EP2183269A2 - Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand - Google Patents

Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand

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Publication number
EP2183269A2
EP2183269A2 EP08829221A EP08829221A EP2183269A2 EP 2183269 A2 EP2183269 A2 EP 2183269A2 EP 08829221 A EP08829221 A EP 08829221A EP 08829221 A EP08829221 A EP 08829221A EP 2183269 A2 EP2183269 A2 EP 2183269A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fviii
membrane
vwf
solution
von willebrand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08829221A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Michel Poulle
Patrick Bonneel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB Biotechnologies SAS filed Critical LFB Biotechnologies SAS
Publication of EP2183269A2 publication Critical patent/EP2183269A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)

Definitions

  • the present invention relates to the field of purification of factor VIII and von Willebrand factor, for their use as drug active ingredient.
  • Factor VIII is a plasma protein present in low concentrations in human plasma. Yet it is the focal point of the coagulation cascade. Indeed, this protein acts as factor IX cofactor (or "FIX") in order to activate factor X (or "FX"). Once activated, factor X converts prothrombin to thrombin, which in turn converts fibrinogen to fibrin, resulting in the formation of the hemostatic fibrin clot.
  • factor IX cofactor or "FIX”
  • Factor VIII concentrates are most often prepared from a fraction of cryoprecipitated human plasma.
  • the purity of Factor VIII concentrates generally obtained in industrial centers for the treatment of human plasma is often of the order of 1 IU / mg and generally does not exceed the limits of 10 to 20 IU / mg.
  • Conventional production techniques involve precipitation steps that aim to eliminate, often very imperfectly, protein contaminants such as fibrinogen, fibronectin, and immunoglobulins. These techniques can use or combine precipitation at low temperature (10 0 C), or the addition of protein precipitation agents; thus hydrophilic polymers such as PEG (Newman et al., Br. J.
  • Factor VIII concentrates were also produced by incorporating into the production protocol a contact with porous silica beads to trap low molecular weight protein contaminants (Margolis et al., Vox Blood 46: 341-348, 1984). .
  • the specific activity of the product remains relatively low: 1 IU / mg.
  • Factor VIII of very high purity totally devoid of proteins of foreign origin such as antibodies of animal origin, by means of processes applicable on an industrial scale.
  • EP 0 343 275 discloses a method for preparing Factor VIII from a cryoprecipitate which is characterized in that, prior to the viral inactivation treatment, the cryoprecipitate is suspended in water containing 1 to 3 U / ml of heparin at pH 6.5-7.5 is reacted with a suspension of aluminum hydroxide and after cooling to 10-18 ° C. and adjusting the pH to 6-7, centrifuging or filtering and then the purification is continued by a subsequent treatment, in particular by chromatography on an ion exchange resin such as Fractogel-DEAE (today DEAE-TOYOPEARL®, marketed by Tosoh Bioscience), of hydrophilic type.
  • Fractogel-DEAE today DEAE-TOYOPEARL®, marketed by Tosoh Bioscience
  • the document EP 0 359 593 describes a method of purification by anion exchange chromatography, which makes it possible to separate the desired proteins in a single chromatographic column under conditions sufficiently gentle to render the subsequent treatments useless. This process allows separation.
  • Factor VIII, fibrinogen, fibronectin and von Willebrand factor proteins of human or animal plasma This method can be summarized thus: the fraction of the cryoprecipitate resolubilized in water is subjected to a single chromatographic separation on an anion exchange resin whose matrix is a macroreticulated vinyl polymer type gel capable, by virtue of its properties of porosity, to retain the Factor VIII-von Willebrand factor complex, and then selectively recover the different proteins by successive increases in the ionic strength of the elution buffer.
  • Von Willebrand factor (hereinafter also referred to as "VWF”) plays an essential role in hemostasis by two distinct functions: as adhesion protein, it allows the dispersion, adhesion and aggregation of blood platelets. on the vascular subendothelium, and thus participates in the process of rapid healing of the injured vessels and, on the other hand, it ensures the stabilization and transport of Factor VIII in the bloodstream, which it is associated non-covalently.
  • Congenital VWF deficiency or structural abnormality of VWF causes von Willebrand disease, which is manifested by cutaneous haemorrhages and mucous membranes. This disease is very heterogeneous in its clinical expression and poses serious problems in case of surgery.
  • vWF-enriched human plasma derivatives eg, the cryoprecipitated fraction of plasma or Factor VIII concentrates containing sufficient VWF associated therewith.
  • VWF is a protein difficult to purify.
  • the Von Willebrand factor is the largest known protein circulating in the plasma. It consists of a set of multimers linked by disulfide bridges, whose base element has a molecular weight close to 260 kilodaltons (kDa).
  • the smallest form of vWF in plasma is a dimer of 440-500 kDa and the largest forms are multimers of this dimer whose molecular weight can reach 20 million daltons.
  • This assembly of the subunits into multimers may be specific for the cells in which it is operated, the VWF being synthesized and polymerized in the megakaryocytes and in the endothelial cells.
  • VWF concentrates typically involve steps of precipitation of a plasma fraction, intended for the removal of most of the unwanted proteins (fibrinogen, fibronectin etc.), and / or chromatographies (exchange of ions, affinity, immunoaffinity, steric exclusion etc.) which aim to obtain very high purity concentrates with a high specific activity, and which make it possible to preserve the integrity of the multimeric forms, especially those high molecular weight whose biological importance is fundamental in the healing processes.
  • Patent EP 0 503 991 discloses a process for the preparation on an industrial scale of a FvW concentrate comprising a step of prepurification of a cryoprecipitated fraction of plasma and three successive stages of chromatography, the third being an affinity chromatography on gelatin column immobilized on agarose.
  • the FvW concentrate thus obtained has a specific activity greater than 100 VWF: RCo / mg expressed in units of ristocetin cofactor activity per mg of protein and a level of multimers of high molecular weight comparable to that of the starting plasma.
  • Patent Application EP 0 934 748 describes a process for the preparation of VWF comprising the combination of anion exchange chromatography and cation exchange chromatography.
  • the VWF fractions obtained have a specific activity greater than 100 IU FvW: Ag / mg expressed in units of VWF antigen per mg of protein, but contain still significant proportions of Factor VIII.
  • US Pat. No. 6,579,723 describes a process for preparing a highly purified vWF by immunoaffinity chromatography, the immunoadsorbents of which are anti-FvW antibodies. It can also be provided an additional purification step by affinity chromatography on heparin.
  • the disadvantage of immunoaffinity purification is the possible presence of residual antibodies that can lead to immunological reactions.
  • EP 0 383 234 teaches the preparation of a FvW concentrate by anion exchange chromatography, carried out with acid solutions (pH 5.5 to 6.5) containing carbohydrates, for fixing the factor VIII on the anion exchanger.
  • acid solutions pH 5.5 to 6.5
  • EP 1 632 501 discloses a process for the preparation of a very high purity von Willebrand factor concentrate from a von Willebrand factor-containing organic fraction comprising anion exchange chromatography separation using a carrier. of vinyl polymer, weak base type. This method has the advantage of being very simple to implement, resulting in a Von Willebrand factor of high specific activity and containing very little factor VIII.
  • FVIII and VWF are very important plasma proteins, and their deficiency in some individuals leads to severe hemostasis disorders. That is why it is of paramount importance to develop processes for the preparation of these proteins, making it possible to obtain products of purity adapted to their repeated use in patients.
  • the invention relates to a method for purifying a solution containing a mixture of FVIII and FvW, or a solution containing vWF or a solution resulting from a secretion of an animal, in particular a human, or a plant extract containing FVIII, characterized in that it comprises a chromatography step on an ion exchange chromatography filter membrane for adsorbing at least one protein selected from FVIII and VWF.
  • the subject of the invention is a process for purifying FVIII or FvW from a solution chosen from (i) a solution containing a mixture of FVIII and FvW, (ii) a solution containing FvW, (iii) a solution derived from a secretion of a non-human animal and (iv) a solution derived from a plant extract containing FVIII, said method being characterized in that it comprises a step of adsorption of FVIII or VWF on an ion exchange chromatography membrane filter.
  • purification process is meant a process for separating FVIII from other molecules in the medium, or a method for separating FvW from other molecules in the medium, or a method for separating FVIII from VWF. , or a method for separating the FVIII / FvW complexes from other molecules contained in the medium.
  • These molecules may be different proteins from FVIII and VWF, viruses, bacteria, spores, culture medium, fetal calf serum, this list not being limiting.
  • FVIII any form of FVIII, in particular capable of acting as a cofactor in the activation of FIX and having the capacity to form a complex with VWF, in particular mature FVIII, biologically active derivatives of FVIII.
  • pro-FVIII which contains the pro-peptide (pro-FVIII)
  • protein constructs comprising immature VWF, precursor of FVIII (pre-pro-FVIII), mature FVIII obtained after cleavage of the signal peptide and pro-peptide.
  • Other biologically active derivatives of FVIII included in the invention are pro-drugs which undergo post-translational modifications or which are converted into biologically active forms, such as truncated forms, deleterious forms, for example FVIII deleted.
  • FVIII one or more amino acids located in the region between Arg-759 and SeM 709 described in EP 218,712, chimeric forms, and forms that have different post-translational modifications of mature natural plasma forms.
  • FVIII may for example be manufactured by modifying mature FVIII or any other form naturally present in the blood.
  • the nucleotide sequence coding for such an FVIII can come from different sources, preferably mammalian, including human, porcine, ovine, bovine, equine, and goat versions, this list not being limiting.
  • vWF is meant any form of vWF, especially mature vWF, biologically active derivatives of mature vWF, such as pro-vWF which contains the propeptide, protein constructs comprising immature vWF, including the precursor of FvW (pre-pro-FvW), propeptide of FvW (pro-FvW), mature vWF obtained after cleavage of signal peptide and pro-peptide.
  • Other biologically active derivatives of VWF included in the invention are prodrugs that undergo post-translational modifications or that are converted into biologically active forms, such as truncated forms, deleterious forms, for example vWF lacking a domain.
  • vWF can for example be manufactured by modifying mature vWF or any other form naturally present in the blood.
  • the nucleotide sequence coding for such a VWF can come from different sources, preferably mammalian, including human, porcine, ovine, bovine, equine, and goat versions, this list not being limiting.
  • solution containing a mixture of FVIII and FvW denotes any solution containing FVIII and FvW, in complexed or separated form. These solutions may be of recombinant origin, transgenic or plasmatic.
  • the solution is of recombinant origin, it is derived from a unicellular system, in which the expression of FVIII and FvW proteins has been induced.
  • the animal or human cell lines transfected with a vector containing the gene coding for each of these proteins, preferably the gene coding for the human protein, said lines being able to be selected especially from the CHO-K, CHO-LeClO, CHO Lec-1, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, YB2 / 0 lines.
  • the solution is of transgenic origin, it is derived from a multicellular system, in particular an animal or a plant obtained by transgenesis, that is to say in which one or more cells have received a molecule of Recombinant DNA.
  • a multicellular system in particular an animal or a plant obtained by transgenesis, that is to say in which one or more cells have received a molecule of Recombinant DNA.
  • dogs, cats, mice, rats, hamster, cows, goats, sheep, rabbits and pigs, horses, insects and plants, for example the tobacco, soy this list is not limiting.
  • animals producing FVIII and VWF this production can take place in various media secreted by the animal, for example urine, blood, saliva or milk, this list not being limiting.
  • Such production methods can be carried out using techniques well known to those skilled in the art.
  • document EP 0 741 515 and EP 807 170 may be cited, this list not being limiting.
  • the latter describes the production of a transgenic animal which has stably integrated into its genome the DNA molecules encoding FVIII and VWF, so as to both express them and secrete them in their milk.
  • the solution in the case where the solution is of plasmatic origin, it can be either plasma, animal or human, or cryoprecipitate, or a fraction obtained by conventional fractionation methods (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. , 68, 459, 1946 and Kistler et al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424). These fractions may optionally have undergone a prepurification treatment such as by adsorption on aluminum hydroxide.
  • solution containing FvW any solution containing vWF, and essentially free, that is to say containing little or very little of FVIII. This solution may be of recombinant origin, transgenic or plasma origin.
  • the solution is of recombinant origin, it is derived from a unicellular system, in which the expression of the FvW protein has been induced.
  • a vector containing the gene coding for this protein preferably the gene coding for the human protein, said lines being able to be selected in particular from CHO-K lines, CHO-LeCI O, CHO Lec-1, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, YB2 / 0, BHK , K61-I6, NSO, SP2 / 0-Ag14 and P3X63Ag8. 653, SK-Hep, HepG2, as well as plant cells, bacterial systems, for example E. CoIi, fungal systems, systems using viruses, in particular baculoviruses, this list not being limiting.
  • Such cell systems express the FvW protein and can be obtained using techniques well known to those skilled in the art.
  • US 5,198,349 and WO 89/06096 may be cited, this list not being limiting.
  • US 5,198,349 thus describes the expression of human VWF in COS cells, by inserting the cDNA encoding human vWF into an expression vector.
  • the solution is of transgenic origin, it is derived from a multicellular system, in particular an animal or a plant obtained by transgenesis, that is to say in which one or more cells have received a molecule of Recombinant DNA encoding VWF.
  • a multicellular system in particular an animal or a plant obtained by transgenesis, that is to say in which one or more cells have received a molecule of Recombinant DNA encoding VWF.
  • transgenic animals producing VWF this production can take place in various media secreted by the animal, for example urine, blood, saliva or milk, this list not being limiting.
  • Such production methods can be carried out using techniques well known to those skilled in the art.
  • the documents WO 2001/022810 and WO1999 / 058699 can be cited, this list not being limiting.
  • WO 2001/022810 describes the production of transgenic mice producing human vWF in female milk.
  • the solution in the case where the solution is of plasmatic origin, it may be a fraction of animal or human plasma, either cryoprecipitate, or a fraction obtained, obtained by conventional fractionation methods (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler et al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424). These fractions may optionally have undergone a prepurification treatment such as by adsorption on aluminum hydroxide.
  • solution derived from a secretion of a non-human animal containing FVIII is meant any solution resulting from any secretion, for example plasma, saliva, urine or milk, produced by an animal transgenic manufactured so that it expresses a molecule of FVIII in one of the secretions mentioned above. In this case, VWF is not expressed by the transgenic animal.
  • solution from the plasma containing FVIII is also meant any solution from plasma naturally containing FVIII, human or animal, and essentially free of VWF. It can be derived from a fraction of animal or human plasma, either cryoprecipitate, or a fraction obtained by conventional fractionation methods (Cohn et al., J.
  • fractions may optionally have undergone a prepurification treatment such as by adsorption on aluminum hydroxide.
  • Such an extract can be made by introducing into a plant cell a nucleotide vector containing the gene encoding FVIII.
  • Such methods are well known to those skilled in the art, and can be illustrated by many documents of the state of the art, such as for example the document US 2005/0060775.
  • ion exchange chromatography filter membrane any semi-permeable physical barrier having the ability to adsorb FVIII and / or VWF by ion exchange when these proteins are entrained through the membrane.
  • this membrane has the ability to pass FVIII and VWF when the ion exchange interaction between the membrane and FVIII and / or VWF is no longer sufficient to retain them on the membrane.
  • an ion exchange filter membrane consisting of a macroporous support comprising, immobilized on said support, a negatively charged or positively charged coating, said coating imparting to the filter membrane the ion exchange properties.
  • the negatively or positively charged coating is immobilized on the macroporous support by chemical grafting.
  • the macroporous support has a porosity, that is to say an average pore size, such that the filtering membrane allows FVIII and FvW to pass through.
  • a first advantage related to the use of such a membrane is the possibility of using disposable exchange membrane filters, which increases the level of safety of the process.
  • a second advantage related to the use of such a membrane is the possibility of carrying out the purification process of the invention, and more precisely the ion exchange chromatography step (s), with a very high flow rate. high of the solution to be purified.
  • any type of physical barrier support may be suitable for a filter membrane adapted to the implementation of the invention, for example a polymer film, capillary network, hollow fiber, stabilized cellulose, polyethersulfone, or any three-dimensional structure having the capacity of pass the FVIII and the VWF.
  • the ion exchange interaction between the filter membrane and the FVIII and FvW proteins is due to the positively or negatively charged coating which is immobilized on the macroporous support, said coating having basic or acidic functional groups that can be exchanged.
  • the ion exchange coating may be of the monofunctional type, that is to say comprising only a variety of functional group, or of polyfunctional type if it comprises different types of functional groups.
  • the filter membrane allows simultaneous capture or adsorption of the FVIII and VWF proteins, thanks to the interaction between these proteins and the membrane.
  • VWF and FVIII are retained by the membrane through ion exchange interactions.
  • This pre-purification step may be advantageous especially in the case of complex solutions, for example from milk or plasma, which is a medium containing many proteins.
  • a pre-purification step may in particular comprise a clarification step, for example as described in document WO 2004/076695, or an extraction step as described for example in documents FR 06 04864 or FR 06 1 1536 , this list not being limiting.
  • the document FR 06 04864 describes a process for extracting at least one protein present in milk, said protein having an affinity for the complexed or non-complexed calcium ions of said milk, comprising the following steps: ) release the protein by precipitating calcium compounds obtained by contacting the milk with a soluble salt, for example sodium phosphate, whose anion is chosen for its ability to form in such a medium said insoluble calcium compounds to thereby obtain a liquid phase enriched in the protein,
  • a soluble salt for example sodium phosphate
  • the document FR 06 1 1536 describes a method for extracting a protein present in milk, having at least one hydrophobic bag and a negative charge at the natural pH of the milk, comprising the following steps of: a) Skimming and delipidation of said milk, b) Passage of the delipidated and skimmed fraction containing said protein on a chromatographic support on which is grafted a ligand having both a hydrophobic character and an ionic character, for example 4-Mercapto-Ethyl-Pyridine under pH conditions allowing said protein to be retained on said support, c) eluting the protein, d) purifying the eluted fraction by removing milk proteins from said eluted fraction, and e) recovering said protein.
  • the prepurification step may be performed immediately after the cell culture step itself.
  • the composition of the cell culture medium can be controlled so that the proteins produced by the cell are excreted in the extracellular medium.
  • the choice of cells can be made in such a way that the protein produced is excreted in the medium.
  • a depth filtration step or a tangential micro-filtration may be suitable to obtain a pre-purification adapted to the implementation of the steps of the purification process of the invention.
  • the filter membrane is a cation exchange membrane.
  • the positive counter-ions of the functional groups carried by the membrane are exchanged by charges of the same sign on VWF and FVIII.
  • CM carboxymethyl
  • SP phosphoryl and sulfopropyl
  • S sulfate
  • the buffers that may be used are Tris-hydroxymethyl-aminomethane, carbonate, ethylene diamine, imidazole or triethanolamine, this list not being limiting.
  • the pH of the buffer will be chosen according to the isoelectric point of the protein, so that the protein is at this overall positive charge pH, according to routine techniques well known to those skilled in the art.
  • the filtering membrane used is an anion exchange membrane. The negative counter-ions of the functional groups carried by the membrane are exchanged by charges of the same sign on the VWF and the FVIII.
  • the buffers that may be used are acetate, citrate, phosphate, glycine or barbiturate, this list not being limiting.
  • the pH of the buffer will be selected according to the isoelectric point of the protein, so that the protein is at this overall negative charge pH, according to routine techniques well known to those skilled in the art. .
  • the filter membrane comprises an ion exchange coating consisting of a strong anion exchanger.
  • strong anion exchanger any anion exchange membrane capable of adsorbing weakly ionized proteins.
  • Such filter membranes are commercially available.
  • membranes carrying QAE, Q groups in particular the Mustang Q® membrane (PaII) or the Sartobind Q membrane (Sartorius), this list not being limiting.
  • the Mustang Q membrane (PaII) is particularly advantageous because it has a high adsorption capacity, high volume chromatography flow rates, a single-use or multi-cycle capability. Moreover, it makes it possible to get rid of the steps of validations of cleaning of the support, such as the regeneration and the sanitization (study viral security, prions, this list not being limiting).
  • the surface of the filter membrane in contact with the solution to be purified comprises an anion exchange coating comprising quaternary ammonium groups which are immobilized on the macroporous support by chemical grafting.
  • the filtering membrane is of macroporous type.
  • macroporous is meant a pore system included in the membrane, whose size is between 0.3 microns and 1.0 microns.
  • the pore size is between 0.5 ⁇ m and 0.9 ⁇ m.
  • the pore size is 0.8 ⁇ m.
  • the support of the membrane is polyethersulfone.
  • such a polyethersulfone membrane may be a Mustang Q® membrane, distributed by PaII. This membrane has pores of size 0.8 ⁇ m, and is grafted with quaternary amino groups.
  • the solution to be purified contains FVIII or VWF, and is of plasmatic origin.
  • the solution to be purified contains a mixture of FVIII and FvW, and is preferably of plasmatic origin.
  • the solution is derived from a natural human or animal plasma, that is to say containing in the natural state of FVIII and FvW, human or animal respectively.
  • a natural human or animal plasma can be taken from pigs, rabbits and goats, this list not being limiting.
  • the filter membranes and in particular the Mustang Q® membrane, have a higher capacity for adsorption of FVIII and / or VWF than that of a resin or a gel.
  • adsorption capacity is meant the amount of the target proteins fixed on the gel; it is generally expressed by the supplier of gels or resins by the amount of BSA (bovine serum albumin) fixed on the gel for the anionic resins.
  • BSA bovine serum albumin
  • it is between 25 and 35 mg / ml for the EAE-TOYOP EARL® gel D, usually used for the purification of FVIII and / or VWF, while it is greater than or equal to 30 mg / ml for the Mustang Q® membrane.
  • This greater adsorption capacity of the filter membrane results in the possibility of using a smaller amount of gel equivalent to adsorb the same amount of FVIII and / or VWF as on a gel or a resin.
  • the greater adsorption capacity of the membrane membrane compared to a gel or a resin could be explained by a better accessibility of ionized sites for FVIII and / or VWF, especially when they form FVIII / VWF complexes. .
  • these proteins have a high size, especially when they form FVIII / FvW complexes, and it can be hypothesized that the ionized sites are more easily accessible when they are grafted onto the filter membrane. macroporous, because of pore size, only on gels or resins, whose ionized sites are encased in canals, making them less readily accessible to larger proteins.
  • the method comprises the following steps: a) Obtaining cryoprecipitate from the plasma, b) Capture, that is to say, adsorption, factor VIII and von Willebrand factor on said ion exchange chromatography membrane, and more particularly on the anion exchange chromatographic membrane, and c) Selective recovery of von Willebrand factor and factor VIII by successive increases in the ionic strength of the elution buffer.
  • a prepurification step is carried out by adsorption of factor VIII and von Willebrand factor on an alumina gel, followed by a cold precipitation.
  • step c) of the above process the ionic strength value of the elution buffer is easily adapted by those skilled in the art, in view of his general knowledge of the physicochemical properties of each of the FvW and FVIII proteins. and ion exchange properties of the filter membrane, which is generally a commercially available filter membrane, for which there are recommendations for use by the manufacturer.
  • those skilled in the art know, from their general knowledge, that FVIII is eluted from an anion exchange chromatography support with a buffer having an ionic strength greater than the ionic strength necessary for the elution of the FvW of the same support.
  • step c) of the above method uses an ionic strength buffer suitable for eluting (desorbing from the support) (i) VWF, (ii) VWF and FVIII, or (iii) successively first the VWF, then the FVIII.
  • an ionic strength buffer suitable for eluting (desorbing from the support) i) VWF, (ii) VWF and FVIII, or (iii) successively first the VWF, then the FVIII.
  • a first embodiment of the alternative (iii) of successive elution of FvW, then of FVIII one skilled in the art can successively use two elution buffers, each elution buffer having an ionic strength adapted to the desorption of VWF or FVIII, respectively.
  • the skilled person elutes with a buffer for generating a gradient of increasing ionic strength, with which are successively desorbed FvW, then FVIII.
  • a linear increase in the ionic strength of the elution buffer is included, which can be obtained by adding a salt, for example sodium chloride, calcium chloride, this list not being limiting.
  • the elution of VWF is first obtained, followed by elution of FVIII by increasing the ionic strength of the buffer. It is therefore possible to either recover the VWF and stop the elution after obtaining the VWF, or to obtain the FVIII while continuing the elution.
  • cryoprecipitate is meant a precipitate obtained from a human or animal plasma by a low temperature precipitation technique.
  • Cryoprecipitate can be obtained by methods well known to those skilled in the art.
  • the frozen plasma is brought to a temperature of approximately -5 ° C. to -15 ° C. and then slowly heated with stirring to a temperature which does not exceed 1 ° C. or optionally 4 ° C. Under these conditions, the frozen plasma melts to give a liquid phase and a solid phase, the solid phase, the cryoprecipitate, being then recovered by centrifugation.
  • Cryoprecipitate is composed mainly of fibrinogen, fibronectin, factor VIII and factor Von
  • vWF Willebrand
  • selective recovery is meant the ability to recover either FVIII or VWF, or a mixture of FVIII and VWF, depending on the elution method, depending on the protein or proteins that are desired.
  • the solution to be purified contains a mixture of
  • This embodiment comprises the following steps: a) Obtaining a cellular supernatant or a pre-purified solution comprising FVIII and VWF. B) Capturing factor VIII and von Willebrand factor on said membrane exchange chromatography membrane. ions, and more particularly on the anion exchange chromatographic membrane, and c) selective recovery of von Willebrand factor and factor VIII by successive increases in the ionic strength of the elution buffer.
  • the solution to be purified contains either
  • This embodiment comprises the following steps: a) Obtaining a Cellular Supernatant or a Purified Solution Comprising FVIII or VWF, b) Capturing Factor VIII or Von Willebrand Factor on the Ion Chromatography Membrane , and more particularly on the chromatographic anion exchange membrane, and c) Recovery of von Willebrand factor or factor VIII.
  • the method of the invention allows a reduction in the amount of vitamin K dependent factors, fibrinogen and fibronectin.
  • the selective recovery of FvW and FVIII is carried out according to the following steps: d) elution of VWF by increasing the ionic strength of the equilibration buffer; said chromatography membrane.
  • the ionic strength may be increased by the addition of 0.25 M sodium chloride to achieve an osmolality of about 600 to 660 mOsm / kg.
  • the ionic strength can be increased by addition of 0.7 M sodium chloride, or 0.35 M calcium chloride, to achieve osmolality of between about 1400 and 1700 mOsm / kg.
  • Step d) is a step of selective recovery of VWF, in which a buffer solution having an ionic strength suitable for desorbing the VWF of the ion exchange membrane is used.
  • Step c2) is a step of selective recovery of FVIII, during which a buffer solution having an appropriate ionic strength is used to desorb the FVIII from the ion exchange membrane filter.
  • step c2) a buffer solution having an ionic strength greater than the ionic strength of the buffer solution used for step d) is used.
  • step d) The fvW eluted in step d) is containing very little FVIII. It is recovered and a purified FvW solution is obtained.
  • the FVIII obtained in step c2) contains less VWF than the starting solution. It is recovered and a solution of purified FVIII is obtained.
  • the method of the invention makes it possible to obtain a solution of purified vWF, by implementation, after the step of simultaneous adsorption of FVIII and vWF on said membrane filtering membrane.
  • ions of the following steps: d) Elution of VWF by increasing the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane, e) capture of von Willebrand factor on ion exchange chromatography membrane, preferably of the same type as the first, and f) eluting the von Willebrand factor by increasing the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane.
  • step d) of eluting FvW by increasing the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane it is possible, after step d) of eluting FvW by increasing the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane, to elute FVIII by an even higher increase in the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane only for the recovery of von Willebrand factor.
  • a solution containing a purified VWF and another solution containing a purified FVIII is obtained successively.
  • the method of the invention therefore has the advantage of allowing sequential or simultaneous purification of FVIII and VWF from a solution containing FVIII and VWF. If the solution is of plasma origin, the method of the invention is particularly advantageous because it makes the best use of the use of plasma, human or animal.
  • this particular embodiment additionally comprises the following steps: g) chromatography of the fraction eluted in step c) enriched in factor Von
  • the fibronectin assay can be performed for example by immunonephelometry, according to a technique well known to those skilled in the art.
  • an embodiment of the method of the invention makes it possible to obtain a solution of purified FVIII and a purified vWF solution, by implementing, after the step of simultaneous capture of FVIII and FvW on the filtering membrane of ion exchange chromatography, the following steps: a) Elution of the VWF by increasing the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane, b) elution of FVIII by an even greater increase in the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane than for the recovery of von Willebrand factor c) Von Willebrand factor capture on ion exchange chromatography membrane, d) eluting the Von Willebrand factor by increasing the ionic strength of the equilibration buffer of said chromatography membrane. e) chromatography of the fraction eluted in step d) enriched in von Willebrand factor on a gelatin gel affinity gel column, and f) recovery of the non-retained fraction on the affinity gel and
  • the method of the invention in its various embodiments, thus makes it possible to separate FVIII and FvW in a simplified manner.
  • the purification steps of the invention are the only ones which make it possible to purify factor VIII and von Willebrand factor separately or simultaneously from the plasma by simultaneous capture of the two proteins on anionic exchange chromatography membrane.
  • Another object of the invention is a process for obtaining a purified FVIII comprising the implementation of the purification process of the invention.
  • Another object of the invention is a process for obtaining a purified FvW comprising the implementation of the purification process of the invention.
  • FIG 1 Diagram of the von Willebrand Factor Purification Process
  • Cryoprecipitate is prepared by thawing frozen fresh plasma at a temperature of between 10 ° C. and 60 ° C.
  • cryoprecipitate containing fibrinogen, fibronectin, von Willebrand factor and factor VIII is recovered and resuspended in an aqueous solution of heparin sodium at 3 IU / ml.
  • the pH of the solution is then adjusted to 7, 0 ⁇ 0.1.
  • the resuspended cryoprecipitate is pre-purified by alumina gel adsorption to remove vitamin K dependent factors and cold precipitation of fibrinogen and fibronectin.
  • alumina hydroxide is added to the stirred suspension for 5 minutes.
  • the pH is adjusted to 6.5 + 0.2 with 0.1 M acetic acid and the solution is cooled with stirring until the temperature is between 14 and 18 ° C.
  • the solution is then centrifuged at a temperature of 14-18 ° C.
  • the supernatant is recovered and clarified by filtration on a 0.22 ⁇ m filter.
  • This pre-purified solution is then subjected to a viral inactivation step by solvent-detergent treatment in the presence of effective Polysorbate 80 (1%, w / v) and Tri-n-Butyl Phosphate (0.3%, v / v). on enveloped viruses.
  • the solvent-detergent treatment is carried out for a period of at least 6 hours at pH 7.1.
  • the protein solution treated solvent-detergent is then passed on a grafted exchange membrane of strong anions, type Mustang capsule Q, previously equilibrated with a buffer solution of base, pH 6,9-7,1 added sodium chloride to reach an osmolality of 370-390 mOsm / kg.
  • the capsule After passage of the protein solution, the capsule is rinsed with the same osmolality buffer solution 370-390 mOsm / Kg until the optical density of the column effluent returns to the baseline.
  • the protein fraction not adsorbed on the membrane is rich in fibrinogen and contains the added chemical agents for the viral inactivation treatment by solvent-detergent treatment.
  • the von Willebrand factor adsorbed on the membrane is then eluted by passage of the basic buffer solution, pH 6.9-7.1 of ionic strength increased by addition of sodium chloride to reach an osmolality of 600-660 mOsm / kg.
  • the eluted fraction is then diluted with the basic buffer solution, pH 6.9-7.1 free of sodium chloride, to an osmolality of 370-390 mOsm / kg.
  • the diluted fraction is then passed on a strong anion exchange graft membrane, Mustang Q capsule type, previously equilibrated with a basic buffer solution, pH 6.9-7.1 added with sodium chloride to reach an osmolality of 370-
  • the capsule is rinsed with the same osmolality buffer solution 370-390 mOsm / Kg until the optical density the column effluent returns to the baseline.
  • the von Willebrand factor adsorbed on the membrane is then eluted by passing the basic buffer solution, pH 6.9-7.1 ionic strength increased by addition of sodium chloride to reach an osmolality of 600-660 mOsm / kg.
  • the eluted fraction is then chromatographed on gelatine ligand affinity gel previously equilibrated with a basic buffer solution, pH 6.9-7.1 of ionic strength increased by addition of sodium chloride to reach an osmolality of 600-660 mOsm. / Kg.
  • the affinity gel is rinsed with the same osmolality buffer solution 600-660 mOsm / Kg until the optical density of the column effluent returns to the baseline.
  • the non-adsorbed fraction including gel wash constitutes the high purity von Willebrand factor enriched fraction.
  • Cryoprecipitate is prepared by thawing frozen fresh plasma at a temperature of between 10 ° C. and 60 ° C.
  • cryoprecipitate containing fibrinogen, fibronectin, von Willebrand factor and factor VIII is recovered and resuspended in an aqueous solution of heparin sodium at 3 IU / ml.
  • the pH of the solution is then adjusted to 7.0 ⁇ 0.1.
  • the resuspended cryoprecipitate is pre-purified by alumina gel adsorption to remove vitamin K dependent factors and cold precipitation of fibrinogen and fibronectin.
  • alumina hydroxide is added to the stirred suspension for 5 minutes.
  • the pH is adjusted to 6.5 + 0.2 with 0.1 M acetic acid and the solution is cooled with stirring until the temperature is between 14 and 18 ° C.
  • the solution is then centrifuged at a temperature of 14-18 ° C.
  • the supernatant is recovered and clarified by filtration on a 0.22 ⁇ m filter.
  • This pre-purified solution is then subjected to a viral inactivation step by solvent-detergent treatment in the presence of effective Polysorbate 80 (1%, w / v) and Tri-n-Butyl Phosphate (0.3%, v / v). on enveloped viruses.
  • the solvent-detergent treatment is carried out for a period of at least 6 hours at pH 7.1.
  • the protein solution treated solvent-detergent is then passed on a grafted exchange membrane of strong anions, type Mustang capsule Q, previously equilibrated with a buffer solution of base, pH 6,9-7,1 added sodium chloride to reach an osmolality of 370-390 mOsm / kg.
  • the capsule After passage of the protein solution, the capsule is rinsed with the same osmolality buffer solution 370-390 mOsm / Kg until the optical density of the column effluent returns to the baseline.
  • the protein fraction not adsorbed on the membrane is rich in fibrinogen and contains the added chemical agents for the viral inactivation treatment by solvent-detergent treatment.
  • the von Willebrand factor adsorbed on the membrane is then eluted by passage of the basic buffer solution, pH 6.9-7.1 of ionic strength increased by addition of sodium chloride to reach an osmolality of 600-660 mOsm / kg.
  • Purification of von Willebrand factor can be continued as described in Example 1.
  • Factor VIII adsorbed on the membrane is then eluted by passage of the base buffer solution, pH 6.9-7.1 ionic strength increased by addition. of sodium chloride to reach an osmolality of 1400-1700 mOsm / kg.
  • the factor VIII is eluted by a buffer solution, pH 6.0, of high ionic strength obtained by addition of calcium chloride.

Abstract

Le procédé de purification comprend, à partir d'une solution choisie parmi (i) une solution contenant un mélange de FVIII et FvW, (ii) une solution contenant du FvW, (iii) une solution issue d'une sécrétion d'un animal non-humain et (iv) une solution issue d'un extrait végétal contenant du FVIII, une étape d'absorption du FVIII ou du FvW sur une membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions.

Description

Procédé de purification du facteur VIII et du facteur Von Willebrand
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la purification du facteur VIII et du facteur Von Willebrand, pour leur utilisation comme principe actif de médicament.
ART ANTERIEUR
Le facteur VIII (ci-après aussi désigné « FVIII ») est une protéine plasmatique présente en faible concentration dans le plasma humain. Pourtant, elle constitue le point central de la cascade de la coagulation. En effet, cette protéine agit comme cofacteur du facteur IX (ou « FIX ») afin d'activer le facteur X (ou « FX »). Une fois activé, le facteur X convertit la prothrombine en thrombine, qui elle-même convertit le fibrinogène en fibrine, aboutissant à la formation du caillot de fibrine hémostatique.
Les individus atteints d'hémophilie A présentent un déficit en FVIII, qui engendre des hémorragies profuses, soit spontanément, soit à la suite d'un traumatisme d'origine accidentel ou chirurgical.
Ces individus sont traditionnellement traités par injection de FVIII plasmatique purifié. Ces injections étant souvent nombreuses et répétées, il est essentiel de disposer de concentrés de FVIII de haute pureté. En effet, si les concentrés de FVIII sont insuffisamment purifiés, ils peuvent contenir des quantités importantes de fibrinogène et d'immunoglobulines, susceptibles d'induire des réponses immunitaires indésirables.
La mise à disposition de protéines plasmatiques pour leur utilisation à des fins thérapeutiques nécessite donc des techniques de purification du FVIII plasmatique permettant d'obtenir des produits de haute pureté.
Les concentrés de Facteur VIII sont le plus souvent préparés à partir d'une fraction de plasma humain cryoprécipité. La pureté des concentrés de Facteur VIII généralement obtenus dans les centres industriels de traitement du plasma humain est souvent de l'ordre de 1 Ul/mg et n'excède généralement pas les limites de 10 à 20 Ul/mg. Les techniques de production classiques font appel à des étapes de précipitation qui visent à éliminer, souvent très imparfaitement, les contaminants protéiques tels que le fibrinogène, la fibronectine, et les immunoglobulines. Ces techniques peuvent utiliser ou combiner une précipitation à faible température (100C), ou l'adjonction d'agents de précipitation des protéines ; ainsi des polymères hydrophiles tels que le PEG (Newman et al., Br. J. Haematol 21 :1 -20, 1971 ; Hao et al. , in Methods of Plasma Protein Fractionation, Académie Press 1980, pp.57-74), la polyvinylpyrrolidone (Casillas et Simonetti, Br. J. Haemato, 50:665-672, 1982), le dextran, le Ficoll, le Percoll, l'amidon hydroxyéthylé et l'alumine ont été proposés comme agents de précipitation. Il en est de même de l'usage de glycocolle et de chlorure de sodium préconisé par Thorell et Blombàck (Thorell et Blombàck, Thromb Res. 1984 Aug 15;35(4):431 -50). De la même façon, certains auteurs (Ng et al, Thrombosis Res. ,42:825-834, 1986) ont réussi à combiner trois agents de précipitation qui sont le PEG, le glycocolle, et le chlorure de sodium pour obtenir des concentrés de Facteur VIII à activité spécifique comprise entre 10 et 16 UI/mg.
Des concentrés de Facteur VIII ont été produits également en intégrant au protocole de production un contact avec des billes de silice poreuse destinées à emprisonner les contaminants protéiques de faible poids moléculaire (Margolis et al., Vox Sang. 46:341 - 348,1984). L'activité spécifique du produit reste relativement faible : 1 UI/mg.
Des techniques sont apparues dans la préparation de concentrés de Facteur VIII de très haute pureté. Ainsi des concentrés obtenus par des méthodes de chromatographie d'immunoaffinité ont été proposés (Zimmerman et Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 58, 1987 ; Berntorp et Nilsson, Thrombosis Res., Suppl. VII, p.60, 1987 ; Levine et al., Thombosis Res, Suppl. VII, 1987). Ces techniques consistent à purifier le Facteur VIII à l'aide d'anticorps anti-Facteur VIIIiC ou anti-facteur von Willebrand immobilisés sur un support chromatographique. Ces techniques sont performantes mais exigent l'emploi de solutions drastiques pour désorber le Facteur VIII soit de son anticorps soit du facteur von Willebrand. Une étape supplémentaire d'ultrafiltration visant à éliminer les agents chimiques indésirables est donc nécessaire mais elle peut nuire à l'activité biologique du Facteur VIII. L'activité spécifique du Facteur VIII peut atteindre 4000 à 10000 Ul/mg en cours de production, mais sa fragilité exige l'adjonction d'un stabilisant, tel que l'albumine, avant l'étape de lyophilisation, ce qui réduit l'activité spécifique du Facteur VIII à 3 à 5 Ul/mg. L'inconvénient majeur de la purification par immunoaffinité est néanmoins la présence d'anticorps résiduels ; ceux-ci étant d'origine animale , ils peuvent entraîner chez les malades l'apparition de réactions immunologiques vis-à-vis de ces protéines étrangères à l'organisme humain. Ainsi, toutes ces techniques ne permettent pas de disposer de concentrés de
Facteur VIII de très haute pureté, totalement dépourvus de protéines d'origine étrangère telles que des anticorps d'origine animale, au moyen de procédés applicables à l'échelle industrielle.
Le document EP 0 343 275 décrit un procédé de préparation de Facteur VIII à partir d'un cryoprécipité qui se caractérise en ce que, précédemment au traitement d'inactivation virale, on met en suspension le cryoprécipité dans de l'eau contenant 1 à 3 U/ml d'héparine à pH 6,5-7,5, on fait réagir avec une suspension d'hydroxyde d'aluminium et après refroidissement à 10-180C et ajustage du pH à 6-7, on centrifuge ou on filtre puis on poursuit la purification par un traitement ultérieur, en particulier par chromatographie sur une résine échangeuse d'ions telle que Fractogel-DEAE (aujourd'hui dénommée DEAE- TOYOPEARL®, commercialisée par Tosoh Bioscience), de type hydrophile. Ce document décrit donc la purification du seul Facteur VIII par l'association d'une étape préliminaire très particulière, se caractérisant notamment par l'absence totale de traitement éthanolique, avec une chromatographie d'échange d'ions sur une résine hydrophile telle que Fractogel DEAE.
Le document EP 0 359 593 décrit un procédé de purification par chromatographie d'échange d'anions, qui permet de séparer sur une seule colonne chromatographique les protéines recherchées dans des conditions suffisamment ménagées pour rendre inutiles les traitements ultérieurs.. Ce procédé permet la séparation des protéines Facteur VIII, fibrinogène, fibronectine et de facteur von Willebrand du plasma humain ou animal. Ce procédé peut être résumé ainsi : on soumet la fraction du cryoprécipité resolubilisée dans l'eau à une séparation unique par voie chromatographique sur une résine échangeuse d'anions dont la matrice est un gel de type polymère vinylique macroréticulé capable, de par ses propriétés de porosité, de retenir le complexe Facteur Vlll-facteur von Willebrand, puis on récupère sélectivement les différentes protéines par des augmentations successives de la force ionique du tampon d'élution. Ce procédé donne des résultats satisfaisants en utilisant des groupements DEAE greffés sur une résine Fractogel® TSK- DEAE 650 (aujourd'hui dénommée D EAE-TOYO P E ARL®, commercialisée par Tosoh Bioscience) . Toutefois, ce procédé, s'il permet d'obtenir un FVIII purifié, ne permet pas d'obtenir un facteur Von Willebrand suffisamment purifié.
Or, le facteur Von Willebrand (ci-après aussi désigné « FvW ») joue un rôle essentiel dans l'hémostase par deux fonctions distinctes : comme protéine d'adhésion, il permet la dispersion, l'adhérence et l'agrégation des plaquettes sanguines sur le sous- endothelium vasculaire, et participe ainsi au processus de cicatrisation rapide des vaisseaux lésés et, d'autre part, il assure la stabilisation et le transport du Facteur VIII dans la circulation sanguine, auquel il est associé de manière non covalente. Une déficience congénitale en FvW ou une anomalie structurale de ce facteur entraîne la maladie de Willebrand qui se manifeste par des hémorragies cutanées et des muqueuses. Cette maladie est très hétérogène dans son expression clinique et pose de graves problèmes en cas d'intervention chirurgicale. Le traitement de la maladie de Willebrand s'impose pour corriger les anomalies de l'hémostase primaire (temps de saignement) et de la coagulation. La maladie se traite traditionnellement par thérapie de substitution par des dérivés de plasma humain enrichis en FvW (par exemple la fraction cryoprécipitée du plasma ou des concentrés de Facteur VIII contenant suffisamment de FvW associé à celui-ci).
Or, le FvW est une protéine difficile à purifier. En effet, le facteur Von Willebrand est la plus grosse protéine connue en circulation dans le plasma. Elle est constituée d'un ensemble de multimères liés par des ponts disulfure, dont l'élément de base a un poids moléculaire voisin de 260 kilodaltons (kDa). La plus petite forme de FvW, dans le plasma, est un dimère de 440-500 kDa et les formes les plus grandes sont des multimères de ce dimère dont le poids moléculaire peut atteindre 20 millions de daltons. Cet assemblage des sous-unités en multimères peut être spécifique des cellules dans lesquelles il est opéré, le FvW étant synthétisé et polymérisé dans les mégacaryocytes et dans les cellules endothéliales.
Ainsi, la complexité de la molécule du facteur von Willebrand, ainsi que sa liaison avec le FVIII, rend sa préparation très difficile. Divers procédés de préparation de concentrés de FvW associent typiquement des étapes de précipitation d'une fraction de plasma, destinée à l'élimination de la majeure partie des protéines indésirables (fibrinogène, fibronectine etc.), et/ou de chromatographies (échange d'ions, d'affinité, d'immunoaffinité, d'exclusion stérique etc.) qui visent à l'obtention de concentrés de très grande pureté, présentant une activité spécifique élevée, et qui permettent de conserver l'intégrité des formes multimériques, notamment celles de haut poids moléculaire dont l'importance biologique est fondamentale dans les processus de cicatrisation.
Le brevet EP 0 503 991 divulgue un procédé de préparation à l'échelle industrielle d'un concentré de FvW comprenant une étape de prépurification d'une fraction cryoprécipitée de plasma et trois étapes successives de chromatographie, la troisième étant une chromatographie d'affinité sur colonne de gélatine immobilisée sur agarose. Le concentré de FvW ainsi obtenu présente une activité spécifique supérieure à 100 VWF : RCo/mg exprimée en unités d'activité de cofacteur de ristocétine par mg de protéines et un taux de multimères de hauts poids moléculaire comparable à celui du plasma de départ. La demande de brevet EP 0 934 748 décrit un procédé de préparation de FvW comprenant la combinaison de chromatographies d'échange d'anions et d'échange de cations. Les fractions de FvW obtenues présentent une activité spécifique supérieure à 100 Ul FvW:Ag/mg exprimée en unités d'antigène de FvW par mg de protéine, mais contiennent des proportions encore notables de Facteur VIII. Le brevet US 6 579 723 décrit un procédé de préparation d'un FvW hautement purifié par chromatographie d'immunoaffinité dont les immunoadsorbants représentent des anticorps anti-FvW. Il peut également être prévu une étape supplémentaire de purification par chromatographie d'affinité sur héparine. Toutefois, l'inconvénient d'une purification par immunoaffinité est la présence éventuelle d'anticorps résiduels pouvant entraîner des réactions immunologiques.
Le brevet EP 0 383 234 enseigne la préparation d'un concentré de FvW par une chromatographie d'échange d'anions, mise en oeuvre avec des solutions acides (pH de 5,5 à 6,5) contenant des hydrates de carbone, pour la fixation du Facteur VIII sur l'échangeur d'anions. La récupération conjointe du FvW, de la fibronectine et du fibrinogène non retenus, par lavage du support, nécessite des étapes supplémentaires de précipitation pour l'isolement d'un concentré de FvW purifié. Le document EP 1 632 501 décrit un procédé de préparation d'un concentré de facteur von Willebrand de très haute pureté à partir d'une fraction biologique contenant du facteur von Willebrand, comprenant une séparation par chromatographie d'échange d'anions utilisant un support de polymère vinylique, de type base faible. Ce procédé possède l'avantage d'être de mise en œuvre très simple, permettant d'aboutir à un facteur Von Willebrand de haute activité spécifique et contenant très peu de facteur VIII.
Le FVIII et le FvW sont des protéines plasmatiques très importantes, et leur déficience chez certains individus entraîne des troubles graves de l'hémostase. C'est pourquoi il est de première importance de mettre au point des procédés de préparation de ces protéines, permettant d'obtenir des produits de pureté adaptée à leur utilisation répétée chez les patients.
Les procédés décrits dans l'art antérieur permettent soit d'obtenir un facteur VIII de bonne pureté, mais un facteur Von Willebrand de pureté insuffisante, soit d'obtenir un FVIII et un FvW de bonne pureté, mais au prix d'un procédé complexe à mettre en œuvre.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention a pour objet un procédé de purification d'une solution contenant un mélange de FVIII et de FvW, ou d'une solution contenant du FvW ou d'une solution issue d'une sécrétion d'un animal, en particulier non-humain, ou d'un extrait végétal contenant du FVIII, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de chromatographie sur une membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions permettant d'adsorber au moins une protéine choisie parmi le FVIII et le FvW.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Ainsi, l'invention a pour objet un procédé de purification de FVIII ou de FvW à partir d'une solution choisie parmi (i) une solution contenant un mélange de FVIII et de FvW, (ii) une solution contenant du FvW, (iii) une solution issue d'une sécrétion d'un animal non- humain et (iv) une solution issue d'un extrait végétal contenant du FVIII, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'adsorption du FVIII ou du FvW sur une membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions.
Par « procédé de purification », on désigne un procédé permettant de séparer le FVIII des autres molécules contenues dans le milieu, ou un procédé permettant de séparer le FvW des autres molécules contenues dans le milieu, ou un procédé permettant de séparer le FVIII du FvW, ou un procédé permettant de séparer les complexes FVIII/FvW des autres molécules contenues dans le milieu. Ces molécules peuvent être des protéines différentes du FVIII et du FvW, des virus, des bactéries, des spores, du milieu de culture, du sérum de veau fœtal, cette liste n'étant pas limitative.
Par « FVIII », on désigne toute forme de FVIII, notamment capable d'agir en tant que cofacteur dans l'activation du FIX et possédant la capacité de former un complexe avec le FvW, notamment le FVIII mature, les dérivés biologiquement actifs du FVIII mature, tels que le pro-FVIII qui contient le pro-peptide (pro-FVIII), les construits protéiques comprenant le FvW immature, le précurseur du FVIII (pré-pro-FVIII), le FVIII mature obtenu après clivage du peptide signal et du pro-peptide. D'autres dérivés biologiquement actifs du FVIII inclus dans l'invention sont des pro-drogues qui subissent des modifications post- traductionnelles ou qui sont converties en formes biologiquement actives, comme les formes tronquées, les formes délétées, par exemple le FVIII délété d'un ou plusieurs acides aminés situés dans la région entre Arg-759 et SeM 709 décrit dans le document EP 218 712, les formes chimériques, et les formes qui possèdent des modifications post- traductionnelles différentes des formes matures naturelles plasmatiques. Ces différentes formes de FVIII peuvent par exemple être fabriquées par modification du FVIII mature ou de toute autre forme naturellement présente dans le sang. La séquence nucléotidique codant pour un tel FVIII peut provenir de différentes sources, de préférence mammifère, incluant les versions humaines, porcines, ovines, bovines, équines, caprines, cette liste n'étant pas limitative. Par « FvW », on désigne toute forme de FvW, notamment le FvW mature, les dérivés biologiquement actifs du FvW mature, tels que le pro-FvW qui contient le pro- peptide, les construits protéiques comprenant le FvW immature, comprenant le précurseur du FvW (pré-pro-FvW), le propeptide du FvW (pro-FvW), le FvW mature obtenu après clivage du peptide signal et du pro-peptide. D'autres dérivés biologiquement actifs du FvW inclus dans l'invention sont des pro-drogues qui subissent des modifications post- traductionnelles ou qui sont converties en formes biologiquement actives, comme les formes tronquées, les formes délétées, par exemple le FvW dépourvu de domaine A2, et résistant à la protéolyse (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77 : 1008-1013, 1997), le fragment de FvW allant de Val 449 à l'Asn 730 incluant le domaine de liaison à la glycoprotéine 1 b et les sites de liaison pour le collagène et l'héparine (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164 : 1339-1347, 1989), les formes chimériques, et les formes qui ont des modifications post-traductionnelles différentes des formes matures naturelles plasmatiques. Ces différentes formes de FvW peuvent par exemple être fabriquées par modification du FvW mature ou de toute autre forme naturellement présente dans le sang. La séquence nucléotidique codant pour un tel FvW peut provenir de différentes sources, de préférence mammifère, incluant les versions humaines, porcines, ovines, bovines, équines, caprines, cette liste n'étant pas limitative.
Par « solution contenant un mélange de FVIII et de FvW », on désigne toute solution contenant du FVIII et du FvW, sous forme complexée ou séparée. Ces solutions peuvent être d'origine recombinante, transgénique ou plasmatique.
Dans le cas où la solution est d'origine recombinante, elle est issue d'un système unicellulaire, dans lequel on a induit l'expression des protéines de FVIII et de FvW. A titre d'exemple, on peut citer toutes les lignées cellulaires animales ou humaines transfectées à l'aide d'un vecteur contenant le gène codant pour chacune de ces protéines, de préférence le gène codant pour la protéine humaine, lesdites lignées pouvant être sélectionnées notamment parmi les lignées CHO-K, CHO-LeCI O, CHO Lec-1 , CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, YB2/0 (ATCC CRL-1662), BHK, K61 -I6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8. 653, SK-Hep, HepG2, PERC6 (Crucell), ainsi que les cellules de plantes, les systèmes bactériens, par exemple E. CoIi, les systèmes fongiques, les systèmes utilisant des virus, notamment des baculovirus, cette liste n'étant pas limitative. De tels systèmes cellulaires expriment les protéines de FvW et FVIII au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier. On peut citer par exemple le document US 5,198,349, dont le contenu est incorporé par référence, qui décrit la co-expression du FVIII et du FvW, notamment dans des cellules CHO co-transfectées avec d'une part un vecteur d'expression dans lequel la séquence du FVIII a été insérée, et d'autre part un vecteur d'expression dans lequel a été insérée la séquence codante du FvW.
Dans le cas où la solution est d'origine transgénique, elle est issue d'un système pluricellulaire, notamment un animal ou une plante obtenu par transgénèse, c'est-à-dire dans lesquels une ou plusieurs cellules ont reçu une molécule d'ADN recombinant . A titre d'exemple on peut citer les chiens, les chats, les souris, les rats, le hamster, les vaches, les chèvres, les moutons, les lapins et les porcs, les chevaux, les insectes, les plantes, par exemple le tabac, le soja, cette liste n'étant pas limitative. Dans le cas des animaux produisant le FVIII et le FvW, cette production peut avoir lieu dans divers milieux sécrétés par l'animal, par exemple l'urine, le sang, la salive ou le lait, cette liste n'étant pas limitative. De telles méthodes de production peuvent être réalisées au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier. On peut citer par exemple le document EP 0 741 515 et le document EP 807 170, cette liste n'étant pas limitative. Ce dernier décrit la production d'un animal transgénique ayant intégré de manière stable dans son génome les molécules d'ADN codant pour le FVIII et le FvW, de manière à les exprimer toutes deux et à les sécréter dans leur lait.
Dans le cas des plantes produisant le FVIII et le FvW, cette production peut être réalisée au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, comme par exemple les documents US 6,331 ,416 et US 5,994,628, cette liste n'étant pas limitative.
Dans le cas où la solution est d'origine plasmatique, elle peut être soit du plasma, animal ou humain, soit du cryoprécipité , ou une fraction obtenue par des méthodes de fractionnement classiques (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc, 68, 459, 1946 et Kistler et al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Ces fractions peuvent éventuellement avoir subi un traitement de prépurification tel que par adsorption sur hydroxyde d'aluminium.
Le mélange de FVIII et de FvW implique que ces protéines peuvent être en proportions environ égales, ou bien qu'une protéine est présente de manière majoritaire, voire très majoritaire, par rapport à l'autre. Par « solution contenant du FvW », on désigne toute solution contenant du FvW, et essentiellement dépourvue, c'est-à-dire contenant peu, voire très peu, de FVIII. Cette solution peut être d'origine recombinante, transgénique ou d'origine plasmatique.
Dans le cas où la solution est d'origine recombinante, elle est issue d'un système unicellulaire, dans lequel on a induit l'expression de la protéine de FvW. A titre d'exemple, on peut citer toutes les lignées cellulaires animales ou humaines transfectées à l'aide d'un vecteur contenant le gène codant pour cette protéine, de préférence le gène codant pour la protéine humaine, lesdites lignées pouvant être sélectionnées notamment parmi les lignées CHO-K, CHO-LeCI O, CHO Lec-1 , CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, YB2/0, BHK, K61 -I6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8. 653, SK- Hep, HepG2, ainsi que les cellules de plantes, les systèmes bactériens, par exemple E. CoIi, les systèmes fongiques, les systèmes utilisant des virus, notamment des baculovirus, cette liste n'étant pas limitative.
De tels systèmes cellulaires expriment la protéine de FvW et peuvent être obtenues au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier. On peut citer par exemple les documents US 5,198,349 et WO 89/06096, cette liste n'étant pas limitative. Le document US 5,198,349 décrit ainsi l'expression du FvW humain dans des cellules COS, au moyen de l'insertion du cDNA codant pour le FvW humain dans un vecteur d'expression.
Dans le cas où la solution est d'origine transgénique, elle est issue d'un système pluricellulaire, notamment un animal ou une plante obtenu par transgénèse, c'est-à-dire dans lesquels une ou plusieurs cellules ont reçu une molécule d'ADN recombinant codant pour le FvW. A titre d'exemple on peut citer les chiens, les chats, les souris, les rats, les vaches, les chèvres, les moutons, les lapins et les porcs, les insectes, les plantes, par exemple le tabac, le soja, cette liste n'étant pas limitative.
Dans le cas des animaux transgéniques produisant le FvW, cette production peut avoir lieu dans divers milieux sécrétés par l'animal, par exemple l'urine, le sang, la salive ou le lait, cette liste n'étant pas limitative. De telles méthodes de production peuvent être réalisées au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier. On peut citer par exemple les documents WO 2001/022810 et WO1999/058699, cette liste n'étant pas limitative. A cet égard, le document WO 2001/022810 décrit la réalisation de souris transgéniques produisant du FvW humain dans le lait des femelles.
Dans le cas des plantes produisant le FVIII et le FvW, cette production peut être réalisée au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, comme par exemple les documents US 6,331 ,416 et US 5,994,628, cette liste n'étant pas limitative.
Dans le cas où la solution est d'origine plasmatique, elle peut être une fraction de plasma animal ou humain, soit du cryoprécipité, ou une fraction obtenue, obtenu par des méthodes de fractionnement classiques (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc, 68, 459, 1946 et Kistler et al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Ces fractions peuvent éventuellement avoir subi un traitement de prépurification tel que par adsorption sur hydroxyde d'aluminium.
Par « solution issue d'une sécrétion d'un animal non-humain contenant du FVIII », on désigne toute solution issue de toute sécrétion, par exemple du plasma, de la salive, de l'urine ou du lait, produite par un animal transgénique fabriqué de manière à ce qu'il exprime une molécule de FVIII dans une des sécrétions citées précédemment. Dans ce cas, le FvW n'est pas exprimé par l'animal transgénique. Par « solution issue du plasma contenant du FVIII », on désigne également toute solution issue du plasma contenant naturellement du FVIII, humain ou animal, et essentiellement débarrassée de FvW. Elle peut être issue d'une fraction de plasma animal ou humain, soit du cryoprécipité, ou une fraction obtenue par des méthodes de fractionnement classiques (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc, 68, 459, 1946 et Kistler et al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424). Ces fractions peuvent éventuellement avoir subi un traitement de prépurification tel que par adsorption sur hydroxyde d'aluminium.
Des méthodes de production de sécrétions d'un animal transgénique peuvent être réalisées au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier. On peut citer par exemple les documents US 5,880,327 et US2007/001 1752, cette liste n'étant pas limitative. A cet égard, le document US 5,880,327 décrit la production de FVIII humain dans le lait d'une souris transgénique. Le document US2007/001 1752 décrit la production de protéines humaines, par exemple le FVIII, dans la salive de différents animaux. Par « solution issue d'un extrait végétal contenant du FVII I », on désigne tout fraction d'un végétal renfermant des protéines de FVIII, notamment humain, produit dans une plante ou une cellule de plante transgénique fabriquée de manière à ce qu'il exprime une molécule de FVIII.
Un tel extrait peut être fabriqué par introduction dans une cellule de plante d'un vecteur nucléotidique contenant le gène codant pour le FVIII. De telles méthodes sont bien connues de l'homme du métier, et peuvent être illustrées par de nombreux documents de l'état de la technique, comme par exemple le document US 2005/0060775.
Par « membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions » on désigne toute barrière physique semi-perméable, possédant la capacité d'adsorber le FVIII et/ou le FvW par échange d'ions lorsque ces protéines sont entraînées à travers la membrane. De plus, cette membrane possède la capacité de laisser passer le FVIII et le FvW lorsque l'interaction par échange d'ions entre la membrane et le FVIII et/ou le FvW n'est plus suffisante pour les retenir sur la membrane.
Ainsi, pour mettre en œuvre le procédé de purification de FVIII ou de FvW de l'invention, on utilise une membrane filtrante échangeuses d'ions constituée d'un support macroporeux comprenant, immobilisé sur ledit support, un revêtement chargé négativement ou positivement, ledit revêtement conférant à la membrane filtrante les propriétés d'échange d'ions. En général, le revêtement chargé négativement ou positivement est immobilisé sur le support macroporeux par greffage chimique. Le support macroporeux possède une porosité, c'est-à-dire une taille moyenne de pores, telle que la membrane filtrante permet de laisser passer le FVIII et le FvW. Un premier avantage lié à l'utilisation d'une telle membrane est la possibilité d'utiliser des membranes filtrantes échangeuses à usage unique, ce qui accroît le niveau de sécurité sanitaire du procédé. Un second avantage lié à l'utilisation d'une telle membrane est la possibilité de réaliser le procédé de purification de l'invention, et plus précisément le ou les étape(s) de chromatographie d'échange d'ions, avec un débit très élevé de la solution à purifier.
Tout type de support barrière physique peut convenir pour une membrane filtrante adaptée à la mise en œuvre de l'invention, par exemple , un film polymère, réseau capillaire, fibre creuse, , cellulose stabilisée, polyéthersulfone, ou toute structure tridimensionnelle ayant la capacité de laisser passer le FVIII et le FvW. L'interaction par échange d'ions entre la membrane filtrante et les protéines de FVIII et de FvW sont dues au revêtement chargé positivement ou négativement qui est immobilisé sur le support macroporeux, ledit revêtement possédant des groupements fonctionnels basiques ou acides qui peuvent être échangés. Le revêtement échangeur d'ions peut être de type monofonctionnel, c'est-à-dire comportant seulement une variété de groupement fonctionnel, ou de type polyfonctionnel s'il comporte différents types de groupements fonctionnels.
Ainsi, la membrane filtrante permet une capture, ou adsorption, simultanée des protéines de FVIII et de FvW, grâce à l'interaction entre ces protéines et la membrane. Lors de l'application d'une solution contenant du FVIII et du FvW sur la membrane, le FvW et le FVIII sont retenus par la membrane grâce à des interactions par échange d'ions.
Dans le cas où les produits à purifier ne sont pas contenus dans du cryoprécipité, il est préférable de réaliser une étape de pré-purification de la solution à purifier avant la mise en œuvre du procédé de purification de l'invention, afin d'obtenir une solution suffisamment débarrassée des impuretés.
Cette étape de pré-purification peut être avantageuse notamment dans le cas des solutions complexes, par exemple issues du lait ou du plasma, qui est un milieu contenant de nombreuses protéines. Une telle étape de pré-purification peut notamment comprendre une étape de clarification, par exemple telle que décrite dans le document WO 2004/076695, ou une étape d'extraction telle que décrite par exemple dans les documents FR 06 04864 ou FR 06 1 1536, cette liste n'étant pas limitative. A cet égard, le document FR 06 04864 décrit un procédé d'extraction d'au moins une protéine présente dans du lait, ladite protéine présentant une affinité pour les ions calcium complexés ou non dudit lait, comprenant les étapes suivantes consistant à : (i) libérer la protéine par la précipitation de composés de calcium obtenue par mise en contact du lait avec un sel soluble, par exemple le phosphate de sodium, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former dans un tel milieu lesdits composés de calcium insolubles, pour ainsi obtenir une phase liquide enrichie en la protéine,
(ii) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et en une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, et
(iii) récupérer la phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine. Par ailleurs, le document FR 06 1 1536 décrit un procédé d'extraction d'une protéine présente dans du lait, présentant au moins une poche hydrophobe et une charge négative au pH naturel du lait, comprenant les étapes suivantes de: a) Ecrémage et délipidation dudit lait, b) Passage de la fraction délipidée et écrémée contenant ladite protéine sur un support chromatographique sur lequel est greffé un ligand présentant à la fois un caractère hydrophobe et un caractère ionique, par exemple le 4-Mercapto-Ethyl- Pyridine dans des conditions de pH permettant à ladite protéine d'être retenue sur ledit support, c) Elution de la protéine, d) Purification de la fraction éluée par élimination des protéines du lait de ladite fraction éluée, et e) Récupération de ladite protéine. Dans le cas des solutions produites par un système cellulaire, l'étape de prépurification peut être effectuée immédiatement après l'étape de culture cellulaire elle- même. La composition du milieu de culture cellulaire peut être contrôlée de manière à ce que les protéines produites par la cellule soient excrétées dans le milieu extra-cellulaire. Par ailleurs, le choix des cellules peut être effectué de manière à ce que la protéine produite soit excrétée dans le milieu.
Puis, une étape de filtration en profondeur ou une micro-filtration tangentielle peut convenir pour obtenir une pré-purification adaptée à la mise en œuvre des étapes du procédé de purification de l'invention.
Dans certains modes de réalisation particulier de l'invention, la membrane filtrante est une membrane échangeuse de cations. Les contre-ions positifs des groupements fonctionnels portés par la membrane sont échangés par des charges de même signe sur le FvW et le FVIII.
Parmi les groupements fonctionnels susceptibles d'être utilisés pour le revêtement échangeur de cations, on peut citer le carboxymétyl (CM), le phosphoryl et le sulfopropyl (SP), le sulfate (S), cette liste n'étant pas limitative.
Dans ces modes de réalisation utilisant une membrane filtrante échangeuse de cations, les tampons susceptibles d'être utilisés sont le Tris-hydroxyméthyl-aminométhane, le carbonate, l'éthylène diamine, l'imidazole ou la triéthanolamine, cette liste n'étant pas limitative. Dans ces modes de réalisation, le pH du tampon sera choisi en fonction du point isoélectrique de la protéine, de manière à ce que la protéine soit à ce pH de charge globale positive, selon des techniques de routine bien connues de l'homme du métier. Dans certains autres modes de réalisation de l'invention, la membrane filtrante mise en œuvre est une membrane échangeuse d'anions. Les contre-ions négatifs des groupements fonctionnels portés par la membrane sont échangés par des charges de même signe sur le FvW et le FVIII. Parmi les groupements fonctionnels susceptibles d'être utilisés pour le revêtement échangeur d'anions, on peut citer le Diéthylaminoéthyl (DEAE), le Diéthyl (2- hydroxypropyl) aminoéthyl ou ammonium quaternaire (QAE, Q), le Diméthylaminoéthyl (DMAE) et le Triméthylaminoéthyl (TMAE), cette liste n'étant pas limitative. Dans ces modes de réalisation, les tampons susceptibles d'être utilisés sont l'acétate, le citrate, le phosphate, la glycine, le barbiturate, cette liste n'étant pas limitative.
Dans ces modes de réalisation, le pH du tampon sera choisi en fonction du point isoélectrique de la protéine, de manière à ce que la protéine soit à ce pH de charge globale négative, selon des techniques de routine bien connues de l'homme du métier.
De manière préférée, la membrane filtrante comprend un revêtement d'échange d'ions consistant en un échangeur anionique fort.
Par « échangeur anionique fort » on désigne toute membrane échangeuse d'anions capables d' adsorber des protéines faiblement ionisées.
De telles membranes filtrantes sont disponibles dans le commerce. A titre d'exemple, on peut citer les membranes portant des groupements QAE, Q, notamment la membrane Mustang Q® (PaII) ou la membrane Sartobind Q (Sartorius), cette liste n'étant pas limitative.
La membane Mustang Q (PaII) est particulièrement avantageuse, car elle possède une grande capacité d'adsorption, des débits volumiques de chromatographie importants, une possibilité d'usage unique ou multi-cycle. Par ailleurs, elle permet de s'affranchir des étapes de validations de nettoyage du support, telles que la régénération et la sanitisation (étude sécurisation virale, prions, cette liste n'étant pas limitative).
L'utilisation d'une telle membrane filtrante permet également de s'affranchir des études de vieillissement réalisées traditionnellement avec les supports classiques. Ainsi, l'utilisation d'une telle membrane permet la réduction des temps de production par rapport à des procédés de l'état de la technique.
De manière préférée, la surface de la membrane filtrante en contact avec la solution à purifier comporte un revêtement échangeur d'anions comprenant des groupes ammonium quaternaires qui sont immobilisés sur le support macroporeux par greffage chimique.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la membrane filtrante est de type macroporeux. Par « macroporeux » on désigne un système de pores compris dans la membrane, dont la taille est comprise entre 0.3 μm et 1.0 μm. Préférentiellement, la taille des pores est comprise entre 0.5 μm et 0.9 μm. De manière particulièrement préférée, la taille des pores est de 0.8 μm. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le support de la membrane est en polyéthersulfone.
A titre d'exemple, une telle membrane en polyéthersulfone peut être une membrane Mustang Q®, distribuée par PaII. Cette membrane possède des pores de taille 0.8 μm, et elle est greffée avec des groupements aminés quaternaires. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la solution à purifier contient du FVIII ou du FvW, et est d'origine plasmatique.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la solution à purifier contient un mélange de FVIII et de FvW, et est préférentiellement d'origine plasmatique.
Ainsi, dans ces modes de réalisation de l'invention, la solution est dérivée d'un plasma humain ou animal naturel, c'est-à-dire contenant à l'état naturel du FVIII et du FvW, humain ou animal respectivement. Un tel plasma animal peut être prélevé chez le porc, le lapin, la chèvre, cette liste n'étant pas limitative.
De manière surprenante, le Demandeur a constaté que les membranes filtrantes, et notamment la membrane Mustang Q®, possèdent une capacité d'adsorption du FVIII et/ou du FvW supérieure à celle d'une résine ou d'un gel. Par capacité d'adsorption, on entend la quantité des protéines cibles fixées sur le gel ; elle est généralement exprimée par le fournisseur des gels ou résines par la quantité de BSA (sérum albumine bovin) fixée sur le gel pour les résines anioniques. Par exemple, elle est comprise entre 25 à 35 mg/ml pour le gel D EAE-TOYOP EARL®, habituellement utilisé pour la purification du FVIII et/ou du FvW, alors qu'elle est supérieure ou égale à 30 mg/ml pour la membrane Mustang Q®.
Cette plus grande capacité d'adsorption de la membrane filtrante se traduit par la possibilité d'utiliser une plus faible quantité d'équivalent gel pour adsorber une même quantité de FVIII et/ou de FvW que sur un gel ou une résine. A titre indicatif, il est possible d'adsorber 50 à 80 Ul FvW et FVIII /ml de gel sur DEAE et 200 à 250 Ul VWF et FVIII/ ml d'équivalent gel pour Mustang Q®.
La plus grande capacité d'adsorption de la membrane filtrante par rapport à un gel ou une résine pourrait s'expliquer par une meilleure accessibilité des sites ionisés pour le FVIII et/ou le FvW, notamment lorsqu'ils forment des complexes de FVIII/FvW. En effet, ces protéines possèdent une taille élevée, notamment lorsqu'ils forment des complexes de FVIII/ FvW, et l'on peut émettre l'hypothèse que les sites ionisés leur sont plus facilement accessibles lorsque ceux-ci sont greffés sur la membrane filtrante macroporeuse, du fait de la taille des pores, que sur les gels ou les résines, dont les sites ionisés sont enchâssés dans des canaux, les rendant moins facilement accessibles à de grosses protéines.
Avantageusement, dans ce mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé comporte les étapes suivantes : a) Obtention du cryoprécipité du plasma, b) Capture, c'est-à-dire adsorption, du facteur VIII et du facteur Von Willebrand sur ladite membrane de chromatographie échangeuse d'ions, et plus particulièrement sur la membrane chromatographique échangeuse d'anions, et c) Récupération sélective du facteur Von Willebrand et du facteur VIII par augmentations successives de la force ionique du tampon d'élution.
Avantageusement, après l'étape d'obtention du cryoprécipité du plasma, on effectue une étape de prépurification par adsorption du facteur VIII et du facteur Von Willebrand sur un gel d'alumine, puis une précipitation à froid.
A l'étape c) du procédé ci-dessus, la valeur de force ionique du tampon d'élution est aisément adaptée par l'homme du métier, au vu de ses connaissances générales des propriétés physico-chimiques de chacune des protéines FvW et FVIII et des propriétés d'échanges d'ions de la membrane filtrante, qui est en général une membrane filtrante accessible dans le commerce, pour laquelle il existe des recommandations d'utilisation par le fabricant. Notamment, l'homme du métier sait, de par ses connaissances générales, que le FVIII est élue d'un support de chromatographie d'échanges d'anions avec un tampon ayant une force ionique supérieure à la force ionique nécessaire à l'élution du FvW du même support.
Ainsi, à l'étape c) du procédé ci-dessus, l'homme du métier utilise un tampon de force ionique appropriée pour éluer (désorber du support) (i) le FvW, (ii) le FvW et le FVIII ou bien encore (iii) successivement d'abord le FvW, puis le FVIII. Selon un premier mode de réalisation de l'alternative (iii) d'élution successive de FvW, puis de FVIII, l'homme du métier peut utiliser successivement deux tampons d'élution, chaque tampon d'élution ayant une force ionique adaptée à la désorption du FvW ou du FVIII, respectivement. Selon un second mode de réalisation de l'alternative (iii), l'homme du métier réalise l'élution avec un tampon permettant de générer un gradient de force ionique croissante, avec lequel sont désorbés successivement le FvW, puis le FVIII.
Ainsi, par « augmentations successives de la force ionique du tampon d'élution », pour l'étape c) du procédé ci-dessus, on englobe une augmentation linéaire de la force ionique du tampon d'élution, qui peut être obtenue en ajoutant un sel, par exemple du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. On obtient tout d'abord l'élution du FvW, puis l'élution du FVIII en augmentant la force ionique du tampon. On peut donc soit récupérer le FvW et arrêter l'élution après l'obtention du FvW, soit obtenir le FVIII en continuant l'élution.
Par « cryoprécipité» on désigne un précipité obtenu à partir d'un plasma humain ou animal par une technique de précipitation à basse température. Le cryoprécipité peut être obtenu par des méthodes bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, le plasma congelé est amené à une température d'environ -50C à -150C puis réchauffé lentement sous agitation à une température qui ne dépasse pas 1 °C ou éventuellement 4°C. Dans ces conditions, le plasma gelé fond pour donner une phase liquide et une phase solide, la phase solide, le cryoprécipité, étant alors récupérée par centrifugation. Le cryoprécipité est composé essentiellement de fibrinogène, fibronectine, facteur VIII et facteur Von
Willebrand (vWF). Dans le cryoprécipité, le FVIII est généralement associé au FvW qui stabilise le FVIII.
Par « récupération sélective » on désigne la faculté de récupérer soit le FVIII, soit le FvW, soit un mélange de FVIII et de FvW, selon la méthode d'élution, selon la ou les protéines que l'on désire obtenir.
Il est possible d'obtenir soit un FvW, soit un FVII I, soit un mélange de FVIII et de FvW, en modifiant le pH, ou en augmentant la force ionique du tampon d'élution selon une technique bien connue de l'homme du métier (voir par exemple l'exemple 1 ). Dans un autre mode de réalisation, la solution à purifier contient un mélange de
FVIII et de FvW d'origine recombinante ou transgénique.
Ce mode de réalisation comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'un surnageant cellulaire ou d'une solution pré-purifiée comprenant le FVIII et le FvW, b) Capture du facteur VIII et du facteur Von Willebrand sur ladite membrane de chromatographie échangeuse d'ions, et plus particulièrement sur la membrane chromatographique échangeuse d'anions, et c) Récupération sélective du facteur Von Willebrand et du facteur VIII par augmentations successives de la force ionique du tampon d'élution. Dans une autre mode de réalisation de l'invention, la solution à purifier contient soit
Ie FVIII, soit le FvW.
Ce mode de réalisation comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'un surnageant cellulaire ou d'une solution purifiée comprenant le FVIII ou le FvW, b) Capture du facteur VIII ou du facteur Von Willebrand sur ladite membrane de chromatographie échangeuse d'ions, et plus particulièrement sur la membrane chromatographique échangeuse d'anions, et c) Récupération du facteur Von Willebrand ou du facteur VIII. De manière avantageuse, dans le cas d'une fraction plasmatique, le procédé de l'invention permet une réduction de la quantité des facteurs vitamine K dépendants, du fibrinogène et de la fibronectine. Avantageusement, plus particulièrement lorsque la solution à purifier contient un mélange de FVIII et de FvW, la récupération sélective du FvW et du FVIII est réalisée selon les étapes suivantes : d ) Elution du FvW par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie. Par exemple, la force ionique peut être augmentée par addition de chlorure de sodium à 0,25 M pour atteindre une osmolalité comprise entre 600 et 660 mOsm/Kg environ. c2) Elution du FVIII par augmentation encore plus élevée de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie que pour la récupération du facteur Von Willebrand. Par exemple, la force ionique peut être augmentée par addition de chlorure de sodium à 0,7 M, ou de chlorure de calcium à 0,35 M, pour atteindre une osmolalité comprise entre 1400 et 1700 mOsm/Kg environ.
L'étape d ) est une étape de récupération sélective du FvW, au cours de laquelle on utilise une solution tampon ayant une force ionique appropriée pour désorber le FvW de la membrane filtrante échangeuse d'ions. L'étape c2) est une étape de récupération sélective du FVIII, au cours de laquelle on utilise une solution tampon ayant une force ionique appropriée pour désorber le FVIII de la membrane filtrante échangeuse d'ions. A l'étape c2), on utilise une solution tampon ayant une force ionique supérieure à la force ionique de la solution tampon utilisée pour l'étape d). Ces étapes sont effectuées après l'étape de capture simultanée du FVIII et du FvW sur la membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions.
Le FvW élue à l'étape d ) est contenant très peu de FVIII. Il est récupéré et l'on obtient une solution de FvW purifiée.
Par ailleurs, le FVIII obtenu à l'étape c2) contient moins de FvW que la solution de départ. Il est récupéré et l'on obtient une solution de FVIII purifiée.
Optionnellement, il est possible de mettre en œuvre une étape supplémentaire permettant la dissociation des complexes de haut poids moléculaire FVIII-FvW, par exemple comme décrit dans le document EP 1 037 923. Optionnellement, il est alors possible de mettre en œuvre une étape de filtration supplémentaire de la solution purifiée de FVIII, sur un filtre hydrophile d'une porosité inférieure ou égale à 20nm, notamment égale à 15nm, comme décrit dans le document WO 2005/040214. Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention permet d'obtenir une solution de FvW purifié, par mise en œuvre, après l'étape d'adsorption simultanée du FVIII et du FvW sur ladite membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions, des étapes suivantes : d) Elution du FvW par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie, e) capture du facteur Von Willebrand sur membrane de chromatographie échangeur d'ions, préférentiellement du même type que la première, et f) élution du facteur Von Willebrand par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie.
Dans ce mode de réalisation, il est éventuellement possible, après l'étape d) d'élution du FvW par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie, d'éluer le FVIII par augmentation encore plus élevée de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie que pour la récupération du facteur Von Willebrand. Ainsi, on obtient successivement, dans un procédé simplifié, à la fois une solution contenant un FvW purifié, et une autre solution contenant un FVIII purifié.
Le procédé de l'invention a donc pour avantage de permettre la purification séquentielle ou simultanée du FVIII et du FvW à partir d'une solution contenant du FVIII et du FvW. Si la solution est d'origine plasmatique, le procédé de l'invention est particulièrement avantageux car il permet de rentabiliser au mieux l'utilisation du plasma, humain ou animal.
Avantageusement, ce mode de réalisation particulier comprend en plus les étapes suivantes : g) chromatographie de la fraction éluée à l'étape c) enrichie en facteur Von
Willebrand sur une colonne de gel d'affinité avec ligand gélatine, et h) récupération de la fraction de facteur Von Willebrand non retenue et dépourvue de fibronectine.
Le dosage de la fibronectine peut être effectué par exemple par immunonéphélométrie, selon une technique bien connue de l'homme du métier.
Ainsi, un mode de réalisation du procédé de l'invention permet d'obtenir une solution de FVIII purifié et une solution de FvW purifié, en mettant en œuvre, après l'étape de capture simultanée du FVIII et du FvW sur la membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions, les étapes suivantes : a) Elution du FvW par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie, b) Elution du FVIII par augmentation encore plus élevée de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie que pour la récupération du facteur Von Willebrand c) Capture du facteur Von Willebrand sur membrane de chromatographie échangeur d'ions, d) élution du facteur Von Willebrand par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie. e) Chromatographie de la fraction éluée à l'étape d) enrichie en facteur Von Willebrand sur colonne de gel d'affinité avec ligand gélatine, et f) Récupération de la fraction non retenue sur le gel d'affinité et enrichie en facteur von Willebrand.
Ainsi, dans ce mode de réalisation, on obtient successivement une solution de FVIII purifié et une solution de FvW purifié.
Le procédé de l'invention, dans ses différents modes de réalisation, permet donc de séparer le FVIII et le FvW de manière simplifiée.
Les étapes de purification de l'invention sont les seules qui permettent de purifier séparément ou simultanément le facteur VIII et le facteur von Willebrand à partir du plasma par captures simultanées des deux protéines sur membrane de chromatographie échangeur anionique. Un autre objet de l'invention est un procédé d'obtention d'un FVIII purifié comprenant la mise en œuvre du procédé de purification de l'invention.
Un autre objet de l'invention est une procédé d'obtention d'un FvW purifié comprenant la mise en œuvre du procédé de purification de l'invention.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Figures
Figure 1 : schéma du procédé de purification du facteur von Willebrand
Figure 2 : schéma du procédé de purification du facteur VIII
Exemples Exemple 1 : Procédé de purification du facteur von Willebrand
Du cryoprécipité est préparé par décongélation du plasma frais congelé à une température située entre 1 0C et 60C.
Après centrifugation, le cryoprécipité contenant le fibrinogène, la fibronectine, le facteur von Willebrand et le facteur VIII est récupéré et remis en suspension dans une solution aqueuse d'héparine sodique à 3 UI/mL Le pH de la solution est alors ajusté à 7,0 ± 0,1.
Le cryoprécipité remis en solution est soumis à une pré purification par adsorption sur gel d'alumine pour éliminer les facteurs vitamine K dépendants et précipitation à froid du fibrinogène et de la fibronectine. Ainsi, de l'hydroxyde d'alumine est ajouté à la suspension sous agitation durant 5 minutes. Le pH est ajusté à 6,5 + 0,2 avec de l'acide acétique 0,1 M et la solution est refroidie sous agitation jusqu'à ce que la température soit comprise entre 14 et 180C. La solution est alors centrifugée à une température de 14- 18°C. Le surnageant est récupéré et clarifié par filtration sur filtre 0,22 μm. Cette solution pré purifiée est ensuite soumise à une étape d'inactivation virale par traitement solvant-détergent en présence de Polysorbate 80 (1 % , p/v) et Tri-n-Butyl Phosphate (0,3% , v/v) efficace sur les virus enveloppés. Le traitement solvant-détergent est réalisé pendant une durée d'au moins 6 heures à pH 7,1.
La solution protéique traitée solvant-détergent est alors passée sur une membrane greffée d'échange d'anions forts, type capsule Mustang Q, préalablement équilibrée avec une solution tampon de base, pH 6,9-7,1 additionnée de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 370-390 mOsm/Kg.
Après passage de la solution protéique, la capsule est rincée avec la même solution tampon d'osmolalité 370-390 mOsm/Kg jusqu'à ce que la densité optique de l'effluent de colonne revienne à la ligne de base. La fraction protéique non adsorbée sur la membrane est riche en fibrinogène et contient les agents chimiques ajoutés pour le traitement d'inactivation virale par traitement solvant-détergent.
Le Facteur von Willebrand adsorbé sur la membrane est alors élue par passage de la solution tampon de base, pH 6,9-7,1 de force ionique augmentée par addition de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 600-660 mOsm/Kg. La fraction éluée est alors diluée avec la solution tampon de base, pH 6,9-7,1 dépourvue de chlorure de sodium jusqu'à atteindre une osmolalité de 370-390 mOsm/Kg.
La fraction diluée est alors passée sur une membrane greffée d'échange d'anions forts, type capsule Mustang Q, préalablement équilibrée avec une solution tampon de base, pH 6,9-7,1 additionnée de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 370-
390 mOsm/Kg. Après passage de la solution protéique, la capsule est rincée avec la même solution tampon d'osmolalité 370-390 mOsm/Kg jusqu'à ce que la densité optique de l'effluent de colonne revienne à la ligne de base. Le facteur von Willebrand adsorbé sur la membrane est alors élue par passage de la solution tampon de base, pH 6,9-7,1 de force ionique augmentée par addition de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 600-660 mOsm/Kg. La fraction éluée est ensuite chromatographiée sur gel d'affinité avec ligand gélatine préalablement équilibré avec une solution tampon de base, pH 6,9-7,1 de force ionique augmentée par addition de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 600-660 mOsm/Kg. Après passage de la solution protéique, le gel d'affinité est rincé avec la même solution tampon d'osmolalité 600-660 mOsm/Kg jusqu'à ce que la densité optique de l'effluent de colonne revienne à la ligne de base. La fraction non adsorbée incluant le lavage du gel constitue la fraction enrichie facteur von Willebrand de haute pureté.
Le schéma de purification est présenté en figure 1
Résultats
Tableau 1 : Purification du facteur von Willebrand
Exemple 2 : Procédé de purification du facteur VIII
Du cryoprécipité est préparé par décongélation du plasma frais congelé à une température située entre 1 0C et 60C.
Après centrifugation, le cryoprécipité contenant le fibrinogène, la fibronectine, le facteur von Willebrand et le facteur VIII est récupéré et remis en suspension dans une solution aqueuse d'héparine sodique à 3 UI/mL. Le pH de la solution est alors ajusté à 7,0 ± 0,1.
Le cryoprécipité remis en solution est soumis à une pré purification par adsorption sur gel d'alumine pour éliminer les facteurs vitamine K dépendants et précipitation à froid du fibrinogène et de la fibronectine. Ainsi, de l'hydroxyde d'alumine est ajouté à la suspension sous agitation durant 5 minutes. Le pH est ajusté à 6,5 + 0,2 avec de l'acide acétique 0,1 M et la solution est refroidie sous agitation jusqu'à ce que la température soit comprise entre 14 et 180C. La solution est alors centrifugée à une température de 14- 18°C. Le surnageant est récupéré et clarifié par filtration sur filtre 0,22 μm. Cette solution pré purifiée est ensuite soumise à une étape d'inactivation virale par traitement solvant-détergent en présence de Polysorbate 80 (1 % , p/v) et Tri-n-Butyl Phosphate (0,3% , v/v) efficace sur les virus enveloppés. Le traitement solvant-détergent est réalisé pendant une durée d'au moins 6 heures à pH 7,1.
La solution protéique traitée solvant-détergent est alors passée sur une membrane greffée d'échange d'anions forts, type capsule Mustang Q, préalablement équilibrée avec une solution tampon de base, pH 6,9-7,1 additionnée de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 370-390 mOsm/Kg.
Après passage de la solution protéique, la capsule est rincée avec la même solution tampon d'osmolalité 370-390 mOsm/Kg jusqu'à ce que la densité optique de l'effluent de colonne revienne à la ligne de base. La fraction protéique non adsorbée sur la membrane est riche en fibrinogène et contient les agents chimiques ajoutés pour le traitement d'inactivation virale par traitement solvant-détergent.
Le Facteur von Willebrand adsorbé sur la membrane est alors élue par passage de la solution tampon de base, pH 6,9-7,1 de force ionique augmentée par addition de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 600-660 mOsm/Kg. La purification du facteur von Willebrand peut être poursuivie comme décrit dans l'exemple 1. Le Facteur VIII adsorbé sur la membrane est ensuite élue par passage de la solution tampon de base, pH 6,9-7,1 de force ionique augmentée par addition de chlorure de sodium pour atteindre une osmolalité de 1400-1700 mOsm/Kg. Avantageusement, le facteur VIII est élue par une solution tampon, pH 6,0, de force ionique élevée obtenue par addition de chlorure de calcium.
Le schéma de purification est présenté en figure 2.
Résultats
Tableau 2 : Purification du facteur VIII

Claims

Revendications
1. Procédé de purification de FVIII ou de FvW à partir d'une solution choisie parmi (i) une solution contenant un mélange de FVIII et de FvW, (ii) une solution contenant du FvW, (iii) une solution issue d'une sécrétion d'un animal non-humain et (iv) une solution issue d'un extrait végétal contenant du FVIII, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'adsorption du FVIII ou du FvW sur une membrane filtrante de chromatographie échangeuse d'ions.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite membrane filtrante est une membrane de chromatographie échangeuse d'anions.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite membrane filtrante est un échangeur anionique fort.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite membrane possède un revêtement comprenant des groupements aminés quaternaires.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite membrane est de type macroporeux.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite membrane est en polyéthersulfone.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite solution contient un mélange de FVIII et de FvW.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite solution est d'origine plasmatique.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention du cryoprécipité du plasma, b) Adsorption du facteur VIII et du facteur Von Willebrand sur ladite membrane de chromatographie échangeuse d'ions, c) Récupération du facteur VIII ou du facteur Von Willebrand en utilisant un tampon d'élution de force ionique appropriée.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite récupération sélective du facteur Von Willebrand et du facteur VIII est réalisée selon les étapes suivantes : d ) Récupération sélective du FvW par élution avec un tampon de force ionique appropriée, c2) Récupération sélective du FVIII par élution avec un tampon approprié ayant une force ionique supérieure à la force ionique du tampon utilisé à l'étape d)..
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes ultérieures suivantes : d) Elution du FvW par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie, e) Capture du facteur Von Willebrand sur membrane de chromatographie échangeur d'ions, préférentiellement du même type que la première, f) Elution du facteur Von Willebrand par augmentation de la force ionique du tampon d'équilibrage de ladite membrane de chromatographie.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : g) Chromatographie de la fraction éluée à l'étape c) de la revendication 11 enrichie en facteur Von Willebrand sur colonne de gel d'affinité avec ligand gélatine, h) Récupération de la fraction de facteur Von Willebrand non retenue et dépourvue de fibronectine.
13. Procédé d'obtention d'un FVIII purifié, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre du procédé tel que définit dans l'une quelconque des revendications 1 à 10.
14. Procédé d'obtention d'un FvW purifié, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre du procédé tel que définit dans l'une quelconque des revendications 1 à 12.
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