KR0168415B1 - 전체혈장으로 혈액응고 viii 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전체(비-한랭침전) 혈장으로부터 높은 특이활성도가 있는 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이 방법은 염화바륨과 수산화 알루미늄을 이용하는 2중 처리에 의한 예비-정제도 포함한다.

또한 이 방법은 DEAE-프렉토겔 종류의 음이온 교환 수지상에서의 크로마토그래피 처리에 따른 정제도 포함한다.

이 방법은 용매-세척제로 처리하는 바이러스 비활성 단계도 포함한다.

이 방법으로 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 항트롬빈 Ⅲ, 피브로넥틴과 또한 동일혈장에서 나온 프로트롬빈 복합물을 희수할 수 있다.

Description

전체혈장으로 혈액응고 Ⅷ인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법

본 발명은 전체 혈장으로부터 그 특이활성도(specific activity)Ⅷ의 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법에 관계한다.

Ⅷ인자를 주사하여 A 혈우병을 치료하는 것은 공지 사실이며 고순도의 조제물을 사용하여 한편으로는 바이러스 오염의 위험을 줄이고 다른 한편으로는 반복주사로 인하여 환자에게 위험한 면역반응을 일으킬 수 있는 다른 잔유 오염물질도 감소시킨다.

이미 여러 가지 방법을 사용하여 인체혈장을 처리해서 Ⅷ 인자를 정제하고 있다. 그중에는 각종 화학제를 이용한 오염 단백질 침전법, 면역친화력 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피와 그외 이러한 방법의 다양한 복합적 방법이 있다.

단지 소량의 Ⅷ 인자가 혈장속에 들어있으므로, 정제 방법의 수득률이 문제가 된다. 더욱이, Ⅷ 인자는 불안정한 단백질이어서 다른 혈액인자에 의해 활성화될 수 도 있다; 그러나, 활성화 상태에서는 치료적인 가치가 없다; 따라서 정제법과 최종분량이 이 문제에 연루된다.

출원인은 이미 프랑스 특허출원 제 88 07530 호에서 설명한 것처럼 고순도 Ⅷ 인자 농축물을 수득할 수 있는 이온교환 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 개발하였다.

그러나, 이 방법은 생산자가 이용하였을 때 사용한 출발 물질이 혈장의 한랭침전 성분이고 이 한랭침전단계에서 30 내지 40% Ⅷ 인자가 손실되고 이것은 상청액에 남는다.

따라서 비-한랭침전 혈장으로 제조하는 방법을 개발하여 Ⅷ 인자 손실을 제한하는 것이 유리하다. 더욱이, 이 방법은 한랭침전하기 어려운 부적절한 생산센터에 유리한 단순성이 있다.

따라서 고순도 안정성 농축물을 아주 우수한 수득률로 얻기 위해 전체 혈장으로 Ⅷ 인자를 정제하는 단순방법을 개발하는 것이 목적이다.

본 발명은 전체 혈장으로부터 Ⅷ 인자 농축물을 제조하는 방법에 관계한다. 이 방법은 예비-정제로 프로트롬빈 복합물의 성분들(Ⅱ인자, Ⅶ인자, Ⅸ인자, Ⅹ인자)을 제거하고 또한 겔과 용리물 완충액을 선택한 음이온 교환 크로마토그래피 정제에 따라 고순도의 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 수득하는 것을 포함한다.

이 방법은 또한 또다른 정제단계 후, 피브로넥틴, 알부민, 면역글로부린과 향트롬빈Ⅲ 같은 다른 혈장 단백질의 정제용액을 얻는데 사용할 수 있다.

이 방법은 인체 혈장을 사용하여 실행하였으나 동물 공급원의 혈장으로 응용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 따라서 출발물질로서 전체혈장 즉, 신선한 혹은 보존하기 위해 냉동한 혈장을 사용하면 한랭침전된 것은 사용하지 않는다. 항응고제나 안정화 용액이 있는 곳에서 이 혈장을 수거하는 것이 좋다. 종래적으로, 시트르산염-덱스트로오스-인산염 혼합물을 사용한다; Ⅷ 인자의 특이 안정화제를 여기에 첨가하거나 이것으로 치환하는 것이 유리하다.

0.2 내지 2U/ml 의 헤파린, 1 내지 5mM의 EDTA와 1 내지 10mM의 CaCl₂또한 필요한 경우 5 내지 60g/l 농도의 글루코오스를 더한 혼합물을 혈장출발 물질을 위한 안정화 용액으로 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법은 염화바륨으로 침전하고 또한 수산화 알루미늄겔상에 흡착하는 것으로된 1차 예비-정제 단계를 포함한다.

혈장에 대한 염화바륨 처리는 최종농도가 0.08M로 될 때까지 1M 염화바륨용액을 첨가하여 교반하면서 pH 6.5로 조절하고 그후 다시 5℃ 내지 10℃에서 원심분리 하여 침전된 단백질을 제거하고 상청액을 수득한다. 침전 단백질을 수득하여 프로트롬빈 복합물이나 그 성분을 생산한다.

상청액을 pH 6.5의 3% 수산화 알루미늄겔과 접촉시켜서 잔존하는 오염 단백질을 흡착시킨다; 그후 0.5 내지 2U/ml의 헤파린을 첨가하는 후속 크로마토그래피 단계에 필요한 충전 완충액 존재하에서 한외여과 하거나 또는 동일 완충액에 있는 세파덱스 G25 상의 크로마토그래피로 상청액에 대해 탈염화한다.

본 발명의 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 분리하는 것도 포함한다. 출원인은 또한 이미 프랑스특허출원 제 88 07530호에서 저 이농 교환력과 공동의 크기가 큰 수지 종류의 장점을 발표하였고 특히 공동의 크기가 크면 매우 큰분자도 보유할 수가 있다. 이 보유력 신장에 따라 수지와 결합한 다소 소수성인 연결부가 생기고 또한 완충액의 이온강도를 선택하여 고착된 분자의 선별적인 탈착(desorption)이 가능하게 한다.

이러한 수지종류는 일반적으로 프렉토겔이라는 명칭으로 시판하고 있다. DEAE-프렉토겔 650(R)과 T-또는 D-MAE-프렉토겔(Merck)도 역시 사용할 수 있다. 이와 동일한 수지를 현재 공급자가 섬모형 수지로 시판하고 있다. 이 메트릭스구조를 변형하여 겔의 용량 증가에 유리한 양전하 고정 표면적을 증가시킨다.

크로마토그래피 칼럼의 충전완충액은 pH 7로 조정한 시트르산 나트륨 및 염화나트륨 기초 완충액에서 여기에 0.5 내지 6mM 농도의 염화칼슘, 2 내지 4g/l 농도의 리신, 또한 8 내지 11g/l 농도의 글리신이 함유되어 있으면 바람직하다.

본 발명에 따른 정제방법의 실행에 있어서, 크로마토그래피 칼럼상에 앞서 말한 예비-정제물을 주입한다. 정해진 조건하에서(0.11M NaCl), 칼럼에 반 빌레브란트인자-Ⅷ 인자 복합물 같은 크기가 큰 분자를 채우고 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 향트롬빈 Ⅲ와 피브로넥틴을 여과물에 흘려보낸다.

본 발명의 바람직한 구체예는 최적의 Ⅷ인자 회수 효율을 얻는 것이 목적이며, 크로마토그래피 칼럼의 용리 작용을 위한 완충액의 이온 농도는 염화나트륨에 대해서 0.27M로 증가한다. 본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 이 용리단계는 이온농도를 염화나트륨에서 0.13M로 증가시키든 예비-세정 작업에 따라 실행되고 피브로넥틴이 제거된다.

이 조건에서 탈착 및 용리된 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물은 최소한 5 내지 10U/mg의 특이 활성도를 갖는다. 이 공정에서의 전체 수득량은 초기혈장의 350U/리터 이며 앞서 말한 안정화 혼합물을 초기혈장에 더할 경우 최소한 500U/리터이다.

용도에 따라 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물의 용액을 정제단계에 또한 특히 또다른 크로마토그래피법에 의한 원심분리단계에 이용할 수 있다. 기존의 것과 마찬가지로, DEAE-나 T/D-MAE-프렉토겔 또는 다른 수지를 사용하여 실행할 수도 있다; 황산 덱스트란, 부동화된 아미노-헥실, 부동화된 헤파린 또한 설포프로필 수지와 친화성이나 면역 친화성 수지 같은 다른 지지물도 사용한다.

이 부가적인 크로마토그래피 단계를 기존의 것과 유사한 염기성 완충액으로 실행한다. 본 발명의 한 바람직한 구체예는 가능한한 농축된 Ⅷ 인자를 수득하는 것이 목적이며 처음과 동일한 조건에서 부가적인 크로마토그래피를 실행한다. 즉 이것은 완충액의 이온농도를 0.27M NaCl로 증가시켜 이루어지는 단일 탈착단계를 뜻한다. 본 발명의 또다른 구체예에 있어서, 먼저 완충액의 이온농도를 0.13M까지 증가시켜서 잔존하는 오염단백질을 제거하고, 2차로 0.27M까지 증가시켜서 고순도의 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합농축물을 회수하며 이것의 특이 활성도를 최소한 10 내지 20U/mg이 된다.

칼럼의 1차 여백에 있는 다른 단백질은 면역글로부린, 알부민, 향트롬빈 Ⅲ, 피브리노겐과 피브로넥틴이며 이것 역시 종래의 크로마토그래피법으로 정제 및 농축할 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 공지기술에 따른 바이러스 비활성화 처리법도 포함한다. 화학제를 사용하는 경우 예컨대 용매-세척제로 처리할 때 어떤 크로마토그래피 단계에 앞서서 이러한 처리를 하면 크로마토그래피 단계에서 비활성 작용제를 제거할 수가 있다.

Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물과 또한 상기의 방법으로 얻은 다른 혈장 단백질도 본 발명의 대상이 된다.

이 농축물을 약전의 표준방법에 따라 만들고 치료학적 목적에 사용할 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 두가지의 구체예를 보여주는 것이다.

[실시예 1]

항응고제/안정화제(예컨대 시트르산-덱스트로스-인산염)가 있는 곳에서 수거하고 또한 아세트산으로 pH 6.5로 조절한 250ml의 신선한 혈장 또는 22-25℃로 해빙한 냉동혈장을 사용한다.

a) 예비-정제

최종농도가 0.08M로 될 때까지 연동펌프로 pH 6.5의 1M 염화바륨을 20ml 첨가한다. 1분당 4 내지 8ml 속도로 염화바륨을 첨가하고 그후 실온에서 15분간 이 혼합물을 교반한다.

혼합물을 8℃에서 20분간 2,700r.p.m으로 원심분리한 후 상청액을 회수한다.

상청액을 수산화알루미늄 겔상에(Alhydrogel Eurobio with 3% Al(OH)₃) 2.3g/l의 혈장비율로 흡착시킨다. pH를 6.5로 조절하고 온도는 저온 유지장치에서 5℃로 저하시킨다. 혼합물을 5℃에서 2,700r.p.m으로 20분간 원심분리하고 상청액을 회수한 후 5℃로 유지한다.

처리결과 공지방법으로 수득하여 정제할 수 있는 프로트롬빈 복합체(Ⅱ, Ⅶ, Ⅸ, Ⅹ인자)의 성분을 제거할 수 있다.

특히, 이 두가지 처리를 함께 실행하면 만족할 수 있는 결과가 나오며 Alhydrogel 처리만 할 경우 프로트롬빈과 PPSB의 다른 성분들을 완전히 제거할 수 없고 염화바륨 처리와 함께 실행하면 다소의 Ⅹ인자, 프로트롬빈 또한 무엇보다도 Ⅶ 인자를 담겨둘 수 있다.

따라서, 수거한 상청액을 1U/ml 헤파린이 첨가된 후속 크로마토그래피 단계의 완충액 존재하에서 실행하는 한외여과나 또는 동일한 완충액속에 있는 세파덱스 G25상에서의 크로마토그래피법으로 탈염처리한다. 용매-세척제를 이용하는 종래의 바이러스 비활성 처리를 24℃ 에서 6시간동안 실행한다(이 처리법은 유럽특허출원 제 0 131 740호에서 설명하였다).

b) 크로마토그래피 정제

예비-정제 투석된 상청액을 크로마토그래피 정제단계에 사용한다. K26/30 칼럼(Pharmacia-Uppsala Sweden)은 2.6㎝ 직경과 또한 30㎝ 높이로 된 것을 사용하고 2중 10㎝는 DEAE-프렉토겔-TSK 650(R) 수지로 충전한다(Merck).

칼럼 충전 및 시료용해 완충액의 조성은 다음과 같다; 시트르산 나트륨, 10mM; 염화칼슘, 1mM; 글리신, 9g/l; 리신, 3g/l.

이 완충액에 염화나트륨을 첨가하고 최종농도를 0.11M으로 또한 pH7로 조절한다.

시료를 100ml/h의 속도로 칼럼에 주입한다. 칼럼을 충전 완충액으로 세척하여 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 항트롬빈 Ⅲ과 피브로넥틴 또한 바이러스 비활성 작용제가 들어있는 무-흡착 단백질을 제거한다.

그후 완충액 이온농도를 염화나트륨에 대해 0.27M로 증가시켜 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 탈착시킨다.

이 방법으로 수득한 Ⅷ 인자용액의 특이활성도는 5 내지 10IU/mg 이고 칼럼상에 주입된 혈장에 관계하여 정제효율은 60 내지 80%이다.

두가지 인자 즉, Ⅷ 인자와 반 빌레브란트 인자의 농도에 있어서 1U/1U에 근접한 비율을 관측할 수 있으며 후자는 리스토세틴(ristocetin) 공동인자 단위로 표시한다.

이 Ⅷ 인자용액의 순도는 생성물을 농축할 수 있는 또다른 크로마토그래피 분리단계에서 다소 향상시킬 수 있다. 예컨대, 상기와 동일한 충전조건에서 DEAE-프렉토겔 2차 칼럼을 사용하고 한편 잔존하는 오염단백질을 제거하기 위해 0.13M NaCl로 예비-세척한다. 완충액의 이온농도를 염화나트륨에 대해 0.27M 까지 증가시켜서 고순도의 농축 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 탈착 및 용리한다.

2차 크로마토그래피 농축 단계를 한외여과 단계로 변경할 수 있다.

본 발명의 통상적인 구체예에 있어서, 크로마토그래피에 의한 1차 정제단계를 DEAE-프렉토겔 수지상에서 실행한다. 그러나 DEAE-프렉토겔과 동등한 특성의 TMAE-프렉토겔(TMAE=트리-메틸-아미노-에틸)이나 DMAE-프렉토겔(DMAE=Di-MAE) 같은 Merck사 시판의 새로운 수지를 사용해도 매우 우수한 결과를 수득할 수 있다. Merck사가 개발한 새로운섬모형(tentacular) 수지를 사용할 수 있다(W. Muller Conference on Liquid Chromatography, June 1989, in Stockholm).

[실시예 2]

본 발명의 또다른 구체예에서는 피브리노겐과 피브로넥틴 농축물을 제조하고 동시에 더 낮은 수득률과 다소 향상된 특이 활성도의 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 농축물을 제공한다.

이 처리법은 DEAE-프렉토겔 1차 칼럼에서 Ⅶ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물이 용리할 때까지 실시예1과 동일한 방법을 사용한다.

칼럼에는 피브리노겐, 향트롬빈 Ⅲ, 알부민과 또한 면역 글루부린 등이 남아있지 않고 여액에서 회수할 수 있다.

Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물은 DEAE-프렉토겔 칼럼상의 2차 크로마토그래피 분리단계에서 정제 및 농축할 수 있으며, 이때 염화나트륨에 대해 이온농도가 0.17M인 충전 완충액을 사용하고 그 결과 잔존하는 오염 단백질을 고착시키지 않게된다. 이온농도를 0.27M로 증가시키면 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 탈착 및 용리할 수 있다. 특이 활성도는 10 내지 20IU/mg이다.

공지된 크로마토그래피 처리법을 사용하여 피브리노겐과 피브로넥틴을 정제할 수 있고 그 결과로 프랑스 특허출원 제 88 07530호에서 설명한 것처럼 치료학적 사용에 적절한 용액이 나온다.

다른 혈장 단백질을 기존의 분류처리법으로 정제 및 농축할 수 있다.

[실시예 3]

25℃로 해동한 초기혈장에 다음과 같은 혼합물을 첨가해서 안정화하면 정제효율이 더 향상된다:

헤파린 : 1U/ml

EDTA : 2mM 또는 0.74g/l

염화칼슘 : 6mM 또는 0.67g/l

이 혼합물에서 5 내지 60g/l 농도의 글루코오스를 첨가한다. 아세트산을 첨가하여 pH 6.5로 낮춘다. 실시예 1이나 2와 같은 정제단계를 실행한다.

이 조건하에서, 정제 처리법의 총 수득량은 초기혈장 1리터당 500U FⅧ:C 이상이다.

이것은 단백질 1mg당 10 내지 30단위의 FⅧ:C 특이활성도에 대해 Ⅷ 인자의 활성도에서 55 내지 65%의 총 회수율에 상응한다.

Claims (16)

1. Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법에 있어서, 신선한 또는 냉동된 전체 혈장을 염화바륨과 수산화 알루미늄으로 2중 처리하여 예비-정제하고, 분자량이 1,000,000달톤이상인 분자를 보존할 수 있는 음이온 교환 겔을 이용한 크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 하는 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 5 내지 60g/ℓ 농도의 글루코오스, 0.2 내지 2U/㎖ 헤파린, 1 내지 5mM의 ETDA, 1 내지 10mM의 CaCl로 구성된 혈장의 변성과 응집을 방지하는 혼합물을 혈장에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 예비 정제는 a) 염화바륨으로 침전시킨 후 상청액을 원심 분리하여 수득하고; b) 수산화 알루미늄 겔에 흡착시킨 후 상청액을 원심 분리하여 수득하고; c) 탈염처리하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, a) 단계에서는 pH 6.5의 1M 염화바륨 용액을 교반하면서 첨가하여, 염화바륨을 이용해 침전시키고 그후 5℃ 내지 10℃로 원심 분리하여 상청액을 수득하고, b) 단계에서는 pH 6.5의 3% 수산화 알루미늄 겔을 사용하여 흡착하고 그 후 5℃로 액화 기체로 급속 냉각하고, 원심 분리하여 상청액을 수득하고, c) 단계에서는 헤파린이 첨가된 충전 완충액 존재하에서 한외 여과하여 탈염처리한 후 다음 크로마토그래피 단계에 사용하거나, 헤파린이 첨가된 충전 완충액속에 있는 세파덱스 G25 칼럼을 이용한 크로마토그래피로 탈염처리한 후 후속 크로마토그래피 단계에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 예비-정제된 혈장의 상청액을 음이온 교환겔을 포함하는 크로마토그래피 칼럼에 넣고, 이때 크로마토그래피 칼럼은 분자량이 1,000,000달톤이상인 분자는 차단하지 못하고, 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 항트롬빈 Ⅲ과 피브로넥틴은 여과물에 포함되도록 여과물로 용출시키고, 크로마토그래피 겔이 DEAE나 T-또는 D-MAE 종류가 고착된 비닐 고분자 겔인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 고분자 겔이 프렉토겔인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 크로마토그래피 칼럼충전 완충액은 글리신 8 내지-11g/ℓ, 리신 2 내지-4g/ℓ 포함된 구연산나트륨 및 염화칼슘계 완충액이고 여기에 0.11M 염화나트륨을 첨가하고 pH 7로 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 완충액의 염화나트륨 이온 농도를 0.27M로 증강시켜, Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 크로마토그래피 칼럼에서 탈착시키는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제5항에 있어서, 완충액의 염화나트륨 이온 농도를 0.13M 염화나트륨으로 증가시켜 피브로넥틴을 제거하고, 다시 0.27M로 증가시켜 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 크로마토그래피 칼럼에서 탈착하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 크로마토그래피 칼럼에서 탈착된 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 크로마토그래피를 이용한 추가 정제 및 농축 단계를 실시하고 이때 추가 크로마토그래피 처리를 DEAE-또는 T/D-MAE-프랙토겔, 고정된 아미노-헥실, 고정된 헤파린, 황산 텍스트란, 설포프로필 또는 친화성 또는 면역친화성 수지 중에서 선택한 이온 교환 수지를 이용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 0.11M 염화나트륨으로 적정한 완충액으로 크로마토그래피 처리하고, 염화나트륨 이온 농도는 연속하여 0.13M, 0.27M 으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 0.17M 염화나트륨으로 적정한 완충액으로 크로마토그래피 처리하고, 염화나트륨 이온 농도는 0.27M로 1회 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 단백질이 제5항에 따른 크로마토그래피 여과물에 들어있고, 이 여과물은 추가 정제 및 농축시키는 단계로 보내는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 크로마토그래피하기 전에 실시하는 바이러스 비활성화단계는 용매-세척제를 사용하여 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항에 따르는 방법으로 수득하는 것을 특징으로 하는 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물.
16. 제1항에 따르는 방법으로 수득하는 것을 특징으로 하는 혈장에서 유도된 단백질 농축물.