KR20100058520A - 인자 Ⅷ 및 폰 빌리브란트 인자(ｖＷＦ)의 정제 방법 - Google Patents

인자 Ⅷ 및 폰 빌리브란트 인자(ｖＷＦ)의 정제 방법 Download PDF

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엘에프비 바이오테크놀로지스
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Abstract

정제방법은, (i) FVIII 및 FvW의 혼합물을 함유하는 용액, (ii) FvW을 함유하는 용액, (iii) 비인간 동물의 분비물로부터 유래된 용액, 및 (iv) FVIII-함유 식물 추출물에서 유래된 용액으로부터 선택된 용액에서 시작하는, 이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막의 FVIII 또는 FvW의 흡착 단계를 포함한다.

Description

인자 Ⅷ 및 폰 빌리브란트 인자(ｖＷＦ)의 정제 방법{Method For Purifing The Factor VIII and The Von Willebrand Factor}
본 발명의 기술분야는 의약품의 활성제로 사용될 인자 VIII 및 폰 빌리브란트 인자(vWF)의 정제에 관한 것이다.
인자 VIII(이하, "FVIII"로 언급되기도 함)은 인간 혈장에 낮은 농도로 존재하는 혈장 단백질이다. 그러나, 응고 연속반응(cascade)에서는 키 포인트로 보인다. 실제로, 이 단백질은 인자 X(또는, "FX")를 활성화시키기 위한 인자 IX (또는, "FIX")의 공인자로 작용한다. 인자 X가 활성화되면, 이 인자는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키고, 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환시켜, 결국 혈류정지(지혈)성 피브린 응집 형성을 유도한다.
A형 혈우병으로 고통받는 사람들은 FVIII 결함이 있으며, 이 결함은 산발적으로, 또는 사고나 외과수술에 의한 외상에 뒤이은 심각한 출혈을 야기한다.
이들 개인들은 정제된 혈장-유래 FVIII를 주입하는 (병원의)전통적인 방법으로 치료되었다. 이러한 주입들은 자주 많이 되풀이되었기 때문에 활용 가능한 고순도의 FVIII 농축물을 제조하는 것은 중요하다. 실제로, FVIII 농축물이 불충분하게 정제되면, 많은 양의 피브리노겐과 면역글로불린이 포함될 수 있어, 원하지 않은 면역 반응을 유도하기 쉬웠다.
치료학적 목적에 사용되는 혈장-유래 단백질의 제공은 결국 고순도의 (혈장-유래 FVIII) 생산물을 얻기 위한 혈장-유래 FVIII 정제 방법을 요구한다.
인자 VIII 농축물은 동결침전된(cryoprecipitated) 인간 혈장 분획물에서 가장 흔히 제조되었다. 인간 혈장을 치료하기 위하여 산업 센터(industrial centers)에서 일반적으로 획득되었던 인자 VIII 농축물의 순도는, 종종 약 1 IU/mg 이며, 일반적으로 최대 10 내지 20 IU/mg를 초과하지 않는다. 가장 일반적인 생산 방법은, 종종 매우 불충분하기는 하지만, 피브리노겐, 피브로넥틴 및 면역글로블린 등의 혈장-유래 오염제의 제거를 목적으로 하는 침전 단계를 의미한다. 이 방법들은 저온 침전(10℃), 또는 침전제로 제시되었던 PEG(Newman and al., Br. J. Haematol 21:1-20, 1971; Hao and al., in Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press 1980, pp.57-74), 폴리비닐피롤리돈 (Casillas and Simonetti, Br. J. Haemato, 50:665-672, 1982), 덱스트란, 피콜, 퍼콜, 히드록시에틸 녹말 및 알루미나 등의 친수성 폴리머들 같은 단백질-침전제의 첨가를 이용하거나 또는 병행한다. Thorell과 Blomback (Thorell and Blomback, Thromb Res. 1984 Aug 15;35(4):431-50)에 의해 제안되었던 글리신 및 염화나트륨의 사용에 대하여 동일하게(=동일한 침전제로) 적용된다. 유사하게, 일부 저자들(Ng and al, Thrombosis Res.,42:825-834, 1986)은 PEG, 글리신, 및 염화나트륨의 세 가지 침전제를 혼합하여, 10 내지 16 IU/mg 범위의 특이적인 활성을 갖는 인자 VIII 농축물을 얻는데 성공하였다.
인자 VIII 농축물은 또한, 저분자량의 단백질-유래 오염제를 포획하기 위하여 다공성 실리카 비드와 접촉하는 단계의 생산 절차를 포함하는 방법으로 생산되었다(Margolis and al., Vox Sang. 46:341-348,1984). 생산물의 특이적인 활성은 여전히 상대적으로 약하게 남아있다: 1UI/mg.
고순도의 인자 VIII 농축물 제조방법이 나타났다. 실제로, 면역친화성 크로마토그래피 방법에 의해 획득된 농축물이 제안되었다(Zimmerman and Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 58, 1987 Berntorp and Nilsson, Thrombosis Res., Suppl. VII, p.60, 1987 Levine and al., Thombosis Res, Suppl. VII, 1987). 이러한 방법들은 크로마토그래피 기질에 고정되어 있는 항-인자 VIII:C 또는 항-폰 빌리브란트 인자 항체를 이용하여 인자 VIII를 정제하는 것으로 구성된다. 이러한 방법들은 효과적이었으나, 인자 VIII의 항체로부터 또는 폰 빌리브란트 인자로부터 인자 VIII를 탈착시키기 위한 과감한(drastic) 용액의 사용이 요구된다. 그러므로 원하지 않는 화학 제제를 제거하기 위한 추가적인 초미세 여과 단계가 필요하지만, 인자 VIII의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수도 있다. 인자 VIII의 특이적인 활성은 생산 과정 중에는 4000 내지 10000 IU/mg에 이를 수도 있지만, 그 불안정성 때문에 인자 VIII의 특이적인 활성이 3 내지 5 IU/mg으로 감소되도록 냉동-건조 단계 전에 알부민 등의 안정화제의 첨가가 요구된다. 그러나, 면역친화성 정제의 주요 약점은 동물 기원의 잔여 항체가 존재하며, 따라서 이들의 비인간 단백질에 대한 면역반응이 환자에게 발생할 수 있다는 것에 있다.
그러므로, 이들 모든 방법들은, 대용량의 산업 환경에 적용가능한 방법으로 동물-유래 항체와 같은 비인간 단백질이 완전히 없는 매우 높은 정도의 순도를 가진 인자 VIII 농축물을 제공하는 것이 불가능하다.
EP 0 343 275는 동결침전물로부터 인자 VIII를 준비하는 방법을 개시하는 것으로, 바이러스의 불활성 처리 전에 6.5 내지 7.5 범위의 pH에서 1 내지 3 U/ml의 헤파린을 함유하는 물에 현탁시킨 동결침전물을 수산화 알루미늄 현탁액과 반응한 후에, 10 내지 18℃의 온도로 식히고, 6 내지 7 범위의 pH 값으로 조정한 후에 원심분리하거나 여과하고, 그런 다음, 친수성 타입의 프락토겔-DEAE(Tosoh Bioscience company에 의해 판매되는 소위 DEAE-TOYOPEARL®,를 말함)와 같은 이온-교환 수지를 사용하는 크로마토크래피 방법으로 후-처리를 하여 추가적인 정제를 수행하는 것을 특징으로 한다.
따라서 이 문헌은 특히 어떤 에탄올 처리도 없는 것으로 특징되는 매우 특이적인 예비 단계를 플락토겔 DEAE와 같은 친수성 타입의 수지 상에서 이온-교환 크로마토그래피와 결부짓는 것에 의한 인자 VIII 만의 정제를 개시한다.
EP 0 359 593은 음이온-교환 크로마토그래피 정제 방법을 개시하는 것으로, 상기 방법은 어떤 후-처리도 불필요하도록 충분히 잘 고려된 조건하에서 예상되는 단백질들을 단일 크로마토그래피 컬럼 상에서 분리가능하게 한다. 이러한 방법은 인간이나 동물 혈장에서 인자 VIII, 피브리노겐, 피브로넥틴 및 폰 빌리브란트 인자 단백질을 분리가능하게 한다. 이러한 방법은 하기와 같이 요약된다: 물에 용해시킨 동결침전 분획물을, 매질이 거대-가교된 비닐 폴리머 겔 타입인 음이온-교환수지를 이용한 크로마토그래피 방법으로 단회 분리되도록 하고, 상기 기질은 그의 다공성 성질들에 의해 인자 VIII-폰 빌리브란트 인자 복합체를 잔류시킬 수 있고, 그 결과용출 완충 용액의 이온 강도를 연속적으로 증가시켜 다양한 단백질들을 선택적으로 수집하였다. 이러한 방법은 프락토겔® TSK-DEAE 650 수지(Tosoh Bioscience company에 의해 판매되는 소위 DEAE-TOYOPEARL®,를 말함) 상에 부착된(grafted) DEAE 분체(moieties)를 이용하여 좋은 결과들을 얻는다. 그러나, 이러한 방법은 정제된 FVIII를 획득하는 것은 가능한 반면, 충분히 정제된 폰 빌리브란트 인자를 수득하는 것이 불가능하다.
반대로, 폰 빌리브란트 인자(이하, "FvW"로 언급되기도 함)는 두 가지 다른 기능으로 혈류정지에서 중요한 역할을 한다: 부착 단백질로서, 이는 혈소판이 혈관성 내피밑층에 흩어지고, 부착해서 응집할 수 있게 하고, 따라서, 손상된 혈관의 신속한 아물기를 담당하며, 그리고 다른 한편으로는, 비공유 결합으로, 혈액 순환에서 인자 VIII (FVIII) 안정화 및 수송을 보장한다.
FvW 선천적인 결함 (정량적인 결함)이나 이 인자의 구조적인 이상(정성적인 결함)은 피부 및 점막 출혈이 나타나는 폰 빌리브란트 질환을 일으킨다. 이 질환의 임상적 현상은 매우 이형질성이며, 외과적 수술의 경우에 매우 해결하기 어렵다. 폰 빌리브란트 질환의 치료는 1차 혈류정지(출혈 시간) 및 응고 결함을 교정하는 것이 반드시 필요하다.
이 질환의 치료는, FvW-풍부의 인간 혈장 파생물(예건대, 혈장의 동결침전된 분획물(cryoprecipitated fraction), 또는 인자 FVIII에 결합된 FvW을 충분하게 함유하는 FVIII 농축물)을 이용한 대체 치료에 의해 치료된다.
그러나, FvW는 정제하기 어려운 단백질이다. 실제로, 폰 빌리브란트 인자 는 혈장에 순환하는 공지의 가장 큰 단백질이다. FvW는 한 세트의 이황화 결합으로 결합된 다량체들(multimers)로 구성되며, 이의 염기 구조적 요소는 약 260 kDa의 분자량을 가진다. 혈장에서 가장 작은 FvW 형태는 440 내지 500 kDa의 이량체이며, 가장 큰 형태는 상기 이량체의 다량체로, 그 분자량이 2000만 달톤(daltons)까지 이를 수 있다. 상기 다량체의 하부 단위체의 배열은, 생산 세포에 특이적일 수 있다:FvW는 거대핵세포 및 내피 세포에서 합성되고 중합된다.
따라서, 그의 복잡성 및 FVIII에 대한 그의 결합 때문에, 폰 빌리브란트 인자 분자를 제조하기 매우 어렵다.
FvW 농축물을 제조하기 위한 다양한 방법은, 대개 원하지 않는 단백질(피브리노겐, 피브로넥틴 등)의 주종을 제거하기 위해 혈장 분획을 침전시키는 것으로 구성되는 단계들, 및/또는 다량체 형태의 완전성-특히 그들의 높은 분자량 및 치유 과정에서 결정적인 생물학적인 작용-을 보존하면서, 높은 특이적인 활성으로 고순도의 농축물을 제공하는 것을 목적으로 하는 크로마토그래피 단계들(이온-교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 입체-배제 크로마토그래피 등)와 조합한다.
유럽특허 EP 0 503 991는, 혈장 동결침전 분획물의 예비-정제 단계 및 세 가지 연속적인 크로마토그래피 단계, 세 번째는 아가로스 고정-젤라틴 컬럼상에서 수행되는 친화성 크로마토그래피를 포함하는, 산업적인 용량의 FvW 농축물의 제조 방법을 개시한다. 그 결과에 의해 획득된 FvW 농축물은 100 VWF 이상의 특이적인 활성을 가진다:RCo/mg의 단백질은 mg당 리스토세틴 공인자 활성 단위로 나타내며, 고분자량 다량체 농도는 최초 혈장 내의 농도 수준과 유사하다.
유럽특허출원 EP 0 934 748는 음이온-교환 및 양이온-교환 크로마토그래피의 조합으로 구성된 FvW 제조방법을 개시한다. 획득된 FvW 분획물은 100 IU FvW 이상의 특이적인 활성을 가진다:Ag/mg은 단백질 mg 당 FvW 항원 단위를 나타낸다. 그러나 여전히 유의미한 정도의 함량의 인자 VIII를 포함한다.
미합중국 특허 US 6,579,723는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 높게 정제된 FvW의 제조 방법을 개시하는 것으로, 면역 흡착제는 항-FvW 항체이다. 또한, 헤파린이 결합된 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 추가적인 단계가 더 제공될 수도 있다. 그러나, 이러한 면역친화성 정제의 단점은 면역 반응을 유도하는 잔여 항체들이 존재할 가능성이 있다는 것이다.
유럽특허 EP 0 383 234는 음이온-교환체 상에 인자 VIII을 고정시키기 위하여, 탄수화물을 함유하는 산성 용액(5.5 내지 6.5의 pH 범위)으로 수행하는 음이온-교환 크로마토그래피를 이용한 FvW 농축물의 제조를 개시한다. 기질을 수세하는 방법으로 피브로넥틴과 피브리노겐이 모두 잔류하지 않은 FvW를 회수하기 위하여, 정제된 FvW 농축물을 분리하기 위한 추가적인 침전 단계들이 요구된다.
EP 1 632 501는 연염(mild base) 타입의, 비닐 폴리머 기질을 이용한 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 분리를 포함하는, 폰 빌리브란트 인자-함유 생물학적 분획으로부터 고순도의 폰 빌리브란트 농축물을 제조하는 방법을 개시한다. 유리하게는, 이러한 방법은 매우 용이하게 수행될 수 있으며, 거의 인자 VIII가 없는 높은 특이성의 폰 빌리브란트 인자를 획득하는 것을 가능하게 한다.
FVIII 및 FvW는 매우 유용한 혈장-유래 단백질이며, 일부 사람들에서의 그들의 결함은 심각한 혈류정지 질환으로 유도한다. 그러므로, 환자들의 반복적인 사용에 적합하도록 순수한 정도의 생산물을 생산가능하게 하는 이들 단백질의 제조방법을 개발하는 것은 지극히 중요하다.
종래 기술에서 개시한 방법들은, 순수한 인자 VIII를 획득하는 것은 가능하지만 폰 빌리브란트 인자는 덜 순수한, 또는 FVIII 및 FvW 둘 모두 순수한 산물을 획득하는 것은 가능하지만 복잡하고 귀찮은 방법으로 수행되었다.
<발명의 요약>
본 발명은 FVIII와 FvW의 혼합물을 함유하는 용액, 또는 FvW-함유 용액, 또는 동물, 특히 비인간 동물의 분비물 또는 FVIII-함유 식물 추출물에서 유래된 용액을 정제하는 방법에 관한 것으로, FVIII 및 FvW로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 흡착할 수 있는 이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막상의 크로마토그래피 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
<발명의 상세한 설명>
그러므로, 본 발명의 목적은 (i) FVIII 및 FvW의 혼합물을 함유하는 용액, (ii) FvW을 함유하는 용액, (iii) 비인간 동물의 분비물로부터 유래된 용액, 및 (iv) FVIII-함유 식물 추출물에서 유래된 용액으로부터 선택된 용액으로부터 FVIII 또는 FvW을 정제하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막의 FVIII 또는 FvW의 흡착 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
도 1은 폰 빌리브란트 인자의 정제 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 인자 VIII의 정제 방법을 도식화한 것이다.
이 명세서에서 사용된, "정제 방법"은 매질에 존재하는 기타 분자들로부터 FVIII를 분리하는 방법, 또는 매질에 존재하는 기타 분자들로부터 FvW를 분리하는 방법, 또는 FvW로부터 FVIII를 분리하는 방법, 또는 매질에 존재하는 기타 분자들로부터 FVIII/FvW 복합체를 분리하는 방법을 의미한다. 이 분자들은 FVIII 및 FvW와는 상이한 단백질, 바이러스, 박테리아, 포자, 배양 배지 및 우태아 혈청일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
이 명세서에서 사용된 "FVIII"는, 특히 FIX 활성에서 공인자로 작용 가능하며 FvW와 복합체를 형성 가능한 모든 형태의 FVIII를 의미하는 것으로, 특히, 성숙 FVIII, 프로-펩타이드(프로-FVIII), 비성숙 FVIII을 함유하는 단백질 구성체, FVIII 전구체 (프리-프로-FVIII)를 포함하는 프로-FVIII와 같은 성숙 FVIII의 생물학적으로 활성적인 유도체들; 및 단일 펩타이드 및 프로-펩타이드의 절단 후에 획득된 성숙 FVIII이 있다. 기타 본 발명에 포함된 FVIII의 생물학적으로 활성적인 유도체들은 번역 후 변형이 진행되는 프로-약물이거나, 말단 결절 형태, 결손 형태(예를 들어, EP 218 712에 설명된 Arg-759 내지 Ser-1709 사이의 영역에서 하나 이상의 아미노산이 결손된 FVIII), 키메릭 형태 및 혈장 자연 성숙 형태와는 다른 번역 후 변형을 포함하는 형태 등의 생물학적으로 활성적인 형태가 변화된 프로-약물이었다. 이 다양한 FVIII 형태들은 예를 들면, 성숙 FVIII의 변형에 의하여 생산될 수도 있으며, 혈액에서 자연적으로 발생된 다른 형태일 수도 있다. 이러한 FVIII를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 다양한 원천으로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 인간, 돼지, 양, 소, 말과 및 양 아과의 원천을 포함하는 포유동물로 부터 유래될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
이 명세서에서 사용된 "FvW"는, 모든 FvW 형태를 의미하는 것으로, 특히 성숙 FvW; 및 프로-펩타이드, 및 FvW 전구체(프리-프로-FvW), FvW 프로펩타이드(프로-FvW)를 포함하는, 비성숙 FvW을 함유하는 단백질 구성체를 포함하는 프로-FvW 같은 성숙 FvW의 생물학적으로 활성적인 유도체들; 단일 펩타이드 및 프로-펩타이드의 절단 후에 획득된 성숙 FvW이 있다. 기타 본 발명에 포함된 FvW의 생물학적으로 활성적인 유도체들은 번역 후 변형이 진행되는 프로-약물이거나 또는 말단 결절 형태, 결손 형태(예를 들어, 단백질가수분해-저항(proteolysis-resistant)인 A2 도메인이 결손된(이하, A2 도메인-결손) FvW(Lankhof and al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997)), 당단백질 1b-결합 도메인 및 콜라겐과 헤파린에 대한 결합 자리를 포함하는 Val 449 내지 Asn 730 사이의 FvW 단편(Pietu and al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989), 키메릭 형태 및 혈장의 자연 성숙 형태와는 다른, 번역 후 변형을 포함하는 형태 등의 생물학적으로 활성적인 형태가 변환된 프로-약물이었다. 이 다양한 FvW 형태들은 예를 들면, 성숙 FvW의 변형에 의하여 제조될 수도 있으며, 혈액에서 자연적으로 발생된 어떤 다른 형태일 수도 있다. 이러한 FvW를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 다양한 원천으로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 인간, 돼지, 양, 소, 말과 및 양 아과의 원천을 포함하는 포유동물로 부터 유래될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
이 명세서에서 사용된 "FVIII 및 FvW 혼합물을 포함하는 용액"은, 섞여진 상태로 또는 분리된 상태의, FVIII 및 FvW을 포함하는 모든 용액을 의미한다. 이 용액들은 혈장의, 재조합의 또는 유전자 이식 기원일 수도 있다.
이 용액이 재조합 기원일 때는, FVIII 및 FvW 단백질 발현이 유도되는 단세포성 시스템에서 유래되어 진다. 각각의 단백질을 암호화하는 유전자를-바람직하게는 인간의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질감염시킨 모든 동물 세포주 또는 인간 세포주가 언급될 수 있으며, 여기에서 상기 세포주는 특히 CHO-K, CHO-LeC10, CHO Lec-1, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, YB2/0 (ATCC CRL-1662), BHK, K61-I6, NSO, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8. 653, SK-Hep, HepG2, PERC6 (Crucell) 세포주 뿐만 아니라, 식물 세포, 박테리아 시스템(예를들어, E. coli), 균류(곰팡이) 시스템, 바이러스(특히, 배큘로바이러스)를 이용하는 시스템으로부터 선택되며, 이에 한정되지 않는다.
이러한 세포성 시스템은 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 FvW 및 FVIII 단백질을 발현한다. US 5,198,349는 하나의 예시로서 언급될 수 있는 것으로 참조로서 이 명세서에 병합되어진다. 상기 문헌은 FVIII 및 FvW 공동-발현을 개시하는데, 특히 한편으로는, FVIII의 암호서열이 삽입된 발현벡터 및 다른 한편으로는, FvW 암호 서열이 삽입된 발현벡터를 공동-형질감염시킨 CHO 세포에서의 공동-발현을 개시한다.
이 용액이 유전자이식 기원일 때는, 다세포성 시스템-특히, 유전자 이식에 의해 획득된 동물이나 식물에서 유래되며, 상기 다세포성 시스템은 재조합 DNA 분자를 (받아서) 가진 하나 또는 그 이상의 세포(들)를 말한다. 그의 적합한 예시들로는 개, 고양이, 생쥐, 쥐, 햄스터, 소, 염소, 양, 토끼 및 돼지, 말, 곤충, 식물(예를 들어, 담배, 콩)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
FVIII 및 FvW가 동물에 의해 생산된다면, 이 생산은 동물에서 분비되는 다양한 매질-예를 들어, 뇨, 혈액, 침 또는 젖에서 발생되며, 이에 한정되지 않는다. 이러한 생산 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행된다. EP 0 741 515 및 EP 807 170가 예시로 언급되나, 이에 한정되지는 않는다. 후자는 FVIII 및 FvW를 암호화하는 DNA 분자가 동물 게놈에 안정한 방식으로 통합되어 둘 모두가 발현되어 젖에 분비되는, 유전자이식 동물의 생산을 개시한다.
FVIII 및 FvW가 식물에서 생산되었을 때, 이 생산은, 예를 들어, US 6,331,416 및 US 5,994,628에서 기술한 바와 같이 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행되며, 이에 한정되지 않는다.
이 용액이 혈장성 기원일 때는, 동물- 또는 인간-기원의 혈장 중의 하나, 또는 동결침전물, 또는 표준 분획화 방법에 의해 획득된 분획물(Cohn and al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler and al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424)일 수도 있다. 이 분획물들에는 선택적으로 수산화 알루미늄에 흡착 등과 같은 예비-정제 처리가 시행될 수도 있다.
FVIII 및 FvW 혼합물은 이들 단백질들이 대략 유사한 양으로 존재하거나, 또는 다른 단백질에 비해 한 단백질이 우세하게 존재하거나, 또는 심지어 다른 단백질에 비해 한 단백질이 매우 우세하게 존재하는 것을 의미한다.
이 명세서에서 사용된, "FvW 함유하는 용액"은 FVIII가 소량이거나 심지어 거의 없는 것을 말하는 것으로, 실질적으로 FVIII가 전혀 없는, FvW를 함유하는 모든 용액을 의미한다. 이 용액은 재조합의, 유전자 이식의 또는 혈장 기원의 것일 수 있다.
이 용액이 재조합 기원일 때, 용액은 FvW 단백질 발현이 유도되는 단세포성 시스템에서 유래된다. 그의 적합한 예시들은 이 단백질을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 인간의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질감염시킨 모든 동물 세포주 또는 인간 세포주를 포함하며, 여기에서 상기 세포주는 특히 CHO-K, CHO-LeC10, CHO Lec-1, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, YB2/0, BHK, K61-I6, NSO, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8. 653, SK-Hep, HepG2 세포주 뿐만 아니라, 식물 세포, 박테리아 시스템(예를들어, E. coli), 균류 시스템, 바이러스 시스템 (특히, 배큘로바이러스)으로부터 선택되며, 이에 한정되지 않는다.
이러한 세포성 시스템은 FvW 단백질을 발현하며, 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 획득될 수 있다. US 5,198,349 및 WO 89/06096는 적합한 예시로 언급될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. US 5,198,349는 인간 FvW를 암호화하는 cDNA를 발현 벡터에 삽입에 의하여, COS 세포에서의 인간 FvW 발현을 개시한다.
이 용액이 유전자 이식 기원일 때는, 다세포성 시스템-특히, 유전자 이식 방법으로 획득된 동물이나 식물에서 유래되며, 상기 다세포성 시스템은 FvW 암호화하는 재조합 DNA 분자를 (받아서) 가진 하나 또는 그 이상의 세포(들)를 말한다. 그의 적합한 예시들로는 개, 고양이, 생쥐, 쥐, 소, 염소, 양, 토끼 및 돼지, 곤충, 식물(예를 들어, 담배, 콩)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
FvW가 유전자 이식 동물에 의해 생산될 때, 이 단백질들은 동물에서 분비되는 다양한 매질-예를 들어, 뇨, 혈액, 침 또는 젖에서 생산될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 이러한 생산 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. WO 2001/022810 및 WO 1999/058699는 그의 적합한 예시였으며, 이에 한정되지는 않는다. 이에 대하여, WO 2001/022810는 젖에서 인간 FvW를 생산하는 유전자 이식 생쥐 암컷의 생산을 기술한다.
FvW가 식물에서 생산될 때, 예를 들어, US 6,331,416 및 US 5,994,628에 기술되어 있는 바와 같이 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 FvW가 생산될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
이 용액이 혈장성 기원일 때는, 동물 또는 인간 혈장 분획물 중의 하나, 또는 동결침전물, 또는 표준 분획화 방법에 의해 획득된 분획물(Cohn and al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler and al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424)일 수도 있다. 이 분획물들은 수산화알루미늄에 흡착 등과 같은 예비-정제 처리를 임의로 시행할 수도 있다.
이 명세서에서 사용된 "FVIII를 함유하는 비인간 동물의 분비물로부터 유래된 용액"은, 예를 들면, 혈장, 침, 뇨 또는 젖의 분비물 중 어느 하나에서 FVIII 분자가 발현되도록 유전자 조작된 유전자 이식 동물에서 생산되는, 모든 분비물, 예컨대, 상기 언급한 분비물로부터 유래된 모든 용액을 의미한다. 이 경우에, FvW는 유전자 이식 동물에서 발현되지 않는다. 또한, 이 명세서에서 사용된 "FVIII-함유 혈장에서 유래된 용액"은 인간 또는 동물 FVIII가 자연적으로 함유된 혈장으로부터 유래된 모든 용액을 포함하는 것을 의미하며, 이 용액에는 FvW는 실질적으로 포함되어 있지 않다. 이것은 동물이나 인간의 혈장 분획물, 또는 동결침전물, 또는 표준 분획화 방법에 의해 획득된 분획물(Cohn and al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler and al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424)에서 유래될 수 있다. 이 분획물들은 수산화 알루미늄에 흡착 등과 같은 예비-정제 처리를 임의로 시행할 수도 있다.
유전자 이식 동물에서 분비물을 생산하는 방법들은 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 이의 적합한 예시들로는 US 5,880,327 및 US2007/0011752이 포함되며, 이에 한정되지 않는다. 이에 대하여, US 5,880,327는 유전자 이식 생쥐의 젖에서 인간 FVIII의 생산을 기술한다. US2007/0011752는 다양한 동물의 침에서 인간의 단백질, 예를 들어 FVIII의 생산을 기술한다.
이 명세서에서 사용된 "FVIII-함유 식물 추출물로부터 유래된 용액"은, FVIII 분자를 발현하도록 유전자 조작된 유전자이식 식물의 식물체 또는 세포에서 획득된, 특히 인간 기원의, FVIII 단백질을 함유하는 식물의 모든 분획물을 의미하는 것이다.
이러한 추출물은 FVIII을 암호화하는 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 벡터를 식물 세포에 도입하여 생산된 것일 수 있다. 이러한 방법들은 당업계의 숙련자에게 잘 알려졌으며, 예를 들어 US 2005/0060775와 같은 당업계에 속해 있는 수많은 문헌에 의해 기술될 수도 있다.
이 명세서에서 사용된 "이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막"은, 단백질이 막을 통과해 배수될 때 이온교환에 의해 FVIII 및/또는 FvW을 흡착시킬 수 있는 모든 물리적 반투과막을 의미한다. 게다가, 이 막과 FVIII 및/또는 FvW 간의 이온-교환 상호작용이 막 상에 더 이상 FVIII 및 FvW을 잔류시키기 충분하지 않을 때, 이 막은 FVIII 및 FvW을 통과하게 할 수 있다
따라서, 본 발명에 따르는 FVIII 또는 FvW를 정제하는 방법을 수행하기 위해서는, 큰 기공성 기질로 제조되며, 상기 기질에 고정되어 있으며, 음전하 또는 양전하로 코팅되어 있으며, 상기 코팅은 이온-교환 성질에 의해 여과기-타입 막에 제공되는 이온-교환 여과기-타입 막이 사용된다. 일반적으로, 음전하 또는 양전하 코팅은 화학적 부착을 통하여 큰 기공성 기질 상에 고정된다.
큰 기공성 기질의 투과성(porosity) 즉, 그의 평균 구멍 크기는, FVIII 및 FvW가 여과기-타입 막을 통과해 흘려보내질 수 있는 정도이다. 이러한 막을 사용하는 첫 번째 이점은 일회용 교환의 여과기-타입 막의 사용 가능성에 있으며, 일회용 막의 사용은 이 방법의 위생적인 안정성 수준을 향상시킨다. 이러한 막을 사용하는 두 번째 이점은, 정제할 용액을 매우 높은 흐름율(속도)하에서 본 발명의 정제 방법 및 더 상세하게는 이온-교환 크로마토그래피 단계(들)을 수행할 조절할 가능성에 있다.
모든 타입의 물리적 장벽의 기질은, 예를 들어, 폴리머 필름, 심지, 속이 텅빈 섬유, 안정화된 셀룰로스, 폴리에테르술폰, 또는 기타의, FVIII 및 FvW가 통과할 수 있는 3차 구조 등의 본 발명의 구현에 맞는 여과기-타입 막에 적합할 것이다.
여과기-타입 막과 FVIII 및 FvW 단백질 간의 이온-교환 상호 작용은 큰 기공성 기질 상에 고정된 양전하 또는 음전하 코팅에 기인한 것으로, 상기 코팅은 염기성 또는 산성 기능적인 분체가 교체될 수도 있다.
이온-교환 코팅은 오직 한 가지 타입의 기능적인 분체를 갖는 단일기능성 타입, 또는 여러 가지 타입의 기능성 분체를 갖는 다중기능성 타입일 수도 있다.
따라서, FVIII 및 FvW 단백질들과 막 간의 상호 작용 덕분에, 여과기-타입 막은 두 단백질 모두를 동시에 잡거나 흡착할 수 있다. 막 상에 FVIII 및 FvW을 함유하는 용액을 적용했을 때, FvW 및 FVIII는 이온-교환 상호 작용 덕분에 막에 잔류하였다.
정제할 생산물들이 동결침전물에 포함되지 않았을 때는, 충분히 오염제들이 제거된 용액을 얻기 위하여, 본 발명에 따른 정제방법을 수행하기 전에 용액의 예비-정제 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
이 예비-정제 단계는, 특히, 아주 많은 단백질을 포함하는 매질인, 예를 들어 젖이나 혈장에서 유래된 까다로운 용액에 유리할 것이다. 이러한 예비-정제 단계는 특히, 예를 들어 WO 2004/076695에서 기술된 것과 같은 확인 단계나, 또는 예를 들어 FR 06 04864 또는 FR 06 11536에서 기술된 것과 같은 추출 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이에 대하여, FR 06 04864는 하기의 단계와 혼합하여 또는 단독으로, 젖에 존재하는 적어도 하나의 단백질 추출 방법을 개시하며, 상기 젖은 칼슘 이온들에 대한 친화성을 가진다:
(i) 예로서 인산나트륨 등의 수용성 염을 젖에 접촉시켜 얻은 칼슘 화합물을 침전시켜 단백질을 방출시키는 단계로, 단백질이 풍부한 액체 상을 얻기 위하여 상기 수용성 염의 음이온이 이러한 매질에서 상기 불용성의 칼슘 화합물을 형성시키는 능력이 있는 것으로 선택되는 것임,
(ii) 상기 칼슘 화합물 침전물로부터 단백질이 풍부한 액체상을 분리하는 단계로, 상기 액체상은 지질상 및 단백질이 포함된 수용성의 비지질상을 형성하기 위해 더 분리되는 것임, 및
(iii) 단백질을 포함하는 수용성의 비지질상을 회수하는 단계.
또한, FR 06 11536는 젖의 중성 pH에서 적어도 하나의 소수성 주머니(pocket)를 가지며 및 음전하인 것인, 하기 단계를 포함하는, 젖에 존재하는 단백질의 추출방법을 개시한다:
a) 상기 젖의 탈지(skimming) 및 탈지방(delipidating) 단계,
b) 상기 단백질을 함유하는 탈지방 및 탈지 분획물을 소수성 및 이온성 특징을 모두 가진 리간드가 접목된 크로마토그래피 기질, 예를 들어, 상기 단백질이 상기 기질에 잔류 가능한 pH 조건 하의 4-머캅토-에틸-피리딘에 적용하는 단계,
c) 상기 단백질을 용출하는 단계,
d) 상기 용출된 분획으로부터 젖 단백질들을 제거하여 용출된 분획을 정제하는 단계, 및
e) 상기 단백질을 회수하는 단계.
세포성 시스템에 의해 생산된 용액의 경우에는, 세포 배양 단계 등의 단계 다음에 즉시 예비-정제 단계를 수행할 수도 있다. 세포 배양 배지의 조성은 세포에 의해 생산된 단백질이 세포외 배지에 배출되도록 조절될 수 있다. 게다가, 세포 선별은 결과 단백질이 배지에 배출되도록 수행될 수 있다.
그 후에, 본 발명에 따른 정제 방법의 단계에 적합한 예비-정제를 획득하기 위해 심층 여과(depth filtration) 단계 또는 접선(tangential) 마이크로-여과가 필요할 수 있다.
본 발명의 일부 특정 실시예들에 따르면, 여과기-타입 막은 양이온-교환 선택적인 막이다. 막에 의해 운반되는 기능적인 그룹의 양성 대조군-이온들은 FvW 및 FVIII상에 동일 부호의 전하로 대체되었다.
양이온-교환 코팅에 사용될 수 있는 기능성 그룹들은 카르복시메틸(CM), 포스포릴 및 술포프로필(SP), 술패이트(S)를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
양이온-교환 여과기-타입 막을 이용한 이 실시예들에 따르면, 사용할 수 있는 완충용액은 트리스-하이드록시메틸-아미노메탄, 탄산염, 에틸렌 디아민, 이미다졸 또는 트리에탄올아민 이 포함되며, 이에 한정되지 않는다.
이 실시예들에서, 완충용액의 pH 값은 당업계의 숙련된 사람에게 공지된 일반적인 방법에 따라 그러한 pH 값에서, 단백질이 전반적으로 양성의 전하를 갖도록 단백질의 등전점에 의존하여 선택될 수 있다.
본 발명의 더 구체적인 예시에 따르면, 실시된 여과기-타입 막은 음이온-교환 선택적인 막이다. 막에 의해 운반되는 기능적인 분체의 음성 대조군-이온은 FvW 및 FVIII 상에 동일 부호의 전하로 대체되었다.
음이온-교환 코팅에 사용될 수 있는 기능적인 분체들(functional moieties)는 디에틸아미노에틸(DEAE), 디에틸(2-하이드록시프로필) 아미노에틸 또는 4차 암모늄 (QAE, Q), 디메틸아미노에틸 (DMAE) 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)는 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 이 예시들에 따르면, 사용될 수 있는 완충용액은 아세트산염, 구연산염, 인산염, 글리신, 바르비투르산염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
이 실시예에서, 완충용액의 pH 값은 당업계의 숙련된 사람에게 공지된 일반적인 방법에 따라 그러한 pH 값에서 단백질은 전반적으로 음성의 전하를 갖도록 단백질의 등전점에 의존하여 선택될 수 있다.
바람직하게, 여과기-타입 막은 강한 음이온-교환체로 구성된 이온-교환 코팅을 포함한다.
이 명세서에서 사용된 "강한 음이온-교환체"는, 약하게 이온화된 단백질들을 흡착할 수 있는 모든 음이온-교환 막을 의미한다.
이러한 여과기-타입 막들은 상업적으로 활용가능하였다. 적합한 예시들로 QAE 또는 Q 분체들을 운반하는 막들, 특히 머스탱 Q® 막 (Pall) 또는 사토바인드 Q 막 (Sartorius)이 포함되며, 이에 한정되지 않는다.
머스탱 Q 막(Pall)은 특히 흥미로운데, 이는 이 막이 높은 흡착 능력과 높은 크로마토그래피 부피 흐름을 가질 뿐만 아니라, 이 막을 단회(일회용) 또는 여러 번 사용할 수 있기 때문이다.
게다가, 상기 막은 재생 및 살균(바이러스 및 프리온 방어 프로토콜 등) 같은 기질의 수세 승인 단계를 수행할 필요가 없다.
이러한 여과기-타입 막의 사용은 또한 표준 기질에 대하여 전통적으로 수행되는 노화 연구를 이행할 필요가 없도록 한다.
따라서, 이러한 막의 이용은 당업계의 방법과 비교하여 생산 시간을 감소시킬 수 있다.
바람직하게, 정제를 위하여 용액과 접촉되는 여과기-타입 막의 표면은 화학적 부착방법으로 큰 기공성 기질상에 고정된 4차 암모늄 그룹을 함유하는 음이온-교환 코팅을 포함한다.
더 구체적인 실시예에서, 여과기-타입 막은 큰 기공성 막이다.
이 명세서에서 사용된 용어 "큰 기공성"은, 막 기공의 크기가 0.3 μm 내지 1.0 μm의 범위로 구성된 시스템을 의미한다. 더욱 바람직하게는 기공의 크기가 0.5 μm 내지 0.9 μm의 범위이다. 가장 바람직하게는 기공의 크기가 0.8 μm이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 막 기질은 폴리에테르술폰 기질이다.
예시로서, 이러한 폴리에테르술폰 막은 폴 사(Pall)에서 판매되는 머스탱 Q® 막일 수도 있다. 이 막은 0.8μm 직경의 구멍을 가지며, 4차 아민 그룹이 부착되어 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 정제할 용액은 FVIII 또는 FvW를 함유하며, 혈장 기원의 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 정제할 용액은 FVIII 및 FvW의 혼합물을 함유하며, 더 바람직하게는 혈장에서 유래된 것이다.
따라서, 본 발명의 이 예시들에 따르면, 용액은 자연의, 인간의 또는 동물 혈장에서 유래되며, 다시 말해 자연적으로 인간 또는 동물의 FVIII 및 FvW이 각각 포함된 인간 또는 동물의 혈장으로부터 유래된다. 이러한 동물의 혈장은 돼지, 토끼, 염소에서 수집될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
놀랍게도, 본 출원인은 여과기-타입 막들, 특히 머스탱 Q® 막이 수지나 겔의 막에 비해 FVIII 및/또는 FvW 흡착능이 더 높다는 것을 발견하였다. 이 명세서에서 사용된 "흡착능"은, 겔에 고정된 목적 단백질의 함량을 의미하며, 대개 음이온성 수지에 대한 겔에 고정된 BSA(우혈청 알부민)의 함량을 겔이나 수지 제조사에서 표기한다. 예를 들어, 전통적으로 FVIII 및/또는 FvW를 정제하기 위해 사용한 DEAE-TOYOPEARL® 겔의 경우는 25 내지 35 mg/ml인 반면, 머스탱 Q® 막의 흡착능은 30 mg/ml로 더 높거나 동일하다.
여과기-타입 막의 높은 흡착능은, 겔이나 수지와 비교하여, 같은 양의 FVIII 및/또는 FvW을 흡착하기 위한 등가의 겔에 대하여 더 작은 함량이 사용될 가능성을 의미한다. 기술한 바와 같이, DEAE 겔상에서는 50 내지 80 IU의 FvW 및 FVIII/ml 이 흡착될 수 있고, 머스탱 Q® 막상의 등가 겔에서는 200 내지 250 IU VWF 및 FVIII/ ml이 흡착될 수 있다.
겔이나 수지와 비교시 여과기-타입 막의 가장 높은 흡착능은, 이온화된 자리에 FVIII 및/또는 FvW의- 특히, FVIII/FvW 복합체를 형성할 때, 접근성이 향상될 수 있다. 실제로, 이 단백질들은- 특히, FVIII/FvW 복합체를 형성할 때 큰 크기를 가지며, 이온화 자리가 채널 안에 박혀 있어서 큰 단백질들과 덜 접촉하게 하는 겔이나 수지상에 비해, 구멍의 크기에 기인하여 큰 크기의 여과기-타입 막 상에 이온화된 자리가 부착되었을 때 이온화된 자리는 그 복합체에 더 쉽게 접근할 수 있다고 추측할 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 바람직한 예시에 따르면, 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 혈장으로부터 동결침전물을 제공하는 단계
b) 상기 이온-교환 크로마토그래피 막 상에, 더 바람직하게는 음이온-교환 크로마토그래피 막 상에 인자 VIII 및 폰 빌리브란트 인자를 포획하는 단계(흡착시키는 단계), 및
c) 용출 완충용액의 이온 강도 값을 연속적으로 증가시켜 폰 빌리브란트 인자 및 인자 VIII를 선택적으로 회수하는 단계.
유리하게는, 혈장으로부터 동결침전물을 제공하는 단계 다음에, 인자 VIII 및 폰 빌리브란트 인자를 알루미나 겔에 흡착시킨 다음 차갑게 침전 시키는 방법으로 예비-정제 단계를 수행할 수 있다.
상기 방법의 단계 c)에서, 용출 완충용액의 이온 강도 값은, FvW 및 FVIII 단백질 각각의 물리-화학적 성질과 제조자가 제공한 권고내용에 의한 여과기-타입 막의 이온-교환 성질에 대한 일반적인 지식에 기반으로 하여 당업계의 기술자에 의해 쉽게 조절된다. 특히, 당업계의 기술자는, 그의 일반적인 지식을 기반으로 하여, 동일한 기질로부터 FvW를 용출하기 위해 필요한 이온 강도 값보다 더 높은 값의 이온 강도 값을 갖는 완충용액으로 음이온-교환 크로마토그래피 기질에서 FVIII가 용출된다는 것을 안다.
따라서, 상기 방법의 단계 c)에서, 당업계의 기술자는 (i) FvW, (ii) FvW 및 FVIII, 또는 (iii) 1차 FvW 용출 후에 연속적인 FVIII의 용출용(기질로부터 탈착용)으로 적합한 이온 강도 값을 가지는 완충용액을 사용한다. 1차 FvW 용출 후에 연속적인 FVIII의 용출로 구성된 대체(iii)의 첫 번째 예시에 따르면, 당업계의 기술자는 두 가지의 용출 완충용액을 연속적으로 사용할 수 있으며, 각각의 용출 완충용액은 FvW 또는 FVIII 각각을 탈착시키도록 조정된 이온 강도 값을 가진다. 대체(iii)의 두 번째 예시에 따르면, 당업계의 기술자는 이온 강도 기울기를 증가시킬 수 있는 완충용액으로 FvW를 탈착시킨 다음, FVIII를 연속적으로 탈착시켜 용출을 수행한다.
따라서, 상기 방법의 단계 c)에 사용된 "용출 완충용액의 이온 강도 값의 연속적인 증가"는, 용출 완충용액의 이온 강도 값의 직선 증가를 포함하는 것으로, 염-예를 들어, 염화나트륨, 염화칼슘을 추가하여 획득될 수 있으며, 이에, 한정되지 않는다.
먼저 FvW 용출물을 획득한 다음 완충용액의 이온 강도 값을 증가시켜 FVIII 용출물을 획득할 수 있다. 그러므로, 결국 FvW를 회수하고 FvV를 획득한 다음 용출을 정지하거나, 용출을 지속시켜 FVIII를 획득하는 것이 가능하다.
이 명세서에서 사용된 "동결침전물"은, 저온-침전 방법을 사용하여 인간이나 동물의 혈장으로부터 획득한 침전물을 의미한다. 동결침전물은 당업계의 기술자로부터 잘 알려진 방법으로 획득될 수 있다. 예를 들어, 냉동 혈장을 약 -5℃ 내지 -15℃의 온도에 둔 다음, 1℃ 또는 임의로 4℃를 넘지 않는 온도로 뒤섞으면서 천천히 데웠다. 이 상태 하에서, 냉동 혈장은 녹아내려 액체상과 고체상으로 된다. 그런 다음, 원심분리하여 고체층, 즉, 동결침전물을 회수한다. 동결침전물은 실질적으로 피브리노겐, 피브로넥틴, 인자 VIII 및 폰 빌리브란트 인자 (vWF)로 구성된다. 동결침전물에서, FVIII는 일반적으로 FvW와 결합하여, 이에 의해 FVIII가 안정화 된다.
이 명세서에 사용된 "선택적으로 회수"는, 용출 방법 또는 기대되는 단백질(들)에 따라, FVIII 또는 FvW, 또는 FVIII와 FvW의 혼합물을 회수하는 능력을 의미한다.
당업계의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라, pH 값을 변화시키거나 또는 용출 완충용액의 이온 강도를 증가시키는 방법으로, FVIII 또는 FvW, 또는 FVIII와 FvW의 혼합물을 획득할 수 있다(실시예 1 참조).
추가 실시예에서, 정제할 용액은 재조합 기원 또는 유전자 이식 기원의 FVIII 및 FvW 혼합물을 포함한다.
이 예시는 하기 단계를 포함한다:
a) FVIII 및 FvW를 함유하는 세포 배양 상등액 또는 예비 정제된 용액을 준비하는 단계,
b) 상기 이온-교환 크로마토그래피 막 상에, 더 바람직하게는 음이온-교환 크로마토그래피 막 상에 인자 VIII 및 폰 빌리브란트 인자를 포획하는 단계, 및
c) 용출 완충용액의 이온 강도 값을 연속적으로 증가시켜 폰 빌리브란트 인자 및 인자 VIII를 선택적으로 회수하는 단계.
본 발명의 구체적인 예시에 따르면, 정제하기 위한 용액은 FVIII 또는 FvW을 함유한다.
이 예시는 하기 단계를 포함한다:
a) FVIII 또는 FvW를 포함하는 세포 배양 상등액 또는 정제된 용액을 준비하는 단계,
b) 상기 이온-교환 크로마토그래피 막 상에, 더 바람직하게는 음이온-교환 크로마토그래피 막 상에 인자 VIII 또는 폰 빌리브란트 인자를 포획하는 단계, 및
c) 폰 빌리브란트 인자 또는 인자 VIII를 회수하는 단계.
유리하게는, 혈장 분획으로부터 실시되며, 본 발명의 방법은 비타민-K 의존성 인자, 피브리노겐 및 피브로넥틴의 함량을 감소시킬 수 있다.
유리하게는, 특히 정제할 용액은 FVIII 및 FvW의 혼합물을 포함할 때, 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 FvW 및 FVIII를 선택적으로 회수될 수 있다:
c1) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을 증가시켜 FvW를 용출하는 단계. 예를 들어, 대략 600 내지 660 mOsm/Kg 범위의 삼투압에 다다를 때까지 염화나트륨 0.25 M을 첨가하여 이온 강도 값을 증가시킬 수 있다.
c2) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을 폰 빌리브란트 인자의 경우보다 더 증가시켜 FVIII를 용출시키는 단계. 예를 들어, 대략 1400 내지 1700 mOsm/Kg 범위의 삼투압에 다다를 때까지 염화나트륨 0.7 M 또는 염화칼슘 0.35 M을 첨가하여 이온 강도 값을 증가시킬 수 있다.
단계 c1)는 이온-교환 여과기-타입 막으로부터 FvW를 탈착시키는데 적합한 이온 강도 값을 가지는 완충용액이 사용될 동안 FvW이 선택적으로 회수되는 단계이다.
단계 c2)는 이온-교환 여과기-타입 막에서 FVIII를 탈착시키는데 적합한 이온 강도 값을 가지는 완충용액이 사용될 동안 FVIII이 선택적으로 회수되는 단계이다. 단계 c2)에서, 단계 c1)에 사용된 완충용액의 이온 강도 값보다 높은 이온 강도 값을 가지는 완충용액이 사용된다.
이 단계들은 이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막상에 FVIII 및 FvW의 동시 포획 단계 후에 수행되었다.
단계 c1)에서 용출된 FvW는 FVIII를 거의 포함하지 않는다. 이것을 회수하여 정제된 FvW를 획득한다.
게다가, 단계 c2)에서 획득한 FVIII는 초기 용액보다 적은 FvW를 포함한다. 이것을 회수하여 정제된 FVIII 용액을 획득한다.
선택적으로, 예를 들어, EP 1 037 923에서 개시된 바와 같이, 고분자량의 FVIII-FvW 복합체를 분리하기 위하여 추가 단계를 수행할 수 있다. 그런 다음, 선택적으로, WO 2005/040214에서 개시한 바와 같이, 정제된 FVIII 용액을 위하여 20nm보다 작거나 동일한, 특히 15nm와 동일한 다공성을 가진 친수성 여과기에서 추가적인 여과 단계가 수행될 수 있다.
더 구체적인 예시에서, 본 발명의 방법은 상기 이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막에서 FVIII 및 FvW를 동시에 흡착하는 단계 후에 하기의 단계를 수행하여 정제된 FvW 용액을 획득할 수 있다:
d) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충 용액의 이온 강도 값을 증가시켜 FvW를 용출하는 단계,
e) 이온-교환 크로마토그래피 막에, 더욱 바람직하게는 첫 번째 막과 동일한 타입의 이온-교환 크로마토그래피 막에 폰 빌리브란트 인자를 포획하는 단계, 및
f) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온강도 값을 증가시켜 폰 빌리브란트 인자를 용출하는 단계.
이 예시에서, 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을 증가시켜 FvW 용출하는 단계 d) 후에, 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을 폰 빌리브란트 인자의 회수를 위한 경우보다 심지어 높이 증가시켜 FVIII를 용출하는 것이 선택적으로 가능하다. 따라서, 간소한 방법으로 정제된 FvW-함유 용액과 정제된 FVIII-함유 용액이 획득되었다.
따라서, 유리하게는, 본 발명의 방법은 FVIII 및 FvW를 함유하는 용액에서 FVIII 및 FvW을 순차적으로 또는 동시에 정제하여 얻을 수 있다. 만약 상기 용액이 혈장 유래의 용액이라면, 인간 또는 동물 혈장을 가능한 많이 사용하는 이점이 있기 때문에 본 발명의 방법은 특히 유리하다.
유리하게는, 이 구체적인 예시는 하기의 단계를 추가로 포함한다:
g) 젤라틴 리간드를 보유한 친화성 겔 컬럼 상에서 단계 c)에서 용출된 폰 빌리브란트 인자-풍부 분획물의 크로마토그래피를 수행하는 단계, 및
h) 피브로넥틴이 잔류하지 않아 전혀 없는 폰 빌리브란트 인자를 회수하는 단계.
피브로넥틴 분석검사는 당업계의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어, 면역-비탁법(immuno-nephelometry)으로 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법의 예시를, 이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막에 FVIII 및 FvW를 동시에 포획하는 단계 후에 하기의 단계를 수행하여 정제된 FVIII 용액 및 정제된 FvW 용액을 획득할 수 있다:
a) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을 증가시켜 FvW를 용출하는 단계,
b) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을, 심지어 폰 빌리브란트 인자의 회수를 위한 경우보다 많이 증가시켜 FVIII를 용출하는 단계,
c) 이온-교환 크로마토그래피 막에 폰 빌리브란트 인자를 포획하는 단계,
d) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온강도 값을 증가시켜 폰 빌리브란트 인자를 용출하는 단계,
e) 젤라틴 리간드를 보유한 친화성 겔 컬럼 상에서 단계 d)에서 용출된 폰 빌리브란트 인자-풍부 분획의 크로마토그래피를 수행하는 단계, 및
f) 친화성 겔상에 잔류되지 않은 폰 빌리브란트 인자-풍부 분획을 회수하는 단계.
따라서, 이 예시에서, 정제된 FVIII 용액과 정제된 FvW 용액을 연속적으로 획득하였다.
따라서, 이 다양한 예시들에서, 본 발명의 방법은 간단한 방식으로 FVIII 및 FvW을 분리하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 정제 단계들은, 음이온-교환 크로마토그래피 선택적 막에 인자 VIII와 폰 빌리브란트 인자를 모두 동시에 포획하여, 혈장에서 인자 VIII와 폰 빌리브란트 인자를 각각 또는 동시에 정제할 수 있도록 하는 유일한 방법이다.
본 발명의 추가적인 목적은 본 발명에 따른 정제 방법의 수행을 포함하는 정제된 FVIII의 조제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 본 발명에 따른 정제 방법의 수행을 포함하는 정제된 FvW의 조제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 관점이나 이점은 하기의 예시들로 설명할수 있을 것이며, 하기의 예시들은 본 발명의 목적을 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
폰 빌리브란트 인자의 정제 방법
1℃ 에서 6℃ 사이의 온도로 신선한 냉동 혈장을 해동하여 동결침전물을 준비하였다.
원심분리 후에, 피브리노겐, 피브로넥틴, 폰 빌리브란트 인자 및 인자 VIII를 함유하는 동결침전물을 회수하여 헤파린 나트륨(3 IU/mL)을 함유하는 수용성 용액에 슬러리화하였다. 그런 다음 용액의 pH 값을 7.0 + 0.1로 조정하였다.
슬러리화된 동결침전물을 비타민 K 의존 인자를 제거하기 위하여 알루미나 겔에 흡착시키고, 피브리노겐 및 피브로넥틴 냉장 침전시켜 예비-정제하였다. 따라서, 5분 동안 교반하면서 수산화 알루미늄을 현탁물에 첨가하였다. 0.1M 아세트산을 이용하여 pH 값을 6.5 ± 0.2로 조정하고 용액의 온도가 14-18℃의 범위가 될 때까지 용액을 교반하면서 식혔다. 그런 다음, 그 용액을 14-18℃의 온도에서 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 0.22 μm 여과기로 여과하여 정제하였다.
그런 다음, 상기 예비정제된 용액을 외피 바이러스에 효과적인 폴리솔배이트 80 (1%, w/v) 및 트리-n-부틸 인산 (0.3%, v/v)의 존재하에 용매/계면활성제를 처리하여 바이러스 불활성 단계를 수행하였다. 용매/계면활성제의 처리는 pH 7.1에서 적어도 6 시간 동안 수행하였다.
그런 다음, 용매/계면활성제-처리의 단백질 용액을 370 내지 390 mOsm/Kg의 범위의 삼투압에 도달하도록 염화 나트륨이 풍부한 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)으로 미리 평형화시킨 머스탱 Q 캡슐과 같은 강한 음이온-교환 부착 막에 통과시켰다.
단백질 용액이 통과되면, 컬럼 유출수의 광학 밀도가 기준선으로 돌아올 때까지 동일한 완충용액(삼투압 370-390 mOsm/Kg)으로 캡슐을 수세하였다. 막에 흡착되지 않았던 단백질 분획은 많은 피브리노겐 뿐만 아니라 용매/계면활성제-기반의 바이러스 불활성 처리를 위해 첨가하였던 화학 제제들을 포함한다.
그런 다음, 삼투압이 600-660 mOsm/Kg에 도달하도록 염화 나트륨을 첨가하여 이온 강도 값을 증가시킨 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)을 적용하여 막에 흡착된 폰 빌리브란트 인자를 용출하였다. 그런 다음, 삼투압이 370 내지 390 mOsm/Kg의 범위에 도달할 때까지 염화 나트륨이 없는 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)으로 용출 분획을 희석하였다.
그런 다음, 삼투압이 370 내지 390 mOsm/Kg 범위에 도달하도록 염화나트륨이 풍부한 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)으로 미리 평형화시킨 머스탱 Q 캡슐 타입의 강한 음이온-교환 부착 막에 희석된 분획물을 통과시켰다. 단백질 용액이 통과되면 컬럼 유출수의 광학 밀도가 기준선으로 되돌아올 때까지 동일한 완충용액(삼투압 370-390 mOsm/Kg)을 이용하여 캡슐을 수세하였다. 그런 다음, 삼투압이 600-660 mOsm/Kg에 도달하도록 염화 나트륨을 첨가하여 이온 강도 값을 증가시킨 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)을 적용하여 막에 흡착된 폰 빌리브란트 인자를 용출하였다. 그런 다음, 삼투압이 600-660 mOsm/Kg에 도달하도록 염화나트륨을 첨가하여 이온 강도 값을 증가시킨 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)으로 미리 평형화시킨 젤라틴 리간드를 이용하여 친화성 크로마토그래피 겔에 용출된 분획물을 적용하였다. 단백질 용액이 통과되면 컬럼 유출수의 광학 밀도가 기준선으로 되돌아올 때까지 동일한 완충용액(삼투압 600-660 mOsm/Kg)을 이용하여 친화성 겔을 수세하였다. 겔 수세를 포함하는(겔 수세에 의해 얻어진) 비흡착된 분획물은 고순도의 폰 빌리브란트 인자-풍부 분획물을 나타낸다.
정제 도식은 도 1에 나타내었다.
결과
폰 빌리브란트 인자의 정제
단계 수율(%) 특이적인 활성(IU/mg)
초기 동결침전물 100 0.46
머스탱 QXT5 캡슐상에서의 1번째 정제 단계 ≥ 30 (30-50) 20-30
머스탱 QXT5 캡슐상에서의 2번째 정제 단계 + 젤라틴 세파로스 상에서 크로마토그래피 ≥ 70 > 80
인자 VIII 정제 방법
1℃ 에서 6℃ 사이의 온도로 신선한 냉동 혈장을 해동하여 동결침전물을 준비하였다.
원심분리 후에, 피브리노겐, 피브로넥틴, 폰 빌리브란트 인자 및 인자 VIII를 함유하는 동결침전물을 회수하여 헤파린 나트륨(3 IU/mL)을 함유하는 수용성 용액에 슬러리화하였다. 그런 다음 용액의 pH 값을 7.0 + 0.1로 조정하였다.
슬러리화된 동결침전물을 비타민 K 의존 인자를 제거하기 위하여 알루미나 겔에 흡착시키고, 피브리노겐 및 피브로넥틴 냉장 침전시켜 예비-정제하였다. 따라서, 5분 동안 교반하면서 수산화 알루미늄을 현탁물에 첨가하였다. 0.1M 아세트산을 이용하여 pH 값을 6.5 ± 0.2로 조정하고 용액의 온도가 14-18℃의 범위가 될 때까지 용액을 교반하면서 식혔다. 그런 다음, 그 용액을 14-18℃의 온도에서 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 0.22 μm 여과기로 여과하여 정제하였다.
그런 다음, 상기 예비정제된 용액을 외피 바이러스에 효과적인 폴리솔배이트 80 (1%, w/v) 및 트리-n-부틸 인산 (0.3%, v/v)의 존재하에 용매/계면활성제를 처리하여 바이러스 불활성 단계를 수행하였다. 용매/계면활성제의 처리는 pH 7.1에서 적어도 6 시간 동안 수행하였다.
그런 다음, 용매/계면활성제-처리의 단백질 용액을 370 내지 390 mOsm/Kg의 범위의 삼투압에 도달하도록 염화 나트륨이 풍부한 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)으로 미리 평형화시킨 머스탱 Q 캡슐과 같은 강한 음이온-교환 부착 막에 통과시켰다.
단백질 용액이 통과되면, 컬럼 유출수의 광학 밀도가 기준선으로 돌아올 때까지 동일한 완충용액(삼투압 370-390 mOsm/Kg)으로 캡슐을 수세하였다. 막에 흡착되지 않았던 단백질 분획은 많은 피브리노겐 뿐만 아니라 용매/계면활성제-기반의 바이러스 불활성 처리를 위해 첨가하였던 화학 제제들을 포함한다.
그런 다음, 삼투압이 600-660 mOsm/Kg에 도달하도록 염화 나트륨을 첨가하여 이온 강도 값을 증가시킨 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)을 적용하여 막에 흡착된 폰 빌리브란트 인자를 용출하였다. 폰 빌리브란트 인자의 정제는 실시예 1에 기술한대로 진행될 수도 있다. 그런 다음, 삼투압이 1400-1700 mOsm/Kg에 도달하도록 염화 나트륨을 첨가하여 이온 강도 값을 증가시킨 기본 완충용액(pH 6.9-7.1)을 적용하여 막에 흡착된 인자 VIII를 용출하였다. 유리하게는, 염화칼슘을 첨가하여 얻은 높은 이온 강도 값을 가진 완충 용액(pH 6.0)으로 인자 VIII를 용출하였다.
정제 도식은 도 2에 도시하였다.
결과
인자 VIII의 정제
단계 수율(%) 특이적인 활성(IU/mg)
초기 동결침전물 100 0.38
머스탱 Q XT5 캡슐상에서의 정제 단계 ≥ 45 (40-60) ≥ 110

Claims (14)

  1. (i) FVIII 및 FvW의 혼합물을 함유하는 용액,
    (ii) FvW을 함유하는 용액,
    (iii) 비인간 동물의 분비물로부터 유래된 용액, 및
    (iv) FVIII-함유 식물 추출물에서 유래된 용액
    으로부터 선택된 용액으로부터 FVIII 또는 FvW의 정제 방법으로서, 이온-교환 크로마토그래피 여과기-타입 막에 FVIII 또는 FvW의 흡착 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 여과기-타입 막은 음이온-교환 크로마토그래피 막인 것인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 여과기-타입 막은 강한 음이온 교환체인 것인 방법.
  4. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 4차 아민 그룹을 포함하는 코팅이 제공된 것인 방법.
  5. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 큰 기공 타입의 막인 것인 방법.
  6. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 폴리에테르술폰 타입의 막인 것인 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 FVIII 및 FvW의 혼합물을 함유하는 것인 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 용액은 혈장 기원인 것인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
    a) 혈장의 동결침전물을 준비하는 단계,
    b) 상기 이온-교환 크로마토그래피 막에 인자 VIII 및 폰 빌리브란트 인자를 흡착시키는 단계, 및
    c) 적합한 이온 강도 값을 갖는 용출 완충용액을 이용하여 인자 VIII 또는 폰 빌리브란트 인자를 회수하는 단계.
  10. 제 9항에 있어서, 하기 단계에 따라 상기 폰 빌리브란트 인자 및 인자 VIII을 선택적으로 회수하는 것인 방법:
    c1) 적합한 이온 강도 값을 갖는 완충용액을 이용한 용출 방법으로 FvW를 선택적으로 회수하는 단계, 및
    c2) 단계 c1)에서 사용된 이온 강도 값보다 높은 값의 이온 강도를 갖는 적합한 완충용액을 이용한 용출 방법으로 FVIII를 선택적으로 회수하는 단계.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 것인 방법:
    d) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을 증가시켜 FvW를 용출하는 단계,
    e) 이온-교환 크로마토그래피 막에, 더욱 바람직하게는 첫 번째 막과 동일한 타입의 막에 폰 빌리브란트 인자를 포획하는 단계, 및
    f) 상기 크로마토그래피 막의 평형화 완충용액의 이온 강도 값을 증가시켜 폰 빌리브란트 인자를 용출하는 단계.
  12. 제 11항에 있어서, 하기 단계를 추가로 더 포함하는 것인 방법:
    g) 젤라틴 리간드를 보유한 친화성 겔 컬럼에 제 11항의 단계 C)에서 용출된 폰 빌리브란트 인자-풍부 분획물의 크로마토그래피를 수행하는 단계, 및
    h) 피브로넥틴이 없는, 폰 빌리브란트 인자가 잔류하지 않은 분획물을 회수하는 단계.
  13. 제 1 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 것을 포함하는, 정제된 FIII의 생산 방법.
  14. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 것을 포함하는, 정제된 FvW의 생산 방법.
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