NO863902L

NO863902L - Fremgangsmaate ved opprensing av proteiner.

Info

Publication number: NO863902L
Application number: NO863902A
Authority: NO
Inventors: Rita White Marhews; Alan J Johnson
Original assignee: Univ New York
Priority date: 1985-02-01
Filing date: 1986-09-30
Publication date: 1986-09-30
Also published as: EP0211895A1; DE211895T1; WO1986004486A1; EP0211895A4; US4743680A; AU5454086A; ES551483A0; IE860305L; ES8702432A1; DK448686D0; JPS62501562A; DK448686A; KR870700006A; FI863954A; NO863902D0; BR8605129A; AU594325B2; FI863954A0

Description

FREMGANGSMÅTE VED OPPRENSING AV PROTEINER

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for opprensing av proteiner. Mer spesielt omhandler foreliggende oppfinnelse en utbytterik fremgangsmåte med høy opp-løsning for opprensing av antihemofelitisk faktor VIII:C ("AHF") ved å anvende kolonnekromatografiteknikker i nærvær av sukkeret, polyhydriske alkoholer, aminosyrer eller salter. AHF-produktene fremskaffet ved foreliggende oppfinnelse er også av høy renhet.

faktor VIII prokoagulant protein (AHF) er et plasmaprotein som har egenskapen å korrigere en koaguleringsdefekt i hemofelitisk plasma. Faktisk blir aktiviteten til AHF målt ved dets egenskap å indusere koagulering i hemofilt A plasma.

En enhet AHF er mengden som er tilstede i en ml av normalt plasma fra voksne hannindivider. Standard brukt heri, en World Health Organization Standard er tilgjengelig fra the National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London NY3 6RD, England.

Den primære terapeutiske anvendelse av AHF har vært dets intravenøse administrering til hemofelitiske pasienter. Først innebefattet dette infusjon av fullblod eller ferskt frosset plasma, noe som krevet lang infusjonstid og ofte forårsaket hypervolemi.

Bruk av plasma cryopresipitat ("cryo") krevet fremdeles lang infusjonstid. Cryo var ikke fullstendig oppløselig i oppløsnignsmidddelet brukt for infusjon og krevet filtrering. Dets AHF-innhold var lavt og svært variabelt. Et stort cryo-volum var krevet og undersøkning av flere for-seglede sterile kontainere for AHF-innhold før bruk var meget tungvint og ble ofte utelatt. Således kunne ekstrakt

-mengden av cryo tilgjengelig for terapi ikke bli fast-slått. Videre krevet cryo lagring ved -20°C i store

plast-blodposer og følgelig tilgjengelighet på store ned-frysningsanordninger. Denne primitive metode gjorde hjemme

-behandling umulig.

Bruk av frysetørkede AHF-konsentrater løste mange av ovenfor nevnte problemer. Konsentratene erholdes vanligvis ved å underkaste cryopresipitering fulgt av en andre presipi-tering med polyetylenglykol. Konsentratene er stabile under nedfrysing; de oppløser seg fullstendig i de rekon-stituerende væske og kan bli rekonstituert i mindre volumer enn cryo-(10-30 ml) for å gi påviselige konsentrasjoner av AHF 10-30 ganger høyere enn det som er tilstede i hel-plasma.

Uheldigvis er utbyttet (AHF-aktiviteten i produktet/AHF-aktiviteten i utgangsplasma) erholdt ved bruken av denne metoden ca. 20%. Dette gjør prisen for faktoren høy. I tillegg forblir det krevede infusjonsvolum ganske høyt (30 ml/1000 enheter av AHF) som igjen danner mangelproblemer og gjør hjemmeadministrering vanskelig og legger således til kostnadene av terapi.

Videre inneholder disse konsentrater mindre enn 0,1% AHF-protein og 99,9% forurensende proteiner innebefattende spesifikke blodtypeantistoff som forårsaker hemolyse, proteiner som kan forårsake immunologiske abnormaliteter innebefattende en inversjon av T-celleforholdet (hjelper/- suppressor) som ligner AIDS, fibronigen, fibronectin, von Willebrandfaktor og andre proteiner. Endelig blir de frysetørkede konsentrater ofte forurenset med virus (så som hepatitt B og non A/non B virus eller muligens virus som er ansvarlig for AIDS). Oppvarming av disse preparater i flytende tilstand ødelegger de fleste mikro-organismer, men forårsaker denaturering av en vesentlig del av AFH.

Kromatografiske teknikker (både ione og hydrofob kromatografi) har blitt brukt men bare i laboratorie. Utbyttene har vært lave (maksimalt 30-40%) og oppløsningen meget

dårlig.

Det er klart et behov i faget for renere AHF-preparater med lavere kostnader og ved høyere utbytte.

Forsøk på å tilfredstille disse behov innebefatter bruk av immunoaffinitetskromatografi som bruker monoklonale anti-stoff: Zimmermann et al, Characeterization of the Human Factor VIII Procoagulant Protein with a Heterologous Preci-pitating Antibody, Proe. Nati. Acad. Sei (U.S.A:) (79:1684

(1982) og US patent nr. 4.361.509 (utgitt 30/11/82). Selv om disse referanser angir 164 000 ganger opprensing fra plasma innebefatter fremgangsmåten seks trinn og den totale gjennvinning er ca. 12% uten oppvarmingssteg.

J.J. Morgenthaler, Chromatography of Antihemophilic Factor on Diaminoalkane- and Aminoalkane-Derivatized sepharose, Thromb. Haemostas., (Stuttgart) 47(2):124 (1982) angir bruk av acetat-lysinbuffer på modifiserte sepharosekolonner for å opprense faktor VIII:C fra polyetylenglykol presipitert AHF. Forfatterne indikerer at hydrofobe istedet for ioniske krefter styrer oppførselen til disse kromatografiske kolonner men referansen tier om utbyttet eller renhet av produktet.

Austen, D.E.G, og Smith, J.K., Factor VIII Fractionation on Aminohexyl Sepharose with Possible Reduction in Hepatitis B Antigen, Thromb. Haemostas. (Stuttgart) 48(1):46 (1982) angir en metode for å behandle plasma med aminoheksyl sephorose kolonnekromatografi ved å bruke 9 x 150 mm kolonner, acetat-lysin vaskebuffer og en salingradient for eluering. Det rapporterte maskimale utbyttet var 46% og renheten ca. 100 ganger i forhold til plasma. Hovedfor-delen ved prosedyren er hevdet å være muligheten for å behandle større prøver. I tillegg rapporterer forfatterne indikasjoner på at prosedyren minker forurensingene noe med hepatitt B virus (ca. 1,5 ganger i størrelsesorden basert på partikkel innholdet).

A. Faure, et al Improved Buffer for the Chromatographic Separation of Factor VIII Coagulent, J. Chromatog. 257:387

(1983) angir bruken av 1 og 10% sakkarose i acetat-lysin-buffere for å forbedre utbyttet av faktor VIII i løpet av kromatografi av cryopresipitat på aminoheksyl sepharose. Den eneste buffer som er rapportert å være konsistent effektiv i å øke faktor VIII separasjon fra protein og gjenvinning er en som inneholder ca. 1% (0,03M) sakkarose og 1% albumin. Ifølge forfatterne ble sukker tilsatt for å inhibere dannelsen av et molekulært kompleks mellom faktor VIII og aktivert faktor IX og faktor X; albumin ble tilsatt for å eliminere ikke spesifikk absorbsjon. I et eksperi-ment nesten doblet denne buffer gjenvinningen av faktor VIII koagulant fra plasma (ikke cryopresipitat) i forhold til den som ble erholdt ved å bruke enten acetat-lysinbuffer alene eller acetat-lysinbuffer med sakkarose. Imidlertid er den rapporterte økning i gjenvinning vanskelig å tolke på grunn av at absolutte gjenvinningstall ikke er angitt og heller ikke renhets eller oppløsningsdata. Bruk av sucrose alene resulterte ikke en konsistentøkning i utbyttet.

Lundblad, R.L. et al, The effect of Dextrose on Chromatography of Antihemophilic Factor (Factor VIII), Thrombosis Research, 1:197 (Pergamon Press, Inc. 1972), angir at tilsetning av 0,05M dekstrose i elueringsbufferen av bovin faktor VIII ionebytte-kolonnekromatografi (på TEAE-cellu-lose) forbedrer til en viss grad renheten av produktet og øker utbyttet av toppfraksjonene fra 15 til 45% til 60 til 70%. Imidlertid var oppløsningen noe redusert.

Verken Lundblad eller Faure bruker høyere konsentrasjoner av sukker. Lundblad antydet at sucrose kunne binde til cellulosematrisen og forhindre ikke spesifikk adsorbsjon av proteinet. Faure antydet at sucrosetillegg kunne forhindre kompleksdannelse mellom AHF og faktorene IXa og X. Ingen underbyggende beviser ble gitt for noen av antydningene. Arakawa T. og Timasheff, S.N., Stabilization of Proteins by Sugars, Biochem. 21:5536 (1982) angir at mange sukkere forårsaker preferentiell hydrering av proteiner i vandige systemer og følgelig virker til å stabilisere proteiner i slike systemer. Artikkelen hevder at i sukkeroppløsninger skifter ekvilibriumet mot en mer tett foldet konformasjon. Imidlertid innebefatter artikkelen ikke faktor VIII, heller ikke proteinopprensking og heller ikke kolonnekromatografi. Angivelsen i denne artikkel er tatt med som referanse.

Et flertall andre artikler angir at sukkeret, polyhydriske alkoholer, aminosyrer eller salter virker for å stabilisere proteinet i vandige systemer: Arakawa T. og Timasheff, S.N., Preferential Interaction of Proteins with Solvent Components in Aqueous Amino Acid Solutions, Arch. Biochem. Biophys. 224(1):169 (1983); Pittz, E.P. og Timasheff, S.N., Interaction of Ribonuclease A with Aqueous 2-methyl-2,4-pentanediol at pH 5,8, Biochem. 17(4):615(1978); Gekko K. og Timasheff, S.N., Mechanism of Protein Stabilization by Glycerol: Preferential Hydration i Glycerol-Water Mixtures, Biochem. 20:4667 (1981); Lee, J.C. og Timasheff S.N., The Stabilization of Proteins by Sucrose, J. Biol. Chem. 256(14):7193 (1981); Gekko, K. og Morikawa, T., Preferential Hydration of Bovine Serum Albumin in Polyhydric Alcohol -Water mixtures, J. Biochem.. 90:39-50 (1981); og Arakawa, T. og Timasheff, S.N., Preferential Interactions of Proteins with Salts i-n Concentrated Solutions, Biochem. 21:6545-6552 (1982). Igjen angir ingen av disse artikler noen ting om protein eller AHF-opprensing eller kolonnekromatografi. Angivelsen av disse artikler er imidlertid innebefattet per referanse fordi de inneholder teknikker og data for å bestemme preferensiel1 hydrering av proteiner som er anvendelige ved utnyttelsen av foreliggende oppfinnelse. Passende utdrag fra disse omtaler har også blitt spesielt innebefattet i denne ansøkning for passende referanse .

Endelig har sukkeret og polyhydriske alkholer blitt brukt for å preservere enzymatisk eller aktivitet av proteiner og stabilisere deres struktur etter at proteinene har blitt isolert fra deres naturlige media. Denne prosedyre har blitt brukt under oppvarming og frysetørking etter opprensing.

Som brukt i denne ansøkning skal de følgende uttrykk har betydningene som er tillagt dem nedenfor: "Biologisk væske" betyr ethvert oppløsning eller suspen-sjonsmedium som inneholder eller kan inneholde et protein uten å forårsake dets permanente denaturering eller in-aktivering, innebefattende uten begrensing: plasma urin, kulturmedia, buffere og fysiologiske oppløsninger.

"Hydreringsadditiv" betyr individuelt eller kollektivt sukkere, polyhydriske alkoholer, aminosyrer og salter hvor bruk av disse i proteinopprensking ved kromatografiøker utbyttet renhet eller oppløsning av proteinet således opprenset. Bruken av dette uttrykket er av letthetshensyn. Selvom nærværende oppfinnere har funnet en nær korrelasjon mellom optimalisering av foreliggende fremgangsmåte ved spesifikke nivå av foretrukket hydrering og har brukt prot-einhydreringsdata som en markør for mengden av hydreringsadditiv som er brukt i foreliggende oppfinnelse, skal det ikke bli antatt at hydrering av et protein og forbedring av dets opprensing ved kromatografi nødvendigvis er relatert som årsak og virkning.

Det er følgelig et mål ved foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for opprensking av AHF og andre proteiner fra biologiske væsker.

Det er også et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for å danne AHF av høy renhet og andre proteinpreparater med en høy renhet i forhold til utgangs-materialet.

Det er et annet mål ved foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for å erholde AHF og andre proteinpreparater med en høy konsentrasjon av AHF eller andre proteiner .

Det er enda et annet mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for å erholde opprensede AHF (eller andre protein) preparater med en lavere konsentrasjon av forurensende proteiner. Det er et annet mål for foreliggende oppfinnelse å senke opprenkingsomkostningene for proteiner og spesielt for AHF.

Det er enda et annet mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for å erholde opprenset AHF og andre proteinpreparater fra tidligere forurensede biologiske væsker med lavere konsentrasjon av forurensende virus.

Det er et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for å erholde AHF fra plasmafraksjoner ved å bruke kolonnekromatografi og mer generelt for å erholde proteiner fra biologiske væsker ved kolonnekromato-gr af i .

Disse og andre mål og trekk for foreliggende oppfinnelse vil bli tydeliggjort for fagmannen i betraktning av følg-ende beskrivelse, medfølgende krav og vedlagte tegninger hvor: Fig. 1 er et diagram av AHF-utbyttet inntegnet mot preferentiell hydrering av bovint serum albumin (BSA) med forskjellige sukkere. Fig. 2 er et diagram over AHF-renhet i forhold til plasma opptegnet mot preferentiel1 hydrering av BSA med forskjellige sukkere.

Flg. 3 er et diagram av AHF-oppløsning erholdt ved bruk av QAE-Sephadex anionebytterkromatografi og aminoheksyl sepha-

rose affinitetskromatografi.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for opprensing av proteiner ved kolonnekromatografi i nærvær av sukker, polyhydrisk alkohol, aminosyre eller salt ved en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å forårsake en vesentlig økning i minst en av utbyttet, oppløsning og renhet av det således opprensede protein.

Som angitt ovenfor har forskjellige sukkere, polyhydriske alkoholer, aminosyrer og salter ("hydreringsadditiver") blitt funnet å stabilisere proteinstruktur ved preferentiell hydrering av proteinene. En optimal økning i den preferentielle hydreringsparameter til proteinet (eller en optimai minking i dets preferentielle interraksjonspara-meter) i vandige proteinoppløsninger er antatt å fremme proteinagregering og øke folding av proteinmolekylet. Det er videre som et resultat antatt at de hydrofobiske grupper blir gjemt mer tett og at overflaten blir mer hydrofil enn i vandig oppløsning av alene.

De gjeldende oppfinnere har funnet at eksponering proteiner til hydreringsadditiver forårsaker den tilsynelatende ioniske interraksjon av proteinet til å øke og den tilsynelatende hydrofobiske interraksjon å avta. Effekten av disse substanser er reversibel og avhenger av deres konsentrasjon i pr<p>teinoppløsningen. Foreliggende oppfinnelse anvender denne egenskap til sukkeret, polyhydriske alkoholer, aminosyrer og salter til fordelaktig å øke selektiv binding av proteiner til en ionisk kolonne og selektivt å eluere proteiner fra en hydrofob affinitetskolonne.

Først blir foreliggende oppfinnelse beskrevet under referanse til en spesielt foretrukket utførelsesform omfattende opprensking av AHF fra cryopresipitat ved sekvensiell behandling først gjennom en ionerbytterkromatograferings-kolonne og derpå gjennom hydrofob affinitets kromatografi-kolonne. Imidlertid er foreliggende oppfinnelse ikke be grenset til bruk av disse kromatografiske separasjoner sammen og heller ikke til opprensking av AHF alene. Om ønsket kan enten kromatografisk separasjon anvendes uten den andre og kan anvendes for opprensking av andre vanskelig opprensbare proteiner tilstede ikke bare i plasma men i andre biologiske eller fysiologiske væsker.

I henhold til en spesielt foretrukket utførelsesform ble cryo fremstilt fra plasma i henhold til den velkjente metoden til Newman, J., Johnson, A.J., Karpatkin, M.H. og Puszkin,'S., Brit. J. Haematol. 21, 1 (1971) som modifisert av Foster, P.R., Dickson, A.J., McQuillan, T.A., Dickson, I.H., Keddie, S., og Watt J.G., Vox Sang. 42, 180 (1982). Angivelsen av disse artikler er innebefattet herved per referanse. Kort fortalt ble frosset plasma til "snø" i en hammerkvern og opptint i et tinekar holdt ved 15-28°C under omrøring ved 55 rpm. Den tinede væske og det suspen-derte cryopresipitat ble tømt ved gravitasjon og samlet i en avkjølt sentrifuge. Cryopresipitatet ble gjenvunnet ved sentrifugering.

Cryo ble oppløst i en buffer inneholdende 0,02M tris(hydr-oksymetyl)aminometan (Tris) pH 7,4, 0,02M natriumcitrat og 0,02M natriumklorid (NaCl) (buffer I) ved 1/10 av det opp-rinnelige volum. Aluminiumhydroksyd ble valgfritt tilsatt for å absorbere koaguleringsfaktor II, VII, IX, X og noe fibrinogen, fibronectin og von Willebrand faktor og prøven ble så sentrifugert for å fjerne hydroksydet. Supernatant-en ble samlet opp.

Sorbitol tilsettes prøven til dets konsentrasjon er IM og oppløsningen surgjøres til pH 6,6 med 0,02M saltsyre (HC1). Polyetylenglycol (PEG) tilsettes til en endelig konsentrasjon på 4% for å felle ut fibronigen, fibronectin og von Willebrand-proteiner. Oppløsningen sentrifugeres og super-natanten spares for kolønnekromatografi.

Både QAE Sephadex A-25 resin og QAE-sepharose 4B -- Fast

Flow ble erholdt fra Pharmacia Chemicals Inc., Piscataway, N.J.. QAE-Sephadex A-25 svelles i 0,5M NaCl over natten ved romtemperatur (eller i 1-2 timer ved temperatur nær kokepunket) under forsiktig omrøring. Et volum i milli-liter av svellet resin lik ca. 2/3 av mengden i milligram av totalt protein som er tilstede i prøvefiltratet pakkes i en kolonne. (Hvis QAE Sepharose Fast Flow anvendes bør ca. 1/4 av denne mengden være tilstrekkelig).

Et resin hvor bredde-til-høydeforholdet er ca. 2:1 brukes i kolonnen: Sephadexresinet ble så vasket med 5 volumer IM NaCl i 0,02M tris (pH 7,4), 5 volumdeler 0,5M NaCl i 0,02M tris (pH 7,4) og endelig med 5 volumdeler av en buffer inneholdende 0,02M tris (pH 7,4), 0,15M NaCl og IM sorbitol (buffer II).

Prøvefiltratet settes på kolonnen ved en strømningshastig-het på ca. 1% av kolonnens bedvolum per minutt og kolonnen vaskes med 2 volumdeler med buffer II ved en strømningsgrad på ca. 3% av kolonnens bedvolum per minutt. Dette blir fulgt av en vask med 5 volumdeler av en buffer inneholdende 0,02M tris pH 7,4, 0,20M NaCl og IM sorbitol (buffer III) og så med 2 volumdeler av 0,02M natriumacetat (NaAc) pH 6,0, 0,035M kalsiumklorid (CaCl2) og IM sorbitol (bi/f f er

IV) .

AHF-proteinet elueres fra kolonnen med 2 volumdeler av en buffer inneholdende 0,1M NaAc (pH 6,0), 0,25M CaCl2, 10% glycerol og 0,01%-0,05% Tween 80<*>(polysorbat 80; ICI, Wilmington, Delaeare) (buffer V). Eluatet samles opp i fraksjoner på 25% av kolonnens bedvolum og hver fraksjon undersøkes for AHF-aktivitet. Proteinkonsentrasjonen i relevante fraksjoner bestemmes i henhold til et modifisert Bradford assay. (Se Bradford M.M., A rapid and sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantitives of

■irA)

^ Anvendelse av Tween<v>er spesielt viktig med QAE-Sepharose 4B-Fast Flow for å maksimalisere utbyttet.

Protein Utilizing the Principal of Protein - Dye Binding, Anal. Biochem. 72:248:254 (1976), hvor angivelsen herav er innebefattet per referanse.

Fraksjonene (QAE-eluatet) inneholdende AHF-aktivitet slås sammen og fortynnes med 4 volumdeler vann.

Aminoheksyl (AH) Sepharoseresin (fra Pharmacia Chemicals Inc., Piscataway, N.J.) svelles over natten i 10 volumdeler 0,5M NaCl. Den svellede gel i et forhold på 4 mm gel til 1000 enheter AHF, pakkes i en kolonne med et bredde:høyde-forhold på 1:1 og vaskes med 5 volumdeler 0,02M NaAc (pH 6,0), 0,15 NaCl og 0,02M CaCl2(buffer VI).

Prøven med fortynnet QAE-eluat settes på kolonnen og vaskes med 10 volumdeler buffer VI, 5 volumdeler av en buffer inneholdende 0,02M NaAc, pH 6,0, 0,35M NaCl og 0,002M CaCl2(buffer VII) og 2 volumdeler av en buffer inneholdende 0,02M tris, pH 7,4, 0,35M NaCl og 0,002M CaCl2(buffer VIII).

AHF elueres med 2 volumdeler av en buffer (buffer IX) inneholdende 0,1M tris, pH 7,4, 0,35M CaCl2, IM sorbitol og 0,1% Tween 80 (polysorbat 80). Fraksjonene undersøkes for AHF-aktivitet og de aktive fraksjoner slås sammen.

Konsentrasjonen av protein i de AHF-inneholdende fraksjoner bestemmes ved Weissman-metoden. (Schaffner, W. og Weissman, C,, A Rapid, Sensitive and Specific Methold for the Determination of Proteins in Dilute Solution Anal. Biochem. 56:502-514 (1973), angivelsen herav er innebefattet per referanse). Kort angitt utfelles prøven med trikloreddik-syre til en endelig konsentrasjon på 15% (v/v) og presipitatet samles opp ved filtrering gjennom et nitrocellulose-filter. (Millipore HAWP fremstilt av Millipore Corp., Medford, Mass.). Presipitatet farges med amidosvart og av-farges med en metanol-eddiksyre-vannblanding. Flekkene skjæres ut, elueres i 1 mm natriumhydroksyd - EDTA (etylen-

diamin tetraacetat) og leses ved A^-.0.

6 30

QAE-kolonnen kan regeneres ved å vaske den med en gradient av NaCl til den er 2M derpå med 0,1N NaOH for å fjerne proteiner, etanol eller ikke-ioniske detergenter for å fjerne lipider og endelig med buffer II for re-ekvilibrer-ing.

AH-Sepharosen kan regeneres ved vask med 1 volumdel t^O,

2 volumdeler butanol, 1 volumdel 95% etanol, 5 volumdeler IM NaCl,'5 volumdeler 0,5M NaCl og 0,02M NaAc pH 6,0 og 5 volumdeler buffer VI.

Den resulterende AHF fra disse sekvensielle kromatografer-ingstrinn har høyt utbytte, renhet og konsentrasjon. Et

vesentlig trekk ved denne oppfinnelsen er bruken av hydreringsadditiver og manipuleringen av deres konsentrasjon ved opprensingen av AHF og andre proteiner for å fremme absorb-sjonen av AHF og andre proteiner til ionebytteresiner og deres desorbsjon fra hydrofobe affinitetsresiner og deres gjenskaffelse ved høyt utbytte, oppløsning og renhet.

De angjeldende oppfinnere har funnet at bruk av hydreringsadditiver: a) vesentligøker affiniteten til AHF overfor anionebytte-resin og tillater selektivit dets gjenvinning over en

ganske smal kolonnebåndbredde og

b) signifikant destabiliserer dets affinitet til hydrofobe resiner og tillater lett eluering derfra.

Grunnene for å velge denne spesielle sekvens av materialet og trinn i anionebytterkromatografi er som følger: a) Påsetting av prøven med buffer II på en anionerbytter-kolonne og vask med samme buffer tillater AHF-protein å

binde ionisk til resinet mens det tillater de fleste andre

proteiner å elueres derigjennom. (Generelt er anionebytterkolonnen i stand til å oppnå en høyere opprinnelig opprensing enn den hydrofobe affinitetskolonne). Buffer II inneholder hydreringsadditivet ved en konsentrasjon hvorved AHF-affiniteten for kolonnen er sterkere enn den til mange forurensende proteiner. b) Buffer III vasker vekk ytterligere forurensende proteiner fra resinet. c) Buffer IV forbereder AHF for eluering ved å senke pH til eluanten nærmere det isoelektriske punkt for AHF og således selektivt svekke dets binding til resinet. Imidlertid for å hindre bredere bånd (og for tidlig eluering) av denne buffer blir ionestyrken på oppløsningsmiddelet sam-tidig minket. d) Buffer V inneholder: (i) en høyere konsentrasjon av bufringssaltet for å sikre at alt proteinet er ved den

passende pH; (ii) kalsiumioner for å eluere proteinet og bryte ikke-kovalente bindinger mellom AHF og forurensende von Willebrand-faktor; (iii) glycerol for å stabilisere proteinet (siden sukkeret ble fjernet for å fremme desorbsjon av proteinet fra resinet); og (iv) Tween 80 for å hjelpe til å eliminere ikke-spesifikk binding av proteinet til gelmatrisen.

Aminoheksylkolonnen opprenser AHF fra forurensende hydrofile proteiner. Generelt binder resinet proteiner via hydrofob interraksjon men aminogruppene på resinet binder proteinene gjennom elektrostatisk interraksjon. Grunnene for valget av trinn og materialer i denne kolonnen er som følger: a) Buffer VI inneholder en moderat mengde salt for å eluere svakt bundede proteiner. b) Buffer VII inneholder en høyere mengde salt for å elu-

ere fastere bundede proteiner.

c) Buffer VIII hever pH til eluanten for å ionisere et antall proteiner slik at de eluerer fra kolonnen. Selv om

ladningen til AHFøkes ved denne pH forblir den bundet til kolonnen men riktignok mer løst.

d) Buffer IX eluerer AHF-proteinet. Den høyere konsentrasjon av bufringssalt forandrer pH. Kalsium gir et motion

for eluering og bryter ikke-kovalente bindinger til von Willebrand-faktor som fremdeles måtte være tilstede. Sorbitol øker den ioniske interraksjon og reduserer den hydrofobe interraksjon av AHF til kolonnen. Tween 80 hjelper til å eliminere hydrofobe og ikke-spesifikke bindinger av proteinet til gelen og øker ytterligere utbytte.

Som angitt ovenfor er den ovenfor beskrevne metode kun en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. Vesentlig opprensing av AHF-proteinet kan erholdes ved å bruke enten en anionebytter eller en hydrofob affinitetskolonne alene som beskrevet for den foretrukkede utførelsesform. Som person-er med vanlig fagkunnskap lett vil forstå kan et antall endringer gjøres uten å innvirke på separasjonskvaliteten hvor et antall av disse er angitt nedenfor.

a) Urenset AHF kan erholdes ved andre kjente metoder så som hydrofile polymere (foreksempel polyetylenglykol) som

kan settes på QAE-kolonnen (ved ca. 4-10 mg/ml protein).

b) Cryo kan rekonstitueres i enhver passende buffer med en pH som strekker seg fra 5,0 til 9,0 (selv om 6,4-7,8 er

foretrukket og 7,0 er optimal). Aluminiumhydroksyd er ikke påkrevet. Ethvert av forskjellige fysiologiske salter kan brukes i bufferen.

c) Et område på 1-6% av PEG kan brukes for å felle ut fibronigenprotein men dette steget er bare viktig når cryo

har mer enn 6 mg protein/ml oppløsning. Alternativt kan

andre hydrofile polymere eller heparin brukes som fibrinogen/f ibronectin utfellende middel.

d) Anionebytteresiner eller hydrofobe affinitetsresiner fra enhver produsent kan anvendes. Selv om enkelte buffer-justeringer kan være påkrevet med enkelte resiner med forskjellige ladningstettheter, hydrofobisiteter eller matris-er enn resinene som her er anvendt kan bufferforandringene lett foretas av en fagmann og er vanligvis innebefattet i produsentens instruksjoner. Maleinsyreanhydrid polyelektro -lytt kromatografi kan erstattes for hydrofob affinitetskromatografi. Videre er det ikke nødvendig at en hydrofob kolonne følger anionebytterkolonnen. Andre ionebyttekolon-ner eller andre delvis hydrofobe kolonner kan anvendes for ytterligere å rense opp materialet innebefattende men ikke begrenset til maleinsyreanhyrid polyelektrolytter. I tillegg som angitt ovenfor kan kun en type kolonne (ionebytter, polyelektrolytt eller hydrofob affinitet) bli brukt en gang om ønsket.

e) Protein til svellet QAE-gel forhold kan variere fra 80:1 til 0,5:1 selv om det foretrukkede område er 5:1 til

0,5:1 og det optimale område er 3:1 til 0,5:1.

f) Forskjellige kolonnedimensjoner kan brukes. Kolonne-bredden : høyden kan variere fra 1:100 til 100:1 selv om det foretrukkede område er 1:1 til 5:1 og det optimale område er 2:1. En fagmann vil forstå at oppløsningen kan forandre seg med forskjellig kolonnestørrelse og at bufferkonsentra-sjonene og elueringsvolumene kan måtte justeres tilsvar-ende . g) Det er ingen strømningsgrad-begrensning utover kolonne-kapasiteten. Generelt gir imidlertid lavere strømnings-grader større oppløsning. h) Vask med alle bufferene II, III og IV er ikke fullstendig påkrevet. I tillegg kan mengdene av hver buffer som brukes variere. For buffer II er arbeidsområdet fra 0-10 eller fler kolonnevolumer, det foretrukkede området er 2-5 volumdeler og den optimale mengde er 2 volumdeler. For buffer III er arbeidsområdet fra 0-10 eller fler volumdeler det foretrukkede området er 3-6 volumdeler og det optimale er 5 volumdeler. For buffer IV er arbeidsområdet 0-10 eller fler kolonnevolumer, det foretrukkede området er 1-5 volumdeler og det optimale er 2 volumdeler. i) Et antall forandringer kan foretas i buffer V uten vesentlig å-redusere dets eluerende effektivitet. Det anvendelige pH-området til bufferen er 4-9, det foretrukkede området er 5,9-6,5 og det optimale er 6,0 (sikker for AHF-stabilitet men nærmere det isoelektriske punkt for AHF). Det er ingen begrensninger til den spesielle bufferkonsen-trasjonen selv om det foretrukkede området er 0,02 til 2,OM og det optimale er 0,35M. Det er ingen begrensninger til det spesielle motion bortsett fra at dets konsentrasjon fortrinnsvis er 0,02 til 0,2M og optimalt er ved 0,35M for divalente ioner og IM for monovalente ioner. Enhver alkohol som er blandbar med vann eller polyhydrisk alkohol eller organisk oppløsningsmiddel som er blandbar med vann kan brukes selv om det ikke er absolutt påkrevet. Etanol er foretrukket ved mengder på 0,05 til 15% og optimalt ved 1%. Enhver ionisk eller ikke-ionisk detergent eller sur-faktant selv om det ikke er påkrevet kan anvendes. For Tween 80 er arbeidsområdet 0-50%, det foretrukkede området er 0,001 til 0,2% og det optimale er 0,025%. j) Hydreringsadditiv-konsentrasjonen varierer med det an-vendte additiv. k) Alternative fysiologiske buffere anvendelige for paren-teral tilførsel kan brukes (som er velkjent i faget) innenfor de ovenfor angitte området for pH og ionestyrke. 1) Det er nødvendig å få bekreftet mengden av sukkere, polyhydriske alkoholer, aminosyrer eller salter (hydrer ingsadditiver) for å optimalisere AHF-utbyttet, renhet og oppløsning. Selv om dette kan gjøres ved prøving og feil-ing har et startpunkt blitt etablert med enkelte sukkere og alkoholer i tilfelle med AHF.

Siden ren AHF var så godt som uoppnåelig (riktig nok i mengder tilstrekkelig for å danne foretrukkede hydrerings-data) ble utbytte og renhet av AHF med varierende konsentrasjoner av hydreringsadditiver i vandig oppløsnings sammenlignet med den foretrukkede hydrering av bovint serum albumin'(BSA) med varierende konsentrasjoner av de samme additiver i samsvar med data fra Gekko, K. og Morikawa T., supra. Data fra Gekko og Morikawa er angitt nedenfor:

: PROTEIN- INTERRAKSJONER MED AMINOSYRER

En person med vanlig fagkompetanse kan fremskaffe utbytte og renhets-kromatograferingsdata for proteinet som skal renses (AHF i dette tilfelle) ved å bruke forskjellige hydreringsadditiver ved konsentrasjoner vist for å danne foretrukne hydreringsverdier på 0,23 med bovint serum albumin .

Ved å bruke hydreringsverdier for BSA i oppløsninger inneholdende forskjellige sukkere ble følgende observasjoner foretatt: Når verdiene for foretrukket hydrering av BSA ble nedtegnet mot utbytte og renhet av AHF erholdt ved kromatografi av cryo i nærvær av forskjellige sukkere og polyhydriske alkoholer ved forskjellige konsentrasjoner ble utbyttet (fig. 1) og renheten (fig. 2) til faktoren funnet å være maksimal over det relativt smale sukkerkonsentrasjonsområdet som ga en foretrukket hydrering av BSA på 0,22 til 0,24 g H20/g BSA. Ved sukkerkonsentrasjoner som ga foretrukket hydrering av BSA som var høyere eller lavere enn denne verdi var utbyttet og renhet av det isolerte AHF lavere. IM sorbitol ga den optimale sorbitiolkonsentrasjon for AHF-opprensing.

En mengde av ethvert hydreringsadditiv som er i stand til å preferentielt hydrere AHF kan bli brukt selv om mengder som preferentielt ville hydrere BSA ved 0,230 g H2/g BSA har blitt funnet å være optimale. Hydreringsadditivet som blir brukt behøver ikke være sorbitol selv om det er foretrukket .

Sukkeret som kan bli brukt (ikke bare for AHF men også for andre proteiner) er sucrose, maltose, lactose, glucose, ribose, arabinose, galactose, fruktose, mannose, rhamnose, malezitose, dekstran, xylose, allose, 6-deoksymanose, 6-deoksy-galactose osv. Fortrinnsvis bør det være mulig for mennesker å metabolisere sukkeret for å eliminere et ytterligere opprensingstrinn. Foretrukket for AHF-opprensing er glucose og maltose. For AHF-opprensing er enkelte av de

foretrukkede konsentrasjonsområder:

sucrose 0,5 til 2,OM med 1,0M mest foretrukket;

lactose 0,0 til 0,4M med 0,25 mest foretrukket;

maltose 0,2 til 0,40M med 0,3M mest foretrukket: og glucose 0,5 til 2,OM med 1,0M mest foretrukket.

Alternativt kan en annen polyhydrisk alkohol, en aminosyre eller et salt brukes.

Generelt er anvendelige polyhydriske alkoholer sorbitol, mannitol, inositol, adonitol, erytritol, etylenglykol, xylotol, propylenglykol, 2-metyl-2,4-pentandiol, ficoll (en syntetisk sucrosepolymer) og ribitol med sorbitol mest foretrukket. Det foretrukkede konsentrasjonsområde for sorbitol i AHF-kromatografi er 0,5 til 2,OM med 1,0M mest foretrukket.

Passende aminosyrer er glysin, beta alanin, alfa alanin og foretrukket betain.

Passende salter er natrium og kaliumacetat, natriumklorid, natriumsulfat, kalsium og magnesiumklorid, magnesiumsulfat, kaliumtiocyanat osv. De foretrukkede hydreringsparametere kan erholdes for flere sukkere, alkoholer, aminosyrer og salter fra ovenfor angitte artikler av Timasheff et al., eller kan bli bestemt empirisk ved hjelp av deres metoder.

De foregående referanser angir foretrukkede interraksjoner eller foretrukket hydrering (begge uttrykk er definert nedenfor) verdier for et antall proteiner ved å bruke et antall oppløsningsmidler og metoder for å bestemme foretrukket hydrering. Hydreringsverdiene og konsentrasjonene av hydreringsadditivene angitt i disse referanser har blitt gjentatt nedenfor: Siden metoden beskrevet i Lee, et al og Arakawa, et al., supra er en komplisert prosedyre og krever en høy grad av fysiokjemisk ekspertise kan det være mulig å bestemme den omtrentelige konsentrasjon av det krevede additiv for å nå den ønskede foretrukne interraksjon eller den ønskede hydrering ved å finne hvorvidt det har blitt brukt tidligere av disse forskere med et bovint albuminsystem eller med et annet protein.

Som angitt ovenfor for AHF ble BSA brukt som modell. Det ble funnet at mengden av additiv som ville fortrinnsvis hydrere albumin til et nivå på ca. 0,22 til 0,24 (g l"^)/

(g BSA) var det optimale for AHF-kromatografi.

Etter at hydreringsverdiene hadde blitt erholdt fra de ovenfor i tabell angitte data er det likevel viktig å finne den optimale konsentrasjon for det spesielle protein som anvendes ved å variere mengden av tilsetningsmiddel som ble brukt under kromatograferingen (innenfor et moderat konsentrasjonsområde som indikert av den foretrukne hydrering av albumin) fordi hvert protein innvirker forskjellig på hvert tilsetningsmiddel. Referanse til albumin gir bare et startpunkt for bestemmelse av hydreringsadditivkonsentra-sjonen som vil bli brukt ved kromatografering av AHF.

Alternativt kan metoden til Lee et al. bli brukt for bestemme de foretrukne hydreringsparametere til det valgte protein og sukkerkonsentrasjonen, de polyhydriske alkoholer eller aminosyrer ville måtte bli optimalisert i det kromatografiske system når det ble anvendt.

Lee et al. prosedyren er et studium av preferentiell binding av løsningsmiddelkomponenter til protein i en vann-sukker (polyhydrisk alkohol, aminosyre etc.) blanding hvor vann er komponent 1, protein er komponent 2, og sukker (eller annet hydreringsadditiv) osv. er komponent 3. Disse interraksjoner måles ved å følge forandringen i partielt spesifikt volum av proteinet som funksjon av hydrerings-additivkonsentrasjonen. Partielle spesifikke volum erholdes fra tetthetsmålinger gjort med et presisjonsdensitimeter

DMA-02 (Anton Paar, Gratz) ved:

Hvor 0 = tilsynelatende partielt spesifikt volum

p-vp = tetthet av oppløsning plus løsningsmiddel henholdsvis

C = proteinkonsentrasjone i g/ml.

Siden prbteintetthetene måles ved konsentrasjoner av både konstant kjemisk potensial og konstant molaritet av opp-løsningskomponentene blir det mulig å bestemme graden av preferentiel1 interraksjon mellom komponentene 3, 2 og 1.

(preferentielt interraksjons-par ameter) ^3er rela"tert til forandringen i tetthet if>) av systemet ved:

hvor nK er molal konsentrasjon av komponent i;

u^er dets kjemiske potensial;

T = termodynamisk temperatur;

P = trykk

g^= konsentrasjonen av komponent i i gram/g H^ O.

Fra definisjonen av partielt spesifikt volum ved uendelig fortynning kan man skrive:

hvor subskript 0 indikerer uendelig fortynning av den makromolekylære forbindelse. ~ Vy = partielt spesifikt volum av komponent 3; = tettheten av oppløsningsmiddel; = tilsynelatende partielt spesifikt volum av proteinet målt under betingelser med konstant molalitet; = tilsynelatende partielt spesifikt volum av protein målt ved konstant kjemisk potensial. Uttrykket -- Ran være positivt noe som betyr preferentiell binding av komponent 3 til proteinet, eller negativt som betyr for lite komponent 3 rundt proteinet og således preferentiell interraksjon med vann. Når fortegnet er negativt er den preferentielle hydreringsparameter gitt ved å

Målinger utføres med presisjonsdensitimetere og tilsynelatende partielle spesifikke volum (0) utregnes med ligning 1. De observerte ekstrapolerte verdier av 0 blir så nedtegnet som funksjon av proteinkonsentrasjonen og de ekstrapolerte verdier ved uendelig fortynning og anvendt i ligning 2 for å regne ut utstrekningen av preferentiell interraksjon. Derpå kan den preferentielle hydreringsparameter regnes ut ved å bruke ligning 3.

Bruk av oppfinnelsen som beskrevet har resultert i opprens-ingsnivå til AHF-protein mellom 100-150 ganger større enn ved tidligere teknikk og gjenvinning av AHF i meget større utbytte. Oppfinnelsen er ytterligere beskrevet ved de følgende eksempler. Disse eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen uten å begrense dens omfang.

Eksempel 1

3 liter frosset humant plasma ble tillatt delvis å mykne og ble så knust med en gummihammer. Det knuste materiale ble tillatt å tine ved 37°C mens temperaturen til plasma ble opprettholdt ved 0-2°C; det ble så umiddelbart plassert i et isbad. Det ble så sentrifugert ved 2500 x g ved 4°C i en halv time. Presipitatet ble rekonstituert i 300 ml buffer II og en 1,3% aluminiumhydroksydsuspensjon (30 ml/liter plasma) ble tilsatt. Blandingen ble så spunnet ved 10°C ved'2500 x g i 15 min. Ved undersøkning av superna-tanten ble protein og AHF-konsentrasjonene funnet å være ca. 4 mg/ml og 2,8 enheter/ml henholdsvis. Dette ga en total protein og AHF-mengde på 1200 mg 840 enheter henholdsvis .

En kolonne inneholdende 800 ml QAE-Sephadex A-25 svellet resin ble forberedt. Kolonnens bredde:høyde var 2:1. De 300 ml av prøvesupernatant ble satt på denne kolonnen ved en gjennomstrømningshastighet på 12 ml/min. Kolonnen ble så vasket med 2 volumdeler buffer II, 5 volumdeler buffer III, 2 volumdeler buffer IV og 2 volumdeler buffer V ved en gjennomstrømningshastighet på 24 ml/min. (Høyere saltkons-entrasjoner var krevet med QAE-sepharose 4B -- Fast Flow for optimal renhet og utbytte). Eluatet ble oppsamlet med buffer V som følger:

Totalt AHF-innhold i produktet:

827 enheter, 0,124 mg totalt protein/ml

Opprensing: 3200 ganger fra cryopresipitat

Gjenvinningsgrad: 98%.

Fraksjon 5-7 som representerte 70% gjenvinning og 2600 ganger opprensing ble slått sammen for å gi et volum på 390 ml. Denne oppløsningen ble fortynnet med 4 volumdeler buffer VI for å gi et totalt volim på 1950 ml. 4 ml svellet AH-sepharose ble pakket i en liten kolonne hvis bredde: høyde-forhold var 1:1. Faktor VIII:C-inneholdende oppløsn-ing fra QAE-opprensingen ble satt på kolonnen ved en gjenn-omstrømningsgrad på 24 ml/min. Kolonnen ble så vasket med 10 volumdeler buffer VI, 5 volumdeler buffer VII, 2 volumdeler buffer VIII og 2 volumdeler buffer IX. Gjennomstrøm-ningsgraden var 24 ml/min. En ml fraksjoner ble samlet opp under eluering med buffer IX. Resultatene er vist nedenfor.

Totalt (dette steg) 577 enheter, 1,47 mg

Opprensing (dette steg) 11 ganger

Endelig opprensing 28.000 ganger i forhold til plasma Gjenvinning (dette steg) 98%

Endelig gjenvinning ca. 70%

I ovenfor angitte eksempel ble kun tre fraksjoner brukt for hydrofob affinitetskromatografi. Dette ble gjort for å maksimalisere oppløsningen og renheten. Hvis utbyttet ble maksimalisert kan alle de aktive fraksjoner fra QAE-kromatograferingen anvendes. På basis av disse og andre data ville den endelige gjenvinning 96%.

Eksempel 2- 6

Cryo ble eluert fra QAE-kolonner som beskrevet i eksempel 1. Opprensing og gjenvinningsresultatene er vist nedenfor.

Eksempel 7-9

Cryo ble eluert fra QAE-kolonner som beskrevet i eksempel 1 bortsett fra at sorbitol ble utelatt. Resultatene er vist nedenfor.

Eksempel 14- 22

Cryo ble opprenset ved QAE-kromatografi som beskrevet i eksempel 1 bortsett fra at forskjellige sukkere ble anvendt. Som angitt ovenfor kunne ikke preferentielle hydr-er ingseksperimenter utføres med faktor VIII slik at data fra Arakawa, Gekko og Morikawa med BSA ble brukt i stedet.

(Se preferentielle hydreringstabeller ovenfor). Resultatene er vist nedenfor.

Når verdiene for renhet og utbytte av AHF ble opptegnet mot verdiene for preferentiell hydrering av BSA med ekvivalente mengder sukker ble en optimal topp observert for hver (fig.

1 og 2 ) .

Eksempel 23

Cryo ble opprenset ved QAE-kromatografi som beskrevet i eksempel 1 med eller uten sorbitol. Resultatene var som følger:

Eksempel 24

Cryo ble opprenset ved QAE-kromatografi som beskrevet i eksempel 1 bortsett fra at maltose ble brukt ved forskjellige konsentrasjoner. Resultatene var som følger:

Eksempel 25

QAE-eluat ble behandlet ved aminoheksyl sepharosekromato-grafi som beskrevet i eksempel 1 bortsett fra at sorbitol var utelatt. Resultatene er som følger:

QAE Eluat Sorbitol

Eksempel 26

Cryo forberedt i henhold til eksempel 1 ble behandlet ved maleinsyreanhydrid polyelektrolytt kromatografi i henhold til eksempel 1. Maleinsyreanhydrid polyelektrolytten kan erholdes fra Speywood i Wrexham, Wales, England (solgt under varemerket SPEYLITE). Bruken av maleinsyreanhydrid polyelektrolytt i AHF-opprensing har blitt beskrevet i Johnson, A.J., et al J. Lab. Clin. Med. 92(2): 194-210 (aug. 1978).

Polyelektrolytteresinet ble forberedt som følger:

Tørt resin ble badet i 0,15M NaCl (30 min.), pH ble senket til 4,0 med sitronsyre, opprettholdt i 20 min. og derpå hevet til 6,6 med NaOH.

Kromatografering fant sted som følger:

Kolonnen ble ekvilibrert med 5 kolonnevolumer 0,1M NaCl, 0,02M natriumcitrat (pH 6,6). AHF-konsentratet ble justert til pH 6,6 med sitronsyre og tilført kolonnen med en hastighet på 1 ml/min. Resultatene var som følger:

De ovenfor angitte resultater indikerer at bruk av maleinsyreanhydrid polyelektrolyttresin er et levedyktig alterna-tiv i forhold til bruk av aminoheksyl sepharose.

Resultatene fra aminoheksyl sepharose kromatograferingen har ikke alltid så gunstige som angitt ovenfor. Nærværende oppfinnere har tilskrevet dette variasjoner i kvaliteten av sepharoseladningene.

Foreliggende oppfinnelse er spesielt passende for opprensing av konstituenter og produkter fra genetisk endrede mikroorganismer.

Selv om spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen har blitt angitt for illustratoriske formål vil det forstås av fagmannen av mange tillegg, substitusjoner og modifikasjon-er er mulige uten å fravike bredden og ånden av oppfinnelsen. Foreksempel selvom AHF-proteinet er beskrevet her i kan den foreliggende opprensingsmetode anvendes for alle proteiner som blir stabilisert og/eller preferentielt hydrert av sukkere, alkoholer, aminosyrer eller salter.

Foreliggende oppfinnelse er mest anvendelig for opprensing av proteiner som er tilstede enten i små mengder i biologiske væsker eller somønskes å bli gjenvunnet ved høyt utbytte. Slike proteiner innebefatter men er ikke begrenset til andre koaguleringsfaktorer så som II, VII, IX ogX. Albumin og immunoglobulin kan også renses opp ved denne metoden selv om bare høy gjenvinningsgrad er viktig i det det er antatt at foreliggende metode ikke vil være kostnads -effektiv for albumin eller immoglobulinopprensing under normale forhold (dvs. når det er nødvendig å rense relativt store mengder av et protein og mindre fullstendig gjenvinning kan tolereres). For hvert protein vil optimal konsentrasjon av hvert hydreringsadditiv for kromatografi måtte bestemmes. Dette kan bli gjort ved metodene disku-tert ovenfor.

Claims

1. Fremgangsmåte ved opprensing av et protein ved kolonnekromatografi, karakterisert ved at den består av å eksponere proteinet for tilstedeværelsen av et hydreringsadditiv valgt fra gruppen bestående sukkere, polyhydriske alkoholer, aminosyrer og salter ved en konsentrasjon som er tilstrekkelig til vesentlig å øke minst en av gjenvinnings-graden, renheten og opplø sningen av proteinet gjenvunnet fra kolonnen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kolonnekromatograferingen velges fra gruppen bestående av ionebytter, hydrofob affinitetskromatografi, blandet hydrofob/ionebytter-kromatografi og seriekoblede kombinasjoner derav.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet velges fra gruppen bestående av antihemofilitis faktor, blodkoaguler-ingsfaktor II, VII, IX og X; albumin og immunoglobuliner.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydreringsadditivet er et sukker valgt fra gruppen bestående sucrose, maltose, lactose, ribose, arabinose, galactose, fruktose, mannose, rhamnose, raffinose, melezitose, dekstran, xylose, allose, 6-deoksymannose og 6-deoksygalactose.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydreringsadditivet er en polyhydrisk alkohol valgt fra gruppen bestående av sorbitol, mannitol, inositol, adonitol, erytritol, etylenglykol, glycerol, propylenglykol, xylitol, 2-metyl-2,4-pentandiol, ficoll og ribitol.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydreringsadditivet ■ er en aminosyre valgt fra gruppen bestående av glycin, beta-alanin, alfa-alanin og betain.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydreringsadditivet er et salt valgt fra gruppen bestående av natrium og kalium -acetat, natriumklorid, natriumsulfat, kalsiumklorid, magnesiumklorid, magnesiumsulfat, cesiumklorid og kaliumtiocyanat.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kolonnekromatografi-en er ionebytterkolonnekromatografi.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at proteinet er antihemofilitisk faktor og at kolonnekromatograferingen er anionerbytterkolonnekromatografi.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at den ytterligere består av en andre opprensing av faktoren ved hydrofob affinitets kolonnekromatografi etterfølgende anionerbytter-kromatograferingen.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at hydreringsadditivet tilsettes kolonnen for å øke bindingen mellom proteinet og ionebyttematerialet i kolonnen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at hydreringsadditivet tilføres i en prøvebuffer for selektivt å øke bindingen mellom proteinet og kolonnen for derved å bedre dets absorbsjon til ionebyttematerialet i kolonnen.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at hydreringsadditivet fjernes fra kolonnen før elueringen av proteinet.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at proteinet er antihemofilitisk faktor.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at additivet er valgt fra gruppen bestående av sucrose, maltose, lactose, glucose, sorbitol og mannitol.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at additivet er sucrose og dets konsentrasjon ligger i området mellom ca. 0,5 og 2 . OM.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at additivet er maltose og dets konsentrasjon ligger i området mellom ca. 0,2 og 0 , 4M.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at additivet er glucose og dets konsentrasjon ligger i området mellom ca. 0,5 og 2 , OM.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karaktisert ved at additivet er sorbitol og dets konsentrasjon ligger i området mellom ca. 0,5 og 2,OM.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at hydreringsaddivitet også tilsettes en ekvi1ibreringsbuffer for kolonnen før tilsetning av prøve av biologisk væske inneholdende proteinet til kolonnen.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at resiner er et kvart-er nært aminoetyl-anionbytter-resin.

22. Fremgangsmåte for opprensing av antihemofilitisk faktor fra plasma cryopresipitat, karakterisert ved at den består av: å sette cryopresipitatet til en anionerbytterkromatograf-eringskolonne i nærvær av et additiv valgt fra gruppen bestående av glucose, sucrose, maltose, lactose og sorbitol i en mengde som er tilstrekkelig vesentlig å øke den tilsynelatende bindingsaffinitet til AHF for kolonnen; vaske kolonnen for å fjerne urenheter; fjerne additivet fra kolonnen; og eluere og gjenvinne faktoren.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at anionerbytterkolonn-en er en kvarternær aminoetylanionerbytter-resinkolonne.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at elueringstrinnet innebefatter bruk av en fysiologisk akseptabel detergent for å øke desorbsjonen av faktoren fra kolonnen.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at additivet er sorbitol anvendt ved en konsentrasjon som ligger mellom ca. 0,5 og 2,OM.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at detergenten er polysorbat 80 ved en konsentrasjon som ligger mellom ca. 0,01 og 0,05%.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at additivet er sorbitol anvendt ved en konsentrasjon på ca. IM.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kolonnekromatograferingen er hydrofob affinitets kolonnekromatografi.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er antihemofilitisk faktor.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydreringsadditivet tilsettes kolonnen for selektivt å svekke bindingen mellom proteinet og det hydrofobe affinitetsmateriale i kolonnne for derved å lette eluering av proteinet fra kolonnen.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at hydreringsadditivet tilsettes elueringsbufferen for kolonnen hvor elueringsbufferen anvendes for eluere proteinet.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at additivet velges fra gruppen bestående av sorbitol, sucrose, maltose, lactose, glucose og mannitol.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at den hydrofobe affinitetskromatografi kolonnen består av i hovedsak aminoheksyl speharose.

34. Fremgangmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at elueringstrinnet innebefatter bruk av en fysiologisk akseptabel detergent for ytterligere å øke desorbsjon av faktoren.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at detergenten er polysorbat 80 ved en konsentrasjon i området mellom ca. 0,01 og 0,8.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at additivet er sorbitol anvendt ved en konsentrasjon i området mellom ca. 0,5 og 2,OM.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at additivet er sucrose og dets konsentrasjon ligger i området mellom ca. 0,5 og 2, OM.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at additivet er maltose og dets konsentrasjon ligger i området mellom ca. 0,2 og 0 , 4M.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at additivet er glucose og dets konsentrasjon ligger i området mellom ca. 0,5 og 2 , OM.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at additivet er sorbitol anvendt ved en konsentrasjon på ca. IM.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kromatograferingen finner sted på en blandet ionebytter/hydrofob affinitetskolonne.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 41, karakterisert ved at kolonnen er en maleinsyreanhydrid polyelektrolyttkolonne.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at detergenten er polysorbat 80 ved en konsentrasjon i området mellom ca.

0,05 og 0,2.