TWI504607B - 以微細分之二氧化矽處理移除絲胺酸蛋白酶 - Google Patents

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Description

以微細分之二氧化矽處理移除絲胺酸蛋白酶 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2010年5月26日申請且以澳大利亞專利第2010202125號頒佈之AU專利申請案第2010202125號、2010年5月27日申請之美國專利申請案第12/789,365號及2010年7月23日申請之美國專利申請案第12/842,944號的優先權，該等文獻之揭示內容據此以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的。
源自血漿之血液產品不僅用以治療多種血液病症，而且用於治療其他來源之疾病。舉例而言，1952年首次使用人類血漿之免疫球蛋白(IgG)產品來治療免疫缺乏症。其後，IgG製劑被廣泛用於至少三個主要類別之醫學病狀中：(1)免疫缺乏症，諸如X連鎖無γ球蛋白血症、低γ球蛋白血症(原發性免疫缺乏症)及後天免疫力低下病狀(繼發性免疫缺乏症)，特徵為抗體含量低；(2)發炎性及自體免疫性疾病；及(3)急性感染。
同樣地，因子H與用於若干人類疾病病況之潛在治療劑有關，該等病況包括年齡相關之黃斑部變性(AMD)、溶血尿毒癥症候群(aHUS)及膜增生性絲球體腎炎(MPGN)。特定言之，已表徵因子H之補體控制蛋白質(CCP)模組7中之單核苷酸多形現象(SNP)與年齡相關之黃斑部變性(AMD)之間的因果關係。
研究已顯示血漿間α抑制劑蛋白質(Inter-alpha-Inhibitor protein，IαIp)含量減低與患嚴重敗血症之患者死亡率之間的關聯性(Lim等人，J Infect Dis.(2003) 9月15日；188(6):919-26及Opal等人，Crit Care Med.(2007) 2月；35(2):387-92)。此外，若干研究已顯示投與IαIp可降低與敗血症及敗血性休克相關之死亡率(Jourdain等人，Am J Respir Crit Care Med.(1997) 12月；156(6):1825-33；Yang等人，Crit Care Med.(2002) 3月；30(3):617-22；Lim等人，J Infect Dis.(2003) 9月15日；188(6):919-26；及Wu等人，Crit Care Med.(2004) 8月；32(8):1747-52；其揭示內容以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)。
當製造及調配源自血漿之生物治療劑時必須考慮各種安全預防措施。此等措施包括移除由使用捐贈血漿所產生之血源性病原體(例如病毒性及細菌性病原體)、抗補體活性及其他有害污染物及/或使其失活之方法。研究表明施與高級醯胺水解活性(amidolytic activity)會引起有害血栓栓塞事件(Wolberg AS等人，Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations. Am J Hematol 2000;65:30-34；及Alving BM等人，Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulins preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980;96:334-346；其揭示內容據此以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)。突顯此問題的是在有關血栓栓塞事件之報導增加之後近來在美國自動撤銷(Octapharma)及歐洲委員會(European Commission)中止及octagam 10%之銷售授權。血栓事件增加可能由生物製劑中由諸如因子XI、因子XIa、因子XII及因子XIIa之絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原雜質引起的高級醯胺水解活性所致(FDA通知：2010年9月23日，自市場自動撤銷Octagam[靜脈注射用免疫球蛋白(人類)]5%液體製劑；AFSSAPS於2010年9月9日線上公佈，檢疫隔離所有批次的Octagam 50 mg/ml輸液(solution pour perfusion)(Octapharma France)；及歐洲藥品管理局(European Medicines Agency)於2010年9月23日線上公佈關於中止Octagam(人類正常免疫球蛋白5%及10%)之銷售授權的問答)。
一般稱為凝血因子之專用絲胺酸蛋白酶為凝血級聯反應之接觸活化與組織因子路徑之主要組分。當刺激凝血路徑時，作為不活化酶前驅體之絲胺酸蛋白酶原成為可催化下一蛋白酶原活化之活化蛋白酶，從而引起活化級聯反應。此凝血級聯反應以活化凝血酶(因子IIa)及因子XIIIa而終結，後兩者功能分別在於使纖維蛋白原(因子I)轉化成纖維蛋白(因子Ia)及使纖維蛋白交聯而形成纖維蛋白凝塊。
亦稱為固有凝血路徑之接觸活化路徑自分別由前激肽釋放酶及因子XII活化激肽釋放酶及因子XIIa(FXIIa)開始。所活化之絲胺酸蛋白酶FXIIa分解因子XI(FXI)，使酶原轉化成因子XIa(FXIa)，即一種活性絲胺酸蛋白酶，其會參與因子Xa(FXa)之後續活化。
由於對源自血漿之蛋白質組合物中存在絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原之擔憂不斷增加，故此項技術中仍存在對降低此等污染物且尤其FXI、FXIa、FXII及FXIIa含量之方法的需要。本發明藉由提供該等方法及絲胺酸蛋白酶與絲胺酸蛋白酶原含量降低之源自血漿之蛋白質組合物來實現此等及其他需要。
在一態樣中，本發明係基於如下令人驚奇之發現：絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原，且特定言之FXI、FXIa、FXII及FXIIa可藉由用微細分之二氧化矽(SiO2 )處理而自源自血漿之蛋白質組合物移除。以此方式本發明提供降低源自血漿之蛋白質組合物之絲胺酸蛋白酶活性、絲胺酸蛋白酶含量及絲胺酸蛋白酶原含量的方法。亦提供絲胺酸蛋白酶活性、絲胺酸蛋白酶含量及絲胺酸蛋白酶原含量降低之治療性源自血漿之蛋白質組合物，以及藉由投與其來治療或預防疾病之方法。
在第一態樣中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使該SiO2 與該組合物分離以移除所結合之絲胺酸蛋白酶。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)或因子XII(FXII)。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在一實施例中，第一目標蛋白質濃化步驟為蛋白質沈澱步驟。在一個特定實施例中，蛋白質沈澱步驟為醇份化步驟。在另一實施例中，第一目標蛋白質濃化步驟為超濾/透濾步驟。
在上述方法之其他實施例中，該方法進一步包含以下步驟：執行第二目標蛋白質濃化步驟，然後使濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在一實施例中，第二目標蛋白質濃化步驟為蛋白質沈澱步驟。在一個特定實施例中，蛋白質沈澱步驟為醇份化步驟。在另一實施例中，第二目標蛋白質濃化步驟為超濾/透濾步驟。在又一實施例中，第二目標蛋白質濃化步驟為層析濃化步驟。
在上述方法之其他實施例中，該方法進一步包含以下步驟：在使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸之後，執行第三目標蛋白質濃化步驟。在一實施例中，第三目標蛋白質濃化步驟為蛋白質沈澱步驟。在一個特定實施例中，蛋白質沈澱步驟為醇份化步驟。在另一實施例中，第三目標蛋白質濃化步驟為超濾/透濾步驟。在又一實施例中，第三目標蛋白質濃化步驟為層析濃化步驟。
在上述方法之某些實施例中，層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合源自血漿之目標蛋白質之條件下使源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及(ii)自該層析樹脂溶離源自血漿之目標蛋白質。在一個特定實施例中，在子步驟(i)中雜質不結合至層析樹脂。在另一特定實施例中，在子步驟(i)中雜質結合至層析樹脂，但在子步驟(ii)中不自層析樹脂溶離。
在上述方法之其他某些實施例中，層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合至少一種雜質之條件下使第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及(ii)使該樹脂與源自血漿之蛋白質組合物分離，其中在子步驟(i)中該源自血漿之目標蛋白質不結合至層析樹脂。
在上述包含層析濃化步驟之方法的某些實施例中，層析樹脂係選自由以下組成之群：陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、疏水性相互作用樹脂、混合式樹脂(mixed mode resin)、羥磷灰石樹脂、配位體親和樹脂、免疫親和樹脂及尺寸排阻樹脂。
在上述包含層析濃化步驟之方法的其他某些實施例中，層析濃化步驟包含使用尺寸排阻層析法按大小及/或形狀自目標蛋白質分離至少一種雜質。
在上述方法之某些實施例中，源自血漿之目標蛋白質係選自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)。在一個特定實施例中，補體系統之蛋白質係選自由因子H(FH)、因子D、補體蛋白質C3及C4結合蛋白質組成之群。
在上述方法之又一實施例中，源自血漿之目標蛋白質組合物為製造中間物。
在第二態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之源自血漿之因子H組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使該SiO2 與組合物分離；(c)在因子H保留結合之溶液條件下自該SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)自該SiO2 溶離因子H。
在上述方法之某些實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含pH值大於約6.0。在另一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含pH值大於約6.5。在另一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含pH值大於約7.0。在又一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含pH值為至少約7.5。
在上述方法之某些實施例中，溶液條件包含pH值不大於11.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於10.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於9.0。
在上述方法之某些實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含電導率大於約10 mS/cm。在上述方法之另一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含電導率大於約20 mS/cm。在上述方法之另一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約50 mS/cm。在上述方法之又一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且因子H保留結合之溶液條件包含電導率為約20 mS/cm至約50 mS/cm。
在第三態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之因子H組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；及(c)在絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合至SiO2 之條件下自SiO2 溶離因子H。
在上述方法之某些實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值大於約6.0。在另一實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值大於約6.5。在另一實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值大於約7.0。在又一實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值為至少約7.5。
在上述方法之某些實施例中，溶液條件包含pH值不大於11.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於10.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於9.0。
在上述方法之某些實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含電導率小於約20 mS/cm。在另一實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含電導率小於約10 mS/cm。在上述方法之另一實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含電導率為約2 mS/cm至約20 mS/cm。在上述方法之又一實施例中，自SiO2 溶離因子H且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含電導率為約2 mS/cm至約10 mS/cm。
在第四態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之因子H組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H而非至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與該組合物分離；及(c)自SiO2 溶離因子H。
在上述方法之某些實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值大於約6.0。在另一實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值大於約6.5。在另一實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值大於約7.0。在又一實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為至少約7.5。
在上述方法之某些實施例中，溶液條件包含pH值不大於11.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於10.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於9.0。
在上述方法之某些實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率大於約10 mS/cm。在上述方法之另一實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率大於約20 mS/cm。在上述方法之另一實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約50 mS/cm。在上述方法之又一實施例中，因子H結合至SiO2 且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為約20 mS/cm至約50 mS/cm。
在第五態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之因子H組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原而非因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸及(b)使SiO2 與組合物分離。
在上述方法之某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值大於約6.0。在另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值大於約6.5。在另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值大於約7.0。在又一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為至少約7.5。
在上述方法之某些實施例中，溶液條件包含pH值不大於11.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於10.0。在另一實施例中，溶液條件包含pH值不大於9.0。
在上述方法之某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率小於約20 mS/cm。在另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率小於約10 mS/cm。在上述方法之另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為約2 mS/cm至約20 mS/cm。在上述方法之又一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為約2 mS/cm至約10 mS/cm。
在第六態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶活性降低之間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶之條件下使含有IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶之溶液與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；(c)在IαI保留結合之條件下自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶；及(d)自SiO2 溶離IαI。
在第七態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶活性降低之間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶之條件下使含有IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶之溶液與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；及(c)在絲胺酸蛋白酶保留結合至SiO2 之條件下自SiO2 溶離IαI。
在第八態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶活性降低之間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合IαI而非至少一種絲胺酸蛋白酶之條件下使含有IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶之溶液與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；及(c)自SiO2 溶離IαI。
在第九態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶活性降低之間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)組合物的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合絲胺酸蛋白酶而非間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)之條件下使含有間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)及至少一種絲胺酸蛋白酶之溶液與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離。
在上述態樣之某些實施例中，以每公克蛋白質至少1公克SiO2 之最終濃度使組合物與SiO2 接觸。在上述態樣之另一實施例中，以每公克蛋白質至少2公克SiO2 之最終濃度使組合物與SiO2 接觸。在上述態樣之另一實施例中，以每公克蛋白質至少2.5公克SiO2 之最終濃度使組合物與SiO2 接觸。
在上述態樣之某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XI。在上述態樣之另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa。在上述態樣之另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XII。在上述態樣之又一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIIa。
在第十態樣中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含根據任一上述態樣降低絲胺酸蛋白酶活性之方法的製程來製備。在一實施例中，組合物經調配用於投與個體。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內、肌肉內或皮下投與。在一實施例中，組合物為水性的。在另一實施例中，組合物為凍乾組合物。
在第十一態樣中，本發明提供一種治療有需要之個體的與血漿蛋白質異常活性相關之疾病的方法，該方法包含投與上述態樣之源自血漿之蛋白質組合物。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)。
在第十二態樣中，本發明提供一種製備因子H組合物之方法，該方法包含以下步驟：(a)使含有因子H之懸浮血漿沈澱部分與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)用低pH值及低電導率之洗滌緩衝劑洗滌SiO2 ；及(c)用pH值為7.0至8.0且電導率為至少10 mS/cm之溶離緩衝劑自SiO2 溶離因子H。在特定實施例中，含有因子H之血漿沈澱部分為科恩部分(Cohn fraction)II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物(Kistler/Nitschmann Precipitate)A或奇石樂/尼赤曼沈澱物B。在某些實施例中，該等方法進一步包含一或多個選自以下之其他步驟：(d)自因子H溶離中沈澱且移除至少一種雜質；(e)自濃化組合物沈澱且回收因子H；(f)藉由陰離子交換層析進一步濃化因子H；(g)藉由肝素親和層析進一步濃化因子H；(h)專用病毒滅活步驟；及(i)藉由超濾/透濾濃縮濃化之因子H組合物。
I.　引言
鑒於廣泛使用治療性源自血漿之血液蛋白質(諸如免疫球蛋白組合物、血液凝固因子、凝血因子抑制劑及補體系統之蛋白質)，確保此等組合物之安全性十分重要。近來對與投與源自血漿之蛋白質組合物之患者中發生血栓栓塞事件成對出現的此等組合物之醯胺水解含量之擔憂已突顯在此項技術中需要在製造此等生物製劑期間減少絲胺酸蛋白酶(例如FXIa及FXIIa)及絲胺酸蛋白酶原(例如FXI及FXII)之方法。本發明宜至少部分基於如下令人驚奇之發現：微細分之二氧化矽(SiO2 )可用以結合源自血漿之蛋白質組合物中存在之絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原。因而，本文提供在製造源自血漿之蛋白質組合物期間降低絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原濃度之方法。
在某些態樣中，本發明提供製造方法，其係基於如下令人驚奇之發現：微細分之二氧化矽(SiO2 )可用以自源自血漿之蛋白質溶液移除大量絲胺酸蛋白酶(例如FXIa及FXIIa)及絲胺酸蛋白酶原(例如FXI及FXII)。因而，可容易地將本文提供之方法整合至現有製造程序中，例如冷卻時藉由乙醇份化混合血漿樣品，較佳為人類血漿樣品(綜述於Schultze H E,Heremans J F;Molecular Biology of Human Proteins.第I卷：Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966,Elsevier Publishing Company；第236-317頁中)。然而，本文提供之方法決不僅限於用於包括乙醇份化之製造方法。純化源自血漿之蛋白質之其他方法亦不會與本文提供之方法矛盾，此等其他方法例如有聚合物(例如PEG)份化及層析方法(例如陰離子及/或陽離子交換層析法、親和層析法、免疫親和層析法、尺寸排阻層析法、疏水性相互作用層析法、混合式層析法及其類似方法)。
此外，不同於經由宿主細胞株中DNA載體之重組表現所產生之其他生物製劑，源自血漿之蛋白質係自人類血液及血漿捐贈物份化而得。因此，此等產品之供應可能不能藉由簡單增加生產量(volume of production)來增加。相反地，市售血液產品之水準受可獲得之血液及血漿捐贈物供應限制。此動態導致可用於製造商業市場尚未充分確立之新穎源自血漿之血液因子的原始人類血漿之可用性不足，該等因子包括補體因子H(CFH)及間α胰蛋白酶抑制劑蛋白質(IαIp)。
由於缺乏可用於製造新穎源自血漿之產品之血漿，故必須將其製造整合至諸如免疫球蛋白及白蛋白的源自血漿之產品的已確立的製造製程之現有構架中。與AMD、aHUS及MPGN以及其他病狀之潛在治療劑有關之因子H為一種如此的源自血漿之血液產品，其正逐漸引起醫師關注。然而，由於該等資源致力於例如IgGγ球蛋白製造，故需要可引入現有製造流程中之製造因子H之方法。已表明若干方法正好可實現此目的，然而許多此等所提出之解決辦法需要修改已確立產品之現有製造流程。對於已確立產品該等變化將需要新的管理許可，且甚至會引起已確立產品之特徵的變化。
舉例而言，WO 2007/066017描述自冷沈澱物之上清液製造因子H製劑的方法。所揭示之方法由以下組成：製備冷沈澱物之上清液，對該上清液進行陰離子交換層析(AEC)，對AEC流過物進行肝素親和層析(HAC)，對相應的HAC溶離液進行強陽離子交換層析(CEC)，對相應的CEC溶離液進行強陰離子交換層析(sAEC)，以及自sAEC溶離因子H。不利的是，在包括IgGγ球蛋白(IVIG及皮下IgGγ球蛋白)及白蛋白的許多商業上重要之源自血漿之血液產品的製造製程中，冷沈澱物上清液為常見中間物部分。對此部分進行層析之步驟將改變冷沈澱物上清液且將會需要以未知方式修改已確立之下游血液產品之製造製程。除需要使此等製造製程完全重新生效且可能重新設計之外，亦需要關鍵管理機構對製造程序之管理再許可。
同樣地，WO 2008/113589描述自人類血漿產生因子H製劑之方法。特定言之，此公開案描述自三個已知血漿處理部分，亦即科恩-翁克萊(Cohn-Oncley)部分I上清液、科恩-翁克萊部分III沈澱及奇石樂/尼赤曼沈澱物B部分來純化出因子H。關於第一種方法，WO 2008/113589揭示因子H可藉由添加肝素親和層析步驟而自科恩-翁克萊部分I上清液移除。不利的是，在包括IgGγ球蛋白(IVIG及皮下IgGγ球蛋白)及白蛋白的許多商業上重要之源自血漿之血液產品的製造製程中，科恩-翁克萊部分I上清液為常見中間物部分。類似地，許多免疫球蛋白(例如IgG、IVIG等)製造製程並不依賴於科恩-翁克萊部分III沈澱或奇石樂/尼赤曼沈澱物B步驟，例如Gammagard液體及Kiovig(Baxter International Inc。)。將諸如肝素親和層析、部分III沈澱或沈澱物B步驟之其他步驟引入如上文所概述的已確立血液產品之製造流程中的缺點為其需要使製造程序重新生效、關鍵管理機構對製造程序之管理再許可，且關於其他已確立產品之產率及/或純度可能進一步具有無法預料的結果。
因而，在此項技術中仍需要不需使用額外輸入的血漿或對商業上重要之源自血漿之血液產品(諸如用於靜脈內(IVIG)或皮下投與之白蛋白及IgGγ球蛋白)的現有製造製程作出重新設計及管理再許可即製造因子H之方法。本發明宜至少部分基於如下令人驚奇之發現：因子H、絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原可同時結合至微細分之二氧化矽(SiO2 )，從而使絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原與未與其結合之相關第一蛋白質(例如IgG)分離，且接著藉由自SiO2 有差別地溶離因子H及絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原來分離。類似地，本發明至少部分基於如下令人驚奇之發現：IαIp、絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原可同時結合至微細分之二氧化矽(SiO2 )且接著藉由自SiO2 有差別地溶離IαIp及絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原來分離。
II.定義
如本文所用之「因子H」係指由補體因子H基因編碼之補體替代路徑之蛋白質組分(例如CFH；NM000186；GeneID:3075；UniProt ID P08603；Ripoche等人，Biochem. J. 249:593-602(1988))。將因子H轉譯為1,213個胺基酸的前驅體多肽，藉由移除18個胺基酸的信號肽對其進行加工，從而產生成熟因子H蛋白質(胺基酸19-1231)。如本發明所用之因子H涵蓋可見於例如人類血漿樣品之血漿樣品中的任何天然變異體、替代性序列、同功異型物或突變體蛋白。可見於人群中之因子H突變之實例包括(但不限於)Y402H；V62I；R78G；R127L；Δ224；Q400K；C431S；T493R；C536R；I551T；R567G；C630W；C673S；C673Y；E850K；S890I；H893R；C915S；E936D；Q950H；Y951H；T956M；C959Y；W978C；N997T；V1007I；V1007L；A1010T；T1017I；Y1021F；C1043R；N1050Y；I1059T；Q1076R；R1078S；D1119G；V1134G；Y1142D；Q1143E；W1157R；C1163W；W1183L；W1183R；T1184R；L1189R；S1191L；G1194D；V1197A；E1198A；F1199S；R1210C；R1215G；R1215Q；YPTCAKR1225:1231FQS；及P1226S。已發現許多此等突變與多種疾病及病症相關，該等疾病及病症包括非典型溶血性尿毒癥症候群(aHUS)、年齡相關之黃斑部變性(AMD)、II型膜增生性絲球體腎炎(MPGNII)、CFH缺乏症及基底膜玻璃膜疣(basal laminar drusen)。因子H亦包括含有轉譯後修飾之蛋白質。舉例而言，咸信因子H在殘基529、718、802、822、882、911、1029及1095處由N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)修飾。
如本文所用之「間α抑制劑蛋白質」或「IαIp」係指血漿蛋白酶抑制劑家族，其包含由以下一或多者編碼之多肽：α-1-微球蛋白/二庫寧(bikunin)前驅體基因(AMBP；UniGene ID:231948，二庫寧多肽)、間α(球蛋白)抑制劑H1基因(ITIH1；UniGene ID:224173，H1多肽)、間α(球蛋白)抑制劑H2基因(ITIH2；Unigene ID:139782，H2多肽)、間α(球蛋白)抑制劑H3基因(ITIH3；UniGene ID:140017，H3多肽)或間α(球蛋白)抑制劑H4(血漿激肽釋放酶敏感醣蛋白，H4多肽)基因(ITIH4；UniGene ID:3321613)。例示性IαIp蛋白酶抑制劑包括(但不限於)IαI(二庫寧、H1及H2多肽)；PαI(二庫寧及H3多肽)、IαLI(二庫寧及H2多肽)、IαIH4P(H4多肽)及二庫寧(Salier,J,等人，上述)。
如本文所用之「貧冷凍物血漿(cryo-poor plasma)」係指在移除藉由在接近冷凍之溫度下，例如在約10℃以下之溫度下，較佳在不高於約6℃之溫度下解凍血漿或混合血漿而形成之冷沈澱物之後所產生的上清液。在本發明之上下文中，血漿可互換地指回收之血漿(亦即離體自全血分離之血漿)或原料血漿(亦即經由血漿去除法收集之血漿)。冷沈澱通常例如藉由解凍已檢定安全及品質因素之先前冷凍之混合血漿來執行，但亦可使用新鮮血漿。在低溫下完全解凍冷凍血漿之後，在冷卻(例如6℃)下藉由過濾離心進行固體冷沈澱物與液體上清液之分離。
如本文所用之「科恩池」係指用於份化血漿樣品或血漿樣品池之起始物質。科恩池包括可能已經受或可能未經受預先加工步驟之全血漿、貧冷凍物血漿樣品及貧冷凍物血漿樣品池。在某些實施例中，科恩池為在預處理步驟，例如吸附於固相(例如氫氧化鋁、微細分之二氧化矽等)或層析步驟(例如離子交換或肝素親和層析)中已移除一或多種血液因子之貧冷凍物血漿樣品。包括(但不限於)因子8抑制劑旁路活性(FEIBA)、因子IX複合物、因子VII濃縮物或抗凝血酶III複合物之各種血液因子可與貧冷凍物血漿樣品分離而形成科恩池。
如本文所用之「部分II+III濾餅」係指在過濾或離心科恩-翁克萊或等效部分II+III糊狀物懸浮液之後所回收之固相。在一個較佳實施例中，部分II+III懸浮液將用例如微細分之二氧化矽的吸附材料處理來移除諸如脂質、纖維蛋白原、醯胺水解活性、前激肽釋放酶活性及脂蛋白之雜質。在另一較佳實施例中，在離心或過濾之前，可將助濾劑添加至部分II+III懸浮液中。在一個最佳實施例中，在離心或過濾之前部分II+III懸浮液將用吸附材料與助濾劑處理。當分離澄清之部分II+III懸浮上清液時，將回收之固相物質稱為部分II+III濾餅。
知本文所用之「微細分之二氧化矽(finely divided silicon dioxide/finely divided silica)」係指以可使因子H吸附於表面上之方式製得的式SiO2 之矽氧化物。適用於本發明方法之微細分之二氧化矽的例示性形式包括(但不限於)煙霧狀二氧化矽、熱解二氧化矽、Aerosil、Cab-O-SilTM 、膠態二氧化矽、矽藻土及其類似物。在一個較佳實施例中，將商業親水性煙霧狀二氧化矽產品用於本文所提供之方法。此等產品之非限制性實例包括由Evonik Industries以商標名Aerosil出售之彼等產品(例如Aerosil 90、Aerosil 130、Aerosil 150、Aerosil 200、Aerosil 300、Aerosil 380、Aerosil OX 50、Aerosil EG 50、Aerosil TT 600、Aerosil 200 SP、Aerosil 300 SP及Aerosil 300/30)。
如本文所用之「與因子H功能障礙相關之疾病或病症」係指個體的由個體因子H活性程度降低所引起、以個體因子H活性程度降低為特徵或導致個體因子H活性程度降低之任何疾病、病症或病狀。就本發明而言，因子H活性可指因子H結合蛋白質或配位體(例如C3b、C3bBb、C3b2Bb、csbC3b、補體因子B(CFB)、C反應蛋白、內皮細胞、葡糖胺聚糖(GAG))之能力，或者可指其因子I輔因子活性或其加速C3bBb及C3b2Bb之不可逆的解離的能力。在一實施例中，與因子H功能障礙相關之疾病或病症會引起C3缺乏症及容易感染細菌。在一些情況下，與因子H功能障礙相關之疾病或病症包括由編碼因子H之CFH基因之突變及多形現象所引起或與其有關的病狀(關於綜述，參見Barlow等人，Adv Exp Med Biol. 2008;632:117-42，其揭示內容係以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)。與CFH基因之突變或多形現象有關之疾病包括(但不限於)因子H缺乏症、非典型溶血性尿毒癥症候群(aHUS)、年齡相關之黃斑部變性(AMD)、II型膜增生性絲球體腎炎(MPGNII; de Cordoba及de Jorge, Clinical and Experimental Immunology 151, 1-13(2008))、心肌梗塞(Kardys等人，Journal of the American College of Cardiology 47, 1568-1575(2006);Mooijaart等人，Experimental Gerontology 42, 1116-1122(2007);Nicaud等人，Journal of Molecular Medicine 85, 771-775(2007);Pai等人，European Heart Journal 28, 1297-1303(2007);Stark等人，Clinical Science (Lond)113, 213-218(2007))、冠心病/冠狀動脈病(CAD/CHD;Meng等人，BMC Medical Genetics 8, 62(2007);Pulido等人，Mayo Clinic Proceedings 82, 301-307(2007);Topol等人，Human Molecular Genetics 15 Spec 第2期，R117-R123(2006))及阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)(Hamilton等人，Neuromolecular Medicine 9,331-334(2007)；Zetterberg等人，American Journal of Ophthalmology 143,1059-1060(2007))。描述CFH基因之突變及多形現象與因子H功能障礙相關疾病之間的關聯性之先前文獻之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的。
如本文所用之「與異常替代途徑補體活性相關之疾病或病症」係指由補體替代途徑之不受控制或異常的活化產生之疾病、病症或病狀。一般而言，補體替代途徑之不受控制或異常的活化會導致宿主細胞及組織之正常功能喪失(bystander damage)以及損耗C3及相應容易感染病原體(例如真菌性、細菌性、病毒性及原生生物性感染)。與異常替代途徑補體活性相關之疾病及病症之實例包括(但不限於)各種自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎、IgA腎病、哮喘、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化症、抗磷脂症候群、ANCA相關血管炎、天疱瘡、葡萄膜炎、重症肌無力(myathemia gravis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis))、腎臟疾病(諸如IgA腎病、溶血尿毒癥症候群、膜增生性絲球體腎炎)、其他疾病(諸如哮喘、阿茲海默氏病、成年黃斑部變性、陣發性夜間血紅素尿(proximal nocturnal hemoglobinuria)、腹主動脈瘤、缺血及敗血症)。
如本文所用之術語「超濾(UF)」涵蓋多種膜過濾方法，其中流體靜壓力迫使液體靠向半透膜。保留高分子量懸浮固體及溶質，而水及低分子量溶質通過薄膜。此分離過程通常用於純化及濃縮巨分子(103 至106 Da)溶液，尤其蛋白質溶液。許多超濾膜可視其保留之分子之大小而定來使用。超濾之特徵通常為薄膜孔徑為1至1000 kDa且操作壓力為0.01至10巴。
如本文所用之術語「透濾」用與超濾相同或類似之薄膜來執行且通常以切向流過濾模式執行。在透濾期間，將緩衝液引入再循環槽中，同時自單元操作移除濾液。在產品為保留物(例如因子H)之製程中，透濾尤其適用於分離蛋白質與小分子(如糖及鹽)。在某些情況下，透濾可用以交換溶液、緩衝劑或緩衝系統之個別組分。
如本文所用之術語「混合」描述藉由任何形式之攪動使兩種或兩種以上不同化合物或物質在溶液或懸浮液中平均分佈之行為。當術語「混合」用於本申請案中時，不需要所有成分在溶液或懸浮液中完全平均分配作為「混合」之結果。
如本文所用之術語「溶劑」涵蓋能夠溶解或分散一或多種其他物質之任何液體物質。溶劑實質上可為無機溶劑，諸如水，或可為有機液體，諸如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如術語「溶劑清潔劑處理」中所使用，溶劑表示有機溶劑(例如磷酸三-正丁酯)，其為用以使溶液中之脂質包膜病毒滅活的溶劑清潔劑混合物之一部分。
如本文所用之術語「清潔劑」在本申請案中可與術語「界面活性劑」或「表面活性劑」互換使用。界面活性劑通常為兩親媒性有機化合物，亦即含有疏水基(「尾部」)與親水基(「頭部」)之兩親媒性有機化合物，其使界面活性劑可溶於有機溶劑與水兩者中。界面活性劑可根據其頭部之形式上帶電的基團之存在分類。非離子型界面活性劑在其頭部沒有帶電基團，然而離子型界面活性劑在其頭部帶有淨電荷。兩性離子界面活性劑含有具有兩個帶相反電荷之基團的頭部。常見界面活性劑之一些實例包括：陰離子型界面活性劑(基於硫酸根、磺酸根或羧酸根陰離子)：全氟辛酸鹽(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂基硫酸銨及其他烷基硫酸鹽、月桂醇醚硫酸鈉(亦稱為月桂基醚硫酸鈉或SLES)、烷基苯磺酸鹽；陽離子型界面活性劑(基於四級銨陽離子)：溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)(亦稱作溴化十六碳烷基三甲基銨)及其他烷基三甲基鍍鹽、氯化十六烷基吡錠(CPC)、聚乙氧基化動物脂胺(POEA)、氯化苯甲烴銨(BAC)、苄索氯銨(BZT)；長鏈脂肪酸及其鹽：包括辛酸鹽、辛酸、庚酸鹽、己酸、庚酸、壬酸、癸酸及其類似物；兩性離子型界面活性劑(兩性)：十二烷基甜菜鹼；椰油醯胺基丙基甜菜鹼；椰油兩性甘胺酸鹽；非離子型界面活性劑：烷基聚(氧化乙烯)、烷基苯酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)與聚(氧化丙烯)之共聚物(商業上稱為泊洛沙姆(Poloxamers)或釙酸胺(Poloxamines))、烷基多葡糖苷(包括辛基葡糖苷、癸基麥芽糖苷)、脂肪醇(例如鯨蠟醇及油醇)、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA、聚山梨醇酯(Tween 20、Tween 80等)、曲拉通清潔劑及氧化十二烷基二甲胺。
如本文所用之術語「治療有效量或劑量」或「足夠/有效量或劑量」係指可在投與期間產生作用之劑量。精確劑量將視治療目的而定且可由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第20版，2003,Gennaro編，Lippincott,Williams & Wilkins；其揭示內容係以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)。
如本申請案中所用之術語「噴霧」係指例如在醇沈澱步驟(諸如科恩份化I或II+III沈澱步驟)中將液體物質以液體物質之細滴或霧氣形式傳遞至系統中之方法。噴霧可用諸如容器(例如噴霧瓶)之任何加壓裝置達成，其具有噴頭或噴嘴且以人工方式或自動操作以由液體產生細霧。通常在將接受液體物質之系統連續攪拌或以別的方式混合以確保系統內之液體快速且平均分佈時執行噴霧。
如本文所用之術語「約」表示自指定值加上或減去10%之近似範圍。舉例而言，語言「約20%」涵蓋18%至22%之範圍。如本文所用之約亦包括精確量。因此，「約20%」意謂「約20%」以及「20%」。如本文所用之「約」係指指定值或約指定值之範圍。
術語「劑量(dose)」及「劑量(dosage)」在本文中可互換使用。劑量係指各次投與時給予個體之活性成分之量。劑量將視許多因素而不同，該等因素包括投藥頻率；個體之尺寸及耐受性；病狀之嚴重程度；副作用之風險；及投藥途徑。熟習此項技術者將認識到劑量可視上述因素或基於治療性進展而定加以修改。術語「劑型」係指藥物之特定型式且視投藥途徑而定。舉例而言，劑型可呈液體形式，例如注射用鹽水溶液。
如本文所用之術語「預防」係指由與血液蛋白質之機能缺乏或機能失調相關之病狀所產生之症狀的可能性降低或發生頻率減小。
如本文所用之術語「療法」、「治療」及「改善」係指由與血液蛋白質之機能缺乏或機能失調相關之病狀所產生之症狀的嚴重程度之任何降低。如本文所用之術語「治療」及「預防」不意欲為絕對術語。治療可指發作之任何延遲、症狀之改善、患者存活之改良、存活時間或存活率增加等。治療效果可與未接受治療之個體或個體群相比。
如本文所用之術語「實質部分」係指組合物中特定蛋白質群體之至少10%。舉例而言，當提及組合物中之絲胺酸蛋白酶之實質部分時，絲胺酸蛋白酶之實質部分與組合物中存在之絲胺酸蛋白酶之至少10%對應。在一實施例中，實質部分係指組合物中特定蛋白質群體之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指組合物中特定蛋白質群體之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指組合物中特定蛋白質群體之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指組合物中特定蛋白質群體之至少10%，或組合物中特定蛋白質群體之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
III.　絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原含量之降低
在第一態樣中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，其係藉由使絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原結合至微細分之二氧化矽(SiO2 )及分離SiO2 與組合物而實現。
在一實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之蛋白質組合物中因子XI之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子XI之條件下使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離以移除結合之因子XI。
在另一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之蛋白質組合物中因子XIa之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子XIa之條件下使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離以移除結合之因子XIa。
在另一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之蛋白質組合物中因子XII之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子XII之條件下使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離以移除結合之因子XII。
在又一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之蛋白質組合物中因子XIIa之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子XIIa之條件下使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離以移除結合之因子XIIa。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一目標蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)藉由在源自混合血漿之起始物質中使蛋白質部分沈澱而形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一實施例中，使用醇實現部分沈澱。在一個較佳實施例中，醇為乙醇。在另一較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。
在另一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)藉由超濾及/或透濾源自混合血漿之起始物質而形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。
在又一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)藉由使源自混合血漿之起始物質與層析樹脂接觸而形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在某些實施例中，層析樹脂係選自陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、疏水性相互作用樹脂、混合式樹脂、羥磷灰石樹脂、配位體親和樹脂、免疫親和樹脂及尺寸排阻樹脂。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一目標蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：在使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸之後，執行目標蛋白質濃化步驟。在某些實施例中，目標蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
同樣地，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之目標蛋白質中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(e)執行第三目標蛋白質濃化步驟以形成第三濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所見之變化形式101至變化形式1100中之任一變化形式。
在上述方法之某些實施例中，層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合源自血漿之目標蛋白質之條件下使源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及(ii)自層析樹脂溶離源自血漿之目標蛋白質。在一個特定實施例中，在子步驟(i)中雜質不結合至層析樹脂。在另一特定實施例中，在子步驟(i)中雜質結合至層析樹脂，但在子步驟(ii)中不自層析樹脂溶離。
在上述方法之其他實施例中，層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合至少一種雜質之條件下使第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及(ii)使樹脂與源自血漿之蛋白質組合物分離，其中在中子步驟(i)中該源自血漿之目標蛋白質不結合至層析樹脂。
在上述方法之某些實施例中，源自血漿之目標蛋白質係選自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AlPI)、丁醯膽鹼酯酶、補體系統之蛋白質(例如因子H)及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)。在一個特定實施例中，補體系統之蛋白質係選自由因子H(FH)、因子D、補體蛋白質C3及C4結合蛋白質組成之群。在一個較佳實施例中，蛋白質組合物為製造中間物。
在本文提供之方法之某些實施例中，使特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少10%。在另一實施例中，使特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少25%。在另一實施例中，使特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少50%。在另一實施例中，使特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少75%。在另一實施例中，使特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少90%。在其他實施例中，使特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少5%或至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或達至低於測試系統偵測極限之程度。
一般而言，本文所述方法所需之微細分之二氧化矽(SiO2 )的量將視若干因素而不同，該等因素包括(但不限於)組合物中存在之蛋白質的總量、組合物中絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原(例如FXI、FXIa、FXII及FXIIa)之濃度、目標蛋白質及溶液條件(例如pH值、電導率等)。舉例而言，可將濃度為每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約10公克之SiO2 添加至目標組合物中。在另一實施例中，可將濃度為每公克蛋白質約1公克至每公克蛋白質約5公克之SiO2 添加至目標組合物中。在另一實施例中，可將濃度為每公克蛋白質約2公克至每公克蛋白質約4公克之SiO2 添加至目標組合物中。在一實施例中，添加最終濃度為每公克總蛋白質至少1公克之SiO2 。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少2公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少2.5公克之煙霧狀二氧化矽。在另一實施例中，可將濃度為每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約5公克之SiO2 添加至目標組合物中。在另一實施例中，可將濃度為每公克蛋白質約0.02公克至每公克蛋白質約4公克之SiO2 添加至目標組合物中。在一實施例中，添加最終濃度為每公克總蛋白質至少0.1公克之SiO2 。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.2公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.25公克之煙霧狀二氧化矽。在其他特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.01公克或每公克總蛋白質至少0.02公克、0.03公克、0.04公克、0.05公克、0.06公克、0.07公克、0.08公克、0.09公克、0.1公克、0.2公克、0.3公克、0.4公克、0.5公克、0.6公克、0.7公克、0.8公克、0.9公克、1.0公克、1.5公克、2.0公克、2.5公克、3.0公克、3.5公克、4.0公克、4.5公克、5.0公克、5.5公克、6.0公克、6.5公克、7.0公克、7.5公克、8.0公克、8.5公克、9.0公克、9.5公克、10.0公克或10.0公克以上之微細分之二氧化矽。
在目標蛋白質係自懸浮血漿沈澱部分萃取之某些實施例中，在二氧化矽處理之後添加助濾劑(例如Celpure C300(Celpure)或Hyflo-Supper-Cel(World Minerals))以有助於深度過濾。可添加最終濃度為每公斤沈澱物約0.01公斤至每公斤沈澱物約1.0公斤、或每公斤沈澱物約0.02公斤至每公斤沈澱物約0.8公斤、或每公斤沈澱物約0.03公斤至每公斤沈澱物約0.7公斤之助濾劑。在其他實施例中，可添加最終濃度為每公斤沈澱物約0.01公斤至每公斤沈澱物約0.07公斤，或每公斤沈澱物約0.02公斤至每公斤沈澱物約0.06公斤、或每公斤沈澱物約0.03公斤至每公斤沈澱物約0.05公斤之助濾劑。在某些實施例中，添加最終濃度為每公斤沈澱物約0.01公斤或每公斤沈澱物約0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0公斤之助濾劑。
A.　免疫球蛋白
在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之免疫球蛋白(Ig)組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使Ig組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與Ig組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在一實施例中，Ig組合物為IgG組合物。在其他實施例中，Ig組合物為IgA、IgM、IgG或其混合組合物。
在一實施例中，該方法進一步包含以下步驟：執行第一Ig蛋白質濃化步驟以形成第一濃化Ig組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一Ig蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。在一實施例中，Ig組合物為IgG組合物。在其他實施例中，Ig組合物為IgA、IgM、IgG或其混合組合物。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：執行第二Ig蛋白質濃化步驟以形成第二濃化Ig組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一Ig蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之Ig組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一Ig濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之Ig組合物；(b)執行第二Ig濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之Ig組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：在使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸之後，執行Ig濃化步驟。在某些實施例中，Ig濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之Ig組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一Ig濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之Ig組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)執行第二Ig濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之Ig組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
同樣地，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之Ig組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一Ig濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之Ig組合物；(b)執行第二Ig濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之Ig組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(e)執行第三Ig濃化步驟以形成第三濃化之源自血漿之Ig組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所見之變化形式101至變化形式1100中之任一變化形式。
在一個特定實施例中，Ig組合物為製造中間物。舉例而言，在某些實施例中，Ig組合物為來自以下之IgG製造中間物：科恩份化程序(J. Am. Chem. Soc.,1946,68(3): 459-475；J. Am. Chem. Soc. 72:465-474(1950))、翁克萊份化程序(J. Am. Chem. Soc.,1949,71(2):541-550)、德馳純化程序(Deutsch purification procedure)(J. Biol. Chem. 164:109-118)、好博純化程序(Hoppe purification procedure)(Munch Med Wochenschr 1967(34): 1749-1752)、法爾克斯韋登純化程序(Falksveden purification procedure)(瑞典專利第348942號)、法爾克斯韋登及倫德布拉德純化程序(Falksveden and Lundblad purification procedure)(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)、樂賓純化程序(Lebing purification procedure)(Vox Sang 2003(84):193-201)、塔納卡純化程序(Tanaka purification procedure)(Braz J Med Biol Res 2000(33) 37-30))、泰仕弛純化程序(Teschner purification procedure)(Vox Sang,2007(92):42-55)、尼赤曼份化程序(Helv. Chim. Acta 37:866-873)、奇石樂/尼赤曼份化程序(Vox Sang. 7:414-424(1962))、巴魯德純化程序(Barundern purification procedure)(Vox Sang. 7:157-74(1962))、克波特純化程序(Koblet purification procedure)(Vox Sang. 13:93-102(1967))(一種美國專利第5,122,373號或第5,177,194號中所揭示之純化程序)、其經修改程序及此項技術中已知之類似或等效純化程序。
在一個特定實施例中，IgG組合物為貧冷凍物料恩池。在另一特定實施例中，IgG組合物為科恩部分I上清液或其等效部分。在另一特定實施例中，IgG組合物為再懸浮科恩部分III沈澱物，或其等效部分。在另一特定實施例中，IgG組合物為再懸浮科恩部分II+III沈澱物，或其等效部分。在另一特定實施例中，IgG組合物為再懸浮科恩部分I+II+III沈澱物，或其等效部分。在另一特定實施例中，IgG組合物為再懸浮沈澱G沈澱物，或其等效部分。在另一特定實施例中，IgG組合物為再懸浮奇石樂/尼赤曼沈澱B沈澱物，或其等效部分。
在一個特定實施例中，本發明提供一種降低再懸浮IgG部分II+III沈澱物中絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原之量的方法。有利的是，已發現，再懸浮IgG部分II+III沈澱物中之因子XI、因子XII、因子XIa及/或因子XIIa的含量可在過濾/離心之前藉由添加預處理步驟而大大減少。在一實施例中，此預處理步驟包含添加微細分之二氧化矽顆粒(例如煙霧狀二氧化矽、Aerosil)，接著為40至80分鐘的培育期，其間不斷混合懸浮液。在某些實施例中，培育期將為約50分鐘至約70分鐘，或約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80分鐘或80分鐘以上。一般而言，將在約0℃至約10℃、或約2℃至約8℃下執行該處理。在某些實施例中，可在約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下執行處理。在一個特定實施例中，在約2℃至約10℃下執行處理。
煙霧狀二氧化矽處理之效果由實例3、實例6及實例7中所見之結果所例示。在此等實例中，將部分II+III沈澱物再懸浮且用不同量之微細分之二氧化矽處理。可如表22、表27、表28及表29中所見，因子XI及XII絲胺酸蛋白酶活性及酶原含量可藉用SiO2 處理懸浮液而降低至少90%。
在某些實施例中，添加濃度為每公斤II+III糊狀物約20公克至每公斤II+III糊狀物約100公克之煙霧狀二氧化矽(亦即對於以1:15之比率萃取之改性部分II+III沈澱物而言，應添加濃度為每16公斤II+III懸浮液約20公克至每16公斤II+III懸浮液約100公克或最終濃度為約0.125%(w/w)至約0.625%(w/w)之煙霧狀二氧化矽)。在某些實施例中，可添加濃度為每公斤II+III糊狀物約20公克或每公斤II+III糊狀物約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100公克之煙霧狀二氧化矽。在一個特定實施例中，將煙霧狀二氧化矽(例如Aerosil 380或等效物)添加至改性部分II+III懸浮液中至最終濃度為每16公斤II+III約40公克。在約2℃至8℃下混合至少50至70分鐘。
在某些實施例中，將濃度為每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約10公克之SiO2 添加至IgG組合物中。在另一實施例中，將濃度為每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約5公克之SiO2 添加至IgG組合物中。在另一實施例中，將濃度為每公克蛋白質約0.02公克至每公克蛋白質約4公克之SiO2 添加至IgG組合物中。在一實施例中，添加最終濃度為每公克總蛋白質至少0.1公克之SiO2 。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.2公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.25公克之煙霧狀二氧化矽。在其他特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少1公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少2公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少2.5公克之煙霧狀二氧化矽。在其他特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.01公克或每公克總蛋白質至少0.02公克、0.03公克、0.04公克、0.05公克、0.06公克、0.07公克、0.08公克、0.09公克、0.1公克、0.2公克、0.3公克、0.4公克、0.5公克、0.6公克、0.7公克、0.8公克、0.9公克、1.0公克、1.5公克、2.0公克、2.5公克、3.0公克、3.5公克、4.0公克、4.5公克、5.0公克、5.5公克、6.0公克、6.5公克、7.0公克、7.5公克、8.0公克、8.5公克、9.0公克、9.5公克、10.0公克或10.0公克以上之微細分之二氧化矽。
在某些實施例中，將在二氧化矽處理之後添加助濾劑(例如Celpure C300(Celpure)或Hyflo-Supper-Cel(World Minerals))以有助於深度過濾。可添加最終濃度為每公斤II+III糊狀物約0.01公斤至每公斤II+III糊狀物約1.0公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.02公斤至每公斤II+III糊狀物約0.8公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.03公斤至每公斤II+III糊狀物約0.7公斤之助濾劑。在其他實施例中，可添加最終濃度為每公斤II+III糊狀物約0.01公斤至每公斤II+III糊狀物約0.07公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.02公斤至每公斤II+III糊狀物約0.06公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.03公斤至每公斤II+III糊狀物約0.05公斤之助濾劑。在某些實施例中，添加最終濃度為每公斤II+III糊狀物約0.01公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0公斤之助濾劑。
在一實施例中，製程改良藉由包括在過濾或離心淨化部分II+III懸浮液之前進行煙霧狀二氧化矽處理來實現。在某些實施例中，煙霧狀二氧化矽處理將包括添加每公斤II+III糊狀物約0.01 kg至每公斤II+III糊狀物約0.07公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.02公斤至每公斤II+III糊狀物約0.06公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.03公斤至每公斤II+III糊狀物約0.05公斤、或每公斤II+III糊狀物約0.02公斤、每公斤II+III糊狀物0.03公斤、每公斤II+III糊狀物0.04公斤、每公斤II+III糊狀物0.05公斤、每公斤II+III糊狀物0.06公斤、每公斤II+III糊狀物0.07公斤、每公斤II+III糊狀物0.08公斤、每公斤II+III糊狀物0.09公斤或每公斤II+III糊狀物0.1公斤的二氧化矽，且將在約2℃至約8℃之溫度下培育混合物約50分鐘至約70分鐘、或約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80分鐘或80分鐘以上。在另一實施例中，製程改良藉由包括降低殘餘纖維蛋白原含量、醯胺水解活性及/或前激肽釋放酶活化劑活性之煙霧狀二氧化矽處理來實現。在一個特定實施例中，製程改良藉由包括降低免疫球蛋白製劑中FXI、FXIa、FXII及FXIIa之含量之煙霧狀二氧化矽處理來實現。
一般而言，自免疫球蛋白組合物移除絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原可藉由在絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 之pH值及電導率溶液條件下用微細分之二氧化矽(SiO2 )處理含有免疫球蛋白之溶液來達成。如實例中所示，適合條件包括低pH值及低電導率。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之免疫球蛋白組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含在約4.0至約7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸以結合絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且自組合物中移除SiO2 。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約6.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約6.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約5.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約6.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約6.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約5.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約6.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約6.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在又一實施例中，該方法包含在約4.6至約5.6之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.7至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.8至約5.4之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.9至約5.3之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約5.2之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.1之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在約4.0或約4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或不大於7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在不大於4.0或不大於約4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或不大於7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。
在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之免疫球蛋白組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含在約0.1 mS/cm至約2.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸以結合絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且自組合物中移除SiO2 。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.7 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.6 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.5 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.4 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.3 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.2 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.1 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約0.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約0.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在0.2 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.3 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約0.4 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.5 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸.在另一實施例中，該方法包含在約0.6 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸.在另一實施例中，該方法包含在約0.7 mS/cm至約0.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸.在其他實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm或不大於0.2 mS/cm、0.3 mS/cm、0.4 mS/cm、0.5 mS/cm、0.6 mS/cm、0.7 mS/cm、0.8 mS/cm、0.9 mS/cm、1.0 mS/cm、1.1 mS/cm、1.2 mS/cm、1.3 mS/cm、1.4 mS/cm、1.5 mS/cm、1.6 mS/cm、1.7 mS/cm、1.8 mS/cm、1.9 mS/cm、2.0 mS/cm、2.1 mS/cm、2.2 mS/cm、2.3 mS/cm、2.4 mS/cm、2.5 mS/cm、2.6 mS/cm、2.7 mS/cm、2.8 mS/cm、2.9 mS/cm或3.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在不大於0.1 mS/cm或不大於0.2 mS/cm、0.3 mS/cm、0.4 mS/cm、0.5 mS/cm、0.6 mS/cm、0.7 mS/cm、0.8 mS/cm、0.9 mS/cm、1.0 mS/cm、1.1 mS/cm、1.2 mS/cm、1.3 mS/cm、1.4 mS/cm、1.5 mS/cm、1.6 mS/cm、1.7 mS/cm、1.8 mS/cm、1.9 mS/cm、2.0 mS/cm、2.1 mS/cm、2.2 mS/cm、2.3 mS/cm、2.4 mS/cm、2.5 mS/cm、2.6 mS/cm、2.7 mS/cm、2.8 mS/cm、2.9 mS/cm或3.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。
在某些實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之免疫球蛋白組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含在低pH值及低離子強度下使組合物與SiO2 接觸以結合絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且自組合物中移除SiO2 。在一個特定實施例中，該方法包含在約4。8至約5.4之pH值下在約0.6 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在一個更特定的實施例中，該方法包含在約4。9至約5。3之pH值下在約0.7 mS/cm至約0.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在一個更特定的實施例中，該方法包含在約5.0至約5.2之pH值下在約0.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在根據如表12、表13、表14 及表15 中所呈現的變化形式1222至3041中之任一變化形式的pH值及離子強度下使組合物與SiO2 接觸。
B.　因子H
在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之因子H組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使因子H組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與因子H組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。
在一實施例中，該方法進一步包含以下步驟：執行第一因子H蛋白質濃化步驟以形成第一濃化因子H組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一因子H蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：執行第二因子H蛋白質濃化步驟以形成第二濃化因子H組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一因子H蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之因子H組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一因子H濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之因子H組合物；(b)執行第二因子H濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之因子H組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：在使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸之後，執行因子H濃化步驟。在某些實施例中，因子H濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之因子H組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一因子H濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之因子H組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)執行第二因子H濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
同樣地，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之因子H組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一因子H濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之因子H組合物；(b)執行第二因子H濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之因子H組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(e)執行第三因子H濃化步驟以形成第三濃化之源自血漿之因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所見之變化形式101至變化形式1100中之任一變化形式。
1.　製造源自血漿之因子H之方法
關於製備，所主張之由人類血漿起始之製程應基於藉由例如冷卻時由乙醇份化沈澱所獲得之典型工業中間物的子份化(綜述於Schultze H E,Heremans J F;Molecular Biology of Human Proteins.第I卷：Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company；第236-317頁中)。該純化之較佳實施例為以一定方式純化來自工業規模血漿份化之副部分(side fraction)的功能因子H，以致於不影響受醫藥管理機構控制之血漿產品(如免疫球蛋白)之已確立及許可製造製程。舉例而言，在過濾部分II+III糊狀物懸浮液(Teschner W等人，Vox Sang. 2007年1月；92(1):42-55)、部分I沈澱物(Cohn等人，(1946)上述)、沈澱物III(Schultze H E,Heremans J F;Molecular Biology of Human Proteins.第I卷：Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966,Elsevier Publishing Company；第236-317頁，在第253頁)及沈澱物B(奇石樂/尼赤曼方法；上述，第253頁)之後所獲得之濾餅為因子H之該等工業來源之實例。由彼等副部分起始，可使用此項技術中已知之純化程序來純化因子H。其可基於用聚乙二醇沈澱(Nagasawa S,Stroud R M;Mol Immunol 1980;17:1365-72)、經由固定肝素親和層析(如前所述引用)、離子交換層析(Crossley L G,Porter R R;Biochem J 1980;191:173-82)及疏水性相互作用層析(Ripoche J,Al Salihi A,Rousseaux J,Fontaine M;Biochem J 1984;221,89-96)。
在一實施例中，使用科恩部分製備本發明之起始物質。此份化為熟知的用於製備可由供體血清或單株或重組免疫球蛋白製備之免疫球蛋白製劑的份化。在典型實例中，自健康供體收集血液。通常，自與將投與免疫球蛋白製劑之個體相同的物種之動物收集血液(通常稱為「同源」免疫球蛋白)。藉由諸如科恩份化、超速離心、電泳製備、離子交換層析、親和層析、免疫親和層析、聚乙二醇份化或其類似程序之適合程序自血液分離免疫球蛋白。(參見例如Cohn等人，J. Am. Chem. Soc. 68:459-75(1946)；Oncley等人，J. Am. Chem. Soc. 71:541-50(1949)；Barundern等人，Vox Sang. 7:157-74(1962)；Koblet等人，Vox Sang. 13:93-102(1967)；美國專利第5,122,373號及第5,177,194號；其揭示內容以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的。)在一實施例中，本發明使用來自免疫球蛋白製備之廢棄部分。在一個特定實施例中，本發明使用一旦過濾部分II+III萃取物即於SiO2 濾餅中所發現之部分。
一般而言，本發明之因子H製劑可由例如回收之血漿或原料血漿之任何適合起始物質來製備。在典型實例中，自健康供體收集血液或血漿。通常，自與將投與因子H製劑之個體相同的物種之動物收集血液(通常稱為「同源」因子H)。藉由諸如沈澱(醇份化或聚乙二醇份化)、層析法(離子交換層析、親和層析、、免疫親和層析等)、超速離心及電泳製備及其類似程序之適合程序自血液或血漿分離因子H。(參見例如Cohn等人，J. Am. Chem. Soc. 68:459-75(1946)；Deutsch等人，J. Biol. Chem. 164:109-118；Oncley等人，J. Am. Chem. Soc. 71:541-50(1949)；Cohn等人，J. Am. Chem. Soc. 72:465-474(1950)；Cohn等人，Blood Cells and Plasma Proteins: Their State in Nature(J.L. Tullis編)，第1-58頁，Academic Press,NewYork and London(1953)；Nitschmann等人，Helv. Chim. Acta 37:866-873；Kistler及Nitschmann,Vox Sang. 7:414-424(1962)；Barundern等人，Vox Sang. 7:157-74(1962)；Koblet等人，Vox Sang. 13:93-102(1967)；美國專利第5,122,373號及第5,177,194號；其揭示內容以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)。
在某些實施例中，在藉由血漿份化製造其他商業上重要之血液產品期間，自另外廢棄之物質回收因子H。舉例而言，在例示性實施例中，自部分I沈澱物萃取及/或自再懸浮部分II+III糊狀物離心或過濾之後所形成之濾餅萃取因子H。有利的是，根據本文所提供之方法，工業規模之因子H製備可在不需要額外輸入的血漿或對其他商業上重要之源自血漿之血液產品(諸如用於靜脈內(IVIG)或皮下投與之IgGγ球蛋白)的現有製造製程作出重新設計及管理再許可之情況下達成。
在一態樣中，本發明提供一種由血漿製備絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之濃化因子H組合物的方法，其係藉由自血漿部分萃取因子H且用本文所提供之SiO2 處理方法降低FXI、FXIa、FXII及/或FXIIa含量來達成。
在一實施例中，提供一種由血漿製備濃化因子H組合物之方法，該方法包含以下步驟：(a)在第一沈澱步驟中在約7.0至約7.5之pH值下用約6%至約10%之醇由貧冷凍物血漿部分沈澱析出蛋白質，獲得第一沈澱物及第一上清液；(b)在第二沈澱步驟中在約6.7至約7.3之pH值下用約20%至約30%之醇自第一上清液沈澱析出因子H，形成第二沈澱物；(c)使第二沈澱物再懸浮以形成懸浮液；(d)混合微細分之二氧化矽(SiO2 )與步驟(c)之懸浮液；(e)分離懸浮液形成濾餅及上清液；及(f)在可降低最終組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之含量的溶液條件下自SiO2 濾餅萃取因子H。在一個較佳實施例中，藉由經由含有適合過濾器之壓濾器過濾懸浮液使濾餅與上清液分離。在一實施例中，可藉由經由含有濾餅之壓濾器再循環萃取緩衝液來萃取因子H。
在第二態樣中，本發明提供一種藉由自部分I沈澱物萃取因子H而由血漿製備絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之濃化因子H組合物的方法。
在一個較佳實施例中，提供一種由血漿製備濃化因子H組合物之方法，該方法包含以下步驟：(a)在第一沈澱步驟中在約7.0至約7.5之pH值下用約6%至約10%醇自貧冷凍物血漿部分沈澱析出蛋白質，以獲得第一沈澱物及第一上清液；(b)用因子H萃取緩衝液自沈澱物萃取因子H，及(c)使用本文所提供之適合方法藉由用SiO2 處理組合物來降低絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之含量。
在一態樣中，提供一種由血漿製備濃化因子H組合物之方法，其係藉由自由經設計以提供第二血液蛋白質(例如IgGγ球蛋白)之製程所產生的兩種或兩種以上製造副產物部分之集合萃取因子H來實現。在一實施例中，該方法包含混合製造IgGγ球蛋白(例如IVIG)期間所形成之部分I沈澱物及部分II+III濾餅且自混合部分萃取因子H。
在某些實施例中，可在自部分I沈澱物及/或部分II+III濾餅萃取之後進一步純化絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之濃化因子H組合物。可利用各種方法來進一步純化因子H，包括(但不限於)其他沈澱步驟或份化、親和層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析、尺寸排阻層析法、溶劑/清潔劑(S/D)處理、奈米過濾、超濾、透濾及其類似方法。
在一實施例中，該方法進一步包含自濃化因子H組合物沈澱析出雜質。在某些實施例中，此步驟包含自組合物沈澱析出至少一種雜質，例如脂質或蛋白質，且接著使沈澱物與含有因子H之上清液分離。接著可視情況在單獨的沈澱中自上清液沈澱析出因子H。
在一個特定實施例中，藉由使用最終濃度為約2。5%至約7.5%之PEG自溶液中沈澱析出至少一種雜質來進一步濃化自血漿部分(例如部分I沈澱物、部分II+III沈澱物、沈澱物B沈澱物等)萃取之因子H組合物。在另一實施例中，使用最終濃度為約3%至約7%之PEG。在另一實施例中，使用最終濃度為約4%至約6%之PEG。在又一實施例中，使用最終濃度為約5%之PEG。
在另一特定實施例中，藉由使用最終濃度為約9%至15%之PEG自溶液中沈澱析出因子H來進一步濃化自血漿部分(例如部分I沈澱物、部分II+III沈澱物、沈澱物B沈澱物等)萃取之因子H組合物。在另一實施例中，使用最終濃度為約10%至約14%之PEG。在另一實施例中，使用最終濃度為約11%至約13%之PEG。在又一實施例中，使用最終濃度為約12%之PEG。
在另一特定實施例中，進一步濃化自血漿部分(例如部分I沈澱物、部分II+III沈澱物、沈澱物B沈澱物等)萃取之因子H組合物，其藉由以下實現：(a)自溶液中沈澱析出至少一種雜質；(b)自溶液中沈澱析出因子H；及(c)回收含有因子H之沈澱物。在某些實施例中，用醇(例如甲醇或乙醇)、PEG或其組合執行沈澱步驟。在一個特定實施例中，用PEG執行沈澱步驟。在某些實施例中，第一沈澱步驟之PEG濃度為約2.5%至約7.5%且第二沈澱步驟之PEG濃度為約9%至約15%。在一個特定實施例中，第一步驟之PEG濃度為約4%至約6%且第二步驟之PEG濃度為約11%至約13%。在一個更特定的實施例中，第一沈澱步驟之PEG濃度為約5%且第二沈澱步驟之PEG濃度為約12%。在其他實施例中，第一及第二沈澱步驟之PEG濃度係選自表16 中所列舉之變化形式1101及變化形式1221之變化形式。
在某些實施例中，製備濃化因子H組合物之方法進一步包含至少一個、較佳兩個層析步驟以進一步濃化組合物之純度。一般而言，可利用任何適合的層析法來進一步濃化因子H組合物，例如自部分I沈澱物或部分II+III濾餅萃取。在某些實施例中，在層析濃化之前，萃取之因子H組合物將經歷一或多個如上所述之其他沈澱步驟，以減少組合物中存在之雜質、減小層析步驟之裝載體積及/或交換組合物之緩衝液。
在某些實施例中，可藉由層析步驟來進一步濃化因子H組合物，該層析步驟包含陰離子交換層析(AEC)、陽離子交換層析(CEC)、肝素親和層析、疏水性交換層析(HIC)、羥磷灰石層析(HAP)、免疫親和層析、尺寸排阻層析法(亦即凝膠過濾)或其他適合的層析步驟。可以分批或管柱模式執行層析步驟。
在一個較佳實施例中，該方法包含使用陰離子交換層析及肝素親和層析。
在某些實施例中，本文所提供用於製備濃化因子H組合物之方法將進一步包括至少一個、較佳至少兩個、最佳至少三個病毒滅活或移除步驟。本文提供之方法可採用的病毒滅活或移除步驟之非限制性實例包括溶劑清潔劑處理(Horowitz等人，Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5增刊3):S21-S28及Kreil等人，Transfusion 2003(43):1023-1028，兩文獻皆明確地以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)、奈米過濾(Hamamoto等人，Vox Sang 1989(56)230-236及Yuasa等人，J Gen Virol. 1991(72(第8部分)):2021-2024，兩文獻明確地以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)、高溫下低pH值培育(Kempf等人，Transfusion 1991 (31)423-427及Louie等人，Biologicals 1994(22):13-19)及凍乾因子H組合物之熱處理(Piszkiewicz等人，Thromb Res. 1987年7月15日；47(2):235-41；Piszkiewicz等人，Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54；Epstein及Fricke,Arch Pathol Lab Med. 1990年3月；114(3):335-40)。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之病毒上安全之濃化因子H組合物的方法，該方法包含(i)使用SiO2 自部分II+III濾餅萃取因子H，(ii)執行第一沈澱步驟以自因子H組合物沈澱析出至少一種雜質，(iii)執行第二沈澱步驟以自組合物沈澱析出因子H，及(iv)執行至少一個病毒滅活或移除步驟，因此製備病毒上安全之濃化因子H組合物。在一實施例中，沈澱步驟包含PEG沈澱。在一個特定實施例中，第一及第二沈澱步驟之PEG濃度係選自表16 中所列舉之變化形式1101及變化形式1221之變化形式。
2.　共同結合及有差別的溶離
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量降低的源自血漿之因子H組合物之方法，該方法包含藉由使蛋白質結合至微細分之二氧化矽(SiO2 )自源自混合血漿之組合物共同萃取因子H及絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原，在第一溶液條件下自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原，及隨後在第二溶液條件下自SiO2 溶離因子H。在一個較佳實施例中，起始組合物為再懸浮部分II+III沈澱物或其等效沈澱物。
在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；(c)在因子H保留結合之溶液條件下自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)自SiO2 溶離因子H。
在某些實施例中，因子H保留結合之溶液條件係指優先溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原，而實質部分之因子H保留結合至SiO2 之條件。在一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之因子H之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之因子H之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之因子H之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之因子H之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之因子H之至少10%或結合至SiO2 之因子H之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
在某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原及因子H之有差別的溶離藉由使SiO2 與適合於溶離大部分絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原而非實質部分之結合因子H的第一溶液條件(例如第一溶離緩衝液)及適合於自SiO2 溶離實質部分之結合因子H的第二溶液條件(例如第二溶離緩衝液)依序接觸(亦即逐步溶離)來達成。
在其他實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原及因子H之有差別的溶離藉由由適合於溶離大部分絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原而非實質部分之結合因子H的第一溶液條件至適合於自SiO2 溶離實質部分之結合因子H的第二溶液條件逐漸改變溶液條件(亦即在溶離梯度下)來達成。以此方式，自SiO2 溶離出之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原及因子H含量可部分重疊。藉由份化溶離物及表徵個別部分，可由因子H含量高且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原含量低之部分產生因子H池。
可經改變以達成上述方法之所需結果的溶液條件包括(但不限於)溶液之pH值、溶液之電導率、溶液之溫度、組合物中因子H之濃度及用於該方法中之SiO2 之濃度。一般而言，適用於降低因子H濃化組合物中絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量之方法的pH值範圍在約3至約11之範圍內。適用於上述方法之電導率在約0.1 mS/cm至約100 mS/cm之範圍內。適用於執行上述方法之溫度在約-10℃至約90℃之範圍內。可使用最終濃度在每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約10公克範圍內之微細分之二氧化矽。最終，因子H組合物之濃度可自約0.001 mg/mL至約100 mg/mL不等。
在一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含pH值為約5.0至約11.0。在另一實施例中，pH值為約6.0至約1.0。在另一實施例中，pH值為約7.0至約9.0。在另一實施例中，pH值為約7.5至約8.5。在又一實施例中，pH值為約7.0至約8.0。
在一個特定實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含pH值為約7.0。在另一實施例中，pH值為約7.5。在另一實施例中，pH值為約8.0。在其他實施例中，pH值為約3.0或約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9及11.0。
在一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含pH值為至少6.0。在另一實施例中，pH值為至少6.5。在另一實施例中，pH值為至少7.0。在又一實施例中，pH值為至少7.5。在其他實施例中，溶液之pH值為至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法之另一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含pH值不大於約11.0。在另一實施例中，pH值不大於約10.0。在另一實施例中，pH值不大於約9.0。在另一實施例中，pH值不大於約8.0。在其他實施例中，pH值不大於約11.0或10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含電導率為至少10 mS/cm。在另一實施例中，電導率為至少20 mS/cm。在其他實施例中，溶液條件之電導率為至少2 mS/cm或至少3 mS/cm、4 mS/cm、5 mS/cm、6 mS/cm、7 mS/cm、8 mS/cm、9 mS/cm、10 mS/cm、11 mS/cm、12 mS/cm、13 mS/cm、14 mS/cm、15 mS/cm、16 mS/cm、17 mS/cm、18 mS/cm、19 mS/cm、20 mS/cm、21 mS/cm、22 mS/cm、23 mS/cm、24 mS/cm、25 mS/cm、26 mS/cm、27 mS/cm、28 mS/cm、29 mS/cm、30 mS/cm、31 mS/cm、32 mS/cm、33 mS/cm、34 mS/cm、35 mS/cm、36 mS/cm、37 mS/cm、38 mS/cm、39 mS/cm、40 mS/cm、41 mS/cm、42 mS/cm、43 mS/cm、44 mS/cm、45 mS/cm、46 mS/cm、47 mS/cm、48 mS/cm、49 mS/cm、50 mS/cm、55 mS/cm、60 mS/cm、65 mS/cm、70 mS/cm、75 mS/cm、80 mS/cm、85 mS/cm、90 mS/cm、95 mS/cm、100 mS/cm或更大。
在一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約100 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約10 mS/cm至約50 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約20 mS/cm至約100 mS/cm。在又一實施例中，電導率為約20 mS/cm至約50 mS/cm。
如實例5中所示及圖3中所圖示，發現使用pH值大於6.0(例如7.5)及電導率增加(例如大於6.0 mS/cm)之溶液條件會引起自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原之作用增大及自SiO2 溶離因子H之作用降低。有利的是，此等發現可用以提供降低因子H組合物中存在之絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原含量的方法。在上述方法之一個特定實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含電導率為至少約10 mS/cm及pH值為至少7.0。在另一特定實施例中，溶液條件包含電導率為至少10 mS/cm且pH值為至少7.5。在另一實施例中，溶液條件包含電導率為至少20 mS/cm且pH值為至少7.0。在又一實施例中，溶液條件包含電導率為至少20 mS/cm且pH值為至少7.5。
3.　共同結合及優先的因子H溶離
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量降低的源自血漿之因子H組合物之方法，該方法包含藉由使蛋白質結合至微細分之二氧化矽(SiO2 )自源自混合血漿之組合物共同萃取因子H及絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原，及在實質部分之結合絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原保留結合至SiO2 之條件下自SiO2 溶離因子H。在一個較佳實施例中，起始組合物為再懸浮部分II+III沈澱物或其等效沈澱物。
在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；及(c)在絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件下自SiO2 溶離因子H。
在某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件係指優先溶離因子H，而實質部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合至SiO2 之條件。在一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%或結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
可經改變以達成上述方法之所需結果的溶液條件包括(但不限於)溶液之pH值、溶液之電導率、溶液之溫度、組合物中因子H之濃度及用於該方法中之SiO2 之濃度。一般而言，適用於降低因子H濃化組合物中絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量之方法的pH值範圍在約3至約11之範圍內。適用於上述方法之電導率在約0.1 mS/cm至約100 mS/cm之範圍內。適用於執行上述方法之溫度在約-10℃至約90℃之範圍內。可使用最終濃度在每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約10公克範圍內之微細分之二氧化矽。最終，因子H組合物之濃度可自約0.001 mg/mL至約100 mg/mL不等。
在一實施例中，自SiO2 溶離因子H且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值為約5.0至約11.0。在另一實施例中，pH值為約6.0至約1.0。在另一實施例中，pH值為約7.0至約9.0。在另一實施例中，pH值為約7.5至約8.5。在又一實施例中，pH值為約7.0至約8.0。
在一個特定實施例中，自SiO2 溶離因子H且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值為約7.0。在另一實施例中，pH值為約7.5。在另一實施例中，pH值為約8.0。在其他實施例中，pH值為約3.0或約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9及11.0。
在一實施例中，自SiO2 溶離因子H且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值為至少6.0。在另一實施例中，pH值為至少6.5。在另一實施例中，pH值為至少7.0。在又一實施例中，pH值為至少7.5。在其他實施例中，溶液之pH值為至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法之另一實施例中，自SiO2 溶離因子H且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含pH值不大於約11.0。在另一實施例中，pH值不大於約10.0。在另一實施例中，pH值不大於約9.0。在另一實施例中，pH值不大於約8.0。在其他實施例中，pH值不大於約11.0或10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一實施例中，自SiO2 溶離因子H且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含電導率不大於約20 mS/cm.在另一實施例中，電導率不大於約10 mS/cm。在其他實施例中，溶液條件之電導率不大於約20 mS/cm或不大於約19 mS/cm、18 mS/cm、17 mS/cm、16 mS/cm、15 mS/cm、14 mS/cm、13 mS/cm、12 mS/cm、11 mS/cm、10 mS/cm、9 mS/cm、8 mS/cm、7 mS/cm、6 mS/cm、5 mS/cm、4 mS/cm、3 mS/cm、2 mS/cm或更小。
在一實施例中，自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原且顯著部分之因子H保留結合之溶液條件包含電導率為約2 mS/cm至約20 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約2 mS/cm至約10 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約20 mS/cm至約6 mS/cm。在又一實施例中，電導率為約10 mS/cm至約6 mS/cm。
如實例5中所示及圖3中所圖示，發現使用pH值大於6.0(例如7.5)及電導率減小(例如小於20 mS/cm)之溶液條件會引起自SiO2 溶離因子H之作用增大及自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原之作用降低。有利的是，此等發現可用以提供降低因子H組合物中存在之絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原含量的方法。在上述方法之一個特定實施例中，自SiO2 溶離因子H且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件包含電導率不大於約20 mS/cm且pH值為至少7.0。在另一特定實施例中，溶液條件包含電導率不大於約10 mS/cm且pH值為至少7.5。在另一特定實施例中，溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約2 mS/cm且pH值為至少7.0。在又一實施例中，溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約2 mS/cm且pH值為至少7.5。
4.　因子H之優先結合
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之源自血漿之因子H組合物的方法，該方法包含：(a)在適合於結合因子H而非至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；及(c)自SiO2 溶離因子H。
在某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件係指在溶液中優先允許因子H結合至SiO2 ，而實質部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留未結合之條件。在一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%或起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
可經改變以達成上述方法之所需結果的溶液條件包括(但不限於)溶液之pH值、溶液之電導率、溶液之溫度、組合物中因子H之濃度及用於該方法中之SiO2 之濃度。一般而言，適用於降低因子H濃化組合物中絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量之方法的pH值範圍在約3至約11之範圍內。適用於上述方法之電導率在約0.1 mS/cm至約100 mS/cm之範圍內。適用於執行上述方法之溫度在約-10℃至約90℃之範圍內。可使用最終濃度在每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約10公克範圍內之微細分之二氧化矽。最終，因子H組合物之濃度可自約0.001 mg/mL至約100 mg/mL不等。
在一實施例中，因子H結合至SiO2 且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為約5.0至約11.0。在另一實施例中，pH值為約6.0至約1.0。在另一實施例中，pH值為約7.0至約9.0。在另一實施例中，pH值為約7.5至約8.5。在又一實施例中，pH值為約7.0至約8.0。
在一個特定實施例中，因子H結合至SiO2 且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為約7.0。在另一實施例中，pH值為約7.5。在另一實施例中，pH值為約8.0。在其他實施例中，pH值為約3.0或約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9及11.0。
在一實施例中，因子H結合至SiO2 且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為至少6.0。在另一實施例中，pH值為至少6.5。在另一實施例中，pH值為至少7.0。在又一實施例中，pH值為至少7.5。在其他實施例中，溶液之pH值為至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法之另一實施例中，因子H結合至SiO2 且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值不大於約11.0。在另一實施例中，pH值不大於約10.0。在另一實施例中，pH值不大於約9.0。在另一實施例中，pH值不大於約8.0。在其他實施例中，pH值不大於約11.0或10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一實施例中，因子H結合至SiO2 且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為至少10 mS/cm。在另一實施例中，電導率為至少20 mS/cm。在其他實施例中，溶液條件之電導率為至少2mS/cm或至少3 mS/cm、4 mS/cm、5 mS/cm、6 mS/cm、7 mS/cm、8 mS/cm、9 mS/cm、10 mS/cm、11 mS/cm、12 mS/cm、13 mS/cm、14 mS/cm、15 mS/cm、16 mS/cm、17 mS/cm、18 mS/cm、19 mS/cm、20 mS/cm、21 mS/cm、22 mS/cm、23 mS/cm、24 mS/cm、25 mS/cm、26 mS/cm、27 mS/cm、28 mS/cm、29 mS/cm、30 mS/cm、31 mS/cm、32 mS/cm、33 mS/cm、34 mS/cm、35 mS/cm、36 mS/cm、37 mS/cm、38 mS/cm、39 mS/cm、40 mS/cm、41 mS/cm、42 mS/cm、43 mS/cm、44 mS/cm、45 mS/cm、46 mS/cm、47 mS/cm、48 mS/cm、49 mS/cm、50 mS/cm、55 mS/cm、60 mS/cm、65 mS/cm、70 mS/cm、75 mS/cm、80 mS/cm、85 mS/cm、90 mS/cm、95 mS/cm、100 mS/cm或更大。
在一實施例中，因子H結合至SiO2 且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約100 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約10 mS/cm至約50 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約20 mS/cm至約100 mS/cm。在又一實施例中，電導率為約20 mS/cm至約50 mS/cm。
如實例5中所示及圖3中所圖示，發現使用pH值大於6.0(例如7.5)及電導率增加(例如大於6.0 mS/cm)之溶液條件會引起絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原對SiO2 之親和力降低且因子H對SiO2 之親和力增加。有利的是，此等發現可用以提供降低因子H組合物中存在之絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原含量之方法。在上述方法之一個特定實施例中，因子H結合至SiO2 且顯著部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為至少約10 mS/cm且pH值為至少7.0。在另一特定實施例中，溶液條件包含電導率為至少10 mS/cm且pH值為至少7.5。在另一實施例中，溶液條件包含電導率為至少20 mS/cm且pH值為至少7.0。在又一實施例中，溶液條件包含電導率為至少20 mS/cm且pH值為至少7.5。
5.　絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之優先結合
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之源自血漿之因子H組合物的方法，該方法包含：(a)在適合於結合絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原而非因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離。
在某些實施例中，因子H不結合至SiO2 之溶液條件係指在溶液中優先允許絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 ，而實質部分之因子H保留未結合之條件。在一實施例中，實質部分係指起始組合物中因子H之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中因子H之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中因子H之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中因子H之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指起始組合物中因子H之至少10%或起始組合物中因子H之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
可經改變以達成上述方法之所需結果的溶液條件包括(但不限於)溶液之pH值、溶液之電導率、溶液之溫度、組合物中因子H之濃度及用於該方法中之SiO2 之濃度。一般而言，適用於降低因子H濃化組合物中絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量之方法的pH值範圍在約3至約11之範圍內。適用於上述方法之電導率在約0.1 mS/cm至約100 mS/cm之範圍內。適用於執行上述方法之溫度在約-10℃至約90℃之範圍內。可使用最終濃度在每公克蛋白質約0。01公克至每公克蛋白質約10公克範圍內之微細分之二氧化矽。最終，因子H組合物之濃度可自約0。001 mg/mL至約100 mg/mL不等。
在一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且顯著部分之因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為約5.0至約11.0。在另一實施例中，pH值為約6.0至約1.0。在另一實施例中，pH值為約7.0至約9.0。在另一實施例中，pH值為約7.5至約8.5。在又一實施例中，pH值為約7.0至約8.0。
在一個特定實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且顯著部分之因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為約7.0。在另一實施例中，pH值為約7.5。在另一實施例中，pH值為約8.0。在其他實施例中，pH值為約3.0或約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9及11.0。
在一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且顯著部分之因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值為至少6.0。在另一實施例中，pH值為至少6.5。在另一實施例中，pH值為至少7.0。在又一實施例中，pH值為至少7.5。在其他實施例中，溶液之pH值為至少3.0或至少3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5或更高。
在任何上述方法之另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且顯著部分之因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含pH值不大於約11.0。在另一實施例中，pH值不大於約10.0。在另一實施例中，pH值不大於約9.0。在另一實施例中，pH值不大於約8.0。在其他實施例中，pH值不大於約11.0或10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或更低。
在一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且顯著部分之因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率不大於約20 mS/cm。在另一實施例中，電導率不大於約10 mS/cm。在其他實施例中，溶液條件之電導率不大於約20 mS/cm或不大於約19 mS/cm、18 mS/cm、17 mS/cm、16 mS/cm、15 mS/cm、14 mS/cm、13 mS/cm、12 mS/cm、11 mS/cm、10 mS/cm、9 mS/cm、8 mS/cm、7 mS/cm、6 mS/cm、5 mS/cm、4 mS/cm、3 mS/cm、2 mS/cm或更小。
在一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且顯著部分之因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率為約2 mS/cm至約20 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約2 mS/cm至約10 mS/cm。在另一實施例中，電導率為約20 mS/cm至約6 mS/cm。在又一實施例中，電導率為約10 mS/cm至約6 mS/cm。
如實例5中所示及圖3中所圖示，發現使用pH值大於6.0(例如7.5)及電導率低(例如小於20 mS/cm)之溶液條件會引起因子H對SiO2 之親和力增加及絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原對SiO2 之親和力降低。有利的是，此等發現可用以提供降低因子H組合物中存在之絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原含量之方法。在上述方法之一個特定實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 且顯著部分之因子H不結合至SiO2 之溶液條件包含電導率不大於約20 mS/cm及pH值為至少7.0。在另一特定實施例中，溶液條件包含電導率不大於約10 mS/cm且pH值為至少7.5。在另一特定實施例中，溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約2 mS/cm且pH值為至少7.0。在又一實施例中，溶液條件包含電導率為約10 mS/cm至約2 mS/cm且pH值為至少7.5。
6.　自血漿沈澱物萃取因子H之方法
在一態樣中，本發明提供一種製備因子H組合物之方法，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之懸浮血漿沈澱物組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，(b)用pH值為5.0至7.0及電導率小於4 mS/cm的溶液洗滌SiO2 ，及(c)用pH值為7.0至8.0及電導率大於10 mS/cm之溶液自SiO2 溶離因子H，從而提供濃化因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為FXI、FXIa、FXII及FXIIa中之一或多者。在某些實施例中，血漿沈澱物為科恩部分I沈澱物、科恩部分II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物A、奇石樂/尼赤曼沈澱物B或其等效部分。在一實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為5.5至6.5。在一個特定實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為6.0±0.2。在一實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為至少20 mS/cm。在一個特定實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為25 mS/cm至40 mS/cm。
在某些實施例中，上述方法進一步包含濃化步驟，該濃化步驟包含自濃化因子H組合物沈澱析出至少一種雜質，其中因子H並未共同沈澱析出。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之懸浮血漿沈澱物組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，(b)用pH值為5.0至7.0及電導率小於4 mS/cm之溶液洗滌SiO2 ，(c)用pH值為7.0至8.0及電導率大於10 mS/cm之溶液自SiO2 溶離因子H，及(d)自因子H溶離物沈澱析出至少一種雜質，其中因子H未沈澱析出，從而提供濃化因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為FXI、FXIa、FXII及FXIIa中之一或多者。在某些實施例中，血漿沈澱物為科恩部分I沈澱物、科恩部分II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物A、奇石樂/尼赤曼沈澱物B或其等效部分。在一實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為5.5至6.5。在一個特定實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為6.0±0.2。在一實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為至少20 mS/cm。在一個特定實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為25 mS/cm至40 mS/cm。在一實施例中，雜質沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，雜質PEG沈澱包含用最終濃度為3%至7%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，雜質沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為5±0。5%。
在某些實施例中，上述方法進一步包含濃化步驟，其包含自濃化因子H組合物沈澱析出因子H。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之懸浮血漿沈澱物組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，(b)用pH值為5.0至7.0及電導率小於4 mS/cm之溶液洗滌SiO2 ，(c)用pH值為7.0至8.0及電導率大於10 mS/cm之溶液自SiO2 溶離因子H，(d)自因子H溶離物沈澱析出至少一種雜質，以形成包含因子H之上清液，及(e)自該上清液沈澱析出因子H，從而提供濃化因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為FXI、FXIa、FXII及FXIIa中之一或多者。在某些實施例中，血漿沈澱物為科恩部分I沈澱物、科恩部分II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物A、奇石樂/尼赤曼沈澱物B或其等效部分。在一實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為5.5至6.5。在一個特定實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為6.0±0.2。在一實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為至少20 mS/cm。在一個特定實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為25 mS/cm至40 mS/cm。在一實施例中，雜質沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，雜質PEG沈澱包含用最終濃度為3%至7%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，雜質沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為5±0.5%。在一實施例中，因子H沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，因子H PEG沈澱包含用最終濃度為10%至15%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，在因子H沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為12±0.5%。
在某些實施例中，上述方法進一步包含濃化步驟，其包含用濃化因子H組合物執行陰離子交換層析。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之懸浮血漿沈澱物組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，(b)用pH值為5.0至7.0及電導率小於4 mS/cm之溶液洗滌SiO2 ，(c)用pH值為7.0至8.0及電導率大於10 mS/cm之溶液自SiO2 溶離因子H，(d)自因子H溶離物沈澱析出至少一種雜質，以形成包含因子H之上清液，(e)自該上清液沈澱析出因子H，(f)使包含因子H之沈澱物再懸浮，(g)使再懸浮沈澱物中存在之因子H結合至陰離子交換樹脂，及(h)自陰離子交換樹脂溶離因子H，從而提供濃化因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為FXI、FXIa、FXII及FXIIa中之一或多者。在某些實施例中，血漿沈澱物為科恩部分I沈澱物、科恩部分II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物A、奇石樂/尼赤曼沈澱物B或其等效部分。在一實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為5.5至6.5。在一個特定實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為6.0±0.2。在一實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為至少20 mS/cm。在一個特定實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為25 mS/cm至40 mS/cm。在一實施例中，雜質沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，雜質PEG沈澱包含用最終濃度為3%至7%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，雜質沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為5±0。5%。在一實施例中，因子H沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，因子H PEG沈澱包含用最終濃度為10%至15%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，在因子H沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為12±0。5%。
在某些實施例中，上述方法進一步包含濃化步驟，其包含用濃化因子H組合物執行肝素親和層析。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之懸浮血漿沈澱物組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，(b)用pH值為5.0至7.0及電導率小於4 mS/cm之溶液洗滌SiO2 ，(c)用pH值為7.0至8.0及電導率大於10 mS/cm之溶液自SiO2 溶離因子H，(d)自因子H溶離物沈澱析出至少一種雜質，以形成包含因子H之上清液，(e)自該上清液沈澱析出因子H，(f)使包含因子H之沈澱物再懸浮，(g)使再懸浮沈澱物中存在之因子H結合至陰離子交換樹脂，(h)自陰離子交換樹脂溶離因子H，(i)使陰離子交換溶離液中存在之因子H結合至肝素親和樹脂，及(j)自肝素親和樹脂溶離因子H，從而提供濃化因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為FXI、FXIa、FXII及FXIIa中之一或多者。在某些實施例中，血漿沈澱物為科恩部分I沈澱物、科恩部分II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物A、奇石樂/尼赤曼沈澱物B或其等效部分。在一實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為5.5至6.5。在一個特定實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為6.0±0.2。在一實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為至少20 mS/cm。在一個特定實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為25 mS/cm至40 mS/cm。在一實施例中，雜質沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，雜質PEG沈澱包含用最終濃度為3%至7%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，雜質沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為5±0.5%。在一實施例中，因子H沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，因子HPEG沈澱包含用最終濃度為10%至15%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，在因子H沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為12±0。5%。
在某些實施例中，上述方法進一步包含使因子H組合物經歷專用病毒移除及/或滅活步驟。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之懸浮血漿沈澱物組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，(b)用pH值為5.0至7.0及電導率小於4 mS/cm之溶液洗滌SiO2 ，(c)用pH值為7.0至8.0及電導率大於10 mS/cm之溶液自SiO2 溶離因子H，(d)自因子H溶離物沈澱析出至少一種雜質，以形成包含因子H之上清液，(e)自該上清液沈澱析出因子H，(f)使包含因子H之沈澱物再懸浮，(g)使再懸浮沈澱物中存在之因子H結合至陰離子交換樹脂，(h)自陰離子交換樹脂溶離因子H，(i)使陰離子交換溶離液中存在之因子H結合至肝素親和樹脂，(j)自肝素親和樹脂溶離因子H，及(k)執行選自奈米過濾、溶劑/清潔劑(S/D)處理、熱處理及在低pH值下培育之專用病毒移除及/或滅活步驟，從而提供濃化因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為FXI、FXIa、FXII及FXIIa中之一或多者。在某些實施例中，血漿沈澱物為科恩部分I沈澱物、科恩部分II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物A、奇石樂/尼赤曼沈澱物B或其等效部分。在一實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為5.5至6.5。在一個特定實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為6.0±0.2。在一實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為至少20 mS/cm。在一個特定實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為25 mS/cm至40 mS/cm。在一實施例中，雜質沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，雜質PEG沈澱包含用最終濃度為3%至7%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，雜質沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為5±0.5%。在一實施例中，因子H沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，因子H PEG沈澱包含用最終濃度為10%至15%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，在因子H沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為12±0.5%。
在某些實施例中，上述方法進一步包含藉由超濾/透濾濃縮濃化因子H組合物之步驟。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合因子H之條件下使含有因子H及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之懸浮血漿沈澱物組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，(b)用pH值為5.0至7.0及電導率小於4 mS/cm之溶液洗滌SiO2 ，(c)用pH值為7.0至8.0及電導率大於10 mS/cm之溶液自SiO2 溶離因子H，(d)自因子H溶離物沈澱析出至少一種雜質，以形成包含因子H之上清液，(e)自該上清液沈澱析出因子H，(f)使包含因子H之沈澱物再懸浮，(g)使再懸浮沈澱物中存在之因子H結合至陰離子交換樹脂，(h)自陰離子交換樹脂溶離因子H，(i)使陰離子交換溶離液中存在之因子H結合至肝素親和樹脂，(j)自肝素親和樹脂溶離因子H，(k)執行選自奈米過濾、溶劑/清潔劑(S/D)處理、熱處理及在低pH值下培育之專用病毒移除及/或滅活步驟，及(l)藉由超濾/透濾濃縮因子H，從而提供濃化因子H組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為FXI、FXIa、FXII及FXIIa中之一或多者。在某些實施例中，血漿沈澱物為科恩部分I沈澱物、科恩部分II+III沈澱物、科恩部分I+II+III沈澱物、奇石樂/尼赤曼沈澱物A、奇石樂/尼赤曼沈澱物B或其等效部分。在一實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為5.5至6.5。在一個特定實施例中，用以洗滌SiO2 之溶液的pH值為6.0±0.2。在一實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為至少20 mS/cm。在一個特定實施例中，用以溶離因子H之溶液的電導率為25 mS/cm至40 mS/cm。在一實施例中，雜質沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，雜質PEG沈澱包含用最終濃度為3%至7%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，雜質沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為5±0.5%。在一實施例中，因子H沈澱步驟為PEG沈澱。在一個特定實施例中，因子H PEG沈澱包含用最終濃度為10%至15%之PEG 4000沈澱。在一個更特定的實施例中，在因子H沈澱步驟中PEG 4000之最終濃度為12±0.5%。
C.　間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)
在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之IαI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使IαI組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與IαI組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。
在一實施例中，該方法進一步包含以下步驟：執行第一Iαi蛋白質濃化步驟以形成第一濃化IαI組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一IαI蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：執行第二IαI蛋白質濃化步驟以形成第二濃化IαI組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一IαI蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之IαI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一IαI濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之IαI組合物；(b)執行第二IαI濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之IαI組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：在使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸之後執行IαI濃化步驟。在某些實施例中，IαI濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之IαI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一IαI濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之IαI組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)執行第二IαI濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之IαI組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
同樣地，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之IαI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一IαI濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之IαI組合物；(b)執行第二IαI濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之IαI組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(e)執行第三IαI濃化步驟以形成第三濃化之源自血漿之IαI組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所見之變化形式101至變化形式1100中之任一變化形式。
1.　共同結合及有差別的溶離
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量降低的源自血漿之IαI組合物的方法，該方法包含藉由使蛋白質結合至微細分之二氧化矽(SiO2 )自源自混合血漿之組合物共同萃取IαI及絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原，在第一溶液條件下自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原，及隨後在第二溶液條件下自SiO2 溶離IαI。在一個較佳實施例中，起始組合物為再懸浮部分II+III沈澱物或其等效沈澱物。
在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；(c)在IαI保留結合之溶液條件下自SiO2 溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)自SiO2 溶離IαI。
在某些實施例中，IαI保留結合之溶液條件係指優先溶離絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原，而實質部分之IαI保留結合至SiO2 之條件。在一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之IαI之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之IαI之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之IαI之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之IαI之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之IαI之至少10%或結合至SiO2 之IαI之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
在某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原及IαI之有差別的溶離係藉由使SiO2 與適合於溶離大部分絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原而非實質部分之結合IαI的第一溶液條件(例如第一溶離緩衝液)及適合於自SiO2 溶離實質部分之結合IαI的第二溶液條件(例如第二溶離緩衝液)依序接觸(亦即逐步溶離)來達成。
在其他實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原及IαI之有差別的溶離藉由由適合於溶離大部分絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原而非實質部分之結合IαI的第一溶液條件至適合於自SiO2 溶離實質部分之結合IαI的第二溶液條件逐漸改變溶液條件(亦即在溶離梯度下)來達成。以此方式，自SiO2 溶離出之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原及IαI含量可部分重疊。藉由份化溶離物及表徵個別部分，可由IαI含量高且絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原含量低之部分產生IαI池。
2.　共同結合及優先的IαI溶離
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量降低的源自血漿之IαI組合物的方法，該方法包含藉由使蛋白質結合至微細分之二氧化矽(SiO2 )自源自混合血漿之組合物共同萃取IαI及絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原，及在實質部分之結合絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原保留結合至SiO2 之條件下自SiO2 溶離IαI。在一個較佳實施例中，起始組合物為再懸浮部分II+III沈澱物或其等效沈澱物。
在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；及(c)在絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件下自SiO2 溶離IαI。
在某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合之溶液條件係指優先溶離IαI，而實質部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留結合至SiO2 之條件。在一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%或結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
3. IαI之優先結合
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之源自血漿之IαI組合物的方法，該方法包含：(a)在適合於結合IαI而非至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使含有IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(b)使SiO2 與組合物分離；及(c)自SiO2 溶離IαI。
在某些實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原不結合至SiO2 之溶液條件係指在溶液中優先允許IαI結合至SiO2 ，而實質部分之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原保留未結合之條件。在一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少10%或起始組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
4.　絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之優先結合
在一態樣中，本發明提供一種製備絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原量降低之源自血漿之IαI組合物的方法，該方法包含：(a)在適合於結合絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原而非IαI之條件下使含有IαI及至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與組合物分離。
在某些實施例中，IαI不結合至SiO2 之溶液條件係指在溶液中優先允許絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 ，而實質部分之IαI保留未結合之條件。在一實施例中，實質部分係指起始組合物中IαI之至少10%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中IαI之至少25%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中IαI之至少50%。在另一實施例中，實質部分係指起始組合物中IαI之至少75%。在其他實施例中，實質部分係指起始組合物中IαI至少10%或起始組合物中IαI之至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
D.　α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)
在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法。在一個特定實施例中，該方法包含以下步驟：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使A1PI組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)使SiO2 與A1PI組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。
在一實施例中，該方法進一步包含以下步驟：執行第一A1PI蛋白質濃化步驟以形成第一濃化A1PI組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一A1PI蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：執行第二A1PI蛋白質濃化步驟以形成第二濃化A1PI組合物，然後使該組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一A1PI蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之A1PI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一A1PI濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之A1PI組合物；(b)執行第二A1PI濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之A1PI組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
在某些實施例中，上述方法進一步包含以下步驟：在使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )之後執行AlPI濃化步驟。在某些實施例中，AlPI濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之AlPI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一AlPI濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之AlPI組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)執行第二AlPI濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之AlPI組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。
同樣地，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之AlPI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)執行第一AlPI濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之AlPI組合物；(b)執行第二AlPI濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之Ig組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使該第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(d)使SiO2與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(e)執行第三A1PI濃化步驟以形成第三濃化之源自血漿之A1PI組合物。在一個較佳實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)及/或因子XII(FXII)。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所見之變化形式101至變化形式1100中之任一變化形式。
在一個特定實施例中，A1PI組合物為製造中間物。舉例而言，在某些實施例中，A1PI組合物為來自以下之製造中間物：科恩份化程序(J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475;J.Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950))、翁克萊份化程序(J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2):541-550)、奇石樂/尼赤曼份化程序(Vox Sang. 7:414-424 (1962))、美國專利第6,974,792號或第7,807,435號中所揭示之純化程序、其經修改程序及此項技術中已知之類似或等效純化程序。前述參考文獻據此以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的。
舉例而言，已知A1PI之許多製造方法，其包含用聚乙二醇4000將血漿份化沈澱，以及各種血漿部分(科恩部分IV-1-沈澱物或奇石樂及尼赤曼上清液A或A+1)之加工(Feldman及Winkelman, Blood Separation and Plasma Fractionation (1991), Wiley-Liss, Inc., 第341-383頁)。在更精細的純化中，各別血液部分已藉助於DEAE纖維素純化(例如Basis等人(Vopr. Med. Khim. 33(1)(1987),54-59))、 用親和層析物質或陽離子交換劑層析物質處理(EP 0 698 615 A1)。美國專利第6,974,792號描述利用科恩部分V沈澱物產生高比活性之A1PI的純化方法。美國專利第7,807,435號描述利用科恩部分IV-1及/或部分IV-4沈澱物提供較高產率之A1PI的純化方法。
在一個特定實施例中，A1PI組合物為貧冷凍物科恩池。在另一特定實施例中，A1PI組合物為再懸浮科恩部分V沈澱物或其等效部分。在另一特定實施例中，A1PI組合物為再懸浮科恩部分IV-1沈澱物或其等效部分。在另一特定實施例中，A1PI組合物為再懸浮科恩部分IV-4沈澱物或其等效部分。在另一特定實施例中，A1PI組合物為奇石樂/尼赤曼上清液A或其等效部分。
一般而言，自A1PI組合物移除絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原可藉由在使絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原結合至SiO2 之pH值及電導率溶液條件下用微細分之二氧化矽(SiO2 )處理含有A1PI之組合物來達成。
在一實施例中，製程改良藉由包括在過濾或離心淨化包含A1PI之血漿沈澱物之前進行煙霧狀二氧化矽處理來實現。在一實施例中，SiO2 處理步驟包含添加微細分之二氧化矽顆粒(例如煙霧狀二氧化矽、Aerosil)，繼之以40分鐘至16小時培育期，其間不斷混合懸浮液。在某些實施例中，培育期將為約50分鐘至約70分鐘，或約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80分鐘或80分鐘以上。在其他實施例中，培育期將為至少1小時、或至少2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時或16小時以上。在一個特定實施例中，培育期將為至少15小時。一般而言，將在約0℃至約25℃，或約2℃至約8℃下執行該處理。在某些實施例中，可在約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃下執行該處理。在一個特定實施例中，在約2℃至約25℃下執行該處理。在一個特定實施例中，製程改良藉由包括降低免疫球蛋白製劑中FXI、FXIa、FXII及FXIIa之含量的煙霧狀二氧化矽處理來實現。
在某些實施例中，添加濃度為每公斤沈澱物約20公克至每公斤沈澱物約100公克之煙霧狀二氧化矽。在某些實施例中，可添加濃度為每公斤沈澱物約20公克或每公斤沈澱物約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100公克之煙霧狀二氧化矽。在一個特定實施例中，將煙霧狀二氧化矽(例如Aerosil 380或等效物)添加至沈澱物再懸浮液中達到最終濃度為每公斤沈澱物約40公克。
在某些實施例中，將濃度為每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約10公克之SiO2 添加至AlPI組合物中。在另一實施例中，將濃度為每公克蛋白質約0.01公克至每公克蛋白質約5公克之SiO2 添加至A1PI組合物中。在另一實施例中，將濃度為每公克蛋白質約0.02公克至每公克蛋白質約4公克之SiO2 添加至A1PI組合物中。在一實施例中，將最終濃度為每公克總蛋白質至少0.1公克之SiO2 添加至A1PI組合物中。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.2公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.25公克之煙霧狀二氧化矽。在其他特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少1公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少2公克之煙霧狀二氧化矽。在另一特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少2.5公克之煙霧狀二氧化矽。在其他特定實施例中，添加濃度為每公克總蛋白質至少0.01公克或每公克總蛋白質至少0.02公克、0.03公克、0.04公克、0.05公克、0.06公克、0.07公克、0.08公克、0.09公克、0.1公克、0.2公克、0.3公克、0.4公克、0.5公克、0.6公克、0.7公克、0.8公克、0.9公克、1.0公克、1.5公克、2.0公克、2.5公克、3.0公克、3.5公克、4.0公克、4.5公克、5.0公克、5.5公克、6.0公克、6.5公克、7.0公克、7.5公克、8.0公克、8.5公克、9.0公克、9.5公克、10.0公克或10.0公克以上之微細分之二氧化矽。
在某些實施例中，將在二氧化矽處理之後添加助濾劑(例如Celpure C300(Celpure)或Hyflo-Supper-Cel(World Minerals))以有助於深度過濾。可添加最終濃度為每公斤沈澱物約0.01公斤至每公斤沈澱物約1.0公斤，或每公斤沈澱物約0.02公斤至每公斤沈澱物約0.8公斤、或每公斤沈澱物約0.03公斤至每公斤沈澱物約0.7公斤之助濾劑。在某些實施例中，將添加最終濃度為每公斤沈澱物至少0.01公斤或每公斤沈澱物至少0.02公斤、0.03公斤、0.04公斤、0.05公斤、0.06公斤、0.07公斤、0.08公斤、0.09公斤、0.1公斤、0.2公斤、0.3公斤、0.4公斤、0.5公斤、0.6公斤、0.7公斤、0.8公斤、0.9公斤或1.0公斤之助濾劑。在某些實施例中，將添加最終濃度為每公斤沈澱物約0.01公斤或每公斤沈澱物約0.02公斤、0.03公斤、0.04公斤、0.05公斤、0.06公斤、0.07公斤、0.08公斤、0.09公斤、0.1公斤、0.2公斤、0.3公斤、0.4公斤、0.5公斤、0.6公斤、0.7公斤、0.8公斤、0.9公斤或1.0公斤之助濾劑。
因此，在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之A1PI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含在約4.0至約7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸以結合絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約6.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約6.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.0至約5.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約6.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約6.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.5至約5.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約6.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約6.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在又一實施例中，該方法包含在約4.6至約5.6之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.7至約5.5之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.8至約5.4之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約4.9至約5.3之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.0至約5.2之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約5.1之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在約4.0或約4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或不大於7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在不大於4.0或不大於約4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或不大於7.0之pH值下使組合物與SiO2 接觸。
在一實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之AlPI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含在約0.1 mS/cm至約2.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸以結合絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.7 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.6 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.5 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.4 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.3 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.2 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.1 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約0.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約0.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在0.2 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.3 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm至約0.4 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.5 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.6 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.7 mS/cm至約0.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在另一實施例中，該方法包含在約0.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在約0.1 mS/cm或不大於0.2 mS/cm、0.3 mS/cm、0.4 mS/cm、0.5 mS/cm、0.6 mS/cm、0.7 mS/cm、0.8 mS/cm、0.9 mS/cm、1.0 mS/cm、1.1 mS/cm、1.2 mS/cm、1.3 mS/cm、1.4 mS/cm、1.5 mS/cm、1.6 mS/cm、1.7 mS/cm、1.8 mS/cm、1.9 mS/cm、2.0 mS/cm、2.1 mS/cm、2.2 mS/cm、2.3 mS/cm、2.4 mS/cm、2.5 mS/cm、2.6 mS/cm、2.7 mS/cm、2.8 mS/cm、2.9mS/cm或3.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在不大於0.1 mS/cm或不大於0.2 mS/cm、0.3 mS/cm、0.4 mS/cm、0.5 mS/cm、0.6 mS/cm、0.7 mS/cm、0.8 mS/cm、0.9 mS/cm、1.0 mS/cm、1.1 mS/cm、1.2 mS/cm、1.3 mS/cm、1.4 mS/cm、1.5 mS/cm、1.6 mS/cm、1.7 mS/cm、1.8 mS/cm、1.9 mS/cm、2.0 mS/cm、2.1 mS/cm、2.2 mS/cm、2.3 mS/cm、2.4 mS/cm、2.5 mS/cm、2.6 mS/cm、2.7 mS/cm、2.8 mS/cm、2.9 mS/cm或3.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。
在某些實施例中，本發明提供一種降低源自血漿之AlPI組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含在低pH值及低離子強度下使組合物與SiO2 接觸以結合絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一個特定實施例中，該方法包含在約4.8至約5.4之pH值下在約0.6 mS/cm至約1.0 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在一個更特定的實施例中，該方法包含在約4.9至約5.3之pH值下在約0.7 mS/cm至約0.9 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在一個更特定的實施例中，該方法包含在約5.0至約5.2之pH值下在約0.8 mS/cm之離子強度下使組合物與SiO2 接觸。在其他實施例中，該方法包含在根據如表12、表13、表14 及表15 中所呈現的變化形式1222至3041中之任一變化形式的pH值及離子強度下使組合物與SiO2 接觸。
1.　絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之結合及溶離
在一態樣中，本發明提供一種降低包含A1PI之再懸浮血漿沈澱物中絲胺酶蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原之量的方法。一般而言，沈澱物可為在混合血漿、較佳為人類血漿份化期間的任意沈澱物。在一實施例中，該方法包含在結合絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原且使A1PI保持不可溶狀態之第一低pH值溶液條件下使包含不可溶狀態之A1PI之再懸浮血漿沈澱物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，使懸浮液之可溶及不可溶部分分離，在適合於使實質部分之A1PI保持不可溶狀態之第二低pH值溶液條件下自SiO2 溶離絲胺酸及/或絲胺酸蛋白酶原，使懸浮液之可溶及不可溶部分分離，及自不可溶部分萃取A1PI。在一實施例中，在沈澱反應之前或期間混合SiO2 且連同沈澱物一起回收。在一個特定實施例中，沈澱物為科恩部分IV-1沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為科恩部分IV-4沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為科恩部分V沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為奇石樂/尼赤曼沈澱物IV。在又一實施例中，沈澱物為奇石樂/尼赤曼沈澱物C。
在上文所提供之方法之一實施例中，第一低pH值溶液條件包含pH值為4.0至7.0及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至7.0及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.0及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0 及離子強度小於約5.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為5.5±0.2及離子強度為小於約5.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為6.0±0.2及離子強度小於約5.0 mS/cm。
在上文所提供之方法之另一實施例中，第一低pH值溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約2.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約1.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約0.5 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約2.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約1.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約0.5 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為5.5±0.2及離子強度小於約3.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為6.0±0.2及離子強度為小於約3.0 mS/cm。在其他實施例中，該第一低pH值溶液條件包含根據如表12 、表13 、表14 及表15 中所呈現的變化形式1222至3041中之任一變化形式的pH值及離子強度。
在上文所提供之方法之一實施例中，第二低pH值溶液條件包含pH值為4.0至7.0及離子強度大於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至7.0及離子強度大於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度大於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.0及離子強度大於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度大於約5.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為5.5±0.2及離子強度大於約5.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為6.0±0.2及離子強度大於約5.0 mS/cm。
在上文所提供之方法之另一實施例中，第二低pH值溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度大於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度大於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度大於約6.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度大於約7.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度大於約10 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度大於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度大於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度大於約6.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度大於約7.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度大於約10 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為5.5±0.2及離子強度大於約10 mS/cm。在另一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為6.0±0.2及離子強度大於約10 mS/cm。
在一個特定實施例中，本發明提供一種降低包含A1PI之再懸浮血漿沈澱物中絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：在pH值為約5.0至約6.5及離子強度小於5.0 mS且結合絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原且使A1PI保持不可溶狀態之第一低pH值溶液條件下使包含不可溶狀態之A1PI之再懸浮血漿沈澱物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，分離懸浮液之可溶及不可溶部分，在pH值為約5.0至約6.5及離子強度大於5.0 mS且使實質部分之A1PI保持不可溶狀態之第二低pH值溶液條件下自SiO2 溶離絲胺酸及/或絲胺酸蛋白酶原，分離懸浮液之可溶及不可溶部分，及自不可溶部分萃取A1PI。在一實施例中，在沈澱反應之前或期間混合SiO2 且連同沈澱物一起回收。在一個特定實施例中，沈澱物為科恩部分IV-1沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為科恩部分IV-4沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為科恩部分V沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為奇石樂/尼赤曼沈澱物IV。在又一實施例中，沈澱物為奇石樂/尼赤曼沈澱物C。
2.　絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之結合及A1PI之萃取
在另一態樣中，本發明提供一種降低包含A1PI之再懸浮血漿沈澱物中絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原之量的方法。一般而言，沈澱物可為在混合血漿、較佳為人類血漿份化期間的任意沈澱物。在一實施例中，該方法包含在pH值低且結合絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原且使A1PI保持不可溶狀態之第一溶液條件下使包含不可溶狀態之A1PI之再懸浮血漿沈澱物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，使懸浮液之可溶及不可溶部分分離，在pH值高之第二溶液條件下自不可溶部分萃取A1PI，且使可溶部分與不可溶部分分離，其中在自不可溶部分萃取A1PI期間實質部分之絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原保留結合至SiO2 。在一實施例中，在沈澱反應之前或期間混合SiO2 且連同沈澱物一起回收。在一個特定實施例中，沈澱物為科恩部分IV-1沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為科恩部分IV-4沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為科恩部分V沈澱物。在另一實施例中，沈澱物為奇石樂/尼赤曼沈澱物IV。在又一實施例中，沈澱物為奇石樂/尼赤曼沈澱物C。
在上文所提供之方法之一實施例中，第一溶液條件包含pH值為4.0至7.0及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至7.0及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.0及離子強度小於約5.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約5.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為5.5±0.2及離子強度小於約5.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為6.0±0.2及離子強度小於約5.0 mS/cm。
在上文所提供之方法之另一實施例中，第一溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約2.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約1.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.0至6.5及離子強度小於約0.5 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約2.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約1.0 mS/c m。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為5.5至6.0及離子強度小於約0.5 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為5.5±0.2及離子強度小於約3.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為6.0±0.2及離子強度為小於約3.0 mS/cm。在其他實施例中，該第一低pH值溶液條件包含根據如表12 、表13 、表14 及表15 中所呈現的變化形式1222至3041中之任一變化形式的pH值及離子強度。
在上文所提供之方法之一實施例中，第二溶液條件包含pH值為7.0至10.0及離子強度小於約10.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至9.0及離子強度小於約10.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約10.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.5及離子強度小於約10.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約10.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為7.5±0.2及離子強度小於約10.0 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為8.0±0.2及離子強度小於約10.0 mS/cm。
在上文所提供之方法之另一實施例中，第二溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約9.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約8.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約7.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約6.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約5 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度小於約2 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.0至8.5及離子強度為2 mS/cm至10 mS/cm。
在上文所提供之方法之另一實施例中，第二溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約9.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約8.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約7.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約6.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約5 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約4.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約3.0 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.0及離子強度小於約2 mS/cm。在另一實施例中，溶液條件包含pH值為7.5至8.5及離子強度為2 mS/cm至10 mS/cm。在一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為7.5±0.2及離子強度為2 mS/cm至10 mS/cm。在另一個特定實施例中，溶液條件包含pH值為8.0±0.2及離子強度為2 mS/cm至10 mS/cm。
IV.　醫藥組合物
在一態樣中，本發明提供絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之源自血漿之蛋白質的組合物，其係根據任何本文所述之方法來製備。在某些實施例中，此等組合物將經調配用於醫藥投與(亦即為醫藥組合物)。一般而言，根據本文所提供之方法製備的源自血漿之血液蛋白質組合物之醯胺水解活性將降低且將提供與當前可獲得之現有源自血漿之生物製劑相比更佳之安全概況。在一個較佳實施例中，本文所提供之組合物之因子XI、因子XIa、因子XII及/或因子XIIa含量將降低。
在一實施例中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含以下步驟之方法來製備：(a)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(b)分離SiO2 與組合物以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一實施例中，組合物經調配用於醫藥投與。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內投與。在另一特定實施例中，組合物經調配用於肌肉內投與。在另一實施例中，組合物經調配用於皮下投與。在又一實施例中，組合物經調配用於眼內投與。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在某些實施例中，上述組合物藉由進一步包含以下步驟之方法來製備：執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化組合物，然後使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一目標蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
在一實施例中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含以下步驟之方法來製備：(a)藉由在源自混合血漿之起始物質中部分沈澱析出蛋白質而形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一實施例中，使用醇實現部分沈澱。在一實施例中，組合物經調配用於醫藥投與。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內投與。在另一特定實施例中，組合物經調配用於肌肉內投與。在另一實施例中，組合物經調配用於皮下投與。在又一實施例中，組合物經調配用於眼內投與。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在一實施例中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含以下步驟之方法來製備：(a)藉由超濾及/或透濾源自混合血漿之起始物質而形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一實施例中，使用醇實現部分沈澱。在一實施例中，組合物經調配用於醫藥投與。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內投與。在另一特定實施例中，組合物經調配用於肌肉內投與。在另一實施例中，組合物經調配用於皮下投與。在又一實施例中，組合物經調配用於眼內投與。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在一實施例中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含以下步驟之方法來製備：(a)藉由使源自混合血漿之起始物質與層析樹脂接觸而形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在一實施例中，使用醇實現部分沈澱。在一實施例中，組合物經調配用於醫藥投與。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內投與。在另一特定實施例中，組合物經調配用於肌肉內投與。在另一實施例中，組合物經調配用於皮下投與。在又一實施例中，組合物經調配用於眼內投與。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在某些實施例中，上述組合物藉由進一步包含以下步驟之方法來製備：執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化組合物，然後使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。在某些實施例中，第一目標蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
在一實施例中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含以下步驟之方法來製備：(a)執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；及(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。在一實施例中，組合物經調配用於醫藥投與。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內投與。在另一特定實施例中，組合物經調配用於肌肉內投與。在另一實施例中，組合物經調配用於皮下投與。在又一實施例中，組合物經調配用於眼內投與。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在某些實施例中，上述組合物藉由進一步包含以下步驟之方法來製備：在使組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸之後，執行目標蛋白質濃化步驟。在某些實施例中，目標蛋白質濃化步驟係選自蛋白質沈澱步驟(例如醇份化步驟)、超濾/透濾步驟及層析步驟。
在一實施例中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含以下步驟之方法來製備：(a)執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使第一第一濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(c)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(d)執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表1中所見之變化形式1至變化形式100中之任一變化形式。在一實施例中，組合物經調配用於醫藥投與。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內投與。在另一特定實施例中，組合物經調配用於肌肉內投與。在另一實施例中，組合物經調配用於皮下投與。在又一實施例中，組合物經調配用於眼內投與。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在一態樣中，本發明提供一種絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之源自血漿之蛋白質組合物，其係用於治療與血液蛋白質缺乏或功能障礙相關之病狀。在某些實施例中，源自血漿之蛋白質係選自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在一實施例中，本發明提供一種源自血漿之蛋白質組合物，其係藉由包含以下步驟之方法來製備：(a)執行第一目標蛋白質濃化步驟以形成第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)執行第二目標蛋白質濃化步驟以形成第二濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物；(c)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下使第二濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸；(d)使SiO2 與組合物分離以移除結合之絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原；及(e)執行第三目標蛋白質濃化步驟以形成第三濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物。在某些實施例中，第一及第二濃化步驟之組合係選自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10或表11中所見之變化形式101至變化形式1100中之任一變化形式。在一實施例中，組合物經調配用於醫藥投與。在一個特定實施例中，組合物經調配用於靜脈內投與。在另一特定實施例中，組合物經調配用於肌肉內投與。在另一實施例中，組合物經調配用於皮下投與。在又一實施例中，組合物經調配用於眼內投與。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在上述組合物之某些實施例中，層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合源自血漿之目標蛋白質之條件下使源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及(ii)自層析樹脂溶離源自血漿之目標蛋白質。在一個特定實施例中，在子步驟(i)中雜質不結合至層析樹脂。在另一特定實施例中，在子步驟(i)中雜質結合至層析樹脂，但在子步驟(ii)中不會自層析樹脂溶離。
在上述組合物之其他某些實施例中，層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合至少一種雜質之條件下使第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及(ii)使樹脂與源自血漿之蛋白質組合物分離，其中在子步驟(i)中源自血漿之目標蛋白質不結合至層析樹脂。
在本文提供之組合物之某些實施例中，特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少10%。在另一實施例中，特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少25%。在另一實施例中，特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少50%。在另一實施例中，特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少75%。在另一實施例中，特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少90%。在其他實施例中，特定絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量減少至少5%或至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之降低係指在個別SiO2 處理步驟內所達成之降低。在另一實施例中，絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之降低係指與除SiO2 處理步驟外以類似方式製備之組合物相比之最終組合物中污染物之含量。
在一實施例中，本文所提供之醫藥組合物藉由調配使用本文所提供之方法分離之源自血漿之蛋白質組合物來製備。一般而言，調配之組合物將經歷至少一個、較佳至少兩個、最佳至少三個病毒滅活或移除步驟。本文提供之方法可利用之病毒滅活或移除步驟之非限制性實例包括溶劑清潔劑處理(Horowitz等人，Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5增刊3):S21-S28及Kreil等人，Transfusion 2003(43):1023-1028，兩文獻皆明確地以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)、奈米過濾(Hamamoto等人，Vox Sang 1989(56)230-236及Yuasa等人，J Gen Virol. 1991(72(第8部分)):2021-2024，兩文獻皆明確地以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的)及高溫下之低pH值培育(Kempf等人，Transfusion 1991(31)423-427及Louie等人，Biologicals 1994(22):13-19)。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在一實施例中，本文所提供之醫藥組合物將包含適用於靜脈內、皮下、肌肉內及/或眼內投與之一或多種緩衝劑或pH穩定劑。適用於調配本文所提供之源自血漿之蛋白質組合物之緩衝劑之非限制性實例包括甘胺酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、麩胺酸鹽、酒石酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、組胺酸或其他胺基酸、葡糖酸鹽、蘋果酸鹽、丁二酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、碳酸鹽或調節至適當pH值之其任何組合。一般而言，緩衝劑足以使調配物中之適合pH值保持較長時間。在一個較佳實施例中，緩衝劑為甘胺酸。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物可視情況進一步包含調整組合物容積滲透濃度之藥劑。容積滲透濃度劑之非限制性實例包括甘露糖醇、山梨糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、果糖(levulose/fructose)、乳糖、聚乙二醇、磷酸鹽、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、葡萄醣庚酸鈉(calcium gluconoglucoheptonate)、二甲碸及其類似物。
本文提供之調配物通常將具有可與生理容積滲透濃度相比之容積滲透濃度，為約285至295 mOsmol/kg(Lacy等人，Drug Information Handbook-Lexi-Comp 1999:1254)。在某些實施例中，調配物之容積滲透濃度為約200 mOsmol/kg至約350 mOsmol/kg、較佳為約240 mOsmol/kg至約300 mOsmol/kg。在特定實施例中，調配物之容積滲透濃度為約200 mOsmol/kg或210 mOsmol/kg、220 mOsmol/kg、230 mOsmol/kg、240 mOsmol/kg、245 mOsmol/kg、250 mOsmol/kg、255 mOsmol/kg、260 mOsmol/kg、265 mOsmol/kg、270 mOsmol/kg、275 mOsmol/kg、280 mOsmol/kg、285 mOsmol/kg、290 mOsmol/kg、295 mOsmol/kg、300 mOsmol/kg、310 mOsmol/kg、320 mOsmol/kg、330 mOsmol/kg、340 mOsmol/kg、340 mOsmol/kg或350 mOsmol/kg。
本文提供之源自血漿之調配物一般以液體形式穩定較長時間。在某些實施例中，調配物在室溫下穩定至少約3個月，或在室溫下至少約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月。調配物在冷藏條件(通常為約2℃至約8℃)下一般亦將穩定6個月或至少約18個月，或在冷藏條件下至少約21、24、27、30、33、36、39、42或45個月。
V.　治療方法
在一態樣中，本發明提供藉由投與治療有效劑量的根據本文所提供之方法製備的絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之源自血漿的蛋白質組合物來治療有需要之個體的與血液蛋白質缺乏或功能障礙相關之疾病或病症之方法。在某些實施例中，組合物包含選自以下之源自血漿之蛋白質：免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
在一態樣中，本發明提供絲胺酸蛋白酶及/或絲胺酸蛋白酶原含量降低之源自血漿之蛋白質組合物的用途，其係用於製造用以治療與血液蛋白質缺乏或功能障礙相關之病狀的藥劑。在某些實施例中，源自血漿之蛋白質係選自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。
A.　免疫球蛋白
如現代醫學中通常所實踐，將濃縮免疫球蛋白(尤其IgG)之滅菌製劑用於治療屬於此等三個主要種類之醫學病狀：免疫缺乏症、發炎性及自體免疫疾病及急性感染。此等IgG製劑亦可能適用於治療多發性硬化症(尤其復發緩解型多發性硬化症或RRMS)、阿茲海默氏病及帕金森氏病(Parkinson's disease)。本發明之純化IgG製劑適合於此等目的，以及IgG製劑之其他臨床上認可之用途。
FDA已批准使用IVIG來治療各種適應症，包括同種異體骨髓移植、慢性淋巴球性白血病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、小兒HIV、原發性免疫缺乏症、川崎氏病(Kawasaki disease)、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病(CIDP)及高抗體接受者或ABO不相容供體之腎臟移植。在某些實施例中，本文提供之IVIG組合物適用於治療或處理此等疾病及病狀。
此外，患者通常標示外使用IVIG以治療或處理各種適應症，例如慢性疲勞症候群、艱難梭菌結腸炎、皮膚肌炎及多發性肌炎、格雷氏眼病(Graves' ophthalmopathy)、格林-巴厘症候群(Guillain-Barrsyndrome)、肌肉萎縮症、包涵體肌炎、蘭伯特-伊頓症候群(Lambert-Eaton syndrome)、紅斑性狼瘡、多灶性運動神經病、多發性硬化症(MS)、重症肌無力、新生兒同種免疫性血小板減少症、細小病毒B19感染、天疱瘡、輸血後紫癜、腎臟移植排斥反應、自發性流產(spontaneous Abortion/Miscarriage)、僵硬人症候群、眼肌陣攣肌陣攣(opsoclonus Myoclonus)、垂危成年人中之嚴重敗血症及敗血性休克、中毒性表皮壞死溶解、慢性淋巴球性白血病、多發性骨髓瘤、X連鎖無γ球蛋白血症及低γ球蛋白血症。在某些實施例中，本文提供之IVIG組合物適用於治療或處理此等疾病及病狀。
最終，已提出IVIG用於治療或處理包括原發性免疫缺乏症、RRMS、阿茲海默氏病及帕金森氏病之疾病的實驗性用途(美國專利申請公開案第U.S. 2009/0148463號，其係為所有用途以全文引用的方式併入本文中)。在某些實施例中，本文提供之IVIG組合物適用於治療或處理原發性免疫缺乏症、RRMS、阿茲海默氏病或帕金森氏病。在包含每天投與之某些實施例中，投與個體之有效量可由醫師考慮年齡、重量、疾病嚴重程度、投藥途徑(例如靜脈內投藥對皮下投藥)及對治療之反應的個體差異來判定。在某些實施例中，每天可將約5 mg/kg至約2000 mg/kg之本發明之免疫球蛋白製劑投與個體。在其他實施例中，可投與總計至少約10 mg/kg、至少15 mg/kg、至少20 mg/kg、至少25 mg/kg、至少30 mg/kg或至少50 mg/kg之免疫球蛋白製劑。在其他實施例中，每天可向個體投與劑量高達約100 mg/kg、約150 mg/kg、約200 mg/kg、約250 mg/kg、約300 mg/kg、約400 mg/kg之免疫球蛋白製劑。在其他實施例中，免疫球蛋白製劑之劑量可更大或更小。此外，每天可投與一或多種劑量之免疫球蛋白製劑。熟悉IgG製劑所治療之疾病的臨床醫師可根據此項技術中已知之準則判定適用於患者之劑量。
根據本發明，完成療程所需之時間可由醫師確定且可在短至一天至一個月以上之範圍內。在某些實施例中，療程可為1至6個月。
藉由靜脈內方法向個體投與有效量之IVIG製劑。術語「有效量」係指使個體疾病或病狀改良或矯正之IVIG製劑的量。投與個體之有效量可由醫師考慮年齡、重量、所治療之疾病或病狀、疾病嚴重程度及對治療之反應的個體差異來判定。在某些實施例中，每次投藥可將劑量為約5 mg/kg至約2000 mg/kg之本發明IVIG製劑投與個體。在某些實施例中，劑量可為至少約5 mg/kg、或至少約10 mg/kg、或至少約20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg、70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg、100 mg/kg、125 mg/kg、150 mg/kg、175 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg、350 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、550 mg/kg、600 mg/kg、650 mg/kg、700 mg/kg、750 mg/kg、800 mg/kg、850 mg/kg、900 mg/kg、950 mg/kg、1000 mg/kg、1100 mg/kg、1200 mg/kg、1300 mg/kg、1400 mg/kg、1500 mg/kg、1600 mg/kg、1700 mg/kg、1800 mg/kg、1900 mg/kg或至少約2000 mg/kg。
IVIG治療之劑量及頻率將視其他因素，即所治療之疾病或病狀及患者中疾病或病狀之嚴重程度而定。一般而言，對於原發性免疫功能障礙，約每3至4週施與每公斤體重約100毫克至約400毫克之劑量。對於神經學及自體免疫疾病，1個月1次經5天過程實施每公斤體重高達2公克，歷時3至6個月。此舉一般補充有維持治療，該維持治療包含約每3至4週一次施與每公斤體重約100毫克至約400毫克。一般而言，患者約每14至35天或約每21至28天接受劑量或治療一次。治療頻率將視其他因素，即所治療之疾病或病狀及患者中疾病或病狀之嚴重程度而定。
在一個較佳實施例中，提供一種治療有需要人類之免疫缺乏症、自身免疫病或急性感染之方法，該方法包含投與本發明之醫藥IVIG組合物。在相關實施例中，本發明提供根據本文所提供之方法製造之IVIG組合物，其係用於治療有需要人類之免疫缺乏症、自身免疫病或急性感染。
在某些實施例中，免疫缺乏症，自身免疫病或急性感染係選自同種異體骨髓移植、慢性淋巴球性白血病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、小兒HIV、原發性免疫缺乏症、川崎氏病、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病(CIDP)、高抗體接受者或ABO不相容供體之腎臟移植、慢性疲勞症候群、艱難梭菌結腸炎、皮膚肌炎及多發性肌炎、格雷氏眼病、格林-巴厘症候群、肌肉萎縮症、包涵體肌炎、蘭伯特-伊頓症候群、紅斑性狼瘡、多灶性運動神經病、多發性硬化症(MS)、重症肌無力、新生兒同種免疫性血小板減少症、細小病毒B19感染、天疱瘡、輸血後紫癜、腎臟移植排斥反應、自發性流產、僵硬人症候群、眼肌陣攣肌陣攣、垂危成年人中之嚴重敗血症及敗血性休克、中毒性表皮壞死溶解、慢性淋巴球性白血病、多發性骨髓瘤、X連鎖無γ球蛋白血症、低γ球蛋白血、原發性免疫缺乏症，RRMS、阿茲海默氏病及帕金森氏病症。
B.　因子H
在一態樣中，本發明提供藉由投與治療有效劑量的根據本文所提供之方法製備的因子H組合物治療有需要之個體的與因子H功能障礙或異常替代途徑補體活性相關之疾病或病症之方法。在一實施例中，因子H組合物藉由自部分I沈澱物萃取因子H來製備。在另一實施例中，因子H組合物藉由自部分II+III濾餅萃取因子H來製備。
在某些實施例中，與因子H功能障礙相關之疾病或病症係選自非典型溶血性尿毒癥症候群(aHUS)、年齡相關之黃斑部變性(AMD)、II型膜增生性絲球體腎炎(MPGNII)、心肌梗塞、冠狀動脈性心臟病/冠狀動脈病(CAD/CHD)及阿茲海默氏病。在一個特定實施例中，疾病為非典型溶血性尿毒癥症候群(aHUS)。在另一特定實施例中，疾病為年齡相關之黃斑部變性(AMD)。在另一特定實施例中，疾病為II型膜增生性絲球體腎炎(MPGNII)。
在某些實施例中，提供一種藉由向個體投與治療有效劑量之本文提供之因子H組合物治療有需要之個體的與異常替代途徑補體活性相關之疾病或病症之方法。在一實施例中，因子H組合物藉由自部分I沈澱物萃取因子H來製備。在另一實施例中，因子H組合物藉由自部分II+III濾餅萃取因子H來製備。
在某些實施例中，與異常替代途徑補體活性相關之疾病或病症係選自自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎、IgA腎病、哮喘、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化症、抗磷脂症候群、ANCA相關血管炎、天疱瘡、葡萄膜炎、重症肌無力、橋本氏甲狀腺炎)、腎臟疾病(諸如IgA腎病、溶血性尿毒癥候群、膜增生性絲球體腎炎)哮喘、阿茲海默氏病、成年黃斑部變性、陣發性夜間血紅素尿、腹主動脈瘤、缺血性再灌注損傷及敗血症。
本發明所提供之醫藥組合物可單獨或聯合其他治療劑投與。可併入此等藥劑作為同一藥物之一部分。
1.　投藥
根據本發明，完成療程所需之時間可由醫師確定且可在短至一天至一個月以上之範圍內。在某些實施例中，療程可為1至6個月。
藉由任何合適方法向個體投與有效量之因子H製劑以治療疾病或病症。舉例而言，在某些實施例中，可藉由靜脈內、眼內、皮下及/或肌肉內方法投與因子H。在一個較佳實施例中，提供治療有需要之個體的年齡相關之黃斑部變性之方法，其包含向患者眼內投與因子H組合物。
在某些實施例中，本文提供之因子H組合物可全身或局部投與。全身性投藥包括：口服、經皮、皮下(subdermal)、腹膜內、皮下(subcutaneous)、經鼻、舌下或直腸投藥。最佳全身性投藥途徑為口服。用於眼部投藥之局部投藥包括：表面、玻璃體內、眼周、經鞏膜、眼球後、近強膜、結膜下或經由眼內裝置投藥。較佳局部傳遞方法包括藉由後近強膜投藥經鞏膜傳遞至黃斑；經由玻璃體內注射；或經由套管，諸如美國專利第6,413,245號中所述之方法，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的。或者，抑制劑可經由玻璃體內或經鞏膜植入之持續傳遞裝置，或藉由其他已知局部眼部傳遞方法傳遞。
在某些實施例中，術語「有效量」係指使個體之疾病或病狀改良或矯正之因子H製劑的量。投與個體之有效量可由醫師考慮年齡、重量、所治療之疾病或病狀、疾病嚴重程度及對治療之反應的個體差異來判定。在某些實施例中，每次投藥可將劑量為約5 mg/kg及2000 mg/kg之因子H製劑投與個體。在某些實施例中，劑量可為至少或約5 mg/kg、或至少或約10 mg/kg、或至少或約20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg、70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg、100 mg/kg、125 mg/kg、150 mg/kg、175 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg、350 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、550 mg/kg、600 mg/kg、650 mg/kg、700 mg/kg、750 mg/kg、800 mg/kg、850 mg/kg、900 mg/kg、950 mg/kg、1000 mg/kg、1100 mg/kg、1200 mg/kg、1300 mg/kg、1400 mg/kg、1500 mg/kg、1600 mg/kg、1700 mg/kg、1800 mg/kg,、1900 mg/kg或2000 mg/kg。因子H治療之劑量及頻率將視其他因素，即所治療之疾病或病狀及患者中疾病或病狀之嚴重程度而定。
2.　年齡相關之黃斑部變性(AMD)
在一個較佳實施例中，本發明提供一種藉由向個體投與治療有效劑量之本文提供之因子H組合物治療有需要之個體的年齡相關之黃斑部變性的方法。
年齡相關之黃斑部變性(AMD)為使60歲以上之老年人群失明之首要原因。現今，據估計35至40%75歲以上之人患有一定程度之AMD。估計全世界約5千萬人受影響，僅美國就有1千萬。目前，每年新確診AMD約155,000例。隨全世界群體連續老齡化，2020年年確診數目預期為三倍。該疾病為一種破壞性疾病，其破壞受影響個體之中央視覺，剝奪其執行日常生活所需之行動(諸如閱讀及駕駛)的能力。
AMD為緩慢進行性疾病，其與外層視網膜之細胞(包括感光器及支撐感光器之視網膜色素上皮(RPE)細胞)以及稱為脈絡膜之鄰近眼睛血管層之細胞相關。黃斑部變性之特徵為破環黃斑，即產生高銳度視力之主要原因的中樞視網膜之一小部分(直徑為約2 mm)。一般將遲發性黃斑部變性(亦即AMD)定義為「乾性」或「濕性」遲發性黃斑部變性。AMD之濕性(「滲出性」)新生血管形成影響約10%患有該疾病之患者，且其特徵為經由RPE由脈絡膜毛細血管層生長之異常血管，通常會引起出血、滲出、結疤及/或血清視網膜脫離。約90%患有AMD之患者具有非新生血管性，或為乾式該疾病，其特徵為RPE萎縮及黃斑部感光器損失。
AMD之特徵為存在稱為「脈絡膜小疣」之碎片樣物質之沈積物，其會積聚於布魯赫膜(Bruch's membrane)上，該布魯赫膜為一種使RPE(視網膜之最外層)與底層脈絡膜分離之細胞外基質組分之多層複合物。脈絡膜小疣可藉由散瞳眼睛檢查觀測到。在患有AMD之患者的供體眼睛之顯微鏡研究中已廣泛表徵此等沈積物。根據包括沈積物之相對大小、豐度及形狀之若干準則，將臨床檢查時在活眼睛中觀測到之沈積物分類為軟脈絡膜小疣或硬脈絡膜小疣。組織化學及免疫細胞化學研究顯示脈絡膜小疣含有多種脂質、多醣、葡糖胺聚糖及蛋白質。
目前，尚無法治癒AMD，但已證明若干類型之治療對處理該疾病有效。濕式疾病中異常血管之雷射光凝固(Laser photocoagulation)為標準治療。此治療之受限之處為僅已充分界定之新生血管性病變可以此方式治療且50%之患者將經歷血管滲漏之復發情況(Fine等人，2000)。由於此治療需要雷射能量，故治療區域中之感光器亦將死亡且患者通常亦將在治療之後即刻經歷中樞失明。最終將顯現新的新生血管性病變，從而需要重複治療。其他干預包括藉由戒菸來改變生活方式及開始用抗氧化劑治療。亦已展示使用VEGF抑制劑來進行抗血管生成治療，例如玻璃體內注射蘭尼單抗(ranibizumab)或貝伐單抗(bevacizumab)。
近來已發現，約35%之個體在其因子H基因之一或兩個複本中有單核苷酸多形現象(SNP)風險。同種接合個體顯現年齡相關之黃斑部變性之可能性增加約七倍，而異種接合者顯現該疾病之可能性增加兩至三倍。位於因子H之CCP模組7中之此SNP已顯示會影響因子H與C反應蛋白及肝素之間的相互作用，從而指示SNP與疾病之間的因果關係。該多形現象為Y420H多形現象。
在限制補體活化從而使個體中顯現年齡相關黃斑部變性(AMD)之進展或發作延遲之方法的一個實施例中，個體不具有任何AMD症狀。
在限制補體活化從而使個體中顯現年齡相關黃斑部變性(AMD)之進展或發作延遲之方法的另一實施例中，個體具有脈絡膜小疣。
在限制補體活化從而使個體中顯現年齡相關黃斑部變性(AMD)之進展或發作延遲之方法的另一實施例中，個體顯現AMD之風險增加。
在限制補體活化從而使個體中顯現年齡相關黃斑部變性(AMD)之進展或發作延遲之方法的另一實施例中，投與為靜脈內投與。
在限制補體活化從而使個體中顯現年齡相關黃斑部變性(AMD)之進展或發作延遲之方法的另一實施例中，該方法進一步包含治療有AMD之病徵及/或症狀之個體。
在限制補體活化從而使個體中顯現年齡相關黃斑部變性(AMD)之進展或發作延遲之方法的另一實施例中，個體已經診斷患有AMD。
在另一態樣中，本發明提供一種治療斷定有顯現年齡相關之黃斑部變性風險之人類個體的方法，該方法包含以下步驟：向個體投與預防或治療有效量之本文提供之因子H製劑且週期性地重複該投藥。
在治療斷定有顯現年齡相關之黃斑部變性風險之人類個體之方法的一實施例中，重複該投藥一段時間以有效延遲該等個體中顯現黃斑部變性之進展或發作。
在治療斷定有顯現年齡相關之黃斑部變性風險之人類個體之方法的另一實施例中，如基於存在一或多種與顯現年齡相關之黃斑部變性相關之遺傳標記物所鑑別，斷定人類個體有顯現年齡相關之黃斑部變性之風險。
在治療斷定有顯現年齡相關之黃斑部變性風險之人類個體之方法的另一實施例中，遺傳標記物為多形現象。
在限制補體活化從而使個體中顯現年齡相關黃斑部變性(AMD)之進展或發作延遲之方法的另一實施例中，個體未經診斷患有AMD。
C.　間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)
在其他態樣中，本發明之一目標為提供藉由投與治療有效量之本文提供之IαIp組合物來治療與IαIp功能降低或IαIp功能障礙相關之病症及疾病的方法。在一實施例中，與IαIp功能降低或IαIp功能障礙相關之疾病或病症為敗血症。
在一實施例中，本發明提供一種治療有效劑量的藉由本文所示之方法製備之IαIp組合物，其係用於治療有需要之個體的與IαIp功能降低或IαIp功能障礙相關之疾病或病症的方法中。在一實施例中，與IαIp功能降低或IαIp功能障礙相關之疾病或病症為敗血症。
在另一態樣中，本發明之一目標為提供藉由投與治療有效量之本文提供之IaIp組合物來治療與血漿絲胺酸蛋白酶活性增加相關之疾病及病症的方法。在一實施例中，與血漿絲胺酸蛋白酶活性增加相關之疾病或病症係選自敗血症、敗血性休克、內毒素性休克、散播性血管內凝血、纖維增生症、炭疽中毒、癌轉移、手術期間之組織損傷、腎病、血管病、凝血、糖尿病及全身性炎症。
在一實施例中，本發明提供一種治療有效劑量的藉由本文所示之方法製備之IαIp組合物，其係用於治療有需要之個體的與血漿絲胺酸蛋白酶活性增加相關之疾病或病症的方法中。在一實施例中，與血漿絲胺酸蛋白酶活性增加相關之疾病或病症係選自敗血症、敗血性休克、內毒素性休克、散播性血管內凝血、纖維增生症、炭疽中毒、癌轉移、手術期間之組織損傷、腎病、血管病、凝血、糖尿病及全身性炎症。
A.　投藥
根據本發明，完成療程所需之時間可由醫師確定且可在短至一天至一個月以上之範圍內。在某些實施例中，療程可為1至6個月。
藉由任何合適方法向個體投與有效量之IαIp製劑以治療疾病或病症。舉例而言，在某些實施例中，可藉由靜脈內、皮下及/或肌肉內方法投與IαIp。在一個較佳實施例中，提供治療有需要之個體之敗血症的方法，其包含向患者靜脈內(IV)投與IαIp組合物。
在某些實施例中，本文提供之IαIp組合物可全身或局部投與。全身性投藥包括：口服、皮下(subdermal)、腹膜內、皮下(subcutaneous)、經鼻、舌下或直腸投藥途徑。局部投藥包括：表面、皮下、肌肉內及腹膜內投藥途徑。
在某些實施例中，術語「有效量」係指使個體之疾病或病狀改良或矯正之IαIp製劑的量。投與個體之有效量可由醫師考慮年齡、重量、所治療之疾病或病狀、疾病嚴重程度及對治療之反應的個體差異來判定。在某些實施例中，每次投藥可將劑量為約5 mg/kg至約2000 mg/kg之IαIp製劑投與個體。在某些實施例中，劑量可為至少約5 mg/kg、或至少約10 mg/kg、或至少約20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg、70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg、100 mg/kg、125 mg/kg、150 mg/kg、175 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg、350 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、550 mg/kg、600 mg/kg、650 mg/kg、700 mg/kg、750 mg/kg、800 mg/kg、850 mg/kg、900 mg/kg、950 mg/kg、1000 mg/kg、1100 mg/kg、1200 mg/kg、1300 mg/kg、1400 mg/kg、1500 mg/kg、1600 mg/kg、1700 mg/kg、1800 mg/kg、1900 mg/kg或至少約2000 mg/kg。IαIp治療之劑量及頻率將視其他因素，即所治療之疾病或病狀及患者中疾病或病狀之嚴重程度而定。
VI.　實例
實例1
為測定源自血漿之蛋白質組合物中存在之殘餘絲胺酸蛋白酶含量及活性，測定以下之醯胺水解活性概況：兩種在不使用SiO2 處理下製造之市售IgG製劑：OCTAGAM(5%靜脈內免疫球蛋白；Octapharma)及Subcuvia(16%皮下免疫球蛋白；Baxter)；兩批在使用SiO2 處理下製造之市售IgG製劑：Gammagard液體(10%靜脈內免疫球蛋白；Baxter)及目前處於開發階段之因子H純化方法。值得注意的是，如上所述藉由結合及隨後自微細分之SiO2 溶離因子H來純化因子H組合物。
簡言之，源自血漿之蛋白質組合物各自之醯胺水解活性概況藉由用具有不同酶特異性之以下發色基質進行檢定來測定：PL-1(廣譜)、S-2288(廣譜)、S-2266(FXIa、腺激肽釋放酶)、S-2222(FXa、胰蛋白酶)、S-2251(纖維蛋白溶酶)及S-2302(激肽釋放酶、FXIa及FXIIa)。亦測定前激肽釋放酶活化劑活性(PKKA)及因子XIa單元之量。如表17中所示，在不使用SiO2 吸附步驟下製造之源自血漿之IgG組合物含有顯著水準之醯胺水解活性及FXIa含量。相反，兩批所測試之Gammagard液體含有最小之醯胺水解活性及FXIa含量。與此等結果一致，藉由結合及自微細分之SiO2 溶離製備之因子H組合物含有極高水準之醯胺水解活性及FXIa含量。
實例2
為確定經濟上有益的用於自血漿樣品製造因子H且允許自同一血漿樣品回收其他血液因子之流程，根據圖1所示流程圖中所概示的流程使一批混合人類血漿經受份化。如圖2中所示，人類血漿貧冷凍物料恩池中存在之大部分因子H(約90%)可見於部分II+III沈澱物中。較小但仍顯著之量的因子H(約10%)亦可見於部分I沈澱物中。此結果與PCT公開案第WO 2011/011753號中所示之結果一致，該文獻的內容據此以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的。
藉由經由壓濾器再循環因子H萃取緩衝液自由於過濾直接位於組合物6上游之「Aerosil處理」組合物(「部分II+III濾液」)所形成的微細分之SiO2 濾餅副產物萃取因子H。接著藉由在pH值8.0下經由添加乙醇至最終濃度為15%且在-6℃下至少培育4小時所執行之第一沈澱步驟自濾餅萃取物移除鹽及各種雜質。在培育1小時之後將沈澱反應之pH值再調整至8.0。接著藉由離心自上清液移除沈澱物。藉由在pH值6.0下經由添加乙醇至最終濃度為25%且在-10℃下培育至少8小時所執行之第二沈澱步驟來進一步濃化因子H。接著藉由離心回收含有因子H之沈澱物。
將由第二沈澱步驟形成之沈澱物以1:9之比率溶解於低離子強度的溶解緩衝液中且作S/D處理以使脂質包膜病毒滅活。隨後藉由陰離子交換層析使用DEAE-瓊脂糖FF樹脂來濃化因子H。簡言之，在低離子強度條件下使因子H結合至DEAE-瓊脂糖樹脂且藉由增加溶液之離子強度來溶離。接著降低DEAE-瓊脂糖溶離液之電導率且藉由肝素親和層析進一步濃化因子H。簡言之，在低離子強度條件下使因子H結合至肝素-瓊脂糖FF樹脂且藉由增加溶液之離子強度來溶離。如表18中所示，大部分因子H結合至DEAE及肝素樹脂。
接著根據標準程序使自肝素樹脂溶離之因子H經受超濾/透濾，繼之以在Superdex 200管柱上進行尺寸排阻層析。接著藉由超濾作用濃縮自尺寸排阻層析回收之因子H，無菌過濾且用PBS緩衝液調配為最終蛋白質濃度為50 mg/mL。
接著表徵最終因子H組合物(FH012)之均質性、雜質及醯胺水解活性。因子H組合物之單分散性藉由尺寸排阻層析法表徵。如表19中所示，當裝載於HP-SEC管柱上時，估計大小為400 kDa之因子H最終組合物中存在之大部分蛋白質遷移。
接著測定最終因子H組合物之內毒素含量、pH值、外觀及最終蛋白質濃度。如表20中所示，如藉由鱟變形細胞溶菌液(LAL)檢定所測定，組合物之內毒素含量低(<0.5 EU/mL)。
接著測定最終因子H組合物中各種蛋白質雜質之含量。如表21中所示，補體蛋白質及IgG免疫球蛋白佔因子H組合物中最終蛋白質濃度之不及1%。
最終，如實例1中所報導測定醯胺水解活性及蛋白酶含量水準。如表17中所示，根據此實例中所述流程純化之源自血漿之因子H含有高水準之醯胺水解活性及FXIa含量。
實例3
為顯示自源自血漿之蛋白質組合物移除醯胺水解活性的能力，用微細分之二氧化矽(SiO2 )處理再懸浮科恩部分II+III沈澱物。簡言之，根據本文所述之IgG純化流程份化混合貧冷凍物人類血漿以得到部分II+III沈澱物。在保持於0℃至8℃之溫度下使部分II+III沈澱物再懸浮於低電導率萃取緩衝液(pH值5.1±0.2；約0.8 mS/cm)中。添加380(Evonik Industries AG)至最終濃度為每公斤II+III沈澱物40公克及60公克。在添加CELPUREC300助濾劑(Advanced Minerals Corporation)至最終濃度為每公斤II+III沈澱物0.5公斤之後，使用深度過濾器過濾懸浮液。接著測試濾液中之免疫球蛋白組合物之FXI酶原含量。如表22中所示，用微細分之SiO2 處理部分II+III懸浮液使組合物之因子XI酶原含量幾乎降低90%。
實例4
為評估絲胺酸蛋白酶自如實例3中所製備之微細分之SiO2 濾餅發生之溶離，在兩種不同pH值(6.0、7.5)下使用含有不同濃度之磷酸鹽緩衝液(100、50、25及5 mM)之溶離緩衝液自SiO2 溶離蛋白質。簡言之，用適當的緩衝系統以1:5之比率溶解濾餅且經由深度過濾器(Cuno 50 SA)過濾。接著測定各溶離液之醯胺水解活性及因子H組合物(表23及表24)。如表23中所示，在較低電導率及pH值(亦即6.0)下，用基質CS2166(FXIa、活化蛋白質C)量測之醯胺水解活性之溶離減少。
在pH值7.5溶離條件(表24)下，因子H溶離隨電導率增加而減少，而絲胺酸蛋白酶溶離隨電導率增加而增加。令人驚奇地，在極低電導率(5 mM磷酸鹽；0.882 mS/cm)下，絲胺酸蛋白酶溶離實質上增加，而因子H溶離減少。在pH值7.5下溶離所獲得之資料圖示於圖3中。
實例5
為了證明有差別地溶離共同結合至SiO2 之絲胺酸蛋白酶及因子H的能力，開發一種兩步溶離程序。簡言之，如前所述製備在SiO2 處理之後所形成之部分II+III濾餅。接著在離子強度為0.882 mS/cm至11.88 mS/cm且pH值為6.0之溶液條件下使濾餅經受第一溶離。如實例4中所表明，在低pH值(pH 6.0)及低離子強度(小於6.5 mS/cm)下處理結合之SiO2 會引起絲胺酸蛋白酶(例如FXIa)溶離，同時實質部分之因子H保留結合。在高pH值(pH 7.5)及高離子強度下的後續處理會引起因子H自SiO2 溶離(表25 )。此外，與實例4中所提供之結果一致，在高pH值(7.5)下用SiO2 初步處理會引起因子H溶離(表26 )。正如所示，在較低電導率及pH 6.0下初步溶離可用以部分降低濾餅之醯胺水解活性，且接著可在100 mM磷酸鹽濃度、150 mM NaCl、pH 7.6下溶離因子H。此程序產生因子H產率為每公升血漿0.31公克及醯胺水解活性降低(CS2166)之濾液以進行進一步加工。
實例6
為測定自源自血漿之蛋白質組合物有效移除絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶原所需的微細分之SiO2 的量，將部分II+III沈澱物(亦即II+III濾餅)溶解，過濾，用SiO2 處理，混合助濾劑且進行第二次過濾。簡言之，首先將部分II+III濾餅溶解於含有150 mM氯化鈉之0.1 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.5；30 mS/cm)中。接著經由Cuno 50 SA過濾器過濾此懸浮液且收集濾液。使Aerosil 380與濾液混合，最終濃度為每公克蛋白質1.0公克或2.5公克，且接著培育至少50分鐘。添加CELPURE助濾劑且使用Cuno 50 SA過濾器執行過濾。接著如表27中所報導表徵所得濾液之醯胺水解活性。結果明顯顯示與用最終濃度為每公克蛋白質1.0公克之Aerosil處理之樣品相比，添加最終濃度為每公克蛋白質2.5公克之Aerosil會降低組合物中激肽釋放酶、FXIa及FXIIa之醯胺水解活性90%以上。
實例7
為評估在源自血漿之蛋白質組合物之工業規模製造期間SiO2 處理移除因子XI酶原之效率，表徵6個工業規模製造批次之FXI酶原含量。表28及表29 顯示在相同製造位置所執行之三個純化之各上游製程步驟的平均FXI酶原含量。表28及表29中之資料表明製造規模之純化的SiO2 處理可降低組合物之FXI酶原含量至少90%。值得注意的是，製造位置1混合最終濃度為每公斤II+III沈澱物50公克之Aerosil，而位置2使用最終濃度為每公斤II+III沈澱物40公克之Aerosil。令人驚奇地，在Aerosil處理之後，所用之Aerosil量之此小差異引起濾液之因子XI酶原含量之顯著差異(位置2之8.1%科恩起始池對位置1之2.8%科恩起始池)。
應瞭解，本文所述之實例及實施例僅用於說明性目的，且熟習此項技術者可想到對其作出各種修改或變化且該等修改或變化包括在本申請案之精神及範圍內及隨附申請專利範圍之範疇內。本文所引用之所有公開案、專利及專利申請案據此以全文引用的方式併入本文中以便達成所有目的。
圖1. 　例示性血漿份化流程之概要；
圖2. 　如藉由ELISA所量測的工業規模血漿蛋白質份化之所選部分中之因子H含量；及
圖3. 　在pH值為7.5且電導率不同之溶液條件下自SiO2 溶離之因子H及醯胺水解活性(如使用基質CS2166所量測)之圖解說明。
(無元件符號說明)

Claims (44)

  1. 一種降低源自血漿之目標蛋白質組合物中絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之量的方法，該方法包含以下步驟：(a)濃化源自血漿之目標蛋白質，在第一目標蛋白質濃化步驟中包含科恩池的醇份化，藉此形成第一濃化源自血漿之目標蛋白質組合物；(b)在適合於結合至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原之條件下，使該第一濃化源自血漿之目標蛋白質組合物或其進一步濃化之組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸，該等條件包括0.1mS/cm至3.0mS/cm之電導率及4.0至7.0之pH值；及(c)使該SiO2 自(b)中的該濃化源自血漿之目標蛋白質組合物中分離，以移除所結合之絲胺酸蛋白酶，其中該至少一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa(FXIa)、因子XIIa(FXIIa)、因子XI(FXI)或因子XII(FXII)，且進一步而言，其中該源自血漿之目標蛋白質係選自白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、補體系統之蛋白質及間α胰蛋白酶抑制劑(IαI)。
  2. 如請求項1之方法，其中該方法進一步包含以下步驟：執行第二目標蛋白質濃化步驟，然後使該濃化組合物與微細分之二氧化矽(SiO2 )接觸。
  3. 如請求項2之方法，其中該第二目標蛋白質濃化步驟為蛋白質沈澱步驟。
  4. 如請求項3之方法，其中該蛋白質沈澱步驟為醇份化步 驟。
  5. 如請求項2之方法，其中該第二目標蛋白質濃化步驟為超濾/透濾步驟。
  6. 如請求項2之方法，其中該第二目標蛋白質濃化步驟為層析濃化步驟。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該方法進一步包含以下步驟：在使該微細分之二氧化矽(SiO2 )自該濃化源自血漿之目標蛋白質組合物分離，以移除所結合之絲胺酸蛋白酶之後，執行目標蛋白質濃化步驟。
  8. 如請求項7之方法，其中在使該微細分之二氧化矽自該濃化源自血漿之目標蛋白質組合物分離之後執行之該目標蛋白質濃化步驟為蛋白質沈澱步驟。
  9. 如請求項8之方法，其中該蛋白質沈澱步驟為醇份化步驟。
  10. 如請求項7之方法，其中在使該微細分之二氧化矽自該濃化源自血漿之目標蛋白質組合物分離之後執行之該目標蛋白質濃化步驟為超濾/透濾步驟。
  11. 如請求項7之方法，其中在使該微細分之二氧化矽自該濃化源自血漿之目標蛋白質組合物分離之後執行之該目標蛋白質濃化步驟為層析濃化步驟。
  12. 如請求項11之方法，其中該層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合該源自血漿之目標蛋白質之條件下使該源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及 (ii)自該層析樹脂溶離該源自血漿之目標蛋白質。
  13. 如請求項12之方法，其中在子步驟(i)中至少一種雜質不結合至該層析樹脂。
  14. 如請求項12之方法，其中在子步驟(i)中至少一種雜質結合至該層析樹脂，但在子步驟(ii)中不會自該層析樹脂溶離。
  15. 如請求項11之方法，其中該層析濃化步驟包含以下子步驟：(i)在適合於結合至少一種雜質之條件下使該第一濃化之源自血漿之目標蛋白質組合物與層析樹脂接觸；及(ii)使該樹脂與該源自血漿之蛋白質組合物分離，其中在子步驟(i)中該源自血漿之目標蛋白質不結合至該層析樹脂。
  16. 如請求項11之方法，其中該層析樹脂係選自由以下組成之群：陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、疏水性相互作用樹脂、混合式樹脂、羥磷灰石樹脂、配位體親和樹脂、免疫親和樹脂及尺寸排阻樹脂。
  17. 如請求項16之方法，其中該層析樹脂為陰離子交換樹脂。
  18. 如請求項16之方法，其中該層析樹脂為陽離子交換樹脂。
  19. 如請求項16之方法，其中該層析樹脂為疏水性相互作用樹脂。
  20. 如請求項16之方法，其中該層析樹脂為混合式樹脂。
  21. 如請求項16之方法，其中該層析樹脂為羥磷灰石樹脂。
  22. 如請求項16之方法，其中該層析樹脂為配位體親和樹脂。
  23. 如請求項16之方法，其中該層析樹脂為免疫親和樹脂。
  24. 如請求項11之方法，其中該層析濃化步驟包含使用尺寸排阻層析法按大小及/或形狀自該目標蛋白質分離至少一種雜質。
  25. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該源自血漿之蛋白質為白蛋白。
  26. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該源自血漿之蛋白質為α-1-抗胰蛋白酶。
  27. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該源自血漿之蛋白質為該補體系統之蛋白質。
  28. 如請求項27之方法，其中該補體系統之該蛋白質係選自由因子H(FH)、因子D、補體蛋白質C3及C4結合蛋白質組成之群。
  29. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該源自血漿之蛋白質為間α胰蛋白酶抑制劑。
  30. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該源自血漿之目標蛋白質組合物為製造中間物。
  31. 如請求項1至6中任一項之方法，其中以每公克蛋白質至少1公克SiO2 之最終濃度使該組合物與SiO2 接觸。
  32. 如請求項31之方法，其中以每公克蛋白質至少2公克SiO2 之最終濃度使該組合物與SiO2 接觸。
  33. 如請求項31之方法，其中以每公克蛋白質至少2.5公克SiO2 之最終濃度使該組合物與SiO2 接觸。
  34. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XI。
  35. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XII。
  36. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIa。
  37. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白酶原為因子XIIa。
  38. 如請求項7中任一項之方法，其中以每公克蛋白質至少1公克SiO2 之最終濃度使該組合物與SiO2 接觸。
  39. 如請求項30之方法，其中以每公克蛋白質至少1公克SiO2 之最終濃度使該組合物與SiO2 接觸。
  40. 如請求項7之方法，其中以每公克蛋白質至少2公克SiO2 之最終濃度使該組合物與SiO2 接觸。
  41. 如請求項30之方法，其中以每公克蛋白質至少2公克SiO2 之最終濃度使該組合物與SiO2 接觸。
  42. 一種藉由包含如請求項1至6中任一項之降低絲胺酸蛋白酶活性之方法的製程來製備之源自血漿之蛋白質組合物之用途，其係用於製備治療與血漿蛋白質異常活性相關之疾病的藥物。
  43. 一種藉由包含如請求項7之降低絲胺酸蛋白酶活性之方法的製程來製備之源自血漿之蛋白質組合物之用途，其 係用於製備治療與血漿蛋白質異常活性相關之疾病的藥物。
  44. 一種藉由包含如請求項30之降低絲胺酸蛋白酶活性之方法的製程來製備之蛋白質組合物之用途，其係用於製備治療與血漿蛋白質異常活性相關之疾病的藥物。
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