RU2094462C1 - Моноклональный иммуноглобулин человека класса iggi против антигена d системы резус - Google Patents
Моноклональный иммуноглобулин человека класса iggi против антигена d системы резус Download PDFInfo
- Publication number
- RU2094462C1 RU2094462C1 RU95119268A RU95119268A RU2094462C1 RU 2094462 C1 RU2094462 C1 RU 2094462C1 RU 95119268 A RU95119268 A RU 95119268A RU 95119268 A RU95119268 A RU 95119268A RU 2094462 C1 RU2094462 C1 RU 2094462C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- antibodies
- antigen
- raised
- class
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: медицинская биотехнология, разработка препаратов для предотвращения гемолитической болезни новорожденных. Сущность изобретения: получение моноклонального иммуноглобулина человека к антигену D системы резус. Иммуноглобулин получают при использовании стабильной гетерогибридомы HG-92 типа человек - мышь. Доза геммуноглобулина, равная 150 мкг, достаточна для лизиса 8 мл резус - положительных эритроцитов.
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для предотвращения сенсибилизации резус-отрицательных женщин резус-положительными эритроцитами плода во время беременности и после родов, т.е. для профилактики гемолитической болезни новорожденных (ГБН). В основе препарата лежат высокоочищенные моноклональные человеческие антитела класса IgGl, продуцируемые бессмертной гетерогибридомой. Антитела при введении их внутримышечно или внутривенно резус-отрицательной женщине в течение 24-72 ч после родов вызывают быстрый клиренс резус-положительных эритроцитов ребенка, которые в количестве 0,2 5 мл попадают в кровь матери при отделении плаценты и могут вызвать образование иммунных антител. Тот же препарат используется и у резус-отрицательных пациентов при переливании им тромбоцитов от резус-положительного донора, поскольку обязательная примесь резус-положительных эритроцитов донора в тромбомассе может вызвать сенсибилизацию больного.
В настоящее время для профилактики ГБН во всем мире используются препараты, изготавливаемые из сывороток резус-отрицательных людей, иммунных против D антигена системы резус. Производство таких препаратов снижается из-за уменьшения общего числа иммунных доноров и из-за постоянной выбраковки пулов сывороток, в которых обнаруживаются вирусы гепатитов или СПИДа. Проблемой является также вероятность внесения с препаратом патогенных вирусов человека. Идея использования моноклональных анти-резус антител для создания препарата для профилактики ГБН возникла сразу после получения первых клеточных линий-продуцентов моноклональных анти-D антител (Hughes-Jones N.C. 1988). В текстах in vitro и in vivo (Kumpel B.M. et al. 1989; Thompson A. et al. 1990) было показано, что анти-D антитела класса IgGl наиболее эффективно стимулируют механизм антителозависимого клеточного цитолиза в сравнении с антителами класса IgG3 (анти-D антитела практически всегда принадлежат к этим классам).
За рубежом получены клеточные линии, продуцирующие моноклональные анти-D антитела классов IgGl и 3, проведены выделение и очистка моноклональных антител, и на шимпанзе и донорах-добровольцах испытан моноклональный препарат (Blancher A. et al. 1992; Kumpel B.M. et al. 1995). Однако в работах были использованы трансформированные вирусом Эпштейн-Барра (EBV) лимфобластоидные клеточные линии. По нашим данным, даже после аффинного выделения иммуноглобулина из супернатантов таких линий не удается избавиться от вирусной ДНК. Поэтому для создания препарата была получена гетерогибридома HG-92, которая в процессе клонирований и культивирования утратила геном EBV, что показано методом полимеразной цепной реакции (Оловникова Н.И. 1994). Препарат на основе моноклональных анти-D антител класса IgGl, продуцируемых линий HG-92, прошел необходимые доклинические испытания. Испытана доза препарата, равная 150 мкг или 750 ME, что теоретически достаточно для лизиса 8 мл резус-положительных эритроцитов. Изучены его свойства в тестах in vitro (специфичность, титр, способность стимулировать антителозависимую цитотоксичность) и in vivo (клиренс эритроцитов). Показано, что характеристики препарата не изменяются при хранении в течение 3 лет при 2-8oC, что свидетельствует о его высокой стабильности. После получения разрешения на клинические испытания препарат был введен 20-ти резус-отрицательным женщинам после рождения резус-положительного ребенка, совместимого с матерью по системе АВО. Показано, что препарат не вызывает никаких побочных реакций. Наблюдение за каждой пациенткой проводилось в течение двух месяцев, и ни у одной из них в этот срок не были обнаружены анти-D антитела, что подтверждает эффективность препарата для предотвращения сенсибилизации. В настоящее время предлагаемый препарат не имеет аналогов ни в России, ни за рубежом. Крупномасштабное культивирование линии-продуцента антител позволяет нарабатывать практически неограниченное количество антител, что актуально в связи с сокращением заготовок иммунных сывороток и почти полным прекращением снабжения родильных домов поликлональными препаратами для профилактики ГБН.
1. Получение бессмертной гетерогибридомной линии HG-92, секретирующей моноклональные анти-D антитела класса IgGl.
а) Лимфоциты для трансформации получены от резус-отрицательного донора, иммунного против D антигена системы резус. Донор здоров и в течение 3 лет после взятия крови для выделения мононуклеаров продолжал сдавать кровь, которая регулярно тестировалась на вирусы гепатитов, СПИДа с отрицательным результатом. Это является дополнительной гарантией того, что лимфоциты не были контаминированы патогенными вирусами человека, несмотря на отрицательные результаты анализов. Мононуклеары выделяли в градиенте плотности и трансформировали вирусом Эпштейна-Барр. В качестве источника вируса была использована линия B-95.8. Клетки культивировали в среде, содержащий вирус, в течение 2 ч и затем рассаживали в 96-ячеечные платы по 30000 на ячейку в присутствии Циклоспорина А 0,75 мкг/мл.
б) Через 3 нед была проведена селекция линий, секретирующих IgG анти-D антитела с помощью непрямого антиглобулинового метода (непрямой пробы Кумбса), и их клонирование на фидерном слое облученных гомотипических клеток (мононуклеары или клетки лимфобластоидной линии, не секретирующей антитела).
в) Клонированные линии наращивали и сливали с миеломой мыши P3-X63-Ag. 8.653 в присутствии полиэтиленгликоля м. в. 3000-3700. Селекцию гибридов проводили в среде с НАТ и уабаином.
г) Гетерогибридомы, секретирующие IgG анти-D антитела, клонировали методом лимитирующих разведений на макрофагах мыши. Линия HG-92 была получена в результате 5 последовательных клонирований со 100%-ным выходом антителопродуцирующих гибридов в двух последних.
д) Максимальное время непрерывного культивирования в роллерных флаконах объемом 2 л 6 мес без снижения титра антител в культуральной среде. Штамм HG-92 хранится в коллекции перевиваемых клеточных культур под номером ВСКК/П/631Д и имеет следующие признаки.
Культуральные признаки. Суспензионная культура в жидкой среде, пассирование 1:2 1:3 через 2-4 сут. Среда для культивирования: RPMI 1640,5% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ HEPES-буфера, 4 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 5•10-5 М 2-меркаптоэтанола, антибиотики. Оптимальной системой для культивирования является роллерная установка типа Bellco.
Криоконсервирование клеток. Клетки суспедируют в полной питательной среде и добавляют равный объем эмбриональной сыворотки с 20% диметилсульфоксида. Клетки в криоампулах помещают в холодильник 70oC, через сутки переносят в жидкий азот.
Цитогенетические признаки. Модальное число хромосом 87 (37%), 6-8 хромосом человека.
Сведения о контаминации линии. Контаминации бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами гепатита В, СПИДа, Эпштейна-Барр не обнаружено, другие вирусы не тестированы.
Характеристики моноклональных антител, продуцируемых штаммом. Антитела принадлежат а классу IgGl человека и специфично выявляют D антиген системы резус, не дают перекрестных реакций с другими эритроцитарными антигенами. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:1024 1:2048 в непрямом антиглобулиновом методе.
2. Разработка моноклонального препарата для профилактики гемолитической болезни новорожденных.
1. Выделение антител из супернатанта клеточной культуры. 3-4-дневную культуру клеток HG-92 центрифугируют при 1000 об/мин для отделения клеток, которые суспендируют в свежей среде (состав см. выше). Супернатант центрифугируют повторно при 5000 об/мин и затем концентрируют в 10 раз. Концентрированный супернатант фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускают через колонку с Протеин А Сефарозой (20 г) со скоростью около 100 мл/ч. После нанесения колонку промывают 0,1 М фосфатным буфером pH 7,0, затем 0,1 М фосфатно-цитратным буфером pH 5,4. Элюцию антител проводят 0,1 М фосфатно-цитратном буфером при pH 3,0. К фракции 3,0 по каплям прибавляют 1 М раствор NaOH при перемешивании до pH 6,8-7,0. Затем добавляют сухой глицин до концентрации 1% растворяют его и немедленно фильтруют раствор через фильтр с диаметром пор 0,22. Этот раствор иммуноглобулина в дальнейшем именуется концентрат.
2. Определение степени чистоты препарата. Проводят электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) после кипячения пробы с 2-Меркаптоэтанолом. Препарат дает в электрофорезе 2 полосы, соответствующие легким и тяжелым цепям IgGl человека, что подтверждено иммуноблотингом с моноспецифичными антителами против цепей иммуноглобулинов человека.
3. Определение концентрации моноклонального иммуноглобулина. Концентрацию оценивают двумя способами: измеряют абсолютное значение концентрации по методу Бредфорда и сравнивают титр препарата с титром стандартного образца, содержащего известное число международных единиц активности (1 мкг равен 5-ти единицам). В качестве стандартов используются поликлональные анти-D иммуноглобулины производства Франции и Германии, которые сертифицируются международной референс-лабораторией в Лондоне.
4. Приготовление препарата. Готовый препарат получают путем разведения концентрата (пункт 1) забуференным физиологическим раствором pH 7,0 с 1% глицина. Перед разведением концентрат тестируют по следующей схеме:
определяют специфичность и титр анти-D антител непрямым антиглобулиновым методом со стандартными резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами;
определяют концентрацию белка по методу Бредфорда;
определяют pH;
проводят электрофоретическое исследование чистоты препарата;
проводят тестирование на пирогенность и стерильность согласно требованиям Фармакопеи. Готовый препарат должен содержать 150 мкг (750 ME) иммуноглобулина анти-D в одной дозе.
определяют специфичность и титр анти-D антител непрямым антиглобулиновым методом со стандартными резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами;
определяют концентрацию белка по методу Бредфорда;
определяют pH;
проводят электрофоретическое исследование чистоты препарата;
проводят тестирование на пирогенность и стерильность согласно требованиям Фармакопеи. Готовый препарат должен содержать 150 мкг (750 ME) иммуноглобулина анти-D в одной дозе.
3. Пример приготовления серии моноклонального анти-D иммуноглобулина.
Все этапы приготовления препарата осуществляются в стерильных условиях с использованием стерильного апирогенного оборудования и посуды.
1. Размораживаем ампулу с 108 криоконсервированных клеток гетерогибридомы HG-92 и культивируем в роллерном флаконе в объеме 300-350 мл в полной питательной среде (см. выше).
2. Через 3-4 сут считаем клетки и рассаживаем до плотности 0,25•108/мл в свежей питательной среде, собирая при этом супернатант. Супернатант центрифугируем при 5000 об/мин и храним при 2-8o. Через 5-6 пассажей объем супернатанта составляет 20 л.
3. Концентрируем 20 л супернатанта на установке Minetan до 2 л. Сразу после процедуры концентрирования фильтруем через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
4. Пропускаем 2 л концентрированного супернатанта через колонку с Протеин А Сефарозой в течение 20 ч, после чего колонку промываем 500 мл фосфатного буфера pH 7,0, 200 мл фосфатно-цитратного буфера pH 5,4 и проводим элюцию связавшихся антител фосфатно-цитратным буфером pH 3,0, прослеживая за концентрацией белка в элюате с помощью увикорда. Объем фракции составляет около 200 мл.
5. Немедленно доводим pH до 6,8-7,0, добавляя по каплям 1 М раствор NaOH и мягко перемешивая. Для нейтрализации требуется добавить объем щелочи, составляющий 15% объема фракции 3,0, т.е. на 200 мл раствора антител необходимо 30 мл 1 М раствора NaOH. В пробе измеряем pH. Затем добавляем 1% (вес/объем), т.е. 2,3 г сухого глицина и фильтруем после полного растворения глицина через апирогенный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
6. Берем пробу и готовим серию 2-кратных разведений в 96-луночном планшете на 24 ячейки (2 ряда) по 50 мкл/ячейку. Аналогично разводим стандарт (см. выше) и супернатант, прошедший через колонку (проскок), чтобы оценить процент несвязавшихся антител. В проскоке количество антител, оцененное по титру, не должно превышать 5% от общего количества иммуноглобулина. В каждую лунку вносим по 50 мкл 2% суспензии в физиологическом растворе трижды отмытых эритроцитов, тщательно перемешиваем и инкубируем при 37oC. Через 45-60 мин эритроциты трижды отмываем физиологическим раствором и прибавляем в каждую лунку по 50 мкл антиглобулинового реагента. Результаты реакции учитываем визуально через 45-60 мин инкубации при комнатной температуре по форме осадка: при положительном результате осадок выстилает лунку или имеет неровные, загнутые края, при отрицательном результате осадок собирается на дне лунки в точку. Сравнивая титр в пробе и в стандарте, оцениваем содержание иммуноглобулина. Например, титр в стандарте 1:32000 и известно, что концентрация анти-D иммуноглобулина составляет 100 мкг/мл (500 ME), титр в исследуемом образце 1:256000. Это означает, что содержание специфического иммуноглобулина 800 мкг/мл (4000 ME). Одновременно измеряем концентрацию по методу Бредфорда. Расхождение не должно составлять более 20% Основным показателем концентрации специфического иммуноглобулина считается тот, который рассчитывается исходя по титру.
7. Пробу тестируем на пирогенность и стерильность согласно требованиям Фармакопеи.
8. Пробу концентрата анализируем на однородность в электрофорезе в 7,5% полиакриламидном геле с SDS после кипячения в течение 5 мин в присутствии 5% 2-меркаптоэтанола.
9. Если препарат специфичный, стерильный, апирогенный дает в электрофорезе 2 полосы, соответствующие тяжелым и легким цепям IgGl человека, то разводим его до концентрации 150 мкг/мл (750 ME/мл) с тем расчетом, чтобы в 1 мл содержалась 1 доза иммуноглобулина. Для разведения используется стерильный физиологический раствор или физиологический раствор, забуференный фосфатным буфером (PBS) с 1% глицина.
10. Стерильно разливаем в ампулы или флаконы.
Литература:
Оловникова Н. И. Белкина Е.В. Берковский А.Л. и др. Гематол и трансфузиол. 1994, т. 39, N 4, с. 3-6.
Оловникова Н. И. Белкина Е.В. Берковский А.Л. и др. Гематол и трансфузиол. 1994, т. 39, N 4, с. 3-6.
Blancher A. Socha W.W. Ruffie J. Vox Sang. 1992, V 63, pp 112-118.
Hughes-Jones N.S. Br.J.Haematol. 1988, V 70, N 3, pp 263-265.
Kumpel B. M. Leader K.A. Merry A.H. et al. Eur.J.Immunol, 1989, V 19, N 12, pp 2283-2288.
Kumpel B.M. Goodrick M.J. Pamphilon D.H. et al. Blood, 1995, V 86, N 5, pp 1701-1709.
Thomson A. Contreras M. Gorick B. et al. Lancet, 1990, V 336, N 8724, pp 1147-1150.
Claims (1)
- Моноклональный иммуноглобулин человека класса JgGI против антигена D системы резус, продуцируемый гетерогибридомой HG-92 и используемый для предотвращения сенсибилизации резусотрицательных женщин и профилактики гемолитической болезни новорожденных.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95119268A RU2094462C1 (ru) | 1995-11-14 | 1995-11-14 | Моноклональный иммуноглобулин человека класса iggi против антигена d системы резус |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95119268A RU2094462C1 (ru) | 1995-11-14 | 1995-11-14 | Моноклональный иммуноглобулин человека класса iggi против антигена d системы резус |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2094462C1 true RU2094462C1 (ru) | 1997-10-27 |
RU95119268A RU95119268A (ru) | 1998-07-27 |
Family
ID=20173758
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU95119268A RU2094462C1 (ru) | 1995-11-14 | 1995-11-14 | Моноклональный иммуноглобулин человека класса iggi против антигена d системы резус |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2094462C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001077181A2 (fr) | 2000-04-12 | 2001-10-18 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Anticorps monoclonaux anti-rhesus d |
-
1995
- 1995-11-14 RU RU95119268A patent/RU2094462C1/ru active
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001077181A2 (fr) | 2000-04-12 | 2001-10-18 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Anticorps monoclonaux anti-rhesus d |
EP1518864A2 (fr) | 2000-04-12 | 2005-03-30 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Anticorps monoclonaux anti-rhesus D |
US7541029B2 (en) | 2000-04-12 | 2009-06-02 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Anti-rhesus D monoclonal antibodies |
US7579170B2 (en) | 2000-04-12 | 2009-08-25 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Method for preparing monoclonal antibodies capable of activating effector cells expressing FCγRIII |
US7931895B2 (en) | 2000-04-12 | 2011-04-26 | Lfb Biotechnologies | Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function |
EP2341078A2 (fr) | 2000-04-12 | 2011-07-06 | LFB Biotechnologies | Anticorps monoclonaux anti-rhesus D |
US8124078B2 (en) | 2000-04-12 | 2012-02-28 | Lfb Biotechnologies | Method for treating idiopathic thrombocytopenic purpura using monoclonal antibodies |
US8153124B2 (en) | 2000-04-12 | 2012-04-10 | Lfb Biotechnologies | Method for treating cancer using monoclonal antibodies |
US8178093B2 (en) | 2000-04-12 | 2012-05-15 | Lfb Biotechnologies | Method for treating infectious disease using monoclonal antibodies |
US8357370B2 (en) | 2000-04-12 | 2013-01-22 | Lfb Biotechnologies | Anti-D monoclonal antibodies |
US8409572B2 (en) | 2000-04-12 | 2013-04-02 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function |
US8685725B2 (en) | 2000-04-12 | 2014-04-01 | Labortoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies | Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function |
EP2947099A1 (fr) | 2000-04-12 | 2015-11-25 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Anticorps presentant une activite adcc amelioree |
US9708409B2 (en) | 2000-04-12 | 2017-07-18 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function |
US9718890B2 (en) | 2000-04-12 | 2017-08-01 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function |
US9718889B2 (en) | 2000-04-12 | 2017-08-01 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function |
US10081683B2 (en) | 2000-04-12 | 2018-09-25 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Monoclonal antibodies with enhanced ADCC function |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tuaillon et al. | Human milk-derived B cells: a highly activated switched memory cell population primed to secrete antibodies | |
Crawford et al. | Production of human monoclonal antibody to rhesus D antigen | |
EP0043718B1 (en) | Improvements in or relating to cell lines | |
Olding et al. | Thymus-derived peripheral lymphocytes from human newborns inhibit division of their mothers' lymphocytes | |
Butcher et al. | Mechanism of host specificity in malarial infection | |
Galbraith et al. | Transferrin binding by human lymphoblastoid cell lines and other transformed cells | |
Kohli‐Kumar et al. | Haemopoietic stem/progenitor cell transplant in Fanconi anaemia using HLA‐matched sibling umbilical cord blood cells | |
Goldsobel et al. | Bone marrow transplantation in DiGeorge syndrome | |
Taurog et al. | CBA/N X-linked B-cell defect prevents NZB B-cell hyperactivity in F1 mice. | |
Geha et al. | Identification of circulating maternal T and B lymphocytes in uncomplicated severe combined immunodeficiency by HLA typing of subpopulations of T cells separated by the fluorescence-activated cell sorter and of Epstein Barr virus-derived B cell lines. | |
Seeger et al. | Severe combined immunodeficiency with B lymphocytes: in vitro correction of defective immunoglobulin production by addition of normal T lymphocytes. | |
Khansari et al. | Phagocytosis of senescent erythrocytes by autologous monocytes: requirement of membrane-specific autologous IgG for immune elimination of aging red blood cells | |
EP0576093B1 (en) | Human monoclonal anti-Rhesus (D) antibodies and cell lines producing same | |
EP0057107A2 (en) | Method of manufacturing monoclonal antibodies and cells capable of manufacturing such antibodies | |
Shirahata et al. | Cell hybridization, hybridomas, and human hybridomas | |
RU2094462C1 (ru) | Моноклональный иммуноглобулин человека класса iggi против антигена d системы резус | |
Sanal et al. | Antibody-dependent cellular cytotoxicity in primary immunodeficiency diseases and with normal leukocyte subpopulations: importance of the type of target | |
Bonduel et al. | Successful related umbilical cord blood transplantation for graft failure following T cell-depleted non-identical bone marrow transplantation in a child with major histocompatibility complex class II deficiency | |
Mompó et al. | Antigen-specific human monoclonal antibodies from transgenic mice | |
Brown et al. | Infectious mononucleosis: a polyclonal B cell transformation in vivo | |
Nordal et al. | Lymphocyte populations and cellular immune reactions in vitro in patients with multiple sclerosis | |
Nelson et al. | ADCC against human erythrocyte target cells: role of the anti-target cell antibodies in determining lymphocyte killer activity. | |
Metcalfe et al. | Use of chloroquine-treated granulocytes and platelets in the diagnosis of immune cytopenias | |
Rearden et al. | Severe hemolytic disease of the newborn due to anti‐Vw and detection of glycophorin A antigens on the Miltenberger I sialoglycoprotein by Western blotting | |
Borzy et al. | Bone marrow transplantation for severe combined immune deficiency in an infant with chimerism due to intrauterine‐derived maternal lymphocytes: Donor engraftment documented by chromosomal marker studies |