DE4204694C3 - Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-ChromatographieInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
das in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebene Verfahren
zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor
VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie aus Blut
plasma oder Kryopräzipitat.
In der EP-A-02 38 701 wird ein Verfahren zur Herstellung
eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors be
schrieben, wobei das Kryopräzipitat mittels Ethanol
fällung von Fibrinogen, Globulinen, Albuminen und anderen
störenden Bestandteilen befreit wird. Die Anreicherung
aus dem Kryopräzipitat ist notwendig, da Faktor VIII nur
in äußerst geringen Mengen in dem Material enthalten ist.
Dieser Anreicherungsschritt beeinträchtigt jedoch den
Gehalt an AHF im Endprodukt. Die bisher bekannten Verfah
ren zur Herstellung von Faktor VIII ergeben nur geringe
Mengen an wirksamer Substanz. Bei der Applikation des auf
herkömmlichem Wege hergestellten Faktors VIII belastet
man den Patienten daher mit großen Mengen antigener Sub
stanzen. Diese Verfahrensweise ist nicht unbedenklich. Es
hat daher nicht an Versuchen gefehlt, den Faktor VIII
durch Trennungsoperationen weiter anzureichern. So wurde
versucht, mittels Affinitätschromatographie mit gegen
Faktor VIII gerichteten tierischen Antikörpern Produkte
mit höherer spezifischer Aktivität zu erhalten. Diese
Technik ist jedoch sehr aufwendig und kostenintensiv. Zum
anderen ist sie auch deshalb nicht unbedenklich, da stets
eine gewisse Menge tierischen Eiweißes bei jeder chroma
tographischen Trennung aus der Säule gewaschen wird.
Die EP-8 81 08 458.6 beschreibt ein Verfahren zur Herstel
lung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors,
in dem ausgehend von Kryopräzipitat der Faktor VIII durch
Behandlung mit Aluminiumhydroxid und biokompatiblen or
ganischen Lösungsmitteln/Detergenzien in bevorzugter
Weise eine Gelpermeationschromatographie an Ionenaus
tauschermaterialien durchgeführt wird. Als besonders ge
eignet wird ein Chromatographiematerial auf Basis von
Copolymerisaten aus Oligoethylenglycolen, Glycidylmeth
acrylaten und Pentaerythroldimethacrylaten genannt.
Zwar wird durch das in der EP-8 81 08 458.6 beschriebene
Verfahren eine Ausbeutesteigerung an Faktor VIII ver
zeichnet, jedoch ist die Ausbeute an biologisch aktivem
Faktor VIII nach wie vor nicht optimal.
Die WO 90/14 886 beschreibt Materialien zur Chromatographie mit
Polyalkylaminketten, die an der Oberfläche eines chromatographischen
Trägers verankert sind. Dies bedeutet, daß unbedingt die
den endständigen funktionellen Rest tragende Gruppe über Stick
stoffatome mit dazwischenliegenden Alkylengruppen an diese Oberfläche
gebunden sind.
Diese Polyamingruppierungen sind über Kupplungsreagenzien mit
der das Chromatographiematerial bildenden Matrix verbunden. Dazu
werden Substanzen wie Cyanogenbromid, Epichlorhydrin, Carbonyl
diimidazol oder 1,4-Butandioldiglycidylether verwendet. Diese
"linking group" wird dadurch charakterisiert, daß sie bis zu 10
Kohlenstoffatome enthalten soll, die durch Sauerstoffatome unter
brochen sein kann und weitere Substituenten wie Hydroxyl oder
Oxo-Gruppen enthalten kann.
Die EPO 3 43 275 A1 beschreibt die Reinigung von Faktor VIII mit
Hilfe der Anionenaustauscher-Chromatographie, wie beispielsweise
TSK DEAE-Fractogel.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem
ist also die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem
sich die Isolierung von biologisch aktivem Faktor VIII
aus den Quellen Kryopräzipitat oder Blutplasma verbessern
läßt und eine wirtschaftlichere Arbeitsweise gewährlei
stet.
Überraschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein
Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die Unter
ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des er
findungsgemäßen Verfahrens.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren
zu verwendenden
Trennmaterialien bestehen aus Trägerteilchen, wie sie in der EP-A-03 37 144
offenbart werden. Dies sind Trägerteilchen mit Hydroxyl
gruppen, auf die über die alpha-C-Atome der Hydroxylgrup
pen ein polymeres Material aufgepfropft ist. Als Träger
teilchen kommen alle allgemein bekannten porösen und
unporösen Chromatographieträger, die primäre oder sekun
däre, aliphatische Hydroxylfunktionen an der Oberfläche
aufweisen, in Frage. Dabei sind bevorzugt hydrophile
Polymere auf Acrylat- und Methacrylatbasis, Polymere auf
Polyvinylalkohol-Basis, diolsubstituierte Kieselgele,
Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulose
derivate oder Polymere auf Dextran-Basis. Es können aber
selbstverständlich auch andere Polymere oder Copolymere
auf der Grundlage von Monomeren wie Vinylverbindungen,
Acrylamid, (Meth)Acrylsäureestern oder (Meth)-Acrylnitril
in hydroxylierter Form eingesetzt werden.
Das polymere Material, das über die α-C-Atome der Hy
droxylgruppen an die Trägerteilchen gebunden ist, basiert
auf den Monomeren der Formeln II und/oder III.
CR⁷R⁸ = CR¹-Y II
Diese Monomeren stellen (Meth)Acrylsäure (Y = -COOH),
(Meth)-Acrylsäurederivate
Allylamine (Y=-CH₂NH₂, -CH₂NR²R³), (Meth)-Acrylnitrile
(Y = -CN), Acroleine (Y = -CHO), Vinylcarboxylate (Y =
-OCOCHR⁵R⁶) oder Vinylencarbonate der Formel III dar.
Alle diese Monomere stellen in wäßriger Lösung radika
lisch polymerisierbare Substanzen mit reversibel binden
den Gruppen dar, die neutral, sauer oder basisch sein
können.
Werden als Monomere Vinylencarbonate der Formel III oder
Vinylcarboxylate CR⁷R⁸ = CR¹-OCOCHR⁵R⁶ der Formel II ein
gesetzt, so wird vorzugsweise das erhaltene Produkt an
schließend in ein Trennmaterial mit Hydroxylgruppen über
führt. Diese Überführung in eine Hydroxyl-Phase wird
durch eine an sich bekannte milde alkalische oder saure
Verseifung erreicht. Beispielsweise kann die Reaktion mit
methanolischer
K2CO3-Lösung bei Raumtemperatur, beschrie
ben z. B. von Y. Tezuka et al., in Macromol. Chem. 186,
685-694 (1985), durchgeführt werden.
In den Formeln I, II und II bedeutet R¹ vorzugsweise H,
d. h. die Acrylsäurederivate sind bevorzugt.
Y in Formel II bedeutet vorzugsweise
-OCOCHR⁵R⁶ oder -CH₂NH₂, in zweiter Linie bevorzugt -CN
oder -CHO. Dementsprechend bedeutet Y in Formel I in erster
Linie bevorzugt
-OH (da vorzugsweise die -OCOCHR⁵R⁶-Gruppe in eine Hy
droxylphase umgewandelt wird) oder -CH2NH2, in zweiter
Linie bevorzugt -CN oder -CHO.
R5 und R6 bedeuten unabhängig voneinander H oder eine
Alkylgruppe mit bis zu 5 C-Atomen. Vorzugsweise ist min
destens einer der Reste R5 und R6 H. Folgende Reste sind
besonders bevorzugt: Acetyloxy-, Propionyloxy-, Butyryl
oxy-, Valeryloxy- und Hexanoyloxy-Rest.
X bedeutet sowohl in Formel I als auch in Formel II -OR4,
-OH oder -NR2R3, vorzugsweise -NR2R3.
Bevorzugt sind dabei Verbindungen, in denen X -NR2R3 be
deutet und einer der Reste R2 und R3 H ist.
Die Reste R2 und/oder R3 bedeuten bevorzugt eine Alkyl-,
Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe, wobei die
Alkyl- und/oder die Phenylgruppe ein- oder mehrfach,
vorzugsweise ein- oder zweifach, insbesondere bevorzugt
einfach, substituiert sein kann durch einen Alkoxy-,
Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammo
nium-, Carboxyl-, Sulfonsäure-, Acetoxy- oder Acetamino-
Rest.
Die Reste R2 und/oder R3 bedeuten bevorzugt Alkyl, Alk
oxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkyl
aminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl oder
Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C-Atomen, bevorzugt bis zu
6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C-Atomen in
der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R2
und/oder R3 bedeuten demnach bevorzugt Methyl, Ethyl,
Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxymethyl, Ethoxy
methyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxapentyl, 2-, 3-,
4- oder 5-Oxahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Oxaheptyl, Iso
propyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2-
Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methylbutyl, 3-Oxa-
4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl, 2-Methyl-3-oxahexyl,
ferner auch Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl.
Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine
Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor
liegen. Demnach bedeuten R2 und/oder R3 bevorzugt Cyano
methyl, Cyanoethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl,
Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxylmethyl,
Carboxylethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Car
boxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-
methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl,
Sulfonsäureethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl,
Sulfonsäurepentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-
methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3-
methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3-
methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.
Ferner sind die Alkylgruppen bevorzugt einfach substi
tuiert durch eine Amino-, Mono- oder Dialkylamino- oder
Trialkylammoniumgruppe. Die Akylgruppen können dabei
gleich oder verschieden sein und bis zu 10, vorzugsweise
bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C-
Atomen, besitzen und bedeuten demnach vorzugsweise Di
methylaminoethyl, Diethylaminoethyl, Methylaminoethyl,
Methylaminopropyl, Dimethylaminopropyl, Ethylaminoethyl,
Propylaminoethyl, Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl,
Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammo
niumethyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammonium
butyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl,
Triethylammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Amino
butyl oder Aminopentyl. Alle diese Alkyl- und substi
tuierten Alkylgruppen sind ebenfalls bevorzugt als Sub
stituenten an der Phenylgruppe.
Bevorzugt für R2 und/oder R3 ist auch ein Sulfonsulfid
der Struktur -(CH2)n-SO2-(CH2)-S-(CH2)nOH mit n=2, 3,
4, 5 oder 6, vorzugsweise 2, 3 oder 4.
Vorzugsweise hat R2 und/oder R3 auch die Bedeutung einer
Phenylgruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist
durch Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Aminoalkyl, Mono- oder
Dialkylamino, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Mono- oder Di
alkylaminoalkyl, Trialkylammonium- oder Trialkylammonium
alkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfon
säurealkyl. Die bevorzugten Bedeutungen dieser Substi
tuenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevorzug
ten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der
Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in
p-Stellung.
p-Acetoxyphenyl, p-Aminophenyl oder p-Acetaminophenyl
sind ebenfalls bevorzugte Bedeutungen für R2 und/oder R3.
Bevorzugt für R2 und/oder R3 ist ferner eine Alkylphenyl-
oder Phenylalkylgruppe, wobei ebenfalls die angegebenen
bevorzugten Bedeutungen für die Alkyl-, substituierten
Alkyl- oder substituierten Phenylgruppen gelten sollen.
Demnach gelten folgende substituierte Phenylgruppen bei
spielsweise als besonders bevorzugt: 4-Cyanophenyl, 4-
Alkylphenyl, 4-(N,N-Dimethylamino)-phenyl, 4-(N,N-Di
alkylaminoethyl)-phenyl, 4-Ethoxyphenyl, 4-Ethoxyethyl
phenyl, 4-Trialkylammoniumphenyl, 4-Carboxylphenyl, 4-
Sulfonsäurephenyl, Phenylethyl, 4-(N-Ethylamino)phenyl
propyl oder 4-Cyanophenyl-ethyl.
Des weiteren sind Einheiten der Formel I bzw. Monomere
der Formel II bevorzugt, in denen R2 und/oder R3 einen
cyclischen oder bicyclischen Rest, der aromatisch oder
gesättigt sein kann, mit 5-10 C-Atomen, worin ein- oder
mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH
und S, oder N oder NH und O ersetzt sind, bedeuten.
R2 und R3 bedeuten demnach bevorzugt auch einen Pyridin
rest, Imidazolylrest, Indolylrest, ferner bevorzugt einen
Pyrrol-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Chinolin- oder Isochino
linrest.
R2 und/oder R3 können beispielsweise auch einen Thiazol-,
Thiadiazol-, Morpholin-, Triazin-, Piperazin-, Benzo
thiazol-, Purin-, Pyrazol-, Triazol-, Pyrrolidin- oder
Isoxazol-Rest bedeuten.
Insbesondere bevorzugt sind dabei die aromatischen, hete
rocyclischen Reste.
Die Reste R2 und R3 müssen, um zu geeigneten Austauschern
zu gelangen, so aufeinander abgestimmt werden,
daß entwe
der beide Reste eine saure oder basische Gruppe enthalten
oder aber einer der Reste neutral ist. Dem Fachmann be
reitet es keine Schwierigkeit, die Gruppen entsprechend
zuzuordnen und somit geeignete Reste für R2 und R3 zu
sammenzustellen, je nach Funktion und Aufgabe des ge
wünschten Ionenaustauschers.
Vorzugsweise ist einer der beiden Reste R2 und R3 ein
neutraler Rest.
R4 bedeutet bevorzugt Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl,
Carboxyalkyl oder Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C-
Atomen, vorzugsweise mit bis zu 6 C-Atomen, insbesondere
bevorzugt mit bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, die
linear oder verzweigt sein kann. R4 bedeutet demnach be
vorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, Methoxy
methyl, Ethoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxa
pentyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Iso
pentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methyl
butyl, 3-Oxa-4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl oder
2-Methyl-3-oxahexyl.
Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine
Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor
liegen. Demnach bedeutet R4 bevorzugt Cyanomethyl, Cyano
ethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl,
2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxymethyl, Carboxyl
ethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carboxylbutyl,
Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-methylpropyl,
Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäure
ethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäure
pentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-methylpropyl,
Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3-methylbutyl,
Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3-methylhexyl
oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.
Alle diese Alkyl- und substituierten Alkylgruppen sind
ebenfalls bevorzugt als Substituenten an der Phenyl
gruppe.
Vorzugsweise hat R4 auch die Bedeutung einer Phenyl
gruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch
Cyano, Cyanoalkyl, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Carboxy,
Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfonsäurealkyl. Die be
vorzugten Bedeutungen dieser Substituenten entsprechen
den vorstehend angegebenen bevorzugten Alkylgruppen und
substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der
Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.
R7 und R8 in den Monomeren der Formel II bedeuten vor
zugsweise H, und damit haben auch R′ und R′′ in Formel I
vorzugsweise die Bedeutung Wasserstoff.
Bevorzugt sind auch Trennmaterialien, bei denen in For
mel I Y = -OH ist und einer der Reste R′ und R′′ ebenfalls
-OH bedeutet. Als Monomeres muß dann ein Vinylencarbonat
der Formel III eingesetzt werden, und das bei der Poly
merisation entstandene Produkt anschließend in eine Hy
droxylphase überführt werden.
R⁷ und R¹ in Formel III bedeuten vorzugsweise H. n in
Formel I stellt die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten
dar und bedeutet 2-100, vorzugsweise 5-60, insbesondere
sind Kettenlängen von 10-30 bevorzugt.
Die EP-0 416 983 A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung
eines Faktors VIII/von Willebrand-Faktor-Konzentrats für die
Blutkoagulation ausgehend von vollständigem Blutplasma. Dort wird
erwähnt, daß sogenanntes Tentakelmaterial der Firma Merck
geeignet ist, als Anionenaustauscher-Material zu fungieren.
Woods, K. und Orme, Th. beschreiben in der EP-A-02 39
859, daß es von Vorteil ist, nach der Virusentfernung
oder -inaktivierung und vor der chromatographischen
Trennung die Probe mit Ölen zu extrahieren, vorzugsweise
mit Sojaöl, Rizinöl und/oder Baumwollsamenöl.
Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen ist es erstmals
möglich, in hohen Ausbeuten einen hochreinen Antihämo
philiefaktor herzustellen, der eine bisher nicht er
reichte spezifische Aktivität aufweist.
Handelsübliches Kryopräzipitat wird bei Raumtemperatur
innerhalb von 3 bis 4 Stunden aufgetaut und in Stücke von
ca. 1 bis 2 cm zerteilt. Diese Stücke werden bei Tempera
turen zwischen 10 und 25°C durch Rühren suspendiert in
etwa dem doppelten Volumen Wasser, welches 1 bis 3 U/ml
Heparin-Natrium enthält. Die Suspension wird mit 0,1 M
Essigsäure auf einen pH-Wert von mindestens 7,0 bis 8,0,
vorzugsweise 7,0 bis 7,1, eingestellt. Es wird 15 bis 60
Minuten, vorzugsweise 30 Minuten bei Raumtemperatur ge
rührt. Daraufhin werden etwa 108 g 2% Aluminiumhydroxid-
Suspension pro kg Kryopräzipitat hinzugefügt und 1 bis 10
Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei Raumtemperatur ge
rührt. Mit Säure, vorzugsweise 0,1 M Essigsäure, wird der
Säuregehalt auf pH 6,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,5 bis 6,6,
eingestellt. Die Probe wird auf 10 bis 18°C, vorzugsweise
14 bis 16°C, gekühlt. Man zentrifugiert bei dieser Tempe
ratur, beispielsweise in einer Sharples AS-16 (Cepa 61)-
Zentrifuge mit einer Rate von 1,0 L/min. Danach schließt
sich eine Filtration des Überstandes, beispielsweise
durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter an. Vorzugsweise nach
dem Abzentrifugieren und Filtrieren erfolgt eine Virus
inaktivierung. Besonders bewährt hat sich die Virusin
aktivierung mit Hilfe von Tween/TNBP (Tri-n-Butylphos
phat). Gute Ergebnisse werden auch mit Natriumcholat/TNBP
erzielt. Das Tween/TNBP- bzw. Natriumcholat/TNBP-Gemisch
kann beispielsweise durch Ölextraktion wieder entfernt
werden.
Man gibt die Probe auf eine Chromatographiesäule, die ein
Gelpermeationsmaterial mit Ionenaustauscheraktivität auf
weist, das unter dem Handelsnamen EMD-TMAE-Fractogel (M)
650 bekannt ist. EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 wurde oben
bereits charakterisiert. Die Säulenkapazität soll vor
zugsweise so beschaffen sein, daß 0,5 kg des Säulenmate
rials pro kg Kryopräzipitat sich in der Säule befinden.
Die Säule wird mit der Probe beschickt und mit Puffern
gewaschen. Nach Elution der Probe mit einem Puffer höhe
rer Ionenstärke wird das erhaltene Produkt mit einem
Puffer mit niedrigem Salzgehalt verdünnt und, falls nö
tig, auf pH 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,9 bis 7,1, ein
gestellt. Danach wird erneut filtriert, vorzugsweise an
Nitrocellulosefiltern, worauf sich eine Sterilfiltration
anschließt.
Erfindungsgemäß wird die Ionenstärke des
Trennpuffers durch quartäres Ammoniumsalz
mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoff
kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Cholinchlorid,
eingestellt wird.
So wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Säule, enthal
tend das oben beschriebene Fractogel (M) 650 mit einem
Puffer A gewaschen und äquilibriert. Der Puffer A enthält
eine Natriumchlorid- oder Cholinchloridkonzentration von
50 bis 200 mM, vorzugsweise 120 mM, bei einem pH-Wert von
5,8 bis 7,8, vorzugsweise 6,5 bis 7,0.
Die Probe wird vorzugsweise aus einem Puffer, der eine
Osmolarität von 200 bis 600 m Osmol, bevorzugt 380 bis
520 m Osmol, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugs
weise 6,5 bis 7,0, aufweist, auf die Säule aufgetragen.
Es empfiehlt sich, daß die Kapazität der Säule 50 I.E.
Faktor VIII/ml Gel nicht überschreitet. Nach dem Auftra
gen wird die Säule mit Puffer A gewaschen.
Danach wäscht man mit Puffer B, der ebenfalls Natrium
citrat, Calciumchlorid, Glycin enthält, jedoch eine
höhere Ionenstärke als der Puffer A aufweist. Die Konzen
tration an quartärem Ammoniumsalz der oben beschriebenen
Art und/oder Natriumchlorid sollte zwischen 150 und
250 mM, vorzugsweise 180 bis 200 mM, betragen, der pH-
Wert sollte zwischen 5,8 bis 7,8, vorzugsweise bei ca.
7,0, liegen.
Die Elution des Produkts von der Säule erfolgt mit einem
Puffer C, der eine gegenüber Puffer B nochmals erhöhte
Ionenstärke aufweist. Der Gehalt an quartärem Ammonium
salz der oben beschriebenen Art, insbesondere Cholin
chlorid und/oder Natriumchlorid, sollte im Bereich von
200 und 500 mM liegen, vorzugsweise ca. 400 mM betragen
bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise ca. 7,0.
Es kann anstelle des Kryopräzipitats auch von Blutplasma
ausgegangen werden. In diesem Fall empfiehlt sich eine
zweistufige chromatographische Aufbereitung.
Claims (4)
1. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti
viertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chro
matographie aus Blutplasma oder Kryopräzipitat unter
Verwendung eines Anionenaustauschermaterials auf Basis
von hydroxylgruppenhaltigen Trägern, deren Oberflächen
mit kovalent gebundenen Polymeren beschichtet sind, die
Polymeren gleiche oder verschieden wiederkehrende Einheiten
der Formel I enthalten,
worin
R¹ H oder CH₃ -CN, -CHO, -OH, -CH₂-NH₂ oder -CH₂NR²R³,
R′ und R′′ jeweils H oder CH3, und falls Y=-OH kann einer der Reste R′ und R′′ auch -OH sein,
X -OH, -NR2R3 oder -OR4,
R2 und R3 jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenyl gruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl-, Sulfon säure- Acetoxy- oder Acetamino-Reste,
einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)n-SO2-(CH2)n S(CH2)nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R2 und R3 auch H bedeuten kann,
wobei R2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind,
n 2 bis 100,
und R4 eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkyl phenylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkyl gruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach sub tituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Carboxyl-, Sulfonsäure- oder Acetoxy-Reste, bedeutet, aufweisen, wobei die Reinigung des Faktors VIII durch Waschen und Elution mit Puffern steigender Ionenstärke durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferionenstärke mittels quartären Ammoniumsalzen mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 C-Atomen allein oder in Kombination mit Kochsalz eingestellt wird.
R¹ H oder CH₃ -CN, -CHO, -OH, -CH₂-NH₂ oder -CH₂NR²R³,
R′ und R′′ jeweils H oder CH3, und falls Y=-OH kann einer der Reste R′ und R′′ auch -OH sein,
X -OH, -NR2R3 oder -OR4,
R2 und R3 jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenyl gruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl-, Sulfon säure- Acetoxy- oder Acetamino-Reste,
einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)n-SO2-(CH2)n S(CH2)nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R2 und R3 auch H bedeuten kann,
wobei R2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind,
n 2 bis 100,
und R4 eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkyl phenylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkyl gruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach sub tituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Carboxyl-, Sulfonsäure- oder Acetoxy-Reste, bedeutet, aufweisen, wobei die Reinigung des Faktors VIII durch Waschen und Elution mit Puffern steigender Ionenstärke durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferionenstärke mittels quartären Ammoniumsalzen mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 C-Atomen allein oder in Kombination mit Kochsalz eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des
Anspruchs 1
mit X = -NR²R³ ist,
worin
R² und R³ jeweils Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl, Sulfonsäurealkyl mit jeweils bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe,
unsubstituiertes oder durch einen oder mehrere Alkyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyl, Cyano-, Cyanoalkyl-, Aminoalkyl-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Mono- oder Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium-, Trialkylammoniumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl, Sulfonsäure-, Sulfonsäurealkyl-, Acetoxy- oder Acetamino-Gruppe(n) substituiertes Phenyl mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)n-SO-(CH2)n- S-(CH2)nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R2 und R3 auch H bedeuten kann, wobei R2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind.
worin
R² und R³ jeweils Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl, Sulfonsäurealkyl mit jeweils bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe,
unsubstituiertes oder durch einen oder mehrere Alkyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyl, Cyano-, Cyanoalkyl-, Aminoalkyl-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Mono- oder Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium-, Trialkylammoniumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl, Sulfonsäure-, Sulfonsäurealkyl-, Acetoxy- oder Acetamino-Gruppe(n) substituiertes Phenyl mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)n-SO-(CH2)n- S-(CH2)nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R2 und R3 auch H bedeuten kann, wobei R2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das quartäre Ammoniumsalz Cholinchlorid ist.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß der Salzgradient, aufgebaut
auf den verwendeten Puffersystem, 0,1 bis 1,0 M
beträgt als Summe aus der Konzentration von Natriumchlorid
und/oder dem quartären Ammoniumsalz nach Anspruch 1
und/oder 3.
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