CH664373A5

CH664373A5 - Verfahren zur inaktivierung von lipidhaltigen viren in einer proteinhaltigen zusammensetzung.

Info

Publication number: CH664373A5
Application number: CH5387/85A
Authority: CH
Inventors: Bernard Horowitz
Original assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1985-12-18
Publication date: 1988-02-29
Also published as: ATA368585A; AT402607B; US4613501A

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von lipidhaltigen Viren in einer proteinhaltigen Zusammensetzung ohne nennenswerte Proteindenaturierung. Die lipidhaltigen Viren können beispielsweise Hepatitis-B-Viren sein. Bei der proteinhaltigen Zusammensetzung kann es sich insbesondere um Humanblut, einen Blutbestandteil, Blutplasma oder eine Fraktion, ein Konzentrat oder ein Derivat davon handeln, welches Blutproteine oder nicht aus Blut stammende Quellen einschliesslich normaler oder Krebszellen enthält, oder auch um Exsudat von Krebs- oder normal gezüchteten Zellen, Hybridomas oder Produkte der Genspleissung (DNA) usw. Ganz besonders nützlich ist das erfindungsgemässe Verfahren für Blutplasma oder andere plasmaproteinhaltige Zusammensetzungen, welche im wesentlichen von Hepatitis B und/oder Nicht-A- und Nicht-B-Hepatitis oder einer anderen viralen Infektivität befreit werden sollen, wobei ein solches Blutplasma oder Fraktionen davon wertvolle labile Proteine, wie z.B. den Faktor VIII, aufweisen.

Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden, Viren wie den Hepatitis-B-Virus (HBV) im Blutplasma von Säugetieren, insbesondere beim Menschen, zu inaktivieren. In einigen Ländern ist es üblich, den Hepatitis-B-Virus im Blutplasma zu inaktivieren, indem das Plasma mit einem virusinaktivierenden Mittel eines Typs in Kontakt gebracht wird, welcher mit dem Proteinanteil des Hepatitis-B-Virus vernetzt oder mit der Nukleinsäure des Virus zusammenwirkt. Zum Beispiel ist es bekannt, zu versuchen, den Hepatitis-B-Virus durch Kontakt mit einem Aldehyd wie Formaldehyd zu inaktivieren, wobei Vernetzung mit dem Protein bewirkt und der Hepatitis-B-Virus inaktiviert wird. Es ist weiter bekannt, die Inaktivierung des Virus durch Kontakt mit Beta-Propiolakton (BPL) zu bewirken, einem Mittel, welches auf die Nukleinsäure des Virus einwirkt. Weiter ist es bekannt, ultraviolettes Licht (UV) anzuwenden, insbesondere nach einer Behandlung mit Beta-Propiolakton.

Weitere Inaktivierungsmittel umfassen niedere Alkylester von Essigsäure für die Inaktivierung des Grippevirus (US 3 655 871); Glutaraldehyd (US 3 983 229 und US 4 070 454); Tri-n-butyl-phosphat zur Inaktivierung des Grippevirus (US

3 962 421); butyliertes Hydroxytoluol (US 4 350 707); Sulfhy-dryl (US 3 651 211); Ethylenimin (US 3 636 196 und US

4 036 952); Beta-Propiolakton kombiniert mit Acetyl-ethylen-imin (US 4 083 958) und Tannin (US 4 178 126). Auch Deter-

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Detergentien wurden als virusinaktivierende Mittel beschrieben (siehe US 4 314 997 und 4 315 919). Mikrowellen wurden ebenfalls vorgeschlagen und beschrieben in US 3 660 234. In US 4 424 206 wird die Anwendung von Hitze beschrieben. Verschiedene chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Tetrachlor-ethylen sind zur Inaktivierung von Myxoviren vorgeschlagen worden (siehe US 3 847 737). Leider ändern, denaturieren oder zerstören Mittel, die Viren inaktivieren, häufig wichtige Proteinbestandteile, insbesondere sogenannte «labile» Blutgerinnungsfaktoren des Plasmas unter den für eine wirksame Inaktivierung der Virusinfektivität erforderlichen Bedingungen. Zum Beispiel wird hierin der Faktor VIII zu 50 bis 90% oder mehr, bezogen auf seinen Gehalt im unbehandelten Plasma, inaktiviert oder denaturiert. Wegen der Denaturie-rungseffekte dieser virusinaktivierenden Mittel ist es bei der Herstellung von Derivaten für die Verabreichung an Patienten notwendig, grosse Mengen des Plasmas zu konzentrieren, damit das dem Patienten verabreichte Material wieder eine ausreichende Konzentration an nicht denaturiertem Protein für eine wirksame therapeutische Behandlung aufweist. Diese Konzentration beeinträchtigt jedoch nicht die Verringerung der Menge an denaturiertem Protein. Als Ergebnis erhält der Patient nicht nur nicht-denaturiertes Protein, sondern auch eine Menge an denaturiertem Protein, die häufig ein Vielfaches der Menge des undenaturierten Proteins ist.

So wird z.B. bei der Inaktivierung von Hepatitis-B-Virus im menschlichen Blutplasma mit Beta-Propiolakton ein Plasma erhalten, dessen Faktor VIII zu 75% inaktiviert wurde. Die verbleibenden 25% des Faktors VIII sind daher in einer so kleinen Konzentration als eine Funktion des Plasmas selbst vorhanden, dass es notwendig ist, grosse Mengen des Faktors VIII zu konzentrieren, um eine ausreichende Konzentration, die von therapeutischem Wert ist, bereitzustellen. Da solche Trenntechniken nicht wirksam denaturierten Faktor VIII von nicht denaturiertem Faktor VIII trennen, kann das dem Patienten verabfolgte Material mehr denaturiertes als nicht denaturiertes Protein enthalten. Sicher ist eine solche Inaktivierung wertvoll vom Standpunkt einer Verringerung des Risikos einer Infektion mit Hepatitisvirus, jedoch erfordert sie die Verarbeitung von grossen Plasmamengen und stellt einen signifikanten Verlust an wertvollen Proteinbestandteilen dar.

Weiter kann die Verabfolgung von grossen Mengen an denaturierten Proteinen dazu führen, dass sie antigen für den Wirt werden und daher zu Autoimmunkrankheiten oder vielleicht rheumatischer Arthritis führen. Der Verlust an diesen wertvollen Proteinkomponenten ist nicht auf den Faktor VIII beschränkt, eines der labilsten der wertvollen Proteine im Blutplasma von Säugetieren. Eine ähnliche Proteindenaturierung tritt bei folgenden anderen wertvollen Plasmabestandteilen auf: Koagulierungsfaktoren II, VII, IX, X; Plasmin, Fibrinogen (Faktor I) IgM, Hämoglobin, Interferon usw.

Faktor VIII wird jedoch zu einem grösseren Ausmass als viele der anderen wertvollen Proteinkomponenten, die im Blutplasma anwesend sind, denaturiert. Daher wird, ausgenommen bei der Verarbeitung von Serumalbumin, einer stabilen Plasmaproteinlösung, welche die Pasteurisierung aushalten kann, weitgehend in den Vereinigten Staaten bei der Verarbeitung von Blutproteinen keine Sterilisierungsmassnahme zur Inaktivierung von Viren vorgenommen. Als Ergebnis müssen die Empfänger von Faktor VIII, Gammaglobulin, Faktor IX, Fibrinogen usw. das Risiko akzeptieren, dass die wertvollen, verabfolgten Proteinkomponenten mit Hepatitisviren ebenso wie mit anderen ansteckenden Viren verunreinigt sein können. Diese Empfänger sind daher mit der Gefahr konfrontiert, durch diese Viren angesteckt zu werden, und haben Schädigung, die der Virus in der Leber und anderen Organsystemen verursacht, sowie die folgende Anfälligkeit und Krankheit, die zum Tod führen kann, zu ertragen.

Das weiter oben beschriebene Verfahren der Inaktivierung mit BPL/UV wurde bisher aus zahlreichen Gründen in den Vereinigten Staaten nicht angenommen. Einer dieser Gründe liegt in der Tatsache, dass viele Forscher glauben, dass BPL selbst schädlich ist, da es nicht vollständig im Anschluss an die Inaktivierung entfernt werden kann und daher im Plasma und den Plasmaderivaten verbleibt. Es hat sich gezeigt, dass BPL bei Tieren krebserzeugend wirkt und selbst für das-Personal, welches damit umgeht, gefährlich ist. Weitere Methoden zur Inaktivierung von Hepatitis-B-Virus im Plasma sind bekannt, aber gewöhnlich unpraktisch. Eine Methode betrifft die Zugabe von Antikörpern zum Plasma, wobei sich ein Immunkomplex bildet. Die Kosten der Antikörperbildung und Reinigung tragen signifikant zu den Kosten der Plasmaherstellung bei: weitergibt es keine Sicherheit, dass eine hinreichende Menge von Hepatitis-B- oder Nicht-A-nicht-B-Virus inaktiviert wird. Es gibt derzeit keinen Test für Nicht-A-nicht-B-Antikörper (obwohl es einen Test für den Virus gibt); daher ist es nicht möglich, Plasma mit hohen Gehalten an Anti-nicht-A-nicht-B-Antikörpern auszuwählen.

Es ist davon auszugehen, dass die Probleme der Inaktivierung von Viren im Plasma von den Problemen der Inaktivierung der Viren selbst verschieden sind, und zwar aufgrund der Mitanwesenheit der erwünschten Proteinkomponenten des Plasmas. Während es daher bekannt ist, wie der Hepatitis-B-Virus zu inaktivieren ist, durch Vernetzungsmittel, z.B. Glutaraldehyd, mit Nukleinsäuren reagierenden Chemikalien, z.B. BPL oder Formaldehyd oder Oxidationsmittel, z.B. Chlorox usw., wurde dagegen angenommen, dass diese Methoden für die Inaktivierung des Virus im Plasma nicht geeignet sind aufgrund der Beobachtung, dass die meisten dieser Inaktivierungsmittel (Natriumhypochlorit, Formaldehyd, Beta-Propiolakton) die wertvollen Proteinbestandteile des Plasmas denaturieren. In US 4 315 919 (Shanbron-) wird ein Verfahren zur Depyrogenierung eines proteinhaltigen, biologischen oder pharmazeutischen Produkts beschrieben, indem das proteinhaltige Produkt mit nicht denaturierenden Amphiphile in Kontakt gebracht wird.

In US 4 314 997 (Shanbrom) wird ein Verfahren zur Verringerung der Pyrogenizität, Hepatitisinfektivität und Gerinnungsaktivierung eines Plasmaprodukts beschrieben, indem dieses Produkt mit einer nicht denaturierten Amphiphile in Berührung gebracht wird. Sowohl Shanbrom '919 als auch '997 erwägen die Verwendung eines nicht ionischen Detergens, z.B. «Tween 80» als Amphiphile. In US 4 540 573 wird gezeigt, dass die Behandlung mit «Tween 80» relativ unwirksam als virusinaktivierendes Mittel ist.

In US 3 962 421 wird ein Verfahren zur Spaltung von infektiösen lipidhaltigen Viren für die Herstellung von Vakzi-nen-Untereinheit beschrieben, indem der Virus in einem wässrigen Medium mit einem Netzmittel und einem Trialkyl-phosphat in Berührung gebracht wird. Ein solches wässriges Medium wird definiert als Allantoin-Flüssigkeit, Gewebekulturflüssigkeit, wässriger Extrakt oder Suspension von Gewebe des zentralen Nervensystems, Blutzelleneluat und ein wässriger Extrakt oder Suspension von Hühnerembryo. Weder wird Hepatitis beschrieben noch die Herstellung von Blutderivaten, welche labile, im wesentlichen von Virusinfektivität als Blutprotein enthalten. Lediglich das Zerreissen der Umhüllung der lipidhaltigen Viren für die Herstellung von Impfstoffen, aber nicht die Verhinderung oder Verringerung der Proteindenaturierung auf dem Weg zu einem Blutderivat werden erwähnt.

Es existieren auch Probleme bei der Derivierung wertvoller Proteine aus Quellenmaterial auf Nicht-Blutbasis. Solches Quellenmaterial umschliesst, ohne hierauf beschränkt zu sein,

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die Milch von Säugetieren, Ascites-Flüssigkeit, Speichel, Pla-centaextrakten, Gewebekulturzellinien und ihren Extrakten einschliesslich transformierter Zellen sowie Produkte der Fermentation, z.B. wurden menschliche Lymphoblastoid-Zellen isoliert, welche Interferon erzeugen. Jedoch hält die heute im Handel verwendete Zellinie Epstein-Barr-Virus-Gene. Es bestehen Bedenken, dass die Verwendung von durch diese Zellen produziertem Interferon Virusinfektionen übertragen oder durch Viren verursachtes Krebswachstum auslösen kann. Die Erfindung ist auf die Erreichung dreier Ziele gerichtet, nämlich (1) eine sichere, (2) viralinaktivierte, proteinhaltige Zusammenstzung (3), ohne dass diese einer nennenswerten Proteindenaturierung unterliegt. Wie weiter oben gezeigt, sind diese drei Ziele nicht notwendigerweise miteinander vereinbar, da z.B. Beta-Propiolakton virale Infektivität inaktiviert, jedoch unsicher ist, und Substanzen wie Formaldehyd Viren inaktivieren, jedoch auch die wertvollen Proteine, z.B. den Faktor VIII denaturieren.

Es wurde daher erwünscht, ein Verfahren zur Gewinnung einer proteinhaltigen Zusammensetzung bereitzustellen,

durch welches die wertvollen Proteinkomponenten nicht wesentlich denaturiert werden und welches nicht die Verwendung eines erwiesenermassen karzinogenen Mittels zur Folge hat. Insbesondere ist es erwünscht, eine blutproteinhaltige Zusammensetzung bereitzustellen, in der im wesentlichen alle Hepatitisviren und andere anwesende Viren inaktiviert sind und in der denaturiertes Protein wie Faktor VIII nur einen kleinen Anteil an der Gesamtmenge dieser Proteine in der blutproteinhaltigen Zusammensetzung ausmachen. Es ist ein weiteres Ziel, Produkte aus Krebszellen oder normalen Zellen oder aus Fermentationsprozessen im Anschluss an Geninser-tionen bereitzustellen, die im wesentlichen frei an Virus sind, insbesondere lipidhaltige Viren.

Das erfindungsgemässe Verfahren, mit dem sich die angegebenen Ziele erreichen lassen, ist im Patentanspruch 1 definiert. Der Patentanspruch 22 gibt eine mit dem Verfahren erhaltene Zusammensetzung an.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass, während die meisten der virusinaktivierenden Mittel den Faktor VIII und andere wertvolle Blutplasmaproteine denaturieren, nicht alle virusinaktivierenden Mittel diesen Effekt haben. Es wurde gefunden, dass wenn eine proteinhaltige Zusammensetzung, wie Blutproteine einschliesslich Gesamtblut, Blutzellproteine, Blutplasma, ein Prezipitat einer Blutplasmafrak-tionierung, der Überstand einer Blutplasmafraktionierung, ein Kryoprezipitat, ein Kryoüberstand oder ein Teil oder Derivat hiervon oder Serum oder ein Nicht-Blutprodukt, hergestellt aus normalen oder Krebszellen (z.B. durch DNA-Rekombinationstechnologie), mit Ölsäure, ihrem Ester oder Salz für eine ausreichend lange Zeit in Berührung gebracht wird, lipidhaltige Viren wie die in der Zusammensetzung anwesenden Hepatitisviren praktisch vollständig ohne nennenswerte Denaturierung der darin enthaltenen Proteine inaktiviert werden. Durch Kontakt einer Mischung oder eines Konzentrats oder einer Fraktion eines Blutproteins mit Ölsäure oder einem C|_4-Alkylester oder einem Alkali- oder Erdalkalisalz können Hepatitisviren wesentlich inaktiviert werden, z.B. mehr als 4 Logs, während eine Proteinaktivität, bezogen auf Gesamtprotein von wenigstens 60%, realisiert wird.

Durch ein solches Verfahren wird eine blutproteinhaltige Zusammensetzung wie Gesamtblut von Säugetieren, Blutzellderivaten (z.B. Hämoglobin, Alpha-Interferon, T-Zellen-wachstumsfaktor, von Blutplättchen derivierter Wachstumsfaktor usw.), Plasminogenaktivator, Blutplasma, Blutplasmafraktion, Blutplasmaprezipitat (z.B. Kryoprezipitat, Ethanol-überstand oder Polyethylenglykolüberstand) bereitgestellt, die gekennzeichnet ist durch die Anwesenheit von einem oder mehreren Blutproteinen, wie dem labilen Blutfaktor VIII mit einer Gesamtausbeute oder Proteinaktivität, bezogen auf Gesamtprotein von wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 70% der blutproteinhaltigen Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung stark verminderte oder praktisch keine Hepatitisviren enthält.

Der Virus in einem Serum wird durch Infektivitätstitratio-nen bestimmt.

Durch das Inaktivierungsverfahren der Erfindung werden die meisten, wenn nicht praktisch alle Hepatitisviren inaktiviert. Das Verfahren zur Bestimmung der Infektivitätsraten an Schimpansen in vivo wird erörtert von Prince, A.M., Stephen, W., Brotman, B., und van den Ende, M.C., «Evaluation of the Effect of Beta-propioIactone/Ultraviolet Irradiation (BPL/ UV) Treatment of Source Plasma on Hepatitis Transmission by factor IX Complex in Chimpanzees, Thrombosis and Hae-mostasis», 44, 138-142, 1980.

Der Hepatitisvirus wird durch Behandlung mit Ölsäure, ihren Estern oder Salzen inaktiviert und nicht wegen Einschlusses in das Plasma der Antikörper, welche sich mit den Hepatitisviren unter Bildung von Immunkomplexen verbinden. Die Inaktivierung des Virus wird erreicht bis zu dem Ausmass von wenigstens «4 logs», d.h. der Virus in einem Serum ist vollständig inaktiviert bis zu dem Ausmass, welches durch Infektivitätsstudien bestimmt wird, wo dieser Virus in dem unbehandelten Serum in einer derartigen Konzentration anwesend ist, dass selbst nach einer Verdünnung auf 104 virale Aktiviät gemessen werden kann.

Blut besteht aus Feststoffen (Zellen, d.h. Erythrocyten, Leukocyten und Thrombocyten) und Flüssigkeit (Plasma). Die Zellen enthalten potentiell wertvolle Substanzen, wie Hämoglobin, und sie können zur Herstellung weiterer potentiell wertvoller Substanzen, wie Interferone. Wachstumfaktoren und weiterer biologischer Responsmodifikatoren veranlasst werden. Das Plasma ist im wesentlichen aus Wasser, Salzen, Lipiden und Proteinen aufgebaut. Die Proteine sind in die Gruppen Fibrinogene, Serumglobuline und Serumalbumine aufgeteilt. Typische Antikörper (Immunglobuline) im menschlichen Blutplasma schliessen solche gegen infektiöse Hepatitis, Grippe H usw. ein.

Bluttransfusionen werden zur Behandlung von Anämie (resultierend aus Krankheit oder Hemorrhagie), Schock (resultierend aus Verlust an Plasmaproteinen oder Verlust an Zirkulationsvolumen), Krankheiten, wo ein adäquates Niveau an Plasmaproteinen nicht aufrechterhalten wird, z.B. Hämophilie, sowie zur passiven Immunisierung verwendet.

Gesamtblut muss vor der Verabfolgung sorgfältig typisiert und kreuzweise verglichen werden. Plasma erfordert jedoch keinen vorherigen Test. Für bestimmte Anwendungen wird nur eine geeignete Fraktion des Plasmas gefordert, wie der Faktor VIII für die Behandlung von Hämophilie oder Wille-brandscher Krankheit. Bei bestimmten Krankheiten fehlen eine oder mehrere der Blutkomponenten. Daher genügt die Verabreichung der richtigen Fraktion, und die anderen Bestandteile werden nicht an den Patienten «verschwendet». Die anderen Fraktionen können für einen anderen Patienten verwendet werden. Die Trennung des Bluts in Bestandteile und ihre anschliessende Fraktionierung erlaubt die Konzten-trierung der Proteine, so dass Konzentrate behandelt werden können. Von grosser Wichtigkeit ist auch die Tatsache, dass die Plasmafraktionen wesentlich länger im Gesamtblut gelagert werden können und dass sie im flüssigen, gefrorenen oder getrockneten Zustand verteilt bzw. gehandelt werden können. Schliesslich ist es möglich, von Blutbanken die Plasmaanteile von veraltetem Gesamtblut zu verwerten, welches für die Verabfolgung von Gesamtblut unsicher ist.

In Humanplasma gefundene Proteine umfassen Präalbumin, retinolbindendes Protein, Albumin, Alpha-Globuline,

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Beta-Globuline, Gamma-Globuline (Immunserumglobuline), die Koagulierungsproteine (Antithrombin III, Prothrombin, Plasminogen, antihämophilischer Faktor, Faktor IX, fibrinstabilisierender Faktor-Faktor XIII, Fibrinogen), Immunoglobuline (Immunoglobuline G, A, M, D und E) und die Komplementärkomponenten. Es gibt derzeit mehr als 100 beschriebene Plasmaproteine. Eine umfassende Aufstellung ist zu finden in «The Plasma Proteins», ed. Putnam, F.W., Academic Press, New York (1975).

Proteine, die in der Blutzellenfraktion gefunden werden, umschliessen Hämoglobin, Fibronectin, Fibrinogen, Enzyme des Kohlenhydrats- und Proteinstoffwechsels und Produkte von Blutzellen, z.B. Elastase usw. Zusätzlich kann die Synthese von weiteren Proteinen, wie Interferonen und Wachstumsfaktoren induziert werden. Eine umfassende Liste von induzierbaren Leukocytproteinen zu finden in Stanley Cohen, Edgar Pick, J.J. Oppenheim, «Biology of the Lymphokines», Academic Press, N.Y. (1979).

Die Blutplasmafraktionierung betrifft im allgemeinen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wie Ethanol, Ether und Polyethylenglykol bei niedrigen Temperaturen und bei kontrollierten pH-Werten, um die Ausfällung einer besonderen Fraktion, welche ein oder mehrere Plasmaproteine enthält, zu bewirken. Der erhaltene Überstand selbst kann dann ausgefällt werden, bis der erwünschte Fraktionierungsgrad erreicht worden ist. Neuere Trennungen basieren auf chromatographischen Verfahren. Eine ausgezeichnete Übersicht über Blutfraktionierungen erscheint in Kirk-Othmer's Encyclope-dia of Chemical Technology, dritte Auflage, Interscience Publishers, Band 4, Seiten 25 bis 62. Die Hauptbestandteile einer kalten Ethanolfraktionierung sind:

Fraktion Proteine

I Fibrinogen, kalt unlösliches Globulin; Faktor XIII, Properdin

II und III IgG; IgM; IgA; Fibrinogen; Beta-Lipoprotein;

Prothrombin; Plasminogen; Piasmininhibitor; Faktor V; Faktor VII; Faktor IX; Faktor X; Thrombin; Antithrombin; Isoglutinine; Cerutoplasmin; Komplementär C'l, C'3 IV-1 Alphai-lipoprotein, Cerutoplasmin;

Piasmininhibitor; Faktor IX; Peptidase; Alpha-und-beta-globuline IV-4 Transferrin; thyroxinbindendes Globulin;

Serumesterase; Alphai-lipoprotein; Albumin; alkalische Phosphatase

V Albumin; Alpha-globulin

VI Aiphai-saures Glycoprotein; Albumin

Das obige Fraktionierungsschema kann als Basis für weitere Fraktionierungen dienen. Fraktion II und III kann beispielsweise weiter zwecks Erhalt von Immunserum-Globulin (ISG) fraktioniert werden.

Ein weiteres Fraktionsschema betrifft die Verwendung von gefrorenem Plasma, das aufgetaut wird, wobei ein Kryoprezipitat, welches AHF (antihämophilischer Faktor) und Fibronectin enthält, sowie ein Kryo-Überstand erhalten wird. Der Überstand wird dann in Fibronectin und AHF fraktioniert. Polyethylenglykol wurde zur Herstellung von hochreinem AHF und nicht aggregiertem ISG verwendet. Hochgefährliche Produkte im Hinblick auf die Übertragung von Hepatitis B und nicht A, nicht B sind Fibrinogen, AHF und Prothrombinkomplex, sowie alle anderen Blutproteinpräparate, ausser Immunserumglobulin und, da sie pasteurisiert sind, Albuminlösungen. Gegenwärtig verfügbare Hepatitistests zeigen die Anwesenheit von Hepatitis-B-Oberflächen-

Antigen, jedoch gibt es gegenwärtig keinen Screeningtest für Nicht-A-nicht-B-Hepatitis.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäs-sen Verfahrens wird eine blutproteinhaltige Zusammensetzung, wie Gesamtblut von Säugetieren, Blutzellen davon, Blutzellproteine, Blutplasma davon, Prezipitate aus beliebigen Fraktionen eines solchen Plasmas, Überstände aus einer Fraktionierung eines solchen Plasmas, Kryoprezipitate, Kryo-überstände oder beliebige Anteile oder Derivate der vorstehenden Komponenten, welche Blutproteine, wie z.B. Prothrombinkomplex (Faktoren II, VII, IX und X) und Kryoprezipitat (Faktoren I und VIII) enthalten, mit einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure in Berührung gebracht. Gleichfalls möglich ist der Kontakt eines Serums, welches ein oder mehrere Blutproteine enthält, mit Ölsäure, ihren Estern oder Salzen. Weiter können Ölsäure oder Ölsäurederivate mit einer blutproteinhaltigen Fraktion, die wenigstens Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Fibrinogen und/ oder IgM enthält, in Berührung gebracht werden. Eine solche blutproteinhaltige Zusammensetzung wird mit Ölsäure, ihrem Ester oder Salz in Berührung gebracht. Wenn ein Ester angewendet wird, hat die Estergruppe einen Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere eine Methyl- oder Ethylgruppe. Besonders geeignete Salze sind das Natrium- und Kaliumsalz, insbesondere Natriumoleat. Die Ölsäure, ihr Ester oder Salz kann mit oder ohne Netzmittel angewandt werden. Es ist jedoch möglich, die Ölsäure, ihren Ester oder Salz in Verbindung mit einem Netzmittel anzuwenden. Solche Netzmittel können entweder vor, gleichzeitig mit oder nach dem Kontakt der Ölsäureverbindung mit der blutproteinhaltigen Zusammensetzung zugegeben werden. Die Wirkung des Netzmittels ist es, die Berührung des Virus in der blutproteinhaltigen Zusammensetzung mit der Ölsäureverbindung zu vergrössern. Das Netzmittel allein inaktiviert den Virus nicht ausreichend. Bevorzugte Netzmittel sind nicht toxische Detergentien. Geeignete nicht ionische Detergentien sind solche, welche bei der herrschenden Temperatur wenigstens 0,1% des Fetts in einer wässrigen, fetthaltigen Lösung dispergieren, wenn ein Gramm Detergens pro 100 ml Lösung eingebracht wird. Besonders geeignete Detergentien sind die Polyoxyethylende-rivate von Fettsäuren, Teilester von Sorbitolanhydriden, z.B. die unter den Handelsbezeichnungen «Tween 80»,

«Tween 20» und «Polysorbat 80» bekannten Produkte, sowie nicht ionische, öllösliche Wasserdetergentien, wie die unter dem Handelsnamen «Triton X 100» (oxyethyliertes Alkylphe-nol) bekannten Produkte. Ebenso geeignet sind Gallensäure-salze, wie Natriumdeoxycholat ebenso wie die «Zwittergents», welche synthetische zwitterionische Detergentien, bekannt als «Sulfobetaine» wie N-dodecyl-N, N-dimethyl-2-ammonio-l-Ethansulfonat und seine Analogen sind, oder nicht-ionische Detergentien, wie Octyl-beta-D-glucopyrano-sid. Substanzen, welche die Wirksamkeit der Ölsäureverbindung verbessern, umfassen Reduktionsmittel, wie Mercapto-ethanol, Dithiothreit, Dithioerythrit und Dithiooctansäure. Geeignete nichtionische, oberflächenaktive Mittel sind oxy-ethylierte Alkylphenole, Polyoxyethylensorbitanfettsäuree-ster, Polyoxyethylensäuren, Polyoxyethylenalkohole, Poly-oxyethylenöle und Polyoxyethylenoxypropylenfettsäuren.

Einige spezielle Beispiele sind:

Alkylphenoxypolyethoxy-(3)-ethanol

Polyoxyethylen-(2)-sorbitanmonolaurat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonopalmitat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonostearat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitantristearat

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat

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Polyoxyethylen-(20)-Iaurylether

Polyoxyethylen-(20)-cetylether

Polyoxyethylen-(20)-stearylether

Polyoxyethylen-(25)-oleylether

Polyoxyethylen-(25)-hydriertes Kastoröl

Polyoxyethylen-(25)-oxypropylenmonostearat

Die Menge an Netzmittel, falls angewendet, ist nicht wesentlich, sie beträgt beispielsweise etwa 0,001 bis 10%, vorzugsweise etwa 0,01 bis 1,5%.

Di- und Trialkylphosphate, wie in US 4 540 573 und SN 631 675 beschrieben, können in Verbindung mit den Ölsäure-verbindungen angewendet werden, die auch in Verbindung mit anderen Inaktivierungsmitteln, wie Alkohol oder Ethern mit oder ohne gleichzeitige Gegenwart von Netzmittel gem. SN 368 250 «Sterilized Plasma and Plasma Derivates and Process Therefor», des gleichen Erfinders beschrieben sind.

Der Ether oder der Alkohol kann in einer Menge von 1 bis 50, vorzugsweise 5 bis 25 Gew.-%, bezogen auf das Volumen des zu behandelnden Blutplasmas, eines Konzentrats oder einer anderen blutplasmaproteinhaltigen Verbindung verwendet werden.

Besonders geeignete Ether für die erfindungsgemässe Inaktivierung sind solche der Formel

R'-O-R2

worin R1 und R2 unabhängig voneinander Ci-Cis-Alkyl oder Alkenyl bedeuten, die ein Sauerstoff- oder Schwefelatom in ihrer Kette enthalten, können bevorzugt Ci-Cs-Alkyl oder Alkenyl. Besonders geeignete Ether sind Dimethylether, Di-ethylether, Ethylpropylether, Methylbutylether, Methyliso-propylether und Methylisobutylether. Geeignete Alkohole haben die Formel

R3OH

worin Rj ein Ci-Cis-Alkyl- oder Alkenylrest ist, der ein oder mehrere Sauerstoff- oder Schwefelatome in der Kette enthalten kann und der durch ein oder mehrere Hydroxygruppen substituiert sein kann. Besonders geeignete Alkohole sind solche, wo die Alkyl- oder Alkenylgruppe 1 bis 8 Atome aufweist. Besonders geeignete Alkohole sind Methanol, Ethanol, Propano!, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, n-Pentanol und die Isopentanole. Ebenfalls geeignete Verbindungen sind Ethylenglykol, 1,2-propylenglykol, 1,3-propandiol, 1,4-butan-diol, 2-hydroxyisobutanol (2-methyl-l,2-dihydroxypropan).

Die Behandlung der blutproteinhaltigen Zusammensetzungen mit Trialkylphosphat wird bei einer Temperatur zwischen — 5 und 70 °C, vorzugsweise zwischen 0 und 60 °C vorgenommen. Die Zeit der Behandlung (Berührung) beträgt wenigstens 1 Minute, vorzugsweise wenigstens 1 Stunde und im allgemeinen 4 bis 24 Stunden. Die Behandlung erfolgt normalerweise unter Normal-Druck, obwohl auch Unter- oder Überdruck angewendet werden kann.

Normalerweise werden nach der Behandlung die Ölsäureverbindung und andere Inaktivierungsmittel, z.B. Ether entfernt, obwohl dies nicht in allen Fällen in Abhängigkeit von der Art des den Virus inaktivierenden Mittels und der beabsichtigten Weiterverarbeitung der blutplasmaproteinhaltigen Zusammensetzung erforderlich ist.

Bei Entfernung des Ethers vom Plasma wird das Plasma im allgemeinen einer Temperatur von 4 bis 37 °C unter leichtem Vakuum zwecks Abzug des restlichen Ethers unterworfen. Bevorzugt wird das Plasma als ein dünner Film ausgebreitet, um maximalen Kontakt und Entfernung des Ethers zu gewährleisten. Andere Methoden zur Entfernung von Ether sind:

(1) Durchleiten von Stickstoffgas

(2) Diafiltration unter Verwendung etherunlöslicher, mikroporöser Membranen, die die Plasmaproteine zurückhalten (z.B. «Teflon»)

(3) Absorption der gewünschten Plasmakomponenten auf chromatographischen oder affinitätschromatographischen Trägern

(4) Ausfällung, z.B. durch Aussalzen von Plasmaproteinen

(5) Lyophilisierung

Wenn Alkohol oder nicht ionische Detergentien mit den Ölsäureverbindungen angewendet werden, werden diese durch die obigen Methoden (2) bis (5) entfernt.

Di- oder Trialkylphosphate können wie folgt entfernt werden:

(a) Die Entfernung von AHF kann bewirkt werden durch Ausfällung von AHF mit 2,2 molarem Glycin und 2,0 M Natriumchlorid.

(b) Die Entfernung von Fibronectin kann bewirkt werden durch Bindung des Fibronectins an einer Säule aus insolubili-sierter Gelatine und reagenzfreies Auswaschen des gebundenen Fibronectins.

Alkohol wird normalerweise zusammen mit dem Detergens entfernt. Wenn das Detergens sowohl Alkohol als auch Ether enthält, wird der Ether normalerweise vor dem Alkohol entfernt.

Das Verfahren gemäss der Erfindung kann mit anderen Methoden der Virusinaktivierung einschliesslich solcher für nicht lipidbeschichtete Viren kombiniert werden. So kann z.B. ein Erhitzungsschritt in Gegenwart eines Proteinstabilisators, z.B. eines Mittels, welches das labile Protein (AHF) gegen Hitzeinaktivierung stabilisiert, durchgeführt werden. Das Erhitzen kann unter Verwendung von Stabilisatoren ausgeführt werden, die auch dazu neigen, das gesamte Protein, einschliesslich von Bestandteilen des Virus, gegen Hitze zu schützen, wenn das Erhitzen eine ausreichend lange Zeit durchgeführt, z.B. wenistens 5 Stunden und vorzugsweise wenigstens 10 Stunden bei einer Temperatur von 50 bis 95 °C, insbesondere 60 bis 70 °C. Auf eine solche Weise wird der Virus bevorzugt inaktiviert, während trotzdem das Protein einen wesentlichen Teil, z.B. grösser/gleich 80% seiner Proteinaktivität behält. Selbstverständlich kann die Hitzebehandlung auch gleichzeitig mit der Ölsäurebehandlung vorgenommen werden.

Die Behandlung des Plasmas oderseiner Konzentrate, Fraktionen oder Derivate gemäss Erfindung kann unter Verwendung einer auf einem festen Substrat immobilisierten Ölsäure, ihres Esters oder Salzes vorgenommen werden. Die Ölsäureverbindung kann auch an einer makromolekularen Struktur fixiert sein, wie sie als Rückgrad für Ionenaustausch-reaktionen dienen kann, wobei eine leichte Entfernung der Ölsäureverbindung vom Plasma oder Plasmakonzentrat ermöglicht wird. Alternativ können die Ölsäureverbindungen auf einem festen Träger, wie Glasperlen insolubilisiert und immobilisiert sein, wobei Silane oder Siloxane als Kupplungsmittel dienen.

Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt das Polen von Humanblutplasma und die Behandlung des gepolten Humanblutplasma sin Form von solchem gepolten Plasma. Es erlaubt ferner die Realisierung von Blutproduktderivaten, wie Faktor VIII, Gamma globulin, Faktor IX oder Prothrombin-komplex (Faktoren II, VII, IX, X), Fibrinogen und anderen Blutderivaten, einschliesslich HBsAg, die für die Herstellung von HBV-Impfstoffen verwendet werden, wobei alle Derivate wenig oder keinen Restgehalt an ansteckenden Hepatitisoder anderen Viren enthalten.

Die Ölsäure, ihr Ester oder Salz wird bevorzugt in einer Konzentration von wenigstens 0,02 Gew.-%, im allgemeinen 0,025 bis 0,1 Gew.-% angewandt. Höhere Konzentrationen als

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

M>

65

7

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0,04 Gew.-% erbringen keine Verbesserung, insbesondere bei 0,035 ist der Grad an Virusinaktivierung derart, dass der Virus unbestimmbar oder im wesentlichen unbestimmbar ist.

Die Dauer der Ölsäurebehandlung beträgt bis zu 5 Stunden, da längere Behandlungsdauern, z.B. 6 Stunden, die Ausbeute an labilem Protein verringern, wenigstens im Fall von AHF bei Natriumoleatkonzentrationen von 0,1 Gew.-%.

Bei Ölsäurekonzentrationen von 0,01 bis 0,06 Gew.-% und Kontaktzeiten von bis zu etwa 5 Stunden sind die AHF-Aus-beuten sehr akzeptabel. So wird z.B. bei einer Kontaktzeit von 1 Stunde unter Verwendung von Natriumoleatbei einer Ölsäurekonzentration von 0,02 bis 0,06 AHF in einer Ausbeute von mehr als 60% erhalten. Wenn die Konzentration 0,02 bis 0,35 beträgt, liegt die AHF-Ausbeue oberhalb von 70%. Bei einer Kontaktzeit von 4 Stunden wird ein grösseres Ausmass an Ausbeuteverlust an AHF beobachtet. Daher sollte bei einer solchen höheren Kontaktzeit die Ölsäurekonzentration unterhalb von etwa 0,038, im allgemeinen bei 0,02 bis 0,038 Gew.-% liegen.

Die Inaktivierung kann bei 0 is 60 ° C ausgeführt werden, obwohl 20 bis 30 °C bevorzugt werden.

Die beigefügte Zeichnung besteht aus 2 Kurven. In der ersten Kurve ist die Ölsäurekonzentration gegen die virale Infektivität, in der zweiten Kurve die gleiche Konzentration gegen die AHF-Ausbeute aufgetragen. Die für die Versuche 5 der Figuren verwendete Ölsäure wurde in Form ihres Natriumsalzes eingesetzt. AHF wurde verwendet als ein Modellblutplasma, da es als das labilste Blutprotein angesehen wird. VSV wurde als Modellvirus gewählt, da sein Verhalten das Verhalten von lipidumhüllten Viren, wie Hepatitis-lo B-Virus, beschreibt, und aus dem zusätzlichen Grund, weil bei den als Testtieren eingesetzten Schimpansen die Bestimmung der Eliminierung von Hepatitisvirus erforderlich war.

Vergleichsbeispiele 15 In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse mit anderen Virusinaktivierungsmitteln und Ölsäure (als Natriumsalz) dargestellt. Die Bedingungen, unter denen das Ölsäuresalz angewendet wurde, sind nicht die bevorzugten Bedingungen. Es wurde eine aussergewöhnliche VSV-Inaktivierung erreicht. 20 Die AHF-Ausbeute wurde ebenso erreicht, manchmal ganz signifikant.

Tabelle

Einfluss von Fettsäuren auf AHF und VSV

Referenzmittel Referenz Bedingungen Angewendete Bedingungen AHF-Ausbeute VSV-Abfall

(%) (log)

BHT

1

bis zu 0,011%, 30 Minuten, Raumtemp.

0,1%, 6 Std., Raumtemp.

100

0,4

Linolsäure

2

0,001-0,01%, 10-60 Minuten,

0,01%, 6 Std., Raumtemp.

97

0,4

(Natriumsalz)

25 °C

Linolenalkohol

3

0,00012%, 20 Minuten, 25 °C

0,01%, 6 Std., Raumtemp.

93

0,1

Ölsäure

2,4

0,001-0,01%, 10-60 Minuten,

0,1%, 1 Std., Raumtemp.

44

4,2

(Natriumsalz)

25 °C

0,1%, 6 Std., Raumtemp.

1

4,2

1. Keith, A.D. and Sniper, W., «Inactivation of lipid containing viruses with butylated hydroxytoluene», U.S.-Patent 4 350 707, 1982.

2. Kohn, A., Gitelman, J., and Inbar, M., «Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses», Arch. Virology, 66:301 (1980).

3. Sands, J., Auperin, D., and Snipes, W., «Extreme sensitivity of enveloped viruses, including herpes simplex, to long-chain unsaturated monoglycerides and alcohols», Antimicrobial Agents and Chemother., 15: 67 (1979).

4. Stock, C.Cl., and Francis, T. Jr., «The inactivation of the virus of epidemie influenza by soaps», J. Exp. Med., 71: 661 (1940).

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist die Herstellung einer blutplasmaproteinhaltigen Zusammensetzung, wie Blut, Blutplasma, Blutplasmafraktionen usw., möglich, die im so wesentlichen frei von ansteckendem Virus ist, jedoch eine wesentliche Menge an lebensfähigem (nicht denaturiertem Protein) enthält. Insbesondere betrifft die Erfindung die Inaktivierung von lipidhaltigen Viren und bevorzugt die Inaktivierung von Hepatitis-B- und Nicht-B-nicht-A-Virus. Wei- 55 tere erfindungsgemäss inaktivierte Viren sind beispielsweise Cytomegalusviren, Epstein-Barr-Viren, Milchsäuredehydro-genaseviren, Herpesgruppeviren, Rhabdoviren, Leucoviren, Myxoviren, Alphaviren, Arboviren (Gruppe B), Paramyxovi-ren, Arenaviren, Coronaviren und Retroviren. Die Erfindung t,o ermöglicht die Herstellung einer proteinhaltigen Zusammensetzung, die ein Produkt ist, erzeugt aus normalen oder Krebszellen, oder durch normale oder Krebszellen (z.B.

durch DNA-Rekombinationstechnologie) wie Säugetierblut, Blutplasma, Blutplasmafraktionen, Prezipitaten aus Blutfrak- 65 tionierungen und Überständen aus Blutfraktionierungen mit einem Ausmass an Inaktivierung des Virus von grösser als 4 log an Virus, wie Hepatitis-B- und Nicht-A-nicht-B-Virus,

wobei die Zusammensetzung eine Proteinaktivität von wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 95%, und insbesondere 98 bis 100%, bezogen auf Gesamtprotein, aufweist.

Die Erfindung betrifft ferner eine Zusammensetzung, die den Faktor VIII enthält, im wesentlichen frei an Hepatitis virus bis zu einer Inaktivierung von grösser als 4 logs des Virus ist und eine Proteinaktivität von wenistens 70, vorzugsweise wenigstens 85, insbesondere wenigstens 95 und ganz besonders 98 bis 100%, bezogen auf Gesamtprotein, hat.

Das Verfahren der Erfindung wurde beschrieben als Behandlung von Plasma, Plasmafraktionen, Plasmakonzentraten oder Bestandteilen davon. Das Verfahren ist jedoch auch nützlich bei der Behandlung von festen Bestandteilen von Blut, Lysaten oder Proteinen, die von Zellen ausgeschieden werden. Daher umfasst das Verfahren auch die Behandlung von Blutplättchen-Konzentraten, Leukozytenkonzentraten und leukozytenarmen, gepackten roten Zellen, ebenso wie blutplättchenreichem Plasma, Blutplättchen-Konzentraten und blutplättchenarmem Plasma einschliesslich gepackter Zellmassen, die den weissen Leukozytenfilm enthalten, der aus weissen Blutzellen, auf gepackten roten Blutzellen

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besteht. Ebenso umfasst das Verfahren die Behandlung von Massen, welche Konzentrate an Granulozyten, Monozyten, Interferon und Transferfaktoren enthalten.

Man kann Plasma selbst gemäss der Erfindung oder frisch gefrorenes Plasma, aufgetautes Plasma, Kryoprezipitat, Kryo-überstände oder Konzentrate aus gefrorenem Plasma ebenso wie Verdünnungsprodukte hiervon behandeln. Auf die oben beschriebene gleiche Behandlungsweise kann ein Virus, der in Produkten aus normalen oder Krebszellen vorhanden ist, inaktiviert werden, während die Aktivität des darin enthaltenen labilen Proteins erhalten bleibt. Zum Beispiel können durch die gleiche Behandlung mit Ölsäure, ihrem Ester oder ihrem Salz Produkte inaktiviert werden, die unter Verwendung von normalen oder Krebszellen hergestellt wurden, das Exsudat aus normalen oder Krebszellen, Hybridomas und 5 Produkte, die durch Genspleissung erhalten worden sind. Solche Behandlung beeinflusst das gewünschte Protein im wesentlichen nicht negativ. Die für die Herstellung des gewünschten Proteins verwendeten Zellen können selbstverständlich sowohl Säugetierzellen als auch Nicht-Säugetierzel-io len sein.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims

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2

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Inaktivierung von lipidhaltigen Viren in einer proteinhaltigen Zusammensetzung ohne nennenswerte Proteindenaturierung, dadurch gekennzeichnet, dass die pro-teinhaltige Zusammensetzung mit einer wirksamen Menge an Ölsäure, einem ihrer Ester oder einem ihrer Alkali- oder Erdalkalisalze für eine zur Inaktivierung des Virus ausreichende Zeit in Berührung gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ölsäuresalz verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Natriumoleat verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ölsäure(Ci_4-Alkyl)ester verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ölsäure verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontakt in Gegenwart eines Netzmittels erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein nicht-ionisches Detergens als Netzmitte] verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Netzmittel der proteinhaltigen Zusammensetzung vor dem Kontakt der proteinhaltigen Zusammensetzung mit der Ölsäure, ihrem Ester oder Salz zugegeben wird.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Netzmittel gleichzeitig mit der Ölsäure, derem Ester oder Salz zugegeben wird.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Netzmittel nach der Ölsäure, ihrem Ester oder Salz zugegeben wird.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Detergens ein Teilester von Sorbitolanhydrid verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,

dadurch gekennzeichnet, dass der Kontakt der proteinhaltigen Zusammensetzung mit der Ölsäure oder ihrem Derivat in Anwesenheit eines weiteren Inaktivierungsmittels aus der aus Ethern und Alkoholen bestehenden Gruppe vorgenommen wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,

dadurch gekennzeichnet, dass die proteinhaltige Zusammensetzung aus Gesamtblut, Blutplasma, einem Plasmakonzentrat, einem Prezipitat, einer Fraktionierung eines Plasmas, einem Überstand aus einer Fraktionierung eines Plasmas, einem Serum, einem Kryoprezipitat, einem Zell-Lysat und/ oder in Blutzellen induzierten Proteinen besteht.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,

dadurch gekennzeichnet, dass die proteinhaltige Zusammensetzung wenigstens ein Protein, ausgewählt aus der aus Fibrinogen, Faktor II, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor I, Immunoglobulinen, Prealbumin, retinolbinden-den Protein, Albumin, Alpha-Globulinen, Beta-Globulinen, Gamma-Globulinen, Faktor III und den Komplementärkomponenten, Fibronectin, Antithrombin III, Hämoglobin, Interferon, T-Zellwachstumsfaktor, Plasminogen-Aktivator bestehenden Gruppe ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,

dadurch gekennzeichnet, dass die proteinhaltige Zusammensetzung das Produkt aus einer Nicht-Blut-Normal- oder -Krebszelle oder das Produkt einer Genspleissung ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15,

dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktzeit zwischen 1 und 5 Stunden liegt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16,

dadurch gekennzeichnet, dass der Kontakt bei einer Temperatur zwischen 0 und 60 °C bewirkt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17,

dadurch gekennzeichnet, dass Ölsäure, ihr Ester oder Salz in einer Konzentration zwischen 0,02 und 0,1 Gew.-% eingesetzt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass Ölsäure, ihr Ester oder Salz in einer Konzentration zwischen 0,02 und 0,04 Gew.-% während 1 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur eingesetzt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 18, ddurch gekennzeichnet, dass die proteinhaltige Zusammensetzung den Faktor VIII enthält.
21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinhaltige Zusammensetzung den Faktor IX enthält.
22. Proteinhaltige Zusammensetzung, erhalten mit dem Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie den Faktor VIII enthält, im wesentlichen frei von Hepatitisvirus bis zu einer Inaktivierung von grösser als 4 logs des Virus ist und eine Proteinaktivität von wenigstens 70%, bezogen auf Gesamtprotein, hat.