JP2839712B2

JP2839712B2 - 第▲ｉｘ▼因子の精製

Info

Publication number: JP2839712B2
Application number: JP6503582A
Authority: JP
Inventors: ダブリュ．ハーリング，スティーブン
Original assignee: ARUFUA SERAPYUUTEITSUKU CORP
Current assignee: ARUFUA SERAPYUUTEITSUKU CORP
Priority date: 1992-07-14
Filing date: 1993-07-13
Publication date: 1998-12-16
Anticipated expiration: 2013-12-16
Also published as: CA2139931C; EP0650364B1; EP0650364A1; EP0650364A4; AU4677293A; WO1994001120A1; AU665452B2; ES2206459T3; US5286849A; JPH07508989A; DE69333241D1; DE69333241T2; CA2139931A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、第IX因子を含む不純タンパク質画分から第
IX因子を分離するために有用な方法に関する。

発明の背景血液凝固の開始は内因性及び外因性凝集経路又はカス
ケードと呼ばれる２つの異なっているが、しかし類似す
る分子機構によるものである。内因性経路は、血液に通
常見出される因子を包含する。外因性経路は、血液成分
の他に組織因子を包含する。２つのカスケードの反応段
階の個々において、プロテイナーゼが不活性チモーゲン
をその酵素的に活性な形に転換する。前記内因性及び外
因性経路の両者において同じである、カスケードの最後
の階段においては、不活性プロトロンビンがトロンビン
に転換され、これが次に、可溶性フィブリノーゲンの不
活性フィブリンへの転換を触媒する。

第IX因子は、血液凝固を導びくカスケード出来事に関
与する。特に、第IX因子は、第XI a又はVII a因子の作
用により活性化される場合、第Ｘを第X a因子に活性化
する。他方、第X a因子は第II因子（プロトロンビン）
を第II a因子（トロンビン）に活性化する。次に、活性
化された第II因子は、フィブリノーゲンを活性化し、血
液凝固のフィブリンポリマーを形成する。血液凝固に包
含される因子のいずれかの活性化の欠損は、血液の適切
な凝集の不能性又は正常よりも長い凝集時間を導びく。
たとえば、第IX因子は、“血友病B"として同定される条
件を有する患者においては不在であり又は欠失してい
る。従って、血友病Ｂ患者の血液は適切に凝集しない。
第IX因子は、できるだけ血友病Ｂ患者の血液の凝集能力
を正常近くに戻すために、十分な第IX因子を供給するよ
う前記患者に投与される。

市販されている第IX因子濃縮物は時々、第IX因子の他
に他の血液因子を含む。たとえば、そのような調製は、
第IX因子の他に第II,V、及びＸ因子を含むプロトロンビ
ン複合体を包含する。

血栓併発症、たとえば深静脈血栓症、散在性血管内凝
集及び肺塞栓の発生が、プロトロンビン複合体濃縮物に
より又は第II及び／又は第Ｘ因子により汚染された第IX
因子調製物で処理された患者に報告されている。それら
の併発症は時々、未熟児、良好でない肺機能を有する患
者及び手術患者に見られた。そのような併発症はまた、
第VIII因子インヒビターバイパス剤としてプロトロンビ
ン複合体濃縮物を受ける血友病Ａ患者において観察され
た。

プロトロンビン複合体濃縮物のトロンボゲン成分は、
活性化された因子、凝集活性リン脂質又はチモーゲンの
オーバーロードに最ともしばしば寄与されて来た。チモ
ーゲンのオーバーロードは、患者が多くの及び反復した
投与量のプロトロンビン複合体濃縮物を受ける手術状況
下での散在性血管内凝集に基づかれている。そのような
場合、循環におけるチモーゲン、特に第II及びＸ因子の
構築が、第IX因子に関してそれらの比較的長い半減期の
ために多分生じるはずである。

プロトロンビン複合体の使用に関連する血栓併発症
は、血友病Ｂ患者の処理に使用するために、他のタンパ
ク質を実質的に含まない第IX因子濃縮物の供給を望まし
いものとする。

第IX因子濃縮物の純度を高めるための種々の方法がこ
れまで報告されて来た。たとえば、プロトロンビン実質
的に含まない第IX因子及び硫酸化デキストラン樹脂上で
の親和性クロマトグラフィーの使用による第Ｘ因子の濃
縮物を生成するための方法が開示されている（D.Menach
e et al.,“Coagulation Factor IX Conontrate:Method
of Preparation and Assessment of Potential In Viv
o Thrombogenicity in Animal Models",Blood,64,1220
−1227〔1984〕。）第IX因子は、ヘパリン−セファロー
ス樹脂上での親和性クロマトグラフィーにより精製され
ている（Ｌ−0.Andersson et al.,“Purification and
Characterization of Human Factor IX",Thrombosis Re
search,7,451−459〔1975〕）。第IX及びＸ因子は、ヘ
パリン−アガロースクロマトグラフィー技法を包含する
方法を用いて分離されて来た（S.P.Bajaj et al.,“A S
implified Procedure For Purification of Human Prot
hrombin Factor IX and Factor X",Preparative Bioche
mistry，11,397−412〔1981〕）。デキストランスルフ
ェート−セファロースゲル上での親和性クロマトグラフ
ィーにより第IX因子を分離するための方法もまた、当業
界において知られている。

第IX因子は実験室においてはセファロース（アガロー
スケル）上で分離され得るが、大規模な分離のためへの
アガロースゲルの使用は満足できるものではないことが
見出された。アガロースゲルが商業的サイズのカラム中
に充填される場合、それらは所望しない程度に圧縮さ
れ、そしてそれによって、カラムを通しての流体の流れ
を阻害する。この問題は、アメリカ特許第4,725,673号
（Herring）に記載されるように、シリカに結合した硫
酸化デキストランの使用により克服されている。この精
製方法は、シリカゲルが高い流速をもたらし、そしてそ
れにより、早い精製工程をもたらすことにおいて所望さ
れるが、ヒト血液由来のタンパク質調製物に存在するウ
ィルス汚染物のいずれをも不活性化するために熱処理が
使用される。その熱処理は、低い比活性の第IX因子調製
物を導びく第IX因子の一部の変性をもたらす。

上記方法の他に、第IX因子の精製がイムノアフィニテ
ィー及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて実施さ
れて来ており（S.S.Ahmad et al.,“Rapid Purificatio
n of Factor IX,Factor X and Prothrombin by Immunoa
ffinity and Ion Exchange Chromatography",Thromb.Re
s.,55,121−133〔1989〕）、この方法は、第IX因子のた
めに269単位/mgもの高い比活性をもたらしている。イム
ノアフィニティー方法は高い比活性の調製物を導びく
が、精製されるべきタンパク質に対するモノクローナル
抗体を調製するための必要性が、その精製方法に相当な
費用を付加する。

従って、ヒトへの使用のために安全である高い比活性
の第IX因子調製物を生成する、第IX因子の精製するため
の方法を、比較的低い費用で提供することが所望され
る。

発明の要約本発明は、第IX因子を含む不純性タンパク質画分から
第IX因子を精製するための方法に関する。その精製方法
は、不純性タンパク質画分の水溶液を供給し、溶媒／界
面活性剤タンパク質溶液を形成するために前記不純性タ
ンパク質画分に溶媒及び界面活性剤を添加し、溶媒／界
面活性剤タンパク質溶液の存在下で、ウィルス性汚染物
のいずれをも不活性化するために前記溶媒／界面活性剤
タンパク質溶液をインキュベートし、そしてさらに、硫
酸化多糖樹脂上でのクロマトグラフィー処理により第IX
因子を精製する階段を含んで成る。

上記工程により精製された第IX因子は、少なくとも85
単位/mgの比活性を有する。

詳細な記載本発明は、不純性タンパク質画分から第IX因子を精製
するための方法に向けられる。精製方法は、血液中に存
在するウィルス又は他の汚染物のいずれをも不活性化す
る方法を包含し、この方法は、精製されるべきタンパク
質の広範な変性を導びかない。これまでの方法は、汚染
物を不活性化するために熱処理に頼よっていた。そのよ
うな熱処理はまた、第IX因子の一部の変性を導びく。そ
の変性は、第IX因子の活性の損失をもたらすが、しかし
この不活性化された第IX因子は活性第IX因子と共に同時
精製され、活性及び不活性第IX因子の両者を含む最終生
成物をもたらす。不活性第IX因子の存在は、単一の又は
高いレベルの第IX因子を含む調製物に起因する比活性よ
りも低い比活性を導びく。本発明の方法は、精製工程の
間に生成される変性された第IX因子の量を減じるため
に、熱不活性化よりもむしろ、溶媒／界面活性剤不活性
化階段を包含する。

本発明により提供される方法は、不純性タンパク質画
分からの第IX因子の分離に関する。本明細書において使
用される場合、“不純性タンパク質画分”とは、第IX因
子の他に、１又は複数のタンパク質を含むタンパク質画
分を意味する。

本発明の方法は、ヒト血漿からの第IX因子の分離に関
して下記に記載されるが、その方法は、他の源、たとえ
ば所望するタンパク質の発現するために構築された組換
え生物から第IX因子を分離するために有用である。

ヒト血漿からのプロトロンビン複合体タンパク質の分離プロトロンビン複合体タンパク質はUS Food and Drug
Administrationにより許可された方法に従って、集め
られ、そして試験されたヒト血漿から分離される。血漿
は初め、約−20℃の温度で凍結される。次に、血漿を０
℃〜５℃で融解し、寒冷沈殿反応を生ぜしめる。得られ
た血漿−寒冷沈殿反応体混合物をプールし、そして寒冷
沈殿反応体を除去するために遠心分離する。次に、プー
ルされたAHF−不十分血漿の重量を計り、０℃〜５℃に
し、そして電気透析し、その元の値から血漿ナトリウム
濃度を85〜105mMに減じる。次に、透析されたAHF−不十
分血漿を、酢酸の添加により、ほぼ中性のpHに調整す
る。

pH調整されたAHF−不十分血漿に含まれるプロトロン
ビン複合体因子を、再生されたDEAE（ジエチルアミノエ
チル）セルロース上に吸着せしめる。DEAEセルロース及
び血漿を約30分間混合し、そして次に、DEAEセルロース
を遠心分離により集める。DEAEセルロース吸着プロトロ
ンビン複合体を、約0.03Mのリン酸ナトリウム及び約0.0
3Mのクエン酸ナトリウムを含む洗浄緩衝液（約6.8のp
H）により洗浄する。洗浄水を捨てる。

次に、洗浄されたDEAEセルロース吸着プロトロンビン
複合体を遠心分離物から除去し、そして洗浄緩衝液に懸
濁する。得られた懸濁液をカラム中に注ぎ、そしてその
カラムからの溶出液を捨てる。DEAEセルロースを洗浄緩
衝液により洗浄し、そしてこれをまた捨てる。次に、プ
ロトロンビン複合体因子を、0.03Mのリン酸ナトリウ
ム、0.03Mのクエン酸ナトリウム及び0.2Mの塩化ナトリ
ウムを含む溶出緩衝液（約6.8のpH）によりカラムを洗
浄することによって溶出する。溶出液を集め、そしてプ
ロトロンビン複合体−含有画分をプールし、そして大量
溶液として集める。集められたプロトロンビン−複合体
画分の適切な試験を行ない、そして前記大量溶液のpHを
ほぼ中性に調整し、前記溶液を滅菌された細菌保持性カ
ートリッジ又は膜を通して濾過し、濾過されたプロトロ
ンビン複合体の大量溶液を形成する。次に、濾過された
プロトロンビン複合体の大量溶液を、処理が必要なまで
凍結し、又はすぐに処理される。

ウィルス汚染物の溶媒／界面活性剤（S/D）不活性化血液由来のタンパク質画分に存在するウィルス又は他
の汚染物のいずれをも不活性化するために、濾過された
プロトロンビン複合体の大量溶液約1kgを、約３％のト
リ−（ｎ）−ブチルホスフェート及び約10％（wt/wt）
のモノオレエート（ポリソルベート80及びTween80とし
ても知られる）を含んで成る混合物約0.11kgと共に混合
する。前記溶液を約6.8のpHに調整し、そして約27℃で
約６〜約７時間、混合しながらインキュベートする。イ
ンキュベーションの最後で、S/D−処理されたプロトロ
ンビン複合体を、約0.02Mのクエン酸ナトリウム及び0.0
5Mの塩化ナトリウムを含んで成る溶液（約7.3〜約7.5の
pH）により約2mgのタンパク質/mlに希釈する。

塩化バリウム沈殿によるプロトロンビン複合体からの第
IX因子の分離プロトロンビン複合体から第IX因子を分離するため
に、第IX因子を沈殿するのに十分な、多量の約0.5M〜約
2Mの塩化バリウム溶液を、希釈S/D−処理されたプロト
ロンビン複合体溶液に添加する。第IX因子を含む沈殿物
を集め、そして約0.2〜約0.6Mの（エチレンジニトリ
ロ）四酢酸（EDTA）の溶液に溶解し、そして約６〜約９
のpHでの緩衝溶液において、低−ナトリウム緩衝液（０
〜0.2MのNaCl）に対してダイアフィルトレーション（di
afilter）し、バリウム及びEDTAを除去し、そして追加
の処理のために所望する低−ナトリウム濃度を得る。ダ
イアフィルトレーションのための適切な緩衝液は、約6.
6〜約７のpHでの約0.02Mのクエン酸ナトリウム及び約0.
05MのNaClを含む。

本発明の実施においては、塩化バリウム沈殿段階は精
製に包含されることが好ましいが、塩化バリウムは、所
望には、省略され得る。そのような場合、第IX因子は、
下記のように硫酸化多糖に直接的にS/D−処理されたプ
ロトロンビン複合体を適用することによって精製され
る。

塩化バリウム沈殿物からの第IX因子の分離次に、前記ダイアフィルトレーションされた塩化バリ
ウム沈殿物溶液を、US特許第4,725,673号（Herring）に
記載されているようにして、硫酸化多糖上でさらに精製
する。硫酸化多糖は硬質樹脂、たとえばメタクリレート
−グリセロールコポリマー、ポリスチレン−ジビニルベ
ンゼン、ポリビニルコポリマー又は当業界において知ら
れている他の硬質樹脂のいずれか又はシリカに結合され
ることが、本発明において好ましい。硬質樹脂又はシリ
カの使用は、それらが精製工程の間に圧縮されないので
好ましい。

約3.8〜約６の量のシリカまたは硬質樹脂に結合さ
れている硫酸化多糖を、精製されるべきダイアフィルト
レーションされた塩化バリウム沈殿物溶液それぞれkg当
たりにカラム中に充填する。

ダイアフィルトレーションされた塩化バリウム沈殿物
溶液を、シリカまたは硬質樹脂に結合されている硫酸化
多糖に適用し、前記溶液に含まれる第IX因子を硫酸化多
糖上に吸着せしめる。この吸着段階が完結された後、前
記硫酸化多糖上に吸着された第IX因子を、カラム中の前
記硫酸化多糖の体積の少なくとも５倍に等しい体積の洗
浄緩衝液（約0.02Mのクエン酸ナトリウム、約6.6〜約7.
0のpH、及び約0.05MのNaCl）により洗浄する。次に、第
IX因子を、約0.05MのNaCl〜約0.6MのNaClの線形塩（塩
化ナトリウム）グラジェントにより前記硫酸化多糖から
溶出する。その塩グラジェントが約0.4Mの濃度に達する
場合、溶出液は実質的に第IX因子のみを含む。その塩グ
ラジェントの完結で、カラムを、グラジェントに使用さ
れる塩化ナトリウムの最大レベル、たとえば0.6Mの濃度
のものを含む洗浄緩衝液により洗浄することによってさ
らに溶出する。第IX因子を含む溶出液をプールし、そし
てナトリウム濃縮を所望する標的レベルに減じるために
ダイアフィルトレーションする。プールされた第IX因子
画分を濾過し、そして後での処理のために凍結し、又は
それらを、所望によりすぐに処理する。凍結される場
合、サンプルを融解し、そして他のプールされた画分と
組合し、そしてpHを必要なら、約6.8に調整する。

前記硫酸化多糖上での第IX因子の精製の後、溶媒／界
面活性剤ウィルス不活性化剤を第IX因子画分から除き、
そして最終産物からそれらの“汚染物”を分離するため
に追加の段階は必要とされない。

第IX因子の追加の精製次に、プールされた第IX因子含有画分を、カラム中に
充填されるシリカまたは硬質樹脂に結合されている硫酸
化多糖に再適用する。この場合、約0.57〜約2.35kgのシ
リカまたは硬質樹脂に結合されている硫酸化多糖が、第
１のシリカまたは硬質樹脂に結合されている硫酸化多糖
から溶出される第IX因子約5kg当たりに使用される。第I
X因子含有溶液が前記硫酸化多糖に適用された後、前記
硫酸化多糖を上記のようにして、洗浄緩衝液（約0.02M
のクエン酸ナトリウム及び約0.05Mの塩化ナトリウム、
約6.6〜約７のpH）により洗浄する。第IX因子を、約0.0
2Mのクエン酸ナトリウム及び約0.6Mの塩化ナトリウムを
含んで成る溶液（約6.6〜約７のpH）により前記カラム
から溶出する。

第IX因子含有画分をプールし、そして標的の第IX因子
活性及びナトリウム濃度レベルにダイアフィルトレーシ
ョンする。ヘパリン及びデキストロースを所望により、
第IX因子含有画分に添加する。次に、第IX因子含有溶液
を上記のようにして滅菌濾過し、第IX因子滅菌物を形成
する。

前記第IX因子滅菌物を滅菌性及び第IX因子活性につい
てサンプリングする。充填体積を第IX因子活性に基づい
て計算する。前記滅菌物を殺菌されたきれいなバイアル
中に充填し、次に真空下で凍結乾燥し、栓をし、そして
密封する。次に、凍結乾燥された最終容器の第IX因子は
品質管理部門により試験される。試験結果がすべての適
用できる規定内にある場合、品質管理部門はロット番号
を付す。

例１溶媒／界面活性剤不活性化段階を用いての第IX因子の精
製第IX因子の精製のための本発明の実施の１つの例にお
いては、寒冷沈殿反応本不十分血漿に含まれる第IX因子
を、0.03Mのリン酸ナトリウム及び0.03Mのクエン酸ナト
リウム溶液（pH6.8）により前もって平衡化されたDEAE
−セルロース上に吸着した。DEAEセルロース及び血漿を
約30分間混合し、そして遠心分離により集められたDEAE
セルロースを、0.03Mのリン酸ナトリウム及び0.03Mのク
エン酸ナトリウム溶液（pH6.8）により洗浄する。洗浄
液は捨てる。

洗浄されたDEAEセルロースを、0.03Mのリン酸ナトリ
ウム及び0.03Mのクエン酸ナトリウム溶液（pH6.8）に懸
濁し、そしてカラム中に注いだ。溶出液を捨てた。DEAE
セルロースを、0.03Mのリン酸ナトリウム及び0.03Mのク
エン酸ナトリウム溶液（pH6.8）により洗浄し、そして
この洗浄液をまた捨てた。第IX因子を、0.03Mのリン酸
ナトリウム、0.03Mのクエン酸ナトリウム及び0.2MのNaC
l溶液（pH6.8）によりDEAEセルロースを洗浄することに
よて溶出した。溶出液を集め、そしてIX因子含有画分を
プールし、そして大量溶液に集めた。その溶液を、滅菌
された保持性カートリッジを通して濾過した。

濾過されたプロトロンビン複合体の大量溶液36.6kg
を、３％のトリ−（ｎ）−ブチルホスフェート及び10％
（wt/wt）のモノオレエート（ポリソルベート80及びTwe
en80としても知られる）を含んで成る混合物約3.9kgと
共に混合した。その溶液を6.8のpHに調整し、そして27
℃ので６時間、混合しながらインキュベートした。イン
キュベーションの最後で、S/D−処理されたプロトロン
ビン複合体を、0.02Mのクエン酸ナトリウム及び0.05Mの
塩化ナトリウムを含む溶液（pH約7.4）により、約1.5mg
のタンパク質/mlに希釈した。

1.0Mの塩化バリウム溶液（４℃）46.6kgを２時間にわ
たって添加し、そしてその混合物をさらに１時間撹拌し
た。その混合物を塩化バリウムの添加及び混合の間、０
℃〜４℃で維持した。混合の後、その溶液をSharples遠
心分離機により分離し、遠心分離機を通しての流速を0.
2〜0.6／分に及び溶液の温度を０℃〜４℃に維持し
た。約11.6kgの塩化バリウム沈殿物をこの態様で集め
た。

塩化バリウム沈殿物に、20℃〜25℃での0.4MのEDTA溶
液約58kgを添加し、沈殿物を溶解し、そして沈殿物をMi
llipore TPカートリッジフィルターを通して濾過し、粒
状物を除去した。濾過の後、前記溶液をMillipore Pell
icon濃縮機に通し、そしてその元の体積の1/5〜1/10に
濃縮した。次に、濃縮された溶液をその元の体積に、0.
02Mのクエン酸ナトリウム及び0.05MのNaCl溶液により希
釈した。前記濃縮及び希釈段階を６回以上くり返し、こ
の時点で溶液の導電性は、0.02Mのクエン酸ナトリウム
及び0.05Mの塩化ナトリウムを含む溶液の導電性にほぼ
等しかった。最終の希釈の後、ダイアフィルトレーショ
ンされた材料の重量は70kgであった。再溶解された沈殿
物は第IX因子を含んだ。

ダイアフィルトレーションされた第IX因子を含む材料
70kgを、約260ml/分の流速で、シリカに結合されている
硫酸化デキストランを含む、洗浄緩衝液（0.02Mのクエ
ン酸ナトリウム及び0.05Mの塩化ナトリウム、pH6.8）に
より平衡化された36cm×37cmのModulineクロマトグラフ
ィーカラムに適用した。続いて、洗浄緩衝液323kgをそ
のカラムに通した。

カラムを上記のようにして洗浄した後すぐに、0.02M
のクエン酸ナトリウム中、0.05MのNaClから0.5MのNaCl
の線形塩グラジェント溶液（pH6.8）228を、１／分
の流速カラムに適用した。カラム溶出液５アリコート
をグラジェントの間に集め、そして第三画分ごとにアッ
セイし、その第IX因子活性を決定した。グラジェントの
完結後、0.02Mのクエン酸ナトリウム及び0.5MのNaClを
含む溶液（pH6.8）157をカラムに適用し、そして溶出
液５アリコートを集め、そして第IX因子活性について
アッセイした。

第IX因子含有画分をプールし、そしてそのプールされ
た材料（142）を、Millipore Pellicon濃縮機を通
し、約５倍に濃縮した。ナトリウム濃度を、洗浄緩衝液
の添加により110m当量／に調整し、そしてナトリウム
調整された第IX画分プールを35の体積に減じた。この
材料を、Modulineクロマトグラフィーカラムに充填さ
れ、そして洗浄緩衝液により平衡化されたシリカに結合
されている硫酸化デキストラン12.1に90ml/分の流速
で適用した。次に、クロマトグラフィー媒体を洗浄緩衝
液96kgにより洗浄した。次に、クロマトグラフィー媒体
を、0.02Mのクエン酸ナトリウム及び0.6MのNaClを含む
溶液（pH6.8）96により溶出した。4.75の画分を集
め、そして第IX因子活性についてアッセイした。第IX因
子含有画分をプールし、そしてそのプールされた材料
（37）を、第IX因子活性及びA₂₈₀についてアッセイし
た。

それらのアッセイの結果は下記第Ｉ表に示される。

第Ｉ表第IX画分の比活性（単位/A₂₈₀）血漿画分^１ 3.3 溶出液^２ 180 1:プロトロンビン複合体 2:2つの硫酸化デキストランクロマトグラフィー段
階からの溶出液第IX因子の純度（比活性）は、２つのシリカに結合さ
れている硫酸化デキストランカラム上での連続的クロマ
トグラフィー処理により55倍に高められた。

例２熱不活性化段階を用いての第IX因子の精製例１に記載される方法をくり返した。但し、熱不活性
化を溶媒界面活性剤段階の代わりに使用した。濾過され
たプロトロンビン複合体の大量溶液を、細菌保持性カー
トリッジを通して濾過し、次に凍結乾燥した。凍結乾燥
された粉末を、ｎ−ヘプタンに懸濁し、そして60℃で20
時間加熱することによってウィルス不活性化した。ヘプ
タンを乾燥により除去した。

約2.04kgの乾燥された粉末を、注射のための冷水約6
4.5kgにより再構成した。その再構成された粉末を、0.0
2Mのクエン酸ナトリウム、pH7.4及び0.25MのNaCl溶液26
6.6kgにより４℃で希釈し、そして２℃〜４℃で20分間
混合した。次に、その溶液を塩化バリウム沈殿にゆだ
ね、そして沈殿物をMillipore TPカートリッジフィルタ
ーを通して濾過し、粒状物を除去した。濾過の完結後、
その材料を例１におけるようにしてダイアフィルトレー
ション処理した。ダイヤルフィルトレーション処理され
た材料を、シリカに結合されている硫酸化デキストラン
を含み、そして洗浄緩衝液（0.02Mのクエン酸ナトリウ
ム及び0.05Mの塩化ナトリウム、pH6.8）により平衡化さ
れた18cm×98cmのModulineクロマトグラフィーカラムに
約120ml/分の流速で適用した。続いて、25kgの洗浄緩衝
液をそのカラムに通した。

カラムを上記のようにして洗浄した後すぐに、0.02M
のクエン酸ナトリウム中、0.05MのNaClから0.5MのNaCl
の線形塩グラジェント溶液（pH6.8）150を、１／分
の流速でカラムに適用した。カラム溶出液3.5アリコ
ートをグラジェントの間に集め、そして第三画分ごとに
アッセイし、その第IX因子活性を決定した。グラジェン
トの完結後、0.02Mのクエン酸ナトリウム及び0.5MのNaC
lを含む溶液（pH6.8）50をカラムに適用し、そして溶
出液3.5アリコート集め、そして第IX因子活性につい
てアッセイした。第IX因子含有画分をプールし、そして
そのプールされた材料を、限外濾過により濃縮し、そし
て第IX因子活性及びA₂₈₀についてアッセイした。

結果は第II表に要約される。

第 II 表第IX因子の比活性（単位/A₂₈₀）血漿画分^１ 3.42 濃縮物^２ 62.7 1:プロトロンビン複合体 2:デキストランスルフェートクロマトグラフィー段
階からの濃縮された溶出液前記結果は、第IX因子の比活性が62.7単位/A₂₈₀であ
ることを示す。

第IX因子を含む不純性タンパク質画分から第IX因子を
分離するための方法の好ましい態様の上記記載は例示目
的のためである。変更が当業者に明らかであろう。従っ
て、本発明は、上記特定の態様に限定されるものではな
い。また、開示される発明は、明細書に特別に開示され
ないいずれかの要素の不在下で実施され得る。本発明の
範囲は次の請求の範囲に定義される。

フロントページの続き (56)参考文献特開平２−180833（ＪＰ，Ａ) 特開平１−207239（ＪＰ，Ａ) 特表昭59−500673（ＪＰ，Ａ) 欧州公開229026（ＥＰ，Ａ２) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，97（1985) ｐ．1347−1355 Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，11 （４）（1981）ｐ．397−412 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，253（17) （1978）ｐ．5946−5951 Ｔｈｒｏｍ．Ｒｅｓ．，19（６) （1980）ｐ．743−755

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】第IX因子を含む不純性タンパク質画分から
第IX因子を精製するための方法であって、前記不純性タンパク質画分の水溶液を用意し；前記不純性タンパク質画分に溶媒及び界面活性剤を添加
して、溶媒／界面活性剤タンパク質溶液を作り；前記溶媒／界面活性剤タンパク質溶液をインキュベート
して、その溶媒／界面活性剤タンパク質溶液中に存在す
るウィルス汚染物のいずれも不活性化し；前記インキュベートされた溶媒／界面活性剤タンパク質
溶液に塩化バリウムを添加して、第IX因子をそれから沈
澱させ；前記塩化バリウム沈澱物を回収し、そして水溶液に溶解
し；前記の溶解した塩化バリウム沈澱物の溶液中の第IX因子
が硫酸化多糖に結合するこができる、硬質樹脂またはシ
リカに結合されている硫酸化多糖に、その溶解した塩化
バリウム沈澱物の溶液を適用し；前記溶媒／界面活性剤をそれから除去するために、前記
硫酸化多糖に結合した第IX因子を洗浄し；そして前記硬質樹脂またはシリカに結合されている硫酸化多糖
から前記の結合した第IX因子を溶離させる、階段を含む方法。
【請求項２】前記界面活性剤がモノオレエートを含む、
請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】前記界面活性剤が約10％（wt/wt）の濃度
で存在する、請求の範囲第１項又は２項に記載の方法。
【請求項４】前記溶媒がトリ−（ｎ）ブチル・ホスフェ
ートを含む、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項５】前記溶媒が約３％（wt/wt）の濃度で存在
する、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項６】前記溶媒／界面活性剤タンパク質画分が27
℃で６時間インキュベートされる、請求の範囲第１項〜
第５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】前記硫酸化多糖がヘパリンである、請求の
範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】前記硫酸化多糖がデルマタン硫酸である、
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項９】前記硫酸化多糖がヘパリン硫酸である、請
求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】前記硫酸化多糖がデキストラン硫酸であ
る、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項１１】前記硫酸化多糖が、メタクリレート−グ
リセロールコポリマー、ポリスチレン−ジビニルベンゼ
ン及びポリビニルコポリマーから成る群から選ばれた硬
質樹脂又はシリカに結合されている、請求の範囲第１項
〜第６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】前記硬質樹脂又はシリカに結合されてい
る硫酸化多糖が、クロマトグラフィー・カラム内に収め
られ、そして前記の溶解された塩化バリウム沈澱物の溶
液がそのカラムに適用される、請求の範囲第11項に記載
の方法。