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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abreicherung von Pathogenen aus proteinhaltigen Lösungen durch Filtration sowie durch dieses Verfahren hergestellte pharmazeutische Präparationen, welche entsprechend einem Nachweis mittels quantitativer PCR frei von Parvovirus ist
Bei der Herstellung von biologischen Präparaten biogenen Ursprungs, wie aus Blut oder Plasma, ist eine Kontamination des Ausgangsmaterials mit Pathogenen als mögliches Risiko zu berücksichtigen. Daher werden während der Produktion von pharmazeutischen Präparationen verschiedenste Verfahren zur Inaktivierung und zur Abreicherung bzw. Entfernung von potentiell vorhandenen Pathogenen in den Produktionsprozess eingegliedert.
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Inaktivierung und Entfernung von durch Blut übertragbare Pathogenen bekannt. Als Virus-Inaktivierungsverfahren sind die Hitzebehandlung, die Solvent/Detergent Behandlung, die Tensidbehandlung und die Photoinaktivierung von Viren zu nennen, wobei jedes dieser Verfahren spezifisch auf bestimmte Viren wirkt Es wird daher empfohlen, verschiedene Inaktivierungsverfahren miteinander zu kombinieren.
Zu den physikalischen Abreicherungsverfahren von Pathogenen gehören verschiedene Filtrationsverfahren, wie z. B. die Ultrafiltration, die Nanofiltration und chromatographische Verfahren.
Bei der Nanofiltration werden Filter verwendet, deren Porendurchmesser kleiner ist als der durchschnittliche Durchmesser der abzutrennenden Viren. Dadurch werden die Viren zurückgehalten, und man erhält aus dem Filtrat eine Präparation, die von solchen Viren frei ist. Bei relativ kleinen Pathogenen, wie Viren, Viroiden und Prionen, besteht allerdings die Gefahr, dass diese nur schwer bzw. unvollständig abgetrennt werden Daher wurde versucht die Viren durch Bindung an Liganden zu vergrössern und dadurch auch relative kleine Viren mittels Nanofilter effektiv abtrennen zu können.
In der WO 97/40 861 A werden Viren mit einem Liganden oder Rezeptor versetzt, der mit einem Rezeptor oder Liganden des Pathogens reagiert, wodurch ein Ligand/Rezeptor-Komplex entsteht, der über Nanofilter oder Tiefenfilter mit einem Ausschlussvolumen von 35 - 100 nm abgetrennt wird.
Gemäss der EP 0 727 226 A werden die Viren mit Antikörpern versetzt und der Komplex über Ultrafilter abgetrennt. Dabei ist jedoch zu beachten, dass bei zu kleinen Porengrössen von Nanofilter bzw einem zu geringen "cut off' von Ultrafiltern auch hochmolekulare Proteine zurückgehalten werden. Immunglobuline (lgG 150 kD) können z. B. nur Filter mit grösserer Ausschlussgrösse passieren.
Die EP 0 798 003 A betrifft die Verwendung von strukturierten Tiefenfiltern zum Abreichern von Viren, wobei jedoch die Ergebnisse eine für pharmazeutische Präparationen nur ungenügende Abreicherung speziell von Parvovirus zeigen. Tiefenfilter werden üblicherweise zum Klären von Flüssigkeiten eingesetzt und besitzen im Allgemeinen einen grösseren Porendurchmesser als der durchschnittliche Durchmesser der Viren. Es wird angenommen, dass Viren im Inneren des Filters abgeschieden werden.
Laut der Offenbarung der EP 0 679 405 A werden proteinhältige Lösungen mit Adsorbentien als feste Phase versetzt, wobei die Viren an dieser festen Phase adsorbieren. Die feste Phase mit den daran adsorbierten Viren wird anschliessend durch Filtration oder Zentrifugation entfernt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein verbessertes Verfahren zur Abtrennung von Pathogenen aus proteinhältigen Präparationen mittels Filtration zur Verfugung zu stellen, sowie pharmazeutische Präparationen, die frei von durch Blut übertragbare Pathogene sind.
Die Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs angegebenen Art erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass die plasmatische Proteine enthaltende Lösung in Gegenwart eines anorganischen partikulären, oberflächenaktiven Reinigungsmittel inkubiert wird und über Tiefenfilter geleitet wird, wobei eine klare Lösung erhalten wird.
Der Effekt der verbesserten Virusabreicherung im Verfahren der vorliegenden Erfindung war insofern überraschend, als sich gezeigt hat, dass es bei der erfindungsgemässen Behandlung von kontaminierten Proteinlösung nur zu geringfügiger Adsorption der Pathogene an das Reinigungsmittel bzw Filterhilfsmittel kommt. Dies konnte dadurch gezeigt werden, dass eine immunglobulinhältige Lösung enthaltend Parvovirus B19 mit einem Filterhilfsmittel versetzt und das
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Filterhilfsmittel mittels Zentrifugation abgetrennt wurde. Parvovirus B19 war nach dem Zentrifugieren im Überstand nachweisbar und hatte offenbar nicht an der festen Phase adsorbiert.
Der Nachweis für die Parvovirus-Genom Kopienzahl wurde in einer quantitativen PCR-Analyse wie von Dorner et al , (1994,25. Hämophilie-Symposium, ed. Scharrer & Schramm, 5 29 - 44) beschrieben, durchgeführt.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch die Zugabe eines anorganischen partikulären, oberflächenaktiven Reinigungsmittels, wie beispielsweise eines Filterhilfsmittels, und anschliessender Filtration über Tiefenfilter Parvovirus B19 vollständig aus einer immunglobulinhaltigen Lösung abgetrennt werden konnte. Im Filtrat war das Virus nicht mehr nachweisbar, sodass ein wesentlich besserer Effekt als durch das Verfahren gemäss der EP 0 798 002 A erreichbar, erzielt werden konnte.
Die Zeitdauer der Inkubation, d. h. des Kontakts zwischen anorganischem partikulären, oberflächenaktiven Reinigungsmittel und der proteinhaltigen Lösung kann dabei von 0,1 bis 48h variieren, 0,2-2h hat sich zur Erzielung einer optimalen Abreicherung als besonders günstig erwiesen.
Gunstig ist in diesem Zusammenhang auch, wenn eine Suspension des partikulären, oberflächenaktiven Reinigungsmittels unter Vermeidung einer Sedimentation über den Tiefenfilter geleitet wird. Die Sedimentation kann z. B. durch das Aussparen einer Zentrifugation, durch Schütteln oder durch Rühren vermieden werden, wobei sich ein inniger Kontakt zwischen proteinhaltiger Lösung und anorganischem partikulären, oberflächenaktiven Reinigungsmittel ergibt.
Als anorganische partikuläre, oberflächenaktive Reinigungsmittel können hierbei unter anderem auch anorganische Filterhilfsmittel eingesetzt werden. Filterhilfsmittel werden üblicherweise bei Suspensionen mit kontaminierenden Feststoffen oder bei Suspensionen enthaltend schleimige Feststoffe eingesetzt, um die Bildung eines Filterkuchens zu ermöglichen.
Sie werden unter anderem zur Klärung von trüben Lösungen verwendet, wie gemäss US 4 305 870 A. Filterhilfsmittel können auf Basis von Kieselsäure, wie z B Aerosil (Degussa), Kieselgur, wie z.B Celite (Johns- Manville Corp. ), Tonmineralien, wie Bentonit, bzw Mischungen hievon hergestellt sein. Die erfindungsgemäss verwendeten Filterhilfsmittel haben vorzugsweise eine aktive Oberfläche von mindestens 50 m2/g.
Das im erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise eingesetzte Aerosil ist aus amorphen, kugelförmigen Teilchen aufgebaut, welche einen Durchmesser von 10 - 20 nm besitzen. Bei einem Volumen von nur 15 ml besitzt 1g Aerosil eine Oberfläche von 100 - 400 m2.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich v.a. für die Herstellung von pharmazeutischen Präparationen aus Plasma, wie Humanplasma, Plasmafraktionen oder Zellkulturen. Bevorzugt ist aus wirtschaftlichen Gründen die Verwendung eines Plasmapools als Ausgangsmaterial, welcher aus mindestens 1000, am meisten bevorzugt aus mindestens 2000 Spendern hergestellt wird Ein aus einem solchen Plasmapool hergestelltes Immunglobulinpräparat enthält beispielsweise ein breites Spektrum von Antikörpern, die von der Vielzahl der unterschiedlichen immunisierten Plasmaspendern stammen.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch für die Herstellung von virussicheren Präparaten auf Basis von Blutgerinnungsfaktoren, wie die Faktoren ll, VII, VIII, IX, X, XIII, als aktivierte Faktoren oder Zymogene, sowie vWF herangezogen werden. Faktoren der Fibrinolyse und Thrombolyse, wie z. B Protein C und Protein S, Orosomucoid, und Albumin, Immunglobuline, Fibrinogen, Prothrombinkomplex, aktivierter Prothrombinkomplex, Inhibitoren, wie a,-Antitrypsin,
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erfindungsgemässe Verfahren virussicher zur Verfügung gestellt werden können. Trotz der Verwendung von oberflächenaktiven Materialien konnte überraschenderweise festgestellt werden, dass auch Plasmaproteine, die durch aktive Oberflächen, wie Kaolin, modifiziert und aktiviert werden, in nativer Form gewonnen werden konnten.
Bevorzugt wird das Verfahren bei der Herstellung von intravenös verträglichen Immunglobulinpräparationen angewendet. Immunglobuline müssen, um i v verträglich zu sein, eine geringe antikomplementäre Aktivität z.B. von weniger als 20 ACA haben, die im wesentlichen durch einen hohen Monomergehalt im Präparat erreicht wird.
Ein nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestelltes Immunglobulinpräparat weist einen Monomergehalt von mindestens 97 %,
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vorzugsweise mindestens 98 %, am meisten bevorzugt mindestens 99 % auf, wobei als Monomere die Summe an Monomer und Dimer gelten Es konnte auch gezeigt werden, dass durch das erfindungsgemässe Verfahren keine Aggregate gebildet wurden und ein Monomergehalt von mindestens 99% erhalten werden konnte Im Gegenteil, geringe Aggregatmengen konnten durch die Tiefenfiltration abgetrennt werden, wodurch ein Monomergehalt von mindestens 99,4% erreicht wurde Ausserdem besitzt eine nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Immunglobulinpräparation eine Reinheit von 98 %, bestimmt durch Elektrophorese, und enthält vorzugsweise keine üblichen Stabilisatoren,
z B ausgewählt aus der Gruppe Zucker oder Zuckeralkohole.
Zu den Pathogenen, die durch das erfindungsgemässe Verfahren abgetrennt werden können, gehören vor allem humanpathogene Viren, wie z B. HAV, HBV, HCV, HIV, HEV, HDV, HGV, CMV, PRV und Parvovirus, aber auch Prionen, wie z B der Erreger der Creutzfeld-Jakob Krankheit. Bei kleinen Viren, d.h. kleiner als 50 nm, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Lösung spezifische Antikörper gegen die Pathogene enthält, oder solche spezifischen Antikörper zugesetzt werden.
Weiters konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Antikörpern, welche fur das abzutrennende Pathogen spezifisch sind, bzw. deren Zusatz in der Lösung die Abtrennung der Pathogene unterstützt. So wurde zu Testvirus MVM ein spezifischer Antikörper zugesetzt, wonach das Virus im Filtrat nicht mehr nachweisbar war Vorzugsweise wurden polyklonale Antikörper eingesetzt, z B. humane Es können aber auch monoklonale Antikörper mit einer hohen Affinität oder Avidität eingesetzt werden.
Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine proteinhältige Lösung mit einer Konzentration von 0,05 bis 100 mg/ml, bevorzugt 0,1 bis 50 mglml und einem pH-Wert von 3,5 bis 8,5, vorzugsweise von 4 bis 8, bei einer Temperatur von 4 bis 37 C mit bis zu 200 mg/1000 mg Protein, bevorzugt mit bis zu 100 mg/1000 mg Protein, partikulären, oberflächenaktiven Reinigungsmittel versetzt Nach 0,1 bis 48 h Inkubation wird die Präparation bei einem Druck von 0,2 bis 3 bar, bevorzugterweise 2 bar, über ein Tiefenfilter geleitet, wobei eine klare Lösung erhalten wird Von einem Tiefenfilter spricht man, wenn Teilchen im Inneren des Filtermittels abgeschieden werden Tiefenfilter basieren ublicherweise z.
B auf Sand, Polypropylen, Zellulose, Fiberglas, Porzellan oder Diatomeenerde Sie haben eine faserige, granuläre oder gesinterte Matrix, welche eine zufällige Porenstruktur bewirkt. Tiefenfilter werden unter anderem als Vorfilter verwendet, um die Lebensdauer von Endfiltern, üblicherweise Oberflächenfilter oder Membranfilter, zu verlängern Beispielsweise werden Tiefenfilter auf Basis von Sand auch zur Virusabreicherung eingesetzt. Für pharmazeutische Produkte wären solche Filter jedoch ungeeignet.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die erhaltene klare Lösung einem weiteren Nanofiltrationsschritt unterzogen, vorzugsweise mit Nanofilter der Porengrösse von 35 - 100 nm, wobei die Sicherheit der Produkte bezüglich filtrierbarer Viren noch mehr erhöht wird Geeignete Verfahren sind z. B. in der WO 97/40 861 A beschrieben.
In Analogie zu den Kriterien für Sterilfilter bei Bakterien gilt ein biologisches Material als sicher virusentfernt, wenn ein Reduktionsfaktor von > 107erreicht wird. Der Virustiter wird üblicherweise mit einer PCR-Methode bestimmt Eine Methode zur Bestimmung der Prionen kann auf Basis eines üblichen Immunassays erfolgen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele bzw. Vergleichsversuche näher erläutert
Beispiel 1:
Abreicherung von HIV-1 und PRV durch Inkubation mit Aerosil und anschliessende Filtration
346,5 ml einer 2,5%igen human Immunglobulin-Lösung wurde mit 3,5 ml hochtitrigem HIV-1 bzw. PRV beaufschlagt Von der Mischung und der Virussuspension wurde der Virustiter bestimmt Dem mit Virus beaufschlagtem Immunglobulin wurde Aerosil 380 zugesetzt (15 mg pro g Protein) und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wurde von einem Aliquot der Virustiter bestimmt. Anschliessend wurde über ein CUNO SA90 Filter, eingespannt in einem 47mm Filterhalter, filtriert. Vom Filtrat wurde eine Probe entnommen und titriert.
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Der Virustiter wurde nach erfolgter serieller 1/2 log Verdünnung in Zellkulturmedium bestimmt.
Jeweils 100 l jeder seriellen Verdünnung wurden in 8 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben,
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der Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die einen positiven CPE zeigten, ermittelt Die Effizienz des Prozesses der Virusabreicherung wurde als Reduktionsfaktor (R.F.) ausgedrückt, der nach der vom E. C.
Committee for Proprietary Medicine (Note for guidance on virus validation studies The design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses, Appendix ll, CPMP/BWP/268/95, 29. 2 1998) empfohlenen Formel berechnet wurde:
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Probenvol. nach Behandl. x Virustiter nach Behandlung
HIV-1 PRV
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Virus-Titer nach1 Stunde 105,4 10' mit mit Aerosil Virus-Titer im Filtrat < 100,6 < 10 ' Reduktionsfaktor > 5,4 > 5,6 Nach einer Stunde Inkubation mit Aerosil erfolgt bereits eine geringfügige Reduktion des
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Virustiter unter die Nachweisgrenze gesunken ( < 100,6 bei HIV-1, < 10 ' bei PRV). Dies zeigt, dass Viren durch die erfindungsgemässe Aerosilbehandlung in Kombination mit Tiefenfilter-Filtration abgetrennt werden können.
Beispiel 2
Abreicherung von HAV durch Inkubation mit Aerosil und anschliessende Filtration
Eine 2,5 %ige Immunglobulin-Lösung wurde analog Beispiel 1 mit HAV versetzt, mit Aerosil eine Stunde gerührt und dann über ein CUNO SA90 Filter filtriert
HAV
Virus-Stock-Titer 108,3
Virus-Titer im Produkt 105.4
Virus-Titer nach 1 Stunde 103.8 mit Aerosil
Virus-Titer im Filtrat < 10 '
Reduktionsfaktor > 5,3
Wie bei Beispiel 1 erfolgt bereits nach einer Stunde Inkubation mit Aerosil eine geringfügige Reduktion des Virustiters (von 105,8 auf 103,8)Nach der Filtration ist der Virustiter unter die Nachweisgrenze gesunken ( < 100,1). HAV ist ein kleines Virus ohne Lipidhülle. Die aus einem Plasmapool von mehr als 2000 Einzelspenden hergestellte Immunglobulinlösung enthält humane Antikörper gegen HAV.
Dies zeigt, dass auch kleine Viren ohne Lipidhülle durch Aerosilbehandlung und Filtration effektiv abgetrennt werden können. Eine vollständige Virusabreicherung erfolgt jedoch auch hier erst in Kombination mit der Tiefenfiltration.
Beispiel 3 :
Abreicherung von Parvovirus B19 durch Inkubation mit Aerosil und anschliessende Filtration
Eine 2,5 %ige Immunglobulin-Lösung wurde analog Beispiel 1 mit B19 versetzt, mit Aerosil eine Stunde gerührt und dann über ein CUNO SA90 Filter filtriert. Da B19 nicht mittels Zellkulturen titriert werden kann, wurde hier die Anzahl der B19-Genome pro ml mittels PCR bestimmt.
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B19 (DNA copies/ml)
Virus-Stock-Titer 109.7
Virus-Titer im Produkt 108,3
Virus-Titer nach 1 Stunde 105.4 mit Aerosil
Virus-Titer im Filtrat < 101,7
Reduktionsfaktor > 6,6
Wie bei Beispiel 1 und 2 erfolgt bereits nach einer Stunde Inkubation mit Aerosil eine geringfügige Reduktion des Virustiters (von 108,3 auf 1054). Nach der Filtration ist der Virustiter unter die Nachweisgrenze gesunken ( < 101,7). Wie HAV ist auch B19 ein kleines Virus ohne Lipidhülle. Die aus einem Plasmapool von mehr als 2000 Einzelspenden hergestellte Immunglobuhnlösung enthält humane Antikörper gegen Parvovirus B19. Dies zeigt wie Beispiel 2, dass auch kleine Viren ohne Lipidhülle durch Aerosilbehandlung und Filtration abgetrennt werden können.
Eine vollständige Virusverabreicherung erfolgt jedoch auch hier erst in Kombination mit der Tiefenfiltration.
Referenzbeispiel:
Adsorption von Parvovirus B19 an Aerosil und anschliessende Zentrifugation
48 ml einer 2,5 %igen Immunglobulin-Lösung wurden mit 2 ml B19 versetzt Wie in Beispiel 1 wurde Aerosil zugegeben und danach eine Stunde gerührt. Im Unterschied zu den Beispielen 1-3 wurde dann Aerosil von der Immunglobulinlösung durch Zentrifugation abgetrennt (20. 000 rpm, 30 Minuten) und im Zentrifugationsüberstand die Anzahl der B19-Genome pro ml mittels PCR bestimmt.
B19 (DNA copies/ml)
Virus-Stock-Titer 109.7
Virus-Titer im Produkt 1093
Virus-Titer nach 1 Stunde 107,8 mit Aerosil
Virus-Titer im Zentrifu- 106,5 gationsüberstand
Reduktionsfaktor 1,3
Wie bei Beispielen 1-3 erfolgt bereits nach einer Stunde Inkubation mit Aerosil eine
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Überstand 1065 DNA-Kopien/ml gefunden, was einen Reduktionsfaktor von 1,3 ergibt. Die Virusabreicherung in der Immunglobulin-Lösung ist ungenügend, wenn Aerosil mittels Zentrifugation abgetrennt wird.
Beispiel 4
Abreicherung von MVM durch Inkubation mit Aerosil und Antikörper und anschliessende Filtration
Eine 2,5%ige Immunglobulin-Lösung wurde analog Beispiel 1 mit MVM versetzt, mit Aerosil eine Stunde gerührt und dann über ein CUNO SA90 Filter filtriert. Zusätzlich wurde noch 0,5% eines Kaninchen anti-MVM-Antiserums (RaMVM) zugefügt
Versuch 1 Versuch 2
Virus-Stock-Titer 109,3 Zugabe von RaMVM 1093
Virus-Titer im Produkt 107,8 107.4
Virus-Titer nach 1 106,0 106.0
Stunde mit Aerosil
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Virus-Titer im Filtrat < 10 ' @100,1
Reduktionsfaktor > 7,7 > 7,3
Wie bei den vorigen Beispielen erfolgt bereits nach einer Stunde Inkubation mit Aerosil eine geringfügige Reduktion des Virustiters.
Nach der Filtration ist der Virustiter unter die Nachweisgrenze gesunken ( < 0,1), wenn bei Versuchsbeginn Antikörper zugesetzt wurden. MVM ist ein kleines Virus ohne Lipidhülle. Die Immunglobulinlösung enthält keine Antikörper gegen MVM, einem Maus Parvovirus Dies zeigt, dass kleine Viren ohne Lipidhülle durch die erfindungsgemässe Aerosilbehandlung und Filtration noch effizienter abgetrennt werden können, wenn spezifische Antikörper gegen dieses Virus zugesetzt werden.
Referenzbeispiel 2.
Inkubation von Immunglobulin mit HIV mit anschliessender Filtration
Wie bei Beispiel 1 wurden 346,5 ml einer 2,5%igen human Immunglobulinlösung mit 3,5 ml hochtitrigem HIV-I beaufschlagt Von der Mischung und der Virussuspension wurde der Virustiter bestimmt. Das mit Virus versetzte Immunglobulin wurde ohne Zusatz von Aerosil 380 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wurde von einem Aliquot der Virustiter bestimmt.
Anschliessend wurde über ein CUNO SA90 Filter, eingespannt in einen 47 mm Filterhalter, filtriert.
Vom Filtrat wurde eine Probe entnommen und titriert.
Virus-Stock-Titer 108,1
Virus-Titer im Produkt 106,3 Virus-Titer nach 1 106,4
Stunde Inkubation bei Raumtemperatur o3,6
Virus-Titer im Filtrat @103.6
Reduktionsfaktor 2,7
Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur ohne Aerosil ist keine Abnahme des Virustiters zu beobachten. Durch die nachfolgende Filtration nimmt der Virustiter auf 103,6 ab (Reduktionsfaktor 2,7). Dies zeigt, dass für eine vollständige Abreicherung von HIV-1 eine Inkubation mit Aerosil vor der Filtration nötig ist
PATENTANSPRÜCHE:
1.
Verfahren zur Abreicherung von Pathogenen aus einer Lösung enthaltend plasmatische
Proteine durch Filtration, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung in Gegenwart eines anorganischen partikulären, oberflächenaktiven Reinigungsmittel inkubiert wird und über
Tiefenfilter geleitet wird, wobei eine klare Lösung erhalten wird.