CN104356231B - 一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法。免疫球蛋白提纯工艺中降低多聚体，十分必要。目前公开报道能去除人免疫球蛋白多聚体的方法有聚乙二醇法和柱层析法，但这两种方法存在添加物难以去除、处理量小、设备昂贵的问题，推广应用较困难。本发明利用辛酸钠沉淀法，选取在溶液pH值5.4,辛酸盐浓度6‑8mmol/L的条件下，沉淀去除IgG多聚体，能够有效地去除多聚体60%以上，使多聚体降低到3%以下，免疫蛋白的损失甚微，多聚体含量稳定，放置2年后仍可以达到《中国药典》和国外相关药典的要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法。
背景技术
免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质，分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。经输注后，能迅速提高受者血液中的IgG水平，增强机体的抗感染能力和免疫调节功能。现公开报道人免疫球蛋白提取方法大都采用E.J.Cohn教授创立的低温乙醇分级沉淀技术，或在Cohn氏工艺分级基础上结合一步或多步离子交换层系统，或结合辛酸沉淀-层析达到提纯而成；病毒灭活方法大都采用经典的巴氏灭活法、有机溶剂法、低pH孵放法等。但无论采用哪种方法，在制备过程由于乙醇的作用，或加热等步骤等影响，都会产生多聚体。IgG多聚体为C1q提供两个以上的结合位点，在没有结合抗原的情况下，激活了补体造成补体的消耗，使机体的免疫防御能力下降。同时，由于补体系统的激活，产生大量过敏毒素、过敏介质，引起炎症反应，从而引起少数患者出现不良反应，头疼、潮红、恶心、休克等症状，所以产品中多聚体含量的多少决定了免疫球蛋白的质量。为此在各国药典中，人免疫球蛋白明确规定了多聚体的含量要求:
*:中国药典中仅规定了单体及二聚体的含量。
英国药典2007版、欧洲药典8.0版中，人免疫球蛋白中多聚体含量要求小于10%，静注人免疫球蛋白（pH4）不高于3%。而现行的中国药典中仅规定了单体及二聚体的要求与发达国家相比还有一定的差距。而稳定考察的数据表明，若多聚体含量小于3.0%，在以后的储存中，多聚体的增加很缓慢，在有效期内一直处于稳定的状态。
因而在免疫球蛋白提纯工艺中降低多聚体，显得十分迫切。经检索文献，目前公开报道能去除人免疫球蛋白多聚体的方法有聚乙二醇法和柱层析法，这两种方法都能降低多聚体的含量，但这两种方法存在添加物难以去除、处理量小、设备昂贵的问题，推广应用较困难。而本发明所使用设备简单，几乎无费用增加，添加物辛酸钠的去除方便彻底，更易推广和应用。目前公开发表的静注人免疫球蛋白分离方法中，与采用辛酸钠沉淀有关的专利（CN95109051.8、CN201210041098、CN201210071691、CN201110174857.1）多用在FII沉淀的粗制过程中，即用来去除FII加FIII中的FIII，而没有在精制过程中采用辛酸钠降低人免疫球蛋白中多聚体的报道。为此申请人经过很多实验，发明了一种采用辛酸钠沉淀法去除人免疫球蛋白多聚体的方法，该方法能够有效降低多聚体含量，而且蛋白质损失小，是一种十分有意义的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法，利用辛酸钠沉淀法去除人免疫球蛋白多聚体，有效降低人免疫球蛋白多聚体的含量，克服传统方法所存在的不足。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
（1）FII溶解后的蛋白液，或巴氏灭活后蛋白液经超滤透析后的蛋白液，调整蛋白液蛋白质含量4～7g/L，调整溶液pH值5.35～5.55；
（2）加入1mol/L的辛酸钠使最终辛酸钠含量达到6～8mmol/L，加入速度10～15L/h，加毕搅拌4小时以上, 复测溶液pH值为5.35～5.55，否则用pH4.0醋酸缓冲液调整至该范围中，温度控制在15～25℃；
（3）静置2小时后压滤分离沉淀，收集上清液，进行超滤透析即为原液，稀释配制后除菌分装。
采取上述措施的本发明，经过多次试验，选取最佳参数：辛酸钠浓度6～8mmol/LpH值：5.35～5.55。本发明采用辛酸盐沉淀法，不需要增加额外的设备，耗能少。通过调整辛酸盐浓度，溶液pH值等参数，能使多聚体降低到3%以下，并且产品在储存条件下放置，多聚体含量稳定，放置2年后仍可以达到《中国药典》和国外相关药典的要求，而蛋白质损失仅在8%以下，究其原因在于溶液pH值远离免疫球蛋白等电点7.0，而辛酸钠浓度，溶液pH值在多聚体和蛋白损失之间做动态平衡。
具体实施方式
实施例1
1. 将FII溶解液，经超滤脱醇后调整蛋白液蛋白质含量4～7g/L，调整溶液pH值5.35～5.55。
2. 加入1mol/L的辛酸钠使最终辛酸钠含量达到6～8mmol/L，加入速度10～15L/h，毕搅拌4小时以上,复测溶液pH值为5.35～5.55，否则用pH4.0醋酸缓冲液调整至该范围中。温度控制在15～25℃。
3. 用7mmol/L辛酸钠平衡液（含辛酸钠7mmol/L、氯化钠：1.25g/L、pH5.35～5.55，温度15℃～25.0℃）400～600L，加硅藻土4Kg对压滤机上滤板循环清洗，清洗后压滤，出液温度10℃～15℃。压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板30～40分钟。用7mmol/L的辛酸钠平衡液400～600L清洗滤板1～2次，回收洗液稀释制品。收集上清，沉淀弃。
4．超滤脱盐，将压滤液用3～4倍2～8℃注射用水连续等体积透析，浓缩至蛋白浓度60～80g/L。进行原液检定、稀释配制后除菌分装。
去除多聚体的效果：
| 步骤 | 实施例1 | 未增加去除多聚体步骤 |
| 脱醇后蛋白液多聚体含量（%） | 6.11% | 6.11% |
| 压滤后多聚体含量（%） | 1.61% | / |
| 成品多聚体含量（%） | 1.63% | 6.72% |
| 人免疫球蛋白收率（g/㎏FII） | 213 | 230 |
实施例2
1. 将巴氏灭活后蛋白液，用2～8℃注射用水连续等体积透析至电导率100μs/cm2以下，蛋白含量浓缩至10g/L。 调整蛋白液蛋白质含量4～7g/L，用pH4.0醋酸缓冲液或0.5mol/L氢氧化钠调整溶液pH值5.35～5.55。
2. 以下同实施例1中2,3,4步骤。
| 步骤 | 实施例1 | 未增加去除多聚体步骤 |
| 脱醇后蛋白液多聚体含量（%） | 9.43% | 9.43% |
| 压滤后多聚体含量（%） | 2.73% | / |
| 成品多聚体含量（%） | 2.74% | 10.11% |
| 人免疫球蛋白收率（g/㎏FII） | 206 | 219 |
实施例3
把样品置于2-8℃环境中放置，测定其多聚体数据，测量方法采用《中国药典》三部2010年版附录VI R 人免疫球蛋白类制品单体加二聚体测定法，结果如下：
| 时间 | 样品1 | 样品2 |
| 0月 | 1.63% | 2.74% |
| 3月 | 1.62% | 2.74% |
| 6月 | 1.68% | 2.76% |
| 9月 | 1.71% | 2.80% |
| 12月 | 1.77% | 2.78% |
| 24月 | 1.85% | 2.79% |
由上述留样测定可知，本发明方法所得产品，样品质量稳定，多聚体含量稳定。
Claims (1)
1.一种有效去除人免疫球蛋白多聚体的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）调整蛋白液蛋白质含量4～7g/L，调整溶液pH值5.35～5.55；
（2）加入辛酸钠溶液，使辛酸钠最终含量达到6～8mmol/L，加入速度10～15L/h，加毕搅拌4小时以上, 复测溶液pH值为5.35～5.55，否则用pH4.0醋酸缓冲液调整至该范围内，温度控制在15～25℃；
（3）静置2小时后压滤分离沉淀，收集上清液，进行超滤透析即为原液，稀释配制后除菌分装；
步骤（1）所述的蛋白液，为FII沉淀经溶解后或巴氏灭活后的蛋白液经超滤透析后的溶液；
步骤（2）所述的辛酸钠溶液为浓度为1mol/L的水溶液。
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