JPH02282400A - 抗血友病因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業−４−の利用分野〕 本発明は、本質的には極めて高純度な抗血友病因子（Ｆ
Ｖ　ＩＩＩ　ｃ）の製造方法、この方法により得られる
抗血友病因子（ＦＶｌｌｌｃ）およびそれを含む医薬組
成物に関するものである。

〔従来の技ＩＦｉ　：］ 抗血友病因子（ＰＶＩＩＩｃ）を精製する神々の方法が
、従来技術で知られている。たとえば、国隙出願の特許
明細書呵０８６１０４４Ｂ（ｉ　にプー−ヨ！−り大学
）には、糖、多価アル：ノール、アミノ酸または塩の存
在下、カラムクロマ１−グツソイ−手法を用いて抗血友
病因子を精製する方法が記載されている（同明細書の１
ページ、ｌ６−２３行および請求項１．３０ページを参
照）。

従来技術におりるこの方法では、牡ζ、多価アルコール
、アミノ酸または塩す〔を含むこれらの添加物は、クロ
マトグラフィー０）ｉｉＬ途中ないし終了時のいずれの
段階ででも力１１えられる。

クロマトグラフィーによる因子νｆｌｌ’、　ｃの精製
に関する種々の文献が、この明細書の本文の３および４
ページに引用されているように、この糖の添加が従来技
術で広く用いられ一〇いることは、注１」すべきである
。これに関連し２て、シコ、ラン１〜ガルトにて出版の
スｍｌンゾ・ヘモスタス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏ
ｓ　ｔａｓ）の４）３巻１号４６ベーシ（１９８２年）
中にアウステン（Ａｕｓｔｅｎ）により書かれた文献を
参考にすることが有効である。ここでは、アミンへキシ
ルセファロースカラムでカラムの溶出に酢酸リジン緩衝
液と食塩水の勾配溶出を用いたクロマトグラフィーによ
る血漿処理のための方法が述べられている。同様に、シ
ェイ・クロマドグ（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａ　ｔｏｇ、）２
５”７巻３８７ページ（１９８３年）には、フォーレ咋
ａｕｒｅ）により、クロマトグラフ用のカラムにアミン
へキシルセファロースを使用した冷却沈澱物のクロマト
グラフィーの際に、酢酸リジン緩衝液に１ないし１０％
の蔗糖を使用して因子ＶＩＩＩｃを好収率で得たことが
記載されている。著者らは、糖の使用が分子複合体の形
成を阻害し得ることを示している。当該文献は、アメリ
カ特許明細書４７４３６８０に対応している。

他の従来技術に関する明細書の例としては、アメリカ特
許４５０８７（１９（ＦＰ−八−１４４９５７に対応）
ないしアメリカ特許４５７８２１８　（ＤＥ−八−３５
０４３８５に対応）がある。従来技術の他の方法がフラ
ンス特許明細書５７０２７６に述べられている。これば
マウス由来の免疫グロブリンが混在する結果となり、ヒ
ｌ〜の治療の場合には不利になることは当業者には容易
に理解できる。

特に、アルモール（、／ｌ　ＲＭ　０１　ｆ＋　）のヨ
ーロッパ特許明細書１４４９５７　（ＵＳ−八−４５０
８７０９に対応）では、因子ＶＩＩＩｃとビレブランド
（Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子の合併吸着につづき、ビ
レブラン１因子を除くための因子Ｖｌｌｌｃとビレブラ
ンド因子の選択的脱着に基礎を置いた、因子Ｖ　ＩＩＩ
　ｃの精製の方法が述べられている。この操作は、本発
明の方法とは根本的にｂ？なっており、本発明の１」的
は、以下に見られるように、本質的にヒレブランド因子
不存の状態で、因子Ｖ　Ｉ１１’　（、のりを吸着さ・
Ｕることである。さらに、因子Ｖ１１に／ビレブランド
因子混合物の吸着には、アルモールば「緩衝液Ａ」と呼
ぶｐＨ約６．８の溶出液を用いているが、これは塩化カ
ルシウムを含んでいない（同明細書の５ページ６−１８
行および６ベージＩ　４−２６　ｆ−ｉを参照）。

次に、アルモールば１０ｍｍｏｌの塩化カルシウムを含
む修Ｉト緩１ψＴ液での洗浄を行っている。アルモール
は、塩化力ルシウＬは従来技術では因子Ｖ　ＩＩＬ　ｃ
、の安定化作用を有することが知られているが、従来技
術では用いられなかったとし、それは凝血内イーを活性
化する危険があり、樹脂上にフィブリン凝血が生じ、因
子Ｖｌｌｌｃの可及的な分解につながるためであること
を強調している（６ペ一ジ２７行目から７ペ一ジ５行目
を参照）。

このように、塩化カルシウム含有の溶出液を最初に用い
ることに対し、当該技術分野においては偏見があった。

（発明が解決しようとする課題〕 さて、以−ドに見られるように、本発明は、本質的には
ビレブランド因子を吸着させず因子ＶＩＩＩ　ｃの選択
的吸着を目的とし、その目的のために塩化カルシウム１
０ｍｍｏｌを含む第１緩衝溶出液を用いるものであり、
従来技術の偏見に抗するものである。

したがって、本発明の１つの目的は、血友病患者に問題
を起こすことのある不純物としてのマウス免疫グロブリ
ンを含まない極度Ｑこ１１ｑ】純度な抗血友病因子（Ｆ
ＶｌｌＩｃ）の製造方法を提供することに伴う、新たな
技（ホ１上の課題を解決することにある。

本発明のもう１つの目的心：Ｌヒレブランド因子のバル
クから単離される抗血友病因子（ｆｉＶｌｌｌＣ）の製
造方法を提供するに伴う新たな技術上の課題を解決する
ことにあり、これは従来技（Ｉｌ：ｆにおけるいくつか
の関連技術、とくにフランス特許明細書２５７０２７６
ないしヨー１＝１ツバ特許明細書１４４９５７　（ＩＩ
ｓ−Ａ−４−５０８７０９に対応）に書かれた技（ホ■
に対比され、従って、本発明の結果として得た抗血友病
因子の活性を蛋白質１ｍｇ当たり２５０国際単位（ＴＵ
）の値にまで著しく高めることを可能にすることである
。

さらに本発明のもう１つの目的は、工業的規模で使用可
能な、とくに簡単で２ｆＥ現性のある製造方法を提供す
るごとに伴う新たな技（ｉ１＋ｒ　Ｊ二の課題を解決す
ることにある。

本発明は、これらの技術上の問題に対し、量的制限のな
い大量を取り扱うことを可能にする工業規模で使用可能
な、満足のいく解決策を始めて提供しており、これは実
験室にしか適用されなかった従来技術に対比される。

さらに本発明は、従来の技術明細書の項目にはなかった
ウィルスの不活性化にも効果がある。

［課題を解決するための手段、作用及び効果］このよう
に、第１の特徴によれば、本発明はヒレプラント因子の
バルクを含まない、極めて高純度な抗血友病因子（ＦＶ
　ＩＩＩ　Ｃ）の製造方法を提供し、それはゲルを有す
るクロマトグラフィーカラムを用いるイオン交換クロマ
１〜グラフイーによる精製過程から成っており、に配積
製過程は当該カラＪ、のゲルへの抗血友病因子の吸着過
程と、精製された抗血友病因子の脱着過程から成ってい
る。この精製された抗血友病因子は、ヒレブランド因子
のバルクおよび主な血漿不純物からの因子１／　ＩＩＩ
　ｃの分離を可能にするイオン強度を有する、第１緩衝
溶１−（長夜により回収される。因子Ｖ　ＩＩＩ　ｃの
粗製溶液は冷却沈澱物から製造され、当該粗製溶液は第
１緩衝溶出液とほぼ同じイオン強度を有し、本質的にビ
レブランＩ・因子を含まない因子Ｖ　ＩＩＩ　（：はカ
ラムのゲルに選択的に吸着され、上記因子Ｖ　ｆｌｌ　
ｃの粗製溶液はまず第１緩衝溶出液で溶出され、第１緩
衝溶１１液によってはカラム内のゲルに吸着したままの
因子ＶＩＴＩｃは、第１緩衝溶出液よりイオン強度の高
い第２緩衝溶出液を用いて脱着され、このようにして、
ビレブランド因子のバルクおよび主な血漿不純物の含ま
ない、極めて高純度な因子Ｖ　ＩＩＩ　ｃの精製溶液を
与える。

本発明の方法の有利な変形では、好ましくは静脈内注射
が可能になるような透析濾過が第３緩衝溶出液で行われ
る。もう一つの有利な特徴によれば、因子ＶＩＩ［ｃの
精製溶液は濃縮され、さらに好ましくは凍結乾燥される
ことがあげられる。

発明の方法のを利な変形では、精製されるべき因子Ｖｌ
ｌｌｃの＊■製温溶液、ヒトの血漿から抽出した冷却沈
澱物を溶解することによって作られる。

本発明の方法のもう−・つの有利な特徴によれば、ヘパ
リンを都合よく加えた水に冷却沈澱物を熔かして得られ
る溶液を水酸化アルミニウムで処理する。水酸化アルミ
ニウムの加える割合は重要ではなく、幅広く変えられ得
る。しかし、因子Ｖ　Ｉｌｉ　ｃを含む溶液の総量に比
して、１０％ｖ／ｖより多い割合を使用するのが好まし
い。目下の好ましい割合は量で１５％ｖ／ｖのオーダー
である。

つぎに、因子Ｖ］ＴＩｃの溶液から水酸化アルミニウム
を分離するために、遠心分離を行うのが有利である。そ
の際、ビタミンに依存因子が除かれる。本発明の方法の
有利な変形では、因子Ｖ　ＩＩＴ　ｃを含む溶液は、コ
ーロッパ特許明細書０１３１７４０またはアメリカ特許
明細書４５４０５７３に記載のように、溶媒と界面活性
剤の混合物を含む緩衝液によりウィルスを失活させるこ
とができる。

精製されるべき因子Ｖ　ＩＩＩ　ｃの粗製溶液は、カラ
ムの吸着過程に移す前に、カラム溶出に用いる第１緩衝
溶出液中で透析ｌ慮過にかげるのが好ましい。

本発明の方法の一つの有利な特徴によれば、イオン交換
りｒ１７トグラフイーカラムに用いる精製用ゲルは、以
下のような本質的特徴をｌｌｒつゲルである。

このゲルは、とくに約６％程度の割合で架橋結合したア
ガロースを基にした１；３イオンタイプのイオン交換樹
脂でビーズ型をしたもので、好ましくは４級アミンタイ
プのものとくに例えばアガロースビーズに結合したＣ：
　、　−ＣＩ＋アルキレン型のような短いスペーサーの
鋺の末端に結合した第４級アミンタイプが良い。

このような特ｉ牧に当てはまる市販のゲルとしては、Ｑ
−セファロース・ファースト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅｆａｓｔ　ｆｌｏｗｌ＋）の商品名で知られ、スイ
スの会社ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社から発
売されており、湿潤状態で４５−１６５μｍの直径のも
のである。

本発明の方法のもう−・つの有利な特徴によれば、第１
緩衝溶出液は以上の組成を持っている。

塩化ナトリウム・・・・・・２５０　ｍｍｏｌ［・リス
・・・・・・２（１ｍｍｏｌ 塩化カルシウム・２水相物・・・・・・１．０　ｍｍ。

この組成物を１２Ｎの濃塩酸でｐＨ６，６にする。

本発明の方法のも・ウ一つの有利な特徴によれば、カラ
ムから因子Ｖ　ＩＩＩ　ｃを脱着するのに用いる第２緩
衝溶出液は、以下の組成を持っている。

塩化ナトリウム・・・・・・７００　ｍｍｏｌト　　　
　リ　　　　ス　　　　　・・・　・・・　　２０　　
ｍｍｏｌ塩化カルシウム・２水和物・・・・・・１０　
ｍｍｏｌこの組成物もまた１２Ｎの濃塩酸でｐＨ　６．
６にする。

本発明の方法のさらにもう一つの有利な特徴によれば、
精製され、熔出された因子Ｖ　ｍ’　ｃの透析′濾過に
用いられる、上記の第３緩衝溶出液は、以下の組成を持
っている。

塩化ナトリウム・・・・・・１．００　ｍｍｏｌＩ・　
　　　リ　　　　ス　　−・・・　　２０　　ｍｍｏｌ
塩化力ルシウＪ・２水和物・・・・・・０．６　ｍｍｏ
ｌＬ−アルギニン・・・・・・１７　ｍｍｏｌｌ５ Ｌ−リシン塩酸塩・・・・・・２（ｌ　ＩＩＩｍ。

この溶液もまた１２Ｎの濃塩酸でｐＨ７にする。

本発明の方法の−・つの有利な特徴によれば、第Ｓ３緩
衝溶出液で透析濾過を行・う前に１　’）　ノＩ・ルの
溶液につき］、７ｍｍｏｌの１．−アルギニンと２０ｍ
ｍｏ　ｌの１．−リジン塩酸塩を精製、溶出した因子ν
Ｉｌｌ　＜：溶液に加える。

本発明の方法の一つの有利な特徴によれば、上記の透析
濾過は、３０ｇ／ｌのバイＩコシηン不含のヒ１−アル
ブミンおよび容量で０．１％ν／νの乳化剤を含むｐＨ
９，６の０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液で処理した透析濾過膜
を用いて行う。

このよ・うにして得た、ヒレブラント因子のバルク不含
で、少なくとも２５０１［１／ｍｇタンパク質の抗血友
病活性Ａを持つ因子Ｖ　ｊｌｌ　（−の極めて高純度な
溶出液を保存するには、孔の直径０．２２／〕ｍの殺菌
用！１８過器での）威菌゛濾過を施し、精製、滅菌した
因子Ｖ　ｌ［ｃ溶液はつぎにシリコン処理したフラスコ
に導入される。

第２の特徴によれば、本発明し、１まだ、−１−、、ｉ
Ｔ己のＧ 方法で得た極めて尚純度な因子Ｖ　Ｉｌｌ　ｃを提供す
る。さらに、本発明はビレブランド因子のバルクを含ま
ない極めて高純度な因子Ｖ　Ｉｎ’　ｃを含む。

本発明による因子Ｖ　ＩＩＩ　ｃの抗血友病活性△は、
少なくとも２５（］ＩＩＩ／ｍｇタンパク質であるのが
好ましい。

第１３の特徴によれば、本発明はさらに、本発明ないし
上記に詳述した方法で得た因子ＶＩＴ［ｃを含む医薬組
成物を包含する。好ましくは、この治療用組成物は即時
使用にｊｍシた注射用製剤となる凍結乾燥型の因子ＶＩ
ＴＩｃ−ｔ”含む。

それ以にの本発明のし１的、特徴および有利性は、以下
の具体的な実施例にある説明で明らかである。実施例は
単なる例示であり、いかなる意味においても本発明の範
Ｄηを１湿定するものではない。この実施例では特に記
す以外、パーセン１−は重量バーセン１〜のことである
。

〔実施例〕

３００　ｐ、のヒ）・の血漿から得た：３ｋｇのヒト血
漿゛冷ノ、１１沈＃吻を、３　　ＩＩＩ／ｍ＋の割合で
ヘパリンを加■（ えた、３，２イｊ″ｆ容量のリムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ
）　ｌ（’？ｆ）１の透析水溶液に溶かし、実験室ｉ’
／！度で２１１．’１間攪拌して、完全に熔解さ−ける
。

最終容量を測定の後、ごの溶液に、ビタミンに依存因子
を除くために全容量に対して容ｈ（で１５％ｖ／ｖの割
合で水酸化アルミニウムを力１１える。

混合物を５分間攪拌してビタミンに依存因子を水酸化ア
ルミニウムに吸着させる。

この水酸化アルミニウム、を５，０ＯＯＧで遠心し、溶
液から除く。

つぎに、因子ＶＩＩ［ｃを含む溶液をヨーロッパ特許明
細書０１．３１７４０またはアメリカ特許明細書４５４
０５７３に記載の方法により処理し、ウィルスの不活性
化を行う。

つぎに、不活性化された因子Ｖ　ｎｌ　ｃを含むこの溶
液を、第１緩衝溶出液を用いて透析濾過する。この第１
緩衝溶出液は、続いて平衡化とカラムクロマトグラフィ
ーの最初の溶出に用いられるもので、以下の組成を有す
る。

塩化ナトリウム・・・・・・２５０　ｍｍｏｌｌ・　　
　　リ　　　　ス　　・・・　・・・　　２０　　ｍｍ
ｏｌ塩化カルシウム・２水和物・・・・・・１０　ｍｍ
ｏｌこの）容量を１２Ｎの濃塩酸でｐＨ６，６にする。

透析濾過は、因子Ｖ　ＩＩ　ｃの不活性溶液の２倍容量
の溶液で行い、ウィルス不活化に用いた生成物のバルク
を除去する。透析濾過用の最初の膜は、分離闇値１００
．０００のミリボアメンブレン旧）ＴＩＩＫである。こ
の操作により、透析濾過された因子Ｖ　Ｉｌｌ　ｃの不
活性溶液が得られ、全量ｌＯ！に濃縮されている。

１０２に濃１宿された？容量は、りＩコマトゲラフイー
カラム溶出用の第１緩衝溶出液とイオン強度が実質的に
同しであることを確かめる。クロマトグラフィーカラＪ
１ば、たとえば高さ２５ｃｍ直径が４０ｃｍのカラムで
、ファルマシア社から得た０３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａ
Ｓｔ　ｆｌｏ−を３２！詰める。

このゲルは第１緩衝ン岩出液で平衡化した後、精製する
ための因子Ｖ　ＩＩＩ　ｃのＩＯＦ、を１時間に２５！
の割合で注入し、ついで同し速度で第１緩衝溶出液をタ
ンパク質のピークが２８０ｎｍの分光光度計でカラム溶
出部分にもはや見られなくなる迄、注入する。当該ピー
クは、おもに除去を目的とするビレブランド因子、フィ
ブリノーゲン、゛ＩルブミンおよびＴ−グロブリンに対
応している。

第１緩衝溶出液でカラＪ、を溶出Ｌ７た後、より高いイ
オン強度の第２の緩衝溶出液を用いる。

この緩衝液は以下の組成を有する。

塩化ナトリウム・・・・・・７００　ｍ　ｍ　Ｏト　　
　　リ　　　　ス　　　・・・・・・　　２０　　ｍｍ
ｏｌ塩化カルシウム・２水和物・・・・・・１．０　ｍ
ｍｏｌこの組成物を１２Ｎの濃塩酸の添加でρ１１（ｉ
、６にし、溶出液として用いる。

第２緩衝溶出液での溶出は、以前と同様の速度で、因子
Ｖ［［ｃに相当するピークが見られる迄行う。検出は当
業者にはごく明白な方法で、分光光度計の感度を調節す
ることにより行われる。

ビレブランド因子を含むあらゆる不純物をとくに含有す
る不要の最初のピークでは、８０ないし１００　ｆｆｉ
容量の溶液の採れることが分かる。これは保存しておき
、精製ビレブランド因子の分離に用いても良い。これは
ビレブランド病と関連して、当業者にはよく知られた治
療上の価値がある。

さらに、溶出後に得られる因子Ｖ　Ｔｌｌ　ｃの溶液ば
、全＋１１４０ないし５０９．であり、因子Ｖ　ＩＩＩ
　ｃ、はたとえば０．５ないし１１１Ｊ／ｍｌ　という
ごく少量で存在する。

Ｌ−アルギニン１７　ｍｍｏＬ＃！および　１．−リジ
ン塩酸塩２０ｍｍｏｌ／　Ｉ！を、このようにして得た
希釈溶液に加える。

つぎに、この溶液は以下の成分を持つ第３緩衝溶出液で
透析濾過し、濃縮する。

塩化ナトリウム・・・・・・１００　ｍｍｏｌｌ・　　
　　リ　　　　ス　　・・・　・・・　　　２０　　ｍ
ｍｏｌ塩化カルシウム・２水和物・・・・・・Ｑ、５　
ｍｍｏｌＬ−アルギニン・・・・・・１７　ｍｍｏｌＬ
−リジン塩酸塩・・・・・・２０　ｍｍｏｌごの組成物
を１２Ｎの濃塩酸でｐ１１７にする。

この操作で、ナトリウムの割合を１００　ｍｍｏｌ／ｆ
ｆｉＱこまで減少し、因子Ｖ　Ｉｌｌ　ｃを３０　Ｉｌ
ｌ／ｍｌに濃縮することができる。ごの操作で用いる透
析濾過膜は、分離閾値３（ＬＯ（１０のミリボアメンブ
レン４ＰＴＴｋである。

すべての透析濾過膜は、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）陰
性透析水で充分に洗浄して前処理するのが非常に重要で
あることに留意する。分離操作では、３０ｇ／　ｊ２の
パイロジェン不含ヒＩ・アルブミンおよび、たとえばツ
イーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０”のような乳化剤を容量で
０．１％ｖ／ｖ含むｐＨ９，６の０１−重炭酸塩緩衝液
５１．を調製し、閉じた系でテフロンビス１−ンどパイ
レックス本体ヲモつＡＳ−Ｔｌｌ′ポンプで、これらの
膜を通して２時間で注入する。つぎに、膜はリムルス陰
性透析水で１時間洗浄した後、上記の第２１Ａ衝溶出液
２０／、を通す。分析生化学（ＡＮＡＬＹＴｒＣＡＬ旧
０ＣＩＩＦ、旧５ＴＲＹ）　ノア２巻２４８−２５４　
　ページ（１，９７６年）でマリオン。

エム、ブラッＦフォｌ”□ａｒｉｏｎ　Ｍ、　Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ）が述べているミクロ方法を用いるタンパク質
定量により、透析濾過の流出「」のタンパク質しへルか
セロであることの確認を行なう。

つぎに、因子Ｖ　Ｉｌｌ　ｃ、溶液の滅菌濾過を、たと
えば孔の直径０．２２μｍのミリボア、より一般的には
ミリディスク（Ｍｉｌｌｉｄｉｓｋ）のような滅菌膜を
用いて行なう。

これにより滅菌された著しく高純度な因子Ｖ　ＩＩＩ　
ｃ、溶液が得られ、つぎに、とくに凍結乾燥などの目的
で製品保存用にシリコン処理したフラスコに分注される
が、これは全く常法により行なわれる。この操作で、少
なくとも２５０１１＋／ｍｇタンパク質比活性を有する
３０１υ／ｍｌの因子ＶＩＩｌｃが得られる。

この因子Ｖｌｌｃは凍結乾燥するに有利であり、非常に
価値の−ｊい医薬用成分を構成してオンリ、血友病治療
にちょうど必要なだけの製品量を血友病患者に注射でき
るようになる。このことは、従来の当業者には全く予期
できなかった決定的な技術進歩を表している。

さらに、この製品が経時的に非常に安定であることをｌ
忍めるべきである。とくに、ン東結乾燥後の因子Ｖ　Ｉ
ＩＩ　ｃの活性低士は２４時間後に１０％以下である。

さらに、本発明の操作により、工業的スケールにおいて
高収量で得られ、回収率は最初に溶解した冷却沈澱物に
対し５０ないし５５％のオーダーである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ゲルを含むクロマトグラフィーカラムを用いてイオ
   ン交換クロマトグラフィーを行う精製過程、当該精製過
   程が当該カラムのゲルに抗血友病因子を吸着させる過程
   、そして、ビレブランド因子のバルクおよび主な血漿不
   純物より因子ＶIIIｃを分離することの可能なイオン強
   度を有するよう調整した第１緩衝溶出液に精製抗血友病
   因子を回収すること、因子ＶIIIｃの粗製溶液を冷却沈
   澱物から製造し、当該粗製溶液は第１緩衝溶出液のイオ
   ン強度と実質的に同一であり、完全にビレブランド因子
   不含の因子ＶIIIｃを選択的にカラムのゲルに吸着させ
   、当該因子ＶIIIｃの粗製溶液を第１緩衝溶出液で溶出
   し、第１緩衝溶出液でカラムのゲルに吸着させた因子Ｖ
   IIIｃを第１緩衝溶出液よりイオン強度の高い第２緩衝
   溶出液で脱着させ、ビレブランド因子のバルクおよび主
   な血漿不純物を含まない極めて高純度の因子ＶIIIｃの
   精製溶液を得ることより成る、ビレブランド因子のバル
   ク不含の極めて高純度な抗血友病因子の製造方法。 ２、好ましくは静脈内注射を可能にする、第３緩衝液で
   透析濾過する、請求項１に記載の方法。 ３、因子ＶIIIｃの精製溶液を濃縮し、好ましくは凍結
   乾燥する、請求項１に記載の方法。 ４、精製すべき因子ＶIIIｃの粗製溶液をヒトの血漿抽
   出物の冷却沈澱物を溶解させることにより製造する、請
   求項１に記載の方法。 ５、有利にヘパリンを加えた水に、冷却沈澱物を溶解し
   て得る溶液を水酸化アルミニウムで処理する、請求項１
   に記載の方法。 ６、因子ＶIIIｃを含む溶液の全量に対し、容量で１０
   ％以上、好ましくは１５％のオーダーに水酸化アルミニ
   ウムを混合する、請求項５に記載の方法。 ７、因子ＶIIIｃの溶液から水酸化アルミニウムを遠心
   分離により分離し、その際、因子ＶIIIｃの溶液からビ
   タミンに依存因子を除去する請求項５に記載の方法。 ８、因子ＶIIIｃを含む溶液を溶媒／界面活性剤混合物
   を含む緩衝液でウィルスを不活化させる、請求項５に記
   載の方法。 ９、精製した因子ＶIIIｃの粗製溶液を、カラムの吸着
   過程に移す前に、カラムの溶出に用いる上記の第１緩衝
   溶出液で透析濾過する、請求項１に記載の方法。 １０、イオン交換クロマトグラフィーカラムに用いる精
   製用ゲルが、以下の本質的特徴を有する、請求項１に記
   載の方法。 このゲルは、とくに約６％の範囲に架橋結合したアガロ
   ースを基とする陰イオン型のイオン交換ゲルでビーズ型
   をしたもので、好ましくは第４級アミンタイプで、特に
   そのアミンが例えばアガロースビーズに結合するＣ＿１
   −Ｃ＿６アルキレンタイプの短いスペーサーの腕の末端
   にあるもの。 このゲルは、好ましくはＱ−セファロース・ファースト
   ・フロー＾Ｒ（ファルマシア社 （ＦＨＡＲＭＡＣＩＡ）の商品名であるＱ−Ｓｅｐｈａ
   ｒｏｓｅｆａｓｔｆｌｏｗ＾Ｒ）であり、ビーズが湿潤
   状態で直径４５−１６５μｍのもの。 １１、上記の第１緩衝溶出液が以下の組成を有し、この
   組成物を１２Ｎの濃塩酸でｐＨ６．６にする請求項１に
   記載の方法。 塩化ナトリウム・・・・・・２５０ｍｍｏｌトリス・・
   ・・・・２０ｍｍｏｌ 塩化カルシウム・２水和物・・・・・・１０ｍｍｏｌ１
   ２、カラムから因子ＶIIIｃを脱着させるのに用いる上
   記の第２緩衝溶出液が以下の組成を有し、この組成物を
   １２Ｎの濃塩酸の添加でｐＨ６．６にする請求項１に記
   載の方法。 塩化ナトリウム・・・・・・７００ｍｍｏｌトリス・・
   ・・・・２０ｍｍｏｌ 塩化カルシウム・２水和物・・・・・・１０ｍｍｏｌ１
   ３、精製し、溶出した因子ＶIIIｃの透析濾過に用いら
   れる、上記の第３の緩衝溶出液が以下の組成を有し、こ
   の組成物を１２Ｎの濃塩酸でｐＨ７にする請求項２に記
   載の方法。 塩化ナトリウム・・・・・・１００ｍｍｏｌトリス・・
   ・・・・２０ｍｍｏｌ 塩化カルシウム・２水和物・・・・・・０．６ｍｍｏｌ
   Ｌ−アルギニン・・・・・・１７ｍｍｏｌ Ｌ−リジン塩酸塩・・・・・・２０ｍｍｏｌ１４、第３
   緩衝溶出液で、この透析濾過を行なう前に、溶液１リッ
   トル当たり１７ｍｍｏ１のＬ−アルギニンおよび２０ｍ
   ｍｏ１のＬ−リジン塩酸塩を因子ＶIIIｃの精製、溶出
   液に加える請求項２に記載の方法。 １５、抗血友病因子ＶIIIｃの極めて高純度な溶出液を
   、孔の直径０．２２μｍの滅菌フィルターで滅菌濾過し
   、ついでこの因子ＶIIIｃの精製、滅菌溶液をシリコン
   処理したフラスコへ導入する、請求項１に記載の方法。 １６、透析濾過を、パイロジェン不含のヒトアルブミン
   ３０ｇ／ｌ、および容量で０．１％ｖ／ｖの乳化剤を含
   むｐＨ９．６の０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液で処理した透析
   濾過膜を用いて行なう、請求項２に記載の方法。 １７、因子ＶIIIｃの抗血友病活性Ａが、少なくとも２
   ５０ＩＵ／ｍｇのタンパク質である、本質的にはビレブ
   ランド因子のバルク不含の極めて高純度な因子ＶIIIｃ
   。 １８、因子ＶIIIｃの抗血友病活性Ａが、少なくとも２
   ５０ＩＵ／ｍｇのタンパク質である、本質的にはビレブ
   ランド因子のバルク不含の因子ＶIIIｃを含む医薬組成
   物。 １９、即時使用の注射製剤の成分となる凍結乾燥型の因
   子ＶIIIｃを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。