HU228076B1 - Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products - Google Patents

Description

Eljárás intravénás beadásra alkalmas immunglobulinok ás más immunglobulin, termékek előállítására

A találmány Immunglobulinok, Így immunglobulin G (IgG) nyers plazmából vagy nyers plazmafehérje-f 'ra kei óból való tisztítási eljárására vonatkozik. A találmány körébe tartozik továbbá egy immunglobulin termék és az immunglobulin termék gyógyászati célokra való alkalmazása.

A humán normál immunglobulin (HNI) számos fertőző betegség megelőzésére és kezelésére való alkalmazását az 1940-ss évek végén vezették be. A HNX, mélyet a Cohn és Oncisy által kidolgozott hideg etanolos frakcionálási módszerrel [Cohn S, és munkatársai, Cl á®. Chem. Soc., SS, 4 59-4 75 (194 6)], majd később a Kistler és Nitschmann által kidolgozott módosításokkal (Kistier P. és Nítschmann HS'., Vbx Sang, 7, 414-424 (1952)} állítottak elő, szubkután vagy íntramuszkulárisan beadva hatásosnak és ugyanakkor biztonságosnak mutatkozott vírusos fertőzések továbbadása ellen.

A veleszületett vagy szerzett., teljes vagy részleges immunglobulin-hiány (azaz primer illetve szekunder immunhiányos szindróma) gyakori jz közönséges és súlyos fertőzésekben, különösen bakteriális természetű fertőzésekben mutatkozik meg. Az ilyen fertőzések megelőzését korábban nagy mennyiségű HHI ismételt intramuszkulátis vagy szubkután injektálásával érték el; ez hetente többszöri beadásból álló, egész életre szóló kezelést jelentett, mely a gyógyszer intramuszkuláris beadása esetén nagyon fájdalmas.

Aktaszám: 93565-2696 KT/KmO

.A 60~as évek elején tehát megkísérelték a HNI-t intravénás- úton. beadni. A vizsgálatok azt mutatták, hogy at egészséges önkéntesek mintegy 5 %-ánál és az immunglobulin hiányos betegek mintegy SS %-ánál azonnal káros hatás· jelentketett, mely a nehézjlégzéstől a keringési sokkig többféle tüt..·· netten megmutatkozott, és olyat súlyos volt, hogy a HNi intravénás beadásét abba kellett hagyni.

Kiderült, hogy az említett káros hatások okozói at immunglobulin aggregátumok, melyek egyéb hatások között erőset aktiválták a komplementrendszsrt. Ez különösen megmutatkozott at immunglobulin-hiányoa betegekben. Különösen súlyos anafiiaktíkus természetű káros hatás volt megfigyelhető olyan betegeknél, akik at IgA ellen ellenanyagot termeltek. Következésképpen az aggregátumok képződésének elkerülését és/vagy ezen aggregátumoknak sz előállítási eljárás során való eltávolítását célzó módszereket fejlesztettek ki, é-s mintegy 20 évvel ezelőtt tesztelték, és megfelelőnek találták az intravénás beadásra alkalmas immunglobulin (ÍVIG) első generációját.

Az ÍVIG eredeti rendeltetése a veleszületett vagy szerzett, teljes vagy részleges immunglobulin-hiányos betegekben fellépő fertőzések enyhítése, valamint a HNI beadásával kapcsolatos kellemetlenségek kiküszöbölése volt. Az ÍVIG másik előnye az, hogy az immunglobulin rövid időn belül nagy dózisban beadható·., és ezáltal nagyon gyorsan megfelelően magasvérbeli koncentrációt érhetünk el. Különösen súlyos bakteriális fertőzések, kezelése esetén nagyon fontos, hogy a fertőzés helyén gyorsan magas koncentrációt érjünk ei.

> * φ φφ áKon.yna.k. mutatkozott más súlyos betegségek esetén is# melyek kezelése másképpen nagyon nehéz lenne, például a vérlemezkék immung-lobű-éin. alapú eltűnése által okozott vérzések, ismeretlen eredetű trombopéniás vérzékenység (1TP)-, néhány ritka betegség, mint például a Kawasaki-szindróma és számos autoimmun betegség, például a poiyrsdicuiitis (Guillain-Barrá-szindróma)· Az IVXG-vel való klinikai kísérletek fázisában vannak jelenleg más olyan betegségek, melyek kezelése a mai napig nehéz volt. A hatásmechanizmus e betegségek esetén csak részlegesen tisztázott. A hatás feltételezetten az IgG úgynevezett immunmoduláló képességével kapcsolatos, azaz a fagoc.ita sejtek Fcy-receptorai blokkolásával,, az IgG megnövekedett metabolizmusával# a cl tokin termelés gátlásával és a feltételezett idiotípus/anti-idiotípus reedseer zavarásával, mely különösen lényeges az autoimmun aktivitás semlegesítése szempontjából .

Az ÍVIG eled generációját a kiindulási anyag (11. Gohnfrakciő; pepszines hasításával állították elő, a hasítás célja az immunglobulin aggregátumok eltávolítása volt. Az eljárásban nem szerepelt oszlopkromatográfiás lépés. A terméket fagyasztva kellett szárítani annak érdekében, hogy elfogadható időtartamig stabil maradjon, és közvetlenül a felhasználás előtt oldották fel.

Az ÍVIG kiindulási anyaga a HNI volt, mely a vírusok továbbadását illetően biztonságosnak bizonyult intramuszkuláris befecskendezés esetén. Ennélfogva az IVIG-t ugyanilyen biztonságosnak vélték. Néhány évi klinikai használat után azonban bizonyos gyártók ÍVIG termékei meglepően a hepatitisz C vírus fertőzés továbbadásét okozták,

A vírusok «ΝΧ előállítása, alatti sorsának tisztázására irányuló tanulmányok azt mutatták, hogy a vírus eltávolítása a plazmából a hhl frakcionálási eljárása során mérsékelt. A HN1 intramuszkuláris alkalmazásakor tapasztalt biztonságossága valószínűleg annak a ténynek köszönhető, hogy védő immunglobulinokat tartalmaz. A mérsékelt beadott térfogattal és a beadás intramuszkuláris. út javai együtt ezek a védő immunglobulinok semlegesíthetik és fertozésképtelenné tehetik a közönséges vírusokat a plazmában. Mint ahogyan azt az 1990-es évek elején bemutatták,· különösen az immunglobulin nagy dózisának intravénás beadása esetén fordulhatnak elő vírusos fertőzések. így felismerték, hogy az előállítási elárásnak egy vagy több jól definiált vírusinaktivaiási

UJés/vagy eltávolítás'! lépést keli λ .«vek közepén vezették be az IV

Z SISS'OCIK Q'Ö' neráció-ját, mely hasítatlan és módosítatlan, immunglobulin molekulákon alapul, és alacsony antikomplement aktivitással és magasabb stabilitással rendelkezik, de még mindig fagyasztva szárított termék formájában. Ezt az IVI.G-t számé; kromatográfiás lépesben tisztították. Jelenleg az ilyen típusú termékek uralják az ÍVIG piacot. Az ÍVIG első és második generációja tehát fagyasztva szárított por formájú, melyet közvetlenül a használat előtt oldanak fel.

A fagyasztva szárított ÍVIG oldódása lassú (akár 30 oer<

egy üvegcsére) . Gyakran több adagot is fel keli oldani eo’ beteg részére, Mivel nagyon előnyös, ha a felhasználók Pi tokában egy felhasználásra kész oldat formájában van az ÍVIG, folyékony termékeket vezettek be a piacra. Még fontosabb, hogy még mindig szükség van az előállítási eljárás .fejlesztésére annak érdekében, hogy nagymértékben tisztított, stabil és teljesen természetes ÍVIG készítményeket kapjunk, melyeknek nagyobb a klinikai hatékonyságuk és kevesebb a hátrányos.hatásuk. Tehát szükség van egy olyan to’ Jbíu vábbfejlesztettVtisztitási eljárásra, mellyel a nyers plazmából vagy plazmafehérje~frakclőbói egy vírusok szempontjából biztonságos folyékony ÍVIG terméket kapunk. Az eljárást olyan módon kell megtervezni, hogy alkalmas legyen nagyméretű termelésre.

A találmány szerinti tisztítási eljárás olyan intravénás beadásra alkalmas folyékony immunglobulin termék előállitását teszi lehetővé, melyre jellemző, hogy nagymértékben tisztított, teljesen természetes, biológiailag aktív, kétszeresen virus-inaktiváit és stabil űj generációs ÍVIG termék, mely nem tartalmaz stabíiizálószerként detergenst, poiietilén-glikolt (PkG) vagy albumintA találmány egy javított tisztítási eljárásra és javított folyékony immunglobulin készítményre vonatkozik, mely beadható» többek között intravénásán.

A találmány szerinti módszerrel előállított immunglobulin terméket harmadik generációs IVIG-nek hívhatjuk. Az eljárást az alábbi frakcionálási feltételekkel jellemezhetjük: a gépszínéé hasítást ki küszöböljük, az aggregátumokat és a részecskéket kícsapatással eltávolítjuk (ez a lépés hitelesítetten víruseltávolítási lépésként működik), további tíszX ♦ X * ·« Λ 4 »4 «Ο χ· Α 4 X Α * X X 4 4 *·· » Α ♦ ♦·«< « ♦ β » Α « « ΑΧ X «Α «α tltást végzünk o.s.zlopkrom.atografíás ioncserélő módszerekkel, S/0 (oldószer/öetergens/ kezelést viszünk be virusínaktiválő lépésként;, és a készítményt folyékony termékként formuiázzuk,

Mivel a találmány szerinti eljárással a technika állása szerinti terítékekhez képest javított tisztaságú immunglobulin termék állítható elő, a folyékony ÍVIG termék tárolása alatt nem szükséges stabilizátocok, Így például nemionos detergens, FkG vagy alfcumín hozzáadása az IgG aggregátumok képződésének elkerülése érdekében. A találmány szerinti eljárással kapható termék jobb minőségű, mint a technika állása szerinti termékek, és javított klinikai hatásokat biztosit, valamint gyakorlatilag nincsenek nemkívánatos káros hatásai .

A találmány immunglobulinok, úgymint IgG nyers immunglobulin tartalmú -plazmafehérje.-frakciőból való tisztítási eljárására vonatkozik, mely az alábbi lépésekből áll:

(a) a nyers immunglobulin tartalmú plazmafehérje-frakcióból vizes szuszpenziót készítünk;

(b; 3000-8000 Da molekula tömegű polietilénglikolt (DSG) adunk az {aj lépésben előállított szuszpenziőhoz 3-15 tömeg% mennyiségben, ezáltal egy szilárd csapadék és egy folyékony feiülúsz.6 keverékét hozzuk létre;

(ej a (bj lépésben kapott elégyből a tisztított immunglobulin G-tartalmú feiüiúszöt visszanyerjük;

(d) a (c) lépésben kapott tisztított immunglobulin. G-tartalmú feiüiúszöt anionoserélő gyászára, majd ezt kővetően kátioncserélő gyantára visszük, ahol az anlonosere* « ·« fe * « .kroma tográf iához és a kát íoacsere-kroma tográf iához ugyanazt a puffért használjuk, és e puffer pH-értéke 6,0 alatti:

íe) a íd) lépes szerinti kationcserélŐ gyantából kimossuk a szennyező fehérjéket és a kicsapódott fehérjéket egy nátrium-acetát pufferrei, melynek nátrium-acetát koncentrációja 5-25 tói, pH-ja 5,0-6,0 és vezetőképessége 1,0-1,4 mS/cm;

íf) az (e) lépés szerinti kát ioncserélő- gyantáról az immunglobulin. G-t eluáljuk nátrium-ecet át. pufferrei, melynek nátrium-acetát koncentrációja 5-40 tói, pH-értéfc.e 5,0-6, 0 és nátrium-klorid koncentrációja 50-500 ni-', ezáltal egy immunglobulin G-tartalmú eluátumot kapunk;

(g) az tf) lápéban kapott immunolobulin G-tartalmú eluátumot día/ultraszűrésnek vetjük alá az eluátum koncentrálása és/vagy dialízise céljából, és adott esetben stabilizálőszert adunk hozzá;

íh) a tg) lépésben kapott día/ultraszűrt és adott esetben stabilizált írtnungiobalin G-tartaimű frakcióhoz oldószert és/vagy detergenst adunk vírus-biztos immunglobulin G-tartalmú oldat előállítása céljából;

íí) a íhj lépésben kapott immunglobulin G-tartalmú oldatot, anioncserélő gyantára, majd ezt követően kationcserélő gyantára visszük fel;

(j) az (i) lépésben szereplő kationcserélŐ gyantát nátrium-acetát pufferrei mossuk, melynek nátrium-acetát koncentrációja 5,25 md, pü-értéke 5,0--6,0 és vezetőképessége 1,0 --1,4 mS/cm;

to ik; a 5 jg lépésben szereplő katicncserélö gyantáról az immunglobulin G-t eluáljuk agy nátriuzmaoetát puff errel, melynek nátrlum-ecetét koncentrációja 5-4ö mM, pK-értéke 5,0-6,0 és nátrium-klorid koncentrációi a 50-500 mM, ezáltal egy immunglobulin G-tartalmú eluátumot kapunk; és ti) a (k) lépésben kapott immunglobulin G-tartalmú eluátumot dia/ultraszúrésnek vetjük alá az ionerősség csökkentése és az immunglobulin G koncentrálása céljából, és .szacharid hozzáadása útján beállítjuk az ozmolaiitást 5-15 % végső koncentrációra,

A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti eljárással előállítható immunglobulin termék, a termék egy gyógyszerként történő alkalmazásra, továbbá az immunglobulin termék alkalmazása a 20. igénypontban megadott betegségek kezelésére szánt gyógyászati készítmény előállítására.

A találmány szerinti tisztítási eljárás kiindulási anyagaként egy immunglobulin-tartalmú nyers plazmafehérjefrakciót használunk. A tisztítási eljárás kiindulási anyaga lehet normál humán plazma vagy származhatnak olyan donoroktól· , akik bizonyos ellenanyagok nagy koncentrációjával rendelkeznek, igy például lehet hiperímmun plazma. A leírásban az úimmungiobelin-tartalmú plazma frakció kifejezés alatt az eljárás összes lehetséges kiindulási anyagát értjük, például kriocsapadék-mentes plazma; vagy olyan kríocsapadék-mentes plazma, melyből bizonyos plazma fehérjéket, például a IX faktort és az φ λ antitrombint eltávolitottuk; különböző Cohn-frakciók; és PSG-t | Polsón és munkatársai, Siochem Sipphys Acta, 82, 464-475 (1964); Polson és Ruiz-Sravo, Vox Sar»g, 23, 107-118 (1972)] vagy ammórdum-szulfásót használó kicsapatásí eljárásokkal kapott frakciók. Egy előnyös megvalósítási mód sze-

rint a plazmafehérje-frakció	II.	és	III.	Cohn-frakció.	de
II. Cohn-frákosét vagy I.,	II.	és	III.	Cohn-frakelót	is
használhatunk. A különböző	Cohn	-frakciókat előnyösen	egy

szokásos Co'hn-frakcionálási módszerrel, lényegében a Kis-tler-Kitschmann által módosított módszerrel állítjuk elő plazmából. Az i.mmu nglobulínokon kívül a Cohn-f rakciók tartalmaznak például fibrinogént,· α-gl.obuiinokat és β-globuiínokat, köztük különböző lipoprcteineket, melyeket előnyösen e.l kell távolítani a következő tisztítási eljárás során, Adott esetben szűrési segédanyag is jelen lehet a Coh.n~frakciók előállításához használt izolálás.! módszertől függően (például centrifugális vagy szűrés).

A találmány szerinti eljárás első lépésében egy immunglobulin-tartalmú plazmafehérje-frakcióból vizes szuszpenziót állítunk elő, ahol a szuszpenziő IgG-koncentrációja elegendően magas ahhoz, hogy a. kővetkező kicsapási lépésben a nem-XgG-fehérjék nagy részét, különösen a magasabb molekulatömegüeket, az aggre-gált. immunglobulinokat és más aggregéit fehérjéket, valamint a potenciálisan, fertőző részecskéket kicsapjuk a monomer IgG számottevő mennyiségének kicsapása nélkül. Ez általában akkor érhető el, ha az IgG koncentrációja a pufférőit és szűrt szuszpenziőban legalább mintegy 4 g/1 a kicsapószer hozzáadása előtt. Figyelembe kell venni, «< ΦΦΧ **»

W* Φ hogy a fehérjekoneentráció, valamint a szuszpenziók pH-jána é.s hőmérsékletének a kicsapásra gyakorolt hatása függ használt kicsapószertői.

Előnyösen a plazmafehérje-frakólöt vízben és/vagy puf ferben szuszpendáÍjuk egy lényegében véve nem denaturáló hő mérsékleten és pü-n. A lényegében véve nem denaturáló ki fejesés alatt azt értjük, hogy a körülmény, melyre vonatko zik, nem okozza az IgG molekulák funkcionális aktivitásána számottevő irreverzibilis veszteségét, azaz az antigén kötő dési aktivitás és/vagy a biológiai Fc-funkció csökkenésé (lásd: 2. példa).

A. plazmafehérje-frákosát előnyösen legalább egy nem de naturálő pufbérrendszerrel savanyított vízben szuszpendál juk, melyet a plazmafehérje-frakció térfogatának β-9-szeres előnyösen 7~ű~szoros mennyiségében alkalmazzuk. Az immungio bulin-tartalmö szuszpenzíók oü-ját előnyösen a β-os oHeiví alatt tartjuk, így például a 4,0-5,0 tartományban, előnyöse 5,1-5,7 tartományban, még előnyösebben mintegy 5,4-es érté

ken an	nak érdekében,	hogy biztosítsuk
ma 1 i s	oldhatóságát,	és hogy biztosíts
csapás	i lépés optims	ilis hatékonyságát

vas puffért használhat j-e-k, de a puff érrendszer előnyösen ie galább egyet tartalmaz, az alábbi pufferek ás savak közül nátrium-foszfát, nátrium-aeetát, ecetsav, sósav, Szakembe is használható.

számára nyilvánvaló, hogy számos más puffé

Az ímmungiobulin-szuszpenziót előnyösen hidegen tartjuk többek között annak érdekében, hogy megelőzzük a számottev fehérje-denaturáciöt és hogy minimalizáljuk a proteáz akti * 9 «*» Φ Φβ

Φ « Φ ♦ Φ X ► «·:♦ ΦΦ* ** Φ Φ« vitást.. Az immunglofeulin-szuszpenzió és a víz, valamint a hozzáadott puftérrendszer előnyösen ugyanolyan hőmérsékletű, mégpedig 0--12 ’C-os, előnyösen 0-8 °C-os,· meg előnyösebben

Egy etanollal kicsapatott pépből készült szuszpenzíó viszonylag nagy mennyiségű aggregált fehérjét tartalmaz. Az immunglobulin-tartalmú szuszpenziót adott annak érdekében., hogy eltávoiiXsük például gátumokat, az adott esetben jelenlévő szűrési segédanyagot és a maradék fel nem oldott pépet.. A szűrést előnyösen rétegszűrőkkel végezzük, például Cl50 AF, AF 2000 vagy AF 1000 (a Schenk cégtől), 30LA (a Cuho cégtől} vagy hasonló szűrőkkel. Az aggregátumok, az adott esetben jelenlevő szűrési segédanyag és a maradék fel nem oldott fehérje eltávolítását centrifugálással is elvégezhetjük.

Legalább egy vízoldhatő, lényegében nem denaturáló fehérjekicsapó szert adunk az immunglobulin-tartalmú szűrt szuszpe-nzióhoz olyan mennyiségben, mely elegendő a nagy molekuiatömegű fehérjék, llpoproteinek, aggregált proteinek, köztük aggregált immunglobulinok nagy részének kicsapásához. Az egyéb részecske jellegű anyagokat, igy például a potenciálisan fertőző részecskéket, például vírusrészecskéket szintén kicsapjuk anélkül, hogy ezzel a monomer IgG számottevő kicsapódását okoznánk. A fertőz alatt a leírásban például vírusrészecskéket (mint például hepatitisz vírusokat, HlVI és 6172 vírust) és baktériumokat értünk.

e setoen s 2 u rj u κ a nagyobb aggrerészecskék kifejezés

X

A lényegében nem denaturáló vlzoldhatő fehérjekicsapő szerek jól ismertek a fehérletisztítás szakterületén. At ilyen kicsapószereket használják fehérje frakoionálásra, mely szuszpenziókból fehérjék részleges tisztítását teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárásban használható sikálh más fehér3ekiesapó szerek közé tartoznak a PEG különféle molekulatömegé formái, a fcaprilsav és az ammónium-szuifát. Szakember számára nyilvánvaló, hogy számos más, nem denaturáló, vízoidható kiosapószer alkalmazható alternatív megoldásként a kicsapáshoz. A ^M fehér gekicsapó szer hozzáadása” kifejezés, illetve a kifejezés variánsai alatt egy vagy több típusú fehérjekicsapó szer hozzáadását értjük.

A Ikdeias ü-yy im.-v: ?ú ípl.ór 1^; ·· A.11 o..·-· mnο: V

Sg-y—előnyé-A kiesapőszér a szerves PEG, különösen a 3O-Ö0-3Ö0Ö DA molekuiatöíEíeg-tartományban levő PEG, így például a EEG 3350, a PEG 1000, a PEG 5000: és különösen a EEG éOOQ: (az adott PEG vegyületek nevében előforduló számok az átlagos molekulatömeget jelentik). A PEG kicsapószerként való alkalmazásának előnye, hogy a PEG nemionos és fehérjestabilizáló tulajdonságokkal rendelkezik, például az alacsony koncentrációban alkalmazott PEG az ÍVIG termékek stabilizálószereként jói ismert. A kicsapási lépés egyúttal a vírus eltávolitási lépés szerepét is betölti. A PEG koncentrálja és kicsapja a vírusokat fajtól, mérettől és felületi borításuktól függetlenül.

A fehérjekicsapó szer adott mennyiséget hozzáadjuk a szűrt szuszpenziöhoz a nagy molekulatömegű és aggregált fehérjék, valamint részecskék többségének kicsapása céljából anélkül, hogy ezzel a monomer IgG számottevő kiesapását okoznánk, így tiszta feiülúsző oldatot képzőnk. A fehérjekicsapó· szert hozzáadhatjuk szilárd por vagy tömény oldat forma j ában.

A PEG kicsapószerként való alkalmazásánál általános szabály, hogy minél nagyobb a vegyület molekulatömege, annál kisebb konoentrációban kell alkalmazni a PEG-t a fehérje kicsapásához. Amikor PEG 33S0~t, PEG· 400ö~t vagy előnyösen PEG 5000-t használunk, a kicsapószer koncentrációja a szőrt szuszpenzióban előnyösen mintegy 3 é.s 15 tömeg % közötti, például 4 és 10 tömegi közötti (például mintegy 5 %, δ %, 7 ·%, 8 %, :9% vagy 10 %), legelőnyösebben 6 %. A kicsapási lépésben a kicsapódás folyamatát legalább addig hagyjuk előrehaladni, míg egyensúly áll be a szilárd és a foiyadékfázis között, például legalább 2 órán át, így például mintegy 2 órától mintegy 12 órán át, előnyösen mintegy 4 órán ét. A kicsapódás alatt a szuszpenzíőt előnyösen alacsony hőmérsékleten tartjuk (például mintegy 12 °C alatt, így például mintegy 10 °C alatt, előnyösen 2 ®C és 8 °C között). A legmegfelelőbb hőmérséklet függ magától az alkalmazott fehérjekicsapő szertől.

A fehérjekícsapódás befejeződése után a kícsapással kapott szilárd csapadék és folyadék felülúszö keverékéből egy IgG-t szinte kizárólag monomer formában tartalmazó tisztított felülúszót nyerünk vissza. A visszanyerést elvégezhetjük a folyadék szilárd, anyagtól való elválasztására vonatkozó szokásos 'technikákkal, mint például cent ri fugálássai és/vagy szűréssel. Előnyösen átfolyó centrifugát (például Westfalía) alkalmazunk 1000 - SöQö g erővel működtetve.

«φ *·« * ♦ # φ

Φ « Α Φ Φ »-Φ ΦΦ » Φ Φ

Λ ♦♦ * X Φ >«> < *<·'

A visszanyert,, tisztított IgG-tartalmö f-elülűszót réteg“szűrjük a nagyobb részecskék és aggregátumok eltávolítása· érdekében. Ezt adott esetben egy szokásos sterilizáló szűrővel (például egy 0,22 pm-es szűrővel a Millipore cégtől vagy a Sartorius cégtől) végrehajtott steril szűrés követi,· mely eltávolítja például a baktériumokat az oldatból.

A tisztított és adott esetben szűrt IgG-tartalmó felülúszót egy legalább egy lépésből, így például két lépésből de adott esetben több lépésből álló anion- és kationcseréiő kromatográf lás eljárásnak vetjük alá annak, érdekében, hogy a megmaradó nem-lgG szennyezők, például IgA, albumin valamint aggregátumok nagy részét eltávolítsuk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a tisztított és

IgG-tartalmú felüiúszót anioncserélő gyantára, majd ezt követően kátioncserélő gyantára visszük, melyeket két megfelelő méretű oszlopba töltünk.

Az IgG tisztítása érdekében végrehajtott ioncserélő kro•ma to-.gr áfiás lépések során a körülményeket, például a pH-t és az. ionerősséget előnyösen olyan módon választjuk meg, hogy a szennyezők (például nem-IgG fehérjék, igy például

IgA, tra.nszfer.rirs, albumán és aggregátumok) nagy része kötődjön az anioncserélő gyantához, míg az IgG alapjában véve ne kötődjön, az aníoncserélő gyantához. Az ezt követő kátioncserélő kromatográfiát illetően az előnyösen megválasztott feltételek azt eredményezik, hogy lényegében véve az alkalmazott oldatban lévő összes IgG molekula kötődik a kationcseréiő· gyantához. Az aníoncserélő gyantára nem kötő·

JÍ φ

:&	φ X ΦΦ Φ ΦΦ * * * * * *44 V φ·« φ * Φ * < X* φ*5 *· 4» *
dött fehérhe szennyezőket és a kícs.aoőszeri·	a kátioncserélő

az eljárás egy előnyös megvaiositasx rk>	dja szerint az
anioneserélő gyantát és a kationcserélő gyár	ítát sorba kőt-

a puffért kicserélnénk, vagy Más körülmények 1	reg vá X to z nána k.
Tobo ok Miatt is előnyős az, ha az s	;n ioncserélő és
.kationcserélő kromatográfiát egy lépésben, k	:ét egymás után
kötött kromatográfiás oszlopon hajtjuk végre	ahelyett, hogy
két különböző kromatográfiás lépést aikalmz	ι znánk, például
különböző ouffer összetételekkel. A. két sort;	s kötött kroma-

zött az IgG-tartalmú frakciót összegyüjtsük,	sem a pH és az
íonerőseég beállítására. Ráadásul a pufferái	camot egyidőben

.fiás lépést két lépésben végrehajtani, azas	: úgy, hogy az
anioneserélő gyantát és katíoncserélő gyantát	nem kapcsoljuk
sorba. A kromatooráfiá.s eljárás két léoésben	történő- végre-

mint amikor az ioncserélő gyantákat sorba k<	apcsoiva aikai-
mázzuk.

·>♦·*.

e. ne 1 yen megjegyezzük, nogy ÍVIG termék nagy tisztasági foka, magé .ν. Φ«·φ Ί&>·'* ·<

lálmány szerint monomer és dím<

tartalma, valamint alacsony IgA tartalma részlegesen, a két sorbakapcso.lt kromatográfiás oszlop alkalmazásának köszönneu ö φ

Szakember számára, nyilvánvaló, hogy mind a mátrix, mind a kapcsolt csoportok szempontjából különféle anyagokon alapuló ioncserélők alkalmazhatók. Például at alábbi mátrixokat alkalmazhatjuk, melyekben az említett anyagok többé vagy kevésbé kereszt-kapcsoltak lehetnek: agaróz alapú (például Sepharose CL-6:8®, Sepharose Fást Flow® és Sepharose High Per-formance®) cellulóz alapú (például DEAE Sephacel*), dextrán alapú (például Sephadex®}, szilíka alapú és szintetikus polimer, alapú. Anioncserélö gyanták esetén a töltött csoportok, melyek kovalens kötéssel kapcsolódnak a mátrixhoz, lehetnek például, dietíiamínoetil (DEAE) , kvaterner aminoetíl (QAE) és/vagy kvaterner ammónium (Q) csoportok. Kationeserélö gyanták esetén a mátrixhoz kovalens kötéssel kapcsolódó töltött csoportok lehetnek például karboximetil (CM), szulfcpropil (SP) és/vagy metiisznifonát (S) csoportok, A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módjában az alkalmazott anioncserélö gyanta DEAE Sepharose Fást Flow®, de más· anioncserélőket ís használhatunk. Egy előnyös kationeserélö gyanta a CM Sepharose Fást Flow®, de má.s kationcserélő gyantákat is használhatunk.

megfelelő térfogatának megválasztásánál figyelembe vesszük az oszlop dimenzióit, például az oszlop átmérőjét és· a gyanfaoszlop magasságát; és ez változhat például az alkalmazott oldat IgG tartalmától és az alkalmazott gyanta kötési kapacitásától. függően.

Ar ioncsere-kromatográflés lépés végrehajtása előtt az ioncserélő gyantát előnyösen egy pufferrel ekvilibráljuk, mely lehetővé teszi, hogy a gyanta megkösse- az ellenionjait. Az anion- és kationcserélő gyantát előnyösen ugyanazzal a pufferrel ekvilibráljuk, mivel, ez megkönnyíti az eljárást, hiszen csak egyetlen puffért keli elkészíteni és használni.

Ha például a választott anioncserélő gyanta DEAE Sepharose FF® és a kationcserélő gyanta CM Sepharose FF^&, és az oszlopokat sorba kötjük, akkor előnyösen mindkét oszlopot egy nem denaturáló savas pufferrel ekvilibráljuk, melynek, körülbelül ugyanakkora a pH-értéke és az ioneros-sége, mint az oszlopra töltendő IgG-oldaté. Számos puffer alkalmas az ioncserélő oszlopok ekvilibrálására, például nátrium-acetát, nátrium-foszfát, triszíhidroximetil)'amino-mstán. Szakember számára nyilvánvaló, hogy számos más puffért is alkalmazhatunk ekvilibrálásra., feltéve, hogy a pH és a vezetőképesség közelítőleg megegyezik az alkalmazott IgG-oIdatévai, Abban az esetben., ha az anioncserélő oszlopot és a katíoncserélö- oszlopot .sorba kapcsoljuk, egy előnyös puffer az ekvilibráláshoz a nátrium-acetát puffer, melynek nátrium-acetát koncentrációja az 5-25 mM tartományban, így például a 10-20 mM tartományban, van, előnyösen mintegy 15 mM, Előnyösen az ekvilibráláshoz használt nátrium-acetát puffer pH-ja az 5,0-5,0 tartományban van, így például as *

IS

5,4-5,9 tartományban, előnyösen mintegy S,?-es értékű. A vezetőképesség előnyösen sz 1,0-1,4 mS/cm tartományban van, előnyösen mintegy 1,2 mS/cm. Alkalmas módon az aeetát puftereket előállíthatjuk nátrium-acetát-tríhidrátból és jégecetből.

A tisztitett és adott esetben szűrt lgG~tartalmú felülüsző ioncserélő oszlopra való felvitele előtt a felülúszó puffer koncentrációját és pH-ját előnyösen szükség esetén beállít juk olyan értékre, mely lényegében, megegyezik az alkalmazott ekviiibrálő puffer koncent ráció- iával és pH-érfékével.

Az IgG-tartalmú felüiúszó sorbakapcsolt oszlopokra való felvitele után az oszlopokat előnyösen, egy oszloptérfogatnyi mosőputferrel mossuk (ez a kezdeti mosás) annak érdekében, hogy biztosítsuk az IgG-tartalmú oldat kvantitatív átvitelét az aníoncserélő oszlopról a kationcse-rélő oszlopra. Ezután az anioncserélő és kationcserélő oszlopokat szétválasztjuk, és a kátioncserélő oszlopot előnyösen mossuk - annak érdekében, hogy eltávolítsák a fehérje szennyezőket a gyantáról egy olyan pufferreL, melynek pH-ja. és ionerősségs elegendő ahhoz, hogy lényegében az összes szennyezőt eluáljuk a kationcserélő gyantáról anélkül, hogy az IgG számottevő mennyiségét elválnánk,

A kezdeti mosást előnyösen az ekviiibrálő pufferrcl hajtjuk végre, bár más, hasonló koncentrációval és pH-értékkel rendelkező puffereket, is alkalmazhatunk a mosáshoz. Sédnyóeesa·. egy aeetát pufiért alkalmazunk a szennyezők kationcseréiö gyantából való kimosására. A puffer ph-értéke

1.9X ΦΦΦ

Π ώ ί\ :Λ t·’Λ' Τ Α +· 't* Ύ Ί ··> >; Ο- ί '< ;'ϊ' ? <\Ο 1 >*Χ Α '3 y Λ 43 £ £? L·* '*··.·<. +· é ν

S f to to to to 7 \· Α to <.· to to C to 4. w Λ X to k. f .Φ. to y D<·.* XtoU <« X —s r to to to to f Ό .··,....· to to> to ·«.· .J. f például 5,4-es érték.

Az IgG katíoncseréló gyantáról való eladóját előnyösen egy alapjában véve nes denaturáló pufferrel hajtjuk végre, melynek pK-ja és ionerössége elegendő ahhoz, hogy az IgG hatékony elúcióját idézze elő, ezáltal egy IgG-tartalmú iuátumot nyerünk. Ebben a szövegösszefüggésben hatékony

Lón azt értjük, nogy a kátioncserélő gyantákra felvitt sorbaksocsolt anion- és fehérjék iecaláfcb · to ο ~ <Λ to to •9}· legalább 80 %-át, például legalább 85 %-át kátioncserélő gyantáról. Az eiúoíöt előnyösen gradiens eiúcíős lépésként hajtjuk végre. A találmány szerinti eljárásban az előnyösen használt puffer olyan nátríum-acetát puffer, melynek pü-értéke az ,1,0-6,0 tartományban, igy például az 5,2-5,8 tartományban van, előnyösen mintegy 5,4, és a koncentrációja az 5.-40 mM, igy például a 10-25 mM tartományban van, előnyösen mintegy 15 mM. Az eluálő puffer előnyösen elegendően magas ahhoz, hogy az só -koncentráció· iCGkiszorítsa a gyantáról. Viszont megjegyezzük, hogy a pH-érték növelése és egy alacsonyabb sokoncentráció ís alkalmazható az IgG gyantáról való eiuáiása céljából. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módjában az elúciőt folyamatos só-gradien;

i ŰC > Ó Várt· :UK

500 mM tarto-amíkőris a nátrium-kloridkoneentráciő az 50 mányban, előnyösen mintegy 125 mM-tól mintegy 350 mM nádi u®- k 1 o r í d kon cent rá c i ói g változik..

Az elúciőt lépésenkénti gradiens elűciö formájában i végrehajthatjuk. Megjegyezzük, hogy az.

eiúcíót .t. b.to K

KUS a * «« ♦» ** ♦ ♦ *« φ χ φ * * Φ φ ♦ *«♦ φ »* * Φ Φ X Φ X

ΦΧΦ μΦΦ φ» φφ Φ X Φ-* eiúciőként is végrehajthatjuk, melyben a kstioncserélö oszlopra felvitt elúciős puffer sókoncentráciöja - a gradiens eluclöval szemben - állandó. Ha Izokratíkus elúciöt alkalmazunk, a só koncentrációja előnyösen a mintegy 350 nmol és 500 mmoi nátrium-kloríd koncentrációtartomány-han van. A gradiens elúció izokratíkus eládával szembeni előnye az, hogy az elúció hatásosabb só-gradienssel,. de egy másik előny ar, hegy az eluátum. íonerőssége alacsonyabb, amely azért előnyös, mert a magas íonerősség kritikus az IgG stabilitása szempontjából. Az eluáló puffer tartalmazhat továbbá fehérjestabilizalő szereket, mint például a későbbiekben felsorolt szereket. Számos más alkalmas puftárrendszert is használhatunk az IgG eiuáiása céljából, ami. szakember -számára nyilvánvaló.

Előnyösen legalább egy fehérjestabilizáló szert adunk az IgG frakcióhoz az elúció alatt vagy közvetlenül utána. A fehér jestabiiízéló szerek szakember számára Ismertek, példaként említhetjük a különböző cukoralkohoiokat és .szacharidokat (például szorbitM', mannőz, glükóz, trechalőz, máitőz), fehérjéket (például albuminti, amínosavakat (például lizint vagy giieint; és szerves savakat (például P£6-t). A választott, közbülső stabilízálószer előnyösen olyan, melyet a következő lépésekben eltávoiírhatunk az IgG-tartalmú oldatból.

Az IgG-tartaimű oldatban a fehérjestabilízé.lő szer alkalmas koncentrációja függ magától az alkalmazott szertől. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a stabilízálószer

X

S2orbitM', előnyösen a 2-15 vegyes % tartományban, például mintegy 2,5 % végső koncentrációban alkalmazva,.

A katíoncserélő gyantáról való elúoiö után az eluátumot előnyösen .sótlanitjuk {azaz dializáljuk) és előnyösen töményitjuk. & puffer kicserélése és az IgG töményítése végrehajtható egy kombinált dia/ultraszürési eljárással. A ”di.a./u.ltraszürés'’‘ kifejezés alatt azt értjük, hogy a dialízis valamint a dia- és ultra-szűrés általi töményítés egyetlen lépésben zajlik le. Megjegyezzük, hogy a dia- és az ültra.szörést két különböző lépésben ís végrehajthatjuk, viszont annak érdekében, hogy elkerüljük a szükségtelen termékveszteséget, előnyös a dialízist valamint a dia- és ultraszürés által végrehajtott tőményitést egy lépésben elvégezni.

A dia/ultraszűréshez használt membránok névleges kritikus áteresztési tömege (cutoff weíght; előnyösen a 10 OGő - löö 000 Da tartományban van, A találmány szerinti eljárás végrehajtásához. egy előnyös membrán típus a Mlilipore cégtől beszerezhető- 30 000 Da névleges kritikus áteresztési tömeggel rendelkező políszulfoh membrán. Ugyanakkor más - hasonló anyagból készült és hasonló porozitássál rendelkező - ultraszűrésre alkalmas membránokat ís alkalmazhatunk.

A koncentráció értéke jelentős tartományban változhat. Az. oldatot mintegy 10 g/al IgG - 10-0 g/mi tartományba eső koncentrációra, előnyösen mintegy 50 mg/ml koncentrációra töményítjük. A tóményítá-s- után az. IgG-koncentrátumot. előnyösen egy alacsony .ionerősségű pufferrel szemben dializáljuk. A sóból származó- ionok eltávolítása mellett e-z a lépés az φ « »♦ ♦ X ♦ * * » * ♦ * χ* β « « « » ψ»» >«r »49 4 φφ alacsony molekulatömegü szennyezőket is eltávolítja az oldatból, és a következő tisztítási lépésben a puffercsere eszköze.. A ^leszűréshez egy előnyös puffer az 5,4-es pH-értékű, 2,5 vegyes % szorbito)ft tartalmazó 15 mM nátrium-acetát puffer. A pufíeres-erét addig folytatjuk, míg az ultraszűrt oldat vezetőképessége 1,5 mS/cm, előnyösen mintegy 1,3 mS/cm érték alá csökken. A día/ultrasz.öré-s ideje alatt a pH-t előnyösen a 4,0-5,0 tartományban, előnyösen az 5,1-5,7 tartományban, még előnyösebben 5,4-es értéken tartjuk.

A dia/ultraszűrés után szükség esetén az oldatban, a fehér jestabilizáló- szer koncentrációját előnyösen beállítjuk az alkalmazott specifikus fehérjestabilizáló szerre jellemző optimális végkoncentráciőra. Ha szerbitől.?. használunk, a szerbitől koncentrációját előnyösen mintegy 10 tömeg%~ra állítjuk be.

A stabilizált oldatot előnyösen egy 0,2-1,0 pm, sen mintegy 0,45 pm pórusátmérőjü szűrőn szűrjük kében, hogy az aggregátumokat eltávoiítsuk a következő lépés előtt. Az XgG-tartalmú oldat ebben a stádiumban egy megfelelő térfogatú, nagy stabilitással rendelkező tiszta oldat, ami a nagy tisztaságnak, az alacsony ioner.ősségnek, a savas pH-nak, a viszonylag magas IgG-koncentrációnak és a hozzáadott stabilízátornak köszönhető.

Az ÍVIG termék előállítási eljárása legalább két meghatározott és Validéit vírus eltávolító és inaktiváló lépést tartalmaz, előnyösen egy PSG-vel végzett kicsapatási. lépést, mely egy általános víruseltávolítási lépés, és egy S/D kezelést, mely a iipidburokkal rendelkező vírusokat célzó vírus * * » * Κ Φ Φ ♦♦ φ * φ » *

X Φ Φ* Φββ* » ** inaktiváló lépés. A kiindulási anyagra vonatkozó szigorú, nemzetközi irányelvek szerinti vírusbiztonsági követelményeken és a többlépéses tisztítási eljárás közismert víruscsö-kken tő kapacitásán túlmenően a két egymástól független, burkolt és nem burkolt vírusok ellen egyaránt aktív redukciós lépés beillesztése révén a találmány szerinti gyógyászati készítmény lényegében vírus-biztos.

Az IgG-tartalmú oldatban adott esetben még mindig jelenlévő, iipidburokkal rendelkező fertőző vírusokat előnyösen az eljárásnak ebben a részében inakéivá!juk azáltal, hogy az IgG-tartalmú oldathoz vírusölő mennyiségben vett virusinaktiválő szert adunk. A vírusölő mennyiségű” vírusinaktiváló szer kifejezés alatt olyan mennyiséget értünk, melynek alkalmazása esetén kapott oldatban a vírus részecskéket lényegében íertőzésmentessé tesszük, és ezáltal egy, a szakterületen definiált vírus-biztos IgG-tartalmú oldatot kapunk. A vírusölő mennyiség” függ magától az alkalmazott vírusinaktiváló szertől, valamint a körülményektől, például az inkubáció idejétől, p'H-tói, a hőmérséklettől, a lipidtartalomtől és a fehérjekonoentrációtól.

A ”vírusinaktiváló szer kifejezés alatt olyan szert vagy módszert értünk, amely alkalmas mind lípidet tartalmazó burkolatú vírusok, mind lípidet nem tartalmazó burkolatú vírusok inaktiválására. A vírus inaktiválószer” kifejezés alá tartozónak értjük az ilyen szerek és/vagy módszerek kombinációit is, ahol ez lehetséges, valamint az önmagában vett ilyen típusú szert vagy módszert is.

;k (például HIV-1 és HIV-2, hepatitisz

Az eXdagfSa vírusinaktíváló szerek detergensek és/vagy oldószerek, legelőnyösebben detergens és oldószer elegyek. Megjegyezzük, hogy a virusínafctiváió szer adott esetben agy vagy több detergens egv vagy több oldószerrel alkotott elegye. Az oldószer/detergens (S/D) kezelés a lípiddel borított és nem-A-S-C, és 2, a herpesz vírus család, köztük a CMV és az Sarr vírus) inaktiválására vérkészítményekben széles körben alkalmazott lépés. Detergensek és oldószerek széles választékát alkalmazhatjuk vírusinaktiválásra. A detergenst a .nem-ionos és ionos detergensek csoportjából választhatjuk, mégpedig olyat választunk, amely lényegében nem denaturáló. Előnyösen nemionos detergenst használunk, mivel ez megkönnyíti a detergens eliminálását az IgG-tartalmú készítmenyből a következő lépés előtt. Alkalmas detergenseket ismertetnek például Shanbrom és munkatársai a 4 314 997 számú és a 4 315 919 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi publikációkban. Előnyös detergensek a Triton X-10G és a Tween 80 márkanéven forgalomba hozott detergensek. A vírusinaktíváló szerekben előnyösen alkalmazott oldószerek a di- vagy triaikiifosztátok, melyeket például Keurath és Horowitz ismertet a 4 764 3ő9 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban. Egy előnyös oldószer a tri (n-but.il) foszfát (TNSSj , A jelen találmány végrehajtásához különösen előnyős vírusinaktíváló szer a TNBP és a Tween 80 elegye, de alternatív módon más kombinációkat is használhatunk. Az előnyős elegyet olyan térfogatban adjuk az IgG-tartalmú oldathoz, hogy a TNBP koncentrációja az oldat* φ « * < » ♦ X * bán a ü,z~0,o tömeg*-os tartományoan, előnyösen mintegy 0,3 törnéd-bán leqyen leien. A Tween 80 koncentrációié az IgG-tartalmű óláéiban a 0,8-1,5 tömeg! tartományban van, előnyösen mintegy 1 tömeg!.

A vírusinaktIcátlés lépést olyan körülmények kötött hajtjuk végre, melyek inaktiválják a burokkal rendelkező vírusokat, és igy egy lényegében vírusmentes IgG-tartalmú oldatot kapunk. A körülmények általában 4-3Q ^ÖC hőmérsékletet, például 19-28 °C, 23-2.4 *0, előnyösen mintegy 25 ”C hőmérsékletet jelentenek, é.s olyan hosszú inkubációs időt, melyet a vaiidáiási vizsgálatokban hatékonynak találtunk. Általában 1-24 órás inkubációs idő elég, előnyösen 4-12 óra, igy például 6 óra elég a vírus inaktiválásának biztosítására. Mindamellett a megfelelő körülmények ·hőmérséklet és inkubációs idő) függnek az alkalmazott ví.rusinaktiváiő szertől, a pR-tól, a fehérjekoncentráciötői és az oldat 1 i p i d t a r z a Írná t ő 1...

Megjegyezzük, hogy vírus-biztos termék előállítása céljából más virusinaktiváíási vagy eltávoiitási módszereket ís használhatunk, erre példa a metilénkék hozzáadása, melyet ultraibolya fénnyel való besugárzással vagy nancfiltrációval való inaktiválás követ.

Az oldószer/detergens kezelés, után az oldatot előnyösen pufferrel hígítjuk., A lényegében vírus-biztos IgG-tartaimú oldatot adott esetben szűrjük, előnyösen rétegszűrön - melyet a találmány szerinti eljárás egy korábbi lépésével kapcsolatban már ismertettünk - és/vagv steril szűrőn kérész-26

A vírus inaktiválás és előnyösen szűrés után íoncserekromatográfiás műveletet hajtunk végre annak érdekében, hogy eltárollésük a virusínaktíváló szert és a fehérje szennyezőket, Ezt a lépést előnyösen úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt a találmány szerinti eljárás előző íonesere-kromafográflás lépésében már ismertettük, azzal a különbséggel, hogy az aníoncserélő gyanta térfogata mintegy fele a kationcseréiő gyanta térfogatának, és az IgG eiuálását megelőzően a mosási lépés alaposabb, a használt puffer térfogata az oszlop térfogatának legalább hatszorosa. Továbbá, a találmány egyik megvalósítási módjában az ekvilibrációs puffer mintegy 5-25 mM, előnyösen 15 mik koncentrációjú, és 5,0-5,8, előnyösen 5,4 pü-értékű nátrium-acetát puffer. Mint korábban említettük, az IgG-tartaimű oldat nátríum-acetáttarfslmát és pH-ját előnyösen az ekvilibrációs puffer koncentrációjára és pH-értékére állítjuk be. Továbbá a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a fehérjestabiiizáiő szer előnyösen maltöz, és olyan mennyiségben adjuk az elnátumhoz, hogy a vég j.koncentráció 1-5 fömeg%, előnyösen mintegy 2, 5 tömeg! legyen.

A vírusínaktiválő szer eltávolítására előnyös módszer az ioncsere-kromatográfla. Viszont más módszereket, például olaj extrakciőf és alternatív kromatográfiás módszereket is hasznosnak tekintünk. A megfelelő módszer függ az alkalmazott virusinaktíváló szertől. Az oldőszer/detergens eltávolítását végrehajthatjuk úgy, hogy az IgG~t gyantához kötjük, majd az inaktiválőszert egy pufferrel alaposan kimossuk, A kationesere-kromatográf is egy alkalmas módszer. A találmány φφ φφ egyik előnyös megvalósítási módja szerint a katíoncserekro-matográfián kívül anioncsere-kromatográflát ís végrehajtunk annak érdekében, hogy javítsuk a lépés végtermékének minőségét és általános tisztaságát.

Az ioncsere-krcmatográfiás lépés után az IgG-tartaimú eiuátumot előnyösen diaiizáljuk és töményítjük, ezáltal a visszamaradt kisebb fehérjekomponens-tartalmat ís hatékonyan csökkentjük. Előnyösen ezt día/ultraszüréssel hajtjuk végre, melyet korábban ismertettünk, A diaszüréshez alkalmazott puffer előnyösen mintegy 4-10 mM, előnyösen 7,5 mM koncentrációjú, és mintegy 4,-0-6,0, előnyösen mintegy 5,1-5,7, így például 5,4-es pH-értékü nátrlum-acetát puffer. Alternatív módon más pufféreket, például nátrium-foszfátot vagy savakat is használhatunk a diaszüréshez. A díaszörést addig folytatjuk, míg a vezetőképesség eléri az 1 mS/cm értéket, vagy ez alá csökken. Adott esetben az IgG-tartsimű oldatot fertőtlenítő szűrésnek vetjük alá.

Kívánt esetben a vírusinaktiválő szertől lényegében mentes tisztított IgG-tartaimú oldatot további kezeléseknek vetjük alá azzal a céllal, hogy alkalmassá tegyük például intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris beadásra alkalmas folyékony halmazállapotú termék előállítására.

Gyakorlati szempontból előnyös, na az immunglobulin termékből készült folyékony készítmény koncentrációja tároláskor és felhasználáskor megegyezik. Az IgG végkoncentrációja a termékben előnyösen a 0,25-20 tömeg! tartományban van (ami literenként 2,5-200 g XgG-nek felel meg), így például φφφ

1-20 tömegé, azaz például 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6%, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %.

Ismeretes, hogy a magas fehérjekoncentráció az IgG nagyobb fokú stabilitását eredményezi. Másrészt a magas IgG~koncentráció azt jelenti, hogy az IgG intravénás beadásakor az infúzió maximális· sebességének alacsonynak keli lennie annak érdekében, hogy elkerüljük a termék magas ozmózisnyomásából eredő transzfúziós problémákat. Az Európai Gyógyszerkönyv által jelenleg ajánlott koncentráció intravénás beadás esetén 5 vegyest,. Másrészt, intramuszkuláris vagy szubkután injekciók esetén egy viszonylag tömény termék (például 10 %-os vagy afölötti) előnyös.

Bár nem előnyös, de nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti különféle eljárási lépésekkel előállítható termékek felhasználhatók például fagyasztva szárított termékekként is folyékony készítmények helyett, bár ez a közvetlenül folyadék formában levő termékek használatához képest kevésbé kedvező, Az utóbbi megvalósítási módot a későbbiekben részletesen ismertetjük,

A folyékony ímmung. lobul ín termékek a plazma í önerő sségénél határozottan alacsonyabb íonerösség mellett a legstabilabbak, azaz a vezetőképesség előnyösen 1,0 m5/cm~nél kisebb, előnyösen mintegy 0,8 mS/cm.

A pH hatással van az IgG stabilitására és az infúzió sebességre. .A. folyékony halmazállapotú immunglobulin termékek savas körülmények között a legstabilábbák, azaz az IgG ízoelektromos pontja alatt (pH - 6,4-8,55, Minél közelebb van a pH-érték a fiziológiás pH-érzékhez (7,1-7,3), annál magasabb ί» * Φ < Κ Φ *

999 ♦

Φ ♦ *

ΦΦΦ φφ ΦΦΦ Φ

-ZÜinfúziós sebességet alkalmazhatunk. A stabilitási követelmények következményeként a találmány szerinti immunglobulin termék pH-ja előnyösen az 5,1-5,7-es tartományban van, igy például 5,2 és 5,6 között, például mintegy 5,4.

Az immunglobulin termék továbbá fehér jestabilízáló· szereket tartalmazhat, ahogyan ezt már ismertettük. A cukoralkoholokon és a szacharinokon (például szorbiteój mannóz, glükóz, trehalóz, maltőz) kívül fehérjék (például albumán) , aminosavak (például lizín, glicin; és szerves savak (például PEG és Tween SQ) is használhatók stabilizálószerként. A stabilizálöszer megfelelő koncentrációja az loG-tartalmú oldatban függ az alkalmazott szertől, mint ahogyan ezt már ismer·!* ώΑΥ·* Τ' Q V

A tisztított IgG-öiőatot szükség esetén tovább módosítjuk stabil é.s ízotóníás oldat előállítása céljából. Az ”izotóniás oldat'’ kifejezés alatt azt értjük, hogy az oldat oz~ mózisnyomása megegyezik, a plazma ozmózis-nyomásával . Mint említettük, a találmány szerinti folyékony halmazállapotú immunglobulin termék íonerőssége lényegesen alacsonyabb, mint. a plazmáé. Ezért előnyösen mono- vagy diszacharidokat .használunk arra, hogy növeljük az. ozmolaiitást az oldatban., mivel ez nem befolyásolja az ionerősséget.. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában maltózt adunk az oldathoz akkora koncentrációban, mely biztosítja, hogy az oldat izotőníás legyen, és ugyanakkor a malföt immunglobulin stabílizámaltőz végkoncentrációja 5 és 15 vegyese közötti, előnyösen

-30~ vegyes! legyen; alternatív módon más szacharinokat, például mannőzt és glükózt is használhatunk.

Az immunglobulin termék előnyös végső koncentrációja egy kompromisszum a stabilitás és a fiziológiailag elfogadható körülmények között, tekintettel a pH-ra, az ionerősségre és a tonicitásrs. Az immunglobulin terméknek továbbá eleget kell tennie a minőségi ellenőrzési vizsgálatok által támasztott követelményeknek, ahogyan ezt az Európai Gyógyszerkönyv 199~~es kiadásának 318. számú monográfiájában meghatározták.

A találmány szerinti eljárással előállított termék fö előnye, hogy ha folyékony készítményként állítjuk elő, a termék egy olyan folyékony, felhasználásra kész termék, mely ugyanakkor nagyon stabil, nagyon tiszta és az IgG alosztályainak eloszlása nagymértékben a szokásos, továbbá rendkívül alacsony ,a.z IgA-tartalma, valamint alacsony az IgM~tarLalms, a visszamaradt ellenanyag aktivitása és az Fc-funkciö által mutatott biológiai aktivitása.

Másfelől lényegében nem tartalmaz immunglobulin aggregátumokat és/vagy más, dimernél magasabb fokú polimerek formájában jelenlévő piazmafehérjéket, valamint alacsony az antikomplementer aktivitása és nagyon magas az IgG monomerés dimertartalma. A monomer IgG legalább 90 %-ot tesz ki, ami ideálisnak tekintett. A nagyfokú stabilitás lehetővé teszi, hogy más stabílizálőszerek, például albumín, glicin, detergensek vagy .PEG hozzáadását elkerüljük. Végűi elmondhatjuk, hogy a termék vírus-biztos, mivei az eljárás jól definiált és vaiidált víruscsökkentési lépéseket tartalmaz, melyek mind lipiöét—burkolatú, mind lípidst nem fpí CükdcthCzC tartalmazó burkolatp vírusok eltávolítását és/vagy inaktiválását célozzák.

Egy lépés viruscsókkentő lépéssé nyilvánításának célja az, hogy bizonyítékot szolgáltassunk arra, hogy az előállítási eljárás hatékonyan inaktiválja/eltávolítja azokat a vírusokat, melyek vagy ismerten szennyezik, vagy elképzelhetően szennyezhetik a kiindulási anyagot, A vaiidáiásí vizsgálatok során szándékosan viszünk be vírust, a hitelesítendő előállítási lépés előtt és mérjük, hogy milyen mértékben történt meg az eitávolítás/ínaktíválás az eljárási Lépés vagy lépések után. A GME követelmények nem engedik meg semmiféle vírus szándékos bevitelét a termelési berendezésekbe. Ezért a validálást egy külön víruskutatásra felszerelt laboratóriumban kell végrehajtani a gyártási eljárás csökkentett léptékű változatában, víruskutató szakemberek, valamint termelési mérnökök együttműködésével. A vizsgálandó termelési lépés kiindulási anyagához hozzáadott, vírus mennyiségének a lehető legnagyobbnak keli lennie annak érdekében, hogy megfelelően megállapíthassuk az előállítási lépés vírus'•inaktíváiő/eltávoiíté kapacitását. Ugyanakkor a vírus hozzáadását agy kell elvégezni, hogy a termelési anyag összetétele ne változzon meg jelentősen, A hozzáadott vírus térfogata előnyösen az egészre vonatkoztatva 10 % vagy annál kevesebb .

A ragáiyosság kvantitatív vizsgálatát a GIF alapéival szerint keli végrehajtani, és ide tartozhat a vérlemezkeö;·'

-képződés valamint más citopata hatások, például szincihiumés göoképződés detektálása, végponttitrálás (például· TCID50)

A·* vizsgálatok, vírus ellenanyag szintézis detektálása vagy más módszerek. A módszernek megfelelő érzékenységgel és reprodukálhatósággal kell rendelkeznie, és elegendő számú párhuzamos mérést és ellenőrzést kell végrehajtani, hogy az eredmények megfelelő statisztikai pontosságát biztosítsuk.

Az eljárás vizsgálatát tipikusan β lóg tartományban vett vírussal végezzük, és ha legalább 4 lóg nagyságrendű csökkenést tapasztalunk, ez világos hatást jelent a vizsgált vírusra vonatkozóan. A 4,5 lóg, 5 lóg vagy akár az 5,5 lóg nagyságrendű csökkenés hasonlóan világos hatást jelent a vizsgáit vírusra vonatkozóan, és a lépést validalt vírusredukciós lépésnek sorolhatjuk be.

A vírus validálási vizsgálatokat olyan vírusokkal keli végrehajtani, melyek a lehető legjobban hasonlítanak a terméket szennyezhető vírusokhoz, valamint a lehető legszélesebb körű fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek annak érdekében, hogy megállapíthassuk a rendszer általánosságban vett vizuseltávolltó képességét.

A vírus validálási vizsgálatokat a 'CPMP Útmutatása jegyzet vírus validálási módszerekhez; vírusok inaktiválására és eltávolítására vonatkozó hitelesítési tanulmányok tervezése, végrehajtása és értelmezése (CFMr Nóta tor Guidanee on Vírus Validation Studies; The Design, Contribution and Interpretáción. of Studies Validating the Inactivation and Femoval of Viruses; CPM8/BWP/268/S5·) és az Útmutatásé jegyzék plazmából származó gyógyászati termékekhez (hete fór Guidanee on Fiasma Derived Medicinái * X φ φ φ* φ *

Φ X * φ*

Products; €Pb8/BNP/269/95) útmutatások szerint kell végrehaj tani.

A találmány szerinti eljárásra vonatkozó validálási vizsgálatokat az 5, példában Ismertetjük.

A találmány szerinti készítmény tisztasága legalább 95 %-os, előnyösen 98 % fölötti. A tisztaság magas foka többek között annak a ténynek köszönhető, hogy a találmány szerinti készítményt legalább egy, előnyösen kettő adott esetben sorbakapcsoit anion/kationcsere-kromatográílás lépéssel állítjuk elő. Ezzel kapcsolatban érdemes megjegyezni, hogy a nagyszámú eljárási lépés ellenére magas hozamot sikerült elérni; gyártási léptékben 1 kg friss fagyasztott plazmából legalább 3,5 g XgG fehérjét nyerünk ki.

Az elvégzett összehasonlító· vizsgálatok (lásd: 2. példa) azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállítható immunglobulin termék ideális funkcionális tulajdonságokkal, így kimagasló ellenanyag-kötő aktivitással és magas Fc-funkciőval rendelkezik, ft találmány szerinti előnyös gyógyászati készítmény egy 5 tömeg%-os immunglobulin oldat. A stabilitás vizsgálatok eddig azt mutatták, hogy 4 “C-os tárolási hőmérsékleten a stabilitás időtartama több mint 1 év, azaz az immunglobulin. termék aggregátumok képződésétől, az immunglobulin G fragmentácíójától, a kívánt biológiai hatás csökkenésétől vagy a nemkívánatos hatásoktól, például antikomplementer aktivitástól és prekaiiíkreín aktivitástól - az in vitro mérések tanúsága szerint -· mentes.

A találmány alapján lehetségss olyan IgG terméket előállítani, melynek tisztasága több, mint 95 %-os, például lege# * t 4 ♦ * iább 96 %-os vagy legalább 97' l~os, például legalább 98 %-os., előnyösen legalább 93 %-os, még előnyösebben legalább 99,

G termék δ mg-nál kevesebb laA/l~t taimaz, .Így például kevesebb, mint 4 mg iga/Z-t, előnyösen kevesebb/ mint 3 mg IgA/Z-t, még előnyösebben kevesebb, mint £ fti-g i gA //i ~ tú,

Hangsúlyozzuk/ hogy más termékek detergens, PEG vagy albumán formájában stabiiizátort tartalmaznak. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény nem tartalmaz egyetlen előbb említet stabiiizátort -sem, ehelyett egy jél tolerálható szaob.arid.ot választottunk.

A. találmány szerinti készítmény egyik jellemzője, hogy nagyon alacsony a polimer- és aggregátum-tartalma. Egy előnyös megvalósítási módban a találmány szerinti készítmény kevesebb, mint 1,5 % polimert és aggregátumot, előnyösen kevesebb, mint 1 %, például kevesebb, mint 0', 5 % vagy kevesebb, mint 0,-.25 % polimert és aggregátumot tartalmaz. Az IgG-.monomerek és dimerek aránya legalább 95 %, igy például legalább 96 % vagy legalább 97 %, például legalább 98 %, előnyösen legalább 98,5 % vagy 99 %.. A. termék IgG—monomer tartalma legalább 90

A vizsgálatok, azt mutatták,, hogy a találmány szerinti készítmény klinikai hatása összehasonlítható a bejegyzett ÍVIG készítményekével. A készítményeket a betegek jól tolerálták, és az immunglobulinok kiürülés! ideje (turnovsr time) a keringésből 4 hét. A vizsgálatokban az ly.VIG, SS! immunmodniálő hatása meggyőzőnek mutatkozott (az adatokat a 3. példában mutatjuk be)

4* <

*0

Az XVXC-re vonatkozó indikációk főként hypo/agammaglobulinaemia, többek között általános változó immunhiány, 'Wi.skott~AIdrieh~szind.r6ma és súlyos kombinált immunhiány (SCID); szekunder hypQ'/agammagiobuiínaem.ia krónikus nyírokleukémiában $CLL> és myeloma multiplex-ben szenvedő betegekben, AIDS és bakteriális fertőzésekben szenvedd gyermekekben, akut és krónikus ismeretlen eredetű trombopéniás vérzékenység (TT?í, a-ilogén csontvelő átültetés (SMT)Kawasaki-kór és Guillan-Barré-szindróma.

őt-.Neurológia: krónikus gyulladásos demieli^ácíós poiineuropátia tClDP) , többgócos motorádecb neuropátia, •szklerőzis multiplex, Myasthenia Grav.is, Eaton-Lambert-szindróma, látóideg-gyulladás, epilepszia.

Nőgyógyászat: szokványos vetélés, primer antifoszfolipid szindróma,

Reumatológia raumatoíd erythematosus.

szisztémás arthritis, szisztémás lupus scleroderma, érgyul.ladás,

Wegner-féie granulomatosis,

Sjögren-szindroma, fiatalkori reumatoi-d arthritis. . / ís.yyy ív ?y

Hematológia: autoimmun. nautropénia,^v'hemolitikus .anémia,· neutropénia.

Gasztrointesztinális: Crohn-féle betegség, fekélyes vastagbé 1 gyulladásbaefeegá—betegség.

Más: asztma, szeptikus sokk szindróma, krónikus fáradtság szindróma, pszoriázis, toxikus sokk szindróma, oukörbe/ n' -top Ί. ád'gyfebd/ \ t e g s écf, * fe-uágfeWvs z 1 vi z om í bán tai ob , szí vbe 1 h á r t ya - g yu 11 a dá s, ateroszklerózis, AIDS-ben és bakteriális fertőzésben szenvedő felnőttek.

> *

Az ÍVIG termékekkel kívül számos súlyos autoimmun betegség, mely általában, kortikoszte.roid és immunazuppressziós terápiára reagál, szintén a találmány szerinti készítmény terápiás célbetegségeinek tekinthető. Ezek közé tartozik számos neurológiai betegség, például poiiraöiculltis, néhány immun-médiáit perifériás polineu.ropátía, valamint bizonyos krónikus gyulladásos reumás és érrendszeri megbetegedések, mint például a. kis erekre kiterjedő szisztémás érgyulladás, poiymyositis és mások.

A találmány szerinti készítmény egy másik hatásmódja lehet a fertőző ellenanyagok eltávolítása krónikus gyulladásokban és az IgG metabolizmus növelése.

A találmányt a továbbiakban nem korlátozó értelmű példákkal kívánjuk szemléltetni.

1.

Az (az S, végre) lobulin tisztítására vonatkozó eljárási lépések pés kivételével minden lépést 5±3 ®C-on hajtjuk munkatársai,

II. és Ili. Cohn-frakció pép késsifcése

Iltixi. Cohn-frakolő pépet humán plazmából állítjuk szokásos Cohn-frakeionálási módszerrel (Cohn E. és , Am. Chem. Soc., 45S-475 ílS46}J lényegében a

Eistler~B.it schmann-féle módosítással (Kistler P. és Mitschmann RS, hoz Sang, 7, 414-424 (1952)}. Az etanolos kicsapást a krioprecipitátum eltávolítása, és kívánt esetben . υ » <.· * φφχ Φ bizonyos plasmafehérjék (mint a IX faktor és az antitro-mbin) például ioncserélő anyagra, és/vagy Kapar in Sepharose® mátrixra való abszorbeálása után kezdjük meg.

A II-.IIZ frakció pép előállításához szükséges körülményeket (pH,, efcanoikoncentráció, hőmérséklet, fehérj'ekoncentráció·} a következő szakirodalmi helyen ismertetik: Harns ŰR (szerkesztő), Bicéd Sepsrati.cn and Piasma Fract íonation, 286. oldal, Wiley-liss, New York (1991) . A pépet szűrési, segédanyaq hozzáadása után szűröorsssei ízoláliuk.

2. lépés lója a 12 Φ 221. Cohn-frakcíó pépből kg szűrési segédanyagot (Schenfc., Németország) tartalmazó 140 kg II + III frakció pépből (mely mintegy 1150 kg kiindulási plazmamennyiségnek felel meg) extrakelőt hajtunk végre úgy, hogy először 525 kg 2,33 mM, pH - 4,0 nátríum-foszfát/aoetát puffért adunk hozzá lassú keverés közben mintegy 1,5 órán át, maid kétszer egymás után 350 kg injektálásra alkalmas vizet (MFI), és minden hozzáadás után mintegy 1,5 órán át keverjük. Végül mintegy 280 kg 21,5 mM, 7,0 nátrium-foszfát/nátrium-acetátot adunk hozzá, ily módon a szuszpenziő pH-ját 5,4-es értékre állítjuk be.

A szuszpenziöt rétegszűrőn (C-I50AF, Scnenk, Németország) szűrjük. A szőriét más fehérjék mellett immunglobulinokat tartalmaz.

pH > * * V* ** « * ··> # * * # 4 ** λ « · · -r * . *

5#* *Φ0 .#- W. X *40 *

3. lépés

A protein aggregátumok kicsapása és a vírusok eltávolítása PEG βΟΟΟ-rel

A 2. lépésben kapott -szűr lethez annyi PEG 6000~t (Merck, Németország) adunk, hogy végső koncentrációja 6 tömeg% legyen, 4 órán át tartó- kies-apás után a PEG szuszpenziöt egy centrifugán (W'estfalia 3KA28, Németország) centrifucárjuk, mig átlátszó nem- lesz, és rétegszürőn szűrjük (S01A és 90LA, Cuno, Franciaország), majd steril szűrést hajtunk végre egy 0,22 pm-es szűrőn (Durapore, Millipo-re, USA). A szűrt PEG felüiűszó pH-jst 5,7 értékre állítjuk be, ebhez 29 rész felülúszóhos 1 rész 0,45 M, pH « 5,' puffért adunk.

latriuís-acetí

4. lépés

Tisstitás kromatográfiás eljárással (X) anion- és katíoncserekét kromatográfiás oszlopot rendre 5S liter EEAE Sepharose FF® (Pharmacia Sioteeh, Svédország), illetve 56 liter CM Sepharose FF® (Pharmacia Sioteeh, Svédország) töltettel töltünk meg. Az oszlopokat sorba kapcsoljuk úgy, hogy a folvadékársm először a DSAE Sepharose avantán. maid a CM Sepharose gyantán haladjon át. Az oszlopba töltött gyantákat 15- mM. pH ~ 5,7 nátrium-aeetát. puf serrel ekvilibráljuk. Ezután a 3. lépésben kapott oldatot a sorba kötött oszlopokra visszük.

Az i-oncser-a-kromatográfia során a felvitt oldatban levő psdá őd' λ· .

^Λ· <;> <*··•ie^’szexnnyezcysíte feherj-ek a D£A£ Seoharosa gyantához kötődik.

Míg az	IgG a DEAE S
3 cU X. kJ kJ	kötődik a CM
folyik	rajta. Az ol<
O f Θ1 '9	•lö pufferrel

lopot lecsatoljuk a CM oszlopról. Ezután a CM oszlopot 3 ossloptérfogatnyi 15 mM, pH = 5,4 nátrium-acetát pufferrel mossuk, majd az IgG-t nátríum-klorid gradiens elúcíóva'l mossuk, a 15 mM, pH = 5,4 nátrium-acetát pufferben a nátrium-klorid koncentrációja 125 mM-töl 350 mM-íg változik. Az elvált IgG frakciót szorbitóiban gyűjtjük, a végső koncentráció 2,5 tömeg!.

Az IgG frakció oldósser/detergens (S/D> kezelés©

Az eluált IgG frakciót ultra/diaszűréssei sőtianitjuk és töményitjük mintegy 50 g IgG/1 koncentrációra. Poliszulfon membránt alkalmazunk, melynek névleges kritikus áteresztési tömege 30 kDa {Miliipore? . A diaszűrést 2,5 tömeg! szorbíto/t tartalmazó 15 mM, pH « 5,4 nátrium-acetát pufferrei .szemben végezzük, míg a vezetőképesség 1,4 mS/cm alá csökken. Az oldat IgG-tartalmát spektrofotometriásán határozzuk meg 280 nm-en (A_23Q) . A szerbit®^ koncentrációját 10 tomeg%-ra állítjuk he, és az oldatot egy 45 urn-ss szűrőn (Pali Corporation, Egyesült Királyság) szűrjük. Ezután Tveen 80-at és TNBP-t adunk hozzá I %,. illetve 0,3 tömeg! végső koncentrációban a kővetkező S/D kezeléshez. Az S/D kezelést legalább 6 órán. át végezzük 25 °C hőmérsékleten.

494

X-S

6. lépés

Ag S/D eltávolítása ioncsare-kromatográfiával (XX) liter DEAE-vel és 58 liter CM Sepharose FF-fel töltött két sorba kapcsolt oszlopot 15 mM, pH ~ 5,4 nátrium-acetáttal ekvilibrálunk. Az 5. lépésben kapott S/D-kezeit

IgG	frakciót 5	rész 15	mH, pH = 5,4 -a cet át pufferrel	H 7	Zy i t ~
ή J VA J'v f	re t ec szűr ö	n (Cuno	90 LA) átszűrjük, majd steril	sa	üres
a la	vetjük (Sa	rt eb ran,	Sartorius), és a két sorbak	apc	sóit
csal	opra vissz	ük fel.	Az ionesers-kromatográfiát	as	az

CgG elúciőját a CH oszlopról lényegében a 4. lépésben ismer* betett módon hajtjuk végre azzal a különbséggel, hogy a CM' oszlopot bőségesen mossuk az oszloptérfogat hatszorosának megfelelő mennyiségű pufferrel, az S/D kezelésben használt szerek eltávolítása érdekében. Az cinéit IgG frakciót maitőzban (Merek, Németország) gyűjtjük 2,5 törnegS végső koncentrációban..

7. lépés

Végső koncentráció beállításé és az immunglobulin formulázása intravénás alkalmazásra

A 6. lépésben kapott eluált IgG frakciót uitraszürésnek és sőmentesitésnek vetjük alá 2,5 tömeg% maltőzt tartalmazó 7,5 mH, pH - 5,4 nátrium-acetát pufferrel szemben történő diaszűréssel, amíg a vezetőképesség 1 mS/cm alá csökken. Poliszuifon membránt alkalmazunk, melynek névleges kritikus áteresztési tömege löö kDa, ezáltal a kisebb molekulatömeg·! fehérjéket elimlnáljuk. Az IgG végső koncentrációját 50 g/l-re állítjuk be, a maltóz végső koncentrációját pedig 10 vegyes%~ra. A mártózzál beállított végterméket steril szűrön (Sartopure GF 2, Sartorius) szűrjük, és aszeptikusán töltjük.

.'ü y

41* Φ φφφ

2. példa

A találmány szerinti eljárással kapott készítmény elei»· zésének eredményei más ÍVIG termékekkel összehasonlítva

	Gasasorsaziv	öctagam	Gammagard	IVXG, SSI
	líofillzált	folyadék	1. iofílizált	fo X y&o^r.fc
'v í ρ ? f t o? ,.5 £í	45, 4%/	99, 1%	94,6%	99,8%
	5S mg/ml:'	kis' mennyisé~ q β k	2 mg/ml4	.nem mutatha: tó 21 i
dimer-tártalom }	98,3%:i	98, 8%	99,8%;	99,3%
POtl i PÁÖ X* *S fc t·	0.815	1.. 6 %	<0,1%S	<Q . ;í'<·,
ACA	2 ö%	30%	4341	32%
FKA	<8,5 OS/mi	<8,3 HE/mi	<3,5 OS/ml.	<8 , 5 NE/ml
K s m a g 1 u 11 η 1 n .· Í3 %-os oldat
asti-A > 1:2	negatív	na gat: 1 v	negatív	negatív
anti-S >1:2	negatív	negatív	negatív	síígat ív
Fc~funkcló	189 %	121%	132%	178%
Alosztály el” OőS· 2X3.3'
IgGl	80,0%	51, 2%	87,7%	5 6,8%
IgG 2	35,3%	33,1%	27,2%	39, 4%
-:;;G2	3,5%	3, 6%	4,4%	2,6%
IgG 4	0,7%	1,4%	0, 8%	1,5%
IgA	2 . 26 mg/1	54,7 mg/1	0,85 mg/1	1,36 mg/1
igd	0.28 mg/1	39,1 mg/1	0,99 mg/1	0,16 mg/1
Twean 80	<20 ppm	<20 ppm	nss határestek mse	<20 ppm.
PEG	3,01 mg/ml	0,01 mg/ml	1,6 mg/ml*	0,02 mg/ml
pH	s, ?	5,7	8,7	S,8
Teljes fehérje kensantra cin	97 g/1	45 g/1	50 g/1	51 g/i
Máltás vagy glükóz	20 mg/ml	92 mg/ml	15 mg/ml	88 mg/ :::1

1: HSA-körrekeié nélkül

2; a gyártó által tejalantéta adat 3: a HSA-csúcsra korrigálva 4: stabillzálószerként alkalmazva.

Tisztaság (fehérje készítmény)

A gyógyszerkönyvi tisztasági követelmények szerint egy ÍVIG-készítménynek legalább 95 % IgG-tertalmúnak kell lennie, azaz nem lehet benne jelen 5 %-nál nagyobb mennyiségű nem-IgG szennyező fehérje, A tisztaságot számos okból nagyon nagy fontosságúnak tartják. Egy ésszerű nézőpontból csak a kívánt funkciót hordozó fehérjének kellene jelen lennie, és más szennyező fehérjék potenciálisan károsak lehetnek, például nemkívánatos hátrányos hatásokat okoznak és/vagy befolyásolják a készítmény stabilitását,

A tisztaságot például meghatározhatjuk elektroforetikus technikákkal az Európai Gyógyszerkönyv 1997. kiadásának 964-965. oldalán részletesen ismertetett módon, ahol a fehérjéket cellulóz acetát. gélen választják el. Gyakorlati célokra viszont agarőz gélt használnak. Eiektroforézis után a gélt fixálják, szárítják, és· megfestik, végül a fehérjesávokat szkenneléssel értékelik ki. A fenti táblázatból kitűnik, hogy a találmány szerinti készítmény gyakorlatilag tiszta

I Ó-·ί> κ ·χζ 1

S -.· ~·· y ο ,· ν

Aibmaín

AZ albumintartalmat lényegében a C. B, Lanreli (Anal Siochem., 10, 358-361 (1965)} szakirodalmi helyen ismertetett kereszt-ímmunelektroforézis módszerrel határoztuk meg, ο μΐ terméket vizsgáltunk snti-humánalbumin ellenanyagokkal szemben (DAmö A/S, Dánia, Aöööl (1/100)]. A nagy tisztaságnak köszönhetően a vizsgált találmány szerinti készítményben nem volt kimutatható mennyiségű albumín.

»χ <

IgG monomer- és dimer-tarbalom

As IgG monomerek és d íme rek mennyiségét gélpermeációs kromatográfiás módszerrel határozhatjuk meg, és a kromafogrémből a monomerek és dimerek csúcsa alatti területek integrálásával értékelhetjük, vő. : Európai Gyógyszerkönyv. A különböző vizsgálatok eredményeit a fenti táblázatban találjuk, melyből kitűnik, hogy a monomerek és címerek csúcsa alatti területek összege a kr.omatogram teljes területének 99,3 %-át teszi ki (ebből a monomer IgG 92 á-ot tesz ki) a találmány szerinti készítmény esetében.

Polimer- és aggregátum-tartalom.

A polimerek és aggregátumok jelenléte Ismerten súlyos hátrányos hatásokat okoz, gyakran influenza-szerű tünetekkel. A nagyon kíméletes előállítási eljárásnak köszönhető nagyon nagyfokú tisztaság miatt a találmány szerinti eljárással előállítható immunglobulin készítmény nagymértékben mentes polimerektől és aggregátumoktól.

A polimereket gélpermeációs kromatográfiás módszerrel határozhatjuk meg, és minden, a dimer IgG retenciós idejénél rövidebb retenciós idejű csúcsot polimer csúcsnak, tekintünk az Európai Gyógyszerkönyv leírásával Összhangban.

Az Európai Gyógyszerkönyv és más irányelvek szerint a fehérje aggregátum-tartalomnak előnyösen 3 % alattinak keli lennie. A találmány szerinti eljárással előállított termék nem tartalmaz mérhető mennyiségű aggregátumot, tehát ügy vesszük, hogy 0,1 t-nál kevesebb polimert és aggregátumot tartalmaz.

ΦΦΧ ΑΧ-β φ>Φ φφ X φ φφ

Anti-komplement aktivitás (ACA) és prékallikrein aktivátor aktivitás (FKA)

Az ACA és FKA aktivitásokat az Európai Gyógyszerkönyvben ismertetett módon határozzuk meg.

Az ACA-nak előnyösen a lehető legalacsonyabbnak kell lennie. As Európai Gyógyszerkönyv szerint a komplement fo-

gyas	te b cd. 2> χ i-ci K	% rór*- 0 .'hetet.
nie.	A taIáÍrnár	íy szer
ta a	zz mutatta	hogy
azaz	hasonló a	más ví

azaz hasonló a más vizsgáit termékekével. Megjegyezzük, hogy az albumin jelenléte a komplement fogyasztás elnyomása irányában hat (a feltaláló- .

Ha a PKA lényeges mértékben van jelen, alapvető a termék alacsony vérnyomást előidéző káros hatása tekintetében. Ezért a. PKA-nak s lehető legalacsonyabbnak kell lennie az immunglobulin termékben. Az Európai Gyógyszerkönyv szerint 3'5 NE/ml alatti értéknek keli lennie az Európai Gyógyszerkönyvben körvonalazott módon mérve. A találmány szerinti készítmény, illetve a más vizsgált készítmények pKa értéke kisebb, mint a módszer mennyiségi meghatározásának határa, azaz 3,5 HE/ml alatti.

rglutinínok

A plazma immunglobulinok IgM frakciója hemagglutininokát, azaz A és 3 vércsoport antigének elleni antitesteket tartalmaz. Az ilyen antitesteket jelenléte nemkívánatos hátrányos hatásokat okozhat a lehetséges hemolitikus- reakció miatt, ha a befogadó A és/vagy 8 vércsoportú.

·> «

-45A gyógyszer könyvi. követelményeknek megfelelően a hemagglutinln-tarcalomnak alacsonyabbnak kell lennie .annál, mint ami az A/'B eritrocitáfc aggintinációját okozná az Immunglobulin termek 1:54 arányú hígításával. Mindegyik vizsgált termék megfelel ennek a követelménynek.

Fc-fnnkció

A visszamaradt antigén-kötő aktivitás alapvető fontosságú ez ÍVIG biológiai funkcióihoz. Ez igaz az immunmodulálö aktivitásra ís, Másrészt viszont a visszamaradt Fc-funkcíó alapvető az ÍVIG különféle fagocita sejtekre és a komplement rendszer aktiválására gyakorolt hatása szempontjából is. Az Fc-fenkciőt különféle technikákkal kimutathatjuk, de az Európai Gyógyszerkönyv egy elfogadott módszere szerint az -ellenanyagok komplement aktiváló hatását a készítményben rubeola antigénnel szemben, mérjük. Az aktivitást egy biológiai referencia immunglobulin készítmény (BR?, Európai Gyógyszerkönyv) aktivitásához hasonlítjuk, a referencia készítmény aktivitását 100 %-nak tekintjük. A termék eleget tesz a vizsgálatnak, ha a relatív aktivitás a referencia készítmény aktivitásának több, mint 60 %-a. Úgy tűnik, hogy a találmány szerinti készítmény Fc-funkciója. nagyon jól. megmarad, különösen a más folyékony halmazállapotú vizsgált termékekkel -összehasonlítva, valószínűleg a kíméletes tisztítási eljárásnak köszönhetően.

As alosztályok eloszlása

Az IgG-alosztályok eloszlását az A. Ingáid (Scand J. Immunoi, 17., 41 (1983)] szakirodalmi helyen ismertetett szabványos Mancin! Ímmundiffúziós módszerrel határozzuk meg.

Φ Φ X Φ XX

Φ Φ Φ -SI

Φ* φ φφ

A koncentrációkat egy WHO referencia 32-érum 67/57; alkalmazásával határozzuk meg, Követelmény, hogy az. aicsrtályeloszlás a normál humán plazmakoncentráció tartományában legyen.

.agos koncentrációtartománvok 3,7 iűb'l / 1. 3 ΟλΘ rum, 1,1 - 5,9 g IgG2/i szérum, 0,15 - 1,3 g IgG3/i szérum

- 1,9

Τ'Λ.·?-· Λ /'* ΐ-ΰ'-ϊ^,' i szérum ÍR, Diuruo munnatarsar,

Stand J. Cián Zab levest, 48, 77 — 83}- így tehát minden vizsgált termék esetén elfogadható az alosztályok eloszlása.

IgA-tartalom

Az IgA jelenléte ismerten potenciálisan at IgA-hiányos befogadok szenzibilízálását okozza. Ha egy IgA-hiányos beteg IgA-tartalmű immunglobulin készítményt kap, az IgA idegen antigénnek tekinthető, melynek eredményeképpen az IgA ellen ellenanyag indukálódik a befogadóban. Amikor következő alkalommal IgA-tartalma készítményt kap infúzióval a beteg, anafHektikus reakció alakulhat ki. Tehát lényeges, hogy egy immunglobulin, készítmény a lehető legkisebb mennyiségben

A;

s A me η n vas e g et e q >

.Vib termeKten

ELlSA-eijárással ellenőrizhetjük, például ahol egy poliklonális anti-IgA-t használunk az IgA befogására, és jelzett anti-IgA-t használunk a kötött IgA detektálására. A standardokat egy hitelesített IgA-tartalommai rendelkező kaiibráiőoldat {Ko, X9Ö3, CAKÓ A/S, Dánia) hígításával készítjük.

Az 1, példában ismertetett eljárással előállított termék kevesebb, mint 2 mg IgA/1-t tartalmaz, amely jelentősen alacsonyabb IgA-tartalom, mint a más vizsgált folyékony halmazáliaootu termékeké. Az IgG és IqA közötti fizikai-kémiai ha* · » » * φ * .·' *7' φ χ * » **' ί *** Φ X Φ 4 «φφ ΦΦΦ φφ «φ* , sonlóságok megnehezítik ezeknek az immunglobulinoknak ez elválasztását a tisztítási folyamatban, viszont V'két enion/kafioncsere-kromatográfiás lépés az eljárásban nagyon alacsony szintre csökkenti az TgA-tartaimat.

Egy ig készítmény IgK-tartaimát ELISA-eljéréssel határozhatjuk meg, például ahol egy poli klónális enti-igM-et használunk az IgM befogására, és egy jelzett anti-IgF-et használunk detektálásra. A standardokat egy hitelesített IgM-tsrtalommal rendelkező kaiíbráióoldat í/to, Χ9Ό8, DAKO A/S, Dánia) hígításával készítjük. A táblázatból kitűnik, hogy a találmány szerinti készítmény IgM-tartalma nagyon alacsony, határozottan alacsonyabb, mint más folyékony halmazállapotú termékeké.

Tween 80, WBP és PEG

A Tween SÖ, THBP és EEG meghatározását szokásos eljárásokkal végezzük. Általában ezen adalékok koncentrációjának a lehető legaiacsonyabbnak kell lennie.

A vizsgáit folyékony halmazállapotú termékek sa· vas, mintegy 5,6-5,1-es érték, míg a vizsgált líofilizáit termékeké oldás után semleges, pH ~ 6,7.

Teljes fehérjekoncentráció

Az Európai	Gyógyszerkönyv szerint	a	fehérjekoncentrá-
ciénak legalább	50 g/i ± 10 %-nak kell	1 ·»π·λ si. üii	í e ? mi neen te rmék
me c felei e ηne k	a követelménynek. A	f eh	érj ekoncéntrációt
Kjeldahl-mődszer	tel mérjük.

·* ♦ *X »'Κ· fefe fefe fefe fe fe X fe fe fe _ Λ G * * fefefe fe X* *-‘i G * fe fe fe fe fe •fefe «XX Jfe* fefe* fe fefe

Maitóg és glükóz st&bilizátorok

A szacharidok általánosan használt stabiiizátorok immunglobulin termékekben, jó stabilizáló tulajdonságaik vannak és gyorsan kiválasztódnak. A m.altóz~, szacharóz- és glükóztartalmat egy kereskedelemben kapható kit alkalmazásával határozzuk meg (Boehringer Mannheim, Németország). Referenciaként maitőzt használunk.

Kitűnik, hogy a két albumínnal, valamint albuminnal és REG-vei stabilizált liofilizált termék szintén tartalmaz szacharid stabil!sátort mintegy 15 mg/ml - 20 mg/ml koncentrációban. A találmány szerinti termék és a másik folyékony halmazállapotú termék nagyon hasonlóan stabilizált, azaz mintegy 9 %, 88 mg/ml és 92 mg/ml maltózzal. Ha a polimeréé aggregátumtartalmat a stabilitás paramétereként tekintjük, a találmány szerinti készítmény nagyobb stabilitású, mint a másik vizsgáit folyékony halmazállapotú készítmény, bár a megjelenési formájuk nagyon hasonlónak tűnik.

3. példa

A klinikai vizsgálatok eredményei .A találmány szerinti termék - melyre ÍVIG, illetve SSI néven is hivatkozunk - klinikai vizsgálatait az XCH és a CRMP/38S/95 irányelveknek megfelelően végezzük.

Vizsgáltuk a farmakokinetikát, a hatást és a biztonságot. A klinikai vizsgálatok eddig, négy csoport betegre terjedtek ki; primer immunhiányos szindrómában szenvedő betegek (15 beteg), szekunder immunhiányos szindrómában szenvedd betegek (6 beteg), ismeretien eredetű trombopéniás vérzékenységben szenvedő betegek (15 beteg) és krónikus gyulladásos »χ

demielinálő poiineuropát.iában szenvedő betegek (5 beteg; csoportjain.

A primer immunhiányos szindrómában vagy szekunder immunhiányos szindrómában szenvedő betegeket 0,2-0,4 g/kg dózissal kezeltük 2-5 hetes időközönként. Az ismeretien eredetű trombopéniás vérzékenységben, szenvedő betegeket 400 mg/kg dózissal kezeltük naponta 5 napon keresztül, vagy 1000 mg/kg dózissal naponta 2 napon át.

A biztonságosság vizsgálatához minden betegben meghatároztuk a szérum-transzaminázokat, a szérum-kreatinint és a vírus markereket, öt ismeretien eredetű trombopéniás vérzékenységben szenvedő beteget kisértünk figyelemmel vírus, vese- és máj-biztonsági markerek szempontjából összesen 24 hétig bezárólag.

Farmakokinetika

A felezési időre átlagosan 30,5 napot mertünk. Ez egyezik a más ÍVIG gyógyszerekre kapott eredményekkel.

Hatás

A primer és szekunder immunhiányos' szindrómában szenvedő betegeknél egy 6 hónapos periódusra, visszamenőleg feljegyeztük a betegséggel és kórházi ápolással elvesztegetett napokat, sz antibiotikumos kezeléssel járó napokat, a lázzal járó napokat és a tüdőgyulladások számát olyan betegeknél, akiket más bejegyzett ÍVIG gyógyszerrel kezeitek. A következő 5 hónapban, amikoris a betegeket folyékony halmazállapotú immunglobulin SSI-vel kezeltük, ugyanezeket a paramétereket regisztráltuk.

Of ♦ »* V* φφ,Χ φ φ»

Arra a következtetésre jutottunk,, hogy a folyékony halmazállapotú immunglobulin SSI ugyanolyan hatásos, mint más ÍVIG készítmények primer és szekunder immunhiányos betegségben szenvedd betegeknél fertőzések profiiaxiss/meuelőzése szempontjából.

Az ismeretlen eredetű trombopéniás vérzékenységben szenvedő betegek 80 %-ánál a vérlemezkék száma a folyékony halmazállapotú immunglobulin SSX-vel való kezelés előtti 30 x leVl értékről a kezelés utánra több mint 50 x 10⁵/I-re emelkedett. A vérlemezkék számának növekedése és a beteg átmeneti javulásának időtartama ugyanolyan szinten volt, mint ugyanilyen dózisban vett más ÍVIG gyógyszerrel való kezelés után abban az esetekben, ahol az összehasonlítás lehetséges volt. Az egyik, IVIG-t először kapó beteg ellenálló volt a vizsgálandó gyógyszerrel szemben. Ilyen reakció az IVIG-vel szemben nem ritka, így nem meglepő. A vérlemezkék számának növekedésének és a növekedés időtartamának részletes vizsgálatai folyamatban vannak.

Arra a következtetésre jutottunk, hogy a folyékony halmazállapotú immunglobulin SSI ugyanolyan hatásos, mint más ÍVIG gyógyszerek az alacsony vériemezke-szám kezelésére krónikus ismeretien eredetű trombopéniás vérzékenységben szenvedő betegeknél.

Klinikusok és a krónikus gyulladásos demieiináló polineuropátíában szenvedő betegek szerint az ÍVIG, SSI. ugyanolyan hatékonyságot mutatott, mint a vizsgálat előtt beadott ÍVIG. Az ÍVIG, SSI-t a betegek ugyanolyan jól tolerálták, mint más ÍVIG termékeket.

φ φ

Biztonság

Egyetlen súlyos kedvezőtlen eseményen, egy iépeltávoiíVason kívül, mely a kutató szerint nem áll kapcsolatban a vizsgálandó gyógyszerrel, csak kisebb káros hatásokat jegyeztünk fel. Ezek a káros hatások főként fejfájás, láz és hányás. Eddig még nem számoltak be abnormális életjelekről az ÍVIG, ESI infúziója közben. Vírusos szerokonverzióról nem számoltak be. Kern számoltak be vese vagy máj károsodásokról vagy an.afilaktíkus sokkról sem,

A klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a folyékony halmazállapotú immunglobulin ESI jól tolerálható. A mellékhatások gyakorisága, mértéke és fajtája nem tér el más ÍVIG termékeknél tapasztaltaktól.

A folyékony ÍVIG stabilitási vizsgálatának eredményei A folyékony ÍVIG termék stabilitásának vizsgálatához egy valós idő, valós körülmények” stabilitási vizsgálatot hajtottunk végre, összesen 4 egymást követő sorozat (250 mi mindegyik mintából) ÍVIG termék szerepelt a vizsgálatban, ezeket 2 °C - 8 °C hőmérsékleten tároltuk legalább 12 hónapig sarzsből vett mintákat elemeztük a 0 időpontban, δ hónapos tárolás után, majd 12 hónap tárolás után, A vizsgálat eredményeit a 4. saras átlagaként az alábbi táblázat foglalja össze.

•X 4 »* -χ-Χ ’♦·>.

** ♦ * 4 4 X 4 Φ χ

Φ * X Λ 0 φ Φ-ί * * Φ* 4 4

Φ«Φ *« Φφ*·* * X*

	ö hónap tárolás után	δ hónap tárolás után	12 hónap tárolás után
Külső	kissé opálos és színtelen	kissé opálos és színtelen	kissé opálos és színtelen
Polimerek t a g g r e g á t. umo k	100 %	99,6 %	-0 ··”' c. a.7 '</ f '5
ACA	39,7 %	38,2 A	n’7 -7 £ ' χ χ- · 7
?KA	<3,5 NE/ml	<8,5 51,ni	<8,5 ΝΈ/ml
Fc-funkció	107 %	113 %	Ili %
Alosztály eloszlás
IgGl	59,2 %	57,7 %	57,1 %
loG2	36,4 %	33, 1 %	38,6 3
IgG 3	2,7 %	2,6 %	2,5 %
. IgG4	1,3 %	1,6 %	1,7 %
pH	5,5	5,5	5,5
Fehérje összetétel (IgG A)	99,S %	99,7 %	99,1 %
Teljes fehérje koncentráció	49,8 g/1	4 3,3 g/1	4 9,2 g/1
Ozmolalitás	348 mOsm/kg	347 mOsm/kg	350 mOsm/kg

Mindegyik említett vizsgálatot az Európai Gyógyszerkönyvvel. összhangban végeztük el, ahogyan ezt a 2, példában elmondtuk.

Az a megfigyelés, hogy a monomer- és dímertsrtalom 12 hónapon át állandó·, azt mutatja, hogy a mintában nem képződtek polimerek. Az immunglobulin polimerek jelenléte közismerten többek között súlyos hátrányos hatásokat okoz,

Sr 9<t 94 *« *4 * * 4 β * X

-53- ί X ϋ η Ζ\ *» 4 4 4 X *» ΌΧ·' 4 «* gyakran, influenza-szerű tünetekkel. A találmány szerinti eljárással előállított immunglobulin termek nagy stabilitása miatt még hosszú tárolási idő után is jóformán mentes polimerektől és aggregátumoktól.

Az AGA. növekedését sem figyeltük meg az Idővel, bár a magas ACA-t mutató sarzsokat szándékosan vettük bele a stabilitási vizsgálatba. Ha az ACA növekedését láttuk volna, ez azt jelezhetné, hogy a tárolás alatt aggregátumok képződtek. Tehát az időben konstans ACA azt jelzi, hogy nem képződnek agg regétűrne k.

Az eredmények továbbá azt is jelzik, hogy a termék tárolása közben nem alakúit ki prskallikrein aktivátor hatás, mivel a PKA aktivitás nem növekszik. Megjegyezzük viszont, hogy a mért értékek a mennyiségi meghatározási határ alatt varrnak..

Az Fe~ funkció mérése azt mutatja:, hogy az érintetlen funkcionális IgG jelenléte fennmarad a tárolás során. Tehát a mintában nincsenek jelen proteázok, mivel ezek lebontották volna a. fehérjéket, ezáltal csökkentették volna az Fc~funkoiöt. Az IgG molekulák denaturálása sem következett be, mivel ez az antígén-kötö aktivitás csökkenésével, járt voIna.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a különféle IgG alosztályok stabilitása között különbségek lehetnek. Az eredményekből látszik, hogy minden alosztály megmaradt a tárolás során, ami azt jelzi, hogy a termék stabil, Ezt alátámasztja az a felismerés is, hogy az IgG mintákban a fehérjeösszetétel körülbelül ugyanazzal a teljes fehérjekoncentrá(

V ♦ ‘•'-φ ·«·* 4»

Φ φ φ φ φ >· Φ φ Φ Φ # < ΦΦΦ φ » X ♦ Φ Φ φ

ΦΦΐί· *Φ «.-:·' Φ ** ciövai ienyegeoer nincs általános termék stabil és hőmérsékleten a ezáltal bemutatta ι változatlan az időben, ami azt jelzi, hogj IgG degradáció. Tehát a találmány szerinte : legalább 12 hónapon át eltartható 2-8 °C jellemzők szignifikáns változása nélkül;

ik a hatékonyságot és a biztonságot.

Validéit, vzruscsökksntö lépések áz ÍVIG előállítási elViruseltávolítás elválasztási lépéssel

A találmány szerinti immunglobulin oldatban jelenlévő vírusok kicsapását polietílén-glikol vírus validáiásí vizsgálatban határoztuk meg két nem-burkolt vírus alkalmazásával; a következő virusosökkenést kaptuk;

6,3 lóg io Hepatitis A vírus (HAV) eltávolítása

7,2 logio Polio vírus eltávolítása

A. vírus validálási vizsgálatokat elvégeztük két, burkolattal rendelkező vírus alkalmazásával, és a következő vírus-csökkenést figyeltük, meg;

7,6 logra HÍV vírus eltávolítása

7,5 lóg io- BVDV eltávolítása.

Vírus inaktiválás 3/D kezelési lépésben Az immunglobulin- oldatot 1 ! Tween 80 t 0,3 % TMSP-ve’:

kezeltük 25 ’⁵C~on több mint 6 órán át. A vírus validálás; vizsgálatokat két, burokkal rendelkező vírus alkalmazásévá; hajtottuk végre, az alábbi vírus csökkenést figyeltük meg:

7,4 looio HÍV inaktiválása

XX· <x fc 'V' <t «

5,3 iog.y Sindbis vírus inaktiválása

4 z x io-gio	SVDV inaktiválása
u γ X x OCJ; 0	PRV inaktiválása.
1) cr -r λ -r;x rv Kz >»Z -X> ÍAA ·«« V»· V-· A A	8 validálási vizsgala	tót	végeztünk el a talál
X; r; y */ y γ yj.f·	eljárás két különbőz	ő lé;	zésében. A PEG kiosa
pasi lépést 4	különböző vírus (két	kis,	burokkal nem rendel
kező vírus: id	kV és Polio vírus, és		burkolattal rendelke
tő vírus: HÍV	és BVüV vírus - min	t a i	iepatitis C vírus mo
delije) aikali	aazásával végeztük el	. A v	izsgáiatok azt mutat

ták, hogy a vírusokat a PSG kicsapással hatékonyan eltávolítót tűk. A PEG kicsapás1 lépést ezért bizonyítottan hatásos víruseltávolítási lépésnek tekintjük. Az S/D kezelést négy különböző, burokkal. rendelkező vírus alkalmazásával valitíáltuk. A validálási vizsgálatokra kapott eredményekből kitűnik, hogy az S/S kezelési lépes hatékonyan inaktíváija mind a négy vírust. Az. S/D lépés tehát igazoltan egy hatásos víruseltávolítási lépés. Mindkét viruscsökkentési lépés, azaz a PEG kicsapással történd víruseltávolítás és az S/D kezeléssel történő inaktiválás igazoltan hatékony négy különböző vírus eltávolításának és inaktiválásának tekintetében, A HÍV és BVDV kumulatív redukciós faktorai az eljárásban rendre 15 és 11,6. Ezzel a találmány szerinti eljárása; előállított készítményt vírus-biztosnak tekintjük.

Claims (20)

1. Sljá rás immunglobulin G (IgG) nyers, immunglobulintartalmú plazmafehérje~frskciöböl való tisztítására, azzal jellemezve, hogy:

(a) a nyers immunglobulin tartalmú plazmafehérje-frakcióbói vizes szuszpenzíőt készítünk;

(fe) 5000-0000 Da moiekulatömegü polietilénglikolt (PEG) adunk az (a) lépésben előállított szuszpenzíöhoz 3-15 tömsg% mennyiségben, ezáltal egy szilárd csapadék és egy folyékony .fe.lülösz.0 keverékét hozzuk létre;

(c) a (b) lépésben kapott elegyből. a tisztított, immunglobulin G-tartalmú felülúszót visszanyerjük;

(dj a (c) lépésben kapott tisztított immunglobulin G-tartalmú felülúszot anioncserélő gyantára, majd ezt követően kationcseréld gyantára visszük, ahol az anion-cserekromatográf iához és a kationcsere-kromatográfiához ugyanazt a puffért használjuk, és e puffer pH-értéke 6,0 alatti;

te) a (d) lépés szerinti kationeserélö gyantából kimossuk a szennyezd fehérjéket és a kicsapódott fehérjéket egy nátrium-acetát pufferrei, melynek nátrium-acetát koncentrációja 5-25 mM, pH-ja 5,0-6,0 és vezetőképessége 1,0-1,( mS/cm;

(f) az (e)lépés szerinti kationeserélö gyantáról az immunglobulin G-t eluáijuk nátrium-aoetát pufferrei, melynek nátrium-acetát koncentrációja 5-40 mé, pH-értéke 5,0-6,0 x « « «« X « «

u. y * x « »«« « <' X X ♦♦ X x x X ♦ s ♦ ♦« « xx » « és nátrium-kloríd koncentrációja 50-500 ezáltal egy immunglobulin G-tartalmú eluátumot kapunk.;

(g5 az (£0 lépében kapott immunglobulin G-tartaimü eluátumot dia/ultraszürésnek vetjük alá az eiuátum koncentrálása és/vagy dialízise céljából, és adott esetben stabilizálószert adunk hozzá;

(h) a (g) lépésben kapott dia/oltrészért és adott esetben stabilizált immunglobulin G~tartalmú frakcióhoz oldószert és/vagy detergenst adunk vírus-biztos immunglobulin G-tartaimű oldat előállítása céljából;

(1) a ih) lépésben kapott immunglobulin G-tartalmú oldatot anion.eseréiő gyantára, majd ezt kővetően kát Ioncserélőgyantára visszük fel;

(ji az fii lépésben szereplő kationcserélő gyantát nátrium-a-cetát pufferrel mossuk, melynek nátrium-aeetát koncentrációja 5,25 md, pH-értéke 5,0-6,0 és vezető képessége 1,0-1,4 mS/cm;

(k) a íj) lépésben szereplő kationcserélő gyantáról az immunglobulin G-t eluáljuk egy nátrium-aeetát pufferrel, melynek nátrium-aeetát koncentrációja 5-40 raM, pH~é.rtéke 5,0-6,0 se nátrium-kloríd koncentrációja 50-500 mik, ezáltal egy immunglobulin G-tartaimú eluátumot kapunk; és ί1) a ík} lépésben kapott immunglobulin G-tartalmú eluátumot dia/uitraszürésnek vetjük alá az ionerősség csökkentése és az immunglobulin G koncentrálása céljából, és szaeha™ ríd hozzáadása utján beállítjuk az ozmolaiitást 5-15 % végső koncentrációra.

«-««» « < * κ ♦ * ·'·- -» «♦

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunglobulin G-tartaimű plazmafehérjefrakciót IT. üohn-frakció; II. és Ili. Cohn-frakció; valamint I., Ii. és Ili. Cchn-frakció közül választjuk meg.

3. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aj lépésben a szuszpenziót 0 és 12°C közötti hőmérsékleten tartjuk, és az a) lépésben a szuszpenziöt 6-os pH-érték alatt tartjuk.

4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a poiietüén-glikölt PEG 3350, PEG 4COO, PEG 5000 és PSG 6000 közül választjuk meg.

5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a íd) és/vagy (i) lépésben as aníoncserélö és a kationcseréio gyantát sorba kötjük.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aníoncsere-kromatcgráfiához és a kationesere-kromafcogréfiához ugyanazt a puffért használjuk, és e puffer pH-értéke 6,0 alatti.

7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a íd) és/vagy íi) lépésben az aníoncserélö gyanta dietilaminoetii-osoportckat tartalmaz, és a (d) és/vagy íi) lépésben a kationcseréio gyanta karbonímetil-osoportokat tartalmaz; a gyanták előnyösen DEAE Sepharose FF^tó; és Cd Sepharose FF*,

0, Az előzd igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (bj - (1) lépesekben acetát59 » Φ X ΧΦΦΦ Φ Φ Φ *

9 Φ Φ Φ * * Φ Φ

Φ X Κ φ φ Φφφ Φ φ φφ« ν X Φ Φ Φ » Φ

Φ * * * ΦΦ Φ X puffért használunk, célszerűen 5,0-6.,0 pH-értékü és 5-25 mM moiaritású acetát puffért.

9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (h) lépésben az oldószer és/vagy detergens legalább egy nem denaturáló detergens és legalább egy tri(rövid szénláncú alkil)-foszfát oldószer keveréke .

10. 2,5-200 g IgG/1 koncentrációj3 immunglobulin termék, amely előállítható az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárással.

11. 2,5-200 g IgG/1 koncentrációjú immunglobulin termék, amely előállítható az 5-7, igénypontok bármelyike szerinti eljárássál,

12. Immunglobulin termék, melyre jellemző:

a) tisztasága 98 3-nál nagyobb,

b) az IgG monomer- és dimertartalma 98,5 i-n.ál nagyobb,

c) az IgA-tartalma 4 mg IgA/i-nél kisebb és

d) Igei, IgG2, lgG3 és lgG4-tartaIom,

13. A 12. igénypont szerinte immunglobulin termék, mely nem tartalmaz detergenst, FEG-t vagy albumínt stabilizálószerként, '

14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti immunglobulin termék, mely 3 mg/l-néi kevesebb IgA-t tartalmaz.

15, Ά 12-14, igénypontok bármelyike szerinti immunglobulin termék, mely 55-65 5 IgGl-et, 33-10 3 IgGz-t, 2-5 % IgG3~at és 1-4 % IgG4-et tartalmaz.

16. A 12-15* igénypontok bármelyike szerinti imtiurigiobuiín termék, mely 0,5 %-nál kevesebb -polimert és aggregátumot tartalmaz.

17. A 12-16. igénypontok bármelyike szerinti folyékony immunglobulin, termék*

18. A 12-17. igénypontok' bármelyike szerinti immunglobulin termék közvetlen intravénás beadásra.

19. A 12-18. igénypontok bármelyike szerinti immunglobulin termék gyógyszerként, történő alkalmazásra.

20. A 12-19. igénypontok bármelyike szerinti Immunglobulin termék alkalmazása emlősökben primer ímmunhíány (PID), szekunder ímmunhiány (SÍD),· ismeretlen eredetű trombopéniás vérzékenység (ITP), polyradic-ulitis, perifériás po-lineuropátia, Kawasaki-kör, polymyos-itis, súlyos krónikus autoimmun betegségek, krónikus gyulladásos demielinizációs poüneuropátié (CIDP) , többgócos- motoros neuropá.tis, szklerózis multiplex, Myasthenia Gravis, Eaton-Lambert-szindróma, látóideg-gyulladás, -epilepszia, szokványos vetélés, primer antifoszfoiipld szindróma, reumatoid arthritis-, szisztémás lupus erythematosus, szisztémás scleroderma, é-rgyulladás, Wegner-féle granulomatosís, Sjögren-szindróma, fiatalkori reumatoid arthritis, autoimmun neutropénia, autoimmun hemolitikus anémia, neutropénia, Crohn-féle betegség, fékélyes vastagbélgyulladás, coliákia, asztma, szeptikus sokk szindróma, krónikus fáradtság szindróma, p-szcriázis, toxikus sokk szindróma, cukorbetegség, arcüreggyulladás, tágulásos. sz-ívi zombántolom, szivbelhártya-gyulladás, at orosz ki erózis, felnőttkori AIDS és bakteriális fertőzések kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására.

21. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az emlős ember