ES2206459T3 - Purificacion del factor ix. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA PURIFICACION DEL FACTOR IX A PARTIR DE UNA FRACCION DE PROTEINA IMPURA QUE CONTIENE EL FACTOR IX. EL PROCESO DE PURIFICACION COMPRENDE LOS PASOS DE ADICION DE UN DISOLVENTE Y DE UN DETERGENTE A UNA FRACCION DE PROTEINA IMPURA E INCUBACION DE LA SOLUCION DE PROTEINA CON DISOLVENTE/DETERGENTE PARA INACTIVAR CUALQUIER CONTAMINANTE VIRAL. EL FACTOR IX ES PURIFICADO A PARTIR DE LA SOLUCION DE PROTEINA CON DISOLVENTE/DETERGENTE POR CROMATOGRAFIA SOBRE UNA RESINA DE POLISACARIDO SULFATADO SIN EXTRAER PRIMERO EL DISOLVENTE Y EL DETERGENTE ANTES DE LA PURIFICACION DE LA RESINA DE POLISACARIDO SULFATADO. EL FACTOR IX, PURIFICADO POR EL PROCESO TIENE UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE POR LO MENOS 85 UNIDADES POR MG.
Description
Purificación del factor IX.
Esta invención se refiere a un método útil para
la separación del Factor IX a partir de una fracción de proteína
impura la cual incluye Factor IX.
El inicio de la coagulación de la sangre es
mediante dos mecanismos moleculares diferentes, pero similares,
denominados cascadas o vías intrínsecas e extrínsecas de la
coagulación. La vía intrínseca implica factores que normalmente se
encuentran en la sangre. La vía extrínseca implica factores
tisulares además de los componentes de la sangre. En cada una de
las etapas de reacción de las dos cascadas, una proteinasa
convierte un zimógeno inactivo en su forma enzimáticamente activa.
En la última etapa de la cascada, la cual es la misma en ambas vías
intrínseca y extrínseca, la protrombina inactiva se convierte en
trombina, la cual cataliza a su vez la conversión del fibrinógeno
soluble en fibrina insoluble.
El Factor IX participa en la cascada de
acontecimientos que conducen a la coagulación de la sangre.
Concretamente, el Factor IX, cuando se activa por la acción de los
Factores XI_{2} o VII_{2}, activa el Factor X a X_{2}. El
Factor X_{2} activa a su vez el Factor II (protrombina) a Factor
II_{2} (trombina). A continuación, el Factor II activado activa
al fibrinógeno para formar los polímeros de fibrina del coágulo de
sangre. Una deficiencia en la actividad de cualquiera de los
factores implicados en la coagulación de la sangre conduce a una
incapacidad de la sangre para coagularse adecuadamente o a un tiempo
de coagulación más largo de lo normal. Por ejemplo, el Factor IX
está ausente o es insuficiente en enfermos que tienen una
enfermedad identificada como "Hemofilia B". Por tanto, la
sangre de los enfermos de Hemofilia B no se coagula adecuadamente.
El Factor IX se administra a los enfermos de Hemofilia B para
proporcionar el Factor IX suficiente, para restituir la capacidad
de coagulación de su sangre tan cerca de lo normal como sea
posible.
Los concentrados de Factor IX comercialmente
disponibles incluyen, además del Factor IX, otros factores de la
sangre. Por ejemplo, algunas de dichas preparaciones comprenden un
complejo de protrombina el cual incluye, además del Factor IX, los
Factores II, V y X .
Se ha descrito la existencia de complicaciones
trombóticas, tales como la trombosis venosa profunda, la
coagulación intravascular diseminada y la embolia pulmonar en
enfermos tratados con concentrados de complejo de protrombina o en
preparaciones de Factor IX que están contaminadas con Factor II y/o
Factor X. Estas complicaciones se ven frecuentemente en niños
prematuros, en enfermos con una función deficiente del hígado y en
enfermos de cirugía. Dichas complicaciones se han observado también
en enfermos de Hemofilia A que reciben un concentrado de complejo
de protrombina como un agente circulatorio inhibidor del Factor
VIII.
El componente trombogénico de los concentrados de
complejo de protrombina se ha atribuido, con la mayor frecuencia, a
cualquiera de los factores activados, a un fosfolípido activo
coagulante, o a una sobrecarga de zimógeno. La sobrecarga de
zimógeno puede ser la base de la coagulación intravascular
diseminada en situaciones quirúrgicas donde los enfermos reciben
dosis grandes y repetitivas de concentrados de complejo de
protrombina. En dichos casos, es probable que ocurra una
concentración de zimógenos en la circulación, particularmente de
Factores II y X, debido a su relativamente larga semivida en
relación con el Factor IX.
Las complicaciones trombóticas asociadas con el
uso del complejo de protrombina hace que sea deseable proporcionar
un concentrado de factor IX, esencialmente libre de otras
proteínas, para usarse en el tratamiento de los enfermos de
Hemofilia B.
Se han descrito diversos métodos para aumentar la
pureza de los concentrados de Factor IX. Por ejemplo, se han
descrito procesos para producir concentrados de Factor IX,
esencialmente libres de protrombina, y de Factor X mediante el uso
de cromatografía de afinidad sobre una resina de dextrano sulfatado
(D. Menache et al., "Coagulation Factor IX Concentrate: Method of
Preparation and Assessment of Potential In Vivo
Thrombogenicity in Animal Models", Blood, 64,
1.220-1.227 (1984)). Se ha purificado el Factor IX
mediante cromatografía de afinidad sobre una resina de sefarosa con
heparina (L-O. Andersson et al., "Purification
and Characterization of Human Factor IX", Thrombosis
Research, 7, 451-459 (1975)). Se han separado
los Factores IX y X usando un proceso que incluye técnicas
cromatográficas en agarosa con heparina (S.P. Bajaj et al., "A
Simplified Procedure For Purification of Human Prothrombin Factor
IX and Factor X" Preparative Biochemistry,11,
397-412 (1981)). También se conocen en la técnica
procedimientos para la separación del Factor IX mediante
cromatografía de afinidad sobre un gel de sefarosa con sulfato de
dextrano.
Aunque que en el laboratorio el Factor IX pueda
separarse en sefarosa geles de agarosa), se ha encontrado que el uso
de geles de agarosa para separaciones a gran escala es
insatisfactorio. Cuando los geles de agarosa se empaquetan en
columnas de tamaño comercial, se comprimen hasta un grado no
deseable y así inhiben el flujo de los líquidos a través de la
columna. Este problema se ha superado mediante el uso de resina de
sílice con sulfato de dextrano, como se describe en el documento de
Patente Nº U.S. 4.725.673 de Herring, incorporada en la presente
invención por esta referencia. Aunque este método de purificación
sea deseable en el sentido de que el gel de sílice da como
resultado caudales mayores, y por tanto, procedimientos de
purificación más rápidos, usa un tratamiento térmico para desactivar
cualquier contaminante vírico que puede estar presente en las
preparaciones de proteína derivadas de la sangre humana. El
tratamiento térmico da como resultado una desnaturalización de una
porción del Factor IX lo cual conduce a una actividad específica
baja de las preparaciones del Factor IX.
Además de los métodos anteriores, la purificación
del Factor IX se ha llevado a cabo usando cromatografía de
intercambio iónico y de inmunoafinidad (S.S. Ahmad et al., "Rapid
Purification of Factor IX, Factor X and Prothrombin by
Immunoaffinity and Ion Exchange Chromatography", Thromb.
Res., 55, 121-133 (1989)), lo cual ha dado como
resultado actividades específicas tan altas como 269 unidades/mg,
para el Factor IX. Aunque los métodos de inmunoafinidad conduzcan a
preparaciones de alta actividad específica, la necesidad de preparar
los anticuerpos monoclonales contra las proteínas a purificar añade
un coste significativo al procedimiento de purificación.
Por tanto, es conveniente proporcionar, a un
coste relativamente bajo, un proceso para la purificación del
Factor IX, el cual produzca una preparación de Factor IX de
actividad específica alta que sea segura para usarse en seres
humanos.
La presente invención se refiere a un proceso
para la purificación del Factor IX a partir de una fracción de
proteína impura que contiene Factor IX. El proceso de purificación
comprende las etapas de: proporcionar una disolución acuosa de la
fracción de proteína impura, añadir un disolvente y un detergente a
la fracción de proteína impura para formar una disolución de
proteína en disolvente/detergente; incubar la disolución de
proteína en disolvente/detergente para desactivar cualquiera de los
contaminantes víricos presentes en la disolución de proteína en
disolvente/detergente; y además, purificar el Factor IX mediante
cromatografía sobre una resina de polisacárido sulfatado.
El Factor IX, purificado mediante el proceso
anteriormente descrito, tiene una actividad específica de al menos
85 unidades/mg.
La presente invención se dirige a un método de
purificación del Factor IX a partir de una fracción de proteína
impura. El método de purificación comprende un método de
desactivación de cualquiera de los contaminantes víricos u otros,
que puedan estar presentes en la sangre, el cual no conduce a una
desnaturalización extensiva de las proteínas a purificar. Los
métodos previos han dependido del tratamiento térmico para
desactivar los contaminantes. Dicho tratamiento térmico también
conduce a la desnaturalización de una porción del Factor IX. La
desnaturalización da como resultado una pérdida de la actividad del
Factor IX, pero este Factor IX inactivado puede purificarse en
conjunto con el Factor IX activo, dando como resultado un producto
final el cual comprende ambos Factores IX activos e inactivos. La
presencia del Factor IX inactivo conduce a una actividad específica
inferior a la que resultaría a partir de una preparación que
comprendiera solamente, o tuviera niveles mayores de, Factor IX. El
método de la presente invención incorpora una etapa de
desactivación con disolvente/detergente, en lugar de la
desactivación térmica, para reducir la cantidad de Factor IX
desnaturalizado producido durante el procedimiento de
purificación.
El proceso proporcionado de acuerdo con la
práctica de los principios de esta invención se refiere a la
separación del Factor IX a partir de una fracción de proteína
impura. Como se indica en la presente invención, una "fracción de
proteína impura" significa una fracción de proteína la cual
incluye una o más proteínas además del Factor IX.
Aunque, a continuación, se describa el proceso de
la invención con referencia a la separación del Factor IX del plasma
humano, se contempla que el proceso también es útil para separar el
Factor IX a partir de otras fuentes, tales como los organismos
recombinantes creados por ingeniería para expresar la proteína
deseada.
Las proteínas del complejo de protrombina se
separan a partir del plasma humano que ha sido recogido y ensayado
de acuerdo con los procedimientos aprobados por "U.S. Food and
Drug Administration". Inicialmente, el plasma se congela a una
temperatura de aproximadamente -20ºC. A continuación, el plasma se
descongela a 0-5ºC para permitir que ocurra la
crioprecipitación. La mezcla resultante del crioprecipitado de
plasma se junta y se centrífuga para eliminar el crioprecipitado. A
continuación, el plasma deficiente en AHF reunido se pesa, se lleva
a 0-5ºC, y se somete a electrodiálisis para reducir
la concentración de sodio en plasma desde su valor original a entre
85 y 105 mM. A continuación, el plasma deficiente en AHF dializado
se ajusta a aproximadamente un pH neutro mediante la adición de
ácido acético.
Los factores del complejo de protrombina
contenidos en el plasma deficiente en AHF ajustado a un pH se
adsorben sobre DEAE (dietilaminoetil)celulosa regenerada. Se
mezcla la DEAE-celulosa y el plasma durante
aproximadamente 30 minutos y, a continuación, se recoge la
DEAE-celulosa por centrifugación. El complejo de
protrombina adsorbido en la DEAE-celulosa se lava
con un tampón de lavado que comprende fosfato de sodio
aproximadamente 0,03 M y citrato de sodio aproximadamente 0,03 M a
un pH de aproximadamente 6,8. Se desecha el lavado.
A continuación, el complejo de protrombina
adsorbido en la DEAE-celulosa lavada se saca de la
centrifugadora y se suspende en un tampón de lavado. A
continuación, la suspensión resultante se vierte en una columna, y
se desecha el eluato de la columna. A continuación, se lava la
DEAE-celulosa con un tampón de lavado, y también se
desecha este lavado. A continuación, se eluyen los factores del
complejo de protrombina mediante el lavado de la columna con un
tampón de elución que comprende fosfato de sodio 0,03 M, citrato de
sodio 0,03 M y cloruro de sodio 0,2 M a un pH de aproximadamente
6,8. Se recoge el eluato, y las fracciones que contienen el
complejo de protrombina se juntan y se recogen en una disolución
madre. Se llevan a cabo los ensayos apropiados de las fracciones
del complejo de protrombina recogidas y, después se ajusta el pH de
la disolución madre a aproximadamente neutro, la disolución se
filtra a través de una membrana o cartucho de retención de
bacterias estéril, para así formar una disolución madre del
complejo de protrombina filtrada. A continuación, se congela la
disolución madre del complejo de protrombina hasta que se necesite
para procesarse o inmediatamente se procesa adicionalmente.
Para desactivar cualquier contaminante vírico u
otro contaminante presente en la fracción de proteína derivada de la
sangre, se mezcla aproximadamente un kilogramo (kg) de la
disolución madre del complejo de protrombina filtrado con
aproximadamente 0,11 kg de una mezcla que comprende aproximadamente
un 3% de fosfato de tri-(n)butilo y aproximadamente un 10%
(peso/peso) de monooleato (también conocido como polisorbato 80 y
Tween 80). Se ajusta la disolución a un pH de aproximadamente 6,8 y
se incuba, mezclándose, a aproximadamente 27ºC durante de
aproximadamente 6 a aproximadamente 7 horas. Al final de la
incubación, el complejo de protrombina tratado con D/D se diluye a
aproximadamente 2 mg de proteína/ml con una disolución que comprende
citrato de sodio aproximadamente 0,02 M y cloruro de sodio
aproximadamente 0,05 M a un pH de aproximadamente 7,3 a
aproximadamente 7,5.
Para separar el Factor IX del complejo de
protrombina, se añade un volumen de disolución de cloruro de bario
aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 2 M, suficiente para
precipitar el Factor IX, a la disolución diluida del complejo de
protrombina tratado con D/D. El precipitado, el cual comprende el
Factor IX, se recoge y se disuelve en una disolución de ácido
(etilendinitrilo)tetraacético (EDTA) aproximadamente 0,2 a
aproximadamente 0,6 M y filtrado por diálisis frente a un tampón
bajo en sodio (NaCl 0-0,2 M, en una disolución
tamponada a un pH de entre aproximadamente 6 a aproximadamente 9
para eliminar el bario y el EDTA y obtener una concentración de
sodio deseablemente baja para el procesamiento adicional. Un tampón
adecuado para la filtración por diálisis comprende citrato de sodio
aproximadamente 0,02 M a un pH de aproximadamente 6,6 a
aproximadamente 7 y NaCl aproximadamente 0,05 M.
A continuación, se purifica más la disolución de
precipitado de cloruro de bario filtrada por diálisis sobre una
resina de polisacárido sulfatado, tal como la que se describe en el
documento de patente 4.725.673 de Herring, el cual se incorpora en
la presente invención por referencia. Es preferible en la práctica
de la presente invención que el polisacárido sulfatado esté unido a
una resina dura, tal como sílice, copolímero de
metacrilato-glicerol,
poliestireno-divinilbenceno, copolímero de
polivinilo, o cualquiera de las otras resinas duras que se conocen
en la técnica. Se prefiere el uso de resinas duras, ya que no se
comprimen durante el proceso de purificación.
Se metió una cantidad de aproximadamente 3,8 a
aproximadamente 6 litros de resina de polisacárido sulfatado en una
columna por cada kg de disolución de precipitado de cloruro de
bario filtrada por diálisis a purificar.
Se aplica la disolución de precipitado de cloruro
de bario filtrada por diálisis a la resina de polisacárido
sulfatado para que el Factor IX contenido en la disolución se
adsorba sobre la resina. Después de que se complete la etapa de
adsorción, se lava el factor IX adsorbido sobre la resina con un
volumen de un tampón de lavado (citrato de sodio aproximadamente
0,02 M, a un pH de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,0, y NaCl
aproximadamente 0,05 M) aproximadamente igual a al menos cinco veces
el volumen de la resina de la columna. A continuación, se eluye el
Factor IX de la resina con un gradiente lineal salino (cloruro de
sodio) desde NaCl aproximadamente 0,05 M a NaCl aproximadamente 0,6
M. Cuando el gradiente salino alcanza una concentración de
aproximadamente 0,4 M, el eluato contiene esencialmente sólo el
Factor IX. A la finalización del gradiente salino, se eluye más la
columna mediante lavado con un tampón de lavado que contiene el
nivel máximo de cloruro de sodio usado en el gradiente, por
ejemplo, 0,6 M. El eluato que contiene el Factor IX se junta y se
filtra por diálisis para reducir la concentración de sodio a los
niveles objetivo deseados. Las fracciones de Factor IX reunidas
pueden filtrarse y congelarse para un procesamiento posterior, o
pueden procesarse inmediatamente, si se desea. Si se congelan, las
muestras se descongelan y se combinan con otras fracciones
reunidas, cuando se desee, y se ajusta el pH a aproximadamente 6,8,
si es necesario.
Después de la purificación del Factor IX sobre la
resina de polisacárido sulfatado, se han eliminado los agentes de
desactivación de virus con disolvente/detergente de la fracción de
Factor IX y no se requieren etapas adicionales para separar estos
"contaminantes" del producto de proteína final.
A continuación, las fracciones reunidas que
contienen el Factor IX se vuelven a aplicar a una resina de
polisacárido sulfatado empaquetada en una columna. En este caso, se
usan de aproximadamente 0,57 a aproximadamente 2,35 kg de resina de
polisacárido sulfatado por cada aproximadamente cinco kg de Factor
IX eluidos de la primera resina de polisacárido sulfatado. Después
se aplica la disolución que contiene el Factor IX a la resina de
polisacárido sulfatado, la resina se lava con un tampón de lavado
(citrato de sodio aproximadamente 0,02 M y cloruro de sodio
aproximadamente 0,05 M a un pH de aproximadamente 6,6 a
aproximadamente 7), como se describió anteriormente. Se eluye el
Factor IX de la columna con una disolución que comprende citrato de
sodio aproximadamente 0,02 M y cloruro de sodio aproximadamente 0,6
M, a un pH de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7.
Las fracciones que contienen el Factor IX se
reunen y se filtran por diálisis hasta los niveles de concentración
de sodio y de actividad del Factor IX objetivos. Puede añadirse
heparina y dextrosa a las fracciones que contienen el Factor IX, si
se desea. A continuación, se filtra de forma estéril la disolución
que contiene el Factor IX, como se describió anteriormente, para
formar la disolución madre estéril de Factor IX.
La disolución madre estéril de Factor IX se
muestrea para ensayar la esterilidad y la actividad del Factor IX.
Se calcula el volumen de llenado en base a la actividad del Factor
IX. La disolución madre estéril se rellena en viales esterilizados y
limpios, a continuación se congelan y se secan bajo vacío, se tapan
y se sellan. A continuación, el Factor IX en el recipiente final
liofilizado se ensaya en lo que se refiere al control de calidad.
Cuando los resultados del ensayo están dentro de las
especificaciones aplicables, el control de calidad pone a la venta
el lote.
En un ejemplo de la práctica de esta invención
para la purificación del Factor IX, el Factor IX contenido en el
plasma deficiente en crioprecipitado se adsorbió sobre la
DEAE-celulosa, la cual había sido previamente
equilibrada con fosfato de sodio 0,03 M y citrato de sodio 0,03 M a
un pH de 6,8. Se mezclaron la DEAE-celulosa y el
plasma durante aproximadamente 30 min y la
DEAE-celulosa recogida mediante centrifugación se
lavó con fosfato de sodio 0,03 M y citrato de sodio 0,03 M a un pH
6,8. Se desechó el lavado.
La DEAE-celulosa lavada se
suspendió en fosfato de sodio 0,03 M y citrato de sodio 0,03 M, a un
pH de 6,8, y se vertió en una columna. Se desechó el eluato. Se
lavó la DEAE-celulosa con fosfato de sodio 0,03 M y
citrato de sodio 0,03 M, a un pH de 6,8, y también se desechó este
lavado. Se eluyó el Factor IX mediante el lavado de la
DEAE-celulosa con fosfato de sodio 0,03 M, citrato
de sodio 0,03 M, a un pH de 6,8, y NaCl 0,2 M. Se recogió el
eluato, y la fracción que contenía Factor IX se reunió y se recogió
en una disolución madre. La disolución se filtró a través de un
cartucho retentivo de bacterias estéril.
Se mezclaron 36,6 kg de la disolución madre del
complejo de protrombina filtrada con aproximadamente 3,9 kg de una
mezcla que comprendía un 3% de fosfato de tri-(n)butilo y un
10% (peso/peso) de monooleato (también conocido como polisorbato 80
y Tween 80). Se ajustó la disolución a un pH de 6,8 y se incubó,
mezclándose, a 27ºC durante 6 horas. Al final de la incubación, el
complejo de protrombina tratado con D/D se diluyó a aproximadamente
1,5 mg de proteína/ml con 244 kg de disolución que comprendía
citrato de sodio 0,02 M y cloruro de sodio 0,05 M, a un pH de
aproximadamente 7,4.
Se añadieron 46,6 kg de una disolución de cloruro
de bario 1,0 M (4ºC) durante el transcurso de 2 horas, y la mezcla
se agitó durante una hora adicional. La mezcla se mantuvo entre 0ºC
y 4ºC durante la adición de cloruro de bario y durante la mezcla.
Tras mezclar, se centrifugó la disolución en una centrífuga
Sharples, manteniendo el caudal a través de la centrífuga entre 0,2
y 0,6 litro por min., y la temperatura de la disolución entre 0ºC y
4ºC. De esta manera, se recogieron aproximadamente 11,6 kg de
precipitado de cloruro de bario.
Al precipitado de cloruro de bario, se añadieron
aproximadamente 58 kg de disolución EDTA 0,4 M, a
20-25ºC, para disolver el precipitado, y se filtró
el precipitado a través de un filtro de cartucho TP Millipore para
eliminar las partículas. Tras la filtración, se pasó la disolución
a través de un concentrador Pellicon Millipore y se concentró a
entre 1/5 y 1/10 de su volumen original. A continuación, se diluyó
la disolución concentrada a su volumen original, con citrato de
sodio 0,02 M y NaCl 0,05 M. La etapas de concentración y dilución se
repitieron seis veces más, en cuyos puntos la conductividad de la
disolución era aproximadamente igual a la de la disolución que
contenía citrato de sodio 0,02 M y cloruro de sodio 0,05 M. Tras la
disolución final, el peso del material filtrado por diálisis era de
70 kg. El precipitado redisuelto contenía Factor IX.
Se aplicó 70 kg del material que contenía el
Factor IX filtrado por diálisis, a un caudal de aproximadamente 260
ml/min, a una columna cromatográfica Moduline de 36x37 cm que
contenía resina de sílice con sulfato de dextrano, se equilibró con
tampón de lavado (citrato de sodio 0,02 M y cloruro de sodio 0,05 M,
pH 6,8). Posteriormente, se pasaron a través de la columna 323 kg
de tampón de lavado.
Inmediatamente después, se lavó la columna como
se describió anteriormente, se aplicó a la columna un gradiente
salino lineal de 228 litros desde NaCl 0,05 M a NaCl 0,5 M en
citrato de sodio 0,02 M, pH 6,8, a un caudal de 1 litro/min. Durante
el gradiente se recogieron alícuotas de 5 litros del eluato de la
columna, y se ensayó cada tres fracciones para determinar su
actividad del Factor IX. Tras la finalización del gradiente, se
aplicaron a la columna 157 litros adicionales de la disolución que
contenía citrato de sodio 0,02 M, pH 6,8, y NaCl 0,5 M, y se
recogieron alícuotas de 5 litros del eluato y en ellos se ensayó la
actividad del Factor IX.
Se reunieron las fracciones que contenían Factor
IX y el material reunido (142 litros) se concentró aproximadamente
cinco veces mediante el paso a través de un concentrador Millipore
Pellicon. Se ajustó la concentración de sodio a 110 meq/litro
mediante la adición del tampón de lavado y se redujo la reserva del
Factor IX ajustada a sodio a un volumen de 35 litros. Se aplicó
este material a un caudal de 90 ml/min a 12,1 litros de sílice con
sulfato de dextrano, empaquetados en una columna cromatográfica
Moduline y equilibrada con tampón de lavado. A continuación, se lavó
el medio cromatográfico con 96 kg de tampón de lavado. A
continuación, se eluyó el medio cromatográfico con 96 litros de una
disolución que comprendía citrato de sodio 0,02 M, pH 6,8, y NaCl
0,6 M. Se recogieron fracciones de 4,75 litros y en ello se ensayó
para la actividad del Factor IX. Se reunieron las fracciones que
contenían Factor IX y en el material reunido (37 litros) se ensayó
la actividad del Factor IX y para A_{280}.
Los resultados de estos ensayos se muestran en la
Tabla I.
| Actividad específica del Factor IX (Unidades/A_{280}) | |
| Fracción de plasma^{1} | 3,3 |
| Eluato^{2} | 180 |
| ^{1} Complejo de protrombina | |
| ^{2} Eluato de las dos etapas de la cromatografía de sulfato de dextrano |
La pureza (actividad específica) del Factor IX se
incrementó 55 veces mediante la cromatografía secuencial en dos
columnas de sílice con sulfato de dextrano
Se repitió el proceso descrito en el Ejemplo 1,
excepto en que se usó la desactivación por calor en lugar de la
etapa con disolvente/detergente. Se filtró la disolución madre del
complejo de protrombina filtrado a través de un cartucho retentivo
de bacterias estéril, y a continuación se liofilizó. Se desactivó
víricamente el polvo liofilizado mediante suspensión en
n-heptano y calentamiento a 60ºC durante 60 horas.
Se eliminó el heptano por secado.
Se reconstituyeron aproximadamente 2,04 kg del
polvo seco con aproximadamente 64,5 kg de agua fría para inyección.
Se diluyó el polvo reconstituido con 266,6 kg de citrato de sodio
0,02 M, pH 7,4, y NaCl 0,25 M a 4ºC, y se mezcló durante 20 min a
2-4ºC. A continuación, la disolución se sometió a
precipitación con cloruro de bario, y se filtró el precipitado a
través de un filtro de cartucho TP Millipore para eliminar las
partículas. Tras la filtración el material se filtró por diálisis
como se describió en el Ejemplo 1. El material filtrado por
diálisis se aplicó a un caudal de aproximadamente 120 ml/min a una
columna cromatográfica Moduline de 18x98 cm que contenía resina de
sílice con sulfato de dextrano, y se equilibró con tampón de lavado
(citrato de sodio 0,02 M y cloruro de sodio 0,05 M, pH 6,8).
Posteriormente, se pasaron a través de la columna 25 kg de tampón
de lavado.
Inmediatamente después de que se lavara la
columna como se describió anteriormente, se aplicó a la columna un
gradiente salino lineal de 150 litros desde NaCl 0,05 M a NaCl 0,5
M en citrato de sodio 0,02 M, pH 6,8, a un caudal de 1 litro/min.
Durante el gradiente se recogieron alícuotas de 3,5 litros del
eluato de la columna, y se ensayó cada tres alícuotas para
determinar su actividad del Factor IX. Tras la finalización del
gradiente, se aplicaron a la columna 50 litros adicionales de la
disolución que contenía citrato de sodio 0,02 M, pH 6,8, y NaCl 0,5
M, y se recogieron alícuotas de 3,5 litros del eluato y se
ensayaron para determinar la actividad del Factor IX. Se reunieron
las fracciones que contenían Factor IX y el material reunido se
concentró mediante ultrafiltración y se ensayó para determinar la
actividad del Factor IX y el valor de A_{280}.
Los resultados se resumen en la Tabla II
| Actividad específica del Factor IX (Unidades/A_{280}) | |
| Fracción de plasma^{1} | 3,42 |
| Concentrado^{2} | 32,7 |
| ^{1} Complejo de protrombina | |
| ^{2} Eluato concentrado de la etapa de la cromatografía con sulfato de dextrano |
Los resultados indican que la actividad
específica del Factor IX es de 62,7 unidades/A_{280}.
La descripción anterior de las realizaciones
preferidas de los procesos de separación del Factor IX a partir de
las fracciones de proteína impura que contienen Factor IX es con
propósitos ilustrativos. Las variaciones serán evidentes para
aquellos expertos en la técnica. Por tanto, la presente invención
no pretende estar limitada a las realizaciones particulares
descritas anteriormente. También la invención descrita puede ponerse
en práctica en ausencia de cualquier elemento que no está
concretamente descrito en la memoria. El alcance de la invención se
define en las siguientes reivindicaciones.
Claims (10)
1. Un proceso para la purificación del Factor IX
a partir de una fracción de proteína impura que contiene Factor IX,
comprendiendo el proceso las etapas de:
- -
- proporcionar una disolución acuosa de la fracción de proteína impura;
- -
- añadir un disolvente y un detergente a la fracción de proteína impura para formar una disolución de proteína en disolvente/detergente;
- -
- incubar la disolución de proteína en disolvente/detergente para desactivar cualquiera de los contaminantes víricos presentes en la disolución de proteína en disolvente/detergente;
- -
- añadir cloruro de bario a la disolución de proteína en disolvente/detergente incubada para precipitar el Factor IX de la misma;
- -
- recuperar y disolver el precipitado de cloruro de bario en una disolución acuosa;
- -
- aplicar la disolución del precipitado de cloruro de bario disuelto a una columna cromatográfica que contiene una resina dura seleccionada de entre el grupo que consiste en: sílice, copolímero metacrilato-glicerol, poliestireno-divinilbenceno y copolímero de polivinilo, estando dicha resina dura acoplada con un polisacárido sulfatado capaz de retener al Factor IX, de tal modo que el Factor IX en la disolución de precipitado de cloruro de bario disuelto se une a la resina vía polisacárido sulfatado;
- -
- lavar la columna para eliminar el disolvente/detergente del Factor IX retenido en la resina; y
- -
- eluir el Factor IX retenido de la columna cromatográfica.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el detergente comprende monooleato.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que el detergente está presente a una concentración de
aproximadamente 10% (peso/peso).
4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el disolvente comprende fosfato
de tri-(n)butilo.
5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el disolvente está presente a una
concentración de aproximadamente 3% (peso/peso).
6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la fracción de proteína
disolvente/detergente se incuba durante aproximadamente 6 horas a
aproximadamente 27ºC.
7. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el polisacárido sulfatado es
heparina.
8. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el polisacárido sulfatado es
sulfato de dermatán.
9. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el polisacárido sulfatado es
sulfato de heparina.
10. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el polisacárido sulfatado es
sulfato de dextrano.
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