DK170806B1

DK170806B1 - Fremgangsmåde til udvinding af et udvalgt af vitamin K afhængigt protein

Info

Publication number: DK170806B1
Application number: DK151784A
Authority: DK
Inventors: Theodore Samuel Zimmerman
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 1983-03-04
Filing date: 1984-03-05
Publication date: 1996-01-22
Also published as: AU2705788A; EP0118256A2; AU641119B2; DK151784D0; JPH0794478B2; NL930143I2; JP2573467B2; JPS6034916A; JPH07126183A; EP0118256B1; CA1252744A; DE3485711D1; EP0118256A3; AU2529584A; DK151784A; NL930143I1

Description

i DK 170806 B1

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til udvinding af et udvalgt af vitamin K afhængigt protein omfattende faktor IX, faktor II, faktor VII, faktor X, prothrombin, protein C og protein S. Mere specifikt 5 adskilles yderst rent protein ved en chromatografisk adsorptions- og koncentrationsteknik fra plasma eller koncentrat .

Blodkoaguleringsfaktorer spiller en vital rolle i den 10 normale koaguleringsmekanisme. F.eks. udviser patienter med mangel på IX alvorlige blødningsproblemer ("Hemophilia B"). Det ville være ønskeligt at være i stand til at isolere væsentlige mængder af faktor IX og andre af vitamin K afhængige proteiner til terapeutisk 15 administrering såvel som til videnskabeligt studium, og der er i litteraturen beskrevet adskillige fremgangsmåder rettet derimod. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen overgår disse fremgangsmåder ved at tilvejebringe en kombination af højt udbytte af det ønskede protein og høj renhed og 20 specielt med relativt lav kontaminering med andre størkningsfaktorer. Desuden kræver de til teknikkens stade hørende fremgangsmåder et stort antal trin, der hver især er tidsrøvende og indfører tab af protein i den totale proces.

25

En sådan proces er den af S.P. Bajaj, et al., "A Simplified Procedure for Purification of Human Prothrombin, Factor IX and Factor X", i Preparative Biochemistry, 11 (4), 397-412 (1981). Denne proces underkaster samlet 30 plasma for adsorption på og eluering fra bariumcitrat, ammoniumsulfatfraktionering, DEAE-Sephadex chromatografi og heparin-agarose-chromatografi i en natriumcitratpuffer ved pH 7,5 til fraskillelse af prothrombin, faktor X og faktor IX. Det rapporterede udbytte af faktor IX var ca.

35 35% ved en specifik aktivitet på 80 til 220 enheder/mg.

En anden fremgangsmåde er den af J.P. Miletich, et al., "Purification of Human Coagulation Factors, II, IX, and X

2 DK 170806 B1

Using Sulfated Dextran Beads", i Methods in Enzymology, bind 80, s. 221-228. Frisk frossen plasma optøes og underkastes en sekvens med udfældning med bariumcitrat, gensuspendering i Tris-HCl med diisopropylfluorphosphat, 5 udfældning med ammoniumsulfat, chromatografi på DE-52-cellulose og påføring af valgte samlede fraktioner på sulfaterede dextranperler. Efter koncentrering siges den fraktion, der indeholder faktor IX, at være forurenet med så meget som 1 vægt-% faktor X. B. Osterud, et al. be-10 skriver i "Human Blood Coagulation Factor IX", J. Biological Chemistry, bind 253, nr. 17, s. 5946-5951 (1978) rensningen af faktor IX ved en sekvens af adsorption på og eluering fra bariumsulfat, DEAE-cellulose batch chromatografi, polyacrylamid gelelektrophorese og heparin-15 agarose affinitetschromatografi. Faktor IX aktiviteten hævdedes at være 207 enheder/mg, skønt udbyttet af faktor IX ikke blev anført.

A.H. Goodall et al. beskriver i "Prepartion of Factor IX 20 Deficient Human Plasma by Immunoaffinity Chromatography using a Monoclonal Antibody", Blood, bind 59, nr. 3 (marts), 1982, pp. 664-670 en murin hybridoma klon, der gror kontinuerligt i kultur og producerer et monoklonalt antistof betegnet RFF-IX/1, som har høj affinitet for et 25 koaguleringssted på faktor IX. RFF-IX/1 immobiliseret på sepharose kan anvendes til delvis befrielse af normal human plasma for faktor IX.

Goodall et al. artiklen angår anvendelsen af plasma del-30 vis befriet for faktor IX som substratet i en en-trins koaguleringsprøve for faktor IX.

En artikel af A.H. Goodall og andre med benævnelsen "Affinity Depletion and Affinity Purification of Human Fac-35 tor IX by Monoclonal Antibodies” i Protides of the Biological Fluids, bind 30, pp. 403-407 (1983), (Proceedings of the Thirtieth Colloquium, 1982), beskriver rensning af 3 DK 170806 B1 human faktor IX under anvendelse af faktor IX koncentrat som udgangsmateriale og en RFF-IX/1 affinitetskolonne, som drives på samme måde som til affinitetsfjernelse.

5 Det er derfor klart, at der stadig eksisterer et behov for en forbedret fremgangsmåde til at adskille og rense faktor IX eller andre af vitamin K afhængige proteiner fra plasma eller koncentrater. Det tilsigtes derfor med den foreliggende opfindelse at tilfredsstille et sådant 10 behov.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til udvinding af et udvalgt af vitamin K afhængigt protein fra en kilde derfor, hvilken fremgangs-15 måde er ejendommelig ved (a) adsorption af det valgte protein fra kilden derfor på et immunoadsorbent, som omfatter partikelformigt materiale, som ikke i sig selv har høj affinitet for 20 protein, såsom glasperler, agarose og derivater der af, til hvilket materiale der er bundet et monoklo-nalt antistof, som er specifikt for det valgte protein, 25 (b) eluering af kilden, der er delvis befriet for det valgte protein, fra det partikelformige materiale, med en pufret opløsning indeholdende lithiumchlorid, og 30 (c) eluering af adsorberet protein fra det partikelformi ge materiale med et vandigt pufret elueringsmiddel, så at det valgte protein udvindes på yderst ren, aktiv og koncentreret form.

35 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til opnåelse af faktor IX i renhed af størrelsesordenen 1500 fold, hvilket repræsenterer en signifikant forbedring i 4 DK 170806 B1 forhold til tidligere procedurer, mens man tilvejebringer en specifik aktivitet på ca. 34,8 enheder/mg eller højere. Endvidere ligger udbyttet af faktor IX ved denne hidtil ukendte fremgangsmåde på gennemsnitligt ca. 50%, og 5 det kan være så højt som ca. 70%.

Fremgangsmåden kan let tilpasses udvinding på renset form af vilkårlige af de proteiner, der er kendt som af vitamin K afhængige proteiner, herunder faktor II, faktor 10 VII, faktor IX, faktor X, prothrombin, protein C og protein S. Typiske kilder omfatter plasma, plasmafraktioner og plasmakoncentrater. Proteinet kan også renses fra en blanding af proteiner dannet ved rekombinant DNA teknik, dvs. en blanding af proteiner udtrykt af bakterier, eller 15 andre celler, hvori et gen til fremstilling af proteinet af interesse er blevet indsat. Teknikken til sådan genindsætning er kendt for fagmanden på området, som også ved, at det udtrykte protein af interesse sædvanligvis findes i blanding med et eller flere andre proteiner, 20 cellerester og lignende.

Den følgende beskrivelse giver detaljer vedrørende foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse.

De andre af vitamin K afhængige proteiner renses ved sam-25 me procedure, modificeres i nødvendig grad til anvendelse af et andet protein i stedet for faktor IX til dyrkning af det antistof, der anvendes.

A. Fremstilling af monoklonalt antistof mod faktor IX 30

Det monoklonale antistof mod faktor IX, som bagefter bindes til adskillelsessubstratet, blev fremstillet ved en trinvis procedure startende med fremstilling af faktor IX, som er højrenset ved en af de adskillige publicerede 35 metoder. Rensningen kan udføres med materiale opnået fra en plasmakilde, eller mindre højrenset materiale anvendes i højere koncentration.

5 DK 170806 B1

Rensning af antikoaguleret normalt plasma blev foretaget ved den fremgangsmåde, der er beskrevet af Osterud et al., som involverer sekvensen BaSO^-adsorption og elue-ring, DEAE-cellulose batch chromatografi, polyacrylamid 5 gelelektrophorese og affinitetschromatografi på en hepa-rinagarosesøjle. Procestrinsfrekvensen giver højrenset faktor IX.

Mus blev injiceret med højrenset faktor IX opnået fra 10 plasma efter følgende skema. Andre skemaer kan forventes at være lige så effektive. På dag nr. nul blev musene injiceret intraperitonealt med et præparat fremstillet ved opløsning (eller suspendering) af 100 ug af proteinet i 0,1 ml puffer indeholdende 0,05 M Tris og 0,15 M natrium-15 chlorid ved pH 7,3 og omrystning med et lige så stort volumen komplet Freund's adjuvant. På dag nr. 15 blev musene ingen injiceret med 56 ug af det samme materiale med den undtagelse, at der i stedet for komplet Freund's adjuvant blev anvendt ukomplet Freund's adjuvant. På dag 20 nr. 22, 30, 38 og 124 blev injektionen fra dag nr. 15 gentaget. På dag nr. 239 blev musene kun injiceret med renset faktor IX. På dag nr. 243 blev musenes milte fjernet og samarbejdet efter en standardprocedure af den type, der er beskrevet af J.P. Brown et al., "Protein Anti-25 gens of Normal and Malignant Human Cells Identified by Immuno-precipitation with Monoclonal Antibodies", Journal of Biological Chemistry, bind 225, s. 4980-4983 (1980). Standardteknikken blev kun varieret på den måde, at 35% polyethylenglycol 1000 blev anvendt i stedet for 50% po-30 lyethylenglycol.

Positive kloner blev identificeret ved inkubering af overliggende medium fra hver klon med en lige så stor del normalt humant plasma og afprøvning for faktor IX aktivi-35 tet. Kloner blev betragtet positive, hvis den overliggende væske i alt væsentligt neutraliserede faktor IX størkningsaktivitet. Efter bestemmelse af de kloner, som var DK 170806 B1 e positive, blev de subklonet mindst to gange, og stabile kloner, der producerede antistof mod faktor IX, blev derpå injiceret i de peritoneale hulheder i Balb/C mus, som var blevet forbehandlet intraperitonealt med 0,5 ml pri-5 Stan mindst fire dage før injektion af celler. Hybridoma-celler blev injiceret i koncentrationer på ca. 5 x 10^ celler pr. mus i 0,5 ml Delbecco's modificerede Eagle's medium uden føtal kalveserum. Musene blev tappet, når de var opsvulmede, og ascitesvæske samlet i heparin i en 10 mængde på ca. 10 enheder/ml. Ascitesvæske fra mange mus blev samlet til opnåelse af et passende volumen til efterfølgende isolering af det monoklonale IgG. Hvis den heparinicerede ascitesvæske ikke anvendes straks, kan den opbevares ved -70 °C og optøes lige før anvendelse. Slut-15 udbyttet af IgG fra ascitesvæsken er ca. 1 g IgG pr. 100 ml ascitesvæske.

Specificiteten af den monoklonale IgG, i henseende til rensning af faktor IX, kan bestemmes ved kobling af IgG 20 til et adskillelsessubstratmedium på den i det følgende beskrevne måde og ved at vise, at det bundne IgG fjerner faktor IX fra plasma, og at faktor IX derefter kan elue-res med en opløsning indeholdende natriumthiocyanat.

25 Den monoklonale IgG, som skal anvendes bagefter til fremstilling af immunoadsorbentet, kan isoleres fra heparini-ceret samlet ascitesvæske umiddelbart efter opsamling, eller en frossen portion af den opbevarede opløsning kan optøes. Uden hensyn til, om der anvendes frisk eller 30 frosset materiale, blev opløsningen bragt til 4 °C og be handlet med et lige så stort volumen phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS), hvis sammensætning fremgår af det følgende. Fortyndet ascites blev udfældet ved dråbevis tilsætning under omrøring ved 4 °C af et lige så stort 35 volumen mættet ammoniumsulfat (SAS) (fremstillet ved kogning af et overskud af ammoniumsulfat i vand, afkøling til 4 °C, frafiltrering af uopløselige krystaller og ind- 7 DK 170806 B1 stilling af pH til 7,0 med ammoniumhydroxid). Bundfaldet og dets overliggende væske blev omrørt i 2 timer og centrifugeret ved 4 °C. Centrifugeringer udføres foretruk-kent ved 14.000 omdr./min i 60 minutter (30.000 x g). Den 5 overliggende opløsning af ascites blev udfældet to gange endnu med SAS, og blandingen af bundfald og overliggende væske blev omrørt og centrifugeret på samme måde som i første kredsløb. Den fra den tredje udfældning resulterende pellet blev gensuspenderet i et volumen PBS lige så 10 stort som volumenet for den fortyndede ascitesvæske, og derpå blev der dialyseret udtømmende mod PBS. I dialyseposerne forekommende klumper blev fjernet ved centrifugering ved 20 °C. Det dialyserede IgG blev adsorberet ved omrøring deraf med en 5%'s vandig opløsning af aluminium-15 hydroxid ved stuetemperatur og centrifugering ved 40 °C efter adsorption. Adsorptionsbehandlingen blev gentaget endnu mindst tre gange under anvendelse af 2,5% alumini-umhydroxidopløsning for hver behandling efter den første.

Den adsorberede IgG blev bragt til 4 °C og genudfældet en 20 gang med SAS som beskrevet i det foregående. De udfældede pellets kan opbevares ved -20 °C indtil anvendelse. Andre metoder til rensning af den monoklonale IgG kan være lige så gode eller bedre end den heri anvendte metode, såsom den, der er beskrevet i Bruck, C., Portetelle, D.

25 Glimeur, C. og Bollen, A. "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid by DEAE Affi-gel Blue Chromatography", Journal of Immunological Methods, 55:313-319 (1982).

30 B. Fremstilling af immunoadsorbenten

Immunoadsorbenten blev fremstillet ved fremstilling af den monoklonale IgG til kobling, fremstilling af det faste substrat til kobling og omsætning af de to kompo-35 nenter for at binde førstnævnte til sidstnævnte.

DK 170806 B1 θ (i) Fremstilling af IgG til kobling

Enten frisk fremstillet IgG kan anvendes eller det tidligere nævnte frosne bundfald kan optøes til anvendelse.

5 Materialet blev derpå dialyseret mod PBS, og mens det stadig var i PBS, blev volumenet og IgG-koncentrationen ^280^1,4 * m9/ml IgG) bestemt. IgG blev derpå behandlet med mellem 10 og 30 mikroliter, foretrukkent 20 mikroli-ter, diisopropylfluorphosphat pr. 50 ml IgG-opløsning.

10 Den resulterende opløsning blev omrørt ved stuetemperatur i et stinkskab i 30 minutter, og den behandlede IgG blev umiddelbart før anvendelse dialyseret natten over mod koblingspuffer. Den koblingspuffer, der er fundet mest egnet, er 0,25 M natriumbicarbonatopløsning indstillet 15 til et pH på 9, foretrukkent med natriumhydroxid.

(ii) Fremstilling af fast substrat til kobling

Skønt det monoklonale antistof kan bindes til et vilkår-20 ligt materiale, som ikke har en høj affinitet for protein, og især til selve faktoren IX, foretrækkes sådanne materialer som glasperler, agarose og derivater deraf.

Mest foretrukkent er en tværbunden agarose, der er tilgængelig i handelen som en gel kendt som "Sepharose" 4B 25 (varemærke tilhørende Pharmacia Fine Chemicals, Piscata-way, N.J.).

Fremgangsmåden til fremstilling af den foretrukne immuno-adsorbentharpiks er almindeligvis den samme som den, der 30 er beskrevet i litteraturen, såsom metoden af J. Porath, et al., Journal of Chromatography, bind 86, s. 53-56 (1973). Den metode, der er fundet mest velegnet, er som følger: et volumen på ca. 2 liter "Sepharose" 4B blev anbragt i en syrerenset 2 liters filtertragt med sintret 35 glas. Harpiksen blev vasket med vand og filtreret til en fugtig kage. Den vaskede harpiks blev anbragt i et stort (ca. 4 liter) bæreglas udstyret med en magnetisk omrører.

9 DK 170806 B1

Til harpiksen blev der derpå sat 750 ml kold kaliumphos-phatpufferopløsning, fremstillet ved at blande en del af en 5 M dibasisk kaliumphosphatopløsning med to dele 5 M tribasisk kaliumphosphatopløsning. Der blev tilsat en 5 tilstrækkelig mængde koldt vand til at bringe det endelige volumen op på 3 liter. Blandingen blev derpå afkølet til 4 °C og holdt ved mellem 4 og 10 °C i et isbad anbragt på en plade til magnetisk omrøring. I et stinkskab blev der sat cyanogenbromid til 300 ml vand i en tilprop-10 pet glasflaske indeholdende en magnetisk omrører. Blandingen blev hurtigt omrørt, indtil der forekom opløsning. Cyanogenbromidopløsningen blev derpå tilsat under omrøring i løbet af 2 minutter til den kolde "Sepharose" blanding. Blanding blev fortsat i yderligere 8 minutter, 15 og opløsningen blev derpå overført i en afkølet 2 liters filtertragt med sintret glas anbragt i en 4 liters vakuumkolbe. Den cyanogenbromid-behandlede harpiks blev derpå vasket med ca. 20 liter koldt vand (indtil filtratets pH var neutralt). Den vaskede harpiks blev derpå hurtigt 20 bragt i ligevægt med kold koblingspuffer og derpå overført til et 4 liters plastbægerglas udstyret med en stor magnetisk omrørestang.

(III) Kobling af det monoklonale antistof til det faste 25 substrat

Det faste harpikssubstrat, fremstilles som anført i det foregående, er klar til anvendelse, når det er bragt i ligevægt med PBS og bør derefter ikke opbevares. Følgelig 30 blev harpiksblandingen kombineret med IgG, som forud var dialyseret natten over mod koblingspuffer. Den kombinerede harpiks/IgG suspenderede blanding blev derpå omrørt ved 4 "C i et tidsrum på ca. 24 timer. ^BO for en ufor_ tyndet prøve af den overliggende koblingsvæske kan be-35 stemmes under anvendelse af kalveserumalbumin (BSA) som standard eller Bio-Red proteinprøve (Bradford reagens) med BSA som standard. Den procentvise ligand, som kobles 10 DK 170806 B1 kan derpå beregnes. Når den 1 det foregående beskrevne procedure følges, er den sædvanligvis ca. 95%. Tilbageblivende aktive steder på harpiksen, der ikke er koblet til antistof, kan blokeres ved vask af harpiksen på en 5 filtertragt med sintret glas med kold koblingspuffer indeholdende 0,1 M glycin. Harpiksen blev derpå gensuspenderet i denne opløsning til et slutvolumen lig med volumenet, når harpiksen og antistof, hver i koblingspuffer, blev kombineret. Suspensionen blev omrørt langsomt natten 10 over ved 4 °C. Harpiksen blev derpå vasket omhyggeligt med PBS, hvis sammensætning er givet i det følgende. Den koblede, blokerede harpiks blev derpå forelueret med PBS yderligere indeholdende 0,5 M calciumioner, foretrukkent calciumchlorid. Harpiksen blev igen vasket med PBS alene 15 og opbevaret ved 4 °C eller i en kontinuerligt pumpet kolonne ved stuetemperatur, indtil den var parat til anvendelse. Koblingsmassefylden for IgG/liter Sepharose bør være 2-5 g, foretrukkent 3-4 g IgG/liter Sepharose per ler.

20

C. Frasklllelse og rensning af faktor IX

Prøvepræparater af faktor IX, såsom human og animalsk plasma og i handelen tilgængelige koncentrater af faktor 25 IX, kan anvendes i den foreliggende opfindelse, og fremgangsmåden er ikke begrænset til en særlig type materiale. Foretrukne materialer, og de, der har udvist succesfulde resultater, er human plasma, plasmafraktioner og koncentrater, der er tilgængelige i handelen eller del-30 vist renset i laboratoriet, indeholdende det ønskede protein. Den efterfølgende beskrivelse giver detaljer for anvendelse af normalt human plasma.

Plasma bliver, når det ikke er frisk udtaget, citreret på 35 konventionel måde og opbevaret i frossen tilstand. Når det skal anvendes, optøes det ved en temperatur på mellem 35 og 40 °C, foretrukkent 37 °C, og føres direkte til 11 DK 170806 B1 kolonnen eller søjlen.

Det skal mærkes, at skønt beskrivelsen primært er rettet på anvendelsen af Immunoadsorbentkoblede partikler 1 en 5 chromatografisøjle, ligger det Inden for opfindelsens rammer at udføre portionsvise adskillelser ved at anbringe de antistofbundne harpikspartikler i en egnet beholder, hvorefter man tilsætter rekonstitueret koncentrat eller plasma og dernæst udvinder det ønskede protein som 10 skitseret 1 det foregående og beskrevet mere detaljeret i det følgende.

Når fremgangsmåden udføres i en chromatografisk proces, foretrækkes følgende udførelsesformer: 15

Harpiksen anbringes i en søjle, såsom en "Amicon" 86001, (varemærke tilhørende Amicon Corp., Lexington, Mass.), udstyret med en peristaltisk pumpe og et højstrømningshoved. Når human plasma anvendes som kilde for faktor IX, 20 behandles for hvert volumen antistofbærende perler ca. 3 til 7 og foretrukkent ca. 5 volumina plasma. Plasma udhældes langsomt gennem søjlen ved en strømningshastighed, som er effektiv til at give en kontakttid, der tillader adsorption af den ønskede mængde af faktor IX fra plasma 25 på immunoadsorbentet. Længere kontakttider foretrækkes for at tillade adsorption af mindst ca. 50% af det protein, der er af interesse, skønt det vil bemærkes, at adsorption af mindst ca. 75% er foretrukkent, og mindst ca.

95% er endnu mere foretrukkent. En kontakttid på 1 til 6 30 timer, foretrukkent 2 til 4 timer, er almindeligvis tilfredsstillende .

Efter påføring af kildematerialet på søjlen bliver den vasket med 50 volumen Tris-lithiumchlorid-puffer (0,1 M 35 lysinbase og 0,5 M lithiumchlorid, pH 8), effektiv til fjernelse af eluerbare proteiner, idet den foretrukkent fjerner mindst 90% eller mere og foretrukkent maksimerer 12 DK 170806 B1 fjernelsen. Dette følges af en anden vask med Tris-hydro-chlorid-puffer (0,05 M Tris-hydrochlorid, pH 8) under betingelser, som er effektive til at maksimere fjernelse af lithiumioner fra søjlen. En kontakttid på ca. 2 til 4 5 timer er tilfredsstillende.

Eluering af renset faktor IX udføres med puffer indeholdende et elueringsmiddel, såsom diethylamin, calciumchlo-rid, natriumthiocyanat, kaliumbromid, eddikesyre (fore-10 trukkent i en koncentration på ca. 0,1 til 1,0 M) eller en saltsyre/glycin-blanding med et pH på 2 til 3, fore-trukkent 2,2. Skønt en lineær koncentrationsgradient arbejder godt, er det ikke påkrævet for at opnå det med opfindelsen tilsigtede; en opløsning med en fast ionkoncen-15 tration er også velegnet. Strømningshastigheden skal helst være effektiv til eluering af proteinet uden at forøge trykket over søjlen ved at forårsage pakning af "Sepharose”. Når således faktor IX elueres med natriumthiocyanat, påføres et elueringsmiddel 2 M til 4 M og fo-20 retrukkent 3 M i natriumthiocyanat ved en strømningshastighed effektiv til at give et tryk ved indgangen på 2 mindre end 9 lbs/inch i en 3 liters søjle, uden at forårsage en trykforøgelse. Eluering med diethylamin foretages med en koncentration på mellem 0,3 og 0,7 M, fore-25 trukkent 0,5 M. Når diethylamin er elueringsmidlet, samles fraktioner bedst i 1 M glycin for at neutralisere diethylamin. Søjlen skal derpå vaskes med PBS eller en anden neutral puffer.

30 Fraktioner indeholdende faktor IX aktivitet samles, og totalvolumenet og aktiviteten for den samlede portion bestemmes. Den eluerede faktor IX blev dialyseret mod PBS til fjernelse af ioner fra elueringsmidlet og derpå afprøvet. Den eluerede faktor IX er til stede i en koncen-35 tration på ca. 10 til ca. 30 enheder/ml og kan som udvunden anvendes til terapeutiske eller analytiske formål.

13 DK 170806 B1

Den samlede mængde faktor IX kan koncentreres 10 til 20 ml ved en standardprocedure, såsom trykultrafiltrering.

Til dette formål har en omrørt Amicon-celle med en YM-10-membran under 50 psl nitrogentryk vist sig at arbejde 5 godt. Langsom omrøring fortsættes i 30 minutter efter frigivelse af nitrogentrykket, og volumenet og aktiviteten af den koncentrerede portion bestemmes. Portionen kan opbevares i kort tid, f.eks. natten over, hvis der holdes en temperatur på 4 °C.

10

Immunoadsorbentsøjlen som beskrevet i det foregående regenereres ved eluering af det rensede protein fra søjlen. Søjlen kan således anvendes gentagne gange 1 det uendelige.

15

Der foretages prøver med en standardiseret partiel throm-boplastintidsprøve.

Inkorporering af 10 mM tetranatrium-EDTA i alle puffere 20 og/eller udførelse af alle procestrin ved 4 °C minimerer aktivering og proteolyse af faktor IX.

Sammensætningen af pufferopløsningen er som følger: 25 Phosphatpufret saltopløsning: 1,6 g natriumphosphat, monobasisk, monohydrat 8,4 g natriumphosphat, dibasisk, vandfri 61,4 g natriumchlorid 30 Vand til 7 liter pH for pufferen er 7,2 I syv forskellige forsøg under anvendelse af den i det foregående beskrevne procedure opnåedes et gennemsnitligt 35 udvindingsudbytte på 52% beliggende i området 32% til 71%. Rensning gav gennemsnitligt 2400 fold med en specifik aktivitet på 34,8 enheder/mg. De i det følgende an- 14 DK 170806 B1 givne data 1 eksemplet er repræsentative for, hvad der opnås ved den foreliggende opfindelse som beskrevet 1 det foregående. Frossen normal human plasma blev optøet ved 37 °C og derpå behandlet 1 overensstemmelse med opfindel-5 sen ved 4 °C.

EKSEMPEL 1

Forsøg A: 100 ml humant plasma Indeholdende 1,5 enhe- 10 der/ml og 0,021 enheder/mg faktor IX aktivitet blev påført en immunoadsorbentsøjle, og plasmaet og derpå faktor IX blev elueret i overensstemmelse med den i det foregående beskrevne fremgangsmåde. Den eluerede faktor IX havde en specifik aktivitet på 31 enheder/mg, hvilket re-15 præsenterede en rensning på næsten 1500 fold. Udvinding af faktor IX var 63,3%. I spidselueringsfraktionen var koncentrationen af faktor IX 12 fold.

Forsøg B: 100 ml humant plasma indeholdende 0,94 enhe-20 der/ml og 0,013 enheder/mg faktor IX aktivitet blev udvundet under anvendelse af ovennævnte procedure med den undtagelse, at alle puffere også indeholdt 10 mM Na^-EDTA. Den eluerede faktor IX havde en specifik aktivitet på 17 enheder/mg. Udvinding af faktor IX var 61%. Den 25 spidseluerede fraktion havde en koncentration af faktor IX på 8 fold.

30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til udvinding af et udvalgt af vitamin K 5 afhængigt protein fra en kilde derfor, kendetegnet ved, (a) adsorption af det valgte protein fra kilden derfor på et immunoadsorbent, som omfatter partikelformigt ma- 10 teriale, som ikke i sig selv har høj affinitet for protein, såsom glasperler, agarose og derivater deraf, til hvilket materiale der er bundet et monoklo-nalt antistof, som er specifikt for det valgte protein, (b) eluering af kilden, der er delvis befriet for det valgte protein, fra det partikelformige materiale med en pufret opløsning indeholdende lithiumchlorid, og 20 (c) eluering af adsorberet protein fra det partikelformi ge materiale med et vandigt pufret elueringsmiddel, så at det valgte protein udvindes på yderst ren, aktiv og koncentreret form.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det partikelformige immunoadsorbentmateriale omfatter agarose.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 30 ved, at immunoadsorbentet har en koblingskapacitet på 3 til 4 g af det monoklonale antistof pr. liter agarose.

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at kilden er plasma, en 35 plasmafraktion eller et plasmakoncentrat. DK 170806 B1

5. Fremgangsmåde Ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at kilden er blevet udtrykt af celler indeholdende et gen til fremstilling af det valgte protein. 5

6. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det valgte protein er faktor IX.

7. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det i trin (c) anvendte elueringsmiddel indeholder kaliumbromid, calciumchlorid, dlethylamin eller natriumthiocyanat. 15 20 25 30 35