DE4204694A1

DE4204694A1 - Verfahren zur gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem faktor viii mittels anionenaustauscher-chromatographie

Info

Publication number: DE4204694A1
Application number: DE4204694A
Authority: DE
Inventors: Monika Stadler; Horst Dr Schwinn
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1992-02-01
Filing date: 1992-02-01
Publication date: 1993-08-12
Anticipated expiration: 2012-02-02
Also published as: JP3556947B2; DK0625161T4; ES2157920T5; DE69330458T2; DE69330458T3; FI943545A0; GR3036849T3; EP0625161B2; AU670776B2; ATE203249T1; NO942832D0; AU3351793A; ES2157920T3; KR950700925A; DE4204694C2; DE4204694C3; NO942832L; PT625161E; EP0625161B9; EP0625161A1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie aus Blut plasma oder Kryopräzipitat.

In der EP-A-02 38 701 wird ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors be schrieben, wobei das Kryopräzipitat mittels Ethanol fällung von Fibrinogen, Globulinen, Albuminen und anderen störenden Bestandteilen befreit wird. Die Anreicherung aus dem Kryopräzipitat ist notwendig, da Faktor VIII nur in äußerst geringen Mengen in dem Material enthalten ist. Dieser Anreicherungsschritt beeinträchtigt jedoch den Gehalt an AHF im Endprodukt. Die bisher bekannten Verfah ren zur Herstellung von Faktor VIII ergeben nur geringe Mengen an wirksamer Substanz. Bei der Applikation des auf herkömmlichem Wege hergestellten Faktors VIII belastet man den Patienten daher mit großen Mengen antigener Sub stanzen. Diese Verfahrensweise ist nicht unbedenklich. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, den Faktor VIII durch Trennungsoperationen weiter anzureichern. So wurde versucht, mittels Affinitätschromatographie mit gegen Faktor VIII gerichteten tierischen Antikörpern Produkte mit höherer spezifischer Aktivität zu erhalten. Diese Technik ist jedoch sehr aufwendig und kostenintensiv. Zum anderen ist sie auch deshalb nicht unbedenklich, da stets eine gewisse Menge tierischen Eiweißes bei jeder chroma tographischen Trennung aus der Säule gewaschen wird.

Die EP-8 81 08 458.6 beschreibt ein Verfahren zur Herstel lung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors, in dem ausgehend von Kryopräzipitat der Faktor VIII durch Behandlung mit Aluminiumhydroxid und biokompatiblen or ganischen Lösungsmitteln/Detergenzien in bevorzugter Weise eine Gelpermeationschromatographie an Ionenaus tauschermaterialien durchgeführt wird. Als besonders ge eignet wird ein Chromatographiematerial auf Basis von Copolymerisaten aus Oligoethylenglycolen, Glycidylmeth acrylaten und Pentaerythroldimethacrylaten genannt.

Zwar wird durch das in der EP-8 81 08 458.6 beschriebene Verfahren eine Ausbeutesteigerung an Faktor VIII ver zeichnet, jedoch ist die Ausbeute an biologisch aktivem Faktor VIII nach wie vor nicht optimal.

Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist also die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Isolierung von biologisch aktivem Faktor VIII aus den Quellen Kryopräzipitat oder Blutplasma verbessern läßt und eine wirtschaftlichere Arbeitsweise gewährlei stet.

Überraschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die Unter ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des er findungsgemäßen Verfahrens.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Trennmaterialien be stehen aus Trägerteilchen wie sie in der EP-A-03 37 144 offenbart werden. Dies sind Trägerteilchen mit Hydroxyl gruppen, auf die über die alpha-C-Atome der Hydroxylgrup pen ein polymeres Material aufgepfropft ist. Als Träger teilchen kommen alle allgemein bekannten porösen und unporösen Chromatographieträger, die primäre oder sekun däre, aliphatische Hydroxylfunktionen an der Oberfläche aufweisen, in Frage. Dabei sind bevorzugt hydrophile Polymere auf Acrylat- und Methacrylatbasis, Polymere auf Polyvinylalkohol-Basis, diolsubstituierte Kieselgele, Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulose derivate oder Polymere auf Dextran-Basis. Es können aber selbstverständlich auch andere Polymere oder Copolymere auf der Grundlage von Monomeren wie Vinylverbindungen, Acrylamid, (Meth)Acrylsäureestern oder (Meth)-Acrylnitril in hydroxylierter Form eingesetzt werden.

Das polymere Material, das über die α-C-Atome der Hy droxylgruppen an die Trägerteilchen gebunden ist, basiert auf den Monomeren der Formeln II und/oder III.

CR⁷R⁸+CR¹-Y II

Diese Monomeren stellen (Meth)Acrylsäure (Y=-COOH), (Meth)-Acrylsäurederivate

Allylamine (Y=-CH₂NH₂, -CH₂NR²R³), (Meth)-Acrylnitrile (Y=-CN), Acroleine (Y=-CHO), Vinylcarboxylate (Y= -OCOCHR⁵R⁶) oder Vinylencarbonate der Formel III dar.

Alle diese Monomere stellen in wäßriger Lösung radika lisch polymerisierbare Substanzen mit reversibel binden den Gruppen dar, die neutral, sauer oder basisch sein können.

Werden als Monomere Vinylencarbonate der Formel III oder Vinylcarboxylate CR⁷R⁸=CR¹-OCOCHR⁵R⁶ der Formel II ein gesetzt, so wird vorzugsweise das erhaltene Produkt an schließend in ein Trennmaterial mit Hydroxylgruppen über führt. Diese Überführung in eine Hydroxyl-Phase wird durch eine an sich bekannte milde alkalische oder saure Verseifung erreicht. Beispielsweise kann die Reaktion mit methanolischer K₂CO₃-Lösung bei Raumtemperatur, beschrie ben z. B. von Y. Tezuka et al., in Macromol. Chem. 186, 685-694 (1985), durchgeführt werden.

In den Formeln I, II und II bedeutet R¹ vorzugsweise H, d. h. die Acrylsäurederivatesind bevorzugt.

Y in Formel II bedeutet vorzugsweise

-OCOCHR⁵R⁶ oder -CH₂NH₂, in zweiter Linie bevorzugt -CN oder -CHO. Dementsprechend bedeutet Y in Formel I in erster Linie bevorzugt

-OH (da vorzugsweise die -OCOCHR⁵R⁶-Gruppe in eine Hy droxylphase umgewandelt wird) oder -CH₂NH₂, in zweiter Linie bevorzugt -CN oder -CHO.

R⁵ und R⁶ bedeuten unabhängig voneinander H oder eine Alkylgruppe mit bis zu 5 C-Atomen. Vorzugsweise ist min destens einer der Reste R⁵ und R⁶ H. Folgende Reste sind besonders bevorzugt: Acetyloxy-, Propionyloxy-, Butyryl oxy-, Valeryloxy- und Hexanoyloxy-Rest.

X bedeutet sowohl in Formel I als auch in Formel II -OR⁴, -OH oder -NR²R³, vorzugsweise -NR²R³.

Bevorzugt sind dabei Verbindungen, in denen X -NR²R³ be deutet und einer der Reste R² und R³ H ist.

Die Reste R² und/oder R³ bedeuten bevorzugt eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe, wobei die Alkyl- und/oder die Phenylgruppe ein- oder mehrfach, vorzugsweise ein- oder zweifach, insbesondere bevorzugt einfach, substituiert sein kann durch einen Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammo nium-, Carboxyl-, Sulfonsäure-, Acetoxy- oder Acetamino- Rest.

Die Reste R² und/oder R³ bedeuten bevorzugt Alkyl, Alk oxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkyl aminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C-Atomen, bevorzugt bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R² und/oder R³ bedeuten demnach bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxymethyl, Ethoxy methyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxapentyl, 2-, 3-, 4- oder 5-Oxahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Oxaheptyl, Iso propyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2- Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methylbutyl, 3-Oxa- 4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl, 2-Methyl-3-oxahexyl, ferner auch Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl.

Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor liegen. Demnach bedeuten R² und/oder R³ bevorzugt Cyano methyl, Cyanoethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxylmethyl, Carboxylethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Car boxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2- methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäureethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäurepentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2- methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3- methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3- methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.

Ferner sind die Alkylgruppen bevorzugt einfach substi tuiert durch eine Amino-, Mono- oder Dialkylamino- oder Trialkylammoniumgruppe. Die Akylgruppen können dabei gleich oder verschieden sein und bis zu 10, vorzugsweise bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C- Atomen, besitzen und bedeuten demnach vorzugsweise Di methylaminoethyl, Diethylaminoethyl, Methylaminoethyl, Methylaminopropyl, Dimethylaminopropyl, Ethylaminoethyl, Propylaminoethyl, Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl, Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammo niumethyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammonium butyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl, Triethylammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Amino butyl oder Aminopentyl. Alle diese Alkyl- und substi tuierten Alkylgruppen sind ebenfalls bevorzugt als Sub stituenten an der Phenylgruppe.

Bevorzugt für R² und/oder R³ ist auch ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH₂)_n-SO₂-(CH₂)-S-(CH₂)_nOH mit n=2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 2, 3 oder 4.

Vorzugsweise hat R² und/oder R³ auch die Bedeutung einer Phenylgruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylamino, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Mono- oder Di alkylaminoalkyl, Trialkylammonium- oder Trialkylammonium alkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfon säurealkyl. Die bevorzugten Bedeutungen dieser Substi tuenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevorzug ten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.

p-Acetoxyphenyl, p-Aminophenyl oder p-Acetaminophenyl sind ebenfalls bevorzugte Bedeutungen für R² und/oder R³.

Bevorzugt für R² und/oder R³ ist ferner eine Alkylphenyl- oder Phenylalkylgruppe, wobei ebenfalls die angegebenen bevorzugten Bedeutungen für die Alkyl-, substituierten Alkyl- oder substituierten Phenylgruppen gelten sollen.

Demnach gelten folgende substituierte Phenylgruppen bei spielsweise als besonders bevorzugt: 4-Cyanophenyl, 4- Alkylphenyl, 4-(N,N-Dimethylamino)-phenyl, 4-(N,N-Di alkylaminoethyl)-phenyl, 4-Ethoxyphenyl, 4-Ethoxyethyl phenyl, 4-Trialkylammoniumphenyl, 4-Carboxylphenyl, 4- Sulfonsäurephenyl, Phenylethyl, 4-(N-Ethylamino)phenyl propyl oder 4-Cyanophenyl-ethyl.

Des weiteren sind Einheiten der Formel I bzw. Monomere der Formel II bevorzugt, in denen R² und/oder R³ einen cyclischen oder bicyclischen Rest, der aromatisch oder gesättigt sein kann, mit 5-10 C-Atomen, worin ein- oder mehrere CH- oder CH₂-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind, bedeuten.

R² und R³ bedeuten demnach bevorzugt auch einen Pyridin rest, Imidazolylrest, Indolylrest, ferner bevorzugt einen Pyrrol-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Chinolin- oder Isochino linrest.

R² und/oder R³ können beispielsweise auch einen Thiazol-, Thiadiazol-, Morpholin-, Triazin-, Piperazin-, Benzo thiazol-, Purin-, Pyrazol-, Triazol-, Pyrrolidin- oder Isoxazol-Rest bedeuten.

Insbesondere bevorzugt sind dabei die aromatischen, hete rocyclischen Reste.

Die Reste R² und R³ müssen, um zu geeigneten Austauschern zu gelangen, so aufeinander abgestimmt werden, daß entwe der beide Reste eine saure oder basische Gruppe enthalten oder aber einer der Reste neutral ist. Dem Fachmann be reitet es keine Schwierigkeit, die Gruppen entsprechend zuzuordnen und somit geeignete Reste für R² und R³ zu sammenzustellen, je nach Funktion und Aufgabe des ge wünschten Ionenaustauschers.

Vorzugsweise ist einer der beiden Reste R² und R³ ein neutraler Rest.

R⁴ bedeutet bevorzugt Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C- Atomen, vorzugsweise mit bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt mit bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R⁴ bedeutet demnach be vorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, Methoxy methyl, Ethoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxa pentyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Iso pentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methyl butyl, 3-Oxa-4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl oder 2-Methyl-3-oxahexyl.

Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor liegen. Demnach bedeutet R⁴ bevorzugt Cyanomethyl, Cyano ethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxymethyl, Carboxyl ethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carboxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäure ethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäure pentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3-methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3-methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.

Alle diese Alkyl- und substituierten Alkylgruppen sind ebenfalls bevorzugt als Substituenten an der Phenyl gruppe.

Vorzugsweise hat R⁴ auch die Bedeutung einer Phenyl gruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cyano, Cyanoalkyl, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfonsäurealkyl. Die be vorzugten Bedeutungen dieser Substituenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevorzugten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.

R⁷ und R⁸ in den Monomeren der Formel II bedeuten vor zugsweise H, und damit haben auch R′ und R^′′ in Formel vorzugsweise die Bedeutung Wasserstoff.

Bevorzugt sind auch Trennmaterialien, bei denen in For mel I Y=-OH ist und einer der Reste R′ und R′′ ebenfalls -OH bedeutet. Als Monomeres muß dann ein Vinylencarbonat der Formel III eingesetzt werden, und das bei der Poly merisation entstandene Produkt anschließend in eine Hy droxylphase überführt werden.

R⁷ und R¹ in Formel III bedeuten vorzugsweise H. n in Formel I stellt die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten dar und bedeutet 2-100, vorzugsweise 5-60, insbesondere sind Kettenlängen von 10-30 bevorzugt.

Woods, K. und Orme, Th. beschreiben in der EP-A-02 39 859, daß es von Vorteil ist, nach der Virusentfernung oder -inaktivierung und vor der chromatographischen Trennung die Probe mit Ölen zu extrahieren, vorzugsweise mit Sojaöl, Rizinöl und/oder Baumwollsamenöl.

Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen ist es erstmals möglich, in hohen Ausbeuten einen hochreinen Antihämo philiefaktor herzustellen, der eine bisher nicht er reichte spezifische Aktivität aufweist.

Handelsübliches Kryopräzipitat wird bei Raumtemperatur innerhalb von 3 bis 4 Stunden aufgetaut und in Stücke von ca. 1 bis 2 cm zerteilt. Diese Stücke werden bei Tempera turen zwischen 10 und 25°C durch Rühren suspendiert in etwa dem doppelten Volumen Wasser, welches 1 bis 3 U/ml Heparin-Natrium enthält. Die Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure auf einen pH-Wert von mindestens 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,0 bis 7,1, eingestellt. Es wird 15 bis 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten bei Raumtemperatur ge rührt. Daraufhin werden etwa 108 g 2% Aluminiumhydroxid- Suspension pro kg Kryopräzipitat hinzugefügt und 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei Raumtemperatur ge rührt. Mit Säure, vorzugsweise 0,1 M Essigsäure, wird der Säuregehalt auf pH 6,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,5 bis 6,6, eingestellt. Die Probe wird auf 10 bis 18°C, vorzugsweise 14 bis 16°C, gekühlt. Man zentrifugiert bei dieser Tempe ratur, beispielsweise in einer Sharples AS-16 (Cepa 61)- Zentrifuge mit einer Rate von 1,0 L/min. Danach schließt sich eine Filtration des Überstandes, beispielsweise durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter an. Vorzugsweise nach dem Abzentrifugieren und Filtrieren erfolgt eine Virus inaktivierung. Besonders bewährt hat sich die Virusin aktivierung mit Hilfe von Tween/TNBP (Tri-n-Butylphos phat). Gute Ergebnisse werden auch mit Natriumcholat/TNBP erzielt. Das Tween/TNBP- bzw. Natriumcholat/TNBP-Gemisch kann beispielsweise durch Ölextraktion wieder entfernt werden.

Man gibt die Probe auf eine Chromatographiesäule, die ein Gelpermeationsmaterial mit Ionenaustauscheraktivität auf weist, das unter dem Handelsnamen EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 bekannt ist. EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 wurde oben bereits charakterisiert. Die Säulenkapazität soll vor zugsweise so beschaffen sein, daß 0,5 kg des Säulenmate rials pro kg Kryopräzipitat sich in der Säule befinden. Die Säule wird mit der Probe beschickt und mit Puffern gewaschen. Nach Elution der Probe mit einem Puffer höhe rer Ionenstärke wird das erhaltene Produkt mit einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt verdünnt und, falls nö tig, auf pH 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,9 bis 7,1, ein gestellt. Danach wird erneut filtriert, vorzugsweise an Nitrocellulosefiltern, worauf sich eine Sterilfiltration anschließt.

Es haben sich als Trennpuffer solche als besonders vor teilhaft herausgestellt, deren Ionenstärke durch Natrium chlorid und/oder einem quartären Ammoniumsalz mit minde stens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Cholinchlorid, eingestellt wird.

So wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Säule, enthal tend das oben beschriebene Fractogel (M) 650 mit einem Puffer A gewaschen und äquilibriert. Der Puffer A enthält eine Natriumchlorid- oder Cholinchloridkonzentration von 50 bis 200 mM, vorzugsweise 120 mM, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise 6,5 bis 7,0.

Die Probe wird vorzugsweise aus einem Puffer, der eine Osmolarität von 200 bis 600 m Osmol, bevorzugt 380 bis 520 m Osmol, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugs weise 6,5 bis 7,0, aufweist, auf die Säule aufgetragen. Es empfiehlt sich, daß die Kapazität der Säule 50 I.E. Faktor VIII/ml Gel nicht überschreitet. Nach dem Auftra gen wird die Säule mit Puffer A gewaschen.

Danach wäscht man mit Puffer B, der ebenfalls Natrium citrat, Calciumchlorid, Glycin enthält, jedoch eine höhere Ionenstärke als der Puffer A aufweist. Die Konzen tration an quartärem Ammoniumsalz der oben beschriebenen Art und/oder Natriumchlorid sollte zwischen 150 und 250 mM, vorzugsweise 180 bis 200 mM, betragen, der pH- Wert sollte zwischen 5,8 bis 7,8, vorzugsweise bei ca. 7,0, liegen.

Die Elution des Produkts von der Säule erfolgt mit einem Puffer C, der eine gegenüber Puffer B nochmals erhöhte Ionenstärke aufweist. Der Gehalt an quartärem Ammonium salz der oben beschriebenen Art, insbesondere Cholin chlorid und/oder Natriumchlorid, sollte im Bereich von 200 und 500 mM liegen, vorzugsweise ca. 400 mM betragen bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise ca. 7,0.

Es kann anstelle des Kryopräzipitats auch von Blutplasma ausgegangen werden. In diesem Fall empfiehlt sich eine zweistufige chromatographische Aufbereitung.

Das Verfahren wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Anreicherung des Faktor VIII aus Kryopräzipitat

Handelsübliches Kryopräzipitat wird bei Raumtemperatur innerhalb von 3 bis 4 Stunden aufgetaut und in Stücke von ca. 1 bis 2 cm zerteilt. Diese Stücke werden bei 20 bis 25°C durch Rühren suspendiert und in etwa dem doppelten Volumen Wasser, welches 2 U/ml Heparin-Natrium enthält, suspendiert. Die Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,1 eingestellt. Man rührt 30 Minuten bei 20 bis 25°C. 108 g 2% Aluminiumhydroxid- Suspension pro kg Kryopräzipitat werden hinzugefügt und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach stellt man den pH-Wert mit 0,1 M Essigsäure auf pH 6,5 bis 6,6 ein. Danach kühlt man die Probe auf 14 bis 16°C ab, zentrifugiert in einer Sharples AS-16 (Cepa 61)- Zentrifuge mit einer Rate von 1,0 L/min. Der Überstand wird durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter filtriert.

Beispiel 2 Vorbereitung der Chromatographiesäule

Zur Trennung des extrahierten Kryopräzipitats wird eine Säule mit mindestens 0,5 l Ionenaustauscher Harz pro kg Kryopräzipitat verwendet. Die Säulenhöhe soll Durch messer sein. Nach dem Beschicken der Säule mit Harz wird die Chromatographiesäule mit 5 Volumina 0,1 M Natrium chloridlösung gewaschen. Danach wäscht man mit einem Puffer A, der wie folgt zusammengesetzt ist:
120 mM Natriumchlorid, 10 mM Natriumcitrat-5H₂O,
120 mM Glycin, 1 mM Calciumchlorid-2H₂O, pH-Wert
6,5 bis 7,0, mit 1 M HCl einzustellen.

Sämtliche Puffer müssen virusfrei sein, da die folgenden Operationen mit virusfreien Extrakten des Kryopräzipitats durchgeführt werden.

Beispiel 3

Die Probe wird auf die Säule aufgetragen und die Absorp tion des Durchflusses bei einer Wellenlänge von 280 nm beobachtet. Das Filtrat wird aufgenommen und auf Faktor VIII-Aktivität untersucht, ebenso wie das Produkt vor der Säulentrennung. Danach wird die Säule mit dem Puffer A gewaschen, bis die Absorption wieder ihren Ausgangswert erreicht. Danach wird die Säule mit Puffer B gewaschen. Dies geschieht so lange, bis die Absorption wieder die Grundlinie erreicht hat.

Der Puffer B hat folgende Zusammensetzung:
180 bis 200 mM Natriumchlorid, 10 mM Natrium citrat-5H₂O, 120 mM Glycin, 1 mM Calciumchlorid- 2H₂O, pH-Wert 6,9 bis 7,0.

Die Elution des Produkts erfolgt mit dem Puffer C. Die nach Zugabe des Puffers C erscheinende Proteinfraktion wird gesammelt. Puffer C weist folgende Zusammensetzung auf:

400 mM Natriumchlorid, 1 mM Natriumcitrat-5H₂O,
120 mM Glycin, 1,0 mM Calciumchlorid-2H₂O,
pH-Wert 6,9 bis 7,0.

Nach Elution der gewünschten Fraktion wird die Säule an schließend mit 5 Volumina des Puffers D, welcher 1 M Na triumchloridlösung enthält, gewaschen.

Die Regenerierung der Säule erfolgt durch Waschen mit 0,1 N NaOH (3 Säulenvolumina), gefolgt durch Waschen der Säule mit 0,1 N Salzsäure (3 Säulenvolumina) und Waschen der Säule mit 5 Säulenvolumina 25% Alkohol in Wasser.

Beispiel 4

Die gesammelten Fraktionen werden mit Puffer E, bestehend aus

20 mM Natriumcitrat, 80 mM Glycin,
2,5 mM Calciumchlorid-2H₂O, pH-Wert 6,9 bis 7,1,

so lange verdünnt, bis sie eine Aktivität von 26 oder 35 U/ml aufweisen. Danach wird der pH-Wert, falls nötig, auf 6,9 bis 7,1 eingestellt, worauf sich eine Filtration des Produkts durch 0,45 µm Sealklean-Filter anschließt. Ab schließend wird eine weitere Sterilfiltration durchge führt.

Beispiel 5

Wenn als Faktor VIII-Quelle humanes Plasma verwendet wer den soll, wird wie folgt aufgearbeitet:

Frisches oder tiefgefrorenes humanes Plasma wird, gegebe nenfalls in einem Wasserbad, temperiert, bis die Mischung eine Temperatur von 20°C erreicht. Das Plasma wird mit 50 vol.-% Wasser verdünnt und danach filtriert. Das Plas mafiltrat wird in eine Ionenaustauschersäule mit EMD- TMAE-Fractogel (M) 650 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor mit einem Puffer folgender Zusammensetzung äquilibriert:

50 mM Natriumchlorid
10 mM Natriumcitrat
120 mM Glycin
100 U/L Heparin pH 6,5 bis 6,9.

Nach dem Auftragen der Probe wird das Ionenaustauscher harz mit dem Waschpuffer mehrere Male gewaschen. Danach wird schrittweise die Konzentration an Kochsalz erhöht, indem zunächst mit einem Puffer gewaschen wird, der 100 mM Natriumchlorid, danach 160 mM Natriumchlorid gefolgt von 200 mM Natriumchlorid enthält. Die Faktor VIII ent haltenden Fraktionen werden gesammelt und durch Zugabe von 1,0 mg/ml humanem Serumalbumin stabilisiert. Die weitere Bearbeitung erfolgt analog den Beispielen 2 bis 4, nur daß anstelle des dort verwendeten handelsüblichen Kryopräzipitats, die Faktor VIII enthaltenden Säulen fraktionen eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti viertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chro matographie aus Blutplasma oder Kryopräzipitat, da durch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauscher material ein Trennmaterial verwendet wird auf Basis von hydroxylgruppenhaltigen Trägern, deren Oberflächen mit kovalent gebundenen Polymeren beschichtet sind, die Polymeren gleiche oder verschiedene wiederkehrende Einheiten der Formel I enthalten, worin
R¹ H oder CH₃ -CN, -CHO, -OH, -CH₂-NH₂ oder -CH₂NR²R³,
R′ und R′′ jeweils H oder CH₃, und falls Y=-OH kann einer der Reste R′ und R′′ auch -OH sein,
X -OH, -NR²R³ oder -OR⁴,
R² und R³ jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenyl gruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe,
wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl-, Sulfon säure- Acetoxy- oder Acetamino-Reste,
einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH₂-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH₂)_n-SO₂-(CH₂)_n S(CH₂)_nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R² und R³ auch H bedeuten kann,
wobei R² und R³ so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind,
n 2 bis 100,
und R₄ eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkyl phenylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkyl gruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach sub stituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Carboxyl-, Sulfonsäure- oder Acetoxy-Reste, bedeutet, aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 mit X=OH oder -OR⁴ bedeutet, wobei R⁴ die in An spruch 1 angegebene Bedeutung hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 mit X=-NR²R³ ist,
worin
R² und R³ jeweils
Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxy alkyl, Sulfonsäurealkyl mit jeweils bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe,
unsubstituiertes oder durch einen oder mehrere Alkyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyl, Cyano-, Cyanoalkyl-, Amino alkyl-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Mono- oder Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium-, Trialkylammo niumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl, Sulfonsäure-, Sulfonsäurealkyl-, Acetoxy- oder Acetamino-Gruppe(n) substituiertes Phenyl mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe,
einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH₂-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH₂)_n-SO-(CH₂)_n- S-(CH₂)_nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R² und R³ auch H bedeuten kann, wobei R² und R³ so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 -CH₂NH₂ oder -CH₂NR²R³ ist, wobei R² und R³ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 -CN, -CHO oder -OH ist.

6. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti viertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chroma tographie aus Blutplasma oder Kryopräzipitat unter Verwendung eines Anionenaustauschermaterials nach min destens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Reini gung des Faktors VIII durch Waschen und Elution mit Puffern steigender Ionenstärke durchgeführt wird, da durch gekennzeichnet, daß die Pufferionenstärke mittels quartären Ammoniumsalzen mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 C-Atomen allein oder in Kombination mit Kochsalz eingestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das quartäre Ammoniumsalz Cholinchlorid ist.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Salzgradient, aufge baut auf den verwendeten Puffersystemen, 0,1 bis 1,0 M beträgt als Summe aus der Konzentration von Natrium chlorid und/oder dem quartären Ammoniumsalz nach An spruch 6 und/oder 7.