KR100320394B1 - 멤브레인크로마토그래피시켜비타민-k의존형단백질을정제시키는방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 C, 단백질 S, 인자 II, VII, IX 및/또는 X 및 예를 들어 PPSB 제조물과 같은 이들의 조합물 뿐만 아니라 비타민 K - 의존형 플라스마 성분을 함유하는 공급원을 특히 멤브레인 크로마토그래피 방법을 사용하는 적절한 분리 절차를 거치게 하여 상기 성분들을 함유하는 제제를 제조하는 방법에 관한다.
Description
본 발명은 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 바이러스 불활성화된 비타민 K - 의존형 혈장 성분을 함유하는 제제를 상기 성분들을 함유하는 공급원으로부터 제조하는 방법에 관한다.
단백질 C, 단백질 S, 인자 II, VII, IX 및 X과 같은 비타민 K - 의존형 혈장 성분은 혈장에 함유되어 혈액 응고 케스케이드의 질병 생리학에서 중요한 역할을 하는 치환체이다. 상기 인자들은 상기 인자들 각각의 결함으로 야기되는 증상을 보이는 환자의 치료에 약제로서 이용된다.
현재, 혈장은 상기 인자들의 상업적인 회수를 위한 공급원으로서 원하는 양만큼 사용할 수 없다. 따라서, 윤리적 및 경제적인 이유에서 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 비타민 K - 의존형 플라스마 성분을 분별 및 분리시켜 한편으로는 각 인자들의 수율을 단독으로 가능한 높게 확보하고 다른 한편으로는 동시에 다른 인자들 각각을 분리시켜야 한다. 상기 목표에 도달할 수 있는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
상기 목적은 특허청구 범위 제 1 항에 기술된 특징을 포함하는 본 발명 방법에 의하여 달성된다.
본 발명 방법에서, 멤브레인 크로마토그래피의 사용은 중요한 역할을 한다.Josi'c 등은 Journal of Chromatography, 632 (1993), 1 - 10 에서, 혈액 응고 케스케이드로부터 플라스마 단백질을 분리시키는데 헤파린 친화성 크로마토그래피의 적절성에 대하여 기술하고 있다. 음이온 크로마토그래피에 의한 예비 분리 후의 인자 IX 및 인자 X의 분리 및 안티트롬빈의 분리에 대하여 기술하고 있다. 인자 IX 및 인자 X의 예비 분리를 위한 음이온 교환 크로마토그래피는 예비 HPLC에 의하여 수행된다. 인자 IX 및 인자 X 을 함유하는 샘플의 보충은 올랜도, 런던에 소재하는 Academic Press 사가 1980 년 출판한 H.G.J. Brummelhuis 의 J. M. Curling (Editor) "Methods of Plasma Protein Fractionation" 페이지 117에 따라 행한다.
혈청 및 혈장 막 단백질의 고성능 멤브레인 크로마토그래피는 이미 Josi'c 등의 Journal of Chromatography, 590 (1992), 59 - 76에 공지되어 있다. 여기에는 혈청 및 혈장 멤브레인 단백질의 분리에 대하여 기술되어 있다. 예를 들어, 간장 및 신장 조직으로부터 얻은 혈장 멤브레인 단백질을 분리시켰다.
놀랍게도 단백질 C, 단백질 S, 인자II, VII, IX 및 X과 같은 귀증한 비타민 K - 의존형 플라스마 성분이 하기하는 방법에 의하여 고순도 및 고수율로 얻어질 수 있음을 알았다.
첫번째 단계에서, 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 각각의 비타민 K - 의존형 혈장 성분을 함유하는 공급원 (바람직하게는 신선한 또는 해동 상태의 혈장으로부터 얻은 공급원을 사용함)을 음이온 교환 물질 상에서 고상 추출한다. 음이온 교환 물질은 멤브레인내에 배열되거나 또는 콤팩트 디스크 형태인 루스 벌크내 미립물질로서 사용될 수 있을 것이다. 염기성 그룹으로 재질되고 임의로 가교결합된다당류 상의 고상 추출이 바람직하다. 더 특별하게는 디에틸아미노 에틸 그룹 (DEAE) 또는 4 차 아민으로 개질시킨 다당류와 같은 물질을 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, SephadexRP 50과 같은 물질을 사용할 수 있을 것이다. 더 특별하게는 DEAE - 개질된 분리 물질을 인자 IX의 분리에 사용한다. 고상 추출에서, 추출시켜야 할 공급원을 고체 상태로 존재하는 물질과 혼합시킨다.
고체 상 추출은 바람직하게는 낮은 이온 강도 조건하에서 수행한다. 임의로 수행되는 세척 단계 후에 용리제를 수거한 다음 기타 단계를 거치게 할 수 있을 것이다.
따라서, 인자 IX를 분리시키기 위하여 샘플은 바람직하게는 적절히 개질된 멤브레인을 통하여 여과시킨다. 이후, 예를 들어, 알부민의 제조에 여액을 임의로 다시 사용할 수 있을 것이다.
멤브레인 또는 각각의 고체상 물질, 즉 인자 II, 특히 인자 IX 및 인자 X에 결합된 단백질은 계속하여 더 높은 이온 강도의 조건에서 고체상으로부터 용리된다. DEAE - 또는 개질된 4 차 아민 멤브레인을 사용하는 경우 이들을 여러번 사용할 수 있는 가능성은 상기에서 언급된 고체상 추출물질 특히 미립물질을 이용한 고체상 추출보다 유리하다.
고체상에 흡착된 물질은 더 이온 강도가 높은 용액의 작용으로 담체 물질로부터 탈착된다. 분획의 이온 강도는 이온 강도를 증가시키는 제제의 첨가 또는 희석 또는 한외여과 또는 투석과 같은 적당한 방법에 의한 연이은 분리 단계를 수행하는데 필요한 조건에 맞춰진 것이다.
이후 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 분리시킬 비타민 K - 의존형 혈장 성분과의 친화성이 높은 고분자량 또는 저분자량의 고정 물질을 사용하는 친화 멤브레인 크로마토그래피 또는 음이온 교환 멤브레인 크로마토그래피가 뒤따를 수 있을 것이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하기 위한 물질 상에서 이러한 크로마토그래피 정제 단계 또한 실행할 수 있을 것이다.
본원에서 음이온 교환 물질로서 더 특별하게는 각각 디에틸아미노에틸. 그룹 또는 4 차 아민으로 개질시킨 멤브레인들을 또한 고려하여야 할 것이다. 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 비타민 K - 의존형 혈장 성분과의 친화성이 높은 물질은 면역친화 리간드일 수 있을 것이다. 고려되는 면역친화 리간드는 분리시킬 인자에 대한 항체이다. 따라서, 예를 들어, 인자 IX의 분리를 위하여 인자 IX에 대한 각각의 고정 항체를 운반하는 막을 사용할 수 있다. 음이온 교환 멤브레인 또는 면역친화 멤브레인에 의하여 보유되지 않는 물질은 세척되고 임의로 수거되어 더욱 처리된다.
소수성 크로마토그래피에 대한 일반적인 리간드는 소수성이 약간 점차적으로 변화함을 보여준다. 이것들에는, 예를 들어, C1- C18알킬 사슬을 갖는 비고리 또는 지환식 지방족 화합물 또는 시아노 그룹과 같은 극성 프로틱 또는 극성 어프로틱 리간드로 또한 재질될 수 있는 방향족 화합물이 포함된다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적당한 소수성 리간드로서는 담체 물질을 개질시킨 프로필, 부틸, 페닐 그룹 및 소수성이 약간 점차로 변하는 유사한 리간드를 특히 생각할 수 있다. 또한 극성 그룹에 의하여 소수성을 점차로 변화시킬 수 있을것이다. 따라서, 더 특별하게는 2 -하이드록시아미노프로필 그룹과 같은 2 - 하이드록시아미노알킬 그룹이 인자 IX에 대한 소수성 리간드로 적당하다.
다음 단계는 서로 다른 극성을 갖는 이온 강도가 더 높은 용매 시스템 또는 면역친화성 리간드 및 기질 사이의 친화성을 반전시키는 용매 시스템으로 이온 강도 및/또는 단계적으로 용리시킴에 의해 PH 값을 변화시켜 흡착된 플라스마 성분들을 다시 분별시키는것을 포함한다. 상기 언급한 절차는 멤브레인으로부터 추가적인 정제 조건까지 용리하는 분획의 이온 강도를 조절하는데 적용할 수 있을 것이다.
특허청구 범위 제 1 항의 임의의 단계 f)는 친화성 멤브레인 크로마토그래피를 포함한다. 본 발명 방법의 영역내에서 친화성 멤브레인 크로마토그래피는 또한 소수성 크로마토그래피를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 적절한 리간드는 이미 상기에서 기술하였다.
본 발명 방법의 영역내에서 친화성 멤브레인 크로마토그래피는 또한 면역친화 리간드로 개질된 멤브레인이 사용되는 크로마토그래피 절차에 관한다. 본원에서는 더 특별하게는 상기 멤브레인에 고정된, 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 비타민 K - 의존형 혈장 성분에 대한 단클론성 항체가 사용된다.
샘플내의 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 비타민 K -의존형 혈장 성분의 크로마토그래피 분리 조작은 한편으로는 이온 교환 그룹, 특히 음이온 교환그룹으로 개질된 기질 물질을 사용하거나 또는 다른 한편으로는 면역친화 리간드로 개질된 물질을 사용하여 수행할 수 있을 것이다.
매우 유리한 방식에서는 상기 크로마토그래피 물질을 멤브레인에 배열한다. 바람직하게, 멤브레인은 재질된 셀룰로즈 또는 합성 섬유와 같은 기질 물질로 이루어진다. 더 구체적으로는 친수화된 폴리스티렌과 같이 다공성 폴리글리시딜 메타크릴레이트 및/또는 유사한 구조를 갖는 기타 다공성 친수성 중합체로 만들어진 콤팩트 디스크 뿐만 아니라 멤브레인이 적당하다.
분리에 적당한 멤브레인은 첫번째 경우 합성섬유의 셀룰로즈로 된 여러겹의 얇은 다공성 필름으로 이루어지는 반면 두번째 경우 이것은 중향체 담체 또는 실리카겔로 된 콤팩트 디스크로 이루어진다. 상기 디스크 멤브레인의 기질 물질에 적절한 음이온 교환 그룹 또는 면역친화 리간드를 제공하였었다. 이온 교환 그룹은, 더 특별하게는 4 차 암모늄 화합물 또는 디에틸아미노에틸 (DEAE) 그룹과 같은 음이온 교환 그룹일 수 있을 것이다. 양이온 교환 물질은 기본적으로 설폰산 또는 인산 그룹으로 개질된 물질과 같은 약산 또는 강산 양이온 교환 물질일 수 있을 것이다.
이온 교환 그룹은 소위 이격자를 통하여 기질 물질 섬유에 결합되거나 결합되지 않을 수도 있었다. 이격자가 있는 물질은 또한 촉수물질 (tantacle materials) 로 불린다. 적당한 이격자 및 리간드는 제 DE 42 04 694호에 구체적으로 기술되어 있다. 예를 들어 글루코자민 성분 또한 이격자 역할을 할수 있다. DEAE 또는 4차 암모늄 화합물과 같은 음이온 교환 그룹은 다공성 폴리글리시딜 메타크릴레이트 또는 언급된 기타 물질로 된 멤브레인에 결합시킬 수도 있었다. 음이온 교환 그룹은 멤브레인을 형성하는 물질에 직접 결합되거나 또는 예를 들어 글루코자민 성분과 같은 이격자를 통하여 결합된다.
본 발명 방법의 또다른 구체예에서는 바람직하게는 인간 또는 쥐과 기원인 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 비타민 K -의존형 혈장 성분과 친화성이 높은 고정된 고 및 저분자량 물질을 이용하는 친화성 멤브레인 크로마토그래피를 사용한다.
단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 비타민 K -의존형 혈장 성분, 인자 II, VII, IX 또는 X 과 친화성인 물질을 화학적으로 활성인 그룹을 사용하여 담체상에 고정시킨다. 활성 그룹이 담체 물질을 직접 공격하지 않고 이격자의 말단에서 공격하는 것이 바람직하다. 상기 인자들과 친화성을 갖는 물질을 토실, 트레실, 하이드라지드 및 기타와 같은 활성 그룹에 동일한 결합력으로 고정시킨다. 적절한 절차는 T. M. Phillips 의 1992 년 암스테르담 Elsevier 에서 출판된 "Chromatography" (E. Heftmann, 출판, 제 5 판) 중 "Affinity Chromatography" 에 공지되었다.
항체는 또한 단백질 A 또는 단백질 G 리간드를 함유하는 멤브레인 상에 우선적으로 흡착시킬 수 있을 것이다. 칼럼의 계속적인 공유 가교결합에 의하여 항체의 용리 (칼럼의 방출)를 막을 수 있을 것이다. 단백질 A 또는 단백질 G로 항체를 가교결합시키기 위하여 개방 담체 (loose carrier) 를 사용하는 것과 유사한 방법을 사용할 수 있을 것이다. 단백질 A 및 단백질 G 상에 고정시키는 이점은 항체가 분자의 불변 세그먼트 (Fc)상에 독립적으로 고정된다는 것이다. 따라서, 항체 - 결합 부분 (Fab) 은 자유롭게 남아 있으며 각각의 인자들과의 상호작용에 방해를 받지않는다.
제 EP 0 131 740 Al 호에 기술된 방법에 따라 예를 들어 트리 - n -부틸 포스페이트와 같은 디 - 또는 트리 -알킬레이트 포스페이트 화합물의 존재하에, 크로마토그래피 정제 후 얻은 분획물을 이온성 및/또는 비이온성 제면활성제와 같은 청정제로 처리시켜 바이러스-불활성화시킨다. 기본적으로 첫번째 크로마토그래피 단계 이전에 또한 바이러스 - 불활성화시킬 수 있을 것이다. 바이러스 - 불활성화에 TritonRX - 100 Tween/TNBP (트리 - n -부틸 포스페이트) 를 사용하는 것이 바람직하다. 소듐 콜레이트/TNBP로 또한 양호한 결과가 얻어진다. 바람직하게는 15 중량 % 이하의 양으로 청정제를 사용한다.
그러나, 또한 열처리로 바이러스-불활성화시킬 수 있을 것이다. 이러한 절차에서, 첫번째 멤브레인 크로마토그래피 후에 단백질 C 및 단백질 S 뿐만아니라 비타민 K -의존형 혈장 성분을 저온살균 단계로 넘긴다. 독일 특허출원 제 P 43 18 435.9 호에 적절한 방법이 제시되어 있다 설탕, 아미노산, 2 가 양이온 및/또는 헤파린과 같은 안정제의 존재하에 인자 VIII 이 풍부한 단편을 디 - 또는 트리알킬 포스페이트 및 임의로 습윤제와 접촉시키고 동시에 또는 연속하여 5 - 30 시간동안 55 - 70 ℃ 의 다소 고온에서 처리한다. 필요한 경우 바이러스를 제거하기 위한 여과를 수행할 수 있을 것이다.
두가지 바이러스 불활성화 방법, 청정제 및 열처리 및 여과를 조합시키는 것이 바람직할 수 있을 것이다.
인자 IX의 분리에서, 바람직하게는 저온 살균 단계를 청구범위 제 1항의 단계 f) 후에 실행한다. 상기 단계에서 사용한 화학약품을 제거하기 위하여 이 후에 또다른 멤브레인 크로마토그래피 단계가 따를 수 있을 것이다. 가해진 안정제를 이격자를 통하여 크로마토그래피 담체 물질 표면 상에 위치시킨 DEAE 또는 4 차 암모늄 화합물로 개질시킨 멤브레인을 이용하여 제거하는 것이 바람직하다. 이격자를 사용하지 않고 크로마토그래피 담체 물질 표면 상에 해당 리간드를 위치시키는 것이 또한 바람직하다.
주어진 조건 하에서, 안정제는 이러한 음이온 교환 물질에 의하여 지지되지 않으나 인자들은 크로마토그래피 물질 상에 흡착된다.
일반적으로 저분자량 물질로 이루어지는 안정제는 또한 한외여과 또는 투석 여과에 의하여 제거할 수 있을 것이다. 필요한 경우 단백질 C 및 단백질 S 와 같은 비타민 K - 의존형 플라스마 성분과 함께 축적된 분획물을 이 후 농축시킨다. 농축 방법은 온건한 조건하에서 용매 (통상적으로 물)를 제거하는 절차이다. 더 특별하게 상기 농축 방법은 예를 들어 냉동 건조 (동결 건조) 또는 분무 건조와 같은 감압 절차 하에서 용매를 제거하는 절차를 포함한다.
더 특별하게는 본 발명에 멤브레인 크로마토그래피를 이용하면 크로마토그래피 분리를 상당히 빠르게 수행시킬 수 있을 것이라는 이점이 있다. 더우기, 이용될 멤브레인을 여러번 재사용할 수 있다. 이와는 반대로 선행기술에 따라 고상 물질을 사용할 경우 이 물질을 재사용할 수 없으며 이미 한 번 사용했다면 처분해야 할 것이다.
인자 IX의 분리방법을 이용하여 본 발명을 더 상세히 예시하기로 하겠다.
실시예 1
SephadexRP 50으로 해동시킨 혈장을 고상 추출한다. 고체상 위에 흡착된 물질을 용리시킨 후 얻은 분획물을 pH 7.4, 10 - 20 mM 의 소듐 시트레이트에 해당하는 이온 강도를 갖도록 조절하고 DEAE QuickDisk (직경 25 mm , 두께 3 mm) 에서 멤브레인 크로마토그래피시킨다. 압력은 약 3 bar이다. 이 후 5ml/min 의 유속으로 크로마토그래피를 수행한다. 상기 풀링 (pooling) 시킨 분획물은 인자II 및 인자 VII의 혼합물을 함유하므로 더 진전시킬 수 있을 것이다. 상기 칼럼으로부터 얻은 피크는 인자 IX 및 인자 X의 혼합물을 함유한다. 멤브레인 크로마토그래피는 상기 초기 완충용액에서 완충액 B로서 pH 7.4, 10 - 20 mM의 소듐 시트레이트 및 1 M의 NaCl로 구성되는 완충용액으로 변화하는 변화도를 사용하여 수행한다. 표면에 리간드를 많이 점유하는 강한 음이온 교환물질을 사용할 경우 높은 커패시티가 얻어질 것이다. 물질의 선택성에 의하여 몇몇의 제한 인자(limiting factor)가 치환된다. 용리 변화 경로는 담체 상의 리간드 표면 점유 정도에 따라 달라질 것이다.
이 후 인자 IX 및 인자 X으로 구성되는 혼합물을 더 크로마토그래피시킨다. 사용되는 멤브레인 크로마토그래피 물질의 부하 용량은 물질의 양을 기준으로 할때 미립물질과 동일하거나 이보다 크다.
실시예 2
인자 IX/X 을 함유하는 실시예 1 에서 회수한 분획물을 <Journal ofChromatography, 632(1993), 1 - 10 에 의하여 처리한다. 인자 IX/X를 함유하는 실시예 1 에서 얻은 분획물을 콤팩트 디스크 상에서 헤파린 친화성 멤브레인 크로마토그래피시킨다. 비교적 이온 강도가 낮은 완충액을 도포시킨후 약 500 mOsm의 이온 강도를 갖는 완충액으로 상기 물질을 헹군다. 이후 약 500 mOsm에서 출발하여 약 1,000 mOsm까지 증가하는 변화도를 사용하여 인자 IX를 옹리시킨다. 이렇게 용리된 인자 IX는 순도가 높다. 인자 IX의 회수율은 첫번째 단계에서 출발하여 약 87%이다.
Claims (18)
- 단백질 C, 단백질 S, 인자II, VII, IX 및/또는 X 및 예를 들어 PPSB 제조물과 같은 이들의 조합물 뿐만 아니라 바이러스 - 불활성화된 비타민 K - 의존형 혈장 성분을 함유하는 제제의 제조방법에 있어서, 이들 성분을 함유하는 공급원은 다음의 처리 단계를 거치는 방법:a) 분리하고자 하는 상기 성분들을 함유한 공급원을 비교적 낮은 이온 강도의 조건 하에서 개방 벌크(loose bulk) 내의 음이온 교환물질, 멤브레인 및/또는 콤팩트 디스크 상에서 고상 추출시키고 얻어진 유출액을 제거하는 단계;b) 상기 고체 상에 흡착된 물질을 용리시키는 단계;c) 트리 - n -부틸 포스페이트와 같은 디 - 또는 트리알킬 포스페이트 화합물의 존재하에 이온성 및/또는 비이온성 청정제에 의해 바이러스 불활성화시키는 단계 ;d) 단백질 C 및 단백질 S 뿐만 아니라 비타민 K -의존형 혈장 성분에 대해 친화성을 갖는 고정된 고분자량 또는 저분자량 물질을 사용한 친화성 멤브레인 크로마토그래피, 음이온 교환 멤브레인 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피시키는 단계 :e) 이온 강도, 극성 및/또는 pH값을 변화시키면서 단계적으로 용리시켜 개개의 성분들을 분별시키는 단계 ;f) 친화성 결합을 반전시키는 조건하에서 친화성 물질에 결합된 물질을 용리시킨 다음, 친화성 물질로부터의 용리를 위하여 사용된 제제의 양을 임의로 감소시키면서 농축시키는 단계.
- 제 1항에 있어서, 단백질 C 및 단백질 S와 같은 비타민 K -의존형 혈장 성분들을 함유하는 공급원이 신선한 또는 해동된 상태의 혈장인 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 고상추출은 SephadexR와 같은 염기성 그룹으로 개질시킨 가교결합된 다당류에 의해 또는 적절하게 개질시킨 음이온 교환 멤브레인에 의해 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 멤브레인 크로마토그래피는 DEAE 또는 4차 아민으로 개질시킨 멤브레인을 사용함으로써 또는 목적하는 플라스마 성분에 특이적으로 결합할 수 있는 저분자량 또는 고분자량 친화성 리간드로 개질시킨 멤브레인을 사용함으로써(멤브레인 친화성 크로마토그래피) 수행되는 방법.
- 제 1 항에 있어서 친화성 크로마토그래피는 헤파린 멤브레인 친화성 크로마토그래피, 분리시킬 물질에 대한 고정 항체를 갖는 멤브레인 면역 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 리간드를 갖는 멤브레인을 사용하는 멘브레인 친화성 크로마토그래피인 방법.
- 제 5 항에 있어서, 크로마토그래피 담체 개질용 소수성 리간드가 2 - 하이드록시아미노프로필과 같은 2 - 하이드록시아미노알킬 그룹 및/또는 프로필, 부틸, 페닐 그룹과 같은 소수성 리간드 및 소수성에 약간의 점차적인 변화를 보이는 기타 유사한 리간드인 방법.
- 제 1항에 있어서, 크로마토그래피 단계 후의 이온 강도 조절은 투석여과 또는 한외여과와 같은 희석 또는 발염 절차에 의해 또는 이온 강도를 증가시키는 제제를 첨가에 의해 수행되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 바이러스-불활성화는 설탕, 아미노산, 2 가 양이온 및/또는 헤파린과 같은 안정화제의 존재하에 5 - 30 시간동안 55 - 70℃에서 분획물을 가열시켜 수행되는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 안정화제는 투석여과 또는 한외여과와 같은 탈염 절차에 의하여, 헤파린 친화성 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 또는 소수성 리간드로 개질시킨 담체 또는 DEAE 또는 4 차 암모늄 화합물로 개질시킨 담체 상에서 제거되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 크로마토그래피 물질은, 개방 벌크로 배열된 미립자물질, 멤브레인에 임베딩된(embedded) 물질 및/또는 상기 각각의 물질로 된 콤팩트 디스크인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 얻어진 분획물은 동결건조 또는 분무 건조에 의해 농축되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 음이온 교환 그룹은 글루코사민 성분과 같은 이격자를 통하여 기질 물질의 섬유에 결합되어 소위 촉수 물질을 형성하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 바이러스-불활성화 단계는 첫 번째 크로마토그래피 단계 이전에 또는 크로마토그래피 정제 이후에 수행되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 단계 a)의 유출액은 기타 물질의 회수를 위한 추가적인 후속 절차에 공급되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 용출액을 함유하는 분획의 pH 값 및/또는 이온 강도를 다음의 정제 단계의 조건에 맞도록 조절시키는 단계가 제 1항의 단계 b)후에 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 멤브레인 친화성 크로마토그래피가 단계 e) 후에 수행되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 제거되지 않은 생성물을 함유한 용출액이 수거되고, 적절한 친화성 물질을 사용하여 임의로 단계 e)를 반복함으로써 추가로 분별시키는 방법.
- 제 1항에 있어서, 바이러스 불황성화를 위해 열 처리가 수행되는 방법.
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