JPS62501562A - 抗血友病因子の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗血友病因子の精製方法 アメリカ合衆国政府は、アメリカ合衆国のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｒ　ｔｌｅａ ｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓからのＮｏ、ＲＯＩ　ＨＬ２９ ６８８及びＮｏ、Ｒ，Ｒ０５３−９９の交付により本発明に関する権利を有する 。

技術分野 本発明は、蛋白質を精製する方法に関づ′る。さらに本発明は、糖類、多価アル コール類、アミノ酸類、塩類の存在で抗血友病因子囚子（ａｎｔｉ　ｈｅｍｏｐ ｈｉｌｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　■：Ｃ”ＡＩ−ＩＦ”）をカラム　クロマトグラフ ィ技術を用いて精製する高回収、高分解能の方法に関する。本発明により得られ るＡＨＦ製品はまた高純度である。

第■囚子Ｐｒｏｃｏａｇｕ　Ｉａｎｔ蛋白質（△］」Ｆ）は血漿蛋白質であり、 血友病血漿における凝固欠陥を治す能力を有している。

事実Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆの活性は、Ａ型血友病面漿中の凝固を誘起する能力によって 測定される。

ＡＨＦの１１Ｉｉ位は、正常な成人男性の血漿の１ミリリツトル中に存在する饋 である。ここに用いられる基準は世界保健機構の基準で、国立研究所から生物学 的製剤の基準及び管理のために入手できる。　Ｈｏ１ｌｙ　１ｌｉｌｌ、Ｈａｍ ｐｓｔｅａｄ、Ｌｏｎｄｏｎ　ＮＹ３６ＲＤ。

背景技術 Ａ）ＩＦの最初の治療的使用は血友病患者に対する静脈注射投与であった。第１ にこれは全血液または新しい冷凍血漿の注入を含み、長い注入時間を必要とし、 しばしば血液預過多症をもたらす。

血漿冷凍沈澱物（’Ｃｒｙｏ”）はなお長い注入時間を必要とする。（：：ｒｙ ｏは注入及び必要な濾過のために使用される溶剤に完全に溶解しなかった。その ＡＨＦ含ｍは低く、非常に変りやすい。使用する前のＡＩ−ＩＦ含かに対する多 重密封無菌容器の検査は非常に扱いにくく、しばしば見逃された。かくして治療 に使えるＣｒｙｏの正確な酊は確かめることができながった。ざらにＣｒｙｏは 大きなプラスチックの血液袋のなかで一２０℃で貯蔵することを必要とした。そ れ故に大きな冷凍施設が利用できることが必要だった。この最初の方法は在宅処 置を不可能にした。

凍結乾燥されたＡＩ−ＩＦｆＪ縮物の使用は、上の問題を多く解決した。濃縮物 は一般的に、ポリエチレングリコールによる第２の沈澱につづいて血漿を冷凍沈 澱を受けやすくして得られる。濃縮物は冷蔵下で安定である。濃縮物は、もどし 液体のなかで完全に溶解し、１０−３０ＩｎＩｌのＣｒｙｏよりすくない容積で もどすことができ、全血漿中に存在するよりも１０−３０倍高いＡＨＦの検査可 能な濃度を与えている。

この方法の使用により得られる収の一出発血漿中の製品／ＡＨＦ活性のＡＨＦ活 性−は約２０％である。これは因子の費用を法外にしている。さらに必要な注入 容積はむしろ多く、３（ｌｄ／１０００単位のＡＨＦにとどまり、再び貯蔵の問 題を生じ、在・宅での投与を困難にし、かくして治療の費用が付加される。

さらに、これらの濃縮物は溶血をもたらづ′特異性血液型の抗体を含む９９．９ ％汚染蛋白質及び０，１％以下のＡＨＦ蛋白質を含み、ＡＩＤＳ、ＩＩ素原、フ ィブロネクチン、ｖｏｎ　ＷｉｌｌＯｂｒａｎｄ囚子に似ている丁−細胞比（ｈ ｅｌｐｅｒ／　５ｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）の転化を包含している免疫学的不規則性 をもたらす蛋白質及び他の蛋白質を含んでいる。最後に凍結乾燥濃縮物はしばし ばＡＩＤＳの原因となるウィルス、ｎｏｎ　Ａ／ｎＯｎ　Ｂウィルス、Ｂ型肝炎 のようなウィルスで汚染される。液体状態中でこれらの製品を加熱することは大 部分の微生物を破壊し、またＡＨＦの本質的蛋白質の変質をもたらす。

イオン性及び疎水性の両クロマトグラフィ技術が研究所においてのみ使用されて きた。収量ｔ、を最大で３０−４０％と低く、分解能は非常に劣っていた。

明らかにより純粋なＡ　Ｉ−１＋：の製品のために低費用、高収量の技術の必要 性が存在している。

この必要性を満足させる試みとしてモノクロナール抗体を使用する免疫親和性ク ロマトグラフィの使用が含すれる。

２ｉｍｍｃｒｍａｎ、他の異種沈澱抗体をもつヒトの第■囚子ｐｒｏｃｏａｇｕ 　Ｉａｎｔ蛋白質の特性、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１１， ｓ、＾、）　７９　：　１６４８　（１９８２）及びアメリカ特許番号４．３６ １．５０９　（１９８２年１１月３０日発行）がある。これらの文献は血漿から １６４，０００倍の精製を報告し、その方法は６段階を含み、全回収は加熱段階 なしに約１２％であった。

Ｊ、Ｊ、Ｈｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ、・ジアミノアルカン−及びアミノアルリカ ン読導体のセファロースについての抗血友病因子のクロマトグラフィＴｈｒｏｌ Ｉｌｂ、　ｌｌａｅｍｏｓｔａｓ、、（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　）　４７（２）　 ：　１２４（１９８２）は、ポリエチレングリコールから沈澱したＡＨＦの第■ 囚子を精製するために変形セファロースカラム上に酢酸塩−リシン緩衝液の使用 を開示している。その著者は、これらのクロマトグラフィ　カラムの挙動を支配 するのはイオン力よりもむしろ疎水的な力であることを示しているが、文献は生 成物の収量または純度について何ら言及していない。

Ａｔ１ＳｔＯｎ、　Ｄ、　Ｅ、　Ｇ及びＳｍ１ｔｈ、Ｊ、に、　Ｂ型肝炎抗原に おける可能性ある減少を伴うアミノへキシル　セファロ−ストの第■囚子の分別 、Ｔｈｒｏｍｂ、ｌＩｅａｍｏｓｔａｓ、（ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　）、　４８（ １）　：　４Ｇ（１９８２）は９ｘ　１５０ｍカラム、酢′Ｍ塩−リシン洗浄Ｍ ＠液及び生理的食塩水の勾配を溶離に使用してアミンへニヤシル　セファロース 　カラム　りロマトグラフィによる血漿の処理方法を開示している。報告された 最大数ωは４６％であり、そのｌＩｒ１度は血漿の約１００倍であった。その方 法の第１の利点は大ｍの試料を処理できる能力があると言われている。さらに、 その著者はその方法がＢ型肝炎ウィルス−粒子含ｍにもとづく約１．５の大きさ により一に対してわずかに汚染を減少する必要な処理を報告している。

Ａ、　Ｆａｕｒｅ、他の第■因子凝固剤のクロマトグラフィ分離用の改良された 緩衝液、Ｌ堕皿Ｕ旦ｙ　２５７　：　３８７　（１９８３）はアミノへキシル　 セファ０−ス上の血漿凍結沈澱物のクロマトグラフィの間の第■因子の収量を改 良するために酢酸塩−リシン緩衝液のなかに１及び１０％の蔗糖の使用を開示し ている。その緩衝液が蛋白質から第■因子の分離及び回収を増大するのに終始− 口して有効であることが報告されていて、その唯一の緩衝液は約１％（０，０３ Ｍ）の蔗糖及び１％のアルブミンを含むところの緩衝液である。その著者によれ ば糖は第■因子、活性化第１χ因子及び第Ｘ因子の間の分子コンプレックスの生 成を妨害するために加えられ、アルブミンは非−特異性吸着を消去するために加 えられた。一つの実験ではこの緩衝液は蔗糖を有する酢酸塩−リシン緩衝液、ま たは酢酸塩リジン緩衝液のいずれかを使用し、得られたところのもの以上に血漿 冷凍沈澱物でない血漿からの第■因子凝固剤の回収を約２倍にした。しかしなが ら、報告された回収の増加は絶対ｔ′に回収形態が与えられてないので説明する のが困難であり、純度または分解能のデータも示されてない。蔗糖単独の使用は 収用を終始一貫して増大するという結果ではない。

Ｌｕｎｄｂｌａｄ、　Ｒ，Ｌ、他の抗血友病因子（第■因子）のクロマトグラフ ィに及ぼすデキストロースの効果、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 １：　１９７（Ｐｅｒａａｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、１９７２　）は生成物 の純度を僅かに改良し、１５−４５％から６０−７０％にピーク分画の収量を増 加するＴＥＡＥ−セルロース上のイオン交換カラム　クロマトグラフィで牛の第 ■因子の溶離緩衝液のなかの０．０５　Ｍのデキストロースの添加を開示してい る。しかしながら分解能ハわずかに減少した。

ＬａｎｄｂｌａｄもＦａｕｅｒも、高濃度の糖を使用していない。Ｌａｎｄｂｌ ａｄは蔗糖が蛋白質の非特異性吸着を妨げ、セルローズマトリックスに結合でき ることを提案した。Ｆａｕｅｒは蔗糖の添加はＡ　Ｉ−Ｉ　Ｆ及び第■の因子及 び第Ｘ因子との間のコンプレックス生成を妨げることを提案した。いずれの提案 にも何ら本質的な証拠は示されていなかった。

＾ｒａｋａｗａ、　Ｔ、及びＴｉｍａｓｈｅｆｆ、Ｓ、Ｎ、の糖類による蛋白質 の安定化　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１　：　６５３６　（１９８２）は、多くの糖類 が水溶液系で蛋白質類の選択的水和を生じ、それ故そのような系で蛋白質を安定 化するのに役立つことを開示している。この論文は糖溶液のなかで平衡がさらに 密に折りたたまれる配位の方向に偏位することを述べている。しかしながら論文 は第■因子を含んでいないし、蛋白質の精製についても、カラム　りＣ７１−グ ラフィについても何ら示していない。この論文の記述は参照のため挿入されてい る。

多数の他の論文は、糖類、多価アルコール類、アミノ酸類または塩類が水溶液系 での蛋白質類の安定化に役立つことを間示しティる。Ａｒａｋａｗａ、　Ｔ、及 びＴｉｍａｓｈｅｆ（Ｓ、Ｎ、の水溶性アミノ酸溶液中の溶剤成分による蛋白質 類の選択的相互作用　＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、８ｉｏ　ｈ　ｓ、　２２４ （１）：１６９（１９８３）；　Ｐｉｔｔｚ、Ｅ、Ｐ、及びＴｉｌ１ａｓｈｅ４ ｒ、Ｓ、Ｎ、、ｐＨ５，８Ｔ：水溶性２−メチ／Ｌ、−２．４−ベンタンジオー ルによるリボヌクレアーゼＡの相互作用　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７（４）　：６ １５（１９７８）　；　Ｇｅｋｋｏ、に、及びＴｉｍａｓｈｅｆｆ、Ｓ、Ｎ、　 、グリセロールによる蛋白質安定化の操作、グリセロール−水混合物における選 択的水和、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０：４６６７（ｔ９８１）：　Ｌｅｅ、Ｊ、Ｃ， 及びＴｉｍａｓｈｅｆｆ、Ｓ、Ｎ、　。

蔗糖による蛋白質類の安定化、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６（１４）　 ：　７１９３（１９８１）　；　Ｇｅｋｋｏ、に、及びＨｏｒｉｋａｗａ、Ｔ、 　、多価アルコール−水混合物における牛血清アルブミンの選択的水和、　Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、９０：３９−５０（１９８１）　；　Ａｒａｋａｗａ、Ｔ、及 びＴｉｌ１ａｓｈｅ４ｒ、Ｓ、Ｎ、、濃厚溶液中の塩類による蛋白質類の選択的 相互作用、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１：６５４５−６５５２（１９８２）、これら の論文には再び、ＡＨＦ精製または蛋白質精製、カラムクロマトグラフィについ ては何ら開示していない。しかしながら、これらの論文が本発明の実施に有効で あるところの蛋白質の選択的水和を決定するための技術及びデータを含むのでこ れらの論文の記述を参照して挿入している。これらの記述の関連ある抜粋はまた 特別にこの明Ｉ１１＠において便利な参照のために挿入した。

最後に、糖類、多価アルコール類は蛋白質類がその自然のままの媒体から遊離さ れた後、彼等の構造を安定化し、蛋白質類の酵素的または他の活性を安全に保つ ために使用されてきた。この方法は精製の後に加熱及び凍結乾燥法の間に使用さ れてきたのである。

この明細書に使用される次の術語は、次に記述するような意味を持つであろう。

「生物学的液体」は、不変的な変質または不活性を生じることなしに、血漿、尿 、培養媒体、緩衝液、生理学的溶液に限定することなく包含する溶液または懸濁 液を意味している。「水和添加物」とは個別的に、または全体的に糖類、多価ア ルコール類、アミノ酸類及び塩類を意味し、その使用はクロマトグラフィによる 蛋白質精製においてかくして精製された蛋白質の収用、純度または分解能を増加 づるものである。この術Ｊｔ１の使用は便利である。本発明者等は、選択的水和 の特異的水準で、本方払の最適化の間の近い相関作用性を観察し、本発明に使用 された水和添加物の１のため目しるしとして蛋白質水和データを使用するけれど も、蛋白質の水和及びクロマトグラフィによる蛋白質精製における改良が必然的 に原因と結果をむずびつけることは当然のこととは思わない。

発　明　の　開　示 本発明の目的は、抗血友病因子（ＡＨＦ）の精製及び生物学的液体から他の蛋白 質の精製のための方法を提供することである。

本発明の目的は、高純度Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆ及び他の蛋白質を出発物質について高収 率で精製する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＡＨＦ及び他の蛋白質を高濃度で有する他の蛋白質及びＡ ＨＦｖｉ製を得るための方法を提供することである。

本発明の他の目的は、低ｍ度の汚染蛋白質を有する精製されたＡＨＦまたは他の 蛋白質製品を得るための方法を提供することである。

本発明の他の目的は、蛋白質とくにＡＨＦの低軽費の精製を提供することである 。

本発明の他の目的は、低濃度の汚染ウィルスによりずでに汚染された生物学的液 体から精製ＡＨＦ及び伯の蛋白質の精製方法を提供することである。

本発明の目的はさらに、血漿画分からカラム　クロマトグラフィを用いてＡ　Ｈ Ｆを得る方法、及びさらに一般的にカラム　クロマトグラフィにより生物学的液 体から蛋白質を得る方法を提供することである。

本発明のこれら及び他の目的及び態様を付属図面、及び請求の範囲、次の記述を 考慮して当業者は理解するであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、種々の糖類による牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の選択的水和に対して 書きこんだ△トＩ　Ｆｌ［ｆｉのグラフである。

第２図は、種々な糖類によるＢＳＡの選択的水和に対して血漿に関づるＡ　ＨＦ の純度をｐｌきこんだグラフである。

第３図は、第４級アミンエヂルーセファデクス　アニオン交換クロマトグラフィ 及びアミノヘキシル　セファロース親和性クロマトグラフィを使用して得られた Ａ）−ＩＦの分解能のグラフである。

発明を実施するための最良の形態 本発明は、糖、多価アルコール、アミノ酸及び塩の存在で精製される蛋白質の純 度、分解能、収缶のすくなくとも１つを実質的に増加を生じるために充分なｏｒ ５Ｉでカラム　クロマトグラフィにより蛋白質を精製する方法に向けられている 。

上述のように種々な糖類、多価アルコール類、アミノ酸類、塩類（水加添加物） が蛋白質の選択的水加によって蛋白質の横道を安定することが知られてきた。水 溶性蛋白質溶液においてその選択的相互作用パラメータの最適な減少または蛋白 質の選択的水和パラメータの最適な増加は蛋白質の凝集を促進し、蛋白質分子の 折りたたみを高めると考えられている。さらに結果として、疎水性基はさらに密 に埋められ、その表面は水溶性溶液におけるよりもさらに疎水性になると考えら れている。

本発明は、蛋白質を水和添加物にさらりと蛋白質のみがけのイオン相互作用を増 加し、みがけの疎水性相互作用を減少することを見い出した。これら物質の効果 は可逆的であり、蛋白質溶液における蛋白質濃度に依存する。本発明は、糖類、 多価アルコール類、アミノ酸類、塩類のこの性質を疎水性、親和性カラムからの 選択的な溶離及びイオンカラムでの蛋白質の選択的結合を高めるために有利に使 用する。

本発明はまず第１にイオン交換クロマトグラフィ　カラムを通して、次に疎水性 、親和性クロマトグラフィ　カラムを通して、連続方法により冷凍沈澱血漿から ＡＨＦを精製する。

特に好ましい具体例を参照して記述する。しかしながら本発明はただＡＨＦの精 製のみだけでな（、これらクロマトグラフィ分離の使用に限定されない。望むな らば、いずれのクロマトグラフィ分離も使用でき、血漿ばがりでなく他の生物学 的または生理学的液体に存在する他のｇ製困難な蛋白質の精製に適用できる。

特に好ましい具体例によれば、血漿冷凍沈澱物はＮｅＷＩｌｌａｎ’　、Ｊ、　 、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、八、Ｊｌ、にａｒｐａｔＫｉｎ、）１．１１．及びＲｕ５ ｚＫｉｎ、　Ｓ、の公知方法により血漿から製造され、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、ｌＩａｅ ｍａｔｏｌ、２１．１．　（１９７１）、それはＦｏｓｔｅｒ、Ｓ、　、Ｄｉｃ ｋｓｏｎ、Ａ、Ｊ　、　ＨｃＱｕｉｌｌａｎ、Ｔ、Ａ、、Ｄｉｃｋｓｏｎ。

１、Ｈ、にｅｄｄｉｅ、Ｓ、及びＷａｔｔ　Ｊ、Ｇ、により変形された。胆Ｌｎ 皿、　４２，１８０（１９８２）、この論文の記述は、ここに参照して挿入され ている。主に冷凍血漿はハンマミルのなかで雪状に変えられ、５５ｒｐＨｌで撹 拌しながら１５−２８℃に保った融氷器内でとかされる。

とけた液体及び懸濁した冷凍沈澱物はｆｎｆｆｉにより流しだし、冷凍遠心分離 器に集められた。冷凍沈澱物は遠心分離により回収された。血漿冷凍沈澱物は、 ０．０２Ｍのトリス（ハイドロキシメヂル）アミノメタン（Ｔ　ｒ　ｔ　ｓ　） 　Ｉ）Ｈ７，４，０，０２Ｍのクエン酸ナトリウム、及び０．０２Ｍの塩化ナト リウム（ＮａＣｆ）を含む緩衝液（これを第１緩桁液という）のなかに出発物質 の１／１０で溶解された。水酸化アルミニウムは場合により凝結因子第■、第ｖ １１第■、第Ｘ及び成るＪ！雑素原、フィブロネクチン及びＶ。

ｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ囚子を吸着するため因子えられる。そこで試料は水酸 化物を除去するために遠心分離される。上澄液が集められる。

試料にソルビトールをそのＩｌｌが１Ｍになるまで加えられ、溶液は０．０２　 Ｍの塩酸（）−Ｉ　Ｃｆ　）によりａｌｌ６．６の酸性にされる。ポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）がｍＭ素原、フィブロネクチン、ｙｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒ ａｎｄ蛋白を沈澱させるために最終濃度４％になるよう加えられる。その溶液は 遠心分離され、上澄液はカラム　クロマトグラフィのために保存される。

第４級アミノエチル（ＱＡＥ）−セファデクスＡ−２５樹脂及びＱＡＥセファロ ース４　Ｂ　−Ｆａｓｔ　Ｆｉｏｗの両者は、ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｈｍｉｃ ａｌｓ　Ｉｎｃ、　、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、から得られた。ＱＡＥセ ファデクスＡ−２５は０．５ＭのＮａＣ１のなかで室温で一夜間または沸ｍ渇汝 に近く１−２荷間のあいだときどき静かに撹拌して膨潤させた。膨潤樹脂の１８ の容積は試料溶液に存在する全蛋白質の■における約２／３の母に等しく、カラ ムに充填される。

もしもＱＡＥセファロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗが使用されるならばこの出の約１ ／４で充分である。

樹脂の幅対高さの比は約２：１でカラムのなかに使用される。セファデクス樹脂 はそこで０．０２　ＭのＴｒｉｓ　（ａｌｌ　７．４）のなかの１ＭのＮａＣｆ ５容、０．０２　ＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ７，４）のなかの０．５ＭのＨａＣｌ　 ５容で洗浄し、忠後に０．０２　ＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ７，４）、０．１５　Ｍ のＮａＣｊ、１Ｍのソルビトールを含むｒａｍ液（１１１１衝液）の５容をもっ て洗浄する。

試料の溶液は１分間当り約１％のカラム床容積の流れ速度でカラムに加えらる。

カラムは第■緩衝液の２容で１分間当り約３％のカラム床容積の流れ速度で洗浄 される。これはひきつづき０．０２　Ｍ（７）Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，４，０，２０ Ｍ（７）ＮａＣｆ、及び１Ｍのソルビトールを含む５容の緩衝液（第ｍｍ１Ｉ液 ）で、ざらにｏ、０２Ｍの酢ｓソーダ（ＮａＡｃ）　ｐＨ６，０，０，０３５Ｍ の塩化カルシウム（ＣａＣＩ２）及び１Ｍのソルビトールを含む２容の緩衝液（ 第■緩衝液）で洗浄される。

ＡＩ−（Ｆ蛋白質は、０．１ＭのＮａＡｃ　（ｐＨ１６，ｏ　）、０．２５Ｍ（ ７）ＣａＣ１２，１０％のグリセロール、及び０．０１％−〇、０５％のＴｗｅ ｅ口８０　（このＴｗｅｅｎの使用はとくに最大収ωのためにＱΔＥ−セファロ ース４３−　Ｆａｓｔ　ＦＩＯＷについて重要である、ポリソルベート８０．７ 　Ｃ（、Ｗｉｌｍｉｎ（７むｏｎ、Ｄａｌａｗａｒｅ　）を含むｉ　ｖ　ｇ　防 液の２容でカラムから溶離される。溶離液はカラム床容積の２５％の分画に集め られ、各分画はＡＩ−ＩＦ活性を検査される。関連する分画の蛋白質濃度は変形 されたＢｒａｃｌｆｏｒｄ検査法により決定される。（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｈ， Ｈ，、蛋白質−染料結合の原理を利用する蛋白質のマイクロダラム駁の定量のた めの迅速及び敏感方法：卸岨、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２４８−２５４（１ ９７６）、その記述はここに参照して挿入れている。

ＡＨＦ活性を含むＱＡＥ溶餌液分画は貯留され、４容積の水で稀釈される。

アミンへキシル（ＡＨ）セファロース樹脂はｐｈａｒａｍａｃ　ｉａＣｈｅｍｉ ｃａｌｓ　Ｉｎｃ、、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、から得られたものであり 、それは０．５ＭのＮａＣＩの１０容のなかで一夜間膨潤される。膨潤ゲルはＡ ＨＦの１０００ｕｎｉｔに対して４１１１１ｇｅｌの比で幅：高さの比が１＝１ のカラムのなかに充填され、０．０２ＭのＮａＡｃ　（ｐＨ６、ｏ　）、０．１ ５ＭのＮａＣｌ、及び０．００２ＭのＣａＣＩ　２を含む第Ｖ緩衝液の５容でも って洗浄される。

試料の稀釈ＱＡＥ溶離液はカラムに加えられ、第Ｖ緩衝液の１０容で洗浄され、 ０．０２ＭのＮａＡｃ　（ｐＨ６０）、０．３５　ＭノＮａＣ１、及ヒ０．００ ２ＭのＣａＣｌ　２を含む第■ＦＪｊ液の５容、０．０２ＭのＴｒｉＳ　（ｐＨ ７，４）、０．３５　ＭのＮａＣｌ、及び０．００２ＭのＣａＣＩ　２を含む第 Ｖ緩衝液の２容をもって洗浄される。

Ａ　ｉｔ　Ｆは０，１ｔｖｌ＋７）Ｔｒｉｓ　（ｐＨ１７，４）、０．３５　Ｍ のＣａＣｌ２．１Ｍのソルビトール、及び０．１％のＴｗｅｅｎ８０　（ポリソ ルベート８０）を含む第１ｘＭ衝液の２溶で溶離される。分画は△１イ「活性を 検査され、活性分画は貯留される。

Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆ−含有のなかの蛋白質濃度は、ｌＪｅｉｓｓｍａｎ方法により決 定される。（５ｃｈａＨｎｅｒ、　Ｗ、及びＷｃｔｓｓｍａｎ、　Ｃ，、ｌｉ釈 溶液）蛋白質類の決定の迅速な敏感な特異性方法、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、５６：５０２−５１４（１９７３）、その記述はここに参照して挿入されてい る。

主に、最終濃度の１５％（Ｖ／Ｖ）の沈澱にトリクロロ酎酸で沈澱された試料は ニトロｌ！維素フィルターを通しで濾過により集められる。ニトロ［［累フィル タ〜はＨｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＩＩＩＶＰであり、Ｈｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ 、、　Ｈａｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓ、により製造された。沈澱はアミドブラック で染色され、メタノール酢酸−水の混合物で脱色する。スポットは切り離され、 １ｄのＮａＯＨ−ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラアセテート）のなかに溶 離され、Ａ６３ｏで読まれる。

ＱＡＥカラムは２ＭまでのＮａＣ１の勾配をもって洗浄することにより再生でき 、そこで０．１ＮのＮ　ａ　Ｏｔｌで蛋白質を除去し、エタノールまた非イオン 洗剤で脂質類を除去し、最後に第２緩衝液で再−平衡化のために洗浄される。

アミノへキシル（ＡＨ）−セファロースは、１容の水、２容のブタノール、１容 の９５％エタノール、５容の１ＭのＮａＣｌ、５容の０．５ＭのＮａＣｌ及び０ ．０２　ＭのＮａＡｃ、　ｐＨ１６，ｏ　、及び５容の第Ｖ緩衝液によって洗浄 することにより再生される。

これらのクロマトクラフィ処理から得られるＡＨＦは高い収岳、純度及び濃度を 有する。この発明の目的達成への重要な態様は水和添加物の使用であり、イオン 交換樹脂に対するＡＨＦ及び他の蛋白質の吸着を促進するためにＡ　Ｉ−（Ｆ及 び他の蛋白質の精製における彼等の濃度の処理であり、疎水性、親和性樹脂から の脱むであり、高収酊、分解能及び純度の回収である。

本発明は水和添加物の使用が （ａ）むしろ狭いカラムバンド幅にわたりその保持を選択的に与えるアニオン交 換樹脂に対してＡ　ＨＦの親和力をかなり増加する。

（ｂ）その容易に溶離することを与える疎水性樹脂に対してその親和力をかなり 不安定化する。

ことを見い出した。

アニオン交換クロマトクラフィの材料及び処理のこの特別な連続を選択する理由 は、次の通りである。

（ａ）アニオン交換カラム上で第■緩附液と共に試料を加えること、及び他の大 部分の蛋白質を溶Ｉ！１させ、樹脂にイオン的に結合するＡＦ（Ｆ蛋白質を与え るために同じ緩衝液でもって洗浄すること。（一般的にはアニオン交換カラムが 疎水性、親和性カラムより高い最初の精製を達成できる）。第■緩衝液はカラム のＡ）−ＩＦ親和力が多くの汚染されている蛋白質類の親和力よりも強い濃度で 水和添加物を含んでいる。

（Ｃ）第ＴＶ緩衝液はＡ　Ｉ（Ｆの等電点に近い溶離液のｐｌ＋を低下させるこ とにより、溶離を目的としてＡＨＦを製造し、かくして選択的に樹脂へのその結 合を弱めている。しかしながら、この緩衝液によりバンドを広げること及び早過 ぎる溶離を妨げるために溶媒のイオン強度が同時に減少される。

（ｄ）第Ｖ緩衝液は （１）すべでの蛋白質が適当なρ１１にあることを確実にするためより高い緩衝 塩８１度を （１１）汚染されているｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ囚子及びＡ　ＨＦ因子非 共有結合を破るため、そして蛋白質を溶離するためにカルシウムイオンを （ｉｉｉ）糖が樹脂から蛋白質の脱着を促進するのを遅くするので蛋白質を安定 化するためにグリセロールを（ｉｖ）ゲルマトリックスに対して蛋白質の非特異 性結合の消去を助けるためにＴｗｅｅｎ８０を含んでいる。

アミノへキシルカラムは汚染している親水性蛋白質がらＡ　ＨＦを精製する。一 般的に樹脂は疎水性相互作用により蛋白質類に結合し、アミン基は樹脂上で静電 的相互作用により、蛋白質に結合する。このカラムの処理及び材料の選択の理由 は次の通りである。

（ａ）第Ｖ緩衝液は、弱く結合する蛋白質類を溶離するため適度な量の塩を含ん でいる。

（ｂ）第■ａＶｆＪ液は、さらに密に結合する蛋白質類を溶離するためにより多 い缶の塩を含んでいる。

（Ｃ）第■緩衝液は、カラムから彼等が溶離するように多数の蛋白質類をイオン 化させるために溶離液のｐＨを上昇させる。

Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆの電荷がこのｊｕｌｌで増加するとはいえ、それにもかかられず それはさらにゆるくカラムに結合してとどまっている。

（ｄ）第１Ｘ緩衝液はＡ　Ｉ−Ｉ　Ｆ蛋白質を溶離する。より高いｖ：ｉ度の緩 ｙＪ塩はｌ）Ｈを変化する。カルシウムは溶離（のために対イオンを与える。い まだ存在することのできるｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ囚子に対する非−共因 子合を切断する。ソルビトールはカラムにとってＡＨＦ疎水性相互作用を低下さ せ、イオン性相互作用を増大づ゛る。Ｔｗｅｅｎ６０はゲルに対する蛋白質の疎 水的及び非−特異的結合を消失せしめるのに役立ち、さらに数回を増加する。

□　上述のように、上述の方法はただ本発明の好ましい１つの具体例である。△ ＨＦ蛋白質の実質的な精製は好ましい具体例に対して記述したようにアニオン交 換カラムかまたは疎水性、親和性カラムのいずれかの１つを使用することにより 得ることができる。当業者は数多くの変形が分離の質に影響を与えることなしに 行い得ることが容易に理解されるであろう。数多くのこれらについては次に記載 する。

（ａ）粗ＡＨＦは親水性ポリマ、たとえばポリエチレングリコールのような他の 公知方法により得ることができる。ＱＡＥカラムを約４−１０１ｎｇａｉ！の蛋 白質に応用できる。

（ｂ）血漿冷凍沈澱物（ｃｒｙ）は５．０から９．０の範囲のｌ）＋１を有する 適当な緩衝液−とはいえｐｌ＋は６．４から７．８の範囲が好ましく、ｐｌ（７ ，０がａ適であるが−のなかでもどすことができる。水酸化アルミニウムは必要 でない。種々、生理学的塩類の１つがａｍ液に使用できる。

（Ｃ）ポリエチレングリコール（ＰＥ’Ｇ）の１−６％の範囲が繊紐素原蛋白質 を沈澱するのに使用できるが、この処理は血漿冷凍沈澱物が６ｍｇの蛋白質／！ ｄの溶液以上を持つときのみ重要である。代苔として、伯の親水性ポリマまたは ヘパリンが繊維素原／フィブロネクチン沈澱剤として使用できる。

（ｄ）アニオン交換樹脂または疎水性、親和性樹脂のある製品が使用できる。成 る緩衝液の調整がここに使用される樹脂よりも疎水性またはマトリックス、異な った電荷密度をイｉする成る樹脂を必要とするけれども、緩衝液の変化は当業者 には容易に行うことができ、通常は製品の指示四に含まれている。マレイン酸無 水物の高分子電解質クロマトグラフィを疎水性、親和性クロマトグラフィに置換 できる。さらに疎水性カラムがアニオン交換カラムにつづく必要はない。他のイ オン交換カラムまたシよ他の特別な疎水性カラムがさらに含有する材料を精製す るのに使用することができるが、マレイン酸無水物高分子電解質に限定されない 。さらに上述のように、もし望むならばイオン交換、高分子電解質または疎水性 親和力の他の型のカラムも使用できる。

（ｅ）膨ｉ１　Ｑ　Ａ　Ｅゲルに対する蛋白質の比は８０：１から０．５：１ま で変化できる。とはいえ好ましい範囲は５：１から０．５：１の範囲であり、最 適な範囲は３：１から０．５：１である。

（ｆ）種々なカラムの大きさが使用できる。カラムの幅：高さは１　：　１００ から１００：１に変化できる。とはいえ好ましい範囲は１：１から５：１であり 、最適範囲は３：１から０．５＝１である。当業者は分解能がことなる大きさの カラムにより変化でき、！！ｌＷＪ液淵度及び濃度容積はそれ故に調整されるべ きことは理解されるであろう。

（０）流速にはカラム能力以外の限定はない。しかしながら、一般により低い流 速はより高い分解能を生じる。

（ｈ）すべての第■、第■及び第■緩衝液による洗浄は絶対的に本質的なもので はない。さらに各緩衝液の使用但は変化できる。第１［Ｗｍ液について、作用範 囲は０−１０のカラム容積またはそれ以上のカラム容積であり、好ましい範囲は ２−５カラム容積であり、最適な吊は２容梢である。第■緩衝液にとっては作用 範囲は０−１０のカラム容積、またはそれ以上の容積であり、好ましい範囲は３ −６容積であり、最適カラム容積は５容積である。第１ｖ緩衝液にとっては作用 範囲は０−１０のカラム容積またはそれ以上のカラム容積であり、好ましい範囲 は１−５容積であり、最適容積は２容積である。

（＋）第ｖＭ′ｆ！Ｂ液ではその溶離効率に実質的な減少なしに数多くの変更を することができる。緩衝液の作用ＤＨ範囲は４−９であり、好ましいｐＨの範囲 は５．９−６．５であり、最適ｐＨは６．０であり、Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆ安定性を安 全にし、Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆの等重点に近い。緩衝液の特別な濃度に関して限定はな いが、好ましい範囲は０．０２−２．０Ｍであり、最適範囲は０．３５　Ｍであ る。対イオンの濃度は好ましくは０．０２−２Ｍであり、最適として２価イオン では０．３５　Ｍであり１価イオンでは１Ｍであることを除いて限定はない。水 と混合できるアルコール、または多価アルコール、または水と混合できる有機溶 剤は絶対的に必要ではないが使用できる。エタールはそのかとして０．０５−１ ５％が好ましく、最適には１％の酊である。イオン洗剤または非イオン洗剤また は界面活性剤は必要ではないといえ使用できる。　’ｒｗｅｅｎａｏについては 、作用範囲は０−５０％であり、好ましくは０．００１−０．２％の範囲であり 、最適範囲は０．０２５％である。

（ｊ）水和添加物の濃度は使用される添加物により変化する。

（ｋ）代替的生理的緩衝液、適当な非経口投与にとって当業者内で知られている ように上に示したｐｌ＋及びイオン強度の範囲以内で使用できる。

（１）糖類、多価アルコール類、アミノ酸類または塩類の量を明らかにすること はＡＨＦの収］１１純度及び分解能を最適にするために必要である。このことは 試行錯誤により行われるが、出発点は若干の糖類及びアルコール類についてＡＨ Ｆの場合に確立されてきたものである。

純粋なＡＨＦは、実質的に選択的水和データを生ずるのに充分な苗で確かに入手 できないので、ＡＨＦの収Ｍと純度は水和添加物の濃度を変えることは、Ｇｅｋ ｋｏ、に、及びＨＯｒｉｋａＷａ、Ｔ。

前掲のデータにより同じ添加物の濃度を変化させて牛血清アルブミン（ＢＳΔ） の選択的水和に関連させた。Ｇｅｋｋｏ及び）ｌｏｒｉｋａｗａのデータを以下 に示す。

〔以下余白〕

当業名はこの場合のＡ　ｌ−１Ｆであるが、精製するのが望まれる蛋白質のため の収量及び純度のクロマトグラフィデータを牛血清アルブミンについて０．２３ の選択的水和値を生じることを示ず濃度で種々の水和添加物を使用することによ って生成することができる。

種々の糖類を含む溶液中の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）についての水和値を使用 することにより、次の観察がなされた。　異なった濃度にて種々の糖類及び多価 アルコール類の存在で血漿冷凍沈澱物のクロマトグラフィによって得られるＡ　 Ｉ−Ｉ　Ｆの収量及びＩ４ｉ度に対してＢＳＡの選択的水和についての値がグラ フに書かれるとぎに因子の第１図の収量及び第２図の純度が０．２２−０．２４ 　ｇＨ２０／　ｇＢＳＡのＢＳＡの選択的水和を生じる比較的狭い糖濃度範囲に わたって最大になることがわかる。この値より低いかまたは高いＢＳＡの選択的 水和を生じる糖の濃度では’ｉｎ　’ＡＩされるへト１［：の数社と純度はより 低くなった。へＨＦ精製に最適なソルビトール８Ｐ度は１Ｍのソルビトールであ った。

Ａ　ＨＦを選択的に水和することのできる水和添加物）岳ハ、０．２３０ｇｍ５ 　Ｈ２０／　ｇｍＢ　Ｓ　Ａでは選択的水和化ＢＳΔの量が最適であることが知 られてｄ３り使用できる。それは好ましいけれども、使用される水和添加物がソ ルビトールである必要はない。

Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆだけでなく他の蛋白質にも使用できるところの糖類は蔗糖、マル トース、ラクトース、グルコース、メルチドース、デキストラン、キシロース、 アロース、６−ジオキシマンノース、６−ジオキシ−ガラクトース等々である。

好ましくはさらに精製処理を消去して糖を代謝づることはヒ１〜にとって可能で ある。好ましいＡ）−ＩＦ精製にはグルコース及びフル１〜−スである。ＡＨＦ 精製に好ましい濃度範囲は蔗糖は０．５から２．０であり　１．０Ｍ７Ｊ＜最も 好ましく、ラクトースは０．０から０．４Ｍであり０．２５　Ｍが最も好ましく 、マルトースは０．２から０．４０　Ｍであり０．３が最も好ましく、グルコー スは０．５から２．ＯＭであり　１．０Ｍが最も好ましい。

他の適当な多価アルコール、アミノ酸または塩が代りに使用できる。

一般的に、適当な多価アルコール類は、ソルビトール、マンニトール、イノシト ール、アドニ］−−ル、エリスリトール、エチレングリコール、キシリトール、 プロピレングリコール、２−メチル−２，４−ベンタンジオール、フィコール（ ｆｉｃｏｌｌ。

合成蔗糖ポリマ）及びリビトールであり、ソルビトールが最も好ましい。ソルビ トールのＡ　Ｉ−Ｉ　Ｆクロマ１〜グラフィでの好ましい濃度は０．５−２．０ Ｍであり、最も好ましいのは１．０Ｍである。

適当なアミノ酸類はグリシン、ベータアラニン、アルファ・アラニンであり好ま しくはベタインである。

適当な塩類は酢酸ナトリウム及び酢酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウ ム、塩化カルシウム及び塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、チオシアン酸カ リウム等々である。

好ましい水和パラメークは種々の糖類、アルコール類、アミノ酸類及び塩類にと ってＴｉｍａｓｈｅｆｆ　ｅｔ　ａｔによる上記論文から得ることができ、また 彼等の方法により実験的に決定することができる。

前述の文献は種々の溶剤を使用して種々な蛋白質類の選択的水和または選択的相 互作用−この両術語とも後はど定義されるが−、選択的水和の決定方法を開示し ている。水和値及び水和添加物の濃度はこれら文献のなかに示されているが次の 通りである。

Ｌｅｅ、他及びＡｒａｋａＷａ他：庇謁に記載された方法は複雑化した方法であ り、高度の生物化学の熟練者を必要とするために牛面清アルブミン系または他の 蛋白質のいずれかがこれらの研究者等によりずでに使用されてきたかを確めるこ とにより、選択的水和または所望の選択的相互作用に達づ゛るのに必要とされる 添加物のおおよその濃度を決定づることが可能である。

ＡＩ−ＩＦについては上述したようにＢＳＡはモデルとして水準でアルブミンを 選択的に水和するであろうところの添加物の川がＡＨＦクロマトグラフィについ て最適であることが見い出された。

上表に示したデータから水和値が得られたあと、なお各々の蛋白質が各々の添加 物に異なって作用するためアルブミンの選択的水和により示されるような適度な 範囲の濃度以内でクロマｌ−グラフィの間に使用される添加酊を変化させ、使用 される特殊な蛋白質について最適な９度を確かめることは重要なことになるであ ろう。アルブミンに関する文献はＡＨＦクロマトグラフィに用いられるであろう 水和添加物濃度の決定に出発点を提供している。

Ｌｅｅ他の方法は選択蛋白質の選択的水和パラメータを決定するのに使用できた 糖類、多価アルコール類またはアミノ酸類の濃度はそれが使用されたクロマトグ ラフィ系において最適であるようにしなければならない。

Ｌｅｅ他の方法は水−糖（多価アルコール、アミノ酸等々）混合物のなかでの蛋 白質に対する溶剤成分の選択的結合の研究である。そこで水は第１成分であり、 蛋白質は第２成分であり、糖その他の水和添加物は第３の成分である。これらの 相互作用は水和添加物濃度の関数として、蛋白質の部分比容積における変化を追 うことにより測定される。部分比容積は、精密密度測定器ＤＭＡ−０２（Ａｎｔ ｏｎ　Ｐａａｒ、Ｇｒａｔｚ）を用いて次式（１）により密度測定から得られる 。

ここでφはみかけの部分比容積、 ’；＋４ｏは溶液と溶剤とをそれぞれ加えた密度であり、 Ｃはｇｒａｍｓ　／ｄで示される蛋白質の濃度である。

蛋白質の密度は一定の化学ポテンシャルと溶剤成分の一定の重量モルｉ９度の両 方の条件で測定される故に、第１、第２及び第３成分間での選択的相互作用の度 合を決定することがでぎる。

ξ３は次式によりその系の密度（ρ）の変化に関係する：ここでｍｉは第ｉ成分 のモル濃度であり、Ｕ・はその化学ポテンシャルであり、 Ｔ　は熱力学的温度 Ｐ　は圧力 Ｑ・は第１成分の（ｌｒａｍｓ　／　ｇＨ２０で示した１ＥＩＩｌｃ［である。

■ 無限希釈での部分比容積の定義から次のように柑くことができる。

γ３は第３成分の部分比容積 ｆｏは溶剤の密度 φ４　は蛋白質のみかけの部分比容積であり、一定の重量モコ ル濃度の条件下で測定される 鈷　は蛋白質のみかけの部分比容積であり、一定の化学ボテンシャルで測定され る。

（’）ｇ３／ｃ’Ω２）■１μｍ、μ３なる符号は、蛋白質に対する第３成分の 選択的結合を意味するところでは正であり、または蛋白質の囲っでの第３成分の 欠乏を意味し、かくして水との選択的相互作用を意味するところでは負である。

符号が負であるときには選択的水和パラメータは次式（３）により与えら＝−１ １０３（つ９３１つ０２）Ｔ、μｍ、μ３・・・・・・（３） 測定は精密密度測定器をもって行われ、みかけの部分比容積（φ）は式（１）に より計算された。φの観察される外挿値が無限希釈で外挿値と蛋白質濃度の関数 としてグラフに書かれ、選択的相互作用の度合を計算するために式（２）を使用 する。かくして選択的水和パラメータは式（３）を使用して計算できる。

記載されたような本発明の方法を使用することにより従来技術よりも１００−１ ５０倍の抗血友病因子の蛋白質の精製水準を得た。本発明は、次の実施例によっ て更に説明される。これらの実施例は本発明を説明し、その範囲を限定するもの ではない。

実施例　１ 冷凍ヒト血漿３１を部分的に柔らかくし、ゴム槌により砕いた。

砕かれた材料は３７℃でとかし、一方血漿の温度をＯ−２℃に保持し、ただちに 水浴に置いた。それは４℃で０．５時間、２５００Ｘ９で遠心分離した。得られ た沈澱物を緩衝液ＩＩ　３００ｎｆｓのなかでもどし、１．３％の水酸化アルミ ニウム懸濁液（３０ｎ＋Ｉｓ　／１ｉｔｅｒの血漿）に加えた。混合物をそこで １０℃で１５分間、２５００ｘ　ｇで回転した。上澄液の試験により、蛋白質及 びＡ　ＨＦ　ｍ度がそれぞれ４ｍｇ／ｒｄ及び２．８ｕｎｉｔｓ　／ｍＲである ことが見い出された。

これはそれぞれ全蛋白質及びＡＩ−（Ｆｌの１２００ｍｇ５及び８４０ｍ位を与 えた。

ＱＡＥ−セハデクスＡ２５膨潤樹脂の８００ｍ　Ｉ　ｓを含有するカラムが作成 された。カラムの幅：高さは２：１であった。３００ｍ１ｓの試料の上澄液は１ ２ｍｅ／ｍｉｎの流速でこのカラムに加えられた。カラムはそこで緩衝液■の２ 容量、緩衝液■の５容■、ａ耐液■の２容聞、緩衝液Ｖの２容量をもって流速２ ４１１１１Ｓ　／ｌ１ｌｉｎで洗浄した。＜ｇ類のより高い温度はＱＡＥ−セハ ローズ４Ｂを最適純度及び教団のために早い流れを必要とした）溶離液は次のよ うに緩衝液Ｖにより集められた。

九五初、第■因子：Ｃ第■因子：Ｃ全蛋白質３　０．８９　１０．８　− ４　０．７４　８８．８　− ５　１．８０　２５２．０　０．０７５６　１．３０　１６９．０　０．０４５ ７　１．４０　１Ｇ８．０　０．００４８　０．７５　９０．０　− ９　０．４１　４９．０　− 〔以下９．會〕 生成物中の全Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｆ含量： ８２７ｕｎｉｔＳ、０．１２４ｍｇ全蛋白質／〃認精製：血漿凍結沈澱物から３ ２００倍　回収＝９８％分画の５−７は、７０％の回収及び２６００倍の精製を 示し、３９０Ｉｎｌ！の容積を与えるように貯留された。この溶液は、全容積１ ９５０ｍ１を与えるように４容聞の緩衝液Ｖｌで稀釈された。

膨潤したアミノへキシル（ＡＨ）−セハローズの４　ｍｌｓが、幅：高さの比は １：１である小さなカラムに充填された。

ＱＡＥ精製からの第■因子二〇含有溶液は２４ｍ１ｓ　／ｍｉｎの流速でカラム に加えられた。カラムはそこで緩衝液Ｖｌの１０容量１緩簡液■の５容６１、緩 衝液■の２容か、緩衝液■の２容ｊをもって洗浄された。流速は２４ｍ１Ｓ　／ ｍｉｎであった。１１Ｒｆｌの分画は緩衝液ＩＸによる溶出の間に集められた。

その結果は次に示される。

２　１９４　０．４３４ ３　２３９　０．４０６ ４　８４　０．１９６ ５４６０゜１８２ ６１５０．１６８ ７　５　０、０５６ ８　０　０、０２８ 全（この段階）　５７７ＬＩｎｉｔｓ、　１．４７ｍｇ５精製（この段階）１１ 倍 全体的精製　２８．０００倍以上　血漿回収（この段階）９８％ 全体的回収　約　７８％ 上の実施例において、ただ３分画のみが疎水性親和力クロマトグラフィに用いら れた。これは分解能と純度を最大にしなかった。もし収量が最大にされると、Ｑ ＡＥ−クロマトグラフィからのすべての活性な分画が使用できる。これ及び伯の データを基にして全般的回収は９６％になる。

実施例　２−６ Ｃｒｙｏは実施例１に記載されるようにしてＱＡＥカラムから溶離された。精製 及び回収の結果は次に示される。

実施例　純度（血漿について）　回収（％）２　３５００　ｘ　１００ ｊ　６２００　Ｘ　１００ ４　５３００　Ｘ　９９ ５　４５００　Ｘ　７９ ６　３７００　Ｘ　ｉ００ 平　均　４６４０　ｘ　９５．６ 実施例　７−９ ＣｒｙＯは、ソルビトールを除いた以外は実施例１に記載されたＱＡＥカラムか ら溶離された。結果は次に示される。

支蓋贋　−７について　１脛工ｌ上 ７　１４００　Ｘ　６９ ８　２５００　Ｘ　４９ −豆−２９００Ｘ　−堕一 平　均　２３００　Ｘ　５９ 実施例　１４−２２ Ｃｒｙｏは、異なる糖が用いられること以外は実施例１に記載されるようにＱＡ Ｅクロマトグラフによって精製された。上述のように好ましい水和実験は、第■ 因子について行なうことができなかった。ＢＳＡによる八ｒａｋｗａ、　Ｇｃｋ ｋｏ及びＨｏｒｉｋａｗａから（ｑられたデータがその代りに用いられた。（上 述の選択的水和の表を見よ）。その結果は次に示される。

−血゛ゝ　ル　ミン　Ｂ　肛１個ｌ 実施例　糖　ｍｍモル　選択的　回収　血漿について□　□　−１灰−２Ｌ］１ −％　−一に痩−一１４　ラクトース　０．２５　０．３００　８５　４４００ 　Ｘ１５　ラクトース　０．２０　０．３００　７０　２７００　Ｘ１６　グル コース　１．０　０．２５０　８３　５１００　Ｘ１７　ソルビトール　１．６ 　０．２３５　８８　２７００　Ｘ１８　ソルビトール　１．１　０．２２９　 １００　５５００　Ｘ１９　グルコース　１．ｓ　０．２２６　１００　ｅｌｏ ｏ　ｘ２０　グルコース　２．０　０．２１２　７６　４９００　ｘ２１　ソル ビトール　０．５５　０．２０５　６２　１７００　Ｘ２２　ソルビトール　０ ．８２　０．１９８　７２　１９００　ＸＡ　ＨＦの純度と収量の値は等配の糖 についてＢＳＡの選択的水和の値に対してグラフにかきこまれ、第１図、第２図 の各々に最適ピークが観察された。

実施例　２３ Ｃｒｙｏは、ソルビトールのある、なしで実施例１に記載されたようなＱＡＥク ロマトグラフィにより精製された。その結果は次に示される。

ソルビトール　回　収　純　度 工亜ａ−Ｅ／四１度上　−±Ｘ上−工廁１」じハエ１上１　７７　４２００　ｘ ｌ　８２　３７００　Ｘ ｌ　１００　５６００　Ｘ ｌ　９２　４０００　Ｘ ｌ　９８　９０００　Ｘ ｌ　９４　３９００　ｘ ｌ　９１　３４００　Ｘ ｏ　３５　５６０　Ｘ Ｑ　４８　５３５　Ｘ ｏ　５９　６８３　Ｘ ｏ　５９　１８００　Ｘ ｏ　７１　７００　Ｘ 実施例　２４ Ｃｒｙｏは、フル１−−スが異なる濃度で使用されること以外は、実施例１に記 載したようなＱＡＥクロマトグラフィによって緒製された。結果は次のとおりで あった。

マルトース　回　収　最終純度 −工■上−−工ｘ上−′　・１″）い１０．３　１００　２１００　Ｘ ｏ、３　８１　１４２０　ｘ Ｏ，３１００２２００Ｘ Ｏ，３１００７５００Ｘ Ｏ，３６４３４００Ｘ Ｐ３ＷＪ液による洗浄：０．０５Ｍのｃａｃ＋　：　０．０２　ＭのＮａ八へ０ ．３　１００　３６００　Ｘ Ｏ，３８８８０００ｘ Ｏ，３１００３０００ｘ 緩衝液による洗Ｑ：０．０２ＭのＮａＡｃ　：　０．０３５Ｍのｃａｃ＋２０． ３　９２　４０００　ｘ Ｏ，３９１１８０００Ｘ ｏ、３　９８　９０００　Ｘ ｏ、０　７１　７００　ｘ ｏ、０　７８　５６０　ｘ Ｏ，３９４３９００ｘ 実施例　２５ ＱＡＥ溶離液は、ソルビトールが除かれること以外実施例１に記載されるような アミノへキシル　セファ０−ス　りロマトグラフィにより行われた。結果は次の Ｊ：うである。

−工しｙＥ」」し銖− ソルビトール　純度　回　収　最終純度（溶離液における　（出発血εカ　（％ ）　（出発血漿−皿１１及１皿±　−（２竺エエ　□　−図２亘エエ０　２００ ０　ｘ　１３　１８００　Ｘｏ　２１００ｘ　４８　２３００ｘ １　４４００　ｘ　ｔｏｏ　３８１００　ｘｌ　４５００Ｘ　９６　３８０００ Ｘ １　５７００ｘ　８９　２５０００ｘ １　２１００　Ｘ　１００　２０７００　Ｘ１５６００　ｘ　９４　８００００ 　Ｘｌ　５７００ｘ　（ｉｏ　１７０００ｘ実施例　２６ 実施例１により製造されるＣｒｙｏは実施例１によりマレイン酸無水物高分子電 解質のクロマ１−グラフィにより行われた。マレイン酸無水物高分子電解質は、 商標５ＰＥＹＬ　ｒＴＥとして市販されテイテ、Ｗｒｃｘｈａｍ　、　Ｗａｌｅ ｓ　、　ＥｎｇｌａｎｄのＳｐｅｙｗｏｏｄから入手できる。Ａ　ＨＦの精製に おけるマレイン酸無水物高分子電解質の使用は、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ａ、Ｊ、他の Ｊ、　Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｈｅｄ、９２（２）：１９４−２１０（ＡＵ（Ｉｔ、 　１９７８）に記載されている。

高分子電解質樹脂は次のようにＩＩＩ造された。乾燥された樹脂は０．１５Ｍの ＮａＣｌに３０分間２！漬され、ｐｌ＋をクエン酸により４．０に下げ、２０分 間保持し、そこでＮａ０１１でｐｌ＋を６．６に上げた。

クロマトグラフィは次のように行われた。カラムは０．１５ＭのＮａＣｌ、０． ０２　Ｍのクエン酸ソーダ（ｐＨ６，６）の５ｃｏ１．Ｖ。

ｆｕｍｅｓにより均衡を保った。ＡＩ−（Ｆ＆！縮物はクエン酸によりｐＨを６ ．６に調節し、１威／ｍｉｎの速度でカラムに適用された。結果は次の通りであ った。

ソルビトール　Ｃｒｙｏ　回　収　最終純度（溶離液の　（血漿について　（％ ）　（血漿について）北肛旦亙孟瓜エ　一度■皮ニー−□ Ｑ　６０　ｘ　４２　２６００　Ｘ Ｑ　６０　ｘ　５５　２０００　ｘ ｏ　６０　Ｘ　３５　１８００　Ｘ ｏ　６０　Ｘ　３１　１８１０　Ｘ ｌ　［ｉｏ　ｘ　７１　３８７０　ｘ ｌ　６０　Ｘ　８５　４１００　Ｘ ｌ　６０　Ｘ　７２　２７００　Ｘ ｌ　６０　Ｘ　７１　３５０ＯＸ 上の結果はマレイン酸無水物高分子電解質がアミノへキシル　セファローズに代 わって使用できることを示している。

アミノへキシル　セファローズ　りロマトグラフイの結果は、上に報告されたよ うに常に満足できるものでなかった。

本発明は、セファローズのバッチ酊を変化させてこれに関連させた。

本発明は、一般的に製造される微生物の生成物及び要素の精製に特に適切である 。

本発明の特別な具体例が目的を説明するのに記述されているが、当業者は多くの 付加、置換及び変形が本発明の範囲及び間挿から逸脱しないかぎり可能であるこ とは理解されるであろう。例えば、ここに記述されたＡ　ＨＦ蛋白質であるが、 本発明の方法は、糖類、アルコール類、アミノ酸類、塩類により安定化及び／ま たは選択的に水和されるずぺての蛋白質に応用できるものである。

本発明は、生化学的液体中に小回存在しているか、ｎ収巳で回収が望まれる蛋白 質の精製に特別に適している。そのような蛋白質は、第■因子、第ｖＩ因子、第 ■因子及び第Ｘ因子のような他の凝結因子に限定されない。本方法がアルブミン または免疫グロブリンの精製にすなわち比較的多ｍの蛋白質のＦｉｉ製が必要で あり、完全性の少ない回収が許容できるとぎには普通の情況の下で費用効果がな いと考えられるけれども、アルブミン及び免疫グロブリンはこの方法により精製 できる。各々の蛋白質にとって各水和添加剤の最適１０度がクロマトグラフィで 決定される。このことは上に記述した方法により行うことができる。

Ｆｌｏ　１ ｍ祝６勺７１（オロ　２イタβ５Δ Ｆ／θ　２ 選祝的水伽　ｇθＢＳＡ Ｆｌｏ、３ 国際調査報告 １ＩＩｌｓ＋ＩＩａｌｌｏｎ＋−＾ｏ−ｕｅｎｏＩＩＮｏ、ＰＣ：Ｔ／ＵＳ８６ １００２２８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １蛋白質を、糖類、多価アルコール類、アミノ酸類、塩類からなる群より選ばれ る１つの水和添加物の存在でカラムから回収される上記蛋白質の回収、純度、分 解能のすくなくとも１つを増加させるために実質的に充分な濃度でさらすことか らなるカラムクロマトグラフィによる蛋白質の精製方法。 ２上記カラムクロマトグラフィがイオン交換、疎水性、親和性クロマトグラフィ 、疎水性／イオン交換混合クロマトグラフィ、その連続組み合わせクロマトグラ フィからなる群から選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載による 方法。 ３上記蛋白質が抗血友病第ＩＩ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ血液凝固剤因子、アル ブミン、免疫グロブリンからなる群より選ばれることを特徴とする特許請求の範 囲第１項記載による方法。 ４上記水和添加物が庶糖、マルトース、ラクトース、グルコトース、リボース、 アラビノース、ガラクトース、フラクトース、マンノース、ラムノース、ラフィ ノース、メレジトース、デキストラン、キシロース、アロース、６−デオキシマ ンノース、６−デオキシガラクトースからなる群から選ばれる一つの糖であるこ とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載による方法。 ５上記水和添加物がソルビトール、マンニトール、イノシトール、アドニトール 、エリスリトール、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール 、キシリトール、２−メチルグリセロール、プロピレングリコール、キシリトー ル、２ーメチル２．４．ペンタンジオール、フィコール、リビトールの群から選 ばれる１つの多価アルコールであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載 による方法。 ６上記水和添加物がグリシン、ベーターアラニン、アルフアーアラニンベタイン からなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることを特徴とする特許請求の範囲 第１項記載による方法。 ７上記水和添加物が酢酸カルリウム，塩化ナトリウム，硫酸ナトリウム，塩化カ ルシウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化セシウム，チオシアン酸 カリウムからなる群がら選ばれる一つの塩であることを特徴とする特許請求の範 囲第１項記載による方法。 ８カラムクロマトグラフィがイオン交換カラムクロマトグラフィであることを特 徴とする特許請求の範囲第１項記載による方法。 ９蛋白質が抗血友病因子であり、上記カラムクロマトグラフィがアニオン交換カ ラムクロマトグラフィであることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載による 方法。 １０さらにアニオン交換クロマトグラフィにつづいて上記因子の第２の精製に疎 水性、親和性カラムクロマトグラフィを含むことを特徴とする特許請求の範囲第 ９項記載による方法。 １１水加添加物が、カラム中で上記蛋白質とイオン交換物質との間の結合を増加 するためにカラムに導入することを特徴とする特許請求の範囲第８項記載による 方法。 １２水加添加物が上記蛋白質とカラムとの間の結合を選択的に増加させるために 試料緩衝液に導入され、その隙カラムにおいてイオン交換物質に蛋白質の吸着を 促進することを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載による方法。 １３水和添加物が上記蛋白質の溶離にさきだちカラムから消去されることを特徴 とする特許請求の範囲第１２項記載による方法。 １４上記蛋白質が抗血友病因子であることを特徴とする特許請求の範囲第１３項 記載による方法。 １５上記添加物が庶糖、マルトース、ラクトース、グルコース、ソルビトール、 マンニトールからなる群から選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１４項 記載による方法。 １６上記添加物が庶糖であり、その濃度が約０．５と０．２Ｍの間の範囲にある ことを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載による方法。 １７上記添加物がマルトースであり、その濃度が約０．２と０．４Ｍの間の範囲 にあることを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載による方法。 １８上記添加物がグルコースであり、その濃度が約０．５と２．０Ｍの間の範囲 にあることを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載による方法。 １９．上記添加物がソルビトールであり、その濃度が約０．５と２．０の間の範 囲にあることを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載による方法。 ２０上記水加添加物がカラムに上記蛋白質を含む上記生物学液体の試料を加える 前に、上記カラムのために平衡緩衝液に加えられることを特徴とする特許請求の 範囲第１２項記載による方法。 ２１上記樹脂が第４級アミノエチルアニオン交換樹脂であることを特徴とする特 許請求の範囲第２０項記載による方法。 ２２上記カラムに抗血友病因子の見かけの結合親和力を実質的に増加するのに充 分な量のグルコース、庶糖、マルトース、ラクトース、ソルビトールからなる群 から選ばれる１つの添加物の存在でアニオン交換クロマトグラフィカラムに血漿 冷凍沈澱物を容れ、不純物を除去するためにカラムを洗浄し、カラムから添加物 を消去し、因子を溶離し、回収することからなることを特徴とする血漿冷凍沈澱 物から抗血友病因子を精製する方法。 ２３上記アニオン交換カラムが第４級アミノエチルアニオン樹脂カラムであるこ とを特徴とする特許請求の範囲第２２項記載による方法。 ２４溶離工理はカラムから上記因子の脱離をたかめるため、生理学的にみとめら れる洗浄剤の使用を含むことを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載による方 法。 ２５上記添加物がソルビトールであり、その濃度が約０．５と２．０Ｍの間の範 囲にあることを特徴とする特許請求の範囲第２４項記載による方法。 ２６上記洗浄剤がポリソルベート８０であり、その濃度は約０．０１と０．０５ ％の問の範囲にあることを特徴とする特許請求の範囲第２５項記載による方法。 ２７上記添加物がソルビトールであり、濃度約１Ｍで使用されることを特徴とす る特許請求の範囲第２６項記載による方法。 ２８カラムクロマトグラフィが疎水性、親和性カラムクロマトグラフィであるこ とを特徴とする特許請求の範囲第１項による方法。 ２９蛋白質が抗血友病因子であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載に よる方法。 ３０水加添加物がカラムのなかで上記蛋白質と疎水性、親和性物質との間の結合 を選択的に弱めるために加えられ、その際カラムから上記蛋白質の溶離を促進す ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載による方法。 ３１上記水加添加物が上記カラムに溶離緩衝液に加えられ、上記溶離緩衝液が上 記蛋白質を溶離することを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載による方法。 ３２上記添加物はソルビトール、庶糖、マルトース、ラクトース、グルコース、 マンニトールからなる群より選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第３０項 記載による方法。 ３３疎水性、親和性クロマトグラフィカラムが本質的にアミノヘキシルセファロ ースからなることを特徴とする特許請求の範囲第３０項記載による方法。 ３４溶離処理がさらに上記因子の脱離をたかめるために生理学的に認められ得る 洗浄剤の使用を含むことを特徴とする特許請求の範囲第３１項記載による方法。 ３５上記洗浄剤がポリソルベート８０であり、その濃度は約０．０１と０．８の 問の範囲にあることを特徴とする特許請求の範囲第３４項記載による方法。 ３６上記添加物がソルビトールであり、その濃度は約０．５と２．０の間の範囲 にあることを特徴とする特許請求の範囲第３４項記載による方法。 ３７上記添加物が庶糖であり、その濃度が０．５と２．０Ｍの間の範囲にあるこ とを特徴とする特許請求の範囲第３４項記載による方法。 ３８上記添加物がマルトースであり、その濃度は約０．２と０．４Ｍの問の範囲 にあることを特徴とする特許請求の範囲第３４項記載による方法。 ３９上記添加物はグルコースであり、その濃度は約０．５と２．０の間の範囲に あることを特徴とする特許請求の範囲第３４項記による方法。 ４１上記クロマトグラフィがイオン交換／疎水親和性混合カラムで行われること を特徴とする特許請求の範囲第１項記載による方法。 ４２上記カラムはマレイン酸無水物高分子電解質カラムであることを特徴として いる特許請求の範囲第４１項記載による方法。 ４３上記洗浄剤はポリソルベート８０であり、その濃度は約０．０５と０．２の 間の範囲にあることを特徴とする特許請求の範囲第３４項記載による方法。