ITFI20110084A1 - Nuovo processo per la preparazione di un concentrato di fv virus inattivato a partire da plasma umano, scalabile a livello industriale. - Google Patents
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Description
TITOLO
Nuovo processo per la preparazione di un concentrato di FV virus inattivato a partire da plasma umano, scalabile a livello industriale.
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo degli emoderivati, in particolare alla purificazione del FV umano. In particolare si riferisce all’ottenimento di un concentrato di FV adatto al trattamento di patologie legate alla carenza/alterazione di tale proteina.
STATO DELL’ARTE
Il Fattore V svolge un ruolo essenziale nella cascata della coagulazione. In seguito alla sua attivazione da parte della trombina e del FXa, agisce come cofattore dello stesso FXa nel complesso protrombinasico, determinando un importante incremento nella velocità di generazione della trombina. L’attività del FVa à ̈ poi down-regolata mediante l’idrolisi da parte della APC. Oltre a questa funzione pro-coagulante il FV agisce anche come anticoagulante: l’idrolisi della catena singola del FV da parte della APC converte il FV in una molecola che opera come cofattore della stessa APC nell’inattivazione del FVIIIa.
Circa l’80% del FV circola nel plasma in una concentrazione di 7-10 Î1⁄4g/ml; il rimanente 20% à ̈ accumulato negli α-granuli piastrinici. Il FV plasmatico viene sintetizzato dagli epatociti come pro-cofattore a catena singola dal PM di 330 KDa; la frazione piastrinica, parzialmente proteolizzata ed associata alla multimerina, viene in parte sintetizzata nei megarociti ed in parte assorbita dal plasma per endocitosi. Strutturalmente la catena singola del FV à ̈ organizzata in domini strutturali A1-A2-B-C1-C2; la rimozione proteolitica del dominio B genera il FVa, che risulta composto da due catene associate mediante legami non covalenti e stabilizzate da ioni Ca<++>. In particolare l’idrolisi da parte del FXa e della trombina a livello dei residui amminoacidici Arg709, Arg1018 e Arg1545, determina il rilascio del FVa costituito da una catena pesante, dal PM di 105 KDa, e da una catena leggera dal PM di 74-71 KDa. La down-regulation del FVa da parte della APC si realizza poi attraverso la proteolisi dei residui Arg506, Arg306 e Arg679; un meccanismo alternativo di inattivazione del FV mediato dalla trombina, si realizza mediante l’idrolisi all’Arg643 in presenza di cellule endoteliali. L’idrolisi della catena singola del FV da parte della APC a livello dell’Arg506 converte il FV in una molecola con attività anticoagulante. In letteratura sono descritte forme di FV-APC resistenti, quali FV-Leiden, FV-Cambridge e FV-Hong Kong, che, determinando un prolungamento dell’attività del FVa, si associano al manifestarsi di fenomeni trombotici. E’ inoltre nota un’altra forma di disordine coagulativo, attribuibile alla carenza di FV e caratterizzata quindi da episodi emorragici. Più precisamente nella Paraemofilia, patologia estremamente rara con incidenza di 1 caso su 1.000.000, classificabile tra i Disordini Coagulativi Ereditari Recessivi (RICD), si osserva una carenza congenita, qualitativa (Tipo II) o quantitativa (Tipo I) di FV, trasmessa con modalità autosomica recessiva. E’ altresì possibile una carenza acquisita di FV conseguente allo sviluppo di inibitori, generalmente scatenato dall’uso topico di trombina bovina, da patologie reumatiche o da trattamenti antibiotici. Poiché una quota del FV circolante à ̈ contenuto all’interno degli α-granuli delle piastrine, un abbassamento della sua concentrazione può verificarsi anche in caso di alterazione di quest’ultime. Le manifestazioni cliniche della deficienza di FV, ascrivibili alla funzione pro-coagulante di questa proteina, variano in entità e frequenza, e sono principalmente rappresentate da sanguinamenti cutanei e muco cutanei, ma anche da emorragie muscolari, emartri, sanguinamenti genitourinari, gastrointestinali e nel SNC. Un’altra patologia correlata à ̈ la carenza congenita associata di Fattore V e Fattore VIII, anch’essa malattia emorragica molto rara, in cui si ha un concomitante abbassamento della concentrazione di entrambi i fattori, generalmente compresa tra il 5% e il 20% dei normali livelli plasmatici. In questo caso la causa principale della patologia à ̈ rappresentata da un difetto di un singolo gene che causa alterato trasporto dei due fattori dalle cellule epatiche nel flusso sanguigno. La sintomatologia emorragica à ̈ simile a quella riscontrata nella carenza di FV, ma con una frequenza maggiore di emartri (50% dei casi).
La rarità delle patologie associate alla deficienza di FV si riflette in un lento progresso della terapia. La terapia sostitutiva per i pazienti affetti da paraemofilia e carenza combinata di Fattore V e Fattore VIII può infatti attualmente basarsi solo sull’utilizzo di Fresh Frozen Plasma (FFP). L’impiego di FFP, non rappresenta però un trattamento ottimale, soprattutto a causa degli effetti collaterali che ne derivano, tra cui i principali sono l’aumento del volume plasmatico, che richiede un monitoraggio attento ed una eventuale somministrazione di diuretici, e il rischio di trasmissione virale.
Possibili alternative sono l’utilizzo di agenti antifibrinolitici, che risultano efficaci solo nel trattamento di emorragie minori, o la somministrazione di rFVIIa e FEIBA, che non costituiscono però un trattamento specifico e possono talvolta generare un rischio trombotico.
La disponibilità di un concentrato di FV, con un buon grado di purezza e viralmente sicuro, potrebbe quindi offrire una alternativa terapeutica più efficace e mirata nel trattamento delle carenze di FV.
A causa dello scarso interesse nello sviluppo di prodotti purificati contenenti FV, non esistono allo stato attuale processi di purificazione consistenti in un numero limitato di step, che permettano di ottenere buone rese di FV, adatti alla produzione su scala industriale di tale proteina.
Nel tradizionale frazionamento del plasma non sono presenti step nei quali si abbia un arricchimento in FV, per cui sono stati messi a punto numerosi processi di purificazione che nella maggior parte dei casi permettono di ottenere FV da plasma o surnatante senza crio. I metodi di purificazione del FV descritti in letteratura prevedono quasi sempre l’impiego di numerosi passaggi, molti dei quali sono costituiti da precipitazioni con eccipienti spesso difficilmente eliminabili dal prodotto finale, e/o l’utilizzo di mezzi cromatografici costosi e non facilmente disponibili come quelli utilizzati nell’immunoaffinità .
I primi tentativi di purificazione del FV descritti in letteratura prevedono l’impiego delle metodiche classiche di precipitazione con idrossido di alluminio e cloruro di bario. Quasi tutti i lavori prevedono l’impiego di PEG, spesso in combinazione con altri step di precipitazione. Tali precipitazioni, che possono causare denaturazione ed inattivazione di proteine labili come il FV, sono state prevalentemente impiegate allo scopo di separare il FV da proteine del complesso protrombinico quali FII, FVII, FIX e FX. La precipitazione con idrossido di alluminio à ̈ descritta anche in alcuni brevetti: in JP56049394(A) la frazione II derivante dal frazionamento di Cohn viene incubata con un monosaccaride ed in seguito precipitata con tale ossido, in modo da separare il FV dai fattori della coagulazione che potrebbero innescare la cascata coagulativa. Anche il brevetto CA1293214(C)-1991 descrive un processo di purificazione del FV, a partire da plasma umano o surnatante senza crio, che prevede come primo step la precipitazione con idrossido di alluminio, seguita poi da incubazione con la resina DEAE Sephadex A50, e successiva precipitazione con solfato di ammonio.
In alternativa infatti, o in associazione alle tecniche di precipitazione, sono stati impiegati step di purificazione per cromatografia con diverse tecniche, tra cui: interazione per adsorbimento su idrossiapatite, gel permeation, affinità , interazione idrofobica, immunoaffinità .
Lo step di purificazione cromatografico più frequentemente inserito à ̈ comunque lo scambio ionico, in particolare anionico, mediante utilizzo di supporti coniugati con gruppi funzionali cationici deboli o forti.
Come scambiatori anionici forti sono riportati supporti con gruppi ammonici quaternari, su matrice di cellulosa o di agarosio. Gli scambiatori anionici deboli prevalentemente utilizzati presentano gruppi funzionali DEAE, su matrice di cellulosa, di agarosio o di destrano. Nei processi riportati nei brevetti che descrivono la purificazione del FV viene spesso utilizzato come scambiatore anionico il supporto DEAE Sephadex A50 in modalità di legame.
Nel brevetto US 5,219,995 il primo step di purificazione prevede l’incubazione del plasma o del surnatante senza crio con tale mezzo cromatografico con tampone fosfato 0.03 M e citrato 0.03M, e successiva eluizione del FV insieme ai fattori II, IX e X con tampone fosfato 0,03M e citrato 0,03M, contenente sodio cloruro 0,2M. Al fine di separare il FV dai suddetti fattori viene quindi effettuato un successivo step di precipitazione con cloruro di bario. Il FV, recuperato nel surnatante, viene quindi parzialmente purificato, anche se l’attività specifica risultante, valutata con dosaggio spettrofotometrico, risulta essere molto bassa (A.S. FV: 0,027 UI/mg).
Il brevetto EP0756638B1 descrive invece uno screening iniziale degli intermedi del frazionamento del plasma per verificare la frazione più idonea da utilizzare come materiale di partenza per la purificazione e, dopo aver verificato il recupero almeno dell’80% di FV nel surnatante senza crio, investiga il legame della proteina alla DEAE Sephadex, nello step utilizzato nel tradizionale processo di frazionamento per la purificazione del PTC. Viene infatti dimostrato che aumentando il rapporto resina/campione rispetto al processo standard e modificando la forza ionica del surnatante, à ̈ possibile aumentare la resa di FV nell’eluato contenente il PTC grezzo. L’ottimizzazione descritta per lo step di legame alla resina prevede comunque l’eluizione del FV insieme al complesso protrombinico e l’ottenimento di un prodotto molto impuro (A.S. FV: 0,4 UI/mg).
Nel brevetto CA1293214(C)-1991 la purificazione del FV viene effettuata sempre a partire da plasma o surnatante senza crio, e nel primo step i fattori componenti il complesso protrombinico sono precipitati con idrossido di alluminio, mentre il FV viene recuperato nel surnatante. La frazione contenente FV viene quindi incubata in batch con la resina DEAE Sephadex A50 in un rapporto molto elevato (13,6 g/L di campione) a pH 7.5 in tampone citrato 0.02 M e NaCl 0.06 M, ottenendo così il legame del FV al supporto, che viene successivamente trasferito in colonna cromatografica. L’eluato contenente FV à ̈ quindi ottenuto per lavaggio con una soluzione contenente NaCl 1M, eparina 1UI/ml, ATIII 0,2UI/ml e CaCl25mM. Per ottenere un preparato di FV stabile non à ̈ inoltre sufficiente la presenza di anticoagulanti, che devono successivamente essere rimossi dal prodotto, ma l’eluato subisce una ulteriore precipitazione con solfato di ammonio, seguita da risospensione, dialisi e liofilizzazione. Non sono inoltre disponibili dati di resa, attività specifica o stabilità del prodotto ottenuto con questo processo laborioso e aggressivo. I metodi di purificazione del FV fino a qui descritti prevedono quindi l’impiego di numerosi passaggi di purificazione, tra cui metodi di precipitazione che possono causare denaturazione ed inattivazione del FV. La separazione del FV dai fattori del complesso protrombinico, necessaria all’ottenimento di un prodotto contenente un FV stabile, à ̈ stata infatti ottenuta esclusivamente mediante questo tipo di tecnica aggressiva o impiegando anticorpi diretti contro il FV, che, a fronte di costi e difficoltà di esecuzione non trascurabili, sono stati ancorati su supporti cromatografici ed utilizzati per isolare il FV. Anche i processi descritti più recentemente, che prevedono un trattamento più blando della proteina e il suo isolamento esclusivamente per immunoaffinità e scambio anionico (WO 2010/069946), non risultano in rese soddisfacenti del FV (non superiori al 30%) e comportano tutte le difficoltà dell’utilizzo di un supporto di immunoaffinità . Tra queste una complicata preparazione del mezzo cromatografico e un basso numero di cicli di riuso: i gruppi funzionali che espongono un anticorpo presentano infatti una maggiore suscettibilità ai trattamenti aggressivi quali sanitizzazione ed esposizione a pH estremi rispetto ai gruppi funzionali classici.
Nei pochi processi decritti in cui à ̈ stata valutata la stabilità del FV nel prodotto finale, la proteina mantiene la propria integrità solo mediante aggiunta in tutti i passaggi di un cocktail di inibitori di proteasi (tra cui Benzamidina, DFP, PMSF e STI), che devono essere rimossi prima della formulazione finale del prodotto.
Per quanto riguarda la sicurezza virale del prodotto, che deve essere assicurata per un impiego clinico, l’unico processo descritto che comprende un unico step di inattivazione virale utilizza a tale scopo eptano (US 5,219,995): l’intermedio liofilizzato à ̈ risospeso in neptano e riscaldato a 60°C per 20 h, quindi l’agente inattivante à ̈ allontanato mediante essiccamento del prodotto. Il trattamento di inattivazione virale preso in considerazione in tale brevetto, oltre ad essere insufficiente in previsione di un uso clinico, à ̈ potenzialmente dannoso per l’integrità della proteina di interesse.
Risulta quindi evidente che allo stato attuale non esiste un processo di purificazione del FV semplice, veloce, facilmente scalabile per una produzione industriale e che permetta di ottenere una proteina integra con buone rese.
Lo scopo della presente invenzione à ̈ quindi quello di fornire un metodo semplice, applicabile su scala industriale, che permetta di ottenere un concentrato di FV virus inattivato, purificato con alte rese, in cui venga conservata il più possibile l’integrità della proteina, che garantisca la sicurezza virale del prodotto e che sia adatto all’uso clinico per via parenterale.
DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI FV: fattore V
FVa: fattore V attivato
FXa: fattore X attivato
APC: proteina C attivata
RICD: disordine coagulativo ereditario recessivo
SNC: sistema nervoso centrale
FFP: plasma fresco congelato
rFVIIa: fattore FVII attivato ricombinante
FEIBA: complesso protrombinico attivato
FVII: fattore VII
FII: fattore II
FIX: fattore IX
FX: fattore X
PTC: complesso protrombinico
TnBP: tri-n-butil-fosfato
DEAE: dietilamminoetil
DFP: diisopropilfluorofosfato
PMSF: fenilmetansulfonilfluoruro
STI: inibitori della tripsina da semi di soia
WFI: acqua per preparazioni iniettabili
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive un processo per la purificazione del FV a partire da plasma umano o una frazione intermedia arricchita in FV in cui la proteina risulti integra, preferibilmente il criosurnatante. Detto processo comprendente due passaggi cromatografici su scambiatori anionici deboli, preferibilmente aventi gruppi funzionali DEAE, in cui il primo passaggio à ̈ eseguito in modalità di “non legame†del FV mentre il secondo in modalità di “cattura†del FV.
Il processo secondo l’invenzione risulta facilmente scalabile a livello industriale e consente di ottenere un concentrato di FV con elevate rese, viralmente sicuro e con un grado di purificazione adatto per l’utilizzo nella terapia di patologie correlate alla carenza di FV, in particolare Paraemofilia e carenza associata di FV e FVIII, patologie attualmente prive di un efficace trattamento.
La prima fase di purificazione à ̈ stata ideata per separare il FV dagli altri fattori della coagulazione, in particolare FVII, FII, FIX e FX, passaggio fondamentale per garantire una maggiore integrità della proteina d’interesse. Detto step consiste in un’incubazione in batch tra resina e criosurnatante in condizioni di pH, conducibilità e carico tali da consentire il legame dei fattori contaminanti alla resina e il recupero del FV nel non adsorbito; tale frazione à ̈ quindi ottenuta attraverso un semplice metodo di filtrazione che consente di separare la resina dal plasma filtrato. L’intermedio così prodotto à ̈ sottoposto al secondo step cromatografico che prevede: legame del FV allo scambiatore anionico, allontanamento delle proteine contaminanti con tamponi di lavaggio, eluizione del FV per incremento della forza ionica nel tampone di eluizione.
Il presente metodo d’invenzione presenta i seguenti vantaggi rispetto a quanto descritto nei brevetti e pubblicazioni sopra citati:
─ E’ un metodo semplice e facilmente eseguibile, in quanto mediante due soli passaggi cromatografici permette di ottenere con buone rese un concentrato di FV purificato. ─ A differenza di quanto riportato in letteratura, la separazione del FV dai fattori del complesso protrombinico avviene per mezzo di uno step di purificazione blando e poco costoso. Il passaggio in questione consiste infatti in una incubazione in batch del surnatante senza crio preferibilmente con la resina DEAE Sephadex A50, in cui sono stati opportunamente modulati la conducibilità del surnatante senza crio e il rapporto resina/volume di campione, in maniera da individuare le condizioni simultanee di non legame per il FV e di legame per FII, FVII, FIX e FX. I lavori pubblicati o brevettati prevedono invece di ottenere tale risultato mediante tecniche di precipitazione, quindi piuttosto drastiche e potenzialmente inattivanti buona parte del FV presente, o per mezzo di tecniche di immunoaffinità , che comportano numerose difficoltà nella preparazione del supporto cromatografico e risultano molto più costose rispetto a quanto riportato nella presente invenzione.
─ La separazione del FV dalle proteine componenti il PTC, condizione essenziale al mantenimento dell’integrità della proteina, avviene nella prima fase del processo di purificazione; operando in questo modo si evita la copurificazione del FV insieme ai suddetti fattori nel PTC per adsorbimento sul supporto DEAE Sephadex A50 che comporterebbe una sua attivazione, e quindi la conseguente inattivazione, come dimostrato nell’esempio 1.
─ Il presente metodo consente inoltre di poter utilizzare il complesso resina-frazione adsorbita per la classica purificazione del PTC, eventualmente anche a 4 componenti, dato che non solo FII, FIX e FX si legano al supporto, ma anche FVII à ̈ quasi completamente adsorbito ad esso.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1 mostra lo schema a blocchi di una forma di realizzazione preferita del metodo dell’invenzione dalla materia prima all’ottenimento del prodotto finito contenente FV.
Figura 2 mostra lo schema del frazionamento del plasma.
Figura 3 mostra l’analisi per Western blot effettuata sul prodotto finito a confronto con standard di riferimento per la verifica dell’integrità del FV.1.Standard PM, 2.Standard FV, 3.Standard FVa, 4.FV Bulk 01; 5.FV Bulk 02.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Il FV à ̈ purificato, secondo la presente invenzione, a partire da plasma umano o da un intermedio del suo frazionamento. Secondo un particolare e preferito aspetto dell’invenzione, tale materiale di partenza à ̈ il criosurnatante, ovvero la frazione non sedimentata derivante, dopo centrifugazione, dallo step di crioprecipitazione del plasma. Preferibilmente il criosurnatante viene addizionato con inibitori di proteasi, utilizzati singolarmente o in associazione tra loro, quali ad esempio Aprotinina, Benzamidina, Leupeptina, STI. Per un aspetto preferito viene utilizzata unicamente Aprotinina quale inibitore di proteasi, poiché risulta sufficiente a garantire l’integrità del FV nel prodotto finale. L’uso di aprotinina inoltre presenta i seguenti vantaggi: a pH 7.4 à ̈ carica positivamente e quindi non si lega agli scambiatori anionici, presumibilmente eluendo nella frazione del non legato nel secondo step cromatografico; successivamente, poiché à ̈ una molecola piccola, facilmente eliminabile per dialisi, può essere ulteriormente allontanata nella fase di ultrafiltrazione.
Il presente metodo prevede preferibilmente l’inserimento di un trattamento solvente/detergente, del tipo Tween 80/TnBP, tra la prima e la seconda cromatografia: oltre a contribuire alla sicurezza virale del prodotto, il posizionamento a questo livello dello step di inattivazione virale permette di avere un abbattimento della concentrazione dei due agenti inattivanti nell’eluato contenente FV. Essi infatti tendono a non legarsi al supporto cromatografico a scambio anionico successivamente utilizzato, e quindi si recuperano in gran parte nel non adsorbito, mentre il FV rimane legato alla resina e viene eluito mediante incremento della forza ionica del tampone di condizionamento. L’uso di tali agenti inattivanti inserito al suddetto livello della purificazione permette sicuramente un miglioramento di quanto riportato in letteratura: nei pochi casi in cui à ̈ previsto uno step di inattivazione virale, questo viene eseguito con eptano, che viene poi allontanato per essiccamento, trattamento potenzialmente dannoso per l’integrità della proteina (US 5,219,995).
In aggiunta al trattamento solvente/detergente à ̈ stato inserito, a valle della seconda cromatografia, uno step di rimozione virale per filtrazione attraverso nanofiltri da 20 nanometri. Questo ulteriore passaggio protegge il prodotto anche dai virus non enveloped di piccole dimensioni come ad esempio HAV.
Il processo descritto si conclude con uno step di ultrafiltrazione che consente di ottenere una soluzione proteica concentrata e dializzata, adeguata alla somministrazione i.v. per il trattamento della Paraemofilia.
Secondo un aspetto preferito della presente invenzione il criosurnatante viene addizionato di Aprotinina ad una concentrazione compresa tra 50 e 1100 KIU/ml, ed in seguito diluito con WFI fino ad un valore di conducibilità compreso tra 3 e 10 mS/Cm, e il suo pH viene aggiustato ad un valore compreso tra 7.0 e 8.0.
In accordo con la presente invenzione il campione così ottenuto viene quindi incubato in batch, ad una temperatura compresa tra 15 e 25°C, con la resina secca o idratata DEAE Sephadex A50, in un rapporto che può variare tra 0,15 e 2,0 g di resina secca per litro di campione diluito, per un tempo compreso tra 30 e 90 minuti.
Secondo la presente invenzione la miscela campione-resina à ̈ filtrata sotto vuoto su buchner od utilizzando capsule disposable, attraverso prefiltri tipo K100 Pall o similari: il FV à ̈ recuperato quasi completamente nel filtrato, mentre FII, FVII, FIX e FX sono adsorbiti prevalentemente sulla resina.
La presente invenzione prevede quindi l’aggiunta al campione filtrato, denominato Filtrato DEAE, di calcio cloruro fino ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 mM, e di sodio cloruro fino ad una concentrazione compresa tra 100 e 130 mM.
Il campione così trattato, à ̈ sottoposto, secondo la presente invenzione, ad una incubazione con tween 80 ad una concentrazione compresa tra 0,5 e 2%.p/p e tri-n-butilfosfato ad una concentrazione compresa tra 0,1 e 0,5% p/p ad una temperatura compresa tra 20 e 30 °C, per un periodo di tempo compreso tra 4 e 10 h.
In accordo con la presente invenzione la soluzione sottoposta a trattamento di inattivazione virale à ̈ filtrata attraverso filtri da 0,2 Î1⁄4m di cut-off, per proteggere il supporto cromatografico successivamente utilizzato nel processo di purificazione.
In accordo con la presente invenzione la soluzione viralmente inattivata à ̈ sottoposta a cromatografia in colonna, preferibilmente su scambiatore anionico debole, quali ad esempio: Fractogel EMD-DEAE (Merck), DEAE Toyopearl 650 M (Tosoh), Macro-Prep DEAE (Bio Rad), DEAE Sepharose FF (GE), DEAE Ceramic HyperD F (Pall). Secondo la presente invenzione il secondo step di purificazione cromatografica viene eseguito in modalità di legame, ed à ̈ caratterizzato da incrementi successivi della concentrazione salina che permettono in sequenza l’eliminazione delle proteine non legate al supporto durante la fase di lavaggio, l’allontanamento delle proteine contaminanti debolmente legate durante gli step intermedi, e l’eluizione selettiva del FV a forza ionica più elevata (FV Eluato).
Secondo la presente invenzione il secondo step di purificazione cromatografica comprende preferibilmente i seguenti step:
a) condizionamento dello scambiatore anionico debole con un tampone acquoso di condizionamento avente un pH compreso tra 7.0 e 7.8, contenente NaCl ad una concentrazione compresa tra 0.05 e 0.13 M, contenente calcio cloruro ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 mM, ed eventualmente comprendente glicina. b) caricamento della frazione arricchita in FV;
c) eluizione delle proteine non legate mediante lavaggio con tampone di condizionamento;
d) eluizione delle proteine debolmente legate con un tampone acquoso ad un pH compreso tra 7.0 e 7.8, contenente NaCl ad una concentrazione compresa tra 0.14 e 0.17 M, contenente calcio cloruro ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 mM, ed eventualmente comprendente glicina;
e) eluizione di una soluzione contenente FV con un tampone acquoso di eluizione ad un pH compreso tra 7.0 e 7.8, contenente NaCl ad una concentrazione compresa tra 0.18 e 0.30 M, contenente calcio cloruro ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 mM, ed eventualmente comprendente glicina.
Tale tampone a pH compreso tra 7.0 e 7,8, Ã ̈ ottenuto ad esempio con citrato, fosfato o tris.
In accordo con la presente invenzione l’eluato contenente FV à ̈ sottoposto a rimozione virale mediante processo di filtrazione attraverso filtri da 0.1 Î1⁄4m (ad esempio DJL-Pall) e nanofiltrazione, effettuato su nanofiltri da 50 e da 20 nanometri quali ad esempio DV50 e DV20 (Pall) oppure N20 (Planova).
La soluzione nanofiltrata, denominata FV NF, secondo la presente invenzione, Ã ̈ successivamente concentrata e dializzata con appropriato tampone al fine di ottenere una soluzione con un titolo di FV di almeno 20 UI/ml, e composizione salina compatibile con la somministrazione endovenosa.
Il prodotto finale così ottenuto, denominato FV Bulk, in accordo con la presente invenzione, à ̈ congelato e conservato a -20°C, condizione in cui il FV contenuto nella soluzione si dimostra stabile.
Con questo metodo può essere ottenuto un concentrato di FV adatto alla somministrazione endovenosa per la terapia della Paraemofilia o altre patologie associate alla carenza di FV.
Il metodo di purificazione della presente invenzione, oltre a fornire un concentrato di FV purificato con alte rese e viralmente sicuro, à ̈ efficiente, riproducibile, semplice e scalabile a livello industriale. Il concentrato contiene FV ad elevata attività specifica, se confrontato con le purificazioni che utilizzano metodiche tradizionali e poco costose quali lo scambio ionico. Le principali proteine contaminanti che potrebbero interferire con la stabilità del prodotto finale, quali FII, FVII, FVIII, FIX e FX sono presenti solo in tracce. Altri contaminanti quali Fibrinogeno, Fibronectina e IgG sono al di sotto del limite di rilevazione, mentre, IgA e IgM sono presenti in bassissime concentrazioni.
Il FV purificato con il presente metodo conserva la sua integrità , come evidenziato dal confronto con uno standard plasmatico mediante analisi per Western Blot.
L’invenzione à ̈ ulteriormente descritta negli esempi che seguono. Tali esempi sono utili a chiarire l’invenzione e non la limitano in nessun modo.
PARTE SPERIMENTALE
Esempio 1: Valutazione FV negli intermedi del frazionamento
Sui diversi intermedi del frazionamento à ̈ stata valutata l’attività del FV mediante test coagulativo, utilizzando plasma carente in FV (Factor V deficient plasma-IL) e tromboplastina commerciale (Recombiplastin2G-IL). Il processo di frazionamento esaminato (Figura 2) comprende lo step di crioprecipitazione e l’adsorbimento su scambio anionico debole, prima dei passaggi tradizionali di frazionamento con etanolo per l’ottenimento di albumina e immunoglobuline.
L’analisi dei diversi intermedi ha evidenziato la ripartizione della quasi totalità del FV nel criosurnatante (98% circa); di questo solo il 17% del FV incubato con la resina a scambio anionico DEAE Sephadex A50 si recupera nel non legato, indicando quindi che la maggior parte di FV si lega al supporto insieme ai componenti del complesso protrombinico. Insieme al PTC eluisce infatti circa il 30% del FV incubato con lo scambiatore anionico, ma la proteina tende a perdere rapidamente attività , come dimostrato dall’analisi dello stesso campione dopo conservazione a -20°C per pochi giorni (Tabella 1).
Tabella 1
Intermedio Resa Step % FV
Surnatante senza crio
Surnatante PTC 17,09
PTC grezzo fresco 29,58
PTC grezzo 7gg a -20°C 5,31
Mano a mano che si procede con le precipitazioni con etanolo il recupero di FV tende a ridursi anche se non drasticamente e la sua attività specifica (A.S.= UI/mg proteine) rimane inferiore a quella valutata nel plasma (0,0145 UI/mg).
Esempio 2: processo purificazione
a) Preparazione del materiale di partenza
Come materiale di partenza à ̈ stato utilizzato il criosurnatante. Il pH di tale intermedio à ̈ stato aggiustato ad un valore di 7.4 con acido cloridrico, quindi il campione à ̈ stato addizionato di Aprotinina fino ad una concentrazione di 1000 KIU/ml e diluito di circa 3,36 volte con WFI fino ad una conducibilità finale di 4,5 mS/cm.
b) Cromatografia in batch a scambio anionico
La cromatografia in batch in modalità di non legame à ̈ stata effettuata su resina a scambio anionico DEAE Sephadex A50 (GE Healthcare). Al criosurnatante trattato come descritto nel paragrafo precedente à ̈ stata aggiunta, sotto agitazione meccanica, la resina secca DEAE Sephadex A50 in un rapporto 0,9g di resina secca / l di campione diluito. L’incubazione à ̈ stata eseguita a 25°C per 60 minuti. Al termine dell’incubazione la miscela resina/campione à ̈ stata filtrata su filtro di profondità del tipo K100 (Pall), trattenendo la resina e la frazione adsorbita su filtro, mentre il non adsorbito à ̈ recuperato nel filtrato. Nelle condizioni indicate à ̈ stato possibile separare FV dai fattori componenti il complesso protrombinico, come riportato in tabella 3:
Tabella 2
Step Resa % Step
FV:Act FVII FII FIX FX Proteine Filtrato DEAE 99,80% 6,03% 4,62% n.d.* 5,77% 88,26% *risultati inferiori al limite di rilevazione del test
c) Inattivazione virale con miscela solvente/detergente
Il campione filtrato à ̈ stato addizionato di sodio cloruro e di calcio cloruro, in modo che la soluzione caricata in colonna nel successivo step cromatografico avesse una concentrazione pari a 5 mM in calcio cloruro e 120 mM in sodio cloruro. L’intermedio così trattato à ̈ stato sottoposto ad inattivazione virale mediante contatto con una miscela di tween 80 (1% p/p) e tri-n-butil-fosfato (0,3 % p/p) per 8 h ad una temperatura controllata di 25±1 °C.
Il campione che ha subito inattivazione virale à ̈ stato chiarificato mediante filtrazione da 0,2 µm di cut-off a protezione del successivo step cromatografico in colonna.
d) Cromatografia in colonna a scambio anionico
La cromatografia a scambio anionico in colonna à ̈ stata effettuata con resina Fractogel EMD DEAE (Merck) impaccata su colonna di diametro di 5 cm per un’altezza di 17 cm. La colonna à ̈ stata condizionata con tampone citrato 10 mM, contenente sodio cloruro 120mM, calcio cloruro 5 mM, glicina 120 mM, pH 7.4, ad un flusso di 180 cm/h.
Il campione inattivato e filtrato à ̈ stato caricato su colonna ad un carico di 340 mg di proteine/ml di resina, ad un flusso di 130 cm/h. Alla fine del caricamento la colonna à ̈ stata lavata con 6 volumi di tampone di condizionamento ad un flusso di 180 cm/h. Le proteine debolmente legate al supporto sono state quindi eliminate mediante lavaggio con 6 volumi di colonna con tampone di condizionamento in cui la concentrazione del sodio cloruro à ̈ stata incrementata fino a 150 mM. Il FV à ̈ stato successivamente eluito incrementando la concentrazione di sodio cloruro nel tampone di eluizione fino a 200 mM, lavando la colonna con 5 volumi di tale tampone ad un flusso di 90 cm/h.
In tabella 3 sono riportate le caratteristiche della soluzione contenente FV eluita dalla colonna cromatografica a scambio anionico:
Tabella 3
Frazione FV:Act Resa % step Proteine Resa % step A.S.
(IU/ml) (mg/ml) (IU/mg) Eluato Fractogel 3,670 100% 0,207 0,13% 17,729 EMD-DEAE
e) Nanofiltrazione
L’eluato Fractogel EMD-DEAE à ̈ stato filtrato prima con filtro di grado sterilizzante e successivamente su filtro di grado virale di porosità 20 nm. I risultati ottenuti in tale processo sono riportati in tabella 4:
Tabella 4
Step Resa step % FV
Filtrazione sterilizzante 92,31%
Filtrazione 20 nm 86,34%
f) Concentrazione/ultrafiltrazione
Il campione nanofiltrato à ̈ stato sottoposto ad ultrafiltrazione mediante dispositivo per filtrazione a flusso tangenziale utilizzando cassette con taglio molecolare da 50 KDa (Pall): il campione à ̈ stato così concentrato fino ad un titolo di FV minimo di 20 UI/ml e dializzato fino a raggiungere la formulazione finale desiderata. Per le fasi di dialisi e formulazione à ̈ stato utilizzato un tampone contenente sodio citrato 10 mM, sodio cloruro 110 mM, glicina 120 mM e calcio cloruro 1 mM, a pH 7.4.
La soluzione finale così ottenuta à ̈ stata sottoposta a filtrazione sterilizzante e inflaconamento, e successivo congelamento a -20°C.
Il processo descritto nel presente esempio permette quindi di ottenere un concentrato di FV con alte rese e buon indice di purificazione (IP) rispetto al materiale di partenza, come riportato in tabella 5:
Tabella 5
Frazione Resa processo % FV A.S. (UI/mg) I.P
Bulk FV 73,4% 20,33 782
Esempio 3: caratterizzazione prodotto finito
In questo esempio à ̈ riportata una tabella (Tabella 6) che riassume le caratteristiche principali del prodotto che si ottiene applicando il protocollo descritto nell’esempio 2.
Tabella 6
IgG (mg/ml) n.d.*
FIB (mg/ml) n.d.*
FNC (mg/ml) n.d.*
IgM (mg/l) 0,084
IgA (mg/l) 0,007
FV:Act (UI/ml) 24,91
FII (UI/ml) 0,01
FX (UI/ml) 0,03
FIX (UI/ml) 0,04
FVII (UI/ml) 0,04
Proteina C (UI/ml) n.d.*
Proteine (mg/ml) 1,23
* risultati inferiori al limite di rilevazione del test
Nel prodotto finito ottenuto à ̈ stata valutata anche l’integrità della proteina di interesse, mediante western blot con anticorpo diretto contro la catena pesante del FV. I risultati di tale analisi sono riportati in figura 3. L’integrità e l’assenza di attivazione di FV nel bulk finale à ̈ dimostrata anche dal dosaggio dei fattori attivati: questo test, che rileva la presenza di fenomeni di attivazione nella cascata coagulativa, ha dato esito negativo.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Un processo per la purificazione del FV a partire da plasma umano o una frazione intermedia arricchita in FV, in cui la proteina risulti integra; detto processo comprendente due passaggi cromatografici su scambiatori anionici deboli, in cui il primo passaggio à ̈ eseguito in modalità di “non legame†mentre il secondo in modalità di “cattura†del FV.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui entrambi gli scambiatori anionici deboli dei due passaggi cromatografici appartengono alla categoria degli scambiatori deboli caratterizzati dal gruppo funzionale Dietilamminoetil (DEAE).
- 3. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-2 in cui i due passaggi cromatografici sono intervallati da almeno un passaggio di inattivazione virale effettuata mediante trattamento con solvente-detergente.
- 4. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui, dopo il secondo passaggio cromatografico, la soluzione contenente FV Ã ̈ sottoposta ad un passaggio di rimozione virale mediante nanofiltrazione.
- 5. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-4 in cui viene impiegato come materia prima il criosurnatante.
- 6. Processo secondo la rivendicazione 5 in cui il criosurnatante à ̈ addizionato con inibitori di proteasi, utilizzati singolarmente o in associazione tra loro, quali ad esempio Aprotinina, Benzamidina, Leupeptina, STI.
- 7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui il campione criosurnatante viene addizionato di Aprotinina ad una concentrazione compresa tra 50 e 1100 KIU/ml, ed in seguito diluito con WFI fino ad un valore di conducibilità compreso tra 3 e 10 mS/Cm, e il suo pH viene aggiustato ad un valore compreso tra 7.0 e 8.0.
- 8. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-7 in cui la matrice dello scambiatore anionico debole utilizzato nel primo passaggio à ̈ del tipo Sephadex, cioà ̈ a base di destrano.
- 9. Processo secondo la rivendicazione 8 in cui il primo step cromatografico viene effettuato in batch, ad una temperatura compresa tra 15 e 25°C, con la resina DEAE Sephadex A50 secca o idratata, in un rapporto che può variare tra 0,15 e 2,0 g di resina secca per litro di campione diluito, per un tempo compreso tra 30 e 90 minuti.
- 10. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-9 in cui lo scambiatore anionico debole impiegato nel secondo passaggio à ̈ costituito da un supporto sintetico idrofilo a struttura tentacolare contenente lunghe catene polimeriche alla cui estremità sono legati gruppi DEAE.
- 11. Processo secondo la rivendicazione 10, in cui il secondo passaggio cromatografico comprende i seguenti passaggi: a) condizionamento della resina a scambio ionico debole con tampone acquoso di condizionamento avente pH compreso tra 7.0 e 7.8, contenente NaCl ad una concentrazione compresa tra 0.05 e 0.13 M, contenente calcio cloruro ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 mM, ed opzionalmente comprendente glicina; b) caricamento della frazione arricchita nelle proteine di interesse; c) eluizione delle proteine non legate mediante lavaggio con tampone di condizionamento; d) eluizione delle proteine debolmente legate con un tampone acquoso ad un pH compreso tra 7.0 e 7.8, contenente NaCl ad una concentrazione compresa tra 0.14 e 0.17 M, contenente calcio cloruro ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 mM, ed opzionalmente comprendente glicina. e) eluizione di una soluzione contenente FV con un tampone di eluizione ad un pH compreso tra 7.0 e 7.8, contenente NaCl ad una concentrazione compresa tra 0.18 e 0.30 M, contenente calcio cloruro ad una concentrazione compresa tra 1 e 10 mM, ed opzionalmente comprendente glicina.
Priority Applications (7)
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| IT000084A ITFI20110084A1 (it) | 2011-04-22 | 2011-04-22 | Nuovo processo per la preparazione di un concentrato di fv virus inattivato a partire da plasma umano, scalabile a livello industriale. |
| PCT/EP2012/057262 WO2012143507A1 (en) | 2011-04-22 | 2012-04-20 | Novel process for the preparation of a virus-inactivated fv concentrate starting from human plasma, scalable to industrial level |
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