CZ291708B6

CZ291708B6 - Způsob výroby přípravků obsahujících faktor IX a/nebo X

Info

Publication number: CZ291708B6
Application number: CZ19961670A
Authority: CZ
Inventors: Djuro Josic; Ales Strancar
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 1993-12-10
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 2003-05-14
Also published as: HU222084B1; DK0733104T3; CZ167096A3; CN1137292A; DE4342132C1; PL180179B1; US6893856B2; UA44261C2; US20020045240A1; CA2178208C; ATE276357T1; EP0733104B1; DE69434001T2; HU9601594D0; WO1995016030A1; IL111925A0; CN1175105C; PL314801A1; EP0733104A1; ZA949820B

Abstract

Zp sob v²roby p° pravk obsahuj c ch faktor IX a/nebo X, jako nap° klad terapeuticky pou iteln²ch protrombinov²ch komplex , p° pravk PPSB, p°i n m se plazmov² zdroj obsahuj c tyto slo ky podrob v po°ad a), b), c), d), e) a f) nebo a), b), e), c), d) a f) n sleduj c m stup m zpracov n : a) plazmov² zdroj obsahuj c odd lovan slo ky se podrob extrakci pevnou f z za pou it anexov ho materi lu ve form voln sypan hmoty, membr ny a/nebo kompaktn ho disku za podm nek pom rn n zk iontov s ly, p°i em vznikl² v²tok se odstra uje; b) l tka adsorbovan na pevn f zi se eluuje; c) v elu tu se inaktivuj viry p soben m iontov²ch a/nebo neiontov²ch detergent za p° tomnosti di- nebo trialkylfosf tov²ch slou enin, jako je tri-n-butylfosf t, a pop° pad tepeln²m zpracov n m; d) virov inaktivovan² elu t z p°edchoz ho stupn se zpracuje alespo jedn m chromatografick²m postupem zvolen²m z anexov membr nov chromatografie, afinitn membr nov chromatografie s imobilizovan²mi vysokomolekul rn mi nebo n zkomolekul rn mi l tkami vykazuj c mi vysokou afinitu v i faktoru IX a/nebo X a hydrofobn interak n chromatografie nebo jejich libovolnou kombinac ; e) jednotliv slo ky se frakcionuj postupnou eluc se zm nou iontov s ly, polarity a/nebo hodnoty pH; f) l tky v zan k afinitn mu materi lu se eluuj za podm nek reverze afinitn vazby, na e se elu t zkoncentruje, pop° pad spolu se sn en m mno stv inidla pou it ho pro eluci z afinitn ho materi lu.\

Description

Způsob výroby přípravků obsahujících faktor IX a/nebo X

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby přípravků obsahujících faktor IX a/nebo X ze zdroje obsahujícího tyto složky.

Dosavadní stav techniky

Faktor IX a X a jiné složky plazmy závislé na vitaminu K, jako je protein C, protein S, faktory II a VII, hrají důležitou úlohu při patofyziologii kaskády fází srážení krve. Těchto faktorů se používá jako léčiv při léčbě pacientů vykazujících symptomy vyvolané nedostatečností příslušných faktorů.

Krevní plazma není v současné době dostupná v požadovaném množství jako zdroj pro průmyslovou výrobu těchto faktorů. Z etických a ekonomických důvodů musí být cílem jakékoliv frakcionace a izolace těchto plazmových složek závislých na vitaminu K, jakož i proteinu C a proteinu S, zajistit co nejvyšší výtěžky každého jednotlivého požadovaného faktoru a současně umožnit izolaci všech ostatních faktorů. Vynález poskytuje postup, který lze využít pro dosažení tohoto cíle.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob výroby přípravků obsahujících faktor IX a/nebo X, jako například terapeuticky použitelných protrombinových komplexů, přípravků PPSB, jehož podstata spočívá v tom, že se plazmový zdroj obsahující tyto složky podrobí v uvedeném pořadí následujícím stupňům zpracování:

a) plazmový zdroj obsahující oddělované složky se podrobí extrakci pevnou fází za použití anexového materiálu ve formě volně sypané hmoty, membrány a/nebo kompaktního disku za podmínek poměrně nízké iontové síly, přičemž vzniklý výtok se odstraňuje;

b) látka adsorbovaná na pevné fázi se eluuje;

c) v eluátu se inaktivují viry působením iontových a/nebo neiontových detergentů za přítomnosti di- nebo trialkylfosfátových sloučenin, jako je tri-n-butylfosfát, a popřípadě tepelným zpracováním;

d) virově inaktivovaný eluát z předchozího stupně se zpracuje alespoň jedním chromatografickým postupem zvoleným zanexové membránové chromatografie, afinitní membránové chromatografie s mobilizovanými vysokomolekulámími nebo nízkomolekulámími látkami vykazujícími vysokou afinitu vůči faktoru IX a/nebo X a hydrofobní interakční chromatografie nebo jejich libovolnou kombinací;

e) jednotlivé složky se frakcionují postupnou elucí se změnou iontové síly, polarity a/nebo hodnoty pH;

f) látky vázané k afinitnímu materiálu se eluují za podmínek reverze afinitní vazby, načež se eluát zkoncentruje, popřípadě spolu se snížením množství činidla použitého pro eluci z afinitního materiálu.

-1 CZ 291708 B6

Způsob se také může provádět s alternativním pořadím jednotlivých stupňů zpracování a), b), e), c), d) a f).

Způsob podle vynálezu zahrnuje také různá výhodná provedení, která jsou charakterizována následujícími přídavnými znaky, jež je možno zařadit samostatně nebo v kombinacích:

Postup podle vynálezu se může ekonomizovat tak, že se výtok ze stupně a) vede do dalších zpracovatelských stupňů za účelem izolace jiných látek.

Po provedení stupně b) se upravuje iontová síla a/nebo hodnota pH frakce obsahující eluát na podmínky panující v dále zařazeném purifíkačním stupni.

Po stupni e) se provádí membránová afinitní chromatografie.

Po stupni e) a případné následné membránové afinitní chromatografíi se sbírá eluát obsahující produkty, které ještě nebyly odstraněny a popřípadě se provádí jeho další frakcionace další membránovou afinitní chromatografíí za použití k tomu účelu vhodných afinitních materiálů.

V libovolné vhodné fázi postupu se provádí filtrace pro odstranění virů.

Jako plazmového zdroje obsahujícího faktor IX a/nebo X se používá krevní plazmy v čerstvém nebo roztátém stavu.

Extrakce pevnou fází se provádí pomocí zesíťovaného polysacharidu modifikovaného bazickými skupinami nebo pomocí vhodně modifikovaných anexových membrán.

Membránová chromatografie se provádí za použití membrán, které byly modifikovány DEAE nebo kvartérními amoniovými sloučeninami nebo za použití membrán pro afinitní chromatografíi, které byly modifikovány nízkomolekulámími nebo vysokomolekulámími afinitními ligandy schopnými se specificky vázat k požadovaným složkám plazmy.

Jako afinitní chromatografie se používá heparinové membránové afinitní chromatografie, membránové imunoafinitní chromatografie s imobilizovanými protilátkami proti látce, která má být izolována, nebo membránové afinitní chromatografie za použití membrán s hydrofobními ligandy. Hydrofobními ligandy pro modifikaci chromatografíckého nosiče jsou přednostně 2hydroxyaminoalkylskupiny, jako je 2-hydroxyaminopropylskupina a/nebo hydrofobní ligandy, jako jsou propylskupiny, butylskupiny, fenylskupiny a podobné ligandy, vykazující určitou postupnou změnu hydrofobicity.

Přizpůsobení iontové síly po chromatografíckých stupních se provádí ředěním nebo odsolováním, jako diafíltrací nebo ultrafíltrací, nebo přídavkem činidel zvyšujících iontovou sílu.

Inaktivace virů se provádí zahříváním frakce na teplotu v rozmezí od 55 do 70 °C po dobu od 5 do 30 hodin za přítomnosti stabilizátoru, jako jsou cukr, aminokyseliny, dvojmocné kationty a/nebo heparin, přičemž stabilizátory se potom s výhodou odstraňují odsolovacími postupy, jako je diafiltrace nebo ultrafiltrace, heparinovou afinitní chromatografíí nebo anexovou chromatografií nebo na nosičích modifikovaných DEAE nebo kvartérními amoniovými sloučeninami nebo na nosičích modifikovaných hydrofobními ligandy.

Jako chromatografíckého materiálu se používá částicového materiálu ve formě volně sypané hmoty, materiálu uloženého v membránách a/nebo kompaktních discích zhotovených z příslušných materiálů.

Získané frakce se koncentrují lyofílizací nebo rozprašovacím sušením.

-2 CZ 291708 B6

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Při způsobu podle vynálezu hraje důležitou úlohu použití membránové chromatografie. Josič et al. popisují vJoumal of Chromatography, 632 (1993), 1 až 10, vhodnost heparinové afmitní chromatografie pro izolaci plazmových proteinů z kaskády srážení krve. Je zde popsána izolace antitrombinu III a separace faktoru IX a faktoru X po předběžné separaci anexovou chromatografií. Anexová chromatografie za účelem předběžného oddělení faktoru IX a faktoru X se provádí preparativní vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Obohacení vzorků obsahujících faktor IX a faktor X se provádí podle publikace H. G. J. Brummelhuis, v Methods of Plazma Protein Fractionation (J. M. Curling ed.) Academie Press, Londýn, Orlando, 1980, str. 117.

Vysoce účinná membránová chromatografie membránových proteinů obsažených v séru a plazmě je již známa z publikace Josič et al., Joumal of Chromatography, 590 (1992), 59 až 76.

V této publikaci je popsána separace membránových proteinů obsažených v séru a plazmě. Tak například se tímto způsobem oddělují plazmové membránové proteiny z jatemích a ledvinových tkání.

S překvapením se nyní zjistilo, že faktor IX a/nebo X je možno získat ve vysoké čistotě a výtěžku způsobem, který je popsán dále.

V prvním stupni se zdroj obsahující faktor IX a/nebo X (jako tohoto zdroje se přednostně používá krevní plazmy v čerstvém nebo roztátém stavu) podrobí extrakci pevnou fází na aniontomeniči. Aniontoměničů se může použít ve formě částicové látky v podobě volně sypané hmoty, ve formě membrán nebo ve formě kompaktních disků. Přednost se dává extrakci pevnou fází na polysacharidech, které jsou modifikovány bazickými skupinami a popřípadě zesíťovány. Konkrétně se může použít látek, jako jsou polysacharidy modifikované diethylaminoethylskupinami (DEAE) nebo kvartémími aminy. Tak například se může použít látek, jako je Sephadex^(R) P50. Pro separaci faktoru IX se používá zejména separačních materiálů modifikovaných DEAE. Při extrakci pevnou fází se extrahovaný zdroj smíchá s látkou, která je přítomna v pevném stavu.

Extrakce pevnou fází se přednostně provádí za podmínek nízké iontové síly. Po případných promývacích stupních se shromáždí výtok, který lze podrobit dalším stupňům zpracování.

Pro oddělení faktoru IX se tedy vzorek přednostně přefiltruje přes vhodnou modifikovanou membránu. Filtrátu se potom popřípadě může dále použít například pro výrobu albuminu.

Potom se z pevné fáze eluují za podmínek vyšší iontové síly proteiny vázané k membráně nebo jinému materiálu v pevné fázi, tj. faktor II, zejména faktor IX a faktor X. Pokud se použije membrány modifikované DEAE nebo kvartémím aminem, je možno je použít několikanásobně, což představuje výhodu ve srovnání s extrakcí pevnou fází pomocí výše uvedených extrakčních materiálů pro extrakci pevnou fází, zejména částicových materiálů.

Látka adsorbovaná na pevné fázi se potom z nosičového materiálu desorbuje působením roztoků o vyšší iontové síle. Potom se iontová síla získané frakce přizpůsobí podmínkám potřebným pro provádění následujících separačních stupňů, což se provádí například zředěním, ultrafiltrací, diafiltrací nebo přídavkem činidel zvyšujících iontovou sílu.

Po výše uvedeném stupni může následovat chromatografie na anexové membráně nebo afmitní membránová chromatografie za použití imobilizovaných vysokomolekulámích nebo nízkomolekulámích látek s vysokou afinitou k faktoru IX a/nebo X, které mají být izolovány.

-3 CZ 291708 B6

Tento stupeň chromatografícké purifikace se také může provádět na materiálech pro provádění hydrofobní interakční chromatografie.

Jako aniontoměniče přicházejí v úvahu i zde zejména membrány modifikované diethylaminoethylskupinami nebo kvartémími aminy. Jako látky vykazující vysokou afinitu vůči faktoru IX a/nebo X přicházejí v úvahu imunoafinitní ligandy. Imunoafinitními ligandy jsou účelně protilátky zaměřené proti faktorům, které mají být izolovány. Tak například pro izolaci faktoru IX se může použít membrán nesoucích příslušné imobilizované protilátky proti faktoru IX. Látky, které nejsou zadrženy v anexové membráně nebo v imunoafinitní membráně, se vymyjí, popřípadě se shromáždí a dále zpracují.

Typické ligandy pro hydrofobní chromatografii vykazují určité stupňovité změny v hydrofobicitě. Tyto látky zahrnují například acyklické nebo alicyklické alifatické sloučeniny, které například obsahují alkylové řetězce s 1 až 18 atomy uhlíku nebo aromatické sloučeniny, které také mohou být modifikovány polárními protickými nebo polárními aprotickými ligandy, jako jsou kyanoskupiny. Jako hydrofobní ligandy, které se hodí pro hydrofobní interakční chromatografii, přicházejí v úvahu zejména propylskupiny, butylskupiny a fenylskupiny, jakož i jiné podobné ligandy vykazující určitý stupeň hydrofobicity, jimiž je nosičový materiál modifikován. Stupňovité změny hydrofobicity je také možno dosáhnout zavedením polárních skupin. Jako hydrofobní ligandy pro izolaci faktoru IX se tedy zvláště hodí 2-hydroxyaminoalkylové skupiny, jako 2-hydroxyaminopropylové skupiny.

Následující stupeň zahrnuje další frakcionaci adsorbovaných složek plazmy stupňovitou elucí, při níž se mění iontová síla a/nebo hodnota pH za použití rozpouštědlových systémů o vyšší iontové síle, rozpouštědlových systémů s různou polaritou nebo rozpouštědlových systémů obracejících afinitu mezi imunoafinitním ligandem a substrátem. Pro nastavení iontové síly frakce eluované z membrány na podmínky následující purifikace se potom může použít některého z výše uvedených postupů.

Stupeň f) výše uvedeného způsobu zahrnuje afínitní membránovou chromatografii. Pod pojmem afínitní membránová chromatografie se podle vynálezu rozumí též hydrofobní chromatografie. Vhodné ligandy již byly popsány výše.

Pod pojmem afínitní membránová chromatografie se podle vynálezu rozumějí také chromatografícké postupy, při kterých se používá membrán modifikovaných imunoafinitními ligandy. Konkrétně se potom používá monoklonálních protilátek proti faktoru IX a/nebo X, kteréžto monoklonální protilátky jsou imobilizovány na membráně.

Způsoby chromatografíckého oddělování faktoru IX a/nebo X ze vzorku je možno provádět jednak za použití substrátových materiálů, které jsou modifikovány iontovýměnnými skupinami, zejména anexů a dále za použití materiálů modifikovaných imunoafinitními ligandy.

Při velmi výhodném provedení způsobu podle vynálezu jsou tyto chromatografícké materiály uspořádány do podoby membrán. Tyto membrány přednostně sestávají ze substrátového materiálu, jako je modifikovaná celulóza nebo syntetické vlákno. Jako konkrétní příklady je možno uvést membrány a kompaktní disky zhotovené z porézních polyglycidylmethakrylátů a/nebo jiných porézních hydrofílních polymerů s podobnou strukturou, jako je hydrofilizovaný polystyren.

V prvním případě se membrána vhodná pro dělení skládá buď ze souboru na sebe položených tenkých porézních fólií z celulózy nebo plastových vláken ave druhém případě je tvořena kompaktními disky ze silikagelu nebo polymemích nosičů. Základní materiály membrán nebo disků jsou opatřeny odpovídajícími skupinami vyměňujícími anionty nebo imunoafinitními ligandy. Jako ionexové skupiny přicházejí v úvahu zejména skupiny vyměňující anionty, jako

-4CZ 291708 B6 jsou skupiny kvartémích amoniových sloučenin nebo diethylaminoethylskupiny (DEAE). Vhodnými katexy jsou zejména v podstatě slabě a silně kyselé měniče kationtů, jako jsou materiály, které jsou modifikovány sulfonovými skupinami nebo skupinami kyseliny fosforečné.

Skupiny vyměňující ionty mohou být připojeny k vláknům základního materiálu prostřednictvím tzv. mezemíků (spacerů), nebo bez nich. Materiály obsahující spacery se také označují názvem tentaklové (tykadlové) materiály. Odpovídající spacery a ligandy jsou uvedeny v DE 42 04 694. Jako spacer může také například sloužit glukosaminový zbytek. Skupiny vyměňující anionty, jako jsou DEAE nebo skupiny kvartémích amoniových sloučenin, mohou být také připojeny k membránám zhotoveným z porézního poly(glycidylmethakrylátu) nebo jiných výše uvedených materiálů. Skupiny vyměňující anionty mohou být přitom připojeny buď přímo kmembránotvomému materiálu nebo také prostřednictvím spaceru, například glukosaminového zbytku.

Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu se používá afinitní membránové chromatografíe s mobilizovanými nízkomolekulámími nebo vysokomolekulámími látkami, které vykazují vysokou afinitu vůči faktoru IX a/nebo X, které jsou přednostně humánního nebo myšího původu.

Látky vykazující afinitu vůči faktoru IX a/nebo X, se na nosičích imobilizují prostřednictvím chemicky reaktivních skupin. Takové reaktivní skupiny přednostně atakují konec spaceru a nikoliv přímo nosičový materiál. Imobilizace látek s afinitou vůči těmto faktorům se provádí prostřednictvím vazby k reaktivním skupinám jako je tosylová, tresylová nebo hydrazidová skupina aj. Odpovídající postupy jsou známy zT. M. Phillips Afinity Chromatography v Chromatography (E. Heftmann ed.), 5. Vydání, Elsevier, Amsterdam 1992.

Protilátky je také možno předadsorbovat na membrány nesoucí ligandy proteinu A nebo proteinu G. Následujícím kovalentním zesíťováním se může zabránit eluci protilátek (vyluhování ze sloupce). Pro zesíťování protilátek na membránách s proteinem A nebo proteinem G se může použít podobného postupu jako v případě volně sypaných nosičů. Výhodou imobilizace na proteinu A nebo proteinu G je, že protilátky jsou imobilizovány výhradně na konstantním segmentu molekuly (F_c). Část vázající antigen (F_ab) tedy zůstává volná a není bráněno její interakci s příslušnými faktory.

Inaktivace virů se provádí tak, že se na frakci získanou při chromatografické purifikaci působí detergenty, jako jsou iontové a/nebo neiontové povrchově aktivní látky, například za přítomnosti dialkylovaných nebo trialkylovaných fosfátových sloučenin, jako je například tri-n-butylfosfát, způsobem popsaným v EP 0 131 740 AI. Inaktivaci virů lze v podstatě také provést před prvním chromatografickým stupněm. Přednostně se inaktivace provádí za použití směsi Tritonu^<R) X-100 (Tween) a tri-n-butylfosfátu (TNBP). Dobrých výsledků se dosahuje také za použití směsi cholátu sodného a TNBP. Detergentů se přednostně používá v množstvích do 15% hmotnostních.

Inaktivace virů se také může provádět zpracováním teplem. Při tomto postupu se po první membránové chromatografii faktor IX a/nebo X zpracuje v pasterizačním stupni. Vhodný postup je navržen vDE P 43 18 435.9. Přitom se frakce obohacené faktorem VIII uvádějí do styku s di- nebo trialkylfosfáty a popřípadě se smáčedly za přítomnosti stabilizátorů, jako jsou cukry, aminokyseliny, dvojmocné kationty a/nebo heparin, a současně nebo následně se na ně působí po dobu 5 hodin až 30 hodin zvýšenými teplotami v rozmezí od 55 do 70 °C. Je-li to žádoucí, může se rovněž provést filtrace pro odstranění virů.

Může být výhodné kombinovat dvě metody inaktivace virů, tj. zpracování detergenty a teplem s filtrací.

Při izolaci faktoru IX se pasterizační stupeň přednostně provádí po stupni f) výše popsaného postupu. Pro odstranění chemikálií použitých v tomto stupni může následovat druhá membrá

-5CZ 291708 B6 nová chromatografie. Oddělování přidaných stabilizátorů se přednostně provádí pomocí membrány modifikované DEAE nebo kvartémími amoniovými sloučeninami, které jsou uspořádány na povrchu chromatografického nosičového materiálu za použití spacerů. Odpovídající ligandy je možno uspořádat na povrchu nosičového materiálu také bez použití spacerů.

Za zvolených podmínek nejsou stabilizátory tímto anexovým materiálem retardovány, kdežto faktory jsou adsorbovány na chromatografickém materiálu.

Stabilizátory, které jsou obvykle tvořeny nízkomolekulámími látkami, je také možno odstraňovat ultrafiltrací nebo diafíltrací. Výsledné frakce, v nichž jsou akumulovány faktor IX a/nebo X se potom popřípadě zkoncentrují. Jako koncentrační způsoby přicházejí v úvahu způsoby, při nichž se za mírných podmínek odstraňuje rozpouštědlo, obvykle voda. Jako konkrétní postupy vhodné pro tento účel je možno uvést postupy, při nichž se rozpouštědlo odstraňuje za sníženého tlaku, jako je například lyofilizace, nebo rozprašovací sušení.

Použití membránové chromatografie při způsobu podle vynálezu je výhodné z toho důvodu, že lze chromatografickou separaci provádět podstatně rychleji. Kromě toho lze membrán používat opakovaně, mnohokrát. Když se naproti tomu pro extrakci použije pevné fáze podle dosavadního stavu techniky, nelze tuto látku znovu používat, nýbrž je nutno sejí po jediném použití zbavit.

Způsob podle vynálezu je blíže objasněn v následujících příkladech provedení na izolaci faktoru IX. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Roztátá krevní plazma se extrahuje pevnou fází (Sephadex^(R) P50). Po eluci látky adsorbované na této pevné fázi se iontová síla vzniklé frakce nastaví na hodnotu odpovídající 10 až 20mM roztoku citranu sodného při pH 7,4 a frakce se podrobí membránové chromatografií za použití disku DEAE OuickDisk (o průměru 25 mm a tloušťce 3 mm). Přibližný tlak je 0,3 MPa. Potom se provede chromatografie za použití průtokové rychlosti 5 ml/min. Spojená frakce obsahující směs faktoru II a faktoru VII se podrobí dalšímu zpracování. Píková frakce eluovaná ze sloupce obsahuje směs faktoru IX a faktoru X. Membránová chromatografie se provádí za použití gradientu, který se mění od počátečního roztoku pufru do roztoku pufru obsahujícího chlorid sodný v 1M koncentraci a citran sodný od 10 do 20 mM koncentrace při pH 7,4 (pufr B). Pokud se použije silného anexu s velkou povrchovou hustotou ligandů, může se dosáhnout zvýšení kapacity. Určitým omezujícím faktorem je selektivita této látky. Průběh elučního gradientu bude záviset na hustotě ligandů na povrchu nosiče.

Směs obsahující faktor IX a faktor X se potom podrobí další chromatografíi. Kapacita použitého membránového chromatografického materiálu je stejná nebo vyšší než kapacita materiálu ve formě částic (vždy vztaženo na množství tohoto materiálu).

Příklad 2

Frakce získaná způsobem podle příkladu 1, která obsahuje faktor IX a faktor X se zpracuje způsobem popsaným v Joumal of Chromatography, 632 (1993), 1 až 10. Frakce obsahující faktor IX a faktor X získaná podle příkladu 1 se podrobí heparinové afínitní membránové chromatografii na kompaktním disku. Po aplikaci z pufru o poměrně nízké iontové síle se materiál

-6CZ 291708 B6 opláchne pufrem s iontovou silou přibližně 500 mOsm. Potom se faktor IX eluuje za použití gradientu, jehož iontová síla stoupá z hodnoty 500 mOsm na asi 1000 mOsm. Eluovaný faktor IX má přitom vysokou čistotu. Výtěžek faktoru IX vztažený na postup od prvního stupně zpracování je přibližně 87 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby přípravků obsahujících faktor IX a/nebo X, jako například terapeuticky použitelných protrombinových komplexů, přípravků PPSB, vyznačující se tím, že se plazmový zdroj obsahující tyto složky podrobí v uvedeném pořadí následujícím stupňům zpracování:

a) plazmový zdroj obsahující oddělované složky se podrobí extrakci pevnou fází za použití anexového materiálu ve formě volně sypané hmoty, membrány a/nebo kompaktního disku za podmínek poměrně nízké iontové síly, přičemž vzniklý výtok se odstraňuje;

b) látka adsorbovaná na pevné fázi se eluuje;

c) v eluátu se inaktivují viry působením iontových a/nebo neiontových detergentů za přítomnosti di- nebo trialkylfosfátových sloučenin, jako je tri-n-butylfosfát, a popřípadě tepelným zpracováním;

d) virově inaktivovaný eluát z předchozího stupně se zpracuje alespoň jedním chromatografickým postupem zvoleným zanexové membránové chromatografie, afinitní membránové chromatografíe s imobilizovanými vysokomolekulámími nebo nízkomolekulámími látkami vykazujícími vysokou afinitu vůči faktoru IX a/nebo X a hydrofobní interakční chromatografíe nebo jejich libovolnou kombinací;

e) jednotlivé složky se frakcionují postupnou elucí se změnou iontové síly, polarity a/nebo hodnoty pH;

f) látky vázané k afinitnímu materiálu se eluují za podmínek reverze afinitní vazby, načež se eluát zkoncentruje, popřípadě spolu se snížením množství činidla použitého pro eluci z afinitního materiálu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se výtok ze stupně a) vede do dalších zpracovatelských stupňů za účelem izolace jiných látek.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se po provedení stupně b) upraví iontová síla a/nebo hodnota pH frakce obsahující eluát na podmínky panující v dále zařazeném purifíkačním stupni.
4. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se po stupni e) provede membránová afinitní chromatografie.
5. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se po stupni e) a případné následné membránové afinitní chromatografii sbírá eluát obsahující produkty, které ještě nebyly odstraněny a popřípadě se provede jeho další frakcionace další membránovou afinitní chromatografií za použití k tomu účelu vhodných afinitních materiálů.

-7CZ 291708 B6
6. Způsob výroby přípravků obsahujících faktor IX a/nebo X, jako například terapeuticky použitelných protrombinových komplexů, přípravků PPSB, vyznačující se tím, že se plazmový zdroj obsahující tyto složky podrobí zpracování v pořadí stupňů zpracování a), b), e), c), d) a f) popsaných v nároku 1.
7. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se v libovolné vhodné fázi postupu provede filtrace pro odstranění virů.
8. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se jako plazmového zdroje obsahujícího faktor IX a/nebo X použije krevní plazmy v čerstvém nebo roztátém stavu.
9. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se t í m, že se extrakce pevnou fází provádí pomocí zesíťovaného polysacharidu modifikovaného bazickými skupinami nebo pomocí vhodně modifikovaných anexových membrán.
10. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se membránová chromatografie provádí za použití membrán, které byly modifikovány DEAE nebo kvartémími amoniovými sloučeninami nebo za použití membrán pro afmitní chromatografií, které byly modifikovány nízkomolekulámími nebo vysokomolekulámími afmitními ligandy schopnými se specificky vázat k požadovaným složkám plazmy.
11. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že afinitní chromatografií je heparinová membránová afinitní chromatografie, membránová imunoafinitní chromatografie s imobilizovanými protilátkami proti látce, která má být izolována, nebo membránová afinitní chromatografie za použití membrán s hydrofobními ligandy.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že hydrofobními ligandy pro modifikaci chromatografického nosiče jsou 2-hydroxyaminoalkylskupiny, jako je 2-hydroxyaminopropylskupina a/nebo hydrofobní ligandy, jako jsou propylskupiny, butylskupiny, fenylskupiny a podobné ligandy, vykazující určitou postupnou změnu hydrofobicity.
13. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se přizpůsobení iontové síly po chromatografických stupních provádí ředěním nebo odsolováním, jako diafiltrací nebo ultrafiltrací, nebo přídavkem činidel zvyšujících iontovou sílu.
14. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se inaktivace virů provádí zahříváním frakce na teplotu v rozmezí od 55 do 70 °C po dobu od 5 do 30 hodin za přítomnosti stabilizátoru, jako jsou cukr, aminokyseliny, dvojmocné kationty a/nebo heparin.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se stabilizátory odstraňují odsolovacími postupy, jako je diafiltrace nebo ultrafíltrace, heparinovou afinitní chromatografií nebo anexovou chromatografií nebo na nosičích modifikovaných DEAE nebo kvartémími amoniovými sloučeninami nebo na nosičích modifikovaných hydrofobními ligandy.

-8CZ 291708 B6
16. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se t í m , že se jako chromatografíckého materiálu použije částicového materiálu ve formě volně sypané hmoty, materiálu uloženého v membránách a/nebo kompaktních discích zhotovených z příslušných

5 materiálů.
17. Způsob podle alespoň jednoho z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se získané frakce zkoncentrují lyofilizací nebo rozprašovacím sušením.