KR101647617B1 - 혈장으로부터 IgG가 풍부한 조성물을 준비하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IVIG 산물의 제조용 개선된 방법들을 제공한다. 이들 방법은 정제 동안 IgG 손실의 감소 및 최종 산물의 개선된 품질과 같은 다양한 장점들을 제공한다. 다른 측면들에서, 본 발명은 정맥내, 피하내, 및/또는 근육내 투여에 적합한 수성 및 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 구체예들에서, 본 발명은 여기에서 제공되는 IgG 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 이상을 치료하는 방법들을 제공한다.

Description

혈장으로부터 IgG가 풍부한 조성물을 준비하는 방법{METHODS FOR PREPARING AN ENRICHED IgG COMPOSITION FROM PLASMA}
인간 혈장의 면역 글로블린 산물들은 면역 결핍을 치료하기 위하여 1952년에 처음으로 이용되었다. 초기에, 면역글로블린 아이소타입 G (IgG)의 근육내 또는 피하 투여가 선택 방법들이었다. 그러나, 다양한 질환들을 효과적으로 치료하는데에 필요한 다량의 IgG를 주사하기 위하여, 농축 수준이 더 낮은 IgG (50mg/mL)를 가진 정맥으로 투여가능한 산물들이 개발되었다. 보통 정맥내 면역글로블린 (IVIG)은 천 명 이상의 혈액 기증자의 혈장으로부터 채집한 (pooled) 면역글로블린 G (IgG) 면역글로블린을 함유한다. 전형적으로 95% 이상의 변형안된 IgG (이때 IgG는 온전한 Fc-의존적 효과기(effector) 기능을 보유함)와 오직 소량의 면역글로블린 A (IgA) 또는 면역글로블린 M (IgM)을 함유하는 IVIGs는 의학적으로 다음의 세 가지 주요 범주를 치료하는데 주로 이용된 멸균, 정제된 IgG 산물들이다: (1) 낮은 항체 수준을 특징으로 하는 X-연계된 무감마글로블린혈증, 저감마글로블린혈증 (주요 면역 결핍), 그리고 후천적 면역기능이 제대로 발휘되지 않는 면역 상태 (2차 면역 결핍)와 같은 면역 결핍; (2) 염증 및 자가면역 질환들; 그리고 (3) 급성 감염들.
특히, 주요 면역결핍 장애들를 가진 많은 사람들은 감염에 저항하는데 필요한 항체들이 부족하다. 일부 경우들에서, 보통 정맥내 투여 (가령, IVIG 요법)를 통하여 정제된 IgG의 주입에 의해 이러한 결핍은 보완될 수 있다. X-연계된 무감마글로블린혈증 (XLA), 공통의 가변 면역결핍 (CVID), 과-IgM 증후군 (HIM), 심각하게 복합된 면역결핍 (SCID), 그리고 일부 IgG 하위집단 결핍을 포함하는 몇 가지 주요 면역결핍 장애들이 보통 이러한 방식으로 치료된다(Blaese and Winkelstein , J. Patient & Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson , MD: Immune Deficiency Foundation; 2007).
IVIG 치료는 주요 면역결핍 장애들을 관리하는데 매우 효과적일 수 있지만, 이 요법은 이 질환을 치료하기 보다는 신체에서 생산되지 않는 항체들을 일시적으로 보충시켜줄 뿐이다. 따라서, IVIG 요법에 의존적인 환자들은 전형적으로 평생동안 1달에 약 1회의, 반복된 투약을 요한다. 이러한 필요는 IVIG 조성물들의 지속적인 생산에 대한 상당한 수요를 주문한다. 그러나, 재조합 DNA 벡터의 시험관내 발현을 통하여 만들어지는 다른 생물상과는 달리, IVIG는 인간 혈액 및 혈장 기부로부터 분취된 것이다. 따라서, IVIG 산물들은 단순히 생산량을 증가시킴으로써 증가시킬 수는 없다. 오히려, 혈액 및 혈장 기부의 이용가능한 공급으로 인하여 시판되는 IVIG의 수준은 제한된다.
IVIG 치료의 수용, IVIG 요법이 효과적인 추가 징후의 확인, 그리고 환자 진단 및 IVIG 처방의 증가를 포함하는 몇 가지 인자들은 IVIG에 대한 요구를 활발히 한다. 특히, IVIG에 대한 전 세계적인 요구는 1990년 이후로 4배 이상이 되었으며, 그리고 매년 약 7% 내지 10% 사이의 비율로 꾸준히 증가하고 있다(Robert P., 약제학적 Policy and Law, 11 (2009) 359-367). 예를 들면, Australian National Blood Authority는 호주에서 IVIG의 수요는 2008-2009년 회계연도에서 10.6% 증가하였다고 보고하였다(National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009).
일부 세계적인 수요의 증가와 면역글로블린 산물들의 이용가능한 공급의 변동성으로 인하여, 호주와 영국을 포함하는 몇몇 나라들은 산물의 공급 부족 기간 동안 최대 수요군 환자들을 위하여 이들 산물들의 공급을 확보하기 위하여 수요 관리 프로그램을 실행하고 있다.
2007년, 2천6백5십만 리터의 혈장을 분획하여, 75.2 미터톤의 IVIG를 생산하였고, 평균 산출량은 2.8 grams/L로 보고되었다(Robert P., supra). 이 보고서는 전 세계에서 IVIG 산출량은 2012년까지 약 3.43 grams/L로 증가할 것으로 예측하였다. 그러나, 지금부터 2015년 사이에 매년 약 7% 내지 13%로 예측되는 전세계 수요의 지속적인 성장으로 인하여, 전 세계적인 요구에 부합하기 위해서는 전반적인 IVIG 산출량의 추가 개선이 필요할 것이다.
IVIG 산물들의 상업적 공급자들은 여러 IVIG 조제 방법들을 이용한다. 현재 IVIG 생산 방법들이 가지고 있는 한 가지 공통적인 문제점은 정제 공정 동안 IgG의 상당한 손실인데, 손실량은 출발 물질의 총 IgG 함량의 최소한 30% 내지 35%로 추정한다. 한 가지 목표는 IgG의 산출량을 강화시키면서 바이러스 비활성화의 성질을 유지시키고, 부작용을 야기할 수 있는 불순물을 없애는 것이다. IVIG의 현재 생산 수준에서, 고려할 것은 산출량의 작은 증가가 실제 유의적이라는 것이다. 예를 들면 2007년 생산 수준에서, 추가 56 milligrams/L에 대응하는 효과의 2% 증가는 1.5 추가 미터톤의 IVIG의 생산할 것이다.
혈청 및 혈장 단백질의 준비 및 성질에 관한 4회분의 일련의 세미나 논문에서, Cohn et al. (J. Am. Chem . Soc , 1946, 68(3): 459 - 475)는 처음으로 혈장 단백질들의 알코올 분획 방법들(방법 6)을 설명하였고, 이는 인간 혈장으로부터 IgG의 농축된 분획물의 단리를 허용한다. 몇 년 후, Oncley et al. (J. Am. Chem . Soc. , 1949, 71(2): 541 - 550)는 방법 (방법 9)을 공개함으로써 Cohn 방법을 확대시켰는데, 더 순수한 IgG 준비물을 단리시켰다.
혈장 유도된 혈액 인자들의 전체 산업에 대한 기반을 마련한 이들 방법들은 Kawasaki 증후군, 면역 혈소판감소성 자반증, 및 주요 면역 결핍을 포함하는 몇 가지 면역-관련된 질환들의 치료를 위한 충분히 높은 농도를 보유한 IgG 조합물(준비물s)을 제공할 수는 없었다. 그러한 이유로, 순도가 더 높은, 그리고 더 높은 농도의 IgG 제제(formulations)를 제공하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피와 같은 다양한 기술을 이용한 추가 방법들을 개발하였다. Hoppe et al. Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752) 및 Falksveden (Swedish Patent No. 348942) and Falksveden and Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)은 그 중에서도 처음으로 이러한 목적을 위하여 이온 교환 크로마토그래피를 이용하였다.
다양한 현대 방법들은 침전 단계를 이용하는데, 예를 들면, 카프릴레이트(caprylate) 침전 (Lebing et al, Vox Sang 2003 (84):193-201) 그리고 컬럼 크로마토그래피에 결합된 Cohn 분획물 (I+)II+III 에탄올 침전 (Tanaka et al, Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30)을 이용한다. 가장 최근에, Teschner et al. Vox Sang, 2007 (92):42-55)는 10% IVIG 산물의 생산 방법을 설명하였는데, 이때 한냉-침전물(cryo-precipitate)은 채집된(pooled) 혈장으로부터 빼내고, 그 다음 변형된 Cohn-Oncley 냉각 에탄올 분별(fractionation)을 실행하고, 이어서 중간생성물의 S/D 처리, 이온 교환 크로마토그래피, 나노여과(nanofilteration), 그리고 임의 선택적으로 한외여과/정용여과(diafilteration)를 실시한다.
그러나, 이러한 IgG 제조 방법들에 의해 순도, 안전성, 및 산출량의 개선에도 불구하고, 상당량의 IgG는 여전히 정제 공정 동안 손실된다. 예를 들면, Teschner et al. 는 이들 방법에 의해 IgG 산출량을 65% 증가되었다고 보고하였다(Teschner et al, supra). 다양한 혈장 산물 모임 동안 보고된 바와 같이, Baxter, CSL Behring, Upfront Technology, Cangene, Prometric BioTherapeutics, 및 Finnish Red Cross로부터 대규모의 IgG 조제물의 평균 산출량은 최종 용기내 약 61% 내지 약 65% 범위라고 보고하였다. 이는 제조 공정 동안 채집된 혈장 분획 안에 존재하는 IgG의 최소한 약 1/3이 손실되었음을 나타낸다.
이러한 이유로, IVIG 산물들의 제조를 위한 개선되고, 더 효과적인 방법들이 여전히 필요하다. 본 발명은 현재 수득가능한 수준보다 최소한 6 내지 10% 더 높은 산출량을 제공하는 IVIG 제조 방법들을 제공하고, 뿐만 아니라 이로부터 제공되는 IVIG 조성물들을 제공함으로써, 이러한 그리고 다른 요구들을 충족시킨다.
발명의 간단한 요약
한 측면에서, 본 발명은 혈장으로부터 IgG가 풍부한 조성물들 (가령, IVIG 조성물들)을 준비하는 방법들을 제공한다. 유익하게, 여기에서 제공되는 이 방법들은 IVIG 조성물들을 준비하는 당업계 현재 제조방법들보다 상당히 개선된 점들을 제공한다. 예를 들면, 여기에서 설명된 방법들은 정맥내 투여에 요구되는 순도의 손실없이 최종 벌크 조성물내 IgG 산출량의 증가를 허용한다.
한 측면에서, 혈장으로부터 IgG가 풍부한 조성물을 준비하는 다음의 단계들을 포함하는 방법이 제시된다: (a) 제 1 침전 단계에서, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 얻기 위하여 약 7.0 내지 약 7.5 사이의 pH에서 약 6% 내지 약 10%의 알코올을 이용하여 동결-불량(cyro-poor) 혈장 분획을 침전시키는 단계, (b) 제 2 침전 단계에서, 제 2 침전물 을 얻기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3 사이의 pH에서 약 20% 내지 약 25%의 알코올을 이용하여 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (c) 제 2 침전물을 재현탁시켜 현탁액을 만드는 단계, (d) 제 3 침전 단계에서 제 3 침전물을 형성시키기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3 사이의 pH에서 약 22% 내지 약 28%의 알코올을 이용하여 단계 c)에서 형성된 현탁액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (e) 제 3 침전물을 재현탁시켜, 현탁액을 만드는 단계, 그리고 (f) 단계 e)에서 형성된 현탁액으로부터 가용성 분획물을 분리하고, 이에 의해 IgG가 풍부한 조성물을 형성하는 단계, 여기에서 제 1 침전 단계, 제 2 침전 단계, 또는 제 3 침전 단계중 최소한 하나는 알코올의 분무 첨가를 포함한다. 한 구체예에서, 알코올은 제 1 침전 단계에서 분무에 의해 추가된다. 또다른 구체예에서, 알코올은 제 2 침전 단계에서 분무에 의해 추가된다. 여전히 또다른 구체예에서, 알코올은 제 3 침전 단계에서 분무에 의해 추가된다.
특정 구체예들에서, 하나 이상 용액의 pH는 pH 변경 물질을 분무에 의해 첨가함으로써 조정할 수 있다. 관련된 구체예들에서, 제 1 침전 단계, 제 2 침전 단계, 또는 제 3 침전 단계중 최소한 하나의 pH는 알코올의 첨가 후, 또는 알코올의 첨가 전과 첨가 후, 알코올의 첨가 동안 그리고 첨가 후, 또는 알코올의 첨가 전, 첨가 동안 그리고 첨가 후 pH 변경 용액을 첨가하여 얻는다. 또다른 관련된 구체예에서, 침전 단계의 pH는 이 pH를 지속적으로 조절함으로써 전체 침전 반응 동안 유지될 수 있다.
한 특이적 구체예에서, 제 1 침전 단계의 pH는 알코올의 첨가 후 pH 변경 물질을 분무 첨가하여 조정한다. 또다른 구체예에서, 제 2 침전 단계의 pH는 알코올의 첨가 후 pH 변경 물질을 분무 첨가하여 조정한다. 여전히 또다른 구체예에서, 제 3 침전 단계의 pH는 알코올의 첨가 후 pH 변경 물질을 분무 첨가하여 조정한다.
추가적으로, IVIG 조합물의 순도 또는 품질을 더 강화시키기 위하여, 여기에서 설명된 준비(preparatory) 방법들은 이온 교환 크로마토그래피 단계 (가령, 음이온 교환 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피), 나노여과 단계, 한외여과/정용여과 단계, 또는 임의의 기타 적합한 정제 기술을 더 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 혈장으로부터 IgG가 풍부한 조성물을 준비하는 다음의 단계들을 포함하는 방법이 제시된다: (a) 동결-불량 혈장 분획물의 pH를 약 7.0로 또는 7.0에서 조절하는 단계, (b) 단계 a)의 동결-불량 혈장 분획물의 에탄올 농도를 (약) -7℃ 내지 (약) -9℃ 사이의 온도에서 (약) 25% (v/v)로 조정하고, 이로 인하여 혼합물이 형성되는 단계, (c) 단계 b)의 혼합물로부터 액체와 침전물을 분리시키는 단계, (d) 단계 c)의 침전물을 인산염 및 아세트산염을 함유하는 완충액으로 재현탁시키고, 여기에서 완충액의 pH는 완충액 1000L당 (약) 600 ml의 빙초산으로 조정되고, 이에 의해 현탁액이 형성되는 단계, (e) 단계 d)의 현탁액과 미세하게 분할된 이산화규소(SiO2)를 최소한 약 30 분 동안 혼합시키는 단계, (f) 이 현탁액을 압착식 여과기로 여과시키고, 이에 의해 여과액이 형성되는 단계, (g) 이 압착식 여과기를 인산염 및 아세트산염을 함유하는 완충액을 압착식 여과기의 무용 용적(dead volumes)의 최소한 3 용적으로 압착식 여과기를 세척시키는 단계, 여기에서 완충액의 pH는 완충액 1000L당 (약) 150 ml의 빙초산으로 조정되고, 이에 의해 세척 용액이 형성되며, (h) 단계 f)의 여과액을 단계 g)의 세척 용액과 복합시키고, 이에 의해 용액이 형성되며, 이 용액을 세제로 처리하는 단계, (i) 단계 h)의 용액의 pH는 (약) 7.0으로 조정하고, 그리고 (약) 25%의 최종 농도가 되도록 에탄올을 추가하고, 이에 의해 침전물이 형성되는 단계, (j) 단계 i)의 혼합물로부터 액체와 침전물을 분리시키는 단계, (k) 용매 또는 세제를 포함하는 수성 용액에 이 침전물을 용해시키고, 최소한 60 분 동안 이 용액을 유지시키는 단계, (l) 단계 k) 이후 이 용액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시키고, 그리고 컬럼상에 흡착된 단백질들은 용리액에 용리시키는 단계, (m) 단계 l)의 용리물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 유출물(effluent)을 생성시키는 단계, (n) 단계 m)의 유출물은 나노필터를 통과시켜 나노여과액을 생성시키는 단계, (o) 단계 n)의 나노여과액은 한외여과 막을 통과시켜 한외여과액을 생성시키는 단계; 그리고 (p) 단계 o)의 한외여과액은 정용여과 완충액에 대하여 정용여과시켜 약 8% (w/v) 내지 약 12% (w/v) 범위의 단백질 농도를 보유하는 정용여과액을 생성시키고, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 수득하는 단계.
또다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 방법들에 의해 준비된 IgG 수성 조성물들을 제공한다. 일반적으로, 이 IgG 조성물들은 높은 순도 (가령, 최소한 95%, 98%, 99%, 또는 이 이상의 IgG 함량)를 갖고, 약 20 g/L 내지 약 200 g/L 범위의 단백질 농도를 함유하며, 그리고 낮은 수준의 통상적인 IVIG 오염물질들, 가령, IgG, IgM, 피브리노겐, 트란스페린, ACA, 아미도용해성(amidolytic) 활성, PKA, 및 이와 유사한 것들을 함유한다.
또다른 측면에서, IVIG 요법에 사용을 위한 약제학적 IgG 조성물 및 제제를 제공한다. 이 약제학적 제제는 높은 순도 (가령, 최소한 98%, 99%, 또는 이 이상의 IgG 함량)를 갖고, 약 20 g/L 내지 약 200 g/L 범위의 단백질 농도를 함유하며, 그리고 상당히 낮은 수준의 통상적인 IVIG 오염물질들, 가령, IgG, IgM, 피브리노겐, 트란스페린, ACA, 아미도용해성(amidolytic) 활성, PKA, 및 이와 유사한 것들을 함유한다. 일반적으로, 이 약제학적 조성물들은 정맥내 투여 (가령, IVIG 요법용), 피하 투여, 또는 근육내 투여에 적합하도록 조제된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 면역결핍, 자가면역 질환, 또는 급성 감염과 관련하여 도움이 필요한 인간에서 면역결핍, 자가면역 질환, 또는 급성 감염을 치료하는 방법을 제시하는데, 이 방법은 여기에서 설명된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 여기에서 설명된 방법들을 통하여 치료 또는 관리될 수 있는 질환들 및 상태들의 비-제한적인 예는 동종(allogeneic) 골수 이식, 만성 림프성 백혈병, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 소아 HIV, 주요 면역결핍, Kawasaki 질환, 만성 염증성 탈수초화 다발성신경병증 (CIDP), 고항체 수취인 또는 ABO 양립불가 기증자와 함께 신장 이식, 만성 피로 증후군, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 대장염, 피부근염 및 다발성근염, Graves의 안병증, Guillain-Barre 증후군, 근위축증, 봉입체 근염, Lambert-Eaton 증후군, 홍반성 낭창, 다촛점운동신경병증, 다발성 경화증(MS), 중증근무력증, 신생아 동종면역 혈소판감소증, 파르보바이러스 B19 감염, 수포창, 수혈후 자반증, 신장 이식 거부, 자연 유산, 전신근강직 증후군, 안구간대경련-근간대경련(opsoclonus Myoclonus), 심각한 폐혈증 및 결정적으로 아픈 성인에서 폐혈증 쇼크, 중독성 표피융해, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, X-연계된 무감마글로블린혈증, 저감마글로블린혈증, 주요 면역 결핍, RRMS, Alzheimer 질환, 그리고 Parkinson 질환을 포함한다.
도 1: ELISA (▲) 및 네펠로메트릭(nephelometric) (●) 방법들에 의해 결정된 IgG 농도 및 여과 후 여과 장치를 세척하는데 이용된 완충액의 다수 무용 용적(dead volume)에 대한 함수로써 분획물 II+III 여과액 세척에 존재하는 전체 단백질 농도(■).
도 2: Aerosil (이산화실리콘) 처리 하에 또는 처리 없이 아세트산의 첨가에 의해 pH 3.8에서 5.0까지 추출 및 정화후 침전물 G 용해된 분획물에서 PKA 평균 활성.
도 3: Aerosil (이산화실리콘) 처리 하에 또는 처리 없이 아세트산의 첨가에 의해 pH 3.8에서 5.0까지 추출 및 정화후 침전물 G 용해된 분획물에서 평균 피브리노겐 함량.
도 4: Aerosil (이산화실리콘) 처리 하에 또는 처리 없이 아세트산의 첨가에 의해 pH 3.8에서 5.0까지 추출 및 정화후 침전물 G 용해된 분획물에서 평균 아미도용해성 활성.
도 5: 4℃에서 2주간 항온 처리 후(◆), 또는 실온에서 추가 2주동안 항온처리 후(■) Aerosil (이산화실리콘) 처리 하에 또는 처리 없이 아세트산의 첨가에 의해 pH 3.8에서 7.8까지 추출되고, 정화된 침전물 G 용해된 분획물에서 아미도용해성 활성.
도 6: pH 3.8에서 7.8까지 추출되고, 정화된 침전물 G 용해된 분획물에서 PKA 활성.
도 7: 훈증된 실리카 처리와 함께 또는 이러한 처리 없이, 변형된 분획물 II+III 여과액의 순도에서 차이. (A) 여과 보조제만으로 정화된 변형된 분획물 II+III 여과액의 셀룰로오스 아세트산염 전기영동의 크로마토그래피와 (B) 훈증된 실리카 처리후 정화된 변형된 분획물 II+III 여과액의 셀룰로오스 아세트산염 전기영동의 크로마토그래피.
도 8: 대규모 IgG 제조시 침전 알코올 첨가후 분획물 II+III 상청액의 pH 6.9로부터 pH 변이.
도 9: 변형된 분획물 II+III 침전물 추출 완충액에서 pH 대(對) 빙초산의 양.
도 10: 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 세척-후 완충액에서 pH 대(對) 빙초산의 양.
정의
여기에서 사용된 것과 같이, "항체"는 면역글로블린 유전자 또는 면역글로블린 유전자들에 의해 실질적으로 인코드되는 폴리펩티드, 또는 이의 단편들을 지칭하며, 이들 항체는 분석물 (항원)에 특이적으로 결합하고 인지한다. 인지된 면역글로블린 유전자들은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변 영역 유전자들과, 뿐만 아니라 무수한 면역글로블린 가변 영역 유전자들을 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파 또는 입실론으로 분류되며, 차례로 면역글로블린 종류, IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE으로 특징화된다.
예시적인 면역글로블린 (항체) 구조 단위는 2개 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되는데, 각 쌍은 한 개의 "경쇄"(약 25 kD)와 한 개의 "중쇄"(약 50-70 kD)를 보유한다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인지를 주로 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로된 가변 영역으로 특징된다. 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이들 중쇄와 경쇄를 말한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "한외여과 (UF)"는 다양한 막 여과 방법들을 망라하는데, 이때 유체정역학적(hydrostatic) 압력으로 반-투과성 막을 통하여 액체를 밀어낸다. 현탁된 고체들과 고분자량의 용질들은 걸리게 되며, 물과 저분자량의 용질들은 막을 통과한다. 이 분리 공정은 거대분자 (103 - 106 Da) 용액, 특히 단백질 용액을 정제 및 농축시키는데 흔히 이용된다. 다수의 한외여과 막들은 이 막들에 의해 걸리는 분자의 크기에 따라 이용가능하다. 한외여과는 전형적으로 1 내지 1000 kDa 사이의 막 포어 크기와 0.01 내지 10 bar 사이의 작동 압력으로 특징화되며, 그리고 설탕 및 염과 같은 작은 분자로부터 단백질들과 같은 콜로이드를 분리시키는데 특히 유용하다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "정용여과(diafiltration)"는 한외여과와 동일한 막으로 실행하며 그리고 접선 흐름(tangential flow) 여과이다. 정용여과 동안, 완충액은 재순환 탱크로 도입되며, 여과액은 단위 작업으로부터 제거된다. 산물이 잔류물질(retentate) (예를 들면 IgG)안에 있는 공정에서, 정용여과는 산물 채집물(pool)로부터 성분을 여과액으로 씻어내고, 이에 의해 완충액을 교환시키고, 원하지 않는 종들의 농도를 감소시킨다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "약"은 명시된 값으로부터 +10% 또는 -10%의 대략적인 범위를 말한다. 예를 들면, "약 20%"는 18-22% 범위를 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "혼합하다(mixing)"는 임의의 형태의 교반에 의해 용액 또는 현탁액 안에 두 개 이상의 별개 화합물 또는 물질들이 고르게 분포되도록 하는 작업을 설명하는 것이다. 이 출원에서 이 용어가 이용될 때, 혼합 결과로 용액 또는 현탁액 안에 모든 성분들의 완벽하게 등가의 분포를 요구하지는 않는다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "용매(solvent)"는 하나 이상 다른 물질을 용해 또는 분산시킬 수 있는 임의의 액체 물질을 포함한다. 용매는 물과 같이 자연상태에서 무기물일 수 있거나, 또는 에탄올, 아세톤, 메틸 아세트산염, 에틸 아세트산염, 헥산, 가솔린 에테르, 등과 같은 유기 액체일 수도 있다. "용매세제 처리"에 이용되었을 때, 용매는 유기 용매(가령, 트리-N-부틸 인산염)를 나타내며, 이는 용액 안에 지질에 에워싸인 바이러스를 비활성화시키는데 이용되는 용매 세제 혼합물의 일부다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "세제(detergent)"는 본 출원에서 용어 "계면활성제" 또는 "표면 활성화제" 용어와 호환 이용된다. 계면활성제는 전형적으로 소수성 기("꼬리")와 친수성 기("머리")를 가지고 있어, 유기 용매와 물 모두에서 계면활성제를 가용성으로 만드는 양쪽성인 유기 화합물이다. 계면활성제는 머리에 하전된 기의 존재에 근거하여 분류할 수 있다. 비-이온성 계면활성제는 이의 머리 부분에 하전된 기들이 없으며, 반면 이온성 계면활성제는 이의 머리기에 순전하(net charge)를 가진다. 쌍성이온(zwitterionic) 계면활성제는 두 개의 상반되는 하전된 기를 가진 머리를 포함한다. 통상적인 계면활성제의 일부 예들은 다음을 포함한다: 음이온성(설페이트, 설포네이트 또는 카르복실레이트 음이온 근거): 퍼플로오르옥타노에이트 (PFOA 또는 PFO), 퍼플로오로옥탄설포네이트 (PFOS), 도데실 설페이트 나트륨(SDS), 라우릴 설페이트 암모늄, 그리고 기타 알킬 설페이트 염, 라우레(laureth) 설페이트 나트륨(라우릴 에테르 설페이트 나트륨, 또는 SLES로 알려짐), 알킬 벤젠 설포네이트; 양이온 (4가 암모늄 양이온 근거): 세틸 트리메틸암모니움 브롬화물 (CTAB) a.k.a. 헥사데실 트리메틸 암모니움 브롬화물, 그리고 기타 알킬트리메틸암모니움 염, 세틸피리디니움 염화물 (CPC), 폴리에톡실화된 우지(tallow) 아민(POEA), 벤잘코니움 염화물 (BAC), 벤조토니움 염화물 (BZT); 장쇄 지방산 및 이의 염: 카프릴레이트(caprylate), 카프릴산(카프릴산), 헵타노에이트(heptanoat), 헥사논산(hexanoic acid), 헵타논산(heptanoic acid), 나논산(nanoic acid), 데카논산(decanoic acid) 및 이와 유사한 것들을 포함; 쌍성이온(양쪽성): 도데실 베타인; 코카미도프로필 베타인(cocamidopropyl betaine); 코코 암포 글리시네이트(coco ampho glycinate); 비이온성: 알킬 폴리(에틸렌 옥시드), 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(에틸렌 옥시드)와 포릴(프로필렌 옥시드)의 코폴리머(Poloxamers 또는 Poloxamines로 상업적으로 알려짐), 옥틸 글루코시드를 포함한 알킬 폴리글루코시드, 데실 말토시드, 지방 알코올 (가령, 세틸 알코올 및올레일 알코올), 코카미드 MEA, 코카미드 DEA, 폴리소르베이트(Tween 20, Tween 80, 등), 트리톤 세제, 및 도데실 디메틸아민 옥시드.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "정맥내 IgG" 또는 "IVIG"치료는 면역 결핍, 염증 질환들, 및 자가면역 질환들과 같은 다수의 병적 상태를 치료하기 위하여 IgG 면역글로블린의 조성물을 환자의 정맥내, 피하 또는 근육내로 투여하는 치료 방법을 말한다. IgG 면역글로블린은 혈장으로부터 전형적으로 채집하고 준비된다. 전체 항체 또는 단편들을 이용할 수 있다. IgG 면역글로블린은 피하 투여를 위하여 더 높은 농도(가령, 10% 이상)로 조제될 수 있고, 또는 근육내 투여를 위하여 조제될 수 있다. 이는 특이적 항원(가령, Rho D 인자, 백일해 독소, 파상풍 독소, 보틀리누스 독소, 공수병, 등)에 대해 평균 역가 이상으로 준비되는 전문 IgG 조합물의 경우에 특히 일반적이다. 토론의 편이성을 위하여, 피하 또는 근육용으로 조제된 IgG 조성물들은 본 출원에서 용어"IVIG"에 또한 포함된다.
"치료요법적으로 유효량 또는 투약량(dose)" 또는 "충분한/유효량 또는 투약량"은 투여하였을 때 효과를 나타내는 투약량을 의미한다. 정확한 투약량은 치료 목적에 따라 달라지며, 공지된 기술을 이용하여 당업계 숙련자가 확인할 수 있을 것이다(가령, Lieberman , Pharmaceutical Dosage Forms ( vols . 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar , Dosage Calculations (1999); and Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro , Ed., Lippincott , Williams & Wilkins 참고).
본 출원에서 이용된 것과 같이, 용어 "분무하는(spraying)"는 가령, 알코올 침전 단계, 가령 변형된 Cohn 분별 I 또는 II+III 침전 단계 동안 액체 물질을 액체 물질의 미세한 작은 방울, 또는 연무의 형태로 시스템 안으로 전달하는 수단을 말한다. 분무는 임의의 가압 장치, 가령, 용기 (가령, 분무 병)로 실시하는데, 이 병은 분무 헤드 또는 노즐을 가지고 있으며, 액체로부터 미세 연무를 만들기 위해 수동으로 또는 자동으로 작동된다. 전형적으로, 분무는 액체 물질을 수용하는 시스템은 지속적으로 교반되거나 또는 다른 방식으로 혼합되도록 하면서 실행되어, 시스템 안에 있는 액체들이 신속하고 균등하게 분포되도록 한다.
발명의 상세한 설명
I. 총람
현대 의학에서 일반적으로 실행되는 것과 같이, 농축된 면역글로블린 (특히 IgGs)의 멸균된 조합물은 다음의 주요 3가지 분류에 속하는 의료 상태를 치료하는데 이용한다: 면역 결핍, 염증 및 자가면역 질환들, 그리고 급성 감염들. 한 가지 보편적으로 이용되는 IgG 산물, 정맥내 면역글로블린 또는 IVIG는 예를 들면, (약) 10% IgG의 농도에서 정맥내 투여용으로 조제된다. 농축된 면역글로블린은 또한 예를 들면, (약) 20% IgG의 농도에서 피하 또는 근육내 투여용으로 조제될 수 있다. 토론의 편이성을 위하여, 피하 또는 근육용으로 조제된 IgG 조성물들은 본 출원에서 용어"IVIG"에 또한 포함된다.
특정 측면들에서, 본 발명은 산물의 최종 산출량을 증가시키는 IVIG 제조 방법들을 제기하며, 동일한 또는 더 높은 품질의 IVIG 조성물들을 제공하며, 그리고 일부 경우에서는 더 높은 농도의 IVIG 조성물들을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상 침전 단계에서 IgG 손실을 감소시키는 변형된 Cohn 분별 방법들을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 개선된 제조 방법들에 따라 준비된 IgG 조성물들을 제공한다. 유익하게, 이들 조성물들은 여기에서 제공되는 방법들에 의해 제공되는 개선된 산출량으로 인하여 현재 상업적으로 이용가능한 산물들보다 더 저렴한 비용으로 제조된다. 더욱이, 이들 조성물들은 상업적 방법들을 이용하여 제조된 조성물들보다 더 순수하지 않을 지라도, 대등한 순도를 가진다. 중요한 것은, 이들 조성물들은 면역 결핍, 염증 및 자가면역 질환들, 그리고 급성 감염들을 위한 IVIG 요법에 사용하는데 적합하다. 한 구체예에서, IgG 조성물은 정맥 투여용 (약) 10% IgG이다. 또다른 구체예에서, IgG 조성물은 피하 또는 근육내 투여용 (약) 20%이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 제공하는 개선된 제조 방법에 따라 준비된 IgG 조성물들의 약제학적 조성물들 및 제제를 제공한다. 특정 구체예들에서, 이들 조성물들 및 제제는 현재 시장에 있는 기타 IVIG 조성물들과 비교하였을 때 개선된 성질들을 제공한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 여기에서 제공되는 조성물들 및 제제는 연장된 시간 동안 안정적이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 면역 결핍, 염증 및 자가면역 질환들, 그리고 급성 감염들을 치료하는 방법을 제시하는데, 이 방법은 여기에서 제시한 개선된 방법들을 이용하여 제조한 IgG 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
II. IVIG 제조 방법들
일반적으로, 본 발명에 따른 면역글로블린 조합물은 적합한 임의의 출발 물질들, 예를 들면, 회수된 혈장 또는 원천 혈장으로부터 제조할 수 있다. 전형적인 예에서, 혈액 또는 혈장은 건강한 기증자로부터 채집한다. 통상적으로, 혈액은 면역글로블린 준비물(preparation)이 투여되는 피험자와 동일한 종의 동물로부터 채집된다(전형적으로 "동족(homologous)" 면역글로블린이라고 함). 면역글로블린은 적합한 과정들, 예를 들면, 침전 (알코올 분별 또는 폴리에틸렌 글리콜 분별), 크로마토그래피 방법들 (이온 교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역친화력 크로마토그래피, 등) 한외원심분리, 그리고 전기영동적 준비 및 이와 유사한 것들을 이용하여 혈액으로부터 단리시킨다(가령, Cohn et al, J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley et al, J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barunderna et al, Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al, Vox Sang 13:93-102 (1967); U.S. 특허 제5,122,373호 및 제5,177,194호 참고; 다목적으로 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다).
많은 경우들에서, 면역글로블린은 당업계에 잘 공지된 알코올 분별 및/또는 이온 교환 및 친화력 크로마토그래피 방법들에 의해 생산되는 감마 글로블린-함유 산물들로부터 준비된다. 예를 들면, 정제된 Cohn 분획물 II은 면역글로블린의 단리를 위한 출발점으로 흔히 이용된다. 출발 Cohn 분획물 II 페이스트는 전형적으로 약 95% IgG이며, 4가지 IgG 아류형(subtypes)으로 구성된다. 상이한 아류형들은 이들이 수득된 채집된 인간 혈장에서 발견되는 것과 대략적으로 동일한 비율로 분획물 II에 존재한다. 분획물 II는 투여가능한 산물로 제제화하기 전 추가 정제한다. 예를 들면, 분획물 II 페이스트는 냉각 정제된 수성 알코올 용액에서 용해시킬 수 있으며, 불순물은 침전 및 여과를 통하여 제거할 수 있다. 최종 여과 후, 알코올을 제거하기 위하여, 면역글로블린 현탁액은 투석시키거나, 정용여과시킬 수 있다(가령, 100,000 daltons 이하의 명목상 분자량 한계를 갖는 한외여과막을 이용). 이 용액을 농축 또는 희석시켜, 원하는 단백질 농도를 얻을 수 있고, 그리고 당업계에 공지되어 기술을 이용하여 추가 정제할 수 있다.
더욱이, 추가 준비 단계들을 이용하여 면역글로블린의 특정 아이소타입 또는 아류형을 농축시킬 수 있다. 예를 들면, 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 H 세파로즈 크로마토그래피를 이용하여 IgG, 또는 특이적 IgG 아류형에 대해 면역글로블린 혼합물을 농축시킬 수 있다. 일반적으로 Harlow and Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); 그리고 U.S. 특허 제5,180,810호 참고, 모든 목적을 위하여 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
상기에서 설명된 방법들과는 달리, 한 측면에서 본 발명은 동결-불량 출발 물질을 이용하는 농축된 IgG 조성물들을 준비하는 방법들을 제시한다. 일반적으로, 여기에서 제시된 방법들은 현재 시판되는 IVIG 조합물에서 볼 수 있는 품질과 비교하여 개선되지 않았다면, 동일한 품질을 유지하면서, 우수한 IgG 산출량을 제공하기 위하여 변형된 Cohn-Oncley 알코올 분별 단계 및 이온 교환 크로마토그래피를 모두 이용한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서 원시 혈장 출발 물질에서 볼 수 있는 IgG 함량의 75%에 근접하게 포함된 최종 벌크 IgG 조성물을 생산하는 방법들을 제공한다. 이들 방법들은 정제 분야에서 기존 방법들보다 전반적으로 IgG 산출량을 최소한 10% 내지 12% 증가시킨다. 예를 들면, GAMMAGARD® LIQUID 제조 공정은 출발 물질에서 볼 수 있는 IgG 함량의 약 60% 내지 65% 사이의 최종 산출량을 제공하는 것을 예측한다. 이와 같이, 여기에서 제시된 방법들은 기존 IgG 정제 기술보다 상당한 개선을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 가공하지 않은 혈장 출발 물질에서 볼 수 있는 IgG 함량의 최소한 70%를 함유하는 정제된 IgG 조성물을 제공한다. 또다른 구체예에서, 가공하지 않은 혈장 출발 물질에서 볼 수 있는 IgG 함량의 최소한 75%를 함유하는 정제된 IgG 조성물을 제공한다. 다른 구체예들에서, 여기에서 제공되는 정제된 IgG 조성물은 가공하지 않은 혈장 출발 물질에서 볼 수 있는 IgG 함량의 최소한 65%를 함유할 수 있거나, 또는 가공하지 않은 혈장 출발 물질에서 볼 수 있는 IgG 함량의 최소한 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75% 또는 그 이상을 함유할 수 있다.
A. 변형된 알코올 침전/이온 교환 크로마토그래피 분별 방법들
한 측면에서, 본 발명은 IVIG 요법에 사용하기에 적합한 IgG 조성물들을 제조하는 개선된 방법들을 제공한다. 일반적으로, 이들 방법들은 시판되는 IVIG 산물들의 생산에 이용되는 현재 방법들보다 더 높은 산출량을 갖고, 순도가 더 높지는 않더라도 필적할 수준의 순도를 갖는 IgG 조합물을 제공한다.
한 가지 특이적 측면에서, 본 발명은 혈장으로부터 농출된 IgG, 가령, 10% IVIG의 조성물을 준비하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 최소한 1회의 알코올 침전 단계와 최소한 1회의 이온 교환 크로마토그래피 단계를 실행하는 것을 포함한다. 특히, 개선된 상류(upstream) 공정에서 몇 단계들은 기존 공정과는 상이한데, 가령, 더 낮은 온도에서 25% 에탄올의 이용, 분무에 의한 에탄올 첨가, 분무에 의해 pH 조정, 그리고 미세하게 분할된 실리카 입자들의 이용.
특정 구체예에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 제 1 침전 단계에서 IgG가 농축된 상청액을 수득하기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3 사이의 pH에서 약 6% 내지 약 10% 알코올로 동결-불량 혈장 분획물을 침전시키는 단계, (b) 제 1 침전물을 형성시키기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3 사이의 pH 및 저온에서 약 20% 내지 약 30% 알코올로 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (c) 현탁액을 만들기 위하여 단계 b)에서 형성된 제 1 침전물을 재현탁시키는 단계, (d) 단계 c)에서 형성된 현탁액을 세제로 처리하는 단계, (e) 제 2 침전물을 형성시키기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3 사이의 pH에서 약 20% 내지 약 30% 알코올로 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (f) 현탁액을 만들기 위하여 단계 e)에서 형성된 제 2 침전물을 재현탁시키는 단계, (g) 단계 f)에서 형성된 현탁액을 용매 및/또는 세제로 처리하는 단계, 그리고 (h) 최소한 1회의 이온 교환 크로마토그래피 분별을 실행하고, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 준비하는 단계. 한 구체예에서, 이 방법은 단계 c)에서 형성된 현탁액을 미세하게 분할된 이산화규소 (Si02)로 처리하고, 단계 d)전에 이 용액을 여과시키는 것을 더 포함한다.
한 구체예에서, 혈장으로부터 농축된 IgG 조성물을 준비하는 방법을 제시하는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 동결-불량 혈장 분획물의 pH를 약 7.0로 조정하는 단계, (b) 단계 a)의 동결-불량 혈장 분획물의 에탄올 농도를 약 -5℃ 내지 약 -9℃의 온도에서 (약) 25% (v/v)로 조정하고, 이에 의해 혼합물을 형성시키는 단계, 여기에서 에탄올 농도는 분무에 의해 조절할 수 있으며, (c) 단계 b)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리시키는 단계, (d) 단계 c)의 침전물을 인산염과 아세트산염을 함유하는 완충액으로 재현탁시키는 단계, 여기에서 완충액의 pH는 완충액 1000L 당 약 400 내지 약 700 ml의 빙초산으로 조정하고, 이에 의해 현탁액이 형성되는 단계, (e) 미세하게 분할된 이산화실리콘 (Si02)과 단계 d)의 현탁액을 최소한 약 30 분 동안 혼합하는 단계, (f) 이 현탁액을 압착식 여과기로 여과시키고, 이에 의해 여과액이 형성되는 단계, (g) 인산염 및 아세트산염을 함유하는 완충액을 압착식 여과기의 무용 용적(dead volumes)의 최소한 3 용적으로 압착식 여과기를 세척시키는 단계, 여기에서 완충액의 pH는 완충액 1000L 당 약 150 ml의 빙초산으로 조정하고, 이에 의해 세척 용액이 형성되며, (h) 단계 f)의 여과액을 단계 g)의 세척 용액에 복합시키고, 이에 의해 용액이 형성되며, 그리고 이 용액을 세제로 처리하는 단계, (i) 단계 h)의 용액의 pH를 약 7.0으로 조정하고, 그리고 에탄올을 최종 농도가 (약) 25%가 되도록 추가하고, 이에 의해 침전물이 형성되는 단계, 여기에서 에탄올 농도 및/또는 pH는 분무에 의해 조정되며, (j) 단계 i)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하는 단계, (k) 용매 또는 세제를 포함하는 수성 용액에 이 침전물을 용해시키고, 그리고 이 용액은 최소한 60 분간 유지시키는 단계, (1) 단계 k) 이후 이 용액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시키고, 컬럼에 흡착된 단백질들을 용출액으로 용리시키는 단계, (m) 단계 l)의 용리물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 유출물(effluent)(가령, 관통-흐름)을 생성시키는 단계, (n) 단계 m)의 유출물은 나노필터를 통과시켜 나노여과액을 생성시키는 단계, (o) 단계 n)의 나노여과액은 한외여과 막을 통과시켜 한외여과액을 생성시키는 단계; 그리고 (p) 단계 o)의 한외여과액은 정용여과 완충액에 대하여 정용여과시켜 약 8% (w/v) 내지 약 22% (w/v) 범위의 단백질 농도를 보유하는 정용여과액을 생성시키고, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 수득하는 단계. 한 구체예에서, 단계 b)의 온도는 (약) -7℃이다. 한 특이적 구체예에서, 단계 d)에서 현탁액 완충액은 약 600 mL의 빙초산으로 조정된다.
특정 구체예들에서, 정용여과물(diafiltrate)은 약 8% 내지 약 12%의 단백질 농도, 예를 들면, 약 8%, 또는 약 9%, 10%, 11%, 또는 12%의 단백질 농도를 보유할 것이다. 바람직한 구체예에서, 이 정용여과물은 (약) 10%의 단백질 농도를 가질 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 이 정용여과물은 (약) 11%의 단백질 농도를 가질 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 이 정용여과물은 (약) 12%의 단백질 농도를 가질 것이다. 다른 구체예들에서, 이 정용여과물은 약 13% 내지 약 17%, 예를 들면, 약 13%, 또는 약 14%, 15%, 16%, 또는 17%의 단백질 농도를 가질 것이다. 기타 구체예들에서, 이 정용여과물은 약 18% 내지 약 22%, 예를 들면, 약 18%, 또는 약 19%, 20%, 21%, 또는 22%의 단백질 농도를 가질 것이다. 바람직한 구체예에서, 이 정용여과물은 (약) 20%의 단백질 농도를 가질 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 이 정용여과물은 (약) 21%의 단백질 농도를 가질 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 이 정용여과물은 (약) 22%의 단백질 농도를 가질 것이다.
본 발명의 특정 구체예들에서, 여기에서 제공된 방법들은 상기에서 설명된 분별 공정 단계중 두 가지 이상의 단계에서 개선점들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 구체예들은 제 1 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 용해단계, 및/또는 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 개선점들을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 제 1 침전 단계에서 만들어진 개선점은 분무에 의해 알코올을 첨가한다는 점이다 또다른 구체예에서, 제 1 침전 단계에서 만들어진 개선점은 분무에 의해 pH 변경 물질을 첨가하는 점이다. 추가 구체예에서, 제 1 침전 단계에서 만들어진 개선점은 알코올을 첨가한 후, 용액의 pH 조정이다. 관련된 구체예에서, 제 1 침전 단계에서 만들어진 개선점은 알코올을 첨가하는 동안 pH를 유지시키는 점이다. 또다른 관련된 구체예에서, 제 1 침전 단계에서 만들어진 개선점은 침전 항온처리 기간 동안 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써 pH를 유지시키는 점이다. 특정 구체예들에서, 제 1 침전 단계는 이들 개선점중 하나 이상의 제공에 의해 개선될 수 있다. 이 단계에서 실현될 수 있는 추가 개선점들은 하기 제 1 침전 단계 - 변형된 분별 I을 논의하는 단락으로부터 명백해질 것이다. 상기 설명된 하나 이상의 개선점을 제공함으로써, 제 1 침전 단계의 침전물 분획물에서 손실되는 IgG의 양은 감소되며 및/또는 침전 단계 동안 IgG의 분획물이 비가역적으로 변성되는 것도 감소된다.
한 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계에서 만들어진 개선점은 분무에 의해 알코올을 첨가한다는 점이다. 또다른 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계에서 만들어진 개선점은 분무에 의해 pH 변경 물질을 첨가하는 점이다. 추가 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계에서 만들어진 개선점은 알코올을 첨가한 후, 용액의 pH 조정이다. 관련된 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계에서 만들어진 개선점은 알코올을 첨가하는 동안 pH를 유지시키는 점이다. 또다른 관련된 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계에서 만들어진 개선점은 침전 항온처리 기간 동안 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써 pH를 유지시키는 점이다. 또다른 측면에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계는 알코올의 농도를 (약) 25%으로 증가시킴으로써 개선된다. 여전히 또다른 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계는 항온처리 온도를 약 -7℃ 내지 -9℃로 낮춤으로써 개선된다. 특정 구체예들에서, 변형된 분획물 II+III 침전 단계는 이들 개선점중 하나 이상의 제공에 의해 개선될 수 있다. 이 단계에서 실현될 수 있는 추가 개선점들은 제 2 침전 단계 - 변형된 분별 II+III를 논의하는 단락으로부터 명백해질 것이다. 상기 설명된 하나 이상의 개선점을 제공함으로써, 변형된 분획물 II+III 침전 단계의 침전물 분획물에서 손실되는 IgG의 양은 감소되며 및/또는 침전 단계 동안 IgG의 분획물이 비가역적으로 변성되는 것도 감소된다.
한 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 용해 단계에서 만들어진 개선은 용해 완충액의 빙초산 함량을 약 0.06%으로 증가시킴으로써 얻어진다. 또다른 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 용해 단계에서 만들어진 개선은 용해 항온처리 기간 동안 이 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써, 이 용액의 pH를 유지시켜 얻어진다. 또다른 구체예에서, 변형된 분획물 II+III 용해 단계에서 만들어진 개선은 미세하게 분할된 이산화실리콘 (Si02)을 여과 전에 분획물 II+III 현탁액과 혼합함으로써 얻어진다. 특정 구체예들에서, 변형된 분획물 II+III 용해 단계는 이들 개선점중 하나 이상의 제공에 의해 개선될 수 있다. 이 단계에서 실현될 수 있는 추가 개선점들은 변형된 분획물 II+III 용해 단계 - 변형된 분획물 II+III 침전물의 추출을 논의하는 단락으로 명백해질 것이다. 상기 설명된 하나 이상의 개선점을 제공함으로써, 분획물 II+III 현탁액으로부터 회수되는 IgG의 양은 증가되며 및/또는 분획물 II+III 현탁액에 있는 불순물의 양은 감소된다.
변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 만들어진 예시적인 개선점은 1000L 당 (약) 150 mL 빙초산을 함유하는 용해 완충액의 최소한 3.6 무용 용적으로 여과기를 후-세척(post-washing)함으로써 실현된다. 이 단계에서 실현될 수 있는 추가 개선점들은 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계 - 변형된 분획물 II+III 현탁액의 선처리 및 여과를 논의하는 단락으로 명백해질 것이다. 상기 설명된 하나 이상의 개선점을 제공함으로써, 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계 동안 손실되는 IgG의 양은 감소된다.
한 구체예에서, 이 방법은 제 1 침전 단계 및 변형된 분획물 II+III 침전 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 제 1 침전 단계 및 변형된 분획물 II+III 용해 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 제 1 침전 단계 및 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 변형된 분획물 II+III 침전 단계 및 변형된 분획물 II+III 용해 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 변형된 분획물 II+III 침전 단계 및 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 변형된 분획물 II+III 용해단계 및 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 제 1 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 침전 단계, 및 변형된 분획물 II+III 용해단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 제 1 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 침전 단계, 및 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 제 1 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 용해단계, 및 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 변형된 분획물 II+III 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 용해단계, 및 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 개선점을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이 방법은 제 1 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 용해단계, 및 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계 모두에서 개선점을 포함할 수 있다.
특정 구체예들에서, 여기에서 제공되는 IgG 정제 방법들에서 한 가지 공정 개선점은 하나 이상 용액이 유동성(fluent) 첨가에 의해 혈장 분획물로 도입되는 대신, 하나 이상의 용액을 분무 첨가하는 것을 포함한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서 이 공정 개선점은 하나 이상 단백질 종의 침전을 목적으로 알코올(가령, 에탄올)을 분무에 의해 혈장 분획물로 첨가하는 것을 포함한다. 다른 구체예들에서, 분무에 의해 혈장 분획물로 추가될 수 있는 용액은 pH 변경 용액, 용매용액, 세제 용액, 희석 완충액, 전도성 변경 용액, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상 알코올 침전 단계는 알코올을 혈장 분획물로 분무에 의해 추가하여 실행한다. 제 2 바람직한 구체예에서, 하나 이상 pH 조정 단계들은 pH 변경 용액을 혈장 분획물로 분무에 의해 추가하여 실행한다.
특정 구체예들에서, 임의의 기타 공정 개선점과 복합시킬 수 있는 또다른 공정 개선점은 침전 물질 (가령, 알코올 또는 폴리에틸렌 글리콜)의 추가 후 및/또는 추가와 동시에 침전되는 혈장 분획물의 pH를 조정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 활발하게 침전되는 혈장 분획물의 pH는 pH를 지속적으로 모니터링하고 조정함으로써 전체 침전 항온처리 단계 또는 유지(hold) 단계를 통하여 유지되는 공정 개선점이 제공된다. 바람직한 구체예들에서, pH의 조정은 pH 변경 용액을 분무에 의해 첨가함으로써 실행된다.
다른 구체예들에서, 임의의 기타 공정 개선점과 복합시킬 수 있는 또다른 공정 개선점은 또다른 공정 개선점은 불순물을 제거하기 위하여 미세하게 분할된 실리카 처리 단계의 이용을 포함한다.
1. 동결-불량 혈장의 준비
농축된 IgG 조성물들을 준비하는데 이용되는 출발 물질은 일반적으로 회수된 혈장 (가령, 생체외에서 전혈로부터 분리된 혈장) 또는 원천 혈장 (가령, 혈장분리반출을 통하여 채집된 혈장)으로 구성된다. 정제 공정은 전형적으로 기존에 냉동시킨 채집된 혈장을 해동시키는 것으로 시작되는데, 안전성 및 품질 고려를 위하여 기존 혈장은 이미 분석하였다. 해동(Thawing)은 전형적으로 6℃ 보다 더 높지 않은 온도에서 실시한다. 냉동된 혈장은 낮은 온도에서 완전하게 해동시킨 후, 원심분리는 액체 상청액으로부터 고체 한냉-침전물을 분리시키기 위하여 차가운 상태(가령, ≤6℃)에서 실행한다. 대안으로, 분리 단계는 원심분리 보다는 여과에 의해 분리 단계를 실행할 수 있다. 액체 상청액 (또는 새로 해동된 혈장으로부터 한냉-불용성 단백질들을 원심분리에 의해 제거한 후 "동결-불량(cryo-poor) 혈장"으로도 불림)은 다음 단계로 진행된다. 8 억제물질 우회 활성 인자(FEIBA), 인자 IX-복합체, 인자 VII-응축물, 또는 항트롬빈(Antithrombin) III-복합체의 단리를 위하여 이 시점에 다양한 추가 단계들을 취할 수 있다.
2. 제 1 침전 사건 - 변형된 분별 I
이 단계에서, 동결-불량 혈장은 전형적으로 약 0 ± 1℃로 냉각시키고, pH는 약 7.0 내지 약 7.5, 바람직하게는 약 7.1 내지 약 7.3, 가장 바람직하게는 약 7.2로 조정한다. 한 구체예에서, 동결-불량 혈장의 pH는 (약) 7.2로 조정한다. 그 다음 혈장을 교반시키면서, 에탄올의 표적 농도가 (약) 8% v/v되도록 사전-냉각시킨 에탄올을 추가한다. 동시에 온도는 약 -4 내지 약 0℃로 더 낮춘다. 바람직한 구체예에서, α2마크로글로블린, β1A- 및 β1C-글로블린, 피브리노겐, 및 인자 VIII와 같은 오염물질들을 침전시키기 위하여 온도는 (약) -2℃로 낮춘다. 전형적으로, 침전 사건은 최소한 약 1 시간의 유지 시간을 포함할 수 있지만, 유지시간은 더 짧거나 더 길 수도 있다. 그 다음 이어서, 동결-불량 혈장에 존재하는 IgG 함량 전부를 이상적으로 포함하는 상청액 (상청액 I)은 원심분리, 여과, 또는 또다른 적합한 방법에 의해 채집한다.
동결-불량 혈장 (Cohn et al, supra; Oncley et al, supra)의 경우 제 1 분별 단계로 이용되는 통상적인 방법들과 비교하였을 때, 몇 가지 구체예들에서 본 발명은 상청액 I 분획물에서 개선된 IgG 산출량을 얻는 방법들을 제공한다. 한 구체예에서, 개선된 IgG 산출량은 알코올을 분무로 추가할 때 얻어진다. 또다른 구체예에서, 개선된 IgG 산출량은 pH 변경 물질을 분무로 추가할 때 얻어진다. 여전히 또다른 구체예에서, 개선된 IgG 산출량은 알코올을 첨가한 후, 용액의 pH를 조정함으로써 얻어진다. 관련된 구체예에서, 개선된 IgG 산출량은 알코올을 첨가하는 동안 용액의 pH를 조정함으로써 얻어진다.
한 가지 특이적 측면에서, 이 개선점은 제 1 침전 단계의 침전물 분획물에서 손실되는 IgG의 양이 감소되는 방법과 관련있다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, Cohn 방법 6 프로토콜의 제 1 침전 단계에서 손실된 IgG의 양과 비교하였을 때, 제 1 침전 단계의 침전물 분획물에서 손실되는 IgG의 양이 감소된다.
특정 구체예들에서, 이 공정 개선점은 침전 알코올을 첨가한 후 용액의 pH를 약 7.0 내지 약 7.5로 조정함으로써 실현된다. 다른 구체예들에서, 용액의 pH는 침전 알코올을 첨가한 후 용액의 pH를 약 7.1 내지 약 7.3으로 조정한다. 다른 구체예들에서, 용액의 pH는 침전 알코올을 첨가한 후 약 7.0 또는 약 7.1, 7.2, 7,3, 7.4, 또는 7.5으로 조정한다. 특정 구체예에서, 용액의 pH는 침전 알코올을 첨가한 후 용액의 pH를 약 7.2로 조정한다. 이렇게 함으로써, 특정 구체예들에서, pH를 침전 알코올을 추가한 후 조정한 것이 아니라 추가 전에 조정한 유사한 침전 단계와 비교하였을 때, 제 1 침전 단계의 침전물 분획물에서 손실되는 IgG의 양은 감소된다. 한 구체예에서, pH는 침전 유지 또는 항온처리 기간 동안 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써, 원하는 pH로 유지시킨다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
기타 특정 구체예들에서, 이 공정 개선점은 pH를 조절하기 위하여 이용된 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성 첨가에 의한 것이 아니라 분무에 의해 추가하였을 때 실현된다. 이렇게 함으로써, 특정 구체예들에서, pH를 조정하기 위하여 이용된 알코올 및/또는 용액이 유동성 첨가에 의해 도입된 유사한 침전 단계와 비교하였을 때, 제 1 침전 단계의 침전물 분획물에서 손실되는 IgG의 양은 감소된다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
기타 특정 구체예들에서, 개선점은 용액의 pH를 약 7.0 내지 약 7.5로 조정함으로써 실현된다. 바람직한 구체예에서, 용액의 pH는 약 7.1 내지 약 7.3으로 조정한다. 다른 구체예들에서, 용액의 pH는 침전 알코올을 첨가한 후, (약) 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5로 조정하며, 그리고 pH를 조정하기 위하여 이용된 알코올 및/또는 용액은 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가한다. 특정 구체예에서, 용액의 pH는 침전 알코올을 첨가한 후, (약) 7.2로 조정하며, 그리고 pH를 조정하기 위하여 이용된 알코올 및/또는 용액은 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가한다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
3. 제 2 침전 사건 - 변형된 분별 II+III
분획물의 IgG 함량 및 순도를 더 향상시키기 위하여, 상청액 I은 제 2 침전 단계를 거치는데, 이는 변형된 Cohn-Oncley 분획물 II+III 분별이다. 일반적으로, 용액의 pH는 약 6.6 내지 약 6.8로 조정한다. 바람직한 구체예에서, 용액의 pH는 (약) 6.7로 조정한다. 알코올, 바람직하게는 에탄올은 분획물에서 IgG를 침전시키기 위하여 용액을 교반시키면서 최종 농도가 약 20% 내지 약 25% (v/v)가 되도록 용액에 추가한다. 바람직한 구체예에서, 알코올은 분획물에서 IgG를 침전시키기 위하여 용액을 교반시키면서 최종 농도가 (약) 25%가 되도록 추가한다. 일반적으로, 오염물질들 가령, α1-지단백질, α1-항트립신, Gc-글로블린, α1X-당단백질, 합토글로블린, 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 트란스페린, 헤모페신(hemopexin), Christmas 인자의 분획물, 티록신(thyroxin) 결합 글로블린, 콜린에스테라아제, 하이퍼텐시노겐(hypertensinogen), 그리고 알부민은 이들 조건들에서 침전되지 않을 것이다.
알코올 첨가 전 또는 첨가와 동시에, 이 용액은 약 -7℃ 내지 약 -9℃로 추가 냉동시킨다. 바람직한 구체예에서, 이 용액은 (약) -7℃로 냉각시킨다. 알코올 첨가를 완료한 후, 이 용액의 pH는 즉시 약 6.8 내지 약 7.0로 조정한다. 바람직한 구체예에서, 이 용액의 pH는 (약) 6.9로 조정한다. 전형적으로, 침전 사건은 최소한 약 10 시간의 유지시간을 포함할 것이지만, 더 긴 또는 더 짧은 유지시간을 이용할 수도 있다. 그 다음 이어서, 이상적으로는 동결-불량 혈장에 존재하는 IgG 함량의 최소한 약 85%, 바람직하게는 최소한 약 90%, 더 바람직하게는 최소한 약 95%을 함유하는 침전물 (변형된 분획물 II+III)은 원심분리, 여과, 또는 또다른 적합한 방법에 의해 상청액으로부터 분리시키고, 채집한다. 동결-불량 혈장 (Cohn et al, supra; Oncley et al, supra)을 위한 제 2 분별 단계로 이용된 통상적인 방법들과 비교하였을 때, 몇 가지 구체예들에서 본 발명은 변형된 분획물 II+III 침전물에서 개선된 IgG 산출량을 얻는 방법들을 제공한다. 관련된 구체예에서, 본 발명은 변형된 II+III 상청액에서 IgG 손실을 감소시킨 방법들을 제공한다.
동결-불량 혈장 (Cohn et al, supra; Oncley et al, supra)을 위한 제 2 분별 단계로 이용된 통상적인 방법들과 비교하였을 때, 몇 가지 구체예들에서 본 발명은 변형된 분획물 II+III 침전물에서 개선된 IgG 산출량을 얻는 방법들을 제공한다. 한 구체예에서, 이 개선점은 알코올을 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 개선점은 pH 변경 물질을 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 개선점은 알코올을 첨가한 후, 이 용액의 pH를 조정함으로써 실현된다. 관련된 구체예에서, 이 개선점은 알코올을 첨가하는 동안 이 용액의 pH를 조정함으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 개선점은 알코올 (가령, 에탄올)의 농도를 약 25% (v/v)로 증가시킴으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 개선점은 침전 단계의 온도를 약 -7℃ 내지 -9℃로 낮춤으로써 실현된다. 바람직한 구체예에서, 이 개선점은 알코올 (가령, 에탄올)의 농도를 약 25% (v/v)로 증가시키고, 그리고 온도는 약 -7℃ 내지 -9℃로 낮춤으로써 실현된다. 비교를 위하여, 침전물에서 오염물질들의 수준을 낮추기 위하여, Cohn et al. and Oncley et al.는 -5℃에서 침전을 실시하고, 그리고 Oncley et al.는 20% 알코올을 이용한다. 유익하게, 여기에서 제공되는 이 방법들은 최종 산물에서 높은 오염 수준없이 최대의 IgG 산출을 허용한다.
이 용액의 pH를 침전 알코올을 첨가하기 전 약 6.9로 조정하였을 때, 이 용액의 pH는 단백질 침전의 일부 원인으로 인하여 pH 6.9로부터 약 7.4 내지 약 7.7로 이동한다는 것을 알았다(도 8). 이 용액의 pH가 6.9로부터 멀어져 버리기 때문에, IgG의 침전은 덜 유익하게 되고, 특정 오염물질들의 침전은 더 유익하게 된다. 유익하게, 발명자들은 침전 알코올의 첨가후, 이 용액의 pH를 조정하면, 분획물 II+III 침전물에서 더 높은 비율의 IgG가 회수된다는 사실을 알았다.
따라서, 한 측면에서, 이 개선점은 변형된 분획물 II+III 침전 단계의 상청액 분획물에서 손실되는 IgG의 양이 감소되는 방법과 관련된다. 환언하면, 증가된 비율의 출발 IgG가 분획물 II+III 침전물에 존재한다는 것이다. 특정 구체예들에서, 이 공정 개선점 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안 이 용액의 pH를 약 6.7 내지 약 7.1로 조정함으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 공정 개선점은 이 용액의 pH를 침전 항온처리 기간 동안 지속적으로 약 6.7 내지 약 7.1로 유지시킴으로써 실현된다. 다른 구체예들에서, 이 용액의 pH는 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안 pH 약 6.8 내지 약 7.0로 조정하거나, 또는 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안 pH 약 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 또는 7.1로 조정한다. 특정 구체예에서, 이 용액의 pH는 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안 약 6.9로 조정한다. 특정 구체예들에서, 이 용액의 pH는 침전 항온처리 기간 지속적으로 약 6.8 내지 약 7.0으로 유지되며, 또는 침전 항온처리 기간 동안 지속적으로 pH 약 6.9에서 유지된다. 이렇게 함으로써, 특정 구체예들에서, 이 용액의 pH가 침전 알코올의 첨가 후 조정된 것이 아닌 첨가 전에 조정된 유사한 침전 단계 또는 침전 항온처리 기간 전체를 통하여 용액의 pH가 유지되지 않은 유사한 침전 단계와 비교하였을 때, 제 2 침전 단계의 상청액 분획물에서 IgG의 손실양은 감소된다. 한 구체예에서, 이 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써, 침전 유지 또는 항온처리 기간 동안 원하는 pH에서 pH를 유지시킨다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
또다른 구체예에서, 이 공정 개선점은 pH를 조정하기 위하여 이용하는 침전 알코올 및/또는 이 용액을 유동성 첨가에 의해 첨가하지 않고 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 이렇게 함으로써, 특정 구체예들에서, pH를 조정하기 위하여 이용하는 침전 알코올 및/또는 이 용액을 유동성 첨가를 통하여 도입한 유사 침전 단계와 비교하였을 때, 제 2 침전 단계의 상청액 분획물에서 손실되는 IgG의 양은 감소된다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
또다른 구체예에서, 이 공정 개선점은 약 -7℃ 내지 약 -9℃의 온도에서 침전 단계를 실행함으로써 실현된다. 한 구체예에서, 이 침전 단계는 (약) -7℃의 온도에서 실행한다. 또다른 구체예에서, 이 침전 단계는 (약) -8℃의 온도에서 실행한다. 또다른 구체예에서, 이 침전 단계는 (약) -9℃의 온도에서 실행한다. 특정 구체예들에서, 이 침전 단계의 알코올 농도는 약 23% 내지 약 27%이다. 바람직한 구체예에서, 알코올 농도는 약 24% 내지 약 26%이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 알코올 농도는 (약) 25%이다. 다른 구체예들에서, 알코올 농도는 (약) 23%, 24%, 25%, 26%, 또는 27%일 수 있다. 특정 구체예에서, 제 2 침전 단계는 (약) 25%의 알코올 농도로 (약) -7℃의 온도에서 실행한다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
제 2 침전의 알코올 농도를 Oncley et al, supra에서 이용한 것과 같은 20%로부터 25%로 증가시키고, 그리고 항온처리 온도를 Cohn and Oncley 방법들에서 이용된 것과 같이 -5℃로부터 (약) -7℃로 더 낮추는 효과는 변형된 분획물 II+III 침전물 안에 IgG 함량을 5%에서 6%의 증가가 된다.
또다른 구체예에서, 이 공정 개선점은 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안 이 용액의 pH를 약 6.7 내지 약 7.1, 바람직하게는 (약) 6.9로 조정하고, 이 침전 항온처리 기간 동안 이 pH를 지속적으로 조절함으로써 pH를 약 6.7 내지 약 7.1, 바람직하게는 (약) 6.9로 유지시키고, 그리고 pH를 조정하기 위하여 이용하는 침전 알코올 및/또는 이 용액을 유동성 첨가에 의해 도입시키기 보다는 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 또다른 특정 구체예에서, 이 공정 개선점은 이 침전 단계를 약 -7℃ 내지 약 -9℃, 바람직하게는 (약) -7℃의 온도에서 실시하고, 그리고 IgG를 약 23% 내지 약 27%, 바람직하게는 (약) 25% 농도의 알코올로 침전시킴으로써 실현된다. 또다른 특정 구체예에서, 이 공정 개선점은 상기에서 제공된 변형된 분획물 II+III 개선점들을 통함시킴으로써 실현된다. 바람직한 구체예에서, 이 공정 개선점은 (약) -7℃의 온도에서 분무에 의해 첨가되는 (약) 25%의 에탄올로 IgG를 침전시키고, 그 다음 이 용액의 pH는 이 침전 알코올을 첨가한 후 pH를 (약) 6.9로 조정함으로써 실현된다. 또다른 바람직한 구체예에서, 이 용액의 pH는 전체 이 침전 항온처리 또는 유지 기간 동안 (약) 6.9에서 유지된다.
4. 변형된 분획물 II+III 침전물의 추출
변형된 분획물 II+III 침전물의 IgG 함량을 가용화시키기 위하여, 냉각 추출 완충액을 이용하여 침전물과 추출 완충액 1: 15의 비율에서 분별 II+III 침전물을 재현탁시켰다. 기타 적합한 재-현탁액 비율을 이용할 수 있는데, 예를 들면 약 1:8에서 약 1:30까지, 또는 약 1:10에서 약 1:20까지, 또는 약 1:12에서 약 1:18까지, 또는 약 1:13에서 약 1:17까지, 또는 약 1:14에서 약 1:16까지의 비율을 이용할 수 있다. 특정 구체예들에서, 재-현탁액 비율은 약 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 또는 더 높을 수 있다.
변형된 II+III 침전물의 추출을 위한 적합한 용액들은 일반적으로 약 4.0 내지 약 5.5의 pH를 보유할 것이다. 특정 구체예들에서, 이 용액은 약 4.5 내지 약 5.0의 pH를 보유할 것이다. 다른 구체예들에서, 추출 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 또는 5.5의 pH를 보유할 것이다. 바람직한 구체예에서, 추출 완충액의 pH는 (약) 4.5일 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 추출 완충액의 pH는 (약) 4.7일 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 추출 완충액의 pH는 (약) 4.9일 것이다. 일반적으로, 이들 pH 요건은 예를 들면, 아세트산염, 구연산염, 단일염기 인산염, 2염기 인산염, 이의 혼합물 및 이와 유사한 것들로부터 선택된 완충물질을 이용하여 맞출 수 있다. 적합한 완충액 농도는 전형적으로 약 5 내지 약 100 mM, 또는 약 10 내지 약 50 mM, 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 mM 완충 물질 범위가 된다.
추출 완충액은 바람직하게는 약 0.5 mScm-1 내지 약 2.0 mScm-1의 전도성을 가질 것이다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 추출 완충액의 전도성은 약 0.5 mScm-1, 또는 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 약 2.0 mScm-1을 가질 것이다. 당업자는 적합한 전도성을 보유하는 추출 완충액을 어떻게 만드는지 알고 있을 것이다.
한 특정 구체예에서, 예시적인 추출 완충액은 (약) 4.5 ± 0.2의 pH와 (약) 0.7 내지 0.9 mS/cm의 전도성에서 (약) 5 mM 단일염기 인산나트륨염 및 (약) 5 mM 아세트산염을 함유할 수 있다.
일반적으로, 추출은 약 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 실시한다. 특정 구체예들에서, 추출은 약 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃에서 실시할 수 있다. 특정 구체예에서, 추출은 약 2℃ 내지 약 10℃에서 실시한다. 전형적으로, 추출 공정은 약 60 내지 약 300 분, 또는 약 120 내지 240 분, 또는 약 150 내지 210 분 동안 진행될 것이며, 진행과정동안 현탁액은 지속적으로 교반된다. 특정 구체예들에서, 이 추출 공정은 약 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 약 300 분 동안 진행될 것이다. 바람직한 구체예에서, 이 추출 공정은 지속적인 교반과 함께 최소한 160 분 동안 진행될 것이다.
5 mM 단일염기 인산나트륨염, 5 mM 아세트산염, 및 0.051% 내지 0.06% 빙초산 (v/v)을 함유하는 추출 완충액을 이용하면 최종 산물의 순도에 위협없이 최종 IgG 조성물에서 산출량 증가의 실질적 증가를 얻을 수 있다는 것을 알았다. 아세트산의 양과 추출 완충액 pH의 상관관계는 도 9에서 설명한다. 바람직한 구체예에서, 분획물 II+III 침전물은 pH of (약) 4.5 ± 0.2의 pH에서 페이스트 대 완충액을 (약) 1:15의 비율로 하여, 페이스트로 추출한다.
유익하게, GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare)의 경우, 5 mM 단일염기 인산나트륨염, 5 mM 아세트산염, 및 0.051% 빙초산 (v/v)을 함유하는 추출 완충액을 이용하는 현행 제조 공정과 비교하였을 때, 빙초산 함량을 (약) 0.06% (v/v)로 증가시킴으로써, IgG 조성물에서 산출량 증가의 실질적 증가를 얻을 수 있다는 것을 알았다. 제 2 침전 단계 (GAMMAGARD® LIQUID)에 의해 형성된 침전물의 추출을 위하여 이용된 기존 방법들과 비교하였을 때, 몇 가지 구체예들에서, 본 발명은 변형된 분획물 II+III 현탁액에서 개선된 IgG 산출량을 얻는 방법들을 제공한다.
한 측면에서, 이 개선점은 변형된 분획물 II+III 침전물의 비-가용화되는 분획물에서 IgG의 손실량이 감소된 방법과 관련된다. 한 구체예에서, 이 공정 개선점은 5 mM 단일염기 인산나트륨염, 5 mM 아세트산염, 및 0.06% 빙초산 (v/v)을 함유하는 용액으로, 1:15 비율로(완충액에 대한 침전물의 비율)에서 변형된 분획물 II+III 침전물을 추출함으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 개선점은 추출 공정 동안 용액의 pH를 유지시킴으로써 실현된다. 한 구체예에서, 이 용액의 pH는 추출 공정 동안 약 4.1 내지 약 4.9에서 유지된다. 바람직한 구체예에서, 이 용액의 pH는 추출 공정 동안 약 4.2 내지 약 4.8에서 유지된다. 더 바람직한 구체예에서, 이 용액의 pH는 추출 공정 동안 약 4.3 내지 약 4.7에서 유지된다.. In 또다른 바람직한 구체예에서, 이 용액의 pH는 추출 공정 동안 약 4.4 내지 약 4.6에서 유지된다. 또다른 바람직한 구체예에서, 이 용액의 pH는 추출 공정 동안 (약) 4.5에서 유지된다.
또다른 측면에서, 이 개선점은 분획물 II+III 용해단계에서 분획물 II+III 침전물로부터 가용화되는 IgG의 양이 증가되는 방법과 관련있다. 한 구체예에서, 이 공정 개선점은 1000 L당 600 mL의 빙초산을 함유하는 용해 완충액에 분획물 II+III 침전물을 용해시킴으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 개선점은 분획물 II+III 침전물에서 IgG가 용해된 후, 불순물이 감소되는 방법과 관련있다. 한 구체예에서, 이 공정 개선점은 미세하게 분할된 이산화실리콘 (Si02)을 분획물 II+III 현탁액에 최소한 약 30 분 동안 혼합시킴으로써 실현된다.
5. 변형된 분획물 II+III 현탁액의 전처리 및 여과
변형된 분획물 II+III 침전물의 비-가용화된 분획물 (가령, 변형된 분획물 II+III 필터 케이크)를 제거하기 위하여, 현탁액은 전형적으로 심층 여과(depth filtration)를 이용하여 여과시킨다. 여기에서 제공되는 방법들에서 이용할 수 있는 심층 여과필터는 금속성, 유리, 세라믹, 유기(가령, 규조토) 심층 여과필터, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 적합한 필터의 예는 Cuno 5OSA, Cuno 90SA, 및 Cuno VR06 필터(Cuno)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대안으로, 분리 단계는 여과보다는 원심분리에 의해 실시할 수 있다.
상기에서 설명된 제조 공정 개선점은 정제 공정의 초기 단계들에서 IgG의 손실을 최소화하지만, 4.9 내지 5.0 부근의 pH에서 추출을 실시한 경우와 비교하였을 때, pH 4.5 또는 4.6에서 II+III 페이스트를 추출할 경우 PKA 활성, 아미도용해성 활성, 및 피브리노겐 함량을 포함하는 결정적인 불순물이 훨씬 더 높다(실시예 2 내지 5 참고).
여기에서 제공되는 방법들에서 추출되는 불순물에 대항하기 위하여, 여과/원심분리 전 전처리 단계의 첨가에 의해 IgG 조성물의 순도가 상당히 강화될 수 있음을 알았다. 한 구체예에서, 이 전처리 단계는 미세하게 분할된 이산화규소 소립자들 (가령, 훈증된 실리카, Aerosil®)을 추가하고, 이어서 40 내지 80 분의 항온처리 기간을 갖는 것을 포함하는데, 이 항온처리 기간 동안 이 현탁액을 끊임없이 혼합시킨다. 특정 구체예들에서, 항온처리 기간은 약 50 분 내지 약 70 분, 또는 약 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 또는 그 이상일 수 있다. 일반적으로, 이 처리는 약 0℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 8℃에서 실시할 것이다. 특정 구체예들에서, 이 처리는 약 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃에서 실시할 수 있다. 특정 구체예에서, 이 처리는 약 2℃ 내지 약 10℃에서 실시한다.
훈증된 실리카 처리의 효과는 실시예 17에서 볼 수 있는 결과들로 예증된다. 이 실시예에서, 분획물 II+III 침전물은 현탁되고, 2개의 시료로 분할하는데, 이중 하나는 여과전 단지 여과 보조제만으로 정화되며(도 7A), 다른 하나는 여과 보조제의 첨가 및 여과 전, 훈증된 실리카로 처리한다(도 7B). 크로마토그래피와 정량화된 데이터에서 볼 수 있는 것과 같이, 훈증된 실리카로 전처리된 여과액 시료는 여과 보조제만으로 처리된 시료보다 훨씬 더 높은 IgG 순도를 보유하였다(68.8% vs. 55.7%; 차례로 표 17과 18에서 비교).
특정 구체예들에서, 훈증된 실리카는 약 20 g/kg II+III 페이스트 내지 약 100 g/kg II+III 페이스트의 농도에서 추가된다 (가령, 1: 15의 비율로 추출된 변형된 분획물 II+III 침전물의 경우, 훈증된 실리카는 약 20 g/16 kg II+III 현탁액 내지 약 100 g/16 kg II+III 현탁액의 농도에서, 또는 약 0.125% (w/w) 내지 약 0.625% (w/w)의 최종 농도로 추가해야만 한다). 특정 구체예들에서, 훈증된 실리카는 약 20 g/kg II+III 페이스트의 농도에서 추가할 수 있거나, 또는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 g/kg II+III 페이스트의 농도에서 추가할 수 있다. 한 특이적 구체예에서, 훈증된 실리카 (가령, Aerosil 380 또는 등가물)는 변형된 분획물 II+III 현탁액에 약 40 g/16 kg II+III의 최종 농도로 첨가한다. 약 2 내지 8℃의 온도에서 최소한 50 내지 70 분 동안 혼합한다.
특정 구체예들에서, 심층 여과를 실시하기 위하여, 여과 보조제, 예를 들면 Celpure C300 (Celpure) 또는 Hyflo-Supper-Cel (World Minerals)는 이산화규소 처리 후, 첨가할 것이다. 여과 보조제는 약 0.1 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.07 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.2 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.06 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.3 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.05 kg/kg II+III 페이스트의 최종 농도로 첨가할 수 있다. 특정 구체예들에서, 여과 보조제는 약 0.1 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 또는 0.7 kg/kg II+III 페이스트의 최종 농도로 첨가할 수 있다.
GAMMAGARD® LIQUID 제조 공정의 여과 단계 동안 IgG의 상당한 분획물을 잃었다. 현행 여과 후(post-filtration) 세척 방법들에서 압착식 여과기 프레임과 라인들을 정화시키는데 현탁액 완충액의 1.8 무용 용적을 이용하는 것은 이 단계에서 IgG를 최대로 회수하는데 불충분하다는 것을 알았다. 뜻밖에도, 변형된 분획물 II+III 정화된 현탁액에서 전체 IgG의 효과적인 회수를 위하여 최소한 3.0 무용 용적(dead volumes), 바람직하게는 3.6 무용 용적(dead volumes)의 현탁액 완충액이 요구되었다는 것을 알았다(실시예 12 및 도 1 참고). 특정 구체예들에서, 압착식 여과기는 임의의 적합한 현탁액 완충액으로 세척할 수 있다. 특정 구체예에서, 세척 완충액은 예를 들면, 5 mM 단일염기 인산나트륨염, 5 mM 아세트산염, 및 0.015% 빙초산 (v/v)을 포함할 것이다.
한 측면에서, 이 개선점은 분획물 II+III 현탁액 여과 단계 동안 손실되는 IgG의 양을 감소시키는 방법과 관련있다. 한 구체예에서, 이 공정 개선점은 1000L 당 150 mL의 빙초산을 함유하는 용해 완충액을 최소한 약 3.6 무용 용적(dead volumes)으로 필터를 후-세척함으로써 실현된다. 후-세척 완충액 안에 빙초산의 양과 pH의 상관관계는 도 10에서 볼 수 있다. 한 구체예에서, 후-세척 추출 완충액의 pH는 약 4.6 내지 약 5.3 사이다. 바람직한 구체예에서, 후-세척 완충액의 pH는 약 4.7 내지 약 5.2 사이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 후-세척 완충액의 pH는 약 4.8 내지 약 5.1 사이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 후-세척 완충액의 pH는 약 4.9 내지 약 5.0 사이다.
제 2 침전 단계 (GAMMAGARD® LIQUID)로부터 형성된 현탁액의 정화를 위하여 기존에 이용한 방법들과 비교하였을 때, 본 발명은 몇 가지 구체예들에서, 정화된 분획물 II+III 현탁액 내에 개선된 IgG 산출량과 순도를 가지는 방법들을 제공한다. 한 측면에서, 이 개선점은 변형된 분획물 II+III 필터 케이크에서 손실되는 IgG의 양을 감소시키는 방법과 관련있다. 다른 측면에서, 이 개선점은 정화된 분획물 II+III 현탁액에서 볼 수 있는 불순물의 양을 감소시키는 방법과 관련있다.
한 구체예에서, 이 공정 개선점들은 변형된 분획물 II+III 현탁액의 여과 또는 원심분리에 의한 정화 이전에 훈증된 실리카의 처리를 포함함으로써 실현된다. 특정 구체예들에서, 훈증된 실리카 처리는 약 0.01 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.07 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.02 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.06 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.03 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.05 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 또는 0.07 kg/kg II+III 페이스트의 첨가를 포함할 것이며, 혼합물은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 약 50 분 내지 약 70 분 동안, 또는 약 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 또는 그 이상의 시간(분) 동안 항온처리될 것이다. 또다른 구체예에서, 이 공정 개선점들은 잔류 피브리노겐, 아미도용해성 활성, 및/또는 프레칼리크레인(prekallikrein) 활성제 활성의 수준을 감소시켰던 훈증된 실리카 처리의 포함에 의해 실현된다.
또다른 구체예에서, 이 공정 개선점들은 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계를 완료한 후, 필터 무용 용적의 약 3 내지 약 5 용적으로 심층 필터를 세척함으로써 실현된다. 특정 구체예들에서, 필터는 필터 무용 용적의 약 3.5 용적 내지 약 4.5 용적, 또는 최소한 약 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 용적으로 세척될 것이다. 특정 구체예에서, 압착식 여과기는 현탁액 완충액의 최소한 약 3.6 무용 용적으로 세척될 것이다.
6. 세제 처리
변형된 분획물 II+III 여과액으로부타 추가 오염물질들을 제거하기 위하여, 시료는 그 다음 세제 처리를 받게 된다. 혈장 유도된 분획물의 세제 처리를 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 임의의 표준 비-이온성 세제 처리는 여기에서 제공된 방법들과 병용할 수 있다. 예를 들면, 세제 처리를 위한 예시적인 프로토콜은 하기에서 제공된다.
간략하게 설명하자면, 폴리소르베이트-80을 교반하면서 약 0.2% (w/v)의 최종 농도로 변형된 분획물 II+III 여과액에 첨가하고, 그리고 시료는 약 2 내지 8℃의 온도에서 최소한 30분간 항온처리한다. 그 다음 구연산나트륨염 탈수물은 그 다음 약 8 g/L의 최종 농도로 이 용액에 혼합하고, 그리고 시료를 약 2 내지 8℃의 온도에서 지속적으로 교반시키면서 추가 30분 동안 항온처리한다.
특정 구체예들에서, 임의의 적합한 비-이온성 세제를 이용할 수 있다. 적합한 비-이온성 세제의 예는 옥틸글루코시드, Digitonin), C12E8, Lubrol, Triton X-100, Nonidet P-40, Tween-20 (가령, 폴리소르베이트-20), Tween-80 (가령, 폴리소르베이트-80), 알킬 폴리(에틸렌 옥시드), Brij 세제, 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥시드), 폴옥사머, 옥틸 글루코시드, 데실 말토시드, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 공정 개선점은 세제 시약들 (가령 , 폴리소르베이트-80 및 구연산나트륨염 탈수물)을 유동성 첨가가 아닌 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 다른 구체예들에서, 세제 시약들은 변형된 분획물 II+III 여과액에 고체로 첨가할 수 있고, 첨가하는 동안 첨가제의 신속한 분포를 확보하기 위하여 시료를 혼합한다. 특정 구체예들에서, 여과액의 비국소화된 표면적 위로 고체 시약들을 뿌리기함으로써 고체 시약들을 첨가하는 것이 바람직하고, 이로써 유동성 첨가에서와 같이 국소적으로 과도한 집중이 일어나지 않는다.
7. 제 3 침전 사건 - 침전 G
몇 가지 잔류하는 작은 단백질들, 가령, 알부민 및 트란스페린을 제거하기 위하여, 25%의 알코올 농도에서 제 3 침전을 실시한다. 간략하게 설명하자면, 세제 처리된 II+III 여과액의 pH는 적합한 pH 변경 용액(가령, 1M 수산화나트륨 또는 1M 아세트산)으로 약 6.8 내지 7.2, 바람직하게는 약 6.9 내지 약 7.1, 가장 바람직하게는 약 7.0로 조정한다. 그 다음 냉각 알코올을 약 25% (v/v)의 최종 농도로 이 용액에 추가하고, 제 3 침전물 (가령, 침전물 G)이 형성되도록 혼합물은 약 -6℃ 내지 약 -10℃에서 최소한 1 시간 동안 교반시키면서 혼합물을 항온처리한다. 한 구체예에서, 이 혼합물은 최소한 2 시간, 또는 최소한 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 그 이상의 시간 동안 항온처리한다. 바람직한 구체예에서, 이 혼합물은 최소한 2 시간 동안 항온처리한다. 더 바람직한 구체예에서, 이 혼합물은 최소한 4 시간 동안 항온처리한다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 이 혼합물은 최소한 8 시간 동안 항온처리한다.
한 측면에서, 공정 개선점은 제 3 침전 단계의 상청액 분획물에서 손실되는 IgG의 양을 감소시키는 방법과 관련있다. 특정 구체예들에서, 이 공정 개선점은 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안 이 용액의 pH를 약 6.8 내지 약 7.2로 조정함으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이 공정 개선점은 이 용액의 pH를 침전 항온처리 기간 동안 약 6.8 내지 약 7.2로 조정함으로써 실현된다. 다른 구체예들에서, 이 용액의 pH를 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안, 약 6.9 내지 약 7.1로 pH를 조정하고, 또는 침전 알코올을 첨가한 후 또는 첨가하는 동안 즉시 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 또는 7.2로 pH를 조정한다. 특정 구체예에서, 이 용액의 pH를 침전 알코올을 첨가한 후 즉시, 또는 첨가 동안 약 7.0로 조정한다. 특정 구체예들에서, 이 용액의 pH를 침전 항온처리 기간 동안 지속적으로 약 6.9 내지 약 7.1로 유지시키거나, 또는 침전 항온처리 기간 동안 pH를 약 7.0으로 유지시킨다. 이렇게 함으로써, 특정 구체예들에서, 이 용액의 pH가 침전 알코올을 첨가한 후가 아닌 첨가하기 전에 조정된 유사한 침전 단계 또는 전체 침전 항온처리 기간 동안 이 용액의 pH가 유지되지 않은 유사 침전 단계와 비교하였을 때, 제 3 침전 단계의 상청액 분획물에서 손실되는 IgG의 양은 감소된다. 한 구체예에서, pH는 침전 유지 또는 항온처리 시간 동안 이 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써 원하는 pH에서 유지된다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
또다른 구체예에서, 이 공정 개선점은 pH를 조정하기 위하여 이용하는 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 이렇게 함으로써, 특정 구체예들에서, pH를 조정하기 위하여 이용하는 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성 첨가에 의해 도입시킨 유사한 침전 단계와 비교하였을 때, 제 3 침전 단계의 상청액 분획물에서 손실되는 IgG의 양이 감소된다. 한 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
8. 침전물 G (PptG)의 현탁액과 여과
침전물 G의 IgG 함량을 용해시키기 위하여, 냉각 추출 완충액을 이용하여 PptG를 재현탁시켰다. 간략하게 설명하자면, 약 40 내지 95 사이의 AU280-320 값을 얻기 위하여, 약 0℃ 내지 약 8℃의 온도에서 주사용 물(WFI)에 이 침전물 G를 1 내지 3.5로 용해한다. 최소한 2 시간 동안 교반되는 이 용액의 최종 pH는 (약) 5.2 ± 0.2로 조정한다. 한 구체예에서, 1M 아세트산으로 pH를 조정한다. IgG의 용해도를 증가시키기 위하여, 현탁액의 전도성은 약 2.5 내지 약 6.0 mS/cm 범위로 증가한다. 한 구체예에서, 이 전도성은 염화나트륨의 첨가로 증가된다. 그 다음, 임의의 용해안된 소립자들을 제거하기 위하여, 현탁된 PptG 용액은 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.4 ㎛의 명목상 포어 크기를 가지는 적합한 심층 필터로 여과시킨다. 한 구체예에서, 정화된 여과액을 수득하기 위하여, 심층 필터의 명목상 포어 크기는 약 0.2 ㎛(가령, Cuno VR06 필터 또는 등가물)이다. 또다른 구체예에서, 현탁된 PptG 용액을 원심분리하여 정화된 상청액을 회수한다. 필터의 후-세척은 약 2.5 내지 약 6.0 mS/cm의 전도성을 가지는 염화나트륨 용액을 이용하여 실행한다. 전형적으로, 침전물 G의 추출을 위한 적합한 용액은 WFI 및 낮은 전도성 완충액들을 포함한다. 한 구체예에서, 낮은 전도성 완충액은 약 10 mS/cm 미만의 전도성을 가진다. 바람직한 구체예에서, 낮은 전도성 완충액은 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 mS/cm 미만의 전도성을 가진다. 바람직한 구체예에서, 낮은 전도성 완충액은 약 6 mS/cm 미만의 전도성을 가진다. 또다른 바람직한 구체예에서, 낮은 전도성 완충액은 약 4 mS/cm 미만의 전도성을 가진다. 또다른 바람직한 구체예에서, 낮은 전도성 완충액은 약 2 mS/cm 미만의 전도성을 가진다.
9. 용매세제 처리
혈장-유도된 산물들 안에 존재할 수 있는 다양한 바이러스 오염물질들을 비활성화시키기 위하여, 그 다음 정화된 PptG 여과액은 용매 세제 (S/D) 처리를 한다. 혈장 유도된 분획물들의 세체 처리를 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있다(참고 자료, Pelletier JP et al, Best Pract Res Clin Haematol . 2006;19(1) :205-42). 일반적으로, 임의의 표준 S/D 처리는 여기에서 제공된 방법들과 병용할 수 있다. 예를 들면, S/D 처리용 예시적인 프로토콜은 하기에서 제공된다.
간략하게 설명하자면, Triton X-100, Tween-20, 및 트리(n-부틸)인산염 (TNBP)을 차례로 약 1.0%, 0.3%, 및 0.3%의 최종 농도가 되도록 정화된 PptG 여과액에 첨가한다. 그 다음 이 혼합물은 약 18℃ 내지 약 25℃의 온도에서 최소한 약 한 시간 동안 교반시킨다.
한 구체예에서, 공정 개선점은 S/D 시약들 (가령, Triton X-100, Tween-20, 및 TNBP)을 유동성 첨가보다는 분무로 첨가함으로써 실현된다. 다른 구체예들에서, 세제 시약들을 정화된 PptG 여과액에 고체로 첨가할 수 있는데, S/D 성분들이 신속하게 분포될 수 있도록 혼합한다. 특정 구체예들에서, 여과액의 비국소화된 표면적 위로 고체 시약들을 뿌림으로써 고체 시약들을 첨가하는 것이 바람직하고, 이로써 유동성 첨가에서와 같이 국소적으로 과도한 집중이 일어나지 않는다.
10. 이온 교환 크로마토그래피
S/D 처리된 PptG 여과액으로부터 IgG를 추가 정제하고 농축시키기 위하여, 양이온 교환 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 IgG를 정제 및 농축하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, U.S. 특허 제5,886,154호는 분획물 II+III 침전물을 낮은 pH (약 3.8 내지 4.5)에서 추출하고, 이어서 카프릴산을 이용하여 IgG를 침전시키고, 그리고 두 가지 음이온 교환 크로마토그래피 단계들을 최종적으로 실행하는 방법을 설명한다. U.S. 특허 제6,069,236호는 알코올 침전에 전혀 의존하지 않는 크로마토그래피 IgG 정제 과정을 설명한다. PCT 공개 WO 2005/073252는 분획물 II+III 침전물의 추출, 카프릴산 처리, PEG 처리 및 단일 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 IgG 정제 방법을 설명한다. U.S. 특허 제7,186,410호는 분획물 I+II+III 또는 분획물 II 침전물의 추출에 이어서 알칼리 pH에서 실행하는 단일 음이온 교환 단계를 포함하는 IgG 정제 방법을 설명한다. U.S. 특허 제7,553,938호는 분획물 I+II+III 또는 분획물 II+III 침전물의 추출, 카프릴레이트 처리, 그리고 하나 또는 두 가지 음이온 교환 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법을 설명한다. U.S. 특허 제6,093,324호는 약 6.0 내지 약 6.6 사이에서 운영된 거대다공성 음이온 교환 수지를 이용하는 정제 방법을 설명한다. U.S. 특허 제6,835,379호는 알코올 분별 없이 양이온 교환 크로마토그래피에 의존하는 정제 방법을 설명한다. 상기 공개 내용은 모든 목적을 위하여 전문이 참고자료에 통합된다.
본 발명의 방법들의 한 구체예에서, S/D 처리된 PptG 여과액은 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 모두 거치게 할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, S/D 처리된 PptG 여과액은 양이온 교환 컬럼을 통과시키고, 이 용액 안에 있는 IgG에 결합한다. 그 다음 흡착된 IgG로부터 S/D 시약들을 씻어내고, 그 다음 이어서 약 8.0 내지 9.0 사이의 pH를 가지는 높은 pH 용리 완충액으로 컬럼을 용리시켰다. 이와 같은 방식에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 준비물로부터 S/D 시약들을 제거할 수 있고, IgG를 함유하는 용액, 또는 이 둘 모두를 농축시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, pH 용리 완충액은 약 8.2 내지 약 8.8 사이의 pH, 또는 약 8.4 내지 약 8.6 사이의 pH, 또는 약 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0의 pH를 보유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 용리 완충액의 pH는 약 8.5 ± 0.1이다.
특정 구체예들에서, 양이온 교환 컬럼의 용출액은 더 낮은 pH 예를 들면 약 5.5 내지 약 6.5로 조정할 수 있고, 그리고 이 용액의 전도성이 감소되도록 적합한 완충액으로 희석시킨다. 특정 구체예들에서, 양이온 교환 용출액의 pH는 약 5.7 내지 약 6.3, 또는 약 5.9 내지 약 6.1, 또는 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5로 조정할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 용출액의 pH는 약 6.0 ± 0.1로 조정한다. 그 다음 용출액을 음이온 교환컬럼에 적하시키고, 이는 준비물 안에 있는 몇 가지 오염물질들에 결합한다. IgG 분획물을 함유하는 컬럼 유동은 컬럼 로딩 및 세척 동안 채집된다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 이온 교환 크로마토그래피 단계들은 컬럼 방식, 배취(batch) 방식 또는 이 둘의 복합 방식으로 실시할 수 있다.
특정 구체예들에서, 공정 개선점은 pH를 조정하는데 이용되는 용액을 유동성 첨가 보다는 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다.
11. 나노여과 및 한외/정용여과
여기에서 제공되는 IgG 조성물에서 바이러스 적하를 더 감소시키기 위하여, 음이온 교환 컬럼 유출물은 적합한 나노여과 장치를 이용하여 나노필터할 수 있다. 특정 구체예들에서, 나노여과 장치는 약 15 nm 내지 약 200 nm 사이의 평균 포어 크기를 가질 것이다. 이 용도에 적합한 나노 필터의 예는 DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N, 및75N (Planova)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특이적 구체예에서, 나노 필터는 약 15 nm 내지 약 72 nm, 또는 약 19 nm 내지 약 35 nm, 또는 약 15 nm, 19nm, 35nm, 또는 72 nm의 평균 포어 크기를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 나노필터는 Asahi PLANOVA 35N 필터 또는 이의 등가물과 같이 약 35 nm의 평균 포어 크기를 가질 것이다.
임의선택적으로, 한외여과/정용여과를 실시하여 나노여과액을 더 농축시킬 수 있다. 한 구체예에서, 특별히 후-세척용으로 기획된 개방 채널 막을 이용하고, 이 생산 공정의 끝 가까이 제제는 IVIGs (가령, GAMMAGARD® LIQUID)의 기술과 비교하였을 때, 산출량 및 저장 안전성에 영향 없이, 단백질 농도가 약 2배 높은 IgG 조성물(200mg/mL)을 제공한다. 대부분의 시판되는 한외여과 막은 주요 단백질 손실없이 200mg/mL 농도의 IgG에 이를 수 없다. 이들 막은 조기에 차단될 것이며, 따라서, 적절한 후-세척을 하기가 곤란하다. 따라서, 개방 채널 막 구성을 이용해야만 한다. 개방 채널 막이라 하더라도, 특별히 기획된 후-세척 과정을 이용해야만 상당한 단백질 손실(2% 미만의 손실) 없이 요구되는 농도를 얻을 수 있다. 더욱 놀라운 것은 200mg/mL보다 더 높은 단백질 농도가 낮은 pH 보관 단계의 바이러스 비활성화 능력에 영향을 주지 않는다는 사실이다.
나노여과에 후속적으로, 여과액은 한외여과/정용여과에 의해 더 농축될 수 있다. 한 구체예에서, 나노여과액은 한외여과를 통하여 약 2% 내지 약 10% (w/v)의 단백질 농도로 더 농축시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 한외여과는 개방 채널 스크린이 있는 카세트에서 실시하는데, 이 한외여과 막은 약 100 kDa 미만의 명목상 분자량 한계(NMWCO) 또는 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 미만, 또는 이 미만의 kDa의 명목상 분자량 한계(NMWCO)를 가진다. 바람직한 구체예에서, 한외여과 막은 50 kDa의 NMWCO를 가진다.
한외여과 단계가 완료될 때, 응축물은 정용여과를 통하여 정맥내 또는 근육내 투여에 적합한 용액으로 더 농축시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 정용여과 용액은 안정화 및/또는 완충 물질을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 안정화 및 완충 물질은 예를 들면, 약 0.20 M 내지 약 0.30M, 또는 약 0.22M 내지 약 0.28M, 또는 약 0.24M 내지 약 0.26 mM, 또는 약 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0 농도와 같은, 적합한 농도의 글리신이다. 바람직한 구체예에서, 정용여과 완충액은 (약) 0.25 M의 글리신을 함유한다.
전형적으로, 최저 교환 용적은 최초 응축물 용적의 최소한 약 3배 또는 최소한 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 그 이상이다. IgG 용액은 약 5% 내지 약 25% (w/v) 사이, 또는 약 6% 내지 약 18% (w/v) 사이, 또는 약 7% 내지 약 16% (w/v) 사이, 또는 약 8% 내지 약 14% (w/v) 사이, 또는 약 9% 내지 약 12% 사이의 최종 단백질 농도, 또는 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% 또는 이 이상의 최종 농도로 농축시킬 수 있다. 한 구체예에서, 후-세척 분획물을 농축된 용액에 추가하지 않고 최소한 약 23%의 최종 단백질 농도를 얻는다. 또다른 구체예에서, 후-세척 분획물을 농축된 용액에 추가하지 않고 최소한 약 24%의 최종 단백질 농도를 얻고, 후-세척 분획물을 농축된 용액에 추가하지 않고 최소한 약 25%의 최종 단백질 농도를 얻는다. 전형적으로, 농도 공정 끝에서, 이 용액의 pH는 약 4.6 내지 5.1 사이일 것이다.
예시적인 구체예에서, IgG 조성물의 pH는 한외여과 전에 약 4.5로 조정한다. 이 용액은 한외여과를 통하여 5 ± 2% w/v의 단백질 농도로 농축시킨다. UF 막은 50,000 Daltons 또는 미만의 명목상 분자량 한계(NMWCO)(Millipore Pellicon Polyether 술폰 막)를 가진다. 이 응축물은 0.25 M 글리신 용액, pH 4.5 ± 0.2의 10 용적에 대하여 정용여과된다.
한외-정용여과 작업을 통하여 이 용액은 약 2℃ 내지 약 8℃ 사이의 온도에서 유지된다. 정용여과 후, 이 용액은 최소한 11 % (w/v)의 단백질 농도로 농축시킨다.
12. 제제(Formulation)
정용여과 단계가 완료될 때, 이 용액의 단백질 농도는 정용여과 완충액으로 약 5% 내지 약 20% (w/v), 또는 약 6% 내지 약 18% (w/v), 또는 약 7% 내지 약 16% (w/v), 또는 약 8% 내지 약 14% (w/v), 또는 약 9% 내지 약 12%의 최종 농도, 또는 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%의 최종 농도로 조정한다. 바람직한 구체예에서, 이 용액의 최종 단백질 농도는 약 9% 내지 약 11%, 더욱 바람직하게는 약 10%이다.
제제화된 벌크 용액은 약 0.22 micron에 지나지 않는 절대 포어 크기를 가진, 예를 들면 약 0.2 micron 포어 크기를 가진 막 필터를 통하여 여과시킴으로써 추가 멸균된다. 그 다음 이 용액은 적절한 밀봉을 위하여 무균상태로 최종 용기에 분배하고, 테스트용 샘플은 취한다.
한 구체예에서, IgG 조성물은 정용여과 완충액으로 약 10.2 ± 0.2% (w/v)의 농도로 추가 조정한다. 필요에 따라 pH는 약 4.4 내지 약 4.9로 조정한다. 끝으로, 이 용액은 멸균 여과시키고, 3주간 (약) 30℃에서 항온처리한다.
13. 알코올 첨가
유익하게, 혈장으로부터 IgG를 분획하는 목적으로, 알코올을 유동성 첨가가 아닌 분무를 통하여 첨가하면, IgG 산출량의 손실이 감소되었다는 것을 알았다. 이론에 결부시키지 않고, 혈장 분획물을 유동성 첨가하는 동안, 유체가 진입할 때 일시적으로 알코올이 국소적으로 과집중되면 IgG가 상청액에 남아있어야 하는 단계들 동안 IgG의 단백질 변성 및 IgG의 비가역적인 손실 및/또는 침전으로 이어질 수 있다. 더욱이, 이들 효과는 다량의 알코올을 첨가해야 하는 경우, 가령, 최소한 100 L의 채집된 혈장의 분별과 같은 산업 규모의 정제시에 이러한 영향은 증폭될 수 있다.
분무를 통한 알코올의 첨가 효과는 실시예 14에서 예시하는데, 동결-불량 혈장 시료들은 유동성 첨가 (1 및 2) 또는 분무 첨가 (3 및 4)에 의해 도입된 8% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. 표 14에서 볼 수 있는 것과 같이, 에탄올을 분무에 의해 시료에 첨가할 경우, 동결-불량 혈장에 존재하는 IgG의 거의 100%를 상청액으로부터 회수하며, 반면 유동성 첨가에 의해 알코올을 첨가할 경우, IgG의 4 내지 5%가 손실된다. 이는 이 단계에서만 약 0.20 내지 0.25 g/L의 IgG 손실을 초래한다. 2007년도 생산 수준에서, 약 5.3 million grams (5,300 kilograms)의 IgG 손실로 설명된다. IVIG의 현재 시장 가격에서, g 당 $50 내지 $100의 범위가 되며, 이 단계에서 4 내지 5% 손실은 매년 최대 5억 달러의 전세계적 손실을 나타낸다.
따라서, 여기에서 제공되는 방법들의 한 측면에서, 하나 이상 침전 단계들은 알코올의 분무 첨가에 의해 실시된다. 특정 구체예들에서, 분무 첨가는 임의의 가압 장치를 이용하여 실시할 수 있는데, 가령, 분무 헤드 또는 노즐이 있고, 액체로부터 미세한 미스트를 만들기 위하여 수작업으로 또는 자동으로 작동되는 용기(가령, 분무병)를 이용하여 실시할 수 있다. 특정 구체예들에서, 분무 첨가는 시스템을 지속적으로 교반시키면서, 또는 다른 수단에 의해 혼합시켜 시스템 안에 액체를 신속하고 균등하게 분포되도록 한다.
14. pH의 조정
혈장 분획물의 단백질 침전은 이 혈장 단백질들이 침전되는 용액의 pH에 매우 의존적이다. 이 사실은 1946년 및 1949년 각각 Cohn and Oncley 방법들이 소개된 이후 혈장 단백질들을 분획하는 과학자들에 의해 설명되어 왔었다. 전통적으로, 혈장 분획물의 pH는 관심 성분의 최대 회수 산출을 위하여 알코올의 첨가 전에 조정한다. 유익하게, 이 용액의 pH를 알코올의 첨가 후 바로 또는 알코올 첨가와 동시에 용액의 pH를 조정하면, 좀더 특정된 그리고 재생가능한 침전을 결과한다는 것을 이제 알았다. 혈장 분획물에 알코올을 첨가하면 이 용액의 pH는 변동되며, 일반적으로 이 용액의 pH는 상승되는 결과를 초래한다. 이러한 것과 같이, 혈장 분획물의 pH를 알코올 첨가 후가 아닌 첨가전에 예정된 pH로 조정함으로써, 이 침전 반응은 비-최적 pH에서 일어날 것이다.
유사하게, 혈장 분획물로부터 단백질의 침전은 정전기적 환경에 영향을 줄 것이며, 따라서 용액의 pH를 변경시킬 것이다. 따라서, 침전 사건이 진행되도록 허용됨에 따라, 이 용액의 pH는 관심 단백질 종들의 최대 회수를 허용하는 예정된 pH 값으로부터 이탈되기 시작할 것이다. 이는 특히 단백질의 큰 분획물이 침전되는 침전 경우, 많은 알코올 함량이 이용되는 침전 경우, 긴 항온처리 시간을 요구하는 침전 경우에서 그러하다.
혈장 분획물의 pH를 조정하는 효과는 실시예 16에서 볼 수 있는 결과들로 예증된다. 이 실시예에서, 분무 알코올을 분무를 통하여 첨가한 후, 상청액 I 분획물의 두 시료로부터 IgG를 침전시켰다. 두 시료의 pH는 알코올 첨가 전 pH 6.7로 조정하고, 그리고 알코올 첨가 후, 그러나 10 시간의 침전 항온처리 단계 전 pH 6.9로 조정하였다. 제 1 시료 (기준)에서, pH는 10 시간 항온처리 동안 조정하지 않았고, 제 2 시료(연속 조정)에서, 10 시간 항온처리 동안 끊임없이 pH 6.9로 조정하였다. 표 16에서 볼 수 있는 것과 같이, 시료로부터 변형된 분획물 II+III 침전물을 제거한 후, 제 1 상청액은 0.2 g IgG/L 혈장을 함유하였지만, 침전 항온처리 동안 pH가 일정하게 유지된 제 2 시료는 단지 0.13 g IgG/L 혈장 만을 함유하였다. 제 2 시료에서 0.07 g IgG/L 혈장의 감소된 손실은 2007년 생산 수준에서, 약 1.9 백만 그램(1,900 kilograms)의 IgG 손실을 나타낸다. IVIG에 대한 현재 시장 가격으로, g 당 $50 내지 $100 이며, 이는 이 단계에서 1.5% 손실은 매년 전세계적이로 최대 $2억 달러를 나타낸다.
따라서, 여기에서 제공된 이 방법들의 한 측면에서, 혈장 분획물의 pH는 알코올의 첨가 직후 조정한다. 관련된 구체예들에서, pH는 알코올 첨가 전과 후, 또는 알코올 첨가하는 동안 그리고 첨가 후, 또는 알코올 첨가 전, 첨가하는 동안 그리고 첨가 후에 조정한다. 관련된 구체예에서, 용액의 pH는 하나 이상 알코올 침전 사건 또는 항온처리 동안 지속적으로 조정한다. 특정 구체예들에서, 시스템을 지속적으로 교반시키거나 다른 수단으로 혼합하여, 시스템내 pH 변경 물질의 신속하고 균등한 분포를 확보하여, 용액의 pH는 지속적으로 조정되거나 유지된다.
알코올의 유동성 첨가의 경우와 유사하게, 큰 용적의 pH 변경 물질의 유동성 첨가는 일시적인 국소 pH 변화를 야기할 수 있고, 이는 원하지 않는 단백질 변성 또는 침전으로 이어질 수 있음을 알았다. 따라서, 여기에서 제시하는 방법들의 한 구체예에서, pH 변경 물질들은 분무에 의해 하나 이상 혈장 분별 단계들로 도입시킬 수 있다. 여기에서 제공되는 방법들의 또다른 구체예에서, 혈장 분획물 또는 침전 단계의 pH는 pH 변경 물질을 분무를 통하여 첨가하여 조정할 수 있다. 특정 구체예들에서, 분무 첨가는 임의의 가압 장치를 이용하여 실시할 수 있는데, 가령, 분무 헤드 또는 노즐이 있고, 액체로부터 미세한 미스트를 만들기 위하여 수작업으로 또는 자동으로 작동되는 용기(가령, 분무 병)를 이용하여 실시할 수 있다. 특정 구체예들에서, 분무 첨가는 시스템을 지속적으로 교반시키면서, 또는 다른 수단에 의해 혼합시켜 시스템 안에 액체가 신속하고 균등하게 분포되도록 한다.
III. 농축된 IgG 조성물들
전체 항체들을 포함하는 IVIG 조성물들은 특정 자가면역 이상의 치료용으로 설명되었다(가령, U.S. 특허 공개 US 2002/0114802, US 2003/0099635, 및 US 2002/0098182 참고). 이들 문헌에서 공개된 IVIG 조성물들은 다클론 항체들을 포함한다.
1. 수성 IgG 조성물들
한 측면에서, 본 발명은 여기에서 제공되는 방법들에 의해 준비된 수성 IgG 조성물들에 관한 것이다. 일반적으로, 여기에서 설명된 신규한 방법들에 의해 준비된 IgG 조성물들은 높은 IgG 함량 및 순도를 가질 것이다. 예를 들면, 여기에서 제공되는 IgG 조성물들은 최소한 약 3% (w/v)의 단백질 농도와 약 90% 순도 이상의 IgG 함량을 보유할 수 있다. 이와 같은 고순도 IgG 조성물들은 치료요법적 투여, 가령, IVIG 요법에 적합하다. 한 구체예에서, IgG의 농도는 약 10%이며, 그리고 정맥내 투여에 이용된다. 또다른 구체예에서, 농도는 약 20%이며, 그리고 피하 또는 근육내 투여용으로 이용된다.
한 구체예에서, 본 발명은 다음의 단계로 준비된 수성 IgG 조성물을 제공한다: (a) 제 1 침전 단계에서 IgG가 풍부한 상청액을 수득하기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 6% 내지 약 10%의 알코올로 동결-불량 혈장 분획물을 침전시키는 단계, (b) 제 1 침전물을 만들기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3 사이의 pH에서 약 20% 내지 약 30%의 알코올로 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (c) 현탁액을 만들기 위하여 단계 b)에서 형성된 제 1 침전물을 재현탁시키는 단계, (d) 단계 c)에서 형성된 현탁액을 세제로 처리하는 단계, (e) 제 2 침전물을 형성하기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 20% 내지 약 30%의 알코올로 현탁액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (f) 현탁액을 만들기 위하여 단계 e)에서 형성된 제 2침전물을 재현탁시키는 단계, (g) 단계 f)에서 형성된 현탁액을 용매 및/또는 세제로 처리하는 단계, 그리고 (h) 최소한 1회의 이온 교환 크로마토그래피 분별을 실행하고, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 준비하는 단계.
특이적 구체예에서, 다음의 단계들을 포함하는 방법에 의해 준비된 IgG 조성물을 제공한다: (a) 동결-불량 혈장 분획물의 pH를 약 7.0으로 조정하는 단계, (b) 단계 a)의 동결-불량 혈장 분획물의 에탄올 농도를 약 -5℃ 내지 약 -9℃ 온도에서 약 25% (v/v)로 조정하고, 이에 의해 혼합물을 형성하는 단계, (c) 단계 b)의 혼합물로부터 액체와 침전물을 분리시키는 단계, (d) 단계 c)의 침전물을 인산염 및 아세트산염을 함유하는 완충액으로 재현탁시키고, 여기에서 완충액의 pH는 완충액 1000L 당 600 ml의 빙초산으로 조정하고, 이에 의해 현탁액이 형성되는 단계, (e) 미세하게 분할된 이산화실리콘 (Si02)을 단계 d)의 현탁액과 최소한 약 30 분 동안 혼합시키는 단계, (f) 현탁액을 압착식 여과기로 여과시키고, 이에 의해 여과액이 형성되는 단계, (g) 인산염 및 아세트산염을 함유하는 완충액을 압착식 여과기의 무용 용적(dead volumes)의 최소한 3 용적으로 압착식 여과기를 세척시고, 여기에서 완충액의 pH는 1000L 당 150 ml의 빙초산으로 조정하고, 이에 의해 세척 용액이 형성되는 단계, (h) 단계 f)의 여과액과 단계 g)의 세척 용액을 복합시키고, 이에 의해 용액이 형성되며, 이 용액은 세제로 처리하는 단계, (i) 이 단계 h)의 용액의 pH는 약 7.0으로 조정하고, 그리고 에탄올은 최종 농도가 약 25%되도록 첨가하고, 이에 의해 침전물이 형성되는 단계, (j) 단계 i)의 혼합물로부터 액체와 침전물을 분리시키는 단계, (k) 용매 또는 세제를 포함하는 수성 용액에 이 침전물을 용해시키고, 그리고 이 용액은 최소한 60 분 동안 유지시키는 단계, (1) 단계 k) 다음 이 용액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시키고 그리고 컬럼에 흡착된 단백질들을 용출액으로 용리시키는 단계, (m) 단계 l)의 용리물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 유출물을 생성시키는 단계, (n) 단계 m)의 유출물은 나노필터를 통과시켜 나노여과액을 생성시키는 단계, (o) 단계 n)의 나노여과액은 한외여과 막을 통과시켜 한외여과액을 생성시키는 단계; 그리고 (p) 단계 o)의 한외여과액은 정용여과 완충액에 대하여 정용여과시켜 약 8% (w/v) 내지 약 12% (w/v) 범위의 단백질 농도를 보유하는 정용여과액을 생성시키고, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 수득하는 단계.
특정 구체예들에서, 상기에서 설명된 분별 공정 단계들중 2계 이상에서 개선점을 포함하는 여기에서 제공되는 방법을 이용하여 수성 IgG 조성물들을 준비한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서 이 개선점은 제 1 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 용해단계, 및/또는 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 찾아볼 수 있다.
한 구체예에서, 여기에서 제공되는 정제 방법들에 의해 준비된 수성 IgG 조성물을 제공하는데, 이때 이 방법은 하나 이상 용액을 혈장 분획물로 유동성(fluent) 첨가에 의해 도입시키는 대신, 하나 이상의 용액을 분무 첨가하는 것을 포함한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서 이 공정 개선점은 하나 이상 단백질 종의 침전을 목적으로 알코올(가령, 에탄올)을 분무에 의해 혈장 분획물로 첨가하는 것을 포함한다. 다른 구체예들에서, 분무에 의해 혈장 분획물로 추가될 수 있는 용액은 pH 변경 용액, 용매용액, 세제 용액, 희석 완충액, 전도성 변경 용액, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상 알코올 침전 단계는 알코올을 혈장 분획물로 분무에 의해 추가하여 실행한다. 제 2 바람직한 구체예에서, 하나 이상 pH 조정 단계들은 pH 변경 용액을 혈장 분획물로 분무에 의해 추가하여 실행한다.
특정 구체예들에서, 여기에서 제공되는 정제 방법들에 의해 준비된 수성 IgG 조성물을 제공하는데, 이때 이 방법은 침전 물질 (가령, 알코올 또는 폴리에틸렌 글리콜)의 추가 후 및/또는 추가와 동시에 침전되는 혈장 분획물의 pH를 조정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 활발하게 침전되는 혈장 분획물의 pH는 pH를 지속적으로 모니터링하고 조정함으로써 전체 침전 항온처리 단계 또는 유지(hold) 단계를 통하여 유지되는 공정 개선점이 제공된다. 바람직한 구체예들에서, pH의 조정은 pH 변경 용액을 분무에 의해 첨가함으로써 실행한다.
한 구체예에서, 본 발명은 약 30 g/L 내지 약 250 g/L의 단백질 농도를 포함하는 수성 IgG 조성물들을 제공한다. 특정 구체예들에서, IgG 조성물의 단백질 농도는 약 50 g/L 내지 약 200 g/L, 또는 약 70 g/L 내지 약 150 g/L, 또는 약 90 g/L 내지 약 120 g/L이거나, 또는 이들 범위내 임의의 적합한 농도, 예를 들면 약 30 g/L, 또는 약 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 65 g/L, 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L, 90 g/L, 95 g/L, 100 g/L, 105 g/L, 110 g/L, 115 g/L, 120 g/L, 125 g/L, 130 g/L, 135 g/L, 140 g/L, 145 g/L, 150 g/L, 155 g/L, 160 g/L, 165 g/L, 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 230 g/L, 235 g/L, 240 g/L, 245 g/L, 250 g/L, 또는 이 이상이다. 바람직한 구체예에서, 수성 IgG 조성물은 (약) 10%의 농도를 가질 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 이 조성물은 10.2 ± 0.2% (w/v)의 농도를 가질 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 수성 IgG 조성물은 (약) 20%의 농도를 가질 것이다.
여기에서 제공되는 방법들은 매우 높은 수준의 순도를 갖는 IgG 조성물들을 만든다. 한 구체예에서, 여기에서 제공되는 조성물내 전체 단백질중 최소한 약 95%는 IgG일 것이다. 다른 구체예들에서, 조성물의 총 단백질의 최소한 약 96% 또는 최소한 약 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 그 이상은 IgG일 것이다. 바람직한 구체예에서, 조성물의 총 단백질의 최소한 97%는 IgG일 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 조성물의 총 단백질의 최소한 98%는 IgG일 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 조성물의 총 단백질의 최소한 99%는 IgG일 것이다.
유사하게 여기에서 제공되는 방법들은 오염 물질의 수준이 상당히 낮은 IgG 조성물의 준비를 허용한다. 예를 들면, 표 20은 여기에서 제공되는 개선된 방법들에 의해 준비된 IgG의 3가지 벌크 용액의 불순물 테스트 결과를 보여준다. 특정 구체예들에서, 약 140 mg/L 미만의 IgA를 함유하는 IgG 조성물을 제공한다. 다른 구체예들에서, 약 60 mg/L 미만의 바람직하게는 약 40 mg/L 미만의 IgA, 가장 바람직하게는 약 30 mg/L IgA 미만의 IgA를 함유하는 IgG 조성물을 제공한다.
또다른 구체예에서, 약 50 mg/L 미만의 IgM을 함유하는 IgG 조성물을 제공한다. 다른 구체예들에서, 약 25 mg/L 미만의 IgM, 바람직하게는 약 10 mg/L 미만의 IgM, 더욱 바람직하게는 약 5 mg/L미만의 IgM, 더욱 바람직하게는 약 4 mg/L미만의 IgM, 더욱 바람직하게는 약 3 mg/L미만의 IgM, 가장 바람직하게는 약 2.5 mg/L미만의 IgM 을 함유하는 IgG 조성물을 제공한다.
또다른 구체예에서, 약 100 PL-1 nmol/mL min 미만의 아미도용해성 활성을 보유하는 IgG 조성물들을 제공한다. 다른 구체예들에서, IgG 조성물은 약 50 PL-1 nmol/mL min 미만의 아미도용해성 활성, 바람직하게는 약 25 PL-1 nmol/mL min 미만의 아미도용해성 활성, 더 바람직하게는 약 20 PL-1 nmol/mL min 미만의 아미도용해성 활성, 더 바람직하게는 약 15 PL-1 nmol/mL min 미만의 아미도용해성 활성, 가장 바람직하게는 약 10 PL-1 nmol/mL min 미만의 아미도용해성 활성을 보유할 것이다.
또다른 구체예에서, 약 20 mg/L 미만의 피브리노겐을 함유하는 IgG 조성물들을 제공한다. 다른 구체예들에서, IgG 조성물은 약 10 mg/L 미만의 피브리노겐, 바람직하게는 약 5 mg/L 미만의 피브리노겐, 더 바람직하게는 약 2.5 mg/L 미만의 피브리노겐, 더 바람직하게는 약 1 mg/L 미만의 피브리노겐, 더 바람직하게는 약 0.5 mg/L 미만의 피브리노겐, 가장 바람직하게는 약 0.25 mg/L 미만의 피브리노겐을 함유할 것이다.
여전히 또다른 구체예에서, 주로 IgG 단량체들/이량체들로 구성된 IgG 조성물들을 제공한다. 한 구체예에서, IgG의 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%), 또는 99.9%는 단량체 또는 이량체인 IgG 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, IgG의 최소한 97%는 단량체 또는 이량체인 IgG 조성물을 제공한다. 더 바람직한 구체예에서, IgG의 최소한 99%는 단량체 또는 이량체다. 더 바람직한 구체예에서, IgG의 최소한 99.5%는 단량체 또는 이량체다. 더 바람직한 구체예에서, IgG의 최소한 99.7%는 단량체 또는 이량체다.
2. 약제학적 조성물들
또다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 제공되는 방법들에 의해 준비된 정제된 IgG를 포함하는 약제학적 조성물 및 제제를 제공한다. 일반적으로, 여기에서 설명하는 신규한 방법들에 의해 준비된 IgG 약제학적 조성물들 및 제제는 높은 IgG 함량 및 순도를 가질 것이다. 예를 들면, 여기에서 제공된 IgG 약제학적 조성물들 및 제제는 최소한 약 7% (w/v)의 단백질 농도와 약 95% 이상 순도의 IgG 함량을 가질 수 있다. 이러한 고순도 IgG 약제학적 조성물들 및 제제는 치료요법적 투여, 가령, IVIG 요법에 적합하다. 바람직한 구체예에서, 약제학적 IgG 조성물은 정맥내 투여 (가령, IVIG 요법)용으로 제제화한다.
한 구체예에서, 여기에서 제공되는 약제학적 조성물들은 여기에서 제공되는 방법을 이용하여 단리된 수성 IgG 조성물을 제제화함으로써 준비한다. 일반적으로, 제제화된 조성물은 최소한 1회, 바람직하게는 최소한 2회, 가장 바람직하게는 최소한 3회의 바이러스 비활성화 또는 제거 단계들을 거치게 될 것이다. 여기에서 제공되는 방법들을 이용할 수 있는 비-제한적인 예시적인 바이러스 비활성화 또는 제거 단계들은 용매세제 처리 (Horowitz et al, Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 and Kreil et al, Transfusion 2003 (43):1023-1028, 이 두 가지 문헌은 모든 목적을 위하여 전문이 여기에 참고자료로 통합된다), 나노 여과 (Hamamoto et al, Vox Sang 1989 ( 56)230 -236 and Yuasa et al., J Gen Virol . 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, 이 두 가지 문헌은 모든 목적을 위하여 전문이 여기에 참고자료로 통합된다), 그리고 고온에서 낮은 pH 항온처리(Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 and Louie et al, Biologicals 1994 (22):13-19)를 포함한다.
특정 구체예들에서, 약 80 g/L IgG 내지 약 120 g/L의 IgG 함량을 보유하는 약제학적 제제를 제공한다. 일반적으로, 이들 IVIG 제제는 여기에서 설명된 방법을 이용하여 혈장으로부터 IgG 조성물을 단리시키고, 이 조성물을 농축시키고, 그리고 정맥내 투여에 적합한 용액에서 농축된 조성물을 제제화함으로써 준비한다. IgG 조성물들은 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용하여 농축시킬 수 있다. 한 구체예에서, 이 조성물은 한외여과/정용여과에 의해 농축시킨다. 일부 구체예들에서, 이 조성물을 응축시키는데 이용된 한외여과 장치는 약 100 kDa 미만의 명목상 분자량 한계(NMWCO) 또는 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 또는 이 미만의 kDa를 가진 한외여과 막을 이용할 것이다. 바람직한 구체예에서, 한외여과 막은 50 kDa의 NMWCO를 가진다. 완충액 교환은 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 기술을 이용하여 이루어질 수 있다. 특이적 구체예에서, 완충액 교환은 정용여과에 의해 실시된다.
한 특이적 구체예에서, IgG의 약제학적 조성물이 제공되는데, 여기에서 IgG 조성물은 다음의 단계들을 포함하는 방법을 이용하여 혈장으로부터 정제하였다: (a) 제 1 침전 단계에서 IgG가 풍부한 상청액을 수득하기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 6% 내지 약 10%의 알코올을 이용하여 동결-불량 혈장 분획물을 침전시키는 단계, (b) 제 1 침전물을 만들기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3 사이의 pH에서 약 20% 내지 약 30%의 알코올을 이용하여 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (c) 현탁액을 만들기 위하여 단계 b)에서 형성된 제 1 침전물을 재현탁시키는 단계, (d) 단계 c)에서 형성된 현탁액을 세제로 처리하는 단계, (e) 제 2 침전물을 형성하기 위하여 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 20% 내지 약 30%의 알코올로 현탁액으로부터 IgG를 침전시키는 단계, (f) 현탁액을 만들기 위하여 단계 e)에서 형성된 제 2침전물을 재현탁시키는 단계, (g) 단계 f)에서 형성된 현탁액을 용매 및/또는 세제로 처리하는 단계, 그리고 (h) 최소한 1회의 이온 교환 크로마토그래피 분별을 실행하는 단계; (i) 용매 세제 처리를 실행하는 단계; 그리고 (j) 이 조성물을 나노여과하고, 이에 의해 IgG의 조성물을 준비하는 단계.
특이적 구체예에서, IgG의 약학 조성물을 제공하는데, 여기에서 IgG 조성물은 다음의 단계들을 포함하는 방법을 이용하여 혈장으로부터 정제하였다: (a) 동결-불량 혈장 분획물의 pH를 약 7.0로 조정하는 단계, (b) 단계 a)의 동결-불량 혈장 분획물의 에탄올 농도를 약 -5℃ 내지 약 -9℃의 온도에서 (약) 25% (v/v)로 조정하고, 이에 의해 혼합물을 형성시키는 단계, 여기에서 에탄올 농도는 분무에 의해 조절할 수 있으며, (c) 단계 b)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리시키는 단계, (d) 단계 c)의 침전물을 인산염과 아세트산염을 함유하는 완충액으로 재현탁시키는 단계, 여기에서 완충액의 pH는 완충액 1000L 당 600 ml의 빙초산으로 조정하고, 이에 의해 현탁액이 형성되는 단계, (e) 미세하게 분할된 이산화실리콘 (Si02)과 단계 d)의 현탁액을 최소한 약 30 분 동안 혼합하는 단계, (f) 이 현탁액을 압착식 여과기로 여과시키고, 이에 의해 여과액이 형성되는 단계, (g) 인산염 및 아세트산염을 함유하는 완충액을 압착식 여과기의 무용 용적(dead volumes)의 최소한 3 용적으로 압착식 여과기를 세척시키는 단계, 여기에서 완충액의 pH는 완충액 1000L 당 150 ml의 빙초산으로 조정하고, 이에 의해 세척 용액이 형성되며, (h) 단계 f)의 여과액을 단계 g)의 세척 용액에 복합시키고, 이에 의해 용액이 형성되며, 그리고 이 용액을 세제로 처리하는 단계, (i) 단계 h)의 용액의 pH를 약 7.0으로 조정하고, 그리고 에탄올을 최종 농도가 약 25%가 되도록 추가하고, 이에 의해 침전물이 형성되는 단계, 여기에서 에탄올 농도 및/또는 pH는 분무에 의해 조정되며, (j) 단계 i)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하는 단계, (k) 용매 또는 세제를 포함하는 수성 용액에 이 침전물을 용해시키고, 그리고 이 용액은 최소한 60 분간 유지시키는 단계, (1) 단계 k) 이후 이 용액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시키고, 컬럼에 흡착된 단백질들을 용출액으로 용리시키는 단계, (m) 단계 l)의 용리물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 유출물을 생성시키는 단계, (n) 단계 m)의 유출물은 나노필터를 통과시켜 나노여과액을 생성시키는 단계, (o) 단계 n)의 나노여과액은 한외여과 막을 통과시켜 한외여과액을 생성시키는 단계; 그리고 (p) 단계 o)의 한외여과액은 정용여과 완충액에 대하여 정용여과시켜 약 8% (w/v) 내지 약 12% (w/v) 범위의 단백질 농도를 보유하는 정용여과액을 생성시키고, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 수득하는 단계.
특정 구체예들에서, IgG의 약제학적 조성물을 제공하는데, 이때 IgG 조성물은 상기에서 설명된 분별 공정 단계들중 2개 이상의 단계에서 개선점을 포함하는 여기에서 제공되는 방법을 이용하여 준비한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서 이 개선점은 제 1 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 침전 단계, 변형된 분획물 II+III 용해단계, 및/또는 변형된 분획물 II+III 현탁액 여과 단계에서 찾아볼 수 있다.
특정 구체예들에서, IgG의 약제학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 제공되는 정제 방법들에 의해 준비된 IgG의 조성물을 제공하는데, 이때 이 방법은 하나 이상 용액을 분무에 의해 혈장 분획물로 첨가하는 것을 포함하는데, 그렇지 않으면, 이 용액은 유동성 첨가에 의해 도입될 것이다. 예를 들면, 특정 구체예들에서 이 공정 개선점은 하나 이상 단백질 종의 침전을 목적으로 알코올(가령, 에탄올)을 분무에 의해 혈장 분획물로 첨가하는 것을 포함한다. 다른 구체예들에서, 분무에 의해 혈장 분획물로 추가될 수 있는 용액은 pH 변경 용액, 용매용액, 세제 용액, 희석 완충액, 전도성 변경 용액, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상 알코올 침전 단계는 알코올을 혈장 분획물로 분무에 의해 추가하여 실행한다. 제 2 바람직한 구체예에서, 하나 이상 pH 조정 단계들은 pH 변경 용액을 혈장 분획물로 분무에 의해 추가하여 실행한다.
특정 구체예들에서, IgG의 약제학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 제공되는 정제 방법들에 의해 준비된 IgG 조성물을 제공하는데, 이때 이 방법은 침전 물질 (가령, 알코올 또는 폴리에틸렌 글리콜)의 추가 후 및/또는 추가와 동시에 침전되는 혈장 분획물의 pH를 조정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 활발하게 침전되는 혈장 분획물의 pH는 pH를 지속적으로 모니터링하고 조정함으로써 전체 침전 항온처리 단계 또는 유지 단계를 통하여 유지되는 공정 개선점이 제공된다. 바람직한 구체예들에서, pH의 조정은 pH 변경 용액을 분무에 의해 첨가함으로써 실행된다.
한 구체예에서, 본 발명은 약 70 g/L 내지 약 130 g/L의 단백질 농도를 포함하는 IgG의 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구체예들에서, IgG 조성물의 단백질 농도는 약 80 g/L 내지 약 120 g/L, 바람직하게는 약 90 g/L 내지 약 110 g/L, 가장 바람직하게는 약 100 g/L이거나, 또는 이들 범위 안에 임의의 적합한 농도, 예를 들면 약 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L, 90 g/L, 95 g/L, 100 g/L, 105 g/L, 110 g/L, 115 g/L, 120 g/L, 125 g/L, 또는 130 g/L이다. 바람직한 구체예에서, (약) 100 g/L의 단백질 농도를 보유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 (약) 102 g/L의 단백질 농도를 가질 것이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 약 170 g/L 내지 약 230 g/L의 단백질 농도를 포함하는 IgG의 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구체예들에서, IgG 조성물의 단백질 농도는 약 180 g/L 내지 약 220 g/L, 바람직하게는 약 190 g/L 내지 약 210 g/L, 가장 바람직하게는 약 200 g/L이거나, 또는 이들 범위내 임의의 적합한 농도, 예를 들면 약 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 또는 230 g/L이다. 바람직한 구체예에서, (약) 200 g/L의 단백질 농도를 갖는 약제학적 조성물을 제공한다.
여기에서 제공되는 방법들은 매우 높은 수준의 순도를 갖는 IgG 약제학적 조성물들의 준비를 허용한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 여기에서 제공하는 조성물 안에 전체 단백질의 최소한 약 95%는 IgG일 것이다. 다른 구체예들에서, 이 단백질의 최소한 약 96%는 IgG이고, 또는 조성물 안에 전체 단백질의 최소한 약 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 그 이상은 IgG일 것이다. 바람직한 구체예에서, 조성물 안에 전체 단백질의 최소한 97%는 IgG일 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 조성물 안에 전체 단백질의 최소한 98%는 IgG일 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 조성물 안에 전체 단백질의 최소한 99%는 IgG일 것이다.
유사하게, 여기에서 제공되는 방법들은 오염 물질의 수준이 상당히 낮은 IgG 조성물의 준비를 허용한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 약 100 mg/L 미만의 IgA를 함유하는 IgG 조성물을 제공한다. 다른 구체예들에서, 약 50 mg/L 미만의 바람직하게는 약 35 mg/L 미만의 IgA, 가장 바람직하게는 약 20 mg/L IgA 미만의 IgA를 함유하는 IgG 조성물을 제공한다.
여기에서 제공하는 약제학적 조성물들은 정맥내, 피하, 및/또는 근육내 투여에 적합한 하나 이상 완충 물질들 또는 pH 안정화 물질들을 포함할 것이다. 여기에서 제공하는 IgG 조성물을 제제화하는데 적한한 예시적인 완충물질들은 글리신, 구연산염, 인산염, 아세트산염, 글루탐산염, 타르타르산염, 벤조산염, 젖산염, 히스티딘 또는 기타 아미노산들, 글루콘산염, 말산염, 숙신산, 포름산염, 프로피온산염, 탄산염, 또는 적합한 pH로 조정되는 임의의 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 완충 물질은 연장된 기간 동안 제제에서 적합한 pH를 유지시키는데 충분할 것이다. 바람직한 구체예에서, 완충 물질은 글리신이다.
일부 구체예들에서, 제제안의 완충 물질의 농도는 약 100 mM 내지 약 400 mM 사이, 바람직하게는 약 150 mM 내지 약 350 mM 사이, 더 바람직하게는 약 200 mM 내지 약 300 mM 사이, 가장 바람직하게는 약 250 mM일 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, IVIG 조성물은 약 200 mM 내지 약 300 mM 사이의 글리신, 가장 바람직하게는 약 250 mM의 글리신을 포함할 것이다.
특정 구체예들에서, 제제의 pH는 약 4.1 내지 약 5.6 사이, 바람직하게는 약 4.4 내지 약 5.3 사이, 가장 바람직하게는 약 4.6 내지 약 5.1 사이일 것이다. 특히 구체예들에서, 제제의 pH는 약 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 또는 5.6일 것이다. 바람직한 구체예에서, 제제의 pH는 약 4.6 내지 약 5.1 사이일 것이다.
일부 구체예들에서, 여기에서 제공되는 약제학적 조성물들은 조성물의 삼투질 농도(osmolality)를 조정하는 물질을 임의선택적으로 더 포함할 수 있다. 삼투질 농도 물질의 예는 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 슈크로즈, 글루코오즈, 덱스트로즈, 레불로오즈, 푸락토오즈, 락토오즈, 폴리에틸렌 글리콜, 인산염, 염화 나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 글루코노글로코펩타노에이트 칼슘(calcium gluconoglucoheptonate), 디메틸 술폰 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
전형적으로, 여기에서 제공되는 제제는 생리학적 삼투질 농도, 약 285 내지 295 mOsmol/kg (Lacy et al, Drug Information Handbook - Lexi -Comp 1999: 1254)에 필적하는 삼투질 농도를 가질 것이다. 특정 구체예들에서, 제제의 삼투질 농도는 약 200 mOsmol/kg 내지 약 350 mOsmol/kg 사이, 바람직하게는 약 240 내지 약 300 mOsmol/kg 사이일 것이다. 특히 구체예들에서, 제제의 삼투질 농도는 약 200 mOsmol/kg, 또는 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 또는 350 mOsmol/kg일 것이다.
여기에서 제공되는 IgG 제제는 연장된 시간 동안 액체 형에 일반적으로 안정적이다. 특정 구체예들에서, 제제는 실온에서 최소한 약 3개월 또는 최소한 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개월 동안 실온에서 안정적이다. 제제는 냉장 조건 (전형적으로 약 2℃ 내지 약 8℃)에서 최소한 약 18개월 동안 또한 안정적일 것이며, 또는 냉장 조건하에서 최소한 약 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 또는 45 개월 안정적일 것이다.
IV. 처리 방법들
현대 의학에서 일상적으로 실행되는 것과 같이, 농축된 면역글로블린 (특히 IgGs)의 멸균 준비물은 세 가지 주요 부류: 면역 결핍, 염증 및 자가면역 질환들, 그리고 급성 감염들에 속하는 의학적 상태를 치료하는데 이용된다. 이들 IgG 준비물은 또한 다발성 경화증(특히 재발성-완화 다발성 경화증 또는 RRMS), Alzheimer 질환, 그리고 Parkinson 질환을 치료하는데 또한 유용할 수 있다. 본 발명의 정제된 IgG 준비물은 이들 목적에 적합하며, 뿐만 아니라 IgG 준비물의 기타 임상적으로 용인되는 용도에 적합하다.
FDA는 동종 골수 이식, 만성 림프성 백혈병, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 소아 HIV, 주요 면역결핍, Kawasaki 질환, 만성 염증 탈수초화 다발성신경병증 (CTDP), 그리고 높은 항체 수령인 또는 ABO 부적합 기증자와의 신장 이식을 포함하는 다양한 징후를 치료하는데 IVIG의 이용을 승인하였다. 특정 구체예들에서, 여기에서 제공된 IVIG 조성물들은 이러한 질환들 및 상태의 치료 또는 관리에 유용하다.
더욱이, IVIG의 오프-라벨 용도(off-label)는 예를 들면, 만성 피로 증후군, 클로스트리디움 디피실 대장염, 피부근염 및 다발성근염, Graves 안병증, Guillain-Barre 증후군, 근위축증, 봉입체 근염, Lambert-Eaton 증후군, 홍반성 낭창, 다촛점운동신경병증, 다발성 경화증(MS), 중증근무력증, 신생아 동종면역 혈소판감소증, 파르보바이러스 B19 감염, 수포창, 수혈후 자반증, 신장 이식 거부, 자연 유산, 전신근강직 증후군, 안구간대경련-근간대경련, 심각한 폐혈증 및 결정적으로 아픈 성인에서 폐혈증 쇼크, 중독성 표피융해, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, X-연계된 무감마글로블린혈증, 저감마글로블린혈증의 다양한 징후의 치료 또는 관리를 위하여 환자들에게 흔히 제공된다. 특정 구체예들에서, 여기에서 제공되는 IVIG 조성물들은 이들 질환 및 상태의 치료 또는 관리에 유용하다.
끝으로, 주요 면역 결핍, RRMS, Alzheimer 질환, 및 Parkinson 질환을 포함하는 질환의 치료 또는 관리를 위하여 IVIG의 실험적 이용을 제안하였다(U.S. 특허 출원 공개 U.S. 2009/0148463, 모든 목적을 위하여 이의 전문에 참고자료에 통합된다). 특정 구체예들에서, 여기에서 제공되는 IVIG 조성물들은 주요 면역 결핍, RRMS, Alzheimer 질환, 또는 Parkinson 질환의 치료 또는 관리에 유용하다. 매일 투여하는 것을 포함하는 특정 구체예들에서, 피험자에 투여되는 유효량은 나이, 체중, 질환 심각성, 투여 경로 (가령, 정맥내 v. 피하) 및 이 요법에 대한 반응에서 개인의 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 면역글로블린 준비물은 피험자에게 매일 약 5 mg/kilogram 내지 약 2000 mg/kilogram 투여할 수 있다. 추가 구체예들에서, 면역글로블린 준비물은 최소한 약 10 mg/kilogram, 최소한 15 mg/kilogram, 최소한 20 mg/kilogram, 최소한 25 mg/kilogram, 최소한 30 mg/kilogram, 또는 최소한 50 mg/kilogram으로 투여할 수 있다. 추가 구체예들에서, 면역글로블린 준비물은 피험자에게 매일 최대 약 100 mg/kilogram, 약 150 mg/kilogram, 약 200 mg/kilogram, 약 250 mg/kilogram, 약 300 mg/kilogram, 약 400 mg/kilogram 투여할 수 있다. 다른 구체예들에서, 면역글로블린 준비물의 투약량은 더 많거나 더 적을 수 있다. 더욱이, 면역글로블린 조합물은 일일 1회 이상의 투약량으로 투여될 수 있다. IgG 준비물로 치료할 수 있는 질환들을 잘 아는 임상의는 당업계에 공지되어 있는 기준에 따라 환자에 적합한 투약량을 결정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 치료 과정을 완성하는데 필요한 시간은 의사가 결정할 수 있으며, 이 기간은 짧게는 1일에서 1달 이상의 범위가 될 수 있다. 특정 구체예들에서, 치료 과정은 1개월 내지 6개월이 될 수 있다.
IVIG 준비물의 유효량은 정맥내 수단을 이용하여 피험자에게 투여된다. 용어 "유효량(effeictive amount)"은 피험자의 질환 또는 상태의 개선 또는 교정을 야기하는 IVIG 준비물의 양을 말한다. 피험자에게 투여되는 유효량은 나이, 체중, 치료될 질환 또는 상태, 질환 심각성, 및 이 요법에 대한 반응에서 개인의 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 특정 구체예들에서, IVIG 준비물은 피험자에게 투여당 약 5 mg/kilogram 내지 약 2000 mg/kilogram의 투약량으로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이 투약량은 최소한 약 5 mg/kg, 또는 최소한 약 10 mg/kg, 또는 최소한 약 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg 1900 mg/kg 또는 최소한 약 2000 mg/kg일 수 있다.
IVIG 치료의 투약량 및 빈도는 다른 인자들중에서도 환자의 치료대상 질환 또는 상태, 그리고 이 질환 또는 상태의 심각성에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 주요 면역 기능장애의 경우 체중 kg 당 약 100 mg/kg 내지 약 400 mg의 투약량을 대략 매 3 내지 4주마다 투여할 것이다. 신경학적 그리고 자가면역 질환들의 경우, 체중 kg 당 최대 2 g을 1달에 한 번, 5일 과정에 걸쳐 3 내지 6개월간 실행한다. 이는 체중 kg 당 약 100 mg/kg 내지 약 400 mg을 대략 매 3-4주에 한 번씩 투여하는 것을 포함하는 유지 요법이 보충된다. 일반적으로, 환자는 투약량 또는 치료를 대략 매 14-35일에 한 번, 또는 대략 매 21일 내지 28일에 한 번씩 제공받을 것이다. 치료의 빈도는 다른 인자들중에서도 환자의 치료 대상 질환 또는 상태, 그리고 이 질환 또는 상태의 심각성에 따라 달라질 것이다.
바람직한 구체예에서, 치료를 요하는 인간에서 면역결핍, 자가면역 질환, 또는 급성 감염을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 본 발명의 약제학적 IVIG 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 관련된 구체예에서, 본 발명은 치료를 요하는 인간의 면역결핍, 자가면역 질환, 또는 급성 감염의 치료를 위하여 여기에서 제공되는 방법에 따라 제조된 IVIG 조성물들을 제공한다.
특정 구체예들에서, 면역결핍, 자가면역 질환, 또는 급성 감염은 동종 골수 이식, 만성 림프성 백혈병, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 소아 HIV, 주요 면역결핍, Kawasaki 질환, 만성 염증 탈수초화 다발성신경병증 (CIDP), 고항체 수령인 또는 ABO 부적합 기증자와의 신장 이식, 만성 피로 증후군, 클로스트리디움 디피실 대장염, 피부근염 및 다발성근염, Graves 안병증, Guillain-Barre 증후군, 근위축증, 봉입체 근염, Lambert-Eaton 증후군, 홍반성 낭창, 다촛점운동신경병증, 다발성 경화증(MS), 중증근무력증, 신생아 동종면역 혈소판감소증, 파르보바이러스 B19 감염, 수포창, 수혈후 자반증, 신장 이식 거부, 자연유산, 전신근강직 증후군, 안구간대경련-근간대경련, 심각한 폐혈증 및 결정적으로 아픈 성인에서 폐혈증 쇼크, 중독성 표피융해, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, X-연계된 무감마글로블린혈증, 저감마글로블린혈증, 주요 면역 결핍, RRMS, Alzheimer 질환, 및 Parkinson 질환으로부터 선택된다.
실시예
다음의 실시예들은 오로지 설명을 위하여 제공되며, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 기본적으로 동일한 또는 유사한 결과들을 낳기 위하여 변경 또는 변형할 수 있는 다양한 비-임계 매개변수들을 용이하게 인지할 것이다.
실시예 1
본 실시예는 피브리노겐, 아미도용해성 활성, 프레칼리크레인(prekallikrein) 활성, 및 지단백질들의 상당한 양을 여과 전, Aerosil로 처리함으로써 변형된 분획물 II+III 페이스트 현탁액으로부터 제거할 수 있음을 설명한다.
훈증된 실리카 (Aerosil 380)는 현재 피브리노겐, 아미도용해성 활성, 프레칼리크레인(prekallikrein) 활성, 및 지단백질들을 흡수하는데 이용한다. 좀더 상세하게 Aerosil의 효과를 조사하기 위하여, 6가지 변형된 분획물 II+III 현탁액들을 여과 전, 다양한 양의 Aerosil로 처리하였다. 간략하게 설명하자면, 5mM 아세트산나트륨염/5mM 이수소 인산나트륨염을 함유하는, pH 4.5의 용해완충액을 이용하여 여기에서 설명된 것과 같이, II+III 페이스트 g 당 15g의 용해완충액 비율로 변형된 II+III 페이스트를 재현탁하였다. 페이스트 첨가 후, 이 현탁액은 pH 조절된 환경(pH IPC 한계: 4.9 내지 5.3)하에서, 2℃ 내지 8℃ 사이에서 1시간 동안 교반하였다. 우리는 이 현탁액의 pH는 약 5.1로 정상적으로 이동하고, 따라서 더 이상의 pH 조정이 필요하지 않는다는 것을 알았다. 추가 추출 후, 0 내지 100 mg/g II+III 페이스트 사이에서 Aerosil 380을 용기에 최소한 120분간 추가하고, 현탁액은 1시간 동안 항온처리하였다. 규조토는 Cuno 50SA 필터로 심층 여과하기 전에 추가하였다. 여과 후, 8 g/L 구연산염 및 0.2% 폴리소르베이트 80 (pH 5.0)을 함유하는 추출 완충액으로 세척하였고, 세척물은 여과액에 추가하였다. 복합된 여과액 및 세척 용액은 그 다음 폴리소르베이트 80으로 처리하여, 소수성 불순물, 예를 들면 지단백질들을 추가 가용화시키고, IgG는 -8℃ 내지 -10℃의 온도에서 25% 에탄올 (pH 7)로 침전시켰다. 생성된 Ppt G 침전물은 거의 백색이며, 더 높은 IgG 순도를 보유하였다. 이 침전물은 그 다음 Ppt G 침전물 2g 당 7g의 물의 비율로 정제수에 용해시켰다.
Cuno 여과 단계 후, IgG 회수 및 불순물에 대하여 IgG 용액을 분석하였다. 특히, 아미도용해성 활성 (PL-1), PKA 활성, 및 피브리노겐의 수준을 측정하였다(표 3). 눈에 띄게, 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 40 내지 60mg의 Aerosil 380/g II+III 페이스트를 이용한 추출 프로토콜에서 아미도용해성 및 PKA 활성의 상당한 감소와, 뿐만 아니라 여과액 안에 피브리노겐의 수준의 상당한 감소와 함께 수용가능한 수준으로 IgG를 회수하였다. Aerosil 처리 없이 실시한 추출과 비교하였을 때, 40mg의 Aerosil 380/gram II+III 페이스트의 첨가로 유사한 IgG 회수(73%)를 유지하면서, PKA 활성 및 피브리노겐 함량의 거의 90% 감소와 아미도용해성 활성의 60% 감소를 얻었다.
Figure 112016008940923-pat00001
실시예 2
본 실시예는 피브리노겐의 상당한 양을 여과 전, Aerosil로 처리함으로써 변형된 분획물 II+III 페이스트 현탁액으로부터 제거할 수 있음을 설명한다. 본 실험의 한 가지 목적은 IgG의 상당한 손실없이 효과적으로 피브리노겐을 제거하기 위한 적합한 조건들을 찾는 것이었다.
여기에서 제공되는 방법들에 따라 준비된 변형된 II+III 페이스트 5mM 아세트산나트륨염/5mM 단일염기 인산나트륨염 완충액 pH 4.5에 용해시켰다. 용해 비율은 II+III 페이스트 1 kg 당 15kg의 완충액이었다. 완충액에 첨가되는 아세트산의 양은 60분 교반 후 pH는 4.9가 되는 방식으로 선택하였다. 이 현탁액을 충분히 균질화시키기 위하여, 100ml 비이커에 각 50ml 씩 6개로 나누기 전에 2 내지 8℃에서 최대 20 시간 동안 교반시키고, 이때 상기 비이커에는 표 2에 나타낸 것과 같이 이미 다양한 양의 Aerosil 380을 포함하고 있었다. 그 다음 II+III 현탁액 용액을 공정 및 분석 전, Aerosil 존재하에 80분간 교반하였다. 교반 후, 모든 시료는 Heraeus Cryofuge 8500i으로 50ml 팔콘 튜브에서 4℃, 30분간 4600rpm으로 원심분리하였다.
이 실험에서, 네펠로메트릭 테스트를 이용하여 IgG 측정하였는데, 이것은 II+III 현탁액 용액에서 발견되는 고 농도에서 ELISA 테스트와 비교하였을 때 값이 좀더 정확하기 때문에 선택되었다. 비특이적인 탁도의 자극을 최소화시키기 위하여, 테스트하기 전, 0.45μm 필터를 통하여 시료들을 여과시켰다. IgM, IgA, 및 피브리노겐의 경우, 현탁액 안에 불순물의 농도가 더 낮기 때문에 ELISA 테스트가 바람직하였다. 이 실험 결과는 하기 표 2에 나타낸다.
실시예 1에서 설명한 것과 같이 피브리노겐의 제거 및 IgG 손실에 있어서 Aerosil 처리 효과를 더 특징화시키기 위하여, Aerosil 농도는 변형된 II+III 페이스트 g당 0mg 내지 40mg 사이로 더 적정하였다. 표 2에 나타낸 결과들에 의해 이 분획물에서 피브리노겐을 감소시키는 Aerosil의 우수한 능력을 확인한다. 특히, II+III 페이스트 g 당 40mg의 사용으로 필터 케이크에서 IgG의 회수는 단지 10%만 감소하면서, 피브리노겐은 거의 90% 감소되는 결과를 낳았다.
Figure 112016008940923-pat00002
실시예 3
본 실시예는 해로운 불순물의 수준은 제한시키면서, 변형된 분획물 II+III 페이스트로부터 IgG를 매우 효과적으로 추출하는 것을 허용하는 적합한 조건들을 설명한다. 특히, II+III 용해완충액에 이용된 아세트산의 농도와 여과전 추출된 용액의 Aerosil 처리를 포함하는 매개변수들을 검사하였다.
표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, II+III 페이스트는 5mM 아세트산나트륨염, 5mM 이수소인산나트륨염 그리고 다양한 양의 농축된 아세트산에서 2℃ 내지 8℃ 온도에서 180분간 추출하였고, 그 다음 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, Aerosil 380을 첨가하였다. 1시간 교반 후, 규조토 존재하에서 Cuno 5OSA 여과에 의해 이 현탁액을 정화하였다. 필터의 후-세척은 여과 전, 상이한 양의 아세트산을 제외하고, 현탁액의 용적의 40%를 이용하여 표 1에서 제공된 것과 같은 추출의 경우와 같이 동일한 완충액에서 추출하였다. 25% 에틸 알코올; 8gL-1 구연산나트륨염, 및 0.2% Tween 80 (pH 7) 존재하에 -8℃에서 침전물 G 침전을 실행하였고, 그리고 8시간의 유지 시간 후, Heraeus Cryofuge 8500i으로 스테인레스 강 비이커 안에서 -10℃에서 30분간 4600rpm으로 원심분리에 의해 분리를 실행하였다. 이 침전물은 정제수에 1:2의 비율로 용해시켰다.
Figure 112016008940923-pat00003
표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, Aerosil을 II+III 페이스트 현탁액에 첨가하면 Ppt G 분획물에서 γ-글로블린 순도에 두드러진 영향을 준다. Aerosil 없는 경우, γ-글로블린 순도는 단지 83.5%이며, II+III 페이스트 g당 40mg Aerosil을 II+III 페이스트 현탁액에 추가하면 γ- 글로블린 순도는 87.2%로 증가된다. 증명된 것과 같이, Aerosil 처리는 피브리노겐, PKA 및 아미도용해성 활성의 상당한 감소를 이끈다. Aerosil상에서 불순물의 흡수도의 한 가지 단점은 필터 케이크에서 IgG 손실은 Aerosil의 양이 증가함에 따라 증가한다는 점이다. 그러나, 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 추출 완충액 안에 더 높은 농도의 아세트산은 필터 케이크에서 IgG 손실에서의 Aerosil 효과를 부분적으로 상쇄시키고, 그리고 상청액 Ppt G 분획물에서 IgG 손실을 더 감소시킨다. 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 용해완충액 안에 아세트산의 양을 페이스트 L 당 400 ul에서 510 ul로 증가시키면, 필터 케이크에서 IgG 손실양은 거의 50% 감소되었다. 유익하게, 더 높은 아세트산 농도는 Ppt G 분획물에서 γ-글로블린 순도에 영향을 주지 않는다 (페이스트 L 당 400ul를 이용한 경우 순도는 87.2%이며, 페이스트 L 당 510ul를 이용한 경우 순도는 86.7%이다). 더욱이, 이 결과에서 상이한 양의 아세트산에 의해 야기되는 pH 값의 차이는 4.75에 가까운 이의 pka 값(Merck)으로 인한 아세트산의 높은 완충 능력으로 인하여 거의 무시할 수준이라는 것을 보여준다. 이는 대규모 제조시 더 나은 정확성을 위하여, 아세트산은 중량비로 추가되어야 한다고 제안한다. 따라서, 순도에서 Aerosil의 영향은 조사된 범위안에서 CAE에 희해 측정된 γ-글로블린 함량으로 나타난 것과 같이, 순도에서 아세트산의 영향보다는 훨씬 더 크다.
실시예 4
실시예 3에서 확인한 결과들은 필터 케이크에서 손실된 IgG의 양은 주어진 Aerosil 농도에서 추출 완충액의 pH 조정에 이용된 아세트산의 양에 상당히 의존적이라는 것을 암시하였다. 이 영향을 더 특징화시키기 위하여, 변형된 II+III 페이스트를 약 120분간 정제수에서 추출하여 균질한 현탁액을 수득하고, 이를 4개로 나누었다. 나눈 부분들의 pH는 1M 아세트산을 이용하여 차례로 pH 3.8, 4.2, 4.6, 및 5.0으로 조정하고, 추가 120분간 제 2 추출하였다. 그 다음, Aerosil 처리는 II+III 페이스트 g당 40mg의 Aerosil 380으로 실시하였다. 1시간 교반한 뒤, 이 현탁액은 규조토 존재 하에 Cuno 50SA 여과를 이용하여 정화하였다. 필터의 후-세척은 100% 현탁액 용적으로 실시하고, 그 다음 상기에서 제공된 것과 같은 pH로 조정된 추출 완충액으로 여과하였다. 이 여과액은 8g L-1 구연산나트륨염과 0.2% Tween 80(pH 7.0으로 조정됨)으로 처리하고, IgG는 -8℃에서 25% 알코올로 침전시켰다. PptG 침전물은 Heraeus Cryofuge 8500i에서 스테인레스 강 비이커를 이용하여, -10℃에서 30분간, 4600rpm에서 원심분리에 의해 회수하였다. 그 다음 이 침전물은 Ppt G 침전물 2g 당 7g의 물의 비율로 정제수에 용해시켰다. 그 다음 관련 분획물은 IgG 회수, PKA 활성, 피브리노겐 함량, 및 아미도용해성 활성에 대해 분석하여 회수의 pH 의존성을 결정하였다(표 4).
Figure 112016008940923-pat00004
정화하는 동안 낮은 pH에서 Aerosil은 PKA, 아미도용해성 활성 (PL-1), 및 피브리노겐의 제거에 효과가 덜하다는 것을 표 4에서 보여준다. 여기에서 얻은 결과들로부터 Ppt G 분획물에서 IgG 회수의 효율은 유지시키면서, PKA, 아미도용해성 활성 (PL-1), 및 피브리노겐의 제거에 있어서 가장 효과적인 pH는 약 pH 5라는 것을 볼 수 있다. 고농도의 아세트산은 필터 케이크에서 IgG의 손실은 최소화시키지만, Ppt G 상청액에서 상당한 IgG 손실로 이어진다(75mM 아세트산 존재하에서 0.85g L-1).
실시예 5
실시예 4에서 발견한 결과에서 Aerosil 처리 의존성을 결정하기 위하여, 이 실험을 반복하였지만, 단 Aerosil 처리 단계는 생략하였다. 간략하게 설명하자면, II+III 페이스트를 약 120분간 정제수에서 추출하여 균질한 현탁액을 수득하고, 이를 4개로 나누었다. 나눈 부분들의 pH는 1M 아세트산을 이용하여 차례로 pH 3.8, 4.2, 4.6, 및 5.0으로 조정하고, 추가 120분간 제 2 추출하였다. 그 다음, 이 현탁액은 규조토 존재 하에 Cuno 50SA 여과를 이용하여 정화하였다. 필터의 후-세척은 100% 현탁액 용적으로 실시하고, 그 다음 상기에서 제공된 것과 같은 pH로 조정된 추출 완충액으로 여과하였다. 이 여과액은 8g L-1 구연산나트륨염과 0.2% Tween 80(pH 7.0으로 조정됨)으로 처리하고, IgG는 -8℃에서 25% 알코올로 침전시켰다. PptG 침전물은 Heraeus Cryofuge 8500i에서 스테인레스 강 비이커를 이용하여, -10℃에서 30분간, 4600rpm에서 원심분리에 의해 회수하였다. 그 다음 이 침전물은 Ppt G 침전물 2g 당 7g의 물의 비율로 정제수에 용해시켰다. 그 다음 관련 분획물은 IgG 회수, PKA 활성, 피브리노겐 함량, 및 아미도용해성 활성에 대해 분석하여 회수의 pH 의존성을 결정하였다(표 5).
Figure 112016008940923-pat00005
실시예 4에서 확인한 결과들과 일치하게, 추출/용해완충액의 pH를 5.0로 증가시키면 필터 케이크에서 IgG 손실의 증가가 작았지만, 그러나, 이러한 상실은 Ppt G 상청액 안에서 IgG 상실의 더 큰 감소에 의해 상쇄 이상이었다.
실시예 4와 실시예 5의 결과들을 비교하였을 때, Aerosil 처리는 II+III 페이스트를 pH 5.0이 아닌 더 낮은 pH(3.8, 4.2, 및4.6)에서 추출하였을 때(도 2) 용해된 PptG 분획물에서 볼 수 있는 잔류 PKA 활성량을 감소시킨다는 것을 볼 수 있다. 역으로, Aerosil 처리는 II+III 페이스트를 더 높은 pH(도 3; pH 3.8 및 4.2에 대해 pH 4.6 및 5.0과 비교함)에서 추출하였을 때, 용해된 PptG 분획물에서 피브리노겐 함량을 상당히 감소시킨다. Aerosil 처리는 용해된 Ppt G 분획물에서 볼 수 있는 잔류 아미도용해성 활성의 수준에 영향을 주지 않는 것으로 보인다(도 4). 명백히, 용해된 Ppt G 분획물에서 3가지 오염물질들 모두의 수준은 pH 3.8, 4.2, 및 4.6에서 추출한 것과 비교하였을 때, pH 5.0에서 추출하면 상당히 감소된다.
실시예 6
상기 실시예들에서 볼 수 있는 것과 같이, 필터 케이크 및 Ppt G 상청액에서 IgG 손실은 II+III 페이스트를 4.5 내지 4.6 부근의 pH에서 추출할 때 최소화된다. 그러나, PKA 활성, 아미도용해성 활성, 및 피브리노겐 함량을 포함하는 주요 불순물은 II+III 페이스트의 추출을 4.9 내지 5.0 부분의 pH에서 실시한 것과 비교하였을 때, pH 4.5 또는 4.6에서 추출하였을 때 훨씬 더 높았다는 것을 앞선 실시예들에서 또한 증명된다. 따라서, II+III 페이스트를 pH 4.5에서 추출할 때 볼 수 있는 더 높은 불순물 수준은 필터 케이크 및 Ppt G 상청액에서 IgG 손실 수준을 낮게 유지하면서, 오염물질들을 흡수하는데 이용되는 Aerosil의 양을 증가시킴으로써 상쇄될 수 있는지를 결정하기 위하여 본 실시예를 실행하였다.
이러한 방향과 함께, 변형된 II+III 페이스트의 추출은 기존과 같이 pH 4.5를 가진 추출 완충액으로 실행하였다. Aerosil 380의 양을 II+III 페이스트 g 당 최대 200mg으로 증가시키면서 첨가하였고, 그리고 이 현탁액은 1시간 동안 교반시켰다. 시료의 추가 공정은 상기와 같이 실행하였다.
표 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 피브리노겐과 PKA 활성 제거는 많은 양의 Aerosil으로 정화함으로써 상당히 개선된다. Aerosil에 결합으로 인하여, 필터 케이트에서 IgG 손실은 많은 양의 Aerosil로 인하여 증가되지만, 이 효과는 Ppt G 상청액에서 IgG 손실의 감소로 인하여 어느 정도 상쇄되었다. 그러나, II+III 페이스트를 pH 4.5에서 추출할 때 많은 양의 Aerosil에 의해 아미도용해성 활성이 현저하게 감소될 수는 없을 것이다. 더욱이, γ-글로블린 순도는 많은 양의 Aerosil로 인하여 개선되지만, 모든 경우에서 추출 및 정화에서 낮은 pH로 인하여 Ppt G의 경우 >86% 명시 한계 아래이다.
Figure 112016008940923-pat00006
실시예 7
본 실시예는 II+III 페이스트 재-현탁 및 정화 후 불순물 제거에 있어서 추출 완충액의 pH의 효과를 설명한다.
변형된 II+III 페이스트의 낮은 pH 추출은 II+III 페이스트 g당 15g 완충액의 비율을 이용하여 pH 4.2에서 실행하였다. 그 다음, 이 현탁액을 3부분으로 분할하고, 3M Tris를 이용하여 pH를 4.5, 4.7, 또는 5.0으로 조정하였다. 그 다음, 각 용액은 2부분으로 나누고, 이를 4℃ 또는 25℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. Cuno 50(90)SA를 이용한 여과는 해당 정화 완충액과 동일한 pH를 보유한 10 mM 아세트산나트륨염 후-세척 완충액을 이용하여 실행하였다. 여과액은 8g L-1 구연산염 및 0.2% Tween 80으로 처리하였고, 그리고 IgG는 -10℃에서 25% 에틸 알코올을 최소한 8 시간 동안 첨가하여 침전시켰다. 이 침전물은 이미 설명한 것과 같이 원심분리에 의해 회수하였고, 그리고 이 침전물은 2배 용적의 정제수에 용해시켰다. 생성된 현탁액은 약 1.3mS cm-1의 전도성을 가진 최종 용액에서 Cuno VR06 여과 장치를 이용하여 여과시켰다.
다양한 조건들을 평가하기 위하여, IgG, IgA, IgM, 트란스페린, 피브리노겐, 및 기타 불순물의 수준을 결정하였다. 표 7에 이 분석 결과를 제시하는데, II+III 페이스트 현탁액의 정화는 pH에 의존성임을 보여준다. 4.5 내지 5.0의 pH 범위안에서 IgA, IgM, 트란스페린, 및 피브리노겐 양은 넓은 범위에서 가변적이지 않았지만, 더 낮은 pH 완충액을 이용할 때, 다른 원치않는 단백질들은 더 높은 수준으로 존재한다. 이들 기타 불순물은 pH 4.5에서 전체 단백질의 10%를 포함하지만, pH 5에서는 1% 미만으로 계산되었다. IgG 함량은 pH 5.0에서 최대이며, 4℃ 내지 25℃ 사이의 온도에서 IgG 함량 및 불순물 수준의 온도 의존성은 무시할 정도이다.
Figure 112016008940923-pat00007
표 8에서 볼 수 있는 것과 같이, 용해된 Ppt G 분획물과 VR06-여과액의 추가 분석에서 II+III 정화 및 II+III 여과액 처리 단계들에서 pH 4.5를 가진 완충액의 사용은 증가된 수준의 집합물과 저분자량 성분을 낳았다는 것을 나타낸다. 이러한 효과는 이 단계들을 4℃에서 실행하기보다 25℃에서 실행할 때 더 강화된다. 역으로, 시료들을 더 높은 pH (pH 5.0)에서 처리할 때, 생성된 Ppt G 현탁액과 여과액은 pH 4.5에서 처리된 용액보다 더 높은 수준의 -350 kDa 물질(이량체 IgG 또는 IgA)을 함유한다 (표 8). 더욱이, 더 낮은 pH 처리는 pH 5.0에서 처리한 것보다 더 높은 수준의 아미도용해성 활성을 초래하였다.
Figure 112016008940923-pat00008
실시예 8
표 7과 8에서 제시되는 결과들은 고분자량(>450KDa)과 저분자량(>70KDa) 성분들의 용해를 최소화시키고, 뿐만 아니라 아미도용해성 활성을 가진 성분들의 용해를 최소화시키기 위하여, II+III 침전물의 재현탁은 냉장 온도(2℃ 내지 8℃)에서 실시되어야 하며, pH는 pH 5.0에서 유지되어야 함을 보여준다. II+III 페이스트 현탁후 효과적인 정화는 Ppt G의 크로마토그래피 하류 공정에 대한 불순물의 적하를 감소시킬 것이며, 따라서 IVIG 최종 용기 특징화를 반복적으로 부합시키는 열쇠다. 이러한 발견을 더 실증하기 위하여, 변형된 II+III 페이스트를 상기와 같이 용해시키고, 가공하며, 변형된 II+III 페이스트는 pH 4.2에서 용해시키고, 그 다음 pH를 4.5, 4.7, 또는 5.0로 조정하였다. 표 9에서 볼 수 있는 것과 같이, IgM은 II+III 페이스트 현탁 및 정화 동안 pH 4.5에서 제거하는 것보다는 pH 5.0에서 더 효과적으로 제거된다. 이 실험에서, IgG 산출량은 pH 5.0와 4.5에서 유사하다.
Figure 112016008940923-pat00009
실시예 9
II+III 페이스트 추출 단계에서 pH 최적 조건을 평가하기 위하여, 여과액 안에 최소화된 단백질분해 활성을 위하여, 추출 및 여과 동안 pH는 pH 3.8 내지 7.8로 더 넓은 범위로 변화시켰다. 이 목적을 위하여, 변형된 II+III 페이스트는 1+8 비율에서 낮은 pH에서 추출하였다. 단시간 교반 후, 균질한 분산액을 수득하기 위하여, 이 현탁액을 8부분으로 나누었고, 아세트산 또는 Tris 완충액으로 pH는 pH 3.8, 4.2, 4.6, 5.0, 6.6, 7.0, 7.4 또는 7.8로 조정하였고, 그리고 추가 120분간 추출하였다. 그 다음, pH를 5.1로 조정하였고, 정화는 50mL 팔콘 튜브에서 원심분리에 의해 실시되었다. Ppt G 침전은 표준 조건하에서 실시하였다. 아미도용해성 활성 및 PKA는 도 5 및 6에 나타낸 것과 같이 Ppt G 용해된 분획물에서 측정하였다.
도 5에서 4℃에서 보관된 시료에서 볼 수 있는 것과 같이, 아미도용해성 활성은 II+III 페이스트를 pH 5.0로 추출할 때 최소화된다. 시료는 연장된 시간 동안 상승된 온도(실온)에서 유지되어서는 안된다는 점을 더 강조하면서, 아미도용해성 활성은 1주일간 실온에서 Ppt G 용해된 분획물을 보관한 후에 상승되었다. 유사하게, 도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, II+III 페이스트를 pH 5.0 또는 이 이상에서 추출할 때 PKA 활성은 최소이다.
실시예 10
본 실시예는 추출 및 정화동안 IgG 산출량 손실에서 pH 의존성을 평가한다. 간략하게 설명하자면, 110 grams의 변형된 II+III 페이스트는 II+III 페이스트 g당 15g의 정제수 비율로 재현탁시키고, 120분간 추출하였다. 그 다음 시료를 4부분으로 나누고, 아세트산을 이용하여 pH는 pH 3.8, 4.2, 4.6, 또는 5.0으로 조정하였다. 4 부분은 언급된 pH로 조정하고, 추가 한 시간 동안 추출되도록 하기 위하여 사전-추출은 고유 pH에서 4부분으로 분할하기 전에 실시하였다. 그 다음 시료들은 각 추출과 Ppt G 침전에 이용된 동일한 pH에서 Cuno 50SA 여과에 의해 정화하였다. Cuno 여과 후, 모든 부분들은 동일한 방식으로 처리하였고, 이는 모든 부분들을 pH 7.0에서 표준 침전물 G 침전을 의미한다. 두 가지 각 실험의 결과는 표 10과 11에 요약한다.
Figure 112016008940923-pat00010
Figure 112016008940923-pat00011
상기 데이터는 낮은 pH 추출에 있어서 단백질분해 효소의 활성에 관하여 도 5와 6에 나타낸 결과를 확인시킨다. 이를 함께 고려하면, 이 데이터에서 낮은 pH 추출은 모든 단백질들의 용해도 증가로 인하여 IgG 손실을 더 적게 한다는 것을 설명한다. 이들 결과는 상기에서 제공된 실시예와 일관된다. 추가적으로, 더 높은 농도의 아세트산은 더 낮은 pH를 낳고, 이는 필터 케이크에서는 IgG 손실을 적게하지만, 침전물 G 상청액에서는 더 많은 IgG를 잃게한다는 것을 표 11의 IgG 손실로부터 암시한다. 이러한 현상은 낮은 pH 추출 후 침전 단계에서 높은 농도의 아세트산염에 의해 설명될 수 있을 것이다.
실시예 11
적합한 II+III 추출 조건들을 결정하기 위하여, 아세트산을 이용하여 pH 4.3으로 조정하고, 여과전 다시 pH 4.9로 조정한 정제수와 함께 낮은 pH 추출을 이용하는 프로토콜과 용해 pH를 4.8에서 4.9로 조정하는 추출 완충액 1000L 당 600g 아세트산과 5mM 아세트산나트륨염/5 mM 이수소 인산나트륨염을 이용한 추출과 비교하였다. 실험들은 3.8 내지 5kg의 변형된 II+III 페이스트를 출발물질로 하는 시범 규모로 실행하였다. 모든 실험들은 II+III 페이스트 kg 당 40g의 Aerosil 처리를 포함하였다. 정화를 위하여, Cuno 50SA 여과 쉬트가 구비된 30cm*30cm의 필터 프레임이 있는 Strassburger 압착식 여과기를 이용하였다. 후 세척은 압착식 여과기의 4 무용 용적으로, 5mM 아세트산 나트륨/5mM 이수소 인산나트륨 완충액와 완충액 1000L 당 150gram의 아세트산으로 실행하였다. 침전물 G의 원심분리는 Cepa® Z61H 원심분리기로 시간 당 40L의 유속에서 17000 RPM(10.5cm의 로터 직경)에서 실행하였다. 3중으로 실시한 실험 결과들은 표 12에 나타낸다.
Figure 112016008940923-pat00012
표 12에서 볼 수 있는 것과 같이, 두 가지 추출 프로토콜은 유사한 IgG 회수를 낳는다. 실시예 3 내지 10을 통하여 제공된 결과는 pH 5.0에서 II+III 페이스트의 추출에 의해 다양한 불순물을 최소화할 수 있다는 것을 보여주며, 표 12에 제공된 결과들은 추출 완충액 1000L 당 600 g 빙초산으로 pH 4.8를 4.9로 조정한 후 추출한 경우가 낮은 pH에서 추출한 후, 후속적으로 pH 4.8에서 5.0으로 조정한 추출보다 우수하다는 것을 보여준다.
실시예 12
제조하는 동안, 탱크에 서로 연결된 압착식 여과기 프레임 및 라인은 상당한 비어있는(void) 용적을 보유하며, 이 공간은 후-세척을 시작하기 전 현탁액 또는 여과액으로 채워져있다. 후 세척이 끝날 때, 비어있는 이 용적은 압착식 여과기 안에 남아있다. 표준 프로토콜은 압착식 여과기의 하나의 무용 용적과 두 개의 무용 용적 사이를 세척함으로써 비어있는 용적을 설명한다. 표준 후-필터가 전체 IgG의 효과적인 회수를 허용하는지를 결정하기 위하여, 세척 완충액의 용적을 변화시키는 실험을 대규모 제조 IgG 정제에서 실시하였다. 도 1은 잔류 IgG 및 전체 단백질의 수준에서 후-세척 용적(무용(dead) 또는 비어있는(void) 용적에 의해 측정하였을 때)의 의존성을 보여준다.
특히, 도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 약 2-배 압착식 여과기 무용 용적을 이용한 후-여과 세척은 세척 용액이 세척 용액 L 당 약 1.5g의 IgG를 함유하기 때문에 상당한 IgG 회수 손실을 초래한다. 뜻밖에도, IgG의 효과적인 회수를 위해서 후-세척 완충액의 3.6-배 압착식 여과기 무용 용적이 필요하다는 것을 알았다(도 1에서 화살표로 나타냄). 더욱이 압착식 여과기의 3.6배 무용 용적 이상의 후-세척은 적당하지 않는데, 그 이유는 추가적인 IgG 회수없이 여과액을 희석시킬 수 있기 때문일 것이다.
실시예 13
II+III 침전 단계 동안, 알코올 농도는 20에서 25%로 증가시켰고, 온도는 -5℃에서 -7℃로 낮추었다. II+III 페이스트를 용해시킬 때, II+III 페이스트 재-현탁액 완충액의 pH를 조정하기 위하여 기존에 이용된 510 mL 빙초산/1000 L 완충액 비율과 대조적으로 1000L 용적당 최소한 600 mL 빙초산을 이용하였다. 추출 비율은 아세트산 완충액으로 1+15이었다. 정화를 위하여, II+III 페이스트 g당 0.04 내지 0.06 gram의 Aerosil (전형적으로 이 범위에서 낮은 값, 가령, 0.04 g)을 추가하였다. 후-세척을 위하여, 후-세척 완충액의 약 4배 (4 x) 압착식 여과기 무용 용적을 이용하였다. 예를 들면, 한 실험에서는 4.3 x 압착식 여과기 무용 용적을 이용하였고, 반면에 또다른 실험에서는 3.6 x 용적을 이용하였다. 기존에 이용된 1.8 x 무용 용적으로부터 4배 이상의 무용 용적 후 세척으로 증가되었다. 완충액은 기존의 120 mL 빙초산/1000 L 완충액으로부터 증가된, 1000 L 완충액 당 이용된 150 mL 빙초산으로 조정하였다. 이러한 변화들은 8% 더 높은 IgG 산출량과 최소한 86% γ-글로블린의 순도를 이끌었다. 0.1 M 인산나트륨염 + 150 mM NaCl (pH 7.4, 전도성 25.5 mS/cm)으로 추출하였을 때, 필터 케이크 추출물에는 매우 낮은 잔류량의 IgG이 발견되었다.
실시예 14
A. 분별 I의 최적화: 분무 대 유동성-방식 첨가에 의한 에탄올 첨가; 에탄올 첨가 후 pH는 7.0 또는 7.5로 조정
표 13은 현재 이용하는 제조방법들에 의한 IgG 산출량을 보여주고, 아래에서 설명된 실험들에서 비교 기준을 제공한다. Cohn 채집으로부터 여과액으로 IgG의 15-20%가 손실된다. 혈장 L당 약 0.4g의 IgG가 II+III 상청액에서 손실된다.
Figure 112016008940923-pat00013
방법
Cohn 채집물은 14-L 버킷안에서 6-7시간 동안 24-27℃에서 해동시켰다. 그 다음 이 물질을 2-8℃에서 하룻밤 동안 혼합시켰다. 그 다음 채집물은 각 800g씩 네 부분으로 나누었다:
1: 유동성-방식에 의한 에탄올 첨가, 이어서 pH는 7.0으로 조정
2: 유동성-방식에 의한 에탄올 첨가, 이어서 pH는 7.5로 조정
3. 분무에 의한 에탄올 첨가, 이어서 pH는 7.0으로 조정
4. 분무에 의한 에탄올 첨가, 이어서 pH는 7.5로 조정
모든 부분들은 우선 0℃로 냉각시켰다. 그 다음 8% 에탄올을 1과 2 부분에 유동성-방식으로 첨가하였고, 분무 헤드를 이용하여 3과 4부분에 분무에 의해 첨가하였다. 이들 두 방법들에서 에탄올은 대략 동일한 속도로 첨가하였다. 에탄올을 첨가하는 동안, 저온유지장치(cryostat)를 -5℃로 조정하였고, 그리고 75 ml 에탄올은 혼합하면서 각 부분에 첨가하였다. 1M 아세트산을 이용하여 pH는 7.0 또는 7.5로 조정하였다. 그 다음 이 용액을 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 이 용액은 비이커 원심분리(4600 rpm; 30 분; -2℃)로 원심분리하였다.
결과
IgG 산출량은 네펠로메트릭에 의해 측정하였고, 표 14에 나타낸다. 개선된 방법(에탄올 분무)으로 분별 I 상청액에서 거의 100% IgG 산출량을 얻었지만, 통상적인 에탄올 첨가의 경우 0.2 내지 0.25 g/L 혈장을 상실하였다. 이들 결과는 개선된 방법은 제조시 IgG 산출량을 최대 0.2 g/L 혈장로 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
Figure 112016008940923-pat00014
B. 시험 규모: 분별 I (분무 대 유동성-방식; 에탄올 첨가 후 pH는 7.4로 조정) 및 분별 II+III (에탄올 첨가 전 pH는 6.7로 조정, 에탄올 첨가 후 pH를 6.9로 다시 조정)
실시예 15
방법
2.8 kg 혈장은 2℃에서 혼합하면서 해동시켰다. 분획물 I: 8% 에탄올을 첨가하였고, 5 M 아세트산을 이용하여 pH는 7.4로 조정하였다. 혼합하는 동안, 이 현탁액은 -2℃로 냉각시켰다. 분무 헤드를 이용하여 분무 상태를 얻었다. 두 가지 방법들에서, 에탄올 및 5 M 아세트산의 첨가는 거의 동일한 속도에서 실시되었다. 1 시간 항온처리 후, -4℃ 온도에서 CEPA 원심분리기를 이용하여 이 용액을 원심분리하였다.
분획물 II+III: pH 4 완충액을 이용하여 pH는 6.7로 조정하였고, 그 다음 25% 에탄올은 (1) 분무 또는 (2) 통상적으로 실행되는 유동성-방식으로 첨가하였다. 그 다음 pH는 6.9로 재조정하였다. -7℃에서 10시간 동안 항온처리를 실시하였다.
결과
25% 에탄올에서 분획물 II+III 동안 IgG의 손실을 네펠로메트릭적으로 측정하였고, 표 15에 나타낸다. IgG 측정은 어느정도 변이가 있었고, 따라서 최적화된 방법의 평균값을 취하였다.
Figure 112016008940923-pat00015
분획물 II+III 침전물 지점까지, 혈장 L당 단지 0.35 g의 IgG를 상실하였다. 유동성-방식의 25% 에탄올 첨가와 비교하여 분무 방법을 이용하여 분별 II+III 동안 혈장 L당 0.04g의 IgG 산출량 증가를 얻었고; 그리고 현행 제조에서 이용되는 유동성-방식에 의한 20% 에탄올 첨가와 비교하여 혈장 L당 0.3 g의 IgG 산출량 증가를 얻었다(0.4 내지 0.06 g/L의 범위의 평균). 여과액에서 IgG 산출량의 증가는 기준과 비교하여 상당히 증가하였고, II+III 침전에서 유동성-방식으로 20% 에탄올을 첨가하는 현재 제조에서 수득되는 80 내지 86%보다 훨씬 우위에 있다.
C. 분별 II+III (20% 에탄올): 분별 II+III에 걸쳐 모두 초기 pH를 유지한다
실시예 16
방법
50L의 혈장은 27 시간 동안 17-20℃에서 혼합하면서 해동시켰다. 분별 I 은 최적화된 공정과 같이 상기 단락에서 언급된 것과 같이 실시하였다. 상청액 I은 2부분으로 분리하였다:
(1) 최악의 경우 pH 조정: 에탄올 첨가 전과 첨가 후에 pH 조정, 그러나 항온처리 기간 동안에는 조정하지 않음.
(2) 최적화된 pH 조정: 에탄올 첨가 전과 첨가 후에 pH 조정과 유지 시간 동안에도 pH의 추가 재조정. 이 용액은 유지 시간 동안에도 일정하게 교반시켰다.
I의 상청액의 pH는 pH 4 완충액을 이용하여 에탄올 첨가전 두 부분 모두에서 6.7로 조정하였다. 분무에 의해 에탄올을 첨가하였고, 에탄올 첨가 후 pH는 6.9로 재조정하였다.
(1) 부분에서, pH 조정은 최악의 경우 시나리오를 가장하기 위하여 주의를 덜 기울이면서 실행하였다. 이 용액의 pH는 에탄올 첨가 직후 바로 조정하였지만, 항온처리 동안 조정하지 않았다. (2) 부분에서, 10시간의 항온처리 시간 동안 pH는 6.8 내지 7.0의 일정한 값으로 재조정하였다.
결과
IgG를 다시 네펠로메트릭적으로 측정하였고, 표 16에 나타낸다. 유지 시간 동안 약 6.9의 일정한 값으로 pH를 일정하게 재조정함으로써, 대규모 제조시 혈장 L당 평균 0.4g의 상실과 비교하여, 혈장 L당 단지 0.13 g의 IgG를 상실하였다. 기준과 비교하여(분무 없이 유기 시간 동안 일정하게 교반함), 혈장 L당 산출량 0.07 g의 IgG 산출량 증가를 얻었다. 현재 이용되는 통상적인 방법과 비교하여(혈장 L당 0.38g의 IgG 손실, 표 13 참고) 혈장 L당 IgG의 산출량은 약 0.20 g 내지 약 0.30 증가하였다.
Figure 112016008940923-pat00016
결론
II+III 상청액에서 IgG 손실은 배취에서 제조시, 20% 에탄올로 침전할 때 현재 혈장 L당 0.4g 수준으로부터 혈장 L당 0.13g 수준으로 감소하고, 그리고 25% 에탄올로 침전할 때, 에탄올을 분무에 의해 첨가하고, 침전 동안 pH를 6.9 ± 0.1로 지속적으로 유지할 경우, 혈장 L당 0.08g 미만 수준으로 감소한다.
침전 I에서, pH 조정 전, 분무에 의해 에탄올을 첨가하면, 분별 I 상청액에서 IgG 산출량을 혈장 L당 0.1 내지 0.2 g의 증가로 이어진다.
논의
IgG는 모든 실험에서 네펠로메트릭적으로 측정하였고, 그리고 최소한 -/+ 5.0%의 변이를 가질 수 있다 (nephelometer의 제조업자, Siemens AG에 의해 나타낸 것과 같이). 따라서, 제조 동안 개선된 방법에 의해 수득된 실질적인 산출량 증가는 실시예들에서 표시된 것보다 약간 더 낮거나 더 높을 수 있다.
새로운 그리고 개선된 방법에 의한 산출량 증가의 추가 증거로써, 이 침전물 IgG 중량은 제조시 동일한 혈장 원천으로부터 수득한 평균 침전물 IgG 중량과 비교하였다. 20.8 kg의 침전물 IgG를 얻은 시험 규모 연구(20% 에탄올 및 분별 II+III에서 최적화된 pH 조정, 모든 완충액과 에탄올은 분무에 의해 첨가)와 대조적으로, 제조시 현재 이용되는 방법에 의한 경우 US 원천 Cohn 채집물의 1000L 당 18 kg의 침전물 IgG를 얻었다. 이는 Cohn 채집물 1000L 당 2kg 이상의 침전물 IgG의 증가이다.
실시예 17
이 실시예는 분획물 II+III 현탁액의 여과 전, 훈증된 실리카 처리 단계의 추가로 더 높은 순도의 IgG 여과액을 얻는다는 것을 설명한다. 간략하게 설명하자면, 동결-불량 혈장은 분획물 II+III 단계에서 상기에서 설명한 것과 같이 분획하였고, 이 지점에서 두 개의 시료로 나누었다. 제 1 시료는 표준 분획물 II+III 현탁액 여과 전 여과 보조제만을 첨가하여 정화하였다(도 7A). 제 2 시료는 여기에서 설명된 것과 같이, 여과 보조제의 첨가 및 표준 분획물 II+III 현탁액 여과전 훈증된 실리카 전처리를 하였다(도 7B).
여과액의 단백질 성분들은 셀룰로오스 아세트산염 전기영동에 의해 분리하였고, 표준 방법들을 이용하여 개별적인 피크 면적을 계산하였다. 크로마토그래피와 정량화된 데이터에서 볼 수 있는 것과 같이, 여과 전, 훈증된 실리카로 처리된 제 2 시료는 훈증된 실리카로 처리되지 않은 시료보다 훨씬 더 높은 IgG 순도를 가진 여과액을 얻었다(68.8% vs. 55.7 γ-글로블린; 표 18을 표 16과 비교).
Figure 112016008940923-pat00017
Figure 112016008940923-pat00018
실시예 18
본 실시예는 피하 투여에 적합한 20% IgG 준비물의 한외여과 및 제제를 설명한다. 이 정보는 스케일-업 및 전-임상적 20% IgG 조합물의 생산 동안 수집하였다. 나노여과 단계 전 20% 로트의 제조에 이용된 공정은 상기에서 설명한 것과 같았다. 한외-/정용여과를 개선시켜 이 용액을 20%로 농축시켰다. 산출량 손실을 최저로 감소시키기 위하여, 정용여과에 이용된 한외여과 장치의 후-세척은 동일한 막이 구비된 제 2의 더 작은 장치에 의해 농축하고, 그 다음 벌크 용액으로 첨가한다.
놀라운 것은, 낮은 pH 보관 동안 바이러스 비활성화는 이 용액의 단백질 농도에 영향을 받지 않음을 볼 수 있을 것이다. 10% 용액 (GAMMAGARD® LIQUID) 및 20 % 용액 모두에서 유사한 바이러스 감소를 얻었다. 따라서, 20 % 산물의 경우 바이러스 감소 단계로써 낮은 pH 보관은 유지하였다.
나노여과 전, IgG 용액의 글리신 농도는 0.25M의 표적으로 조정한다. 그 다음 이 용액은 한외여과(UF)를 통하여 6 ± 2 % w/v의 단백질 농도로 농축한다. pH는 5.2 ± 0.2로 조정한다. 이용된 UF 막은 50,000 daltons 또는 미만의 명목상 분자량 한계(NMWCO)를 가지고, 점성이 높은 산물들을 위해 특별히 고안되었다(가령, V screen, Millipore).
응축물은 그 다음 0.25M 글리신 용액, pH 4.2 ± 0.2에 대해 정영여과시킨다. 최저 교환 용적은 최초 응축물 용적의 10배이다. 한외여과/정용여과 작업을 통하여, 약 4℃ 내지 20℃ 사이에서 이 용액을 유지한다.
정용여과 후, 이 용액은 단백질 농도가 최소한 22% (w/v)가 되도록 농축한다. 이 용액 온도는 2℃ 내지 8℃로 조정한다.
시스템 안에서 완전한 잔류 단백질을 회수하기 위하여, 제 1의 더 큰 한외여과 시스템의 후-세척은 모든 단백질이 씻겨나올 수 있도록 재순환 방식에서 최소한 2배 무용 용적으로 실행한다. 그 다음 제 1 한외여과 시스템의 후-세척은 제 1 시스템의 것보다 1/10 크기 또는 이 미만의 동일한 유형의 막이 구비된 제 2 한외-/정용여과 시스템으로 단백질 농도를 최소한 22% w/v로 농축시킨다. 후-세척 응축물을 벌크 용액에 추가한다. 그 다음 제 2 한외여과 시스템을 후-세척한다. 이 후-세척은 최종 제제의 단백질 농도 조정을 위하여 이용한다. 약 2℃ 내지 8℃ 사이에서 이 용액의 온도를 유지한다.
최종 용액을 제제화하기 위하여, 단백질 농도는 더 작은 제 2의 한외여과 시스템의 후-세척 및/또는 정용여과 완충액으로 약 20.4 ± 0.4% (w/v)으로 조정한다. 필요에 따라, pH는 약 4.4 내지 4.9로 조정한다.
실시예 19
현재 GAMMAGARD® LIQUID 제조 공정에서 분획물 II+III 여과액에서 회수된 IgG의 분획물과 비교하기 위하여, 여기에서 제공된 개선된 분획물 II+III 침전 및 용해방법들을 이용하여 IgG의 5가지 제조 규모 정제를 실행하였다. 간략하게 설명하자면, 현재 제조 공정에서 이용되는 20% 에탄올과 -5℃와 비교하여, IgG의 출발 농도는 약 6.14 g/L으로 하여, IgG Cohn 채집물의 침전은 유동성 첨가에 의해 첨가된 25% 에탄올과 -7℃에서 실시하였다. 그 다음 변형된 분획물 II+III 침전물은 pH 4.3을 가진 또는 0.06% 빙초산으로 조정된 용해 완충액으로 1 내지 15로 추출하였고, 그 다음 이어서 용해 완충액의 4.3 무용 필터 용적으로 최종 세척에 의해 심층 여과를 통하여 여과하였다. 표 19에서 볼 수 있는 것과 같이, 여기에서 제공되는 개선된 방법들에 의해 준비된 변형된 분획물 II+III 여과액은 현재 제조 과정에 따라 준비된 분획물 II+III 여과액보다 출발 Cohn 채집물에 존재하는 IgG를 상당히 더 높은 비율(최소한 8.0% 증가)로 함유하였다(차례로 91.1% 및 91.6% vs. 83.1% 및 83.8%)).
Figure 112016008940923-pat00019
실시예 20
여기에서 제공된 IgG 조성물들의 순도를 결정하기 위하여, 여기에서 제공되는 개선된 방법들에 따라 3가지 IgG 로트를 준비하였다. IgA, IgM, 아미도용해 활성, C3, 및 피브리노겐을 포함하는 몇 가지 오염물질에 대해 이들 정제의 최종 IgG 산물들을 테스트하였고, 뿐만 아니라 최종 조성물에서 IgG 단량체들/이량체들의 비율을 결정하기 위하여 이들 정제의 최종 IgG 산물들을 테스트하였다. 하기 표 20에서 볼 수 있는 것과 같이, 여기에서 제공하는 개선된 제조 방법들은 현재 이용되는 방법들의 경우 60% 내지 70%와 비교하였을 때, 현재 IgG 제조 표준보다 순도 프로파일이 더 우수하지 않다면 동일하게 양호한 순도 프로파일을 유지하면서, 출발 물질의 73.6% 내지 78.5%로 IgG의 회수가 증가된 최종 벌크 조성물들을 낳았다.
Figure 112016008940923-pat00020
여기에서 설명하는 실시예들 및 구체예들은 오로지 설명을 위함이며, 이의 다양한 변형 및 변경이 당업자에게 암시될 수 있으며, 이는 명세서 및 첨부된 청구범위의 범위 및 사상에 포함된다. 여기에서 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 전문이 참고자료에 통합된다.

Claims (23)

  1. (a) 제 1 침전 단계에서, 제 1 침전물 및 제 1 상청액을 얻기 위하여 약 7.0 내지 약 7.5의 pH에서 약 6% 내지 약 10%의 알코올로 동결-불량(cryo-poor) 혈장 분획을 침전시키는 단계;
    (b) 제 2 침전 단계에서, 제 2 침전물을 얻기 위하여 약 6.7 내지 약 7.1의 pH 및 -7℃ 내지 -9℃의 온도에서 약 23% 내지 약 27%의 알코올로 제 1 상청액으로부터 IgG를 침전시키는 단계;
    (c) 제 2 침전물을 현탁시켜 현탁액을 형성하는 단계;
    (d) 제 3 침전 단계에서 제 3 침전물을 형성시키기 위하여 6.7 내지 7.3의 pH에서 22% 내지 28%의 알코올로 단계 (c)에서 형성된 현탁액으로부터 IgG를 침전시키는 단계;
    (e) 제 3 침전물을 재현탁시켜 현탁액을 형성하는 단계; 및
    (f) 단계 (e)에서 형성된 현탁액으로부터 가용성 분획물을 분리하고, 이에 의해 IgG가 풍부한 조성물을 형성하는 단계,
    를 포함하는, 혈장으로부터 IgG가 풍부한 조성물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 침전 단계 (b)의 온도는 -7℃인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 침전 단계 (b)의 알코올 농도는 약 25%인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 침전 단계 (b)의 알코올 농도는 약 25%인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제 1 침전 단계, 제 2 침전 단계, 및 제 3 침전 단계 중 적어도 하나의 pH는 알코올의 첨가 후 pH 변경 용액의 첨가에 의해 달성되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, pH 변경 용액의 첨가는 pH 변경 용액의 분무 첨가를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 침전 단계의 pH는 알코올의 첨가 이전과 이후, 또는 알코올의 첨가 동안 그리고 첨가 이후, 또는 알코올의 첨가 이전, 첨가 동안 그리고 첨가 이후 변경되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 침전 단계의 pH는 pH의 연속 조정에 의해 전체 침전 단계 동안 유지되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 형성된 침전물을 침전물 kg당 약 12L 내지 약 18L의 완충액으로 현탁시키는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피 정제 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 나노여과 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 나노여과 단계는 약 35 nm의 평균 포어 크기를 갖는 나노필터의 사용을 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (f)에서 수득한 IgG가 풍부한 조성물은 단계 (a)에서 사용된 동결-불량 혈장 분획물에서 발견되는 IgG 함량의 적어도 85%를 함유하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 (f)에서 수득한 IgG가 풍부한 조성물은 단계 (a)에서 사용된 동결-불량 혈장 분획물에서 발견되는 IgG 함량의 적어도 90%를 함유하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 혈장은 인간 혈장인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 형성된 현탁액을 미세하게 분할된 이산화규소로 처리하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 미세하게 분할된 이산화규소에 의한 처리는 적어도 30분 동안 단계 (c)에서 형성된 현탁액과 미세하게 분할된 이산화규소를 혼합하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 단계 (c)에서 형성된 현탁액을 제 2 침전 현탁액 kg당 약 0.02kg 내지 약 0.06kg의 미세하게 분할된 이산화규소로 처리하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 단계 (c)에서 형성된 현탁액을 제 2 침전 현탁액 kg당 약 0.02kg 내지 약 0.06kg의 미세하게 분할된 이산화규소로 처리하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 미세하게 분할된 이산화규소가 훈증된 실리카인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 미세하게 분할된 이산화규소가 훈증된 실리카인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 미세하게 분할된 이산화규소가 훈증된 실리카인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 미세하게 분할된 이산화규소가 훈증된 실리카인 방법.
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