TW200918145A - Method for purifying factor VIII and von willebrand factor - Google Patents

Description

200918145 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明領域係關於擬用作藥物活性劑之第八因子及溫韋 伯氏（Von Willebrand)因子的純化。 【先前技術】

第八因子（下文中亦稱為"FVIII”）係以低濃度存在於人類 血漿中之血漿蛋白。然而，其代表凝血級聯中之關鍵點。 實際上，δ亥蛋白質作為第九因子（或"FIX")之輔因子來激活 第十因子（或”FX")。-旦被激活，第十因子即將凝血酶原 轉化成凝血酶，凝血酶又將纖維蛋白原轉化成纖維蛋白， 由此導致形成止血性纖維蛋白凝塊。 患有A型血友病之人們缺乏FVIn，此導致自發地或意外 或手術來源創傷後嚴重出血。 彼等個體傳統上藉由注射經純化之血漿衍生來治 療。由於該等注射通常為數衆多且重複，因此得到高度純 淨之Fvm濃縮物甚為重要。實際上，若Fvm濃縮物:化 得不夠充分，則其可能含有大量可能引起不期望免疫應答 之纖維蛋白原及免疫球蛋白。 因：，擬用於治療目的之血漿衍生蛋白質供應品需要血 漿何生FVIII純化方法以獲得高純度產物。 第八因子濃縮物最常見自經低溫沈殿之人類

備。在處理人類*装之工業中心中通常獲 I 縮物的純度通常為約！ IU/mg且通常不超子'辰 ⑽叫之最大範圍。最常見之生產方法 的自1〇至20 目的在於移除 134I44.doc 200918145 (通常極為不充分）諸如纖維蛋白原、纖維連接蛋白及免疫 球蛋白等蛋白質衍生雜質之沈澱步驟。該等方法可使用或 組合低溫沈澱（1 〇)、或添加蛋白質沈殿劑，象建議諸如 PEG (Newman等人，Br. J. Haematol 21:1-20, 1971; Hao等 人 ’ in Methods of Plasma Protein Fractionation，Academic Press 1980，第57-74頁）、聚乙烯吡咯啶酮（casillas及 Simonetti, Br. J. Haemato，50:665-672，1982)、葡聚糖、薦 聚糖（Ficoll)等親水性聚合物、珀可（perc〇u)、經乙基澱粉 及氧化銘作為沈澱劑。對於使用由Thorell及BlombSck (Thorell 及 Blomback，Thromb Res. 1984 年 8 月 15 日； 35(4):43 1-50)推薦之甘胺酸及氯化鈉亦適用。類似地，一 些作者（Ng等人 ’ Thrombosis Res.，42:825-834，1986)成功 地將PEG、甘胺酸及氯化納三種沈澱劑組合以獲得比活性 介於10至16 IU/mg範圍内之第八因子濃縮物。 亦藉由將與意欲捕獲低分子量蛋白質衍生雜質之多孔石夕 石珠粒之接觸步驟包括於生產程序中來生產第八因子濃縮 物（Margolis等人，v〇x Sang 46:341_348, 1984)。產物之 比活性仍然相對較低：1 UI/mg。 出現了用於製備具有才亟高純纟之第人因子滚縮物的方 法。實際上，提出過藉助免疫親和層析方法來獲得濃縮物 (Zimmermai^Fulcher，Thr〇mb〇sis Res，νπ增刊，第 w 頁，1987; Berntorp及則ss〇n，Thr〇mb〇sis —，μ增刊， 第 60 頁，1987 ; Levine等人，Th〇mb〇sis Res，vn 增刊， 1987)。該等方法在於藉助固定於層析基質上之抗第八因 134I44.doc 200918145 子：c或抗溫韋伯氏因子抗體 4 & 來4化第人因子。該等方法係 向效的，但需要使用烈性溶 、 ^ m ? & 自第八因子抗體或自溫拿 伯氏因子解吸附出第八因子。 早 因此站要目的在於移除不期 望化學劑之額外超濾步 ’ 仁此步驟可能影響第八因子 生物活性。在生產期間第八因子之比活性可能達 但其不穩定性需要在冷康乾燥步驟之前添 加諸如白蛋白等穩定劍，該穩定劑將第八因子之比活性降 低至3-5 IU/mg。然而，免疫舖和站^+ 尤/又親和純化之主要缺點在於存 在動物來源之殘留抗體且因此可在患者中導致發生對抗彼 等非人類蛋白質之免疫反應。 四=此所有。亥等方法皆不容許藉助可應用於大規模工業 ίΜ兄之方法提供具有極高程度純度之完全不含諸如動物衍 生抗體等非人類蛋白質的第八因子濃縮物。 歐洲專利第〇 343 275號闡述自低溫沈殿物製備第八因子 ^方法’其特徵在於在病毒失活處理之前將低溫沈殿物懸 浮於pH值介於6.5至75範圍内之含有心】肝素之水 中’與氫氧化紹懸浮液反應並在於10°C至18°c溫度下冷卻 及將pH值調節至介於6至7之間之值後離心分離或過濾，隨 後進-步實施純化與後處理，尤其藉助使用諸如親水型 FraCt〇gel-DEAE( j見稱為 deae -TOYOPEARL®，由 T〇s〇h B1〇SCience公司出售）等離子交換樹脂之層析。 因此，該文件闌述藉由將特徵尤其在於完全缺少任何乙 醇處理之非常特別的預步驟與在諸如Fractogel DEAE等親 水型树脂上之離子交換層析結合來純化唯一的第八因子。 134144.doc 200918145 歐洲專利第0 359 593號闡述陰離子交換層析純化方法， 其能夠在單層析管柱上於充分徹底考慮以不需要任何後處 理之條件下分離預期蛋白質。該等方法使得能夠自人類或 $物也漿分離第八因子、纖維蛋白原 ' 纖維連接蛋白及溫 韋伯氏因子蛋白質。該方法可概述如下·· €已溶解於水中 之低溫沈澱物部分經受藉助使用陰離子交換樹脂之層析的 單次分離’該樹脂之基體係宏觀交聯之乙烯基聚合物凝膠 類型’由於其多孔特性能夠保留第八因子_溫韋伯氏因子 複合物’ 後藉由相繼增加溶析緩衝液之離子強度選擇性 收集各種蛋白質。該方法藉由錢接枝至^一⑽ΤΙ DEAE 650 樹脂（現稱為 deae_t〇y〇pearl⑧由

Bioscience公司出售）上之DEAE部分給出較佳结果。缺 而’雖然能夠獲得經純化之FVIII，但該方法不能獲得經 充分純化之溫韋伯氏因子。 另外’溫韋伯氏因子（下文中亦稱為"Fvw")藉由發揮兩 種載然不同之功能起至關重要的作用：作為點著蛋白，其 容許血小板分散、黏著及聚集至灰管内皮下膜上，且因此 參與損傷血管之快速癒合，且另一方面，其確保與其非共 價結合之第八因子的穩定及至血液循環之運送。

FvW先天性缺乏或該因子之結構缺陷導致表現為皮膚及 黏膜出血之溫韋伯氏病。該疾病之臨床表現非常混雜且當 不得不實施手術時非常成問題。溫韋伯氏病之治療必須校 正初級止血（出血時間）及凝血缺陷。 該疾病之治療傳統上以佬用舍人c 使用田含FvW之人類血漿衍生物 134144.doc 200918145 (例如血衆之經低溫沈澱部分或充分含有與第八因子結合 之FvW的第八因子濃縮物）的替代療法實現。 但疋FvW係難以純化之蛋白質。實際上，溫韋伯氏因子 係已头在血漿中循環之最大蛋白質。其由一組二硫橋鍵連 接之多聚體構成，其基礎元件之分子量為約260千道爾頓 (kDa)。血漿中之FvW的最小形式係440至500 kDa之二聚體 且最大形式係該二聚體之多聚體，其分子量可高達2000萬 道爾頓。多聚體中亞單元之該排列對於FvW在其中形成之 細胞而言可為特異性的：FvW在巨核細胞及在内皮細胞中 合成及聚合。 因 由於’·™羊伯氏因子之複雜性及由於其與fVIII結 合，故溫韋伯氏因子分子之製備非常複雜。 用於製備FvW濃縮物之各種方法一般將以下步驟組合： 沈澱血漿部分以移除不期望蛋白質之主要部分(纖維蛋白 原、纖維連接蛋白、及諸如此類）及/或層析步驟（離子交換 層析、親和層析、免疫親和層析、空間排阻色譜、及諸如 此類）’豸等層析步驟之目的在於提供具有高比活性之高 度、”物’同時保持多聚體形式之完整性，尤其彼 等间刀子里多聚體形式之完整性，其生物作用對於醫治過 程係決定性的。 歐洲專利第0 503 991號揭示用於製備FvW濃縮物之工業 規模方法’其包含血衆經低溫沈殿部分之預純化步驟及三 個相繼層析步驟，第三層析步驟係在凌脂糖固定之明勝管 柱上實施之親和層析。由此獲得之FvW濃縮物之比活性高 134144.doc 10 200918145 於100 VWF:RCo/mg(以瑞斯西丁菌素輔因子之活性單位/mg 蛋白質表示），且高分子量多聚體之含量與初始血漿之含 量類似。 歐洲專利申請案第〇 934 748號闡述FvW製備方法，其包 . 含將陰離子交換與陽離子交換層析組合。所得FvW部分之 比活性高於100 IU FvW:Ag/mg(以FvW抗原單位/mg蛋白質 表示）’但仍含有大量第八因子。 Γ 美國專利第0，579,723號闡述藉由免疫親和層析製備經高 度純化之FvW的方法，其中免疫吸附劑係抗FvW抗體。亦 可提供藉由在肝素上親和層析之額外純化步驟。然而，該 免疫親和純化之缺點係可能存在可能引起免疫反應之殘留 抗體。 歐洲專利第0 383 234號教示藉助用含有碳水化合物之酸 性溶液（pH值介於5.5至6_5範圍内）實施之陰離子交換層析 將第八因子固定在陰離子交換器上來製備FvW濃縮物。為 1/ 藉由洗滌回收FvW與未保留之纖維連接蛋白及纖維蛋白 原，基質需要額外沈澱步驟以分離出經純化之Fvw濃縮 物。 ^洲專利第1 632 501號闡述自含有溫韋伯氏因子之生物 • #分製備高度純淨溫韋伯氏濃縮物之方法，其包含藉由陰 離子交換層析使用弱鹼型乙烯基聚合物基質分離。較佳 地-亥t法可非常容易地實施且使得可能獲得含有極少第 八因子之向度專一性之溫韋伯氏因子。 FVIII與pvW係非常有用之血漿衍生蛋白質且對於一些 134144.doc 200918145 人而言其缺乏會導致嚴重止血病症。因此’研發出能夠生 產具有適於患者重複使用之純度之產物的製備該等蛋白質 之方法極為重要。 在先前技術中闡述之該等方法能夠獲得純淨第八因子但 純度較差之溫韋伯氏因子或獲得二者均純淨之與 FvW ’然而條件係實施複雜且麻煩之方法。 【發明内容】 本發明係關於含有FVIII與FvW之混合物的溶液、或含 有FvW之溶液或衍生自動物（尤其非人類動物）分泌物之溶 液、或含有FVIII之植物提取物的純化方法，其特徵在於 其包含在可吸附至少一種選自FVIII與FvW之蛋白質之離子 交換層析過濾式臈上的層析步驟。 【實施方式】 因此’本發明之目的係提供自選自以下之溶液純化 FVIII或FvW之方法：⑴含有ρVIII與FvW之混合物的溶 液、（η)含有FvW之溶液、（iii)衍生自非人類動物分泌物之 溶液及（iv)衍生自含有FVIII之植物提取物的溶液，該方法 之特徵在於其包含在離子交換層析過濾式膜上吸附FVin 或FvW的步驟。 本文所用之"純化方法”意指將FVIII與存在於介質中之其 他分子分開之方法、或將FvW與存在於介質中之其他分子 分開之方法、或將FVIII與FvW分開之方法、或將 FVIII/FvW複合物與存在於介質中之其他分子分開之方 法。彼等分子可為不同於FVIII與FvW之蛋白質、病毒、細 134144.doc 200918145 菌、孢子、培養基、胎牛血清，此列示係非限制性。 本文所用之，，FVIII"意指任何形式之Fvm，尤其能夠在 FIX激活中作為輔因子及能夠與FvW形成複合物者，特別 為成熟Fvm、&熟Fvm±物活性衍生物，例如含有前狀 (前-FVIII)之前·FVI11、包含未成熟Fv W之蛋白f構建體、 :則前體(前-前-FVIII)、在#號肽及前肽裂解後獲得之成 熟FVIII。包括於本發明中之其他Fvn^物活性衍生物係 經歷轉譯後㈣或轉化成生㈣性形式之前藥，該等生物 活性形式係例如截短形式、刪除形式，例如闡述於歐洲專 利第218 712號中之刪除一或多個位於Afg_759與s仏17〇9 之間之區域中之胺基酸的卿、嵌合形式、及包含轉譯 後修飾之不同於血漿天然成熟形式的形式。該等多種 FVHI形式可藉由（例如）修飾成熟FVIII或在血液中天然存 在之4何’、他形式來產生。編碼該FVIn之核普酸序列可 衍生自多種來源’較佳衍生自哺乳動物，包括人類、豬 動物、綿羊科動物、牛科動物、馬科動物及羊亞科動物來 源’此列示係非限制性。 、本文所用之"FvW”意指任何FvW形式，尤其成熟FvW、 成’、’、FvW± %活性衍生⑼’例如含有前肽之前Aw，包含 未成|，、FvW之蛋白質構建體，包括FvW前體（前-前_FvW)、 Μ前肽(前铺)、在信號肽及前肽裂解後獲得之成熟 FvW。包括於本發明中之其他Fvw生物活性衍生物係經歷 轉譯後修飾或轉化成生物活性形式之前藥，該等生物活性 形式係例如截短形式、删除形式，例如抵抗蛋白酶解之A2 I34144.doc -13· 200918145 結構域刪除之FvW (Lankhof等人，Thr〇mb Haem〇st 77: 1008-1013, 1997)、介於Val 449與Asn 73〇之間之包括糖蛋 白1^結合結構域及膠原及肝素結合位點的FvW片段（Pietu 專人 Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989)、嵌合形式及包含轉譯後修飾之不同於血漿天然成 熟形式之形式。該等多種FvW形式可藉由（例如）修飾成熟 FvW或在血液中天然存在之任何其他形式來產生。編碼該 FvW之核苷酸序列可衍生自多種來源，較佳衍生自哺乳動 物，包括人類、豬科動物、綿羊科動物、牛科動物、馬科 動物及羊亞科動物來源’此列示係非限制性。 本文所用之"含有FVIII與FvW之混合物的溶液”意指含有 呈複合狀態或分離狀態之FVIII與FvW的任何溶液。該等溶 液可來自血漿或重組或基因轉殖。 當溶液由重组法產生時，其衍生自單細胞系統，其中已 誘導FVIII與FvW蛋白質表現。可提及已用包含編碼每一該 4蛋白質之基因（較佳為編碼人類蛋白質之基因）之載體轉 染的任何動物或人類細胞系’其中該等細胞系可尤其選自 CHO-K、CHO-LeCIO、CHO Lec-l、CH0 Pr〇_5、ch〇 dhfr_、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、YB2/0 (ATCC CRL-1662)、ΒΗΚ、K61-I6、NSO、 SP2/0-Ag 14及 P3X63Ag8。653、SK-Hep、HepG2、PERC6 (Crucell)細胞系以及植物細胞、細菌系統（例如大腸桿菌 (E. Coli))、真菌系統、使用病毒（尤其桿狀病毒）之系統， 此列示係非限制性。 134144.doc •14· 200918145 該等細胞系統藉助熟習此項技術者所熟知之方法表現 FvW及FVIII蛋白質。美國專利第5，198,349號可作為實例 提及，其内容以引用方式併入本文中。該文件闡述fviii 與FvW共表現，尤其在用一方面其中插入FVin編碼序列之 表現載體及在另一方面其中插入FvW編碼序列之表現載體 共轉染的CHO細胞中。 當溶液由基因轉殖法產生時，其係衍生自多細胞系統， 尤其衍生自藉由基因轉殖獲得之動物或植物，即其中一個 或數個細胞接受重組DNA分子。其適宜實例包括狗、貓、 小鼠、大鼠、倉鼠、母牛、山羊、綿羊、兔及豬、馬、昆 蟲、諸如煙草、大豆等植物，此列示係非限制性。 當F VIII與FvW係藉由動物產生時，此產生可發生在由 動物分泌之多種介質中，例如尿、血液、唾液或乳汁，此 列不係非限制性。該等產生方法可藉助熟習此項技術者所 熟知之方法實施。歐洲專利第〇 741 5丨5號及歐洲專利第 807 170號可作為實例提及，此列示係非限制性。後者閣 述基因轉殖動物的產生，該基因轉殖動物以穩定方式將編 碼FVIII與FvW之DNA分子整合於其基因組中，以表現 FVIII與FvW二者及在乳汁中分泌FVIII與Fvw。 當FVIII與FvW係由植物產生時，此產生可藉助熟習此 項技術者所熟知之方法實施，如（例如）美國專利第 6,331，416號及美國專利第5,994,628號中所述，此列示係非 限制性。 當溶液來自血漿時，其可為動物或人類衍生血漿、或低 134144.doc •15- 200918145 溫沈澱物、或藉由標準分級分離方法獲得之部分（c〇hn等 人，J· Am. Chem· Soc·，68, 459, 1946及 Kistler 等人，Vox

Sang.，7, 1962’ 414-424)。該等部分可視情況經受諸如在 氫氧化鋁上吸附等預純化處理。 FVIII與FvW混合物意指該等蛋白f可依近似類似的含 量存在，&其中—種蛋白質相對於另-種蛋白質以優勢含 量存在或甚至以非常優勢含量存在。 本文所用之”含有FvW之溶液"意指含有Fvw且基本上無 (即具有少或甚至非常少)剛之任何溶液。該溶液可來自 重組、基因轉殖或血漿。 當溶液由重組法產生時，其衍生自單細胞系統，其中已 誘導FvW蛋白質表現。其適宜實例包括已藉助包含編㈣ 蛋白質之基因（較佳為編碼人類蛋白質之基因）之載體轉染 的所有動物或人類細胞系，其中該等細胞系可尤其選自 CHO-K、CHO-LeCIO、CHO Lec-1、CHO Pro_5、CH〇 dhfr-、Wil-2、jurkat、Ver〇、M〇h_4、c〇S 7、μ% HEK、YB2/0、BHK、K61-I6、NSO、SP2/0-Ag 14 及 P3X63Ag8. 653、SK-Hep、HepG2 細胞，系、以及植物細 胞、細菌系統（例如大腸桿菌）、真菌系統、使用病毒（尤其 桿狀病毒）之系統，此列示係非限制性的。 該等細胞系統表現F v W蛋白質且可藉助熟習此項技術者 所熟知之方法獲得。美國專利第5，198,349號及w〇 89/06096可作為適宜實例提及’此列示係非限制性的。美 國專利第5,1 98,349號闡述藉由向表現載體中插入編碼人類 134l44.doc -16 - 200918145

FvW之cDNA在COS細胞中表現人類FvW。 當溶液由基因轉殖法產生時，其衍生自多細胞系統尤 其衍生自藉由基因轉殖獲得之動物或植物，即其中一或多 個細胞接受編碼FvW之重組DNA分子。其適宜實例包括 狗、描、小鼠、大鼠、母牛、山羊、錦羊、兔及豬、昆 蟲、諸如煙草、大豆等植物，此列示係非限制性的。 當FvW係藉由基因轉殖動物產生時，此產生可在由動物 分泌之多種介質中實現，例如尿 '血液、唾液或乳汁，此 列示係非限制性的。該等產生方法可藉助熟習此項技術者 所熟知之方法實施。WO 20〇1/〇2281〇及貨〇 1999/〇58699 係其適且實例，此列示係非限制性的。在該態樣中，w〇 2001/022810闈述雌性基因轉殖小鼠的產生，在該等雌性 基因轉殖小鼠之乳汁中會產生人類FvW。 當FvW係藉由植物產生時，此產生可藉助熟習此項技術 者所熟知之方法實現，如（例如）美國專利第6,331，416號及 美國專利第5,994,628號中所述，&列示係非限制性的。 當溶液來自血聚時，其可為動物或人類血漿部分、或低 溫沈澱物、或藉助標準分級分離方法獲得之部分⑴❶匕等 人，J· Am. Chem· Soc·，68, 459, 1946及 Kistler 等人，ν〇χ Sang·’ 7，1962, 414-424)。該等部分可視情況經受諸如在 氫氧化鋁上吸附等預純化處理。 本文所用之'，衍生自含有FVI„之非人類動物分泌物的溶 液”意指衍生自由基因轉殖動物產生之任何分泌物（例如衍 生自血敷、衍生自唾液、衍生自尿或衍生自乳汁）的任何 134144.doc -17· 200918145 溶液，該基因轉殖動物經設計以在一種先前所提及分泌物 中表現FVIII分子。在該情形下，該基因轉殖動物不表現 FvW。本文所用之”衍生自含有Fvm之血漿的溶液π亦意欲 包括衍生自天然含有人類或動物FVni(即基本上不含FvW) 之血漿的任何溶液。其可衍生自動物或人類血漿部分、或 低溫沈殿物、或藉由標準分級分離方法獲得之部分（Cohn 等人，J· Am. Chem. Soc.，68, 459，1946 及 Kistler等人， Vox Sang·，7，1962，414-424)。該等部分可視情況經受諸 如在氫氧化鋁上吸附等預純化處理。 自基因轉殖動物產生分泌物之方法可藉由熟習此項技術 者所熟知之手段實施。其適宜實例包括美國專利第 5,880,327號及美國專利第2007/001 1752號，此列示係非限 制性的。在該態樣中，美國專利第5,88〇,327號闡述在基因 轉殖小鼠之乳汁中產生人類FVIII。美國專利第 2007/0011752號闡述自各種動物之唾液中產生人類蛋白 質，例如FVIII。 本文所用之"衍生自含有FVIII之植物提取物的溶液|，意指 來自含有FVIII蛋白質（尤其為人類來源）之植物的任何部 分’該等FVIII蛋白質係在經設計以表現FVIII分子之植物 或基因轉殖植物之細胞中獲得。 該提取物可藉由向植物細胞中引入含有編碼FVIII之基 因的核苷酸載體而產生。該等方法已為熟習此項技術者所 熟知’且可藉由屬於此技術領域的多個文件闡釋，例如美 國專利第2005/0060775號。 134144.doc -18- 200918145 本文所用之"離子交換層析過濾式膜，，意指當使該等蛋白 貝'瓜過膜時能夠藉由離子交換吸附FVIII及/或FvW之任何 物理半滲透屏障。另外，當膜與FVIII及/或FvW之間之離 子交換相互作用不再足以將FVIII與FvW保留在膜上時該膜 能夠容許FVIII與FvW流過。 ' 因此’為實施本發明FVIII. FvW之純化方法，使用離 子交換過濾式膜’該膜由大孔基質製成，其包含固定在該 基質上之帶負電或帶正電之塗層，該塗層提供具有離子交 換特性之過據式膜。通f而言，通過化學接枝將帶負電或 帶正電之塗層固定至大孔基質上。 大孔基質之孔隙率（即其平均孔徑）應能夠使過滤式膜容 許FVm與FvW流過1用該膜之第—個益處依賴於可使用 用=棄式交換過m此使該方法之衛生安全程度得以 提巧使用該膜之第二個益處依賴於可在擬純化溶液之非 常高的流速下實施本發明純化方法且更準確而言離子交換 層析步驟。 ' 任何類型之物理屏障基質皆可能適於適合於實施本發明 之過濾式m ’例如聚合物膜、燈芯、中空纖維、經穩定纖 維素、聚醚礪、或可容許FVIlmFvW流過之任何三維結 過濾式膜與FVIII及FvW蛋 用係由固定至大孔基質上之帶正電或帶負電之塗層產生， 該塗層包含可經代替之鹼性或酸性官能部分。 離子交換塗層可為單官能類型，即 丨堡包含一種類型官能 I34144.doc -19. 200918145 部分，或若存在多種類型官能部分則為多官能類型。 因此’由於該等蛋白f與膜之間之相互作用，過遽式膜 能夠同時俘獲或吸附FVIimFvW蛋白f二者…旦將含有 FVIII與IW之溶液施加至膜上’則由於離子交換相互作用 FvW與FVIII將由膜保留。 當低溫沈澱物中未含有擬純化產物時，則較佳在實施本

發明純化方法之前對擬純化溶液實施預純化步驟以獲得已 使其充分不含雜質之溶液。 該預純化步驟可較為有益，尤其對於複雜溶液，例如衍 生自札汁或也漿者，乳汁或血漿係含有大量蛋白質之介 貝。δ亥預純化步驟可尤其包含闡述於（例如）w〇 2〇〇4/〇76695 中之澄清步驟或闡述於（例如）法國專利第〇6 〇4864號或法 國專利第06 U536號中之提取步驟，此列示係非限制性 的。在邊態樣中，法國專利第〇6 〇4864號闡述存在於乳汁 中之至少一種蛋白質之提取方法，無論是否複合，該蛋白 質對於該乳汁之鈣離子皆具有親和性，該提取方法包含以 下步驟： (1)藉由使鈣化合物沈澱釋放蛋白質以獲得富含該蛋 白質之液相，該等鈣化合物係藉由使乳汁與可溶性鹽 (例如填酸鈉）接觸獲得，該可溶性鹽之陰離子係針對其 在該介質中形成該等不溶性#5化合物之能力選擇， Ο)使富含該蛋白質之液相與該鈣化合物沈澱物分 離，此外對該液相實施分離以形成脂質相及含有該蛋白 質之水性非脂質相，及 134144.doc -20- 200918145 (iii)回收含有該蛋白質之該水性非脂質相。 而且，法國專利第06 1 1536號闡述存在於乳汁中之蛋白 質（其在乳汁之天然pH值下包含至少一個疏水口袋及負電 荷）之提取方法，其包含以下步驟： a) 將該乳汁之表層撇去並脫脂， b) 將含有該蛋白質之經脫脂及撇去表層的部分施加 至層析基質上，該層析基質接枝有在能夠使該蛋白質保 留在該基質上之pH條件下具有疏水及離子特徵二者之配 體’例如4-巯基-乙基-吡咬， c) 對該蛋白質實施溶析， d) 藉由自經溶析部分移除乳汁蛋白質對該經溶析部 分實施純化，及 e) 回收該蛋白質。 在藉由細胞系統產生之溶液情形下’可在細胞培養步驟 後原樣立即實施預純化步驟。可控制細胞培養基之組成以 使由該細胞產生之蛋白質在細胞外介質中分泌。而且，可 實施細胞選擇以使所得蛋白質在介質中分泌。 h後，可能需要深度過濾步驟或切向微過濾以獲得適合 於實施本發明純化方法步驟之預純化。 在本發明之一些特定實施例中，過濾式膜係陽離子交換 選擇性膜。藉由該瞑攜帶之官能團的陽性抗衡離子由FvW 及FVIII上相同符號之電荷代替。 可用於陽離子交換塗層之官能團包括羧曱基(CM)、磷醯 基及丙基（SP)、硫酸鹽（S)，此列示係非限制性的。 134144.doc 200918145 在使用陽離子交換過濾式膜之該等實施例中，可使用之 緩衝液包括叁-羥基曱基·胺基甲烷'碳酸鹽、乙二胺、咪 唑或二乙醇胺，此列示係非限制性的。 在該等實施例中，緩衝液pH值將端視蛋白質之等電點而 «，以使按照熟習此項技術者所熟知之常規方法蛋白質 在該pH值下具有正整體電荷量。 在本發m㈣财，所實施之_式膜係陰離子 c 《換選擇性臈。藉由該膜攜帶之官能部分的陰性抗衡離子 由FvW及FVIII上相同符號之電荷代替。 可用於陰離子交換塗層之官能部分包括二乙基胺基乙基 (DEAE)、二乙基（2_經基丙基）胺基乙基或四級銨^αε : Q)、二曱基胺基乙基（DMAE)及三曱基胺基乙基（tMae)， 此列示係非限制性的。在該等實施例中，可使用之緩衝液 係乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘胺酸、巴必妥酸鹽，此 列示係非限制性的。 在該等實施例中，緩衝液PH值將端視蛋白質之等電點而 選擇，以使在該pH值下按照熟習此項技術者所熟知之常規 方法蛋白質具有負整體電荷量。 較佳地，過滤式膜包含為強陰離子交換器之離子交換塗 層0 本文所用之，，強陰離子交換器”意指能夠吸附較弱離子化 蛋白質之任何陰離子交換膜。 該等過濾式膜市面有售。適宜實例包括攜帶QAE或(^部 分之膜，尤其為Mustang Q⑧膜（pall)或以加以以q膜 134144.doc •22· 200918145 (Sartorius)，此列示係非限制性的。 由於MUStang⑽（Pall)具有高吸附容量及高層析體積流 且由於其可用於單循環（用即棄）或多循環中，故 膜（Pall)尤其令人關注。 而且，該膜使得不必要實施基質洗條之驗證步驟，例如 再生及衛生處理（病毒及朊病毒安全方案、及諸如此類）。 使用該過渡式膜亦使得不必要實施傳統上對於標準基質 所實施之老化研究。 因此，與先前技術方法相比使用該膜能夠縮短生產時 間。 較佳地，接觸擬純化溶液之過濾式膜的表面包含陰離子 父換塗層，該陰離子交換塗層包含藉由化學接枝固定於大 孔基質上之四級銨基團。 在又一特定實施例中，過濾式膜係大孔膜。 本文所用之術語，，大孔”意指由孔徑介於〇3 ^^至^ fe圍内之臈孔構成之系統。更佳地，孔徑介於〇 5 至〇 9 μηι範圍内。最佳地’孔徑為〇 8 μιη。 在本發明之尤佳實施例中，膜基質係聚醚颯基質。 作為實例，該聚醚砜膜可為由Pall出售之Mustang Q⑧ 膜。該膜具有0.8 μηι_直徑孔且接枝有四級胺基團。 在本發明之特定實施例中’擬純化溶液含有FVIII或 FvW ’且為血漿來源。 在本發明之較佳實施例中’擬純化溶液含有FVIII與 FvW之混合物’且更佳衍生自血漿。 I34144.doc -23- 200918145 因此，在本發明之該等實施例中，溶液衍生自天然人類 或動物血漿，即衍生自分別天然含有人類或動物FVIII與 FvW之人類或動物血漿：。該動物血聚可在緒、兔、山羊中 採集，此列示係非限制性的。 令人驚奇地，申請者觀察到過濾式膜且尤其Mustang Q® 膜具有高於樹脂或凝膠之FVIII及/或FvW吸附容量。本文 所用之”吸附容量”意指固定於凝膠上之目標蛋白質的量， 且對於陰離子樹脂而言其通常由凝膠或樹脂製造商表示為 固定於凝膠上之BSA的量（牛血清白蛋白）。例如，對於傳 統上用於純化FVIII及/或FvW之DEAE-TOYOPEARL®凝膠 而言，其介於25至35 mg/ml範圍内，而對於Mustang Q®膜 而言其高於或等於30 mg/ml。 過濾式膜之該較高吸附容量意味著與凝膠或樹脂相比可 使用較少量之凝膠來等效吸附相同量之FVIII及/或FvW。 作為闡釋，在DEAE上可吸附50至80 IU FvW及FVIII /ml凝 膠及在Mustang Q®膜上可等效吸附200至250 IU VWF及 FVIII/ ml凝膠。 與凝膠或樹脂相比，過濾式膜之最高吸附容量可由 FVIII及/或FvW至離子化位點之改良的可及性達成，尤其 當其形成FVIII/FvW複合物時。實際上，該等蛋白質具有 大尺寸，尤其當其形成FVIII/FvW複合物時，且吾人可以 假定，由於孔徑，當其接枝至大孔過濾式膜上時較接枝至 凝膠或樹脂上更容易觸及離子化位點，凝膠或樹脂之離子 化位點散入至通道中使其對大蛋白質之可及性較差。 134144.doc -24- 200918145 較佳地，在本發明之該較佳實施例中，該方法包含以下 步驟： a) 提供來自血漿之低溫沈殿物， b) 將第八因子及溫韋伯氏因子俘獲（即吸附）於該離子 父換層析膜上，且更具體而言於陰離子交換層析膜上，及 c) 藉由相繼增加溶析緩衝液之離子強度值選擇性回 收溫韋伯氏因子及第八因子。 較佳地，在提供來自血漿之低溫沈澱物步驟後，可藉由 將第八因子及溫韋伯氏因子吸附於氧化鋁凝膠上實施預純 化步驟及隨後低溫沈澱。 在上文方法之步驟C)中，熟習此項技術者基於其關於每 - Fvw及FVI^白質之物理化學特性及關於過遽式膜之離 子父換特）生的一般知識可容易地對溶析緩衝液之離子強度 值予以調節，該過濾式臈通常為市面有售之過濾式臈，其 使用建議纟以商提m熟習此項技術者之一般知 識，熟習此項技術者尤其瞭解，FVIII係用具有較自相同 基質溶析FvW所需要之離子強度值為高之離子強度值的緩 衝液自陰離子交換層析基質溶析。 因此，在上文方法之步驟c)中，熟習此項技術者使用具 有適於溶析（自基質解吸附）以下之離子強度值的緩衝液： ⑴FvW，（ii) FvW&FVm或（m)相繼地首先Fvw，隨後 FVIII。按照在於首先FvW隨後Fνπι相繼溶析之替代（出）之 第實施例，熟習此項技術者可相繼使用兩種溶析緩衝 液，每一溶析緩衝液均具有經調節以分別解吸附FvW或 134144.doc -25- 200918145 FVIII之離子強度值。按照替代（iii)之第二實施例，熟習此 項技術者用能夠產生漸增離子強度梯度之緩衝液實施溶 析’用該緩衝液FvW隨後FVIII相繼解吸附。 因此，對於上文方法之步驟c)而言，本文所用之"溶析 緩衝液之離子強度值相繼增加"包括可藉由添加鹽（例如氯 化鈉、氯化鈣，此列示係非限制性的）獲得之溶析緩衝液 離子強度值的線性增加。

C 藉由增加緩衝液之離子強度值吾人可首先獲得FvW溶析 及隨後獲得FVIII溶析。因此，可回收FvW並在獲得Fvw後 停止溶析或藉由繼續溶析獲得FVIII。 本文所用之”低溫沈澱物 心扣柯w m肌"υ啊々成日入頸 或動物也漿獲得之沈殿物。低溫沈殿物可使用熟習此項技 術者所熟知之方法獲得。作為實例，使冷Μ衆之溫度為 約-5°C。至-15它，隨後在攪拌下緩慢升溫至不超過丨它或視 ft況C之,皿度。在該等條件下，冷;東血漿融化得到液相 及固相。隨後藉由離心分離回收固相，即低溫沈殿物。低 溫沈澱物實質上由纖維蛋白原、、纖維連接蛋白、第八因子 及溫韋伯氏因子（vWF)構成。在低溫沈澱物中，F彻 與FvW結合，此FvW使FVIII穩定。 之之”選擇性时"意指端視溶析方法端視所預期 能力。貝口收FVI11、或FVW、或FVI11與FvW之混合物的 藉 或 134144.doc -26· 200918145 FVIII與FvW之混合物（參見例如實例1)。 在又一實施例中’擬純化溶液含有重組或基因轉殖來源 之FVIII與FvW的混合物。 該實施例包含以下步驟： a) 提供包含FVIII與FvW之細胞培養物上清液或經預 純化溶液， b) 將第八因子及溫韋伯氏因子俘獲於該離子交換層 析膜上，且更具體而言於陰離子交換層析膜上，及 c) 藉由相繼增加溶析緩衝液之離子強度值選擇性回 收溫韋伯氏因子及第八因子。 在本發明又一實施例中，擬純化溶液含有FVIII或 FvW。 一 該實施例包含以下步驟： Μ提供含有丽或FvW之細胞培養物上清液或經純 化溶液， b)將第人因子或溫韋伯氏因子俘獲於該離子交換層 析膜上，且更具體而言於陰離子交換層析膜上，及 e)回收溫韋伯氏因子或第八因子。 較佳地’用血衆部分，本發明方法能夠降低維生拉依 賴性因子、纖維蛋白原及纖維連接蛋白的量。 較佳地，尤其當擬純化溶液含有FViii^FvW之混合物 時，FvW與”慨選擇性回收可藉助以下步驟實現： cl)藉由增加該層析膜之平衡緩衝液的離子強度值溶析 FvW。例如，離子強度值可藉由添加氣化鈉q.25 m而增加 134144.doc -27- 200918145 以達到約介於600至660 mOsm/Kg範圍内之滲透壓。 e2)藉由使該層析膜之平衡緩衝液的離子強度值增加至 甚至大於用於回收溫韋伯氏因子者溶析FVIn。例如，離 子強度值可藉由添加氣化鈉〇7河或氣化鈣〇.35 M而增加 、乂達到約介於1400至17〇〇 m〇sm/Kg範圍内之滲透壓。 步驟cl)係FvW選擇性回收步驟，㈣使用具有適於自 離子父換過遽式臈解吸w〗FvW之離子強度值的緩衝溶液。

步驟叫係FVI11選擇性回收步驟，期間使用具有適於自 離子交換過渡式臈解吸附阳„之離子強度值的緩衝溶 液在步驟C2)中，使用具有較用於步驟川之緩衝溶液之 離子強度值為高的離子強度值之緩衝溶液。 在於離子父換層析過渡式膜上同時俘獲ρνιιι與^谓步 驟後實施該等步驟。 在步驟〇1)中，谷析之FvW含有非常少之⑴。對其實施 回收並獲得經純化之FVW溶液。 而且，在步驟c2)中獲得之Fvnm初始溶液含有較少之 FvW。對其實施回收並獲得經純化之删溶液。 視情況，可實施額外步驟以離解高分子量·μ複 合物’例如閣述於歐洲專利第"37 923號中者。視情況， 可隨後如W〇_5/_2l4中所述在孔隙率低於或等於2〇 _、尤其等於15⑽之親水性過遽器上對簡經純化溶液 實施額外過濾步驟。 在又一特定實施例中，太欢。。 、 本發明方法藉由在於該離子交換 層析過滤式膜上同時吸附F V T T T h 附FVIII與FvW步驟後實施以下步驟 134144.doc •28- 200918145 能夠獲得經純化之FvW溶液： 句藉由增加該層析膜之平衡緩衝液的離子強度值溶 析 FvW， 〇將溫韋伯氏因子俘獲於離子交換層析膜上，更佳 於與第一膜相同類型之膜上，及 〇藉由增加該層析臈之平衡緩衝液的離子強度值溶 析溫韋伯氏因子。 在該實施例中，在藉由增加該層析媒之平衡緩衝液的離 子強度值實施FvW溶析步驟d)後，可視情況藉由使該層析 膜之平衡緩衝液的離子強度值增加至甚至大於用於回收溫 韋伯氏因子者來溶析FVIII溫韋伯氏因子。因此，在簡： 方法中’獲得經純化之含有FvW之溶液及經純化之 FVIII之溶液二者。 因此’本發明方法較佳能夠獲得自含有FVm與FvW之 冷液之FVIII與FvW的依序或同時純化。若溶液來自血浆， 則本發明方法由於能夠盡可能多地獲得使用人類或動物血 漿之益處而尤其佳。 較佳地，該特定實施例另外包含以下步驟： g) 於具有明膠配體之親和凝膠管柱上對在步驟^中溶 析之田含’皿韋伯氏因子之部分實施層析，及 h) 回收未保留且無纖維連接蛋白之溫韋伯氏因子 分。 纖維連接蛋白分析可按照熟習此項技術者所熟知之方法 藉由（例如）免疫比濁法實施。 I34144.doc •29- 200918145 因此，本發明方法之實施例藉由在於該離子交換層析過 濾式膜上同時俘獲F VIΠ與F v W步驟後實施以下步驟能夠獲 得經純化之FVIII溶液及經純化之Fvw溶液： a)藉由增加該層析膜之平衡緩衝液的離子強度值溶 析 F v W， b) 藉由使該層析膜之平衡緩衝液的離子強度值增加 至甚至大於用於回收溫韋伯氏因子者溶析Fvin。 c) 將溫韋伯氏因子俘獲於離子交換層析臈上， d) 藉由增加該層析膜之平衡緩衝液的離子強度值溶 析溫韋伯氏因子， e) 於具有明膠配體之親和凝膠管柱上對在步驟句中溶 析之富含溫韋伯氏因子之部分實施層析及 f) 回收未保留於凝膠親和管柱上之富含溫韋伯氏的 部分。 因此’在該實施例中’相繼獲得經純化之FVIII溶液及 經純化之F v W溶液。 因此，在本發明方法之多個眚 心夕似貫施例中，本發明方法能夠 以簡化方式分離FVIII與fvw。 本發明純化步驟係唯一能夠鋅ώ 月匕幻稭由將第八因子及溫韋伯氏 因子同時俘獲於陰離子交換屉批 卞父換層析選擇性膜上分別或同時自 血漿中純化兩種蛋白質者。 本發明之又-目的係提供製備經純UVni之方法，立 包含實施本發明純化方法。 〃 本發明之又一目的係提供製備經純化FvW之方法，其包 134144.doc •30· 200918145 含實施本發明純化方法。 其 本發明之其他態樣及彳喜&验+、，丁 & 及優點將在以下實例中予以闡述 僅忍為闡釋目 …以任何方式限制本發明之範疇 貫例 實例1:溫韋伯氏因子之純化方法 低恤沈殿物係藉由將新鮮冷來血漿解來至位於化與$ 之間之溫度來製備。 j離心分離後，回收含有纖維蛋白原、、纖維連接蛋白、 溫韋伯氏因子及第八因子之低溫沈殿物並在含有肝素納之 水’合液中製成漿液(3 IU/mL)。隨後將溶液之PH值調節至 7.0±0.1。 使製成漿液之低溫沈澱物經受藉由在氧化鋁凝膠上吸附 (以移除維生素K依賴性因子）及藉由纖維蛋白原及纖維連 接蛋白低溫沈澱實施之預純化。因此，在攪拌下於5分鐘 内將氫氧化銘添加至懸浮液中。用乙酸〇1 _pH值調節 至6.5土〇.2並將溶液在攪拌下冷卻直至溫度介於1 4°C至1 8°C 範圍内。隨後對溶液實施離心分離以使溫度為14_ 1 8。(：。 回收上清液並藉由在0.22 μιη過濾器上過濾使之澄清。 隨後藉由在有效對抗有包膜病毒之聚山梨酯8〇 (丨％， w/v)及磷酸三正丁酯（〇 3%，ν/ν)存在下用溶劑/清潔劑處理 使該經預純化之溶液經受病毒失活步驟。用溶劑/清潔劑 之處理在pH值7 · 1下實施至少6小時時間段。 隨後使經溶劑/清潔劑處理之蛋白質溶液通過先前用驗 性緩衝溶液（pH 6.9-7.1)平衡之強陰離子交換接枝臈（例如 134144.doc 31 200918145

Mustang Q膜囊（capsuie))，該鹼性緩衝溶液富含氯化鈉以 達到介於370至390 mOsm/Kg範圍内之滲透壓。 一旦蛋白質溶液通過’即用相同緩衝溶液（滲透壓37〇_ 390 mOsm/Kg)沖洗臈囊’直至管柱流出物之光密度回到基 線。未吸附於膜上之蛋白質部分含有較多纖維蛋白原以及 添加用於基於溶劑/清潔劑之病毒失活處理的化學劑。

Ik後藉由施加離子強度值已藉由添加氣化鈉而增加以使 滲透壓達到600-600 mOsm/Kg之鹼性緩衝溶液（pH 6.9-7.1) 將吸附於膜上之溫韋伯氏因子溶析。隨後用無氣化鈉之鹼 性緩衝溶液（pH 6.9-7.1)稀釋經溶析部分直至達到介於37〇 至390 mOsm/Kg範圍内之滲透壓。

Ik後使經稀釋部分通過先前用鹼性緩衝溶液（pH 6.9-7.1) 平衡之強陰離子交換接枝膜（例如Mustang Q膜囊型），該驗 性緩衝溶液富含氣化鈉以達到介於370至390 mOsm/Kg範 圍内之參透壓。一旦蛋白質溶液通過，即使用相同緩衝溶 液（滲透壓370-390 mOsm/Kg)沖洗膜囊，直至管柱流出物 之光密度回到基線。隨後藉由施加離子強度值已藉由添加 氯化鈉而增加以使滲透壓達到60〇_66〇 m〇sm/Kg2鹼性緩 衝溶液（pH 6.9-7.1)將吸附於膜上之溫韋伯氏因子溶析。隨 後在凝膠上使用先前用離子強度值藉由添加氣化鈉而增加 以使滲透壓達到600-660 mOsm/Kg之鹼性緩衝溶液（pH 6 9_ 7.1)平衡之明膠配體使經溶析部分經受親和層析。一旦蛋 白質溶液通過，即使用相同緩衝溶液（滲透壓6〇〇_66〇 mOsm/Kg)沖洗親和凝膠，直至管柱流出物之光密度回到 134144.doc -32- 200918145 基線。包括凝膠洗《之未吸附部分代表高度純淨之富含 温韋伯氏因子的部分。 純化圖闡釋於圖1中 結果 表1 :溫韋伯氏因子之純化 -——~~--- 步驟 ---—^——_ 產率 (%) -—---! 比活性 ΓΓΤ T/mM 初始低 >益 >尤殿物 100 〇 Af. f^ustang Q XT5轉上之第一純化 在Mustang Q XTSmil^^TJ：~~ 步驟+在明膠-瓊脂糖上之居杆 '-------L ^ 30 (30-50) -------— >70 —--------- v.*f〇 20-30 ------ >80 ----- 實例2:第八因子之純化方法 低丨皿沈殿物係藉由將新 柯田牌新鮮冷凍血漿解凍至Γ 之溫度來製備。 之間 在離心分離後，回收令右總 、、β 3有纖維蛋白原、纖維連接蛋白、 >皿早伯氏因子及第八阳2 、 子之低溫沈澱物並在含有肝素鈉之 水溶液_製成襞液τ、 7 〇+〇 1 m )。奴後將溶液之pH值調節至 使製成漿液之低溫沈、觀机ά 尤歲物猎由在氧化鋁凝膠上吸附（以 移除，准生素Κ依賴性因子）月並山μ )及糟由纖維蛋白原及纖維連接蛋 白低溫沈；!殿進行預純化 ,,_ 化因此，在攪拌下，於5分鐘内添 加虱氧化鋁至懸浮液中。 ,干用乙酸0.1 Μ將pH值調節至 6.5 _ 〇. 2 ’並使溶液在撥挑τ、人+ +下冷部直至溫度介於14。(：至18t 範圍内。隨後溶液進行、 订離〜刀離，使溫度為M_18〇c。 134144.doc 33· 200918145 收上清液並在0.22 μιη過濾器上過濾使之澄清。 隨後在有效對抗有包膜病毒之聚山梨酯8〇 (1%，w/y)及 磷酸二正丁酯（〇·3%，v/v)存在下，用溶劑/清潔劑處理，使 該經預純化之溶液進行病毒失活步驟。該溶劑/清潔劑之 處理法係在pH值7.1下進行至少6小時。 隨後使經溶劑/清潔劑處理之蛋白質溶液流過先前用鹼 性緩衝溶液（pH 6.9-7.1)平衡之強陰離子交換接枝膜 (Mustang Q膜囊），該鹼性緩衝溶液中已添加氯化鈉，以達 到介於370至390 m0sm/Kg範圍内之滲透壓。 一旦蛋白質溶液通過，即使用相同緩衝溶液（滲透壓 370-390 m〇sm/Kg)沖洗臈囊，直至管柱流出物之光密度回 到基線。未吸附於臈上之蛋白質部分含有較多纖維蛋白原 以及添加用於基於溶劑/清潔劑之病毒失活處理法的化學 劑。 酼後施加已藉由添加氣化鈉而增加離子強度值並使滲透 壓達到600-660 m0sm/Kgi鹼性緩衝溶液（pH 69·7ΐ)，將 吸附於膜上之溫羊伯氏因子溶析。可繼續如實例1中所述 方法純化溫韋伯氏因子。隨後藉由施加已藉由添加氯化納 而增加離子強度值並使渗達到1400-17()() mQsm/Kg 鹼性緩衝溶液(pH 6.9_7i)將吸附於臈上之第八因子溶析。 較佳地，第八因子係用已藉由添加氯化詞而獲得之高離子 強度值的緩衝溶液（PH 6.0)溶析。 純化圖闌釋於圖2中。 結果 134144.doc -34 - 200918145 表2 :第八因子之純化 步驟 產率 (%) 比活性 (IU/mg) 初始低溫沈澱物 100 0.38 在Mustang Q XT5膜囊上之純化步驟 > 45 (40-60) >110 【圖式簡單說明】 圖1 :溫韋伯氏因子純化方法圖。 圖2 :第八因子純化方法圖。 134144.doc 35·

Claims (1)

1. 200918145 十、申請專利範圍： 1. 一種自溶液純化FVIII或FvW之方法’該溶液係選自：⑴ 含有FVIII與FvW之混合物的溶液、含有FvW之溶 液、（Hi)衍生自非人類動物分泌物之溶液及（iv)衍生自 含有FVIII之植物提取物的溶液’該方法之特徵在於其包 括在離子交換層析過濾式膜上吸附FVIII或FvW的步驟。 2·如請求項丨之方法，其中該過濾式膜係陰離子交換層析 膜。 ' 3.如請求項1或2之方法，其中該過濾式膜係強陰離子交換 器。 ' 4，如請求項1或2之方法，其中該膜提供有包含四級胺基團 之塗層》 & 5. 如請求項1或2之方法，其中該膜係大孔型的膜。 6. 如請求項丨或2之方法，其中該膜係聚醚砜型的膜。

   月长項1或2之方法，其中該溶液含有fvih與fvw之混 合物。 8·如凊求項7之方法，其中該溶液來自血漿。 9.如凊求項8之方法，其包含以下步驟： a) 提供來自血漿之低溫沈澱物， b) 將第八因子及溫韋伯氏（Von WiUebrand)因子吸附 &該離子交換層析膜上， ★ C)藉由使用具有適宜離子強度值之溶析緩衝液回收 第八因子或溫韋伯氏因子。 1〇.如請求項9之方法 其中/皿早伯氏因子及第八因子之該 134144.doc 200918145 選擇性回收係按照以下步驟實施： 衝液溶析來選擇 c】）藉由用具有適宜離子強度值之緩 性回收FvW， c2)藉由用具有高於步騍c 值之離斤用鲛衝液之離子強度 =強度值的適宜緩衝液溶析來選擇性回收F彻。 】·如“項】或2之方法’其包含額外以下步驟·· d)藉由增加該層析膜 析FvW ’ 十衡緩衝液的離子強度值溶 e) 於離子交換層析膜上俘獲溫韋伯氏因 俘獲於與第一膜相同類型之臈上 f) 藉由增加該層析膜之平衡緩衝液的離子強度值 析溫韋伯氏因子 又 12. 13. 14. 士-月求項1 1之方法’其進—步包含以下步驟： g)於具有明膠配體之親和凝膠管柱上對該在請求項 11之步驟C)中溶析之富会π貪 、 I〈田3 /皿早伯氏因子之部分實施層 析， 曰 h)回收該未保留且無纖維連接蛋白之溫韋伯 部分。 ，其包含實施如請求項i至 其包含實施如請求項1至i 2 一種產生經純化FVIII之方法 10中任一項之方法。 一種產生經純化Fv\V之方法， 中任一項之方法。 134144.doc