PL196770B1 - Sposób oczyszczania immunoglobuliny, produkt immunoglobuliny i jego zastosowanie - Google Patents

Abstract

1. Sposób oczyszczania immunoglobuliny (IgG), z zawieraj acej immunoglobulin e surowej frakcji bia lek osocza zawiera- j acej immunoglobulin e, znamienny tym, ze obejmuje etapy: (a) przygotowanie wodnej zawiesiny surowej frakcji bia lek osocza zawieraj acej immunoglobulin e; (b) dodanie do zawiesiny z etapu (a) rozpuszczalnego w wodzie, zasadniczo niedenaturuj acego srodka wytr acaj acego bia lko w ilo sci wystarczaj acej do wytr acenia w du zej ilo sci bia lek innych ni z bia lka immunoglobuliny G, agregatów immunoglobulin i cz astek obejmuj acych cz astki potencjalnie zaka zne, takie jak cz astki wirusów, bez spowodowania znacz acego wytr acenia monomerycznej immunoglobuliny G, z wytworzeniem w ten sposób mieszaniny sta lego osadu i ciek le- go supernatantu; (c) odzyskanie klarownego supernatantu zawieraj acego immunoglobulin e G z mieszaniny z etapu (b); (d) naniesienie klarownego supernatantu zawieraj acego immunoglobulin e G z etapu (c) na zywic e anionowymienn a, a nast epnie na zywic e kationowymienn a, przy czym zywica anionowymienna i zywica kationowymienna s a polaczone szerego- wo, a w chromatografii anionowymiennej i kationowymiennej stosuje si e ten sam bufor, którego pH wynosi poni zej 6,0, (e) wyp lukanie zanieczyszcze n bia lkowych i srodka wytr acaj acego bia lko z zywicy kationowymiennej z etapu (d) buforem o pH i sile jonowej wystarczaj acej do usuni ecia zanieczyszcze n z zywicy, bez spowodowania zasadniczego wyeluowania immunoglobuliny G; (f) wyeluowanie immunoglobuliny G z zywicy kationowymiennej z etapu (e) zasadniczo niedenaturuj acym buforem o warto sci pH i sile jonowej wystarczaj acej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawieraj acego immunoglobulin e G; (g) poddanie eluatu zawieraj acego immunoglobulin e G z etapu (f) diafiltra- cji/ultrafiltracji, w celu zat ezenia i/lub dializowania eluatu i ewentualnie dodanie srodka stabilizuj acego; (h) dodanie do frakcji zawieraj acej immunoglobulin e G poddanej diafiltracji/ultrafiltracji i ewentualnie stabilizowanej z etapu (g) wirusobójczej ilo sci srodka inaktywuj acego wirusy, z uzyskaniem zasadniczo bezpiecznego pod wzgl edem wirusów roztworu zawieraj acego immu- noglobulin e G; (i) naniesienie roztworu zawieraj acego immunoglobulin e G z etapu (h) na zywic e anionowymienn a, a nast epnie na zywic e kationowymienn a; (j) przemycie zywicy kationowymiennej z etapu (i) buforem o pH i sile jonowej wystarczaj acej do wyp lukania zanieczyszcze n bia lkowych i srodka inaktywuj acego wirusy z zywicy, bez zasadniczego wyeluowania immunoglobu- liny G; (k) wyeluowanie immunoglobuliny G z zywicy kationowymiennej z etapu (j) zasadniczo niedenaturuj acym buforem o pH i sile jonowej wystarczaj acej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawieraj a- cego immunoglobulin e G; oraz (l) poddanie eluatu zawieraj acego immunoglobulin e G z etapu (k) diafiltracji/ultrafiltracji w celu obni zenia si ly jonowej i zat ezenia roztworu immunoglobuliny G, oraz wyregulowanie osmolowo sci przez dodanie sacharydu. PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 344671	(11) 196770 (13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 09.06.1999	(51) Int.Cl. C07K 16/06 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 09.06.1999, PCT/DK99/00312	A61K 39/395 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
Rzeczypospolitej Polskiej	16.12.1999, WO99/64462 PCT Gazette nr 50/99

(54) Sposób oczyszczania immunoglobuliny, produkt immunoglobuliny i jego zastosowanie

(30) Pierwszeństwo:	(73) Uprawniony z patentu:
09.06.1998,EP,98201909.3	STATENS SERUM INSTITUT,Kopenhaga S.,DK
28.09.1998,US,60/102,055	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Inga Laursen,Hellerup,DK
19.11.2001 BUP 24/01	BYrge Teisner,Odense C,DK
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	(74) Pełnomocnik:
31.01.2008 WUP 01/08	Zofia Szczepańska, PATPOL Sp. z o.o.

(57) 1. Sposób oczyszczania immunoglobuliny (IgG), z zawierającej immunoglobulinę surowe j frakcji białek osocza zawierającej immunoglobulinę, znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) przygotowanie wodnej zawiesiny surowej frakcji białek osocza zawierającej immunoglobulinę; (b) dodanie do zawiesiny z etapu (a) rozpuszczalnego w wodzie, zasadniczo niedenaturującego środka wytrącającego białko w ilości wystarczającej do wytrącenia w dużej ilości białek innych niż białka immunoglobuliny G, agregatów immunoglobulin i cząstek obejmujących cząstki potencjalnie zakaźne, takie jak cząstki wirusów, bez spowodowania znaczącego wytrącenia monomerycznej immunoglobuliny G, z wytworzeniem w ten sposób mieszaniny stałego osadu i ciekłego supernatantu; (c) odzyskanie klarownego supernatantu zawierającego immunoglobulinę G z mieszaniny z etapu (b);

(d) naniesienie klarownego supernatantu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (c) na żywicę anionowymienną, a następnie na żywicę kationowymienną, przy czym żywica anionowymienna i ż ywica kationowymienna są połączone szeregowo, a w chromatografii anionowymiennej i kationowymiennej stosuje się ten sam bufor, którego pH wynosi poniżej 6,0, (e) wypłukanie zanieczyszczeń białkowych i środka wytrącającego białko z żywicy kationowymiennej z etapu (d) buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do usunięcia zanieczyszczeń z żywicy, bez spowodowania zasadniczego wyeluowania immunoglobuliny G;

(f) wyeluowanie immunoglobuliny G z żywicy kationowymiennej z etapu (e) zasadniczo niedenaturującym buforem o wartości pH i sile jonowej wystarczającej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawierającego immunoglobulinę G; (g) poddanie eluatu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (f) diafiltracji/ultrafiltracji, w celu zatężenia i/lub dializowania eluatu i ewentualnie dodanie środka stabilizującego; (h) dodanie do frakcji zawierającej immunoglobulinę G poddanej diafiltracji/ultrafiltracji i ewentualnie stabilizowanej z etapu (g) wirusobójczej ilości środka inaktywującego wirusy, z uzyskaniem zasadniczo bezpiecznego pod względem wirusów roztworu zawierającego immunoglobulinę G; (i) naniesienie roztworu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (h) na żywicę anionowymienną, a następnie na żywicę kationowymienną; (j) przemycie żywicy kationowymiennej z etapu (i) buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do wypłukania zanieczyszczeń białkowych i środka inaktywującego wirusy z żywicy, bez zasadniczego wyeluowania immunoglobuliny G; (k) wyeluowanie immunoglobuliny G z żywicy kationowymiennej z etapu (j) zasadniczo niedenaturującym buforem o pH i sile jonowej wystarczają cej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawierają cego immunoglobulinę G; oraz (l) poddanie eluatu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (k) diafiltracji/ultrafiltracji w celu obniżenia siły jonowej i zatężenia roztworu immunoglobuliny G, oraz wyregulowanie osmolowości przez dodanie sacharydu.

PL 196 770 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania immunoglobuliny, produkt immunoglobuliny i jego zastosowanie. Przedmiotowy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania immunoglobulin, tj. immunoglobuliny G (IgG), z surowego osocza lub z frakcji białkowej surowego osocza. Produkt immunoglobulinowy znajduje zastosowanie do celów medycznych.

W póź nych latach 1940-tych wprowadzono stosowanie normalnej immunoglobuliny ludzkiej (HNI) do zapobiegania i leczenia wielu chorób zakaźnych. HNI wytworzona przez frakcjonowanie przy użyciu zimnego etanolu metodą opisaną przez Cohn i Oncley (E. Cohn i in., (1946), J. Am. Chem. Soc., 68, 459-475) (Oncley i in., (1949), J. Am. Chem. Soc., 71, 541-550), a następnie zmodyfikowana, jak opisali Kistler i Nitschmann (P. Kistler i HS Nitschmann (1952), Vox Sang, 7, 414-424) okazała się być bezpieczna i skuteczna przeciwko przenoszeniu zakażeń wirusowych przy podawaniu podskórnym i domięśniowym.

Wrodzony lub nabyty całkowity lub częściowy brak immunoglobuliny (odpowiednio pierwotny i wtórny zespół niedoboru odporności) objawia się częstymi zwyczajnymi i poważnymi zakażeniami, zwłaszcza o charakterze bakteryjnym. Do tej pory zakażeniom takim zapobiegano przez wielokrotne domięśniowe lub podskórne wstrzykiwanie dużych ilości HNI, aż do kilku razy tygodniowo przy leczeniu długotrwałym, co w przypadku podawania leku domięśniowo, jest bardzo bolesne.

A zatem, we wczesnych latach sześćdziesiątych prowadzono próby podawania HNI drogą dożylną. Próby te wykazały, że u około 5% zdrowych ochotników i około 95% pacjentów z niedoborem immunoglobuliny rozwinęły się natychmiastowe skutki uboczne od duszności do wstrząsu krążeniowego, o charakterze tak poważnym, że dożylnego podawania HNI zaniechano.

Powodem wymienionych powyżej skutków ubocznych okazały się agregaty immunoglobuliny, które, oprócz innych działań, silnie aktywują układ dopełniacza. Można to zaobserwować zwłaszcza u pacjentów z brakiem immunoglobuliny. Szczególnie poważ ne skutki uboczne o charakterze anafilaktycznym można zauważyć u pacjentów, u których wytworzyły się przeciwciała przeciwko IgA. W konsekwencji, opracowano sposoby zapobiegające tworzeniu się agregatów i/lub eliminujące agregaty podczas procesu wytwarzania i prawie dwadzieścia lat temu przebadano pierwszą generację immunoglobuliny do podawania dożylnego (IVIG) i stwierdzono, że jest ona odpowiednia.

Pierwotnym celem IVIG było łagodzenie epizodów zapalnych u pacjentów z wrodzonym lub nabytym całkowitym albo częściowym brakiem immunoglobulin i wyeliminowanie dyskomfortu związanego z podawaniem HNI. Inną zaletą IVIG jest fakt, że w krótkim czasie można podać duże dawki immunoglobuliny, w wyniku czego bardzo szybko możliwe jest uzyskanie wystarczająco wysokich stężeń we krwi. Szczególnie w leczeniu poważnych zakażeń bakteryjnych ważne jest szybkie uzyskanie wysokich stężeń w miejscach zakażenia.

W ostatnich latach IVIG okazała się skuteczna w innych poważnych chorobach, których leczenie w inny sposób mogłoby być trudne, na przykład w krwotokach spowodowanych zanikaniem płytek krwi o podłożu immunologicznym, w chorobie Werlhofa (ITP), w niektórych rzadkich chorobach, takich jak zespół Kawasaki, oraz w kilku chorobach autoimmunizacyjnych, takich jak zapalenie wielokorzeniowe (zespół Guillain Barre'a). Obecnie próbom klinicznym z IVIG poddaje się również inne choroby, których leczenie do tej pory było trudne. Mechanizm działania w tych chorobach został jedynie częściowo wyjaśniony i przypuszcza się, że jest on związany z tak zwanymi immunomodulacyjnymi własnościami IgG, np. blokowaniem receptorów Fcy na komórkach fagocytowych, zwiększonym metabolizmem IgG, regulacją produkcji cytokin w dół i zakłócaniem domniemanej sieci idiotypów/antyidiotypów, co jest szczególnie istotne dla neutralizacji reaktywności układu odpornościowego.

Pierwszą generację IVIG wytworzono przez rozszczepienie pepsyny w materiale wyjściowym (frakcja Cohna II), a celem tego rozszczepienia było usunięcie agregatów immunoglobuliny. Proces ten nie obejmował etapów chromatografii kolumnowej. Aby produkt pozostał trwały przez dopuszczalny okres, należało go liofilizować i rozpuszczać bezpośrednio przed użyciem.

Substancją wyjściową dla IVIG byłą HNI, która okazała się bezpieczna pod względem przenoszenia wirusów przy stosowaniu na drodze iniekcji dożylnej. Z tego względu uważano, że IVIG jest również bezpieczna. Jednakże, po kilku latach stosowania klinicznego okazało się, że produkty IVIG od niektórych producentów powodują przenoszenie zakażenia wirusowym zapaleniem wątroby typu C.

Badania nad wyjaśnieniem losu wirusów podczas wytwarzania NHI wykazały, że usunięcie wirusów w procesie frakcjonowania z osocza do HNI jest niewielkie. Bezpieczeństwo HNI przy zastosowaniu dożylnym wiąże się prawdopodobnie z faktem, że zawiera ona ochronne immunoglobuliny. Te

PL 196 770 B1 ochronne immunoglobuliny, w połączeniu ze wstrzykiwaniem małej objętości i domięśniową drogą podawania, mogą zobojętnić wszystkie wirusy w osoczu i sprawić, że staną się one niezakaźne. Jak wykazano we wczesnych latach 90-tych, zakażenie wirusami może rozwinąć się szczególnie wówczas, gdy dożylnie podaje się duże dawki immunoglobuliny. Uznano zatem, że sposób wytwarzania powinien obejmować jeden lub więcej ściśle określonych etapów inaktywacji i/lub usuwania wirusów.

W połowie lat osiemdziesiątych wprowadzono drugą generację IVIG opartą na nierozszczepionych i niemodyfikowanych cząsteczkach immunoglobuliny o niskiej aktywności antykomplementarnej i większej trwał o ś ci, ale nadal w postaci liofilizowanego produktu. Tę IVIG oczyszczono metod ą kilkuetapowej chromatografii. Produkty tego rodzaju dominują w tej chwili na rynku IVIG. Pierwszą i drugą generację IVIG stanowią liofilizowane proszki, które rozpuszcza się bezpośrednio przed użyciem.

Rozpuszczanie liofilizowanej IVIG przebiega powoli (do 30 minut dla jednej fiolki). Dla jednego pacjenta często trzeba rozpuszczać kilka porcji. Ponieważ dla użytkowników priorytetową sprawą jest otrzymanie IVIG w roztworze gotowym do stosowania, wprowadzono na rynek ciekłe produkty. Jeszcze ważniejsza jest potrzeba ulepszenia procesu produkcji w celu uzyskania wysoce czystego, trwałego i całkowicie natywnego preparatu IVI o wyższej skuteczności klinicznej i zmniejszonych reakcjach ubocznych. A zatem konieczne są dalsze prace nad ulepszonym sposobem oczyszczania IgG z surowego osocza lub frakcji białkowej osocza, w którym uzyskano by wolny od wirusów, ciekły produkt IVIG. Sposób ten powinien być ponadto opracowany tak, aby mógł być stosowany na skalę przemysłową.

Sposób oczyszczania opisany w niniejszym zgłoszeniu prowadzi do ciekłego produktu immunoglobuliny do podawania dożylnego, który można scharakteryzować jako wysoce czystą, całkowicie natywną, aktywną biologicznie, podwójnie inaktywowaną na wirusy i trwałą nową generację IVIG, która nie zawiera żadnego detergentu, glikolu polietylenowego (PEG) lub albuminy jako stabilizatora.

STRESZCZENIE WYNALAZKU

Wynalazek niniejszy dotyczy ulepszonego sposobu oczyszczania i ulepszonego ciekłego produktu immunoglobuliny, który, między innymi, można podawać dożylnie.

Produkt immunoglobuliny otrzymany sposobem według niniejszego wynalazku określić można jako trzecią generację IVIG. Sposób charakteryzuje się następującymi warunkami frakcjonowania: wyeliminowane jest rozszczepianie pepsyny, agregaty i cząstki zostają usunięte przez wytrącenie (potwierdzono, że ten etap procesu pełni funkcję etapu usuwania wirusów), dalsze oczyszczanie prowadzi się metodami jonowymiennej chromatografii kolumnowej, jako etap inaktywacji wirusów wprowadza się obróbkę S/D, a preparat wytwarza się w postaci ciekłego produktu.

Z uwagi na poprawioną czystość produktu immunoglobuliny otrzymanego sposobem według wynalazku, w porównaniu z produktami znanymi ze stanu techniki, w celu uniknięcia agregacji IgG podczas przechowywania IVIG jako ciekłego produktu, nie jest konieczne stosowanie stabilizatorów, takich jak niejonowe detergenty, PEG lub albumina. Produkt uzyskany sposobem według wynalazku ma wyższą jakość niż produkty znane ze stanu techniki i zapewnia lepsze efekty kliniczne, a niepożądane skutki uboczne właściwie nie występują.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Wynalazek niniejszy dotyczy sposobu oczyszczania immunoglobulin, tj. IgG, z surowego osocza lub zawierającej immunoglobulinę frakcji białek osocza, który obejmuje etapy:

(a) wytworzenie wodnej zawiesiny surowej frakcji białek osocza zawierającej immunoglobulinę;

(b) dodanie do zawiesiny z etapu (a) rozpuszczalnego w wodzie, zasadniczo niedenaturującego środka wytrącającego białko w ilości wystarczającej do wytrącenia w dużej części białek innych niż immunoglobulina G, agregatów immunoglobulin i cząstek obejmujących cząstki potencjalnie zakaźne, takie jak cząstki wirusów, bez spowodowania znaczącego wytrącenia monomerycznej immunoglobuliny G, z wytworzeniem w ten sposób mieszaniny stałego osadu i ciekłego supernatantu;

(c) odzyskanie klarownego supernatantu zawierającego immunoglobulinę G z mieszaniny z etapu (b);

(d) naniesienie klarownego supernatantu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (c) na żywicę anionowymienną, a następnie na żywicę kationowymienną;

(e) wypłukanie zanieczyszczeń białkowych i osadu białka z żywicy kationowymiennej buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do usunięcia zanieczyszczeń z żywicy, bez spowodowania zasadniczego wyeluowania immunoglobuliny G;

(f) wyeluowanie immunoglobuliny G z żywicy kationowymiennej zasadniczo niedenaturującym buforem o wartości pH i sile jonowej wystarczającej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawierają cego immunoglobulinę G;

PL 196 770 B1 (g) poddanie eluatu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (f) diafiltracji/ultrafiltracji, w celu zatężenia i/lub dializy eluatu i ewentualnie dodanie środka stabilizującego;

(h) dodanie wirusobójczej ilości środka inaktywującego wirusy do frakcji z etapu (g) zawierającej immunoglobulinę G poddanej diafiltracji/ultrafiltracji i ewentualnie stabilizowanej, z uzyskaniem zasadniczo pozbawionego wirusów roztworu zawierającego immunoglobulinę G;

(i) naniesienie roztworu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (h) na żywicę anionowymienną, a następnie na żywicę kationowymienną;

(j) przemycie żywicy kationowymiennej z etapu (i) buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do wypłukania zanieczyszczeń białkowych i środka inaktywującego wirusy z żywicy, bez zasadniczego wyeluowania immunoglobuliny G;

(k) wyeluowanie immunoglobuliny G z żywicy kationowymiennej z etapu (j) zasadniczo niedenaturującym buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawierającego immunoglobulinę G; oraz (l) poddanie eluatu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (k) diafiltracji/ultrafiltracji w celu obniżenia siły jonowej i zatężenia immunoglobuliny G w roztworze, oraz wyregulowanie osmolowości przez dodanie sacharydu.

W opisanym procesie oczyszczania materiałem wyjściowym moż e być surowe osocze, ale korzystnie stosuje się frakcję białek surowego osocza zawierającą immunoglobulinę. Materiałem wyjściowym w procesie oczyszczania może być normalne osocze ludzkie lub osocze pochodzące od dawców z wysokim mianem swoistych przeciwciał, np. osocze hiperimmunizowane. W niniejszym opisie określenie „frakcja osocza zawierająca immunoglobulinę” obejmuje wszystkie materiały wyjściowe nadające się do zastosowania w niniejszym wynalazku, np. osocze wolne od krioprecypitatu lub osocza wolne od krioprecypitatu, z którego usunięto różne białka osocza, takie jak Czynnik IX i antytrombina, różne frakcje Cohna i frakcje otrzymane metodami precypitacji z zastosowaniem PEG (Polson i in. (1964), Biochem Biophys Acta, 82, 463-475; Polson i Ruiz-Bravo (1972), Vox Sang, 23, 107-118) lub siarczanu amonu. W korzystnym wykonaniu frakcja białek osocza stanowi frakcje Cohna II i III, ale można także stosować frakcję Cohna II, albo frakcje Cohna I, II i III. Korzystnie różne frakcje Cohna wytwarza się z osocza standardowymi metodami frakcjonowania Cohna, zasadniczo w postaci zmodyfikowanej przez Kistlera-Nitschmanna. Oprócz immunoglobulin frakcje Cohna zawierają np. fibrynogen, α-globuliny i β-globuliny, obejmujące różne lipoproteiny, które korzystnie powinny być usunięte w czasie następnego procesu oczyszczania. W zależności od sposobu wyodrębniania stosowanego do uzyskania frakcji Cohna (wirowanie, filtrowanie), można stosować lub można nie stosować środków pomocniczych do filtrowania.

Pierwszy etap sposobu według wynalazku obejmuje przygotowanie wodnej zawiesiny frakcji białek osocza zawierającej immunoglobulinę, w której stężenie IgG jest na tyle wysokie, aby podczas następnego etapu precypitacji wytrąciła się większa część białek nie stanowiących IgG, zwłaszcza tych o wyższym ciężarze cząsteczkowym, agregatów immunoglobuliny i agregatów innych białek, jak również potencjalnie zakaźnych cząstek, bez znaczącego wytrącenia się monomerycznej IgG. Cel taki osiąga się zwykle, gdy przed dodaniem środka wytrącającego stężenie IgG w buforowanej i przesączonej zawiesinie wynosi co najmniej 4 g/l. Należy wziąć pod uwagę, że wpływ stężenia białka, jak również pH i temperatury zawiesiny na wytrącanie, zależny jest od wybranego środka wytrącającego.

Korzystnie frakcję białek osocza zawiesza się w wodzie i/lub buforze w zasadniczo niedenaturującej temperaturze i pH. Określenie „zasadniczo niedenaturująca”, oznacza, że warunki, których ono dotyczy, nie powodują znaczącej nieodwracalnej utraty aktywności funkcyjnej cząsteczek IgG, np. utraty aktywności wiązania antygenu i/lub utraty biologicznej funkcji Fc (patrz przykład 2).

Korzystnie frakcję białek osocza zawiesza się w wodzie zakwaszonej co najmniej jednym niedenaturującym układem buforowym, w objętościach stanowiących od 6 do 9, a korzystnie od 7 do 8 objętości frakcji białek osocza. W celu zapewnienia optymalnej rozpuszczalności immunoglobuliny i optymalnego rezultatu następnego etapu wytrącania przy użyciu PEG, pH zawiesiny zawierającej immunoglobulinę korzystnie utrzymuje się na poziomie poniżej 6, takim jak w zakresie 4,0-6,0, korzystnie 5,1-5,7, a najkorzystniej około 5,4. Można stosować każdy odpowiedni bufor kwasowy, ale korzystnie układ buforowy zawiera co najmniej jeden spośród następujących buforów i kwasów: fosforan sodu, octan sodu, kwas octowy, HCl. Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że można stosować wiele innych buforów.

Zawiesinę immunoglobuliny korzystnie utrzymuje się w niskiej temperaturze, między innymi po to, aby zapobiec znacznej denaturacji białka i zminimalizować aktywność proteazy. Korzystnie zawiesina

PL 196 770 B1 immunoglobuliny i woda, jak również dodany układ buforowy, mają tę samą temperaturę w zakresie 0-12°C, korzystnie 0-8°C, a najkorzystniej 1-4°C.

Zawiesina wytrąconej etanolem pasty zawiera stosunkowo duże ilości zagregowanego materiału białkowego. W celu usunięcia, np. dużych agregatów, pomocniczych materiałów do filtracji, jeśli są obecne, i resztkowej nierozpuszczonej pasty, ewentualnie przesącza się zawiesinę zawierającą immunoglobulinę. Korzystnie sączenie prowadzi się stosując głębokie filtry, np. C150 AF, AF 2000 lub AF 1000 (Schenk), 30LA (Cuno), lub podobne. Agregaty, materiały filtrujące, jeśli są obecne, oraz resztkowy nierozpuszczony materiał białkowy można również usunąć przez odwirowanie.

Do zawierającej immunoglobulinę przesączonej zawiesiny dodaje się co najmniej jeden rozpuszczalny w wodzie, zasadniczo niedenaturujący środek wytrącający białko w ilości wystarczającej do wytrącenia stosunkowo wysokiej ilości białek o wysokim ciężarze cząsteczkowym, lipoprotein i agregatów białek, między innymi agregatów immunoglobuliny. Wytrąca się również inny materiał w postaci cząstek, taki jak cząstki potencjalnie zakaźne, np. cząstki wirusów, nie powodując zasadniczego wytrącenia monomerycznej IgG. W kontekście niniejszego opisu określenie „cząstki zakaźne” obejmuje np. cząstki wirusów (takich jak wirusy zapalenia wątroby, HIV1 i HIV2) oraz bakterie.

W technice oczyszczania biał ek dobrze znane są zasadniczo niedenaturują ce, rozpuszczalne w wodzie środki wytrącające białka. Takie środki wytrącające są stosowane do frakcjonowania białek, czego wynikiem jest częściowe oczyszczenie białek z zawiesin. Odpowiednie do stosowania w sposobie według wynalazku środki wytrącające białka obejmują PEG o różnych ciężarach cząsteczkowych, kwas kaprylowy oraz siarczan amonu. Dla specjalisty w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że jako alternatywne środki do wytrącania można również stosować inne niedenaturujące, rozpuszczalne w wodzie środki wytrącające. Przez określenie „dodawanie środka wytrącającego białko” i terminy mu pokrewne należy rozumieć dodawanie jednego lub więcej typów środków wytrącających białko.

Korzystnym środkiem wytrącającym jest organiczny czynnik PEG, a szczególnie PEG o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 3000-8000 Da, taki jak PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000, a zwłaszcza PEG 6000 (liczby przy wymienionych konkretnie związkach PEG oznaczają ich średni ciężar cząsteczkowy). Zaletą stosowania PEG jako środka wytrącającego jest fakt, że PEG jest niejonowy i ma własności stabilizujące białko, np. w niskim stężeniu PEG jest dobrze znany jako stabilizator produktów IVIG. Etap wytrącania spełnia również funkcję etapu usuwania wirusów. PEG zatęża i wytrąca wirusy niezależnie od ich gatunku, wielkości i ich powierzchniowej otoczki.

W celu wytrącenia wię kszoś ci biał ek o wysokim ciężarze czą steczkowym, zagregowanych białek i cząstek, bez zasadniczego wytrącania monomerycznej IgG, do przesączonej zawiesiny dodaje się ustaloną ilość środka wytrącającego białko, z wytworzeniem klarownego roztworu supernatantu. Środek wytrącający białko można dodawać w postaci stałego proszku lub w postaci stężonego roztworu.

W przypadku stosowania PEG jako środka wytrącającego obowiązuje ogólna zasada, że im wyższy jest jego ciężar cząsteczkowy, tym mniejsze stężenie PEG wymagane jest do wytrącenia białka. Gdy stosuje się PEG 3350, PEG 4000 albo, korzystnie, PEG 6000, wówczas stężenie środka wytrącającego białko w przesączonej zawiesinie korzystnie mieści się w zakresie 3-15% wagowych, na przykład 4-10% wagowych (na przykład około 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%), przy czym najkorzystniejsze jest stężenie 6%. W etapie wytrącania proces wytrącania przebiega aż do uzyskania stanu równowagi pomiędzy fazą stałą i ciekłą, np. zwykle przez co najmniej dwie godziny, przykładowo od około 2 do około 12 godzin, a korzystnie około 4 godziny. Podczas wytrącania zawiesinę korzystnie utrzymuje się w niskiej temperaturze (np. poniż ej około 12°C, takiej jak poniż ej okoł o 10°C, a korzystnie pomię dzy 2°C i 8°C). Najbardziej odpowiednią temperaturę dobiera się w zależności od rodzaju środka wytrącającego białko.

Po zakończeniu wytrącania białka, z otrzymanej w wyniku wytrącenia mieszaniny stałego osadu i ciekłego supernatantu odzyskuje się klarowny supernatant zawierający IgG, prawie wyłącznie w postaci monomerycznej. Odzyskiwanie prowadzi się konwencjonalnymi technikami oddzielania cieczy od fazy stałej, takimi jak wirowanie i/lub filtrowanie. Korzystnie stosuje się wirówkę przepływową o sile 1000-5000 g (np. Westfalia).

Ewentualnie, odzyskany, klarowny supernatant zawierający IgG sączy się głęboko w celu usunięcia większych cząstek i agregatów. Następnie ewentualnie prowadzi się sterylną filtrację stosując konwencjonalny filtr do sterylizacji (taki jak 0,22 μm filtr z firmy Millipore lub Sartorius), który usuwa z roztworu, np. bakterie.

Klarowny i ewentualnie przesączony supernatant zawierający IgG poddaje się co najmniej jednemu etapowi, na przykład dwóm etapom, ale ewentualnie więcej niż dwóm etapom chromatografii

PL 196 770 B1 anionowymiennej i kationowymiennej w celu usunięcia znacznej części pozostałych, nie stanowiących IgG, zanieczyszczeń, np. IgA, albuminy, jak również agregatów. W korzystnym wykonaniu, klarowny i ewentualnie przesączony supernatant zawierający IgG nanosi się na żywicę anionowymienną, a następnie na żywicę kationowymienną, wypełniającą dwie kolumny o odpowiednich wymiarach.

Gdy podczas oczyszczania IgG prowadzi się etapy chromatografii jonowymiennej, korzystnie warunki, np. pH i siłę jonową, dobiera się w taki sposób, że większa część zanieczyszczeń (np. białek innych niż IgG, takich jak IgA, transferyna, albumina i agregaty) we wprowadzanym roztworze wiąże się z żywicą anionowymienną , podczas gdy IgG zasadniczo nie adsorbuje się na tej żywicy. Jeś li chodzi o nastę pny proces chromatografii kationowymiennej, korzystne warunki dobiera się tak, aby zasadniczo wszystkie cząsteczki IgG obecnej w nanoszonym roztworze wiązały się z żywicą kationowymienną. Zanieczyszczenia białkowe nie zaadsorbowane na żywicy anionowymiennej i środek wytrącający usuwa się w następnym etapie przemywania żywicy kationowymiennej.

W korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku ż ywica anionowymienna i ż ywica kationowymienna są połączone szeregowo. W tym kontekście stosowane w odniesieniu do żywic jonowymiennych określenie „połączone szeregowo” oznacza, że białka przechodzące przez żywicę anionowymienną są wprowadzane bezpośrednio na żywicę kationowymienną bez zmiany buforu lub innych warunków.

Prowadzenie chromatografii anionowymiennej i kationowymiennej w jednym etapie, z zastosowaniem dwóch szeregowo połączonych kolumn chromatograficznych, zamiast dwóch niezależnych etapów, np. z buforami o różnych składach, jest korzystne z kilku powodów. Zastosowanie dwóch połączonych szeregowo kolumn chromatograficznych sprawia, że proces jest bardziej praktyczny, np. w celu możliwości uregulowania pH i siły jonowej nie jest konieczny pośredni etap zbierania frakcji zawierającej IgG, co ma miejsce w dwuetapowych metodach chromatografii jonowymiennej. Ponadto bufor przepływa do obydwu kolumn w tym samym czasie, a dwie kolumny równoważy się tym samym buforem. Jednakże, rozważa się również możliwość prowadzenia chromatografii w dwóch etapach, tj. z niepołączonymi szeregowo żywicami anionowymienną i kationowymienną. Prowadzenie chromatografii w dwóch etapach, jak opisano powyżej, mogłoby być jednakże bardziej pracochłonne w porównaniu z procesem z połączonymi szeregowo żywicami jonowymiennymi.

Uważa się obecnie, że wysoki stopień czystości, wysoka zawartość monomerów i dimerów IgG oraz niska zawartość IgA w produkcie IVIG według wynalazku częściowo wynikają ze stosowania dwóch połączonych szeregowo kolumn chromatograficznych.

Dla specjalistów w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że wymieniacze jonowe mogą być oparte na różnych materiałach, jeśli chodzi o matrycę, jak również o przyłączone grupy z ładunkami. Przykładowo, można stosować następujące matryce, w których wymienione materiały mogą być bardziej lub mniej usieciowane: oparte na agarozie (takie jak Sepharose CL-6B®, Sepharose Fast Flow® i Sepharose High Performance®), oparte na celulozie (takie jak DEAE Sephacel®), oparte na dekstranie (takie jak Sephadex®), oparte na krzemionce i oparte na syntetycznych polimerach. W żywicach anionowymiennych grupami z ładunkami, które są kowalencyjnie związane z matrycą, mogą być na przykład dietyloaminoetyl (DEAE), czwartorzędowa grupa aminoetylowa (QAE) i/lub czwartorzędowa grupa amoniowa (Q). W żywicach kationowymiennych, grupami z ładunkami, które są kowalencyjnie związane z matrycą, mogą być na przykład grupa karboksymetylowa (CM), sulfopropylowa (SP) i/lub metylosulfonianowa (S). W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku jako żywicę anionowymienną stosuje się DEAE Sepharose Fast Flow®, ale można stosować również inne żywce. Korzystną żywicą kationowymienną jest CM Sepharose Fast Flow®, ale można również stosować inne wymieniacze kationowe.

Odpowiednia objętość żywicy wprowadzonej do kolumny jonowymiennej do chromatografii zależy od rozmiarów kolumny, tj. od średnicy kolumny i wysokości żywicy, i zmienia się w zależności np. od ilości IgG we wprowadzanym do kolumny roztworze i zdolności żywicy do wiązania.

Przed procesem chromatografii jonowymiennej, żywicę jonowymienną korzystnie równoważy się buforem, który umożliwia związanie się żywicy z jej przeciwjonami. Korzystnie żywicę anionowymienną i żywicę kationowymienną równoważy się tym samym buforem, co upraszcza proces, ponieważ należy przygotować i stosować tylko jeden bufor.

Przykładowo, gdy jako żywicę anionowymienną stosuje się DEAE Sepharose FF®, jako żywicę kationowymienną stosuje się CM Sepharose FF®, a kolumny są połączone szeregowo, wówczas korzystnie obydwie kolumny równoważy się niedenaturującym buforem kwasowym, w przybliżeniu o tym samym pH i sile jonowej, jak wprowadzony roztwór IgG. Do równoważenia kolumn jonowymiennych nadaje się wiele różnych buforów, np. octan sodu, fosforan sodu, tris(hydroksymetylo)amino-metan.

PL 196 770 B1

Dla specjalisty w tej dziedzinie techniki oczywiste będzie, że można również stosować wiele innych buforów, o ile ich pH i przewodność są w przybliżeniu takie same, jak wprowadzanego roztworu IgG. Gdy kolumny anionowymienna i kationowymienna są połączone szeregowo, korzystnym buforem do ich zrównoważenia jest bufor oparty na octanie sodu, w którym stężenie octanu sodu mieści się w zakresie 5-25 mM, na przykład 10-20 mM, a korzystnie wynosi około 15 mM. Korzystnie pH stosowanego do zrównoważenia opartego na octanie sodu buforu mieści się w zakresie 5,0 do 6,0, na przykład 5,4-5,9, a korzystnie około 5,7. Przewodność mieści się w zakresie 1,0-1,4 mS/cm, a korzystnie około 1,2 mS/cm. Odpowiednie bufory octanowe można wytworzyć z trihydratu octanu sodu i lodowatego kwasu octowego.

Przed wprowadzeniem klarownego i ewentualnie przesączonego supernatantu zawierającego IgG do kolumn jonowymiennych, stężenie buforu i pH supernatantu korzystnie reguluje się, w razie potrzeby, do wartości zasadniczo równoważnych stężeniu i pH stosowanego buforu równoważącego.

Po wprowadzeniu supernatantu zawierającego IgG do kolumn połączonych szeregowo, korzystnie przemywa się je (przemycie początkowe) jedną objętością kolumny buforu przemywającego, w celu zapewnienia ilościowego przeniesienia roztworu zawierającego IgG z kolumny anionowymiennej do kolumny kationowymiennej. Następnie kolumny anionowymienną i kationowymienną rozłącza się i aby usunąć zanieczyszczenia białkowe z żywicy, kolumnę kationowymienną korzystnie przemywa się buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do wyeluowania zasadniczo wszystkich zanieczyszczeń z ż ywicy kationowymiennej, bez zasadniczego wyeluowania IgG.

Do początkowego przemycia korzystnie stosuje się bufor równoważący, chociaż można stosować również inne bufory o podobnym stężeniu i wartości pH. Korzystnie do wypłukania zanieczyszczeń z żywicy kationowymiennej stosuje się bufor octanowy. pH buforu może mieścić się w zakresie od 5,0 do 6,0, na przykład w zakresie 5,2-5,8, na przykład może wynosić około 5,4.

Eluowanie IgG z żywicy kationowymiennej korzystnie prowadzi się stosując zasadniczo niedenaturujący bufor o pH i sile jonowej wystarczającej do skutecznego wyeluowania IgG, z odzyskaniem w ten sposobu zawierają cego IgG eluatu. W tym kontek ś cie „skuteczne wyeluowanie” oznacza, ż e co najmniej 75%, np. co najmniej 80% i np. co najmniej 85% białek IgG wprowadzonych na połączone szeregowo żywice anionowymienną i kationowymienną zostanie wyeluowane z żywicy kationowymiennej. Eluowanie korzystnie prowadzi się jako etap eluowania gradientem. W sposobie według wynalazku korzystnie jako bufor stosuje się octan sodu o pH w zakresie 5,0-6,0, takim jak 5,2-5,8, a korzystnie około 5,4, i stężeniu w zakresie 5-40 mM, takim jak 10-25 mM, a korzystnie około 15 mM.

Korzystnie, stężenie soli w buforze eluującym jest wystarczająco wysokie do wyrugowania IgG z ż ywicy. Jednakże rozważ a się stosowanie do wyeluowania IgG z żywicy wyższego pH i niższego stężenia soli. W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku eluowanie prowadzi się jako elucję ciągłą gradientem soli, stosując chlorek sodu w stężeniach w zakresie 50-500 mM, a korzystnie od około 125 mM do około 350 mM.

Eluowanie można również prowadzić jako etapowe eluowanie gradientem. Rozważa się również eluowanie solą o stałym stężeniu, w którym bufor do elucji wprowadzany do kolumny kationowymiennej, w przeciwieństwie do eluowania gradientem, ma tylko jedno stężenie soli. Gdy prowadzi się stałe eluowanie solą, korzystnie stężenie soli może mieścić się w zakresie od około 350 mM do około 500 mM chlorku sodu. W porównaniu ze stałym eluowaniem solą, eluowanie gradientem soli ma tę zaletę, że jest bardziej skuteczne, a ponadto eluat ma mniejszą siłę jonową, co jest korzystne, ponieważ wysoka siła jonowa jest krytyczna dla trwałości IgG. Bufor do eluowania może ponadto zawierać czynnik stabilizujący białko, taki jak wymieniony poniżej. Do eluowania IgG można również stosować wiele innych odpowiednich układów buforowych, co będzie oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie techniki.

Korzystnie do frakcji IgG natychmiast po lub podczas eluowania dodaje się co najmniej jeden czynnik stabilizujący białko. Czynniki stabilizujące białko są znane specjalistom w tej dziedzinie techniki i obejmują np. różne alkohole cukrowe i sacharydy (takie jak sorbitol, mannoza, glukoza, trehaloza, maltoza), białka (takie jak albumina), aminokwasy (takie jak lizyna, glicyna) oraz czynniki organiczne (takie jak PEG). Korzystnie jako pośredni stabilizator wybiera się stabilizator, który można usunąć z roztworu zawierającego IgG w następnych etapach.

Odpowiednie stężenie czynnika stabilizującego białko w roztworze zawierającym IgG zależy od konkretnego stosowanego środka. W jednym z korzystnych wykonań jako czynnik stabilizujący stosuje się sorbitol, korzystnie w końcowym stężeniu w zakresie 2-15% (wag./obj.), np. około 2,5%.

PL 196 770 B1

Po wyeluowaniu z kolumny kationowymiennej eluat korzystnie odsala się (tj. dializuje) i korzystnie zatęża. Zmianę buforu i stężenia IgG można przeprowadzić stosując połączony proces diafiltracji/ultrafiltracji. Określenie „diafiltracja/ultrafiltracja” oznacza, że dializa i zatężanie odpowiednio przez filtrację i ultrafiltrację prowadzi się w jednym etapie. Rozważa się prowadzenie diafiltracji i ultrafiltracji jako dwóch oddzielnych etapów. Jednakże, w celu zapobieżenia niepotrzebnej utracie produktu, korzystnie dializę i zatężanie prowadzi się sposobami diafiltracji i ultrafiltracji w jednym etapie.

Membrany stosowane do diafiltracji/ultrafiltracji korzystnie odcinają przy nominalnym ciężarze w zakresie 10 000 - 100 000 Da. Korzystnym typem membrany do stosowania w niniejszym procesie jest membrana polisufonowa odcinająca przy ciężarze nominalnym 30 000 Da, z firmy Millipore. Można również stosować inne membrany do ultrafiltracji z porównywanego materiału i o porównywalnej porowatości.

Zakres zatężania może zmieniać się znacznie. Roztwór zatęża się od około 10 g/l IgG do około 100 g/l, a korzystnie do około 50 g/l. Po zatężeniu koncentrat IgG korzystnie dializuje się do buforu o niskiej sile jonowej. W etapie tym oprócz jonów soli z roztworu usuwane są również zanieczyszczenia o niskim ciężarze cząsteczkowym i uzyskuje się środek do wymiany buforu w następnym etapie oczyszczania. Korzystnym buforem do diafiltracji jest 15 mM octan sodu o pH 5,4, zawierający 2,5% (wag./obj.) sorbitolu. Wymianę buforu prowadzi się aż do zmniejszenia przewodności poddawanego ultrafiltracji roztworu do wartości poniżej około 1,5 mS/cm, a korzystnie poniżej około 1,3 mS/cm. Podczas diafiltracji/ultrafiltracji pH korzystnie utrzymuje się w zakresie 4,0-6,0, korzystniej 5,1-5,7, a najkorzystniej około 5,4.

Po diafiltracji/ultrafiltracji korzystnie w roztworze reguluje się stężenie czynnika stabilizującego białko, w razie potrzeby, do końcowego optymalnego stężenia właściwego dla konkretnego stosowanego środka stabilizującego białko. Gdy stosuje się sorbitol, korzystnie stężenie sorbitolu wynosi około 10% wagowych.

W celu usunięcia agregatów przed następnym etapem, korzystnie stabilizowany roztwór filtruje się przez filtr o średnicy porów w zakresie 0,2-1,0 μm, korzystnie około 0,45 μm. Na tym etapie roztwór zawierający IgG jest klarownym roztworem o odpowiedniej objętości i wysokiej stabilności, co jest wynikiem kombinacji wysokiej czystości, niskiej siły jonowej, kwasowego pH, stosunkowo wysokiego stężenia IgG i dodanego stabilizatora.

Do procesu wytwarzania produktu IVIG wprowadzono obecnie co najmniej dwa określone i obowiązujące etapy usuwania i inaktywacji wirusów, którymi korzystnie są wytrącanie przy użyciu PEG jako główny etap usuwania wirusów oraz obróbka S/D jako etap inaktywacji wirusów ukierunkowany na wirusy z otoczką lipidową. Oprócz zgodnych z międzynarodowymi wytycznymi surowych wymagań dotyczących zabezpieczenia materiału wyjściowego przed wirusami i dobrze znanego wieloetapowego procesu oczyszczania redukującego liczbę wirusów, wprowadzenie dwóch niezależnych etapów redukcji wirusów, z których obydwa są aktywne zarówno wobec wirusów otoczkowych, jak i wobec wirusów bez otoczki, sprawia, że lek według wynalazku jest zasadniczo wolny od wirusów.

Wirusy zakaźne z otoczką lipidową, które nadal mogą być obecne w roztworze zawierającym IgG, korzystnie inaktywuje się na tym etapie procesu przez dodanie do roztworu zawierającego IgG wirusobójczej ilości czynnika inaktywującego wirusy. Określenie „wirusobójcza ilość” czynnika inaktywującego wirusy odnosi się do ilości, która powoduje, że obecne w roztworze cząstki wirusów stają się zasadniczo niezakaźne, a „roztwór zawierający IgG jest zabezpieczony przed wirusami”, jak określono w stanie techniki. Taka „wirusobójcza ilość” zależeć będzie od stosowanego czynnika inaktywującego, jak również od warunków, takich jak czas inkubacji, pH, temperatura, skład lipidów i stężenie białka.

Określenie „czynnik inaktywujący wirusy” odnosi się do takiego środka lub metody, które można stosować w celu inaktywowania wirusów z otoczką lipidową, a także wirusów nieotoczkowych. Należy rozumieć, że określeniem „czynnik inaktywujący wirusy” objęto zarówno kombinację takich czynników i/lub metod, jeśli zachodzi taka potrzeba, jak również tylko jeden rodzaj takiego czynnika lub metody.

Korzystnymi czynnikami inaktywującymi wirusy są detergenty i/lub rozpuszczalniki, a najkorzystniej mieszaniny detergent-rozpuszczczalnik. Należy rozumieć, że czynnik inaktywujący ewentualnie stanowi mieszaninę jednego lub więcej detergentów z jednym lub więcej rozpuszczalnikami. Obróbka mieszaniną rozpuszczalnik/detergent (S/D) jest powszechnie stosowanym etapem inaktywacji wirusów z otoczką lipidową (np. HIV1 i HIV2, wirusów zapalenia wątroby typu C i nie A-B-C, HTLV 1 i 2, wirusów z rodziny herpes, obejmujących CMV i wirus Epsteina Barra) w produktach opartych na krwi. Do inaktywacji wirusów można stosować wiele różnych detergentów i rozpuszczalników. Detergent można wybrać z grupy obejmującej detergenty niejonowe i jonowe, ale wybiera się detergent, który

PL 196 770 B1 zasadniczo nie ma własności denaturujących. Korzystnie stosuje się detergent niejonowy, ponieważ można go łatwo wyeliminować z preparatu IgG w następnym etapie. Odpowiednie detergenty opisali Shanbrom i in. w patentach USA nr nr 4,314,997 i 4,315,919. Korzystnymi detergentami są detergenty sprzedawane pod nazwą handlową Triton X-100 i Tween 80. Korzystnymi rozpuszczalnikami do stosowania jako czynniki inaktywujące wirusy są di- lub trialkilofosforany, jak opisali np. Neurath i Horowitz w patencie USA nr 4,764,369. Korzystnym rozpuszczalnikiem jest fosforan tri(n-butylu) (TNBP). Szczególnie korzystnym czynnikiem inaktywującym wirusy do stosowania w niniejszym wynalazku jest mieszanina TNBP i Tween 80, ale alternatywnie można stosować również inne kombinacje. Korzystną mieszaninę dodaje się w takiej objętości, aby stężenie TNBP w roztworze zawierającym IgG było w zakresie 0,2-0,6% wagowych, a korzystnie okoł o 0,3% wagowych. Stężenie Tween 80 w roztworze zawierającym IgG mieści się w zakresie 0,8-1,5% wagowych, a korzystnie około 1% wagowego.

Etap inaktywacji wirusów prowadzi się w warunkach inaktywujących wirusy otoczkowe, z uzyskaniem zasadniczo wolnego od wirusów roztworu zawierającego IgG. Warunki takie obejmują zwykle temperaturę 4-30°C, taką jak 19-28°C, 23-27°C, a korzystnie około 25°C, oraz czas inkubacji, który w oparciu o obowią zują ce badania, został uznany za skuteczny. Na ogół , do osiągnię cia inaktywacji wirusów, wystarczający jest czas inkubacji 1-24 godzin, korzystnie 4-12 godzin, taki jak około 6 godzin. Jednakże, odpowiednie warunki (temperatura i czas inkubacji) zależą od stosowanego czynnika inaktywującego wirusy, pH, stężenia białek oraz zawartości lipidów w roztworze.

Rozważa się, że do wytworzenia bezpiecznego pod względem wirusów produktu można również stosować inne sposoby usuwania lub inaktywowania wirusów, takie jak dodawanie błękitu metylenowego, a następnie inaktywacja przez napromienienie światłem ultrafioletowym lub nanofiltracja.

Po obróbce mieszaniną rozpuszczalnik/detergent, roztwór korzystnie rozcieńcza się buforem. Ewentualnie zasadniczo bezpieczny pod względem wirusów roztwór zawierający IgG sączy się, korzystnie przez głęboki filtr, jak opisano uprzednio we wcześniejszym etapie sposobu według wynalazku, i/lub przez sterylny filtr.

Po inaktywacji wirusów i korzystnie po przefiltrowaniu, w celu usunięcia czynnika inaktywującego wirusy i zanieczyszczeń białkowych prowadzi się chromatografię jonowymienną. Etap ten korzystnie prowadzi się jak opisano uprzednio w odniesieniu do wcześniejszego etapu chromatografii jonowymiennej, z tym wyjątkiem, że objętość anionowymiennej żywicy wynosi połowę objętości żywicy kationowymiennej, a przemywanie przed eluowaniem IgG jest bardziej intensywne i stosuje się bufor w obję toś ci równej co najmniej 6-obję toś ciom kolumny. Ponadto, w korzystnym wykonaniu wynalazku, jako bufor równoważący stosuje się octan sodu o stężeniu w zakresie około 5-25 mM, korzystnie 15 mM, i pH w zakresie okoł o 5,0-5,8, a korzystnie 5,4. Jak opisano uprzednio, zawartość octanu sodu i pH roztworu zawierającego IgG korzystnie doprowadza się do wartości równych stężeniu i pH roztworu równoważącego. Ponadto, w korzystnym wykonaniu wynalazku, czynnik stabilizujący białko, korzystnie maltozę, dodaje się do odzyskanego eluatu do końcowego stężenia w zakresie 1-5%, a korzystnie około 2,5% wagowych.

Korzystnym sposobem usuwania czynnika inaktywującego wirusy jest chromatografia jonowymienna. Jednakże za użyteczne uważa się również inne metody, takie jak ekstrakcja olejem lub alternatywne metody chromatograficzne. Odpowiedni sposób zależy od stosowanego czynnika inaktywującego wirusy. A zatem, mieszaninę detergent/rozpuszczalnik można usunąć przez związanie IgG z żywicą, a następnie przez wypłukanie czynnika inaktywującego buforem. Przydatna jest również metoda chromatografii kationowymiennej. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, w celu poprawienia jakości i całkowitej czystości końcowego produktu sposobu według wynalazku, oprócz chromatografii anionowymiennej prowadzi się także chromatografię kationowymienną.

Po etapie chromatografii jonowymiennej eluat zawierający IgG korzystnie dializuje się i zatęża, w wyniku czego zawartość pozostają cych mniejszych składników białkowych również zostaje skutecznie zmniejszona. Korzystnie uzyskuje się to przez diafiltrację/ultrafiltrację, jak opisano uprzednio. Jako bufor do diafiltracji stosuje się octan sodu, korzystnie o stężeniu od około 4 do 10 mM, a korzystnie 7,5 mM, i pH w zakresie od okoł o 4,0 do 6,0, korzystnie okoł o 5,1-5,7, takim jak okoł o 5,4. Alternatywnie do diafiltracji można stosować inne bufory, takie jak fosforan sodu lub kwasy. Diafiltrację prowadzi się aż do przewodności mniejszej lub równej 1 mS/cm. Ewentualnie roztwór zawierający IgG poddaje się dalszemu sterylnemu filtrowaniu.

W razie potrzeby, oczyszczony roztwór zawierają cy IgG, który jest zasadniczo wolny od czynnika inaktywującego wirusy, poddaje się dalszej obróbce, aby nadawał się on do kompozycji jako ciekły produkt do stosowania np. dożylnego, podskórnego lub domięśniowego.

PL 196 770 B1

Z praktycznego punktu widzenia, korzystnie zawartość ciekłego preparatu w produkcie immunoglobuliny do przechowywania i do stosowania jest taka sama. Końcowe stężenie IgG w produkcie korzystnie mieści się w zakresie 0,25-20% wagowych (co odpowiada 2,5-200 g IgG/l) i jest takie jak około 1-20% wagowych, tj. około 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%.

Jak wiadomo, wysokie stężenie białka przyczynia się do większej stabilności IgG. Z drugiej strony, wysokie stężenie IgG oznacza, że maksymalna szybkość infuzji przy podawaniu dożylnym IgG pacjentowi musi być względnie niska, aby wyeliminować problemy z transfuzją związane z wysokim ciśnieniem osmotycznym produktu. Aktualnie zalecane przez European Pharmacopoeia (Ph.Eur) stężenie przy podawaniu dożylnym wynosi 5% (wag./obj). Z drugiej strony, do wstrzyknięć domięśniowych lub podskórnych korzystny jest raczej stężony produkt (np. 10% lub powyżej).

Oczywiste jest, aczkolwiek niekorzystne, że produkty otrzymane w różnych etapach sposobu według wynalazku można również stosować jako produkty liofilizowane zamiast ciekłych preparatów, chociaż jest to mniej korzystne w porównaniu ze stosowaniem produktów immunoglobuliny jako ciekłych kompozycji gotowych do stosowania. Te ostatnie produkty będą opisane bardziej szczegółowo poniżej.

Ciekłe produkty immunoglobuliny są najbardziej stabilne przy sile jonowej znacząco niższej od siły jonowej osocza, co oznacza, że przewodność jest korzystnie mniejsza niż 1,0 mS/cm, a korzystnie wynosi około 0,8 mS/cm.

pH wpływa na stabilność IgG i na szybkość infuzji. Ciekłe produkty immunoglobuliny są najbardziej stabilne w warunkach kwasowych, tj. poniżej izoelektrycznego punktu IgG, przy pH 6,4-8,5. Im wartość pH jest bliższa wartości fizjologicznej (7,1-7,3), tym większą szybkość infuzji można zastosować. Aby utrzymać wymaganą stabilność, pH produktu immunoglobuliny według wynalazku korzystnie powinno mieścić się w zakresie 5,1-5,7, takim jak 5,2-5,6 i wynosić około 5,4.

Ponadto, produkty immunoglobuliny, mogą zawierać czynniki stabilizujące białko, jak opisane powyżej. Oprócz alkoholi cukrowych i sacharydów (takich jak sorbitol, mannoza, glukoza, trehaloza, maltoza), jako stabilizatory można również stosować białka (takie jak albumina), aminokwasy (takie jak lizyna, glicyna) i środki organiczne (takie jak PEG i Tween 80). Jak opisano powyżej, odpowiednie stężenie środka stabilizującego w roztworze zawierającym IgG zależy od konkretnego stosowanego środka.

W celu uzyskania stabilnego i izotonicznego roztworu, w razie potrzeby, oczyszczony roztwór IgG poddaje się obróbce. Określenie „izotoniczny roztwór” oznacza roztwór o tym samym ciśnieniu osmotycznym, co osocze. Jak wspomniano uprzednio, w produktach immunoglobuliny według wynalazku w postaci ciekłej formulacji siła jonowa jest znacząco niższa od siły jonowej w osoczu. Z tego względu, w celu zwiększenia osmolalności roztworu korzystnie stosuje się mono- lub disacharydy, ponieważ nie mają one wpływu na siłę jonową. W korzystnym wykonaniu wynalazku, dodaje się maltozę w stężeniu zapewniającym izotoniczność roztworu, która z drugiej strony pełni funkcję czynnika stabilizującego immunoglobulinę. Korzystnie maltozę dodaje się do końcowego stężenia w zakresie około 5% do 15% (wag./obj.), a korzystnie 10% (wag./obj.). Alternatywnie można stosować inne sacharydy, takie jak mannoza i glukoza.

Korzystne warunki końcowe dla produktów immunoglobulinowych są kompromisem pomiędzy stabilnością i warunkami dopuszczalności fizjologicznej w odniesieniu do np. pH, siły jonowej i toniczności. Ponadto, produkt immunoglobuliny musi spełniać wymogi kontroli jakości, jak określone w Monograph

No. 918, Ph. Eur., 1997.

Główne zalety produktu otrzymanego sposobem według wynalazku polegają na tym, że gdy jest on w postaci ciekłego preparatu, stanowi kombinację ciekłego, gotowego do stosowania produktu, który jednocześnie jest bardzo trwały, wysoce czysty, ma w znacznej części normalny rozkład podklas IgG, ma stosunkowo niską zawartość IgA, jak również IgM i zachowuje aktywność przeciwciała i aktywność biologiczną, wykazywaną przez funkcję Fc.

Ponadto, produkt zasadniczo nie zawiera agregatów immunoglobuliny i/lub innych białek osocza, określonych jako polimery wyższe niż dimery, ma niską aktywność przeciw dopełniaczowi i wysoką zawartość monomerów i dimerów IgG. Monomeryczna IgG stanowi co najmniej 90%, co uważa się za idealne. Z uwagi na wysoką stabilność, można uniknąć dodatku innych stabilizatorów, takich jak albumina, glicyna, detergent lub PEG. W końcu, produkt jest bezpieczny pod względem wirusów, ponieważ proces obejmuje ściśle określone i obowiązujące etapy redukcji wirusów obejmujące usuwanie i/lub inaktywację, zarówno wirusów z otoczką lipidową, jak i bez otoczki lipidowej.

Celem potwierdzenia, że etap wytwarzania jest etapem redukcji wirusów, jest dostarczenie dowodu, że sposób wytwarzania skutecznie inaktywuje/usuwa wirusy, o których wiadomo, że zanieczyszczają materiał wyjściowy, lub które mogłyby go zanieczyścić. Badania potwierdzające obejmują

PL 196 770 B1 celowe dodawanie wirusów przed etapami wytwarzania i pomiar zakresu ich usunięcia/inaktywacji po etapie lub etapach wytwarzania. Ograniczenia GMP zapobiegają celowemu wprowadzeniu wirusów do aparatury produkcyjnej. A zatem, badania potwierdzające powinny być prowadzone w odddzielnym laboratorium przystosowanym do pracy z wirusami w skali będącej pomniejszeniem etapu produkcji, przez specjalistów z dziedziny wirusologii i inżynierów zajmujących się produkcją. Ilość wirusów dodanych do materiału wyjściowego w etapie produkcji, który ma być oceniany, powinna być możliwie wysoka, w celu określenia czy w etapie tym we właściwy sposób można usunąć/inaktywować wirusy. Jednakże, wirusy powinny być dodane w takiej ilości, aby skład stosowanego w produkcji materiału nie zmienił się w znaczny sposób. Korzystnie objętość wsadu wirusowego powinna być równa lub mniejsza od 10%.

Ilościowe badanie zakaźności powinny być prowadzone zgodnie z zasadami GLP i mogą obejmować tworzenie się łysinek, wykrywanie innych skutków cytopatologicznych, takich jak tworzenie się syncytii lub ognisk, końcowy punkt miareczkowania (np. badania TCID50), wykrywanie syntezy antygenu wirusa lub inne metody. Metody te powinny być odpowiednio czułe i odtwarzalne, a w celu zapewnienia właściwej dokładności statystycznej wyników, należy je prowadzić w wystarczającej ilości powtórzeń i prób kontrolnych.

Zwykle etap procesu rozpoczyna się od 6 log wirusa, i osiągnięcie zmniejszenia rzędu 4 log lub więcej jest wskaźnikiem wyraźnego działania na konkretnym badany wirus. Podobnie, redukcja rzędu 4,5 log, 5 log lub nawet 5,5 log jest wskaźnikiem wyraźnego wpływu na konkretny badany wirus i etap taki można uznać za wiarygodny etap redukcji.

W celu określenia zdolności układu do wyeliminowania wirusów w ogóle, wirusowe badania walidacyjne należy prowadzić stosując wirusy możliwie najbardziej podobne do tych, które mogą zanieczyszczać produkt, i które, z drugiej strony, charakteryzują się możliwie najszerszym zakresem własności fizyko-chemicznych.

Wirusowe badania walidacyjne należy prowadzić zgodnie z wytycznymi CPMP Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses (CPMP/BWP/268/95) oraz Note for Guidance on Plasma Derived

Medical Products (CPMP/BWP/269/95).

Badania walidacyjne w sposobie według wynalazku przedstawiono w przykładzie 5.

Czystość produktu według wynalazku wynosi ponad 95%, a korzystnie ponad 98%. Wysoki stopień czystości między innymi wiąże się z faktem, że produkt według wynalazku uzyskuje się w co najmniej jednym, a korzystnie w dwóch etapach chromatografii aniono-kationowymiennej, ewentualnie z szeregowo połączonymi kolumnami. W tym kontekście warto podkreślić, że pomimo ilości stosowanych etapów procesu, możliwe jest otrzymanie z wysoką wydajnością na skalę przemysłową co najmniej 3,5 g białka IgG na kg świeżo zamrożonego osocza.

Przeprowadzone badania porównawcze (przykład 2) wykazały, że produkt immunoglobuliny uzyskany sposobem według wynalazku ma idealne własności funkcyjne, takie jak aktywność wiążącą główny antygen i wysoką funkcję Fc. Korzystny lek opracowany przez twórców niniejszego wynalazku stanowi 5% wagowych roztworu immunoglobuliny. Badania stabilności wykazały trwałość powyżej jednego roku przy przechowywaniu w temperaturze 4°C, co oznacza, że w produkcie immunoglobuliny nie tworzą się agregaty lub nie zachodzi fragmentacja immunoglobulin G, produkt nie traci żądanej aktywności biologicznej, nie zachodzi wzrost niepożądanych aktywności, np. aktywności przeciw dopełniaczowi i aktywności prekalikreiny, co zmierzono in vitro.

Produkt immunoglobuliny, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że ma następującą charakterystykę

a) czystość powyżej 95%,

b) zawartość monomerów i dimerów IgG powyżej 98,5%,

c) zawartość IgA poniżej 6 mg/l, oraz

d) zawiera IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

A zatem, można uzyskać produkt IgG o czystości powyżej 95%, takiej jak co najmniej 96% lub co najmniej 97%, na przykład co najmniej 98%, korzystnie co najmniej 99%, a bardziej korzystnie co najmniej 99,5%. Produkt IgG powinien zawierać poniżej 6 mg IgA/l, np. mniej niż 4 mg IgAI, korzystnie mniej niż 3 mg IgA/l, a bardziej korzystnie poniżej 2 mg IgA/l.

Należy podkreślić, że inne produkty zawierają stabilizatory w postaci detergentu, PEG lub albuminy. W korzystnym wykonaniu, produkt według wynalazku nie zawiera żadnego z tych stabilizatorów, a zamiast nich wybrano dobrze tolerowany sacharyd.

PL 196 770 B1

Jako jedną z cech charakterystycznych, produkt według niniejszego wynalazku ma bardzo niską zawartość polimerów i agregatów. W korzystnym wykonaniu zawartość polimerów i agregatów w produkcie wedł ug wynalazku wynosi poniż ej 1,5%, jest taka jak poniż ej 1%, np. poniż ej 0,5% lub poniżej 0,25%. Zawartość monomerów i dimerów IgG wynosi co najmniej 95%, jest taka jak co najmniej 96% lub co najmniej 97%, np. co najmniej 98%, a korzystnie co najmniej 98,5% lub 99%. Zawartość monomerycznej IgG w produkcie wynosi co najmniej 90%.

Produkt immunoglobuliny określony powyżej, zgodnie z wynalazkiem, służy do stosowania jako lek.

Zastosowanie produktu immunoglobuliny określonego powyżej, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że służy on do wytwarzania leku do leczenia ssaków, u których występuje(ą) PID (pierwotny zespół niedoboru odporności), SID (wtórny zespół niedoboru odporności), ITP (idiopatyczna plamica małopłytkowa), zapalenie wielokorzeniowe, polineuropatie obwodowe, choroba Kawasaki, zapalenie wielomięśniowe, ostre przewlekłe choroby autoimmunizacyjne, przewlekła zapalna polineuropatia demielinująca (CIDP), wieloogniskowa neuropatia motoryczna, stwardnienie rozsiane, miastenia gravis, zespół Eatona-Lamberta, zapalenie nerwu wzrokowego, padaczka, poronienie zwyczajne, pierwotny zespół antyfosfolipidowy, reumatoidalne zapalenie stawów, układowy liszaj rumieniowaty, układowa twardzina skóry, zapalenie naczyń, ziarniniak Wegenera, zespół Sjogren'a, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, neutropenia autoimmunizacyjna, autoimmunizacyjna niedokrwistość hemolityczna, neutropenia, choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, celiakia, astma, zespół wstrząsu septycznego, zespół przewlekłego przemęczenia, łuszczyca, zespół wstrząsu toksycznego, cukrzyca, zapalenie zatok, kardiomiopatia rozstrzeniowa, zapalenie wsierdzia, miażdżyca tętnic, AIDS u dorosłych i zakażenia bakteryjne.

Korzystnie, wytwarzany lek stosuje się do leczenia człowieka.

Badania wykazały kliniczne działanie produktu według wynalazku w porównaniu z zarejestrowanymi produktami IVIG. Produkt jest dobrze tolerowany przez pacjentów, a czas obrotu metabolicznego immunoglobuliny w krążeniu określono na cztery tygodnie. W obecnych badaniach działanie immunomodulacyjne IVIG, SSI jest przekonujące (dane przedstawiono w przykładzie 3).

Wskazaniami dla IVIG są pierwotna hipo/agammaglobulinemia obejmująca powszechne odmiany niedoboru odporności, zespół Wiskotta-Aldricha i ostry połączony zespół niedoboru odporności (SCID), wtórna hipo/agammaglobulinemia u pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną (CLL) i stwardnieniem rozsianym, AIDS u dzieci i zakaż enia bakteryjne, ostra i przewlekł a idiopatyczna plamica małopłytkowa (ITP), allogeniczne przeszczepy szpiku kostnego (BMT), choroba Kawasaki i zespół Guillan-Barre' a.

Neurologia: przewlekła zapalna polineuropatia demielinująca (CIDP), wieloogniskowa neuropatia motoryczna, stwardnienie rozsiane, miastenia gravis, zespół Eatona-Lambert' a, zapalenie nerwu wzrokowego, padaczka.

Ginekologia: poronienie zwyczajne, pierwotny zespół antyfosfolipidowy.

Reumatologia: reumatoidalne zapalenie stawów, układowy liszaj rumieniowaty, układowa twardzina skóry, zapalenie naczyń, ziarniniak Wegenera, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów.

Hematologia: neutropenia autoimmunizacyjna, autoimmunizacyjna niedokrwistość hemolityczna, neutropenia.

Gastrologia: choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, celiakia.

Inne: astma, zespół wstrząsu septycznego, zespół przewlekłego przemęczenia, łuszczyca, zespół wstrząsu toksycznego, cukrzyca, zapalenie zatok, kardiomiopatia rozstrzeniowa, zapalenie wsierdzia, miażdżyca tętnic, AIDS u dorosłych i zakażenia bakteryjne.

Oprócz wymienionych powyżej wskazań, do leczenia produktami IVIG jako cele terapii produktami według wynalazku rozważa się również inne stany, mianowicie niektóre poważne choroby autoimmunizacyjne, które powszechnie leczy się kortykosteroidami i terapią immunosupresyjną. Choroby te obejmują choroby neurologiczne, takie jak zapalenie wielokorzeniowe i niektóre polineuropatie obwodowe związane z układem odpornościowym, jak również niektóre przewlekłe stany zapalne stawów i naczyń, takie jak układowe zapalenie naczyń obejmujące naczynia małe, zapalenie wielomięśniowe i inne.

Innym sposobem działania produktu według wynalazku może być eliminowanie antygenów zakaźnych w przewlekłych zakażeniach oraz wzrost metabolizmu IgG.

Wynalazek zilustrowano poniżej następującymi przykładami, które nie ograniczają jego zakresu.

PL 196 770 B1

PRZYKŁADY

P r z y k ł a d 1

ETAPY SPOSOBU OCZYSZCZANIA IMMUNOGLOBULINY (wszystkie etapy, z wyjątkiem 5, prowadzono w temperaturze 5±3°C)

Etap 1: Przygotowanie pasty frakcji Cohna II + III

Pastę frakcji Cohna II + III otrzymano z osocza ludzkiego standardową metodą frakcjonowania Cohna (E. Cohn i in., (1946), J. Am. Chem. Soc. 459-475), zasadniczo jak zmodyfikowana przez Kistlera-Nitschmanna (P. Kistler i HS. Nitschmann, (1952), Vox Sang, 7, 414-424). Po usunięciu krioprecypitatu i, w razie potrzeby, po adsorpcji niektórych białek osocza (takich jak czynnik IX i antytrombina) np. na materiale jonowymiennym i/lub matrycy Heparin Sepharose®, przeprowadzono wytrącanie etanolem.

Dokładne warunki (pH, stężenie etanolu, temperatura, stężenie białka) otrzymania pasty frakcji II-III przedstawiono na rysunku na stronie 266 książki JR Harn (wyd.), Blood Separation and Plasma Fractionation, Wiley-Liss, Nowy Jork, 1991. Przed przesączeniem pastę wyizolowano na prasie filtracyjnej, dodając środka filtrującego.

Etap 2: Ekstrakcja immunoglobulin z pasty frakcji Cohna II + III

Ekstrakcję prowadzono stosując 140 pasty frakcji II + III, zawierającej 30 kg środka filtrującego (Schenk, Niemcy) (co odpowiada wyjściowej objętości osocza - około 1150 kg), dodając najpierw, przy powolnym mieszaniu przez około 1,5 godziny, 525 kg 2,33 mM buforu fosforan sodu/octan sodu, pH 4,0, a następnie dwukrotnie w sposób ciągły dodano 350 kg wody do iniekcji (WFI) z mieszaniem przez 1,5 godziny po każdym dodaniu. Na końcu dodano około 280 kg mieszaniny 21:5 mM fosforanu sodu/octanu sodu, pH 7,0, doprowadzając w ten sposób pH zawiesiny do wartości 5,4.

Zawiesinę przesączono przez głęboki filtr (C-150AF, Schenk, Niemcy). Oprócz innych białek przesącz zawierał immunoglobuliny.

Etap 3: Wytrącenie agregatów białek i usunięcie wirusów przy użyciu PEG 6000:

Do przesączu z etapu 2 dodano PEG 6000 (Merck, Niemcy) do końcowego stężenia 6% wagowych. Po wytrącaniu przez 4 godziny, zawiesinę PEG odwirowano do klarowności w wirówce przepływowej (Westfalia BKA28, Niemcy) i głęboko przesączono (50LA i 90LA, Cuno, Francja), a następnie przesączono sterylnie przez filtr 0,22 μm (Durapore, Millipore, USA). pH przesączonego supernatantu z PEG wyregulowano do wartości 5,7 buforem przez dodanie 1 części 0,45M octanu sodu, pH 5,7 do 29 części supernatantu.

Etap 4: Oczyszczanie metodą szeregowej chromatografii anionowymiennej i kationowymiennej (I):

Do dwóch kolumn chromatograficznych wprowadzono odpowiednio 56 l DEAD Sepharose FF® (Pharmacia Biotech, Szwecja) i 56 l CM Sepharose FF® (Pharmacia Biotech, Szwecja). Kolumny połączono szeregowo, w taki sposób, że przepływ cieczy najpierw przechodził przez żywice DEAE Sepharose, a następnie przez żywicę CM Sepharose. Żywice w kolumnach zrównoważono 15 mM octanu sodu o pH 5,7 jako buforem. Następnie do szeregowo połączonych kolumn wprowadzono roztwór z etapu 3.

Podczas chromatografii jonowymiennej, większość zanieczyszczających białek we wprowadzanym roztworze związała się z żywicą DEAE Sepharose. IgG przepływa bez wiązania się z żywicą DEAE Sepharose, natomiast wiąże się z żywicą CM Sepharose, gdy roztwór przechodzi przez tę żywicę. Po wprowadzeniu roztworu i przemyciu jedną objętością kolumny buforu równoważącego, kolumnę DEAE odłączono od kolumny CM. Następnie kolumnę CM przemyto 15 mM octanu sodu o pH 5,4 jako buforem w ilości trzech objętości kolumny, po czym IgG wyeluowano gradientem NaCl od 125 mM do 350 mM i 15 mM octanu sodu o pH 5,4. Wyeluowaną frakcję IgG zebrano w sorbitolu do końcowego stężenia 2,5% wagowych.

Etap 5: Obróbka frakcji IgG układem rozpuszczalnik/detergent (S/D)

Wyeluowaną frakcję IgG zatężono i odsolono przez ultrafiltrację/diafiltrację do stężenia około 50 g IgG/litr. Jako membranę stosowano membranę polisulfonową odcinającą przy ciężarze nominalnym 30 kDa (Millipore). Diafiltrację prowadzono do buforu 15 mM octanu sodu o pH 5,4, zawierającego 2,5% wagowych sorbitolu i kontynuowano aż przewodność osiągnęła wartość poniżej 1,4 mS/cm. Zawartość IgG w roztworze określono spektrofotometrycznie przez pomiar przy 280 nm (A280). Stężenie sorbitolu doprowadzono do wartości 10% wagowych i roztwór przesączono przez filtr 0,45 μm (Pall Corporation, UK). Następnie, w celu następnej obróbki S/D dodano Tween 80 i TNBP do końcowego stężenia odpowiednio 1% i 0,3%. Obróbkę S/D prowadzono co najmniej 6 godzin w temperaturze 25°C.

Etap 6: Usuwanie S/D metodą chromatografii jonowymiennej (II):

Do dwóch szeregowo połączonych kolumn wprowadzono odpowiednio 28 l DEAE i 56 l CM Sepharose FF i zrównoważono 15 mM octanu sodu, pH 5,4. Poddaną obróbce S/D frakcję IgG z etapu 5

PL 196 770 B1 rozcieńczono 5 częściami 15 mM buforu octanowego o pH 5,4, przesączono przez głęboki filtr (Cuno 90 LA) i następnie przesączono w sposób sterylny (Sartobran, Sartorius), po czym wprowadzono do dwóch szeregowo połączonych kolumn. Chromatografię jonowymienną, a następnie eluowanie IgG z kolumny CM prowadzono zasadniczo jak opisano w etapie 4, z tym wyją tkiem, ż e kolumnę CM intensywnie przemyto buforem w ilości 6 objętości kolumny, aby usunąć środki pozostałe po obróbce S/D. Wyeluowaną frakcję IgG zebrano w maltozie (Merck, Niemcy) do końcowego stężenia 2,5% wagowych.

Etap 7: Końcowe zatężenie i przygotowanie preparatu immunoglobuliny do stosowania dożylnego: Wyeluowaną frakcję IgG z etapu 6 poddano ultrafiltracji i odsoleniu przez diafiltrację do 7,5 mM octanu sodu zawierającego 2,5% wagowych maltozy, pH 5,4, do końcowej przewodności poniżej 1 mS/cm. Jako membranę stosowano membranę polisulfonową odcinającą przy nominalnym ciężarze 100 kDa, umożliwiającą usunięcie białek o niższym ciężarze cząsteczkowym. Końcowe stężenie IgG doprowadzono do wartości 50 g/l, a końcowe stężenie maltozy ustalono na 10% (wag./obj.). Wyrównoważony maltozą preparat końcowy przesączono przez sterylny filtr (Sartopure GF 2, Sartorius) i aseptycznie wprowadzono do pojemników.

P r z y k ł a d 2

WYNIKI BADAŃ ANALITYCZNYCH PRODUKTU OTRZYMANEGO SPOSOBEM WEDŁUG WYNALAZKU W PORÓWNANIU Z INNYMI PRODUKTAMI IVIG

	Gammonativ liofilizowany	Octagam ciekły	Gammagard liofilizowany	IVIG, SSI ciekły
Czystość	45,4%1	99,1%	94,6%1	99,8%1
Albumina	50 mg/ml2	małe ilości	3 mg/ml2	niewykrywalna
Zawartość monomerów+dimerów	98,3%3	96,8%	97,6%3	99,3%
polimery+agregaty	0,8%3	1,6%	<0,1%3	<0,1%
ACA	26%	30%	24%	32%
Hemaglutynina, 3% roztwór
anty-A >1:2	ujemny	ujemny	ujemny	ujemny
anty-B >1:2	ujemny	ujemny	ujemny	ujemny
funkcja Fc	169%	121%	132%	178%
Rozkład podklas
lgG1	60,0%	61,9%	67,7%	56,6%
lgG2	35,8%	33,1%	27,2%	39,4%
lgG3	3,5%	3,6%	4,4%	2,6%
lgG4	0,7%	1,4%	0,6%	1,5%
IgA	2,95 mg/l	54,7 mg/l	0,85 mg/l	1,36 mg/l
IgM	0,28 mg/l	39,1 mg/l	0,99 mg/l	0,16 mg/l
Tween 80	<20 ppm	<20 ppm	nie oznaczono	<20 ppm
TNBP	2,0 ppm	1,5 ppm	1,5 ppm	1,5 ppm
PEG	0,01 mg/ml	0,01 mg/ml	1,6 mg/ml4	0,02 mg/ml
PH	6,7	5,7	6,7	5,6
Całkowite stężenie białka	97 g/l	45 g/l	50 g/l	51 g/l
Maltoza lub glukoza	20 mg/ml	92 mg/ml	15 mg/ml	88 mg/ml

¹ bez korekty dla HSA ² zgodnie z oś wiadczeniem producenta; ³ skorygowano dla piku HSA;

⁴ stosowany jako stabilizator.

PL 196 770 B1

Czystość (skład białek)

Zgodnie z wymaganiami Pharmacopoeia czystość dla preparatu IVIG wynosi co najmniej 95% IgG, co oznacza, że obecnych jest nie więcej niż 5% zanieczyszczających białek nie stanowiących IgG. Z kilku powodów uważa się, że czystość ma szczególnie ważne znaczenie. Z racjonalnego punktu widzenia, powinny być obecne jedynie białka, które pełnią żądaną funkcję, zaś inne zanieczyszczenia białkowe mogą być potencjalnie szkodliwe, np. mogą powodować niepożądane skutki uboczne i/lub wpływać na stabilność produktu.

Czystość można zbadać techniką elektroforezy, jak opisano szczegółowo w Ph. Eur., 1997, strony 964-965, w której białka rozdziela się w żelu - octanie celulozy. Jednakże dla celów praktycznych stosuje się żel agarozowy. Po elektroforezie żel utrwala się, suszy i zabarwia. Na końcu pasma białka monitoruje się metodą skaningu. Jak widać z powyższej tabeli, produkt według wynalazku jest rzeczywiście czysty (99,8%).

Albumina

Zawartość albuminy badano metodą krzyżowej immunoelektroforezy, zasadniczo jak opisał C.B. Laurell (Anal. Biochem. (1965), 10, 358-361). 5 μΐ produktu badano na przeciwciała przeciwludzkiej albuminie (DAKO A/S, Dania, Nr A0001 (1/100)). Dzięki wysokiej czystości w badanym produkcie według wynalazku nie wykryto żadnej albuminy.

Zawartość monomerów i dimerów IgG

Zawartość monomerów i dimerów IgG badano metodą chromatografii żelowej i monitorowano z chromatogramu przez całkowanie powierzchni piku monomeru i dimeru, patrz Ph. Eur. Z przedstawionych w powyższej tabeli wyników różnych badań widać, że dla produktu według wynalazku suma powierzchni monomeru + dimeru stanowi 99,3% całkowitej powierzchni chromatogramu (z tego monomeryczna IgG stanowi 92%).

Zawartość polimerów i agregatów

Jak wiadomo, obecność polimerów i agregatów powoduje poważne skutki uboczne, a często objawy grypopodobne. Z uwagi na wysoki stopień czystości osiągnięty w wyniku raczej łagodnego sposobu wytwarzania, produkt immunoglobuliny otrzymany sposobem według wynalazku jest zasadniczo wolny od polimerów i agregatów. Polimery można badać metodą chromatografii żelowej, a każdy pik białka z czasem retencji krótszym niż czas retencji dla dimerycznej IgG, uważa się za polimeryczny, jak opisano w Ph. Eur.

Zgodnie z Ph. Eur. i innymi podręcznikami, zawartość agregatów białek korzystnie powinna być mniejsza niż 3%. Produkt według wynalazku nie zawiera możliwych do zmierzenia agregatów, a zatem uważa, się, że zawiera poniżej 0,1% polimerów i agregatów.

Aktywność przeciw dopełniaczowi (ACA) i aktywność aktywatora prekalikreiny (PKA)

ACA i PKA mierzono jak opisano w Ph. Eur.

ACA korzystnie powinna być możliwie najniższa. Zgodnie z Ph. Eur. zużycie dopełniacza powinno być mniejsze lub równe 50%. Zgodnie z pomiarem zużycie dopełniacza przez próbkę produktu według wynalazku wynosi około 30%, co oznacza, że jest porównywalne z innymi badanymi produktami. Należy zauważyć, że na skutek obecności albuminy zmniejsza się zużycie dopełniacza (obserwacja twórcy).

PKA, gdy występuje w znacznych ilościach, ma zasadnicze znaczenie dla podciśnienia będącego ubocznym skutkiem działania produktu. A zatem PKA w produkcie immunoglobuliny korzystnie powinna być możliwie jak najniższa. Zgodnie z Ph. Eur. i opisanymi tam pomiarami PKA powinna wynosić <35 lU/ml. PKA produktu według wynalazku, jak również innych badanych produktów, jest mniejsza od poziomu ilościowego metody, tj. poniżej 8,5 IE/ml.

Hemaglutyniny

Frakcja IgM immunoglobuliny osocza zawiera hemaglutyniny, to jest przeciwciała przeciwko antygenom krwi typu A i B. Obecność takich przeciwciał spowodować może niepożądane skutki uboczne, co wiąże się z możliwą reakcją hemolityczną, gdy biorca przyjmuje krew typu A i/lub B.

Zgodnie z wymaganiami Pharmacopoeia, zawartość hemaglutynin w produkcie immunoglobuliny w rozcieńczeniu 1:64 musi być niższa niż zawartość powodująca aglutynację erytrocytów A/B. Wszystkie badane produkty spełniają to wymaganie.

Funkcja Fc

Zachowana aktywność wiążąca antygen ma zasadnicze znaczenie dla biologicznych działań IVIG. To samo dotyczy aktywności immunomodulacyjnych. Z drugiej strony, zachowanie funkcji Fc jest zasadnicze dla działania IVIG na różne komórki fagocytarne i aktywacji układu dopełniacza. Funkcję

PL 196 770 B1

Fc można określić różnymi technikami, ale w metodologii przyjętej i opisanej w Ph. Eur. dokonuje się pomiaru potencjału przeciwciał aktywujących dopełniacz przy wytwarzaniu antygenu przeciwko różyczce. Aktywność porównuje się z aktywnością biologicznego porównawczego preparatu immunoglobuliny (BRP, Ph. Eur.), którą przyjmuje się jako 100%. Produkt spełnia warunki badania, gdy aktywność względna wynosi powyżej 60% w stosunku do preparatu odniesienia. Wydaje się, że funkcja Fc w produkcie według wynalazku jest bardzo dobrze zachowana, szczególnie w porównaniu z innymi badanymi ciekłymi produktami, co przypuszczalnie wiąże się z łagodnym procesem oczyszczania.

Rozkład podklas

Rozkład podklas IgG mierzy się standardową metodą immunodyfuzji Mancini'ego, zasadniczo jak opisał A. Ingild (Scand. J. Immunol, (1983), 17, 41). Stężenia określa się stosując jako wzorzec surowicę WHO (67/97). Zgodnie z wymaganiami, rozkład podklas powinien mieścić się w zakresie normalnego osocza ludzkiego z medianą stężeń w zakresie: 3,7-10,2 g IgGl/l surowicy, 1,1-5,9 g IgG2/l surowicy, 0,15-1,3 g IgG3/l surowicy i 0,06-1,9 g IgG4/l surowicy (R. Djurup i in., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 48, 77-83). We wszystkich produktach rozkłady podklas mieszczą się w dopuszczalnych zakresach.

Zawartość IgA

Jak wiadomo, obecność IgA potencjalnie powoduje uczulenie biorcy z niedoborem IgA. Gdy pacjent z niedoborem IgA otrzymuje preparat immunoglobuliny zawierający IgA, wówczas IgA może być uznana za obcy antygen, w wyniku czego u biorcy mogą wytworzyć się przeciwciała przeciwko IgA. Gdy następnym razem pacjentowi na drodze infuzji poda się preparat zawierający IgA, można sprowokować reakcję anafilaktyczną. Tak więc, sprawą zasadniczą jest, aby preparat immunoglobuliny zawierał możliwie najmniej IgA. Zawartość IgA w produkcie IVIG można monitorować technikami ELISA, w których na przykład do wychwycenia IgA stosuje się poliklonalne anty-IgA, a do wykrywania związanej IgA stosuje się znakowane anty-IgA. Wzorce konstruuje się przez rozcieńczenie kalibratora (Nr X908, DAKO A/S, Dania) podaną zawartością IgA.

Produkt wytworzony sposobem opisanym w przykładzie 1 zawiera mniej niż 2 mg IgA/l, co uważa się za niską zawartość IgA w stosunku do innych badanych ciekłych produktów. Z uwagi na fizyko-chemiczne podobieństwa pomiędzy IgG i IgA, trudno jest rozdzielić te immunoglobuliny podczas etapu oczyszczania. Jednakże prowadzone w sposobie dwa etapy chromatografii anionowymiennej/kationowymiennej zmniejszają zawartość IgA do bardzo niskiego poziomu.

Zawartość IgM

IgM w preparacie Ig można monitorować technikami ELISA, w których np. do wychwycenia IgM stosuje się poliklonalne anty-IgM, a do wykrywania stosuje się znakowane anty-IgM. Wzorce konstruuje się przez rozcieńczenie kalibratora (Nr X908, DAKO A/S, Dania) podaną zawartością IgM. Jak widać z tabeli, zawartość IgM w produkcie według wynalazku jest bardzo niska i znacząco niższa niż w innym ciekłym produkcie.

Tween 80, TNBP i PEG

Tween 80, TNBP i PEG mierzy się standardowymi metodami. Ogólnie, zawartość tych dodatków powinna być możliwie jak najniższa.

pH pH badanych ciekłych produktów jest kwasowe, i ma wartość 5,6-5,7, natomiast badane produkty liofilizowane są obojętne po rozcieńczeniu, a ich pH wynosi 6,7.

Całkowite stężenie białka

Zgodnie z Ph. Eur. stężenie białka powinno wynosić co najmniej 50 g/l ± 10%; wszystkie produkty spełniają to wymaganie. Stężenie białka mierzy się metodą Kjeldahla.

Maltoza i glukoza jako stabilizatory

W produktach immunoglobuliny jako stabilizatory powszechnie stosuje się sacharydy, które mają dobre własności stabilizujące i są szybko wydalane. Zawartość maltozy, sacharozy i glukozy określa się stosując dostępny na rynku zestaw (Boehringer Mannheim, Niemcy) z maltozą jako wzorcem.

Okazuje się, że dwa liofilizowane produkty stabilizowane albuminą lub albuminą i PEG, odpowiednio, zawierają również sacharyd jako stabilizator w stężeniach od około 15 mg/ml do 20 mg/ml. Produkt według wynalazku i inny ciekły produkt są tak samo stabilizowane, tj. około 9%, 88 mg/ml i 92 mg/ml maltozy. Jeśli chodzi o zawartość polimerów i agregatów, co jest parametrem stabilności, produkt według wynalazku ma wyższą stabilność niż inny badany ciekły produkt, aczkowiek ich składy są bardzo podobne.

PL 196 770 B1

P r z y k ł a d 3

WYNIKI BADAŃ KLINICZNYCH

Badania kliniczne produktu według wynalazku, określanego również jako IVIG, SSI, prowadzono zgodnie z wytycznymi ICH i CPMP/388/95.

Badano farmakokinetykę, działanie i bezpieczeństwo. Badania kliniczne obejmowały cztery grupy pacjentów: pacjentów z pierwotnym zespołem niedoboru odporności (15 pacjentów), wtórnym niedoborem odporności (6 pacjentów), idiopatyczną plamicą małopłytkową (15 pacjentów) i pacjentów z przewlekłą zapalną polineuropatią demielinując ą (5 pacjentów).

Pacjentom z pierwotnym zespołem niedoboru odporności lub wtórnym zespołem niedoboru odporności podawano 0,2-0,4 g/kg z przerwami co 2-5 tygodni. Pacjentom z idiopatyczną plamicą małopłytkową podawano 400 mg/kg dziennie przez pięć dni lub 1000 mg/kg dziennie przez dwa dni.

W pomiarach bezpieczeń stwa u wszystkich pacjentów oznaczano transaminazy w surowicy, kreatyninę w surowicy i markery wirusów. Pięciu pacjentów z idiopatyczną plamicą małopłytkową badano na obecności wirusa, znaczników nerkowych i wątrobowych, do 24 tygodni łącznie.

Farmakokinetyka

Wartości T1/2 mierzono do 30,5 dni (mediana) i były one zgodne z wynikami dla innych leków IVIG.

Działanie

U pacjentów z pierwotnym i wtórnym zespołem niedoboru odporności retrospektywnie przez okres 6 miesięcy rejestrowano dni, w których występowała choroba, dni hospitalizacji, dni, w których podawano antybiotyki, dni z gorączką i liczbę zapaleń płuc, w czasie których pacjentów leczono innymi zarejestrowanymi lekami IVIG. W następnych 6 miesiącach pacjentów leczono immunoglobuliną SSI i rejestrowano te same parametry.

Wniosek jest taki, że ciekła immunoglobuliną SSI jest tak samo skuteczna, jak inne kompozycje IVIG, w profilaktyce/zapobieganiu zakażeniom u pacjentów z pierwszorzędowym i wtórnym zespołem niedoboru odporności.

U 80% pacjentów z idiopatyczną plamicą mał opł ytkową ilość pł ytek wzrosł a od <30 x 10⁹/l przed leczeniem ciekłą immunoglobuliną SSI do >50 x 10⁹/l po leczeniu. W przypadkach, gdzie możliwe było porównanie, wzrost ilości płytek i czas reemisji u każdego pacjenta były na tym samym poziomie, jak przed podaniem tej samej dawki innych leków IVIG. Jeden z pacjentów, który otrzymał IVIG po raz pierwszy, był odporny na badany lek. Taka reakcja na IVIG nie jest rzadka, a więc nie jest niczym dziwnym. Szczegóły dotyczące wzrostu płytek i czasu jego trwania podano poniżej.

Wniosek jest taki, że ciekła immunoglobulina SSI jest tak samo skuteczna w leczeniu małej ilości płytek u pacjentów z przewlekłą idiopatyczną plamicą małopłytkową, jak inne leki IVIG.

Zgodnie z opinią lekarzy, u pacjentów cierpiących na przewlekłą zapalną polineuropatię demielinującą IVIG, SSI wykazuje identyczną skuteczność, jak IVIG podawana przed badaniem i jest tolerowana przez pacjentów tak samo jak inne produkty IVIG.

Bezpieczeństwo

Oprócz jednego poważnego niepomyślnego przypadku, splenektomii, która według prowadzącego badanie nie ma związku z badanym lekiem, zaobserwowano jedynie niewielkie skutki uboczne. Skutkami tymi były głównie ból głowy, gorączka i wymioty. Do tej pory nie donoszono o nienormalnych objawach czynności życiowych podczas infuzji IVIG, SSI. Nie odnotowano serokonwersji wirusów. Brak jest również raportów o uszkodzeniach nerek lub wątroby lub przypadkach wstrząsów anafilaktycznych.

Badania kliniczne wykazują, że ciekła immunoglobulina SSI jest dobrze tolerowana. Częstość skutków ubocznych, ich stopień i rodzaj nie odbiegają od wyników uzyskanych w badaniach innych leków IVIG.

P r z y k ł a d 4

WYNIKI BADAŃ STABILNOŚCI CIEKŁEJ IVIG

W celu zbadania stabilności ciekłego produktu IVIG w ciągu danego czasu prowadzono badania „Real time Real condition”. Do badań stosowano łącznie 4 kolejne serie (próbki po 250 ml każda) produktu IVIG, które przechowywano w temperaturze 2°C-8°C co najmniej przez 12 miesięcy. Próbki z czterech serii badano w czasie 0, po 6 i po 12 miesiącach przechowywania. Wyniki badania przedstawiono poniżej jako średnią z 4 serii.

PL 196 770 B1

	0 miesięcy przechowywania	6 miesięcy przechowywania	12 miesięcy przechowywania
Wygląd	Lekko opalizujący i bezbarwny	Lekko opalizujący i bezbarwny	Lekko opalizujący i bezbarwny
Zawartość monomerów	100%	99,6%	99,5%
i dimerów
polimery + agregaty	<0,1%	<0,1%	<0,1%
ACA	39,7%	38,2%	37,3%
PKA	<8,5 lE/ml	<8,5 El/ml	<8,5 lE/ml
Funkcja Fc	107%	113%	111%
Rozkład podklas
lgG1	59,2%	57,7%	57,1%
lgG2	36,4%	38,1%	38,6%
lgG3	2,7%	2,6%	2,5%
lgG4	1,8%	1,6%	1,7%
pH	5,5	5,5	5,5
Skład białek (% IgG)	99,8%	99,7%	99,1%
Całkowite stężenie białka	44,8 g/l	48,3 g/l	49,2 g/l
Osmolowość	348 mOsm/kg	374 mOsm/kg	350 mOsm/kg

Wszystkie wymienione powyżej badania prowadzono zgodnie z Ph. Eur., jak opisano w przykładzie 2.

Obserwacja, że zawartość monomerów i dimerów jest stała w ciągu 12-miesięcznego okresu przechowywania świadczy o tym, że w próbce nie tworzą się polimery. Jak wiadomo, między innymi obecność polimerów immunoglobuliny powoduje poważne skutki uboczne, a często objawy grypopodobne. Z uwagi na bardzo wysoką stabilność produktu otrzymanego sposobem według wynalazku, produkt ten jest zasadniczo wolny od polimerów i agregatów, nawet po długim okresie przechowywania.

Aczkolwiek opisanymi badaniami stabilności celowo objęto serie wykazujące raczej wysoką ACA, nie zaobserwowano wzrostu ACA w czasie. Odnotowanie takiego wzrostu mogłoby świadczyć, że podczas przechowywania wytworzyły się agregaty. A zatem, stała wartość ACA wskazuje, że nie wytworzyły się żadne agregaty.

Wyniki wskazują ponadto, że podczas przechowywania produktu nie rozwinęła się aktywność aktywatora prekalikreiny, ponieważ aktywność PKA nie wzrosła. Jednakże należy zauważyć, że zmierzone wartości są znacznie niższe od najniższego poziomu ilościowego oznaczenia.

Pomiar funkcji Fc wskazuje, że podczas przechowywania utrzymuje się obecność nieuszkodzonej funkcjonalnej IgG. Tak więc, w próbkach nie występują proteazy, ponieważ mogłyby one rozłożyć białka, a tym samym obniżyć funkcję Fc. Nie występuje również denaturacja cząsteczek IgG, która mogłaby spowodować zmniejszenie aktywności wiążącej antygen.

Dla specjalistów w tej dziedzinie oczywiste będzie, że może wystąpić różnica w stabilności poszczególnych subklas IgG. Jak widać z powyższych wyników, podczas przechowywania zachowały się wszystkie subklasy, co świadczy, że produkt jest stabilny. Jest to również poparte stwierdzeniem, że skład białek IgG w próbce, z tym samym w przybliżeniu całkowitym stężeniem białka, prawie nie zmienia się w czasie, co wskazuje na całkowity brak rozkładu IgG. A zatem, produkt według wynalazku jest stabilny i może być przechowywany co najmniej przez 12 miesięcy w temperaturze 2-8°C, bez znacznych zmian jego charakterystyki, co świadczy o jego skuteczności i bezpieczeństwie.

P r z y k ł a d 5

ETAPY POTWIERDZONEJ REDUKCJI WIRUSÓW W SPOSOBIE WYTWARZANIA IVIG WEDŁUG WYNALAZKU

USUWANIE WIRUSÓW W ETAPIE ROZDZIELANIA

Do wytrącania wirusów obecnych w roztworze immunoglobuliny stosowano glikol polietylenowy. Wirusowe badania walidacyjne prowadzono z użyciem dwóch małych wirusów nieotoczkowych, i uzyskano następujące zmniejszenia ilości wirusów:

usunięcie wirusa zapalenia wątroby A (HAV) - 6,3 Iog10

PL 196 770 B1 usunięcie wirusa Polio - 7,2 log10

Wirusowe badania walidacyjne prowadzono z dwoma wirusami otoczkowymi i uzyskano następujące zmniejszenia ich ilości:

usunięcie HIV - 7,6 log10 usunięcie BVDV - 7,5 log10

INAKTYWACJA WIRUSÓW W ETAPIE OBRÓBKI S/D

Prowadzono obróbkę roztworu immunoglobuliny stosując 1% Tween 80 + 0,3% TNBP, w temperaturze 250°C przez > 6 godzin.

Wirusowe badania walidacyjne prowadzono z czterema wirusami otoczkowymi i uzyskano następujące zmniejszenia ich ilości:

inaktywacja HIV - 7,4 log10 inaktywacja Sindbis Virus - 5,3 log10 inaktywacja BVDV - 4,1 log10 inaktywacja PRB - 5,1 log10

Dla dwóch różnych etapów sposobu według wynalazku prowadzono łącznie 8 badań walidacyjnych. Przeprowadzono walidację etapu wytrącania PEG, jako etapu usuwania wirusów, stosując cztery różne wirusy, dwa wirusy nieotoczkowe HAV i Polio oraz dwa wirusy otoczkowe HIV i BVDV jako model dla wirusa zapalenia wątroby typu C. Badania te wykazały, że wszystkie cztery wirusy zostały skutecznie usunięte przez wytrącanie PEG. A zatem potwierdzono, że etap wytrącania PEG jest skutecznym etapem usuwania wirusów. Walidację obróbki S/D prowadzono stosując cztery różne wirusy otoczkowe. Z danych badań walidacyjnych wynika, że etap obróbki S/D skutecznie inaktywuje wszystkie cztery wirusy. A zatem, potwierdzono, że etap obróbki S/D jest skutecznym etapem inaktywacji wirusów. Potwierdzono, że w sposobie wytwarzania IVIG, obydwa etapy redukcji, usuwanie przez wytrącanie PEG i inaktywacja przez obróbkę S/D, są skuteczne w usuwaniu i inaktywacji czterech różnych wirusów. Łączne współczynniki redukcji HIV i BVDV w sposobie wynoszą, odpowiednio, 15 i 11,6. Z tego względu produkt sposobu według wynalazku można uważać za bezpieczny ze względu na wirusy.

Claims (22)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oczyszczania immunoglobuliny (IgG), z zawierającej immunoglobulinę surowej frakcji białek osocza zawierającej immunoglobulinę, znamienny tym, że obejmuje etapy:

(a) przygotowanie wodnej zawiesiny surowej frakcji białek osocza zawierającej immunoglobulinę;

(b) dodanie do zawiesiny z etapu (a) rozpuszczalnego w wodzie, zasadniczo niedenaturującego środka wytrącającego białko w ilości wystarczającej do wytrącenia w dużej ilości białek innych niż białka immunoglobuliny G, agregatów immunoglobulin i cząstek obejmujących cząstki potencjalnie zakaźne, takie jak cząstki wirusów, bez spowodowania znaczącego wytrącenia monomerycznej immunoglobuliny G, z wytworzeniem w ten sposób mieszaniny stałego osadu i ciekłego supernatantu;

(c) odzyskanie klarownego supernatantu zawierającego immunoglobulinę G z mieszaniny z etapu (b);

(d) naniesienie klarownego supernatantu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (c) na żywicę anionowymienną, a następnie na żywicę kationowymienną, przy czym żywica anionowymienna i żywica kationowymienna są połączone szeregowo, a w chromatografii anionowymiennej i kationowymiennej stosuje się ten sam bufor, którego pH wynosi poniżej 6,0, (e) wypłukanie zanieczyszczeń białkowych i środka wytrącającego białko z żywicy kationowymiennej z etapu (d) buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do usunięcia zanieczyszczeń z żywicy, bez spowodowania zasadniczego wyeluowania immunoglobuliny G;

(f) wyeluowanie immunoglobuliny G z żywicy kationowymiennej z etapu (e) zasadniczo niedenaturującym buforem o wartości pH i sile jonowej wystarczającej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawierającego immunoglobulinę G;

(g) poddanie eluatu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (f) diafiltracji/ultrafiltracji, w celu zatężenia i/lub dializowania eluatu i ewentualnie dodanie środka stabilizującego;

(h) dodanie do frakcji zawierającej immunoglobulinę G poddanej diafiltracji/ultrafiltracji i ewentualnie stabilizowanej z etapu (g) wirusobójczej ilości środka inaktywującego wirusy, z uzyskaniem zasadniczo bezpiecznego pod względem wirusów roztworu zawierającego immunoglobulinę G;

(i) naniesienie roztworu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (h) na żywicę anionowymienną, a następnie na żywicę kationowymienną;

PL 196 770 B1 (j) przemycie żywicy kationowymiennej z etapu (i) buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do wypłukania zanieczyszczeń białkowych i środka inaktywującego wirusy z żywicy, bez zasadniczego wyeluowania immunoglobuliny G;

(k) wyeluowanie immunoglobuliny G z żywicy kationowymiennej z etapu (j) zasadniczo niedenaturującym buforem o pH i sile jonowej wystarczającej do skutecznego wyeluowania immunoglobuliny G, z odzyskaniem w ten sposób eluatu zawierającego immunoglobulinę G; oraz (l) poddanie eluatu zawierającego immunoglobulinę G z etapu (k) diafiltracji/ultrafiltracji w celu obniżenia siły jonowej i zatężenia roztworu immunoglobuliny G, oraz wyregulowanie osmolowości przez dodanie sacharydu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawierająca immunoglobulinę G frakcja białek osocza jest wybrana z grupy obejmującej frakcję Cohna II, frakcje Cohna II i III oraz frakcje Cohna I, II i III.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiesinę w etapie (a) utrzymuje się w temperaturze od 0°C do 12°C, a pH zawiesiny w etapie (a) utrzymuje się poniżej 6.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że środek wytrącający białko w etapie (b) jest wybrany z grupy obejmującej glikol polietylenowy (PEG), kwas kaprylowy i siarczan amonu.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że środek wytrącający białko jest wybrany z grupy obejmującej PEG o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 3000-8000, taki jak PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000 i PEG 6000.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że żywica anionowymienna i żywica kationowymienna w etapie (i) są połączone szeregowo.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w chromatografii anionowymiennej i w chromatografii kationowymiennej stosuje się ten sam bufor, a pH tego buforu ma wartość poniżej 6,0.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że żywica anionowymienna w etapie (d) i/lub etapie (i) zawiera grupy dietyloaminoetylowe i/lub żywica kationowymienna w etapie (d) i/lub w etapie (i) zawiera grupy karboksymetylowe, a jako te żywice korzystnie stosuje się DEAE Sepharose i CM Sepharose.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapach (b) do (l) stosuje się bufor octanowy, taki jak bufor o pH 5,0-6,0 i molowości 5-25 mM.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (h) jako czynnik inaktywujący wirusy stosuje się mieszaninę co najmniej jednego niejonowego lub jonowego detergentu i co najmniej jednego rozpuszczalnika.

11. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że w etapie (h) jako czynnik inaktywujący wirusy stosuje się mieszaninę co najmniej jednego zasadniczo niedenaturującego detergentu i co najmniej jednego fosforanu tri(niższego alkilu) jako rozpuszczalnika.

12. Produkt immunoglobuliny, znamienny tym, że ma następującą charakterystykę

a) czystość powyżej 95%,

b) zawartość monomerów i dimerów IgG powyżej 98,5%,

c) zawartość IgA poniżej 6 mg/l, oraz

d) zawiera IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

13. Produkt immunoglobuliny według zastrz. 12, znamienny tym, że nie zawiera detergentu, PEG lub albuminy jako stabilizatora.

14. Produkt immunoglobuliny według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że zawiera mniej niż 3 mg/l IgA.

15. Produkt immunoglobuliny według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera 55-65% IgG1, 30-40% IgG2, 2-5% IgG3 i 1-4% IgG4.

16. Produkt immunoglobuliny według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera mniej niż 0,5% polimerów i agregatów.

17. Ciekły produkt immunoglobuliny określony w zastrz. 12 do 16.

18. Produkt immunoglobuliny określony w zastrz. 12 do 17 do natychmiastowego podawania dożylnego.

19. Produkt immunoglobuliny określony w zastrz. 12 do 18 do stosowania jako lek.

20. Zastosowanie produktu immunoglobuliny określonego w zastrz. 12 do 18 do wytwarzania leku do leczenia ssaków, u których występuje(ą) PID (pierwotny zespół niedoboru odporności), SID (wtórny zespół niedoboru odporności), ITP (idiopatyczna plamica małopłytkowa), zapalenie wielokorzeniowe, polineuropatie obwodowe, choroba Kawasaki, zapalenie wielomięśniowe, ostre przewlekłe choroby autoimmunizacyjne, przewlekła zapalna polineuropatia demielinująca (CIDP), wieloogniskowa neuropatia motoryczna, stwardnienie rozsiane, miastenia gravis, zespół Eatona-Lamberta,

PL 196 770 B1 zapalenie nerwu wzrokowego, padaczka, poronienie zwyczajne, pierwotny zespół antyfosfolipidowy, reumatoidalne zapalenie stawów, układowy liszaj rumieniowaty, układowa twardzina skóry, zapalenie naczyń, ziarniniak Wegenera, zespół Sjogren'a, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, neutropenia autoimmunizacyjna, autoimmunizacyjna niedokrwistość hemolityczna, neutropenia, choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, celiakia, astma, zespół wstrząsu septycznego, zespół przewlekłego przemęczenia, łuszczyca, zespół wstrząsu toksycznego, cukrzyca, zapalenie zatok, kardiomiopatia rozstrzeniowa, zapalenie wsierdzia, miażdżyca tętnic, AIDS u dorosłych i zakażenia bakteryjne.

21. Zastosowanie według zastrz.

22, znamienne tym, że wytwarzany lek stosuje się do leczenia człowieka.