WO2007054297A2 - Verwendung hydrophober interaktionschromatographie zur virusabreichung - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for the depletion of viruses, in particular of unencapsulated viruses in the production process of biologics using hydrophobic interaction chromatography (HIC).
  • HIC hydrophobic interaction chromatography
  • biologics for example products of blood / plasma, urine or other biological fluids of animal or human origin, from in vitro cultures of cells of animal or human origin or from in vivo cultures of cells or organs and tissues of animal and human
  • Origin including recombinantly expressed proteins, is based on a multifactorial approach with (1) selection of the starting material with no or minimal content of infectious virus, (2) testing of
  • Pasteurization heat treatment in a (stabilized) solution at usually
  • the Solvent / Detergent (SD) method (Seitz et al., Comparable Virus Inactivation by Bovine or Vegetable Derived Tween 80 During Solvent / Detergent Treatment, Biologicals 30, 2002, 197-205) and the treatment of product intermediates with caprylate ( Lebing et al., Properties of a novel intravenous immunoglobulin (IGIV-C, 10%) produced by virus inactivation with caprylate and column chromatography, Vox Sanguinis 84, 2003, 193-201) result in efficient inactivation of enveloped viruses.
  • other methods are used, such as irradiation (UV-C or gamma irradiation) or nucleic acid-intercalating substances.
  • Nanofilters with a mean pore diameter of 15-20 nm are responsible for a high proportion of the risk viruses human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis B virus (HBV) and picornaviruses and parvoviruses.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • HCV hepatitis C virus
  • HBV hepatitis B virus
  • chromatographic methods can be differentiated into adsorption, distribution, gel permeation, ion exchange and hydrophobic interaction chromatography on the basis of their physico-chemical mechanisms of action.
  • a use of chromatography for Separation of viruses from a protein solution is only useful with a chromatographic method that does not interfere with the biological activity of the target protein.
  • One such chromatographic method is, inter alia, hydrophobic interaction chromatography (HIC).
  • virus reduction methods are influenced by the physico-chemical properties of viruses (for example, the SD method is only effective against enveloped viruses and irradiation, especially against viruses with single-stranded nucleic acid), according to the guidelines of the authorities (eg CPMP / BWP / 269/95).
  • the SD method is only effective against enveloped viruses and irradiation, especially against viruses with single-stranded nucleic acid
  • the authorities eg CPMP / BWP / 269/95.
  • two different process steps for virus reduction integrated in the production process of biologicals to inactivate and / or remove a wide range of viruses such as enveloped and non-enveloped viruses.
  • two different process steps for virus reduction integrated in the production process of biologicals to inactivate and / or remove a wide range of viruses such as enveloped and non-enveloped viruses.
  • enveloped and non-enveloped viruses e.g.
  • the combination SD method and dry heating is a widely used production method for plasma derivatives (Dichtelmüller et al., Improvement of virus safety of a S / D-treated factor VIII concentrate by additional dry heat treatment at 100 degrees C, Biologicals 24, 1996, 125- 30).
  • the combination of pasteurization with one or more chromatographic separation steps is also a way to inactivate and remove a wide range of viruses.
  • the HIC is a universal method for the purification of macromolecules (proteins) in which the substances are separated via their hydrophobic interactions with the gel matrix.
  • hydrophobic regions of the target protein interact with the hydrophobic ligands of the adsorber.
  • the preferred ligands are hydrocarbon chains of different lengths, for example octyl groups or aromatic ligands.
  • High salinity, and associated high ion concentration in the running buffer blocks ionic interactions and brings to bear the hydrophobic regions of the target protein. Therefore, it is important to determine the appropriate salt concentration for the target protein. Due to the stabilizing effect of high salt concentrations on the conformation of the target protein, HIC is a gentle method of protein purification.
  • the anions isothiocyanate, chlorate, nitrate, bromide, acetate, sulfate and phosphate.
  • the cations only play a minor role.
  • the sulfate ion is used in the form of ammonium sulfate.
  • matrices for the HIC include: ethyl-hexyl- / octyl- / decyl-imino-agarose, phenyl-superose, SynChropak propyl and hydroxypropyl, methyl sepharose, phenyl sepharose, octyl sepharose, butyl sepharose, hexyl S-Sepharose, butyl -S-Sepharose, pyridyl-S-Sepharose, epoxy and polypropylene glycol-Sepharose, TSK-phenyl 5PW, Toyopearl ether-5PW or phenyl-5PW.
  • HIC columns are generally low, a typical HIC column is at a bed height of 5-15 Once the separation parameters have been optimized, then upscaling is generally performed by increasing the diameter of the column.
  • HIC HIC to isolate enveloped viruses
  • adenovirus Huyghe et al., Purification of a type 5 recombinant adenovirus encoding human p53 by column chromatography, Human Gene Therapy 6, 1995, 1403-1416.
  • HIC is always to be understood as meaning the contacting of biologics with matrices suitable for HIC in the presence of hydrophobic interaction-enhancing salts, in the case of acetate in concentrations above 50 mM.
  • HIC without an adsorption step, hereinafter referred to as a flow-through HIC, for example, takes place when conditions are chosen that achieve the desired separation effect, while the application buffer is identical to the elution buffer.
  • a flow-through HIC takes place when conditions are chosen that achieve the desired separation effect, while the application buffer is identical to the elution buffer.
  • Characteristic of the flow HIC is that the target protein to be purified in the application buffer can enter the eluate without changing the buffer. Also in this implementation of the HIC salts are used, which enhance the hydrophobic interaction.
  • the invention relates to a method for the depletion of enveloped and unencapsulated viruses, in particular parvoviruses, from a solution of biologics, in particular from a plasma protein solution using the HIC.
  • the virus elimination preferably takes place via an HIC, which deviates from the standard HIC.
  • the implementation of the standard HIC is based on the manufacturer's instructions for the column matrix, which must be cleaned and equilibrated according to the manufacturer's instructions.
  • the HIC-GeI matrix used was the phenyl Sepharose 6 Fast Flow from Amersham Biosciences, in which a gel bed height of 5-15 cm is recommended.
  • enveloped viruses such as BVDV (a model virus for HCV) and HIV, as well as non-enveloped viruses, can be depleted with greatly enhanced efficacy if the column height chosen to carry out the HIC exceeds that selected by general expertise. column height recommended by the manufacturers of the column matrix is increased.
  • One aspect of this invention is a method for reducing infectious unencapsulated viruses of less than 35 nm in diameter, especially parvoviruses, more preferably parvovirus B19 and related genotypes in biologics, wherein the depletion step is ensured by allowing the biologic to grow during the Manufacturing process with suitable for hydrophobic interaction chromatography matrices in the presence of the hydrophobic interaction enhancing salts is brought into contact.
  • Another aspect of this invention is methods for reducing infectious virus in biologics, wherein the depletion step is accomplished by contacting the biologic during the manufacturing process with matrices suitable for hydrophobic interaction chromatography in the presence of hydrophobic interaction enhancing salts, the column height of the for hydrophobic interaction chromatography suitable matrix at least 20 cm is. Preferred are column heights of more than 30 cm, more preferably more than 40 cm, even more preferably more than 50 cm. Very particularly preferred are column heights of more than 55 cm.
  • a particularly preferred aspect of this invention is methods for reducing infectious virus in biologics characterized in that the biologic is contacted during the manufacturing process with matrices suitable for hydrophobic interaction chromatography in the presence of hydrophobic interaction enhancing salts, the column height being for hydrophobic interaction chromatography is at least 10 cm and the biologic is not adsorbed to the matrix in the loading buffer, where it is applied to the matrix suitable for hydrophobic interaction chromatography.
  • the biological can not be eluted with application buffer.
  • Preference is given here a column height of at least 20cm. Further preferred are column heights of more than 30 cm, more preferably more than 40 cm, even more preferably more than 50 cm. Very particularly preferred are column heights of more than 55 cm.
  • the invention also encompasses the combination of the virus reduction method of the invention with other virus depletion or virus inactivation methods.
  • example 1 the target protein C1 inhibitor (with the exception of example 1, in which fibrinogen was investigated), the method according to the invention can be described as follows: example 1
  • a HIC system with three different matrices was used.
  • the detection of the proteins was carried out at 280 nm.
  • Table 1 shows that at a gel bed length in the dimension proposed by the manufacturer, no significant depletion of the parvovirus CPV is achieved.
  • a HIC system with a phenyl Sepharose matrix (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow from Amersham Biosciences) was used.
  • the separation of the plasma protein fibrinogen (short column) and the target protein C1 inhibitor (long column) and the CPV used was carried out at a flow rate of 1.5 ml / min in a suitable buffer (0.8 M ammonium sulfate, 0.01 M Tris, pH 7) at room temperature.
  • the detection of the proteins was carried out at 280 nm.
  • Table 2 shows that extension of the phenyl sepharose column from 7 cm to 59 cm increased CPV elimination by more than a factor of 10 6 . This applies equally to unpacked (418 ml gel volume) and packed (512 ml gel volume) columns.
  • a HIC system with a phenyl Sepharose matrix (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow from Amersham Biosciences) was used.
  • the detection of the proteins took place at 280 nm. In the flow-through HIC fractions were collected and the virus content was determined.
  • the bovine viral diarrhea virus (BVDV), a enveloped virus of the family Flaviviridae, as a model virus for the human pathogenic hepatitis C virus, was propagated in bovine ovaries and then separated by low-speed centrifugation of cells and cell debris. The virus-containing supernatant was aliquoted and until assayed at ⁇ - stored at -70 0 C.
  • BVDV bovine viral diarrhea virus
  • a phenyl Sepharose matrix Phenyl Sepharose 6 Fast Flow from Amersham Biosciences
  • Table 4 shows that extension of the phenyl sepharose column from 6.25 cm to 59 cm increased BVDV elimination by more than a factor of 1000. This applies equally to unpacked (418 ml gel volume) and packed (512 ml gel volume) columns.
  • the human immunodeficiency virus (HIV), a coated virus of the family Retroviridae, was propagated in Jurkat cells and then separated by low-speed centrifugation of cells and cell debris. The virus-containing supernatant was aliquoted and until assayed at ⁇ - stored at -70 0 C.
  • HIC human immunodeficiency virus
  • Phenyl Sepharose 6 Fast Flow from Amersham Biosciences
  • Table 5 shows that extension of the phenyl sepharose column from 6.25 cm to 59 cm increased HIV elimination by more than a factor of 1000.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abreicherung von Viren, insbesondere von nicht umhüllten Viren im Herstellungsprozess von Biologika unter Verwendung der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC).

Description

Verwendung hydrophober Interaktionschromatographie zur
Virusabreicherung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abreicherung von Viren, insbesondere von nicht umhüllten Viren im Herstellungsprozess von Biologika unter Verwendung der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC).
Die Virussicherheit von Biologika, beispielsweise Produkte aus Blut/Plasma, Urin oder anderen biologischen Flüssigkeiten tierischen oder menschlichen Ursprungs, aus in vitro Kulturen von Zellen tierischen oder menschlichen Ursprungs oder aus in vivo Kulturen von Zellen oder Organen und Geweben tierischen und menschlichen
Ursprungs, wobei rekombinant exprimierte Proteine eingeschlossen sind, beruht auf einem multifaktoriellen Ansatz mit (1) Auswahl des Ausgangsmaterials mit keinem oder minimalem Gehalt an infektiösen Viren, (2) Testung von
Produktintermediaten auf Abwesenheit von Viren und (3) Herstellungsprozessen mit Verfahrensschritten, die Viren inaktivieren und/oder entfernen.
Es sind viele Verfahrensschritte bekannt, die mit hoher Kapazität, Viren inaktivieren und/oder zu entfernen, so z.B. Virusinaktivierung durch erhöhte Temperatur oder durch Chemikalien, die insbesondere die Lipidhülle von Viren zerstören. Die
Pasteurisierung (Hitzebehandlung in einer (stabilisierten) Lösung bei üblicherweise
600C über 10 Stunden (Chandra et al. Effectiveness of alternative treatments for reducing potential viral contamination from plasma-derived products - Thrombosis Research 2002; 105:391 -400), die Dampfbehandlung (Kreil et al., West Nile virus and the safety of plasma derivatives: verification of high safety margins, and the validity of predictions based on model virus data. Transfusion 43, 2003, 1023 - 1028) sowie die Trockenerhitzung (Hart et al., Effect of terminal (dry) heat treatment on non-enveloped viruses in coagulation factor concentrates. Vox Sang 67, 1994, 345 - 350) führen zu einer wirksamen Inaktivierung von Viren. Das Solvent/Detergent (SD)-Verfahren (Seitz et al., Comparable Virus Inactivation by Bovine or Vegetable Derived Tween 80 During Solvent/Detergent Treatment, Biologicals 30, 2002, 197 - 205 ) sowie die Behandlung von Produkt-Intermediaten mit Caprylat (Lebing et al., Properties of a new intravenous Immunoglobulin (IGIV- C, 10%) produced by virus inactivation with caprylate and column chromatography, Vox Sanguinis 84, 2003, 193 - 201) führen zu einer wirksamen Inaktivierung von umhüllten Viren. Daneben kommen weitere Verfahren zum Einsatz wie Bestrahlung (UV-C oder Gammabestrahlung) oder Nukleinsäure-interkalierende Substanzen.
Neben diesen Beispielen von Verfahren zur Virusinaktivierung finden weitere Maßnahmen Anwendung, die Viren abreichern, so z.B. Virusfiltration - hier werden Viren entsprechend ihrer Größe durch kleinporige Filtermaterialien zurückgehalten und Plasmaproteine werden im Filtrat gesammelt - sowie chromatographische Verfahren, bei denen Viren aufgrund ihrer Eigenschaften, wie z.B. Affinität zu Liganden, Oberflächenladung etc. abgetrennt werden können. Nanofilter mit einem mittleren Porendurchmesser von 15-20 nm halten die Risikoviren Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis C Virus (HCV), Hepatitis B Virus (HBV) sowie Picornaviren und Parvoviren zu einem hohen Anteil zurück. Da die meisten Plasmaproteine jedoch ein so großes Molekulargewicht besitzen, dass sie nicht durch einen 15-20 nm Filter filtrierbar sind, sind für die Filtration der meisten Plasmaproteine nur Filter mit einem mittleren Porendurchmesser von 35 nm (bzw. einer nominellen Molekulargewichts-Trenngrenze von 70.000 D bis 100.000 D) oder größer geeignet, die jedoch Picornaviren (wie z.B. das Hepatitis A Virus) und Parvoviren (wie das humanpathogene Parvovirus B19) nicht in ausreichendem Maße aus Plasmaproteinen entfernen. Die chromatographischen Verfahren können aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Wirkungsmechanismen in Adsorptions-, Verteilungs-, Gelpermeations-, lonenaustausch- und hydrophobe Interaktions- Chromatographie unterschieden werden. Ein Einsatz der Chromatographie zur Abtrennung von Viren aus einer Proteinlösung ist nur mit einem chromatographischen Verfahren sinnvoll, welches die biologische Aktivität des Zielproteins nicht beeinträchtigt. Ein solches chromatographisches Verfahren ist u.a. die hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC).
Da Virusreduktionsverfahren von den physico-chemischen Eigenschaften von Viren beeinflusst werden (so ist z.B. das SD-Verfahren nur gegenüber umhüllten Viren und Bestrahlung besonders gegenüber Viren mit einzelsträngiger Nukleinsäure wirksam) werden entsprechend den Richtlinien der Behörden (z.B. CPMP/BWP/269/95) häufig 2 unterschiedliche Verfahrensschritte zur Virusreduktion im Herstellungsverfahren von Biologika integriert um ein breites Spektrum an Viren wie umhüllte und nicht-umhüllte Viren zu inaktivieren und/oder zu entfernen. So ist z.B. die Kombination SD-Verfahren und Trockenerhitzung ein weit verbreitetes Herstellungsverfahren bei Plasmaderivaten (Dichtelmüller et al., Improvement of virus safety of a S/D-treated factor VIII concentrate by additional dry heat treatment at 100 degrees C, Biologicals 24, 1996,125-30). Die Kombination Pasteurisierung mit einem oder mehreren chromatographischen Trennschritten ist ebenfalls eine Möglichkeit um ein breites Spektrum an Viren zu inaktivieren und zu entfernen.
Die HIC ist eine universelle Methode zur Reinigung von Makromolekülen (Proteinen) bei der die Substanzen über ihre hydrophoben Wechselwirkungen mit der Gel-Matrix aufgetrennt werden. Hierbei interagieren hydrophobe Regionen des Zielproteins mit den hydrophoben Liganden des Adsorbers. Als Liganden werden zumeist Kohlenwasserstoffketten unterschiedlicher Länge, z.B. Octylgruppen oder aromatische Liganden, gewählt. Ein hoher Salzgehalt, und damit verbunden eine hohe lonenkonzentration im Laufpuffer, blockiert ionische Wechselwirkungen und bringt die hydrophoben Regionen des Zielproteins zum Tragen. Daher ist es wichtig, für das Zielprotein die geeignete Salzkonzentration zu ermitteln. Durch die stabilisierende Wirkung hoher Salzkonzentrationen auf die Konformation des Zielproteins ist die HIC ein schonendes Verfahren der Proteinreinigung. Als Salze, die die hydrophobe Wechselwirkung verstärken können beispielsweise mit steigender Wirkung die Anionen Isothiocyanat, Chlorat, Nitrat, Bromid, Acetat, Sulfat und Phosphat eingesetzt werden. Die Kationen spielen nur eine untergeordnete Rolle. Insbesondere wird in der HIC das Sulfation in Form von Ammoniumsulfat eingesetzt.
Als Matrices für die HIC können beispielsweise eingesetzt werden: EthylVhexyl- /octyl-/decyl-imino-agarose, Phenyl-Superose, SynChropak Propyl and Hydroxypropyl, Methyl Sepharose, Phenyl Sepharose, Octyl Sepharose, Butyl Sepharose, Hexyl-S-Sepharose, Butyl-S-Sepharose, Pyridyl-S-Sepharose, Epoxy- and Polypropylene Glycol-Sepharose, TSK-Phenyl 5PW, Toyopearl Ether-5PW oder Phenyl-5PW.
Wie in „Hydrophobie Interaction Chromatography - Principles and Methods" (ISBN 91-970490-4-2) angegeben, sind wie bei allen adsorptiven, hoch selektiven chromatographischen Reinigungstechniken HIC Säulen generell niedrig. Eine typische HIC Säule ist auf eine Betthöhe von 5-15 cm gepackt. Wenn die Trennungsparameter einmal optimiert sind, wird ein Upscaling dann im allgemeinen durch Vergrößerung des Säulendurchmessers durchgeführt.
Der Einsatz der HIC zum Abtrennen von umhüllten Viren wurde beschrieben (Omar and Koblet, Semliki Forest virus particles containing only the E1 envelope glycoprotein are infectious and can induce cell-cell fusion, Virology 166, 1988, 17- 23). Die Bindung von großen nichtumhüllten Viren an in der HIC verwendete Matrices wurde am Beispiel von Adenovirus untersucht (Huyghe et al., Purification of a type 5 recombinant adenovirus encoding human p53 by column chromatography, Human Gene Therapy 6, 1995, 1403-1416).
Während mittels eines der HIC verwandten Reinigungsverfahrens, bei dem im Unterschied zur HIC aber nur eine niedrige (5OmM) Konzentration von Acetat eingesetzt wurde, die die hydrophobe Wechselwirkung der zu reinigenden Biologika nicht verstärkte, eine Abreicherung des Parvovirus MVM (Minute Virus of Mice) gezeigt werden konnte (Schwartz et al., Comparison of hydrophobic Charge induction chromatography with affinity chromatography on protein A for harvest and purification of antibodies, J. Chromat. 908, 2001 , 251-263.), wurde bislang kein Verfahren zur Abreicherung von nichtumhüllten Viren mit einem Durchmesser von weniger als 35nm, besonders von Picornaviren und Parvoviren, insbesondere von humanen Parvoviren mittels HIC beschrieben.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist unter HIC immer die Kontaktierung von Biologika mit für die HIC geeigneten Matrices in Anwesenheit von die hydrophobe Wechselwirkung verstärkenden Salzen, im Falle von Acetat in Konzentrationen über 5OmM zu verstehen.
Neben der bisher beschriebenen klassischen HIC welche einen Adsorptions- und einen Elutionsschritt umfasst, kann auch eine Auftrennung von Biologika über für die HIC geeignete Matrices erfolgen, ohne dass ein klassischer Adsorptionsschritt stattfindet. Eine HIC ohne Adsorptionsschritt, im folgenden als Durchfluss-HIC bezeichnet, findet beispielsweise statt, wenn Bedingungen gewählt werden, die den gewünschten Auftrennungseffekt erreichen, während der Auftragspuffer mit dem Elutionspuffer identisch ist. Die Vermeidung einer Adsorption der zu trennenden
Biologika kann allerdings auch bei Verwendung unterschiedlicher Puffer für Auftrag und Elution erreicht werden. Kennzeichnend für die Durchfluss-HIC ist, dass das zu reinigende Zielprotein im Auftragspuffer ohne Änderung des Puffers ins Eluat gelangen kann. Auch bei dieser Durchführung der HIC werden Salze eingesetzt, die die hydrophobe Interaktion verstärken.
Ein Verfahren zur Abreicherung von Viren aus Biologika mittels Durchfluss-HIC wurde am Beispiel der umhüllten Viren HBV und NANB gezeigt. Die Säulenhöhe der hydrophoben Matrix wurde wie für die HIC üblich niedrig gehalten, hier im unteren Drittel der vom Hersteller empfohlenen Säulenhöhe (5cm bei einer Empfehlung des Hersteller von 5-15cm; Einarsson et al., Removal of hepatitis B virus from a concentrate of coagulation factors II, VII, IX and X by hydrophobic interaction chromatography, Journal of Virological Methods, 4, 1981 , 213-28 sowie Einarsson et al., Removal of non-A, non-B hepatitis virus from a concentrate of the coagulation factors II, VII, IX and X by hydrophobic interaction chromatography, Scandinavian Journal of Infectious Diseases 17, 1985, 141 -6).
Die bei der industriellen Herstellung des Zielproteins eingeführten Verfahrensschritte zur Virusinaktivierung / Viruselimierung führen zu Plasmaproteinen mit einem sehr hohen Sicherheitsstandard. Hierbei gilt es allerdings zu beachten, dass nicht-hüllhaltige Viren, insbesondere Parvoviren, stabile Viren sind, die unter bestimmten Bedingungen nur eingeschränkt durch den eingeführten Verfahrensschritt zur Virusinaktivierung / Viruselimierung abgereichert werden. Es besteht deshalb weiterhin ein Bedarf an einem Verfahren zur Inaktivierung und/oder Eliminierung von Viren, insbesondere Parvoviren, aus einer Biologikalösung insbesondere einer Plasmaproteinlösung, das die biologische Aktivität des Zielproteins nicht beeinträchtigt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abreicherung von umhüllten und nicht-umhüllten Viren, insbesondere Parvoviren, aus einer Lösung von Biologika, insbesondere aus einer Plasmaproteinlösung unter Verwendung der HIC. Bevorzugt erfolgt hierbei die Viruseliminierung über eine HIC, die von der Standard- HIC abweicht. Die Durchführung der Standard HIC richtet sich nach den Herstellerangaben für die Säulenmatrix, die entsprechend den Herstellerangaben zu reinigen und zu äquilibrieren ist. Im vorliegenden Beispiel wurde als HIC-GeI- Matrix die Phenyl Sepharose 6 Fast Flow der Firma Amersham Biosciences eingesetzt, bei der eine Gelbetthöhe von 5-15 cm empfohlen wird. Faktoren - wie Flussrate, lonenstärke, Temperatur, pH - die das chromatographische Verhalten des Zielproteins in der HIC beeinflussen können, müssen optimiert werden. In der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass sich nicht-umhüllte Viren, die kleiner als 35 nm Durchmesser aufweisen (wie es bei CPV mit einem Durchmesser von etwa 20 nm der Fall ist) mittels HIC aus Biologika stark abreichern lassen.
Insbesondere wurde überraschenderweise gefunden, dass sich sowohl umhüllte Viren wie BVDV (ein Modellvirus für HCV) und HIV, als auch nichtumhüllte Viren mit einer stark erhöhten Effektivität abreichern lassen, wenn die bei der Durchführung der HIC gewählte Säulenhöhe über die nach allgemeinem Fachwissen gewählte bzw. von den Herstellern der Säulenmatrix empfohlene Säulenhöhe hinaus erhöht wird.
Überraschenderweise konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass eine vielfache Verlängerung der Gelbetthöhe über das von der Herstellerfirma vorgegebene Maß zu einer deutlichen Erhöhung der Virusabreicherung führt. So wurde insbesondere bei einer ca. 8fachen Gelbetterhöhung eine über 106 fache Erhöhung der Parvovirusabreicherung gefunden.
Ein Aspekt dieser Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reduktion infektiöser nicht- umhüllter Viren mit einem Durchmesser von weniger als 35 nm, insbesondere Parvoviren, besonders bevorzugt von Parvovirus B19 und verwandten Genotypen in Biologika, wobei der Abreicherungsschritt dadurch gewährleistet wird, dass das Biologikum während des Herstellprozesses mit für die hydrophobe Interaktionschromatograpie geeigneten Matrices in Gegenwart von die hydrophobe Interaktion verstärkenden Salzen in Kontakt gebracht wird.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung sind Verfahren zur Reduktion infektiöser Viren in Biologika, wobei der Abreicherungsschritt dadurch gewährleistet wird, dass das Biologikum während des Herstellprozesses mit für hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrices in Gegenwart von die hydrophobe Interaktion verstärkenden Salzen in Kontakt gebracht wird, wobei die Säulenhöhe der für hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrix mindestens 20 cm beträgt. Bevorzugt sind Säulenhöhen von mehr als 30 cm, besonders bevorzugt von mehr als 40 cm, noch mehr bevorzugt von mehr als 50 cm. Ganz besonders bevorzugt sind Säulenhöhen von mehr als 55 cm.
Ein besonders bevorzugter Aspekt dieser Erfindung sind Verfahren zur Reduktion infektiöser Viren in Biologika dadurch gekennzeichnet, dass das Biologikum während des Herstellprozesses mit für die hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrices in Gegenwart von die hydrophobe Interaktion verstärkenden Salzen in Kontakt gebracht wird, wobei die Säulenhöhe der für hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrix, mindestens 10 cm beträgt und das Biologikum in dem Auftragspuffer, in dem es auf die für die hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrix aufgetragen wird, nicht an diese Matrix adsorbiert. Als Adsorption wird in diesem Zusammenhang verstanden, dass das Biologikum nicht mit Auftragspuffer eluiert werden kann. Bevorzugt ist hierbei eine Säulenhöhe von mindestens 20cm. Weiter bevorzugt sind Säulenhöhen von mehr als 30 cm, besonders bevorzugt von mehr als 40 cm, noch mehr bevorzugt von mehr als 50 cm. Ganz besonders bevorzugt sind Säulenhöhen von mehr als 55 cm.
Die Erfindung umfasst ebenfalls die Kombination des erfindungsgemäßen Virusreduktionsverfahrens mit anderen Virus-Abreicherungs- oder Virus- Inaktivierungsverfahren.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch in keiner Weise einschränkende Wirkung haben sollen. Am Beispiel des Zielproteins C1 -Inhibitor (mit Ausnahme von Beispiel 1 , in welchem Fibrinogen untersucht wurde) lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt beschreiben: Beispiel 1
Das Canine Parvovirus (CPV), ein nicht-umhülltes Virus der Familie Parvoviridae, als Modellvirus für humanpathogene Parvoviren, wurde in Katzennierenzellen vermehrt und danach durch niedertourige Zentrifugation von Zellen und Zellresten getrennt. Der virushaltige Überstand wurde aliquotiert und bis zur Untersuchung bei <- 70 0C gelagert. Für die Durchführung wurde ein HIC-System mit drei verschiedenen Matrices verwendet. Die Auftrennung des Plasmaproteins Fibrinogen und des eingesetzten CPV1 mit einem Durchmesser von etwa 20 nm, erfolgte bei einer Flussrate von 1 ,5 ml/min in einem geeigneten Puffer (0,8 M Ammoniumsulfat, 0,01 M Tris, pH 7) bei Raumtemperatur. Die Detektion der Proteine erfolgte bei 280 nm. Das Ergebnis der Tabelle 1 zeigt, dass bei einer Gelbettlänge in der vom Hersteller vorgeschlagenen Dimension, keine nennenswerte Abreicherung des Parvovirus CPV erzielt wird.
Tabelle 1 : Keine CPV-Reduktion durch Standard-HIC
Figure imgf000010_0001
Beispiel 2
Für die Durchführung wurde ein HIC-System mit einer Phenyl Sepharose Matrix (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow der Firma Amersham Biosciences) verwendet. Die Auftrennung des Plasmaproteins Fibrinogen (kurze Säule) sowie des Zielproteins C1 -Inhibitor (lange Säule) und des eingesetzten CPV, erfolgte bei einer Flussrate von 1 ,5 ml/min in einem geeigneten Puffer (0,8 M Ammoniumsulfat, 0,01 M Tris, pH 7) bei Raumtemperatur. Die Detektion der Proteine erfolgte bei 280 nm. Das Ergebnis der Tabelle 2 zeigt, dass durch die Verlängerung der Phenyl Sepharose Säule von 7 cm auf 59 cm die CPV-Eliminierung um mehr als den Faktor 10 6erhöht wurde. Dies gilt gleichermassen für ungepackte (418 ml Gelvolumen) als auch für gepackte (512 ml Gelvolumen) Säulen.
Tabelle 2: Erhöhte C PV- Reduktion durch HIC nach Gelbettverlängerung
Figure imgf000011_0001
Beispiel 3
Für die Durchführung wurde ein HIC-System mit einer Phenyl Sepharose Matrix (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow der Firma Amersham Biosciences) verwendet. Die Auftrennung des Zielproteins C1 -Inhibitor und des eingesetzten CPV, sowie des human Hepatitis A Virus (HAV, Vertreter der Familie Picornaviren) erfolgte bei einer Flussrate von 1 ,5 ml/min in einem geeigneten Puffer (0,8 M Ammoniumsulfat, 0,01 M Tris, pH 7) bei Raumtemperatur. Die Detektion der Proteine erfolgte bei 280 nm. Bei der Durchfluss-HIC wurden Fraktionen aufgefangen und der Virusgehalt bestimmt. Das Ergebnis der Tabelle 3 zeigt, dass in den Fraktionen 1 und 2 sowie in der C1 -Inhibitor enthaltenden Fraktion (Fraktion 3) kein CPV nachweisbar war. Hingegen wurde in Fraktion 4 die gesamte CPV Virusmenge wiedergefunden. HAV wurde bereits in geringen Mengen in den Fraktionen 1-3 gefunden. Da jedoch die Hauptmenge an HAV in Fraktion 4 nachgewiesen wurde, während C1 -Inhibitor in Fraktion 3 enthalten ist, wurde auch für HAV eine effektive Abreicherung erzielt.
Tabelle 3: Verteilung des CPV und HAV Loads in der HIC
Figure imgf000012_0001
Beispiel 4
Das Bovine Virale Diarrhoevirus (BVDV), ein umhülltes Virus der Familie Flaviviridae, als Modellvirus für das humanpathogene Hepatitis C Virus, wurde in Rinderovarzellen vermehrt und danach durch niedertourige Zentrifugation von Zellen und Zellresten getrennt. Der virushaltige Überstand wurde aliquotiert und bis zur Untersuchung bei <- 70 0C gelagert. Für die Durchführung wurde ein HIC- System mit einer Phenyl Sepharose Matrix (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow der Firma Amersham Biosciences) verwendet. Die Auftrennung des Zielproteins C1 - Inhibitor und des eingesetzten Viruses BVDV, mit einem Durchmesser von etwa 40 bis 60 nm, erfolgte bei einer Flussrate von 1 ,5 ml/min in einem geeigneten Puffer (0,8 M Ammoniumsulfat, 0,01 M Tris, pH 7) bei Raumtemperatur. Die Detektion der Proteine erfolgte bei 280 nm. Das Ergebnis der Tabelle 4 zeigt, dass durch die Verlängerung der Phenyl Sepharose Säule von 6,25 cm auf 59 cm die BVDV- Eliminierung um mehr als den Faktor 1000 erhöht wurde. Dies gilt gleichermassen für ungepackte (418 ml Gelvolumen) als auch für gepackte (512 ml Gelvolumen) Säulen.
Tabelle 4: Erhöhte BVDV-Reduktion durch HIC nach Gelbettverlängerung
Figure imgf000013_0001
Beispiel 5
Das Human Immunodeficiency Virus (HIV), ein umhülltes Virus der Familie Retroviridae, wurde in Jurkat Zellen vermehrt und danach durch niedertourige Zentrifugation von Zellen und Zellresten getrennt. Der virushaltige Überstand wurde aliquotiert und bis zur Untersuchung bei <- 70 0C gelagert. Für die Durchführung wurde ein HIC-System mit einer Phenyl Sepharose Matrix (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow der Firma Amersham Biosciences) verwendet. Die Auftrennung des Zielproteins C1 -Inhibitor und des eingesetzten HIV, mit einem Durchmesser von etwa 80 bis 100 nm, erfolgte bei einer Flussrate von 1 ,5 ml/min in einem geeigneten Puffer (0,8 M Ammoniumsulfat, 0,01 M Tris, pH 7) bei Raumtemperatur. Die Detektion der Proteine erfolgte bei 280 nm. Das Ergebnis der Tabelle 5 zeigt, dass durch die Verlängerung der Phenyl Sepharose Säule von 6,25 cm auf 59 cm die HIV-Eliminierung um mehr als den Faktor 1000 erhöht wurde.
Tabelle 5: Erhöhte HIV-Reduktion durch HIC nach Gelbettverlängerung
Figure imgf000014_0001

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Reduktion infektiöser nicht umhüllter Viren mit einem Durchmesser von weniger als 35 nm, im Rahmen des Herstellprozesses eines Biologikums durch hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC).
2. Verfahren nach Anspruch 1 wobei es sich bei den infektiösen Viren um Picornaviren und/oder Parvoviren handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2 wobei es sich bei den infektiösen Viren um
HAV und/oder Parvovirus B19 und verwandten Genotypen handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 in Verbindung mit weiteren Virus- Abreicherungs- oder Virus-Inaktivierungsverfahren.
5. Verfahren zur Reduktion infektiöser Viren in Biologika wobei die Biologika während des Herstellprozesses mit für die hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrices in Kontakt gebracht werden und wobei die Säulenhöhe der für hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrix mindestens 20 cm beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5 wobei es sich bei den infektiösen Viren um Picornaviren und/oder Parvoviren handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6 wobei es sich bei den infektiösen Viren um
HAV und/oder Parvovirus B19 und verwandten Genotypen handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 5 wobei es sich bei den infektiösen Viren um Flaviviren, Retroviren oder Herpesviren handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 5 bis 8 in Verbindung mit weiteren Virus-
Abreicherungs- oder Virus-Inaktivierungsverfahren.
10. Verfahren zur Reduktion infektiöser Viren in Biologika, wobei die Biologika während des Herstellprozesses mit für die hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrices in Kontakt gebracht werden und wobei die Säulenhöhe der für hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrix, mindestens 10 cm beträgt und wobei das Biologikum in dem Auftragspuffer in dem es auf die für die hydrophobe Interaktionschromatographie geeigneten Matrix aufgetragen wird nicht an diese Matrix adsorbiert.
11. Verfahren nach Anspruch 10 wobei es sich bei den infektiösen Viren um Picornaviren und/oder Parvoviren handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11 wobei es sich bei den infektiösen Viren um HAV und/oder Parvovirus B19 und verwandten Genotypen handelt.
13. Verfahren nach Anspruch 10 wobei es sich bei den infektiösen Viren um Flaviviren, Retroviren oder Herpesviren handelt.
14. Verfahren nach Anspruch 10-13 in Verbindung mit weiteren Virus-
Abreicherungs- oder Virus-Inaktivierungsverfahren.
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