NO167627B

NO167627B - Fremgangsmaate for rensing av faktor viii:c.

Info

Publication number: NO167627B
Application number: NO844837A
Authority: NO
Inventors: Godfrey A Amphlett; Michael E Hrinda
Original assignee: Armour Pharma
Priority date: 1983-12-05
Filing date: 1984-12-04
Publication date: 1991-08-19
Also published as: JPH0535159B2; JPS60136518A; KR850004593A; ATE60996T1; SG14992G; DK162896B; FI844804L; EP0144957B1; EP0144957A3; IE57644B1; AU569129B2; ES8600690A1; DK575184D0; IN162586B; CA1248449A; IE843105L; DK575184A; NO167627C; IL73734A0; ES538912A0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av prokoagulant Faktor VIII:C fra et råmateriale slik som plasma eller cryopresipitat som inneholder anti-hemofil faktor (heretter "AHF").

Det er generelt antatt innen dette område at AHF

i dets naturlige form som erholdt fra plasma består av aggregater av to molekylære enheter som er angitt som Faktor VIII:R og Faktor VTII:C. Faktor VIII:C er biologisk aktiv hva gjelder korrigering av koagulasjonseffekten ved Hemifilia A. Faktor VTII:R, også kjent som Faktor VIII:WF

(von willebrand Faktor) er biologisk aktiv ved korrigering

av koagulasjonsdefekten ved von Willebrand's sykdom, en forstyrrelse ved blodplateaggregering. Det er meget ønske-lig å være i stand til å rense Faktor VIII:C med hensyn til Faktor VIII:R og de andre plasmaproteiner med hvilke Faktor VIII:C normalt finnes, innbefattende i særdeleshet fibronectin og fibrinogen.

Kjente prosesser for rensing av Faktor VIII:C bevirker tap av utbytte og/eller renhet som hittil er blitt tolerert. Ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås høyere renhetsgrader og utbytte uten deaktivering på en måte som ikke er foreslått innen teknikkens stand.

D.E.G. Austen, "The Chromatographic Separation of Factor VIII on Aminohexyl Sepharose<®>', i British Journal of Hematology, 1979, (43) 669-674, beskriver en kromatografisk separasjonsprosess hvori human eller svine Faktor VIII konsentrat føres gjennom en kolonne av 6-amino-n-hexyl-substituert agarose. Kolonnen og alle elueringsløsninger ble holdt ved en pH på 5,5. En høy grad av separasjon av Faktor VIII:C fra Faktor VIII:R, og en høy grad av rensing

av Faktor VTII:C fra andre proteiner, ble oppnådd.

Den totale gjenvinning av humane Faktor VIII:C

var imidlertid bare 35 - 40 %, og for svine Faktor VTII:C

var den bare 24 - 30 %. Forfatterne indikerte at mer sure pH-verdier i bufferne (ned til en pH på ca. 5,2) ville begunstige høyere rensing av Faktor VIII, og de foreslo å velge pH lik 5,5 for å oppnå et så surt miljø som mulig uten å få <6or lave utbytter. Forfatternes lære førte således

bort fra høyere (dvs. mindre sure) pH-verdier.

Ifølge flere mer nylige publikasjoner har man fortsatt å insistere på å opprettholde en sur pH i den kromatografiske kolonne. Morgenthaler, "Chromatography of Antihemophilic Factor on Diaminoalkane- and Aminoalkan-Derivatized Sepharose®, Thromb, Haemostas, 4 7(2) 124-127

(1982), fant at når AHF ble kromatografert på Sepharose CL-3B agarosegel ved pH-verdier på 6,0, 6,5 og 7,0, kunne ingen signifikant separasjon av Faktor VIII:C og VIII:R erhd.ldes. Kromatografi av AHF ved en pH av 5,5 av en meget markert separasjon mellom Faktor VIII:C og VIII:R ble oppnådd. En enda nyligere publikasjon av Faure et al., Note, "Improved buffer for the chromatografic separation of Faktor VIII coagulant", J. Chromatography 257 (1983), 387-2 91, bibeholder pH-verdien på 5,5 som indikert av Austen og Attempts for å forbedre yteevnen ved den kromatografiske prosedyre ved å tilsette forbindelsene til bufferne. I et forsøk på å forbedre de erholdte resultater angitt i den ovenfor angitte publikasjon, fortsatte Austen å operere ved en pH på 5,5 og oppnådde et utbytte av Faktor VIII:C av ca. 40 %, Austen et al., "Factor VIII Fractionation on Aminohexyl Sepharos th Possible Reduction in Hepatitis B Antigen", Thromb. Haemostasis, 48 (1 ), 46-48 (1982). Såvidt man kjenner til er Faktor VIII:C blitt påført en kolonne ved en pH nærmere den nøytrale verdi bare i det tilfeller hvori Faktor VIII:R og et stort antall av andre forurensninger, innbefattende fibronectin og fibro-nogen allerede er blitt separert fra Faktor VIII:C. I US patentskrift 4; 361 509, har Zimmerman et al. anvendt en kolonne som bærer monoklonale antistoffer overfor Faktor VIII:R for å gjenvinne en fortynnet oppløsning av Faktor VIII:C som er blitt ultra-renset for Faktor VIII:R. Løs-ningen av ultrarenset Faktor VIII:C ble konsentrert ved justering av pH til 6,8 med buffer, løsningen ble påført til en kolonne: av aminohexylagarose, og Faktor VIII:C ble deretter eluert fra kolonnen. Dette konsentrasjonstrinn starter fra materiale som er ca. 1000 ganger så rent som utgangsmaterialet, og det antydes således ikke hva resultatet ville ha blitt hvis betydelige mengder av VIII:R var tilstede. Hvis fagmannen som hadde lest dette patentskrift ble presentert med et råmateriale inneholdende både Faktor VIII:C og VIII:R ville han anvende den videre effektive monoklonale antistoff-kolonneseparasjonsteknikk for å fjerne Faktor VIII:R. Læren ifølge US patentskrift 4 361 509 med hensyn til betingelsene for anvendelse av aminohexylagarose-kolonnen står således ikke i motsetning til eller modifi-serer læren ifølge de ovenfor diskuterte artikler. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppnås den fordelaktige kombinasjon av utbytte for rensing under betingelser som er fullstendig uventet og faktisk er ugun-stig ifølge teknikkens stand. Spesifikt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for rensing av Faktor VIII:C i et høyt utbytte fra et råmateriale inneholdende Faktor VTII:C og VIII:R, kjennetegnet ved at (a) det tilveiebringes en vandig løsning av angitte råmateriale som har en pH mellom 5,5 og 8,0, og en ledningsevne på 25 mS/cm til 35 mS/cm, (b) faktor VIII:C og faktor VIII:R adsorberes fra løsningen på aminohexylagarose som er blitt ekvilibrert til pH-verdien på den vandige løsning,

(c) faktor VIII:R elueres fra aminohexylagarosen

med et element som er i stand til å eluere angitte

faktor VIII:R fra angitte aminohexylagarose, hvorpå

(d) faktor VIII:C elueres fra aminohexylagarosen,

fortrinnsvis med en bufret, vandig løsning inneholdende 1,0 M NaCl, og at en proteolytisk inhibitor eventuelt er til stede i trinn (a), (b), (c) og (d) i små, men effektive mengder for å inhibere proteolyse av faktor VIII:C.

Råmateriale som er egnet for anvendelse ifølge oppfinnelsen innbefatter ethvert materiale inneholdende Faktor VIII:C med Sn eller flere ytterligere plasmaproteiner. Særlige eksempler er materialer som inneholder Faktor VIII, dvs. komplekset av Faktor VIII:C og VIII:R, slik som plasma, kommersielle Faktor Vlll-konsentrater og cryopresipitat erholdt fra plasma, såvel som produktfraksjoner og på annen måte fjernede bifraksjoner fra den velkjente Cohn fraksjo-neringsprosess. Humant kildemateriale såvel som fra kveg og svin kan behandles. Proteiner ved siden av Faktor VIII:R som kan være tilstede innbefatter fibrogen, fibronectin og albumin.

Når cryopresipitat er utgangsmaterialet, må dette rekonstitueres i en vandig buffer på kjent måte innen faget, men under hensyntagen til det nye pH-område og ionestyrken som tas i betraktning i henhold til foreliggende oppfinnelse. Plasma og plasmakonsentrater er allerede i en egnet tilstand for tilførsel til kolonnen bortsett fra at disse også må

ha deres pH og ionestyrke justert hensiktsmessig med vandig buffer.

pH kan justeres ved tilsetning av en vandig løsning av forbindelser som vil buffre pH i den resulterende løsning innen det ønskede område på 6,5 til 7,2, og som ikke ødeleg-ger aktiviteten av Faktor VIII:C. Mange slike løsninger er kjent for fagmannen, og et eksempel er en bufferløsning inneholdende 20 millimol imidazol, 0,1 M lysin og 0,02 % natriumazid (heretter "Buffer A"), som buf f rer pH til ca. 6,8. Et annet eksempel er 10 mM histidin, 0,1M lysin og 0,02 vekt% natriumazid.

Ledningsevnen kan justeres enkelt ved tilsetning av natriumklorid i en tilstrekkelig mengde slik at den totale ledningsevne sammen med de andre tilstedeværende ioner ligger mellom 25 mS/cm og 35 mS/cm (milli-Siemens pr. cm, ekvivalent med 10 _ omhos/cm) . Natriumklorid kan tilset-tes som fast materiale eller som en vandig løsning til buf-ferløsningen eller direkte til Faktor VTII:C kildeløsningen. Hvis ledningsevnen er for høy eller for lav tapes bindings-kapasiteten og hvis den er for lav vil dette også gå ut over renheten på produktet.

Adsorbentmaterialet anvendt i kolonnen er aminohexylagarose. Som kjent innen faget er dette agarose med omega-aminosidekjeder. Det må være tilstrekkelig side-kjeder tilstede for å tillate at den ønskede rensing finner sted. Fortrinnsvis skal det være minst 10 mikromol amino-hexy ls i dek j eder pr. gram agarose, og mest fordelaktig minst 15 mikromol/g. Mengder av adsorbent er angitt i foreliggende beskrivelse og krav som våtvekt, definert som vekten av materiale som er blitt filtrert under sug til et punkt ved hvilket filterkaken sprekker. Tilfredsstillende aminohexylagarose er tilgjengelig kommersielt under varemerket "Aminohexyl Sepharose®1, solgt av Pharmacia Fine Chemicals Company med 12 mikromol aminohexylkjeder pr. gram materiale.

Adsorbenten fremstilles ved ekvilibrering av denne, dvs. vasking av denne i en buffer som gir en pH fra 5,5

til 8,0, fortrinnsvis fra 6,0 til 7,5 og helst fra 6,5 til 7,2. Forholdet mellom kilde (rå)-materialet og adsorbent må ikke overskride adsorbentharpiksens kapasitet, som er en verdi som lett kan bestemmes av fagmannen med kromatografiske separasjoner. Generelt er kapasiteten 5-10 VIII:C enheter pr. gram harpiks når cryopresipitatet anvendes, og flere ganger større når det rensede råmateriale anvendes. Absorpsjonen kan utføres satsvis eller i en kolonne, og i hvert tilfelle under anveridelse av teknikker og utstyr som er vanlig for kromatografiske separasjoner av denne type.

Råmaterialet som separat allerede er blitt justert til samme pH som absorbenten, påføres til absorbenten idet det muliggjøres at tilstrekkelig kontakttid for den ønskede protein-absorbent-interaksjoner kan finne sted. I kolonne-modellen er typiske tilfredsstillende strømningshastigneter 5 kolonnevolumer pr. time, men ikke så høye at kolonnen pakkes eller ødelegges. Materialet som passerer gjennom kolonnen først i dette trinn vil være tømt for Faktor-VIII :C såvel som tømt for Faktor VIII:R hvis faktor VIII:C i råmaterialet var tilstede som kompleks med Faktor VIII:R. Fjer-ning av ikke-adsorbert materiale kan assisteres ved vasking av kolonnen med bufferløsning slik som Buffer A inneholdende 0,3M NaCl.

Etter at mengden av ikke-adsorbert materiale er blitt vasket fra kolonnen (som indikert ved en absorbans ved 280 nm for eluatet på 1 eller mindre), fortsettes vask-ingen under anvendelse av Buffer A inneholdende 0,3M NaCl og 10 mM CaCl2. CaCl2 er kjent innen faget for å stabilisere Faktor VIII:C, men kan ikke anvendes tidligere på grunn av faren for aktivererenl.de klumpningsfaktorer som fører til fibrinklumper på harpiksen og potensiell nedbrytning av Faktor VIII:C. Vasking av harpiksen er effektiv for å fjerne fibronectin, fibrinogen og mengden av forurenset protein.

Hvor Faktor VIII:C er kompieksdannet med Faktor VIII:R er det fordelaktig å eluere kolonnen deretter med et elueringsmiddel som er effektivt til å desorbere meste-parten av Faktor VIII:R som er tilbake på kolonnen og som ikke ble eluert ved vasking. Noe Faktor VIII:C kan også elueres i dette trinn, men dette kompenseres ved det faktum at Faktor VIII:C som ikke elueres i dette trinn, vil bli gjenvunnet i en mer begrenset form og méd et utbytte som fremdeles overgår kjente teknikker med en vesentlig faktor. Faktor VIII:R kan elueres med et elueringsmiddel omfattende den ovenfor angitte Buffer A inneholdende oppløst deri 0,4M NaCl og 10 mM CaCl2. Den eluerte fraksjon oppsamles og representerer en anriket kilde for Faktor VIII:R. Dette elueringstrinn kan utelates hvis meget høye utbytter av Faktor VIII:C ønskes (f.eks. minst 80 % til 90 %) og nærvær av Faktor VIII:R i det eluerte Faktor VIII: C-produkt kan. tolereres.

Faktor VIII:C som er tilbake på absorbenten elueres deretter under betingelser som er effektive til å desorbere Faktor VIII:C uten å nedsette dets biologiske aktivitet. Et tilfredsstillende elueringsmiddel omfatter den ovenfor angitte Buffer A inneholdende oppløst deri 0, 3M til 0, 5M CaCl2, fortrinnsvis 0,5M CaCl2. En annen er Buffer A inneholdende IM NaCl. Den eluerte fraksjon oppsamles og kan ytterligere bearbeides eller anvendes per se som en kilde for Faktor VIII:C for terapeutiske formål.

Når plasma er råmaterialet, utføres prosessen med tilsetning av små men effektive mengder av inhibitorer av proteolytisk nedbrytning, slik som benzamidin, pancreatisk trypsininhibitor, eller hirudin. Ingen slike inhibitorer er nødvendige når kildematerialet er cryopresipitat eller materiale med større Faktor VIII:C renhet.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de etter-følgende eksempler.

Eksempel 1

Dette eksempel sammenligner rensing av antihemo-fil faktor fra humant cryopresipitat ved foreliggende fremgangsmåte og beslektede publiserte prosedyrer. Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur,

a. Rensing ved foreliggende fremgangsmåte

3 g humant cryopresipitat ble resuspendert under anvendelse av en vibroblander i 10 ral Buffer A (2 0 mM imidazol, 0,1M lysin, 0,02 % azid, pH 6,8) inneholdende 0,3M NaCl. Vitamin K avhengige proteaser ble fjernet ved behand-ling med aluminiumhydroxydgel (Rehsorptar", Armour Pharmaceutical Co.). Løsningen ble omrørt med 1/30 volum "Rehsorptar" i 10 minutter, ble sentrifugert ved 10 000 x g

i 5 minutter og readsorbert med samme mengde "Rehsorptar" i 10 minutter. Etter sentrifugering (10 000 x g i 5 minutter) ble løsningen ført gjennom to lag av osteduk. Den resulterende løsning hadde en ledningsevne på 32 mS/cm. 2,5 ml

av denne løsning ble tilført til en 10 ml<1>s kolonne AH-Sepharose^(Pharmacia) (10 x 0,55 cm) ekvilibrert i Buffer A inneholdende 0,3M NaCl ved en strømningshastighet på 12 ml/ time. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbuffer (Buffer A inneholdende 0,3M NaCl) inntil absorbansen ved 280 nm på

eluatet var mindre enn 0,1. Kolonnen ble ytterligere vasket med Buffer A inneholdende 0,3M NaCl og lOmM CaCl2, ble deretter eluert, først med Buffer A inneholdende 0,4 M NaCl og li.0mM'.CaCl2 og deretter med Buffer A inneholdende 0,5M CaCl2.

En oppsamlet mengde av de to fraksjoner inneholdende signifikant Faktor VIII:C-aktivitet vil ha 90 % av den tilførte Faktor VIII:C ved en spesifik aktivitet på

3,9 U/mg for en 16-gangers rensing,

b. Rensing ved fremgangsmåten ifølge Austen

2,5 g humant cryopresipitat ble resuspendert

under anvendelse av en vibroblander i 7,5 ml Buffer B

(0,1M lysin, 0,1M natriumacetat, pH 5,5) og ble adsorbert

to ganger med 'iRehsorptar" som i (a) . pH i løsningen som på dette punkt ble funnet å være 6,5, ble senket til 5,5

ved langsom tilsetning av 10 % eddiksyre under god omrøring. Et tungt, gelatinøst bunnfall ble gjenvunnet ved sentrifugering (10 000 x g i 20 minutter) og ført gjennom to lag av osteduk. 3,5 ml klaret cryopresipitatløsning ble tilført til en 10 ml kolonne av AH-Sepharosé(r-^)(Pharmacia) (10x0,55 cm), ekvilibrert i Buffer B ved en strømningshastighet på

12 ml/time. Kolonnen ble vasket med Buffer B inntil adsor-bansen ved 280 nm for eluatet var mindre enn 0,1, ble deretter eluert med Buffer B inneholdende 0,2M NaCl og til slutt med Buffer B inneholdende IM NaCl.

c. Rensing ved metoden ifølge Faure et al.

3,8 g humant cryopresipitat ble oppløst under anvendelse av en vibroblander i 11 ml Buffer C (1 % sukrose,

1 % humant serumalbumin, 0,1M lysin, 0,1M natriumacetat, pH 5,5) og ble adsorbert to ganger med'Rehsorptar" som i (a). pH i løsningen som var 6,4 ved dette punkt, ble nedsatt til 5,5 ved langsom tilsetning av 10 % eddiksyre med om-røring, og det resulterende tunge bunnfall ble fjernet som beskrevet i (b). 3,5 ml klaret cryopresipitatløsning ble tilsått til en 10 ml's kolonne av AH-Sepharos<e>P (Pharmacia) (10 x 0,55 cm), ekvilibrert i Buffer C, i en strømningshas-tighet på 12 ml/time. Kolonnen ble vasket med Buffer C inntil absorbansen på eluatet var mindre enn 0,1, med Buffer C inneholdende 0,2M NaCl og til slutt med Buffer C inneholdende IM NaCl.

Hverken spesifik aktivitet eller rensingsnivå er meningsfullt i dette eksempel på grunn av den høye konsen-trasjon (10 mg/ml) av albumin tilstedeværende i alle fraksjoner.

Eksempel 2

Dette eksempel demonstrerer fordelingen av andre proteiner av interesse - fibronectin, von Willibrand's faktor (Faktor VIII:R) og fibrinogen - på rensing av Factor VTII:C fra human cryopresipitat ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Renseprosedyren var som beskrevet i Eksempel 1 (a). Utbyttene i hver fraksjon vist i det etterfølgende er ut-trykt som en prosent av mengden av det protein som ble tilført kolonnen.

Eksempel 3

Dette eksempel sammenligner fibronectine og fibrinogeninnholdende i Faktor VIII:C renset fra human cryopresipitat ved foreliggende fremgangsmåte med et kommersielt høyrenset Faktor VIII:C (Faktorate^ Generation IIB, Armour Pharmaceutical).

Renseprosedyren var som beskrevet i eksempel 1 (a) .

Eksempel 4

Dette eksempel demonstrerer anvendelsen av foreliggende fremgangsmåte for å rense Faktor VIII:C fra human plasma. Det illustrerer også effektiviteten av proteolytiske inhibitorer, spesielt thrombin inhibitorer slik som hirudin, for å forbedre utbyttet av Faktor VIII:C i denne rensing.

Fast natriumklorid ble tilsatt til humant plasma for å heve dets ledningsevne til 30 - 35 mS/cm. I et for-søk ble kolonnen kjørt uten anvendelse av inhibitorer.

I et annet forsøk ble 0,5M benzaraid og pancreatintrypsin inhibitor (Trasylo <i>®, 1 mg/ml) tilsatt til sluttkonsentrasjoner på ImM og 0,01 mg/ml. I et tredje forsøk ble hirudin (Calbiochem Co., 25 U/ml) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 enhet/ml. 5 ml plasma ble til-ført til en 4 ml<1>s (4 x 0,55 cm) kolonne av AH-Sepharose^

(Pharmacia) ekvilibrert i Buffer A (20 mM imidazol, 0,1M lysin, 0,02 % azid, pH 6,8) inneholdende 0,3M NaCl ved en strømningshastighet på 12 ml/time. Hvis proteolytiske inhi-titorer var blitt tilsatt til plasmaet ble de også tilsatt til kolonnens buffere. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbuffer (eksempel 1) inntil absorbansen ved 280 nm på eluatet var mindre enn 0,02, og ble deretter eluert med 0,5M CaCl2 i Buffer A.

Det fremgår at selv uten, inhibitorer renser fore-

liggende fremgangsmåte effektivt Faktor VIII:C med en faktor godt over 10:1, dvs. 20:1, 25:1, 30:1 eller bedre, avhengig av den bestemte fraksjon som oppsamles. Med inhibitorer er rensefaktoren enda høyere og kan overskride 40:1. Ved enhver gitt grad av rensing er utbyttet, dvs. mengden av Faktor VTII:C tilført til prosessen som gjenvinnes som renset pro-

dukt høyere enn hva som kan oppnås under anvendelse av kjente prosesser med samme rensegrad. Utbytter på over 30 % kan oppnås selv uten inhibitorer, og utbytter over 50 %

og så meget som 70 - 90 % kan oppnås med inhibitorer. Denne kombinasjon av rensing og utbytte er meget fordelaktig og uven te t.

Claims

1. Fremgangsmåte for rensing av faktor VIII:C fra råmateriale omfattende plasma, et plasmakonsentrat eller et cryopresipitat som inneholder AHF, inneholdende faktor VIII:C

og faktor VIII:R,karakterisert ved at (a) det tilveiebringes en vandig løsning av angitte råmateriale som har en pH mellom 5,5 og 8,0, og en ledningsevne på 25 mS/cm til 35 mS/cm, (b) faktor VIII:C og faktor VIII:R adsorberes fra løsningen på aminohexylagarose som er blitt ekvilibrert til pH-verdien på den vandige løsning, (c) faktor VIII:R elueres fra aminohexylagarosen med et element som er i stand til å eluere angitte faktor VIII:R fra angitte aminohexylagarose, hvorpå (d) faktor VIII:C elueres fra aminohexylagarosen, fortrinnsvis med en bufret, vandig løsning inneholdende 1,0 M NaCl, og at en proteolytisk inhibitor eventuelt er til stede i trinn (a), (b), (c) og (d) i små, men effektive mengder for å inhibere proteolyse av faktor VIII:C.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et råmateriale med pH 6,0 til 7,5.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes et råmateriale med pH 6,5 til 7,2.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at det anvendes aminohexylagarose som inneholder minst 10 mikromol aminohexylkjeder pr. gram.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at det anvendes råmateriale som også inneholder fibronectin og/eller fibrinogen og at fibronectinet koelueres med faktor VIII:R.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-5, karakterisert ved at faktor VIII:C elueres med en vandig bufret løsning inneholdende 0,3 til 0,5 M'CaCl2.