-
Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Immunglobulin G. Das Produkt kann
bei der Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen verwendet werden.
-
Der menschliche Organismus wird vor
externen pathologischen Organismen durch das Immunsystem geschützt, wobei
ein Teil davon aus den Immunglobulinen IgG, IgM und IgA besteht.
Um einwandfrei als Teil des Immunsystems zu funktionieren, müssen die
Immunglobuline in ihrer ursprünglichen Form
vorliegen. Folglich muss das Molekulargewicht von IgG etwa 150 kD
betragen, und der sogenannte Fc-Teil muss ungebrochen und funktionsfähig sein. IgG
kann seine ursprüngliche
Form beim Reinigungsverfahren, z. B. als Ergebnis von durch Ethanol verursachter
Polymerisation verlieren. Die modifizierte IgG-Fraktion kann das
Komplement in vivo so stark aktivieren, dass der Patient, dem das
Produkt infundiert wird, eine schwerwiegende anaphylaktische Reaktion
erleidet. Die Fähigkeit
der IgG-Fraktion, das Komplement zu binden, wird in vivo als Antikomplement-Aktivität gemessen.
-
Immunglobulin wird bei der Behandlung
von bestimmten Erkrankungen, z. B. bei idiopathischer Thrombozytopänie, sowie
beim Schützen
von Patienten, welchen Immunglobulin G entweder als angeborenes
oder vorübergehendes
Merkmal fehlt (Patienten mit hypo- oder agamma-Glubolinämie), vor
Infektionen verwendet. Spezielle Immunglobuline, wie Produkte, die
Antikörper
gegen Tetanus, Röteln, Anti-D
oder Tollwut enthalten, werden zum Schutz von Menschen vor speziellen
Erkrankungen verwendet.
-
Es wurde herausgefunden, dass Hepatitis-Viren
an Patienten durch bestimmte Immunglobulin-Produkte übertragen
wurden. Dies bedeutet, dass nicht alle infektiösen Viren beim Herstellungsverfahren
getötet
wurden. Hepatitis wurde in 10– 20%
der Patienten diagnostiziert, die eine intravenöse Immunglobulin-Behandlung erhielten.
-
Das am besten bekannte Verfahren
zur Herstellung von intravenösen
Immunglobulinen ist die Behandlung mit schwachem Pepsin bei einem pH-Wert
von 4 (Barandun et al., Vox Sang 7: 157–174, 1962; FI-Patent 73 597;
Suomela et al., Biotechnology of Blood Proteins, 227: 261–265, 1993), Das
Ziel der Pepsin-Behandlung
war, die Antikomlementarität
zu eliminieren. Andere mögliche
Verfahren sind z. B. intensives Fraktionieren von Immunglobulinen
durch proteolytische Enzyme wie Pepsin oder Plasmin. Die Proteinmoleküle im erhaltenen
Produkt sind so stark fragmentiert (über die Hälfte der Moleküle), dass
Antikomplement-Aktivität überhaupt
nicht mehr gemessen werden kann (Römer et al., Develop. Biol.
Standard 44: 147–151,
1979). Proteinmoleküle können auch
durch chemische Mittel, z. B. durch Sulfonieren, Reduzieren und
Alkylieren oder Ausfällen mit
Polyethylenglycol oder dessen Derivate behandelt werden (Römer et al.,
Vox Sang 42: 62–73, 1982).
-
Hepatitis-Viren können durch eine Behandlung
mit einem Lösungs-Netzmittel
(S/D) inaktiviert werden (US-Patente 4,591,505, 4,613,501, 4,481,189;
Horowitz et al., Int. Assoc. Biol. Standard, 9. Nov. 1992).
-
Im allgemeinen vertragen Patienten
mit schwachem Pepsin behandeltes Immunglobulin ziemlich gut, jedoch
wurden Hepatitis-Übertragungen von
gemäß diesem
Verfahren hergestellten Produkten dokumentiert (Williams et al.,
Vox Sang 57: 15–18,
1989) Unter den Nachteilen von insbesondere enzymatisch fraktionierten
oder chemisch behandelten Produkten sind die verkürzte biologische
Halbwertszeit und die Ineffizienz zu erwähnen (Römer et al., Vox Sang 42: 62–73, 1982).
-
US-Patent 4,874,708 beschreibt die
Reinigung einer Immunglobulinfraktion durch Polyethylenglycol (PEG).
PEG ist ein Fällungsmittel.
Ultrafiltration wird zum Einengen der Lösung von gamma-Globulinen verwendet,
und Diafiltration wird zum Entfernen des PEGs verwendet.
-
EP-A-448075 betrifft ein Verfahren
zur Herstellung von Immunglobulin-G-Zubereitungen. Ein poröser Polyolefinmembranfilter
mit einer Porengröße vorzugsweise
innerhalb des Bereichs von 0,015 bis 0,17 μm wird zum Entfernen von Antikomplement-Aggregaten
verwendet.
-
BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erefindung eröffnet ein
Verfahren zur Herstellung von Immunglobulin G gemäß nachstehendem
Anspruch 1. Ein paar vorteilhafte Modifikationen der Erfindung werden
in den zusätzlichen
Ansprüchen
herangezogen.
-
Um die Antikomplementarität und inaktivierte Viren
zu eliminieren, umfasst das Verfahren aufeinanderfolgende Pepsin-
und S/D-Behandlungen, wonach die Chemikalien und das Pepsin, welche
bei der Inaktivierung verwendet wurden, und die Abbauprodukte von
Immunglobulin entfernt werden. Außerdem wird zur Eliminierung
von Viren Filtration mit einem perforierten Filter durchgeführt, dessen
maximale Perforationsgröße nicht
größer als
35 nm ist.
-
Die Pepsin-Behandlung ist eine solche,
die schwache Proteolyse oder charakteristische Verarbeitung verursacht,
und vorteilhaft von einer Art ist, die bei der Herstellung von für klinische
Verwendung bestimmte Produkte verwendet wird. Die Behandlung wird
bei einem pH-Wert von 3,8–4,6
für eine
geeignete Dauer unter Bedingungen durchgeführt, bei welchen das Pepsin
enzymatisch aktiv ist. Am vorteilhaftesten ist die Behandlungsdauer
mit schwachem Pepsin bei einer Temperatur von etwa 33–40°C außergewöhnlich lang,
etwa 60–72
Stunden, und die Behandlung wird bei einem pH-Wert von 4,2–4,5, der höher als
normal ist, durchgeführt.
Von einer langen Behandlungsdauer wurde herausgefunden, dass sie die
Virusinaktivierung erhöht.
Eine lange Behandlungsdauer erhöht
auch die Menge von Abbauprodukten. Dies ist jedoch für das Endprodukt
nicht nachteilig, da die Abbauprodukte entfernt werden.
-
Stark gespaltene Produkte (z. B.
ad 70%) können
ebenso mit diesem Verfahren hergestellt werden. Bei der Lösungs-Netzmittel-Behandlung wird
eine Lösungs-Netzmittel-Kombination
verwendet, die die Lipidhülle
von Viren zersetzt. Es werden gewöhnlich 0,3% Tri(n-butyl)phosphat
und 1% Polysorbat (z. B. Tween 80), 1% Octoxynol (z. B. Triton 100)
oder 0,2% Natriumcholat oder nur 2% Tri(n-butyl)phosphat verwendet. Die Behandlungsdauer
beträgt
gewöhnlich
4–6 Stunden
und die Temperatur 24–37°C.
-
Die Chemikalien, das Pepsin und die
Spaltprodukte werden am besten gleichzeitig durch Binden des Immunglobulins
an einen Ionenaustauscher, am vorteilhaftesten an einen Kationenaustauscher entfernt.
Ein Agarose-Typ eines Kationenaustauschers (z. B. CM-Sepharose)
wird am vorteilhaftesten verwendet.
-
Es wurde herausgefunden, dass Virusfiltration
wirksam solche Viren entfernt, die bei der S/D-Behandlung nicht
inaktiviert werden. Die Filtration kann in jedem beliebigen Stadium
durchgeführt
werden. Am vorteilhaftesten wird sie nach Entfernung der Chemikalien
und der Abbauprodukte oder während der
Pepsin-Inkubation
durchgeführt.
Es wurde überraschend
auch entdeckt, das die Pepsin-Behandlung die
Durchlässigkeit
von Proteinen bei der Filtration deutlich verbessert.
-
Die Größe der Perationen in den bei
der Virusentfernung verwendeten Filtern (z. B. Nanofilter Planova,
Asahi Chemical Co., Japan) beträgt
maximal 35 nm, z. B. nicht mehr als 20 nm, am vorteilhaftesten nicht
mehr als 15 nm.
-
Die nahegelegte Verfahrenskombination
eliminiert auch nicht umhüllte
Viren und gering umhüllte Viren
wirksam.
-
Am vorteilhaftesten wird schließlich das
Produkt z. B. durch Zugabe von Mono- oder Disaccharid oder Zuckeralkohol
stabilisiert.
-
Bei dem ursprünglichen Material kann es sich
um Blutplasmafraktionen, die durch einige bekannte Verfahren hergestellt
sind und Immunglobulin G enthalten, z. B. Fraktionen, die mit Polyethylenglycol
oder Chromatografie gereinigt wurden, handeln. Es kann sich um normales
oder Hyperimmunplasma oder einer gereinigten Fraktion aus der Placenta
handeln. Insbesondere kann das ursprüngliche Material eine Cohn-Fraktion
II sein, die am vorteilhaftesten mit einem Anionenaustauscher weiter
gereinigt und aus Ethanol gefriergetrocknet wird. Es ist auch möglich, ein
Pulver oder eine Lösung
von Immunglobulin G, das durch ein anderes Verfahren hergestellt
wurde, z. B. ein Überstand
III der Cohn-Fraktion oder eine Cohn-Fraktion II, die nicht weiter
behandelt wurde, mit einer elektrophoretischen Reinheit von 90%,
zu verwenden. Der Ethanol in den ethanolhaltigen Fraktionen kann
z. B. durch Ultrafiltration, Gelfiltration oder Gefriertrocknen
vor dem Lösen
des Immunglobulins entfernt werden.
-
Eine Anionenaustauscherbehandlung
(z. B. DEAE-Sephadex) wird vorteilhaft als ein Schritt bei der Reinigung
der Cohn-Fraktion verwendet.
-
Durch die Erfindung werden äußerst reine und
gut verträgliche
intravenös
verabreichte Produkte erhalten, die kein Pepsin enthalten und eine
geringere Antikomplement-Aktivität
als alle Produkte des Fachgebiets aufweisen. Mindestens 95%, vorteilhaft mindestens
98% der Proteine in dem Produkt sind IgG und mindestens 90% des
IgG sind monomer oder dimer. Die Menge von polymerem IgG beträgt weniger
als 1% und die Menge an kleinen Fragmenten beträgt weniger als 5%. Erfindungsgemäß ist es möglich, Produkte
mit einem IgA-Gehalt unter 5 mg/l, typischerweise 2–3 mg/l
zu erhalten. Der Gehalt des Prekallikrein-Aktivators beträgt typischerweise
weniger als 1 IU/ml. Zudem wird der virale Schutz der Produkte in
mehr Arten als in den Produkten des Stands der Technik gesichert.
-
Das Verfahren kann auf die Herstellung
von sowohl normalen als auch spezifischen Immunglobulinen angewandt
werden.
-
Für
eine Flüssig-Zubereitung
wird etwas Lösung
nach der Kationenaustausch-Chromatografie extrahiert
und diese Lösung
z. B. mittels pH-Wert-Einstellung, Einengung, Waschen und Filtrieren
zu einem als Flüssig-Zubereitung
zu konservierenden Produkt verarbeitet.
-
Das Produkt kann eingeengt und in
einer Ultrafiltrationsvorrichtung mit einem Filter, der für Proteine,
die kleiner als etwa 150 kD sind, permeabel ist, bei konstantem
Volumen gewaschen werden.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren wird z. B. wie
folgt realisiert:
Immunglobulin wird zu einer wässrigen
Lösung
gelöst.
Der pH-Wert wird mit einer schwachen Säure auf etwa 4,4 eingestellt.
Am vorteilhaftesten wird die Säure
der Lösung
in so feinen Teilchen wie möglich zugesetzt.
Folglich wird der pH-Wert
schnell, ohne Schädigen
des Immunglobulins eingestellt. Pepsin wird mit einem Gewichtsverhältnis von
etwa 1 : 10.000 zugesetzt. Die Lösung
wird etwa 66 Stunden bei einer Temperatur von grob 35°C inkubiert.
-
Ein Gemisch aus der Lösung und
dem Netzmittel wird zugesetzt und die Inkubation mindestens 8 Stunden
lang bei einer Temperatur von 26 ± 2°C fortgesetzt. Immunglobulin
wird an den Kationenaustauscher gebunden und mit einem biologisch
vereinbaren Puffer eluiert.
-
Der pH-Wert des Eluats wird auf etwa
6,9 eingestellt. Das Eluat wird eingeengt, bei konstantem Volumen
gewaschen und gleichzeitig um 3–15%, vorteilhaft
8–9% Saccharose
zu enthalten, ins Gleichgewicht gebracht, klärfiltriert, portioniert und gefriergetrocknet.
-
Das erhaltene Ergebnis ist ein trockenes
Warenprodukt, das durch Zugabe von Wasser zu einer Injektionslösung wird.
-
Die gemäß der vorstehenden Beschreibung hergestellte
Injektionslösung
wurde an 15 Patienten in 7 verschiedenen Krankenhäusern verabreicht.
Es wurde herausgefunden, dass das Produkt weniger Nebenwirkungen
als die beiden Bezugsprodukte in gegenwärtiger Verwendung verursachte.
Die Teilnehmer an diesem Versuch waren Patienten, die früher eine
Behandlung mit einem Bezugsprodukt für Hyper-gamma-Globulinämie erhielten.
Es wurde keine Übertragung
von infektiösen
Viren als Ergebnis der Verwendung des Produkts nachgewiesen.
-
Die als Flüssig-Zubereitung konservierte
Immunglobulin-Lösung
wird z. B. wie folgt hergestellt: Das ursprüngliche Material ist die aus
dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Lösung vor dem
Gefriertrocknen, am vorteilhaftesten nach dem Kationenaustausch.
Der pH-Wert des aus der Säule erhaltenen
Eluats wird eingestellt und die Lösung durch Ultrafiltration
eingeengt. Der gewählte
Ultrafilter ist vorteilhaft eine Art, die für Proteine mit einer Molekulargröße, die
kleiner als etwa 150 kD ist, permeabel ist. Die Lösung wird
auf einen Proteingehalt von 2–10%
(G/G), am vorteilhaftesten etwa 5–6% eingeengt. Falls nötig, werden
Filterstoffe, z. B. Al(OH)3-Gel und/oder
Diatomeenerde zugesetzt und gemischt. Die Filterstoffe werden durch
Filtrieren oder Zentrifugation entfernt.
-
Die Lösung wird klärfiltriert
und anschließend mit
einem Filter mit einer Perforationsgröße von 15 nm filtriert.
-
Nach dem Filtrieren wird 10%ige (G/G)
Saccharose in der Lösung
gelöst,
der pH-Wert wird überprüft und,
falls nötig,
eingestellt. Anschließend
wird steril filtriert und abgefüllt.
Die Lösung
sollte bei einer Temperatur von 2–8°C aufbewahrt werden.
-
Bei der Herstellung eines als Flüssig-Zubereitung
zu konservierenden Produkts ist es möglich, den Gefriertrocknungsschritt
zu vermeiden, der die Herstellung beschränkt und Kosten erhöht.
-
BEISPIEL 1
-
Eine Cohn-Fraktion II des Materials
wird mit einem Anionenaustauscher des Typs DEAE-Sephadex unter den
folgenden Bedingungen gereinigt: der pH-Wert des Gels und schwachen
Acetat-Puffers beträgt
6,85 ± 0,05,
die Temperatur 6–8°C, die Verfahrensdauer
3 Stunden. Für
ein Kilogramm Material werden 35 g trockener Anionenaustauscher
verwendet.
-
2,66 kg gereinigtes und gefriergetrocknetes Pulver
der Cohn-Fraktion II werden in 35,64 l 10%iger Saccharose-Lösung, enthaltend
0,2 M NaCl, gelöst.
Dies wird durch Filtrieren geklärt.
Der pH-Wert der Lösung
wird mit 0,2 M HCl bei 0°C
auf 4,4 eingestellt, und es werden 240 mg gereinigtes Schweinepepsin
zugesetzt. Die Lösung
wird durch Filtrieren geklärt.
Die Lösung
wird 66 Stunden bei einer Temperatur von 35°C inkubiert. Der pH-Wert wird mit
0,2 M NaOH bei 0°C
auf 5,5 eingestellt, und es wird steril filtriert. Dann werden 461
g Tween 80 und 135 g Tri(n-butyl)phosphat der Lösung zugesetzt, und dies wird
bei 26°C
eine Stunde gemischt.
-
Die Lösung wird durch eine Schlauchpumpe zu
einem virusfreien Produktionsbereich befördert, wo sie weiter mindestens
6–20 Stunden
in einem geschlossenen Behälter
aufbewahrt wird. In diesem Bereich verwendet die Produktion nur
Autoklavengerätschaft
oder eine Gerätschaft,
die von Viren in etwas anderer Weise gereinigt wurden. Die Lösung wird
auf eine 40-l-CM-Sepharose-FF-Säulegepackt,
die mit 50 mM Acetat-Puffer, pH-5,0 ins Gleichgewicht gebracht ist.
Tween 80 und das Tri(n-butyl)phosphat, Pepsin und ein Teil der Immunglobulinabbauprodukte fließen durch.
Das an die Säule
gebundene Immunglobulin wird mit einem 15 nM Natriumacetat-Puffer, pH
5,0, enthaltend 0,5 M NaCl, eluiert.
-
Der pH-Wert der Lösung wird mit 0,2 M NaOH auf
6,9 eingestellt und die Lösung
auf etwa 40 l durch Ultrafiltration eingeengt. Der Proteingehalt und
die Salzzusammensetzung der Lösung
wird durch Waschen bei konstantem Volumen mit 180 l einer Lösung, enthaltend
8% (G/V) Saccharose, 0,8% Glysin und 60 mM NaCl, gewaschen. Klärfiltration und
Filtration mit einem Filter mit 15 nm wird durchgeführt. Nach
sterilem Filtrieren wird die Lösung
entweder in der endgültigen
Flasche gefriergetrocknet und unter Vakuum verschlossen oder zu
einem als Flüssig-Zubereitung
konservierten Produkt verarbeitet.
-
BEISPIEL 2
-
Ein Cohn-Fraktion III-Überstand
oder nicht gefriergetrocknete Cohn-Fraktion II-Lösung
wird zum Entfernen von Ethanol ultrafiltriert oder gelfiltriert
und zum Entfernen von Verunreinigungen mit DEAE-Ionenaustauscher
behandelt. Die Lösung
wird durch Waschen bei konstantem Volumen zu einer Lösung mit
5– 10%iger
(G/V) Saccharose und 0,2%igem (G/V) NaCl ins Gleichgewicht gebracht.
Die Produktion wird gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren fortgesetzt.
-
BEISPIEL 3
-
Der pH-Wert des gemäß Beispiel
1 oder 2 hergestellten CM-Sepharose-Eluats wird mit 0,2 M NaOH bei
0°C auf
5,1 eingestellt. Die Lösung
wird in Bezug auf das Protein auf 5–10% durch Ultrafiltration mit
einem Membranfilter, der für
alle Moleküle,
die kleiner als 150 kD sind, permeabel ist, eingeengt. Waschen bei
konstantem Volumen mit 5–8
Volumeneinheiten destilliertem Wasser wird durchgeführt.
-
Falls gewünscht, werden als Filterstoffe Al(OH)3-Gel 10–30
ml/l und Diatomeenerde-Filterstoff (z. B. Filtercel) 5–40 g/l
zugesetzt. Die Filterstoffe werden durch Zentrifugation oder vorteilhaft
durch Filtration in Verbindung mit Klärfiltration entfernt.
-
Die Lösung wird zuerst mit einem
aus Glas hergestellten Vorfilter und dann mit Membranfiltern mit
220 nm und 100 nm filtriert. Als nächstes wird durch einen Filter
mit 15 nm filtriert. Der Lösung
wird 10%ige (G/V) Saccharose zugesetzt, und nach deren Lösen der
pH-Wert überprüft und,
falls nötig,
der pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 1,5 eingestellt. Die Lösung wird
steril filtriert und abgefüllt.
-
BEZUGSBEISPIEL
-
Von einem Ansatz im Produktionsmaßstab (4
kg Immunglobulin) wurden 300 ml Lösung von dem Produktionsschritt
vor der Pepsinverarbeitung extrahiert. Die Lösung wurde in zwei Teile, A
und B, geteilt. Teil A wurde der Pepsinverarbeitung unter Bedingungen,
bei welchen das Pepsinverhältnis 1/10.000
des Immunglobulingewichts betrug, pH 4,4, Temperatur 37°C, Dauer
66 Stunden, unterzogen. Teil B wurde in derselben Weise, jedoch
ohne Pepsin behandelt. Nach der Inkubation wurde der pH-Wert beider
Lösungen
auf 5,0 eingestellt. Beide Teile wurden nacheinander mit derselben
Gerätschaft
und demselben Filter filtriert. Der Transmembrandruck wurde auf
0,5 bar eingestellt. Bei der Filtration von Teil A wurde zuerst
eine 30-minütige
Stabilisationsfiltration mit einer Filtrierlösung durchgeführt. Als
die Filtrationsgeschwindigkeit stabilisiert war, wurde die Filtration
90 Minuten lang fortgesetzt. Die mittlere Filtrationsgeschwindigkeit
(der mittlere Proteinfluss) für Lösung A betrug
168,4 gh–1m–2.
Die Gerätschaft
wurde vorsichtig mit Lösung
B gewaschen, und es wurde eine 30-minütige Stabilisati onsfiltration
und eine 90-minütige
Filtration durchgeführt.
Der mittlere Proteinfluss betrug 58,5 gh–1m–2.
-
Folglich betrug die filtrierte Menge
an digeriertem Pepsin Immunglobulin pro Zeiteinheit verglichen mit
dem nicht digeriertem Produkt das Dreifache.