ES2708759T3 - Procedimientos para el tratamiento de la neurodegeneración - Google Patents

Abstract

Una preparación para su uso en un procedimiento para tratar la neurodegeneración en un sujeto, comprendiendo la preparación polipéptidos que tienen una región Fc, en la que al menos el 70 % de glicanos ramificados en la región Fc de dichos polipéptidos en dicha preparación tienen al menos una galactosa conectada a un ácido siálico terminal respectivo en un brazo α 1,3 del glicano ramificado, unido a la galactosa a través de un enlace terminal NeuAc-α 2,6-Gal; y en la que dichos polipéptidos se derivan de IVIG.

Description

DESCRIPCION

Procedimientos para el tratamiento de la neurodegeneracion

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0001] Los polipeptidos terapeuticos son una clase importante de productos de biotecnologla terapeutica, y los polipeptidos que contienen Fc terapeuticos, tal como IVIG, fusiones de receptores de Fc y anticuerpos (incluidos los anticuerpos murinos, quimericos, humanizados y humanos y fragmentos de los mismos) representan la mayorla de los productos biologicos terapeuticos.

[0002] La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad relacionada con la edad que involucra neurodegeneracion que da como resultado una perdida progresiva de la funcion cognitiva. Actualmente se usan cinco medicamentos para tratar las manifestaciones cognitivas de la EA: cuatro son inhibidores de la acetilcolinesterasa (tacrina, rivastigmina, galantamina y donepezilo) y el otro (memantina) es un antagonista del receptor de NMDA. RESUMEN DE LA INVENCION

[0003] La presente invention proporciona una preparation para su uso en un procedimiento para tratar la neurodegeneracion en un sujeto, comprendiendo la preparacion polipeptidos que tienen una region Fc, en la que al menos el 70 % de los glicanos ramificados en la region Fc de dichos polipeptidos en dicha preparacion tienen al menos una galactosa conectada a un acido sialico terminal respectivo en un brazo a 1,3 del glicano ramificado, unido a la galactosa a traves de un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal; y en la que dichos polipeptidos se derivan de IVIG.

[0004] Mas en general, la presente description abarca el descubrimiento de que los polipeptidos que contienen Fc que incluyen glicanos ramificados y que estan sialilados en el glicano ramificado (p. ej., en un brazo a 1,3 y/o a 1,6 en el sitio de glosilacion unido a N de la region Fc), con, p.ej., un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal o NeuAc-a 2,3-Gal, son utiles para tratar la neurodegeneracion, p. ej., en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer. La presente descripcion proporciona, en parte, procedimientos para tratar la neurodegeneracion o enfermedades neurodegenerativas mediante la administration de composiciones que contienen dichos polipeptidos que contienen Fc, as! como procedimientos para evaluar, identificar y/o producir (p. ej., fabricar) dichos polipeptidos para el tratamiento de la neurodegeneracion.

[0005] En un primer aspecto, la presente descripcion presenta un procedimiento para el tratamiento de la neurodegeneracion. El procedimiento incluye administrar (p. ej., a un sujeto que lo necesite) una preparacion que incluye polipeptidos que tienen una region Fc (p. ej., una region Fc de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) en la que al menos el 10 % (p. ej., al menos 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, hasta e incluyendo el 100 %) de los glicanos ramificados (p. ej., en la region Fc) tiene al menos una galactosa conectada a un acido sialico terminal respectivo (es decir, estan sialilados).

[0006] En determinadas realizaciones de la descripcion, los glicanos ramificados (p. ej., al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, hasta e incluyendo el 100 %), estan sialilados en un brazo a 1,3 del glicano ramificado (p. ej., a traves de un enlace terminal NeuAc-a 2, 6-Gal y/o NeuAc-a 2,3-Gal).

[0007] En algunas realizaciones, los polipeptidos se derivan de IVIG (p. ej., IgG sialiladas purificadas o enriquecidas de IVIG; IVIG modificada (p. ej., sialilada enzimaticamente) o regiones Fc producidas a partir de IVIG). En otras realizaciones, los polipeptidos son regiones Fc derivadas de IVIG (por ejemplo, digestion con papalna y sialilacion).

[0008] En determinadas realizaciones, la preparacion incluye polipeptidos recombinantes que tienen una region Fc (p. ej., una region Fc de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) en la que al menos el 10 % (p. ej., al menos 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, hasta e incluyendo el 100 %) de los glicanos ramificados (p. ej., en la region Fc) tienen al menos una galactosa conectada a un acido sialico terminal respectivo (es decir, estan sialilados).

[0009] En determinadas realizaciones de cualquiera de los procedimientos anteriores, los polipeptidos incluyen una region Fab de IgG que esta o no esta sialilada.

[0010] En otras realizaciones, los polipeptidos son regiones Fc (p. ej., regiones Fc recombinantes) o polipeptidos que contienen regiones Fc (p. ej., que contienen regiones Fc recombinantes).

[0011] En realizaciones adicionales de cualquiera de los procedimientos anteriores, los polipeptidos se administran en una formulation farmaceutica (p. ej., incluyendo un portador o diluyentes farmaceuticamente aceptables).

[0012] En otro aspecto, la presente descripcion presenta un procedimiento de fabricacion de un producto farmaceutico para el tratamiento de la neurodegeneracion. Este procedimiento incluye: proporcionar una muestra de una preparacion de ensayo que incluye polipeptidos (p. ej., polipeptidos que tienen una region Fc); determinar el porcentaje de glicanos ramificados (p. ej., en las regiones Fc) de los polipeptidos que poseen un resto galactosa conectado a un acido sialico terminal; y procesar la preparacion de ensayo en un producto farmaceutico para el tratamiento de la neurodegeneracion si el porcentaje de glicanos ramificados (p. ej., en las regiones Fc) de los polipeptidos es mayor que 10 % (p. ej., mayor que 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 hasta e incluyendo el 100 %), fabricando as! un producto farmaceutico para el tratamiento de la neurodegeneracion.

[0013] En una realizacion adicional, la presente descripcion presenta otro procedimiento de fabricacion de un producto farmaceutico. Este procedimiento incluye: proporcionar una muestra de una preparacion de ensayo que incluye polipeptidos (p. ej., polipeptidos que tienen una region Fc); determinar el porcentaje de glicanos ramificados (p. ej., en las regiones Fc) de los polipeptidos que tienen al menos una galactosa conectada a un acido sialico terminal (p. ej., en un brazo a 1,3 del glicano, unida a la galactosa a traves de un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal); y procesar la preparacion de ensayo en un producto farmaceutico si el porcentaje de glicanos ramificados (p. ej., en las regiones Fc) de los polipeptidos es mayor que 10 % (p. ej., mayor que 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, hasta e incluyendo el 100 %), fabricando as! un producto farmaceutico.

[0014] En realizaciones adicionales, la etapa de procesamiento incluye combinar la preparacion de ensayo con un excipiente o tampon.

[0015] En otras realizaciones, la etapa de procesamiento incluye: (a) combinar (p. ej., formular) la preparacion con un excipiente farmaceuticamente aceptable; y (b) envasar la combinacion con instrucciones para su uso en el tratamiento de una o mas enfermedades neurodegenerativas.

[0016] En otras realizaciones mas, la etapa de procesamiento incluye uno o mas de: formular la preparacion de ensayo; procesar la preparacion de ensayo en un medicamento; combinar la preparacion de ensayo con un segundo componente, p. ej., un excipiente o tampon; cambiar la concentracion del polipeptido en la preparacion; liofilizar la preparacion de ensayo; combinar una primera y segunda partes allcuotas del polipeptido para proporcionar una tercera parte allcuota mas grande; dividir la preparacion de ensayo en partes allcuotas mas pequenas; disponer la preparacion de ensayo en un recipiente, p. ej., un recipiente hermetico de gases o llquidos; envasar la preparacion de ensayo; asociar un recipiente que comprende la preparacion de ensayo con una etiqueta (p. ej., etiquetado); y enviar o trasladar la preparacion de ensayo a una ubicacion diferente.

[0017] En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos anteriores, los polipeptidos incluyen una region Fc de IgG humana (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). En otras realizaciones de cualquiera de los procedimientos anteriores, los polipeptidos incluyen IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, o una mezcla de las mismas.

[0018] En un aspecto adicional, la descripcion presenta un procedimiento de selection de una preparacion util para el tratamiento de la neurodegeneracion. Este procedimiento incluye las etapas de proporcionar una muestra de una preparacion de ensayo (p. ej., derivada de IVIG) que incluye polipeptidos (p. ej., polipeptidos que tienen una region Fc de IgG); adquirir un valor de entrada para la preparacion de ensayo para uno o mas parametros enumerados en la tabla 1; adquirir una o mas evaluaciones realizadas al comparar el valor de entrada para la preparacion de ensayo con uno o mas valores objetivos, y seleccionar la preparacion de ensayo como util para el tratamiento de la neurodegeneracion si los valores de entrada para al menos un parametro en la preparacion de ensayo enumerados en la tabla 1 cumple el valor objetivo correspondiente para el parametro.

[0019] En algunas realizaciones, la preparacion de ensayo se deriva de IVIG. En determinadas realizaciones, la preparacion de ensayo es una preparacion de IVIG modificada o fraction de IVIG. En otras realizaciones, la preparacion de ensayo incluye una region Fc derivada de IVIG.

[0020] En determinadas realizaciones de cualquiera de los procedimientos anteriores, la neurodegeneracion se relaciona con una enfermedad seleccionada de entre el grupo que consiste en demencia relacionada con la edad, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), ataxia cerebelosa, enfermedad de Creutzfedt-Jakob, slndrome de Down, degeneraciones/demencia del lobulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, miositis por cuerpos de inclusion, demencia con cuerpos de Lewy, polineuropatla desmielinizante inflamatoria cronica, slndrome de Guillain-Barre, slndrome de Charcot-Marie-Tooth, miastenia grave, slndrome miastenico de Lambert-Eaton, neuropatlas motoras multifocales, esclerosis multiple, atrofia sistemica multiple, enfermedad de Parkinson, demencia vascular, slndrome de Lennox-Gastaut, ataxia telangiectasia, enfermedad de Lyme neurodegenerativa, encefalomielitis aguda diseminadora, disautonomla idiopatica aguda, adrenoleucodistrofia, encefalitis desmielinizante del tronco encefalico, neuropatla desmielinizante asociada con IgM monoclonal, mielopatla asociada a HTLV-1, otras neurodegeneraciones paraneoplasicas, neuropatla o encefalopatlas, plexitis lumbosacra o braquial, slndrome POEMS, ataxia cerebral postinfeccion, presbiacusia, ataxia espinocerebelosa, otras neuropatlas perifericas (p. ej., mononeuropatla, mononeuritis multiple, polineuropatla, neuropatla autonomica y neuritis) y demencia vascular.

Tabla 1

[0021] En el caso de que una o mas de la bibliografla y materiales similares citados en este documento difieran o contradigan esta memoria descriptiva incluidos, pero no limitados a, los terminos definidos, el uso de los terminos, las tecnicas descritas o similares, esta memoria descriptiva prevalece. Los encabezados de seccion usados en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito de ninguna manera.

[0022] Estos y otros aspectos se describen con mas detalle a continuation y en las reivindicaciones.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

[0023]

La figura 1 es una ilustracion esquematica de un pentasacarido central comun (Man)³(GlcNAc)(gLCNAc) de IN-glicanos.

La figura 2 es una ilustracion esquematica de una molecula de anticuerpo IgG

La figura 3A representa una secuencia de aminoacidos de sialiltransferasa ST6 ejemplar (SEQ ID NO: 1).

La figura 3B representa una secuencia de aminoacidos de sialiltransferasa ST6 ejemplar (SEQ ID NO:2).

La figura 3C representa una secuencia de aminoacidos de sialiltransferasa ST6 ejemplar (SEQ ID NO:3).

La figura 4 es una ilustracion esquematica de un esquema de reaction para la sialiltransferasa ST6 (fucosa: triangulos, N-acetilglucosamina: cuadrados, manosa: clrculos oscuros, galactosa: clrculos claros, acido sialico: diamantes). La figura 5 es una representation grafica de la abundancia relativa de glicanos en diversos momentos durante una reaccion de sialilacion con sialiltransferasa ST6.

La figura 6 es una imagen que muestra el diseno experimental.

La figura 7 es una imagen que muestra el curso cllnico de EAE.

Las figuras 8A y 8B son imagenes que muestran la mayor frecuencia de celulas T en el bazo despues del tratamiento. Las figuras 9A -9D son imagenes que muestran la frecuencia aumentada de celulas T no tratadas previamente y la frecuencia disminuida de celulas T de memoria despues del tratamiento.

La figura 10A-10E son imagenes que muestran la caracterizacion de las poblaciones del SNC usando el analisis FACS. La figura 11A y 11B son imagenes que muestran los niveles de expresion CCL2 (MCP-1) y eotaxina despues del tratamiento.

DESCRIPCION DETALLADA

[0024] Los anticuerpos estan glicosilados en posiciones conservadas en las regiones constantes de su cadena pesada. Por ejemplo, los anticuerpos IgG tienen un unico sitio de glicosilacion unido a N en Asn297 del dominio C^h2. Cada isotipo de anticuerpo tiene una variante distinta de estructuras de carbohidratos unidos a N en las regiones constantes. Para la IgG humana, el oligosacarido central consiste normalmente en GlcNAc² MAN³ GlcNAc, con diferentes numeros de restos externos. La variation entre las IgG individuales puede producirse mediante la union de galactosa y/o galactosa-acido sialico en una o ambas GlcNAc terminales o mediante la union de un tercer brazo de GIcNAc (bisectriz de GIcNAc).

[0025] La presente descripcion se refiere a preparaciones de polipeptidos (p. ej., preparaciones de polipeptidos que contienen la region Fc (p. ej., anticuerpos contra IVIG, Fc o IgG)) que tienen niveles particulares de glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3, un brazo a 1,6, o ambos, de los glicanos ramificados en la region Fc (p. ej., con un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal). Los niveles pueden medirse en una region Fc individual (p. ej., el numero de glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3, un brazo a 1,6, o ambos, de los glicanos ramificados en la region Fc), o en la composicion global de una preparacion de polipeptidos (p. ej., el numero o porcentaje de glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3, un brazo a 1,6, o ambos, de los glicanos ramificados en la region Fc en una preparacion de polipeptidos).

[0026] Los inventores han descubierto que los polipeptidos que contienen la region Fc que tienen glicanos ramificados que se sialilan preferentemente en un brazo a 1,3 del glicano ramificado en la region Fc (p. ej., con un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal) son utiles para el tratamiento de la neurodegeneracion, p. ej., enfermedades neurodegenerativas. En este documento se describen polipeptidos (p. ej., anticuerpos o protelnas de fusion, tales como las protelnas de fusion Fc) que tienen glicanos ramificados sialilados en un brazo a 1,3 del glicano ramificado en la region Fc (p. ej., con un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal) y utiles en el tratamiento de la neurodegeneracion, p. ej., enfermedades neurodegenerativas. Tambien se describen procedimientos de fabricacion y uso de dichas composiciones.

[0027] Las preparaciones utiles en este documento se pueden obtener de cualquier fuente. En algunos casos, proporcionar u obtener una preparacion (p. ej., tal como un principio activo biologico o un precursor del mismo), p. ej., que es o incluye un polipeptido, puede incluir proporcionar una celula huesped, p. ej., una celula huesped de mamlfero (p. ej., una celula CHO) que esta disenada por ingenierla genetica para expresar un polipeptido (p. ej., una celula modificada por ingenierla genetica); cultivar la celula huesped en condiciones adecuadas para expresar el polipeptido (p. ej., ARNm y/o protelna); y, opcionalmente, purificar el polipeptido expresado, p. ej., en forma de una protelna de fusion recombinante) a partir de la celula cultivada, produciendo as! una preparacion.

Definiciones

[0028] Como se usa en este documento, «adquirir o que adquiere (p. ej., adquirir informacion)» significa obtener la posesion de una entidad flsica, o un valor, p. ej., un valor numerico, mediante la «adquisicion directa» o la «adquisicion indirecta» de la entidad flsica o valor. «Adquirir directamente» significa realizar un procedimiento (p. ej., realizar un ensayo o prueba en una muestra o «analizar una muestra» como se define ese termino en este documento) para obtener la entidad flsica o el valor. «Adquirir indirectamente» se refiere a recibir la entidad flsica o el valor de otra parte o fuente (p. ej., un laboratorio de terceros que adquirio directamente la entidad flsica o el valor). «Adquirir directamente» una entidad flsica incluye realizar un procedimiento, p. ej., analizar una muestra, que incluye un cambio flsico en una sustancia flsica, p. ej., un material de partida. Los cambios ejemplares incluyen fabricar una entidad flsica a partir de dos o mas materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, separar o purificar una sustancia, combinar dos o mas entidades separadas en una mezcla, realizar una reaccion qulmica que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. «Adquirir directamente» un valor incluye realizar un procedimiento que incluye un cambio flsico en una muestra u otra sustancia, p. ej., realizar un procedimiento analltico que incluye un cambio flsico en una sustancia, p. ej., una muestra, analito o reactivo (a veces denominado en este documento «analisis flsico»), realizar un procedimiento analltico, p. ej., un procedimiento que incluye uno o mas de los siguientes: separar o purificar una sustancia, p. ej., un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito, o fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, p. ej., un tampon, un disolvente o un reactivo; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, p. ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo atomo del analito; o cambiando la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, p. ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo atomo del reactivo. Los procedimientos anallticos ejemplares se muestran en la tabla 2.

[0029] Como se usa en este documento, el termino «anticuerpo» se refiere a un polipeptido que incluye al menos una region variable de inmunoglobulina, p. ej., una secuencia de aminoacidos que proporciona un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una region variable de cadena pesada (H) (abreviado en este documento como V^h) y una region variable de cadena ligera (L) (abreviado en este documento como V^l). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L). El termino «anticuerpo» abarca fragmentos de anticuerpos de union a antlgenos (p. ej., anticuerpos de cadena simple Fab, F(ab')² , Fd, Fv, y fragmentos dAb) as! como anticuerpos completos, p. ej., inmunogloblulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (as! como subtipos de las mismas). Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda.

[0030] En algunos casos, una preparacion (p. ej., tal como una preparacion de un polipeptido que contiene la region Fc) puede ser una muestra de un lote propuesto o de ensayo de un medicamento. Como se usa en este documento, un «lote» de una preparacion se refiere a una sola ejecucion de produccion. La evaluacion de diferentes lotes significa, por lo tanto, la evaluacion de diferentes ejecuciones o lotes de produccion. Como se usa en este documento, «muestra o muestras» se refiere a muestras obtenidas por separado. Por ejemplo, la evaluacion de muestras separadas podria significar la evaluacion de diferentes recipientes o viales disponibles en el mercado del mismo lote o de diferentes lotes. Un lote puede incluir un medicamento.

[0031] Como se usa en este documento, la expresion «region constante» se refiere a un polipeptido que corresponde a, o se deriva de, uno o mas dominios de inmunoglobulina de region constante de un anticuerpo. Una region constante puede incluir cualquiera o todos los siguientes dominios de inmunoglobulina: un dominio C^h1, una region bisagra, un dominio C^h2, un dominio C^h3 (derivado de una IgA, IgD, IgG, IgE o IgM) y un dominio C^h4 (derivado de una IgE o IgM).

[0032] Como se usa en este documento, «IVIG» es una preparacion de IgG polivalente combinada, que incluye los cuatro subgrupos de IgG, extraidos del plasma de al menos 1.000 donantes humanos. La IVIG esta aprobada como una terapia de reemplazo de proteinas plasmaticas para pacientes inmunodeficientes. El nivel de sialilacion del glicano de IVIG Fc varia entre aproximadamente el 10-20 % entre las preparaciones de IVIG.

[0033] Como se usa en este documento, la expresion «derivado de IVIG» se refiere a polipeptidos que resultan de la manipulacion de IVIG. Por ejemplo, los polipeptidos purificados a partir de IVIG (p. ej., enriquecidos para IgG sialiladas, IVIG modificadas (p. ej., IgG IVIG enzimaticamente sialiladas), o las regiones Fc de IVIG (p. ej., digestion con papaina y sialilacion) se derivan de IVIG.

[0034] Como se usa en este documento, «evaluar», p. ej., en los aspectos evaluadores/de evaluacion/, identification y/o production descritos en este documento, significa revisar, considerar, determinar, evaluar, analizar, medir y/o detectar la presencia, ausencia, nivel, y/o relation de uno o mas parametros en una preparacion para proporcionar information perteneciente a uno o mas parametros. En algunos casos, la evaluacion puede incluir realizar un procedimiento que implique un cambio fisico en una muestra u otra sustancia, p. ej., un material de partida. Los cambios ejemplares incluyen fabricar una entidad fisica a partir de dos o mas materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, separar o purificar una sustancia, combinar dos o mas entidades separadas en una mezcla, realizar una reaction quimica que incluye romper o formar un enlace covalente o no covalente. «Evaluar» puede incluir realizar un procedimiento analitico que incluye un cambio fisico en una sustancia, p. ej., una muestra, analito o reactivo (a veces denominado en este documento «analisis fisico»), realizar un procedimiento analitico, p. ej., un procedimiento que incluye uno o mas de los siguientes: separar o purificar una sustancia, p. ej., un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito, o fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, p. ej., un tampon, un disolvente o un reactivo; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, p. ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo atomo del analito; o cambiando la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, p. ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo atomo del reactivo.

[0035] Como se usa en este documento, el termino «region Fc» se refiere a un dimero de dos «polipeptidos Fc», incluyendo cada «polipeptido Fc» la region constante de un anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de region constante. En algunas realizaciones, una «region Fc» incluye dos polipeptidos Fc unidos por uno o mas enlaces disulfuro, enlazadores quimicos o enlazadores peptidicos. «Polipeptido Fc» se refiere a los dos ultimos dominios de inmunoglobulina de region constante de IgA, IgD e IgG, y los tres ultimos dominios de inmunoglobulina de region constante de IgE e IgM, y tambien puede incluir parte o todo el extremo N-terminal de la bisagra flexible para estos dominios. Para IgG, el «polipeptido Fc» comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 (C^y2) y Cgamma3 (C^y3) y la parte inferior de la bisagra entre Cgammal (C^y1) y C^y2. Aunque los limites del polipeptido Fc pueden variar, el polipeptido Fc de la cadena pesada de la IgG humana se define generalmente para comprender restos que comienzan en T223 o C226 o P230, hasta su extremo carboxilo, en el que la numeration es segun el indice de la UE como en Kabat y col., (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Services, Springfield, VA). Para IgA, el polipeptido Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Calpha2 (Ca2) y Calpha3 (Ca3) y la parte inferior de la bisagra entre Calphal (Cal) y Ca2. Una region Fc puede ser sintetica, recombinante o generada a partir de fuentes naturales tales como IVIG.

[0036] Un «polipeptido que contiene la region Fc» es un polipeptido que incluye toda o una portion sustancial de una region Fc. Ejemplos de una preparacion de polipeptidos que contiene la region Fc incluyen, p. ej., una preparacion de fragmentos Fc, una preparacion de moleculas de anticuerpo, una preparacion de proteinas de fusion Fc (p. ej., una proteina de fusion del receptor Fc) y una preparacion de moleculas de inmunoglobulina polivalente combinadas (p. ej., IVIG). Dicho polipeptido que contiene la region Fc puede ser recombinante (p. ej., una preparacion de fragmento Fc recombinante o una preparacion de anticuerpo recombinante) o derivado naturalmente (tal como IVIG).

[0037] Como se usa en este documento, la expresion «variante de la region Fc» se refiere a un analogo de una region Fc que posee una o mas actividades mediadas por Fc descritas en este documento. Esta expresion incluye regiones Fc que tienen una o mas modificaciones de aminoacidos (p. ej., sustituciones, adiciones o eliminaciones) en relacion con una region Fc de origen natural o de tipo silvestre. Por ejemplo, las regiones Fc variantes pueden poseer al menos aproximadamente un 50 % de homologia, al menos aproximadamente un 75 % de homologia, al menos aproximadamente un 80 % de homologla, al menos aproximadamente un 85 %, homologla, al menos aproximadamente un 90 % de homologla, al menos aproximadamente un 95 % de homologla, o mas, con una region Fc de origen natural. Por ejemplo, las regiones Fc variantes pueden poseer entre 1 y 5 sustituciones de aminoacidos, p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoacidos tales como sustituciones de fenilalanina a alanina. Las variantes de regiones Fc tambien incluyen regiones Fc que tienen uno o mas restos de aminoacidos anadidos o eliminados del extremo N o C de una region Fc de tipo silvestre.

[0038] Como se usa en este documento, «glicano» es un azucar, que puede ser monomeros o pollmeros de restos de azucar, tales como al menos tres azucares, y puede ser lineal o ramificado. Un «glicano» puede incluir restos de azucar natural (p. ej., glucosa, N-acetilglucosamina, acido N-acetil neuramlnico, galactosa, manosa, fucosa, hexosa, arabinosa, ribosa, xilosa, etc.) y/o azucares modificados (p. ej., 2'-fluororibosa, 2'-desoxirribosa, fosfomanosa, 6'sulfo N-acetilglucosamina, etc.). El termino «glicano» incluye homo y heteropollmeros de restos de azucar. El termino «glicano» tambien abarca un componente de glicano de un glicoconjugado (p. ej., de un polipeptido, glicollpido, proteoglicano, etc.). El termino tambien abarca los glicanos libres, incluidos los glicanos que se han escindido o liberado de otro modo a partir de un glicoconjugado.

[0039] Como se usa en este documento, el termino «glicoprotelna» se refiere a una protelna que contiene una estructura peptldica unida covalentemente a uno o mas restos de azucar (es decir, glicanos). El resto o restos de azucar pueden estar en forma de monosacaridos, disacaridos, oligosacaridos y/o polisacaridos. El resto o restos de azucar pueden comprender una sola cadena no ramificada de restos de azucar o pueden comprender una o mas cadenas ramificadas. Las glicoprotelnas pueden contener restos de azucar unidos a O y/o restos de azucar unidos a N.

[0040] Como se usa en este documento, el termino «neurodegeneracion» se refiere a la perdida progresiva de la estructura o funcion de las neuronas, incluida la muerte de las neuronas. La expresion «enfermedad neurodegenerativa» se refiere a enfermedades en las que la neurodegeneracion es, al menos en parte, una causa, slntoma o fenotipo. Las enfermedades neurodegenerativas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, demencia relacionada con la edad, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), ataxia cerebelosa, enfermedad de Creutzfedt-Jakob, slndrome de Down, degeneraciones/demencia del lobulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, miositis por cuerpos de inclusion, demencia con cuerpos de Lewy, polineuropatla desmielinizante inflamatoria cronica, slndrome de Guillain-Barre, slndrome de Charcot-Marie-Tooth, miastenia grave, slndrome miastenico de Lambert-Eaton, neuropatlas motoras multifocales, esclerosis multiple, atrofia sistemica multiple, enfermedad de Parkinson, demencia vascular, slndrome de Lennox-Gastaut, ataxia telangiectasia, enfermedad de Lyme neurodegenerativa, encefalomielitis aguda diseminadora, disautonomla idiopatica aguda, adrenoleucodistrofia, encefalitis desmielinizante del tronco encefalico, neuropatla desmielinizante asociada con IgM monoclonal, mielopatla asociada a HTLV-1, otras neurodegeneraciones paraneoplasicas, neuropatla o encefalopatlas, plexitis lumbosacra o braquial, slndrome POEMS, ataxia cerebral postinfeccion, presbiacusia, ataxia espinocerebelosa, otras neuropatlas perifericas (p. ej., mononeuropatla, mononeuritis multiple, polineuropatla, neuropatla autonomica y neuritis).

[0041] Como se usa en este documento, un «sitio de N-glicosilacion de un polipeptido Fc» se refiere a un resto de aminoacido dentro de un polipeptido Fc al que un glicano esta unido a N. En algunas realizaciones, una region Fc contiene un dlmero de polipeptidos Fc, y la region Fc comprende dos sitios de N-glicosilacion, uno en cada polipeptido Fc.

[0042] Como se usa en este documento, «porcentaje (%) de glicanos ramificados» se refiere al numero de moles de glicano X en relacion con el total de moles de glicanos presentes, en los que X representa el glicano de interes.

[0043] Como se usa en este documento, «porcentaje (%) de identidad de secuencia» con respecto a una secuencia se define como el porcentaje de restos de aminoacidos o nucleotidos en una secuencia candidata que son identicos a los restos de aminoacidos o nucleotidos en la secuencia de referencia, despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje maximo de identidad de secuencia. Los huecos pueden introducirse en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o acido nucleico para una alineacion optima y las secuencias no homologas pueden ignorarse con fines de comparacion. La alineacion con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia se puede lograr de determinadas maneras que estan dentro de la tecnica, por ejemplo, usando un software informatico disponible publicamente como el software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parametros adecuados para medir la alineacion, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineacion maxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. En una realizacion, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparacion es de al menos el 30 %, p.ej., al menos el 40 %, por ejemplo, al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Luego se comparan los restos de aminoacidos o los nucleotidos en las posiciones de aminoacidos correspondientes o las posiciones de nucleotidos. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. En algunos casos, un producto incluira variantes de aminoacidos, p. ej., especies que difieren en los restos terminales, p. ej., en uno, dos, tres o cuatro restos N-terminales y/o un resto C-terminal. En el caso de dichos casos, la identidad de secuencia que se compara es la identidad entre las secuencias de aminoacidos primarias de las especies activas mas abundantes en cada uno de los productos que se comparan. En algunos casos, la identidad de secuencia se refiere a la secuencia de aminoacidos codificada por un acido nucleico que se puede usar para fabricar el producto.

[0044] La expresion «cantidad farmaceuticamente efectiva» o «cantidad terapeuticamente efectiva» se refiere a una cantidad (p. ej., una dosis) efectiva en el tratamiento de un paciente, que tiene un trastorno o afeccion descrito en este documento. Tambien debe entenderse en este documento que una «cantidad farmaceuticamente efectiva» puede interpretarse como una cantidad que proporciona un efecto terapeutico deseado, ya sea tomada en una dosis o en cualquier dosificacion o via, tomada sola o en combinacion con otros agentes terapeuticos.

[0045] Como se usa en este documento, «polinucleotido» (o «secuencia de nucleotidos» o «molecula de acido nucleico») se refiere a un oligonucleotido, nucleotido o polinucleotido y fragmentos o porciones de los mismos, y a ADN o ARN de origen genomico o sintetico, que puede ser de cadena simple o doble, y representan la cadena sentido o antisentido.

[0046] Como se usa en este documento, «polipeptido» (o «secuencia de aminoacidos» o «protelna») se refiere a una glicoprotelna, oligopeptido, peptido, polipeptido o secuencia de protelna, y fragmentos o porciones de los mismos, y a moleculas de origen natural o sinteticas. «Secuencia de aminoacidos» y terminos similares, como «polipeptido» o «protelna», no pretenden limitar la secuencia de aminoacidos indicada a la secuencia de aminoacidos nativa completa asociada con la molecula de protelna citada.

[0047] «Nivel predeterminado» como se usa en este documento, se refiere a un nivel particular especificado previamente de uno o mas glicanos particulares, p. ej., glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3, y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,6 y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3 y en un brazo a 1,6. En algunas realizaciones, un nivel predeterminado es un valor o intervalo absoluto. En algunas realizaciones, un nivel predeterminado es un valor relativo. En algunas realizaciones, un nivel predeterminado es el mismo o diferente (p. ej., mayor o menor que) un nivel de uno o mas glicanos particulares (p. ej., glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3 y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,6 y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3 y en un brazo a 1,6) en una referencia, p. ej., un producto polipeptldico de referencia, o un documento de referencia, tal como una especificacion, un llmite de alerta o registros de mezclas madre para un producto farmaceutico.

[0048] En algunas realizaciones, un nivel predeterminado es un nivel o intervalo absoluto de (p. ej., numero de moles de) uno o mas glicanos (p. ej., glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3 y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,6 y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3 y en un brazo a 1,6) en una preparacion de polipeptidos. En algunas realizaciones, un nivel predeterminado es un nivel o intervalo de uno o mas glicanos (p. ej., glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3, y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,6, y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3 y en un brazo a 1,6) en una preparacion de polipeptidos en relacion con el nivel total de glicanos en la preparacion de polipeptidos. En algunas realizaciones, un nivel predeterminado es un nivel o intervalo de uno o mas glicanos (p. ej., glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3, y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,6, y/o glicanos ramificados que tienen un acido sialico en un brazo a 1,3 y en un brazo a 1,6) en una preparacion de polipeptidos en relacion con el nivel total de glicanos sialilados en la preparacion de polipeptidos. En algunas realizaciones, un nivel predeterminado se expresa como un porcentaje.

[0049] Por «purificado» (o «aislado») se refiere a un polinucleotido o un polipeptido que se elimina o separa de otros componentes presentes en su entorno natural. Por ejemplo, un polipeptido aislado es uno que esta separado de otros componentes de una celula en la que se produjo (p. ej., el retlculo endoplasmico o las protelnas citoplasmicas y el ARN). Un polinucleotido aislado es uno que esta separado de otros componentes nucleares (p. ej., histonas) y/o de los acidos nucleicos corriente arriba o corriente abajo. Un polinucleotido o polipeptido aislado puede estar al menos libre en un 60 %, o al menos libre en un 75 %, o al menos libre en un 90 %, o al menos libre en un 95 % de otros componentes presentes en el entorno natural del polinucleotido o polipeptido indicado.

[0050] «Polipeptido de referencia», como se usa en este documento, se refiere a un polipeptido que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos que (p. ej., que tiene aproximadamente 95-100 % de aminoacidos identicos de) un polipeptido descrito en este documento, p. ej., un polipeptido con el que se compara. En algunas realizaciones, un polipeptido de referencia es un polipeptido terapeutico descrito en este documento, p. ej., un polipeptido terapeutico aprobado por la FDA.

[0051] Como se usa en este documento, el termino «sialiltransferasa ST6» se refiere a un polipeptido cuya secuencia de aminoacidos incluye al menos una secuencia caracterlstica de y/o muestra al menos el 100 %, 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 % o 70 % de identidad con una protelna involucrada en la transferencia de un acido sialico a una galactosa terminal de un glicano a traves de un enlace a 2,6 (p. ej., ST6 Gal-I). Se conoce en la tecnica una amplia diversidad de secuencias de sialiltransferasa ST6, tales como las descritas en este documento; en algunas realizaciones, una sialiltransferasa ST6 comparte al menos una secuencia caracterlstica de y/o muestra el grado especificado de identidad de secuencia global con una de las sialiltransferasas ST6 expuestas en este documento (cada una de las cuales puede considerarse una sialiltransferasa ST6 de «referencia»). En algunas realizaciones, una sialiltransferasa ST6 como se describe en este documento comparte al menos una actividad biologica con una sialiltransferasa ST6 de referencia como se expone en este documento. En alguna de dichas realizaciones, la actividad biologica compartida se relaciona con la transferencia de un acido sialico a un glicano.

[0052] El termino «sujeto», como se usa en este documento, significa cualquier sujeto para el cual se desea un diagnostico, pronostico o terapia. Por ejemplo, un sujeto puede ser un mamlfero, p. ej., un primate humano o no humano (tal como un simio, mono, orangutan o chimpance), un perro, un gato, una cobaya, un conejo, una rata, un raton, un caballo, ganado o una vaca. En una realization preferida, el sujeto es un ser humano.

[0053] Como se usa en este documento, «valor objetivo» se refiere a un cambio estadlsticamente significativo (p. ej., un cambio mayor al 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % o mas) en relation con un polipeptido no modificado que tiene una region Fc de IgG, p. ej., IVIG.

[0054] El termino «tratamiento» o «que trata», como se usa en este documento, se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera y/o modo efectivo para mejorar una estado, slntoma o parametro asociado con un trastorno o afeccion o para evitar o reducir la progresion de un trastorno o afeccion hasta un grado detectable para un experto en la materia. Una cantidad, manera o modo efectivo puede variar dependiendo del sujeto y puede adaptarse al sujeto.

[0055] Como se usa en este documento, los terminos «acoplado», «enlazado», «unido», «fusionado» y «fusion» se usan indistintamente. Estos terminos se refieren a la union de dos elementos o componentes mas por cualquier medio, incluida la conjugation qulmica o el medio recombinante.

[0056] Los terminos «sobreexpresar», «sobreexpresion» o «sobreexpresado» se refieren indistintamente a un polipeptido o polinucleotido que se transcribe o traduce a un nivel detectable mayor, tal como en una celula cancerosa, en comparacion con una celula de control. El termino incluye la expresion debida a la transcription, el procesamiento postranscripcional, la traduction, el procesamiento postraduccional, la localization celular (p. ej., organulo, citoplasma, nucleo, superficie celular) y la estabilidad de ARN y protelnas, en comparacion con una celula de control. La sobreexpresion se puede detectar usando tecnicas convencionales, p. ej., para detectar ARNm (es decir, TR-RCP, RCP, hibridacion) o protelnas (es decir, ELISA, tecnicas inmunohistoqulmicas). La sobreexpresion puede ser la expresion en una cantidad mayor que aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas en comparacion con una celula de control. En determinados casos, la sobreexpresion es 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o mas, un nivel mas alto de la transcripcion o traduccion en comparacion con una celula de control.

[0057] Si bien la presente description proporciona unidades y procedimientos ejemplares para los procedimientos de evaluation, identification y production descritos en este documento, un experto en la materia apreciara que el rendimiento de los procedimientos de evaluacion, identificacion y produccion en este documento no se limita al uso de esas unidades y/o procedimientos. Por ejemplo, el «porcentaje de glicanos ramificados» proporcionado en este documento se describe en general, como un valor para un glicano o estructura en relacion con el total de glicano o estructura en una base mol/mol. Un experto en la materia entiende que aunque el uso de otras metricas o unidades (p. ej., masa/masa, porcentaje en moles contra porcentaje en peso) para medir un parametro descrito puede dar lugar a valores absolutos diferentes a los descritos en este documento, una preparation de ensayo cumple con un valor objetivo descrito incluso si se usan otras unidades o metricas, siempre que la preparacion de ensayo cumpla el valor descrito en este documento cuando se usan las unidades y metricas descritas en este documento, p. ej., permitiendo que la sensibilidad (p. ej., variabilidad analltica) del procedimiento que se usa mida el valor.

I. Polipeptidos

[0058] Ejemplos de una preparacion de polipeptidos que contiene la region Fc incluyen, p. ej., una preparacion de fragmentos Fc, una preparacion de moleculas de anticuerpo, una preparacion de protelnas de fusion Fc (p. ej., una protelna de fusion del receptor Fc) y una preparacion de moleculas de inmunoglobulina polivalente combinadas (p. ej., IVIG). Los polipeptidos que contienen la region Fc pueden ser recombinantes o derivados naturalmente.

[0059] Los polipeptidos derivados naturalmente que se pueden usar en los procedimientos de la descripcion incluyen, por ejemplo, inmunoglobulina intravenosa (IVIG) y polipeptidos derivados de IVIG (p. ej., polipeptidos purificados a partir de IVIG (p. ej., enriquecidos para IgG sialiladas), IVIG modificada (p. ej., IgG de IVIG sialiladas enzimaticamente, o regiones Fc de IVIG (p. ej., digestion con papalna y sialiladas)).

[0060] Los polipeptidos recombinantes que contienen la region Fc que se pueden usar en los procedimientos de la descripcion se pueden expresar, por ejemplo, y purificar a partir de celulas CHO y sialilarse usando la enzima ST6-Gal sialtransferasa humana (expresada y purificada a partir de celulas de E. coli) o se expresan y se purifican a partir de celulas CHO y sialilarse usando la enzima ST6-Gal sialtransferasa humana (expresada y purificada a partir de celulas CHO).

A. Glicosilacion ligada a N

[0061] Las cadenas de oligosacaridos unidas a N se anaden a una protelna en el lumen del retlculo endoplasmatico. Especlficamente, se anade un oligosacarido inicial (tlpicamente 14-azucar) al grupo amino en la cadena lateral de un resto de asparagina contenido dentro de la secuencia de consenso objetivo de Asn-X-Ser/Thr, en la que X puede ser cualquier aminoacido excepto prolina. La estructura de este oligosacarido inicial es comun a la mayorla de los eucariotas y contiene 3 restos de glucosa, 9 de manosa y 2 de N-acetilglucosamina. Esta cadena inicial de oligosacaridos puede recortarse mediante enzimas glicosidasas especlficas en el retlculo endoplasmico, lo que da como resultado un oligosacarido de nucleo ramificado corto compuesto por dos restos de N-acetilglucosamina y tres de manosa. Una de las ramas se denomina en la tecnica el «brazo a 1,3», y la segunda rama se denomina el «brazo a 1,6» como se indica en la figura 1.

[0062] Los N-glicanos se pueden subdividir en tres grupos distintos llamados «tipo de alto contenido en manosa», «tipo hlbrido» y «tipo complejo», con un nucleo de pentasacarido comun (Man (a 1,6)-(Man (a 1,3)-Man (p 1,4)-GlcpNAc (p 1,4)-GlcpNAc (p 1, N)-Asn) que aparece en los tres grupos.

[0063] Despues del procesamiento inicial en el retlculo endoplasmico, el polipeptido se transporta al Golgi donde puede tener lugar un procesamiento adicional. Si el glicano se transfiere al Golgi antes de recortarlo completamente a la estructura del pentasacarido central, se obtiene un «glicano de alto contenido en manosa».

[0064] Ademas o como alternativa, se pueden anadir una o mas unidades de monosacaridos de N-acetilglucosamina a las subunidades de manosa central para formar un «glicano complejo». La galactosa se puede anadir a las subunidades de N-acetilglucosamina, y las subunidades de acido sialico se pueden anadir a las subunidades de galactosa, dando como resultado cadenas que terminan con cualquiera de un acido sialico, una galactosa o un resto de N-acetilglucosamina. Ademas, se puede anadir un resto de fucosa a un resto de N-acetilglucosamina del oligosacarido central. Cada una de estas adiciones esta catalizada por glucosil transferasas especlficas.

[0065] Los «glicanos hlbridos» comprenden las caracterlsticas de los glucanos tanto complejos como de alto contenido en manosa. Por ejemplo, una rama de un glicano hlbrido puede comprender principalmente o exclusivamente restos de manosa, mientras que otra rama puede comprender azucares N-acetilglucosamina, acido sialico, galactosa y/o fucosa.

[0066] Los acidos sialicos son una familia de monosacaridos de 9 carbonos con estructuras anulares heteroclclicas. Llevan una carga negativa a traves de un grupo acido carboxllico unido al anillo, as! como otras decoraciones qulmicas, incluidos los grupos N-acetilo y N-glicolilo. Los dos tipos principales de restos de sialilo encontrados en los polipeptidos producidos en sistemas de expresion de mamlferos son el acido N-acetil-neuramlnico (NeuAc) y el acido N-glicolilneuramlnico (NeuGc). Estos aparecen generalmente como estructuras terminales unidas a restos de galactosa (Gal) en los extremos no reductores de los glicanos unidos a N y O. Las configuraciones de enlace glicosldico para estos grupos sialilo pueden ser a 2,3 o a 2,6.

[0067] Las regiones Fc estan glicosiladas en sitios de glicosilacion unidos a N conservados. Por ejemplo, cada cadena pesada de un anticuerpo IgG tiene un solo sitio de glicosilacion unido a N en Asn297 del dominio C^h2. Los anticuerpos IgA tienen sitios de glicosilacion unidos a N dentro de los dominios C^h2 y C^h3, los anticuerpos IgE tienen sitios de glicosilacion unidos a N dentro del dominio C^h3 y los anticuerpos IgM tienen sitios de glicosilacion unidos a N dentro de los dominios C^h1, C^h2, C^h3 y C^h4.

[0068] Cada isotipo de anticuerpo tiene una diversidad distinta de estructuras de carbohidratos unidos a N en las regiones constantes. Por ejemplo, la IgG tiene un solo carbohidrato biantenario unido a N en Asn297 del dominio C^h2 en cada polipeptido Fc de la region Fc, que tambien contiene los sitios de union para C1q y FcyR. Para la IgG humana, el oligosacarido central consiste normalmente en GlcNAc ² Man ³GlcNAc, con diferentes numeros de restos externos. La variacion entre la IgG individual puede producirse mediante la union de galactosa y/o acido sialicogalactosa en una o ambas GlcNAc terminales o mediante la union de un tercer brazo de GlcNAc (biseccion de GlcNAc).

B. Anticuerpos

[0069] La estructura basica de un anticuerpo IgG se ilustra en la figura 2. Como se muestra en la figura 2, un anticuerpo IgG consiste en dos cadenas polipeptldicas ligeras identicas y dos cadenas polipeptldicas pesadas identicas unidas entre si por enlaces disulfuro. El primer dominio ubicado en el extremo amino de cada cadena es variable en la secuencia de aminoacidos, proporcionando las especificidades de union al anticuerpo encontradas en cada anticuerpo individual. Estas se conocen como regiones variables pesadas (V^h) y variables ligeras (V^l). Los otros dominios de cada cadena son relativamente invariantes en la secuencia de aminoacidos y se conocen como regiones pesadas constantes (C^h) y ligeras constantes (C^l). Como se muestra en la figura 2, para un anticuerpo IgG, la cadena ligera incluye una region variable (V^l) y una region constante (C^l). Una cadena pesada de IgG incluye una region variable (V^h), una primera region constante (C^h1), una region bisagra, una segunda region constante (C^h2) y una tercera region constante (C^h3). En los anticuerpos IgE e IgM, la cadena pesada incluye una region constante adicional (C^h4).

[0070] Los anticuerpos descritos en este documento pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespeclficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quimericos, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos a disulfuro (sdFv) y anticuerpos antiidiotlpicos (anti-Id), y fragmentos de union a antlgeno de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAI e IgA2) o subclase.

[0071] El termino «fragmento Fc», como se usa en este documento, se refiere a uno o mas fragmentos de una region Fc que conserva una funcion y/o actividad de Fc descrita en este documento, tal como la union a un receptor Fc. Ejemplos de dichos fragmentos incluyen fragmentos que incluyen un sitio de glicosilacion unido a N de una region Fc (p. ej., un Asn297 de una cadena pesada de IgG o sitios homologos de otros isotipos de anticuerpos), tal como un dominio C^h2. La expresion «fragmento de union a antlgeno» de un anticuerpo, como se usa en este documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especlficamente a un antlgeno. Ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro de la expresion «fragmento de union a antlgeno» de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')² , un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento scFv, un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341:544-546), y una region aislada determinante complementaria (CDR). Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos pueden seleccionarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

[0072] Los polipeptidos que contienen la region Fc de referencia descritos en este documento pueden producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la slntesis de anticuerpos (vease, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Brinkman y col., 1995, J. Immunol. Methods 182: 41-50; el documento WO 92/22324; el documento WO 98/46645).

[0073] Los polipeptidos que contienen la region Fc de referencia adicionales descritos en este documento son anticuerpos biespeclficos y anticuerpos multivalentes, como se describe, p. ej., en Segal y col., J. Immunol. Methods 248:1-6 (2001); y Tutt y col., J. Immunol. 147:60 (1991).

C. Conjugados de polipeptidos

[0074] La description incluye polipeptidos (o regiones Fc o fragmentos Fc de las mismas que contienen uno o mas sitios de N-glicosilacion) que estan conjugados o fusionados con uno o mas restos heterologos y que tienen diferentes niveles de glicanos sialilados en relation con un polipeptido de referencia correspondiente. Los restos heterologos incluyen, pero no se limitan a, peptidos, polipeptidos, protelnas, protelnas de fusion, moleculas de acido nucleico, moleculas pequenas, agentes mimeticos, farmacos sinteticos, moleculas inorganicas y moleculas organicas. En algunos casos, un polipeptido de referencia es una protelna de fusion que comprende un peptido, polipeptido, armazon proteico, scFv, dsFv, diacuerpo, Tandab o un anticuerpo mimetico fusionado a una region Fc, como una region Fc glicosilada. La protelna de fusion puede incluir una region enlazadora que conecta la region Fc al resto heterologo (vease, por ejemplo, Hallewell y col., (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan y col., (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996)).

[0075] En algunos casos, una protelna de fusion de referencia incluye una region Fc (o un fragmento Fc que contiene uno o mas sitios de N-glicosilacion de la misma) conjugada con un polipeptido heterologo de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, a al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoacidos.

[0076] En algunos casos, una protelna de fusion de referencia puede incluir una region Fc (o un fragmento Fc que contiene uno o mas sitios de N-glicosilacion de la misma) conjugada con secuencias marcadoras, tales como un peptido para facilitar la purification. Una secuencia marcadora de aminoacidos particular es un peptido hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, California, 91311). Otras etiquetas peptldicas utiles para la purificacion incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta «HA» de hemaglutinina, que corresponde a un epltopo derivado de la protelna de la hemaglutinina de la influenza (Wilson y col., 1984, Cell 37:767) y la etiqueta «flag».

[0077] En otros casos, un polipeptido de referencia (o una region Fc o fragmento Fc que contiene uno o mas sitios de N-glicosilacion del mismo) se conjuga con un agente de diagnostico o detectable. Dichas protelnas de fusion pueden ser utiles para monitorear o pronosticar el desarrollo o la progresion de una enfermedad o trastorno como parte de un procedimiento de ensayo cllnico, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Dicho diagnostico y deteccion se puede lograr mediante el acoplamiento del polipeptido a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, diversas enzimas, tales como, pero no se limitan a, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos protesicos, tales como, pero no se limitan a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no se limitan a, umbeliferona, fluorescelna, isotiocinato de fluorescelna, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescelna, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no se limitan a, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radioactivos, tales como pero no se limitan a, yodo (131I, 125I, 123I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenon (133Xe), fluor (18F), 153Sm, 177Lu, 153Gd, 159Gd, 149Pm,140La, 169Yb, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, , 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 51Cr , 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Sn; metales emisores de positrones que usan diversas tomograflas de emision de positrones, iones metalicos paramagneticos no radiactivos y moleculas que estan radiomarcadas o conjugadas con radioisotopos especlficos.

[0078] Las tecnicas para conjugar restos terapeuticos con anticuerpos son bien conocidas (vease, p. ej., Arnon y col., «Monoclonal antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy» en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col., (Eds.), pag. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., «Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson y col., (Eds.), pag. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)).

D. Polipeptidos de sialiltransferasa

[0079] Los procedimientos y composiciones descritos en este documento incluyen el uso de una enzima sialiltransferasa, p. ej., una sialiltransferasa a 2,6 (p. ej., ST6 Gal-I). En la tecnica se conocen varias sialiltransferasas ST6 y estan disponibles en el mercado (vease, p. ej., Takashima, Biosci. Biotechnol. Biochem. 72: 1155-1167 (2008); Weinstein y col., J. Biol. Chem. 262: 17735 -17743 (1987)). ST6 Gal-I cataliza la transferencia de acido sialico de un donante de acido sialico (p. ej., citidina 5'-monofosfo-acido N-acetil neuramlnico) a un resto de galactosa terminal de glicanos a traves de un enlace a 2,6. El producto de reaccion del donante de acido sialico es citidina 5'-monofosfato. Las figuras 3A-3C representan tres secuencias de aminoacidos de sialiltransferasa ST6 ejemplares (SEQ ID NO: 1­ 3). En algunas realizaciones, una sialiltransferasa ST6 tiene o incluye una secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2, o en los restos de aminoacidos 95-416 de la SEQ ID NO:3, o un elemento de secuencia caracterlstico de la misma o en la misma. En algunas realizaciones, una sialiltransferasa ST6 tiene al menos 100 %, 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, o 70 % de identidad de secuencia global con una o mas de la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o los restos de aminoacidos 95-416 de la SEQ ID NO:3. Como alternativa o ademas, en algunas realizaciones, una sialiltransferasa ST6 incluye al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, o 150 o mas restos de aminoacidos encontrados en la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o los restos de aminoacidos 95-416 de la SEQ ID NO:3.

[0080] En algunas realizaciones, una sialiltransferasa ST6 difiere de una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2, o en los restos de aminoacidos 95-416 de la SEQ ID NO: 3, o los elementos de secuencia caracterlsticos de la misma o en la misma, por uno o mas restos de aminoacidos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la diferencia es una sustitucion conservativa o no conservativa de uno o mas restos de aminoacidos. Las sustituciones conservativas son aquellas que sustituyen un aminoacido dado en un polipeptido por otro aminoacido de caracterlsticas similares. Las sustituciones conservativas tlpicas son los siguientes reemplazos: el reemplazo de un aminoacido alifatico, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, con otro aminoacido alifatico; el reemplazo de una serina por una treonina o viceversa; el reemplazo de un resto acido tal como el acido aspartico y el acido glutamico, con otro resto acido; el reemplazo de un resto que lleva un grupo amida, como asparagina y glutamina, con otro resto que lleva un grupo amida; el intercambio de un resto basico, tal como lisina y arginina, con otro resto basico; y el reemplazo de un resto aromatico, tal como fenilalanina y tirosina, con otro resto aromatico.

[0081] En algunas realizaciones, un polipeptido de sialiltransferasa ST6 incluye un grupo sustituyente en uno o mas restos de aminoacidos. Otros polipeptidos utiles se asocian con (p. ej., fusionados, unidos o acoplados a) otro resto (p. ej., un peptido o molecula). Por ejemplo, un polipeptido sialiltransferasa ST6 puede fusionarse, unirse o acoplarse a una secuencia de aminoacidos (p. ej., una secuencia llder, una secuencia secretora, una secuencia proprotelna, un segundo polipeptido o una secuencia que facilite la purificacion, el enriquecimiento o la estabilizacion) del polipeptido).

II. Procedimientos de produccion de polipeptidos sialilados

[0082] La presente descripcion se refiere a preparaciones de polipeptidos que contienen la region Fc (p. ej., anticuerpos IVIG, Fc o IgG) que tienen niveles mas altos de glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3 o 1,6 de los glicanos ramificados en la region Fc (p. ej., con un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal o NeuAc-a 2,3-Gal), en relacion con una preparacion de polipeptido de referencia correspondiente. Los niveles mas altos se pueden medir en una region Fc individual (p. ej., un aumento en el numero de glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3 de los glicanos ramificados en la region Fc), o la composition global de una preparacion de los polipeptidos puede ser diferente (p. ej., una preparation de polipeptidos puede tener un numero mas alto o un mayor porcentaje de glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3 de los glicanos ramificados en la region Fc) en relation con una preparacion de polipeptidos de referencia correspondiente).

[0083] En procedimientos ejemplares, las moleculas de Fc se obtuvieron o se produjeron a partir de diversas fuentes, se caracterizaron las composiciones de glicano y se determinaron las actividades. Las moleculas Fc se probaron para determinar su capacidad para proteger a los ratones de la neurodegeneracion en un modelo EAE de raton.

[0084] La sialiltransferasa ST6 Gal-I cataliza la transferencia de acido sialico de un donante de acido sialico (p. ej., citidina 5'-monofosfo-acido N-acetil neuramlnico) a un resto de galactosa terminal de glicanos a traves de un enlace a 2,6. La presente description aprovecha el descubrimiento de que la sialiltransferasa ST6 cataliza la transferencia de acido sialico a glicanos ramificados (p. ej., glicanos ramificados Fc) que comprenden un brazo a 1,3 y un brazo a 1,6 de una manera ordenada. Como se muestra en la figura 4, la sialiltransferasa ST6 transfiere un acido sialico a un brazo a 1,3 de un glicano ramificado, que puede ir seguido de la transferencia de un segundo acido sialico a un brazo a 1,6 (que produce un glicano ramificado desialilado), y puede seguirse de la elimination del acido sialico de un brazo a 1,3 (que produce un glicano ramificado que tiene un acido sialico en un brazo a 1,6). En consecuencia, controlando y/o modulando la actividad (p. ej., la cinetica) de la sialiltransferasa ST6, pueden producirse polipeptidos que tienen patrones de sialilacion particulares.

[0085] Cualquier parametro conocido en general que afecte a la cinetica enzimatica puede controlarse y/o modularse para producir una preparacion de polipeptidos que tenga un nivel predeterminado de acido sialico en un brazo a 1,3 de un glicano ramificado, en un brazo a 1,6 de un glicano ramificado y/o en un brazo a 1,3 y un brazo a 1,6 de un glicano ramificado. Por ejemplo, el tiempo de reaction, la concentration de sialiltransferasa ST6 y/o la actividad especlfica, la concentracion de glicano ramificado, la concentracion de donante de acido sialico, la concentracion del producto de reaccion del donante de acido sialico, el pH, la composition del tampon y/o la temperatura se pueden controlar y/o modular para producir una preparacion de polipeptidos que tiene un nivel deseado de sialilacion (p. ej., sialilacion en el brazo a 1,3 y/o en el brazo a 1,6).

[0086] En algunas realizaciones, para sialilar preferentemente un brazo a 1,3 de glicanos ramificados (p. ej., que tienen un brazo a 1,3 y un brazo a 1,6), los glicanos ramificados se ponen en contacto in vitro con una sialiltransferasa ST6 en condiciones de reaccion limitadas. Dichas condiciones de reaccion limitadas se seleccionan de tal manera que la adicion de un acido sialico a un brazo a 1,3 se mejore en relacion con la adicion de un acido sialico a un brazo a 1,6 (p. ej., la velocidad de transferencia de un acido sialico a un brazo a 1,3 («Ra ^{1 3} ») excede la velocidad de transferencia de un acido sialico a un brazo a 1,6 («Ra ¹⁶ »). En algunas realizaciones, las condiciones de reaccion limitadas se seleccionan adicionalmente de tal manera que la eliminacion de un acido sialico de un brazo a1, 6 se mejore en relacion con la adicion de un acido sialico a un brazo a 1,6 (p. ej., la velocidad de eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,6 («Rr ¹⁶ ») excede la velocidad de transferencia de un acido sialico a un brazo a 1,6 («Ra ^{1 6} »). Las condiciones de reaccion limitadas pueden incluir, por ejemplo, disminucion del tiempo de reaccion, disminucion de la concentracion y/o actividad de la enzima, disminucion de la cantidad de glicanos ramificados, disminucion del nivel de donante de acido sialico y/o disminucion de la temperatura.

[0087] En algunas realizaciones, para sialilar preferentemente un brazo a1, 6 de glicanos ramificados (p. ej., que tienen un brazo a 1,3 y un brazo a 1,6), los glicanos ramificados pueden ponerse en contacto in vitro con una sialiltransferasa ST6 en condiciones de reaccion prolongadas. Dichas condiciones de reaccion prolongadas se seleccionan de tal manera que la adicion de un acido sialico a un brazo a 1,6 se mejore en relacion con la eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,6 (p. ej., la velocidad de transferencia de un acido sialico a un brazo a 1,6 («Ra ¹⁶ ») excede la velocidad de eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,6 («Rr ^{1 6} »). En algunas realizaciones, las condiciones de reaccion prolongadas se seleccionan ademas de tal manera que, despues de las condiciones iniciales que mejoran la adicion de acido sialico a un brazo a 1,3, las condiciones se prolongan de tal manera que la eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,3 con el tiempo se mejore en relacion con la adicion de un acido sialico a un brazo a 1,3 (p. ej., la velocidad de eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,3 («Rr ^{1 3} ») excede la velocidad de transferencia de un acido sialico a un brazo a 1,3 («Ra ^{1 3} »). Las condiciones de reaccion prolongadas pueden incluir, por ejemplo, aumento del tiempo de reaccion, aumento de la concentracion y/o actividad de la enzima, aumento de la cantidad de glicanos ramificados, aumento del nivel de donante de acido sialico, y/o aumento de la temperatura.

[0088] En algunas realizaciones, para sialilar preferentemente tanto un brazo a 1,3 como un brazo a 1,6 de glicanos ramificados (p. ej., que tienen un brazo a 1,3 y un brazo a 1,6), los glicanos ramificados se ponen en contacto in vitro con una sialiltransferasa ST6 en condiciones de reaccion intermedias. Dichas condiciones de reaccion intermedias se seleccionan de tal manera que la adicion de un acido sialico a un brazo a 1,3 se mejore en relacion con la eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,3 (p. ej., la velocidad de transferencia de un acido sialico a un brazo a 1,3 («Ra ^{1 3} ») exceda la velocidad de eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,3 («Rr ^{1 3} »). En algunas realizaciones, las condiciones de reaccion intermedias se seleccionan adicionalmente de tal manera que la adicion de un acido sialico a un brazo a 1,6 se mejore en relacion con la eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,6 (p. ej., la velocidad de adicion de un acido sialico a un brazo a 1,6 («Ra ^{1 6} ») excede la velocidad de eliminacion de un acido sialico de un brazo a 1,6 («Rr1’6»). Las condiciones de reaccion intermedias pueden incluir, por ejemplo, tiempo de reaccion intermedio, concentracion y/o actividad de enzima intermedia, cantidad intermedia de glicanos ramificados, nivel intermedio de donante de acido sialico y/o temperatura intermedia. En algunas realizaciones, las condiciones de reaccion intermedias incluyen ademas complementar el donante de acido sialico al menos una vez durante la reaccion. En algunas realizaciones, las condiciones de reaccion intermedias incluyen ademas eliminar un producto de reaccion del donante de acido sialico al menos una vez durante la reaccion. En algunas realizaciones, las condiciones de reaccion intermedias incluyen ademas complementar el producto de reaccion del donante de acido sialico al menos una vez durante la reaccion.

[0089] En algunas realizaciones, un polipeptido, p. ej., un anticuerpo glicosilado, se sialila despues de que se produce el polipeptido. Por ejemplo, un polipeptido puede expresarse de manera recombinante en una celula huesped (como se describe en este documento) y purificarse usando procedimientos convencionales. El polipeptido purificado se pone a continuacion en contacto con una sialiltransferasa ST6 (p. ej., una sialiltransferasa ST6 expresada de forma recombinante y purificada) en presencia de condiciones de reaccion como se describe en este documento. En determinadas realizaciones, las condiciones incluyen poner en contacto el polipeptido purificado con una sialiltransferasa ST6 en presencia de un donante de acido sialico, por ejemplo, citidina 5'-monofosfo-acido N-acetil neuramlnico, manganeso y/u otros iones metalicos divalentes. En algunas realizaciones, la IVIG se usa en un procedimiento de sialilacion descrito en este documento.

[0090] En algunas realizaciones, la sialilacion quimioenzimatica se usa para sialilar polipeptidos. En resumen, este procedimiento implica la sialilacion de un glicano ramificado purificado, seguido de la incorporacion del glicano ramificado sialilado en bloque sobre un polipeptido para producir un polipeptido sialilado.

[0091] Un glicano ramificado puede sintetizarse de novo usando tecnicas convencionales o puede obtenerse a partir de una preparacion de polipeptidos (p. ej., un polipeptido recombinante, Fc o IVIG) usando una enzima adecuada, tal como una endoglicosidasa (p. ej., EndoH o EndoF). Despues de la sialilacion del glicano ramificado, el glicano ramificado sialilado puede conjugarse con un polipeptido usando una enzima adecuada, tal como una transglicosidasa, para producir un polipeptido sialilado.

[0092] En un procedimiento ejemplar, se obtiene un N-glicano ramificado purificado a partir de un polipeptido (p. ej., una preparacion de polipeptido, p. ej., IVIG) usando una endoglicosidasa. El N-glicano ramificado purificado se activa a continuacion qulmicamente en el extremo reductor para formar un intermedio qulmicamente activo. El N-glicano ramificado se procesa, recorta y/o glicosila adicionalmente usando glicosidasas conocidas adecuadas. El glicano ramificado se sialila a continuacion usando una sialilacion ST6 como se describe en este documento. Despues de la modificacion por ingenierla, el N-glicano ramificado deseado se transfiere a un polipeptido usando una transglicosidasa (tal como una transglicosidasa en la que se ha atenuado la actividad glicosldica usando ingenierla genetica).

[0093] En algunas realizaciones, un glicano ramificado usado en los procedimientos descritos en este documento es un glicano ramificado galactosilado (p. ej., incluye un resto de galactosa terminal). En algunas realizaciones, un glicano ramificado se galactosila antes de ser sialilado usando un procedimiento descrito en este documento. En algunas realizaciones, un glicano ramificado primero se pone en contacto con una galactosiltransferasa (p. ej., una beta-1,3-galactosiltransferasa) y posteriormente se pone en contacto con una sialiltransferasa ST6 como se describe en este documento. En algunas realizaciones, un glicano galactosilado se purifica antes de ponerse en contacto con una sialiltransferasa ST6. En algunas realizaciones, un glicano galactosilado no se purifica antes de ponerse en contacto con una sialiltransferasa ST6. En algunas realizaciones, un glicano ramificado se pone en contacto con una galactosiltransferasa y una sialiltransferasa ST6 en una sola etapa.

[0094] En algunas realizaciones, una celula huesped se modifica por ingenierla genetica para expresar un polipeptido descrito en este documento y una o mas enzimas sialiltransferasa, p. ej., una sialiltransferasa ST6. En algunas realizaciones, la celula huesped esta disenada geneticamente para expresar adicionalmente una galactosiltransferasa. La celula huesped geneticamente modificada puede cultivarse en condiciones suficientes para producir un polipeptido sialilado particular. Por ejemplo, para producir polipeptidos preferentemente sialilados en brazos a 1,3 de glicanos ramificados, se puede modificar una celula huesped por ingenierla genetica para expresar un nivel relativamente bajo de sialiltransferasa ST6, mientras que para producir polipeptidos preferentemente sialilados en brazos a 1,6 de glicanos ramificados, se puede modificar una celula huesped por ingenierla genetica para expresar un nivel relativamente alto de sialiltransferasa ST6. En algunas realizaciones, para producir polipeptidos preferentemente sialilados en brazos a 1,3 de glicanos ramificados, se puede cultivar una celula huesped modificada por ingenierla genetica con un nivel relativamente bajo de donante de acido sialico, mientras que para producir polipeptidos preferentemente sialilados en brazos a 1,6 de glicanos ramificados, se puede cultivar una celula huesped modificada por ingenierla genetica con un nivel relativamente alto de donante de acido sialico.

[0095] La expresion recombinante de un gen, tal como un acido nucleico que codifica un polipeptido de referencia y/o una sialtransferasa descrita en este documento, puede incluir la construccion de un vector de expresion que contiene un polinucleotido que codifica un polipeptido de referencia y/o una sialtransferasa. Una vez que se ha obtenido un polinucleotido, se puede producir un vector para la produccion del polipeptido de referenda mediante tecnologla de ADN recombinante usando tecnicas conocidas en la tecnica. Se pueden usar procedimientos conocidos para construir vectores de expresion que contengan secuencias codificantes de polipeptidos y senales de control de transcripcion y traduccion adecuadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo.

[0096] Un vector de expresion puede transferirse a una celula huesped mediante tecnicas convencionales, y las celulas transfectadas pueden entonces cultivarse mediante tecnicas convencionales para producir polipeptidos de referencia.

[0097] Se puede usar una diversidad de sistemas de vectores de expresion del huesped (vease, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 5.807.715). Dichos sistemas de expresion del huesped pueden usarse para producir polipeptidos y, cuando se desee, purificarse posteriormente. Dichos sistemas de expresion del huesped incluyen microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli y B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriofago recombinante, ADN plasmldico o vectores de expresion de ADN cosmido que contienen secuencias codificantes de polipeptidos; levaduras (p. ej., Saccharomyces y Pichia) transformadas con vectores de expresion de levaduras recombinantes que contienen secuencias codificantes de polipeptidos; sistemas de celulas de insecto infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias codificantes de polipeptidos; sistemas de celulas vegetales infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (p. ej., plasmido Ti) que contiene secuencias codificantes de polipeptidos; o sistemas celulares de mamlferos (p. ej., celulas COS, CHO, BHK, 293, NS0 y 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamlferos (p. ej., promotor de metalotionelna) o de virus de mamlferos (p. ej., el adenovirus tardlo promotor; el promotor 7.5K del virus vaccinia).

[0098] Para sistemas bacterianos, se pueden usar varios vectores de expresion, que incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresion de E. coli pUR278 (Ruther y col., 1983, EMBO 12: 1791); vectores plN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. Los vectores pGEX tambien se pueden usar para expresar polipeptidos extranos como protelnas de fusion con glutation 5-transferasa (GST).

[0099] Para la expresion en celulas huesped de mamlferos, se pueden utilizar sistemas de expresion basados en virus (vease, p. ej., Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81: 355-359). La eficiencia de la expresion puede mejorarse mediante la inclusion de elementos potenciadores de la transcripcion adecuados, terminadores de la transcripcion, etc. (vease, p. ej., Bittner y col., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).

[0100] Ademas, se puede elegir una cepa de la celula huesped que modula la expresion de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto genico en la forma especlfica deseada. Diferentes celulas huesped tienen mecanismos caracterlsticos y especlficos para el procesamiento y la modificacion postraduccional de protelnas y productos genicos. Se pueden elegir llneas celulares o sistemas huesped adecuados para asegurar la correcta modificacion y procesamiento del polipeptido expresado. Dichas celulas incluyen, por ejemplo, llneas celulares de mamlferos establecidas y llneas celulares de insectos, celulas animales, celulas fungicas y celulas de levadura. Las celulas huesped de mamlferos incluyen, pero no se limitan a, celulas CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, NS0 (una llnea celular de mieloma murino que no produce de manera endogena ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O y HsS78Bst.

[0101] Para la produccion a largo plazo y de alto rendimiento de protelnas recombinantes, las celulas huesped estan disenadas por ingenierla para expresar de manera estable un polipeptido. Las celulas huesped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresion adecuados conocidos en la tecnica, que incluyen promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion y marcadores seleccionables. Se pueden usar procedimientos comunmente conocidos en la tecnica de la tecnologla de ADN recombinante para seleccionar un clon recombinante deseado.

[0102] En algunas realizaciones, un polipeptido que contiene la region Fc de referencia se produce de forma recombinante en celulas como se describe en este documento, se purifica y se pone en contacto con una enzima sialtransferasa in vitro para producir polipeptidos que contienen la region Fc que contienen niveles mas altos de glicanos que tienen niveles mas altos de acido sialico en los brazos a 1,3 de los glicanos ramificados con un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal, en relacion con el polipeptido de referencia. En algunas realizaciones, un polipeptido de referencia purificado se pone en contacto con la sialtransferasa en presencia de CMP-acido sialico, manganeso y/u otros iones metalicos divalentes.

[0103] Un polipeptido que contiene la region Fc de referencia se puede purificar por cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la purificacion, por ejemplo, por cromatografla (p. ej., cromatografla de intercambio ionico, afinidad y columna de tamano), centrifugacion, solubilidad diferencial o por cualquier otra tecnica convencional para la purificacion de protelnas. Por ejemplo, un anticuerpo de referencia se puede aislar y purificar seleccionando y combinando adecuadamente columnas de afinidad, tal como la columna de protelna A con columnas de cromatografla, filtracion, ultrafiltracion, precipitacion de protelnas y procedimientos de dialisis (vease Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Ademas, como se describe en este documento, un polipeptido de referencia puede fusionarse con secuencias de polipeptidos heterologos para facilitar la purificacion.

[0104] En algunas realizaciones, un polipeptido se puede purificar usando una columna de lectina por procedimientos conocidos en la tecnica (vease, p. ej., el documento WO 02/30954). Por ejemplo, una preparacion de polipeptidos puede enriquecerse para polipeptidos que contienen glicanos que tienen acidos sialicos en el enlace a 2,6 como se describe, por ejemplo, en el documento WO2008/057634. Despues del enriquecimiento de polipeptidos que contienen glicanos que tienen acidos sialicos en enlace a 2,6, la composicion de glicanos de dichos polipeptidos puede caracterizarse adicionalmente para identificar polipeptidos que tienen acidos sialicos unidos al brazo a 1,3 de un glicano ramificado. Las preparaciones de polipeptidos que contienen un nivel predeterminado de glicanos que tienen acidos sialicos en el enlace a 2,6 en el brazo a 1,3 pueden seleccionarse para su uso, p. ej., para su uso terapeutico. Dichas composiciones pueden tener niveles aumentados de actividad antiinflamatoria.

[0105] Segun la presente descripcion, se pueden emplear tecnicas convencionales de biologla molecular, microbiologla y ADN recombinante dentro de la experiencia de la tecnica. Dichas tecnicas se describen en la bibliografla (vease, p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; DNA Cloning: A Practical Approach, volumenes I y II (Dⁿ Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (BD Hames & SJ Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (BD Hames & SJ Higgins, ed. (1984)); Animal Cell Culture (RI Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); FM Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

[0106] Las composiciones de glicano pueden caracterizarse usando procedimientos descritos, p. ej., en Barb, Biochemistry 48: 9705-9707 (2009); Anumula, J. Immunol. Methods 382: 167-176 (2012); Gilar y col., Analytical Biochem. 417: 80-88 (2011).

Evaluacion de glicanos

[0107] Los glicanos de polipeptidos pueden evaluarse usando cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Por ejemplo, la sialilacion de composiciones de glicano (p. ej., el nivel de glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3 y/o un brazo a 1,6) se puede caracterizar usando procedimientos descritos, p. ej., en Barb, Biochemistry 48:9705-9707 (2009); Anumula, J. Immunol. Methods 382:167-176 (2012); Gilar y col., Analytical Biochem. 417:80-88 (2011); Wuhrer y col., J. Chromatogr. B. 849:115-128 (2007). En algunas realizaciones, ademas de la evaluacion de la sialilacion de glicanos, se evaluan uno o mas parametros descritos en la tabla 2.

[0108] En algunos casos, la estructura y la composicion del glicano como se describe en este documento se analizan, por ejemplo, mediante uno o mas, espectrometrla de masas (MS) enzimatica, cromatografica, cromatografla seguida de MS, procedimientos electroforeticos, procedimientos electroforeticos seguidos de MS, resonancia magnetica nuclear (procedimientos de RMN), y combinaciones de los mismos. Los procedimientos enzimaticos ejemplares incluyen poner en contacto una preparacion de polipeptidos con una o mas enzimas en condiciones y durante un tiempo suficiente para liberar uno o mas glicanos (p. ej., uno o mas glicanos expuestos). En algunos casos, la una o mas enzimas incluye o incluyen PNGase F. Los procedimientos cromatograficos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cromatografla de intercambio anionico fuerte que usa deteccion amperometrica pulsada (SAX-PAD), cromatografla llquida (LC), cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografla llquida de rendimiento ultra (UPLC), cromatografla en capa fina (TLC), cromatografla en columna de amida y combinaciones de las mismas. La espectrometrla de masas (MS) ejemplar incluye, pero no se limita a, MS en tandem, LC-MS, LC-MS/MS, espectrometrla de masas de ionizacion por desorcion laser asistida por matriz (MALDI-MS), espectrometrla de masas por transformada de Fourier (FTMS), separacion de la movilidad de iones con espectrometrla de masas (IMS-MS), disociacion de transferencia de electrones (ETD-MS) y combinaciones de los mismos. Los procedimientos electroforeticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, electroforesis capilar (CE), CE-MS, electroforesis en gel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de acrilamida, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de transferencia Western usando anticuerpos que reconocen estructuras especlficas de glicanos, y combinaciones de los mismos. La resonancia magnetica nuclear ejemplar (RMN) incluye, pero no se limita a, RMN unidimensional (RMN-1D), RMN bidimensional (RMN-2D), espectroscopla por RMN de correlation con giro al angulo magnetico (C^o S^y -RMN), espectroscopla por RMN de correlacion total (TOCSY-RMN), RMN de coherencia cuantica simple heteronuclear (HSQC-RMN), RMN de coherencia cuantica multiple heteronuclear (HMQC-RMN), espectroscopla por RMN de efecto Overhauser nuclear rotacional (ROESY-RMN), espectroscopla de efecto Overhauser nuclear (NOESY-RMN), y combinaciones de los mismos.

[0109] En algunos casos, las tecnicas descritas en este documento pueden combinarse con una o mas tecnologlas para la deteccion, analisis y/o aislamiento de glicanos o polipeptidos. Por ejemplo, en determinados casos, los glicanos se analizan segun la presente descripcion usando uno o mas procedimientos disponibles (para dar solo algunos ejemplos, vease Anumula, Anal. Biochem., 350 (1):1, 2006; Klein y col., Anal. Biochem., 179:162, 1989 y/o Townsend, RR Carbohydrate Analysis «High Performance Liquid Chromatography and Capillar Electrophoresis., Ed. Z. El Rassi, pags. 181-209, 1995; el documento WO2008/128216; el documento WO2008/128220; el documento WO2008/128218; el documento WO2008/130926; el documento WO2008/128225; el documento WO2008/130924; el documento WO2008/128221; el documento WO2008/128228; el documento WO2008/128227; el documento WO2008/128230; el documento WO2008/128219; el documento WO2008/128222; el documento WO2010/071817; el documento WO2010/071824; el documento WO2010/085251; el documento WO2011/069056; y el documento WO2011/127322). Por ejemplo, en algunos casos, los glicanos se caracterizan usando uno o mas de los procedimientos cromatograficos, los procedimientos electroforeticos, los procedimientos de resonancia magnetica nuclear y sus combinaciones.

[0110] En algunos casos, los procedimientos para evaluar uno o mas parametros especlficos de la protelna diana, p. ej., en una preparacion de polipeptidos, p. ej., uno o mas de los parametros descritos en este documento, pueden realizarse mediante uno o mas de los siguientes procedimientos.

T l 2: r imi n m l r v l i n r m r :

[0111] Otros procedimientos para evaluar uno o mas parametros se describen en los ejemplos.

III. Tratamiento de la neurodegeneracion

[0112] Los inventores han descubierto que la actividad biologica mediada por el acido sialico de las moleculas que contienen Fc no solo se debe al nivel de sialilacion, sino tambien a disposiciones particulares de ramificacion. En consecuencia, los polipeptidos que contienen la region Fc descritos en este documento (p. ej., los polipeptidos que contienen la region Fc que contienen glicanos que contienen acido sialico en brazos a 1,3 de glicanos ramificados con un enlace terminal NeuAc-a 2,6 Gal) tienen una actividad aumentada en relacion con un polipeptido de referencia.

[0113] En algunas realizaciones, los polipeptidos que contienen la region Fc que tienen acidos sialicos en los brazos a 1,3 y a 1,6 de los glicanos ramificados pueden ser utiles en el tratamiento de la neurodegeneracion.

IV. Composiciones farmaceuticas y administracion

[0114] Un polipeptido de la presente descripcion, p. ej., un polipeptido que contiene una region Fc que comprende glicanos ramificados que se sialilan en un brazo a 1,3 del glicano ramificado en la region Fc, p. ej., con un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal, puede incorporarse a una composicion farmaceutica y puede ser util en el tratamiento de la neurodegeneracion. Dicha composicion farmaceutica es util como una composicion mejorada para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades en relacion con el polipeptido de referencia correspondiente. Las composiciones farmaceuticas que comprenden un polipeptido pueden formularse por procedimientos conocidos por los expertos en la materia. La composicion farmaceutica se puede administrar por via parenteral en forma de una formulacion inyectable que comprende una solucion o suspension esteril en agua u otro llquido farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede formularse combinando adecuadamente el polipeptido sulfatado con vehlculos o medios farmaceuticamente aceptables, tales como agua esteril y solucion salina fisiologica, aceite vegetal, emulsionante, agente de suspension, tensioactivo, estabilizante, excipiente aromatizante, diluyente, vehlculo, conservante, aglutinante, seguido de la mezcla en una forma de dosis unitaria requerida para las practicas farmaceuticas generalmente aceptadas. La cantidad de principio activo incluida en las preparaciones farmaceuticas es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del intervalo designado.

[0115] La composicion esteril para la inyeccion se puede formular segun las practicas farmaceuticas convencionales usando agua destilada para la inyeccion como vehlculo. Por ejemplo, se puede usar una solucion salina fisiologica o una solucion isotonica que contenga glucosa y otros suplementos tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio como solucion acuosa para inyeccion, opcionalmente en combinacion con un agente solubilizante adecuado, por ejemplo, alcohol tal como etanol y polialcohol tal como propilenglicol o polietilenglicol, y un tensiaoctivo no ionico tal como polisorbato 80™, HCO-50 y similares.

[0116] Ejemplos no limitantes de llquido oleoso incluyen aceite de sesamo y aceite de soja, y se puede combinar con benzoato de bencilo o alcohol bencllico como agente solubilizante. Otros elementos que pueden incluirse son un tampon tal como un tampon de fosfato o un tampon de acetato de sodio, un agente calmante tal como el clorhidrato de procalna, un estabilizante tal como alcohol bencllico o fenol y un antioxidante. La inyeccion formulada puede envasarse en una ampolla adecuada.

[0117] La via de administracion puede ser parenteral, por ejemplo, administration por inyeccion, administration transnasal, administracion transpulmonar o administracion transcutanea. La administracion puede ser sistemica o local mediante inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal, inyeccion subcutanea.

[0118] Se puede seleccionar un medio de administracion adecuado en funcion de la edad y el estado del paciente. Una dosis unica de la composicion farmaceutica que contiene un polipeptido modificado puede seleccionarse de un intervalo de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal. Por otro lado, se puede seleccionar una dosis en el intervalo de 0,001 a 100000 mg/peso corporal, pero la presente description no se limita a dichos intervalos. La dosis y el procedimiento de administracion varlan dependiendo del peso, la edad, el estado y similares del paciente, y los expertos en la materia pueden seleccionarlos adecuadamente segun sea necesario.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: galactosilacion y sialilacion de IVIG

[0119] Se analizo la sialilacion de IVIG por la sialiltransferasa ST6. La IVIG fue primero galactosilada y a continuation sialilada. Las reacciones se realizaron secuencialmente. No hubo purification entre las reacciones de galactosilacion y sialilacion. La abundancia relativa de glicoformas se analizo despues de las reacciones de sialilacion. A. Galactosilacion

[0120] Se establecio una reaction que contenla los siguientes componentes en las concentraciones indicadas:

[0121] La reaccion se incubo durante 72 horas a 37 °C.

B. Sialilacion

[0122] A una parte allcuota de la reaccion de galactosilacion se anadieron CMP-NANA, tampon MOPS y ST6Gal1. El volumen final se ajusto de modo que la concentration final de los componentes en la reaccion fuera la indicada.

[0123] La reaccion se incubo a 37 °C. Se extrajeron partes allcuotas en los tiempos indicados en la figura 2 y se congelaron a -20 °C para su posterior analisis.

C. Resultados

[0124] Como se muestra en la figura 5, la glicoforma predominante cambio con el tiempo de G2F a A1F (1,3) a A2F a A1F (1,6). Los resultados se resumen en el esquema de reaccion representado en la figura 4. Como se muestra en la figura 4, la glicoforma del producto puede cambiar entre G2F, A1F (1,3), A2F y A1F (1,6) durante el curso de una reaccion debido a las etapas de adicion (reaccion directa) y elimination (reaccion inversa) de la competencia.

[0125] La sialiltransferasa ST6 puede anadir acido sialico a cualquiera de las ramas de un N-glicano biantenario de un sustrato. Sin embargo, estos resultados demuestran que la adicion a cada rama se produce a diferentes velocidades, lo que resulta en diferentes productos finales dependiendo de las condiciones de reaccion. La adicion de acido sialico a la rama a 1,3 es mucho mas rapida que la adicion a la rama a 1,6.

[0126] Estos datos tambien demuestran que la sialiltransferasa ST6 tambien puede catalizar la eliminacion de acidos sialicos de los N-glicanos. La eliminacion del acido sialico de la rama a 1,3 es mucho mas rapida que la eliminacion de la rama a 1,6. Esto puede conducir sorprendentemente a la production de glicanos Fc sustancialmente o principalmente monosialilados en la rama a 1,6 mediante la modulation de las condiciones de reaccion.

[0127] Este ejemplo demuestra que las condiciones de reaccion pueden controlarse para producir un producto de glicoprotelna que tiene unos niveles de sialilacion predeterminados. Dichas condiciones pueden incluir el tiempo, la concentration de sialiltransferasa ST6, la concentration de sustrato, la concentration de nucleotidos de azucar del donante, la concentracion de nucleotidos del producto, el pH, la composition del tampon y/o la temperatura.

Ejemplo 2: tratamiento de la neurodegeneracion con IVIG sialilada

[0128] Para probar la eficacia y los mecanismos de action de estos agentes en la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras enfermedades neurodegenerativas, se administro IVIG a 2,6 sialilada en el glicano biantenario unido a N en ^a SN-297 en la region Fc a ratones con encefalitis autoinmune experimental.

[0129] Las preparaciones sialiladas especlficas de IVIG probadas en estos estudios incluyen:

1) La IVIG monosialilada (s1) es una preparation donde el 63-79 por ciento de los glicanos Fc estan sialilados exclusivamente en el brazo a 1,3, fucosilados y no bisectados. Menos del 15 % de los glicanos Fc estan sialilados exclusivamente en el brazo a 1,6, fucosilados y no bisectados. Menos del 15 % de los glicanos Fc estan sialilados en los brazos a 1,3 y a 1,6, fucosilados y no bisectados. Las especies bisecadas y las especies afucosiladas, las cuales son componentes minoritarios, tambien fueron sialiladas predominantemente en el brazo a 1,3 solamente.

2) La IVIG desialilada (s2) es una preparacion donde el 87 por ciento de los glicanos Fc estan sialilados en los brazos a 1,3 y a 1,6, fucosilados y no bisectados. Menos del 6 % de los glicanos de Fc estan sialilados en el brazo a 1,3, fucosilados y no bisectados. Los glicanos de Fc sialilados en el brazo a 1,6, fucosilados y no bisectados no se detectaron. Las especies bisectadas y las especies afucosiladas, las cuales son componentes minoritarios, tambien fueron sialiladas predominantemente en ambos brazos.

[0130] La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo mas comunmente usado de autoinmunidad, desmielinizacion, trafico celular e induction de tolerancia en el SNC.

[0131] EAE esta mediada por celulas T CD4+ especlficas de la mielina, pero tambien se caracteriza por una participation crltica del compartimiento inmunitario innato, especialmente monocitos, macrofagos, celulas dendrlticas y microglia. EAE induce la infiltration inflamatoria del SNC a traves de la barrera hematoencefalica. Ademas, el dano en el SNC en EAE esta impulsado por celulas inmunitarias adaptativas (celulas T) y microglia, celulas inmunitarias innatas especlficas del SNC.

[0132] Se indujo EAE en ratones C57BL/6 mediante inmunizacion subcutanea con el peptido 35-55 de la proteina oligodendrocito de mielina (MOG) en una emulsion completa de adyuvante de Freund (c Fa ), seguida de la administracion de toxina de Pertussis (PTX). Tlpicamente, la EAE se desarrollo 8-10 dlas despues de la inmunizacion y se caracterizo por una paralisis ascendente, comenzando con la perdida del tono de la cola.

[0133] Los ratones se inyectaron por via subcutanea en dos sitios en la parte posterior con la emulsion MOG ^35-55/CFA. Un sitio de inyeccion estaba en el area de la espalda superior, aproximadamente 1 cm caudal de la llnea del cuello. El segundo sitio estaba en el area de la espalda baja, aproximadamente 2 cm craneal de la base de la cola. El volumen de inyeccion fue de 0,1 ml en cada sitio.

[0134] Dentro de las 2 horas posteriores a la inyeccion de la emulsion, y a continuacion nuevamente 24 horas despues de la inmunizacion, se administraron por via intraperitoneal (ip) 0,1 ml (143 ng) de PTX.

[0135] Los ratones se calificaron en una escala de 0 a 5, como se indica a continuacion, por una persona que desconoce el tratamiento y las puntuaciones previas de cada raton.

0 No hay signos de enfermedad

1 Cola flacida. Cuando el raton fue recogido por la cola, en lugar de estar erecto, toda la cola cayo sobre el dedo.

2 Cola flacida y debilidad de las patas traseras. Cuando el raton fue recogido por la cola, las patas no se separan, sino que se mantienen unidas. Cuando se observo que el raton caminaba, tenia un andar claramente tambaleante aparentemente.

3 Cola flacida y paralisis completa de las patas traseras (la mas comun) O cola flacida con paralisis de una pata delantera y una pata trasera O TODAS de:

• Fuerte inclinacion de la cabeza,

• Desplazamiento solo a lo largo de los bordes de la jaula,

• Empuje contra la pared de la jaula,

• Giro cuando es recogido por la cola.

4 Cola flacida, paralisis completa de las patas traseras y parcial de las patas delanteras. El raton se movla mlnimamente alrededor de la jaula, pero parece estar alerta y alimentandose. Por lo general, se recomendo la eutanasia despues de que el raton obtuvo el nivel 4 durante 2 dlas. Cuando el raton fue sacrificado debido a una paralisis extrema, se ingreso una puntuacion de 5 para ese raton durante el resto del experimento.

5 Moribundos o muertos.

[0136] A los ratones se les administro Q3D ip a partir del dla de la inmunizacion (Figura 6). Los tejidos se recogieron a los 3 dlas (una inyeccion), a los 8 dlas (3 inyecciones) y al final del experimento (d21; 7 inyecciones). Se usaron 8 C57BI/6 hembras por condition (por punto de tiempo y por tratamiento).

[0137] Estos experimentos tienen como objetivo comparar la eficacia de la IVIG y la IVIG sialilada (s1 y s2) en la modulation de las puntuaciones cllnicas de la EAE, as! como en las lecturas celulares y moleculares. Las lecturas incluyen puntuaciones cllnicas, analisis FACS, Luminex, proteomica de escopeta y TR-RCP cuantitativa. Los tejidos analizados incluyen sangre (FACS), suero (Luminex), bazo (FACS/Proteomics/TRc-RCP), ganglios linfaticos (Proteomics), medula osea (FACS/TRc-RCP/Proteomics) y medula espinal (FACS).

Procedimientos

FACS

[0138] Los tejidos se procesaron y filtraron a traves de un filtro de 70 □m. Los globulos rojos (bazo/sangre) se lisaron durante 10 min a 4 °C. Las muestras se resuspendieron a continuacion en tampon FACS y se sembraron en una placa de 96 pocillos con fondo en V. Los receptores Fc se bloquearon durante 10 min en SFB y se tineron durante 20 min en diversos cocteles de anticuerpos (Tabla 3) a 4 °C. Las muestras se resuspendieron en PFA al 1 %. Los datos se adquirieron con un verslculo FACS (Becton Dickinson) y se analizaron con el software FlowJo (TreeStar).

Tabla 3: cocteles de anticuer os

Luminex

[0139] Se uso el kit de citoquina/quimiocina de raton MILLIPLEX™ de Millipore para cuantificar las siguientes 32 citoquinas y quimiocinas de raton del plasma:

eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFN □, IL-1 □, IL-1 □, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL -17, IP-10, KC, LIF, LIX, MCP-1, M-CSF, MIG, MIP-1 □, MIP-1 □, MIP-2, RANTES, TNF □ y VEGF.

Caracterizacion de la eficacia cifnica de IVIG y s1-IVIG en EAE

[0140] Los tratamientos con IVIG y sIVIG parecieron haber pospuesto el comienzo de EAE de una manera dependiente de la dosis (Figura 7). Ningun agente mostro una disminucion estadlsticamente significativa en la gravedad maxima de EAE (MMS). Para el retraso del comienzo de la enfermedad, la IVIG y s1-IVIG parecieron ser igualmente eficaces a 0,5 g/kg, pero la s1-IVIG a 0,05 g/kg fue tan efectiva como la IVIG a una dosis de 0,5 g/kg. Sin embargo, no se observaron diferencias estadlsticamente significativas con respecto al comienzo de la EAE o la gravedad de la EAE entre el grupo tratado con el vehlculo y los grupos tratados con IVIG o s1-IVIG a 0,005 g/kg (Tabla 4). Estos resultados demuestran el aumento de la potencia de s1-IVIG que fue eficaz para retrasar el comienzo de la enfermedad a 0,05 g/kg, mientras que la IVIG no fue eficaz a esta dosis, pero alcanzo este nivel de eficacia a la dosis de 0,5 g/kg.

Tabla 4: analisis estadlstico de la EAE cllnica. Comparacion de la incidencia, mediana del dla de comienzo y untuacion clinica media maxima MMS.

Modulacion de la diferenciacion de celulas T por IVIG, s1-IVIG o s2-IVIG

[0141] Los investigadores descubrieron que las celulas T reguladoras CD3+ CD4+ CD25+ FoxP3+ aumentaron en el bazo despues del tratamiento con IVIG, s1- y s2-IVIG despues de una sola inyeccion (d3). Este aumento de la frecuencia se mantiene y potencia el dla 8 despues de la inmunizacion (Figuras 8A y 8B). No se observo diferencia entre los grupos de IVIG y s1- y s2-IVIG.

[0142] EAE depende de la activacion y diferenciacion de las celulas T. La frecuencia de las celulas T CD44' CD62L+ CD4+ y CD8+ no tratadas previamente se reduce despues de la induction de EAE (Figuras 9A-9D). Sin embargo, la frecuencia de las celulas T CD4+ y CD8+ no tratadas previamente se elevo significativamente despues de s1- y s2-IVIG en comparacion con el vehlculo y el tratamiento con IVIG. Por el contrario, la frecuencia de las celulas CD4+ y CD8+CD44+ CD62L' de memoria efectora fue significativamente mas reducida en los grupos tratados con s1-IVIG y s2-IVIG.

[0143] Este resultado sugiere que s1- y s2-IVIG son significativamente mas potentes que la IVIG para evitar la activacion de las celulas T. Estos resultados podrlan ser beneficiosos en la eA, considerando la alteration del compartimiento de las celulas de memoria asociado con la enfermedad.

Modulacion de la diferenciacion y activacion de las celulas mieloides por IVIG, s1-IVIG o s2-IVIG

[0144] Microglia a menudo se encuentran cerca de tejido danado en pacientes con EA. Los estudios han demostrado que la microglia desempena funciones opuestas en la patogenesis de la enfermedad al eliminar los agregados de beta-amiloide a traves de la fagocitosis, pero tambien al matar las neuronas cercanas mediante la liberacion de factores neurotoxicos. La microglia se puede subdividir en dos subconjuntos diferentes: microglia residente y microglia parenquimatosa (Figura 10A). La microglia parenquimatosa se origina a parti r de la extravasacion de monocitos perifericos a traves de la barrera hematoencefalica y esta influenciada por los gradientes quimiotacticos.

[0145] Se ha demostrado que la expresion de CCR2, un quimiocinereceptor en monocitos y microglia parenquimatosa, desempena un papel positivo en la eliminacion de las placas de Ap en un modelo de raton de EA al promover la infiltracion de monocitos en el SNC.

[0146] En el modelo de los investigadores, se observa una reduccion de la frecuencia de microglia parenquimatosa en el SNC, despues del tratamiento con s1- y s2-IVIG (Figura 10B). El tratamiento con IVIG e IVIG sialilada se asocio con una mayor frecuencia de celulas CCR2 positivas en el SNC (Figura 10C), pero tambien en la periferia (medula osea) (Figura 10D) y el bazo (Figura 10E). Estos resultados sugieren una mayor capacidad de la IVIG sialilada para regular positivamente los mecanismos microgliales beneficiosos para la eliminacion de la placa neurodegenerativa, asi como para disminuir el porcentaje de microglia inflamatoria perjudicial.

Modulacion de la expresion de quimioquinas por IVIG y s1-IVIG

[0147] Similar a muchas otras enfermedades que implican neurodegeneracion, tal como la esclerosis lateral amiotrofica (ELA) y la enfermedad de Huntington (EH), la barrera hematoencefalica esta intacta en la enfermedad de Alzheimer. Se cree que las respuestas inflamatorias cronicas son causadas por celulas residentes del SNC. Se ha encontrado un numero impresionante de quimioquinas y receptores en las celulas residentes del SNC, incluidas MCP-1 y eotaxina, que son ligandos de CCR2.

[0148] MCP-1 esta involucrado en el trafico de monocitos. En la EA, se ha encontrado en placas seniles maduras, pero no inmaduras, y en microglia reactiva de tejidos cerebrales de pacientes, lo que sugiere que puede contribuir a la maduracion de las placas seniles. Se ha demostrado que los niveles sericos aumentan en los pacientes que pasan de un deterioro cognitivo leve (MCI) a la EA.

[0149] Anteriormente se demostro que las concentraciones de eotaxina eran elevadas en el suero de los pacientes con EA y los niveles elevados de eotaxina pueden estar asociados con el envejecimiento. Ademas, recientemente se demostro un papel para la eotaxina en la neurogenesis. Por lo tanto, la inhibicion de MCP-1 y eotaxina puede disminuir las placas y preservar las neuronas en el envejecimiento.

[0150] Los niveles de MCP-1 se redujeron significativamente en el grupo tratado con s1-IVIG, en comparacion con el vehiculo (Figura 11A), sugiriendo un papel para la sialilacion en la regulacion de la expresion de esta quimioquina.

[0151] Los niveles de eotaxina se redujeron tanto en los grupos de IVIG como en los de s1-IVIG 0,5 g/kg (Figura 11B). Este resultado sugiere un papel para la IVIG en la regulacion de la expresion de la citoquina, pero no necesariamente para la sialilacion.

Relevancia para la neurodegeneracion de la IVIG sialilada

[0152]

• Reduccion de la infiltracion del SNC: reduccion de la inflamacion del SNC/SNP.

• Aumento de la expresion de CCR2: mayor capacidad para la eliminacion de la placa/reabsorcion de la lesion • Aumento de la diferenciacion de las celulas T reguladoras: regulacion de la inflamacion/activacion de las celulas T.

• Disminucion de la diferenciacion de celulas T de memoria (y, a la inversa, aumento del fenotipo no tratado previamente): reduccion de la inflamacion y migracion a SNC/^s N^p .

• Reduccion de la expresion de MCP-1: disminucion de la migracion de monocitos al SNC/SNP. Disminucion de la secrecion de citoquinas proinflamatorias (IL-1 □).

• Reduccion de los niveles de eotaxina: neurogenesis mejorada.

[0153] Si bien los procedimientos se han descrito junto con diversos casos y ejemplos, no se pretende que los procedimientos se limiten a dichos casos o ejemplos. Por el contrario, los procedimientos abarcan diversas alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciaran los expertos en la materia.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una preparacion para su uso en un procedimiento para tratar la neurodegeneracion en un sujeto, comprendiendo la preparacion polipeptidos que tienen una region Fc, en la que al menos el 70 % de glicanos ramificados en la region Fc de dichos polipeptidos en dicha preparacion tienen al menos una galactosa conectada a un acido sialico terminal respectivo en un brazo a 1,3 del glicano ramificado, unido a la galactosa a traves de un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal; y en la que dichos polipeptidos se derivan de IVIG.

2. La preparacion para su uso de la reivindicacion 1, en la que dichos polipeptidos son IgG sialiladas purificadas o enriquecidas a partir de IVIG: IVIG modificada (p. ej., IVIG enzimaticamente sialilada); regiones Fc producidas a partir de IVIG; o regiones Fc derivadas de IVIG (p. ej., por digestion con papalna y sialilacion).

3. La preparacion para su uso de la reivindicaciones 1 o 2, en la que dicha preparacion se administra en una formulacion farmaceutica que comprende dichos polipeptidos y un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable.

4. La preparacion para su uso de cualquier reivindicacion anterior, en la que al menos el 70 % de los glicanos ramificados en la region Fc de dichos polipeptidos en dicha preparacion tienen al menos una galactosa conectada a un acido sialico terminal respectivo tanto en un brazo a 1,3 como en un brazo a 1,6 del glicano ramificado, unido a la galactosa a traves de un enlace terminal NeuAc-a 2,6-Gal.