JPS6034916A - 第１ｘ因子および他のビタミンｋ依存性タンパク質の高純度精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は第Ｉ因子および他のビタミンに依存性タンパク
質である第■因子、第ＶＩ［因子、第Ｘ因子、プロトロ
ビン、タンパク質Ｃ並びにタンパク質Ｓの分離および精
製の方法に関する。特には、高純度タンパク質を血漿ま
たは濃縮物からクロマトグラフ吸着および濃縮技術によ
り分離する方法に関する。

従来技術 血液凝固因子は正常な凝固機構において、生命の維持に
必要な役割を果たしている。例えば、第Ｉ因子欠乏症の
患者は重大な出血問題を示している（血友病Ｂ）。従っ
て、和学研究用だけでなく、治療に用いる量の第Ｉ因子
および他のビタミンに依存性タンパク質の単離を可能に
することが望まれていた。この目的に対して種々の方法
が文献に記載されている。本発明の方法は、高純度でか
つ高収率で目的とするタンパク質が得られ、特に他の凝
血因子による汚染の比較的低い点において従来技術より
優れているものである。更に、多くの工程を必要とする
従来技術では、時間がかかるのと全工程でのタンパク質
の損失が避けられない。

従来方法の一つとして、Ｓ　、　Ｐ　、Ｂａｊａｊ等に
よる「人間のプロトロビン、第】Ｘ因子および第Ｘ因子
の精製のための簡単化した処理方法」、Ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，　］　１（４）、
　３　９　７〜４　１　２　（　１　９８１年）がある
。この方法では、血漿をクエン酸バリウムへの吸着およ
びそれからの溶離、硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−
セフ′アデツクスクロマトグラフイー、そして、ｐＨ７
５のクエン酸ナトリウム緩衝液中でのヘノシリン−アガ
ロースクロマトグラフィーによってプロトロビン、第Ｘ
因子および第ＴＸ因子を分離するものである。第ＩＸ因
子の報告された収率は、８０〜２２０ユニツト／ｒｖの
比活性で約３５％であった。他の方法として、Ｊ　、　
Ｐ　、　Ｍｉｌｅｔｉｃｈ等による「硫酸塩化したデキ
ストラン球体を用いての人間の血液凝固因子の第■、第
■および第Ｉの精製」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、第８０巻、頁２２１〜２２８に記載の
ものがある。この方法では、新鮮な冷凍血漿を解凍し、
クエン酸バリウム（Ｃよる沈殿、ジイソプロピルフルオ
ロリン酸塩とトリス−塩酸中での再懸濁、硫酸アンモニ
ウム（による沈殿、Ｄ　Ｅ−５２セルロースへのクロマ
トグラフィー、そして得られた分画の選択的な硫酸塩化
したデキストラン球体への適用の手順で行うものである
。第１Ｘ因子を含む分画の濃度は第Ｘ因子の１ｗｔ％と
同じ程度に不純物が混じっているとされている。Ｂ、　
０ｓｔｅｒｕｄ　等による「人間の血液凝固因子■」、
Ｊ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２
５３巻、Ｎｏ、１７、頁５９４６〜５９５　］、　（１
９７８年）、では、第Ｘ因子の精製を以下の手順、硫酸
バリウムへの吸着およびそれからの溶離、ＤＥＡＥ−セ
ルロースパッチクロマトグラフィー、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、そしてヘハリンーアガロースのアフィ
ニティークロマトグラフで行っている。第１Ｘ因子活性
は、２０７ユニツト／ｍｇであり、収率は記載されてい
ない。

以上のことから、第Ｘ因子または他ρビタミンに依存性
クンバク質を血漿または濃縮物から分離、精製する改良
された方法が必要であり、本発明はそのような必要を満
足させることを目的としている。

発明の要約 本発明はビタミンに依存性タンパク質および１種または
それ以上の他のタンパク質を含む源物質から目的とする
ビタミンに依存性タンパク質を分離する方法に関する。

本方法はタンパク質への特異的な抗体を用いての吸着操
作で高度に精製されたタンパク質を得ることができろ。

第１の段階は、血漿または濃縮物のような源物質からの
タンパク質の免疫吸着を含む。用いられる吸着体はタン
パク質て特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノ
クローナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に
結合されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を
非吸着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗
浄する。

吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させる。

回収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほとんど
なく、治療に用いることも更に精製することもできる。

本発明のプロセスでは第１Ｘ因子の精製が１５００倍の
程度で得られ、これは従来技術を通じて大きな改良であ
る。比活性は約３４８ユニツ）　７ｍｇであり、さら（
Ｃ第］Ｘ因子の収率はこの新規な方法において平均約５
０％、高くて約７０％である。

本方法はビタミンに依存性タンパク質として知られてい
る第１１因子、第■■因子、第１Ｘ因子、第Ｘ因子、プ
ロトロンビン、タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓのあら
ゆるタンパク負債製フオーム（Ｃおける回収に容易如適
用できる。血漿、血漿分画、血漿濃縮物が典型的な源物
質として含まれる。タンパク質はまた、ＤＮＡ組み換え
技術、即ち、バクテリア、酵母または他の細胞の中へタ
ンパク質を生産するための遺伝子を組み入れたタンパク
質の混合物からも精製することができろ。このような遺
伝子組み込み技術は当該技術分野に通常の技術を有する
ものであれば公知のことであり、また、示されたクンバ
ク質が１種またはそれ以上のタンパク質、細胞の残骸等
の混合状態であることは理解されろ。

以下の説明は、従来一つの操作で達成されるとは知られ
ていなかった純度と濃度にまで第１Ｘ囚子の分離と精製
を達成するためＣてなされ、用いられろ本発明の具体例
の詳細を提供するものである。

この説明は、第Ｘ因子の精製に適用される本発明の好適
例であり、本発明を限定するものでなく、当該技術分野
の領域内にある変化応用は本発明の範囲に属すると考え
ろべきである。その他のビタミンＩ（依存性タンパク質
は同様の操作６てより精製されるが、その操作は用いら
れる抗１木を生じさせる第１Ｘ因子に代わる他のタンパ
ク質を用いろ範囲で改変されろ。

Ａ、第］Ｘ因子に対するモノクローナル抗体の調製第１
Ｘ因子Ｃて吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離
基質に結合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の
公開されている方法により高度に精製さ；ｌｔ７．）第
１Ｘ因子の調製することに始よる段階的手順により調製
される。第■因子の精製は血漿源から得られる物質を用
いて達成されるが、純度が充分に高くないものは高濃度
で用いられる。

抗疑血性の正常な血漿の精製はＱｓｔｅｒｕｄ等ｉＣよ
り示された方法、硫酸バリウムへの吸着および溶離、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースパッチクロマトグラフィー、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリン−アガロー
スカラム如よるアフィニティークロマトグラフィーの順
序で行なわれた。この方法による順序は、高度に精製さ
れた第■因子を提供する。

以下の手順に従って、血漿から得られた高度に精製され
た第１Ｘ因子をマウス（で注射した。他の手順でも同様
の効果を期待できる。第Ｏ日月、前記タンパク質Ｉ　Ｑ
　Ｏμｇを０．０５Ｍ１・リス、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含むｐＨ７，３の緩衝液０．１　ｍｌて溶解（ま
たは懸濁）させ、完全なフロイント補佐剤の同容駄で振
とうして調製した組成物をマウスの腹膜を通して注射し
た。第１５白目、完全なフロイント補佐剤を不完全なフ
ロイントの補佐剤（（代えて以外は同様のタンパク質５
６μ７を再び注射した。第２２．３０．３８および１２
４日目１第１５白目の注射を繰り返した。第２３９白目
、マウスに精製した第１Ｘ因子のみを注射した。第２４
３日月、マウスの牌臓を取り出し、常法に従って溶かし
た。この方法はＪ　、　Ｐ　、　Ｂｒｏｗｎ等による「
モノクローナル抗体との免疫沈降反応により同定される
正常および悪性の人細胞のタンパク質抗原」、ＪＯＵＲ
ＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴ
ＲＹ。

２２５巻、頁４９８０〜４９８３（１９８０年）に記載
されている。この標準的手法は３５％ポリエチレングリ
コール１０００を５０％ホリエチレングリコールシて代
える程度おいて変化させられる。

陽性クローンは、正常人血漿の等量と各クローンからの
上清液を培養し、第１Ｘ因子活性を分析することにより
同定される。クローンは、上清液が実質的に第■因子凝
血活性を中和したならば陽性と見なされる。クローンが
陽性であると決定した後、それらは少なくとも２度ザブ
クローンｒヒし、第■因子に対する抗体を生産する安定
なりローンを得、少なくとも細胞の注入４日前ＬＣ０，
５ｍｌＥのプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ　）で腹膜を
通じて前もって処理したＢａ１ｂ／ｃ　マウスの腹腔中
に注射した。

ハイプリドーム細胞を牛の胎児の血清を含まないＤｅｌ
ｂｅｃｃｏで修飾されたｌｉ：ａｇｌｅ媒質ｏ５ｍｌに
おいて、マウス１匹当り約５．Ｘ１０’細胞の濃度にな
るように注射した。マウスの腹が膨れるのを確認して、
腹水液をヘパリン中に約１０ユニツト／ｍｌで集めた。

多数のマウスからの腹水液は次のモノクローナル免疫グ
ロブリン（ＩｇＧ）の単離のために適当な容量に分けて
貯蔵した。ヘパリン処理腹水液をすぐに使用しない場合
には、−７０’Ｃで貯蔵し、使用直前に解凍するのがよ
い。腹水液からのＩｇＧの最終収率は、腹水液１００ｍ
１当たり約１９のＩｇＧである。

第■因子を精製する目的のためのモノクローナルＩｇＧ
の特異性は、後述するようにモノクローナルＩｇＧが分
離基質媒体にカンブリングすることにより、そして、分
離基質に結合したＩｇＧが血漿から第■因子を除きその
第■因子が続くチオシアン酸ナトリウムを含む溶液で溶
離されろことを示すことにより評価される。

モノクローナルＩｇＧは、続く免疫吸着体を調製するの
に用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の冷凍部分を解
凍したヘパリン処理した腹水液から単離される。新鮮ま
たは凍結物に関わりなく使用され、溶液を４℃とし、等
容量のリン酸塩緩衝液の塩溶液（ＰＢＳ）で処理し、以
下に示す組成物とする。希釈腹水を４℃で攪拌しながら
等容量の飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）（水中に過剰
の硫酸アンモニウムを入れ沸とうさせ、４℃に冷却し、
不溶の結晶をろ過し水酸化アンモニウムでｐＨ７，０に
調整して得る）を滴下しながら加え沈殿させた。沈殿物
と上清液を２時間以上攪拌し、４℃（Ｃて遠心分離した
。遠心分離は好ましくは、６０分間、１４．０００ｒｌ
ｌｌｌ　（３０，０００Ｘ　ｇ）て行なう。腹水の上清
液はＳＡＳでさらに２回沈殿させ、その沈！股物と上清
液を第１回目と同様に攪拌し、遠心分離した。３回目の
沈殿から得られたペレットを希釈した腹水液と等量のＰ
ＢＳで再懸濁した後、ＰＢＳに対し充分圧透析した。透
析袋に凝固物が現われた時、２０℃で遠心分離てより除
いた。透析されたＩｇＧを室温で５％の水酸化アルミニ
ウム水溶液と共に攪拌して吸着させ、吸着後２０℃で遠
心分離した。吸着処理は第１回目の後少なくとも３回以
上、それぞれ２．５％水酸化アルミニウム溶液を用いて
繰り返される。吸着されたＩｇＧは４℃にして、上記の
如＜　ＳＡＳで再沈殿させた。沈殿させたベレットは使
用するまで一２０°Ｃで貯蔵される。モノクローナルＩ
ｇＧ精製の他の方法は、ここで用いた方法と同様にもし
くはよりよいものであり、例えば、　Ｂｒｕｃｋ、Ｃ、
、Ｐｏｒｔｅｔｅｌｌｅ、　Ｄ、、Ｇｌｉｍｅｕｒ、　
Ｃ，、Ｂｏｌｌｅｎ、　Ａ’。

の記述による「ＤＥＡＥアフィニティーゲルブルークロ
マトグラフィーによる腹水液からのマウスモノクローナ
ル抗体の一段階精製」がＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５３巻、頁３
１３〜３１９（ｉ９８２年）に記載されている。

Ｂ、免疫吸着体の調製 免疫吸着体は、カップリングのためのモノクローナルＩ
ｇＧを調製し、カップリングのための固体基質を調製し
、モノクローナルＩｇＧを固体基質に結合させるために
２つの成分を反応させることにより好適に調製される。

（１）　カップリングのためのＩｇＧの調製新しく沈殿
させたＩｇＧ　または以前に冷凍した沈殿を解凍したも
のも用いることができる。その物質をＰＢＳに対して透
析し、ＰＢＳ中にある間６τ、ＩｇＧの容量と濃度（Ａ
２８０／１．４　＝　ｍり：、４？ＩｇＧ）を決定する
。次いで、ＩｇＧ溶液５０ｍ１当たり、ジインプロピル
フルオロリン酸塩の１０〜３０μｌ、好ましくは２０μ
ｌで処理した。得られた溶液を３０分間、ドラフト中室
温で攪拌し、その処理したＩｇＧを使用直前にカップリ
ング緩衝液に対し一晩透析した。見い出されている最も
好適なカップリング用緩衝液は、好ましくは水酸化ナト
リウムでｐＨ９に調整された０、２５Ｍ重炭酸ナトリウ
ム溶液である。

（１１）　カップリングのための固体基質の調製モノク
ローナル抗体はタンパク質、特には第１Ｘ因子自体に高
い親和性を有するものでなければあらゆる物質眞結合さ
れるが、そのような物質として、ガラスビーズ、アガロ
ースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好ましくは
、架橋結合されたアガロースで、セファロース４　Ｂ　
（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ　、　Ｊ　、の登録商
標）として知られたゲルで市販されている。

好ましい免疫吸着体樹脂を調製する方法は、一般に文献
に記載の方法と同様であり、例えば、Ｊ。

ｐｏｒａｔｈ等如よる方法、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ
ｈｒｏ−ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、８６巻、貞５３〜５６
（１，９７３年）がある。見い出された最も好適な方法
は以下の如くである。即ち、容量約２１のセファロース
４Ｂを酸で洗浄した２１用の２３’Ｌ結グラスフイルタ
ーロートに入れた。樹脂を水洗し、ろ過１−て水気のあ
る状態にした。水洗した樹脂を回転子を入れた大容量（
約４４）のガラスビーカーに移した。

次いで、５Ｍの２塩基性リン酸カリウム溶液の１部と５
Ｍの３塩性リン酸カリウム溶液の２部を混合して調製し
た７５０ｍ１の冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加え
た。充分に冷却した水を加えて最終容量を３１とした。

次に、この混合物を４℃に冷却し、マグネチツクスター
ラ上の水−水浴中で４〜１０’Ｃに保持した。ドラフト
内で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビンの
３００ｍ１の水中に加えた。混合物を溶液になるまで迅
速に攪拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セファロー
ス混合物［２分間以上攪拌しながら加えた。

攪拌を続けて８分間行ない、その溶液を４１の耐圧ビン
に固定した冷２１焼結ガラスフイルターロートに移し、
た。次いで、臭化シアン処理した樹脂を約２０１の冷水
で（ろ液のｐＨが中性になるまで）洗浄した。水洗した
樹脂は冷却したカップリング用緩衝液と速やかに平価状
態とし、大きな回転子を入れた４１のプラスチックビー
カーに移した。

（ｉｉｉｌ　モノクローナル抗体の固体基質へのカップ
リング 上記の如く調製した固体基質樹脂は、ＰＢＳと平衝状態
にある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵され
るべきではない。従って、樹脂混合物は、カップリング
反応用緩衝液に対して前もって１晩透析したＩｇＧ　と
結合さぜた。この結合した樹脂／ｕｇｃ　懸濁混合物を
２４時間４°Ｃで攪拌した。カップリンク時の上清液の
無希釈サンプルのＡ　２８０は、標準試料として牛の血
清アルブミン（ＵＳＡ）を用いてまたは標準試料として
ＢＳＡと共にバイオ−ラド（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　）タン
パク質分析（ブラッドフォード試薬）により決定される
。次に、カップリングしたりガントのパーセンテージを
計算する。上記した手順が行なわれろ時、この値は通常
約９５％である。抗体とカップリングしなかった樹脂上
に残っている活性サイトは、０１Ｍダリシンを陰有する
冷カップリング用緩衝液で焼結ガラスフィルターロート
上の樹脂を洗浄することによりブロックされる。次いで
、この樹脂を樹脂と抗体を結合させた時のそれぞれのカ
ップリング用緩衝液と等容量になるように上記溶液で再
懸濁した。懸濁液をゆっくり４℃で１晩攪拌した。次い
で、この樹脂をＰＢＳで光分疋洗浄した。その組成を以
下て示す。カップリングし、ブロックされた上記樹脂は
、付加的に０．５Ｍカルシウムイオン、好ましくは塩化
カルシウムを含むＰ１３Ｓで予備溶離される。樹脂を再
びＰＢＳのみで洗浄し、４°Ｃで貯蔵するかまたは使用
できる用意ができるまで、室温で連続したポンプの働い
ているカラム内におかれる。セファロースに対するＩｇ
Ｇのカップリング密度は、セファロース球体１１当り２
〜５．９部ｇＧ、好ましくは３〜４ｇＩｇＧであろう。

Ｃ１第１Ｘ因子の分離と精製 人や動物の血漿および市販の第（Ｘ因子の濃縮物のよう
な第■因子の試料調製は、本発明の方法を用いろことが
でき、本方法は物質の特定のクイズに限定されない。好
適な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞ
れ目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画およ
び一縮物、市販または一部実験室で精製されたものであ
る。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳
ｉ（Ｈを説明する。

新しく採取したものでない血漿は通常の手段でクエン酸
塩化され冷凍保谷される。使用準備ができた時、３５〜
４０℃、好ましくは３７℃の温度で解凍し、カラム（Ｃ
直接式れる。

本発明の説明では最初＆Ｃ直接にクロマトグラフ用カラ
ムに免疫吸着体とカップリングする粒子を入れて使用し
たが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹脂粒子を入れ
てバッチ法で分離し、その後再構成した濃縮物または血
漿を加え、上記で概要を示したように目的とするタンパ
ク質を回収する方法も本発明の範囲しであるものである
。以下、さらに詳細に説明する。

クロマトグラフ工程を遂行する尾は、以下の具体例が好
ましい。

カラム如充填した、例几ばＡｍ１ｃｏｎ　８６００１（
Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｌｅｘｉｇｔｏｎ、　Ｍ
ａｓｓ、の登録商標）樹脂を、ぜん動性ポンプで速やか
に流れろようにする。人の血漿を第１Ｘ因子源として使
用する時、抗体を保持する球体の各容量に対し約３〜７
、好ましくは５部の血漿が処理される。血漿はゆつくり
とカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血漿からの第
■因子の望ましい量が吸着される接触時間を与えるもの
である。より長い接触時間がタンパク質の少なくとも約
５０％、好ましくは７５％、より好ましくは、９５％以
上を吸着させるの眞必要であり、その時間は１〜６時間
、好ましくは２〜４時間で一般的υて満足される。

原物質をカラムに入れた後、５０部のトリス−塩化リチ
ウム緩衝液（０，１ＭＩＪジン塩基と０．５Ｍ塩化リチ
ウム、ｐＨ８）　で洗浄し、溶離タンパク質を有効Ｃで
除去する。除去率は好ましくは少なくとも９０％、より
好ましくは最大の除去である。

次いで、第２の洗浄をトリス−塩酸緩衝液（０，０５Ｍ
トリス−塩酸、ｐＨ８）　でカラムからリチウムイオン
を最大限に除去する条件で行なう。約２〜４時間の接触
時間で満足されろ。

精製第１Ｘ因子の溶離は、ジエチルアミン、塩化カルシ
ウム、チオシアン酸ナトリウム塩、臭化カリウム、酢酸
（好ましくは濃度的０．１〜１．０Ｍ）またはｐＨ２〜
３、好ましくは約２２の塩酸−グリシン混合物の如き溶
離液を含む緩衝液で行なわれる。他の適当な溶離剤は、
当該技術分野の通常の技術で簡単疋同定することができ
る。直線的な濃度勾配の溶離液が良い結果を与えるが、
本発明の目的を達成するため６τは必要はなく、一定の
イオン濃度を有する直載がさらて適当である。流出速度
はセファロースの充填にまりカラム内の圧力を上げない
でタンパク質の溶離を効果的に行うべきである。このよ
うに、第１Ｘ因子をチオシアン酸ナトリウムで溶離する
時、チオシアン酸ナトリウムの溶離液を２Ｍ〜４Ｍ、好
ましくは３Ｍを流１゜、その流速は３１カラムておいて
平方インチ当たり９ポンド以上の導入部の圧力を与え、
圧力の上昇をしないように行なう。ジエチルアミンの溶
離では、０３〜０７Ｍ、好ましく　＆″ｒ、ｏ、　５　
Ｍの濃度で行なわれろ。ジエチルアミンを溶離液として
用いた場合、分画はジエチルアミンを中和するため６て
ＩＭグラシン中Ｇで集められるべきである。続いて、そ
のカラムはＰＢＳ　−１：たは中性緩衝液で洗浄される
。

第１Ｘ因子活性を含む分画を貯蔵し、その全容量および
活性を決定する。溶離された第１Ｘ因子な溶離液のイオ
ンを除くため（、でＰＢＳ　Ｋ対して透析し、次いで分
析する。溶離された第１Ｘ因子は濃度約１、Ｏ〜３０ユ
ニット／ｍｌであり、治療または分析に用いることがで
きる。

第１Ｘ因子を集めた液は限外ろ過のような通常の方法に
より１０〜２０　：ｎｌに濃縮することができろ。

この目的のためには、窒素圧５　Ｑ　ｐｓｉ下でＹＭ−
１０メンプランとアミコン攪拌セル（Ａｍｌ　ＣＯｎ５
ｔｉｒｒｅｄ　ｃｅｌｌ）がよいことがわかった。ゆっ
くりとした攪拌を窒素圧を低下した後３０分間続け、濃
縮液の容量と活性を決定した。ため（・τ液は濃度を４
°Ｃに保つならば短期間、例えば１晩貯蔵してもよい。

上記した免疫吸着体カラムはカラムから精製したタンパ
ク質を除く溶離により再生されろ。カラムはこのように
何回でも繰り返し使用できる。

分析は通常の部分トロンボプラスチン時間分析（Ｐａｒ
ｔｉａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ　ｔｉｍｅ　
ａｓｓａｙ　）で行なわれる。

すべての緩衝液において、ＥＤＴＡ　４ナトリウム塩の
１０　ｍＭを含んだもの、および／またしますべての処
理行程を４℃で行なうこ件は、第】Ｘ因子の活性および
タンパク質分解を最小にする。

緩衝液の組成を以下に示す。

リン酸緩衝塩溶液 １．６ｇのリン酸す）　ＩＪウム１塩基性１水和物８．
４ｇのリン酸ナトリウム２塩基性無水物６１．４ｇの塩
化ナトリウム 水を加えて７１とする。ｐＨを７．２に調整。

上記で説明した手順で７回の実験を行ない、平均回収率
５２％、その範囲３２％〜７１％であった。精製度は平
均２４００倍、比活性は３４．８ユニット／ｍ９であっ
た。以下の実施例１で示すデータは、上で述べた本発明
で得られたものの代表である。冷凍された正常人の血漿
を３７℃で燵凍し、次いで４°Ｃで処理したものである
。

実施例１ 実験Ａ：　第■因子活性の１５ユニツ）／ｍｌ、００２
１ユニット／ｍｇを含む人の血漿］、　ＯＯｍｌを免疫
吸着体カラムに入れ、最初１．で血漿を次いで第■因子
を上述した方法に従って溶離した。溶離された第■因子
は３１ユニット／ｍりの比活性を有しており、約１５０
０倍の精製度を示した。第■因子の回収率６３．３％。

溶離分画のピ一つておいては、第■因子の濃度の１２倍
であρた。

実験Ｂ：　第■因子活性の０．９４ユニツ）／ｍｌ、０
Ｏ１３ユニット／ｍｙを含む人の血漿１００ｍ１を、す
べての緩衝液にＥＤＴＡ　４ナトリウム塩の１０ｍＭを
含ませた以外は上記手順と同様にして回収した。溶離し
た第１Ｘ因子は１７ユニツト／ｍ９の比活性を有し、約
１３００倍の精製度を示した。

回収率は６１％。溶離分画のピークにおいては、第■因
子の濃度の８倍であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ビタミンに依存性タンパク質からなる群から選
   ばれるタンパク質Ａと１種またはそれ以上の他のタンパ
   ク質Ｂとの混合物からなる原物質から前記ビタミンに依
   存性タンパク質からなる群から選ばれるタンパク質Ａを
   回収する方法で、　（ａ）。 前記タンパク質Ａに特異的なモノクローナル抗体に結合
   した吸着体粒子上に、前記原物質がら前記タンパク質Ａ
   を吸着し、　（ｂ）、前記粒子から前記タンパク質Ａを
   欠いた原物質を溶離ｉ−１さら如、（Ｃ）、前記粒子か
   ら吸着したタンパク質Ａを溶離し、それによりタンパク
   質入を高い純度で濃縮されたかたちで回収することを特
   徴とするビタミンに依存性タンパク質がｒ）なる群から
   選ばれろタンパク質への回収方法。 （２）前記原物質が血漿、血漿分画または血漿濃縮であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の回収方
   法。 （３）前記原物質が前記タンパク質Ａを生産するための
   遺伝子を含む細胞（Ｌ′ｃより表わされるものであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の回収方法。 （４）前記選択されるタンパク質Ａが第１Ｘ因子である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１ＪＡ記載の回収方
   法。 （５）前記撰択されるタンパク質Ａが第１Ｘ因子である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の回収方法
   。 （６）前記選択されるタンパク質Ａが第■因子であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の回収方法。 （７）ステップ（ｂｌで用いろ溶離液が塩類溶液である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の回収方法
   。 （８）ステップ（ｃｌで用いる溶離液がチオシアン酸ナ
   トリウム（水溶液）であることを特徴とする特許請求の
   範囲第７項記載の回収方法。 （９）ステップ（ｅ）で用いる溶離が臭化カリウム水溶
   液であることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
   回収方法。 （１０）ステップ（ｃ）で用いる溶離液がジエチルアミ
   ン（水溶液）であることを特徴とする特許請求の範囲第
   ７項記載の回収方法。 旧）ステップ（ｃｌで用いる溶離液が塩化カルシウム水
   溶液であることを特徴とする特許 第７項記載の回収方法。 α２）ステップ（ａｌＫおける前記吸着体粒子がアガロ
   ースであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の回収方法。 （１３）　ビタミンに依存性タンパク質および１種また
   はそれ以上の他のタンパク質とからなる混合物からビタ
   ミンに依存性タンパク質の単離と精製のための免疫吸着
   体で、固体粒子に結合し、前記ビタミンに依存性タンパ
   ク質に特異的なモノクロール抗体からなることを特徴と
   する免疫吸着体。 （ｌ（１）前記固体粒子が樹脂からなることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１３項記載の免疫吸着体。 ０５）前記樹脂がアガロ−スからなることを特徴とする
   特許請求の範囲第１４項記載の免疫吸着体。 ０６）第Ｉ因子タンパク質と１種またはそれ以上の他の
   タンパク質の混合物から第ＩＸ因子の単離と精製のため
   の免疫吸着体で、固体粒子ｂて結合し、第Ｉ因子に特異
   的なモノクローナル抗体であることを特徴とする免疫吸
   着体。 （［７）前記固体粒子が樹脂からなることを特徴とする
   特許請求の範囲第１６項記載の免疫吸着体。 （Ｉ８）　前記樹脂がアガロースからなることを特徴と
   する特許請求の範囲第１７項記載の免疫吸着体。 （１９）　ｉｎＴ記免疫吸着体がアガロース１ｌ当たり
   モノクローナル抗体３〜４ｇの結合密度を有することを
   特徴とす特許請求の範囲第１６項記載の免疫吸着体。 （２０）特許請求の範囲第１項記載の方法により得られ
   た高い純度で精製され濃縮されたビタミンに依存性タン
   パク質。 （２Ｉ）特許請求の範囲第１項記載の方法により得られ
   た高い純度で精製され濃縮さ，ｈた第ＩＸ因子。