JP2716871B2 - 血漿分画精製法 - Google Patents
血漿分画精製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、精製された因子Xa、リン脂質、Ca2+、及び
因子Vaを含む血漿分画（plasma fractions）を使用し
て、精製されたプロトロンビン（prothrombin）（因子I
I）からトロンビン（thrombin）を調製するために有用
な方法であって、因子（II、Va及びXa）のすべてが単一
の精製手順から得られるような方法に関する。
因子Vaを含む血漿分画（plasma fractions）を使用し
て、精製されたプロトロンビン（prothrombin）（因子I
I）からトロンビン（thrombin）を調製するために有用
な方法であって、因子（II、Va及びXa）のすべてが単一
の精製手順から得られるような方法に関する。
発明の背景 血液凝固の開始は、２つの異なるが類似した、内因性
の及び外因性凝固経路又はカスケードといわれる分子機
構による。この内因性の凝固経路は、血液成分に加えて
組織因子を含んでいる。この２つのカスケードの反応段
階のそれぞれにおいて、プロテイナーゼが、不活性チモ
ーゲンをその酸素的に活性な形態に変換している。その
カスケードの最後の段階においては、内因性経路及び外
因性経路の両方において同じであるが、不活性のプロト
ロンビンがトロンビンに変換され、これは、次に、可溶
性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンへの変換を触媒
する。
の及び外因性凝固経路又はカスケードといわれる分子機
構による。この内因性の凝固経路は、血液成分に加えて
組織因子を含んでいる。この２つのカスケードの反応段
階のそれぞれにおいて、プロテイナーゼが、不活性チモ
ーゲンをその酸素的に活性な形態に変換している。その
カスケードの最後の段階においては、内因性経路及び外
因性経路の両方において同じであるが、不活性のプロト
ロンビンがトロンビンに変換され、これは、次に、可溶
性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンへの変換を触媒
する。
両カスケードにおけるチモーゲンの活性プロテイナー
ゼへの変換は、補助因子の非存在中においては非常に遅
い。この補助因子は、それらの非存在中において観察さ
れる速度の104から105倍までのチモーゲン活性化速度を
刺激する。このカスケードにおいては、３種類の補助因
子：（１）Ca2+イオン、（２）血小板又は損傷組織の膜
二重層から生じた酸性リン脂質、及び（３）与えられた
チモーゲンの活性化に特に要求される蛋白補因子、が働
いている。約69,000〜約80,000の分子量をもつプロトロ
ンビンは、１本のポリペプチド鎖から成る。血液凝固チ
モーゲンのすべての活性化と同様に、プロトロンビンの
活性化は、血小板又は損傷組織から生じた陰性に帯電し
たリン脂質、例えば、ホスファチジルセリンにより提供
される表面上で起こるこのような脂質は、細胞膜の脂質
二重層の、ほとんどもっぱら細胞質側又は内側に在る。
プロトロンビンは、その細胞が破壊されそれらの内表面
を晒さない場合には、その赤血球又は内皮細胞に癒着し
ない。したがって、陰性に帯電したリン脂質を露出させ
る細胞破壊は、プロトロンビンが上記のリン脂質に結合
することができるようにする。これが、プロトロンビン
の活性化における第一段階である。プロトロンビンの上
記のリン脂質への結合は、Ca2+−依存性の過程である。
ゼへの変換は、補助因子の非存在中においては非常に遅
い。この補助因子は、それらの非存在中において観察さ
れる速度の104から105倍までのチモーゲン活性化速度を
刺激する。このカスケードにおいては、３種類の補助因
子：（１）Ca2+イオン、（２）血小板又は損傷組織の膜
二重層から生じた酸性リン脂質、及び（３）与えられた
チモーゲンの活性化に特に要求される蛋白補因子、が働
いている。約69,000〜約80,000の分子量をもつプロトロ
ンビンは、１本のポリペプチド鎖から成る。血液凝固チ
モーゲンのすべての活性化と同様に、プロトロンビンの
活性化は、血小板又は損傷組織から生じた陰性に帯電し
たリン脂質、例えば、ホスファチジルセリンにより提供
される表面上で起こるこのような脂質は、細胞膜の脂質
二重層の、ほとんどもっぱら細胞質側又は内側に在る。
プロトロンビンは、その細胞が破壊されそれらの内表面
を晒さない場合には、その赤血球又は内皮細胞に癒着し
ない。したがって、陰性に帯電したリン脂質を露出させ
る細胞破壊は、プロトロンビンが上記のリン脂質に結合
することができるようにする。これが、プロトロンビン
の活性化における第一段階である。プロトロンビンの上
記のリン脂質への結合は、Ca2+−依存性の過程である。
プロトロンビンの活性化は、Ca2+＋依存性相互作用を
介してリン脂質にも結合する、因子Xaにより触媒され
る。しかしながら、プロトロンビンの活性化の最大速度
は、因子Vaも上記のプロトロンビン−Xa−Ca2+−リン脂
質複合体に結合する場合にのみ得られる。
介してリン脂質にも結合する、因子Xaにより触媒され
る。しかしながら、プロトロンビンの活性化の最大速度
は、因子Vaも上記のプロトロンビン−Xa−Ca2+−リン脂
質複合体に結合する場合にのみ得られる。
因子Ｘは、約59,000〜約70,000の分子量をもつ糖蛋白
であり、そして２つのサブユニット、すなわち、約40,0
00の分子量をもつ１つのサブユニット及び約19,000の他
のサブユニット、から成る。因子Ｘは、内因性経路及び
外因性経路の両方において、因子Xaに活性化される。
であり、そして２つのサブユニット、すなわち、約40,0
00の分子量をもつ１つのサブユニット及び約19,000の他
のサブユニット、から成る。因子Ｘは、内因性経路及び
外因性経路の両方において、因子Xaに活性化される。
330,000の分子量をもつ因子Ｖは、Vaの活性化のため
に不可欠の１つの固く結合したCa2+を含む１つのポリペ
プチド鎖から成る糖蛋白である。因子Vaは、プロテイナ
ーゼではないが、プロトロンビン活性化のための補助蛋
白として働き、これは、プロトロンビン活性化の速度を
増加させるように働く。因子Ｖそれ自体は、トロンビン
により活性化され；それ故、トロンビン活性化反応にお
いて、生じたトロンビンが因子Ｖを因子Vaに活性化し、
これは、次に、トロンビン合成速度を増加させる。
に不可欠の１つの固く結合したCa2+を含む１つのポリペ
プチド鎖から成る糖蛋白である。因子Vaは、プロテイナ
ーゼではないが、プロトロンビン活性化のための補助蛋
白として働き、これは、プロトロンビン活性化の速度を
増加させるように働く。因子Ｖそれ自体は、トロンビン
により活性化され；それ故、トロンビン活性化反応にお
いて、生じたトロンビンが因子Ｖを因子Vaに活性化し、
これは、次に、トロンビン合成速度を増加させる。
インビトロにおける研究は、Ca2+及びリン脂質が、因
子Xa単独による変換速度に比べて約50倍程、プロトロン
ビンのトロンビンへの因子Xaによる変換速度を増加させ
ることを示した。因子Vaは、約350倍、Xaによる変換速
度を増加させるが、因子のすべてが一緒になれば、少な
くとも約20,000倍の速度に増加される。このように、Ca
2+−リン脂質−Xa−Va複合体は、２週間に因子Xa単独に
より作られるであろうものと同じ量のトロンビンを１分
間以内に作りだす。
子Xa単独による変換速度に比べて約50倍程、プロトロン
ビンのトロンビンへの因子Xaによる変換速度を増加させ
ることを示した。因子Vaは、約350倍、Xaによる変換速
度を増加させるが、因子のすべてが一緒になれば、少な
くとも約20,000倍の速度に増加される。このように、Ca
2+−リン脂質−Xa−Va複合体は、２週間に因子Xa単独に
より作られるであろうものと同じ量のトロンビンを１分
間以内に作りだす。
トロンビンは、フィブリノーゲンからフィブリン、す
なわち、血塊を形成する不溶性蛋白への変換における活
性剤であるので、トロンビンは、創傷（wounds）、出血
潰瘍、外科手術、及び他のこのような損傷（injuries）
からの血液の損失の防止における用途をもつ。天然の血
液凝固は、損傷部位から血液の流れを効果的に停止させ
るまで数分間を必要とする；しかしながら、損傷部位に
おけるトロンビンの使用は、即効性の凝固をもたらす。
それ故、トロンビンの典型的な用途は、外科手術及び外
傷（trauma）後に存在する症状において、好ましく、又
は致死の多量の血液損失を防ぐための、潰瘍の治療にお
ける経口用途において好ましい。また、眼の外科手術の
間の硝子体腔へのトロンビンの注入は、焼灼術（cauter
ization）についての識別することが困難である部位か
らの出血を防止することができる。このような治療は、
定例的な外科手術の間の眼内圧における上昇を原因とす
るその眼に対する損傷の危険を減少させる。
なわち、血塊を形成する不溶性蛋白への変換における活
性剤であるので、トロンビンは、創傷（wounds）、出血
潰瘍、外科手術、及び他のこのような損傷（injuries）
からの血液の損失の防止における用途をもつ。天然の血
液凝固は、損傷部位から血液の流れを効果的に停止させ
るまで数分間を必要とする；しかしながら、損傷部位に
おけるトロンビンの使用は、即効性の凝固をもたらす。
それ故、トロンビンの典型的な用途は、外科手術及び外
傷（trauma）後に存在する症状において、好ましく、又
は致死の多量の血液損失を防ぐための、潰瘍の治療にお
ける経口用途において好ましい。また、眼の外科手術の
間の硝子体腔へのトロンビンの注入は、焼灼術（cauter
ization）についての識別することが困難である部位か
らの出血を防止することができる。このような治療は、
定例的な外科手術の間の眼内圧における上昇を原因とす
るその眼に対する損傷の危険を減少させる。
最近、ウシ・トロンビン調製物が、時事的用途のため
に入手可能である。しかしながら、ウシ・トロンビン調
製物は、治療されている患者内で、しばしば、不所望の
免疫応答を引き起こす。このような応答は、ヒト・トロ
ンビン調製物の使用により避けることができる。しかし
ながら、ヒト・トロンビン調製物は、高価であり、した
がって、それらの使用の必要性を減少させている。それ
故、ヒト源から、プロトロンビンを精製し、そしてそれ
をトロンビンに活性化する経済効果のある手段について
の必要性が在る。
に入手可能である。しかしながら、ウシ・トロンビン調
製物は、治療されている患者内で、しばしば、不所望の
免疫応答を引き起こす。このような応答は、ヒト・トロ
ンビン調製物の使用により避けることができる。しかし
ながら、ヒト・トロンビン調製物は、高価であり、した
がって、それらの使用の必要性を減少させている。それ
故、ヒト源から、プロトロンビンを精製し、そしてそれ
をトロンビンに活性化する経済効果のある手段について
の必要性が在る。
発明の要約 本発明は、因子Va及び因子Xaを使用いて因子IIを因子
IIaに活性化する方法であって、因子II、Va及びXaがす
べて単一の純粋でない蛋白画分から得られるような方法
について記載している。
IIaに活性化する方法であって、因子II、Va及びXaがす
べて単一の純粋でない蛋白画分から得られるような方法
について記載している。
この活性化方法は、因子IIを活性化バッファーに添加
し、因子II溶液を提供する工程を含んで成る。この因子
IIを、純粋でない蛋白分画の水溶液を提供することによ
り調製す。この純粋でない蛋白画分中に含まれる因子I
I、Ｖ及びＸを、DEAEリガンドに結合させ、そして次
に、そのDEAEリガンドから回収する。この回収した因子
II及びＸの蛋白画分を、塩化バリウムの添加により沈殿
させる。この塩化バリウム沈殿物を、溶解させ、そして
因子Ｘと結合するが因子IIには弱く結合するか場合によ
っては全く結合しないリガンドにより結合されているク
ロマトグラフィー樹脂に、適用する。因子IIを、その因
子Ｘ結合リガンドに結合せずに又は弱く結合して残った
画分から回収する。
し、因子II溶液を提供する工程を含んで成る。この因子
IIを、純粋でない蛋白分画の水溶液を提供することによ
り調製す。この純粋でない蛋白画分中に含まれる因子I
I、Ｖ及びＸを、DEAEリガンドに結合させ、そして次
に、そのDEAEリガンドから回収する。この回収した因子
II及びＸの蛋白画分を、塩化バリウムの添加により沈殿
させる。この塩化バリウム沈殿物を、溶解させ、そして
因子Ｘと結合するが因子IIには弱く結合するか場合によ
っては全く結合しないリガンドにより結合されているク
ロマトグラフィー樹脂に、適用する。因子IIを、その因
子Ｘ結合リガンドに結合せずに又は弱く結合して残った
画分から回収する。
因子Ｖを、上記の因子II溶液に添加し、因子II/因子
Ｖ溶液を提供する。ここで、この因子Ｖを、上記の因子
II調製手順により純粋でない血漿画分から作った塩化バ
リウム上澄液から回収する。因子Ｖを、因子IIaによる
因子II活性化反応の間に、活性化する。この活性化反応
においては、因子IIは、因子Vaの非存在中で非常にゆっ
くりと活性化される。しかしながら、少量の因子IIaが
作られる。これらの少量の因子IIaを、次に入手し、因
子Ｖを因子Vaに活性化することができ、そしていくつか
の因子Vaが、この精製工程の間に作られる。このよう
に、因子Vaを、次に入手し、上記の因子II活性化反応に
おいて相互作用させることができる。これは、因子IIa
合成の速度における増加をもたらす。それ故、因子Ｖの
ための別個の活性化段階は、必要ない。
Ｖ溶液を提供する。ここで、この因子Ｖを、上記の因子
II調製手順により純粋でない血漿画分から作った塩化バ
リウム上澄液から回収する。因子Ｖを、因子IIaによる
因子II活性化反応の間に、活性化する。この活性化反応
においては、因子IIは、因子Vaの非存在中で非常にゆっ
くりと活性化される。しかしながら、少量の因子IIaが
作られる。これらの少量の因子IIaを、次に入手し、因
子Ｖを因子Vaに活性化することができ、そしていくつか
の因子Vaが、この精製工程の間に作られる。このよう
に、因子Vaを、次に入手し、上記の因子II活性化反応に
おいて相互作用させることができる。これは、因子IIa
合成の速度における増加をもたらす。それ故、因子Ｖの
ための別個の活性化段階は、必要ない。
因子Xaを、上記の因子II/因子Ｖ溶液に添加し、因子I
I/因子V/因子Xa溶液を提供する。この因子Xaを、上記の
因子II調製手順の因子Ｘ結合リガンドから因子Ｘを回収
することにより調製する。
I/因子V/因子Xa溶液を提供する。この因子Xaを、上記の
因子II調製手順の因子Ｘ結合リガンドから因子Ｘを回収
することにより調製する。
リン脂質膜及びカルシウム・イオンを、この因子II/
因子V/因子Xa溶液に添加し、そして得られた混合物を、
因子IIに因子IIaに活性化させるためにインキュベート
する。
因子V/因子Xa溶液に添加し、そして得られた混合物を、
因子IIに因子IIaに活性化させるためにインキュベート
する。
図面の簡単な説明 本発明の特徴、態様、及び利点は、以降の詳細な説
明、添付の請求の範囲及び、本発明の方法の好ましい態
様を示しているフロー・ダイアグラムである添付の図面
に関して考慮するとき、さらに十分に理解されるであろ
う。
明、添付の請求の範囲及び、本発明の方法の好ましい態
様を示しているフロー・ダイアグラムである添付の図面
に関して考慮するとき、さらに十分に理解されるであろ
う。
詳細な説明 本発明の実施に従って提供される方法は、単一の純粋
でない画分からの因子II、Ｖ及びＸの分離に関する。本
明細書中で使用するとき、“純粋でない蛋白画分（impu
re protein fraction）”は、因子II、Ｖ及びＸに加え
て１以上の蛋白を含むことを意味する。因子Ｘを次に活
性化し、そして活性化反応物であってカルシウム、リン
脂質及び因子V2をも含むものに添加し、その因子IIのチ
モーゲンを活性な触媒作用のある因子IIaに活性化させ
る。
でない画分からの因子II、Ｖ及びＸの分離に関する。本
明細書中で使用するとき、“純粋でない蛋白画分（impu
re protein fraction）”は、因子II、Ｖ及びＸに加え
て１以上の蛋白を含むことを意味する。因子Ｘを次に活
性化し、そして活性化反応物であってカルシウム、リン
脂質及び因子V2をも含むものに添加し、その因子IIのチ
モーゲンを活性な触媒作用のある因子IIaに活性化させ
る。
因子II、Ｖ及びＸの精製 フロー・ダイアグラム中に説明する因子II、Ｖ及びＸ
の精製は、米国食品及び医薬品局により認可された手順
に従って回収及びテストされたヒト血漿からのものであ
る。この血漿を、所望によりこの精製段階に先立って低
温沈殿させることができる。この血漿画分を、電気透析
し、そのナトリウム濃度をその元の値から85と105mMと
の間まで減少させることができる。この透析された血漿
を、次に酢酸の添加によりほとんど中性のpHに調整す
る。
の精製は、米国食品及び医薬品局により認可された手順
に従って回収及びテストされたヒト血漿からのものであ
る。この血漿を、所望によりこの精製段階に先立って低
温沈殿させることができる。この血漿画分を、電気透析
し、そのナトリウム濃度をその元の値から85と105mMと
の間まで減少させることができる。この透析された血漿
を、次に酢酸の添加によりほとんど中性のpHに調整す
る。
このpH調整血漿中に含まれる因子II、Ｖ、IX及びＸ
を、再生DEAE（ジエチル・アミノエチル）セルロース、
DEAEセファデックス、又は他の好適なイオン−交換媒
質、すなわち、バッファー、例えば、約6.8のpHにおけ
る約0.03Mリン酸ナトリウム及び約0.03Mのクエン散ナト
リウム（リン酸／クエン酸バッファー）により平衡とし
てある因子II、Ｖ、IX及びＸに結合する媒質の上に吸着
させる。このDEAE樹脂及び低温沈殿血漿を、約30分間混
合し、そしてこのDEAE樹脂を次に遠心分離により回収す
る。このDEAE樹脂を、バッファー、例えば、リン酸／ク
エン酸バッファーで洗浄する。この洗浄液を廃棄する。
この洗浄したDEAE樹脂を、バッファー、例えば、リン酸
／クエン酸バッファー中で懸濁させる。得られた懸濁液
を、次にカラムに濯ぎ、そして溶出液を廃棄する。この
DEAE樹脂を、バッファー、例えば、リン酸／クエン酸バ
ッファーで洗浄し、そしてこの洗浄液を、また、廃棄す
る。因子II、Ｖ、IX及びＸを、約6.8のpHにおける約0.0
3Mリン酸ナトリウム及び約0.2M NaClを含む約0.03Mのク
エン酸ナトリウムを含んで成るバッファーで溶出させる
ことにより、このDEAE樹脂を洗浄することにより、溶出
させる。この溶出液を回収し、そして因子II、Ｖ、IX及
びＸ含有画分を、プールし、そしてバルク溶液中に回収
する。この回収された画分の適切なテストを行い、そし
てこのバルク溶液のpHがほとんど中性に調整された後、
この溶液を、無菌バクテイア−保持カートリッジ又は膜
を通して濾過し、それにより因子II、Ｖ、IX及びＸのバ
ルク溶液を作る。このバルク溶液を、さらに処理するま
で凍結させる。
を、再生DEAE（ジエチル・アミノエチル）セルロース、
DEAEセファデックス、又は他の好適なイオン−交換媒
質、すなわち、バッファー、例えば、約6.8のpHにおけ
る約0.03Mリン酸ナトリウム及び約0.03Mのクエン散ナト
リウム（リン酸／クエン酸バッファー）により平衡とし
てある因子II、Ｖ、IX及びＸに結合する媒質の上に吸着
させる。このDEAE樹脂及び低温沈殿血漿を、約30分間混
合し、そしてこのDEAE樹脂を次に遠心分離により回収す
る。このDEAE樹脂を、バッファー、例えば、リン酸／ク
エン酸バッファーで洗浄する。この洗浄液を廃棄する。
この洗浄したDEAE樹脂を、バッファー、例えば、リン酸
／クエン酸バッファー中で懸濁させる。得られた懸濁液
を、次にカラムに濯ぎ、そして溶出液を廃棄する。この
DEAE樹脂を、バッファー、例えば、リン酸／クエン酸バ
ッファーで洗浄し、そしてこの洗浄液を、また、廃棄す
る。因子II、Ｖ、IX及びＸを、約6.8のpHにおける約0.0
3Mリン酸ナトリウム及び約0.2M NaClを含む約0.03Mのク
エン酸ナトリウムを含んで成るバッファーで溶出させる
ことにより、このDEAE樹脂を洗浄することにより、溶出
させる。この溶出液を回収し、そして因子II、Ｖ、IX及
びＸ含有画分を、プールし、そしてバルク溶液中に回収
する。この回収された画分の適切なテストを行い、そし
てこのバルク溶液のpHがほとんど中性に調整された後、
この溶液を、無菌バクテイア−保持カートリッジ又は膜
を通して濾過し、それにより因子II、Ｖ、IX及びＸのバ
ルク溶液を作る。このバルク溶液を、さらに処理するま
で凍結させる。
さらなる処理のために、このバルク溶液を解凍し、そ
してMillipore Corp.of Bedford,MAにより提供された
“Millipore Pellicon"濃縮器を使用してダイアフィル
トレーションを行い、その溶出液を約10g蛋白/lまで濃
縮することができる。１つの例示的な態様においては、
因子II、Ｖ、IX及びＸのバルク溶液を、処理し、その溶
液中に含まれるウイルス汚染物のいずれをも不活性化さ
せる。このウイルス不活性化段階（溶媒−界面活性剤
（solvent−detergent）処理又はＤ−Ｓ処理ともいわれ
る）を、このダイアフィルトレーション・バルク溶液を
約３（v/v）％のTri−（ｎ）ブチル・ホスフェート及び
約10％のポリソルベート80を含んで成る水溶液と混合す
ることにより行う。約0.08〜0.14kgのTri−（ｎ）ブチ
ル・ホスフェート、ポリソルベート80溶液を、バルク溶
液のkg当たりに添加する。得られた溶液を、約27℃にお
いて約６〜約８時間、混合する。処理された因子II−、
ｖ−、IX−及びＸ−含有溶液を、次に本発明の処理に従
ってさらに処理する。
してMillipore Corp.of Bedford,MAにより提供された
“Millipore Pellicon"濃縮器を使用してダイアフィル
トレーションを行い、その溶出液を約10g蛋白/lまで濃
縮することができる。１つの例示的な態様においては、
因子II、Ｖ、IX及びＸのバルク溶液を、処理し、その溶
液中に含まれるウイルス汚染物のいずれをも不活性化さ
せる。このウイルス不活性化段階（溶媒−界面活性剤
（solvent−detergent）処理又はＤ−Ｓ処理ともいわれ
る）を、このダイアフィルトレーション・バルク溶液を
約３（v/v）％のTri−（ｎ）ブチル・ホスフェート及び
約10％のポリソルベート80を含んで成る水溶液と混合す
ることにより行う。約0.08〜0.14kgのTri−（ｎ）ブチ
ル・ホスフェート、ポリソルベート80溶液を、バルク溶
液のkg当たりに添加する。得られた溶液を、約27℃にお
いて約６〜約８時間、混合する。処理された因子II−、
ｖ−、IX−及びＸ−含有溶液を、次に本発明の処理に従
ってさらに処理する。
バリウム／クエン酸塩沈殿による因子II、Ｖ及びＸの精
製 本発明の実施の１つの例示的な態様においては、先に
記載したように作られた、ウイルス不活性化因子II−、
Ｖ−、IX−、及びＸ−含有溶液を、希釈バッファー（約
7.3〜約7.5のpHにおける、0.02Mのクエン酸ナトリウム
により、約２〜10倍希釈する。所望により、因子II−、
Ｖ−、IX−、及びＸ−含有溶液であってウイルスを不活
性化されているもの、又は先に記載した方法以外の方法
によりウイルスを不活性化されているものを、使用する
ことができる。
製 本発明の実施の１つの例示的な態様においては、先に
記載したように作られた、ウイルス不活性化因子II−、
Ｖ−、IX−、及びＸ−含有溶液を、希釈バッファー（約
7.3〜約7.5のpHにおける、0.02Mのクエン酸ナトリウム
により、約２〜10倍希釈する。所望により、因子II−、
Ｖ−、IX−、及びＸ−含有溶液であってウイルスを不活
性化されているもの、又は先に記載した方法以外の方法
によりウイルスを不活性化されているものを、使用する
ことができる。
因子II、IX、及びＸを沈殿させるのに十分な0.5〜2M
塩化バリウム溶液の１容量を、上記の希釈II−、Ｖ−、
IX−、及びＸ−含有溶液に添加する。得られた塩化バリ
ウム濃度は、約0.1〜約0.2Mである。この沈殿物（バリ
ウム又はBa沈殿物ともいわれる）を、回収し、そして0.
2〜0.6M EDTA（（エチレン−ジニトリロ）テトラ酢酸）
に溶液中に溶解させ、そして先に記載したように、バリ
ウム及びEDTAを除去するために、低−ナトリウム・バッ
ファー（約6.0と約9.0との間のpHに緩衝化した溶液中の
０〜約0.2M NaCl）に対し、ダイアフィルトレーション
を行い、そしてさらなる処理のための好ましい低ナトリ
ウム濃度を得る。このダイアフィルトレーションに好適
なバッファーは、約6.6〜約７のpHにおける約0.02Mのク
エン酸ナトリウム、及び約0.05M NaClを含んで成る。
塩化バリウム溶液の１容量を、上記の希釈II−、Ｖ−、
IX−、及びＸ−含有溶液に添加する。得られた塩化バリ
ウム濃度は、約0.1〜約0.2Mである。この沈殿物（バリ
ウム又はBa沈殿物ともいわれる）を、回収し、そして0.
2〜0.6M EDTA（（エチレン−ジニトリロ）テトラ酢酸）
に溶液中に溶解させ、そして先に記載したように、バリ
ウム及びEDTAを除去するために、低−ナトリウム・バッ
ファー（約6.0と約9.0との間のpHに緩衝化した溶液中の
０〜約0.2M NaCl）に対し、ダイアフィルトレーション
を行い、そしてさらなる処理のための好ましい低ナトリ
ウム濃度を得る。このダイアフィルトレーションに好適
なバッファーは、約6.6〜約７のpHにおける約0.02Mのク
エン酸ナトリウム、及び約0.05M NaClを含んで成る。
因子Ｖを含む上澄液を、先に記載したように、約0.06
M Tris、pH7.2、0.09M NaCl、及び0.01M CaCl2を含んで
成るバッファーに対して、別個にダイアフィルトレーシ
ョンを行う。因子Ｖ含有溶液を、使用のためにん必要と
されるまで凍結させる。
M Tris、pH7.2、0.09M NaCl、及び0.01M CaCl2を含んで
成るバッファーに対して、別個にダイアフィルトレーシ
ョンを行う。因子Ｖ含有溶液を、使用のためにん必要と
されるまで凍結させる。
塩化バリウム沈殿が、約1.2〜約３までの因子II、IX
及びＸの比活性における増加を生じさせた。
及びＸの比活性における増加を生じさせた。
このダイアフィルトレーションされた、溶解したバリ
ウム沈殿物を、硫酸デキストラン（DSS）と結合したシ
リカ樹脂を含むカラムに適用する。
ウム沈殿物を、硫酸デキストラン（DSS）と結合したシ
リカ樹脂を含むカラムに適用する。
硫酸デキストラン・シリカ樹脂の調製 本発明の原理の実施において有用なDSS樹脂の調製の
１つの例示的な態様においては、登録商標CNBR SP500の
下、SERVA Fine Biochemicals Inc.of Westbury,NYによ
り供給された、活性化されたシリカ樹脂を、米国特許第
4,725,673号中に記載されるように使用し、そして本明
細書中に本引用により取り込んだ。簡単に言えば、その
CNBr−活性化形態において供給される、1kgの樹脂の、2
kgの蒸留水により穏やかにスラリー化し、そして次に、
ブフナー漏斗中の湿気溜（dampness）に吸引する。この
スラリー／洗浄段階を、２回以上繰り返した。硫酸デキ
ストラン溶液を、バッファー溶液、好ましくは約0.1M N
aHCO3（約8.3のpHにおける）中に10〜200グラムの硫酸
デキストランを溶解させることにより調製し、そしてそ
の洗浄したシリカ樹脂と硫酸デキストラン溶液を合わ
せ、そして１から約24時間までの間混合し、その硫酸デ
キストラン・リガンドをその活性化シリカ樹脂に結合さ
せる。このリガンド結合樹脂を、次に、ブフナー漏斗内
で１容量以上の蒸留水で３回洗浄し、そして湿気溜から
吸引した。このリガンド結合樹脂を、次にさらに、ブフ
ナー漏斗を使用して、約６〜８のpHにおいて、約2.0〜
約4.0M NaClを含む溶液で、数回洗浄し、そして湿気溜
に吸引した。この樹脂を、さらに、１容量以上の約６〜
８のpHにおける約０〜約0.2M NaClを含むバッファー溶
液による同様の洗浄及び吸引により洗浄した。
１つの例示的な態様においては、登録商標CNBR SP500の
下、SERVA Fine Biochemicals Inc.of Westbury,NYによ
り供給された、活性化されたシリカ樹脂を、米国特許第
4,725,673号中に記載されるように使用し、そして本明
細書中に本引用により取り込んだ。簡単に言えば、その
CNBr−活性化形態において供給される、1kgの樹脂の、2
kgの蒸留水により穏やかにスラリー化し、そして次に、
ブフナー漏斗中の湿気溜（dampness）に吸引する。この
スラリー／洗浄段階を、２回以上繰り返した。硫酸デキ
ストラン溶液を、バッファー溶液、好ましくは約0.1M N
aHCO3（約8.3のpHにおける）中に10〜200グラムの硫酸
デキストランを溶解させることにより調製し、そしてそ
の洗浄したシリカ樹脂と硫酸デキストラン溶液を合わ
せ、そして１から約24時間までの間混合し、その硫酸デ
キストラン・リガンドをその活性化シリカ樹脂に結合さ
せる。このリガンド結合樹脂を、次に、ブフナー漏斗内
で１容量以上の蒸留水で３回洗浄し、そして湿気溜から
吸引した。このリガンド結合樹脂を、次にさらに、ブフ
ナー漏斗を使用して、約６〜８のpHにおいて、約2.0〜
約4.0M NaClを含む溶液で、数回洗浄し、そして湿気溜
に吸引した。この樹脂を、さらに、１容量以上の約６〜
８のpHにおける約０〜約0.2M NaClを含むバッファー溶
液による同様の洗浄及び吸引により洗浄した。
この洗浄したリガンド結合樹脂を、次に、数容量の血
清アルブミンと、１から10時間までの間、混合すること
により処理し、“遊離（free）”の結合基のいずれをも
ブロックした。このブロックされたリガンド結合樹脂
を、ブフナー漏斗内で蒸留水により数回洗浄し、過剰の
ブロック剤を除去した。このブロックされた、リガンド
結合樹脂を、次に約６〜８のpHにおいて、約2.0〜約4.0
M NaClを含む溶液の１容量以上で、数回洗浄した。蒸留
水での最後の洗浄を提供し、そしてその樹脂を湿気溜に
吸引した。
清アルブミンと、１から10時間までの間、混合すること
により処理し、“遊離（free）”の結合基のいずれをも
ブロックした。このブロックされたリガンド結合樹脂
を、ブフナー漏斗内で蒸留水により数回洗浄し、過剰の
ブロック剤を除去した。このブロックされた、リガンド
結合樹脂を、次に約６〜８のpHにおいて、約2.0〜約4.0
M NaClを含む溶液の１容量以上で、数回洗浄した。蒸留
水での最後の洗浄を提供し、そしてその樹脂を湿気溜に
吸引した。
リガンド結合樹脂のための最後の調製段階は数樹脂容
量の“アルカトン（alcatone）”（50容量％のアセト
ン、35容量％のエタノール、及び15容量％の水の溶液）
による反復洗浄を含んでいた。このスラリーを、その使
用に先立って２℃〜８℃において保管した。この樹脂
を、上記のアルカトンからデカンテーションし、そして
約6.8のpHにおいて蒸留水で洗浄し、カラムに詰め、そ
して使用に先立ち、約６〜約９のpHにおいて、約０と約
0.05Mとの間のNaClにより平衡化した。このクロマトグ
ラフィー樹脂を平衡化するのに好適なバッファーは、約
6.6〜約７のpHにおいて、約0.02Mのクエン酸ナトリウ
ム、及び約0.05M NaClを含んで成る。
量の“アルカトン（alcatone）”（50容量％のアセト
ン、35容量％のエタノール、及び15容量％の水の溶液）
による反復洗浄を含んでいた。このスラリーを、その使
用に先立って２℃〜８℃において保管した。この樹脂
を、上記のアルカトンからデカンテーションし、そして
約6.8のpHにおいて蒸留水で洗浄し、カラムに詰め、そ
して使用に先立ち、約６〜約９のpHにおいて、約０と約
0.05Mとの間のNaClにより平衡化した。このクロマトグ
ラフィー樹脂を平衡化するのに好適なバッファーは、約
6.6〜約７のpHにおいて、約0.02Mのクエン酸ナトリウ
ム、及び約0.05M NaClを含んで成る。
因子II及び因子Ｘの分離 普通には、２と５リッターとの間の硫酸デキストラン
・シリカ樹脂が、処理されるウイルス不活性化因子II、
IX及びＸ溶液のそれぞれの5kgについて必要である。こ
の硫酸デキストラン・シリカ樹脂が、好ましい。なぜな
ら、このシリカ樹脂は、カラム・クロマトグラフィー手
順において使用されるとき容易に圧縮されず、そしてそ
れ故上記のような段階を通して所望の流速を維持するか
らである。しかしながら、他の樹脂、例えば、セファロ
ースの、使用することもできるであろう。また、硫酸デ
キストランを特に記載したが、他のリガンド、例えば、
ヘパリンを、使用することもできるであろう。
・シリカ樹脂が、処理されるウイルス不活性化因子II、
IX及びＸ溶液のそれぞれの5kgについて必要である。こ
の硫酸デキストラン・シリカ樹脂が、好ましい。なぜな
ら、このシリカ樹脂は、カラム・クロマトグラフィー手
順において使用されるとき容易に圧縮されず、そしてそ
れ故上記のような段階を通して所望の流速を維持するか
らである。しかしながら、他の樹脂、例えば、セファロ
ースの、使用することもできるであろう。また、硫酸デ
キストランを特に記載したが、他のリガンド、例えば、
ヘパリンを、使用することもできるであろう。
ダイアフィルトレーションされたバリウム沈殿物を含
む溶液を、先に記載したように、調製する。この溶液
を、次に、その溶液に含まれる因子IX及びＸがその樹脂
上に吸収されるように、そのカラム中の硫酸デキストラ
ン・シリカ樹脂を通して、ポンプで送った。因子IIは、
吸着されずに残ったか又は緩やかに吸着され、そしてブ
レークスルー（breakthrough）溶出液中に、又はその後
の溶出段階の初期において、そのカラムから洗浄され
る。この吸着段階の終了後、因子IX−、Ｘ−吸着樹脂
を、そのカラムの樹脂容量の約１〜３倍の洗浄バッファ
ー容量で洗浄する。好適な洗浄バッファーは、約6.6〜
約７のpHにおいて、約0.02Mのクエン酸ナトリウム、及
び約0.05MのNaClを含んで成る。背景を超えるA280をも
つ、溶出液及び洗浄溶液（すなわち、上記の平衡化工程
の間にそのカラムから溶出されたバッファーについて得
られたA280の読み）を、この両方が因子IIを含むが、プ
ールする。この因子II含有画分を、直ちにさらに処理す
るか又はその後の処理のために凍結させそして保管する
かのいずれかとする。
む溶液を、先に記載したように、調製する。この溶液
を、次に、その溶液に含まれる因子IX及びＸがその樹脂
上に吸収されるように、そのカラム中の硫酸デキストラ
ン・シリカ樹脂を通して、ポンプで送った。因子IIは、
吸着されずに残ったか又は緩やかに吸着され、そしてブ
レークスルー（breakthrough）溶出液中に、又はその後
の溶出段階の初期において、そのカラムから洗浄され
る。この吸着段階の終了後、因子IX−、Ｘ−吸着樹脂
を、そのカラムの樹脂容量の約１〜３倍の洗浄バッファ
ー容量で洗浄する。好適な洗浄バッファーは、約6.6〜
約７のpHにおいて、約0.02Mのクエン酸ナトリウム、及
び約0.05MのNaClを含んで成る。背景を超えるA280をも
つ、溶出液及び洗浄溶液（すなわち、上記の平衡化工程
の間にそのカラムから溶出されたバッファーについて得
られたA280の読み）を、この両方が因子IIを含むが、プ
ールする。この因子II含有画分を、直ちにさらに処理す
るか又はその後の処理のために凍結させそして保管する
かのいずれかとする。
因子IX及びＸを、約6.6〜約７のpHにおいて、約0.02M
のクエン酸ナトリウムを含んで成るバッファー溶液中の
約0.05Mから約0.6M NaClまでの線型塩（NaCl）グラジエ
ントによりその樹脂から溶出する。このNaCl濃度が約0.
2Mのとき、因子Ｘは、そのカラムから溶出する。因子Ｘ
含有画分をプールし、そして直ちにさらに処理するか又
はその後の処理のために凍結させそして保管するかのい
ずれかとする。所望により、因子Ｘ含有画分を、DDS樹
脂に再適用し、そして先に記載したように、さらなる精
製のために溶出させることができる。この因子Ｘ溶出液
を、さらなる処理又は凍結に先立って濾過することがで
きる。数回の操作からの別々にプールされた因子II、IX
及びＸ画分が集積したとき、この画分をそれぞれ、さら
に処理する。
のクエン酸ナトリウムを含んで成るバッファー溶液中の
約0.05Mから約0.6M NaClまでの線型塩（NaCl）グラジエ
ントによりその樹脂から溶出する。このNaCl濃度が約0.
2Mのとき、因子Ｘは、そのカラムから溶出する。因子Ｘ
含有画分をプールし、そして直ちにさらに処理するか又
はその後の処理のために凍結させそして保管するかのい
ずれかとする。所望により、因子Ｘ含有画分を、DDS樹
脂に再適用し、そして先に記載したように、さらなる精
製のために溶出させることができる。この因子Ｘ溶出液
を、さらなる処理又は凍結に先立って濾過することがで
きる。数回の操作からの別々にプールされた因子II、IX
及びＸ画分が集積したとき、この画分をそれぞれ、さら
に処理する。
上記の塩グラジエントが、約0.25M〜約0.4Mの濃度に
達したとき、因子IXとＸとの両方が溶出する。約0.4Mを
超える濃度においては、因子IXのみが、溶出する。因子
IX含有画分をプールし、そして直ちにさらに処理するか
又はその後の処理のために凍結させそして保管するかの
いずれかとする。
達したとき、因子IXとＸとの両方が溶出する。約0.4Mを
超える濃度においては、因子IXのみが、溶出する。因子
IX含有画分をプールし、そして直ちにさらに処理するか
又はその後の処理のために凍結させそして保管するかの
いずれかとする。
さらなる処理のために、因子Ｘ含有画分を、（凍結し
ている場合に）解凍し、そして合わせ、そしてそのpH
を、ほぼ中性に調整する。この合わせたプールを、次に
活性化バッファー、例えば、約7.4のpHにおける、約0.0
2M HEPES（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラ
ジン−エタンスルホン酸）、及び0.15M NaClに対して、
ダイアフィルトレーションを行い、因子Ｘ活性及びナト
リウム濃度の正確な標的パラメーターを得る。これは、
好ましくは、0.02M HEPES、pH7.4及び0.15M NaClであ
る。
ている場合に）解凍し、そして合わせ、そしてそのpH
を、ほぼ中性に調整する。この合わせたプールを、次に
活性化バッファー、例えば、約7.4のpHにおける、約0.0
2M HEPES（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラ
ジン−エタンスルホン酸）、及び0.15M NaClに対して、
ダイアフィルトレーションを行い、因子Ｘ活性及びナト
リウム濃度の正確な標的パラメーターを得る。これは、
好ましくは、0.02M HEPES、pH7.4及び0.15M NaClであ
る。
因子Ｘの無菌バルクを、因子Ｘ活性についてサンプリ
ングする。この因子Ｘを使用のための要求があるまで凍
結させることができる。
ングする。この因子Ｘを使用のための要求があるまで凍
結させることができる。
さらなる処理のために、因子II含有画分を、（凍結し
ている場合に）解凍し、そして合わせ、そしてそのpH
を、ほぼ中性に調整する。この合わせたプールを、因子
IIを濃縮するために、次の限外濾過し、因子II活性及び
ナトリウム濃度の正確な標的パラメーターを得る。この
pHを、チェックし、そして必要により再調整する。所望
にいより、因子IIの濃縮の他の方法、例えば、硫酸アン
モニウム沈殿、その後のダイアフィルトレーション、又
は当業者に知られた他の好適な手段を、使用することが
できる。
ている場合に）解凍し、そして合わせ、そしてそのpH
を、ほぼ中性に調整する。この合わせたプールを、因子
IIを濃縮するために、次の限外濾過し、因子II活性及び
ナトリウム濃度の正確な標的パラメーターを得る。この
pHを、チェックし、そして必要により再調整する。所望
にいより、因子IIの濃縮の他の方法、例えば、硫酸アン
モニウム沈殿、その後のダイアフィルトレーション、又
は当業者に知られた他の好適な手段を、使用することが
できる。
因子IIを使用するための要求があるまで凍結させ又は
凍結乾燥させることができる。
凍結乾燥させることができる。
因子Ｘの因子Xaへの活性化 血液中では、因子Ｘは、内因性カスケードにおいて、
因子VIIIa、カルシウム・イオン及びリン脂質の存在中
で因子IXaにより、そして外因性経路においては、因子I
II、リン脂質、及びカルシウム・イオンの存在中で因子
VIIaにより、活性化される。本発明における、因子Ｘの
活性化を、これらの血液因子を働きにより達成すること
ができる。あるいは、他の蛋白分解酵素、例えば、ラッ
セルクサリヘビ蛇毒（Russell's viper venom）を、使
用することができる。
因子VIIIa、カルシウム・イオン及びリン脂質の存在中
で因子IXaにより、そして外因性経路においては、因子I
II、リン脂質、及びカルシウム・イオンの存在中で因子
VIIaにより、活性化される。本発明における、因子Ｘの
活性化を、これらの血液因子を働きにより達成すること
ができる。あるいは、他の蛋白分解酵素、例えば、ラッ
セルクサリヘビ蛇毒（Russell's viper venom）を、使
用することができる。
好ましくは、先に記載した手順により精製された因子
Ｘを、ラッセルクサリヘビ（Vipera russelli）蛇毒か
ら得られた蛇毒の蛋白分解酵素とのインキュベーション
により、その活性な触媒作用のある形態に活性化する。
Ｘを、ラッセルクサリヘビ（Vipera russelli）蛇毒か
ら得られた蛇毒の蛋白分解酵素とのインキュベーション
により、その活性な触媒作用のある形態に活性化する。
約2gの因子Ｘを、0.5〜10mg/mlのラッセルクサリヘビ
蛇毒及び0.005M CaCl2と共に、37℃において30分間イン
キュベートし、因子Ｘを因子Xaに変換する。この活性化
の終点において、この蛇毒蛋白分解酵素を、ベンズアミ
ジン−セファロース（Pharmacia of Uppsala,Swedenに
より提供される）上で、カラム・クロマトグラフィーに
より、除去する。このベンズアミジン−セファロース
を、活性化バッファー、例えば、0.02M HEPES、pH7.4、
及び0.15M NaClにより平衡化する。この活性化因子Ｘ
を、適用し、そしてこのベンズアミジン−セファロース
に結合させる。因子Xaを、活性化バッファー中に約0.00
5Mのベンズアミジンを含むクロマトグラフィー媒質から
洗浄する。溶出した因子Xaを、回収し、そして約0.02M
Tris HCl、pH5.5、及び0.15M NaClに対してダイアフィ
ルトレーションし、そして0.1（wt/wt）％アルブミン及
び１（wt/wt）％ポリエチレン・グリコール又はグリセ
ロールの添加により安定させることができる。
蛇毒及び0.005M CaCl2と共に、37℃において30分間イン
キュベートし、因子Ｘを因子Xaに変換する。この活性化
の終点において、この蛇毒蛋白分解酵素を、ベンズアミ
ジン−セファロース（Pharmacia of Uppsala,Swedenに
より提供される）上で、カラム・クロマトグラフィーに
より、除去する。このベンズアミジン−セファロース
を、活性化バッファー、例えば、0.02M HEPES、pH7.4、
及び0.15M NaClにより平衡化する。この活性化因子Ｘ
を、適用し、そしてこのベンズアミジン−セファロース
に結合させる。因子Xaを、活性化バッファー中に約0.00
5Mのベンズアミジンを含むクロマトグラフィー媒質から
洗浄する。溶出した因子Xaを、回収し、そして約0.02M
Tris HCl、pH5.5、及び0.15M NaClに対してダイアフィ
ルトレーションし、そして0.1（wt/wt）％アルブミン及
び１（wt/wt）％ポリエチレン・グリコール又はグリセ
ロールの添加により安定させることができる。
因子IIの因子IIaへの活性化 因子IIの因子IIaへの活性化を、リン脂質膜及びカル
シウムの存在中における因子Xa及び因子Vaの両方の働き
により達成する。
シウムの存在中における因子Xa及び因子Vaの両方の働き
により達成する。
リン脂質膜を、個々のリン脂質から合成し、又はリン
脂質／脂肪エマルジョン、例えば、商標SOYCAL及びFLUO
SOLの下、Alpha Therapeutic Corporation of Los Ange
ls,CAにより販売されるものにより、提供することがで
きる。リン脂質膜を、音波処理により、個々のリン脂
質、例えば、ホスファチジルセリン及びホスファチジル
コリンから合成することができる。
脂質／脂肪エマルジョン、例えば、商標SOYCAL及びFLUO
SOLの下、Alpha Therapeutic Corporation of Los Ange
ls,CAにより販売されるものにより、提供することがで
きる。リン脂質膜を、音波処理により、個々のリン脂
質、例えば、ホスファチジルセリン及びホスファチジル
コリンから合成することができる。
精製された因子Ｖを、先に記載したように得て、又
は、あるいは、純粋でなく且つ未分画の血漿を使用する
ことができる。因子Ｖは、因子IIaによる因子II活性化
手順の間に、活性化される。活性化反応においては、因
子IIは、因子Vaの非存在中において非常にゆっくりと活
性化される。しかしながら、少量の因子IIaが作られ
る。これらの少量の因子IIaは、因子Ｖを因子Vaに活性
化するために使用されることができ、そしていくらかの
Vaも、その精製工程の間に作られる。したがって、この
生じた因子Vaは、次に、因子II活性化反応において相互
作用させるために使用されることができ、、これが、因
子IIa合成速度における増加をもたらす。それ故、因子
Ｖのための別個の活性化段階は全く必要ない。
は、あるいは、純粋でなく且つ未分画の血漿を使用する
ことができる。因子Ｖは、因子IIaによる因子II活性化
手順の間に、活性化される。活性化反応においては、因
子IIは、因子Vaの非存在中において非常にゆっくりと活
性化される。しかしながら、少量の因子IIaが作られ
る。これらの少量の因子IIaは、因子Ｖを因子Vaに活性
化するために使用されることができ、そしていくらかの
Vaも、その精製工程の間に作られる。したがって、この
生じた因子Vaは、次に、因子II活性化反応において相互
作用させるために使用されることができ、、これが、因
子IIa合成速度における増加をもたらす。それ故、因子
Ｖのための別個の活性化段階は全く必要ない。
因子IIを活性化するために、先に述べたように得られ
た因子IIを、約7.3のpHにおける、約0.06MのTrisバッフ
ァー中で、約２〜約20A280単位に希釈し、約0.09M NaC
l、約0.1μg/mlの因子Xa画分、約30〜約200μｇの因子
Ｖ画分、約５〜約50nモル/mlのリン脂質、約２〜20mM C
aCl2（最終濃度）、約0.3％Tri−（ｎ）ブチル・リン酸
塩、及び約１（wt/wt）％のポリソルベート80（最終濃
度）を添加する。この混合液を、約24℃〜約30℃におい
て約５〜約６時間の間インキュベートする。インキュベ
ーションの終点において、この混合液のpHを、約6.5に
調整し、そしてその溶液を、約５（wt/wt）％のPEG（最
終濃度）の添加及び遠心分離により清澄化することがで
きる。
た因子IIを、約7.3のpHにおける、約0.06MのTrisバッフ
ァー中で、約２〜約20A280単位に希釈し、約0.09M NaC
l、約0.1μg/mlの因子Xa画分、約30〜約200μｇの因子
Ｖ画分、約５〜約50nモル/mlのリン脂質、約２〜20mM C
aCl2（最終濃度）、約0.3％Tri−（ｎ）ブチル・リン酸
塩、及び約１（wt/wt）％のポリソルベート80（最終濃
度）を添加する。この混合液を、約24℃〜約30℃におい
て約５〜約６時間の間インキュベートする。インキュベ
ーションの終点において、この混合液のpHを、約6.5に
調整し、そしてその溶液を、約５（wt/wt）％のPEG（最
終濃度）の添加及び遠心分離により清澄化することがで
きる。
因子IIaを、Pharmacia of Uppsala,Swedenにより供給
されたスルファプロピル−セファデックス上のクロマト
グラフィー、又は他の好適なクロマトグラフィー樹脂に
より、その上澄液から回収する。このクロマトグラフィ
ー媒質を、バッファー、例えば、約6.5のpHにおける約
0.01Mクエン酸ナトリウムにより平衡化する。このクロ
マトグラフィー媒質に因子IIa含有混合物を適用した後
に、このクロマトグラフィー媒質を、約6.5のpHにおけ
る約0.01Mクエン酸ナトリウム又は他の好適なバッファ
ーで洗浄する。この因子IIaは、バッファー、例えば、
約6.7のpHにおける約0.1Mクエン酸ナトリウムにより、
このクロマトグラフィー媒質から溶出する。この因子II
aを、濾過し、そしてダイアフィルトレーションを行
い、その組成を、約５〜10mMヒスチジン、pH6.7、約0.1
〜0.2％Caイオン、そして約0.1〜0.2M NaClに調整す
る。この溶液を、次に、前もって滅菌したバクテリア保
持カートリッジ又は膜フィルターを使用して滅菌濾過
し、そして凍結乾燥させた。
されたスルファプロピル−セファデックス上のクロマト
グラフィー、又は他の好適なクロマトグラフィー樹脂に
より、その上澄液から回収する。このクロマトグラフィ
ー媒質を、バッファー、例えば、約6.5のpHにおける約
0.01Mクエン酸ナトリウムにより平衡化する。このクロ
マトグラフィー媒質に因子IIa含有混合物を適用した後
に、このクロマトグラフィー媒質を、約6.5のpHにおけ
る約0.01Mクエン酸ナトリウム又は他の好適なバッファ
ーで洗浄する。この因子IIaは、バッファー、例えば、
約6.7のpHにおける約0.1Mクエン酸ナトリウムにより、
このクロマトグラフィー媒質から溶出する。この因子II
aを、濾過し、そしてダイアフィルトレーションを行
い、その組成を、約５〜10mMヒスチジン、pH6.7、約0.1
〜0.2％Caイオン、そして約0.1〜0.2M NaClに調整す
る。この溶液を、次に、前もって滅菌したバクテリア保
持カートリッジ又は膜フィルターを使用して滅菌濾過
し、そして凍結乾燥させた。
例１ 因子II、Ｖ、IX及びＸの調製 因子II、Ｖ、IX及びＸの精製のための本発明の実施の
１つの態様においては、低温沈殿させた血漿中に含まれ
る因子II、Ｖ、IX及びＸを、前もって6.8のpHにおける
0.03Mリン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウムに
より平衡化されているDEAEセルロース上に吸着させた。
このDEAEセルロース及び血漿を、約30分間混合し、そし
て遠心分離により回収したDEAEセルロースを、6.8のpH
における0.03Mリン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナト
リウムで洗浄した。この洗浄液を廃棄した。
１つの態様においては、低温沈殿させた血漿中に含まれ
る因子II、Ｖ、IX及びＸを、前もって6.8のpHにおける
0.03Mリン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウムに
より平衡化されているDEAEセルロース上に吸着させた。
このDEAEセルロース及び血漿を、約30分間混合し、そし
て遠心分離により回収したDEAEセルロースを、6.8のpH
における0.03Mリン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナト
リウムで洗浄した。この洗浄液を廃棄した。
この洗浄されたDEAEセルロースを、6.8のpHにおける
0.03Mリン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウム中
に懸濁させ、そしてカラム中に濯いだ。この溶出液を廃
棄した。このDEAEセルロースを、6.8のpHにおける0.03M
リン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウムで洗浄
し、そしてこの洗浄液も廃棄した。因子II、Ｖ、IX及び
Ｘを、6.8のpHにおける0.3Mリン酸ナトリウム及び0.03M
クエン酸ナトリウム及び0.2M NaClでDEAEセルロースを
洗浄することにより溶出させた。この溶出液を回収し、
そして因子II−、Ｖ−、IX−及びＸ−含有画分をプール
し、そしてバルク溶液中に回収した。この溶液を無菌バ
クテリア保持カートリッジを通して濾過し、そして凍結
乾燥させた。この凍結乾燥粉末を、ヘプタン中への懸濁
及び60℃における20時間の加熱によりウイルス不活性と
した。ヘプタンを、乾燥により除去した。
0.03Mリン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウム中
に懸濁させ、そしてカラム中に濯いだ。この溶出液を廃
棄した。このDEAEセルロースを、6.8のpHにおける0.03M
リン酸ナトリウム及び0.03Mクエン酸ナトリウムで洗浄
し、そしてこの洗浄液も廃棄した。因子II、Ｖ、IX及び
Ｘを、6.8のpHにおける0.3Mリン酸ナトリウム及び0.03M
クエン酸ナトリウム及び0.2M NaClでDEAEセルロースを
洗浄することにより溶出させた。この溶出液を回収し、
そして因子II−、Ｖ−、IX−及びＸ−含有画分をプール
し、そしてバルク溶液中に回収した。この溶液を無菌バ
クテリア保持カートリッジを通して濾過し、そして凍結
乾燥させた。この凍結乾燥粉末を、ヘプタン中への懸濁
及び60℃における20時間の加熱によりウイルス不活性と
した。ヘプタンを、乾燥により除去した。
約2.04kgの乾燥粉末を、約64.5kgのインクジェクショ
ンのための冷水（CWFI）で再構築した。この再構築粉末
を、266.6kgの0.02Mクエン酸ナトリウム、pH7.4、及び
４℃における0.25M NaClで希釈し、そして２℃〜４℃に
おいて20分間混合した。
ンのための冷水（CWFI）で再構築した。この再構築粉末
を、266.6kgの0.02Mクエン酸ナトリウム、pH7.4、及び
４℃における0.25M NaClで希釈し、そして２℃〜４℃に
おいて20分間混合した。
約53.4gの1.0M塩化バリウム溶液（４℃）を、２時間
の経過時間にわたり添加し、そしてその混合物を、さら
に１時間撹拌した。この混合物を、塩化バリウムの添加
の間及び混合の間に０℃と４℃との間に保った。混合
後、この溶液を、Sharples遠心分離機内で、１分間当た
り１リッター当たり0.2と0.6との間における遠心分離機
を通しての流速を保ちながら、遠心分離した。約10kgの
塩化バリウム沈殿物を、このように回収した。因子Ｖを
含む上澄液を回収した。
の経過時間にわたり添加し、そしてその混合物を、さら
に１時間撹拌した。この混合物を、塩化バリウムの添加
の間及び混合の間に０℃と４℃との間に保った。混合
後、この溶液を、Sharples遠心分離機内で、１分間当た
り１リッター当たり0.2と0.6との間における遠心分離機
を通しての流速を保ちながら、遠心分離した。約10kgの
塩化バリウム沈殿物を、このように回収した。因子Ｖを
含む上澄液を回収した。
この因子Ｖ含有上澄液を、Millipore TPカートリッジ
・フィルターを通して濾過し、粒子のいずれをも除去し
た。この溶液を、Millipore Pellicon濃縮器を通過さ
せ、そしてその元の容量の1/30と1/50との間まで濃縮し
た。この濃縮溶液を、次に、0.06M Tris、0.09M NaCl、
pH7.2（“TBS"溶液）で５倍に希釈した。この希釈の
間、この物質を、そのTBS希釈前のその容量まで再濃縮
した。この濃縮及びTBS希釈段階を、３回以上繰り返し
た。因子Ｖ溶液を、最後に１回濃縮し、次に、TBSによ
りその元の容量の1/10〜1/30まで希釈した。この点にお
いて、この溶液の導電率は、TBS溶液のものとほぼ同じ
であった。
・フィルターを通して濾過し、粒子のいずれをも除去し
た。この溶液を、Millipore Pellicon濃縮器を通過さ
せ、そしてその元の容量の1/30と1/50との間まで濃縮し
た。この濃縮溶液を、次に、0.06M Tris、0.09M NaCl、
pH7.2（“TBS"溶液）で５倍に希釈した。この希釈の
間、この物質を、そのTBS希釈前のその容量まで再濃縮
した。この濃縮及びTBS希釈段階を、３回以上繰り返し
た。因子Ｖ溶液を、最後に１回濃縮し、次に、TBSによ
りその元の容量の1/10〜1/30まで希釈した。この点にお
いて、この溶液の導電率は、TBS溶液のものとほぼ同じ
であった。
塩化バリウム沈殿物に、20℃〜25℃における、約66.7
kgの0.4M EDTA溶液を添加し、、その沈殿物を溶解さ
せ、そしてその沈殿物を。Millipore TPカートリッジ・
フィルターを通して濾過し、粒子を除去した。濾過後、
この溶液を、Millipore Pellicon濃縮器を通過させ、そ
してその元の容量の1/5と1/10との間まで濃縮した。こ
の濃縮溶液を、次に、0.02Mクエン酸ナトリウム及び0.0
5M NaClにより、元の容量まで希釈した。この濃縮及び
希釈段階を、６回以上繰り返した。この点において、こ
の溶液の導電率は、0.02Mクエン酸ナトリウム及び0.05M
NaCl溶液のものとほぼ同じであった。最後の希釈後、
このダイアフィルトレーション物質の重量は76.4kgであ
った。この再溶解沈殿物は、因子II、IX、及びＸを含ん
でいた。
kgの0.4M EDTA溶液を添加し、、その沈殿物を溶解さ
せ、そしてその沈殿物を。Millipore TPカートリッジ・
フィルターを通して濾過し、粒子を除去した。濾過後、
この溶液を、Millipore Pellicon濃縮器を通過させ、そ
してその元の容量の1/5と1/10との間まで濃縮した。こ
の濃縮溶液を、次に、0.02Mクエン酸ナトリウム及び0.0
5M NaClにより、元の容量まで希釈した。この濃縮及び
希釈段階を、６回以上繰り返した。この点において、こ
の溶液の導電率は、0.02Mクエン酸ナトリウム及び0.05M
NaCl溶液のものとほぼ同じであった。最後の希釈後、
このダイアフィルトレーション物質の重量は76.4kgであ
った。この再溶解沈殿物は、因子II、IX、及びＸを含ん
でいた。
因子II、IX、及びＸを含む、ダイアフィルトレーショ
ン物質の半分（38.6kg）を、約170ml/分の流速におい
て、18cm x 94cm Modulineクロマトグラフィー・カラム
であって硫酸デキストラン・シリカ樹脂（DSS）を含み
洗浄バッファー（0.02Mクエン酸ナトリウム及び0.05M N
aCl、pH6.8）により平衡化されているものに、適用し
た。因子IIを含む溶出液を、回収した。最終的に、425k
gの洗浄バッファーがこのカラムを通過した。
ン物質の半分（38.6kg）を、約170ml/分の流速におい
て、18cm x 94cm Modulineクロマトグラフィー・カラム
であって硫酸デキストラン・シリカ樹脂（DSS）を含み
洗浄バッファー（0.02Mクエン酸ナトリウム及び0.05M N
aCl、pH6.8）により平衡化されているものに、適用し
た。因子IIを含む溶出液を、回収した。最終的に、425k
gの洗浄バッファーがこのカラムを通過した。
約25リッター（洗浄の１カラム容量）の最初の洗浄液
を、上記の因子IIの溶出液と合わせた。この因子IIのプ
ールを、Millipore Pellicon濃縮器を使用するダイアフ
ィルトレーションにより濃縮した。濃縮後、この因子II
溶出液を、（滅菌）0.2ミクロン・フィルターを通して
濾過し、その後凍結させた。
を、上記の因子IIの溶出液と合わせた。この因子IIのプ
ールを、Millipore Pellicon濃縮器を使用するダイアフ
ィルトレーションにより濃縮した。濃縮後、この因子II
溶出液を、（滅菌）0.2ミクロン・フィルターを通して
濾過し、その後凍結させた。
カラムを先に記載したように洗浄した直後に、0.02M
クエン酸ナトリウム、pH6.8中の0.05M NaClから0.6M Na
Clまでの、150リッターの線型塩グラジエントを、650ml
/分の流速において、そのカラムに適用した。そのカラ
ム溶出液の3.25リッターの部分を、グラジエントの間に
回収し、そしてそれぞれの第三画分を、その因子IX及び
Ｘの活性を測定するために検定した。このグラジエント
の終了後、0.02Mクエン酸ナトリウム、pH6.8中の0.5M N
aClを含む追加の75リッターの溶液を。このカラムに適
用し、そしてこの溶出液の3.25リッターの部分を回収
し、そして因子IX及びＸの活性について検定した。比較
的高い因子Ｘ活性を含むが低い因子IX活性を含む部分
を、プールし、因子Ｘ溶出液プールを作った。この因子
Ｘ溶出液プールを、Millipore Pellicon濃縮器を使用す
るダイアフィルトレーションにより濃縮した。濃縮後、
この因子Ｘ溶出液を、（滅菌）0.2ミクロン・フィルタ
ーを通して濾過し、その後凍結させた。
クエン酸ナトリウム、pH6.8中の0.05M NaClから0.6M Na
Clまでの、150リッターの線型塩グラジエントを、650ml
/分の流速において、そのカラムに適用した。そのカラ
ム溶出液の3.25リッターの部分を、グラジエントの間に
回収し、そしてそれぞれの第三画分を、その因子IX及び
Ｘの活性を測定するために検定した。このグラジエント
の終了後、0.02Mクエン酸ナトリウム、pH6.8中の0.5M N
aClを含む追加の75リッターの溶液を。このカラムに適
用し、そしてこの溶出液の3.25リッターの部分を回収
し、そして因子IX及びＸの活性について検定した。比較
的高い因子Ｘ活性を含むが低い因子IX活性を含む部分
を、プールし、因子Ｘ溶出液プールを作った。この因子
Ｘ溶出液プールを、Millipore Pellicon濃縮器を使用す
るダイアフィルトレーションにより濃縮した。濃縮後、
この因子Ｘ溶出液を、（滅菌）0.2ミクロン・フィルタ
ーを通して濾過し、その後凍結させた。
因子II−、IX−、Ｘ−含有出発濃縮物からの物質及び
上記の濃縮因子IIプールを、因子II活性及び蛋白含量に
ついて検定した。因子II−、Ｖ−、IX−及びＸ−含有濃
縮物及び上記の濃縮因子Ｘ部分のプールを、因子Ｘ活性
及び蛋白含量について検定した。これらの検定の結果
を、表１中に示す。
上記の濃縮因子IIプールを、因子II活性及び蛋白含量に
ついて検定した。因子II−、Ｖ−、IX−及びＸ−含有濃
縮物及び上記の濃縮因子Ｘ部分のプールを、因子Ｘ活性
及び蛋白含量について検定した。これらの検定の結果
を、表１中に示す。
因子IIの純度（比活性）は、硫酸デキストラン・クロ
マトグラフィーにより12％増加した。因子Ｖの純度は、
バリウム沈殿により60％増加した。因子Ｘの純度は、硫
酸デキストラン・クロマトグラフィーにより10倍増加し
た。
マトグラフィーにより12％増加した。因子Ｖの純度は、
バリウム沈殿により60％増加した。因子Ｘの純度は、硫
酸デキストラン・クロマトグラフィーにより10倍増加し
た。
例２ 因子Ｘの因子Xaへの活性化 例１の手順に従って調製した約460mgの因子Ｘを、１
〜2mgのラッセルクサリ蛇毒及び5mgのCaCl2と共に全容
量1,300mg中で37℃において30分間、インキュベート
し、因子Ｘを因子Xaに変換させた。この活性化の終点に
おいて、この蛇毒を、ベンズアミジン−セファロース上
のカラム・クロマトグラフィーにより除去した。このベ
ンズアミジン−セファロースを、0.02M HEPES、pH7.4、
0.15M NaClにより平衡とした。この活性化された因子Ｘ
を、上記のベンズアミジン−セファロースに適用し、そ
して結合させた。非結合の物質を、0.02M HEPES、pH7.
4、0.15M NaCl、0.005Mベンズアミジンにより上記のク
ロマトグラフィー媒質から溶出させた。この溶出した因
子Xaを、回収し、0.02M Tris、pH5.5、0.15M NaClに対
して透析し、そして0.1（wt/wt）％アルブミン及び1.0
（wt/wt）％ポリエチレン・グリコールの添加により安
定化させた。
〜2mgのラッセルクサリ蛇毒及び5mgのCaCl2と共に全容
量1,300mg中で37℃において30分間、インキュベート
し、因子Ｘを因子Xaに変換させた。この活性化の終点に
おいて、この蛇毒を、ベンズアミジン−セファロース上
のカラム・クロマトグラフィーにより除去した。このベ
ンズアミジン−セファロースを、0.02M HEPES、pH7.4、
0.15M NaClにより平衡とした。この活性化された因子Ｘ
を、上記のベンズアミジン−セファロースに適用し、そ
して結合させた。非結合の物質を、0.02M HEPES、pH7.
4、0.15M NaCl、0.005Mベンズアミジンにより上記のク
ロマトグラフィー媒質から溶出させた。この溶出した因
子Xaを、回収し、0.02M Tris、pH5.5、0.15M NaClに対
して透析し、そして0.1（wt/wt）％アルブミン及び1.0
（wt/wt）％ポリエチレン・グリコールの添加により安
定化させた。
上記の活性化及び精製は、約1,200単位/mgの比活性を
もつ因子Xaをもたらした。
もつ因子Xaをもたらした。
例３ リン脂質膜の調製 75mgのホスファチジルセリンと225mgのホスファチジ
ルコリンと混合し、そして30〜45分間、４℃において音
波処理し、合成リン脂質膜を作った。
ルコリンと混合し、そして30〜45分間、４℃において音
波処理し、合成リン脂質膜を作った。
例４ 因子IIの因子IIaへ小規模活性化 例１の手順に従って調製した200mgの因子IIを、例２
の手順に従って調製した0.09M NaCl及び４μｇの因子Xa
を含むpH7.3における0.06M Trisバッファー中で、5mg/m
lに希釈し；因子Ｖを含む400μｌの塩化バリウム上澄液
を例１の手順に従って調製し;7mM CaCl2、0.3（wt/wt）
％のTri−（ｎ）ブチル・ホスフェート及び１（wt/wt）
％のポリソルベート80を添加した。この反応混合物を、
室温において６時間インキュベートした。
の手順に従って調製した0.09M NaCl及び４μｇの因子Xa
を含むpH7.3における0.06M Trisバッファー中で、5mg/m
lに希釈し；因子Ｖを含む400μｌの塩化バリウム上澄液
を例１の手順に従って調製し;7mM CaCl2、0.3（wt/wt）
％のTri−（ｎ）ブチル・ホスフェート及び１（wt/wt）
％のポリソルベート80を添加した。この反応混合物を、
室温において６時間インキュベートした。
インキュベーションの終点において、この混合物のpH
を、6.7に調整し、PEGの添加により、５（wt/wt）％PEG
の最終濃度までもっていき、そして室温において30分間
混合した。この沈殿物を、3,000rpmにおいて30分間、遠
心分離により除去した、得られたPEG上澄液を、等容量
の蒸留水で希釈し、そして9.21mlのスルファプロピル−
セファデックス（6.5のpHにおける0.01のクエン酸ナト
リウムにより平衡化されているもの）と、１時間４℃に
おいて混合した。この因子II含有スルファプロピル−セ
ファデックスを、次にカラムに濯ぎ、そして6.7のpHに
おける0.01Mクエン酸ナトリウムで洗浄した。この因子I
Iaを次に6.5のpHにおける0.1Mクエン酸ナトリウムによ
り溶出した。1,220単位/A280単位の比活性を、85％の収
率を伴う、小規模活性化手順により得た。この結果を、
表II中に要約する。
を、6.7に調整し、PEGの添加により、５（wt/wt）％PEG
の最終濃度までもっていき、そして室温において30分間
混合した。この沈殿物を、3,000rpmにおいて30分間、遠
心分離により除去した、得られたPEG上澄液を、等容量
の蒸留水で希釈し、そして9.21mlのスルファプロピル−
セファデックス（6.5のpHにおける0.01のクエン酸ナト
リウムにより平衡化されているもの）と、１時間４℃に
おいて混合した。この因子II含有スルファプロピル−セ
ファデックスを、次にカラムに濯ぎ、そして6.7のpHに
おける0.01Mクエン酸ナトリウムで洗浄した。この因子I
Iaを次に6.5のpHにおける0.1Mクエン酸ナトリウムによ
り溶出した。1,220単位/A280単位の比活性を、85％の収
率を伴う、小規模活性化手順により得た。この結果を、
表II中に要約する。
例５ 因子IIから因子IIaへのパイロット規模活性化 例１の手順に従って調製した20gの因子IIを、例２の
手順に従って調製した0.09M NaClを含むpH7.3における
0.06M Trisバッファー中で5mg/mlに希釈し;4mgの因子Xa
を例２の手順に従って調製し；例１の手順に従って調製
した因子Ｖを含む100mlの塩化バリウム上澄液を添加
し、そしてこの溶液を、最終濃度までもっていき、そし
て例３の手順に従って調製した28nモル/mlのリン脂質、
7mM CaCl2、0.3（wt/wt）％のTri−（ｎ）ブチル・ホス
フェート及び１（wt/wt）％のポリソルベート80を添加
した。この反応混合物を、室温において６時間インキュ
ベートした。インキュベーションの終点において、この
混合物のpHを、6.5に調整し、固体PEGの添加により、５
（wt/wt）％PEGの最終濃度までもっていき、そして室温
において30分間混合し、そのPEGを溶解させた。この混
合物を、次に、3,000rpmにおいて30分間、遠心分離し、
そのPEG沈殿物を除去した。得られたPEG上澄液を、等容
量の蒸留水で希釈し、そして11のスルファプロピル−セ
ファデックス（6.5のpHにおける0.01Mのクエン酸ナトリ
ウムにより平衡化されているもの）と、１時間４℃にお
いて混合した。この因子II含有スルファプロピル−セフ
ァデックスを、次にカラムに濯ぎ、そして6.5のpHにお
ける0.01Mクエン酸ナトリウムで洗浄した。この因子IIa
を次に6.7のpHにおける0.1Mクエン酸ナトリウムにより
溶出した、1,100単位/mlの比活性を、75％の収率を伴
う、パイロット規模活性化手順により得た。この結果
を、表III中に要約する。
手順に従って調製した0.09M NaClを含むpH7.3における
0.06M Trisバッファー中で5mg/mlに希釈し;4mgの因子Xa
を例２の手順に従って調製し；例１の手順に従って調製
した因子Ｖを含む100mlの塩化バリウム上澄液を添加
し、そしてこの溶液を、最終濃度までもっていき、そし
て例３の手順に従って調製した28nモル/mlのリン脂質、
7mM CaCl2、0.3（wt/wt）％のTri−（ｎ）ブチル・ホス
フェート及び１（wt/wt）％のポリソルベート80を添加
した。この反応混合物を、室温において６時間インキュ
ベートした。インキュベーションの終点において、この
混合物のpHを、6.5に調整し、固体PEGの添加により、５
（wt/wt）％PEGの最終濃度までもっていき、そして室温
において30分間混合し、そのPEGを溶解させた。この混
合物を、次に、3,000rpmにおいて30分間、遠心分離し、
そのPEG沈殿物を除去した。得られたPEG上澄液を、等容
量の蒸留水で希釈し、そして11のスルファプロピル−セ
ファデックス（6.5のpHにおける0.01Mのクエン酸ナトリ
ウムにより平衡化されているもの）と、１時間４℃にお
いて混合した。この因子II含有スルファプロピル−セフ
ァデックスを、次にカラムに濯ぎ、そして6.5のpHにお
ける0.01Mクエン酸ナトリウムで洗浄した。この因子IIa
を次に6.7のpHにおける0.1Mクエン酸ナトリウムにより
溶出した、1,100単位/mlの比活性を、75％の収率を伴
う、パイロット規模活性化手順により得た。この結果
を、表III中に要約する。
因子II、Ｖ、IX及びＸの精製のための、そして因子Ｘ
の因子Xaへの活性化のための例示的な態様に関する上記
の記載は、説明という目的のためのものである。当業者
には変更は明らかであろうことから、本発明は、先に記
載した特定の態様に限定されることを意図されていな
い。また、開示された本発明は、本明細書中に特に開示
されていない要素のいずれの非存在中においても行われ
ることができる。本発明の範囲を、以下の請求の範囲に
より定める。
の因子Xaへの活性化のための例示的な態様に関する上記
の記載は、説明という目的のためのものである。当業者
には変更は明らかであろうことから、本発明は、先に記
載した特定の態様に限定されることを意図されていな
い。また、開示された本発明は、本明細書中に特に開示
されていない要素のいずれの非存在中においても行われ
ることができる。本発明の範囲を、以下の請求の範囲に
より定める。
フロントページの続き (72)発明者 ノダ ムネヒロ 奈良県天理市田町515 (72)発明者 シタニシ，ケネス ティー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 91607，エヌオー．ハリウッド，シンプ ソン アベニュ 5501 (56)参考文献 特開 平１−294697（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−500673（ＪＰ，Ａ) 米国特許4725673（ＵＳ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，ｖｏｌ．71（1969）ｐ．164 要約 番号1765ｆ
Claims (26)
- 【請求項１】因子II,V及びＸを含む単一の純粋でない蛋
白画分から因子II、因子Ｖ及び因子Ｘのそれぞれを精製
するための方法であって： 上記の純粋でない蛋白画分の水溶液を調製し； この水溶液を第一リガンドと接触させ、これにより、因
子II,V及びＸを、この第一リガンドに結合させ； この第一リガンドから因子II,V及びＸ蛋白画分を回収
し； 塩化バリウムをこの回収した因子II,V及びＸ蛋白画分に
添加し、因子II及びＸを含んで成るバリウム沈殿物を作
り； このバリウム沈殿物の上澄液から因子Ｖを回収し； このバリウム沈殿物を水溶液中で溶解させ、因子II−及
び因子Ｘ−含有溶液を作り； この因子II−及び因子Ｘ−含有溶液を、因子Ｘと結合す
ることができるが因子IIとは弱く結合するか又は全く結
合しない第二リガンドに適用し； 因子Ｘをこの第二リガンドに結合させ； この第二リガンドに結合しないか、又は弱く結合した画
分から因子IIを回収し；そして、 この第二リガンドから因子Ｘを回収する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】第一リガンドがDEAEリガンドである、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】因子II,V及びＸ蛋白画分を0.2M NaClによ
る溶出によりDEAEリガンドから回収する、請求項２に記
載の方法。 - 【請求項４】因子II,V及びＸ蛋白画分を0.01M〜0.22Mの
最終濃度まで塩化バリウムを添加することにより沈殿さ
せる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】第二リガンドが硫酸デキストランである、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】因子Ｘを0.2M NaClによる溶出により第二
リガンドから回収する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】因子IIを含む純粋でない蛋白画分から因子
IIを分離するための方法であって： 上記の純粋でない蛋白画分の水溶液を調製し； この水溶液を第一リガンドと接触させ、これにより、因
子II,V及びＸを、この第一リガンドに結合させ； この第一リガンドから因子II,V及びＸ蛋白画分を回収
し； 塩化バリウムをこの回収した因子II,V及びＸ蛋白画分に
添加し、因子II及びＸを含んで成るバリウム沈殿物を作
り； このバリウム沈殿物を水溶液中で溶解させ、因子II−及
び因子Ｘ−含有溶液を作り； この因子II−及び因子Ｘ−含有溶液を、因子Ｘと結合す
ることができるが因子IIとは弱く結合するか又は全く結
合しない第二リガンドに適用し；そして、 この第二リガンドに結合しないか、又は弱く結合した画
分から因子IIを回収する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項８】第一リガンドがDEAEリガンドである、請求
項７に記載の方法。 - 【請求項９】因子II,V及びＸ蛋白画分を0.2M NaClによ
る溶出によりDEAEリガンドから回収する、請求項８に記
載の方法。 - 【請求項１０】因子II,V及びＸ蛋白画分を0.1M〜0.2Mの
最終濃度まで塩化バリウムを添加することにより沈殿さ
せる、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】第二リガンドが硫酸デキストランであ
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】因子Ｖを含む純粋でない蛋白画分から因
子Ｖを分離するための方法であって： 上記の純粋でない蛋白画分の水溶液を調製し； この水溶液を第一リガンドと接触させ、これにより、因
子II,V及びＸを、この第一リガンドに結合させ； この第一リガンドから因子II,V及びＸ蛋白画分を回収
し； 塩化バリウムをこの回収した因子II,V及びＸ蛋白画分に
添加し、因子II及びＸを含んで成るバリウム沈殿物を作
り；そして、 このバリウム沈殿物の上澄液から因子Ｖを回収する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項１３】第一リガンドがDEAEリガンドである、請
求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】因子II,V及びＸ蛋白画分を0.2M NaClに
よる溶出によりDEAEリガンドから回収する、請求項13に
記載の方法。 - 【請求項１５】因子II,V及びＸ蛋白画分0.1M〜0.2Mの最
終濃度まで塩化バリウムを添加することにより沈殿させ
る、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１６】因子IIを因子IIaに活性化するための方
法であって： 活性化バッファー中で因子II〔ここで、因子IIを、以下
の： 因子II,V及びＸを含んで成る純粋でない蛋白画分の水溶
液を調製し； この水溶液を第一リガンドと接触させ、因子II,V及びＸ
をこの第一リガンドに結合させ； この第一リガンドから因子II,V及びＸ蛋白画分を回収
し； 塩化バリウムをこの回収した因子II,V及びＸ蛋白画分に
添加し因子II及びＸを含んで成るバリウム沈殿物を作
り； このバリウム沈殿物を水溶液中で溶解させ、因子II−及
び因子Ｘ−含有溶液を作り； この因子II−及び因子Ｘ−含有溶液を、因子Ｘと結合す
るが因子IIとは弱く結合するか又は全く結合しない第二
リガンドに適用し；そして、 この因子Ｘ結合第二リガンドに結合しないで残ったか、
又は弱く結合して残った画分から因子IIを回収する、 ことを含んで成る方法により調製する。〕を希釈し、因
子II溶液を提供し； 因子Ｖをこの因子II溶液に添加し、因子II/因子Ｖ溶液
を提供し； 因子Xa〔ここで、因子Xaを： 因子Ｘを上記の因子II調製手順の第二リガンドから回収
し； そして、 この因子Ｘを特異的な蛋白分解性解裂により活性化させ
る、 ことにより調製する。〕を、この因子II/因子Ｖ溶液に
添加し、因子II/因子V/因子Xa溶液を提供し； リン脂質膜及びカルシウム・イオンを、この因子II/因
子V/因子Xa溶液に添加し；そして、 得られた混合物をインキュベートし、因子IIを因子IIa
に活性化させる、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項１７】第一リガンドがDEAEリガンドである、請
求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】因子II,V及びＸ蛋白画分を0.2M NaClに
よる溶出によりDEAEリガンドから回収する、請求項17に
記載の方法。 - 【請求項１９】因子II,V及びＸ蛋白画分を0.1M〜0.2Mの
最終濃度まで塩化バリウムを添加することにより沈殿さ
せる、請求項16に記載の方法。 - 【請求項２０】第二リガンドが硫酸デキストランであ
る、請求項16に記載の方法。 - 【請求項２１】因子Ｘを0.2M NaClによる溶出により第
二リガンドから回収する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項２２】因子Ｘを、カルシウム・イオンの存在
中、ラッセルクサリ蛇毒（Russell's Viper venom）と
共にインキュベーションすることにより活性化させる、
請求項16に記載の方法。 - 【請求項２３】因子Ｖを、因子II調製手順により生じた
バリウム上澄液から回収する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項２４】因子Ｖを、血漿の一部又は低温沈殿させ
た血漿により提供する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項２５】リン脂質の濃度が５〜50nモル/mlであ
る、請求項16に記載の方法。 - 【請求項２６】カルシウム濃度が２〜20mMである、請求
項16に記載の方法。
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