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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren, das für
die Abtrennung von Faktor IX von einer Faktor IX einschließenden unreinen
Proteinfraktion nützlich
ist.
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Hintergrund der Erfindung
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Die Einleitung der Blutgerinnung
erfolgt durch zwei unterschiedliche und doch ähnliche molekulare Mechanismen,
die sogenannten intrinsischen und extrinsischen Koagulationswege
oder Kaskaden. Der intrinsische Weg schließt Faktoren ein, die man normalerweise
im Blut findet. Der extrinsische Weg schließt zusätzlich zu den Blutkomponenten
Gewebefaktoren ein. In allen Reaktionsschritten der beiden Kaskaden
wandelt eine Proteinase ein inaktives Zymogen in seine enzymatisch
aktive Form um. Im letzten Schritt der Kaskade, der bei dem intrinsischen
und dem extrinsischen Weg gleich ist, wird inaktives Prothrombin
in Thrombin umgewandelt, das wiederum die Umwandlung von löslichem
Fibrinogen in unlösliches
Fibrin katalysiert.
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Der Faktor IX nimmt an der Ereigniskaskade,
die zur Blutgerinnung führt,
teil. Genauer gesagt aktiviert Faktor IX bei Aktivierung durch die
Wirkung der Faktoren XIa oder VIIa Faktor X zu Xa. Faktor Xa wiederum aktiviert
Faktor II (Prothrombin) zu Faktor IIa (Thrombin). Der aktivierte
Faktor II aktiviert dann Fibrinogen zu den Fibrinpolymeren des geronnenen
Blutes. Mangelhafte Aktivität
einer der an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren führt dazu,
dass das Blut nicht richtig gerinnen kann, bzw. zu abnorm langen
Gerinnungszeiten. Beispielsweise ist Faktor IX bei Patienten mit
einer als „Hämophilie
B„ identifizierten
Krankheit nicht oder nicht ausreichend vorhanden. Daher gerinnt
das Blut von Hämophilie
B-Patienten nicht richtig. Hämophilie
B-Patienten wird Faktor IX verabreicht, damit sie ausreichend davon
haben, so dass die Fähigkeit
ihres Blutes zu gerinnen wieder so normal wie möglich wird.
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Im Handel erhältliche Faktor IX-Konzentrate
schließen
häufig
andere Blutfaktoren zusätzlich
zu Faktor IX ein. Einige solche Präparate umfassen z. B. den Prothrombinkomplex,
der die Faktoren II, V und X zusätzlich
zu Faktor IX einschließt.
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Bei Patienten, die mit Prothrombinkomplexkonzentraten
oder Faktor IX-Präparation,
die mit Faktor II und/oder Faktor X verunreinigt waren, behandelt
worden waren, wurde das Auftreten von Thrombosekomplikationen wie
Thrombosen der tiefen Venen, disseminierte intravaskuläre Koagulation
und Lungenembolien berichtet. Diese Komplikationen werden häufig bei
noch nicht ausgewachsenen Kleinkindern, Patienten mit gestörter Leberfunktion
und OP-Patienten beobachtet. Solche Komplikationen wurden auch bei
Hämophilie A-Patienten beobachtet,
die ein Prothrombinkomplexkonzentrat als ein den Faktor VIII-Inhibitor
umgehendes Mittel erhalten.
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Die thromboseerzeugende Komponente
der Prothrombinkomplexkonzentrate wurde meistens den aktivierten
Faktoren, dem gerinnend wirkenden Phospholipid oder einer Zymogenüberlastung
zugeschrieben. Eine Zymogenüberlastung
kann die Ursache für
eine disseminierte intravaskuläre
Koagulation in OP-Situationen sein, in denen Patienten wiederholt
große
Dosen Prothrombinkomplexkonzentrate erhalten. In solchen Fällen reichern
sich die Zymogene, insbesondere die Faktoren II und X, wahrscheinlich
aufgrund ihrer relativ langen Halbwertszeit im Vergleich zu Faktor
IX im Blutkreislauf an.
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Die Thrombosekomplikationen im Zusammenhang
mit der Verwendung des Prothrombinkomplexes macht die Bereitstellung
eines von anderen Proteinen im Wesentlichen freien Faktor IX-Konzentrates
zur Behandlung von Hämophilie
B-Patienten wünschenswert.
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Es wurde über verschiedene Verfahren
zur Verbesserung der Reinheit von Faktor IX-Konzentraten berichtet. Es wurden beispielsweise
Verfahren zur Herstellung von Faktor IX-Konzentraten, die im Wesentlichen frei
von Prothrombin waren, sowie von Faktor X-Konzentraten mittels Affinitätschromatographie
auf einem sulfatierten Dextranharz offenbart (D. Menache et al., „Coagulation
Factor IX Concentrate: Method of Preparation and Assessment of Potential
In Vivo Thrombogenicity in Animal Models„, Blood, 64, 1220–1227 (1984)).
Faktor IX wurde mittels Affinitätschromatographie
auf einem Heparin-Sepharose-Harz
gereinigt (L.-O. Andersson et al., „Purification and Characterization
of Human Factor IX„,
Thrombosis Research, 7, 451–459
(1975)). Die Faktoren IX und X wurden mittels eines Heparin-Agarose-Chromatographietechniken
einsetzenden Verfahrens getrennt (S. P. Bajaj et al., „A Simplified
Procedure for Purification of Human Prothrombin Factor IX and Factor
X„, Preparative
Biochemistry, 11, 397–412
(1981)). Auch sind im Stand der Technik Verfahren zur Abtrennung
von Faktor IX mittels Affinitätschromatographie
auf einem Dextransulfat Sepharose-Gel bekannt.
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Während
Faktor IX auf Sepharose (Agarosegels) im Labor abgetrennt werden
kann, hat sich die Verwendung von Agarosegels bei der Abtrennung
im industriellen Maßstab
als unbefriedigend herausgestellt. Werden die Agarosegels in großtechnische
Säulen
gefüllt,
komprimieren sie in einem unerwünschter.
Ausmaß und
behindern so das Fließen
der Flüssigkeiten
durch die Säule.
Dieses Problem wurde durch die Verwendung eines Dextransulfatsiliziumdioxid-Harzes
gelöst,
wie es in dem US-Patent Nr. 4,72,673 von Herring beschrieben ist,
auf das hierin Bezug genommen wird. Zwar ist dieses Reinigungsverfahren
wünschenswert,
da das Siliziumdioxidgel zu höheren
Fließgeschwindigkeiten
und damit zu schnelleren Reinigungsvorgängen führt, doch erfolgt dabei eine
Wärmebehandlung
zur Inaktivierung viraler Verunreinigungen, die in den aus menschlichem
Blut gewonnenen Proteinpräparaten
vorhanden sein können.
Die Wärmebehandlung
aber führt
zur Denaturierung eines Teils des Faktors IX, was in Faktor IX-Präparaten
mit geringer spezifischer Aktivität resultieren kann.
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Zusätzlich zu den zuvor erwähnten Verfahren
erfolgte die Reinigung von Faktor IX mittels Immunoaffinitäts- und
Ionenaustauschchromatographie (S. S. Ahmad et al., „Rapid
Purification of Factor IX, Factor X and Prothrombin by Immunoaffinity
and Ion Exchange Chromatography„, Thromb. Res., 55, 121–133 (1939)),
was zu spezifischen Faktor IX-Aktivitäten von
269 Einheiten/mg führte.
Die Immunoaffinitätsverfahren
resultieren zwar in Präparaten
mit hoher spezifischer Aktivität,
doch die Notwendigkeit der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen
die zu reinigenden Proteine macht das Reinigungsverfahren erheblich
teurer.
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Es ist daher wünschenswert, ein relativ kostengünstiges
Verfahren zur Reinigung von Faktor IX bereitzustellen, das ein für die Verwendung
beim Menschen sicheres Faktor IX-Präparat mit hoher spezifischer
Aktivität
liefert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zur Reinigung von Faktor IX von einer Faktor IX
enthaltenden unreinen Proteinfraktion. Das Reinigungsverfahren umfasst
die Schritte der Bereitstellung einer wässrigen Lösung der unreinen Proteinfraktion,
die Zugabe eines Lösungsmittels
und eines Detergens zu der unreinen Proteinfraktion zur Bildung
einer Lösungsmittel-/Detergens-Proteinlösung, das
Inkubieren der Lösungsmittel-/Detergens-Proteinlösung zur
Inaktivierung in der Lösungsmittel-/Detergens-Proteinlösung vorliegender
viraler Verunreinigungen und die weitere Reinigung von Faktor IX
mittels Chromatographie auf einem sulfatierten Polysaccharid-Harz.
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Der Faktor IX besitzt nach der Reinigung
mittels des zuvor beschriebenen Verfahrens eine spezifische Aktivität von mindestens
85 Einheiten/mg.
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Detaillierte Beschreibung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zur Reinigung von Faktor IX von einer unreinen
Proteinfraktion. Das Reinigungsverfahren umfasst ein Verfahren zur
Inaktivierung unter Umständen
im Blut vorliegender viraler oder anderer Verunreinigungen, das
nicht zu einer extensiven Denaturierung der zu reinigenden Proteine
führt.
Verfahren aus dem Stand der Technik verließen sich bei der Inaktivierung
von Verunreinigungen auf eine Wärmebehandlung.
Eine solche Wärmebehandlung
führt jedoch
zu einer Denaturierung eines Teils des Faktors IX. Zwar resultiert
die Denaturierung in einem Verlust der Faktor IX-Aktivität, doch dieser inaktivierte
Faktor IX wird unter Umständen
gleichzeitig mit dem aktiven Faktor IX gereinigt, was zu einem Endprodukt
führt,
das sowohl den aktiven als auch den inaktiven Faktor IX umfasst.
Das Vorliegen des inaktiven Faktors IX aber führt zu einer spezifischen Aktivität, die geringer
ist, als es bei einem Präparat,
das ausschließlich
oder größere Mengen
an Faktor IX umfasst, der Fall wäre.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet
einen Lösungsmittel-/Detergens-Inaktivierungsschritt,
keine Wärmeinaktivierung,
um die Menge an während
des Reinigungsverfahrens erzeugtem denaturiertem Faktor IX zu reduzieren.
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Das gemäß der Ausführung der erfindungsgemäßen Prinzipien
bereitgestellte Verfahren bezieht sich auf die Abtrennung von Faktor
IX von einer unreinen Proteinfraktion. Der Begriff „unreine
Proteinfraktion„,
wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Proteinfraktion, die
ein oder mehrere Proteine) zusätzlich
zu Faktor IX einschließt.
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Zwar wird das erfindungsgemäße Verfahren
nachfolgend mit Bezug auf die Abtrennung von Faktor IX von Humanplasma
beschrieben, doch es wird erwogen, dass das Verfahren auch für die Abtrennung
von Faktor IX von anderen Quellen, z. B. zur Exprimierung des gewünschten
Proteins gentechnisch erzeugten rekombinanten Organismen, nützlich sein
könnte.
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Abtrennung von Prothrombinkomplexproteinen
von Humanplasma
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Prothrombinkomplexproteine werden
von Humanplasma abgetrennt, das gemäß den von der amerikanischen Überwachungsstelle
für Lebens-
und Arzneimittel zugelassenen Verfahren gesammelt und getestet wurde.
Das Plasma wird zunächst
bei einer Temperatur von etwa –20° C eingefroren.
Dann wird das Plasma bei 0°C
bis 5°C
aufgetaut, damit eine Kryoausfällung
erfolgen kann. Das entstehende Plasma-Kryoausfällungs-Gemisch wird gepoolt
und zentrifugiert, um die Kryoausfällung zu entfernen. Das gepoolte
AHF-arme Plasma wird anschließend
gewogen, auf eine Temperatur von 0°C bis 5°C gebracht und elektrodialysiert,
um die Plasmanatriumkonzentration von ihrem ursprünglichen
Wert auf einen Wert zwischen 85 und 105 mM zu reduzieren. Das dialysierte,
AHF-arme Plasma wird dann durch Zugabe von Essigsäure auf
einen in etwa neutralen pH-Wert eingestellt.
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Die in dem pH-Wert-eingestellten,
AHF-armen Plasma enthaltenen Prothrombinkomplexfaktoren werden von
regenerierter DEAE-Cellulose (DEAE = Diethylaminoethyl) absorbiert.
Die DEAE-Cellulose und das Plasma werden etwa 30 Minuten lang gemischt,
dann wird die DEAE-Cellulose mittels Zentrifugieren gesammelt. Der
von der DEAE-Cellulose absorbierte Prothrombinkomplex wird mit einem
etwa 0,03 M Natriumphosphat und etwa 0,03 M Natriumcitrat eines
pH-Wertes von etwa 6,8 umfassenden Waschpuffer gewaschen. Die Waschflüssigkeit
wird entsorgt.
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Anschließend wird der gewaschene, von
der DEAE-Cellulose absorbierte Prothrombinkomplex aus der Zentrifuge
entfernt und in einem Waschpuffer suspendiert. Die entstandene Suspension
wird nun in eine Säule
gegossen und das Eluat aus der Säule
entfernt. Die DEAE-Cellulose wird dann mit einem Waschpuffer gewaschen;
diese Waschflüssigkeit
wird ebenfalls entsorgt. Anschließend werden die Prothrombinkomplexfaktoren
durch Waschen der Säule
mit einem 0,03 M Natriumphosphat, 0,03 M Natriumcitrat und 0,2 M
Natriumchlorid eines pH-Wertes von etwa 6,8 umfassenden Eluierpuffer
eluiert. Das Eluat wird gesammelt und die den Prothrombinkomplex
enthaltenden Fraktionen werden gepoolt und in einer Masselösung gesammelt.
Es werden geeignete Test der gesammelten Prothrombinkomplexfraktionen
durchgeführt;
danach wird die Lösung,
nachdem der pH-Wert der Masselösung
auf etwa neutral eingestellt worden ist, durch eine sterile, Bakterien zurückhaltende
Absorptionspatrone oder Membran gefiltert. so dass sich eine Masselösung des
filtrierten Prothrombinkomplexes bildet. Die Masselösung des
filtrierten Prothrombinkomplexes wird anschließend bis zur Verarbeitung eingefroren
oder unmittelbar weiterverarbeitet.
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Lösungsmittel-/Detergens(S/D)-Inaktivierung
viraler Verunreinigungen
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Zur Inaktivierung viraler oder anderer
Verunreinigungen, die in der aus Blut gewonnenen Proteinfraktion
vorliegen, wird etwa ein Kilogramm (kg) Masselösung des filtrierten Prothrombinkomplexes
mit etwa 0,11 kg eines etwa 3% Tri-(n)butylphosphat und etwa 10
Gew.-% Monooleat (auch bekannt als Polysorbat 80 und Tween 80) umfassenden
Gemisches gemischt. Die Lösung
wird auf einen pH-Wert von etwa 6,8 eingestellt und unter Mischen
bei etwa 27°C
etwa 6 bis etwa 7 Stunden lang inkubiert. Am Ende der Inkubation
wird der S/D-behandelte
Prothrombinkomplex mit einer etwa 0,02 M Natriumcitrat und etwa
0,05 M Natriumchlorid eines pH-Wertes von etwa 7,3 bis etwa 7,5
umfassenden Lösung
auf etwa 2 mg Protein/ml verdünnt.
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Abtrennung von Faktor
IX von dem Prothrombinkomplex durch Bariumchloridausfällung
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Zur Abtrennung von Faktor IX von
dem Prothrombinkomplex wird der verdünnten, S/D-behandelten Prothrombinkomplexlösung ein
für das
Ausfällen
von Faktor IX ausreichendes Volumen von etwa 0,5 M bis etwa 2 M
Bariumchloridlösung
zugesetzt. Die Faktor IX umfassende Ausfällung wird gesammelt, in einer
Lösung
von etwa 0,2 bis etwa 0,6 M (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure (EDTA)
gelöst
und zur Entfernung von Barium und EDTA und zur Erzielung einer wünschenswert
niedrigen Natriumkonzentration für
die Weiterverarbeitung in einer Pufferlösung eines pH-Wertes zwischen
etwa 6 und etwa 9 gegen einen natriumarrnen Puffer (0–0,2 M NaCl)
diafiltriert. Ein geeigneter Puffer für die Diafiltration umfasst
etwa 0,02 M Natriumcitrat eines pH-Wertes von etwa 6,6 bis etwa
7 sowie etwa 0,05 M NaCl.
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Abtrennung von Faktor
IX von der Bariumchloridausfällung
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Die diafiltrierte Bariumchloridausfällungslösung wird
nun auf einem sulfatierten Polysaccharid-Harz, wie dem in dem Patent
4,725,673 von Herring beschriebenen, auf das hierin Bezug genommen
wird, weiter gereinigt. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung
wird das sulfatierte Polysaccharid vorzugsweise an ein Hartharz
wie z. B. Siliziumdioxid, Methacrylat-Glycerin-Copolymer, Polystyrol-Divinylbenzol-Polyvinyl- Copolymer oder ein
anderes, im Stand der Technik bekanntes Hartharz angelagert. Die
Verwendung von Hartharzen ist bevorzugt, da sie während des
Reinigungsverfahrens nicht komprimieren.
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Pro kg zu reinigender diafiltrierter
Bariumchloridausfällungslösung wird
eine Menge von etwa 3,0 bis etwa 6 Litern sulfatiertes Polvsaccharid-Harz
in eine Säule
gegeben.
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Die diafiltrierte Bariumchloridausfällungslösung wird
auf das sulfatierte Polysaccharid-Harz aufgetragen, so dass der
in der Lösung
enthaltene Faktor IX von dem Harz absorbiert wird. Nach Beendigung
des Absorptionsschrittes wird der von dem Harz absorbierte Faktor
IX mit einem Volumen eines Waschpuffers (etwa 0,02 M Natriumcitrat
eines pH-Wertes von etwa 6,6 bis etwa 7,0 sowie etwa 0,05 M NaCl),
das mindestens etwa 5 Mal so groß ist wie das Harzvolumen in
der Säule,
gewaschen. Anschließend
wird der Faktor IX mit einem linearen Salzgradienten (Natriumchlorid)
von etwa 0,05 M NaCl bis etwa 0,6 M NaCl aus dem Harz eluiert. Erreicht
der Salzgradient eine Konzentration von etwa 0,4 M, enthält das Eluat
im Wesentlichen nur noch Faktor IX. Nach Erzielung des Salzgradienten
wird die Säule
durch Waschen mit einem Waschpuffer, der die maximale Menge des
für den
Gradienten verwendeten Natriumchlorids, z. B. 0,6 M, enthält, weiter
eluiert. Das den Faktor IX enthaltende Eluat wird gepoolt und diafiltriert,
um die Natriumkonzentration auf die gewünschte Zielmenge zu reduzieren.
Die gepoolten Faktor IX-Fraktionen können filtriert und für eine spätere Verarbeitung eingefroren
oder, falls gewünscht,
unmittelbar verarbeitet werden. Die eingefrorenen Proben werden
aufgetaut und ggf. mit anderen gepoolten Fraktionen kombiniert;
der pH-Wert wird, wenn notwendig, auf etwa 6,8 eingestellt.
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Nach der Reinigung von Faktor IX
auf dem sulfatierten Polysaccharid-Harz wurden die Lösungsmittel-/Detergens-Mittel
zur viralen Inaktivierung aus der Faktor IX-Fraktion entfernt und
es sind keine zusätzlichen
Schritte notwendig, um diese „Verunreinigungen" aus dem endgültigen Proteinprodukt
abzutrennen.
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Weitere Reinigung von
Faktor IX
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Anschließend werden die gepoolten,
Faktor IX enthaltenden Fraktionen erneut auf ein sulfatiertes Polysaccharid-Harz
in einer Säule
aufgetragen. In diesem Fall werden etwa 0,57 bis etwa 2,35 kg sulfatiertes
Polysaccharid-Harz pro etwa 5 kg aus dem ersten sulfatierten Polysaccharid-Harz
eluiertem Faktor IX verwendet. Nach dem Auftragen der Faktor IX enthaltenden
Lösung
auf das sulfatierte Polysaccharid-Harz wird das Harz wie zuvor beschrieben
mit einem Waschpuffer (etwa 0,02 M Natriumcitrat und etwa 0,05 M
Natriumchlorid eines pH-Wertes von etwa 6,6 bis etwa 7) gewaschen.
Der Faktor IX wird mit einer etwa 0,02 M Natriumcitrat und etwa
0,6 M Natriumchlorid eines pH-Wertes von etwa 6,6 bis etwa 7 umfassenden
Lösung
aus der Säule eluiert.
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Die Faktor IX enthaltenden Fraktionen
werden gepoolt und diafiltriert, um die Faktor IX-Aktivität und die
Natriumkonzentrationen zu erzielen. Falls gewünscht, können den Faktor IX enthaltenden
Fraktionen Heparin und Dextrose zugesetzt werden. Die Faktor IX
enthaltende Lösung
wird dann wie zuvor beschrieben steril filtriert, so dass die sterile
Faktor IX-Masse entsteht.
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Die sterile Faktor IX-Masse wird
hinsichtlich Sterilität
und Faktor IX-Aktivität
getestet. Das Füllvolumen wird
basierend auf der Faktor IX-Aktivität berechnet. Die sterile Masse
wird in saubere, sterilisierte Fläschchen gefüllt, eingefroren und unter
Vakuum getrocknet; die Fläschchen
werden mit einem Stöpsel
versehen und verschlossen. Dann durchläuft der Behälter mit dem endgültigen gefriergetrockneten
Faktor IX die Qualitätskontrolle.
Liegen die Testergebnisse innerhalb aller anwendbaren Anforderungen,
gibt die Qualitätskontrolle
die Charge frei.
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Beispiel 1
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Reinigung von Faktor IX
in einem Lösungsmittel-/Detergens-Inaktivierungsschritt
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In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung zur Reinigung von Faktor IX wurde der in dem kryoausfällungsarmen
Plasma enthaltene Faktor IX von zuvor mit 0,03 M Natriumphosphat
und 0,03 M Natriumcitrat eines pH-Wertes von 6,8 äquilibirierter
DEAE-Cellulose absorbiert.
Die DEAE-Cellulose und das Plasma wurden etwa 30 Minuten lang gemischt
und die durch Zentrifugieren gesammelte DEAE-Cellulose wurde mit
0,03 M Natriumphosphat und 0,03 M Natriumcitrat eines pH-Wertes
von 6,8 gewaschen. Die Waschflüssigkeit
wurde entsorgt.
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Die gewaschene DEAE-Cellulose wurde
in 0,03 M Natriumphosphat und 0,03 M Natriumcitrat eines pH-Wertes
von 6,8 suspendiert und in eine Säule gegossen. Das Eluat wurde
entsorgt. Die DEAE-Cellulose wurde mit 0,03 M Natriumphosphat und
0,03 M Natriumcitrat eines pH-Wertes von 6,8 gewaschen; die Waschflüssigkeit
wurde ebenfalls entsorgt. Der Faktor IX wurde durch Waschen der
DEAE-Cellulose mit 0,03 M Natriumphosphat, 0,03 M Natriumcitrat
eines pH-Wertes von 6,8 und 0,2 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde
gesammelt und die Faktor IX enthaltende Fraktion wurde gepoolt und
in einer Masselösung
gesammelt. Die Lösung wurde
durch eine sterile, Bakterien zurückhaltende Absorptionspatrone
gefiltert.
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36,6 kg Masselösung des filtrierten Prothrombimkomplexes
wurden mit etwa 3.9 kg eines 3% Tri-(n)butylphosphat und 10 Gew.-%
Monooleat (auch als Polysorbat 80 und Tween 80 bekannt) umfassenden Gemisches
gemischt. Die Lösung
wurde auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und unter Mischen bei
27°C 6 Stunden
lang inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde der S/D-behandelte
Prothrombinkomplex mit 244 kg einer 0,02 M Natriumcitrat und 0,05
M Natriumchlorid eines pH-Wertes von etwa 7,4 umfassenden Lösung auf etwa
1,5 mg Protein/ml verdünnt.
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Im Verlauf von 2 Stunden wurden 46,6
kg 1,0 M Bariumchloridlösung
(4°C) zugesetzt
und das Gemisch wurde eine weitere Stunde lang gerührt. Während der
Zugabe von Bariumchlorid und während
des Mischens wurde das Gemisch bei einer Temperatur zwischen 0°C und 4°C gehalten.
Nach dem Mischen wurde die Lösung
in einer Sharples-Zentrifuge zentrifugiert, wobei die Fließgeschwindigkeit
durch die Zentrifuge zwischen 0,2 und 0,6 Litern pro Minute und
die Temperatur der Lösung
zwischen 0°C
und 4°C
gehalten wurde. Auf diese Weise wurden etwa 11,6 kg Bariumchloridausfällung gesammelt.
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Der Bariumchloridausfällung wurden
bei 20°C
bis 25°C
etwa 58 kg einer 0,4 M EDTA-Lösung zugesetzt,
um die Ausfällung
zu lösen;
anschließend
wurde die Ausfällung
zur Entfernung von Teilchen durch einen Millipore TP-Patronenfilter
gefiltert. Nach der Filtration wurde die Lösung durch einen Millipore
Pellicon-Konzentrator geleitet und auf 1/5 bis 1/10 ihres ursprünglichen
Volumens konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde nun mit 0,02 M Natriumcitrat
und 0,05 M NaCl auf ihr ursprüngliches
Volumen verdünnt.
Die Konzentrations- und Verdünnungsschritte
wurden 6 Mal wiederholt, bis die Leitfähigkeit der Lösung etwa
der der 0,02 M Natriumcitrat und 0,05 M Natriumchlorid enthaltenden
Lösung
entsprach. Nach der letzten Verdünnung
betrug das Gewicht des diafiltrierten Materials 70 kg. Die erneut
gelöste
Ausfällung
enthielt Faktor IX.
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70 kg des diafiltrierten, Faktor
IX enthaltenden Materials wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 260
ml/min in eine 36 cm × 37
cm große,
ein 3 Dextransulfatsiliciumdioxid-Harz enthaltende Moduline-Chromatographiesäule (mit
Waschpuffer, also 0,02 M Natriumcitrat und 0,05 M Natriumchlorid,
pH 6.8, äquilibriert)
eingetragen. Anschließend
wurden 323 kg Waschpuffer durch die Säule geleitet.
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Unmittelbar nach dem Waschen der
Säule wie
zuvor beschrieben wurden 228 eines linearen Salzgradienten aus 0,05
M NaCl bis 0,5 M NaCl in 0,02 M Natriumcitrat, pH-Wert 6,8, mit
einer Fließgeschwindigkeit von
1 l/min in die Säule
eingetragen. Während
des Gradienten wurden 5 l-Aliquote des Säuleneluats gesammelt und jede
dritte Fraktion wurde zur Bestimmung seiner Faktor IX-Aktivität untersucht.
Nach Erzielung des Gradienten wurden weitere 157 Liter der 0,02
M Natriumcitrat, pH-Wert 6,8, und 0,5 M NaCl enthaltenden Lösung in
die Säule
eingetragen und es wurden 5 l-Aliquote des Eluats gesammelt und
hinsichtlich ihrer Faktor IX-Aktivität untersucht.
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Die Faktor IX enthaltenden Fraktionen
wurden gepoolt und das gepoolte Material (142 Liter) wurde durch
etwa fünfmaliges
Hindurchleiten durch einen Millipore Pellicon-Konzentrator konzentriert.
Die Natriumkonzentratiun wurde durch Zugabe von Waschpuffer auf
110 Milliäquivalente/Liter
eingestellt und der natriumeingestellte Faktor IX-Pool wurde auf
ein Volumen von 35 Litern reduziert. Dieses Material wurde mit einer Fließgeschwindigkeit
von 90 ml/min in 12,1 Liter Dextransulfatsiliziumdioxid in einer
Moduline-Chromatographiesäule
eingetragen und mit Waschpuffer äquilibriert.
Dann wurde das Chromatographiemedium mit 96 kg Waschpuffer gewaschen.
Anschließend
wurde das Chromatographiemedium mit 96 Litern einer 0,02 M Natriumcitrat,
pH-Wert 6,8, und 0,6 M NaCl umfassenden Lösung eluiert. 4,75 l-Fraktionen
wurden gesammelt und hinsichtlich ihrer Faktor IX-Aktivität untersucht.
Die Faktor IX enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und das gepoolte
Material (37 Liter) wurde hinsichtlich seiner Faktor IX-Aktivität und A280
untersucht.
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Die Ergebnisse dieser Tests sind
in Tabelle I dargestellt. Tabelle
I
| | Spezifische
Aktivität
von Faktor IX (Einheiten/A280) |
| Plasmafraktion | 3,3 |
| Eluat | 180 |
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Die Reinheit (spezifische Aktivität) von Faktor
IX wurde durch aufeinander folgende Chromatographien auf zwei Dextransulfatsiliziumdioxid-Säulen um
dass 55-fache gesteigert.
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Beispiel 2
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Reinigung von Faktor IX
in einem Wärmeinaktivierungsschritt
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Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren
wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass anstelle des Lösungsmittel-/Detergens-Schrittes
eine Wärmeinaktivierung
erfolgte. Die Masselösung
des filtrierten Prothrombinkomplexes wurde durch eine sterile, Bakterien
zurückhaltende
Patrone gefiltert und anschließend
lypohilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde durch Suspension
in n-Heptan und 20-stündige
Erwärmung
bei 60°C vireninaktiviert.
Das Heptan wurde durch Trocknen entfernt.
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Mit etwa 64,5 kg kaltem Wasser für die Injektion
wurden etwa 2,04 kg getrocknetes Pulver wiederhergestellt. Das wiederhergestellte
Pulver wurde mit 266,6 kg 0,02 M Natriumcitrat, pH-Wert 7,4, und
0,25 M NaCl bei 4°C
verdünnt
und 20 Minuten lang bei 2°C
bis 4°C
gemischt. Die Lösung
wurde dann einer Bariumchloridausfällung unterzogen und die Ausfällung wurde
zur Entfernung von Teilchen durch einen Millipore TP-Patronenfilter
gefiltert. Nach der Filtration wurde das Material wie in Beispiel
1 beschrieben diafiltriert. Das diafiltrierte Material wurde mit
einer Fließgeschwindigkeit
von etwa 120 ml/min in eine ein Dextransulfatsiliziumdioxid-Harz
enthaltende, 18 cm × 98
cm große
Moduline-Chromatographiesäule (mit
W aschpuffer, also 0,02 M Natriumcitrat und 0,05 M Natriumchlorid,
pH-Wert 6,8, äquilibriert)
eingetragen. Anschließend
wurden 25 kg Waschpuffer durch die Säule geleitet.
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Unmittelbar nach dem Waschen der
Säule wie
zuvor beschrieben wurden 150 Liter eines linearen Salzgradienten
aus 0,05 M NaCl bis 0,5 M NaCl in 0,02 M Natriumcitrat, pH-Wert
6,8, mit einer Fließgeschwindigkeit
von 1 l/min in die Säule
eingetragen. Während
des Gradienten wurden 3,5 l-Aliquote des Säuleneluats gesammelt und jede
dritte Fraktion wurde zur Bestimmung seiner Faktor IX-Aktivität untersucht.
Nach Erzielung des Gradienten wurden weitere 50 Liter der 0,02 M
Natriumcitrat, pH-Wert 6,8, und 0,5 M NaCl enthaltenden Lösung in
die Säule
eingetragen und es wurden 3,5 l-Aliquote des Eluats gesammelt und
hinsichtlich ihrer Faktor IX-Aktivität untersucht. Die Faktor IX
enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und das gepoolte Material
wurde durch Ultrafiltration konzentriert und hinsichtlich seiner
Faktor IX-Aktivität
und A280 untersucht.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle II
zusammengefasst. Tabelle
II
| | Spezifische
Aktivität
von Faktor IX (Einheiten/A280) |
| Plasmafraktion
1 | 3,42 |
| Konzentrat
2 | 62,7 |
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Die Ergebnisse deuteten darauf hin,
dass die spezifische Aktivität
von Faktor IX 62,7 Einheiten/A280 beträgt.
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Die obige Beschreibung bevorzugter
Ausführungsformen
der Verfahren zur Abtrennung von Faktor IX von Faktor IX enthaltenden
unreinen Proteinfraktionen dient illustrativen Zwecken. Abwandlungen
sind für
den Fachmann ersichtlich. Daher soll die vorliegende Erfindung nicht
auf die zuvor beschriebenen speziellen Ausführungsformen begrenzt sein.
Die offenbarte Erfindung kann außerdem in Abwesenheit aller
Elemente, die in der Beschreibung nicht spezifisch offenbart sind,
durchgeführt
werden. Der Umfang der Erfindung ist in den nachfolgenden Patentansprüchen definiert.