AT402607B

AT402607B - Verfahren zur gewinnung einer ein labiles verfahren zur gewinnung einer ein labiles protein enthaltenden zusammensetzung protein enthaltenden zusammensetzung

Info

Publication number: AT402607B
Application number: AT0368585A
Authority: AT
Original assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1985-12-19
Publication date: 1997-07-25
Also published as: US4613501A; CH664373A5; ATA368585A

Description

AT 402 607 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer ein labiles Protein enthaltenden Zusammensetzung, welches Verfahren das Inberührungbringen einer ein labiles Protein und lipidhaltige Viren enthaltenden Zusammensetzung mit einem Virusinaktivierungsmittel umfaßt, um eine Zusammensetzung zu erzeugen, welche ein labiles Protein und inaktivierte lipidhaltige Viren enthält, wobei die Ausbeute an Proteinaktivität, bezogen auf das Gesamtprotein, wenigstens 70 % beträgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Inaktivierung von Viren, insbesondere von lipidbeschichteten Viren, z.B. Hepatitis B in Humanblut, einem Blutbestandteil, Blutplasma oder einer Fraktion, einem Konzentrat oder einem Derivat davon, welches Blutproteine oder nicht aus Blut stammende Quellen einschließlich normaler oder Krebszellen enthält, dem Exsudat von Krebs- oder normal gezüchteten Zellen, Hybridomas, in Produkten der rekombinanten DNA-Technologie usw. durch Verwendung von Ölsäure, ihren Estern und Salzen. Ganz besonders bezieht sich die Erfindung auf die Behandlung von Blutplasma oder anderen plasmaproteinhaltigen Zusammensetzungen, welche im wesentlichen von Hepatitis B und/oder non-A- und non-B-Hepatitis oder einer anderen viralen Infektivität befreit werden sollen, wobei ein solches Blutplasma oder Fraktionen davon wertvolle labile Proteine wie z.B. den Faktor VIII aufweisen.

Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden, Viren wie das Hepatitis-B-Virus (HBV) im Blutplasma von Säugetieren, insbesondere beim Menschen, zu inaktivieren. In einigen Ländern ist es üblich, das Hepatitis-B-Virus im Blutplasma zu inaktivieren, indem das Plasma mit einem virusinaktivierenden Mittel eines Typs in Kontakt gebracht wird, welcher mit dem Proteinanteil des Hepatitis-B-Virus vernetzt oder welcher mit der Nukleinsäure des Virus zusammenwirkt. Zum Beispiel ist es bekannt, zu versuchen, das Hepatitis-B-Virus durch Kontakt mit einem Aldehyd wie Formaldehyd zu inaktivieren, wobei Vernetzung mit dem Protein bewirkt wird und das Hepatitis-B-Virus inaktiviert wird. Es ist weiter bekannt, die Inaktivierung des Virus durch Kontakt mit beta-Propiolakton (BPL) zu bewirken, einem Mittel, welches auf die Nukleinsäure des Virus einwirkt. Weiter ist es bekannt, ultraviolettes Licht (UV) anzuwenden, insbesondere nach einer Behandlung mit beta-Propiolakton.

Weitere Inaktivierungsmittel umfassen niedere Alkylester von Essigsäure für die Inaktivierung des Grippevirus (US 3,655,871); Glutaraldehyd (US 3,983,229 und US 4,070,454); Tri-n-butyl-phosphat zur Inaktivierung des Grippevirus (US 3,962,421); butyliertes Hydroxytoluol (US 4,350,707); Sulfhydryl (US 3,651, 211); Ethylenimin (US 3,636,196 und US 4,036,952); Beta-Propiolakton kombiniert mit Acetyl-ethylenimin (US 4,083,958) und Tannin (US 4,178,126). Auch Detergentien wurden als virusinaktivierende Mittel beschrieben (siehe US 4,314,997 und 4,315,919). Mikrowellen wurden ebenfalls vorgeschlagen und beschrieben in US 3,660,234. In US 4,424,206 wird die Anwendung von Hitze beschrieben. Verschiedene chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Tetrachlorethylen sind zur Inaktivierung von Myxoviren vorgeschlagen worden (siehe US 3,847,737). Leider ändern, denaturieren oder zerstören Mittel, die Viren inaktivieren, häufig wichtige Proteinbestandteile, insbesondere sogenannte "labile" Blutgerinnungsfaktoren des Plasmas unter den für eine wirksame Inaktivierung der Virusinfektivität erforderlichen Bedingungen. Zum Beispiel wird hierin der Faktor VIII zu 50 bis 90% oder mehr, bezogen auf seinen Gehalt im unbehandelten Plasma inaktiviert oder denaturiert. Wegen der Denaturierungseffekte dieser virusinaktivierenden Mittel ist es bei der Herstellung von Derivaten für die Verabreichung an Patienten notwendig, große Menge des Plasmas zu konzentrieren, damit das dem Patienten verabreichte Material wieder eine ausreichende Konzentration an nicht denaturiertem Protein für eine wirksame therapeutische Behandlung aufweist. Diese Konzentration beeinträchtigt jedoch nicht die Verringerung der Menge an denaturiertem Protein. Als Ergebnis erhält der Patient nicht nur nicht-denaturiertes Protein, sondern auch eine Menge an denaturiertem Protein, die häufig ein Vielfaches der Menge des undenaturieten Proteins ist.

So wird z.B. bei der Inaktivierung von Hepatitis-B-Virus im menschlischen Blutplasma mit Beta-Propiolakton ein Plasma erhalten, dessen Faktor VIII zu 75% inaktiviert wurde. Die verbleibenden 25% des Faktors VIII sind daher in einer so geringen Konzentration als eine Funktion des Plasmas selbst vorhanden, daß es notwendig ist, große Mengen des Faktors VIII zu konzentrieren, um eine ausreichende Konzentration, die von therapeutischem Wert ist, bereitzustellen. Da solche Trenntechniken denaturierten Faktor VIII von nicht denaturiertem Faktor VIII nicht wirksam trennen, kann das dem Patienten verabreichte Material mehr denaturiertes als nicht-denaturiertes Protein enthalten. Sicher ist eine solche Inaktivierung wertvoll vom Standpunkt einer Verringerung des Risikos einer Infektion mit Hepatitisvirus, jedoch erfordert sie die Verarbeitung von großen Plasmamengen und stellt einen signifikanten Verlust an wertvollen Proteinbestandteilen dar.

Weiter kann die Verabreichung von großen Mengen an denaturierten Proteinen dazu führen, daß sie antigen für den Wirt werden, und daher zu Autoimmunkrankheiten, wie z.B. rheumatischer Arthritis, führen. Der Verlust an diesen wertvollen Proteinkomponenten ist nicht auf den Faktor VIII beschränkt, eines der labilsten der wertvollen Proteine im Blutplasma von Säugetieren. Eine ähnliche Proteindenaturierung tritt bei folgenden anderen wertvollen Plasmabestandteilen auf: Gottnnungsfaktoren II, VII, IX, X; Plasmin, Fibrinogen 2

AT 402 607 B (Faktor I) IgM, Hämoglobin, Interferon usw.

Faktor VIII wird jedoch zu einem größeren Ausmaß als viele andere Plasmaproteine denaturiert.

Daher wird, ausgenommen bei der Verarbeitung von Serumalbumin, einer stabilen Plasmaproteinlösung, welche die Pasteurisierung aushalten kann, weitgehend in den Vereinigten Staaten bei der Verarbeitung von Blutproteinen keine Sterilisierungsmaßnahme zur Inaktivierung von Viren vorgenommen. Als Ergebnis müssen die Empfänger von Faktor VIII, Gammaglobulin, Faktor IX, Fibrinogen usw. das Risiko akzeptieren, daß die wertvollen, verabreichten Proteinkomponenten mit Hepatitisvieren ebenso wie mit anderen anstek-kenden Viren verunreinigt sein können. Diese Empfänger sind daher mit der Gefahr konfrontiert, durch diese Viren angesteckt zu werden, und leiden unter der Beeinträchtigung, die das Virus in der Leber und anderen Organsystemen verursacht, sowie der folgenden Anfälligkeit und Krankheit, die zum Tod führen kann.

Das weiter oben beschriebene Verfahren der Inaktivierung mit BPLVUV wurde bisher aus zahlreichen Gründen in den Vereinigten Staaten nicht angenommen. Einer dieser Gründe liegt darin, daß viele Forscher glauben, daß BPL selbst schädlich ist, da es im Anschluß an die Inaktivierung nicht vollständig entfernt werden und daher im Plasma und den Plasmaderivaten verbleibt. Es hat sich gezeigt, daß BPL bei Tieren krebserzeugend wirkt und selbst für das Personal, welches damit umgeht, gefährlich ist. Weitere Methoden zur Inaktivierung von Hepatitis-B-Virus im Plasma sind bekannt, aber gewöhnlich unpraktisch. Eine Methode betrifft die Zugabe von Antikörpern zum Plasma, wobei sich ein Immunkomplex bildet. Die Kosten der Antikörperbildung und Reinigung tragen signifikant zu den Kosten der Plasmaherstellung bei; weiter gibt es keine Sicherheit, daß eine hinreichende Menge von Hepatitis-B oder non-A-non-B Virus inaktiviert wird. Es gibt derzeit keinen Test für non-A,-non-B Antikörper (obwohl es einen Test für das Virus gibt); daher ist es nicht möglich, Plasma mit hohen Gehalten an Anti-non-A,-non-B Antikörper auszuwählen.

Es ist davon auszugehen, daß die Probleme der Inaktivierung von Viren im Plasma von den Problemen der Inaktivierung der Viren selbst verschieden sind, und zwar aufgrund der Mitanwesenheit der erwünschten Proteinkomponenten des Plasmas. Während es daher bekannt ist, wie das Hepatitis-B-Virus zu inaktivieren ist, durch Vernetzungsmittel, z.B. Glutaraldehyd, mit Nukleinsäuren reagierenden Chemikalien, z.B. BPL oder Formaldehyd oder Oxidationsmittel, z.B. Chlorox usw., wurde dagegen angenommen, daß diese Methoden für die Inaktivierung des Virus im Plasma nicht geeignet sind aufgrund der Beobachtung, daß die meisten dieser Inaktivierungsmittel (Natriumhypochlorit, Formaldehyd, Beta-Propiolakton) die wertvollen Proteinbestandteile des Plasmas denaturieren. In US 4,315,919 (Shanbrom) wird ein Verfahren zur Depyro-genierung eines proteinhaltigen, biologischen oder pharmazeutischen Produkts beschrieben, indem das proteinhaltige Produkt mit nicht denaturierenden Amphiphile in Kontakt gebracht wird.

In US 4,314,997 (Shanbrom) wird ein Verfahren zur Verringerung der Pyrogenizität, Hepatitisinfektivität und Gerinnungsaktivierung eines Plasmaprodukts beschrieben, indem dieses Produkt mit einer nicht denaturierten Amphiphile in Berührung gebracht wird. Sowohl Shanbrom '919 als auch '997 erwägen die Verwendung eines nicht-ionischen Detergens, z.B. "Tween 80" (Polyoxyethylensorbitanmonooleat) als Amphiphile. In US 4,540,573 wird gezeigt, daß die Behandlung mit "Tween 80" relativ unwirksam als virusinaktivierendes Mittel ist.

In US 3,962,421 wird ein Verfahren zur Spaltung von infektiösen lipidhaltigen Viren für die Herstellung von Vakzinen-Untereinheit beschrieben, indem das Virus in einem wässrigen Medium mit einem Netzmittel und einem Trialkylphosphat in Berührung gebracht wird. Ein solches wässriges Medium wird definiert als Allantoin-Flüssigkeit, Gewebekulturflüssigkeit, wässriger Extrakt oder Suspension von Gewebe des zentralen Nervensystems, Blutzelleneluat und ein wässriger Extrakt oder Suspension von Hühnerembryo. Weder wird Hepatitis beschrieben noch die Herstellung von Blutderivaten, welche labile, im wesentlichen von Virusinfek-tivität als Blutprotein enthalten.

Lediglich das Zerreißen der Umhüllung der lipidhaltigen Viren für die Herstellung von Impfstoffen, aber nicht die Verhinderung oder Verringerung der Proteindenaturierung auf dem Weg zu einem Blutderivat werden erwähnt.

In EP 9277 wird eine Vakzine gegen Newcastle-Krankheit beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiete von Blutderivaten wird aber spezielle Fachinformationen aus dem Gebiet der Vakzintechnik nicht besonders berücksichtigen. Bei der Synthese von Vakzinen wird nämlich, im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, nicht auf die Beibehaltung von Proteinaktivität geachtet. In der zitierten EP 9277 erfolgt das Inberührungbringen mit der Ölphase nach der Inaktivierung, d.h. die Exponierung gegenüber Lipiden erfolgt nach der Inaktivierung. Somit sind die Lipide an der Inaktivierung nicht beteiligt. Die Inaktivierung vor der Einführung von Lipiden erfolgt durch Verwendung üblicher Inaktivatoren. Die Tatsache, daß die Inaktivierung vor der Verwendung von Lipiden erfolgt, ist an vielen Stellen in der EP 9277 beschrieben. Diese Literaturstelle enthält somit keine Lehre oder auch nur eine diesbezügliche Anregung, eine Inaktivierung von Viren unter Anwendung von Lipiden unter solchen Bedingungen vorzunehmen, unter denen die Aktivität eines labilen 3

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Proteins aufrechterhalten wird.

Es existieren auch Probleme bei der Derivierung wertvoller Proteine aus Quellenmaterial auf Nicht-Blutbasis. Solches Quellenmaterial umschließt, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Milch von Säugetieren, Ascites-Flüssigkeit, Speichel, Placentaextrakte, Gewebekulturzellinie und ihre Extrakte einschließlich transformierter Zellen sowie Produkte der Fermentation, z.B. wurden menschliche Lymphoblastoid-Zellen isoliert und zur Erzeugung von Interferon verwendet. Jedoch enthält die heute im Handel verwendete Zellinie Epstein-Barr-Virus-Gene. Es bestehen Bedenken, daß die Verwendung von durch diese Zellen produziertem Interferon Virusinfektionen übertragen oder durch Viren verursachtes Krebswachstum auslösen kann.

Die Erfindung ist auf die Erreichung dreier Ziele gerichtet, nämlich (1) eine sichere, (2) Virus-desaktivierte, proteinhaltige Zusammensetzung (3), ohne daß diese einer nennenswerten Proteindenaturierung unterliegt. Wie weiter oben gezeigt, sind diese drei Ziele nur schwer miteinander vereinbar, da z.B. Beta-Propiolakton virale Infektivität inaktiviert, jedoch unsicher ist, und Substanzen wie Formaldehyd Viren inaktivieren, jedoch auch die wertvollen Proteine, z.B. den Faktor VIII denaturieren.

Es wäre daher erwünscht, ein Verfahren zur Gewinnung einer proteinhaltigen Zusammensetzung bereitzusteilen, durch welches die wertvollen Proteinkomponenten nicht wesentlich denaturiert werden und welches nicht die Verwendung eines erwiesenermaßen karzinogenen Mittels zur Folge hat. Insbesondere ist es erwünscht, Blutprotein in der Weise zu verabreichen, in der im wesentlichen alle Hepatitisviren und andere anwesende Viren inaktiviert sind und in der denaturiertes Protein wie Faktor VIII nur einen kleinen Anteil an der Gesamtmenge dieser Proteine in der blutproteinhaltigen Zusammensetung ausmachen.

Es ist ein weiteres Ziel, Produkte aus Krebszellen oder normalen Zellen oder aus Fermentationsprozessen im Anschluß an Geninsertionen bereitzustellen, die im wesentlichen frei von Viren, insbesondere lipidhaltigen Viren, sind.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß, während die meisten der virusinaktivierenden Mittel den Faktor VIII und andere wertvolle Blutplasmaproteine denaturieren, nicht alle virusinaktivierenden Mittel diesen Effekt haben. Es wurde gefunden, daß dann, wenn man proteinhaltige Zusammensetzungen wie Blutproteine einschließlich Gesamtblut, Blutzellproteine, Blutplasma, ein Präzipitat einer Blutplasmafraktionierung, der Überstand einer Blutplasmafraktionierung, ein Kryopräzipitat, ein Kryoüberstand oder ein Teil der Derivat hiervon oder Serum oder ein Nicht-Blutprodukt, hergestellt aus normalen oder Krebszellen (z.B. durch DNA-Rekombinationstechnologie), mit einer 0,01 Gew.-% bis 0,1 Gew.-% betragenden Menge an Ölsäure als dem Virusinaktivierungsmittel, mit einem ihrer C1-C4-Alkylester oder mit einem Alkali- oder Erdalkalimetallsalz davon, zur Inaktivierung des darin enthaltenen Virus bis zu 5 Stunden lang in Berührung bringt, wobei dieses Inberührungbringen gegebenenfalls in der Gegenwart eines Netzmittels durchgeführt wird, lipidhaltige Viren wie die in der Zusamensetzung anwesenden Hepatitisviren praktisch vollständig ohne nennenswerte Denaturierung der darin enthaltenen Proteine inaktiviert werden. Durch Kontakt einer Mischung oder eines Konzentrats oder einer Fraktion eines Blutproteins mit Ölsäure oder einem C1-4-Alkylester oder einem Alkali- oder erdalkalisalz können Hepatitisviren wesentlich inaktiviert werden, z.B. mehr als 4 Logs, während eine proteinaktivität, bezogen auf Gesamtprotein von wenigstens 60 %, realisiert wird.

Durch ein solches Verfahren wird eine blutproteinhaltige Zusammensetzung wie Gesamtblut von Säugetieren, Blutzellderivaten (z.B. Hämoglobin, Alpha-Interferon, T-Zellenwachstumsfaktor, von Blutplättchen derivierter Wachstumsfaktor usw.), Plasminogenaktivator, Blutplasma, Blutplasmafraktion, Blutplasmapräzipitat (z.B. Kryopräzipitat, Ethanolüberstand oder Polyethylenglykoiüberstand) bereitgestellt, die gekennzeichnet ist durch die Anwesenheit von einem oder mehreren Blutproteinen, wie dem labilen Blutfaktor VIII mit einer Gesamtausbeute oder Proteinaktivität, bezogen auf Gesamtprotein von wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 70%, der blutproteinhaltigen Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung nur wenige oder praktisch keine Hepatitisviren enthält.

In der Folge wurde der Virustiter der Sera bestimmt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die meisten, wenn nicht praktisch alle Hepatitisviren inaktiviert. Das Verfahren zur Bestimmung der Infektivitätsraten an Schimpansen in vivo wird erörtert von Prince, A.M., Stephen, W., Brotman, B. und van den Ende, M.C., "Evaluation of the Effect of Beta-propiolactone/Ultraviolet Irradiation (BPL/UV) Treatment of Source Plasma on Hepatitis Transmission by factor IX Complex in Chimpanzees, Thrombosis and Haemostasis", 44, 138-142,1980.

Das Hepatitisvirus wird durch Behandlung mit Ölsäure, ihren Estern oder Salzen inaktiviert, und nicht etwa durch Einschluß in das Plasma von Antikörpern, welche sich mit den Hepatitisviren unter Bildung von Immunkomplexen verbinden.

Die Inaktivierung des Virus wird erreicht bis zu dem Ausmaß von wenigstens "4 log", d.h. das Virus in einem Serum ist vollständig inaktiviert bis zu dem Ausmaß, welches durch Infektivitätsstudien bestimmt wird, wobei dieses Virus in dem unbehandelten Serum in einer derartigen Konzentration anwesend ist, daß 4

AT 402 607 B selbst nach einer Verdünnung auf 104 virale Aktivität gemessen werden kann.

Blut besteht aus Feststoffen (Zellen, d.h. Erythrocyten, Leukocyten und Thrombocyten) und Flüssigkeit (Plasma). Die Zellen enthalten potentiell wertvolle Substanzen, wie Hämoglobin, und sie können zur Herstellung weiterer potentiell wertvoller Substanzen, wie Interferone, Wachstumfaktoren und weiterer biologischer Responsmodifikatoren veranlaßt werden. Das Plasma ist im wesentlichen aus Wasser, Salzen, Lipiden und Proteinen aufgebaut. Die Proteine sind in die Gruppen Fibrinogene, Serumglobuline und Serumalbumine aufgeteilt. Typische Antikörper (Immunglobuline) im menschlichen Blutplasma schließen solche gegen infektiöse Hepatitis, Grippe H usw. ein.

Bluttransfusionen werden zur Behandlung von Anämie (resultierend aus Krankheit oder Hemorrhagie), Schock (resultierend aus Verlust an Plasmaproteinen oder Verlust an Zirkulationsvolumen), Krankheiten, wo ein adäquates Niveau an Plasmaproteinen nicht aufrechterhalten wird, z.B. Hämophilie, sowie zur passiven Immunisierung verwendet.

Gesamtblut muß vor der Verabreichung sorgfältig typisiert und kreuzweise verglichen werden. Plasma erfordert jedoch keinen vorherigen Test. Für bestimmte Anwendungen wird nur eine geeignete Fraktion des Plasmas gefordert, wie der Faktor VIII für die Behandlung von Hämophilie oder Willebrand'scher Krankheit. Bei bestimmten Krankheiten fehlen eine oder mehrere der Blutkomponenten. Daher genügt die Verabreichung der richtigen Fraktion und die anderen Bestandteile werden nicht an den Patienten "verschwendet". Die anderen Fraktionen können für einen anderen Patienten verwendet werden. Die Trennung des Bluts in Bestandteile und ihre anschließende Fraktionierung erlaubt die Konzentrierung der Proteine, so daß Konzentrate behandelt und dann verabreicht werden können. Von großer Wichtigkeit ist auch die Tatsache, daß die Plasmafraktionen wesentlich länger als Gesamtblut gelagert werden können, und daß sie im flüssigen, gefrorenen oder getrockneten Zustand in der Verkehr gebracht werden können. Schließlich ist es möglich, von Blutbanken die Plasmaanteile von veraltetem Gesamtblut zu verwerten, welches für die Verabreichung von Gesamtblut unsicher ist.

In Humanplasma gefundene Proteine umfassen Präalbumin, retinolbindendes Protein, Albumin, Alpha-Globuline, Beta-Globuline, Gamma-Globuline (Immunserumglobuline), die Koagulierungsproteine (Antithrombin III Prothrombin, Plasminogen, Antihämophilie-Faktor (AHF), Faktor IX, fibrinstabilisierender Faktor-Faktor XIII, Fibrinogen), Immunoglobine (Immunoglobuline G, A, M, D und E) und die Komplementärkomponenten. Es gibt derzeit mehr als 100 beschriebene Plasmaproteine. Eine umfassende Auffstellung ist zu finden in "The Plasma Proteins", ed. Putnam, F.W., Academic Press, New York (1975).

Proteine, die in der Blutzellenfraktion gefunden werden, umschließen Hämoglobin, Fibronectin, Fibrinogen, Enzyme des Kohlenhydrats- und Proteinstoffwechsels und Produkte von Blutzellen, z.B. Elastase usw. Zusätzlich kann die Synthese von weiteren Proteinen, wie Interferonen und Wachstumsfaktoren induziert werden. Eine umfassende Liste von induzierbaren Leukocytproteinen zu finden in Stanley Cohen, Edgar Pick, J.J. Oppenheim, "Biology of the Lymphokines", Academic Press, N.Y. (1979).

Die Biutplasmafraktionierung betrifft im allgemeinen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wie Ethanol, Ether und Polyethylenglykol bei niedrigen Temperaturen und bei kontrollierten pH-Werten, um die Ausfällung einer besonderen Fraktion, welche ein oder mehrere Plasmaproteine enthält, zu bewirken.

Der erhaltene überstand selbst kann dann ausgefällt werden bis der erwünschte Fraktionierungsgrad erreicht worden ist. Neuere Trennungen basieren auf chromatographischen Verfahren. Eine ausgezeichnete Übersicht über Blutfraktionierungen erscheint in Kirk-Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology, dritte Auflage, Interscience Publishers, Band 4, Seiten 25 bis 62.

Die Hauptbestandteile einer kalten Ethanolfraktionierung sind:

Fraktion Proteine I Fibrinogen, Kalt unlösliches Globulin; Faktor XIII, Properdin II und III IgG; IgM; IgA; Fibrinogen; Beta-Lipoprotein; Prothrombin; Plasminogen; Plasmininhibitor; Faktor V; Faktor VII; Faktor IX; Faktor X; Thrombin; Antithrombin; Isoglutinine; Cerutoplasmin; Komplementär C'1, C'3 IV-1 Alphai -lipoprotein, Cerutoplasmin; Plasmininhibitor; Faktor IX; Peptidase; Alpha-und-beta-globuline 5

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Fraktion Proteine IV-4 Transferrin; thyroxinbindendes Globulin; Serumesterase, AiphaHipoprotein; Albumin; alkalische Phosphatase V Albumin; Alpha-globulin VI Alphai -saures Glycoprotein; Albumin

Das obige Fraktionierungsschema kann als Basis für weitere Fraktionierungen dienen. Fraktion II und III kann bspw. weiter zwecks Erhalt von Immunserum-Globulin (ISG) fraktioniert werden.

Ein weiteres Fraktionsschema betrifft die Verwendung von gefrorenem Plasma, das aufgetaut wird, wobei ein Kryoprezipitat, welches AHF (Antihämophilie-Faktor) und Fibronectin enthält, sowie ein Kryo-Überstand erhalten wird. Der Überstand wird dann in Fibronectin und AHF fraktioniert.

Polyethylenglykol wurde zur Herstellung von hochreinem AHF und nicht-aggregiertem ISG verwendet. Hoch infektiöse Produkte im Hinblick auf die Übertragung von Hepatitis-B und non-A,-non-B sind Fibrinogen, AHF und Prothrombinkomplex, sowie alle anderen Blutproteinpräparate außer Immunserumglobulin und, da sie pasteurisiert sind, Albuminlösungen. Gegenwärtig verfügbare Hepatitistests zeigen die Anwesenheit von Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen, jedoch gibt es gegenwärtig keinen Screeningtest für non-A,-non-B-Hepati-tis.

Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, eine blutproteinhaltige Zusammensetzung, wie Gesamtblut von Säugetieren, Blutzellen davon, Blutzellproteine, Blutplasma davon, Präzipitate aus beliebigen Fraktionen eines solchen Plasmas, Überstände aus einer Fraktionierung eines solchen Plasmas, Kryopräzipitate, Kryoüberstände oder beliebige Anteile oder Derivate der vorstehenden Komponenten, welche Blutproteine, wie z.B. Prothrombinkomplex (Faktoren II, VII, IX und X) und Kryopreziptitat (Faktoren I und VIII) enthalten, mit einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure in Berührung zu bringen. Die Erfindung betrifft ebenso den Kontakt eines Serums, welches ein oder mehrere Blutproteine enthält, mit Ölsäure, ihren Estern oder Salzen. Weiter ist die Erfindung darauf gerichtet, Ölsäure oder Ölsäurederivate mit einer blutproteinhaltigen Fraktion, die wenigstens Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Fibrinogen und/oder IgM enthält, in Berührung zu bringen.

Eine solche blutproteinhaltige Zusammensetzung wird mit Ölsäure, ihrem Ester oder Salz in Berührung gebracht. Wenn ein Ester angewendet wird, hat die Estergruppe einen Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere eine Methyl- oder Ethylgruppe. Besonders geeignete Salze sind das Natrium- und Kaliumsalz, insbesondere Natriumoleat. Die Ölsäure, ihr Ester oder Salz kann mit oder ohne Netzmittel angewandt werden. Es ist jedoch möglich, die Ölsäure, ihren Ester oder Salz in Verbindung mit einem Netzmittel anzuwenden. Solche Netzmittel können entweder vor, gleichzeitig mit oder nach dem Kontakt der Ölsäureverbindung mit der blutproteinhaltigen Zusammensetzung zugegeben werden. Die Wirkung des Netzmittels ist es, die Berührung des Virus in der blutproteinhaltigen Zusammensetzung mit der Ölsäureverbindung zu vergrößern. Das Netzmittel allein inaktiviert das Virus nicht ausreichend. Bevorzugte Netzmittel sind nichttoxische Detergentien. Geeignete nicht-ionische Detergentien sind solche, welche bei der herrschenden Temperatur wenigstens 0,1 des Fetts in einer wässrigen, fetthaltigen Lösung dispergieren, wenn ein Gramm Detergens pro 100 ml Lösung eingebracht werden. Besonders geeignete Detergentien sind die Polyoxyeth-ylenderivate von Fettsäuren, Teilester von Sorbitolanhydriden, z.B. die unter den Markenbezeichnungen "Tween 80", "Tween 20" und "Polysorbat 80” bekannten Produkte, sowie nicht-ionische, öllösliche Wasserdetergentien, wie die unter dem Markennamen "Triton X 100" (oxyethyliertes Alkylphenol) bekannten Produkte. Ebenso geeignet sind Gallensäuresalze, wie Natriumdeoxycholat ebenso wie die "Zwittergents", welche synthetische zwitterionische Detergentien, bekannt als "Sulfobetaine" wie N-dodecyl-N, N-dimethyl-2-ammonio-1 Ethansulfonat und seine Analogen sind, oder nicht-ionische Detergentien, wie Octyl-beta-D-glucopyranosid. Substanzen, welche die Wirksamkeit der Ölsäureverbindung verbessern, umfassen Reduktionsmittel, wie Mercaptoethanol, Dithiothreit, Dithioerythrit und Dithiooctansäure. Geeignete nichtionische, oberflächenaktive Mittel sind oxyethylierte Aklylphenole, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Poly-oxyethylensäuren, Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylenöle und Polyoxyethylenoxypropylenfettsäuren. Einige spezielle Beispiele sind:

Alkylphenoxypolyethoxy-(3)-ethanol

Polyoxyethylen-(2)-sorbitanmonolaurat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonopalmitat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonostearat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitantristearat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitantrioleat 6

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Polyoxyethylen-(20)-palmitat Polyoxyethylen-(20)-Iaurylether Polyoxyethylen-(20)-cetylether Polyoxyethylen-(20)-stearylether s Polyoxyethylen-(25)-oleylether

Polyoxyethylen-(25)-hydriertes Kastorö I .Polyoxyethylen-(25)-oxypropylenmonostearat

Die Menge an Netzmittel, falls angewendet, ist nicht wesentlich, sie beträgt bspw. etwa 0,001% bis 10%, vorzugsweise etwa 0,01 bis 1,5%. io Di- und Trialkylphosphate, wie in US 4,540,573 und SN 631,675 beschrieben, können in Verbindung mit den Ölsäureverbindungen angewendet werden, die auch in Verbindung mit anderen Inaktivierungsmitteln, wie Alkohol oder Ethern mit oder ohne gleichzeitige Gegenwart von Netzmittel gern. SN 368,250 "Sterilized Plasma and Plasma Derivates and Process Therefor", des gleichen Erfinders beschrieben sind.

Der Ether oder der Alkohol kann in einer Menge von 1 bis 50, vorzugsweise 5 bis 25 Gew.-%, bezogen auf 75 das Volumen des zu behandelnden Blutplasmas, eines Konzentrats oder einer anderen blutplasmaproteinhaltigen Verbindung verwendet werden.

Besonders geeignete Ether für die erfindungsgemäße Inaktivierung sind solche der Formel R’-O-R2 20 worin R1 und R2 unabhängig voneinander Ci -Cie-Alkyloder Alkenyl bedeuten, die ein Sauerstoff- oder Schwefelatom in ihrer Kette enthalten, können bevorzugt Ci-Cs-Alkyloder Alkenyl. Besonders geeignete Ether sind Dimethylether, Diethylether, Ethylpropylether, Methylbutylether, Methylisoproylether und Methyli-sobutylether. Geeignete Alkohole haben die Formel 25

R3OH worin R3 ein Ci -Ci s-A(kyl- oder Alkenylrest ist, der ein oder mehrere Sauerstoff- oder Schwefelatome in der Kette enthalten kann und der durch ein oder mehrere Hydroxygruppen substituiert sein kann. Besonders 3o geeignete Alkohole sind solche, wo die Alkyl- oder Alkenylgruppe 1 bis 8 Atome aufweist. Besonders geeignete Alkohole sind Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, n-Pentanol und die Isopentanole. Ebenfalls geeignete Verbindungen sind Ethylenglykol, 1,2-Propylenglykol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 2-Hydroxyisobutanol (2-Methyl-1,2-dihydroxypropan).

Die Behandlung der blutproteinhaltigen Zusammensetzungen mit Trialkylphosphat wird bei einer Tempera-35 tur zwischen -5 und 70 *C, vorzugsweise zwischen 0 und 60 *C vorgenommen. Die Zeit der Behandlung (Berührung) beträgt wenigstens 1 Minute, vorzugsweise wenigstens 1 Stunde und im allgemeinen 4 bis 24 Stunden. Die Behandlung erfolgt normalerweise unter Normal-Druck, obwohl auch Unter- oder Überdruck angewendet werden kann.

Normalerweise werden nach der Behandlung die Ölsäureverbindung und andere Inaktivierungsmittel, z.B. 40 Ether entfernt, obwohl dies nicht in allen Fällen in Abhängigkeit von der Art des das Virus inaktivierenden Mittels und derbeabsichtigten Weiterverarbeitung der blutplasmaproteinhaltigen Zusammensetzung erforderlich ist.

Bei Entfernung des Ethers vom Plasma wird das Plasma im allgemeinen einer Temperatur von 4 bis 37 * C unter leichtem Vakuum zwecks Abzug des restlichen Ethers unterworfen. Bevorzugt wird das Plasma als ein 45 dünner Film ausgebreitet, um maximalen Kontakt und Entfernung des Ethers zu gewährleisten. Andere Methoden zur Entfernung von Ether sind: (1) Durchleiten von Stickstoffgas (2) Diafiltration unter Verwendung etherunlöslicher, mikroporöser Membranen, die die Plasmaproteine zurückhalten (z.B. Tetrafluorethylen) so (3) Absorption der gewünschten Plasmakomponenten auf chromatographischen oder affinitätschromatographischen Trägern (4) Ausfällung, z.B. durch Aussalzen von Plasmaproteinen (5) Lyophilisierung

Wenn Alkohol oder nicht-ionische Detergentien mit den Ölsäureverbindungen angewendet werden, werden 55 diese durch die obigen Methoden (2) bis (5) entfernt.

Di- oder Trialkylphosphate können wie folgt entfernt werden: (a) Die Entfernung von AHF kann bewirkt werden durch Ausfällung von AHF mit 2,2 molarem Glycin und 2,0 M Natriumchlorid 7

AT 402 607 B (b) Die Entfernung von Fibronectin kann bewirkt werden durch Bindung des Fibronectins an einer Säule aus insolubilisierter Gelatine und reagenzfreies Auswaschen des gebundenen Fibronectins.

Alkohol wird normalerweise zusammen mit dem Detergens entfernt. Wenn das Detergens sowohl Alkohol als auch Ether enthält, wird der Ether normalerweise vor dem Alkohol entfernt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann mit anderen Methoden der Virusinaktivierung einschließlich solcher für nicht-lipidbeschichtete Viren kombiniert werden.

So kann z.B. ein Erhitzungsschritt in Gegenwart eines Proteinstabilisators, z.B. eines Mittels, welches das labile Protein (AHF) gegen Hitzeinaktivierung stabilisiert, durchgeführt werden. Das Erhitzen kann unter Verwendung von Stabilisatoren ausgeführt werden, die auch dazu neigen, das gesamt Protein, einschließlich von Bestandteilen des Virus, gegen Hitze zu schützen, wenn das Erhitzen eine ausreichend lange Zeit durchgeführt wird, z.B. wenigstens 5 Stunden und vorzugsweise wenigstens 10 Stunden bei einer Temperatur von 50 bis 95 ”C, insbesondere 60 bis 70 "C. Auf eine solche Weise wird das Virus bevorzugt inaktiviert, während trotzdem das Protein einen wesentlichen Teil, z.B. größer/gleich 80% seiner Proteinaktivität behält. Selbstverständlich kann die Hitzebehandlung auch gleichzeitig mit der Ölsäurebehandlung vorgenommen werden.

Die Behandlung des Plasmas oder seiner Konzentrate, Fraktionen oder Derivate gemäß der Erfindung kann unter Verwendung einer auf einem festen Substrat immobilisierten Ölsäure, ihres Ester oder Salzes vorgenommen werden. Die Ölsäureverbindung kann auch an einer makromolekularen Struktur fixiert sein, wie sie als Rückgrad für lonenaustauschreaktionen dienen kann, wobei eine leichte Entfernung der Ölsäureverbindung vom Plasma oder Plasmakonzentrat ermöglicht wird. Alternativ können die Ölsäureverbindungen auf einem festen Träger, wie Glasperlen insolubilisiert und immobilisiert sein, wobei Silane oder Siloxane als Kupplungsmittel dienen.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt das Poolen von Humanblutplasma und die Behandlung des gepoolten Humanblutplasmas in Form von solchem gepoolten Plasma. Es erlaubt ferner die Realisierung von Blutproduktderivaten, wie Faktor VIII, Gamma-globulin, Faktor IX oder Prothrombinkomplex (Faktoren II, VII, IX, X), Fibrinogen und anderen Blutderivaten einschließlich HBsAg, die für die Herstellung von HBV-Impfstoffen verwendet werden, wobei alle Derivate wenig oder keinen Restgehalt an ansteckenden Hepatitis- oder anderen Viren enthalten.

Die Ölsäure, ihr Ester oder Salz wird bevorzugt in einer Konzentration von wenigstens 0,02 Gew.-%, im allgemeinen 0,025 bis 0,1 Gew.-% angewandt. Höhere Konzentrationen als 0,04 Gew.-% erbringen keine Verbesserung, insbesondere bei 0,035 ist der Grad an Virusinaktivierung derart, daß das Virus unbestimmbar oder im wesentlichen unbestimmbar ist.

Die Dauer der Ölsäurebehandlung beträgt bis zu 5 Stunden, da längere Behandlungsdauern, z.B. 6 Stunden, die Ausbeute an labilem Protein verringern, wenigstens im Fall von AHF bei Natriumoleatkonzen-trationen von 0,1 Gew.-%.

Bei Ölsäurekonzentrationen von 0,01 bis 0,06 Gew.-% und Kontaktzeiten von bis zu etwa 5 Stunden sind die AHF-Ausbeuten sehr akzeptabel. So wird z.B. bei einer Kontaktzeit von 1 Stunde unter Verwendung von Natriumoleat bei einer Ölsäurekonzentration von 0,02 bis 0,06 AHF in einer Ausbeute von mehr als 60% erhalten. Wenn die Konzentration 0,02 bis 0,35 beträgt, liegt die AHF-Ausbeute oberhalb von 70%. Bei einer Kontaktzeit von 4 Stunden wird ein größeres Ausmaß an Ausbeuteverlust an AHF beobachtet. Daher sollte bei einer solchen höheren Kontaktzeit die Ölsäurekonzentration unterhalb von etwa 0,038, im allgemeinen bei 0,02 bis 0,038 Gew.-% liegen.

Die Inaktivierung kann bei 0 bis 60’ C ausgeführt werden, obwohl 20 bis 30’C bevorzugt werden.

Die beigefügte Zeichnung besteht aus 2 Kurven. In der ersten Kurve (Fig. 1) ist die Ölsäurekonzentration gegen die virale Infektivität, in der zweiten Kurve (Fig. 2) die gleiche Konzentration gegen die AHF-Ausbeute aufgetragen. Die für die Versuche der Figuren verwendete Ölsäure wurde in Form ihres Natriumsalzes eingesetzt. AHF wurde verwendet als ein Modellblutplasma, da es als das labilste Blutprotein angesehen wird. VSV (= Virus der vesikulären Stomatitis) wurde als Modellvirus gewählt, da sein Verhalten das Verhalten von lipidumhüllten Viren, wie Hepatitis-B-Virus, beschreibt und aus dem zusätzlichen Grund, weil bei den als Testtieren eingesetzten Schimpansen die Bestimmung der Eliminierung von Hepatitisvirus erforderlich war.

Vergleichsbeispiele:

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse mit anderen Virusinaktivierungsmitteln und Ölsäure (als Natriumsalz) dargestellt. Die Bedingungen, unter denen das Ölsäuresalz angewendet wurde, sind nicht die bevorzugten Bedingungen. Es wurde eine außergewöhnliche VSV-lnaktivierung erreicht. Die AHF-Ausbeute wurde ebenso erreicht, manchmal ganz signifikant. 8

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Die Erfindung ist u.a. gerichtet auf die Herstellung einer blutplasmaproteinhaltigen Zusammensetzung, wie Blut, Blutplasma, Blutplasmafraktionen usw., die im wesentlichen frei von ansteckendem Virus ist, jedoch die eine wesentliche Menge an lebensfähigem (nicht-denaturiertem Protein) enthält. Insbesondere betrifft die Erfindung die Inaktivierung von lipidhaltigen Viren und bevorzugt die Inaktivierung von Hepatitis-B und non-B, non-A Virus. Weitere erfindungsgemäß inaktivierte Viren sind bspw. Zytomegalieviren, Epstein 9

Claims

AT 402 607 B Barr Viren, Milchsäuredehydrogenaseviren, Herpesgruppeviren, Rhabdoviren, Leucoviren, Myxoviren, Alphaviren, Arboviren (Gruppe B), Paramyxoviren, Arenaviren, Coronaviren und Retroviren. Die Erfindung betrifft eine proteinhaltige Zusammensetzung, ein Produkt erzeugt aus normalen oder Krebszellen, oder durch normale oder Krebszellen (z.B. durch DNA-Rekombinationstechnologie) wie Säugetierblut, Blutplasma, Blutplasmafraktionen, Präzipitaten aus Blutfraktionierungen und Überständen aus Blutfraktionierungen, mit einem Ausmaß an Inaktivierung des Virus von größer als 4 log an Virus, wie Hepatitis-B und non-A,-non-B Virus, wobei die Zusammensetzung eine Proteinaktivität von wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 95%, und insbesondere 98 bis 100%, bezogen auf Gesamtprotein, aufweist. Die Erfindung betrifft ferner eine Zusammensetzung, die den Faktor VIII enthält, die im wesentlichen frei an Hepatitisvirus bis zu einer Inaktivierung von größer als 4 log des Virus ist und eine Proteinaktivität von wenigstens 70, vorzugsweise wenigstens 85, insbesondere wenigstens 95 und ganz besonders 98 bis 100%, bezogen auf Gesamtprotein, hat. Das Verfahren der Erfindung wurde beschrieben als Behandlung von Plasma, Plasmafraktionen, Plasmakonzentraten oder Bestandteilen davon. Das Verfahren ist jedoch auch nützlich bei der Behandlung von festen Bestandteilen von Blut, Lysaten oder Proteinen, die von Zellen ausgeschieden werden. Daher umfaßt das Verfahren auch die Behandlung von Blutplättchen-Konzentraten, Leukozytenkonzentraten und leukozytenarmen, gepackten roten Zellen, ebenso wie blutplättchenreichem Plasma, Blutplättchen-Konzentraten und blutplättchenarmem Plasma einschließlich gepackter Zellmassen, die den weißen Leukozytenfilm enthalten, der aus weißen Blutzellen, auf gepackten roten Blutzellen besteht. Ebenso umfaßt das Verfahren die Behandlung von Massen, welche Konzentrate an Granulozyten, Monozyten, Interferon und Transferfaktoren enthalten. Man kann Plasma selbst gemäß der Erfindung oder frisch geforenen Plasma, aufgetautes Plasma, Kryopräzipitat, Kryoüberstände oder Konzentrate aus gefrorenem Plasma ebenso wie Verdünnungsprodukte hiervon behandeln. Auf die oben beschriebene gleiche Behandlungsweise kann ein Virus, das in Produkten aus normalen oder Krebszellen vorhanden ist, inaktiviert werden, während die Aktivität des darin enthaltenen labilen Proteins erhalten bleibt. Zum Beispiel können durch die gleiche Behandlung mit Ölsäure, ihrem Ester oder ihrem Salz Produkte inaktiviert werden, die unter Verwendung von normalen oder Krebszellen hergestellt wurden, das Exsudat aus normalen oder Krebszellen, Hybridomas und Produkte, die durch Genspleißung erhalten worden sind. Solche Behandlung beeinflußt das gewünschte Protein im wesentlichen nicht negativ. Die für die Herstellung des gewünschten Proteins verwendeten Zellen können selbstverständlich sowohl Säugetierzellen als auch Nicht-Säugetierzellen sein. Patentansprüche 1. Verfahren zur Gewinnung einer ein labiles Protein enthaltenden Zusammensetzung, welches Verfahren das Inberührungbringen einer ein labiles Protein und lipidhaltige Viren enthaltenden Zusammensetzung mit einem Virusinaktivierungsmittel umfaßt, um eine Zusammensetzung zu erzeugen, welche ein labiles Protein und inaktivierte lipidhaltige Viren enthält, wobei die Ausbeute an Proteinaktivität, bezogen auf das Gesamtprotein, wenigstens 70 % beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannte Zusammensetzung mit einer 0,01 Gew.-% bis 0,1 Gew.-% betragenden Menge an Ölsäure als dem Virusinaktivierungsmittel, mit einem ihrer C1-C4-Alkylester oder mit einem Alkali- oder Erdalkalimetallsalz davon, zur Inaktivierung des darin enthaltenen Virus bis zu 5 Stunden lang in Berührung bringt, wobei dieses Inberührungbringen gegebenenfalls in der Gegenwart eines Netzmittels durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkalimetallsalz Natriumoleat verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein nicht-ionisches Detergens als Netzmittel verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Detergens ein Teilester von Sorbitanhydrid verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontakt der proteinhaltigen Zusammensetzung mit der Ölsäure oder ihrem Derivat in Anwesenheit eines weiteren Inaktivierungsmittels aus der Gruppe bestehend aus Ethern und Alkoholen vorgenommen wird. 10 AT 402 607 B
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Zusammensetzung aus Gesamtblut, Blutplasma, einem Plasmakonzentrat, einem Präzipitat einer Fraktionierung eines Plasmas, einem Überstand aus einer Fraktionierung eines Plasmas, einem Serum, einem Kryopräzipitat, einem Zellysat und/oder in Blutzellen induzierten Proteinen besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Zusammensetzung wenigstens ein Protein, ausgewählt aus der aus Fibrinogen, Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor I, Immunglobulinen, Präalbumin, retinolbindendem Protein, Albumin, AlphaGlobulinen, Beta-Globulinen, Gamma-Globulinen, Faktor III und den Komplementärkomponenten, Fibronectin, Antithrombin III, Hämoglobin, Interferon, T-Zellwachstumsfaktor, Plasminogen-Aktivator bestehenden Gruppe ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Zusammensetzung das Produkt aus einer nicht-Blut-Normal- oder -Krebszelle oder das Produkt einer rekombinanten DNA-Technologie ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontaktzeit zwischen 1 und 5 Stunden liegt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontakt bei einer Temperatur zwischen 0 und 60 *C bewirkt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Ölsäure, ihr Ester oder Salz in einer Konzentration zwischen 0,02 und 0,1 Gew.-% eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Ölsäure, ihr Ester oder Salz in einer Konzentration zwischen 0,02 und 0,04 Gew.-% während 1 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Zusammensetzung den Faktor VIII enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Zusammensetzung den Faktor IX enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inaktivierung des Virus in einem Ausmaß bewirkt, das großer als 4 log an Virus (entsprechend 10.000 infektiösen Viruseinheiten) ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbeute an Proteinaktivität, bezogen auf das Gesamtprotein, wenigstens 95% beträgt.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbeute an Proteinaktivität, bezogen auf das Gesamtprotein, wenigstens 98% bis 100% beträgt. Hiezu 1 Blatt Zeichnungen 11