заново оцените. Следующая процедура может быть использована для очистки колонки; отключите ячейку и почистите колонку 80% элюатом 1, 20% - элюатом 2 в течение 5 мин, затем 50% - элюатом 1, 50% - элюатом 2 в течение 10 мин. Заново сбалансируйте колонку и ячейку (с включенной ячейкой) при первоначальных условиях и снова оцените.

Последовательность впрыскивания

Установите последовательность впрыскивания выделенных олигосахаридов следующим образом: стандарт стахиозы (30 мкл);

исходный материал (60 мкл);

образец(ы) (60 мкл);

исходный материал (60 мкл).

Рекомендуется, чтобы функционировали <5 образцов между впрыскиваниями бракетированного исходного материала.

Анализ данных

Анализ хроматограмм. Анализ хроматограмм для исходного материала и образцов в Етро\\'ег. Установите параметры интеграции так, чтобы формирование максимума и база совпадали с фиг. 76, линии интеграции могут устанавливаться вручную. Проведите вычисления для относительных зон домена и показанных относительных зон максимума. Определите средние значения для этих параметров для материала СТ^А4-Iβ и для каждого образца, если были сделаны повторные впрыскивания. Для исходного материала определите относительное отклонение для доменов I, II, III, максимумов 1А и 1В для каждого повтора относительно среднего показателя всех повторов.

Сравнение профилей образца с профилями исходного материала. Визуальное сравнение. Определите, имеют ли оба образца и исходный материал одинаковое количество доменов и первоначальные максимумы. Первоначальные максимумы - это максимумы, отмеченные на фиг. 76 (максимумы 1А, 1В, 1С, 1Ώ, 2, 3 и 4). Сравнение относительного количественного анализа. Сравните относительные области образцов (домены I, II и III максимумы 1А и 1В; если повторные впрыскивания были сделаны из образцов, используйте их средние значения) со средними относительными зонами из бракетированных впрыскиваний СТ^А4-Iβ. Определите относительную разность этих зон из средних значений материала СТ^А4-Iβ. Вычисления - % зоны домена (относительная зона домена). Подсчитайте % зоны домена для доменов профилей для исходного материала и образцов. См. фиг. 76 относительно образца зон домена. Следуя примеру на фиг. 76, посчитайте процентные соотношения домена, используя следующую информацию и формулу (время удержания зависит от системы и показывает результат на фиг. 76).

Домен I: Сумма зон максимума при приблизительном времени удержания 18-24 мин (максимумы 1А-1Е).

Домен II: Сумма максимумов от 26-38 мин.

Домен III: Сумма максимумов от 39-50 мин.

Домен IV: Сумма максимумов от 51-64 мин.

Домен V: Сумма максимумов от 65-75 мин.

Примечание: интервалы времени удержания для доменов будут варьироваться согласно изменениям в ежедневном хроматографическом функционировании. Настройте время согласно

Индивидуальная зона домена

Зона домена %=............................................х 100%

Сумма всех зон домена

Для доменов также посчитайте средние значения во впрыскиваниях бракетированного исходного материала, а также в образцах, если были сделаны повторные впрыскивания.

% зоны максимума (зона относительного максимума). Посчитайте % зоны максимума для максимумов 1А, 1В, 1С и 3 профилей для исходного материала и образцов. См. фиг. 1 относительно образца зон максимума; время удержания зависит от системы. Посчитайте процентные соотношения максимума, используя следующую информацию и формулу:

Индивидуальная зона максимума

Индивидуальная зона максимума %= .......................................-.......х

100%

Сумма всех зон домена

Для каждого максимума 1А и 1В также посчитайте средние значения во впрыскиваниях бракетированного исходного материала, а также в образцах, если были сделаны повторные впрыскивания. Подсчет процентной разности из средних значений исходного материала. Используйте следующую формулу для подсчета процентной разности в средних относительных зон доменов максимумов 1А и 1В образцов, сравниваемых с исходным материалом:

- 134 017765

где КМ - среднее значение процента относительной зоны для исходного материала;

- среднее значение процента относительной зоны для образца;

Ι - абсолютное значение.

Типичные значения. Для пригодного функционирования необходимо соответствовать типичным значениям и все впрыскивания, подходящие для образца, должны пройти успешно. Кроме того, для каждого впрыскивания бракетированного исходного материала % зон домена для домена Ι, ΙΙ и ΙΙΙ и % зон максимума для максимума 1А и 1В должны находиться в пределах 15% от их средних величин.

Анализ при помощи НРАЕС-РАЭ: ^связанные олигосахариды были гидролизованы из молекул СТ^Ά4-Iд и проанализированы НРАЕС-РАЭ. Олигосахариды элюируют в четыре домена, основанных на количестве присутствующей сиаловой кислоты. Домены были установлены на основе перемещения стандартов олигосахарида и подтверждены М8. Домен Ι представляет асилированные виды. Домены ΙΙ, ΙΙΙ и Ιν представляют моно-, ди- и трисилированные виды соответственно. Для того чтобы описать структуру олигосахаридов на трех ^связанных точках, пептиды Т5, Т7 и Т14 были индивидуально выделены (см. табл. 59 для идентичности этих пептидов).

Это было выполнено с помощью трипсинового гидролиза СТ^Ά4-Iд и ручного сбора максимумов, относящихся к этим трем пептидам.

Выделенные пептиды обрабатывались с помощью РNΘаδе Е для выделения олигосахаридов, которые затем были очищены и проанализированы с помощью НРАЕС-РАЭ. Пептид Т5 не произвел хороший профиль, поскольку его трудно очистить из-за его чрезмерной гидрофобности. Количество гидролизованных олигосахаридов маленькое из-за небольшого получения этого пептида из стадии хроматографии с обращенными фазами после трипсинового гидролиза.

Таблица 59 Теоретически ожидаемые и наблюдаемые массы СТ^Ά4-I§

Фрагмент Νο	Остаток Νο	Ожидаемая масса (ϋυΐίοηδ)	Наблюдаема я масса (Ουίίοηδ)	Последовательность пептидов
Т1+А	-1-14	1536.8	1536.8	АМНУА(}РАУУЬА88К
Т1	1-14	1465.8	1465.7	МНУАСРАУУЬА88К
Т2	15-28	1485.7	1485.6	ΟΙΑδΕΥΟΕΥΑδΡΟΚ
ТЗ	29-33	574.6	574.2	АТЕУК
Т4	34-38	586.7	586.3	УТУЬК
Т5а	39-83	4900.4		(^ΑΟδΟνΤΕνΟΑΑΤΥΜΜΟΝΕΕΤΕΕΟΟδΙΟ Τ6Τ88ΟΝ(2νΝυΠ(26ΕΚ
Тб	84-93	1171.4	1171.4	АМОТОЬУГСК
Т7а	94-128	3997.5		УЕЬМУРРРУУЕО1СЖ6Т(21УУ1ОРЕРСРО8 Οζ)ΕΡΚ
Т8Ъ	129-132	435.2	ΝΟ	δδϋΚ
Т9Ь	133-158	3345.7		ТНТ8РР8РАРЕЕЕОС88УЕЬРРРКРК
Т10	159-165	834.9	834.4	ОТЬМКН
Т11	166-184	2139.3	2138.6	ТРЕУТСУУУОУ8НЕОРЕУК.
Т12	185-198	1677.8	1677.2	ΕΝλνΥνϋΟνΕνΗΝΑΚ
Т13	199-202	500.6	500.3	ТКРК
Т14а	203-211	1189.2		ΕΕ9ΥΝ8ΤΥΚ
Т15	212-227	1808.1	1807.4	ννδνΕΓνι,ΗςολνΕΝΟκ

- 135 017765

Т16	228-230	438.5	438.1	ΕΥΚ
Т17	231-232	307,4	Νϋ	СК
Т18	233-236	446.5	Νϋ	νδΝΚ
Т19	237-244	838.0	837.4	ΑΕΡΑΡΤΕΚ
Т20	245-248	447.5	447.2	ΤΙδΚ
Т21	249-250	217.2	Νϋ	ΑΚ
Т22	251-254	456.2	456.2	6(2₽κ
Т23	255-265	1286.4	1286.6	ΕΡΟνΥΤϋΡΡδΚ
Т24	266-270	604.7	604.3	ϋΕΕΤΚ
Т25	271-280	1161.4	1160.5	ΝΟνδΕΤσϋνΚ
Т26	281-302	2544.7	2545.6	ΘΡΥΡδϋΙΑνΕΑΕδΝΟζ^ΡΕΝΝΥΚ
Т27	303-319	1874.1	1873.2	ττρρνϋϋεσδΡΡΕΥδκ
Т28	320-324	574.7	574.2	ϋτνϋκ
Т29	325-326	261.3	Νϋ	δΚ
ТЗО	327-349	2803.1	2800.8	ΑΟί^ΟΝνΡδαδνΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚ
Т31	350-356	659.7	659.1	δϋδϋδρσ
Т31+К	350-357	787.9	787.0	δϋδϋδρσκ
Т2 сНр	15-23	ΝΕ	1045.3	ΟΙΑδΡνΟΕΥ
Т12сНр	185-195	ΝΕ	1364.7	ΓΝΑΥνϋΟνΕνΗ
Т27 сНр	303-317	ΝΕ	1658.5	ΤΤΡΡνΕϋδϋσϋΕΡΕΥ
ТЗО сНр	327-335	ΝΕ	1125.3	Αΐ^σΝνΡδσ
ТЗО сИр	327-333	ΝΕ	878.3	Α(2<26ΝνΕ

N0 - не определено.

NЕ - не ожидается от трипсинового гидролиза (эти массы не ожидались от гидролизата, не специфический гидролиз).

а - трипсиновые пептиды Т5, Т7 и Т14 имеют ^связанное гликозилирование. Представленная масса относится к пептиду без гликолизирования.

Ь - трипсиновые пептиды Т8 и Т9 имеют О-связанное гликозилирование. Представленная масса относится к пептиду без гликолизирования. с - наблюдения велись за несколькими различными массами, относящимися к различным гликоформам гликозилированных пептидов.

Профили НРАЕС-РАЭ для всех ^связанных углеводов из СТ^А4-Iд и три пептида показаны на фиг. 55. Секция А показывает ^связанный профиль олигосахарида молекулы СТ^А4-Iд, секции В, С и Ώ показывают профили для Т5, Т7 и Т14 соответственно. Количество олигосахаридов, введенных для каждого пептида, отличается из-за процессов приготовления. Большинство олигосахаридов, обнаруженных на пептиде Т5, состоят из моно- и дисилированных олигосахаридов. Профиль Т7 содержит первично моно-, ди- и несколько асилированных и трисилированных гликановых видов. Только небольшое количество трисилированных структур могут быть определены на Т5. Пептид Т14 состоит из преимущественно асилированных олигосахаридов и небольшого количества моно- и дисилированных олигосахаридов.

Результаты, полученные с помощью НРАЕС-РАЭ, предоставляют информацию по сайтспецифичному ^связанному гликолизированию. ^связанные олигосахариды из области СТЬА4 в СТ^А4-Iд содержат пропорцию силированных видов больше, чем олигосахариды из области Рс в СТ^А4-Iд.

Трипсиновое, Асп-Л и трипсиновое/химотрипсиновое картирование пептида СТ^А4-Iд: СТ^А4-Iд был денатурирован и восстановлен в 50 мМ три буфере (рН 8.0), содержащем 6 М гуанидина и 5 мМ дитиотреитола (ЭТТ). После 20 мин инкубации при 50°С к окончательной концентрации 10 мМ добавили йодоацетамид ЦАА) для алкилирования свободных тиолов и инкубация продолжалась дополнительные 20 мин при 50°С в темноте. Восстановленная и алкилированная смесь была помещена в обессоливающую колонну (АтегкНат NЛР-5), затем элюирована в свободный объем или с 50 мМ Тпк, 10 мМ СаС1₂, рН 8.0 или 50 мМ буфера фосфата натрия, рН 7.5. После обессоливания восстановленный/алкилированный СТ^А4-Iд был гидролизирован с использованием двух различных протеаз: трипсин или Акр-К Для гидролиза трипсин плюс химотрипсин СТ^А4-Iд не восстанавливается и не аликилиру

- 136 017765 ется.

Для трипсинового гидролиза был последовательно добавлен трипсин (КосНе, 2%, г/г, фермент/протеин) и выдержан 4 ч при 37°С. Для гидролиза А^^ был последовательно добавлен Аф^ (КосНе, 4%, г/г, фермент/протеин) и выдержан 16 ч при 37°С. Для гидролиза трипсин/химотрипсин был последовательно добавлен трипсин (Рготеда, 4%, г/г, фермент/протеин) и выдержан 4 ч при 37°С, затем был добавлен а-химотрипсин (З1дта, 4%, г/г, фермент/протеин) и выдержан 16 ч при 37°С. Все образцы были помещены в морозильную камеру после гидролиза.

Полученные смеси пептида были выделены градиентным элюированием из колонны Аакгк А!1апйк^ТМ йС18 (2.1x250 мм) на рабочей станции Аакгк АШапсе НРЬС при 0.120 мл/мин. Колонна была напрямую соединена с масс-спектрометром Аакгк Мкготакк Р-ТоГ т1сго^ТМ, оснащенным ионоразбрызгивателем для сбора масс спектра. Смеси пептида были также выделены на колонне Vа^^аη Ро1апк С18 (4.6x250 мм) при 0.7 мл/мин с использованием такой же рабочей станции НРЬС. Колонны были сбалансированы растворителем А (0.02% ТЕА в воде) и пептиды были элюированы с помощью увеличения концентрации растворителя В (95% ацетонитрил/0.02% ТЕА в воде). Разделяющий клапан колонки использовали для направления 15% потока к рабочей станции Р-ТоГ, которая функционировала в положительном Т0Е режиме (т/ζ 100-2000). Типичное использованное напряжение ионоразбрызгивателя было 3000 ν.

Анализ СТ^А4-Iд с помощью МЗ: СТ^А4-Iд был разбавлен 100 мМ Тик, 25 мМ №С1, ρН 8 до окончательной концентрации в 0.7 мг/мл. РNСакеЕ (№г Епд1апй Вк1аЬк) был разбавлен 30-кратным 100 мМ Тик, 25 мМ №С1, ρН 8 до окончательной концентрации в 17 υ/цЬ. Равные объемы (каждый по 60 мл) разбавленного очищенного образца ферментации и разбавленного раствора гликозидазы были перемешаны и выдержаны при 37°С в течение 4 ч.

Полученный дегликозилированный СТ^А4-Iд (2 мг) был загружен в колонку экстракционного патрона обращенной фазы с полимерным основанием (сополимер полистирола и поли-№винил-2пирролидинон) Аа!егк 0ак1к® (2.1x20 мм). Загруженная колонка была промыта 5% растворителем В (растворитель А: 1% муравьиной кислоты в воде, растворитель В: 1% муравьиной кислоты в ацетонитриле) при уровне потока 0.2 мл/мин в течение 5 мин для обессоливания, с элюатом, отведенным для сброса. В конце 5 мин быстродействующий градиент (5% растворитель В до 95% растворителя В через 10 мин) начинает элюирование СТ^А4-Iд из колонки; здесь элюат направлен в масс-спектрометр (Аа!егк Мкготакк Р-ТоГ ткго^ТМ) при 45 мл/мин после разделения потока (использованная система хроматографии - Аа!егк АШапсе 2695, оснащенная детектором Аа!егк 2996).

Капиллярное напряжение для Р-ТоГ ткго^ТМ было установлено на 3 кВ и конусное напряжение образца - на 40 В. Сканирования каждые 0.9 с были усреднены до одного сканирования; время внутреннего сканирования 0.1 с. Анализатор Р-То£ сканирует от т/ζ 800 до 2500. Спектры, соответствующие более высокой части, чем половина максимальной высоты максимума (на хроматограмме ТК.')· комбинируются с использованием программного обеспечения Аа!егк МаккЬупх^ТМ. Скомбинированный спектр был подвержен деконволюции Аа!егк МахЕпН. Повторное разложение было установлено при 1 Ьа/СНаппек и была отобрана однородная модель повреждаемости Саикаап с шириной в половину высоты, установленной между 0.5-1 Ьа. Минимальные соотношения интенсивности для левого и правого максимума были установлены на 50%.

Анализ ^связанных олигосахаридов жидкостной хроматографией/масс-спектрометрией (ЬС/МЗ) с использованием пористого графитированного углерода (РС0): выделенные олигосахариды были отделены на пористой графитированной колонне (ТНегто Нуρе^са^Ь; 4.6x100 мм) с использованием системы Аа!егк АШапсе 2695 НРЬС, оснащенной детектором матрицы фотодиодов Аа!егк 2996. Выделение олигосахаридов было выполнено с использованием двухступенчатого градиента увеличения пропорций ацетонитрила в 0.05% ТЕА. На первой фазе градиента процентное соотношение ацетонитрила варьировалось от 9.6% во время впрыскивания до 24% через 80 мин. На второй фазе градиента процентное соотношение ацетонитрила варьировалось от 24% через 80 мин до 60% через 110 мин. Используемая скорость потока была 0.2 мл/мин. За потоком элюирования наблюдали с помощью определения υν при 206 нм и анализировали масс-спектрометрией с помощью Аа!егк МкгоМакк Р-То£ ткго^ТМ для масс идентификации.

Анализ углевода с помощью метода ЬС/МЗ РСС: выделение олигосахарида путем дегликолизирования протеина было осуществлено ферментным гидролизом с помощью РNСаке Е (№г Епд1апй Вк1аЬк, Веуег1у, МА). Для дегликозилирования, между 1 и 2 мг гликопротеина в 160 мл 50 мМ буфера фосфата натрия, содержащего 0.15% (г/ν) Каρ^декΐ ЗЕ (Аакгк Со1рога!кп), было денатурировано нагреванием при 100°С в течение 2 мин. Охлажденный раствор перемешали и добавили 40 мл РNСакеЕ (50.000 υ/мл, в 50 мМ буфера фосфата натрия, рН 7.5). Образец перемешали потряхиванием, затем выдержали при 38°С в течение 24 ч. Ферментно выделенные олигосахариды были очищены жидкостной хроматографией высокой эффективности. Жидкостная хроматография с обращенными фазами была выполнена на колонне РНепотепех Ьипа 5 мл С18 (4.6x150 мм, РНепотепех, Тоггапсе, СА), связанной с ТНегто Нуρе^Са^Ь 5 мл (4.6x100 мм, РНепотепех, Тоггапсе, СА) при скорости потока 1.0 мл/мин. Колонны были сбаланси

- 137 017765 рованы 0.05% трифторуксусной кислотой (ТРА) до впрыскивания. После впрыскивания образца (150 мл гидролизатной смеси) был инициирован градиент ацетонитрила, завершаемый через 15 мин, а также смесь растворителя 0.05% ТРА в 12% ацетонитриле. Гликаны затем были элюированы из колонны НурегСагЬ путем промывания с помощью 0.05% ТРА в 60% ацетонитриле. Гликаны были определены коэффициентом пропускания υV при 206 нм. Были собраны максимумы, элюированный из промывания НурегсагЬ и концентрированы до сухого состояния под вакуумом. До последовательных впрыскиваний колонна Ьипа С18 была очищена с помощью 0.05% ТРА в 40% ацетонитриле, 40% изопропаноле, 20% воды.

Профилирование выделенных олигосахаридов с помощью Р0С.

Система, использованная для Р0С хроматографии выделенных олигосахаридов, состояла из \Уа1егк АШапсе, оснащенной детектором матрицы фотодиодов \Уа1егк 2996, использующим колонну НурегсагЬ (2.1x100 мм). Образцы олигосахарида были элюированы с использованием ацетонитрилового градиента.

Кислотное элюирование подвижной фазы: ацетонитриловый градиент в 0.05% трифторуксусной кислоте (ТРА). Для хроматографического разделения олигосахаридов использовался двухфазный градиент возрастающего ацетонитрила. За первоначальным линейным градиентом возрастающего объемного процентного соотношения ацетонитрила от 9.6% во время впрыскивания до 24% через 80 мин следует второй градиент возрастающего объемного процентного соотношения ацетонитрила от 24% через 80 мин до 60% ацетонитрила через 110 мин. По всему градиенту использовалась скорость потока 0.15 мл/мин. За элюированным потоком наблюдали при 206 нм с помощью детектора \Уа1егк за ним следовал М1сготакк О-ТоГ Мтсто для идентификации массы. Параметры ионизации пробы ЕЗI были установлены следующим образом: капиллярное напряжение = 3 кВ, конусное напряжение = 45 В, исходная температура 80°С и температура десольватации 175°С.

Основное элюирование подвижной базы: ацетонитриловый градиент в 0.4% гидроксида аммония (БН40Н) использовался для хроматографического разделения олигосахаридов. Для производства профиля был использован линейный градиент возрастающего объемного процентного соотношения ацетонитрила от 10.4% во время впрыскивания до 28% через 150 мин при скорости потока 0.15 мл/мин. За элюированным потоком наблюдали при 206 нм с помощью детектора \Уа1егк за ним следовал М1сготакк О-ТоГ Мтсто для идентификации массы. Параметры ионизации пробы ЕЗI были установлены следующим образом: капиллярное напряжение = 3 кВ, конусное напряжение = 45 В, исходная температура 80°С и температура десольватации 175°С.

Прямое профилирование смесей гидролизата олигосахарида с помощью Р0С: система для Р0С хроматографии смесей гидролизата олигосахарида состояла из \Уа1егк А111апсе, смонтированной с Ьипа С18 и пористой графитовой колонной НурегсагЬ (4.6x100 мм, ТЬегто). Система была сопряжена с детектором матрицы фотодиодов \Уа1егк 2996 и О-ТоР М1сго (микромасса). Дегликозилирование белка было проведено ферментным гидролизом с использованием ΡNОаке Р. Для дегликозилирования, между 1 и 2 г гликопротеина в 160 мл 50 мМ буфера фосфата натрия, содержащего 0.15% Ο/ν) Кар1дек! ЗР (\Уа1егк СотротаБоп), было денатурировано нагреванием при 100°С в течение 2 мин. Охлажденный раствор перемешали и добавили 40 мл ΡNОакеР (50.000 и/мл, в 50 мМ буфера фосфата натрия, рН 7.5). Образец перемешали и затем выдержали при 38°С в течение 24 ч. Ферментно выделенные олигосахариды были очищены жидкостной хроматографией высокой эффективности. Жидкостная хроматография с обращенными фазами была выполнена на колонне РЬепотепех Ьипа 5 мл С18 (4.6x150 мм), сцепленной с колонной ТЬегто НурегСагЬ 5 мл (4.6x100 мм), при скорости потока 1.0 мл/мин. Колонны были сбалансированы 0.05% трифторуксусной кислотой (ТРА). После впрыскивания образца (150 мл гидролизатной смеси) был инициирован градиент ацетонитрила, завершаемый на 11 мин, а также смесь растворителя 0.05% ТРА в 9% ацетонитриле. Переключатель колонны использовался для выделения колонны НурегСагЬ, затем гликаны были элюированы из колонны НурегСагЬ с помощью линейного градиента возрастающего процентного соотношения ацетонитрила. Был использован первоначальный градиент возрастающего процентного соотношения ацетонитрила от 9% во время впрыскивания до 36% при 160 мин. Второй градиент содержал возрастающее объемное процентное соотношение ацетонитрила от 36% при 160 мин до 60% ацетонитрила при 170 мин. На всем протяжении градиентов элюирования использовалась скорость 0.15 мл/мин. Гликаны определялись коэффициентом пропускания ΌΎ при 206 нм и МЗ сканированием диапазона массы от 400-3000 т/ζ. Параметры МЗ были установлены на следующие значения: капиллярное 3 кВ, конусное 45 В. До последовательных впрыскиваний колонна Ьипа С18 была очищена с помощью 0.05% ТРА в 40% ацетонитриле, 40% изопропаноле, 20% воды.

Анализ с помощью хроматографии пористого графитированного углерода.

Структуры олигосахаридов из доменов БШ были исследованы с использованием хроматографии пористого графитированного углерода (Р0С), прикрепленного к МЗ. ^связанные олигосахариды были выделены из СТ^Α4-Iд и очищены, как описано в предыдущем разделе НРАЕС-РАЭ. Олигосахариды были проанализированы с использованием колонки НурегсагЬ (Р0С) с детектором затем с помощью О-Т0Р ЕЗI/МЗ. Профиль Р0С для ^связанных олигосахаридов, выделенных из СТ^Α4-Iд с помощью гидролиза ΡNОаке Р, показан на фиг. 56 с отмеченными доменами. Порядок элюирования такой же, как в

- 138 017765

НРАЕС-РАЭ. Полученные структуры показаны в табл. 60.

Номенклатура для обозначения олигосахаридов, указанных в табл. 60, приведена ниже.

Серый цвет обозначает основную структуру Ν-связанных олигосахаридов, где Р обозначает гидролиз РNСазе Е, последовательные цифры показывают номер манозы (круг), фукозы (треугольник, указывающий вниз), галактозы (треугольник, указывающий вправо) и остатки сиаловой кислоты (звезда) соответственно. Ν-ацетиловый глюкозамин (С1сNΑс) обозначен квадратом.

Таблица 60

Структура Ν-связанных олигосахаридов и массы, обозначенных в СТЬА4-1д

- 139 017765

Р2120	Ж-Ш-ф»· — Ш>-НВИ—	1787	1900 [М-Н1-ТРА
моносилилированная
Р2111		1916	1915 [М-Н]
Р2121	гО	2078	2077 [М-Н]
Р3131	не	2443	1279 [М-2Н]2
ди-силилированная
Р2122	—Ч5НИВ-ЯЗГ	2369	1184 [М-2Н]2
Р3132		2734	1367 [М-2Н]2
Р4142		3099	1549 [М-2Н]2
три-силилированнная
Р3133		3025	1512 [М-2Н]2
Р4133		3389	1695 [М-2Н]2

	ΝΑΝΑ
0	Галактоза
о	ΟΙοΝΑο
О	Манноза
V	Фукоза

- 140 017765

В домене I были определены шесть максимумов, соответствующих трем асилированным олигосахаридам (структуры Р2100, Р2110, Р2120). Различие массы 113 ЭаНоп между предсказанной структурой и полученной массой происходит из-за выявления продукта присоединения трифторуксусной кислоты (ТРА). Различные максимумы с одинаковой массой 1.463, соответствующей Р2100, показывают, что они вероятно разные аномеры.

В домене II были определены шесть максимумов, соответствующих трем двуантенальным и трехантенальным олигосахаридам (структуры Р2111, Р2121 и Р3131 соответственно), каждый содержит один остаток сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовая кислота, NАNА).

В домене III были определены шесть максимумов, соответствующих трем двуантенальным, трехантенальным и четырехантенальным олигосахаридам (структуры Р2122, Р3132 и Р4142 соответственно), каждый содержит два остатка сиаловой кислоты (NАNА).

В домене IV были определены два максимума, соответствующих двум трехантенным и четырехантенным олигосахаридам (структуры Р3133 и Р4133), каждый содержит три остатка сиаловой кислоты (тт).

Измерение молярного отношения молей сиаловой кислоты к молям молекул СТЬА4-1д или димера с помощью обработки кислотным гидролизом молекул СТЬА4-1д (см. фиг. 25 и 26): в данном методе NАNА и NСNА гидролизуются из протеина кислотным гидролизом. Выделенные NАNА и NСNА отделяются с помощью НРЬС на колонне Еехех МопокассЫапбе КНМ и определяются коэффициентом пропускания υν (206 нм), NАNА и NСNА количественно анализируются на основе ответных факторов параллельной работы стандартов NΛNА и NСNА. Результаты теста сообщаются протеину как молярные отношения (МК) NАNА и NСNА соответственно. Это испытание определяет общее количество молей, связанных и несвязанных, сиаловой кислоты.

Реагент, средства измерения и хроматографические условия, использованные при испытании: 1 М серной кислоты Н₂§0₄ (сырье) и 5 мМ Н₂§0₄ подвижной фазы работающего буфера; NАNА стандартный раствор 1 мг/мл; NСNА стандартный раствор 1 мг/мл. Объединение хроматографической системы - \Уа1ег5 Согрогайоп 2695 Зерагайопк Моби1е со встроенным автоматическим пробоотборником; колонна Еехех топокассЫапбе КНМ - 8 мкм, 7.8x300 мм, РЫепотепех, оснащенный защитной колонной 7.8x50 мм, РЫепотепех; детектор - детектор матрицы фотодиодов \Уа1ег5 Согрогайоп 996 или детектор коэффициента пропускания двойной длины волны \Уа1ег5 Согрогайоп 2487. Хроматографические параметры: поток - 0.600 мл/мин; подвижная фаза - 5 мМ Н₂§0₄; объем впрыскивания - 5 мкл; целевая концентрация - 1 мг/мл; время работы - 25 мин; температуры колонки - 40°С; температура автопробоотборника - 4°С; длина волны - 206 нм; время удержания NАNА (зависит от системы) - 10.8 мин (±1 мин); время удержания NСNА (зависит от системы) - 9.8 мин (±1 мин).

Стандарт, пригодный для системы: добавьте 50 мл каждого из 1 мг/мл из NΛNА и NСNА к 900 мл Н₂0 в подходящем контейнере. Храните при 4°С в течение 3 месяцев; рабочий стандарт ^ацетиловой нейраминовой кислоты (0.05 мг/мл); рабочий стандарт №гликолиловой нейраминовой кислоты (0.05 мг/мл).

Гидролиз образцов и стандартного материала СТЬА4-1д: образцы и стандартный материал СТЬА41д разбавляется с 1 мг/мл в Н₂0 для гидролиза. Образцы СТЬА4-1д и стандартный материал СТЬА4-1д гидролизуются путем добавления 10 мл 1 М Н₂§0₄ к 190 мл 1 мг/мл разбавленных образцов и СТЬА4-1д. Гидролиз проводится повторно в 1.5-мл колбах микроцентрифуги. Крышки закрепляются запорами или липкой лентой. Колбы перемешиваются потряхиванием и помещаются в 80°С нагревающий блок на 1 ч. После выдерживания колбы убираются из нагревательного блока, охлаждаются при комнатной температуре в течение 3 мин и помещаются в центрифугу, затем быстро прокручиваются, чтобы образец осел на дно. Из колб 50 мл разделяются аликвотами гидролизованного раствора в пузырек для образцов, который расположен в охлажденном автоматическом пробоотборнике для впрыскивания. Холостой гидролиз производится как отдельное приготовление путем добавления 10 мл 1 М Н₂§0₄ к 190 мл воды в 1.5-мл баллоны центрифуги. Холостая проба обрабатывается как образцы.

Пригодность системы: для проверки пригодности системы было проведено шесть повторных впрыскиваний стандарта, пригодного для системы (5 мл каждый), затем было одно впрыскивание холостого гидролиза (5 мл). С помощью последнего впрыскивания стандарта, пригодного для системы, повторного растворения (К) допустимые значения выше 1.3 и теоретические тарелки (N1, количество допустимых теоретических тарелок должно быть минимум 4000, были подсчитаны соответственно. С помощью последних пяти повторов пригодности системы была подсчитана повторяемость NАNА и оценен холостой гидролиз.

Повторное растворение: используя последнее впрыскивание стандарта, пригодного для системы, был подсчитан максимум повторного растворения с помощью следующего уравнения:

К=2(Т2-Т1)/(№2+№1) где К - повторное растворение;

Т2 - время удержания максимума NАNА (максимум 2);

Т1 - время удержания максимума NСNА (максимум 1);

- 141 017765 \2 - ширина на базе линий по касательной к сторонам максимума 2;

\1 - ширина на базе линий по касательной к сторонам максимума 1.

Фиг. 25 показывает типичное впрыскивание пригодности системы.

Теоретические тарелки (К): с помощью последнего впрыскивания стандарта, пригодного для системы, было подсчитано количество теоретических тарелок (К), используя следующее уравнение:

N 16(КГ7\\') где N - количество теоретических тарелок;

КТ - время удержания максимума NАNА, в мин;

\ - ширина базы линий по касательной к сторонам максимума NЛNА.

Последние пять впрыскиваний стандарта, пригодного для системы, были использованы для вычисления средних подсчетов области и их стандартного отклонения для NАNА. Относительно стандартное отклонение равнялось или было меньше 3%. Холостой гидролиз был свободен от каких-либо значительных максимумов со временем удержания NАNА и NСNА.

Последовательность впрыскивания: была впрыснута одна инъекция каждого из рабочих стандартов NАNА и NСNА, затем был гидролизованный пробный материал СТ^А4-Iд (повторный образцы), затем гидролизованный материал СТ^А4-Iд. После завершения работы СТ^А4-Iд была впрыснута одна инъекция каждого из рабочих стандартов NЛNА и NСNА.

Чтобы определить моли NЛNА и NСNА, впрыснутых в рабочий стандарт, используется следующее уравнение:

моль тт или ^т=(С)(Р)а)/М\ где С - концентрация NЛNА и NСNА в рабочем стандарте;

Р - чистота стандарта;

Ι - объем впрыскивания;

М\ - молекулярная масса (309.2 г/моль для NЛNА и 325.3 г/моль для NСNА).

Чтобы определить моли NЛNА и NСNА в образцах СТ^А4-Iд, используется следующее уравнение: моли NЛNА или NСNА в образце=(Х)(У)/2 где X - количество молей в рабочем стандарте NЛNА и NСNА;

Υ - средний подсчет NАNА и NСNА в образце СТ^А4-Iд;

Ζ - усредненная площадь повторов NАNА и NСNА в рабочих стандартах.

С повторных впрыскиваний стандартов площадь подсчетов стандарта NЛNА и NСNА должны иметь менее 10% К8Б.

Чтобы определить количество впрыснутого в каждом образце, используется следующее уравнение: моли протеина=(С)(О)([)/М\У где С - концентрация димера СТ^А4-Iд в г/мл (полученная из анализа υν);

Ό - разжижение для гидролиза (0.95);

Ι - объем впрыскивания (0.005 мл);

М\ - молекулярная масса димера СТ^А4-Iд, определенная по масс-спектрометрии (92.439 г/моль).

Молярное соотношение (МК) NАNА или NСNА к протеину СТ^А4-Iд подсчитывается с помощью следующего уравнения:

МК=А/В где А - количество молей NЛNА или NСNА;

В - количество молей молекул или димера СТ^А4-Iд.

Молярное соотношение (МК) сиаловой кислоты, NАNА и NСNА к протеину СТ^А4-Iд подсчитывается с помощью следующего уравнения:

МК=(А+В)/С где А - количество молей NЛNА;

В - количество молей NСNА;

С - количество молей молекул или димера СТ^А4-Iд.

Повторы образцов СТ^А4-Iд и стандартного материала СТ^А4-Iд должны иметь менее 10% К8Б в молярном отношении для NЛNА.

Линейность реакций, определенных гидролизным методом измерений содержания сиаловой кислоты: реакции NАNА были линейными относительно концентраций стандарта NЛNА в диапазоне от 0.5 мкг/мл (~0.1% номинального стандарта NАNА= ЛNА-^^) до 98.7 мкг/мл (~200% номинального стандарта NЛNА). Реакции NСNА были линейными относительно концентраций стандарта NСNА в диапазоне от 5.0 мкг/мл (~10% номинального стандарта NСNА) до 82.0 мкг/мл (~160% номинального стандарта NСNА).

Реакции NЛNА с гидролизованного материала СТ^А4-Iд линейные относительно концентраций белка в диапазоне от 0.25 мг/мл (25% номинальной загрузки СТ^А4-Iд) до 2.0 мг/мл СТ^А4-Iд (200% номинальной загрузки СТ^А4-Iд). Реакции NСNА с гидролизованного материала СТ^А4-Iд линейные к концентрациям белка в диапазоне от 0.25 мг/мл (25% номинальной загрузки СТ^А4-Iд) до 2.0 мг/мл СТ^А4-Iд (200% номинальной загрузки СТ^А4-Iд).

Погрешность гидролизного метода измерения содержания сиаловой кислоты: погрешность была

- 142 017765 продемонстрирована по материалу СТ^А4-Iд (1 мг/мл), скрепленному со стандартами NΛNА или NСNА.

Точность гидролизного метода измерения содержания сиаловой кислоты: подтверждение правильности экспериментов, демонстрирующих точность измерений (%ВБЭ <3%), повторяемость для приготовления образцов (% ИБО <4%) и воспроизводимость через различные приготовления образца, разные дни, разные инструменты и разные исследователи (% ИБО <6% для NАNА, % ИБО <12% для NСNА). Молярные соотношения NΛNА и NСNА рассматривались как точные в диапазоне 10 и 20% соответственно по доложенным результатам.

Диапазон гидролизного метода измерения содержания сиаловой кислоты: рабочий диапазон для данного анализа был показан от 0.49 до 3.87 мг/мл материала 0Т^Λ4-[д.

Предел обнаружения (ЭЬ) гидролизного метода измерения содержания сиаловой кислоты. Индивидуальные значения ЭБ для стандартов NΛNА и NСNА, использующих детектор матрицы фотодиодов (РОА; НРЬС система 1), были 0.464 и 0.402 мг/мл соответственно; индивидуальные значения ЭЬ для NАNА и NСNА, использующих детектор двойной длины волны (НРЬС система 2), были 0.131 и 0.111 мг/мл соответственно. Метод ОБ для обоих видов сиаловой кислоты и основанный на использовании наименее чувствительного детектора был 0.5 мг/мл для NАNА и NСNА.

Предел количественного анализа (ОБ) гидролизного метода измерения содержания сиаловой кислоты: индивидуальные значения РБ для стандартов NΛNА и NСNА, использующих детектор матрицы фотодиодов (РОА; НРЬС система 1), были 1.68 и 1.52 мг/мл соответственно; значения РБ для NΛNА и NСNА, использующих детектор двойной длины волны (НРЬС система 2), были 0.48 и 0.41 мг/мл соответственно. Метод РЬ для обоих видов сиаловой кислоты и основанных на использовании наименее чувствительного детектора был 1.7 мг/мл для NАNА и NСNА.

Расчлененность/выносливость: показанный метод был устойчивым относительно образца устойчивого раствора, охлажденного в течение 48 ч, использование различных колонн, использование различных партий NАNА и NСNА и использование подвижных фаз с ±5% изменением концентрации.

Гель-электрофорез ШЕ. Коэффициент продуктивности гликопротеина также можно измерить до и после обработки нейраминидазой для удаления сиаловых кислот. Увеличение коэффициента продуктивности следующей за обработкой нейраминидазой указывает на присутствие сиаловых кислот в гликопротеине. Гель ШЕ может быть использован для определения изолициновой точки, количество изоформ СТ^Λ4-[д. Пригодной системой для функционирования геля ШЕ является система электрофореза Ми1ΐίρΗοΐΐ ΙΙ и гель ШЕ с рН 4.0 до 6.5 (АтегкЫат Вюкаепсер. Анодный буфер имеет следующий состав: 0.1 М глутаминовой кислоты в 0.5 М ортофосфорной кислоты. Катодный буфер имеет следующий состав: 0.1 М бета-аланина. Гель ШЕ установлен на заданный фокус при постоянной мощности (25 Вт) и токе (25 мА), пока напряжение не достигнет >300 V. Были загружены стандарты калибрования ШЕ и образцы соответствующей концентрации, и гель функционировал при постоянной мощности (25 Вт) и токе (25 мА) с максимумом 2000 V в течение 2.5 ч. После фиксации и окрашивания геля ШЕ в кумасси голубой протеиновые зоны проявились с помощью денсиметра. Типичный гель ОВЕ приготовления димера СТ^А4-Iд показан на фиг. 11.

Пример 4. Выделение и характеристика одиночной цепи (мономер) СТ^Λ4-[д.

Приготовление естественной одиночной цепи СТ^Λ4-[д: образцы рекомбинантного белка СТБА4Ι§, приготовленного методами изобретения, были выделены неденатурированным БЕС с использованием 2695 АШапсе НРЬС (^а1ег8, МПГогФ МА) на двух препаративных колонках 21.5x300 мм ТБК Се1® ^3000Б\VX^ (ТоюЫ Вюкшепсе, МоШдотегу, РА) последовательно. Тридцать впрыскиваний (1.0 мл каждое) образца при ~50 мг/мл были выделены при изократических условиях с использованием подвижной фазы, состоящей из 0.2 М NаН₂Р0₄, 0.9% ΜΙ, ρН 7.0, при скорости потока 1.0 мл/мин. За образцами наблюдали при коэффициенте пропускания 280 нм с использованием детектора \Уа1ег'5 2996 РОА. Анализ был проведен с использованием \Уа1ег5 МШеппшт 4.0™ и программным обеспечением Ет]эо\уег Рго©. Фракции были собраны (1.0 мл каждая) в автоматизированный сборник фракций Еоху 200 от 90 до 150 мин. Фракции 16 до 39 (начиная с 105 мл и заканчивая 129 мл) были объединены и сконцентрированы с использованием центромерных концентраторов с остановом 3500 МВ.

Образец (2.0 мл при ~4 мг/мл) далее был хроматографирован при условиях денатурации с использованием подготовительных градуированных колонок НШоаб 26/60 Б^еМех 200 (Атешйат Вюкшепсек, Р18са1атау, N1) при изократической скорости потока 2.0 мл/мин с использованием 200 мМ Nаί1ίеРСН, 6.0 М гидрохлорида гуанидина при рН 6.0 как подвижная фаза на ΛКТАеxρ1ο^е^™ (АтешЫат ВююЕ епсер. Фракции 12-16 были собраны, объединены, обменены буферами в 200 мМ NаКίеРСυ, ρН 6.0 с использованием обессоливающей колонки Н1Рге|л 26/10 (Атешйат Вюкаепсер и в конце сконцентрированы.

Приготовление индуцированной одиночной цепи СТ^Λ4-[д: индуцированная одиночная цепь СТ^Λ4-[д была приготовлена с помощью денатурирования, редуцирования и алкилирования рекомбинатного белка СТ^Λ4-[д. приготовленного методами изобретения. Гидрохлорид гуанидина (0.684 г) был взвешен в 1.5-мл баллон центрифуги Еρρеηάο^Γ. и 512 мкл 200 мМ NаН₂Р0₄, ρН 6.0 было добавлено и перемешано потряхиванием до полного растворения гидрохлорида гуанидина. Рекомбинантный белок

- 143 017765

СТ^Λ4-Iд был денатурирован путем добавления 238 мкл материала СТ^Λ4-Iд (концентрация 50 мг/мл) в вышеуказанный баллон и перемешан потряхиванием до окончательной концентрации СТ^Λ4-Iд в ~10.0 мг/мл в 6.0 М гидрохлориде гуанидина. Денатурированный белок был редуцирован путем добавления 2.6 мкл 1.0 М ОТТ и выдержан при 37°С в течение 90 мин. Редуцированный белок затем был алкилирован путем добавления 0.047 г твердого йодоацетамида в смесь образца, затем его перемешали потряхиванием и выдержали при 37°С в течение 60 мин в темноте. Образец (2.0 мл при ~4.0 мг/мл для каждого впрыскивания) был хроматографирован при условиях денатурации с использованием подготовительной градуированной колонки Н1Ьоай 26/60 8ирегйех 200 при изократнческой скорости потока 2.0 мл/мин, используя 200 мМ КаН₂Р0₄, 6.0 М гндрохлорнд гуанидина при рН 6.0 на АКТАехр1огег™. Получающиеся фракции одиночной цепи (9-12) были собраны, объединены, обменены буферами в 200 мМ КаН₂Р0₄, рН 6.0 на обессоливающей колонке Н1Ргер 26/10 и концентрированы.

Анализ масс-спектрометрией МΛ^^I-Т0Е не подвергнутой воздействию и индуцированной одиночной цепи СТ^Λ4-Iд: образцы одиночной цепи (20 мкл) были обессолены и концентрированы с С4 21рТ1рк (М1Шроге, ВШепса, МА), затем элюированы с 20 мкл 80% ацетонитрила с 0.1% ТЕА насыщенным синаповой кислотой. Смесь (1.0 мкл) была расположена в ячейке пластины с образцами МΛ^^I и высушена сжатым воздухом перед перенесением в масс-спектрометр. Спектр МΛ^^I-М8 был получен на масс-спектрометре 0тшЕ1ех (Вгикег ОаНошск, МА) с использованием азотного лазера (337 нм). Образцы были проанализированы в рефлективном, положительно ионном режиме путем извлечения с задержкой, используя ускорительное напряжение 20 кВ и время задержки 200 нс. Все одноразовые 250 спектры были суммированы для каждого образца. Внешняя калибровка была получена с использованием смеси Тгурктодеп (23982 т/ζ), протеина А (44613 т/ζ) и альбумина Воуте (66431 т/ζ).

Анализ одиночной цепи с использованием денатурирования (гуанидин НС1). Гель-хроматография: надосадочная жидкость СТ^Λ4-Iд из роста культуры клеток, собранная на различных точках с течением времени, приготовлена для анализа НРЬС. Образцы приготовлены путем взвешивания 0.114 г гидрохлорида гуанидина (МаШпскгой! Вакег Ечс.) в 0.65-мл баллон микроцентрифуги ЕррепйогГ; добавили 125 мкл образца периода действия СТ^Λ4-Iд и перемешали потряхиванием до полного растворения гуанидина НС1. Затем сразу добавили 1.8 мкл 250 мМ йодоацетомида и перемешали, выдержали при 37°С в течение 30 мин.

Тандем эксклюзионной колонны Т8К-СЕЬ®С30008^ХЬ (7.8 мм Шх30 см) с защитной колонной Т8К (8^ХЬ, 6.0 мм 100x4.0 см) используется для анализа одиночной цепи 8ЕС, проведенного на узле выделения ^а!егк 2695 с детектором матрицы светодиодов 2996. 25 мл каждого образца впрыснуто в колонну, сбалансированную 200 мМ фосфата натрня, 6.0 М гидрохлорида гуанидина, рН 6.0 как подвижная фаза. Белки выделены на колонне со скоростью потока 0.5 мл/мин, и полученная хроматограмма собирается через 60-минутный интервал. Интеграция и количественный анализ индивидуальных максимумов (мономер, одиночная цепь и т.д.) осуществляются с помощью программного обеспечения Ешро\\'ег Рго. Чтобы убедиться, что система НРЬС работает должным образом, впрыскивания также осуществляются на подвижной фазе, буфере образца белка, стандарте, пригодном к системе, и данном материале СТ^Λ4-Iд до и после впрыскиваний образца. Высчитываются максимальное повторное растворение и количество микроорганизмов на хроматограмме стандарта, пригодного к системе.

Анализ цистеиниляции одиночной цепи СТ^Λ4-Iд анализом пептида ЬС/М8. СТ^Λ4-Iд был денатурирован и редуцирован в 50 мМ Трис буфере (рН 8.0), содержащем 6 М гуанидина и 5 мМ дитиотреитола (ОТТ). После 20-минутной выдержки при 50°С йодоацетамнд ДАМ) был добавлен к конечной концентрации 10 мМ для алкилирования свободных тиолов и выдерживание было продолжено в течение дополнительных 20 при 50°С в темноте. Редуцированная и алкилированная смесь была загружена на обессоливающую колонну (АтегкЬат, КАРА), затем элютнрована в свободный объем или с 50 мМ Трис, 10 мМ СаС1₂, рН 8.0 или 50 мМ буфера фосфата натрня, рН 7.5. После обессоливания редуцнрованный/алкнлнрованный СТ^Λ4-Iд был гндролизован с использованием двух различных протеаз: трипсин или Акр-Ν. Материал СТ^Λ4-Iд был также подвержен трипсиновому/химотрипсиновому гидролизу без редукции и алкилирования.

Для трипсинового гидролиза был добавлен трипсин последовательной очистки (Рготеда, 2%, ν/ν, фермент/протеин) и смесь выдержали в течение 4 ч при 37°С. Для гидролиза Акр-Ν был добавлен Акр-Ν последовательной очистки (КосЬе, 2%, ν/ν, фермент/протеин) и смесь выдержали в течение 16 ч при 37°С. Для гидролиза трипсин/химотрипсин был добавлен трипсин последовательной очистки (Рготеда, 4%, ν/ν, фермент/протеин) и смесь выдержали в течение 4 ч при 37°С, затем добавили а-химотрипсин (8щта, 4%, ν/ν, фермент/протеин) и смесь выдержали в течение 16 ч при 37°С. Все образцы были заморожены (-20°С) после гидролиза.

Полученные смеси пептида были выделены градиентным элюированием из колонки ^а!егк А!1ап!1к^ТМ ЙС18 (2.1x250 мм) на рабочей станции ^а!егк АШапсе НРЬС при 0.12 мл/мин. Колонна была напрямую соединена с масс-спектрометром ^а!егк Мюготакк О-ТоГ ткго^ТМ, оснащенным ионоразбрызгивателем для сбора масс спектра. Смеси пептида были также выделены на колонке Уапап Ро1апк С18 (4.6x250 мм) при 0.70 мл/мин с использованием такой же рабочей станции НРЬС. Колонны были сбалан

- 144 017765 сированы растворителем А (0.02% ТЕΑ в воде) и пептиды были элюированы с помощью увеличения концентрации растворителя В (95% ацетонитрил/0.02% ТЕΑ в воде). Разделяющий клапан колонны использовали для направления 15% потока к рабочей станции Ц-ТоГ, которая функционировала в положительном ТΟЕ (время пролета) режиме (т/ζ 100-2000). Типичное использованное напряжение ионоразбрызгивателя было 3000 У.

Потеря 113±4 и при редукции предполагает, что присутствует ковалентная дисульфидная модификация протеина. Предсказанное изменение для цистеинилирования - 119.14 и. Однако действительная потеря массы в 111.14 и ожидается при редукции изотопов одиночной цепи. Потеря в 119.14 и происходит из-за удаления цистеина, а приобретение 8 и приводит к добавлению 8 протонов при редукции восьми межцепьевых цистеинов (Сук^{47, 74, 92, 118, 197, 157, 303, 361} в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:2). Таким образом, дополнительные 113±4 и на неповрежденной массе соответствуют цистеинилированию с цистеиновой аминокислотой. Цистеин, который вероятнее всего будет модифицирован, это Сук¹⁴⁶, поскольку межцепьевая дисульфидная взаимосвязь отсутствует в изотопах одиночной цепи, основанной на незатронутых данных МЛ^^I. С помощью анализа пептида БС/М8 для исследования пептидов, которые содержат Сук¹⁴⁶, обнаружено, что редуцированный и нередуцированный материал показывает другое время удержания и массы, чем материал одиночной цепи. Для подтверждения цистеинилирования был собран пептид одиночной цепи, содержащий Сук¹⁴⁶, и проанализирован с помощью МЛ^^I.

Собранный максимум, содержащий Сук¹⁴⁶, имеет массу в 1787.48 и, в соответствии с предсказанной массой в 1787.51 и для пептида с цистеинилированием в Сук¹⁴⁶ (фиг. 27, панель А). Этот пептид после подвергания редукции теряет 119.11 и в соответствии с предсказанной потерей в 119.14 и; потеря цистеина (фиг. 27, панель В). Далее материалом манипулируют йодоацетамидом, создавая изменение в 56.99 и в соответствии с предсказанным приобретением массы в 57.03 и (фиг. 27, панель С).

Пример 5. Манипулирующий мономер или формирование мультимера СТ^Л4-Iд.

Агонистическое влияние среды и компонентов среды на формирование одиночной цепи: агонистическое влияние различных видов среды компонентов среды определяется для формирования одиночной цепи. Молекулы СТ^Л4-Iд могут выдерживаться при 37°С с различными видами среды и индивидуальными составляющими среды в течение 60 ч и анализироваться для формирования одиночной цепи сдвоенной колонкой денатурирующей 8ЕС. Подавляющая агонистская реакция для формирования одиночной цепи выявляется при добавлении 10 мМ цистеина к буферному составу. Существует быстрое увеличение в формировании одиночной цепи, которая удерживает максимум в течение 6 ч после добавления цистеина. Эта реакция постепенно снижается в течение оставшихся 56 ч. В добавление, +30% подача повлияла на более постепенное, но все еще относительно быстрое увеличение в формировании одиночной цепи. +30% подача - состав из галактозы и 117Е. Эта смесь добавляется каждый день для питания клеток. Во время этого эксперимента цистеин был введен в искусственно больших количествах, независимых от 117Е, существует необходимость определить, какой из компонентов 117Е может быть использован для формирования одиночной цепи.

Специфические компоненты 117Е и другой среды выдерживаются с СТ^Α4 Ц в течение 60 ч и разделяются на составные для формирования одиночной цепи сдвоенной колонной денатурирующей 8ЕС. Здесь нет исследования этого центра среды вокруг возможных дисульфидных редуцирующих компонентов и/или ингибиторов, которые будут влиять на образование одиночной цепи, основанной на предыдущих экспериментах, показывающих межцепьевой дисульфид. Были исследованы составляющие 117Е, которые, как известно, имеют некоторое редуцирующее влияние на дисульфиды; липоевая кислота, цистин, цистеин, метионин и глутатнон. Снова, подавляющая агонистическая реакция для образования одиночной цепи появляется при добавлении цистеина к буферному составу. Существует быстрая реакция при формировании одиночной цепи, находящаяся на пике около 6 ч после добавления цистеина. Эта реакция постепенно уменьшается в течение оставшихся 56 ч. Основное формирование одиночной цепи происходит со средой, содержащей цистеин: цистеин, дрожжевые экстракты и среда ферментации. Другие серосодержащие компоненты, такие как метионин и глутатион, могут оказывать очень небольшое влияние на формирование одиночной цепи. Не наблюдается никакого влияния хлорида аммиака.

Настоящее изобретение, следовательно, охватывает метод для обеспечения соотношения одиночной цепи: димерная форма белка, такой белок способен к существованию в димере так же, как и в форме одиночной цепи, включающий шаги (1) обеспечения и/или поддерживания (как во время шага (2)) жидкой среды культуры клеток, выражающей вышеуказанный белок, в котором концентрация агента, способного к редуцированию или задерживанию образования димера (такого как цистеин), выбирается для обеспечения вышеуказанного соотношения, и (2) культивирования вышеуказанных клеток для выражения вышеуказанного белка. Добавление и/или увеличение концентрации подобного агента (например, цистеин) в жидкой среде культуры клеток обеспечивает более высокое соотношение одиночной цепи: димерная форма такого протеина при удалении, понижающая или устраняющая концентрацию такого агента (например, цистеин) в жидкой среде культуры клеток, понижает соотношение одиночной цепи: димерная форма вышеуказанного белка.

Одно определенное использование данного метода - это то, где вышеуказанный белок - гликопро

- 145 017765 теин, способный к формированию димера через формирование межцепьевой дисульфидной связи, такой как молекулы СТ^Λ4-Iд настоящего изобретения.

Агонистическое влияние высокой соли на формирование высокомолекулярной массы: во время процесса очистки СТ^Λ4-Iд подвергается концентрации высокой соли для варьирования количества времени. Влияние концентрации высокой соли определяется для формирования высокомолекулярной массы Т. СТ^Λ4-Iд (при ~50 мг/мл) выдерживается в присутствии 500 мМ фосфата натрия, рН 6.0, 37°С. Существует агонистическое влияние на высокие концентрации фосфата натрия; в течение 100 ч наблюдается непрерывное быстрое увеличение форм высокомолекулярной массы, в основном тетрамера.

Настоящее изобретение, следовательно, охватывает метод для снижения соотношения множества: димерная форма белка, такой белок способен к существованию во множестве, также как и в форме димера, во время обработки (например, во время очистки) такого протеина, включающего использование одной или более жидкостей, которые являются солевыми растворами с отсутствием скоплений. Солевой раствор с отсутствием скоплений относится к жидкости, содержащей концентрацию растворенной соли, которая, относительно такой же жидкости, содержащей более высокую концентрацию такой соли, является менее агонистической при формировании скоплений.

Одно определенное практическое применение данного метода - это то, где вышеуказанный белок гликопротеин, способный к формированию димера через формирование межцепьевой дисульфидной связи, такой как молекулы СТ^Λ4-Iд настоящего изобретения.

Антагонистическое влияние на формирование одиночной цепи: предыдущие моделирующие эксперименты показали большое и быстрое влияние на формирование одиночной цепи при добавлении компонентов, содержащих цистеин. Цистеин является аминокислотой, которая содержит свободный сульфгидрил. Если сульфгидрил участвует в формировании одиночной цепи, он должен быть заблокирован через использование антагонистических соединений. Одно из таких соединений - йодоацетамид. Йодоацетамид - водорастворимое вещество, которое реагирует в быстрой манере с любым свободным сульфгидрилом для образования необратимой связи тиоэфира. СТ^Λ4-Iд выдерживается при 37°С в различной среде, с цистеином и йодоацетамидом в течение 60 ч и разделяется на составные для формирования одиночной цепи с помощью сдвоенной колонки денатурирующей 8ЕС и НМ\У помощью сдвоенной колонки не денатурирующей 8ЕС. Йодоацетамид блокирует не только формирование одиночной цепи, но и формирование скоплений в составе СТ^Λ4-Iд и высокой соли. Йодоацетамид не блокирует формирование скоплений в мономере пониженной сиаловой кислоты. Однако количество скоплений сформированной в материале пониженной сиаловой кислоты сравнимо с количеством, образованным в составе СТ^Λ4-Iд.

Модель помогает лучше понять механизм, который до этого не был понятен. Выясняется, что существует по крайней мере два основных пути формирования скоплений в процессе СТ^Λ4-[д. которые были определены. При первом пути, который производит большое количество скоплений, свободный сульфгидриловый цистеин действует как агонист для формирования изотопов одиночной цепи. Агонистический эффект цистеина можно блокировать путем добавления йодоацетамида. Удивительно, йодоацетамид является не только антагонистом для формирования одиночной цепи, но также для формирования высокомолекулярной массы. Следует отметить, что технология спроектирована для производства состава, который содержит увеличенное количество сиаловой кислоты по сравнению с ферментацией во время очистки ниже по течению. При втором пути, при котором производится намного меньше скопления, подвид, который содержит небольшое количество сиаловой кислоты, не подвержен влиянию йодоацетамида для образования одиночной цепи или скопления.

Настоящее изобретение, следовательно, охватывает метод для снижения соотношения одиночной цепи: димерная форма белка, такой белок способен к существованию в димере так же, как и в форме одиночной цепи, включая шаги (1) обеспечения и/или поддерживания (как во время шага (2)) жидкой среды культуры клеток, выражая вышеуказанный белок, такая среда содержит агент антагонистический к формированию одиночной цепи (такой как йодоацетамид), и (2) культивирования вышеуказанных клеток для выражения вышеуказанного белка.

Настоящее изобретение также охватывает метод для снижения соотношения скопления: димерная форма белка, такой белок, способный к существованию в скоплении так же, как и в форме димера, включая шаги (1) обеспечения и/или поддерживания (как во время шага (2)) жидкой среды культуры клеток, выражая вышеуказанный протеин, такая среда содержит агент, антагонистический к формированию цепи скопления и/или антагонистический к формированию одиночной цепи (такой как йодоацетамид), и (2) культивирования вышеуказанных клеток для выражения вышеуказанного белка.

Одно определенное практическое применение данного метода - это то, где вышеуказанный белок гликопротеин, способный к формированию димера через формирование межцепьевой дисульфидной связи, такой как молекулы СТ^Λ4-Iд настоящего изобретения.

Основываясь на этих данных, не трудно представить, по крайней мере два пути по формированию скоплений осуществляются в СТ^Λ4-Iд. При главном пути одиночная цепь участвует в формировании скопления через еще не полностью очищенный механизм. Второй путь, который не зависит от формирования одиночной цепи, участвует в формировании скопления. Эти пути могут помочь объяснить, почему существует по крайней мере три формы видов высокомолекулярной массы, которые могут быть выделе

- 146 017765 ны хроматографически. Это модели и они должны быть проверены во время фактического процесса ферментации для того, чтобы определить влияние, если оно существует, и величину влияний. Основываясь на этих данных, необходимо уделить внимание проверке не только текущего процесса ферментации, но и цистеина, свободного от ферментации.

Пример 6. СТ^Л4-Iд димер и тетрамер.

СТ^Л4-Iд связывание димера и тетрамера с В7-11д.

Изобретение предоставляет методы для оценки СТ^Л4-Iд соединения димера и тетрамера с В7-11д. Физические характеристики (например, коэффициент диффузии, молекулярная масса, валентность соединения) и рабочие параметры измерений (например, скорость потока, плотность кристалла) могут влиять на результаты анализа В1асоге. При ограничении передачи массы интенсивность соединения тетрамера приблизительно на 20% ниже, чем димера для такой же молярной концентрации. При определенной скорости потока возможно, что молекулы тетрамера проникли в матрицу менее эффективно по сравнению с димером. При высокой плотности фиксированного кристалла В7-11д конкурентное связывание тетрамера и димера показывает сравнимые кривые ингибирования. Это указывает на то, что теоретическая валентность тетрамера (четыре) против димера (два) не имеет влияния на связывание с В7-11д. Молярные концентрации тетрамера могут быть подсчитаны на основании стандартной кривой димера. Используя данный подход, было обнаружено, что связывание тетрамера с В7-11д имеет реакцию, зависимую от эквивалентной дозы по сравнению с димером.

На сравнение потенциала связывания тетрамера и димера оказывает влияние единица измерения, использованная для изготовления стандартов и образцов. Образцы тетрамера и димера могут сравниваться при концентрации 2000 нг/мл. На основании массы (нг/мл) каждый вид показывает потенциал связывания приблизительно 100%, используя стандартную кривую таких же видов. Однако потенциал связывания тетрамера был уменьшен наполовину при определении на стандартной кривой димера и потенциал связывания димера был удвоен при определении на стандартной кривой тетрамера. Поскольку инструмент В1асоге определяет молекулярные взаимодействия, основанные на массе, единицы сигнального резонанса (КИ) с идентичных концентраций (нг/мл) тетрамера и димера должны быть одинаковыми. Хотя система определения - это функция массы, взаимодействие между молекулами проявляется на молярной основе. Следовательно, молярные концентрации димера СТ^Л4-Iд и тетрамера СТ^Л4-Iд 21.6 пнМ и 10.8 нМ соответственно при 2000 нг/мл. Используя молярную концентрацию, образцы димера СТ^Л4-Iд и тетрамера СТ^Л4-Iд показывают сравнительный потенциал связывания на стандартной кривой димера. Используя подход такой же молярной концентрации на стандартной кривой тетрамера СТ^Л4-Iд. образец димера СТ^Л4-Iд показывает дополнительное увеличение на 30% потенциала связывания по сравнению с образцом тетрамера. Это наблюдение происходит по причине понижения наклона стандартной кривой тетрамера при высоких концентрациях, приводящих к более высокой подсчитанной концентрации для данной первоначальной интенсивности связывания. Одним из объяснений этого наблюдения является влияние массопередачи.

Эксперимент по ограничению массопередачи показывает, что первоначальная интенсивность связывания тетрамера СТ^Л4-Iд приблизительно на 20% ниже, чем димера СТ^Л4-Iд для такого же количества молекул (т.е. интенсивность связывания тетрамера отличается от димера фактором в 0.8). Это наблюдаемое различие происходит из-за молекулярной массы двух видов и ее влияния на диффузию молекул к поверхности кристалла. Коэффициент диффузии молекулы обратно пропорционален кубическому корню молекулярной массы. Более низкий коэффициент диффузии указывает на более медленное движение молекул. Основываясь на соответствующих молекулярных массах, подсчитанный коэффициент диффузии тетрамера СТ^Л4-Iд составляет 0.8 коэффициента димера СТ^Л4-Iд. или наоборот, димер составляет 1.25 тетрамера. Экспериментальные данные согласуются с этим наблюдением, где димер СТ^Л4-Iд показывает потенциал в 133%, как подсчитано по стандартной кривой тетрамера СТ^Л4-Iд с использованием молярных концентраций. Ограничение массопередачи на высокоплотных кристаллах ярче выражено при более низких скоростях потока и более низких концентрациях веществ, определяемых при анализе. При увеличении скорости потока димер показывает более быстрые первоначальные скорости соединения по сравнению с тетрамером. Следовательно, увеличенная молекулярная масса и более низкий коэффициент диффузии тетрамера содействуют первоначальным различиям интенсивности связывания по сравнению с димером.

Конкурентное связывание тетрамера и димера СТ^Л4-Iд с В7-11д указывает на то, что тетрамер и димер показывают одинаковую валентность связывания при условиях ограничения массопередачи. Влияние дополнительного тетрамера на кристалл В7-11д, первоначально связанного с димером или тетрамером, указывает на низкий потенциал связывания. Это наблюдение происходит не из-за ограниченной возможности связывания, потому что дополнительный димер может связываться с кристаллами В711д, первоначально связанными с димером СТ^Л4-Iд или тетрамером СТ^Л4-Iд. Ограниченное проникновение в матрицу может объяснить наблюдаемое понижение в связывании тетрамера.

Качество связывания молекул с В1асоге влияет на интерпретацию результатов. Молекулы тетрамера и димера рассеиваются на разных скоростях из-за их различий в молекулярном размере при условии ограничения массопередачи. В добавление, стерическое несоответствие на поверхности высокоплотного

- 147 017765 кристалла влияет на проникновение последовательных молекул в матрицу.

Физические характеристики, такие как молекулярная масса, коэффициент диффузии и связывание каждого вида, необходимо рассматривать при осуществлении анализов концентрации на В1асоге. Стандарты, использованные для сравнения с анализируемым веществом, должны быть из того же материала. Однако тетрамер может быть проанализирован по отношению к стандартам димера, если стандарты и образцы представлены на молярной основе, где принимается во внимание молекулярный размер. Представленные данные указывают, что связывание димера СТ^Ά4-Iд и тетрамера СТ^Ά4-Iд к В7-Нд сравнимо.

Димер и тетрамер СТ^Ά4-Iд показывают одинаковые скорости ассоциации (к_оп). Однако тетрамер показывает более медленную скорость диссоциации (кой), которая приписывается авидности из-за увеличения количества мест связывания.

Кинетический анализ связывания между двумя протеинами, такими как лиганд и рецептор, может осуществляться на В1асоге с использованием кристалла фиксированного низкой плотностью лиганда в приблизительно 600-800 КИ, при этом максимальная мощность связывания (Ктах) находится в диапазоне 50-150 Ки. Целью низкоплотного кристалла является снижение влияния авидности и массопередачи. Авидность наблюдается, когда многовалентные анализируемые вещества остаются связанными с поверхностью кристалла из-за близкого соседства доступных лигандов, так как появляется распад индивидуальных мест связывания. Массопередача наблюдается, когда присутствует значительное различие в концентрациях анализируемого вещества между поверхностью кристалла и основной массой раствора.

В одном примере осуществления молекула СТ^Ά4-Iд - это димер, состоящий из двух одноцепных молекул, соединенных простой межцепьевой дисульфидной связью, и он содержит два места связывания для молекул В7. В другом примере осуществления образование тетрамера СТ^Ά4-Iд, как подтверждено светорассеиванием, 8ЕС и 8О§-РАСЕ, приводит к образованию молекулы с потенциальными четырьмя местами связывания. Связывающая кинетика очищенного мономера и димера статистически сравнивается с димерным материалом СТ^Ά4-Iд. Нет значительных различий в скоростях к_оп (р значения > 0.05). Скорость ко_££ тетрамера значительно отличается от скорости ко_££ димера. Скорость ко_££ димера, очищенного от пика очистки ШС, незначительно отличается от скорости ко_££ димерного материала СТ^Ά4-Iд. Следовательно, тетрамер диссоциируется медленнее, чем димер, показывая влияние авидности из-за увеличенного количества мест связывания на молекулу.

Тетрамер может быть развернут и диссоциирован в димер с помощью обработки гуанидином. Этот димер СТ^Ά4-[д. обработанный гуанидином, был разложен на части и результаты показали, что его связующие кинетические характеристики были похожи на характеристики димера СТ^Ά4-Iд, образованного при физиологических условиях. Это наблюдение поддерживает гипотезу, что наблюдаемое различие в скорости ко££ между димером и тетрамером относится к связующей валентности молекул и природе, свойственной специфическому методу В1асоге, где авидность играет роль в связующей кинетике.

Аффинная очистка материала СТ^Ά4-Iд от пика очистки ШС.

Аффинная хроматография протеина А-сефарозы: 500 мл пика очистки ШС было профильтровано через 0.22 мкм 1-л фильтровальную систему (Соттд, Соттд, ИУ, часть № 430517) и загружено в колонну протеина А-сефарозы (5 смх15 см), которая была предварительно сбалансирована фосфатным забуференным раствором (81дта, 81. Ьош8, МО, Р-4417) при рН 7.4. Колонну промыли 700 мл РВ8, рН 7.4 и элюировали 100 мМ глицином, рН 3.5. Фракции по 50 мл каждая были нейтрализованы во время сбора при добавлении 0.5 мл 2.0 М Трис, рН 10 к сборочным баллонам. Фракции были испытаны при коэффициенте пропускания 280 нм, объединены и сконцентрированы с использованием центрипетального контейнера УМ-3 (МОрою СогрогаНоп, Вебйогб, МА, часть № 4203). Очищенный белковый раствор хранили при -70°С.

Аффинная хроматография РК08ЕР-гА (рекомбинантный протеин А): 500 мл пика очистки ШС было профильтровано через 0.22 мкм 1-л фильтровальную систему (Соттд, Соттд, НУ, часть № 430517) и загружено при скорости потока 25 мл/мин в колонну мощности РК08ЕР-гА (МОроге СогрогаНоп, Вебйогб, МА) (25 ммх28 см), которая была предварительно сбалансирована 25 мМ Трис, рН 8.0, содержащем 250 мМ хлорида натрия. Для этой хроматографии была использована система \а1ег§ РгерЬС, оснащенная \а1ег8 2767 8атр1е Мападег и детектором матрицы фотодиодов \а1ег§ 2996. Колонна была промыта 25 уравновешивающим буфером в течение 30 мин при скорости потока 25 мл/мин и элюирована 100 мМ ацетата, рН 3.0 при скорости потока 25 мл/мин в течение 30 мин. Фракции по 10 мл каждая были нейтрализованы во время элютирования при сборе более 50 мкл 2.0 М 1г15, рН 10, который был предварительно добавлен в баллоны. Фракции, имеющие высокий коэффициент пропускания при 280 нм, были объединены и сконцентрированы с использованием центрипетального контейнера УМ-3 (МШороге Согрогабоп, Вебйогб, МА, часть № 4203). Очищенный протеиновый раствор хранили при -70°С.

Гель-хроматография: гель-хроматография была проведена на модуле разделения \а1ег§ АШапсе 2695, оснащенном детектором матрицы фотодиодов \а1ег§ 2996 (Мбйогб, МА) и сборником фракций Роху 200 под контролем МШеппшт³² версия 3.20 или программного обеспечения Етро\\'ег. Сдвоенные колонны Т080Н ВI08СIЕNСЕ (Моп1дотегу, РА) Т8К С3000 8\ (21.5 ммх300 мм) и Т8К С3000 8\хЬ

- 148 017765 (7.8 ммх300 мм) были использованы для препаративного и аналитического 8ЕС соответственно. За элютированными протеинами наблюдали при помощи коэффициента пропускания ИУ при 280 нм.

Препаративное выделение димера, тетрамера и мультимера было получено с помощью 8ЕС материала пика очистки очищенного хроматографией гидрофобного взаимодействия протеина А. Тринадцать образцов (~10 мг каждый) элюата протеина А были впрыснуты в препаративную сдвоенную колонну 8ЕС, используя подвижную фазу 100 мМ одноосновного буфера фосфата натрия рН 7.0, содержащего 0.9% хлорида натрия при скорости потока 1 мл/мин. Фракции были собраны на каждой минуте от 90-160 мин с каждого из 13 образцов. Время выполнения для каждого впрыскивания было 180 мин.

Каждая фракция была проверена сдвоенной колонной гель-жидкостной хроматографией высокого разрешения, фракции 13-15 (содержащие мультимер), фракции 22 и 23 (содержащие тетрамер) и фракции 43-49 (содержащие димер) были объединены. Очищенные фракции мультимера, тетрамера и димера были проверены на аналитических двух колоннах 8ЕС с выявлением динамического рассеивания (О8Ь).

Биоспецифический связующий анализ компонента СТ^А4-Iд пика очистки ШС и очищенных компонентов к фиксированому В7-Пд: биоспецифическое связывание СТ^А4-Iд с фиксированным В7-Пд (на кристалле СМ8) было измерено с помощью 8РВ, основанном на биодатчике ЫАсоге С (ЫАсоге, АВ, Р1кса!атау N1). Материал СТ^А4-Iд был использован для создания стандартной кривой. В7-Пд был зафиксирован при плотности 5000 до 10000 резонансных единиц (ВИ) на активированной сенсорной схеме СМ5. Начальные стандарты СТ^А4-Iд, контроли качества и образцы были впрыснуты при скорости потока 20 мл/мин через поверхность сенсорной схемы В7-Пд для производства сенсорграм. Первоначальная связывающая скорость (ВИ/к) СТ^А4-Iд на фиксированном В7-Ид была замерена при условиях, ограничивающих диффузию, на поверхности В7-Пд высокой плотности, и это напрямую находится в связи с активной концентрацией СТ^А4-Iд в образцах. Стандарт, образец контроля качества и неизвестные концентрации образца были интерполированы со стандартной кривой, сделанной с помощью построения ВИ в сравнении с концентрациями СТ^А4-Iд в номинальном диапазоне 125-8000 нг/мл. Окончательные результаты были показаны в виде связывания процентов (средняя концентрация неизвестного образца/2000)х100.

Определение молярной массы и гидродинамического радиуса: разделение 8ЕС было осуществлено с помощью колонны Т8К3000 8АХЬ и соответствующей защитной колонны. Подвижная фаза состояла из 25 мМ НЕРЕ8, 850 мМ №С1, рН 7.0, с использованием изократических условий для элютирования при 0.8 мл/мин. Анализы НРЬС были произведены при температуре окружающей среды и образцы поддерживались при 4°С во время анализа. Определение молярной массы включало Ауа!! Оа\уп Е08, используя 15 выраженных углов рассеивания для измерения изменения угла светорассеивания для каждого вида. Была использована графическая формальная система Ζίιηιη для определения молярной массы, где срезы для каждого вида были усреднены для молярной массы. Специфическое рефракционное значение увеличения показателя (йп/йс), использованное для подсчета абсолютной молярной массы, было 0.189, полученное с помощью интерферометра 0рй1аЬ Э8Р (ΒΙ). Определение гидродинамического радиуса (В_Н) было осуществлено на одной линии с детектором Р1о!оп Согге1а!ог 0ЕБ8, расположенным под углом приблизительно в 90° к проточной кювете. Константа поступательной диффузии измеряется с этого сигнала и В_Н подсчитывается с помощью соотношения Етк!еш-8!окек. Анализ данных был завершен с использованием программного обеспечения Ак!га, версия 4.90 с Ауай ТесНпо1оду.

Выяснилось, что значения молекулярной массы и гидродинамического радиуса для видов димера и тетрамера находятся между 86-91 и 172-199 кДа соответственно. Образцы пика очистки содержат дополнительные виды НМА, соответствующие гексамеру и декамеру по молекулярной массе. Диапазон гидродинамических радиусов для видов димера находится в пределах 3.8-4.7 нм. Диапазоны гидродинамических радиусов для неоднородных видов тетрамера были от 5.7 до 6.2-6.3 нм.

Связывание димера и тетрамера СТ^А4-Iд с В7-Ие, используя плазмонный резонанс поверхности: Анализ концентрации: Анализ концентрации различных видов СТ^А4-Iд к В7-Пд был сделан на измерительном приборе В1асоге 3000 (В1асоге, Р|кса1а\уау, N1) согласно методу 7441-4² с небольшими модификациями. В модификации вошло следующее: был использован В1асоге 3000 вместо В1асоге С. Скорость потока была 10 мкл/мин вместо 20 мкл/мин. Образец впрыскивался 60 с вместо 15 с. Поверхность сенсорного чипа была регенирирована при 30 мкл/мин тремя короткими 30-секундными выбросами (15 мкл) 10 мМ дигидрата цитрата натрия, рН 4.0, содержащего 100 гМ №1С1 (буфер регенерации), за ними идет один 30-секундный выброс воды.

Сенсорный чип СМ8 был зафиксирован с помощью В7-Ид при концентрации 20 нг/мл в ацетатном буфере, рН 5.0, нацеливаясь на плотность вещества мишени в 6000-12000 резонансных единиц (ВИ). Стандарты были приготовлены с помощью последовательно разведенного материала СТ^А4-Iд до концентраций в 62.5-8000 нг/мл (0.675-86.3 нм) и димера до концентраций в 125-16000 нг/мл (0.675-86.3 нм) в буфере НВ8-ЕР. Проверочные образцы, состоящие или из мономера, или из димера, были разведены до целевой концентрации в ~2000 нг/мл и проанализированы на В1асоге. Концентрации были определены с помощью программного обеспечения ВМе^ики-Шоп (версия 4.0.1) с использованием стандартных кривых или материала СТ^А4-Iд (>98% мономера) или очищенного димера. Потенциал связывания подсчитан

- 149 017765 как процентное содержание концентрации, определенной на В1асоге, деленной на концентрацию, определенную А280 нм.

Скорость связывания молекулы с данной поверхностью - это функция концентрации, которая позволяет определить неизвестные концентрации. Димер СТ1.А4-Щ показывает более высокую скорость связывания как функцию концентрации (нг/мл) по сравнению с тетрамером СТ^Α4-Iд.

Потенциалы связывания димера и тетрамера СТГ.-АД-Щ суммированы в табл. 9. Основываясь на нг/мл, потенциал связывания образца димера подсчитывается со стандартной кривой димера и составляет 99.5%; тогда как эквивиалентная концентрация образца тетрамера составляет 47.2%. И наоборот, потенциал связывания образца димера подсчитывается со стандартной кривой тетрамера и составляет 266%; тогда как эквивалентная концентрация образца тетрамера составляет 103%. Однако, когда димер и тетрамер выражены как молярные концентрации (нм), потенциалы связывания обоих видов сравнимы. Потенциал связывания образцов димера и тетрамера, подсчитанных со стандартной кривой димера, составляет 99.4 и 94.3% соответственно. На стандартной кривой тетрамера он составляет 133 и 103% соответственно. Стандартные кривые димера и тетрамера сравниваются на основе молярных концентраций.

Таблица 9 Потенциалы связывания димера и . тетрамера СТ^Α4-I§

Стандартная кривая Стандартная кривая димера ...тетрамера

Образец	нг/мл	нм	нг/мл	нм
димер	99.5%	99.4%	266%	133%
тетрамер	472%	943%	103%	103%

Валентность связывания: димер СТ^Α4-Iд (25-1600 нм) или тетрамер (25-400 нм) был предварительно смешан при различных молярных пропорциях с В7-Пд в течение 3 мин до впрыскивания 30 мл смеси при скорости потока 10 мкл/мин через схему В7-Пд, фиксированную с плотностью 9392 КП. Схема была регенерирована после каждого впрыскивания тремя 30-секундными выбросами буфера регенерации, за которыми идет один 30-секундный выброс воды. Ки, полученные в конце каждого впрыскивания, были сравнены.

Теоретически, валентность связывания молекулы димера составляет два; каждая одиночная цепь состоит из одного места связывания. Молекула тетрамера состоит из двух молекул димера и таким образом имеет валентность связывания четыре. Чтобы определить явную валентность связывания димера и тетрамера, был спроектирован конкурентный анализ и проведен на В1асоге 3000. Во время эксперимента анализируемые вещества были предварительно смешаны с В7-Пд при различных молярных соотношениях в течение 3 мин до впрыскивания смеси на схему 137-Ид (9392 Ки) при скорости потока 10 мкл/мин в течение 1 мин. Табл. 10 показывает процентное соотношение димера или тетрамера, которое было конкурентно ингибировано с увеличивающимся молярным количеством 137-Ид. При молярном соотношении в 1.25 (137-Ид) к 1 (димер или тетрамер) наблюдалось значительное различие в конкурентном ингибировании с мономером при 96.1% и димером при 84.9%. Однако димер и тетрамер показывают одинаковые кривые ингибирования, это дает предположение, что валентности приблизительно одинаковые. В добавление, и димер, и тетрамер показали одинаковые профили ингибирования с использованием кристаллов более низкой плотности.

Таблица 10

Ингибирование димера и тетрамера с В7-П§

	димер (% ингибирование)	тетрамер (% ингибирование)
В7-11§ молярно е	N	средн ИЙ	δ.ϋ.	N	средний	8.ϋ.
0.02 к 1	1	1.5	Нет	1	3.4	Нет
0.04 к 1	2	1.2	0.2	2	5.1	0.3
0.08 к 1	3	2.9	1.1	3	7.4	0.8
0.16 к 1	4	5.5	0.7	4	12.6	0.9
0.32 к 1	5	14.7	3.3	5	20.9	2.2
0.64 к 1	5	38.1	6.1	4	40.8	3.5
1.25 к 1	5	96.1	2.6	3	84.9	4,6
2.5 к 1	4	99.7	0.1	2	97.5	0.5
5.0 к 1	3	99.9	0.1	1	99.4	Нет
10.0 к 1	2	100.0	0.0	Нет	Нет	Нет
20.0 к 1	1	100.0	Нет	Нет	Нет	Нет

Насыщение кристалла В7-Пд: димер или тетрамер СТ^Α4-Iд (200, 1000 или 8000 нг/мл) первоначально был впрыснут при 10 мл/мин в течение 1 мин через кристалл высокой плотности 137-Ид (6738 Ки), затем прошла серия из семи одноминутных впрыскиваний с мономером или димером (200, 1000 или 8000 нг/мл). Кристалл был регенерирован после каждого условия четырьмя 25 мл впрыскиваниями буфера регенерации, затем 25 мл впрыскиванием воды. Ки, полученные в конце каждого впрыскивания, были сравнены.

Или димер, или тетрамер были повторно впрыснуты через поверхность 137-Ид, предварительно об

- 150 017765 работанную димером или тетрамером без регенерации поверхности. Первоначальное связывание с тетрамером не препятствует последовательным впрыскиваниям димера со связывания, однако дополнительные впрыскивания тетрамера могут привести к значительно сниженной скорости связывания по сравнению с впрыскиванием димера. Первоначальное связывание с димером, за которым следуют после довательные впрыскивания димера, приводят к увеличенному связыванию по отношению к насыщению. Последовательное впрыскивание тетрамера в предварительно обработанный кристалл димера показывает постепенное понижение связывания, указывая на диссоциацию молекул из кристалла и отсутствие проникновения тетрамера в матрицу. Подобные результаты можно наблюдать при первоначальном впрыскивании или 200 нг/мл, или 8000 нг/мл молекул СТЬА4-1д.

Тетрамер СТЬА4-1д имеет более высокую авидность к рецептору В7-11д: виды СТЬА4-1д, включая отсортированные части колонн очистки, такие как очистительные максимумы колонн Н1С и ()ЕЕ, были очищены, и их связывающая кинетика была проанализирована на В1асоге.

Виды СТЬА4-1д с пика очистки Н1С: колонна хроматографии гидрофобного взаимодействия используется в процессе СТЬА4-1д для удаления видов с высокомолекулярной массой, как ДНК. Виды СТЕА4-1д с пика очистки с колонны Н1С могут быть использованы для последовательной очистки и кинетического анализа. Пик очистки Н1С был пропущен через колонну протеина А для захвата всех видов СТЕА4-1д и для удаления других примесей, которые могут там присутствовать. Элюат с колонны протеина А, который состоял из смеси всех видов СТЬА4-1д (т.е. димер, тетрамер, гексамер, мультимер), показал явные скорости к_о££ и к_оп, которые были сравнимы со стандартом димера СТЕА4-1д. Разделение элюатом протеина А 2-колонной БЕС привело к трем видам СТЕА4-1д: димер, тетрамер и гексамер/мультимер, скоростями к_о££ и к_оп, как показано в табл. 11. Содержание сиаловой кислоты очищенного димера с пика очистки Н1С было низким по сравнению с димером СТЕА4-1д.

В табл. 11 концентрации образца в 75-200 нм были проверены на схеме В7-11д (694 КП). Виды СТЕА4-1д, очищенные с пика очистки Н1С, показали более низкое связывание по сравнению с материалом СТЕА4-1д. Тетрамер, который был дезагрегирован, дал сравнимые скорости к_о££ и к_оп к материалу СТЕА4-1д.

Таблица 11

Кинетический анализ видов СТЕА4-1 в пике очистки Н1С Виды

Стандарт димера СЬТА4-1д

Элюат протеина А

Димер________________

Тетрамер_______________

Гексамер________________

Димеризованный тетрамер коп хЮ³ 4,03 3.77

1.52

1.65

1.54

3.12 'кой хЮ³ (1/8)

9.65

9.73

5.88

8.07

123

9.88

Кд х 107(1/М)

4.18

3.87

2.59

2.04

1.25

3.16

Κϋ (нм)

23.9

25.8

38.7

48.9

79.9

31.7

Статистический анализ данных был осуществлен с использованием Т-теста Стьюдента, основанного на 7 наблюдениях стандарта димера СТЕА4-1д и 14 наблюдениях очищенного димера и тетрамера. В скоростях к_оп не было отличия по сравнению стандарта димера СТЕА4-1д с очищенным димером или тетрамером. Однако скорости к_о££ и ΚΌ были статистически значительными, когда исходный материал сравнили с очищенным тетрамером (табл. 12). По сравнению очищенного тетрамера с очищенным димером скорости к_о££, к_оп и ΚΌ были статистически разными. Следует отметить, что хотя данные были сгруппированы в димер и тетрамер, индивидуальные классификации образцов (т.е. фронтальная, задняя сторона и т.д.) могут иметь слегка разные характеристики, которые могут влиять на их кинетику связывания. Для димера скорости к_о££, к_оп усреднены 3.3±1.0х10⁵ М-1з^-1 и 8.8±3.5х10³ з^-1 соответственно. Скорости к_о££, к_оп тетрамера были 2.6±0.8х10⁵ М-1з^-1 и 3.1±1.4х 10³ з^-1 соответственно.

В табл. 12 были проанализированы димер (п=14) и тетрамер (п=14) и стандарт димера СТЕА4-1д (п=7).

Таблица 12

Статистический анализ видов СЕТА4-1д.

Т-тест Стью дента	р-значения
	коп	коп	Κϋ
Стандарт димера в сравнении с димером	0.9118	0.8678	0.7893
Стандарт димера в сравнении с тетрамером	0.1044	0.0000002	0,0002
Димер в сравнении с тетрамером	0.0372	0.000006	0.0004

Виды СТЕА4-1р с ΟΕΕ пика очистки: колонна ()ЕЕ является последней колонной очистки, использованной для вычищения остаточного загрязнения из продукта. Виды СТЕА4-1д были выделены с пика очистки колонны ()ЕЕ с использованием метода 2-колонны БЕС и проанализированы на В1асоге 3000. Данные показали, что кинетика связывания этого образца пика очистки ОЕЕ была похожа на стандарт димера СТЕА4-1д. В добавление димер и тетрамер, очищенные с пика очистки ЦЕЕ, дали схожую кинетику связывания по сравнению с очищенными из состава. Кроме того, содержание сиаловой кислоты во фракциях очищенного мономера было выше, чем в стандарте димера СТЕА4-1д.

- 151 017765

Обработка гуанидином (димеризация тетрамера): тетрамер может быть преобразован в димер при помощи обработки гуанидином, за которым следует диализ в буфер фосфата и подтверждение перехода в димер аналитическим БЕС. Кинетический анализ димеризованного тетрамера с пика очистки ШС показал, что его скорости к_оГГ, к_оп были схожи со скоростями димера СТ^А4-Iд.

Пример 7. Интактный анализ при помощи электрораспылительной ионизации МБ (ЕБЕ).

СТ^А4-Iд был разбавлен 100 мМ Тпз, 25 мМ №С1, рН 8 до окончательной концентрации 0.7 мг/мл. РNСазеЕ (Μν Епд1апй В1о1аЬз) был разбавлен 30-кратно с помощью 100 мМ Тпз, 25 мМ №С1, рН 8 до окончательной концентрации в 17 единиц/мкл. Равные объемы (60 мкл каждый) разбавленного образца и разбавленного раствора глюкозидазы были смешаны и выдержаны при 37°С в течение 4 ч.

Полученный дегликозилированный 0^^4-^ (2 мкл) был загружен в колонну экстракционного патрона обратной фазы \а!егз 0аз1з® (2.1 х20 мм). Загруженная колонна была промыта 5% растворителем В (растворитель А: 1% муравьиной кислоты в воде, растворитель В: 1% муравьиной кислоты в ацетонитриле) при скорости потока 0.2 мл/мин в течение 5 мин для обессоливания, с элюентом, отведенным в отходы. В конце 5 мин быстродействующий градиент (5% растворителя В в 95% растворителя В в течение 10 мин) начал элюирование СТ^А4-Iд из колонны; здесь элюент был направлен в масс-спектрометр (\а!егз Мкготазз О-ТоГ ткго^ТМ) при 45 мкл/мин после разделения потока (использованная система хроматографии была \а!егз АШапсе 2695, оснащенная детектором \а!егз 2996).

Капиллярное напряжение для О-ТоГ т1сго^ТМ было установлено на 3 кВ и коническое напряжение образца на 40 В. Сканирования (каждые 0.9 с) были усреднены в одно сканирование; время внутреннего сканирования было 0.1 с. Анализатор О-ТоГ сканирует от т/ζ 800 до 2500. Спектры, относящиеся к части выше половины максимальной высоты (на хроматограмме ТК.'), были объединены с помощью программного обеспечения \а!егз МаззЬупх^ТМ. Объединенные спектры были подвержены обращению свертки \а!егз МахЕп!1. Разрешение было установлено на 1 Ба/канал и была отобрана однородная модель повреждаемости Саизз1ап с шириной в половину высоты, установленной между 0.5-1 Ба. Минимальные соотношения интенсивности для левого и правого максимума были установлены на 50%.

Пример 8. Ионизация лазерной десорбции с помощью матрицы-время пролета (МАкБЕТОЕ).

Спектры МАББЕМБ были обнаружены на 0тпЕ1ех™ (Вгикег Ба1!ошсз, МА) с помощью азотного лазера (337 нм). Образцы белка использовались без обессоливания или обессоливались с использованием экстракции твердой фазы в форме микродозаторов С4 Ζ^рТ^р® (М1Шроге, ВейГогй МА). Микродозаторы были увлажнены ацетонитрил-водой (1:1 ν/ν) и сбалансированы 0.1% трифторуксусной кислотой (ТЕА) до использования. Микродозаторы затем были загружены путем извлечения и вытеснения 10 мкл образца из пипетки три раза. Загруженный образец три раза был промыт 10 мкл 0.1% ТЕА. Обессоленные образцы протеина были элюированы из пипетки с 10 мкл ацетонитрила к воде (1:1 ν/ν). Образцы были распределены путем смешивания 1 мкл образца (или обессоленного, или содержащего буфер) с 1 мкл раствора матрицы и размещения 1 мкл смеси на мишени из нержавеющей стали. Раствор матрицы - это насыщенный раствор синаповой кислоты в 1:1 воды к ацетонитрилу (ν/ν), содержащей 0.1% ТЕА. Смесь была распределена на пластине для образцов МЛ^^I и высушена на открытом воздухе до перенесения в масс-спектрометр. Все образцы белка были проанализированы в линейном, положительно-ионном режиме с помощью замедленной экстракции с использованием ускоряющего напряжения в 20 кВ и времени задержки в 200 нс. Все 400 единичных спектров были собраны с каждого образца. Внешняя поверка была выполнена с использованием смеси стандартных протеинов, содержащих трипсиноген (23982 т/ζ), протеин А (44613 т/ζ) и альбумин Вогте (66431 т/ζ).

Анализ пептидов МАББЕТОЕ МБ.

Смесь пептидов была выделена хроматографией с обращенными фазами и фракции с хроматографических пиков были собраны и выпарены до сухого состояния. Образец был воспроизведен в 50 мкл 25 мМ фосфатного буфера, рН 7.5. БТТ был добавлен к окончательной концентрации 5 мМ и фракции были выдержаны при 50°С в течение 20 мин. После редукции IЛМ был добавлен к 10 мМ окончательной концентрации и выдержан в темноте при 50°С дополнительные 20 мин.

Спектры МАББЕМБ были получены на 0тп1Е1ех (Вгикег Ба1!ошсз, МА) с использованием азотного лазера (337 нм). Образцы были приготовлены путем смешивания 1 мкл образца с 1 мкл раствора матрицы. Раствор матрицы - насыщенный раствор а-циано-4-оксикоричной кислоты в 1 к 1 воды:ацетонитрил с 0.1% ТЕА. Смесь была помещена в ячейку пластины для образцов МЛ^^I и высушена на открытом воздухе до перенесения в масс-спектрометр. Все пептиды были проанализированы в положительно-ионном режиме в отраженном свете с помощью замедленной экстракции с использованием ускоряющего напряжения в 20 кВ времени задержки в 200 нс. Все 100 единичных спектров были собраны с каждого образца. Внешняя поверка была выполнена с использованием смеси стандартных протеинов, содержащих ангиотензин ΙΙ (1046.54 т/ζ), ангиотензин Ι (1296.68 т/ζ), вещество Р (1347.74 т/ζ), бомбезин (1619.82 т/ζ), АСТН фиксатор 1-17 (2093.09 т/ζ), АСТН фиксатор 18-39 (2465.20 т/ζ) и соматостатин (3147.47 т/ζ).

- 152 017765

Пример 9. Анализ среды и влияния составляющих среды на изотопы одиночной цепи и мультимера СТ^А4-Iд.

Димер СТ^А4-Iд, подфракция пониженной сиаловой кислоты, подфракция повышенной сиаловой кислоты, мономер фронтальный и изотопы мономера СТ^А4-Iд приготовлены и очищены. Эти образцы использованы в серии моделирующих экспериментов, спроектированных для определения влияния среды и составляющих среды на одиночную цепь и образование высокомолекулярной массы в течение времени между 0 до по крайней мере 60 ч. Проверены влияния буферного состава, йодоацетамида, фосфата натрия, хлорида аммиака, основной питательной среды, питательной среды брожения, среды 177е, среды концентрированного кислотного раствора Ι, среды концентрированного кислотного раствора ΙΙ, инсулина, ЕОТА, цистеина, липоевой кислоты, глутатнона, метионина и дрожжевых экстрактов по одному и в сочетаниях.

Пример 10. Анализирование молекул СТ^А4-Iд по размеру.

Метод гель-хроматографии (ЗЕС), который использует условия денатурации, может применяться для количественного анализа протеиновых изотопов различного размера. При одном практическом применении тандемного метода ЗЕС с использованием условий денатурации может применяться для количественного анализа изотопов одиночной цепи СТ^А4-Iд. Одиночная цепь СТ^А4-Iд может быть видом с недостающей межцепьевой дисульфидной связью. Изотоп одиночной цепи СТ^А4-Iд, выделенный во время процесса очистки, рассматривается как естественная одиночная цепь СТ^А4-Iд. Очищенная одиночная цепь, созданная восстановлением и алкилированием димера СТ^А4-Iд, рассматривается как искусственная одиночная цепь.

Естественная и искусственная одиночные цепи СТ^А4-Iд имеют одинаковые характеристики.

Материалы:

одноосновный фосфат калия (КН2Р04) АСЗ очищенный; гидроксид калия (К0Н) 45% г/г раствор АСЗ очищенный; хлорид натрия (№·ιί.Ί) АСЗ очищенный;

калиброванный регулируемый одинарный пипетор, 100 л;

раинин (каталог № Р-100);

вода (Н₂0) НРЬС очищенная;

2.0 мл криогенные флаконы Nа1деηе (каталог № 5000-0020);

концентрированная соляная кислота (НС1) Фишер (каталог № А144-212); каустическая сода, (№ЮН) I0N раствор;

ЕТ.Вакег (каталог № 5674-02);

1000-мл блок фильтров 0.22-мм гранулирование (каталог №430517);

полипропиленовая 15-мл пробирка Еа1соп (каталог № 352097);

азид натрия ^а^) АСЗ очищенный;

одноосновный фосфат натрия, моногидрат (NаН₂Р0₄-Н₂0);

гидроксид калия (К0Н) гранулы.

Измерения и условия:

система НРЬС модуля разделения Аа!егк 2695;

колонна Токо Наак 5 ρТЗК 3000 ЗАХЬ, 300 ммx7.8 мм Ι.Ό. (часть № 08541);

защитная колонна Токо Наак 5 цТЗК 3000 ЗАХЬ, 40 ммx6.0 мм Ι.Ό. (часть № 08543); детектор Аа!егк 2487;

детектор двойной длины волны;

длина волны 280 нм;

скорость потока 1 мл/мин;

система интеграции Εтρоге^;

объем впрыскивания 20 мкл;

анализ планового конуса, 10 мг/мл;

подвижная фаза 0.2 М КН₂Р0₄, 0.9% №С1, ρН 6.8 с К0Н;

время выполнения анализа 20 мин;

температура окружающей среды колонны;

температура образца 4°С;

время удержания мономера 8.7±1.0 мин, ВМА виды при 7.5±1.0 мин, если присутствующие виды МА будут элюировать после пика мономера.

Реагенты:

N гидроксид калия (4 N К0Н) (100 мл).

Используйте одно из следующих описываемых приготовлений.

Добавьте 40 мл очищенной воды НРЬС и 11.6 мл 45% г/г раствора К0Н в 100-мл мерную колбу. Доведите объем до 100 мл очищенной водой НРЬС. В 100-мл мерную колбу добавьте 80 мл очищенной воды НРЬС, взвесьте 22.4 г гранул К0Н и магнитно перемешайте до полного растворения. Доведите до объема 100 мл очищенной водой НРЬС.

- 153 017765

Перенесите раствор в 250-мл стеклянную колбу для реактивов. Хорошо перемешайте опрокидыванием. Храните при комнатной температуре до одного года. Подвижная фаза (0.2 М КН₂Р0₄, 0.9% ЫаС1, ρΗ 6.8).

Взвесьте 27.2 г КН₂Р0₄ и 9.0 г ЫаС1 в 1000-мл мензурку. Растворите твердые вещества в 800 мл очищенной воды НРЬС, постоянно помешивая магнитной палочкой для перемешивания.

Используя рН измеритель, установите рН раствора на 6.8, используя раствор 4 N К0Н. Если рН превышает 6.8, отрегулируйте его с помощью концентрированного НС1.

Доведите окончательный объем до 1 л, используя 1000-мл градуированный цилиндр. Профильтруйте раствор через 0.22-мкм блок фильтров.

Перенесите в 1000-мл стеклянную колбу для реактивов и диспергируйте во время вакуумной дегазации в течение 5±1 мин. Дегазируйте перед каждым использованием.

Храните при комнатной температуре до одного месяца. 2 N гидроксид натрия (2 N Ыа0Н).

Перелейте 20 мл 10 N Ыа0Н в 100-мл стеклянный градуированный цилиндр.

Доведите объем до 100 мл водой НРЬС.

Перелейте раствор в 250-мл стеклянную колбу для реактивов. Хорошо перемешайте опрокидыванием. Храните при комнатной температуре до одного года.

Взвесьте 3.45 г ЫаН₂Р0₄-Н₂0 и 2.92 г ЫаС1 и растворите, перемешивая палочкой в 900 мл очищенной воды НРЬС. С помощью измерителя рН установите рН раствора на 7.4 с 2 N Ыа0Н. Если рН превышает 7.4, отрегулируйте его концентрированным НС1.

Доведите окончательный объем до 1 л, используя 1000-мл градуированный цилиндр.

Профильтруйте раствор через 0.22-мкм блок фильтров.

Храните при 2-8°С до 6 месяцев.

Колонна буферного запаса (0.05% ^/ν ЫаЫа в воде).

Взвесьте 50±5 мг азида натрия и добавьте его 1000-мл мензурку с магнитной палочкой.

Добавьте 500 мл очищенной воды НРЬС в мензурку и мешайте до полного растворения.

Доведите объем до 1 л водой. Профильтруйте раствор через 0.22-мкм блок фильтров и вылейте в 1000-мл колбу для реактивов НРЬС. Храните при комнатной температуре до 6 месяцев.

Приготовление видов высокомолекулярной массы и стандарта, пригодного к системе.

Это будет предусматривать трехкратное разбавление нагретого и ненагретого исходного материала СТЬА4-1§ и 15-30% количества процентного соотношения видов высокомолекулярной массы. В 15-мл пробирке Еа1соп приготовьте приблизительно 3 мл исходного материала при 10.0±1.0 мг/мл, используя буфер разбавления СТЬА4-1д. Первоначальная концентрация СТЬА4-1д идет из СОА. Разбавьте 10.0+1.0 мг/мл от этого значения. Перенесите 1.0 мл разбавленного исходного материала в 2.0 мл криопузырек, используя 1-мл пипеттор, и подогрейте на водяной бане при 61±2°С в течение 45±2 мин. Перенесите нагретый исходный материал назад в 15-мл пробирку с помощью 1-мл пипеттора. Осторожно отбирайте пипеткой вверх и вниз 1 мл объема содержимого пробирки десять раз. Это стандарт, пригодный к системе. Условия хранения: подготовьте 150 мкл аликвоты стандарта, пригодного к системе, в 2.0 мл криопузырьки для хранения при -80±5°С до 1 года. Получите первоначальную концентрацию исходного материала и разбавьте 10.0±1.0 мг/мл от этого значения. Используйте минимум 100 мкл исходного материала и подходящее количество буфера разбавления, чтобы получить окончательную концентрацию 10.0±1.0 мг/мл. Используйте следующее уравнение для разбавлений:

Буфер разбавления для добавления = (объем аликвоты х начальная концентрация) - объем аликвоты

Конечная концентрация

Для лекарственного вещества СТЬА4-1§ приготовьте 10.0±1.0 мг/мл растворение из концентрации протеина, используя минимум 100 мкл аликвоты образца и подходящее количество буфера разбавления, чтобы получить окончательную концентрацию 10.0±1.0 мг/мл. Используйте следующее уравнение для разбавления:

(0.1 мл х 25 мг/мл) - 0.2 мл = 0.3 мл буфера разбавления мг/мл

После растворения до 10.0±1.0 мг/мл образцы могут храниться при 2-8°С до 24 ч. Для лекарственного продукта СТЬА4-1§ сделайте разбавление 10.0±1.0 мг/мл из концентрации протеина, используя минимум 200 мкл аликвоты образца и подходящее количество буфера разбавления, чтобы получить окончательную концентрацию 10.0±1.0 мг/мл. Используйте следующее уравнение для разбавления:

(0.2 мл х 25 мг/мл) - 0.2 мл = 0.3 мл буфера разбавления мг/мл

Поместите подвижную фазу в одном резервуаре растворителя и очищенную воду НРЬС в другом. Диспергируйте и вакуумируйте до функционирования. Включите детектор и дайте 15 мин для нагревания перед функционированием. До использования новой или не новой колонны для анализа промойте колонну очищенной водой НРЬС в течение минимум 20 мин, затем уравновесьте буфер подвижной фазы в течение минимум 20 мин. Используйте скорость потока 1.0 мл/мин. Дайте растаять 150 мкл аликвоты

- 154 017765 стандарта, пригодного к системе, добавьте его в пузырек автоматического пробоотборника и поместите пузырек в пробоотборник. Впрысните 20 мкл стандарта при этих условиях.

Определите процентное соотношение видов высокомолекулярной массы, элюирующих приблизительно 7.5 мин в соответствии со следующей формулой (в нижеприведенной формуле мономер действительно относится к димеру):

Площадь % видов высокомолекулярной массы = , (А) . _х юо (А) + (В) где А - площадь пиков видов высокомолекулярной массы;

В - площадь пиков мономера.

Площадь процентного соотношения видов высокомолекулярной массы не должна быть менее 15%. Если она менее 15%, добавьте дополнительные концентрированные виды высокомолекулярной массы к вышеуказанному стандарту, пригодному к системе.

Определение повторного растворения (К) и вычисление времени удержания.

Впрысните 20 мкл стандарта, пригодного к системе. Подсчитайте повторное растворение между видами высокомолекулярной массы (время удержания приблизительно 7.5 мин) и пиком мономера (время удержания приблизительно 8.7 мин), используя следующее уравнение (в нижеприведенной формуле мономер фактически относится к димеру):

2(12 -11)

Повторное растворение (К) =----------------\У2 + \У1 где 11 - время удержания видов высокомолекулярной массы;

- время удержания мономера;

- ширина пика видов высокомолекулярной массы;

Ш2 - ширина пика мономера.

Ширина пика измеряется в минутах на основе пика после экстраполирования относительно прямых сторон пика к основанию. Время удержания и ширина пика измеряются в одинаковых единицах. При одном практическом применении (К) должно быть >1.2 и время удержания для пика должно быть 8.7±1.0 мин.

Вычисление количества теоретических тарелок (№).

По хроматограмме стандарта, пригодного к системе, определите эффективность колонны, подсчитав количество теоретических тарелок (ЭД согласно следующему уравнению:

где 1 - время удержания мономера (мин);

\ν - ширина (мин) на основании мономера, полученная экстраполированием сторон пика к основанию.

Будут сделаны все 6 впрыскиваний материала СТЬА4-1§. Разделите аликвотами 200 мкл исходного материала 10 мг/мл в пузырек автоматического пробоотборника, поместите пузырек в автоматический пробоотборник и впрысните 6 раз. Проанализируйте хроматограммы и подсчитайте площадь пика димера для каждой хроматограммы. Суммируйте области максимумов димера с 6 хроматограмм и подсчитайте средний показатель, отклонение стандарта % К8Б согласно следующим уравнениям:

Х_<4-Х?. + Хз.,..Хп гь где Х₁-Х_п - специфическое значение в наборе данных; п_х - набор значений (х).

5.4.4.2 Подсчитайте отклонение стандарта:

где п - количество значений (х) в наборе данных;

х - одно значение в наборе данных.

5.4.4.3 Подсчитайте % относительное отклонение стандарта (К8Б):

% Κ8Ό = Отклонение стандарта х 100 среднее значение

- 155 017765

Пример последовательности впрыскивания.

ОБРАЗЕЦ	ВПРЫСКИВАНИЕ
Буфер холостого разведения	1 впрыскивание
Пригодность к системе	1 впрыскивание
Исходный материал	6 впрыскиваний
образец #1	2 впрыскивания
образец #2	2 впрыскивания
образец #3	2 впрыскивания
Исходный материал	1 впрыскивание
Буфер холостого разведения	1 впрыскивание

Интеграция максимумов.

Интегрируйте все области максимумов в хроматограмме от 5.5 до 11.8 мин. Увеличьте основание хроматограммы, чтобы обеспечить общую площадь для всех видов ЕМШ и НМШ, включенных в интеграцию. Не придавайте значения максимума в образце, который относится к максимумам в системе регулирования. Максимум объема включения (11.8-13.5 мин) и последующие максимумы не рассматриваются при данном вычислении. Однако, если площадь при объеме включения составляет 0.1% или больше от общей площади, это следует отметить. Максимум димера элюирует при 8.7±1.0 мин, максимум видов высокомолекулярной массы элюирует при 7.5±1.0 мин и виды низкомолекулярной массы (например, мономер, если есть) будут элюировать после максимума димера. Следует отметить любой максимум, кроме видов высокомолекулярной массы, димера или видов низкомолекулярной массы, который имеет коэффициент пропускания 280 нм, превышая 0.1 от области % от общей области максимумов. Подсчитайте процентное соотношение области (ссылка на ΑЬаΐасерΐ мономер в этом примере относится к димеру СТ^-^.)

7.2.1 Площадь % видов высокомолекулярной массы == (В) х 100 (А) + (В)+(С) (С)

7.2.2 Площадь % видов низкомолекулярной массы =.........— х 100 (А) + (В) + (С)

Площадь % мономера - 100-(площадь % ΗΜλΥ + площадь % ЬМ\¥) где А - площадь пика ΑЬаΐасерΐ мономера;

В - общая площадь всех пиков со временем удержания меньше, чем ΑЬаΐасерΐ мономера;

С - общая площадь всех пиков со временем удержания больше, чем пика ΑЬаΐасерΐ мономера (исключая объем включения).

Образцы отобраны гель-хроматографией с использованием ШаЮг'к Α11^аηсе® 2695 (МйГогб, МΑ) на двух колоннах 7.8x300 мм Т8К Ое1 О30008^ХЬ™ (ТокоН Вюкер, Моп1§отегу, ΡΑ), размещенных последовательно, с применением защитной колонны 6.0x40 мм. 25-мкл каждого очищенного образца было впрыснуто и выделено при изократических условиях с использованием 0.1 М Nа₂ΗΡΟ₄, 0.1 М №₂8Ο₄, рН 6.8 при 1.0 мл/мин. Образцы были определены при 280 нм, используя детектор 996 Ρ^Α (матрица фотодиодов) (Ша1егк, МйГогб, и проанализированы, используя программное обеспечение хроматографии

МШеппшт 4.0™ (Ша1егк, МйГогб, МΑ).

Накладываемые хроматограммы естественного искусственного материала одиночной цепи из денатурирующей аналитической тандемной гель-хроматографии показывают среднее время удержания (6 повторов) 27.96±0.02 и 27.99±0.02 соответственно. Площадь среднего пика для естественной одиночной цепи была 495525.0±9589.6 и для искусственной одиночной цепи - 463311.8±7997.2 (табл. 13). Накладываемые спектры МΑ^^I-ТΟЕ материала естественной и искусственной одиночной цепи имеют пики, которые достаточно широкие, с шириной основы около 15000 единиц массы. Это ожидается из-за неоднородности гликозилирования в обоих образцах. Высшая точка максимума одиночной цепи в каждом спектре масс была использована для подсчета средней массы. Средние массы для естественных и искусственных одиночных цепей СТ^Α4-Iд составляют 45694.426±297.735 и 45333.086±264.778 единиц массы соответственно, основанных на анализе шести повторов (табл. 14). Ожидается, что масса естественной одиночной цепи будет выше, чем искусственной одиночной цепи, потому что на естественной одиночной цепи присутствует дополнительный цистеин (остаточная масса 103 Да) на Сук 81%) ΙΌ ΝΟ:2, тогда как искусственная одиночная цепь является результатом избирательного понижения одиночной межцепьевой дисульфидной связи, за которым следует алкилирование, добавляющее ацетиловую группу (масса 58 Да).

Эти данные показывают, что естественные и искусственные материалы предоставляют равнознач

- 156 017765 ные результаты анализов денатурирующей хроматографии 8ЕС и МΑ^^I-ΊΟΡ. Эти результаты показывают сопоставимость между материалами естественной и искусственной одиночной цепи СΊ^Α4-Iд.

Таблица 13

Данные естественной и искусственной одиночной цепи НРЬС 8ЕС

повторы	искусственная	естественная
Время удержания (мин)	пик (1хУ8ес)	удержание (мин)	площадь пика (1хУ§ес)
1	27.985	470199	27.968	505576
2	27.979	464424	27.941	499800
3	27.977	469509	27.934	505708
4	27.998	469081	27.954	482472
5	28.027	453103	27.991	490434
6	28.016	453555	27.985	489160
спелний	27.997	463311.8	27.962	495525.0
8ίάεν	0.021	7997.2	0.023	9589.6
% Κδϋ	0.074	1.726	0.083	1.935 .

Таблица 14

Данные масс-спектрометрии МΑ^^I-ΊΟЕ естественной и искусственной одиночной цепи

повторы	искусственная 8С	Естественная 5>С масса
1	45397.896	45597.475
2	45432.199	45621.300
3	45256.929	45543.839
4	45433.849	45555.893
5	45381 812	45634.620
6	45348.376	45340.712
средний	45375.177	45548.973
δΐάεν	66.265	108.043
% Κ8ϋ	0.15	0.24

Присутствие цистеинов внутри полипептидной цепи позволяет образовать дисульфидные связи, которые могут быть интрамолекулярными или интермолекулярными, ведущими к образованию димерных или тетрамерных протеиновых комплексов. СΊ^Α4-Iд существует как димер (где димер состоит из двух мономеров, имеющих одну из следующих последовательностей: (1) 26-383 8Е^ ΙΌ Ν0:2, (ίί) 26-382 8Е^ ΙΌ Ν0:2; (ΐΐΐ) 27-383 8Е^ ΙΌ Ν0:2, (ίν) 26-382 8Е^ ΙΌ Ν0:2), (ν) 25-382 8Е^ ΙΌ Ν0:2 и (νι) 25-383 81% ΙΌ Ν0:2, удерживаются вместе одной дисульфидной связью между С¹⁴⁶ на каждой цепи. Редукция этой дисульфидной цепи может привести к образованию двух эквивалентных протеиновых цепей, скрепленных не ковалентными электростатическими полями. При подвергании денатурирующим условиям, которые разрушают или перевешивают силы электростатического напряжения, такой СΊ^Α4-Iд может полностью разложиться, приводя к двум идентичным протеиновым структурам в приблизительно 46 кДа. Полученная структура относится к одиночной цепи или мономеру. Присутствие одиночной цепи можно наблюдать с помощью функционирования тандемной колонны гель-хроматографии при денатурирующих условиях.

Субпопуляция молекул СΊ^Α4-Iд содержит модификацию на Суз¹⁴⁶: дисульфидная связь, присутствующая в большей части популяции, изменяется в свободную цистеиновую аминокислоту (имеет отношение к цистеиниляции). Димер СΊ^Α4-Iд в основном является протеином с молекулярной массой приблизительно 92.000. Состоит из двух гликозилированных полипептидных связей, которые держатся вместе одной межцепьевой дисульфидной связью при Суз¹⁴⁶ и не ковалентными взаимосвязями (также имеет отношение к димеру СΊ^Α4-Iд). Очищенный протеин существует как неоднородная популяция и содержит модификации, такие как гликозилирования и вариации при Ν- и С-концах.

Существует отдельная популяция молекул СΊ^Α4-Iд, которой не хватает межцепьевой дисульфидной связи. Эта нековалентно связанная популяция существует внутри фронтального пика димера, генерированного гель-хроматографией. Было обнаружено, что фронтальному димеру не хватает межцепьевой дисульфидной связи. Виды СΊ^Α4-Iд, которым не хватает межцепьевой дисульфидной связи, модифицируются цистеиниляцией при Суз¹⁴⁶, чья модификация проявляется при >99% видов одиночной цепи, основанных на неповрежденных данных Е8ПМ8. Цистеиниляция Суз¹⁴⁶ и обогащение О-связанных углеводородов являются двумя основными модификациями видов одиночной цепи СΊ^Α4-Iд. Фронтальный димер подвергается денатурирующей гель-хроматографии, приводящей к выделению пика одиночной цепи СΊ^Α4-Iд. Очищенный материал фронтального мономера сравнили с СΊ^Α4-Iд с и без выделения твердой фазы (8РЕ) и проанализировали на МΑ^^I. Очищенный фронтальный мономер содержит два доминантных вида: основной вид при или 47005 и для 8РЕ-обработанного, или 46897 и для необработанного; второстепенный вид при или 95070 и для 8РЕ-обработанного, или 96172 и для необработанного. Материал СΊ^Α4-Iд также содержит два доминантных вида: основной вид при или 91518 и для 8РЕобработанного, или 91143 и для необработанного; второстепенный вид при или 45660 и для 8РЕобработанного или 46014 и для необработанного.

- 157 017765

	Пример 1	Пример 2
Гель-однородный (НРЬС)	> 95.5 площади %	> 95.5 площади %
димер	> 97.0% площади %	97,0% площади %
Гель-однородный (НРЬС) вид с высокой моляной массой	<3.0 площади %.	<3.0 площади %.
Гель-однородный (НРЬС) вид с низкой молярной массой (мономер)	<2.0 площади %.	<2.0 площади %.
<0.5 площади %	<0.5 площади %

Состав СТ^А4-Iд при одном практическом применении имеет следующие характеристики в отношении гель-однородного (НРЬС) анализа димера, видов с высокомолекулярной массой и видов с низкой молекулярной массой (мономер, одиночная цепь):

>97.0% димер;

>2.0% видов НМА (с высокой молекулярной массой);

< 0.5% видов ЬМА (с низкой молекулярной массой) (например, мономер, одиночная цепь).

При другом практическом применении состав 01^4-0 имеет следующее характерное количество каждого вида:

>95.5% димера;

<3.0% видов НМА;

<0.5% видов ЬМА (например, мономер, одиночная цепь).

Сводка анализа ЗЕ-НРЬС хода процесса партий СБ-СН01

Ход процесса СО-СНО1
	п= 109
	димер	НМА
средний (%)	99.4	0.6
% СУ (коэффициент изменчивости)	0.3%	45.7%
минимум (%)	98.4	0.2
максимум (%)	99.8	1.6
95% толерантный интервал	>98.7	<1.3

Процент мономера варьировался от 98.4 до 99.8% со средним значением 99.4% для лекарственного вещества, произведенного с использованием процесса СБ-СН01. Процентное соотношение видов НМА варьировалось от 0.2 до 1.6%. Среднее значение было 0.6% с СУ (коэффициент изменчивости) 45.7%. 95% толерантный интервал был >98.7% для димера и <1.3% для видов высокомолекулярной массы. Процент видов высокомолекулярной массы партий варьировался от минимального значения 0.4% до максимального значения 2.1%. Средний процент видов НМА (высокомолекулярной массы) был 0.8% с % СУ в 40%. Во всех случаях виды низкомолекулярной массы или мономер были ниже предела обнаружения (ОГ 0.1%). Толерантный интервал 95% (для обеспечения охвата 99% площади популяции) для СТЬА4Ι§, произведенного процессом СЭ-СН01, был <1.3 и <1.8% соответственно для видов НМА. Толерантные интервалы 95% для димера в лекарственном веществе из процесса СЭ-СН01 были 98.7 и 96.5% соответственно.

- 158 017765

Отчет сводных данных для СТ^А4-Iд

	Димер (п=143)	НМАУ(п=141)
Средний (%)	99.3	0.6
%СУ	0.5	46.9
Минумум (%)	94.8	0.2
Максимум (%)	99.8	2.1
95% толерантный интервал	>97.3	<1.8
%СУ (между участками)	0.3%	26.4%
%СУ (внутри участка)	0.5%	44.2%
% СУ (весь участок)	0.6%	51.4%

Вышеуказанная таблица показывает, что процент видов НМ^ варьировался от 0.2 до 2.1% со средним показателем 0.6%. Димер варьировался от 94.8 до 99.8% со средним значением 99.3% и точностью 0.3%. Изменение между участками, внутри участка и изменение всего участка для димера находилось между 0.3 и 0.5%. Изменение между участками для НМ^ было 26.4%. Изменение внутри участка и всего участка было для процента видов НМ^ 44.2 и 51.4% соответственно. Толерантный интервал 95% для димера (97.3%) и видов НМ^ (1.8%) находился в пределах спецификации.

Пример 11. Построение вектора.

Построение рс8Б вектора экспрессии: вектор экспрессии, рс8Б был построен из серийно выпускаемого вектора пкДНК3 (Iην^ΐ^οβеη, Саг1кЬай, СА), как показано на фиг. 28. Генная кассета, устойчивая к неомицину, была удалена из плазмида пкДНК3 путем гидролиза с ограничением эндонуклеазы Иае I. Ограничение эндонуклеазы Иае I создает тупые концы. Фрагменты ДНК были выделены гельэлектрофорезом агарозы, и 3.821 кЬ рсОКА3 векторная основа была очищена от геля. Фрагмент ДНК, содержащий генную кодировку для дигидрофолатредуктазы мыши (ГОГг), и промотор 8У40 были выделены из плазмида р8У2-ТЬГг путем гидролиза плазмида с ограничением эндонуклеазы РуиП и ВатНТ Фрагмент 1.93 кб, относящийся к генной кассете ГОГг, был выделен и очищен гель-электрофорезом агарозы. 3-первичных углубленных концов, произведенные гидролизом ВатШ, были заполнены при использовании фрагмента Кленова полимеразы I ДНК для производства тупых концов. Этот выделенный фрагмент был привязан к векторной основе 3.8 кб пкДНК3 с тупым концом для создания вектора экспрессии рс8Б. Этот вектор экспрессии имеет следующие характеристики: промотор цитомегаловируса (СМУ), за которым следует множественный сайт встраивания, сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (ВСН) и транскрипционная последовательность терминации, ГОГг мыши с последовательностью ДНК для отбора и амплификации, и ген устойчивый к ампициллину и рСС происхождение репликации для отбора и поддерживания в ЕксЬепсЫа со11.

Построение вектора экспрессии ρс8^ЬиСТ^А4-Iβ: 1.2 кнлобазы (кб) фрагмента ОИА, содержащего последовательность кодирования протеина СТ^А4-Iβ, было выделено из плазмида ρС^М8-СТ^А4-Iβ гидролизом рестриктазами НтЛП и ХЬаТ Фрагмент 1.2-кб Н^ηЛΠ/XЬаI был привязан к вектору рГОИ до гидролиза рестриктазами НтЛП и ХЬаТ Полученная конструкция плазмида, обозначенная рГОИЬиСТ^А4-Iβ, показана на фиг. 21. Плазмид ρ^^N-ЬиСТ^А4-Iβ был использован как источник последовательности кодировки СТ^А4-Iβ, применяемой в конструировании окончательного вектора экспрессии ρс8^ЬиСТ^А4-Iβ.

Окончательный вектор для экспрессии гена СТ^А4-Iβ был сконструирован, как показано на фиг. 29. Фрагмент 1.2 кЬ ДНК, содержащий ген СТ^А4-Iβ, был выделен из плазмида ρ^^N-т^СТ^А4-Iβ с помощью двухступенчатой процедуры с ограничением гидролизата. Плазмид ρ^^N-ЬиСТ^А4-Iβ был сначала гидролизован рестриктазой НтЛП. Полученные 3-первичные углубленные концы были заполнены путем обработки фрагментом Кленова полимеразы I ДНК. Плазмид затем был гидролизован рестриктазой XЬаI для освобождения фрагмента 1.2 кб, содержащего ген СТ^А4-Iβ. Этот фрагмент был очищен и привязан к фрагменту ЕсоКУ и ХЬа! выделенному из ограничения гидролиза рс8О. Участки ограничения ЕсоКУ и XЬаI расположены на множественном сайте встраивания рс8О между промотором СМУ и кассетой, содержащей сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (ВСН) и транскрипционную последовательность терминации.

Такнм образом, фрагмент гена СТ^А4-Iβ поставлен под контроль промотора ЦМВ. Данная плазмида обозначается как ρс8^ЬиСТ^А4-Iβ и содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в 8Е^ ГО N0:1.

- 159 017765

Пример 12. Трансфекция вектора экспрессии СТЬА4-1д для получения линий стабильных клеток.

В данном примере и примере 13 описывается впервые трансфицированная популяция клеток, из которых были выбраны и выведены в культуру индивидуальные клоны, таким образом, выведенные клоны отличаются от клеток, имеющихся в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под входящим номером СКЬ-10762. Предыдущая клеточная линия СНО, включающая вектор экспрессии с ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, соответствующую СТЬА4-1д (ДНК под входящим номером АТСС 68629), описана в патенте США № 5434131. Вкратце, экспрессионная плазмида (например, рСЭМ8), содержащая кДНК, которая включена в АТСС под входящим номером 68629, была трансфицирована при помощи липофекции с использованием стандартных процедур в ДГФР-дефицитные клетки СНО для получения линий клеток, которые стабильно экспрессируют СТЬА4-1д. В результате скрининга В7-положительных клеточных линий СНО на связывание В7 в среде с использованием иммунного окрашивания выявлен стабильный трансфектант, экспрессирующий СТЬА4-1д. Гетерогенная популяция трансфицированных клеток обозначена как линия клеток яичников китайского хомячка СТЬА4-1д-24 и включена в АТСС согласно Будапештскому договору от 31 мая 1991 г. под входящим номером СКЬ10762.

Линия клеток яичников китайского хомячка, ЭС44, включает делецию гена, несущего информацию о ферменте дигидрофолатредуктазе. Экспрессионная плазмида рсЗПЬиСТЬА4-1д содержит копию гена дигидрофолатредуктазы (ДГФР). В результате введения плазмиды рсЗПЬиСТЬА4-1д в геном ΌΟ44 наблюдается функциональная комплементация делеции ДГФР. Данную функциональную комплементацию можно использовать для выбора трансфектантов в присутствии метотрексата (МТ), а также амплификации ДГФР и смежных генов.

Человеческая СТЬА4-1д-секретирующая линия клеток 1Ό5 создана посредством трансфекции клеточной линии ЭС44 экспрессионной плазмидой рсЗПЬиСТЬА4-1д, как показано на фиг. 29. ДНК плазмиды вводили в клетки ЭС44 при помощи электропорации посредством известных в данной области стандартных процедур. Трансфектанты отбирали с использованием минимальной поддерживающей среды (МЕМ; корпорация ЖН Вюкаепсек, штат Канзас), дополненной 5% (об./об.) диализированной эмбриональной бычьей сывороткой. Далее проводили скрининг надосадочной жидкости культур трансфектантов на продуцирование человеческого 1дС при помощи сэндвич-метода твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫЗА). В качестве иммобилизованных антител использовали козьи антитела, специфичные к Рс-фрагменту 1дС человека. Для выявления человеческого 1дС использовали козьи антитела к 1дС человека, конъюгированные с пероксидазой хрена. Трансфектанты, экспрессирующие большее количество человеческого гена СТЬА4-1д, отбирали для дальнейшей амплификации.

Амплификацию генов отобранных трансфектантов осуществляли добавлением МТ в культуральную среду при конечной концентрации 100 нМ. МТ - аналог фолиевой кислоты, который действует как конкурентный ингибитор дигидрофолатредуктазы. Добавление МТ в среду позволило отобрать трансфектанты, содержащие множественные копии гена ДГФР и повышенный уровень дигидрофолатредуктазы. Трансфектанты, также содержащие множественные копии смежного гена СТЬА4-1д, были идентифицированы с помощью метода ЕЬ1ЗА, специфичного к человеческому 1дС. Клон, продуцирующий СТЬА4-1д, обозначенный как 1Ό5, был отобран для последующего культивирования, описанного в примере 13.

Пример 13. Субклонирование стабильно трансфицированных клеток.

Клеточную линию 1Ό5 подвергли клонированию в мягком агаре. Субклоны, полученные в результате, анализировали на продуцирование человеческого 1дС методом ЕЬ1ЗА. Отобранные субклоны оценивали касательно продуцирования СТЬА4-1д и ростовых свойств. Был выбран ведущий субклон, обозначенный как Ш5-100А1.

Клеточную линию Ш5-100А1 адаптировали из среды ОЕ (корпорация ЖН Вюкаепсек, штат Канзас), которая содержит сырье, полученное от животных, в химически определенную среду, обозначенную как СЭ-СН0 (табл. 15). СЭ-СН0 - патентованная среда без компонентов животного происхождения, которую производит корпорация 1пу|1годеп, Карлсбад, штат Калифорния.

- 160 017765

Таблица 15

Состав среды для процесса Υ

Компонент	Концентрация
СО-СНО 25х растворимые кислоты I	40,0 мл/л
СО-СНО 25х растворимые кислоты II	40,0 мл/л
СЭ-СНО 25х соли I	40,0 мл/л
СО-СНО 25х соли II	40,0 мл/л
Ь-глутамин	0,585 г/л
Рекомбинантный человеческий инсулин (раствор 10 мг/мл)	0,1 мл/л
Метотрексат (раствор 20 мМ)	5 мкл/л
Натрия бикарбонат	2,22 г/л
Вода	По необходимости
Раствор 1 N НС1	0—5 мл/л для коррекции рН
Раствор 10 N ИаОН	0—10 мл/л для коррекции рН

Клеточную линию 1В5-100А1 культивировали и пассировали в среду БЕ в соответствии со стандартным протоколом культивирования тканей. Затем клетки переносили в среду, состоящую на 50% из среды ΌΞ и на 50% из среды СП-СН0. После нескольких пассажей в данную среду клетки переносили в культуральные флаконы, содержащие 100% среды СП-СН0. В 100% среде СП-СН0 выращивали клетки для нескольких пассажей. Затем адаптированные клетки подвергали клонированию методом серийных разведений.

Клетки из СВ-СН0-адаптироваиной клеточной линии 1В5-100А1 клонировали методом серийных разведений с использованием бессывороточной среды. Клетки Ю5-100А1 засевали из расчета 1 клетка на лунку в 96-луночные титрационные микропланшеты, содержащие вспомогательную среду МСНВ. МСНВ представляет собой химически определенную среду, которую распространяет компания БштаА1бпсЫ, Сент-Луис, штат Миссури. Среду МСНВ дополнили 4 мМ глутамина, 500 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулина, 100 иМ МТ и 10% кондиционированной среды. Кондиционированной средой являлась стерилизованная посредством фильтрации надосадочная жидкость культуры из С0-СН0адаптированной клеточной линии 1^5-100Λ1, выращенной в среде МСНВ.

Далее идентифицировали лунки, содержащие одну колонию, и оценивали клоны при помощи метода Е1 ЛБА на продуцирование СТ^Λ4-Iд. Отобранные клоны выводили в культуру из 96-луиочиых титрациоииых микропланшетов в 6-луиочиые культуральные планшеты. Затем объем культуры увеличивали в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см² и в роллерных бутылях.

Культуры в роллерных бутылях оценивали на титр СТ^Λ4-Iд, содержание сиаловой кислоты СТ^Λ4-Iд и рост. Три клона отобрали для дальнейшего анализа в биореакторах и характеристики. Для создания банка клеток использовали замороженную в сосудах исследуемую массу клеточных клонов 1^5-100Λ1.17, хранимую при температуре -80°С.

Пример 14. Получение СТ^Λ4-Iд в биореакторах посредством периодической подпитки.

Коммерческое культивирование суспензии клеток млекопитающих, которые экспрессируют СТ^Λ4-Iд: в данном примере описывается получение молекул СТ^Λ4-Iд, содержащих мономеры последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в БЕР ΙΌ N0:2, из суспензионной культуры ДГФР-дефицитных клеток СНО. Приведенные методы можно адаптировать и расширить для получения других рекомбинантных белков, в том числе среди прочего, таких секретируемых белков, как цитокины и другие гормоны, секретируемых белков, которые являются членами суперсемейства иммуноглобулинов или включают часть белка, относящегося к суперсемейству иммуноглобулинов, а также, в целом, любых белков, экспрессируемых в клетках СНО. Схема технологического процесса культивирования СТ^Λ4-Iд изображена на фиг. 10.

На этапе увеличения объема инокулята в процессе культивирования СТ^Λ4-Iд, чтобы сериально репродуцировать клетки из замороженного флакона, обеспечив достаточное количество жизнеспособных клеток для инокуляции в 20000-л биореактор, использовали культуральные флаконы (например, Т-175 и колбы Эрленмейера), роллерные бутыли и культуральные мешочки.

Один сосуд с клетками вынимают из паровой фазы системы охлаждения жидким азотом и размораживают на водяной бане при температуре 37°С. Все содержимое сосуда с соблюдением асептики переносят в стерильную коническую центрифужную пробирку 15 мл. Затем добавляют среду СП-СН0 до конечного объема 10 мл. Клеточную суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют и дебрис ресуспендируют в 10 мл культуральной среды СП-СН0. Ресуспеидироваииые клетки переносят во флаконы Т-175, содержащие 10 мл среды СП-СН0. Определяют концентрацию жизнеспособных клеток

- 161 017765 и процент жизнеспособности культуры во флаконе Т-175. На данном этапе установлен критерий процента жизнеспособности >84%. Во флакон Т-175 добавляют среду СЭ-СН0 для достижения целевой концентрации жизнеспособных клеток 1.6-2.6х10⁵ клеток/мл.

Инкубирование флаконов Т-175 проводят при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 6% углекислого газа в течение максимум четырех дней до целевого финального количества >6х10⁶ жизнеспособных клеток. После завершения обработки во флаконах Т-175 объем культуры увеличивают с использованием серии шейкеров, 1- и 2-л роллерных бутылей, как показано на фиг. 10. При каждом пассаже клетки высевают с целевой плотностью 2.0х10⁵ жизнеспособных клеток/мл, при этом целевая конечная жизнеспособность клеток культуры составляет >80%. Инкубирование культуры в среде СЭ-СН0 проводят при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 6% углекислого газа в течение максимум четырех дней.

Увеличение объема культуры происходит в серии культуральных мешочков (20-, 100- и 200-л) для последующей инокуляции в 1000-л биореактор. Материал культуры клеток, полученный на стадии увеличения объема инокулята в 2-л роллерных бутылях, собирают для инокуляции в 20-л культуральный мешочек при целевой плотности засевания 2.0х10⁵ жизнеспособных клеток/мл. Заданы следующие значения: конечная плотность жизнеспособных клеток на стадии увеличения объема инокулята в 2-л роллерных бутылях 1.0-2.0х10⁶ клеток/мл, минимальный процент жизнеспособности клеток >80%. После инокуляции культуру из 20-л мешочка инкубируют в среде СЭ-СН0 при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 6% углекислого газа в течение максимум четырех дней. При каждом последующем пассаже (100- и 200-л культуральные мешочки) клетки засевают с целевой плотностью 2.0х10⁵ жизнеспособных клеток/мл, при этом целевая конечная жизнеспособность клеток культуры составляет >80%. Инкубирование культуры в среде С0-СН0 проводят при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 6% углекислого газа в течение максимум четырех дней. Заданы следующие образцовые значения: конечная плотность жизнеспособных клеток на стадии увеличения объема инокулята в 20-, 100- и 200-л культуральных мешочках 1.0-2.0х10⁶ клеток/мл, минимальный процент жизнеспособности клеток >80%. При данных образцовых значениях обеспечивается достаточное количество жизнеспособных клеток для инокуляции в 1000-л биореактор.

Целью стадии увеличения объема инокулята в 1000- и 4000-л биореакторе для выращивания посевного материала в рамках производства СТЬА4-1д является получение достаточного количества жизнеспособных клеток для инокуляции в 20000-л продукционный биореактор.

Биореакторы для выращивания посевного материала действуют в режиме производства по одной партии с использованием культуральной среды С0-СН0. Температуру, рН, концентрацию растворенного кислорода, давление, скорость перемешивания, расход воздуха, кислорода и углекислого газа контролируют при помощи распределенной системы управления (РСУ), обеспечивая условия для оптимального роста культуры в биореакторах для выращивания посевного материала. Биореакторы для выращивания посевного материала работают при температуре 37°С. Для определения плотности жизнеспособных клеток, процента жизнеспособности и концентрации метаболита берут пробы культуры из данных биореакторов.

В 1000-л биореактор для выращивания посевного материала вводят инокулят, полученный на стадии увеличения объема культуры в 200-л культуральном мешочке, до целевой исходной плотности 1.03.0х10⁵ жизнеспособных клеток/мл. Инкубацию культуры в среде СЭ-СН0 проводят при температуре 37°С в течение максимум пяти дней. Заданы следующие образцовые значения: конечная плотность жизнеспособных клеток на стадии увеличения объема инокулята в 1000-л биореакторах для выращивания посевного материала 1.0-2.0х 10⁶ клеток/мл, минимальный процент жизнеспособности клеток >80%.

В 4000-л биореактор для выращивания посевного материала вводят инокулят, полученный на стадии увеличения объема культуры в 1000-л биореакторе для выращивания посевного материала, до целевой исходной плотности 1.0-3.0х10⁵ жизнеспособных клеток/мл. Инкубацию культуры в среде СЭ-СН0 проводят при температуре 37°С в течение максимум шести дней. Заданы следующие образцовые значения: конечная плотность жизнеспособных клеток на стадии увеличения объема инокулята в 4000-л биореакторах для выращивания посевного материала 1.0-2.0х10⁶ клеток/мл, минимальный процент жизнеспособности клеток >80%. При данных образцовых значениях обеспечивается достаточное количество жизнеспособных клеток для инокуляции в 20000-л продукционный биореактор.

В 20000-л биореактор для выращивания посевного материала вводят инокулят, полученный на стадии увеличения объема культуры в 4000-л биореакторе для выращивания посевного материала, до целевой исходной плотности 1.0-1.8х 10⁵ жизнеспособных клеток/мл. Инкубацию культуры в среде С0-СН0 проводят при температуре 37°С в течение максимум шести дней.

Заданы следующие образцовые значения: конечная плотность жизнеспособных клеток на стадии увеличения объема инокулята в 20000-л биореакторе для выращивания посевного материала 1.0-2.0х 10⁶ клеток/мл, минимальный процент жизнеспособности клеток >80%. При данных образцовых значениях обеспечивается использование достаточного количества жизнеспособных клеток до начала фазы образо

- 162 017765 вания продукта в 20000-л продукционном биореакторе.

Коммерческое производство СТЬА4-1д: на фазе образования продукта для данного изобретения, протекающей в 20000-л продукционном биореакторе, получают большое количество высококачественного белка СТЬА4-1д, осуществляя серию прогонов культуры с двухэтапным температурным сдвигом. 20000 л культуры, которые инкубировали в среде С^-СНΟ при температуре 37°С в течение максимум 6 дней (как указано выше), на шестой день (конец фазы логарифмического роста) подвергают температурному сдвигу (ΐ-сдвиг) с 37 до 34°С. Через 12 ч после температурного сдвига с 37 до 34°С среду С^-СНΟ дополняют модифицированной питательной средой еКБЕ (корпорация 1пуйгодеп, Карлсбад, штат Калифорния, табл. 16, 17) и ежедневно вводят данное питание в продукционный реактор болюсом (1% в весовом отношении).

Таблица 16

Состав питательной среды еКБЕ

Компонент	Концентрация
Среда еКВР-1 (корпорация ΙηνίΐΓθ§εη)	16,47 г/кг
Декстроза	30,29 г/кг
ϋ-галактоза	12,38 г/кг
Ь-глутамин	4,02 г/кг
Рекомбинантный человеческий инсулин (раствор 10 мг/мл)	0,98 мл/кг
Дрожжевой экстракт для культуры ткани	4,90 г/кг
Вода	По необходимости
Раствор 1 N НС1	0—5 мл/кг для коррекции рН
Раствор 10 N ИаОН	0—2 мл/кг для коррекции рН

Таблица 17

Состав среды еКБЕ-1

- 163 017765

Инкубирование 20000 л культуры в среде СБ-СН0, ежедневно дополняемой питательной средой еКВР, проводят при температуре 34°С в течение максимум 4 дней. На десятый день 20000 л культуры подвергают второму ΐ-сдвигу с 34 до 32°С. Для 20000 л культуры в продукционном биореакторе поддерживали температуру 32°С в течение максимум 8 дней. На восемнадцатый день пробу культуры анализировали относительно следующих образцовых значений: плотность жизнеспособных клеток на стадии производства в 20000-л биореакторе для выращивания посевного материала 3.0-8.0х10⁶ клеток/мл; минимальный процент жизнеспособности клеток >38%; конечная молярная концентрация сиаловой кислоты >6; конечный титр произведенного белка СТЬА4-1д 0.5-1.3 г/л. При данных образцовых значениях обеспечивается получение из рекомбинантной линии клеток СНО достаточного количества белка приемлемого качества и готовность к сбору 20000 л культуры клеток млекопитающих.

В культуру биореактора на протяжении фазы образования продукта ежедневно вводят болюс питания в виде модифицированной среды еКВР (табл. 16, 17): через 12 ч после первого температурного сдвига (с 37 до 34°С) добавляют питательную среду в количестве минимум 1% от объема культуры. При снижении уровня глюкозы <3 г/л добавляют расчетный объем до восстановления уровня глюкозы 3 г/л.

Для объема 20000 л фаза образования продукта длилась 18 дней. Из продукционного биореактора ежедневно брали пробы на анализ. Например, пробу, использованную для подсчета клеток, окрашивали трипановым синим (компания 81§та, Сент-Луис, штат Миссури). Количество и жизнеспособность клеток устанавливали с помощью гемоцитометра, подсчитывая жизнеспособные окрашенные клетки под микроскопом. Для анализа метаболитов центрифугировали дополнительную аликвотную пробу в течение

- 164 017765 мин при 2000 об/мин (4°С) для осаждения клеток. Надосадочную жидкость анализировали в отношении титра белка, сиаловой кислоты, глюкозы, лактата, глутамина, глутамата, рН, рО2, рСО2, аммиака и ЛДГ, используя традиционные для данной области методы и протоколы.

Пример 15. Очищение рекомбинантного СТ^Ά4-Iд.

Анионообменная хроматография с ОХЬ для очищения СТ^Ά4-Iд: на стадии анионообменной хроматографии в рамках обработки СТ^Ά4-Iд используют анионообменную смолу торговой марки 08ер11аго5е Ех1гете Ьоаб (ОХЬ). Данную смолу выпускает компания СЕ Неа11йсаге, Уокешо, штат Висконсин (ранее Атегкйат Вюкаепсек). На стадии хроматографии с ОХЬ захватывают и концентрируют димер СТ^Ά4-Iд из материала, полученного на стадиях сбора клеток, для дальнейшего производства и выделения целевого продукта.

В колонку с внутренним диаметром 1.0-2.0 м вводят смолу ОХЬ на высоту 17-30 см, что соответствует объему 643-1018 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее высоты, эквивалентной одной теоретической тарелке (НЕТР), и асимметрии (АД Колонка для хроматографии с ОХЬ характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и А, 0.8-1.2.

Колонка для хроматографии с ОХЬ функционирует при температуре окружающей среды. Очищенный культуральный бульон загружают в уравновешенную колонку для хроматографии с ОХЬ. Хроматографию с ОХЬ проводят при максимальной скорости потока 99.4 л/мин. Давление на входе колонки поддерживают ниже 35 рад. Максимальное содержание белка СТ^А4-Iд в колонке для хроматографии с ОХЬ - 28 г СТ^А4-Iд на 1 л смолы.

Вначале колонку для хроматографии с ОХЬ дезинфицируют при помощи раствора 1 N гидроксида натрия. Раствор используют в количестве, равном 2-4 объемам колонки (ОК). Дезинфекцию завершают, когда проводимость эффлюента составляет 169±33 мС/см, затем колонку выдерживают в течение 60-120 мин.

После дезинфекции колонку уравновешивают при помощи буфера, содержащего 75 мМ НЕРЕ8, 360 мМ хлорида натрия, рН 8.0. Колонку считают уравновешенной, пропустив через нее буфер в количестве минимум 3 ОК, а также достигнув значений рН и проводимости эффлюента 8.0±0.2 и 13.4±1.0 мС/см соответственно.

Перерабатываемый материал, полученный на стадиях сбора клеток, загружают в колонку для хроматографии с ОХЬ. Колонку промывают с использованием промывочного буфера (75 мМ НЕРЕ8, 360 мМ №С1, рН 8.0) в количестве минимум 10 ОК, в конце данного этапа измеряют поглощение эффлюента при длине волны 280 нм (А₂₈₀). Затем СТ^А4-Iд элюируют из колонки с помощью буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 325 мМ №С1 или 850 мМ №С1, рН 7.0. Элюат отводят в сосуд для сбора, когда А₂₈₀ превышает значение, полученное в конце этапа промывания, >0.02 единиц оптической плотности (ЕОП). Элюат собирают, пока А₂₈₀ заднего края пика элюирования не снизится до значения <1.0 ЕОП.

Собирают димерный продукт СТ^А4-Iд с молярным соотношением сиаловой кислоты и белка СТ^А4-Iд >8, имеется также пул высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд в количестве <25.6%. Высокомолекулярный материал СТ^А4-Iд, включающий тетрамеры, можно затем очистить для использования в качестве отдельной субстанции при описанных в данном документе методах лечения.

Гидрофобная хроматография с Р11епу1 8ер11аго5е РР для очищения СТ^А4-Iд: на этапе гидрофобной хроматографии используют смолу торговой марки Рйепу1 8ер11аго5е Ра§1 Р1о\у (компания СЕ Неа11йсаге, Уокешо, штат Висконсин (ранее Атегайат Вюкаепсек)). В ходе гидрофобной хроматографии снижают уровень высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд, присутствующего в пуле продукта хроматографии с ОХЬ. Димер СТ^А4-Iд не связывается со смолой для гидрофобной хроматографии при условиях загрузки, используемых на данном этапе.

В колонку с внутренним диаметром 1.0-2.0 м вводят смолу Рйепу1 8ерйаго5е Ра§1 Р1о\у на высоту 1822 см, что соответствует объему 680-852 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее НЕТР и А,. Колонка для гидрофобной хроматографии характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и А, 0.8-1.2.

Колонка для гидрофобной хроматографии функционирует при температуре окружающей среды. Пул элюата из колонки для хроматографии с ОХЬ без дальнейшей обработки загружают в уравновешенную колонку для гидрофобной хроматографии. Этап гидрофобной хроматографии проходит при максимальной скорости потока 65.4 л/мин и рабочем давлении <13 рад. Максимальное содержание белка СТ^А4-Iд в колонке для гидрофобной хроматографии - 10.0 г белка СТ^А4-Iд на 1 л смолы. Возможно проведение нескольких циклов гидрофобной хроматографии в зависимости от количества белка СТЬА4присутствующего в пуле элюата ОХЬ.

Вначале колонку для гидрофобной хроматографии дезинфицируют при помощи раствора 1 N гидроксида натрия. Дезинфекцию завершают, пропустив через колонку 2-4 ОК раствора. Затем колонку выдерживают в течение 60-120 мин, чтобы гарантировать эффективность санитарной обработки.

После дезинфекции колонку уравновешивают при помощи буфера, содержащего 75 мМ НЕРЕ8, 2.55 М хлорида натрия, рН 7.0. Уравновешивание завершают, пропустив через колонку минимум 3 ОК

- 165 017765 уравновешивающего буфера, а также достигнув значений рН и проводимости эффлюента 7.0±0.3 и 71.575.5 мС/см соответственно.

Элюат, полученный на стадии хроматографии с ЦХЬ, применяют в уравновешенной колонке для гидрофобной хроматографии. Затем колонку промывают с помощью уравновешивающего буфера, пока А₂₈₀ эффлюента не снизится до 0.8-1.0 ЕОП. Эффлюент, содержащий белок СТ^А4-Iд, после каждого цикла в рамках гидрофобной хроматографии пропускают через фильтр из ацетилцеллюлозы 0.2 мкм, отводя в сосуд для сбора из обычной нержавеющей стали. Пул продукта гидрофобной хроматографии держат в сосуде для сбора при температуре 2-8°С. Максимальный срок хранения в сосуде для сбора составляет 3 дня.

Собирают димерный продукт СТ^А4-Iд с молярным соотношением сиаловой кислоты и белка СТ^А4-Iд >8, имеется также пул высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд в количестве <2.5%.

Аффинная хроматография с рекомбинантным белком А для очищения СТ^А4-Iд: аффинная смола торговой марки ЗерНагс^е Ε·ΐδΙ Иоте на основе рекомбинантного белка А (гРА), использованная в производстве и выделении СТ^А4-Iд, изготовлена компанией 0Е Неа1!Ьсаге (Уокешо, штат Висконсин (ранее АтегаЬат В^οδс^еηсеδ)). В колонке для хроматографии с гРА белок СТ^А4-Iд подвергают дальнейшему очищению. На данном этапе удаляют ДНК и белки клеток-хозяев, в том числе белки хемотаксиса моноцитов 1.

В колонку с внутренним диаметром 80-140 см вводят смолу гРА на высоту 18-25 см, что соответствует объему 339-372 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее НЕТР и А Колонка характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и А 0.8-1.2. В ходе исследования срока службы смолы гРА выяснено, что ее можно использовать максимум 60 раз.

Колонка для хроматографии с гРА функционирует при температуре окружающей среды. После уравновешивания в нее загружают пул продукта инактивации вируса. Этап хроматографии с гРА проходит при максимальной скорости потока 26.6 л/мин и рабочем давлении <13 рδ^д. Максимальное содержание белка СТ^А4-Iд в колонке для хроматографии с гРА - 25 г белка СТ^А4-Iд на 1 л смолы.

Колонку для хроматографии с гРА уравновешивают при помощи буфера, содержащего 25 мМ Трис, 250 мМ №С1, рН 8.0. Уравновешивание завершают, пропустив через колонку минимум 3 ОК уравновешивающего буфера, а также достигнув значений рН и проводимости эффлюента 7.8-8.2 и 23.0-27.0 мС/см соответственно.

В уравновешенной колонке для хроматографии с гРА применяют пул продукта, полученный на стадии инактивации вируса. Стадия хроматографии с гРА включает два этапа промывки. Первую промывку осуществляют при помощи минимум 5 ОК буфера, содержащего 25 мМ Трис, 250 мМ №С1, 0.5% Тритон Х-100, рН 8.0, удаляя из колонки для хроматографии с гРА слабосвязанный материал. Вторую промывку осуществляют при помощи буфера, содержащего 25 мМ Трис, 250 мМ №С1, рН 8.0. При второй промывке используют минимум 5 ОК для удаления из колонки остатков Тритон Х-100.

Белок СТ^А4-Iд элюируют из колонки для хроматографии с гРА при помощи буфера, содержащего 100 мМ глицина, рН 3.5. Элюат отводят в сосуд для сбора, когда А₂₈₀ превышает исходные значения >0.2 ЕОП. Эффлюент пропускают через фильтр из ацетилцеллюлозы 0.2 мкм и выводят в сосуд для сбора, оборудованный смесителем. Элюат собирают, пока А280 заднего края пика элюирования не снизится до значения <0.2 ЕОП. рН пула элюата корректируют до значения 7.5±0.2 с помощью буфера, содержащего 2 М НЕРЕЗ, рН 8.0. Пул продукта, полученный на этапе хроматографии с гРА, держат при температуре 2-8°С в течение максимум 3 дней.

Собирают димерный продукт СТ^А4-Iд с молярным соотношением сиаловой кислоты и белка СТ^А4-Iд >8, имеется также пул высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд в количестве <2.5% и пул белка хемотаксиса моноцитов 1 в количестве <38 нг/мл.

Анионообменная хроматография с ЦЕЕ для очищения СТ^А4-Iд: на стадии анионообменной хроматографии в рамках производства и выделения СТ^А4-Iд используют анионообменную хроматографическую смолу торговой марки Ц-ЗерНагс^е Ε·ΐδΙ Иоте (ЦЕЕ) (компания 0Е Неа1!Ьсаге, Уокешо, штат Висконсин (ранее Ате^Иат В^οδс^еηсеδ)). Целью хроматографии с ЦЕЕ является снижение уровня остаточного белка А и дальнейшее уменьшение количества ДНК клеток-хозяев в пуле продукта после этапа вирусной фильтрации. Колонку для хроматографии с ЦЕЕ также используют для контроля молярного отношения сиаловой кислоты к белку СТ^А4-Iд пула продукта, получаемого на этапе хроматографии с ЦЕЕ, и уровня перерабатываемого высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд. Первичной точкой внутрипроизводственного контроля над сокращением количества высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд является этап гидрофобной хроматографии.

В колонку с внутренним диаметром 60-140 см вводят смолу ЦЕЕ на высоту 28-35 см, что соответствует объему 536-667 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее НЕТР и А Колонка характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и А 0.8-1.2.

Колонка для хроматографии с ЦЕЕ функционирует при температуре окружающей среды. После уравновешивания в нее загружают пул продукта для этапа фильтрации вируса. Хроматографию с ЦЕЕ проводят при максимальной скорости потока 38.6 л/мин и рабочем давлении <35 рδ^д. Максимальное

- 166 017765 содержание белка СТ^А4-Iд в колонке для хроматографии с РЕЕ - 25 г СТ^А4-Iд на 1 л смолы.

Вначале колонку для хроматографии с РЕЕ дезинфицируют при помощи раствора 1 N гидроксида натрия. Последний используют в количестве 2-4 ОК. Дезинфекцию завершают, когда проводимость эффлюента составляет 136-202 мС/см, затем колонку выдерживают в течение 60-120 мин.

После дезинфекции колонку уравновешивают при помощи буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 100 мМ хлорида натрия, рН 8.0. Уравновешивание заканчивают, пропустив через колонку минимум 4 ОК буфера, а также достигнув значений рН и проводимости эффлюента 7.6-8.3 и 10.5-12.9 мС/см соответственно.

Пул продукта фильтрации вируса, содержащийся в биопроцессорных мешочках, переносят в стерильные сосуды для сбора из нержавеющей стали.

Пул продукта фильтрации вируса применяют в уравновешенной колонке для хроматографии с РЕЕ. Стадия хроматографии РЕЕ включает два этапа промывки. Первую промывку осуществляют при помощи буфера в количестве минимум 5.0 ОК, содержащего 25 мМ Трис, 120 мМ №С1, рН 8.0. Вторую промывку осуществляют при помощи буфера в количестве минимум 5.0 ОК, содержащего 25 мМ Трис, 130 мМ №С1, рН 8.0.

Димер СТ^А4-Iд элюируют из колонки для хроматографии с РЕЕ при помощи буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 200 мМ №С1, рН 8.0. К сбору элюата приступают, когда начинает возрастать А₂₈₀ эффлюента. Во время элюирования эффлюент пропускают через фильтр из ацетилцеллюлозы 0.2 мкм и выводят в сосуд для сбора из нержавеющей стали. Элюат собирают, пока поглощение заднего края пика элюирования не снизится до значения <0.2 ЕОП выше исходного уровня. Затем сосуд для сбора охлаждают до 2-8°С. Максимальный срок хранения пула продукта хроматографии с РЕЕ при температуре 28°С составляет 3 дня.

Собирают димерный продукт СТ^А4-Iд с молярным соотношением сиаловой кислоты и белка СТ^А4-Iд >8, имеется пул высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд в количестве <2.5%, пул низкомолекулярного материала СТ^А4-Iд (например, мономер СТ^А4-Iд) в количестве <0.5% и пул белка хемотаксиса моноцитов 1 в количестве <9.5 нг/мл.

На этапе концентрации и диафильтрации в рамках производства и выделения СТ^А4-Iд используют систему проточной фильтрации вдоль потока компании Ра11 ЕШтоп. Целью данного этапа является концентрация пула продукта, полученного на этапе хроматографии с РЕЕ, до 45-55 г/л и замена элютивного буфера, который использовался для хроматографии с РЕЕ, финальным буфером, применяемым для составов СТ^А4-Iд. Сконцентрированный пул продукта белка СТ^А4-Iд пропускают через поливинилиденфторидный фильтр 0.2 мкм и переносят в 50-л биопроцессорный мешочек.

Пример 16. Определение молярного соотношения аминомоносахаридов СТ^А4-Iд.

В данном примере описаны методы получения молярного соотношения аминомоносахаридов (№ ацетилгалактозамин, Кацетилглюказамин) и белка в пробах СТ^А4-Iд.

Инструментарий: система капиллярного электрофореза типа Бекман Р/АСЕ МБР, система индуцированной лазером флуоресценции с детектором типа Бекман (совмещенная с Р/АСЕ МБР); капилляр без покрытия (внутренний диаметр 25 мкм; внешний диаметр 360 мкм) общей длиной 27-31 см для Р/АСЕ МБР или 5510 компании Ро1уМ1сго Тесйпо1од1ез, кат. № Т8Р025375; миксер Мах1-М1х Тйегто1упе (каталожный номер ν\Κ 58810-185).

Реагенты:

Гидролизный раствор (водный раствор 4 N НС1)

Добавить 160 мл 6 N НС1 и 80 мл чистой воды для хроматографии в стеклянную бутыль 250 мл.

Хорошо перемешать.

Хранить при температуре 2-8°С не более 6 месяцев.

Раствор для дериватизации Ι (0.1 М водного раствора аминопропилтриметоксисилана)

Добавить 192 мкл чистой воды для хроматографии к 10 мг порошка аминопропилтриметоксисилана в стеклянном сосуде.

Встряхивать сосуд в течение 5-10 с до полного растворения аминопропилтриметоксисилана.

Хранить при температуре -20°С не более 1 года.

Раствор для дериватизации ΙΙ (1 М уксусной кислоты и 0.25 М NаВНзСN)

Разбавить 20 мкл уксусной кислоты 320 мкл чистой воды для хроматографии (17-кратное разбавление) в центрифужной пробирке 0.4 мл, получив в результате 1 М раствор уксусной кислоты.

Отмерить 2.0±0.5 мг NаВНзСN в криогенный сосуд.

Добавить соответствующее количество 1 М раствора уксусной кислоты для получения 0.25 М NаВНзСN по следующей формуле:

Объем (мкл)=10³х(вес NаВНзСN в мг)/(62.84 г/мольх0.25 моль/л)

Цианоборгидрид натрия ^аВН₃СК) хранить в темном месте в эксикаторе.

Во избежание постоянного открытия исходной бутыли с реагентом рекомендуется хранить реагент в нескольких криогенных сосудах по 2.0 мл: отмерить 1.0 г±0.2 мг цианоборгидрида натрия в криогенный сосуд 2.0 мл. Распределить таким образом весь цианоборгидрид натрия из исходной бутыли. Крепко

- 167 017765 закрыть криогенные сосуды и наклеить этикетки с указанием порядкового номера (1, 2, 3 и т.д.), названия реагента, номера партии и даты истечения 6-месячного срока годности. Во избежание появления влажности сосуды запечатать парафильмом. Цианоборгидрид натрия отмеряют при подготовке раствора для дериватизации ΙΙ не более трех раз из одного и того же криогенного сосуда. Количество использований и порядковый номер криогенного сосуда отмечают в лабораторном журнале. При постоянном открытии криогенного сосуда или в результате использования неприемлемой партии цианоборгидрида натрия возможно наблюдение пика реагента в профиле капиллярного электрофореза или слабое включение метки. При возникновении такого эффекта необходимо выбросить использовавшийся криогенный сосуд и отмерить реагент из криогенного сосуда со следующим порядковым номером или из новой партии цианоборгидрида натрия.

Буфер для реацетилирования (25 мМ бикарбоната натрия, рН 9.5) Отмерить 0.210±0.02 г бикарбоната натрия в чистый стеклянный стакан 100 мл. Добавить 90 мл чистой воды для хроматографии и мешать на пластине для смешивания до полного растворения солей.

Скорректировать рН до значения 9.5±0.1 с помощью 10 N №10Н.

Добавить чистую воду для хроматографии до конечного объема 100 мл. Профильтровать (шаг 1.26) раствор и хранить при комнатной температуре не более 3 месяцев.

Подвижный буфер (60±5 мМ тетрабората натрия, рН 9.25) Отмерить 1.21 ±0.02 г тетрабората натрия в чистый стеклянный стакан 100 мл. Добавить 90 мл чистой воды для хроматографии и мешать на пластине для смешивания до полного растворения солей.

Скорректировать рН до значения 9.25±0.10 с помощью 10 N №10Н.

Добавить чистую воду для хроматографии до конечного объема 100 мл и концентрации 60±5 мМ.

Для раствора 55 мМ отмерить 1.11 г (±0.02) тетрабората натрия и следовать вышеуказанным инструкциям по разведению и титрации.

Для раствора 65 мМ отмерить 1.31 г (±0.02) тетрабората натрия и следовать вышеуказанным инструкциям по разведению и титрации.

Хранить при комнатной температуре не более 3 месяцев. Приготовить свежий буфер при влиянии на степень разделения пиков (значение В<1.0).

Опционально: развести буферный раствор тетрабората натрия (М1сго8ок), добавив 120 мл ультрачистой воды к 80 мл тетрабората натрия 150 мМ до финальной концентрации 60 мМ (±5 мМ). Титрировать раствор при помощи 10 N №10Н до значения рН 9.25 (±0.1).

Для получения раствора тетрабората натрия 55 мМ развести 66 мл тетрабората натрия 150 мМ в 114 мл ультрачистой воды. Титрировать, как указано выше.

Для получения раствора тетрабората натрия 65 мМ развести 78 мл тетрабората натрия 150 мМ в 102 мл ультрачистой воды. Титрировать, как указано выше.

Хранить раствор при комнатной температуре в течение максимум 3 месяцев. Приготовить свежий буфер при влиянии на степень разделения пиков (значение В<1.0).

Растворы для промывания капилляров

Раствор N №10Н

Добавить 1 мл раствора 10 N №10Н в градуированную пластиковую пробирку 15 мл, содержащую 9 мл чистой воды для хроматографии. Хорошо перемешать, встряхивая в течение 5-10 с.

Хранить раствор при комнатной температуре не более 6 месяцев.

Раствор N НС1

Добавить 1 мл раствора 6 N НС1 в градуированную пластиковую пробирку 15 мл, содержащую 5 мл чистой воды для хроматографии. Хорошо перемешать, встряхивая в течение 5-10 с.

Хранить раствор при комнатной температуре не более 6 месяцев. 3.6.3 80% раствор метанола.

Добавить 8 мл чистого метанола для хроматографии в градуированную пластиковую пробирку 15 мл, содержащую 2 мл чистой воды для хроматографии. Хорошо перемешать, встряхивая в течение 510 с.

Хранить раствор при комнатной температуре не более 6 месяцев.

Стандартный исходный моносахаридный раствор №ацетилглюкозамин (СаШАс)

Точно отмерить 5±1 мг СаШАс в криогенный сосуд 2.0 мл.

Добавить 1 мл чистой воды для хроматографии и хорошо перемешать встряхиванием до растворения.

Записать точную концентрацию раствора (мг/мл).

N-ацетилгалактозамин (С1сNАс)

Точно отмерить 5±1 мг С1сNАс в криогенный сосуд 2.0 мл.

Добавить 1 мл чистой воды для хроматографии и хорошо перемешать встряхиванием до растворения.

- 168 017765

Записать точную концентрацию раствора (мг/мл).

N-ацетилманнозамин (МаηNАс)

Точно отмерить 5±1 мг МаηNАс в криогенный сосуд 2.0 мл.

Добавить 1 мл чистой воды для хроматографии и хорошо перемешать встряхиванием до растворения.

Записать точную концентрацию раствора (мг/мл).

Хранить стандартные исходные моносахаридные растворы при температуре -20°С не более 1 года.

Рабочий моносахаридный раствор Ι: рабочий раствор внутреннего стандарта

100-кратно развести исходный раствор МаηNАс с чистой водой для хроматографии путем добавления 20 мкл исходного раствора МаηNАс в криогенный сосуд 2 мл, уже содержащий 1980 мкл чистой воды для хроматографии. Встряхивать в течение примерно 5-10 с.

Хранить рабочий раствор внутреннего стандарта при температуре 2-8°С не более 6 месяцев. Рабочий моносахаридный раствор ΙΙ: стандартный рабочий раствор смеси аминов

Добавить в криогенный сосуд 2.0 мл, содержащий 1960 мкл чистой воды для хроматографии, 20 мкл исходных растворов СаШАс и С1сNАс соответственно. Встряхивать в течение примерно 5-10 с.

Хранить стандартный рабочий раствор смеси аминов при температуре 2-8°С не более 6 месяцев. Растворы проб и эталонного материала

Оттаять замороженные пробы белка при температуре 2-8°С и осторожно смешать, переворачивая.

Развести обе пробы и эталонный материал чистой водой для хроматографии до примерно 1.0 мг/мл. Указать концентрацию тремя значащими цифрами.

Условия для проведения капиллярного электрофореза:

подвижный буфер (шаг 2.5): 60 мМ тетрабората натрия, рН 9.25;

температура капиллярного картриджа 25°С;

электрическое напряжение 25-30 кВ, положительная полярность;

характеристики детектора: детектор для индуцированной лазером флуоресценции; возбуждение при 488 нм, излучение при 520 нм;

введение пробы: режим впрыскивания под давлением, 20 с при 0.5 [экк время работы 10 мин;

хранение пробы при температуре 10°С.

Процедура.

Примечание: использовать пипеттор 10 мкл и микродозаторы для переноса проб объемом 10 мкл, а также пипетторы соответствующих размеров для переноса других реагентов (см. диапазон в шаге 2.102.14).

Гидролиз.

В центрифужную пробирку 0.65 мл добавить 10 мкл рабочего раствора МаηNАс и 200 мкл 4 N гидролизного раствора (шаг 3.1). Это холостая проба.

В центрифужную пробирку 0.65 мл добавить 10 мкл рабочего раствора МаηNАс и 10 мкл стандартного раствора смеси аминов (шаг 3.9). Далее добавить 200 мкл 4 N гидролизного раствора. Это моносахаридный стандарт для количественной оценки и определения пригодности системы. Подготовить дубликат.

В центрифужную пробирку 0.65 мл добавить 10 мкл рабочего раствора МаηNАс и 10 мкл раствора эталонного материала СТ^А4-Iд (примерно 1 мг/мл).

Далее добавить 200 мкл раствора 4 N НС1. Подготовить дубликат.

В центрифужную пробирку 0.65 мл добавить 10 мкл рабочего раствора МаηNАс и 10 мкл раствора пробы (примерно 1 мг/мл). Далее добавить 200 мкл раствора 4 N НС1. Подготовить дубликат.

Встряхивать пробы в течение примерно 10 с и центрифугировать в течение 5-10 с. Поместить пробы в стойку на 96 сосудов и инкубировать в печи при температуре 95°С в течение 6 ч.

После гидролиза выдержать гидролизованные пробы при температуре -20°С в течение 10 мин для охлаждения.

Подвергнуть гидролизованные пробы краткому центрифугированию до опущения конденсата на дно пробирки (5-10 с на высокой скорости). Высушить пробы в ЗρеейVас.

Примечание: отключить подачу жара в ЗρеейVас и установить уровень высушивания низкий.

Восстановить каждую пробу при помощи 100 мкл чистой воды для хроматографии и встряхивать в течение 10-15 с. Высушить пробы в ЗρеейVас.

Примечание: отключить подачу жара в ЗρеейVас и установить уровень высушивания низкий. Реацетилирование.

Восстановить каждую пробу с помощью 10 мкл буфера для реацетилирования М6 и хорошо перемешать встряхиванием в течение 5-10 с. Добавить 4 мкл реагента для реацетилирования М3 в каждую пробирку. Встряхивать в течение примерно 5-10 с. Инкубировать на льду в течение 30 мин.

Примечание: буфер для реацетилирования (М6) и реагент (М3) можно заменить самостоятельно приготовленными NаНС0з 25 мМ (добавить 20 мкл) и уксусным ангидридом (добавить 4 мкл) соответственно.

- 169 017765

Высушить пробы в ЗреебУас.

Примечание: отключить подачу жара в ЗреебУас и установить уровень высушивания низкий.

Восстановить каждую пробу при помощи 100 мкл чистой воды для хроматографии и встряхивать в течение 10-15 с. Высушить пробы в ЗреебУас.

Примечание: отключить подачу жара в ЗреебУас и установить уровень высушивания низкий. Дериватизация.

Поместить микроцентрифугу в печь, чтобы уравновесить ее температуру до температуры печи 55°С.

Восстановить каждую пробу с помощью 10 мкл раствора для дериватизации Ι (0.1 М раствора аминопропилтриметоксисилана, шаг 3.2). Встряхивать в течение примерно 5-10 с.

Добавить 5 мкл раствора для дериватизации ΙΙ (1 М НАс и 0.25 М №ВН₃С^ шаг 3.3). Встряхивать в течение примерно 5-10 с и центрифугировать.

Быстро загрузить сосуды с пробами в предварительно нагретую центрифугу и поместить последнюю обратно в печь при температуре 55°С. Инкубировать в течение 3 ч, центрифугируя при 2000 об/мин. Это предотвратит конденсацию растворителя на поверхности сосуда.

Подготовка инструментов.

Новый капилляр перед установкой промыть под высоким давлением (80 рк1) в такой последовательности:

Ν NаΟΗ - в течение 20 мин;

вода чистая для хроматографии - в течение 10 мин;

буферный раствор тетрабората натрия 60 мМ - в течение 10 мин.

Эксплуатация.

Перед каждой эксплуатацией осуществлять промывание в надлежащей последовательности для очистки капилляра.

Далее пропустить стандарт пригодности системы (моносахаридный стандарт), чтобы убедиться в пригодности системы.

При использовании 1 Ν NаΟΗ возможно травление капилляров других производителей изнутри, что приводит к изменению времени миграции в ходе работы. Если время миграции последнего пика ^ΠΝΑ^ превышает 10 мин, промывание на 2-м шаге необходимо осуществлять не 1 Ν №Ο11_ а раствором 0.1 Ν NаΟΗ или чистой водой для хроматографии.

Если замена капилляра на эквивалентный и использование вышеописанной процедуры промывания не помогают, для последнего пика ^ΠΝΑ^ следует применить 80% метанол и/или 1 Ν НС1, чтобы не превысить образцовое значение 10 мин.

Подготовка к впрыскиванию.

После дериватизации дать пробам остыть до комнатной температуры. Центрифугировать в течение примерно 10 с при комнатной температуре, пока конденсат не опустится на дно пробирки.

Добавить в каждую пробирку 85 мкл чистой воды для хроматографии до конечного объема 100 мкл. Встряхивать в течение 5-10 с.

Перенести 10 мкл пробы из каждой пробирки в микрососуд для капиллярного электрофореза и добавить 190 мкл чистой воды для хроматографии в каждую пробирку. Встряхивать в течение 5-10 с.

Этапы промывания и последовательность впрыскивания.

Примечание: через каждые четыре впрыскивания следует менять подвижный буфер для капиллярного электрофореза на заново приготовленный (вследствие эффекта ионного истощения). Промывать капилляр при 40 ркк

- 170 017765

		(Примечание: при использовании в шаге 2 чистой воды для хроматографии шаги 1, 2 и 3 можно объединить в одно 3минутное промывание)
3 (промывание)	Чистая вода для хроматографии	1
4 (промывание)	Подвижный буфер, 60 мМ тетрабората натрия	5
5 (промывание)	Холостая проба (маркер, внутренний стандарт)	10
6 (промывание)	Повторить 1—4	10
7 (промывание)	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 1)	10
8 (промывание)	Повторить 1—4	10
9	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 1)	10
10 (промывание)	Повторить 1—4	10
11	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 2)	10
12 (промывание)	Повторить 1—4	10
13	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 2)	10
14 (промывание)	Повторить 1—4	10
15	СТЬА4-1§, препарат 1	10
16 (промывание)	Повторить 1—4	10
17	СТЬА4-1§, препарат 2	10
18 (промывание)	Повторить 1—4	10
19	Проба 1, препарат 1	10
20 (промывание)	Повторить 1—4	10
21	Проба 1, препарат 1	10
22 (промывание)	Повторить 1—4	10
23	Проба 1, препарат 2	10
24 (промывание)	Повторить 1—4	10
25	Проба 1, препарат 2	10
26 (промывание)	Повторить 1—4	18
27	Проба 2, препарат 1	10
28 (промывание)	Повторить 1—4	10
29	Проба 2, препарат 1	10
30 (промывание)	Повторить 1—4	10
31	Проба 2, препарат 2	10
32 (промывание)	Повторить 1—4	10
33	Проба 2, препарат 2	10
34 (промывание)	Повторить 1—4	10
35	Проба 3, препарат 1	15
36 (промывание)	Повторить 1—4	10
37	Проба 3, препарат 1	10
38 (промывание)	Повторить 1—4	10

39	Проба 3, препарат 2	10
40 (промывание)	Повторить 1—4	10
41	Проба 3, препарат 2	10
42 (промывание)	Повторить 1—4	10
43	СТЬА4-1§, материал, препарат 1	10
44 (промывание)	Повторить 1—4	10
45	СТЬА4-1§, материал, препарат 2	10
46 (промывание)	Повторить 1—4	10
47	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 1)	10
48 (промывание)	Повторить 1—4	10
49	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 1)	10
50	Повторить 1—4	10
51	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 2)	10
52	Повторить 1—4	10
53	Пригодность системы (моносахаридный стандарт, препарат 2)	10

Пригодность системы.

Примечание: значения пригодности системы определяют с помощью первого впрыскивания стандарта пригодности системы, если не указано иное.

Электроферограмма первого теста пригодности системы должна быть такой же, как представлена на фиг. 81, где пик 1 - ОаШАс, пик 2 - МапИАс, пик 3 - О1сКАс.

Примечание: при использовании другого инструментария для капиллярного электрофореза (не РА

- 171 017765

СЕ Ι4ΟΟ типа Бекман) длина капилляра может быть отличной от той, что описана в данном методе, вследствие разных конфигураций картриджей, удерживающих разделяющий капилляр. Это может привести к изменению времени миграции аналита, а также интенсивности пика.

Степень разделения двух соседних пиков подсчитывают инструментально для первого стандарта пригодности системы по следующему уравнению:

К=2(1₂-11)/(ЗУ1+\У₂) где К - степень разделения;

ΐ₂, ΐ₁ - время миграции двух соседних пиков соответственно;

Ш₁, Ш₂ - ширина двух соседних пиков на исходном уровне соответственно.

Значение К должно быть >1.0. Если К<1.0, необходимо очистить капилляр промыванием в указанной последовательности. Если таким образом проблема не устраняется, следует приготовить свежий подвижный буфер или заменить капилляр. Для заключительного впрыскивания в ходе тестирования пригодности системы последний пик (С1сNΑс) должен иметь коэффициент асимметрии <1.4 при расчете по следующей формуле:

Τ=\ν₀,05/21 где Т - коэффициент асимметрии пика;

Ш₀.₀5 - ширина пика при 5% высоте;

£ - ширина передней части пика у максимума пика.

Если Т>1.4, необходимо очистить капилляр промыванием в указанной последовательности. Если таким образом проблема не устраняется, следует приготовить свежий подвижный буфер или заменить капилляр.

При повторных впрыскиваниях наблюдаются следующие образцовые значения:

соотношение площадей пиков С1сNΑс и МаNΑс: ΟСΟ <10% (вычислено на шаге 7.1);

время миграции С1сNΑс должно быть <10 мин;

профиль должен быть таким же, как приведен на фиг. 81, где наблюдаются три пика, а внутреннему стандарту (МаηNΑс) соответствует пик под номером 2.

Если перед тестированием проб какое-либо из вышеуказанных значений не соответствует образцовому, вначале следует увеличить напряжение, при времени миграции С1сNΑс более 10.0 мин. Далее, при соотношении площадей пиков >10% приготовьте свежий буферный раствор для капиллярного электрофореза, проверив его рН, или заменить капилляр. Отрегулировав прибор, повторите впрыскивание для определения пригодности системы. Если при анализе профиля пика наблюдается значительное снижение высоты пика МаηNΑс, проверьте, не сместился ли волоконно-оптический кабель, подведенный к модулю индуцированной лазером флуоресценции.

Определите процент ОСО для моносахаридного стандарта, сравнив соотношение площадей пиков внутреннего стандарта и компонентов моносахаридного стандарта. Разделите площадь пика для каждого моносахаридного компонента на площадь пика внутреннего стандарта при каждом впрыскивании моносахаридного стандарта. Вычислите процент ОСО СаШАс и С1сNΑс для двух охваченных стандартов. ОСО должно быть <10%. Если не получено данное усредненное образцовое значение, капилляр следует промыть или заменить, как указано выше.

Вычисления.

Вычисление соотношения площадей пиков СаШАс и С1сNΑс относительно внутреннего стандарта (МаηNΑс). Используется на повторных впрыскиваниях первых четырех стандартов пригодности системы для достижения вышеуказанных образцовых значений и проведения тех же вычислений для всех охваченных стандартов пригодности системы, впрыскиваемых до и после проб(ы).

Соотношение площадей пиков = частное площади пика для каждого моносахаридного компонента (Са1NΑс, С1сNΑс) на площадь пика внутреннего стандарта (МаηNΑс) при каждом впрыскивании стандарта пригодности системы.

Соотношение площадей пиков = площадь пика моносахаридов/площадь пика МаNΑс.

Вычислите среднее соотношений площадей пиков СаШАс и С1сNΑс для стандартов пригодности системы. Также вычислите стандартное отклонение (СО) и процент относительного стандартного отклонения (% ОСО).

Образцовые значения: ОСО для соотношения площадей пиков С1сNΑс <10%.

Два охваченных стандарта пригодности системы, впрыскиваемые до и после проб(ы): процент ОСО для соотношения площадей пиков С1сNΑс и СаШАс <10%. Если усредненное образцовое значение не достигнуто (ОСО>10%), капилляр необходимо промыть повторно в указанной последовательности, а пробы и охваченные моносахаридные стандарты пропустить заново. Если усредненное образцовое значение все равно не достигнуто, следует заменить и промыть капилляр. Затем снова пустите пробы и охваченные моносахаридные стандарты.

- 172 017765

Стандартное отклонение = У(пХх² - (^χ)²)/η(η-1) где п - количество измерений в пробе;

х - индивидуальные измерения.

%ОСО = (стандартное отклонение/среднее измеренных площадей пика) х 100

Вычислите молярное соотношение СаШАс/белок

Κ-θΗ1Ν Ас=( АсХ Αμ₃πΝΑοΟ^χ V 6а№ АсОХСсыИ АсО^хМ\У АЬа1асер(У ( АмапШсХ Аоа]Ц АсОХ^ _рхС_рхМ\¥ СЫ N Ас) где К^ш^ - молярное соотношение СаШАс/белок;

Ао-аш^ - площадь пика (мкВ-с) СаШАс в пробе;

Ама^^ - площадь пика (мкВ-с) МаπNАс в пробе;

А_Мапт_с0 - среднее площади пика (мкВ-с) МаπNАс в моносахаридном стандарте;

Ао-аш^ц - среднее площади пика (мкВ-с) СаШАс в моносахаридном стандарте;

У^гп^о - объем СаШАс, содержащийся в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (мкл);

С^^^о - концентрация СаШАс, содержащегося в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (в мг/мл);

У_р - объем пробы белка, использованной для гидролиза (мкл);

С_р - концентрация пробы белка, использованной для гидролиза (в мг/мл);

М^_АЬа_!асер! - молекулярная масса эталонного материала абатацепта согласно сертификату анализа (СА);

М^_Са1т_с - молекулярная масса СаШАс (221.2 Да).

Охваченные стандарты.

При вычислении молярных соотношений материала и проб СТ^А4-Iд используйте все восемь охваченных стандартов пригодности системы. Выведите среднее значение площадей пиков для включения в данное уравнение. Это для первых трех проб. Для остальных проб всегда используйте среднее площади пика следующих четырех охваченных моносахаридных стандартов и предыдущих четырех охваченных моносахаридных стандартов для расчета молярных соотношений.

Вычислите молярное соотношение С1сNАс/белок

ΚσίοΝ Ас=(Аб1с\АсХ АмапИ АсОХУ Ц]с\АсОХСс1сЦ ΑοθΧΜν7οΤΕΑ4Ι_δ)/(Α_ΜΗηΝΑοΧΑ_Ο1εΝΑο₀Χν_ρΧθρΧΜλν_αΐοΝΑο) где Κοίο^ο - молярное соотношение С1сNАс/белок;

Аи^^ - площадь пика (мкВ-с) С1сNАс в пробе;

А_С1стс - площадь пика (мкВ-с) МаηNАс в пробе;

Аи^^ю - среднее площади пика (мкВ-с) МаπNАο в моносахаридном стандарте;

А_С1стс0 - среднее площади пика (мкВ-с) С1οNАο в моносахаридном стандарте;

У_С1ст_с0 - объем С1οNАο, содержащийся в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (мкл);

С_С1ст_с0 - концентрация С1οNАο, содержащегося в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (в мг/мл);

Ур - объем пробы белка, использованной для гидролиза (мкл);

Ср - концентрация пробы белка, использованной для гидролиза (в мг/мл);

М^^ - молекулярная масса эталонного материала СТ^А4-Iд;

МШ_ст_с - молекулярная масса С1οNАο (221.2 Да).

Образцовые значения.

Процент ОСО для соотношений площадей пиков аминомоносахаридов двух охваченных стандартов пригодности системы не должен превышать 10%. Среднее молярных соотношений для аминомоносахаридов в эталонном материале не должно выходить из диапазона, указанного в таблице ниже. Для каждого компонента % ОСО четырех результатов (повторное впрыскивание повторных препаратов) должно быть <25%.

Диапазон молярных соотношений эталонного материала СТ^А4-I§

Моносахарид	Диапазон
ОаШАс	2,0-3,2
ΟΙοΝΑε	18—32

Пример 17. Определение молярного соотношения аминомоносахаридов (СаШАс и С1οNАο) при помощи капиллярного электрофореза (КЭ).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав СТ^А4-Iд характеризуется наличием от около 15-35 моль С1οNАο/моль белка и от примерно 1.6-3.6 моль СаШАс/моль белка. В следующем примере описан метод определения данных молярных соотношений.

- 173 017765

Реагенты: гидролизный раствор (4 N НС1); раствор для дериватизации Ι (0.1 М 8-амино-1,3,6трисульфокислота, тринатриевая соль (аминопропилтриметоксисилан), водный раствор); раствор для дериватизации ΙΙ (0.25 М NаВНзСN в 1 М уксусной кислоты); буфер для реацетилирования (25 мМ бикарбоната натрия, рН 9.5); подвижный буфер (60±5 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); растворы для чистки капилляров (1 N №0Н; 1 N НС1; 80% метанол); стандартные исходные моносахаридные растворы СаШАс, С1с¥Ас и МаηNЛс в концентрации 5 мг/мл; рабочий моносахаридный раствор Ι: внутренний стандартный рабочий раствор является 100-кратно разбавленным исходным раствором МапNЛс; рабочий моносахаридный раствор ΙΙ: стандартные рабочие растворы смеси аминов, 100-кратно разбавленные исходные растворы СаШАс и С1сNЛс.

Инструментарий. Система КЭ: система Р/АСЕ МЭО типа Бекман; детектор: система индуцированной лазером флуоресценции с детектором типа Бекман (совмещенная с Р/АСЕ МЭО); капилляр без покрытия (внутренний диаметр 25 мкм; внешний диаметр 360 мкм) общей длиной 27-31 см для Р/АСЕ моо.

Условия для капиллярного электрофореза: подвижный буфер (60 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); температура капиллярного картриджа: 25°С, напряжение: 25-30 кВ, положительная полярность; характеристики детектора: детектор для индуцированной лазером флуоресценции, возбуждение при 488 нм, излучение при 520 нм; введение пробы: режим впрыскивания под давлением, 20 с при 0.5 р§1; время работы: 10 мин; хранение пробы при температуре 10°С.

Гидролиз: для приготовления холостой пробы смешивали 10 мкл рабочего раствора МаηNЛс и 200 мкл 4 N НС1. Для приготовления моносахаридного стандарта смешивали 10 мкл рабочего раствора МаηNЛс и 10 мкл стандартного раствора смеси аминов с 200 мкл 4 N НС1. Для приготовления тестовой пробы смешивали 10 мкл рабочего раствора МаηNЛс и 10 мкл димера СТ^Л4-Iд (примерно 1 мг/мл) с 200 мкл 4 N НС1. Все пробирки встряхивали в течение 10 с и центрифугировали в течение 10 с с последующей инкубацией при температуре 95°С в течение 6 ч. После гидролиза пробы оставляли при температуре -20°С на 10 мин для охлаждения. Далее центрифугировали на низкой скорости в течение 10 с и высушивали в 8реебУас.

Реацетилирование: гидролизованные и высушенные пробы восстанавливали при помощи 100 мкл чистой воды для хроматографии. Восстановленные пробы подвергали реацетилированию, добавляя 10 мкл ре-№-ацетилирующего буфера М6 (компания С1уко) и 4 мкл реацетилирующего реагента М3 (компания С1уко), после чего смешивали и инкубировали на льду (30 мин). Далее центрифугировали на низкой скорости в течение 10 с и высушивали в 8рееб Уас.

Дериватизация: восстановленные пробы (100 мкл чистой воды для хроматографии) доводили до температуры 55°С, после чего добавляли 10 мкл раствора для дериватизации Ι, быстро перемешивали и добавляли 5 мкл раствора для дериватизации ΙΙ. Пробы загружали в предварительно нагретую центрифугу и инкубировали в течение 3 ч при температуре 55°С, центрифугируя при 2000 об/мин.

Впрыскивание в систему КЭ: после дериватизации объем проб доводили до конечных 100 мкл, добавляя чистую воду для хроматографии, затем 10 мкл проб переносили в микрососуды КЭ с 190 мкл чистой воды для хроматографии. Перед впрыскиванием проб картридж КЭ тщательно промывали с помощью чистой воды для хроматографии (в течение 1-3 мин), а затем регулировали с помощью подвижного буфера (в течение 5 мин). После начального промывания в картридж КЭ впрыскивали моносахаридные стандарты и пробы для анализа (время работы 10 мин). После обработки каждого стандарта или тестовой пробы картридж КЭ промывали и регулировали при помощи чистой воды для хроматографии и подвижного буфера. Электроферограмма пригодности системы должна быть такой, как на фиг. 30.

Вычисления: вычисление соотношения площадей пиков СаШАс и С1сNЛс относительно внутреннего стандарта МаηNЛс.

Соотношение площадей пиков = площадь пика моносахарида (СаШАс или С1с¥Ас)/площадь пика МаηNЛс, где относительное стандартное отклонение (ОСО) соотношения пиков площадей меньше или равно 10%. Расчет соотношения моносахарида (например, СаШАс) и белка СТ^Л4-Iд:

Εσ₃]ΝАс=(АоаШАсХ АмапКЛсО*VОаШАсОХСоаШЛс0ХМУ/_димер СТИА4Ι₆)/( Αμ₃πΝ АсХ АоаМ АсО^х Υ _рхС_рхМУ/θ_Η1Ν Ас) где КзаШ_Ас - молярное соотношение СаШАс/белок;

А_Са1ХЛс - площадь пика (мкВ-с) в пробе СаШАс;

Л_{МапЬ1Ло} - площадь пика (мкВ-с) в пробе МаηNЛс;

Ащ^м - среднее площади пика (мкВ-с) МаηNЛс в моносахаридном стандарте;

А_Са1\_Лс0 - среднее площади пика (мкВ-с) СаШАс в моносахаридном стандарте;

У_Саш_Лс0 - объем СаШАс, содержащийся в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (мкл);

С_Саш_Ас0 - концентрация СаШАс, содержащегося в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (в мг/мл);

У_р - объем пробы белка, использованной для гидролиза (мкл);

- 174 017765

С_р - концентрация пробы белка, использованной для гидролиза (в мг/мл); МА _димер - молекулярная масса димера СΊ^Л4-Iд;

^ΜΑ(,;ι1νν = ²²1·^{2 Да}·

Таблица 18

Среднее молярное соотношение моносахарида и молекул или димера СΊ^Л4-Iд

Моносахарид	Диапазон
СаШАс	2,0-3,2
61сЫАс	18—32

Пример 18. Определение молярного соотношения нейтральных аминомоносахаридов (маннозы, фукозы и галактозы) при помощи капиллярного электрофореза (КЭ).

Реагенты: гидролизный раствор (2 М трифторуксусной кислоты); раствор для дериватизации Ι (0.1 М 8-амино-1,3,6-трисульфокислота, тринатриевая соль (аминопропилтриметоксисилан), водный раствор); раствор для дериватизации ΙΙ (0.25 М NаВН₃СN в 1 М уксусной кислоты); подвижный буфер (60±5 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); растворы для чистки капилляров (1 Ν №011; 1 Ν НС1; 80% метанол); стандартные исходные моносахаридные растворы маннозы (Мап), фукозы (Рис), галактозы (Оа1) и ксилозы (Ху1) в концентрации 5 мг/мл; рабочий моносахаридный раствор Ι: внутренний стандартный рабочий раствор является 100-кратно разбавленным исходным раствором Ху1; рабочий моносахаридный раствор ΙΙ: стандартные рабочие растворы нейтральной смеси, 100-кратно разбавленные исходные растворы Мап, Еис и Оа1.

Инструментарий. Система КЭ: система Р/АСЕ М1)С) типа Бекман; детектор: система индуцированной лазером флуоресценции с детектором типа Бекман (совмещенная с Р/АСЕ М^^); капилляр без покрытия (внутренний диаметр 25 мкм; внешний диаметр 360 мкм) общей длиной 27-31 см для Р/АСЕ М^^·

Условия для капиллярного электрофореза: подвижный буфер (60 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); температура капиллярного картриджа: 25°С, напряжение: 25-30 кВ, положительная полярность; характеристики детектора: детектор для индуцированной лазером флуоресценции, возбуждение при 488 нм, излучение при 520 нм; введение пробы: режим впрыскивания под давлением, 20 с при 0.5 р81; время работы: 10 мин; хранение пробы при температуре 10°С.

Гидролиз: для приготовления холостой пробы смешивали 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 200 мкл 2 М трифторуксусной кислоты. Для приготовления моносахаридного стандарта смешивали 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 10 мкл стандартного раствора нейтральной смеси с 200 мкл 2 М трифторуксусной кислоты. Для приготовления тестовой пробы смешивали 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 10 мкл димера СΊ^Л4-Iд (примерно 1 мг/мл) с 200 мкл 2 М трифторуксусной кислоты. Все пробирки встряхивали в течение 10 с и центрифугировали в течение 10 с с последующей инкубацией при температуре 95°С в течение 6 ч. После гидролиза пробы оставляли при температуре -20°С на 10 мин для охлаждения. Далее центрифугировали на низкой скорости в течение 10 с и высушивали в 8ρеебVас·

Дериватизация: пробы восстанавливали с помощью 100 мкл чистой воды для хроматографии и доводили до температуры 55°С, после чего добавляли 10 мкл раствора для дериватизации Ι, быстро перемешивали и добавляли 5 мкл раствора для дериватизации ΙΙ. Далее загружали в предварительно нагретую центрифугу и инкубировали в течение 3 ч при температуре 55°С, центрифугируя при 2000 об/мин.

Впрыскивание в систему КЭ: после дериватизации объем проб доводили до конечных 100 мкл, добавляя чистую воду для хроматографии, затем 10 мкл проб переносили в микрососуды КЭ с 190 мкл чистой воды для хроматографии. Перед впрыскиванием проб картридж КЭ тщательно промывали с помощью чистой воды для хроматографии (в течение 1-3 мин), а затем регулировали с помощью подвижного буфера (в течение 5 мин). После начального промывания в картридж КЭ впрыскивали моносахаридные стандарты и пробы для анализа (время работы 15 мин). После обработки каждого стандарта или тестовой пробы картридж КЭ промывали и регулировали при помощи чистой воды для хроматографии и подвижного буфера. Электроферограмма пригодности системы должна быть такой, как на фиг. 31.

Вычисления: вычисление соотношения площадей пиков Мап, Оа1 и Еис относительно внутреннего стандарта ксилозы.

Соотношение площадей пиков = площадь пика моносахарида (Оа1, Еис или Мап)/площадь пика ксилозы, где относительное стандартное отклонение (ОСО) соотношения пиков площадей меньше или равно 10%. Расчет соотношения моносахарида (например, Мап) и белка СΊ^Л4-Iд:

К_Мап - молярное соотношение Мап/белок;

Αμ^ - площадь пика (мкВ-с) Мап в пробе;

Α_χ^ - площадь пика (мкВ-с) Ху1 в пробе;

Α_χ^₀ - среднее площади пика (мкВ-с) Ху1 в моносахаридном стандарте; Α^ηο - среднее площади пика (мкВ-с) Мап в моносахаридном стандарте;

- 175 017765

Vм_аη0 - объем маннозы, содержащийся в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (мкл);

С_Мап0 - концентрация маннозы, содержащейся в моносахаридном рабочем растворе, использованном для гидролиза (в мг/мл);

V_р - объем пробы белка, использованной для гидролиза (мкл);

С_р - концентрация пробы белка, использованной для гидролиза (в мг/мл);

МУ _{димер С}ть_А4_-1§ - молекулярная масса димера СТЬА4-1д;

М^Мап = 180.2 Да.

Таблица 19

Среднее молярное соотношение моносахарида и молекул или димера СТЬА4-1д

Пример 19. Получение СТЬА4^{А2 4Е}-1д.

СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д - генно-инженерный химерный белок, который состоит из функционального связывающего домена модифицированного человеческого СТЬА-4 и Рс-домена человеческого иммуноглобулина класса 1дС1. Для создания данной молекулы были сделаны две аминокислотные замены (Ь104Е и А29У) в области связывания В7 домена СТЬА-4. Молекула состоит из двух гликозилированных полипептидных цепей с 357 аминокислотами в каждой. Она существует в виде ковалентного димера, связанного внутрицепным дисульфидным мостиком. СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д имеет среднюю массу около 91800 Да согласно результатам матричной лазерной десорбционной времяпролетной (МАЬВ1-Т0Р) массспектрометрии.

СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д - это модифицированная форма СТЬА4-1д. Модификация состоит в точечных мутациях, которые приводят к двум аминокислотным заменам (Ь104Е и А29У). По сравнению с СТЬА4-1д СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д связывает СЭ80 (В7-1) примерно в 2 раза прочнее, СЭ86 (В7-2) - в 4 раза. СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д примерно в 10 раз эффективнее абатацепта ингибирует пролиферацию Т-клеток, выработку цитокина и СБ28-зависимое убийство клеток-мишеней естественными клетками-киллерами. Вызывает умеренное ингибирование В7-1 опосредованной пролиферации Т-клеток, но обладает гораздо более выраженным потенциалом к блокированию В7-2 опосредованной пролиферации Т-клеток. В данном примере описывается производство молекул СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в ЗЕС) ΙΌ N0:4. Приведенные методы можно адаптировать и расширить для получения других рекомбинантных белков, в том числе среди прочего, таких секретируемых белков, как цитокины и другие гормоны, секретируемых белков, которые являются членами суперсемейства иммуноглобулинов или включают часть белка, относящегося к суперсемейству иммуноглобулинов, а также, в целом, любых белков, экспрессируемых в клетках СНО.

Схема технологического процесса культивирования СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д приведена на фиг. 24. СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д получают в 5000-л продукционных биореакторах с примерным рабочим объемом 4000 л. Одну партию лекарственного вещества получают в одном продукционном биореакторе, который загружали из одного сосуда банка клеток. Процесс производства включает три стадии, состоящие из увеличения объема инокулята, выведения культуры клеток и последующей очистки. На этапе увеличения объема инокулята используют среду без компонентов животного происхождения. На этапе выведения культуры клеток также используют среду без компонентов животного происхождения за исключением Ό-галактозы.

Среда для культуры клеток. Все среды готовят в чистых сосудах для сред соответствующего размера, стерилизованных при помощи фильтрации. Состав среды, используемой для увеличения объема инокулята, представлен в таблице ниже.

Базальная среда для выращивания клеток инокулята.__________________________

Компонент	Концентрация
СЬ-СНО, 25х концентрированные растворимые кислоты I	40 мл/л
Οϋ-СНО, 25х концентрированные растворимые кислоты II	40 мл/л
СЬ-СНО, 25х концентрированные соли I	40 мл/л
СО-СНО, 25х концентрированные соли II	40 мл/л

- 176 017765

Базальная среда для выращивания клеток инокулята.

Компонент	Концентрация
Ь-глутамин	0,88 г/л
Натрия бикарбонат	2,22 г/л
Рекомбинантный человеческий инсулин (10	0,1 мл/л
мг/мл)
Метотрексат (20 мМ)	0,05 мл/л

Базальная среда, используемая в продукционных биореакторах и биореакторах для выращивания посевного материала.

Компонент	Концентрация
СО-СНО, 25х концентрированные растворимые кислоты I	40 мл/л
СО-СНО, 25х концентрированные растворимые кислоты II	40 мл/л
СО-СНО, 25х концентрированные соли I	40 мл/л
СО-СНО, 25х концентрированные соли II	40 мл/л
Ь-глутамин	1,32 г/л
Натрия бикарбонат	2,22 г/л
Рекомбинантный человеческий инсулин (10 мг/мл)	0,1 мл/л

Питательная среда для продукционного биореактора.

Компонент	Концентрация
Порошок еКОЕ	25,2 г/л
Декстроза	30,9 г/л
ϋ-галактоза	12,5 г/л
Ь-глутамин	4,1 г/л
Рекомбинантный человеческий инсулин (10 мг/мл)	1,0 мл/л
Декстрансульфат (добавляют в качестве болюсного питания)	50 мг/л

Увеличение объема инокулята.

Замороженный сосуд из банка клеток оттаивают при контролируемой температуре и центрифугируют для удаления криозащитной среды. Клетки ресуспендируют в среду инокулята и восстанавливают в культуральный флакон. Образцовое значение минимальной жизнеспособности клетки после размораживания 80%. В ходе инкубации в культуральном флаконе контролируют температуру и углекислый газ. Культуральный флакон инкубируют до получения 1.0х10⁷ жизнеспособных клеток, затем содержимое переносят во встряхиваемую колбу. Объем культуры увеличивают, используя несколько встряхиваемых колб, для достижения необходимого количества инокулята. Диапазон плотности посевного материала для пассажей во встряхиваемых колбах 1.0-3.0х10⁵ жизнеспособных клеток/мл. В ходе инкубации во встряхиваемых флаконах контролируют температуру, углекислый газ и скорость встряхивания. Достигнув диапазона плотности жизнеспособных клеток 1.5-3.0х10⁶ клеток/мл, культуры из встряхиваемого флакона собирают в стерильные сосуды для переноса инокулята. Примерно 20 л полученных на последнем этапе увеличения объема инокулята во встряхиваемом флаконе переносят в 140-л биореактор для выращивания посевного материала, чтобы получить исходный диапазон плотности 0.2-1.0х10⁶ жизнеспособных клеток/мл.

Эксплуатация биореактора для выращивания посевного материала.

140-л биореактор для выращивания посевного материала с рабочим объемом примерно 90 литров функционирует в режиме производства по одной партии. Температуру, рН, давление и концентрацию растворенного кислорода в 140-л биореакторе для выращивания посевного материала отслеживают и контролируют с помощью распределенной системы управления (РСУ). Из 140-литрового биореактора ежедневно берут пробы для мониторинга роста клеток. Диапазон плотности посевного материала в 140-л биореакторе 0.2-1.0х10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Когда плотность жизнеспособных клеток достигает значения >1.5х10⁶ клеток/мл, культуру из 140-литрового биореактора инокулируют в 1100-л биореактор для выращивания посевного материала. Продолжительность этапа с использованием 140-литрового биореактора для выращивания посевного материала составляет примерно 3 дня. Изначальная целевая плотность жизнеспособных клеток в 1100-л биореакторе 0.4-1.5х10⁶ жизнеспособных клеток/мл.

Изначально в 1100-л биореакторе для выращивания посевного материала содержится культура объемом 260 л.

1100-л биореактор функционирует в режиме производства по одной партии. Температуру, рН, дав

- 177 017765 ление и концентрацию растворенного кислорода в 1100-л биореакторе для выращивания посевного материала отслеживают и контролируют с помощью РСУ. Когда плотность жизнеспособных клеток достигнет показателя >1.5х10⁶ клеток/мл, объем культуры доводят при помощи базальной среды до 900 литров. Из 1100-литрового биореактора ежедневно берут пробы для мониторинга роста клеток. Когда плотность жизнеспособных клеток достигает значения >2.0х10⁶ клеток/мл, культуру из 1100-л биореактора используют для инокуляции в 5000-л продукционный биореактор. Продолжительность этапа с использованием 1100-л биореактора для выращивания посевного материала составляет примерно 4 дня. Изначальная целевая плотность жизнеспособных клеток в 5000-л продукционном биореакторе 0.4-1.5х10⁶ жизнеспособных клеток/мл.

Эксплуатация продукционного биореактора.

Изначально в 5000-л продукционном биореакторе содержится культура объемом 3000 л. 5000-л продукционный биореактор функционирует в режиме производства по одной партии, при этом его температуру, рН, давление и концентрацию растворенного кислорода отслеживают и контролируют с помощью РСУ. Примерно через 72 ч в культуру добавляют болюс декстрана сульфата. В ходе эксплуатации продукционного биореактора заданную температуру культуры снижают с 37 до 34°С через 144±8 ч. Сдвиг температуры и добавление декстрана сульфата необходимы для увеличения продолжительности периода высокой жизнеспособности клеток. Из биореактора берут пробы для отслеживания роста и жизнеспособности клеток, а также концентрации глюкозы, лактата и аммиака. Пробы также тестируют на концентрацию СТЕА4^{А29¥Е104Е}-!д и молярное соотношение сиаловой кислоты и белка СТЕА4^{А29¥Е104Е}-!д. Для поддержания желаемой концентрации глюкозы в биореактор добавляют питательную среду. Первичным критерием сбора для продукционного биореактора является молярное соотношение сиаловой кислоты и белка СТЬА4 Ι§. Сбор клеток из продукционного биореактора начинают при целевом молярном соотношении сиаловой кислоты и белка СТЕА4^{А29¥Е104Е}-!д >6. Продолжительность этапа с использованием 5000-л продукционного биореактора составляет около 14 дней. Из 5000-л продукционного биореактора собирают примерно 4000 л клеток.

Удаление клеток и концентрация продукта.

Клетки удаляют из культурального бульона при помощи микрофильтрации в тангенциальном потоке с использованием мембран 0.65 мкм. Пермеат микрофильтрации концентрируют при помощи ультрафильтрации в тангенциальном потоке с использованием мембран номинального молекулярно-массового предела задерживания (НММП) 30 кДа. В ходе этапов микрофильтрации и ультрафильтрации контролируют трансмембранное давление и скорость потока. Затем концентрат пропускают через несколько мембранных фильтров, заканчивая фильтром 0.2 мкм однократного применения. рН концентрата корректируют до 8.0 добавлением 0.5 М раствора Трис. Фильтры, применяемые в микрофильтрации и ультрафильтрации, предназначены для многоразового использования. Фильтры для микрофильтрации промывают с гидрохлоритом натрия и Тритоном Х-100, хранят в фосфорной кислоте. Фильтры для ультрафильтрации промывают с гидрохлоритом натрия и гидроксидом натрия, хранят в гидроксиде натрия.

Пример 20. Очищение рекомбинантного СТЕА4^{А29¥Е104Е}-!д.

Пример 20-А. Пример процесса очистки СТЕА4^{А29¥Е104Е}-!д приведен на следующей схеме последовательностей операций.

Обрабатываемый собранный материал 1 V Инактивация вируса (Тритон Х-100) 1 V Аффинная хроматография (белок А МаЬ8е1ес1) 1 1 1 V Анионообменная хроматография (смола О-Зерйагоке Раз! Ρίονν) 1 1 1 V Гидрофобная хроматография (смола Рйепу! 650М) 1 V Фильтрация вируса (фильтр Р1апоуа МетЬгапе РНЧабоп 15 нм) 1 V Очищенный материал

Внутрипроизводственный контроль и тесты в процессе обработки ----------> Пул продукта проверяют на титр, высокомолекулярный материал, сиаловую кислоту, С/ЕВР-гомологичный белок, белки хемотаксиса моноцитов 1, белок А, Тритон Х-100, эндотоксин, ДНК ..........> Пул продукта проверяют на титр, высокомолекулярный материал, сиаловую кислоту, С/ЕВР-гомологичный белок, белки хемотаксиса моноцитов 1, белок А, эндотоксин, ДНК .......—> Пул продукта проверяют на титр, высокомолекулярный материал, сиаловую кислоту, С/ЕВР-гомологичный белок, белки хемотаксиса моноцитов 1, белок А, эндотоксин, ДНК

- 178 017765

Инактивация вируса.

Значение рН очищенного концентрированного собранного материала корректируют до 8.0 добавлением 0.5 М раствора Трис. Возможных побочных вирусных возбудителей инактивируют добавлением 20% Тритона Х-100 до финальной концентрации 0.5% (об./об.). Обработанный Тритоном Х-100 раствор белка смешивают в течение >2 ч.

Аффинная хроматография.

Аффинную хроматографию с использованием колонки со смолой на основе белка А МаЬЗе1ес! (компания СЕ НеаННсаге, ранее известная как АтегкНат Вюкаепсек) применяют для выделения белка СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд из обрабатываемого материала, полученного на этапе инактивации вируса, и отделения белка белатацепта от большинства примесей.

Колонку с белком А МаЬЗе1ес! уравновешивают при помощи буфера, содержащего 25 мМ NаН₂Р0₄, 150 мМ №С1, рН 7.5. Потенциал динамического связывания аффинной смолы составляет 25 г белка СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд на 1 л смолы при линейной скорости 350 см/час. 157-л слой колонки может связать около 3.9 кг белка СТ!^'' -^.

Обработанный Тритоном Х-100 материал применяют в колонке с белком А МаЬЗе1ес!, колонку промывают уравновешивающим раствором в количестве, равном минимум 3 объемам колонки (ОК), для удаления слабосвязанных примесей. К таким примесям относятся цитокин, белки хемотаксиса моноцитов 1 и Тритон Х-100. Затем белок СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд элюируют из колонки с буфером, содержащим 250 мМ глицина, рН 3.0. Белок СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд элюируется в виде узкого пика примерно в 2-3 ОК элютивного буфера, затем его собирают в резервуар с буфером, содержащим 2 М НЕРЕЗ, рН 7.5, чтобы быстро увеличить рН, тем самым, минимизировав образование высокомолекулярных видов белатацепта.

Анионообменная хроматография.

Анионообменную хроматографию с использованием смолы Ρ^ρΙιηΐΌ^ Еак! Е1ог (РЕЕ) (компания СЕ НеаННсаге) применяют, в основном, для увеличения количества видов белка СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд с повышенным содержанием сиаловой кислоты. Пул продукта белатацепта из колонки с белком А МаЬЗе1ес! после коррекции рН разбавляют водой для инъекций примерно в два раза перед применением в колонке с РЕЕ.

Колонку для хроматографии с РЕЕ уравновешивают при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕЗ, 50 мМ №С1, рН 7.0. Пул продукта, полученный из колонки с белком А МаЬЗе1ес!, после коррекции рН и проводимости применяют в колонке с РЕЕ, колонку промывают уравновешивающим раствором в количестве, равном минимум 3 объемам колонки (ОК), для удаления слабосвязанных примесей. Затем колонку промывают буфером, содержащим 50 мМ НЕРЕЗ, 140 мМ №С1, рН 7.0, для удаления видов белка СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд с низким содержанием сиаловой кислоты. Виды белка СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд с наиболее высоким содержанием сиаловой кислоты впоследствии элюируют из колонки при помощи буфера в количестве <5 ОК, содержащего 50 мМ НЕРЕЗ, 200 мМ №С1, рН 7.0.

Гидрофобная хроматография.

Гидрофобную хроматографию с использованием смолы Тоуо]эеаг1 РНепу1 650М (компания ТокоН Вюкаепсек) применяют, в основном, для сокращения количества высокомолекулярных видов СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд в пуле продукта, полученном на этапе хроматографии с РЕЕ. Перед применением в колонке для гидрофобной хроматографии пул продукта, полученный на этапе хроматографии с РЕЕ, разбавляют буфером, содержащим 50 мМ НЕРЕЗ, рН 7.0, и буфером, содержащим 50 мМ НЕРЕЗ, 3.6 М аммония сульфата, рН 7.0, чтобы получить проводимость и концентрацию СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд в пуле продукта хроматографии с РЕЕ примерно 135 мС/см и <1 г/л соответственно.

Колонку для гидрофобной хроматографии уравновешивают при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕЗ, 1.2 М аммония сульфата, рН 7.0. Пул продукта СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, полученного на этапе хроматографии с РЕЕ, применяют в колонке после коррекции концентрации и проводимости. Затем колонку промывают при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕЗ, 1.2 М аммония сульфата, рН 7.0, для удаления слабосвязанных примесей. Белок СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд элюируют из колонки для гидрофобной хроматографии при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕЗ, 0.55 М аммония сульфата, рН 7.0.

Фильтрация вируса.

Концентрацию и диафильтрацию пула продукта СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд, полученного на этапе гидрофобной хроматографии, проводят при помощи ультрафильтрации. На этапе ультрафильтрации используют мембрану с НММП 30 кДа и буфер, содержащий 25 мМ NаН₂Р0₄, 10 мМ №С1, ρН 7.5. После ультрафильтрации проводят фильтрацию вируса при помощи мембраны Р1аηоνа 15 нм (компания АкаЫ Каке)). Затем пул продукта СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд корректируют до концентрации белка 25 г/л при помощи ультрафильтрации, используя мембрану НММП 30 кДа.

Санитарная обработка и хранение колонки.

Колонку для хроматографии с белком А МаЬЗе1ес! обрабатывают с помощью раствора 0.1 N №0Н, промывают буфером, содержащим 25 мМ NаН₂Р0₄, 150 мМ №С1, рН 7.5, чтобы понизить рН, а затем хранят в 20% этиловом спирте при температуре 2-8°С. Колонку для хроматографии с РЕЕ обрабатывают с помощью раствора 1 N №ЮН и хранят в растворе 0.1 N №ЮН при комнатной температуре. Колонку

- 179 017765 для гидрофобной хроматографии обрабатывают с помощью раствора 0.1 N №0Н, промывают 20% этиловым спиртом и хранят в 20% этиловом спирте при комнатной температуре.

Пример 20-Б. Далее приведен еще один пример данного метода очищения.

Инактивация вируса.

Значение рН очищенного концентрированного собранного материала корректируют до 8.0 добавлением 0.5 М раствора Трис. Возможных побочных вирусных возбудителей инактивируют добавлением 20% Тритона Х-100 до финальной концентрации 0.5% (об./об.). Обработанный Тритоном Х-100 раствор белка смешивают в течение >2 ч.

Афинная хроматография с белком А для очищения СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д. Аффинную хроматографию в колонке со смолой на основе белка А МаЬ8е1ес! (компания СЕ НеаЙЕсаге, ранее известная как АтегкЕат Вюкаепсек) применяют для выделения СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д из обрабатываемого материала, полученного на этапе инактивации вируса, и отделения СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д от большинства примесей.

В колонку с внутренним диаметром 140 см вводят смолу МаЬ8е1ес! РгА на высоту 18-25 см, что соответствует объему 339-372 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее НЕТР и Ад. Колонка характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и 0.8-1.2.

Колонка для хроматографии с МаЬ8е1ес1 РгА функционирует при температуре окружающей среды. После уравновешивания в нее загружают пул продукта инактивации вируса. Этап хроматографии с МаЬ8е1ес1 РгА проходит при максимальной скорости потока 26.6 л/мин и рабочем давлении <13 рад. Максимальное количество белка СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д, загружаемого в колонку для хроматографии с МаЬ8е1ес1 РгА, составляет 25 г белка СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д на 1 л смолы при линейной скорости 350 см/ч. Слой колонки может связать около 3.9 кг белка СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

Колонку с МаЬ8е1ес1 РгА уравновешивают при помощи буфера, содержащего 25 мМ NаН₂Р0₄, 150 мМ №С1, рН 7.5. Уравновешивание заканчивают, пропустив через колонку минимум 3 ОК уравновешивающего буфера, а также достигнув значений рН и проводимости эффлюента 7.3-7.6 и 14.5-17.5 мС/см соответственно.

В уравновешенной колонке для хроматографии с МаЬ8е1ес1 РгА применяют материал, обработанный Тритоном Х-100. Колонку промывают при помощи минимум 3 ОК буфера, содержащего 25 мМ NаН₂Р0₄, 150 мМ №С1, 0.5% Тритон Х-100, рН 7.5, удаляя слабосвязанные примеси. Данные примеси включают цитокин, белки хемотаксиса моноцитов 1 и Тритон Х-100. На следующих этапах промывания используют буфер, содержащий 25 мМ NаН₂Р0₄, 150 мМ №С1, рН 7.5, удаляя из колонки для хроматографии с МаЬ8е1ес1 РгА остатки Тритона Х-100.

СТЬА4-1д элюируют из колонки для хроматографии с МаЬ8е1ес1 РгА при помощи буфера, содержащего 250 мМ глицина, рН 3.0. Элюат отводят в сосуд для сбора, когда А₂₈₀ превышает исходные значения >0.2 ЕОП. Эффлюент пропускают через фильтр из ацетилцеллюлозы 0.2 мкм и выводят в сосуд для сбора, оборудованный смесителем. Элюат собирают, пока А280 заднего края пика элюирования не снизится до значения <0.2 ЕОП. СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д элюируется в виде узкого пика примерно в 2-3 ОК элютивного буфера. Значение рН элюированного пула корректируют до 7.5±0.2 при помощи буфера, содержащего 2 М НЕРЕ8, рН 7.5, чтобы быстро увеличить рН, тем самым, минимизировав образование высокомолекулярных видов СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д. Пул продукта, полученный на этапе хроматографии с МаЬ8е1ес1 РгА, держат при температуре окружающей среды в течение максимум 5 дней. Пул продукта можно хранить в охлажденном виде, профиль стабильности СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д одинаков при 5 и 22°С. Продукт годен не более 5 дней.

Собирают димер СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д с молярным соотношением сиаловой кислоты и белка СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д около 6 или 5.2-7.6.

Анионообменная хроматография с ОЕЕ для очищения СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д. Анионообменную хроматографию с использованием смолы 0-8ерЕагоке Рак! Е1о\г (ОРР) (компания СЕ НеаЙЕсаге) применяют, в основном, для увеличения количества видов белка СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д с наибольшим содержанием сиаловой кислоты и снижения уровня остаточного белка А. Пул продукта СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д из колонки с белком А МаЬ8е1ес! после коррекции рН разбавляют водой для инъекций примерно в два раза перед применением в колонке с О1Т.

В колонку с внутренним диаметром 80 см вводят смолу ОРР на высоту 27-35 см, что соответствует объему 136-176 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее НЕТР и Ад. Данная колонка характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и А, 0.8-1.2.

Колонка для хроматографии с ОРР функционирует при температуре окружающей среды. Колонку уравновешивают при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕ8, 50 мМ №С1, рН 7.0. Пул продукта, полученного на этапе хроматографии с белком А МаЬ8е1ес!, применяют в колонке для хроматографии с О1Т после коррекции рН и проводимости. Хроматографию с ОРР проводят при максимальной скорости потока 16.4 л/мин (196 см/ч) и максимальном рабочем давлении 35 ркг

Колонку дезинфицируют до и после использования при помощи раствора 1 N №ЮН. Раствор натрия гидроксида пропускают в количестве, равном не менее 2 объемам колонки. Затем колонку выдерживают в течение 60-120 мин. Приемлемый диапазон проводимости раствора и эффлюента 136-202 мС/см.

- 180 017765

Колонку уравновешивают при помощи буфера в количестве, равном не менее 5 объемам колонки, содержащего 50 мМ НЕРЕ8, 50 мМ натрия хлорида, рН 7.0. Диапазон рН и проводимости данного буфера 6.8-7.2 и 5.0-7.0 мС/см соответственно. Эти диапазоны также используют, определяя, уравновешена ли колонка.

Пул продукта, полученный из колонки с белком А МаЬ8е1ес!, применяют в колонке с РЕЕ после коррекции рН и проводимости, колонку промывают уравновешивающим раствором в количестве минимум 3 ОК для удаления слабосвязанных примесей. Затем колонку промывают буфером, содержащим 50 мМ НЕРЕ8, 135 мМ №1С1, рН 7.0, для удаления видов СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд с низким содержанием сиаловой кислоты.

Внды белка СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд с наиболее высоким содержанием сиаловой кислоты элюируют из колонки при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕ8, 200 мМ ИаС1, рН 7.0. К сбору элюата приступают с началом применения элютивного буфера в колонке. Во время элюирования эффлюент пропускают через фильтр 0.2 мкм и выводят в сосуд для сбора. Элюат собирают, пока поглощение заднего края пика элюнровання не снизится до значения <0.2 ЕОП выше исходного уровня. СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд элюируют из колонки при помощи буфера в количестве <5 ОК, содержащего 50 мМ НЕРЕ8, 200 мМ ИаС1, рН 7.0. Затем сосуд для сбора охлаждают до температуры 2-8°С. Максимальное время выдержки для пула продукта хроматографии с РЕЕ при температуре 2-8°С - 3 дня.

Собирают димер СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд с молярным соотношением сиаловой кислоты и белка СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд около 6 или 5.2-7.6.

Гидрофобная хроматография с РЬепу1 8ерЬагоке ЕЕ для очищения СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Гидрофобную хроматографию с использованием смолы Тоуореаг1 РЬепу1 650М (компания ТокоЬ Вюкшепсек) применяют, в основном, для сокращения количества высокомолекулярных видов СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд в пуле продукта, полученном на этапе хроматографии с РЕЕ.

В колонку с внутренним диаметром 100 см вводят смолу РЬепу1 8ерЬагоке РЬепу1 650М на высоту 18-22 см, что соответствует объему 141-173 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее НЕТР и А Колонка для гидрофобной хроматографии характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и А_к 0.8-1.2.

Колонка для гидрофобной хроматографии функционирует при температуре окружающей среды. Перед применением в колонке для гидрофобной хроматографии пул продукта, полученный на этапе хроматографии с РЕЕ, разбавляют буфером, содержащим 50 мМ НЕРЕ8, рН 7.0, и буфером, содержащим 50 мМ НЕРЕ8, 3.6 М аммония сульфата, рН 7.0, чтобы получить проводимость и концентрацию €4^4^^9,91,104^^ в пуле продукта хроматографии с РЕЕ около 135 мС/см и <1 г/л соответственно. Гидрофобную хроматографию проводят при максимальной скорости потока 22.6 л/мин (173 см/ч) и максимальном рабочем давлении 45 ркк Возможно проведение нескольких циклов гидрофобной хроматографии в зависимости от количества СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, присутствующего в пуле элюата РХЬ.

Вначале колонку для гидрофобной хроматографии дезинфицируют при помощи раствора 1 N гидроксида натрня. Дезинфекцию завершают, пропустив через колонку 2-4 ОК раствора 1 N гндрокснда натрия. Затем колонку выдерживают в течение 60-120 мин, чтобы гарантировать эффективность санитарной обработки.

После дезинфекции колонку для гидрофобной хроматографии уравновешивают при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕ8, 1.2 М аммония сульфата, рН 7.0. Уравновешивание заканчивают, пропустив через колонку минимум 3 ОК буфера и достигнув значений рН и проводимости эффлюента 7.0±0.3 и 135 мС/см соответственно.

Пул продукта СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, полученного на этапе хроматографии с РЕЕ, применяют в колонке после коррекции концентрации и проводимости. Затем колонку промывают при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕ8, 1.2 М аммония сульфата, рН 7.0, для удаления слабо связанных примесей. СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд элюируют из колонки для гидрофобной хроматографии при помощи буфера, содержащего 50 мМ НЕРЕ8, 0.55 М аммония сульфата, рН 7.0. Пул продукта гидрофобной хроматографии хранят в сосуде для сбора при температуре 2-8°С. Максимальное время выдержки в сосуде для сбора 3 дня.

Собирают димерный продукт СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд с молярным соотношением сиаловой кислоты и белка СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд около 6 или 5.2-7.6, имеется пул высокомолекулярного материала СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд в количестве <2.5%, пул низкомолекулярного материала СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд (например, мономер СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд) в количестве <0.5% и пул белка хемотаксиса моноцитов 1 в количестве <9.5 нг/мл.

Фильтрация вируса. Концентрацию и диафильтрацню пула продукта СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, полученного на этапе гидрофобной хроматографии, проводят при помощи ультрафильтрации. На этапе ультрафнльтрации используют мембрану с НММП 30 кДа и буфер, содержащий 25 мМ КаН₂Р0₄, 10 мМ ИаС1, рН 7.5. После ультрафильтрации проводят фильтрацию вируса при помощи мембраны Р1апома 15 нм (компания АкаЫ Каке1). Затем пул продукта СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд корректируют до концентрации белка 25 г/л при помощи ультрафильтрации, используя мембрану с НММП 30 кДа.

На этапе концентрации и диафильтрации в рамках производства и выделения СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд ис

- 181 017765 пользуют систему проточной фильтрации вдоль потока компании Ра11 РШгоп. Целью данного этапа является концентрация пула продукта, полученного на этапе гидрофобной хроматографии, до 45-55 г/л и замена элютивного буфера, который использовался для гидрофобной хроматографии, финальным буфером, применяемым для составов СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд. Сконцентрированный пул продукта СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}1д пропускают через поливинилиденфторидный фильтр 0.2 мкм и переносят в 50-л биопроцессорный мешочек.

Пример 21. Биологическая активность - определение биоспецифического связывания СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд с корецептором В-71д при помощи поверхностного плазмонного резонанса.

Поверхностный плазмонный резонанс (связывание В7).

В данном случае измеряется связывание СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд с типичным корецептором В7 при помощи поверхностного плазмонного резонанса. В-71д иммобилизуют при высокой плотности посредством первичных аминогрупп на поверхности активированного сенсорного чипа СМ5. Материал СТБА4-1§, образцы для контроля качества и пробы растворяют до концентрации 0.125-8 нг/мл и инжектируют по поверхности с В-71д для создания сенсограмм связывания. Начальную степень (угловой коэффициент) связывания СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд с иммобилизованным В-71д измеряют на поверхности с В-71д в ограниченных условиях массопереноса (диффузии). Начальная степень связывания в единицах резонанса в секунду (КИ/с) напрямую соотносится с активной концентрацией. Степень связывания проб преобразуют в активную концентрацию при помощи эталонной калибровочной кривой, где степень связывания материала СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд наносится в зависимости от концентрации. Окончательные результаты выражаются в качестве процента связывания пробы относительно материала СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд.

Присутствие Рс-фрагмента человеческого 1§О1 в СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд определяли при помощи поверхностного плазмонного резонанса (ППР). ППР позволяет измерять биоспецифические взаимодействия в реальном времени. Фрагмент антитела, специфичного к Рс-фрагменту человеческого иммуноглобулина (козьи антитела Р(аЬ')₂, специфичные к Рс-фрагменту человека), ковалентно иммобилизовали на поверхности сенсорного чипа. Связывание проб СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд определяли, измеряя реакцию на поверхности по сравнению с неизмененной поверхностью сенсорного чипа. Получены сравнимые результаты в единицах резонанса для процесса В, процесса С и совместной смеси, как показано на фиг. 6 и в табл. 23.

Таблица 23

Определение Рс-фрагментов человеческого иммуноглобулина в партиях лекарственного вещества СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-I_ё с использованием ППР

Партия №	КБ для антител к Рс	Ни для неизмененной поверхности
Партия А	1295	1
Партия В	1309	1
Совместная смесь	1268	1

Анализ ингибирования ИЛ-2 человеческих клеток.

Метод основан на угнетении с помощью СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд синтеза ИЛ-2 Т-клетками при стимулировании анти-СБ3 и В-клеток. Т-клетки линии 1игка1, трансфицированные геном люциферазы под контролем промотора ИЛ-2, стимулируют совместно с В-клетками линии 1)аиб1 и анти-СБ3 в присутствии различных концентраций СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд. При совместном стимулировании активируется промотор ИЛ-2, что, в свою очередь, приводит к продуцированию белка люциферазы. Получаемый в результате люминесцентный сигнал измеряют при помощи системы анализа люциферазы. В данной системе СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд провоцирует дозозависимое снижение активности люциферазы.

Получены сравнимые результаты для процесса В партии 000929-278, процесса С партии 2248182004-007 и совместной смеси партии 55128-162, как показано в табл. 24. Значения ЭК₅₀, угловых коэффициентов, верхней и нижней асимптот аналогичны для всех трех проб в рамках одного стандартного отклонения. Это означает, что СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд, полученный в результате процесса С и В, ведет себя одинаково в ходе анализа потенции ίη νΐίΓο.

Таблица 24 Сравнение активности люциферазы, медиируемой промотором человеческого ИЛ-2, в биотесте потенции ίη νότο. Параметры кривой дозовой зависимости для процессов изобретения

Партия №	ЭК5о (нг/мл)	Угловой коэффициент	Верхняя асимптота (фотонов в сек)	Нижняя асимптота (фотонов в сек)
Процесс А	19,1 ±1,9	-0,91 ±0,06	85000 ±15000	30000 ± 6000
Совместная смесь	21,5 ±2,7	-0,93 ±0,08	88000 ± 16000	29000 ± 5000
Процесс В	21,8 ±1,4	-0,91 ±0,09	81000 ± 17000	27000 ± 7000

- 182 017765

Материалы:

сенсорный чип СМ5, сертифицированный В1асоге (каталожный номер ВИ-1000-13);

буфер НВБ-ЕР, сертифицированный В^, содержит 10 мМ НЕРЕБ, рН 7.4, 150 мМ №0, 3.4 мМ ЭДТА, 0.005% об./об.;

сурфактант Р20 В1асоге (каталожный номер ВИ-1001-88);

набор реагентов для ковалентной иммобилизации лигандов за первичные аминогруппы компании В1асоге, сертифицирован В^, 115 мг N-гидроксисукцинимида (ХНБ), 750 мг 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлорида (ЕЭС), 10.5 мл этаноламина-НС1 (каталожный номер ВИ-1000-50);

В1асоге С Iη8ΐштеηΐ с РС-совместимым компьютером компании В1асоге (каталожный номер ВИ1100-51);

программное обеспечение В1асоге С Соп!го1, поставляемое с В1асоге С Iη8ΐштеηΐ, версия 1.0.1.

Сертифицированный набор реагентов. Набор содержит по одному флакону: 115 мг ХНБ, 750 мг ЕЭС и 10.5 мл этаноламина. Подготовьте каждый флакон согласно указаниям производителя. Распределите 200 мкл всего объема растворов N43 и ЕЭС по отдельным пластиковым/стеклянным флаконам соответствующего размера и закройте крышкой. Данные растворы стабильны в течение 2 месяцев при температуре -20°С. Распределите по отдельным пластиковым/флаконам соответствующего размера и закройте крышкой 200 мкл этаноламина. Данный раствор хранят при температуре 2-8°С; согласно указаниям производителя он остается стабильным.

Чтобы обеспечить надежное связывание с проточной кюветой, последнюю используют только в течение одной недели или 286 инъекций, в зависимости от того, что наступит первым. Новую проточную кювету иммобилизуют в начале каждой недели. Иммобилизация В7.1-Ц перед тестированием пробы. Примечание: распределите 200 мкл всех растворов по пробиркам компании В1асоге 7 мм для анализа. Разморозьте один флакон, содержащий В7.14д, при температуре окружающей среды. Разбавьте В7.1-Ц при помощи буфера, содержащего 10 мМ ацетата, рН 5.0 (1.7), до массы поверхности около 3000-9000 единиц резонанса (ИИ). Разморозьте по одному флакону (200 мкл) ЕЭС и NНБ при температуре окружающей среды. Достаньте этаноламин-НС1 из холодильника и дайте нагреться до комнатной температуры. Из программного обеспечения компании В1асоге: откройте опубликованный проект Иммобилизация В7-[д. выбрав его в Мастере иммобилизации. Откройте опубликованный файл В7 ЕптоЬ.ЬЕг. Следуйте указаниям мастера, подтвердите или измените выбор, нажмите Далее. Под графой Информация пользователя выберите проточную кювету, введите сведения об эксперименте во вкладке Блокнот. Поставьте флаконы с реагентом и лигандом на стойку для проб, как указано. Сверьтесь с инструкцией. Сохраните шаблонный файл как: В7 IттοЪ ВЮ0С№ Дата Инициалы Чип № Проточная кювета №. Ы\у. Приступите к иммобилизации, нажав Пуск. Сохраните получившийся файл как: В7 IттοЪ ВЮ0С№ Дата Инициалы Чип № Проточная кювета №.Ъ1г. После завершения анализа распечатайте результаты мастера и сенсограмму.

Пример 22. Анализ состава СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд по содержанию углевода. Триптическое пептидное картирование и изоэлектрическое фокусирование.

Пептидное картирование с использованием триптического гидролизата.

При использовании данного триптического метода пробы СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд денатурируют с помощью гуанидина-НС1, восстанавливают и алкилируют с помощью ДТТ и ИАА. Обессоливают в колонке NΛР-5 и гидролизуют трипсином. Гидролизованную смесь отделяют при помощи обратнофазовой хроматографии (С18), пики определяют по УФ-поглощению при длине волны 215 нм.

Реагенты: раствор подвижной фазы А (0.02% трифторуксусная кислота (ТФК) в воде (об./об.)); раствор подвижной фазы В (0.02% ТФК в 95% АЦН (ацетонитрил) и 5% воды (об./об.)); алкилирующий агент (200 мМ йодацетамида (ИАА)); растворяющий буфер (100 мМ Трис, 25 мМ №0, ρН 8.0); денатурирующий буфер (8 М гуанидина, 50 мМ Трис, рН 8.0); буфер для гидролиза (50 мМ Трис, 10 мМ СаС1₂, рН 8.0); восстанавливающий агент (100 мМ ДТТ).

Инструментарий (можно использовать эквивалентные приборы): колонки NΛР-5 (компания АтегкЫат, кат. № 17-0853-02); нагреватель колонки ВЭЖХ; система ВЭЖХ с нагревателем колонки и УФдетектором \Уа1ег'5 АШапсе.

- 183 017765

Обзор процедуры.

СТЬА4^{а29¥ь104Б}-1§

I

V Денатурированный/восстановленный/ алкилированный белок

I

V Обессоленный белок

I

V

Гидролизованный белок

I

V

Профиль карты и сведения МС

Восстановление и алкилирование: пробы (например, СТ^А4^{Λ29Υ^104Е}-Iд и т.д.) разбавляли до 10 мг/мл, добавляя воду до конечного объема 100 мкл (1 мг). 560 мкл денатурирующего буфера и 35 мкл восстанавливающего агента (100 мМ ДТТ) добавляли к 100 мкл проб, смешивали и центрифугировали на низкой скорости в течение 3 с. Затем пробы инкубировали при температуре 50°С в течение 20±2 мин. Далее в каждую пробу добавляли 35 мкл алкилирующего агента (200 мМ ИАА) и снова перемешивали, центрифугировали на низкой скорости в течение 3 с. Затем пробы закрывали алюминиевой фольгой и инкубировали при температуре 50°С в течение 20±2 мин. После уравновешивания колонок NАР-5 пропусканием буфера для гидролиза в количестве, равном 3 объемам колонки (около 7-8 мл), 500 мкл восстановленных и алкилированных смесей выливали на колонки NАР-5, давая жидкости стечь сквозь колонку. Далее пробы собирали с колонок NАР-5 посредством элюирования при помощи 1 мл буфера для гидролиза.

Гидролиз: пробы гидролизовали при помощи 20 мкл трипсина (0.5 мкг/мкл) при температуре 38°С на водяной бане в течение 4 ч (±0.5 ч). По завершении пробы подкисляли при помощи 2.5 мкл ТФК. Затем пробы помещали в сосуды автодозатора для последующего анализа.

Инструментальный метод: инструментальный метод приведен ниже.

Время (мин)	Поток (мл/мин)	Подвижная фаза А	Подвижная фаза В
0	0,7	100	0
17	0,7	83	17
27	0,7	78	22
42	0,7	73	27
58	0,7	65	35
74	0,7	52	48
79	0,7	0	100
84	0,7	100	0
88	0,7	100	0

Колонку уравновешивали 100% буфером подвижной фазы А в течение 25 мин до первой инъекции. УФ-поглощение отслеживали при 215 нм, температуру колонки поддерживали на уровне 37°С, температуру автодозатора - на уровне 4°С. Холостую пробу буфера подвижной фазы А пускали перед первым стандартом пригодности системы, вслед за которым инжектировали по 50 мкл каждой пробы. Эталонный материал инжектировали через каждые шесть инъекций проб.

Число теоретических тарелок. Эффективность колонки, измеряемую в числе теоретических тарелок, можно количественно оценить при помощи показателей времени удерживания и ширины пика согласно следующему уравнению:

Ν=16χ(ΐΛν)² где \ν - ширина пика в основании, измеренная экстраполяцией сравнительно прямых боковых сто рон к основанию;

- время удерживания пика, измеренное от времени инъекции до времени элюирования максимума пика.

Если N <50000, уравновесьте колонку заново.

Степень разделения: определите степень разделения (К) двух пиков, например пиков Т2 и Т12, как показано на фиг. 32, используя следующее уравнение:

К=2(1₂-11)/0У]+^₂) где 1₁, 1₂ - время удерживания пиков фрагментов Т2 и Т12 соответственно.

\₁, \₂ - сегмент основания пика, который отсекается двумя касательными в точках перегиба пиков со временем удерживания 1₁ и 1₂ соответственно.

- 184 017765

Если К <1.5, колонку следует уравновесить повторно. Если проблема не устраняется, замените колонку.

На фиг. 32 и в табл. 25 показаны пептидные фрагменты, полученные путем гидролиза СТЬА4^{А29¥Ь104Е}-1§ трипсином. Участок с пептидами Т7 и Т9 на ~50 мин иногда отражает неполный гидролиз проб, и в разные дни возможно различное качество пиков; однако в рамках одного захода наблюдается сравнимость всех проб.

Номер фрагмента

Т1

Т2

ТЗ

Т4

Тб

Т9⁷ тю

Т11

Таблица 25

Триптические пептидные фрагменты СТЕА4^{А29УЕ104Е}-1д

Номер остатка

1—14

15—28

29—33

34—38

39—83^е

84—93

94—128°

129—132

133—158°

159—165

166—184

Теоретиче

Наблюдав

Пептидная последовательность ская масса мая масса

МНУА(2РАУУЬА881<

1485,7

666,3

586,7

4900,4

1171,4

3983,5

435,4

3345,7

834,9

2140,3

666,4

586,4

1170,5

Нет данных

---а—

834,5

2138,5

О1А8РУСЕУА8РОК

УТЕУК

УТУЬК

ζ)Αϋδ()νΤΕνΕΑΑΤΥΜΜ(3ΝΕΕΤΕΕϋ

Ο8ΙΕΤ(3Τ88(3Νζ)νΝΕΤΙ9ϋΕΚ

АМЛТ6ЬУ1СК νΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟΙΟΝΟΤζΗΥνίϋΡΕΡ

СРО8О(2ЕРК

88ЭК

ТНТ8РР8РАРЕЕЕСС88УРЬРРРКРК

ОТЬМ18К

ТРЕУТСУУУОУ8НЕОРЕУК

- 185 017765

Т12	185—198	1677,8	1677,8	ΕΝλνΥνϋθνΕνΗΝΑΚ
Т13	199—202	500,6	500,3	ТКРК
Τ14η	203—211е	1189,2	о	ΕΕ0ΥΝ8ΤΥΚ
Τ15	212—227	1808,1	1808	уузуьтуьнооуъмсгК
Τ16	228—230	438,5	438,2	ΕΥΚ
Τ17	231—232	307,4	Нет данных	СК
Τ18	233—236	446,5	Нет данных	ν§ΝΚ
Τ19	237—244	838,0	837,4	АЬРАИЕК
Τ20	245—248	447,5	447,2	ΤΙ8Κ
Τ21	249—250	217,2	Нет данных	АК
Τ22	251—254	456,5	456,3	σς)ρκ
Τ23	255—265	1286,4	1285,6	ЕРС^УУТЬРРЗК
Τ24	266—270	604,7	604,3	ЭЕЬТК
Τ25	271—280	1161,4	1160,7	НОУЗЬТСЬУК
Τ26	281—302	2544,7	2544	ΟΡΥΡ8ΟΙΑνΕν/Ε8Ν(3ζ)ΡΕΝΝΥΚ
Τ27	303—319	1874,1	1873,9	ТТРРУЬОЗООЗРРЬУЗК
Τ28	320—324	574,7	574,3	υτνϋκ
Τ29	325—326	261,28	Нет данных	8К
ТЗО	327—349	2803,09	2802,1	λνΟΟσΝνΡδΟδνΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚ
Τ31	350—356	659,7	659,2	8Ь8Ь8РО
Тб	84—93	1171,4	1170,5	АМОТСЬУ1СК

- 186 017765

Т7Ь	94_128е	3983,5	----2Σ3----	νΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟίσΝΟΤί^ΙΥνίϋΡΕΡ ΟΡϋ8ϋζ)ΕΡΚ
Т815	129—132	435,4	Нет данных	88ΏΚ
Т95	133—158е	3345,7	ύ	ТНТ.8РР8РАРЕЕЕ6(388УЕЕЕРРКРК
Т10	159—165	834,9	834,5	ОТЬМ18К
Т11	166—184	2140,3	2138,5	ТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕУК
Т12	185—198	1677,8	1677,8	ΕΝ\νΥνϋθνΕνΗΝΑΚ
Т13	199—202	500,6	500,3	ΤΚΡΚ
Т14	203—211е	1189,2	ά	ΕΕ(2ΥΝ8ΤΥΚ
Т15	212—227	1808,1	1808	УУЗУЕТУЕНОЮМОЮК
Т16	228—230	438,5	438,2	ΕΥΚ
Т17	231—232	307,4	Нет данных	СК
Т18	233—236	446,5	Нет данных	Υ8ΝΚ
Т19	237—244	838,0	837,4	ΑΕΡΑΡΙΕΚ
Т20	245—248	447,5	447,2	ΤΙ8Κ
Т21	249—250	217,2	Нет данных	ΑΚ
Т22	251—254	456,5	456,3	СЭРЕ
Т23	255—265	1286,4	1285,6	ЕРЭУУТЬРРЗЕ
Т24	266—270	604,7	604,3	ОЕЬТК
Т25	271—280	1161,4	1160,7	НСЗУЗЬТСЬУК
Т26	281—302	2544,7	2544	ΟΡΥΡδϋΙΑνΕλνΕδΝσΟΡΕΝΝΥΚ
Т27	303—319	1874,1	1873,9	ΤΤΡΡνΕΟ8Ο68ΓΡΕΥ8Κ
Т28	320—324	574,7	574,3	ΕΤνϋΚ
Т29	325—326	261,28	Нет данных	8Κ
ТЗО	327—349	2803,09	2802,1	Μ/ζίζΚιΝνΕδΟδνΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤί^Κ
Т31	350—356	659,7	659,2	8Ε8Ε8ΡΟ

^а Пептиды с N-связанным углеводом.

^Ь Пептиды с О-связанным углеводом.

^с Для Т5, Т7, Т9 и Т14 даны массы без учета углеводного компонента.

^б Наблюдалось несколько масс, соответствующих гликозилированным пептидам.

Изоэлектрическое фокусирование.

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) применяют для оценки изоэлектрических точек (р1) различных изоформ СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд в лекарственном веществе и готовой лекарственной форме. Для данного метода использовали пластины АтрйоНпе® РАС Р1а1е компании Рйагтас1а Вю1есй при градиенте рН 4.0-6.5 и планшетную систему для электрофореза МиШрйоге П. Пробы (например, СТ^А4^{Ά29Υ^104Е}-Iд и т.д.) растворяют в воде, очищенной в системе Милли^, и загружают прямо в гель при помощи полосок для внесения проб. Гель фокусируют в течение 2.5 ч под возрастающим напряжением с использованием катодной полоски, пропитанной 100 мМ β-аланина, и анодной полоски, пропитанной 100 мМ глутаминовой кислоты/500 мМ фосфорной кислоты. После фокусирования гель фиксируют при помощи сульфосалициловой кислоты/трихлоруксусной кислоты и окрашивают кумасси синим. Далее влажный гель сканируют в цифровое изображение, используя лазерный денситометр при пространственном разрешении 50 или 100 мкм с обеспечением до 4096 уровней оптической плотности. СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд фо

- 187 017765 кусируют в 10-15 полос в диапазоне рI от 4.5 до 5.5.

При изоэлектрическом фокусировании нативного СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд на геле (рН 4.0-6.5) получают сходный паттерн полос в диапазоне рI от 4.6 до 5.5 для процесса С партии 224818-2004-007, процесса В партии 000929-287 и совместной смеси партии 55128-162, как показано на фиг. 12. Это доказывает, что материалы В и С сравнимы при их анализе в одном и том же геле ИЭФ.

Стандарты изоэлектрофокусирования должны хорошо выделяться на фоне (см. фиг. 12).

Стандарт белка	р1
Лектин чечевицы	8,65 8,45
Лошадиный миоглобин	7,35 6,85
Кональбумин	5,90
Лактоглобулин	5,20
Соевый ингибитор трипсина	4,55
Амилоглюкозидаза	3,50

СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд определяют в виде множественных полос (>10) с диапазоном рI от около 4.5 до примерно 5.5 (фиг. 32).

СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд - химерный гликопротеид СТ^Α4-Iд второго поколения, состоящий из модифицированного связывающего лиганд домена антигена цитотоксических Т-лимфоцитов 4 (СТ^Α4) и константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина Ιρ6|. Данная инновационная молекула имеет терапевтическое применение в качестве иммунодепрессанта. СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд содержит множественные заряженные изоформы, которые можно расщепить с помощью изоэлектрического фокусирования (ИЭФ). Был разработан метод ИЭФ для анализа лекарственного вещества и готовой лекарственной формы СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд. Данный метод используют для изучения СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд в планшетной системе для электрофореза МиШрйоге ΙΙ на пластине Αтрйо1^ηе® ΡΑΟ Р1а1е с рН 4.0-6.5. Лекарственное вещество СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд, готовую лекарственную форму и эталонный материал растворяют в воде, очищенной в системе Милли-Р, и загружают прямо в гель. Гель фокусируют в течение 2.5 ч под возрастающим напряжением с использованием катодной полоски, пропитанной 100 мМ Р-аланина, и анодной полоски, пропитанной 100 мМ глутаминовой кислоты/500 мМ фосфорной кислоты. После фокусирования гель фиксируют и окрашивают кумасси синим. Окрашенный гель сканируют при помощи лазерного денситометра и проводят полуколичественный анализ полосок геля на цифровом изображении.

Материалы:
Пластины АтрЬоИпе РАС Р1а1е с гелем рН 4,0—6,5	Компания ОЕ Неакйсаге (кат. номер 80-1124-81)
Электродные полоски ИЭФ 6 х 280 мм	Компания СЕ Неакйсаге (кат. номер 80-1004-40)
Фрагменты для нанесения проб	Компания СЕ Неакйсаге (кат. номер 80-1129-46)
Оборудование:
Система для электрофореза МиШрйог II	Компания СЕ Неа11йсаге (кат. номер 18-1018-06)
Охлаждающая пластина 125 х 260 мм	Компания СЕ Неакйсаге (кат. номер 80-1106-54)
Источник питания,	Компания ΝΟνΕΧ (модель Ва81с 3540) Компания ВюКай (модель РАС3000)
Термостатический циркулятор	Компания νλΥΚ (модель 13271-074/11608 1160А)
Орбитальный встряхиватель	Компания ΙΚΑ (модель К8250/260)
Персональный денситометр 81	Компания ОЕ НеаИНсаге (модель 375)
Программное обеспечение 1та§е(2иап1ТЬ	Компания СЕ Неакйсаге

Приготовление реагентов.

Анодный буферный раствор (100 мл): 0.1 М глутаминовой кислоты в 0.5 М фосфорной кислоты; 3.4 мл 85% фосфорной кислоты; 1.47±0.02 г глутаминовой кислоты; вода, очищенная в системе МиллиС). Добавить глутаминовую кислоту к 50 мл воды, очищенной в системе Милли-р. Добавить 85% фосфорную кислоту и довести до объема 100 мл, перемешать. Указать дату истечения 6-месячного срока годности, хранить при температуре 4°С.

Катодный буферный раствор (100 мл): 0.1 М β-аланин, 0.9±0.02 г β-аланина, вода, очищенная в системе Милли-р. Соединить реагент с водой, очищенной в системе Милли-Р, до объема 100 мл, перемешать. Указать дату истечения 6-месячного срока годности, хранить при температуре 4°С.

- 188 017765

Фиксирующий раствор (2000 мл): 3.5% 5-сульфасалициловой кислоты в 12% трихлоруксусной кислоте; 240±5.0 г трихлоруксусной кислоты, 70±2.0 г 5-сульфасалициловой кислоты, вода, очищенная в системе Милли-9. Соединить реагенты и воду, очищенную в системе Милли-9, до объема 2000 мл. Указать дату истечения 3-месячного срока годности, хранить при комнатной температуре.

Подготовка приборов и приготовление геля. Подсоедините охлаждающую платформу прибора для электрофореза Ми1йрйоге ΙΙ к термостатическому циркулятору МиНСТетр и выставите температуру 10°С. Дождитесь, пока температура циркулятора составит 10±2°С. Достаньте гель из холодильника. При помощи ножниц аккуратно обрежьте конверт вдоль всех четырех сторон, не затрагивая гель/подложку геля. Добавьте примерно 1.0 мл воды, очищенной в системе Милли-9, на один край охлаждающей платформы. Поместите один край геля/подложки геля в воду, так чтобы вода омывала его полностью. Осторожно распределите гель по охлаждающей платформе, избегая образования пузырей воздуха. Удалите прозрачную пленку с поверхности геля. Пропитайте каждую электродную полоску примерно 3.0 мл соответствующего электродного раствора (см. таблицу ниже). Наложите электродные полоски примерно в 10 мм от верхнего и нижнего края геля. Поместите катодную полоску ближе к отметке (-), а анодную - к отметке (+) на охлаждающей платформе. После наложения электродных полосок обрежьте их по размерам геля, не затрагивая подложку.

Электродные растворы и параметры электрофореза

Диапазон РН	Анодный раствор	Катодный раствор	Напряжение	Сила тока (мА)	Мощность (Вт)	Время (ч)
4,0 - 6,5	0,1 М глутаминовая кислота в 0,5 Μ Н3РО4	0,1 Μβаланин	2000	25	25	2,5

Наложите фрагменты для нанесения проб примерно на 10 мм выше катодной полоски. Задав параметры электрофореза, определенные в таблице выше, проведите предварительную фокусировку геля, пока напряжение не достигнет 300 В.

Приготовление ИЭФ маркёра ρI и контроля окрашивания. Восстановите ИЭФ маркёр ρI при помощи 100 мкл воды, очищенной в системе Милли-9. Восстановите контроль окрашивания карбоангидразу ΙΙ при помощи 1000 мкл воды, очищенной в системе Милли-9, для получения 1.0 мг/мл исходного раствора. Добавьте 10 мкл исходного раствора (1.0 мг/мл) к 90 мкл воды, очищенной в системе Милли-9, получив конечную концентрацию загрузки 0.10 мг/мл.

Приготовление пробы. Разведите эталонный материал СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е}-Iд и пробы до концентрации 2 мг/мл. Пример: если концентрация пробы СΊ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд составляет 25 мг/мл, для получения финальной концентрации загрузки 2 мг/мл разбавьте следующим образом:

мкл (25 мг/мл) + 115 мкл воды, очищенной в системе Милли-9 = 2 мг/мл. Примечание: если концентрация пробы <2.0 мг/мл, загружайте неразбавленные пробы. Загрузка геля. Загрузите гели для облегчения идентификации пробы на основе схемы электрофореза. Не загружайте гель симметрично. Загрузите ИЭФ маркёр р^д контроль окрашивания, эталонный материал СΊ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд и пробы СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е}-Iд, как указано в таблице ниже. Загрузите все пробы на фрагменты для нанесения.

Схема загрузки геля.

Линия	Описание	Концентрация загрузки (мкг/мкл)	Объем загрузки (мкл)	Содержание белка (мкг)
1	ИЭФ маркер ρΐ*	-	10,0	-
2	ИЭФ маркер ρΐ	-	10,0	-
3	Эталонный материал СТЬА4а29¥Е104е-1§	2,0	10,0	20
4	Проба 1	2,0	10,0	20
5	Контроль окрашивания	0,10	10,0	1,0
6	Проба 2	2,0	10,0	20
7	Эталонный материал СТЬА4А29¥Е104Е-1§	2,0	10,0	20
8	ИЭФ маркер р!	-	10,0	-

* Загрузка ИЭФ маркёра ρI на линию 1 необходима для определения ориентации геля. Загрузите по схеме линию 2, затем повторите для дополнительных проб. ИЭФ маркёр ρI следует загружать хотя бы на каждую десятую линию (пример: МК818₂8₃8₄8₅8₆КМ; М - маркёр; К - эталонный материал, 8_Х - проба).

- 189 017765

Обработка геля. Поместите электрододержатель на прибор МиШрЬог II, расположите электроды посредине электродных полосок на геле. Подсоедините электроды из электрододержателя к базовому прибору и установите в заданное положение предохрантительную крышку. При помощи клейкой ленты закройте отверстия в предохрантительной крышке, чтобы не дать гелю высохнуть. Подсоедините электроды к источнику питания. Проведите электрофорез при соответствующем напряжении, силе тока и мощности. После окончания электрофореза отключите питание, уберите предохрантительную крышку и электрододержатель. Осторожно удалите электродные полоски и фрагменты для нанесения проб из геля. Переместите весь гель и подложку с охлаждающей пластины в чашку Ругех™ 280x180x40 мм, содержащую 200 мл фиксирующего раствора. Накройте чашку пластиковой оболочкой и поместите в орбитальный встряхиватель при комнатной температуре минимум на 20 мин. Примечание: гель фиксируют максимум в течение 1 ч. По окончании фиксации промойте гель 3 раза по 5 мин в примерно 200 мл воды, очищенной в системе Милли-9. Смешайте раствор реагента для окрашивания Ое1Собе В1ие, несколько раз перевернув флакон. Наносить следует гомогенный реагент, поэтому обязательно смешивайте его перед использованием. Добавьте примерно 200 мл окрашивающего реагента в чашку. Накройте чашку пластиковой оболочкой и поместите в орбитальный встряхиватель при комнатной температуре на 18-20 ч для создания оптимального паттерна полос. По завершении окрашивания промойте гель, заменив окрашивающий реагент примерно 200 мл воды, очищенной в системе Милли-9. Для оптимального результата замените воду как минимум 3 раза в течение 1-2 ч.

Сканирование и анализ геля. Сканируйте гель согласно параметрам, определенным в таблице ниже. Анализ геля проводят по сканированному изображению.

Параметры сканирования и анализа геля

Параметры сканирования	Установки
Размер пикселя	100
Цифровое разрешение	12 бит
Параметры определения полос
Минимальный угловой коэффициент	Исходное значение 100
Подавление шумов	Исходное значение 10
Максимальный пик (%)	Исходное значение 0
Ширина линии (%)	Установить 90%

Примечание: в табл. 3 приведены общие рекомендации по анализу изображений геля. Более подробные сведения по надлежащей регулировке каждого из параметров определения полос см. в бумажном и электронном руководстве 1таде9иап1 ТЕ (версия 2003.03).

Откройте файл с изображением геля (отсканированные необработанные данные) в <1ϋ Ое1 Апа1ук1к> в программе 1таде9иап1ТЬ. На панели инструментов выберите меню <Соп1гак1> и снижайте значение параметра <1таде Н1к1одгат> до четкого проявления полос. Щелкните меню создания линии <Ьапе Сгеа1юп> и выберите ручной режим <Мапиа1>, чтобы задать количество линий для анализа ШгпЬег оГ Ьапек>. Выставьте ширину линии <Ьапе% ^161Ь> до 100%, чтобы охватить линии геля. При необходимости настройте должным образом отдельные линии. Используйте функцию <Ко11тд Ва11>, чтобы убрать фон. Для анализа изображения геля ИЭФ это не критично. Определите полосы при помощи исходных значений минимального углового коэффициента <М1штит З1оре>, подавления шумов <Ж1ке Кебис1юп> и максимального пика <%Мах1тит Реак>, указанных в табл. 3. Корректировка этих значений необходима для точного определения полос. Вручную задайте пропущенные или неверно идентифицированные полосы. Вычислите значение р1 полосы, используя стандартный маркёр р1 из меченых маркёров, перечисленных в разделе Пригодность системы для геля рН/р1 4.0-6.5. Не проводите калибровку и нормализацию. Экспортируйте данные, содержащиеся в окне измерений, в таблицу Ехсе1 для дальнейших вычислений и составления отчета. Импортируйте данные Ехсе1 в утвержденную крупноформатную таблицу для проведения количественного анализа полученных результатов.

Пригодность системы. Стандарты изоэлектрофокусирования (маркёры р1) должны быть хорошо отличимыми от фона и давать ограниченное искажение при визуальном осмотре сканированного изображения геля (список маркёров р1 см. в таблице ниже).

- 190 017765

Стандарты изоэлектрофокусирования

Белок	Значение р1
Трипсиноген	9,30
Лектин чечевицы, базовый	8,65
Лектин чечевицы, средний	8,45
Лектин чечевицы, кислый	8,15
Миоглобин, базовый	7,35
Миоглобин, кислый	6,85
Карбоангидраза В (человеческая)	6,55
Карбоангидраза В (бычья)	5,85
В-лактоглобулин А	5,20
Ингибитор соевого трипсина	4,55
Метиловый красный (краситель)	3,75
Амилоглюкозидаза	3,50

Примечание: на геле проявляются не все стандарты изоэлектрофокусирования, так как диапазон р11/μΙ геля составляет 4.0-6.5. Маркёры рI при 3.50, 4.55, 5.20 и 5.85 идентифицируют и помечают на геле.

Паттерн полос эталонного материала СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд и тестовых проб должен давать ограниченное искажение при визуальном осмотре сканированного изображения геля. Контроль окрашивания карбоангидразу ΙΙ (р 5.4) при низком уровне содержания белка (1.0 мкг) используют для демонстрации равномерного окрашивания геля. Полоса должна явно выделяться на фоне при визуальном осмотре сканированного изображения геля. Эталонный материал СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд должен содержать 8-15 полос интенсивностью >1.0% в диапазоне рI 4.5-5.6. Полосы эталонного материала 01^4^⁹^¹⁰⁴^¾ в диапазоне рI 4.5-5.6 должны обладать совокупной процентной интенсивностью >95%.

Расчет данных. Для расчета совокупной процентной интенсивности проб СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд относительно эталонного материала используют следующее уравнение:

Совокупная процентная интенсивность=(% интенсивности полосы пробы φΙ 4.5-5.6)/% интенсивности эталонной полосы (р/4.5-5.6))х100.

Пример: если интенсивность полосы пробы в процентах (при рI 4.5-5.6) составляет 95%, а интенсивность полосы эталонного материала в процентах (при рI 4.5-5.6) - 100%, совокупная процентная интенсивность равна 95%.

Материал СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд в одном варианте должен содержать полосы с относительной интенсивностью >1.0% в диапазоне рI 4.5-5.6. Материал СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд имеет совокупную процентную интенсивность относительно эталонного материала СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд в диапазоне рI 4.5-5.6.

Пример 23. Трансфекция и генерация линий клеток.

Перед электропорацией вектор экспрессии р^16^ЕЛ29Υ линеаризовали с ферментом ВкΐВI для получения сравнимых липких концов 4 т.п.н. Линеаризованный вектор и расщепленную ДНК из спермы лосося (в качестве переносчика) совместно осаждали при помощи этилового спирта и с соблюдением асептики ресуспендировали в среду РР СНО (компания ТВН Вюкшепсек) для электропорации в клетки ОС44.

После электропорации клеткам давали восстановиться в неселективной среде. Затем засевали их в 96-луночные планшеты в селективной среде РР СНО, содержащей 500 нг/мл рекомбулина (компания С1Ьсо), 4 мМ Ь-глутамина (компания С1Ьсо) и метотрексат (компания ^Η).

Линии клеток, продуцирующих СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд, отбирали с данного планшета для амплификации экспрессии, используя следующую прогрессию концентраций метотрексата (МТКС), добавленного в среду:

Вся экспрессионная плазмида СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд интегрируется в клеточный геном.

Отбор продукционной линии клеток.

Финальную продукционную линию клеток СР1.1.9 выделяли после двух циклов клонирования методом серийных разведений амплифицированных клеточных линий с наилучшей производительностью из основной лунки. Выбор клеточной линии СР1.1.9 основывался на схеме роста, титре, пониженном содержании в продукте высокомолекулярного компонента и повышенном содержании сиаловой кислоты в сравнении с материалом, продуцируемым другими клонами.

- 191 017765

Пример 24. Генетическая характеристика СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд.

Геномные исследования стабильности.

ДНК и РНК, выделенные из клеток, полученных из банка клеток, использовали для БоиШегп и №г111егп анализа гибридизации, а также задания последовательности кДНК для кодирующей последовательности СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Полученное сравнивали с результатами по СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд.

Результаты №г111егп анализа гибридизации и оценки последовательности кДНК представлены ниже.

№г111егп анализ гибридизации.

Объем культуры, инокулированной клетками из банка клеток, увеличивали и использовали для выделения РНК и №г111егп анализа гибридизации. Приготовленная культура была представлена клетками примерно 27 поколений, возникших после клеток ш у11го, использованных для процесса производства СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Общая РНК была выделена из клеток, полученных их банка клеток СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд и культуры СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд увеличенного объема. В данных экспериментах также применяли контроль в виде общей РНК из родительской линии клеток СНО. Примерно 5 мкг общей РНК подвергли электрофорезу в агарозном геле в условиях денатурации. РНК в геле блотировали на нейлоновой мембране и гибридизовали с ³²Р-меченым фрагментом ДНК 1.2 т.п.н. НшйШ/ХЬаф содержащим ген СТЬА4^А29™^04ЕΙ§. Фрагмент ДНК 1.2 т.п.н. НтйШ/ХЬаф использованный для образца, выделяли из плазмиды р^16^ЕЛ29Υ.

Виды мРНК длиной примерно 1.6 т.п.н., которые гибридизовали в образец гена СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, определяли в пробе общего РНК из банка клеток, как показано на фиг. 33. Панель А и панель В, приведенные на фиг. 33, представляют агарозный гель, окрашенный этидия бромидом, и соответствующую авторадиограмму.

Полученные результаты указывают на то, что культуры увеличенного объема, полученные из банка клеток СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, экспрессировали только один транскрипт, кодирующий СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Кроме того, в данных пробах не наблюдалось определяемых изменений транскрипта мРНК СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд по сравнению с результатами, полученными с использованием банка клеток.

Пример 25. Гель-проникающая хроматография.

Гель-проникающую хроматографию применяли для анализа составов СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд с использованием колонки ТозоНааз Т8К-3000 Б\ХЬ 7.8 ммх300 мм, оборудованной защитной колонкой с детектированием при 280 нм. СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд оценивали на гомогенность продукта, включая мономер (одиночная цепь), димер и высокомолекулярные виды (например, тетрамер). Для метода характерна высокая точность (<2%) при номинальной концентрации около 10 мг/мл и линейность от ~ 0.5-15 мг/мл (г²=0.999). ПО (предел обнаружения) ~2.26 Фг/мл, ПКО (предел количественного определения) ~7.53 Фг/мл. Данные растворимые молекулы СТ^А4-Iд являются химерными белками, состоящими из связывающего лиганд домена антигена цитотоксических Т-лимфоцитов 4 (СТБА4) и константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина Ιβ%, которые можно применять в терапевтических целях в качестве иммунодепрессантов. Эти соединения оказывают физиологическое действие, связывая антигены В7 (СБ80 и СБ86) на поверхности различных антигенпредставляющих клеток (АПК), таким образом блокируя функциональное взаимодействие В7.1 и В7.2 с СБ28 на поверхности Т-клеток. Данная блокировка приводит к угнетению активации Т-клеток, а следовательно, иммунного ответа. Хотя ^ЕЛ29Υ отличается от СТ^А4Iд только двумя аминокислотными остатками, ЬеЦ1₀₄-д1и и А1а29-Тгу, молекулы обладают совершенно разной авидностью в отношении антигенов В7.1 и В7.2. ^ЕЛ29Υ обладает в 5-10 раз большей авидностью в отношении человеческой формы В7.2 (СБ86) и схожей авидностью в отношении человеческой В7.1 (СБ80) по сравнению с родительской СТ^А4Iд.

Гель-проникающую хроматографию с использованием колонки Т8К-3000 Б\ХЬ (7.8 ммх300 мм), оборудованной защитной колонкой с детектированием при 280 нм, применяют для анализа лекарственного вещества СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд на гомогенность. Дифференцируют димер СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд, высокомолекулярные и низкомолекулярные виды.

Гель-проникающую хроматографию (ГПХ) применяют для оценки продукта СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд на гомогенность. На фиг. 34 показаны хроматограммы ГПХ СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд для процесса В, процесса С и партии совместной смеси. Согласно ГПХ СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд материал процесса С на 99.8% площади состоит из димера, на 0.2% из высокомолекулярных видов, низкомолекулярных видов не обнаружено. Данные результаты сравнимы с результатами по материалу процесса В (димер 97.4 - процента площади, высокомолекулярные виды - 2.6 процента площади, низкомолекулярные виды <110).

Реагенты: 4 N К0Н (100 мл); стандарт пригодности системы (маркёры молекулярной массы, растворенные в чистой воде для хроматографии); подвижный буфер подвижной фазы (0.2 М КН₂Р0₄, 0.9% №С1, рН 6.8); 4 N №10Н; растворяющий буфер (25 мМ NаН₂Р0₄-Н₂0, 10 мМ №С1, рН 7.5).

Инструментарий и условия: возможна замена эквивалентными приборами

- 192 017765

Тип насоса Колонка

Детектор______________

Длина волны_________

Скорость потока_______

Интеграционная система Система инжекции

Объем инъекции________

Целевая концентрация для количественного анализа Подвижная фаза________

Время выполнения количественного анализа Температура колонки

Время удерживания \Уа1ег8 Мобе! 600___________________________________

Τοδο Нааз 5 :т Т8К 3000 З^УХЬ, внутренний диаметр 300 мм х 7,8 мм, компания Ηεννίείί Раскагб, (каталожный номер 7991283-597), оборудованная защитной колонкой 5 :ш Т8К 3000 8\¥ХЬ, внутренний диаметр 40 мм х 6,0 мм, компания Ηεννίείί Раскате!, (каталожный номер 7991283-527)___________________ )Уа1ег8 Мобе! 486. Необходимо 15 минут для разогрева 280 нм_________________________________________ мл/мин_________________________________________

УС МиШсйгот___________________________ \Уа1егз Мобе1 717 Виз АШо8атр1ег, оборудованная системой охлаждения до 4°С._______________________ мл________________________________________ мг/мл

0,2 М КН₂РО₄,0,9% ЫаС!, рН 6,8 с КОН мин

Температура окружающей среды______________

СТЬА4^{а2ууь104Ь}-1_§ ~ 8,5 мин ± 0,5 мин, высокомолекулярные виды на ~ 7,5 мин ± 0,5 мин

Стандарты и пробы (10 мг/мл) готовили в объеме 50 мл в маркированных сосудах автодозатора. Готовили дубликаты проб.

Вычисления.

Определение степени разделения (К) и оценка времени удерживания: 20 мл стандартов пригодности системы вводили для вычисления степени разделения двух пиков на хроматограмме, полученной для этих стандартов (например, один пик, пик 1, со временем удерживания ~8.5 мин и второй, пик 2, со временем удерживания ~10 мин) при помощи следующего уравнения.

Степень разделения (К) = 2(12-Ιι)/0&ι +ν7₂) где ίΐ - время удерживания пика 1;

ί₂ - время удерживания пика 2;

₁ - ширина пика 1;

- ширина пика 2.

Степень разделения (К) = 2(ΐ₂-ίι )/(^1+^)=2( 10,07-8,52)/(0,57-0,86)=2,12 3 1,3

Ширина пика равна ширине (в мин) фрагмента основания пика, полученного экстраполяцией сравнительно прямых боковых сторон пика к основанию. Время удерживания и ширину пиков измеряли в одних и тех же единицах.

К должно быть 3 1,3, время удерживания для пика ~ 8,5 V 0,5 минут,

Определение числа теоретических тарелок: по хроматограмме стандарта пригодности системы эффективность колонки можно определить вычислением числа теоретических тарелок согласно следующему уравнению:

Κ=16(ΐΛν)² где ί - время удерживания для пика 2 (в мин);

\у - ширина (в мин) фрагмента основания пика 2, полученного экстраполяцией боковых сторон пика к основанию, как показано на фиг. 1.

Интеграция пиков: площади пиков на хроматограмме объединяли (например, фиг. 34). Пик димера СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд наблюдается на ~8.5 мин, пик высокомолекулярных видов на ~7.4 мин.

Проценты площадей можно вычислить по приведенным ниже формулам:

% площадь димера

100 = (% площадь высокомолекулярных видов +% площадь низкомолекулярных видов) % площадь высокомолекулярных видов = (В/(А+В+С))х100 % площадь низкомолекулярных видов = (С/(А+В+С))х100 где А - площадь пика димера СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд;

В - общая площадь всех пиков с временем удерживания менее времени удерживания димера СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд;

С - общая площадь всех пиков со временем удерживания больше времени удерживания димера СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд (за исключением доли включений).

Определен % ОСО единиц общей площади (за исключением доли включений). % ОСО единиц общей площади должен быть <2%. Если площадь <2707 единиц площади, следует регистрировать ПО, (предел обнаружения) (~2.26 мкг/мл). Если получено 2707-9014 единиц площади, следует регистриро

- 193 017765 вать ПКО (предел количественного определения) (~ 7.53 мкг/мл). Если получено 39014 единиц площади, следует фиксировать результат с точностью до одной десятой процента.

Пример 26. БЭБ-РАСЕ и дисульфидные мостики.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (БЭБ-РАСЕ) для анализа СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд применяют в качестве испытания на чистоту. Пробы приготавливают в буфере, содержащем Трис-НС1 (рН 6.8), додецилсульфат натрия (БОБ), сахарозу и бромфенол синий, в присутствии (редуцированный) или в отсутствие (нередуцированный) дитиотреитола (ДТТ). Пробы помещают на водяную баню при 80°С на 2 мин и подвергают электрофорезу в готовом градиентом (4-20%) полиакриламидном БОБ геле с использованием подвижного буфера Трис-глицин-БОБ. После электрофореза гель фиксируют и окрашивают кумасси синим или серебряным. Нередуцированный СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}Ц наблюдается в виде одной крупной полосы с явной примерной молекулярной массой ~104 кД. СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд наблюдается в виде самой крупной полосы с явной примерной молекулярной массой ~53 кД.

Пробы, полученные в результате процесса В, партия 000929-278, процесса С, партия 224818-2004007, и совместной смеси, партия 551218-162, расщепили при помощи электрофореза с использованием 420% градиентных гелей БЭБ-РАСЕ в условиях наличия и отсутствия редуцирования. Гели отдельно окрашивали кумасси или серебряным, как показано на фиг. 35 и 36. В результате БЭБ-РАСЕ нередуцированного СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд получена самая крупная полоса примерно 104 кДа, представляющая цельный мономер. Также наблюдались три полосы поменьше, плохо различимые на электронных изображениях, при значениях ~200, 65 и 53 кДа. Редуцированные пробы СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд показали самую крупную полосу при ~53 кДа, представляющую одиночную цепь, и более мелкую полосу при ~150 кДа. Согласно результатам сравнения три протестированных материала сопоставимы при анализе в одном и том же геле.

Дисульфидные мостики.

Дисульфидные мостики характеризовали для лекарственного вещества процесса С с использованием партии 224818-2004-007. Каждая цепь СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд содержала девять цистеинов: Су§21, Су§48, Су§66, Су§92, Су§120, Су§171, Су§231, Су§277 и Су§335. Для идентификации участков внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных связей в СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд использовали пептидное картирование редуцированного и нередуцированного СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд с ЖХ/МС/МС в реальном времени.

Список пептидов, полученных в результате пептидного картирования нередуцированного СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд, а также значения ожидаемой и наблюдаемой молекулярной массы приведены в табл. 27.

Исчезновение некоторых пиков на нередуцированной пептидной карте и появление новых пиков на редуцированной пептидной карте свидетельствовали о существовании трех пептидов с дисульфидной связью: Т2-Т6, Т11-Т17 и Т25-Т30, что соответствует дисульфидным мостикам Су821-Су892, Су§171Су§231 и Су8277-Су8335. Пептиды Т5 и Т7 имели сравнительно высокую молекулярную массу и содержали N-связанные углеводы, что затрудняет локализацию дисульфидных связей. Для создания более коротких пептидов без углевода СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд гидролизовали смесью трипсина и химотрипсина. В результате дополнительного расщепления химотрипсином Т7 преобразовался из 35-аминокислотного пептида в 15-аминокислотный, обозначенный как Т7'-Т7', в котором удалили ^связанный углевод. Пептид с дисульфидной связью Т7'-Т7' отмечается на нередуцированной карте (см. фиг. 37). МС/МС Т7'-Т7' подтверждает его последовательность и внутрицепную дисульфидную связь у Су8120-Су8120.

- 194 017765

Таблица 27

Пептидная последовательность и молекулярная масса пептидов с дисульфидной связью, полученных гидролизом СТЕАТ'²⁹^¹⁰⁴^^ с помощью трипсина в условиях отсутствия редуцирования

Дисульфидная связь

Т2—Тб (С21—С92)

Т11—Т17 (С171—С231)

Т25—ТЗО (С277—С335)

Т5 (С48—С66)

Т7—Т7 (С 120—С120)

Последовательность

С1А8ЕУСЕУА8РСК

I _________АМРТСТЛТСК______ ТРЕУТСУУУОУ8НЕОРЕУК

I

СК__________________ ^УЗЬТСЕУК

I

А(3(ЗСМУР8С8УМНЕАЕНМНУТ(ЗК (2АО8(2УТЕУСААТУММС

I

ΝΚΕθρΐΤΕΝνθΝ688Τ6Τα8ΡΡΕΕΓΕΕ νΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕΟίσΝΟΤΟΙΥνίΟΡΕΡϋΡ ϋδϋζΙΕΡΚ

I νΕΕΜΥΡΡΡΥΥΕσίΟΝΟΤΟΙΥνίϋΡΕΡσΡ ϋδρΟΕΡΚ

Наблюдаемая

Теоретическая молекулярная [молекулярная масса масса

2539,2

2328,1

2539,6

2328,4

3846,3

Гликопептид³

Гликопептид ^а Пептиды Т5 и Т7-Т7 привели к возникновению нескольких масс изза гетерогенности ^связанного гликозилирования, что затруднило локализацию дисульфидных связей.

Обработка смесью трипсина и химотрипсина также привела к формированию фрагментов, которые соответствовали более коротким версиям других пептидов с дисульфидной связью, наблюдавшихся при гидролизе СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд только трипсином. Они приведены в табл. 28.

Таблица 28

Пептидная последовательность и молекулярная масса пептидов с дисульфидной связью, полученных гидролизом СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд с помощью трипсина и химотрипсина

Последовательность

СЬУК

УГОРЕРСРОЖОЕРК ^КО88ТОТС18ООЬРТЬЕ

Дисульфидная связь

ОАОЗОУТЕУСААТУММСМКЬ □ΩΙΤΕΥ

Наблюдаемая молекулярная масса

8С8УМ

УЮРЕРСРОйЫОЕРК

Теоретическая молекулярная масса

872,4

При гидролизе СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд смесью трипсина и химотрипсина установлено дисульфидное соединение в Т7-Т7 и подтверждены дисульфидные связи, отмеченные при гидролизе одним трипсином. Однако данная смесь ферментов не оказала влияния на пептид Т5, который также является гликопептидом. Чтобы удалить ^связанные углеводы из Т5, СТ^А4^{Л29Υ^104Ε}-Iд гидролизовали со смесью трипсина и эластазы, как показано на фиг. 38. Данной смесью ферментов гидролизовали Т5 в четырех различных участках, получая более короткий пептид, обозначенный (Т5'-Т5), как показано в табл. 29. Данный образованный пептид имел ожидаемую массу 1259 Да и содержал дисульфидный мостик, соответствующий Сук46-Сук66. Профиль пептидной карты, полученной в результате гидролиза нередуцированного СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд при помощи смеси трипсина и эластазы, приведен на фиг. 38, пептидная последовательность Т5'-Т5 - в табл. 29.

- 195 017765

Таблица 29

Пептидная последовательность и молекулярная масса пептида Т5'-Т5, полученная гидролизом СТЬА4^А29УЫ04Е-1д при помощи смеси трипсина и эластазы

Дисульфидная связь	Последовательность
Т5 (С48—С66)	ЕУС 1 ТСБООЬР

Теоретическая молекулярная масса	Наблюдаемая молекулярная масса
Гликопептид

Согласно полученным результатам СТЬА4 ^Е-1д имеет четыре внутримолекулярных дисульфидных мостика в позициях Суз21-Суз92 (Т2-Т6), Суз48-Суз66 (соответствует одному отдельному пептиду Т5), Суз171-Суз231 (Т11-Т17) и Суз277-Суз335 (Т25-Т30) и один внутрицепной дисульфидный мостик в позиции Суз120-Суз120 (Т7-Т7). Данные обосновывают все восемнадцать цистеиновых остатков. Ошибочных спариваний не отмечено.

Пример 27. Состав СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д.

СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д для инъекций во флаконах по 100 мг, стерильный, не пирогенный, лиофильный. Состав готовой лекарственной формы приведен в табл. 30. Это белый или желтоватый, целый или поделенный на куски брикет, выпускаемый в стеклянных флаконах типа I, укупоренных серыми бутилкаучуковыми пробками и запечатанных алюминиевыми крышками. Во флаконе содержится на 10% больше продукта, чем указано, для компенсации того объема, который теряется, оседая на стенках флакона, в шприце и игле.

Перед введением СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д для инъекций во флаконах по 100 мг разводят в 4.2 мл стерильной воды для инъекций (фармакопея США) до концентрации 25 мг/мл. Препарат можно разбавить далее вплоть до концентрации 1 мг/мл при помощи 5% декстрозы для инъекций (фармакопея США) или 0.9% хлорида натрия для инъекций (фармакопея США). После разбавления получают прозрачный, бесцветный раствор, в целом без твердых частиц при визуальном осмотре.

Таблица 30 Состав СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д для инъекций во флаконах по 100 мг

Компонент	Функция	Количество во флаконе (мг)
СТЕА4А2”и“ь-18	Активный ингредиент	110а
Сахароза	Лиопротектор	220
Моногидрат одноосновного фосфата натрия	Буферное вещество	15,18
Хлорид натрия	Коррекция ионной силы	2,55
1 N гидроксид натрия	Коррекция рН	До 7,5 ± 2
1 N соляная кислота	Коррекция рН	До 7,5 ± 2
Вода для инъекций^	Растворитель	Достаточное количество, до 5,5 мл

^а В каждом флаконе содержится на 10% больше продукта, чем указано, для компенсации того объема разбавленного раствора, который теряется, оседая на стенках флакона, в шприце и игле.

^б Удаляется в ходе лиофилизации.

Температура стеклования замороженного раствора, который подвергают лиофильной сушке, определена на уровне -28.9°С. Проводили исследования лиофилизации при различных температурах хранения, чтобы определить наивысшую допустимую температуру хранения при первичной сушке без риска для качества продукта. По результатам данных исследований для этапа первичной сушки в рамках лиофилизации СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д была выбрана температура хранения -20°С. В конце цикла лиофилизации флаконы укупоривают при пониженном давлении.

Процесс производства включает замораживание флаконов с основным объемом раствора для лиофилизации (с соответствующими эксципиентами) в лиофилизационной камере с последующей сублимацией замороженной воды при контролируемых температуре и давлении. Температуру и давление в камере оптимизируют для эффективной сублимации без ущерба качеству продукта.

Исследовали совместимость раствора с различными поверхностями, с которыми контактирует продукт, и компонентами упаковки. Выяснилось, что раствор совместим с нержавеющей сталью 316Ь, силиконовыми трубками, АсгоТ1зс™, НТ Ти££гуп (полисульфон), мембранными фильтрами МИИроге РУЭЕ (поливиниленфторид) и выбранной системой укупорки контейнеров.

СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д для инъекций во флаконах по 100 мг упаковывают во флаконы из флинтгласа 15 см типа I, укупоривают серыми бутилкаучуковыми пробками, покрытыми фторкаучуком, Эа1куо Ώ-21-78/В2-ТК 20 мм и запечатывают алюминиевыми отламывающимися крышками 20 мм.

Выбор флакона для инъекционного СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д основывался на объеме наполнения 5.5 мл с целью обеспечить эффективную лиофилизацию, выбор серых бутилкаучуковых пробок, покрытых фторкаучуком, ЕТикуо Э-21-7-8/В2-ТК 20 мм аргументирован данными о совместимости.

Проводились исследования совместимости при длительном использовании. СТЬА4^{А29УЕ104Е}-1д для инъекций 100 мг/мл при разведении до 25 мг/мл стерильной водой для инъекций можно хранить при температуре окружающей среды 15-25°С (59-77°Е) и комнатном освещении в течение 24 ч. Не отмечено

- 196 017765 снижения потенции или повышения уровня высокомолекулярных видов в 24-часовой период при дальнейшем разбавлении раствора до 1 мг/мл или 10 мг/мл при помощи 0.9% хлорида натрия для инъекций (изотонический раствор) или 5% декстрозы для инъекций и хранении в пакетах из ПВХ или ЕНга не из ПВХ при температуре окружающей среды 15-25°С (59-77°Е) и комнатном освещении. Разбавленный раствор следует пропустить через смешанный фильтр из ацетата целлюлозы 0.2-1.2 мкм. Разбавленный раствор совместим со смешанным фильтром из ацетата целлюлозы 0.2-1.2 мкм.

Продукт не совместим с силиконом. В результате их взаимодействия появляются видимые частицы. Поэтому следует избегать контакта с поверхностями, обработанными силиконом, например, с силиконизированными шприцами.

Пример 28. Процесс производства СТ^А4-Iд.

СТ^А4-Iд продуцируется в виде секретируемого белка в крупномасштабной культуре с использованием линии клеток яичников китайского хомячка (СНО). Процесс производства СТ^А4-Iд начинается с ряда этапов увеличения объема инокулята в культуральных флаконах и биореакторах для выращивания посевного материала. Содержимое последнего биореактора для выращивания посевного материала инокулируют в 5000-л продукционный реактор. Культуру клеток, собранных в 5000-л продукционном биореакторе, очищают и концентрируют при помощи микрофильтрации и ультрафильтрации. Перед производством и выделением целевого продукта собранный бесклеточный материал корректируют по рН и проводимости. СТ^А4-Iд очищают при помощи нескольких этапов хроматографии и фильтрации. Процесс производства и выделения СТ^А4-Iд включает два этапа анионообменной хроматографии, один этап гидрофобной хроматографии и один этап аффинной хроматографии. Цель данных этапов - очистить белок СТ^А4-Iд, удалить высокомолекулярный материал СТ^А4-Iд и проконтролировать содержание сиаловой кислоты в лекарственном веществе СТ^А4-Iд. Процесс производства и выделения целевого продукта включает также этап инактивации вируса и этап фильтрации вируса для удаления возможных побочных вирусных возбудителей. Очищенное лекарственное вещество СТ^А4-Iд заливают в 2-л поликарбонатные бутыли и замораживают при целевой температуре -70°С перед хранением при целевой температуре -40°С. Замороженное лекарственное вещество оттаивает.

Ν-ацетилнейраминовая кислота (NАNА) - основной вид сиаловой кислоты, присутствующий в лекарственном веществе СТ^А4-Iд. Под сиаловой кислотой в данном разделе подразумевается именно этот вид. В лекарственном веществе СТ^А4-Iд также присутствует небольшое количество Νгликолизнейраминовой кислоты (NΟNА). Для конечного лекарственного вещества СТ^А4-Iд определяют уровень и NАNА, и NΟNА. Схема технологического процесса производства СТ^А4-Iд приведена ниже.

- 197 017765

Высвобождение сосуда из рабочего банка клеток

I

V Размораживание сосуда из рабочего банка клеток

I

V

Увеличение объема инокулята

I

V

5000-литровый продукционный биореактор

I

V Сбор клеток

I

V Анионообменная хроматография

I

V Гидрофобная хроматография

I

V Инактивация вируса

I

V Аффинная хроматография

I I

V Концентрация/диафильтрация

I

V Фильтрация вируса

I

V Анионообменная хроматография

I

V Концентрация/диафильтрация

I

V

Финальное наполнение лекарственного вещества

I

V

Заморозка лекарственного вещества

I

V Размораживание лекарственного вещества

СТЬА4-1§ получают в 5000-л продукционных биореакторах с примерным рабочим объемом 4300 л. Одну партию лекарственного вещества получают в одном продукционном биореакторе, который загружали из одного сосуда банка клеток.

Процесс производства и выделения культуры начинают с применением одного сосуда из банка клеток. Сосуд оттаивают и все содержимое засевают в культуральный флакон, содержащий среду для выращивания культуры. Затем объем культуры увеличивают в ряде шейкерных флаконов. По завершении последнего этапа увеличения объема инокулята в шейкерах содержимое флаконов инокулируют в 140-л биореактор для выращивания посевного материала. 140-л биореактор для выращивания посевного материала имеет рабочий объем около 100 л. Содержимое 140-литрового биореактора инокулируют в 1100-л биореактор для выращивания посевного материала. 1100-л биореактор для выращивания посевного материала имеет рабочий объем около 600 л. Содержимое 1100-литрового биореактора засевают в 5000-л продукционный биореактор. В 5000-л продукционном биореакторе клетки культивируют около 14 дней. На следующем этапе культуральный бульон из одного биореактора переносят в сосуд сбора клеток для дальнейшей обработки. Для отделения секретированного белка СТЬА4-1§ от клеток-хозяев и клеточного детрита используют устройство микрофильтрации в тангенциальном потоке. Затем пермеат микрофильтрации, содержащий белок СТЬА4-1§, концентрируют при помощи ультрафильтрации и корректируют по рН и проводимости перед первым этапом хроматографии.

Очищение и процесс производства и выделения лекарственного вещества СТЬА4-1§ состоят из анионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, инактивации вируса, аффинной хроматографии, концентрации и диафильтрации с помощью ультрафильтрации в тангенциальном потоке, фильтрации вируса, второй анионообменной хроматографии и концентрации с диафильтрацией при помощи ультрафильтрации. На этапе гидрофобной хроматографии каждую партию СТЬА4-1§ подвергают не

- 198 017765 скольким циклам обработки, в зависимости от количества СТ^А4-Iβ. Материал, обработанный в ходе нескольких циклов гидрофобной хроматографии, собирают в пул для последующей инактивации вируса. Обработанный материал из разных партий в один пул собирать нельзя. Для обработки одной партии СТ^А4-Iβ могут быть использованы несколько вирусных фильтров параллельно. После данного этапа фильтрат собирают в пул для дальнейшей обработки.

Каждую партию СТ^А4-Iβ пропускают через фильтр 0.2 мкм и собирают в 2-л поликарбонатные (ПК) бутыли, в которых оставляют на временное хранение при температуре 2-8°С. 2-л ПК бутыли с СТ^А4-Iβ замораживают при целевой температуре -70°С, а затем хранят при целевой температуре -40°С. Затем бутыли с лекарственным веществом размораживают в инкубаторе при температуре 22-24°С и охлаждают до 2-8°С перед отправкой.

Производство.

СТ^А4-Iβ продуцируется в крупномасштабной культуре с использованием линии клеток яичников китайского хомячка (СНО). Процесс производства и выделения СТ^А4-Iβ начинают с оттаивания замороженного сосуда из банка клеток. Объем культуры увеличивают в культуральном флаконе, а затем в ряде шейкерных флаконов. Полученные культуры переносят в 140-л биореактор для выращивания посевного материала. Культуру из 140-л биореактора переносят в 1100-л биореактор для выращивания посевного материала. Культуру из 1100-л биореактора инокулируют в 5000-л продукционный биореактор. Клетки из продукционного биореактора собирают, главным образом, основываясь на показателе целевого молярного соотношения сиаловой кислоты и белка СТ^А4-Iβ. Собранную клеточную культуру очищают и концентрируют при помощи микрофильтрации и ультрафильтрации. Наконец, перед производством и выделением целевого продукта сконцентрированный бесклеточный материал корректируют до целевого значения рН и проводимости.

Подготовка культуральной и питательной среды.

Взвешивают и измеряют твердые и жидкие компоненты среды. В ходе обработки используют две культуральные среды. Среду 127-С применяют в культуральных флаконах, шейкерных флаконах, биореакторах для выращивания посевного материала и продукционном биореакторе. Среду 117-Е используют в качестве питательной среды в продукционном биореакторе. Состав среды 127-С приведен в таблице ниже.

Состав среды

Компонент_______________________

СР-СНО 25х растворимые кислоты I СР-СНО 25х растворимые кислоты II СР-СНО 25х соли I________________

СР-СНО 25х соли II________________

Ь-глутамин________________________

Рекомбинантный человеческий инсулин (раствор 10 мг/мл)_____________________

Метотрексат (раствор 20 мМ)_________

Натрия бикарбонат__________________

Вода для инъекций__________________

Раствор 1 N НС1____________________

Раствор 10 N ИаОН________________

117-Е приведен в таблице ниже.

Концентрация 40,0 мл/л 40,0 мл/л 40,0 мл/л 40,0 мл/л 0,585 г/л 0,1 мл/л мкл/л_____________________

2,22 г/л

По необходимости_________

0—5 мл/л для коррекции рН

0—10 мл/л для коррекции рН

Компонент___________________________

Среда еКРР-1

Декстроза______________________________

Р-галактоза

Ь-глутамин

Рекомбинантный человеческий инсулин (раствор 10 мг/мл)_________________________

Дрожжевой экстракт для культуры ткани Вода для инъекций

Раствор 1 N НС1________________________

Раствор 10 N №ОН

Концентрация

16,47 г/кг

30,29 г/кг

12,38 г/кг ~ 4,02 г/кг

0,98 мл/кг

4,90 г/кг_____________________

По необходимости________

0—5 мл/кг для коррекции рН 0—2 мл/кг для коррекции рН

Состав среды еКБЕ-1 приведен ниже.

- 199 017765

Компонент

Меди сульфат 5 НгО Железа сульфат 7 НгО Магния сульфат (М§80₄)

Цинка сульфат 7 НгО Натрия пируват ОЬ-тиоктовая кислота

Линолевая кислота__________

Ь-аланин

Ь-аргинин

Ь-аспарагин Ь-аспарагиновая кислота

Ь-цистин 2 НС1 Ь-глютаминовая кислота Глицин

Ь-гистидин НС1-Н₂О

Ь-изолейцин_______________

Ь-лейцин

Ь-лизин НС1 Ь-метионин

Ь-фенилаланин

Ь-пролин

Ь-гидроксипролин

Ь-серин____________________

Ь-треонин__________________

Ь-триптофан_______________

Ь-тирозин 2 Νη 2Н₂О Ь-валин

Параамино-бензойная кислота Витамин В12

Биотин ϋ-Са пантотенат

Холина хлорид Фолиевая кислота ϊ-инозитол

Никотинамид

Пиридоксаль НС1

Пиридоксин НС1 Рибофлавин Тиамин НС1

Путресцин 2НС1

Концентрация (мг/л)

0,0008

0,220

66,20_________________

0,230

110,0

0,050

0,021

6,68

581,44

94.59

39,93

105,38

39.7

42.8

75.47

157.40

165.30

197,26

49,24

74.30

55,3___________________

31,5

85.10

110.8

18.40 __________________

108.10

108,9

0,51

0,339_________________

1,00

1.29 ____________________

12.29

1,96

46,84

1.47

1,00

0,420

0,21

1.59

0,020

Культуральную среду 127-О, используемую в процессе производства в культуральных и шейкерных флаконах, готовят в сосудах для сред, снабженных смесителем для перемешивания и градуированным мерным стеклом для определения объема. На этапах увеличения объема инокулята размер партии среды 127-О, используемой в культуральных и шейкерных флаконах, составляет 75 л. Среду 127-О готовят с использованием воды для инъекций, в которую добавляют твердые и жидкие компоненты среды. После добавления каждого компонента среду перемешивают в течение требуемого времени. С помощью воды для инъекций добиваются финального объема партии 75 л. Из окончательного препарата среды берут пробу, по которой проверяют концентрацию глюкозы, рН и осмотическую концентрацию, чтобы обеспечить соответствие среды критериям приемлемости. Среду пропускают через фильтр 0.2 мкм и распределяют по стерильным бутылям из полиэтиленгликольтерефталата (ПЭГТ). Среду 127-О, приготавливаемую для использования на этапах увеличения объема инокулята в культуральных и шейкерных флаконах, хранят при температуре 2-8°С не более 42 дней. Среду 127-О, используемую в 140-л и 1100-л биоре акторах для выращивания посевного материала, готовят в сосудах, оснащенных смесителем для перемешивания. Размер партии среды 127-О, используемой в 140-л биореакторе для выращивания посевного материала, составляет 120 л. Сосуд для приготовления данной среды оснащен градуированным мерным стеклом для определения объема. Размер партии среды 127-О, используемой в 1100-л биореакторе для выращивания посевного материала, составляет 600 кг. Сосуд для приготовления данной среды оснащен дифференциальным датчиком давления для определения веса.

Требуемый объем среды 127-О переносят в 140-л и 1100-л биореакторы для выращивания посевного материала через последовательные фильтры 0.2 и 0.1 мкм. Среду 127-О, используемую в 140-л и 1100-л биореакторах для выращивания посевного материала, можно хранить при температуре 37°С не более 48 ч. В течение еще 84 ч среду можно хранить при температуре 4°С.

- 200 017765

Приготовление культуральных сред 127-6 и 117-Е, используемых в 5000-л продукционном биореакторе.

Среду 127-6 для 5000-л продукционного биореактора получают в сосуде для приготовления среды, оснащенном смесителем и дифференциальным датчиком давления для определения веса. Размер партии среды 127-6, используемой в 5000-л продукционном биореакторе, составляет 2900 кг. Требуемое количество среды 127-6 переносят в 5000-л продукционный биореактор через последовательные фильтры 0.2 и 0.1 мкм. Среду 127-6, используемую в 5000-л продукционном биореакторе, можно хранить при температуре 37°С не более 48 ч. В течение еще 84 ч среду можно хранить при температуре 4°С.

Среду 117-Е получают в сосуде для приготовления среды, оснащенном смесителем для перемешивания и дифференциальным датчиком давления для определения веса. Размер партии среды 117-Е, используемой в 5000-л продукционном биореакторе, составляет 1800 кг. Компоненты среды 117-Е добавляют к определенному количеству воды для инъекций в сосуде для приготовления среды. После добавления каждого компонента среду перемешивают в течение требуемого времени. Затем добавляют воду для инъекций, доводя до обозначенного конечного веса. Из окончательного препарата среды берут пробу, по которой проверяют концентрацию глюкозы, рН и осмотическую концентрацию, чтобы обеспечить соответствие среды критериям приемлемости. Требуемый объем среды 117-Е переносят в бак-сборник питательной среды через последовательные фильтры 0.2 и 0.1 мкм. Среду 117-Е, используемую в 5000-л продукционном биореакторе, можно хранить при температуре 37°С не более 2 дней. В течение еще 4 дней среду можно хранить при температуре 4°С.

Этапы увеличения объема инокулята в культуральных и шейкерных флаконах.

Целью стадии увеличения объема инокулята в культуральных и шейкерных флаконах в рамках производства СТЬА4-1д является последовательное разведение клеток из сосуда банка клеток с получением достаточного количества жизнеспособных клеток для инокуляции в 140-л продукционный биореактор. Один сосуд из банка клеток вынимают из паровой фазы системы охлаждения жидким азотом и размораживают на водяной бане при температуре 37°С. Все содержимое сосуда с соблюдением асептики переносят в стерильную коническую центрифужную пробирку 15 мл. Затем добавляют среду 127-6 до конечного объема 10 мл. Клеточную суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, дебрис ресуспендируют в 10 мл культуральной среды 127-6. Ресуспендированные клетки переносят во флаконы Т-175, содержащие 10 мл среды 127-6. Определяют плотность жизнеспособных клеток и процент жизнеспособности культуры во флаконах Т-175. На данном этапе установлен процент жизнеспособности >84%. Во флакон Т-175 добавляют среду 127-6 для достижения целевой концентрации жизнеспособных клеток 2.1 x 10⁵ клеток/мл.

Флаконы Т-175 инкубируют при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 6% углекислого газа в течение максимум четырех дней до целевого финального количества 1.80x10’ жизнеспособных клеток. После флаконов Т-175 объем культуры увеличивают в нескольких шейкерных флаконах: 0.25-л, 1-л и 3-л. При каждом пассаже клетки засевают с целевой плотностью 2.0x10^я жизнеспособных клеток/мл. Культуры в шейкерных флаконах инкубируют при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 6% углекислого газа.

Культуральный материал из последнего 3-литрового шейкерного флакона собирают в стерилизованный 20-л сосуд для переноса инокулята. Установлены следующие значения: конечная плотность жизнеспособных клеток на стадии увеличения объема инокулята в 3-л шейкерных флаконах 1.0-2.0x10⁶ клеток/мл, минимальный процент жизнеспособности клеток >80%. При данных образцовых значениях обеспечивается достаточное количество жизнеспособных клеток для инокуляции в 140-л биореактор для выращивания посевного материала. Для инокуляции в 140-л биореактор для выращивания посевного материала используют культуру, собранную на этапе увеличения объема инокулята в последнем 3-л шейкерном флаконе, общим объемом 12-18 л.

Этап увеличения объема инокулята в 140-л и 1100-л биореакторах для выращивания посевного материала.

Целью стадии увеличения объема инокулята в 140-л и 1100-л биореакторах для выращивания посевного материала в рамках производства СТЬА4-1д является получение достаточного количества жизнеспособных клеток для инокуляции в 5000-л продукционный биореактор. Биореакторы для выращивания посевного материала функционируют в режиме производства по одной партии с использованием культуральной среды 127-6. Температуру, рН, концентрацию растворенного кислорода, давление, скорость перемешивания, расход воздуха, кислорода и углекислого газа контролируют при помощи распределенной системы управления (РСУ), обеспечивая условия для оптимального роста культуры в данных биореакторах. Биореакторы для выращивания посевного материала работают при температуре 37°С. Для определения плотности жизнеспособных клеток, процента жизнеспособности и концентрации метаболита из данных биореакторов извлекают пробы культуры.

В 140-л биореактор для выращивания посевного материала вводят инокулят, собранный на стадии увеличения объема культуры в 3-л шейкерном флаконе, до целевой исходной плотности жизнеспособных клеток 2.0x105 клеток/мл. Установлены следующие значения: конечная плотность жизнеспособных

- 201 017765 клеток на этапе увеличения объема инокулята в 1100-л биореакторе для выращивания посевного материала 1.0-2.5х10⁶ клеток/мл, минимальный процент жизнеспособности клеток >80%. При данных критериях приемлемости обеспечивается достаточное количество жизнеспособных клеток для инокуляции в 5000-л продукционный биореактор. Культуру клеток из 1100-л биореактора для выращивания посевного материала переносят в 5000-л продукционный биореактор, чтобы добиться целевой исходной плотности жизнеспособных клеток 1.5х10⁵ клеток/мл.

Этап обработки в продукционном биореакторе.

Целью этапа обработки в 5000-л продукционном биореакторе является увеличение числа жизнеспособных клеток и получение белка СТ^Л4-Iд· Продолжительность этапа с использованием продукционного биореактора составляет примерно 14 дней. Инокулят из 1100-л биореактора засевают в 5000-л продукционный биореактор, содержащий культуральную среду 127-С. Продукционный биореактор функционирует в режиме производства по одной партии с подпиткой.

Температуру, рН, концентрацию растворенного кислорода, давление, скорость перемешивания, расход воздуха, кислорода и углекислого газа контролируют при помощи РСУ, обеспечивая условия для оптимального роста культуры и получения белка СТ^Л4-Iд в продукционном биореакторе.

В 5000-л продукционном биореакторе используют трехэтапный метод контроля температуры для оптимизации роста клеток и выработки СТ^Л4-Iд· В ходе начальной инкубации для оптимального роста клеток в продукционном биореакторе задают температуру 37°С. Когда плотность жизнеспособных клеток достигает значения 4.0х 10⁶ клеток/мл или через 144 ч после инокуляции, в зависимости от того, что наступит первым, температуру снижают до 34°С. Через 240 ч температуру опять снижают уже до 32°С и поддерживают на этом уровне до сбора. Ежедневно из 5000-литрового продукционного биореактора берут пробы для контроля роста и жизнеспособности клеток, концентрации метаболитов, титра СТ^Л4-Iд. а также молярного соотношения сиаловой кислоты и белка СТ^Л4-Iд·

Подпитку продукционного биореактора средой 117-Е начинают через 12-24 ч после момента инокуляции. Среду 117-Е добавляют ежедневно до целевого 1% (об./об.) от общего объема культуры или в достаточном количестве для достижения уровня глюкозы 3 г/л. Такой метод обеспечивает достаточный уровень глюкозы и других питательных веществ в культуре для выработки белка СТ^Л4-Iд в продукционном биореакторе.

Среду 117-Е дополняют Ό-галактозой, способствуя тем самым повышенному гликозилированию белка СТ^Л4-Iд· Добавление галактозы приводит к увеличению содержания терминальной сиаловой кислоты белка СТ^Л4-Iд· Молярное соотношение сиаловой кислоты и белка СТ^Л4-Iд является важным критерием сбора в процессе производства СТ^Л4-Iд·

Для контроля концентрации растворенного кислорода и скорости перемешивания в продукционном биореакторе также применяют трехэтапный метод. При начальной интенсивности смешивания 30 об/мин в 5000-л продукционном биореакторе обеспечивается согласованность физических условий и предотвращается осаждение клеток. При начальном заданном значении концентрации растворенного кислорода 40% обеспечивается наличие в продукционном биореакторе достаточного количества растворенного кислорода для роста культуры. Через 96 ч после момента инокуляции заданные значения концентрации растворенного кислорода и скорости перемешивания меняют на 50% и 40 об/мин соответственно. Через 120 ч после момента инокуляции устанавливают значения концентрации растворенного кислорода и скорости перемешивания 60% и 50 об/мин соответственно. При использовании данного метода обеспечивается наличие достаточного объема растворенного кислорода для поддержки роста культуры в продукционном биореакторе. В ходе этапа с использованием продукционного биореактора увеличивается титр белка СТ^Л4-Iд· Жизнеспособность культуры контролируют на протяжении всего этапа. Молярное соотношение сиаловой кислоты и белка СТ^Л4-Iд проверяют два раза в сутки, начиная с 6-го дня после инокуляции и до сбора клеток. Показатель молярного соотношения сиаловой кислоты и белка СТ^Л4-Iд достигает пика (около 10) примерно на 8-ой день после инокуляции, а затем постепенно снижается до конца этапа с использованием продукционного биореактора. Первичным критерием сбора для продукционного биореактора является показатель молярного соотношения сиаловой кислоты и белка СТ^Л4-Iд· Клетки из продукционного биореактора собирают при достижении целевого значения данного показателя 8.0.

Для сбора клеток установлено минимальное значение показателя жизнеспособности клеток 38%. Указанные критерии сбора гарантируют однородность обработанного материала, собранного для процесса производства и выделения лекарственного вещества СТ^Л4-Iд· От начала увеличения объема инокулята до сбора из продукционного биореактора в рамках предварительного этапа производства СТ^Л4[д вырастает примерно 38 поколений клеток. В ходе исследований стабильности клеточной линии установлено, что линия клеток, используемая в процессе производства, остается стабильной в течение 105 поколений.

- 202 017765

Этап сбора клеток.

Целью этапа сбора является удаление клеток и клеточного детрита из собираемого материала, а также концентрация обрабатываемого потока, содержащего белок СТ^Л4-Iд, для дальнейшего производства и выделения целевого продукта. Перед обработкой собранного материала проводят дезинфекцию систем микрофильтрации и ультрафильтрации. Для этого их промывают раствором надуксусной кислоты. Затем систему микрофильтрации обрабатывают раствором гипохлорита натрия, а систему ультрафильтрации - раствором гидроксида натрия. Наконец, обе системы промывают водой для инъекций до значения проводимости для концентрата и пермеата <3 мкС/см. Культуральный бульон из 5000-л продукционного биореактора переносят в сосуд для сбора клеток. Для удаления клеток и клеточного детрита из собранного материала, включающего белок СТТ.М-Щ, используют микрофильтрацию в тангенциальном потоке с поливинилиденфторидными мембранами 0.65 мкм. Бесклеточный пермеат микрофильтрации собирают в сосуд для пермеата и одновременно концентрируют при помощи ультрафильтрации в тангенциальном потоке с использованием полиэфирсульфоновых мембран номинального молекулярномассового предела задерживания 30 килодальтон (кДа). Пермеат ультрафильтрации используют в качестве среды для диафильтрации на этапе микрофильтрации. Для хранения системы микрофильтрации применяют 0.1 N раствор фосфорной кислоты. Для хранения системы ультрафильтрации применяют 0.1 N раствор гидроксида натрия. В ходе микрофильтрации и ультрафильтрации отслеживают и контролируют температуру, скорость потока пермеата и концентрата, а также трансмембранное давление. Скорость потока измеряют при помощи поточных расходомеров, имеющихся на фильтрационных рамах. Для измерения давления и температуры используют датчики. Установлено значение скорости потока концентрата при микрофильтрации 163-235 л/мин и трансмембранного давления <3.8 ркщ. При данных значениях обеспечивается согласованность операций на этапе сбора клеток.

Последней операцией на этапе сбора клеток является коррекция рН и проводимости очищенного и концентрированного материала, находящегося в обработке. Проводимость и рН концентрированного материала корректируют для захвата белка СТТ.М-Щ во время первого этапа хроматографии в рамках производства и выделения целевого продукта. Значение рН корректируют до 8.0 добавлением раствора 2 М Трис, проводимость концентрированного пермеата сокращают до 10 мС/см добавлением воды для инъекций. Затем концентрированный и скорректированный материал пропускают через три параллельных и одно последовательное фильтровальное отделение, содержащие одноразовые фильтры 0.2 мкм, отводя в уравнительный бак, находящийся в зоне очистки на стадии производства и выделения целевого продукта.

Таблица 31

Состав среды СЭ-СН0

Компонент	Концентрация
СЭ-СНО 25х растворимые кислоты I	40,0 мл/л
СО-СНО 25х растворимые кислоты II	40,0 мл/л
СЭ-СНО 25х концентрированные соли I	40,0 мл/л
СО-СНО 25х концентрированные соли II	40,0 мл/л
Ь-глутамин	0,585 г/л
Рекомбинантный человеческий инсулин (раствор 10 мг/мл)	0,1 мл/л
Метотрексат (раствор 25 мг/мл)	0,0018 мл/л
Натрия бикарбонат	2,22 г/л
Вода для инъекций	По необходимости
Раствор 1 М НС1	По необходимости для коррекции рН
Раствор 10 N ИаОИ	По необходимости для коррекции рН

Таблица 32

Состав питательной среды еКОР

Компонент Среда еКЭР-1 Декстроза ϋ-галактоза

Концентрация

16,80 г/л

30,9 г/л

12,6 г/л

Ь-глутамин

Рекомбинантный человеческий инсулин (раствор 10 мг/мл)________________________

Дрожжевой экстракт для культуры ткани Вода для инъекций

Раствор 1 М НС1

Раствор 10 N ЫаОН

По необходимости для коррекции рН По необходимости для коррекции рН

- 203 017765

Таблица 33

Состав модифицированной 50% среды СЭ-СН0

Компонент	Концентрация
СО-СНО 25х растворимые кислоты I	20,0 мл/л
СО-СНО 25х растворимые кислоты II	20,0 мл/л
СО-СНО, 25х концентрированные соли I	20,0 мл/л
СО-СНО 25х концентрированные соли II	20,0 мл/л
О-галактоза	0,4 г/л
Рекомбинантный человеческий инсулин (раствор 10 мг/мл)	0,05 мл/л
Натрия бикарбонат	1,11 г/л
Вода для инъекций	По необходимости
Раствор 1 М НС1	По необходимости для коррекции рН
Раствор 10 N №ОН	По необходимости для коррекции рН

Пример 29. Процесс очищения СТЬА4-1§.

Финальный скорректированный по рН и проводимости материал, сбор которого описан в примере 28, вначале подвергают анионообменной хроматографии. Пул продукта, полученный на первом этапе анионообменной хроматографии, подвергают гидрофобной хроматографии. Затем материал, содержащий СТЬА4-1§, обрабатывают при помощи Тритона Х-100 для инактивации возможных побочных вирусных возбудителей. Материал, обработанный Тритоном Х-100, подвергают аффинной хроматографии с использованием рекомбинантного белка А. Полученный в результате пул продукта концентрируют и диафильтруют. Затем проводят фильтрацию вируса для удаления возможных побочных вирусных возбудителей. Фильтрат подвергают дальнейшей очистке при помощи второй анионообменной хроматографии. Наконец, очищенный белок СТЬА4-1§ концентрируют и диафильтруют в заключительный буфер лекарственного вещества.

СТЬА4-1§ - генно-инженерный химерный белок, который состоит из функционального связывающего домена человеческого антигена цитотоксических Т-лимфоцитов 4 и Рс-домена человеческого моноклонального иммуноглобулина класса 1дС1. Димер СТЬА4-1§ состоит из двух гомологических гликозилированных полипептидных цепей, примерно по 46 кДа каждая, которые ковалентно связаны единственным дисульфидным мостиком. Схема технологического процесса производства и выделения СТЬА41д приведена ниже. СТЬА4-1§ получают в 5000-л продукционных биореакторах с использованием линии клеток яичников китайского хомячка (СНО). Хроматографию и фильтрацию в рамках производства и выделения СТЬА4-1§ проводят при температуре окружающей среды. Между этапами обрабатываемый материал хранят при температуре 2-8°С. Процесс производства и выделения целевого продукта начинается с приемки обработанного материала, собранного на предыдущем этапе. Вначале материал пропускают через колонку анионообменной хроматографии с использованием смолы С) 8ерйаго§е™ Ехйете 1,оас1 (РХЬ). Колонка с ОХР выполняет функцию захвата белка СТЬА4-1§ из собранного материала. На этапе захвата в колонке с 0X1. одновременно снижается объем для последующей обработки в рамках производства и выделения целевого продукта.

Полученный в результате пул продукта пропускают через колонку для гидрофобной хроматографии с использованием смолы РЕепу1 8ерЕаго§е Рак! Р1о^. На данном этапе высокомолекулярный материал СТЬА4-1§ и белки клеток-хозяев яичников китайского хомячка (СНО) связываются с колонкой. Димерный белок СТЬА4-1§ не связывается со смолой для гидрофобной хроматографии и проходит через колонку. После этапа гидрофобной хроматографии используют детергент Тритон® Х-100 для инактивации возможных побочных вирусных возбудителей. На следующем этапе применяют колонку с аффинной смолой 8ерЕаго§е Рак! Р1о^ на основе рекомбинантного белка А (гРА). На данном этапе снижают уровень белка клеток-хозяев СНО и белка хемотаксиса моноцитов 1. Указанный этап с гРА определяют как элиминацию вируса. После аффинной хроматографии белок СТЬА4-1§ концентрируют и диализируют при помощи ультрафильтрационных мембран 30 кДа, а также пропускают через фильтры Р1апоуа™ 15 нм для удаления возможных побочных вирусных возбудителей. По завершении фильтрации вируса белок СТЬА4-1§ подвергают второй анионообменной хроматографии в колонке со смолой О 8ерЕаго§е Рак! Р1о^ (РРР). На этапе хроматографии с С)1Т' снижают уровень остаточного рекомбинантного белка А и ДНК. Данный этап с ОРТ определяют как элиминацию вируса. Наконец, белок СТЬА4-1§ концентрируют и диафильтруют при помощи ультрафильтрационной мембраны 30 кДа на растворе 25 мМ фосфата натрия, 50 мМ №С1, рН 7.5. Далее перед заключительным этапом наполнения лекарственное вещество СТЬА4-1§ пропускают через фильтр 0.2 мкм.

- 204 017765

Анионообменная хроматография со смолой 0 Зерйагозе Ех1гете Ьоаб

I

V

Гидрофобная хроматография со смолой РЬепу1 ЗерЬагозе Ра§1 Р1ом/ I

V

Инактивация вируса при помощи 0,5% Тритона Х-100 I

V

Аффинная хроматография со смолой Зерйагозе Ра§1 Ρ1ο\ν на основе рекомбинантного белка А

I

V

Концентрация/диафильтрация ультрафильтрационные мембраны с НММП 30 кДа I

V

Удаление вируса фильтр Р1апоуа 15 нм I

V

Анионообменная хроматография со смолой ζ) Зерйагозе Раз! Ρ1ο\ν

I

V

Концентрация/диафильтрация ультрафильтрационные мембраны с НММП 30 кДа

I

V Лекарственное вещество хранение при 2—8°С или заморозка и хранение при -40°С

Уровень примесей, связанных с процессом производства (белок клеток-хозяев СНО, белок хемотаксиса моноцитов 1, остаточный рекомбинантный белок А, ДНК и Тритон Х-100), снижают на специальных этапах в рамках производства и выделения СТЬА4-1д. На первичной контрольной точке в процессе производства для каждой примеси устанавливают производственные параметры с допустимыми пределами. Белок клеток-хозяев СНО и белок хемотаксиса моноцитов 1 в составе пула продукта задают в качестве производственных параметров на этапе хроматографии с гРА. Остаточный лиганд рекомбинантного белка А, ДНК и Тритон Х-100 в составе пула продукта задают в качестве производственных параметров на этапе хроматографии с С)1Т. Учитывая известную структуру и хроматографическое удерживание инсулина, этапы гидрофобной хроматографии, хроматографии с гРА и С)1Т должны обеспечивать значительный клиренс инсулина на базе ортогональных мод взаимодействия. Кроме того, инсулин с молекулярной массой 5.8 кДа следует элиминировать в три этапа концентрации/диафильтрации 30 кДа в ходе процессов сбора и выделения целевого продукта. На этапе хроматографии с гРА обеспечивается клиренс метотрексата (МТКС) >3.0 1од10. Кроме того, МТКС с молекулярной массой 0.455 кДа следует элиминировать в три этапа концентрации/диафильтрации 30 кДа в ходе процессов сбора и выделения целевого продукта. Инсулин и МТКС добавляются к ферментативной среде в фиксированных количествах и потребляются в рамках клеточного метаболизма в течение ферментативного процесса в 5000-л биореакторе перед выделением целевого продукта. Уровень инсулина и МТКС измеряют на множественных точках в ходе производства и выделения целевого продукта. На каждой из этих точек уровень инсулина и МТКС ниже уровня, полученного количественным анализом за прошлые выполненные этапы.

Буферы. Целью данного этапа является получение буферов для процесса выделения целевого продукта, которые соответствуют образцовым значениям, допустимым и предупреждающим пределам. Неизменное качество буфера чрезвычайно важно для обеспечения воспроизводимого хроматографического процесса. Для процесса С^-СНΟ1 в рамках производства и выделения СТЬА4-1д необходимо 17 буферов и растворов. Буферы и растворы приготавливают и используют для конкретных этапов обработки в рамках партии. Буферы, которые контактируют с обрабатываемым материалом СТЬА4-1д, считаются важными производственными буферами. Среди буферов, контактирующих с продуктом, буфер для уравновешивания, промывки, элюирования и коррекции пула продукта. Буферы и растворы, используемые на этапах очистки и санитарной обработки, а также функционального тестирования ультрафиолетовых (УФ) детекторов на хроматографических рамах, имеют широкие нормативные пределы, поэтому, а также из-за отсутствия контакта с продуктом, производственные параметры для них не назначают. Производственные параметры определяют для десяти буферов, контактирующих с продуктом, соответствующие значения подытоживают. Максимальный предел срока хранения данных буферов - 3 дня, что установле- 205 017765 но в исследованиях хранения буфера в сосуде и подтверждено результатами исследований стабильности буфера. Буферы, контактирующие с продуктом, также имеют заданные производственные параметры с соответствующими предупреждающими пределами, указанные ниже. Буферы и растворы, которые не контактируют с обрабатываемым материалом СП ,Λ4-Ιμ, имеют заданные производственные параметры с предупреждающими или допустимыми пределами, как указано ниже. Буферы и растворы, не контактирующие с продуктом, не проверяют на эндотоксин, потому что они являются дезинфицирующими растворами, промывочными буферами для хроматографической смолы или растворами, после применения которых следует этап санитарной обработки колонки.

Анионообменная хроматография со смолой О 8ерйагозе Ех1гете Ьоаб.

Анионообменную хроматографию проводят с использованием смолы 0X1, от компании СЕ НеаЕйсаге (ранее Атегзйат Вюзщепсез). В колонку с внутренним диаметром 1.0 м вводят смолу 0X1. на высоту 17-24 см, что соответствует объему 133-188 л. Пригодность колонки для использования определяют вычислением ее высоты, эквивалентной одной теоретической тарелке (НЕТР), и асимметрии (А_з). Колонка для хроматографии с 0X1. характеризуется следующими значениями: НЕТР 0.02-0.08 см и А₃ 0.8-1.2. Колонка с 0X1. выполняет функцию захвата белка СП ,Λ4-Ιμ из собранного материала. На этапе захвата в колонке с 0X1, одновременно снижается объем для последующей обработки в рамках производства и выделения целевого продукта. Колонка для хроматографии с 0X1, функционирует при температуре окружающей среды. Очищенный культуральный бульон загружают в уравновешенную колонку для хроматографии с РКЬ. Хроматографию с 0X1. проводят при максимальной скорости потока 28 л/мин. Давление на входе колонки поддерживают ниже 35 рз1д. Максимальное содержание белка абатацепта в колонке для хроматографии с 0X1. - 28 г на 1 л смолы. Колонку подготавливают, уравновешивая при помощи буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 100 мМ №С1, рН 8.0. После уравновешивания собранный материал загружают в колонку, постоянно контролируя УФ-поглощение эффлюента при 280 нм. Далее колонку промывают при помощи буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 120 мМ №С1, рН 8.0. Затем белок СТЬА4Ιμ элюируют из колонки с помощью буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 850 мМ №С1, рН 7.0. В таблице ниже приведены производственные параметры для этапа хроматографии со смолой О 8ерйагозе ЕхИ'еше Ьоаб.

Параметр	У становленное/целе вое значение	Допустимые пределы	Критерий приемлемости
Содержание белка’ь	Не определено	Не определено	<28 Г/лСМолы
Бионагрузка пула продукта	Не определено	Не определено	<1 колониеобразующих ед./мл
Эндотоксин в пуле продукта13’ά	Не определено	Не определено	<5,0 эндотоксиновых ед./мл

Срок хранения собранного продукта обеспечивает соответствие процесса установленным предупреждающим пределам.

Значение бионагрузки пула продукта до фильтрации задают в промежутке между предупреждающими и допустимыми пределами <10 колониеобразующих ед./мл и <100 колониеобразующих ед./мл соответственно. Для хроматографии с 0X1. заданы шесть производственных параметров с допустимыми пределами: высота колонки, частота потока, проводимость промывочного буфера, оптическая плотность конца пика элюирования, выход продукта на этапе и бионагрузка продукта. Диапазон высоты колонки задают, чтобы обеспечить достаточный объем смолы для захвата продукта из собранного материала. Допустимые пределы для данного параметра устанавливали на базе имеющихся сведений. Скорость потока является важным фактором обеспечения согласованности и действенности хроматографического этапа. Для этапа хроматографии с 0X1. ее определяют в качестве производственного параметра с максимальным допустимым пределом. Проводимость промывочного буфера устанавливают, чтобы обеспечить удаление слабосвязанных примесей из смолы РКЬ. Согласно результатам исследований по определению диапазона с пропорциональным уменьшением значений данный параметр является важным фактором в поддержании согласованности этапа хроматографии с РКЬ. Оптическую плотность конца пика элюирования определяют, чтобы минимизировать уровень высокомолекулярного материала СТЕА4-Тд в пуле продукта. Высокомолекулярный материал ΟΠ.Λ4-Ιμ элюируется в конце пика элюирования. Задав допустимые пределы выхода продукта на этапе, обеспечивают производственную согласованность хроматографии с 0X1.. Установлены допустимые пределы для следующих производственных параметров: скорость потока, оптическая плотность конца пика элюирования и выход продукта на этапе. Для параметра бионагрузка продукта задан допустимый предел <1 колониеобразующих ед./мл. Ниже приведены допустимые пределы, определенные для двенадцати производственных параметров хроматографии с РКЬ.

В процессе наблюдают значения рН и проводимости буфера. При несоответствии на стадии приготовления показателей рН и проводимости образцовым значениям буфер признают негодным и всю партию списывают. Для этапа хроматографии с 0X1. определяют проводимость и рН уравновешивающего буфера, рН промывочного буфера, рН и проводимость буфера для элюирования. Заданное давление на

- 206 017765 входе колонки обеспечивает согласованность во время этапа хроматографии связывания и элюирования. Этап хроматографии с ОХЬ проводят при максимальном пределе давления 35 ряд. Предел давления 35 р81д установлен для предотвращения сжатия смолы ОХЬ в соответствии со спецификациями производителя. Проводимость пула продукта также является производственным параметром с допустимым пределом. Проводимости пула продукта задают допустимый предел, чтобы обеспечить эффективное связывание высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд и белка клеток-хозяев СНО в пуле продукта ОХЬ с применяемой впоследствии колонкой для гидрофобной хроматографии. Установлены предупреждающие пределы 58.5-69.1 мС/см. Показателям титра пула продукта, молярного соотношения сиаловой кислоты (СК) №ацетилнейраминовой кислоты (ПАКА), высокомолекулярного материала СТ^А4-Iд и белка клеток-хозяев СНО также заданы предупреждающие пределы для обеспечения согласованности процесса. Установлены предупреждающие пределы титра пула продукта и СК.

Обрабатываемый материал, полученный на стадиях сбора клеток, загружают в колонку для хроматографии с ОХЬ. Колонку промывают с использованием промывочного буфера (25 мМ НЕРЕ8, 120 мМ №С1, рН 8.0) в количестве минимум 10 ОК, в конце данного этапа измеряют поглощение эффлюента при длине волны 280 нм (А280). Затем белок абатацепта элюируют из колонки с помощью буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 850 мМ №С1, рН 7.0. Элюат отводят в сосуд для сбора, когда А₂₈₀ превышает значение, полученное в конце этапа промывания, >0.02 единиц оптической плотности (ЕОП). Элюат собирают, пока А₂₈₀ заднего края пика элюирования не снизится до значения <1.0 ЕОП. Буфер для элюирования добавляют прямо в сосуд для сбора элюата, добиваясь целевого веса элюата 600±10 кг. Чтобы обеспечить надлежащее смешивание содержимого, в сосуде для сбора элюата поддерживают скорость перемешивания 30±5 об/мин. После перемешивания в течение >5 мин содержимое сосуда для сбора пропускают через фильтр из ацетилцеллюлозы 0.2 мкм и отводят в сосуд для хранения. В сосуд для сбора добавляют еще 50 кг буфера для элюирования, затем пропускают содержимое через фильтр из ацетилцеллюлозы 0.2 мкм и отводят в тот же самый сосуд для хранения. Содержимое последнего сосуда хранят при температуре 2-8°С не более 72 ч.

- 207 017765

Таблица 5

Производственные параметры для этапа хроматографии со смолой С) Беρйа^ο8е Ех1геше Еоаб

Параметр	Установленное/ целевое значение	Предупреждающи й предел	Допустимый предел
Время хранения собранного материала11	Неприменимо0	<10 часов	<24 часов
Бионагрузка пула продукта перед фильтрацией0	Неприменимо	<10 колониеобразующ их ед./мл	<100 колониеобразу ющих ед./мл
Высота колонки0	Неприменимо	Неприменимо	17—24 см
Скорость потока	15—28 л/мин	Неприменимо	<28 л/мин
Проводимость промывочного буфера1	Неприменимо	Неприменимо	11,0—15,0 мС/см
Оптическая плотность конца пика элюирования	1,00 ЕОПё	Неприменимо	0,97—1,03 ЕОПЬ
Выход продукта на этапе	Неприменимо	Неприменимо	69—107%
Бионагрузка продукта1	Неприменимо	Неприменимо	<1 колониеобразу ющих ед./мл
Проводимость уравновешивающего буфера	Неприменимо	10,7—12,7 мС/см	Неприменимо
рН уравновешивающего буфера	Неприменимо	7,8-8,2	Неприменимо
рН промывочного буфера	Неприменимо	7,7-8,3	Неприменимо
Проводимость буфера для элюирования	Неприменимо	69,8—77,1 мС/см	Неприменимо
рН буфера для элюирования	Неприменимо	6,7-7,3	Неприменимо
Время загрузки1	Неприменимо	<6 часов	Неприменимо
Давление на входе колонки	Неприменимо	<35 ρδΐ§	Неприменимо
Проводимость пула продукта11	Неприменимо	58,5—69,1 мС/см	Неприменимо
Титр пула продукта	Неприменимо	>2,0 г/л	Неприменимо

Этап гидрофобной хроматографии со смолой РНепу! Беρйа^ο8е Еаз! Е1о^.

Первичной целью гидрофобной хроматографии является снижение уровня высокомолекулярных видов СТЕАТ-^ (например, тетрамера), присутствующих в пуле продукта хроматографии с ^X^. Тетрамер СТЕАТ-^ не связывается со смолой для гидрофобной хроматографии при условиях загрузки, используемых на данном этапе.

Гидрофобную хроматографию проводят с использованием смолы РНепу! Беρйа^ο8е Еаз! Е1о^ от компании СЕ НеаНЕсаге. Колонка для хроматографии связывает высокомолекулярный материал СТЕА4Ι§ и белок клеток-хозяев СНО, таким образом снижая их концентрацию в потоке белка СТ^Λ4-Iд. Колонку для гидрофобной хроматографии подготавливают, уравновешивая при помощи буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕБ, 850 мМ МП, ρН 7.0. В уравновешенной колонке применяют пул продукта СТЕА4Ι§, полученный на этапе хроматографии с ^X^. После загрузки в колонке применяют буфер, содержащий 25 мМ НЕРЕБ, 850 мМ М, ρН 7.0. СТ^Λ4-Iд собирают с колонки в основном и дополнительном смыве после промывки буфером. Для обработки одной партии СТ^Λ4-Iд проводят несколько циклов гидрофобной хроматографии в зависимости от общей массы СТ^Λ4-Iд в пуле продукта хроматографии с С)ХР. Между циклами и обработкой разных партий колонку моют и дезинфицируют.

Производственный параметр бионагрузка продукта гидрофобной хроматографии ограничен предупреждающими и допустимыми пределами. Его задают в промежутке между предупреждающими и допустимыми пределами <10 колониеобразующих ед./мл и <100 колониеобразующих ед./мл соответственно. Для колонки, используемой на этапе гидрофобной хроматографии, определены пять параметров: высота колонки, скорость потока, оптическая плотность дополнительного смыва, выход продукта на этапе и срок хранения продукта. Высоту колонки определяют, чтобы обеспечить достаточный объем смолы для обработки пула элюирования из колонки с С)ХР за один, два или три цикла на партию. Допустимые пределы для данного параметра устанавливали на базе имеющихся данных. Скорость потока является важным фактором обеспечения согласованности и действенности этапа хроматографии. Для этапа гидрофобной хроматографии ее определяют в качестве производственного параметра с максимальным допустимым пределом. Оптическую плотность дополнительного смыва определяют, чтобы минимизировать уровень высокомолекулярного материала СТ^Λ4-Iд в пуле продукта.

Высокомолекулярный материал СТ^Λ4-Iд элюируется в конце пика продукта. Задавая допустимые

- 208 017765 пределы выхода продукта на этапе, обеспечивают производственную согласованность гидрофобной хроматографии. Установлены допустимые пределы для следующих производственных параметров: скорость потока, оптическая плотность дополнительного смыва и выход продукта на этапе. Задавая допустимые пределы для времени хранения продукта, обеспечивают согласованность производства. Допустимый предел производственного параметра срок хранения продукта <5 дней подкреплен результатами исследований биохимической стабильности и срока хранения продукта в сосуде. Ниже приведены допустимые пределы, установленные для девяти производственных параметров гидрофобной хроматографии. В качестве производственных параметров с допустимыми пределами заданы рН и проводимость буфера, используемого в процессе выделения целевого продукта. При несоответствии на стадии приготовления показателей рН и проводимости образцовым значениям буфер признают негодным и всю партию списывают. Для этапа гидрофобной хроматографии в качестве производственных параметров с допустимыми пределами также заданы проводимость и рН уравновешивающего буфера/буфера для дополнительной промывки. Заданное давление на входе колонки обеспечивает согласованность хроматографического этапа. Этап гидрофобной хроматографии проводят при максимальном пределе давления 13 рк!§. Предел давления 13 рк!§ установлен для предотвращения сжатия смолы для гидрофобной хроматографии в соответствии со спецификациями производителя. Допустимые пределы титра пула продукта и СК, обеспечивающие согласованность процесса производства, устанавливаются в отчете РАК. На данном этапе задают предупреждающие пределы содержания ДНК, белка клеток-хозяев и белка хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта, чтобы облегчить количественный анализ при их последующем удалении на этапе хроматографии с гРА.

Таблица 7 Производственные параметры для этапа гидрофобной хроматографии со смолой РЬепу1 8ерйагоке Так! Τ^ν

Параметры	У становленное/це левое значение	Предупреждающий предел	Допустимый предел
Бионагрузка продукта	Неприменимо	<10 колониеобразующи х ед./мл	<100 колониеобразующи х ед./мл
Высота колонки11	Неприменимо	Неприменимо	18—22 см
Скорость потока	7,6—18 л/мин	Неприменимо	<18 л/мин
Оптическая плотность конца дополнительного смыва	1,0 ЕОПС	Неприменимо	0,8-1,0 ЕОП
Выход продукта на этапе	Неприменимо	Неприменимо	55—79%
Срок хранения продукта	Неприменимо	Неприменимо	<5 дней
Проводимость уравновешивающего буфера/буфера для дополнительной промывки	Неприменимо	71,5—75,5 мС/см	Неприменимо
рН уравновешивающего буфера/буфера для дополнительной промывки	Неприменимо	6,7-7,3	Неприменимо
Температура бака загрузки	22°С	19—25°С	Неприменимо
Давление на входе колонки	Неприменимо	<13 ρδί§	Неприменимо
Титр пула продукта	Неприменимо	>1,0 г/л	Неприменимо
Молярное соотношение СК ΝΑΝΑ в пуле продукта	Неприменимо	6,8—11,4	Неприменимо
Белок клеток-хозяев СНО в пуле продуктаг	Неприменимо	<6600 нг/мл	Неприменимо
ДНК в пуле продукта1	Неприменимо	<45000000 пг/мл	Неприменимо
Белок хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта6	Неприменимо	<5600 нг/мл	Неприменимо

^п Информация получена из табл. 2 финального отчета РАК: Очистка.

Этап инактивации вируса. Возможных побочных вирусных возбудителей в пуле продукта, полученном на этапе гидрофобной хроматографии, инактивируют добавлением 20% Тритона Х-100 до финальной концентрации 0.5% (об./об.). Обработанный детергентом раствор перемешивают и выдерживают при температуре 22±3°С в течение 1-4 ч перед началом следующего этапа. Для этапа инактивации

- 209 017765 вируса выделены пять производственных параметров, указанных ниже. Верхний предел параметра добавление 20% Тритона Х-100 составляет 3.8%. Производственные параметры для этапа инактивации вируса приведены . в таблице ниже.____________________________________________________

Параметры	У становленное/целев ое значение	Допустимый предел	Критерии приемлемости
Добавление 20% Тритона Х-100а’5	2,5% (% объема от пула продукта	Неприменимос	1,3—3,8% (% объема от пула продукта
	гидрофобной хроматографии)		гидрофобной хроматографии)
Продолжительность смешивания0	Неприменимо	Неприменимо0	>20 минут
Скорость перемешивания0	30 об/мин	25—35 об/мин	>20 об/мин
Бионагрузка пула продукта	Неприменимо	Неприменимо	<1 колониеобразующих ед ./мл
Эндотоксин в пуле продукта5’с	Неприменимо	Неприменимо	<5,0 эндотоксиновых ед ./мл

п

Информация получена из исследований по удалению вируса, РР-58Улиз С1еагапсе-ВМ8188667-001

Таблица 9

Производственные параметры для этапа инактивации вируса

Параметры	У становленное/цел евое значение	Предупреждающий предел	Допустимый предел
Температура бака при добавлении Тритона X100а'5	22°С	19—25°С	2—25°С
Срок хранения продукта0	Неприменимой	Неприменимо	<5 дней
Время инкубирования с Тритоном Х-100’ь	Неприменимо	Неприменимо	1—4 часов
Выход продукта на этапе	Неприменимо	Неприменимо	94—108%

^п Информация получена из табл. 3 финального отчета РАК: Очистка.

Этап аффинной хроматографии со смолой БерБагозе Еаз! Е1о^ на основе рекомбинантного белка А.

Аффинную хроматографию проводят с использованием иммобилизованной смолы гРА от компании СЕ НеаИНсаге. На этапе хроматографии с гРА осуществляют дальнейшее очищение белка СТБА4-1д, снижая уровень белка клеток-хозяев СНО, белка хемотаксиса моноцитов 1 и возможных побочных вирусных возбудителей. Колонку для аффинной хроматографии уравновешивают при помощи буфера, содержащего 25 мМ Трис, 250 мМ ЫаС1, рН 8.0. После уравновешивания в колонке для аффинной хроматографии применяют материал, полученный на этапе инактивации вируса и обработанный Тритоном Х100. Вначале колонку промывают буфером, содержащим 25 мМ Трис, 250 мМ ЫаС1, 0.5% Тритон Х-100, рН 8.0, а затем буфером, содержащим 25 мМ Трис, 250 мМ ЫаС1, рН 8.0. Далее белок СТБА4-1д элюируют из колонки с помощью буфера, содержащего 100 мМ глицина, рН 3.5. Значение рН пула продукта, полученного из колонки для аффинной хроматографии, корректируют до 7.5±0.2 с помощью буфера, содержащего 2 М НЕРЕ8, рН 8.0. Четыре производственных параметра, определенных для этапа хроматографии с гРА, представлены в табл. 10. Этап хроматографии с гРА обозначен в качестве этапа удаления вируса, поэтому установлен новый производственный параметр высота основания колонки с образцовым значением 21-25 см. Белок клеток-хозяев СНО и белок хемотаксиса моноцитов 1 уже были заданы в качестве производственных параметров на этапе хроматографии с гРА. Данные примеси вновь заданы в качестве производственных параметров с допустимыми пределами. Производственные параметры для этапа хроматографии со смолой БерБагозе Еаз! Е1озд на основе рекомбинантного белка А приведены в таблице ниже.

Параметры	У становленное/целевое значение	Допустимый предел	Критерии приемлемости
Высота колонки5	Неприменимо0	Неприменимо	21—25 см
Содержание белка	Неприменимо	Неприменимо	<25 г/лСМолы
Бионагрузка пула продукта	Неприменимо	Неприменимо	<1 колониеобразующих ед./мл
Эндотоксин	Неприменимо	Неприменимо	<5,0 эндотоксиновых ед./мл

^п Информация получена из табл. 4 финального отчета РАК: Очистка.

Ниже указаны предупреждающие и допустимые пределы, заданные для трех производственных параметров этапа хроматографии с гРА. Установленный срок хранения продукта обеспечивает соответствие процесса предупреждающим пределам, определенным в отчете РАК. Задав допустимые пределы

- 210 017765 срока хранения продукта, обеспечивают согласованность производства. Допустимый предел производственного параметра срок хранения продукта <48 ч подкреплен результатами исследований биохимической стабильности и срока хранения продукта в сосуде. Согласно результатам исследований по определению диапазона, рН буфера для элюирования является значимым фактором, влияющим на уровень высокомолекулярного материала СТ^Λ4-Iд в пуле продукта хроматографии с гБА. Установлены допустимые пределы рН буфера для элюирования по результатам исследования диапазона с пропорциональным уменьшением значений. Производственный параметр бионагрузка продукта хроматографии с гЕА задавали в промежутке между предупреждающими и допустимыми пределами <10 колониеобразующих ед./мл и <100 колониеобразующих ед./мл соответственно.

Для этапа хроматографии с ША выделены семь производственных параметров с допустимыми пределами - это давление на входе колонки, скорость потока, выход продукта на этапе, исходный рН пула продукта, высокомолекулярный материал в пуле продукта, белок клеток-хозяев СНО в пуле продукта и белок хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта. Установлен предел давления <13 р81д, предотвращающий сжатие смолы для хроматографии с в соответствии со спецификациями производителя. Скорость потока является важным фактором обеспечения согласованности и действенности этапа хроматографии. Для этапа хроматографии с г?А ее определяют в качестве производственного параметра с максимальным допустимым пределом. Задавая допустимые пределы выхода продукта на этапе и исходного рН пула продукта, обеспечивают производственную согласованность этапа хроматографии с г?А. Установлены допустимые пределы скорости потока и исходного рН пула продукта. Из-за возможности формирования высокомолекулярного материала СТЬА4-[д во время пика элюирования для данного параметра необходим допустимый предел <2.5%. Диапазон допустимого предела 66-108% установлен с использованием среднего ±3 стандартного отклонения для одной партии смолы 1ТА. Данный диапазон соответствует значению выхода продукта, наблюдавшемуся во время исследования срока годности смолы. Примеси, связанные с процессом производства, белок клеток-хозяев СНО и белок хемотаксиса моноцитов 1, уже были заданы в качестве производственных параметров на этапе хроматографии с ША. На данном этапе указанные примеси вновь заданы в качестве производственных параметров с допустимыми пределами. Белок клеток-хозяев СНО и белок хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта заданы в виде критических атрибутов качества с указанием образцовых значений для обеспечения их контроля. Ниже приведены допустимые пределы, определенные для двенадцати производственных параметров хроматографии с ША. В качестве производственных параметров с допустимыми пределами приняты рН и проводимость буфера, используемого в процессе выделения целевого продукта. При несоответствии на стадии приготовления показателей рН и проводимости образцовым значениям буфер признают негодным и всю партию списывают. Для этапа хроматографии с в качестве производственных параметров с предупреждающими пределами задают проводимость и рН уравновешивающего буфера/промывочного буфера 2, рН и проводимость промывочного буфера 1, проводимость буфера для элюирования.

- 211 017765

Таблица 11

Производственные параметры для этапа хроматографии со смолой Зерйагозе Раз! Е1о\у на основе рекомбинантного белка А

Параметры	У становленное/целе вое значение	Предупреждающий предел	Допустимый предел
Срок хранения продуктаь	Неприменимо0	<43 часа	<48 часов
рН буфера для элюирования	Неприменимо	3,4-3,7	3,2-3,8
Бионагрузка продукта0	Неприменимо	<10 колониеобразующи х ед./мл	<100 колониеобразующи х ед./мл
Давление на входе колонки	Неприменимо	Неприменимо	<13 Р81§
Скорость потока	6,7—9,6 л/мин	Неприменимо	<9,6 л/мин
Выход продукта на этапе	Неприменимо	Неприменимо	66—108%
Исходный рН пула продукта	Неприменимо	Неприменимо	>5,8
Высокомолекулярный материал в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<2,5%
Белок клеток-хозяев СНО в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<380 нг/мл
Белок хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<38 нг/мл
Проводимость уравновешивающего буфера/промывочного буфера 2	Неприменимо	23,0—27,0 мС/см	Неприменимо
рН уравновешивающего буфера/промывочного буфера 2	Неприменимо	7,8-8,2	Неприменимо
Проводимость промывочного буфера 1	Неприменимо	22,2—27,4 мС/см	Неприменимо
рН промывочного буфера 1	Неприменимо	7,7-8,3	Неприменимо
Проводимость буфера для элюирования	Неприменимо	0,5—1,5 мС/см	Неприменимо
Конечный рН пула продукта	7,5	7,3-7,7	Неприменимо
Титр пула продукта	Неприменимо	>6,0 г/л	Неприменимо
Молярное соотношение СК ΝΑΝΑ в пуле продукта	Неприменимо	8,0—11,0	Неприменимо
Объем пула продукта после коррекции рНс	Неприменимо	127—294 кг	Неприменимо
ДНК в пуле продукта	Неприменимо	<47000 пг/мл	Неприменимо
Остаточный рекомбинантный белок А в пуле продуктаг	Неприменимо	<160 нг/мл	Неприменимо
Тритон Х-100 в пуле продукта®	Неприменимо	<4,0 мкг/мл	Неприменимо

^п Информация получена из табл. 4 финального отчета РАК: Очистка.

Этап концентрации/диафильтрации и фильтрации вируса. После элюирования с колонки с гРА пул продукта концентрируют до целевого объема в пределах концентрации СТ^А4-Iд. Затем концентрат диафильтруют при помощи буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 100 мМ №С1, рН 8.0, используя систему ультрафильтрации с мембранами номинального молекулярно-массового предела задерживания (НММП) 30 кДа. После диафильтрации используют цепочку фильтров для удаления возможных побочных вирусных частиц. Цепочка состоит из фильтра 0.2 мкм, фильтра 0.1 мкм и фильтров с мембраной 15 нм (Р1аηονа 15 К). Фильтры, используемые на этапе ультрафильтрации (0.2 мкм, 0.1 мкм и 15 нм), являются одноразовыми. Верхний предел диапазона концентрации СТ^А4-Iд и дифференциального давления Р1аηονа после ультрафильтрации повышали на основе продемонстрированного клиренса вируса с использованием заданных условий. Производственные параметры для этапа фильтрации вируса приведены в таблице ниже.

- 212 017765

Параметры	У становл енное/целев ое значение	Допустимый предел	Критерий приемлемости
Концентрация абатацепта после ультрафильтрации*1, ь	Неприменимо0	Неприменимо	6,0—22 г/л
Отношение объема загрузки к площади поверхности	<36 кг/м2	Неприменимо	<100 кг/м2
Дифференциальное давление Р1апоуа	Неприменимо	Неприменимо	<14 ρδϊ§
Бионагрузка	Неприменимо	Неприменимо	<1 колониеобразующих ед./мл
Эндотоксин в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<0,50 эндотоксиновых ед./мл

^п Информация получена из исследований по удалению вируса, Рр-58У1ги§ С1еагапсе-ВМ8188667-001, ВЭ-2004-001.0 и ВВ-2005-832.0

Таблица 13

Производственные параметры для этапа фильтрации вируса

Параметры	У становл енное/целе вое значение	Предупреждающий предел	Допустимый предел
Бионагрузка пула продукта ультрафильтрации 1ь	Неприменимо0	<10 колониеобразующи х ед./мл	<100 колониеобразующи х ед./мл
Объемы диафильтрации	Неприменимо	Неприменимо	>5,0
Выход продукта на этапе	Неприменимо	Неприменимо	86—114%
Срок хранения продукта11	Неприменимо	Неприменимо	<5 дней
Давление на входе при ультрафильтрации	Неприменимо	<35 ρδϊ§	Неприменимо
Поток концентрата, полученного ультрафильтрацией	Неприменимо	2,5—7,5 л/мин	Неприменимо
Проводимость фильтрата	Неприменимо	10,7—12,7 мС/см	Неприменимо

^п Информация получена из табл. 5 финального отчета РАК: Очистка. ^п Информация получена из ВБ-2005-706.0.

Этап анионообменной хроматографии со смолой О 8еρΗа^ο8е Ех1геше Ьоай.

Целью хроматографии с ОЕЕ является снижение уровня остаточного белка А и дальнейшее уменьшение количества ДНК клеток-хозяев в пуле продукта после этапа вирусной фильтрации. Колонку для хроматографии с ОЕЕ также используют для контроля уровня высокомолекулярного материала и молярного отношения сиаловой кислоты к молекулам или белку СТ^Λ4-Iд в пуле продукта, получаемого на этапе хроматографии с РРР. На этапе анионообменной хроматографии с ОЕЕ также удаляют остаточный рекомбинантный белок А, ДНК клеток-хозяев, Тритон Х-100 и возможных побочных вирусных возбудителей.

Анионообменную хроматографию проводят с использованием смолы ОЕЕ от компании ОЕ НеаИйсаге. Колонку для хроматографии с ОЕЕ уравновешивают при помощи буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 100 мМ ЫаС1, ρΗ 8.0. После уравновешивания в колонке применяют фильтрат Р1аηονа. Колонку промывают вначале буфером, содержащим 25 мМ НЕРЕ8, 120 мМ ЫаС1, ρΗ 8.0, а затем буфером, содержащим 25 мМ НЕРЕ8, 130 мМ ЫаС1, ρΗ 8.0. Далее белок СТ^Λ4-Iд элюируют из колонки с помощью буфера, содержащего 25 мМ НЕРЕ8, 200 мМ ЫаС1 или 850 мМ ЫаС1, ρΗ 8.0.

Бионагрузка продукта хроматографии с ОЕЕ составляет <10 колониеобразующих ед./мл или <100 колониеобразующих ед./мл соответственно. Для этапа хроматографии с ОЕЕ заданы следующие двенадцать производственных параметров с допустимыми пределами: скорость потока, проводимость промывочного буфера 2, проводимость буфера для элюирования, срок хранения продукта, выход продукта на этапе, уровни остаточного белка А, ДНК, Тритона Х-100, СК, высокомолекулярного материала, белка клеток-хозяев СНО и белка хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта хроматографии с РРР. Скорость потока является важным фактором обеспечения согласованности и действенности этапа хроматографии. Для этапа хроматографии с ОЕЕ ее определяют в качестве производственного параметра с максимальным допустимым пределом, установленным в отчете РАК. Проводимость промывочного буфера 2 и буфера для элюирования заданы в качестве производственных параметров с допустимыми пределами вследствие их важной роли в определении качества и выхода продукта на этапе. Допустимые пределы для данных параметров устанавливали в ходе исследований по определению диапазона с уменьшением

- 213 017765 пропорциональных значений. Установив допустимые пределы срока хранения продукта, обеспечивают согласованность производства. Допустимый предел производственного параметра срок хранения продукта <5 дней подкреплен результатами исследований биохимической стабильности и срока хранения продукта в сосуде. Задав допустимые пределы выхода продукции на этапе, обеспечивают производственную согласованность хроматографии с 9ТТ. На последнем хроматографическом этапе необходим жесткий контроль качественных параметров, содержания СК, высокомолекулярного материала, белка клеток-хозяев СНО и белка хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта. Установлены допустимые пределы выхода продукта на этапе, а также уровня СК, белка клеток-хозяев СНО и белка хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта хроматографии с 9ТТ. Примеси, связанные с процессом производства, остаточный рекомбинантный белок А, ДНК и Тритон Х-100, уже были заданы в качестве производственных параметров на этапе хроматографии с ^ТТ. Данные примеси вновь заданы в качестве производственных параметров с допустимыми пределами. Остаточный рекомбинантный белок А, ДНК и Тритон Х-100 заданы в виде критических атрибутов качества с указанием образцовых значений для обеспечения их контроля. В данном примере допустимый предел содержания высокомолекулярного материала в пуле продукта был снижен с <2.5 до <2.0%.

В качестве производственных параметров с допустимыми пределами заданы рН и проводимость буфера, используемого в процессе выделения целевого продукта. При несоответствии на стадии приготовления показателей рН и проводимости образцовым значениям буфер признают негодным и всю партию списывают. Для этапа хроматографии с ^ТТ в качестве производственных параметров с предупреждающими пределами задают проводимость и рН уравновешивающего буфера, рН и проводимость промывочного буфера 1, рН промывочного буфера 2 и буфера для элюирования. Данные пределы установлены. Заданное давление на выходе колонки обеспечивает согласованность во время этапа хроматографии связывания и элюирования. Этап хроматографии с СЕТ проводят при максимальном пределе давления 35 рк1§ в соответствии со спецификациями производителя. Для обеспечения согласованности процесса задают предупреждающие пределы следующим параметрам: объем промывочного буфера 1, объем промывочного буфера 2, титр и объем пула продукта.

Таблица 15 Производственные параметры для этапа хроматографии со смолой 9 Зерйагоке Так! Е1о\у

Параметры”	У становленное/целев ое значение	Предупреждающий предел	Допустимый предел
Бионагрузка продукта”	Неприменимо”	<10 колониеобразующи х ед./мл	<100 колониеобразую щих ед./мл
Скорость потока”	4,8—8,7 л/мин	Неприменимо	<8,7 л/мин
Проводимость промывочного буфера 2е	Неприменимо	Неприменимо	12,8—15,2 мС/см
Проводимость буфера для элюирования”	Неприменимо	Неприменимо	18,5—20,9 мС/см
Срок хранения продуктаг	Неприменимо	Неприменимо	<5 дней
Выход продукта на этапе	Неприменимо	Неприменимо	65—104%
Остаточный рекомбинантный белок А в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<9,5 нг/мл
ДНК в пуле продукта®	Неприменимо	Неприменимо	<20 пг/мл
Тритон Х-100 в пуле продукта”	Неприменимо	Неприменимо	<4,0 мкг/мл
Молярное соотношение СК и ΝΑΝΑ в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	8,0—11,9

- 214 017765

Высокомолекулярный материал в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<2,0%
Белок клеток-хозяев СНО в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<95 нг/мл
Белок хемотаксиса моноцитов 1 в пуле продукта	Неприменимо	Неприменимо	<9,5 нг/мл
Проводимость уравновешивающего буфера	Неприменимо	10,5—12,9 мС/см	Неприменимо
рн уравновешивающего буфера	Неприменимо	7,7— 8,3	Неприменимо
Проводимость промывочного буфера 1	Неприменимо	12,4—14,4 мС/см	Неприменимо
рН промывочного буфера 1	Неприменимо	7,7-8,3	Неприменимо
рН промывочного буфера 2	Неприменимо	7,7-8,3	Неприменимо
рН буфера для элюирования	Неприменимо	7,7-8,3	Неприменимо
Давление на входе колонки	Неприменимо	<35 р81§	Неприменимо
Объем промывочного буфера 1	Неприменимо	5,0-5,3 ОК	Неприменимо
Объем промывочного буфера 2	Неприменимо	5,0-5,4 ОК	Неприменимо
Титр пула продукта	Неприменимо	>0,65 г/л	Неприменимо
Объем пула продукта	Неприменимо	<800 кг	Неприменимо

^п Информация получена из табл. 6 финального отчета РАК: Очистка.

Этап концентрации/диафильтрации и наполнения. Пул продукта, полученный на этапе анионообменной хроматографии с РРР, концентрируют и подвергают диафильтрации с использованием буфера, содержащего 25 мМ фосфата натрия, 50 мМ №0, рН 7.5, при помощи системы ультрафильтрации с мембранами НММП 30 кДа. Диафильтрованный концентрат пропускают через фильтр 0.2 мкм и отводят в стерильные контейнеры, в которых хранят при температуре 2-8°С. Лекарственное вещество можно при необходимости замораживать при температуре -70°С и хранить при -40°С. Единственный производственный параметр, заданный для этапа наполнения, представлен ниже. Производственные параметры для этапа концентрации лекарственного вещества/диафильтрации и наполнения приведены в таблице ниже.

Параметры	Установленное/целевое значение	Допустимый предел	Критерий приемлемости
Финальная концентрация3, ь	50 г/л	48—52 г/л	45—55 г/л

Значение бионагрузки пула продукта ультрафильтрации 2 задают в промежутке между предупреждающими и допустимыми пределами <10 колониеобразующих ед./мл и <50 колониеобразующих ед./мл соответственно. Для этапа концентрации/диафильтрации и наполнения установлены шесть производственных параметров с допустимыми пределами, указанные ниже: объемы диафильтрации, проводимость и рН фильтрата, выход продукта на этапе, срок хранения продукта и выход продукта в результате процесса. Нижний предел объемов диафильтрации установлен, чтобы обеспечить полную замену буфера белка СТЕА^^ на буфер финального лекарственного вещества до этапа наполнения. Установив значения проводимости и рН фильтрата, также обеспечивают надежность состава лекарственного вещества. Заданные допустимые пределы выхода продукции на этапе обеспечивают производственную согласованность концентрации/диафильтрации и наполнения. Установлены допустимые пределы для следующих производственных параметров: объемы диафильтрации, проводимость и рН фильтрата, выход продукта на этапе. Заданные допустимые пределы срока хранения продукта обеспечивают согласованность производства. Срок хранения продукта ультрафильтрации 2 <5 дней подкреплен результатами исследований биохимической стабильности и срока хранения продукта в сосуде. Рекомендован допустимый предел выхода продукта в результате процесса 20-62%. Для обеспечения согласованности процесса на данном этапе двум производственным процессам заданы предупреждающие пределы, указанные ниже.

- 215 017765

Таблица 17

Производственные параметры для этапа концентрации лекарственного вещества/диафильтрации и наполнения

Параметры	У становленное/целев ое значение	Предупреждающи й предел	Допустимый предел
Бионагрузка пула продукта, полученного ультрафильтрацией 2Ь	Неприменимо0	<10 колониеобразующ их ед./мл	<50 колониеобразующ их ед./мл
Объемы диафильтрации	Неприменимо	Неприменимо	>5,0
Проводимость фильтрата	Неприменимо	Неприменимо	8,3—10,3 мС/см
рН фильтрата	Неприменимо	Неприменимо	7,3-7,7
Выход продукта на этапе	Неприменимо	Неприменимо	73—110%
Срок хранения продукта^	Неприменимо	Неприменимо	<5 дней
Выход продукта в результате процесса0	Неприменимо	Неприменимо	20—62%
Давление на входе при ультрафильтрации	Неприменимо	<35 р81§	Неприменимо
Поток концентрата, полученного ультрафильтрацией	Неприменимо	2,5—7,5 л/мин	Неприменимо

^п Информация получена из табл. 7 финального отчета РАК: Очистка.

Пример 30. Этап финального наполнения лекарственного вещества.

После завершения этапа концентрации и диафильтрации 2 СТ^А4-Iд, лекарственным веществом СТ^А4-Iд из 300-л биопроцессорных мешочков наполняют предварительно стерилизованные 2-л и 10-л бутыли Вю1атег РС класса 100 безопасности для окружающей среды.

Снаружи каждую бутыль дезинфицируют 70% раствором изопропанола. Удалив печать с крышки, бутыль взвешивают перед наполнением. Полученные значения фиксируют в документах на партию, чтобы обеспечить вес наполнения в диапазоне 500-1950 г для 2-л бутылей и 7500-10200 г для 10-л бутылей. Лекарственное вещество распределяют по бутылям Вю1ашег при помощи перистальтического насоса через одноразовый фильтр 0.45/0.2 мкм одноразовый фильтр 0.45/0.2 мкм и снаряжающая лента. Бутылки закрываются крышками, которые затягиваются до определенной степени. Крышка каждой бутылки герметизируется лентой, на которую ставятся инициалы и дата. Каждая бутылка помечается идентифицирующей информацией и датой заполнения, а также порядковым номером в партии и инициалами оператора.

В процессе наполнения происходит микробиологический контроль воздуха и поверхностей. Образцы медикаментов берутся в процессе наполнения бутылок. Один образец берется непосредственно перед наполнением первой бутылки для анализа на эндотоксины. Дополнительные образцы для этого анализа берутся в середине и в конце процесса наполнения. В процессе наполнения берется также образец для сдаточных испытаний.

Пример 31. Иммунологические исследования.

СТ^А4-Iд - это растворимый сложный белок, состоящий из внеклеточного домена и антигена цитотоксических Т-лимфоцитов 4 (СТЬА-4) человека, связанного с модифицированным сегментом (шарнир, домены С_Н2 и С_Н3) человеческого иммуноглобулина (Ι§) ^СП Это первый в новом классе препаратов, одобренных для лечения ревматоидного артрита (РА), который выборочно модулирует С1)82^;'С1)86:С1)28 стимулирующий сигнал, используемый для полной активации Т-клеток (Тлимфоцитов). Ревматоидный артрит характеризуется тем, что неизвестный антиген представляется в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости и активирует аутореактивные Тклетки в присутствии стимулирующего сигнала. Впоследствии активированные Т-лимфоциты привлекают и активируют клетки иммунной системы, управляя и поддерживая клеточные процессы, что, в свою очередь, приводит к воспалению и разрушению суставов (СЬоу апй Рапау1 (2001)П Епд1 О Мей, 344 (12):907-916).

Лечебные рекомбинантные биологические препараты, такие как СТ^А4-Iд, могут быть иммуногенными и вследствие этого вызывать образование антител. Теоретически иммуногенность может отрицательно влиять на безопасность, эффективность и фармакокинетику данного биологического препарата. Антитело-зависимый клиренс биологической терапии может привести к снижению уровня лекарства в крови, что, в свою очередь, приводит к снижению эффективности действия лекарства. Образование антител также может препятствовать связыванию препарата с его фармакологической мишенью, что, в свою очередь, снижает эффективность лечения. Со временем это может привести к необходимости увеличения дозы медикамента, так называемое нарастание дозы. Это явление было описано при длительном ис

- 216 017765 пользовании анти-ФНО (фактор некроза опухоли) антител, инфликсимаба, при лечении ревматоидного артрита (Апбегкоп (2005) Зетш АгШлбк КЬеит, 34(5 Збрр11):19-22) и рассматривалось как результат действия антител, выработанных против инфликсимаба, которые и привели к снижению эффективности действия этого лекарства у некоторых пациентов (Нагаош е! а1. (2006), 1. КЬеита1о1, 33(1):31-36).

В данной работе было исследовано формирование анти-СТЬА4-1д и анти-СТЬА-4 антител и их потенциальное влияние на эффективность и безопасность СТЬА4-1д лечения. Так как СТЬА4-1д, вероятнее всего, подавляет иммунный ответ на самого себя, что объясняется его активностью как селективного костимулирующего модулятора, и так как эти реакции рассмотрены в неклинических моделях, был также исследован эффект пропуска 1-2 доз и прерванной терапии на уровне иммуногенности. В заключение было произведено тестирование серопозитивных образцов на нейтрализацию активности антител.

Материалы и методы.

Оценка исследования.

Для того чтобы определить вызывает ли СТЬА4-1д иммуногенный ответ у пациентов с РА, были проведены многочисленные исследования реакции антител во время фазы 2 и фазы 3 клинический испытаний, включающих в себя 6 1)В (двойное слепое) и 4 01, (открытых) исследования у 2237 пациентов с ревматоидным артритом, включая пациентов, у которых была неадекватная реакция на метотрексат (МТК) и анти-ФНО терапию. В одном из исследований (фаза 11а) было также опробовано лечение больных РА с применением СТЬА4-1д в качестве монотерапии (см. табл. 40). Все образцы были тщательно протестированы до начала исследования, непосредственно в процессе лечения и/или через 56 и 85 дней после приема последней дозы, для того чтобы было достаточно времени для клиренса СТЬА4-1д.

Таблица 40

Сводные результаты исследований

	Количество пациентов подвергавшихся терапии при помощи СТЬА4-1ц.	Общее количест во
№ фазы исследо вания	Вид исследования	Предшествующее лечение	Количество пациентов в группе	10 мг/кг или фиксированная	Другие дозы (мг/кг)
Исследования больных РА с неадекватной реакцией на МТК
Фаза II ΙΜ 101 100	Рандомизированн ое, плацебоконтролируемое ОВ исследование пациентов с РА, применяющих МТК с целью выявления оптимальной дозы	Дни 1-180: МТ (10-30 мг/нд) Дни 181-360 в совокупности с другим небиологичес КИМ видом лечения РА.	119	115	105(2.0)	339
Фаза III ΙΜ 101 102	Р андомизированно е плацебоконтролир уемое ЭВ исследование пациентов с РА, применяющих МТК.	Дни 1-169: МТ (10-30 мг/нд) Дни 170-365: в совокупност и с другим небиологиче ским видом лечения РА	219	433	0	652
Исследования больных РА с неадекватной реакцией на препараты блокирующие ФИО.
Фаза Ш ΙΜ101 029	Рандомизированное плацебоконтролиру емое ϋΒ исследование пациентов больных РА, проходивших курс терапии БПРП, у которых лечение при помощи блокаторов ФИО было неэффективным.	Дни 1-169: Любое небиологиче ское лечение РА	133	258	0	391
Исследования безопасности при лечении РА
Фаза III ΙΜ101 031	Рандомизированное плацебоконтролиру емые ϋΒ исследование пациентов больных РА (как с сопутствующими патологиями, так и без них) проходивших БПРП терапию и лечение биопрепаратами.	Дни 1-85: Стабильные дозы:±Небиологическая терапия РА ± Биологическая терапия. Дни 85-365 Позволеное сочетание биологической и небиологическ ой терапии	482	959	0	1441

- 217 017765

Другие сопутствующие исследования
Фаза И ΙΜΙ01 101	Рандомизированн ое, плацебоконтролир уемое ϋΒ исследование пациентов больных РА проходящих курс лечения этанерцептом.	Дни 1-180: этанерцепт (25 мг 2х/нд) Дни 181-360: Сочетание этанерцепта + не биологическая БПРП терапия.	36	0	85 (2.0)	121
Фаза Па ΙΜΙ03 002	Рандомизированно е, с варьированием доз, плацебоконтролир уемое ϋΒ исследование пациентов больных РА, лечение которых при помощи курсов БПРП или этанерцепта оказалось безрезультатным. Продолжительност ь 85 дней, с контролем до 169 дня.	Нет	32	33	26 (0.5) 32 (2.0)	122

ФК (фармакокинетические) исследования здоровых пациентов в рамках программы по лечению РА

Исследования после завершения основных испытаний препаратов
Фаза II ΙΜ101 100	Открытые неконтролируемые исследования 3-х групп пациентов (84,68,и 67 пациентов) проходивших ранее лечение дозами по 10 мг/кг, 2 мг/кг и плацебо, соответственно.	Начиная с 361 го дня МТ + небиологиче ская терапия РА.	0	219*	0	219
Фаза II ΙΜ101 101	Открытые, неконтролируемые исследования 2 -х групп пациентов(58 и 22 чел) проходивших ранее лечение дозами по 2мг/кг и плацебо	Начиная с 361 го дня этанерцепт ± 1 вид небиологиче ской терапии РА.	0	80*	0	80
ФазаШ ΙΜ101 029	Открытое, неконтролируемое исследование 2-х групп пациентов (218 и 99 чел.) проходивших ранее лечение дозами 10 мг/кг и	Начиная с 170 го дня любая небиологиче ская терапия РА или анакинра	0	317*	0	317
Фаза II ΙΜ101 017	Открытое, неконтролируемое, ФК исследование здоровых пациентов с применением одной дозы.	Нет	0	30	0	30

Фаза III	Открытое,	Начиная с	0	539*	0	539
ΙΜ1011 02	неконтролируемое	360-го дня
ОЬ	исследование 2-х	МТК(10-30
	групп (378 и 161	мг/нд)
	чел.)	+небиологич
	проходивших	еская
	ранее лечение дозами 10 мг/кг и	терапия РА.
	плацебо ,
	соответственно.

ΓΑ - ревматоидный артрит; МТК - метотрексат; ЭВ - двойное слепое исследование (анонимное); 01, - открытое исследование; ФНО - фактор некроза опухоли; БПРП - базовые противоревматические препараты, модифицирующие течение болезни; ФК - фармакокинетический.

* Объектами открытых неконтролируемых исследований становились те подгруппы испытуемых, которые прошли двойные слепые плацебоконтролируемые исследования.

Всевозможные виды предсказуемых периинфузионных побочных эффектов, в том числе и тяжелые, а также отмен приема лекарства, были выявлены и исследованы у пациентов, у которых наблюдался положительный антительный ответ на СΊ^Л4-Iд и СΊ^Л-4· Эффект воздействия иммуногенности на эффективность лечения у пациентов с положительным антительным ответом был также исследован Амери

- 218 017765 канским Институтом Ревматологии (АИР) при помощи ВСЗ (вопросник состояния здоровья).

Определение иммуногенности.

Основные методы исследования: из-за существующей высокой перекрестной реактивности на Рс фрагмент СТЬА4-1д в человеческой сыворотке, в частности в сыворотке больных РА, были применено два варианта прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ1ЗА или ИФА) для оценки выработки антител. При использовании анти-СТЬА4-1д варианта анализа возможно измерить выработку антител на все фрагменты молекулы, но он отличается низкой чувствительностью измерения. При использовании анти-СТЬА-4 варианта возможно измерить выработку антител только на СТЬА-4 фрагмент, удаляя 1д область молекулы, и таким образом, добиться большей чувствительности анализа. Оба теста были использованы как в формате конечной точки титрования (КТТ) (тест А), так и в скрининговом режиме (тест В).

Тест А: фаза II двойного слепого клинического исследования методами определения иммуногенности.

анти-СТЬА4-1д и анти-СТЬА-4 анализы, использованные в процессе фазы II исследований РА, относятся в совокупности к тесту А. В тесте А СТ^А4-Iд или СТЬА-4 был абсорбирован на 96-луночный микропланшет, в котором затем инкубировали тестируемую сыворотку (в 3-кратном серийном разведении, начиная с 1:10). Связавшиеся антитела определялись при добавлении конъюгата антител с щелочной фосфатазой (ЗоШНегп Вю1есЬ, ВиттдНат, ИЗ) и визуализировались при добавлении субстрата - пнитрофенил фосфата (ПНФФ). Так как антитела к СТЬАЛЧд человека или сыворотка для положительного контроля не были доступны, эти анализы были проведены с использованием СТ^А4-Iд антисыворотки, полученной у макак-крабоедов. Результаты всех анализов были представлены в виде значений КТТ. Считалось, что сыворотка пациента была сероконверсирована, когда его/ее КТТ была увеличена относительно ее первоначального значения (день 1) на два или более серийных разведения (в 9 или более раз).

Тест В: фаза III и фаза II открытого клинического исследования методами определения иммуногенности.

Для фазы III и двухгодичной фазы II открытых исследований оба варианта анализа: анти-СТ^А4-Iд и анти-СТЬА-4-, были модифицированы с целью уменьшить неспецифическое связывание, повысить чувствительность, а также был изменен метод определения положительных проб. Все эти изменения и характеризуют тест В. Эти анализы также были проведены с использованием специфических антител к СТ^А4-Iд, выделенных из антисыворотки макак-крабоедов. При каждой постановке ИФА 96-луночный микропланшет, покрытый СТ^А4-Iд (0.25 мкг/мл) или СТЬА-4 (0.5 мкг/мл), инкубировали с тестируемой сывороткой, разведенной 1:400, 2 ч при температуре 22±5°С (анти-СТ^А4-Iд) или, в случае разведенния сыворотки 1:25, 2 ч при температуре 32-40°С (анти-СТЬА-4). После первой инкубации связавшиеся антитела определялись при добавлении конъюгата антител против антител человека с пероксидазой хрена и последующем добавлении тетраметила бензидина в качестве субстрата.

Результаты анти СТ^А4-Iд анализа были представлены как отношения до/после, вычисленное путем деления значения оптической плотности после применения препарата на соответствующее значение до применения препарата, значения были получены на одном микропланшете. Положительность определялась на основе малозначимых величин, установленных на основе образцов от пациентов, проходивших лечение плацебо. Если тестовая величина была ниже установленной, то результат считался отрицательным и оценивался как титровая величина <400. Если же тестовая величина превышала установленную, то результат оценивался как условно положительный.

Результаты анти-СТЬА-4 анализа были представлены как Норма 1, значение которой было вычислено делением значения образца сыворотки среднего пациента на значение негативного контроля, полученное на том же микропланшете. Положительность определялась на основе значения, установленного при использовании в качестве отрицательного контроля смешанной сыворотки пациентов, проходивших лечение РА с применением плацебо. Если тестовая величина была меньше установленной, то образец считался отрицательным, и его титровая величина оценивалась как <25. Любая величина, превышающая установленное значение, оценивалась как условно положительная.

Подтверждающие анализы.

Условно положительные образцы, выявленные в каждом виде анализа (анти-СТ^А4-Iд и антиСТЬА-4) и в каждом формате тестирования (тест А и В), были также подвергнуты анализу при помощи иммунокомплексного клиренс-метода для определения специфичности ответа. анти-СТ^А4-Iд положительные образцы были преинкубированы с раствором примерно 40 мг/мл либо СТ^А4-Iд (СТЬА-4 фрагментом молекулы), либо с другим соединенным с Ц белком (СЬ40[д). либо с несвязанным белком (овальбумин) для того, чтобы определить, на какую часть молекулы может быть направлена реакция анти-СТ^А4-Iд антител (СТЬА-4, Ц или соединеняющий фрагмент). анти-СТЬА-4 положительные образцы были также преинкубированы с СТ^А4-Iд (СТЬА-4 фрагментом молекулы) или с овальбумином для подтверждения специфичности анти-СТЬА-4 реакции. После преинкубации все образцы были заново проанализированы посредством описанных выше методов. Образцы, для которых результатом преинкубации было снижение средней дозы, более чем на 30% по сравнению с образцами, не подвергавшимися воздействию, считались определенно положительными. Если образцы были признаны положительными,

- 219 017765 то они подвергались титрованию для того, чтобы определить степень разведения сыворотки, которая дала уровень значения, равный заданному для конкретного анализа, и это значение было принято как КТТ.

Определение нейтрализующей активности антител.

Для определения способности образцов со специфическими антителами к СТЬА-4 подавлять или нейтрализовывать активность СТ^Λ4-Iд (подавлять связывание с СЭ80/86 на поверхности Т-клетки) был проведен специальный биологический анализ. Стабильные трансфекты Т-лимфоцитов линии 1игка!, экспрессирующие ген люциферазы, под контролем промотора интерлейкина (ИЛ)-2 были костимулированы с В-клетками Ьаик| в присутствии анти-СЬ3 антитела. Эта костимуляция посредством взаимодействия между СЭ28 Т-клеток линии 1итка! и СО 80/86 В-клеток Ьаик| совместно с анти-СЬ3 антителами активируют промотор ИЛ-2, что приводит к увеличению транскрипции гена люциферазы и, соответственно, повышению уровня экспрессии белка люциферазы. Люминесцентный сигнал измеряется с помощью системы анализа люциферазы. Так как СТЬА4-[д блокирует взаимодействие СО 80/86 и СВ28, добавление СТ^Λ4-Iд к смеси клеток блокирует активацию промотора ИЛ-2 и уменьшает люминесцентное излучение, тогда как преинкубация с нейтрализующим антителом восстанавливает костимулирующее взаимодействие и увеличивает люминесцентное излучение.

Нейтрализующая активность антител к СТ^Λ4-Iд была охарактеризована путем определения реакции СТЬА4-[д при концентрациях 0.1, 0.25 или 0.5 мкг/мл в биотесте в присутствии 1:25 раствора серопозитивной сыворотки и проведения статистического сравнения с соответствующим образцом дня 1. Мышиные моноклональные антитела против СТЬА-4 человека (11Ό4), имеющие СТ^Λ4-Iд нейтрализующую способность, были использованы как показатель положительности в каждой серии анализов. Вследствие ограничений, присущих методу биотестирования, могут быть измерены только образцы после применения препарата, с уровнем СТЬА4-[д <1 мкг/мл, так как более высокая концентрация медикамента помешает нейтрализующей реакции и последующее разведение образца приведет к снижению точности анализа.

Фармакокинетическая оценка.

Данные по образцам сыворотки с позитивной иммунной реакцией, полученные у пациентов во время анонимного анализа в фазах ΙΙ и ΙΙΙ, были подвергнуты популяционно-фармакокинетическому анализу (ПОПФ). Утвержденная ПОПФ модель была применена к значениям концентрации в сыворотках отдельных пациентов, и при помощи апостериорного байесовского подхода были получены значения индивидуальных фармакокинетических параметров. Распределение клиренса, установленные объемы, равновесное значение площади под кривой (ППК) и минимальная концентрация препарата в теле после приема (С_т1п) были затем сравнены с распределением тех же параметров в большей когорте пациентов, участвовавших в этом же исследовании, у которых не развивалась иммунная реакция.

Результаты.

Частота возникновения анти-СТ^Λ4-Iд и анти-СТЬА-4 ответов.

У группы пациентов в количестве 2237 человек взяли для обследования образцы сыворотки до и после начала испытаний. Из них 62 (2.8%) пациента имели признаки анти-СТЬА4-[д и анти-СТЬА-4 реакции, как было установлено в процессе проведения тестов А и В (фиг. 39). Ни у одного пациента не было выявлено реакции одновременно и на Ес, и на СТЬА4 фрагменты СТ^Λ4-Iд. Три пациента имели реакцию на соединяющий фрагмент. При использовании более чувствительного теста В выработка антител на СТЬА4-!д была выявлена у 60 пациентов из 1990 (3%) (фиг. 39).

Среди пациентов, участвовавших в фазе ΙΙΙ исследований (1764 чел.), 203 прекратили прием СТЬА4-[д в течение анонимного или открытого периода исследований или даже не перешли на открытый период. У этих пациентов была взята сыворотка на 56 и/или 85 день после прекращения терапии. Из этих 203 пациентов 15 (7.4%) имели иммуноположительную реакцию либо на СТ^Λ4-Iд (вся молекула; 5 чел., 2.5%), либо на СТЬА-4 (10 чел., 4.9%, табл. 42). Из оставшихся 1561 пациентов, которые завершили фазу ΙΙΙ анонимного периода исследований и перешли в открытый период, 40 пациентов (2.6%) имели положительный антительный ответ в течение обоих периодов: 33 (2.1%) на СТ^Λ4-Iд и 7 (0.4%) на СТЬА-4. Примечательно, что в течение фазы ΙΙ испытаний СТ^Λ4-Iд как монотерапии, ни у одного пациента не наблюдалось сероконверсии на СТЬА4-[д или СТЬА-4 части молекулы, однако эти данные были получены при использовании варианта теста А, который является менее точным.

Группа пациентов в количестве 191 человек имела более чем 30-дневный перерыв в приеме СТЬА4Ι§ между участием в анонимной и открытой фазах исследований. Из них 3 (1.6%) пациента имели положительный антительный ответ на СТ^Λ4-Iд и 1 (0.5%) имел положительный антительный ответ на СТЬА-4 во время открытой фазы исследований (табл. 41). Также были взяты пробы у 587 пациентов, которые пропустили прием 1-2 доз медикамента и начали прием заново на том или ином этапе. У 15 из этих пациентов (2.6%) был выявлен положительный антительный ответ на СТ^Λ4-Iд и у 7 (1.2%) положительный антительный ответ на СТЬА-4 (табл. 41).

- 220 017765

Таблица 41

Количество (%) пациентов с сероположительной реакцией, которые прерывали СТ1 ,Λ4-Ιμ терапию

Описание характера и продолжительности прерывания приема СТЬА4-1§	Количество положительных реакций/соотношения в£%)
Анти -СТЬА4-1§	Анти -СТЬА-4	Общее
Пропуск 1 -2-х доз и возобновление приема	15/587	7/587	22/587
(2.6)	(1.2)	(3.7)
>30 дней без СТЬА4-1§ между анонимным и	3/191	1/191	4/191
открытым периодами	(1.6%)	(0.5%)	(2.1%)
Прерывание в течение Фазы III анонимного периода	5/203	10/203	15/203
(сыворотка взята через 56 и 85 дней после последнего приема)	(2.5)	(4.9)	(7.4)

СТЬА-4 - антиген цитотоксических Т-лимфоцитов 4.

Влияние сопутствующего применения МТК на иммуногенность.

Группе пациентов в количестве 2451 человек был введен МТК, а другой группе из 493 человек нет. Общее количество пациентов с положительной реакцией антител на СТ1 ,Λ4-Ιμ было примерно одинаковое в обеих группах (2.3 и 1.4%) (табл. 42).

Таблица 42

Количество пациентов (%) с положительным антительным ответом на СТЬА4-Т§ и СТЬА-4, принимавших и не принимавших МТК

Сопутствующая терапия	Количество пациентов с положительной реакцией / в
процентном соотношении	Общее
Анти-СТЬА4-1§	Анти-СТЬА4
Метотрексат	40/2451	16/2451	56/2451
	(1.6)	(0.6)	(2.3)
Не принимались	2/493	5/493	7/493
никакие препараты	(0.4)	(1.0)	(1.4)

СТЬА-4 - антиген цитотоксических Т-лимфоцитов 4.

Влияние иммуногенности на безопасность и эффективность СТ1 ,Λ4-Ιμ.

Показатели побочных эффектов, тяжелых побочных эффектов и периинфузионных побочных эфектов у всех пациентов с положительной реакцией были тщательно исследованы, и никакой связи между иммуногенностью и безопасностью лечения не было обнаружено. Также не была обнаружена связь между иммуногенностью и эффективностью лечения, однако трактовать эти результаты как окончательные не представляется возможным, так как количество обследованных пациентов с сероконверсией достаточно ограничено.

Нейтрализующая активность анти-СТЬА-4 антител.

При скрининговом исследовании на антитела к СТЬА-4 двадцать четыре образца сыворотки, взятых у 20 пациентов, были признаны положительными по анти-СТЬА-4 реактивности. Из них 14 образцов (взятых у 13 пациентов) соответствовали типичному уровню (< мкг/мл ΟΙΊ,Λ4-Ιμ) при биологическом тестировании нейтрализирующей активности. Из этих 13 образцов 1 был положительным на 56-й день после принятия последней дозы препарата, и 10 были положительными на 85-й день после последнего приема. Девять из 14 образцов (взятых у 8 пациентов) продемонстрировали нейтрализующую активность антител. За исключением одного случая сепсиса у одного пациента, не было выявлено ни одного значимого побочного эффекта в период сероконверсии, который можно было бы соотнести с проводимой у этих пациентов терапией. Данные по эффективности за период, последовавший после прекращения терапии (56 и 85 дней с момента прекращения), не были собраны. Это тот самый период, когда основное количество образцов идеально подходило для проведения оценки деятельности нейтрализующих антител. Поэтому не удалось определить, как нейтрализующие антитела воздействуют на эффективность терапии.

Фармакокинетическое тестирование.

Фармакокинетические параметры были установлены для 31 из 32 пациентов, которые имели положительную реакцию антител во время фаз ΙΙ и ΙΙΙ анонимных испытаний. Сбор образцов сыворотки для ФК анализа не обязательно проводился в те же дни, когда была зафиксирована положительная иммунная реакция. Анализ данных, полученных у этих пациентов во время анонимного периода, проведенный при помощи фармакокинетического популяционного моделирования, позволяет предположить, что прогно

- 221 017765 зируемые ФК параметры у этой группы пациентов (31 человек) сравнимы с параметрами пациентов из большей группы (386 человек), у которых не была выявлена положительная иммунная реакция. Несмотря на то что сывороточные концентрации, определяемые в течение анонимного периода исследований в дни, когда была зафиксирована сероконверсия, варьировались от 1.16 до 24.21 мкг/мл, в большинстве случаев сывороточная концентрация укладывалась в пределы от 5 до 20 мкг/мл. Сероконверсия не повлияла на титры сыворотки. Распределение клиренса и объема центральной камеры по иммуногенному статусу показано на фиг. 40

Электрохемилюминесцентный анализ с применением М81) технологии.

Для усовершенствования чувствительности связывающего анализа иммуногенности и возможности определять антитела в присутствии препарата (толерантность к лекарственным средствам) было создано новое поколение анализа иммуногенности с применением М81) технологии для отслеживания антиСТ^Λ4-Iд антител. Эта новая технология использует метку, которая излучает свет под воздействием электрохимической стимуляции на электродной поверхности микропланшета. Доказано, что этот метод является более чувствительным и имеет лучшую способность определять антитела в присутствии препарата по сравнению с методом ЕЫ8А (ИФА). Данная гомогенная технология позволяет меченому лекарственному средству (препарату) эффективнее конкурировать с лекарственным средством в сыворотке и имеет больший динамический диапазон, отношение сигнала к шуму и увеличенную емкость поверхности по сравнению с методом ИФА. В отличие от ИФА, который использует либо СТЬА-4 фрагмент молекулы, либо всю молекулу, как связывающий реагент, новый вид анализа - это связующий анализ, который использует биотинилированную и помеченную рутением молекулу СТ^Λ4-Iд, которая инкубируется с образцами пациентов перед помещением в М81) микропланшет, покрытый авидином. Электролюминесцентный сигнал, излучаемый рутениевой меткой, измеряется при помощи М81) прибора. Положительные образцы, определенные на основании утвержденной минимальной величины, в дальнейшем определялись методом иммуннодеплеции с СТ^Λ4-Iд, СТЬА-4 или С^40Iд в М81) анализе для подтверждения положительного результата и выяснения, на какой именно фрагмент молекулы была направлена иммуногенная реакция, а также для определения конечной точки титрования.

Пример 32. Фармакокинетические параметры у макак.

Шести женским особям макак-крабоедов в группе была сделана разовая инъекция СТ^Λ4-Iд, полученного в результате СП-СН01 процесса, из расчета 10 мг/кг. Контрольная группа из 6 особей женского пола получила инъекцию физиологического раствора (1 мл/кг). Для тестирования биологической активности СТ^Λ4-Iд все макаки были иммунизированы внутримышечно (10 мг/животное) Т-зависимым антигеном гемоцианином моллюска (КЬН) за 30 мин до инъекции медикамента.

Животные проходили обследование в течение следующих 6-ти недель. Образцы крови были взяты за 30 и за 3 мин до инъекции, через 1, 2, 4, 8, 24, 48 ч и на 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36, 43 день после инъекции для того, чтобы определить фармакокинетический профиль. В отчетах эти дни соотносятся с 0, 1, 2, 3, 6, 10, 14, 21, 28, 35 и 42-м днем соответственно. Образцы сыворотки были подвергнуты анализу на СТЬА4методом ИФА. Соответствующие образцы крови были собраны у животных из контрольной группы в те же дни и подвергнуты анализу на анти-КЬН антитела. Исследования образования специфических СТ^Λ4-Iд антител были проведены на сыворотке, взятой у животных, получавших инъекции СТ^Λ4-Iд, непосредственно перед инъекцией и еженедельно после нее. Образование анти-КЬН антител было установлено на образцах сыворотки, взятых у всех животных до иммунизации и еженедельно в течение 4-х недель после иммунизации. Дополнительные данные, использованные во время исследования, включали в себя такие показатели, как выживаемость, клинические симптомы, физические показатели (включая неврологические показатели, частоту дыхания и данные аускультации), вес тела, температуру тела и аппетит.

Исследования всех клинических патологий были проведены до начала испытаний и через 45 дней после. По завершении испытаний все животные были возвращены в вольеры.

Таблица 43 Фармакокинетические параметры СТ^Λ4-I§, полученные в процессе его синтеза

Процесс ВМ8- 188667 (№лота)	Стах (мкг/мл)	Площадь под кривой (1111К) (0-Т)ь (мкг.ч/мл)	Период полужизни Тклеток (ΙΙΠΤΚ) (ч)	сиг (мл/ч/кг)	ν65 (мл/кг)
СО-СНО1	330.22	19916.75	121.47	0.50	73.40
(Лот№М(Д611)	(53/52)	(3123.04)	(19.57)	(0.08)	(12.59)

Реакция антител на медикаменты была выявлена после 29-го дня у трех макак из шести, получавших инъекции продукта СП-СН01 процесса (табл. 43, фиг. 41). Минимальное увеличение (20%) остаточного азота мочевины (ОАМ) и уменьшение (14%) сывороточного калия у макак, получавших эти инъекции, не имели физиологического или токсикологического значения, так как эти значения только незначительно отличались от обычных, наблюдаемых ранее, и, в случае с ОАМ, не было выявлено сопутствующего увеличения сывороточного креатинина. Никаких других изменений клинических параметров не

- 222 017765 было выявлено. Заметное подавление анти-КЬН реакции (<4% от пиковой реакции) было замечено у макак, получавших инъекции продукта С0-СН01 процесса. Иммуногенность была значительно снижена до тех пор, пока уровень СТЬА4-1д в сыворотке не опустился ниже иммуносупрессивного уровня примерно в 1 мкг/мл на 29-й день или после него.

Клиническая патология. Образцы крови были взяты из бедренных вен специально голодавших животных перед приемом препарата (13 день) и после последнего взятия анализа крови (45 день). Анализ мочи проводился в пробах мочи, взятых за 18 ч до начала испытаний и после последнего взятия анализа крови. В процессе анализов были рассмотрены следующие параметры: Гематология: гемоглобин, гематокрит, количество эритроцитов, средний объем эритроцита, средний эритроцитарный гемоглобин, средняя эритроцитарная концентрация гемоглобина, количество ретикулоцитов, общее количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула, количество тромбоцитов и значения клеточной морфологии в периферической крови. Свертывание крови: протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), фиброген плазмы. Химический анализ сыворотки: определяли азот мочевины, креатинин, глюкоза, общий холестерол, общий белок, альбумин, глобулин, соотношение альбумина и глобулина, аланин аминотрансфераза, аспартат аминотрансфераза, щелочная фосфатаза, билирубин, триглецириды, гаммаглутамилтрансфераза, натрий, калий, кальций, хлор и фосфор. При анализе мочи были установлены следующие параметры: количество, удельный вес, рН, цвет и прозрачность, количественный анализ глюкозы, белка, кетоновых тел, биллибурина, скрытая кровь и уробилиноген. Также были исследованы мочевые осадки при помощи микроскопа.

Специфический антительный ответ. Специфичный антительный ответ на лекарственное средство, сравнимый по интенсивности, был выявлен у 3-х макак из 6-ти, получавших инъекции продукта СЭСН01 процесса на 29-й день или в период после него. Как и ожидалось, иммуногенность была значительно снижена до тех пор, пока уровень СТЬА4-1д в сыворотке не опустился ниже иммуносупрессивного уровня примерно в 1 мкг/мл на 29-й день или после него. Выработка антител на СТЬА4-1д у макак, получавших инъекции, появилась на 36-й день и достигла своего пика на 43-й день (последний день взятия анализов). Пиковые титры антител у этих макак варьировались от 23 до 10448.

Пример 33. Дезагрегация на хроматографической колонке.

Процесс дизагрегации при прохождении через смолу при аффинной хроматографии является полезным и применим для всех рекомбинантных молекул, основанных на 1дС-Рс, продуцируемых в клетках млекопитающих. Хаотропы (разобщающие агенты) могут быть использованы для того, чтобы разрушать белки или материалы с большой молекулярной массой. Такую колонковую дезагрегацию можно проделать для любого такого белка. Данный пример демонстрирует метод проведения дезагрегационного процесса на примере СТЬА4-1д.

СТЬА4-1д с большой молекулярной массой, произведенный в биореакторе, может быть частично конвертирован в функциональный СТЬА4-1д димер посредством использования разобщающих агентов в растворе (периодический режим) или в совокупности с аффинной хроматографией (колоночная модель). Этот процесс условно называется дезагрегацией. Руководствуясь результатами анализов СТЬА4-1д, прошедшего дезагрегацию, можно утверждать, что он биохимически сравним с СТЬА4-1д, не проходившим ее.

20-25% протеина СТЬА4-1д, полученного в процессе ферментации, имели высокую молекулярную массу (ВММ), т.е. являлись агрегатами. Превращение этой части в функциональный димер позволит увеличить продуктивность синтеза СТЬА4-1д более чем на 10%.

Дезагрегация в периодическом режиме.

Дезагрегация в периодическом режиме (в растворе) была проведена при помощи использования разобщающих агентов невысокой концентрации, таких как, например, гидрохлорид гуадинина или мочевина с последующим быстрым растворением в низкосолевом буферном растворе для того, чтобы помочь молекуле приобрести ее обычную конформацию.

СТЬА4-1д, очищенный при помощи протеина А (смола с моноклональными антителами), был затем разведен до концентрации примерно 4-5 мг/мл для того, чтобы его можно было использовать в качестве исходного материала в эксперименте. Затем этот раствор был смешан в пропорции 1:1 с хаотропным буфером двойной концентрации для того, чтобы итоговая хаотропная концентрация была 1-3 М (для гидрохлорида гуандинина) и 2-7 М (для мочевины). Для эффективной дезагрегации высокомолекулярного СТЬА4-1д оказались эффективны следующие концентрации: >2 М для гидрохлорида гуандинина и >4 М для мочевины. В качестве подвижной фазы для этого эксперимента была использована фосфатная буферная система с рН 6.5-7. Реакция дезагрегации была подавлена быстрым растворением (в соотношении 1:5) в буферном растворе, состоящем из 50 мМ ТгЦ, 25 мМ №С1, рН 8.5. В эксперименте с периодической дезагрегацией от 50 до 60% высокомолекулярного СТЬА4-1д были конвертированы в СТЬА4-1д димер с производительностью >95%. Уменьшение уровня высокомолекулярного СТЬА4-1д после дезагрегации показано на фиг. 42.

- 223 017765

Дезагрегация на хроматографической колонке.

Для того чтобы преодолеть потенциальные ограничения в объеме сосуда и смешивании, при увеличении масштаба дезагрегации в периодическом режиме, был исследован процесс, совмещающий в себе захват протеина А и дезагрегацию. Этот процесс включал в себя использование хаотропного раствора в качестве элюирующего буфера для протеина А с последующим сбором элюционного пула в восстанавливающий/растворяющий буфер.

Продуктивность процесса дезагрегации в обоих процессах была примерно одинаковая. Колоночная дезагрегация может иметь большее преимущество из-за меньшего количества необходимых процедур. Детали эксперимента по использованию протеина А в процессе столбовой дезагрегации показаны в следующей таблице.

Использована смола с моноклональными антителами (от СЕ НеаЙНсаге); высота колонки 20-25 см.

Шаг	Буфер	Буферный объем	Время нахождени я (мин)
Уравновешивание	25 мМ фосфата, 150 мМХаС!, водородный показатель(рН) 7.5	Коэффициент объемз (КО) >3 Процесс продолжается до тех пор, пока рН и проводимость не станут равны уравновешивающему буферу, или пока эти величины не прекратят меняться с каждым последующим изменением объема буфера.	5
Загрузка столба	Собранная суспензия клеточной культуры.	>30 г/л смолы	5
Промывка	25 мМ фосфата, 150 мМ Ν301,рН 7.5	КО>3 Продолжается пока абсорбция не достигнет величины < 0.2 АЕ (атомных единиц)	5
Элюция	25 мМ фосфата, 2.65 М СЙНС1, рН 6.5 (±0.2)	Пиковый сбор начинается в тот момент, когда абсорбция достигает 0.2 АЕ выше исходного состояния. Прекращается также в тот момент, когда абсорбция возвращается к значению 0.2 АЕ выше исходного состояния.	10
Пиковое разведение.	50мМ Тп», 25 мМ N301, рН 8.5	Пик элюции должен быть немедленно собран в растворяющий буфер в соотношении 1:5	Нет
Очистка колонки	0.1 ΝΝβΟΗ	КО~3	5
Хранение колонки	20% Этзнол	КО~3	5

Возможность включения в процесс прямого направления.

Для создания готового материала с применением дезагрегации на хроматографической колонке с применением протеина А и без него был проведен процесс очистки через 3 колонки. Результаты хроматографии, полученные в двух экспериментах, представлены в табл. 44.

Таблица 44

Данные хроматографии для процесса дезагрегации с 3 колонками и без них Выход этапа (%)

3-столбовый процесс (контрольный)

Этап процесса

Протеин А

ХГВ (хроматография гидрофобного взаимодействия)

АЕХ (анион-обменная хроматография)

Общий выход

3-столбовый процесс со столбовой дезагрегацией

Включения этапа дезагрегации в данный процесс позволило увеличить выход примерно на 10%. Образцы, полученные в результате обоих процессов, были проанализированы, чтобы определить биохимическую идентичность полученного СТ^Λ4-Iд.

Результаты N-гликанового анализа МАЙОРТОЕ (матричная лазерная десорбционная ионизация МЛДИ) показаны на фиг. 43. Согласно этому анализу полученные образцы сравнимы. Этот вывод был подтвержден также и при помощи N-гликанового теста на основе ВЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Этот анализ показал, что разница в биантенарном сиалово-кислотном пике между этими образцами менее 1.7%.

- 224 017765

Для определения количества дезамидированных и окисленных пептидов в полученных образцах была составлена триптическая пептидная карта. Результаты этого исследования (табл. 45) показывают сравнимый уровень дезамидирования и окисления этих двух образцов.

Таблица 45

Результаты пептидной карты

Образец	Т26 область дезамидирования (% площади)	Тб область оксидирования (% площади)
Контрольный 3-колоночный процесс.	0.76	0.35
3-колоночный процесс с дезагрегацией.	0.69	0.33
Стандартный материал (5 г/л)	0.94	0.37

Дополнительно анализ связывания В7 показал результаты в 101 и 98% для контрольного материала и материала, подвергавшегося дезагрегации на хроматографической колонке соответственно.

Метод дезагрегации рекомбинантных молекул Ι^-Ρ^ которые синтезируются в клетках млекопитающих, включает в себя контакт со структурой, содержащей в себе эти молекулы в совокупности с разобщающими агентами (гидрохлорид гуанденина или мочевина), в количестве и во время, подходящее для дезагрегации определенного количества таких агрегированных молекул, за которым может последовать контакт этих дезагрегированных молекул с рефолдинг и/или подавляющим агентом (например, быстрым растворением в низкосолевом рефолдинг буфере для того, чтобы помочь молекуле восстановить ее первоначальную конформацию). Контакт с разобщающим агентом может происходить в периоде, полупериоде или непрерывно в растворе (как в периодическом режиме), или параллельно с хроматографией, например, в процессе аффинной хроматографии (колоночный режим).

Процесс, комбинирующий очистку на колонке, как, например, захват протеина А и упомянутый выше способ дезагрегации, может увеличить общую эффективность процесса и является одной из модификаций всего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение является методом дезагрегации рекомбинантных молекул Ι^-Ρ^ которые производятся в клетках млекопитающих, включающим в себя контакт со структурой, имеющей в себе эти молекулы в совокупности с разобщающими агентами (гидрохлорид гуанденина или мочевина) в количестве и во время, подходящее для дезагрегации определенного количества таких объединенных молекул, при котором контакт происходит в хроматографическом колонке, когда разобщающие агенты используются в растворе для элюирования колонки (как, например, элюирующий буфер для колонки с протеином А), за которым может последовать контакт этих дезагрегированных молекул с рефолдинг и/или подавляющим агентом (например, быстрым растворением в низкосолевом рефолдинг буфере для того, чтобы помочь молекуле восстановить ее первоначальную конформацию).

Структура для контакта с разобщающими агентами может содержать рекомбинантные молекулы ΕΟ-Ι'ο не только в агрегированной форме, но и в форме одиночной цепи или димера, в дополнении к агрегированной форме.

Данные ^С-Ес молекулы могут содержать гликопротеин, как, например, молекулы СТ^А4-Iβ.

Пример 34. Фармакокинетика.

Фаза 2В рандомизированных, мультицентровых, анонимных, плацебоконтролируемых исследований для определения безопасности и клинической эффективности двух разных доз СТ^А4-Iβ, введенных внутривенно пациентам с РА во время прохождения лечения МТК. Во время этих исследований пациенты получали 2 различные дозы СТ^А4-Iβ (2 и 10 мг/кг) или комбинацию плацебо с МТК. СТ^А4-Iβ был произведен по стандартной процедуре и поставлен в ампулах, содержащих 200 мг СТ1 ..АД-Е. СТ1 ..АЭ-Е вводился на 1-й, 15-й и 30-й день и после этого каждые 30 дней в течение года. Множественные изъятия образцов для ФК исследований из сыворотки производились в период приема препарата, между 60-м и 90-м днем у пациентов, которые были вовлечены в локальные промежуточные ФК исследования. Образцы крови для этих исследований были взяты до приема препарата на 60-й день, а для ФК среза, начавшегося на 60-й день, через 30 мин (относительно окончания инфузии СТ^А4-Iβ), через 4 ч после начала инфузии и еженедельно до 90-го дня. В ФК промежуточные исследования было вовлечено 90 пациентов. Однако полный ФК срез между 60-м и 90-м днем прошли 29 пациентов, из которых 15 получали дозы 2 мг/кг и 14 получали дозы 10 мг/кг.

Сводка ФК параметров представлена в табл. 46. Результаты показали, что С_тах и ППК(ТАЕ), где ТАЕ = 30 дней, увеличились пропорционально увеличению дозы. При номинальном увеличении дозы в соотношении 1:5 геометрическое значение С_тах увеличилось в соотношении 1:5.2, а геометрическое значение ППК(ТАЕ) увеличилось в соотношении 1:5. Значения ППТК, СЬТ и Vзз также оказались зависимы от дозы. У этих испытуемых с РА значения ППТК, СЬТ и Vзз были примерно 13 дней, ~0.2 мл/ч/кг и ~0.07 л/кг соответственно. Низкое значение Vзз показывает, что СТ^А4-Iβ привязан, главным образом, к объему внеклеточной жидкости. При схеме приема на 2-й и 4-й неделе после первой инфузии, и затем ежемесячно, устойчивые условия для СТкАД-Е были достигнуты к 3-му ежемесячному приему. Также результатом данной схемы приема препарата была более высокая сывороточная концентрация, чем в первые 2 месяца лечения. Сравнения наименьших значений (С_т;_п) на 60-й, 90-й и 180-й дни показывает,

- 225 017765 что СТЕАДЛд не аккумулируется по мере приема новых доз. Стабильные значения С_т;_п для всех пациентов, получавших ежемесячно дозы 2 и 10 мг/кг СТЕАДЛд, варьировались от 4.4 до 6.7 мкг/мл и от 22.0 до 28.7 мкг/мл соответственно.

Объект исследова НИЙ	Исследов ания	иоъекты (муж/жен	Возраст (средне е, диапозо	Дозы (мг/кг)	ФК параметры
Геометрическое среднее (%С\/)	Среднее
Стах (мкг/мл)	дис (ΐ ди) (мкг.К/мл)	Т-НАЬЕ (Дни)	СЬТ (мл/Ь/кг)	\/38(л/КГ)
Эффективность , безопасность, многократная доза фармакокинети ческого и иммуногенетич еского потенциала внутривенно введенного препарата	Рандомизи рованные плацебокон тролируем ые исследован ИЯ многократн ой дозы 30минутный IV настой	29 (18/11)	54 (34-83)	2.0 (N=15)	54,9 (29)	9573,5 (30)	13,5 (5,9)	0.23(0,13)	0.07 (0.04)
10.0 (N=14)	284,2 (23)	47624,2(31)	13.1 (5.31)	0,22 (0,09)	0.07(0,03)

У пациентов с РА после нескольких внутривенных инъекций фармакокинетические показатели СТ^А4-Iд показали пропорциональное увеличение С_тах и НИК при переходе от дозы 2 мг/кг к 10 мг/кг. При дозе 10 мг/кг сывороточная концентрация достигла стабильного значения к 60-му дню с наименьшей концентрацией 24 (1-66) мкг/мг. Никакой систематической аккумуляции при регулярном, ежемесячном приеме доз по 10 мг/кг у больных РА не было выявлено.

Популяционные ФК анализы у пациентов с РА выявили, что существует тенденция к увеличению клиренса СТ^А4-Iд, находящаяся в прямой зависимости от веса тела пациента. Соответствующей зависимости от возраста или пола пациента не было обнаружено. Сопутствующие приемы МТК, нестероидных противовоспалительных средств (НПС), кортикостероидов, блокирующих ФНО агентов, не повлияли на клиренс СТ^А4-Iд.

Пример 35. Определение молярной концентрации маннозы, фукозы и галактозы КЭ методом.

Метод КЭ (капиллярный электрофорез) был разработан для количественного анализа нейтральных моносахаридных составляющих ЬЕА2 СТ^А4^{А29^104Е}-Iд. Нейтральные моносахариды, такие как манноза, фукоза и галактоза, выделяются из образцов СТ^А4^{Λ29^104Е}-Iд при помощи кислотного гидролиза при больших температурах (2 М трифторуксусной кислоты, в течение 6 ч, при температуре 95°С). Выделенные нейтральные моносахариды затем метят флюоресцентным веществом (аминопирентрисульфидной кислотой (АПТК)) в присутствии уксусной кислоты в качестве катализатора и NаВН₃СN в качестве редуцирующего реагента (67 мМ АПТК, 330 мМ НАс, 83 мМ NаВН₃СN, в течение 3 ч при температуре 55°С). К каждому образцу добавляется ксилоза, которая служит внутренним стандартом. Соотношение площади пика каждого нейтрального моносахарида к внутреннему стандарту используется для количественного анализа.

Реагенты: гидролизный раствор (2 М трифторуксусной кислоты (ТФК)); раствор для получения производных 1 (0.1 М 8-амиио-1,3,6-трисульфокислота, водный раствор тринатриевой соли); раствор для получения производных 2 (0.25 М NаВН₃СN в 1 М уксусной кислоты); подвижный буфер (60±5 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); раствор для промывания капилляров (1 N №0Н; 1 N НС1; 80% метанол); исходные растворы моносахаридов: маннозы, фукозы, галактозы и ксилозы в концентрации 10 мг/мл; рабочий раствор моносахарида 1: рабочий раствор внутреннего стандарта - это раствор исходного раствора ксилозы из расчета 1:100; рабочий раствор моносахарида 2: нейтральный смешанный рабочий раствор маннозы, фукозы и галактозы из расчета 1:100 к исходному раствору.

Инструментарий: прибор для КЭ (Весктап Р/АСЕ МОО СЕ Бу1ет); детектор: лазериндуцированный детектор Весктап совместно с Весктап Р/АСЕ МОО; капилляры без покрытия (внутренний диаметр - 25 мкм, внешний диаметр 360 мкм) длина 27-31 см для использования Р/АСЕ МОО.

Условия для КЭ: подвижный буфер (60 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); температура капиллярного сосуда: 25°С; напряжение - 25-30 кВ, положительный заряд; условия работы детектора: лазерный индуцированный детектор, возбуждение при 488 нм, излучении на 520 м; введение образца: впрыскивание под давлением, 20 единиц Сведберга (ЕС) при давлении 0.5 фунта/кв.дюйм; время: 10 мин; температура хранения образцов: 10°С.

Гидролиз: 10 мл рабочего раствора ксилозы и 200 мл 2 М трифторуксусной кислоты были смешаны для контроля системы, 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 10 мкл нейтрального смешанного раствора

- 226 017765 стандарта были смешаны с 200 мл 2 М трифторуксусной кислоты для получения стандартных моносахаридов. 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 10 мкл образца (например, 1.Е.А2 СТ^А4^{Ά29^104Е}-Iд примерно 1 мг/мл) были смешаны с 200 мкл 2 М трифторуксусной кислоты для получения тестового образца, все пробирки были перемешаны на вортексе в течение 10 с, подвергнуты центрифугированию в течение 10 с и инкубации при температуре 95°С в течение 6 ч. После гидролиза все образцы охлаждались 10 мин при температуре -20°С. Затем образцы были слиты и выпарены до твердого состояния в вакуумном усилителе.

Получение производных (дериватизация): образцы были восстановлены с 10 мкл деривационного раствора 1. Далее образцы были слегка перемешаны, и к ним был добавлен деривационный раствор 2 в количестве 5 мл. Образцы были загружены в предварительно нагретую центрифугу и инкубировались в течение 3 ч при температуре 55°С и одновременном вращении со скоростью 2000 об/мин.

КЭ инъекциионный раствор: конечный объем образцов после деривации был доведен до 10 мл добавлением специальной воды для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) и 10 мкл раствора были перемещены в микрососуд для КЭ, содержащий 190 мл воды для ВЖХ. Перед введением образца картридж для КЭ был промыт водой для ВЖХ (в течение 1-3 мин), за этим последовало выравнивание с применением активного буфера (5 мин). После этого вводились стандартные моносахариды или образцы для анализа в картридж для КЭ (15 мин). После введения каждого стандартного или тестового образца КЭ картридж был промыт и уравновешен при помощи воды для ВЖХ и активного буфера (табл. 51). Электроферограмма системы должна быть сходна с фиг. 45, в котором пик 1 - манноза, пик 2 ксилоза, пик 3 - фукоза, пик 4 - галактоза.

Таблица 51

Инструментальный метод

Время	Действие	Значение	Прод олжи тельн ость	Вывод	Описание
	Промывка под давлением.	40.0 ώνΗτ/кв.дюйм	3.00 мин	прямо	Промывка водой
	Промывка под давлением	40.0 фунт/кв.дюйм	5.00 мин	прямо	Промывка активным буфером
	Введение под давлением	0.5 фунт/кв.дюйм	20.00 сек	По контуру и прямо	Введение
0.00 мин	Разделение под напряжением	30 кВ	15.00 мин	0.17 мин наклон, нормальная полярность	Разделение
0.05 мин	Сброс
15.00 мин	Остановка
15.00 мин	Конец

Требования к системе.

Электроферограмма системы должна совпадать с фиг. 45, в котором пик 1 - манноза, пик 2 - ксилоза, пик 3 - фукоза, пик 4 - галактоза.

При использовании другой КЭ системы, отличной от Весктап VIIX), необходимая длина капилляров может отличаться от той, что была обозначена выше. Это повлечет изменения во времени миграции аналита и пиковой интенсивности, но пиковые схемы для аналитов моносахаридов должны остаться прежними.

Разрешение между 2-мя соседними пиковыми значениями для первого стандарта требований к системе может быть подсчитано по следующей формуле:

К= 2(ί₂-ίι)/(\¥ι+\ν₂) где К - разрешение;

11, 1₂ - время миграции двух соседних пиков соответственно;

\\'₂ - ширина двух соседних пиков на начальном уровне соответственно.

Значение К должно быть >1.0, если К <1.0, необходимо промыть капилляры. Если проблема остается, то необходимо заменить активный буфер на свежий или заменить капилляры.

При последнем введении последний пик (галактоза) должен иметь коэффициент размывания <1.4, используя следующую формулу:

где Т - коэффициент размывания;

^₀.₀₅ - ширина пика на 5% от высоты;

Р - ширина пика на максимуме.

Если Т >1.4, необходимо промыть капилляры, как описано выше. Если проблема остается, необходимо заменить активный буфер или капилляры. Соотношение пиковых площадей галактозы и ксилозы ОСО (относительное стандартное отклонение) <10%.

Время миграции галактозы должно быть <15 мин. Данные электроферограммы должны совпадать с

- 227 017765 фиг. 45.

ОСО для стандартов моносахаридов может быть определено путем сравнения соотношения пиковых площадей внутреннего стандарта и стандартов моносахаридных компонентов путем деления пиковой площади для каждого моносахаридного компонента на пиковую площадь внутреннего стандарта для каждого введения моносахарида. ОСО может быть высчитано для маннозы, фукозы и галактозы. ОСО должно быть <10%.

Определение молярного соотношения нейтральных моносахаридов к белку.

Соотношение пиковых площадей для нейтральных моносахаридов (маннозы, фукозы или галактозы) относительно внутреннего стандарта может быть посчитано по приведенной ниже формуле и использовано для определения молярного соотношения каждого моносахарида к белку. Например, пиковое соотношение площади равно пиковой площади моносахарида, деленной на пиковую площадь ксилозы, тогда как ОСО <10%. Приведенные ниже формулы могут быть использованы для вычисления следующих соотношений.

Для молярного соотношения манноза/протеин

К_тап= (А^А^У^СтапО*^^ где К_тап - молярное соотношение маннозы к белку;

А_тап - пиковая площадь маннозы в образце;

А_ху1 - пиковая площадь ксилозы в образце;

А_ху10 - среднее значение пиковой площади ксилозы в стандарте моносахарида;

А_тап0 - среднее значение пиковой площади маннозы в стандарте моносахарида;

У_тап0 - объем маннозы в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза;

С_тап0 - концентрация маннозы, содержащаяся в рабочем растворе моносохарида, используемом для гидролиза;

У_р - объем белка, использованного для гидролиза (мл);

С_р - концентрация белка, использованного для гидролиза (мг/мл);

М^_ЬЕА29У: молекулярная масса БЕА29У (или СТЕА4^{А29¥Е104Е}-1д) (91.232 Да).

Молекулярная масса маннозы: 180.2 Да.

Для молярного соотношения фукоза/протеин

Щис=(А£_ис*А_Ху10*Угис0*С_тап0*ЛТ\¥ьЕА₂9у)/(А_Ху1*А£_ис0*Ур*Ср*164.2) где К_£ис - молярное соотношение фукозы к белку;

А_£ис - пиковая площадь фукозы в образце;

А_ху1 - пиковая площадь ксилозы в образце;

А_ху10 - среднее значение пиковой площади ксилозы в стандарте моносахарида;

А_£ис0 - среднее значение пиковой площади фукозы в стандарте моносахарида;

С_£ис0 - концентрация фукозы, содержащаяся в рабочем растворе моносохарида, используемом для гидролиза;

У_£ис - объем фукозы, содержащийся с рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза;

У_р - объем белка, использованного для гидролиза (мл);

Ср - концентрация белка, использованного для гидролиза (мг/мл);

М^_ЬЕА29У - молекулярная масса БЕА29У (или СТЕА4^{А29УЕ104Е}-1д) (91.232 Да).

Молекулярная масса фукозы: 164.2 Да.

Для молярного соотношения галактоза/протеин

К_8а1=(А_еа1*А_ху1о*У_еа1о*С_еа]о*М^_ЬЕА29т)/(А_ху)*А_8а1о*У_р*С_р*180.2) где К_да1 - молярное соотношение галактозы к белку;

А_да1 - пиковая площадь галактозы в образце;

А_ху1 - пиковая площадь ксилозы в образце;

А_ху10 - среднее значение пиковой площади ксилозы в стандарте моносахарида;

А_да10 - среднее значение пиковой площади галактозы в стандарте моносахарида;

У_да1 - объем галактозы, содержащийся с рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза;

С_да10 - концентрация галактозы, содержащаяся в рабочем растворе моносохарида, используемом для гидролиза;

У_р - объем белка, использованного для гидролиза (мкл);

Ср - концентрация белка, использованного для гидролиза (мкг/мл);

М^_ЬЕА29У - молекулярная масса БЕА29У (или СТЕА4^{А29АЕ104Е}-1д) (91.232 Да).

Молекулярная масса галактозы: 180.2 Да.

- 228 017765

Таблица 52

Среднее молярное соотношение моносахаридов к СТ^Α4^{Л29Υ^104Е}-Iд белку

МОНОСАХАРИД	ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ
Манноза	11-23
Фукоза	4.2-7.5
Галактоза	9.2-18

Пример 36. Определение молярного отношения Οа1NΑс и ϋΕ-ΓΝΑΓ при помощи КЭ.

КЭ был создан для количественного анализа аминомоносахаридного содержания в молекуле СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iд гликопротеина с 6 Ν-связанными центрами гликозилирования и по крайней мере одним О-связанным центром гликозилирования. Аминомоносахариды, такие как Ν-ацетилгалактозамин (Οа1NΑс) и Ν-ацетилглюкозамин (θ^ΝΑ^, высвобождаются из СТ^Α4^{Л29Υ^104Е}-Iд путем кислотного гидролиза при высокой температуре (4 Ν НС1, в течение 6 ч при температуре 95°С). Высвобожденные аминосахариды проходят реацетилирование путем инкубации с уксусным ангидридом во льду в течение получаса. Затем они метятся флюоресцентным веществом (аминопирентрисульфидной кислотой (АПТК)) в присутствии уксусной кислоты в качестве катализатора и NаΒΗ₃СN в качестве редуцирующего реагента (67 мМ АПТК, 330 мМ НАс, 83 мМ №ВН₃ СН в течение 3 ч при температуре 55°С). К каждому образцу добавляется Ν-ацетилманозамин, который служит в качестве внутреннего стандарта. Отношение пиковой площади каждого аминомоносохарида к пиковой площади внутреннего стандарта используется для расчетов.

Реагенты: гидролизный раствор (4 Ν НС1); раствор для получения производных 1 (0.1 М 8-амино1,3,6-трисульфокислота, водный раствор тринатриевой соли); Раствор для получения производных 2 (0.25 М NаΒΗ₃СN в 1 моль уксусной кислоты); подвижный буфер (60±5 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); раствор для промывания капилляров (1 Ν №ΟΙ I; 1 Ν НС1; 80% метанол); исходные растворы моносахаридов: Οа1NΑс, ϋΕ-ΓΝΑΓ и МаηNΑс в концентрации 10 мг/мл. Рабочий раствор моносахарида 1: рабочий раствор внутреннего стандарта - это раствор исходного раствора МаηNΑс из расчета 1:100; рабочий раствор моносахарида 2: смешанный рабочий аминораствор Οа1NΑс, ϋΕ-ΓΝΑΓ из расчета 1:100 к исходному раствору.

Инструментарий: прибор для КЭ (Весктап Ρ/ΑСЕ МПС) СЕ Зу!ет); детектор: лазерный индуцированный детектор Весктап совместно с Весктап Ρ/ΑСЕ М^^.

Условия для КЭ: подвижный буфер (60 мМ тетрабората натрия, рН 9.25); температура капиллярного сосуда: 25°С; напряжение - 25-30 кВ, положительный заряд; условия работы детектора: лазерный индуцированный детектор, возбуждения на 488 нм, излучение на 520 м; введение образца: впрыскивание под давлением, 20 единиц Сведберга (ЕС) при давлении 0.5 фунта/кв.дюйм; время: 10 мин; температура хранения образцов: 10°С.

Гидролиз: 10 мкл рабочего раствора МаηNΑс и 200 мкл 4 Ν НС1 были смешаны для контроля системы, 10 мкл рабочего раствора МаηNΑс и 10 мкл смешанного амино раствора стандарта были смешаны с 200-ми мкл 4 Ν НС1 для получения стандартных моносахаридов. 10 мкл рабочего раствора МаηNΑс и 10 мкл образца (например, СТ^Α4^{Α29^104Е}-Iд примерно 1 мкг/мл) были смешаны с 200 мкл 4 Ν НС1 для получения тестового образца, все пробирки перемешивались на вортексе в течение 10 с, центрифугировались в течение 10 с и инкубировались при температуре 95°С в течение 6 ч. После гидролиза все образцы охлаждались 10 мин при температуре -20°С. Затем образцы были слиты и выпарены до твердого состояния в вакуумном усилителе.

Реацетилирование: после гидролиза и сушки образцы были восстановлены с 20 мкл реацетилирующего буфера и 4 мкл уксусного ангидрида, с последующим перемешиванием и инкубацией на льду (30 мин). Затем образцы сливаются и выпариваются до твердого состояния в вакуумном усилителе.

Все образцы были восстановлены с 100 мл воды для ВЖХ, а затем выпарены до твердого состояния в вакуумном усилителе.

Дериватизация: образцы были восстановлены с 10 мкл деривационного раствора 1. Далее образцы были быстро перемешаны, и к ним был добавлен деривационный раствор 2 в количестве 5 мкл. Образцы были загружены в предварительно нагретую центрифугу и инкубировались в течение 3 ч при температуре 55°С и одновременном вращении со скоростью 2000 об/мин.

КЭ инъекционный раствор: конечный объем образцов после деривации был доведен до 10 мкл добавлением специальной воды для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ), и 10 мкл раствора были перемещены в микрососуд для КЭ, содержащий 190 мкл воды для ВЖХ. Перед введением образца картридж для КЭ был промыт водой для ВЖХ (в течение 1-3 мин), за этим последовало выравнивание с применением активного буфера (5 мин). После этого в картридж для КЭ вводились стандартные моносахариды или образцы для анализа (10 мин). После введения каждого стандартного или тестового образца КЭ картридж был промыт и уравновешен при помощи воды для ВЖХ и активного буфера. Электроферограмма системы должна совпадать с фиг. 46, на котором пик 1 - Οа1NΑс, пик 2 - МаηNΑс, пик 3 - ϋΕ-ΓΝΑΓ.

- 229 017765

Таблица 53

Инструменты и методы

Время	Действие	Значение	Прод олжи тельн ость	Вывод	Описание
	Промывка под давлением.	40.0 фунт/кв.дюйм	3.00 мин'	прямо	Промывка водой
	Промывка под давлением	40.0 фунт/кв.дюйм	5.00 мин	прямо	Промывка активным буфером
	Введение под давлением	0.5 фунт/кв.дюйм	20.00 сек	По контуру и прямо	Введение
0.00 мин	Разделение под напряжением	30 кВ	10.00 мин	0.17 мин наклон, нормальная полярность	Разделение
0.05 мин	Сброс
15.00 мин	Остановка
15.00 мин	Конец

Требования к системе.

Электроферограмма системы должна совпадать с фиг. 46, на которой пик 1 - Оа1ЫАс, пик 2 - МапЫАс, пик 3 - ОБсНАс.

При использовании другой КЭ системы, отличной от Весктап МОР, необходимая длина капилляров может отличаться от той, что была обозначена выше. Это повлечет изменения во времени миграции аналита и пиковой интенсивности, но пиковые схемы для аналитов моносахаридов должны остаться прежними.

Разрешение между 2-мя соседними пиковыми значениями для первого стандарта требований к системе может быть подсчитано по следующей формуле:

К= 2 (1₂-1ι) / (У^+ХУг) где К - разрешение;

ΐ₁, ΐ₂ - время миграции двух соседних пиков соответственно;

^₁, ^₂ - ширина двух соседних пиков на начальном уровне соответственно.

Значение К должно быть >1.0, если К <1.0, необходимо промыть капилляры. Если проблема остается, то необходимо заменить активный буфер на свежий или заменить капилляры.

При последнем введении последний пик (ОБсНАс) должен иметь коэффициент размывания <1.4, который может быть вычислен по следующей формуле:

Τ=λν₀.₀₅/2Γ где Т - коэффициент размывания;

Ш₎₀₅ - ширина пика на 5% от высоты;

Р - ширина пика на максимуме.

Если Т >1.4, необходимо промыть капилляры, как описано выше. Если проблема остается, необходимо заменить активный буфер или капилляры. Соотношение пиковых площадей ОБсНАс и МапЫАс 0С0 (относительное стандартное отклонение) <10%. Время миграции галактозы должно быть <10 мин. Данные электроферограммы должны совпадать с фиг. 46.

ОСО для стандартов моносахаридов может быть определено путем сравнения соотношения пиковых площадей внутреннего стандарта и стандартов моносахаридных компонентов путем деления пиковой площади для каждого моносахаридного компонента на пиковую площадь внутреннего стандарта для каждого введения моносахарида. ОСО может быть высчитано для Оа1ЫАс и ОБсНАс. 0С0 должно быть <10%.

Определение молярного соотношения аминомоносахаридов к белку.

Соотношение пиковых площадей для аминомоносахаридов (например, Оа1ЫАс и ОБсНАс) относительно внутреннего стандарта МапЫАс может быть просчитано по приведенной ниже формуле и использовано для определения молярного соотношения каждого аминомоносахарида к белку. Например, пиковое соотношение площади равно пиковой площади аминомоносахарида, деленной на пиковую площадь МапЫАс, тогда как ОСО <10%. Приведенные ниже формулы могут быть использованы для вычисления следующих соотношений:

Для молярного соотношения Оа1ЫАс/Протеин ^Са№Ас⁼(АсаШАс*АмапМАсО*УсаДОАсО*СсаДОАеО*М^УьЕА29¥)/(АмагДОАс*Ац_аДОАсО*Ур*Ср*221.2) где КОа1ЫАс - молярное соотношение Оа1ЫАс к белку;

А_Оа1ЫАс - пиковая площадь Оа1ЫАс в образце;

- 230 017765

Αμβ^ο - пиковая площадь МаηNЛс в образце;

Α^^οο - среднее значение пиковой площади МаηNЛс в стандарте моносахарида;

Αο^^ο - среднее значение пиковой площади 0.1ΝΑο в стандарте моносахарида;

- объем 0.1ΝΑο, содержащийся в рабочем растворе моносахарида, используемого для гидролиза;

Сош^ю - концентрация 0.1ΝΑο, содержащаяся в рабочем растворе моносохарида, используемом для гидролиза;

V_ρ - объем белка, использованного для гидролиза (мл);

С_р - концентрация белка, использованного для гидролиза (мкг/мл);

МА·. .;.·: молекулярная масса ^ЕЛ29Υ (или СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е}-Iд) (91.232 Да).

Молекулярная масса Οа1NЛс: 221.2 Да.

Для молярного соотношения 0^сNЛс/Протеин

ΚσΕεΝΑ€=(ΑοΕ_€ΝΑε*ΑΜ3πΝΑεΟ*ν(;^ΝΑοΟ*€(;ΓεΝΑεΟ*ΜΧνΕΕΑ29γ)/(ΑΜ8ηΝΑο*Α6£_€ΝΑεΟ*νρ*€ρ*221.2) где ΗΟΕοΝΑο - молярное соотношение ΟΕοΝΑο к белку;

ΑΟΕοΝΑο - пиковая площадь ΟΕοΝΑο в образце;

Αμ^^. - пиковая площадь МаηNЛс в образце;

Αμ^^ - среднее значение пиковой площади МаηNЛс в стандарте моносахарида;

Α_{ΟΕοΝΑο0} - среднее значение пиковой площади в стандарте моносахарида;

ν₀Ε_θΝΑο - объем ΟΕοΝΑο, содержащийся в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза;

С_оь_стс - концентрация ΟΕοΝΑο, содержащаяся в рабочем растворе моносохарида, используемом для гидролиза;

V_ρ - объем белка, использованного для гидролиза (мкл);

Ср - концентрация белка, использованного для гидролиза (мг/мл);

МАц^у - молекулярная масса ^ЕЛ29Υ (или СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е}-Iд) (91.232 Да). Молекулярная масса ΟΕοΝΑο: 221.2 Да.

Таблица 54

Среднее молярное соотношение моносахаридов к СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е}-Iд белку

МОНОСАХАРИД	ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ
ΟαΙΝΑο	2.0-3.2
ΟΣεΝΑο	18-32

Пример 37. Ν-связанный олигосахаридный углеводный анализ СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е}-Iд при помощи хроматографии высокоэффективного анионного обмена (ХВАО).

Углеводная структура гликопротеинов может влиять на их функции и естественный клиренс. Таким образом, представляется важным отслеживать структуру углеводов в рекомбинантно-произведенных гликопротеинах. Здесь представлен мониторинг Ν-связанных (аспарагин-связанных) углеводов в молекуле СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е} В этом методе олигосахариды расщепляются при помощи ферментного переваривания с РМОзе Е (пептид: Ν-связанная гликозидаза Е), разделяются при помощи ХВАО и отслеживаются при помощи электрохимической детекции (интегрированная апмерометрия). Полученная хроматограмма является углеводным Ν-связанным анализом, тогда как анализ СΊ^Л4^{Α29Υ^104Е} должен быть сходным с этим.

Реагенты для подвижной фазы, служащие для изоляции олигосахаридов и обратной фазы, и графитированный уголь для ВЭЖХ: элюент 1 (0.05% трифторуксусной кислоты (ТФК) в воде для ВЭЖХ; элюент 2 (0.05% ТФК в ацетонитриле (60%), 40% воды для ВЭЖХ; элюент 3 (0.05% ТФК в 40% ацетонитриле, изопропанол (40%) и вода для ВЭЖХ (20%).

Реагенты для подвижной фазы для ХВАО олигосахаридного углеводного анализа: элюент 1 (500 мМ уксусно-кислого натрия (Ν.0Αο)); элюент 2 (400 мМ гидроксида натрия (№011); (4 М №0Н); 50 мМ натриево-фосфатного буфера, 0.02% азида натрия, рН - 7.5; РМ'Озе Е энзим в 1,9685 дюймы натриево-фосфатного буфера, 0.02 азида натрия, рН 7.5; базовый раствор стахиозы (1.25 мкг/мл); стандартная стахиозная система (12.5 мкг/мл).

Инструменты и условия проведения - (инструменты могут быть заменены на эквивалентные).

Инструментарий.

Система для ВЭЖХ с калиброванным, температуроконтролиремым автосэмплером (37°С), переключающий аппарат и детектор УФ-излучения в 6-колоночном селекторе.

Производство Аа1егз Согрогайоп.

Столб 1: Йипа 5μ, С18(2) 4.6x150 мм. Производство Рйепотепех (номер в каталоге Αν0-6080).

Столб 2: НурегСагЬ 5μ 4.6x100 мм. Производство Рйепотепех (номер в каталоге 00Е-4252-Е0).

- 231 017765

Система для ВЭЖХ ЭХ-500 включает в себя:

наклонный насос СР50, автосэмплер А8850 (с охлаждением), модуль дегазирующий элиент, модуль жидкостной хроматографии, детектор ЕЭ40,

ЭХ-ЕАЫ,

РеакЫе! 8о11\\'аге (версия 5.1 или выше) или другая подходящая компьютерная система, столб 3: СагЬоРас РА-1 4х250 мм. Производство Эюпех СогрогаНоп (номер в каталоге 35391), страхующий столб СагЬоРас РА-1 4х250 мм. Производство Эюпех СогрогаНоп (номер в каталоге 43096), система сбора данных МШеппшш версия 3.2.

Подготовка образцов: в пробирку типа Эппендорф, объемом 1.7 мл, добавили 80 мкл натрийфосфатного буфера (50 мМ), содержащего 0.02% азида натрия, рН 7 и 80 мкл тестового образца (25 мкг/мл для общего объема СТЬА4^{А29¥Е104Е} 2 мг), затем 16 мкл 10-кратного денатурирующего буфера (5% 8Э8, 10% β-меркаптоэтанола). Образцы перемешивали и подогревались в течение 2 мин для денатурации белков. Затем пробирки охлаждали до комнатной температуры, далее добавляли 16 мкл №40 (10%) и 40 мкл рабочего раствора РЫСаке Р, все это перемешивали. После инкубации образцов при температуре 37°С в течение 24±2 ч образцы помещали в карусель автосэмплера для ввода в прибор для ВЭЖХ.

Условия хроматографии для изоляции олигосахаридов. Температура колонки равна температуре окружающей среды (22-25°С).

График изменения расхода изначально до 30.0 мин 1.0 мл/мин

30.0 до 35.0 мин, 1.0-2.0 35.0 до 40.0 мин, 2.0-1.0 40.0 до

50.0 мин, 1.0 50.0 50.0 до 60.0 мин, 1.0-0.1

Подвижная фаза и график понижения.

1. 0.05% ТФК Время

2. 0.05% ТФК (мин) в ацетонитрил/ Н₂0 (60:40)

3. 0.05% ТФК в ацетонитрил/изопропан/ Н₂0 (40/40/20)

Начальное 15.00 15.01 25.00 30.00 35.00 40.00 50.00 60.01

Температура автосэмплера 37°С

Объем введенного препарата 100 мкл

Время процесса. 50 мин

Время сбора данных 50 мин

Переключатель для 6-ти столбового Начальное клапаного аппарата «КЪеойап» Начальное

Начальное Начальное 11.0 30.0 30.0 30.0 40.0 40.0

%1	%2	%3
100	0	0
80	20	0
0	100	0
0	100	0
0	0	100
0	0	100
100	0	0
100	0	0
100	0	0

Переключатель 1 выкл. Переключатель 2 вкл. Переключатель 3 вкл.

Переключатель 4 выкл. Переключатель 4 выкл. Переключатель 4 выкл. Переключатель 1 вкл.

Переключатель 2 выкл.

Переключатель 2 вкл.

Переключатель 1 выкл.

Условия проведения хроматографии для тестирования олигосахаридов при помощи анионного об мена.

- 232 017765

Хроматография:

стандарту.

1 500мМИаОАс	Время
2 400μΜΝηΟΗ 3 Очищенная вода.	(мин)	%1	%2	%3
	Начальное	0	50-35	50-65
	0.0	0	50-35	50-65
	1.0	0	50-35	50-65
	2.0	4	50-40	46-56
	60.0	45	50	5
	61.0	0	50	50
	80.0	0	50	50

Время

Интег.

Диапазон

ЗОмкл

Начало

Конец емпература автосэмплера

Объем вводимого вещества

Время процесса окружающей среды (22-25 С) мл/мин

Настоики детектора ЕО40

Режим

Приложенные потенциалы

Примерное удержание.

Стандарту Соответствия Системы (ССС)

Нулевая позиция =5% от полного объема

Полное напряжение =

Время подъема =

Полярность =

Градиентная программа.

*Второе значение для некоторых градиентных шагов обозначает экстент, на который может быть изменено значение градиента, для того, чтобы время удержания соответствовало температура столба =

Мощность потока

Подвижная фаза и условия градиента.

Время (удержание; минут) соответственно

Результаты углеводного анализа образцов СТЬА4^А29¥Ы04Е-1§

33-43 мин.

могут быть представлены, как на фиг. 47. Время удержания в каждом домене, как показано на фиг. 47, должно быть примерно:

Домен 1 (Пики 1А,1В, 1С,Ю и 1Е) 10-17 мин.

Домен 2 21-29 мин.

Домен 3

Домен 4 48-56 мин.

Значения времени удержания зависят от системы и должны меняться так же, как и стахиоза.

Вычисления.

Теоретические тарелки (Ν). Количество теоретических тарелок может быть определено при помощи приведенной ниже формулы с использованием значения пика стахиозы. Это делается в системе анализа данных МШеппшт, но может быть проделано и вручную.

Ν= 16 (1А¥)² где 1 - время удержания, измеренное от времени инъекции до времени пика элюирования на максимальной высоте;

- ширина пика, измеренная путем экстраполяции сторон к линии основания;

N должно быть >6000. Если количество тарелок меньше 6000, необходимо заменить колонку.

Коэффициент размывания (Т): коэффициент размывания колонки (Т) может быть вычислен при по

- 233 017765 мощи приведенной ниже формулы с использованием значения пика стахиозы. Это делается в системе анализа данных МШеппшт, но может быть проделано и вручную.

Т=0¥о.о5/2Г) где А₀.₀₅ - ширина пика на высоте 5% от общей высоты;

£ - ширина, измеренная от переднего края пика на высоте 5% от общей до середины пика на максимальной высоте.

Т должно быть <1.2. Если Т больше 1.2, необходимо заменить буфер или изменить его состав, возможно, также нужно заменить колонку или прочистить ее.

% Площади домена.

Домен 1. Сумма пиковых площадей при примерном времени удержания 10-15 мин (пики 1А-1Е; см. фиг. 47).

Домен 2. Сумма пиков на 21-27 мин.

Домен 3. Сумма пиков на 34-40 мин.

Домен 4. Сумма пиков на 45-56 мин.

Относительная площадь домена (%) = (Площадь конкретного домена)/(сумму площадей всех доменов) х 100 %

Относительная площадь главного пика: относительная площадь главного пика для 5-ти основных пиков может быть вычислена при помощи формулы, представленной ниже. Пики 1А, 1В, 1С, 2 (не структурированный), 3 (не структурированный) и 4.

Относительная площадь пика = (площадь конкретного пика)/(сумма всех площадей доменов)х100%.

Пример 38. Капиллярный электрофорез для определения СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд в лекарственных веще ствах и препаратах.

СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд - это растворимый в воде гликопротеин с иммуноподавляющей активностью. Метод КЭ использует непокрытые капилляры из плавленого кварца. Для этого образцы нагреваются в течение 5 мин при температуре 70°С и затем немедленно анализируются при помощи УФ-излучения при 214 нм для подтверждения идентификации.

Дополнительно смесь СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд и СТ^А4-Iд в соотношении 1:1 была введена для подтверждения того, что оба эти протеина могут быть разделены и идентифицированы. Этот метод позволяет отличить СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд от СТ^А4-Iд путем сравнения времени миграции.

Оборудование (может быть заменено на другое соответствующее)

Прибор для КЭ

Тип детектора

Капилляры

Устройство управляющее окнами в капиллярах.

Вескшап Р/АСЕ Μϋζ)

УФ на 214 нм.

Ро1уппсго Тес1шо1о§1е8 1пс, (внешний диаметр 360 мм, внутренний 75 мм. (# 2000019, Т8Р075375)

ΜίοΌδοΙνε Тескпо1о§у (№ 07200-8)

Реагенты и растворы: активный буфер (14.4 мМ бората натрия, 17.3 мМ додесульфата натрия, 2.0% ацетонитрила); фосфатный дилюционный буфер (22.3 мМ двуосновного фосфата натрия; 4.2 мМ одноосновного фосфата натрия; 53.4 мМ хлорида натрия); дилюционный боратный буфер (85.5 мМ NаВΟ₂, рН 9.6); рабочий раствор образца (10±1 мг/мл образца в фосфатном дилюционном буфере); раствор образца для тестирования (10.0 мкл образца+50 мкл дилюционного боратного буфера); смесь СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд и СТ^А4-Iд с отношении 1:1 (10 мкл СТ^А4-Iд и 10 мкл СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд + 50 мкл боратного дилюционного буфера).

Условия проведения.

Длина волн УФ детектора

Скорость передачи данных

Пиковая ширина(в точках)

Введение

Общая длина*

214 нм

Гц

16-25 с (0.5 фунт/кв.дюйм) ~ 60 см

Рабочая длина капилляра**

Температура картриджа капилляра

Напряжение

Время проведения см

15°С кВ-23кВ мин * Общая длина: от входа капилляра до выхода.

** Рабочая длина: от входа капилляра до измерительного окна.

- 234 017765

Время миграции образца υΓΕΛ4-Ι§ главного пика - примерно 11.0±0.4 мин. Время миграции образца СТ^А4^{А29Υ^104Н}-Iд главного пика - примерно 12.0±0.4 мин. Время миграции главного пика двух образцов должно отличаться по крайней мере на 0.6 мин (фиг. 48).

Пример 39. Гидролиз и ВЭЖХ определения наличия №ацетилнейраминовой кислоты и N гликольнейраминовой кислоты в СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд.

Степень сиалирования рекомбинантных белков может повлиять на их фармакокинетические свойства и клиренс. СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд - это рекомбинантный белок, содержащий N и О связанные углеводные участки. Гликаны, находящиеся на этих участках, обладают разной степенью сиалирования. Кроме структурной гетерогенности каждого сиалирования содержание каждой сиаловой кислоты может отличаться от партии к партии. Общее соотношение сиаловых кислот в протеине необходимо измерять.

Было протестировано содержание №ацетилнейраминовой кислоты (АНК) и N гликольнейраминовой кислоты (ГНК) в СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Сиаловые кислоты были высвобождены из протеина путем кислотного гидролиза и помечены флюоресцентной меткой при помощи ЭМВ. Меченые сиаловые кислоты были разделены на установке КР-НРЬС С-18 и подвергнуты количественному анализу на основании фактора ответной реакции конкурирующих сиаловых кислот. Данные анализа (молярное соотношение АНК или ГНК к протеину) уточнены в соответствии с данным методом. Этот пример описывает метод, использованный для определения количества АНК и ГНК в СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд. Силовые кислоты были высвобождены из протеина путем кислотного гидролиза. Освобожденные АНК и ГНК были затем флюоресцентно помечены при помощи 1,2-диамино-4,5-метилоксибензина (ДМБ). Маркированные сиаловые кислоты были разделены на КР-НРЬС С-18 и подвергнуты флюоресцентной детекции (Ех=373 нм, Ет=448 нм). АПК и ГНК подвергнуты количественному анализу на основании факторов конкурирующих кислот АПК и ГНК. Результаты теста представлены в виде молярного соотношения (МС) АПК и ГНК к белку.

Реагенты и растворы: 1.0 моль Н₂80₄ и 50 мМ Н₂80; флюоресцентная метка (18 мМ) гидросульфит натрия (№₂8₂0₄), 7% 2-меркаптоэтанол, 7 мМ ДМБ, активный буфер для подвижной фазы А (20% метанол), буфер для подвижной фазы В (70% метанол), стандартный раствор АПК (1 мг/мл), стандартный раствор ГНК (1 мг/мл), стандарт системного соответствия (50 мкл АПК или ГНК в 900 мкл воды), растворы образцов (например, 2 мг/мл СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд), стандартный рабочий раствор АПК (50 мкг/мл), стандартный рабочий раствор ГНК (50 мкг/мл).

Гидролиз: 20 мкл АНК стандарта, ГНК стандарта и СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд и раствора ССС были помещены в отдельные микроцентрифужные пробирки, объемом 1.5 мл, и в каждый сосуд было добавлено 200 мкл серно-кислого раствора (50 мМ). Все реагенты перемешивали и инкубировали при 80ЕС на 1 ч и 5 мин. После завершения гидролиза все образцы были сразу же отцентрифугировали.

Флюоресцентное мечение: флюоресцентная метка (200 мкл) добавлялась в каждый образец и растворялась. Затем образцы инкубировали в темноте при 80ЕС на 45 мин и постепенно охлаждали.

- 235 017765

Инструменты и условия хроматографии (Инструменты могут быть заменены на аналогичные)

Трехкомпонентная насосная система

Неи4е11 Раскате! модель 1090

КР-НРЬС С-18 4.6 х 50 мм, 3 μ

Чопез СНгото§гарЬу (Каталог №

4М5313)

Детектор флюоресцентного излучения

Автосэмплер

Ηεννίεΐί Раскате! модель

1046 А

Неу/1ей Раскагй модель

1090 (с охладителем до 4°С)

Система интеграции

УСг/МиШсЬгот

Прибор для ВЭЖХ (серия ϋθδ)

Ηεχνίεΐΐ Раскате!

Параметры хроматографии

Мощность потока

Подвижная фаза А

Подвижная фаза В

1.0 мл/мин % МеОН/вода

70% МеОН/вода

Линейный градиент:

Время	%А	%В
0.01	98	2.0
1.0	98	2.0
4.0	90	1.0
4.01	98	2.0
6.00	98	2.0

Объем загрузки

Время проведения

Температура столба

Время удержания (АНК)

Время удержания (ГНК) Давление макс.

Длина волн при возбуждении Длина волн при выбросе Уровень РМТ мкл.

мин. комнатная

3.1 А 0.5 мин.

2.3 А 0.5 мин.

300 бар.

373 нм.

448 нм.

Система для ВЭЖХ разделительный модуль ДУа1ег8 2690/2695 или его аналог.

Детектор флюоресцентного излучения: многоволновой детектор флюоресцентного излучения ХУа1ег8 2475 или его аналог.

Система сбора данных У/а!ет8 МШеппшш 32 или Етрохуег/

Столб Ьипа 5 μ, С 18,100 А, 150x4.6 мм, РЬепотепех (№ 00Е-4252Е0)

Цифровой нагревательный блок

У/УК (№ 13259-056) или его эквивалент.

Мини центрифуга

Подвижная фаза А

Подвижная фаза В

Мощность потока

Объем инъекции

Время проведения

Температура столба

Длина волн при возбуждении

Длина волн при выбросе Уровень

Элюционный градиент

М/УК (№ модели С-1200) или ее эквивалент.

% МеОН/90% воды % МеОН/30 % воды мл/мин мл мин.

Комнатная

373 нм.

448 нм.

Время	Мощность потока	%А	%В	Кривая
Начало	1.0	85.0	15.0	*
20.00	1.0	85.0	15.0	6
20.50	1.0	0.0	100.0	6
25.00	1.0	0.0	100.0	6
25.50	1.0	85.0	15.0	6
30.00	1.0	85.0	15.0	6
35.00	0.05	0.0	100.0	11

Приготовление стандартов сиаловых кислот (примерно 5 мМ). АНК (молярная масса=309) стандарт (примерно 5 мМ). Необходимо аккуратно взвесить 154.5±1.0 мг АНК в мерной колбе объемом 100 мл. Долейте дистиллированной воды до полного объема, тщательно перемешайте и распределите по криогенным пробиркам объемом 2 мл.

- 236 017765

Сопс (мМ) = (У/Т(мг) * Р)/(309.3*100(мл))

Р = чистая АНК от Уепбог СОА ( 99%=0.99)

ГНК (молярная масса=325.7) Взвесить 8.0±1.0 мг ГНК в мерной колбе объемом 100 мл. Долить дистиллированную воду до полного объема, тщательно перемешать и распределить по криогенным пробиркам объемом 2 мл.

Сопс (мМ) = (Жмг)*Р)/( 325.7* 100(мл))

Р = чистая ГНК Уепбог СОА ( 99%=0.99).

Стандарты сиаловых кислот можно хранить при -20°С в течение 6 месяцев.

Приготовления стандарта смеси сиаловых кислот. Стандартная смесь сиаловых кислот для количественного анализа и соответствия системы (50 мМ АНК, 1 мМ ГНК).

Добавьте 1 мл АНК (5 мМ), 400 мкл ГНК (0.25 мМ) в мерную колбу объемом 100 мл. Добавить дистиллированную воду до полного объема и перемешать. Распределить смесь по криогенным пробиркам объемом 2 мл. Эту смесь можно хранить до 6 месяцев при температуре -20°С.

Приготовление образцов и исходных материалов. Разморозить образец белка при температуре 28°С, хорошо перемешать. Разведите как образцы, так и исходные материалы до концентрации примерно 0.5 мг/мл (например, если начальная концентрация белка 25.0 мг/мл, добавьте 50 мкл протеина к 2450 мкл воды). Разведенные образцы и исходные материалы затем центрифугируют в течение 5 мин при скорости 10000 об/мин, для того чтобы удалить примеси.

Гидролиз. Слепой опыт: в микроцентрифужные пробирки (2.0 мл) добавить 50 мкл дистиллированной воды и 200 мкл серной кислоты (50 мМ). Это холостая проба. Стандарт сиаловых кислот для количественного анализа и соответствия системы. В микроцентрифужные пробирки (2.0 мл) добавляется 50 мкл стандартной смеси сиаловых кислот и 200 мкл серной кислоты (50 мМ). Необходимо приготовить два таких образца и обозначить как обр. 1 и обр. 2.

Исходный материал: в микроцентрифужные пробирки (2.0 мл) добавить 50 мкл разведенного СТГА4^{А29¥Е104Е}-1д исходного материала (0.5 мг/мл) и 200 мкл серной кислоты (50 мМ). Приготовить 2 таких образца, обозначить как пр.1 и пр.2. Тестовые образцы. В микроцентрифужную пробирку (2.0 мл) добавить 50 мкл разведенного СТГА4^{А29¥Е104Е}-1д лекарственного вещества (05 мг/мл) и 200 мкл серной кислоты. Приготовить несколько образцов. Обозначить как С1-1, С1-2, С2-1 и т.д. Перемешивать на вортексе 5 с и отцентрифугировать 5-10 с. Поместить образцы в нагревательный блок и инкубировать при 80±5°С в течение 55-65 мин. Дать гидролизованным образцам остыть до комнатной температуры. Далее центрифугировать образцы в течение примерно 10 с на большой скорости для стимуляции конденсата.

Дериватизация. Разогреть нагревательный блок до 80±5°С. Добавить 200 мкл флюоресцентной метки к каждому образцу, подвергнутому гидролизу. Перемешивать на вортексе 5 с и центрифугировать 10 с. Поместить образцы в нагревательный блок (после того, как его температура достигнет 80±5°С) на 3545 мин. Покрыть нагревательный блок алюминиевой фольгой, так как метка чувствительна к свету.

Дериватизированные образцы охладить до комнатной температуры. Перемешать на вортексе и отцентрифугировать в течение

Приготовления к введению образцов. Перед анализом убедитесь, что колонка уравновешена подвижной фазой. Перелейте соответствующее количество (100-200 мкл) образца из каждой микроцентрифужной пробирки в сосуд автосэмплера. Обычная загрузка автосэмлера на 10 введений выглядит следующим образом:

Обр. 1 и Обр. 2 - препараты стандартной смеси сиаловых кислот;

Пр. 1 и Пр. 2 - препараты контрольных образцов;

С - это введения образца.

Первые 4 (образцы 2 и 3) стандарта сиаловой кислоты будут использованы для определения соот

- 237 017765 ветствия системы. Четыре введения образца номер 3 (Обр.1) и образца номер 4 (Обр. 2) будут использованы для расчетов. Для получения дополнительных образцов для введения можно повторить загрузку с 5-го по 16-й образец.

Система соответствия. Хроматографический анализ образцов для определения соответствия системы показан на фиг. 49. Для первого введения стандарта системы соответствия разрешение и8Р для АНК и ГНК должно быть >1.5. Четыре введения стандарта соответствия системы должны отвечать следующим требованиям: ОСО для пиковой площади АНК должно быть <5%. ОСО для пиковой площади ГНК должно быть <10%. Время миграции для пика ГНК должно быть 11.3±2 мин. Время миграции для АНК должно быть 16.0±2.5 мин. ОСО пиковой площади 4 введений стандарта (Обр. 1, Обр. 3) и (Обр.2, Обр. 4) должно быть<10%. ОСО пиковой площади для всех стандартов из партии должно быть <15%.

Приготовления системы для ВЭЖХ. Столбы необходимо уравновесить 98% буфера А и 2% буфера 2 при мощности 1 мл/мин в течение 15 мин. Затем 10 мкл раствора соответствия системы, помеченного флюоресцентной меткой, добавить в аппарат. Пиковое разрешение и количество теоретических тарелок может быть высчитано по формуле:

К=2(Т2-Т1)/(А¥2+\¥1) где К - разрешение;

Т1 - время удержания ГНК;

Т2 - время удержания АНК;

- пиковая ширина по основанию у ГНК;

\\'2 - пиковая ширина по основанию у АНК.

Значение разрешения должно быть равно 1.5.

Количество теоретических тарелок может быть высчитано по следующей формуле:

Ν=16(Τ2Λ¥2)² где N - количество теоретических тарелок;

Т2 - время удержания АНК (мин);

\\'2 - пиковая ширина АНК по линии основания.

Количество теоретических тарелок должно быть 2000. Хроматограмма гидролиза СТРА4^{А29¥Е104Е}-1д должна соответствовать фиг. 49.

Образцы были проанализированы ВЭЖХ обратной фазы в следующем порядке: АНК и ГНК стандарты были введены первыми, затем ввели образцы, при необходимости с повторениями (например, СТРА4^{А29¥Е104Е}-1д). После анализа образцов столб был промыт мобильной фазой В в течение 20 мин при мощности 0.5 мл/мин. При необходимости столб можно перевернуть.

Определение молярного соотношения сиаловых кислот (АНК и ГНК) к протеину.

Молярное соотношение сиаловых кислот к протеину может быть вычислено при помощи программ МШеппшт или Етро^ег.

Коэффициент разбавления:

ϋ~(Vр_Г0(е)п+V\уа!ег)/ Урго1е1п где У_Рго1е;_п - объем исходного раствора протеина (мл);

\_АУ._1|ег - объем добавленной воды (мл).

Концентрация протеина в рабочем растворе (протеин, используемый для гидролиза) (мкМ)

Ср_ГО(ет= (Сд280)/(МУ/ СТЬА29УЫ0е)х(1А))х10⁶ где С_рго1е;_п - концентрация белка в рабочем растворе;

С_А280 - А280 концентрация белка в исходном растворе (мг/мл); М^_СТЬА29у_Ь10Е=молекулярная масса СТРА4^{А29¥Е104Е}-1д, равная 91232 Да.

Концентрация сиаловых кислот в рабочем растворе белка (мкМ)

Сипкпо\уп⁼С₅1с1 X (А_и/А₅ц)) где С_ипкпо^_п - концентрация сиаловых кислот (АНК и ГНК) в неизвестном образце; С_з1а - концентрация сиаловых кислот (АНК и ГНК) в стандарте;

А_и - пиковая площадь сиаловых кислот (АНК И ГНК) в неизвестном образце;

А_зй - пиковая площадь сиаловых кислот (АНК И ГНК) в стандарте.

Молярное соотношение (МС) сиаловых кислот к белку:

МС = Сипкпои/п/Сргогет

Вычисление общего молярного соотношения сиаловых кислот к белку (ОМС)

ОМС = МС (АНК) +МС (ГНК)

Относительное стандартное отклонение (ОСО) в расчетах площади для двух образцов АНК должно быть <10%. Для ГНК также <10%. ОСО в расчетах площади для двух независимых гидролизатов должно быть <10%.

В одной партии среднее молярное соотношение сиаловых кислот в СТРА4^{А29¥Е104Е}-1д должно варьироваться в пределах, показанных в таблице ниже.

- 238 017765

Молярное соотношение материала СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд.

Моносахарид	Пределы значений
АНК	5.0-10.0
ГНК	<1.5

Процент отклонения для молярного соотношения сиаловых кислот в исходных материала и образцах для приготовления двух образцов должен быть <15, <20, <25, <30 или <35%.

Пример 40. Биотестирование СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд ш уВго.

Т-клетки требуют двух сигналов для активации и последующей пролиферации. Первый сигнал обеспечивается взаимодействием антигенного пептида с комплексом ТСК-СБ3. Второй костимулирующий сигнал происходит при взаимодействии СБ28 Т-клетки и белка В7 (СБ80/86) на антигенпредставляющей клетке. При получении этих сигналов Т-клетка выделяет цитокин ИЛ-2 (интерлейкин 2). Выработка ИЛ-2 ведет к активации и полиферации клеток. СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд - это растворимое соединение, обладающее иммуносупрессирущей активностью, также связывается с белком В7 на антигенпредставляющей клетке, блокируя, таким образом, взаимодействие с СБ28 и предотвращая возникновение костимулирующего сигнала, который необходим для синтеза ИЛ-2.

В этом методе Т-клетки линии 1игка!, трансфицированные геном люциферазы под контролем промотора ИЛ-2, костимулируются В-клетками Баик1 в присутствии анти-СБ. Взаимодействие костимулирующих молекул активирует промотор ИЛ-2, который, в свою очередь, запускает продукцию белка люциферазы. Результирующий люминесцентный сигнал измеряется при помощи системы анализа люциферазы. Она основана на том, что активность люциферазы напрямую зависит от дозы СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд.

Этот метод исследует действие СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд на костимулирующий сигнал, необходимый для продукции ИЛ-2. Присутствие растворимого СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд препятствует обмену сигналами между Тклеткой и антигенпредставляющей клеткой. Без этого сигнала ИЛ-2 не вырабатывается, что соответственно препятствует клональной экспансии Т-клеток. Был создан вектор для переноса гена люциферазы с использованием промотора ИЛ-2. Далее Т-клетки линии 1игка! были трансфицированы с помощью этого вектора. В этом методе был отобран и использован позитивный клон ЗигкаТСА.

Данный биологический тест включает в себя стимуляцию трансфицированных Т-клеток линии 1игка! анти-СБ3 антителами и В-лимфоцитами (Баик1). Костимуляционный сигнал, обеспеченный Вклетками, подавляется СТ^Λ4^{А29У^104Ε}-Iд. Клетки 1игка! и клетки Баик1 помещаются в 96-луночный, белый непрозрачный планшет с плоским дном и стимулируются при помощи анти-СБ3 в присутствии различных концентраций СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд. После инкубации (от 16 до 20 ч) при температуре 37°С лунки тестируются на люциферазную активность. Подавление костимуляции можно определить по тому, как понижается люциферазная активность с повышением дозы СТ^Λ4^{Λ29У^104Ε}-Iд.

Реагенты: культура клеток Баик1 (10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)), 1% МΕМ пирувата натрия в ΚΡМI-1640; культура клеток 1игка! (10% ЭТС, 1% МΕМ пирувата натрия, 400 мкг/мл генетицина ΚΡМI-1640); среда для биотестирования (0.2 мкг/мл анти-СБ3 антител и 1% раствор пенициллина-стрептомицина в культуральной среде для клеток Баикг Раствор ярко-люминесцирующей люциферазы (Вп§Ы-С1о ЬисПегазе δο1и1^οπ) для тестирующих систем (Ρι-отеда, № Е2620).

Инструментарий: №коп, зеркальный микроскоп Б1арЕо! 200, измеритель люминесцентного излучения Ρаска^к ТорСоип! NXТ, устройство подачи жидкости Тесап Сепе§18; цитомер /утагк Κар^кΡ1а1е-96.

- 239 017765

Процедура.

логического тестирования.

Культурная среда для клеток ИаиЛ. Добавить 300 мл КРМI 1640 в фильтр объемом 1 л, затем добавить 100 мл ЭТС и 10 мл МЕМ пирувата натрия. Довести КРМI 1640 до полного объема (1 л). Профильтровать и хранить при температуре 4°С в течение месяца.

Культурная среда для клеток 1игка1. Добавить 300 мл КРМI 1640 в фильтр объемом 1 л, затем добавить 100 мл ЭТС, 10 мл МЕМ пирувата натрия, 8 мл генетицина при 50 мг/мл (итоговая концентрация 400 мкг/мл). Довести КРМI 1640 до полного объема (1 л). Профильтровать и хранить при температуре 4°С в течение месяца.

Среда для биологического тестирования. Поместить 100 мл среды для клеток ИаиЛ (2.1) в бутылку для среды объемом 100 мл. Затем добавить анти-СИ3 антитела в концентрации 0.2 мг/мл и 1 мл раствора пенициллин-стрептомицина (1.1). Перемешать и хранить при комнатной температуре не более 8 ч.

Ярко-люминесцирующий раствор люциферазы. Приготовьте раствор, как описано в системе (1.21), добавив тестовый буфер к субстрату люциферазы, и перемешайте вращением. Этот реагент необходимо использовать в течение 2 ч или хранить в темноте при температуре - 20°С до 4 недель.

Поддержание клеточной линии. Определите количество клеток на 1 мл для линий клеток ИаиЛ и 1игка1, посчитав клетки на счетчике клеток. Это количество должно варьироваться между 1 х 10⁵ и 1.5 х 10⁶ клеток на 1 мл. Поместите вместе 12х 10⁶ клеток ИаиЛ и 12х 10⁶ клеток 1игка1 в стерильной центрифужной пробирке. Центрифугируйте клетки при ~125д в течение 10 мин при комнатной температуре. Тщательно ресуспендируйте клетки серологической пипеткой в 9 мл среды для клеток ИаиЛ (2.1), до тех пор пока не исчезнут видимые конгламераты клеток, для достижения концентрации 2.7х10⁶ клеток в 1 мл. Убедитесь в этом при помощи счетчика клеток. Поместите ресуспендированные клетки в лунки планшета (1.3) в количестве 75 мкл на лунку (200 тысяч клеток на лунку). Инкубируйте плашку в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и влажности 85%, пока стандарты, образцы и контрольные образцы не будут готовы. Приготовление препаратов номинальной концентрации СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд для стандартов, образцов и контрольных образцов. Приготовьте 3 мл материала рабочего раствора СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд при 5000 нг/мл в биосреде (2.3) для использования в стандартной кривой. Приготовьте 3 мл материала рабочего раствора СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд при 5000 нг/мл в биосреде (2.3) для использования в кривой контроля. Приготовьте 3 мл каждого из двух рабочих растворов образца СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд при 5000 нг/мл для использования в кривых образцов (примерная концентрация образцов СТ^Л4^{Л29Υ^104Е}-Iд может быть использована для подготовки 8 точеных кривых, и значения относительной мощности могут быть скорректированы, как описано в пункте 5.5, когда значения концентраций будут доступны).

- 240 017765

Восемь точечных кривых были построены для стандарта, образца и контрольного образца при концентрациях 5000, 200, 100, 50, 25, 10, 5 и 0.1 нг/мл СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд, как показано в табл. 55 ниже, для конечной концентрации в анализе после двойного растворения в лунках 2500, 100, 50, 25, 12.5, 5, 2.5 и 0.05 нг/мл.

Таблица 55 Разведения, использованные для создания стандартных кривых

Можно использовать две схемы процесса. Рандомизированная схема требует использования устройства подачи жидкости. Обычная схема имеет трипликаты, и каждая точка кривой добавляется в соответствующем порядке. Для тестирования по рандомизированной схеме необходимо поместить 75 мкл каждого раствора (4.8) в подходящую лунку и с клетками (4.5), как показано на схеме ниже. Для стандартной схемы необходимо поместить 75 мкл каждого раствора (4.8) в соответствующую лунку с клетками, как показано на схеме внизу.

Закройте планшеты с помощью Тор8еа1-А (1.22). Убедитесь, что все герметично и нет отверстий. Инкубируйте плашки при температуре 37°С, 5% СО₂ и влажности 85% от 16 до 20 ч. Нагрейте плашки и раствор люцеферазы (2.4) до одинаковой рабочей температуры. Добавьте 150 мкл раствора люциферазы одновременно в каждую лунку и перемешайте. После перемешивания сразу же поместите плашку в ТорСоип1 NXТ для уравновешивания в темноте в течение 10 мин. Измерьте люминесцентный сигнал в ТорСоип1 NXТ, используя интеграцию в 1 с на лунку или другую, соответственно типу измерителя. Выход из ТорСоип! NXТ фиксируется. При использовании стандартной схемы используются данные с 2-х плашек. Первая будет тестирована по образцу из лунки (А1) верхнего левого угла. Вторая (А1) из нижнего правого.

Схема рандомизированного тестирования

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
А	ко	Обр!	Стнд	Стад	КО	Стад	Стнд	Обр2	Обр2	Стад	Обр1	Стнд
	0,05	12.5	0.05	2500	12.5	100	5	5	12.5	2.5	12.5	25
В	Стад.	Обр2	Обр!	Обр!	Обр1	КО	Стнд	КО	Обр1	КО	КО	Обр2
5	25	5	0.05	12.5	2,5	0.05	2500	25	25	5	100
с	ОбР2	Стад	КО 5	Стнд	КО	КО 5	Обр2	Обр]	КО_	Обр!	КО	Стнд
	5	100		2.5	0.05		100	_	100	100	50	5
ϋ	Обр1	Обр2	Обр!	КО	Обр!	Обр2	Обр]	Стнд	Обр2	КО	Стад.	Обр]
100	12.3	50	50	2500	2500	2.5	25	5	2500	100	50
Е	КО	Обр2	КО	Обр2	Обр2	Обр2	Стад	Обр!	Обр!	Обр!	Обр1	Обр2
100	100	25	2500	12,5	50	2500	25	5	2.5	0,05	2.5 ...
Г	ко	Стад	Обр1	Стнд	Стад	Обр]	Стнд	Обр2	Обр2	Стад	КО	Обр2
	2500	12,5	2.5	25	12.5	5	25	2ί	0.05	2500	2.5	50
С	КО	Обр2	Обр2	Обр]	Обр2	КО	Обр1	КО	Стнд	КО	Обр]	Обр2
2.5	50	0,05	25	0.05	50	100	100	О.О5	0.05	25 00	2500
	Стнд	Обр!	Обр2	КО	КО	Обр2	Обр1	Стнд	Стнд	КО	Обр2	Стад
н	50	2500	2.5	12.5	25	25	50	80	50	12.5	25	12,5

Стнд: стандарт от 2500 до 0.05 нг/мл (конечная концентрация в лунке);

КО: контрольный образец 2500 до 0.05 нг/мл (конечная концентрация в лунке);

Обр.1 и Обр.2: образцы 1 и 2 от 2500 до 0.05 нг/мл (конечная концентрация в лунке).

- 241 017765

Схема стандартного тестирования

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	И	12
А	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд
2500	2500	2500	100	100	100	50	50	50	25	25	25
В	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд	Стнд
12,5	12.5	12.5	5	5	5	2.5	2.5	2.5	0.05	0.05	0.05
С	КО	ко	КО	КО	КО	КО	КО	КО	КО	КО	КО	КО
2500	2500	2500	100	100	100	50	50	50	25	25	25
ϋ	КО	КО	КО	ко	ко	ко	КО	КО	КО	КО	КО	КО
12.5	12.5	12.5	5	5	5	2.5	25	2.5	0.05	0.05	0.05
Е	Обр!	Обр1	Обр1	Обр!	Обр!	Обр!	Обр I	Обр1	Обр!	Обр!	Обр!	Обр1
2500	2500	2500	100	100	100	50	50	50	25	25	25
Г	Обр1 12.5	Обр! 12.5	Обр1 12.5	Обр! 5	Обр] 5	Обр! 5	Обр! 2.5	Обр] 2.5	Обр! 2.5	Обр] 0.05	Обр! 0.05	Обр! 0.05
С	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2
2500	2500	250Ю	100	100	100	50	50	50	25	25	25
Н	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр2	Обр!	Обр2	Обр!	Обр2	Обр2	Обр2
12.5	12.5	12.5	5	5	5	2.5	2.5	2.5	0.05	0.05	0.05

Стнд: стандарт от 2500 до 0.05 нг/мл (конечная концентрация в лунке);

КО: контрольный образец от 2500 до 0.05 нг/мл (конечная концентрация в лунке); Обр. 1 и Обр.2: образцы 1 и 2 от 2500 до 0.05 нг/мл (конечная концентрация в лунке).

200 тысяч клеток были добавлены в каждую из 96 лунок и инкубировались при температуре 37°С, 5% СО₂ и влажности 85%. 12x106 клеток ,1нгка1 и 12x106 клеток 1)анс11 были помещены в стерильную центрифужную пробирку. Их центрифугировали при 125xд в течение 10 мин при комнатной температуре, и потом они были заново ресуспендированы в 9 мл среды для клеток 1)анс11 серологической пипеткой, до полного исчезновения видимых клеточных конгламератов, для достижения концентрации 2.7x106 клеток/мл. 75 мкл каждого раствора из табл. 55 были добавлены в соответствующую лунку планшета, содержащую клетки. Затем планшет закрыли при помощи ТорЗеа1-А и инкубировали при температуре 37°С, 5% СО₂ и влажности 85% в течение 16-20 ч. После этого плашки и раствор люциферазы были нагреты до одинаковой рабочей температуры, 150 мкл люминесцентного раствора люциферазы были добавлены в каждую лунку одновременно и перемешаны. Сразу же после этого плашка была помещена в ТорСонп! NXТ для уравновешивания в темноте в течение 10 мин. Люминесцентный сигнал был затем измерен, используя интеграцию в 1 с на лунку или другое значение, соответствующее типу оборудова ния.

Все данные на выходе из ТорСонп! NXТ были зафиксированы и применены по программе стандартного анализа, затем они были преобразованы с помощью логарифмов (база 10). Преобразованные данные из каждого анализа были введены в логистическую модель с 4-мя переменными, как показано ниже в формуле 1.

Формула 1:

Ьо£₁₀(У*)=О+(А-П)/(1 +(_Х1/С)^в) где А - верхнее положение кривой;

Ώ - нижнее положение кривой;

В - угловой коэффициент;

С - это концентрация, которая дает эффект, равный среднему арифметическому А и В.

Коэффициент детерминированности (К²) и Р-критерий могут быть посчитаны для каждого эксперимента. Также можно посчитать соотношения минимума, максимума и углового коэффициента к стандартному материалу. В дополнение можно вычислить и дополнительные интервалы.

Относительная активность каждого образца может быть определена с помощью одной формулы, в которую вводятся данные соответствующего теста и данные контрольного теста.

Т^7^=О+Э-ПИ7+(хг/(С_а*(С_к/Са)^,))^В) где А, В и I) - параметры являются общими как для исследуемого теста, так и для контрольного;

С_К - параметр контрольного теста;

С_А - исследуемого теста;

соотношение С_К/С_А - относительная активность;

индекс I - индикатор, который может варьироваться. Он устанавливается как равный 1, если данные из исследуемого теста, и как 0, если из стандартного материала.

Относительная активность каждого образца выражалась в процентах и фиксировалась как значение выхода из программы.

Выверка значений относительной мощности, полученных при примерных данных концентрации. Из-за временного промежутка между получением образца и получением точных данных о концентрации белка образцы могут быть протестированы с примерным значением концентрации, и полученные данные могут быть выверены после получения точных данных. Эта выверка производится с применением формулы 2, показанной ниже, где относительная активность, определенная при тестировании, умножается на соотношение концентрации СТЬА4^{А29АЕ104Е}-1д, использованное при проведении теста, к полученной точной концентрации СТЬА4^{А29АЕ104Е}-1д в образце.

- 242 017765

Формула 2:

Регистрируемая относительная активность = (полученная относительная активность * значение концентрации, использованное при тестировании) / точное значение концентрации.

Пример.

Образец был протестирован с использованием значения концентрации 25 мг/мл.

Относительная активность была определена как 105%.

Точная концентрация, определенная позже, равна 25.5 мг/мл.

Регистрируемая относительная активность = (105х25)/25.5=103%.

Стандартный материал: значение ЕС₅₀ для выхода стандарта должно быть от 5 до 35 нг/мл. Разница между концентрациями 2500 нг/мл и 0.05 нг/мл должна быть >40.000 периодов в минуту. Коэффициент детерминированности должен быть больше 0.95.

Значения относительной активности образцов в табл. 9 должны быть между 25 и 175% от контрольного стандарта. Если значения не вписываются в эту область значений, то необходимо повысить или понизить концентрацию образцов и провести повторные анализы.

Линия В клеток Оаибт

Источник: клетки Иаиб1 были получены от АТСС. Был создан основной банк клеток, состоящий из 64 пробирок. Рабочий банк клеток получали после 4 пассажей из одной пробирки основного банка (примечание: размораживание считалось за нулевой пассаж, и затем проводили 3 дополнительных пассажа для получения рабочего банка клеток).

Среда: клетки Иаиб1 выращиваются в ΚΡМI 1640 (содержит НЕРЕЗ и Ь-глютамин) с добавлением 10% ЭТС и 1% пирувата натрия.

Условия инкубирования: клетки помещаются в вентилируемые культуральные Т-флаконы при температуре 37°С, 5% СО₂ и влажности 70-90%.

Размораживание: пробирку с клетками после хранения в камере с жидким азотом помещают в водяную баню при температуре 37°С. К содержимому добавляют 10 мл культуральной среды и перемешивают. Клетки считают и затем собирают при помощи центрифугирования при 125хд в течение 10 мин. После этого удаляется надосадочная жидкость, и клетки растворяются в свежей среде до 3х10⁵ жизнеспособных клеток/мл. Описанная процедура принимается за нулевой пассаж клеток.

Условия роста: клеточная линия растет в суспензии.

Субкультивирование: культуры поддерживаются пассажами дважды в неделю с перерывом не более 5 дней между пассажами. Клетки в концентрации от 0.5х10⁵ до 2х10⁵ жизнеспособных клеток в 1 мл помещают в вентилируемый культуральный Т-флакон со свежей средой. Плотность клеток не должна превышать 1.5х10⁶ на 1 мл. Жизнеспособность клеток должна быть больше 80%. Жизнеспособность определяется окрашиванием трипановым синим. Дата и номер пассажа должны быть написаны на Тфлаконе после проведения пассажа.

Время удвоения клеток в культуре варьирует от 18 до 26 ч.

Ограничения в пересевании клеток: клетки из рабочего банка должны пройти не мене 3-х пассажей, прежде чем их можно использовать в биологическом тестировании. Клетки должны оставаться в культуре не более чем на 20 пассажей. После этого необходимо разморозить новую пробирку для создания рабочего банка.

Замораживание клеток: концентрация замороженных клеток составляет от 5 до 10х10⁶ клеток в 1 мл в криопробирке. Криозащитная среда приготавливается путем добавления в культуральную среду 5% 1)\-1З(.) (диметилсульфоксида). Клетки замораживаются со шагом 1°С/мин, пока не достигнут температуры жидкого азота (приблизительно -190°С).

Т-клеточная линия ^и^каΐ.СΑ.

Источник: Т-клетки Зигка! были трансфицированы плазмидой, кодирующей молекулу СΤ^Α4-Iд. Рабочий банк клеток получали из пробирки основного банка клеток после 3 пассажей (примечание: размораживание считалось за нулевой пассаж, и затем проводили 2 дополнительных пассажа для получения рабочего банка клеток).

Т-клетки ^и^каΐ.СΑ росли в среде КРМЕ1640, содержащей НЕРЕЗ и Ь-глутамин, с добавлением 10% ЭТС и 1% пирувата натрия, и генетицина (сульфат О418) в конечной концентрации 400 мкг/мл.

Условия инкубирования: клетки помещали в вентилируемые культуральные Т-флаконы при температуре 37°С, 5% СО₂ и влажности 70-90%.

Размораживание: пробирку с клетками после хранения в камере с жидким азотом помещают в водяную баню при температуре 37°С. К содержимому добавляют 10 мл культуральной среды и перемешивают. Клетки считают и затем собирают при помощи центрифугирования при 125хд в течение 10 мин. После этого удаляется надосадочная жидкость и клетки растворяются в свежей среде до 3х10⁵ жизнеспособных клеток/мл. Описанная процедура принимается за нулевой пассаж клеток.

Условия роста: клеточная линия растет в суспензии.

- 243 017765

Субкультивирование: культуры поддерживаются пассажами дважды в неделю с перерывом не более 5 дней между пассажами. Клетки в концентрации от 0.5х10⁵ до 2х10⁵ жизнеспособных клеток в 1 мл помещают в вентилируемый культуральный Т-флакон со свежей средой. Плотность клеток не должна превышать 1.5х10⁶ на 1 мл. Жизнеспособность клеток должна быть больше 80%. Жизнеспособность определяется окрашиванием трипановым синим. Дата и номер пассажа должны быть написаны на Тфлаконе после проведения пассажа.

Время удвоения клеток в культуре варьирует от 18 до 26 ч.

Ограничения в пересевании клеток: клетки из рабочего банка должны пройти не менее 3-х пассажей, прежде чем их можно использовать в биологическом тестировании. Клетки должны оставаться в культуре не более чем на 20 пассажей. После этого необходимо разморозить новую пробирку для создания рабочего банка.

Замораживание клеток: концентрация замороженных клеток составляет от 5 до 10х10⁶ клеток в 1 мл в криопробирке. Криозащитная среда приготавливается путем добавления в культуральную среду 5% ЭМ80 (диметилсульфоксида). Клетки замораживаются со шагом 1°С/мин, пока не достигнут температуры жидкого азота (приблизительно -190°С).

Пример 41. Определение биоспецифического связывания СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд с рецептором ВТДпри помощи поверхностного плазмонного резонанса (В^соге).

Относительное связывание образцов СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд с рецептором ВТЛЛд измерялось при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора ШАсоге. В этом анализе СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд связывается с составным В7.1Л§ белком, полученным из белка В7.1, содержащегося в мембране антигенпрезентирующих клеток (АПК). После иммобилизации рецепторов В7ЛЛ§ в большой плотности на поверхности активированного сенсорного чипа, материал СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд, контрольные образцы и тестовые образцы были растворены для создания привязывающих сенсограмм. Начальная степень связывания (наклон)/единицу резонанса (ЕР), необходимую для иммобилизации поверхности В7.1была измерена в условиях ограниченной диффузии на поверхности В7ЛЛ§ с высокой плотностью. Начальная степень связывания в ЕР/с прямо соотносится с биоактивной концентрацией. Значение степени связывания образцов преобразовывается в значение активной концентрации при помощи стандартной кривой, где значение степени связывания изображается напротив значения концентрации. Конечные результаты изображаются в процентах связанных образцов по отношению к материалу СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд или как концентрация.

Реагенты: аминосвязывающий комплект ША Сегййеб (комплект содержит: 115 мг Νгидрооксисукцинимида (НГС), 750 мг 3-дихлорэтана (ДХЭ) и этаноламин); регенерационный буфер (10 мМ цитрат натрия, 100 мМ ИаС1, рН 4.0)

Измерительные приборы: прибор ШАсоге с РС совместимым компьютером (ШАсоге (№ ВК-110051)); В^соге С контрольная программа версия 1.0.2; ШАсоге расчетная программа, версия 1.0; 96-луночный планшет В^соге, И-образной формы (№ ВК-1005-03); ШАсоге герметизатор для фольги (№ ВК-1005-78).

Порядок действия.

- 244 017765

Материалы.

Сенсорный чип СМ5.

ЕМАсоге АВ ( Νο. ВК-1000-12)

В1Асоге руководство по применению

В1Асоге (Νο. ВК-1005-11)

Буфер ΒΙΑ (сертифицированный)

ВТАсоге (Νο. ВК1ОО1-88 )

ΒΙΑ нормализирующий раствор (40% раствор глицерола)

Сертифицированный аминосвязывающий комплект ВЕАсоге (Ио. ВИ-1000-50) ВВА 115 мг НГС и 750 мг ДХЭ

В1Асоге АВ (Νο. ВК-1002-22)

Хлорид натрия (№С1)

Ацетатный буфер рН 5.0

81§ша (Νο.8-9888)

В1Асоге (Νο. ВК-1003-51)

Цитрат натрия (СбНзМазО)

81§та (Νο. 8-4641)

Соляная кислота (НС1)

Р18йег 8с1еп1Жс (Νο. А144-212)

Установочный комплект ВЕАсоге

ВГАсоге (Νο. ВК-1006-67)

Реагенты.

Атте Со^Ип^ КН (Аминосвязывающий набор) ВЕА СеШйед (комплект содержит по одному флакону каждого реагента: 115 мг И-гидрооксисуцинимида (НГС), 750 мг 3-дихлорэтана (ДХЭ) и этаноламин). Необходимо распределить растворы согласно рекомендациям производителя и хранить, как указано ниже.

Аликвоты НГС 11.5 мг/мл хранятся при -20°С. Они могут храниться в течение 2 месяцев с момента приготовления. Аликвоты ДХЭ хранятся при температуре -20°С. Их срок годности так же составляет 2 месяца с момента приготовления. Аликвоты 1.0 М этаноламина-НС1 рН 8.5 хранятся при температуре -20°С, их срок годности составляет 2 месяца с момента приготовления.

Регенерационный буфер (10 мМ цитрата натрия, 100 мМ ИаС1, рН 4/0). Взвесьте на аналитических весах 1.5±0.1 г цитрата натрия и 2.9±0.1 г ИаС1. Добавьте их к 500 мл Милли^ воды и доведите рН до 4.0 раствором 1 N НС1. Профильтруйте раствор через фильтр (0.22 мкм) и распределите 500 мл раствора частями по 45 мл в конические трубки объемом 50 мл. Срок хранения этого раствора 6 месяцев при температуре 2-8°С.

Измерительные приборы

Прибор ВЬАсоге с РС совместимым компьютером

В1Асоге (№ ВК.-1100-51)

ВТАсоге С контрольная программа

Версия 1.0.2

В1Асоте расчетная программа

Версия 1.0

Измеритель рН

Οήοη, Мос1е1720А+

Приготовление сенсорного чипа. Вставьте новый сенсорный чип СМ5 в кассетное гнездо детекторного модуля прибора. Заправьте систему согласно руководству, используя сертифицированный буфер.

Работа прибора ВВАсоге С. Прибор ВВАсоге С управляется РС совместимым компьютером с операционной системой Мтсгозой ШшНо\\'Б с установленной ВВАсоге С контрольной программой. Для установки и использования прибора ЫАсоге С обратитесь к следующим руководствам: Ορе^айοη оГ ЫАсоге С Iη8ί^итеηί (работа прибора ЫАсоге С) и СаНЬгайоп апд Маш1епапсе оГ ЫАсоге С Iη8ί^итеηί (Установка и настройка ЫАсоге С).

Метод иммобилизации В7.1 Ι§.

Приготовление В7.1 Ι§. Пробирку, содержащую В7.1 Ι§, размораживали при температуре 22.5±5°С и разводили до концентрации, которая иммобилизирует 3000-9000 ЕР, в качестве растворителя использовался ацетат с рН 5.0 (10 мМ). Пробирки с НГС, ДХЭ и этаноламином из Атте Со^Ип^ КН также размораживали. Затем пробирки с реагентами и лигандом помещали в штатив для образцов, как предписано в программе, и в соответствии с инструкцией начинали иммобилизацию.

Приготовление стандартной кривой СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iβ.

Стандарты и образцы (например, СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iβ) размораживали при комнатной температуре. Стандарты, предназначенные для построения стандартной кривой, были разведены до необходимых концентраций (250, 500, 1000, 2000, 4000 и 8000 нг/мл).

Для разведения образца (например, раствора СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iβ для хранения) до концентрации 25 мг/мл необходимо провести следующие действия.

1. Развести до соотношения 1/50 (500 мкг/мл) добавлением 20 мкл образца к 980 мкл буфера.

2. Развести до соотношения 16 мкг/мл путем добавления 30 мкл раствора, полученного ранее, к

- 245 017765

908 мкл буфера.

3. Последовательно разводить (растворять) до концентрации 250 нг/мл (500 мкл раствора, полученного ранее +500 мкл буфера)

Каждый стандарт может быть поставлен в дупликатах, что даст 2 значения углового коэффициента.

Образцы контроля качества (контрольные образцы, КО).

КО СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д готовятся в стандартном буфере, в трех необходимых концентрациях 750, 2500 и 5000 нг/мл и замораживаются в 7-миллиметровых пластиковых сосудах при температуре -80°С, как аликвоты объемом 200 мкл. Концентрация СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д в КО определяется в трех независимых анализах концентрации, проводящихся с использованием данного метода. В этом эксперименте все добавленные КО должны соответствовать номинальной концентрации с разбросом (±) не более 20%. Приготовленные, измеренные и замороженные КО хранятся в течение 6 месяцев с момента приготовления. В день эксперимента необходимо разморозить по одной пробирке с каждым из КО, разморозить при комнатной температуре. Поместите КО на штатив для образцов, как описано в руководстве к данному методу, и проанализируйте каждый КО в трипликатах. Также КО могут быть приготовлены и непосредственно в день проведения анализа.

Тестовые образцы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

Образцы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д должны быть разбавлены до концентраций, требуемых для проведения анализа (от 750 до 5000 нг/мл). Образцы с примерно известной концентрацией должны быть растворены до концентрации 2000 нг/мл. После размораживания образцов при комнатной температуре их разводят до концентрации 2000 нг/мл в стандартном буфере. Растворы образцов могут быть приготовлены для анализа в полипропиленовой тестовой трубе (В1Асоге) или в плашке с 96-ю лунками. Далее представлен пример растворения тестового образца СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д.

После размораживания при комнатной температуре образцы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д разводили до концентраций, необходимых для проведения теста (в диапозоне от 750 до 5000 нг/мл). Образцы с известной концентрацией СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д должны быть разведены в стандартном буфере до концентрации 2000 нг/мл в полипропиленовой пробирке или в планшете.

Пример разведения образца СТБА4 (до концентрации 25 мг/мл).

1. Развести до соотношения 1/50 (500 мкг/мл) добавлением 20 мкл образца к 980 мкл буфера.

2. Развести до соотношения 1/25 (20 мкг/мл) добавлением 30 мкл раствора, полученного ранее к 720 мкг стандартного буфера.

3. Развести до соотношения 1/10 (2 мкг/мл) путем добавления 100 мкл раствора, полученного ранее к 900 мкл стандартного буфера.

Перемешайте растворы на вортексе с умеренной скоростью в течение 2-4 с. Все образцы готовятся в трех экземплярах (три отдельных разведения, приготовленные из исходного раствора) и каждый раствор анализируется при одном вводе.

Начало анализа с использованием В1АСОКЕ с программы. Открыть программу выбрать в меню ЕПе-Рго)ес1-РиЫ|з11е0-8164-2-Сопсеп1га1юп Апа1уз1 \У|/агД кликните №х1 и выберите шаблон для анализа, например анализ концентрации СТЬА4^{А29¥Е104Е} в образце. Введите максимальное количество образцов, которое планируется в этом анализе. Это количество включает в себя и копии, т.е. если необходимо проанализировать 8 образцов в трипликатах, то необходимо ввести число 24. Выберете проточную кювету (1-4), в которой В7.1 1д лиганд был иммобилизирован.

Кликните на №х1 и введите обозначения образцов, их факторы растворения и количество копий. Нажмите №х1 и проверьте расположение сосудов. В этот момент сосуды можно поместить так, как необходимо. Нажмите Ыех1 и подтвердите все выбранные параметры на панели РгерагаИоп £ог Апа1уз1з. Нажмите №х1 для сворачивания. Поместите стандарты, КО, регенерирующий раствор и тестовые образцы в соответствующие позиции. Нажмите 81агГ' для начала анализа.

Обработка данных

Запустите программу В1Асоге С и откройте В1Асоге й1е***Ыг, который был создан. Затем выберите пункт \У|/аг4 КезиЙз из меню У|е\у для начала обработки полученных данных.

Примерные значения для поверхности В7-11д.

Масса В7-11д иммобилизированного на активированной проточной кювете была выражена в ЕР. Эта масса должна варьироваться в пределах от 3000 до 9000 ЕР для оптимальной эффективности теста. Если эта масса не попадает в данный диапазон, то можно подстроить время активации (введение стандартного буфера) или изменить концентрацию В7-11д и иммобилизировать другую проточную кювету.

Примерные значения для колебания базового уровня.

Колебания базового уровня для каждого эксперимента было посчитано как процентное изменение базового уровня относительно поверхностной массы лиганда между каждым циклом. Наибольшее колебание между любыми циклами должно быть <5%. Например, если базовый уровень в 20-м цикле = 13500 ЕР, в 23-м цикле = 13650 и плотность В7-11д на поверхности = 6000 ЕР, то смешение базового значения = (13650-13500)/6000х100 = 2.5%.

- 246 017765

Примерные значения для стандартов.

Примерные значения концентраций, применимые для стандартной кривой, составляют примерно 500 нг/мл и выше. Коэффициент вариации (%КВ) значений при каждом значении углового коэффициента и стандартной концентрации, использованный для построения стандартной кривой, должен варьироваться в пределах ±10%. Вычисленное значение концентрации (нг/мл) при каждой стандартной концентрации должно варьироваться в пределах 15% от номинального значения. Разницу между вычисленной концентрацией и номинальной концентрацией можно разделить на номинальную концентрацию и умножить на 100. Например, стандарт = 500нг/мл, концентрация, вычисленная при помощи В^зсоге С = 510 нг/мл. Процент отклонения высчитывается следующим образом:

(510 нг/мл-500 нг/мл)/500 нг/мл х100%=2.0%.

Примерные значения для КО: КВ (коэффициент вариации) для трех значений концентрации каждого КО должен варьироваться в пределах 10%. Результаты для КО должны варьироваться в пределах ±15% от их относительного номинального значения для по крайней мере 7 вычислений из 9. Различие в значении углового коэффициента между первым и последним введением при концентрации 2500 нг/мл должно быть ±5%. Например, если первый угловой коэффициент был 10.366 ЕР, а последний 10.230 ЕР то разница в процентах будет равна:

(10.366-10.230)/10.366х100%=1.3%.

Примерные значения для исследуемых образцов.

Значения КВ, полученные от каждого тестового образца, должны варьироваться в пределах 20%. Угловые коэффициенты для образца должны в соответствии с условиями эксперимента распределяться следующим образом: среднее значение углового коэффициента для КО 1< среднего углового коэффициента < среднего углового коэффициента для КО 3.

Вычисления результатов образцов.

Для определения процента связывания тестового образца относительно материала СТЬЛ4^{А29¥Е104Е}Ιμ значения концентраций для каждого исследуемого образцы вычисляются из стандартной кривой в нг/мл. Программа [ИЛсоге для вычислений рассчитывает концентрацию СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд в неразведенном образце, основываясь на значении степени разведения, введенном для каждого образца.

Определение процента связывания: вычисленное значение концентрации для каждого исследуемого образца может быть умножено на 100 и разделено на значение концентрации белка в образце, полученное с помощью коэффициента поглощения при 280 нм (А₂₈₀). Округленное до целого числа значение является процентом связывания относительно стандартного образца. Например, образец был разведен с фактором разведения 12.500 (концентрация белка в образце = 25 мг/мл). Вычисленная средняя концентрация СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд в трех введениях образца = 25.3 мг/мл. А₂₈₀ для этого = 24.2 мг/мл. Высчитанный процент связывания относительно стандартных образцов будет равняться:

25.3 мг/мл/24.2 мг/млх100%=104.545%.

Схема иммобилизации 01^4^⁹^¹⁰⁴^¾.

Параметры иммобилизирующих введений

	Буфер	В7.1-1ё	Этаноламин	Цитрат
Время взаимодействия (мин)	7	7	6	2
Расход (мкл/мин)	5	5	5	10
Объем введения (мкл)	35	35	30	20

Сводная таблица условий проведения анализа

ГО	Время (сек)	До /После	начало/ конец	Введени е№.	Тип	Относит ельно.	Окно (сек).	Результ ат
Базовый уровень	10 ..	До	Начало	1-е	АЬЖезр	—	5	Нет
Активация	10	До	Начало	2-е	КеЖекр	Базового уровня	5	Нет
Уровень иммобилизации	85	После	Конец	3-е	Ке1Ке8р	Базового уровня	5	Да

Пример 42. Корреляция между данными углеводного анализа СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд и фармакокинетическими данными.

Углеводные структуры в СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд играют важную роль в фармакокинетике (ФК) СТЬЛ4Ιμ как лечебного средства. Несколько методов анализа были созданы для того, чтобы охарактеризовать углеводную структуру. Два аналитических параметра коррелируют с значениями клиренса: соотношение сиаловой кислоты (NΛNΛ) к белку СТ^Λ4-Iд и процентное содержание домена ΙΙΙ и Ιν из углеводного анализа. Третий параметр (соотношение галактозы и маннозы из анализа на моносахариды) также хорошо коррелирует. Например, спецификации для этих параметров могут быть

- 247 017765

Соотношение ΝΑΝΑ / СТЬА4-1§ >8.0

Углеводный анализ Домены III и IV >25 % (Метод 1)

Соотношение Галактоза/Манноза >0.65

Важным этапом в процессе ферментации СТ^Λ4-Iд может быть выбор параметров, которые дадут максимальный выход конечного продукта, обладающего необходимыми характеристиками (см. табл. 6). Один из показателей (соотношение NΛNΛ:белок) достаточно информативный и быстрый для определения таких параметров. Целевое соотношение NАNΛ к белку может обеспечить уровень соотношения NΛNΛ в большинстве полученных веществ на уровне >7.0. Процесс очищения может улучшить этот показатель до >9.0.

СТ^Λ4-Iд - гликопротеин с несколькими ^связанными и О-связанными центрами гликозилирования. ^связанные углеводные структуры типично являются двух- и трехантениальными и, если полностью сиалированы, заканчиваются углеводами NАNΛ(АΗΚ)-Оа1-О1сNΛс. Большинство молекул сиалированы только частично и содержат некоторые углеводные цепи, заканчивающиеся Оа1 или О1сNΛс. Отсутствие концевой сиаловой кислоты (АНК) является фактором, увеличивающим мощность воздействия со стороны кровяного потока. В этом примере данные представлены с учетом того, что концевая галактоза также обеспечивает некоторую защиту от быстрого клиренса.

Основной параметр, используемый для оценки гликозилирования, - молярное соотношение АНК/СТ^Λ4-Iд. Фармакокинетические анализы у макак показали, что приемлемый клиренс может быть достигнут при использовании молекулы СТ^Λ4-Iд с соотношением АНК = 6.9. Первая партия материала СТ^Λ4-Iд (полученного в результате процесса Υ), испытанная на макаках, имела соотношение АНК = 7.1. Удивительно, но она была очищена в два раза быстрее, чем материал с АНК соотношением = 6.9. Резюмируя результаты моносахаридного анализа, можно увидеть что, материал, полученный в результате процесса X, имеет большее количество галактозы, чем продукт процесса СО-СНО. Новый процесс (СП-СН01), включающий в себя введение галактозы, был применен, и СТ^Λ4-Iд, произведенный таким способом, имел более высокий уровень галактозы и сиаловой кислоты, по сравнению с процессом Υ. Данные анализа и ФК исследований материала, полученного процессом СП-СН01, показаны ниже и сравнены с процессами Υ и X.

Методы анализа.

Углеводный анализ основан на ферментативном удалении целого углеводных фрагментов, с последующим их разделением при помощи анионной обменной хроматографии. Углеводные пики распадаются на 4 или 5 кластеров (доменов), основанных, в основном, на количестве остатков сиаловых кислот в каждой структуре. Домен I не сиалирован, домен II моносиалирован, домен III дисиалирован, домен IV трисиалирован и домен V тетрасиалирован. Площадь под каждым пиком или доменом может быть определена и зафиксирована как процент от общей площади под всеми пиками.

Значение клиренса определялось путем трехкратного введения 10 мг/кг дозы СТ^Λ4-Iд макакам, за которым последовало уменьшение сывороточных концентраций после 28-дневного периода. Значение клиренса соотносится с площадью под кривой или ППК. ППК имеет обратную зависимость от клиренса, повышение клиренса ведет к уменьшению ППК и наоборот. Большее значение ППК представляет замедление клиренса СТ^Λ4-Iд.

Фиг. 50 изображает некоторые из многих ^связанных структур, найденных в белках млекопитающих. Все цепочки имеют общую структуру кора с двумя молекулами О1сNΛс и тремя остатками маннозы. От кора ответвляются 2-4 цепи, содержащие одну из трех структур: -О1сNΛс-Оа1-NΛNΛ, -О1сNΛсОа1 или -О1сNΛс (фиг. 50, структуры 1, 2 и 3). Считается, что концевая сиаловая кислота (АНК) ответственна за уменьшение клиренса белка из кровотока. Однако удивителен тот факт, что уровень клиренса в СТ^Λ4-Iд у макак увеличился вдвое, хотя соотношение АНК осталось прежним (табл. 56, образцы СТ^Λ4-Iд 81 и СТ^Λ4-Iд (-) Оа1 соответственно, на фиг. 51, 52). Единственным отличием между образцами, приготовленными в разных средах, было молярное соотношение галактозы к белку, которое было заметно выше у образцов, полученных в результате процесса X, по сравнению с образами, полученными в результате процесса Υ. Это позволило предположить, что значение клиренса, главным образом, определяется концевым остатком О1сNΛс и что концевая галактоза может обеспечить некоторую защиту. Для того чтобы увеличить галактозилирование СТ^Λ4-Iд, в процессе Υ галактоза добавлялась в корм. Новый процесс (С0-СН01; СТ^Λ4-Iд 82 фиг. 51, 52) значительно увеличил молярные соотношения АНК и галактозы в СТ^Λ4-Iд в биореакторах.

В дальнейшем ФК исследования макак были продолжены. Использовался СТ^Λ4-Iд, произведенный тремя разными способами (процесс X, процесс Υ и процесс СП-СН01, СТ^Λ4-Iд 81, СТ^Λ4-Iд(-) Оа1 и СТ^Λ4-Iд 82 соответственно, фиг. 51-52). В дополнение был также протестирован СТ^Λ4-Iд с очень низким соотношением АНК (восстановленный в процессе отмывания процедуры очистки, см. фиг. 62). Данные анализов и ФК исследований всех образцов сведены в табл. 56. В самом последнем исследовании (табл. 56) был протестирован СТ^Λ4-Iд, полученный в результате продления ферментации в процессе Υ (СТЬА^д 83).

На фиг. 51 показана корреляция между АНК и значением ППК в ФК исследованиях макак всех об

- 248 017765 разцов. Образцы, полученные в результате процесса Υ (СТ^А4-Iд(-) Са1) и процесса СЭ-СН01 (СТЙА4Ι§ З2), показали сильную корреляцию между этими параметрами, показывая, что АНК имеет значительное влияние на клиренс СТ^А4-Iд. Анализ графика показывает, что при АНК=9, СТ^А4-Iд(-) Са1 и СТ^А4-Iд З2 очищаются за то же время, что и СТ^А4-Iд З1. Уменьшение АНК до 8 уменьшает ППК в ФК исследовании макак примерно на 25%, в то время как увеличение до 10 приводит, в свою очередь, к увеличению ППК примерно на 25%. Хотя существует строгая корреляция между АНК и ППК в процессах Υ и СП-СН01, необходимо помнить, что СТ^А4-Iд З1 с АНК=7 имеет тот же клиренс, что и СТЙА4Ι§ З2 с АНК = 9. Таким образом, не только соотношение АНК определяет клиренс СТ^А4-Iд.

Таблица 56 Углеводный анализ СТ^А4-Iд. М-1 означает, что был использован метод 1, М-2 означает использование несколько отличного метода 2, РА означает материал белка А, очищенного из культуральной среды

ТЕСТ	Параметры процесса ферментации.	Процесс X	Процесс Υ	Процесс Υ
Сиаловая	АНК: Протеин.	6.9	7.1	6.9
кислота
Углевод	% Домен I (РА) %
ный	Домен II (РА) %
анализ.	Домен III (РА) % Домен IV (РА) % Домен 11 (М-1) %	42.4% 28.2% 21.1% 7.4%	49.1%	43.1%
	Домен II (М-1) %	31.1%	32.8%
	Домен III (М-1) %	15.9%	19.7%
	Домен IV (М-1)	3.8%	3.7%
Моносахарид	Манноза	17.3	17.2	15.0
ный анализ.	Фукоза	5.7	5.7	6.7
	Г алактоза	13.1	8.1	9.1
	ОаШАс	2.7	3.4	3,2
	ΟΙοΝΑο	19.9	21.3	26.3
ФК анализ	Оа1;Мап	75.7%	47.1%	60.7%
6а1;61с1ЧАс	65.8%	38.0%	34.6%
макак
0802051-1	ППК (час*мг/мл)	17060 1171	8832 2203
ФК анализ макак 0802051-2	ППК (час*мг/мл)	15753 4395		7765 1247
ФК анализ макак 0802051-3	ППК (час*мг/мл)	15459
ФК анализ макак 0803228	ППК (час*мг/мл)

- 249 017765

ТЕСТ	Параметры процесса ферментации.	Процесс Υ СО	Процесс СР-
СНО1 СО
Сиаловая	АНК;Протеин (М-2)	7.3	9.9
кислота
Углеводный	% Домен I (РА)
тест	% Домен II (РА)		36.0%
	% Домен III (РА)		35.6%
	% Домен IV (РА)		23.1%
	% Домен I (М-1)	42.9%	5.2%
	% Домен II (М-1)	33.5%	33.6%
	% Домен III (М-1)	18.4%	31.6%
	% Домен 1У4 (М-1)	3.6%	27.5% 5.9%
Моносахарид	Манноза	19.6	18.0
ный анализ	Фукоза	4.6	4.8
	Г алактоза	11.1	15.8
	Са1НАс	3.3	3.3
	ΟΙεΝΑο	21.9	22.3
	СакМап	56.6%	87.8%
	СакС1сКАс	50.7%	70.9%
ФК анализ макак Б502051-1	ППК (час*мг/мл)
ФК анализ макак Б502051-2	ППК (час*мг/мл)	7266 787	20445 2425
ФК анализ	ППК (час*мг/мл)
макак
Б502051-3
ФК анализ макак 0803228	ППК (час*мг/мл)

ТЕСТ	Параметры процесса ферментации	Процесс X	(д!2) Процесс СОСНО1	(д!6) Процесс СБ-
СНО1
		СО	СО	СО
Сиаловая	АНК:Протеин.	2.3	9.8	8.8
кислота
Углеводный	% Домен I (РА)	63.8%	34.1%	42.0%
анализ	% Домен II (РА)	26.5%	28.3%	30.1%
	% Домен III (РА)	7.3%	25.7%	22.4%
	% Домен IV (РА)	2.4%	10.7%	5.3%
	% Домен I (М-1)		34.8%	38.2%
	% Домен II (М-1)		28.7%	34.8%
	% Домен III (М-1)		30.1%	22.5%
	% Домен IV (М-1)		6.1%	4.3%
	% Домен I (М-2)		37.8%	44.4%
	% Домен II (М-2)		34.5%	32.8%
	% Домен III (М-2)		22.8%	19.6%
	% Домен IV (М-2)		5.0%	3.2%
Моносахаридн	Маноза	17.9	13.6	14.5
ый анализ	Фукоза	5.5	5.4	5.3
	Галактоза	4.1	12.8	11.4
	ОаЖАс	2.9	2.1	2.2
	ΟΙεΝΑο	22.0	26.3	19.9
	СакМап	22.9%	94.1%	78.6%
	631:01ϋΝΑο	18.6%	48.7%	57.3%
ФК анализ	ППК (час*мг/мл)
макак
ϋ802051-1
ФК анализ макак 0802051-2	ППК (час*мг/мл)	2337 414
ФК анализ макак 0802051-3	ППК (час*мг/мл)		20707	15779
ФК анализ макак 0803228	ППК (час*мг/мл)

- 250 017765

Тест	Параметры	(д!4)	(д!6)	(д!6)
	процесса ферментации	Процесс X	СО-СНО1		СТЬА4-1е 83
				СО
		СО		СО	СО-СНО1
Сиаловая	АНКЛротеин. (ВА8)	10.0	10.3		7.9
кислота
Углеводный	% Домен I (РА)	38.6%	41.3%		56.2%
анализ	% Домен II (РА)	30.1%	32.2%		26.9%
	% Домен III (РА)	23.1%	21.9%		13.1%
	% Домен IV (РА)	7.6%	4.6%		3.7%
	% Домен I (М-1)		39.5%		49.0%
	% Домен II (М-1)		31.8%		29.1%
	% Домен III (М-1)		21.9%		15.7%
	% Домен IV (М-1)		7.8%		6.3%
	% Домен I (М-2)	38.2%	36.2%		47.1%
	% Домен II (М-2)	33.7%	34.3%		33.6%
	% Домен III (М-2)	24.6%	21.1%		14.5%
	% Домен IV (М-2)	3.6%	8.4%		4.8%
Моносахарид	Манноза	14.8	14.7		11.8
ный анализ	Фукоза	5.3	4.9		5.7
	Галактоза	13.0	12.6		11.5
	СаЩАс	2.2	2.2		2.3
	ΟΙοΝΑε	20.2	16.3		28.4
	Са1:Мап	87.8%	85.7%		97.5%
	Са1:О1с1ЧАс	64.4%	77.3%		40.5%
ФК анализ	ППК (час*мг/мл)
макак
ФК анализ макак 0802081-2	1111К (час*мг/мл)
ФК анализ макак 0802051-3	ППК (час*мг/мл)	18750
ФК анализ	ППК (час*мг/мл)		17739	2546	9425 1504
макак
0803228

Другое ФК исследование (табл. 56) было проведено на макаках для сравнения клиренса СТ^А4Iд, полученного в результате трех различных процессов (X, Υ и СВ-СНО1). В дополнение был также протестирован СТ^А4-Iд с очень низким соотношением АНК (восстановленный в процессе отмывания процедуры очистки). СТ^А4Iд, полученный в результате процесса СО-СНО в биореакторах объемом 50 л или 5000 л, имел молярное соотношение АНК, близкое к материалу, произведенному в результате процесса X, и ФК тестирование этого материала показало, что значение ППК у этого СТ^А4Iд примерно в два раза меньше, чем у материала, произведенного процессом X. СО-СНО, полученный способом СОСНО, имеет соотношение АНК больше, чем СО-СНО, полученный способом Х (9.9 и 6.9 соответственно), и значение ППК у него выше примерно на 30%, что означает также и более медленный клиренс. Слабо-сиалилизированный и гликозилированный материал с АНК=2.3 очищался очень быстро (ППК=2337 ч-мкг/мл в сравнении с 15753 у материала процесса X).

Другое исследование (табл. 56) имело целью сравнить СТ^А4-Iд, полученный в процессе СОСНО1, в биореакторе объемом 5000 л и изъятом в разные дни. В процессе ферментации соотношение АНК достигает своего пика примерно на 8-й день, затем постепенно уменьшается. Аликвоты из двух этапов были изъяты на 12-й, 14-й и 16-й дни и затем очищены. После очистки соотношение АНК варьировалось в них от 8.8 до 10.0. Образцы, изъятые на 12-й и 14-й день (АНК=9.8 и 10 соответственно), имели значение ППК, почти идентичное с материалом процесса X.

Еще одним способом анализа гликозилирования СТк.АДЛд является углеводный анализ. Внутренние Ν-связанные углеводные структуры удаляются и разделяются при помощи анионного обмена. Большое количество пиков возникает в этом процессе, в дальнейшем они преобразуются в 4-5 доменов (см. фиг. 58-62). Домены I и II обычно имеют асиалированную или моносиалированную структуру, тогда как домены III, IV и V имеют ди-, три- и тетрасиалированную структуру.

Эмпирически было выявлено, что процентное соотношение общего тестирования доменов III и IV хорошо коррелируется со значением ППК для всех образцов, включая материал процесса Х (фиг. 52). Большая часть структур в этих доменах должна быть полностью сиалирована и гликозилирована. Согласно данным из группы М-1 процентное соотношение доменов III и IV примерно равно 29 процентам, и они должны иметь тот же клиренс, что и материал процесса X. Данные доменов III и IV, полученные методом 2, примерно на 4% ниже (21 и 25% соответственно), чем данные, полученные методом 1.

Дополнительно было замечено, что процентное соотношение общего теста и доменов I и II хорошо коррелируют с ППК для всех образцов (фиг. 57). Большинство структур в этих доменах являются асиалированными и моносиалированными. Фиг. 57 показывает, что степень клиренса выше у образцов с более низким содержанием доменов I и II в противоположность с тем, что имеют более высокое содержание этих доменов. Сниженное гликозилирование доменов I и II соотносится с увеличенным содержанием

- 251 017765 гликозилированных пептидов в доменах ΙΙΙ и ТУ.

Хотя молярное соотношение сиаловых кислот к белку традиционно использовалось для прогнозирования значения клиренса для СТ^А4-Iд, различные ферментирующие среды, использованные в экспериментах с макаками, давали в результате молекулы с одинаковым соотношением АНК, но разными значениями клиренса. Для того чтобы прогнозировать клиренс более точно, были проведены два других анализа (моносахаридный и углеводный), и полученные данные были сравнены с данными ФК анализа. Наиболее предсказуемым параметром является увеличение галактозилирования СТ^А4-Iд. Для уменьшения изменчивости результатов анализа молярное соотношение галактозы было нормализировано до молярного соотношения маннозы. Получившееся в результате соотношение Са1:Мап хорошо коррелировало с значением ППК для всех образцов из исследований, проводимых на макаках, включая материал процесса X. Эти результаты согласуются с идеей о том, что клиренс СТ^А4-Iд, в основном, зависит от количества внешних концевых остатков С1οNАο в молекуле. Если эта теория верна, то определение степени гликозилирования помогает предсказывать значение клиренса эффективнее, чем сиалирование. Для обеспечения фармакокинетической сопоставимости (ППК >75% материала процесса X) соотношение Са1:Мап >0.65 рекомендуется для очищенного неупакованного лекарственного препарата ^ϋδ) СТЕА4Ι&

В тех случаях, когда анализируется только материал процессов Υ и СБ-СН01, молярное соотношение АНК и белка помогает прогнозировать клиренс достаточно точно. Однако это не относится к материалу процесса X. Для того чтобы материалы процессов Υ и СБ-СН01 могли быть сравнимы с материалом процесса X, их уровень АНК должен быть выше на 2 единицы (АНК=9 для материала СБ-СН01 сопоставимо с АНК=7 для материала X). Так как тестирование при помощи сиаловой кислоты является точным и быстрым, то оно является очень полезным средством для проверки качества производимого СТ^А4-Iд непосредственно в процессе ферментации.

Для получения необходимых фармакокинетических качеств (ППК>75%) рекомендованный уровень АНК для очищенного неупакованного лекарственного препарата должен быть >8. Это значение также представляет хороший критерий для показания готовности препарата в процессе этапа ферментации. Так как процесс очистки может увеличить соотношение сиаловой кислоты по крайней мере на 2 единицы, устанавливая конечное значение АНК на уровне 8, можно соответственно задать уровень АНК для прекращения ферментации на уровне 7. Процесс очистки может увеличить уровень АНК до 9, что сравнимо с материалом процесса X и значительно превосходит упомянутый выше минимально рекомендованный уровень для очищенного неупакованного препарата.

Углеводный анализ также довольно точно спрогнозировал ФК результаты у макак для материалов X и Υ, в том случае, когда площадь под доменами 2 и 3 сравнивалась с ППК. Домены 3 и 4 состоят преимущественно из полностью сиалированных и гликозилированных углеводных структур.

Данные в табл. 56 могут продемонстрировать корреляцию между значениями ППК, АНК, галактозы и общее процентное содержание суммы значений ППК для доменов 2 и 4. См. ниже.

ППК	АНК	Г алакт оза	Сумма доменов 3 и 4
2.337	2.3	4.1	9.7
8.832	7.1	8.1	19.7
7.266	7.3	11.1	22.0
9.425	7.9	11.5	22.0
7.765	6.9	9.1	23.4
15.779	8.8	11.4	26.8
18.750	10	13.0	28.2
17,060 15,753 15,459	6.9	13.1	28.5
17.739	10.3	12.6	29.7
20.445	9.9	15.8	33.4
20,707	9.8	12.8	36.2

Таблица выше показывает, что существует корреляция между суммами доменов ΙΙΙ и ХУ и ФК выходом этой смеси. ППК доменов ΙΙΙ, и У прямо зависят от молярного соотношения АНК и Са1 к СТ^А4-Iд. Таким образом, углеводные анализы этих композиций содержат суммы доменов ΙΙΙ и или суммы доменов ΙΙΙ, и У в количестве от 18 до 37 ППК %. В разных носителях сумма доменов ΙΙ, и У была: от 19 до 36, от 20 до 35, от 21 до 34, от 22 до 33, от 24 до 31, от 25 до 30, от 26 до 29, от 27 до 28 ППК %. В одном носителе смесь СТ^А4-Iд характеризуется тем, что домен ΙΙΙ имеет ППК в % = 19±4; и домен имеет ППК в %=7±4.

Пример 43. Триптическая пептидная карта СТ^А4-Iд.

СТ^А4-Iд, произведенный из клеток яичника китайского хомячка (процесс СНО), является гликопротеином с молекулярной массой примерно 92500 Да. Пептидная карта - это высокоточный метод определения первичной структуры белка, он полезен при определении посттрансляционных модификаций. Белок денатурируется при помощи гуанидина-НС1, редуцированного и алкилированного при помощи дитионтрентола (ДТТ) и индолилуксусной кислоты (ИУК). Белок обессоливается на NАΡ-5 колонках, и

- 252 017765 переработанная смесь анализируется хроматографией обратной фазы (С18). Определение пиков выполняется УФ-поглощением на 215 нм.

Реагенты: раствор подвижной фазы А (0.02% трифторуксусной кислоты (ТФК) в воде); раствор подвижной фазы В (0.02% ТФК в 95% ацетонитрила и 5% воды); алкилирующий агент (200 мМ ИУК); разводящий буфер (100 мМ Триса, 25 мМ №С1, рН 8.0); денатурирующий буфер (8 М гуанидина, 50 мМ триса, рН 8.0); расщепляющий буфер (50 мМ триса, 10 мМ СаС1₂, рН 8.0); редуцирующий агент (100 мМ ДТТ).

Измерительные приборы: (допускается использование аналогичных приборов) колонки NΑР-5 (Αιηегзйат, Ν 17-0853-02); нагреватель колонок для ВЭЖХ; система для ВЭЖХ (производство Аа1ег'з Α111апсе) с колоночным нагревателем и УФ-детектором.

Редуцирование и алкилирование: образцы (например, стандарты СΊ^Α4-Iд) были разведены до концентрации 10 мг/мл водой, до общего объема в 100 мкл (1 мг). 560 мкл денатурирующего буфера и 35 мкл редуцирующего агента (100 мМ ДТТ) добавляли к 100 мкл образца, перемешивали и откручивали в микроцентрифуге в течение 3 с. Затем образцы инкубировали при температуре 50°С в течение 20±2 мин. 35 мкл алкилирующего агента (200 мМ ИУК) добавляли к каждому образцу и снова перемывали и откручивали в центрифуге в течение 3 с. Затем образцы инкубировали при температуре 50°С в течение 20±2 мин в темноте. После того как колонки NΑР-5 были уравновешены путем заливания расщепляющего буфера в количестве 3 объемов колонок (7-8 мл), 500 мкл редуцированной и алкилированной смеси было пропущено через колонки, затем образцы собирали из колонок путем элюирования с использованием 1 мл расщепляющего буфера.

Расщепление. Образцы расщепляли 20 мкл трипсина (0.5 мкг/мкл) в водяной бане при температуре 38°С в течение 4 ч (±0.5 ч). После расщепления образцы окисляли 2.5 мкл ТФК. Образцы помещали в автосэмплер для последующих анализов.

Инструментальный метод.

Инструментальный метод показан ниже.

Время (мин.)	Потока (мл/мин.)	Подвижная фаза А	Подвижная <]
0	0.7	100	0
17	0.7	83	17
27	0.7	78	22
42	0.7	73	27
58	0.7	65	35
74	0.7	52	48
79	0.7	0	100
84	0.7	100	0
88	0.7	100	0

Колонка была уравновешена при помощи буфера подвижной фазы А (100%) в течение 25 мин перед первым введением. Поглощение УФ-излучения измерялось при 215 нм, при температуре колонки 37°С и в аутосэмплере при температуре 4°С. Подвижная фаза А была пропущена в холостую перед первым введением стандарта системы, затем последовало введение 50 мкл каждого образца. Введение эталонного материала должно происходить через каждые 6 введений. Хроматограмма пептидной карты для образца СΊ^Α4-Iд показана на фиг. 53. Разница времени удержания для пиков Т2, Т3, Т15 и Т19 (фиг. 53 и табл. 57) между начальным и промежуточными введениями должна быть ±0.5 мин.

Таблица 57

Теоретически расчетные составляющие СΊ^Α4-Iд, расщепленные трипсином

№ фрагмент	Остаток	Масса моноизотоп	Средняя масса	Последовательность
Т1	1-14	1464.8	1465.7	ΜΗ VАОР АУУЬАЗ 8К
Т2	15-28	1484.7	1485.6	ΟΙΑδΡνΟΕΥΑδΡΟΚ
ТЗ	29-33	574.3	574.6	АТЕУК
Т4	34-38	586.4	586.7	УТУЬК

- 253 017765

Т5*	39-83	4895.2	4898.3	^Α^8^VΤΕVСΑΑΤΥΜΜΟNΕ^ΤΡ^^^
Тб	84-93	1170.5	1171.4	АМОТОЬУ1СК
Т7*	94-128	3993.9	3996.4	УЕЬМУРРРУУЕСЮХСТСЖУТОРЕРС
Т8**	129-132	435,2	435.4	88ΌΚ
Т9**	133-158	2687.4	2689.1	гНТ8РР8РАРЕЕЬСС88УРЕРРРКРК
Т10	159-165	834.4	835.0	ЭТЬМИК
Т11	166-184	2138.0	2139.3	гРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕУК.
Т12	185-198	1676.8	1677.8	ΡΝλΥΥνϋσνΕνΗΝΑΚ
Т13	199-202	500.3	500.6	ТКРК
Т14*	203-211	1188.5	1189.2	ΕΕζ)ΥΝ8ΤΥΚ
Т15	212-227	1807.0	1808.1	\У8УХТУЬН(2О\У1ХТОК
Т16	228-230	438.2	438.5	ΕΥΚ
Т17	231-232	306.1	306.3	СК
Т18	233-236	446.2	446.5	νδΝΚ
Т19	237-244	837.5	838.0	АЬРАРТЕК
Т20	245-248	. 447.3	447.5	ΤΙ8Κ
Т21	249-250	217.1	217.3	АК
Т22	251-254	456.2	456.5	СТОРК
Т23	255-265	1285.7	1286.5	ЕРЭУУТЬРРЗК
Т24	266-270	604.3	604.7	ЭЕЬТК
Т25	271-280	1160.6	1161.4	МЭУЗЬТСТУК
Т26	281-302	2543.1	2544.7	ΟΡΥΡδϋΙΑνΕλΥΕδΝσί^ΡΕΝΝΥΚ
Т27	303-319	1872.9	1874.1	1ТРРУЬО8ОС8РРЬУ8К
Т28	320-324	574.3	574.7	ЬТУОК
Т29	325-326	261.1	261.3	8К
ТЗО	327-349	2800.3	2802.1	νΑΚ)ΟΝνΤ8Ε8νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤζ)Κ
Т31	350-356	659.3	659.7	ЗЬЗЬЗРб

* Содержит ^связанные углеводы.

** Содержит О-связанные углеводы.

Количество теоретических тарелок: эффективность колонки оценивается по количеству теоретических тарелок и может быть измерена количественно с использованием времени удержания и ширины пика по следующей формуле:

Ν=16(ίΑν)² где ν - ширина пика на базовом уровне, измеренная экстраполяцией прямых сторон относительно базового уровня;

! - время удержания пика, измеренное от времени введения до времени элюирования максимального пика.

Если N<5000, необходимо заново уравновесить колонку.

Разрешение: разрешение (Р) между 2-мя пиками, например Т30 и Т12, как показано на фиг. 53, может быть определено по следующей формуле:

^=(2(^-11))/(^+^) где !₂, !₁ - время удержания пиков Т12 и Т30 соответственно;

\₁, \\₂ - ширина пика на базовом уровне, определенная по тангенсу, с временами удержания !₁ и !₂ соответственно.

Если Р<1.5, колонка должна быть заново уравновешена, а если проблема остается, то ее необходимо заменить.

Примерные значения. Различие между относительными площадями для пиков Т3, Т15 и Т19 в тестовых образцах и исходных материалах должно быть <10.0%. Относительная площадь пика определяется как процентное соотношение площади пика к площади Т2. Различие между относительными площадями пиков тестовых образцов и начальной системой соответствия получаются по приведенной ниже формуле. Относительная площадь пика (К_5х) может быть вычислена для каждого пика Т3, Т15 и Т19 в хроматограмме по следующей формуле:

К₈х=(А_5Х/А₅₂)*100 где К_5х - относительная площадь пика Х в хроматограмме;

А_кх - площадь пика Х в образце;

А_§2 - площадь пика Т2 в образце.

Таким образом, относительная площадь пика может быть вычислена для каждого пика в хроматограмме стандарта. Различие между относительной площадью пика в образце и стандарте (1)_х) может быть вычислено по формуле ϋχ = [(К.8х-Кях)/(К-ях)]*100

Если в образце наблюдается дополнительный пик, его относительная высота относительно пика Т11 может быть определена по следующей формуле:

Относительная высота пика Кт= (Нт/Нц)*100 где Н_т - высота пика с временем удержания ! минут;

Н₁₁ - высота пика Т11, самого высокого в хроматограмме.

- 254 017765

В одном носителе, если относительная высота нового пика <5.0%, то данный срез можно считать соответствующим стандарту СТ^А4-Iд. Если относительная высота пика >5%, то данный срез считается не соответствующим стандарту СТ^А4-Iд.

Данные процента окисления были получены с использованием метода ВЭЖХ ОФ триптического картирования, который измеряет в процентах область окисления Ме185 в белке к сульфоксиду метионина. Процент окисления в этом методе получается путем измерения площади УФ-пика в триптической карте ВЭЖХ ОФ для триптического пептида Т6, состоящего из остатков 84-93, содержащих Ме185, и соответствующего окисленного триптического пептида Т6ох, содержащего Ме1(0)85. Относительное окисление Ме185 и Ме1(0)85 пропорционально относительной площади пика Т6ох:

Относительное окисление = 100* Атбох/( А_Тбох+ А_Т6) где А_Т6 - пиковая площадь для триптического пептида Т6 (84-93);

А_Т6ох - пиковая площадь триптического пептида Т6ох, Ме1(0)⁸⁵(84-93).

Значение относительного дезамидирования также было получено с использованием метода триптической карты, который подсчитывает относительное дезамидирование путем измерения площади УФпика в триптической карте для триптического пептида Т26, состоящего из остатка 281-302, содержащего Акп294, и дезамидированного триптического пептида Т26йеат1, содержащего 1коАкр294. Область дезамидирования в процентах Акп294 к 1коАкр294, таким образом, пропорциональна относительной площади пика Т26йеат1:

Относительное дезамидирование = 100* (А_Т26<1еат1)/(Ат2б+ А_Т26_йеат1+ Ат26(1еат2+

Ат26йеатЗ+ Ат26йеат4) где А_Т26 - площадь пика Т26 (281-302);

А_Т26йеат1 - площадь пика Т26йеат1, 1коАкр²⁹⁴(281-302);

А_{Т26йеат2} - площадь пика Т26йеат2, 1коАкр²⁹⁹ (281-302);

А_Т26йеатз - площадь пика Т26йеат3, 1коАкр²⁹⁴ (281-302);

А_{Т26йеат4} - площадь пика Т26йеат4, 1коАкр²⁹⁴ (281-302).

Пример 44. Углеводный анализ N-связанного олигосахарида в СТ^А4-Iд при помощи хроматографии анионного обмена с высоким рН и с электрохимической детекцией.

Углеводные структуры, представленные в гликопротеинах, могут влиять на их функции и клиренс т у1уо. Таким образом, представляется важным отслеживать состав углеводов в гликопротеинах, полученных рекомбинантным способом. СТ^А4-Iд - это рекомбинантный белок, содержащий N-связанные и О-связанные (связанные с серином) сайты гликозилирования. В данном методе анализируется N связанные (связанные с аспарагином) сайты гликозилирования, присутствующие в СТ^А4-Iд. В данном методе олигосахариды расщепляются ферментативным перевариванием с РNСаке Р (пептидная N гликозидаза Р). Затем выделяются методом ВЭЖХ обратной фазы в 2-колоночной системе, потом разделяются при помощи высокоэффективной анионно-обменной хроматографии (ВХАО) с высоким рН, и проверяются электрохимической детекцией (интегрированной амперометрией). Полученная хроматограмма - результат углеводного анализа N-связанного центра гликозилирования, тогда как тестирование образцов должно быть сходным с этим.

Данный метод описывает процедуру ВХАО для анализа N-связанного олигосахарида, выделенного из образцов СТ^А4-Iд. Целью данного метода является обеспечение хроматографических профилей N связанных олигосахаридов в СТ^А4-Iд, которые могут быть использованы для сравнительного анализа. Гликозилирование СТ^А4-Iд содержит N-связанные олигосахариды. Эти олигосахариды высвобождаются при помощи ферментативного расщепления РNС-азой Р в течение 22 ч. Свободные олигосахариды тестируются при помощи ВХАО с высоким рН с привлечением электрохимической детекции. Олигосахаридные тесты на лекарственных препаратах проходят параллельно с тестированием контрольного материала. Результаты представляются как процент отклонения выбранных доменов и пиков от тех же пиков в стандартном материале.

% Разн.	Относительная разница (%)
% ОО	Относительное отклонение (%)
ВХАО	Хроматография анионного обмена с высоким рН
ВЭЖХ	Высокоэффективная жидкостная хроматография
ХаОАс	Ацетат натрия
ΝηΟΗ	Гидроксид натрия
РХСазе Г	Пептидная Ν-гликозидаза Р ,

Материалы.

Допускается использование аналогичных материалов (если обратное не оговаривается).

Пробирки для восстановления с мембранами У/а1ег8 Согрогайоп (№186000234)

- 255 017765 из политетрафторэтилена или силикона

Фильтрующие устройства для центрифуги Мюгосоп ΥΜ 10 МШроге (№ 42407)

Кар1Сез(8Р ΝΫ а1ег8 Согрогайоп (№ 186001861)

Инструментарий и условия. Аналогичные инструменты могут быть использованы (если обратное не оговаривается).

Измерительные приборы:

Система для ВЭЖХ оборудованная автосэмплером (с охлаждением) дегазирующим модулем и электохимическим детектором (Мобе! 2465)

У/а1ег8 СогрогаОоп

Колонка: СагЬоРас РА-1 4x250 мм.

Ограничительная колонка СагЬоРас РА-1

4x50 мм ϋίοηεχ Согрогайоп (№ 3539) ϋϊοηβχ Согрогайоп (№ 43096)

Система сбора данных Ешроу/ег

Версия 3.2 или текущая версия одобренная ВМ8

Условия хроматографии для олигосахаридного тестирования при помощи анионобменной хроматографии.

Температура колонки 29°С

Мощность потока Подвижная фаза и условия градиента

500 мМ ΝηΟΑο

400 мМ ΝβΟΗ

Вода для ВЭЖХ

Гидравлические параметры 2465

Тип

Параметры системы Επιρον/ег мл/мин.

градиентная программа.

Время
(мин)	%1	%2	%3
Начало	0	30	70
0.0	0	30	70
11.0	0	30	70
12.0	4	30	66
20.0	10	30	60
80.0	45	30	25
81.0	0	30	70
100	0	30	70

Импульсный диапазон силы тока =5мА

Е1=+0.05В Е2=+0.75В Е3= -0.15В = 400 мсек 12 = 200 мсек = 400 мсек

Время отбора проб = 100 мсек Константа времени(фильтра) 0.1 сек Диапазон коррекции = 5% Полярность +

Температура = 29°С

Примечание. Перед введениями исследуемых образцов необходимо уравновесить колонку и детектор с начальной подвижной фазой при скорости потока той же что и во время тестирования в течение 2 ч.

Температура автосэмплера устанавливается на 4°С.

Вводимый объем 60 мкл.

Время проведения 100 мин.

Примерное время удержания (ВУ) доминантных пиков в каждом домене (см. фиг. 1) могут варьировать в зависимости от ВУ стандарта системы соответствия (СС).

- 256 017765

Примерное ВУ (мин.)

сс	18.5
Пик 1А	20.0
Пик 1В	20.8
Пик 1С	21.4
Пик Ю	22.4
Пик 1Е	23.1
Пик 2	31.5
Пик 3	44.8
Пик 4	58.5

Очистка электрода (^а!егк 2465). Следуйте инструкциям в руководстве к детектору. Для полировки электрода используйте алмазный шликер, поставляемый в комплекте с проточной кюветой. Если эта процедура не позволяет получить приемлемые результаты работы, необходимо заменить электрод новой проточной кюветой. Переустановите кювету, используя прокладку (50 мкм).

Реагенты. Примечание. Прикрепите ярлыки к реагентам и задокументируйте их приготовление.

Приготовление подвижной фазы для ВХАО углеводного анализа олигосахаридов.

ВХАО элюент 1: 500 мМ ацетата натрия (^ΟΑε). Масса 20.5±0.05 г ацетата натрия добавляется в градуированный цилиндр объемом 500 мл, содержащий 400 мл очищенной воды. Общий объем доводится до 500 мл добавлением очищенной воды и перемешивается пластиковой серологической пипеткой до полного растворения. Далее раствор фильтруется через нейлоновый фильтр 0.2 мкм. Затем необходимо перелить раствор в бутылку объемом 1 л. Далее неплотно закрыть бутылку и обливать гелием в течение 20 мин. Плотно закрыть крышку и опрессовать ее с гелием. Хранить раствор при комнатной температуре под гелием до 3-х недель.

ВХАО элюент 2: 400 мМ гидроксида натрия (NаΟΗ). Используя градуированный цилиндр объемом 1 л, отмерить 960 мл очищенной воды и перелить ее в чистую бутылку. Используя серологическую пластиковую пипетку, добавить 40.0 мл 10 Ν NаΟΗ в бутылку и перемешать элюент вращением. Далее неплотно закрыть бутылку и обливать гелием в течение 20 мин. Плотно закрыть крышку и опрессовать ее с гелием. Хранить раствор при комнатной температуре под гелием до 3-х недель.

ВХАО люент 3: очищенная вода. Наполните бутылку объемом 1 л очищенной водой в количестве примерно 1 л. Далее надо поместить бутылку на систему, неплотно закрыть и обливать гелием в течение 20 мин. Плотно закрыть крышку и опрессовать ее с гелием. Хранить раствор при комнатной температуре под гелием до 3-х недель.

мМ буфера из фосфата натрия, 0.02% азида натрия, рН 7.5. Азид натрия (ΝΝ₃) требует бережного обращения для того, чтобы избежать вдыхания паров и контакта с кожей. Для ознакомления с мерами предосторожности дополнительно ознакомьтесь с руководством. После взвешивания ΝίΐΝ тщательно почистите чашу весов.

ΝπΗ₂ΡΟ₄Η₂Ο 6.9 г.

№Ν₃ 0.02 г.

Н₂О 1.0 Литра конечного объема.

Взвесьте 6.9±0.1 г NаΗ₂ΡΟ₄ Н₂О и 0.2 г ΝίΐΝ и растворите в 800 мл очищенной воды в бутылке для реагента объемом 1 л, используя магнитную мешалку. Используя рН-метр, доведите рН раствора до 7.5, используя 10 М раствор Доведите конечный объем до 1.0 л, используя градуированный цилиндр объемом 1 л. Храните раствор при комнатной температуре до 6 месяцев. Рабочий раствор ΡNΟ-азы Т Еп/уте в 50 мМ буфера фосфата натрия, 0.02% азида натрия, рН 7.5

Буфер из фосфата натрия (50мМ)

0.02 % азида натрия, рН = 7.5 1.8 мл

РМбазе Р из комплекта (№ Р0704Ь) 0.2 мл

Налейте 1.8 мл буфера из фосфата натрия (50 мМ), 0.02% азида натрия, рН 7.5 в криогенную пробирку объемом 1.8 мл. Добавьте 0.2 мл ΡNΟ-азы Т из комплекта и тщательно перемешайте. Храните до 6 месяцев при температуре -20°С. Перед замораживанием можно разделить на аликвоты.

Дополнительный стандарт соответствия системы. Исходный раствор стахиозы (1.25 мг/мл): Взвесьте 0.125г стахиозы на весовой бумаге, используя аналитические весы, и переместите в мерную колбу объемом 100 мл. Наполните очищенной водой до отметки и тщательно перемешайте. Разлейте порциями по 2 мл в криопробирки. Хранить при температуре от -20°С и ниже в течение 6-ти месяцев.

Стандарт системы соответствия стахиозы (12.5 мкг/мл). Отмерьте 1 мл исходного раствора стахиозы (1.25 мг/мл) в мерную колбу объемом 100 мл. Заполните водой до отметки и тщательно перемешайте. Разлейте частями по 200 мкл в микроцентрифужные пробирки объемом 0.65 мл. Поместите пробирки с коробку и пометьте ее соответствующим ярлыком. Раствор хранится при температуре от -20°С и ниже в течение 6-ти месяцев.

Приготовление стандартов и образцов.

Приготовление исходного материала. В сосуд, содержащий 1 мг сублимированного КарЁОек! ЗТ, добавляется 625 мкл буфера из фосфата натрия (50 мМ), содержащего 0.02% азида натрия, рН 7.5. При

- 257 017765 мечание: Во время теста для всех образцов следует использовать только один сосуд, содержащий КарЮек! ЗЕ и буфер. Несколько пробирок с КарЮек! ЗЕ могут быть приготовлены и смешаны для получения нужного объема. В пробирку типа эппендорф объемом 0.65 мл добавляется 120 мкл буфера, содержащего КарЮек! ЗЕ. Добавьте 40 мкл исходного материала (~50 мг/мл). Конечная концентрация КарЮек! ЗЕ должна быть 0.12% насыпного веса. Добавьте 40 мкл рабочего раствора РNСаке Е, тщательно перемешайте, слейте и поместите водяную баню или автосэмплер при температуре 38±2°С на 22±2 ч. Поместите образец в центрифужный фильтр Мюгосоп Υ^10 и центрифугируйте при 13.000 д в течение 30 мин. Залейте 200 мкл ВЭЖХ воды в фильтр и центрифугируйте еще 30 мин при 13.000 д. Перемешайте получившийся фильтрат на вортексе в течение 15 с и центрифугируйте образец 10 с. При помощи пипетки перенесите получившийся раствор (~380 мкл) в пробирку для восстановления в автосэмплере.

Приготовление образца. В пробирку типа эппендорф объемом 0.65 мл добавляется 120 мкл буфера, содержащего КарЮек! ЗЕ. Добавьте 40 мкл образца белка (этот объем должен соответствовать 1-2 мг СТ^А4-Iд). Конечная концентрация КарЮек! ЗЕ должна быть 0.12% насыпного веса. Добавьте 40 мкл рабочего раствора РNС-азы Е, тщательно перемешайте на вортексе в течение 10 с. Поместите на водяную баню или автосэмплер при температуре 38±2°С на 22±2 ч. Поместите образец в центрифужный фильтр Мктосоп Υ№-Ι0 и центрифугируйте при 13.000 д в течение 30 мин. Залейте 200 мкл ВЭЖХ воды в фильтр и центрифугируйте еще 30 мин при 13.000 д. Перемешайте получившийся фильтрат на вортексе в течение 15 с и центрифугируйте образец 10 с. При помощи пипетки перенесите получившийся раствор (~380 мкл) в сосуд для восстановления в автосэмплере.

Электрохимическая стабилизация ячейки детектора: введите 30 мкл стандарта системы соответствия стахиозы (12.5 мкг/мл). Убедитесь, что высота пика для стахиозы >800 нА. Убедитесь в отсутствие электрических помех от ячейки и в том, что базовый уровень плоский. Если чувствительность стахиозы или базовый уровень неприемлемы, проверьте состав буфера, почистите электрод или замените его. Если шум все же присутствует, проверьте ячейку, чтобы убедиться в отсутствие пузырьков воздуха. Стабилизируйте ячейку заново и повторите введение стандарта стахиозы. Если проблема остается, повторите процедуру или обратитесь к начальству.

Теоретические тарелки (№): определите количество теоретических тарелок (№), основываясь на пике стахиозы и используя формулу, приведенную ниже. Это делается с помощью аналитической системы Етрогег, но может также делаться и вручную.

где ! - время удержания, измеренное от времени введения до времени пика элюирования на максимальной высоте;

А - ширина пика, измеренная экстраполяцией сторон к базовому уровню;

N должно быть >6000. Если значение меньше 6000, настройте градиент или замените колонку.

Коэффициент размывания (Т): определите коэффициент размывания для колонки, основываясь на значении пика стахиозы, используя формулу, приведенную ниже. Это делается с помощью аналитической системы Етрогег, но может также делаться и вручную.

Т = (А₀.₀₅/2£) где А₀.₀₅ - ширина пика на высоте 5% от общей (0.05 Н);

£ - измерение (ширина) от переднего края пика на А₀.₀₅ до вершины пика.

Т должно быть <1.2. Если коэффициент размывания больше 1.2, необходимо проверить состав буфера, почистить или заменить колонку и ввести заново стандарт системы соответствия.

Верификация времени удержания стандарта системы соответствия стахиозы: время удержания зависит от системы. Стандарт системы соответствия стахиозы должен демонстрировать время удержания 18.5±2.0 мин.

Исходный материал СТ^А4-Iд - просмотрите результаты углеводного анализа от первого захвата исходного материала, введенного до начала тестирования образцов. Углеводный анализ должен быть сходным с данными на фиг. 68. Значения абсолютного времени удержания зависят от системы. Убедитесь в том, что разница во времени удержания между первым пиком в домене 1 (пик 1А) и главным пиком в домене 3 находится в промежутке между 22 и 28 минутами. Если очертания пиков не сходятся с изображенными на фиг. 68, примите соответствующие меры (проверьте исправность приборов, почистите колонку, проверьте или замените буферы, замените колонку) и повторите оценку. Следующая процедура может быть использована для чистки колонки: отсоедините ячейку и прочистите колонку смесью из 80% элюента 1 и 20% элюента 2 в течение 5 мин, а затем раствором 50% и 50% соответственно в течение 10 мин. Уравновесьте колонку и ячейку (ячейка отсоединена) до начального состояния и повторите оценку.

Последовательность введений.

Установите следющую последовательность введений изолированных олигосахаридов: стандарт стахиозы (30 мкл);

исходный материал (60 мкл);

образец(ы) (60 мкл);

исходный материал (60 мкл).

- 258 017765

Рекомендуется вводить исходный материал не реже чем через каждые 5 введений образцов.

Обработка данных: запустите хроматограмму для исходного материала и образцов в Етро\уег. Установите параметры интеграции так, чтобы очертания пика и базового уровня соответствовали показанным на фиг. 68, линии интеграции, возможно, придется устанавливать вручную. Произведите вычисления для относительных площадей доменов и относительных площадей пиков (см. таблицы, включенные в описание фиг. 68 и в конце этого раздела). Определите средние значения для этих параметров для исходного материала и для каждого образца, если производились дублирующие введения.

Для контрольного материала необходимо определить относительное отклонение для доменов 1.2 и 3, пиков 1А и 1В для каждого повторения, относительно среднего значения для всех повторений.

Сравнение результатов тестирования образцов и исходного материала.

Визуальное сравнение. Убедитесь, что образец и исходный материал имеют то же количество доменов и основных пиков. Основные пики - это пики, помеченные в описании к фиг. 68 (пики 1А, 1В, 1С, 10, 2, 3 и 4). Количественное сравнение. Сравните относительные площади образцов (домены I, II и III и пики 1А и 1В; если введения дублировались, сравните их среднюю величину) со средней относительной площадью введений исходного материала. Определите относительную разницу этих значений со средним значением для введений исходного материала.

Вычисления. % Площади домена (относительная площадь домена): рассчитайте относительную площадь домена для доменов данного среза, для исследуемых образцов и исходного материала. Обратитесь к фиг. 68 для ознакомления с образцом площади домена. Следуя примеру на фиг. 68, рассчитайте относительную площадь домена, используя следующую информацию и формулу (значения времени удержания зависят от системы и отражают результаты на фиг. 68):

домен I: сумма площадей пиков при примерном времени удержания 18-24 мин (пики 1А-1Е);

домен II: сумма пиков с временем удержания 26-38 мин;

домен III: сумма пиков с временем удержания 39-50 мин;

домен IV: сумма пиков с временем удержания 51-64 мин;

домен V: сумма пиков с временем удержания 65-75 мин.

Примечание: окна времени удержания будут смещаться в соответствии с изменениями в ежедневных показаниях хроматограммы. Корректируйте значения времени соответственно.

Относительная площадь домена(%)=(площадь отдельного домена)/(сумма площадей всех доменов)х100%

Для доменов также необходимо высчитать средние значения для введений исходного материала, также как и у исследуемых образцов, если исследования образцов повторялись.

% Площади пика (относительная площадь пика). Рассчитайте % площади пика для пиков 1А, 1В, 1С и 3 для тестовых образцов и исходного материала. Обратитесь к фиг. 68 для ознакомления с образцом площади пика; значения времени удержания зависят от системы. Рассчитайте относительную площадь пиков, используя следующие данные и формулу:

Относительная площадь пика = (площадь пика)/(сумма площадей всех доменов)х100%

Для каждого пика 1А и 1В также следует рассчитать среднее значение для введений исходного материала, так же как и у исследуемых образцов, если исследования образцов повторялись.

Расчет процентной разницы от средних значений для исходного материала. Используйте следующую формулу для расчета относительной разницы в значениях средней относительной площади доменов Σ-Ш, пиков 1А и 1В, образцов в сравнении с исходным материалом.

%ϋί££ =1КМ - 81 /КМ *100 где КМ - среднее относительное значение для исходного материала;

- среднее относительное значение для образца;

I I - абсолютное значение.

Результаты: результаты, которые должны быть представлены, - это процентная разница от исходного материала для доменов I, II и III, пиков 1А и 1В. Следует также включить интегрированную хроматограмму для исходного материала и образца. Включить значения относительных площадей для доменов 13 и пиков 1А и 1В до десятых процента как для образца, так и для исходного материала (среднее для контрольных введений). Дополнительно, для каждого контрольного введения исходного материала относительные площади доменов для доменов I, II и III и относительные площади пиков для пиков 1А и 1В должны варьироваться в пределах 15% от их средних значений.

Фиг. 57-62, 68, 76 и 82-84 показывают данные, полученные в результате анализов N-связанных олигосахаридов, описываемых здесь. Фиг. 68 показывает типичный тест N-связанного олигосахарида (домены I, II, III, IV и V, и пики 1А и 1В находятся в пределах 5% от общего среднего результата). Пики 1А, 1В и 1С представляют N-связанные олигосахаридные структуры в С0, С1 и 02.

Фиг. 68 показывает типичный углеводный тестовый срез N-связанного углевода в композиции СТΕΆ4-|д. Данная таблица демонстрирует данные такого анализа.

- 259 017765

Домен /Пик	Время удержан ия (мин)	Относител ьная площадь	Относит ельная высота пика (в сравнен ии с самым высоким λ	Относите льная площадь первичног о домена.	Структура домена
Домен 1	19.413	31.3			5 Пиков
Домен 11	29.076	33.2			5 Пиков
Домен 111	42.819	24			5 Пиков
^омен	55.В99	9.4			6 Пиков
Домен V	67.546	2.2			6 Пиков
Пик 1А	19.413	7.3	89.8	23.3
Пик 1В	20.29	10.7	100	3422.
Ник 1С	21.032	В.8	94.3	28.1
Пик ГО	21.925	2.6	27.5	8.95
Пик 1Е	22.665	1.7	11.8	5.43
Дик2	......30.763.,	.. 1,8.3,	. 88.9	55.1
Пик 3	. 43.623	_	5Ζ8	_
Пик 4	........5Ζ3&	14	Ж1	46.8

Следующая таблица показывает полученные границы значений для СТЬА4-1д

Домен / Пик	Минимальная площадь %	Максимальная площадь %
Домен I	24.5	35.2
Домен II	26.3	34.1
Домен III	21.9	31.5
Домены 1У+У	7.9	18.6
Пик 1А	4.5	11.2
Пик 1В	8.7	11.8

Пример 45. Клеточный биотест СТЬА4-1§ в лабораторных условиях.

Т-клеткам необходимы два сигнала для активации и пролиферации. Первый сигнал обеспечивается взаимодействием антигенного пептида с комплексом ТСК-СЭ3. Второй костимулирующий сигнал происходит при взаимодействии СЭ28 Т-клетки и В7 белка на антигенпредставляющей клетке. После получения этих сигналов Т-клетка выделяет цитокин интерлейкин 2 (ИЛ-2). Выделение ИЛ-2 ведет к активации и полиферации клеток. СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д - это растворимое соединение, обладающее иммуносупрессирующей активностью, также связывается с В7 белком на антигенпредставляющей клетке, блокируя, таким образом, взаимодействие с СЭ28 и предотвращая возникновение костимулирующего сигнала, который необходим для синтеза ИЛ-2.

В этом методе Т-клетки линии Зигка!, трансфицированные геном люциферазы под контролем промотора ИЛ-2, костимулируются В-клетками линии Паид1 в присутствии анти-СП3. Такое костимулирующее взаимодействие активирует промотор ИЛ-2, что ведет к продукции белка люциферазы. Результирующий люминесцентный сигнал измеряется при помощи системы анализа люциферазы. Она основана на том, что активность люциферазы напрямую зависит от дозы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1§.

В данном биологическом тесте исследуется действие СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1§ на костимулирующий сигнал, необходимый для выработки ИЛ-2. Присутствие растворимого СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1§ препятствует обмену сигналами между Т-клеткой и антигенпредставляющей клеткой. Без этого сигнала не вырабатыватся ИЛ-2, что предотвращает клональную экспансию Т-лимфоцитов. Был создан вектор для переноса гена люциферазы с использованием промотора ИЛ-2. Далее Т-клетки линии Зигка! были трансфицированы с помощью этого вектора. В этом методе был отобран и использован позитивный клон 1игка1.СА.

Данный биологический тест включает в себя стимуляцию трансфицированных Т-клеток линии 1игка! анти-СП3 антителами и В-лимфоцитами (Паид1). Костимуляционный сигнал, обеспеченный Вклетками, подавляется СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1§. Клетки 1игка1 и клетки Паид1 помещаются в 96-луночный, белый непрозрачный планшет с плоским дном и стимулируются при помощи анти-СП3 в присутствии различных концентраций СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1§. После инкубации (от 16 до 20 ч) при температуре 37°С лунки тестируются на люциферазную активность. Подавление костимуляции можно определить по тому, как понижается люциферазная активность с повышением дозы СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1§.

Реагенты. Культура клеток Паид1 (10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)), 1% МЕМ пирувата натрия в КРМ1-1640; культура клеток 1игка1 (10% ЭТС, 1% МЕМ пирувата натрия, 400 мкг/мл генетицина КРМ1-1640); среда для биотестирования (0.2 мкг/мл анти-СП3 антител и 1% раствор пенициллина-стрептомицина в культуральной среде для клеток Ваидь Раствор ярко-люминесцирующей люциферазы (ВпдЫ-СЬ Ьис1£егазе 8о1ийоп) для тестирующих систем (Рготеда, № Е2620).

Измерительные приборы. К1коп, зеркальный микроскоп ЭхарБо! 200, измеритель люминесцентного излучения Раскагд ТорСоип! ΝΧΪ, устройство подачи жидкости Тесап Сепез1з; цитомер /утагк Кар1дР1а1е-96.

- 260 017765

Процедура.

Приготовление рабочего раствора: 3 мл СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-Iд (5000 нг/мл) в среде для проведения биологического тестирования.

Восемь точечных кривых были построены для стандарта, образца и контрольного образца при концентрациях 100, 4, 2, 1, 0.5 и 0.2, 0.1 и 0.002 мкг/мл СТ^Λ4^{А29Υ^104Е}-Iд, как показано в табл. 58 ниже, для конечной концентрации в анализе после двойного растворения в лунках 50, 2.1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05 и 0.001 мкг/мл.

Таблица 58

Разведения, использованные для стандартных кривых

Точки кривой	Кривая стандарта	Кривая контрольного образца	Образец 1	Образец 2
1	100 мкг/мл	100 мкг/мл	100 мкг/мл	мкг/мл
2	4	4	4	4
3	2	2	2	2
4	1	1	1	1
5	0.5	0.5	0.5	0.5
6	0.2	0.2	0.2	0.2
7	0.1	0.1	0.1	0.1
8	0.002	0.002	0.002	0.002

200 тысяч клеток добавляли в каждую из 96 лунок и инкубировали при температуре 37°С, 5% СО₂ и влажности 85%. 12х10⁶ клеток .1игка! и 12х10⁶ клеток Баиб1 были помещены в стерильную центрифужную пробирку. Их центрифугировали при 125хд в течение 10 мин при комнатной температуре и потом они были заново ресуспендированы в 9 мл среды для клеток Баиб1 серологической пипеткой, до полного исчезновения видимых клеточных конгламератов, для достижения концентрации 2.7х10⁶ клеток/мл. 75 мкл каждого раствора из табл. 55 были добавлены в соответствующую лунку планшета, содержащую клетки. Затем планшет закрыли при помощи Тор8еа1-Л и инкубировали при температуре 37°С, 5% СО₂ и влажности 85% в течение 16-20 ч. После этого плашки и раствор люциферазы были нагреты до одинаковой рабочей температуры, 150 мкл люминесцентного раствора люциферазы были добавлены в каждую лунку одновременно и перемешаны. Сразу же после этого плашка была помещена в ТорСоип! NXТ для

- 261 017765 уравновешивания в темноте в течение 10 мин. Люминесцентный сигнал был затем измерен, используя интеграцию в 1 с на лунку или другое значение, соответствующее типу оборудования.

Все данные на выходе из ТорСоип! NXΊ были зафиксированы и применены по программе стандартного анализа, затем они были преобразованы с помощью логарифмов (база 10). Преобразованные данные из каждого анализа были введены в логистическую модель с 4-мя неременными, как показано ниже.

Формула 1:

Ьо§₁₀(У}к)=О+(А-О)/(1А(_Х1/С)^в) где А - верхнее положение кривой;

О - нижнее положение кривой;

В - угловой коэффициент;

С - концентрация, которая дает эффект, равный среднему арифметическому А и В.

Коэффициент детерминированности (К²) и Е-критерий могут быть посчитаны для каждого эксперимента. Также можно подсчитать соотношения минимума, максимума и углового коэффициента к стандартному материалу. В дополнение можно вычислить и дополнительные интервалы.

Относительная активность каждого образца может быть определена с помощью одной формулы, в которую вводятся (подставляются) данные соответствующего теста и данные контрольного теста.

Формула 2:

^_7ОЫ=£>+(А-Ж7+^/(С_а*(С_е/Са)¹))^В) где А, В и I) - параметры являются общими как для исследуемого теста, так и для контрольного;

С_к - параметр контрольного теста;

- исследуемого теста;

соотношение Ск./^ - относительная активность;

индекс Ι - индикатор, который может варьироваться. Он устанавливается как равный 1, если данные из исследуемого теста, и как 0, если из стандартного материала.

Относительная активность каждого образца была выражалась в процентах и фиксировалась как значение выхода из программы.

Восемь значений относительной активности, полученные на выходе при каждой новой установке параметров, могут быть проанализированы. Получить среднее арифметическое этих значений можно по формуле 3, а значение стандартного отклонения - по формуле 4. Средний результат описывается как процент относительной активности, округленный до ближайшего целого числа.

Формула 3:

Среднее значение = (значение1+значение2+значениеЗ+значение4+значение5+значениеб+значение7+значение8)/8

Формула 4:

Стандартное отклонение = квадратный корень из ((8£х²- (Σ^χ)²)/(8(8 -1))) где 8 - количество измерений мощности;

х - отдельное измерение.

Выверка значений относительной мощности, полученных при примерных данных концентрации: из-за временного промежутка между получением образца и получением точных данных о концентрации белка образцы могут быть протестированы с примерным значением концентрации, и полученные данные могут быть выверены после получения точных данных. Эта выверка производится с применением формулы 5, показанной ниже, где относительная активность, определенная при тестировании, умножается на соотношение концентрации СП ,.-6.4-% использованное при проведении теста, и полученной точной концентрации СΊ^Α4-Iд в образце.

Формула 5:

Регистрируемая относительная активность = (полученная относительная активность * значение концентрации, использованное при тестировании) / точное значение концентрации.

Пример.

Образец был протестирован с использованием значения концентрации 25 мг/мл.

Относительная активность равна 105%.

Точная концентрация, определенная позже, равна 25.5 мг/мл.

Итоговая относительная активность = (105х25)/25.5=103%.

Значения относительной активности образцов должны быть между 25 и 175% от контрольного стандарта. Если значение не вписываются в эту область значений, то необходимо повысить или понизить концентрацию образцов и провести повторные анализы.

- 262 017765

Пример 46. Структурная характеристика О-связанных олигосахаридов.

О-связанное гликозилирование было охарактеризовано пептидным картированием и последующими тестами ЕЗ1-МЗ/МЗ и МАГ01-Т0Р.

Анализ Т8 и Т9 при помощи пептидного картирования с ЕЗ1-МЗ/МЗ.

Для анализа О-связанных гликопептидов Т8 и Т9 (см. табл. 59) был использован модифицированный ручной метод триптидного расщепления, совместно с ЕЗ1-МЗ/МЗ, с использованием массспектрометра ионной ловушки Финнигана.

Фиг. 63 демонстрирует триптидную пептидную карту СТ1 А4-1д показывающую, что Т8 элюирует в конце фронта растворения, а Т9 элюирует на плече Т27.

Полный масс-спектр пептида Т8 показан на фиг. 64, где пик 436.2 соответствует прогнозируемой молярной массе однозарядного немодифицированного пептида Т8, и пик 1092.2 соответствует молярной массе однозарядного гликозилированного Т8. Масса, соответствующая главному пику и его структуре (Т8-Не^Ас-Нех-№иАс), показана в табл. 61.

Таблица 61

Таблица 3.2.З.3.1.4.1.Т03: Структура олигосахарида в пептиде Т8

Гликопептид	Прогнозируема я масса	Полученная масса
^модифицированный Т8	435	436.2 [М+Н]+
Т8-Гн-Г-А	1092	1092.2 [М+Н]+'

А - АНК;

Г - гексоза; Гн - НеxNΑс.

Полный масс-спектр пептида Т9 показан на фиг. 65, где появляются двух- и трехзарядные ионы гликопептидов, соответствуя ряду гетерогенных гликоформ. Главный пик 1115.9 соотносится с молярной массой трехзарядного Т9 гликозилированного с НеxNΑс-Неx-NеиΑс. Пики 1213.0 и 1334.8 соотносятся с молекулярной массой трехзарядного Т9, гликозилированного с НеxNΑс(NеиΑс)-Неx-NеиΑс и (НехNΑс(NеиΑс)-Неx-NеиΑс)² соответственно (табл.62). Доминантная гликоформа - это моносилированный Т9-НеxNΑс-Неx-NеиΑс, тогда как другие гликоформы представлены в гораздо меньшем количестве.

Таблица 62

Таблица 3.2.З.3.1.4.1.Т04: Структура олигосахарида в пептиде Т9

Гликопептид	Прогнозируемая масса	Фактическая масса
Неизмененный Т9	2689	1345.1 ГМ+2Н12+
Т9-Гн-Г-А	3345	1115.9 [М+ЗН13+
Т9-Гн-Г-А А	3637	1213.0 [М+ЗН]3+
Т9-Гн-Г-А Гн-Г-А	4002	1334.8 [М+ЗН]3+

А - АНК;

Г - гексоза; Гн - НеxNΑс.

Для того чтобы определить О-связанные сайты, было выполнено пептидное картирование СТИА41д так же, как было описано в примере 4, и участок Т8-9 (благодаря неполному расщеплению при помощи трипсина) был собран и подвергнут секвенированию по методу Эдмана. Данные этого анализа показывают, что в первом цикле появляется дополнительный пик. Время удержания этого пика не согласуется ни с какой стандартной аминокислотой, позволяя предположить, что Зег в точке 1 в Т8 (серин 129) модифицируется и содержит О-связанные гликаны. Появление серина и дополнительного пика показывает, что серин частично модифицируется. Это соответствует данным МЗ для Т8. Секвенирование также показало, что серин 139 в Т9 является О-связанным сайтом. В заключение, два сайта гликозилирования были определены в аминокислотных остатках серин 129 и серин 139. Доминирующий гликан, связанный с этими двумя центрами, - НеxNΑс-Неx-NеиΑс.

МАГ01-Т01·’ анализ пептида Т9.

Образец: стандарт СТЕА4-1д.

Трипсин/Акр-Т/Химотрипсин пептидное картирование СТЕА4-1д: белки денатурировали и редуцировали в Тпк буфере (р.Н 8.0), содержащем 6 М гуанидина и 5 мМ ДТТ. После 20-минутной инкубации

- 263 017765 при температуре 50°С в раствор добавляли йодоацетамид в финальной концентрации 10 мМ и образцы инкубировали в темноте при температуре 50°С еще 20 мин. Редуцированная и алкилированная смесь была залита в колонку NЛР-5 и затем подвергалась элюции с 50 мМ триса, 10 мМ СаС1₂, рН 8.0. После добавляли трипсин (2% в весовом отношении, фермент:белок) и смесь инкубировали при температуре 37°С в течение 4 ч. В случае расщепления с Азп^ добавляли Азп^ (4% в весовом отношении, фермент:белок) и затем смесь инкубировали при температуре 37°С в течение 16 ч.

В случае с расщеплением трипсином или химотрепсином белок находился в 50 мМ буфера из фосфата натрия, рН 7.5. Затем добавляли трипсин (4% в весовом отношении, фермент:белок) и смесь инкубировали при температуре 37°С в течение 4 ч. Если добавляли химотрепсин (4% в весовом отношении, фермент:белок), то смесь инкубировали при температуре 37°С в течение 16 ч. Поле расщепления образцы хранили при температуре -20°С.

Пептидные смеси разделили градиентным элюированием на колонке А!1ап!1з С18 (2.1х250 мм) на рабочей станции для ВЭЖХ (^а!егз, МИГогсТ МА) при 0.120 мл/мин. Колонку соединяли непосредственно с Р-То£ Ш1сго (^а!егз, МИГогсТ МА), оборудованной распыляющим ионизатором, с помощью которого были получены данные масс-спектра. В случае пептидного картирования Азр^ пептидные смеси разделяли на колонке Уапап С18 (4.6х250 мм) при 0.7 мл/мин с использованием рабочей станции для ВЭЖХ. Колонки уравновешивали растворителем А (0.02% ТФК в воде) и пептиды были элюированы увеличением концентрации растворителя В (95% ацетонитрила, 0.02% ТФК в воде). Для направления 15% полученного вещества в Р-То£ Ш1сго был использован клапан сплиттера. Прибор работал в положительном режиме (отношение массы к заряду 100-2000). Напряжение на капиллярах было установлено на уровне 3000 В.

Тандемная масс-спектрометрия пептидов. Образцы, прошедшие хроматографию, были собраны и залиты в Р-То£ Ш1сго с мощностью 20 мкл/мин. Тандемная масс-спектрометрия была проведена с использованием энергии столкновений, оптимизированной для конкретного пептида (варьируется от 25 до 42 эВ).

Результаты.

Окисление СТ^А4-Iд: СТ^А4-Iд содержит 7 метионинов на одну цепь: Ме!¹, Ме!⁵³, Ме!⁵⁴, Ме!⁸⁵, Ме!⁹⁷, Ме!¹⁶² и Ме!³³⁸. Для определения вариантов окисленных продуктов в каждом из этих центров было проведено пептидное картирование. Окисление Ме!¹, Ме!⁸⁵ и Ме!¹⁶² было выявлено методом пептидного картирования (фиг. 67). В Ме!³³⁸ окисление не выявлено. Триптидные фрагменты, содержащие Ме!⁵³, Ме!⁵⁴ и Ме!⁹⁷, - это большие пептиды, содержащие гетерогенные N-связанные углеводы. Эти пептиды не пригодны для идентификации и сравнительного количественного анализа окисления. Таким образом, был совершен протеолиз с использованием нескольких ферментов, которые производят короткие, не гликозилированные пептиды. Пептид Азр^ ЕVСААТΥММСN (46-56) и триптидный/химотриптидный пептид МУРРРУ (97-102) были использованы для определения окисления Ме!⁵³, Ме!⁵⁴ и Ме!⁹⁷. Относительное окисление метионина высчитывается соответственно относительной площади пика ионной хроматограммы. Сравнительное количество окисленных пептидов приведено в табл. 63. Выявлено окисление по шести метионинам из семи, содержащихся в одной цепочке СТ^А4-Iд. Пики А и В - единственные окисленные формы пептидов ЕVСЛЛТΥММСN (46-56) (пик 3). Пептиды из пиков 2А и 2В изобарические и имеют увеличение массы в 16 в сравнении с массой немодифицированных пептидов. Каждый пик характеризует окисление по разным метионинам. Степень окисления различна в двух центрах.

Таблица 63

Оксидирование метионинов в СТ^А4-Iд

Метио НИН	Пептид	Прогнози рованная масса(не оке.)	Полученн ая масса (не оке.)	Прогноз ируемая масса (оке.)	Получен ная масса (оке.)	Процент оксидиро вания
1	ΑΤΙ: АМНУАЭРАЗУЬАЗЖ	768.9 (+2)	768.9	776.91 (+2)	776.9	0.9
1	Т1: МНУА<2РАУУЬА88К	733.4 (+2)	733.4	741.4 (+2)	741.4	2.4
53	ϋ5: ΕνΟΑΑΤΥΜΜΟΝ	1246.5	1246.6	1262.5	1262.5	3.4
54	ϋ5: ΕνΟΑΑΤΥΜΜΟΝ	1246.5	1246.6	1262.5	1262.6	4.3
85	Тб: амотсьуюк:	1171.6	1171.5	1187.6	1187.5	1.0
97	ΜΥΡΡΡΥ	767.3	767.9	783.3	783.9	1.5
162	Т10: ОТЬМ18К	835.4	835.4	851.4	851.4	1.7
338	ТЗО: \У99ООУР8С8УМНЕАЬН1ЧНУТ0 К	1401.1 (+2)	1401.1	1409.1 (+2)

* Из-за того что степень окисления АТ1 была минимальной, она не была включена в расчеты общего окисления СТ^А4-Iд.

Результаты общей количественной оценки окисления метионина в составе СТ^А4-Iд согласно расчетам составляют 2.0%. Расчет производился при сложении общего процента окисления в каждом участке и делении на общее число остатков метионина, которое равно семи. МС/МС анализ проводился для

- 264 017765 окисленных и нативных пептидов, которые перечислены в табл. 63.

Все пептиды за исключением Ό5 были просеквенированы с использованием МС/МС. Количество окисленных аминокислот определялось по различию масс в ионных сериях Ь и у. Спектр МС/МС для окисленного и нативного пептида Т1 содержит ионы-предшественники с двойным зарядом с т/ζ 741.4 и 733.4. Различие между массами составляет 8 (для состояния с двойным зарядом), а при коррекции на заряженное состояние - 16 ед. Трипсиновый пептид Т1 (1-14) содержит остаток Ме!¹. Нативный пептид и его окисленное производное исходно разделяют с использованием обращенно-фазовой хроматографии. Ионная хроматограмма для ионов с двойным зарядом Т1 и его производных показана на фиг. 67. Ионные серии Ь и у являются предоминантными ионами, образующимися при индуцированной столкновениями диссоциации. Ионы у6-у13 характеризуются одинаковыми модифицированными и немодифицированными массами. Ион Ь2 окисленного пептида на 16 ед. больше соответствующего иона Ь2 нативного пептида. Ионные серии Ь и у вместе с массами пептидов позволяют идентифицировать метионин 1 как модифицированную аминокислоту в составе пептида Т1. Таким же способом определяется окисление Ме! в пептидах АТ1, Т6, Т10 и МΥΡΡΡΥ (97-102).

Дезаминирование СТ^Λ4-Iд: СТ^Λ4-Iд содержит 15 остатков аспарагина в одной цепи. Известно, что три аспарагиновых остатка соединяются с Ν-связанными карбогидратными структурами. Картирование пептида использовалось для идентификации и относительной количественной оценки дезаминирования, происходящего в остальных 12 остатках Асн. Дезаминирование Асн , Асн , Асн , Асн и Асн³⁴⁴ идентифицировали при помощи ЖХ/МС картирования с трипсиновым пептидом (табл. 64). Относительная количественная оценка дезаминирования аспарагина рассчитывается по процентной площади пика на экстрагированных ионных хроматограммах. Относительные количества дезаминированных пептидов перечислены в табл. 64. Согласно оценкам общая величина дезаминирования аспарагина в составе СТ^Λ4-Iд по результатам расчетов составляет 0.3%. Расчет производился при сложении общего процента дезаминирования и делении на 15. Результаты анализа МС/МС, проведенного для дезаминированных и нативных пептидов, представлены в табл. 64.

Таблица 64

Дезаминирование Асн в составе СТ^Λ4-Iд

Ас н	Пептид	Предполагае мая масса недезаминир ованного вещества	Зафиксир ованная масса недезами нированн ого вещества	Предполага емая масса дезаминиро ванного вещества	Зафиксирован ная масса дезаминирова иного вещества	Процент дезаминиро вания
18 6	Τ12: ΡΝν/ΥνϋΟνΕνΗΝ АК	839,4 (+2)	839,4	839,9 (+2)	839,9	0,9
22 5	Τ15: УУЗУЬТУЬНСУОХУ εν ОК	904,5 (+2)	904,5	905,0 (+2)	905,0 / 905,0	1,5/0,8
27 1	Т25: Νζ)ν8ΕΤΟΕνΚ	1161,6	1161,7	1162,6	1162,7	0,3
29 4	Т26: ΟΡΥΡδϋΙΑνΕλνΕδ ΝΟ ΟΡΕΝΝΥΚ	1272,6 (+2)	1272,6	1273, 1 (+2)	1273,1	1,2
34 4	ТзоГ λνς&ΟΝνΡδΟδν МНЕ ΑΌΗΝΗΥΤΟΚ	1401,1 (+2)	1401,2	1401, 6 (+2)	1401,7	0,2

Дезаминированную кислоту определяли по различию между массами в сериях Ь и у. Например, при наличии двух дезаминированных пиков для пептида Т1 5 - массы 905.0 ед. Пик 1 элюирует до нативного пика; пик 3 элюирует после нативного пика. Трипсиновые пептиды и их дезаминированные формы исходно разделяются в обращенно-фазовую колонку. Результаты анализа МС/МС для трипсиновых пептидов и дезаминированных пептидов указаны в табл. 64. Пики 1-3 содержат одни и те же ионы у1 и у2, что указывает на то, что аминокислоты С-концевого участка одинаковы для всех трех пиков; однако ионы у3-у14 из пиков 1 и 3 на 1 ед. больше, чем соответствующие ионы из пика 2. Различия в массе между у2 и у3 для пика 2 составляют 114 ед., что соответствует наличию остатка Асн. Различие в массе, равное 115 ед., для пиков 1 и 3 отражает увеличение массы на 1 ед. по сравнению с массой остатка Асн; это соответствует наличию аспарагиновой или изоаспарагиновой кислоты. Аналогичным образом проводилась идентификация дезаминирования в Т12, Т25, Т26 и Т30 и оценка идентичности ионных фрагментов в модифицированных участках.

Дезаминирование аспрагина и окисление метионина определялось при расщеплении СТ^Λ4-Iд эндопептидазой с использованием анализов ЖХ/МС и ЖХ/МС/МС. Модификации идентифицировали по изменению масс модифицированных пептидов по сравнению с немодифицированными пептидами. Модифицированные аминокислоты идентифицировали при помощи МС/МС секвенирования. В небольшом проценте в материале СТ^Λ4-Iд присутствуют шесть участков окисленного метионина и пять участков дезаминированного аспарагина. Было выявлено, что Ме!¹, Ме!⁵³, Ме!⁵⁴, Ме!⁸⁵, Ме!⁹⁷ и Ме!¹⁶² в составе СТ^Λ4-Iд находятся в окисленном состоянии. Эти участки окисленного метионина в составе СТ^Λ4-Iд составляют менее 2.5% от всех остатков метионина в составе СТ^Λ4-Iд. Было показано, что остатки Асн¹⁸⁶, Асн²⁵⁵, Асн²⁷¹, Асн²⁹⁴ и Асн³⁴⁴ находятся в дезаминированном состоянии в небольших количест

- 265 017765 вах. Эти участки дезаминированного аспарагина в составе СТ^Λ4-[д составляют менее 0.5% от всех остатков аспарагина в СТ^Λ4-Iд.

Пример 48. Анализ СТ^Λ4-Iд и СТ^Λ^{4Λ29Υ^104Е}-Iд на бактериальные эндотоксины.

В одной из модификаций в состав лекарственного препарата СТ^Λ4-[д входит 0.15 ЕЭ/мг бактериальных эндотоксинов или менее. Был проведен количественный анализ на наличие бактериальных эндотоксинов в составе СТ^Λ4-[д с использованием метода лизирования сгустка в геле лизатом амебоцитов Ыти1и8 (БАБ) в соответствии с требованиями Фармакопеи США <85>. При приготовлении к анализу и при его проведении необходимо соблюдать осторожность в обращении с образцами во избежание массивной микробной контаминации; необходимо обрабатывать все контейнеры и приборы с целью устранения инородных эндотоксинов, которые могут присутствовать на их поверхностях, с использованием таких методов, как обработка в сухожаровом шкафу с использованием валидизированного цикла.

Реагент для БАБ: (производства филиалов корпорации Саре Сод - или эквивалентные реагенты) лиофилизированный Ытп1и5.

Реагент лизат амебоцитов (БАБ), такой как Пиротелл, необходимо хранить в соответствии с инструкциями производителя. Разведенный реагент БАБ можно хранить в замороженном состоянии не дольше одного месяца; реагент не должен размораживаться и замораживаться более одного раза.

Стандарты эндотоксина: (производства филиалов корпорации Саре Сод - или эквивалентные реагенты). Контрольный стандартный эндотоксин (КСЭ) для этого теста должен быть доступным и стандартизированным по отношению к стандартному референсному эндотоксину (СРЭ). Контейнеры с неразведенным эндотоксином должны храниться в холодильнике; после разведения они должны храниться при температуре 2-8°С не более 14 дней, за исключением ситуаций, когда при валидации будет показана пригодная реактивность при более длительных периодах хранения.

Тестирование производственных серий.

Для каждой лекарственной формы должно быть валидизировано отсутствие ингибирования продукта или усиление при процедуре БАБ. Тестирование производственных партий производится с использованием трех отдельных наборов, представляющих начало, середину и конец производства. Наборы образцов могут тестироваться по отдельности или совместно. При проведении валидационного тестирования необходимо использовать репрезентативный положительный контроль препарата с известной чувствительностью к лизату в той же концентрации, что и тестируемый образец, в который добавляют двойной объем КСЭ (или РСЭ). Необходимо скорректировать рН готового продукта/раствора лизата таким образом, чтобы он был в диапазоне от 6.0 до 8.0, с использованием стерильного, не содержащего эндотоксин раствора НС1, №0Н или подходящего буфера. В некоторых ситуациях можно использовать такие буферные агенты, как пиразол в качестве альтернативного средства для корректировки рН. Подробная информация по применению описана в инструкции производителя.

Применение буферного агента для разведения лизата.

Буферные агенты, такие как пиразол (производства филиалов корпорации Саре Сод), используются для разведения лизата, применяемого для тестирования, и предназначены для увеличения буферной емкости лизата. Разведенный пиразолом лизат можно использовать для тестирования образцов или разведения образцов. Если пиразол не используется, может потребоваться коррекция рН с применением кислоты или основания, либо возможна преципитация при коррекции рН. При добавлении в тестируемый образец лизат, разведенный пиразолом, придает ему розовую окраску, что указывает на то, что рН соответствует диапазону валидационного теста. Если значения выходят за пределы диапазона, раствор приобретает желтую или пурпурную окраску; в этом случае необходима дополнительная коррекция рН тестируемого образца. Способ применения пиразола для разведения лизата определяется в зависимости от конкретного метода.

Применение глюкагон-ингибирующего буфера для разведения лизата.

Глюкагон-ингибирующие буферы, такие как глюкашилд (производства филиалов корпорации Саре Сод), используются для разведения лизата, используемого для тестирования, и разработаны для блокирования потенциальных взаимодействий с глюкагоном. Разведенный при помощи глюкозил лизат может использоваться для тестируемых образцов или разведений образцов, которые могут содержать глюкагон. В результате контаминации глюкагоном при тестировании некоторых продуктов могут быть получены ложноположительные ответы. Таким образом, использование разведенных при помощи глюкозил лизатов может блокировать или уменьшать подобную интерференцию и снижать количество ложноположительных результатов. Способ применения глюкозил для разведения лизата определяется в зависимости от конкретного метода.

Разведения образцов.

При необходимости скорректировать концентрации эндотоксина в образце необходимо приготовить соответствующие серии разведений образцов в стерильной воде, не содержащей эндотоксины. Перемешайте и добавьте 0.1 мл каждого тестируемого препарата в две стерильные, не содержащие эндотоксин стеклянные пробирки для тестирования размером 10x75 мм.

Приготовление стандартных растворов эндотоксина для построения стандартных кривых.

Разведите содержащийся во флаконе эндотоксин водой, не содержащей эндотоксин, в соответствии

- 266 017765 с инструкциями производителя. Тщательно перемешайте содержимое флакона при помощи вихревого смесителя в прерывистом режиме в течение 30 мин. Хранить концентрат можно в холодильнике при температуре 2-8°С не более 4 недель. До использования раствор необходимо тщательно перемешать при помощи вихревого смесителя в течение не менее 3 мин. Проверьте концентрацию маточного раствора эндотоксина по сертификату анализа производителя и приготовьте стандартные серии разведения эндотоксина таким образом, чтобы диапазон разведений включал требуемые значения, как указано ниже в примере:

0.5 мл (1000 ЕЭ/мл) + 9.5 мл воды, не содержащей эндотоксин = 50 ЕЭ/мл;

5.0 мл (50 ЕЭ/мл) + 5.0 мл воды, не содержащей эндотоксин = 25 ЕЭ/мл;

1.0 мл (25 ЕЭ/мл) + 9.0 мл воды, не содержащей эндотоксин = 2.5 ЕЭ/мл;

1.0 мл (2.5 ЕЭ/мл) + 9.0 мл воды, не содержащей эндотоксин = 0.25 ЕЭ/мл;

5.0 мл (0.25 ЕЭ/мл) + 5.0 мл воды, не содержащей эндотоксин = 0.125 ЕЭ/мл;

5.0 мл (0.125 ЕЭ/мл) + 5.0 мл воды, не содержащей эндотоксин = 0.06 ЕЭ/мл;

5.0 мл (0.06 ЕЭ/мл) + 5.0 мл воды, не содержащей эндотоксин = 0.03 ЕЭ/мл;

5.0 мл (0.03 ЕЭ/мл) + 5.0 мл воды, не содержащей эндотоксин = 0.015 ЕЭ/мл.

Тщательно перемешайте каждый раствор с разными разведениями в течение минимум 30 с перед тем, как приступить к работе со следующим разведением. Следует использовать отрицательный водный контроль, в качестве которого должен выступать используемый растворитель. Перемешайте и добавьте по 0.1 мл каждого раствора с концентрациями 0.125 ЕЭ/мл, 0.06 ЕЭ/мл, 0.03 ЕЭ/мл, 0.015 ЕЭ/мл (или растворы с альтернативной последовательностью концентраций) и отрицательного водного контроля в две стеклянные пробирки, не содержащие эндотоксин, размером 10х75 мм для получения двух дублирующихся кривых.

Приготовление раствора реагента ТАТ.

Достаньте лиофилизированный реагент ЬАЬ из холодильника. В асептических условиях добавьте 0.5 мл воды, не содержащей эндотоксин, во флакон (за исключением случаев, когда специфический метод требует разведения буфером). Перемешайте или встряхните содержимое флакона для растворения реагента.

Приготовление положительного контроля продукта.

Все продукты должны тестироваться с использованием положительного контроля. Ознакомьтесь с соответствующей инструкцией для специфического метода по приготовлению положительного контроля. Если инструкция отсутствует, приготовьте положительный контроль продукта, содержащий эндотоксин, таким образом, чтобы его пик в 2 раза превышал уровень чувствительности лизата в комбинации с продуктом в тестируемой концентрации. При тестировании воды для инъекций или воды для процессов высокого качества используйте такое разведение разбавленного стандартного эндотоксина, чтобы при добавлении к образцу концентрация эндотоксина в 2 раза превышала чувствительность раствора ТАП Например, если чувствительность лизата составляет 0.06 ЕЭ/мл, добавьте 0.1 мл раствора эндотоксина с концентраций 2.5 ЕЭ/мл к 1.9 мл тестируемого образца (в форме, добавляемой к раствору ТАТ) = 0.125 ЕЭ/мл.

Объем раствора эндотоксина не должен быть больше 0.1 мл, а общее разведение - не менее 1:20.

Процедура тестирования.

1. В асептических условиях растворите 0.1 мл раствора реагента ТАТ в каждой пробирке с тестируемым образцом и в пробирках со стандартом эндотоксина, обращая внимание на то, чтобы содержимое пробирок не попадало в другие пробирки. Примечание: оставшийся реагент поместите в холодильник и храните при температуре от -10 до -25°С.

2. Порядок приготовления смеси лизат-продукт представлен в соответствующем вкладыше с инструкцией к лизату.

3. Поместите каждую пробирку в инкубатор, например на водяную баню или в нагревательный блок, в котором необходимо поддерживать температуру на уровне 37±1°С. Отметьте время начала инкубации и температуру водяной бани или нагревательного блока.

4. Инкубируйте каждую пробирку непрерывно в течение 60±2 мин.

5. После инкубации отметьте время ее окончания и рассмотрите содержимое приборок, осторожно переворачивая их на 180°. О положительном результате свидетельствует получение плотного геля, который сохраняет структуру при осторожном перевертывании пробирки, отрицательный результат характеризуется отсутствием такого геля или образованием вязкого геля, который не сохраняет свою структуру. Работайте с пробирками осторожно и не допускайте воздействия вибрации, что может стать причиной получения ложноотрицательных результатов.

Оценка.

Минимальная концентрация в каждой из дублированных серий, при которой получается положительный результат, называется конечной точкой. Рассчитайте геометрическую среднюю конечную точку для теста по следующей формуле:

- 267 017765 геометрическое среднее = антилогарифм логарифмической суммы конечных точек гелеобразования, разделенный на число дублированных анализов по определению конечной точки.

В результате теста можно получить геометрическую среднюю конечной точки, значение которой лежит в пределах двойного разведения установленной инструкцией чувствительности лизата; для положительного контроля продукта результат положительный, для отрицательного водного контроля - отрицательный. Определите приблизительный уровень бактериального эндотоксина для тестируемого образца при сравнении установленной инструкции чувствительности лизата с положительными или отрицательными результатами с учетом коэффициентов разведения тестируемых образцов. Вещество отвечает критериям теста, если образования плотного геля не происходит при уровне эндотоксина, описанном в отдельных монографиях или спецификации.

Метод для СТЬА4^{А29¥Ъ104Е}-1д.

Этот метод используется для характеристики бактериальных эндотоксинов в образцах лекарственного вещества СТЬА4^{А29¥Е104В}-1д и лекарственного продукта с применением кинетического турбидиметрического метода ЬАЬ. Результаты описываются в ЕЭ/мл или ЕЭ/мг эквивалента лекарственного продукта.

Термины:

^Λ^ - лизат амебоцитов Ь1ти1ик;

КСЭ - контрольный стандартный эндотоксин;

ЕЭ - единицы эндотоксина по фармакопее США;

ЕЭ/мг - единицы эндотоксина по фармакопее США на миллиграмм;

ЕЭ/мл - единицы эндотоксина по фармакопее США на миллилитр;

ЬК^ - водный реагент ГАЕ

Турбидиметрический раствор лизата амебоцитов Ь1ти1ик (Пнротелл-Т®). Перед вскрытием дайте флаконам с Пнротелл-Т и Пиразол нагреться до комнатной температуры в течение 30 мин. Удалите металлическую крышку с флакона с Пнротелл-Т® и в асептических условиях откройте пробку. Разбавьте Пнротелл-Т® при помощи 5.0 мл буфера для разведения Пиразол®. Осторожно встряхните флакон для того, чтобы смешать и полностью растворить содержимое. Разбавляйте буфер непосредственно перед применением. Разведенный Пиротелл-Т можно хранить при температуре 2-8°С не более 24 ч. Закройте контейнер слоем Парафилма®.

Раствор контрольного стандартного эндотоксина. Перед вскрытием флакона позвольте КСЭ (1.2) нагреться до комнатной температуры в течение 30 мин. Удалите металлическую крышку и в асептнческих условиях откройте пробку. Осторожно приоткройте пробку таким образом, чтобы во флакон попал воздух, при этом нарушаются вакуумные условия. Разбавьте контрольный стандартный эндотоксин (КСЭ) 5.0 мл ЬК^ (1.4). Покройте слоем Парафилма. Тщательно перемешивайте в течение 1 мин с 5-10минутными интервалами в течение 30-60 мин при комнатной температуре. Теперь КСЭ готов к применению. Для получения необходимой активности контрольного стандартного эндотоксина (КСЭ) в ЕЭ по Фармакопее США на флакон при использовании специфической серии Пнротелл-Т® см. сертификат анализа производителя. Рассчитайте содержание КСЭ во флаконе в И8Р-ЕЭ/мл. Разведенный КСЭ можно хранить при температуре 2-8°С в течение 30 дней. После каждого применения покрывайте контейнер новым слоем Парафилма®.

Пример.

Для получения активности 6.000 И8Р-ЕЭ на флакон добавьте 5.0 мл ЬК^, полученная активность составит 1.200 И8Р-ЕЭ/мл.

Активность = 6.000 ЕЭ/флакон/5.0 мл = 1,200 ЕЭ/флакон.

Установите параметры анализа в программе Пнромофт-11®. Общие параметры. Установите параметры в таблице с общей информацией по тестированию, как показано в таблице ниже.

- 268 017765

Общая информация по тестированию

Параметр	Значение
Валидный минимальный температурный диапазон	36,5
Валидный максимальный температурный диапазон	37,5
Минимальный диапазон для выхода пика	50
Максимальный диапазон для выхода пика	200
Порог ОП (мАбс)	20
Макс. ОП при хранении (мАбс)	100
Максимальное время тестирования (мин)	120
Исходная скорректированная активность	Проверено
Автоматическое окончание	Не проверено
Проверка отрицательного контроля	Не проверено
Опции
Индикаторный коэффициент корреляции	Проверено
Дисплейный коэффициент корреляции	Не проверено
Индикаторный коэффициент корреляции	Не проверено
Экстраполяция	Не проверено
№ авто-теста	Не проверено
Показ записи ложных результатов	Проверено
Автоматическая печать	Не проверено

Распределение пробирок - пример

Пробирка №	Описание	Стандартная/пиковая концентрация	Единицы	Разведение образца
1	Отрицательный контроль		ЕЭ/мл
2	Отрицательный контроль		ЕЭ/мл
3	Стандарт	0.064	ЕЭ/мл
4	Стандарт	0.064	ЕЭ/мл
5	Стандарт	0.032	ЕЭ/мл
6	Стандарт	0.032	ЕЭ/мл
7	Стандарт	0.016	ЕЭ/мл
8	Стандарт	0.016	ЕЭ/мл
9	Стандарт	0.008	ЕЭ/мл
10	Стандарт	0.008	ЕЭ/мл
И	Стандарт .	0.004	ЕЭ/мл
12	Стандарт	0.004	ЕЭ/мл
13	Стандарт	0.002	ЕЭ/мл
14	Стандарт	0.002	ЕЭ/мл
15	Образец 1		ЕЭ/мл	1:1
16	Образец 1		ЕЭ/мл	1:1
17	Образец 1 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
18	Образец 1 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
19	Образец 2		ЕЭ/мл	1:1
20	Образец 2		ЕЭ/мл	1:1
21	Образец 2 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
22	Образец 2 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
23	Образец 3		ЕЭ/мл	1:1
24	Образец 3		ЕЭ/мл	1:1
25	Образец 3 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
26	Образец 3 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
27	Образец 4		ЕЭ/мл	1:1
28	Образец 4		ЕЭ/мл	1:1

- 269 017765

29	Образец 4 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
30	Образец 4 Пик	0.016	ЕЭ/мл	1:1
31	Положительный водный контроль	0.016	ЕЭ/мл
32	Положительный водный контроль	0.016	ЕЭ/мл

Приготовление стандартной кривой концентрации. Приготовьте рабочий маточный раствор контрольного стандартного эндотоксина (КСЭ) с концентрацией 4 ИЗР-ЕЭ/мл. Приготовьте рабочий раствор КСЭ с активностью 4 ЕЭ/мл. Рассчитайте необходимый для разведения объем ЕКШ с использованием уравнения 1. Добавьте 20 мкл раствора КСЭ (2.2) к соответствующему количеству (уравнение 1) ЕКШ (1.4) в полистероловой пробирке (1.9). Перемешивайте в течение 30 с.

Пример.

Для получения раствора КСЭ с активностью 1.200 ЕЭ/мл добавьте 20 мкл раствора КСЭ к 0.980 мкл ι.ι/\ν.

Объем ЬКУ/ = (20 мкл * 1,200 ЕЭ/мл / 4 ЕЭ/мл) - 20 мкл

Приготовьте рабочий маточный раствор КСЭ с активностью 0.64 ЕЭ/мл. Приготовьте рабочий раствор КСЭ с активностью 0.64 ЕЭ/мл, добавив 1.6 мл маточного раствора КСЭ с активностью 4 ИЗРЕЭ/мл к 8.4 мл ЕКШ в полистероловой пробирке. Перемешивайте в течение 30 с.

Приготовьте стандартные маточные растворы. Стандартные маточные растворы готовятся с активностью 0.128, 0.064, 0.032, 0.016, 0.008 и 0.004 ЕЭ/мл из рабочего раствора и КСЭ в полистероловых пробирках. Перемешивайте содержимое каждой пробирки в течение 30 с после разведения. Схемы разведения показаны в таблице ниже.

Схема разведения для стандартных маточных растворов

Объем раствора (мкл) с определенной концентрацией	(мл)	Концентрация (МЕ/мл)
2 мл раствора с концентрацией 0,64 ЕЭ/мл	8	0.128
4 мл раствора с концентрацией 0,128 ЕЭ/мл	4	0.064
4 мл раствора с концентрацией 0,064 ЕЭ/мл	4	0.032
4 мл раствора с концентрацией 0,032 ЕЭ/мл	4	0.016
4 мл раствора с концентрацией 0,016 ЕЭ/мл	4	0.008
4 мл раствора с концентрацией 0,008 ЕЭ/мл	4	0.004

* Конечное двукратное разведение получается в реакционных пробирках.

Приготовление образца. Приготовление образца лекарственного препарата. Приготовьте разведение образца с концентрацией 0.25 мг/мл. Рассчитайте объем ЬКЖ, необходимый для разведения, с использованием представленного ниже уравнения. Осторожно удалите верхний слой образца в контейнере и добавьте 50 мкл образца к соответствующему количеству (см. уравнение) ЬКЖ в полистероловой пробирке для получения раствора с концентрацией 0.25 мг/мл. Перемешивайте образец в течение 30 с. Закройте образец в контейнере слоем Парафилма®.

Пример.

Для приготовления образца с концентрацией 24.7 мг/мл добавьте 50 мкл (0.05 мл) образца к 4.89 мл воды.

Уравнение 2:

Объем ЬА¥К (мл) = (0,05 * концентрация белка (мг/мл)/0,25 мг/мл) - 0,05 мл

Приготовление образца лиофильного лекарственного продукта. Примечание: одна серия лекарственного продукта включает три отдельных образца: начало, середина и конец. Разбавьте лекарственный продукт во флаконе водным реагентом ΕΑΕ в соответствии со спецификациями по идентификации продукта (ИП). Разбавьте разведенные образцы до концентрации 0.25 мг/мл. Рассчитайте необходимый для разведения объем ЬК/Ж с использованием уравнения 2. Тщательно удалите верхний слой образца в контейнере и добавьте 50 мкл образца к соответствующему количеству (уравнение 2) ЬКЖ в полистероловую пробирку для получения раствора с концентрацией 0.25 мг/мл. Перемешивайте образец в течение 30 с. Закройте образец в контейнере слоем Парафилма.

Приготовление готового к употреблению образца лекарственного продукта. Разбавьте образец до концентрации 0.25 мг/мл. Рассчитайте необходимый для разведения объем ЬК/Ж с использованием уравнения 3. Тщательно удалите верхний слой образца в контейнере и добавьте 10 мкл образца к соответствующему количеству (уравнение 3) ЬКЖ в полистероловую пробирку для получения раствора с концентрацией 0.25 мг/мл. Перемешивайте образец в течение 30 с. Закройте образец в контейнере слоем Парафилма.

- 270 017765

Пример.

Для приготовления образца с концентрацией 125.0 мг/мл добавьте 10 мкл (0.01 мл) образца к 4.99 мл воды.

Уравнение 3:

Объем ЬХУК (мл) ~ (0,01 * концентрация белка (мг/мл)/0,25 мг/мл) - 0,01 мл

Готовый к употреблению образец плацебо лекарственного продукта. Разбавьте плацебо (точно таким же образом, как и белковый лекарственный продукт с номинальной концентрацией 125 мг/мл) до получения концентрации 25 мг/мл. Это эквивалентно разведению 1:500. Рассчитайте необходимый для разведения объем ЕКА с использованием уравнения 3. Тщательно удалите верхний слой образца в контейнере и добавьте 10 мкл образца к соответствующему количеству (уравнение 3) ЬКА в полистероловую пробирку для получения раствора с концентрацией 0.25 мг/мл.

Положительный водный контроль. Положительный водный контроль готовят с использованием стандартной кривой при добавлении 100 мкл стандарта с концентрацией 0.032 ЕЭ/мл к 100 мкл ЬКА в реакционные пробирки.

Подготовка реакционных пробирок - пример

Пробирка №	Описание	Концентрация стандартного маточного раствора (ЕЭ/мл)	Стандарт/образцы (мкл)	(мкл)	Пик раствора (мкл)	Концентра ция (ЕЭ/мл)
1	Отрицательный контроль	-	0	200	0	0,000
2	Отрицательный контроль	-	0	200	0	0,000
3	Стандарт 1	0,004	100	100	0	0,002
4	Стандарт 1	0,004	100	100	0	0,002
5	Стандарт 2	0,008	100	100	0	0,004
6	Стандарт 2	0,008	100	100	0	0,004
7	Стандарт 3	0,016	100	100	0	0,008
8	Стандарт 3	0,016	100	100	0	0,008
9	Стандарт 4	0,032	100	100	0	0,016
10	Стандарт 4	0,032	100	100	0	0,016
11	Стандарт 5	0,064	100	100	0	0,032
12	Стандарт 5	0,064	100	100	0	0,032
13	Стандарт 6	0,128	100	100	0	0,064
14	Стандарт 6	0,128	100	100	0	0,064
15	Образец 1		100	100	0	не известно
16	Образец 1		100	100	0	не известно
17	Образец 1 Пик		100	0	100	Исходная + 0,016
18	Образец 1 Пик		100	0	100	Исходная + 0,016
19	Образец 2		100	100	0	не известно
20	Образец 2		100	100	0	не известно
21	Образец 2 Пик		100'	0	100	Исходная + 0,016
22	Образец 2 Пик		100	0	100	Исходная + 0,016
23	Образец 3		100	100	0	не известно
24	Образец 3		100	100	0	не известно
25	Образец 3 Пик		100	0	100	Исходная + 0,016
26	Образец 3 Пик		100	0	100	Исходная + 0,016
27	Образец 4		100	100	0	не известно
28	Образец 4		100	100	0	не известно
29	Образец 4 Пик		100	0	100	Исходная + 0,016
30	Образец 4 Пик		100	0	100	Исходная + 0,016
31	Положительный водный контроль	0,032	0	100	100	0,016
32	Положительный водный контроль	0,032	0	100	100	0,016

Добавление реагента Пиротелл-Т®. Добавьте по 50 мкл раствора Пиротелл-Т® в каждую реакционную пробирку (отрицательный контроль, стандарты, образцы, меченые образцы и положительный водный контроль) при помощи пипетки. Перемешайте содержимое каждой пробирки в течение 1-2 с и поместите их в соответствующие ячейки (табл. 1) прибора Пирос Кинетике.

Анализ данных.

Анализ. При помощи программного обеспечения ПироСофт®Л 1 проводится автоматический анализ всех стандартов, контролей и образцов и по завершении пробега выдается отчет результатов для тес

- 271 017765 тируемых образцов в ЕЭ/мл. Для каждых дублированных образцов выдается средний из двух значений результат. Если значение, полученное для пробирки из дублированной пары, не распознается программой ПироСофр=11, пробирка может быть исключена из дальнейшего анализа данных и результаты будут повторно пересчитаны. Пиковый выход (положительный контроль образца) рассчитывается на основании количества эндотоксина в образце (0.016 ЕЭ/мл).

Перевод значений с ЕЭ/мл в ЕЭ/мг для разведенного лекарственного вещества или лекарственного продукта.

Пример.

Исходные данные выдаются в ЕЭ/мл и сообщаются в ЕЭ/мг белка. Для перевода значений из ЕЭ/мл в ЕЭ/мг разделите значение, полученное для эндотоксина (ЕЭ/мл), на концентрацию белка (0.125 мг/мл). Округлите результат до целого числа.

Пример.

Для образца, при анализе которого получено значение 0.23 ЕЭ/мл, эта величина в ЕЭ/мг составит 2 ЕЭ/мг (1.8 округляется до целого числа) (0,23 ЕЭ/мл / 0,125 мг/мл) = 1,84 ЕЭ/мг = 2 ЕЭ/мг

Результат для образца лекарственного вещества. Результат округляется до целого числа. Предел количественного определения (РЬ) для этого анализа составляет 0.02 ЕЭ/мг. При концентрации образца <0.02 ЕЭ/мг выдается следующий результат: [<РЬ, (ОЕ 0.02 ЕЭ/мг)].

Результат для образца лекарственного вещества. Результат округляется до целого числа. Предел количественного определения (РЬ) для этого анализа составляет 0.02 ЕЭ/мг. При концентрации образца <0.02 ЕЭ/мг сообщается такой же результат, как и для образца лекарственного продукта. Для образцов лекарственного продукта сообщается средний результат из трех образов для каждой серии лекарственного продукта в ЕЭ/мг, округленный до целого числа (начало, середина, конец). В случаях, когда результаты для одного или более образцов в серии будут ОЕ (0.02 ЕЭ/мг), для расчета среднего будет использоваться значение 0.02 ЕЭ/мг. При значении среднего < 0.02 ЕЭ/мг выдается следующий результат: [<рЬ, (рй=0.02 ЕЭ/мг)].

Пример. __________________________________________________

Образцы из партии лекарственного препарата	Значение, ЕЭ/мг
Начало	«2Ь = 0,02 ЕЭ/мг
Середина	0,023
Конец	0,031
Полученное значение (среднее)	0,02 ЕЭ/мг

В этом примере для плацебо лекарственного продукта будет сообщен результат: 3 ЕЭ/мл, что эквивалентно 0.02 ЕЖ/мг при номинальной концентрации лекарственного продукта 125 мг/мл.

Пригодность системы. Образцы лекарственного вещества необходимо получать в полистероловых контейнерах при температуре 2-8°С. Нельзя использовать для анализа образцы, получаемые в разных контейнерах и при разных температурах. Коэффициент определения для стандартной кривой (г²) должен быть >0.99. Если значение г² <0.99, анализ не действителен и нуждается в повторении. Средний результат измерения концентрации эндотоксина в отрицательном контроле должен быть <0.002 ЕЭ/мл. Если значение для отрицательного контроля >0.002 ЕЭ/мл, анализ не действителен и нуждается в повторении. Значение для меченого образца должно быть в пределах диапазона 50-200% от ожидаемого значения. Если значение для меченого образца <49% или >201% от ожидаемого, анализ не действителен и нуждается в повторении. Значения для эндотоксина должны попадать в диапазон стандартной кривой для эндотоксина (от 0.002 до 0.064 ИЗР-ЕЭ/мл). Если в образцах значения <0.002 ЕЭ/мл, эти результаты не достигают предела количественного определения метода и сообщаются, как описано в разделе 5.4. Если значение в образце >0.064 ИЗР-ЕЭ/мл, образцы необходимо развести до получения значений, соответствующих диапазону метода.

Пример 49. Микробиологический контроль (бионагрузка) для СТ^А4-Iд.

Этот метод включает процедуры тестирования с целью оценки количества жизнеспособных аэробных микроорганизмов и подтверждения отсутствия определенных видов микробов.

В одной из модификаций в составе СТ^А4-Iд бионагрузка должна быть на уровне <1 КОЕ/10 мл.

При приготовлении и проведении тестов соблюдайте правила асептики при обращении с образцами. Термин рост определяется как наличие предполагаемой пролиферации жизнеспособных микроорганизмов. Валидность результатов тестирования в большинстве случаев подразумевает получение доказательств того, что тестируемые образцы в условиях тестирования не ингибируют рост микроорганизмов, присутствие которых возможно в образцах. Такое тестирование должно включать добавление к соответствующим образом приготовленным образцам тестируемого материала отдельных жизнеспособных культур микроорганизмов. При этом, если микроорганизмы в тестируемом материале отсутствовали, рост этих классов микроорганизмов, при помощи которых осуществлялась провокация, ингибироваться не будет. Бета-лактамные продукты, используемые при тестировании, должны быть обработаны соответствующим количеством пенициллиназы, следуя валидизированной инструкции по проведению процедур.

- 272 017765

Жидкости для разведения и среды.

1. Приготовление культурных сред и жидкостей для разведения. Можно либо готовить культурные среды и жидкости для разведения, либо использовать дегидратированные культурные среды, следя за тем, чтобы при разведении в соответствии с инструкций производителя/распространителя полученные препараты содержали такие же ингредиенты и/или чтобы получались такие же среды, как и при использовании представленных в этом документе формул. При приготовлении сред по формулам растворите растворимые твердые вещества в воде, при необходимости нагревая их до полного растворения, и добавьте растворы соляной кислоты или гидроксида натрия в количествах, необходимых для достижения требуемых значений рН среды. После этого раствор готов к применению. Среды должны быть простерилизованы в автоклаве по валидизированной методике стерилизации. После стерилизации при температцре 25±2°С определите рН.

Усиление роста.

a) Каждая партия проавтоклавированной среды тестируется на способность усиления роста. Для этого в дублированные тестовые контейнеры со средой вносят менее 100 микроорганизмов и инкубируют с соблюдением указанных ниже условий. Могут применяться микроорганизмы из культуры, прошедшие не более 5 пассажей, исходно полученной из АТСС (Американской базы типов культур микроорганизмов).

b) Качество тестовой среды удовлетворительное, если признаки роста появляются в течение 48-72 ч для бактерий и 5 дней для грибов. Тест на активацию роста может производиться одновременно с использованием тестовой среды для тестирования материала. Однако при получении неудовлетворительных результатов этого теста результаты тестирования материала считаются не действительными.

Тестовые микроорганизмы, используемые в анализе сред в тесте на активацию роста

ТЕСТ	СРЕДА	ТЕСТ МИКРООРГАНИЗМЫ	АТСС4 ЙЖША
Общее количество аэробов	Т8А	(I)	81арЬу1ососсиз аигеиз	6538	30°-35°С
Микробное число		или:	Мкгососсиз 1и1еиз	9341	30°-35°С
		(2)	ВасШиз зиЬбНз		30°-35°С
		(3)	ЕзсЬепсЫа соП	8739	30°-35°С
Общее суммарное число дрожжевых и плесневых грибов	8ЭА	(I)	СапсМа а1Ысап8	10231	20°-25°С
		(2)	АзрегдШиз шдег	16404	20°-25°С
Отсутствие Рзеидотопаз аегицтоза	Τ8Β	(1)	Ркеийотопаз аеги§тоза	9027	30°-35°С
отсутствие 81арпу1ососсиз аигеиз	Т8В	СР	8!арЬу1оссосиз аигеиз	6538	30°-35°С
Отсутствие 8а1топе11а	РЬМ	(1)ог:	8а1топе11а сЬо1егаези1з 8а1топе11а (урЫтипит*	13311	3(Е-35'“'С 30°-35°С
Отсутствие ЕзсЬепсЫа СОИ.	РЬМ	(1)	ЕзсЬепсЫа соИ	8739	30°-35°С

* Могут использовать другие непатогенные виды 8а1топе11а.

Процедура определения общего числа аэробных микроорганизмов и общего суммарного числа дрожжей и плесневых грибов.

а) Приготовление образца. За исключением случаев, когда в инструкции по проведению специфического метода указаны другие инструкции, готовьте образец для тестирования следующим образом. Дополнительная информация относительно сред и процедур инкубации в зависимости от вида проводимого теста представлена ниже в соответствующем разделе.

ΐ) Нерасфасованные порошки и сырьевые материалы - приготовьте раствор или суспензию, добавив 10 г или 10 мл образца к 90 мл стерильного фосфатного буфера с рН 7.2. Хорошо перемешайте получившийся продукт и внесите по 1.0 мл в каждую из двух стерильных чашек Петри.

ίί) Капсулы - в асептических условиях внесите 2 оболочки капсулы с их содержимым в 20 мл стерильного фосфатного буфера с рН 7.2. Нагрейте на водяной бане (при температуре приблизительно 45°С) в течение примерно 10 мин. Тщательно встряхните до получения однородной суспензии и перенесите по 1.0 мл получившегося продукта в каждую из двух стерильных чашек Петри.

ίίί) Порошки для суспензии - разбавьте образец в соответствии с инструкцией с использованием в качестве растворителя стерильного фосфатного буфера с рН 7.2. Тщательно встряхните и перенесите по 1.0 мл получившегося продукта в каждую из двух стерильных чашек Петри.

ίν) Растворы/суспензии - перенесите по 1.0 мл в каждую из двух стерильных чашек Петри.

ν) Таблетки - поместите 4 таблетки (твердые таблетки предварительно необходимо измельчить в порошок с использованием ступки и пестика) в фосфатный буфер с рН 7.2. Хорошо встряхните емкость до полного измельчения и растворения таблеток и перенесите по 1.0 мл получившегося продукта в каждую из двух стерильных чашек Петри.

- 273 017765 νί) Оболочки капсул - поместите 25 оболочек капсул в 100 мл стерильного фосфатного буфера с рН 7.2 и нагрейте на водяной бане (при температуре приблизительно 45°С) в течение примерно 15 мин, постоянно встряхивая емкость для растворения оболочек капсул. Хорошо встряхните емкость и перенесите по 1.0 мл получившегося продукта в каждую из двух стерильных чашек Петри.

νίί) Мази - наберите в стерильный контейнер приблизительно 5 мл из каждого из 3 образцов, взятых из партии, и перемешайте их. Перенесите по 0.1 мл этого комбинированного образца в обычные чашки Петри. Распределите образец по поверхности среды при помощи стерильного стеклянного шпателя (клюшки). Используйте для каждой инкубационной чашки отдельный стерильный шпатель, как описано в методике процедуры Определение общего количества аэробов.

b) Мембранная фильтрация. В качестве альтернативы методу заливки чашек Петри с успехом может использоваться валидизированная процедура мембранной фильтрации. Этот метод может быть особенно полезным при тестировании продуктов, содержащих ингибиторные вещества.

c) Повторное тестирование. Для подтверждения сомнительных результатов, полученных при проведении любой из описанных ниже процедур, может быть проведено повторное тестирование с использованием образца, объем которого минимум в 2.5 раз превышает объем исходного образца, с соответствующей корректировкой разведения.

Тестирование общего числа аэробных микроорганизмов.

1. Приготовьте образцы для тестирования следующим образом. В каждую чашку Петри добавьте 15-20 мл стерильного ТСА, расплавленного и охлажденного до 45°С. Закройте чашку и осторожно переверните или встряхните ее для того, чтобы смешать образец с агаром, и оставьте чашку при комнатной температуре, чтобы содержимое застыло. Переверните чашки и инкубируйте их в течение 48-72 ч при температуре 30-35°С.

2. После инкубации проверьте чашки на наличие роста с использованием увеличительного прибора, например счетчика колоний Квебек, подсчитайте число колоний и рассчитайте результаты на анализируемую единицу (таблетку, капсулу, миллилитр, грамм и т.д.), как описано в спецификациях для материала, и оцените в соответствии с ними приемлемость результатов.

3. Более подробно охарактеризуйте контаминацию с использованием окраски по грамму и при определении морфологии микроорганизмов при микроскопии. Проведите биохимические тесты с использованием грамотрицательных и грамположительных кокков (или с использованием других подходящих способов идентификации).

Примечание. При подсчете колоний для облегчения дифференцировки роста колоний от тестируемого материала иногда рекомендуется использовать 2% раствор 2,3,5-трифенилтетразол хлорида (ТТХ) в качестве агента, способствующего обнаружению микробного роста. ТТХ - это бесцветный окислительновосстановительный индикатор, который становится красным при дегидрогенизации под действием восстанавливающих сахаров, содержащихся в живых клетках, при этом колонии приобретают ярко-красный цвет. При использовании ТТХ залейте в чашку Петри приблизительно 1 мл 2% раствора и инкубируйте в чашке при температуре 30-25°С в течение приблизительно 2 ч. Колонии микробов будут ярок выделять от другого материала в чашке, и их будет легче подсчитать.

С. Тест на определение общего суммарного числа дрожжей и плесневых грибов. 1. Приготовьте образцы для тестирования следующим образом. В каждую чашку Петри добавьте 15-20 мл стерильного СДА, расплавленного и охлажденного до 45°С. Закройте каждую чашку и осторожно переверните или встряхните ее для того, чтобы смешать образец с агаром, и оставьте чашку при комнатной температуре, чтобы содержимое застыло. Переверните чашки и инкубируйте их в течение 5-7 дней при температуре 20-25°С [примечание: не трогайте чашки во время инкубации, так как распространение плесневых грибов по чашке может привести к тому, что будет обнаружено большее число микроорганизмов, чем присутствует на самом деле].

2. После инкубации проверьте чашки на наличие роста с использованием увеличительного прибора, например счетчика колоний Квебек, подсчитайте число колоний и рассчитайте результаты на анализируемую единицу (таблетку, капсулу, миллилитр, грамм и т.д.), как описано в спецификациях для материала, и оцените в соответствии с ними приемлемость результатов.

3. Более подробно охарактеризуйте грибковую контаминацию, определив морфологии микроорганизмов макроскопическим и микроскопическим методом. При необходимости проведите биохимические тесты для дрожжевых грибов (или используйте другие пригодные для идентификации методы).

Процедура тестирования по определению отсутствия определенных микроорганизмов.

a) Приготовление образца. За исключением случаев, когда в инструкции по проведению специфического метода указаны другие инструкции, готовьте образец для тестирования, как описано выше в разделах Приготовление образца для определения общего числа аэробов и общего суммарного числа дрожжей и плесневых грибов, следующим образом. Дополнительная информация по каждому используемому тесту представлена ниже в соответствующем разделе.

b) Мембранная фильтрация. В качестве альтернативы методу заливки чашек Петри с успехом может использоваться валидизированная процедура мембранной фильтрации. Этот метод может быть особенно полезным при тестировании продуктов, содержащих ингибиторные вещества.

- 274 017765

с) Повторное тестирование. Для подтверждения сомнительных результатов, полученных при проведении любой из описанных ниже процедур, может быть проведено повторное тестирование с использованием образца, объем которого минимум в 2.5 раз превышает объем исходного образца, с соответствующей корректировкой разведения.

В. Тест на отсутствие З1арйу1ососсик аигеик и Ркеийошопак аегидшока. Добавьте в образец 100 мл ТБС до получения объема 100 мл, перемешайте получившийся раствор и инкубируйте его в течение 2448 ч при температуре 30-35°С. Проконтролируйте среду на наличие роста. При наличии роста при помощи петли для посева перенесите порцию материала в селективную среду, проинкубируйте и исследуйте на перечисленные ниже характеристики (для проведения отдельных идентификационных тестов могут использовать имеющиеся в продаже наборы для идентификации).

Характеристика З1арйу1ососсик аигеик

Среда:	Вогеля-Джонсона Маннитол-солевая Бейд-Паркера
Морфология:	Черные колонии, Желтые колонии, Черные светящиеся колонии, окруженные желтой окруженные желтой окруженные светлой зоной зоной зоной диаметром 2-5 мм
Коагулазный тест*:	положительный положительный положительный

Окраска по Грамположительные Грамположительные Грамположительные кокки

Граму:_________кокки (группами)_____кокки (группами)________(группами)__________________ ^Перенесите репрезентативные подозрительные колонии из селективной агаровой среды в отдельные пробирки, содержащие 0.5 мл плазмы млекопитающих (предпочтительно плазмы кролика или лошади), инкубируйте при температуре 37°С, проверьте результат через 3-4 ч и затем через соответствующие временные интервалы до 24 ч, контролируя коагуляцию.

Характеристика Ркеийотопак аегидшока

Среда:	Центримвд	РЗР*	РЗР*
Морфология:	зеленоватый	Бесцветный или желтоватый	зеленоватый
Флуоресценция в УФ-свете:	зеленоватый	желтоватый	синий
Оксидаза**:	положительный	положительный	положительный
Окраска по Граму:	Грамотрицательные палочки	Грамотрицательные палочки	Грамотрицательные палочки

*Для проведения теста с окрашиванием перенесите репрезентативные подозрительные колонии из центримидного агара в чашки с РЗР и РЗР. Закройте их и инкубируйте при температуре 35±2°С в течение минимум 3 дней. Исследуйте чашки в УФ-свете.

** При проведении подтверждающего оксидазного теста для подозрительных колоний перенесите их на тестовые полоски или в чашки, импрегнированные Ν,Νдиметил-р-фенилендиамин дигидрохлоридом; если розовый цвет не меняется на пурпурный, образец отвечает требованиям по отсутствию Ркеийотопак аегидшока. Обратите внимание, что также могут использоваться и доступные в коммерческой продаже наборы для тестирования, которые позволяют получить приемлемые результаты.

Если рост отсутствует или ни одна из обнаруженных колоний не соответствует группе характеристик, перечисленных в таблицах выше, образец отвечает требованиям теста на отсутствие данного орга низма.

Тест на отсутствие видов За1топе11а и ЕксйепсЫа сой.

Перенесите образец в стерильный контейнер с жидкой лактозной средой таким образом, чтобы общий объем составил 100 мл, и инкубируйте при температуре 30-35°С в течение 24-48 ч. Осторожно встряхните и проверьте контейнеры на наличие роста (так же для проведения отдельных тестов могут использоваться доступные в коммерческой продаже наборы для идентификации).

а) За1топе11а - если в жидкой лактозной среде выявляется рост:

1) перенесите порции по 1.0 мл в пробирки объемом 10 мл, содержащие жидкую цистинселинитовую среду и жидкую тетратионатную среду, смешайте получившийся раствор и инкубируйте при температуре 30-35°С в течение 24-48 ч;

2) при помощи петли перенесите образцы двух сред в бриллиантовый зеленый агар, лизиндезоксихолатный агар и висмут-сульфитный агар. Закройте емкости со средами, переверните их и инкубируйте при температуре 30-35°С в течение 24-48 ч, а затем определите описанные ниже морфологиче ские характеристики:

- 275 017765

Характеристики сальмонеллы (8а1топе11а)

Среда:	Бриллиантовый зелёный	Ксилоза- ЛизинДезоксихолат	Сульфат висмута
Морфология:	малые, прозрачные, бесцветные или розовые (часто окружённые зоной от розового до красного цвета)	красные, с чёрным центром или без чёрного центра	чёрные или зелёные

3) дальнейшую идентификацию можно проводить, перенося сомнительные колонии в пробирку со скошенной питательной средой тройной сахарный агар-железо, сначала делая посев штрихом на поверхности скошенного агара, а затем хорошо протыкая поверхности микробиологической проволочной петлей. Инкубируют при 30-35°С в течение 24-48 ч и исследуют. Если в пробирках отсутствует доказательство в виде щелочных (красный) скошенных слоев и кислых (желтый) торцов (слоев) (с сопутствующим почернением или без почернения торца (слоя)), то образец отвечает требованиям теста на отсутствие бактерий рода сальмонелла.

б) ЕасРепсЫа со11 - Если рост осуществляют в жидкой лактозной среде:

1) с помощью инокуляционной петли наносят порцию на агар МакКонки (МасСопкеу). Накрывают, переворачивают и инкубируют при 30-35°С в течение 24-48 ч;

2) если ни одна из полученных колоний не становится кирпично-красного цвета (с возможной окружающей полосой осажденной желчи), но они представляют собой грамотрицательные палочки (СоссоВас1111), то образец отвечает требованиям теста на отсутствие ЕасРепсЫа со11;

3) если колонии соответствуют этому описанию, переносят их на среду Левина (эозин-метиленовый синий-агар). Накрывают плашки, переворачивают и инкубируют при 30-35°С в течение 24-48 ч. Если ни в одной из колоний не появляется ни характерный металлический блеск в отраженном свете, ни черносинее окрашивание в проходящем свете, то образец отвечает требованиям теста на отсутствие ЕасРепсЫа со11.

Состав сред.

1. Фосфатный буфер рН 7.2.

а) Исходный раствор: одноосновный фосфат калия 34.0 г; вода (дистиллированная или деионизированная) 1000 мл; гидроксид натрия Т8 (титрованный раствор) 175 мл. В мерной колбе на 1000 мл растворяют 34 г одноосновного фосфата калия примерно в 500 мл воды. Доводят рН до 7.1-7.3, добавляя гидроксид натрия Т8 (около 175 мл), добавляют воду до метки и перемешивают. Стерилизуют и хранят на холоду (2-8°С) до употребления.

б) Рабочий раствор. Для применения разводят исходный раствор водой в соотношении 1 к 800 и стерилизуют.

2. Ί8Α (ТСА, триптиказо-соевый агар/соево-казеиновый ферментативный агар). Гидролизат казеина панкреатический 15.0 г; папаиновый гидролизат соевой муки 5.0 г; хлорид натрия 5.0 г; агар 15.0 г; вода 1000 мл; рН после стерилизации: 7.3±0.2.

3. Т8В (ТСБ, триптиказо-соевый бульон/соево-казеиновый ферментативный бульон). Гидролизат казеина панкреатический 17.0 г; папаиновый гидролизат соевой муки 5.0 г; хлорид натрия 5.0 г; двухосновный фосфат калия 2.5 г; декстроза 2.5 г; вода 1000 мл; рН после стерилизации: 7.3±0.2.

4. 8ΌΑ (сабуро (8аЬоигаи4)-декстрозный агар); декстроза 40 г; смесь равных частей пептического гидролизата (перевара) животной ткани и панкреатического гидролизата казеина 10.0 г; агар 15.0 г; вода 1000 мл; смешивают и кипятят до растворения; рН после стерилизации: 5.6±0.2.

5. РИМ (Жидкая лактозная среда). Мясной экстракт 3.0 г; панкреатический гидролизат желатина 5.0 г; лактоза 5.0 г; вода 1000 мл. После стерилизации охлаждают как можно быстрее. рН после стерилизации: 7.1±0.2.

Пример 50. Изоэлектрическое фокусирование в геле СΊ^Α4-Iд·

Целью данного примера является определение изоэлектрической точки, числа изоформ и микрогетерогенности СΊ^Α4-Iд·

Материалы:

набор для калибровки (калибровочный набор) 1ЕЕ (рН 3-10), СтегаНат РРагтас1а, Са1а1од №. 170471-01) или (рН 2.5-6.5), ^тега^ат Рйагтасла, Са1а1од №. 17-0472-01);

гель Απη^^ί^ РΑ^ρ1аΐе: рН 4.0-6.5, СтегаНат Рйагтасла, Са1а1од №. 80-1124-81);

аппликаторы образцов ЖЕ 8атр1е Αρρ1^саΐο^а, СтегаНат РРагтас1а, Са1а1од №. 80-1129-46);

ТЕЕ стрип-электроды (Αте^аЬат РРагтас1а, Са1а1од №. 80-1104-40); фосфорная кислота (85%) (ЕМЭ, Са1а1од №. РХ0995-6).

Оборудование:

электрофоретическая система МиШрйог ΙΙ Е1ес1гор1тогеа1а 8уа1ет, (ОЕ Неа^саге, Са1а1од №. 181018-06).

Приготовление реагентов.

Анодный буфер (0.1 М глутаминовая кислота в 0.5 М фосфорной кислоте) (пропитанные этим раствором фитили помещают на (+) полюс блока (для изофокусирования)).

- 276 017765

Пример.

3.4 мл 85% фосфорной кислоты.

1.47±0.02 г глутаминовой кислоты.

Вода для ВЭЖХ.

Смешивают вышеуказанные реагенты в мерном цилиндре на 100 мл, доводят объем до 100 мл водой для ВЭЖХ, закрывают пробкой и несколько раз переворачивают для перемешивания.

Хранят раствор при 2-8°С до 6 месяцев.

Катодный буфер (0.1 М β-аланин) (пропитанные этим раствором фитили помещают на (-) полюс блока (для изофокусирования)).

Пример.

0.9±0.02 г β-аланина.

Вода для ВЭЖХ.

Смешивают вышеуказанные реагенты в мерном цилиндре на 100 мл, доводят объем до 100 мл водой для ВЭЖХ, закрывают пробкой и несколько раз переворачивают для перемешивания.

Хранят раствор при 2-8°С в течение шести месяцев.

Катодный буфер (0.1 М β-аланин) (пропитанные этим раствором фитили помещают на (-) полюс блока (для изофокусирования)).

Фиксирующий раствор (3.5% 5-сульфосалициловая кислота в 12% трихлоруксусной кислоте).

Пример.

240±5.0 г трихлоруксусной кислоты. 70±2.0 г 5-сульфосалициловой кислоты. 2000 мл воды для ВЭЖХ.

Смешивают вышеуказанные реагенты, доводят объем до 2000 мл. Хранят раствор при комнатной температуре до трех месяцев.

Раствор для окрашивания.

Смешивают раствор реагента гелькоут синий (Се1Собе В1ие) непосредственно перед употреблением, осторожно переворачивая и вращая бутыль несколько раз.

Примечание: важно перемешать окрашивающий реагент перед тем, как его выливать или распределять, чтобы гарантировать гомогенность образца реагента.

Приготовление контроля для окрашивания.

Восстанавливают карбоангидразу (угольную ангидразу) II водой для ВЭЖХ, получая исходный раствор с концентрацией 1.0 мг/мл.

мкл исходного раствора смешивают с 90 мкл воды для ВЭЖХ, получают рабочий раствор с концентрацией 0.10 мкг/мкл.

Наносят 10 мкл раствора с концентрацией 0.10 мкг/мкл на гель (нагрузка 1.0 мкг).

Методика.

Разведение образца.

Готовят раствор образца и эталонного материала 20 мкг/в 10 мкл воды для ВЭЖХ.

Пример.

Заданная концентрация · (2 · мкг / мкл)

--------------- -----—------------------ х · 200 · мкл- = Концентрация · образца (50 · мкг / мкл) мкл образца,-добавляемого · до · 200 · мкл · конечного · объёма

2· мкг! мкл _Л_.

--х · 200 · мкл = 0.04 · х · 200 мкл = 8 · мкл образца

-мкг/ мкл (добавляют · 192 · мкл воды для ВЭЖХ )

Прибор и приготовление геля.

Соединяют охлаждающий столик прибора МиШрРоге II для электрофореза с термостатом и устанавливают темпратуру 10±2°С.

Примечание. Термостат оставляют работать по меньшей мере в течение 20 мин до достижения вышеуказанной температуры.

Вынимают гель из холодильника. Осторожно обрезают упаковку по краям, чтобы ни в коем случае не срезать гель/гелевую подложку (пластину геля).

Добавляют около 1.0 мл воды для ВЭЖХ на один конец охлаждающего столика.

Один край пластины геля (гель/гелевой подложки) помещают в воду таким образом, чтобы за счет капиллярности вода пропитала весь фронт (край) геля. Медленно, так чтобы не попали пузырьки воздуха, наносят гель на охлаждающий столик. При необходимости можно добавить воду для ВЭЖХ.

Удаляют прозрачную пленку с поверхности геля.

Пропитывают один электрод анодным буфером и помещают на край геля, ближайший к отметке (+) охлаждающего столика.

Пропитывают один электрод катодным буфером и помещают по другую сторону геля, ближайшую

- 277 017765 к отметке (-) охлаждающего столика.

После нанесения стрип-электродов осторожно срезают избыток новым бритвенным лезвием таким образом, чтобы конец стрипов совпадал с краем геля, а не подложки геля.

Наносят образец на сторону, ближайшую к отметкам (-) на охлаждающем столике, обеспечивая тесный контакт между нанесенными порциями образца и гелем. Примечание: следует предусмотреть, чтобы аппликаторы ТЕР не касались стрипа, пропитанного катодным буфером, не смачивались катодным буфером и были бы достаточно разделены, чтобы гарантировать, что каждый образец идет отдельно. Аппликаторы образцов должны быть твердо закреплены в пластине геля.

Размещают держатель электродов ячейки МиШрог II и располагают (выравнивают) электроды вдоль центра стрип-электродов на геле. Соединяют два электрода в держателе электродов с основной ячейкой и ставят крышку безопасности в нужное положение. Отверстия в крышке безопасности закрывают липкой лентой для предупреждения высыхания геля. Соединяют электроды с источником тока.

Фокусируют на гель ток из источника тока с параметрами, указанными ниже, до тех пор, пока разность потенциалов не достигнет >300 В.

Таблица 1

Параметры источника тока для фокусирования ШР гелей

Параметры опыта

Разность потенциалов (переменный параметр) Сила тока (постоянный ______параметр)______ Мощность (постоянный параметр)

Величина

2000 вольт максимально миллиампер ватт

Нанесение на гель.

После фокусировки геля выключают подачу тока, удаляют крышку безопасности, разъединяют электроды и удаляют держатель электродов из ячейки МиШрйог II.

Отбирают образцы в аппликаторы образцов в определенной последовательности. При этом нужно убедиться, что стрип с (-) катодным буфером является ближайшим к аналитику.

Образцы наносят справа налево. Сначала два или более раз наносят ШР калибровочные стандарты (дорожки 1 и 2), один из эталонных материалов (дорожка 3), один из испытуемых образцов #1 (дорожка

4), один из контрольных окрашивающих препаратов (дорожка 5), один из испытуемых образцов #2 (дорожка 6), один из эталонных материалов (дорожка 7) и один из ЕЕР калибровочных стандартов (дорожка 8).

Добавляют третий и четвертый образец, наносят эталонный материал (дорожка 9), один раз наносят испытуемый образец #3 (дорожка 10), делают одно внесение окрашивающего контрольного образца для репарации (дорожка 11), одно внесение тестируемого образца #4 (дорожка 12), одно внесение эталонного материала (дорожка 13) и одно внесение ШР калибровочного стандарта (дорожка 14). Пятый и шестой образцы наносят, повторяя образцы 3 и 4, дорожки 15-20. Порядок нанесения образцов показан в табл. 2.

Таблица 2 Схема разведения образцов и нанесения их на гель

Дорожка	Описание	Рабочая концентрация (мкг/мкл)	Объём вносимого образца (мкл)	Нагрузка белка (мкг)
1	ЕР ρί маркер*	-	10	-
2	ЕР ρί маркер	-	10	-
3	Эталонный материал	2.0	10	20

- 278 017765

4	Образец 1	2.0	10	20
5	Контроль окрашивания	0.10	10	1.0
6	Образец 2	2.0	10	20
7	Эталонный материал	2.0	10	20
8	ΙΕΡ р1 маркер	-	10	-
9	Эталонный материал	2.0	10	20
10	Образец 3	2.0	10	20
11	Контроль окрашивания	0.10	10	1.0
12	Образец 4	2.0	10	20
13	Эталонный материал	2.0	10	20
14	ΙΕΡ р1 маркер	-	10	-
15	Эталонный материал	2.0	10	20
16	Образец 5	2.0	10	20
17	Контроль окрашивания	0.10	10	1.0
1.8	Образец 6	2.0	10	20
19	Эталонный материал	2.0	10	20
20	ΙΕΡ ρΐ маркер	-	10	-

Электрофорез. После нанесения образцов на гель ставят на место держатель электродов ячейки прибора Мультифор и располагают (выравнивают) электроды вдоль центра стрип-электродов на геле. Соединяют два электрода в держателе электродов с основной ячейкой и ставят крышку безопасности в нужное положение. Отверстия в крышке безопасности заклеивают липкой лентой для предупреждения высыхания геля. Соединяют электроды с источником тока. Устанавливают нужные значения разности потенциалов, силы тока и мощности и начинают эксперимент.

Таблица 3

Параметры источника тока для работы 1ЕЕ гелей

Параметры опыта

Величина

Разность потенциалов (переменный параметр) Сила тока (постоянный _________параметр)_________ Мощность (постоянный _________параметр)_________ Время (постоянный параметр)

2000 вольт максимально миллиампер ватт

2.5 часа

После окончания работы геля выключают подачу тока, удаляют крышку безопасности, разъединяют электроды и удаляют держатель электродов из ячейки МиШрЬог II.

Осторожно удаляют стрип-электроды и аппликаторы образцов из геля.

Примечание. Можно поместить слой геля непосредственно в фиксирующий раствор и оставить, чтобы стрип-электроды и аппликаторы всплыли над гелем.

Удаляют гель/гелевую подложку (пластину) с охлаждающего столика и помещают в пустую плашку, содержащую достаточный объем фиксирующего раствора (стадия 3.3), чтобы сохранять гель влажным. Покрывают пластиковым оберточным материалом и помещают на ротационную платформу и инкубируют 20-60 мин. Регистрируют время начала и окончания в 1ЕЕ протоколе.

Примечание: гели 1ЕЕ, остающиеся в фиксативе слишком долго, иногда расслаиваются. Этого можно избежать, уменьшая время фиксации примерно до 1 ч.

4.5. Окрашивание геля.

После фиксации промывают гель 3x5 мин достаточным объемом воды для ВЭЖХ, чтобы гель оставался влажным. Регистрируют время начала и окончания в 1)ЕЕ протоколе.

После смешения раствора реагентов для окрашивания гелькоут синий (Се1Собе В1ие) (стадия 3.4) помещают гель в объем красителя, достаточный для того, чтобы гель оставался влажным. Инкубируют 15-24 ч в плотно герметизированном контейнере, чтобы предупредить испарение реагентов. Регистрируют время начала и окончания в 1ЕЕ протоколе.

Окрашенные гели обесцвечивают (деколоризуют), заменяя раствор для окрашивания водой для ВЭЖХ. Отмывают гель, по меньшей мере три раза меняя воду в течение 1-2 ч. Регистрируют время начала и окончания в ЕЕЕ протоколе. После обесцвечивания гель готов к сканированию.

Примечание: может потребоваться дополнительное промывание для уменьшения фонового окрашивания 1ЕЕ геля.

Пригодность системы.

Стандарты для изоэлектрического фокусирования легко отличить от фона. Стандарты белков, которые смещаются, до значений р1 между 4.0 и 6.5, видны на геле. Стандарты белков с р1 вне этого интервала не видны на геле, р1 маркёры со значениями 3.50, 4.55, 5.20 и 5.85 идентифицируют и метят на изображении (фигуре) геля.

- 279 017765

Таблица 4

Компоненты калибровочных стандартов 1ЕР

Белковый стандарт	ρΐ
Трипсиноген	9.30
Лектин чечевицы основная полоса	8.65
Лектин чечевицы средняя полоса	8.45
Лектин чечевицы кислая полоса	8.15
Миоглобин основная полоса	7.35
Миоглобин кислая полоса	6.85
Человеческая карбоангидраза В	6.55
Бычья карбоангидраза В	5.85
β- Лактоглобулин А	5.20
Соевый ингибитор трипсина	4.55
Амилоглюкозид	3.50

Контроль для окрашивания, стандарт карбоангидразы II (р1 5.4), при низких нагрузках белка (1.0 мкг) используют для визуализации однородности (консистенции) окрашивания геля. Эта полоса должна очень отличаться от фона при визуальном изучении сканированного изображения геля.

Эталонный материал СТЬА4-1§ следует перечислить (привести) в полосах 10-22 в интервале р1 4.35.6.

Суммарная интенсивность (в процентах) большинства основных полос эталонного СТЬА4-1§ должна быть >90% в интервале р1 4.3-5.3.

Для эталонного материала следует удостовериться с помощью визуального исследования, что три основные полосы фокусируются между р1 маркёрами 4.5-4.2 (см. фигуру схемы основных полос).

Сканирование и анализ геля.

После электрофореза и окрашивания все гели сканируют, используя сканирующий денситометр. Файлы изображений хранятся на локальном жестком диске компьютера и/или подсоединяются к сети и архивируют в местной сети. Анализ сканированных изображений геля осуществляют с помощью программы [тацеОиагЛ ТР (ν2003.03). Показатели сканирования и анализы приводятся в табл. 5. Результаты сканирования собирают и рассчитывают количественно, используя соответствующие (ведомственные) методики.

Таблица 5

Параметры сканирования и анализа гелей

Параметры сканирования	Значение параметра
Размер пикселя	100
Вес младшего разряда	12 бит
Параметры детекции полосы
Минимальный наклон	Начальный 100
Уменьшение уровня шума	Начальный 10
% от максимального пика	Начальный 0
% ширины дорожки	Установлено на 90%

Примечание. Вышеуказанные методы включают основные стадии анализа изображений геля. Параметры сканирования приводятся в таблице. Параметры детекции полос в таблице задаются начальными значениями. Корректировка параметров детекции полос может понадобиться для точной идентификации полос вследствие изменений физического состояния геля (таких как уменьшение объема, усадка после окрашивания/обесцвечивания) и изменения очертаний и сдвига полосы геля. Вручную корректируют любые утраченные и плохо определенные полосы.

Сканируют гели, используя параметры сканирования, указанные в таблице. Весь анализ и оценки геля делают на основании сканированного изображения. Открывают файл изображения геля (сканированные грубые (приблизительные) данные) из <1ϋ Анализ геля> в программе Iтаβе^иапΐТ^. Переходят к опции <Контраст> на панели инструментов и в опции <Г истограмма изображения> спускаются до более низкого параметра до тех пор, пока все полосы не станут четко видимыми. Выбирают опцию Создание полос>, а в ней <Руководство>, устанавливают <Число полос> для анализа. Корректируют <Дорожка % ширины> до 100%, чтобы охватить дорожки в геле. При необходимости соответствующим образом настраивают (выравнивают) одиночные дорожки. Для того чтобы вычесть фон, используют метод <Катящегося шариках>. Полосы детектируют, используя начальные показатели в опциях <Минимальный наклон>, Снижение уровня шума> и <% максимального пика>, приведенные в табл. 3. Подсчитывают величину р1 полосы, используя стандартный р1 маркёр из перечня меченых маркёров, приведенного в разделе Пригодность системы, для геля с рН/р1 4.0-6.5. Пропускают стадии калибровки и нормализации. Подсчитывают число полос в интервале р1 от 4.3 до 5.6. Заносят результаты в бланк Ехсе1 для подробной документации и регистрации. Расчет суммарной интенсивности (в процентах) образцов относительно эталонов (эталонных материалов). Примечание: суммарная интенсивность (в процентах) для об

- 280 017765 разца представляет собой процентное содержание полос, которые смещаются в интервале ρΙ 4.3-5.3, относительно составляющих 100% всех полос на дорожке. Для расчета суммарной интенсивности (в процентах) образцов относительно эталона:

Относительная интенсивность образца в процентах (%)=

Интенсивность % · полос · образца -(р! · 4.3 - 5.3) _{ν ηη} ----------------------------------------------ιυυ Интенсивность % полос · эталона -(р! · 4.3 - 5.3)

Примечание: если обратиться к паттерну нанесения на гель (паттерну нагрузки на гель), для расчетов нужно использовать эталонный материал, следующий за образцом. Если суммарная величина (интенсивности для) эталонного материала составляет 100%, а для образца эта величина составляет 95%, относительная величина в процентах для образца составляет 95/100x100=95%. Если суммарная величина (интенсивности для) эталона составляет 95%, а для образца эта величина составляет 100%, относительная величина в процентах для образца составляет 100/95x100=105%.

Отчет о результатах.

Сообщают число полос, зарегистрированных в интервале ρΙ 4.3-5.6. Сообщают суммарную интенсивность в процентах относительно эталона СТ^Λ4-Iд в интервале ρΙ 4.3-5.3 (см. на фигуре пример отчета о количественном анализе 1ЕР геля, определенном в данном методе). В результате визуального просмотра убеждаются, что три основные полосы расположены между ρΙ маркёрами 4.5-5.2 относительно эталона (см. фиг. 1 для паттерна основных полос), и сообщают число основных полос, наблюдаемых в пределах маркёров ρΙ 4.5-5.2. Визуально подтверждают, что между ρΙ маркёрами 4.5-5.2 относительно эталона отсутствуют новые значительные полосы.

В некоторых вариантах изобретения результаты этого метода показывают наличие полос в ρΙ интервале 4.3-5.6 или 4.3-5.6, причем идентифицируют от 10 до 22 полос с суммарной интенсивностью полос 90-110%. В другом варианте изобретения ρΙ интервал составляет 4.5-5.2 с 3 основными полосами. В другом варианте изобретения ρΙ интервал составляет 4.3-5.6 с числом полос от 10 до 22. В другом варианте изобретения ρΙ интервал составляет 4.3-5.3, причем суммарная интенсивность полос составляет 95105%. В другом варианте изобретения ρΙ интервал составляет 4.5-5.2 с двумя выделяющимися полосами.

Пример 51. БЭБ-РАСЕ эталонного СТ^Λ4-Iд.

В примере описан анализ СТ^Λ4-Iд методом БЭБ-РАСЕ как в восстановительных, так и в невосстановительных условиях.

Материалы:

трис-глициновый (Тг18-С1у) БЭБ буфер для образцов 2Х (Н/пйгодеп, Са1а1од №.ЬС2676);

NиРΛСЕ восстановитель для образцов 10Х (Iην^ΐ^οдеη, Са1а1од №. NР0004); гель с 4-20% трис-глицина - 1.0 ммх12 лунок Цпуйгодеп, Са1а1од №. ЕС60252В0Х); Трис-глициновый БЭБ рабочий буфер 10Х (Iην^ΐ^οдеη, Са1а1од №. ИС2675);

Магк12™ неокрашенный стандарт в широком интервале Цпуйгодеп, Са1а1од №. ЕС5677);

реагент для окрашивания Се1Соде В1ие (Кумасси синий) (Р1егсе, Са1а1од №. 24590: 500 мл. Са1а1од №. 24592: 3.5 л);

набор для окрашивания Б^1νе^Бηаρ® Б1ат Κίΐ ΙΙ (серебряный краситель) (Р1егсе, Са1а1од №. 24612).

Оборудование:

Хсе11 БигеЬоск М1ш Се11 Цпуйгодеп, Са1а1од №. ЕЮ001);

источник тока для электрофореза (('Ж'1, Беρа^аΐ^οη Буз1етз, Са1а1од №. 0БР-300).

Реагенты:

фиксирующий раствор для красителя Кумасси синий (50% метанола и 7% уксусной кислоты в воде для ВЭЖХ).

Пример.

В градуированный соответствующего объема сосуд, снабженный магнитной мешалкой, помещают 500 мл метанола.

Добавляют 70 мл уксусной кислоты.

Добавляя воду для ВЭЖХ, доводят до объема 1000 мл.

Хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.

Краситель Кумасси (бриллиантовый) синий (Се1Соде В1ие).

Используют непосредственно из стандартной тары. Добавляют количество, достаточное для того, чтобы покрыть гель, около 50 мл для одной мини-пластины геля (10x10 см) в малом планшете.

Хранят при 2-8°С до одного года.

Фиксирующий раствор серебряного красителя Бйуег Б1ат (30% этанола и 10% уксусной кислоты в воде для ВЭЖХ).

В градуированный соответствующего объема сосуд, снабженный магнитной мешалкой, помещают 300 мл этанола. Добавляют 100 мл уксусной кислоты. Добавляя воду для ВЭЖХ, доводят объем до 1000 мл. Перемешивают раствор и хранят при комнатной температуре до 6 месяцев. Раствор для отмывки геля (10% этанол).

- 281 017765

В центрифужную пробирку на 50 мл помещают 1.0 мл энхансера (набор 811уег 81ат). Добавляют 50 мл серебряного красителя (набор 8йуег 81ат). Закрывают пробирку пробкой и осторожно перемешивают на вортексе в течение 3-5 с. Рабочий раствор проявителя. Готовят непосредственно перед употреб лением.

В центрифужную пробирку на 50 мл помещают 1.0 мл энхансера (набор 811уег 81ат). Добавляют 50 мл проявителя (набор 8йуег 81ат). Закрывают пробирку пробкой и осторожно перемешивают на вортексе в течение 3-5 с. 1К Трис-глицин (Тп8-С1у) - 8Ό8 рабочий буфер. В градуированный цилиндр помещают 900 мл воды для ВЭЖХ. Добавляют 100 мл Трис-глицин - 8Ό8 10.x рабочего буфера. Объединяют вышеуказанные реагенты, накрывают парафильмом и несколько раз переворачивают для перемешивания.

Контроль окрашивания. Помещают 1 мл воды для ВЭЖХ в ампулу, содержащую 2 мг ингибитора трипсина (контроль окрашивания). При этом получают исходный раствор с концентрацией 2 мкг/мкл, устойчивый при -200°С в течение шести месяцев. Для предупреждения расщепления вследствие многочисленных циклов замораживания/оттаивания переносят аликвоты 50 мкл в маленькие пробирки и хранят при -200°С. Прибавляют 25 мкл исходного раствора к 75 мкл воды для ВЭЖХ, получают раствор с концентрацией 0.5 мкг/мкл. Прибавляют 40 мкл раствора с концентрацией 0.5 мкг/мкл к 160 мкл воды для ВЭЖХ, получают раствор с концентрацией 0.1 мкг/мкл. Помещают 10 мкл раствора с концентрацией 0.1 мкг/мкл, 50 мкл 2Х Тп§С1у буфера для образцов и 40 мкл воды для ВЭЖХ в центрифужную пробирку. Конечная концентрация раствора ингибитора трипсина для контроля окрашивания составляет 0.01 мкг/мкл. После анализа на пригодность и окрашивания Кумасси синим образцы наносят в концентрации 10 мг на 10 мкл.

Для гелей, окрашенных Кумасси синим, разводят эталонный материал и образец в воде для ВЭЖХ до концентрации 10 мкг/мкл.

Пример: смешивают 80 мкл раствора эталона и образца с концентрацией 50 мкг/мкл + 320 мкл воды для ВЭЖХ. В случае невосстанавливаемых образцов в микроцентрифужной пробирке к 50 мкл 2Х Тп§С1у буфера для образцов и 40 мкл воды для ВЭЖХ прибавляют 10 мкл раствора с концентрацией 10 мкг/мкл. В случае восстанавливаемых образцов к 50 мкл 2Х Тп§С1у буфера для образцов, 30 мкл воды для ВЭЖХ и 10 мкл 10Х восстановителя прибавляют 10 мкл раствора с концентрацией 10 мкг/мкл. Для гелей, окрашенных серебром, раствор с концентрацией 10 мкг/мкл разводят далее водой для ВЭЖХ до концентрации 1 мкг/мкг. Пример: смешивают 40 мкл раствора с концентрацией 10 мкг/мкл и 360 мкл воды для ВЭЖХ. Для невосстанавливаемых образцов в микроцентрифужной пробирке к 50 мкл 2Х Тп§С1у буфера для образцов и 40 мкл воды для ВЭЖХ прибавляют 10 мкл раствора с концентрацией 1 мкг/мкл. Для восстанавливаемых образцов к 50 мкл 2Х Тп8-С1у буфера для образцов, 30 мкл воды для ВЭЖХ и 10 мкл 10Х восстановителя прибавляют 10 мкл раствора с концентрацией 1 мкг/мкл. В холостом опыте в микроцентрифужной пробирке смешивают 50 мкл 2Х Тпз-С1у буфера для образцов и 50 мкл воды для ВЭЖХ.

Таблица 6

Интервал молекулярных масс (кДа) для полос предполагаемого минорного белка, который может присутствовать в восстановленных и невосстановленных . образцах абатацепта

Описание полосы (полос)

Невосстановленный (кДа)

Минорная(ые) полоса(ы) Минорная(ые) полоса(ы) Минорная(ые) полоса(ы) Минорная(ые) полоса(ы)

Нет данных

30- 70

Нет данных 175-230

Восстановленный (кДа) 15- 45

Нет данных 80- 55 175-200

Извлекают гель(и) из упаковки и промывают снаружи водой для ВЭЖХ, чтобы удалить остатки полиакриламидного полимера. Осторожно удаляют гребенку для формирования лунок, чтобы гарантировать, что при необходимости лунки выравниваются кончиком (гребенки) для заливки геля. Заполняют лунки водой для ВЭЖХ и стряхивают, чтобы удалить воду из лунок. Повторяют отмывание еще два раза.

5.2. Помещают гели в приборе КСеИ таким образом, чтобы короткая передняя сторона была обращена к внутренней камере. Если используют только один гель, вставляют с противоположной стороны пластину из плексигласа. Надежно закрепляют гель (гели), так что образуется внутренняя и внешняя камеры. Внутреннюю камеру заполняют рабочим буфером 1.\ трис-глицин 8Ό8. Проверяют, есть ли утечка, затем заполняют наружную камеру рабочим буфером 1.\ трис-глицин 8Ό8. Все гели должны содержать по меньшей мере одну дорожку для контрольной пробы (холостой опыт) и одну дорожку маркёра молекулярной массы. Добавляют контроль окрашивания только для гелей, окрашенных Кумасси синим. Используют кончики для нанесения геля. Наносят по меньшей мере один Холостой (контрольный) образец между восстановленным и невосстановленным образцами. Обрабатывают маркёры молекулярной массы как восстановленный образец. Это позволяет предупредить восстановление невосстановленных образцов вследствие утечки восстановителя. Прикрепляют верхнее покрытие прибора .\οο11 и соединяют электроды с источником тока. Доводят силу тока до 25 мА на гель и устанавливают максимальные значения для разности потенциалов (В) и мощности (Вт). В случае использования двух гелей устанавливают

- 282 017765 силу тока 50 мА. Корректируют силу тока, если в опыте участвуют два геля в одном приборе, или если несколько Хсе11 приборов подсоединены к одному источнику тока. Электрофорез проводят в течение 60±5 мин или до тех пор, пока фронт буфера пройдет по меньшей мере 80% всего пути. Регистрируют начальное и конечное время в протоколе. Осторожно разрезают две пластиковые пластины, удерживающие гель, ножом для геля. После отделения геля следует процедура окрашивания.

Окрашивание Кумасси синим. Помещают гель в 50 мл фиксирующего раствора для Кумасси синего (50% метанола и 7% уксусной кислоты) на 15 мин. Гель отмывают 3 раза, используя ~100 мл воды для ВЭЖХ в течение 5 мин, всего 15 мин. Добавляют краситель Кумасси синий непосредственно в гель (гели) и инкубируют 15-24 ч. Окрашенные гели обесцвечивают (удаляют краситель), заменяя реагент Кумасси синий водой для ВЭЖХ (100 мл). После обесцвечивания (удаления красителя) в течение 1 ч гель готов для сканирования.

Сканирование и анализ геля. После электрофореза и окрашивания гели сканируют, используя сканирующий денситометр. Файлы изображений хранят на локальном жестком диске компьютера и/или подсоединяются к сети и архивируют в местной сети. Анализ сканированных изображений геля осуществляют с помощью программы 1тацеС)иап1 ТЬ (ν2003.03). Результаты сканирования собирают и рассчитывают количественно, используя соответствующие (ведомственные) методики.

Таблица 7

Параметры сканирования и анализа гелей

Параметры сканирования	Значение параметра
Размер пикселя	100
Вес младшего разряда	12 бит
Параметры детекции полосы
Минимальный наклон	Начальный 100
Уменьшение уровня шума	Начальный 10
% от максимального пика	Начальный 0
% ширины дорожки	Установлено на 90%

При визуальном изучении основная полоса восстановленного СТ^Α4-Iβ должна появляться в виде широкой полосы, которая смещается в положение, проксимальное к маркёру молекулярной массы 55400 Да (дегидрогеназе глутаминовой кислоты).

Пример 52. Определение примесей белка клеток хозяина (клеток яичника китайского хомячка (СНО)) в лекарственном веществе СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iβ методом Е^IзΑ (ТИФА).

В данном примере описывается применение твердофазного иммуноферментного анализа ^ΕΚΑ) для количественного определения уровней примесей С^-СΗΟ1 остаточных белков клеток хозяина (НСР) в испытуемых образцах. Сначала антитело к 1дО С^-СΗΟ1 НСР иммобилизуют на микротитрационном планшете. Эталоны НСР для сравнения, образцы контроля качества и лекарственного вещества СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iβ инкубируют со связанным кроличьим антителом против 1дО С^-СΗΟ1 НСР. После отмывки микротитрационных планшетов добавляют поликлональное кроличье антитело против конъюгата Биотин-1дО С^-СΗΟ1 НСР, которое связывается с НСР, захваченными на начальной стадии. Микротитрационные планшеты отмывают для удаления любых несвязанных поликлональных антител. Добавляют конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена и микротитрационный планшет снова отмывают, удаляя несвязанные конъюгированные антитела. Затем добавляют хромоген ТМВ, вызывающий колориметрическую реакцию. Реакцию прекращают, добавляя серную кислоту, и с помощью 96-луночного ридера для планшетов измеряют оптическую плотность при 450 нм. Цвет проявляется пропорционально количеству захваченного НСР. Концентрации образцов определяют на стандартной кривой зависимости оптической плотности от концентрации НСР в интервале от 4.11 до 3000 нг/мл.

Для получения конъюгата СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-Iβ используют линию клеток (ЭО44) яичника китайского хомячка (СНО). Для получения белка С^-СΗΟ1 (НСР) клетки ЭО44 стабильно трансфецируют при использовании рекомбинантного вектора рк)16 и выращивают в среде О-С1ΟΕ дополненной галактозой и рекомбулином (рекомбинантным человеческим инсулином). Рекомбинантные антитела для данного варианта метода Е^IЗΑ получают, используя новозеландских белых кроликов, иммунизированных концентратом материала С^-СΗΟ1 НСР. Кроличьи антитела очищают аффинной хроматографией (белок А), затем подвергают диализу в фосфатно-солевой буферный раствор и концентрируют. Около 50 мг 1дО фракции кроличьего антитела против С^-СΗΟ1 биотинилируют, используя реакцию с эфиром Νгидроксисульфосукцинимида. Для адсорбции на 96-луночных планшетах используют немодифицированное кроличье антитело против СЮ1. Оно захватывает С^-СΗΟ1 НСР, которые обнаруживают с помощью биотинилированных кроличьих антител к С^-СΗΟ1.

Конъюгат стрептавидин - пероксидаза хрена связывается с биотином, а для количественного определения С^-СΗΟ1 НСР используют хромоген ТМВ.

Этот метод разработан с целью количественно определить остаточные уровни С^-СΗΟ1 белков клеток хозяина с помощью Е^IЗΑ для проверки высвобождения лекарственного вещества СТ^Α4^{Α29Υ^104Е}-I_§.

- 283 017765

Описание метода.

Иммобилизуют кроличье антитело против СЦ-СНО1 на микротитрационном планшете, инкубируют 18 часов

Отмывают планшет £

Блокируют планшет раствором БеаЫоск £

Готовят разведения образцов СТЬА4^{А29¥Е104Е}- 1д и эталона СЦ-СНО1 НСР £

Отмывают планшет £

Добавляют НСР эталон, образцы и контроль в микротитрационный планшет, инкубируют 1 час £

Отмывают планшет £

Добавляют биотинилированное кроличье антитело к СЦ-СНО1, инкубируют 1 час £

Отмывают планшет £

Добавляют стрептавидин- пероксидазу хрена, инкубируют 1 час

Отмывают планшет £

Добавляют ТМВ хромоген, инкубируют 2 минуты г

Прекращают реакцию, добавляя 1Ν серную кислоту £

Считывают оптическую плотность на ридере микротитрационных планшетов £

Оценивают и документируют данные, представляют результаты

Кроличье антитело к СИ-СН01 биотинилируют, используя набор для биотинилирования с сульфосукцинимидил-6 (биотинамидо)гексаноатом в качестве биотинилирующего агента. Для биотинилирования можно использовать реагент от РШКСЕ (продукт # 21335) с сульфо-ИНЗ-йС-биотин. Антитело метят в соответствии с рекомендациями производителя, в руководстве, прилагаемом к реагенту для биотинилирования. После мечения и разделения на колонке для эксклюзионной хроматографии определяют включение биотина и образец замораживают в аликвотах по 50 мкл или менее при -70°С. Отношение биотинПдО в конечном продукте должно быть между 2 и 4. Хранят при температуре -70°С или ниже.

Иммобилизация на планшетах. Готовят раствор очищенного кроличьего антитела против СИ-СН01 НСР φ(.ι в карбонатном буфере с концентрацией 8 мкг/мл (для микротитрационного планшета требуется 12 мл раствора). В каждую лунку микротитрационного планшета Iтти1оη 4 с помощью калиброванного многоканального микродозатора вносят 100 мкл этого раствора. Микротитрационный планшет закрывают парафильмом и инкубируют при 4°С в течение 18±2 ч.

Отмывка и блокирование планшетов. Отмывают планшет три раза буфером для отмывки с помощью промывателя планшетов. В каждую лунку с помощью калиброванного многоканального микродозатора добавляют 300 мкл раствора ЗеаВ1оск. Инкубируют планшет в течение 1 ч при 22.5±5°С. В градуированных стерильных полипропиленовых пробирках на 15 мл готовят различные концентрации образцов эталонного СИ-СН01 и образцов контроля качества. Разводят материал эталона и контроля качества с помощью разбавителя Текпоуа (1.21). Готовят стандартные растворы (растворы стандарта) в день эксперимента в концентрациях, перечисленных в нижеприведенных примерах.

- 284 017765

Разведения образцов для стандартной кривой (пример для ежедневного приготовления). Исходная концентрация СБ-СН01 белка 5.7 мг/мл.

Разведение А: 26.3 мкл (5.7 мг/мл) + 4.973 мл РТВ разбавителя = 30 мкг/мл

Разведение В: 0.6 мл (30 мкг/мл) + 5.4 мл Разбавителя	3000 нг/мл
2 мл (3000 нг/мл) + 4 мл Разбавителя	1000 нг/мл
2 мл (1000 нг/мл) + 4 мл Разбавителя	333.3 нг/мл
2 мл (333.3 нг/мл) + 4 мл Разбавителя	111.1 нг/мл
2 мл (111.1 нг/мл) + 4 мл Разбавителя	37.0 нг/мл
2 мл (37.0 нг/мл) + 4 мл Разбавителя	12.3 нг/мл
2 мл (12.3 нг/мл) + 4 мл Разбавителя	4.11 нг/мл
0 + 4 мл Разбавителя	0 нг/мл

РС анализ концентрации, хранение и годность.

Готовят образцы контроля качества (РС) при трех различных концентрациях (25, 100 и 700 нг/мл) и свежие образцы используют в день анализа или готовят в большем количестве и хранят в виде аликвот в замороженном состоянии при температуре -70°С или ниже. Замороженные аликвоты анализируют в трех независимых экспериментах. Средний результат трех экспериментов публикуют в Сертификате анализа (СОА) для каждого из трех РС образцов. В день эксперимента замороженные РС оттаивают и анализируют, как описано ниже. После оттаивания каждый РС образец перемешивают на вортексе при скорости в среднем положении в течение 2-4 с. Замороженные РС образцы годны в течение 6 месяцев после даты приготовления. Их используют при их номинальной концентрации, сообщаемой в СОА. Свежеприготовленные РС пригодны в течение 24 ч после приготовления.

Разведения образцов контроля качества (РС) (пример).

Разведение А: 26.3 мкл (5.7 мг/мл) + 4.973 мл Разбавителя = 30 мкг/мл

233 мкл (30 мкг/мл) + 9.767 мл Разбавителя - 700 нг/мл (ОС 1)

1.43 мл (700 нг/мл) + 8.57 мл Разбавителя = 100 нг/мл (РС 2)

2.5 мл (100 нг/мл) + 7.5 мл Разбавителя = 25 нг/мл (ОС 3)

Приготовление образцов. Разводят образцы лекарственного вещества до примерной концентрации 12.5, 6.25 и 3.125 мг/мл.

Разведение А: 400 мкл образца (~25 мг/мл) + 400 мкл Разбавителя = 12.5 мг/мл

Разведение В: 400 мкл (-12.5 мг/мл) + 400 мкл Разбавителя = 6.25 мг/мл

Разведение С: 400 мкл (-6.25 мг/мл) + 400 мкл Разбавителя = 3.125 мг/мл

Отмывка планшетов. Планшеты отмывают три раза буфером для отмывки, используя промыватель планшетов. В лунки блокированного и отмытого планшета добавляют по 100 мкл образцов и РС образцов с каждой стандартной концентрацией в тройном повторе. РС образцы с каждой концентрацией добавляют дважды, всего шесть лунок на планшет. См. предполагаемое размещение на карте планшета в приложении метода. Инкубируют 1 ч при 22.5±5°С. Повторяют стадию отмывки 5 раз. Разводят кроличье антитело против СБ-СН01 ΗСΡ Биотин в буфере Текпоуа до концентрации 2 мкг/мл. Раствор перемешивают на вортексе при скорости в среднем положении в течение примерно 2-4 с. Добавляют по 100 мкл на лунку. Инкубируют 1 ч при 22.5±5°С. Повторяют 5-кратную ступенчатую отмывку. Соответствующим образом разводят конъюгат стрептавидин-НК? ^А-НКТ) в буфере Текпоуа (пример: разведение 1/20000 обычно дает приемлемые показания оптической плотности). Добавляют по 100 мкл разведения δΛ-ΗΚΡ в каждую лунку и инкубируют при 22.5±5°С в течение 1 ч. Берут ТМВ хромоген из холодильника и декантируют в подходящую емкость минимум по 10 мл на планшет. Помещают в темное место и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Повторяют стадию 5-кратной отмывки. Добавляют по 100 мкл ТМВ хромогена в каждую лунку и инкубируют при 22.5±5°С около 2 мин. Реакцию с хромогеном прекращают, добавляя в каждую лунку по 100 мкл 1 N Η2δΌ4. Стоп-реагент добавляют в планшеты и лунки в том же порядке, что и хромоген, чтобы гарантировать одно и то же время реакции хромогена с ферментом в каждой лунке. Определяют оптическую плотность при 450 нм при длине волны стандарта для сравнения 630 нм на соответствующем ридере 96-луночных планшетов.

Анализ данных. Устанавливают шаблон программы δοйтаx СН01 Е11§а. !етр1а!е.ррг, чтобы получить средние значения, стандартные отклонения, % СУ, вычисленные значения концентраций, параметры для построения кривой, е!с. Стандартная кривая. Стандартные данные для сравнения подгоняют к стандартной кривой, используя функцию соответствия четырехпараметрической кривой.

- 285 017765

Υ = ((А - О)/(1+(Х/С^лВ)) +О где Υ - величина оптической плотности (Ад₅₀-А₆₃₀);

А - величина оптической плотности, соответствующая минимальной асимптотической величине;

Ό - величина оптической плотности, соответствующая максимальной асимптотической величине;

С - оптическая плотность, соответствующая половине абсолютной разности между максимальной и минимальной асимптотическими величинами (точка перегиба);

В - тангенс угла наклона в точке перегиба кривой;

Х - концентрация СБ-СНО1 НСР.

Шаблон программы Бойтах СНО1 Е11за. 1етр1а1е.ррг определяет коэффициент смешанной корреляции (К²) линии регрессии для стандартов, используя вычисленное среднее.

Иллюстративные значения. Определяют, соответствуют ли результаты для стандартов (эталонов), ОС и образцов иллюстративным значениям, приведенным ниже. Иллюстративные значения для стандартов. Коэффициент корреляции (К²) для стандартной кривой должен быть >0.99. Среднее фоновое значение для стандартной концентрации 0 нг/мл должно быть <0.2 единиц оптической плотности. Если две или более из семи номинальных концентраций стандартной кривой, за исключением нуля и концентраций ниже ОЕ (12.3 нг/мл), не отвечают условиям 6.1.4 и 6.1.5, анализ полагают неверным и его следует повторить. Рассчитанное среднее значение (нг/мл) при каждой стандартной концентрации, используемое для определения стандартной кривой, за исключением нуля и концентраций ниже ОЕ (12.3 нг/мл), должно быть в пределах 20% заданного (номинального) значения. Коэффициент вариации (%СУ) величин оптической плотности в тройном повторе при каждой стандартной концентрации, за исключением нуля и концентраций ниже ОЕ (12.3 нг/мл), должен быть менее 20%. Для того чтобы гарантировать, что по меньшей мере две конгруэнтные полученные точки пригодны для вычислений, стандарты, контроли качества и образцы засевают в лунки в тройном повторе. Каждое значение в трипликате анализируют по отдельности. Значение, которое дальше всего находится от заданного, отбрасывают. Кривую рассчитывают заново и снова анализируют иллюстративные (образцовые, типичные) значения.

Пример.

Заданное значение (нг/мл) Действительное значение (нг/мл)

12

Единственное значение, самое дальнее от заданного значения 25 нг/мл, это 12 нг/мл. Если отбросить 12 нг/мл из тройного повтора, то среднее оставшихся величин отвечает всем иллюстративным (типичным) значениям. Если показано, что среднее двух остальных величин не отвечает типичным (образцовым) значениям, то эту единичную точку отбрасывают и кривую рассчитывают заново.

Пример.

Заданное значение (нг/мл) Действительное значение (нг/мл)

5.0

5.5

Среднее значение >20% от заданного вне зависимости от того, какое значение отбрасывается, следовательно, единичную точку на кривой отбрасывают и кривую заново пересчитывают.

Типичные значения для ОС образцов. ОС образец представляет собой набор из шести лунок с фиксированной (указанной) концентрацией. По меньшей мере, значения для четырех из шести лунок ОС образца должны быть в пределах 20% от номинального значения, чтобы ОС образец был приемлемым. Все три ОС образца должны быть приемлемыми. Если они не соответствуют типичным значениям, анализ следует повторить.

Типичные значения для испытуемых образцов. Величина оптической плотности анализируемого образца должна быть меньше наивысшей величины РС. Если эта величина превышает наивысшую величину оптической плотности (^С, испытуемый образец следует заметно разбавить, чтобы получить среднее значение между 700 и 12.3 нг/мл. По меньшей мере одно из трех разведений образца (12.5, 6.25 и 3.125 мг/мл) должно попадать в интервал подлежащих регистрации результатов на стандартной кривой, если оптическая плотность всех разведений не находится ниже ОЕ в анализе. В этом случае испытуемые образцы регистрируются как <-ОЕ. Среднее из трех значений оптической плотности в тройном повторе разведений образца более высокое, чем ОЕ, и попадающее в интервал анализа, должно иметь СУ менее 20%.

Расчет и регистрация данных о концентрации СБ-СНО1 НСР в образцах.

Расчет концентрации СБ-СНО1 НСР в образцах. Умножают средние результаты для образцов на соответствующий фактор разведения (т.е. 2, 4 и 8), получают концентрацию СБ-СНО1 НСР в неразведенном образце в нг/мл для каждого из разведений. Определяют среднее для результатов тех разведений,

- 286 017765 которые попадают в интервал анализа. Делят результат на зарегистрированную концентрацию белка СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд (мг/мл), получают концентрацию СВ-СН01 НСР в нг/мг СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд.

Пример расчета

Средний результат образца: 235 нг СР- СНО1 НСР/мл = 9.4 нг/мг

Конц, белка: 25.0 мг/мл

Примечание: нг С1)-С1101 НСР/мг продукта (нг/мг) эквивалентно частям на миллион (м.д., ррт).

Пример 53. Определение уровней белка А в СТ^А4^{А29Υ^104Е}-Iд методом ЕЫ8А.

В этом твердофазном иммуноферментном анализе (ЕЫ8А) количественно определяют уровни примеси белка А в испытуемых образцах СТ^А4^{Λ29Υ^104Е}-Iд. Сначала иммобилизуют кроличье антитело против белка А на микротитрационном планшете. Эталоны для сравнения, образцы контроля качества, образцы контроля выхода белка А и образцы СТ^А4^{Λ29Υ^104Е}-Iд инкубируют с антителом к конъюгированному белку А ОО. После отмывки титрационных микропланшетов добавляют биотинилированное моноклональное кроличье антитело к конъюгату белок А ВО, которое связывается с белком А, захваченным на начальной стадии. Микротитрационные планшеты отмывают, чтобы удалить любые несвязанные моноклональные антитела. Через 1 ч после инкубации прибавляют конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена; микротитрационный планшет снова отмывают, чтобы удалить любые несвязанные конъюгированные антитела. Затем добавляют ТМВ хромоген, вызывающий колориметрическую реакцию. Реакцию прекращают, добавляя серную кислоту, и с помощью ридера для 96-луночных планшетов измеряют оптическую плотность при 450 нм. Цвет проявляется пропорционально количеству захваченного белка А. Концентрации образцов определяют на стандартной кривой зависимости оптической плотности от концентрации белка А в интервале от 0.188 до 12 нг/мл.

Описание метода.

Иммобилизуют кроличье антитело против Белка А на микротитрационном планшете, инкубируют 18 ч г

Отмывают планшет г

Блокируют планшет раствором ЗирегЫоск™

Готовят разведения образцов СТЬА4^а29¥1'^104Еэталонного материала Белка А и контроля выхода

I

Отмывают планшет

I

Добавляют эталон Белка А, образцы и контроль качества в микротитрационный планшет, инкубируют 1 час г

Отмывают планшет г

Добавляют биотинилированное кроличье антитело к Белку А, инкубируют 1 час

Отмывают планшет

Ф

Добавляют стрептавидин- пероксидазу хрена, инкубируют 1 час г

Отмывают планшет

Ф

Добавляют ТМВ хромоген, инкубируют 2 минуты г

Прекращают реакцию, добавляя 1Ν серную кислоту

Ф

Считывают оптическую плотность на ридере микротитрационных планшетов

Оценивают и документируют данные, представляют результаты

Нанесение иммобилизованного антитела на планшет (сенсибилизация). Готовят раствор кроличьего антитела против белка А в буфере для сенсибилизации поверхности с концентрацией 1 мкг/мл и добавляют 100 мкл этого раствора в каждую лунку микротитрационного планшета Со§1аг. Инкубируют при 4°С в течение 18±2 ч.

- 287 017765

Отмывка и блокирование планшетов. Отмывают планшеты три раза раствором для отмывки, используя промыватель планшетов (вошер). В каждую лунку добавляют 200 мкл 8ирегВ1оск™. Инкубируют микротитрационный планшет в течение 60 мин при комнатной температуре. Приготовление эталона для сравнения. Готовят эталон для сравнения, смешивая соответствующее количество эталонного материала белка А и соответствующий объем ацетатного буфера. Раствор перемешивают на вортексе при скорости в среднем положении в течение 2-4 с. Инкубируют образцы эталона для сравнения, контроля качества и контроля выхода в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем добавляют в микротитрационный планшет.

Пример. Эталонный материал белок А, концентрация исходного раствора 2.3 мг/мл

1: 200 10 мкл (2.3 мг/мл) + 1990 мкл (Ацетатный буфер) = 11500 нг/мл

1: 479 10 мкл (11500 нг/мл) + 4780 мкл (Ацетатный буфер) = 24 нг/мл мл (24 нг/мл) + 2 мл (Ацетатный буфер) =12 нг/мл мл (12 нг/мл) + 2 мл (Ацетатный буфер) = 6 нг/мл мл (6 нг/мл) + 2 мл (Ацетатный буфер) = 3 нг/мл мл (3 нг/мл) + 2 мл (Ацетатный буфер) = 1.5 нг/мл мл (1.5 нг/мл) + 2 мл (Ацетатный буфер) = 0.75 нг/мл мл (0.75 нг/мл) + 2 мл (Ацетатный буфер) = 0.375 нг/мл мл (0.375 нг/мл) + 2 мл (Ацетатный буфер) = 0.188 нг/мл мл + 2 мл (Ацетатный буфер) = 0 нг/мл

Каждую концентрацию эталона (стандарта) анализируют в тройном повторе. Образцы помещают в микротитрационный планшет, как описано в приложении метода. Приготовление образцов контроля качества (РС). Готовят образцы контроля качества (РС) белка А в ацетатном буфере при трех заданных уровнях концентраций, 0.5, 2 и 5 нг/мл. Их готовят либо в день эксперимента и используют свежеприготовленные, либо готовят в большем количестве и хранят в виде аликвот по 750 мкл в замороженном состоянии при температуре <70°С. Концентрацию белка А в замороженных РС образцах предварительно определяют в трех независимых анализах методом БОЗА белка А и средние концентрации для каждого РС образца публикуют в Сертификате анализа (СОА) как номинальные РС концентрации.

В день эксперимента ампулы с каждым их трех РС образцов размораживают при комнатной температуре. Каждую РС концентрацию анализируют дважды (в двух тройных повторах каждой концентрации). Помещают РС образцы в микротитрационный планшет, как описано в приложении метода.

Эталонный материал Белок А, 2.3 мг/мл

1: 200 10 мкл (2.3 мг/мл) + 1990 мкл (Ацетатный буфер) = 11500 нг/мл

1: 479 10 мкл (11500 нг/мл) + 4780 мкл (Ацетатный буфер) = 24 нг/мл

833.3 мкл (24 нг/мл) + 3.166 мл (Ацетатный буфер)= 5 нг/мл (ζ)Ο1)

1.600 мл (5 нг/мл) + 2.4 мл (Ацетатный буфер)= 2 нг/мл (6>С2) мл (2 нг/мл) + 3 мл (Ацетатный буфер)= 0.5 нг/мл (ОСЗ)

Приготовление испытуемых образцов. В полипропиленовых пробирках готовят образцы СТ^Л4^{А29Υ^104Е}-Iд для испытания с концентрациями 2.5 мг/мл, 1.25 мг/мл и 0.625 мг/мл, используя ацетатный буфер (рН 3.5). Испытуемые образцы инкубируют около 10 мин при комнатной температуре, а затем добавляют в микротитрационные планшеты.

Отмывка планшетов. Планшеты отмывают три раза раствором для отмывки, используя промыватель планшетов (вошер). Промыватель планшетов устанавливают таким образом, чтобы в лунках было по 300 мкл буфера для отмывки, время замачивания ноль. В каждую лунку добавляют по 100 мкл каждого из образцов эталона для сравнения, контроля качества, контроля выхода и тестируемых образцов и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Повторяют стадию (отмывки). Разводят биотинилированное антитело против белка А в разбавителе Текпоуа до заданной концентрации, указанной для оптимизации каждой новой партии. Например, готовят разведение 1: 64000 для конъюгата моноклонального антитела против белка А с биотином, перемешивают на вортексе при скорости в среднем положении и в каждую лунку добавляют по 100 мкл, используя многоканальный микродозатор. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре.

Разводят конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена в разбавителе Текпоуа до заданной концентрации, указанной для оптимизации каждой новой партии. Например, готовят разведение 1:80000 конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена. Перемешивают на вортексе при среднем положении скорости и добавляют по 100 мкл в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Повторяют стадию, но отмывают пять раз. Добавляют по 100 мкл ТМВ хромогена в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре около 2 мин. Оптическая плотность для наивысшей концентрации на стан

- 288 017765 дартной кривой должна быть между 0.980 и 1.400. Реакцию с хромогеном прекращают, добавляя в каждую лунку по 100 мкл 1 N Н₂8О₄. Стоп-реагент добавляют в планшеты и лунки в том же порядке, что и хромоген, чтобы гарантировать одно и то же время реакции хромогена с ферментом в каждой лунке. Определяют оптическую плотность при 450 нм при длине волны стандарта для сравнения 630 нм на соответствующем ридере 96-луночных планшетов.

Анализ данных. Устанавливают шаблон программы 8ойтах для Рго1ет А ЕЫ8А так как она дает среднее значение, стандартные отклонения и % СV и т.д. Все расчеты, проводимые в разделах Анализ данных, осуществляют, используя шаблон Рго1ет А ЕЫЗА 1етр1а1е.ррг в программе 8о11МахРго.

Анализируют средние значения оптической плотности (АЬз) тройного повтора, полученные для каждой концентрации эталона и образца. Моделируют данные для стандартов белка А, используя невзвешенную четырехпараметрическую регрессию вида:

., тт - тах

АЬз = -----------+ тах

1+(с/ег»₅₀ ) где АЬз - оптическая плотность;

тш - величина оптической плотности, соответствующая минимальной асимптотической величине; тах - величина оптической плотности, соответствующая максимальной асимптотической величине;

ЕЭ₅₀ - оптическая плотность, соответствующая половине абсолютной разности между максимальной и минимальной асимптотическими величинами;

В - тангенс угла наклона в точке перегиба кривой;

С - концентрация белка А.

Типичные (образцовые) значения.

Типичные значения для эталонов. Типичные значения для эталонов применяются к значениям, равным или превышающим количественный предел ^Ь), тогда как величины ниже ОЕ применяются только для того, чтобы содействовать установлению экстремумов кривой. Коэффициент смешанной корреляции (К²) для стандартной кривой должен быть >0.99. Среднее фоновое значение для концентрации стандарта 0 нг/мл должно быть <0.08 единиц оптической плотности. Рассчитанное среднее значение (нг/мл) при каждой концентрации стандарта, используемое для определения стандартной кривой, за исключением нуля и ^^, должно быть в пределах 15% заданного (номинального) значения. Среднее значений оптической плотности трипликата ОЕ на стандартной кривой должно иметь % СТ менее 20% и быть в пределах 20% от заданного.

Пример 54. ЕЫЗА для определения МСР-1 подобного белка в СТ^Ά4^{Ά29Υ^104Е}-Iд.

В этом твердофазном иммуноферментном анализе (ЕЫ8А) определяют концентрацию МСР-1подобного белка в СТ^Ά4^{Ά29Υ^104Е}-Iд. Растворы в концентрациях на стандартной кривой (0.4-25.6 нг/мл), образцов контроля качества и испытуемых образцов наносят на микротитрационные планшеты с иммобилизованным козьим антителом против мышиного МСР-1 и инкубируют 60 мин при комнатной температуре (22.5±5°С). Планшеты отмывают, добавляют вторичное антитело (кроличье против МСР-1 ^С крысы) и инкубируют 60 мин при 22.5±5°С. Планшеты отмывают, в каждую лунку добавляют конъюгат антитела козы против кроличьего ^С и инкубируют 30 мин при 22.5±5°С. Планшеты отмывают и добавляют ТМВ хромоген, происходит колориметрическая реакция. Реакцию прекращают, добавляя 1 N Н₂8О₄, с помощью ридера для 96-луночных планшетов измеряют оптическую плотность при 450 нм и моделируют данные, используя кривую регрессии с подгонкой по 4 параметрам. Затем рассчитывают концентрацию МСР-1-подобного белка для каждого тестируемого образца относительно МСР-1 эталонного материала. Концентрацию дают в нг МСР-1-подобного белка на 1 мг (части на миллион, м.д., ррт) образца, получают делением результата (концентрации, найденной) на стандартной кривой на концентрацию неразведенного образца. Этот метод позволяет определять примеси МСР-1-подобного белка в биологических образцах из клеточных культур по ходу процесса, в очищенном лекарственном веществе и лекарственном продукте. МСР-1-подобный белок может присутствовать в биологических образцах, полученных в культуре клеток яичника китайского хомячка (СНО). Идентифицировано два поликлональных антитела, которые связываются с примесью МСР-1-подобного белка после очистки от СНО клеток. Антитела специфичны к мышиному и крысиному МСР-1 (интактному) и оба перекрестно реагируют с МСР-1-подобным белком из СНО клеток, что демонстрируется в данном сообщении.

Сенсибилизация планшетов. Для покрытия планшета разводят козье антитело против мышиного МСР-1 до концентрации 5 мкг/мл с помощью буфера для сенсибилизации. Вносят разведение в лунки по 100 мкл/лунка. Планшеты закрывают крышкой и инкубируют при 22.5±5°С 12-18 ч. Отмывка планшетов. Планшеты отмывают три раза раствором для отмывки, используя промыватель планшетов (вошер). Программу вошера устанавливают на 3 отмывки, 300 мкл/лунка и время замачивания ноль. Или же планшеты можно отмывать вручную. Добавляют 300 мкл раствора в каждую лунку с помощью калиброванного многоканального микродозатора. Лунки освобождают, вытряхивая в приемник (ванну), и осторожно наносят капли на бумажное полотенце. Повторяют трижды.

Блокирование планшетов. В каждую лунку калиброванным многоканальным микродозатором добавляют 300 мкл буфера для стабилизации сенсибилизации и блокирования. Планшеты инкубируют

- 289 017765

1-2 ч при температуре 22.5±5°С. Отмывка и хранение планшетов. Планшеты отмывают трижды раствором для отмывки, как описано в разделе 4.2. Заполняют планшеты, добавляя 300 мкл буфера для сенсибилизации в каждую лунку, герметично заклеивают и хранят в темноте при 2-8°С в течение одной недели.

Приготовление стандартов (эталонов). Из исходного раствора МСР-1-подобного белка готовят раствор с концентрацией 25.6 нг/мл в РТВ и делают серийные разведения (1: 2) до 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 и 0 нг/мл, используя РТВ в качестве разбавителя. Или же можно использовать замороженные эталоны (стандарты), готовя большое количество эталонов. Аликвоты хранят при температуре (-70)-(-80)°С. Следует избегать многократных циклов замораживания/оттаивания. Замороженные эталоны (стандарты) следует количественно определить относительно образцов контроля качества в трех независимых опытах ЕГОЗА. Замороженные эталоны (стандарты) и ОС должны быть приемлемыми в каждом опыте. По завершении трех приемлемых опытов выдают Сертификат анализа. Замороженные эталоны (стандарты) применяют в их номинальной концентрации. Они пригодны в течение 3 месяцев с момента приготовления.

Пример приготовления МСР-1 эталона из исходного раствора с концентрацией 0.97 мг/мл:

а) готовят 2.5 мл раствора с концентрацией 5200 нг/мл в РТВ: 13.4 мл исходного раствора + 2.487 мл разбавителя;

б) готовят 160 мл раствора с концентрацией 25.6 нг/мл в РТВ: 788 мл исходного раствора +160 мл разбавителя.

Каждый раствор перемешивают в пробирке на вортексе 2-3 с, а затем осторожно переворачивают 23 раза.

Контроль качества. Для программы контроля качества ^С) берут МСР-1-подобный белок, приготовленный в номинальных концентрациях 17.7, 5.3 и 1.2 нг/мл в РТВ. Готовят большое количество аликвот ОС и хранят при (-70)-(-80)°С до 3 месяцев. Избегают многократных циклов замораживание/оттаивание. Делают количественные определения для образцов для контроля качества относительно стандартной кривой в трех опытах ЕГОЗА. ОС должны быть приемлемы в каждом опыте. По завершении трех приемлемых опытов вносят в протокол средний результат каждого приемлемого ОС и издают Сертификат анализа. ОС используют в рассчитанных концентрациях. Они пригодны в течение трех месяцев с момента приготовления. Пример приготовления замороженных ОС разведений из эталона МСР-1 с исходной концентрацией 0.97 мг/мл:

а) готовят 2.5 мл с концентрацией 5200 нг/мл в РТВ: 13.4 мл исходного раствора + 2.487 мл разбавителя;

б) готовят конечное разведение образцов МСР-1-подобного белка (контроль качества) следующим образом: ______________________________________________________

Концентрация МСР-1 (нг/мл)	5200 нг/мл МСР-1 подобный пептид для добавления (мкл))	Количество РТВ буфера для добавления (мл)	Общий объём (мл)
17.7	409	119.6	120
5.3	122	119.9	120
1.2	28	120	120

Перемешивают каждый раствор на вортексе в течение 2-3 с, а затем осторожно переворачивают 2-3 раза. Или же ОС можно готовить непосредственно в день анализа.

Испытуемые образцы. Испытуемые образцы готовят, добавляя 200 мкл образца для испытания к 200 мкл РТВ и перемешивая на вортексе в течение 2-4 с. Вносят эталоны для сравнения, образцы контроля качества (х2) и тестируемые образцы в планшеты, в тройном повторе, 100 мкл на лунку, и инкубируют 1 ч при 22.5±5°С (не используют внешние лунки). Готовят вторичное кроличье антитело против крысиного МСР-1 в РТВ буфере с концентрацией 2 мкг/мл в объеме, достаточном для планшетов, используемых в анализе. Перемешивают на вортексе 2-4 с. Повторяют отмывку, но отмывают пять раз. В каждую лунку добавляют 100 мкл раствора вторичного антитела и инкубируют 60 мин при 22.5±5°С. Готовят раствор конъюгата третичного антитела козы против кроличьего иммуноглобулина - НКР (например, разведение 1:20000 или подходящее разведение), используя РТВ в качестве разбавителя. Перемешивают раствор на вортексе 2-4 с. Повторяют отмывку. В каждую лунку добавляют по 100 мкл НКР конъюгата и инкубируют при 22.5±5°С в темноте в течение 30 мин. Повторяют отмывку. В каждую лунку добавляют по 100 мкл ТМВ и инкубируют при 22.5±5°С в темноте 3-6 мин или до появления нужного цвета. Прекращают реакцию хромогена, добавляя в каждую лунку по 100 мкл 1 Ν Н₂ЗО₄ в том же порядке, как и при прибавлении хромогена. Считывают оптическую плотность при 450 нм при длине волны стандарта для сравнения 630 нм на соответствующем ридере 96-луночных планшетов.

Обработка полученных данных.

Используют программу Зойшах™ Зо11\\аге с файлом протокола МСР-1.ррг для построения стандартной кривой с помощью невзвешенной четырехпараметрической регрессии вида:

Оптическая плотность^ — ~—1—· + О

- 290 017765 где А - величина оптической плотности₄₅₀, соответствующая минимальной асимптотической величине;

Ό - величина оптической плотности₄₅₀, соответствующая максимальной асимптотической величине;

с - концентрация, соответствующая половине абсолютной разности между максимальной и минимальной асимптотическими величинами;

В - аппроксимированный тангенс угла наклона линейного участка кривой;

х - концентрация эталона для сравнения (исходная).

Сообщают результаты только для образцов с приемлемыми данными для стандартных кривых, контроля качества и тестируемых образцов.

Типичные (иллюстративные) значения для стандартов. Типичные значения для стандартов (эталонов) применяют к значениям, которые равны нли выше РЬ (0.8 нг/мл), тогда как значения ниже РЬ применяются только для того, чтобы содействовать установлению экстремумов кривой. Среднее фоновое значение (для стандартной концентрации 0 нг/мл) должно быть <0.1 единиц оптической плотности. Средняя полученная при обратном расчете концентрация МСР-1 (нг/мл) в каждой концентрации стандарта, используемой для определения на стандартной кривой, должна быть в пределах 15% от заданной (номинальной) величины. Коэффициент вариации (% СУ) величин А₄₅₀ в тройном повторе при каждой стандартной концентрации, используемой для определения на стандартной кривой, должен быть <15%. Средние значения А₄₅₀ тройного повтора в рь стандартной кривой должны иметь % СУ <20% и обратный расчет в пределах 20% от заданной (номинальной) концентрации (0.8 нг/мл). Каждое значение в трипликате, используемое для расчета среднего, анализируют по отдельности. Значение, которое дальше всего находится от среднего, отбрасывают, кривую рассчитывают заново и снова анализируют типичные значения. Если оказывается, что среднее из остальных двух значений по-прежнему не отвечает типичным (образцовым) значениям, тогда единичную точку отбрасывают и кривую снова пересчитывают.

Типнчные значения для РС образцов. РС образец определяют как набор из трех лунок с фикснрованной (указанной) концентрацией, следовательно, для трех номинальных концентраций, установленных в данном методе, получают набор из шести РС образцов. Концентрации, полученные с помощью обратного расчета, по меньшей мере в двух из трех лунок РС образца должны быть в пределах 20% от предварительно определенной заданной концентрации (см. СОА) для РС образца для того, чтобы быть приемлемыми. По меньшей мере четыре из шести РС образцов должны быть приемлемыми; два из шести РС образцов (но не два при одной и той же концентрации) могут быть неприемлемыми, и не более 6 РС образцов из 18 лунок могут отличаться более чем на 20% от соответствующих заданных концентраций. Если они не соответствуют типичным значениям, анализ следует повторить.

Типичные значения для испытуемых образцов. Средняя вычисленная концентрация МСР-1 должна быть ниже наивысшей концентрации РС. Если средняя вычисленная концентрация МСР-1 >0.8 нг/мл (ΩΟ, % СУ определений тройного повтора должен быть <20%. Если это условие не соблюдается, результат образца неверен и должен быть повторен. Если результат соответствует этому критерию, среднюю концентрацию МСР-1 используют для расчета конечного результата. Если вычисленная концентрация <0.8 нг/мл (РЬ), образец регистрируется как < рь, а величину < 0.8 нг/мл используют для расчета конечного результата.

Пример 55. Обнаружение ДНК СНО в СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д и СТЬА4-1д с помощью количественной полимеразной цепной реакции.

Этот метод разработан с целью обнаружения остаточной ДНК СНО в образцах лекарственного вещества с применением количественной полимеразной цепной реакции (цРСК) в реальном времени. ПЦР представляет собой репликацию смеси ДНК. В этом анализе используют флуорогенный зонд для обнаружения специфического СНО ПЦР продукта по мере его накопления в ходе анализа. Скорость амплификации ПЦР продукта прямо пропорциональна количеству ДНК, присутствующей в образце.

Перевод величины ДНК в пикограммы/миллиграмм. Величину в пг/мл делят на концентрацию образца, определяемую по оптической плотности при 280 нм. Типичный расчет для образца с концентрацией белка 50 мг/мл и сообщаемым значением от Вюгейапсе = 0.67 фг/мкл. Стадия 1: перевод в пг/мл = 0.67 пг/мл. Стадия 2: перевод в пг/мг = (0.67 пг/мл/50.0 мг/мл) = 0.013 пг/мг.

Пример 56. Анализ СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д методом 8П8-РАРЕ.

В данном примере описан анализ СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д с целью оценки чистоты СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д лекарственного вещества и лекарственного продукта. СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д представляет собой полученный генетической инженерией слитый белок, состоящий из модифицированного лигандсвязывающего домена цитотоксического Т лимфоцитарного антигена 4 (СТЬА4) и Есу1 области человеческого 1дС. СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д имеет молекулярную массу ~92 кДа и среднюю (кажущуюся) молекулярную массу 97 кДа (невосстановленный) или 55 кДа (восстановленный). Электрофорезом СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д на 4-20% градиентных 8О8-полиакриламндных гелях отделяют основные мономерные частицы от более высокомолекулярных частиц (агрегатов, димеров и мультимеров более высокого порядка), а также более низкомолекулярные частицы (фрагменты, полученные при расщеплении). Денситометрическое сканирование и программа ИпадеРиагИТЕ™ для количественного анализа гелей, окрашенных Кумасси синим, позво

- 291 017765 ляют определить чистоту белка. Результаты выражаются как процент чистоты СТЬА4^{А29¥Е104Е}-1д в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Реагенты.

Примечание: все реагенты можно заменить на эквивалентные альтернативы. 1Х Трис-Глицин-ЗБЗ Рабочий буфер. В мерный цилиндр на 1 л помещают 100 мл рабочего буфера Трис-Глицин-ЗЭЗ 10Х. Доводят объем до 1 л водой, очищенной в системе Милли-9, или водой для ВЭЖХ. Закрывают, несколько раз переворачивают для перемешивания. Этот реагент следует готовить в день анализа. Примечание: при необходимости готовят дополнительный объем.

Реагент для окрашивания Кумасси синим. Перемешивают раствор реагента для окрашивания 6е1Собе В1ие непосредственно перед применением, осторожно переворачивая бутыль или наклоняя и перемешивая ее круговыми движениями несколько раз. Такое перемешивание особенно важно, когда использую контейнер 6е1Собе на 3.5 л с ручным насосом (Са1а1од Νσ. 24592). Для перемешивания раствора не следует встряхивать бутыль. Примечание: важно перемешать окрашивающий реагент перед применением, чтобы гарантировать его однородность.

Фиксирующий раствор: 50% метанола/7% уксусной кислоты в воде. В мерном цилиндре на 1 л смешивают 500 мл метанола и 70 мл уксусной кислоты. Доводят объем до 1 л водой, очищенной в системе Милли-9, и перемешивают. Фиксирующий раствор устойчив при комнатной температуре до 6 месяцев. Примечание: фиксирующий раствор следует готовить в химическом вытяжном шкафу.

Препарат контроля окрашивания. Восстанавливают ингибитор трипсина водой, очищенной в системе Милли-9, получают исходный раствор с концентрацией 2 мг/мл. Готовят аликвоты по 50 мкл и замораживают при -30±10°С, хранят в замороженном состоянии до 6 месяцев. Для разведения исходного раствора белка до рабочей концентрации используют следующий порядок разведения :

мкл исходного раствора + 75 мкл воды Милли-9 \уа1ег = 0.5 мкг/мкл мкл раствора с концентрацией 0.5 мкг/мл +160 мкл воды Милли-9 = 100 нг/мкл

Для приготовления наносимого раствора для контроля окрашивания используют нижеприведенную таблицу.

Приготовление образцов для контроля окрашивания

Приготовление контроля окрашивания	Невосстановленный (мкл)
Ингибитор трипсина (100 нг/мкл)	10
Буфер для образцов Трис- Глицин 8В8 (2Х)	50
Вода Милли- 9	40
Общий объём	100

Нагрузка 10 мкл препарата для контроля окрашивания дает нагрузку по белку 100 нг.

Приготовление эталонов и образцов

Схема нагрузки в стационарном процессе, образцы 6ЙР/6МР лекарственного вещества, лекарственного продукта или образцы стабильности. Разведение для гелей, окрашенных Кумасси синим. Разводят тестируемые изделия и эталонный материал до рабочей концентрации 1.0 мкг/мкл и наносят как восстанавливающиеся, так и невосстанавливающиеся с маркёрами молекулярной массы, как описано в приведенной ниже таблице.

Разведение образца и нагрузка на гель для геля, окрашенного Кумасси синим

Дорож- Описание ка	(ΝΚ/Κ) Условия	Рабочая концентрация (мкг/мкл)	Объём нагрузки (мкл)	Нагрузка белка (мкг)
1	Образец 1	Ж	1.0	10	10
2	Эталон	Ж	1.0	10	10
3	Контроль1	Ж	0.0	10	0
4	Образец 1	К	1.0	10	10
5	Эталон	к	1.0	10	10
6	Исслед. молек. массы.	к	-	10	-
7	Эталон	к	1.0	10	10
8	Образец 2	к	1.0	10	10
9	Контроль11	ж	0.0	10	0
10	Эталон	ж	1.0	10	10
11	Образец 2	ж	1.0	10	10
12	Контроль	ж	0.01	10	0.1

_____окрашивания________________________________________________ Контроль¹ - нагрузка 10 мкл 1Х ΝΗ буфера образца.

Примечание: Полосу контроля окрашивания включают в сканированное изображение геля для визуального изучения с целью оценки пригодности системы. Полоса контроля окрашивания отсутствует в кадрированном изображении для сохранения единообразия в отчете о геле.

- 292 017765

Приготовление образца и электрофорез. Разведение образца для нанесения по 10 мкг белка/дорожка. Следуют описанному ниже методу для приготовления образцов для нагрузки 10 мкг/10 мкл. Используя в качестве разбавителя воду Милли-Ц, разводят испытуемые образцы и эталон до концентрации 10 мг/мл СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-[§. Для расчетов можно использовать примерные концентрации. Например: если образец лекарственного вещества СТ^Λ4^{Λ29Υ^104Е}-[§ имеет концентрацию 25 мг/мл, готовят разведение 1:2.5 (добавляют 40 мкл образца к 60 мкл воды Милли-Ц). При приготовлении конечного образца для электрофореза следуют нижеприведенной таблице. Для приготовления этих разведений используют микроцентрифужные пробирки.

Разведение испытуемых образцов

Реагент	Восстанавливающийся (мкл)	Невосстанавливающийся (мкл)
Тестируемое изделие 10 мг/мл	10	10
Трис- Глицин 8В8 Буфер для образцов	50	50
(2Х)
МиРАСЕ восстановитель (10Х)	10	ΝΑ
Вода Милли-0	30	40
Общий объём	100	100

Примечание: при необходимости объем раствора белка доводят до 100 мкл, добавляя воду МиллиЦ. Примечание: если концентрация образца < 10 мг/мл, готовят конечный образец в соответствии с вышеприведенной таблицей. Объем раствора белка и воды корректируют таким образом, чтобы нагрузка белка на гель была максимальной.

Нагревание образцов. После приготовления разведений образца закрывают микроцентрифужные пробирки и перемешивают раствор на вортексе. Образец (образцы) нагревают на водяной бане при температуре 80±5°С в течение 2.0±0.5 мин (используют точный таймер). Вынимают образец (образцы) из бани и оставляют охлаждаться до комнатной температуры. Пробирки переворачивают несколько раз, чтобы снять конденсат с верхней части и боковых сторон пробирок.

Подготовка прибора и геля. Вынимают гель из упаковки и осторожно удаляют гребенку, чтобы гарантировать, что стенки лунок ровные. Лунки, при необходимости, выравнивают кончиком (гребенки) для заливки геля. Вносят гель в электрофоретическую ячейку так, чтобы короткая стеклянная пластина была обращена к противоположной стороне. Закрепляют гель (гели) таким образом, чтобы герметично отделить внутреннюю камеру от внешней камеры. Целиком заполнить внутреннюю камеру рабочим буфером 1Х Трис-Глицин-8О8. Проверяют, нет ли утечки, затем заполняют внешнюю камеру до верха лунок рабочим буфером 1Х Трис-Глицин-8О8. Осторожно отмывают лунки пипеткой с рабочим буфером 1Х Трис-Глицин-8Э8, удаляя остатки акриламида. Повторяют промывку лунок до тех пор, пока лунки не станут абсолютно прозрачными и готовыми к проведению определений.

Нанесение образцов. С помощью аппликаторов для нанесения образцов на гель вносят в каждую лунку 10 мкл образца. На все дорожки для контроля наносят 10 мкг 1Х невосстанавливающего буфера для образцов. Это позволяет предотвратить восстановление невосстанавливающегося образца за счет утечки восстановителя и сохранить близкую концентрацию соли на всем протяжении геля.

Электрофорез. Подсоединяют крышку блока с гелем и соединяют электроды с источником тока. Доводят силу тока до 25 мАмп/гель (мА) и устанавливают напряжение (В) и мощность (Вт) на максимум. Примечание: настойки источника могут меняться в зависимости от фирмы-изготовителя. Устанавливают настройки таким образом, чтобы сила тока была 25 мА/гель. Проводят электрофорез в течение 60 мин или до тех пор, как только фронт красителя буфера для образца не достигнет нижней части геля. Выключают источник тока, отсоединяют провода и вынимают гель (гели) из прибора. Осторожно извлекают пластиковые пластины. Удерживают пластиковую пластину со связанным с ней гелем над подходящим фиксирующим раствором для окрашивания. Погружают гель в раствор до тех пор, пока гель не удалится с пластиковой пластины.

Фиксация геля. Примечание: все стадии проводят при комнатной температуре при осторожном встряхивании на орбитальном шейкере. Примечание: окрашивание проводят в плотно закрытом контейнере для предупреждения испарения реагента. Примечание: хотя можно использовать приведенный объем, важно, чтобы гель был полностью покрыт на всех стадиях. При определении объемов нужно принимать во внимание размеры геля и лотка для окрашивания. После электрофореза на 15 мин добавляют 50 мл фиксирующего раствора (раствор 50% метанола/7% уксусной кислоты). Промывают гель трижды по 5 мин, каждый раз берут ~100 мл воды МИНЦ. Перед употреблением перемешивают раствор реагента для окрашивания Кумасси и добавляют 50 мл на 8x10 см мини-пластин геля. Если используют лоток большего размера, может потребоваться дополнительный реагент. Лоток осторожно встряхивают на орбитальном шейкере в течение 20±1 ч. Для однородности окрашивают все гели в том же опыте (той же партии) одинаковое время. Краситель удаляют (обесцвечивают), заменяя реагент для окрашивания Кумасси на 100 мл воды Милли-Ц. После 1 ч деколоризации гель готов к сканированию.

- 293 017765

Сканирование и анализ гелей.

После электрофореза и окрашивания все гели сканируют, используя сканирующий денситометр. Файлы изображений хранятся на локальном жестком диске компьютера и/или подсоединяются к сети и архивируют в местной сети. Анализ сканированных изображений геля осуществляют с помощью программы Iтаде^иаη! ТЕ (ν2003.03). Показатели сканирования и анализы приводятся в табл. 5. Результаты сканирования собирают и рассчитывают количественно, используя соответствующие (ведомственные) методики.

Таблица 5

Параметры сканирования и анализа гелей

Параметры сканирования	Значение параметра
Размер пикселя	100
Вес младшего разряда	12 бит
Параметры детекции	полосы
Корректировка фона	Установка радиуса 200
Минимальный наклон	Начальный 500
Уменьшение уровня шума	Начальный 5
% от максимального	Начальный 0
пика
% ширины дорожки	Установлено на 75%

Примечание: параметры сканирования в данной таблице не следует менять в ходе сканирования.

Параметры - детекция полосы, ширина дорожки (установлена на 75%) и корректировка радиуса (радиус установлен на 200) - рекомендуются для анализа изображения всех сканированных гелей (какие-либо изменения следует документировать). Корректировка параметров, таких как минимальный наклон, снижение уровня шума и % максимального пика, может быть необходимой для точной идентификации полос вследствие различий в физическом состоянии геля, таких как уменьшение объема, усадка после окрашивания/обесцвечивания, и разницы очертаний полосы геля. Вручную корректируют любые утраченные и плохо определенные полосы. Следуют инструкциям в руководстве к Iтаде^иаη! ТЕ (ν2003.03) и на экране, чтобы получить дополнительную информацию о параметрах обнаружения полос.

Сканируют гели, используя параметры сканирования, указанные в таблице. Весь анализ и оценки геля делают на основании сканированного изображения. Открывают файл изображения геля (сканированное изображение) из <1Ώ Анализ геля> в программе Iтаде^иаη!Т^. Переходят к опции <Контраст> на панели инструментов и устанавливают в опции <Гистограмма изображения - параметр Высота> на 0.3 с целью улучшить изображение так, чтобы все полосы стали четко видимыми. Примечание: эту стадию проводят для четкой визуализации изображения геля для последующего анализа, она не влияет на количественный результат. Не используют более четкое (улучшенное) изображение геля для визуальной оценки полос геля или для отчета о геле. Выбирают опцию <Создание полос>, а в ней <Руководство>, устанавливают <Число полос> для анализа. Корректируют <Дорожка % ширины> до 75%. При необходимости соответствующим образом настраивают (выравнивают) одиночные дорожки. Для того чтобы вычесть фон, используют метод <Катящегося шарика>. Для точного расчета фона устанавливают <Радиус> на 200. Полосы детектируют, используя начальные показатели в опциях <Минимальный наклон>, <Снижение уровня шума> и <% максимального пика>, приведенные в табл. 4. Для точной идентификации полос может быть необходима корректировка этих значений. Вручную оценивают любые недостающие или недостаточно четкие полосы. Определяют молекулярную массу полосы, используя маркёр молекулярной массы из перечня молекулярных маркёров, приведенного ниже. Пропускают стадии калибровки и нормализации. Заносят результаты, включая молекулярные массы, объем полосы и % полосы в бланк Ехсе1 для подробной документации и регистрации. Одиннадцать из двенадцати эталонов молекулярной массы, перечисленных в табл. 5, можно легко отличить от фона (фиг. 79). Примечание: цепь В инсулина (3500 кДа) и цепь А инсулина (2500 кДа) могут выходить в виде одной широкой полосы, либо полосу цепи А инсулина нельзя визуально идентифицировать на геле.

- 294 017765

Характеристика 12 эталонов молекулярной массы

Белковый маркер	Молекулярная масса (Дальтон)
Миозин (из мышц кролика)	200000
β- Галактозидаза (Е. со11)	116300
Фосфорилаза В (из мышц	97400
кролика)
Альбумин бычьей сыворотки	66300
Глутаминовая дегидрогеназа (из	55400
бычьей печени)
Лактат дегидрогеназа (из мышцы	36500
свиньи)
Карбоновая ангидраза (бычьих	31000
эритроцитов)
Ингибитор трипсина (соевый)	21500
Лизоцим (яичного белка)	14400
Апротинин (бычьего лёгкого)	6000
Инсулин А цепь (бычья	3500
поджелудочная железа
Инсулин В цепь (бычья	3500
поджелудочная железа

В данном примере основные полосы испытуемого (тестируемого) изделия, как невосстановленного (мономер), так и восстановленного (единичная цепь), должны быть в том же относительном положении на геле, что и эталон СТ^А4^{Λ29Υ^104Ε}-Iд. См. фиг. 78. Эталон контроля окрашивания соевого ингибитора трипсина (21500 Да) при нагрузке 100 нг/нагрузка должен быть видимым на сканированном изображении геля (фиг. 78, дорожка 12). За исключением минорной полосы в невосстанавливающих условиях, которая обычно наблюдается (единичная цепь) проксимально к маркёру молекулярной массы 55400 Да, относительная интенсивность в процентах любой дополнительной полосы в геле, окрашенном Кумасси синим, должна быть <2% относительно эталона. Примечание: определение молекулярной массы основной полосы нельзя сделать точно вследствие ее негауссовского распределения. Визуальное изучение восстановленного эталона проводится для того, чтобы выделить единичную широкую полосу, сдвигающуюся в положение, проксимальное к маркёру молекулярной массы 55400 Да (см. фиг. 78). Чистота восстановленной основной полосы в процентах должна быть >97%. Визуальное изучение основной полосы невосстановленного эталона позволяет выделить единичную широкую полосу, сдвигающуюся в положение, проксимальное к маркёрам молекулярной массы 97400 и 116300 Да (фиг. 79, дорожка 2). Чистота основной полосы эталона в процентах должна быть >97%.

Пример 57. ВЭЖХ метод количественного определения тритона Х-100 в СТ^А4^{Λ29Υ^104Ε}-Iд.

Низкие уровни Тритона Х-100 в образцах белка СТ^А4^{Λ29Υ^104Ε}-Iд, выражаемые в миллионных долях (частях на миллион, м.д. ррт) (<10 м.д.), определяют методом ВЭЖХ. Метод включает экстракцию Тритона Х-100 средами для твердофазной экстракции с последующим промыванием водой для удаления остаточного белка и элюцией Тритона Х-100 ацетонитрилом. Элюат в ацетонитриле хроматографируют на колонке ΡΗепοтепеx Нурегзй ΟΙ, подвижная фаза представляет собой смесь ацетонитрил:вода (80:20). УФ-детекцию проводят при 225 нм. Метод является линейным между 1-22 м.д., предел обнаружения составляет 0.25 м.д. СТ^А4^{Λ29Υ^104Ε}-Iд, потенциальный иммунодепрессант (иммуносупрессор), является слитым белком второго поколения, состоящим из лиганд-связывающего домена цитотоксического Т лимфоцитарного антигена 4 (СТЬА4) и константной области тяжелой цепи человеческого ^СЕ Тритон Х-100, неионное поверхностно-активное вещество, применяется для вирусной инактивации при очистке СТ^А4^{А29Υ^104Ε}-Iд. Хотя Тритон Х-100 удаляется, для установления качества или для контроля продукта необходимо определить остаточные уровни или отсутствие поверхностно-активного вещества в белке. Для этой цели был разработан метод обнаружения и количественного определения следовых уровней Тритона Х-100. Тритон Х-100 экстрагируют из белка на δΡΕ среды и элюируют ацетонитрилом, а затем анализируют методом ВЭЖХ.

Приготовление эталонов (стандартов).

Контроль. Все образцы или эталон для сравнения, которые предварительно анализируют этим методом и определяют, что они не содержат детектируемых уровней Тритона Х-100, можно использовать в качестве контроля. Контрольные пробы следует проверять в опытах с образцами.

Исходный стандартный раствор. Точно взвешивают 10.0 V 1.0 мг Тритона Х-100 в мерную колбу на 100 мл, доводят до нужного объема водой и смешивают. Примечание: Тритон Х-100 медленно растворяется в воде. Проверяют полноту растворения (обычно через 15 мин) перед употреблением. Тритон Х-100 имеет более высокую вязкость, чем вода, поэтому нерастворенные частицы видны в воде.

Рабочий стандартный раствор. Добавляют 25 мкл исходного стандартного раствора Тритона Х-100 в 0.5 мкл контроля СТ^А4^{Λ29Υ^104Ε}-Iд. Тщательно перемешивают на вортексе или другим подходящим способом. Этот рабочий стандартный раствор содержит около 5 м.д. (или 5 мкг/мл вес./об.) Тритона Х100. Примечание: стандартные растворы должны быть свежеприготовленными (в день анализа).

- 295 017765

Приготовление образца. Образец используют как он есть. Холостой опыт (контрольная проба) следует проводить одновременно с опытом с образцом (образцами). Экстракция Тритона Х-100 из растворов стандартов (эталонов, стандартных растворов) и образцов. Описанные ниже стадии экстракции проводят в вакууме 3-5 дюймов (76.2-127 мм) Нд (10.16-16.93 кПа).

Активация сред для твердофазной экстракции (ТФЭ, 8РЕ). Поднимают крышку вакуумного манифолда и помещают пробирки в адаптер внутри манифолда. Это пробирки для слива. Заменяют крышку блока и помещают картриджи 8РЕ на вакуумный манифолд таким образом, чтобы гарантировать, что пробирка для слива находится под каждым 8РЕ (ТФЭ) картриджем (патроном). В каждый картридж (колонку) добавляют один мл ацетонитрила и к пробиркам подают вакуум до тех пор, пока весь ацетонитрил не пройдет через слой среды (сорбента). Повторяют стадию. Концентрация Тритона Х-100 на 8РЕ (ТФЭ) средах из матрицы эталонов (стандартов)/образцов (проб). В отдельные активированные 8РЕ картриджи пипеткой вносят 0.50 мл одного из следующих растворов: рабочего стандартного раствора, образцов и контрольной пробы. К 8РЕ пробиркам подают вакуум до тех пор, пока весь раствор не пройдет через слой среды. Удаляют остаточный белок из 8РЕ подложки (слоя). Добавляют один мл воды на каждый 8РЕ картридж и подают вакуум до тех пор, пока вода не пройдет через слой среды. Повторяют стадию. Элюция Тритона Х-100 с 8РЕ подложки (слоя). Отключают вакуум, подаваемый на манифолд, создавая в системе нормальное давление. Осторожно поднимают крышку манифолда, причем 8РЕ картриджи со стандартом и образцами еще подсоединены. Заменяют пробирки для слива набором предварительно маркированных пробирок (для стандарта (эталона), контрольной пробы и образцов) для сбора любого Тритона Х-100, который может элюироваться с 8РЕ подложек (носителей) на последующих стадиях. Это пробирки для элюата. Заменяют крышку манифолда, чтобы гарантировать, что под каждой 8РЕ подложкой находится пробирка для элюата. В каждый 8РЕ картридж добавляют 0.50 мл ацетонитрила и к пробиркам подают вакуум до тех пор, пока весь ацетонитрил не пройдет через слой среды (сорбента). Отключают манифолд от вакуума и поднимают крышку и достают пробирки с элюатом. Помещают элюаты стандарта, образцов и контроля в виалы автосэмплера для инжекции в хроматографическую систему.

Пригодность системы

Уравновешивают колонку/систему подвижной фазой примерно час перед началом инжекции (впрыска). Получают хроматограмму стандартного раствора. Время удерживания Тритона Х-100 должно быть 5 V 1 мин. Эффективность колонки для Тритона Х-100, определяемую числом теоретических тарелок, Ν, должна быть > 2000 тарелок/колонка, где Ν рассчитывают по уравнению:

N=16 (-)² νν где ΐ обозначает время удерживания пика Тритона Х-100;

V обозначает ширину основания пика Тритона Х-100, полученную экстраполяцией сторон пика к базовой (фоновой) линии.

Делают по меньшей мере три инжекции стандартного раствора. Процент Κ8Ό (относительное стандартное отклонение) площади одиночных импульсов счета последних трех инжекций должно быть не более 3.0%.

Вычитают результаты контрольной хроматограммы из хроматограмм эталона и образца и проводят следующие расчеты:

Концентрация Тритона X-100 (м.д.) = ^_{тона Д00 (ж);г 05 л<Л} площадь эталона где

0.5 =

1000-жкг 1 25 · микролитров

-----χ-----χ---------' 100 -мкл

1- мг

0.25 · мл

1· мл

1000 · микролитров

Пример 58. Определение содержания СНО клеточной ДНК в композициях СΊ^Л4-Iд·

Данный метод разработан для обнаружения остаточной ДНК СНО в образцах лекарственного вещества с применением количественной полимеразной цепной реакции (цРСК) в реальном времени. ПЦР представляет собой репликацию смеси ДНК. В этом анализе используют флуорогенный зонд для обнаружения специфического СНО ПЦР продукта по мере его накопления в ходе анализа. Скорость амплификации ПЦР продукта прямо пропорциональна количеству начальной ДНК, присутствующей в образце. Целью является обнаружение количества геномной ДНК СНО в образцах композиций СΊ^Л4-Iд·

Образец анализируют, детектируя ДНК СНО в биологических образцах с помощью количественной полимеразной цепной реакции. Проводят расчеты и результаты изображают в виде двух статистически значимых диаграмм в единицах пг/мг. Если результаты ниже нижнего предела количественного анализа, результаты регистрируют как <р.Ь. или 9.Й. анализа. Перевод величины ДНК в единицы пикограмм/миллиграмм. Величину в пг/мл делят на концентрацию образца, определяемую по оптической плотности при 280 нм. Типичный расчет для образца с концентрацией белка 50 мг/мл и сообщаемым

- 296 017765 значением от Вюгекапсе = 0.67 фг/мкл.

Стадия 1. Перевод в пг/мл = 0.67 пг/мл.

Стадия 2. Перевод в пг/мг = (0.67 пг/мл/50.0 мг/мл) = 0.013 пг/мг.

Пример 59. Определение содержания белка МСР-1 в биологических образцах и в композициях СТЕА4-]д.

В данном примере представлены методы количественного определения остаточного МСР-1подобного белка в биологических образцах и образцах СТЕА4-]д.

Материалы.

Нейтрализующее антитело козы к мышиному МСР-1 (мышиному ЛЗ [МСР-1])

Κ&ϋ 8у8!ет8, (Са1а1о§ Νο. АВ-479- ΝΑ), хранят при -20°С

Кроличье антитело против крысиного МСР-1

Антитело козы к кроличьему 1§С (Н+Е), конъюгированному с НКР

Рерго Теск, (Са!а1о§ Νο. 500-Р76), хранят при -20°С

ЗоиЛегп Вю1есй (Са!а1о§ Νο. 4050-05, хранят при 2-8° С

Реагенты.

Фосфатно-солевой буферный раствор (РВ8, 10 мМ фосфатного буфера, 137 мМ НаС], 2.7 мМ КС1, рН 7.3-7.5). Готовят в соответствии с инструкциями производителя на бутыли. В сосуд подходящего размера помещают воду для ВЭЖХ, пеллеты РВ8 и магнитную мешалку. Перемешивают магнитной мешалкой до растворения пеллет и соли. При необходимости доводят рН до 7.3-7.5, добавляя гидроксид натрия или соляную кислоту. Перемешивают до полного смешения. Фильтруют через одноразовый фильтроэлемент с размером пор 0.22 мкм. Раствор хранят при 2-8°С до 30 дней с момента приготовле ния.

МСР-1 (моноцитарный хемотаксический белок-1) представляет собой человеческий белок, который участвует в рекрутменте моноцитов к сайтам поражения и инфекции. Белок может считаться МСР-1подобным на основании гомологии и перекрестной реактивности с антителами против МСР-1. Так как антитела, используемые в методе ЕБЩА, распознают только участок белка-мишени, усеченные (процессированные) формы МСР-1 могут реагировать в процессе анализа, даже если они формально не являются активными. Таким образом, любой вариант МСР-1 хомячка, который реагирует в ходе анализа, количественно определяется, поэтому данный анализ позволяет детектировать полноразмерный МСР-1 и любые варианты МСР-1, которые содержат корректные эпитопы. Следует отметить, что при использовании смеси поликлональных антител существует большая вероятность представления целого ряда эпитопов.

Раствор для отмывки (1.0 мМ фосфатного буфера, 137 мМ МаС1, 0.27 мМ КС1, рН 7.3-7.5, содержащий 0.01% об./об. Твин 20). В емкость, содержащую 4.0 л дистиллированной воды или воды для ВЭЖХ, помешают магнитную мешалку, 2 таблетки РВ8, 28.8 г ХаО и 0.4 мл Твин 20. Осторожно перемешивают до растворения содержимого. При необходимости доводят рН до 7.3-7.5, добавляя гидроксид натрия или соляную кислоту. Хранят при 2-8°С до 30 дней с момента приготовления.

Разбавители (РВ8, рН 7.3-7.5, содержащий 1% вес./об. В8А, и 0.05% об./об. Твин-20) (следует отметить, что это альтернатива применению продажного разбавителя). В 4 л фосфатно-солевого буферного раствора помещают магнитную мешалку, добавляют 40 г В8А и 2 мл Твин 20. Осторожно перемешивают до растворения содержимого. Фильтруют через фильтр с размером пор 0.22 мкм. Хранят при 2-8°С до 30 дней с момента приготовления в закрытом виде или 7 дней после вскрытия.

Реагент для сенсибилизации планшетов. Восстанавливают несколько виалу антитела козы против мышиного МСР-1 согласно инструкциям производителя, перемешивают, осторожно переворачивая несколько раз, и объединяют. Готовят аликвоты и хранят при -20°С до одного года (не следует превышать указанного производителем срока годности). Избегают многократных циклов замораживания/оттаивания. Или же, виалы с лиофилизированными образцами можно хранить при -20°С свыше шести месяцев. После реконституции антитело можно хранить при 2-4°С в течение одного месяца.

Вторичный реагент. Восстанавливают одну виалу кроличьего антитела против крысиного МСР-1 согласно инструкциям производителя, перемешивают, осторожно переворачивая несколько раз, и объединяют. Хранят при -2-8°С до четырех недель. Или же, виалы с лиофилизированными образцами устойчивы при -20°С более одного года.

Третичный (третьего порядка) реагент. Объединяют несколько виал с козьим антителом против кроличьего ]дС (Н+И) НКР и перемешивают, осторожно переворачивая несколько раз. Готовят аликвоты и хранят при -20°С до 2 лет (не следует превышать указанного производителем срока годности). Избегают многократных циклов замораживания/оттаивания. После оттаивания виалу можно хранить при температуре 2-8°С до 30 дней.

Приготовление эталонов. Из исходного раствора МСР-1-подобного белка готовят раствор с концентрацией 25.6 нг/мл в разбавителе, а из него готовят серийные разведения (2-кратные), постепенно переходя к концентрациям 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8 и 0.4 нг/мл. Эталон с концентрацией 0 нг/мл представляет собой неразведенный разбавитель.

- 297 017765

Пример приготовления эталонов (стандартных растворов) из исходного раствора МСР-1 с концентрацией 0.97 мг/мл:

б) (раствор А) готовят 2.5 мл раствора в разбавителе с концентрацией 5200 нг/мл: 13.4 мкл исходного раствора + 2.487 мл разбавителя;

в) (раствор В) готовят 3.9 мл раствора в разбавителе с концентрацией 25.6 нг/мл: 19.2 мкл исходного раствора + 3.881 мл разбавителя.

Готовят остальные стандарты (эталоны), используя указанные ниже объемы.

Рабочий раствор	Уо1ише (мл)	Разбавитель (мл)	Конечная концентрация (нг/мл)
25.6 нг/мл	1мл	0	25.6 нг/мл
25.6 нг/мл	1мл	1мл	12.8 нг/мл
12.8 нг/мл	1мл	1мл	6.4 нг/мл
6.4 нг/мл	1мл	1мл	3.2 нг/мл
3.2 нг/мл	1мл	1мл	1.6 нг/мл
1.6 нг/мл	1мл	1мл	0.8 нг/мл
0.8 нг/мл	1мл	1мл	0.4 нг/мл

Перемешивают каждый раствор на вортексе с установочными параметрами в среднем положении примерно 2-3 с, а затем осторожно переворачивают 2-3 раза.

Приготовление образцов контроля качества. Готовят образцы контроля качества (ОС) из виалы с МСР-1-подобным белком в разбавителе. Готовят исходный раствор с концентрацией 520 нг/мл, из которого получают следующие образцы контроля качества для замораживания: 11.0, 5.3 и 1.2 нг/мл. Разведения готовят, как указано в приведенной ниже таблице.

Пример приготовления ОС образцов из исходного раствора МСР-1 с концентрацией 0.97 мг/мл:

а) (раствор А) готовят 2.5 мл раствора в разбавителе с концентрацией 5200 нг/мл: 13.4 мкл исходного раствора + 2.487 мл разбавителя;

б) (раствор В) готовят 5.0 мл раствора в разбавителе с концентрацией 520 нг/мл: 500 мкл исходного раствора + 4.500 мл разбавителя;

в) готовят конечное разведение МСР-1-подобного белка для ОС образцов следующим образом:

ОС определение	Концентрация МСР-1 (нг/мл)	Объём добавляемого ОС раствора В (мкл)	Объём добавляемого разбавителя (мл)	Общий объём (мл)
ОС1	11.0	106	4.894	5.0
0С2	5.3	53	5.147	5.2
Осз	1.2	12	5.188	5.2

Перемешивают каждый раствор на вортексе с установочными параметрами в среднем положении примерно 2-3 с, а затем осторожно переворачивают 2-3 раза.

Приготовление тестируемых (испытываемых) образцов (образцов для испытания). Каждый тестируемый образец состоит из разведенного тестируемого изделия. Тестируемые образцы готовят, добавляя 200 мкл тестируемого образца к 200 мкл разбавителя. Перемешивают каждый раствор на вортексе при средней скорости примерно 2-3 с, а затем осторожно переворачивают 2-3 раза.

Методика. Сенсибилизация планшетов. С помощью РВ8 разводят антитело козы к мышиному МСР-1 до концентрации 5 мкг/мл. Перемешивают раствор антитела и РВ8 на вортексе с установочными параметрами в среднем положении примерно 2-3 с, а затем осторожно переворачивают 2-3 раза. Многоканальным микродозатором в каждую лунку добавляют 100 мкл этого раствора. Планшеты накрывают крышкой для планшетов и инкубируют 12-18 ч. Отмывка планшетов. Планшеты отмывают три раза раствором для отмывки, используя вошер (промыватель для планшетов). Устанавливают на вошере параметры: три отмывки, 300 мкл/лунка при времени замачивания ноль. Или же планшеты можно отмывать вручную. В каждую лунку каждого планшета многоканальным микродозатором добавляют 300 мкл раствора для отмывки. Лунки освобождают, вытряхивая в приемник (ванну), и осторожно наносят капли на бумажное полотенце. Повторяют трижды. Блокирование планшетов. В каждую лунку калиброванным многоканальным микродозатором добавляют 300 мкл С8ВВ. Инкубируют планшеты около 60±10 мин при комнатной температуре. Добавление образцов. В планшеты добавляют образцы эталонов для сравнения, контроля качества (два набора каждой концентрации) и испытуемые образцы, в тройном повторе, по 100 мкл/лунка, инкубируют около 60±10 мин при комнатной температуре. Не используют внешние лунки. Готовят вторичное кроличье антитело против крысиного МСР-1. Разводят исходный раствор кроличьего антитела против крысиного МСР-1 до концентрации 2 мкг/мл или до подходящего разведения (как для проверки соответствия партии или СОА) в объеме разбавителя, достаточном для планшетов, используемых в анализе. Перемешивают раствор на вортексе около 2-4 с при средней скорости. Повторяют отмывку планшетов, но отмывают пять раз. Многоканальной пипеткой в каждую лунку добавляют

- 298 017765 по 100 мкл раствора вторичного антитела и инкубируют 60± 10 мин при комнатной температуре. Добавляя разбавитель, готовят раствор третичного антитела козы против кроличьего иммуноглобулина конъюгат с НКР (0.5 мкг/мл или подходящее разведение). Перемешивают НКР конъюгат на вортексе при средних параметрах около 2-3 с, а затем осторожно переворачивают 2-3 раза. Разводят до концентрации, установленной как для ведомственных БОР для количественного определения реагента. Повторяют отмывку планшетов пять раз. Многоканальной пипеткой в каждую лунку добавляют по 100 мкл НКР конъюгата и инкубируют при комнатной температуре в темноте примерно 30±5 мин. Повторяют отмывку планшетов пять раз. Многоканальной пипеткой в каждую лунку добавляют 100 мкл ТМВ и инкубируют при комнатной температуре в темноте примерно 2.5-4 мин. Прекращают ТМВ реакцию, с помощью многоканальной пипетки добавляя 100 мкл 1.0 N Н₂БО₄ в той же последовательности, как при прибавлении ТМВ. Считывают оптическую плотность при 450 нм при длине волны эталона 630 нм на ридере 96-луночных планшетов.

Типичные (иллюстративные) значения. Типичные значения для стандартов (эталонов) применяют к тем значениям, которые равны или превышают (верхний) количественный предел Ок (0.8 нг/мл), тогда как значения ниже Ой применяются только для того, чтобы содействовать установлению экстремумов кривой. Среднее фоновое значение, вычисленное с помощью нижеприведенного расчета (для стандартной концентрации 0 нг/мл), должно быть < 0.1 единиц оптической плотности.

Х_х +Х₂+Х₃......Х_п

N где Χι-Χ₃ - конкретное значение в наборе данных;

N - число значений в наборе данных.

Каждая концентрация, используемая для определения стандартной кривой, исключая ноль, 0.4 и Ой (0.8 нг/мл), должна быть в пределах 15% от заданной (номинальной) величины. Коэффициент вариации (%СУ) величин А₄₅₀ в тройном повторе при каждой стандартной концентрации, используемой для определения стандартной кривой, исключая 0, 0.4 и Ой (0.8 нг/мл), должен быть < 15%. Средние вычисленные значения концентрации МСР-1 для тестируемого образца композиции СТЬА4-1§ должны быть <11.0 нг/мл. Если средняя вычисленная концентрация > 0.8 нг/мл (Ой анализа), рассчитывают % СУ определений тройного повтора и типичные значения (значения в примерах) должны быть <20%. Если значения в примерах соответствуют этому, среднюю концентрацию МСР-1 используют для расчетов м.д. (ррт). Если вычисленная концентрация МСР-1 < 0.8 нг/мл (Ой анализа), отмечают образец как < Ой, и для расчета м.д. (ррт) используют величину < 0.8 нг/мл. %СУ определения тройного повтора не рассматривают.

(,ЗС образец определяют как набор из трех лунок с фиксированной (указанной) концентрацией, следовательно, для трех номинальных концентраций, установленных в данном методе, получают набор из шести ОС образцов. Концентрации по меньшей мере в двух из трех лунок ОС образца должны быть в пределах 20% от фиксированной номинальной концентрации ОС образца для того, чтобы быть приемлемыми. По меньшей мере двенадцать из восемнадцати определений ОС образцов должны быть в пределах 20% от соответствующих заданных (целевых) значений. Шесть из восемнадцати ОС образцов (но не три с одной и той же концентрацией) могут отклоняться более чем на 20% от соответствующей номинальной величины. По меньшей мере четыре из шести ОС образцов должны быть приемлемыми. Разрешается, чтобы два образца были неприемлемыми, при условии, что у них не одна и та же концентрация.

Оценка данных. Используют программу Бойтах™ БоЙмаге с файлом протокола МСР-1.ррг для построения стандартной кривой с помощью невзвешенной четырехпараметрической регрессии вида:

Оптическая плотность^ = —-—— + В

1+(-/ с

где А - величина оптической плотности₄₅₀, соответствующая минимальной асимптотической величине;

Ό - величина оптической плотности, соответствующая максимальной асимптотической величине;

с - концентрация, соответствующая половине абсолютной разности между максимальной и минимальной асимптотическими величинами;

Ь - аппроксимированный тангенс угла наклона линейного участка кривой;

х - концентрация эталона для сравнения (исходного раствора).

Расчеты концентрации МСР-1-подобного белка. Количество МСР-1-подобного белка в испытуемом образце можно вычислить с помощью программы Бойтах Р1а!е Кеадег Боймаге. Приведенный ниже пример иллюстрирует, как можно описывать конечные результаты. Анализируют двукратное разведение каждого образца. Вычисленную концентрацию умножают на соответствующий фактор разведения (2), получают концентрацию неразбавленного тестируемого изделия.

- 299 017765

Примеры.

1) Концентрация разведенного тестируемого образца 10.0 нг/мл. Концентрация МСР-1-подобного белка в неразведенном тестируемом изделии равна нг/млх2 = 20 нг/мл МСР-1.

2) Полученный результат для разведенного образца <0.8 нг/мл. Концентрация МСР-1-подобного белка в неразведенном тестируемом изделии равна <0.8 нг/млх2 = <1.6 нг/мл МСР-1.

Для того чтобы выразить конечный результат в нг МСР-1-подобного белка на 1 мг образца (м.д., ррт), делят полученный выше результат на концентрацию неразведенного образца.

Примеры.

1) Концентрация белка в тестируемом образце = 50 мг/мл.

Концентрация МСР-1-подобного белка = 200 нг/мл.

200 нг/мл МСР-1/50 мг/мл = 4 нг/мг.

В отчете сообщают об образце 4 м.д. (ррт) (части на миллион, миллионные доли).

2) Концентрация белка в тестируемом образце = 50 мг/мл.

Концентрация МСР-1- подобного белка = <1.6 нг/мл:

<1.6 нг/мл МСР-1/50 мг/мл = <0.032 нг/мг.

В отчете сообщают об образце <0Е, (<0.032 м.д. (ррт)).

Пример 60. Определение остаточных уровней белка С^-СΗΟ1 методом для аттестационного испытания СТ^Л4-Iд материала лекарственного вещества.

Карбонатный буфер. В соответствующий сосуд со стержнем магнитной мешалки добавляют 200 мл воды для ВЭЖХ, содержимое двух капсул с карбонатным буфером. Перемешивают на магнитной мешалке до растворения материала. Используя рН-метр, доводят рН до 9.6, при необходимости добавляя 1 Ν NаΟΗ или Η₂ЗΟ₄. Раствор перемешивают 5 мин на магнитной мешалке. Раствор фильтруют через фильтр 0.22 мкм. Раствор хранят при 2-8°С до 30 дней и маркируют в соответствии с ведомственными инструкциями.

Буфер для отмывки (РВЗ, содержащий 0.05% об./об. Твин 20, рН 7.4). В бутыль на 4 л помещают воду для ВЭЖХ, стержень магнитной мешалки, 20 таблеток РВЗ, добавляют 2 мл Твин 20. Перемешивают на магнитной мешалке до растворения материала. Используя рН-метр, доводят рН до 7.4, при необходимости добавляя 1 Ν NаΟΗ или 1 Ν НС1. Раствор перемешивают 5 мин на магнитной мешалке. Раствор фильтруют через фильтр 0.22 мкм. Раствор хранят при 2-8°С до 30 дней и маркируют в соответствии с ведомственными инструкциями.

Стрептавидин-НИР. В виалу с конъюгатом стрептавидин-НИР добавляют 0.5 мл воды для ВЭЖХ. Виалу плотно закрывают и осторожно перемешивают на вортексе 10 с. В виалу с конъюгатом стрептавидин-НИР добавляют 0.5 мл глицерина. Перемешивают. Проверяют прозрачность раствора, отбирая его чистой пастеровской пипеткой. Если раствор непрозрачен, перемешивают его в соответствии с разделом 3.3.2 и повторяют в соответствии с разделом 3.3.5 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Определяют подходящую схему разведения, которую следует использовать для партии стрептавидин-НИР в соответствии с ведомственными инструкциями. Аликвоты объемом 20 мкл помещают в пробирки на 0.5 мл с завинчивающейся крышкой.

Плотно закрывают и помещают в шкаф (помещение, камеру) для хранения. Раствор хранят при -20°С до 365 дней и маркируют в соответствии с ведомственными инструкциями.

Стоп-раствор (1 Ν Η₂ЗΟ₄). В вытяжном шкафу (тяга) на магнитную мешалку ставят подходящую емкость. В нее помещают стержень мешалки. Добавляют 485.6 мл воды для ВЭЖХ. Включают магнитную мешалку для перемешивания воды. Медленно добавляют 14.4 мл концентрированной Η₂ЗΟ₄. Раствор устойчив в течение 90 дней при комнатной температуре. Раствор маркируют в соответствии с ведомственными инструкциями.

Методика. Сенсибилизация планшетов. Раствор очищенного кроличьего антитела против С^-СΗΟ1 в карбонатном буфере с концентрацией 8 мкг/мл, который используют для сенсибилизации микротитрационных планшетов (на микротитрационный планшет требуется 10 мл раствора). В каждую лунку микротитрационного планшета 1тти1оп 4 многоканальным микродозатором добавляют по 100 мкл этого раствора. Накрывают микротитрационный планшет парафильмом и инкубируют при 2-8°С в течение 18 ±2 ч.

Отмывка планшетов. Планшеты отмывают три раза, добавляя 300 мкл буфера для отмывки, используют промыватель планшетов (вошер). Или же планшеты можно отмывать вручную, используя многоканальный микродозатор. После последней отмывки планшет переворачивают вверх дном и вытряхивают на бумажное полотенце, лежащее на твердой поверхности.

Блокирование планшетов. В каждую лунку калиброванным многоканальным микродозатором добавляют 300 мкл буфера для стабилизации сенсибилизации и блокирования. Планшеты инкубируют 1-2 ч при температуре 22.5±5°С. Отмывка и хранение планшетов. Планшеты отмывают трижды раствором для отмывки, как описано в разделе 4.2. Заполняют планшеты, добавляя 300 мкл буфера для сенсибили

- 300 017765 зации в каждую лунку, герметично заклеивают и хранят в темноте при 2-8°С в течение одной недели.

Блокирование планшетов. Многоканальной пипеткой добавляют 300 мкл буфера ЗеаВ1оск в каждую лунку. Планшет инкубируют в темноте в течение 1 ч (±6 мин) при комнатной температуре. Планшеты можно либо обернуть алюминиевой фольгой, либо поместить их в бокс или выдвижной ящик. Приготовление образцов для стандартной кривой с применением разбавителя Текпоуа в градуированных стерильных полипропиленовых пробирках на 15 мл в соответствии с приведенной ниже схемой разведения. Примечание: приведенная ниже схема разведения рассчитана на 5 планшетов. При необходимости корректируют объемы в соответствии с числом планшетов в анализе. Получают исходную концентрацию (эталонную для сравнения) белка СБ-СНО1 (КеГегепсе 81апбагб, КеГ 8ΐά) из Сертификата Анализа (СОА). Готовят раствор белка с концентрацией 30 мкг/мл из раствора СБ-СНО1 КеГ 8ΐά. Рассчитывают требуемый объем раствора белка СБ-СНО1 КеГ 8ΐά, чтобы получить раствор с концентрацией 30 нг/мл. Минимальный переносимый объем раствора белка СБ-СНО1 КеГ 8ΐά должен быть 10 мкл.

_Л __ .. Заданная - концентрация-х-заданный-объём

Формула: Объем =------------———————————— концентрация - исходного - раствора

Примечание: единицы должны быть совместимы.

_π ЗОмкг / млхЛО-мл

Пример: ----------------= -12мкл

25-мг/мл

Рассчитывают объем разбавителя, вычитая требуемый объем белка СБ-СНО1 КеГ 8ΐά из заданного объема.

Формула: (заданный объем)-(объем КеГ 8ΐά) = (объем разбавителя).

Пример. 10.0 мл-0.012 мл = 9.988 мл разбавителя.

Добавляют рассчитанный объем КеГ 8ΐά белка СБ-СНО1 в стерильную пробирку на 15 мл, которая содержит вычисленный объем разбавителя. Закрывают пробирку пробкой и перемешивают на вортексе 2-4 с. Готовят остальные стандарты (эталоны). Следующая таблица приводится как пример.

Рабочая концентрация (нг/мл)	Объём (мл)	Разбавитель (мл)	Общий объём (мл)	Концентрация (нг/мл)
30000	0.6	5.4	6.0	3000
3000	2.0	4.0	6.0	1000
1000	2.0	4.0	6.0	333.3
333.3	2.0	4.0	6.0	111.1
111.1	2.0	4.0	6.0	37.0
37.0	2.0	4.0	6.0	12.3
12.3	4.0	2.0	6.0	8.2
ΝΑ	ΝΑ	4.0	4.0	0

После каждой стадии разведения закрывают пробирку и осторожно перемешивают на вортексе 2-4 с перед следующей стадией разведения.

Готовят растворы контроля качества ^С), добавляя разбавитель Текпоуа в градуированные стерильные полипропиленовые пробирки на 15 мл в соответствии с приведенной ниже схемой разведения. Получают концентрацию раствора эталонного материала (КеГ Ма!) белка СБ-СНО1 из сертификата анализа (СОА). Готовят раствор эталона для сравнения (КеГ Ма!) белка СБ-СНО1 с концентрацией 30 мкг/мл. Закрывают пробирку пробкой и перемешивают на вортексе 2-4 с. Растворы ОС готовят с концентрацией 700, 100 и 25 нг/мл. Пример схемы разведения приводится ниже.

	Рабочая концентрация (нг/мл)	Объём (мл)	Разбавитель (мл)	Общий объём (мл)	Концентрация (нг/мл)
ОС1	30000	0.233	9.767	10.0	700
ОС2	700	1.430	8.570	10.0	100
ОСЗ	100	2.500	7.500	10.0	25

Закрывают пробкой каждую пробирку с ОС раствором и осторожно перемешивают 2-4 с. Растворы контроля качества могут быть свежеприготовленными в день анализа или можно приготовить аликвоты этих растворов и заморозить. Определяют действительную концентрацию трех ОС растворов в трех независимых экспериментах. Усредняют результат трех экспериментов для каждого ОС раствора и получают СОА для каждого из трех ОС растворов. Эти экспериментально определенные ОС концентрации следует использовать в качестве заданных величин при проведении анализа на СТ^Л4-Iд образцах. Хранят ОС растворы в виде готовых к употреблению аликвот при -70°С. Срок годности ОС растворов составляет 6 месяцев с момента приготовления. В день анализа ОС растворы вынимают из морозильной

- 301 017765 камеры, где они хранятся, и оттаивают при комнатной температуре. Перед употреблением размороженные ОС растворы перемешивают на вортексе 2-4 с.

Приготовление образцов. Готовят раствор с примерной концентрацией 12.5 мг/мл каждого анализируемого образца СТ^Λ4-Iд в разбавителе, добавляя 250 мкл образца лекарственного вещества к 750 мкл разбавителя. Закрывают пробирку пробкой (колпачком) и осторожно перемешивают на вортексе 2-4 с. Готовят раствор каждого образца СТ^Λ4-Iд для анализа с концентрацией 6.25 мг/мл, добавляя 400 мкл раствора с концентрацией 12.5 мг/мл в пробирку, содержащую 400 мкл разбавителя. Закрывают пробирку пробкой (колпачком) и осторожно перемешивают на вортексе 2-4 с. Готовят раствор каждого образца СТ^Λ4-Iд для анализа с концентрацией 3.125 мг/мл, добавляя 400 мкл раствора с концентрацией 6.25 мг/мл в пробирку, содержащую 400 мкл разбавителя. Закрывают пробирку пробкой (колпачком) и осторожно перемешивают на вортексе 2-4 с. Многократно отмывают планшет. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл раствора каждой концентрации стандарта, образцов и ОС в тройном повторе в блокированный и отмытый планшет. ОС образцы с каждой концентрацией добавляют дважды, всего шесть лунок на планшет. Инкубируют 1 ч (±6 мин) в темноте при комнатной температуре. Повторяют отмывку 5 раз. Вынимают стрептавидин-НКР из морозильной камеры и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Разводят кроличье антитело против С1)-С1101-Биотин в буфере Текпоуа до концентрации 2 мкг/мл. Раствор перемешивают на вортексе при средней скорости в течение примерно 2-4 с. Добавляют по 100 мкл на лунку многоканальной пипеткой. Инкубируют 1 ч (±6 мин) в темноте при комнатной температуре. Разводят конъюгат стрептавидин-НКР до концентрации, установленной для применения в анализе с учетом сертификации партии реагента в соответствии с ведомственной методикой. Закрывают пробирку пробкой (колпачком) и на средней скорости перемешивают на вортексе 2-4 с. Многоканальной пипеткой добавляют по 100 мкл разведения стрептавидин-НКР в каждую лунку. Инкубируют 1 ч (±6 мин) в темноте при комнатной температуре. Повторяют. Многоканальной пипеткой добавляют по 100 мкл ТМВ хромогена в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре 2 мин (±12 с). Многоканальной пипеткой добавляют по 100 мкл/лунка стоп-раствора (1 N Н₂80₄). Стоп-раствор добавляют в планшеты и лунки в том же порядке, что и хромоген, чтобы гарантировать одно и то же время реакции хромогена с ферментом в каждой лунке. Используя 8рес1гаМах Р1и8 ридер, определяют оптическую плотность при 450 нм при длине волны стандарта для сравнения 630 нм на соответствующем ридере 96луночных планшетов.

Анализ данных. Устанавливают шаблон программы 8ойтах, так как он позволяет получить средние значения, стандартные отклонения и % СУ и т.д. Каждую величину в примерах получают, используя величины оптической плотности в тройном повторе, полученные для анализируемых разведений эталона, ОС и образца. Строят стандартную кривую. Моделируют данные эталона для сравнения, используя четырехпараметрическую регрессию вида:

где АВ - оптическая плотность при 450 нм;

А - величина оптической плотности, соответствующая минимальной асимптотической величине; Ό - величина оптической плотности, соответствующая максимальной асимптотической величине;

с - концентрация, соответствующая половине абсолютной разности между максимальной и минимальной асимптотическими величинами;

В - аппроксимированный наклон на линейном участке кривой;

С - концентрация материала эталона СБ-СН01.

Определяют коэффициент корреляции (К²) для линии регрессии для стандартов, используя вычисленное среднее. Расчет концентрации СБ-СН01 в образцах. Умножают средние результаты для образцов на соответствующий фактор разведения (а именно 4, 8 и 16), получают концентрацию СБ-СН01 в исходном образце в нг/мл. Делят полученные результаты на подтвержденную концентрацию белка СТЕЛ4Ιμ, получают концентрацию СБ-СН01 в нг/мг СТ^Λ4-Iд. Определяют среднее всех полученных результатов, которые попадают в интервал стандартной кривой. Рассчитывают концентрацию белка С1)-С1101 в неразведенном образце, вводя фактор разведения. Для определения концентрации белка СБ-СН01 относительно концентрации СТ^Λ4-Iд в образце делят на концентрацию неразведенного образца.

Пример расчета:

Средний · результат образца _ 235-нг- СО СНОР / мл _нг/ _мл

Концентрация ВМ8 —188667 50 · мг /мл

Примечание: нг С0-СН01 на 1 мг продукта (нг/мг) эквивалентен частям на миллион (миллионным долям, м.д., ррт).

Иллюстративные значения (значения в примерах). Типичные (иллюстративные) величины для эталонов (стандартов). Коэффициент корреляции (К) для стандартной кривой должен быть >0.99. Среднее фоновое значение для стандартной концентрации 0 нг/мл должно быть <0.10 единиц оптической плотно

- 302 017765 сти. Среднее рассчитанных значений (нг/мл) при каждой концентрации стандарта (эталона), используемое для определения стандартной кривой, за исключением нуля и концентраций ниже ОВ (12.3 нг/мл), должно быть в пределах 20% заданного (номинального) значения. Коэффициент вариации (% СУ) величин оптической плотности в тройном повторе при каждой концентрации эталона, применяемой для определения стандартной кривой, за исключением нуля и концентраций ниже ОВ (12.3 нг/мл), должен быть менее 20%, как определено с использованием программы. Для того чтобы гарантировать, что по меньшей мере две конгруэнтные полученные точки пригодны для вычислений, эталоны (стандарты), контроли качества и образцы засевают в лунки в тройном повторе. Каждое значение в трипликате анализируют по отдельности. Отбрасывают значения, которые дальше всего находятся от заданного.

Пример.

Заданное значение (нг/мл) Действительное значение (нг/мл)

25

Единственное значение, самое дальнее от заданного значения 50 нг/мл, это 25 нг/мл. Если отбросить величину 25 нг/мл из тройного повтора, то среднее оставшихся величин отвечает всем иллюстративным (типичным) значениям.

Если показано, что среднее двух остальных величин все еще не отвечает типичным значениям, то эту единичную точку отбрасывают и кривую рассчитывают заново.

Пример.

Заданное значение (нг/мл) Действительное значение (нг/мл)

10

10.5

Среднее значение > 20% от заданного вне зависимости от того, какое значение отбрасывается, следовательно, единичную точку на кривой отбрасывают и кривую заново пересчитывают. Можно отбросить только 2 точки на стандартной кривой.

Типичные значения для РС образцов. РС образец определяют как набор из шести лунок с фиксированной (указанной) концентрацией, следовательно, для трех номинальных концентраций, фиксированных в этом методе, имеется всего шесть РС образцов. По меньшей мере, значения для двух из трех лунок РС образца должны быть в пределах 20% от номинального значения, чтобы РС образец был приемлемым. По меньшей мере, значения для четырех из шести РС образцов должны быть в пределах 20% от соответствующих заданных концентраций; значения для двух из шести РС образцов (не при одной и той же концентрации) могут превышать девиацию 20% от номинального значения, вычисленного с помощью программы. Не более 6 из 18 лунок с РС образцами может отклоняться более чем на 20% от соответствующих заданных (целевых) концентраций.

Типичные значения для испытуемых образцов. Средняя оптическая плотность анализируемого образца должна быть меньше наивысшей точки на стандартной кривой. Если средняя оптическая плотность образца превышает среднюю эталонную оптическую плотность 3000 нг/мл, испытуемый образец следует значительно разбавить, чтобы получить среднее значение между 3000 и 12.3 нг/мл. Средняя оптическая плотность по меньшей мере одного из трех разведений образца (12.5, 6.25 и 3.125 мг/мл) должна попадать в интервал на стандартной кривой для регистрируемого результата, если средняя оптическая плотность всех разведений не находится ниже средней оптической плотности ОВ (эталон 12.3 нг/мл). В этом случае испытуемые образцы регистрируются как <РЬ. Среднее из трех значений оптической плотности в тройном повторе разведений образца более высокое, чем ОВ, и попадающее в интервал на стандартной кривой должно иметь СУ менее 20% по определению с помощью программы. Если после отбрасывания одного из результатов оптической плотности тройного повтора и перерасчета результатов СУ попрежнему >20% или если СУ двух разведений образца для оптической плотности выше 20% и попадают в интервал стандартной кривой, анализ этого образца следует повторить.

- 303 017765

Пример 61. Определение остаточного количества Тритона Х-100 в композициях СТЬА4-1д. Материалы

Виалы для ВЭЖХ	У/а(ег8, То1а1 Кесоуегу У1а1 КЬ, Зсгеу/ Сар ν/ίίΗ Ьопбеб ргезП! РТЕЕ/8Шсопе 8ер1а (Са1а1о§ 186000385) Примечание', требуются стеклянные виалы
Трубки (картриджи) для твердофазной эктракции	\Уа1ег8 ΟΑ8Ι8 НЬВ, 30 мг/1 мл, (Са1а1о§ Νο. \УАТ094225)

Колонка

ТЬегто Е1ес1гоп Согр. 8А8 Нурегзй, 5 мк, 4.6 х

250 мм (Рай ЫитЬег 30505- 254630)

Оборудование Жидкостной хроматограф Детектор Система 8РЕ	У/аГегз 2695 Зерагайопз Мос1и1е У/а1ег8 2487 Оиа1 \Уауе1еп§Й1 ЫУ Ое1ес1ог ΙΤ Вакег Уасишп МашГоИ, Μοάεΐ8ре-21
Аналитические весы	Любые весы, на которых можно точно взвешивать 0.01 мг
Компоновка	\Уа1ег8 Етроу/ег Оа1а 8у$1ет

Приготовление реагентов.

Приготовление подвижной фазы: ацетонитрил:вода (80:20). Для получения 1 л магнитной мешалкой тщательно перемешивают 800 мл ацетонитрила и 200 мл очищенной воды или воды для ВЭЖХ. Фильтруют через найлоновый фильтр 0.2 мкм. Подвижную фазу дегазируют с помощью встроенного дегазатора, такого как система АШапсе, или барботируя гелий. Готовят свежую фазу ежедневно.

Ν №011. Взвешивают и количественно переносят 80±1 г твердого №0Н в колбу на 1 л. Доводят до нужного объема, добавляя очищенную воду или воду для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают на магнитной мешалке и фильтруют через фильтр с размером пор 0.22 мкм. Или же делают готовят разведение, получают 10 Ν раствор №0Н. Хранят до 6 месяцев при комнатной температуре.

Буфер для лекарственного вещества. Взвешивают и количественно переносят 3.45 г №Н₂Р0₄-Н₂О и 2.92 г №С1 в колбу на 1 л. Добавляют примерно 800 мл очищенной воды или воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают магнитной мешалкой и доводят до нужного объема, добавляя очищенную воду или воду для ВЭЖХ. Доводят рН до 7.5, добавляя 2 Ν №0Н. Раствор фильтруют через фильтрующий элемент с размером пор 0.22 мкм. Хранят до 4 месяцев при 4°С.

Приготовление контрольного (холостого) образца стандарта (эталона). Любой образец СТЬА4-1д или исходного материала (для сравнения), который был ранее проанализирован и при этом обнаружено, что он не содержит детектируемые уровни Тритона Х-100, можно использовать в качестве контрольного образца. Контрольный образец белка участвует в эксперименте наряду с образцом (образцами). Тритон Х-100 медленно растворяется в воде. Проверяют полноту растворения (обычно через 15 мин) перед употреблением. Тритон Х-100 имеет более высокую вязкость, чем вода, поэтому нерастворенные части цы видны в воде.

Приготовление исходного стандартного раствора Тритона Х-100 1 с концентрацией 10.0 мкг/мл. Точно взвешивают 10.0±1.0 мг Тритона Х-100 в мерную колбу на 100 мл и разводят водой до нужного объема; осторожно перемешивают магнитной мешалкой. Маркируют как ТХ100 исходный стандартный раствор А. Отбирают 10 мл ТХ100 исходного стандартного раствора А в мерную колбу на 100 мл.

Разводят водой до нужного объема. Маркируют как ТХ100 исходный стандартный раствор 1. Готовят ежедневно свежий раствор.

Приготовление исходного стандартного раствора Тритона Х-100 2 с концентрацией 10.0 мкг/мл. Точно взвешивают 10.0±1.0 мг Тритона Х-100 в мерную колбу на 100 мл и разводят водой до нужного объема; осторожно перемешивают магнитной мешалкой. Маркируют как ТХ100 исходный стандартный раствор В. Отбирают 10 мл ТХ100 исходного стандартного раствора В в мерную колбу на 100 мл. Разводят водой до нужного объема. Маркируют как ТХ100 исходный стандартный раствор #2. Готовят ежедневно свежий раствор.

Приготовление раствора ТХ100 для оценки пригодности системы #1 (ЗЗ#1). Из ТХ100 исходного стандартного раствора #1 готовят раствор ТХ100 для оценки пригодности системы #1 с концентрацией 5.0 мкг/мл разведением 300 мкл исходного стандартного раствора ТХ100 #1 путем добавления 300 мкл ацетонитрила. Тщательно перемешивают, набирая в пипетку и выпуская из нее.

Приготовление раствора ТХ100 для оценки пригодности системы #2 (ЗЗ#2). Из ТХ100 исходного стандартного раствора #2 готовят раствор ТХ100 для оценки пригодности системы #1 с концентрацией 5.0 мкг/мл разведением 300 мкл исходного стандартного раствора ТХ100 #1 путем добавления 300 мкл ацетонитрила. Тщательно перемешивают, набирая в пипетку и выпуская из нее.

- 304 017765

Приготовление ТХ100 контроля прохождения, эталона предельного значения (ограничения), контроля неудачного опыта. Из исходного стандартного раствора ТХ100 #1 готовят раствор, определяемый в приведенной ниже таблице.

Определение раствора	Процедуры разведения
Контроль прохождения (0.4 мкг/мл)	Разбавляют 20 мкл, добавляя 480 мкл СТЬА4- Ιβϋδ
Эталон предельного значения (0.5 мкг/мл)	Разбавляют 25 мкл, добавляя 475 мкл СТЬА4-
Контроль неудачного опыта (0.6 мкг/мл)	Разбавляют 30 мкл, добавляя 470 мкл СТЬА4- 18 05

Приготовление образца. Раствор используют в отсутствие концентрирования или разведения. Методика: экстракция Тритона Х-100 из раствора эталона и образца (препарата). Внимание: стадии экстракции, описанные ниже, проводят в вакууме 3-3.5 дюймов Нд (76.2-88.9 мм Нд) (10.16-11.85 кПа).

Активация сред для твердофазной экстракции (ТФЭ, ЗРЕ). Поднимают крышку вакуумного манифолда и помещают пустые пробирки 12х75 мм в держатель внутри манифолда. Это пробирки для слива. Заменяют крышку и помещают картриджи ЗРЕ на вакуумный манифолд таким образом, чтобы гарантировать, что пробирка для слива находится под каждым ЗРЕ (ТФЭ) картриджем (колонкой). В каждый ЗРЕ картридж (колонку) добавляют 1000 мкл ацетонитрила и к колонкам подают вакуум до тех пор, пока весь ацетонитрил не пройдет через слой среды (сорбента). Повторяют стадию с дополнительным количеством (1000 мкл) ацетонитрила. Добавляют 500 мкл очищенной воды или воды для ВЭЖХ в каждый ЗРЕ картридж и подают вакуум до тех пор, пока вся вода не пройдет через слой среды. Повторяют, добавляя еще 500 мкл очищенной воды или воды для ВЭЖХ.

Концентрация Тритона Х-100 на ЗРЕ (ТФЭ) средах для эталона предела (ограничения) и контрольных проб. В отдельные активированные ЗРЕ картриджи пипеткой вносят 500 мкл одного из следующих растворов: эталона (стандартного раствора) предельного определения (предела), контроля прохождения, контроля неудачного эксперимента, контрольной пробы (холостой опыт) и образцов. К ЗРЕ картриджам подают вакуум до тех пор, пока весь раствор не пройдет через слой среды.

Удаляют остаточный белок из ЗРЕ подложки (слоя). Добавляют 1000 мкл воды на каждый ЗРЕ картридж и подают вакуум к пробиркам до тех пор, пока вода не пройдет через слой среды. Повторяют стадию, снова добавляя 1000 мкл воды.

Элюция Тритона Х-100 с ЗРЕ подложки (слоя). Отключают вакуум, подаваемый на манифолд, создавая в системе нормальное давление. Осторожно поднимают крышку манифолда, причем ЗРЕ картриджи еще подсоединены. Заменяют пробирки для слива набором предварительно маркированных пробирок для сбора элюата или виал для автосэмплеров (предварительно маркированных для эталона (стандартного раствора) предельного определения (предела), контроля прохождения, контроля неудачного эксперимента, контрольной пробы (холостой опыт) и образцов) для сбора любого Тритона Х-100, который может элюироваться с ЗРЕ подложек (носителей). Заменяют крышку манифолда, чтобы гарантировать, что под каждой ЗРЕ подложкой (ЗРЕ картриджем эталона (стандартного раствора) предельного определения (предела), контроля прохождения, контроля неудачного эксперимента, контрольной пробы (холостой опыт) и образцов) находится соответствующая пробирка для элюата или виала для автосэмплера. В каждый ЗРЕ картридж добавляют 500 мкл ацетонитрила и к пробиркам подают вакуум до тех пор, пока весь ацетонитрил не пройдет через слой сред (сорбента). Отключают манифолд от вакуума, поднимают крышку и достают пробирки с элюатом или виалы для автосэмплера. При использовании пробирок помещают ацетонитрильные элюаты в элюаты эталона (стандартного раствора) предельного определения (предела), контроля прохождения, контроля неудачного эксперимента, контрольной пробы (холостой опыт) и образцов стандарта, образцов и контроля в виалы автосэмплера для инжекции (впрыска) в хроматографическую систему. Если для сбора элюата используют виалы автосэмплера, виалы помещают непосредственно в хроматографическую систему.

Условия эксперимента

Длина волны

Чувствительность

Подвижная фаза

Скорость потока Впрыскиваемый объём Температура колонки Приблизительное время удерживания

Общее время эксперимента Температура автосэмплера

225 нм

0.1 АЦР8

Ацетонитрил: вода (80: 20)

0.8 мл/мин мкл

Комнатная (20- 25°С)

Тритон X- 100: 5.0 ± 1 минута минут

10±4°С

Пригодность системы. Устанавливают хроматографическую систему; нагревают лампу и уравновешивают систему подвижной фазой по меньшей мере в течение 1 ч перед анализом. Вводят ЗЗ#1 минимум четыре раза. Если не указано иначе, вторую инжекцию ЗЗ#1 применяют для всех анализов пригод

- 305 017765 ности системы. Время удерживания Тритона Х-100 должно быть 5.0±1 мин. Эффективность колонки для Тритона Х-100, определяемая числом теоретических тарелок (И), должна быть >2000 тарелок/колонка, где N рассчитывают по уравнению:

N=16 (-)² νν где ! обозначает время удерживания пика Тритона Х-100, измеряемое с момента впрыска (инжекции) до момента элюции максимума пика;

г обозначает ширину пика Тритона Х-100, полученную экстраполяцией сторон пика к базовой (фоновой) линии.

Разрешение между пиком Тритона Х-100 и ближайшим прилегающим пиком (если таковой имеется) должно быть >1.

_ ^2 ~~*1)

И'+Ж, где ! обозначает время удерживания пика Тритона Х-100 и прилегающего пика в эталоне;

А обозначает соответствующие величины ширины пиков, полученные экстраполяцией сторон пика к базовой (фоновой) линии.

Рассчитывают коэффициенты отклика последних трех ЗЗ#1 впрысков (инжекций) по следующему уравнению:

где А - площадь пика Тритона Х-100;

А - вес Тритона Х-100 (в мг), используемого в приготовлении соответствующего исходного стандартного раствора ТХ100.

Коэффициенты отклика последних трех инжекций (впрысков) ЗЗ#1 должны иметь стандартное отклонение (КЗЭ) <10%. Рассчитывают % КЗЭ по следующему уравнению:

„ _ „ Стандартное отклонение , „ „ %Κ8ϋ = -------------------х 100

Среднее

Стандартное отклонение =

ΕςΖΞςΕΕ

V и(и-1) где п - число измерений образца;

х - отдельные измерения.

Сравнивают коэффициент отклика одиночной инжекции (впрыска) ЗЗ#2 со средним коэффициентом отклика последних трех инжекций ЗЗ#1. Разность в процентах между коэффициентом отклика ЗЗ#2 и средним коэффициентом отклика трех инжекций ЗЗ#1 должна быть <10%. Вычисляют разность в процентах по следующему уравнению:

где КР1 - средний коэффициент отклика трех инжекций ЗЗ#1;

КЕ₂ = коэффициент отклика ЗЗ#2.

Делают единичную инжекцию образца контроля после ЗРЕ. Если обнаружены некие уровни Тритона Х-100, делают две инжекции холостого образца (контроля). Если Тритон Х-100 присутствует, отбрасывают СТ^А4-Iд лекарственное вещество и готовят новый эталон предела и новые контрольные образцы с новой партией лекарственного вещества СТ^А4-Iд, которая анализировалась ранее и было найдено, что она не содержит детектируемых уровней Тритона Х-100. Если они не удовлетворяют приведенным выше типичным величинам, продолжают уравновешивание колонки еще в течение 1 ч и снова впрыскивают стандартный раствор. Если опять нет соответствия типичным значениям, выполняют следующие стадии. Проверяют утечки, удостоверяются, что все соединения трубок надежны. Если продолжительный процесс установления равновесия не работает, корректируют содержание органических веществ в подвижной фазе и/или готовят новую партию подвижной фазе и снова готовят ЗЗ#1 и ЗЗ#2. Заменяют колонку, если продолжительное уравновешивание и/или корректировка подвижной фазы не дает соответствия типичным значениям. Перед началом уравновешивают по меньшей мере в течение 1 ч.

Последовательность инжекций. Предварительное уравновешивание системы ВЭЖХ. Делают единичную инжекцию пост-ЗРЕ буфера для лекарственного вещества, соотносят с указанным в вышеприведенном разделе в качестве контроля для калибровки. Наблюдают отсутствие отклика Тритона Х-100. Если имеется пик со временем удерживания пика Тритона Х-100, продолжают инжекции контроля (холостого) до тех пор, пока не будет наблюдаться отклика. Делают единичную инжекцию лекарственного вещества СТ^А4-Iд после ЗРЕ, соотносят с указанным в вышеприведенном разделе в качестве контроля для образца. Наблюдают отсутствие отклика Тритона Х-100. Показания этой хроматограммы вычитают

- 306 017765 из показаний хроматограмм стандарта, контроля и образца перед обработкой данных. Делают двойные (в двойном повторе) инжекции контроля прохождения, эталона предела и контроля неудачного эксперимента. Один раз впрыскивают буфер лекарственного вещества, не должно быть отклика Тритона Х-100. Делают в двойном повторе инжекции образцов. Инжекции образцов группируют с двумя инжекциями (двойной повтор) эталона предельного значения и одной инжекцией буфера лекарственного вещества таким образом, чтобы между бракетированием инжекций эталона предельного значения и лекарственного вещества было не более 10 инжекций образцов. Конец опыта можно завершить двойными (в двойном повторе) инжекциями эталона предельного значения и одной инжекцией контроля (холостого) буфера лекарственного вещества.

Обработка данных. Перед обработкой данных вычитают показания хроматограммы, полученной при инжекции контроля (холостого опыта) для образца из показаний хроматограмм всех стандартов (эталонов), контрольных проб и образцов. Обеспечивают, чтобы пики Тритона Х-100 в хроматограммах стандарта (эталона) предельного значения, контроля и образца располагались соответствующим образом. Пик Тритона Х-100 в образце, если он имеется, должен находиться в окне с таким же временем удерживания, что и стандарт предельного значения. Усредняют площадь пика каждого набора двойного повтора инжекций. Двойные повторы инжекций должны иметь разность площади пика в % <10%. Если дублируемая инжекция стандарта (эталона) предельного значения, контроля прохождения или контроля неудачного опыта не отвечает этому критерию, весь опыт считается неудачным и требует повторения. Если не удается сделать так, чтобы двойные инжекции образца удовлетворяли этому критерию, образец считается неудачным и требует повторения. Все другие образцы, контрольные пробы и эталоны (стандарты) считаются действительными, коль скоро они соответствуют критерию <10%. Средняя площадь пика Тритона Х-100 во всех вилках стандартов предельного значения, включая конечные инжекции, должна быть в пределах 10% начальной усредненной площади пика стандарта предельного значения. Если любой промежуточный стандарт предельного значения не удовлетворяет критерию сравнения 10%, все образцы, анализированные после последнего прохода стандарта предельного значения, считаются неверными и должны анализироваться повторно.

Анализ образцов стандарта предельного значения, контроля прохождения, контроля неудачного опыта. Сравнивают усредненные площади пика Тритона Х-100 для стандарта предельного значения, контроля прохождения и контроля неудачного опыта. Площадь пика образца контроля неудачного опыта должна быть больше, чем площадь пика стандарта предельного значения. Площадь пика образца контроля прохождения должна быть меньше, чем площадь пика стандарта предельного значения. Если есть соответствие с обоими условиями, продолжают анализ образцов.

Анализ образцов. Усредненную площадь пика Тритона Х-100 для стандарта предельного значения можно скорректировать с учетом количества материала, взвешенного при приготовлении исходного эталонного раствора Тритона Х-100 #1, а именно

Ац = АьдХ (10.00 мг/вес) где А_е - площадь пика с поправкой на предельное значение 0.5 мкг/мл;

Аь8 - усредненная площадь пика Тритона Х-100 сгруппированных стандартов предельного значения.

Примечание: А_ь обозначает скорректированную площадь при пределе (предельном значении) определения 0.5 мкг/мл и используется для сравнения с образцами.

Сравнивают усредненную площадь пика Тритона Х-100 образца с А_ь Если площадь пика <А_Ь образец подходит по характеристикам. Если площадь пика >А_Ь образец не отвечает требованиям. Положительные результаты испытания документируют как <0.50 ррт (частей на миллион, м.д.), а неудачные как >0.50 ррт (частей на миллион, м.д.) или иначе, как требуется по условиям протокола.

Пример 62. Количественное определение остаточного белка А в материале лекарственного вещества СТЬА4-1д.

Материалы.

Кроличье антитело против 81§та, (Са1а1о§ Νο. Р3775)

Белка А Биотинилированное 81§ша, (Са!а1о§ Νο. В3150) моноклональное антитело против Белка А

Реагенты.

Карбонатный буфер для сенсибилизации. В подходящий сосуд помещают стержень магнитной мешалки. Прибавляют 500 мл воды для ВЭЖХ или воды, очищенной в системе М1Шроге. Добавляют содержимое 5 капсул карбоната. Тщательно перемешивают. Проверяют среду и доводят рН до 9.6±0.1 с помощью М10Н (1.16) или НС1 (1.23). Раствор выливают в систему фильтрационной стерилизации объемом 500 мл. Включают вакуум для фильтрационной стерилизации раствора. В асептических условиях удаляют фильтроэлемент и закрывают бутыль. Раствор устойчив в течение 30 дней при хранении при температуре 2-8°С. Маркируют раствор как Карбонатный буфер для сенсибилизации. Буфер для от

- 307 017765 мывки: (РВ8 + 0.05% Твин 20). В бутыль на 4 л помещают воду для ВЭЖХ или воду Мййроге; помещают стержень магнитной мешалки. Добавляют 20 таблеток РВ8. Добавляют 2.0 мл Твин 20. Проверяют среду и доводят рН до 7.4±0.1 с помощью ХаОН или НС1. Перемешивают на магнитной мешалке до растворения. Раствор устойчив в течение 30 дней при хранении при температуре 2-8°С. Маркируют раствор как Буфер для отмывки. Стоп-раствор (1 N Н₂8О₄) или используют 1.000 нормальную серную кислоту без разведения. Под тягой ставят подходящую емкость на магнитную мешалку; вносят стержень магнитной мешалки, добавляют 485.6 мл воды для ВЭЖХ или воды, очищенной в системе Мййроге. Включают магнитную мешалку для перемешивания воды. Медленно прибавляют 14.4 мл концентрированной Н₂8О₄. Раствор устойчив 30 дней при комнатной температуре. Маркируют емкость Стопраствор.

Ацетатный буфер (0.5 М уксусной кислоты, 0.1 М хлорида натрия, 0.1% Твин 20, рН 3.5). Под тягой ставят подходящую емкость на магнитную мешалку; вносят стержень магнитной мешалки, добавляют 400 мл воды для ВЭЖХ или воды, очищенной в системе Мййроге. Включают магнитную мешалку для перемешивания воды. Медленно прибавляют 14.8 мл ледяной уксусной кислоты. Тщательно перемешивают. Добавляют 2.9 г хлористого натрия. Тщательно перемешивают. Проверяют среду и доводят рН до 3.5±0.1 с помощью МаОН или НС1. Добавляют 0.5 мл Твин 20. Тщательно перемешивают. Доводят до объема 500 мл, добавляя воду для ВЭЖХ или воду, очищенную в системе Мййроге. Тщательно перемешивают. Раствор устойчив 30 дней при температуре 2-8°С. Маркируют емкость как Ацетатный буфер.

Кроличье антитело против белка А. Вынимают виалу из холодильника и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Добавляют 2.0 мл воды для ВЭЖХ или воды Мййроге. Помещают аликвоты объемом 20 мкл в пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 0.5 мл. Плотно закрывают и помещают в шкаф (помещение, камеру) для хранения. Раствор устойчив в течение 365 дней при хранении при -20°С. Биотинилированное антитело против белка А. Вынимают виалу из холодильника и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Добавляют 1.0 мл воды для ВЭЖХ или воды Мййроге. Помещают аликвоты объемом 60 мкл в пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 2.0 мл. Плотно закрывают и помещают в шкаф (помещение, камеру) для хранения. Раствор устойчив в течение 365 дней при хранении при -20°С.

Стрептавидин-НКР. В виалу с конъюгатом стрептавидин-НКР добавляют 0.5 мл воды для ВЭЖХ или воды Мййроге. Виалу плотно закрывают и осторожно перемешивают на вортексе приблизительно 10 с. В виалу с конъюгатом стрептавидин-НКР добавляют 0.5 мл глицерина. Закрывают виалу и осторожно несколько раз переворачивают ее. Аликвоты объемом 20 мкл помещают в пробирки на 0.5 мл с завинчивающейся крышкой. Плотно закрывают и помещают в шкаф (помещение, камеру) для хранения. Раствор хранят при -20°С в течение 365 дней.

Приготовление эталона (стандарта). Концентрацию белка в эталонном материале (ге£ та!) белка А получают из сертификата анализа (СОА). Готовят раствор белка А с концентрацией 11500 нг/мл из геГ та!, размораживая исходный раствор белка А при комнатной температуре. Рассчитывают требуемый объем геГ та1 белка А для получения раствора с концентрацией 11500 нг/мл. Минимальный переносимый объем должен быть 10 мкл.

_ .. Заданная концентрация · х · заданный · объём

Формула: Объем =-------------——----------------концентрация · исходного · раствора

Примечание: единицы должны быть совместимы.

_π 2.30- мкг/мл χ10· мл

Пример: ------------------= -92мкл

0.25- мг / мл

Рассчитывают объем ацетатного буфера (3.4), вычитая требуемый объем белка А геГ та1 из заданного объема.

Формула: (Заданный объём)-(объём Ке! 8Ш) = (Объём разбавителя)

Пример: 10.0 мл- 0.920 мл = 9.180 мл разбавителя

Добавляют рассчитанный объем белка А геГ та1 в стерильную пробирку на 15 мл, которая содержит вычисленный объем ацетатного буфера. Закрывают пробирку пробкой. Осторожно перемешивают на вортексе (установочный параметр 4 на приборе 7()110.4 Сеше 2) в течение 2-4 с. Готовят остальные стандарты (эталоны) в соответствии с приведенными далее объемами.

- 308 017765

Рабочая концентрация (нг/мл)	Объём раствора с рабочей КОНЦ, (мл)	Ацетатный буфер (мл)	Общий объём (мл)	Конечная концентрация (нг/мл)
2300000 (2.3 мг/мл)	0.010	1.990	2.0	11500
11500	0.010	4.780	4.790	24.0
24.0	2.0	2.0	4.0	12.0
12.0	2.0	2.0	4.0	6.00
6.00	2.0	2.0	4.0	3.00
3.00	2.0	2.0	4.0	1.50
1.50	2.0	2.0	4.0	0.75
0.75	2.0	2.0	4.0	0.375
0.375	2.0	2.0	4.0	0.188
Ν/Α	Ν/Α	2.0	2.0	0

После каждой стадии разведения закрывают пробирку н осторожно перемешивают 2-4 с на вортексе перед следующей стадией разведения. Инкубируют образцы эталона - исходного раствора н контроля качества в течение 10 мнн прн комнатной температуре, а затем добавляют в мнкротнтрацнонный планшет. Каждую концентрацию эталона анализируют в тройном повторе.

Приготовление испытуемых образцов. В полипропиленовых пробирках готовят образцы СТЬА4-1§ для испытания с концентрациями 5, 2.5 н 1.25 мг/мл, используя ацетатный буфер (рН 3.5). Перед тем как готовить разведения, оттаивают образец СТЬА4-1§ прн комнатной температуре. Рассчитывают требуемый объем испытуемого образца для того, чтобы получить раствор с концентрацией 5.0 мг/мл. Минимальный переносимый объем должен быть 10 мкл.

__ .. Заданная· концентрация-х-заданный-объём

Формула: Объем =-----------------------------концентрация - испытуемого - образца „ 5.0-лгкг/л/лх1.0-л/л ___

Пример: -——-— ----— ---= -200мо

25-мг/мл

5.1.3 Рассчитывают объем ацетатного буфера, вычитая требуемый объем испытуемого образца нз заданного объема.

Формула; (Заданный обьём)-(объём испытуемого образца) = (Объём разбавителя)

Пример; 1.0 мл- 0.200 мл = 0.800 мл разбавителя

Добавляют рассчитанный объем испытуемого образца в стерильную пробирку на 15 мл, которая содержит вычисленный объем ацетатного буфера. Закрывают пробирку пробкой. Осторожно перемешивают на вортексе (установочный параметр 4 на приборе Уог!ех Оеше 2) в течение 2-4 с. Испытуемые образцы ннкубнруют 10 мнн прн комнатной температуре н добавляют в мнкротнтрацнонный планшет.

Приготовление образцов контроля качества. Концентрацию белка в эталонном материале (ге£ та!) белка А получают нз СОА. Готовят раствор белка А с концентрацией 11500 нг/мл нз ге£ та! белка А. Готовят образцы контроля качества ^С), как описано в прнведенной ниже таблице.

Рабочая концентрация (нг/мл)	Объём раствора с рабочей КОНЦ. (мл)	Ацетатный буфер (мл)	Общий объём (мл)	Конечная концентрация (нг/мл)
2300000 (2.3 мг/мл)	0.010	1.990	2.0	11500
11500	0.010	4.780	4.790	24.0
24.0	0.8333	3.166	4.0	5.0 (0С1)
5.0	1.6	2.4	4.0	2.0 (0С1)
2.00	1.0	3.0	4.0	0.5 (0С1)

Аликвоты объемом 700 мкл помещают в пробнркн с завинчивающимися крышками объемом 2.0 мкл. Закрывают пробнркн н помещают в камеру для хранения. Раствор устойчив в течение 180 дней прн -70°С нлн ниже. Концентрации белка А в ОС образцах следует предварительно определить с помо

- 309 017765 щью трех независимых анализов белка А методом ЕЬКА. Усредняют результаты 18 определений (для 3 независимых анализов требуется 6 лунок на анализ). Концентрацию белка А для каждого образца рС устанавливают для каждого препарата. В день эксперимента размораживают одну виалу каждого РС образца при комнатной температуре или готовят свежие РС образцы из виалы с исходным раствором белка А. Осторожно перемешивают (установочный параметр 4 на Уог!ех Сете 2) в течение 2-4 с.

Методика. Сенсибилизация планшетов иммобилизованным антителом. Получают концентрацию белка в кроличьем антителе против белка А из СОА производителя. Рассчитывают нужный объем кроличьего антитела против белка А для получения 10 мл раствора с концентрацией 100 мкг/мл. Минимальный переносимый объем должен быть 10 мкл.

_ __ .. Заданная · концентрация ·χ· заданный-объём

Формула: Объем =---------------— ----------------концентрация · антитела

Примечание: Единицы должны быть совместимы.

„ 100· мкг! млхЗ- мл

Пример: --------------=12 л/о

25-мг/мл

Рассчитывают объем разбавителя, вычитая требуемый объем антитела кролика против белка А из заданного объема.

Формула: (Заданный объём)-(объём антитела) = (Объём разбавителя)

Пример: 3.0 мл- 0.012 мл = 2.988 мл разбавителя

Добавляют рассчитанный объем кроличьего антитела против белка А в стерильную пробирку на 15 мл, которая содержит вычисленный объем разбавителя. Закрывают пробирку пробкой и осторожно перемешивают на вортексе в течение 2-4 с. По формулам готовят раствор кроличьего антитела против белка А в буфере для сенсибилизации с концентрацией 1 мкг/мл. В каждую лунку микротитрационного планшета ^тШоп ГУ помещают 100 мкл раствора. Инкубируют при 2-8°С в течение 18±2 ч. Отмывают планшеты трижды раствором для отмывки, используя промыватель (вошер) планшетов, установочные параметры 300 мкл буфера для отмывки и время замачивания ноль. Многоканальной пипеткой добавляют 200 мкл δире^Β1οск™. Инкубируют микротитрационный планшет в темноте в течение 60 мин при комнатной температуре. Повторяют отмывку. Добавляют 100 мкл каждого из образцов: эталона для сравнения, контроля качества и испытуемого образца для анализа. Инкубируют микротитрационный планшет в темноте в течение 60±10 мин при комнатной температуре. Повторяют отмывку. Получают концентрацию белка конъюгата биотин-антитело против белка А из СОА производителя. Готовят раствор конъюгата биотин-антитело против белка А в разбавителе с концентрацией 1.0 мг/мл. Перемешивают на вортексе при средней скорости. Добавляют 50 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл (7.9.1) к 0.950 мл разбавителя. Перемешивают на вортексе при средней скорости. Добавляют 150 мкл раствора с концентрацией 50 мкг/мл (7.9.3) к 14.850 мл разбавителя. Многоканальной пипеткой добавляют 100 мкл в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 60±10 мин. Повторяют отмывку. Разводят стрептавидин-НКР следующим образом: добавляют 10 мкл стрептавидина-НКТ к 0.990 мкл разбавителя, получают раствор стрептавидина-НКР с концентрацией 0.01 мг/мл. Перемешивают на вортексе при средней скорости. Прибавляют 80 мкл раствора стрептавидина-НКР с концентрацией 0.01 мг/мл к 39.920 мл разбавителя. Перемешивают на вортексе при средней скорости. Многоканальным микродозатором в каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора. Инкубируют в течение 30±5 мин при комнатной температуре. Вынимают ТМВ из холодильника и декантируют в подходящий контейнер из расчета минимум 10 мл на планшет. Помещают в темное место и оставляют доходить до комнатной температуры. Повторяют отмывку, но пять раз. В каждую лунку добавляют по 100 мкл ТМВ хромогена. Инкубируют при комнатной температуре примерно 2±1 мин. Реакцию хромогена прекращают, добавляя по 100 мкл/лунка стоп-раствора. Стоп-раствор добавляют в планшеты и лунки в том же порядке, что и хромоген, чтобы гарантировать одно и то же время реакции хромогена с ферментом в каждой лунке. Определяют оптическую плотность (АВ) при 450 нм при длине волны стандарта для сравнения 630 нм.

Типичные значения. Типичные значения для эталонной (стандартной) кривой. Типичные значения для эталонов применяются к значениям, равным или превышающим количественный предел (РЬ), тогда как величины ниже ОЬ применяются только для того, чтобы содействовать установлению экстремумов на кривой. Коэффициент смешанной корреляции (К) для стандартной кривой должен быть >0.99, по определению с помощью программы δοί'!МаxΡΚΌ. Среднее фоновое значение для концентрации стандарта 0 нг/мл должно быть <0.08 единиц оптической плотности. Рассчитанное среднее значение (нг/мл) при каждой концентрации стандарта, используемое для определения стандартной кривой, за исключением нуля и РЬ, по определению с помощью программы должно быть в пределах 15% заданного (номинального) значения. Коэффициент вариации (% СУ) тройных значений АВ450 при каждой концентрации стандарта, используемой для определения стандартной кривой, исключая ноль и ОЕ, как определено с помощью программы, должен быть <15%. Среднее значений оптической плотности трипликата РЬ, по определению с применением программы, на стандартной кривой должно иметь % СУ менее 20% и быть

- 310 017765 в пределах 20% от заданного. Для того чтобы гарантировать, что по меньшей мере две конгруэнтные полученные точки пригодны для вычислений, стандарты, контроли качества и образцы засевают в лунки в тройном повторе. Каждое значение в тройном повторе анализируют по отдельности. Например:

Заданное значение (нг/мл) Действительное значение (нг/мл)

2.5 1.2

2.3

2.5

Единственное значение, самое дальнее от заданного значения 2.5 нг/мл, это 1.2 нг/мл. Если отбросить 1.2 нг/мл из тройного повтора, то среднее оставшихся величин отвечает всем типичным значениям. Если при повторном расчете другая точка не отвечает типичным значениям, тогда анализ неверен и должен быть переделан. Если показано, что среднее двух остальных величин не отвечает типичным значениям, тогда эту единичную точку (все 3 лунки) отбрасывают и кривую рассчитывают заново.

Типичные значения для ОС образцов. ОС образец определяют как набор из трех лунок с фиксированной (указанной) концентрацией, следовательно, для трех номинальных концентраций, установленных в данном методе, получают набор из шести ОС образцов (всего 18 лунок). Концентрации, полученные с помощью обратного расчета, по меньшей мере в двух из трех лунок ОС образца должны быть в пределах 20% от номинальной для ОС образца для того, чтобы этот образец был приемлемым. По меньшей мере четыре из шести ОС образцов должны быть приемлемыми; два из шести ОС образцов (но не два при одной и той же концентрации) могут быть неприемлемыми, и не более 6 лунок ОС образцов из 18 лунок могут отличаться более чем на 20% от соответствующих заданных концентраций.

Типичные значения для испытуемых образцов. Каждая из величин тройного повтора испытуемого образца должна быть в пределах 20% от средней величины при данной концентрации, как определено с применением программы. Если два или более средних значений АВ450 нельзя рассчитать, так как они лежат выше наивысшей точки на стандартной кривой, тогда образец надо снова анализировать при более высоких разведениях до тех пор, пока по меньшей мере два из трех значений не попадут на стандартную кривую. % СV результатов в тройном повторе, полученный для каждой заданной концентрации испытуемого образца, должен быть <20%, как определено с применением программы.

Расчеты. Устанавливают шаблон программы 8ойтах для Рго1ет А ЕЙША, так как она дает среднее значение, стандартные отклонения и % СУ. Усредняют значения оптической плотности (АВ), полученные для каждой концентрации эталона и образца. Моделируют данные для стандартов белка А, используя невзвешенную четырехпараметрическую регрессию вида . _ тт - тах АВ= ---—ггде тт - величина АВ, соответствующая минимальной асимптотической величине; тах - величина АВ, соответствующая максимальной асимптотической величине;

ЕО₅₀ - АВ, соответствующая половине абсолютной разности между максимальной и минимальной асимптотическими величинами;

В - аппроксимированный тангенс угла наклона линейного участка кривой;

С - концентрация белка А.

Расчет концентрации белка А в образцах. Умножают средние результаты на соответствующий фактор разведения (т.е. 2, 4 и 8), получают концентрацию белка А в неразведенном образце в нг/мл. Делят результат на зарегистрированную концентрацию белка СТ1 ,.Μ-Ο (мг/мл), получают концентрацию белка А нг/мг в СТ^А4-Iд.

Пример расчёта

Средний результат для образца 235 -нг- Белка -А/ мл , „ ,

------------------------------£-----=----------------------= -4.7 · нг / мг Концентрация · абатацепта 50 -мг! мл

Примечание: нг Белка А/мг СТ1А4-(нг/мг) эквивалентно частям на миллион (м.д., ррт).

Расчеты концентрации белка А в нг/мл в образцах. Количество белка А в испытуемых образцах рассчитывают, применяя современную программу 8ойМах, использующую уравнение регрессии. Анализируют три разведения каждого образца. Вычисленное значение концентрации умножают на соответствующий фактор (коэффициент) разведения, получают начальную концентрацию испытуемого образца.

- 311 017765

Пример.

Концентрация испытуемого образца 50 мг/мл. Разведение образца Фактор разведения мг/мл10

2.5 мг/мл20

1.25 мг/мл40 образец 5 мг/мл - по данным ЕЫБА концентрация белка А равна 10 нг/мл;

нг/млх10 (фактор разведения) = 100 нг/мл белка А в испытуемом образце;

образец 2.5 мг/мл - по данным ЕЫБА концентрация белка А равна 5.0 нг/мл;

нг/млх20 (фактор разведения) = 100 нг/мл белка А в испытуемом образце;

образец 1.25 мг/мл - по данным ЕЫБА концентрация белка А равна 2.5 нг/мл;

2.5 нг/млх40 (фактор разведения) = 100 нг/мл белка А в испытуемом образце.

Рассчитывают среднюю концентрацию из трех значений.

Документирование результатов. Результаты могут сообщаться в виде % вес./вес. тотального белка, нг белка А/мг тотального белка, по-другому это обозначается ρρт (части на миллион, миллионные доли, м.д.).

Пример:

0.0001% вес./вес. = 1 нг/мг = 1 ρρт (часть на миллион, м.д.) (вес./вес.).

Пример расчета.

0.0001 -мг/мл· Белка · А

50-мг/мл- испытуемого - образца х100% = 2-нг/мг = 2· ррт

Образцы, у которых величина АВ₄₅₀ меньше АВ₄₅₀ ОЕ (0.188 нг/мл), документируют (заносят в протокол) как меньше РЬ. Образцы, у которых величина АВ₄₅₀ больше АВ₄₅₀ ОЕ (0.188 нг/мл), следует регистрировать в протоколе в виде ближайшего целого числа частей на миллион (ρρΐ!, м.д.).

Пример.

Концентрация образца 50 мг/мл. Наивысшая анализируемая концентрация образца 5 мг/мл (разведение 1/10). АВ₄₅₀ образца меньше РЬ.

ОЕ = 0.188 нг/мл.

< 0.188 нг/5 мг.

< 0.04 нг/мг.

В протоколе пишут <, ОЕ = 0.04 ρριπ (частей на миллион, м.д.).

Пример 63. Способы получения образцов лекарственных веществ СТ^А4-Iд с молярными отношениями аминомоносахаридов (Х-ацетилгалактозамина, Х-ацетилглюкозамина) к белку.

Реагенты.

Гидролизующий раствор (водный 4 N раствор НС1). В стеклянную бутыль на 250 мл помещают 160 мл 6 N НС1 и 80 мл воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают. Хранят при 2-8°С до 6 месяцев. Раствор для дериватизации Ι (0.1 М водный раствор АРТБ). В стеклянной виале к 10 мг порошка АРТБ добавляют 192 воды для ВЭЖХ. Виалу перемешивают на вортексе 5-10 с до полного растворения АРТБ. Хранят при -20°С до одного года.

Раствор для дериватизации ΙΙ (1 М раствор уксусной кислоты и 0.25 М NаВНзСN). В центрифужной пробирке на 0.4 мл к 20 мкл уксусной кислоты добавляют 320 мкл воды для ВЭЖХ (17-кратное разбавление), получают 1 М раствор уксусной кислоты. В криогенной виале взвешивают 2.0±0.5 мг NаВНзСN. В соответствии с нижеприведенной формулой добавляют соответствующее количество 1 М раствора уксусной кислоты, чтобы получить 0.25 М NаВНзСN.

Объем (мкл) = 10³х(вес NаВНзСN в мг)/(62.84 г/мольх0.25 моль/л).

Примечание: готовят непосредственно перед применением. Цианоборгидрид натрия (NаВНзСN) следует хранить в темноте в эксикаторе. Во избежание многократного открывания бутыли с исходным реагентом рекомендуется распределить реагенты в несколько криовиал объемом 2.0 мл следующим образом: взвешивают 1.0 г±0.2 мг цианоборгидрида натрия в криовиалу объемом 2.0 мл. Готовят аликвоты из всего содержащегося в бутыли исходного раствора цианоборгидрида натрия следующим образом. Тщательно закрывают виалы и маркируют порядковым номером (1, 2, 3 и т.д.), также пишут название реагента, номер партии и дату окончания 6-месячного срока годности. Виалы следует герметизировать с помощью парафильма во избежание попадания влаги. Из одной и той же виалы взвешивают цианоборгидрид натрия для раствора для дериватизации ΙΙ не более трех раз. Следует отмечать это и порядковый номер криовиалы в лабораторном журнале. После многократного открывания криовиалы или при использовании этой конкретной партии цианоборгидрида натрия в СЕ (КЭ, капиллярный электрофорез) профиле может появиться пик реагента или маркировка может быть неверной. Если это повлияет на результат, отбрасывают использованную криовиалу и/или взвешивают реагент из криовиалы со следующим порядковым номером или из новой партии цианоборгидрида натрия.

- 312 017765

Буфер для реацетилирования (25 мМ раствор бикарбоната натрия, рН 9.5). В чистый стеклянный химический стакан на 100 мл помещают 0.210±0.02 г бикарбоната натрия. Добавляют 90 мл воды для ВЭЖХ и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения соли. Доводят рН до 9.5±0.1, добавляя 10 Ν №ЮН. Добавляют воду для ВЭЖХ до 100 мл. Раствор фильтруют и хранят при комнатной температуре до 3 месяцев. Подвижный буфер (60±5 мМ тетраборат натрия, рН 9.25). В чистый стеклянный химический стакан на 100 мл взвешивают 1.21±0.02 г тетрабората натрия. Добавляют 90 мл воды для ВЭЖХ и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения соли. Добавляя 10 Ν ^ЮН, доводят рН до 9.25±0.10. Водой для ВЭЖХ доводят до конечного объема 100 мл с конечной концентрацией раствора 60±5 мМ. Для приготовления раствора с концентрацией 55 мМ взвешивают 1.11 г (±0.02) тетрабората натрия и растворяют и титруют, следуя вышеприведенным инструкциям. Для приготовления раствора с концентрацией 65 мМ взвешивают 1.31 г (±0.02) тетрабората натрия и растворяют и титруют, следуя вышеприведенным инструкциям. Хранят при комнатной температуре до 3 месяцев. Если осуществляется разрешение пиков (определение в разделе пригодности системы) (величина И < 1.0), готовят свежий буфер. Необязательно: тетраборатный буферный раствор (МюгоЗок) разводят, добавляя 120 мл ультрачистой воды к 80 мл тетраборатного буферного раствора с концентрацией 150 мМ до конечной концентрации 60 мМ (±5 мМ). Титруют 10 Ν раствором ^ЮН, доводят рН до 9.25 (±0.1). Для приготовления 55 мМ тетраборатного раствора к 66 мл тетраборатного буфера с концентрацией 150 мМ добавляют 114 мл ультрачистой воды. Титруют, как указано выше. Для приготовления 65 мМ тетраборатного раствора к 78 мл тетраборатного буфера с концентрацией 150 мМ добавляют 102 мл ультрачистой воды. Титруют, как указано выше. Хранят раствор при комнатной температуре максимум 3 месяца. Если осуществляется разрешение пиков (определение в разделе пригодности системы) (величина И < 1.0), готовят свежий буфер.

Растворы для промывки капилляров.

Ν раствор №ЮН: 1 мл 10 Ν раствора NаΟΗ помещают в градуированную пластиковую пробирку на 15 мл, содержащую 9 мл воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с. Раствор хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.

Ν раствор НС1: 1 мл 6 Ν раствора НС1 помещают в градуированную пластиковую пробирку на 15 мл, содержащую 5 мл воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с. Раствор хранят при комнатной температуре до 6 месяцев. 80% раствор метанола: 8 мл метанола для ВЭЖХ помещают в градуированную пластиковую пробирку на 15 мл, содержащую 2 мл воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с. Раствор хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.

Стандартные исходные растворы моносахаридов.

Ν-Ацетилглюкозамин (Οа1NΑс). В криогенную виалу объемом 2 мл точно взвешивают 5±1 мг Оа1ΝΑο. Добавляют 1 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают на вортексе до растворения. Записывают точную концентрацию раствора (мг/мл).

Ν-Ацетилгалактозамин (βΕΝΑ^. В криогенную виалу объемом 2 мл точно взвешивают 5±1 мг Ο1сNΑс. Добавляют 1 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают на вортексе до растворения. Записывают точную концентрацию раствора (мг/мл).

Ν-Ацетилманнозамин (МаηNΑс). В криогенную виалу объемом 2 мл точно взвешивают 5±1 мг МаηNΑс. Добавляют 1 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают на вортексе до растворения. Записывают точную концентрацию раствора (мг/мл).

Стандартные исходные растворы моносахаридов хранят при - 20°С до 1 года.

Рабочий раствор моносахарида I. Рабочий раствор внутреннего стандарта. Разводят исходный раствор МаηNΑс в 100 раз водой для ВЭЖХ, добавляя 20 мкл исходного раствора МаηNΑс в криогенную виалу на 2 мл, содержащую 1980 мкл воды для ВЭЖХ. Перемешивают на вортексе около 5-10 с. Рабочий раствор внутреннего стандарта хранят при 2-8°С вплоть до 6 месяцев.

Рабочий раствор моносахарида II. Стандартный рабочий раствор смеси аминов. В криогенную виалу на 2 мл, содержащую 1960 мкл воды для ВЭЖХ, добавляют 20 мкл исходных растворов Οа1NΑс и Ο1сNΑс соответственно. Перемешивают на вортексе около 5-10 с. Стандартный рабочий раствор смеси аминов хранят при 2-8°С вплоть до 6 месяцев.

Растворы образцов и эталонных материалов. Размораживают образцы белков при 2-8°С и перемешивают, осторожно переворачивая. Разбавляют образцы и эталон водой для ВЭЖХ до примерной концентрации 1.0 мг/мл. Отмечают уменьшение концентрации по трем характерным данным.

- 313 017765

Условия СЕ электрофореза (КЭ, капиллярного электрофореза).

Подвижный буфер (стадия 2.5) 60 мМ раствор тетрабората натрия, рН 9.25 25°С

25-30 кВ, позитивный метод ЫР детектор, Возбуждение: 488 нм, излучение: 520 нм.

Инжекция под давлением, 20 сек при 0.5 ρδΐ (3.44 кПа) минут 10°С

Температура в кассете с капилляром Разность потенциалов Характеристики детектора

Ввод образца

Время прохождения Хранение образца

Методика.

Гидролиз. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора МаηNΑс и 200 мкл 4 N раствора для гидролиза. Этот раствор служит в качестве контроля системы. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора МаηNΑс и 10 мкл стандартного раствора смеси аминов. Кроме того, добавляют 200 мкл 4 N раствора для гидролиза. Этот раствор служит в качестве стандартного раствора моносахаридов для количественного определения пригодности системы. Готовят в двойном повторе. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора МаηNΑс и 10 мкл стандартного (эталонного) раствора СТЬА4-1д (около 1 мг/мл). Далее добавляют 200 мкл 4 N раствора НС1. Готовят в двойном повторе. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора МаηNΑс и 10 мкл раствора образца (около 1 мг/мл). Далее добавляют 200 мкл 4 N раствора НС1. Готовят в двойном повторе. Образцы перемешивают на вортексе около 10 с и центрифугируют 5-10 с. Образцы помещают штатив на 96 виал и инкубируют в сушильном шкафу при 95°С в течение 6 ч. После гидролиза гидролизованные образцы помещают при -20°С для охлаждения в течение 10 мин. Быстро центрифугируют гидролизованные образцы до тех пор, пока некоторое количество конденсата принудительно не опустится на дно пробирки (5-10 с при высокой скорости). Образцы упаривают досуха на концентраторе БреедУас. Каждый образец восстанавливают, добавляя 100 мкл воды для ВЭЖХ, и перемешивают на вортексе 10-15 с. Образцы упаривают досуха на концентраторе БреедУас.

Реацетилирование. Каждый образец восстанавливают, добавляя 10 мкл М6 буфера для реацетилирования и тщательно перемешивая на вортексе 5-10 с. В каждую пробирку добавляют 4 мкл М3 реагента для реацетилирования. Перемешивают на вортексе примерно 5-10 с. Инкубируют на льду 30 мин. Образцы упаривают досуха на концентраторе БреедУас. Каждый образец восстанавливают, добавляя 100 мкл воды для ВЭЖХ, и перемешивают на вортексе 10-15 с. Образцы упаривают досуха на концентраторе БреедУас.

Дериватизация. Помещают микроцентрифугу в сушильный шкаф, чтобы уравновесить с температурой сушильного шкафа 55°С. Восстанавливают каждый образец, добавляя 10 мкл раствора для дериватизации I (0.1 М раствор АРТБ). Перемешивают на вортексе около 5-10 с. Добавляют 5 мкл раствора для дериватизации II (1 М НАс и 0.25 М ЖВН₃С^. Перемешивают на вортексе около 5-10 с и центрифугируют. Быстро переносят виалы с образцами в предварительно нагретую центрифугу и центрифугу снова помещают в сушильный шкаф при 55°С. Инкубируют 3 ч при центрифугировании со скоростью 2000 об/мин. Это предупреждает конденсацию растворителя на поверхности виал.

Подготовка аппаратуры.

5.4.1. Установка нового капилляра (капиллярной колонки), промывают под высоким давлением (80 рз1, 551.58 кПа) в следующей последовательности (стадии): 1 N раствором №ОН в течение 20 мин; водой для ВЭЖХ в течение 10 мин; натрий-тетраборатным буфером с концентрацией 60 мМ в течение 10 мин.

Ежедневная операция.

Ежедневно перед началом работы проводят последовательные операции по промывке/прополаскиванию капилляра.

Затем пропускают стандарт пригодности системы (моносахаридный стандарт), чтобы быть уверен ными в пригодности системы.

N раствор №О11 может разъесть внутреннюю стенку капилляров от различных производителей и вызвать сдвиг времени миграции в ходе опыта. Если в результате время миграции последнего пика (С1сNΑс) составляет более 10.0 мин, может быть необходимым заменить 1 N раствор №ОН 0.1 N раствором №О11 или водой для ВЭЖХ на стадии 2 промывки.

Если применение эквивалентного капилляра и вышеописанной процедуры отмывки не является адекватным, для того, чтобы время выхода последнего пика (С1сNΑс) было в пределах типичных значений 10.0 мин, может быть необходимым применение 80% метанола и/или 1 N НС1.

Подготовка к инжекции (впрыску).

После дериватизации образцы оставляют охлаждаться до комнатной температуры. Центрифугируют около 10 с при комнатной температуре до тех пор, пока некоторое количество конденсата принудительно не опустится на дно пробирки.

В каждую пробирку добавляют 85 мкл воды для ВЭЖХ, чтобы довести конечный объем до 100 мкл.

- 314 017765

Перемешивают на вортексе 5-10 с.

мкл образца из каждой пробирки перенося в СЕ (КЭ) микровиалу и в каждую пробирку добавляют 190 мкл воды для ВЭЖХ. Перемешивают на вортексе 5-10 с.

Стадии промывки и последовательность инжекций.

Примечание. Для каждых четырех инжекций меняют СЕ (КЭ) подвижный буфер на свежеприготовленный СЕ подвижный буфер (из-за эффекта ионного истощения). Капилляр промывают под давлением 40 рз1 (275.79 кПа).

Стадия	Описание	Продолжительность (мин)
1 (Промывка)	Вода для ВЭЖХ	1
2 (Промывка)		ШИаОНили Ο.ΙΝΝβΟΗ	3
ОК
Вода для ВЭЖХ Примечание: При применении воды для ВЭЖХ стадия 2 промывки, стадии 1, 2 и 3 можно объединить в одну 3х минутную обработку.	1
3 (Промывка)	Вода для ВЭЖХ	1
4 (Промывка)	обработка 60 мМ натрий-тетраборатным буфером	5
5 (Промывка)	Контроль (маркер внутреннего стандарта)	10
6 (Промывка)	Повторяют 1-4	10
7 (Промывка)	Пригодность системы (Μοηο δίά прел. 1)	10
8 (Промывка)	Повторяют 1-4	10
9	Пригодность системы (Μοηο διά прел. 1)	10
Ю(Промывка)	Повторяют 1-4	10
11	Пригодность системы (Μοηο διά прел. 2)	10
12(Промывка)	Повторяют 1-4	10
13	Пригодность системы (Μοηο 8М прел. 2)	10
14(Промывка)	Повторяют 1-4	10

- 315 017765

15	СТЬА4-1д КеГ. Ма1. (Эталон) преп. 1	10
16(Промывка)	Повторяют 1-4	10
17	СТЬА4-1§ КеГ. Маг. (Эталон) преп 2	10
18(Промывка)	Повторяют 1-4	10
19	Образец 1 преп 1	10
20(Промывка)	Повторяют 1-4	10
21	Образец 1 преп 1	10
22(Промывка)	Повторяют 1-4	10
23	Образец 1 преп 2	10
24(Промывка)	Повторяют 1-4	10
25	Образец 1 преп 2	10
26(Промывка)	Повторяют 1-4	18
27	Образец 2 преп 1	10
28(Промывка)	Повторяют 1-4	10
29	Образец 2 преп 1	10
ЗО(Промывка)	Повторяют 1-4	10
31	8атр1е 2 ргер 2	10
32(Промывка)	Повторяют 1-4	10
33	Образец 2 преп 2	10
34(Промывка)	Повторяют 1-4	10
35	Образец 3 преп 1	15
Зб(Промывка)	Повторяют 1-4	10
37	Образец 3 преп 1	10
38(Промывка)	Повторяют 1-4	,0
39	Образец 3 преп 2	10
40(Промывка)	Повторяют 1-4	10
41	Образец 3 преп 2	10
42(Промывка)	Повторяют 1-4	10
43	СТЬА4-1§ Эталон преп. 1	10
44(Промывка)	Повторяют 1-4	10

- 316 017765

45	СТЬА4-1§ Эталон преп. 2	10
46(Промывка)	Повторяют 1-4	10
47	Пригодность системы (Мопо 8ίά преп. 1)	10
48(Промывка)	Повторяют 1-4	10
49	Пригодность системы (Мопо διά преп. 1)	10
50	Повторяют 1-4	10
51	Пригодность системы (Мопо διά преп. 2)	10
52	Повторяют 1-4	10
53	Пригодность системы (Мопо δίά преп. 2)	10

* Примечание: повторяют последовательность операций с участием до трех образцов в двойном повторе и объединяют (группируют, бракетируют) с 2 инжекциями каждого препарата эталона (стандарта) моносахаридов. Если прогоняют более трех образцов, запускают дополнительные образцы, как показано в вышеприведенной последовательности операций, начиная со строки 19. Завершают ряд операций, выполняя пункт Пригодность системы (Мопо 8ίά), как показано в таблице пп.47-53.

** Группируют образцы с двумя инжекциями каждого препарата эталонного материала С'Т1 ,Λ4-Ιμ.

Пригодность системы. Примечание: если иначе не указано, показатели пригодности системы определяют первую инжекцию стандарта (эталона) пригодности системы. Электроферограмма пригодности первой системы должна быть аналогична электроферограмме, показанной на фиг. 1, в которой пик 1 относится к СаШЛс; пик 2 относится к ΜаηNАс; пик 3 относится к С1сNАс. Примечание: если должны использоваться другие СЕ (КЭ) приборы, нежели Весктап РАСЕ ΜΏΡ, длина капилляра может отличаться от длины, описанной в данном методе, вследствие различных конфигураций элементов, фиксирующих разделительный капилляр. Это приводит к изменению времени миграции аналита, а также интенсивности пика.

Разрешение между двумя соседними пиками рассчитывают для первого эталона. Пригодности системы с помощью измерительного прибора по следующему уравнению:

К ₌ 2(% ~ ^1) (^+Ж₂) где К - разрешение;

ί₂, ίί - время миграции двух соседних пиков соответственно;

А1, А₂ - ширина на уровне базовой линии двух соседних пиков, соответственно значение К должно быть >1.0.

Если К <1.0, промывают (ополаскивают) капилляр в соответствии с последовательностью промывок/ополаскиваний; если проблема остается, заменяют старый буфер свежеприготовленным подвижным буфером или заменяют капилляр.

При последней инжекции пригодности системы последний пик (С1сNАс) должен иметь коэффициент ассиметрии пика <1.4 при расчете по нижеприведенной формуле:

Τ=Αο._Ο5/2ί где Т - коэффициент ассиметрии пика;

А₀.₀₅ - ширина пика на уровне 5% его высоты; ί - ширина фронта пика на уровне его максимума.

Если Т>1.4, промывают (ополаскивают) капилляр в соответствии с последовательностью промывок/ополаскиваний; если проблема остается, заменяют старый буфер свежеприготовленным подвижным буфером или заменяют капилляр.

6.1 Повторные инжекции эталонов пригодности системы должны отвечать следующим типичным значениям:

отношение площади пика С1сNАс ν§. ΜаNАс: 1К81) <10% (рассчитано на стадии 7.1); время миграции С1сNАс должно быть <10 мин;

профиль должен быть эквивалентен профилю на фиг. 1, где наблюдаются три пика, а внутреннему стандарту (ΜаηNАс) соответствует пик под номером 2.

Если какое-либо из приведенных выше типичных (иллюстративных) значений не удовлетворяет

- 317 017765 этим условиям для испытываемых образцов, сначала повышают разность потенциалов, если время миграции ОкНАв более 10.0 мин. Затем, если отношение площади пика >10%, готовят свежий СЕ (КЭ) буфер, проверяют точность рН или заменяют капилляр. После корректировки прибора повторяют инжекции для проверки пригодности системы. Если при анализе профиля пика наблюдается значительное уменьшение высоты пика МаηNΆс, проверяют, чтобы удостовериться, что световодный (оптоволоконный) кабель в модуль ЫР не смещен.

Определяют процент КЗО (относительное стандартное отклонение) моносахаридного стандарта, сравнивая отношения площадей пиков внутреннего стандарта и компонентов моносахаридного стандарта. Делят площадь пика каждого моносахаридного компонента на площадь пика внутреннего стандарта для каждой инжекции моносахаридного стандарта. Рассчитывают процент ИЗО для Θа1NΆс и С1сНАс для двух бракетированных (входящих в группу, сгруппированных) стандартов. ИЗО должно быть <10%. Если не получают такое среднеарифметическое типичное значение (значение в примере), тогда следует промыть капилляр или заменить, как указано выше.

Вычисления.

Расчет отношения площадей пиков ОаВДАс и С1сНАс относительно внутреннего стандарта (МапНАс). Используют при повторных инжекциях первых четырех стандартов пригодности системы с тем, чтобы они соответствовали типичным значениям, и при проведении таких же вычислений для всех сгруппированных (бракетированных) стандартов пригодности системы, вводимых до и после образца (образцов).

Отношение площадей пиков = делят площадь пика каждого моносахаридного компонента (ΟΗΝ^, ОаВДАс) на площадь пика внутреннего стандарта (МапЫАс) для каждой инжекции стандарта пригодности системы.

„ площадь пика моносахарида

Отношение площадей пиков =-----------------------площадь пика ΜαΝΑο

Рассчитывают среднее отношений площадей пиков для и ОаВДАс в стандартах пригодности системы. Также рассчитывают стандартное отклонение (девиацию) (З.О.) и относительное остаточное отклонение в процентах (% КЗО).

Типичные значения: ИЗО для отношения площади пика Θ1сNΆс<10%. Два сгруппированных (бракетированных) стандарта пригодности системы, введенных до и после образца (образцов): процент КЗО для отношения площади пиков и ОаВДА^^/о.

Если это среднеарифметическое типичное значение не удовлетворяет условию (КЗО >10%), тогда капилляр надо снова промыть по методикам промывки и снова прогнать эти образцы и бракетированные (входящие в эту группу) моносахаридные стандарты. Если среднеарифметическое типичное значение попрежнему не удовлетворяет условию, заменяют капилляр и промывают как положено. Снова пропускают образцы и бракетированные моносахаридные стандарты.

Стандартное отклонение =

Γ^ηΣ*²

V и(и-1) где п - число измерений образца;

х - отдельные измерения;

„ _π „„ Стандартное · отклонение , _ _ %κδϋ = ---------------------------х 100

Средняя найденная площадь пика

Рассчитывают молярное соотношение ОаШАс/белок

АоаШАс X АмапИЛсО X УовШАсО X СовШЛеО X МУАп Κα·ΐΝΑ<> — - ................ ............—.....τίΚΤ,.?.

Ам«пмас х Αο»ινα«ο X Υρ х Ср X МУ/_01сЫАС где Ко_аШАс - молярное отношение ОаВДАс νδ. белок;

- площадь пика (мкВ-с) ОаВДАс в образце;

Амшмс - площадь пика (мкВ-с) МапХАс в образце;

- средняя площадь пика (мкВ-с) МапПАс в моносахаридном стандарте;

- средняя площадь пика (мкВ-с) ОаВДАс в моносахаридном стандарте;

Vθ_а]_NАс0 - объем ОаВДАс в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мкл);

Со_аш_Ас0 - концентрация ОаШАс в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мг/мкл);

V - объем образца белка, используемого для гидролиза (мкл);

С_р - концентрация образца белка, используемого для гидролиза (в мг/мл);

М^ст^д^ - молекулярная масса эталонного материала СТ^Ά4-Iд;

ГО . _А - молекулярная масса ОаШАс (221.2 Да).

Группирование (бракетирование) стандартов. При расчетах молярных отношений эталонного материала СТЬАГОд и образцов используют все восемь сгруппированных (бракетированных, взятых в скобки) стандартов пригодности системы. Усредняют площади пиков для введения в это уравнение. Это ис

- 318 017765 пользуют для первых трех образцов. Для всех других образцов при расчетах молярного соотношения всегда используют среднюю площадь пика следующих четырех бракетированных моносахаридных стандартов и предыдущих четырех бракетированных моносахаридных стандартов.

Рассчитывают молярное соотношение С1еNАе/белок _ ΑοίοΝΑο X ΑΜμιΝΑοΟ X УокЫ АсО X ΟαϊβΝΑβΟ X МАстъамв*

ГЧОЫЫАя — .............. и........ .

ΑΜβπΝΑο X ΑαΐεΝΑοΟΧ Ур X Ср X ΜΑΰΙοΝΑο где - молярное отношение С1еNАе ν^ белок;

'ош'с - площадь пика (мкВ-с) С1еNАе в образце;

'ш^'с - площадь пика (мкВ-с) МаηNАс в образце;

'мя^со - средняя площадь пика (мкВ-с) МаηNАе в моносахаридном стандарте;

'щс^со - средняя площадь пика (мкВ-с) С1еNАе в моносахаридном стандарте;

Уош'ш - объем С1еNАе в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мкл);

Сцш'ш - концентрация С1еNАе в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мг/мкл);

У_р - объем образца белка, используемого для гидролиза (мкл);

С_р - концентрация образца белка, используемого для гидролиза (в мг/мл);

МА_СТг'_4-1_д - молекулярная масса эталонного материала СТ^А4-Iд для СОА;

МАс^ - молекулярная масса С1еNАе (221.2 Да).

Типичные значения. Процент КЗЭ для двух, бракетированных, отношений площадей пиков аминных стандартов пригодности системы не должен превышать 10%. Два средних молярных отношения для аминомоносахаридов в эталонном материале должны быть в описанных интервалах. Для каждого компонента % КЗЭ для четырех результатов (инжекции в двойном повторе препаратов в двойном повторе) должны быть <25%.

Молярное отношение СТ^А4-Iд эталонного материала._________

Моносахарид	Интервал
ОаШАс	2.0- 3.2
ΟΙοΝΑε	18- 32

Документирование результатов. Средний результат выражают в виде числа молекул СаШАс на молекулу СТ^А4-Iд и числа молекул С1еNАе на число молекул СТ^А4-Iд. Переносят данные молярного соотношения в две характерные диаграммы. Для каждого компонента % КЗЭ для четырех результатов (инжекции в двойном повторе препаратов в двойном повторе) должны быть <25%.

Пример 64. Методы определения молярных отношений нейтральных моносахаридов (маннозы, фукозы, галактозы) к белку в образцах лекарственного вещества СТ^А4-Iд.

Реагенты.

Раствор для гидролиза (2 М водный раствор ТРА (ТФК)). В микроцентрифужную пробирку на 1.7 мл помещают 148 мкл ТЕА и 852 мкл воды для ВЭЖХ. Перемешивают на вортексе 5-10 с. При необходимости можно увеличивать. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Раствор для дериватизации Ι (0.1 М водный раствор АРТЗ). В стеклянной виале к 10 мг порошка АРТЗ добавляют 192 воды для ВЭЖХ. Виалу перемешивают на вортексе 5-10 с до полного растворения АРТЗ. Хранят при -20°С до одного года.

Раствор для дериватизации ΙΙ (1 М раствор уксусной кислоты и 0.25 М ^ВН^СК). В центрифужной пробирке на 0.4 мл к 20 мкл уксусной кислоты добавляют 320 мкл воды для ВЭЖХ (17-кратное разбавление), получают 1 М раствор уксусной кислоты. В криогенную виалу взвешивают 2.0±0.5 мг ^ВН^СК В соответствии с нижеприведенной формулой добавляют соответствующий объем 1 М раствора уксусной кислоты, чтобы получить 0.25 М ЖВН₃СК

Объем (мкл) = 10³х(вес NаВН₃СN в мг)/(62.84 г/мольх0.25 моль/л).

Цианоборгидрид натрия (NаВН₃СN) следует хранить в темноте в эксикаторе.

Во избежание многократного открывания бутыли с исходным реагентом рекомендуется распределить реагенты в несколько криовиал объемом 2.0 мл следующим образом.

Взвешивают 1.0 г±0.2 мг цианоборгидрида натрия в криовиалу объемом 2.0 мл. Таким образом, готовят аликвоты из всего содержащегося в бутыли исходного раствора цианоборгидрида натрия.

Тщательно закрывают виалы и маркируют порядковым номером (1, 2, 3 и т.д.), также пишут название реагента, номер партии и дату окончания 6-месячного срока годности.

Виалы следует герметизировать с помощью парафильма во избежание попадания влаги.

Из одной и той же виалы взвешивают цианоборгидрид натрия для раствора для дериватизации ΙΙ не более трех раз. Следует отмечать это и порядковый номер криовиалы в лабораторном журнале.

После многократного открывания криовиалы или при использовании этой конкретной партии цианоборгидрида натрия в СЕ (КЭ) профиле может появиться пик реагента или маркировка может быть неверной. Если это повлияет на результат, отбрасывают использованную криовиалу и/или взвешивают реагент из криовиалы со следующим порядковым номером или из новой партии цианоборгидрида натрия.

- 319 017765

Подвижный буфер (раствор тетрабората натрия с концентрацией 60±5 мМ, рН 9.25).

Взвешивают 1.21±0.02 г тетрабората натрия в чистую стеклянную бутыль на 100 мл.

Добавляют 90 мл воды для ВЭЖХ и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения солей.

Добавляя 10 Ν раствор №0Н, доводят рН до 9.25±0.10.

Добавляя воду для ВЭЖХ, доводят до конечного объема 100 мл с конечной концентрацией 60 мМ (±5 мМ).

Для приготовления раствора с концентрацией 55 мМ взвешивают 1.11 г (±0.02 г) тетрабората натрия, растворяют и титруют в соответствии с вышеприведенными инструкциями.

Для приготовления раствора с концентрацией 65 мМ взвешивают 1.31 г (±0.02 г) тетрабората натрия, растворяют и титруют в соответствии с вышеприведенными инструкциями.

Хранят при комнатной температуре до 3 месяцев. Если осуществляется разрешение пиков (определение в разделе пригодности системы) (величина К <1.0), готовят свежий буфер.

Необязательно: тетраборатный буферный раствор (М1сго8о1у) разводят, добавляя 120 мл ультрачистой воды к 80 мл тетраборатного буферного раствора с концентрацией 150 мМ до конечной концентрации 60 мМ (±5 мМ). Титруют 10 Ν раствором №0Н, доводят рН до 9.25 (±0.1).

Для приготовления тетраборатного раствора с концентрацией 55 мМ к 66 мл тетраборатного буфера с концентрацией 150 мМ добавляют 114 мл ультрачистой воды. Титруют, как указано выше.

Для приготовления тетраборатного раствора с концентрацией 65 мМ к 78 мл тетраборатного буфера с концентрацией 150 мМ добавляют 102 мл ультрачистой воды. Титруют, как указано выше.

Хранят раствор при комнатной температуре максимум 3 месяца. Если осуществляется разрешение пиков (определение в разделе пригодности системы) (величина К <1.0), готовят свежий буфер.

Растворы для промывки капилляров.

Ν раствор №10Н:

мл 10 Ν раствора №10Н помещают в градуированную пластиковую пробирку на 15 мл, содержащую 9 мл воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с. Раствор хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.

Ν раствор НС1:

мл 6 Ν раствора НС1 помещают в градуированную пластиковую пробирку на 15 мл, содержащую 5 мл воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с. Раствор хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.

80% раствор метанола:

мл метанола для ВЭЖХ помещают в градуированную пластиковую пробирку на 15 мл, содержащую 2 мл воды для ВЭЖХ. Тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с. Раствор хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.

Стандартные исходные растворы моносахаридов.

Манноза (Мап).

В криогенную виалу на 2.0 мл точно взвешивают 5±1 мг маннозы.

Добавляют 1 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с.

Записывают точную концентрацию раствора (мг/мл).

Фукоза (Еис).

В криогенную виалу на 2.0 мл точно взвешивают 5±1 мг фукозы.

Добавляют 1 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с.

Записывают точную концентрацию раствора (мг/мл).

Галактоза (Оа1).

В криогенную виалу на 2.0 мл точно взвешивают 5±1 мг галактозы.

Добавляют 1 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с.

Записывают точную концентрацию раствора (мг/мл).

Ксилоза (Ху1).

В криогенную виалу на 2.0 мл точно взвешивают 5±1 мг ксилозы.

Добавляют 1 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают на вортексе 5-10 с.

Записывают точную концентрацию раствора (мг/мл).

Исходные стандартные растворы моносахаридов хранят при -20°С до 1 года.

Рабочий раствор моносахарида Ι: Рабочий раствор внутреннего стандарта. Для приготовления рабочего раствора внутреннего стандарта исходный раствор ксилозы разводят в 100 раз водой для ВЭЖХ, добавляя 20 мкл исходного раствора ксилозы (3.6.4) в криогенную виалу, уже содержащую 1980 мкл воды для ВЭЖХ. Перемешивают на вортексе около 5-10 с. Этот рабочий раствор внутреннего стандарта хранят при 2-8°С до 6 месяцев.

Рабочий раствор моносахаридов ΙΙ: Рабочий раствор стандарта нейтральной смеси. В криогенную виалу на 2.0 мл, содержащую 1940 мкл воды для ВЭЖХ, добавляют 20 мкл исходных растворов маннозы, фукозы и галактозы соответственно. Перемешивают на вортексе около 5-10 с. Этот рабочий раствор

- 320 017765 внутреннего стандарта хранят при 2-8°С до 6 месяцев.

Растворы образцов и эталонных материалов. Размораживают образцы белков при 2-8°С и перемешивают, осторожно переворачивая. Разбавляют образцы и эталон водой для ВЭЖХ до примерной концентрации 1.0 мг/мл.

Условия СЕ электрофореза (КЭ, капиллярного электрофореза).

Подвижный буфер

Температура в кассете с капилляром

Разность потенциалов

Характеристики детектора

Ввод (инжекция) образца

Время прохождения

Хранение образца мМ раствор тетрабората натрия, рН 9.25

25°С

25- 30 кВ, позитивный метод ЫР детектор, Возбуждение: 488 нм, излучение: 520 нм.

Инжекция под давлением, 20 сек при 0.5 ρδΐ (3.44 кПа) минут

10°С

Методика.

Гидролиз. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 200 мкл 2 М ТФК. Этот раствор служит в качестве контроля системы. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 10 мкл стандартного рабочего раствора нейтральной смеси. Кроме того, добавляют 200 мкл 2 М раствора ТФК и перемешивают на вортексе 3-4 с. Этот раствор служит в качестве стандартного раствора моносахаридов для количественного определения пригодности системы. Готовят в двойном повторе. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 10 мкл стандартного (эталонного) раствора СТ^А4-Iд (около 1 мг/мл). Далее добавляют 200 мкл 2 М раствора ТФК и перемешивают на вортексе 3-4 с. Готовят в двойном повторе. В центрифужную пробирку на 0.65 мл помещают 10 мкл рабочего раствора ксилозы и 10 мкл раствора образца (около 1 мг/мл). Далее добавляют 200 мкл 2 М раствора ТФК и перемешивают на вортексе 3-4 с. Готовят в двойном повторе. Образцы перемешивают на вортексе около 20 с и центрифугируют примерно 5-10 с. Образцы помещают в штатив на 96 виал и инкубируют в сушильном шкафу при 95°С в течение 6 ч. После гидролиза образцы помещают при -20°С для охлаждения в течение 10 мин. Быстро центрифугируют гидролизованные образцы до тех пор, пока некоторое количество конденсата принудительно не опустится на дно пробирки (5-10 с при высокой скорости). Образцы упаривают досуха на концентраторе 8реебУас. Каждый образец восстанавливают, добавляя 100 мкл воды для ВЭЖХ, и перемешивают на вортексе 10-15 с. Образцы упаривают досуха на концентраторе 8реебУас.

Дериватизация: помещают микроцентрифугу в сушильный шкаф, чтобы уравновесить с температурой сушильного шкафа 55°С. Восстанавливают каждый образец, добавляя 10 мкл раствора для дериватизации Ι (0.1 М раствор АРТ8). Перемешивают на вортексе около 5-10 с. Добавляют 5 мкл раствора для дериватизации ΙΙ (1 М НАс и 0.25 М КаВН₃СК). Перемешивают на вортексе около 5-10 с и центрифугируют. Быстро переносят виалы с образцами в предварительно нагретую центрифугу и центрифугу снова помещают в сушильный шкаф при 55°С. Инкубируют 3 ч при центрифугировании со скоростью 2000 об/мин. Это предупреждает конденсацию растворителя на поверхности виал.

Подготовка аппаратуры: установка нового капилляра (капиллярной колонки), промывают под высоким давлением (80 рз1, 551.58 кПа) в следующей последовательности (стадии):

N раствор КаОН в течение 20 мин;

вода для ВЭЖХ в течение 10 мин;

натрий-тетраборатный буфер с концентрацией 60 мМ в течение 10 мин.

Проводят последовательные операции по промывке/прополаскиванию капилляра. Затем пропускают эталон пригодности системы (моносахаридный стандарт), чтобы быть уверенными в пригодности системы. 1 N раствор КаОН может разъесть внутреннюю стенку капилляров от различных производителей и вызвать сдвиг времени миграции в ходе опыта. Если в результате время миграции последнего пика (галактозы) составляет более 15.0 мин, может быть необходимым заменить 1 N раствор КаОН 0.1 N раствором КаОН или водой для ВЭЖХ на стадии 2 промывки. Когда используют эквивалентный капилляр, а вышеописанная процедура промывки не адекватна, для того, чтобы время выхода последнего пика (галактозы) было в пределах типичных значений 15.0 мин, может потребоваться промывка 80% метанолом и/или 1 N НС1.

Подготовка к инжекции (впрыску): после дериватизации образцы оставляют охлаждаться до комнатной температуры. Центрифугируют около 10 с при комнатной температуре до тех пор, пока некоторое количество конденсата принудительно не опустится на дно пробирки. В каждую пробирку добавляют 85 мкл воды для ВЭЖХ, чтобы довести конечный объем до 100 мкл. Перемешивают на вортексе 5-10 с. 10 мкл образца из каждой пробирки переносят в СЕ (КЭ) микровиалу и в каждую пробирку добавляют 190 мкл воды для ВЭЖХ. Перемешивают на вортексе 5-10 с.

- 321 017765

Стадии промывки и последовательность инжекции.

Стадия	Описание	Продолжительность (мин)
1 (Промывка)	Вода для ВЭЖХ	1
2 (Промывка)		ΙΝΝηΟΗηπη О.тЦаОН	3
ОК
Вода для ВЭЖХ Примечание: При применении воды для ВЭЖХ стадия 2 промывки, стадии 1, 2 и 3 можно объединить в одну 3х минутную обработку.	1
3 (Промывка)	Вода для ВЭЖХ	1
4 (Промывка)	обработка 60 мМ натрий-тетраборатным подвижным буфером	5
5 (Промывка)	Контроль (маркер внутреннего стандарта)	15
6 (Промывка)	Повторяют 1-4	10
7 (Промывка)	Пригодность системы (Μοηο διά преп. 1)	15
8 (Промывка)	Повторяют 1-4	10
9	Пригодность системы (Μοηο 8ίά преп. 1)	15
Ю(Промывка)	Повторяют 1-4	10
11	Пригодность системы (Μοηο преп. 2)	15

- 322 017765

12(Промывка)	Повторяют 1-4	10
13	Пригодность системы (Μοηο 8ίά преп. 2)	15
14(Промывка)	Повторяют 1-4	10
15	СТЬА4-1д КеГ. Ма1. (Эталон) преп. 1	15
16(Промывка)	Повторяют 1-4	10
17	СТЬА4-1§ КеГ. Ма1. (Эталон) преп 2	15
18(Промывка)	Повторяют 1-4	10
19	Образец 1 преп 1	15
20(Промывка)	Повторяют 1-4	10
21	Образец 1 преп 1	15
22(Промывка)	Повторяют 1-4	10
23	Образец 1 преп 2	15
24(Промывка)	Повторяют 1-4	10
25	Образец 1 преп 2	15
26(Промывка)	Повторяют 1-4	10
27	Образец 2 преп 1	15
28(Промывка)	Повторяют 1-4	10
29	Образец 2 преп 1	15
ЗО(Промывка)	Повторяют 1-4	10
31	5>атр1е 2 ргер 2	15
32(Промывка)	Повторяют 1-4	10
33	Образец 2 преп 2	15
34(Промывка)	Повторяют 1-4	10
35	Образец 3 преп 1	15
Зб(Промывка)	Повторяют 1-4	10
37	Образец 3 преп 1	15
38(Промывка)	Повторяют 1-4	10
39	Образец 3 преп 2	15
40(Промывка)	Повторяют 1-4	10
41	Образец 3 преп 2	15

- 323 017765

42(Промывка)	Повторяют 1-4	10
43	СТЬА4-12 Эталон преп. 1	15
44(Промывка)	Повторяют 1-4	10
45	СТЬА4-1§ Эталон преп. 2	15
46(Промывка)	Повторяют 1-4	10
47	Пригодность системы (Μοηο преп. 1)	15
48(Промывка)	Повторяют 1-4	10
49	Пригодность системы (Μοηο διά преп. 1)	15
50	Повторяют 1-4	10
51	Пригодность системы (Μοηο διά преп. 2)	15
52	Повторяют 1-4	10
53	Пригодность системы (Μοηο 8Й преп. 2)	15

* Примечание: повторяют последовательность операций с участием до трех образцов в двойном повторе и объединяют (группируют, бракетируют) с 2 инжекциями каждого препарата эталона (стандарта) моносахаридов. Используют все восемь инжекций стандарта (эталона) Пригодности системы. Если прогоняют более трех образцов, запускают дополнительные образцы, как показано в вышеприведенной последовательности операций, начиная со строки 19.

** Группируют образцы с двумя инжекциями каждого препарата эталонного материала СТЕА44д.

Пригодность системы. Электроферограмма пригодности первой системы должна быть аналогична электроферограмме, в которой пик 1 относится к маннозе; пик 2 относится к ксилозе; пик 3 относится к фукозе и пик 4 относится к галактозе. Примечание: если должны использоваться другие СЕ (КЭ) приборы, нежели Весктап РАСЕ МИО, длина капилляра может отличаться от длины, описанной в данном методе, вследствие различных конфигураций элементов(кассет), фиксирующих разделительный капилляр. Это приводит к изменению времени миграции аналита, а также интенсивности пика.

Разрешение между двумя соседними пиками рассчитывают для первого эталона пригодности системы с помощью измерительного прибора по следующему уравнению:

_ 2(^2 ~ 7] ) ~ (^+Ψ₂) где К - разрешение;

ΐ₂, ΐ₁ - время миграции двух соседних пиков соответственно;

^₁, - ширина на уровне базовой линии двух соседних пиков соответственно.

Значение К должно быть >1.0. Если К <1.0, промывают (ополаскивают) капилляр в соответствии с последовательностью промывок/ополаскиваний; если проблема остается, заменяют старый буфер свежеприготовленным подвижным буфером или заменяют капилляр.

При последней инжекции пригодности системы последний пик (галактоза) должен иметь коэффициент ассиметрии пика <1.4 при расчете по нижеприведенной формуле:

где Т - коэффициент ассиметрии пика;

А'₀₀₅ - ширина пика на уровне 5% его высоты;

£ - ширина фронта пика на уровне его максимума.

Если Т >1.4, промывают (ополаскивают) капилляр в соответствии с последовательностью промывок/ополаскиваний; если проблема остается, заменяют старый буфер свежеприготовленным подвижным буфером или заменяют капилляр.

Повторные инжекции эталонов пригодности системы должны отвечать следующим типичным значениям:

отношение площади пика галактозы νδ. ксилозы: 1К81) <10%; время миграции галактозы должно быть <15 мин;

профиль должен быть эквивалентен профилю на фиг. 1, где наблюдаются четыре пика, а внутреннему стандарту (ксилозе) соответствует пик под номером 2.

- 324 017765

Если какое-либо из приведенных выше типичных (иллюстративных) значений не удовлетворяется, сначала повышают разность потенциалов, если время миграции галактозы более 15.0 мин. Затем, если отношение площади пика >10%, готовят свежий СЕ (КЭ) буфер, проверяют точность рН или заменяют капилляр.

После корректировки прибора повторяют инжекции для проверки пригодности системы. Если при анализе профиля пика наблюдается значительное уменьшение высоты пика ксилозы, проверяют, чтобы удостовериться, что световодный (оптоволоконный) кабель в модуль ЬЕР не смещен. Определяют процент КЗ1) (относительное стандартное отклонение) моносахаридного стандарта, сравнивая отношения площадей пиков внутреннего стандарта и компонентов моносахаридного стандарта. Делят площадь пика каждого моносахаридного компонента на площадь пика внутреннего стандарта для каждой инжекции моносахаридного стандарта. Рассчитывают процент 1КЗ1) для маннозы, фукозы и галактозы для двух бракетированных (входящих в группу, сгруппированных) стандартов. КЗБ должно быть <10%. Если не получают такое среднеарифметическое типичное значение (значение в примере), тогда следует промыть капилляр или заменить, как указано выше. Образцы и объединенные с ними в группу (бракетированные) эталоны моносахаридов следует повторить.

Вычисления. Расчет отношения площадей пиков Мап, Рис и Оа1 относительно внутреннего стандарта (ксилозы). Используют при повторных инжекциях первых четырех стандартов пригодности системы с тем, чтобы они соответствовали типичным значениям, и при проведении таких же вычислений для всех сгруппированных (бракетированных) стандартов пригодности системы, вводимых до и после образца (образцов). Отношение площадей пиков = площадь пика каждого моносахаридного компонента (Мап, Рис и Оа1) делят на площадь пика внутреннего стандарта (ксилозы) для каждой инжекции стандарта при годности системы.

_ „ площадь пика моносахарида

Отношение площадей пиков =------------------------площадь пика ксилозы

Рассчитывают среднее отношений площадей пиков для Мап, Рис и Оа1 в стандартах пригодности системы. Также рассчитывают стандартное отклонение (девиацию) (ЗТ).) и относительное остаточное отклонение в процентах (% КЗБ). Типичные значения: КЗ1) для отношения площади пика галактозы <10%. Два сгруппированных (бракетированных) стандарта (эталона) пригодности системы, введенных до и после образца (образцов)(к): Процент КЗ1) для отношения площади пиков Мап, Рис и Оа1 <10%.

Если это среднеарифметическое типичное значение не удовлетворяет условию (КЗ1) >10%), тогда капилляр надо снова промыть по методикам промывки и снова прогнать эти образцы и бракетированные (входящие в эту группу) моносахаридные стандарты. Если среднеарифметическое типичное значение попрежнему не удовлетворяет условию, заменяют капилляр и промывают, как положено. Снова пропускают образцы и бракетированные моносахаридные стандарты.

Стандартное отклонение =

Ι»Σ^χ2-<Σ^^Γ

У п(п-Т) где п - число измерений образца;

х - отдельные измерения _п _ Стандартное -отклонение ...

%К8 ϋ = ---------------------------х 100

Средняя найденная · площадь пика

Рассчитывают молярное соотношение манноза/белок _ Ам«п х ДхуЮ X УмвпО х СмапО X МАУсТ1А44в

КМап =..... ' ' ............

АХу1 X Ам«тО X Ур х Ср X МУ/Мап где К_Мап - молярное отношение манноза (Мап) ук. белок;

А_Мап - площадь пика (мкВ-с) Мап в образце;

А_Ху1 - площадь пика (мкВ-с) ксилозы (Ху1) в образце;

А_Ху1₀ - средняя площадь пика (мкВ-с) Ху1 в моносахаридном стандарте;

А_Мап0 - средняя площадь пика (мкВ-с) Мап в моносахаридном стандарте;

У_Мап0 - объем Мап в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мкл);

С_Мап0 - концентрация Мап в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мг/мкл);

У_р - объем образца белка, используемого для гидролиза (мкл);

С_р - концентрация образца белка, используемого для гидролиза (мг/мл);

МА_{СТ| АИц} - молекулярная масса эталонного материала СТЬА4-1д по Сертификату Анализа (СОА);

М^_Мап - молекулярная масса маннозы (180.2 Да).

Группирование (объединение, бракетирование) стандартов. При расчетах молярных отношений эталонного материала СТЬА4-1д и образцов используют все восемь сгруппированных (бракетированных, взятых в скобки) стандартов пригодности системы. Усредняют площади пиков для введения в это уравнение. Это используют для первых трех образцов. Для всех других образцов при расчетах молярного соотношения всегда используют среднюю площадь пика следующих четырех бракетированных моноса

- 325 017765 харидных стандартов и предыдущих четырех бракетированных моносахаридных стандартов. Рассчитывают молярное соотношение фукоза/белок

Арис х АхуЮ х УрисО X ОисОХ МЛУСТЬА4.|₈

Аху! X АКисО X ν₽ X Ср X МУ/Рис где И_Рис - молярное отношение фукоза (Рис) νδ. белок;

А_Рис - площадь пика (мкВ-с) Рис в образце;

А_Ху1 - площадь пика (мкВ-с) ксилозы (Ху1) в образце;

А_Ху10 - средняя площадь пика (мкВ-с) Ху1 в моносахаридном стандарте;

А_Рис0 - средняя площадь пика (мкВ-с) Рис в моносахаридном стандарте;

У_Рис0 - объем Рис в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мкл);

С_Рис0 - концентрация Рис в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мг/мкл); ν_ρ - объем образца белка, используемого для гидролиза (мкл);

С_р - концентрация образца белка, используемого для гидролиза (в мг/мл);

- молекулярная масса эталонного материала СТ^Λ4-Iд по Сертификату Анализа (СОА); - молекулярная масса фукозы (164.2 Да).

Рассчитывают молярное соотношение фукоза/белок

Л ат со/ где Во_а1 - молярное отношение галактоза (Са1) νδ. белок;

А_Са1 - площадь пика (мкВ-с) Са1 в образце;

А_Ху1 - площадь пика (мкВ-с) ксилозы (Ху1) в образце;

А_Ху10 - средняя площадь пика (мкВ-с) Ху1 в моносахаридном стандарте;

А_Са10 - средняя площадь пика (мкВ-с) Са1 в моносахаридном стандарте;

У_Са10 - объем Са1 в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мкл);

С_Са10 - концентрация Са1 в рабочем растворе моносахарида, используемом для гидролиза (мг/мкл); ν_ρ - объем образца белка, используемого для гидролиза (мкл);

Ср - концентрация образца белка, используемого для гидролиза (в мг/мл);

- молекулярная масса эталонного материала СТ^Λ4-Iд по Сертификату Анализа (СОА);

- молекулярная масса галактозы (180.2 Да).

Примечание. При расчетах молярных отношений эталонного материала СТ^Λ4-Iд и образцов используют последний стандарт (эталон) пригодности системы и препарат следующего бракетированного стандарта пригодности системы. Усредняют площади пиков для введения в это уравнение. Это используют для первых шести образцов. Для всех других образцов при расчетах молярного соотношения всегда используют среднюю площадь пика двух бракетированных моносахаридных стандартов.

Типичные значения. Процент ИББ для отношений площадей пиков двух, бракетированных, нейтральных стандартов пригодности системы не должен превышать 10%. Средние молярные отношения для нейтральных моносахаридов в эталонном материале должны быть в описанных в приведенной ниже таблице интервалах. Для каждого компонента % ИББ для четырех результатов (инжекции в двойном повторе препаратов в двойном повторе) должны быть <25%.

Молярное отношение СТ^Λ4-Iд эталонного материала.

Моносахарид	Интервал
Манноза	И-18
Фукоза	4.2- 7.5
Галактоза	9.2- 18

Документирование результатов. Средний результат выражают в виде числа молекул маннозы на молекулу СТ^Λ4-Iд, числа молекул фукозы на молекулу СТ^Λ4-Iд и числа молекул галактозы на число молекул СТ^Λ4-Iд. Переносят данные молярного соотношения в две характерные диаграммы. Для каждого компонента % ИББ для четырех результатов (инжекции в двойном повторе препаратов в двойном повторе) должны быть <25%.

Пример 65. Картирование триптических пептидов. Количественный анализ окисления и деамидирования СТ^Λ4-Iд.

Целью данного метода является контроль стабильности СТ^Λ4-Iд от партии к партии при использовании неавтоматизированной процедуры пептидного картирования после расщепления трипсином с конкретным обнаружением и количественным определением окисления метионина и деамидирования аспарагина. Пептидное картирование включает протеолиз или другую фрагментацию белка с целью создания строго определенного набора пептидных фрагментов, которые затем анализируют, например, методом ВЭЖХ. Хроматограмма пептидной карты очень чувствительна даже к малейшим изменениям хи

- 326 017765 мической структуры белка и поэтому применима для обнаружения и определения характеристик посттрансляционных модификаций. Образец белка СТ^Α4-Iд денатурируют в 8 М буфере гуанидин-НС1, а цистеиновые дисульфидные мостики восстанавливают дитиотреитолом и З-алкилируют йодацетамидом, а затем расщепляют протеолитическим ферментом, трипсином. Затем полученную смесь триптических пептидов анализируют обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФВЭЖХ) с УФ-детекцией при 215 и 280 нм. Ниже даются некоторые аббревиатуры:

Авп	Аспарагин
Авр	Аспарагиновая кислота
Ави	Аминосукцинимид
ΐβοΑβρ	Изоаспарагиновая кислота
Ме!(О)	Метионин сульфоксид
Т26	(281 - 302) триптический пептид
Т26(1еат1	1воАвр294 (281 - 302) триптический пептид
Т260еат2	Азр299 (281 - 302) триптический пептид
Т26<1еатЗ	Азр294 (281 - 302) триптический пептид
Т264еат4	Ази294 (281 - 302) триптический пептид
Тб	(84 - 93) триптический пептид
Тбох	Ме!(О)85(84 - 93) триптический пептид

Химические вещества и реагенты

Подвижная фаза А - 0.1% ΤΕΑ (ТФК) в воде для ВЭЖХ.

Переносят все содержимое ампулы на 1 мл с ΤΕΑ в 1000 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают, получают 0.1% раствор ΤΕΑ (подвижная фаза А).

0.1% раствор ΤΕΑ может храниться при комнатной температуре до двух месяцев.

Подвижная фаза В - 0.1% ΤΕΑ в 80% ΑСN и 20% воды для ВЭЖХ. Переносят все содержимое ампулы на 1 мл с ΤΕΑ в 800 мл ацетонитрила и 200 мл воды для ВЭЖХ и тщательно перемешивают, получают 0.1% раствор ΤΕΑ в 80% ΑСN (подвижная фаза В), которая может храниться при комнатной температуре до двух месяцев.

Буфер для разведения - 100 мМ 'ПИ1З (Трис), 25 мМ №С1, рН 7.6. Растворяют 14.0 г реактива Ίϊί/та Рте-Зе! Сгук!а1 рН 7.6 и 1.46 г №С1 в 1000 мл воды для ВЭЖХ, перемешивая раствор на магнитной мешалке. Раствор фильтруют через фильтроэлемент с размером пор 0.2 мкм. Раствор хранят при температуре 2-8°С до двух месяцев.

Денатурирующий буфер - 8 М гуанидина, 50 мМ ΤИIЗ (Трис), рН 8.0 152.8 г гуанидина гидрохлорида и 1.4 г реактива Ίϊί/та Рте-Зе! Сгук!а1 рН 8 при перемешивании на магнитной мешалке растворяют в 90 мл воды для ВЭЖХ. Доводят рН до 8.0, добавляя либо НС1, либо ΝηΟΙ I, и водой для ВЭЖХ доводят объем до 200 мл. Раствор фильтруют через фильтроэлемент с размером пор 0.2 мкм. Раствор хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.

Буфер для гидролиза (расщепления) - 50 мМ ΤИIЗ, 10 мМ СаС1₂, рН 7.6 7.0 г реактива Ίϊί/та РгеЗе! Сгук!а1 рН 7.6 и 1.47 г СаС1₂ растворяют в 1000 мл воды для ВЭЖХ при перемешивании на магнитной мешалке. Раствор фильтруют через фильтроэлемент с размером пор 0.2 мкм. Раствор хранят при температуре 2-8°С до двух месяцев.

Восстановитель - 200 мМ раствор дитиотреитола (ΌΤΤ).

К 30.8±0.2 мг ΌΤΤ непосредственно перед употреблением прибавляют 1000 мкл воды и перемешивают на вортексе до растворения. Раствор годен в течение 24 ч с момента приготовления.

Алкилирующий реагент - 400 мМ раствор иодацетамида (IΑМ).

Непосредственно перед употреблением к 74.0±0.5 мг иодацетамида прибавляют 1000 мкл и перемешивают на вортексе до растворения. Раствор годен в течение 24 ч с момента приготовления.

1.0 М раствор НС1.

8.7 мл концентрированной соляной кислоты разбавляют до 100 мл водой для ВЭЖХ. Раствор хранят при комнатной температуре до двух месяцев.

Эталоны и контрольные пробы

Эталон пептида Т6ох, 30 мкМ.

Синтетическим эталоном Т6ох триптического пептида является Α1а-Ме!(Ο)-Αкр-ΤЬ^-Ο1у-^еи-Τу^I1е-Сук-^ук·2ΤΕΑ, М.в. 1358.4, чистота ~95 вес.%. Твердое вещество хранят в герметичной упаковке при -20°С и для предупреждения поглощения влаги всегда нагревают до комнатной температуры в эксикаторе. Взвешивают 1.0±0.1 мг Т6ох, записывают точный вес и растворяют в 1.50 мл буфера для гидролиза (расщепления). Добавляют 40 мкл 200 мМ раствора ΌΤΤ и на 20 мин ставят при 37°С. Охлаждают до комнатной температуры, добавляют 48 мкл раствора иодацетамида с концентрацией 400 мМ и алкилируют при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Разводят до конечного объема 24.5 мл,

- 327 017765 добавляя буфер для гидролиза, получают стандартный раствор с концентрацией 30±3 мкМ. Хранят в виде аликвот объемом 1 мл 30 мкМ эталона Т6ох при -70°С до 24 месяцев.

Эталон Т26беат1 пептида, 30 мкМ.

Синтетическим эталоном Т26беат1 триптического пептида является С1у-Рйе-Туг-Рго-8ег-А8р-ПеА1а-Vа1-С1и-Т^р-С1и-8е^-^8оА8р-С1у-С1п-Р^о-С1и-А8п-А8п-Ту^-^у8·2ТРА, М.в. 2773.7, чистота ~85 вес.%. Твердое вещество хранят в герметичной упаковке при -20°С и для предупреждения поглощения влаги всегда нагревают до комнатной температуры в эксикаторе. Взвешивают 1.0±0.1 мг Т26беат1, записывают точный вес и растворяют в 1 мл 30% об.:об. ацетонитрила в буфере для (ферментативного) гидролиза (расщепления). Разводят до конечного объема 10.7 мл, получают стандартный раствор с концентрацией 30±3 мкМ. Хранят в виде аликвот объемом 1 мл 30 мкМ Т26беат1 эталона при -70°С до 24 месяцев.

Приготовление стандартов (эталонов) и образцов

Восстановление и алкилирование.

Концентрация белка для пептидного картирования составляет около 20 мг/мл. Если концентрация белка >20 мг/мл, разводят образец буфером для разведения до конечной концентрации около 20 мг/мл. Готовят по меньшей мере 100 мкл разбавленного раствора. В центрифужную пробирку на 1.7 к 550 мкл буфера для денатурации (денатурирующего буфера) прибавляют 100 мкл раствора СТ^А4-Iд с концентрацией 20 мг/мл (2 мг) (образец или эталон). Прибавляют 35 мкл раствора восстановителя с концентрацией 200 мМ, пробирку перемешивают на вортексе 3-5 с, затем центрифугируют около 3 с. Пробирки инкубируют при 37°С в течение 20±2 мин. В каждую пробирку добавляют 38.5 мкл 400 мМ раствора алкилирующего реагента, перемешивают на вортексе 3-5 с, затем центрифугируют около 3 с. Образцы инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 20±2 мин. Колонки NАР-5 помещают на подставку. Для одного образца используют одну колонку. Пока образцы инкубируются в !АМ, колонки NАР-5 уравновешивают с помощью 7.5 мл буфера для гидролиза. Элюат отбрасывают для различных процедур. На каждую колонку NАР-5 наносят 500 мкл восстановленных и алкилированных смесей, оставляя жидкость проходить через колонку. Добавляют 1.0 мл буфера для гидролиза (расщепления) в колонки NАР-5, собирают элюат в центрифужную пробирку на 1.7 мл и осторожно перемешивают собранный элюат.

Ферментативный гидролиз (расщепление). Восстанавливают (реконституция) одну виалу с трипсином (20 мкг) на каждый мл образца или эталона, который нужно гидролизовать, плюс одну дополнительную виалу с трипсином, каждую с помощью 86 мкл трипсинового буфера (поставляемого с ферментом), получают концентрацию 0.25 мкг/мкл. Содержимое виал с трипсином объединяют в одну виалу. Гидролизуют каждый образец, используя 80 мкл вышеуказанного раствора трипсина на 1 мл образца при 37°С в течение 120±12 мин. По окончании гидролиза подкисляют образцы, добавляя по 40 мкл 1.0 М НС1 на 1 мл образца, и перемешивают на вортексе 3-5 с. Пипеткой отбирают по 100 мкл каждого из гидролизованных образцов и эталона в виалы автосэмплера. Г отовят дополнительную контрольную пробу для проверки пригодности системы, содержащую 95 мкл гидролизата эталона в смеси с 5 мкл 30 мкМ эталона Т6ох и 5 мкл 30 мМ эталона Т26беат1 пептида, получают гидролизат, к которому добавлено 5% Т6ох и 5% Т26беат1. Все виалы помещают в автосэмплер при 5±5°С для ВЭЖХ анализа. Все остальные образцы гидролизата хранят при -70°С.

Условия хроматографии

В нижеприведенной таблице приводится скорость потока и градиент концентраций подвижных фаз.

Время (мин)	Поток (мл/мин)	Подвижная фаза А	Подвижная фаза В
0	0.25	100	0
4	0.25	100	0
10	0.25	92	8
72	0.25	72	28
84	0.25	60	40
92	0.25	0	100
94	0.40	0	100
95	0.40	100	0
109	0.40	100	0
110	0.25	100	0

Уравновешивают колонку при 55°С 100% подвижной фазой А по меньшей мере в течение 25 мин перед первой инжекцией. Проводят мониторинг УФ оптической плотности при 215 нм и при 280 нм. Внутренний диаметр трубок, идущих от колонки к детектору, должен быть <0.01, чтобы минимизировать диффузионное уширение полос. В колонке поддерживают температуру 55±2°С. Температура в автосэмплере поддерживается 5±5°С. Для холостой (контрольной) инжекции используют подвижную фазу А. Объединяют (бракетируют) образцы (не более десяти одновременно) с инжекциями эталона. В нижеприведенной таблице показана последовательность инжекции в хроматографическом анализе. Следует отметить, что все инжекции имеют объем 25 мкл, за исключением контрольного образца, состоящего из эталона с добавлением эталонов пептидов 5% Т6ох и 5% Т26беат1, объем этой инжекции 28 мкл.

- 328 017765

Впала#	Инжекция	Название образца	Объём инж, (мкл)
1	1	Контроль (подвижная фаза А)	25
2	1	Эталонный материал	25
3	1	Образец 1	25
4	1	Образец 2	25
5	1	Образец 3	25
6	1	Эталонный материал с добавкой 5% Тбох и 5% Т264еат1	28
2	1	Эталонный материал	25

Типичные (иллюстративные) значения

Типичные значения. Профиль пептидной карты эталонного материала визуально должен быть сравним с хроматограммой, представленной на фиг. 1, в том, что касается числа, относительной величины и порядка элюции пиков для областей 215 нм и 280 нм. Разница между временем удерживания пиков Т4, Т25 и Т27 в начальном и бракетированном (объединенном) эталонном материале не должна превышать ±0.5 мин. Число теоретических тарелок (№) должно быть >100000. Если N <100.000, колонку уравновешивают повторно. Если проблема остается, заменяют колонку. Разрешение (К) должно быть >1.5 для пиков Т2 и Т12. Если К <1.5, колонку уравновешивают повторно. Если проблема остается, заменяют колонку. На хроматограмме области 280 нм эталона для сравнения с добавкой 5% Т6ох и Т6беат1 должно наблюдаться увеличение пика Т6ох, элюируемого через ~33.0 мин, как показано на фиг. 84. На хроматограмме области 215 нм эталона для сравнения с добавкой 5% Т6ох и Т6беаш1 должно наблюдаться увеличение пика Т6беат1, элюируемого через ~66.5 мин, как показано на фиг. 86.

Типичные значения для образцов. Хроматограммы, полученные при первой инжекции эталонного материала и образца, визуально должны быть эквивалентны в том, что касается числа, относительной величины и порядка элюции пиков для областей 215 и 280 нм, как показано для меченых пиков на фиг. 84, за исключением пиков продуктов окисления и/или деамидирования для Т6ох и Т26беат, которые даются отдельно. Разница между временем удерживания пиков Т4, Т25 и Т27 в образце и временем удерживания соответствующих пиков при первой инжекции эталонного материала не должна превышать ±0.5 мин.

Расчеты. Примечания.

Если не указано иначе, для этих расчетов используют данные, основываясь на поглощении при 215 нм. Время удерживания пиков Т4, Т25 и Т27 (фиг. 84) в опытах с бракетированным эталонным материалом не должно отличаться более чем на 0.5 тт (фиг. 84).

Число теоретических тарелок. Эффективность колонки, определяемая числом теоретических тарелок (^, рассчитывают исходя из времени удерживания и ширины пика Т27 при инжекции эталонного материала (фиг. 85) по уравнению:

ί 1

N=16 (-)² где \ обозначает ширину пика на уровне базовой линии (основания), полученную экстраполяцией относительно прямых сторон пика к базовой (фоновой) линии;

ΐ обозначает время удерживания пика Т27, определяемое с момента инжекции до момента элюции максимума пика.

Разрешение. Разрешение (К) между пиком Т12 и пиком Т2 (фиг. 85) рассчитывают по следующему уравнению:

(^1+%) где ΐι, ΐ₂ - время удерживания пика Т12 и пика Т2 соответственно;

\ι, ν₂ - определяемая расстоянием между касательными на уровне базовой линии ширина пиков со временем удерживания ΐ₁ и ΐ₂ соответственно.

Для всех образцов и стандартов (эталонов) процент окисления Ме185 рассчитывают из данных площади пика при поглощении при 280 нм следующим образом:

Процент окисления = 100 * Атбох/(Атбох + Атб) где А_Т6 - площадь пика для Т6, (84-93) на кривой при 280 нм;

А_Т6ох - площадь пика для Т6ох, Μοΐ(0)⁸⁵ (84-93), на кривой при 280 нм.

Для всех образцов и стандартов (эталонов) процент деамидирования Азп294 из данных площади пика при поглощении при 280 нм, показанных на фиг. 86:

д

Процент деамидирования = 100*------------------^!'^;1----------------4г26 + А_П64еапЛ ⁺ ЛдбЛгот? ⁺ Д’264еатЗ ⁺ АдбЛаииД где А_Т26 - площадь пика Т26, (281-302), на кривой при 215 нм;

- 329 017765

А_{Т26деат1} - площадь пика Т26деат1, 1зоАзр²⁹⁴(281-302), на кривой при 215 нм;

А_{Т26деат2} - площадь пика Т26деат2, Азр²⁹⁴(281-302), на кривой при 215 нм;

А_{Т26деат3} - площадь пика Т26деат3, Азр²⁹⁴(281-302), на кривой при 215 нм;

А_{Т26деат4} - площадь пика Т26деат4, Азр²⁹⁴(281-302), на кривой при 215 нм.

Теоретически ожидаемые фрагменты триптического гидролизата СТЬА4-1д (см. фиг. 84)

Фраг-	Остаток	Последовательность
мент
Т1	1-14	ΜΗνΑΩΡΑννΐ_Ά88Κ
Т2	15-28	0ΙΑ8Ρν0ΕΥΑ8ΡΘΚ
ТЗ	29-33	АТЕУР
Т4	34-38	ντνι_ρ
Т5*	39-83	ΟΑΟδανΤΕνΟΑΑΤΥΜΜΘΝΕΙΤΡΙΟΟείΟΤΘΤεδΘΝα νΝΙ_ΤΙΟ<3Ι_Ρ
Тб	84-93	ΑΜΟΤΘΕΥΙΟΚ
Т7*	94-128	νΕΙΜΥΡΡΡΥΥΙΘΙΘΝΟΤΟΙΥνίΟΡΕΡΟΡΟδΟΟΕΡΚ
Т8**	129-132	δδϋκ
Т9**	133-158	ΤΗΤ8ΡΡ8ΡΑΡΕΙ±ΘΘ88νΕΙ_ΕΡΡΚΡΚ
Т10	159-165	ϋτίΜίδπ
Т11	166-184	ΤΡΕνΤΟνννονδΗΕϋΡΕνΚ
Т12	185-198	ΕΝννΥνϋΘνΕνΗΝΑΚ
Т13	199-202	ΤΚΡΗ
Т14*	203-211	ΕΕΟΥΝ3ΤΥΡ
Т15	212-227	ννδνΐ_ΤνΐΗ00ννΐ_ΝΘΚ
Т16	228-230	ΕΥΚ
Т17	231-232	СК
Т18	233-236	νδΝΚ
Т19	237-244	ΑΙ-ΡΑΡΙΕΚ
Т20	245-248	τΐδκ
Т21	249-250	ΑΚ
Т22	251-254	ΟΘΡΗ
Т23	255-265	ΕΡΩνΥΤΙ-ΡΡδΗ
Т24	266-270	ϋΕΙ-ΤΚ
Т25	271-280	ΝΟνδίΤΟΙ-νΚ
Т26	281-302	ΘΕΥΡδΟΙΑνΕννΕδΝΘΘΡΕΝΝΥΚ
Т27	303-319	ΤΤΡΡνΐ_080Θ8ΕΕΙ_ΥδΚ
Т28	320-324	ι_τνϋκ
Т29	325-326	δπ
ТЗО	327-349	ννΟΟΘΝνΕδΟδνΜΗΕΑΙΗΝΗΥΤΟΚ
Т31	350-356	8Ι_8Ι_δΡΟ

* Содержит ^связанный углевод.

** Содержит О-связанный углевод.

Пример 66. Опыты с разовой дозой на здоровых людях.

Рандомизированное исследование с введением разовой дозы в одно место проводят для оценки фармакокинетики процесса СТЬА4-1д (продуцируемого при использовании СЭ-СНО1) у здоровых людей. 13 человек, которые соответствуют типичным (образцовым) условиям включения (в исследование) и исключения (из исследования), были допущены в блок для проведения клинического исследования и получали СТЬА4-1д, продуцируемый при использовании процесса СЭ-СНО1, в виде однократной внутривенной инфузии 10 мг/кг в течение 30 мин. Каждый участник наблюдался в блоке для проведения клинического исследования в течение 24 ч после инфузии. Пробы крови берут в конкретные периоды времени после введения дозы вплоть до 71 дня с целью количественной оценки СТЬА4-1д. У участников проверяют фармакокинетические показатели: Стах, Ттах, АиС (ШЕ), Т-НАЬЕ, СЕТ и Узз для каждого участника получают из данных зависимости сывороточной концентрации от времени. СТЬА4-1д дают в виде препарата 200 мг/виала. Здоровым людям вводят 10 мг/кг СТЬА4-1д в виде 30-минутной 1У (в.в.) инфузии. Определение РК, безопасности и иммуногенности оценивают в конкретных временных точках вплоть до дня 71 после введения дозы.

Статистические методы

Объем выборки: объем выборки 13 человек обеспечивает 90% уверенность в том, что оценка отношения среднего геометрического будет в пределах 15% от истинного значения Стах и в пределах 10% истинного значения АиС(ШЕ) для СТЬА4-1д. Статистический анализ: демографические данные участников, физический осмотр, лабораторные анализы и показатели жизненно важных функций суммируют. Частоту встречаемости побочных явлений сводят в таблицы в зависимости от системы организма и степени тяжести. Для Стах и АиС(ШЕ) СТЬА4-1д 90% доверительные интервалы для отношений средних геометрических величин популяции для процесса СО-СНО1 рассчитывают из результатов дисперсионного анализа значений 1од(Стах) и 1од(АиС).

- 330 017765

Фармакокинетические результаты

Фармакокинетические результаты определяют, используя утвержденную программу некомпартментного модельно-независимого анализа. Фармакокинетические параметры получают у 13 человек, получивших Ргосекк СЭ-СН01 СТ^Λ4-Iβ. В нижеприведенной таблице приведены суммарные статистические данные фармакокинетических параметров СТ^Λ4-Iβ у здоровых людей.

Фармакокинетический параметр	(N = 13)
Стах (мкг/мл)	284.7
Среднее геометрическое (СУ%)	(23%)
Αυθ(ΙΝΓ) (мкг.час/мл)	44403.0
Среднее геометрическое (СУ%)	(18%)
Ттах (час)	0.50
Медианное (тт, тах)	(0.50, 2.00)
Т- НАЬР (Дни)	16.68
Среднее (δϋ)	(3.24)
СБТ (мл/час/кг)	0.23
Среднее (δθ)	(0.04)
У88 (Л/КГ)	0.09
Среднее (δϋ)	(0.02)

Средние значения Т-НАБВ для СТ^Λ4-Iβ у здоровых людей составляют около 17 дней, что согласуется с периодами полужизни, найденными у больных псориазом (10-18 дней) и ревматоидным артритом (около 13 дней). Полученные средние значения Укк 0.09-0.10 л/кг показывают, что СТ^Λ4-Iβ ограничивается, главным образом, сердечно-сосудистой системой и заметно не затрагивает внесосудистую область.

В нижеприведенной таблице показаны сывороточные концентрации (нг/мл) у испытуемых.

те*е сагаипяаасы

8ПВЛЗСГ ТЙЕВДМЕКГГ ПДУЗ (НК) (ВП/МЬ)

| | сосна.	1 1	0.00 0.25	<ιυο 130335.6
	1	0.50	251679.1
	1	1.00	266363.1
	1	2.00	286465.6
	1	6.00	243171.3
	1	12.(X)	252164.9
	2	0.00	17044В.6
	4	0.00	12006В.1
	8	0.00	67988.11
	15	0.00	41464.24
	22	0.00	22306.20
	29	0.00	17333.61
	43	0.00	10214.14
	57	0.00	4759.26
	71	0.00	2794.16

Подписи:

	49123.2	2.00		0.20	0.08
33477.3	1.00	0.30	0.11
247.04	40009.4	2.00	19.80	0.25	0.13
365.56	43112.7	0.50	17.И	0.33	0.09
255.1В	45276.2	2.00	15.29	0.32	0.09
309.40	4884«,2	1.00	18.95	0.30	0.09
278.33	35339.3	0.50	14.23	0.38	0.09
24« .33	кта > 38534.8 50418.0	0.50	20.»	0.»	ОДО
174.37 375.»	0.50 0.50	13 ЛО	0.3« 0.30	0.13 0.07
426.97	50761.0	0.50	&?5	0.30	0.0«
297.59	61322.4	0.50	0.16	0.10
300.»	36438.5	0.50	12.42	0.37	0.08

13	13	13	13	13
45068.89	0.»	16.68	0.23	0.09
В085.22	0.64	3.24	0.04	0.02
44403.04	0.77	16.40	0.23	0.09
18	69	19	18	23
46276.20	0.50	15.97	0.22	0.09
33477.26	0.50	12.42	0.16	0.06
61322.42	2.00	23.45	0.30	0.13

СУБЪЕКТ ОБРАБОТКА ДНИ ВРЕМЯ (ЧАС) КОНЦЕНТРАЦИЯ (НГ/МЛ)

Обработка Субъект Стах (мкг/мл) (мкг.час/мл) (час) (дни) Клиренс (мл/час/кг) (л/кг)

Обработка Статистика

- 331 017765

Анализ сыворотки на СТ^А4-Iβ.

Образцы сыворотки анализируют на ΟΓΙ,.Ά-Ιμ с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕМ8Л) всего в 25 аналитических опытах. Все результаты анализа отвечают образцовым (примерным) значениям, полученным перед анализом выборки, это показывает, что метод ЕЫ8А является точным и подходит для количественного анализа СТ^А4-Iβ в исследуемых образцах. Краткие сведения о параметрах стандартной кривой и средние ОС данные для СТ^А4-Iβ в сыворотке представлены в табл. 48. Вариабельность (мера изменчивости) аналитических ОС для СТ^А4-Iβ между опытами и внутри опыта составляет 4.5 и 3.5% соответственно. Средние полученные величины концентрации аналитических ОС образцов отклоняются менее чем на ±8.9.5 от номинальных величин (табл. 48).

Таблица 48

Количественные контрольные данные анализа С'Т1 ,Λ4-Ιμ в человеческой сыворотке

Номинальная (расчётная) конц.	Низкая (3.000 нг/мл)	Средняя (12.500 нг/мл)	Высокая (24.000 нг/мл)
Средняя полученная конц.	2.866	13.608	24.526
%ϋεν (девиация)	-4.5	8.9	2.2
Точность между опытами (%СУ)	4.5	2.8	3.0
Точность внутри опыта (%СУ)	2.4	3.5	2.9
Полная вариация (%СУ)	5.1	4.5	4.2
η	75	75	75
Число опытов	25	25	25

Фармакокинетика СТ^А4-Iβ.

Средние и стандартные отклонения сывороточных концентраций СТ^А4-Iβ для всех испытуемых представлены в нижеприведенной таблице. Средние сывороточные концентрации во времени в течение 71 дня представлены на фиг. 43.

Средние сывороточные концентрации С'Т1 ,Λ4-Ιμ (нг/мл) в зависимости от времени

Дни	Час.	Мин	N	Среднее	8ϋ	%СУ
		0	15	0.42	0.87	207.21
		15	15	135475.0	28811.82	21.27
		30	15	273867.9	71406.26	26.07
	1	0	15	253311.5	43221.58	17.06
	2	0	15	254479.4	39611.12	15.57
	6	0	15	219082.5	44894.29	20.49
	12	0	15	191885.0	45180.00	23.55
1	0	0	15	161732.2	28740.25	17.77
3	0	0	15	101411.4	18615.59	18.36
7	0	0	15	59375.96	13598.10	22.90
14	0	0	15	33676.97	8148.64	24.20.
21	0	0	15	21909.72	5226.77	23.86
28	0	0	15	17193.52	5145.61	29.93
42	0	0	15	8828.95	3246.22	36.77
56	0	0	15	5244.51	2621.36	49.48
70	0	0	15	2970.32	1811.64	60.99

Суммарная статистика для фармакокинетических параметров (Стах, АиС (ШТ), СЬТ, У§8, Ттах и Т-НАТТ) представлена в табл. 50. Результаты показывают, что СТ^А4-Iβ, продуцируемый по способу (процессу) по изобретению, имеет среднее значение Т-НАТТ около 17 дней (интервал 7-25 дней). Полученные значения У§8 0.09-0.10 л/кг показывают, что СТ^А4-Iβ находится главным образом в объеме внеклеточной жидкости.

Таблица 50

Суммарная статистика фармакокинетических параметров СТ^А4-Iβ, продуцируемого по способу по изобретению

Препарат	Стах (мкг/мл) Геом. средн. (СУ%)	ΑϋΌ(ΙΝΕ) (мкг.час/мл) Геом. средн. (СУ%)	Клиренс (мл/час/кг) Среднее (80	У88 (л/кг) Среднее (80)	Ттах (час) Медиана (пип, тах)	Т-НАЬЕ (Дни) Среднее (50)
Процесс 1 (п = 13)	284.71 (23%)	44403.4 (18%)	0.23 (0.04)	0.09 (0.02)	0.50 (0,50, 2.00)	16.68 (3.24)

Результаты показывают, что среднее значение Т-НАТТ для СТ^А4-Iβ, продуцируемого (получаемого) по способу по изобретению, равно примерно 17 дням. Как величина клиренса, так и величина объема распределения также представлены в табл. 50.

Фармакокинетика СТ^А4-Iβ у взрослых здоровых людей после однократной внутривенной инфузии 10 мг/кг и у больных КЛ (РА, ревматоидным артритом) после многократных внутривенных инфузий 10 мг/кг представлена в табл. 47.

- 332 017765

Таблица 47

Фармакокинетические параметры (значения, диапазон) у здоровых людей и у больных КА после 10 мг/кг внутривенных инфузий

РК параметр	Здоровые люди (После разовой дозы 10 мг/кг) п=13	КА Пациенты (После многократных доз* 10 мг/кг) п=14
Максимальная концентрация (Стах) [мкг/мл]	292 (175-427)	295 (171-398)
Конечный период полужизни (йа) [дни]	16.7 (12-23)	13.1 (8-25)
Системный клиренс (СЕ) [мл/час/кг]	0.23 (0.16-0.30)	0.22 (0.13-0.47)
Объём распределения (Уза) [л/кг]	0.09 (0.06-0.13)	0.07 (0.02-0.13)

^а Многократные внутривенные инфузии вводят в дни 1, 15, 30, а затем раз в месяц. Пример 67. Последовательность ДНК плазмиды рсδ^йиСТ^А4Iβ.

Вд1и

ЗАТСТССОЗА ТСОССГАТОЗ ТСЗАСТСТСА ОТАСААХСГЗ СТСТОВЛХЗСС ЗСАТАЗТТАА ставАозаст аозозатасс азстзазазт сатсттлоас саеасгасос! ссгоатсалтт

СССАСТАТСТ ЗСГСССТССТ ТСТСТСТТСС АЗОТСЗСТОА СТАСТЗСЗСЗ ЛЕСААААЗТТ СЗЗГСАТАЗА СОАО&ЗАСЗА АСАСАСААОС ТССАЗССАСГ САГСАССОЗС ТОЗТГТТААА

121 ААЗСТАСААС ААЗЗСААЗЗС ТТЗАСОЗАСА АГГССАТЗАА ОААТСГЗСТТ АОЗОТТАОСС ГГОЗАТСТТС ТГСССТТССС ААСТЗЗСТСТ ТААОЗТАСТТ СТТАСАСОАА ТСССААТССЗ

-СМУ Рголюйег------------------131 СТТГГССЗСТ ССТГСЗОЗАТ СТАОЗОЗССА САТАТАОЗОЗ СТОАСАТТСА ТГАТТОАСТА САААА05О0А СОААСССЗСТА САТОССС0СТ СТАТАТВССС ААСТХЗГААСТ ААЗЛАСТОАТ

241 ОТТАТТААТА ЗТААТСААТТ АСОЗЗЗГОАТ ТЛОТТСАТАН СССАТАтаТЗ ОАОТТСОБСВ СААТААТГАТ САТТАСГГАА ТССОССАЗТА АТСААЗТАТС ОЗЗТАТАТАС СГСААООСЗС

301 ГГАСАПААСТ ТАСОЗТААЛТ СОССаЗСаГО ЗСТЗАСОЗСС СААСЗАСССС СЗСССАТТОА ААТОТАТПЗА АТСЗССА1ТТА ССОЗЗСЗЗАС СЗАСТСЗСОЗ ОТТССТСОЗЗ ЗСЗООТААСТ

363 ОЗТСХАТААТ ЗАССЗТАТЗТТ ССОАТАЗТАА СЗССААТАОЗ ОАСТТГССАТ ГОАСОТСААТ ССАСТТАГТА СТССАТАСАА СЗЗеТАТСАТТ сххгаталтсс СТОАААССТА АСТЗСЗМЗГГА

421 ОЗСТСЗАСГА ТТТАОЗСГАА АСТССССАСТ ТСЗСАЗГАСА ТСААЗТСТАТ САТАТЗССАА СССАССТОАТ АААТСССАТТ ТШМЗЗОСТОА АСОЗТСАЮТ ЛСТТСАСАТА СГАЗАСОЗГТ

431 ЗГАСЗССССС ТАТТСАОаТС ААТСАОССТА ААТЗССССЗС СТ05САТТАТ ЕСССАСТАСА . САТ5СОЗОЗС АТААСТЗСАС ТГАСТЗССАТ ТТАССОЗСС53 САССЗТААТА СОЗЗГСАТКГ

Ναοί

541 ТСАССТГАТС ЗСАСТТТССТ АСТТОЗСАЗТ АСА1СТАСОТ АТГАСТСАТС ЗСТАТТАССА АСТЗОАА1АС СС1ОААА0СА ТОААССЯТСА ТЗТАЗАТЗСА ТААТСАЗТАЗ СОАТААТСОТ

- 333 017765

601

661

721

761

841

901

ΝοοΙ

- - -------------------------.-СМУ Ргопк>1сг--------------------------гсатвлтсса стсттсасдс тасатсалто свсвтввата всввтттоас тсасссонат АССАСГАОЗС СААААССВТС АТЕТАЕГГАС СОССАССТАТ ССССАААСТС АВТВСГССТА

ГГССААСТСТ ССАССССАТТ ОАССТСААТС ОЗАСТГТСТТ ТТСССАОСАА. ААТСААССОС ААОСТТСАСА ССТОБСОТАА СТВСАСГГАС ССТСАААСАА ААССВТЙВГТ ТТМЗТТВССС

АСТГГССААА АТОТОЙТААС ААСТСаССОС САТТЙАСССА ААТЙОВС05Т АОЙОЙТСТАС ТВАААВВТТТ ТАСАОСАТГС ТТСАЯЗОССВ ВТААСТВСВТ ТТАССОВССА ТССВСАСА!ГС

ОСТССОАОСТ СГАТАТААСС ССАСССТССА ОАТАТАЧТСП

ХИДСТСТСТ ТСТСВАВАОА састАЛсгаа лваасссаст СОВАТТВАТС ТСТТВОВТВА еатаствос СВААНИСаВ

ПАТССЗАААТ ААТЛВСГТТА >

ТААТАСОАСТ

АТТАТССТВА сдстатааза СТОЛПА ТССС тюттасоза адссатоосг

В«тНХ аставахгсс садоостдао

РвЫ

АСТАОТААСВ

Т6АТСАТГСС

ССОСССАСТС соеаютсАс ?-ЬиСТЪА*4 1е* м в ν ь СГГСАССААТ СВСЭТСТАСГС ВАМИССЮТ. СССАСАТСАС

961

Г» Т с Η Т Ь Ь 5 Ь V Ь А Ъ Ь Ρ Р 3 МАЗ СТОАСАСАСА ОВАОПСТВСГ САСТСТСаТС СПССАСТСС ТСТТТССААВ еКГОЗСВАВС алатагатст сствсваова атсАВАсоАа ОАДсатадос асаалоотгс атдссастоз

1031

1081

РУСЕ У А 5 РСК. А Т В V НУТ V 1 Н итстетгата астатссатс тссасвсааа сссастсаос тссвввтвас авгосттсво

АААСАСАСАС ТСАТАССПЗ» АССТСССТТТ СОСТСАСГСС АОЙСССАСГЙ ТСАОСААССС

1141

............................киСТЬЛ41_&........................... 0 А О 5 ςντ Е V С ЛАТУ ММВ ЯВЬ саосстслса ссайсстаАС талдатсют ооовсаасст асатоатойс оаатсасттс вгссзваствт овзтссасзпз асттсаеаса свссвттеса тотастасос спастсаас

1201

Ναοί

1261

1321

Ρ Ρ Р У У Ь В I 8 N С Т 0 I У V I ϋ Р В ССАСЗСВССАТ АСТАССтаоа САТАООСААС ВВААСССАВА ГГГАТаТААТ ТСЗАТОСАСАА огтссозатА тсатсоассс статсозттс ссттвсвгсг алатасатта асгайсхсгт

1381

РСРО 5 О ς ВРК ВВИК ТНТ ВРР ССВГССССАВ АТТСТСАТСА ОБАВСССААА ТСГГСТОАСА АААСТСАСАС атссосасоз ОЙСАСОСЕТС ТААЕАСТАЙТ сстаматтт АЕААСАСТСГ ПТОАСТСТС ТАЕОЙСТСЕС

1441

Р А Р Е Ъ Ь В С 8 В V Ρ I» Ρ Ρ Р КРК ТССССАВСАС СТСААСТССТ ВВВВВВАТСЕ ТСАВТСТГСС ГСТТСССССС ААААСССААС Авоаатсата оасттсайоа сссссстаос аотсаоадоз аоадозсозв ттткзааттс

1501 ϋ Т Ь Μ Ι3Η Τ Р Е V Т С V V V Ώ V В Н ЕАСА.СССГСА ТСАТСГССОЕ ОАСОССТЕАС СТСАСАТЙОЗ ГЕЕТОЗТЕОА СЗГВМЗССАС сготсволвт Астаддазас стваскистс састстдссс ассассасст ссастсозте

1561

УОСУ ВУН КАК

БОРЕ V К Г N » У

ОААСАСССТС АВСТСААВТТ СААСГВСТАС СТССАСОБОЙ ТЕЕАВЕТЕСА ТААТВССААВ СТТСТОВВАС ТССАЕГТСАА ВТГОАССАТС СДССТВССВС АОСТССАОВТ АТЗАОССТТС

- 334 017765

1621

...........................ЬиСТЪАЧ1ц............................ Т К Ρ Н Е Е О У N Б ТУНУ V В V ЬТУ АСАААВООЕС ОВВАОВАВОА ОТАСААСАОС ЛСВТАСОВПЗ ТВВГСАВаЗГ ССТОАОСВГС тстттозает ссстсстетт аихзтгетаз твсатввсас ассавгсвса ввавтввслв

1681

1741

Ρ А Ρ I ВКТ Ι5Κ А К С 0 РВЕ Р С V ссавссссса тозасаааас сатстссааа бссааавввс лвсосовава АССАСАОЕТС ВВТСВВВВВТ АВСТСТТТТВ ВТАВАОВТТТ СОЕТТГССОЕ ТСВВВВСТСТ ТСЗТВТССАС

1801

У Г Ь Р Р 5 Н О В Ι> Т К N 0 V 3 Ь Т С Ь

ТАСАСССТСС ССОСАТССет озатеассте ассааваасс аввтсаесст васствсстс АТВТСОЕАОВ вовотаовас ССГАСТСЕАС ТОЕТТСТГОЗ ТССАВТСОЕА СТСЕАСООАС

1861

УКОР У Р 5 И I А УВИВ В N В О Г В ВТСААДСВеТ ТСГАТСССАВ ССАСАТСССС аТЕВАСТСВС АВАЕСААТЕВ ЕСАСССОЗАС сдаттгсасА двАтаавагс сстстаесое сасстсассс тстссгтасс свтсхзвсстс

1921

N N У К ТГР Ρ V 1> О 5 ϋ Е 5 Ρ ₽ ЬУЗ аасаасеаса Авдссдазсс тссазтоств адстссвАСЕ астссттстт сстстасавс ТТСТТЕАТСТ ТСПЗЕТССОЗ АВВВСАСВАС СГВАВВСТВС СВАВВААВАА ВВАВАТСГГСС

1981

К Ь Т V П К 3 НИВ (2 В N У Р В С ЗУМ ААВСГОАССЕ ТВВАСААВАВ СЛВВТВВСАв САВВОВААОВ ТСТТСТСАТВ СТССВТЕАТС ГГаВАВТВВС АССТВТГСТС етссассетс отссостгос аоааваетас ваовсастас

2041

Η Е А сатсаввстс ВТАСТССВАВ

Ь НИН ГССАСААССА давтвтгеат ·--------------------------------—->

утр квье ьвр в к ♦ СТАСАОВСЛВ ААСАСССТСГ СССТВТСТСС аОЕТАААТОА САТСТВСЕТС ТГСТСВВАВА ВОВАСАОАВВ СССАТТГАСТ

ХЬа!

2101 атсозАСОзс САОВСГСССВ

СВЗСААВССС асетттссоо ссстстсаса етсесасеас оатзсгтста совладаете сасоетссгс сгаовааваг

ХЬа!

2161 тгсиаяотс ААВАТАТСАС

ТСАССТАААТ АсяхзоктА.

?- - - —ВСН роЪ^йвоуЬНоп ιίβπηΐ----ССТАВАВСТС ВСТВАГСАВС СГСВАСГВГВ СВАТСТСИ® ОСАСТАЕТСа оасстеасас

2221 ссттстдвтт асслаесАТС тотгвгггвс ссстасссав тссстгсстт вассствваа. ОЗААВАТСАА СОЗТОЗСГГАС АСЛАаДАДОЕ аОЗАСаОЕЕС АСВВААВВАА стаоздсстг

2281

ОСТСССАСТС СОАСТСТССТ ТТССТААТАА ААГВАВВААА ТТССАТСЕСА ΊΤΕΤΟΤΕΑΕΓ ССАССЕТСАС ВВТВАСАВВА ААОЕАТГАТТ ТТАСТССГГТ АА0С7АСССТ ААСАСАСТСА

2341

АЕВТСТСАТТ СТАТТСТООЕ ВВВТВВВВТВ ТССАСАОТАЛ ВАТААВЛССС СССАССССАС

ВОВСАВВАСА

ССС6ТССТОТ асААооаэвА аоттссссст

ВОСТТВОВАА ССТААСССГТ

2401

ЕАСААТАЕСА СХВТТАТОВТ

ОССАТССГОЕ ССЗТАСОАСС

--> озатсссстс: ССТАСЕССАС «ЗСТСТАТВВ ССЕАОАТАСС

СГТСТвДВОС ВАЛЗАСГССВ

ССАААЙААСС сагггсттов

2461 ластоаааст гссасссоеа

СТАВЗВВВТА ЕАТСССССАТ тссссАоасв аввввтвсвс сссгвтаваа ОЗВАСАТС8С

ВСВСАГТЛАВ СХЙЗВТАА1ТС снсасозсят еозссссссд

2521 саосслосот

СГССТВВГТА

САССАССААТ ОСВСВТСВСА

ОАСОВСТАСА

СТ0В00А1СТ стгвасАвав вааовотсвс ссставсвсс воватзосоз ссстссттгс ВОЗАВВАААВ

2581 встттсггсс СВАААВААВС сттсстггст ВААВВАААВА ооссАаоттс ВСОВТВСААВ вссстзтвва

СВВВАСАССГ

ДТВГВТОТСА ТАСАСАСАСТ

СЗГГАСССТСТ СААТОССАСА

2641

ОЕАААЕТССС ССТГТСйСВС слсостсссс СТССЕАСаОЗ

АОСАВОСЛОА тсстсавтст

ДОГАТЕСААД ТСАТАСВТТТ

ЕСАТОСАТСТ ССТАССтаСА

СААзтаагоА СГГААТСАВТ

2701

ССААССАОСТ ааттавгссА

СТООААЯСТС СЛОСТТГСАВ

СССАВВСТОС ооотсазлоа

ССАОСАВВСА ОВТОЗТССЕТ

СААСТАТССА СТТСАГАОЗТ

ДАССАТаСАТ ТТСОТАОЭТА

- 335 017765

2761 стсаагтавт

ЗДЗТТААТСА

САВСААССАТ стазттзстА

АСТССССССС тслваасовв

СТААСТССОС ССАТССССЗСС ССТААСТССХЗ ЗАТТЗАЗЗСС ОЗТАЯЗОСЗа ЗЗАТТЗАЗЗС

2821

СОСАОТТССС азатсАдаас

СССАТГСГСС саотААОАоа

Ναοί ассссдтоас авоаотлссв

-_5У40 Его то Се г--------таАСТААТТТ ПТТГАТТГА ТВСАВАОВСС АСТЗАТЕААА АААААТААА.1 АССТСТССЗС

2881 заввссвсст агсоззсссд сввссгстза вссоваваст всжгтсслз СОАТААВСГС

ААОТАВТОАВ ТТСЛТСАСТС сдоастттгг ТОЗАОЗССТА СГСОЗААААА АССТССОЗАТ

2941

0ОСТТГТССА ССЗААААССТ

Аслаагадва тставдстсс ссгасзлтгт ССАСОСХААА

СОСОССАААС ТТСАОБССАА асссзаггга аасгссозтт

3001 тсстАссста АСОАТСССАС

ААСССТО37А ТТОСХЗАССАТ ззаттшатс

ССТАЛАА1АП

СССССТЙССА завсзловот

.....--Л/г........ ТСАПЯВТГСЗ АССАТТЗААС АВТАССААВС ТОЗТААСТТЗ

3061 гссАтозтсв созтзтсссд азататсозз АтгаоаяАОА ясааоАсст Ассепзассг асзтазсазс сасАсдозат тстадАсссс тадсссттст тзсстсгоза тозоасозза

3121

ССЗСТСАОЗА АООАЗТГСАА ЗГАСТГССАА азаатзасса саасстсттс АСТЯЗААСЗТ ОЗОЗАОТССТ ТОСТСААЙТТ САГЗААОаТТ ТСТТАСТСаТ ОТтаСАОААЗ ТСАССТТССА

3181

АААСАЗААТС ТСаТЭАТГАТ ОаЗТАЗЗААА АССТОЗСТСТ ССАТТССТЗА ЗААЗААТСЗА ТТТВТСГГАЗ АССАСТААТА СССАТССТТТ ТСЙАОСААОА ОВТААВЗАСТ СТТСТОЙЗСТ

3241

ССТГГАААСС АСАСААТТАА ТАТАСТТСТС АЗГАЗАЗААС ТСАААЗААСС ЛССАСОАЗЗА ОЗАААГТТОЗ ТСТСТГААТТ АТАТСААЗАЗ ТОАТСТСТТа АВТТТСТГСЗ ТОЗТЗСТСОТ

3301

-----------------------------ЯЯ/г-------------------------------ССТСАТГТТС ТТОССААААЗ ТПОЗАГВАТ ССССТАА£Э4С ТТАТТОААСА АССВВААТТВ СЗАСТААААС ААСЗЗТГГТС АААОСТАСТА СВВААТТСТВ ЛАТААСГЮТ ТОВССГГААС

3361

ЗСААСТАААЗ ТАСАОАТЗаГ ЮТОАТАЗТС СВАОВСАВТТ СТЗТГТАССА ЗЗААСССАТО ССТТСАГТТС АТСТСТАССА ААССТАТСАЗ ССГССЗТСАА БАСАААТОВТ ССТГОВЮТС

3421

ААТСААССАС СССАССТСАЗ АСТСЯТТОТа АСААСЗКГСА ТССАОСААП ТВАААСТВАС ГГАЗТТВаГС СЗаТСОАЗТС тзазааасас тсттсстаегг асзгсзттаа асттгсастз

3481

АСЗИПТСС САДАААТГЕА ПТССОЗААА 1ЖЕАААС1ТС ТСССАВААТА ССОИВОПГС ТССАААААСС СТСТТТААСГ АААОСССТТТ АТАТСТЗААЗ АЗЗЗТСТТАТ ЗЗСТСКГССАС

3541

СГСТСТЗАЗЗ ОАОАОАСТСС

ТССАЗЗАЗОА ААААЯЗСАТС АОЗТССТССТ тггтсозтаа

ААЗТАТААЗТ ТГСАГАТТСА

ГГСАМЗТСТА СОДОААОААА аасттсаоат асгсттсггт

3601

--> ОАСТААСАОа СТВАТД5ТОС

ААОАЗаСТТТ ТГСГАСВААА

СААЗТТСТСТ аГГСАЛОАОА астсссстсс

С0А0В60А0В

ТАААЗСТАТЗ СА1ГИТТА1А АТГТОЗАТАС

ЗТАААААТАТ

Ναοί

3661

АОАоакгааа тстеотАссс астттхзстс

ТСААААСЗАС

ЗСГТТАЗАГС СгаААТСХАВ

ААСОТТЛСТГ ТтаЯААТЗАА стогозтстз ЗАСА СПАСЛО

3721

АСАТААТТСС ТСТАТТААОС

АСАААСТАСС ТСТТТЗАТОЗ

ТАСАЗАВАТТ

Д1ОТСТСТАА таДАВСТСТА АТТТСЗЛЗАГ

ДИЛСАААТАТ ЛАААГТГГГА ТССАТТтаТА ТЮТАААААТ

3781

АСТЗТАТААТ ТСАСА ТАТТА

СТ0ГГАААСТ САСААТТГОА

ЛСТЗАТТСТА ТЗАСТААЗАТ

ТЛТТТТАВМ' ТССААССТАТ

Аттзггтста

ТААСАААСАС АТААААТСТА АОЗТТСЗАТА

3841

ОЗААСТСАТЗ ссттадстдс

ААТОВЗАОСА тгАссстсаг

СГОЗТЗЗААТ САССАССТТА

СССТТТААТС АСЗААААССТ ЗТТТГССТСА СЗОАДАТГАС ТССТТГГОЗА СААААСОАОТ

- 336 017765 □ 901 ВАЛВАЛАТаС САТСТЛВ1ВА ШАтаАСЗВСТ АСТВСТОАСТ СТСААСАТТС ТАСТССТССА СГТСТПАСО ОТДЕАТСДСТ АСТАСТССВА ТВАСВАСТЕА САВТТЕТААВ АТВАСОАСВТ

961 АДАААСЗДАОА ЕАААВСТАВА АЙАССССААЕ ВАСТТТССТТ САЕААТТВСТ ААВТТТТТТС

ТТГТГСТТСТ СГГГОСАТСТ гстсооаттс СТОАААДСАД СТСПДАСЕА тгсаааааас

021 АСТСАГССТВ ТВСТТАВГАА ТАаААСГСГТ всттоств СТДТТТАСАС САСАДДОЗАА

ТСАВТАСВДС АСДААТСАТГ АТСТТОАВАА СОЛАСВАААС ВАГАЛАТКГС ВГОТГТССТТ

081 АААПСТССАС ГВСТАТАСАА ВААААТТАТС ΟΑΑΑΑΑΤΑΤΤ СТЕТКАОСТТ ТАТДАСТДВЕ ттгазАсате асйагапзтт стяллгас сттгжпа васаттсода ататтсатсс

4141 САТААСМЗТТ ДГДАТСАТАД САТАСТВТТТ ТГГСТГАСТС САСАСАВЕСА ТАОЛИОГОТ ВГАТТСГСАА таГГАСТАТТ СТАТЕАСААА ΑΑΑ0ΑΑΤ0Α3 ОГВТОТСССТ АГСТСАОАВА

4201 ВСТАТГАДТА АСТАТЕ СТ СА ЛАААТИИОТ АССТГГАОСТ ТТГТААТГТС 1АААССОЕТТ ОЕАТААТГАТ ТСДТАСВДВТ ТГГТААСАСА ТЭЕАДАТСОД АААДТТААДС АТТТОСССАА

4261 ΑΑΤΑΑΟΕΑΑΤ АТПСАТСТА ТАСТХЗССТТС АСТАВАВАГС АТААТСАВСС АТЛССАСАТТ

ГТАТТССТГД ТАДДССАСДТ АТСАСВВААС ТСДТСТСТАП ТАТТАСТОСС ТДТОЕТСТАД

4321 ТОТАВМОТТ ТТАССТВСТТ ТААААААССТ сссаоасстс сссстваасс ТОАААСАХАА АСАТСТССДА ΆΑΤΒΑΑΟΕΑΑ АПТОТГООА ВВОЮТОВАВ ООООАСТГОа АСТТгаГДТТ

4381 АДТСААТВСА АТТСИСТТС ТТААСТТОСТ ТЯТТОСЛССТ ТАГААТСОГГ АСАААТАААВ ТтаСТТАССТ ТААСААСААС ААТТОААСАА АТААССТСНА АТАТТАССАА таТТТАТ’ТТС

4441 СААТАВСАТС АСАААТТТСА САААТААЛВС МТТТТТТСА СТВСАТТСТА В1ТСТВ5ГГТ

ВГТАТОСТАВ ТЕТТТААДВГ СТГЕАТТГСС ТАААААААСТ СДСВТААЕДТ САДСАССААА

4501 ВТССАААСТС АТСААТО1ЛТ СТТАТСАЮТ СККЗАТ055С ТСВДТЕАТСС ТССАЗСЙСОЕ САСОТТ1ВДС ТАСТТАСАТА ВААТАСГАСА ЕАССТАЕСОЕ Асстастасс АОСТССОЕСС

4561 ГИАГСТСАТС СТЕОАОТТСТ ТСЕОССАССС СААСТТОГГТ АТСССАОСГГ АСААТПВГТА ССТАВАСТАС ОАОСТСААЕА ЛЕОЗОВГОСЕ СПВААСААД ТААСВТССЗАА ТАТТАССААТ

4621 СТААТАААВС ААТЙЕСАГСА СДААТГГСАС АААТАААССД ТТГСТТТСДС ТССАТТСТАВ ВГТТАТТГОЗ ТТАТОЗТАВТ аТТГАДАЕГЕ ТГГАТТТСаТ АДАДАДДСТВ АССТДАВАТС

4681 ТТСТВВТГТЕ ТССАААСТСА ГСАДТОТАТС ТЕАТСАТЯТС ТСГМАСОСТ ССАССТСТАС АДСАССДАДС ДПСТТТВАВТ АОГГАСАХАВ ААТДСТАСАВ АСАТАТОЙСА ССГОЕАВАТС

4741 СТАВАВСТТВ ССОТААГСАТ 83ГСМЖЯСТ ОТГТОСТЗТО ТВАААТТСТТ ЛТСОЗСГСАС ВАТСТООАДС СЕСАТтаВТА ССАОТАТСВА ОЛААВВАОЛС АСГСТАДОАД ТАСВОЗАСТО

4801 ААТТСОАСАС ААСАТАОВАВ СОЕВААВСАГ АААСТИПААА ВССГОВВВ1В ССТААТВХЗТ ПААСВГОТВ ТТСТАТВСТС ОВССТТСЕТА ТТТСАСАТГТ СВВАССССАС ВЕАТГАСТСА

4861 ВАЕСТААСТС АСАТТААТТС ОЗТГСВВСТС АСТВССС5СТ ТТССАВТССВ САААССТВТС СТОЕАГТВАЕ ТВГААТГААС ВСААСВСВАС ТСАСВВЕСЕА ААОЗТСАССС СТТТВВАСАС

4921 ВЮССАОСТВ САТТААТВАА ТСЙВССААСВ СССВОВВАВА ОЕСОЕТТТСС СТАТТЕОСС5 САОЭВТСВАС СТААТГАСТТ АВСОВВПСС «КСОССТСТ ССВОСАААСВ САТААССССС

4981 стсттссаст тсстсастсА ствдстсвст сссстсоатс сптоэзствс сасадвсват ВАВААОЗСВА АВЕЛЕСВАЕТ ВАСТВАВОВА СЕСВАЕССЛС СААВССВАСВ ССССТСЕССА

5041 АТСАВСТСАС ТСААЛОЗССС ΤΑΑΤΑΟΕΕΤΓ АТССАСАЕАА ТСАСВЕВАТА АОЗОДЭЗААД ТАВТСЕАВТС АВПТСОЕСС АТГДТВССДА ТЛЕЕТЕГСТТ АВГОСССТАТ ТВСаТССГГТ

?........................Со1Е1 оН.............................

5101 ОААСАТСТВД ССААААВВСС АВСААААВСС СЛВВААССВТ АААААЗСССВ СВТТОСГСВС сттстаслст соттгтссвз тсвтатасав отссггвоса тттгтссввс всааоеассв

5161 ВТТГТГССАТ АОЕСТСОЕСС ССССТВАОВА ВСАТСАОААА ААГСВАСВСТ СААВТСАВАВ САААААВВГА ТССЕАСЕСОС ВВВОАСГОСТ ССТАВТВТТТ ПАЕСТВСЕА СГГСАОТСТС

5221 ВТВеСВАААС СОВАОиЗВАС ΤΑΤΑΑΑΒΑΤΑ ССАОЕСВТТТ СССССТВОАА ВСТСВСТСОТ САССССПТВ СПСТВТССТВ АТАТТТСТАТ ОЕТССВСААА ВВОВВАОСТТ аЗАОООАВСА

- 337 017765

.......-.............. СоВЛоН ------------------------------5281 ЙСЙСТСТССГ ЙТТССХЗАССС 1ПССОСТТАС СОЗАТАССТО ТСССССТТТС ТСССТТОЗС5 СЙСЙАСАОЙА СААйасТОйС АСОССОААТС СССТАТСХЗАС АСЙСОЙАЛАЙ АОЗОААСССС

5341 ААСОаТОаСЕ СТТТС7КААТ ЙСТСАОЙСТЙ ХАСЙГАТСТС АСТТССЙТСТ АОЗТОЗТГОЙ ТТСЕСАССЙС САААЙАЙТГА СЙАПТйССАа АТССАТАЕАЙ ТСААЙССАСА ТССАССААОС

АраЫ

5401 стссАласта састзтатсс асодасссос ссттсасссс олссззстаса ссттатссой САОйТТСОАС СОЙАСАСАСЙ ТССТТОЗЙОЙ ЙСААЙТСОЗЙ СКЗСОЗАОЗС ОЙААТАОЙСС

5461 ТААСТАТОЙТ СТТСАЙТССА АССОЗСТААЙ АСАСЙАСТТА ТССССАСТСЙ САССАЙССАС АТТЗАТАЙСА СААСТСЛОСТ ТЙОЗССАТТС ТЙГОСТОААТ АССЗОТЙАСС ОТСЙТСОЗТЙ

5521 ТССТААСАОЙ АГТАССАСАЙ СЙАЗСТАТСТ АОЗС5ОТЗСТ АСАОЮГГСТ ТЙААСТОЗКЗ Асакгтзтас таатозтстс остауалсл тссаослсал ^отставал асггсассас

5581 ЙССГААС1АС ЙЙСТАСАС1А ЙААОЙАСАСТ АТТТСОТАТС ТСОПСТСТОС ТСААОССАЙГ СЙЙАТГЙАГЙ ССЙАЮТЗАТ СГГССТОТСА ТАААССМЯЙ АСООЗАЙАСЙ АСТТСЙЙГСА

5641 ТАССТТСОЙА ААААЙАЙТТЙ ЙТАЙСТСТТЙ АТССХЗЙСААА САААССАССЙ СТСЮТЛВСОВ АТОЗААЙССТ ТГТТСТСААС САТО5АЙААС тасС0С<»Т1'Г О1ТТОЙТОЙС ОАССАТОЗСС

5701 тоатоттаст отттйсаайс аосаоаттас осйсаоаааа ааазйатстс алзааоатсс АССААААААА САААОЗТТОЙ ГСОТСГААта СОСПТСЮТТ ΓΙΤΟΛΙΑΟΛΟ ТТСТТСТАЙЙ

------------------?

5761 ГТТЙАТСТСТ ТСТАСЙОааТ СПЗАСеСТСА ЙТСЙААССАА ААСТСАГСГТ ААСОЙАСТТГ

АААСТАСААА АЙА1ЙССССА ЙАСТОСЙМТ САССТТССГТ ТТЙАСТССАА ТТСССТАААА

5821 ООТСАТОАОА ТТАГГСААААА ЗЙАТСТГСАС СТАОАТССТТ ΤΤΑΆΑΤΤΑΑΑ ААТОАДСТТГ ССАЙТАСТСТ ААТАйТтГ ССТАаЛАЙТО ЙАКЛАОЙАА ААТГГААГГТ ТТАСТТСААА

5881 ТАААТСААТС 7АААСТАТАГ АТСАСТАААС ТГСОТСТОАС АЙГПАССААТ ССТТААТСАС АТТТАОТТАЙ АТГТСАТАТА ТАСТСМ’ПХЗ ААОСАЙАСЛЙ ТСААТООТТА СОДАПАОТС

5841 ГСАЙССАССТ АТСТСАОСОА ТСГОТСТАТТ ТСЙТТСАТСС АГАЙТТОССТ ОАСТСССССГ

АСТССЙТОЗА ТАЙАСГСЙСТ АЙАСАОАТАА АССААЙТАЙС ТАТСААСЙЙА СТЙАЙЙС5ЙСА

6001 ОНТСТАСАТА АСТАСЙА1АС ОЙСАЙОБССТ АССАТСГЙСС СССАЙТОСТС СААГОАТАСС ОСАСАТСТАТ ТЙАТЙСТАТС СССТСССЙАА ТОСТАЙАСОЙ ОЕЙТСАССАС ЙПА.СТАТОЙ

6061 ЙСЙАЯАСССА СССГСАСССВ СТССАЙАТТТ АТСАЙСААТА ААССАЙССАС ССЙСААЙСЙС сосгстааот асадатоссс оаййтстааа тазтазттАТ ттойтссйгс аоссгтссао

6121 азАссссАзл Астхзйтсстз сАлсгпАтс сасстссАтс сайтссагга лтаиттасоз ОСТОССВТСГ ТСАССАОЙАС ЙГГСАААТАЙ асайдаПТАЙ ОТСАЙАЗААТ 7ААСААС0ЙС

6181 ОйДАЙСтаДА СТААСТАОТГ айССАОТТАА ТАОПТОССС ААСЙСТйТга ажГТОСТАС ССТТСЙАТСТ САГТСАТСАА ЙСЙСТСААТТ АТСАААОЗСЙ ПЙСААСААС ССТААСЙАТС

6241 АоасАтсата стйтсаййст озтсйттгсй татойсгтса ттсасстссй оттсссааоз ТСаСИАОСАС САСАЕТССЙА ЙСАССАААСС АТАСОЙААЙТ ААСТСОАООС СААЯСЙТТСС

6301 АТСААОЙСЗА СТТАСАК1АТ СССССАГСТТ СТЙСАААААА асааТТАйСТ ССТТСастСС ГАЙТТСОЗСТ САЖЮТАСТА аййОЗТАСАА САССТТТТТТ СЙССААТОЗА ЙОАЛСаСАЯЙ

- 338 017765

ΡνυΙ

---------------------------— атрЯ-----------------------------6361 тсозлтсаст втсасаавта АегйзесоЕс аствггатоа стватзстта тозсаосаст АВВСТАВСАА САВТСТТСАТ ТСААСССВСВ ТСАСААГАВТ ВАСТАССААТ АССВТССТОА

6421 ВСАГААТТСТ СТТАСТЭТСА ТСССАТССВТ АМАТВСТТТ ТСТОТОАСТВ ВТВАВТАСТС СВТАТГААВА ВААТОАСАСТ АСОВГАСССА ТТСТАСОААА АСАСАСТСАС САСГСАТВАВ

6481 ААССААСГСА ТТСТСАВААТ АВТСТАГЕСВ СОСАОВВАВТ ТВСТС1ТССС СОВОЗТСААГ ТТОВТГСАСТ ААВАСТСТТА ТСАСАТАССС СВСТООСГСА АСВАВААССС ВССВСАВГГА

6541 АСОООАХААТ АССВООССАС АТАССАВААС ТПАЛААВТС СГСАТСАТТС СААААССТТС ТССОСТАГТА ТВССВСОВТС ТАГОЗТСТТС АААТТТГСАС ВАВГАВТААС СТТТТЕСААВ

6601 ттоаввасоА ааастстсаа озатсттяос встастаАОА гссаоттсоа твгаасссас ААЗССССВСТ ТТТВАСЕАВТТ ссгаваагсв свасаастст асвтоаавст асаттвозтв

АраЫ

6661 ТСВТВСАОСС ААСТОАТСТТ СЯЯСАТСГГГ ТАСТГТСАСС АВ03ТТТСТЭ ООТОАЗОАЛА АВСАСОТОВа ТТСАСТАОАА СгПХИЛВААА АТВААЛаГОВ тсвсадавас ссастввтгт

6721 ААСАВВААВВ СААААТВСОВ СААААААОВВ ЛКГААООВОЗ АСАОЗОАААТ ОТВААТАСТ ТТСТССТГСС СТТТГАСВСС СТТТТ’ГГССС ТТАТТСССОС ГСТОССТТТА аЛАСТТАТСА

6781 САТАСТСТТС СТТТГГСААТ АТГАТТСААВ СКГТТАТСАВ ОВТТАТТСПС ТСАТСАССОЗ СТАТСАВААВ САААААСГГТА ТААТААСТТС ВТАААТАВТС ССААТААСАВ АОТАСТО5СС

6841 АТАСА ТАИТ ВААТВТАТТТ АВАААААТАА АСАААТАСОВ СТТООЗСВСА САТТТССССЕ ЕАТСТАТАДА СТТАСАТААА ТСЮТТГАГТ ТИГЗТАТССС САЛЗООЗОЗТ ВТААДОСОаС

Вд111

6901 ААААОТОССА ССГСАОСТОС АОСМАГОаОВ А ттттсАСоат салстосАас твсетлвссс т

Подписи:

(с. 334) СМV Промотор;

(с. 336) ВСН Сигнал полиаденилирования;

(с. 337) 8V40 Промотор;

(с. 339) атрК.

Приведенные выше примеры 1-14, 16-18, 21, 28-34, 42, 44-51, 58-67 относятся, в частности, к белку СТ^А4-Iд, имеющему последовательность 8Е(,) ГО NО:1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 18, а вышеприведенные примеры 19, 20, 22-27, 35-41, 52-57 относятся, в частности, к белку СТ^А4-Iд, имеющему последовательность 8ЕР ГО NО:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. Как указано в данном описании, способы, относящиеся к этим белкам, и применение этих белков в примерах иллюстрируют способы, относящиеся к другим СТ^А4-Iд белкам по изобретению, и применение других СТ^А4-Iд белков по изобретению.

Типичные (образцовые) и неограничивающие композиции, содержащие СТ^А4-Iд молекулы по изобретению, включают такие композиции, в которых:

(1) молекулы СТ^А4-Iд содержат одну или более из последовательностей 8ЕР ГО NО:2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 18, и СТ^А4-Iд молекулы содержат менее 5.0% или примерно 5.0%, по площади, высокомолекулярных частиц СТ^А4-Iд (или СТ^А4-Iд тетрамеров), как определено эксклюзионной хроматографией и спектрофотометрией (метод измерения представлен в примере 10). Более конкретно, данное изобретение включает такие композиции, которые дополнительно включают одну или более из следующих характеристик:

не превышают максимальное количество бактериального эндотоксина 0.35 Εϋ/мг СТ^А4-Iд молекул или 76.8 Εϋ/мл (что может обозначать отсутствие эндотоксина); метод определения этих характеристик представлен в примере 48;

не превышают максимальной бионагрузки 1 КОЕ/10 мл или 1 КОЕ/мл (что может обозначать отсутствие бионагрузки); метод определение этой характеристики представлен в примере 49;

имеют (в виде молекул СТЕА4Пд или в виде указанной композиции) (а) около 10-22 полос с рI интервалом около 4.3-5.6, с суммарной интенсивностью полос 90-110% в рI интервале около 4.3-5.3, и около 3 основных полос в рI интервале около 4.5-5.2, или (б) доминантные СТ^А4-Iд изоформы, имеющие рI меньше или равную 5.1, и по меньшей мере у 90% молекул СТЕА4Пд рI меньше или равна 5.3; метод определения этой характеристики представлен в примере 50;

менее 3.5% площади или 3.5% площади СТЕА4Пд молекул составляют продукты его окисления (окисленные частицы), менее 2.5% площади или 2.5% площади СТЕА4Пд молекул составляют продукты его деамидирования (деамидированные частицы; методы определения этих характеристик представлены

- 339 017765 в примере 47;

молекулы СТЬА4-1д на 95.0% по площади или более чем на 95% по площади представляют собой СТЬА4-1д димеры, как определено эксклюзионной хроматографией и спектрофотометрией; метод определения этой характеристики представлен в примере 10;

молекулы СТЬА4-1д менее чем на 5.0% по площади представляют собой высокомолекулярные частицы СТЬА4-1д (СТЬА4-1д тетрамеры), как определено эксклюзионной хроматографией и спектрофотометрией; метод определения этой характеристики представлен в примере 10;

молекулы СТЬА4-1д менее чем на 0.5% по площади или 0.5% по площади состоят из низкомолекулярных частиц СТЬА4-1д (СТЬА4-1д мономеры), как определено эксклюзионной хроматографией и спектрофотометрией; метод определения этой характеристики представлен в примере 10;

не превышают максимальное количество ДНК 2.5 пг/мг СТЬА4-1д молекул или 2.5 пг/мг СТЬА4-1д димера (что может обозначать отсутствие ДНК); метод определения этой характеристики представлен в примере 58;

не превышают максимальное количество МСР-1 3.0 нг/мг всех (тотального белка) СТЬА4-1д молекул, 5 ррт (м.д.), или 5 нг/мг СТЬА4-1д димера (что может обозначать отсутствие МСР-1); метод определения этой характеристики представлен в примере 59;

не превышают максимальное количество белка клетки-хозяина (также известного как клеточный белок) 25 нг/мг СТЬА4-1д молекул или 50 нг/мг СТЬА4-1д димера (что может обозначать отсутствие белка-клетки-хозяина или клеточного белка); метод определения этой характеристики представлен в примере 60;

не превышают максимальное количество Тритона Х-100 1.0 нг/мг СТЬА4-1д молекул (что может обозначать отсутствие Тритона-Х); метод определения этой характеристики представлен в примере 61;

не превышают максимальное количество Белка А 5.0 нг/мг СТЬА4-1д молекул (что может обозначать отсутствие белка); метод определения этой характеристики представлен в примере 62;

молекулы СТЬА4-1д характеризуются тем, что среднее молярное отношение С1сNΛс к СТЬА4-1д молекулам (или к СТЬА4-1д димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 15 до примерно 35; метод определения этой характеристики представлен в примере 63;

молекулы СТЬА4-1д характеризуются тем, что среднее молярное отношение СаТОАс к СТЬА4-1д молекулам (или к СТЬА4-1д димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 1.7 до примерно 3.6; метод определения этой характеристики представлен в примере 63;

молекулы СТЬА4-1д характеризуются тем, что среднее молярное отношение галактозы к СТЬА4-1д молекулам (или к СТЬА4-1д димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 8.0 до примерно 17; метод определения этой характеристики представлен в примере 64;

молекулы СТЬА4-1д характеризуются тем, что среднее молярное отношение фукозы к СТЬА4-1д молекулам (или к СТЬА4-1д димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 3.5 до примерно 8.3; метод определения этой характеристики представлен в примере 64;

молекулы СТЬА4-1д характеризуются тем, что среднее молярное отношение маннозы к СТЬА4-1д молекулам (или к СТЬА4-1д димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 7.7 до примерно 22; метод определения этой характеристики представлен в примере 64;

молекулы СТЬА4-1д характеризуются тем, что среднее молярное отношение сиаловой кислоты к СТЬА4-1д молекулам (или к СТЬА4-1д димерам), выражаемое как моли/моль белка, больше или равно 8.0, а именно примерно от 8.0 до примерно 12; метод определения этой характеристики представлен в примере 16;

молекулы СТЬА4-1д характеризуются тем, что среднее молярное отношение NАNА к СТЬА4-1д молекулам (или к СТЬА4-1д димерам), выражаемое как моли/моль белка, больше или равно 8.0, а именно примерно от 8.0 до примерно 12; метод определения этой характеристики представлен в примере 16;

молекулы СТЬА4-1д содержат ^связанное гликозилирование, так что процентное содержание (по площади) домена I составляет примерно от 24.5 до примерно 35.2%, или процентное содержание (по площади) домена II составляет примерно от 26.3 до примерно 34.1%, или процентное содержание (по площади) домена III составляет примерно от 21.9 до примерно 31.5%, или процентное содержание (по площади) домена IV и домена V составляет примерно от 7.9 до примерно 18.6%; метод определения этой характеристики представлен в примере 44;

молекулы СТ^Λ4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение NСNА к СТЬА4-[д молекулам (или к СТЬА4-[д димерам), выражаемое как моли/моль белка, меньше чем или равно 1.5; метод определения этой характеристики представлен в примере 16.

Изобретение включает такие композиции в виде изолированных (выделенных) или практически чистых композиций. Изобретение включает такие композиции в виде фармацевтических композиций или в виде фармацевтически приемлемых композиций. Изобретение охватывает композиции, которые включают перестановку или комбинацию этих характеристик:

(2) молекулы СТЬА4-[д содержат одну (любую) или более из последовательностей 8ЕЦ ГО N0:4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 24 (например, СТТА4^{А29¥Е104Е}-[д), молекулы СТЬА4-[д менее чем на 5.0% по площади или на 5.0% по площади представляют собой высокомолекулярные частицы СТТА4-[д (или

- 340 017765

СТ^А4-Iд тетрамеры), как определено эксклюзионной хроматографией и спектрофотометрией (метод определения этой характеристики представлен в примере 25). Более конкретно, данное изобретение включает такие композиции, которые дополнительно включают одну или более из следующих характеристик:

молекулы СТ^А4-Iд более чем на 95.0% по площади или на 95.0% по площади представляют собой СТ^А4-Iд димеры, как определено эксклюзионной хроматографией и спектрофотометрией; метод определения этой характеристики представлен в примере 25;

молекулы СТ^А4-Iд менее чем на 1.0% по площади или на 1.0% по площади состоят из низкомолекулярных частиц СТ^А4-Iд (или СТ^А4-Iд мономеров), как определено эксклюзионной хроматографией и спектрофотометрией; метод определения этой характеристики представлен в примере 25;

имеют (в виде СТ^А4-Iд молекул или в виде указанной композиции) около 8-15 полос с рI интервалом примерно от 4.5 примерно до 5.6 и суммарную интенсивность полос 95-105% в интервале рI примерно от 4.5 примерно до 5.6; а метод определения этой характеристики представлен в примере 22;

не превышают максимального количества ДНК около 2.5 пг/мг молекул СТ^А4-Iд; метод определения этой характеристики представлен в примере 55;

не превышают максимального количества Белка А около 5 нг/мг молекул СТ^А4-Iд; метод определения этой характеристики представлен в примере 53;

не превышают максимальное количество МСР-1 5 нг/мг СТ^А4-Iд молекул; метод определения этой характеристики представлен в примере 54;

не превышают максимальное количество белка клетки-хозяина (также известного как клеточный белок) 50 нг/мг СТ^А4-Iд молекул; метод определения этой характеристики представлен в примере 52;

не превышают максимальное количество бактериального эндотоксина 0.42 ЕИ/мг СТ^А4-Iд молекул; метод определения этой характеристики представлен в примере 48;

не превышают максимальной бионагрузки 1 КОЕ/мл; метод определения этой характеристики представлен в примере 49;

не превышают максимальное количество Тритона Х-100 2 ррт (части на миллион, м.д.); метод определения этой характеристики представлен в примере 57;

молекулы СТ^А4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение сиаловой кислоты к СТ^А4-Iд молекулам (или к СТ^А4-Iд димерам), выражаемое как моли/моль белка, более или равно 5.0, а именно примерно от 5 до примерно 9 или примерно от 5.0 примерно до 10.0; метод определения этой характеристики представлен в примере 39;

молекулы СТ^А4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение NАNА к СТ^А4-Iд молекулам (или к СТ^А4-Iд димерам), выражаемое как моли/моль белка, более или равно 5.0, т.е. примерно от 5 до примерно 9 или примерно от 5.0 примерно до 10.0; метод определения этой характеристики представлен в примере 39;

молекулы СТ^А4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение СаШАс к СТ^А4-Iд молекулам (или к СТ^А4-Iд димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 0.7 до примерно 4.0; метод определения этой характеристики представлен в примере 36;

молекулы СТ^А4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение С1сNАс к СТ^А4-Iд молекулам (или к СТ^А4-Iд димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 14 до примерно 35; метод определения этой характеристики представлен в примере 36;

молекулы СТ^А4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение галактозы к СТ^А4-Iд молекулам (или к СТ^А4-Iд димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 8.0 до примерно 14; метод определения этой характеристики представлен в примере 35;

молекулы СТ^А4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение фукозы к СТ^А4-Iд молекулам (или к СТ^А4-Iд димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 1.7 до примерно 9.3; метод определения этой характеристики представлен в примере 35;

молекулы СТ^А4-Iд характеризуются тем, что среднее молярное отношение маннозы к СТ^А4-Iд молекулам (или к СТ^А4-Iд димерам), выражаемое как моли/моль белка, составляет примерно от 9 до примерно 18; метод определения этой характеристики представлен в примере 35.

Изобретение включает такие композиции, изолированные (выделенные) или практически чистые. Изобретение включает белки и композиции, имеющие перестановку или комбинацию этих характеристик.

Вышеприведенные примеры 1-14, 16-18, 21, 28-34, 42, 44-51, 58-67 относятся, в частности, к белку СТ^А4-Iд (1), см. выше, хотя, как показано в данном описании, методы, относящиеся к такому белку, или применение такого белка в этих примерах, являются иллюстрацией методов, относящихся к другим белкам СТ^А4-Iд по изобретению, или иллюстрацией применения других белков СТ^А4-Iд по изобретению.

Вышеприведенные примеры 19, 20, 22-27, 35-41, 52-57 относятся, в частности, к белку СТ^А4-Iд (2), см. выше, хотя, как показано в данном описании, методы, относящиеся к такому белку, или применение такого белка в этих примерах, являются иллюстрацией методов, относящихся к другим белкам СТ^А4-Iд по изобретению, или иллюстрацией применения других белков СТ^А4-Iд по изобретению.

- 341 017765

Список последовательностей <110> БРИСТОЛ - МАЕРС СКВИББ КОМПАНИ <120> КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ МОЛЕКУЛЫ СТ1_4-1д И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ <130> 10734 Т1л/ <140> 95147641 <141> 2006-12-19 <150> 60/849,543 <151> 2006-10-05 <150> 60/752,267 <151> 2005-12-20 <150> 60/752,150 <151> 2005-12-20 <160> 77 <170> Ра!еп!1п νβΓδτοη 3.3 <210> 1 <211> 1223 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<22 3> СТ1_А41д <22О>

<221> СОБ <222> (11)..(1159) <400>1 адсттсасса а!д дд! д!а с!д с!с аса сад адд асд с!д с!с ад! с!д49 ме! С1у \/а1 ьеи ьеи тЬг 61 η Агд тЬг Ьеи 1_еи Бег ьеи

510

дгс Уа1

С!! ьеи 15

дса А1а

С!С С!д !!!

сса аде а!д дед аде а!д дса

а!д ме!

сас НТ 5

97

Ьеи

ьеи РЬе

РГО 20

Бег

ме! А1а

Бег

ме! 25

А1а

дсс

сад

СС!

дс!

д!а

с!д

дсс

аде

аде

еда

ддс

а!с

дсс

аде

!!!

145

А1а

61 η

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

Бег

Бег

Агд

б!у

11 е

А1а

Бег

РЬе

30

35

40

45

Й?

!д!

дад

!а!

дса

!с!

сса

ддс

ааа

дсс

ас!

дад

д!с

едд

Й? 60

аса

193

СУ5

61 и

Туг

А) а 50

Бег

РГО

б!у

ЬУ5

А1а 55

ТЬг

61 и

Уа1

Агд

ТЬг

С!!

едд

сад

дс!

дас

аде

сад

дед Уа1

ас!

даа

д!с

где

дед

дса

асе

241

Ьеи

Агд

61 η

А1а

А5р

Бег

61 η

тЬг

61 и

Уа1

Суз

А1а

А1а

ТЬг

65

70

75

!ас

а!д

а!д

ддд 61у

аа!

дад

«д

асе

«с

с!а

да!

да!

!СС

а!с

!дс

асд

289

Туг

мет

ме! 80

А5П

61 и

ьеи

тЬг 85

РЬе

ьеи

Азр

АЗр

Бег 90

Не

Суз

тЬг

ддс 61 у

асе

!СС

ад!

дда 61 у

аа!

саа

аас

С!С

ас!

а!с

саа

дда

с!д

адд

337

ТЬг

Бег

Бег

АЗП

61 η

АЗП

ьеи

ТЬг

И е

61 η

61 у

ьеи

Агд

95

100

105

дсс

а!д

дас

асд

дда

С!С

!ас

а!с

!дс

аад

дед

дад

С1С

а!д

!ас

сса

385

- 342 017765

А1а мег Аар тЬг б!у ьеи

туг

И е суз

ьуз

Уа! 120

61 и

Ьеи мег

ту г

РГО 125

110

115

ссд

сса

гас

Гас

егд

ддс

ага

ддс

аас

дда

асе

сад

агг

гаг

дга

агг

433

Рго

Рго

Туг

Туг

ьеи

б1у

11 е

сТу

Азп

б1у

тЬг

б!п

Не

туг

Уа1

11 е

130

135

140

да!

сса

даа

сед

где

сса

даг

гсг

даг

сад

дад

ссс

ааа

гсг

ГСГ

дас

481

Азр

Рго

61 и

РГО

суз

Рго

Азр

Зег

Азр

61 п

61 и

Рго

ьуз

Зег

Зег

Азр

145

150

155

ааа

ас Г

сас

аса

Гее

сса

сед

Гее

сса

дса

ССГ

даа

сгс

егд

ддд

дда

529

гуз

тНг

НТ 5

тЬг

Зег

Рго

рго

Зег

Рго

А1а

Рго

61 и

ьеи

геи

61 у

б1у

160

165

170

гсд

Гса

дгс

ггс

сгс

ггс

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асе

сгс

агд

аге

577

Зег

Зег

Уа!

РЬе

ьеи

РЬе

Рго

РГО

Гу5

РГО

гуз

Азр

ТЬг

геи

мег

Не

17 5

180

185

ГСС

едд

асе

ссГ

дад

дгс

аса

где

дгд

дгд

дгд

дас

дгд

аде

сас

даа

625

Зег

Агд

тНг

РГО

61 и

Уа!

тЬг

Суз

Уа1

Уа!

Уа1

Азр

Уа!

Зег

НТ 5

61 и

190

195

200

205

дас

ссг

дад

дгс

аад

ггс

аас

гдд

Гас

дгд

дас

ддс

дгд

дад

дгд

саг

673

Азр

Рго

61 и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

туг

Уа!

Азр

61 у

Уа1

61 и

Уа1

нт 5

210

215

220

ааг

дсс

аад

аса

аад

сед

едд

дад

дад

сад

гас

аас

аде

асд

гас

едг

721

Азп

А1 а

1_уз

тЬг

гуз

Рго

Агд

61 и

61 и

61 п

Туг

АЗП

Зег

ТНг

туг

Агд

225

230

235

дгд

дгс

аде

дгс

сгс

асе

дгс

егд

сас

сад

дас

гдд

егд

ааг

ддс

аад

769

Уа1

Уа!

Зег

Уа1

ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Нт 5

61 п

А5р

тгр

Геи

АЗП

61 у

Гуз

240

245

250

дад

гас

аад

где

аад

дгс

Гее

аас

ааа

дсс

сгс

сса

дсс

ссс

аге

дад

817

61 и

туг

Ьуз

суз

ьуз

уа!

Зег

Азп

ьуз

А1а

ьеи

Рго

А1а

РГО

11 е

61 и

255

260

265

ааа

асе

аге

гее

ааа

дес

ааа

ддд

сад

ссс

еда

даа

сса

сад

дгд

Гас

865

ьуз

ТЬг

И е

Зег

гуз

А1а

ьуз

61 у

61 п

Рго

Агд

61 и

Рго

61 η

Уа!

туг

270

275

280

285

асе

егд

ссс

сса

гее

едд

даг

дад

егд

асе

аад

аас

сад

дгс

аде

егд

913

тНг

геи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

61 и

геи

ТНг

ьуз

АЗП

61 п

Уа!

Зег

Геи

290

295

300

асе

где

егд

дгс

ааа

ддс

ггс

ГаГ

ссс

аде

дас

аге

дсс

дгд

дад

гдд

961

тНг

Суз

1_еи

Уа1

гуз

61 у

РНе

туг

Рго

Зег

Азр

11 е

А1а

Уа1

61 и

тгр

305

310

315

дад

аде

ааг

ддд

сад

сед

дад

аас

аас

гас

аад

асе

асд

ССГ

ссс

дгд

1009

61 и

Зег

АЗП

61 у

61 η

РГО

61 и

Азп

Азп

туг

гуз

тЬг

тЬг

рго

Рго

Уа!

320

325

330

егд

дас

Гее

дас

ддс

гее

ГГС

ГГС

СГС

Гас

аде

аад

сгс

асе

дгд

дас

1057

Ьеи

Азр

Зег

Азр

61 у

Зег

РЬе

РНе

Ьеи

туг

5ег

ьуз

геи

тЬг

Уа1

Азр

335

340

345

аад

аде

адд

гдд

сад

сад

ддд

аас

дгс

ГГС

гса

где

Гее

дгд

агд

саг

1105

ьуз

Зег

Агд

тгр

61 η

61 η

61 у

АЗП

Уа1

РЬе

Зег

суз

Зег

Уа1

мег

Нт 5

350

355

360

365

дад

дсг

егд

сас

аас

сас

гас

асд

сад

аад

аде

сгс

гее

егд

гсг

сед

1153

61 и

А1а

Геи

нт 5

Азп

НТ 3

туг

тНг

61 п

гуз

Зег

геи

Зег

Геи

Зег

Рго

370

375

380

- 343 017765 ддг ааа гдадгдсдас ддссддсаад ссссдсгссс сдддсгсгсд сддгсдсасд 1209 С1у гуз аддагдсггс гада 1223 <210> 2 <211> 383 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СТ1_д41д <400> 2

мег 61 у 1

Уа1

геи геи 5

ТЬг 61п Агд

ТЬг

геи геи Бег 10

геи

Уа!

геи 15

А1а

геи

геи

РЬе

Рго

Бег

мег

А1а

Бег

мег

А1а

мег

НТ 3

уа!

А1а

61 п

РГО

20

25

30

А1а

Уа1

Уа1

геи

А1а

Бег

Бег

Агд

61 у

И е

А1а

Бег

рЬе

Уа1

Суз

61 и

35

40

45

Туг

А1 а

Бег

Рго

61 у

гув

А1а

ТЬг

61 и

Уа1

Агд

Уа1

ТЬг

Уа1

геи

Агд

50

55

60

61 η

А1 а

А5р

Бег

61 п

Уа1

ТЬг

61 и

Уа!

Су 5

А1а

А1а

тЬг

Туг

мег

мег

65

70

75

80

С1у

АЗП

61 и

геи

ТЬг

РЬе

геи

Азр

Азр

Бег

11 е

Суз

ТЬг

61 у

тЬг

Бег

85

90

95

Бег

61 у

Азп

61 п

Уа1

Азп

геи

ТЬг

11 е

61 п

61 у

геи

Агд

А1а

мег

Азр

100

105

110

ТЬг

61 у

геи

Туг

Не

Суз

гуз

Уа1

61 и

геи

Мег

Туг

РГО

РГО

РГО

Туг

115

120

125

туг

геи

61 у

11 е

61 у

АЗП

61 у

ТЬг

б1п

11 е

Туг

Уа1

11 е

Азр

РГО

61 и

130

135

140

Рго

Сув

Рго

Азр

Бег

АЗР

61 п

61 и

Рго

гуз

Бег

Бег

Азр

гуз

тЬг

НТ 5

145

150

155

160

ТЬг

Бег

Рго

Рго

Бег

Рго

А1а

Рго

61 и

геи

геи

61 у 61 у

Бег

Бег

Уа1

165

170

175

РЬе

геи

РЬе

рго

рго

гуз

рго

гуз

А5р

ТЬг

геи

мег

Не

Бег

Агд

тЬг

180

185

190

- 344 017765

Рго 01 и \/а1 195

тЬг Сув Уа1

Уа1

Уа1 200

А5р Уа1

Бег

ΗΊ 5

01 и 205

Азр

Рго

01 и

\/а1

Бу5 210

рЬе

Азп

тгр

Туг

Уа1 215

АЗр

01 у

Уа1

01 и

Уа1 220

Н1 $

АЗП

А1а

Буз

ТЬг

Був

РГО

Агд

01 и

01 и

01 п

Туг

Азп

Бег

тЬг

Туг

Агд

\/а1

\/а1

Бег

225

230

235

240

Уа1

Беи

тНг

Уа1

Беи

ΗΊ5

С1п

Азр

тгр

Беи

АЗП

01 у

Буз

01 и

Туг

БУ5

245

250

255

Суь

Був

Уа1

Бег

АВП

БУВ

А1а

Беи

Рго

А1а

рго

11 е

01 и

Буз

тЬг

11 е

260

265

270

Бег

Був

А1а

Буз

01 у

01 п

РГО

Агд

01 и

Рго

С1п

Уа1

туг

тНг

Беи

Рго

275

280

285

Рго

Бег

Агд

Азр

01 и

Беи

тНг

Буз

Азп

01 п

Уа1

Бег

Беи

ТЬг

Суз

Беи

290

295

300

Уа1

Був

01 у

Рпе

туг

Рго

Бег

Азр

11 е

А1а

Уа1

01 и

тгр

01 и

Бег

Азп

305

310

315

320

С1у

01 η

Рго

01 и

Азп

Азп

туг

Буз

тНг

тНг

РГО

РГО

\/а!

Беи

АЗр

Бег

325

330

335

А5р

01 у

Бег

РЬе 340

РИе

Беи

Туг

Бег

Буз 345

Беи

тЬг

Уа1

Аэр

Буз 350

Бег

Агд

тгр

01 η

01 п

01 у

Азп

Уа1

РКе

Бег

Суз

Бег

Уа1

мет

ΗΊ 8

01 и

А1а

Беи

355

360

365

Н1 5

Авп

Н1 в

туг

ТЬг

01 п

Буз

Бег

Беи

Бег

Беи

Бег

Рго

01 у

Буг

370

375

380

<210>3 <400>3

ООО эта последовательность специально оставлена пустой <210> 4 <211>384 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> СТБА4А29УБ104Е <400> 4 мет б1у Уа1 Беи Беи тКг с1п Агд тЬг Беи Беи Бег Беи Уа1 Беи А1а

10 15

- 345 017765

Ьеи Ьеи Рке Рго Зег 20

мег

А1 а

зег мет А1а 25

мег

Н1 3

Уа1

А1а 30

б1п

РГО

А1а

Уа1

Уа1

геи

А1а

зег

Зег

Агд

61 у

11 е

А1а

Зег

Рке

Уа1

Суз

б!и

35

40

45

Туг

А1а 50

Зег

Рго

61 у

Суз

туг 55

Ткг

61 и

Уа1

Агд

Уа1 60

ткг

Уа1

Ьеи

Агд

61 η

А1а

А5р

5ег

61 п

Уа1

Ткг

61 и

Уа1

суз

А1а

А1а

ткг

Туг

Мег

мег

65

70

75

80

61 у

АЗП

61 и

Ьеи

Ткг

Рке

геи

Азр

Азр

Зег

11 е

Суз

Ткг

61у

Ткг

Зег

85

90

95

Зег

61 у

АЗП

61 п

Уа1

Азп

Ьеи

Ткг

Не

61 п

61 у

геи

Агд

А1а

мег

Азр

100

105

110

ткг

61 у

Ьеи

Туг

Не

Суз

|_уз

Уа1

61 и

геи

Мет

Туг

Рго

Рго

РГО

Туг

115

120

125

Туг

61 и

61 у

Не

61 у

АЗП

61 у

Ткг

61 п

11 е

Туг

Уа1

Не

Азр

РГО

61 и

130

135

140

Рго

Суз

Суз

Рго

Азр

Зег

Азр

61 п

61 и

Рго

1_У5

Зег

Зег

Азр

|_уз

Ткг

145

150

155

160

Н1 5

ткг

Зег

Рго

Рго

Зег

Рго

А1а

Рго

61 и

ьеи

Ьеи

61у 61у

5ег

зег

165

170

175

Уа1

Рке

ьеи

Рке

Рго

Рго

ьуз

Рго

Ьуз

АЗр

Ткг

ьеи

Мег

11 е

5ег

Агд

180

185

190

ткг

РГО

61 и

Уа1

ткг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

АЗр

Уа1

Зег

ΗΊ 8

61 и

Азр

Рго

195

200

205

61 и

Уа1

ьуз

Рке

АЗП

Тгр

туг

Уа1

Азр

61 у

Уа1

61 и

Уа1

Н1 5

АЗП

А1а

210

215

220

ЬУ5

ткг

1_уз

Рго

Агд

61 и

61 и

61 п

туг

АЗП

5ег

Ткг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

225

230

235

240

Зег

Уа1

Беи

Ткг

Уа1

Ьеи

ΗΪ 3

б1п

Азр

тгр

ьеи

АЗП

61 у

ьуз

61 и

Туг

245

250

255

гуз

СУ5

Ьуз

Уа1

Зег

АЗП

Ьуз

А1а

|_еи

Рго

А1а

РГО

Не

61 и

|_уз

Ткг

260

265

270

Не

Зег

ьуз

А1а

ьуз

61 у

61 п

Рго

Агд

61 и

Рго

61 п

Уа1

Туг

Ткг

геи

275

280

285

- 346 017765

РГО

Рго

Зег

Агд

Азр

б!и

Ьеи

ТНг

ьуз

Азп

61 η

Уа1

Зег

ьеи

ТНг

суз

290

295

300

ьеи

Уа1

Ьуз

01 у

РНе

Туг

РГО

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

61 и

тгр

01 и

Зег

305

310

315

320

АЗП

01 у

01 η

Рго

61 и

АЗП

АЗП

Туг

ьуз

тНг

ТНг

РГО

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

325

330

335

Зег

А5р

61у

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Зег

ьуз

Ьеи

тНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

340

345

350

Агд

Тгр

61 η

61 η

61 у

Азп

Уа1

РНе

5ег

Суз

Зег

\/а1

мет

Н1 8

61 и

А1а

355

360

365

Ьеи

Н1 5

АЗП

Ηί 5

туг

ТНг

Οίη

Ьуз

5ег

ьеи

Зег

ьеи

Зег

РГО

01 у

ьуз

370

375

380

<210> 5 <211> 359 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> ι

СТЬА41д

- Аминокислоты 25-383 из

ЗЕО

Ю N0:2

<400>

5

МеТ

А1 а

мет

Н1 3

Уа1

А1а

01 η

РГО

А1а

Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

5ег

Агд

1

5

10

15

01 у

11 е

А1а

Зег 20

РНе

Уа1

Суз

61 и

Туг 25

А1а

Зег

Рго

61 у

Ьуз 30

А1а

ТНг

61 и

Уа1

Агд

Уа1

тНг

Уа1

Ьеи

Агд

61 η

А1а

Азр

Зег

61 п

Уа1

ТНг

61 и

35

40

45

Уа1

Суз

А1а

А1а

тНг

Туг

МеТ

мет

61у

Азп

61 и

Ьеи

ТНг

РНе

ьеи

Азр

50

55

60

Азр

зег

Не

Суз

тНг

61у

ТЬг

Зег

Зег

61 у

Азп

01 п

\/а1

А5П

Ьеи

ТНг

65

70

75

80

11е

61 η

61 у

Ьеи

Агд

А1а

мет

Азр

тНг

61 у

Ьеи

туг

Не

Суз

ьуз

Уа1

85

90

95

61 и

ьеи

мет

Туг

Рго

Рго

Рго

туг

Туг

Ьеи

61 у

11е

61 у

Азп

61 у

ТНг

100

105

110

01 η

Не

туг

Уа1

Не

Азр

Рго

61 и

рго

Суз

Рго

Азр

Зег

Азр

61 п

61 и

115

120

125

- 347 017765

рго гуз 130

Бег Бег Азр гуз тЬг 135

НТ 5

тЬг

Бег Рго Рго 140

Бег

РГО

А1а

Рго

61 и

геи

Ееи

61 у 61 у

Бег

Бег

Уа1

РЬе

Ееи

РЬе

Рго

Рго

Еуз

РГО

Еуз

145

150

155

160

Азр

тЬг

геи

мег

11 е

Бег

Агд

тЬг

Рго

61 и

Уа!

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа!

165

170

175

Азр

Уа1

Бег

НТ 5 180

61 и

АЗр

Рго

61 и

Уа! 185

Еуз

РЬе

Α5Π

тгр

190

Уа!

Азр

61 у

Уа!

61 и 195

Уа1

Нт 8

АЗП

А1а

Еуз 200

тЬг

Еуз

рго

Агд

61 и 205

61 и

6ΐη

туг

АЗП

Бег 210

ТЬг

туг

Агд

Уа!

Уа! 215

Бег

Уа1

Ееи

ТЬг

Уа1 220

Ееи

НТ 8

61 η

АЗр

тгр

геи

Азп

61 у

гуз

61 и

туг

Еуз

Суз

Еуз

Уа!

Бег

Азп

Еуз

А1а

Ееи

225

230

235

240

Рго

А1а

Рго

Не

61 и 245

гуз

тЬг

11 е

Бег

гуз 250

А1а

гуз

61 у

61 η

РГО 255

Агд

б!и

Рго

61 η

Уа1 260

Туг

ТЬг

Ееи

РГО

Рго 265

Бег

Агд

Азр

61 и

Ееи 270

ТЬг

Еуз

АЗП

С1п

Уа!

Бег

Ееи

тЬг

Суз

Ееи

Уа!

Еуз

61 у

рЬе

Туг

Рго

Бег

Азр

275

280

285

И е

А1 а 290

Уа!

61 и

тгр

61 и

Бег 295

АЗП

61 у

61 η

РГО

61 и 300

А5П

АЗП

туг

ЕУЗ

тЬг

тЬг

Рго

Рго

Уа1

Ееи

Азр

Бег

Азр

61 у

Бег

РЬе

РЬе

Ееи

туг

Бег

305

310

315

320

Еуз

геи

ТЬг

Уа1

Азр

Еуз

Бег

Агд

тгр

61 η

б1п

61 у

АЗП

Уа!

РЬе

Бег

325

330

335

Суз

Бег

Уа!

мег

НТ 5

61 и

А1а

Ееи

НТ 5

АЗП

НТ 5

Туг

тЬг

61 η

Еуз

Бег

340

345

350

Ьеи Бег геи Бег Рго б!у гуз

355 <210> 6 <211> 358 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 348 017765 <223> СТЬА41д - Аминокислоты 26-383 из БЕЦ Ю N0:2 <400> 6

А1а 1

ме!

ΗΊ 3

Уа1

А1а 5

61 п Рго А1а Уа1

Уа1 10

Ьеи

А1а Бег

Бег

Агд 15

61 у

Не

А1 а

Бег

РЬе

Уа1

Суз

61 и

Туг

А1а

Бег

РГО

61 у

ьуз

А1а

ТЬг

61 и

20

25

30

Уа1

Агд

\/а1

тЬг

\/а1

ьеи

Агд

61 п

А1а

Азр

Бег

61 п

Уа1

ТЬг

61 и

Уа1

35

40

45

Суз

А1а

А1а

ТЬг

Туг

ме!

ме!

б1у

А5П

61 и

Ьеи

ТЬг

РЬе

Ьеи

Азр

Азр

50

55

60

Бег

11 е

Суз

ТЬг

61 у

тЬг

Бег

Бег

61 у

Азп

61 п

Уа1

АЗП

Ьеи

ТЬг

Не

65

70

75

80

С1п

С1у

ьеи

Агд

А1а

Ме!

Азр

ТЬг

б1у

ьеи

Туг

11 е

Суз

ьуз

Уа1

61 и

85

90

95

ьеи

ме!

туг

РГО

Рго

РГО

Туг

Туг

Ьеи

61 у

Не

61 у

АЗП

61 у

ТЬг

61 п

100

105

110

11 е

туг

Уа1

11 е

Азр

РГО

61 и

Рго

Суз

РГО

Азр

Бег

Азр

61 п

61 и

Рго

115

120

125

ьуз

Бег

Бег

Азр

ьуз

ТЬг

Н1 3

ТЬг

Бег

Рго

РГО

Бег

Рго

А1а

Рго

61 и

130

135

140

Ьеи

ьеи

С1у

61 у

Бег

Бег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

РГО

рго

ьуз

РГО

ьуз

Азр

145

150

155

160

ТЬг

ьеи

ме!

Не

Бег

Агд

тЬг

Рго

61 и

Уа1

ТЬг

суз

УаТ

х/а!

Уа1

АЗр

165

170

175

Уа1

Бег

Н13

61 и

АЗр

Рго

б1и

Уа1

ьуз

РЬе

Азп

Тгр

туг

Уа1

Азр

61 у

180

185

190

Уа1

61 и

Уа1

ΗΪ з

АЗП

А1а

Ьуз

тЬг

Ьуз

РГО

Агд

61 и

61 и

61 п

туг

Азп

195

200

205

Бег

тЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

тЬг

Уа1

Ьеи

Н15

б!п

Азр

Тгр

210

215

220

ьеи

АЗП

61у

ьуз

61 и

Туг

ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

ьуз

А1а

ьеи

Рго

225

230

235

240

А1а

Рго

11 е

61 и

ьуз

ТЬг

Не

Бег

ьуз

А1а

Ьуэ

61 у

61 п

Рго

Агд

61 и

245

250

255

- 349 017765

РГО

01 η

Уа1

туг

ТЬг

Ьеи

РГО

Рго

Бег

Агд

Азр

01 и

ьеи

ТЬг

ьуз

АЗП

260

265

270

01 η

Уа1

Бег

Ьеи

тЬг

Суз

Ьеи

Уа!

ьуз

01 у

РЬе

Туг

РГО

Бег

Азр

11 е

275

280

285

А1а

Уа1

01 и

тгр

01 и

Бег

Азп

01 у

С1п

Рго

01 и

АЗП

АЗП

Туг

ьуз

ТЬг

290

295

300

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

ьеи

Азр

Бег

Азр

01 у

Бег

РЬе

РЬе

ьеи

Туг

Бег

Ьуз

305

310

315

320

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

ьуз

Бег

Агд

Тгр

01 η

01 η

01 у

Азп

Уа1

РЬе

Бег

Суз

325

330

335

Бег

Уа1

мег

Н1 5

01 и

А1а

ьеи

Н1 8

АЗП

Ηΐ 5

Туг

ТЬг

01 п

Ьуз

Бег

Ьеи

340

345

350

Бег

Ьеи

Бег

Рго

01 у

ьуз

355 <210> Ί <211> 357 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> >

СТЬА41д -

- Аминокислоты 27-383 из

БЕЦ

Ю N0:2

<400>

7

Мет

Н1 5

Уа1

А1а

01 п

Рго

А1а

Уа1

νβΐ

ьеи

А1а

Бег

Бег

Агд

01 у

11 е

1

5

10

15

А1а

Бег

РЬе

Уа1

Суз

01 и

туг

А1а

Бег

РГО

01 у

ьуз

А1а

тЬг

01 и

Уа!

20

25

30

Агд

Уа1

ТЬг

Уа1

ьеи

Агд

01 п

А1а

АЗр

Бег

01 п

Уа1

тЬг

01 и

Уа1

Суз

35

40

45

А1а

А1а

ТЬг

Туг

мет

мет

01 у

АЗП

01 и

Ьеи

тЬг

РЬе

Ьеи

Азр

Азр

Бег

50

55

60

Не

суз

ТЬг

01 у

ТЬг

Бег

Бег

01 у

Азп

01 п

Уа1

АЗП

ьеи

ТЬг

Не

01 п

65

70

75

80

01 у

Ьеи

Агд

А1а

мет

Азр

ТЬг

01 у

ьеи

туг

Не

Суз

ьуз

Уа1

01 и

Ьеи

85

90

95

мет

туг

РГО

Рго

РГО

туг

Туг

ьеи

С1у

11 е

01 у

АЗП

01 у

тЬг

01 п

11 е

100

105

110

- 350 017765

Туг

Уа!

11 е

Азр

Рго

61 и

РГО

суз

Рго

Азр

Бег

Азр

61 п

61 и

РГО

туз

115

120

125

Бег

Бег

Азр

туз

ТНг

Нтз

ТНг

Бег

Рго

Рго

Бег

Рго

А1а

РГО

61 и

Теи

130

13 5

140

Ьеи

61 у

61 у

Бег

Бег

Уа!

РНе

Теи

РНе

Рго

РГО

туз

Рго

туз

Азр

ТНг

145

150

155

160

Ьеи

мет

Пе

Бег

Агд

ТНг

Рго

61 и

Уа1

тНг

Суз

Уа!

Уа!

Уа1

Азр

Уа!

165

170

175

Бег

Нт 5

61 и

Азр

Рго

61 и

Уа!

туз

РНе

А5П

тгр

Туг

Уа!

Азр

61у

Уа1

180

185

190

61 и

Уа1

Н1 3

АЗП

А1а

1_уз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

61 и

б1и

61 п

туг

АЗП

Бег

195

200

205

ТНг

Туг

Агд

Уа!

Уа1

Бег

Уа!

Теи

тНг

Уа1

ьеи

Нт 3

61 п

Азр

тгр

Теи

210

215

220

ΑδΠ

61 у

Туз

01 и

туг

ьуз

суз

1-уз

Уа1

Бег

АЗП

ЬУ5

А1а

теи

Рго

А1а

225

230

235

240

РГО

11 е

01 и

|_уз

ТНг

Не

Бег

ьуз

А1а

Туз

61 у

61 п

РГО

Агд

61 и

Рго

245

250

255

01 п

Уа1

Туг

ТНг

Теи

Рго

РГО

Бег

Агд

А5р

61 и

Теи

ТНг

Туз

АЗП

61 п

260

265

270

Уа1

Бег

1_еи

ТНг

суз

ьеи

Уа1

Туз

61 у

РНе

туг

Рго

Бег

Азр

Не

А1а

275

280

285

Уа!

61 и 290

Тгр

01 и

Бег

Азп

61 у 295

01 п

Рго

01 и

АЗП

АЗП 300

туг

туз

ТНг

тНг

РГО

РГО

уа!

Теи

Азр

Бег

Азр

61 у

Бег

РНе

РНе

ьеи

туг

Бег

Туз

Теи

305

310

315

320

ТНг

Уа1

Азр

ьуз

Бег

Агд

Тгр

61 п

61 п

61 у

АЗП

Уа!

РНе

Бег

суз

Бег

325

330

335

Уа!

мет

нтз

61 и

А1а

Теи

Нт 5

Азп

НТ 5

Туг

ТНг

61 п

ьуз

Бег

теи

Бег

340

345

350

теи Бег рго 61у Ьуз

355 <210> 8 <211> 358 <212> БЕЛОК

- 351 017765 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СТ1_А41д - Аминокислоты 25-382 из БЕЦ Ю N0:2 <400> 8

Мет А1а Мет Нт 5 1

Уа1 5

А1а

01 п

Рго А1а Уа1 Уа1 10

Беи

А1а

Бег

Бег 15

Агд

01 у

Не

А1а

Бег 20

РНе

Уа1

Суз

01 и

ΙΓ

А1а

Бег

Рго

01 у

С

А1а

тНг

01 и

Уа1

Агд

Уа1

ТНг

Уа1

Беи

Агд

01 п

А1а

Азр

Бег

01 п

Уа1

ТНг

01 и

35

40

45

Уа1

Суз

А1а

А1а

тНг

туг

мет

мет

01 у

АЗП

01 и

Беи

ТНг

РНе

Беи

Азр

50

55

60

Азр

Бег

11е

Суз

тНг

С1у

ТНг

Бег

Бег

01 у

Азп

ΟΙ п

Уа1

Азп

Беи

тНг

65

70

75

80

11 е

01 η

01у

Беи

Агд

А1а

мет

Азр

ТНг

01 у

Беи

Туг

11 е

Суз

Буз

Уа1

85

90

95

С1и

Беи

мет

Туг

Рго

Рго

РГО

туг

Туг

Беи

01 у

Не

01 у

Азп

01 у

ТНг

100

105

110

с1п

Не

туг 115

Уа1

Не

Азр

РГО

01 и 120

Рго

Сув

Рго

АЗР

Бег 125

Азр

01 п

01 и

РГО

Буз

Бег

Бег

Азр

Буз

тНг

Нтз

ТНг

Бег

РГО

РГО

Бег

Рго

А1а

Рго

130

135

140

01 и

Беи

Беи

01 у 01 у

Бег

Бег

Уа1

РНе

ьеи

РНе

РГО

РГО

Буз

Рго

Буг

145

150

155

160

Азр

ТЬг

Беи

мет

Не

Бег

Агд

ТНг

Рго

01 и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

165

170

175

АЗр

Уа1

Бег

НТ 5

01 и

Азр

РГО

01 и

Уа1

Буз

РНе

Азп

тгр

Туг

Уа1

АЗр

180

185

190

С1у

Уа1

01 и

Уа1

нтз

Азп

А1а

Буз

ТНг

Буз

Рго

Агд

с! и

01 и

01 п

Туг

195

200

205

АЗП

Бег

тНг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Беи

тНг

Уа1

Беи

нтз

01 п

Азр

210

215

220

тгр

Беи

А5П

01 у

Буз

01 и

Туг

Буз

Суз

Буз

Уа1

Бег

АЗП

Буз

А1а

Беи

225

230

235

240

- 352 017765

РГО

А1а

Рго

Не

61 и 245

гуз

Ткг

Не

зег

гуз 250

А1а

гуз

61 у

61 п

Рго 255

Агд

61 и

РГО

61 п

Уа!

туг

Ткг

геи

Рго

РГО

Зег

Агд

АЗр

61 и

геи

Ткг

гуз

260

265

270

А5П

61 п

Уа!

зег

геи

Ткг

Суз

геи

Уа!

гуз

61 у

Рке

Туг

Рго

Зег

Азр

275

280

285

Не

А1а

Уа1

61 и

Тгр

(Л и

5ег

Азп

61 у

61 п

Рго

61 и

Азп

Азп

Туг

гуз

290

295

300

Ткг

Ткг

Рго

Рго

Уа!

геи

Азр

Зег

Аэр

61 у

Зег

Рке

Рке

геи

Туг

Зег

305

310

315

320

гуз

геи

Ткг

Уа!

АЗр

гуз

Зег

Агд

тгр

б!п

61 п

61 у

Азп

Уа!

Рке

Зег

325

330

335

Суз

Зег

Уа!

мег

НТ 5

61 и

А1а

геи

Нт 8

Азп

Нт 5

Туг

Ткг

61 п

гуз

Зег

340

345

350

геи

зег

геи

зег

Рго

61 у

355

<210> 9 <211> 357 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> <

СТгА41д - аминокислоты 26-382 из ЗЕЦ Ю N0:2

<400> I

9

А1а

мег

НТ 5

Уа1

А1а

61 п

Рго

А1а

Уа1

Уа1

геи

А1а

Зег

зег

Агд

61 у

1

5

10

15

Не

А1 а

Зег

Рке

Уа1

Суз

61 и

туг

А1а

Зег

рго

61 у

гуз

А1а

Ткг

61 и

20

25

30

Уа1

Агд

Уа1

Ткг

Уа1

геи

Агд

61 п

А1а

А5р

Зег

61 п

Уа1

Ткг

61 и

Уа1

35

40

45

Суз

А1а 50

А1а

ткг

туг

мег

мег 55

61 у

А5П

61 и

геи

ткг 60

Рке

геи

Азр

Азр

5ег

Не

Суз

ткг

61 у

ткг

Зег

зег

61 у

Азп

61 п

Уа1

АЗП

геи

ткг

Не

65

70

75

80

61 п

61 у

геи

Агд

А1а 85

мег

Азр

Ткг

61 у

Ееи 90

Туг

Не

суз

гуз

Уа! 95

61 и

геи

мег

ту Г

Рго

Рго

Рго

туг

Туг

геи

61 у

Не

61 у

АЗП

61 у

Ткг

61 п

- 353 017765

100

105

110

Не

туг

Уа1

11 е

Азр

Рго

61 и

Рго

Суз

РГО

Азр

Зег

Азр

61 η

61 и

Рго

115

120

125

ьуз

Зег

5ег

Азр

ьуз

ТНг

НТ 5

ТНг

Зег

РГО

РГО

Зег

РГО

А1а

РГО

61 и

130

135

140

ьеи

ьеи

61у

61 у

Зег

Зег

\/а1

РНе

ьеи

РНе

рго

Рго

ьуз

Рго

Ьуз

Азр

145

150

155

160

тНг

ьеи

Мет

Не

зег

Агд

ТНг

Рго

61 и

Уа1

ТНг

суз

Уа1

Уа1

Уа1

АЗр

165

170

175

\/а1

Зег

НТ 5

61 и

Азр

Рго

01 и

\/а1

ьуз

РНе

АЗП

Тгр

Туг

Уа1

Азр

61 у

180

185

190

Уа1

61 и

Уа1

НТ 8

АЗП

А1а

ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

61 и

61 и

01 η

туг

АЗП

195

200

205

Зег

ТНг

Туг

Агд

Уа1

\/а1

Зег

Уа1

ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

НТ 5

61 η

Азр

Тгр

210

215

220

ьеи

АЗП

61 у

ьуз

61 и

Туг

ьуз

Суз

ьуз

Уа1

Зег

АЗП

ьуз

А1а

Ьеи

РГО

225

230

235

240

А1а

Рго

11 е

61 и

ьуз 245

тНг

Не

Зег

ьуз

А1 а 250

ьуз

61 у

61 η

РГО

Агд 255

61 и

Рго

61 η

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

рго

Рго

Зег

Агд

Азр

61 и

ьеи

ТНг

Ьуз

АЗП

260

265

270

61 η

Уа1

5ег

Ьеи

ТНг

Суз

ьеи

Уа1

Ьуз

61 у

РНе

Туг

РГО

Зег

Азр

Не

275

280

285

А1а

Уа1

61 и

Тгр

61 и

Зег

АЗП

61 у

61 η

Рго

01 и

АЗП

АЗП

Туг

ьуз

ТНг

290

295

300

ТНг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

61 у

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Зег

ьуз

305

310

315

320

Ьеи

ТНг

ν31

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

61 η

01 η

61 у

АЗП

Уа1

РНе

5ег

Суз

325

330

335

Зег

Уа1

МеТ

ΗΊ 8

01 и

А1а

Ьеи

НТ 8

Азп

НТ 5

Туг

ТНг

61 η

Ьуз

Зег

ьеи

340

345

350

Зег ьеи Зег Рго б!у

355

- 354 017765 <210> 10 <211> 356 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> СТГА41д - Аминокислоты 27-382 из ЗЕО Ю N0:2 <400> 10

мег нт 5 1

Уа1

А1а

61 п 5

Рго А1а

Уа1 Уа1

геи А1а 10

Зег зег Агд

61 у 15

11 е

А1а

Зег

РНе

Уа1 20

суз

61 и

туг

А1а

Зег 25

РГО

61 у

Гуз

А1а

ТНг 30

61 и

Уа!

Агд

Уа1

ТНг 35

Уа!

геи

Агд

61 п

А1а 40

А5р

Зег

б!п

Уа!

тНг 45

61 и

Уа1

суз

А1а

А1а

тНг

туг

мег

мег

61 у

Азп

61 и

геи

ТНг

РНе

геи

Азр

АЗр

Зег

50

55

60

Не

суз

ТНг

61 у

тНг

Зег

Зег

61 у

Азп

61 п

Уа!

АЗП

геи

тНг

Не

61 п

65

70

75

80

61 у

ьеи

Агд

А1а

мег

Азр

ТНг

61 у

Геи

туг

Не

суз

гуз

Уа1

61 и

Геи

85

90

95

мег

Туг

Рго

рго

Рго

туг

туг

Геи

61 у

Не

61 у

Азп

61 у

ТНг

61 п

Не

100

105

110

туг

Уа1

11 е

Азр

Рго

61 и

Рго

суз

Рго

Азр

5ег

Азр

61 п

61 и

РГО

гуз

115

120

125

Зег

Зег

А5р

ЬУ5

ТНг

НТ 5

тНг

Зег

РГО

Рго

Зег

РГО

А1а

РГО

61 и

геи

130

135

140

ьеи

61 у 61 у

Зег

Зег

Уа1

РНе

Геи

РНе

Рго

Рго

гуз

Рго

гуз

Азр

ТНг

145

150

155

160

Ьеи

мег

Не

Зег

Агд

ТНг

РГО

61 и

Уа1

тНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа!

165

170

175

Зег

Нт 5

61 и

Азр 180

Рго

61 и

Уа1

гуз

РНе 185

АЗП

Тгр

туг

Уа!

Азр 190

61 у

Уа1

61 и

Уа!

Нт 3 195

Азп

А1а

Гуз

ТНг

гуз 200

Рго

Агд

61 и

61 и

61 п 205

туг

Азп

Зег

ТНг

туг 210

Агд

Уа!

Уа1

Зег

Уа! 215

Геи

ТНг

Уа1

Геи

нт 5 220

61 п

Азр

Тгр

Геи

Азп

61 у

1-уз

61 и

Туг

Гуз

Суз

гуз

Уа!

5ег

АЗП

Гуз

А1а

Геи

рго

А1а

- 355 017765

225

230

235

240

Рго

Не

61 и

ЕУЗ

ТЬг

Не

Бег

гуз

А1а

гуз

61 у

61 п

РГО

Агд

61 и

РГО

245

250

255

61 η

Уа1

Туг

ТЬг

геи

РГО

Рго

Бег

Агд

Азр

61 и

геи

тЬг

гуз

АЗП

61 п

260

265

270

Уа1

Бег

Ееи

ТЬг

суз

геи

Уа1

гуз

61 у

рЬе

Туг

РГО

Бег

Азр

11 е

А1а

275

280

285

Уа!

61 и

Тгр

61 и

Бег

АЗП

61 у

61 η

Рго

61 и

Азп

АЗП

Туг

гуз

ТЬг

ТЬг

290

295

300

Рго

рго

Уа!

Ееи

Азр

Бег

Азр

61 у

Бег

РЬе

РЬе

геи

Туг

Бег

гуз

геи

305

310

315

320

тЬг

Уа1

Азр

Еуз

Бег

Агд

Тгр

61 η

61 η

61 у

АЗП

уа!

РЬе

Бег

суз

Бег

325

330

335

Уа!

мег

НТ 5

61 и

А1а

геи

НТЗ

Азп

нт 3

Туг

ТЬг

61 п

гуг

Бег

геи

Бег

340

345

350

геи

Бег

Рго

61 у

355 <210> И <211> 359 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> ι

СТЕА4а29УЕ104Е -

АМИНОКИСЛОТЬ

>ι 25-

-382

ИЗ !

5Е0 Ю N0:4

<400> :

11

Мег

А1а

мег

Нт 5

Уа1

А1а

61 п

РГО

А1а

Уа1

Уа!

геи

А1а

Бег

Бег

Агд

1

5

10

15

61 у

Не

А1 а

Бег

РЬе

Уа!

Суз

61 и

Туг

А1а

Бег

РГО

61 у

гуз

Туг

ТЬг

20

25

30

61 и

Уа!

Агд

Уа!

тЬг

Уа1

геи

Агд

61 п

А1а

Азр

Бег

61 п

Уа1

тЬг

61 и

35

40

45

Уа1

Суз

А1а

А1а

тЬг

туг

мег

мег

61 у

Азп

61 и

геи

ТЬг

РЬе

геи

А5р

50

55

60

Азр

Бег

11 е

Суз

тЬг

61 у

тЬг

Бег

Бег

61 у

Азп

61 п

Уа!

АЗП

геи

ТЬг

65

70

75

80

11 е

61 п

61 у

геи

Агд

А1а

мег

Азр

ТЬг

61 у

геи

туг

11 е

Суз

гуз

Уа!

85

90

95

- 356 017765

С1и

ьеи

мет

Туг 100

РГО

Рго

РГО

Туг

Туг 105

01 и

01 у

Не

01 у

АЗП 110

61 у

ТЬг

01η

11 е

туг 115

Уа!

Не

АЗР

РГО

01 и 120

Рго

Суз

Рго

Азр

Бег 125

А5р

61 п

61 и

РГО

ьуз

Бег

Бег

АЗр

ьуз

тЬг

нтз

ТЬг

Бег

Рго

РГО

Бег

РГО

А1а

Рго

130

135

140

С1и

ьеи

ьеи

01 у

01 у

Бег

Бег

Уа!

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

РГО

ьуз

Рго

Ьуз

145

150

155

160

Азр

тЬг

ьеи

мет

11 е

Бег

Агд

ТЬг

РГО

01 и

Уа!

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

165

170

175

АЗР

Уа!

Бег

НТЗ

01 и

Азр

РГО

С1и

Уа!

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

туг

Уа1

А5р

180

185

190

С1у

Уа!

01 и

Уа!

НТЗ

Азп

А1а

ьуз

ТЬг

ьуз

РГО

Агд

01 и

61 и

01 п

туг

195

200

205

АЗП

Бег

ТЬг

Туг

Агд

Уа!

Уа!

Бег

Уа1

ьеи

ТЬг

Уа1

ьеи

нтз

61 п

Азр

210

215

220

тгр

ьеи

АЗП

01 у

ьуз

01 и

туг

ьуз

Суз

ьуз

УаТ

Бег

Азп

ьуз

А1а

ьеи

225

230

235

240

Рго

А1а

Рго

11 е

01 и 245

ьуз

ТЬг

Не

Бег

ьуз 250

А1а

ьуз

01 у

61 п

Рго 255

Агд

01 и

РГО

01 п

Уа! 260

Туг

ТЬг

ьеи

рго

РГО 265

Бег

Агд

Азр

01 и

Ьеи 270

ТЬг

ьуз

Азп

01 п

Уа!

Бег

Ьеи

ТЬг

суз

ьеи

Уа1

ьуз

01 у

РЬе

туг

Рго

Бег

Азр

275

280

285

И е

А1а 290

Уа1

01 и

тгр

01 и

Бег 295

Азп

01 у

01 п

Рго

01 и 300

А5П

Азп

туг

ьуз

тЬг

ТЬг

РГО

РГО

Уа!

Ьеи

АЗр

Бег

Азр

01 у

Бег

РЬе

РЬе

ьеи

туг

Бег

305

310

315

320

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

тгр

01 п

01 п

01 у

Азп

Уа!

РЬе

Бег

325

330

335

Суз

Бег

Уа1

мет

Нт 5

01 и

А1а

Ьеи

нтз

Азп

Нтз

туг

ТЬг

61 п

ьуз

Бег

340

345

350

Ьеи

Бег

Ьеи

Бег

Рго

01 у

ьуз

- 357 017765

355 <210> 12 <211> 358 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> СТЬа4А29УЬ104е - Аминокислоты 26-383 из 5ЕЦ Ю N0:4 <400> 12

А1а 1

мет

НТ 5

Уа1

А1а 61 η 5

Рго А1а

Уа1

Уа1 10

ьеи

А1а Бег

Бег

Агд 15

61 у

11 е

А1а

Бег

РЬе

Уа1

суз

61 и

Туг

А1а

Бег

Рго

61 у

ьуз

туг

ТЬг

61 и

20

25

30

Уа1

Агд

Уа1

ТЬг

Уа1

ьеи

Агд

61 η

А1а

Азр

Бег

61 п

Уа1

тЬг

61 и

Уа1

35

40

45

Суз

А1а 50

А1а

тЬг

туг

Ме!

Ме! 55

61 у

Азп

61 и

ьеи

ТЬг 60

РЬе

ьеи

Азр

А5р

Бег 65

Не

Суз

ТЬг

61 у

ТЬг 70

Бег

Бег

61 у

Азп

61 п 75

Уа1

Азп

ьеи

ТЬг

Не 80

61 η

61 у

Ьеи

Агд

А1а 85

ме!

Азр

тЬг

61 у

Ьеи 90

туг

Не

Суз

ьуз

Уа1 95

61 и

Ьеи

ме!

туг

Рго 100

Рго

Рго

туг

Туг

61 и 105

61 у

Не

61 у

А5П

61 у 110

ТЬг

61 п

Не

туг

Уа1

Не

АЗр

РГО

61 и

РГО

суз

Рго

Азр

Бег

А5р

61 п

б!и

Рго

115

120

125

ьуз

Бег

Бег

Азр

ьуз

ТЬг

НТ 3

ТЬг

Бег

РГО

Рго

Бег

РГО

А1а

Рго

61 и

130

135

140

ьеи

ьеи

61 у 61 у

Бег

Бег

Уа1

РЬе

ьеи

РЬе

Рго

РГО

ьуз

РГО

Ьуз

Азр

145

150

155

160

тЬг

Ьеи

ме!

11 е

Бег 165

Агд

ТЬг

Рго

61 и

Уа1 170

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1 175

Азр

Уа1

Бег

НТ 5

61 и 180

Азр

РГО

61 и

Уа1

ьуз 185

РЬе

АЗП

тгр

туг

Уа1 190

Азр

61 у

Уа1

61 и

Уа1 195

НТ 5

АЗП

А1а

ьуз

ТЬг 200

Ьуз

Рго

Агд

61 и

61 и 205

61 п

Туг

АЗП

Бег

ТЬг

туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

тЬг

Уа1

ьеи

Н1 5

61 п

Азр

тгр

210

215

220

- 358 017765

теи 225

АЗП б!у

туз

61 и

туг Туз 230

Суз

туз Уа1

Бег 235

Азп Туэ

А1а

теи

Рго 240

А1а

РГО

11 е

61 и

туз 245

ТНг

Не

Бег

туз

А1 а 250

туз

61 у

61 η

РГО

Агд 255

61 и

Рго

61 η

Уа!

Туг

ТНг

теи

РГО

Рго

Бег

Агд

Азр

61 и

Теи

ТНг

Туз

Азп

260

265

270

61 η

Уа1

Бег 275

Теи

ТНг

Суз

Теи

Уа! 280

Туз

61 у

РНе

Туг

Рго 285

Бег

Азр

Не

А1а

Уа1

61 и

Тгр

61 и

Бег

Азп

61 у

61 η

Рго

61 и

Азп

Азп

Туг

туз

ТНг

290

295

300

тНг

Рго

Рго

Уа1

Теи

Азр

Бег

Азр

61 у

Бег

РНе

РНе

теи

туг

Бег

Туз

305

310

315

320

Теи

тНг

Уа!

Азр

туз 325

Бег

Агд

тгр

61 η

61 п 330

61 у

АЗП

Уа1

РНе

Бег 335

Суз

Бег

Уа1

мет

НТЗ

61 и

А1а

теи

НТЗ

АЗП

нтз

Туг

ТНг

61 п

туз

Бег

теи

340

345

350

Бег

теи

Бег

Рго

61 у

Туз

355 <210> 13 <211> 357 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> СТТА4А29УТ104Е -

АМИНОКИСЛОТ!

.1 27-

-383

ИЗ 1

5 ЕС) Ю N0:4

<400> 13

мес

нтз Уа!

А1а

61 п

РГО

А1а

Уа!

Уа!

Теи

А1а

Бег

Бег

Агд

б1у

11 е

1

5

10

15

А1а

Бег РНе

Уа!

Суз

б!и

Туг

А1а

Бег

РГО

61 у

туз

туг

ТНг

61 и

Уа!

20

25

30

Агд

Уа! ТНг

Уа!

теи

Агд

61 п

А1а

Азр

Бег

61 п

Уа!

ТНг

61 и

Уа1

суз

35

40

45

А1а

А1а тНг 50

туг

мес

мес

61 у 55

АЗП

61 и

теи

тНг

РНе 60

теи

Азр

Азр

Бег

Не

Суз ТНг

61 у

ТНг

Бег

Бег

61 у

Азп

61 п

Уа1

АЗП

Теи

ТНг

П е

61 η

65

70

75

80

- 359 017765

61у ьеи Агд А1а Мет

Азр

Ткг 61 у геи

туг Не 90

суз гуз

Уа!

61 и 95

геи

85

мег

Туг

РГО

Рго 100

Рго

туг

туг

61 и

61 у 105

11 е

61 у

АЗП

61 у

ткг 110

61 п

11 е

Туг

уа!

Не 115

Азр

Рго

61 и

Рго

Суз 120

РГО

АЗр

зег

Азр

61 п 125

61 и

Рго

гуз

Зег

зег

Азр

гуз

Ткг

НТЗ

ткг

Зег

Рго

РГО

Зег

Рго

А1а

Рго

61 и

геи

130

135

140

геи

61 у 61 у

5ег

Зег

уа!

Рке

геи

Рке

Рго

РГО

гуз

Рго

гуз

Азр

ткг

145

150

155

160

геи

мег

Не

зег

Агд

Ткг

Рго

61 и

Уа!

ткг

Суз

Уа1

уа!

Уа!

Азр

Уа!

165

170

175

Зег

НТ 5

61 и

АЗр

рго

61 и

Уа1

гуз

Рке

АЗП

тгр

туг

Уа1

Азр

61 у

Уа1

180

185

190

61 и

Уа1

НТ 5

Азп

А1а

гуз

ткг

гуз

Рго

Агд

61 и

61 и

61 п

туг

Азп

зег

195

200

205

Ткг

туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

геи

Ткг

Уа1

геи

нтз

61 п

Азр

тгр

геи

210

215

220

А5П

61 у

гуз

61 и

туг

гуз

Суз

гуз

Уа1

Зег

Азп

гуз

А1а

геи

РГО

А1а

225

230

235

240

Рго

11 е

61 и

гуз

Ткг 245

Не

Зег

гуз

А1а

гуз 250

61 у

61 η

РГО

Агд

61 и 255

Рго

61 η

Уа1

Туг

Ткг 260

геи

Рго

Рго

Зег

Агд 265

Азр

61 и

геи

Ткг

гуз 270

АЗП

61 п

Уа1

Зег

геи 275

Ткг

Суз

геи

Уа1

Йо

61 у

Рке

туг

РГО

Зег 285

А5Р

Не

А1а

Уа1

61 и 290

тгр

61 и

Зег

АЗП

61 у 295

61 п

РГО

61 и

АЗП

АЗП 300

туг

гуз

ткг

ткг

Рго

Рго

Уа1

геи

Азр

Зег

Азр

б!у

Зег

Рке

Рке

геи

Туг

зег

гуз

геи

305

310

315

320

Ткг

Уа1

Азр

гуз

Зег

Агд

тгр

61 п

61 п

61 у

АЗП

Уа1

Рке

зег

Суз

Зег

325

330

335

Уа!

мег

НТЗ

61 и

А1а

геи

нтз

Азп

нтз

туг

ткг

61 η

гуз

Зег

геи

Зег

340

345

350

- 360 017765

Ьеи Бег рго б!у ьуз

355 <210> 14 <211> 358 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СТЬА4а29уЫ04е - Аминокислоты 25-382 из БЕС} Ю N0:4 <400> 14

Мет 1

А1а мет нт з

Уа1 5

А1а

01п рго

А1а Уа1 10

Уа1

ьеи

А1а

Бег

Бег 15

Агд

61 у

11 е

А1а

Бег

РНе

\/а1

Суз

61 и

Туг

А1а

Бег

РГО

61 у

ьуз

Туг

ТНг

20

25

30

61 и

Уа1

Агд

Уа1

тНг

Уа1

Ьеи

Агд

61 п

А1а

Азр

Бег

61 п

\/а1

ТНг

61 и

35

40

45

Уа1

Суз

А1а

А1а

ТНг

Туг

МеТ

мет

61 у

АЗП

61 и

ьеи

ТНг

РНе

Ьеи

Азр

50

55

60

Азр

Бег

11 е

Су5

ТНг

01 у

ТНг

Бег

Бег

61 у

Азп

61 п

Уа1

АЗП

ьеи

ТНг

65

70

75

80

11 е

61 η

О1у

ьеи

Агд 85

А1а

МеТ

Азр

ТНг

61 у 90

Ьеи

туг

11 е

Суз

ьуэ 95

Уа1

61 и

Ьеи

мет

туг

Рго

Рго

Рго

Туг

Туг

61 и

61 у

Не

61 у

Азп

б!у

тНг

100

105

110

01 η

11 е

туг

Уа1

11 е

Азр

Рго

61 и

РГО

Суз

РГО

Азр

Бег

А5р

61 п

61 и

115

120

125

Рго

ьуз

Бег

Бег

Азр

Ьуз

тНг

НТ 8

ТНг

Бег

Рго

РГО

Бег

РГО

А1а

Рго

130

135

140

61 и

ьеи

Ьеи

61 у

01 у

Бег

Бег

Уа1

РНе

Ьеи

РНе

РГО

Рго

ьуз

Рго

Ьуз

145

150

155

160

А5р

тНг

ьеи

МеТ

11 е

Бег

Агд

тНг

РГО

61 и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

165

170

175

АЗР

Уа1

Бег

НТ 5

01 и

Азр

Рго

61 и

Уа1

ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

180

185

190

б1у

Уа1

61 и

Уа1

Н18

Азп

А1а

ьуз

тНг

ьуз

Рго

Агд

61 и

61 и

61 п

туг

195

200

205

- 361 017765

АЗП Бег 210

ТЬг Туг

Агд

Уа!

Уа1 215

Бег

Уа!

Геи

ТНг

Уа1 220

геи

нтз

61 п

Азр

тгр

ьеи

Азп

61 у

Гуз

61 и

Туг

Гуз

Суз

гуз

Уа1

Бег

Азп

гуз

А1а

Геи

225

230

235

240

РГО

А1а

Рго

Не

61 и

гуз

тЬг

11 е

Бег

гуз

А1а

Гуз

61 у

61 п

РГО

Агд

245

250

255

61 и

Рго

61 п

Уа!

Туг

ТЬг

геи

Рго

Рго

Бег

Агд

АЗр

61 и

геи

ТЬг

Гуз

260

265

270

А5П

б!п

Уа!

Бег

Геи

ТЬг

Суз

Геи

Уа1

гуз

61 у

РНе

Туг

РГО

Бег

Азр

275

280

285

Не

А1а

Уа1

61 и

тгр

61 и

Бег

АЗП

61 у

61 п

Рго

61 и

Азп

Азп

Туг

Гуз

290

295

300

тЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Геи

Азр

Бег

Азр

61 у

Бег

РЬе

РЬе

геи

туг

Бег

305

310

315

320

Ьуз

1_еи

ТЬг

Уа!

Аэр

гуз

Бег

Агд

тгр

61 п

61 п

61 у

Азп

Уа1

РЬе

Бег

325

330

335

Суз

Бег

Уа1

мет

Н1 з

61 и

А1а

геи

НТ 5

АЗП

Нт 3

Туг

ТЬг

61 п

Гуз

Бег

340

345

350

ьеи

Бег

Геи

Бег

Рго

61 у

355 <210> 15 <211> 357 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> <

6ΤΕΑ4Α29ΥΓ104Ε -

АМИНОКИСЛОТЬ

-ι 26-

-382

из бец :

Ю N0:4

<400> :

15

А1а

мет

Нт з

Уа1

А1а

61 п

Рго

А1а

Уа!

Уа1

геи

А1а

Бег

Бег

Агд

61 у

1

5

10

15

11 е

А1а

Бег

РЬе

Уа1

Суз

61 и

Туг

А1а

Бег

Рго

61 у

Гуз

Туг

ТЬг

61 и

20

25

30

Уа!

Агд

Уа1

ТЬг

Уа1

Геи

Агд

61 п

А1а

А5Р

Бег

61 п

Уа1

ТЬг

61 и

Уа1

35

40

45

суз

А1а

А1а

ТЬг

Туг

мет

мет

61 у

Азп

61 и

геи

тЬг

РЬе

геи

Азр

Азр

50

55

60

Бег

Не

Суз

ТЬг

61 у

тЬг

Бег

Бег

61 у

АЗП

61 п

Уа1

Азп

Геи

ТЬг

Не

- 362 017765

65

70

75

80

01η

01 у

Беи

Агд

А1а

мет

Азр

тНг

01 у

Беи

туг

Не

Суз

Буз

\/а1

01 и

85

90

95

Беи

мет

Туг

Рго

РГО

РГО

Туг

Туг

01 и

01 у

Не

01 у

АЗП

01 у

тНг

01 п

100

105

110

11 е

туг

Уа1

Не

Азр

Рго

01 и

Рго

Суз

Рго

Азр

Бег

Азр

01 п

01 и

РГО

115

120

125

Буз

Бег

Бег

Азр

Буз

ТНг

НТ 8

ТНг

Бег

РГО

Рго

Бег

Рго

А1а

Рго

01 и

130

135

140

Беи

Беи

01 у

01 у

Бег

Бег

х/а!

РНе

Беи

РНе

Рго

Рго

Буз

Рго

Буз

Азр

145

150

155

160

ТНг

Беи

мет

11 е

Бег

Агд

ТНг

Рго

01 и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа!

А5р

165

170

175

Уа1

Бег

Нтз

01 и

Азр

Рго

01 и

Уа!

Буз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

01 у

180

185

190

Уа1

01 и

Уа1

нтз

АЗП

А1а

Буз

ТНг

Буз

РГО

Агд

01 и

01 и

01 п

Туг

АЗП

195

200

205

Бег

ТНг 210

Туг

Агд

7а1

\/а1

Бег 215

Уа1

Беи

тНг

х/а!

Беи 220

НТ 8

01 п

Азр

Тгр

Беи

АЗП

01 у

Буз

01 и

Туг

Буз

Суз

Буз

Уа1

Бег

АЗП

БуЗ

А1а

Беи

Рго

225

230

235

240

А1а

Рго

11 е

01 и

Буз

ТНг

Не

Бег

Буз

А1а

Буз

С1у

01 п

Рго

Агд

01 и

245

250

255

Рго

01 η

Уа1

Туг

ТНг

Беи

Рго

Рго

Бег

Агд

Азр

01 и

Беи

ТНг

Буз

АЗП

260

265

270

01 п

\/а!

Бег

Беи

ТНг

Суз

Беи

Уа1

Буз

01 у

РНе

туг

Рго

Бег

А5Р

Не

275

280

285

А1а

Уа1

01 и

Тгр

01 и

Бег

Азп

01 у

01 п

Рго

01 и

АЗП

АЗП

Туг

Буз

ТНг

290

295

300

тНг

Рго

РГО

Уа1

Беи

А5Р

Бег

Азр

01 у

Бег

РНе

РНе

Беи

Туг

Бег

Буг

305

310

315

320

Беи

ТНг

Уа1

Азр

Буз

Бег

Агд

Тгр

01 п

01 п

01 у

Азп

х/а!

РНе

Бег

Суз

325

330

335

- 363 017765

Бег Уа1 мег нтз 61 и А1а геи нтз азп Нтз Туг тЬг 61 η гуэ Бег геи

340 345 350

Бег геи Бег Рго б!у

355 <210> 16 <211> 356 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СТгА4А29Уг104Е - Аминокислоты 27-382 из 5Е0 Ю N0:4 <400> 16

мег 1

Ш 5

уа!

А1а 61 η Рго 5

А1а Уа!

Уа!

геи А1а 10

Бег Бег

Агд

61 у 15

Не

А1а

Бег

РЬе

Уа1

суз

61 и

Туг

А1а

Бег

рго

61 у

гуз

туг

тЬг

61 и

Уа1

20

25

30

Агд

Уа1

ТЬг

Уа1

геи

Агд

61 η

А1а

Азр

Бег

б1п

УаТ

тЬг

61 и

Уа!

Суз

35

40

45

А1а

А1 а

ТЬг

туг

мег

Мег

б1у

АЗП

61 и

геи

ТЬг

РЬе

геи

Азр

АЗр

Бег

50

55

60

11е

Суз

ТЬг

61 у

тЬг

Бег

Бег

61 у

АЗП

61 η

Уа1

АЗП

геи

тЬг

И е

61 η

65

70

75

80

61 у

геи

Агд

А1а

мег

Азр

ТЬг

61 у

геи

Туг

Не

суз

гуз

Уа!

61 и

геи

85

90

95

мег

ту Г

Рго

Рго

рго

туг

Туг

61 и

61 у

Не

61 у

АЗП

61 у

тЬг

61 η

Не

100

105

110

туг

Уа1

Не

АЗр

Рго

61 и

Рго

Суз

рго

Азр

Бег

Азр

61 η

61 и

Рго

гуз

115

120

125

Бег

Бег

Азр

гуз

тЬг

Нт 3

ТЬг

Бег

РГО

РГО

Бег

рго

А1а

РГО

61 и

геи

130

135

140

геи

61 у

61 у

Бег

Бег

Уа!

РЬе

геи

РЬе

Рго

Рго

гуз

РГО

гуз

Азр

ТЬг

145

150

155

160

геи

мег

Не

Бег

Агд

ТЬг

Рго

61 и

Уа!

тЬг

Суз

уа!

Уа1

Уа!

Азр

Уа1

165

170

175

Бег

НТ 3

61 и

АЗр

Рго

61 и

Уа1

гуз

РЬе

АЗП

Тгр

туг

Уа1

Азр

61у

Уа1

180

185

190

61 и

Уа!

Нт 5

АЗП

А1а

гуз

ТЬг

гуз

Рго

Агд

61 и

61 и

61 η

туг

Азп

Бег

195

200

205

- 364 017765

ТЬг Туг Агд

Уа!

Уа!

Бег Уа1 215

ьеи

тНг Уа!

ьеи нт з 220

61 п

Азр

Тгр

Ьеи

210

Азп 225

ОТ у

ьуз

61 и

Туг

Суз

ьуз

Уа!

Бег

АЗП 235

ьуз

А1а

ьеи

рго

А1а 240

Рго

11 е

61 и

ьуз

ТЬг

Не

Бег

ьуз

АТ а

Ьуз

61 у

01 п

Рго

Агд

01 и

ΡΓΟ

245

250

255

СТ η

Уа1

туг

тЬг 260

ьеи

Рго

Рго

Бег

Агд 265

Азр

О1и

Ьеи

тЬг

$

АЗП

01 п

УаТ

Бег

ьеи

ТЬг

суз

Ьеи

Уа!

ьуз

61 у

РЬе

туг

Рго

Бег

АЗр

Не

А1а

275

280

285

УаТ

01 и

Тгр

01 и

Бег

Азп

61 у

61 п

Рго

61 и

Азп

Азп

туг

ьуз

ТЬг

ТЕ г

290

295

300

Рго 305

Рго

Уа!

Ьеи

Азр

Бег 310

Азр

61 у

Бег

р|те

РЬе 315

Ьеи

Туг

Бег

ьуз

Ьеи 320

ТЬг

Уа!

АЗр

ьуз

Бег 325

Агд

тгр

01 п

61 п

61 у 330

АЗП

Уа!

РЬе

Бег

т

Бег

УаТ

мет

НТ 8

61 и

А1а

Ьеи

Нтз

АЗП

нтз

Туг

ТЬг

61 п

ьуз

Бег

Ьеи

Бег

340

345

350

Ьеи Бег рго С1у

355 <210> 17 <211> 6928 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Синтетическая плазмида <220>

<221> С05 <222> (949)..(2097)
<400> 17
датстсссда	тсссстатдд	тсдастстса	дтасаатстд	стстдатдсс	дсатадттаа	60
дссадтатст	дстссстдст	тдтдтдттдд	аддтсдстда	дТадтдсдсд	адсааааттт	120
аадстасаас	ааддсааддс	ттдассдаса	аттдсатдаа	даатстдстт	адддттаддс	180
дттттдсдст	дсттсдсдат	дтасдддсса	дататасдсд	ттдасаттда	ттаттдаста	240
дттаттаата	дтаатсаатт	асддддТсат	тадттсатад	сссаТаТатд	дадттссдсд	300
ттасатааст	тасддтааат	ддсссдсстд	дсТдассдсс	саасдасссс	сдсссаттда	360

- 365 017765

сдгсаагааг дасдгагдгг сссагадгаа сдссаагадд дасгггссаг гдасдгсааг	420
дддсддасеа гегасддгаа аседсссасг сддсадсаса гсаадгдгаг сагагдссаа	480
дсасдссссс гаеедасдСс аасдасддга аасддсссдс седдсаггае дсссадгаса	540
сдассггасд ддасеггссг асггддсадг асагсгасдг аггадгсагс дсгаггасса	600
СддСдаедсд дггггддсад сасассааед ддсдгддага дсддггсдас гсасддддаг	660
ггссаадгсг ссассссагг дасдгсаагд ддадгггдгг ссддсассаа аагсаасддд	720
асгггссааа агдгсдгаас аасгссдссс сасгдасдса аагдддсддг аддсдгдгас	780
ддсдддаддс ссатагаадс ададсссгсг ддсгаассад адаасссасг дсггасгддс	840
ссассдааае саасасдасе састасаддд адасссаадс ссддсассда дсесддарсс	900
асгадгаасд дссдссадгд сдсгддаагг сгдсадагад сггсасса агд ддс дса	957

мег сТу Уа!

сгд Ьеи

ссс ьеи 5

аса тНг

сад адд

асд сед

ссс аде сед дсс

ссс дса

ссс теи

сед Теи

ггг рНе

1005

61 η

Агд

тпг

ьеи 10

теи

Бег Теи

Уа1

теи 15

А1а

сса

аде

агд

дед

аде

асд

дса

асд

сас

39

дсс

сад

ссс

дес

39

дга

1053

РГО

Бег

мес

А1а

Бег

мес

А1а

мес

нтз

А1а

61 п

Рго

А1а

уа!

20

25

30

35

сгд

дсс

аде

аде

еда

ддс 61у

асе

дсс

аде

ссс

39

гдг

дад

сас

дса

гсг

1101

ьеи

А1а

Бег

Бег

Агд 40

11 е

А1а

Бег

рНе 45

суз

61 и

туг

А1а 50

Бег

сса

ддс 61 у

ааа

дсс

асе

дад

дгс

едд

39 60

аса

39

ссс

едд

сад

дсс

дас

1149

Рго

ьуз

А1а 55

ТНг

61 и

Уа1

Агд

ТНг

теи

Агд

61 п 65

А1а

Азр

аде

сад

39

асе

даа

дес

гдг

дед

дса

асе

сас

асд

асд

ддд 61у

аас

дад

1197

Бег

61 η

ТНг

61 и

Уа1

Суз

А1а

А1а

ТНг

туг

мес

мес

АЗП

61 и

70

75

80

ссд

асе

ССС

сса

дас

дас

ссс

асе

где

асд

ддс

асе

ссс

аде

дда б!у

ааг

1245

Теи

ТНг 85

рНе

Теи

Азр

Азр

Бег 90

Не

суз

ТНг

61 у

ТНг 95

Бег

Бег

АЗП

саа

39

аас

ССС

асе

асе

саа

дда 61 у

сед

адд

дсс

асд

дас

асд

дда

сгс

1293

61 η

Азп

ьеи

ТНг

11 е

61 п

Теи

Агд

А1а

мес

Азр

тНг

61 у

теи

100

105

110

115

Сас

асе

сде

аад

39 120

дад

сгс

асд

сас

сса

ссд

сса

Сас

Сас

сед

ддс 61 у

1341

Туг

Пе

Суз

суз

61 и

Теи

мес

Туг

Рго 125

Рго

Рго

Туг

туг

теи 130

аса

ддс 61 у

аас

дда

асе

сад

асе

сас

дга

асе

дас

сса

даа

ссд

где

сса

1389

Не

Азп

61 у

тНг

61 п

Не

туг

Уа!

11 е

Азр

Рго

61 и

Рго

суз

РГО

135

140

145

дас

ССС

дас

сад

дад

ссс

ааа

СсС

Ссе

дас

ааа

асе

сас

аса

гее

сса

1437

А5р

Бег

Азр 150

61 п

61 и

Рго

туз

Бег 155

Бег

Азр

туз

ТНг

Н18 160

ТЬг

Бег

РГО

ссд

ссс

сса

дса

ссс

даа

ссс

сед

ддд

дда

гсд

Сса

дгс

ссс

сгс

ггс

1485

Рго

Бег

Рго

А1а

РГО

61 и

теи

Теи

61 у

61 у

Бег

Бег

Уа!

РНе

теи

РНе

165

170

175

- 366 017765

ссс сса ааа ссс аад

дас асе ссс асд асе тсс сдд асе еес дад дес

1533

Рго рго 180

гуз рго гуз

Азр 185

ткг

геи

мес

11 е

Бег 190

Агд

Ткг

РГО

61 и

Уа! 195

аса Ткг

1дс Суз

дед дед Уа1 Уа1

За? 200

дас Азр

аде Бег

сас нтз

даа 61 и 205

дас Азр

еес РГО

дад 61 и

дес Уа!

аад суз 210

«с Рке

1581

аас

сдд

Сас

дас

ддс б1у

£?

дад

£?

сас

аас

дсс

аад

аса

аад

ссд

1629

Азп

тгр

туг

Азр

61 и

нтз

Азп

А1а

суз

ткг

суз

РГО

215

220

225

сдд

дад

дад

сад

сас

аас

аде

асд

сас

еде

дсс

аде

дсс

ссс

асе

1677

Агд

61 и

61 и

61 п

туг

АЗП

Бег

Ткг

туг

Агд

Уа1

Бег

Уа!

Сеи

Ткг

230

235

240

дгс

ссд

сас

сад

дас

сдд

сед

аас

ддс 61 у

аад

дад

сас

аад

еде

аад

дес

1725

Уа!

геи 245

Нтз

61 п

Азр

Тгр

геи 250

АЗП

гуз

61 и

туг 255

суз

суз

суз

Уа1

Ссс

аас

ааа

дсс

ссс

сса

дес

ссс

асе

дад

ааа

асе

асе

есс

ааа

дсс

1773

Бег

Азп

гуз

А1а

геи

Рго

А1а

РГО

Не

61 и

гуз

ткг

Не

Бег

суз

А1а

260

265

270

275

ааа

ддд

сад

ссс

еда

даа

сса

сад

Ж

сас

асе

сед

ссс

сса

Ссс

сдд

1821

гуз

б1у

61 п

РГО

Агд 280

61 и

Рго

61 п

туг 285

Ткг

геи

Рго

Рго

Бег 290

Агд

дат

дад

стд

асе

аад

аас

сад

дтс

аде

сед

асе

Где

сед

дсс

ааа

ддс

1869

Азр

61 и

геи

Ткг

гуз

Азп

61 п

Уа1

Бег

геи

ткг

Суз

сеи

Уа!

суз

б1у

295

300

305

еес

сас

ссс

аде

дас

асе

дес

£? 315

дад

сдд

дад

аде

аас

ддд 61 у

сад

ссд

1917

Рке

туг

РГО 310

Бег

Азр

Не

А1а

61 и

тгр

61 и

Бег

Азп 320

61 п

РГО

дад

аас

аас

сас

аад

асе

асд

еес

ссс

сед

дас

Ссс

дас

ддс 61у

ссс

1965

61 и

Азп

АЗП

туг

гуз

ткг

ткг

Рго

Рго

геи

Азр

Бег

Азр

Бег

325

330

335

ССс

ссс

сСс

сас

аде

аад

есс

асе

Й?

дас

аад

аде

адд

сдд

сад

сад

2013

Рке

Рке

геи

туг

Бег

гуз

геи

ткг

Азр

гуз

Бег

Агд

Тгр

61 п

61 п

340

345

350

355

ддд бТу

аас

дгс

ССС

•сса

еде

ссс

Ж

асд

сас

дад

дсс

сед

сас

аас

сас

2061

АЗП

Уа1

Рке

Бег

Суз

Бег

мес

нтз

61 и

А1а

сеи

НТ 5

Азп

Нтз

360

365

370

гас

асд

сад

аад

аде

СТС

ссс

сед

ссс

ссд

ддс 61 у

ааа

сдадсдсдас

2107

Туг

ткг

61 п

гуз

Бег

геи

Бег

геи

Бег

Рго

суз

375

380

ддссддсаад сссссдсесс ссдддсСсСс дсддссдсас даддаедесс ссададддсс	2167
ссасессаса дсдссассса ааедсеадад сесдседаСс адссСсдасе дсдсссссса	2227
дседссадсс аСсСдседес СдссссСссс ссдсдссесс сССдасссед дааддедсса	2287
сссссассде ссеесссСаа Сааааедадд аааседсасс дсаседссед адсаддсдсс	2347
ассссасссе ддддддеддд деддддсадд асадсааддд ддаддассдд даадасааса	2407
дсаддсаедс сддддасдсд дсдддсссса сддсиссда ддеддааада ассадсСддд	2467
дсессадддд деасссссас дсдссседеа дсддсдсаСС аадсдсддсд ддсдсддсдд	2527
ССасдсдсад сдедассдсе асасседсса дсдсссеадс дсссдссссс сесдсссссс	2587

- 367 017765

!ссс!!сс!! !с!сдссасд «сдсссгд! ддаагд!д!д !сад!!аддд гдгддааад!	2647
ссссаддсгс сссадсаддс адаад!а!дс ааадсагдса !сгсаа!!ад гсадсаасса	2707
дд!д!ддааа дгссссаддс гссссадсад дсадаадга! дсааадсагд сагсгсаа!!	2767
адгсадсаас са!ад!сссд сссстаасис сдссса!ссс дссссгаас! ссдсссад!!	2827
ссдссса!!с Тссдсссса! ддстдас!аа ΐΐΐΐΐΐΐΐαΐ «агдсадад дссдаддссд	2887
сс!сддсс!с !дадс!а!!с садаад!ад! даддаддс!! !!!!ддаддс с!аддс!!!!	2947
дсааааадс! !ддасадс!д адддсгдсда !!!сдсдсса аас!!дасдд саагссгадс	3007
д!дааддс!д дгадда!!!! а!ссссдс!д сса!са!дд! гсдасса!!д аасгдсагсд	3067
!сдссд!д!с ссаада!а!д дддаггддса адаасддада сс!ассс!дд сс!ссдс!са	3127
ддаасдад!! саад!ас!!с сааадаагда ссасаассгс «садгддаа ддгааасада	3187
а!с!дд!да! !а!ддд!адд аааасс!дд! !с!сса!!сс гдадаадаа! сдассгхсаа	3247
аддасадаа! !аа!а!ад!! сгсадгадад аас!сааада ассассасда ддадсгса!!	3307
«сггдссаа аадгггдда! да!дсс!!аа дас!!а!!да асаассддаа !!ддсаад!а	3367
аадгадаса! дд!!!дда!а дгсддаддса д!!с!д!!!а ссаддаадсс а!даа!саас	3427
саддссасс! садас!с!« дгдасаадда !са!дсадда а!!!дааад! дасасд!!!!	3487
!сссадааа! !да!!!дддд ааа!а!ааас !!с!сссада а!асссаддс д!сс!сгс!д	3547
адд!ссадда ддаааааддс а!саад!а!а ад!!!даад! схасдадаад ааадасгаас	3607
аддаада!дс !!!саад!!с !сгдс!сссс гссгааадс! а!дса«!!! а!аадассаг	3667
дддас!!!!д с!ддс!!!ад а!с!!!д!да аддаасс!!а с!!с!д!дд! д!даса!аа!	3727
гддасааас! асс!асадад а!!!ааадс! с!аадд!ааа !а!аааа!!! !!аад!д!а!	3787
аа!д!д«аа ас!ас!да« с!аа!!д!!! д!дга!!!!а датйссаасс !а!ддаас!д	3847
агдааьддда дсад!дд!дд аа!дсс!!!а а!даддаааа сс!д!!!!дс гсадаадааа	3907
!дсса!с!ад !да!да!дад дс!ас!дс!д ас!с!сааса «сгасиссх ссаааааада	3967
ададааадд! адаадасссс ааддас!!!с с!!садаа!! дсгаад!!!! !!дад!сагд	4027
с!д!д!!!ад !аа!адаас! с«дс«дс! !!дс!а!«а сассасааад дааааадс!д	4087
сас!дс!а!а саадаааа!! а!ддааааа! а!!с!д!аас с!!!агаад! аддса!ааса	4147
д!!а!аагса !аасагас!д !!«!!с!!а сиссасасад дсагададгд !с!дс!а!!а	4207
агаас!а!дс гсааааа!!д !д!асс!!!а дс!!!!!аа! !!д!аааддд д!!аа!аадд	4267
аагагигда! д!а!ад!дсс !!дас!адад а!са!аа!са дсса!ассас а!!!д!адад	4327
д«!!ас!!д с!«аааааа ссгсссасас с!ссссс!да ассгдаааса !аааа!даа!	4387
дсаа!!д!!д !!д!!аас!! д!!!а!!дса дс!!а!аа!д д!!асааа!а аадсаагадс	4447
агсасааа!! !сасааа!аа адса!!!!!! !сас!дса!1 с!ад!!д!дд !!!дгссааа	4507
с!са!саа!д га!с!!а!са !д!с!дда!с ддс!дда!да !сс!ссадсд сдддда!с!с	4567

- 368 017765

атдстддадт	тсттсдссса	ссссаасттд	тттагтдсад	сттатаатдд	ттасааатаа	4627
адсаагадса	гсасаааттт	сасааатааа	дсаттттттт	састдсаттс	тадтгдтддт	4687
ГТдгссааас	тсатсаатдт	атстгатсаг	дгстдгатас	сдтсдасстс	тадсгададс	4747
ТТддсдТааТ	сатддтсата	дстдтттсст	дтдтдааатт	дттатссдст	сасааттсса	4807
сасаасатас	дадссддаад	саТааадТдТ	ааадсстддд	дтдсстаатд	адтдадстаа	4867
стсасаттаа	ттдсдттдсд	стсастдссс	дстттссадт	сдддааассТ	дтсдтдссад	4927
стдсаттаат	даатсддсса	асдсдсдддд	ададдсддТТ	тдсдтаттдд	дсдстсттсс	4987
дсттсстсдс	тсастдастс	дстдсдстсд	дтсдттсддс	Тдсддсдадс	ддтатсадст	5047
састсааадд	сддтаатасд	дттатссаса	даатсадддд	атаасдсадд	ааадаасатд	5107
Тдадсаааад	дссадсаааа	ддссаддаас	сдТааааадд	ссдсдгтдст	ддсдтттттс	5167
сатаддстсс	дсссссстда	сдадсатсас	аааааТсдас	дстсаадтса	даддтддсда	5227
аасссдасад	дастатааад	аТассаддсд	ТТТссссстд	даадстссст	сдтдсдстст	5287
сстдттссда	ссстдссдст	тассддатас	стдтссдсст	ттстсссттс	дддаадсдтд	5347
дсдстттстс	аатдстсасд	стдтаддтат	стсадттсдд	тдтаддтсдт	тсдстссаад	5407
стдддстдтд	тдсасдаасс	ссссдттсад	сссдассдст	дсдссттатс	сддтаастат	5467
сдтсттдадт	ссаасссддт	аадасасдас	ттатсдссас	тддсадсадс	састддтаас	5527
аддаттадса	дадсдаддта	Тдгаддсддт	дстасададт	тсттдаадтд	дтддсстаас	5587
гасддстаса	сгадааддас	адтатттддт	атстдсдстс	гдстдаадсс	адттассттс	5647
ддааааадад	ттддтадстс	ттдатссддс	ааасааасса	ссдстддтад	сддтддтттт	5707
тттдтттдса	адсадсадат	тасдсдсада	ааааааддат	стсаадаада	тсстттдатс	5767
гтттстасдд	ддтстдасдс	ТсадТддаас	даааастсас	дттаадддат	тттддтсатд	5827
адаттатсаа	аааддатстт	сасстадатс	сТТТТаааТТ	ааааатдаад	гтттааатса	5887
атстааадта	тататдадта	аасттддтст	дасадттасс	аатдсттаат	садтдаддса	5947
ссгатстсад	сдатстдтст	атттсдттса	гссатадттд	сстдастссс	сдтсдтдтад	6007
атаастасда	Тасдддаддд	сгтассатст	ддссссадтд	стдсаатдаг	ассдсдадас	6067
ссасдстсас	сддстссада	тгтатсадса	атааассадс	садссддаад	ддссдадсдс	6127
адаадтддтс	стдсаастгт	атссдсстсс	атссадтста	ттааттдттд	ссдддаадст	6187
ададтаадта	дттсдссадт	таатадтттд	сдсаасдТТд	хтдссаттдс	ТасаддсаТс	6247
дтддтдтсас	дстсдтсдтт	тддтатддст	Тсагтсадст	ссддттссса	асдтсааддс	6307
дадттасатд	атсссссатд	ТТдТдсаааа	аадсддттад	стссттсддт	ссссдатсдт	6367
тдгсадаадт	аадттддссд	садтдттатс	астсатддтт	атддсадсас	Тсагаатгст	6427
сттастдтса	тдссатссдт	аадатдсттт	тстдтдасгд	дтдадтастс	аассаадтса	6487
ттстдадаат	адтдтатдсд	дсдассдадт	тдстсттдсс	сддсдгсаат	асдддатаат	6547
ассдсдссас	атадсадаас	тттаааадтд	стсатсаттд	даааасдттс	ттсддддсда	6607

- 369 017765

ааастстсаа	ддаТсТТасс	дстдттдада	тссадттсда	тдтаасссас	ТсдТдсассс	6667
аастдатстт	садсатсттт	тастттсасс	адсдтттстд	ддтдадсааа	аасаддаадд	6727
саааатдссд	сааааааддд	аатаадддсд	асасддааат	дттдаатаст	сатастсттс	6787
стттттсаат	аттаттдаад	сатттатсад	ддттаттдтс	тсатдадсдд	атасататтт	6847
даатдтаттт	адааааатаа	асааатаддд	дТТссдсдса	сатттссссд	аааадтдсса	6907
сстдасдтсд	асддатсддд	а				6928

<210> 18 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> СТГА4 последовательность внеклеточного домена <400> 18

мет 1

Нт 5

Уа1

А1а

61 η 5

РГО

А1а

Уа1

Уа!

геи 10

А1а

Бег

Бег

Агд

61 у 15

Не

А1а

Бег

р|те

Уа! 20

суз

61 и

туг

А1а

Бег 25

Рго

61 у

гуз

А1а

ТЬг 30

61 и

Уа1

Агд

Уа!

тЬг

Уа1

Геи

Агд

61 η

А1а

Азр

Бег

61 η

Уа1

ТЬг

61 и

Уа1

Суз

35

40

45

А1а

А1а

ТЬг

туг

мет

мет

61 у

Азп

61 и

геи

ТЬг

РЬе

Геи

Азр

Азр

Бег

50

55

60

Не

Суз

тЬг

с1у

ТЬг

Бег

Бег

61 у

А5П

61 η

Уа!

АЗП

Геи

ТЬг

Не

61 п

65

70

75

80

61 у

геи

Агд

А1а

мет

Азр

ТЬг

61 у

геи

туг

Не

суз

гуз

Уа!

61 и

Геи

85

90

95

мет

туг

Рго

РГО

Рго

Туг

туг

Геи

61 у

11 е

61 у

Азп

б!у

ТЬг

61 п

11 е

100

105

но

Туг

Уа!

11 е

Азр

Рго

61 и

Рго

Суз

РГО

Азр

Бег

Азр

115

120

<210> 19 <211> 39 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 19

- 370 017765 адаааадддд стддададат ддстсадТдд ттаададса <210>

<211>

<212>

<213>

ϋΝΑ

Искусственная последовательность <22О>

<223>

Синтетический олигонуклеотид <400> дТасТсадд <210>

<211>

<212>

<213>

ϋΝΑ

Искусственная последовательность <220>

<223>

Синтетический олигонуклеотид <400> адТсададас <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

ϋΝΑ искусственная последовательность

Синтетический олигонуклеотид <400>

сддсадатст стдтдадттт даддссадсс тддтстасаа адсаадтт <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

1152 ϋΝΑ

Искусственная последовательность стБА41д <220>

<221>

<222>

СОБ (1)..(1149) <400>

атд ддт дта мег С1у Уа1 1

стд сТс

аса сад адд

асд стд сте адт стд дтс

стт Беи 15

дса А1а

Беи

Беи 5

тНг

С1п Агд

тНг

Беи Беи 10

Бег Беи

Уа1

СТС

стд

ΐΐΐ

сса

аде

атд

дед

аде

атд

дса

атд

сас

дес

сад

сст

Беи

Беи

РНе

РГО

Бег

мет

А1а

Бег

мет

А1а

мет

нтз

А1а

С1п

Рго

20

25

30

дет

д*д Уа1

дта

стд

дес

аде

аде

еда

ддс С1у

атс

дет

аде

ΐΐΐ

ΐθΐ

дад

А) а

Уа1

Беи

А1а

Бег

Бег

Агд

11 е

А1а

Бег

РНе

Суз

С1и

35

40

45

тат

дса

тст

сса

ддс С1у

ааа

тат

аст

дад

д^с

едд

аса

стт

едд

туг

А1а

Бег

Рго

Буз

Туг

тНг

61 и

Уа1

Агд

тНг

Беи

Агд

50

55

60

144

192

- 371 017765

сад 61η 65

дсг дас аде

сад дгд асг даа дгс

гдг суз

дед дса асе

гас туг

агд мег

агд мег 80

240

А1а Азр

Бег

61 п

Уа1 70

тЬг

61 и

Уа!

А1 а 75

А1а

ТЬг

ддд 61у

ааг

дад

ггд

асе

ггс

сга

даг

даг

гее

аге

где

асд

ддс 61у

асе

гее

288

АЗП

С1 и

геи

тЬг

РЬе

геи

Азр

Азр

Бег

Не

суз

тЬг

ТЬг

Бег

85

90

95

адг

дда с Ту

ааг

саа

аас

сгс

асг

аге

саа

дда 61у

егд

адд

дес

агд

дас

336

Бег

АЗП

С1п

АЗП

геи

тЬг

Не

61 п

геи

Агд

А1а

мег

Азр

100

105

110

асд

дда 61 у

сгс

гас

аге

где

аад

дгд Уа1 120

дад

сгс

агд

гас

сса

сед

сса

гас

384

тЬг

геи 115

туг

11 е

суз

гуз

61 и

геи

мег

туг

РГО 125

РГО

рго

Туг

гас

дад

ддс 61 у

ага

ддс 61 у

аас

дда 61 у

асе

сад

агг

гаг

дга

агг

даг

сса

даа

432

Туг

61 и

11 е

Азп

тЬг

61 п

Не

ту г

Уа!

Не

Азр

Рго

61 и

130

135

140

сед

где

сса

даг

гсг

даг

сад

дад

ссс

ааа

гсг

гсг

дас

ааа

асг

сас

480

РГО

суз

Рго

АЗр

Бег

Азр

61 п

61 и

Рго

гуз

Бег

Бег

Азр

гуз

тЬг

Нтз

145

150

155

160

аса

гее

сса

сед

гее

сса

дса

ссг

даа

сгс

сед

???

дда 61 у

есд

гса

дгс

528

ТЬг

Бег

РГО

РГО

Бег

рго

А1а

РГО

61 и

геи

геи

Бег

Бег

Уа!

165

170

175

ггс

сгс

ггс

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асе

сгс

агд

аге

гее

едд

асе

576

РЬе

геи

РЬе

рго 180

Рго

гуз

РГО

гуз

Азр 185

ТЬг

геи

мег

Не

Бег 190

Агд

ТЬг

ссг Рго

дад 61 и

дгс Уа!

аса тЬг

где суз

дгд дгд дгд Уа! Уа1 Уа1

дас Азр

дед уа!

аде Бег

сас НТВ

даа 61 и

дас Азр

ссг Рго

дад 61 и

624

195

200

205

дгс

аад

ггс

аас

гдд

гас

дас

ддс 61 у

дгд Уа1

дад

саг

ааг

дес

аад

672

Уа1

гуз

рЬе

АЗП

тгр

Туг

Азр

61 и

Нтз

АЗП

А1а

гуз

210

215

220

аса

аад

сед

едд

дад

дад

сад

гас

аас

аде

асд

гас

едг

дгс

аде

720

ТЬг

гуз

РГО

Агд

61 и

61 и

61 π

туг

Азп

Бег

ТЬг

туг

Агд

Уа!

Бег

225

230

235

240

дгс

сгс

асе

дгс

егд

сас

сад

дас

едд

егд

ааг

ддс б1у

аад

дад

гас

аад

768

Уа!

геи

ТЬг

Уа1

геи 245

нтз

61 п

Азр

Тгр

геи 250

Азп

гуз

61 и

туг 255

гуз

где

аад

дгс

гее

аас

ааа

дес

сгс

сса

дес

ссс

аге

дад

ааа

асе

аге

816

суз

гуз

Уа1

Бег

Азп

гуз

А1а

геи

рго

А1а

рго

Не

61 и

гуз

ТЬг

Не

260

265

270

гее

ааа

дес

ааа

ддд 61 у

сад

ссс

еда

даа

сса

сад

дед Уа!

гас

асе

егд

ссс

864

Бег

гуз

А1а

гуз

61 п

рго

Агд

61 и

РГО

61 п

ту г

тЬг

геи

РГО

275

280

285

сса

гее

едд

даг

дад

егд

асе

аад

аас

сад

дгс

аде

сед

асе

где

егд

912

Рго

Бег

Агд

Азр

61 и

геи

ТЬг

гуз

АЗП

61 п

уа!

Бег

геи

тЬг

суз

геи

290

295

300

дгс

ааа

ддс 61 у

ггс

гаг

ссс

аде

дас

аге

дес

дад

едд

дад

аде

ааг

960

Уа1

гуз

РЬе

туг

РГО

Бег

Азр

11е

А1а

61 и

тгр

61 и

Бег

АЗП

305

310

315

320

ддд С1у

сад

сед

дад

аас

аас

гас

аад

асе

асд

ссг

ссс

егд

дас

гее

1008

61 η

Рго

С1и

АЗП

АЗП

туг

гуз

тЬг

ТЬг

рго

РГО

геи

Азр

Бег

325

330

335

- 372 017765

дас ддс

тсс ттс

ттс СТС РЬе ьеи

тас аде

аад стс

асе дтд дас аад

аде Бег

адд Агд

1056

А5р

61 у

Бег

Рпе 340

Туг

Бег

ьуз 345

ьеи

тЬг

Уа!

Азр

ьуз 350

*дд

сад

сад

999

аас

дтс

ттс

тса

тде

тсс

атд

сат

дад

дет

стд

1104

Тгр

01 η

01 η

01 у

Азп

Уа!

РЬе

Бег

Суз

Бег

мет

нтз

01 и

А1а

ьеи

355

360

365

сас

аас

сас

Тас

асд

сад

аад

аде

СТС

тсс

стд

тст

ссд

дд* С1у

ааа

Тда

1152

нтз

АЗП

нтз

Туг

ТЬг

01 п

ьуз

Бег

Ьеи

Бег

ьеи

Бег

Рго

ьуз

370

375

380

<210> 24 <211> 124 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> СТЬА4 внеклеточный домен с Α29Υ и Ь104Е <400>24

мет

нтз

Уа!

А1а

01 п

Рго

А1а

Уа1

Уа!

ьеи

А1а

Бег

Бег

Агд

01 у

Не

1

5

10

15

А1а

Бег

РЬе

Уа!

Суз

01 и

туг

А1а

Бег

РГО

01 у

ьуз

туг

ТЬг

01 и

УаТ

20

25

30

Агд

Уа1

тЬг 35

Уа!

Ьеи

Агд

01 п

А1а 40

АЗр

Бег

01 п

Уа1

тЬг 45

01 и

Уа1

суз

А1а

А1а

ТЬг

Туг

Мет

Мет

01 у

АЗП

01 и

Ьеи

тЬг

РЬе

Ьеи

А5р

Азр

Бег

50

55

60

Не

Суз

ТЬг

01 у

ТЬг

Бег

Бег

01 у

А5П

01 п

Уа!

АЗП

Ьеи

ТЬг

Не

01 п

65

70

75

80

01 у

Ьеи

Агд

А1а

мет

Азр

ТЬг

01 у

ьеи

туг

Не

суз

ьуз

Уа!

01 и

Ьеи

85

90

95

мет

туг

Рго

Рго

рго

Туг

Туг

01 и

01 у

Не

01 у

АЗП

01 у

тЬг

01 п

11 е

100

105

110

туг

Уа1

11 е

Азр

Рго

01 и

Рго

Суз

РГО

Азр

Бег

АЗр

115

120

<210>25 <211>15 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> трипсиновый пептид <400> 25

- 373 017765

А1а мет нтз Уа1 А1а 61 η Рго А1а Уа! Уа!	Геи А1а Бег Бег Агд 15
1	5	10
<210>	26
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Трипсиновый пептид
<400>	26
мет Нтз Уа! А1а 61 η рго А1а Уа!	Уа! геи	А1а	Бег	Бег	Агд
1	5	10
<210>	27
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственная последовательность
чс с. <223>	трипсиновый пептид
<400>	27
61у Не А1а Бег РКе Уа! Суз 61и	Туг А1а	Бег	рго	61 у	гуз

5 10 <210> 28 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>28

А1а тЬг С1и Уа1 Агд <210>29 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>29

Уа! ТКг Уа! Геи Агд <210>30 <211>45 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 30 п А1а Азр Бег с!п Уа! ТЬг 61 и Уа1 Суз А1а А1а ТЬг Туг мет мет

- 374 017765

1

5

10

15

61 у

Азп

61 и

геи

Ткг

Рке

геи

Азр

Азр

Бег

11 е

Суз

Ткг

61 у

ткг Бег

20

25

30

Бег

61 у

Азп

61 п

Уа!

А5П

геи

ткг

Не

61 п

61 у

геи

Агд

35

40

45

<210> 31 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>31

А1а Мес Азр ткг С1у геи туг 11е суз гуз

1	5	10
<210> <211> <212> <213> <220> <223>	32 35 БЕЛОК искусственная последовательность
Трипсиновый пептид
<400>	32

Уа1 1

61 и

геи

Мес

Туг 5

РГО

Рго

Рго Туг Туг 10

геи

61 у

11 е

61 у

АЗП 15

61 у

Ткг

61 η

Не

туг

уа!

Не

Азр

Рго 61 и Рго

суз

РГО

А5Р

Бег

Азр

61 η

20

25

30

и Рго Еуз <210>33 <211>4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 33

Бег Бег А5р гуз

<210> <211> <212> <213>	34 26 БЕЛОК Искусственная последовательность
<22О> <223>	Синтетический пептид

- 375 017765 <400>34

ТЬг нтз тНг Бег Рго Рго Бег Рго А1а Рго С1и Беи Беи С1у С1у Бег 15 1015

Бег Уа1 РНе Беи РНе Рго Рго Буз Рго Буз

2025 <210> 35 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>35

Азр тНг Беи мет 11е Бег Агд <210>36 <211>19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>36 тНг рго С1и 7а1 тНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Бег Нтз С1и Азр Рго 15 1015

С1 и Уа! Буз <210>37 <211>14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Синтетический пептид <400>37

РНе Азп тгр туг Уа1 Азр с!у Уа1 С1и Уа1 нт 5 Азп А1а Буз 1510 <210>38 <211>4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400> 38

ТНг Буз Рго Агд

- 376 017765 <210> 39 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> трипсиновый пептид <400> 39 и 61 и 61η туг Азп Бег тНг Туг Агд <210> 40 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> трипсиновый пептид <400>40

Уа! Уа1 Бег Уа1 теи ТЬг Уа1 Теи нтз 61 η Азр тгр Теи Азп 61 у Туз

1015 <210>41 <211>4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 41

Уа! Бег азп Туз <210> 42 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>42

А1а Теи Рго А1а Рго 11 е б1и Туз <210>43 <211>4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 43

ТНг 11е Бег туз

- 377 017765 <210> 44 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400> 44

С1у 61 η Рго Агд <210> 45 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>45 и Рго 61 η Уа! туг тЬг ьеи Рго Рго Бег Агд

510 <210>46 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>46

Азр 61 и Ьеи ТЬг ьуз <210>47 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>47

Азп 61п Уа1 Бег Ьеи тЬг суз Ьеи Уа! ьуз 1510 <210>48 <211> 22 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 48

О1у РЬе туг Рго Бег Азр 11е А1а Уа1 61 и Тгр 61 и Бег Азп 61у 61п 15 10 15

- 378 017765

Рго 61 и Азп Азп Туг ьуз <210> 49 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>49 ткг ткг рго Рго Уа1 геи Азр Бег Азр б1у Бег Рке Рке геи туг Бег

1015 гуз <210>50 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>50 геи ткг Уа! Азр гуз <210>51 <211> 23 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>51

Тгр 61η 61п б!у Азп Уа! Рке Бег Суз Бег Уа1 Мес Нт5 б!и А1а Ееи

1015

Нтз Азп Нтз Туг Ткг 61п Еуз <210>52 <211>7 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400> 52

Бег геи Бег геи Бег рго б!у

5

- 379 017765 <210> 53 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>53

Бег ьеи Бег Беи Бег Рго С1у Буз <210>54 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> трипсиновый пептид <400>54 у 11 е А1а Бег РНе \/а1 Суз С1и Туг <210>55 <211> И <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>55

РНе Азп Тгр Туг \/а1 Агр 61 у \/а! 61 и \/а1 нтз

510 <210>56 <211>15 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> трипсиновый пептид <400>56 тНг тНг Рго Рго \/а! Беи Азр Бег Азр С1у Бег РНе РНе Беи Туг 15 1015 <210>57 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400> 57

Тгр 61 η 61 η 61 у Азп \/а1 РНе Бег Суз

5

- 380 017765 <210> 58 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>58 тгр с!п СТ η СТ у Азп УаТ рЬе <210>59 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400> 59 туг ТЬг С1и УаТ Агд <210> 60 <211> 35 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 60

УаТ

СТи

геи

Мег

Туг

РГО

Рго

Рго туг

туг

С1и

С1у

Не

С1у

АЗП

С1у

1

5

10

15

ТЬг

6ΐη

11 е

Туг

Уа!

Не

Азр

Рго С1и

РГО

суз

Рго

Азр

Бег

АЗр

61 п

20

25

30

сТи Рго гуз <210> 61 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 61

С1п А1а Азр Бег С1п Уа1 тЬг сТи Уа1 Суз А1а АТа тЬг туг мег мег

10 15 у

- 381 017765 <210> 62 <211> 28 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Триш	синовый пептид
<400> 62
Азп Агд геи	61 у	61 η 11е 5	тЬг	геи Азп	Уа! 10	61 η	Азп 61 у	Бег Бег тЬг 15
с!у тЬг Суз	11 е	Бег Азр	Азр	геи РЬе	ТЬг	Геи	61 и
20			25

<210> 63 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400> 63

Уа1 Суз 61и Туг <210> 64 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>64

Суз 1_еи Уа1 Гуз <210>65 <211>5 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>65

Бег Суз Бег Уа1 мет <210> 66 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400> 66

Уа1 11е Азр Рго С1и Рго Суз Рго Азр Бег Азр С1п С1и Рго Гуз

- 382 017765

10 15 <210> 67 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>67

61η А1а Азр Бег б!п Уа! ТЬг с!и Уа1 Суз А1а А1а тНг туг Мег мег

1015 у Азп Агд Теи 61 у 61п 11е ТНг Теи Уа!

2025 <210> 68 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Трипсиновый пептид <400>68

61η азп б!у Бег Бег тНг б!у тНг суз 11е Бег Азр Азр теи РНе тНг

1015

Теи 61 и <210>69 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400>69 тНг Суз 11е Бег Азр Азр теи РНе <210>70 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Азр-Ν пептид <400>70 б1и Уа! Суэ А1а А1а тНг туг Мег мег 61у Азп

510 <210>71 <211> 6

- 383 017765 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> трипсиновый пептид <400>71

Ме! Туг Рго Рго Рго Туг <210>72 <211>23 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> трипсиновый пептид <400>72 тгр 61 η 61 η 61 у Азр Уа1 РЬе Бег суз Бег Уа1 мет нтз б!и Д1а Ьеи 15 1015

Нт 3 АЗП Нтз Туг тЬг 61п ьуз <210>73 <211> 22 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Синтетический пептид <22О>

<221> ΜΟϋ_ΚΕ5 <222> (14)..(14) <223> тзо-Азр <400>73

С1у РЬе Туг Рго Бег Азр 11е А1а Уа1 61 и тгр б!и Бег Аэр б!у 61 η 15 1015

Рго 61 и Азп Азп Туг Ьуз <210>74 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Синтетический пептид <220>

<221> ΜΟϋ_ΚΕ5 <222> (7)..(7) <223> Сат <400> 74

- 384 017765

Уа1 11е Азр Рго С1и Рго Хаа Рго Азр Бег Азр С1л 61 и Рго Ьуз 15 10 15 <210> 75 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический 6х Нт 5 гад <400>75

Нт 5 Нт 3 Нт 5 Нт 5 Нт 8 НТ 5 <210>76 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Азр-Ν Пептид <400>76

Азр 61 η 61 и Рго Ьуз Бег Бег <210>77 <211>13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Трипсиновый пептид <400> 77 тЬг Нтз тЬг Бег Рго Рго Бег Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи 15 10

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Фармацевтическая композиция, содержащая сиалированные молекулы СТ^А4-Iβ, связывающиеся с СО80 и/или СО86, отличающаяся тем, что: а) среднее молярное отношение ^ацетилнейраминовой кислоты (NАNА) к молекулам СТ^А4-Iβ составляет от примерно 8 до примерно 12 и б) высокомолекулярные формы молекул СТ^А4-Iβ составляют 5.0% по площади или менее по определению методами эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрии.
2. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что высокомолекулярные формы составляют менее 2.5% по площади от молекул СТ^А4-Iβ по определению методами эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрии.
3. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что высокомолекулярные формы составляют 0.5% по площади или менее от молекул СТЕА4-[§ по определению методами эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрии.
4. 4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что: а) среднее молярное отношение NАNА к молекулам СТ^А4-Iβ составляет от 8 до 11.9 и б) высокомолекулярные формы составляют 2.0% по площади молекул или менее от молекул СТ^А4-Iβ по определению методами эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрии.
5. 5. Композиция по п.2, также отличающаяся тем, что содержание в ней примесного моноцитарного хемотаксического белка-1 составляет менее около 5 ррт.
6. 6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что димеры СТ^А4-Iβ составляют 95% по площади или более от молекул СТ^А4-Iβ по определению методами эксклюзионной хроматографии.
7. 7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что низкомолекулярная форма составляет 1.0% по площади или менее от молекул СТ^А4-Iβ по определению методами эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрии.
8. 8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что низкомолекулярная форма составляет 0.5% по площади или менее от молекул СТ^А4-Iβ по определению методами эксклюзионной хроматографии и спектрофотометрии.
9. 9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что молекулы СТИ/ЫЗд содержат один или несколько полипетидов, имеющих 8ЕР ГО N0:2, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
10. 10. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что молекулы СТ^А4-Iβ содержат один или несколько полипетидов, имеющих 8ЕР ГО N0:18.
11. 11. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что молекулы СТ^А4-Iβ содержат один или несколько

    - 385 017765 полипетидов, имеющих 8Ε^ ΙΌ N0:4, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.
12. 12. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что молекулы СТЬА4-1д содержат один или несколько полипетидов, имеющих 8Ε^ ΙΌ N0:24.
13. 13. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-12 для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения гомологичной болезни (реакции трансплантатпротив-хозяина), лечения или предупреждения отторжения трансплантированного органа, ткани или клетки, лечения иммунного расстройства, связанного с отторжением трансплантата, лечения псориаза, лечения волчанки, лечения ревматоидного артрита или лечения рассеянного склероза.